特許 7654204 ８－オキソグアニンを含むＲＮＡ干渉誘導核酸、８－オキソグアニンを含むマイクロＲＮＡと結合する修飾核酸およびこれらの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-03-24

(45)【発行日】2025-04-01

(54)【発明の名称】８－オキソグアニンを含むＲＮＡ干渉誘導核酸、８－オキソグアニンを含むマイクロＲＮＡと結合する修飾核酸およびこれらの使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20250325BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20250325BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20250325BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20250325BHJP

   A01K 67/027 20240101ALI20250325BHJP

   A61K 31/7115 20060101ALI20250325BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20250325BHJP

   A61K 31/198 20060101ALI20250325BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20250325BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20250325BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20250325BHJP

   A61P 39/06 20060101ALI20250325BHJP

   A61K 31/085 20060101ALI20250325BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

C12N15/09 Z

C12N15/63 Z

C12Q1/6869 Z

A01K67/027

A61K31/7115

A61K45/00

A61K31/198

A61K48/00

A61P9/00

A61P43/00 105

A61P43/00 111

A61P39/06

A61P43/00 121

A61K31/085

【請求項の数】 16

(21)【出願番号】P 2022531533

(86)(22)【出願日】2020-11-30

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-04-03

(86)【国際出願番号】 KR2020017341

(87)【国際公開番号】W WO2021107747

(87)【国際公開日】2021-06-03

【審査請求日】2022-12-08

(31)【優先権主張番号】10-2019-0156147

(32)【優先日】2019-11-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】510273880

【氏名又は名称】コリア ユニバーシティ リサーチ アンド ビジネス ファウンデーション

【氏名又は名称原語表記】ＫＯＲＥＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＡＮＤ ＢＵＳＩＮＥＳＳ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ

(74)【代理人】

【識別番号】110002952

【氏名又は名称】弁理士法人鷲田国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】チ ソン ウク

(72)【発明者】

【氏名】ソク ヒ ヨン

【審査官】井関 めぐみ

(56)【参考文献】

【文献】Jian-Xun WANG et al.，“Oxidative Modification of miR-184 Enables It to Target Bcl-xL and Bcl-w”，Molecular Cell，2015年07月，Vol. 59, No. 1，p.50-61，DOI: 10.1016/j.molcel.2015.05.003

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／１１３

Ｃ１２Ｎ １５／０９

Ｃ１２Ｎ １５／６３

Ｃ１２Ｑ １／６８６９

Ａ０１Ｋ ６７／０２７

Ａ６１Ｋ ３１／７１１５

Ａ６１Ｋ ４５／００

Ａ６１Ｋ ３１／１９８

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｐ ９／００

Ａ６１Ｐ ４３／００

Ａ６１Ｋ ３１／０８５

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
核酸の二本鎖のうちの少なくとも一本鎖において、５’末端から１番目～９番目のヌクレオチドとして一つ以上の８－オキソグアニン（８－ｏｘｏｇｕａｎｉｎｅ；ｏ８Ｇ）を含み、
前記５’末端から１番目～９番目のヌクレオチドはマイクロＲＮＡの配列を含み、
前記マイクロＲＮＡはｍｉＲ－１であり、
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸を細胞または動物に注入したときに心筋肥大が誘導される、
ＲＮＡ干渉誘導核酸。

【請求項2】

下記グループ２のポリヌクレオチドのうちの一つ以上を含む、請求項１に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸。
［グループ２］
配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド（５’ｐ－Ｕｏ８ＧＧＡＡＵＧＵＡＡＡＧＡＡＧＵＡＵＧＵＡＵ－３’）；
配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド（５’ｐ－ＵＧｏ８ＧＡＡＵＧＵＡＡＡＧＡＡＧＵＡＵＧＵＡＵ－３’）；
配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド（５’ｐ－ＵＧＧＡＡＵｏ８ＧＵＡＡＡＧＡＡＧＵＡＵＧＵＡＵ－３’）。

【請求項3】

請求項１または２に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸および抗酸化剤を含む組成物。

【請求項4】

５’末端から２番目、３番目または７番目のヌクレオチドのうちの一つ以上のグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ；Ｇ）が８－オキソグアニン（８－ｏｘｏｇｕａｎｉｎｅ；ｏ８Ｇ）に修飾されたマイクロＲＮＡと特異的に結合する修飾核酸であって、
前記修飾核酸は、修飾されたマイクロＲＮＡの５’末端から２番目および３番目のうちのいずれか一つのヌクレオチドから始まって６つ以上の連続したポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含み、
前記修飾されたマイクロＲＮＡの５’末端から２番目、３番目または７番目のヌクレオチドのうちの一つ以上の８－オキソグアニン（ｏ８Ｇ）と結合する位置のヌクレオチドとしてアデニン（Ａｄｅｎｉｎｅ；Ａ）を含み、
前記マイクロＲＮＡは下記グループ１のマイクロＲＮＡのうちの一つ以上である、
修飾核酸。
［グループ１］
ｍｉＲ－１、ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、及びｍｉＲ－１－３ｐ。

【請求項5】

５’－ＡＣＡＵＵＣＡ－３’、５’－ＡＣＡＵＵＡＣ－３’、５’－ＡＡＡＵＵＣＣ－３’のうちの一つ以上の塩基配列を含む、請求項４に記載の修飾核酸。

【請求項6】

請求項４または５に記載の修飾核酸をコードする遺伝子を含む組換えベクター。

【請求項7】

５’末端から１番目～９番目のヌクレオチドのうちの一つ以上のグアニン（Ｇ）が８－オキソグアニン（ｏ８Ｇ）に修飾されたマイクロＲＮＡと特異的に結合する修飾核酸であって、
前記修飾核酸はマイクロＲＮＡの５’末端から２番目および３番目のうちのいずれか一つから始まって６つ以上の連続したポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含み、
前記マイクロＲＮＡの５’末端から１番目～９番目のヌクレオチドのうちの一つ以上の８－オキソグアニン（ｏ８Ｇ）と結合する位置のヌクレオチドにアデニン（Ａｄｅｎｉｎｅ；Ａ）を含む修飾核酸、または、
前記修飾核酸をコードする遺伝子を含む組換えベクターを含み、
前記マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ－１である、
心肥大症治療用薬学組成物。

【請求項8】

前記マイクロＲＮＡは、５’末端から２番目、３番目または７番目のヌクレオチドのうちの一つ以上のグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ；Ｇ）が８－オキソグアニン（８－ｏｘｏｇｕａｎｉｎｅ；ｏ８Ｇ）に修飾されたものである、請求項７に記載の心肥大症治療用薬学組成物。

【請求項9】

抗酸化剤をさらに含む、請求項７または８に記載の心肥大症治療用薬学組成物。

【請求項10】

前記抗酸化剤は、Ｎ－アセチルシステイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ、ＮＡＣ）またはブチルヒドロキシアニソール（Ｂｕｔｙｌａｔｅｄ ｈｙｄｒｏｘｙａｎｉｓｏｌｅ、ＢＨＡ）である、請求項９に記載の薬学組成物。

【請求項11】

動物の心筋細胞から分離されたマイクロＲＮＡのヌクレオチド中の一つ以上のグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ；Ｇ）が８－オキソグアニン（８－ｏｘｏｇｕａｎｉｎｅ；ｏ８Ｇ）に修飾されているか否かを確認する工程；および
前記マイクロＲＮＡの５’末端から１番目～９番目のヌクレオチド中の一つ以上のグアニン（Ｇ）が８－オキソグアニン（ｏ８Ｇ）に修飾されている場合、心肥大症に分類する工程を含み、
前記マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ－１、ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、またはｍｉＲ－１－３ｐである、
心肥大症診断のための情報提供方法。

【請求項12】

前記８－オキソグアニン（８－ｏｘｏｇｕａｎｉｎｅ；ｏ^８Ｇ）に修飾されているヌクレオチドは、マイクロＲＮＡの５’末端から２番目、３番目または７番目のヌクレオチドである、請求項１１に記載の心肥大症診断のための情報提供方法。

【請求項13】

（ａ）請求項４に記載の修飾核酸をコードする遺伝子をプロモーターに作動可能に連結して組換えベクターを製作する工程；
（ｂ）前記組換えベクターをヒト以外の動物の受精卵に導入する工程；および
（ｃ）前記受精卵を発生させて形質転換動物モデルを得る工程を含む、ヒト以外の心肥大症抵抗性動物モデルの製作方法。

【請求項14】

請求項４に記載の修飾核酸をコードする遺伝子をプロモーターに作動可能に連結した組換えベクターを含む、ヒト以外の心肥大症抵抗性動物モデル。

【請求項15】

（ａ）心肥大症動物モデルの心筋細胞に候補物質を処理する工程；
（ｂ）前記心肥大症動物モデルの心筋細胞で発現されるマイクロＲＮＡのヌクレオチドのうちのグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ；Ｇ）の８－オキソグアニン（８－ｏｘｏｇｕａｎｉｎｅ；ｏ８Ｇ）への修飾頻度を分析する工程；および
（ｃ）前記８－オキソグアニン（ｏ８Ｇ）が候補物質を処理していない場合に比べて減少する場合、前記候補物質を心肥大症治療剤として選別する工程を含み、
前記マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ－１である、
心肥大症治療用候補物質のスクリーニング方法。

【請求項16】

前記候補物質は抗酸化剤である、請求項１５に記載の心肥大症治療用候補物質のスクリーニング方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、８－オキソグアニンを含むＲＮＡ干渉誘導核酸、８－オキソグアニンを含むマイクロＲＮＡに特異的に結合する修飾核酸およびこれらを用いた薬学組成物、組換え動物モデル、薬物のスクリーニング方法、病気の診断方法および病理生理学的現象を調節する方法などに関する。

【背景技術】

【0002】

細胞が病理生理学的変化を経るようになれば、一般に酸化ストレスが発生し、これによって活性酸素（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ；ＲＯＳ）が発生する。発生した活性酸素は大きな反応性によって様々な生物学的構成体を修飾し、そのうちの最も容易に修飾されるものがＲＮＡである。特に、酸化修飾されるＲＮＡ塩基のうち最も容易に多く起こることがグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ；Ｇ）塩基が酸化修飾されて８－オキソグアニン（８－ｏｘｏｇｕａｎｉｎｅ；ｏ^８Ｇ）に修飾されることである。

【0003】

一方、心臓疾患は癌を含んで大韓民国成人の３大死亡疾患の一つである。その発病過程の様々な病理的ストレスが心臓組織のサイズに変化を起こし、心肥大症（ｃａｒｄｉａｃ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ）を誘発することから始まり、心肥大症は心筋細胞のサイズ、タンパク質の合成速度増加などの特徴を示す。心肥大症は次第に心筋線維化および心不全症を誘導して、最終的には心臓機能喪失（または心不全：ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ）として表れる。特に、心不全の場合は特に死亡率が５０％前後で非常に高いため、究極的には心筋肥大症を予防するか治療法を開発しようとする研究が行われており、したがって、これに対する疾患モデルを構築することが必要である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【文献】韓国登録特許第１４８１００７号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明者らは酸化ストレスによってマイクロＲＮＡのシード領域（シード ｒｅｇｉｏｎ）でグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ；Ｇ）塩基が８－オキソグアニン（８－ｏｘｏｇｕａｎｉｎｅ；ｏ^８Ｇ）に酸化修飾が起こった場合、ｏ^８Ｇ：Ａ配置を通じて標的配列と結合することを確認し、前記マイクロＲＮＡの逆転写を通じて製造されたｃＤＮＡでＧ→Ｔに修飾が起こった位置を同定することによって８－オキソグアニンに酸化修飾が起こった位置を確認した。したがって、これを基礎としてマイクロＲＮＡでグアニン（Ｇ）を８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）で置換したＲＮＡ干渉誘導核酸を製造して細胞またはマウスに投与した時、多様な病理生理学的現象が誘導されることを確認し、これに基づいて本発明を完成した。

【0006】

したがって、本発明は、ＲＮＡ干渉を誘導する核酸の二本鎖のうちの少なくとも一本鎖であって、５’末端から１番目～９番目のヌクレオチドとして一つ以上の８－オキソグアニン（８－ｏｘｏｇｕａｎｉｎｅ；ｏ^８Ｇ）を含むＲＮＡ干渉誘導核酸を提供する。

【0007】

また、本発明では、８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）の位置の同定方法を提供する。

【0008】

また、本発明では、５’末端から１番目～９番目のヌクレオチドのうちの一つ以上のグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ；Ｇ）が８－オキソグアニン（８－ｏｘｏｇｕａｎｉｎｅ；ｏ^８Ｇ）に修飾されたマイクロＲＮＡと特異的に結合する修飾核酸、および前記修飾核酸をコードする遺伝子を含む組換えベクターを提供する。

【0009】

また、本発明では、前記修飾核酸または前記組換えベクターを含む心肥大症治療用薬学組成物および前記ＲＮＡ干渉誘導核酸を含む肝癌治療用または膠芽腫治療用薬学組成物を提供する。

【0010】

他の実施形態は、抗酸化剤を有効成分として含む心肥大症予防または治療用薬学的組成物および心肥大症診断のための情報提供方法を提供する。

【0011】

また他の実施形態は、心肥大症抵抗性動物モデルの製作方法および心肥大症抵抗性動物モデルを提供する。

【0012】

また他の実施形態は、心肥大症治療用候補物質のスクリーニング方法を提供する。

【0013】

本発明が目的とする技術的課題は以上で言及した課題に制限されず、言及されていないまた他の課題は以下の記載から本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に明確に理解されるはずである。

【課題を解決するための手段】

【0014】

本発明は、核酸の二本鎖のうちの少なくとも一本鎖において、５’末端から１番目～９番目のヌクレオチドとして一つ以上の８－オキソグアニン（８－ｏｘｏｇｕａｎｉｎｅ；ｏ^８Ｇ）を含む、ＲＮＡ干渉誘導核酸を提供する。

【0015】

本発明の一実施形態として、前記５’末端から１番目～９番目のヌクレオチドはマイクロＲＮＡの配列を含むＲＮＡ、干渉誘導核酸を提供する。

【0016】

本発明の他の実施形態として、前記マイクロＲＮＡは、下記グループ１のマイクロＲＮＡのうちの一つ以上であってもよい：
［グループ１］
ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１８４、ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｍｉＲ－１－３ｐ、ｍｉＲ－１２２、ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－１２４。

【0017】

本発明の他の実施形態として、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）の位置でｏ^８Ｇ：Ａ配置が起こる標的サイトを認識することができる。

【0018】

本発明の他の実施形態として、前記核酸の二本鎖のうちの少なくとも一本鎖は下記グループ２のポリヌクレオチドのうちの一つ以上を含むことができる。
［グループ２］
配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド（５’ｐ－Ｕｏ^８ＧＧＡＡＵＧＵＡＡＡＧＡＡＧＵＡＵＧＵＡＵ－３’）；
配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド（５’ｐ－ＵＧｏ^８ＧＡＡＵＧＵＡＡＡＧＡＡＧＵＡＵＧＵＡＵ－３’）；
配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド（５’ｐ－ＵＧＧＡＡＵｏ^８ＧＵＡＡＡＧＡＡＧＵＡＵＧＵＡＵ－３’）；
配列番号６５の塩基配列からなるポリヌクレオチド（５’ｐ－Ｕｏ^８Ｇｏ^８ＧＡＧＵＧＵＧＡＣＡＡＵＧＧＵＧＵＵＵＧ－３’）；
配列番号６６の塩基配列からなるポリヌクレオチド（５’ｐ－ＵＧＡｏ^８ＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＡＧｄＴｄＴ－３’）；
配列番号６７の塩基配列からなるポリヌクレオチド（５’ｐ－ＵＡＡｏ^８ＧＧＣＡＣＧＣＧＧＵＧＡＡＵＧＣｄＴｄＴ－３’）。

【0019】

本発明によるＲＮＡ干渉誘導核酸は、細胞または動物に注入する場合、心筋肥大、肝癌細胞遊走抑制またはアポトーシスを誘導することができる。

【0020】

本発明は、前述のＲＮＡ干渉誘導核酸および抗酸化剤を含む組成物を提供する。

【0021】

また、本発明は、下記の工程を含む、８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）の位置同定方法を提供する：
（ａ）細胞からＲＮＡを抽出する工程；
（ｂ）前記抽出したＲＮＡから８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）が含まれているＲＮＡを抗－ｏ^８Ｇ抗体を用いて免疫沈降法（ＩＰ）で分離する工程；
（ｃ）前記分離した８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）が含まれているＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを製造し、８－オキソグアニンの位置を把握するためのシーケンシングライブラリーを製作してシーケンシングする工程；および
（ｄ）前記シーケンシングの結果、グアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ；Ｇ）がチミン（Ｔｈｙｍｉｎｅ；Ｔ）に修飾された位置を確認してグアニン（Ｇ）が８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）に修飾された位置を同定する工程。

【0022】

また、本発明は、５’末端から１番目～９番目のヌクレオチドのうち一つ以上のグアニン（Ｇ）が８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）に修飾されたマイクロＲＮＡと特異的に結合する修飾核酸であって、
前記修飾核酸は、修飾されたマイクロＲＮＡの５’末端から２番目および３番目のうちのいずれか一つのヌクレオチドから始まって６つ以上の連続したポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含み、
前記マイクロＲＮＡの５’末端から１番目～９番目のヌクレオチドのうちの一つ以上の８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）と結合する位置のヌクレオチドにアデニン（Ａｄｅｎｉｎｅ；Ａ）を含む、修飾核酸を提供する。

【0023】

本発明の一実施形態として、前記修飾核酸と特異的に結合する前記マイクロＲＮＡは５’末端から２番目、３番目または７番目のヌクレオチドのうち一つ以上のグアニン（Ｇ）が８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）に修飾されたものであり、
前記修飾核酸は、マイクロＲＮＡの５’末端から２番目または３番目のうちいずれか一つのヌクレオチドから始まって６つ以上の連続したポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含み、 前記マイクロＲＮＡの５’末端から２番目、３番目または７番目のヌクレオチドのうちの一つ以上の８－オキソグアニンと結合する位置のヌクレオチドにアデニン（Ａ）を含むことができる。

【0024】

本発明の一実施形態として、前記修飾核酸は、５’－ＡＣＡＵＵＣＡ－３’（配列番号４）、５’－ＡＣＡＵＵＡＣ－３’（配列番号５）、または５’－ＡＡＡＵＵＣＣ－３’（配列番号６）の塩基配列を含むことができる。

【0025】

また、本発明は、前述の修飾核酸をコードする遺伝子を含む組換えベクターを提供する。

【0026】

また、本発明は、５’末端から１番目～９番目のヌクレオチドのうち一つ以上のグアニン（Ｇ）が８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）に修飾されたマイクロＲＮＡと特異的に結合する修飾核酸であって、
前記修飾核酸はマイクロＲＮＡの５’末端から２番目および３番目のうちのいずれか一つから始まって６つ以上の連続したポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含み、
前記マイクロＲＮＡの５’末端から１番目～９番目のヌクレオチドのうち一つ以上の８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）と結合する位置のヌクレオチドにアデニン（Ａｄｅｎｉｎｅ；Ａ）を含む修飾核酸、または
前記修飾核酸をコードする遺伝子を含む組換えベクターを含む、心肥大症治療用薬学組成物を提供する。

【0027】

本発明の一実施形態として、前記マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１８４、ｌｅｔ－７ｆ－５ｐまたはｍｉＲ－１－３ｐであってもよい。

【0028】

本発明の一実施形態として、前記心肥大症治療用薬学組成物は抗酸化剤をさらに含むことができる。

【0029】

また、本発明は、核酸の二本鎖のうちの少なくとも一本鎖において、５’末端から１番目～９番目のヌクレオチドとして一つ以上の８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）を含むＲＮＡ干渉誘導核酸を含む、肝癌治療用または膠芽腫治療用薬学組成物を提供する。

【0030】

本発明の一実施形態として、肝癌治療用薬学組成物において前記マイクロＲＮＡがｍｉＲ－１２２であってもよい。

【0031】

本発明の他の実施形態として、膠芽腫治療用薬学組成物において前記マイクロＲＮＡがｌｅｔ－７またはｍｉＲ－１２４であってもよい。

【0032】

本発明の他の実施形態として、前記肝癌治療用または膠芽腫治療用薬学組成物は抗酸化剤をさらに含むことができる。

【0033】

また、本発明は、抗酸化剤を有効成分として含む心肥大症の予防または治療用の薬学組成物であって、 前記抗酸化剤は、ＲＮＡの５’末端から１番目～９番目のヌクレオチドのうちの一つ以上のグアニン（Ｇ）の８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）への酸化修飾を抑制することを特徴とする、薬学組成物を提供する。

【0034】

本発明の一実施形態として、前記抗酸化剤は、Ｎ－アセチルシステイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ、ＮＡＣ）またはブチルヒドロキシアニソール（Ｂｕｔｙｌａｔｅｄ ｈｙｄｒｏｘｙａｎｉｓｏｌｅ、ＢＨＡ）であってもよい。

【0035】

本発明の他の実施形態として、前記ＲＮＡは、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１８４、ｌｅｔ－７ｆ－５ｐまたはｍｉＲ－１－３ｐであってもよい。

【0036】

また、本発明は、動物の心筋細胞で発現されるマイクロＲＮＡのヌクレオチドのうち一つ以上のグアニン（Ｇ）が８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）に修飾されているか否かを確認する工程；および
前記マイクロＲＮＡのヌクレオチドのうち一つ以上のグアニン（Ｇ）が８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）に修飾されている場合、心肥大症に分類する工程、を含む、心肥大症診断のための情報提供方法を提供する。

【0037】

本発明の一実施形態として、前記ヌクレオチドはマイクロＲＮＡの５’末端から１番目～９番目のヌクレオチドであってもよい。

【0038】

本発明の他の実施形態として、前記ヌクレオチドはマイクロＲＮＡの５’末端から２番目、３番目または７番目のヌクレオチドであってもよい。

【0039】

本発明のまた他の実施形態として、前記マイクロＲＮＡはｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１８４、ｌｅｔ－７ｆ－５ｐまたはｍｉＲ－１－３ｐであってもよい。

【0040】

また、本発明は、（ａ）前記修飾核酸をコードする遺伝子をプロモーターに作動可能に連結して組換えベクターを製作する工程；
（ｂ）前記組換えベクターを動物の受精卵に導入させる工程；および
（ｃ）前記受精卵を代理母に移植した後、受精卵を発生させて形質転換動物モデルを得る工程を含む、ヒトを除いた心肥大症抵抗性動物モデルの製作方法、および前記方法で製作された、ヒトを除いた心肥大症抵抗性動物モデルを提供する。

【0041】

また、本発明は、（ａ）心肥大症動物モデルの心筋細胞に候補物質を処理する工程；
（ｂ）前記心肥大症動物モデルの心筋細胞で発現されるマイクロＲＮＡのヌクレオチドのうちのグアニン（Ｇ）の８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）への修飾頻度を分析する工程；および
（ｃ）前記８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）が候補物質を処理しない場合に比べて減少する場合、前記候補物質を心肥大症治療剤に選別する工程を含む、心肥大症治療用候補物質のスクリーニング方法を提供する。

【0042】

本発明の一実施形態として、前記候補物質は抗酸化剤であってもよい。

【0043】

本発明の他の実施形態として、前記マイクロＲＮＡはｍｉＲ－１であってもよい。

【0044】

また、本発明は、前記修飾核酸を個体に投与する工程を含む、心肥大症抑制方法を提供する。

【0045】

また、本発明は、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸を個体に投与する工程を含む肝癌転移抑制または膠芽腫治療方法を提供する。

【0046】

また、本発明は、抗酸化剤を有効成分として含む組成物を個体に投与する工程を含む、心肥大症の予防または治療方法を提供する。

【0047】

また、本発明は、前記修飾核酸の心肥大症抑制における使用を提供する。

【0048】

また、本発明は、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸の肝癌転移抑制および肝癌治療または膠芽腫治療における使用を提供する。

【0049】

また、本発明は、抗酸化剤を有効成分として含む組成物の心肥大症の予防または治療における使用を提供する。

【0050】

また、本発明は、抗酸化剤の、心肥大症治療に用いられる薬剤を生産するための使用を提供する。

【発明の効果】

【0051】

本発明によるＲＮＡ干渉誘導核酸および５’末端から１番目～９番目のヌクレオチドのうち一つ以上のグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ；Ｇ）が８－オキソグアニン（８－ｏｘｏｇｕａｎｉｎｅ；ｏ^８Ｇ）に修飾されたマイクロＲＮＡ核酸と特異的に結合する修飾核酸を用いて、細胞または動物の病理生理学的現象を調節することができる。

【0052】

具体的には、心肥大症、肝癌または膠芽腫などの診断および治療剤開発などに活用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0053】

【図1a】マウス（ｎ＝７）に７５ｍｇ／ｋｇのイソプロテレノール（ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ、ＩＳＯ）を２日ごとに２９日間腹腔内（Ｉ．Ｐ）注射したことを図式化して示したものである。

【図1b】ＩＳＯおよびＮＡＣ処理によるマウス心臓のサイズの変化を確認した図である。

【図1c】ＩＳＯ処理によって生成されたＲＯＳのＲＮＡ酸化作用を確認した図である。

【図1d】ｒＣＭＣ細胞のＰＥまたはＩＳＯ処理によるマイクロＲＮＡのｏ^８Ｇ修飾が、Ａｇｏ２とｏ^８Ｇの免疫蛍光染色で共に示されることで確認した結果を示した図である。

【図1e】Ｈ９ｃ２におけるＰＥまたはＩＳＯ処理によるｏ^８ＧおよびＡｇｏ２の免疫蛍光染色結果を示した図である。

【図1f】Ｈ９ｃ２およびｒＣＭＣ細胞に対してｏ^８Ｇ特異的抗体を使用したドットブロット分析結果を示した図である。

【図1g】ＰＥ処理されたＨ９ｃ２細胞（図１ｇの上段）およびＩＳＯ処理されたマウス心臓（図１ｇの下段）のｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ分析結果を示した図である。

【図1h】ＩＳＯ処理されたマウス心臓からゲル抽出された～２０ｎｔ ｍｉＲＮＡを用いたドットブロット分析の結果を示した図である。

【図2a】ｏ^８Ｇシーケンシング方法（ｏ^８Ｇ－ｍｉＳｅｑ）の模式図を示したものである。

【図2b】ｏ^８Ｇに対する免疫沈降（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ、ＩＰ）最適化プロセスを示した図である。

【図2c】最適化されたＩＰプロセスで得たｏ^８Ｇの量を示した図である。

【図2d】酸化されたｍｉＲＮＡのｃＤＮＡにおけるＧ→Ｔ変異を、制限酵素部位の配列特異的切断によって間接的に（図２ｄの上段）、およびシーケンシングによって直接的に（図２ｄの中間および下段）確認した図である。

