7654757 抗トランスフェリン受容体抗体およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-03-24

(45)【発行日】2025-04-01

(54)【発明の名称】抗トランスフェリン受容体抗体およびその使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20250325BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20250325BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20250325BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20250325BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20250325BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20250325BHJP

   C07K 16/46 20060101ALN20250325BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20250325BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20250325BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20250325BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20250325BHJP

   C12N 15/63 20060101ALN20250325BHJP

【ＦＩ】

A61K39/395 N

A61K31/7088

A61K31/713

A61K47/68

A61P21/00

C07K16/28 ZNA

C07K16/46

C12N15/11 Z

C12N15/113 Z

C12N15/13

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

【請求項の数】 37

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023195532

(22)【出願日】2023-11-16

(62)【分割の表示】P 2021533671の分割

【原出願日】2019-12-20

(65)【公開番号】P2024026108

(43)【公開日】2024-02-28

【審査請求日】2023-12-12

(31)【優先権主張番号】62/784,181

(32)【優先日】2018-12-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】518345192

【氏名又は名称】アビディティー バイオサイエンシーズ，インク．

(74)【代理人】

【識別番号】110003797

【氏名又は名称】弁理士法人清原国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ダリモント，ベアトリス ダイアナ

(72)【発明者】

【氏名】ドパラプディ，ヴェンカタ ラマナ

(72)【発明者】

【氏名】ジョーンズ，レイチェル

【審査官】原 大樹

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１８－５０３３５７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１４－５０９８５７（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ

Ａ６１Ｐ

Ｃ１２Ｎ

Ｃ０７Ｋ

ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ／ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

被験体の疾患を処置するための製剤の製造における抗トランスフェリン受容体抗体またはその抗原結合フラグメントの使用であって、前記処置は、前記抗トランスフェリン受容体抗体またはその抗原結合フラグメントを投与する工程を含み、ここで、前記抗トランスフェリン受容体抗体またはその抗原結合フラグメントは、可変重鎖（ＶＨ）領域と可変軽鎖（ＶＬ）領域を含み、
（ａ）前記ＶＨ領域は、配列番号１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号４を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号３を含むＨＣＤＲ３配列、ならびに、前記ＶＬ領域は、配列番号６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号７を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号８を含むＬＣＤＲ３配列、
（ｂ）前記ＶＨ領域は、配列番号１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号３を含むＨＣＤＲ３配列、ならびに、前記ＶＬ領域は、配列番号６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号９を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号１０を含むＬＣＤＲ３配列、または
（ｃ）前記ＶＨ領域は、配列番号１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号５を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号３を含むＨＣＤＲ３配列、ならびに、前記ＶＬ領域は、配列番号１１を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号１２を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号１０を含むＬＣＤＲ３配列、
を有する、抗トランスフェリン受容体抗体またはその抗原結合フラグメントの使用。

【請求項2】

前記抗トランスフェリン受容体抗体またはその抗原結合フラグメントは、多特異性抗体またはその結合フラグメントを含む、請求項１に記載の使用。

【請求項3】

被験体の疾患を処置するための製剤の製造のためのトランスフェリン受容体に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントの使用であって、前記処置は、前記抗体またはその抗原結合フラグメントを投与する工程を含み、ここで、可変重鎖（ＶＨ）領域と可変軽鎖（ＶＬ）領域を含む、前記抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
（ａ）前記ＶＨ領域は、配列番号１４の配列を含み、および、前記ＶＬ領域は、配列番号１８の配列、
（ｂ）前記ＶＨ領域は、配列番号１３の配列を含み、および、前記ＶＬ領域は、配列番号２０の配列、または
（ｃ）前記ＶＨ領域は、配列番号１５の配列を含み、および、前記ＶＬ領域は、配列番号２１の配列、
を有する、抗体またはその抗原結合フラグメントの使用。

【請求項4】

前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、あるいはキメラ抗体またはその結合フラグメントを含む、請求項３に記載の使用。

【請求項5】

前記抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ、ＢｉＴＥ、ダイアボディ、ＤＡＲＴ、ＴａｎｄＡｂ、ｓｃダイアボディ、ｓｃダイアボディ－ＣＨ３、トリプルボディ、ｓｃＦｖ－ＣＨ３ ＫＩＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ ＫＩＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＣＨ－ＣＬ－ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、Ｆ（ａｂ’）２－ｓｃＦｖ２、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＫＩＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ、四価ＨＣＡｂ、ｓｃダイアボディ－Ｆｃ、ダイアボディ－Ｆｃ、タンデムｓｃＦｖ－Ｆｃ、およびイントラボディから選択される、請求項３に記載の使用。

【請求項6】

前記抗原結合フラグメントは、ＢｉＴＥ、ダイアボディ、ＤＡＲＴ、ＴａｎｄＡｂ、ｓｃダイアボディ、ｓｃダイアボディ－ＣＨ３、トリプルボディ、ｓｃＦｖ－ＣＨ３ ＫＩＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ ＫＩＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＣＨ－ＣＬ－ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、Ｆ（ａｂ’）２－ｓｃＦｖ２、ｓｃＦｖ、およびｓｃＦｖ－ＫＩＨから選択される、請求項５に記載の使用。

【請求項7】

前記抗トランスフェリン受容体抗体は、ＩｇＧ１フレームワーク、ＩｇＧ２フレームワーク、ＩｇＧ２ｂフレームワーク、またはＩｇＧ４フレームワークのうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の使用。

【請求項8】

前記抗トランスフェリン受容体抗体は、Ｆｃ領域中に少なくとも１つの突然変異をさらに含み、前記少なくとも１つの突然変異はエフェクター機能を調節する、請求項１に記載の使用。

【請求項9】

前記エフェクター機能は、Ｆｃ－γ受容体結合を弱めるか、または取り除くことを含む、請求項８に記載の使用。

【請求項10】

前記少なくとも１つの突然変異は、残基位置Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ｋ３２２、Ｌ３２８、またはＰ３２９にあり、ここで、前記残基位置はＩｇＧ１を基準としている、請求項８に記載の使用。

【請求項11】

前記Ｆｃ領域はＬ２３３とＬ２３４において突然変異を含み、ここで、残基は配列番号２３の位置２３３と位置２３４に対応する、請求項８に記載の使用。

【請求項12】

前記Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域またはＩｇＧ２ｂ Ｆｃ領域を基準とし、Ｄ２６５とＮ２９７において突然変異を含む、請求項８に記載の使用。

【請求項13】

前記抗トランスフェリン受容体抗体は、重鎖（ＨＣ）配列と軽鎖（ＬＣ）配列とを含み、
（ａ）前記ＨＣは、配列番号２９－３４から選択される配列を含み、および、前記ＬＣは、配列番号４７の配列を含み、
（ｂ）前記ＨＣは、配列番号２３－２８から選択される配列を含み、および、前記ＬＣは、配列番号４９の配列を含み、または
（ｃ）前記ＨＣは、配列番号３５－４０から選択される配列を含み、および、前記ＬＣは、配列番号５０の配列を含む、
請求項１に記載の使用。

【請求項14】

前記抗トランスフェリン受容体抗体はヒトトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に特異的に結合する、請求項１に記載の使用。

【請求項15】

以下の式（Ｉ）を含む、被験体の疾患を処置するための製剤の製造における抗トランスフェリン受容体抗体コンジュゲートの使用であって、

【化1】

式中、
Ａは抗トランスフェリン受容体抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、前記抗トランスフェリン受容体抗体またはその抗原結合フラグメントは可変重鎖（ＶＨ）領域と可変軽鎖（ＶＬ）領域を含み、
（ａ）前記ＶＨ領域は、配列番号１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号４を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号３を含むＨＣＤＲ３配列、ならびに、前記ＶＬ領域は、配列番号６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号７を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号８を含むＬＣＤＲ３配列、
（ｂ）前記ＶＨ領域は、配列番号１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号３を含むＨＣＤＲ３配列、ならびに、前記ＶＬ領域は、配列番号６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号９を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号１０を含むＬＣＤＲ３配列、または
（ｃ）前記ＶＨ領域は、配列番号１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号５を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号３を含むＨＣＤＲ３配列、ならびに、前記ＶＬ領域は、配列番号１１を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号１２を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号１０を含むＬＣＤＲ３配列、を有し、
Ｂはポリ核酸分子を含み、
Ｘ^１は単結合またはリンカーからなり、および、
ｎは１－１２から選択された平均値である、抗トランスフェリン受容体抗体コンジュゲートの使用。

【請求項16】

以下の式（Ｉ）を含む、被験体の疾患を処置するための製剤の製造における抗トランスフェリン受容体抗体コンジュゲートの使用であって、

【化2】

式中、
Ａは抗トランスフェリン受容体抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、前記抗トランスフェリン受容体抗体またはその抗原結合フラグメントは可変重鎖（ＶＨ）領域と可変軽鎖（ＶＬ）領域を含み、
（ａ）前記ＶＨ領域は、配列番号１４の配列を含み、および、前記ＶＬ領域は、配列番号１８の配列、
（ｂ）前記ＶＨ領域は、配列番号１３の配列を含み、および、前記ＶＬ領域は、配列番号２０の配列、または
（ｃ）前記ＶＨ領域は、配列番号１５の配列を含み、および、前記ＶＬ領域は、配列番号２１の配列、を有する、
Ｂはポリ核酸分子を含み、
Ｘ^１は単結合またはリンカーからなり、および、
ｎは１－１２から選択された平均値である、抗トランスフェリン受容体抗体コンジュゲートの使用。

【請求項17】

前記抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ、ＢｉＴＥ、ダイアボディ、ＤＡＲＴ、ＴａｎｄＡｂ、ｓｃダイアボディ、ｓｃダイアボディ－ＣＨ３、トリプルボディ、ｓｃＦｖ－ＣＨ３ ＫＩＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ ＫＩＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＣＨ－ＣＬ－ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、Ｆ（ａｂ’）２－ｓｃＦｖ２、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＫＩＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ、四価ＨＣＡｂ、ｓｃダイアボディ－Ｆｃ、ダイアボディ－Ｆｃ、タンデムｓｃＦｖ－Ｆｃ、およびイントラボディから選択される、請求項１５または１６に記載の使用。

【請求項18】

前記ポリ核酸分子は、短干渉核酸（ｓｉＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴ（ＰＭＯ）、およびｍＲＮＡから選択される、請求項１５または１６に記載の使用。

【請求項19】

前記ポリ核酸分子は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である、請求項１５または１６に記載の使用。

【請求項20】

前記ポリ核酸分子は、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である、請求項１５または１６に記載の使用。

【請求項21】

前記ポリ核酸分子は、パッセンジャー鎖とガイド鎖とを含む、請求項１５または１６に記載の使用。

【請求項22】

前記ガイド鎖は、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、少なくとも１つの反転脱塩基部分、少なくとも１つの５’－ビニルホスホネート修飾された非天然のヌクレオチド、あるいは、これらの組み合わせを含む、請求項２１に記載の使用。

【請求項23】

前記ポリ核酸分子は、２’位置での糖部分の修飾をさらに含み、２’－位置での修飾は、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－デオキシ、２’－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、または、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾されたヌクレオチドから選択される、請求項１５または１６に記載の使用。

【請求項24】

前記パッセンジャー鎖は、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー修飾された非天然のヌクレオチドを含む、請求項２１に記載の使用。

【請求項25】

Ａ－Ｘ^１は前記パッセンジャー鎖の５’末端または前記パッセンジャー鎖の３’末端にコンジュゲートする、請求項２１に記載の使用。

【請求項26】

前記ポリ核酸分子は遺伝子の標的配列にハイブリダイズし、および、前記ポリ核酸分子は、前記遺伝子に対するＲＮＡ干渉を媒介する、請求項１５または１６に記載の使用。

【請求項27】

前記遺伝子は、ＩＧＦ１－Ａｋｔ－ＦｏｘＯ経路、グルココルチコイド－ＧＲ経路、ＰＧＣ１α－ＦｏｘＯ経路、ＴＮＦα－ＮＦκＢ経路、またはミオスタチン－ＡｃｔＲＩＩｂ－Ｓｍａｄ２／３経路、Ｅ３リガーゼ、フォークヘッドボックス転写因子、アトロジン－１遺伝子（ＦＢＸＯ３２）、ＭｕＲＦ１遺伝子（ＴＲＩＭ６３）、ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＯ３、ＭＳＴＮ、ＤＭＤ、またはＤＭＰＫ内のアップレギュレートされた遺伝子を含む、請求項２６に記載の使用。

【請求項28】

前記ＲＮＡ干渉は、前記抗トランスフェリン受容体抗体コンジュゲートが被験体に投与されるときに、筋肉で優先的に媒介される、請求項２６に記載の使用。

【請求項29】

前記疾患は、筋萎縮症または筋緊張性ジストロフィーである、請求項１に記載の使用。

【請求項30】

前記筋萎縮症は、糖尿病に関連する筋萎縮症または癌性悪液質に関連する筋萎縮症である、請求項２９に記載の使用。

【請求項31】

前記筋萎縮症は、インスリン欠損症、慢性腎不全、うっ血性心不全、慢性呼吸病、慢性感染症、絶食、除神経、サルコペニア、または１型筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ１）に関連する、請求項２９に記載の使用。

【請求項32】

前記筋緊張性ジストロフィーはＤＭ１である、請求項２９に記載の使用。

【請求項33】

被験体の網状赤血球レベルは、抗トランスフェリン受容体抗体またはその抗原結合フラグメント投与後に減少しない、請求項１に記載の使用。

【請求項34】

抗トランスフェリン受容体抗体またはその抗原結合フラグメントコンジュゲートの投与は、前記被験体のＳＳＢ ｓｉＲＮＡまたはＳＳＢ ｍＲＮＡのレベルをダウンレギュレートする、請求項１に記載の使用。

【請求項35】

ＳＳＢ ｓｉＲＮＡまたはＳＳＢ ｍＲＮＡのダウンレギュレーションは、筋肉内におけるものである、請求項３４に記載の使用。

【請求項36】

前記筋肉は骨格筋である、請求項３５に記載の使用。

【請求項37】

前記筋肉は心筋である、請求項３５に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本出願は、２０１８年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／７８４，１８１号の利益を主張し、その全体は引用によって本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

本発明は医薬製剤の分野に属し、特に抗体に関する。本発明は、抗トランスフェリン受容体抗体、および抗トランスフェリン受容体抗体を調製および使用する方法を提供する。

【0003】

診断法の既存の使用に加えて、抗体は、治療剤として有用であることが示されている。例えば、免疫療法、または治療目的のための抗体の使用は、癌および他の障害を処置するために近年利用されている。トランスフェリン受容体は、標的とされた癌の診断薬または治療薬を開発する際に、最も広く利用されている標的受容体の１つである。このＩＩ型膜貫通型糖タンパク質は、細胞内の鉄輸送を担っており、多くの正常な細胞タイプの表面に低レベルで見られる。製薬使用のための改善された抗トランスフェリン受容体抗体の開発に対するニーズがある。

【発明の概要】

【0004】

特定の実施形態において、抗トランスフェリン受容体抗体、抗トランスフェリン受容体抗体コンジュゲート、および抗トランスフェリン受容体抗体またはコンジュゲートを含む医薬組成物が本明細書で開示されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された抗トランスフェリン受容体抗体を利用してペイロードを送達する方法、および本明細書に記載された抗トランスフェリン受容体抗体の使用による処置の方法も本明細書で開示されている。

【0005】

特定の実施形態では、可変重鎖（ＶＨ）領域と可変軽鎖（ＶＬ）領域とを含む抗トランスフェリン受容体抗体が本明細書に開示され、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列と、ＨＣＤＲ２配列ＥＩＮＰＩＸ_１ＧＲＳＮＹＡＸ_２ＫＦＱＧであって、Ｘ_１がＮまたはＱから選択され、Ｘ_２がＱまたはＥから選択される、ＨＣＤＲ２配列と、配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列とを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号：２を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号：４を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ領域は配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号：５を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬ領域は、ＬＣＤＲ１配列ＲＴＳＥＮＩＹＸ_３ＮＬＡ、ＬＣＤＲ２配列ＡＸ_４ＴＮＬＡＸ_５、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ_６を含み、ここで、Ｘ_３はＮまたはＳから選択され、Ｘ_４はＡまたはＧから選択され、Ｘ_５はＤまたはＥから選択され、および、Ｘ_６は存在し、または存在せず、存在する場合にはＦである。いくつかの実施形態では、ＶＬ領域は、配列番号：６を含むＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列ＡＡＴＮＬＡＸ_５、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ_６を含み、ここで、Ｘ_５はＤまたはＥから選択され、Ｘ_６は存在し、または存在せず、存在する場合にはＦである。いくつかの実施形態では、ＶＬ領域は、配列番号：６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号：７を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号：８を含むＬＣＤＲ３配列を含んでいる。いくつかの実施形態では、ＶＬ領域は、配列番号：６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号：９を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号：１０を含むＬＣＤＲ３配列を含んでいる。いくつかの実施形態では、ＶＬ領域は、配列番号：１１を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号：１２を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号：１０を含むＬＣＤＲ３配列を含んでいる。いくつかの実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号：２を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ならびに、ＶＬ領域は、配列番号：６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号：７を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号：８を含むＬＣＤＲ３配列を含んでいる。いくつかの実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号：４を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ならびに、ＶＬ領域は、配列番号：６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号：７を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号：８を含むＬＣＤＲ３配列を含んでいる。いくつかの実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号：５を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ならびに、ＶＬ領域は、配列番号：６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号：９を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号：１０を含むＬＣＤＲ３配列を含んでいる。いくつかの実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号：４を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ならびに、ＶＬ領域は、配列番号：１１を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号：１２を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号：１０を含むＬＣＤＲ３配列を含んでいる。いくつかの実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号：１３－１６から選択される配列に対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬ領域は、配列番号：１８－２１から選択される配列に対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、あるいはキメラ抗体またはその結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、抗トランスフェリン受容体抗体は、多特異性抗体またはその結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、抗トランスフェリン受容体抗体は、二重特異性抗体またはその結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ、ナノボディ、ＢｉＴＥ、ダイアボディ、ＤＡＲＴ、ＴａｎｄＡｂ、ｓｃダイアボディ、ｓｃダイアボディ－ＣＨ３、トリプルボディ、ミニ抗体、ミニボディ、ＴｒｉＢｉミニボディ、ｓｃＦｖ－ＣＨ３ ＫＩＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ ＫＩＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＣＨ－ＣＬ－ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）２－ｓｃＦｖ２．ｓｃＦｖ－ＫＩＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ、四価ＨＣＡｂ、ｓｃダイアボディ－Ｆｃ、ダイアボディ－Ｆｃ、タンデムｓｃＦｖ－Ｆｃ、またはイントラボディを含む。いくつかの実施形態では、抗トランスフェリン受容体抗体はＩｇＧ１フレームワークを含む。いくつかの実施形態では、抗トランスフェリン受容体抗体はＩｇＧ２フレームワークを含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ２フレームワークはＩｇＧ２ｂフレームワークである。いくつかの実施形態では、抗トランスフェリン受容体抗体はＩｇＧ４フレームワークを含む。いくつかの実施形態では、抗トランスフェリン受容体抗体は、Ｆｃ領域中に少なくとも１つの突然変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの突然変異はエフェクター機能を調節する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの突然変異は、Ｆｃ－γ受容体結合を弱めるか、または取り除く。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの突然変異は、残基位置Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ｋ３２２、Ｌ３２８、またはＰ３２９にあり、ここで、残基位置はＩｇＧ１を基準としている。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は２以上、３以上、または４以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域はＬ２３３とＬ２３４において突然変異を含み、ここで、残基は配列番号：２３の位置２３３と位置２３４に対応する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域はＤ２６５とＮ２９７で突然変異を含む。いくつかの実施形態では、抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号：２３－４６から選択された重鎖（ＨＣ）配列と、配列番号：４７－５０から選択された軽鎖（ＬＣ）配列とを含む。いくつかの実施形態では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ヒトトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に特異的に結合する。

【0006】

特定の実施形態では、本明細書に記載される抗トランスフェリン受容体抗体と、ペイロードとを含む抗トランスフェリン受容体抗体コンジュゲートが本明細書で開示される。いくつかの実施形態では、ペイロードは小分子、ペプチド、タンパク質、またはポリ核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、ペイロードはポリ核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、短干渉核酸（ｓｉＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ＰＭＯ、またはｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ペイロードはｄｓＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ペイロードはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは小分子、ペプチド、またはタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、微小管破壊剤、ＤＮＡ修飾剤、またはＡｋｔ阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、オーリスタチンまたはその誘導体、ドラスタチンまたはその誘導体あるいはアナログ、メイタンシノイド、もしくは、ピロロベンゾジアゼピンまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態では、オーリスタチンまたはその誘導体は、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である。いくつかの実施形態では、メイタンシノイドはＤＭ１またはＤＭ４である。いくつかの実施形態では、ピロロベンゾジアゼピンは、ピロロベンゾジアゼピン二量体である。いくつかの実施形態では、ペイロードは免疫調節剤または免疫調節薬を含む。いくつかの実施形態では、免疫調節薬はサイトカインを含む。いくつかの実施形態では、ペイロードはタンパク質またはペプチドトキシンあるいはそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、リンカーを介して抗トランスフェリン受容体抗体にコンジュゲートする。いくつかの実施形態では、抗トランスフェリン受容体抗体はさらに、２つ以上のペイロードにコンジュゲートする。いくつかの実施形態では、抗トランスフェリン受容体抗体に対するペイロードの比率は、約１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、または１２：１である。いくつかの実施形態では、抗トランスフェリン受容体抗体コンジュゲートは、Ａ－（Ｘ^１－Ｂ）_ｎ（式（Ｉ））を含み、式中、Ａは抗トランスフェリン抗体を含み、Ｂはペイロードを含み、Ｘ^１は単結合またはリンカーからなり、および、ｎは１－１２から選択された平均値である。いくつかの実施形態では、ペイロードはポリ核酸分子である。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、パッセンジャー鎖とガイド鎖とを含む。いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、少なくとも１つの逆位脱塩基部分、少なくとも１つの５’－ビニルホスホネート修飾された非天然のヌクレオチド、あるいは、これらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの５’－ビニルホスホネート修飾された非天然のヌクレオチドは、ガイド鎖の５’末端から、約１、２、３、４、または５つの塩基離れて位置する。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、２’位置での糖部分の修飾をさらに含む。いくつかの実施形態では、２’－位置での修飾は、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、または、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２－Ｏ－ＮＭＡ）修飾されたヌクレオチドから選択される。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖は、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー修飾された非天然のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖はガイド鎖よりも長さが短く、それによって、５’オーバーハング、３’オーバーハング、１つの末端の平滑末端、またはこれらの組み合わせを生成する。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖はガイド鎖と長さが等しく、それによって、ポリ核酸分子の各末端で平滑末端を生成する。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖はＡ－Ｘ^１にコンジュゲートする。いくつかの実施形態では、Ａ－Ｘ^１はパッセンジャー鎖の５’末端にコンジュゲートする。いくつかの実施形態では、Ａ－Ｘ^１はパッセンジャー鎖の３’末端にコンジュゲートする。いくつかの実施形態では、抗トランスフェリン受容体抗体コンジュゲートは、Ａ－Ｘ^１－（Ｂ－Ｘ^２－Ｃ）_ｎ（式（ＩＩ））を含み、式中、Ａは抗トランスフェリン受容体抗体を含み、Ｂはポリ核酸分子を含み、Ｃはポリマーからなり、Ｘ^１は単結合または第１のリンカーからなり、Ｘ^２は単結合または第２のリンカーからなり、および、ｎは１－１２から選択された平均値である。いくつかの実施形態では、Ｃはポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、パッセンジャー鎖とガイド鎖とを含む。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖はＡ－Ｘ^１とＸ^２－Ｃにコンジュゲートする。いくつかの実施形態では、Ａ－Ｘ^１はパッセンジャー鎖の５’末端へコンジュゲートし、Ｘ^２－Ｃはパッセンジャー鎖の３’末端へコンジュゲートする。いくつかの実施形態では、Ｘ^２－Ｃはパッセンジャー鎖の５’末端へコンジュゲートし、Ａ－Ｘ^１はパッセンジャー鎖の３’末端へコンジュゲートする。いくつかの実施形態では、Ｘ^１とＸ^２はそれぞれ独立して非ポリマーリンカーである。いくつかの実施形態では、抗トランスフェリン受容体抗体コンジュゲートはＤをさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｄはエンドソーム溶解部分である。

【0007】

特定の実施形態では、本明細書に記載された抗トランスフェリン受容体抗体をコードする核酸ポリマーが本明細書で開示される。

【0008】

特定の実施形態では、本明細書に記載された抗トランスフェリン受容体抗体をコードする核酸ポリマーを含むベクターが本明細書で開示される。

【0009】

特定の実施形態において、医薬組成物が本明細書で開示され、上記医薬組成物は、本明細書に記載される抗トランスフェリン受容体抗体、または、本明細書に記載される抗トランスフェリン受容体抗体コンジュゲート、および、薬学的に許容可能な賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は全身投与のために製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は非経口投与のために製剤化される。

【0010】

特定の実施形態では、被験体の対象となる標的部位にペイロードを送達する方法が本明細書で開示され、上記方法は、対象となる標的部位にペイロードを送達するために、本明細書に記載される抗トランスフェリン受容体抗体コンジュゲート、または、本明細書に記載される医薬組成物を、被験体に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、対象となる標的部位は、過剰発現された原因となるタンパク質を含む細胞である。いくつかの実施形態では、対象となる標的部位は腫瘍部位である。いくつかの実施形態では、対象となる標的部位は脳にある部位である。

【0011】

特定の実施形態において、被験体の癌を処置する方法が本明細書で開示され、上記方法は、対象となる被験体の癌を処置するために、本明細書に記載される抗トランスフェリン受容体抗体コンジュゲート、または、本明細書に記載される医薬組成物を、被験体に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、癌は固形癌である。いくつかの実施形態では、癌は血液悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、癌は、膀胱癌、肺癌、脳癌、黒色腫、乳癌、非ホジキンリンパ腫、子宮頚癌、卵巣癌、大腸癌、膵臓癌、食道癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌、白血病、甲状腺癌、肝臓癌、または子宮癌である。いくつかの実施形態では、癌は転移性癌である。いくつかの実施形態では、癌は再発性または難治性の癌である。

【0012】

特定の実施形態では、被験体の筋萎縮症または筋緊張性ジストロフィーを処置する方法が本明細書で開示され、上記方法は、本明細書に記載される抗トランスフェリン受容体抗体コンジュゲート、または、本明細書に記載される医薬組成物を、被験体に投与する工程を含み、ここで、ポリ核酸分子はアトロジーンの標的配列にハイブリダイズし、および、ここで、ポリ核酸分子は、アトロジーンに対するＲＮＡ干渉を媒介し、それによって被験体の筋萎縮症を処置する。いくつかの実施形態では、筋萎縮症は、糖尿病に関連する筋萎縮症または癌性悪液質に関連する筋萎縮症である。いくつかの実施形態では、筋萎縮症は、インスリン欠損症、慢性腎不全、うっ血性心不全、慢性呼吸病、慢性感染症、絶食、除神経、サルコペニア、または筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）に関連する。いくつかの実施形態では、被験体の網状赤血球レベルは、抗トランスフェリン受容体抗体の投与後に減少しない。いくつかの実施形態では、抗トランスフェリン受容体抗体コンジュゲートの投与は、被験体のＳＳＢ ｓｉＲＮＡまたはＳＳＢ ｍＲＮＡのレベルをダウンレギュレートする。いくつかの実施形態では、ＳＳＢ ｓｉＲＮＡまたはＳＳＢ ｍＲＮＡのダウンレギュレーションは、筋肉内におけるものである。いくつかの実施形態では、筋肉は骨格筋である。いくつかの実施形態では、筋肉は心筋である。

