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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-03-21
(45)【発行日】2025-03-31
(54)【発明の名称】骨形成促進温度応答性巨大分子
(51)【国際特許分類】
A61L 27/18 20060101AFI20250324BHJP
A61K 9/06 20060101ALI20250324BHJP
A61K 31/661 20060101ALI20250324BHJP
A61K 33/14 20060101ALI20250324BHJP
A61K 38/06 20060101ALI20250324BHJP
A61K 47/59 20170101ALI20250324BHJP
A61L 24/00 20060101ALI20250324BHJP
A61L 24/04 20060101ALI20250324BHJP
A61L 27/52 20060101ALI20250324BHJP
A61L 27/54 20060101ALI20250324BHJP
A61P 19/08 20060101ALI20250324BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20250324BHJP
【ＦＩ】
A61L27/18 ZNA
A61K9/06
A61K31/661
A61K33/14
A61K38/06
A61K47/59
A61L24/00 210
A61L24/00 240
A61L24/04 200
A61L27/52
A61L27/54
A61P19/08
A61P43/00 111
【請求項の数】
2
(21)【出願番号】P 2019531139
(86)(22)【出願日】2017-12-08
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-01-23
(86)【国際出願番号】 US2017065352
(87)【国際公開番号】W WO2018107049
(87)【国際公開日】2018-06-14
【審査請求日】2020-12-03
【審判番号】
【審判請求日】2023-02-06
(31)【優先権主張番号】62/432,266
(32)【優先日】2016-12-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/571,495
(32)【優先日】2017-10-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】513208191
【氏名又は名称】ノースウエスタン ユニバーシティ
【氏名又は名称原語表記】ＮＯＲＴＨＷＥＳＴＥＲＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【住所又は居所原語表記】６３３ Ｃｌａｒｋ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｅｖａｎｓｔｏｎ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ ６０２０８，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】アミール，ギジェルモ エー．
(72)【発明者】
【氏名】モロチュニク，シモーナ
【合議体】
【審判長】原田 隆興
【審判官】渕野 留香
【審判官】田中 耕一郎
(56)【参考文献】
【文献】特表２００２－５２７２０８号公報（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１０－５２５０７０号公報（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１０－５３７７６３号公報（ＪＰ，Ａ）
【文献】Frontiers Bioengineering Biotechnology Conference Abstract: 10th World Biomaterials Congress，2016.03.30，<URL:https://www.frontiersin.org/10.3389/conf.FBIOE.2016.01.02759/event_abstract>
【文献】Biomedical Materials，2016, Vol.11, No.2, 025021，pp.1-13
【文献】Calcif. Tissue Int., 1992,Vol.51, pp.305-311
【文献】Biomaterials, 2011, Vol.31 No.14, pp.3976-3985
【文献】Biomacromolecules, 2014, Vol.15, pp.3942-3952
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
A61K、A61L
REGISTRY/CAPLUS/MEDLINE/BIOSIS/EMBASE(STN)
JSTPlus/JMedPlus/JST7580(JDreamIII)
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
クエン酸、ポリ（エチレングリコール）、グリセロール１，３－ジグリセロラートジアクリラート、及びβ－グリセロリン酸の各モノマーからなる重縮合物と、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドモノマーとのフリーラジカル重合物であるＰＰＣＮ系リン酸塩表出ハイドロゲルを含む、骨修復を促進する用途に使用するための組成物であって、前記ＰＰＣＮ系リン酸塩表出ハイドロゲルは、クエン酸、ポリ（エチレングリコール）、グリセロール１，３－ジグリセロラートジアクリラート、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、及びβ－グリセロリン酸が共有結合にて連結されたポリマーである、組成物。
【請求項2】
（ａ）クエン酸、ポリ（エチレングリコール）、グリセロール１，３－ジグリセロラートジアクリラート、及びβ－グリセロリン酸の各モノマーの重縮合を行う工程、並びに、それに続く（ｂ）（ａ）工程で得られた重縮合物とＮ－イソプロピルアクリルアミドモノマーとのフリーラジカル重合を行う工程を含む、クエン酸、ポリ（エチレングリコール）、グリセロール１，３－ジグリセロラートジアクリラート、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、及びβ－グリセロリン酸が共有結合にて連結されたポリマーを製造する工程を含む、
請求項１に記載の組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本発明は、２０１６年１２月９日に出願された米国仮特許出願第６２／４３２，２６６号、及び２０１７年１０月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／５７１，４９５号に対する優先権を主張するものであり、そのいずれも参照によりその全体が組み込まれる。
本発明は、２０１６年１２月９日に出願された米国仮特許出願第６２／４３２，２６６号、及び２０１７年１０月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／５７１，４９５号に対する優先権を主張するものであり、そのいずれも参照によりその全体が組み込まれる。
【0002】
