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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-03-19
(45)【発行日】2025-03-28
(54)【発明の名称】ＣＡＲ－Ｔ細胞の製造方法、核酸導入キャリア及びキット
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20250321BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20250321BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20250321BHJP
C12N 15/54 20060101ALI20250321BHJP
C12N 15/87 20060101ALI20250321BHJP
C12N 9/10 20060101ALI20250321BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10 ZNA
C12N5/0783
C12N15/12
C12N15/54
C12N15/87 Z
C12N9/10
【請求項の数】
22
(21)【出願番号】P 2023130389
(22)【出願日】2023-08-09
(62)【分割の表示】P 2019135549の分割
【原出願日】2019-07-23
(65)【公開番号】P2023153231
(43)【公開日】2023-10-17
【審査請求日】2023-08-09
(73)【特許権者】
【識別番号】000003078
【氏名又は名称】株式会社東芝
(73)【特許権者】
【識別番号】504180239
【氏名又は名称】国立大学法人信州大学
(74)【代理人】
【識別番号】110001737
【氏名又は名称】弁理士法人スズエ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】赤星 英一
(72)【発明者】
【氏名】石原 美津子
(72)【発明者】
【氏名】中沢 洋三
(72)【発明者】
【氏名】盛田 大介
【審査官】小林 薫
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１８－５０９１５１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１５－５００８３５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００２－５２９４３９（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／０６１６１５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１４／１５３１１４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１８－５３３５７３（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１８／０７３３９３（ＷＯ，Ａ２）
【文献】米国特許出願公開第２０１８／００１６３３７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１９－５０７５７９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００８－５４５３７５（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１６／０１４５３４８（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特開２００４－１５９５０１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１９－５１１５６６（ＪＰ，Ａ）
【文献】Proc. Natl. Acad. Sci.，2016年，Vol.113, No.3，pp.520-525
【文献】Drug Deliv.，2013年，Vol.20, No.2，pp.57-64
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ （ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を製造する方法であって、Ｔ細胞を含む細胞集団を、前記Ｔ細胞を活性化する抗体で刺激する刺激工程、
前記刺激工程の後、前記細胞集団に、中空体である脂質粒子と、前記脂質粒子の内腔に内包された、ＣＡＲ遺伝子を含む第１核酸及びトランスポゼース遺伝子を含む第２核酸とを含む核酸導入キャリアを接触させる遺伝子導入工程、及び
前記遺伝子導入工程の後、前記細胞集団を培養する培養工程
を含み、
前記脂質粒子を構成する第１の脂質化合物は、下記式（１－０１）及び／又は下記式（１－０２）の化合物を含み、
【化1-1】
【化1-2】
【請求項2】
前記脂質粒子は、前記核酸導入キャリアの表面電荷を調整する脂質と、前記核酸導入キャリア同士の凝集を抑制する脂質との少なくとも１つを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記脂質粒子の酸解離定数が６．５～８．０である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記第１核酸及び前記第２核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ又はこれらの何れかの誘導体である、請求項１～３の何れか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記第１核酸及び前記第２核酸は、一本鎖又は二本鎖の、環状、直鎖又は分岐鎖核酸である、請求項１～４の何れか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記第１核酸及び前記第２核酸は、一緒に前記脂質粒子に内包されているか、或いは、別々の前記脂質粒子に内包されている、請求項１～５の何れか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記トランスポゼースは、ＰｉｇｇｙＢａｃである、請求項１～６の何れか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記核酸導入キャリアは、前記第１核酸が第１の脂質粒子に内包されている第１のサブ核酸導入キャリアと、前記第２核酸が第２の脂質粒子に内包されている第２のサブ核酸導入キャリアとを含み、前記第１の脂質粒子と、前記第２の脂質粒子とが、互いに同じ又は異なる組成を有する、請求項１～７の何れか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記遺伝子導入工程において、前記第１のサブ核酸導入キャリアと、前記第２のサブ核酸導入キャリアとを同時に接触させる、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記遺伝子導入工程において、前記第２のサブ核酸導入キャリアを前記第１のサブ核酸導入キャリアよりも先に接触させる、請求項８に記載の方法。
【請求項11】
前記刺激工程における前記抗体が、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体の少なくともどちらか１つを含む、請求項１～１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項12】
Ｔ細胞にＣＡＲ遺伝子を導入するための核酸導入キャリアであって、中空体である脂質粒子と、前記脂質粒子の内腔に内包されたＣＡＲ遺伝子を含む第１核酸及びトランスポゼース遺伝子を含む第２核酸とを含み、
前記脂質粒子を構成する第１の脂質化合物は、下記式（１－０１）及び／又は下記式（１－０２）の化合物を含み、
【化2-1】
【化2-2】
【請求項13】
前記脂質粒子は、前記核酸導入キャリアの酸解離定数を調整する脂質と、前記核酸導入キャリア同士の凝集を抑制する脂質との少なくとも１つを更に含む、請求項１２に記載の核酸導入キャリア。
【請求項14】
前記脂質粒子の酸解離定数が６．５～８．０である、請求項１２又は１３の何れか１項に記載の核酸導入キャリア。
【請求項15】
前記第１核酸及び前記第２核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ又はこれらの何れかの誘導体である、請求項１２～１４の何れか１項に記載の核酸導入キャリア。
【請求項16】
前記第１核酸及び前記第２核酸は、一本鎖又は二本鎖の、環状、直鎖又は分岐鎖核酸である、請求項１２～１５の何れか１項に記載の核酸導入キャリア。
【請求項17】
前記核酸導入キャリアが前記第１核酸及び前記第２核酸の両方を含む場合、前記第１核酸及び前記第２核酸は、一緒に前記脂質粒子に内包されているか、或いは、別々の前記脂質粒子に内包されている、請求項１２～１６の何れか１項に記載の核酸導入キャリア。
【請求項18】
前記トランスポゼースは、ＰｉｇｇｙＢａｃである、請求項１２～１７の何れか１項に記載の核酸導入キャリア。
【請求項19】
前記核酸導入キャリアは、前記第１核酸が第１の脂質粒子に内包されている第１のサブ核酸導入キャリアと、前記第２核酸が第２の脂質粒子に内包されている第２のサブ核酸導入キャリアとを含み、前記第１の脂質粒子と、前記第２の脂質粒子とが、互いに同じ又は異なる組成を有する、請求項１２～１８の何れか１項に記載の核酸導入キャリア。
【請求項20】
請求項１２～１９の何れか１項に記載の核酸導入キャリア、及び前記核酸導入キャリアの保管安定性を向上させる物質
を少なくとも含む、ＣＡＲ－Ｔ細胞を製造するためのキット。
【請求項21】
前記核酸導入キャリアが、固相に直接又は間接的に付着又は固定されている、請求項２０に記載のキット。
【請求項22】
前記固相が、金属、樹脂、ゲル又は繊維を材料とする容器、プレート又はシートである、請求項２１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の製造方法、核酸導入キャリア及びキットに関する。
【背景技術】
【0002】
キメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＣＡＲ）を産生するよう遺伝子改変したＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を用いたＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、腫瘍に対する治療効果が非常に高いことで注目されている。この方法では、患者から採取したＴ細胞にＣＡＲ遺伝子を導入してＣＡＲ－Ｔ細胞を作製し、それを患者に投与する。投与されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、患者の体内で遭遇した腫瘍細胞を殺傷する。
【0003】
ＣＡＲ－Ｔ細胞の作製時、ＣＡＲ遺伝子の導入にはウィルスベクター法やエレクトロポレーション法が一般的に用いられている。しかしながら、これらの方法では、特に遺伝子導入や培養の工程において煩雑な操作が必要であることに加え、ウィルスベクターを使用する際には、専用細胞培養設備が必要となるため、治療費が非常に高額になるという経済性の問題もある。
【0004】
そこで、ＣＡＲ遺伝子を簡単且つ高効率にＴ細胞に導入する方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】国際公開第２０１７／０６１６１５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、簡単な手順でＣＡＲ遺伝子をＴ細胞により効率よく導入することができ、且つＣＡＲ遺伝子の発現量の多いＣＡＲ－Ｔ細胞を得ることができるＣＡＲ－Ｔ細胞の製造方法、核酸導入キャリア及びキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
実施形態に従う方法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を製造する方法である。本方法は、Ｔ細胞を含む細胞集団を、Ｔ細胞を活性化する抗体で刺激する刺激工程、刺激工程の後、前記細胞集団に、脂質粒子と、脂質粒子に内包された、ＣＡＲ遺伝子を含む第１核酸及びトランスポゼース遺伝子を含む第２核酸とを含む核酸導入キャリアを接触させる遺伝子導入工程、及び遺伝子導入工程の後、細胞集団を培養する培養工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【発明を実施するための形態】
【0009】
以下、実施形態の核酸導入キャリア、ＣＡＲ－Ｔ細胞の製造方法及びキットについて図面を参照して説明する。各図は実施形態とその理解を促すための模式図であり、その形状や寸法、比等は実際と異なる箇所があるが、これらは以下の説明と公知の技術を参酌して適宜、設計変更することができる。
【0010】
・核酸導入キャリア
実施形態の核酸導入キャリアは、詳しくは後述するが、ＣＡＲ－Ｔ細胞の製造のために用いられ、細胞に接触させることによりＣＡＲ遺伝子を細胞に導入することが可能である。核酸導入キャリアの一例について図１を参照して説明する。
実施形態の核酸導入キャリアは、詳しくは後述するが、ＣＡＲ－Ｔ細胞の製造のために用いられ、細胞に接触させることによりＣＡＲ遺伝子を細胞に導入することが可能である。核酸導入キャリアの一例について図１を参照して説明する。
【0011】
核酸導入キャリア１０は、例えば、脂質粒子１と、脂質粒子１に内包されている第１核酸２及び第２核酸３とを備える。第１核酸２は、ＣＡＲ遺伝子をコードする配列（以下、「ＣＡＲ遺伝子配列」と称する）２ａを含む。第２核酸３は、トランスポゼース遺伝子をコードする配列（以下、「トランスポゼース遺伝子配列」と称する）３ａを含む。第１核酸２と第２核酸３とは、例えば、核酸凝縮ペプチド５で凝縮された状態で脂質粒子１に内包されている。
【0012】
以下、各構成成分について詳細に説明する。
【0013】
（脂質粒子）
実施形態の脂質粒子１は、複数の脂質分子１ａが非共有結合で配列してできた脂質膜からなる、略球状の中空体である。そして、その中心の内腔１ｂに第１核酸２及び第２核酸３が内包されている。脂質粒子１は、脂質単分子膜であってもよいし、脂質二重膜であってもよい。また、脂質粒子１は、一層の膜からなっていてもよいし、多重層の膜からなっていてもよい。
実施形態の脂質粒子１は、複数の脂質分子１ａが非共有結合で配列してできた脂質膜からなる、略球状の中空体である。そして、その中心の内腔１ｂに第１核酸２及び第２核酸３が内包されている。脂質粒子１は、脂質単分子膜であってもよいし、脂質二重膜であってもよい。また、脂質粒子１は、一層の膜からなっていてもよいし、多重層の膜からなっていてもよい。
【0014】
脂質粒子１の材料は、下記に例示するベース脂質から構成されてもよいが、ベース脂質の他に下記に例示する第１の脂質化合物及び／又は第２の脂質化合物を更に含むことが好ましい。
【0015】
ベース脂質として、例えば、生体膜の主成分である脂質を用いることができる。ベース脂質は、リン脂質又はスフィンゴ脂質、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、ケファリン又はセレブロシド、或いはこれらの組み合わせ等である。
【0016】
例えば、ベース脂質として、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデシル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２－ジミリストイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（１４：０ ＤＡＰ）、１，２－ジパルミトイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（１６：０ ＤＡＰ）、１，２－ジステアロイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（１８：０ ＤＡＰ）、Ｎ－（４－カルボキシベンジル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（オレオイロキシ）プロパン（ＤＯＢＡＱ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホクロリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホクロリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ＤＯＰＳ）、又はコレステロール、或いはこれらの何れかの組み合わせ等を用いることが好ましい。特にＤＯＴＡＰは、カチオン性脂質であり、その含有量によって脂質粒子１の酸解離定数を調節することができるため好ましい。上記ベース脂質は、細胞膜と融合しやすく、特に、ジアシルホスファチジルコリン、及びジアシルホスファチジルエタノールアミンを用いる場合、脂質粒子１の構造や粒子径の制御が容易であり、且つ細胞膜と融合しやすいため好ましい。脂質に含まれるアシル基の炭化水素鎖の長さはＣ１０～Ｃ２０であることが好ましい。この炭化水素鎖は飽和炭化水素基であっても、不飽和炭化水素基であってもよい。
【0017】
ベース脂質は、脂質粒子１に含まれる脂質分子１ａ全体に対して１００％近く含まれてもよい。或いは、脂質粒子１が第１及び／又は第２の脂質化合物を含む場合は、ベース脂質は脂質分子１ａ全体に対して約３０％～約８０％（モル比）含まれることが好ましい。
【0018】
第１の脂質化合物は、例えば、生分解性である。第１の脂質化合物は、Ｑ－ＣＨＲ２の式で表すことができる。（式中、Ｑは、３級窒素を２つ以上含み、酸素を含まない含窒素脂肪族基であり、Ｒは、それぞれ独立に、Ｃ１２～Ｃ２４の脂肪族基であり、少なくとも一つのＲは、その主鎖中又は側鎖中に、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、及び－ＮＨＣ（＝Ｏ）－からなる群から選択される連結基ＬＲを含む）。