【0013】

いくつかの実施形態では、筋緊張性ジストロフィーはＤＭ１である。いくつかの実施形態では、アトロジーンは、ＩＧＦ１－Ａｋｔ－ＦｏｘＯ経路、グルココルチコイド－ＧＲ経路、ＰＧＣ１α－ＦｏｘＯ経路、ＴＮＦα－ＮＦκＢ経路、またはミオスタチン－ＡｃｔＲＩＩｂ－Ｓｍａｄ２／３経路内のアップレギュレートされた遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、アトロジーンはＥ３リガーゼをコードする。いくつかの実施形態では、アトロジーンはフォークヘッドボックス転写因子をコードする。いくつかの実施形態では、アトロジーンはアトロジン－１遺伝子（ＦＢＸＯ３２）、ＭｕＲＦ１遺伝子（ＴＲＩＭ６３）、ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＯ３、またはＭＳＴＮを含む。いくつかの実施形態では、アトロジーンはＤＭＰＫを含む。いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。

【0014】

特定の実施形態では、被験体の筋ジストロフィーを処置する方法が本明細書で開示され、上記方法は、本明細書に記載される抗トランスフェリン受容体抗体コンジュゲート、または、本明細書に記載される医薬組成物を、被験体に投与する工程であって、それによって被験体の筋ジストロフィーを処置する、工程を含む。いくつかの実施形態では、筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、または筋緊張性ジストロフィーである。いくつかの実施形態では、筋ジストロフィーはデュシェンヌ型筋ジストロフィーである。いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。

【0015】

特定の実施形態では、本明細書に記載される抗トランスフェリン受容体抗体、本明細書に記載される抗トランスフェリン受容体抗体コンジュゲート、本明細書に記載される核酸ポリマー、本明細書に記載されるベクター、または本明細書に記載される医薬組成物を含むキットが本明細書で開示される。

【図面の簡単な説明】

【0016】

本開示の様々な態様が、添付の請求項において具体的に明記されている。本開示の特徴と利点についてのよりよい理解は、本開示の原則が利用されている例示的な実施形態を説明する以下の詳細な記載と、以下の添付の図面とを参照することにより得られる。本特許出願ファイルは、カラーで描かれた少なくとも１つの図面を含んでいる。カラーの図面を有するこの特許出願公開のコピーは、必要な料金の請求および支払い後に事務局によって提供される。

【図1】例示的なＳＳＢパッセンジャー鎖の構造を例示する。

【図2】相補的な１９の塩基と１つの３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ例示的な平滑末端二重鎖の構造を例示する。精製された一本鎖を二重にして二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。

【図3A】組換えヒトＴｆＲ１に対するＴｆＲ１．ＩｇＧ２ ｍＡｂとＴｆＲ１．ＩｇＧ２ ｍＡｂ－ＳＳＢのインビトロ結合を例示する。

【図3B】組換えカニクイザルＴｆＲ１に対するＴｆＲ１．ＩｇＧ２ ｍＡｂとＴｆＲ１．ＩｇＧ２ ｍＡｂ－ＳＳＢのインビトロ結合を例示する。

【図4A】ｈＴｆＲ１．ＩｇＧ２ ｍＡｂ ＳＳＢまたはｈＴｆＲ１．ＩｇＧ２ ｍＡｂ ＭＳＴＮ（陰性対照）コンジュゲートで処理したＨｅｌ９２．１．７細胞におけるｓｉＲＮＡ送達でのＳＳＢ ｍＲＮＡレベルを例示する。

【図4B】ｈＴｆＲ１．ＩｇＧ２ ｍＡｂ ＳＳＢまたはｈＴｆＲ１．ＩｇＧ２ ｍＡｂ ＭＳＴＮ（陰性対照）コンジュゲートで処理した不死化したヒト骨格筋細胞におけるｓｉＲＮＡ送達でのＳＳＢ ｍＲＮＡレベルを例示する。

【図5A】ｈＴｆＲ１．ＩｇＧ２ ｍＡｂ－ＳＳＢコンジュゲートを３０および６０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝３）で投与した後の、カニクイザルの腓腹筋におけるＳＳＢ ｍＲＮＡおよびＳＳＢ ｓｉＲＮＡのレベルを例示する。

【図5B】ｈＴｆＲ１．ＩｇＧ２ ｍＡｂ－ＳＳＢコンジュゲートを３０および６０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝３）で投与した後の、カニクイザルの大腿四頭筋におけるＳＳＢ ｍＲＮＡおよびＳＳＢ ｓｉＲＮＡのレベルを例示する。

【図6】ｈＴｆＲ１．ＩｇＧ２ ｍＡｂ－ＳＳＢコンジュゲートを３０および６０ｍｇ／ｋｇで投与する前後のカニクイザルの相対的な網状赤血球レベルを例示する。

【図7】カニクイザルＣＤ７１に対する例示的な抗ＴｆＲ抗体の結合定数を例示する。

【図8】ヒトＣＤ７１に対する例示的な抗ＴｆＲ抗体の結合定数を例示する。

【図9A】競合的な設定下におけるＴｆＲに対する例示的な抗ＴｆＲ抗体の結合を例示する。

【図9B】図９Ａの試験済みの抗ＴｆＲ抗体の結合定数を示す。

【図10A】ＴｆＲに対する例示的な抗ＴｆＲ抗体の結合が維持されることを示す。

【図10B】図１０Ａの試験済みの抗ＴｆＲ抗体の結合定数を示す。

【図11】例示的な抗ＴｆＲ抗体のＡＤＣＣ活性を示す。

【図12】抗ＴｆＲ抗体がＴｆＲ２に結合しないことを示す。

【図13A】ＨＥＬ９２細胞における％ ＳＳＢ ｍＲＮＡノックダウンを示す。

【図13B】図１３Ａの試験済みの抗ＴｆＲ抗体のＥＣ５０を示す。

【図14】例示的な抗ＴｆＲ抗体のＡＤＣＣ活性を例示する。

【図15】例示的な抗ＴｆＲ抗体のＣＤＣ活性を例示する。

【図16】初代ヒト骨格筋細胞（筋管）におけるＴｆＲ１．ｍＡｂコンジュゲートの取り込みを示す。

【図17】ＴｆＲ１．ｈＩｇＧ２ ｍＡｂまたはＴｆＲ１．ｈＩｇＧ１ ｍＡｂ変異体のＳＳＢまたはＳｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡコンジュゲートで処置された初代ヒト骨格筋細胞におけるＳＳＢ ｍＲＮＡレベルを示す。

【図18】ＴｆＲ１標的ＡＯＣを投与（１日目に単回投与）前後のカニクイザルにおける絶対的な網状赤血球レベルを示す。

【図19】ＴｆＲ１ ｍＡｂ ＳＳＢコンジュゲートの単回投与から２１日後のカニクイザルの筋肉におけるＳＳＢ ｍＲＮＡレベルを示す（ｎ＝３）。

【図20A】ｈＩｇＧ１ ＴｆＲ－Ｖａｌ２ｉｉ－ＳＳＢコンジュゲートの６ｍｇ／ｋｇ単回投与から２１日後のカニクイザルの組織におけるＳＳＢ ｓｉＲＮＡレベルを示す（ｎ＝２）。

【図20B】ｈＩｇＧ１ ＴｆＲ－Ｖａｌ２ｉｉ－ＳＳＢコンジュゲートの６ｍｇ／ｋｇ単回投与から２１日後のカニクイザルの組織におけるＳＳＢ ｍＲＮＡレベルを示す（ｎ＝２）。

【発明を実施するための形態】

【0017】

トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）は、膜糖タンパク質のファミリーを含み、遺伝子ＴＦＲＣによってコードされる。ＴｆＲは、鉄－トランスフェリン複合体と相互作用して鉄を細胞内に取り込みやすくすることで、鉄代謝に関与している。ＴｆＲには、トランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１またはＣＤ７１）とトランスフェリン受容体２（ＴｆＲ２）の２つのサブタイプがある。ＴｆＲ１は様々な種類の細胞にユビキタスに発現するが、ＴｆＲ２は肝細胞に特異的に発現する。

【0018】

いくつかの例では、ＴｆＲ１の異常な発現は様々な癌で顕著である。実際、ある研究では、乳癌細胞においてＴｆＲ１の発現レベルが上昇していることが示されている（Ｐｉｚｚａｍｉｇｌｉｏ， ｅｔ ａｌ． “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｒｏｎ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｎｏｎ－ｃａｎｃｅｒｏｕｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒｏｕｓ ｂｒｅａｓｔ ｔｕｍｏｒｓ，” Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ． ２０１７；１８）。別の研究では、ＴＦＲ１が脳癌で過剰発現していることが示されている（Ｒｏｓａｇｅｒ， ｅｔ ａｌ．，“Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－１ ａｎｄ ｆｅｒｒｉｔｉｎ ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｓ ｉｎ ａｓｔｒｏｃｙｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒｓ： Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｖａｌｕｅ，” ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １２：ｅ０１８２９５４ （２０１７））。 さらに別の研究では、鉄の取り込みが腫瘍開始細胞で上昇していることが指摘されている（Ｒｙｃｈｔａｒｃｉｋｏｖａ， ｅｔ ａｌ．，“Ｔｕｍｏｒｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ａｎｄ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｏｒｉｇｉｎ ｓｈｏｗ ｔｈｅ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｉｒｏｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，”Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ． ８：６３７６－６３９８ （２０１７））。

【0019】

いくつかの実施形態では、抗トランスフェリン受容体抗体、抗トランスフェリン受容体抗体コンジュゲート、およびそれを含む医薬組成物が本明細書で開示される。さらなる実施形態では、ペイロードの送達のために抗トランスフェリン受容体抗体を利用する方法、および対象となる送達のためにトランスフェリン受容体の存在を利用することによって疾患または疾病を処置する方法が本明細書で開示される。

【0020】

抗トランスフェリン受容体抗体
特定の実施形態では、抗トランスフェリン受容体抗体が本明細書に開示される。いくつかの例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に特異的に結合する。いくつかの例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ヒトトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に特異的に結合する。場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、トランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１）（またはＣＤ７１）に特異的に結合する。場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ヒトトランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１）（またはヒトＣＤ７１）に特異的に結合する。

【0021】

いくつかの例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、可変重鎖（ＶＨ）領域と可変軽鎖（ＶＬ）領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列と、ＨＣＤＲ２配列ＥＩＮＰＩＸ_１ＧＲＳＮＹＡＸ_２ＫＦＱＧであって、Ｘ_１がＮまたはＱから選択され、Ｘ_２がＱまたはＥから選択される、ＨＣＤＲ２配列と、配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列とを含む。

【0022】

いくつかの実施形態では、抗トランスフェリン抗体のＶＨ領域は、表１から選択された、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３の配列を含む。

【0023】

【表1】

【0024】

いくつかの実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号：２、４、または５を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列を含む。いくつかの例では、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号：２を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列を含む。いくつかの例では、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号：４を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列を含む。いくつかの例では、ＶＨ領域は配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号：５を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列を含む。

【0025】

いくつかの実施形態では、抗トランスフェリン受容体抗体のＶＬ領域は、ＬＣＤＲ１配列ＲＴＳＥＮＩＹＸ_３ＮＬＡ、ＬＣＤＲ２配列ＡＸ_４ＴＮＬＡＸ_５、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ_６を含み、ここで、Ｘ_３はＮまたはＳから選択され、Ｘ_４はＡまたはＧから選択され、Ｘ_５はＤまたはＥから選択され、および、Ｘ_６は存在し、または存在せず、存在する場合にはＦである。

【0026】

いくつかの実施形態では、抗トランスフェリン受容体抗体のＶＬ領域は、表２から選択された、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３の配列を含む。

【0027】

【表2】

【0028】

いくつかの例では、ＶＬ領域は、ＬＣＤＲ１配列ＲＴＳＥＮＩＹＸ_３ＮＬＡ、配列番号：７、９、または１２を含むＬＣＤＲ２配列、配列番号：８または１０を含むＬＣＤＲ３配列を含み、ここで、Ｘ_３はＮまたはＳから選択される。

【0029】

いくつかの例では、ＶＬ領域は、配列番号：６または１１を含むＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列ＡＸ_４ＴＮＬＡＸ_５、および配列番号：８または１０を含むＬＣＤＲ３配列を含み、ここで、Ｘ_４はＡまたはＧから選択され、Ｘ_５はＤまたはＥから選択される。

【0030】

いくつかの例では、ＶＬ領域は、配列番号：６または１１を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号：７、９、または１２を含むＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ_６を含み、ここで、Ｘ_６は存在し、または存在せず、存在する場合には、Ｆである。

【0031】

いくつかの例では、ＶＬ領域は、配列番号：６を含むＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列ＡＡＴＮＬＡＸ_５、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ_６を含み、ここで、Ｘ_５はＤまたはＥから選択され、Ｘ_６は存在し、または存在せず、存在する場合にはＦである。

【0032】

いくつかの例では、ＶＬ領域は、配列番号：６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号：７を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号：８を含むＬＣＤＲ３配列を含んでいる。

【0033】

いくつかの例では、ＶＬ領域は、配列番号：６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号：９を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号：１０を含むＬＣＤＲ３配列を含んでいる。

【0034】

いくつかの例では、ＶＬ領域は、配列番号：１１を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号：１２を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号：１０を含むＬＣＤＲ３配列を含んでいる。

【0035】

いくつかの実施形態では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域とＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列と、ＨＣＤＲ２配列ＥＩＮＰＩＸ_１ＧＲＳＮＹＡＸ_２ＫＦＱＧであって、Ｘ_１がＮまたはＱから選択され、Ｘ_２がＱまたはＥから選択される、ＨＣＤＲ２配列と、配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列とを含み、ならびに、ＶＬ領域は、ＬＣＤＲ１配列ＲＴＳＥＮＩＹＸ_３ＮＬＡ、ＬＣＤＲ２配列ＡＸ_４ＴＮＬＡＸ_５、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ_６を含み、ここで、Ｘ_３はＮまたはＳから選択され、Ｘ_４はＡまたはＧから選択され、Ｘ_５はＤまたはＥから選択され、および、Ｘ_６は存在し、または存在せず、存在する場合にはＦである。

【0036】

いくつかの例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域とＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列と、ＨＣＤＲ２配列ＥＩＮＰＩＸ_１ＧＲＳＮＹＡＸ_２ＫＦＱＧであって、Ｘ_１がＮまたはＱから選択され、Ｘ_２がＱまたはＥから選択される、ＨＣＤＲ２配列と、配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列とを含み、ならびに、ＶＬ領域は、ＬＣＤＲ１配列ＲＴＳＥＮＩＹＸ_３ＮＬＡ、配列番号：７、９、または１２を含むＬＣＤＲ２配列、配列番号：８または１０を含むＬＣＤＲ３配列を含み、ここで、Ｘ_３はＮまたはＳから選択される。

【0037】

いくつかの例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域とＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列と、ＨＣＤＲ２配列ＥＩＮＰＩＸ_１ＧＲＳＮＹＡＸ_２ＫＦＱＧであって、Ｘ_１がＮまたはＱから選択され、Ｘ_２がＱまたはＥから選択される、ＨＣＤＲ２配列と、配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列とを含み、ならびに、ＶＬ領域は、配列番号：６または１１を含むＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列ＡＸ_４ＴＮＬＡＸ_５、および配列番号：８または１０を含むＬＣＤＲ３配列を含み、ここで、Ｘ_４はＡまたはＧから選択され、Ｘ_５はＤまたはＥから選択される。

【0038】

いくつかの例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域とＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列と、ＨＣＤＲ２配列ＥＩＮＰＩＸ_１ＧＲＳＮＹＡＸ_２ＫＦＱＧであって、Ｘ_１がＮまたはＱから選択され、Ｘ_２がＱまたはＥから選択される、ＨＣＤＲ２配列と、配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列とを含み、ならびに、ＶＬ領域は、配列番号：６または１１を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号：７、９、または１２を含むＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ_６を含み、ここで、Ｘ_６は存在し、または存在せず、存在する場合には、Ｆである。

【0039】

いくつかの例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域とＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列と、ＨＣＤＲ２配列ＥＩＮＰＩＸ_１ＧＲＳＮＹＡＸ_２ＫＦＱＧであって、Ｘ_１がＮまたはＱから選択され、Ｘ_２がＱまたはＥから選択される、ＨＣＤＲ２配列と、配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列とを含み、ならびに、ＶＬ領域は、配列番号：６を含むＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列ＡＡＴＮＬＡＸ_５、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ_６を含み、ここで、Ｘ_５はＤまたはＥから選択され、Ｘ_６は存在し、または存在せず、存在する場合にはＦである。

【0040】

いくつかの例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域とＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列と、ＨＣＤＲ２配列ＥＩＮＰＩＸ_１ＧＲＳＮＹＡＸ_２ＫＦＱＧであって、Ｘ_１がＮまたはＱから選択され、Ｘ_２がＱまたはＥから選択される、ＨＣＤＲ２配列と、配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列とを含み、ならびに、ＶＬ領域は、配列番号：６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号：７を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号：８を含むＬＣＤＲ３配列を含んでいる。

【0041】

いくつかの例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域とＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列と、ＨＣＤＲ２配列ＥＩＮＰＩＸ_１ＧＲＳＮＹＡＸ_２ＫＦＱＧであって、Ｘ_１がＮまたはＱから選択され、Ｘ_２がＱまたはＥから選択される、ＨＣＤＲ２配列と、配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列とを含み、ならびに、ＶＬ領域は、配列番号：６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号：９を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号：１０を含むＬＣＤＲ３配列を含んでいる。

【0042】

いくつかの例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域とＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列と、ＨＣＤＲ２配列ＥＩＮＰＩＸ_１ＧＲＳＮＹＡＸ_２ＫＦＱＧであって、Ｘ_１がＮまたはＱから選択され、Ｘ_２がＱまたはＥから選択される、ＨＣＤＲ２配列と、配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列とを含み、ならびに、ＶＬ領域は、配列番号：１１を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号：１２を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号：１０を含むＬＣＤＲ３配列を含んでいる。

【0043】

いくつかの例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域とＶＬ領域を含み、ここで、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号：２を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ならびに、ＶＬ領域は、ＬＣＤＲ１配列ＲＴＳＥＮＩＹＸ_３ＮＬＡ、配列番号：７、９、または１２を含むＬＣＤＲ２配列、配列番号：８または１０を含むＬＣＤＲ３配列を含み、ここで、Ｘ_３はＮまたはＳから選択される。

【0044】

いくつかの例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域とＶＬ領域を含み、ここで、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号：２を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ならびに、ＶＬ領域は、配列番号：６または１１を含むＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列ＡＸ_４ＴＮＬＡＸ_５、および配列番号：８または１０を含むＬＣＤＲ３配列を含み、ここで、Ｘ_４はＡまたはＧから選択され、Ｘ_５はＤまたはＥから選択される。

【0045】

いくつかの例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域とＶＬ領域を含み、ここで、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号：２を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ならびに、ＶＬ領域は、配列番号：６または１１を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号：７、９、または１２を含むＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ_６を含み、ここで、Ｘ_６は存在し、または存在せず、存在する場合には、Ｆである。

【0046】

いくつかの例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域とＶＬ領域を含み、ここで、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号：２を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ならびに、ＶＬ領域は、配列番号：６を含むＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列ＡＡＴＮＬＡＸ_５、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ_６を含み、ここで、Ｘ_５はＤまたはＥから選択され、Ｘ_６は存在し、または存在せず、存在する場合にはＦである。

【0047】

いくつかの例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域とＶＬ領域を含み、ここで、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号：２を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ならびに、ＶＬ領域は、配列番号：６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号：７を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号：８を含むＬＣＤＲ３配列を含んでいる。

【0048】

いくつかの例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域とＶＬ領域を含み、ここで、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号：２を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ならびに、ＶＬ領域は、配列番号：６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号：９を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号：１０を含むＬＣＤＲ３配列を含んでいる。

【0049】

いくつかの例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域とＶＬ領域を含み、ここで、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号：２を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ならびに、ＶＬ領域は、配列番号：１１を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号：１２を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号：１０を含むＬＣＤＲ３配列を含んでいる。

【0050】

いくつかの例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域とＶＬ領域を含み、ここで、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号：４を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ならびに、ＶＬ領域は、ＬＣＤＲ１配列ＲＴＳＥＮＩＹＸ_３ＮＬＡ、配列番号：７、９、または１２を含むＬＣＤＲ２配列、配列番号：８または１０を含むＬＣＤＲ３配列を含み、ここで、Ｘ_３はＮまたはＳから選択される。

【0051】

いくつかの例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域とＶＬ領域を含み、ここで、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号：４を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ならびに、ＶＬ領域は、配列番号：６または１１を含むＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列ＡＸ_４ＴＮＬＡＸ_５、および配列番号：８または１０を含むＬＣＤＲ３配列を含み、ここで、Ｘ_４はＡまたはＧから選択され、Ｘ_５はＤまたはＥから選択される。

【0052】

いくつかの例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域とＶＬ領域を含み、ここで、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号：４を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ならびに、ＶＬ領域は、配列番号：６または１１を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号：７、９、または１２を含むＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ_６を含み、ここで、Ｘ_６は存在し、または存在せず、存在する場合には、Ｆである。

【0053】

いくつかの例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域とＶＬ領域を含み、ここで、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号：４を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ならびに、ＶＬ領域は、配列番号：６を含むＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列ＡＡＴＮＬＡＸ_５、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ_６を含み、ここで、Ｘ_５はＤまたはＥから選択され、Ｘ_６は存在し、または存在せず、存在する場合にはＦである。

【0054】

いくつかの例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域とＶＬ領域を含み、ここで、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号：４を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ならびに、ＶＬ領域は、配列番号：６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号：７を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号：８を含むＬＣＤＲ３配列を含んでいる。

【0055】

いくつかの例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域とＶＬ領域を含み、ここで、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号：４を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ならびに、ＶＬ領域は、配列番号：６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号：９を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号：１０を含むＬＣＤＲ３配列を含んでいる。

【0056】

いくつかの例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域とＶＬ領域を含み、ここで、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号：４を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ならびに、ＶＬ領域は、配列番号：１１を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号：１２を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号：１０を含むＬＣＤＲ３配列を含んでいる。

【0057】

いくつかの例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域とＶＬ領域を含み、ここで、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号：５を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ならびに、ＶＬ領域は、ＬＣＤＲ１配列ＲＴＳＥＮＩＹＸ_３ＮＬＡ、配列番号：７、９、または１２を含むＬＣＤＲ２配列、配列番号：８または１０を含むＬＣＤＲ３配列を含み、ここで、Ｘ_３はＮまたはＳから選択される。

【0058】

いくつかの例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域とＶＬ領域を含み、ここで、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号：５を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ならびに、ＶＬ領域は、配列番号：６または１１を含むＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列ＡＸ_４ＴＮＬＡＸ_５、および配列番号：８または１０を含むＬＣＤＲ３配列を含み、ここで、Ｘ_４はＡまたはＧから選択され、Ｘ_５はＤまたはＥから選択される。

【0059】

いくつかの例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域とＶＬ領域を含み、ここで、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号：５を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ならびに、ＶＬ領域は、配列番号：６または１１を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号：７、９、または１２を含むＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ_６を含み、ここで、Ｘ_６は存在し、または存在せず、存在する場合には、Ｆである。

【0060】

いくつかの例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域とＶＬ領域を含み、ここで、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号：５を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ならびに、ＶＬ領域は、配列番号：６を含むＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列ＡＡＴＮＬＡＸ_５、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ_６を含み、ここで、Ｘ_５はＤまたはＥから選択され、Ｘ_６は存在し、または存在せず、存在する場合にはＦである。

【0061】

いくつかの例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域とＶＬ領域を含み、ここで、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号：５を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ならびに、ＶＬ領域は、配列番号：６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号：７を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号：８を含むＬＣＤＲ３配列を含んでいる。

【0062】

いくつかの例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域とＶＬ領域を含み、ここで、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号：５を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ならびに、ＶＬ領域は、配列番号：６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号：９を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号：１０を含むＬＣＤＲ３配列を含んでいる。

【0063】

いくつかの例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域とＶＬ領域を含み、ここで、ＶＨ領域は、配列番号：１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号：５を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号：３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ならびに、ＶＬ領域は、配列番号：１１を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号：１２を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号：１０を含むＬＣＤＲ３配列を含んでいる。

【0064】

いくつかの実施形態では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域とＶＬ領域を含み、ここで、ＶＨ領域の配列は、配列番号：１３－１６に対する約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％ ９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含み、ならびに、ＶＬ領域の配列は、配列番号：１８－２１に対する約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％ ９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含む。

【0065】

いくつかの実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号：１３－１６（表３）から選択された配列を含み、および、ＶＬ領域は、配列番号：１８－２１（表４）から選択された配列を含む。表３および表４で強調された領域は、それぞれのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３の配列を表示している。

【0066】

【表3】

【0067】

【表4】

【0068】

いくつかの実施形態では、抗トランスフェリン受容体抗体は、表５で例示されるようなＶＨ領域とＶＬ領域を含む。

【0069】

【表5】

【0070】

いくつかの実施形態では、上記の抗トランスフェリン受容体抗体は、完全長の抗体である。他の実施形態では、抗トランスフェリン受容体抗体はその結合フラグメントである。場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、多特異性抗体またはその結合フラグメント、あるいは二重特異性抗体またはその結合フラグメントである。場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ）’３フラグメント、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ビス－ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ）２、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、Ｉｇ ＮＡＲ、ラクダ科抗体またはその結合フラグメント、あるいはその化学修飾された誘導体である。

【0071】

いくつかの実施形態では、抗トランスフェリン受容体抗体は多特異性抗体である。場合によっては、多特異性抗体は、２つ以上の標的結合部位を含み、ここで、２つ以上の標的結合部位の各々は抗原に特異的に結合し、２つ以上の抗原は異なっている。場合によっては、多特異性抗体は、３つ以上の異なる抗原、４つ以上の異なる抗原、または５つ以上の異なる抗原に特異的に結合する標的結合部位を含む。

【0072】

いくつかの実施形態では、抗トランスフェリン受容体抗体は二重特異性抗体である。場合によっては、二重特異性抗体または結合フラグメントは、ノブイントゥホール（Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－Ｈｏｌｅｓ）（ＫｉＨ）、非対称的再操作技術－免疫グロブリン（Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｒｅ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ－ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）（ＡＲＴ－Ｉｇ）、トリオマブ クアドロマ（Ｔｒｉｏｍａｂ ｑｕａｄｒｏｍａ）、二重特異性モノクローナル抗体（ＢｉＭＡｂ、ＢｓｍＡｂ、ＢｓＡｂ、ｂｓＭａｂ、ＢＳ－Ｍａｂ、またはＢｉ－ＭＡｂ）、ＦｃΔＡｄｐ、ＸｍＡｂ、Ａｚｙｍｅｔｒｉｃ、Ｔ細胞受容体（ＢＥＡＴ）に基づく抗体による二重特異性結合、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、Ｂｉｃｌｏｎｉｃｓ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｔｗｏ－ｉｎ－ｏｎｅ／Ｄｕａｌ Ａｃｔｉｏｎ Ｆａｂ（ＤＡＦ）、ＦｉｎｏｍＡｂ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ－（Ｆａｂ）融合、Ｄｏｃｋ－ａＮｄ－Ｌｏｃｋ（ＤＮＬ）、Ａｄａｐｔｉｒ（旧ＳＣＯＲＰＩＯＮ）、タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ）、二重親和性再標的化（Ｄｕａｌ－ａｆｆｉｎｉｔｙ－ＲｅＴａｒｇｅｔｉｎｇ）（ＤＡＲＴ）、ナノボディを含む。