本明細書は、室温で液体であり、担体材料として使用でき、体温でゲルとなって放出制御を可能にする、注入可能な温度応答性ハイドロゲルを提供する。特に、治療剤（例えば、薬物、イオン等）が内部に組み込まれている、または付加されているＰＰＣＮ系ハイドロゲルを提供し、併せて、それを調製する方法、ならびにそれを、例えば、骨の形成／修復の促進及び／または骨疾患の治療のために使用する方法を提供する。
【背景技術】
【0003】
骨組織再生分野において骨欠損修復用材料の開発が重要視されてきている。骨疾患を対象とする研究は非常に少ない。したがって、材料の骨形成誘導能というよりむしろ材料の強度が主な焦点とされてきた。これらの材料は、生物学的に不活性（例えば、メタクリル酸メチル）または脆弱（例えば、リン酸カルシウム）な充填用硬ペースト剤であることが多い。その上、炎症及び骨粗鬆症性骨という課題はほとんど研究されていない。侵襲性が最小限の手技で使用して特有の骨折部位に適合させることができる材料、複雑な細胞環境と相互作用して、すべての骨種で治癒を加速させ、幹細胞が骨細胞になるよう誘導し、かつ必要に応じ、局所的薬物送達を可能にする材料の開発は未だそのニーズが満たされていない。
【発明の概要】
【0004】
本明細書は、室温で液体であり、担体材料として使用でき、体温でゲルとなって放出制御を可能にする、注入可能な温度応答性ハイドロゲルを提供する。特に、治療剤（例えば、薬物、イオン等）が内部に組み込まれている、または付加されているＰＰＣＮ系ハイドロゲルを提供し、併せて、それを調製する方法、ならびにそれを、例えば、骨の形成／修復の促進及び／または骨疾患の治療のために使用する方法を提供する。
【0005】
いくつかの実施形態では、本明細書は、クエン酸、ポリ（エチレングリコール）、グリセロール１，３－ジグリセロラートジアクリラート、及びポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）の各モノマー、ならびにその中に組み込まれている少なくとも１つの生理活性物質及び／またはそれに付加されている少なくとも１つの生理活性物質を含むＰＰＣＮ系ハイドロゲルを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、生理活性物質は、ＰＰＣＮ系ハイドロゲル骨格内に組み込まれているさらなるモノマーである。いくつかの実施形態では、生理活性物質はβ－グリセロリン酸である。いくつかの実施形態では、生理活性物質は、ＰＰＣＮハイドロゲルに付加されているペンダント基である。いくつかの実施形態では、ペンダント基は低分子である。いくつかの実施形態では、ペンダント基はペプチドである。いくつかの実施形態では、生理活性物質は環状Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ｃＲＧＤ）ペプチドである。いくつかの実施形態では、生理活性物質はイオン性架橋剤である。いくつかの実施形態では、生理活性物質は、Ｃａ２＋、Ｂａ２＋、またはＳｒ２＋である。
【0006】
いくつかの実施形態では、本明細書は、クエン酸、ポリ（エチレングリコール）、グリセロール１，３－ジグリセロラートジアクリラート、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、及びβ－グリセロリン酸の各モノマーを含むＰＰＣＮ系リン酸塩表出ハイドロゲルを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ＰＰＣＮ系リン酸塩表出ハイドロゲルは、構造
【0007】
【化1】
【0008】
を含み、ここで、ｘ及びｙは互いに独立して２～２０である。いくつかの実施形態では、組成物は、（ａ）クエン酸、ポリ（エチレングリコール）、グリセロール１，３－ジグリセロラートジアクリラート、及びβ－グリセロリン酸の各モノマーの重縮合、それに続く（ｂ）ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）とのフリーラジカル重合によって調製する。いくつかの実施形態では、スキーム１に示す反応によって組成物を調製する。
【0009】
いくつかの実施形態では、本明細書は、クエン酸、ポリ（エチレングリコール）、グリセロール１，３－ジグリセロラートジアクリラート、及びポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）の各モノマー、ならびにクエン酸モノマーのカルボキシ基と共有結合で複合体化しているペプチドを含むＰＰＣＮ系ペプチド表出ハイドロゲルを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ペプチドを、クエン酸モノマーのカルボキシ基とカルボジイミド化学による共有結合で複合体化させる。いくつかの実施形態では、ペプチドは環状Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ｃＲＧＤ）である。いくつかの実施形態では、ｃＲＧＤを、ＰＰＣＮのカルボキシ基と共有結合で複合体化させる。いくつかの実施形態では、スキーム２に示す反応によって組成物を調製する。
【0010】
いくつかの実施形態では、本明細書は、クエン酸、ポリ（エチレングリコール）、グリセロール１，３－ジグリセロラートジアクリラート、及びポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）の各モノマーと金属イオン架橋とを含むＰＰＣＮ系ハイドロゲルを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は金属イオン架橋ＰＰＣＮを含む。いくつかの実施形態では、金属イオンの塩の存在下でＰＰＣＮをインキュベートすることによって組成物を調製する。いくつかの実施形態では、金属イオンは、Ｃａ２＋、Ｂａ２＋、またはＳｒ２＋である。
【0011】
いくつかの実施形態では、本明細書は、本明細書に記載する組成物（例えば、ＰＰＣＮ系ハイドロゲル）を、骨折部位または骨の罹患部位に投与し、組成物をゲル化させることを含む、骨修復を促進させる方法を提供する。
【0012】
いくつかの実施形態では、本明細書は、骨修復を促進させる、本明細書に記載する組成物（例えば、ＰＰＣＮ系ハイドロゲル）の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】（ａ）ＰＰＣＮ－ｃＲＧＤのＭＡＬＤＩスペクトルの主要ピークは、予測イオン化環状－ＲＧＤｆＣを５８１．７ｍ／ｚで、また完全モノマーを１１５６ｍ／ｚで含む。（ｂ）ＰＰＣＮ－Ｓｒゲルからの５０ｍＭ及び１００ｍＭのＳｒ２＋放出をＩＣＰ－ＯＥＳで調べると、大部分のストロンチウムが１週間で放出されることが分かる。ＰＰＣＮ－ｐｈｏｓのＦＴ－ＩＲでは、試薬β－グリセロリン酸に関連するピークの成長、すなわち、ＯＨ伸縮の広幅化を３４００ｎｍ－１にて、またホスホン酸塩に起因する新たなピークを１２３８ｎｍ－１付近で示す。元素分析でこのデータは実証され、炭素豊富なＰＥＧ鎖がβ－グリセロリン酸により置換されているため、炭素が少し減少している。
【図2】ＰＰＣＮ（ａ）のレオロジー特性解析では、ＰＰＣＮ－ｃＲＧＤ（ｂ）、ＰＰＣＮ－Ｓｒ（ｃ）及びＰＰＣＮ－ｐｈｏｓ（ｄ）と比較すると、３つの骨誘導性変異型はいずれも温度応答性挙動を維持し、ＰＰＣＮよりも低いＬＣＳＴ遷移を示すことが確認される。
【図3】３Ｄゲルに播種し、通常のＤＭＥＭで培養したｈＭＳＣ及びＭＣ３Ｔ３のＬＩＶＥ／ＤＥＡＤイメージングである。細胞を、アルギン酸ゲル、ＰＰＣＮゲル、ＰＰＣＮ－ｃＲＧＤゲル、ＰＰＣＮ－Ｓｒゲル、またはＰＰＣＮ－ｐｈｏｓゲルのいずれかに播種した。ＰＰＣＮ－ｃＲＧＤゲルで増殖させた細胞は形態の広がりを示し、ＰＰＣＮとの複合体化後にもＲＧＤの機能性が保存されていることが確認される。どのゲルでも生存率は７５％を上回っている。１０日目に撮像し、３ウェルずつの中からの各代表画像を示す。