【図2e】Ｈ９ｃ２細胞で酸化されたｍｉＲＮＡのｏ^８Ｇ－ｍｉＳｅｑ結果を示した図である。

【図2f】Ｈ９ｃ２細胞に対するＶｏｌｃａｎｏ ｐｌｏｔ分析結果を示した図である。

【図2g】ｒＣＭＣ細胞において酸化されたｍｉＲＮＡのｏ^８Ｇ－ｍｉＳｅｑ結果を示した図である。

【図2h】ｒＣＭＣ細胞およびＨ９ｃ２細胞を血清欠乏に暴露させた後にｏ^８Ｇ－ｍｉＳｅｑ分析した結果を示した図である。

【図2i】同上

【図2j】Ｈ_２Ｏ_２処理されたＨ９ｃ２細胞において酸化されたｍｉＲＮＡのｏ^８Ｇ－ｍｉＳｅｑ結果をＷａｎｇ ＪＸ、２０１５年（Ｗａｎｇ， Ｊ． Ｘ． ｅｔ ａｌ． Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲ－１８４ Ｅｎａｂｌｅｓ Ｉｔ ｔｏ Ｔａｒｇｅｔ Ｂｃｌ－ｘＬ ａｎｄ Ｂｃｌ－ｗ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ５９， ５０－６１）の結果と比較して示した図である。

【図3a】ｒＣＭＣ細胞でＰＥ処理によって酸化誘導されたｍｉＲＮＡの相対的なｏ^８Ｇの量を示した図である。

【図3b】マウス心臓でＩＳＯ処理によって酸化誘導されたｍｉＲ－１の相対的な量およびｏ^８Ｇ ＩＰによるｍｉＲ－１の量を示した図である。

【図3c】酸化されたｍｉＲ－１のｏ^８Ｇ：Ａ塩基配列による標的サイレンシング効果を認した図である。

【図3d】同上

【図3e】ＰＥまたはＨ_２Ｏ_２処理されたＡＣ１６における、ｍｉＲ－１ オキソ部位を有するルシフェラーゼレポーターによる分析結果を示した図である。

【図3f】Ｈ９ｃ２細胞に対してフローサイトメトリーを用い、ＧＦＰによってｍｉＲ－１ ７オキソ部位を有する二重蛍光タンパク質（ｄＦＰ）レポーターを分析した結果を示した図である。

【図3g】Ｈ９ｃ２細胞に対してフローサイトメトリーを用い、ＧＦＰによってｍｉＲ－１シード部位を有する二重蛍光タンパク質（ｄＦＰ）レポーターを分析した結果を示した図である。

【図3h】ＡＣ１６、Ｈ９ｃ２、ｒＣＭＣ、マウス心臓でのｍｉＲ－１発現を示した図である。

【図3i】Ｈ９ｃ２細胞に対してでフローサイトメトリーを用い、ＧＦＰによってｍｉＲ－１ ７オキソ、３ｏｘｏ、２オキソ部位を有する二重蛍光タンパク質（ｄＦＰ）レポーターを分析した結果を示した図である。

【図3j】ｍｉＲ－１ ７オキソ部位を含む、ＧＦＰのサイズ（ｌｏｇ_１０（ＦＳＣ））およびＧＦＰ値（ｌｏｇ_１０（ＧＦＰ））のＨ９ｃ２細胞における分布を示した図である。

【図3k】Ｈ９ｃ２細胞に対してフローサイトメトリーを用いたｄＦＰレポーター定量結果を示した図である。

【図3l】Ｈ９ｃ２細胞に対してｄＦＰレポーター分析を用いた、ｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇ（ＲＦＰ：ＧＦＰ－７オキソ 対 ＲＦＰ：ＧＦＰ、ＮＴ）の活性を実証する図である。

【図3m】Ｈ９ｃ２細胞のＮＡＣ処理によるｄＦＰレポーター分析結果を示した図である。

【図3n】Ｈ９ｃ２細胞に対してフローサイトメトリーを用い、ＲＦＰによってｍｉＲ－１ ７オキソ部位を有するｄＦＰレポーターを分析した結果を示した図である。

【図3o】２５％という最も低いレポーター値（ＲＦＰ）のＨ９ｃ２細胞に限定した細胞集団のみを考慮したｄＦＰレポーター分析結果を示した図である。

【図3p】Ｈ９ｃ２細胞において、２ｏ^８Ｇ、３ｏ^８Ｇ、７ｏ^８Ｇ、およびｍｉＲ－１の存在下でｍｉＲ－１ シード部位を有する、ルシフェラーゼレポーター分析結果を示した図である。

【図4a】ＰＥまたはＮＡＣ処理されたｒＣＭＣ細胞におけるｍｉＲ－１発現の効果を確認した図である。

【図4b】本発明の一実施形態によるｍｉＲ－１：ｏ^８Ｇ（ｍｉＲ－１：２ｏ^８Ｇ、ｍｉＲ－１：３ｏ^８Ｇ、ｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇ）またはｍｉＲ－１：２Ｕ、ｍｉＲ－１：３Ｕ、ｍｉＲ－１：７Ｕを形質導入したｒＣＭＣ細胞の細胞サイズを確認した図である。

【図4c】本発明の一実施形態による酸化されたｍｉＲ－１（ｍｉＲ－１：２ｏ^８Ｇ、ｍｉＲ－１：３ｏ^８Ｇ、ｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇ）またはｍｉＲ－１：Ｕ（ｍｉＲ－１：２Ｕ、ｍｉＲ－１：３Ｕ、ｍｉＲ－１：７Ｕ）を形質導入したＨ９ｃ２の顕微鏡観察結果を示した図である（スケールバー：５０μｍ）。

【図4d】本発明の一実施形態によるＰＥおよびＮＡＣ処理による心臓肥大マーカＡＮＰの発現増加を確認した図である。

【図4e】ｍｉＲ－１：７Ｕを形質導入したＨ９ｃ２細胞のサイズ分布を示した図である。

【図4f】本発明の一実施形態によるｍｉＲ－１：７ｏ^８ＧまたはｍｉＲ－１：７Ｕを形質導入させたｒＣＭＣ細胞（図４ｆの上段）およびＨ９ｃ２細胞（図４ｆの下段）の時間経過イメージを示した図である。

【図4g】本発明の一実施形態によるｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇを尾静脈を通じてマウスに注入した時、生体内で心臓肥大に与える影響（図４ｈの上段）および心臓組織への送達をｑＰＣＲ定量によって確認した結果（図４ｈの下段）を示した図である。

【図4h】本発明の一実施形態によるｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇを生体内で送達したマウス心臓を示した図である。

【図4i】本発明の一実施形態によるｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇをマウスに注入した時の、心室中隔（ＩＳ）の免疫染色結果および心筋細胞とＡＮＰの発現を確認した図である。

【図5a】肝癌細胞であるＨｕｈ７において、ｍｉＲ－１２２のｏ^８Ｇ修飾が２番目と３番目の塩基で発生した時に認識することのできる、標的サイトに対するルシフェラーゼレポーターを行った結果を、Ｈｕｈ７からｍｉＲ－１２２を除去した細胞（Ｈｕｈ７：ｍｉＲ－１２２ ＫＯ）と比較して示した図である。

【図5b】神経膠腫細胞であるＨＳ６８３において、ｌｅｔ－７の４番目の塩基がｏ^８Ｇに修飾された時に認識することのできる、修飾されたｌｅｔ－７の存在を４オキソ部位に対するルシフェラーゼレポーターを使用して確認した結果を示した図である。

【図5c】神経膠腫細胞であるＨＳ６８３からウシ胎児血清を除去して酸化ストレスを与え、ｍｉＲ－１２４の４番目の塩基がｏ^８Ｇに修飾された時に認識することのできる、修飾されたｍｉＲ－１２４の存在を４オキソ部位に対するルシフェラーゼレポーターを使用して確認した結果を示した図である。

【図5d】肝癌細胞であるＨｕｈ７に導入したｏ^８ＧによってｍｉＲ－１２２が酸化修飾されると、細胞遊走が変わり、ｍｉＲ－１２２：２、３ｏ^８Ｇは抗酸化剤処理によってさらに効率的な効果を示すことを観察した結果を示した図である。

【図5e】ｌｅｔ－７の４番目の塩基がｏ^８Ｇに修飾されたｌｅｔ－７ａ：４ｏ^８Ｇを導入したＨＳ６８３（神経膠腫細胞）におけるアポトーシスの機能を確認した結果を示した図である。

【図5f】ｍｉＲ－１２４の４番目の塩基がｏ^８Ｇに修飾されたｍｉｒ－１２４：４ｏ^８Ｇを導入したＨＳ６８３（神経膠腫細胞）におけるアポトーシスの機能を確認した結果を示した図である。

【図6a】ヒト心筋症患者の心臓の左心室由来Ａｇｏ ＨＩＴＳ－ＣＬＩＰの結果を示した図である。

【図6b】Ａｇｏ－ｍＲＮＡクラスターにおけるｏ^８Ｇ：Ａ結合の頻度を確認した図である。

【図6c】本発明の一実施形態によるアンチーシードおよびアンチ－７オキソの塩基配列（図６ｃの上段）、ならびにこれらに対するルシフェラーゼレポーター分析結果（図６ｃの下段）を示した図である。

【図6d】一実施形態によるアンチ－７オキソ（９ｘ）のｍｉＲ－１ ７オキソ標的抑制活性を示した図である。

【図6e】一実施形態によるアンチ－７オキソ（４ｘ）をｒＣＭＣに導入した時に示される心臓肥大抑制効果を確認した図である。

【図6f】一実施形態によるアンチ－７オキソ（４ｘ）ＲＮＡまたはα－ＭＨＣ １３ｘをＩＳＯ－処理マウスに注入した時に示される心臓肥大抑制効果を確認した図である。

【図6g】一実施形態によるアンチ－７オキソ（α－ＭＨＣ １３ｘ）の投与による心筋細胞サイズ（図６ｇの上段）およびｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇ標的抑制効果（図６ｇの下段）を確認した図である。

【図6h】ＩＳＯ処理マウスの心臓におけるＲＯＳ上昇に対して一実施形態によるアンチ－７オキソ（４ｘまたは１３ｘ）の投与が与える影響を確認した図である。

【図6i】一実施形態によるアンチ－７オキソ（α－ＭＨＣ １３ｘ）を発現する形質転換マウスを生成するために設計した組換えベクターを示した図である。

【図6j】図５ｉの組換えベクターで形質転換させたマウスにおけるアンチ－７オキソ（１３ｘ）発現を確認した図である。

【図6k】一実施形態によるアンチ－７オキソ（１３ｘ）で形質転換されたマウスの心臓サイズを確認した図である。

【図6l】一実施形態によるアンチ－７オキソ（１３ｘ）で形質転換されたマウスにおけるｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇ標的の全体的な抑制を確認した図である。

【図6m】一実施形態によるアンチ－７オキソ（１３ｘ）で形質転換されたマウスの心室中隔（ＩＳ）における心筋細胞のサイズ減少を確認した図である。

【図6n】ＲＯＳによって誘導されたｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇの位置特異的酸化およびその心臓肥大誘導過程を示す概略図である。

【図7a】血漿サンプルを得るための一実施形態による心肥大症動物モデルにおいて、心肥大症が成功裏に誘導されたことを確認した図である。

【図7b】図６ａで血漿サンプルを確保した後の実験過程を説明した図である。

【図7c】心肥大症群およびその対照群の血漿サンプルに対してｍｉＲＮＡ－１を測定した結果を示す図である。

【図7d】心肥大症群およびその対照群の血漿サンプルに対してｏ^８Ｇ免疫沈降によって測定すると、心肥大症において酸化修飾されたｍｉｃｒｏＲＮＡ－１（ｍｉＲ－１：ｏ^８Ｇ）が増加することを確認した図である。

【図8a】Ｈ９ｃ２細胞の抗酸化剤（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ、以下、ＮＡＣ）処理によって、ＰＥ誘導性心臓肥大が減少することを免疫染色で確認した図である。

【図8b】ＩＳＯおよびＮＡＣ処理に対する、マウス心臓超音波結果を示した図である。

【図8c】ＰＥおよびＮＡＣ処理したｒＣＭＣおよびＨ９ｃ２細胞のｏ^８Ｇの免疫蛍光染色結果を示した図である。

【図8d】ＰＥまたはＩＳＯで処理して心筋細胞肥大を誘導したＨ９ｃ２細胞をＢＨＡとＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社の細胞培養用抗酸化剤で処理して心筋細胞肥大を抑制した結果を観察した図である。

【図8e】ＰＥ処理によって心筋細胞肥大が誘導されたＨ９ｃ２細胞に対して、ｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇを抑制するための一実施形態によるアンチ－ｍｉＲ－１－７オキソを導入した時、抗酸化剤であるＮＡＣで処理した場合に、心筋細胞肥大が完全に抑制されることを確認した図である。

【発明を実施するための形態】

【0054】

本発明において、用語“ヌクレオチド”は窒素含有ヘテロサイクリック塩基、糖および一つ以上のホスフェート基を含む。これらは核酸配列の単量体単位である。

【0055】

ＲＮＡにおいて糖はリボースであり、ＤＮＡにおいてはデオキシリボース、即ち、リボースに存在するヒドロキシル基を欠如する糖である。窒素含有ヘテロサイクリック塩基はプリンまたはピリミジン塩基であってもよい。プリン塩基は、アデニン（Ａｄｅｎｉｎｅ；Ａ）およびグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ；Ｇ）、およびこれらの修飾された誘導体または類似体を含む。ピリミジン塩基は、シトシン（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ；Ｃ）、チミン（Ｔｈｙｍｉｎｅ；Ｔ）およびウラシル（Ｕｒａｃｉｌ；Ｕ）、およびこれらの修飾された誘導体または類似体を含む。本発明において、前記ヌクレオチドの糖はリボースであり、塩基としてはアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、またはウラシル（Ｕ）を含む。

【0056】

本発明で、用語“標的部位（ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ）”は、マイクロＲＮＡの５’末端を基準にして、２番目から８番目の塩基配列と結合する標的塩基配列を意味する。

【0057】

本発明で、“シード領域（ｓｅｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）”は、マイクロＲＮＡの５’末端基準で１番目から９番目の間の塩基配列を意味する。

【0058】

本発明において、前記“細胞”の種類は脊椎動物、例えば、ヒトをはじめとする哺乳動物（ヒト、猿、マウス、ラット、ハムスター、牛など）、鳥類（鶏、ダチョウなど）、両生類（カエルなど）、および魚類、または無脊椎動物、例えば、昆虫類（カイコ、ガ、ショウジョウバエなど）、植物、酵母のような微生物などが含まれ、好ましくは、ヒトをはじめとする哺乳動物であってもよいが、これに制限されない。

【0059】

本発明で、“心肥大症（ｃａｒｄｉａｃ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ）”は心筋線維が肥大した結果、心重量の増加、心室壁が肥厚した状態を言い、心臓肥大症、心不全症、心線維症（ｃａｒｄｉａｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、僧帽弁閉鎖不全症、大動脈弁閉鎖不全症、拡張型心筋症、虚血性心疾患、心室中隔欠損症、三尖弁閉鎖不全症、肺動脈弁閉鎖不全症、肺動脈高血圧、右心室心筋梗塞、右心室を侵す心筋症、心房中隔欠損症、心房細動、肥大型心筋症または浸潤性心筋症の初期症状であってもよいが、前記疾患以外に心肥大症に関連する疾患であればその種類に制限されない。

【0060】

本発明で、用語“組換え”は、細胞が異種の核酸を複製するか、前記核酸を発現するかまたはペプチド、異種のペプチドまたは異種の核酸コードするタンパク質を発現する細胞を称するものである。組換え細胞は、前記細胞の天然形態では発見されない遺伝子または遺伝子切片を、センスまたはアンチセンス形態のうちの一つに発現することができる。また、組換え細胞は天然状態の細胞で発見される遺伝子を発現することができるが、前記遺伝子は修飾されたものであって、人為的な手段によって細胞内再導入されたものである。

【0061】

本発明で用語“ベクター”は、適した宿主内でＤＮＡの発現を遂行することができる適した調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ構造物を意味する。適した調節配列は、転写を遂行するためのプロモーター、転写を調節するための任意のオペレーター配列、適したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、および転写および翻訳の終結を調節する配列を含む。本発明のベクターは細胞内で複製可能なものであれば特に限定されず、当業界に知られた任意のベクターを用いることができ、例えばプラスミド、コスミド、ファジー粒子、ウイルスベクターであってもよい。

【0062】

本発明で用語“組換えベクター”は、発現させようとする目的ポリペプチドをコードする遺伝子が作動可能に連結されて、組換えベクターが宿主細胞で発現可能なたときに、適切な宿主細胞で前記目的ポリペプチドを高い効率で発現させることができれば、目的ポリペプチドの発現ベクターとして使用することができ得る。宿主細胞は好ましくは真核細胞であってもよく、宿主細胞の種類によってプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｏｒ）、ターミネーター（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）などのような発現調節配列、膜標的化または分泌のための配列などを適切に選択し目的によって多様に組み合わせることができる。

【0063】

本発明で用語“プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｏｒ）”は転写調節因子が結合するＤＮＡ塩基配列部位であって、遺伝子発現を調節する核酸配列を意味し、目的遺伝子の過発現を誘導するためのものである。例えば、本発明の組換えベクターはアルファＭＨＣ（αＭＨＣ）プロモーター、ベータＭＨＣ（βＭＨＣ）プロモーター、Ｎｋｘ２．５プロモーター、心筋トロポニンＴ（ｃａｒｄｉａｃ ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｔ；ＴＮＮＴ２）プロモーター、筋肉クレアチンキナーゼ（ｍｕｓｃｌｅ ｃｒｅａｔｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ；ＭＣＫ）プロモーター、ヒトアルファ骨格アクチン（ｈｕｍａｎ α－ｓｋｅｌｅｔａｌ ａｃｔｉｎ；ＨＡＳ）プロモーター、およびマウス幹細胞ウイルス（ｍｕｒｉｎｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｖｉｒｕｓ；ＭＳＣＶ）プロモーターからなる群より選択されたプロモーターが作動可能に連結されて心筋細胞特異的発現を調節することができ、本発明の一実施形態によれば、アルファＭＨＣ（αＭＨＣ）プロモーターが作動可能に連結されたものであってもよいが、前記プロモーターの種類に制限されない。

【0064】

本発明で前記“心筋細胞特異的”という用語は、心筋細胞以外の細胞では発現されないか低い程度に発現される反面、心筋細胞では非常に高い程度に発現される特徴を意味する。

【0065】

本発明で用語“発現”はポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）が構造遺伝子から生産される過程を称し、前記過程は遺伝子のｍＲＮＡへの転写、およびこのようなｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を含む。

【0066】

本発明で用語“形質転換”は、ベクター形態のＤＮＡを細胞に物理化学的に直接導入するか、ウイルスを宿主細胞に感染させて外来遺伝子を発現させること、即ち、遺伝子を宿主細胞内に導入して宿主細胞内で発現させることによって、生物の遺伝的な性質が変わることを意味する。

【0067】

本発明において、“抗酸化剤”は、活性酸素の過量生産を遮断する物質であって、細胞と組織において酸化的ストレスを防止する役割を果たす。前記抗酸化剤は、細胞内で有害な反応を起こすフリーラジカルがＤＮＡを攻撃するか、脂質を酸化させる前にこれらを中和させる。また、抗酸化剤は、反応性が高く、体内の有害物質と反応して活性酸素による連鎖反応を防止し、細胞を保護する役割を果たす。

【0068】

本発明において、“予防”とは、本発明による組成物の投与によって標的とする病理生理学的現象を抑制させるか発病を遅延させる全ての行為を意味する。

【0069】

本発明において、“治療”とは、本発明による組成物の投与によって標的とする疾患の症状が好転するか有利に変更される全ての行為を意味する。

【0070】

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は約２１個の塩基から構成された小ＲＮＡであって、標的遺伝子の転写後の過程で遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する機能を果たす。マイクロＲＮＡは、主に５’末端に位置するシード領域（ｓｅｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）（１～８位）の塩基配列を通じて数百個の標的ｍＲＮＡを認識し、続いて塩基を配列させ、その発現を抑制して生物学的機能を調節する。したがって、マイクロＲＮＡのシード領域にグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ；Ｇ）から８－オキソグアニン（８－ｏｘｏｇｕａｎｉｎｅ；ｏ^８Ｇ）への修飾が発生する場合、これによって可能になったｏ^８Ｇ：Ａの塩基の配列を通じて、他のｍＲＮＡとの塩基の配列によって新たな標的を抑制することができるので、他の病理生理学的機能を調節することができる。

【0071】

即ち、シード領域に発生した酸化修飾は自然発生または病理発生するマイクロＲＮＡによる標的の認識を調節する機構である可能性があり、これに基づいて、人為的に病理生理学的機能を誘導するか抑制するための技術開発が可能である。以前からＲＮＡで起こる８－オキソグアニン修飾は主に人体の老化過程に関連する疾患群（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ）で多く発生すると知られており、心臓疾患もこれと関連が深い。したがって、８－オキソグアニン修飾に基づく核酸体は、多様な疾病を調節することができる可能性がある。

【0072】

本発明は、核酸の二本鎖のうちの少なくとも一本鎖で、５’末端から１番目～９番目のヌクレオチドとして一つ以上の８－オキソグアニン（８－ｏｘｏｇｕａｎｉｎｅ；ｏ^８Ｇ）を含むＲＮＡ干渉誘導核酸を提供する。

【0073】

前記核酸の二本鎖のうちの少なくとも一本鎖で５’末端から１番目～９番目のヌクレオチドとして一つ以上の８－オキソグアニンを含むことができ、前記核酸の二本鎖全て、即ち、二つの一本鎖全てにおいて５’末端から１番目～９番目のヌクレオチド内に一つ以上の８－オキソグアニンを含むことができる。

【0074】

前記ＲＮＡ干渉誘導核酸はマイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ；ｓｈＲＮＡ）、ＤｓｉＲＮＡ、ｌｓｉＲＮＡ、ｓｓ－ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｅｎｄｏ－ｓｉＲＮＡ、およびａｓｉＲＮＡからなる群より選択できるが、ＲＮＡ干渉を誘導する核酸であれば前記種類に制限されない。

【0075】

一例として、前記５’末端から１番目～９番目のヌクレオチドは、マイクロＲＮＡの配列を含むことができる。

【0076】

一例として、前記マイクロＲＮＡは下記グループ１のマイクロＲＮＡのうちの一つ以上であってもよい：
［グループ１］
ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１８４、ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｍｉＲ－１－３ｐ、ｍｉＲ－１２２、ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－１２４。

【0077】

例えば、前記マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１２２、ｌｅｔ－７またはｍｉＲ－１２４であってもよい。

【0078】

一例として、前記８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）は、マイクロＲＮＡの５’末端から２番目、３番目、４番目、７番目またはこれらの組み合わせに該当する位置に存在してもよい。

【0079】

一例として、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は核酸の二本鎖のうちの少なくとも一本鎖がｍｉＲ－１の５’末端から１番目～９番目のヌクレオチドを含み、このうち一つ以上のグアニン（Ｇ）が８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）で置換されたものであってもよく、例えば、前記８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）は前記ｍｉＲ－１の５’末端から２番目、３番目、７番目またはこれらの組み合わせに該当する位置に存在してもよい。

【0080】

一例として、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は核酸の二本鎖のうちの少なくとも一本鎖がｍｉＲ－１２２の５’末端から１番目～９番目のヌクレオチドを含み、このうち一つ以上のグアニン（Ｇ）が８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）で置換されたものであってもよく、例えば、前記８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）は前記ｍｉＲ－１２２の５’末端から２番目、３番目またはこれらの組み合わせに該当する位置に存在してもよい。

【0081】

一例として、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は核酸の二本鎖のうちの少なくとも一本鎖がｌｅｔ－７またはｍｉＲ－１２４の５’末端から１位～９位のヌクレオチドを含み、このうち一つ以上のグアニン（Ｇ）が８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）で置換されたものであってもよく、例えば、前記８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）は前記ｌｅｔ－７またはｍｉＲ－１２４の５’末端から４位に該当する位置に存在してもよい。

【0082】

前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）の位置でｏ^８Ｇ：Ａ配置が起こって標的サイト（ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ）を認識することができる。

【0083】

一例として、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、下記グループ２のポリヌクレオチドのうちの一つ以上を含むことができる：
［グループ２］
配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド（５’ｐ－Ｕｏ^８ＧＧＡＡＵＧＵＡＡＡＧＡＡＧＵＡＵＧＵＡＵ－３’）；
配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド（５’ｐ－ＵＧｏ^８ＧＡＡＵＧＵＡＡＡＧＡＡＧＵＡＵＧＵＡＵ－３’）；
配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド（５’ｐ－ＵＧＧＡＡＵｏ^８ＧＵＡＡＡＧＡＡＧＵＡＵＧＵＡＵ－３’）；
配列番号６５の塩基配列からなるポリヌクレオチド（５’ｐ－Ｕｏ^８Ｇｏ^８ＧＡＧＵＧＵＧＡＣＡＡＵＧＧＵＧＵＵＵＧ－３’）；
配列番号６６の塩基配列からなるポリヌクレオチド（５’ｐ－ＵＧＡｏ^８ＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＡＧｄＴｄＴ－３’）；
配列番号６７の塩基配列からなるポリヌクレオチド（５’ｐ－ＵＡＡｏ^８ＧＧＣＡＣＧＣＧＧＵＧＡＡＵＧＣｄＴｄＴ－３’）。

【0084】

前述のＲＮＡ干渉誘導核酸を細胞または動物に注入する場合、多様な病理生理学的現象を調節することができ、例えば、心筋肥大、肝癌細胞遊走抑制またはアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）などを誘導することができる。

【0085】

一例として、ｍｉＲ－１の５’末端から１番目～９番目のヌクレオチドを含み、このうち一つ以上のグアニン（Ｇ）が８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）で置換されたＲＮＡ干渉誘導核酸は、細胞または動物に注入された場合、心筋肥大を誘導することができる。

【0086】

一例として、ｍｉＲ－１２２の５’末端から１番目～９番目のヌクレオチドを含み、このうち一つ以上のグアニン（Ｇ）が８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）で置換されたＲＮＡ干渉誘導核酸は、肝癌細胞に注入された場合、肝癌細胞の遊走抑制を誘導することができる。

【0087】

一例として、ｌｅｔ－７またはｍｉＲ－１２４の５’末端から１番目～９番目のヌクレオチドを含み、このうち一つ以上のグアニン（Ｇ）が８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）で置換されたＲＮＡ干渉誘導核酸は、神経膠腫細胞に注入された場合、アポトーシスを誘導することができる。

【0088】

本発明は、前述のＲＮＡ干渉誘導核酸および抗酸化剤を含む組成物を提供する。

【0089】

前記抗酸化剤は、ＲＮＡ干渉誘導核酸のさらなる酸化、即ち、グアニン（Ｇ）から８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）へのさらなる酸化を防止してＲＮＡ干渉誘導核酸がさらに効果的に病理生理学的現象を調節することができるようにする。前記抗酸化剤は、当該分野で一般に使用される抗酸化剤を全て使用することができる。

【0090】

また、本発明は、下記の工程を含む、８－オキソグアニン（８－ｏｘｏｇｕａｎｉｎｅ；ｏ^８Ｇ）の位置同定方法を提供する：
（ａ）細胞からＲＮＡを抽出する工程；
（ｂ）前記抽出したＲＮＡから８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）が含まれているＲＮＡを抗－ｏ^８Ｇ抗体を用いて免疫沈降法（ＩＰ）で分離する工程；
（ｃ）前記分離した８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）が含まれているＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを製造し、８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）の位置を把握するためのシーケンシングライブラリーを製作してシーケンシングする工程；および
（ｄ）前記シーケンシングの結果、グアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ；Ｇ）がチミン（Ｔｈｙｍｉｎｅ；Ｔ）に修飾された位置を確認して、グアニン（Ｇ）が８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）に修飾された位置を同定する工程。