【0073】

いくつかの例では、二重特異性抗体は三機能性抗体または二重特異性ミニ抗体である。場合によっては、二重特異性抗体は三機能性抗体である。いくつかの例では、三機能性抗体は、２つの異なる抗原のための結合部位を含む完全長のモノクローナル抗体である。

【0074】

場合によっては、二重特異性抗体は二重特異性ミニ抗体である。いくつかの例では、二重特異性ミニ抗体は、二価Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ）’３フラグメント、ビス－ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ）２、ダイアボディ、ミニボディ、トリアボディ、テトラボディ、または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、２つのｓｃＦｖｓが２つの異なる抗原のエピトープを標的とする２つの単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖｓ）を含む融合タンパク質である。

【0075】

いくつかの例では、抗トランスフェリン受容体抗体は三重特異性抗体である。いくつかの例では、三重特異性抗体はＦ（ａｂ）’３フラグメントまたはトリアボディを含む。いくつかの実施形態では、抗トランスフェリン受容体抗体は、Ｄｉｍａｓ，ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｔｏ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｔａｒｇｅｔ ｔｈｒｅｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ，” Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、１２（９）：３４９０－３５０１（２０１５）に記載されるような三重特異性抗体である。

【0076】

いくつかの例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ， “Ｔｈｅ ｍａｋｉｎｇ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ＭＡＢＳ ９（２）： １８２－２１２ （２０１７）の図２に例示された抗体フォーマットを含む。

【0077】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載された抗トランスフェリン受容体抗体は、ＩｇＧフレームワーク、ＩｇＡフレームワーク、ＩｇＥフレームワーク、またはＩｇＭフレームワークを含む。いくつかの例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＩｇＧフレームワーク（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）を含む。場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＩｇＧ１フレームワークを含む。場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＩｇＧ２（例えば、ＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂ）フレームワークを含む。場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＩｇＧ２ａフレームワークを含む。場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＩｇＧ２ｂフレームワークを含む。場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＩｇＧ３フレームワークを含む。場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＩｇＧ４フレームワークを含む。

【0078】

場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、フレームワーク領域において、例えば、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ヒンジ領域、またはその組み合わせにおいて、１つ以上の突然変異を含む。いくつかの例では、１つ以上の突然変異は、抗体を安定させるための、および／または半減期を増大させるためのものである。いくつかの例では、１つ以上の突然変異は、Ｆｃ受容体の相互作用を調節し、ＦｃｙＲ、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などのＦｃエフェクターの機能を低下または消失させたりするためのものである。さらなる例では、１つ以上の突然変異はグリコシル化を修飾するためのものである。

【0079】

いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異はＦｃ領域に位置する。いくつかの例では、Ｆｃ領域は、残基位置Ｌ２３４、Ｌ２３５、またはその組み合わせにおいて突然変異を含む。いくつかの例では、突然変異はＬ２３４とＬ２３５を含む。いくつかの例では、突然変異はＬ２３４ＡとＬ２３５Ａを含む。場合によっては、残基位置はＩｇＧ１を基準としている。

【0080】

いくつかの例では、Ｆｃ領域は、残基位置Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ｋ３２２、Ｌ３２８、またはＰ３２９、あるいはその組み合わせにおいて突然変異を含む。いくつかの例では、突然変異は、残基位置Ｋ３２２、Ｌ３２８、またはＰ３２９における突然変異と組み合わせてＬ２３４とＬ２３５を含む。場合によっては、Ｆｃ領域は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、およびＫ３２２において突然変異を含む。場合によっては、Ｆｃ領域は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、およびＬ３２８において突然変異を含む。場合によっては、Ｆｃ領域は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、およびＰ３２９において突然変異を含む。場合によっては、Ｆｃ領域、Ｄ２６５とＮ２９７において突然変異を含む。場合によっては、残基位置はＩｇＧ１を基準としている。

【0081】

いくつかの例では、Ｆｃ領域は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｋ３２２Ｇ、Ｌ３２８Ｒ、またはＰ３２９Ｇ、あるいはその組み合わせを含む。いくつかの例では、Ｆｃ領域は、Ｋ３２２Ｇ、Ｌ３２８Ｒ、またはＰ３２９Ｇと組み合わせてＬ２３４ＡとＬ２３５Ａを含む。場合によっては、Ｆｃ領域は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＫ３２２Ｇを含む。場合によっては、Ｆｃ領域は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＬ３２８Ｒを含む。場合によっては、Ｆｃ領域は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ｇを含む。場合によっては、Ｆｃ領域は、Ｄ２６５ＡとＮ２９７Ｇを含む。場合によっては、残基位置はＩｇＧ１を基準としている。

【0082】

いくつかの例では、Ｆｃ領域は、残基位置Ｌ２３５、Ｌ２３６、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ｋ３２２、Ｌ３２８、またはＰ３２９における突然変異、あるいは突然変異の組み合わせを含む。いくつかの例では、Ｆｃ領域は、Ｌ２３５とＬ２３６における突然変異を含む。いくつかの例では、Ｆｃ領域は、残基位置Ｋ３２２、Ｌ３２８、またはＰ３２９の突然変異と組み合わせてＬ２３５とＬ２３６における突然変異を含む。場合によっては、Ｆｃ領域は、Ｌ２３５、Ｌ２３６、およびＫ３２２において突然変異を含む。場合によっては、Ｆｃ領域は、Ｌ２３５、Ｌ２３６、およびＬ３２８において突然変異を含む。場合によっては、Ｆｃ領域は、Ｌ２３５、Ｌ２３６、およびＰ３２９において突然変異を含む。場合によっては、Ｆｃ領域は、Ｄ２６５とＮ２９７において突然変異を含む。場合によっては、残基位置はＩｇＧ２ｂを基準としている。

【0083】

いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３６Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｋ３２２Ｇ、Ｌ３２８Ｒ、またはＰ３２９Ｇ、あるいはその組み合わせを含む。いくつかの例では、Ｆｃ領域は、Ｌ２３５ＡとＬ２３６Ａを含む。いくつかの例では、Ｆｃ領域は、Ｋ３２２Ｇ、Ｌ３２８Ｒ、またはＰ３２９Ｇと組み合わせてＬ２３５ＡとＬ２３６Ａを含む。場合によっては、Ｆｃ領域は、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３６Ａ、およびＫ３２２Ｇを含む。場合によっては、Ｆｃ領域は、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３６Ａ、およびＬ３２８Ｒを含む。場合によっては、Ｆｃ領域は、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３６Ａ、およびＰ３２９Ｇを含む。場合によっては、Ｆｃ領域は、Ｄ２６５ＡとＮ２９７Ｇを含む。場合によっては、残基位置はＩｇＧ２ｂを基準としている。

【0084】

いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、残基位置Ｌ２３３、Ｌ２３４、Ｄ２６４、Ｎ２９６、Ｋ３２１、Ｌ３２７、またはＰ３２８において突然変異を含み、ここで、残基は、配列番号：２３の位置２３３、２３４、２６４、２９６、３２１、３２７、および３２８に対応する。いくつかの例では、Ｆｃ領域は、Ｌ２３３とＬ２３４における突然変異を含む。いくつかの例では、Ｆｃ領域は、残基位置Ｋ３２１、Ｌ３２７、またはＰ３２８の突然変異と組み合わせてＬ２３３とＬ２３４における突然変異を含む。場合によっては、Ｆｃ領域は、Ｌ２３３、Ｌ２３４、およびＫ３２１において突然変異を含む。場合によっては、Ｆｃ領域は、Ｌ２３３、Ｌ２３４、およびＬ３２７において突然変異を含む。場合によっては、Ｆｃ領域は、Ｌ２３３、Ｌ２３４、およびＫ３２１において突然変異を含む。場合によっては、Ｆｃ領域は、Ｌ２３３、Ｌ２３４、およびＰ３２８において突然変異を含む。いくつかの例では、Ｆｃ領域は、Ｄ２６４とＮ２９６における突然変異を含む。場合によっては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のフレームワークにおける残基Ｌ２３３、Ｌ２３４、Ｄ２６４、Ｎ２９６、Ｋ３２１、Ｌ３２７、またはＰ３２８に対する同等の位置が企図されている。場合によっては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４のフレームワークにける配列番号：２３の残基Ｌ２３３、Ｌ２３４、Ｄ２６４、Ｎ２９６、Ｋ３２１、Ｌ３２７、またはＰ３２８に対応する残基に対する突然変異も企図される。

【0085】

いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｌ２３３Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｄ２６４Ａ、Ｎ２９６Ｇ、Ｋ３２１Ｇ、Ｌ３２７Ｒ、またはＰ３２８Ｇを含み、ここで、残基は、配列番号：２３の位置２３３、２３４、２６４、２９６、３２１、３２７、および３２８に対応する。いくつかの例では、Ｆｃ領域は、Ｌ２３３ＡとＬ２３４Ａを含む。いくつかの例では、Ｆｃ領域は、Ｋ３２１Ｇ、Ｌ３２７Ｒ、またはＰ３２８Ｇと組み合わせてＬ２３３ＡとＬ２３４Ａを含む。場合によっては、Ｆｃ領域は、Ｌ２３３Ａ、Ｌ２３４Ａ、およびＫ３２１Ｇを含む。場合によっては、Ｆｃ領域は、Ｌ２３３Ａ、Ｌ２３４Ａ、およびＬ３２７Ｒを含む。場合によっては、Ｆｃ領域は、Ｌ２３３Ａ、Ｌ２３４Ａ、およびＫ３２１Ｇを含む。場合によっては、Ｆｃ領域は、Ｌ２３３Ａ、Ｌ２３４Ａ、およびＰ３２８Ｇを含む。いくつかの例では、Ｆｃ領域は、Ｄ２６４ＡとＮ２９６Ｇを含む。

【0086】

いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ定常領域は、例えば、Ｎａｔｓｕｍｅ ｅｔ ａｌ．， ２００８ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ６８（１０）： ３８６３－７２； Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．， ２００１ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １６６（４）： ２５７１－５； Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１０ ｍＡｂｓ， ２（２）： １８１－ １８９； Ｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．， ２００６ ＰＮＡＳ， １０３（１１）： ４００５－４０１０， Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．， ２００１ ＪＢＣ， ２７６（ ９）： ６５９１－ ６６０４； Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００７ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ６７（１８）： ８８８２－８８９０； Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００８ Ａｄｖａｎ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ．， ４８： １５２－１６４； Ａｌｅｇｒｅ ｅｔ ａｌ， １９９２ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １４８： ３４６１－３４６８； Ｒｅｖｉｅｗｅｄ ｉｎ Ｋａｎｅｋｏ ａｎｄ Ｎｉｗａ， ２０１１ Ｂｉｏｄｒｕｇｓ， ２５（１）： １－１１に記載されたアミノ酸修飾を用いて、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を改変するように修飾される。

【0087】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載された抗トランスフェリン受容体抗体は、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）を含む、完全長の抗体である。場合によっては、重鎖（ＨＣ）は表６から選択された配列を含む。場合によっては、軽鎖（ＬＣ）は表７から選択された配列を含む。強調された部位はそれぞれのＣＤＲを表示する。

【0088】

【表6-1】

【0089】

【表6-2】

【0090】

【表6-3】

【0091】

【表6-4】

【0092】

【表6-5】

【0093】

【表7】

【0094】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載された抗トランスフェリン受容体抗体は、基準の抗トランスフェリン受容体抗体と比較して、改善された血清半減期を有する。いくつかの例では、改善された血清半減期は、基準の抗トランスフェリン受容体抗体よりも、少なくとも３０分、１時間、１．５時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１４日、３０日、またはそれ以上長い。

【0095】

抗体またはその結合フラグメントの産生
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、抗体とその結合フラグメント）は、とりわけ、化学合成によって、または組換え発現によって、ポリペプチド（例えば、抗体）の合成に役立つように、当該技術分野で知られている任意の方法を使用して生成され、および、好ましくは組換え発現技術によって生成される。

【0096】

いくつかの例では、抗体またはその結合フラグメントは組換え発現され、抗体またはその結合フラグメントをコードする核酸は、化学的に合成されたオリゴヌクレオチド（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２に記載されるような）から組み立てられ、これは、抗体をコードする配列の一部を含有する重複するオリゴヌクレオチドの合成、オリゴヌクレオチドのアニーリングとライゲーション、および、その後のＰＣＲによるライゲートされたオリゴヌクレオチドの増幅を含む。

【0097】

代替的に、抗体をコードする核酸分子は、配列の３’と５’の末端へハイブリダイズすることができる合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、あるいは特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用してクローンを作ることによって、適切なソース（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、または免疫グロブリンを発現する任意の組織あるいは細胞から生成されたｃＤＮＡライブラリー）から随意に生成される。

【0098】

いくつかの例では、抗体またはその結合は、ポリクローナル抗体を産生するためにウサギなどの動物を免疫化することにより、または、より好ましくは、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７）によって記載されるように、または、Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２）あるいはＣｏｌｅら（１９８５ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７－９６）によって記載されるように、モノクローナル抗体を産生することによって、随意に生成される。代替的に、抗体の少なくともＦａｂ部分をコードするクローンは、特異的抗原に結合するＦＡｂフラグメントのクローンのためにＦａｂ発現ライブラリー（例えば、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５－１２８１に記載される）をスクリーニングすることにより、または抗体ライブラリー（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４； Ｈａｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：４９３７を参照）をスクリーニングすることにより、随意に得られる。

【0099】

いくつかの実施形態では、適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子と一緒に、適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子をスプライシングすることにより、「キメラ抗体」（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１：８５１－８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４－６０８；Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２－４５４）の産生のために開発された技術が使用される。キメラ抗体は、異なる部分が、マウスのモノクローナル抗体に由来する可変領域、およびヒト免疫グロブリン定常領域、例えば、ヒト化抗体を有する動物種などの様々な動物種に由来する分子である。

【0100】

いくつかの実施形態では、単鎖抗体の産生について記載された技術（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，６９４，７７８；Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３； ａｎｄ Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４－５４）は、単鎖抗体を産生するために適合される。単鎖抗体は、アミノ酸ブリッジによってＦｖ領域の重鎖および軽鎖のフラグメントを結合することによって形成され、結果として単鎖ポリペプチドを生じさせる。大腸菌中の機能的なＦｖフラグメントの組み立てのための技術も随意に使用される（Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８－１０４１）。

【0101】

いくつかの実施形態では、抗体のヌクレオチド配列を含む発現ベクターまたは抗体のヌクレオチド配列は、従来の技術（例えば、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション、および、リン酸カルシウム沈澱反応）によって宿主細胞に導入され、トランスフェクトされた細胞はその後、抗体を産生するために従来の技術によって培養される。特定の実施形態では、抗体の発現は、構成的な、誘導可能な、または組織特異的なプロモーターによって調節される。

【0102】

いくつかの実施形態では、様々な宿主発現ベクター系は、本明細書に記載される抗体またはその結合フラグメントを発現するために利用される。そのような宿主発現系は、抗体のコード配列を生成し、その後精製するビヒクルを表すだけでなく、適切なヌクレオチドコード配列でトランスフェクトされるか、あるいはトランスフェクトされるときに、抗体またはその結合フラグメントをインサイツで発現する細胞も表す。これらは、限定されないが、抗体またはその結合フラグメントコード配列を含む、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、あるいはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌と枯草菌）などの微生物、抗体またはその結合フラグメントコード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロミケス・ピキア）、抗体またはその結合フラグメントコード配列を含む組替えウイルス発現ベクターに感染した昆虫細胞系（例えば、バキュロウイルス）、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）およびタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））に感染した、あるいは、抗体またはその結合フラグメントコード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系、もしくは、哺乳動物細胞（例えば、メタロチオネイン・プロモーター）のゲノム、または、哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）に由来するプロモーターを含む、組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３細胞）を含む。

【0103】

組換えタンパク質の長期的かつ高収率の生成のためには、安定した発現が好ましい。いくつかの例では、安定して抗体を発現する細胞株が随意に操作される。ウイルスの複製開始点を含む発現ベクターを使用するのではなく、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択可能なマーカーによって制御されたＤＮＡで形質転換される。外来性ＤＮＡの導入後に、細胞を操作して富化培地で１－２日間成長させ、その後、選択培地に切り替える。組換えプラスミドにおける選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を与え、細胞が、プラスミドをその染色体に安定的に統合し、成長してフォーカスを形成し、これがクローン化されて細胞株へと拡大することを可能にする。この方法は、抗体またはその結合フラグメントを発現する細胞株を操作するために有利に使用することができる。

【0104】

いくつかの例では、限定されないが、それぞれｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞、またはａｐｒｔ細胞で利用される単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７７，Ｃｅｌｌ １１：２２３）、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，１９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２０２）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：８１７）遺伝子を含む、多くの選択系が使用される。同様に、代謝拮抗薬の耐性は、以下の遺伝子の選定基準として使用される：メトトレキサートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：３５７； Ｏ’Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：１５２７）；ミコフェノール酸に対する耐性を与えるｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ，１９８１，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：２０７２）；アミノグリコシドＧ－４１８に対する耐性を与えるｎｅｏ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８－５０５； Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ， １９９１， Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７－９５； Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ， １９９３， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． ３２：５７３－５９６； Ｍｕｌｌｉｇａｎ， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６－９３２、およびＭｏｒｇａｎ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ， １９９３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６２：１９１－２１７；Ｍａｙ，１９９３，ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１５５－２１５）、ならびに、ヒグロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８４， Ｇｅｎｅ ３０：１４７）。使用可能な組換えＤＮＡ技術の技術分野で一般的に知られている方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．， １９９３， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹ； Ｋｒｉｅｇｌｅｒ， １９９０， Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ； ａｎｄ ｉｎ Ｃｈａｐｔｅｒｓ １２ ａｎｄ １３， Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ）， １９９４， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹ．； Ｃｏｌｂｅｒｒｅ－Ｇａｒａｐｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９８１， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１）に記載される。

【0105】

いくつかの例では、抗体の発現レベルは、ベクター増幅によって増加する（検討のために、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．３．（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７を参照））。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルが増加すると、標識遺伝子のコピーの数が増加する。増幅した領域が抗体のヌクレオチド配列に関連しているため、抗体の産生も増加する（Ｃｒｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３：２５７）。

【0106】

いくつかの例では、抗体または抗体コンジュゲートの精製または分析のための当該技術分野で知られている任意の方法は、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、とりわけ、プロテインＡの後の特異性抗原への親和性、および、サイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、差次的溶解性によって、またはタンパク質の精製のための他の標準的な技術によって使用される。例示的なクロマトグラフィー方法としては、限定されないが、強力な陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および高速タンパク質液体クロマトグラフィーが挙げられる。

【0107】

抗トランスフェリン受容体抗体コンジュゲート
いくつかの実施形態では、上記の抗トランスフェリン受容体抗体はさらにペイロードにコンジュゲートする。いくつかの例では、ペイロードは小分子を含む。他の例では、ペイロードはタンパク質またはペプチドを含む。さらなる例では、ペイロードはポリ核酸分子を含む。

【0108】

いくつかの例では、ペイロード対抗トランスフェリン受容体抗体（薬物から抗体への比率あるいはＤＡＲ比）の比は、約１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、または１６：１である。

【0109】

場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体コンジュゲートは、

【0110】

【化1】

を含み、
式中、
Ａは抗トランスフェリン受容体抗体を含み、
Ｂはペイロードを含み、
Ｘ^１は単結合またはリンカーからなり、および、
ｎは１－１２から選択された平均値である。

【0111】

いくつかの例では、Ｂ対Ａ（抗トランスフェリン受容体抗体）のＤＡＲ比は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６である。場合によっては、Ｂ対ＡのＤＡＲ比は約１である。場合によっては、Ｂ対ＡのＤＡＲ比は約２である。場合によっては、Ｂ対ＡのＤＡＲ比は約３である。場合によっては、Ｂ対ＡのＤＡＲ比は約４である。場合によっては、Ｂ対ＡのＤＡＲ比は約６である。場合によっては、Ｂ対ＡのＤＡＲ比は約８である。場合によっては、Ｂ対ＡのＤＡＲ比は約１０である。場合によっては、Ｂ対ＡのＤＡＲ比は約１２である。場合によっては、Ｂ対ＡのＤＡＲ比は約１６である。

【0112】

いくつかの例では、ポリ核酸分子（Ｂ）対抗トランスフェリン受容体抗体ＡのＤＡＲ比は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６である。いくつかの例では、ポリ核酸分子（Ｂ）対抗トランスフェリン受容体抗体ＡのＤＡＲ比は、約１である。いくつかの例では、ポリ核酸分子（Ｂ）対抗トランスフェリン受容体抗体ＡのＤＡＲ比は、約２である。いくつかの例では、ポリ核酸分子（Ｂ）対抗トランスフェリン受容体抗体ＡのＤＡＲ比は、約３である。いくつかの例では、ポリ核酸分子（Ｂ）対抗トランスフェリン受容体抗体ＡのＤＡＲ比は、約４である。いくつかの例では、ポリ核酸分子（Ｂ）対抗トランスフェリン受容体抗体ＡのＤＡＲ比は、約５である。いくつかの例では、ポリ核酸分子（Ｂ）対抗トランスフェリン受容体抗体ＡのＤＡＲ比は、約６である。いくつかの例では、ポリ核酸分子（Ｂ）対抗トランスフェリン受容体抗体ＡのＤＡＲ比は、約７である。いくつかの例では、ポリ核酸分子（Ｂ）対抗トランスフェリン受容体抗体ＡのＤＡＲ比は、約８である。いくつかの例では、ポリ核酸分子（Ｂ）対抗トランスフェリン受容体抗体ＡのＤＡＲ比は、約９である。いくつかの例では、ポリ核酸分子（Ｂ）対抗トランスフェリン受容体抗体ＡのＤＡＲ比は、約１０である。いくつかの例では、ポリ核酸分子（Ｂ）対抗トランスフェリン受容体抗体ＡのＤＡＲ比は、約１１である。いくつかの例では、ポリ核酸分子（Ｂ）対抗トランスフェリン受容体抗体ＡのＤＡＲ比は、約１２である。いくつかの例では、ポリ核酸分子（Ｂ）対抗トランスフェリン受容体抗体ＡのＤＡＲ比は、約１３である。いくつかの例では、ポリ核酸分子（Ｂ）対抗トランスフェリン受容体抗体ＡのＤＡＲ比は、約１４である。いくつかの例では、ポリ核酸分子（Ｂ）対抗トランスフェリン受容体抗体ＡのＤＡＲ比は、約１５である。いくつかの例では、ポリ核酸分子（Ｂ）対抗トランスフェリン受容体抗体ＡのＤＡＲ比は、約１６である。

【0113】

いくつかの実施形態では、Ｂは小分子、ペプチド、またはタンパク質を含む。

【0114】

いくつかの実施形態では、Ｂはポリ核酸分子を含む。場合によっては、ポリ核酸分子は、パッセンジャー鎖とガイド鎖とを含む。場合によっては、パッセンジャー鎖はＡ－Ｘ^１にコンジュゲートする。場合によっては、Ａ－Ｘ^１はパッセンジャー鎖の５’末端にコンジュゲートする。場合によっては、Ａ－Ｘ^１はパッセンジャー鎖の３’末端にコンジュゲートする。

【0115】

場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体コンジュゲートは、

【0116】

【化2】

を含み、
式中、
Ａは抗トランスフェリン受容体抗体を含み、
Ｂはペイロードを含み、
Ｃはポリマーからなり、
Ｘ^１は単結合または第１のリンカーからなり、
Ｘ^２は単結合または第２のリンカーからなり、および、
ｎは１－１２から選択された平均値である。

【0117】

場合によっては、Ｃはポリエチレングリコールである。

【0118】

場合によっては、Ｂはポリ核酸分子である。場合によっては、ポリ核酸分子は、パッセンジャー鎖とガイド鎖とを含む。場合によっては、パッセンジャー鎖はＡ－Ｘ^１とＸ^２－Ｃにコンジュゲートする。いくつかの実施形態では、Ａ－Ｘ^１はパッセンジャー鎖の５’末端へコンジュゲートし、Ｘ^２－Ｃはパッセンジャー鎖の３’末端へコンジュゲートする。いくつかの実施形態では、Ｘ^２－Ｃはパッセンジャー鎖の５’末端へコンジュゲートし、Ａ－Ｘ^１はパッセンジャー鎖の３’末端へコンジュゲートする。

【0119】

場合によっては、Ｘ^１とＸ^２はそれぞれ独立して非ポリマーリンカーである。

【0120】

場合によっては、式（ＩＩ）Ａ－Ｘ^１－（Ｂ－Ｘ^２－Ｃ）_ｎのコンジュゲートはさらに、エンドソーム溶解部分であるＤを含む。

【0121】

コンジュゲーション化学
いくつかの実施形態では、Ｂは化学的なライゲーションプロセスによってＡにコンジュゲートする。いくつかの例では、Ｂは天然のライゲーションによってＡにコンジュゲートする。いくつかの例では、コンジュゲーションは、Ｄａｗｓｏｎ， ｅｔ ａｌ． ”Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｎａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９４， ２６６， ７７６－７７９； Ｄａｗｓｏｎ， ｅｔ ａｌ． ”Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｔｈｉｏｌ Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ，” Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９７， １１９， ４３２５－４３２９； Ｈａｃｋｅｎｇ， ｅｔ ａｌ． ”Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ ｎａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ：Ｅｘｐａｎｄｅｄ ｓｃｏｐｅ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｓｔｒａｉｇｈｔｆｏｒｗａｒｄ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ．，” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９９９， ９６， １００６８－１００７３；あるいは、Ｗｕ， ｅｔ ａｌ． ”Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｆｒｅｅ ｎａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ，” Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． ２００６， ４５， ４１１６－４１２５に記載される通りである。いくつかの例では、コンジュゲーションは米国特許第８，９３６，９１０号に記載されるとおりである。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、天然のライゲーション化学を介して、結合部分に部位特異的または非特異的にコンジュゲートする。

【0122】

いくつかの例では、Ｂは「トレースレス（ｔｒａｃｅｌｅｓｓ）」カップリング技術（ＰｈｉｌｏＣｈｅｍ）を利用する部位指定的な方法によってＡにコンジュゲートする。いくつかの例では、「トレースレス」カップリング技術は、アルデヒド基を含むポリ核酸分子とコンジュゲートする結合部分のＮ末端 １，２－アミノチオール基を利用する。（Ｃａｓｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｃｅｌｅｓｓ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｄｒｕｇｓ ｔｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｏｄｅｌｉｖｅｒｙ，” ＪＡＣＳ １３４（１３）： ５８８７－５８９２ （２０１２）を参照）

【0123】

いくつかの例では、Ｂは、結合部分に導入された非天然のアミノ酸を利用する部位指定的な方法によってＡにコンジュゲートする。いくつかの例では、非天然アミノ酸はｐ－アセチルフェニルアラニン（ｐＡｃＰｈｅ）を含む。いくつかの例では、ｐＡｃＰｈｅのケト基は、オキシム結合を形成するために、アルコキシ－アミン由来のコンジュゲート部分に選択的に連結される。（Ａｘｕｐ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ，” ＰＮＡＳ １０９（４０）： １６１０１－１６１０６ （２０１２））を参照）。