【図4】（ａ）ｈＭＳＣ及び（ｂ）ＭＣ３Ｔ３の３日目及び１０日目のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を示す。ｈＭＳＣの１０日目ではＡＬＰの有意な上昇は検出されない。しかしながら、ＰＰＣＮ－Ｓｒゲル及びＰＰＣＮ－ｐｈｏｓゲルで増殖させたＭＣ３Ｔ３ではいずれもＡＬＰの有意な上昇が検出される。＊Ｐ値＜０．０５及び＊＊Ｐ値＜０．０１。
【図5】カルシウム沈着のアリザリンレッドＳによる染色、オステオポンチン（ＯＰＮ）及びオステオカルシン（ＯＣＮ）両方の免疫組織染色による、ｈＭＳＣの２１日目の特性解析である。その右に、対応する定量化を示す。３つの機能付与すべてにおいて石灰化が見られる。データによると、オステオポンチンの発現はＰＰＣＮ－Ｓｒで最も高く、オステオカルシンの発現はＰＰＣＮ－ｐｈｏｓで最も高い。
【図6】大腿筋肉注射によるＰＰＣＮ及びＰＰＣＮ－Ｓｒの０日目から４２日目までのマイクロＣＴ分析を示す。右上パネルは、マイクロＣＴ画像の位置を合せたマウスの大腿部である。右下パネルは、マイクロＣＴ画像（ｎ＝３）の定量化を示す。ＰＰＣＮ－Ｓｒ群で石灰化が認められ、１０日目から始まり、６週間を通して一貫して増加している。機能付与していないＰＰＣＮ対照では石灰化は認められない。Ｏｓｉｒｉｘで閾値強度を用いて石灰化領域を定量化し、３Ｄはめ込み画像を示すよう再構成した。
【図7】ＰＰＣＮ対照（ａ）と比較すると、ＰＰＣＮ－Ｓｒは有意なオステオカルシン発現及び細胞浸潤（ｂ）を示す。石灰化を調べるアリザリンレッドＳ染色においても、ＰＰＣＮ－Ｓｒ（ｄ）は、機能付与していないＰＰＣＮ（ｃ）と比べると、赤色のカルシウム沈着で検出されるように強い石灰化を示す。ＰＰＣＮ及びＰＰＣＮ－Ｓｒそれぞれの組織切片全体を（ｅ）及び（ｆ）に示す。
【図8】４２日目におけるマウス８匹の臓器のＩＣＰ分析では、消化時、どの主要臓器にもストロンチウムが存在しないことを示している（ａ）。さらに、薄片にした筋組織のＸＰＳ分析では、ストロンチウムが除去されており、注射部位にはすでに存在していないことを示している（ｂ）。ＸＰＳ分析から、カルシウム、リン酸塩及び酸素の含有量はＰＰＣＮ－Ｓｒ群における石灰化と一致しているが、６週目においてストロンチウムの局所的残存は見られないことが分かる。
【0014】
定義
本明細書に記載の実施形態の実施または試験に際し、本明細書に記載される方法及び材料と類似または同等の任意のものを使用することができるが、いくつかの好ましい方法、組成物、デバイス、及び材料を本明細書に記載する。ただし、本願の材料及び方法を記載する前に、本明細書に記載される特定の分子、組成物、方法論、またはプロトコルは慣例となっている実験及び最適化に従って異なってよいことから、本発明は、それらに限定されるわけではないことを理解されるべきである。記載において使用される用語は、あくまでも個別の改変例または個別の実施形態を説明するためのものであり、本明細書に記載する実施形態の範囲を限定することを意図しないということも理解されるべきである。
本明細書に記載の実施形態の実施または試験に際し、本明細書に記載される方法及び材料と類似または同等の任意のものを使用することができるが、いくつかの好ましい方法、組成物、デバイス、及び材料を本明細書に記載する。ただし、本願の材料及び方法を記載する前に、本明細書に記載される特定の分子、組成物、方法論、またはプロトコルは慣例となっている実験及び最適化に従って異なってよいことから、本発明は、それらに限定されるわけではないことを理解されるべきである。記載において使用される用語は、あくまでも個別の改変例または個別の実施形態を説明するためのものであり、本明細書に記載する実施形態の範囲を限定することを意図しないということも理解されるべきである。
【0015】
特別に定義しない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語はいずれも、本発明の属する分野の当業者に共通して理解される意味と同一の意味を持つ。ただし、矛盾がある場合は、定義も含め、本明細書が優先する。したがって、本明細書に記載する実施形態においては以下の定義が適用される。
【0016】
本明細書添付の請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、文脈で特に明確に指示されない限り複数の指示対象が含まれる。したがって、例えば、「ポリマー（ａ ｐｏｌｙｍｅｒ）」への言及は、当業者に公知の１つ以上のポリマー（ｐｏｌｙｍｅｒｓ）及びその同等物等への言及である。
【0017】
本明細書で使用する場合、用語「及び／または」には、掲載物品の任意の物品一つ一つを含め、掲載物品のあらゆる組み合わせが含まれる。例えば、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、及びＡＢＣを包含し、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」という記述によって、その各々が別々に記載されているものとみなされる。本明細書で使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びその言語的変形は、記述されている特徴（複数可）、要素（複数可）、方法のステップ（複数可）等の存在を表し、さらなる特徴（複数可）、要素（複数可）、方法のステップ（複数可）等の存在を排除するものではない。逆に、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及びその言語的変形は、記述されている特徴（複数可）、要素（複数可）、方法のステップ（複数可）等の存在を表し、普通に伴う不純物を除いては、記述されていないいかなる特徴（複数可）、要素（複数可）、方法のステップ（複数可）等も排除される。語句「本質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、記述されている特徴（複数可）、要素（複数可）、方法のステップ（複数可）等の他、組成物、システム、または方法の基本的性質に物質的に影響を与えない任意のさらなる特徴（複数可）、要素（複数可）、方法のステップ（複数可）等を表す。本明細書の多くの実施形態は，オープンランゲージ「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を使用して記載されている。そのような実施形態は、複数のクローズドランゲージ「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び／または「本質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」を使用した実施形態を包含し、それらは、そのような言語を使用して別の方法で主張または記載される場合がある。
【0018】
本明細書で使用する場合、用語「実質的にすべて」、「実質的に完全な」及び同様の用語は、９９％より大きいことを指し、用語「実質的にない」、「実質的に含まない」、及び同様の用語は、１％未満であることを指す。
【0019】
用語「約」により、値または範囲におけるある程度の変動性が認められる。本明細書で使用する場合、用語「約」とは、記述されている値または範囲の１０％以内の値を指す（例えば、約５０は４５～５５と同等である）。
【0020】