【0091】

前記８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）の位置の同定方法は、ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを製造し、これをシーケンシングすることによって、既存の位置同定方法より正確にグアニン（Ｇ）が８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）に修飾された位置を同定することができる。

【0092】

また、本発明は、５’末端から１番目～９番目のヌクレオチドのうち一つ以上のグアニン（Ｇ）が８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）に修飾されたマイクロＲＮＡと特異的に結合する修飾核酸を提供する。

【0093】

前記修飾核酸は修飾されたマイクロＲＮＡの５’末端から２番目および３番目のうちのいずれか一つのヌクレオチドから始まって６つ以上、例えば、６つ、７つまたは８つの連続したポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含み、

【0094】

前記修飾されたマイクロＲＮＡの５’末端から１番目～９番目のヌクレオチドのうち一つ以上の８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）と結合する位置のヌクレオチドにアデニン（Ａｄｅｎｉｎｅ；Ａ）を含むことができる。

【0095】

一例として、前記修飾核酸は、５’末端から２番目、３番目または７番目のヌクレオチドのうち一つ以上のグアニン（Ｇ）が８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）に修飾されたマイクロＲＮＡと特異的に結合できる。

【0096】

前記修飾核酸は、修飾されたマイクロＲＮＡの５’末端から２番目または３番目のうちのいずれか一つのヌクレオチドから始まって６つ以上の連続したポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含み、

【0097】

前記修飾されたマイクロＲＮＡの５’末端から２番目、３番目または７番目のヌクレオチドのうち一つ以上の８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）と結合する位置のヌクレオチドにアデニン（Ａ）を含むことができる。

【0098】

一例として、前記修飾核酸は５’－ＡＣＡＵＵＣＡ－３’、５’－ＡＣＡＵＵＡＣ－３’、５’－ＡＡＡＵＵＣＣ－３’のうち一つ以上の塩基配列を含むことができるが、これに制限されない。

【0099】

また、本発明は、前述の修飾核酸をコードする遺伝子を含む組換えベクターを提供する。

【0100】

前記組換えベクターはＤＮＡを含むことができ、前記ＤＮＡは本発明の心肥大症抑制のための修飾核酸のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含む。例えば、心肥大症抑制のための修飾核酸の塩基がアデニン（Ａ）である場合にはチミン（Ｔ）塩基、心肥大症抑制のための修飾核酸の塩基がグアニン（Ｇ）である場合にはシトシン（Ｃ）塩基、心肥大症抑制のための修飾核酸の塩基がシトシン（Ｃ）である場合にはグアニン（Ｇ）塩基、心肥大症抑制のための修飾核酸の塩基がウラシル（Ｕ）である場合にはアデニン（Ａ）塩基を含むことができる。

【0101】

また、本発明は、前述の修飾核酸または前記組換えベクターを含む心肥大症治療用薬学組成物を提供する。

【0102】

一例として、前記心肥大症治療用薬学組成物は、５’末端から１番目～９番目のヌクレオチドのうち一つ以上のグアニン（Ｇ）が８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）に修飾されたマイクロＲＮＡと特異的に結合する修飾核酸を含むことができる。

【0103】

前記修飾核酸が特異的に結合する前記修飾されたマイクロＲＮＡは、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１８４、ｌｅｔ－７ｆ－５ｐまたはｍｉＲ－１－３ｐのうちのいずれか一つが修飾されたものであってもよい。

【0104】

前記修飾されたマイクロＲＮＡは、例えば、ｍｉＲ－１が修飾されたものであってもよく、例えば、ｍｉＲ－１の５’末端から２番目、３番目、７番目またはこれらの組み合わせに該当する位置のグアニン（Ｇ）が修飾されたものであってもよい。

【0105】

一例として、前記心肥大症治療用薬学組成物は、抗酸化剤をさらに含むことができる。前記抗酸化剤は当該分野で一般に使用される抗酸化剤を全て使用することができ、例えば、ＮＡＣ、ＢＡＨまたは細胞培養用抗酸化剤（Ａ１３４５；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をさらに使用することができるが、これに制限されない。

【0106】

また、本発明は、前述のＲＮＡ干渉誘導核酸を含む肝癌治療用または膠芽腫治療用薬学組成物を提供することができる。

【0107】

一例として、前記肝癌治療用薬学組成物は核酸の二本鎖のうちの少なくとも一本鎖がｍｉＲ－１２２の５’末端から１番目～９番目のヌクレオチドを含み、このうち一つ以上のグアニン（Ｇ）が８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）で置換されたＲＮＡ干渉誘導核酸を含むことができる。

【0108】

例えば、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、ｍｉＲ－１２２の５’末端から１番目～９番目のヌクレオチドのうち５’末端から２番目、３番目またはこれらの組み合わせに位置するグアニン（Ｇ）が８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）で置換された塩基配列を含む一本鎖を含むことができる。

【0109】

一例として、前記膠芽腫治療用薬学組成物は、核酸の二本鎖のうちの少なくとも一本鎖がｌｅｔ－７またはｍｉＲ－１２４の５’末端から１番目～９番目のヌクレオチドを含み、このうち一つ以上のグアニン（Ｇ）が８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）で置換されたＲＮＡ干渉誘導核酸を含むことができる。

【0110】

例えば、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、ｌｅｔ－７またはｍｉＲ－１２４の５’末端から１番目～９番目のヌクレオチドのうち５’末端から４番目に位置するグアニン（Ｇ）が８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）で置換された塩基配列を含む一本鎖を含むことができる。

【0111】

一例として、前記肝癌治療用薬学組成物はＲＮＡ干渉誘導核酸以外にも抗酸化剤をさらに含むことができ、前記膠芽腫治療用薬学組成物も同様にＲＮＡ干渉誘導核酸以外に抗酸化剤をさらに含むことができる。前記抗酸化剤は一般に使用される抗酸化剤を意味し、例えば、ＮＡＣ、ＢＡＨまたは細胞培養用抗酸化剤（Ａ１３４５；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用することができるが、これに制限されない。

【0112】

前記肝癌治療用または膠芽腫治療用薬学組成物は抗酸化剤をさらに含むことによって、ＲＮＡ干渉誘導核酸が細胞内の活性酸素によって他のグアニン（Ｇ）が追加的に酸化することを防止してその機能を極大化することができる。

【0113】

本発明による薬学組成物は、それぞれ通常の方法により多様な形態に剤形化して使用することができる。例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップなどの経口型剤形に剤形化することができ、クリーム、ゲル、パッチ、噴霧剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、リニメント剤、パスタ剤またはカタプラズマ剤などの皮膚外用剤、坐剤および滅菌注射液の形態に剤形化して使用することができる。

【0114】

本発明による薬学組成物は、薬学組成物の製造に通常使用する適切な担体、賦形剤および希釈剤をさらに含むことができる。この時、組成物に含まれる担体、賦形剤および希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、オリゴ糖、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アラビアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート、および鉱物油が挙げられる。製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調製される。経口投与のための固形製剤には錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は前記抽出物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、カルシウムカーボネート（ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混合して調製される。また、単純な賦形剤以外にマグネシウムスチレートタルクのような潤滑剤も使用される。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当し、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外にの様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などを含むことができる。非経口投与のための製剤には滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどを使用することができる。坐剤の基剤としては、ウィテプソール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ｔｗｅｅｎ ６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを使用することができる。

【0115】

本発明の薬学組成物は目的とする方法によって経口投与するか非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）することができ、投与量は患者の状態および体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路および時間によって異なるが、当業者によって適切に選択できる。

【0116】

本発明の薬学組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明において“薬学的に有効な量”は医学的治療に適用可能な合理的な恩恵／危険比率で疾患を治療することに十分な量を意味し、有効容量レベルは患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路および排出比率、治療期間、同時使用される薬物を含む要素およびその他医学分野によく知られた要素によって決定することができる。本発明による薬学的組成物は個別治療剤として投与するか他の治療剤と併用して投与されてもよく、従来の治療剤とは順次的または同時に投与されてもよく、単一または多重投与されてもよい。前記要素を全て考慮して副作用なく最小限の量で最大効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは当業者によって容易に決定できる。投与は一日に１回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。

【0117】

また、本発明は、抗酸化剤を有効成分として含む心肥大症予防または治療用薬学組成物であって、前記抗酸化剤はマイクロＲＮＡの５’末端基準１番目～９番目のヌクレオチドのうち一つ以上のグアニン（Ｇ）の８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）への酸化修飾を抑制する、薬学組成物を提供する。

【0118】

本発明において、前記抗酸化剤はグアニン（Ｇ）塩基が８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）に酸化修飾されることを抑制する役割を果たし、例えば、Ｎ－アセチルシステイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ、ＮＡＣ）、ブチルヒドロキシアニソール（Ｂｕｔｙｌａｔｅｄ ｈｙｄｒｏｘｙａｎｉｓｏｌｅ、ＢＨＡ）、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ、Ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ）、グルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）、ウレート（ｕｒａｔｅ）、ビリルビン（ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ）、ビタミンＥ、カロチノイド（ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ）、ユビキノール（ｕｂｉｑｕｉｎｏｌ、Ｃｏ－Ｑ１０）、フラボノイド（ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ）、抗酸化酵素であるＳＯＤ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）、カタラーゼ（ｃａｔａｌａｓｅ）、グルタチオンペルオキシダーゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＧＳＨ－ＰＸ）、グルタチオンレダクターゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、グルタチオントランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ＳＯＤ模写体（ＣｕＤＩＯＳ）、エブセレン（ｅｂｓｅｌｅｎ）、ラザロイド（ｌａｚａｒｏｉｄｓ、２１－ａｍｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄｓ）、捕獲性オレフィン（ｃａｐｔｏｄａｔｉｖｅ ｏｌｅｆｉｎｓ）、α－リポ酸（α－ｌｉｐｏｉｃ ａｃｉｄ）とジヒドロリポ酸（ｄｉｈｙｄｒｏｌｉｐｏｉｃ ａｃｉｄ）（ＤＨＬＡ）、５－ＨＴＰ（ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）、ＤＨＥＡ（ｄｅｈｙｄｒｏｅｐｉａｎｄｒｏｓｔｅｒｏｎｅ）、アミノ酸、薬草抗酸化剤（ｈｅｒｂａｌ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ）、およびミネラルからなる群より選択される一つ以上であってもよく、本発明の一実施形態によれば、Ｎ－アセチルシステイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ、ＮＡＣ）またはブチルヒドロキシアニソール（Ｂｕｔｙｌａｔｅｄ ｈｙｄｒｏｘｙａｎｉｓｏｌｅ、ＢＨＡ）であってもよいが、前記抗酸化剤の種類に制限されない。

【0119】

一例として、前記マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１８４、ｌｅｔ－７ｆ－５ｐまたはｍｉＲ－１－３ｐであってもよい。

【0120】

また、本発明は、動物の心筋細胞から分離されたマイクロＲＮＡのヌクレオチドのうち一つ以上のグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ；Ｇ）が８－オキソグアニン（８－ｏｘｏｇｕａｎｉｎｅ；ｏ^８Ｇ）に修飾されているかどうかを確認する工程；および
前記マイクロＲＮＡのヌクレオチドのうち一つ以上のグアニン（Ｇ）が８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）に修飾されている場合、心肥大症に分類する工程を含む、
心肥大症診断のための情報提供方法を提供する。

【0121】

本発明で、“診断”は、病理状態の存在または特徴を確認することを意味する。本発明の目的上、診断は、心肥大症の発病有無を確認することである。

【0122】

一例として、前記ヌクレオチドは、マイクロＲＮＡの５’末端から１番目～９番目のヌクレオチドであってもよい。

【0123】

一例として、前記ヌクレオチドは、マイクロＲＮＡの５’末端から２番目、３番目または７番目のヌクレオチドであってもよい。

【0124】

一例として、前記マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１８４、ｌｅｔ－７ｆ－５ｐまたはｍｉＲ－１－３ｐであってもよい。

【0125】

また、本発明は、（ａ）前記心肥大症抑制のための修飾核酸をコードする遺伝子をプロモーターに作動可能に連結して組換えベクターを製作する工程；
（ｂ）前記組換えベクターを動物の受精卵に導入させる工程；および
（ｃ）前記受精卵を代理母に移植した後、受精卵を発生させて形質転換動物モデルを得る工程を含む、ヒトを除いた心肥大症抵抗性動物モデルの製作方法および前記方法で製作されたヒトを除いた心肥大症抵抗性動物モデルを提供する。

【0126】

一例として、前記マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１８４、ｌｅｔ－７ｆ－５ｐまたはｍｉＲ－１－３ｐであってもよく、例えば、ｍｉＲ－１であってもよい。

【0127】

例えば、前記動物は、非ヒトである霊長類、マウス、犬、猫、ウサギ、馬、または牛であってもよい。

【0128】

本発明の一実施形態によれば、前記動物はマウスであってもよいが、ヒトを除いた哺乳類であればその種類に特に制限がない。

【0129】

本発明において、ベクター形態のＤＮＡを細胞に導入する方法としては特に制限がなく、例えば、ヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）、一過性形質導入（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、細胞融合、リポソーム仲介形質導入（ｌｉｐｏｓｅｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、ポリブレン仲介形質導入（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、リン酸カルシウムを用いた形質導入（Ｇｒａｈａｍ、ＦＬら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６（１９７３））、ＤＥＡＥデキストランによる形質導入、微細注射による形質導入（Ｃａｐｅｃｃｈｉ、ＭＲ、Ｃｅｌｌ、２２：４７９（１９８０））、陽イオン性脂質による形質導入（Ｗｏｎｇ、ＴＫら、Ｇｅｎｅ、１０：８７（１９８０））、電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ Ｅら、ＥＭＢＯ Ｊ、１：８４１（１９８２））、形質導入またはトランスフェクションのように文献（Ｂａｓｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｄａｖｉｓら、１９８６およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｄａｖｉｓら、１９８６）に記載されているように本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者によく公知されている方法によって行うことができる。

【0130】

また、本発明は、（ａ）心肥大症動物モデルの心筋細胞を候補物質で処理する工程；
（ｂ）前記心肥大症動物モデルの心筋細胞で発現されるマイクロＲＮＡのヌクレオチドのうち、グアニン（Ｇ）が８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）に修飾される頻度を分析する工程；および
（ｃ）候補物質による処理をしない場合と比べて、前記８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）が減少する場合、前記候補物質を心肥大症治療剤として選別する工程を含む、心肥大症治療用候補物質のスクリーニング方法を提供する。

【0131】

本発明において、前記候補物質とは、心肥大症動物モデルの心筋細胞における前記ポリヌクレオチドとｏ^８Ｇ：Ａ配置標的部位との結合頻度に影響を与えるかどうかを検査するためのスクリーニングに用いられる未知の物質を意味し、化学物質、タンパク質、（ポリ）ヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ）、または天然物抽出物などが含まれるが、これに制限されない。

【0132】

本発明において、前記候補物質は抗酸化剤であってもよいが、これに制限されない。

【0133】

また、本発明は、前記修飾核酸を個体に投与する工程を含む、心肥大症抑制方法を提供する。

【0134】

また、本発明は、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸を個体に投与する工程を含む、肝癌転移抑制または膠芽腫治療方法を提供する。

【0135】

また、本発明は、抗酸化剤を有効成分として含む組成物を個体に投与する工程を含む、心肥大症予防または治療方法を提供する。

【0136】

本発明において、“個体”とは、心肥大症抑制のための修飾核酸または肝癌治療または膠芽腫治療のためのＲＮＡ干渉誘導核酸または抗酸化剤を含む組成物の投与を必要とする対象を意味し、より具体的には、ヒトまたはヒト以外の霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）、犬、猫、馬および牛などの哺乳類を意味する。

【0137】

本発明において、“投与”とは、任意の適切な方法で個体に所定の本発明の心肥大症抑制のための修飾核酸または肝癌治療または膠芽腫治療のためのＲＮＡ干渉誘導核酸または抗酸化剤を含む組成物を提供することを意味する。

【0138】

また、本発明は、前記修飾核酸の心肥大症抑制における使用を提供する。

【0139】

また、本発明は、前記ＲＡＮ干渉誘導核酸の肝癌転移抑制および肝癌治療または膠芽腫治療における使用を提供する。

【0140】

また、本発明は、抗酸化剤を有効成分として含む組成物の心肥大症予防または治療における使用を提供する。

【0141】

以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例によって本発明の内容が限定されるのではない。

【実施例】

【0142】

実施例１．細胞培養、薬物処理および形質導入
１．細胞培養
ラット（ｒａｔ）心筋芽細胞株Ｈ９ｃ２（Ｈ９ｃ２（２－１）、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１４４６；Ｈ９ｃ２、韓国細胞株銀行）、ヒト心室心筋細胞株ＡＣ１６（Ｊ．Ｈａｎ、Ｈ．－Ｗ．Ｌｅｅ、およびＷ．Ｊ．Ｐａｒｋ提供）、およびヒト子宮頸部腺癌細胞株ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２）を１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、Ｗｅｌｇｅｎｅ）が補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）で３７℃、５％ＣＯ_２の培養条件で成長させた。

【0143】

結果の一貫性のために、二つの互いに異なる施設（ＡＴＣＣおよび韓国細胞株銀行）で維持されたＨ９ｃ２の様々の異なるバッチ（ｂａｔｃｈ）を使用し、ＡＣ１６はＤｒ．Ｍ．Ｍ．Ｄａｖｉｄｓｏｎから提供を受けてたもの（ｓｃｃ１０９、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）から誘導した異なるバッチのそれぞれから得た。

【0144】

ラット新生児心筋細胞（ｒＣＭＣ）の１次培養は製造会社のプロトコールによりＮｅｏｍｙｔ ｋｉｔ（ｎｃ－６０３１；Ｃｅｌｌｕｔｒｏｎ）を使用してＳｅｏｋ、Ｈ．Ｙ．ｅｔ ａｌ． Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ １１４、１５８５－１５９５．およびＨｕａｎｇ、Ｚ．Ｐ．ｅｔ ａｌ． Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ １１２、１２３４－１２４３．に前述の通り準備した。

【0145】

即ち、出生後１日（Ｐ１）にＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット心臓由来心室組織を収集した後、洗浄して３～４ｍｍの片に切断し、３７℃で５０ｍｌフラスコで攪拌し、繰り返しの酵素反応（Ｎｅｏｍｙｔ ｋｉｔによって提供された溶液）によって心室片由来細胞を完全に分離させた。ストレイナーを用いて得られた上層液から消化されなかった組織を除去した後、初めに２時間プレーティングして容易に付着する非心筋細胞を除去した。最後に、付着しないｒＣＭＣを回収し、１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、５％のウマ血清（ＨＳ；Ｗｅｌｇｅｎｅ）、２％のＬ－グルタミン（Ｗｅｌｇｅｎｅ）、０．１ｍＭの５－ブロモ－２’－デオキシウリジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１００Ｕ ｍｌ^－１のペニシリン、および１００μｇ ｍｌ^－１のストレプトマイシン（Ｗｅｌｇｅｎｅ）が補充された、ＤＭＥＭ：Ｍ１９９（Ｗｅｌｇｅｎｅ）の４：１混合物と共にＳｕｒｅＣｏａｔ（ｓｃ－９０３５；Ｃｅｌｌｕｔｒｏｎ）培養プレートで維持した。

【0146】

２．薬物処理
アドレナリン性肥大を誘導するために、別途指示されない限り、ｒＣＭＣ、Ｈ９ｃ２またはＡＣ１６を２００μＭのフェニレフリン（ｐｈｅｎｙｌｅｐｈｒｉｎｅ、ＰＥ）または１０μＭのイソプロテレノール（ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ、ＩＳＯ）で通常通り処理し、処理から４８時間後に検査した。血清欠乏を心筋肥大に対する前処理条件として使用する場合もあるため、処理２４時間前にＦＢＳおよびＨＳのない同じ培地に交換した。酸化防止剤で処理する場合、ＰＥまたはＩＳＯによる処理の間、２ｍＭのＮ－アセチルシステイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ、ＮＡＣ）を適用した。

【0147】

３．形質導入
一般に、Ｈ９ｃ２、ＡＣ１６、ｒＣＭＣまたはＨｅＬａ細胞内への二重ｍｉＲＮＡを有するベクターの形質導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）または同時形質導入（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００または３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行われるが、その反面、ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ阻害剤（５０ｎＭ）の形質導入はＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、製造会社が提供した一般的なプロトコールにより行った。最大効率を達成するために、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ＩＩ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して正確な細胞数を計数し、形質導入前にプレートに分注した。

【0148】

実施例２．ＲＯＳおよび細胞サイズの測定
細胞ＲＯＳレベルの定量的測定のために、ＲＯＳ蛍光染料およびジヒドロエチジウム（ｄｉｈｙｄｒｏｅｔｈｉｄｉｕｍ、ＤＨＥ）に基づくフローサイトメトリー法をＭｕｓｅ Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｓｔｒｅｓｓ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）と共にＭｕｓｅ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を使用して実施した。即ち、薬物処理前日にＨ９ｃ２またはＡＣ１６細胞を１０^６細胞／６ウエルプレートの密度で分注した。処理後１０分から４８時間まで細胞を回収し、製造会社のプロトコールに従って、固定、染色、および測定を繰り返した（ｎ＝３。分析のために、同じ数の細胞（ｎ＝１０，０００）をＲＯＳレベルおよび細胞サイズの両方ともに対して定量した。細胞サイズとしてＦＳＣ（フォワード－Ｓｃａｔｔｅｒｅｄ Ｌｉｇｈｔ）を製造会社のプロトコールにより測定した（ｌｏｇ_１０（ＦＳＣ）、ｙ軸；肥大、細胞サイズ＞３）。

【0149】

心臓組織溶解物中のＲＯＳ量を測定するために、ＣＭ－Ｈ_２ＤＣＦＤＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。プロテアーゼ阻害剤（ｃＯｍｐｌｅｔｅ、Ｍｉｎｉ、ＥＤＴＡ－ｆｒｅｅ；Ｒｏｃｈｅ）および２．５ｍＭのデフェロキサミンメシル酸塩（ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ ｍｅｓｙｌａｔｅ、ＤＦＯＭ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した１ｘＲＩＰＡ溶解緩衝液（ＤｙｎｅＢｉｏ）で製造された溶解物のホモジェネートについて、Ｑｕｂｉｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してタンパク質を定量化した。１００μｇの溶解物を２μＭのＣＭ－Ｈ_２ＤＣＦＤＡと共に暗所、３７℃で３０分間インキュベートした。蛍光信号はＱｕｂｉｔ ２．０ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって検出した。

【0150】

細胞ＲＯＳレベルを視覚化するために、ＤＨＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が使用された。最初に、Ｈ９ｃ２細胞を２４時間、血清欠乏させ、指定の時間まで１００μＭのＰＥで処理した。その後、回収した細胞を無血清ＤＭＥＭで洗浄し、１０μＭのＤＨＥと共に、光を避けながら１０分間、３７℃でインキュベートし、インキュベート後に細胞を無血清ＤＭＥＭで再び洗浄した。ＲＯＳイメージは倒立蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭｉ８）を使用して得た。

【0151】

実施例３．免疫蛍光染色（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）
Ｈ９ｃ２またはｒＣＭＣを４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ；Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ）で１５分間、室温で固定した。これを０．１％のＮＰ－４０（Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＰＢＳ（Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ）で２回洗浄した後、サンプルを５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｂｏｖｏｇｅｎ）を添加して室温で１時間インキュベートした。その後、２回洗浄し、次の条件で一次抗体と共にインキュベートした：０．１％のＮＰ－４０および３％のＢＳＡ、ＭＦ２０（１：１０００、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）、ｏ^８Ｇ（１５Ａ３、１：１０００、ＱＥＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＡｇｏ２（ａｂ５０７２、１：２００、Ａｂｃａｍ）を含むＰＢＳで４℃で一晩。ＤＡＰＩ（１．５μｇ／ｍｌ、Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂ）は核染色に使用した。（全てのＨ９ｃ２細胞が心筋細胞と同一な系統にあるにもかかわらず）Ｈ９ｃ２心筋芽細胞における細胞運命の不均質性のため、ＭＦ２０を使用して心筋細胞を染色した。ＲＮａｓｅの処理のために、一次抗体とインキュベートする前に１０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を室温で１５分間使用し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ロバ抗体マウスＩｇＧ（１：１０００、Ａｂｃａｍ）およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４ ロバ抗ウサギＩｇＧ（１：１０００、Ａｂｃａｍ）を０．１％のＮＰ－４０を含むＰＢＳ中の２次抗体として、室温で１時間使用した。染色された細胞は倒立蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭｉ８）で調査し、Ｌｅｉｃａ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｕｉｔｅ（ＬＡＳ）で分析し、ＩｍａｇｅＪ（≧１００ｃｅｌｌｓ、ｈｔｔｐｓ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）で定量化した。

【0152】

実施例４．細胞サイズの測定
培養液または組織切片から細胞サイズをＩｍａｇｅＪ １．５１ｓソフトウェア（ｈｔｔｐｓ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）の“測定”機能を使用して定量した。様々なイメージで一貫した比較のために全てのイメージを３５．５６×２６．６７ｉｎｃｈ^２に該当する２５６０×１９６２ピクセルのサイズに変換した。その次に、変換されたイメージで細胞面積をｉｎｃｈ^２（７１．９ ｐｉｘｅｌ／ｉｎｃｈ）の単位で測定し、次の分析に使用した。

【0153】

実施例５．ＲＮＡ合成および修飾
ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＵＳＡ）、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＵＳＡ）、ＳＴ Ｐｈａｒｍ（Ｋｏｒｅａ）およびＢｉｏｎｅｅｒ（Ｋｏｒｅａ）の注文型合成および修飾サービスを使用して多様な修飾を有するＲＮＡを生産し、その品質を質量分析を通じてモニタリングおよび確認した。

【0154】

リボヌクレオチド内の８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）をｍｉＲ－１（５’ｐ－ＵＧＧＡＡＵＧＵＡＡＡＧＡＡＧＵＡＵＧＵＡＵ－３’；配列番号７）の表示された位置に導入した：ｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇ、５’ｐ－ＵＧＧＡＡＵｏ^８ＧＵＡＡＡＧＡＡＧＵＡＵＧＵＡＵ－３’（配列番号３）；ｍｉＲ－１：２ｏ^８Ｇ、５’ｐ－Ｕｏ^８ＧＧＡＡＵＧＵＡＡＡＧＡＡＧＵＡＵＧＵＡＵ－３’（配列番号１）；ｍｉＲ－１：３ｏ^８Ｇ、５’ｐ－ＵＧｏ^８ＧＡＡＵＧＵＡＡＡＧＡＡＧＵＡＵＧＵＡＵ－３’（配列番号２）。

【0155】

酸化された誘導体を含むｍｉＲ－１の二本鎖（ｄｕｐｌｅｘ）は、合成されたｍｉＲ－１パセンジャー鎖（５’ｐ－ＡＣＡＵＡＣＵＵＣＵＵＵＡＵＡＵＧＣＣＣＡＵＡ－３’（配列番号８）にアニーリングすることによって、下記条件でｉｎ ｖｉｔｒｏで生成し、移動が確認されたら、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を５’末端に付着した：９０℃で２分、３０℃で１時間、および４℃で５分間。