【0124】

いくつかの例では、Ｂは、酵素触媒プロセスを利用する部位指定的な方法によってＡにコンジュゲートする。いくつかの例では、部位指定的な方法はＳＭＡＲＴａｇ（商標）技術（Ｒｅｄｗｏｏｄ）を利用する。いくつかの例では、ＳＭＡＲＴａｇ（商標）技術は、アルデヒドタグの存在下での酸化プロセスを介するホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）によるシステインからのホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）残基の生成、および、ヒドラジノ－Ｐｉｃｔｅｔ－Ｓｐｅｎｇｌｅｒ（ＨＩＰＳ）ライゲーションを介するアルキルヒドラジン機能化ポリ核酸分子へのＦＧｌｙのその後のコンジュゲーションを含む。（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，”Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｃｏｄｅｄ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｔａｇ，” ＰＮＡＳ １０６（９）： ３０００－３００５ （２００９）； Ａｇａｒｗａｌ，ｅｔ ａｌ．，”Ａ Ｐｉｃｔｅｔ－Ｓｐｅｎｇｌｅｒ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，” ＰＮＡＳ １１０（１）：４６－５１（２０１３）を参照）

【0125】

いくつかの例では、酵素触媒プロセスは、微生物トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）を含む。場合によっては、Ｂは、微生物トランスグルタミナーゼ触媒プロセスを利用してＡにコンジュゲートする。いくつかの例では、ｍＴＧは、認識配列内のグルタミンのアミド側鎖と機能化ポリ核酸分子の一級アミンとの間の共有結合の形成を触媒する。いくつかの例では、ｍＴＧはストレプトマイセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒｅｎｓｉｓ）から産生される。（Ｓｔｒｏｐ ｅｔ ａｌ．，“Ｌｏｃａｔｉｏｎ ｍａｔｔｅｒｓ： ｓｉｔｅ ｏｆ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，”Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０（２） １６１－１６７（２０１３）を参照）

【0126】

いくつかの例では、Ｂは、配列に特異的なトランスペプチダーゼを利用する、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１４／１４０３１７号に記載される方法によってＡにコンジュゲートする。

【0127】

いくつかの例では、Ｂは、米国特許出願公開第２０１５／０１０５５３９号および第２０１５／０１０５５４０号に記載されるような方法によってＡにコンジュゲートする。

【0128】

ペイロード
ポリ核酸分子
いくつかの実施形態では、ペイロードはポリ核酸分子である。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）または遺伝子発現抑制（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）治療などの遺伝子治療に関与する。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ｍＲＮＡのスプライシングを調節し、それによってコードされたタンパク質のその後の生成を調節する。

【0129】

いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、短干渉核酸（ｓｉＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む。

【0130】

他の実施形態では、ポリ核酸分子はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。

【0131】

いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子はＰＭＯを含む。

【0132】

さらなる実施形態では、ポリ核酸分子はｍＲＮＡを含む。

【0133】

いくつかの例では、ポリ核酸分子は、萎縮関連遺伝子（アトロジーンとも呼ばれる）の標的配列にハイブリダイズする。アトロジーン、すなわち、萎縮関連遺伝子は、委縮する筋肉でアップレギュレートまたはダウンレギュレートされる遺伝子である。いくつかの例では、アップレギュレートされたアトロジーンは、ユビキチンリガーゼ、フォークヘッドボックス転写因子、成長因子、脱ユビキチン化酵素、またはグルココルチコイドにより誘導された萎縮に関与するタンパク質をコードする遺伝子を含む。いくつかの例では、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ユビキチンリガーゼ（例えば、Ｅ３ユビキチンリガーゼまたはミトコンドリアユビキチンリガーゼ）の標的配列にハイブリダイズする。いくつかの例では、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、フォークヘッドボックス転写因子の標的配列にハイブリダイズする。いくつかの例では、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、成長因子の標的配列にハイブリダイズする。いくつかの例では、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、脱ユビキチン化酵素の標的配列にハイブリダイズする。

【0134】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＦＢＸＯ３２、ＴＲＩＭ６３、ＴＲＡＦ６、ＦＢＸＯ３０、ＦＢＸＯ４０、ＮＥＤＤ４、ＴＲＩＭ３２、ＭＵＬ１、ＳＴＵＢ１、ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＯ３、ＭＳＴＮ、ＵＳＰ１４、ＵＳＰ１９、ＤＤＩＴ４、ＣＴＳＬ２、ＴＧＩＦ、ＭＹＯＧ、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＭＴ１Ｌ、ＭＴ１Ｂ、またはＤＭＰＫの標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＦＢＸＯ３２、ＴＲＩＭ６３、ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＯ３、またはＭＳＴＮの標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＦＢＸＯ３２の標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＴＲＩＭ６３の標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＴＲＡＦ６の標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＦＢＸＯ３０の標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＦＢＸＯ４０の標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＮＥＤＤ４の標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＴＲＩＭ３２の標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＭＵＬ１の標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＳＴＵＢ１の標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＦＯＸＯ１の標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＦＯＸＯ３の標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＭＳＴＮの標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＵＳＰ１４の標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＵＳＰ１９の標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＤＤＩＴ４の標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＣＴＳＬ２の標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＴＧＩＦの標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＭＹＯＧの標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＨＤＡＣ２の標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＨＤＡＣ３の標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＭＴ１Ｌの標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＭＴ１Ｂの標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＤＭＰＫの標的配列にハイブリダイズする。

【0135】

いくつかの例では、ポリ核酸分子は、限定されないが、神経筋疾患、遺伝病、癌、遺伝性疾患、または心血管疾患などの疾患または障害をもたらす、誤ってスプライシングされたｍＲＮＡの標的領域をハイブリダイズする。場合によっては、神経筋疾患または障害は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、または筋緊張性ジストロフィーである。

【0136】

いくつかの例では、ポリ核酸分子は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを引き起こすＤＭＤ遺伝子中で突然変異するエクソンを標的とする。デュシェンヌ型筋ジストロフィーを引き起こすＤＭＤ遺伝子中で突然変異する例示的なエクソンとしては、限定されないが、エクソン、２、３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、および７８が挙げられる。

【0137】

いくつかの例では、ポリ核酸分子は、癌遺伝子の標的領域にハイブリダイズする。例示的な癌遺伝子としては、限定されないが、Ａｂｌ、ＡＫＴ－２、ＡＬＫ、ＡＭＬ１（または、ＲＵＮＸ１）、ＡＲ、ＡＸＬ、ＢＣＬ－２、３、６、ＢＲＡＦ、ｃ－ＭＹＣ、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ－２（Ｈｅｒ２、Ｎｅｕ）、Ｆｍｓ、ＦＯＳ、ＧＬＩ１、ＨＰＲＴ１、ＩＬ－３、ＩＮＴＳ２、ＪＵＮ、ＫＩＴ、ＫＳ３、Ｋ－ｓａｍ、ＬＢＣ（ＡＫＡＰ１３）、ＬＣＫ、ＬＭＯ１、ＬＭＯ２、ＬＹＬ１、ＭＡＳ１、ＭＤＭ２、ＭＥＴ、ＭＬＬ（ＫＭＴ２Ａ）、ＭＯＳ、ＭＹＢ、ＭＹＨ１１／ＣＢＦＢ、ＮＯＴＣＨ１（ＴＡＮ１）、ＮＴＲＫ１（ＴＲＫ）、ＯＳＴ（ＳＬＣ５１Ｂ）、ＰＡＸ５、ＰＩＭ１、ＰＲＡＤ－１、ＲＡＦ、ＲＡＲ／ＰＭＬ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＲＥＬ／ＮＲＧ、ＲＥＴ、ＲＯＳ、ＳＫＩ、ＳＲＣ、ＴＩＡＭ１、またはＴＳＣ２が挙げられる。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＫＲＡＳ、ＥＧＦＲ、ＡＲ、ＨＰＲＴ１、ＣＮＮＴＢ１（β－カテニン）、またはβ－カテニン関連遺伝子の標的領域にハイブリダイズするである。

【0138】

いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子はｍＲＮＡを含む。場合によっては、ｍＲＮＡは細胞傷害性のタンパク質またはペプチドをコードする。例示的な細胞傷害性のタンパク質またはペプチドとしては、α孔形成毒素（例えば、大腸菌由来の細胞溶解素Ａ）、β孔形成毒素（例えば、α－ヘモリジン、ＰＶＬ－パントンバレンタインロイコシジン、エアロライシン、クロストリジウムイプシロントキシン、クロストリジウムペルフリンゲンスエンテロトキシン）、二成分毒素（炭疽菌毒素、水腫菌毒素、クロストリジウム・ボツリヌムＣ２毒素、クロストリジウムスピロフォルム毒素、クロストリジウムペルフリンゲンスイオタ毒素、クロストリジウムディフィシル細胞致死毒素（ＡおよびＢ））、プリオン、パラスポリン、コレステロール依存性細胞溶解素（例えば、ニューモリシン）、小孔形成毒素（例えば、グラミシジンＡ）、シアノトキシン（例えば、ミクロシスチン、ノデュラリン）、ヘモトキシン、神経毒（例えば、ボツリヌス神経毒）、細胞毒素、コレラ毒素、ジフテリア毒素、シュードモナスエキソトキシンＡ、破傷風毒素、または免疫毒素（イダルビシン、リシンＡ、ＣＲＭ９、ポークウィード抗ウイルスタンパク質、ＤＴ）などの細菌性細胞毒素が挙げられる。

【0139】

いくつかの例では、ｍＲＮＡは、細胞傷害性ペプチド、または細胞傷害性Ｔ細胞あるいはＢ細胞エピトープなどの免疫系に関連するペプチドをコードして、ＭＨＣ Ｉ複合体、補体系の膜攻撃複合体タンパク質（ＭＡＣ）、パーフォリン、グランザイム、およびグラニュライシンとの当該エピトープの提示を介して特異的な免疫応答を刺激する。

【0140】

場合によっては、ｍＲＮＡは、アポトーシスプロテアーゼ活性化因子－１（Ａｐａｆ－１）、シトクロム－ｃ、カスパーゼイニシエータータンパク質（ＣＡＳＰ２、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＣＡＳＰ１０）、アポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）、ｐ５３、ｐ７３、ｐ６３、Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ、グランザイムＢ、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）、およびＰ２１活性化キナーゼ２（ＰＡＫ２）などのアポトーシス誘導タンパク質またはペプチドをコードする。

【0141】

いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は核酸デコイである。いくつかの例では、核酸デコイは、ＲＮＡベースのタンパク質結合模倣物などのタンパク質結合核酸の模倣物である。例示的な核酸デコイとしては、トランス活性化領域（ＴＡＲ）デコイおよびｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）デコイが挙げられる。

【0142】

いくつかの例では、ペイロードはアプタマーである。アプタマーは、特定の標的分子に結合する小さなオリゴヌクレオチドまたはペプチド分子である。例示的な核酸アプタマーは、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、または１つ以上の非天然ヌクレオチドを含むＲＮＡおよび／またはＤＮＡアプタマーであるＸＮＡアプタマーを含んでいる。例示的な核酸アプタマーとしては、ＡＲＣ１９４９９（Ａｒｃｈｅｍｉｘ Ｃｏｒｐ．）、ＲＥＧ１（Ｒｅｇａｄｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびＡＲＣ１９０５（Ｏｐｈｔｈｏｔｅｃｈ）が挙げられる。

【0143】

いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は天然または合成または人工のヌクレオチドアナログまたは塩基を含む。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはヌクレオチドのアナログの組み合わせを含む。いくつかの例では、合成または人工ヌクレオチドのアナログまたは塩基は、リボース部分、リン酸塩部分、ヌクレオシド部分、またはその組み合わせの１つ以上における修飾を含む。

【0144】

いくつかの実施形態では、ヌクレオチドアナログまたは人工ヌクレオチド塩基は、リボース部分の２’ヒドロキシル基における修飾を有する核酸を含む。いくつかの例では、修飾はＨ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、またはＣＮを含み、Ｒはアルキル部分である。例示的なアルキル部分としては、限定されないが、ハロゲン、硫黄、チオール、チオエーテル、チオエステル、アミン（一級、二級、または三級）、アミド、エーテル、エステル、アルコール、および酸素が挙げられる。いくつかの例では、アルキル部分はさらに修飾を含む。いくつかの例では、修飾はアゾ基、ケト基、アルデヒド基、カルボキシル基、ニトロ基、ニトロソ基、ニトリル基、複素環（例えば、イミダゾール、ヒドラジノ、またはヒドロキシルアミノ）基、イソシアネート基またはシアネート基、あるいは硫黄含有基（例えば、スルホキシド、スルホン、スルフィド、またはジスルフィド）を含む。いくつかの例では、アルキル部分はさらにヘテロ置換を含む。いくつかの例では、複素環式基の炭素は窒素、酸素、または硫黄によって置換される。いくつかの例では、複素環式置換は、限定されないが、モルホリノ、イミダゾール、および、ピロリジノを含む。

【0145】

いくつかの事例では、２’ヒドロキシル基での修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）修飾である。場合によっては、２’－Ｏ－メチル修飾は、メチル基をリボース部分の２’ヒドロキシル基に加え、一方で２’Ｏ－メトキシエチル修飾は、メトキシエチル基をリボース部分の２’ヒドロキシル基に加える。アデノシン分子の２’－Ｏ－メチル修飾およびウリジンの２’Ｏ－メトキシエチル修飾の典型的な化学構造が、以下に例証される。

【0146】

【化3】

【0147】

いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基での修飾は、プロピルリンカーを含む伸長したアミン基がアミン基を２’酸素に結合させる２’－Ｏ－アミノプロピル修飾である。いくつかの例では、この修飾は、１糖当たりアミン基から１つの正電荷を導入することによってオリゴヌクレオチド分子のリン酸塩由来の全体的な負電荷を中和し、それによって、その双性イオン特性による細胞取り込み特性を改善する。２’－Ｏ－アミノプロピルヌクレオシドホスホラミダイトの例示的な化学構造が、以下に例証される。

【0148】

【化4】

【0149】

いくつかの例では、２’ヒドロキシル基での修飾はロックドまたは架橋リボース修飾（例えば、ロックド核酸またはＬＮＡ）であり、ここで、２’炭素で結合された酸素分子はメチレン基によって４’炭素に連結され、これにより、２’－Ｃ，４’－Ｃ－オキシ－メチレン結合二環式リボヌクレオチド単量体を形成する。ＬＮＡの化学構造の例示的な表示が以下に例証される。左に示される表示は、ＬＮＡ単量体の化学結合性を強調している。右に示される表示は、ＬＮＡ単量体のフラノース環のロックド３’－ｅｎｄｏ（^３Ｅ）構造を強調している。

【0150】

【化5】

【0151】

いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基での修飾は、糖構造をＣ_３’－ｅｎｄｏ糖パッカリング構造（ｓｕｇａｒ ｐｕｃｋｅｒｉｎｇ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）へとロックする、例えば、２’－４’－エチレン架橋核酸などのエチレン核酸（ＥＮＡ）を含む。ＥＮＡは、ＬＮＡも含む修飾された核酸の架橋された核酸クラスの一部である。ＥＮＡおよび架橋された核酸の典型的な化学構造は、以下に例証される。

【0152】

【化6】

【0153】

いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基でのさらなる修飾は、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、または２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）を含む。

【0154】

いくつかの実施形態では、ヌクレオチドアナログは、修飾された塩基、例えば、限定されないが、５－プロピニルウリジン、５－プロピニルシチジン、６－メチルアデニン、６－メチルグアニン、Ｎ，Ｎ，－ジメチルアデニン、２－プロピルアデニン、２－プロピルグアニン、２－アミノアデニン、１－メチルイノシン、３－メチルウリジン、５－メチルシチジン、５－メチルウリジン、および、５位置に修飾を有する他のヌクレオチド、５－（２－アミノ）プロピルウリジン、５－ハロシチジン、５－ハロウリジン、４－アセチルシチジン、１－メチルアデノシン、２－メチルアデノシン、３－メチルシチジン、６－メチルウリジン、２－メチルグアノシン、７－メチルグアノシン、２，２－ジメチルグアノシン、５－メチルアミノエチルウリジン、５－メトキシウリジン、７－デアザ－アデノシンなどのデアザヌクレオチド、６－アゾウリジン、６－アゾシチジン、６－アゾチミジン、５－メチル－２－チオウリジン、他のチオ塩基、例えば、２－チオウリジンと４－チオウリジン、および２－チオシチジン、ジヒドロウリジン、プソイドウリジン、キューオシン、アルカエオシン、ナフチルおよび置換されたナフチル基、任意のＯアルキル化およびＮアルキル化プリンおよびピリミジン、例えば、Ｎ６－メチルアデノシン、５－メチルカルボニルメチルウリジン、ウリジン ５－オキシ酢酸、ピリジン－４－オン、ピリジン－２－オン、フェニルおよび修飾フェニル基、例えば、アミノフェノールまたは２，４，６－トリメトキシベンゼン、Ｇクランプヌクレオチドとして作用する修飾されたシトシン、８－置換されたアデニンおよびグアニン、５－置換されたウラシルおよびチミン、アザピリミジン、カルボキシヒドロキシアルキルヌクレオチド、カルボキシアルキルアミノアルキルヌクレオチド、および、アルキルカルボニルアルキル化ヌクレオチドを含む。修飾されたヌクレオチドはさらに、リボシルではない糖またはそのアナログを有するヌクレオチドと同様に、糖部に対して修飾されるヌクレオチドを含む。例えば、糖部は、場合によっては、マンノース、アラビノース、グルコピラノース、ガラクトピラノース、４’－チオリボース、および、その他の糖類、複素環、または炭素環であるか、または、これらがベースである。ヌクレオチドという用語はさらに、普遍的な塩基として当該技術分野で知られているものを含む。一例として、普遍的な塩基は、限定されないが、３－ニトロピロール、５－ニトロインドール、またはネブラリンを含む。

【0155】

いくつかの実施形態では、ヌクレオチドアナログは、モルホリノ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイト、１’，５’－アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、またはその組み合わせをさらに含む。モルホリノまたはホスホロジアミデートモルホリノオリゴ（ＰＭＯ）は合成分子を含み、その構造は、正常な糖およびリン酸塩構造からの逸脱によって天然の核酸構造を模倣している。いくつかの例では、５員のリボース環は、４つの炭素、１つの窒素、および１つの酸素を含有している６員のモルホリノ環で置換される。場合によっては、リボース単量体は、リン酸基の代わりにホスホロジアミデート基によって結合する。場合によっては、骨格の変質はすべての正電荷と負電荷を取り除き、モルホリノ中性分子は、荷電オリゴヌクレオチドで使用されるような細胞送達剤の助けを借りることなく細胞膜を通過できるようになる。

【0156】

【化7】

【0157】

いくつかの実施形態では、ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、糖環もリン酸塩結合も含まず、塩基は結合し、オリゴグリシン様分子によって適切に間隔を置かれ、そうすることで骨格電荷を除去する。

【0158】

【化8】

【0159】

いくつかの実施形態では、１つ以上の修飾が随意にヌクレオチド間結合で生じる。いくつかの例では、修飾されたヌクレオチド間結合は、限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、５’－アルキレンホスホネート、５’－メチルホスホネート、３’－アルキレンホスホネート、三フッ化ホウ素（ｂｏｒｏｎｔｒｉｆｌｕｏｒｉｄａｔｅｓ）、３’－５’結合または２’－５’結合のボラノリン酸エステルおよびセレノホスフェート、ホスホトリエステル、チオノアルキルホスホトリエステル、水素ホスホネート結合、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、アリールホスホノチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスフィネート、ホスホルアミデート、３’－アルキルホスホルアミデート、ホスホロピペラジデート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ケトン、スルホン、スルホンアミド、カルボネート、カルバメート、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、チオアミデート、リボアセチル基との結合、アミノエチルグリシン、シリル、またはシロキサン結合、例えば、飽和または不飽和の、および／または、置換された、および／またはヘテロ原子を含む１～１０の炭素のヘテロ原子を含むまたは含まないアルキルまたはシクロアルキル結合、塩基が骨格のアザ窒素に直接的または間接的に結合しているモルホリノ構造、アミド、またはポリアミドとの結合、および、これらの組み合わせを含む。ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＰＳ ＡＳＯ）は、ホスホロチオエート結合を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。例示的なＰＳ ＡＳＯが以下に例証される。

【0160】

【化9】

【0161】

いくつかの例では、修飾は、メチルホスホネート修飾またはチオールホスホネート修飾などのメチル修飾またはチオール修飾である。例示的なチオールホスホネートヌクレオチド（左）およびメチルホスホネートヌクレオチド（右）が、以下に例証される。

【0162】

【化10】

【0163】

いくつかの例では、修飾されたヌクレオチドは、限定されないが、以下のように例証される２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイトを含む：

【0164】

【化11】

【0165】

いくつかの例では、修飾されたヌクレオチドは、限定されないが、以下のように例証されるヘキシトール核酸（または、１’、５’－アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ））を含む：

【0166】

【化12】

【0167】

いくつかの実施形態では、上記のヌクレオチドアナログまたは人工ヌクレオチド塩基は、リボース部分の５’ヒドロキシル基における修飾を有する５’－ビニルホスホネート修飾ヌクレオチド核酸を含む。いくつかの実施形態では、５’－ビニルホスホネート修飾ヌクレオチドは、以下から提供されたヌクレオチドから選択され、式中、ＸはＯまたはＳであり、および、Ｂは複素環式塩基部分である。

【0168】

【化13】

【0169】

いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基での修飾は、プロピルリンカーを含む伸長したアミン基がアミン基を２’酸素に結合させる、２’－Ｏ－アミノプロピル修飾である。いくつかの例では、この修飾は、１糖当たりアミン基から１つの正電荷を導入することによってオリゴヌクレオチド分子のリン酸塩由来の全体的な負電荷を中和し、それによって、その双性イオン特性による細胞取り込み特性を改善する。

【0170】

いくつかの例では、５’－ビニルホスホネートはロックドまたは架橋リボース修飾（例えば、ロックド核酸またはＬＮＡ）でさらに修飾され、ここで、２’炭素で結合された酸素分子はメチレン基によって４’炭素に結合され、それにより、２’－Ｃ、４’－Ｃ－オキシ－メチレン結合二環式リボヌクレオチド単量体を形成する。５’－ビニルホスホネート修飾されたＬＮＡの化学構造の例示的な表現が以下に例示され、式中、ＸはＯまたはＳであり、Ｂは複素環式塩基部分であり、および、Ｊは、ポリヌクレオチドの隣接するヌクレオチドに結合するヌクレオチド間結合基である。

【0171】

【化14】

【0172】

いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基でのさらなる修飾は、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、または２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）を含む。

【0173】

いくつかの実施形態では、ヌクレオチドアナログは、修飾塩基、例えば、限定されないが、５－プロピニルウリジン、５－プロピニルシチジン、６－メチルアデニン、６－メチルグアニン、Ｎ，Ｎ，－ジメチルアデニン、２－プロピルアデニン、２－プロピルグアニン、２－アミノアデニン、１－メチルイノシン、３－メチルウリジン、５－メチルシチジン、５－メチルウリジン、および、５位置に修飾を有する他のヌクレオチド、５－（２－アミノ）プロピルウリジン、５－ハロシチジン、５－ハロウリジン、４－アセチルシチジン、１－メチルアデノシン、２－メチルアデノシン、３－メチルシチジン、６－メチルウリジン、２－メチルグアノシン、７－メチルグアノシン、２，２－ジメチルグアノシン、５－メチルアミノエチルウリジン、５－メトキシウリジン、デアザヌクレオチド（７－デアザ－アデノシン、６－アゾウリジン、６－アゾシチジン、または６－アゾチミジンなど）、５－メチル－２－チオウリジン、他のチオ塩基（２－チオウリジン、４－チオウリジン、および２－チオシチジンなど）、ジヒドロウリジン、プソイドウリジン、キューオシン、アルカエオシン、ナフチルおよび置換されたナフチル基、任意のＯアルキル化およびＮアルキル化プリンおよびピリミジン（例えば、Ｎ６－メチルアデノシン、５－メチルカルボニルメチルウリジン、ウリジン ５－オキシ酢酸、ピリジン－４－オン、またはピリジン－２－オン）、フェニルおよび修飾フェニル基、例えば、アミノフェノールまたは２，４，６－トリメトキシベンゼン、Ｇクランプヌクレオチドとして作用する修飾されたシトシン、８－置換されたアデニンおよびグアニン、５－置換されたウラシルおよびチミン、アザピリミジン、カルボキシヒドロキシアルキルヌクレオチド、カルボキシアルキルアミノアルキルヌクレオチド、および、アルキルカルボニルアルキル化ヌクレオチドを含む。５’－ビニルホスホネート修飾されたヌクレオチドはさらに、リボシルではない糖またはそのアナログを有する５’－ビニルホスホネート修飾されたヌクレオチドと同様に、糖部に対して修飾されるこれらのヌクレオチドを含む。例えば、糖部は、場合によっては、マンノース、アラビノース、グルコピラノース、ガラクトピラノース、４’－チオリボース、および、その他の糖類、複素環、または炭素環であるか、あるいは、これらがベースである。ヌクレオチドという用語はさらに、普遍的な塩基として当該技術分野で知られているものを含む。一例として、普遍的な塩基は、限定されないが、３－ニトロピロール、５－ニトロインドール、またはネブラリンを含む。

【0174】

いくつかの実施形態では、５’－ビニルホスホネート修飾されたヌクレオチドアナログはさらに、モルホリノ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、２’－フルオロＮ３－Ｐ５’ホスホラミダイト、または１’，５’－アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）を含む。モルホリノまたはホスホロジアミデートモルホリノオリゴ（ＰＭＯ）は合成分子を含み、その構造は、天然の核酸構造を模倣しているが、正常な糖とリン酸塩の構造からは逸脱している。いくつかの例では、５員のリボース環は、４つの炭素、１つの窒素、および１つの酸素を含有している６員のモルホリノ環で置換される。場合によっては、リボース単量体は、リン酸基の代わりにホスホロジアミデート基によって結合する。場合によっては、骨格の変質はすべての正電荷と負電荷を取り除き、モルホリノ中性分子は、荷電オリゴヌクレオチドで使用されるような細胞送達剤の助けを借りることなく細胞膜を通過できるようになる。５’－ビニルホスホネート修飾されたモルホリノオリゴヌクレオチドの非限定的な例が以下に例証され、式中、ＸはＯまたはＳであり、および、Ｂは複素環式塩基部分である。

【0175】

【化15】

【0176】

いくつかの実施形態では、上に記載された５’－ビニルホスホネート修飾されたモルホリノまたはＰＭＯは、正電荷またはカチオン電荷を含むＰＭＯである。いくつかの例では、ＰＭＯはＰＭＯｐｌｕｓ（Ｓａｒｅｐｔａ）である。ＰＭＯｐｌｕｓは、任意の数の（１－ピペラジノ）ホスフィニリデンデオキシ（ｐｈｏｓｐｈｉｎｙｌｉｄｅｎｅｏｘｙ）、（１－（４－（オメガ－グアニジノ－アルカノイル））－ピペラジノ）ホスフィニリデンデオキシ結合（例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２００８／０３６１２７号に記載されるものなど）を含むホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーを指す。いくつかの例では、ＰＭＯは、米国特許第７９４３７６２号に記載されるＰＭＯである。

【0177】

いくつかの実施形態では、上に記載されたモルホリノまたはＰＭＯはＰＭＯ－Ｘ（Ｓａｒｅｐｔａ）である。場合によっては、ＰＭＯ－Ｘは、少なくとも１つの結合、または、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１１／１５０４０８号と米国出願公開第２０１２／００６５１６９号に記載されるものなどの開示された末端修飾の少なくとも１つを含むホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーを指す。