本明細書で使用する場合、用語「ポリマー」とは、構造単位、すなわち「モノマー」が繰り返されている鎖で、典型的には分子量の大きいものを指す。ポリマーの例には、ホモポリマー（１種類のモノマーサブユニット）、コポリマー（２種類のモノマーサブユニット）、及びヘテロポリマー（例えば、３種類以上のモノマーサブユニット）が含まれる。本明細書で使用する場合、用語「オリゴマー」とは、わずか少数のモノマー単位（例えば、２、３、４、５、またはそれ以上）から最高約５０のモノマー単位までのポリマー、例えば、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体・・・十量体等を指す。
【0021】
本明細書で使用する場合、用語「直鎖ポリマー」とは、分子が、分岐または架橋構造のない長鎖を形成しているポリマーを指す。
【0022】
本明細書で使用する場合、用語「分岐ポリマー」とは、１つ以上のさらなるモノマーを有するポリマー骨格を含む、またはポリマー骨格から伸びる鎖もしくはモノマーを含むポリマーを指す。「分岐」の相互接続の程度は、ポリマーを不溶性にするには不十分な程度である。
【0023】
本明細書で使用する場合、用語「プレポリマー」とは、適切な条件下（例えば、「硬化する」及び／または熱硬化性樹脂またはハイドロゲルを形成する条件下）で架橋対象になることができ、それまでまだ適切な条件下に供されていない直鎖または分岐のポリマー（例えば、有意には架橋していない）を指す。
【0024】
本明細書で使用する場合、用語「架橋ポリマー」とは、複数のポリマー鎖間の相互接続の程度が有意であり、その結果が不溶性ポリマーネットワークであるポリマーを指す。例えば、複数のポリマー鎖は、ポリマー鎖の末端に限らず、それらの構造内部のポイントで互いに架橋していてよい。
【0025】
本明細書で使用する場合、用語「生体適合性」とは、材料、化合物、または組成物を指し、対象に投与した場合に有意な有害作用を生じさせない、または誘発しないことを意味する。生体適合性を制限する、考えられる有害作用の例には、過渡炎症、過渡または有害な免疫応答、及び毒性が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【0026】
本明細書で使用する場合、用語「ハイドロゲル」とは、水中で溶解するのではなくむしろ膨張する親水性ポリマーの３次元（３Ｄ）架橋ネットワークを指す。
【0027】
本明細書で使用する場合、用語「温度応答性」とは、異なる温度域において物理的特性の変化を示す材料を指す。特に本明細書で関連するのは、「相転移する温度応答性」材料である。「相転移する温度応答性」材料は、第１の温度域（例えば、２６℃）では可溶性または液体状態であり、第２の温度域（例えば、３０～４５℃）では不溶性または固体状態である。
【発明を実施するための形態】
【0028】
本明細書は、室温で液体であり、イオンまたは治療薬の担体材料として使用でき、体温でゲルとなって放出制御を可能にする、注入可能な温度応答性ハイドロゲルを提供する。いくつかの実施形態では、材料は抗酸化物質であり、骨形成因子を添加しなくても材料の特性に基づいて骨形成を促進することができる。いくつかの実施形態では、材料は、例えば、リン酸塩、ｃＲＧＤ、及び／またはストロンチウムなどの骨促進剤を含む。
【0029】
いくつかの実施形態では、本明細書は、クエン酸、ポリ（エチレングリコール）、グリセロール１，３－ジグリセロラートジアクリラート、及びポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）の各モノマーを含む温度応答性ハイドロゲルを提供する。いくつかの実施形態では、温度応答性ハイドロゲルはＰＰＣＮ系ハイドロゲルである。いくつかの実施形態では、ＰＰＣＮ系ハイドロゲルは、クエン酸、ポリ（エチレングリコール）、グリセロール１，３－ジグリセロラートジアクリラート、及びポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）の各モノマーならびに１つ以上のさらなるモノマー群（例えば、β－グリセロリン酸）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＰＣＮ系ハイドロゲルは、クエン酸、ポリ（エチレングリコール）、グリセロール１，３－ジグリセロラートジアクリラート、及びポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）の各モノマーを含み、１つ以上の生理活性物質（例えば、金属イオン（例えば、Ｓｒ２＋）、ペプチド（例えば、ｃＲＧＤ）等）と複合体化している。
【0030】
いくつかの実施形態では、ＰＰＣＮ系ハイドロゲルの負電荷を持つカルボキシル基（例えば、クエン酸モノマー上に表出）は、正電荷を持つ金属イオン（例えば、Ｓｒ２＋、Ｃａ２＋、Ｂａ２＋等）と複合体化する。いくつかの実施形態では、別々のカルボキシル基が金属イオンに配位することによりＰＰＣＮ系ポリマーに架橋がもたらされる。いくつかの実施形態では、本明細書の材料は、金属イオンの同一性による限定を受けない。いくつかの実施形態では、金属イオンは、塩としてＰＰＣＮ系材料に導入される。
【0031】
いくつかの実施形態では、ＰＰＣＮ系ハイドロゲルのカルボキシル基（例えば、クエン酸モノマー上に表出）は、ペプチドまたは生理活性低分子に適切なリンカー化学を介して複合体化される。いくつかの実施形態では、生理活性であるペプチド及び／または低分子をＰＰＣＮ系ハイドロゲルに連結させるための適切な化学には、アルキン／アジド、チオール／マレイミド、チオール／ハロアセチル（例えば、ヨードアセチル等）、チオール／ピリジルのジスルフィド（例えば、ピリジルジチオール等）、スルホニルアジド／チオ酸等が含まれる。
【0032】
いくつかの実施形態では、骨の治癒及び／または修復を促進する生理活性ペプチドをＰＰＣＮ系ハイドロゲルと複合体化させる。適切なペプチドには、Ｐ－１５ペプチド（Ｂｈａｔｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．１９９９；５（１）：５３－６５．；参照によりその全体が組み込まれる）、ＲＧＤ含有ペプチド（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ＆Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ．Ｃｅｌｌ．１９８６；４４（４）：５１７－８．；参照によりその全体が組み込まれる）、ＧＦＯＧＥＲ（グリシン－フェニルアラニン－ヒドロキシプロリン－グリシン－グルタマート－アルギニン）（配列番号１）、コラーゲン結合モチーフ（ＣＢＭ）、ＤＧＥＡ（Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｌａ）（配列番号２）、ＳＶＶＹＧＬＲ（Ｓｅｒ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ）（配列番号３）、ＫＲＳＲ（リシン－アルギニン－セリン－アルギニン）（配列番号４）、ＦＨＲＲＩＫＡ（Ｐｈｅ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｉｌｅ－Ｌｙｓ－Ａｌａ）（配列番号５）、フィブロネクチン（ＦＮ）由来ペプチド、及び他のＥＣＭ由来ペプチド（Ｐｏｕｎｔｏｓ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｍｅｄ．２０１６；１４：１０３．；参照によりその全体が組み込まれる）が含まれる。
【0033】