【0156】

また、リボヌクレオチド内の８－オキソグアニン（ｏ^８Ｇ）をｍｉＲ－１２２（５’ｐ－ＵＧＧＡＧＵＧＵＧＡＣＡＡＵＧＧＵＧＵＵＵＧ－３’；配列番号６８）、ｌｅｔ－７（５’－ｐＵＧＡＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＡＧｄＴｄＴ－３’；配列番号６９）およびｍｉＲ－１２４（５’－ｐＵＡＡＧＧＣＡＣＧＣＧＧＵＧＡＡＵＧＣｄＴｄＴ－３’；配列番号７０）の表示された位置に次のようにして導入した。ｍｉＲ－１２２：２、３ｏ^８Ｇ、５’ｐ－Ｕｏ^８Ｇｏ^８ＧＡＧＵＧＵＧＡＣＡＡＵＧＧＵＧＵＵＵＧ－３’（配列番号６５）；ｌｅｔ－７：４ｏ^８Ｇ：５’ｐ－ＵＧＡｏ^８ＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＡＧｄＴｄＴ－３’（配列番号６６）；ｍｉＲ－１２４：４ｏ^８Ｇ、５’－ｐＵＡＡｏ^８ＧＧＣＡＣＧＣＧＧＵＧＡＡＵＧＣｄＴｄＴ－３’（配列番号６７）。

【0157】

酸化された誘導体を含むｍｉＲ－１２２、ｌｅｔ－７およびｍｉＲ－１２４の二本鎖（ｄｕｐｌｅｘ）はｍｉＲ－１の二本鎖（ｄｕｐｌｅｘ）と同様な方法で製作された。

【0158】

表示された位置にＧ→Ｕへの置換を含むｍｉＲ－１も合成し（ｍｉＲ－１：２ＧＵ、５’ｐ－ＵＵＧＡＡＵＧＵＡＡＡＧＡＡＧＵＡＵＧＵＡＵ－３’（配列番号９）；ｍｉＲ－１：３ＧＵ、５’ｐ－ＵＧＵＡＡＵＧＵＡＡＡＧＡＡＧＵＡＵＧＵＡＵ－３’（配列番号１０）；ｍｉＲ－１：７ＧＵ、５’ｐ－ＵＧＧＡＡＵＵＵＡＡＡＧＡＡＧＵＡＵＧＵＡＵ－３’（配列番号１１））、ｍｉＲ－１のパッセンジャー鎖で二本鎖化された。対照のｍｉＲＮＡとして、ｃｅｌ－ｍｉＲ－６７（Ｄ．Ｄｈａｒｍａｃｏｎによって陰性対照として提供されたＣ．ｅｌｅｇａｎｓ－特異的ｍｉＲＮＡ）に由来した非標的ｍｉＲＮＡ（ＮＴ）５’－ＵＣＡＣＡＡＣＣＵＣＣＵＡＧＡＡＡＧＡＧＵＡ－３’；配列番号１２）をｓｉＲＮＡとして合成し、二本鎖（ガイド鎖：５’ｐ－ＵＣＡＣＡＡＣＣＵＣＣＵＡＧＡＡＡＧＡＧＵＡｄＴｄＴ－３’（配列番号１３）、パッセンジャー鎖：５’ｐ－ＵＡＣＵＣＵＵＵＣＵＡＧＧＡＧＧＵＵＧＵＧＡｄＴｄＴ－３’（配列番号１４）、‘ｄＴ’はチミジンデオキシヌクレオチドを示す）として使用した。シード仲介オフ－ターゲット効果を排除する場合、ＮＴは以前に報告されたようにガイドおよびパッセンジャー鎖の両方ともで６位にｄＳｐａｃｅｒ（脱塩基デオキシヌクレオチド（ａｂａｓｉｃ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）；φ）を含むか、１位および２位に２’－Ｏ－メチルを含むように追加的に修飾された。

【0159】

ｏ^８Ｇで誘導したＧ→Ｔ突然変異を確認するために、ＲＴ－ＰＣＲの際にｏ^８Ｇ：Ａ塩基結合を通じて潜在的なＥｃｏＲ１部位を生成する３９－オキソ－Ｒ（ｏ^８Ｇ；５’－ＣＣＵＧＧＵＣＣＣＡＧＡＣＵＡＡＡＧＡＡＵｏ ^８ ＧＣＵＵＧＡＣＡＧＵＵＡＵＣＵＣＧＵＡＵＧＣＣＧＵＣＵＵＣＵＣＧＡＧＧＵＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＵＧＡＧＣＵＵＵＧＡＡＧＵ－３’；配列番号１５）、およびその対照として３９Ｒ（Ｇ；５’－ＣＣＵＧＧＵＣＣＣＡＧＡＣＵＡＡＡＧＡＡＵＧＣＵＵＧＡＣＡＧＵＵＡＵＣＵＣＧＵＡＵＧＣＣＧＵＣＵＵＣＵＣＧＡＧＧＵＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＵＧＡＧＣＵＵＵＧＡＡＧＵ－３’；配列番号１６）を合成した。スパイクイン（Ｓｐｉｋｅ－ｉｎ）の対照としてｏ^８Ｇスパイクイン（５’ｐ－Ｕｏ ^８ Ｇｏ ^８ ＧＡＡＵＧＵＡＡＡＧＡＡＧＵＡＵＧＵＡＵ－３’；配列番号１７）、Ｇスパイクイン（５’ｐ－ＵＧＧＡＡＵＧＵＡＡＡＧＡＡＧＵＡＵＧＵＡＵ－３’；配列番号１８）、およびｍｉＲＮＡ：ｏ^８Ｇスパイクイン（５’ｐ－ＵＡＡＧｏ ^８ ＧＣＡＣＧＣＧＧＵＧＡＡＵＧＣＣＡＡ－３’；配列番号１９）を合成した。

【0160】

競合的ｍｉＲ－１およびｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇ阻害剤の場合、アンチ－シード（２ｘ：５’－ｄＴｄＴφＡＣＡＵＵＣＣＡφＡＣＡＵＵＣＣＡφｄＴｄＴ－３’（５’－ＡＣＡＵＵＣＣ－３’はｍｉＲ－１シード部位；配列番号２０））、アンチ－７オキソ（２ｘ：５’－ｄＴｄＴφＡＡＡＵＵＣＣＡφＡＡＡＵＵＣＣＡφｄＴｄＴ－３’、４ｘ：５’－ｄＴＡＡＡＵＵＣＣＡＡＡＵＵＣＣＡＧＡＡＡＵＵＣＣＡＣＡＡＡＵＵＣＣＡｄＴ－３’、９ｘ：５’－ｄＮｄＮφＡＡＡＵＵＣＣＡφＡＡＡＵＵＣＣＡφＡＡＡＵＵＣＣＡφＡＡＡＵＵＣＣＡφＡＡＡＵＵＣＣＡφＡＡＡＵＵＣＣＡφＡＡＡＵＵＣＣＡφＡＡＡＵＵＣＣＡφＡＡＡＵＵＣＣＡφｄＮｄＮ－３’；‘ｄＮ’はジオキシヌクレオチド、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧを示す（５’－ＡＡＡＵＵＣＣ－３’はｍｉＲ－１ ７オキソ部位；配列番号６））、対照（アンチ－ＮＴ；２ｘ：５’－ｄＴｄＴφＧＧＵＵＧＵＧＡφＧＧＵＵＧＵＧＡφｄＴｄＴ－３’、４ｘ：５’－ｄＴＧＧＵＵＧＵＧＧＧＵＵＧＵＧＡＧＧＧＵＵＧＵＧＡＣＧＧＵＵＧＵＧＡｄＴ－３’、９ｘ：５’－ｄＮｄＮφＧＧＵＵＧＵＧＡφＧＧＵＵＧＵＧＡφＧＧＵＵＧＵＧＡφＧＧＵＵＧＵＧＡφＧＧＵＵＧＵＧＡφＧＧＵＵＧＵＧＡφＧＧＵＵＧＵＧＡφＧＧＵＵＧＵＧＡφＧＧＵＵＧＵＧＡφｄＮｄＮ－３’（５’－ＧＧＵＵＧＵＧ－３’は対照ＮＴ部位；配列番号２１）を合成した。阻害剤の５’および３’末端の両方ともで“ｄＴ”または“ｄＮ”を意図的にＲＮＡ安定性に寄与するように付着した。接合（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）部の推定配列によるオフ－ターゲット効果を防止するために、アンチーシード（２ｘ）またはアンチ－７オキソ（２ｘ）の標的部位の接合部に脱塩基（ａｂａｓｉｃ）デオキシヌクレオチド（φ）を導入することによって、脱塩基デオキシヌクレオチドのない阻害剤の表現型に差がないのを確認した。前記配列の下線は対応する標的阻害部位を示す。

【0161】

実施例６．ＲＮＡ抽出
サイズによってＲＮＡを精製するためにｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して製造会社が提供したプロトコールにより小さな（＜～２００ｎｔ）および大きな（＞約２００ｎｔ）ＲＮＡ画分を分離した。心臓組織サンプルの場合、Ｍｉｎｉｌｙｓ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（Ｂｅｒｔｉｎ）またはｇｌａｓｓ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒを７００μｌのＱｉａｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）の存在下で使用し、以前に報告された試験管内酸化を防止するために、２．５ｍＭのＤＦＯＭ（Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ）で補充した。総ＲＮＡ精製のために、２０％のクロロホルム（Ｍｅｒｃｋ）の添加後、２．５ｍＭのＤＦＯＭを含むＱｉａｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔのみを使用し、その次に、イソプロピルアルコールでＲＮＡ沈殿させ、ＲＱ１ ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅで処理した（３７℃で３０分；熱不活性化によって溶液を停止、６５℃で１０分；Ｐｒｏｍｅｇａ）。ＲＮＡの正確な定量のために、分光光度計（Ｄｅｎｏｖｉｘ）およびＱｕｂｉｔ蛍光定量（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。

【0162】

ｍｉＲＮＡを精製するために、総ＲＮＡから約２０ｎｔのゲル抽出を行った。ゲルローディング緩衝剤ＩＩ（９０℃で２分；Ａｍｂｉｏｎ）で変性された総ＲＮＡを、標識された約２０ｎｔのｍｉＲＮＡマーカー（合成されたｍｉＲ－１）と共に１５％の尿素－ＰＡＧＥゲルによって分離し、そのサイズを１４～３０のｓｓＲＮＡ Ｌａｄｄｅｒマーカー（Ｔａｋａｒａ）で交差確認した。その後、ＳＹＢＲＧｏｌｄで染色した後、ゲルから約２０ｎｔのサイズを切り取り、ゲル抽出緩衝液（０．５Ｍのアンモニウムアセテート、１０ｍＭのマグネシウムアセテート、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）と共に６５℃一晩ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（Ｔｈｒｉｌｌｅｒ、Ｐｅｑｌａｂ）でインキュベートし、Ｏｌｉｇｏ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（Ｚｙｍｏ）で追加精製した。

【0163】

実施例７．ＥＬＩＳＡによるｏ ^８ Ｇの定量
ｏ^８Ｇの比色検出および定量化は、製造会社のプロトコールによりＯｘｉＳｅｌｅｃｔ Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ＲＮＡ Ｄａｍａｇｅ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して行った。サンプルを調製するために、精製された小ＲＮＡまたは大ＲＮＡ（０．４～５μｇ）を３７℃で１時間、Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｐ１（Ｗａｋｏ）で処理し、エタノール沈殿を通じて抽出し、プレート上に事前コーティングした抗－ｏ^８Ｇ抗体との結合についてｏ^８Ｇ／ＢＳＡコンジュゲートと競争するように添加し、その次に検出のために当該キットで提供するＨＲＰ結合二次抗体と反応させた。サンプルの吸光度は分光光度計（４５０ｎｍ、ＧｌｏＭａｘ－Ｍｕｌｔｉ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定し、ｏ^８Ｇの濃度は予め決定されたｏ^８Ｇ標準曲線と比較して推定し、相対量で示した。

【0164】

実施例８．薬物処理
全ての実験手続は高麗大学校実験動物運営委員会の承認を受け、動物保護および実験動物使用ガイドを遵守して行った。アドレナリン性心臓肥大を誘導するために、ＩＳＯ（７５ｍｇ／ｋｇ）を合計２９日間にわたり、２日ごとに、８週から１２週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｋｏａｔｅｃｈ）に腹腔内注射（ＩＰ）を通じて投与した。模擬－注入対照群（Ｍｏｃｋ）として、同一な体積のＰＢＳを使用し、抗酸化効果を調査するために１００ｍｇ／ｋｇのＮＡＣを投与した。注射された薬物に応じてマウスを様々なグループに分けた（各グループがｎ＝４、サンプルサイズは以前の研究（Ｌｅｅ、Ｈ．Ｓ．ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ６、１０１５４）で使用された最小数に基づいて選択される）：Ｍｏｃｋ、ＩＳＯ、ＩＳＯ＋ＮＡＣ、およびＮＡＣ。最初に注射してから２９日後に、それぞれの心臓組織を回収し、心臓重量（ｈｅａｒｔ ｗｅｉｇｈｔ、ＨＷ）、体重（ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ、ＢＷ）および脛骨長さ（ｔｉｂｉａ ｌｅｎｇｔｈ、ＴＬ）を測定し、心臓サイズを正規化するためにＨＷ／ＢＷまたはＨＷ／ＴＬを使用した。全てのサンプルをＲＯＳ測定、ＣＬＥＡＲ－ＣＬＩＰおよびＲＮＡ抽出、次いでｏ^８ＧのＥＬＩＳＡ、ドットブロット（ｄｏｔ ｂｌｏｔ）、ノースウェスタン、ＩＰおよびｑＰＣＲによる分析まで－８０℃で保管した。パラコート（ｐａｒａｑｕａｔ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）処理のために、１０ｍｇ／ｋｇのパラコートを、合計４週間にわたり、ＩＰによりマウスに投与した。その後、ＲＮＡを抽出してＥＬＩＳＡに使用した。ＲＮＡ－Ｓｅｑの場合、１日目、３日目および５日目にＩＳＯを３回ＩＰ注射し、１週後にマウス（ｎ＝３）を殺処理し、同じ容積のＰＢＳを対照に注入した。ＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリーの構築およびｑＰＣＲ分析に使用されるまで全てのサンプルを－８０℃で保管した。

【0165】

実施例９．心臓超音波
三星医療センターの動物イメージング核心施設の統制下で心臓超音波をモニタリングし、記録した。具体的には、麻酔をかけるためにマウスを最初に２～５％のイソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）に暴露し、約５分間の心臓超音波記録（Ｖｉｓｕａｌ Ｓｏｎｉｃｓ Ｖｅｖｏ ２１００ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）を測定する間、１％のイソフルランで維持した。Ｍ－モードのトレーシング下で２－Ｄの短軸（ｓｈｏｒｔ－ａｘｉｓ）を個別の記録位置であるマウスの乳頭領域を固定させるために適用した。拡張期および収縮期の壁厚を含む心拍数、左室（ｌｅｆｔ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ、ＬＶ）径、およびＬＶ末期－拡張期および末期－収縮期チャンバー径を測定した。

【0166】

実施例１０．ドットブロット（ｄｏｔ ｂｌｏｔ）およびノースウェスタンブロット（ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）分析
ドットブロットの場合、サイズ別ＲＮＡ（８０～３００ｎｇ）またはゲル精製されたｍｉＲＮＡ（５０ｎｇ）をＺｅｔａ－Ｐｒｏｂｅブロッティング膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）にプロットし、Ｓｐｅｃｔｒｏｌｉｎｋｅｒ ＸＬ－１０００（Ｓｐｅｃｔｒｏｌｉｎｅ）の最適架橋（１２０ｍＪ／ｃｍ^２）オプションのＵＶ照射によって架橋させた。ノースウェスタンブロットの場合、総ＲＮＡをＧｅｌ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（９０℃で２分；Ａｍｂｉｏｎ）で変性させ、２２ｎｔ ｍｉＲＮＡサイズマーカー（合成されたｍｉＲ－１）を使用して１５％のＮｏｖｅｘ ＴＢＥ－尿素ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で分離し、Ｚｅｔａ－Ｐｒｏｂｅブロッティング膜に移し、ＵＶ（１２０ｍＪ／ｃｍ^２、Ｓｐｅｃｔｒｏｌｉｎｋｅｒ ＸＬ－１０００）で架橋させた。膜は室温で１時間、５％のＢＳＡと共に１ｘＴＢＳＴ（Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ）でブロッキングし、室温で１時間、１ｘＴＢＳＴ中で抗－ｏ^８Ｇ抗体（１５Ａ３、１：２０００；ＱＥＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と共にインキュベートした。その後、ＴＢＳＴ中のＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：５０００、Ｐｉｅｒｃｅ）を室温で１時間で使用し、次いで検出のためにＥＣＬ（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＰＬＵＳ、Ｐｉｅｒｃｅ）と反応させた。蛍光団が結合された２次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０ ヤギ抗マウスＩｇＧ、１ｘＴＢＳＴで１：１５０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用する場合、Ｂｌｏｃｋｅｒ ＦＬ蛍光ブロッキングバッファー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）をブロッキングおよび抗－ｏ^８Ｇ抗体とのインキュベーションの両方ともに使用した。蛍光信号をｉＢｒｉｇｈｔ ＦＬ１００イメージングシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって直接定量し、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ（１：１００００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって染色された点で表示されたＲＮＡの総量に対する相対的な強度として計算した。

【0167】

実施例１１．ｏ ^８ Ｇ免疫沈降（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ、ＩＰ）の最適化
抗－ｏ^８Ｇ抗体（１５Ａ３、ＱＥＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に対するｏ^８Ｇの免疫沈降（ＩＰ）条件を最適化するために、２つのｏ^８Ｇ塩基を含む合成２０ｎｔ長のＲＮＡであるｏ^８Ｇスパイクイン（５’ｐ－Ｕｏ^８Ｇｏ^８ＧＡＡＵＧＵＡＡＡＧＡＡＧＵＡＵＧＵＡＵ－３’）をｏ^８ＧのないＧスパイクイン（５’ｐ－ＵＧＧＡＡＵＧＵＡＡＡＧＡＡＧＵＡＵＧＵＡＵ－３’）と比較した。抗－ｏ^８Ｇ抗体が付着されたビーズ（ｂｅａｄ）を製造するために、２．５μｇの抗－ｏ^８Ｇ抗体（１５Ａ３、ＱＥＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を室温で１時間、２５μｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および２００μｌのＰＢＳとインキュベートした。抗－ｏ^８Ｇ抗体の非特異的相互作用を防止するために、２５０μｇのデオキシグアノシン（ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ）（ｄＧ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の添加をビーズ（ｂｅａｄ）製造の際に試験した。洗浄および精製のために、ＤｙｎａＭａｇ－２ ｍａｇｎｅｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇを分離した。ＰＢＳで３回ビーズを洗った後、ＩＰバッファーの他の条件をｏ^８Ｇスパイクインｖｓ．Ｇスパイクイン（１０ｐｇまたは１００ｐｇ、３００ｎｇの小ＲＮＡの存在下）で確認した：０．０４％のＮＰ－４０を含有したＰＢＳ；低洗浄剤、０．００４％のＮＰ－４０を含有したＰＢＳ；高洗浄剤、ＰＸＬ（ＰＢＳ、０．１％のＳＤＳ、０．５％のデオキシコレート、０．５％のＮＰ－４０）。参考として、全てのＩＰ工程を２．５ｍＭのＤＦＯＭおよび４０Ｕの組換えＲＮａｓｅ阻害剤（Ｔａｋａｒａ）の存在下、４℃で２時間行った。

【0168】

洗浄緩衝剤の他の条件も検査した：高洗浄剤、ＩＰバッファー（２回）→ＰＸＬ（４回）→ＰＢＳ（２回）；塩追加、１００ｍＭのＮａＣｌを補充したＰＢＳ（３回）→ＰＢＳ（５回）；高塩で一連の洗浄、ＴＥ（１５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、５ｍＭのＥＤＴＡ）→高洗浄剤を含有したＴＥ（１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１％のｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．１％のＳＤＳ、および２．５ｍＭのＥＧＴＡ）および高塩（１ＭのＮａＣｌ）→高洗浄剤および塩を含有したＴＥ（１２０ｍＭのＮａＣｌ）→洗浄緩衝剤（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、１ｍＭのＭｇＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＮＰ－４０）；極度の塩で一連の洗浄、ＴＥ→高洗浄剤および高塩を含有したＴＥ→高洗浄剤および極度の塩（２ＭのＮａＣｌ）を含有したＴＥ→高洗浄剤および塩を含有したＴＥ→洗浄バッファー。ビーズ内のＲＮＡを２．５ｍＭのＤＦＯＭおよび２０％クロロホルムが補充された７００μｌのＱｉａｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔで精製した後、ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ）を使用した。スパイクイン対照のサイズが２２ｎｔであるため、ｏ^８ＧスパイクインおよびＧスパイクインの量はｍｉＲＮＡに対する定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって測定され、その相対的な比率は信号：ＩＰ工程でのノイズを推定することに使用された。

【0169】

実施例１２．ｍｉＲＮＡに対する定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）
ｍｉＲＮＡを定量化するために、ｍｉＲＮＡ ｑＰＣＲ方法またはＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ分析法（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。具体的には、ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製された１μｇの小ＲＮＡまたはＩＰ精製されたＲＮＡをポリ（Ａ）ポリメラーゼ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して総１０μｌ体積でポリアデニル化させた。その次に、ポリアデニル化されたＲＮＡを２μＭのオリゴ（ｄＴ）アダプタープライマー（５’－ＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ－３’；配列番号２２）と共にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して逆転写させた。ｑＰＣＲ反応はフォワード（標的ｍｉＲＮＡとして同一な配列）およびリバースプライマー（５’－ＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ－３’；配列番号２３）と共にＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行われた：サイクリング条件（９５℃で５分；９５℃で１５秒、５５℃で１５秒、および７２℃で２０秒の４５サイクル；および７２℃で５分）。Ｕ６ ｓｎＲＮＡはｏ^８ＧまたはＧスパイクイン（フォワード：５’－ＴＧＧＡＡＴＧＴＡＡＡＧＡＡＧＴＡＴＧＴＡＴ－３’（配列番号２４）、リバース：５’－ＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ－３’（配列番号２５））またはｍｉＲＮＡ：ｏ^８Ｇスパイクイン（フォワード：５’－ＴＡＡＧＧＣＡＣＧＣＧＧＴＧＡＡＴＧＣＣＡＡ－３’（配列番号２６）、リバース：５’－ＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ－３’（配列番号２７））を使用することを除いて、一般に参照対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ、フォワード：５’－ＣＧＣＴＴＣＧＧＣＡＧＣＡＣＡＴＡＴＡＣ－３’（配列番号２８）、リバース：５’－ＴＴＣＡＣＧＡＡＴＴＴＧＣＧＴＧＴＣＡＴ－３’（配列番号２９））として測定された。

【0170】

ＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙを使用する場合、製造会社が提供したプロトコールに沿って行った。即ち、１００ｎｇの小ＲＮＡをそれぞれのｍｉＲＮＡ配列を認識する特定ＲＴプローブと共にＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して逆転写させた。ＲＴ産物と共に、ｑＰＣＲ反応を特定ｑＰＣＲプライマーとＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｏ ＡｍｐＥｒａｓｅ ＵＮＧ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で行った。特定ｍｉＲＮＡを検出することに使用されたＲＴプローブおよびｑＰＣＲプライマーは次のようなキットによって供給された：ｒＣＭＣのｍｉＲ－１ｂとｈｓａ－ｍｉＲ－１（ＩＤ：００２２２２）、ｒＣＭＣのｍｉＲ－１－３ｐとｒｎｏ－ｍｉＲ－１（ＩＤ：００２０６４）、ｒＣＭＣのｍｉＲ－１８４とｈａｓ－ｍｉＲ－１８４（ＩＤ：０００４８５）、ｒＣＭＣのｌｅｔ－７ｆとｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ（ＩＤ：０００３８２）、Ｈ９ｃ２のｍｉＲ－１とｈｓａ－ｍｉＲ－１（ＩＤ：００２２２）、ＡＣ１６、ｒＣＭＣ、およびマウス心臓、Ｕ６とＵ６ ｓｎＲＮＡ（ＩＤ：００１９７３）；ｏ^８ＧまたはＧスパイクイン、ｈｓａ－ｍｉＲ－１（ＩＤ：００２２２２）；ｍｉＲＮＡ：ｏ^８Ｇスパイクイン、ｍｍｕ－ｍｉＲ－１２４ａ（ＩＤ：００１１８２）；ＮＴ、ｃｅｌ－ｍｉＲ－６７－３ｐ（ＩＤ：０００２２４）。全てのｑＰＣＲ分析は、技術的複製物（ｎ＝３）および逆転写酵素なしの同時反応（ｐａｒａｌｌｅｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ）（陰性対照群）と共に、Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ Ｑ（Ｑｉａｇｅｎ）によって行われた。

【0171】

実施例１３．ＲＴ－ＰＣＲにおけるｏ ^８ Ｇ→Ｔ転換の分析
ｏ^８ＧがＡと対を成すことができるため、合成された３９－オキソ－ＲにおけるＧＡＡＵｏ^８ＧＣのＧＡＡＴＴＣ（ＥｃｏＲＩ部位）への変化に基づいてＧ→Ｔ転換を誘導する効能を調査した。ＲＴプライマー（５’－ＡＣＴＴＣＡＡＡＧＣＴＣＡＣＧＧＴＴＣＣＧＣＴＡＣＣＴＣＧＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡ－３’（配列番号３０）、Ｂｉｏｎｅｅｒ）と共にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってｏ^８Ｇ対照群（３９－オキソ－Ｒ）およびＧ対照群（３９Ｒ）の逆転写を行った。ｃＤＮＡは、ＰＣＲ反応（９８℃で１０秒；９８℃で１０秒、４０℃で３０秒、７２℃で２０秒の３０サイクル；および７２℃で１０分）でプライマー（フォワード：５’－ＣＣＴＧＧＴＣＣＣＡＧＡＣＴＡＡＡＧＡＡＴ－３’（配列番号３１）、リバース：５’－ＡＣＴＴＣＡＡＡＧＣＴＣＡＣＧＧＴＴＣＣＧ－３’（配列番号３２）；Ｂｉｏｎｅｅｒ）と共にＥｘ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）で増幅させた。Ｏｌｉｇｏ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（Ｚｙｍｏ）で精製した後、ＲＴ－ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ）で消化し、ＴＢＥ中、１２％のＰＡＧＥゲル上で分離した。

【0172】

ＲＴ－ＰＣＲにおいてｏ^８Ｇで誘導されたＧ→Ｔ転換は、また、シーケンシングによって直接確認された。各ライゲーション工程後に、ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ）を使用したことを除いて、修飾のある小ＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリー構築のためのプロトコール（実施例１４参照）によって２２ｎｔの合成ＲＮＡ（５’ｐ－ＵＧＧＡＡＵｏ^８ＧＵＡＡＡＧＡＡＧＵＡＵＧＵＡＵ－３’；配列番号３３）を含む４００ｎｇのｏ^８Ｇに対してシーケンシングライブラリーを構築した。特に、５’アダプター中の縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）バーコード（４つのランダムヌクレオチド）による固有のリード値を計算してｏ^８Ｇの位置のヌクレオチド頻度を分析することで、ＰＣＲ増幅における交絡バイアス（ｃｏｎｆｏｕｎｄｉｎｇ ｂｉａｓ）を排除することができる。