【0178】

いくつかの実施形態では、上に記載されたモルホリノまたはＰＭＯは、米国出願公開第２０１４／０２９６３２１号の表５に記載されるようなＰＭＯである。

【0179】

５’－ビニルホスホネート修飾された核酸の化学構造の例示的な表現が以下に例示され、式中、ＸはＯまたはＳであり、Ｂは複素環式塩基部分であり、および、Ｊはヌクレオチド間結合である。

【0180】

【化16】

【0181】

いくつかの実施形態では、ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、糖環もリン酸塩結合も含まず、塩基は結合し、オリゴグリシン様分子によって適切に間隔を置かれ、そうすることで骨格電荷を除去する。

【0182】

【化17】

【0183】

いくつかの実施形態では、５’－ビニルホスホネート修飾されたオリゴヌクレオチドの１つ以上の修飾は、ヌクレオチド間結合で随意に生じる。いくつかの例では、修飾されたヌクレオチド間結合は、限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、５’－アルキレンホスホネート、５’－メチルホスホネート、３’－アルキレンホスホネート、三フッ化ホウ素、３’－５’結合または２’－５’結合のボラノリン酸エステルとセレノホスフェート、ホスホトリエステル、チオノアルキルホスホトリエステル、水素ホスホネート結合、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、アリールホスホノチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスフィネート、ホスホルアミデート、３’－アルキルホスホルアミデート、アミノアルキルホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、ホスホロピペラジデート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ケトン、スルホン、スルホンアミド、カーボネート、カルバメート、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、チオアミデート、リボアセチル基との結合、アミノエチルグリシン、シリルまたはシロキサン結合、例えば、飽和または不飽和の、および／または、置換された、および／またはヘテロ原子を含む１～１０の炭素のヘテロ原子を含むまたは含まないアルキルまたはシクロアルキル結合、塩基が骨格のアザ窒素に直接的または間接的に結合しているモルホリノ構造、アミド、またはポリアミドとの結合、および、これらの組み合わせを含む。

【0184】

いくつかの例では、修飾は、メチルホスホネート修飾またはチオールホスホネート修飾などのメチル修飾またはチオール修飾である。例示的なチオールホスホネートヌクレオチド（左）、ホスホロジチオエート（中）、およびメチルホスホネートヌクレオチド（右）が、以下に例証される。

【0185】

【化18】

【0186】

いくつかの例では、５’－ビニルホスホネート修飾されたヌクレオチドは、限定されないが、以下として例示されるホスホラミダイトを含む。

【0187】

【化19】

【0188】

いくつかの例では、修飾されたヌクレオチド間結合はホスホロジアミデート結合である。モルホリノ系とのホスホロジアミデート結合の非限定的な例が以下に示される。

【0189】

【化20】

【0190】

いくつかの例では、修飾されたヌクレオチド間結合はメチルホスホネート結合である。メチルホスホネート結合の非限定的な例が以下に示される。

【0191】

【化21】

【0192】

いくつかの例では、修飾されたヌクレオチド間結合はアミド結合である。アミド結合の非限定的な例が以下に示される。

【0193】

【化22】

【0194】

いくつかの例では、５’－ビニルホスホネート修飾されたヌクレオチドは、限定されないが、以下に例示される修飾された核酸を含む。

【0195】

いくつかの実施形態では、１つ以上の修飾は、修飾が中性または非荷電の骨格を生成する、修飾リン酸骨格を含む。いくつかの例では、リン酸骨格は、非荷電または中性のリン酸骨格を生成するアルキル化によって修飾される。本明細書で使用されるように、アルキル化は、メチル化、エチル化、およびプロピル化を含む。場合によっては、アルキル基は、アルキル化の文脈において本明細書で使用されるように、１～６の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素基を指す。いくつかの例では、例示的なアルキル基としては、限定されないが、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、１，１－ジメチルブチル、２，２－ジメチルブチル、３．３－ジメチルブチル、および２－エチルブチルの基が挙げられる。場合によっては、修飾リン酸は、米国特許第９４８１９０５号に記載されるリン酸基である。

【0196】

いくつかの実施形態では、さらなる修飾リン酸骨格は、メチルホスホネート、エチルホスホネート、メチルチオホスホネート、またはメトキシホスホネートを含む。場合によっては、修飾リン酸はメチルホスホネートである。場合によっては、修飾リン酸はエチルホスホネートである。場合によっては、修飾リン酸はメチルチオホスホネートである。場合によっては、修飾リン酸はメトキシホスホネートである。

【0197】

いくつかの実施形態では、１つ以上の修飾はさらに、リボース部分、リン酸骨格、およびヌクレオシドの修飾、あるいは３’または５’末端のヌクレオチドアナログの修飾を含む。例えば、３’末端は、随意に、または、３’－３’結合で３’－末端でヌクレオシドを反転させることによって、３’カチオン基を含む。別の代替物では、３’－末端は随意に、アミノアルキル基、例えば、３’Ｃ５－アミノアルキルｄＴとコンジュゲートする。追加の代替物では、３’－末端は随意に、脱塩基部位、例えば、アプリン酸またはアピリミジン酸部位とコンジュゲートする。いくつかの例では、５’－末端は、アミノアルキル基、例えば、５’－Ｏ－アミノアルキル置換基とコンジュゲートする。場合によっては、５’－末端は、脱塩基部位、例えば、アプリン酸またはアピリミジン酸部位とコンジュゲートする。

【0198】

いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログの１つ以上を含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、本明細書に記載される人工ヌクレオチドアナログの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２５、またはそれ以上を含む。いくつかの実施形態では、人工ヌクレオチドアナログは、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、または、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイト、あるいはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、または、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイト、あるいはこれらの組み合わせから選択された、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２５、またはそれ以上の人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２５、またはそれ以上の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２５、またはそれ以上の２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２５、またはそれ以上のチオールホスホネートヌクレオチドを含む。

【0199】

いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、複数のホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーまたは複数のペプチド核酸修飾非天然ヌクレオチドを含み、および、少なくとも１つの逆位脱塩基部分を随意に含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー修飾非天然ヌクレオチドを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、１００％ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー修飾非天然ヌクレオチドを含む。

【0200】

いくつかの例では、ポリ核酸分子は、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のペプチド核酸修飾非天然ヌクレオチドを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、１００％ペプチド核酸修飾非天然ヌクレオチドを含む。

【0201】

いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、各ヌクレオチドアナログが立体化学的に異性型である１つ以上のヌクレオチドアナログを含む。そのような例では、ポリ核酸分子はキラル分子である。場合によっては、ヌクレオチドアナログは骨格立体化学を含む。さらなる場合には、ヌクレオチドアナログは、米国特許第９，９８２，２５７号、第９，６９５，２１１号、または第９，６０５，０１９号に記載されるようなキラルアナログを含む。

【0202】

いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約５％～約１００％の修飾、約１０％～約１００％の修飾、約２０％～約１００％の修飾、約３０％～約１００％の修飾、約４０％～約１００％の修飾、約５０％～約１００％の修飾、約６０％～約１００％の修飾、約７０％～約１００％の修飾、約８０％～約１００％の修飾、および、約９０％～約１００％の修飾の少なくとも１つを含む。

【0203】

場合によっては、ポリ核酸分子は、約１０％～約９０％の修飾、約２０％～約９０％の修飾、約３０％～約９０％の修飾、約４０％～約９０％の修飾、約５０％～約９０％の修飾、約６０％～約９０％の修飾、約７０％～約９０％の修飾、および、約８０％～約１００％の修飾の少なくとも１つを含む。

【0204】

場合によっては、ポリ核酸分子は、約１０％～約８０％の修飾、約２０％～約８０％の修飾、約３０％～約８０％の修飾、約４０％～約８０％の修飾、約５０％～約８０％の修飾、約６０％～約８０％の修飾、および、約７０％～約８０％の修飾の少なくとも１つを含む。

【0205】

いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１０％～約７０％の修飾、約２０％～約７０％の修飾、約３０％～約７０％の修飾、約４０％～約７０％の修飾、約５０％～約７０％の修飾、および、約６０％～約７０％の修飾の少なくとも１つを含む。

【0206】

いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１０％～約６０％の修飾、約２０％～約６０％の修飾、約３０％～約６０％の修飾、約４０％～約６０％の修飾、および約５０％～約６０％の修飾の少なくとも１つを含む。

【0207】

場合によっては、ポリ核酸分子は、約１０％～約５０％の修飾、約２０％～約５０％の修飾、約３０％～約５０％の修飾、および約４０％～約５０％の修飾の少なくとも１つを含む。

【0208】

場合によっては、ポリ核酸分子は、約１０％～約４０％の修飾、約２０％～約４０％の修飾、および約３０％～約４０％の修飾の少なくとも１つを含む。

【0209】

場合によっては、ポリ核酸分子は、約１０％～約３０％の修飾、および約２０％～約３０％の修飾の少なくとも１つを含む。

【0210】

場合によっては、ポリ核酸分子は、約１０％～約２０％の修飾を含む。

【0211】

場合によっては、ポリ核酸分子は、約１５％～約９０％、約２０％～約８０％、約３０％～約７０％、または約４０％～約６０％の修飾を含む。

【0212】

さらなる場合には、ポリ核酸分子は、少なくとも約１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の修飾を含む。

【0213】

いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、またはそれ以上の修飾を含む。

【0214】

いくつかの例では、ポリ核酸分子は、少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、またはそれ以上の修飾されたヌクレオチドを含む。

【0215】

いくつかの例では、約５～約１００％のポリ核酸分子は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約１０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約１５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約２０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約２５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約３０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約３５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約４０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約４５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約５０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約５５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約６０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約６５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約７０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約７５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約８０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約８５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約９０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約９５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約９６％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約９７％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約９８％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約９９％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約１００％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、人工ヌクレオチドアナログは、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、または、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイト、またはこれらの組み合わせを含む。

【0216】

いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は約１～約２５の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は約１の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は約２の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は約３の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は約４の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は約５の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は約６の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は約７の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は約８の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は約９の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は約１０の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は約１１の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は約１２の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は約１３の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は約１４の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は約１５の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は約１６の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は約１７の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は約１８の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は約１９の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は約２０の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は約２１の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は約２２の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は約２３の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は約２４の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は約２５の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。

【0217】

いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は２つの別個のポリヌクレオチドから組み立てられ、ここで、１つのポリヌクレオチドはセンス鎖を含み、第２のポリヌクレオチドはポリ核酸分子のアンチセンス鎖を含む。他の実施形態では、センス鎖はリンカー分子によってアンチセンス鎖に接続され、これは、いくつかの例では、ポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーである。

【0218】

いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、センス鎖中のピリミジンヌクレオチドは２’－Ｏ－メチルピリミジンヌクレオチドを含み、センス鎖中のプリンヌクレオチドは２’－デオキシプリンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、センス鎖中に存在するピリミジンヌクレオチドは２’－デオキシ－２’－フルオロピリミジンヌクレオチドを含み、センス鎖中に存在するプリンヌクレオチドは２’－デオキシプリンヌクレオチドを含む。

【0219】

いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、ピリミジンヌクレオチドは、前記アンチセンス鎖中に存在する場合、２’－デオキシ－２’－フルオロピリミジンヌクレオチドであり、プリンヌクレオチドは前記アンチセンス鎖中に存在する場合、２’－Ｏ－メチルプリンヌクレオチドである。

【0220】

いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、ピリミジンヌクレオチドは、前記アンチセンス鎖中に存在する場合、２’－デオキシ－２’－フルオロピリミジンヌクレオチドであり、プリンヌクレオチドは前記アンチセンス鎖中に存在する場合、２’－デオキシ－プリンヌクレオチドを含む。

【0221】

いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、センス鎖は、センス鎖の５’－末端、３’－末端、または５’と３’の末端の両方で末端キャップ部分を含む。他の実施形態では、末端キャップ部分は逆位デオキシ脱塩基部分である。

【0222】

いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖はアンチセンス鎖の３’末端にリン酸塩骨格修飾を含む。いくつかの例では、リン酸骨格修飾は、ホスホロチオエートである。場合によっては、パッセンジャー鎖は、ガイド鎖よりも多くのホスホロチオエート修飾を含む。他の場合では、ガイド鎖は、パッセンジャー鎖よりも多くのホスホロチオエート修飾を含む。さらなる場合には、パッセンジャー鎖は、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のホスホロチオエート修飾を含む。さらなる場合には、ガイド鎖は、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のホスホロチオエート修飾を含む。

【0223】

いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖はアンチセンス鎖の３’末端にグリセリル修飾を含む。

【0224】

いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、センス鎖は、１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ－２’－フルオロ、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にセンス鎖の３’－末端、５’－末端、あるいは３’－と５’－の末端の両方の末端キャップ分子を含み、および、アンチセンス鎖は、約１～約１０またはそれ以上の、とりわけ、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１つ以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ－２’－フルオロ、および／または、１つ以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にアンチセンス鎖の３’－末端、５’－末端、あるいは３’－と５’－の末端の両方の末端キャップ分子を含む。他の実施形態では、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の１つ以上の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のピリミジンヌクレオチドは、２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、および／または２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチドを用いて、あるいは１つ以上の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、同じあるいは異なる鎖に存在する３’－末端、５’－末端、あるいは３’－と５’－の末端の両方の末端キャップ分子を用いて、または、用いずに、化学修飾される。

【0225】

いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、センス鎖は、約１～約２５、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ－２’－フルオロ、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にセンス鎖の３’－末端、５’－末端、あるいは３’－と５’－の末端の両方の末端キャップ分子を含み、および、アンチセンス鎖は、約１～約２５またはそれ以上の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１つ以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ－２’－フルオロ、および／または、１つ以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にアンチセンス鎖の３’－末端、５’－末端、あるいは３’－と５’－の末端の両方の末端キャップ分子を含む。他の実施形態では、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の１つ以上の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のピリミジンヌクレオチドは、２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、および／または２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチドを用いて、約１～約２５またはそれ以上の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、同じあるいは異なる鎖に存在する３’－末端、５’－末端、あるいは３’－と５’－の末端の両方の末端キャップ分子を用いて、または、用いずに、化学修飾される。

【0226】

いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖は、１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、約１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ－２’－フルオロ、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にセンス鎖の３’－末端、５’－末端、あるいは３’－と５’－の末端の両方の末端キャップ分子を含み、および、アンチセンス鎖は、約１～約１０またはそれ以上の、とりわけ、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ－２’－フルオロ、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にアンチセンス鎖の３’－末端、５’－末端、あるいは３’－と５’－の末端の両方の末端キャップ分子を含む。他の実施形態では、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のピリミジンヌクレオチドは、２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、および／または２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチドを用いて、１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、同じあるいは異なる鎖に存在する３’－末端、５’－末端、あるいは３’と５’－の末端の両方の末端キャップ分子を用いて、または、用いずに、化学修飾される。

【0227】

いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖は、約１～約２５またはそれ以上の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ－２’－フルオロ、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にセンス鎖の３’－末端、５’－末端、あるいは３’－と５’－の末端の両方の末端キャップ分子を含み、および、アンチセンス鎖は、約１～約２５またはそれ以上の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ－２’－フルオロ、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にアンチセンス鎖の３’－末端、５’－末端、あるいは３’－と５’－の末端の両方の末端キャップ分子を含む。他の実施形態では、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のピリミジンヌクレオチドは、２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、および／または２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチドを用いて、約１～約５、例えば、約１、２、３、４、５またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、同じあるいは異なる鎖に存在する３’－末端、５’－末端、あるいは３’－と５’－の末端の両方の末端キャップ分子を用いて、または、用いずに、化学修飾される。

【0228】

いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、以下の特性：高い肝細胞安定性、全体的な電荷の減少、肝細胞の取り込みの減少、または薬物動態の拡張の１つ以上を有する二重鎖ポリ核酸分子である。いくつかの実施形態では、二重鎖ポリ核酸分子は、複数の修飾を含むパッセンジャー鎖（例えば、センス鎖）とガイド鎖（例えば、アンチセンス鎖）を含む。

【0229】

いくつかの実施形態では、二重鎖ポリ核酸分子は、上に記載された修飾の１つ以上を有するガイド鎖（例えば、アンチセンス鎖）、および複数のホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーまたは複数のペプチド核酸修飾非天然ヌクレオチドを有するパッセンジャー鎖（例えば、センス鎖）を含む。

【0230】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ポリ核酸分子の各鎖において、約１～約２５、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する化学修飾された短干渉核酸分子である。

【0231】

別の実施形態では、本明細書に記載されるポリ核酸分子は２’－５’ヌクレオチド間結合を含む。いくつかの例では、２’－５’ヌクレオチド間結合は、一方または両方の配列鎖の３’－末端、５’－末端、あるいは３’－末端と５’－末端の両方にある。さらなる例では、２’－５’ヌクレオチド間結合は、一方または両方の配列鎖内の様々な他の位置に存在し、例えば、ポリ核酸分子の一方または両方の鎖中のピリミジンヌクレオチドのすべてのヌクレオチド間結合を含む約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上は、２’－５’ヌクレオチド間結合を含み、あるいは、ポリ核酸分子の一方または両方の鎖中にプリンヌクレオチドのすべてのヌクレオチド間結合を含む約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上は、２’－５’ヌクレオチド間結合を含む。

【0232】

場合によっては、ポリ核酸分子は、自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域を有する、二重の、非対称的で二重の、ヘアピン型の、または非対称的なヘアピン型の二次構造を有するポリヌクレオチドであり、ここで、アンチセンス領域は、別の標的核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。他の場合には、ポリ核酸分子は、２つ以上のループ構造と、自己相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を含む基部とを有する、環状の単鎖ポリヌクレオチドであり、ここで、アンチセンス領域は、標的核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有し、環状ポリヌクレオチドは、ＲＮＡｉを媒介することが可能な活性なポリ核酸分子を生成するためにインビボまたはインビトロで処理される。さらなる場合には、ポリ核酸分子はさらに、標的核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する単鎖ポリヌクレオチドを含み（例えば、そのようなポリ核酸分子は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列のポリ核酸分子内に存在することを必要としない）、単鎖ポリヌクレオチドはさらに、５’－ホスフェート（例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃｅｌｌ．，１１０，５６３－５７４と、Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，１０，５３７－５６８を参照）または５’，３’－ジホスフェートなどの末端リン酸基を含む。

【0233】

いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、細胞または再構成されたインビトロ系でＲＮＡｉ活性を媒介する単鎖ポリ核酸分子であり、ここで、ポリ核酸分子は、標的核酸配列に対する相補性を有する単鎖ポリヌクレオチドを含み、および、ポリ核酸中に存在する１つ以上のピリミジンヌクレオチドは、２’－デオキシ－２’－フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば、ここで、ピリミジンヌクレオチドはすべて２’－デオキシ－２’－フルオロピリミジンヌクレオチドであり、または、代替的に、複数のピリミジンヌクレオチドは２’－デオキシ－２’－フルオロピリミジンヌクレオチドであり）、および、ポリ核酸中に存在する任意のプリンヌクレオチドは、２’－デオキシプリンヌクレオチドであり（例えば、すべてのプリンヌクレオチドは２’－デオキシプリンヌクレオチドであり、または、代替的に、複数のプリンヌクレオチドは２’－デオキシプリンヌクレオチドであり）、ならびに、末端キャップ修飾は、アンチセンス配列の３’－末端、５’－末端、あるいは３’と５’－末端の両方で随意に存在し、ポリ核酸分子は随意に、ポリ核酸分子の３’末端に約１～約４（例えば、約１、２、３、または４）の末端２’－デオキシリボヌクレオチドをさらに含み、ここで、末端のヌクレオチドはさらに、１つ以上（例えば、１、２、３、または４）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、および、ポリ核酸分子は随意に、５’－末端リン酸基などの末端リン酸基をさらに含む。

【0234】

いくつかの例では、非対称の二重鎖は、アンチセンス領域と、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含むループ部分と、センス領域とを含む線形のポリ核酸分子であり、センス領域は、アンチセンス領域と塩基対をなし、ループを有する二重鎖を形成するのに十分な相補的なヌクレオチドを有する程度には、アンチセンス領域よりも少ないヌクレオチドを含む。例えば、非対称的なヘアピン型のポリ核酸分子は、細胞またはインビトロ系でＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さを有し、かつ、約４～約８のヌクレオチドを含むループ領域を有するアンチセンス領域（例えば、約１９～約２２ヌクレオチド）と、アンチセンス領域に相補的な約３～約１８のヌクレオチドを有するセンス領域とを含む。場合によっては、非対称的なヘアピン型のポリ核酸分子はさらに、化学修飾された５’末端リン酸基を含む。さらなる場合には、非対称的なヘアピン型のポリ核酸分子のループ部分は、ヌクレオチド、非ヌクレオチド、リンカー分子、またはコンジュゲート分子を含む。

【0235】

いくつかの実施形態において、非対称的な二重鎖は、センス領域およびアンチセンス領域を含む２つの別々の鎖を有するポリ核酸分子であり、センス領域は、アンチセンス領域と塩基対をなし、二重鎖を形成するのに十分な相補的なヌクレオチドを有する程度には、アンチセンス領域よりも少ないヌクレオチドを含む。例えば、非対称的な二重ポリ核酸分子は、細胞またはインビトロ系でＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さを有するアンチセンス領域（例えば、約１９～約２２のヌクレオチド）と、アンチセンス領域に相補的な約３～約１８のヌクレオチドを有するセンス領域とを含む。

【0236】

場合によっては、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログの１つ以上は、天然のポリ核酸分子と比較して、例えば、ＲＮａｓｅ Ｈなどのリボヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅなどのデオキシリボヌクレアーゼ、または、５’－３’エキソヌクレアーゼおよび３’－５’エキソヌクレアーゼなどのエキソヌクレアーゼ等のヌクレアーゼに対する耐性を有する。いくつかの例では、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、または、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイト、あるいは、これらの組み合わせを含む人工ヌクレオチドアナログは、ＲＮａｓｅ Ｈなどのリボヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅなどのデオキシリボヌクレアーゼ、または、５’－３’エキソヌクレアーゼおよび３’－５’エキソヌクレアーゼなどのエキソヌクレアーゼ等のヌクレアーゼに対する耐性を有する。いくつかの例では、２’－Ｏ－メチル修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、または３’－５’エキソヌクレアーゼ耐性）である。いくつかの例では、２’Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、または３’－５’エキソヌクレアーゼ耐性）である。いくつかの例では、２’－Ｏ－アミノプロピル修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、または３’－５’エキソヌクレアーゼ耐性）である。いくつかの例では、２’－デオキシ修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、または３’－５’エキソヌクレアーゼ耐性）である。いくつかの例では、Ｔ－デオキシ－２’－Ｏ－フルオロ修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、または３’－５’エキソヌクレアーゼ耐性）である。いくつかの例では、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、または３’－５’エキソヌクレアーゼ耐性）である。いくつかの例では、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、または３’－５’エキソヌクレアーゼ耐性）である。いくつかの例では、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、または３’－５’エキソヌクレアーゼ耐性）である。いくつかの例では、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、または３’－５’エキソヌクレアーゼ耐性）である。いくつかの例では、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、または３’－５’エキソヌクレアーゼ耐性）である。いくつかの例では、ＬＮＡ修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、または３’－５’エキソヌクレアーゼ耐性）である。いくつかの例では、ＥＮＡ修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、または３’－５’エキソヌクレアーゼ耐性）である。いくつかの例では、ＨＮＡ修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、または３’－５’エキソヌクレアーゼ耐性）である。いくつかの例では、モルホリノは、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、または３’－５’エキソヌクレアーゼ耐性）である。いくつかの例では、ＰＮＡ修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼに対する耐性を有する（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、または３’－５’エキソヌクレアーゼ耐性）。いくつかの例では、メチルホスホネートヌクレオチド修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、または３’－５’エキソヌクレアーゼ耐性）である。いくつかの例では、チオールホスホネートヌクレオチド修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、または３’－５’エキソヌクレアーゼ耐性）である。いくつかの例では、２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイトを含むポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、または３’－５’エキソヌクレアーゼ耐性）である。いくつかの例では、本明細書に記載された５’コンジュゲートは、５’－３’エキソヌクレアーゼ切断を阻害する。いくつかの例では、本明細書に記載された３’コンジュゲートは、３’－５’エキソヌクレアーゼ切断を阻害する。

【0237】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログの１つ以上は、同等の天然ポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させている。２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、または、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、または２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイトを含む人工ヌクレオチドアナログの１つ以上は、同等の天然ポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させている。いくつかの例では、２’－Ｏ－メチル修飾ポリ核酸分子は、同等の天然ポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させている。いくつかの例では、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）修飾ポリ核酸分子は、同等の天然ポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させている。いくつかの例では、２’－Ｏ－アミノプロピル修飾ポリ核酸分子は、同等の天然ポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させている。いくつかの例では、２’－デオキシ修飾ポリ核酸分子は、同等の天然ポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させている。いくつかの例では、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ修飾ポリ核酸分子は、同等の天然ポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させている。いくつかの例では、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）修飾ポリ核酸分子は、同等の天然ポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させている。いくつかの例では、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）修飾ポリ核酸分子は、同等の天然ポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させている。いくつかの例では、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）修飾ポリ核酸分子は、同等の天然ポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させている。いくつかの例では、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）修飾ポリ核酸分子は、同等の天然ポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させている。いくつかの例では、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾ポリ核酸分子は、同等の天然ポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させている。いくつかの例では、ＬＮＡ修飾ポリ核酸分子は、同等の天然ポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させている。いくつかの例では、ＥＮＡ修飾ポリ核酸分子は、同等の天然ポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させている。いくつかの例では、ＰＮＡ修飾ポリ核酸分子は、同等の天然ポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させている。いくつかの例では、ＨＮＡ修飾ポリ核酸分子は、同等の天然ポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させている。いくつかの例では、モルホリノ修飾ポリ核酸分子は、同等の天然ポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させている。いくつかの例では、メチルホスホネートヌクレオチド修飾ポリ核酸分子は、同等の天然ポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させている。いくつかの例では、チオールホスホネートヌクレオチド修飾ポリ核酸分子は、同等の天然ポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させている。いくつかの例では、２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイトを含むポリ核酸分子は、同等の天然ポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させている。場合によっては、増加した親和性は、低Ｋｄ、高融解温度（Ｔｍ）、またはその組み合わせで例証される。

【0238】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、キラル純粋（またはステレオ純粋）なポリ核酸分子、または単一のエナンチオマーを含むポリ核酸分子である。いくつかの例では、ポリ核酸分子はＬ－ヌクレオチドを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子はＤ－ヌクレオチドを含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子組成物は、その鏡像異性体の３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下を含む。場合によっては、ポリ核酸分子組成物は、ラセミ混合物の３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下を含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、米国特許出願公開第２０１４／１９４６１０号と第２０１５／２１１００６号、および、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１５１０７４２５号に記載されるポリ核酸分子である。

【0239】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、アプタマーコンジュゲート化部分を含めるようにさらに修飾される。いくつかの例では、アプタマーコンジュゲート化部分は、ＤＮＡアプタマーコンジュゲート化部分である。いくつかの例では、アプタマーコンジュゲート化部分は、Ａｌｐｈａｍｅｒ（Ｃｅｎｔａｕｒｉ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）であり、これは、特定細胞表面標的と、循環抗体に結合するための特定のエピトープを示す部分とを認識するアプタマー部分を含んでいる。いくつかの例において、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、米国特許第８，６０４，１８４号、第８，５９１，９１０号、および、第７，８５０，９７５号に記載されるようなアプタマーコンジュゲート化部分を含めるようにさらに修飾される。