【0019】
脂質粒子１が第１の脂質化合物を含む場合、脂質粒子１の表面が非カチオン性となるため、細胞導入における障害が低減され、核酸の導入率が高まる。
【0020】
第１の脂質化合物として、例えば、下記式で表される構造を有する脂質を用いれば、核酸の導入効率がより優れているため好ましい。
【化1-1】
【化1-2】
【化1-3】
【0021】
第２の脂質化合物は、例えば、生分解性である。第２の脂質化合物は、Ｐ－［Ｘ－Ｗ－Ｙ－Ｗ’－Ｚ］２の式で表すことができる。（式中、Ｐは、１つ以上のエーテル結合を主鎖に含むアルキレンオキシであり、Ｘは、それぞれ独立に、三級アミン構造を含む２価連結基であり、Ｗは、それぞれ独立に、Ｃ１～Ｃ６アルキレンであり、Ｙは、それぞれ独立に、単結合、エーテル結合、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、チオエステル結合、アミド結合、カルバメート結合及び尿素結合からなる群から選ばれる２価連結基であり、Ｗ’は、それぞれ独立に、単結合又はＣ１～Ｃ６アルキレンであり、Ｚは、それぞれ独立に、脂溶性ビタミン残基、ステロール残基、又はＣ１２～Ｃ２２脂肪族炭化水素基である）。
【0022】
第２の脂質化合物を含む場合、Ｐに含まれるエーテル結合を構成する酸素が、内包される核酸と水素結合を形成するため、核酸の内包量が多くなる。
【0023】
例えば、以下の構造を有する第２の脂質化合物を用いれば、核酸内包量がより優れているため好ましい。
【化2-1】
【化2-2】
【化2-3】
【0024】
以上に説明した第１及び第２の脂質化合物を含む脂質粒子１を用いた場合、核酸の内包量を増加させ、且つ核酸の導入率を高めることが可能である。かつ導入した細胞の細胞死も低減することができる。特に、式（１－０１）、式（１－０２）及び／又は式（２－０１）の化合物を用いれば核酸内包量及び核酸導入効率が特に優れているため好ましい。
【0025】
第１及び第２の脂質化合物は、脂質粒子１全体に対して約２０％～約７０％（モル比）で含まれることが好ましい。
【0026】
脂質粒子１は、脂質粒子１の凝集を抑制する脂質、例えば、ＰＥＧ修飾した脂質、特にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ジミリストイルグリセロール（ＤＭＧ－ＰＥＧ）、オメガ－アミノ（オリゴエチレングリコール）アルカン酸モノマーから誘導されるポリアミドオリゴマー（米国特許第６，３２０，０１７号）、モノシアロガングリオシドを更に含むことが好ましい。このような脂質は、脂質粒子１全体に対して約１％～約５％（モル比）で含まれることが好ましい。
【0027】
脂質粒子１は、毒性を調整するための相対的に毒性の低い脂質；脂質粒子１に配位子を結合させる官能基を有する脂質；ステロール、例えばコレステロール等の内包物の漏出を抑制するための脂質等の脂質を含んでもよい。特に、コレステロールを含ませることが好ましい。
【0028】
脂質粒子１に用いる脂質の種類及び組成は、目的とする脂質粒子１の酸解離定数（ｐＫａ）若しくは脂質粒子１のサイズ、内包物の種類、或いは導入する細胞中での安定性等を考慮して適切に選択される。酸解離定数（ｐＫａ）は、６．５～８．０であることが好ましい。この値であれば、核酸の細胞への導入効率を高めることが可能である。
【0029】
例えば、脂質粒子１は、式（１－０１）若しくは式（１－０２）の化合物及び／又は式（２－０１）の化合物と、ＤＯＰＥ及び／又はＤＯＴＡＰと、コレステロールと、ＤＭＧ－ＰＥＧとを含む場合、核酸内包量及び核酸導入効率が特に優れているため好ましい。例えば、これらの成分を以下の表１に示す（１）～（１７）の何れかの組成で含むことが好ましい。
【表1】
【0030】
特に、（１）の組成を用いれば核酸の導入効率を更に高めることができる。また、（５）～（８）の組成は脂質粒子１の酸解離定数を６．５～８．０とすることが可能であり、核酸の導入効率を更に高めることができる。
【0031】
（核酸）
第１核酸２及び第２核酸３は、例えば、一本鎖又は二本鎖の環状、直鎖又は分岐鎖核酸である。第１核酸２及び第２核酸３は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ又はこれらの誘導体の何れかである。誘導体とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＰＮＡにヌクレオチドアナログを挿入したもの、或いはＤＮＡ、ＲＮＡ又はＰＮＡの何れかの末端を標識又は官能基で修飾したもの等である。第１核酸２及び第２核酸３は、例えば、互いに異なる種類の核酸であってもよい。例えば、第１核酸２及び第２核酸３のどちらか一方がＤＮＡで他方がＲＮＡであってもよい。
第１核酸２及び第２核酸３は、例えば、一本鎖又は二本鎖の環状、直鎖又は分岐鎖核酸である。第１核酸２及び第２核酸３は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ又はこれらの誘導体の何れかである。誘導体とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＰＮＡにヌクレオチドアナログを挿入したもの、或いはＤＮＡ、ＲＮＡ又はＰＮＡの何れかの末端を標識又は官能基で修飾したもの等である。第１核酸２及び第２核酸３は、例えば、互いに異なる種類の核酸であってもよい。例えば、第１核酸２及び第２核酸３のどちらか一方がＤＮＡで他方がＲＮＡであってもよい。
【0032】
第１核酸２及び／又は第２核酸３がＲＮＡである場合、分解耐性を有するように修飾されていることが好ましい。例えば、当該修飾は、ＲＮａｓｅ等によりＲＮＡが分解されないようにする公知の修飾であればよい。そのような修飾は、例えば、ＲＮＡへの天然修飾ヌクレオチド又は非天然ヌクレオチドの使用／導入、非天然配列の使用／付加、又は天然／非天然ＣＡＰ構造の付加等である。
【0033】
天然修飾ヌクレオチドは、例えば、シュードウリジン、５－メチルシチジン、１－メチルアデノシン等である。非天然ヌクレオチドは、例えば、ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）、又はＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）等である。
【0034】
非天然配列は、例えば、人工的に作成された天然には存在しない塩基配列であり、例えば、ランダムな塩基配列、又は天然／非天然アミノ酸と核酸のハイブリッド配列等である。非天然配列は、例えばＲＮＡの末端に付加することが好ましい。
【0035】
天然ＣＡＰ構造は、例えば、ＣＡＰ０（ｍ７ＧｐｐｐＮ）、ＣＡＰ１（ｍ７ＧｐｐｐＮｍ）等である。非天然ＣＡＰ構造は、例えば、ＡＲＣＡ（Ａｎｔｉ－ＲｅｖｅｒｓｅＣａｐＡｎａｌｏｇ）又はＬＮＡ－グアノシン等である。非天然ＣＡＰ構造は、例えばＲＮＡの５’末端に付加することが好ましい。
【0036】
第１核酸２はＣＡＲ遺伝子配列２ａを含む。ＣＡＲ遺伝子とは、特定の標的（抗原）と結合する抗体の抗原結合ドメイン（細胞外ドメイン）と、抗原結合ドメインへの標的の結合によりＴ細胞を活性化するシグナルを伝達するシグナルドメイン（細胞内シグナルドメイン）とを少なくとも含む融合タンパク質の遺伝子であればよい。ＣＡＲ遺伝子として、一般的にＣＡＲとして知られる融合タンパク質の遺伝子を用いてもよいし、或いはそれを同様の機能を有する範囲で改変した融合タンパク質、更なるドメインを追加した融合タンパク質又は同様の機能を有する新規の融合タンパク質の遺伝子等を用いることも可能である。
【0037】
以下、ＣＡＲの一例について詳細に説明する。ＣＡＲは、例えば、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む。
【0038】
（ａ）細胞外ドメイン
細胞外ドメインは、上記したとおりＴ細胞の外側に配置され、標的と特異的に結合するドメインである。例えば細胞外ドメインは、抗標的モノクローナル抗体の抗原結合性断片、例えば、ｓｃＦｖ断片を含む。モノクローナル抗体として、例えば、齧歯類（マウス、ラット、ウサギ等）の抗体、ヒト抗体或いはヒト化抗体等を用いることができる。ｓｃＦｖ断片は、免疫グロブリンの軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）とがリンカーを介して連結された構造体である。リンカーとして、例えば直鎖状にアミノ酸が連結したペプチドからなるペプチドリンカーを用いることができる。ペプチドリンカーは、例えば、グリシンとセリンとから構成されるリンカー（例えば、ＧＧＳリンカー又はＧＳリンカー）である。例えば、アミノ酸残基数が５～２５個のリンカーを用いることができる。
細胞外ドメインは、上記したとおりＴ細胞の外側に配置され、標的と特異的に結合するドメインである。例えば細胞外ドメインは、抗標的モノクローナル抗体の抗原結合性断片、例えば、ｓｃＦｖ断片を含む。モノクローナル抗体として、例えば、齧歯類（マウス、ラット、ウサギ等）の抗体、ヒト抗体或いはヒト化抗体等を用いることができる。ｓｃＦｖ断片は、免疫グロブリンの軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）とがリンカーを介して連結された構造体である。リンカーとして、例えば直鎖状にアミノ酸が連結したペプチドからなるペプチドリンカーを用いることができる。ペプチドリンカーは、例えば、グリシンとセリンとから構成されるリンカー（例えば、ＧＧＳリンカー又はＧＳリンカー）である。例えば、アミノ酸残基数が５～２５個のリンカーを用いることができる。
【0039】
細胞外ドメインの種類及び構成は、標的の種類に依存して選択される。標的は、典型的には腫瘍細胞に関連する抗原である。腫瘍細胞に関連する抗原とは、例えば、腫瘍細胞、その周辺組織の細胞又は腫瘍細胞を有する生体において特異的又は選択的な発現が認められる抗原をいう。腫瘍とは、例えば、Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、網膜芽腫、肺小胞腫又は中枢神経腫瘍等である。標的は、例えば、ＣＤ１９抗原、ＣＤ２０抗原、ＧＤ２抗原、ＣＤ２２抗原、ＣＤ３０抗原、ＣＤ３３抗原、ＣＤ４４ｖａｒｉａｎｔ７/８抗原、ＣＥＡ抗原、Ｈｅｒ２/ｎｅｕ抗原、ＭＵＣ１抗原、ＭＵＣ４抗原、ＭＵＣ６抗原、ＩＬ－１３ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ａｌｐｈａ２、イムノグロブリン軽鎖、ＰＳＭＡ抗原又はＶＥＧＦｒｅｃｅｐｔｏｒ２等である。
【0040】
或いは、標的が骨髄系腫瘍の白血病幹細胞、白血病前駆細胞又は白血病細胞等である場合は、細胞外ドメインとしてＧＭ－ＣＳＦ（顆粒球単球コロニー刺激因子）受容体のリガンドであるＧＭ－ＣＳＦを用いることも可能である。
【0041】
（ｂ）膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは、細胞外ドメインと細胞内シグナルドメインとの間に設けられ、Ｔ細胞の細胞膜に配置されるドメインである。膜貫通ドメインとして、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ８α、ＣＤ３、ＣＤ４又は４－１ＢＢ等を用いることができる。或いは人工的に構築したポリペプチドからなる膜貫通ドメインを用いることも可能である。
膜貫通ドメインは、細胞外ドメインと細胞内シグナルドメインとの間に設けられ、Ｔ細胞の細胞膜に配置されるドメインである。膜貫通ドメインとして、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ８α、ＣＤ３、ＣＤ４又は４－１ＢＢ等を用いることができる。或いは人工的に構築したポリペプチドからなる膜貫通ドメインを用いることも可能である。
【0042】
（ｃ）細胞内シグナルドメイン
細胞内シグナルドメインは、上記したとおりＴ細胞の内側に配置され、細胞外ドメインが標的の抗原と結合した際、Ｔ細胞の活性化に必要なシグナルを伝達するドメインである。細胞内シグナルドメインは、例えば、ＴＣＲ複合体を介したシグナルを伝達するためのドメイン（第１ドメイン）と、共刺激シグナルを伝達するためのドメイン（第２ドメイン）とを含む。第１ドメインとして、ＣＤ３ζ又はＦｃεＲＩγ等を用いることができる。好ましくは、ＣＤ３ζが用いられる。また、第２ドメインとして、例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１３４、ＯＸ－４０又はＩＣＯＳ等の共刺激分子の細胞内ドメインを用いることができる。好ましくは、ＣＤ２８又は４－１ＢＢが用いられる。第１ドメイン及び第２ドメインはそれぞれ、上記列挙した要素のうち１つを含んでもよいし、同一又は異種の複数の上記要素をタンデム状に連結した構成としてもよい。
細胞内シグナルドメインは、上記したとおりＴ細胞の内側に配置され、細胞外ドメインが標的の抗原と結合した際、Ｔ細胞の活性化に必要なシグナルを伝達するドメインである。細胞内シグナルドメインは、例えば、ＴＣＲ複合体を介したシグナルを伝達するためのドメイン（第１ドメイン）と、共刺激シグナルを伝達するためのドメイン（第２ドメイン）とを含む。第１ドメインとして、ＣＤ３ζ又はＦｃεＲＩγ等を用いることができる。好ましくは、ＣＤ３ζが用いられる。また、第２ドメインとして、例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１３４、ＯＸ－４０又はＩＣＯＳ等の共刺激分子の細胞内ドメインを用いることができる。好ましくは、ＣＤ２８又は４－１ＢＢが用いられる。第１ドメイン及び第２ドメインはそれぞれ、上記列挙した要素のうち１つを含んでもよいし、同一又は異種の複数の上記要素をタンデム状に連結した構成としてもよい。
【0043】
第１ドメインと第２ドメインとの連結される順番は特に限定されないが、膜貫通ドメイン側に第２ドメインを配置することが好ましい。第１ドメインと第２ドメインとは、これらを直接連結しても、これらの間にリンカーを介在させてもよい。リンカーとしては例えば２～１５個のアミノ酸が直鎖状に連結したペプチドからなるペプチドリンカーを用いることができる。
【0044】
（ｄ）その他の要素
ＣＡＲは、その他の要素を含んでもよい。その他の要素として、例えば、ＣＡＲの分泌を促すリーダー配列（シグナルペプチド）、例えば、ＧＭ－ＣＳＦレセプターのリーダー配列等を用いることができる。また、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間にスペーサードメインを配置してもよい。スペーサードメインは、ＣＡＲと標的との結合を促進させ得る。スペーサードメインとして、例えば、ヒトＩｇＧ（例えばヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ４）のＦｃ断片を用いることがきる。或いは、ＣＤ２８の細胞外ドメインの一部やＣＤ８αの細胞外ドメインの一部等をスペーサードメインとして用いることもできる。尚、膜貫通ドメインと細胞内シグナルドメインの間にもスペーサードメインを設けることもできる。
ＣＡＲは、その他の要素を含んでもよい。その他の要素として、例えば、ＣＡＲの分泌を促すリーダー配列（シグナルペプチド）、例えば、ＧＭ－ＣＳＦレセプターのリーダー配列等を用いることができる。また、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間にスペーサードメインを配置してもよい。スペーサードメインは、ＣＡＲと標的との結合を促進させ得る。スペーサードメインとして、例えば、ヒトＩｇＧ（例えばヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ４）のＦｃ断片を用いることがきる。或いは、ＣＤ２８の細胞外ドメインの一部やＣＤ８αの細胞外ドメインの一部等をスペーサードメインとして用いることもできる。尚、膜貫通ドメインと細胞内シグナルドメインの間にもスペーサードメインを設けることもできる。
【0045】
ＣＡＲ遺伝子は、例えば、上記各ドメインに対応する遺伝子を適切な順番で結合したものである。ＣＡＲ遺伝子配列２ａは上記の何れかＣＡＲ遺伝子の全長を含むものであってもよく、或いは一部を含むものであってもよい。
【0046】
第１核酸２は、ＤＮＡであることが好ましい。
【0047】
第１核酸２は、例えば、図２に示すようにＣＡＲ遺伝子配列２ａの両端に配置された第１のトランスポゼース認識配列及び第２のトランスポゼース認識配列を含んでもよい。
【0048】
第１のトランスポゼース認識配列２ｂ及び第２のトランスポゼース認識配列２ｃは、トランスポゼースがこれらの配列を認識して、そこに結合し、ＣＡＲ遺伝子配列２ａを切り出すための配列である。第１のトランスポゼース認識配列２ｂ及び第２のトランスポゼース認識配列２ｃは、互いに逆向きの同じ配列を含む塩基配列である。これらの配列は逆向き反復配列（ＩｎｖｅｒｔｅｄＲｅｐｅａｔＳｅｑｕｅｎｃｅｓ：ＩＲ）とも称される配列である。
【0049】
第１のトランスポゼース認識配列２ｂ及び第２のトランスポゼース認識配列２ｃの配列は、第２核酸３に含まれるトランスポゼース遺伝子配列３ａの種類に対応して選択される。
【0050】
トランスポゼース遺伝子配列３ａとしてＰｉｇｇｙＢａｃの遺伝子を用いる場合、例えば、第１のトランスポゼース認識配列２ｂ及び第２のトランスポゼース認識配列２ｃに挟まれたＣＡＲ遺伝子配列２ａの配列として表２に示す配列番号１の配列を用いることができる。なお、配列番号１の第１番目～第３１２番目までが第１のトランスポゼース認識配列２ｂ（５’ＩＲ配列）、第４３００番目～第４５３６番目までが第２のトランスポゼース認識配列２ｃ（３’ＩＲ配列）であり、その間にＣＡＲ遺伝子が含まれている。
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【0051】
第１核酸２の長さは、例えば、３～約２００００塩基である。第１核酸２は、核酸導入キャリア１０内に１～１００分子含まれることが好ましい。