いくつかの実施形態では、ＰＰＣＮまたはＰＰＣＮ系ポリマーもしくはハイドロゲルは、クエン酸モノマーを少なくとも０．１％（例えば、＞０．１％、＞０．２％、＞０．５％、＞１％、＞２％、＞３％、＞４％、＞５％、＞１０％、＞２０％、＞３０％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）含む。いくつかの実施形態では、本明細書のポリマーは、クエン酸モノマーを９９％未満（例えば、＜９９％、＜９８％、＜９５％、＜９０％、＜８０％、＜７０％、＜６０％、＜５０％、＜４０％、＜３０％、＜２０％、＜１０％、＜５％、＜４％、＜３％、＜２％、＜１％、＜０．５％）含む。いくつかの実施形態では、ポリマーは、クエン酸モノマーを約９９％、約９８％、約９５％、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、または約０．５％含む。
【0034】
いくつかの実施形態では、ＰＰＣＮまたはＰＰＣＮ系ポリマーもしくはハイドロゲルは、ポリエチレングリコールモノマーを少なくとも０．１％（例えば、＞０．１％、＞０．２％、＞０．５％、＞１％、＞２％、＞３％、＞４％、＞５％、＞１０％、＞２０％、＞３０％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）含む。いくつかの実施形態では、本明細書のポリマーは、ポリエチレングリコールモノマーを９９％未満（例えば、＜９９％、＜９８％、＜９５％、＜９０％、＜８０％、＜７０％、＜６０％、＜５０％、＜４０％、＜３０％、＜２０％、＜１０％、＜５％、＜４％、＜３％、＜２％、＜１％、＜０．５％）含む。いくつかの実施形態では、ポリマーは、ポリエチレングリコールモノマーを約９９％、約９８％、約９５％、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、または約０．５％を含む。
【0035】
いくつかの実施形態では、ＰＰＣＮまたはＰＰＣＮ系ポリマーもしくはハイドロゲルは、グリセロール１，３－ジグリセロラートジアクリラートモノマーを少なくとも０．１％（例えば、＞０．１％、＞０．２％、＞０．５％、＞１％、＞２％、＞３％、＞４％、＞５％、＞１０％、＞２０％、＞３０％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）含む。いくつかの実施形態では、本明細書のポリマーは、グリセロール１，３－ジグリセロラートジアクリラートモノマーを９９％未満（例えば、＜９９％、＜９８％、＜９５％、＜９０％、＜８０％、＜７０％、＜６０％、＜５０％、＜４０％、＜３０％、＜２０％、＜１０％、＜５％、＜４％、＜３％、＜２％、＜１％、＜０．５％）含む。いくつかの実施形態では、ポリマーは、グリセロール１，３－ジグリセロラートジアクリラートモノマーを約９９％、約９８％、約９５％、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、または約０．５％を含む。
【0036】
いくつかの実施形態では、ＰＰＣＮまたはＰＰＣＮ系ポリマーもしくはハイドロゲルは、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドモノマーを少なくとも０．１％（例えば、＞０．１％、＞０．２％、＞０．５％、＞１％、＞２％、＞３％、＞４％、＞５％、＞１０％、＞２０％、＞３０％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）含む。いくつかの実施形態では、本明細書のポリマーは、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドモノマーを９９％未満（例えば、＜９９％、＜９８％、＜９５％、＜９０％、＜８０％、＜７０％、＜６０％、＜５０％、＜４０％、＜３０％、＜２０％、＜１０％、＜５％、＜４％、＜３％、＜２％、＜１％、＜０．５％）含む。いくつかの実施形態では、ポリマーは、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドモノマーを約９９％、約９８％、約９５％、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、または約０．５％含む。
【0037】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する材料は、本明細書に記載するＰＰＣＮ系温度応答性ハイドロゲル材料と１つ以上のさらなる構成成分との複合材料を含む。いくつかの実施形態では、さらなる構成成分は、複合材料に１～９９重量％（例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはその間の範囲）含まれる。いくつかの実施形態では、複合材料は、ＰＰＣＮ系ハイドロゲルを少なくとも１％（例えば、＞１％超、＞２％、＞３％、＞４％、＞５％、＞１０％、＞２０％、＞３０％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）含む。いくつかの実施形態では、温度応答性複合材料は、ＰＰＣＮ系ハイドロゲルを９９％未満（例えば、＜９９％、＜９８％、＜９５％、＜９０％、＜８０％、＜７０％、＜６０％、＜５０％、＜４０％、＜３０％、＜２０％、＜１０％、＜５％、＜４％、＜３％、＜２％、＜１％）含む。いくつかの実施形態では、複合材料は、ＰＰＣＮ系ハイドロゲルを約９９％、約９８％、約９５％、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、またはその間の範囲の量で含む。前述のパーセンテージは重量％またはモル％であってよい。
【0038】
いくつかの実施形態では、温度応答性ＰＰＣＮ系ハイドロゲル材料とバイオセラミックス成分との複合材料を提供する。適切なバイオセラミックスには、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ；Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）、リン酸三カルシウムベータ（β－ＴＣＰ；Ｃａ３（ＰＯ４）２）、及びＨＡＰとβ－ＴＣＰの混合物が含まれる。
【0039】
いくつかの実施形態では、複合材料は、ＰＰＣＮ系ハイドロゲル及び１つ以上のさらなるポリマー成分を含む。適切な生分解性ポリマーには、コラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸と誘導体、アルギン酸ナトリウムと誘導体、キトサンと誘導体、ゼラチン、デンプン、セルロースポリマー（例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシルメチルセルロース、セルロースアセタートフタラート、セルロースアセタートスクシナート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート）、カゼイン、デキストランと誘導体、多糖類、ポリ（カプロラクトン）、フィブリノゲン、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ（Ｌ－ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド）、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド）、乳酸とグリコール酸のコポリマー、ε－カプロラクトンとラクチドのコポリマー、グリコリドとε－カプロラクトンのコポリマー、ラクチドと１，４－ジオキサン－２－オンのコポリマー、ポリマーとコポリマーでＤ－ラクチド、Ｌ－ラクチド、Ｄ，Ｌ－ラクチド、グリコリド、ε－カプロラクトン、炭酸トリメチレン、１，４－ジオキサン－２－オン、または１，５－ジオキセパン－２－オンの各モノマーの残基単位のうち１つ以上が含まれているもの、ポリ（グリコリド）、ポリ（ヒドロキシ酪酸）、ポリ（アルキルカーボナート）及びポリ（オルトエステル）、ポリエステル、ポリ（ヒドロキシ吉草酸）、ポリジオキサノン、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（リンゴ酸）、ポリ（タルトロン酸）、ポリ無水物、ポリホスファゼン、ポリ（アミノ酸）、ならびに上記ポリマーのコポリマー、ならびに上記ポリマーの混合及び組み合わせなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。