【0240】

さらなる実施形態では、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、その安定性を増大させるために修飾される。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子はＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）である。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、その安定性を増大させるために、上に記載された修飾の１つ以上によって修飾される。場合によっては、ポリ核酸分子は、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、または、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾、あるいは、ロックドまたは架橋リボース構造（例えば、ＬＮＡまたはＥＮＡ）によるなどして、２’ヒドロキシル位置で修飾される。場合によっては、ポリ核酸分子は、２’－Ｏ－メチルおよび／または２’－Ｏ－メトキシエチルリボースによって修飾される。場合によっては、ポリ核酸分子はさらに、その安定性を増大させるために、モルホリノ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、および／または２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイトを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子はキラル純粋な（またはステレオ純粋な）ポリ核酸分子である。いくつかの例では、キラル純粋な（またはステレオ純粋な）ポリ核酸分子はその安定性を増大させるために修飾される。送達の安定性を増大させるためのＲＮＡの適切な修飾は当業者には明らかとなるであろう。

【0241】

場合によっては、普遍的な塩基とは、ほとんど見分けがつかない天然のＤＮＡ／ＲＮＡ塩基の各々と塩基対を形成するヌクレオチド塩基アナログを指す。普遍的な塩基の非限定的な例は、従来技術で知られているようなＣ－フェニル、Ｃ－ナフチル、および他の芳香族誘導体、イノシン、アゾールカルボキサミド、ならびに、３－ニトロピロール、４－ニトロインドール、５－ニトロインドール、および６－ニトロインドールなどのニトロアゾール誘導体を含む（例えば、Ｌｏａｋｅｓ，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２９，２４３７－２４４７を参照）。

【0242】

小分子、タンパク質、およびペプチド
いくつかの実施形態では、ペイロードは小分子である。いくつかの例では、小分子は細胞傷害性ペイロードである。例示的な細胞傷害性ペイロードは、限定されないが、微小管破壊剤、ＤＮＡ修飾剤、またはＡｋｔ阻害剤を含む。

【0243】

いくつかの実施形態では、ペイロードは微小管破壊剤を含む。例示的な微小管破壊剤としては、限定されないが、２－メトキシエストラジオール、オーリスタチン、カルコン、コルヒチン、コンブレタスタチン、クリプトフィシン、ディクチオスタチン、ディスコデルモリド、ドラスタイン（ｄｏｌａｓｔａｉｎ）、エリュテロビン、エポチロン、ハリコンドリン、ラウリマリド、メイタンシン、ノスカピノイド、パクリタキセル、ペロルシド、フォモプシン、ポドフィロトシン、リゾキシン、スポンジスタチン、タキサン、チューブリシン（ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ）、ビンカアルカロイド、ビノレルビン、またはその誘導体あるいはアナログが挙げられる。

【0244】

いくつかの実施形態では、チューブリシンは、米国特許第８５８０８２０号と第８９８０８３３号、および米国出願公開第２０１３０２１７６３８号、第２０１３０２２４２２８号、ならびに第２０１４００３６３４５４号に記載されるようなチューブリシンのアナログまたは誘導体である。

【0245】

いくつかの実施形態では、メイタンシンはメイタンシノイドである。いくつかの実施形態では、メイタンシノイドはＤＭ１、ＤＭ４、またはアンサマイトシンである。いくつかの実施形態では、メイタンシノイドはＤＭ１である。いくつかの実施形態では、メイタンシノイドはＤＭ４である。いくつかの実施形態では、メイタンシノイドはアンサマイトシンである。いくつかの実施形態では、メイタンシノイドは、米国特許第５２０８０２０号、第５４１６０６４号、第７２７６４９７号、および第６７１６８２１号、または米国出願公開第２０１３０２９９００号および第２０１３０３２３２６８号に記載されるようなメイタンシノイドの誘導体またはアナログである。

【0246】

いくつかの実施形態では、ペイロードは、ドラスチンまたはその誘導体あるいはアナログである。いくつかの実施形態では、ドラスチンは、ドラスチン１０またはドラスチン１５、あるいはその誘導体またはアナログである。いくつかの実施形態では、ドラスチン１０アナログは、オーリスタチン、ソブリドチン、シンプロスタチン１、またはシンプロスタチン３である。いくつかの実施形態では、ドラスチン１５アナログは、セマドチンまたはタシドチンである。

【0247】

いくつかの実施形態では、ドラスチン１０アナログは、オーリスタチンまたはオーリスタチン誘導体である。いくつかの実施形態では、オーリスタチンまたはオーリスタチン誘導体は、オーリスタチンＥ（ＡＥ）、オーリスタチンＦ（ＡＦ）、オーリスタチンＥ５－ベンゾイル吉草酸エステル（ＡＥＶＢ）、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、またはモノメチルオーリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、オーリスタチンＰＥ、あるいはオーリスタチンＰＹＥである。いくつかの実施形態では、オーリスタチン誘導体はモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態では、オーリスタチン誘導体はモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である。いくつかの実施形態では、オーリスタチンは、米国特許第６８８４８６９号、第７６５９２４１号、第７４９８２９８号、第７９６４５６６号、第７７５０１１６号、第８２８８３５２号、第８７０３７１４号、および号８８７１７２０号に記載されるようなオーリスタチン誘導体またはアナログである。

【0248】

いくつかの実施形態では、ペイロードはＤＮＡ修飾剤を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修飾剤はＤＮＡ開裂剤、ＤＮＡインターカレータ、ＤＮＡ転写阻害剤、またはＤＮＡ架橋剤を含む。いくつかの例では、ＤＮＡ開裂剤は、ブレオマイシンＡ２、カリケアミシン、またはその誘導体あるいはアナログを含む。いくつかの例では、ＤＮＡインターカレータは、ドキソルビシン、エピルビシン、ＰＮＵ－１５９６８２、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、オリゴマイシンＣ、ダウノルビシン、バルルビシン、トポテカン、またはその誘導体あるいはアナログを含む。いくつかの例では、ＤＮＡ転写阻害剤はダクチノマイシンを含む。いくつかの例では、ＤＮＡ架橋剤はマイトマイシンＣを含む。

【0249】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修飾剤は、アムサクリン、アントラサイクリン、カンプトテシン、ドキソルビシン、デュオカルマイシン、エンジイン、エトポシド、インドリノベンゾジアゼピン、ネトロプシン、テニポシド、またはその誘導体あるいはアナログを含む。

【0250】

いくつかの実施形態では、アントラサイクリンは、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン－Ｃ、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、ネモルビシン、ピクサントロン、サバルビシン、またはバルルビシンである。

【0251】

いくつかの実施形態では、カンプトテシンのアナログは、トポテカン、イリノテカン、シラテカン、コシテカン、エキサテカン、ルートテカン、ジャイマテカン、ベロテカン、ルビテカン、またはＳＮ－３８である。

【0252】

いくつかの実施形態では、デュオカルマイシンは、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、またはＣＣ－１０６５である。いくつかの実施形態では、エンジインはカリケアミシン、エスペラミシン、またはダイネマイシンＡである。

【0253】

いくつかの実施形態では、ピロロベンゾジアゼピンは、アントラマイシン、アベイマイシン、チカマイシン、ＤＣ－８１、マゼトラマイシン、ネオトラマイシンＡ、ネオトラマイシンＢ、ポロトラマイシン、プロトラカルシン、シバノマイシン（ＤＣ－１０２）、シビロマイシン、またはトマイマイシンである。いくつかの実施形態では、ピロロベンゾジアゼピンは、米国特許第８４０４６７８号および第８１６３７３６号に記載されるようなトマイマイシン誘導体である。いくつかの実施形態では、ピロロベンゾジアゼピンは、米国特許第８４２６４０２号、第８８０２６６７号、第８８０９３２０号、第６５６２８０６号、第６６０８１９２号、第７７０４９２４号、第７０６７５１１号、第ＵＳ７６１２０６２号、第７２４４７２４号、第７５２８１２６号、第７０４９３１１号、第８６３３１８５号、第８５０１９３４号、および第８６９７６８８号、ならびに米国出願公開第ＵＳ２０１４０２９４８６８号に記載されるようなものである。

【0254】

いくつかの実施形態では、ピロロベンゾジアゼピンは、ピロロベンゾジアゼピン二量体である。いくつかの実施形態では、ＰＢＤ二量体は対称的な二量体である。対称ＰＢＤ二量体の例としては、限定されないが、ＳＪＧ－１３６（ＳＧ－２０００）、ＺＣ－４２３（ＳＧ２２８５）、ＳＪＧ－７２０、ＳＪＧ－７３８、ＺＣ－２０７（ＳＧ２２０２）、およびＤＳＢ－１２０（表２）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＰＢＤ二量体は非対称二量体である。非対称ＰＢＤ二量体の例としては、限定されないが、米国特許第８６９７６８８号および第９２４２０１３号、ならびに米国出願公開第２０１４０２８６９７０号に記載されるようなＳＪＧ－１３６誘導体が挙げられる。

【0255】

いくつかの実施形態では、ペイロードはＡｋｔ阻害剤を含む。場合によっては、Ａｋｔ阻害剤は、イパタセルチブ（ＧＤＣ－００６８）またはその誘導体を含む。

【0256】

いくつかの実施形態では、ペイロードは、限定されないが、α－アマニチンなどのポリメラーゼＩＩ阻害剤、およびポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤を含む、ポリメラーゼ阻害剤を含む。例示的なＰＡＲＰ阻害剤は、限定されないが、イニパリブ（ＢＳＩ ２０１）、タラゾパリブ（ＢＭＮ－６７３）、オラパリブ（ＡＺＤ－２２８１）、オラパリブ、ルカパリブ（ＡＧ０１４６９９、ＰＦ－０１３６７３３８）、ベリパリブ（ＡＢＴ－８８８）、ＣＥＰ ９７２２、ＭＫ ４８２７、ＢＧＢ－２９０、または３－アミノベンズアミドを含む。

【0257】

いくつかの実施形態では、ペイロードは、造影剤である。いくつかの例では、ペイロードは、「放射線不透過性の」標識、例えば、Ｘ線を使用して視覚化された標識を含む。放射線不透性物質は、当業者に周知である。例示的な放射線不透性物質は、ヨウ化物、臭化物、またはバリウム塩を含む。追加の放射線不透性物質は、限定されないが、有機ビスマス誘導体（例えば、米国特許第５，９３９，０４５号）、放射線不透性ポリウレタン（例えば、米国特許第５，３４６，９８１号を参照）、有機ビスマス複合体（例えば、米国特許第５，２５６，３３４号を参照）、放射線不透性バリウムポリマー複合体（例えば、米国特許第４，８６６，１３２号を参照）などを含む。

【0258】

いくつかの例では、ペイロードは、例えば、イムノコンジュゲートに使用される検出可能な標識を含み、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的な手段によって検出可能な任意の組成物を含む。有用なラベルは、磁気ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標））、蛍光色素（例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など）、放射性同位体（例えば、^３Ｈ、^１２５Ｉ、^３５Ｓ、^１４Ｃ、または^３２Ｐ）、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびその他共通してＥＬＩＳＡに使用されるもの）、ならびに比色定量ラベル、例えば、コロイド金または着色ガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズ、ナノ粒子、量子ドットなどを含む。

【0259】

いくつかの実施形態では、適切な放射標識は、限定されないが、^９９Ｔｃ、^２０３Ｐｂ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^７２Ａｓ、^１１１Ｉｎ、^１１３ｍＩｎ、^９７Ｒｕ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^５２Ｆｅ、^５２ｍＭｎ、^５１Ｃｒ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^７７Ａｓ、^９０Ｙ、^６７Ｃｕ、^１６９Ｅｒ、^１２１Ｓｎ、^１２７Ｔｅ、^１４２Ｐｒ、^１４３Ｐｒ、^１９８Ａｕ、^１９９Ａｕ、^１６１Ｔｂ、^１０９Ｐｄ、^１６５Ｄｙ、^１４９Ｐｍ、^１５１Ｐｍ、^１５３Ｓｍ、^１５７Ｇｄ、^１５９Ｇｄ、^１６６Ｈｏ、^１７２Ｔｍ、^１６９Ｙｂ、^１７５Ｙｂ、^１７７Ｌｕ、^１０５Ｒｈ、および^１１１Ａｇを含む。

【0260】

いくつかの例では、ペイロードは、細胞に対する電離放射線（^６０ＣｏまたはＸ線源などで生成されるような）の細胞毒性効果を高める放射線増感剤を含む。多くの放射線増感剤が知られており、限定されないが、ベンゾポルフィリン誘導体化合物（例えば、米国特許第５，９４５，４３９号を参照）、１，２，４－ベンゾトリアジンオキシド（例えば、米国特許第５，８４９，７３８号を参照）、特定のジアミンを含有する化合物（例えば、米国特許第５，７００，８２５号を参照）、ＢＣＮＴ（例えば、米国特許第５，８７２，１０７号を参照）、放射線増感性ニトロ安息香酸アミド誘導体（例えば、米国特許第４，４７４，８１４号を参照）、様々な複素環誘導体（例えば、米国特許第５，０６４，８４９号を参照）、白金錯体（例えば、米国特許第４，９２１，９６３号を参照）などを含む。

【0261】

いくつかの例では、ペイロードは、α放射体、すなわち、α粒子を放出する放射性同位体を得る。α放射体は、癌の処置に有効であると近年示されている（例えば、ＭｃＤｅｖｉｔｔ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９４：１５３７－１５４０；Ｂａｌｌａｎｇｒｕｄ ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６１： ２００８－２０１４； Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６３：５０８４－５０を参照）。適切なα放射体は、限定されないが、^２１３Ｂｉ、^２１１Ａｔなどを含む。

【0262】

いくつかの例では、ペイロードは免疫調節剤を含む。有用な免疫調節剤としては、腫瘍に対するホルモンの作用を阻害する抗ホルモン剤、およびサイトカインの産生を抑制したり、自己抗原の発現をダウンレギュレートしたり、またはＭＨＣ抗原をマスクしたりする免疫抑制剤が挙げられる。代表的な抗ホルモン剤としては、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性の４（５）－イミダゾール類、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ １１７０１８、オナプンストン、およびトレミフェンなどの抗エストロゲン、ならびに、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリド、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲン、ならびに、抗副腎剤が挙げられる。免疫抑制剤としては、限定されないが、２－アミノ－６－アリール－５－置換ピリミジン、アザチオプリン、シクロホスファミド、ブロモクリプチン、ダナゾール、ダプソン、グルタルアルデヒド、ＭＨＣ抗原およびＭＨＣフラグメントに対する抗イディオタイプ抗体、シクロスポリンＡ、グルココルチコステロイドなどのステロイド、ストレプトキナーゼ、またはラパマイシンなどが挙げられる。

【0263】

いくつかの実施形態では、ペイロードはタンパク質またはペプチドトキシンあるいはそのフラグメントを含む。例示的な酵素学的に活性な毒素またはそのフラグメントとしては、限定されないが、ジフテリア毒素Ａフラグメント、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａからの）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、ａ－サルシン、特定のシナアブラギリタンパク質、特定のダイアンシンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ－Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィキナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトギリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンが挙げられる。

【0264】

いくつかの例では、ペイロードは免疫調節薬である。例示的な免疫調節薬としては、限定されないが、ガンシクロビエ、エタネルセプト、タクロリムス、シロリムス、ボクロスポリン、シクロスポリン、ラパマイシン、シクロホスファミド、アザチオプリン、ミコフェノールゲートモフェチル、メトトレキサート、グルココルチコイドおよびそのアナログ、キサンチン、幹細胞成長因子、リンパトキシン、造血因子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）（例えば、ＴＮＦα）、インターロイキン（例えば、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、およびＩＬ－２１）、コロニー刺激因子（例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ））、インターフェロン（例えば インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ）、「Ｓ１因子」と名付けられる幹細胞増殖因子、エリスロポエチン、およびトロンボポエチン、またはその組み合わせが挙げられる。

【0265】

いくつかの例では、ペイロードはサイトカインを含む。いくつかの実施形態では、サイトカインはＩＬ－２、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、インターフェロン（例えば、ＩＦＮα、ＩＦＮβ）、またはＴＮＦαを含む。

【0266】

ポリマー
いくつかの実施形態では、本明細書に記載された抗トランスフェリン受容体抗体コンジュゲートは、高分子（ポリマー部分Ｃ）をさらに含む。いくつかの例では、ポリマー部分は、分岐したまたは分枝していない単量体の長鎖、および／または、二次元あるいは三次元の単量体の架橋したネットワークからなる、天然または合成のポリマーである。いくつかの例では、ポリマー部分は多糖、リグニン、ゴム、またはポリアルキルエンオキシド（例えば、ポリエチレングリコール）を含む。いくつかの例では、少なくとも１つのポリマー部分としては、限定されないが、アルファ－ジヒドロキシルポリエチレングリコール、オメガ－ジヒドロキシルポリエチレングリコール、生物分解性ラクトンベースのポリマー、例えば、ポリアクリル酸、ポリラクチド酸（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリシアノアクリレート、ポリイミド、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ、ＰＥＴＧ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴＥ）、ポリテトラメチレングリコール（ＰＴＧ）、またはポリウレタン、およびこれらの混合物が挙げられる。本明細書で使用されるように、混合物は、ブロックコポリマーに関連する場合と同様に、同じ化合物内の様々なポリマーの使用を指す。場合によっては、ブロックコポリマーは、ポリマーの少なくとも１つの部分が別のポリマーの単量体から構築されるポリマーである。いくつかの例では、ポリマー部分はポリアルキレンオキシドを含む。いくつかの例では、ポリマー部分はＰＥＧを含む。いくつかの例では、ポリマー部分はポリエチレンイミド（ＰＥＩ）またはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）を含む。

【0267】

いくつかの例では、ＣはＰＥＧ部分である。いくつかの例では、ＰＥＧ部分はポリ核酸分子の５’末端にコンジュゲートするが、結合部分はポリ核酸分子の３’末端にコンジュゲートする。いくつかの例では、ＰＥＧ部分はポリ核酸分子の３’末端にコンジュゲートするが、結合部分はポリ核酸分子の５’末端にコンジュゲートする。いくつかの例では、ＰＥＧ部分はポリ核酸分子の内部部位にコンジュゲートする。いくつかの例では、ＰＥＧ部分、結合部分、またはその組み合わせは、ポリ核酸分子の内部部位にコンジュゲートする。いくつかの例では、コンジュゲーションは直接コンジュゲーションである。いくつかの例では、コンジュゲーションは天然のライゲーションを介するものである。

【0268】

いくつかの実施形態では、ポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）は多分散または単分散の化合物である。いくつかの例では、多分散材料は、平均重量（重量平均）サイズおよび分散度を特徴とする、異なる分子量の材料の分散分布を含む。いくつかの例では、単分散ＰＥＧは１つのサイズの分子を含む。いくつかの実施形態では、Ｃは多分散または単分散のポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）であり、示された分子量は、ポリアルキレンオキシド、例えば、ＰＥＧ分子の分子量の平均を表す。

【0269】

いくつかの実施形態では、ポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）の分子量は、約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３２５０、３３５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４６００、４７５０、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００、３５，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、または１００，０００Ｄａである。

【0270】

いくつかの実施形態では、Ｃはポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）であり、約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３２５０、３３５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４６００、４７５０、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００、３５，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、または１００，０００Ｄａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、ＣはＰＥＧであり、約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３２５０、３３５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４６００、４７５０、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００、３５，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、または１００，０００Ｄａの分子量を有する。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約３００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約４００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約６００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約７００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約８００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約９００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１１００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１２００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１３００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１４００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１４５０Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１６００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１７００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１８００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１９００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２１００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２２００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２３００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２４００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２６００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２７００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２８００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２９００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約３０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約３２５０Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約３３５０Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約３５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約３７５０Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約４０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約４２５０Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約４５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約４６００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約４７５０Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約５０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約５５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約６０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約６５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約７０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約７５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約８０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１０，０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１２，０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２０，０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約３５，０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約４０，０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約５０，０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約６０，０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１００，０００Ｄａである。

【0271】

いくつかの実施形態では、ポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）は、離散ＰＥＧ（ｄｉｓｃｒｅｔｅ ＰＥＧ）であり、離散ＰＥＧは、１を超える繰り返しエチレンオキシド単位を含むポリマーＰＥＧである。いくつかの例では、離散ＰＥＧ（ｄＰＥＧ）は、２～６０、２～５０、または２～４８の反復エチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４２、４８、５０、またはそれ以上の反復エチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約２以上の反復エチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約３以上の反復エチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約４以上の反復エチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約５以上の反復エチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約６以上の反復エチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約７以上の反復エチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約８以上の反復エチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約９以上の反復エチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約１０以上の反復エチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約１１以上の反復エチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約１２以上の反復エチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約１３以上の反復エチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約１４以上の反復エチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約１５以上の反復エチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約１６以上の反復エチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約１７以上の反復エチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約１８以上の反復エチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約１９以上の反復エチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約２０以上の反復エチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約２２以上の反復エチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約２４以上の反復エチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約２６以上の反復エチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約２８以上の反復エチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約３０以上の反復エチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約３５以上の反復エチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約４０以上の反復エチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約４２以上の反復エチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約４８以上の反復エチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約５０以上の反復エチレンオキシド単位を含む。場合によっては、ｄＰＥＧは、純粋な（例えば、約９５％、９８％、９９％、または９９．５％）出発物質から単一分子量化合物として段階的に合成される。場合によっては、ｄＰＥＧは、平均分子量ではなく、特定の分子量を有する。場合によっては、本明細書に記載されるｄＰＥＧはＱｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，ＬＭＤのｄＰＥＧである。

【0272】

いくつかの実施形態では、ポリマー部分Ｃは、カチオン性ムチン酸ベースのポリマー（ｃＭＡＰ）を含む。いくつかの例では、ｃＭＡＰは、少なくとも１つの反復サブユニットの１つ以上のサブユニットを含み、サブユニット構造は式（ＩＩＩ）として表され、

【0273】

【化23】

【0274】

ここで、ｍは、それぞれ存在する場合、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、好ましくは、４－６、または５であり、および、ｎは、それぞれ存在する場合、独立して、１、２、３、４、または５である。いくつかの実施形態では、ｍとｎは、例えば、約１０である。

【0275】

いくつかの例では、ｃＭＡＰはさらにＰＥＧ部分にコンジュゲートし、ｃＭＡＰ－ＰＥＧコポリマー、ｍＰＥＧ－ｃＭＡＰ－ＰＥＧｍトリブロックポリマー、またはｃＭＡＰ－ＰＥＧ－ｃＭＡＰトリブロックポリマーを生成する。いくつかの例では、ＰＥＧ部分は約５００Ｄａ～約５０，０００Ｄａの範囲である。いくつかの例では、ＰＥＧ部分は、約５００Ｄａ～約１０００Ｄａ、１０００Ｄａ超～約５０００Ｄａ、５０００Ｄａ超～約１０，０００Ｄａ、１０，０００超～約２５，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ超～約５０，０００Ｄａ、またはこれらの範囲の２つ以上の任意の組み合わせの範囲である。

【0276】

いくつかの例では、Ｃは、ｃＭＡＰ－ＰＥＧコポリマー、ｍＰＥＧ－ｃＭＡＰ－ＰＥＧｍトリブロックポリマー、またはｃＭＡＰ－ＰＥＧ－ｃＭＡＰトリブロックポリマーである。場合によっては、ＣはｃＭＡＰ－ＰＥＧコポリマーである。他の場合には、ＣはｍＰＥＧ－ｃＭＡＰ－ＰＥＧｍトリブロックポリマーである。さらなる場合には、ＣはｃＭＡＰ－ＰＥＧ－ｃＭＡＰトリブロックポリマーである。

【0277】

エンドソーム溶解部分
いくつかの実施形態では、抗トランスフェリン受容体抗体コンジュゲートは、追加のコンジュゲート化部分をさらに含む。いくつかの例では、追加の結合部分はエンドソーム溶解部分である。場合によっては、エンドソーム溶解部分は、細胞区画放出成分、例えば、エンドソーム、リソソーム、小胞体（ＥＲ）、ゴルジ体、微小管、ペルオキシソーム、または細胞を有する他の小胞体などの、当該技術分野で知られている細胞区画のいずれかから放出することができる化合物である。場合によっては、エンドソーム溶解部分は、エンドソーム溶解性ポリペプチド、エンドソーム溶解性ポリマー、エンドソーム溶解性脂質、またはエンドソーム溶解性小分子を含む。場合によっては、エンドソーム溶解部分はエンドソーム溶解性ポリペプチドを含む。他の場合では、エンドソーム溶解部分はエンドソーム溶解性ポリマーを含む。

【0278】

エンドソーム溶解性ポリペプチド
いくつかの実施形態では、抗トランスフェリン受容体抗体コンジュゲートはさらに、エンドソーム溶解性ポリペプチドとコンジュゲートする。いくつかの実施形態では、式（Ｉ）：Ａ－（Ｘ^１－Ｂ）_ｎ、または、式（ＩＩ）：Ａ－Ｘ^１－（Ｂ－Ｘ^２－Ｃ）_ｎのコンジュゲートは、エンドソーム溶解性ポリペプチドとさらにコンジュゲートする。場合によっては、エンドソーム溶解性ポリペプチドはｐＨ依存性膜活性ペプチドである。場合によっては、エンドソーム溶解性ポリペプチドは両親媒性ポリペプチドである。さらなる場合には、エンドソーム溶解性ポリペプチドはペプチド模倣薬である。いくつかの例では、エンドソーム溶解性ポリペプチドは、ＩＮＦ、メリチン、ムチン（ｍｅｕｃｉｎ）、またはそのそれぞれの誘導体を含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性ポリペプチドは、ＩＮＦまたはその誘導体を含む。他の場合には、エンドソーム溶解性ポリペプチドは、メリチンまたはその誘導体を含む。さらなる場合には、エンドソーム溶解性ポリペプチドは、ムチンまたはその誘導体を含む。

【0279】

いくつかの例では、ＩＮＦ７は２４残基ポリペプチドであり、この配列は、ＣＧＩＦＧＥＩＥＥＬＩＥＥＧＬＥＮＬＩＤＷＧＮＡ（配列番号：５１）またはＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＣ（配列番号：５２）を含む。いくつかの例では、ＩＮＦ７またはその誘導体は、以下の配列を含む：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＷＤＹＧＳＧＳＣＧ（配列番号：５３）、ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧ ＷＹＧ－（ＰＥＧ）６－ＮＨ２（配列番号：５４）、または、ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＷＤＹＧ－ＳＧＳＣ－Ｋ（ＧａｌＮＡｃ）２（配列番号：５５）。

【0280】

場合によっては、メリチンは２６残基ポリペプチドであり、この配列は、ＣＬＩＧＡＩＬＫＶＬＡＴＧＬＰＴＬＩＳＷＩＫＮＫＲＫＱ（配列番号：５６）、または、ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ（配列番号：５７）を含む。いくつかの例では、メリチンは、米国特許第８，５０１，９３０号に記載されるポリペプチド配列を含む。

【0281】

いくつかの例では、ムチンは、サソリ（Ｍｅｓｏｂｕｔｈｕｓ ｅｕｐｅｕｓ）の毒液腺に由来する抗菌ペプチド（ＡＭＰ）である。いくつかの例では、ムチンは、ＩＦＧＡＩＡＧＬＬＫＮＩＦ－ＮＨ２（配列番号：５８）を含むムチン－１３、および、ＦＦＧＨＬＦＫＬＡＴＫＩＩＰＳＬＦＱ（配列番号：５９）を含むムチン－１８配列から構成される。