【0052】
第２核酸３は、トランスポゼース遺伝子配列３ａを含む。トランスポゼース遺伝子配列として、例えば、ＰｉｇｇｙＢａｃ、ＳｌｅｅｐｉｎｇＢｅａｕｔｙ、ＦｒｏｇＰｒｉｎｃｅ、Ｈｓｍａ、Ｍｉｎｏｓ、Ｔｏｌ１、Ｔｏｌ２、Ｐａｓｓｐｏｒｔ、ｈＡＴ、Ａｃ／Ｄｓ、ＰＩＦ、Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ、Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ３－ＤＲ、Ｈｉｍａｒ１、Ｈｅｒｍｅｓ、Ｔｃ３又はＭｏｓ１等の遺伝子をコードする配列を用いることができる。第２核酸３は、ＤＮＡであってもよいし、ＲＮＡであってもよいが、ＲＮＡであることが好ましい。ＲＮＡである場合は、第２核酸３は、トランスポゼース遺伝子のｍＲＮＡであってもよい。
【0053】
トランスポゼース遺伝子配列３ａの配列として、例えば、以下の配列を用いることができる。表３はＤＮＡの配列を示すが、ＲＮＡである場合は、下記配列のチミン（Ｔ）はウラシル（Ｕ）に置き換えたものを使用することができる。
【表3】
【0054】
第２核酸３は、トランスポゼース遺伝子配列３ａの他に更なる配列を有してもよい。更なる配列は、例えば、５’末端リーダー配列、ＩＲＥＳ（ＩｎｔｅｒｎａｌＲｉｂｏｓｏｍｅＥｎｔｒｙＳｉｔｅ）、転写終結配列、又はＰｏｌｙ（Ａ）配列等である。第２核酸３は、ＣＡＰ構造を有してもよい。
【0055】
第２核酸３の長さは、例えば、約２０～約５０００塩基である。第２核酸３は、核酸導入キャリア１０内に１～約１０００分子含まれることが好ましい。
【0056】
脂質粒子１に内包される核酸は、第１核酸２及び第２核酸３の他に、更なる核酸を含んでもよい。そのような核酸は、例えば、ＤＮＡのメチル化、脱メチル化、修復及び／又は結合等、ＤＮＡを修飾する機能を有するＤＮＡ又はＲＮＡである。例えば、これらの核酸は、上記修飾の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡであってもよい。これらの核酸を含むことによって、ゲノムに導入されたＣＡＲ遺伝子配列２ａやその周辺の配列に上記修飾を加えることが可能である。それにより、例えば、Ｔ細胞に更なる機能改変を加えることができる。
【0057】
（核酸凝縮ペプチド）
核酸凝縮ペプチド５は、より多くの核酸をより小さく凝縮し、脂質粒子１内に多くの核酸を効率よく内包するためのペプチドである。このようなペプチドとして、例えば、カチオン性のペプチドを用いることが好ましい。カチオン性のペプチドは、例えば、アニオン性の核酸の螺旋形状の隙間に入り込んで隙間を縮めることにより核酸を凝縮することができる。
核酸凝縮ペプチド５は、より多くの核酸をより小さく凝縮し、脂質粒子１内に多くの核酸を効率よく内包するためのペプチドである。このようなペプチドとして、例えば、カチオン性のペプチドを用いることが好ましい。カチオン性のペプチドは、例えば、アニオン性の核酸の螺旋形状の隙間に入り込んで隙間を縮めることにより核酸を凝縮することができる。
【0058】
好ましい核酸凝縮ペプチド５は、例えば、カチオン性のアミノ酸を全体の４５％以上含むペプチドである。より好ましい核酸凝縮ペプチド５は、一方の端にＲＲＲＲＲＲ（第１のアミノ酸配列）を有し、他方の端が配列ＲＱＲＱＲ（第２のアミノ酸配列）を有する。そして、両アミノ酸配列の間に、ＲＲＲＲＲＲ又はＲＱＲＱＲからなる中間配列を０個又は１個以上含む。また、第１のアミノ酸配列、第２のアミノ酸配列及び中間配列のうち、隣り合う２つの配列の間に２つ以上の中性アミノ酸を含む。中性アミノ酸は、例えば、Ｇ又はＹである。
【0059】
上記核酸凝縮ペプチド５は、好ましくは、以下のアミノ酸配列を有する。
ＲＱＲＱＲＹＹＲＱＲＱＲＧＧＲＲＲＲＲＲ （配列番号３）
ＲＱＲＱＲＧＧＲＲＲＲＲＲ （配列番号４）。
ＲＱＲＱＲＹＹＲＱＲＱＲＧＧＲＲＲＲＲＲ （配列番号３）
ＲＱＲＱＲＧＧＲＲＲＲＲＲ （配列番号４）。
【0060】
このような核酸凝縮ペプチド５によれば、Ｒによるカチオン性により核酸を効率よく凝縮し、且つ核酸の有するアニオン性を弱めることが可能であるため、効率よく核酸を脂質粒子１内に封入することが可能である。更に、当該核酸凝縮ペプチド５は細胞中で核酸を効率よく解離するため、細胞内に導入された核酸を細胞内で効率よく発現させることが可能である。
【0061】
或いは、核酸凝縮ペプチド５は、一方の端にＲＲＲＲＲＲ（第３のアミノ酸配列）を有し、他方の端にＲＲＲＲＲＲ（第４のアミノ酸配列）を有する。そして、両アミノ酸配列の間に、ＲＲＲＲＲＲ又はＲＱＲＱＲからなる中間配列を０個又は１個以上含む。また、第３のアミノ酸配列、第４のアミノ酸配列及び中間配列のうち、隣り合う２つの配列の間に２つ以上の中性アミノ酸を含む。
【0062】
このような核酸凝縮ペプチド５は、好ましくは、以下のアミノ酸配列を有する。
ＲＲＲＲＲＲＹＹＲＱＲＱＲＧＧＲＲＲＲＲＲ （配列番号５）。
ＲＲＲＲＲＲＹＹＲＱＲＱＲＧＧＲＲＲＲＲＲ （配列番号５）。
【0063】
このような核酸凝縮ペプチド５は、両端のカチオン性が強く、核酸との結合性が高い。したがって、更に効率よく核酸を凝縮し、より多くの核酸を脂質粒子１内に内包することができる。その結果、脂質粒子１外に残存する核酸の量が低減され、それによって核酸導入キャリア同士の凝集が防止されるため、核酸導入キャリアが細胞内に取り込まれやすくなる。
【0064】
更に、次のようなアミノ酸配列を有する核酸凝縮ペプチド５を上記の何れかの核酸凝縮ペプチド５と組み合わせて用いることもできる。
ＧＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（Ｍ９）（配列番号６）
ＧＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（Ｍ９）（配列番号６）
【0065】
このペプチドは、上記核酸凝縮ペプチド５で凝縮した核酸凝集体を更に凝縮することができる。したがって、更に粒径の小さい核酸導入キャリアを得ることが可能である。そのような核酸導入キャリアは細胞内に取り込まれやすいため、より効率よく核酸を細胞のゲノムに導入することが可能である。
【0066】
例えば、脂質粒子１に内包する前に、第１核酸２及び第２核酸３を核酸凝縮ペプチド５と撹拌混合することによって第１核酸２及び第２核酸３を凝縮することができる。第１核酸２及び第２核酸３を一緒に凝縮してもよいし、別々に凝縮してもよい。
【0067】
以上に説明した効果を奏することから核酸凝縮ペプチド５を用いることが好ましいが、用いる核酸の種類、又は細胞の培養条件等によっては核酸凝縮ペプチド５を用いなくともよい。
【0068】
核酸導入キャリア１０は、上記核酸の他に、更なる成分を内包していてもよい。例えば、レチノイン酸、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）又はアスコルビン酸等の細胞内での核酸の発現を調節する化合物；ペプチド、ポリペプチド、サイトカイン、増殖因子、アポトーシス因子、分化誘発因子、他の細胞表面受容体及びそのリガンド等を内包することも可能である。
【0069】
核酸導入キャリア１０は、例えば、小分子を脂質粒子等に封入する際に用いられる公知の方法、例えば、バンガム法、有機溶媒抽出法、界面活性剤除去法、凍結融解法等を用いて作製することができる。例えば、脂質粒子１の材料をアルコール等の有機溶媒に含ませて得られた混合物に、第１核酸２及び第２核酸３等の内包されるべき成分を含む水性緩衝液を添加し、撹拌して懸濁することにより核酸導入キャリアを作製することができる。脂質粒子１に内包する核酸の量比は、水性緩衝液中の両者の量比を変えることにより容易に調節することができる。核酸の内包量の確認は、例えば、市販のＤＮＡ及びＲＮＡ定量キット等を用いて行うことができる。
【0070】
核酸導入キャリア１０の平均粒子径は、例えば約５０ｎｍ～約３００ｎｍであり、好ましくは約５０ｎｍ～約２００ｎｍである。例えば、超音波処理によって粒子径を小さくすることができる。また、ポリカーボネート膜やセラミック膜を透過させて、核酸導入キャリア１０のサイズを調整することも可能である。なお、核酸導入キャリア１０の平均粒子径は、例えば動的光散乱法を用いたゼータサイザーによって測定することができる。
【0071】
更なる実施形態において、第１核酸２及び第２核酸３は、コアシェル構造を有してもよい。
【0072】
図３の（ａ）に示される核酸導入キャリア２０は、第１核酸２を含む第１核酸コア６、及び第１核酸コア６をコーティングする第２核酸３を含む第２核酸シェル７を含むコアシェル構造を備える。反対に、図３の（ｂ）に示される核酸導入キャリア２１は、第２核酸３を含む第２核酸コア８、及び第２核酸コア８をコーティングする第１核酸２を含む第１核酸シェル９を含むコアシェル構造を備える。コアシェル構造は、脂質粒子１に内包されている。
【0073】
コアシェル構造は、例えば、次のように製造することができる。まず、コア用の核酸を核酸凝縮ペプチド５で凝縮してコアを作製する。次にシェル用の核酸をコアに接触させることによって、シェル用の核酸が静電気的にコアの周囲に張り付き、シェルが形成される。シェル用の核酸は、核酸凝縮ペプチド５で凝縮されたものであってもよい。その結果、コアシェル構造が形成される。次いで、脂質粒子１の材料を含む溶媒にコアシェル構造を添加し、撹拌することによってコアシェル構造が脂質粒子１に内包され、核酸導入キャリア２０又は２１が製造される。
【0074】
このような構造を有することによって、第１核酸２と第２核酸３との時間差導入が可能である。コアに含まれる核酸の放出速度及び放出持続時間は、核酸凝縮ペプチド５の組成又は量、或いは核酸の量等によって調節可能である。ＣＡＲ－Ｔ細胞の作製においては、第２核酸３から翻訳されるトランスポサーゼタンパク質が、第１核酸２へ作用することから、第２核酸３が先に放出される核酸導入キャリア２０の構成を有することが好ましい。
更なる実施形態によれば、図４に示すように、第１核酸２と第２核酸３とが、別々の脂質粒子１に内包されていてもよい。即ち、第１核酸２は第１の脂質粒子１ｃに内包されており（第１のサブ核酸導入キャリア２２）、第２核酸３は、第２の脂質粒子１ｄに内包されている（第２のサブ核酸導入キャリア２３）。第１核酸２と第２核酸３とはそれぞれ、核酸凝縮ペプチド５で凝縮された状態で各脂質粒子に内包されていてもよい。
更なる実施形態によれば、図４に示すように、第１核酸２と第２核酸３とが、別々の脂質粒子１に内包されていてもよい。即ち、第１核酸２は第１の脂質粒子１ｃに内包されており（第１のサブ核酸導入キャリア２２）、第２核酸３は、第２の脂質粒子１ｄに内包されている（第２のサブ核酸導入キャリア２３）。第１核酸２と第２核酸３とはそれぞれ、核酸凝縮ペプチド５で凝縮された状態で各脂質粒子に内包されていてもよい。
【0075】
第１の脂質粒子１ｃ及び第２の脂質粒子１ｄは、互いに同じ組成を有してもよいし、互いに異なる組成を有してもよい。
【0076】
第１のサブ核酸導入キャリア２２と第２のサブ核酸導入キャリア２３とによれば、コアシェル構造を有する核酸導入キャリア２０，２１よりも更に長く間隔をあけて第１核酸２と第２核酸３とを時間差導入することができる。例えば、後述する遺伝子導入工程（Ｓ２）において、一方を細胞に接触させた後、３０分以上の間隔を空けて他方を接触させることが可能である。故に、核酸導入キャリア２０，２１を用いるよりも導入時間の差を調節しやすい。第２のサブ核酸導入キャリア２３を第１のサブ核酸導入キャリア２２よりも先に細胞に接触させることが好ましい。或いは、両者を同時に細胞に接触させてもよい。
【0077】
以上に説明した実施形態の核酸導入キャリアは、適切な担体に含ませた組成物として提供されてもよい。担体は、例えば、水、生理食塩水のような食塩水、グリシン水溶液又は緩衝液等である。
【0078】
核酸導入キャリアが図４に示す第１のサブ核酸導入キャリア２２及び第２のサブ核酸導入キャリア２３のような形態である場合は、これらは別々の容器に収容され、別々の組成物として提供されてもよい。
【0079】
組成物は、保管安定性を向上させる物質を更に含んでもよい。保管安定性を向上させる物質は、限定されるものではないが、例えば、アルブミン、リポタンパク、アポリポタンパク、グロブリン等の糖タンパク等：ｐＨ調整剤、緩衝化剤、張度調整剤等；ナトリウムアセテート、ナトリウムラクテート、ナトリウムクロリド、カリウムクロリド、カルシウムクロリド等の製薬学的に許容可能であり、医薬組成物を生理的状態に近づける関与剤；フリーラジカルによるダメージを抑制する、α－トコフェロールのような脂肪親和性フリーラジカルクエンチャー；脂質の過酸化損傷を抑制し、貯蔵安定性を改良するためのフェリオキサミンのような水溶性キレーター等の脂質保護剤等である。保管安定性を向上させる物質は好ましくは、核酸導入キャリアの形成の後に加える。
【0080】
組成物は、一般的な方法によって滅菌されていてもよい。また、組成物は、液体として提供されてもよいし、それを乾燥した粉末として提供されてもよい。粉末の組成物は、例えば、適切な液体に溶解することにより使用可能となる。
【0081】
組成物中に含まれる核酸導入キャリアの濃度は、限定されるものではないが、０．０１～３０質量％、好ましくは０．０５～１０質量％であることが好ましい。濃度は、目的に応じて適切に選択される。
【0082】
・ＣＡＲ－Ｔ細胞の製造方法
以下に、実施形態の核酸導入キャリアを用いるＣＡＲ－Ｔ細胞の製造方法について説明する。実施形態のＣＡＲ－Ｔ細胞の製造方法は、図５に示す次の工程を含む。Ｔ細胞を含む細胞集団を、Ｔ細胞を活性化する抗体で刺激する刺激工程（Ｓ１）、刺激工程の後、細胞集団に実施形態の核酸導入キャリアを接触させる遺伝子導入工程（Ｓ２）、及び遺伝子導入工程の後、細胞集団を培養する培養工程（Ｓ３）。
以下に、実施形態の核酸導入キャリアを用いるＣＡＲ－Ｔ細胞の製造方法について説明する。実施形態のＣＡＲ－Ｔ細胞の製造方法は、図５に示す次の工程を含む。Ｔ細胞を含む細胞集団を、Ｔ細胞を活性化する抗体で刺激する刺激工程（Ｓ１）、刺激工程の後、細胞集団に実施形態の核酸導入キャリアを接触させる遺伝子導入工程（Ｓ２）、及び遺伝子導入工程の後、細胞集団を培養する培養工程（Ｓ３）。
【0083】
以下、各工程について詳細に説明する。
【0084】
まず、刺激工程（Ｓ１）に先立ち、Ｔ細胞を含む細胞集団を用意する。Ｔ細胞は、ＣＤ４陽性ＣＤ８陰性Ｔ細胞、ＣＤ４陰性ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ｉＰＳ細胞から調製されたＴ細胞、αβ－Ｔ細胞、γδ－Ｔ細胞又はその前駆細胞等を含む。このようなＴ細胞を含むものであれば様々な細胞集団を用いることができる。細胞集団は、例えば、末梢血から採取される末梢血単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ ＭｏｎｏｎｕｃｌｅａｒＣｅｌｌｓ：ＰＢＭＣ）であることが好ましい。
【0085】
細胞集団は、実施形態の製造方法で最終的に得られるＣＡＲ－Ｔ細胞を投与する対象から採取された自家由来の細胞集団であることが好ましいが、他家由来の細胞集団や市販の細胞集団等も用いることができる。また、採取又は入手した細胞集団から不要な細胞を分離する処理を行った細胞集団を用いてもよい。
【0086】
細胞集団は、例えば、適切な培地及び培養条件で培養しておくことが好ましい。そして図６の（Ｓ１）に示すように、Ｔ細胞を活性化する抗体２６を接触させる。それによって、抗体２６によりＴ細胞を刺激することができる（刺激工程（Ｓ１））。抗体２６との接触は、例えば、抗体２６を細胞懸濁液に添加する方法、抗体２６がコートされたビーズを細胞懸濁液に添加する方法、又は抗体２６で培養面をコートした容器等に細胞懸濁液を添加する方法等を用いることができる。
【0087】
抗体として、例えば、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の少なくともどちらか一方を用いることが好ましい。抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体は、抗体の全領域を用いても良いし、抗原への結合能を有する限りにおいては、その一部たとえば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを用いても良い。
【0088】
次に、図６の（Ｓ２）に示すように、細胞集団２５に核酸導入キャリア１０を接触させる（遺伝子導入工程（Ｓ２））。ここでは核酸導入キャリア１０を用いた例を示すが、核酸導入キャリア２０，２１又は第１のサブ核酸導入キャリア２２及び第２のサブ核酸導入キャリア２３を同様に用いることも可能である。接触は、培地２４に細胞集団２５を懸濁した細胞懸濁液に核酸導入キャリア１０（例えば、組成物の形態）を添加することにより行うことができる。或いは、接触は、後述するような核酸導入キャリア１０が表面に付着又は固定された容器等に細胞懸濁液を添加する方法により行われてもよい。
【0089】
遺伝子導入工程（Ｓ２）における核酸導入キャリア１０の接触によって第１核酸及び第２核酸を細胞に導入することができる。導入は例えば次のように行われる。まず核酸導入キャリア１０の接触によって、エンドサイトーシスにより核酸導入キャリア１０がＴ細胞２５に取り込まれる。Ｔ細胞２５内に入り込んだ核酸導入キャリア１０の脂質粒子１から、第１核酸２及び第２核酸３がＴ細胞２５内に放出される。その後、第２核酸３からはトランスポゼースが翻訳される。
【0090】
トランスポゼースは、第１核酸２のトランスポゼース認識配列２ｂ、２ｃを認識して切断し、ＣＡＲ遺伝子配列２ａ及びトランスポゼース認識配列２ｂ、２ｃを第１核酸２から切り出す。切り出された断片とトランスポゼースの複合体は、Ｔ細胞のゲノムに結合して、ゲノムを切断し、ＣＡＲ遺伝子配列２ａをＴ細胞のゲノムに挿入する。
【0091】
以上のようにして、Ｔ細胞２５のゲノム上にＣＡＲ遺伝子配列２ａが導入される。
【0092】