（概要は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＩｌｌｕｍ，Ｌ．，Ｄａｖｉｄｓ，Ｓ．Ｓ．（ｅｄｓ．）”Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”Ｗｒｉｇｈｔ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，１９８７；Ａｒｓｈａｄｙ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １７：１－２２，１９９１；Ｐｉｔｔ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒ．５９：１７３－１９６，１９９０；Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ４：１５５－０１８０，１９８６を参照のこと）。適切な非生分解性ポリマーには、シリコンゴム、ポリエチレン・、アクリル樹脂、ポリウレタン、ポリプロピレン、及びポリメチルメタクリレートが含まれる。
【0040】
本明細書は、全体を通して記載されているように、硬化性（例えば、温度応答性）ハイドロゲル及び／またはその複合材料を含むＰＰＣＮ系材料を提供する。これらの材料は、さまざまな用途で利用される。例えば、液体及び／または可溶性の形態で投与され、その後、所望の条件（例えば、生理的温度）に曝露された場合に（短時間で）固体及び／または不溶性になる材料が所望されるあらゆる用途で利用される。本明細書に記載する材料は、例えば、医療及び歯科における骨修復用途、例えば、頭蓋顔面損傷の修復、複雑骨折の安定化、骨成長の促進、骨再生、骨補填材として、インプラントの接着等などで利用される。いくつかの実施形態では、材料は、医療／歯科以外の用途で利用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載するＰＰＣＮ系材料は、生理的温度以下（例えば、３６℃、３５℃、３４℃、３３℃、３２℃、３１℃、３０℃、２９℃、２８℃、２７℃、２６℃、２５℃、２４℃、２３℃、２２℃、２１℃、２０℃、またはそれより低温またはその間の範囲）で液体である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載するＰＰＣＮ系材料は、生理的温度（例えば、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、またはその間の範囲）またはその近傍ではゲルである。
【0041】
本明細書の材料が、骨または骨折／損傷の修復、安定化、再生、成長等に使用されるいくつかの実施形態では、材料はさらに、骨、骨成長、骨再生等への取り込みを促進するさらなる構成成分／薬剤を含む。いくつかの実施形態では、さらなる構成成分／薬剤は材料内に組み込まれ、その後、硬化時に材料内に封入される。そのような実施形態では、さらなる構成成分／薬剤は、ＰＰＣＮ系ハイドロゲル及び材料の他の構成成分と非共有結合で会合する。他の実施形態では、さらなる構成成分／薬剤は、共有結合で連結されているＰＰＣＮ系ハイドロゲルである。
【0042】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する材料は、骨欠損の修復及び／または骨の再生のための成長因子または他の生理活性物質の送達において利用される。本明細書の実施形態での使用に適切な薬剤には、骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ－１、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－６、及びＢＭＰ－７）；ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、及びＴＧＦ－β３が含まれるがこれに限定されないトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーのメンバー；増殖分化因子（ＧＤＦ１、ＧＤＦ２、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ミオスタチン／ＧＤＦ８、ＧＤＦ９、ＧＤＦ１０、ＧＤＦ１１、及びＧＤＦ１５）；血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）；線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）等が挙げられるが、されるものではない。これらの薬剤または他の薬剤は、本明細書に記載する材料またはその構成成分に共有結合で連結すること、本明細書に記載する材料またはその構成成分に表出する部分に非共有結合で会合させること、本明細書に記載する材料内に包埋すること等が可能である。
【0043】
いくつかの実施形態では、本明細書のＰＰＣＮ系ハイドロゲルは、治療薬（例えば、骨粗鬆症の薬物）の担体、細胞（例えば、幹細胞）、成長因子等として利用される。いくつかの実施形態では、本明細書のＰＰＣＮ系ハイドロゲルにより、中に封入されている生理活性物質の局所的制御送達が提供される。
【0044】
いくつかの実施形態では、本明細書は、本明細書に記載のＰＰＣＮ系ハイドロゲルを含む組成物を骨欠損部または骨折部に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書は、骨欠損または骨折を修復するために本明細書に記載のＰＰＣＮ系ハイドロゲルの使用することを提供する。
【0045】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＰＰＣＮ系ハイドロゲルを骨折部位内に注入して（例えば、整形外科手術中）治癒を促進及び／または加速させる。
【実施例】
【0046】
実験
細胞培養
ゲル試験では、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ、ＡＴＣＣ）を、１０％ＦＢＳ及び５ｍｌの１０×ペニシリン－ストレプトマイシンを添加し、それ以外の骨形成因子を添加しないダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。これらの試験に使用したｈＭＳＣは継代６代目以下のものであった。マウスの前骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞（ＡＴＣＣ）をＤＭＥＭ：Ｆ１２で培養した。両細胞株を３７℃で、５％二酸化炭素（ＣＯ２）で培養した。
細胞培養
ゲル試験では、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ、ＡＴＣＣ）を、１０％ＦＢＳ及び５ｍｌの１０×ペニシリン－ストレプトマイシンを添加し、それ以外の骨形成因子を添加しないダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。これらの試験に使用したｈＭＳＣは継代６代目以下のものであった。マウスの前骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞（ＡＴＣＣ）をＤＭＥＭ：Ｆ１２で培養した。両細胞株を３７℃で、５％二酸化炭素（ＣＯ２）で培養した。