【0282】

いくつかの例では、エンドソーム溶解性ポリペプチドは、その配列がＩＮＦ７またはその誘導体、メリチンまたはその誘導体、あるいはムチンまたはその誘導体に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％配列同一性であるポリペプチドを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解部分は、ＩＮＦ７またはその誘導体、メリチンまたはその誘導体、あるいはムチンまたはその誘導体を含む。

【0283】

いくつかの例では、エンドソーム溶解部分は表８で例証されるような配列を含む。

【0284】

【表8-1】

【0285】

【表8-2】

【0286】

場合によっては、エンドソーム溶解部分は、Ｂｃｌ－２および／またはＢｃｌ－ｘＬなどの抑制因子標的の拮抗を介してアポトーシスを誘発するＢａｋ ＢＨ３ポリペプチドを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解部分は、Ａｌｂａｒｒａｎ， ｅｔ ａｌ．， “Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｗｉｔｈ ａ ｐＨ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｃａｒｒｉｅｒ，” Ｒｅａｃｔｉｖｅ ＆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ７１： ２６１－２６５ （２０１１）に記載されるＢａｋ ＢＨ３ポリペプチドを含む。

【0287】

いくつかの例では、エンドソーム溶解部分は、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１３／１６６１５５号または第ＷＯ２０１５／０６９５８７号に記載されるようなポリペプチド（例えば、細胞透過性ポリペプチド）を含む。

【0288】

エンドソーム溶解性ポリマー
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）：Ａ－（Ｘ^１－Ｂ）_ｎ、または、式（ＩＩ）：Ａ－Ｘ^１－（Ｂ－Ｘ^２－Ｃ）_ｎのコンジュゲートは、エンドソーム溶解性ポリマーとさらにコンジュゲートする。本明細書で使用される場合、エンドソーム溶解性ポリマーは、線形、分岐ネットワーク、星形、くし形、またはしご型のポリマーを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性ポリマーは、２つ以上の異なる型の単量体を含むホモポリマーまたはコポリマーであある。場合によっては、エンドソーム溶解性ポリマーはポリカチオンポリマーである。他の場合において、エンドソーム溶解性ポリマーはポリアニオンポリマーである。

【0289】

いくつかの例では、ポリカチオンポリマーは、電荷が正、電荷が中性、または電荷が負である単量体単位を含み、正味の電荷は正である。他の場合において、ポリカチオンポリマーは、２つ以上の正電荷を含有する非ポリマー分子を含む。例示的なカチオンポリマーとしては、限定されないが、ポリ（Ｌ－リジン）（ＰＬＬ）、ポリ（Ｌ－アルギニン）（ＰＬＡ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ［α－（４－アミノブチル）－Ｌ－グリコール酸］（ＰＡＧＡ）、２－（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）、またはＮ，Ｎ－ジエチルアミノエチルメタクリレート（ＤＥＡＥＭＡ）が挙げられる。

【0290】

場合によっては、ポリアニオンポリマーは、電荷が正、電荷が中性、または電荷が負である単量体単位を含み、正味の電荷は負である。他の場合において、ポリアニオンポリマーは、２つ以上の負電荷を含有する非ポリマー分子を含む。例示的なアニオンポリマーは、ｐ（アルキルアクリレート）（例えば、ポリ（プロピルアクリル酸）（ＰＰＡＡ））、またはポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＮＩＰＡＭ）を含む。さらなる例は、ＰＰ７５、Ｋｈｏｒｍａｅｅ，ｅｔ ａｌ．，“Ｅｄｏｓｏｍｏｌｙｔｉｃ ａｎｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡｓ ｉｎ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，” Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ２３： ５６５－５７４ （２０１３）に記載されるＬ－フェニルアラニン－ポリ（Ｌ－リジンイソフタルアミド）ポリマーを含む。

【0291】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるエンドソーム溶解性ポリマーは、ｐＨ応答性のエンドソーム溶解性ポリマーである。ｐＨ応答性ポリマーは、環境のｐＨに応じてサイズを増大させる（膨潤させる）か、崩壊するポリマーを含む。ポリアクリル酸およびキトサンはｐＨ応答性ポリマーの例である。

【0292】

いくつかの例では、本明細書に記載されるエンドソーム溶解部分は、膜破壊性ポリマーである。場合によっては、膜破壊性ポリマーは、カチオンポリマー、中性または疎水性ポリマー、あるいはアニオンポリマーを含む。いくつかの例では、膜破壊性ポリマーは親水性ポリマーである。

【0293】

いくつかの例では、本明細書に記載されるエンドソーム溶解部分は、膜破壊性ポリマーである。例示的なｐＨ応答性の膜破壊性ポリマーは、ｐ（アルキルアクリル酸）、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＮＩＰＡＭ）コポリマー、スクシニル化ｐ（グリシドール）、およびｐ（β－リンゴ酸）ポリマーを含む。

【0294】

いくつかの例では、ｐ（アルキルアクリル酸）は、ポリ（プロピルアクリル酸（ｐｏｌｙＰＡＡ）、ポリ（メタクリル酸（ＰＭＡＡ）、ポリ（エチルアクリル酸）（ＰＥＡＡ）、およびポリ（プロピルアクリル酸）（ＰＰＡＡ）を含む。いくつかの例では、ｐ（アルキルアクリル酸）は、Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ３７２： ６５－７５ （２００３）に記載されるｐ（アルキルアクリル酸）を含む。

【0295】

いくつかの実施形態では、ｐＨ応答性の膜破壊性ポリマーは、ｐ（ブチルアクリレート－ｃｏ－メタクリル酸）を含む。（Ｂｕｌｍｕｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ９３： １０５－１２０ ２００３、およびＹｅｓｓｉｎｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １６１３： ２８－３８ （２００３）を参照）

【0296】

いくつかの実施形態では、ｐＨ応答性の膜破壊性ポリマーは、ｐ（スチレン－ａｌｔ－無水マレイン酸）を含む。（Ｈｅｎｒｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ７：２４０７－２４１４（２００６）を参照）

【0297】

いくつかの実施形態では、ｐＨ応答性の膜破壊性ポリマーは、ポリ（ＭＡＡ－ｃｏ－ＰＤＳＡ）、ポリ（ＥＡＡ－ｃｏ－ＰＤＳＡ）、ポリ（ＰＡＡ－ｃｏ－ＰＤＳＡ）、ポリ（ＭＡＡ－ｃｏ－ＢＡ－ｃｏ－ＰＤＳＡ）、ポリ（ＥＡＡ－ｃｏ－ＢＡ－ｃｏ－ＰＤＳＡ）、またはポリ（ＰＡＡ－ｃｏ－ＢＡ－ｃｏ－ＰＤＳＡ）ポリマーなどのピリジルジスルフィドアクリレート（ＰＤＳＡ）ポリマーを含む。（Ｅｌ－Ｓａｙｅｄ，ｅｔ ａｌ．，“Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｐＨ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ａｎｄ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０４： ４１７－４２７ （２００５）、またはＦｌａｎａｒｙ ｅｔ ａｌ．， “Ａｎｔｉｇｅｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙ（ｐｒｏｐｙｌａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ） ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｄ ＭＨＣ－１ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔ－ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，” Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ２０： ２４１－２４８ （２００９）を参照）。

【0298】

いくつかの実施形態では、ｐＨ応答性の膜破壊性ポリマーは、以下の塩基構造を含む溶解性ポリマーを含む：

【0299】

【化24】

【0300】

いくつかの例では、本明細書に記載されるエンドソーム溶解部分はさらに、追加のコンジュゲート、例えば、ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、または修飾されたポリマー（例えば、コレステロール修飾されたポリマー）にコンジュゲートする。

【0301】

いくつかの例では、追加のコンジュゲートは界面活性剤（例えば、トリトンＸ－１００）を含む。いくつかの例では、本明細書に記載されるエンドソーム溶解部分は、界面活性剤（例えば、トリトンＸ－１００）とコンジュゲートされたポリマー（例えば、ポリ（アミドアミン））を含む。いくつかの例では、本明細書に記載されるエンドソーム溶解部分は、ポリ（アミドアミン）－トリトンＸ－１００コンジュゲート（Ｄｕｎｃａｎ， ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｐｏｌｙｍｅｒ－Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｐＨ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ： ａ ｍｏｄｅｌ ｓｙｓｔｅｍ ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｗｉｔｈｉｎ ａｃｉｄｉｃ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ，” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ２： ３４１－３４７ （１９９４））を含む。

【0302】

エンドソーム溶解性脂質
いくつかの実施形態では、エンドソーム溶解部分は脂質（例えば、融合性脂質）である。いくつかの実施形態では、式（Ｉ）：Ａ－（Ｘ^１－Ｂ）_ｎ、または、式（ＩＩ）：Ａ－Ｘ^１－（Ｂ－Ｘ^２－Ｃ）_ｎのコンジュゲートは、エンドソーム溶解性脂質（例えば、融合性脂質）とさらにコンジュゲートする。例示的な融合性脂質は、１，２－ジレオイル（ｄｉｌｅｏｙｌ）－ｓｎ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、（６Ｚ、９Ｚ、２８Ｚ、３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６、９、２８、３１－テトラエン－１９－オール（Ｄｉ－Ｌｉｎ）、Ｎ－メチル（２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）メタンアミン（ＤＬｉｎ－ｋ－ＤＭＡ）、およびＮ－メチル－２－（２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）エタンアミン（ＸＴＣ）を含む。

【0303】

いくつかの例では、エンドソーム溶解部分は、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ０９／１２６，９３３号に記載される脂質（例えば、融合性脂質）である。

【0304】

エンドソーム溶解性小分子
いくつかの実施形態では、エンドソーム溶解部分は小分子である。いくつかの実施形態では、式（Ｉ）：Ａ－（Ｘ^１－Ｂ）_ｎ、または、式（ＩＩ）：Ａ－Ｘ^１－（Ｂ－Ｘ^２－Ｃ）_ｎの分子は、エンドソーム溶解性小分子とさらにコンジュゲートする。エンドソーム溶解部分として適切な例示的な小分子としては、限定されないが、キニーネ、クロロキン、水酸化クロロキン、アモジアキン（カルノキン（ｃａｒｎｏｑｕｉｎｅｓ））、アモピロキン、プリマキン、メフロキン、ニバキン（ｎｉｖａｑｕｉｎｅｓ）、ハロファントリン、キノンイミン、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの例では、キノリンエンドソーム溶解部分としては、限定されないが、７－クロロ－４－（４－ジエチルアミノ－１－メチルブチル－アミノ）キノリン（クロロキン）、７－クロロ－４－（４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－メチルブチル－アミノ）キノリン（ヒドロキシクロロキン）、７－フルオロ－４－（４－ジエチルアミノ－１－メチルブチル－アミノ）キノリン、４－（４－ジエチルアミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン、７－ヒドロキシ－４－（４－ジエチル－アミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン、７－クロロ－４－（４－ジエチルアミノ－１－ブチルアミノ）キノリン（デスメチルクロロキン）、７－フルオロ－４－（４－ジエチルアミノ－１－ブチルアミノ）キノリン、４－（４－ジエチル－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン、７－ヒドロキシ－４－（４－ジエチルアミノ－１－ブチルアミノ）キノリン、７－クロロ－４－（１－カルボキシ－４－ジエチルアミノ－１－ブチルアミノ）キノリン、７－フルオロ－４－（１－カルボキシ－４－ジエチル－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン、４－（１－カルボキシ－４－ジエチルアミノ－１－ブチルアミノ）キノリン、７－ヒドロキシ－４－（１－カルボキシ－４－ジエチルアミノ－１－ブチルアミノ）キノリン、７－クロロ－４－（１－カルボキシ－４－ジエチルアミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン、７－フルオロ－４－（１－カルボキシ－４－ジエチル－アミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン、４－（１－カルボキシ－４－ジエチルアミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン、７－ヒドロキシ－４－（１－カルボキシ－４－ジエチルアミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン、７－フルオロ－４－（４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン、４－（４－エチル－（２－ヒドロキシ－エチル）－アミノ－１－メチルブチルアミノ－）キノリン、７－ヒドロキシ－４－（４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン、ヒドロキシクロロキンホスフェート、７－クロロ－４－（４－エチル－（２－ヒドロキシエチル－１）－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン（デスメチルヒドロキシクロロキン）、７－フルオロ－４－（４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン、４－（４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン、７－ヒドロキシ－４－（４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン、７－クロロ－４－（１－カルボキシ－４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン、７－フルオロ－４－（１－カルボキシ－４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン、４－（１－カルボキシ－４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン、７－ヒドロキシ－４－（１－カルボキシ－４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン、７－クロロ－４－（１－カルボキシ－４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン、７－フルオロ－４－（１－カルボキシ－４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン、４－（１－カルボキシ－４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン、７－ヒドロキシ－４－（１－カルボキシ－４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン、８－［（４－アミノペンチル）アミノ－６－メトキシジヒドロクロリドキノリン、１－アセチル－１，２，３，４－テトラヒドロキノリン、８－［（４－アミノペンチル）アミノ］－６－メトキシキノリンジヒドロクロリド、１－ブチリル－１，２，３，４－テトラヒドロキノリン、３－クロロ－４－（４－ヒドロキシ－α，α’－ビス（２－メチル－１－ピロリジニル）－２，５－キシリジノキノリン、４－［（４－ジエチル－アミノ）－１－メチルブチル－アミノ］－６－メトキシキノリン、３－フルオロ－４－（４－ヒドロキシ－α，α’－ビス（２－メチル－１－ピロリジニル）－２，５－キシリジノキノリン、４－［（４－ジエチルアミノ）－１－メチルブチル－アミノ］－６－メトキシキノリン、４－（４－ヒドロキシ－α，α’－ビス（２－メチル－１－ピロリジニル）－２，５－キシリジノキノリン、４－［（４－ジエチルアミノ）－１－メチルブチル－アミノ］－６－メトキシキノリン、３，４－ジヒドロ－１－（２Ｈ）－キノリンカルボキシアルデヒド、１，１’－ペンタメチレンキノリニウムヨージド、８－硫酸キノリノール、およびそのアミノ、アルデヒド、カルボン酸、ヒドロキシル、ハロゲン、ケト、スルフヒドリル、ならびにビニル誘導体またはアナログが挙げられる。いくつかの例では、エンドソーム溶解部分は、Ｎａｉｓｂｉｔｔ ｅｔ ａｌ （１９９７，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒａｐｙ ２８０：８８４－８９３）および米国特許第５，７３６，５５７号に記載される小分子である。

【0305】

いくつかの実施形態では、エンドソーム溶解部分は、ニゲリシンまたはそのコンジュゲート、例えば、葉酸－ニゲリシンのエステルコンジュゲート、葉酸－ニゲリシンのアミドコンジュゲート、または葉酸－ニゲリシンのカルバメートコンジュゲートなどである。いくつかの例では、エンドソーム溶解部分は、Ｒａｎｇａｓａｍｙ， ｅｔ． ａｌ．， ”Ｎｅｗ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｃｏｎｔｅｎｔｓ： ｏｓｍｏｔｉｃ ｌｙｓｉｓ ｖｉａ ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｋ＋／Ｈ＋ ｅｘｃｈａｎｇｅ，” Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ２９：１０４７－１０５９ （２０１８）に記載されるニゲリシンである。

【0306】

リンカー
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるリンカーは、切断可能なリンカーまたは切断不可能なリンカーである。いくつかの例では、リンカーは切断可能なリンカーである。他の例では、リンカーは切断不可能なリンカーである。

【0307】

場合によっては、リンカーは非ポリマーリンカーである。非ポリマーリンカーは、重合プロセスによって生成された単量体の反復単位を含まないリンカーを指す。例示的な非ポリマーリンカーとしては、限定されないが、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル基（例えば、Ｃ_５、Ｃ_４、Ｃ_３、Ｃ_２、またはＣ_１アルキル基）、ホモ二機能性架橋リンカー、ヘテロ二機能性架橋リンカー、ペプチドリンカー、トレースレスリンカー、自壊性リンカー、マレイミドベースのリンカー、またはそれらの組み合わせが挙げられる。場合によっては、非ポリマーリンカーは、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル基（例えば、Ｃ_５、Ｃ_４、Ｃ_３、Ｃ_２、またはＣ_１アルキル基）、ホモ二機能性架橋リンカー、ヘテロ二機能性架橋リンカー、ペプチドリンカー、トレースレスリンカー、自壊性リンカー、マレイミドベースのリンカー、またはそれらの組み合わせを含む。さらなる場合には、非ポリマーリンカーは、２つを超える同じタイプのリンカー、例えば、２つを超えるホモ二機能性架橋リンカー、または２つを超えるペプチドリンカーを含まない。さらなる場合には、非ポリマーリンカーは随意に１つ以上の反応性官能基を含む。

【0308】

いくつかの例では、非ポリマーリンカーは、上に記載されたポリマーを包含しない。いくつかの例では、非ポリマーリンカーは、ポリマー部分Ｃによって包含されるポリマーを包含しない。場合によっては、非ポリマーリンカーはポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）を包含しない。場合によっては、非ポリマーリンカーはＰＥＧを包含しない。

【0309】

いくつかの例では、リンカーはホモ二機能性リンカーを含む。例示的なホモ二機能性リンカーは、限定されないが、Ｌｏｍａｎｔの試薬ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）ＤＳＰ、３’３’－ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロプリオネート（ＤＴＳＳＰ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ）、ジスクシンイミジルタルトレート（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジルタルトレート（スルホＤＳＴ）、エチレングリコビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、Ｎ，Ｎ’－ジスクシンイミジルカルボネート（ＤＳＣ）、ジメチルアジピミデート（ＤＭＡ）、ジメチルピメリミデート（ＤＭＰ）、ジメチルスベリミデート（ＤＭＳ）、ジメチル－３，３’－ジチオビスプロピオンイミデート（ＤＴＢＰ）、１，４－ジ－３’－（２’－ピリジルジチオ）プロピオンアミド）ブタン（ＤＰＤＰＢ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、ハロゲン化アリール含有化合物（ＤＦＤＮＢ）、例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼンまたは１，３－ジフルオロ－４，６－ジニトロベンゼン、４，４’－ジフルオロ－３，３’－ジニトロフェニルスルホン（ＤＦＤＮＰＳ）、ビス－［β－（４－アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル、アジピン酸ジヒドラジド、カルボヒドラジド、ｏ－トルイジン、３，３’－ジメチルベンジジン、ベンジジン、α，α’－ｐ－ジアミノジフェニル、ジヨード－ｐ－キシレンスルホン酸、Ｎ，Ｎ’－エチレン－ビス（ヨードアセトアミド）、または、Ｎ，Ｎ’－ヘキサメチレン－ビス（ヨードアセトアミド）を含む。

【0310】

いくつかの実施形態では、リンカーはヘテロ二機能性リンカーを含む。例示的なヘテロ二機能性リンカーとしては、限定されないが、アミン反応性およびスルフヒドリル架橋リンカー、例えば、Ｎ－スクシンイミジル ３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ｓＰＤＰ）、長鎖Ｎ－スクシンイミジル ３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＬＣ－ｓＰＤＰ）、水溶性の長鎖Ｎ－スクシンイミジル ３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（スルホ－ＬＣ－ｓＰＤＰ）、スクシンイミジルオキシカルボニル－α－メチル－α－（２－ピリジルジチオ）トルエン（ｓＭＰＴ）、スルホスクシンイミジル－６－［α－メチル－α－（２－ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート（スルホ－ＬＣ－ｓＭＰＴ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ｓＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（スルホ－ｓＭＣＣ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢｓ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ－ＭＢ）、Ｎ－スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ｓＩＡＢ）、スルホスクシンイミジル（４－ヨードアクテイル）アミノベンゾエート（スルホ－ｓＩＡＢ）、スクシンイミジル－４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレート（ｓＭＰＢ）、スルホスクシンイミジル－４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレート（スルホ－ｓＭＰＢ）、Ｎ－（γ－マレイミドブチルオキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢｓ）、Ｎ－（γ－マレイミドブチルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（スルホ－ＧＭＢｓ）、スクシンイミジル６－（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサノエート（ｓＩＡＸ）、スクシンイミジル６－［６－（（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサノイル）アミノ］ヘキサノエート（ｓＩＡＸＸ）、スクシンイミジル－４－（（（ヨードアセチル）アミノ）メチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ｓＩＡＣ）、スクシンイミジル６－（（（（４－ヨードアセチル）アミノ）メチル）シクロヘキサン－１－カルボニル）アミノ）ヘキサノエート（ｓＩＡＣＸ）、ｐ－ニトロフェニルヨードアセテート（ＮＰＩＡ）、カルボニル反応性およびスルフヒドリル反応性の架橋リンカー、例えば、４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）、４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシル－ヒドラジド－８（Ｍ２Ｃ２Ｈ）、３－（２－ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）、アミン反応性および光反応性の架橋リンカー、例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル－４－アジドサリチル酸（ＮＨ－ＡｓＡ）、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミジル－４－アジドサリチル酸（スルホ－ＮＨ－ＡｓＡ）、スルホスクシンイミジル－（４－アジドサリチルアミド）ヘキサノエート（スルホ－ＮＨ－ＬＣ－ＡｓＡ）、スルホスクシンイミジル－２－（ρ－アジドサリチルアミド）エチル－１，３’－ジチオプロピオネート（ｓＡｓＤ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル－４－アジドベンゾエート（ＨｓＡＢ）、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミジル－４－アジドベンゾエート（スルホ－ＨｓＡＢ）、Ｎ－スクシンイミジル－６－（４’－アジド－２’－ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（ｓＡＮＰＡＨ）、スルホスクシンイミジル－６－（４’－アジド－２’－ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（スルホ－ｓＡＮＰＡＨ）、Ｎ－５－アジド－２－ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド（ＡＮＢ－ＮＯｓ）、スルホスクシンイミジル－２－（ｍ－アジド－ｏ－ニトロベンズアミド）－エチル－１，３’－ジチオプロピオネート（ｓＡＮＤ）、Ｎ－スクシンイミジル－４（４－アジドフェニル）１，３’－ジチオプロピオネート（ｓＡＤＰ）、Ｎ－スルホスクシンイミジル（４－アジドフェニル）－１，３’－ジチオプロピオネート（スルホ－ｓＡＤＰ）、スルホスクシンイミジル ４－（ρ－アジドフェニル）ブチレート（スルホ－ｓＡＰＢ）、スルホスクシンイミジル ２－（７－アジド－４－メチルクマリン－３－アセトアミド）エチル－１，３’－ジチオプロピオネート（ｓＡＥＤ）、スルホスクシンイミジル ７－アジド－４－メチルクマリン－３－アセテート（スルホ－ｓＡＭＣＡ）、ρ－ニトロフェニルジアゾピルベート（ρＮＰＤＰ）、ρ－ニトロフェニル－２－ジアゾ－３，３，３－トリフルオロプロピオネート（ＰＮＰ－ＤＴＰ）、スルフヒドリル反応性および光反応性の架橋リンカー、例えば、１－（ρ－アジドサリチルアミド）－４－（ヨードアセトアミド）ブタン（ＡｓＩＢ）、Ｎ－［４－（ρ－アジドサリチルアミド）ブチル］－３’－（２’－ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）、ベンゾフェノン－４－ヨードアセトアミド、ベンゾフェノン－４－マレイミドカルボニル反応性および光反応性の架橋リンカー、例えば、ρ－アジドベンゾイルヒドラジド（ＡＢＨ）、カルボキシレート反応性および光反応性の架橋リンカー、例えば、４－（ρ－アジドサリチルアミド）ブチルアミン（ＡｓＢＡ）、ならびにアルギニン反応性および光反応性の架橋リンカー、例えば、ρ－アジドフェニルグリオキサール（ＡＰＧ）が挙げられる。

【0311】

いくつかの例では、リンカーは反応性官能基を含む。場合によっては、反応性官能基は、結合部分に存在する求電子基に反応性の求核基を含む。例示的な求電子基は、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、エノン、ハロゲン化アシル、または酸無水物などのカルボニル基を含む。いくつかの実施形態では、反応性官能基はアルデヒドである。例示的な求核基は、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジドを含む。

【0312】

いくつかの実施形態では、リンカーはマレイミド基を含む。いくつかの例では、マレイミド基はマレイミドスペーサーとも呼ばれる。いくつかの例では、マレイミド基はカプロン酸をさらに包含し、マレイミドカプロイル（ｍｃ）を形成する。場合によっては、リンカーはマレイミドカプロイル（ｍｃ）を含む。場合によっては、リンカーはマレイミドカプロイル（ｍｃ）である。他の例では、マレイミド基は、上に記載されたスクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ｓＭＣＣ）、または、スルホスクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（スルホ－ｓＭＣＣ）などのマレイミドメチル基を含む。

【0313】

いくつかの実施形態では、マレイミド基は自己安定化マレイミドである。いくつかの例では、自己安定化マレイミドは、チオスクシンイミド環加水分解の分子内触媒作用をもたらすために、マレイミドに隣接する塩基性アミノ基を取り込むべくジアミノプロピオン酸（ＤＰＲ）を利用し、それによって、マレイミドがレトロマイケル反応による脱離反応を経験することのないようにする。いくつかの例では、自己安定化マレイミドは、Ｌｙｏｎ，ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｌｆ－ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ ｍａｌｅｉｍｉｄｅｓ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，” Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３２（１０）：１０５９－１０６２（２０１４）に記載されるマレイミド基である。いくつかの例では、リンカーは自己安定化マレイミドを含む。いくつかの例では、リンカーは自己安定化マレイミドである。

【0314】

いくつかの実施形態では、リンカーはペプチド部分を含む。いくつかの例では、ペプチド部分は、少なくとも１、２、３、４、５、または６より多くのアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、ペプチド部分は、最大で１、２、３、４、５、６、７、または８のアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、ペプチド部分は、約２、約３、約４、約５、または約６のアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、ペプチド部分は、切断可能なペプチド部分（例えば、酵素的または化学的に）である。いくつかの例では、ペプチド部分は切断不可能なペプチド部分である。いくつかの例では、ペプチド部分は、Ｖａｌ－Ｃｉｔ（バリン－シトルリン）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ａｒｇ、Ｐｈｅ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ａｒｇ、Ｌｅｕ－Ｃｉｔ、Ｉｌｅ－Ｃｉｔ、Ｔｒｐ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ａｌａ、Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ、またはＧｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙを含む。いくつかの例では、リンカーは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ（バリン－シトルリン）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ａｒｇ、Ｐｈｅ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ａｒｇ、Ｌｅｕ－Ｃｉｔ、Ｉｌｅ－Ｃｉｔ、Ｔｒｐ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ａｌａ、Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ、またはＧｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙなどのペプチド部分を含む。場合によっては、リンカーはＶａｌ－Ｃｉｔを含む。場合によっては、リンカーはＶａｌ－Ｃｉｔである。

【0315】

いくつかの実施形態では、リンカーは安息香酸基またはその誘導体を含む。いくつかの例では、安息香酸基またはその誘導体はパラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）を含む。いくつかの例では、安息香酸基またはその誘導体はγ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を含む。