【0173】

実施例１４．ｏ^８Ｇ－ｍｉＳｅｑ
ＲＴ－ＰＣＲにおけるｏ^８Ｇ ＩＰ条件およびｏ^８Ｇ誘導Ｇ→Ｔ転換の最適化に基づいて、酸化されたｍｉＲＮＡおよびそのｏ^８Ｇの位置を識別するためのシーケンシング方法（ｏ^８Ｇ－ｍｉＳｅｑ）が開発された。１．２ｍｇのデオキシグアノシン（ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ）（Ｓｉｇｍａ）が補充されたＰＢＳ（総容量５００μｌ）中の１２５μｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に１時間室温で交互に１２．５μｇの抗－ｏ^８Ｇ抗体（１５Ａ３、ＱＥＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とインキュベートすることによって抗体が付着されたマグネチックビーズ（ｂｅａｄ）を製造した。洗浄および精製のために、ＤｙｎａＭａｇ－２ ｍａｇｎｅｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇを分離した。ＰＢＳによる洗浄２回の後、ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で精製された７～１０μｇの小ＲＮＡサンプルを２．５ｍＭのＤＦＯＭ（Ｓｉｇｍａ）および４０Ｕの組換えＲＮａｓｅ阻害剤（Ｔａｋａｒａ）を含む２００μｌのＰＸＬで準備されたビーズと混合した。４℃で交互に培養して２時間後、超高塩による一連の洗浄を行った：ＴＥ（１５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、５ｍＭのＥＤＴＡ）；高洗浄剤（１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１％のデオキシコレート、０．１％のＳＤＳ、および２．５ｍＭのＥＧＴＡ）および高塩（１ＭのＮａＣｌ）を含有したＴＥ；高洗浄剤および超高塩（２ＭのＮａＣｌ）を含有したＴＥ；高洗浄剤および塩（１２０ｍＭのＮａＣｌ）を含有したＴＥ；洗浄緩衝剤（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、１ｍＭのＭｇＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＮＰ－４０）。ビーズ上の精製された酸化小ＲＮＡはそのまま、または抽出後にさらに処理した。

【0174】

インタクトなビーズで処理する場合、ビーズのＲＮＡをＰＮＫバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ７．４、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．５％のＮＰ－４０）で２回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡおよび４０Ｕの組換えＲＮａｓｅ阻害剤（Ｔａｋａｒａ）が補充された８０μｌのＴ４ ＲＮＡライゲーズ緩衝液（ＮＥＢ）中の８μｌのＴ４ ＲＮＡ ｌｉｇａｓｅ ２ ｃｌｅａｖａｇｅ ＫＱ（ＮＥＢ）を使用して７０℃で２分間インキュベートした後、氷の上で製造した０．２５μＭの３’アダプター（５’－（ｒＡｐｐ）Ｔ（ＰＭｅ）ＧＧＡＡＴＴＣＴＣＧＧＧＴＧＣＣＡＡＧＧ（ｄｄＣ）－３’（配列番号３４）；ｒＡｐｐ：アデニル酸、ＰＭｅ：メチルホスホン酸、ｄｄＣ：ジデオキシシトシン；Ｔｒｉｌｉｎｋ）とライゲーションした。熱混合器（ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ）（Ｔｈｒｉｌｌｅｒ、Ｐｅｑｌａｂ）において２８℃で１時間インキュベートした後、ビーズをＰＸＬ（２．５ｍＭのＤＦＯＭ）で１回、ＰＮＫ緩衝剤で２回洗浄した。５’アダプターライゲーションの場合、７０℃で２分間インキュベートした後、氷上で製造された０．２５μＭの５’アダプター（５’－ＧＵＵＣＡＧＡＧＵＵＣＵＡＣＡＧＵＣＣＧＡＣＧＡＵＣＮＮＮＮ（２’－ｍｅｔｈｏｘｙ－Ｃ）－３’（配列番号３５）；Ｔｒｉｌｉｎｋ）を８μｌのＴ４ ＲＮＡライゲーズ（Ｔｈｅｒｍｏ）、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡおよび４０Ｕの組換えＲＮａｓｅ阻害剤から構成された総８０μｌのＴ４ ＲＮＡライゲーズ緩衝剤のビーズ上で熱混合器（Ｔｈｒｉｌｌｅｒ、Ｐｅｑｌａｂ）で２８℃で１時間ＲＮＡと共にインキュベートした。ＰＸＬ（２．５ｍＭのＤＦＯＭ）および１ｘ第１鎖バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で順次に洗浄した後、ビーズ上のＲＮＡを次のように逆転写させた：１μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．７２μＭのＲＴプライマー（５’－ＧＣＣＴＴＧＧＣＡＣＣＣＧＡＧＡＡＴＴＣＣＡ－３’；配列番号３６）、３７５μＭのｄＮＴＰ、７．２５ｍＭのＤＴＴおよび４Ｕの組換えＲＮａｓｅ阻害剤を含む合計４０μｌの１ｘ第１鎖バッファー；熱混合器（Ｔｈｒｉｌｌｅｒ、Ｐｅｑｌａｂ）において５５℃で１時間のインキュベーション。得られたｃＤＮＡをＰＣＲによってさらに増幅させてシーケンシングライブラリーを構築した。

【0175】

同時に、ｃＤＮＡシーケンシングライブラリーは、また、ｉｎｐｕｔ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ（０．４～１μｇ；ｓｍａｌｌ ＲＮＡ－Ｓｅｑ）またはｏ^８Ｇ ＩＰ（２．５ｍＭのＤＦＯＭおよび２０％のクロロホルム）が補充された７００μｌのＱｉａｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔでビーズを精製し、次いでＲＮＡ（Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５ ｋｉｔで濃縮）から抽出された産物から行われた。最初に、２０％のＰＥＧ ８０００および２０Ｕの組換えＲＮａｓｅ阻害剤が補充された１３μｌのｔｏｔａｌ Ｔ４ ＲＮＡ ｌｉｇａｓｅバッファー中の１μｌのＴ４ ＲＮＡ ｌｉｇａｓｅ ２ ｃｌｅａｖａｇｅ ＫＱ（ＮＥＢ）を使用して０．２５μＭの３’アダプター（７０℃で２分間インキュベーション後、氷上で製造される）をライゲーションさせ、２８℃で６０分間インキュベートした後、６５℃で２０分間不活性化した。その後、０．２５μＭの５’アダプターを含む１３μｌのＴ４ ＲＮＡ ｌｉｇａｓｅバッファー、２μｌのＴ４ ＲＮＡライゲーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、４０Ｕの組換えＲＮａｓｅ阻害剤、および１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを添加して５’アダプターをライゲーションさせ、これは２８℃で６０分間インキュベーションし、６５℃で２０分間不活性化した。ライゲーションされた総ＲＮＡサンプルを７０℃で２分間、１０μＭのＲＴプライマーの１μｌと共に変性させ、氷上に１分間置いて、次のように逆転写させた：合計４０μｌの１ｘ第１鎖バッファー中の１μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、３７５μＭのｄＮＴＰ、７．２５ｍＭのＤＴＴおよび４Ｕの組換えＲＮａｓｅ阻害剤；５５℃で１時間、７０℃で１５分間のインキュベーション。生成されたｃＤＮＡをシーケンシングライブラリーを製造するためにＰＣＲによってさらに増幅させた。

【0176】

製造されたｃＤＮＡをＴｒｕｓｅｑインデックスアダプター配列（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を含むようにさらに処理した。まず、１００ｎＭのユニバーサルフォワードプライマー（５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＧＴＴＣＡＧＡＧＴＴＣＴＡＣＡＧＴＣＣＧＡ－３’；配列番号３７）および１００ｎＭのＲＴプライマーでＱ５ ｈｉｇｈａｃｃｕｒａｃｙ ２ｘ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ＮＥＢ）を使用してＰＣＲによってｃＤＮＡを増幅させた：９８℃で３０秒；９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、および７２℃で１５秒の５サイクル；および７２℃で１０分。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して１次ＰＣＲ産物を精製した後、溶離液の一部を使用し、Ｑ５ ｈｉｇｈａｃｃｕｒａｃｙ ２ｘ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘにＳＹＢＲ Ｇｅｅｎ Ｉ（１：１００００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加してｑＰＣＲ（Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ Ｑ；Ｑｉａｇｅｎ）を行い、増幅の線形範囲に到達するために必要なサイクル数を決定した。マルチプレックスなバーコード（２５０ｎＭのユニバーサルフォワードプライマー、２５０ｎＭのバーコードプライマー：５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ－６ｍｅｒのバーコード－ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＴＧＧＣＡＣＣＣＧＡＧＡＡＴＴＣＣＡ－３’；配列番号３８）を生成するために、決定した最適サイクル数で、Ｑ５ ｈｉｇｈａｃｃｕｒａｃｙ ２ｘ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘを使用し、残りの精製された１次ＰＣＲ産物に対して２次ＰＣＲを行った。予想サイズが約２０ｎｔの挿入を含有するＰＣＲ産物は１５％の尿素－ＰＡＧＥゲル抽出（実施例６参照）または３％のアガロースゲルカセットと共にＰｉｐｐｉｎ Ｐｒｅｐ（Ｓａｇｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してさらに精製し、クロスチェックと共にＱｕｂｉｔ ＲＮＡ ＨＳ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＦｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｄｖａｎｃｅｄ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を用いて定量化した。最終的に、製造されたライブラリーをＨｉＳｅｑ ２５００システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）によって５０個の単一末端リードとしてシーケンシングし、ＣＡＳＡＶＡ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて脱多重化させた。

【0177】

実施例１５．生物情報学および統計データ分析
生物情報学分析のために、主にＰｙｔｈｏｎスクリプト（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｉｐ．ｋｏｒｅａ．ａｃ．ｋｒ／ｏｘｏｇ／）とＵＣＳＣゲノムブラウザー（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）を使用した。ＲＮＡ－Ｓｅｑ分析は、Ｔｕｘｅｄｏ Ｓｕｉｔｅを使用して行われた；ＴｏｐＨａｔ２（ｈｔｔｐ：／／ｃｃｂ．ｊｈｕ．ｅｄｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｔｏｐｈａｔ）、ＣｕｆｆｌｉｎｋｓおよびＣｕｆｆｄｉｆｆ（ｈｔｔｐ：／／ｃｏｌｅ－ｔｒａｐｎｅｌｌ－ｌａｂ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ／）。Ｂｏｗｔｉｅ（ｈｔｔｐ：／／ｂｏｗｔｉｅ－ｂｉｏ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ）を使用してｍｉＲＮＡに対するシーケンシングリードのマッピングを行った。ＣＬＩＰデータのピーク（ｐｅａｋ）分析は、ＣＬＩＰｉｃｋ（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｉｐ．ｋｏｒｅａ．ａｃ．ｋｒ／ｃｌｉｐｉｃｋ／）によって処理された。別途の表示がない限り、基本媒介変数と共にＤＡＶＩＤ（ｈｔｔｐ：／／ｄａｖｉｄ．ａｂｃｃ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ／）を使用してＧＯ分析を行い、ＲＥＶＩＧＯ（ｈｔｔｐ：／／ｒｅｖｉｇｏ．ｉｒｂ．ｈｒ／）で視覚化した。機能的錫の補強はＧＳＥＡ（ｈｔｔｐ：／／ｓｏｆｔｗａｒｅ。ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ。ｏｒｇ／ｇｓｅａ／）を使用して分析された。

【0178】

標準実験室実習無作為化手続を細胞株グループおよび同じ年齢と性別のマウスに使用した。実験者らは実験および結果評価の間にバッチに対する情報が与えられなかった。Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ－Ｓｍｉｒｎｏｖ検定（ＫＳ検定）、ｔ－検定（独立両側検定）およびＦｉｓｈｅｒ’ｓ ｅｘａｃｔ ｔｅｓｔ（マッピングされた総ｍｉＲ－１リード値に相対的）を含む全ての統計的検定はＳｃｉｐｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｐｙ．ｏｒｇ／）またはＥｘｃｅｌ（ｔｗｏ－ｓｉｄｅｄ ｔｅｓｔ）を用いて行った。値は別途に言及されない限り平均±ｓ．ｄを示す。統計的有意性は基本的にＰ＝０．０５に設定され、分散はグループ間で類似した。

【0179】

実施例１６．ｏ ^８ Ｇ－ｍｉＳｅｑデータ分析
脱多重化された（ｄｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ）シーケンシングリード（ＦＡＳＴＱファイル）は２つのミスマッチ（Ｂｏｗｔｉｅ－－ｎｏｒｃ－ｌ７－ｎ２－ａ－ｆ）を許容するＢｏｗｔｉｅを使用してアラインし、縮少されたシーケンシングリードはインデキシングされ（基本媒介変数と共にｂｏｗｔｉｅ－ｂｕｉｌｄ ｉｎｄｅｘｅｒ使用）、ｍｉＲＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）で同一な種の成熟ｍｉＲＮＡ配列によってマッピングされた。ミスマッチエラーがあるリード値をフィルタリングして結果をさらに構文解析し、その結果、品質スコアは２０未満であった。ｍｉＲＮＡ当りのリード数は総リード値（総リード値百万当りのリード値；ＲＰＭ）に対して正規化され、ｌｏｇ_２値（例：ｌｏｇ_２（入力（ｉｎｐｕｔ））およびｌｏｇ_２（ｏ^８Ｇ ＩＰ））として使用された。特に、ｏ^８Ｇの富化度（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）は、入力小ＲＮＡ－Ｓｅｑ（入力；ｍｉＲＮＡ頻度）のＲＰＭと共にｏ^８Ｇ ＩＰシーケンシング（ｏ^８Ｇ ＩＰ）のＲＰＭを測定することで推定し、ｌｏｇ_２比率として計算し、ｖｏｌｃａｎｏ ｐｌｏｔ分析で有意性（－ｌｏｇ_１０（Ｐ－ｖａｌｕｅ）、ｔ－ｔｅｓｔ）として示した。ｍｉＲＮＡ配列中のＧの頻度によって影響を受けるｏ^８Ｇ ＩＰバイアスを調査するために、配列中のＧ－含量（Ｇの数）およびｏ^８Ｇ富化度（ｂｉｎ ｓｉｚｅ＝１）によって分類されたｍｉＲＮＡの数を熱地図分析（Ｔｒｅｅｖｉｅｗ、ｈｔｔｐ：／／ｒａｎａ．ｌｂｌ．ｇｏｖ／ＥｉｓｅｎＳｏｆｔｗａｒｅ．ｈｔｍ）を通じて視覚化した。ＰＥ処理による差異的なｏ^８Ｇ富化度を分析するために、相対的なｏ^８Ｇ富化度値をＰＥ処理ｖｓ．ｍｏｃｋ（無処理）の間のｏ^８Ｇ富化度比率から計算した。ベースコールにおいて最高品質スコアを有するミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）の場合のみを考慮して、ｍｉＲＮＡ配列の各位置で発生するミスマッチの百分率は総マッチ頻度に対して相対的に計算された；ミスマッチ（％）。特に、ｍｉＲ－１：２ＵおよびｍｉＲ－１：３Ｕからのシード配列は他の哺乳動物ｍｉＲＮＡと重複しない（ｎ＝１７，９４８；ｍｉＲＢａｓｅ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）が、但し、種－特異的ｍｉＲＮＡであるｍｄｏ－ｍｉＲ－１２３２０－３ｐおよびｍｍｕ－ｍｉＲ－７２１６－３ｐ（＜８０シーケンシング判読値）を有するｍｉＲ－１：７Ｕとは、無視できるほどの非常に低い発現を示す、を除いて。

【0180】

実施例１７．酸化されたｍｉＲＮＡのｏ^８Ｇ ＩＰおよびｑＰＣＲによる定量
ｒＣＭＣ（ｎ＝３）を１００μＭのＰＥで４８時間処理するか、ＩＳＯ（７５ｍｇ ｋｇ^－１）を慢性注射（ｎ＝３）してマウスで肥大性心臓を誘導した後、小ＲＮＡをｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出した。その後、交差－確認として、分光光度計（Ｄｅｎｏｖｉｘ）およびＱｕｂｉｔ蛍光定量法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の両方によって正確に測定された同じ量の小ＲＮＡ（２μｇ、ＰＥ処理ｖｓ．処理無し）を１０ｐｇ ｍｉＲＮＡ：ｏ^８Ｇスパイクイン対照群の存在下でｏ^８Ｇ免疫沈降に使用した。Ｑｉａｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ ＲｅａｇｅｎｔおよびＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ）を使用してビーズからＲＮＡを抽出した後、ＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してｏ^８Ｇ ＩＰの特定のｍｉＲＮＡの量を評価した。参照のために、逆転写前の全ての過程を２．５ｍＭのＤＦＯＭの存在下で行い、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＲＮＡの酸化を防止した。ＩＰ工程からの変異を正規化するために、ｏ^８Ｇ ＩＰでｍｉＲＮＡ：ｏ^８Ｇスパイクインの量をｑＰＣＲで測定し、特定ｍｉＲＮＡの相対的なｏ^８Ｇ値を定量するための分母として使用した。また、ｏ^８Ｇ ＩＰでＵ６ ｓｎＲＮＡを測定することによって相対レベルを推定し、特定ｍｉＲＮＡで酸化の富化を確認するための正規化に使用した。

【0181】

実施例１８．ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）レポーターの構築
ｍｉＲＮＡ仲介遺伝子抑制活性を測定するために、ｐｓｉＣｈｅｃｋ－２（Ｐｒｏｍｅｇａ）またはｐｍｉｒＧＬＯベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。特にｍｉＲ－１ オキソ部位の場合、標的部位を並べて繰り返し（ｎ＝５）、ｐｓｉＣｈｅｃｋ－２のＲｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ｈＲＬｕｃ）の３’ＵＴＲに挿入して検出感度を増加させた。

【0182】

このようなベクター構築のために、多様なｍｉＲ－１ オキソ部位を含む合成２本鎖オリゴヌクレオチド（Ｍａｃｒｏｇｅｎ）を指示された通りＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ部位を介してｐｓｉＣｈｅｃｋ－２プラスミドにクローニングした：ｍｉＲ－１－シード ｓｉｔｅ、フォワード：５’－ＴＣＧＡＧＡＣＡＴＴＣＣＡＣＡＴＴＣＣＡＣＡＴＴＣＣＡＣＡＴＴＣＣＡＣＡＴＴＣＣＧＣ－３’（配列番号３９）、リバース：５’－ＧＧＣＣＧＣＧＧＡＡＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＣ－３’（配列番号４０）；ｍｉＲ－１－２オキソ部位、フォワード：５’－ＴＣＧＡＧＡＣＡＴＴＣＡＡＣＡＴＴＣＡＡＣＡＴＴＣＡＡＣＡＴＴＣＡＡＣＡＴＴＣＡＧＣ－３’（配列番号４１）、リバース：５’－ＧＧＣＣＧＣＴＧＡＡＴＧＴＴＧＡＡＴＧＴＴＧＡＡＴＧＴＴＧＡＡＴＧＴＴＧＡＡＴＧＴＣ－３’（配列番号４２）；ｍｉＲ－１－３オキソ部位、フォワード：５’－ＴＣＧＡＧＡＣＡＴＴＡＣＡＣＡＴＴＡＣＡＣＡＴＴＡＣＡＣＡＴＴＡＣＡＣＡＴＴＡＣＧＣ－３’（配列番号４３）、リバース：５’－ＧＧＣＣＧＣＧＴＡＡＴＧＴＧＴＡＡＴＧＴＧＴＡＡＴＧＴＧＴＡＡＴＧＴＧＴＡＡＴＧＴＣ－３’（配列番号４４）；ｍｉＲ－１－７オキソ部位、フォワード：５’－ＴＣＧＡＧＡＡＡＴＴＣＣＡＡＡＴＴＣＣＡＡＡＴＴＣＣＡＡＡＴＴＣＣＡＡＡＴＴＣＣＧＣ－３’（配列番号４５）、リバース：５’－ＧＧＣＣＧＣＧＧＡＡＴＴＴＧＧＡＡＴＴＴＧＧＡＡＴＴＴＧＧＡＡＴＴＴＧＧＡＡＴＴＴＣ－３’（配列番号４６）；ｍｉＲ－１ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉｔｅ、フォワード：５’－ＴＣＧＡＧＡＣＴＴＴＣＣＡＣＴＴＴＣＣＡＣＴＴＴＣＣＡＣＴＴＴＣＣＡＣＴＴＴＣＣＧＣ－３’（配列番号４７）、リバース：５’－ＧＧＣＣＧＣＧＧＡＡＡＧＴＧＧＡＡＡＧＴＧＧＡＡＡＧＴＧＧＡＡＡＧＴＧＧＡＡＡＧＴＣ－３’（配列番号４８））。重要にも、ｍｉＲ－１対照部位は、同一塩基を有することによってｍｉＲ－１シード部位の６位（ｐｉｖｏｔ）にミスマッチを有し、ここで、損傷されたｐｉｖｏｔはシード仲介標的抑制を喪失すると報告され、したがって陰性対照として使用されるように構成した。

【0183】

前記と同じ方式で、ｍｉＲ－１２２、ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－１２４のシード部位にｏ^８Ｇ修飾を生成するときに認識可能な配列を５’末端基準で８番目までの相補的な配列にｏ^８Ｇ修飾が起こった部位に対してはＡで置換して製作した。確認されたｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇ標的ｍＲＮＡで７オキソ部位を高感度で確認するために、標的サイトの２回または３回の繰り返しを含むようにｐｓｉＣｈｅｃｋ－２ベクターを修飾してサブクローニングした。まず、予測されたオフセット７オキソ部位（３：８）を含有するホタル遺伝子（ｈｌｕｃ＋）を、ＡｐａＩおよびＸｂａＩ部位を介して、７オキソ部位がなく、ｐｍｉｒＧＬＯベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に位置する異なるホタル遺伝子（Ｌｕｃ２）で置換した。

【0184】

実施例１９．ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）レポーター分析
多様なルシフェラーゼレポーターベクター（ｐｍｉｒＧＬＯ、ｐｓｉＣｈｅｃｋ－２または所望の部位を含有するその修飾されたプラスミド）および／または合成２本鎖ｍｉＲＮＡ（５０～７５ｎＭ、別途明示される）をＨ９ｃ２、ｒＣＭＣおよびＡＣ１６に形質導入した。形質導入から２４時間後、発現されたルシフェラーゼの活性を全般的に測定した。薬物処理の場合、明示された濃度のＰＥ、Ｈ_２Ｏ_２および／またはＮＡＣを明示された時間で処理し、処理は形質導入から２４時間後に開始し、処理後のものを得た。製造会社のプロトコールにより複製物（ｎ＝６）でＧｌｏＭａｘ－Ｍｕｌｔｉ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共に二重－ルシフェラーゼレポーター分析システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて相対活性（ホタルルシフェラーゼで正規化されたＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性）を測定した。ｍｉＲＮＡ仲介抑制の効率を評価するために、異なる濃度のｍｉＲＮＡ（０～１００ｎＭ）をＨｅＬａに形質導入した。その後、Ｓｃｉｐｙ（ｓｃｉｐｙ．ｏｐｔｉｍｉｚｅ．ｃｕｒｖｅ＿ｆｉｔ）を使用してシグモイド関数（ｓｉｇｍｏｉｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）に対して非線形最小自乗フィッティングを行ってＩＣ_５０を計算した。最小自乗が関数に合わない場合、回帰線で大略的なＩＣ_５０を計算した。

【0185】

実施例２０．二重（ｄｕａｌ）蛍光レポーターの製造
二重蛍光タンパク質（ｄＦＰ）レポーターベクターはｐｓｉＣｈｅｃｋ－２（Ｐｒｏｍｅｇａ）に基づいて構築し、ルシフェラーゼ遺伝子を蛍光タンパク質遺伝子で置換した。ｐＵｌｔａ（Ａｄｄｇｅｎｅ；Ｍａｌｃｏｌｍ Ｍｏｏｒｅ提供）でｅＧＦＰ遺伝子を増幅させＮｈｅＩおよびＸｈｏＩ部位を介してｈＲＬｕｃを置換した：フォワードプライマー：５’－ＴＡＧＧＣＴＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡ－３’（配列番号４９）、リバースプライマー：５’－ＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＡＴＣＧＣＣＴＡＧＡＡＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣ－３’（配列番号５０）。ｐＴＲＩＰＺ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でＴｕｒｂｏＲＦＰ遺伝子を増幅させ、ＡｐａＩおよびＸｂａＩ部位（フォワードプライマー：５’－ＧＡＡＧＧＧＣＣＣＴＡＴＧＡＧＣＧＡＧＣＴＧＡＴＣＡＡＧＧＡＧＡ－３’（配列番号５１）、リバースプライマー：５’－ＧＡＣＴＣＴＡＧＡＡＴＴＡＴＴＡＴＣＴＧＴＧＣＣＣＣＡＧＴＴＴＧＣＴＡＧ－３’（配列番号５２））を介してｈｌｕｃ＋を置換し、追加的に処理してＰＣＲ仲介欠失によるｈｌｕｃ＋配列の残存３３ｂｐを除去し（フォワードプライマー：５’－ＧＴＡＣＴＧＴＴＧＧＴＡＡＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＧＡＧＣＴＧＡＴＣＡ－３’（配列番号５３）、リバースプライマー：５’－ＴＣＣＴＴＧＡＴＣＡＧＣＴＣＧＣＴＣＡＴＧＧＴＧＧＣＴＴＴＡＣＣＡＡＣＡ－３’（配列番号５４））、次いで、欠失されなかった骨格プラスミドを除去した（ＤｐｎＩ処理）。全てのＰＣＲ反応は製造会社のプロトコールによりＰｆｕＵｌｔｒａ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して行った。また、転換されたｄＦＰベクター（Ｊｅｎｓ Ｇｒｕｂｅｒから提供されたｐ．ＵＴＡ．３．０ Ｅｍｐｔｙ；Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ ＃８２４４７）を使用し、これはｐｓｉＣｈｅｃｋ－２ベクターに由来し、ａｃＧＦＰがｈｌｕｃ＋を置換し、ＲＦＰがｈＲＬｕｃを置換し、まるでレポーターおよび対照蛍光遺伝子がｄＦＰで交換されたようものであった。最後に、ｍｉＲ－１ シード部位、７オキソ部位、２オキソ部位および３オキソ部位はｐｓｉＣｈｅｃｋ－２に使用されたのと同一のサブクローニング（ｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇ）方法によってｄＦＰまたは転換されたｄＦＰベクター（ｐ．ＵＴＡ．３．０）に挿入された。

【0186】

実施例２１．フローサイトメーターを用いた単一細胞レポーター分析
フローサイトメーターを用いて単一細胞レベルでｍｉＲＮＡ仲介遺伝子抑制を測定するために蛍光タンパク質レポーターベクターを使用した。まず、ｍｉＲ－１ シード、７オキソ、３オキソまたは２オキソ部位を含有するｄＦＰ（ＲＦＰ：ＧＦＰ部位）または転換されたｄＦＰ（ＧＦＰ：ＲＦＰ部位）をＨ９ｃ２に形質導入し、形質導入から２４時間後に細胞を回収した。陽性対照として、各標的サイトに対する同族のｍｉＲＮＡ（５０ｎＭ）を共形質導入させた。ｍｉＲ－１ オキソ部位の抑制が内因性ｍｉＲ－１によって仲介されることを確認するために、ｍｉＲＩＤＩＡＮ マイクロＲＮＡヘアピン阻害剤（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）から得られた５０ｎＭのｍｉＲ－１特異的阻害剤をまた共形質導入させた。共形質導入の場合、同じ量のＮＴを対照として使用した。薬物処理のために、２００μＭのＰＥ（血清枯渇したＨ９ｃ２）または２ｍＭのＮＡＣを形質導入時点から開始して２４時間処理した。細胞を４％のＢＳＡ（Ｂｏｖｏｇｅｎ）および５ｍＭのＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）と共にＰＢＳ（Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ）から回収し、フローサイトメーターで分析した。