【0047】
材料の調製及び特性解析
ＰＰＣＮ（ポリ（ポリエチレングリコール・クエン酸－コ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）を重縮合、その後のラジカル重合により調製した。
ＰＰＣＮ（ポリ（ポリエチレングリコール・クエン酸－コ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）を重縮合、その後のラジカル重合により調製した。
【0048】
ＰＰＣＮ－ｐｈｏｓを調製するため、本来のＰＰＣＮ合成を調整して、０．１モル比のβ－グリセロリン酸を第１の重縮合ステップ（スキーム１）で加えた。それ以降の反応ステップは変更しなかった。
【0049】
【化2】
【0050】
ＰＰＣＮ－ｃＲＧＤゲルを調製するため、報告にあるようにＰＰＣＮを生成させた。その後、環状ＲＧＤｆＣペプチド（ＡＢＩ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ＰＰＣＮポリマー鎖内のクエン酸の利用可能なカルボキシ基とマレイミド化学を介して共有結合で複合体化させた（スキーム２）。意図した環状ＲＧＤペプチドの濃度は１０％であった。
【0051】
【化3】
【0052】
ＰＰＣＮ－Ｓｒゲルを調製するため、ＰＰＣＮをＰＢＳ（１×）に１００ｍｇ／ｍｌで溶解させた。１００ｍＭのＳｒＣｌ２６Ｈ２Ｏ（Ｓｉｇｍａ）をＰＰＣＮ／ＰＢＳ溶液に混合し、４℃で一晩放置し架橋させた（スキーム２）。
【0053】
ゲルの特性解析を図１に示す。マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）によってＰＰＣＮ－ｃＲＧＤの複合体化を確認した（図１ａ）。アルファ－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸マトリックスを用いて試料を調製した。誘導結合プラズマ発光分光分析装置（Ｔｈｅｒｍｏ ｉＣＡＰ ７６００ ＩＣＰ－ＯＥＳ）によるストロンチウム放出試験でＰＰＣＮ－Ｓｒの特徴付けを行った。ゲルを擬似体液に浸漬し、溶液を１４日かけて除去し、Ｓｒ２＋濃度についてアッセイした（図１ｂ）。ＦＴ－ＩＲ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｔｅｎｓｏｒ３７）及びＸＰＳによってＰＰＣＮ－ｐｈｏｓの特徴付けを行った（図１ｃ）。ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製ＤＨＲレオメーターで２０ｍｍ、２°のコーンペルチェプレートジオメトリー及び試料の蒸発を最小限に抑えるソルベントトラップカバーを用いてさらなるレオロジー特性解析を行った。５℃／分の加熱速度で１５℃から４５℃まで昇温させる実験でゲルを試験した。角周波数を１０ラジアン／秒、ひずみ振幅５％を適用して粘弾性係数をモニターした。全試料とも５２μｍの間隙高さを使用した。粘弾性特性の初期変化を、損失弾性率（Ｇ’’）に対する貯蔵弾性率（Ｇ’）の上昇によって特徴付けした。
【0054】
３Ｄ分化試験
ＰＢＳ（１×）にＰＰＣＮを１００ｍｇ／ｍＬで溶解させた、さまざまな温度応答性ＰＰＣＮ溶液で細胞を封入した。細胞を、液体ＰＰＣＮ１ｍＬあたり１×１０５細胞の濃度で均一混合により溶液に加えた。細胞－ＰＰＣＮ混合物を３７℃で５分間インキュベートし、ゲルを形成させた。一旦ゲルが形成された後、温めておいた培地を上部に加え、２日毎に交換した。播種する前に、プレートに細胞が付着しないようプレートをＳｉｇｍａ－ｃｏｔｅでコートし、数度の培地交換を通して存続する細胞すべてが３Ｄゲル環境内で確実に存続するようにした。取扱い中は、温度変動のためにゲルが溶解または希釈しないことを保証するため、プレートをプレートウォーマー上に保持した。各時点において、培地を除去し、ゲルを採取した後、ＡＬＰ及びＤＮＡ分析の場合は凍結し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ、アリザリンレッド染色、及び免疫組織染色の場合は直接アッセイした。
ＰＢＳ（１×）にＰＰＣＮを１００ｍｇ／ｍＬで溶解させた、さまざまな温度応答性ＰＰＣＮ溶液で細胞を封入した。細胞を、液体ＰＰＣＮ１ｍＬあたり１×１０５細胞の濃度で均一混合により溶液に加えた。細胞－ＰＰＣＮ混合物を３７℃で５分間インキュベートし、ゲルを形成させた。一旦ゲルが形成された後、温めておいた培地を上部に加え、２日毎に交換した。播種する前に、プレートに細胞が付着しないようプレートをＳｉｇｍａ－ｃｏｔｅでコートし、数度の培地交換を通して存続する細胞すべてが３Ｄゲル環境内で確実に存続するようにした。取扱い中は、温度変動のためにゲルが溶解または希釈しないことを保証するため、プレートをプレートウォーマー上に保持した。各時点において、培地を除去し、ゲルを採取した後、ＡＬＰ及びＤＮＡ分析の場合は凍結し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ、アリザリンレッド染色、及び免疫組織染色の場合は直接アッセイした。
【0055】
骨分化アッセイ
骨分化の初期検出では（図４）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を測定した。３日目及び１０日目にゲルを採取し、蛍光定量キット（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）で細胞外アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を検出した。非蛍光基質リン酸４－メチルウンベリフェリル二ナトリウム塩（ＭＵＰ）を加え、ＡＬＰで切断し、蛍光シグナルを得た（Ｅｘ／Ｅｍ＝３６０／４４０ｎｍ）。マイクロプレートリーダーで蛍光を読み取った。段階希釈したゲル標準に基づいて酵素活性を計算し、同時Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて総ＤＮＡ含量を基準として正規化した。
骨分化の初期検出では（図４）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を測定した。３日目及び１０日目にゲルを採取し、蛍光定量キット（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）で細胞外アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を検出した。非蛍光基質リン酸４－メチルウンベリフェリル二ナトリウム塩（ＭＵＰ）を加え、ＡＬＰで切断し、蛍光シグナルを得た（Ｅｘ／Ｅｍ＝３６０／４４０ｎｍ）。マイクロプレートリーダーで蛍光を読み取った。段階希釈したゲル標準に基づいて酵素活性を計算し、同時Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて総ＤＮＡ含量を基準として正規化した。
【0056】
骨分化の後期検出では（図５）、オステオカルシン（ＯＣＮ）及びオステオポンチン（ＯＰＮ）のアリザリンレッドＳ染色及び免疫組織染色を実施した。アリザリンレッドＳでは、温めておいたゲルの内側に細胞を固定し、ゲルに染色を透過させ、その後、ＤＩ水で数回洗浄して余剰染色をすすいだ。光学顕微鏡で石灰化を表示させた。免疫組織染色では、温めておいたゲルの内側に細胞を固定し、ＯＰＮまたはＯＣＮの一次抗体を加え、ＤＡＰＩで対比染色を行った。
【0057】
石灰化