ここで、核酸導入キャリア１０が第２核酸３をＤＮＡの形態で含む場合、細胞内にトランスポゼースが発現する段階で、転写及び翻訳が必要であるが、ＲＮＡの形態で導入する場合は転写工程を省略することができるので、より迅速かつ高効率に細胞内でトランスポゼースを発現させることが可能である。その結果、より効率的にＴ細胞２５のゲノムにＣＡＲ遺伝子配列２ａを導入することが可能である。
【0093】
次に、得られた細胞集団２５を培養する（図６、培養工程（Ｓ３））。培養期間は例えば７日～２８日、好ましくは１０日～２１日、更に好ましくは１２日～１６日である。
【0094】
培養に用いる基本培地は、Ｔ細胞の培養に適した一般的に使用されるものを用いればよい。例えば、培地は、ＴｅｘＭＡＣＳＴＭ、ＡＩＭ Ｖ（登録商標）、又はＡＬｙｓ７０５等を用いることができる。その他の培養条件は、Ｔ細胞の生存、増殖に適した一般的な条件であればよく、例えば、温度は３７℃、ＣＯ２濃度は、５．０％であることが好ましい。
【0095】
培養工程（Ｓ３）においては、Ｔ細胞の増殖率及び生存率を向上させるために、培地にＴ細胞増殖因子（例えばＩＬ－１５及び／又はＩＬ－７）を添加することが好ましい。ＩＬ－１５の添加量は例えば５～１０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ－７の添加量は例えば５～１０ｎｇ／ｍｌとすることが好ましい。培地に血清（ヒト血清又はウシ胎仔血清等、好ましくは自己血清）を添加して培養を行ってもよいが、無血清培地を使用することが好ましい。
【0096】
例えば、刺激工程（Ｓ１）により細胞集団２５に含まれるＴ細胞が活性化し、培養工程（Ｓ３）を経ることによりＴ細胞を増殖させることができる。
【0097】
培養後、細胞集団を凍結保存することも可能である。しかしながら、その場合、使用時に細胞集団を融解し、再度、刺激工程（Ｓ１）及び培養工程（Ｓ３）を行うことが好ましい。
【0098】
以上の工程により、ＣＡＲ－Ｔ細胞を製造することができる。例えば、ある実施形態においては、上記工程（Ｓ１）～（Ｓ３）を行うことにより、その他の手順や工程を追加で行うことなく、ＣＡＲ－Ｔ細胞を製造することができる。
【0099】
培養工程（Ｓ３）の後、例えば、得られたＣＡＲ－Ｔ細胞を回収する。回収は、例えば、ピペッティング、遠心等の一般的な処理によって行うことができる。
【0100】
実施形態の核酸導入キャリアによれば、第１核酸２及び第２核酸３をより効率よくＴ細胞内に導入し、Ｔ細胞のゲノムにＣＡＲ遺伝子を導入し、ＣＡＲ遺伝子をより効率よく細胞内で発現させることが可能である。
【0101】
例えば、実施形態の核酸導入キャリアはリポフェクション（脂質と核酸との複合体）を用いる場合と異なり、脂質粒子１の内腔１ｂに核酸を内包することから、より多くの核酸を内包し、且つ核酸を分解や不要な分子との凝集から保護するため、細胞内への核酸の導入効率においても優れており、導入したＣＡＲ遺伝子のゲノムへの導入率及びＣＡＲの発現量においても優れている。また、導入する第１核酸２及び第２核酸３の量比を容易に調節することも可能である。
【0102】
実施形態のＣＡＲ－Ｔ細胞の製造方法によれば、実施形態の核酸導入キャリアを用いるため、より簡単な操作により、ＣＡＲの発現率が高いＣＡＲ－Ｔ細胞を効率よく製造することができる。故に、遺伝子導入工程及び培養工程において煩雑な操作を行う必要が無く、コストや手間が削減され、且つコンタミネーションによる品質や製造量の低下等も防止することができる。以上のことから、実施形態の方法によればより効率よくＣＡＲ－Ｔ細胞を製造することができ、製造コストを削減することも可能である。
【0103】
加えて、実施形態の核酸導入キャリアによれば、細胞集団に核酸を均一に導入することができるため、製造されるＣＡＲ－Ｔ細胞の品質が安定しており、且つ実施形態の製造方法によって得られた細胞集団にはＣＡＲ遺伝子を発現するＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）がより多く含まれる。このような特徴もまた、実施形態の方法のＣＡＲ－Ｔ細胞の製造効率が非常に高い一因である。
【0104】
また、そこに含まれるＣＡＲ－Ｔ細胞は、従来のリポフェクションを用いる方法よりもＣＡＲ遺伝子の発現率が高い。そのため、実施形態の方法で製造されたＣＡＲ－Ｔ細胞をＣＡＲ－Ｔ細胞療法に用いれば、治療効果、例えば、抗腫瘍効果がより高まる。
【0105】
また、トランスポゼース遺伝子をＲＮＡの形態で導入する場合は、トランスポゼース遺伝子が細胞のゲノム上に組み込まれることがない。そのため、トランスポゼース遺伝子が細胞のゲノムに組み込まれることによる不利な影響を防止したＣＡＲ－Ｔ細胞を製造することができる。
【0106】
また、上記のように核酸導入キャリア１０に核酸凝縮ペプチド５を用いること、ＲＮＡに耐分解性を付与すること、また脂質粒子１に第１及び／又は第２の脂質化合物を含めることにより、よりＣＡＲ遺伝子のＴ細胞のゲノムへの導入効率を高めることが可能である。その結果、ＣＡＲ－Ｔ細胞の製造効率を高めることができる。
【0107】
実施形態の方法により得られたＣＡＲ－Ｔ細胞を用いて、細胞製剤を製造してもよい。細胞製剤には、ＣＡＲ－Ｔ細胞が治療有効量で含まれ得る。細胞製剤には、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）又は血清アルブミン等のＣＡＲ－Ｔ細胞を保護する薬剤、抗生物質等の微生物の増殖を防止する薬剤、ビタミン類、サイトカイン、成長因又はステロイド等の細胞の活性化、増殖又は分化誘導等のための薬剤等を含ませてもよい。
【0108】
実施形態のＣＡＲ－Ｔ細胞又は細胞製剤の投与経路は特に限定されない。例えば、静脈内注射、動脈内注射、門脈内注射、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、又は腹腔内注射によって投与する。或いは投与方法は、局所投与であってもよい。その場合、例えば、目的の組織、臓器又は器官へ直接注入する。投与スケジュールは、対象（患者）の性別、年齢、体重又は病態等を考慮して選択すればよく、単回投与であってもよいし、連続的又は定期的な複数回投与であってもよい。
【0109】
・キット
実施形態のキットは、ＣＡＲ－Ｔ細胞の製造方法に用いられるキットであって、実施形態の核酸導入キャリアと核酸導入キャリアの保管安定性を向上させる物質とを含む。
実施形態のキットは、ＣＡＲ－Ｔ細胞の製造方法に用いられるキットであって、実施形態の核酸導入キャリアと核酸導入キャリアの保管安定性を向上させる物質とを含む。
【0110】
核酸導入キャリアは、例えば、上記のような組成物として提供され得る。核酸導入キャリアが第１のサブ核酸導入キャリア２２、第２のサブ核酸導入キャリア２３として提供される場合は、キットは、第１のサブ核酸導入キャリア２２を含む組成物と、第２のサブ核酸導入キャリア２３を含む組成物とのどちらか一方を含んでもよいし、両方を含んでもよい。
【0111】
或いは、第１のサブ核酸導入キャリア２２を含み、第２のサブ核酸導入キャリア２３を含まない組成物が提供されてもよい。このような組成物は、トランスポゼースを用いない方法でＣＡＲ遺伝子の導入を行う場合に、ＣＡＲ遺伝子を細胞に導入するために用いられてもよい。
【0112】
保管安定性を向上させる物質は、上記した何れかのものである。
【0113】
キットは、上記組成物中に又は別の組成物として、その他の成分を更に含んでいてもよい。その他の成分は、細胞培養培地及び／又はＴ細胞を活性化させるための抗体、ペプチド等を含む。
【0114】
実施形態のキットにおいて、核酸導入キャリア１０（或いは、核酸導入キャリア２０，２１又は第１のサブ核酸導入キャリア２２及び第２のサブ核酸導入キャリア２３であってもよい）は、固相４０の一面４１に直接又は間接的に付着又は固定されて提供されてもよい。固相４０は、例えば、金属、樹脂、ゲル又は繊維等を材料とする容器であるが、必ずしも容器形状である必要はなく、プレート又はシート等であってもよい。
【0115】
このような固相４０を実施形態のＣＡＲ－Ｔ細胞の製造方法に用いる場合、遺伝子導入工程（Ｓ２）は、固相の核酸導入キャリア１０が付着又は固定された面上に細胞集団２５を含む細胞懸濁液を添加することにより簡便に行うことが可能である。例えば、核酸導入キャリア１０は遊離可能に付着又は固定されており、細胞懸濁液を添加することにより核酸導入キャリア１０が細胞懸濁液内に遊離し、細胞集団２５と接触することが可能である。
【0116】
直接的な付着又は固定は、例えば、上記組成物を固相の表面に直接塗布し、乾燥させることにより行うことができる。間接的な付着又は固定は、固相上に、例えば、ペプチド、樹脂、又は抗体等を介して上記組成物を塗布し、乾燥することにより行うことができる。
【0117】
［例］
以下に、実施形態の方法で脂質粒子及びＣＡＲ－Ｔ細胞を作製し、使用した例について説明する。しかしながら、本発明の実施の形態は下記例に限定されるものではない。
以下に、実施形態の方法で脂質粒子及びＣＡＲ－Ｔ細胞を作製し、使用した例について説明する。しかしながら、本発明の実施の形態は下記例に限定されるものではない。
【0118】
例１．核酸を内包する脂質粒子のＰＢＭＣ細胞への導入効率の評価
・ＤＮＡ内包キャリアの調製
ＤＮＡとして、サイトメガロウイルスプロモーターの下流にＮａｎｏＬｕｃ遺伝子を連結したプラスミドＤＮＡを使用した。このＤＮＡを含むＤＮＡ溶液にカチオン性ペプチドを加え、ＤＮＡ－ペプチド凝縮体を形成した。次いで、それをエタノール溶解脂質溶液（（６）ＦＦＴ１０（前記式（１－０１）の脂質化合物）／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝３７／１０．５／５．７５／６０／４ｍｏｌ）に添加し、更に１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加した後、遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮して、ＤＮＡ内包キャリアを得た。当該核酸導入キャリアのＤＮＡ内包量は、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（登録商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎｄｓＤＮＡＡｓｓａｙＫｉｔ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック製）で測定し、ＤＮＡが十分な量で内包されていることを確認した。
・ＤＮＡ内包キャリアの調製
ＤＮＡとして、サイトメガロウイルスプロモーターの下流にＮａｎｏＬｕｃ遺伝子を連結したプラスミドＤＮＡを使用した。このＤＮＡを含むＤＮＡ溶液にカチオン性ペプチドを加え、ＤＮＡ－ペプチド凝縮体を形成した。次いで、それをエタノール溶解脂質溶液（（６）ＦＦＴ１０（前記式（１－０１）の脂質化合物）／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝３７／１０．５／５．７５／６０／４ｍｏｌ）に添加し、更に１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加した後、遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮して、ＤＮＡ内包キャリアを得た。当該核酸導入キャリアのＤＮＡ内包量は、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（登録商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎｄｓＤＮＡＡｓｓａｙＫｉｔ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック製）で測定し、ＤＮＡが十分な量で内包されていることを確認した。
【0119】
・ＲＮＡ内包キャリアの調製
ＲＮＡとして、レポーター遺伝子である緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ、オズバイオサイエンス製）を使用した。このｍＲＮＡを含むＲＮＡ溶液を、エタノール溶解脂質溶液（（６）ＦＦＴ１０／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝３７／１０．５／５．２５／６０／４ｍｏｌ）に加え、ピペッティングで懸濁した後、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加し、この溶液を遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮してＲＮＡ内包キャリアを得た。当該核酸導入キャリアのＲＮＡ内包量は、ＱｕａｎｔｉＦｌｕｏｒ（登録商標）ＲＮＡＳｙｓｔｅｍ（プロメガ製）で測定し、ｍＲＮＡが十分な量で内包されていることを確認した。
ＲＮＡとして、レポーター遺伝子である緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ、オズバイオサイエンス製）を使用した。このｍＲＮＡを含むＲＮＡ溶液を、エタノール溶解脂質溶液（（６）ＦＦＴ１０／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝３７／１０．５／５．２５／６０／４ｍｏｌ）に加え、ピペッティングで懸濁した後、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加し、この溶液を遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮してＲＮＡ内包キャリアを得た。当該核酸導入キャリアのＲＮＡ内包量は、ＱｕａｎｔｉＦｌｕｏｒ（登録商標）ＲＮＡＳｙｓｔｅｍ（プロメガ製）で測定し、ｍＲＮＡが十分な量で内包されていることを確認した。
【0120】
・ＰＢＭＣの調製
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＴｅｘＭＡＣＳ培地（ミルテニーバイオテク製）で培養し、遠心で細胞を回収した後、３．３×１０６細胞／ｍＬとなるように新鮮なＴｅｘＭＡＣＳに細胞を懸濁して、４ウェル培養ディッシュ（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ）に、１．０×１０６細胞／ウェルとなるように、細胞懸濁液を３００μＬ加えた。
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＴｅｘＭＡＣＳ培地（ミルテニーバイオテク製）で培養し、遠心で細胞を回収した後、３．３×１０６細胞／ｍＬとなるように新鮮なＴｅｘＭＡＣＳに細胞を懸濁して、４ウェル培養ディッシュ（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ）に、１．０×１０６細胞／ウェルとなるように、細胞懸濁液を３００μＬ加えた。
【0121】
・ＤＮＡ内包キャリア及びＲＮＡ内包キャリアによる核酸の導入
その後、ＤＮＡ内包キャリア及びＲＮＡ内包キャリアをＤＮＡ及びＲＮＡが２．４μｇ／ウェルずつ、計４．８μｇ／ウェルとなるように上記ウェルに添加して、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養した。
その後、ＤＮＡ内包キャリア及びＲＮＡ内包キャリアをＤＮＡ及びＲＮＡが２．４μｇ／ウェルずつ、計４．８μｇ／ウェルとなるように上記ウェルに添加して、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養した。
【0122】
・リポフェクタミン３０００によるＤＮＡの細胞への導入
比較対象として、リポフェクタミン３０００試薬（インビトロジェン製）を用いて、上記プラスミドＤＮＡ及びｍＲＮＡをＰＢＭＣに導入した。導入は、当該試薬に添付されたマニュアルに従って行った。プラスミドＤＮＡは、２．４μｇ／ウェルとなるようにＰＢＭＣに添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養した。
比較対象として、リポフェクタミン３０００試薬（インビトロジェン製）を用いて、上記プラスミドＤＮＡ及びｍＲＮＡをＰＢＭＣに導入した。導入は、当該試薬に添付されたマニュアルに従って行った。プラスミドＤＮＡは、２．４μｇ／ウェルとなるようにＰＢＭＣに添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養した。
【0123】
・ＮａｎｏＬｕｃ発現量（発光強度）の測定（ＮａｎｏＬｕｃ発光アッセイ）
ＤＮＡ内包キャリア又はリポフェクタミン３０００を用いたプラスミドＤＮＡの添加の４８時間後、各培養プレートをインキュベータから取り出し、発光顕微鏡システム（オリンパス製）で、ＮａｎｏＬｕｃの発光細胞の写真を撮影した。ＮａｎｏＬｕｃの発光強度は、画像処理ソフト（ＩｍａｇｅＪ）を用いて、発光細胞の写真から求めた。
ＤＮＡ内包キャリア又はリポフェクタミン３０００を用いたプラスミドＤＮＡの添加の４８時間後、各培養プレートをインキュベータから取り出し、発光顕微鏡システム（オリンパス製）で、ＮａｎｏＬｕｃの発光細胞の写真を撮影した。ＮａｎｏＬｕｃの発光強度は、画像処理ソフト（ＩｍａｇｅＪ）を用いて、発光細胞の写真から求めた。
【0124】
・ＧＦＰ発現量の測定
次に、ＲＮＡ内包キャリア又はリポフェクタミン３０００を用いたｍＲＮＡの添加の２４時間後、各培養プレートをインキュベータから取り出し、遠心で細胞を回収した後、リン酸緩衝液ＰＢＳで１回洗浄後、ＰＢＳに再懸濁し、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ；ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（登録商標）、ＢＤバイオサイエンス製）により、ＧＦＰの緑色蛍光を検出した。
次に、ＲＮＡ内包キャリア又はリポフェクタミン３０００を用いたｍＲＮＡの添加の２４時間後、各培養プレートをインキュベータから取り出し、遠心で細胞を回収した後、リン酸緩衝液ＰＢＳで１回洗浄後、ＰＢＳに再懸濁し、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ；ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（登録商標）、ＢＤバイオサイエンス製）により、ＧＦＰの緑色蛍光を検出した。