【0187】

ｄＦＰ（ＲＦＰ：ＧＦＰ部位）形質導入されたＨ９ｃ２の場合、初期に４－ｂｌｕｅ構成で作動されるＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６ Ｐｌｕｓ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した（ブルーレーザー装備のみを備える、励起波長：４８８ｎｍ；標準フィルター、ＧＦＰ：５３３／３０、ＲＦＰ：６７０ＬＰ）。生きている単一細胞を（ＦＳＣおよびＳＳＣに基づいて）ゲーティングした後、レポーター発現がない細胞をｐｓｉ－Ｃｈｅｃｋ２形質導入された細胞によって推定された自動蛍光の基礎レベルに基づいて、さらに取り除いた。その次に、ＧＦＰｖｓ．ＲＦＰ信号（ｎ＝１０，０００細胞）の散布図（ｓｃａｔｔｅｒ ｐｌｏｔｓ）を分析した。Ｈ９ｃ２の細胞サイズはＦＳＣ値によって推定された。酸化されたｍｉＲ－１仲介抑制に対するＰＥ処理の効果を試験するために、ＰＥ処理ｖｓ．無処理を比較することによってＧＦＰ強度（ｌｏｇ_２（ＧＦＰ））または相対ＧＦＰ比（ｌｏｇ_２（ＧＦＰ／ＲＦＰ））による細胞分布を示し、累積分率分析（Ｓｃｉｐｙ、ｓｃｙｐｙ．ｓｔａｔｓ．ｋｓ＿２ｓａｍｐ）を使用して行われたＫＳ検定））によってさらに統計分析を行った。

【0188】

ｄＦＰ（ＲＦＰ：ＧＦＰ部位）および転換されたｄＦＰ（ＧＦＰ：ＲＦＰ部位）の両方に対する検出感度を高めるために、その後、青色（４８８ｎｍ）および黄色（５６１ｎｍ）のレーザーが装着されたＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターを使用してＧＦＰおよびＲＦＰの両方の完全励起を達成した。前記分析のために、ＧＦＰおよびＲＦＰ信号の範囲は初期に散布図分析から選択され、類似の範囲のベクター発現（ｄＦＰに対するｌｏｇ_１０（ＲＦＰ）および転換されたｄＦＰに対するｌｏｇ_１０（ＧＦＰ）によって推定される；同様に入力）から誘導されたレポーター値（ｄＦＰに対するｌｏｇ_１０（ＧＦＰ）および転換されたｄＦＰに対するｌｏｇ_１０（ＲＦＰ））を平均化して相対比として定量化した。究極的には、相対的な倍率変化は、部位の無い同じレポーターに由来した値（例：ｄＦＰ値およびＲＦＰ値の各ｂｉｎに含まれるＦＰ値の平均は、部位無しの対照の値として表示される）で相対的比率を正規化して計算した。レポーター発現が最も低い２５％のみとなるように分析範囲を狭めるために、それぞれのベクター発現値のｂｉｎでのレポーター値が最も低い２５％である細胞のみを使用して相対倍率変化を再計算した。

【0189】

実施例２２．ｍｉＲ－１：ｏ ^８ Ｇを用いた心臓細胞肥大の誘導
ＮＴ－６φ、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇ、ｍｉＲ－１：２ｏ^８Ｇ、ｍｉＲ－１：３ｏ^８Ｇ、ｍｉＲ－１：７Ｕ、ｍｉＲ－１：２Ｕ、ｍｉＲ－１：３Ｕを製造会社のプロトコールによりＲＮＡｉＭａｘまたはリポフェクタミン３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってＨ９ｃ２またはｒＣＭＣ細胞に形質導入させ、静止画を得るために、倒立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭｉ８）を使用し、ＩｍａｇｅＪ（≧１００細胞、ｈｔｔｐｓ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）で分析した。時系列の画像を生成するために、ｍｉＲ－１：７ｏ^８ＧまたはｍｉＲ－１：７Ｕの形質導入後、Ｌｕｍａｓｃｏｐｅ ４００（Ｅｔａｌｕｍａ）を２０分間隔で０から５０ｈの間で使用した。

【0190】

実施例２３．マウスにｍｉＲＮＡ投与
マウスへのｍｉＲＮＡの生体内送達を行った。具体的に、２本鎖ｍｉＲＮＡ（５ｍｇ ｋｇ^－１）を製造会社のプロトコールによりｉｎ ｖｉｖｏ ｊｅｔＰＥＩ（Ｎ／Ｐ比率＝５；Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）を使用して静脈内注射（Ｉ．Ｖ．）によって１２週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｋｏａｔｅｃｈ）に投与した。注入されたｍｉＲＮＡ（ＮＴ ｖｓ．ｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇ、ＮＴ ｖｓ．ｍｉＲ－１：７Ｕ；ｎ＝４）に応じてマウスを２つのグループに分配することにより、２セットの実験を設計した。ｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇ（４ｍｇ ｋｇ^－１）またはｍｉＲ－１：７Ｕ（４ｍｇ ｋｇ^－１）を注射する場合、ＮＴ（１ｍｇ ｋｇ^－１）も共に注射してマウス心臓への送達を確認した。特に、注射に使用されたｍｉＲ－１：７ｏ^８ＧまたはｍｉＲ－１：７Ｕの二本鎖は、５’末端にＦＩＴＣを含有するｍｉＲ－１ パッセンジャー鎖を使用して心臓組織への送達を確認することによって生成された。注射は１日目および２日目の２回行われ、マウスは７日目に殺処理した。それぞれの心臓測定用に心臓組織を回収した：ＨＷ、ＢＷおよびＴＬ。ＲＮＡ抽出（小ＲＮＡおよび大ＲＮＡ；ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）のために切断された心臓組織を直ちに使用し、送達されたＮＴの量をｑＰＣＲ（ｍｉＲＮＡセクションに対するｑＰＣＲの詳細な方法参照）に次いでＲＮＡ－ＳｅｑおよびｑＰＣＲ分析で調査した。切断された心臓の一部はまた、免疫組織化学分析のためにスライド上の組織切片として製造された。

【0191】

実施例２４．ｍＲＮＡに対する定量的ＲＴ－ＰＣＲ
ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いたカラムのＤＮＡ消化を通じてＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して総ＲＮＡを分離した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびオリゴ（ｄＴ）プライマーで逆転写を行った。ｑＰＣＲ分析はＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。全ての反応は標準２工程サイクリングプロトコールで３回行い、対照としてＡＣＴＢおよびＧＡＰＤＨを使用したΔＣＴ方法によって相対的定量を計算した。

【0192】

実施例２５．心臓組織の免疫組織化学
解剖したたマウスの心臓組織を固定し（４％のパラホルムアルデヒド、一晩４℃）、保存し（７０％のエタノール）、パラフィンで包埋し、切断した後（横断面、連続切片；５μｍ幅）、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。パラフィン包埋した切片の準備、Ｈ＆Ｅ染色、およびマッソンの三重染色は、サービス加入を通じて、心血管製品評価センター（延世大学校医科大学、韓国）または病理学核心施設（ソウル大学校医科大学、韓国）によって行われた。その後、製造されたスライド上で免疫蛍光染色を行った。Ｈｉｓｔｏ－Ｃｌｅａｒ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で切片を脱パラフィンした後、段階希釈したエタノールで切片を加水分解し、ＰＢＳに保存した。製造会社のプロトコールによりＢＤ Ｒｅｔｒｉｅｖａｇｅｎ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して抗原を回収した。その次に、ＰＡＰ ｐｅｎ（Ｓｉｇｍａ）によって定義した標的染色領域を明示したように免疫染色し、ブロッキング溶液（１０％の正常ヤギ血清および１％のＢＳＡを含有したＰＢＳ）、室温で１時間；ＭＦ２０抗体（１：２００、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）、ブロッキング溶液、４℃で一晩；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ロバ抗マウスＩｇＧ（１：１０００、Ａｂｃａｍ）、ブロッキング溶液、室温で１時間。また、Ａｌｅｘ Ｆｌｕｏｒ ５９４結ＷＧＡ（５０μｇ／ｍｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＤＡＰＩ（１．５μｇ／ｍｌ；Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂ）を適用して細胞膜と核をそれぞれ視覚化した。染色された組織を倒立蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭｉ８；２０ｘまたは４０ｘ倍率）で観察し、Ｌｅｉｃａ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｕｉｔｅ（ＬＡＳ）で分析し、ＩｍａｇｅＪ（≧１００細胞、ｈｔｔｐｓ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）で定量化した。

【0193】

実施例２６．形質転換マウス生成
心筋細胞特異的形質転換マウス（ＴＧ）を生産するために、アンチ－７オキソ（α－ＭＨＣ １３ｘ）プラスミドをＢａｍＨＩを使用して分解して形質転換カセットを分離した。ゲル－精製された形質転換カセットを交配後、過排卵されたＣ５７ＢＬ／６雌マウス（ＰＭＳＧおよびＨＣＧによって誘導される）から製造されたマウス受精卵の核に注射した。その後、マウス胚（受精された単細胞受精卵）を偽妊娠雌マウス（Ｋｏｒｅａ Ｂｉｏ Ｃｏ．Ｌｔｄ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）に移植した。送達後、全てのアンチ－７オキソＴＧ（＋）マウスを、ｈＧＨポリ（Ａ）に対応するプライマーセット（フォワード：５’－ＣＣＡＣＣＡＧＣＣＴＴＧＴＣＣＴＡＡＴＡＡＡ－３’（配列番号５５）、リバース：５’－ＣＡＧＣＴＴＧＧＴＴＣＣＣＡＡＴＡＧＡ－３’（配列番号５６））を使用してゲノムＤＮＡ（末端から精製される）のＰＣＲ分析によって確認した。アンチ－７オキソＴＧの場合、４つの独立したファウンダー系統（Ｆ_０；＃４４、＃６５、＃６８、および＃６９）が確立され、研究された。全てのマウスは任意に食べ物と水を与えられ、１２：１２時間の明：暗周期で維持させた。

【0194】

実施例２７．ＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリー構築および分析
ＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリーは、アダプターライゲーションに基づく方法または鎖置換停止／ライゲーション方法を使用して全体または大ＲＮＡから生成した。アダプターライゲーションに基づく方法の場合、１００ｎｇの総ＲＮＡ（ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎで精製される）を製造会社のプロトコールによりＮｅｏＰｒｅｐ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に適用した；サンプル名称：Ｈ９Ｃ２－ＮＴ－Ｎ１、Ｈ９Ｃ２－ｍｉＲ－１－２ｏ^８Ｇ－Ｎ１、Ｈ９Ｃ２－ｍｉＲ－１－３ｏ^８Ｇ－Ｎ１。また、ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ ＬｉｂｒａｒｉｅｓはＯｍｅｇａ Ｂｉｏｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ、ＵＳＡ）によって構築、シーケンシングおよび脱多重化された；サンプル名称：Ｈ９Ｃ２－ＮＴ－Ｏ１、Ｈ９Ｃ２－ＮＴ－Ｏ２、Ｈ９Ｃ２－ｍｉＲ－１－７ｏ^８Ｇ－Ｏ１、Ｈ９Ｃ２－ｍｉＲ－１－７ｏ^８Ｇ－Ｏ２。

【0195】

残りサンプルは次のように鎖置換停止／ライゲーション方法を使用して処理された。即ち、１．５μｇの大ＲＮＡ（＞２００ｎｔ、ＲＮｅａｓｙまたはｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎによって抽出される）から、ポリアデニル化されたｍＲＮＡを１０μｌのＤｙｎａｂｅａｄ Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）_２５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造会社が提供したプロトコールにより使用して精製した。その次に、１０ｎｇの精製されたｍＲＮＡに対して、製造会社の説明書に基づき、ＳＥＮＳＥ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリーキット（Ｌｅｘｏｇｅｎ）を使用してＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリーを製造した。ライブラリーが生成された後、これらを最適サイクルが最も低いＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲは異なるサイクルの結果を比較するか前記実施例１４のｏ^８Ｇ－ｍｉＳｅｑの方法に記載された通りｑＰＣＲを行うことによって決定された。増幅されたライブラリーの品質はサイズ分布および量に対してＦｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｄｖａｎｃｅｄ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を使用することによって確認された。必要な場合、尿素－ＰＡＧＥゲル抽出またはＰｉｐｐｉｎ Ｐｒｅｐ（Ｓａｇｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）をサイズ選択のために追加的に使用した。最後に、Ｑｕｂｉｔ ＲＮＡ ＨＳ分析キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）とＦｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して準備された多重化されたライブラリーを正確に定量化し、５０個の単一－末端リードとしてＨｉＳｅｑ２５００システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）によってシーケンシングされるように適用した。シーケンシングするためにＨ９Ｃ２－対照、Ｈ９Ｃ２－アンチ－７オキソ、ｍＨＴ－ＩＳＯ－対照、ｍＨＴ－ＩＳＯ－アンチ－７オキソ、ｍＨＴ－ＩＳＯ－アンチ－７オキソ－ＴＧ（－）およびｍＨＴ－ＩＳＯ－アンチ－７オキソ－ＴＧ（＋）と命名されたサンプル、ＭｉｎｉＳｅｑシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用した。ＨｉＳｅｑ２５００システムの結果と一貫性を維持するために、ＭｉｎｉＳｅｑシステムにはＳＥ５０情報のみ使用された。

【0196】

脱多重化された配列分析リード（ＣＡＳＡＶＡ；Ｉｌｌｕｍｉｎａを使用して獲得）を、ＲｅｆＳｅｑ遺伝子注釈の供給下でＴｏｐＨａｔ２（ｔｏｐｈａｔ２ －ａ ４ －ｇ １ －－ｂ２－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ －ｒ １００ －－ｍａｔｅ－ｓｔｄ－ｄｅｖ＝５０ －－ｌｉｂｒａｒｙ－ｔｙｐｅ ｆｒ－ｆｉｒｓｔｓｔｒａｎｄ）を使用してマウスゲノム（ｍｍ９）またはラットゲノム（ｒｎ５）とアラインした。鎖置換停止／ライゲーション方法を使用してシーケンシングライブラリーを製造した場合、リードの開始側から最初の９個のヌクレオチドを製造会社の説明書に従ってＴｏｐＨａｔ２に対してトリミングした。Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ（ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ －Ｎ－ｂ）を使用して転写レベルを定量化し、同一の実験条件のグループでのマッピング結果の供給と共にＣｕｆｆｄｉｆｆ（Ｃｕｆｆｄｉｆｆ －－ＦＤＲ＝０．１ －ｂ －Ｎ －－ｍｉｎ－ａｌｉｇｎｍｅｎｔ－ｃｏｕｎｔ＝１０ －ｌｉｂｒａｒｙ－ｎｏｒｍ－ｍｅｔｈｏｄ＝ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ）で差異的転写プロファイルを分析した。有効なステータス値のみを選択し、倍率変化および統計的有意性（ｐ値）に加えて使用した。複製物が２つの異なるライブラリー構築方法（アダプターライゲーションに基づく方法および鎖置換停止／ライゲーション方法）から派生した場合、ｃｕｆｆｌｉｎｋｓは同一な類型のライブラリーにのみ使用された後、中央値ＲＰＫＭおよびｐ値（ｔ検定、両側）を全ての複製物から計算した。

【0197】

実施例２８．累積分率分析
与えられたｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ阻害剤による推定標的転写体阻害または脱抑制の傾向を試験するために、倍率変化（ｌｏｇ_２比率）のある累積分率を分析した。推定されるｍｉＲ－１：ｏ^８Ｇ標的は３’ＵＴＲ（ＵＣＳＣゲノムブラウザーからダウンロードしたＲｅｆＳｅｑによって定義される）にｍｉＲ－１ オキソ部位を含有する転写体として選択され、ここで、ｍｉＲ－１：ｏ^８Ｇの２～８位にマッチする全ての６量体（ｏ^８Ｇ：Ｃの代わりにｏ^８Ｇ：Ａのマッチ）について、別途の表示がない限り通常通り調査した。“部位無し”はｍＲＮＡ配列でｍｉＲ－１ シード部位およびオキソ部位を含有しない転写体を示す。“対照部位”は３’ＵＴＲにｍｉＲ－１対照部位を含有する転写体を示し、オキソ部位でｏ^８Ｇと結合するヌクレオチドを以前の研究で陰性対照として使用された通り、Ｇで置換した。ＫＳ検定は総ｍＲＮＡまたは対照部位に対してＳｃｉｐｙ（ｓｃｙｐｙ．ｓｔａｔｓ．ｋｓ＿２ｓａｍｐ）を使用して行った。倍率変化および有意性（－ｌｏｇ_１０（ｐ値））を計算してＶｏｌｃａｎｏ ｐｌｏｔを分析し、このうちカットオフを使用して差異的に発現された遺伝子（ＤＥＧ）を選択した。

【0198】

実施例２９．Ａｇｏ ＨＩＴＳ－ＣＬＩＰデータ分析
心筋症患者の左心室組織からのＡｇｏ ＨＩＴＳ－ＣＬＩＰ結果はＧＥＯデータベース（ＧＳＥ８３４１０）から検索された。ｍｉＲＮＡ配列を含むリードはＢｏｗｔｉｅ（サンプルリードに対する成熟ｍｉＲＮＡ配列のアラインメント）からの‘逆方向’マッピングによって２つのミスマッチの許容と共に確認され、ｍｉＲＮＡリードの位置的ミスマッチがｍｉＲ－１に対して分析された。ｍｉＲ－１オキソ部位の富化分析のために、Ｇ：Ｕ結合によって仲介されたｍｉＲ－１シード部位と比較して、以前の研究（Ｓｐｅｎｇｌｅｒ、Ｒ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４４、７１２０－７１３１）によって提供されたＡｇｏ２結合クラスターを分析した。脳特異的ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ－１２４のシード部位は心臓組織には存在しないため、陰性対照として使用された。ｍｉＲ－１の非核生成バルジ部位も陰性対照として使用された。

【0199】

心筋症患者でｍｉＲ－１ ７オキソ部位を確認するために、Ａｇｏ ＨＩＴＳ－ＣＬＩＰの生シーケンシングデータをＣＬＩＰＩｃｋによって処理した。具体的には、ＦＡＳＴＱファイルは最初に品質点数（ｆａｓｔｑ＿ｆｉｌｔｅｒ．ｐｌ －ｆ ｍｅａｎ：０－２４：２０）に基づいてフィルタリングされ、縮小された（ｆａｓｔｑ２ｃｏｌｌａｐｓｅ．ｐｌ）。その後、前処理されたリード値を同一の仲介変数でＮｏｖｏＡｌｉｇｎプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍ）を使用してヒトゲノム（ｈｇ１９）にアラインした。注釈が付けられた転写体（ＲｅｆＳｅｑ）でリード値を選択した後、ＢｅｄＴｏｏｌｓおよびＳＡＭｔｏｏｌｓ（ｈｔｔｐ：／／ｓａｍｔｏｏｌｓ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／）を使用してアラインされたＡｇｏ ＣＬＩＰリード値をＢＥＤまたはＢＡＭファイルに生成し、ヒトの心臓（ＲＮＡ－Ｓｅｑ Ａｔｌａｓに由来する、ｈｔｔｐ：／／ｍｅｄｉｃａｌｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ／ｒｎａ＿ｓｅｑ＿ａｔｌａｓ）の発現プロファイル供給有のピーク分析に使用した。ピーク（ｐｅａｋ）、編集された全てのリード値、および推定ｍｉＲ－１ ７オキソ部位（２～８位の６量体）を視覚化するために、ＵＣＳＣゲノムブラウザー（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）を適用した。

【0200】

実施例３０．ＣＬＥＡＲ－ＣＬＩＰ
ＩＳＯ処理またはＰＢＳ処理されたマウスから解剖されたマウス心臓組織（約１５０ｍｇ）を粉砕し、ＵＶ照射（４００ｍｊ／ｃｍ^２、３回；Ｓｐｅｃｔｒｏｌｉｎｋｅｒ ＸＬ－１０００）してｉｎ ｖｉｖｏ ＲＮＡ－タンパク質複合体の架橋共有結合を誘導した。５０μＵ／μｌのＲＮＡｓｅ Ａ（ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）で３７℃で５分間処理することによって得られた処理済みＡｇｏ－関連断片ｍＲＮＡは、６０ｍｇのＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に付着された２つの異なる抗Ａｇｏ抗体（２Ａ８；Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ、２Ｅ１２；Ａｂｎｏｖａ）１０μｇによって免疫沈降させた。ｍｉＲＮＡ－標的ｍＲＮＡキメラを生成するためのライゲーションは、１６℃で一晩、０．６２５Ｕ／μｌのＴ４ ＲＮＡライゲーズ１（ＮＥＢ）を処理することによって行われ、２５℃で７５分間、３％のＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）および１８％のＰＥＧ８０００（Ｓｉｇｍａ）の存在下でさらに１Ｕ／μｌのＴ４ ＲＮＡライゲーズ１（ＮＥＢ）で処理することによって強化された。同位元素標識されたＲＮＡ－タンパク質複合体はＮｕＰＡＧＥ １０％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を作動させてサイズ別に分離し、ニトロセルロース膜（ＢＡ８５；Ｗｈａｔｍａｎ）に移し、切り出し、４ｍｇ／ｍｌのプロテネーズＫ（Ｒｏｃｈｅ）および７Ｍの尿素（Ｓｉｇｍａ）で処理し、酸フェノール：クロロホルム：ＩＡＡ（１２５：２４：１；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５キット（Ｚｙｍｏ）で抽出した。精製されたＲＮＡはアダプターライゲーションおよびＲＴ－ＰＣＲに適用してｓｍａｌｌ ＲＮＡ－Ｓｅｑ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐキット（Ｌｅｘｏｇｅｎ）を使用することによって高処理量シーケンシングのためのライブラリーを生成し、最終的にＨｉＳｅｑ２５００システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でシーケンシングした。

【0201】

シーケンシングリードを前処理してマッピングし、アダプター配列が除去された後、ｍｉＲＮＡ配列を含有する潜在的なキメラリードが‘リバース’マッピングによって確認され、ここで、成熟したｍｉＲＮＡ配列はＢｏｗｔｉｅを使用してサンプルライブラリーに逆向きに整列された。その後、残りの配列をマウスゲノム（ｍｍ９）にマッピングし、２Ａ８および２Ｅ１２抗体の両方からの組み合わせエクソンと重なったもののみを追加的に選択し、キメラリードを含むｍｉＲ－１にのみに最終的に焦点を合わせた。ｍｉＲ－１ シードおよびオキソ部位の調査において、ＩＳＯ注入および非注入マウス心臓の間の富化結果を比較してマッピングされたキメラリードから上流（５’、－）および下流（３’、＋）が拡張された（－／＋０、－／＋２５、－／＋５０、－／＋１００）。

【0202】

実施例３１．心筋細胞特異的ｍｉＲ－１：７ｏ ^８ Ｇ阻害剤の構築
心筋細胞においてｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇを特異的に抑制するために、心筋細胞特異的α－ＭＨＣプロモーターを保有するｐＪＧ／ＡＬＰＨＡ ＭＨＣプラスミドに基づいて複数のｍｉＲ－１ ７オキソ標的サイトを含有する競合的阻害剤を構築した。１３個のｍｉＲ－１ ７オキソ部位（５’－ＡＡＡＵＵＣＣ－３’；配列番号６）または対照ＮＴ標的部位（５’－ＧＧＵＵＧＵＧ－３’；配列番号２１）を含む合成二重オリゴ（Ｍａｃｒｏｇｅｎ）をＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を介して、説明書の通りにｐＪＧ／ＡＬＰＨＡ ＭＨＣベクターにクローニングした。アンチ－７オキソ、α－ＭＨＣ １３ｘ、フォワード：５’－ＴＣＧＡＣＡＡＡＴＴＣＣＡＡＡＡＡＴＴＣＣＡＴＡＡＡＴＴＣＣＡＧＡＡＡＴＴＣＣＡＣＡＡＡＴＴＣＣＡＡＡＡＡＴＴＣＣＡＣＡＡＡＴＴＣＣＡＴＡＡＡＴＴＣＣＡＧＡＡＡＴＴＣＣＡＡＡＡＡＴＴＣＣＡＴＡＡＡＴＴＣＣＡＧＡＡＡＴＴＣＣＡＣＡＡＡＴＴＣＣＡＡ－３’（配列番号５７）、リバース：５’－ＡＧＣＴＴＴＧＧＡＡＴＴＴＧＴＧＧＡＡＴＴＴＣＴＧＧＡＡＴＴＴＡＴＧＧＡＡＴＴＴＴＴＧＧＡＡＴＴＴＣＴＧＧＡＡＴＴＴＡＴＧＧＡＡＴＴＴＧＴＧＧＡＡＴＴＴＴＴＧＧＡＡＴＴＴＧＴＧＧＡＡＴＴＴＣＴＧＧＡＡＴＴＴＡＴＧＧＡＡＴＴＴＴＴＧＧＡＡＴＴＴＧ－３’（配列番号５８）；対照、アンチ－ＮＴ、フォワード：５’－ＴＣＧＡＣＧＧＴＴＧＴＧＡＡＧＧＴＴＧＴＧＡＴＧＧＴＴＧＴＧＡＧＧＧＴＴＧＴＧＡＣＧＧＴＴＧＴＧＡＡＧＧＴＴＧＴＧＡＣＧＧＴＴＧＴＧＡＴＧＧＴＴＧＴＧＡＧＧＧＴＴＧＴＧＡＡＧＧＴＴＧＴＧＡＴＧＧＴＴＧＴＧＡＧＧＧＴＴＧＴＧＡＣＧＧＴＴＧＴＧＡＡ－３’（配列番号５９）、リバース：５’－ＡＧＣＴＴＴＣＡＣＡＡＣＣＧＴＣＡＣＡＡＣＣＣＴＣＡＣＡＡＣＣＡＴＣＡＣＡＡＣＣＴＴＣＡＣＡＡＣＣＣＴＣＡＣＡＡＣＣＡＴＣＡＣＡＡＣＣＧＴＣＡＣＡＡＣＣＴＴＣＡＣＡＡＣＣＧＴＣＡＣＡＡＣＣＣＴＣＡＣＡＡＣＣＡＴＣＡＣＡＡＣＣＴＴＣＡＣＡＡＣＣＧ－３’（配列番号６０）。注目すべきことは、対照ベクター（アンチ－ＮＴ）は、ｃｅｌ－ｍｉＲ－６７（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ－）に由来した非標的ｓｉＲＮＡ（ＮＴ）の結合部位を含むものを除いてはアンチ－７オキソ（α－ＭＨＣ １３ｘ）に使用されたものと同一なプラスミドであった。ｐＪＧ／ＡＬＰＨＡ ＭＨＣベクターはＪｅｆｆｒｅｙ Ｒｏｂｂｉｎｓ（Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ ＃５５５９４）からＤｒ．Ｄａ－Ｚｈｉ Ｗａｎｇに提供されたものであった。他の競合的ｍｉＲＮＡ阻害剤はＲＮＡから合成された（ＲＮＡ合成方法参照）。