石灰化を評価するため、イソフルランでマウスに麻酔をかけ、加温イクロＣＴ台に載せた。前臨床マイクロＰＥＴ／ＣＴイメージングシステムｎａｎｏＳｃａｎスキャナー（Ｍｅｄｉｓｏ－ＵＳＡ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で画像を取得した。データは、拡大「中程度」、３３μｍ焦点、１×１ビニング、全周にわたる投影像７２０枚、照射時間３００ｍｓで取得した。画像を３５ｋＶｐを使用して取得した。Ｍｅｄｉｓｏ製フィルタ補正逆投影ソフトウェアを使用してボクセルサイズを６８μｍで投影データを再構成した。再構成したデータを表示させ、Ｍａｃ用Ｏｓｉｒｉｘ Ｌｉｔｅでセグメント化した。冠状面を使用して、下限閾値に６００ハンスフィールドユニット（ＨＵ）、上限閾値に１０，０００ハンスフィールドユニットを使用する２Ｄ領域拡張で関心領域（ＲＯＩ）を作成することにより、画像を定量化した。関心領域（ＲＯＩ）を使用し、各ＲＯＩの平均ＨＵを計算して（骨は、７００～３，０００ＨＵ）石灰化の定量化を行った。
石灰化を評価するため、イソフルランでマウスに麻酔をかけ、加温イクロＣＴ台に載せた。前臨床マイクロＰＥＴ／ＣＴイメージングシステムｎａｎｏＳｃａｎスキャナー（Ｍｅｄｉｓｏ－ＵＳＡ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で画像を取得した。データは、拡大「中程度」、３３μｍ焦点、１×１ビニング、全周にわたる投影像７２０枚、照射時間３００ｍｓで取得した。画像を３５ｋＶｐを使用して取得した。Ｍｅｄｉｓｏ製フィルタ補正逆投影ソフトウェアを使用してボクセルサイズを６８μｍで投影データを再構成した。再構成したデータを表示させ、Ｍａｃ用Ｏｓｉｒｉｘ Ｌｉｔｅでセグメント化した。冠状面を使用して、下限閾値に６００ハンスフィールドユニット（ＨＵ）、上限閾値に１０，０００ハンスフィールドユニットを使用する２Ｄ領域拡張で関心領域（ＲＯＩ）を作成することにより、画像を定量化した。関心領域（ＲＯＩ）を使用し、各ＲＯＩの平均ＨＵを計算して（骨は、７００～３，０００ＨＵ）石灰化の定量化を行った。
【0058】
免疫蛍光抗体法
動物を二酸化炭素吸入により安楽死させた。組織を採取し、ＰＢＳに溶解させた４％パラホルムアルデヒドで４℃にて一晩固定した。パラホルムアルデヒド残渣を除去するため、ＰＢＳを何度か取り替えて試料を洗浄した。エタノール系列で試料の脱水を行い、キシレンで除去し、パラフィンに包埋した。厚さ５ミクロンの切片をカットし、スライドに装着した。切片をキシレンで処理してパラフィンを除去し、エタノールと水を交互に用いて補水させた。スライドを抗原賦活化用緩衝液（１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ６．０）に浸漬し、１００℃で１５分間加熱した。ＰＢＳで洗浄後、試料を、５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、５％正常ヤギ血清を含有するＰＢＳ中で３０分間ブロッキングした。試料を、ブロッキングバッファーで希釈した１次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。スライドをＰＢＳで３回洗浄し（１回５分間）、その後、ブロッキングバッファーで希釈した二次抗体で室温にて３０分間インキュベートした。スライドをＰＢＳで６回洗浄し（１回５分間）、その後、退色防止封入剤で封入し、マニキュアで密封した。Ｎｉｋｏｎ ＴＥ－２０００Ｕ顕微鏡またはＣｙｔａｔｉｏｎ５イメージリーダーで画像を取得した。
動物を二酸化炭素吸入により安楽死させた。組織を採取し、ＰＢＳに溶解させた４％パラホルムアルデヒドで４℃にて一晩固定した。パラホルムアルデヒド残渣を除去するため、ＰＢＳを何度か取り替えて試料を洗浄した。エタノール系列で試料の脱水を行い、キシレンで除去し、パラフィンに包埋した。厚さ５ミクロンの切片をカットし、スライドに装着した。切片をキシレンで処理してパラフィンを除去し、エタノールと水を交互に用いて補水させた。スライドを抗原賦活化用緩衝液（１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ６．０）に浸漬し、１００℃で１５分間加熱した。ＰＢＳで洗浄後、試料を、５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、５％正常ヤギ血清を含有するＰＢＳ中で３０分間ブロッキングした。試料を、ブロッキングバッファーで希釈した１次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。スライドをＰＢＳで３回洗浄し（１回５分間）、その後、ブロッキングバッファーで希釈した二次抗体で室温にて３０分間インキュベートした。スライドをＰＢＳで６回洗浄し（１回５分間）、その後、退色防止封入剤で封入し、マニキュアで密封した。Ｎｉｋｏｎ ＴＥ－２０００Ｕ顕微鏡またはＣｙｔａｔｉｏｎ５イメージリーダーで画像を取得した。
【0059】
ストロンチウム分布
いくつかの主要臓器、すなわち、心臓、脳、脾臓、精巣、筋肉、肺、腎臓、及び肝臓でストロンチウム分布をアッセイした。安楽死させた後、各臓器を採取し、分析時まで－８０℃で保存した。各試料に７０％硝酸及び３７％過酸化水素を加えて組織消化を行った。１時間後、試料のキャップを外し、蓄積したガスを放出させた。組織を放置し、室温で２日間消化させた。２日後、試料をＭＱ水で２．４％の酸まで希釈し、上述のようにＩＣＰ－ＯＥＳ用に調製した。
いくつかの主要臓器、すなわち、心臓、脳、脾臓、精巣、筋肉、肺、腎臓、及び肝臓でストロンチウム分布をアッセイした。安楽死させた後、各臓器を採取し、分析時まで－８０℃で保存した。各試料に７０％硝酸及び３７％過酸化水素を加えて組織消化を行った。１時間後、試料のキャップを外し、蓄積したガスを放出させた。組織を放置し、室温で２日間消化させた。２日後、試料をＭＱ水で２．４％の酸まで希釈し、上述のようにＩＣＰ－ＯＥＳ用に調製した。
【0060】
元素分析
Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＥＳＣＡＬａｂ ２５０ＸｉでＡｌ Ｋ－アルファＸ線源（１４８６．６ｅＶ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ）を使用して切片組織のＸＰＳ分析を実施した。単色化Ｘ線ビームのスポットサイズは直径３００μｍ、及び出力は１００ワットであった。サーベイスキャンでは１００ｅＶのパスエネルギー、及び１ｅＶのステップサイズを使用した。高解像度スキャンでは、５０ｅＶのパスエネルギー及び０．１ｅＶのステップサイズを使用した。取り込み時間は５０ｍｓであった。ＸＰＳスペクトルを２８４．８ｅＶの汚染炭素ピークで較正した。全ＸＰＳデータをＡｖａｎｔａｇｅソフトウェアで処理した。
Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＥＳＣＡＬａｂ ２５０ＸｉでＡｌ Ｋ－アルファＸ線源（１４８６．６ｅＶ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ）を使用して切片組織のＸＰＳ分析を実施した。単色化Ｘ線ビームのスポットサイズは直径３００μｍ、及び出力は１００ワットであった。サーベイスキャンでは１００ｅＶのパスエネルギー、及び１ｅＶのステップサイズを使用した。高解像度スキャンでは、５０ｅＶのパスエネルギー及び０．１ｅＶのステップサイズを使用した。取り込み時間は５０ｍｓであった。ＸＰＳスペクトルを２８４．８ｅＶの汚染炭素ピークで較正した。全ＸＰＳデータをＡｖａｎｔａｇｅソフトウェアで処理した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】