【0125】
・結果
図７に、ＮａｎｏＬｕｃ発光強度の測定結果を示す。ＤＮＡ内包キャリアを用いて導入した場合（核酸導入キャリア（＋）、リポフェクタミン３０００（－））では、リポフェクタミン３０００によって導入した場合（核酸導入キャリア（－）、リポフェクタミン３０００（＋））の約３．５倍もの発光強度が得られた。この結果から、ＤＮＡ内包キャリアを用いてＤＮＡを導入した細胞では、ＤＮＡがよく導入され、且つＮａｎｏＬｕｃ遺伝子がよく発現していることが明らかである。このことは、ＤＮＡを脂質粒子に内包して導入する方法は、リポフェクタミンとＤＮＡとの複合体を用いる方法よりもＤＮＡ導入効率及び遺伝子発現効率が高いことを示している。
図７に、ＮａｎｏＬｕｃ発光強度の測定結果を示す。ＤＮＡ内包キャリアを用いて導入した場合（核酸導入キャリア（＋）、リポフェクタミン３０００（－））では、リポフェクタミン３０００によって導入した場合（核酸導入キャリア（－）、リポフェクタミン３０００（＋））の約３．５倍もの発光強度が得られた。この結果から、ＤＮＡ内包キャリアを用いてＤＮＡを導入した細胞では、ＤＮＡがよく導入され、且つＮａｎｏＬｕｃ遺伝子がよく発現していることが明らかである。このことは、ＤＮＡを脂質粒子に内包して導入する方法は、リポフェクタミンとＤＮＡとの複合体を用いる方法よりもＤＮＡ導入効率及び遺伝子発現効率が高いことを示している。
【0126】
図８に、ＧＦＰ蛍光強度の測定結果を示す。ＲＮＡ内包キャリアを用いて導入した場合（核酸導入キャリア（＋）、リポフェクタミン３０００（－））では、リポフェクタミン３０００によって導入した場合（核酸導入キャリア（－）、リポフェクタミン３０００（＋））の約１０倍もの蛍光強度が得られた。この結果から、ＲＮＡ内包キャリアを用いてＲＮＡを導入した細胞では、ＲＮＡがよく導入され、且つＧＦＰ遺伝子がよく発現していることが明らかである。このことは、ＲＮＡを脂質粒子に内包して導入する方法は、リポフェクタミンとＲＮＡとの複合体を用いる方法よりもＲＮＡ導入効率及び遺伝子発現効率が高いことを示している。
【0127】
例２．ＤＮＡを内包し、生分解性脂質を含む脂質粒子によるＰＢＭＣ細胞への核酸導入率の評価
・ＤＮＡ内包キャリアの調製
ＤＮＡとして、サイトメガロウイルスプロモーターの下流にＮａｎｏＬｕｃ遺伝子を連結したプラスミドＤＮＡを使用した。このＤＮＡを含むＤＮＡ溶液にカチオン性ペプチドを加え、ＤＮＡ－ペプチド凝縮体を形成した。次いで、それを３種のエタノール溶解脂質溶液（（１）ＦＦＴ１０／ＤＯＴＡＰ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝７４／２１／６０／４ｍｏｌ、（２）ＦＦＴ１０／ＳＳＴ０４（前記式（２－０１）の脂質化合物）/ＤＯＴＡＰ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝３７／７．５／２１／６０／４ｍｏｌ、（３）ＤＯＴＡＰ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝２１／３０／２ｍｏｌ）にそれぞれ添加し、更に１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加した後、遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮して、ＤＮＡ内包キャリアを得た。当該核酸導入キャリアのＤＮＡ内包量は、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（登録商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎｄｓＤＮＡＡｓｓａｙＫｉｔ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック製）で測定し、ＤＮＡが十分な量で内包れていることを確認した。
・ＤＮＡ内包キャリアの調製
ＤＮＡとして、サイトメガロウイルスプロモーターの下流にＮａｎｏＬｕｃ遺伝子を連結したプラスミドＤＮＡを使用した。このＤＮＡを含むＤＮＡ溶液にカチオン性ペプチドを加え、ＤＮＡ－ペプチド凝縮体を形成した。次いで、それを３種のエタノール溶解脂質溶液（（１）ＦＦＴ１０／ＤＯＴＡＰ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝７４／２１／６０／４ｍｏｌ、（２）ＦＦＴ１０／ＳＳＴ０４（前記式（２－０１）の脂質化合物）/ＤＯＴＡＰ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝３７／７．５／２１／６０／４ｍｏｌ、（３）ＤＯＴＡＰ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝２１／３０／２ｍｏｌ）にそれぞれ添加し、更に１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加した後、遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮して、ＤＮＡ内包キャリアを得た。当該核酸導入キャリアのＤＮＡ内包量は、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（登録商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎｄｓＤＮＡＡｓｓａｙＫｉｔ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック製）で測定し、ＤＮＡが十分な量で内包れていることを確認した。
【0128】
・ＰＢＭＣの調製
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＴｅｘＭＡＣＳ培地（ミルテニーバイオテク製）で培養し、遠心で細胞を回収した後、２．０×１０６細胞／ｍＬとなるように新鮮なＴｅｘＭＡＣＳに細胞を懸濁した。９６ウェル培養プレートに、４．０×１０６細胞／ウェルとなるように、細胞懸濁液を２００μＬ加えた。
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＴｅｘＭＡＣＳ培地（ミルテニーバイオテク製）で培養し、遠心で細胞を回収した後、２．０×１０６細胞／ｍＬとなるように新鮮なＴｅｘＭＡＣＳに細胞を懸濁した。９６ウェル培養プレートに、４．０×１０６細胞／ウェルとなるように、細胞懸濁液を２００μＬ加えた。
【0129】
・ＤＮＡ内包キャリアによる核酸の導入
その後、ＤＮＡ内包キャリアをＤＮＡが０．５μｇ／ウェルとなるように上記ウェルに添加して、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養した。
その後、ＤＮＡ内包キャリアをＤＮＡが０．５μｇ／ウェルとなるように上記ウェルに添加して、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養した。
【0130】
・ＮａｎｏＬｕｃ発現量（発光強度）の測定（ＮａｎｏＬｕｃ発光アッセイ）
ＤＮＡ内包キャリアと混合したプラスミドＤＮＡの添加の４８時間後、培養プレートをインキュベータから取り出し、Ｎａｎｏ－ＧｌｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙＳｙｓｔｅｍ（プロメガ製）で、ＮａｎｏＬｕｃの発光強度をルミノメーター（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）Ｆ２００ＰＲＯ、テカン製）で測定した。測定は、キット及び装置に添付のマニュアルに従って行った。
ＤＮＡ内包キャリアと混合したプラスミドＤＮＡの添加の４８時間後、培養プレートをインキュベータから取り出し、Ｎａｎｏ－ＧｌｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙＳｙｓｔｅｍ（プロメガ製）で、ＮａｎｏＬｕｃの発光強度をルミノメーター（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）Ｆ２００ＰＲＯ、テカン製）で測定した。測定は、キット及び装置に添付のマニュアルに従って行った。
【0131】
・結果
ＮａｎｏＬｕｃ発光強度の測定結果を図９に示し、ＤＮＡ内包量の結果を図１０に示す。生分解性脂質を含む脂質粒子（１）を用いた場合では、生分解性脂質を含まない脂質粒子（３）を用いた場合と比較して、約１５７倍の発光強度が得られ、また５倍以上のＤＮＡ内包量が得られた。生分解性脂質を含む脂質粒子（２）を用いた場合では、脂質粒子（３）を用いた場合と比較して、約３６倍の発光強度が得られ、約２倍のＤＮＡ内包量が得られた。この結果から、生分解性脂質を含む脂質粒子を用いると、核酸の内包量が向上し、且つ遺伝子の発現量が大きく向上することが明らかとなった。このことは、生分解性脂質を含む脂質粒子を用いると核酸の導入効率が非常に高くなることを示す。
ＮａｎｏＬｕｃ発光強度の測定結果を図９に示し、ＤＮＡ内包量の結果を図１０に示す。生分解性脂質を含む脂質粒子（１）を用いた場合では、生分解性脂質を含まない脂質粒子（３）を用いた場合と比較して、約１５７倍の発光強度が得られ、また５倍以上のＤＮＡ内包量が得られた。生分解性脂質を含む脂質粒子（２）を用いた場合では、脂質粒子（３）を用いた場合と比較して、約３６倍の発光強度が得られ、約２倍のＤＮＡ内包量が得られた。この結果から、生分解性脂質を含む脂質粒子を用いると、核酸の内包量が向上し、且つ遺伝子の発現量が大きく向上することが明らかとなった。このことは、生分解性脂質を含む脂質粒子を用いると核酸の導入効率が非常に高くなることを示す。
【0132】
また、（１）の脂質粒子を用いた場合と（２）の脂質粒子を用いた場合を比較すると、（１）の脂質粒子を用いた場合の方がＮａｎｏＬｕｃ発光強度及びＤＮＡ内包量がそれぞれ、約４倍及び約３倍と優れていることが明らかとなった。したがって、（１）の脂質を用いれば、核酸の導入効率をより高めることが示された。
【0133】
例３．ＤＮＡを内包し、生分解性脂質を含む脂質粒子によるＰＢＭＣ細胞への核酸導入率の評価・ＤＮＡ内包キャリアの調製
ＤＮＡとして、サイトメガロウイルスプロモーターの下流にＮａｎｏＬｕｃ遺伝子を連結したプラスミドＤＮＡを使用した。このＤＮＡを含むＤＮＡ溶液にカチオン性ペプチドを加え、ＤＮＡ－ペプチド凝縮体を形成した。次いで、それを表４に示す１０種のエタノール溶解脂質溶液にそれぞれ添加し、更に１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加した後、遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮して、ＤＮＡ内包キャリアを得た。
ＤＮＡとして、サイトメガロウイルスプロモーターの下流にＮａｎｏＬｕｃ遺伝子を連結したプラスミドＤＮＡを使用した。このＤＮＡを含むＤＮＡ溶液にカチオン性ペプチドを加え、ＤＮＡ－ペプチド凝縮体を形成した。次いで、それを表４に示す１０種のエタノール溶解脂質溶液にそれぞれ添加し、更に１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加した後、遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮して、ＤＮＡ内包キャリアを得た。
【表4】
【0134】
当該核酸導入キャリアのＤＮＡ内包量は、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（登録商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック製）で測定し、ＤＮＡが十分な量で内包されていることを確認した。
【0135】
・ＰＢＭＣの調製
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＴｅｘＭＡＣＳ培地（ミルテニーバイオテク製）で培養し、遠心で細胞を回収した後、２．０×１０６細胞／ｍＬとなるように新鮮なＴｅｘＭＡＣＳに細胞を懸濁した。９６ウェル培養プレートに、４．０×１０６細胞／ウェルとなるように、細胞懸濁液を２００μＬ加えた。
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＴｅｘＭＡＣＳ培地（ミルテニーバイオテク製）で培養し、遠心で細胞を回収した後、２．０×１０６細胞／ｍＬとなるように新鮮なＴｅｘＭＡＣＳに細胞を懸濁した。９６ウェル培養プレートに、４．０×１０６細胞／ウェルとなるように、細胞懸濁液を２００μＬ加えた。
【0136】
・ＤＮＡ内包キャリアによる核酸の導入
その後、ＤＮＡ内包キャリアをＤＮＡが０．５μｇ／ウェルとなるように上記ウェルに添加して、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養した。
その後、ＤＮＡ内包キャリアをＤＮＡが０．５μｇ／ウェルとなるように上記ウェルに添加して、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養した。
【0137】
・核酸導入キャリアの酸解離定数の測定
ゼータサイザーナノの自動滴定装置（マルバーン社製）によって、核酸導入キャリアの酸解離定数ｐＫａ（ゼータ電位が０になるｐＨ）を測定した。ｐＨは塩酸と水酸化Ｎａを用いて調整した。
ゼータサイザーナノの自動滴定装置（マルバーン社製）によって、核酸導入キャリアの酸解離定数ｐＫａ（ゼータ電位が０になるｐＨ）を測定した。ｐＨは塩酸と水酸化Ｎａを用いて調整した。
【0138】
・ＮａｎｏＬｕｃ発現量の測定（ＮａｎｏＬｕｃ発光アッセイ）
ＤＮＡ内包キャリアと混合したプラスミドＤＮＡの添加の４８時間後、培養プレートをインキュベータから取り出し、Ｎａｎｏ－ＧｌｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙＳｙｓｔｅｍ（プロメガ製）で、ＮａｎｏＬｕｃの発光強度をルミノメーター（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）Ｆ２００ＰＲＯ、テカン製）で測定した。測定は、キット及び装置に添付のマニュアルに従って行った。
ＤＮＡ内包キャリアと混合したプラスミドＤＮＡの添加の４８時間後、培養プレートをインキュベータから取り出し、Ｎａｎｏ－ＧｌｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙＳｙｓｔｅｍ（プロメガ製）で、ＮａｎｏＬｕｃの発光強度をルミノメーター（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）Ｆ２００ＰＲＯ、テカン製）で測定した。測定は、キット及び装置に添付のマニュアルに従って行った。
【0139】
・結果
表５に脂質粒子の酸解離定数（ｐＫａ）及びＮａｎｏＬｕｃ発現量（発光量：ＲＬＵ）を示す。
表５に脂質粒子の酸解離定数（ｐＫａ）及びＮａｎｏＬｕｃ発現量（発光量：ＲＬＵ）を示す。
【表5】
【0140】
また、ＮａｎｏＬｕｃ発現量と脂質粒子の酸解離定数との関係を図１１に示す。表５及び図１１に示す結果から、ｐＫａ６．５～７．６の間で８０００ＲＬＵ以上の高いＮａｎｏＬｕｃ発現量が得られることが明らかとなった。したがって、５、６及び７の組成の脂質粒子は、核酸導入効率において特に優れていることが示された。
【0141】
例４．ＤＮＡ及びｍＲＮＡを内包し、生分解性脂質を含む脂質粒子によるＰＢＭＣ細胞への核酸導入率の評価・ＤＮＡ内包キャリアの調製
ＤＮＡとして、サイトメガロウイルスプロモーターの下流にＮａｎｏＬｕｃ遺伝子を連結したプラスミドＤＮＡ、及びサイトメガロウイルスプロモーターの下流にＧＦＰ遺伝子を連結したプラスミドＤＮＡ使用した。これらのＤＮＡを含むＤＮＡ溶液にカチオン性ペプチドを加え、ＤＮＡ－ペプチド凝縮体を形成した。次いで、それをエタノール溶解脂質溶液（（６）ＦＦＴ１０／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝３７／１０．５／５．２５／６０／４ｍｏｌ）に添加し、更に１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加した後、遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮して、ＮａｎｏＬｕｃ－ＤＮＡ内包キャリア及びＧＦＰ－ＤＮＡ内包キャリアを得た。当該核酸導入キャリアのＤＮＡ内包量は、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（登録商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎｄｓＤＮＡＡｓｓａｙＫｉｔ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック製）で測定し、ＤＮＡが十分な量で内包れていることを確認した。
ＤＮＡとして、サイトメガロウイルスプロモーターの下流にＮａｎｏＬｕｃ遺伝子を連結したプラスミドＤＮＡ、及びサイトメガロウイルスプロモーターの下流にＧＦＰ遺伝子を連結したプラスミドＤＮＡ使用した。これらのＤＮＡを含むＤＮＡ溶液にカチオン性ペプチドを加え、ＤＮＡ－ペプチド凝縮体を形成した。次いで、それをエタノール溶解脂質溶液（（６）ＦＦＴ１０／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝３７／１０．５／５．２５／６０／４ｍｏｌ）に添加し、更に１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加した後、遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮して、ＮａｎｏＬｕｃ－ＤＮＡ内包キャリア及びＧＦＰ－ＤＮＡ内包キャリアを得た。当該核酸導入キャリアのＤＮＡ内包量は、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（登録商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎｄｓＤＮＡＡｓｓａｙＫｉｔ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック製）で測定し、ＤＮＡが十分な量で内包れていることを確認した。