【0203】

実施例３２．ＩＳＯ処理マウスへのｍｉＲＮＡ阻害剤の投与
競合的ｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇ阻害剤（アンチ－７オキソ）が生体内でＩＳＯ－誘導心臓肥大を弱化させることができるかどうかを調査するために、ＩＳＯ（７５ｍｇ ｋｇ^－１）を最初に８週～１２週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｋｏｒｅａ Ｂｉｏ Ｃｏ．ＬＴＤ）に腹腔内注射（Ｉ．Ｐ）によって投与し、この時、同じ容量のＰＢＳを対照として使用した（各セットに対してｎ＝５）。８時間後、製造会社のプロトコールにより明示された量および比率でｉｎ ｖｉｖｏ ｊｅｔＰＥＩ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）を使用してアンチ－７オキソまたは対照（アンチ－ＮＴ）をマウスに静脈注射した；アンチ－７オキソ（α－ＭＨＣ １３ｘ）または対照（アンチ－ＮＴ １３ｘ）、１．９ｍｇ ｋｇ^－１、Ｎ／Ｐ比率＝８；アンチ－７オキソ（４ｘ）または対照（アンチ－ＮＴ ４ｘ）、５ｍｇ ｋｇ^－１、Ｎ／Ｐ比率＝５。連続注射は１日目、２日目および５日目に３回行われ、７日目に全てのマウスを殺処理して心臓を検査した。ｈＧＨ ポリ（Ａ）（フォワード：５’－ＴＡＡＡＴＴＣＣＡＡＡＴＴＣＣＡＧＡＡＡＴＴＣＣＡＣＡＡＡＴＴＣＣＡＴ－３’（配列番号６１）、リバース：５’－ＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＴＣＣＣＡＡＴＡＧＡ－３’（配列番号６２））を含むアンチ－７オキソ転写体のＲＴ－ｑＰＣＲを行うことによって心臓組織へのアンチ－７オキソ（α－ＭＨＣ １３ｘ）の送達率を測定した。アンチ－７オキソ（４ｘ）がマウス心臓に送達されることを確認するために、ポリ（Ａ）テールに基づくｍｉＲＮＡ ｑＰＣＲ方法（ｍｉＲＮＡに対する定量的ＰＣＲの方法参照）をアンチ－７オキソ（４ｘ）（フォワード、５’－ＴＡＡＡＴＴＣＣＡＡＡＴＴＣＣＡＧＡＡＡＴＴＣＣＡＣＡＡＡＴＴＣＣＡＴ－３’；配列番号６３）特異的プライマーで行った。

【0204】

実施例３３．経時的なＩＳＯにおけるｍｉＲ－１：ｏ ^８ Ｇの定量
経時的なＩＳＯ（ＩＳＯ ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ）実験で酸化されたｍｉＲ－１の量の変化を調査するために、７５ｍｇ ｋｇ^－１のＩＳＯをＩＰ注射によってマウスに投与し、注入されたマウスを処理時点から１日目、５日目および７日目に殺処理した（各時点についてｎ＝４）。同じ容量のＰＢＳをさらに注入し、マウスを直ちに殺処理して０日目のサンプルとして使用した（ｎ＝４）。心臓を解剖した後、ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して小ＲＮＡを抽出した。ｍｉＲ－１：ｏ^８Ｇを定量するために、“ｏ^８Ｇ ＩＰおよびｑＰＣＲによる酸化されたｍｉＲＮＡの定量化”方法に記述された通り、ｏ^８Ｇ ＩＰおよびその後のｍｉＲ－１ ｑＰＣＲを行ったが、次のように若干の変更があった。ビーズ製造においては、１５０μｌのＰＸＬ中の３μｇの抗ｏ^８Ｇ抗体（１５Ａ３、ＱＥＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、３０μｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および３００μｇのデオキシグアノシン（ｄＧ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用；ＩＰ培養では、２．５ｍＭのＤＦＯＭおよび４０Ｕの組換えＲＮａｓｅ阻害剤（Ｔａｋａｒａ）を含有する２５０μｌのＰＸＬ中で２μｇの小ＲＮＡサンプルおよび１ｐｇのｏ^８ｄＧ ＲＮＡスパイクイン（ｍｉＲ－１２４－３ｐ：４ｏ^８ｄＧ：５’ｐ－ＵＡＡＧｏ ^８ ｄＧＣＡＣＧＣＧＧＵＧＡＡＵＧＣＣ－３’；配列番号６４）を使用。

【0205】

実施例３４．３’ＵＴＲ内のｍｉＲ－１標的部位の配列保存分析
３’ＵＴＲで保存される配列のモチーフを計数する場合、哺乳類に対するＰｈａｓｔＣｏｎｓ結果をＵＣＳＣゲノムブラウザー（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ）から得て、スコアが０．９以上である場合にのみ使用し、保存率（保存されたモチーフ数／総モチーフ数；％）を計算した。全ての３’ＵＴＲ（ＲｅｆＳｅｑによって定義される）での保存率は、ｍｉＲ－１の４つの異なる部位（シード、２オキソ、３オキソおよび７オキソ部位）に対して保存されたｍｉＲＮＡファミリーのシード部位（ｎ＝１０３、２～８位の６量体）で計算した。このうち大部分の哺乳動物で配列が保存される（しかし、一般に胎盤哺乳動物を超えてはいない；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇ）。バックグラウンド対照として、全ての６量体（ｎ＝４０９８）の保存も計算された。得られた分布は累積分率および母集団の比率として表された。

【0206】

実施例３５．データの利用可能性
ｏ^８Ｇ－ｍｉＳｅｑ（ＳＲＰ１８９８０６、ＳＲＰ１８９８０７、ＳＲＰ１８９８０８、ＳＲＰ２２６１２５）、ＲＮＡ－Ｓｅｑ（ＳＲＰ１８９８１３、ＳＲＰ１８９１１７、ＳＲＰ１８９８１２、ＳＲＰ１８９８１１、ＳＲＰ１８９８０９、ＳＲＰ２１３９９８、ＳＲＰ２１４４００、ＳＲＰ２２８２７４）およびＣＬＥＡＲ－ＣＬＩＰ（ＳＲＰ１８９８１０）の全ての生シーケンシングデータはＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅａｄ Ａｒｃｈｉｖｅｓに保管された。スパイクインがあるｏ^８Ｇ ＩＰのシーケンシングデータを含む全てのＦＡＳＴＱファイルはプロジェクトウェッブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｉｐ．ｋｏｒｅａ．ａｃ．ｋｒ／ｏｘｏｇ／）でも提供される。

【0207】

実施例３６．心肥大症動物モデルの血漿（ｐｌａｓｍａ）におけるｍｉＲ－１：ｏ ^８ Ｇの測定
実施例８で記述したのと同様の方法で、ＩＳＯ注入を通じてマウスの心肥大症を誘導した（図６ａ）。その後、ＰＢＳ処理した対照群の３匹と、過剰量のＩＳＯで処理した実験群の３匹からそれぞれ７００μｌの血液を採取した後、４℃、１０００ｘｇ、で５分間の遠心分離を通じて沈降させて血漿を分離した。各群当り３５０μｌ等量の血漿からＱｉａｇｅｎ社のｍｉＲＮｅａｓｙ Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ Ｋｉｔを使用して小ＲＮＡを抽出し、抽出された小ＲＮＡにおけるｍｉＲ－１の測定は、実施例１２で記述した通りｑＰＣＲを実施し、Ｕ６の量で補正して定量した。また、血漿から分離した１００ｎｇの小ＲＮＡから実施例１１で記述した通り抗体沈降（ＩＰ）を通じてｏ^８Ｇ修飾されたＲＮＡを特異的に分離し、ｑＰＣＲ方法を通じてｍｉＲ－１を定量した。また、ｏ^８Ｇに修飾されたｍｉＲ－１の定量は、ＤＮＡ形態で５位にｏ^８Ｇが合成された、１ｐｇのｍｉＲ－１２４－３ｐ：４ｏ^８ｄＧ（ＵＡＡＧｏ ^８ ｄＧＣＡＣＧＣＧＧＵＧＡＡＵＧＣＣ－３’；配列番号６４）を^８Ｇ抗体を用いた免疫沈降実験に加え、ｑＰＣＲで測定し、補正することで行った。

【0208】

実験例１．ＲＯＳ依存性心臓肥大におけるｍｉＲＮＡの酸化
Ｈ９ｃ２ラット心筋母細胞細胞株をα－アドレナリン性受容体（ＡＲ）作動薬（フェニレフリン；ＰＥ）で処理して、ＰＥ処理による病理生理学的肥大刺激およびＲＯＳ生成とｍｉＲＮＡの酸化を確認した。ＲＯＳ蛍光染料（ＤＨＥ）を使用してフローサイトメトリー（１０，０００細胞、ｎ＝３）で分析した結果、ＰＥ処理後の細胞内でＲＯＳが増加したことを確認し、特にＰＥで処理された後に発生した肥大細胞のうちの９３％は処理後のＲＯＳ生成が１．８倍に増加した。アドレナリン性肥大を刺激するために確立された前提条件である血清欠乏は、基底ＲＯＳレベルの高い拡大表現型を向上させる。

【0209】

生体内マウスモデルにさらに拡張して、図１ａに示すβ－ＡＲ作動薬であるイソプロテレノール（ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ、ＩＳＯ）の慢性投与は、図１ｂに示したように、心臓肥大（約１３％の増加）を誘導する。このうち病理は心臓超音波で確認し、前記ＩＳＯで処理した時にＲＯＳを生成することを確認した。

【0210】

その次に、前記のＩＳＯを投与した心臓肥大マウスモデルでＲＮＡがＲＯＳによって酸化されたかを調査した。

【0211】

サイズ（２００ヌクレオチド基準）によってＲＮＡを分離して、ＩＳＯ処理によって誘導された８－オキソグアニン（８－ｏｘｏｇｕａｎｉｎｅ、ｏ^８Ｇ）をｏ^８Ｇ特異的抗体を用いるＥＬＩＳＡで測定した。測定結果は、図１ｃに示したように、小ＲＮＡにおいて大ＲＮＡよりも約３．１倍多くｏ^８Ｇが生成されたことを確認した。これは大ＲＮＡがパラコート（ｐａｒａｑｕａｔ、ＰＱ）処理によって誘発される酸化ストレスを受ける場合の大ＲＮＡ（１．８倍）よりもさらに急激なことが確認された。

【0212】

小ＲＮＡの酸化は、図１ｄに示したようにＲＮＡ誘導サイレンシング複合体のカギとなるタンパク質であるＡｒｇｏｎａｕｔｅ２（Ａｇｏ２）とｏ^８Ｇとの共存（ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）に基づいてｍｉＲＮＡまでさらに分解して、定量化及び増加させ、これはＰＥ処理されたｒＣＭＣ（約８倍）で定量化されて増加することを確認し、図１ｅに示したようにＰＥ－またはＩＳＯ－処理されたＨ９ｃ２でも増加することを確認した（平面（ｐｌａｎｅ）当りのｏ^８Ｇ＋、Ａｇｏ２＋；１００細胞、ｎ＝４；Ｐ＝０．０５）。

【0213】

独立的に、ｏ^８Ｇ特異的抗体を使用したドットブロット分析は図１ｆに示したように、酸化還元反応依存的方式でＰＥ－処理されたＨ９ｃ２およびｒＣＭＣから小ＲＮＡ（＜２００ｎｔ）の酸化が増加することが確認された。

【0214】

ＰＥ処理されたＨ９ｃ２およびＩＳＯ注入マウス心臓でｍｉＲＮＡの酸化を確認した時、図１ｇに示したようにＰＥ処理されたＨ９ｃ２（図１ｇの上段）およびＩＳＯ注入マウス心臓（図１ｇの下段）でのｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ分析結果、および図１ｈに示すゲル抽出した約２０ｎｔのｍｉＲＮＡのドットブロット分析結果を通じて、ＰＥおよびＩＳＯそれぞれの処理によって、ｏ^８Ｇはサイズが約２０ｎｔのｍｉＲＮＡから発生することを確認した。

【0215】

前記実験結果を要約すれば、心臓肥大は酸化還元反応依存的であり、ＲＯＳの生成を可能にし、生成されたＲＯＳはｍｉＲＮＡのｏ^８Ｇ修飾を誘導する。

【0216】

実験例２．心臓ｍｉＲＮＡ内の部位特異的ｏ ^８ Ｇのシーケンシング
酸化されたｍｉＲＮＡおよび対応するｏ^８Ｇの位置を確認するために、ｏ^８Ｇの免疫沈降（ＩＰ）を最適化しｏ^８Ｇ－誘導されたＧ→Ｔ塩基転換を検出することによってｍｉＲＮＡでｏ^８Ｇに対する新たなシーケンシング方法（ｏ^８Ｇ－ｍｉＳｅｑ）を開発し、その模式図を図２ａに示した。

【0217】

まず、図２ｂに示したように、ＣＬＩＰに使用された条件を採択してｏ^８Ｇに対するＩＰプロセスが広範囲に改善され、図２ｃに示したように最適化したＩＰは非特異的背景（酸化されていないＧ）に比べて約３０００倍の合成ｏ^８Ｇ量を示した。ｏ^８ＧはＡと対を成すことができるため、ｃＤＮＡでＧ→Ｔ変異を誘導する効能は約５０～６０％に到達するように向上し、これは図２ｄに示したように獲得された制限酵素部位の配列特異的切断によって間接的に（図２ｄの上段）およびシーケンシングによって直接的に（図２ｄの中間および下段）立証された。

【0218】

その次に、下記表１に示したようにｏ^８Ｇ－ｍｉＳｅｑを初期にＨ９ｃ２に適用し、ｍｉＲ－１ｂをその基本発現（ｏ^８Ｇ富化、ｌｏｇ_２（ＩＰ／ｉｎｐｕｔ）＝７；ｍｉＲＮＡ－Ｓｅｑによって標準化される）に関連して最も酸化されたｍｉＲＮＡとして確認し、ｏ^８Ｇ富化度（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）、即ち、ｍｉＲＮＡに対するインプットリードカウントに対して正規化されたｏ^８Ｇ ＩＰのｌｏｇ比率はｍｉＲＮＡ頻度によって点で表示して図２ｅの左側図面に表し、ヒートマップ密度として配列でのＧの数を図２ｅの右側図面に示した。

【0219】

【表1】

【0220】

ｍｉＲＮＡの量およびＧ含量からのバイアス（ｂｉａｓ）が全く観察されないことによって、ＩＰは特異的に実行されることが立証され、Ｖｏｌｃａｎｏ ｐｌｏｔとして有意性（－ｌｏｇ_１０（Ｐ値））を示した図２ｆのようにｍｉＲ－１ｂでｏ^８Ｇは有意的に高く（Ｐ＜０．０１）、Ｇ→Ｔ突然変異率に基づいてシード領域（２位、３位および７位）で顕著であることが確認された。また、下記表２のようにｒＣＭＣに対する追加適用によって、図２ｇに示したようにｏ^８Ｇ－ｍｉＳｅｑはシード領域の識別された位置（２位、３位および７位）でｏ^８Ｇの増加（図２ｇの上段）と共にＰＥ処理によってｍｉＲ－１ｂが優先的に酸化されるのを追加的に示した（相対的ｏ^８Ｇ富化度、ｌｏｇ_２（ＰＥ／Ｍｏｃｋ）＝１．６６；図２ｇの下段）。

【0221】

【表2】

【0222】

その次に、ｒＣＭＣの肥大性表現型を悪化させるためにｒＣＭＣを血清欠乏に露出させた後、下記表３に示したようにｏ^８Ｇ－ｍｉＳｅｑ分析のためのＰＥ処理を行った。その結果、図２ｈに示したようにｍｉＲ－１配列でＧ→Ｔ転換率によって推定されたとおり、７位でｏ^８Ｇは劇的に増加し（ｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇ、～２倍増加）。図２ｉおよび表４に示したように強化されたｍｉＲ－１ｂ酸化を観察すること以外にも相当の量のｏ^８Ｇ（ｌｏｇ_２（ｏ^８Ｇ－ＩＰ）＞１０）と共にｍｉＲ－１８４、ｌｅｔ－７ｆ－５ｐおよびｍｉＲ－１－３ｐ（Ｐ＜０．０１）のような他のｍｉＲＮＡでも有意的な酸化が観察された。特に、ｍｉＲ－１８４は図２ｊに示したように以前のＨ_２Ｏ_２処理結果と同一に確認され、その他の他のｍｉＲＮＡの場合は若干のミスマッチがあった。

【0223】

全般的に、ｏ^８Ｇ－ｍｉＳｅｑを使用することによって、心臓肥大の間に酸化されたｍｉＲ－１およびその特定のｏ^８Ｇの位置を正確に検出することができた。

【0224】

【表3】

【0225】

【表4】

【0226】

実験例３．酸化されたｍｉＲ－１のｏ ^８ Ｇ：Ａ塩基対による標的サイレンシング効果
前記実験例２で確認した通り酸化されたｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－１ｂ、ｍｉＲ－１－３ｐ、ｍｉＲ－１８４およびｌｅｔ－７ｆ）に対して、図３ａに示したように、ＰＥ処理によるｏ^８Ｇ ＩＰ（ｍｉＲＮＡ：ｏ^８Ｇ）を通じてこれらの量の有意な増加を観察しｒＣＭＣでこれらを検証した（Ｐ＜０．０５、ｔ－ｔｅｓｔ）。そのうち、ｍｉＲ－１は最も劇的な向上を示し（～２．５－５倍）、図３ｂに示したようにＩＳＯ処理後下向調節にもかかわらずＩＳＯ－処理された肥大性マウス心臓でも確認された。

【0227】

ｍｉＲ－１を中心にして、シード領域で識別されたｏ^８Ｇの位置（２位、３位および７位）がｍｉＲ－１（ｍｉＲ－１：２ｏ^８Ｇ、ｍｉＲ－１：３ｏ^８ＧおよびｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇ）がｏ^８Ｇ：Ａ塩基結合を通じて相応する新たな標的部位（２オキソ、３オキソおよび７オキソ部位）を認識することができるかどうかを調査し、その結果を図３ｃに示した。

【0228】

ルシフェラーゼレポーター分析を行うことによって、合成されたｍｉＲ－１：２ｏ^８Ｇ、ｍｉＲ－１：３ｏ^８ＧおよびｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇが当該酸化修飾時Ｇ；Ａ塩基配列で認識することができるオキソ部位（２オキソ、３オキソおよび７オキソ部位）を有する標的をサイレンシングさせることができるのを確認し、これはｍｉＲ－１によって抑制されなかった。

【0229】

実際に、図３ｄに示したようにｍｉＲ－１ オキソ部位を有するこれらルシフェラーゼレポーターは全てＰＥ－処理されたｒＣＭＣで抑制されたが、抗酸化剤ＮＡＣの存在下で活性化され、これはターゲット認識を変えてサイレンシングを行うに十分なｒＣＭＣのアドレナリン性刺激によって生成された内因性ｍｉＲ－１：ｏ^８Ｇのレベルを示唆する。

【0230】

また、図３ｅに示したようにＰＥまたはＨ_２Ｏ_２処理直後ＡＣ１６で一貫した結果を観察した。

【0231】

その次に、細胞集団の異質性から合成効果を排除するために、図３ｆに示したように二重蛍光タンパク質（ｄＦＰ）レポーターでフローサイトメトリー法を行った：ｍｉＲＮＡ標的サイトを有する緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）およびサイトを有しない赤色蛍光タンパク質遺伝子（ＲＦＰ）。ｄＦＰレポーターは肥大性Ｈ９ｃ２で相対的活性の累積分率分析（Ｐ＝１．５６×１０^－５、Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ－Ｓｍｉｒｎｏｖ ｔｅｓｔ（ＫＳ ｔｅｓｔ）、ＧＦＰ／ＲＦＰ）によって観察されたものである。

【0232】

内因性ｍｉＲ－１の低い発現レベル（恐らく図３ｈに示す心筋芽細胞株の運命異質性に起因する）にもかかわらず、図３ｇに示したように、個別Ｈ９ｃ２細胞レベルでｍｉＲ－１：ｏ^８Ｇ－依存的抑制を検出することができた。ｄＦＰレポーターの全てのｍｉＲ－１オキソ部位（７オキソ、３オキソおよび２オキソ部位）はｏ^８Ｇ－ｍｉＳｅｑ（図２ｆ）によって観察されたｍｉＲ－１：ｏ^８Ｇの位置（２位、３位および７位）と一致しｍｉＲ－１：ｏ^８Ｇの基底レベルによって仲介された抑制を検出するための敏感度を有して内生的に抑制されることを図３ｉで確認し、ｍｉＲ－１阻害剤または同族ｍｉＲ－１変異体を形質導入させることによって確認された。

【0233】

また、ｄＦＰレポーターは、図３ｊに示したように肥大Ｈ９ｃ２でｍｉＲ－１ ７オキソ部位の有意なＰＥ－依存的抑制を検出した。

【0234】

また、二つの蛍光タンパク質の完全な励起からの感度が増加することによって、図３ｋに示したようにサイトを有しない（ｎｏ ｓｉｔｅ）ｄＦＰレポーター（ＲＦＰ：ＧＦＰ、ＮＴ）と比較して値を比較することによって図３ｌに示すｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇ（ＲＦＰ：ＧＦＰ－７オキソ ｖｓ．ＲＦＰ：ＧＦＰ、ＮＴ）および図３ｍに示すＮＡＣ処理によるその活性化（ＲＦＰ：ＧＦＰ－７オキソ、ｍｏｃｋ ｖｓ．ＮＡＣ）の内因性レベルによるｍｉＲ－１の抑制を検証して分析を綿密に調査した。

【0235】

重要に、細胞で類似の範囲の対照群蛍光値（ＲＦＰ）でレポーター蛍光値（ＧＦＰ－７オキソ）を平均化して計算されたこのような相対的抑制はレポーター蛍光値（ＧＦＰ－７オキソ）の最も低い２５％である時目立ち、高いレベルのｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇを有する細胞集団の存在を暗示することに考慮された。また、図３ｎに示したように、レポーターと対照群蛍光タンパク質が相互交換されたｄＦＰレポーターは、ｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇの内因性レベルによるｍｉＲ－１ ７オキソ部位の抑制および抑制のＰＥ依存的増加を敏感に検出した。

【0236】

また、図３ｏに示したように、転換されたｄＦＰレポーターを使用し、レポーター値（ＲＦＰ）が２５％で最も低い制限された細胞集団のみ考慮する時、ｍｉＲ－１ ７オキソ部位のＰＥ－誘導抑制がより実質的であることが観察され、ｍｉＲ－１阻害剤を導入することによって回復されたレポーター活性（ＲＦＰ）の観察はｍｉＲ－１ ７オキソ部位のＰＥ－依存的抑制がｍｉＲ－１によって仲介されることを追加的に確認した。特に、図３ｐに示したように、酸化されたｍｉＲ－１（２ｏ^８Ｇ、３ｏ^８Ｇおよび７ｏ^８Ｇ）の導入は酸化されないｍｉＲ－１よりあまり強力でないが、ｏ^８Ｇ：Ｃ塩基結合の維持された活性のためルシフェラーゼレポーターでシード部位を抑制することができた。ｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇはアドレナリン性心臓肥大から獲得されたｏ^８Ｇ：Ａ塩基結合を通じて標的ｍＲＮＡをサイレンシングさせることが観察された。

【0237】

実験例４．ｍｉＲ－１：ｏ ^８ Ｇの心臓肥大誘導確認
ｍｉＲ－１が肥大で陰性機能を果たすと報告されたが、ＰＥ処理は図４ａに示したｒＣＭＣ細胞の顕微鏡観察結果および細胞サイズ定量結果のようにｒＣＭＣのｍｉＲ－１－誘導萎縮を減少させた。細胞サイズ（ｉｎｃｈ^２、ｎ＝１００）はＩｍａｇｅＪを用いて定量した。

【0238】

前記実験例２でのｍｉＲ－１：ｏ^８Ｇの発見とＰＥ誘導された肥大の酸化還元反応依存性によって持続された合成ｍｉＲ－１：２ｏ^８Ｇ、ｍｉＲ－１：３ｏ^８ＧまたはｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇを導入して、図４ｂに示したように、ＰＥ処理より実質的にｒＣＭＣの肥大がさらに誘導されることを観察した。

【0239】

このような効果はｏ^８ＧをＵで置換した合成ｍｉＲ－１（ｍｉＲ－１：２Ｕ、ｍｉＲ－１：３ＵおよびｍｉＲ－１：７Ｕ）を導入した場合にも対等に示され、これによって肥大現象の発生がｏ^８Ｇ：Ａ塩基結合に依存するということが分かる。

【0240】

このような効果は図４ｃに示したように、Ｈ９ｃ２でも同一に観察された。

【0241】

具体的に、図４ｄに示すｑＰＣＲ測定結果のようにｍｉＲ－１：７ｏ^８ＧまたはｍｉＲ－１：７Ｕによって誘導された肥大は、ＰＥ処理で観察されたように心臓肥大マーカと知られた心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）の発現を有意に増加させた。このような結果は、図４ｅに示すフローサイトメトリーとｒＣＭＣ（図４ｆの上段）およびＨ９ｃ２（図４ｆの下段）の時間経過イメージによって追加的に確認した。

【0242】

また、ｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇが生体内で心臓肥大に与える影響について試験した。図４ｇに示したようにｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇを尾静脈を通じて非標的化対照群（ＮＴ）を有するｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ（ＰＥＩ）複合体として注射し（図４ｇの上段）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって心臓組織への送達を検証した（図４ｇの下段）。結果的に、図４ｈに示したように心臓サイズの少なくとも～１０％以上が有意に増加し（Ｐ＝０．００１、ｎ＝３）、図４ｉに示したようにＨ＆Ｅ染色した心臓組織のうち心室中隔（ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｓｅｐｔｕｍ、ＩＳ）を免疫染色し心筋細胞のサイズを定量した結果、心筋細胞サイズの～１９％症がおよびＡＮＰ発現の相当な上向調節を観察した。この時、図４ｊでＷＧＡ（ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）は細胞境界、ＭＦ２０は心筋細胞、ＤＡＰＩは核染色に使用した。

【0243】

前記実験結果を要約すれば、ｍｉＲ－１、特にｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇの位置特異的酸化はｏ^８Ｇ：Ａ塩基結合を通じて生体内で心臓肥大を十分に誘導することができる。

【0244】

実験例５．酸化されたｍｉＲ－１２２、ｌｅｔ－７およびｍｉＲ－１２４の発見とこれによる機能獲得
心筋肥大症以外にも酸化ストレスが発生すると知られた他の疾病に対しても様々なマイクロＲＮＡの５’末端から８番目までの発端部分がｏ^８Ｇ修飾有無を確認した。