【0142】
・ＲＮＡ内包キャリアの調製
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として、レポーター遺伝子である緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）のｍＲＮＡ（オズバイオサイエンス製）を使用した。このｍＲＮＡを含むＲＮＡ溶液を、エタノール溶解脂質溶液（（６）ＦＦＴ１０／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝３７／１０．５／５．２５／６０／４ｍｏｌ）に加え、ピペッティングで懸濁した後、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加し、この溶液を遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮してＧＦＰ－ＲＮＡ内包キャリアを得た。当該核酸導入キャリアのＲＮＡ内包量は、ＱｕａｎｔｉＦｌｕｏｒ（登録商標）ＲＮＡＳｙｓｔｅｍ（プロメガ製）で測定し、ｍＲＮＡが十分な量で内包されていることを確認した。
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として、レポーター遺伝子である緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）のｍＲＮＡ（オズバイオサイエンス製）を使用した。このｍＲＮＡを含むＲＮＡ溶液を、エタノール溶解脂質溶液（（６）ＦＦＴ１０／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝３７／１０．５／５．２５／６０／４ｍｏｌ）に加え、ピペッティングで懸濁した後、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加し、この溶液を遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮してＧＦＰ－ＲＮＡ内包キャリアを得た。当該核酸導入キャリアのＲＮＡ内包量は、ＱｕａｎｔｉＦｌｕｏｒ（登録商標）ＲＮＡＳｙｓｔｅｍ（プロメガ製）で測定し、ｍＲＮＡが十分な量で内包されていることを確認した。
【0143】
・ＰＢＭＣの調製
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＴｅｘＭＡＣＳ培地（ミルテニーバイオテク製）で培養し、遠心で細胞を回収した後、３．３×１０６細胞／ｍＬとなるように新鮮なＴｅｘＭＡＣＳに細胞を懸濁して、４ウェル培養ディッシュ（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ）に、１．０×１０６細胞／ウェルとなるように、細胞懸濁液を３００μＬ加えた。
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＴｅｘＭＡＣＳ培地（ミルテニーバイオテク製）で培養し、遠心で細胞を回収した後、３．３×１０６細胞／ｍＬとなるように新鮮なＴｅｘＭＡＣＳに細胞を懸濁して、４ウェル培養ディッシュ（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ）に、１．０×１０６細胞／ウェルとなるように、細胞懸濁液を３００μＬ加えた。
【0144】
・ＤＮＡ内包キャリア、ＲＮＡ内包キャリアによる核酸の導入
その後、ＮａｎｏＬｕｃ－ＤＮＡ内包キャリアとＧＦＰ－ＤＮＡ内包キャリアとをＤＮＡが、２．４μｇと２．４μｇずつの合計４．８μｇ／ウェルとなるように上記の同じウェルに添加した（ＤＮＡ×ＤＮＡ共導入）。また、ＮａｎｏＬｕｃ－ＤＮＡ内包キャリアとＧＦＰ－ＲＮＡ内包キャリアとをＤＮＡとＲＮＡとが、２．４μｇと２．４μｇずつの合計４．８μｇ／ウェルとなるように上記の同じウェルに添加した（ＤＮＡ×ＲＮＡ共導入）。細胞は、脂質粒子を添加後、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養した。
その後、ＮａｎｏＬｕｃ－ＤＮＡ内包キャリアとＧＦＰ－ＤＮＡ内包キャリアとをＤＮＡが、２．４μｇと２．４μｇずつの合計４．８μｇ／ウェルとなるように上記の同じウェルに添加した（ＤＮＡ×ＤＮＡ共導入）。また、ＮａｎｏＬｕｃ－ＤＮＡ内包キャリアとＧＦＰ－ＲＮＡ内包キャリアとをＤＮＡとＲＮＡとが、２．４μｇと２．４μｇずつの合計４．８μｇ／ウェルとなるように上記の同じウェルに添加した（ＤＮＡ×ＲＮＡ共導入）。細胞は、脂質粒子を添加後、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養した。
【0145】
・ＮａｎｏＬｕｃ発現量及びＧＦＰ発現量の測定
核酸導入キャリア添加の２４時間後、培養プレートをインキュベータから取り出し、ＮａｎｏＬｕｃの発光強度とＧＦＰの蛍光強度とを、例１に記載した発光顕微鏡システムと蛍光活性化セルソーターとでそれぞれ測定した。
核酸導入キャリア添加の２４時間後、培養プレートをインキュベータから取り出し、ＮａｎｏＬｕｃの発光強度とＧＦＰの蛍光強度とを、例１に記載した発光顕微鏡システムと蛍光活性化セルソーターとでそれぞれ測定した。
【0146】
・結果
図１２に、ＮａｎｏＬｕｃ発光強度の測定結果を、図１３にＧＦＰ蛍光強度の測定結果を示す。ＧＦＰ遺伝子をＲＮＡ形態で共導入した場合（ＤＮＡ×ＲＮＡ共導入）、同遺伝子をＤＮＡの形態で共導入した場合（ＤＮＡ×ＲＮＡ共導入）の約３倍のＮａｎｏＬｕｃの発光強度が得られた。また、ＧＦＰ蛍光強度に関しても、ＤＮＡ×ＲＮＡ共導入の場合は、ＤＮＡ×ＤＮＡ共導入の場合の２倍以上の強度が得られた。この結果から、両方の遺伝子をＤＮＡの形態で共導入するよりも、異なる２種の核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）の形態で共導入した方が、ＤＮＡ及びＲＮＡの発現量が高いことが明らかになった。
図１２に、ＮａｎｏＬｕｃ発光強度の測定結果を、図１３にＧＦＰ蛍光強度の測定結果を示す。ＧＦＰ遺伝子をＲＮＡ形態で共導入した場合（ＤＮＡ×ＲＮＡ共導入）、同遺伝子をＤＮＡの形態で共導入した場合（ＤＮＡ×ＲＮＡ共導入）の約３倍のＮａｎｏＬｕｃの発光強度が得られた。また、ＧＦＰ蛍光強度に関しても、ＤＮＡ×ＲＮＡ共導入の場合は、ＤＮＡ×ＤＮＡ共導入の場合の２倍以上の強度が得られた。この結果から、両方の遺伝子をＤＮＡの形態で共導入するよりも、異なる２種の核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）の形態で共導入した方が、ＤＮＡ及びＲＮＡの発現量が高いことが明らかになった。
【0147】
例５．ＣＡＲ－ＤＮＡ内包キャリア及びＰｉｇｇｙＢａｃ ｍＲＮＡ内包キャリアの同時導入によるＣＡＲ遺伝子導入効率の評価
・ＣＡＲ－ＤＮＡ内包キャリアの調製
ＤＮＡとして、ＰｉｇｇｙＢａｃ認識配列（５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲ）の間にサイトメガロウイルスプロモーターとＣＡＲ遺伝子を連結したＣＡＲ遺伝子発現カセットを組込んだプラスミドＤＮＡを使用した。ＣＡＲ－ＤＮＡを含むＤＮＡ溶液をエタノール溶解脂質溶液（（１４）ＦＦＴ１０／ＤＯＴＡＰ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝３７／２１／３０／２ｍｏｌ）に加え、ピペッティングで懸濁した後、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加し、この溶液を遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮してＣＡＲ－ＤＮＡ内包キャリアを得た。
・ＣＡＲ－ＤＮＡ内包キャリアの調製
ＤＮＡとして、ＰｉｇｇｙＢａｃ認識配列（５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲ）の間にサイトメガロウイルスプロモーターとＣＡＲ遺伝子を連結したＣＡＲ遺伝子発現カセットを組込んだプラスミドＤＮＡを使用した。ＣＡＲ－ＤＮＡを含むＤＮＡ溶液をエタノール溶解脂質溶液（（１４）ＦＦＴ１０／ＤＯＴＡＰ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝３７／２１／３０／２ｍｏｌ）に加え、ピペッティングで懸濁した後、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加し、この溶液を遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮してＣＡＲ－ＤＮＡ内包キャリアを得た。
【0148】
・ＰｉｇｇｙＢａｃ ｍＲＮＡ内包キャリアの調製
ＰｉｇｇｙＢａｃ ｍＲＮＡは、Ｔ７プロモーターにＰｉｇｇｙＢａｃ遺伝子を連結したインビトロ転写用プラスミドＤＮＡから、市販のインビトロ転写ＲＮＡ合成キット（ＣＵＧＡ７ｉｎｖｉｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｋｉｔ、ニッポンジーン製）によりＲＮＡを合成した。市販のキットで当該ＲＮＡの５’末端にＣａｐ構造を付加し、３’末端にポリＡ構造を付加し、ＰｉｇｇｙＢａｃｍＲＮＡを得た。ｍＲＮＡの合成は、キット添付のマニュアルに従った。ＰｉｇｇｙＢａｃｍＲＮＡを含むＲＮＡ溶液をエタノール溶解脂質溶液（（１５）ＦＦＴ１０／ＤＯＰＥ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝３７／２１／３０／２ｍｏｌ）に加え、ピペッティングで懸濁した後、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加し、この溶液を遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮してＰｉｇｇｙＢａｃ－ＲＮＡ内包キャリアを得た。
ＰｉｇｇｙＢａｃ ｍＲＮＡは、Ｔ７プロモーターにＰｉｇｇｙＢａｃ遺伝子を連結したインビトロ転写用プラスミドＤＮＡから、市販のインビトロ転写ＲＮＡ合成キット（ＣＵＧＡ７ｉｎｖｉｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｋｉｔ、ニッポンジーン製）によりＲＮＡを合成した。市販のキットで当該ＲＮＡの５’末端にＣａｐ構造を付加し、３’末端にポリＡ構造を付加し、ＰｉｇｇｙＢａｃｍＲＮＡを得た。ｍＲＮＡの合成は、キット添付のマニュアルに従った。ＰｉｇｇｙＢａｃｍＲＮＡを含むＲＮＡ溶液をエタノール溶解脂質溶液（（１５）ＦＦＴ１０／ＤＯＰＥ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝３７／２１／３０／２ｍｏｌ）に加え、ピペッティングで懸濁した後、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加し、この溶液を遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮してＰｉｇｇｙＢａｃ－ＲＮＡ内包キャリアを得た。
【0149】
・ＣＡＲ－ＤＮＡ／ＰｉｇｇｙＢａｃ－ＤＮＡ内包キャリアの調製
比較対象として、ＣＡＲ－ＤＮＡ、及びサイトメガロウイルスプロモーターとＰｉｇｇｙＢａｃ遺伝子を連結したプラスミドＤＮＡの混合溶液をエタノール溶解脂質溶液（（１４）ＦＦＴ１０／ＤＯＴＡＰ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝３７／２１／３０／２ｍｏｌ）に添加し、更に１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加した後、遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮して、ＣＡＲ－ＤＮＡ／ＰｉｇｇｙＢａｃ－ＤＮＡ内包キャリアを得た。
比較対象として、ＣＡＲ－ＤＮＡ、及びサイトメガロウイルスプロモーターとＰｉｇｇｙＢａｃ遺伝子を連結したプラスミドＤＮＡの混合溶液をエタノール溶解脂質溶液（（１４）ＦＦＴ１０／ＤＯＴＡＰ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝３７／２１／３０／２ｍｏｌ）に添加し、更に１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加した後、遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮して、ＣＡＲ－ＤＮＡ／ＰｉｇｇｙＢａｃ－ＤＮＡ内包キャリアを得た。
【0150】
・細胞の調製及び核酸導入キャリアによる核酸の導入
凍結した市販のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ、Ｌｏｎｚａ）を３７℃の恒温槽で融解した後、遠心で細胞を回収した。細胞を２種類のサイトカイン（１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５（ミルテニー））を含むＴｅｘＭＡＣＳに懸濁した後、６ｃｍ培養ディッシュに播種して、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベータ内で培養した。１晩培養した後、インキュベータから培養ディッシュを取り出して、遠心で細胞を回収し、ＴｅｘＭＡＣＳ（１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５を含む）に懸濁した後、ＣＤ３抗体（ミルテニー）及びＣＤ２８抗体（ミルテニー）でコーティングした４８ウェル培養プレートで、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で一晩培養した。
凍結した市販のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ、Ｌｏｎｚａ）を３７℃の恒温槽で融解した後、遠心で細胞を回収した。細胞を２種類のサイトカイン（１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５（ミルテニー））を含むＴｅｘＭＡＣＳに懸濁した後、６ｃｍ培養ディッシュに播種して、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベータ内で培養した。１晩培養した後、インキュベータから培養ディッシュを取り出して、遠心で細胞を回収し、ＴｅｘＭＡＣＳ（１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５を含む）に懸濁した後、ＣＤ３抗体（ミルテニー）及びＣＤ２８抗体（ミルテニー）でコーティングした４８ウェル培養プレートで、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で一晩培養した。
【0151】
細胞培養液に、ＣＡＲ－ＤＮＡ内包キャリア（４μｇ）及びＰｉｇｇｙＢａｃ－ＲＮＡ内包キャリア（４μｇ）を添加し、ピペッティングで穏やかに混合した後、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養を継続した。また、比較対象として、ＣＡＲ－ＤＮＡ／ＰｉｇｇｙＢａｃ－ＤＮＡ内包キャリア（４μｇ×４μｇ）を細胞培養液に添加し、ピペッティングで穏やかに混合した後、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養を継続した。
【0152】
・ＣＡＲ発現Ｔリンパ球細胞の検出
核酸導入キャリア添加から７日後、培養プレートをインキュベータから取り出し、遠心で細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した後、抗ヒトＩＧＧ抗体（Fluorescein (FITC) F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG (H+L)、Jackson ImmunoResearch）及びＣＤ３抗体（Ｖ４５０ マウス抗ヒトＣＤ３、クローンＵＣＨＴ１、ＢＤバイオサイエンス製）を加えて細胞と反応させた。反応が終了した後、遠心で細胞を回収してウシ血清アルブミンを１％含むＰＢＳで洗浄した後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳに再懸濁してＦＡＣＳの測定試料とした。ＦＡＣＳでは、抗ＩＧＧ抗体結合細胞（ＣＡＲ発現細胞）及び抗ＣＤ３抗体結合細胞（Ｔリンパ球細胞）を、ＡＰＣフィルターセット及びＶ４５０フィルターセットでそれぞれ検出した。
核酸導入キャリア添加から７日後、培養プレートをインキュベータから取り出し、遠心で細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した後、抗ヒトＩＧＧ抗体（Fluorescein (FITC) F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG (H+L)、Jackson ImmunoResearch）及びＣＤ３抗体（Ｖ４５０ マウス抗ヒトＣＤ３、クローンＵＣＨＴ１、ＢＤバイオサイエンス製）を加えて細胞と反応させた。反応が終了した後、遠心で細胞を回収してウシ血清アルブミンを１％含むＰＢＳで洗浄した後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳに再懸濁してＦＡＣＳの測定試料とした。ＦＡＣＳでは、抗ＩＧＧ抗体結合細胞（ＣＡＲ発現細胞）及び抗ＣＤ３抗体結合細胞（Ｔリンパ球細胞）を、ＡＰＣフィルターセット及びＶ４５０フィルターセットでそれぞれ検出した。