【0245】

先ず、活性酸素が増加したと知られた腫瘍のうち、ｍｉＲ－１２２が特異的に多く発現される肝細胞に由来した肝癌細胞株であるＨｕｈ７で、ｍｉＲ－１２２のグアニンのうち２番目（２オキソ）、３番目（３オキソ）、または２番目と３番目がｏ^８Ｇ修飾されているか（２オキソ、３オキソ）ルシフェラーゼレポーターを製作して確認してみた。この時のルシフェラーゼレポーター実験はｍｉＲ－１２２の発端部分でｏ^８Ｇ：Ａ配置で結合して認識することができる標的サイトを５個含むようにｐｓｉ－ｃｈｅｃｋ２（Ｐｒｏｍｅｇａ社）ベクターを使用して製作した後、Ｈｕｈ７にトランスファクションした後に測定した。また、当該サイトの抑制が直接的にｍｉＲ－１２２によることであるのを明らかにするために、Ｈｕｈ７でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いた遺伝子矯正でｍｉＲ－１２２遺伝子を除去した細胞株（Ｈｕｈ７：ｍｉＲ－１２２ ＫＯ）をｍｉＲＮＡ ＣＲＩＳＰＲ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｋｉｔｓ（Ｃａｎｏｐｙ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用して製作して同一な条件で共に実験した。

【0246】

前記実験による結果は図５ａに示した。

【0247】

実験の結果、既存のｍｉＲ－１２２が認識するシードサイト（シード：５’－ＡＣＡＣＵＣＣＡ－３’）標的が抑制されただけでなく、２番ｏ^８Ｇ修飾サイト（２ｏｘｏ：５’－ＡＣＡＣＵＣＡＡ－３’）、３番ｏ^８Ｇ修飾サイト（３オキソ：５’－ＡＣＡＣＵＡＣＡ－３’）、２番と３番が同時にｏ^８Ｇ修飾されたサイト（２オキソ、３オキソ：５’－ＡＣＡＣＵＡＡＡ－３’）が抑制された。

【0248】

また、Ｈｕｈ７：ｍｉＲ－１２２ ＫＯでｍｉＲ－１２２の３番ｏ^８Ｇ修飾サイト（３オキソ）、２番と３番が同時にｏ^８Ｇ修飾されたサイト（２オキソ、３オキソ）の抑制が無くなることを観察して、当該抑制がｍｉＲ－１２２の修飾によることであるのを証明した。

【0249】

ｌｅｔ－７に対して４位ｏ^８Ｇサイト（４オキソ：５’－ＣＵＡＣＡＵＣＡ－３’）に対するルシフェラーゼレポーターを以前と同様な方法で製作し、これを用いて膠芽腫であるＨＳ６８３で測定してみた結果、ｌｅｔ－７のシードサイト（シード：５’－ＣＵＡＣＣＵＣＡ－３’）よりはその阻害程度が小さいが、対照群に比べて有意に抑制されること（Ｐ＜０．０１）を確認し、その結果は図５ｂに示した。

【0250】

また、神経細胞および膠芽腫細胞で多く発現されると知られたｍｉＲ－１２４に対しても同一にｏ^８Ｇ修飾がシード領域に生成されたかを調べてみるために、ｍｉＲ－１２４の４位ｏ^８Ｇ修飾標的サイト（４オキソ：５’－ＧＵＧＣＡＵＵＡ－３’）に対してもルシフェラーゼレポーター実験を膠芽腫であるＨＳ６８３細胞で実施し、その結果は図５ｃに示した。

【0251】

実験の結果、ｍｉＲ－１２４のシードサイト（シード：５’－ＧＵＧＣＣＵＵＡ－３’）は抑制されたが、４オキソ部位の抑制は観察されなかった。腫瘍細胞の場合、栄養分や血液供給が不足する場合、酸化ストレスが増加して細胞内の酸化が増加すると知られている。したがって、ＨＳ６８３で発現されるｍｉＲ－１２４のｏ^８Ｇ修飾がこのような状況で増加するかを調べてみるために、細胞培養培地から血清を除去して実験を行い、この時にはｍｉＲ－１２４の４オキソ部位が有意に（Ｐ＜０．０１）抑制されることを発見した。

【0252】

前記実験結果を通じて、肝癌細胞のｍｉＲ－１２２では２位、３位、または２位３位が共にｏ^８Ｇ修飾されているという事実と、膠芽腫ではｌｅｔ－７の４位塩基がｏ^８Ｇ修飾されており、ｍｉＲ－１２４はインキュベーション液での血清除去のように腫瘍細胞で起こることが可能な酸化ストレスを与えた時、４位塩基のｏ^８Ｇ修飾が起こって、これらが新しく認識する標的遺伝子に対してその発現を抑制することができるということを確認した。

【0253】

肝癌細胞で転移されるためには優先的に肝癌細胞遊走能力が必要であり、この時、ｍｉＲ－１２２の発現は肝癌細胞遊走を抑制すると知られている。肝癌細胞株であるＨｕｈ７でｍｉＲ－１２２が２位と３位がｏ^８Ｇ修飾（ｍｉＲ－１２２：２、３ｏ^８Ｇ）されていることを観察したので、当該酸化ｍｉＲ－１２２が肝癌細胞遊走能力に影響を与えるかを調べているために、ｍｉＲ－１２２：２、３ｏ^８Ｇ（５’ｐ－Ｕｏ ^８ Ｇｏ ^８ ＧＡＧＵＧＵＧＡＣＡＡＵＧＧＵＧＵＵＵＧ－３’、配列番号６５）をＴｒｉｌｉｎｋ社のＲＮＡ合成サービスを通じて合成し、これをパッセンジャー鎖（ｈａｓ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ）と二本鎖を作った後、Ｈｕｈ７にトランスフェクションさせた後に創傷治癒分析（ｗｏｕｎｄ－ｈｅａｌｉｎｇ ａｓｓａｙ）実験を行った。

【0254】

実験の結果、図５ｄに示したように、対照群であるＮＴ－６ｐｉ（ｃｅｌ－ｍｉＲ－６７の６位塩基を全てｄＳｐａｃｅｒで置換した）に比べてｍｉＲ－１２２：２、３ｏ^８Ｇを細胞に導入した時、Ｈｕｈ７の移動能力が顕著に阻害されることを確認した。

【0255】

このように細胞に導入されたｍｉＲ－１２２：２、３ｏ^８Ｇは細胞内の活性酸素によって他のグアニンが追加的に酸化されてその機能が多少減る可能性がある（図８ｅ参照）。したがって、細胞培養用抗酸化剤（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社のａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を処理し同一に創傷治癒分析実験を行ってみた時は、ｍｉＲ－１２２：２、３ｏ^８Ｇの肝癌細胞移動抑制能がさらに大きく示されることを確認した。即ち、ｏ^８Ｇ修飾されたマイクロＲＮＡの生物学的効果は当該細胞に抗酸化剤と共に処理することによってその機能を極大化することができる。

【0256】

また、膠芽腫で確認したｏ^８Ｇ修飾マイクロＲＮＡであるｌｅｔ－７：４ｏ^８Ｇの機能を調査するために、これをｓｉＲＮＡ形態に合成し（ｌｅｔ－７：４ｏ^８Ｇ：５’－ｐＵＧＡｏ ^８ ＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＡＧｄＴｄＴ－３’、配列番号６６）ｄｕｐｌｅｘ形態にＨＳ６８３細胞に導入した後、アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）をｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用してＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターを通じて測定した。

【0257】

実験の結果、図５ｅに示したように、ＨＳ６８３のアポトーシスが有意に増加したことを確認した。

【0258】

前記と同一な実験をｍｉＲ－１２４：４ｏ^８ＧのｓｉＲＮＡ合成形態（５’ｐ－ＵＡＡｏ ^８ ＧＧＣＡＣＧＣＧＧＵＧＡＡＵＧＣｄＴｄＴ－３’、配列番号６７）に対して行い、図５ｆに示したように、アポトーシスが誘導されることを観察した。

【0259】

実験例１～５の実験結果を参照すれば、様々なマイクロＲＮＡのシード領域（５’末端基準で８番目までの塩基）に起こるｏ^８Ｇ修飾は合成して当該細胞内に導入した時、多様な病理生理学的機能を示すことができるのが分かる。

【0260】

実験例６．心筋症でｍｉＲ－１：７ｏ ^８ Ｇおよびその機能喪失
ヒト心筋症患者心臓の左心室から得られたＡｇｏ ＨＩＴＳ－ＣＬＩＰ結果を分析することによってｍｉＲ－１の酸化を調査した（ｎ＝６、表５～７参照）。

【0261】

【表5】

【0262】

【表6】

【0263】

【表7】

【0264】

その結果、図６ａに示したように、たとえ比率は低かったが、Ａｇｏ－関連ｍｉＲ－１から同一なパターンのＧ→Ｔ突然変異（２位、３位、７位）が検出され（図６ａ左側図面）、主に最も高い頻度の７位とともに他の小さい位置（２位、３位、および１２位；ｎ＝４）を有する患者グループ（１、２、４および５）を含むことと群集化された；他の一つ（３および６）は２位で独占的に最も高い頻度を有した（ｎ＝２）（図６ａ右側図面）。標準化されたＡｇｏ－ｍＲＮＡクラスターで、２位、３位、または７位を通じてｏ^８Ｇ：Ａ結合で示される酸化されたｍｉＲ－１標的サイトは図６ｂに示したように予想より顕著に観察され（Ｐ＜０．０１、ｃｈｉ－ｓｑｕａｒｅ ｔｅｓｔ）、Ｇ：Ｕ結合（～１０％）および対照部位（～７％）を超過する平均～１８％に該当する。

【0265】

ｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇの生理学的関連性を追加的に扱うために、機能損失を評価した。シード－仲介された標的部位のタンデム（ｔａｎｄｅｍ）リピートを保有するためにＲＮＡとして合成された競合的阻害剤であるｍｉＲＮＡ ｓｐｏｎｇｅからの概念を採択して、図６ｃのようにｍｉＲ－１（アンチーシード）およびｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇ（アンチ－７オキソ）を準備し（図６ｃの上段）、これらの特定抑制に対して検証した（図６ｃの下段）。

【0266】

アンチ－７オキソ（９ｘ）の抑制活性は図６ｄに示したようにＲＮＡ－Ｓｅｑ（表８参照）を行うことによって血清が欠乏したＨ９ｃ２でｍｉＲ－１ ７オキソ標的を全体的に抑制することを確認した。

【0267】

【表8】

【0268】

その次に、図６ｅに示したようにアンチ－７オキソ（４ｘ）がｒＣＭＣに導入されＰＥ－誘導肥大を弱化させることが確認された。また、合成されたアンチ－７オキソ（４ｘ）ＲＮＡとしてまたは１３個の標的部位を含有する心筋細胞－特異的発現ベクター（α－ＭＨＣ １３ｘ）としてＩＳＯ－処理されたマウスに注入された、アンチ－７オキソ（４ｘおよびα－ＭＨＣ １３ｘ）両方とも図６ｆに示したように強力にアドレナリン性心臓肥大に拮抗作用を果たし、アンチ－７オキソ（α－ＭＨＣ １３ｘ）の送達程度が確認されこれらの抑制活性と相関関係があることが観察された。

【0269】

アンチ－７オキソ（α－ＭＨＣ １３ｘ）の投与は図６ｇに示したように心筋細胞サイズを維持させ（図６ｇの上段）、ｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇターゲットを全体的に抑制した（図６ｇの下段および表９参照）。しかし、図６ｈに示したようにＩＳＯ処理マウス心臓でＲＯＳ上昇に与える影響はなかった。

【0270】

【表9】

【0271】

また、図６ｉに示したように、アンチ－７オキソ（α－ＭＨＣ １３ｘ）を発現する形質転換マウスを生成し（ＴＧ）、表１０および図６ｊに示したようにその発現が確認された（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）。

【0272】

【表10】

【0273】

その結果、図６ｋに示したようにこれらの心臓サイズに基礎的な差はなかったが（図６ｋの上段）、ＩＳＯ－誘導された心臓肥大は３つの異なるＴＧモデルの全てで有意に予防され（図６ｋの下段）、図６ｌに示したようにｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇ標的の全体的な抑制を示し、図６ｍに示したようにＩＳＯ処理（ＴＧ（＋）_ＩＳＯ ｖｓ．ＴＧ（－）_ＩＳＯ）の存在下でもＩＳで心筋細胞のサイズが減少した。

【0274】

総合すれば、ｍｉＲ－１、特にｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇの位置特異的酸化は心臓肥大および疾病の内因性ドライバー役割を果たしながら心筋症患者で標的相互作用を発生させ変えることを示唆するのを立証した。これに関連して、ＲＯＳによって誘導された本発明によるｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇの位置特異的酸化およびその心臓肥大誘導過程に対する概略図を図６ｎに示した。

【0275】

実験例７．心肥大症動物モデルの血漿（ｐｌａｓｍａ）でｍｉＲ－１：ｏ ^８ Ｇ増加確認
心肥大症モデルおよび心筋肥大患者の心臓組織でｍｉＲ－１のｏ^８Ｇ修飾が増加することを観察した後、これを比浸湿的に検出して心肥大症を診断することができるか確認するために、心肥大症を誘導させたマウスの血液からｍｉＲ－１のｏ^８Ｇ修飾を検出しようとした。先ず、ＩＳＯ処理を通じてマウスの心肥大症が誘導されたかを確認した。図７ａはＩＳＯを通じて誘導した心肥大症の代表心臓写真であって、各群当り３匹である。ＩＳＯが処理された実験群の心臓が対照群に比べて平均的に約３０％（３６％のＨ／Ｂ ｖｓ ３２％のＨ／Ｔ）で心臓サイズが増加した。その詳しい内容は表１１に記録した。また、動物モデルの血液でｍｉＲ－１：ｏ^８Ｇが測定されるか、また心肥大症にｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔされるか確認するために、血漿を分離しｍｉＲ－１：ｏ^８Ｇを定量した（ｎ＝３）。

【0276】

【表11】

【0277】

その次に、各動物モデルから分離した血液で血漿を分離し小ＲＮＡを抽出した後、分離された小ＲＮＡでのｍｉＲ－１の量を測定しながら同時にｍｉＲ－１がｏ^８Ｇ修飾された量をｏ^８Ｇに対する免疫沈降を通じて測定した（図７ｂ）。同量の血漿から）抽出されたＲＮＡからｍｉＲ－１の量を測定した結果、ｍｉＲ－１が血漿に存在し、当該量は心肥大誘導と関係なく同量が存在するということを実験群と対照群の間の測定結果が統計的に有意でなく出るのを確認することができた（図７ｃ）。

【0278】

その後、血漿に存在するｍｉＲ－１：ｏ^８Ｇを確認するために、血漿から分離した小ＲＮＡに対してｏ^８Ｇ－ＩＰを行った（図７ｂ）。この時、ｏ^８Ｇ－ＩＰ過程での差を補正して定量するためにｏ^８Ｇが５位にＤＮＡに合成されたｈｕｍａｎ ｍｉＲ－１２４－３ｐを免疫沈降前に小ＲＮＡサンプルに同量を入れて使用した。その結果、心肥大症血漿で観察した酸化修飾されたｍｉＲ－１：ｏ^８Ｇは各３匹の場合、平均的に約３７９％増加し、この変化は統計的に有意であるのをＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ結果を通じて確認した（ｐ＝０．０３１）（図７ｄ）。総合してみれば、血漿でｑＰＣＲを通じて測定されたｍｉｃｒｏＲＮＡ－１は心肥大症と対照群で差がないが、ｏ^８Ｇ－ＩＰ－ｑＰＣＲを通じて酸化修飾されたｍｉｃｒｏＲＮＡ－１（ｍｉＲ－１：ｏ^８Ｇ）を測定した結果、心肥大症で有意的に増加することを確認し、これによって非浸湿的に血液を基盤にしてｍｉＲ－１：ｏ^８Ｇ測定を通じて心肥大症を診断することができるという点を観察した。

【0279】

実験例８．心筋肥大に対する抗酸化剤の効果および抗酸化剤処理時ｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇを抑制するアンチ－ｍｉＲ－１－７オキソの心筋細胞肥大抑制能向上の確認。
ＰＥ処理によって誘導された肥大細胞に抗酸化剤ＮＡＣを処理すれば、図８ａに示したように、肥大が減少したことを確認し（ｎ＝４；ｉｎｃｈ^２、ＩｍａｇｅＪ）、図８ｂに示したように、ＩＳＯとＮＡＣの共同処理はＩＳＯ－誘導された心臓肥大を弱化させることを確認した。

【0280】

また、図８ｃに示したように、ＩＳＯまたはＰＥ処理によるｏ^８Ｇ増加がＮＡＣの処理によって減少することを確認した（スケールバー、１００μｍ）。即ち、抗酸化剤ＮＡＣの処理によってｍｉＲＮＡの酸化が減少した。

【0281】

ＮＡＣ処理によってＩＳＯによる心肥大症が抑制される現象を観察した後（図１ｂ）、他の抗酸化剤処理を通じても同一に心肥大症を抑制することができるかを確認するために、Ｈ９ｃ２細胞にＰＥとＩＳＯを処理して心筋細胞の肥大を誘導させながら他の抗酸化剤であるブチルヒドロキシアニソール（Ｂｕｔｙｌａｔｅｄ ｈｙｄｒｏｘｙａｎｉｓｏｌｅ、ＢＨＡ）と細胞培養用抗酸化剤として販売されているＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社のＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ａ１３４５）を処理してみた（図８ｄ）。その結果、抗酸化剤の種類に関係なく全て心筋細胞のサイズを縮小させ、特にＰＥやＩＳＯを処理しても全くＨ９ｃ２心筋細胞株のサイズが大きくならないということを３回の反復実験で統計的に有意に確認した（＊、Ｐ＜０．０１）。

【0282】

また、ラット（ｒａｔ）胚での一次心筋細胞（ｒＣＭＣ）をインキュベートした後、ＰＥ処理によって当該細胞で肥大症が起こることを確認した（図８ｅ、上のパネル）。ここにｍｉＲ－１の７番がｏ^８Ｇ修飾された形態（ｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇ）を抑制するようにこれを認識する７オキソ部位を多数含む阻害用アンチ－７オキソ（４ｘ）を導入した時、心筋細胞の肥大が進行した後に抑制されることを再び確認し、追加的に抗酸化剤であるＮＡＣと共に処理した時には心筋細胞が全く肥大化しない最大の効果を観察することができた（図８ｅ、中間パネル）。このような結果は抗酸化剤の効果がアンチ－７オキソ（４ｘ）とシナジー作用して起こる現象であると言え、またアンチ－７オキソ（４ｘ）を細胞に導入後、ＰＥ処理によって増加する活性酸素によって追加的に起こることのあるｏ^８Ｇ酸化がアンチ－７オキソ（４ｘ）に起こることを防止して示される効果であり得る。実際に、細胞に人為的に導入するＲＮＡで追加的なｏ^８Ｇ生成が起こってその効果が阻害されるかを調べてみるために、今回は活性酸素が発生されるＰＥ処理でないｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇ導入によって心筋細胞肥大を誘導し同時に酸化ストレスを加えようと１００μＭの過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）を処理してみた（図８ｅ、下パネル）。

【0283】

その結果、既存のｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇ発現による心筋細胞肥大現象が過酸化水素処理によって阻害されることを観察し、これとは反対に、抗酸化剤であるＮＡＣを処理した時はｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇによって誘導される心筋細胞肥大がより効率的に示されるのを確認することができた。

【0284】

したがって、このような結果から推察すると、抗酸化剤処理はＮＡＣのみでない、ＢＨＡと他の一般的な細胞培養用抗酸化剤など抗酸化効果を示すことができるものであれば心筋細胞肥大を抑制することができるという事実を確認しただけでなく、抗酸化剤の処理はｏ^８Ｇ修飾されたマイクロＲＮＡまたはこれを抑制するＲＮＡに起こる可能性のある追加的な酸化修飾を防止して人為的なＲＮＡ発現による心筋細胞サイズの調節を効率的に誘導することができるのが分かった。特に、心肥大症は生理的肥大と病理的肥大として示され、生理的肥大は運動選手や妊産婦の場合に十分な血液供給が必要な時これを円滑に供給するために心臓を肥大にする場合であって、状況によっては心臓の機能を強化するための用途に臨時的に誘導することが必要なことがある。したがって、心筋細胞へのｍｉＲ－１：７ｏ^８Ｇ導入による心肥大誘導はこのような生理的肥大として作用することも可能であり、この時の抗酸化剤処理は心筋細胞肥大の効果を効率的に誘導することができるだけでなく、一般に病理学的現象を起こす追加的な酸化ストレスを防止して病理的心肥大症を抑制する効果を示すこともできる。

【0285】

前述の本発明の説明は例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は本発明の技術的な思想や必須の特徴を変更せず他の具体的な形態に容易に変形が可能であるということが理解できるはずである。したがって、以上で記述した実施形態は全ての面で例示的なものであり限定的ではないと理解しなければならない。

【配列表フリーテキスト】

【0286】

配列番号１： ｍｉＲ－１：２（８－オキソグアニン）、２位は８－オキソグアニン
配列番号２： ｍｉＲ－１：３（８－オキソグアニン）、３位は８－オキソグアニン
配列番号３： ｍｉＲ－１：７（８－オキソグアニン）、７位は８－オキソグアニン
配列番号４： ｍｉＲ－１ ２オキソ部位
配列番号５： ｍｉＲ－１ ３オキソ部位
配列番号６： ｍｉＲ－１ ７オキソ部位
配列番号７： ｍｉＲ－１、１～２２位はｍｉＲ－１
配列番号８： ｍｉＲ－１パッセンジャー
配列番号９： ｍｉＲ－１：２ＧＵ
配列番号１０： ｍｉＲ－１：３ＧＵ
配列番号１１： ｍｉＲ－１：７ＧＵ
配列番号１２： ｃｅｌ－ｍｉＲ－６７、１～２２位はｃｅｌ－ｍｉＲ－６７
配列番号１３： チミンデオキヌクレオチド（ｄＴ）、２３～２４位はチミンデオキヌクレオチド（ｄＴ）
配列番号１４：パッセンジャー鎖、２３～２４位はチミンデオキヌクレオチド（ｄＴ）
配列番号１５： ３９－オキソ－Ｒ、２２位は８－オキソグアニン
配列番号１６： ３９Ｒ
配列番号１７： ８－オキソグアニンスパイクイン、２～３位は８－オキソグアニン
配列番号１８： Ｇスパイクイン
配列番号１９： ｍｉＲＮＡ：８－オキソグアニンスパイクイン、５位は８－オキソグアニン
配列番号２０： ｍｉＲ－１シード部位
配列番号２１： 対照 ＮＴ部位
配列番号２２： オリゴｄＴアダプタープライマー
配列番号２３： ｍｉＲＮＡリバースプライマー
配列番号２４： ８－オキソグアニンまたはＧスパイクインフォワードプライマー
配列番号２５： ８－オキソグアニンまたはＧスパイクインリバースプライマー
配列番号２６： ｍｉＲＮＡ：８－オキソグアニンスパイクインフォワードプライマー
配列番号２７： ｍｉＲＮＡ：８－オキソグアニンスパイクインリバースプライマー
配列番号２８： 対照フォワードプライマー
配列番号２９： 対照リバースプライマー
配列番号３０： ＲＴプライマー
配列番号３１： ３９－オキソ－Ｒまたは３９Ｒフォワードプライマー
配列番号３２： ３９－オキソ－Ｒまたは３９Ｒリバースプライマー
配列番号３３： ２２ｎｔの合成ＲＮＡ、７位は８－オキソグアニン
配列番号３４： ３’アダプター：５’－アデニル化、２位はグアニンメチルホスホネート、２位はジデオキシシトシン
配列番号３５： ５’アダプター、３１位は２’－メトキシ－Ｃ
配列番号３６： ＲＴプライマー
配列番号３７： ユニバーサルフォワードプライマー
配列番号３８： バーコードプライマー
配列番号３９： ｍｉＲ－１－シード部位のフォワードプライマー
配列番号４０： ｍｉＲ－１－シード部位のリバースプライマー
配列番号４１： ｍｉＲ－１－２オキソ部位のフォワードプライマー
配列番号４２： ｍｉＲ－１－２オキソ部位のリバースプライマー
配列番号４３： ｍｉＲ－１－３オキソ部位のフォワードプライマー
配列番号４４： ｍｉＲ－１－３オキソ部位のリバースプライマー
配列番号４５： ｍｉＲ－１－７オキソ部位のフォワードプライマー
配列番号４６： ｍｉＲ－１－７オキソ部位のリバースプライマー
配列番号４７： ｍｉＲ－１対照部位のフォワードプライマー
配列番号４８： ｍｉＲ－１対照部位のリバースプライマー
配列番号４９： ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩ部位のフォワードプライマー
配列番号５０： ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩ部位のリバースプライマー
配列番号５１： ＡｐａＩおよびＸｂａＩ部位のフォワードプライマー
配列番号５２： ＡｐａＩおよびＸｂａＩ部位リバースプライマー
配列番号５３： ｈｌｕｃ＋配列の残存３３ｂｐ用のフォワードプライマー
配列番号５４： ｈｌｕｃ＋配列の残存３３ｂｐ用のリバースプライマー
配列番号５５： ｈＧＨポリ（Ａ）フォワードプライマー
配列番号５６： ｈＧＨポリ（Ａ）リバースプライマー
配列番号５７： アンチ－７オキソ（アルファ－ＭＨＣ １３ｘ）フォワードプライマー
配列番号５８： アンチ－７オキソ（アルファ－ＭＨＣ １３ｘ）リバースプライマー
配列番号５９： 対照（アンチ－ＮＴ １３ｘ）フォワードプライマー
配列番号６０： 対照（アンチ－ＮＴ １３ｘ）リバースプライマー
配列番号６１： ｈＧＨポリ（Ａ）フォワードプライマー
配列番号６２： ｈＧＨポリ（Ａ）リバースプライマー
配列番号６３： アンチ－７オキソ（４ｘ）プライマー
配列番号６４： ８－オキソデオキシグアノシンＲＮＡスパイクイン、５位は８－オキソデオキシグアノシン
配列番号６５： ｍｉＲ－１２２：２，３（８－オキソグアニン）、２位は８－オキソグアニン、３位は８－オキソグアニン
配列番号６６： ｌｅｔ－７：４（８－オキソグアニン）、４位は８－オキソグアニン
配列番号６７： ｍｉＲ－１２４：４（８－オキソグアニン）、４位は８－オキソグアニン
配列番号６８： ｍｉＲ－１２２
配列番号６９： ｌｅｔ－７
配列番号７０： ｍｉＲ－１２４

【図1a】

【図1b】

【図1c】

【図1d】

【図1e】

【図1f】

【図1g】

【図1h】

【図2a】

【図2b】

【図2c】

【図2d】

【図2e】

【図2f】

【図2g】

【図2h】

【図2i】

【図2j】

【図3a】

【図3b】

【図3c】

【図3d】

【図3e】

【図3f】

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【図3i】

【図3j】

【図3k】

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【図3m】

【図3n】

【図3o】

【図3p】

【図4a】

【図4b】

【図4c】

【図4d】

【図4e】

【図4f】

【図4g】

【図4h】

【図4i】

【図5a】

【図5b】

【図5c】

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【図5e】

【図5f】

【図6a】

【図6b】

【図6c】

【図6d】

【図6e】

【図6f】

【図6g】

【図6h】

【図6i】

【図6j】

【図6k】

【図6l】

【図6m】

【図6n】

【図7a】

【図7b】

【図7c】

【図7d】

【図8a】

【図8b】

【図8c】

【図8d】

【図8e】

【配列表】

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