【0153】
・結果
結果を図１４に示す。図１４の（ａ）、（ｂ）は、ＣＡＲ－ＤＮＡ内包キャリア及びＰｉｇｇｙＢａｃ－ＲＮＡ内包キャリアを導入した結果を示す。図１４の（ｃ）、（ｄ）は、ＣＡＲ－ＤＮＡ／ＰｉｇｇｙＢａｃ－ＤＮＡ内包キャリアを導入した結果を示す。
結果を図１４に示す。図１４の（ａ）、（ｂ）は、ＣＡＲ－ＤＮＡ内包キャリア及びＰｉｇｇｙＢａｃ－ＲＮＡ内包キャリアを導入した結果を示す。図１４の（ｃ）、（ｄ）は、ＣＡＲ－ＤＮＡ／ＰｉｇｇｙＢａｃ－ＤＮＡ内包キャリアを導入した結果を示す。
【0154】
図１４の（ａ）、（ｃ）は、ＣＤ３及びＩＧＧをそれぞれ縦軸と横軸にとった２カラードットプロットを示す。このドットプロットから、ＵＲ画分にＣＤ３陽性（Ｔリンパ球細胞）かつＩＧＧ陽性（ＣＡＲ発現細胞）の細胞が存在することが明らかとなった。この結果は、ＤＮＡが細胞に導入され、ＣＡＲ遺伝子が発現したことを示している。
【0155】
図１４の（ｂ）、（ｄ）は縦軸を細胞数（％）とし、横軸を蛍光標識抗体からの蛍光強度としたヒストグラムを示す。破線は、ＤＮＡ及びＲＮＡを導入していない細胞（コントロール）における結果を示し、実線は、核酸導入キャリアを添加した細胞における結果を示す。図１４（ｂ）又は（ｄ）のヒストグラムの破線の領域と重なっていない実線の領域の割合（図中、矢印で指す領域）は、ＣＡＲ－Ｔ細胞、即ちＣＤ３陽性かつＣＡＲ陽性細胞の割合を示す。この割合は、ＣＡＲ－ＤＮＡ内包キャリア及びＰｉｇｇｙＢａｃ－ＲＮＡ内包キャリアを用いた場合では４１％であった。対して、ＣＡＲ－ＤＮＡ内包キャリア及びＰｉｇｇｙＢａｃ－ＤＮＡ内包キャリアを用いた場合では２５％であった。したがって、ＰｉｇｇｙＢａｃをＤＮＡの形態で細胞に導入するよりも、ＲＮＡの形態で細胞に導入した方がＣＡＲ－Ｔ細胞の製造効率がより高まることが明らかとなった。
【0156】
例６．ＣＡＲ－ＤＮＡ及びＰｉｇｇｙＢａｃ－ｍＲＮＡを内包し、生分解性脂質を含む脂質粒子を用いたＣＡＲ－Ｔ細胞の調製・ＣＡＲ－ＤＮＡ内包キャリアの調製
ＤＮＡとして、サイトメガロウイルスプロモーターの下流にＣＡＲ遺伝子（ＣＤ１９．ＣＡＲ遺伝子）を連結したプラスミドＤＮＡを使用した。このＤＮＡを含むＤＮＡ溶液にカチオン性ペプチドを加え、ＤＮＡ－ペプチド凝縮体を形成した。次いで、それをエタノール溶解脂質溶液（（１６）：ＦＦＴ１０／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝３７／５．２５／１０．５／６０／４ｍｏｌ、（１７）：ＦＦＴ２０（前記式（１－０２）の脂質化合物）／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝３７／１０．５／５．２５／６０／４ｍｏｌ）に添加し、更に１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加した後、遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮して、ＤＮＡ内包キャリアを得た。
ＤＮＡとして、サイトメガロウイルスプロモーターの下流にＣＡＲ遺伝子（ＣＤ１９．ＣＡＲ遺伝子）を連結したプラスミドＤＮＡを使用した。このＤＮＡを含むＤＮＡ溶液にカチオン性ペプチドを加え、ＤＮＡ－ペプチド凝縮体を形成した。次いで、それをエタノール溶解脂質溶液（（１６）：ＦＦＴ１０／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝３７／５．２５／１０．５／６０／４ｍｏｌ、（１７）：ＦＦＴ２０（前記式（１－０２）の脂質化合物）／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝３７／１０．５／５．２５／６０／４ｍｏｌ）に添加し、更に１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加した後、遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮して、ＤＮＡ内包キャリアを得た。
【0157】
・ＲＮＡ内包キャリアの調製
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として、ＰｉｇｇｙＢａｃ遺伝子のｍＲＮＡを使用した。このｍＲＮＡを含むＲＮＡ溶液を、２種のエタノール溶解脂質溶液（（１６）：ＦＦＴ１０／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝３７／５．２５／１０．５／６０／４ｍｏｌ、（１７）：ＦＦＴ２０／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝３７／１０．５／５．２５／６０／４ｍｏｌ）に加え、ピペッティングで懸濁した後、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加し、この溶液を遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮してＲＮＡ内包キャリアを得た。
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として、ＰｉｇｇｙＢａｃ遺伝子のｍＲＮＡを使用した。このｍＲＮＡを含むＲＮＡ溶液を、２種のエタノール溶解脂質溶液（（１６）：ＦＦＴ１０／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝３７／５．２５／１０．５／６０／４ｍｏｌ、（１７）：ＦＦＴ２０／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝３７／１０．５／５．２５／６０／４ｍｏｌ）に加え、ピペッティングで懸濁した後、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加し、この溶液を遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮してＲＮＡ内包キャリアを得た。
【0158】
・ＰＢＭＣの調製
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＴｅｘＭＡＣＳ培地（ミルテニーバイオテク製）で培養し、遠心で細胞を回収した後、２．０×１０６細胞／ｍＬとなるように新鮮なＴｅｘＭＡＣＳに細胞を懸濁した。４８ウェル培養プレートに、１．０×１０６細胞／ウェルとなるように、細胞懸濁液を５００μＬ加えた。
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＴｅｘＭＡＣＳ培地（ミルテニーバイオテク製）で培養し、遠心で細胞を回収した後、２．０×１０６細胞／ｍＬとなるように新鮮なＴｅｘＭＡＣＳに細胞を懸濁した。４８ウェル培養プレートに、１．０×１０６細胞／ウェルとなるように、細胞懸濁液を５００μＬ加えた。
【0159】
・ＤＮＡ内包キャリア及びＲＮＡ内包キャリアによる核酸の導入
その後、ＤＮＡ及びＲＮＡが、それぞれ４．０μｇずつの合計８．０μｇ／ウェルとなるように上記ウェルにＤＮＡ内包キャリアとＲＮＡ内包キャリアとを添加して、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養した。
その後、ＤＮＡ及びＲＮＡが、それぞれ４．０μｇずつの合計８．０μｇ／ウェルとなるように上記ウェルにＤＮＡ内包キャリアとＲＮＡ内包キャリアとを添加して、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養した。
【0160】
・ＣＡＲ発現量の測定
核酸導入キャリア添加から７日後及び１４日後、各培養プレートをインキュベータから取り出し、遠心で細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した後、抗ヒトＩＧＧ抗体（Fluorescein (FITC) F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG (H+L)、Jackson ImmunoResearch）及びＣＤ３抗体（Ｖ４５０ マウス抗ヒトＣＤ３、クローンＵＣＨＴ１、ＢＤバイオサイエンス製）を加えて細胞と反応させた。反応が終了した後、遠心で細胞を回収してＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに再懸濁してＦＡＣＳの測定試料とした。ＦＡＣＳでは、抗ＩＧＧ抗体結合細胞（ＣＡＲ発現細胞）及び抗ＣＤ３抗体結合細胞（Ｔリンパ球細胞）を、ＡＰＣフィルターセット及びＶ４５０フィルターセットでそれぞれ検出した。
核酸導入キャリア添加から７日後及び１４日後、各培養プレートをインキュベータから取り出し、遠心で細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した後、抗ヒトＩＧＧ抗体（Fluorescein (FITC) F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG (H+L)、Jackson ImmunoResearch）及びＣＤ３抗体（Ｖ４５０ マウス抗ヒトＣＤ３、クローンＵＣＨＴ１、ＢＤバイオサイエンス製）を加えて細胞と反応させた。反応が終了した後、遠心で細胞を回収してＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに再懸濁してＦＡＣＳの測定試料とした。ＦＡＣＳでは、抗ＩＧＧ抗体結合細胞（ＣＡＲ発現細胞）及び抗ＣＤ３抗体結合細胞（Ｔリンパ球細胞）を、ＡＰＣフィルターセット及びＶ４５０フィルターセットでそれぞれ検出した。
【0161】
・結果
測定結果を図１５及び図１６に示す。図１５は、（１６）の脂質組成の脂質粒子を添加したＰＢＭＣの培養７日後及び１４日後のＣＤ３発現（ＣＤ３陽性）、及びＣＡＲ発現（ＩＧＧ陽性）をそれぞれ縦軸と横軸にとったドットプロットを示す。図１６は、（１７）の脂質組成の核酸導入キャリアを用いた場合の培養７日後及び１４日後のドットプロットを示す。
測定結果を図１５及び図１６に示す。図１５は、（１６）の脂質組成の脂質粒子を添加したＰＢＭＣの培養７日後及び１４日後のＣＤ３発現（ＣＤ３陽性）、及びＣＡＲ発現（ＩＧＧ陽性）をそれぞれ縦軸と横軸にとったドットプロットを示す。図１６は、（１７）の脂質組成の核酸導入キャリアを用いた場合の培養７日後及び１４日後のドットプロットを示す。
【0162】
このドットプロットから、ＵＲ画分にＣＤ３陽性（Ｔリンパ球細胞）かつＩＧＧ陽性の細胞（ＣＡＲ発現細胞）、すなわちＣＡＲ－Ｔ細胞が存在することが明らかとなった。（１６）の脂質粒子を使用した場合では、７日目でのＣＡＲ－Ｔ細胞の割合は１５．０％であり、１４日目でのＣＡＲ－Ｔ細胞の割合は、３９．１％であった。（１７）の脂質粒子の場合では７日目でのＣＡＲ－Ｔ細胞の割合は２６．５％であり、１４日目でのＣＡＲ－Ｔ細胞の割合は、１７．１％であった。
【0163】
この結果より、生分解性脂質を主成分として含む脂質粒子によってＣＡＲを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞を調整できることが明らかになった。
【0164】
例７．ＣＡＲ－ＤＮＡ及びＰｉｇｇｙＢａｃ－ｍＲＮＡを内包し、生分解性脂質を含む脂質粒子を用いて調整したＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍効果の評価・ＣＡＲ－ＤＮＡ内包キャリアの調製
ＤＮＡとして、サイトメガロウイルスプロモーターの下流にＣＡＲ遺伝子（ＣＤ１９．ＣＡＲ遺伝子）を連結したプラスミドＤＮＡを使用した。このＤＮＡを含むＤＮＡ溶液にカチオン性ペプチドを加え、ＤＮＡ－ペプチド凝縮体を形成した。次いで、それをエタノール溶解脂質溶液（（１４）ＦＦＴ１０／ＤＯＴＡＰ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝３７／２１／３０／２ｍｏｌ）に添加し、更に１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加した後、遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮して、ＤＮＡ内包キャリアを得た。
ＤＮＡとして、サイトメガロウイルスプロモーターの下流にＣＡＲ遺伝子（ＣＤ１９．ＣＡＲ遺伝子）を連結したプラスミドＤＮＡを使用した。このＤＮＡを含むＤＮＡ溶液にカチオン性ペプチドを加え、ＤＮＡ－ペプチド凝縮体を形成した。次いで、それをエタノール溶解脂質溶液（（１４）ＦＦＴ１０／ＤＯＴＡＰ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝３７／２１／３０／２ｍｏｌ）に添加し、更に１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加した後、遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮して、ＤＮＡ内包キャリアを得た。
【0165】
・ＲＮＡ内包キャリアの調製
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として、ＰｉｇｇｙＢａｃ遺伝子のｍＲＮＡを使用した。このｍＲＮＡを含むＲＮＡ溶液を、エタノール溶解脂質溶液（（１５）ＦＦＴ１０／ＤＯＰＥ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝３７／２１／３０／２ｍｏｌ）に加え、ピペッティングで懸濁した後、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加し、この溶液を遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮してＲＮＡ内包キャリアを得た。
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として、ＰｉｇｇｙＢａｃ遺伝子のｍＲＮＡを使用した。このｍＲＮＡを含むＲＮＡ溶液を、エタノール溶解脂質溶液（（１５）ＦＦＴ１０／ＤＯＰＥ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝３７／２１／３０／２ｍｏｌ）に加え、ピペッティングで懸濁した後、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加し、この溶液を遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮してＲＮＡ内包キャリアを得た。
【0166】
・ＰＢＭＣの調製
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＴｅｘＭＡＣＳ培地（ミルテニーバイオテク製）で培養し、遠心で細胞を回収した後、２．０×１０６細胞／ｍＬとなるように新鮮なＴｅｘＭＡＣＳに細胞を懸濁した。４８ウェル培養プレートに、１．０×１０６細胞／ウェルとなるように、細胞懸濁液を５００μＬ加えた。
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＴｅｘＭＡＣＳ培地（ミルテニーバイオテク製）で培養し、遠心で細胞を回収した後、２．０×１０６細胞／ｍＬとなるように新鮮なＴｅｘＭＡＣＳに細胞を懸濁した。４８ウェル培養プレートに、１．０×１０６細胞／ウェルとなるように、細胞懸濁液を５００μＬ加えた。
【0167】
・ＤＮＡ内包キャリア、ＲＮＡ脂質粒子による核酸の導入
その後、ＤＮＡ及びＲＮＡが４．０μｇずつの合計８．０μｇ／ウェルとなるように上記ウェルにＤＮＡ内包キャリアとＲＮＡ内包キャリアとを添加して、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養した。
その後、ＤＮＡ及びＲＮＡが４．０μｇずつの合計８．０μｇ／ウェルとなるように上記ウェルにＤＮＡ内包キャリアとＲＮＡ内包キャリアとを添加して、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養した。
【0168】
・ＣＡＲ発現量の測定
脂質粒子添加から１４日後、培養プレートをインキュベータから取り出し、遠心で細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した後、抗ヒトＩＧＧ抗体（Fluorescein (FITC) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG (H+L), Jackson ImmunoResearch inc）及び抗ＣＤ３抗体（CD3-APC human monoclonal, Miltenyi Biotec）を加えて細胞と反応させた。反応が終了した後、遠心で細胞を回収してＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳに再懸濁してＦＡＣＳの測定試料とした。ＦＡＣＳでは、抗ＩＧＧ抗体結合細胞（ＣＡＲ発現細胞）及び抗ＣＤ３抗体結合細胞（Ｔリンパ球細胞）を、ＦＩＴＣフィルターセット及びＡＰＣフィルターセットでそれぞれ検出した。
脂質粒子添加から１４日後、培養プレートをインキュベータから取り出し、遠心で細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した後、抗ヒトＩＧＧ抗体（Fluorescein (FITC) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG (H+L), Jackson ImmunoResearch inc）及び抗ＣＤ３抗体（CD3-APC human monoclonal, Miltenyi Biotec）を加えて細胞と反応させた。反応が終了した後、遠心で細胞を回収してＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳに再懸濁してＦＡＣＳの測定試料とした。ＦＡＣＳでは、抗ＩＧＧ抗体結合細胞（ＣＡＲ発現細胞）及び抗ＣＤ３抗体結合細胞（Ｔリンパ球細胞）を、ＦＩＴＣフィルターセット及びＡＰＣフィルターセットでそれぞれ検出した。
【0169】
・結果
ＣＡＲ発現量の結果を図１７に示す。この結果から、ＵＲ画分にＣＤ３陽性（Ｔリンパ球細胞）かつＩＧＧ陽性の細胞（ＣＡＲ発現細胞）、すなわちＣＡＲ－Ｔ細胞が２２．９％含まれることが明らかとなった。
ＣＡＲ発現量の結果を図１７に示す。この結果から、ＵＲ画分にＣＤ３陽性（Ｔリンパ球細胞）かつＩＧＧ陽性の細胞（ＣＡＲ発現細胞）、すなわちＣＡＲ－Ｔ細胞が２２．９％含まれることが明らかとなった。
【0170】
・ＳＵＳＲ細胞との共培養
ターゲット細胞として、ＣＤ１９陽性腫瘍細胞株であるＳＵ/ＳＲ細胞を使用した。エフェクター細胞として、１４日間培養したＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＤ１９.ＣＡＲ－Ｔ ｃｅｌｌ）、及びコントロールとして脂質粒子未添加Ｔ細胞を使用した。
ターゲット細胞として、ＣＤ１９陽性腫瘍細胞株であるＳＵ/ＳＲ細胞を使用した。エフェクター細胞として、１４日間培養したＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＤ１９.ＣＡＲ－Ｔ ｃｅｌｌ）、及びコントロールとして脂質粒子未添加Ｔ細胞を使用した。
【0171】
エフェクター細胞：ターゲット細胞は、１：１０で混合し、次のように共培養を行った。ターゲット細胞５．０×１０５個／ｗｅｌｌに対し、エフェクター細胞を５．０×１０４個／ｗｅｌｌとして、４８ウェル培養プレートで１０％ＦＢＳを加えたＲＰＭＩ－１６４０培地１ｍＬを用いて培養した。５日間共培養を行った後、培養プレートをインキュベータから取り出し、遠心で細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した後、抗ＣＤ１９抗体（CD19-PE human monoclonal, Miltenyi Biotec）及び抗ＣＤ３抗体（CD3-APC human monoclonal, Miltenyi Biotec）を加えて細胞と反応させた。反応が終了した後、遠心で細胞を回収してＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに再懸濁してＦＡＣＳの測定試料とした。ＦＡＣＳでは、抗ＣＤ１９抗体結合細胞（ＳＵＳＲ細胞、ターゲット細胞）及び抗ＣＤ３抗体結合細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞、エフェクター細胞）を、ＰＥフィルターセット及びＡＰＣフィルターセットでそれぞれ検出した。ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性は、ＦＡＣＳのデータから、ＳＵＳＲ細胞の生存率として算出した。
【0172】
・結果
結果を図１８に示す。ＳＵＳＲ細胞のみの場合（ａ）、９９．７％の割合で抗ＣＤ１９抗体結合細胞（ＳＵＳＲ細胞）が検出されたが、ＣＡＲ－Ｔ細胞と共培養した場合（ｃ）では、抗ＣＤ１９抗体結合細胞（ＳＵＳＲ細胞）は、１．４４％のみであった。このことは、ＣＡＲ－Ｔ細胞の存在により、ＳＵＳＲ細胞の生存率が９８．５％も低下したことを示している。したがって、実施形態に従うＣＡＲ－Ｔ細胞は、優れた抗腫瘍活性を有することが明らかとなった。
以下に、出願当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を製造する方法であって、
Ｔ細胞を含む細胞集団を、前記Ｔ細胞を活性化する抗体で刺激する刺激工程、
前記刺激工程の後、前記細胞集団に、中空体である脂質粒子と、前記脂質粒子の内腔に内包された、ＣＡＲ遺伝子を含む第１核酸及びトランスポゼース遺伝子を含む第２核酸とを含む核酸導入キャリアを接触させる遺伝子導入工程、及び
前記遺伝子導入工程の後、前記細胞集団を培養する培養工程
を含み、
前記第１核酸及び前記第２核酸は互いに核酸の種類が異なる、製造方法。
［２］
前記脂質粒子を構成する脂質化合物は第１の脂質化合物を含み、
前記第１の脂質化合物は、式Ｑ－ＣＨＲ ２
（式中、
Ｑは、３級窒素を２つ以上含み、酸素を含まない含窒素脂肪族基であり、
Ｒは、それぞれ独立に、Ｃ １２ ～Ｃ ２４ の脂肪族基であり、
少なくとも一つのＲは、その主鎖中または側鎖中に、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、および－ＮＨＣ（＝Ｏ）－からなる群から選択される連結基ＬＲを含む）で表される、［１］に記載の方法。
［３］
前記第１の脂質化合物は、下記式（１－０１）～（１－２１）
の群から選択される少なくとも１つで表される、［２］に記載の方法。
［４］
前記脂質粒子は、前記第１の脂質化合物として前記式１－０１及び／又は前記式１－０２の化合物を含む、［３］に記載の方法。
［５］
前記脂質粒子は、前記核酸導入キャリアの表面電荷を調整する脂質と、前記核酸導入キャリア同士の凝集を抑制する脂質との少なくとも１つを更に含む、［１］～［４］の何れか１つに記載の方法。
［６］
前記脂質粒子の酸解離定数が６．５～８．０である、［１］～［５］の何れか１つに記載の方法。
［７］
前記第１核酸及び前記第２核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ又はこれらの何れかの誘導体である、［１］～［６］の何れか１つに記載の方法。
［８］
前記第１核酸及び前記第２核酸は、一本鎖又は二本鎖の、環状、直鎖又は分岐鎖核酸である、［１］～［７］の何れか１つに記載の方法。
［９］
前記第１核酸及び前記第２核酸は、一緒に前記脂質粒子に内包されているか、或いは、別々の前記脂質粒子に内包されている、［１］～［８］の何れか１つに記載の方法。
［１０］
前記トランスポゼースは、ＰｉｇｇｙＢａｃである、［１］～［９］の何れか１つに記載の方法。
［１１］
前記核酸導入キャリアは、前記第１核酸が第１の脂質粒子に内包されている第１のサブ核酸導入キャリアと、前記第２核酸が第２の脂質粒子に内包されている第２のサブ核酸導入キャリアとを含み、
前記第１の脂質粒子と、前記第２の脂質粒子とが、互いに同じ又は異なる組成を有する、［１］～［１０］の何れか１つに記載の方法。
［１２］
前記遺伝子導入工程において、前記第１のサブ核酸導入キャリアと、前記第２のサブ核酸導入キャリアとを同時に接触させる、［１１］に記載の方法。
［１３］
前記遺伝子導入工程において、前記第２のサブ核酸導入キャリアを前記第１のサブ核酸導入キャリアよりも先に接触させる、［１１］に記載の方法。
［１４］
前記刺激工程における前記抗体が、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体の少なくともどちらか１つを含む、［１］～［１３］の何れか１つに記載の方法。
［１５］
Ｔ細胞にＣＡＲ遺伝子を導入するための核酸導入キャリアであって、
中空体である脂質粒子と、前記脂質粒子の内腔に内包されたＣＡＲ遺伝子を含む第１核酸及び／又はトランスポゼース遺伝子を含む第２核酸とを含み、
前記第１核酸及び前記第２核酸は互いに核酸の種類が異なる、核酸導入キャリア。
［１６］
前記脂質粒子を構成する脂質化合物は、第１の脂質化合物を含み、
前記第１の脂質化合物は、式Ｑ－ＣＨＲ ２
（式中、
Ｑは、３級窒素を２つ以上含み、酸素を含まない含窒素脂肪族基であり、
Ｒは、それぞれ独立に、Ｃ １２ ～Ｃ ２４ の脂肪族基であり、
少なくとも一つのＲは、その主鎖中または側鎖中に、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、および－ＮＨＣ（＝Ｏ）－からなる群から選択される連結基ＬＲを含む）で表される、［１５］に記載の核酸導入キャリア。
［１７］
前記第１の脂質化合物は、下記式（１－０１）～（１－２１）
の群から選択される１つで表される、［１６］に記載の核酸導入キャリア。
［１８］
前記第１の脂質化合物は、前記式（１－０１）又は（１－０２）で表される、［１７］に記載の核酸導入キャリア。
［１９］
前記脂質粒子は、前記核酸導入キャリアの酸解離定数を調整する脂質と、前記核酸導入キャリア同士の凝集を抑制する脂質との少なくとも１つを更に含む、［１４］～［１８］の何れか１つに記載の核酸導入キャリア。
［２０］
前記脂質粒子の酸解離定数が６．５～８．０である、［１４］～［１９］の何れか１つに記載の核酸導入キャリア。
［２１］
前記第１核酸及び前記第２核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ又はこれらの何れかの誘導体である、［１４］～［２０］の何れか１つに記載の核酸導入キャリア。
［２２］
前記第１核酸及び前記第２核酸は、一本鎖又は二本鎖の、環状、直鎖又は分岐鎖核酸である、［１４］～［２１］の何れか１つに記載の核酸導入キャリア。
［２３］
前記核酸導入キャリアが前記第１核酸及び前記第２核酸の両方を含む場合、
前記第１核酸及び前記第２核酸は、一緒に前記脂質粒子に内包されているか、或いは、別々の前記脂質粒子に内包されている、［１４］～［２２］の何れか１つに記載の核酸導入キャリア。
［２４］
前記トランスポゼースは、ＰｉｇｇｙＢａｃである、［１４］～［２３］の何れか１つに記載の核酸導入キャリア。
［２５］
前記核酸導入キャリアは、前記第１核酸が第１の脂質粒子に内包されている第１のサブ核酸導入キャリアと、前記第２核酸が第２の脂質粒子に内包されている第２のサブ核酸導入キャリアとを含み、
前記第１の脂質粒子と、前記第２の脂質粒子とが、互いに同じ又は異なる組成を有する、［１４］～［２４］の何れか１つに記載の核酸導入キャリア。
［２６］
中空体である脂質粒子と、前記脂質粒子の内腔に内包されている、ＣＡＲ遺伝子を含む第１核酸及び／又はトランスポゼース遺伝子を含む第２核酸とを備える核酸導入キャリア、及び
前記核酸導入キャリアの保管安定性を向上させる物質
を少なくとも含み、
前記第１核酸及び前記第２核酸は互いに核酸の種類が異なる、ＣＡＲ－Ｔ細胞を製造するためのキット。
［２７］
前記核酸導入キャリアが、固相に直接又は間接的に付着又は固定されている、［２６］に記載のキット。
［２８］
前記固相が、金属、樹脂、ゲル又は繊維を材料とする容器、プレート又はシートである、［２７］に記載のキット。
結果を図１８に示す。ＳＵＳＲ細胞のみの場合（ａ）、９９．７％の割合で抗ＣＤ１９抗体結合細胞（ＳＵＳＲ細胞）が検出されたが、ＣＡＲ－Ｔ細胞と共培養した場合（ｃ）では、抗ＣＤ１９抗体結合細胞（ＳＵＳＲ細胞）は、１．４４％のみであった。このことは、ＣＡＲ－Ｔ細胞の存在により、ＳＵＳＲ細胞の生存率が９８．５％も低下したことを示している。したがって、実施形態に従うＣＡＲ－Ｔ細胞は、優れた抗腫瘍活性を有することが明らかとなった。
以下に、出願当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を製造する方法であって、
Ｔ細胞を含む細胞集団を、前記Ｔ細胞を活性化する抗体で刺激する刺激工程、
前記刺激工程の後、前記細胞集団に、中空体である脂質粒子と、前記脂質粒子の内腔に内包された、ＣＡＲ遺伝子を含む第１核酸及びトランスポゼース遺伝子を含む第２核酸とを含む核酸導入キャリアを接触させる遺伝子導入工程、及び
前記遺伝子導入工程の後、前記細胞集団を培養する培養工程
を含み、
前記第１核酸及び前記第２核酸は互いに核酸の種類が異なる、製造方法。
［２］
前記脂質粒子を構成する脂質化合物は第１の脂質化合物を含み、
前記第１の脂質化合物は、式Ｑ－ＣＨＲ ２
（式中、
Ｑは、３級窒素を２つ以上含み、酸素を含まない含窒素脂肪族基であり、
Ｒは、それぞれ独立に、Ｃ １２ ～Ｃ ２４ の脂肪族基であり、
少なくとも一つのＲは、その主鎖中または側鎖中に、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、および－ＮＨＣ（＝Ｏ）－からなる群から選択される連結基ＬＲを含む）で表される、［１］に記載の方法。
［３］
前記第１の脂質化合物は、下記式（１－０１）～（１－２１）
【化3-1】
【化3-2】
【化3-3】
［４］
前記脂質粒子は、前記第１の脂質化合物として前記式１－０１及び／又は前記式１－０２の化合物を含む、［３］に記載の方法。
［５］
前記脂質粒子は、前記核酸導入キャリアの表面電荷を調整する脂質と、前記核酸導入キャリア同士の凝集を抑制する脂質との少なくとも１つを更に含む、［１］～［４］の何れか１つに記載の方法。
［６］
前記脂質粒子の酸解離定数が６．５～８．０である、［１］～［５］の何れか１つに記載の方法。
［７］
前記第１核酸及び前記第２核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ又はこれらの何れかの誘導体である、［１］～［６］の何れか１つに記載の方法。
［８］
前記第１核酸及び前記第２核酸は、一本鎖又は二本鎖の、環状、直鎖又は分岐鎖核酸である、［１］～［７］の何れか１つに記載の方法。
［９］
前記第１核酸及び前記第２核酸は、一緒に前記脂質粒子に内包されているか、或いは、別々の前記脂質粒子に内包されている、［１］～［８］の何れか１つに記載の方法。
［１０］
前記トランスポゼースは、ＰｉｇｇｙＢａｃである、［１］～［９］の何れか１つに記載の方法。
［１１］
前記核酸導入キャリアは、前記第１核酸が第１の脂質粒子に内包されている第１のサブ核酸導入キャリアと、前記第２核酸が第２の脂質粒子に内包されている第２のサブ核酸導入キャリアとを含み、
前記第１の脂質粒子と、前記第２の脂質粒子とが、互いに同じ又は異なる組成を有する、［１］～［１０］の何れか１つに記載の方法。
［１２］
前記遺伝子導入工程において、前記第１のサブ核酸導入キャリアと、前記第２のサブ核酸導入キャリアとを同時に接触させる、［１１］に記載の方法。
［１３］
前記遺伝子導入工程において、前記第２のサブ核酸導入キャリアを前記第１のサブ核酸導入キャリアよりも先に接触させる、［１１］に記載の方法。
［１４］
前記刺激工程における前記抗体が、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体の少なくともどちらか１つを含む、［１］～［１３］の何れか１つに記載の方法。
［１５］
Ｔ細胞にＣＡＲ遺伝子を導入するための核酸導入キャリアであって、
中空体である脂質粒子と、前記脂質粒子の内腔に内包されたＣＡＲ遺伝子を含む第１核酸及び／又はトランスポゼース遺伝子を含む第２核酸とを含み、
前記第１核酸及び前記第２核酸は互いに核酸の種類が異なる、核酸導入キャリア。
［１６］
前記脂質粒子を構成する脂質化合物は、第１の脂質化合物を含み、
前記第１の脂質化合物は、式Ｑ－ＣＨＲ ２
（式中、
Ｑは、３級窒素を２つ以上含み、酸素を含まない含窒素脂肪族基であり、
Ｒは、それぞれ独立に、Ｃ １２ ～Ｃ ２４ の脂肪族基であり、
少なくとも一つのＲは、その主鎖中または側鎖中に、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、および－ＮＨＣ（＝Ｏ）－からなる群から選択される連結基ＬＲを含む）で表される、［１５］に記載の核酸導入キャリア。
［１７］
前記第１の脂質化合物は、下記式（１－０１）～（１－２１）
【化4-1】
【化4-2】
【化4-3】
［１８］
前記第１の脂質化合物は、前記式（１－０１）又は（１－０２）で表される、［１７］に記載の核酸導入キャリア。
［１９］
前記脂質粒子は、前記核酸導入キャリアの酸解離定数を調整する脂質と、前記核酸導入キャリア同士の凝集を抑制する脂質との少なくとも１つを更に含む、［１４］～［１８］の何れか１つに記載の核酸導入キャリア。
［２０］
前記脂質粒子の酸解離定数が６．５～８．０である、［１４］～［１９］の何れか１つに記載の核酸導入キャリア。
［２１］
前記第１核酸及び前記第２核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ又はこれらの何れかの誘導体である、［１４］～［２０］の何れか１つに記載の核酸導入キャリア。
［２２］
前記第１核酸及び前記第２核酸は、一本鎖又は二本鎖の、環状、直鎖又は分岐鎖核酸である、［１４］～［２１］の何れか１つに記載の核酸導入キャリア。
［２３］
前記核酸導入キャリアが前記第１核酸及び前記第２核酸の両方を含む場合、
前記第１核酸及び前記第２核酸は、一緒に前記脂質粒子に内包されているか、或いは、別々の前記脂質粒子に内包されている、［１４］～［２２］の何れか１つに記載の核酸導入キャリア。
［２４］
前記トランスポゼースは、ＰｉｇｇｙＢａｃである、［１４］～［２３］の何れか１つに記載の核酸導入キャリア。
［２５］
前記核酸導入キャリアは、前記第１核酸が第１の脂質粒子に内包されている第１のサブ核酸導入キャリアと、前記第２核酸が第２の脂質粒子に内包されている第２のサブ核酸導入キャリアとを含み、
前記第１の脂質粒子と、前記第２の脂質粒子とが、互いに同じ又は異なる組成を有する、［１４］～［２４］の何れか１つに記載の核酸導入キャリア。
［２６］
中空体である脂質粒子と、前記脂質粒子の内腔に内包されている、ＣＡＲ遺伝子を含む第１核酸及び／又はトランスポゼース遺伝子を含む第２核酸とを備える核酸導入キャリア、及び
前記核酸導入キャリアの保管安定性を向上させる物質
を少なくとも含み、
前記第１核酸及び前記第２核酸は互いに核酸の種類が異なる、ＣＡＲ－Ｔ細胞を製造するためのキット。
［２７］
前記核酸導入キャリアが、固相に直接又は間接的に付着又は固定されている、［２６］に記載のキット。
［２８］
前記固相が、金属、樹脂、ゲル又は繊維を材料とする容器、プレート又はシートである、［２７］に記載のキット。
【符号の説明】
【0173】
１…脂質粒子、１ｂ…内腔、１ｃ…第１の脂質粒子、１ｄ…第２の脂質粒子、２…第１核酸、２ａ…ＣＡＲ遺伝子配列、２ｂ…第１のトランスポゼース認識配列、２ｃ…第２のトランスポゼース認識配列、３…第２核酸、３ａ…トランスポゼース遺伝子配列、５…核酸凝縮ペプチド、１０…核酸導入キャリア、２０…核酸導入キャリア、２１…核酸導入キャリア、２２…第１のサブ核酸導入キャリア、２３…第２のサブ核酸導入キャリア、２５…細胞集団、２６…抗体
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】