【0316】

いくつかの実施形態では、リンカーは、任意の組み合わせにおける、マレイミド基、ペプチド部分、および／または、安息香酸基の１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、マレイミド基、ペプチド部分、および／または、安息香酸基の組み合わせを含む。いくつかの例では、マレイミド基はマレイミドカプロイル（ｍｃ）である。いくつかの例では、ペプチド基はｖａｌ－ｃｉｔである。いくつかの例では、安息香酸基はＰＡＢＡである。いくつかの例では、リンカーはｍｃ－ｖａｌ－ｃｉｔ基を含む。場合によっては、リンカーはｖａｌ－ｃｉｔ－ＰＡＢＡ基を含む。さらなる場合には、リンカーはｍｃ－ｖａｌ－ｃｉｔ－ＰＡＢＡ基を含む。

【0317】

いくつかの実施形態では、リンカーは自壊性リンカーまたは自己脱離リンカーである。場合によっては、リンカーは自壊性リンカーである。他の場合には、リンカーは自己脱離リンカー（例えば、環化自己脱離リンカー）である。いくつかの例では、リンカーは、米国特許第９，０８９，６１４号またはＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１５０３８４２６号に記載されるリンカーを含む。

【0318】

いくつかの実施形態では、リンカーは樹状型リンカーである。いくつかの例では、樹状型リンカーは分岐した多機能リンカー部分を含む。いくつかの例では、樹状型リンカーは、ポリヌクレオチドＢ対結合部分Ａのモル比を増加させるために使用される。いくつかの例では、樹状型リンカーはＰＡＭＡＭデンドリマーを含む。

【0319】

いくつかの実施形態では、リンカーは、トレースレスリンカーであり、または切断後に、結合部分Ａ、ポリヌクレオチドＢ、ポリマーＣ、またはエンドソーム溶解部分Ｄへのリンカー部分（例えば、原子またはリンカー基）を残さないリンカーである。例示的なトレースレスリンカーは、限定されないが、ゲルマニウムリンカー、ケイ素リンカー、硫黄リンカー、セレンリンカー、窒素リンカー、リンリンカー、ホウ素リンカー、クロムリンカー、またはフェニルヒドラジドリンカーを含む。場合によっては、リンカーは、Ｈｅｊｅｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｔｒａｃｅｌｅｓｓ ａｒｙｌ－ｔｒｉａｚｅｎｅ ｌｉｎｋｅｒ ｆｏｒ ＤＮＡ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｏｒｇ Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ １１（１５）：２４９３－２４９７ （２０１３）に記載されるようなトレースレスアリール－トリアゼンリンカーである。いくつかの例では、リンカーは、Ｂｌａｎｅｙ，ｅｔ ａｌ．，“Ｔｒａｃｅｌｅｓｓ ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０２：２６０７－２０２４（２００２）に記載されるトレースレスリンカーである。いくつかの例では、リンカーは、米国特許第６，８２１，７８３号に記載されるようなトレースレスリンカーである。

【0320】

いくつかの実施形態では、リンカーは、米国特許第６，８８４，８６９号、第７，４９８，２９８号、第８，２８８，３５２号、第８，６０９，１０５号、または、第８，６９７，６８８号、米国特許公開第２０１４／０１２７２３９号、第２０１３／０２８９１９号、第２０１４／２８６９７０号、第２０１３／０３０９２５６号、第２０１５／０３７３６０号、または、第２０１４／０２９４８５１号、あるいは、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１５０５７６９９号、第ＷＯ２０１４０８０２５１号、第ＷＯ２０１４１９７８５４号、第ＷＯ２０１４１４５０９０号、または、第ＷＯ２０１４１７７０４２号に記載されるリンカーである。

【0321】

いくつかの実施形態では、Ｘ^１とＸ^２はそれぞれ独立して、単結合または非ポリマーリンカーである。いくつかの例では、Ｘ^１とＸ^２はそれぞれ独立して単結合である。場合によっては、Ｘ^１とＸ^２はそれぞれ独立して非ポリマーリンカーである。

【0322】

いくつかの例では、Ｘ^１は単結合または非ポリマーリンカーを含む。いくつかの例では、Ｘ^１は単結合である。いくつかの例では、Ｘ^１は非ポリマーリンカーである。いくつかの例では、リンカーはＣ_１－Ｃ_６アルキル基である。場合によっては、Ｘ^１はＣ_１－Ｃ_６アルキル基、例えば、Ｃ_５、Ｃ_４、Ｃ_３、Ｃ_２、またはＣ_１アルキル基などである。場合によっては、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル基は非置換のＣ_１－Ｃ_６アルキル基である。リンカーの文脈において使用されるように、とりわけ、Ｘ１の文脈において使用されるように、アルキルは、最大で６つの炭素原子を含む飽和した直鎖または分岐鎖の炭化水素ラジカルを意味する。いくつかの例では、Ｘ^１は上に記載されたホモ二機能性リンカーまたはヘテロ二機能性リンカーを含む。場合によっては、Ｘ^１はヘテロ二機能性リンカーを含む。場合によっては、Ｘ^１はｓＭＣＣを含む。他の例では、Ｘ^１は、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル基に随意にコンジュゲートしたヘテロ二機能性リンカーを含む。他の例では、Ｘ^１は、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル基に随意にコンジュゲートしたｓＭＣＣを含む。さらなる例では、Ｘ^１は、上に記載されたホモ二機能性リンカーまたはヘテロ二機能性リンカーを含まない。

【0323】

いくつかの例では、Ｘ^２は単結合またはリンカーである。いくつかの例では、Ｘ^２は単結合である。他の場合には、Ｘ^２はリンカーである。さらなる場合には、Ｘ^２は非ポリマーリンカーである。いくつかの実施形態では、Ｘ^２はＣ_１－Ｃ_６アルキル基である。いくつかの例では、Ｘ^２は上に記載されたホモ二機能性リンカーまたはヘテロ二機能性リンカーである。いくつかの例では、Ｘ^２は上に記載されたホモ二機能性リンカーである。いくつかの例では、Ｘ^２は上に記載されたヘテロ二機能性リンカーである。いくつかの例では、Ｘ^２はマレイミド基、例えば、マレイミドカプロイル（ｍｃ）、または上に記載された自己安定化マレイミド基を含む。いくつかの例では、Ｘ^２はＶａｌ－Ｃｉｔなどのペプチド部分を含む。いくつかの例では、Ｘ^２はＰＡＢＡなどの安息香酸基を含む。さらなる例では、Ｘ^２はマレイミド基、ペプチド部分、および／または、安息香酸基の組み合わせを含む。さらなる例では、Ｘ^２はｍｃ基を含む。さらなる例では、Ｘ^２はｍｃ－ｖａｌ－ｃｉｔ基を含む。さらなる例では、Ｘ^２はｖａｌ－ｃｉｔ－ＰＡＢＡ基を含む。さらなる例では、Ｘ^２はｍｃ－ｖａｌ－ｃｉｔ－ＰＡＢＡ基を含む。

【0324】

使用の方法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載された抗トランスフェリン受容体抗体の使用によって、対象となる標的部位にペイロードを送達する方法が本明細書に記載されている。いくつかの例では、対象となる標的部位は、疾患または疾病に関連付けられる原因となるタンパク質を過剰発現する細胞である。いくつかの例では、対象となる標的部位は、非機能的なタンパク質、または、疾患あるいは疾病につながる発現が低下したタンパク質をコードする正しく処理されていないｍＲＮＡを含む細胞である。いくつかの例では、対象となる標的部位は腫瘍部位である。さらなる例では、対象となる標的部位は脳にある部位である。

【0325】

いくつかの実施形態では、過剰発現されたタンパク質を特徴とする疾患または障害を処置する方法が本明細書に記載される。いくつかの例では、疾患または障害は筋萎縮症である。いくつかの例では、疾患または障害は筋緊張性ジストロフィーである。

【0326】

１つの実施形態では、筋萎縮症は筋力の著しい喪失を指す。筋力の著しい喪失とは、対照被験体の同じ筋組織と比較して、被験体の病気の、損傷した、または使用していない筋組織の強度の低下を意味する。ある実施形態において、筋力の著しい喪失は、対照被験体の同じ筋組織と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、またはそれ以上の強度の低下である。別の実施形態では、筋力の著しい喪失とは、非使用期間前の同じ被験体の同じ筋組織の筋力と比較して、使用していない筋組織の強度の低下を意味する。ある実施形態において、筋肉強度の著しい喪失は、非使用期間前の同じ被験体の同じ筋組織の筋強度と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、またはそれ以上の低下である。

【0327】

別の実施形態では、筋萎縮症は筋肉量の著しい喪失を指す。筋肉量の著しい喪失とは、対照被験体の同じ筋組織と比較して、被験体の病気の、損傷した、または使用していない筋組織の筋肉体積の減少を意味する。ある実施形態において、筋肉体積の著しい喪失は、対照被験体の同じ筋組織と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、またはそれ以上である。別の実施形態では、筋肉量の著しい喪失とは、非使用期間前の同じ被験体の同じ筋組織の筋肉体積と比較して、使用していない筋組織の筋肉体積の低下を意味する。ある実施形態において、筋肉組織の著しい喪失は、非使用期間前の同じ被験体の同じ筋組織の筋肉体積と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、またはそれ以上である。筋肉体積は、磁気共鳴撮像（例えば、筋肉体積／断面積（ＣＳＡ）ＭＲＩ方法による）によるなどして筋肉の断面積を評価することにより、随意に測定される。

【0328】

いくつかの実施形態では、筋萎縮症は、悪液質、脱神経、ミオパシー、運動ニューロン疾患、糖尿病、慢性閉塞性肺疾患、肝疾患、うっ血性心不全、慢性腎不全、慢性感染症、敗血症、絶食、サルコペニア、グルココルチコイド関連筋萎縮症、または廃用性関連筋萎縮を含み、または、これらに関連付けられる。

【0329】

悪液質とは、基礎疾患によって引き起こされる筋肉の後天性の加速度的に失われていくことである。いくつかの例では、悪液質は、栄養では回復させることができない体重の喪失を指し、一般的には、基礎疾患、例えば、癌、ＣＯＰＤ、ＡＩＤＳ、心不全などに関連付けられる。悪液質が末期癌の患者で見られるとき、それは「癌性悪液質」と呼ばれる。癌性悪液質は、進行癌の患者の大部分に影響を与え、処置耐性、治療に対する反応、生活の質、および生存期間の減少に関連付けられる。いくつかの例では、癌性悪液質は、体脂肪量の喪失を伴ってまたは伴わずに、骨格筋量の進行中の喪失を特徴とする他因子症候群として定義され、従来の栄養学的なサポートでは完全には回復できず、進行性の機能障害を引き起こしかねない。場合によっては、骨格筋の喪失は、癌性悪液質で最も重要な事象であると思われる。加えて、癌性悪液質の分類は、診断基準が、体重減少が悪液質のプロセスのシグナル事象であることだけでなく、患者の当初の蓄え、低いＢＭＩ、または低レベルの筋肉質も考慮されなければならないと提唱している。

【0330】

除神経は、臓器と中枢神経系との間の神経線維の部分的または完全な遮断を伴う末梢性の運動ニューロンに対する損傷であり、神経伝導と運動ニューロン発火の遮断を引き起こし、その結果、骨格筋の収縮性（ｃｏｎｔｒａｃｔａｂｉｌｉｔｙ）が妨げられる。神経機能のこの喪失は、運動ニューロン単位全体の喪失により局在化または一般化される。骨格筋が収縮できないと、筋萎縮症が引き起こされる。いくつかの例では、除神経は、変性、代謝性、または炎症性の神経障害（例えば、ギランバレー症候群、末梢神経障害、または環境毒物あるいは薬物への暴露）に関連付けられ、あるいはこれらの結果として関連付けられる。さらなる例では、除神経は肉体損傷、例えば、外科手術に関連付けられる。

【0331】

ミオパシーは筋肉の疾患を記載する総称である。いくつかの例では、ミオパシーは筋緊張症、先天性ミオパシー、例えば、ネマリンミオパシー、マルチコア／ミニコアミオパシー、および筋細管（中心核）ミオパシー、ミトコンドリアミオパシー、家族性周期性四肢麻痺、炎症性ミオパシー、例えば、グリコーゲンまたは脂質蓄積疾患によって引き起こされた代謝性ミオパシー、皮膚筋炎、多発性筋炎、封入体筋炎、骨化性筋炎、横紋筋融解症、および、ミオグロビン尿症を含む。いくつかの例では、ミオパシーは、筋ジストロフィー症候群、例えば、デュシェンヌ型、ベッカー型、筋緊張性、顔面肩甲上腕型、エメリ・ドレフュス型、眼咽頭型、肩甲上腕骨型、肢帯型、福山型、先天性筋のジストロフィー、または遺伝的な遠位型ミオパシーなどによって引き起こされる。いくつかの例では、ミオパシーは筋緊張性ジストロフィー（例えば、筋緊張性ジストロフィー１型またはＤＭ１）によって引き起こされる。いくつかの例では、ミオパシーはＤＭ１によって引き起こされる。

【0332】

運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）は、身体の随意筋を制御する細胞である運動ニューロンに影響を与える神経異常を包含する。例示的な運動ニューロン疾患は、限定されないが、成人の運動ニューロン疾患、乳児脊髄性筋萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、若年性脊髄性筋萎縮症、多巣性伝導ブロックによる自己免疫性の運動ニューロパチー、脳卒中または脊髄損傷による麻痺、あるいは外傷による骨格の固定化を含む。

【0333】

糖尿病（真性糖尿病、ＤＭ）は、１型糖尿病、２型糖尿病、３型糖尿病、４型糖尿病、二重糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤ）、妊娠性糖尿病、新生児真性糖尿病（ＮＤＭ）、若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）、ウルフラム症候群、アルストレーム症候群、糖尿病前症、または尿崩症を含む。非インスリン依存性糖尿病とも呼ばれる２型糖尿病は、すべての糖尿病症例の９５％を占める最も一般的な型の糖尿病である。いくつかの例では、２型糖尿病は、膵臓のβ細胞機能障害によるインスリン抵抗性を含む因子の組み合わせによって引き起こされ、結果として高血圧グルコース濃度に結びつく。場合によっては、グルカゴンレベルの増加が肝臓を刺激して、異常な量の必要のないグルコースを生成させ、これが高血圧グルコース濃度の原因となる。インスリン依存性糖尿病とも呼ばれる１型糖尿病は、すべての糖尿病症例の約５％から１０％を含む。１型糖尿病は、Ｔ細胞が膵臓中のインスリン産生β細胞を攻撃して破壊する自己免疫疾患である。いくつかの実施形態では、１型糖尿病は遺伝子と環境要因によって引き起こされる。４型糖尿病は、６５歳以上の糖尿病患者の約２０％に影響を与える型の糖尿病である。いくつかの実施形態では、４型糖尿病は、年齢に関連するインスリン耐性を特徴とする。３型糖尿病は、脳のインスリン抵抗性に起因するアルツハイマー病の用語として使用されている。

【0334】

慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、長期的な呼吸障害と空気の流れの悪さを特徴とする閉塞性肺疾患の一種である。慢性気管支炎と気腫は２つの異なる型のＣＯＰＤである。

【0335】

肝疾患（または肝臓病）は、線維症、肝硬変、肝炎、アルコール性肝臓疾患、脂肪肝、遺伝性疾患、または原発性肝癌を含む。

【0336】

うっ血性心不全は、心臓が身体の組織に対して十分な血液と酸素を送ることができない状態である。

【0337】

慢性腎不全または慢性腎臓病は、時間の経過とともに腎臓機能が徐々に失われていくことを特徴とする疾病である。

【0338】

いくつかの実施形態では、ＡＩＤＳなどの慢性感染症はさらに、筋萎縮症を引き起こす。

【0339】

敗血症は、組織損傷、臓器機能不全、および／または死亡に結びつく感染症に対する免疫応答である。

【0340】

絶食は、一定の期間、一部またはすべての食物、飲み物、あるいはその両方を自発的に断つこと、あるいは、減らすことである。

【0341】

サルコペニアとは、数ヶ月から数年にわたって徐々に筋肉量や筋力が低下していくことを特徴とする、通常の老化の過程における筋萎縮症の継続的なプロセスである。通常の老化プロセスとは、本明細書では、骨格筋神経変性を促す障害および疾患の存在によって影響を受けることも加速されることもない老化プロセスを意味する。

【0342】

いくつかの例では、グルココルチコイドを用いる処置はさらに、筋萎縮症を引き起こす。例示的なグルココルチコイドは、限定されないが、コルチゾール、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、およびプレドニゾロンを含む。

【0343】

廃用性に関連する筋萎縮症は、四肢が固定される結果として生じる（例えば、四肢または関節の骨折、あるいは殿部または膝の置換手術などの整形手術による）。本明細書で使用されるように、「固定化」または「固定された」とは、長期間（例えば、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、またはそれ以上）、四肢、筋肉、骨、腱、関節、または他の身体部分の運動の部分的または完全な制約を指す。いくつかの例では、固定化の期間は、入浴、外部装置の交換、または外部装置の調整など、短期間または短時間の拘束されない動きを含む。四肢の固定化は、限定されないが、装具、スリング、ギプス、包帯、およびスプリント（これらのいずれも随意に、限定されないが、布、ガーゼ、ガラス線維、プラスチック、石膏、または金属を含む硬質材料または軟質材料で構成される）を含む任意の様々な外部装置と、外科的に移植されたスプリント、プレート、装具などを含む任意の様々な内部装置によって実施される。四肢の固定化の文脈において、動きの制約は、単関節または多関節（例えば、肩関節または股関節などの単関節、橈骨手根関節などの複合関節、および、限定されないが、以下の１つ以上を含む、膝関節などの複関節：手の関節、肩関節、肘関節、手首の関節、補助関節、胸鎖関節、椎骨の関節、顎関節、仙腸関節、股関節、膝関節、および足の関節）、単一の腱または靭帯あるいは複数の腱または靭帯（例えば、限定されないが、以下の１つ以上を含む：前十字靱帯、後十字靱帯、回旋腱板腱、肘と膝の内側側副靱帯、手の屈筋腱、足首の外側靱帯、および顎または顎関節の腱と靭帯）、単一の骨または複数の骨（例えば、限定されないが、以下の１つ以上を含む：頭蓋、下顎、鎖骨、肋骨、橈骨、尺骨、上腕骨、骨盤、仙骨、大腿骨、膝蓋骨、指骨、手根骨、中手骨、足根骨、中足骨、腓骨、脛骨、肩甲骨、および椎骨）、単一の筋肉または複数の筋肉（例えば、限定されないが、以下の１つ以上を含む：広背筋、僧帽筋、三角筋、胸筋、二頭筋、三頭筋、外腹斜筋、腹筋、大殿筋、大腿屈筋、大腿四頭筋、腓腹筋、および横隔膜）、一本の四肢または複数の四肢、腕と脚の１つ以上）、あるいは、骨格筋系全体またはその一部（例えば、全身ギプスまたはスパイカギプスの場合）を含む。

【0344】

筋緊張性ジストロフィーは、２つの主要な型：筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）および筋緊張性ジストロフィー２型（ＤＭ２）を含む多全身系神経筋疾患である。ＤＭ１は、遺伝子ＤＭプロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）中での優勢遺伝性の「ＣＴＧ」反復拡張によって引き起こされ、これは、ｍＲＮＡへ転写されるとき、タンパク質のＭｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ－ｌｉｋｅ（ＭＢＮＬ）ファミリーに高い親和性で結合するヘアピンを形成する。ＭＢＮＬタンパク質は、転写後のスプライシングに関与し、ポリアデニル化（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｎ）部位の制御とＭＢＮＬタンパク質機能の喪失は、核病巣の下流への蓄積を引き起こし、ミススプライシング事象を増加させ、その後、筋緊張症と他の臨床症状を引き起こす。

【0345】

いくつかの実施形態では、誤ってスプライシングされたｍＲＮＡを特徴とする疾患または障害を処置する方法が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗トランスフェリン受容体抗体は、エクソンスキッピングまたはエクソンインクルージョンを誘発するために、誤ってスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物の部位にポリ核酸分子を送達する。

【0346】

いくつかの例では、不適切にスプライシングされた、または、部分的にスプライシングされたｍＲＮＡに起因する疾患または障害としては、限定されないが、神経筋疾患、遺伝病、癌、遺伝性疾患、または心血管疾患が挙げられる。

【0347】

いくつかの例では、遺伝病または遺伝障害は、常染色体優性障害、常染色体劣性障害、Ｘ連鎖優性障害、Ｘ連鎖劣性障害、Ｙ連鎖障害、ミトコンドリア遺伝病、または多因子あるいは多遺伝子障害を含む。

【0348】

いくつかの例では、高コレステロール血症などの心血管疾患は、不適切にスプライシングされた、または、部分的にスプライシングされたｍＲＮＡに起因する。高コレステロール血症では、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）のエクソン１２中の一塩基多型がエクソンスキッピングを促進することが示されている。

【0349】

いくつかの例では、不適切にスプライシングされた、または、部分的にスプライシングされたｍＲＮＡは、癌を引き起こす。例えば、不適切にスプライシングされた、または、部分的にスプライシングされたｍＲＮＡは、限定されないが、増殖、運動性、および薬物応答を含む、癌に関与する細胞のプロセスに影響を与える。いくつかの例では、固形癌または血液の癌がある。いくつかの例では、癌は、膀胱癌、肺癌、脳癌、黒色腫、乳癌、非ホジキンリンパ腫、子宮頚癌、卵巣癌、大腸癌、膵臓癌、食道癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌、白血病、甲状腺癌、肝臓癌、または子宮癌である。

【0350】

いくつかの例では、不適切にスプライシングされた、または、部分的にスプライシングされたｍＲＮＡは、神経筋疾患または障害を引き起こす。例示的な神経筋疾患としては、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、または筋緊張性ジストロフィーなどの筋ジストロフィーが挙げられる、いくつかの例では、筋ジストロフィーは遺伝的である。いくつかの例では、筋ジストロフィーは自然突然変異によって引き起こされる。ベッカー型筋ジストロフィーとデュシェンヌ型筋ジストロフィーは、タンパク質ジストロフィンをコードするＤＭＤ遺伝子中の突然変異に関与していることが示されてきた。顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーは二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）遺伝子中の突然変異に関与していることが示されている。

【0351】

いくつかの例では、不適切にスプライシングされた、または、部分的にスプライシングされたｍＲＮＡは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを引き起こす。デュシェンヌ型筋ジストロフィーは重度の筋衰弱を引き起こし、機能的なジストロフィンの産生を消失させるＤＭＤ遺伝子中の突然変異によって引き起こされる。いくつかの例では、デュシェンヌ型筋ジストロフィーは、ＤＭＤ遺伝子中のエクソンの突然変異の結果である。いくつかの例では、デュシェンヌ型筋ジストロフィーは、ＤＭＤ遺伝子中のエクソン１、２、３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、および７９の少なくとも１つの突然変異の結果である。いくつかの例では、デュシェンヌ型筋ジストロフィーは、ＤＭＤ遺伝子中のエクソン３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、および６３の少なくとも１つの突然変異の結果である。いくつかの例では、デュシェンヌ型筋ジストロフィーは、ＤＭＤ遺伝子中のエクソン８、２３、３５、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、および５５の少なくとも１つの突然変異の結果である。いくつかの例では、多くのエクソンが突然変異する。例えば、エクソン４８－５０の突然変異は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー患者において一般的である。いくつかの例では、デュシェンヌ型筋ジストロフィーはエクソン５１の突然変異の結果である。いくつかの例では、デュシェンヌ型筋ジストロフィーはエクソン２３の突然変異の結果である。いくつかの例では、突然変異は１つまたは複数のエクソンの欠失を含む。いくつかの例では、突然変異は１つまたは複数のエクソンの重複を含む。いくつかの例では、突然変異はエクソンの点突然変異に関与している。例えば、患者の中にはＤＭＤ遺伝子のエクソン５１のナンセンス点突然変異を抱えているものもいることが示されている。

【0352】

医薬製剤
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される医薬製剤は、限定されないが、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内）、経口、鼻腔内、頬側、直腸、または経皮の投与経路を含む、複数の投与経路によって、被験体に投与される。いくつかの例では、本明細書に記載される医薬組成物は、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、腹腔内、髄腔内、大脳内、脳室内、または頭蓋内）投与のために製剤化される。他の例では、本明細書に記載される医薬組成物は、経口投与のために製剤化される。また他の例では、本明細書に記載される医薬組成物は、経鼻投与のために製剤化される。

【0353】

いくつかの実施形態では、医薬製剤は、限定されないが、水性液体分散液、自己乳化分散液、固溶体、リポソーム分散液、エアロゾル、固形剤形、粉末、即時放出製剤、制御放出製剤、速溶製剤、錠剤、カプセル、丸剤、遅延放出製剤、持続放出製剤、パルス放出製剤、多粒子製剤（例えば、ナノ粒子製剤）、および即時放出と制御放出の混合製剤を含む。

【0354】

いくつかの例では、医薬製剤は多粒子製剤を含む。いくつかの例では、医薬製剤はナノ粒子製剤を含む。いくつかの例では、ナノ粒子は、ｃＭＡＰ、シクロデキストリン、または脂質を含む。場合によっては、ナノ粒子は、固体脂質ナノ粒子、ポリマーナノ粒子、自己乳化ナノ粒子、リポソーム、マイクロエマルジョン、またはミセル溶液を含む。さらなる例示的なナノ粒子としては、限定されないが、常磁性ナノ粒子、超常磁性ナノ粒子、金属ナノ粒子、フラーレン様材料、無機ナノチューブ、デンドリマー（共有結合した金属キレートを有するものなど）、ナノファイバー、ナノホーン、ナノオニオン、ナノロッド、ナノロープ、および量子ドットが挙げられる。いくつかの例では、ナノ粒子は、金属ナノ粒子、例えば、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、イットリウム、ジルコニウム、ニオブ、モリブデン、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、銀、カドミウム、ハフニウム、タンタル、タングステン、レニウム、オスミウム、イリジウム、白金、金、ガドリニウム、アルミニウム、ガリウム、インジウム、スズ、タリウム、鉛、ビスマス、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウム、リチウム、ナトリウム、カリウム、ホウ素、シリコン、リン、ゲルマニウム、ヒ素、アンチモン、およびこれらの組み合わせ、その合金またはオキシドのナノ粒子である。

【0355】

いくつかの例では、ナノ粒子は、コア、または、コアシェルナノ粒子のような、コアおよびシェルを含む。

【0356】

いくつかの例では、ナノ粒子は、（例えば、本明細書に記載されるポリ核酸分子または結合部分の１つ以上との）機能要素の結合のために分子でさらにコーティングされる。いくつかの例では、コーティングは、硫酸コンドロイチン、硫酸デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、アルギン酸、ペクチン、カラギーナン、フコイダン、アガロペクチン、ポルフィラン、カラヤゴム、ジェランガム、キサンタンガム、ヒアルロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン、キチン（またはキトサン）、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、リゾチーム、チトクロムＣ、リボヌクレアーゼ、トリプシノゲン、キモトリプシノーゲン、α－キモトリプシン、ポリリシン、ポリアルギニン、ヒストン、プロタミン、オバルブミン、またはデキストリンあるいはシクロデキストリンを含む。いくつかの例では、ナノ粒子はグラフェンコーティングされたナノ粒子を含む。

【0357】

場合によっては、ナノ粒子は、約５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、または１００ｎｍ未満の少なくとも１つの寸法を有する。

【0358】

いくつかの例では、ナノ粒子製剤は、常磁性ナノ粒子、超常磁性ナノ粒子、金属ナノ粒子、フラーレン様材料、無機ナノチューブ、デンドリマー（共有結合した金属キレートを有するものなど）、ナノファイバー、ナノホーン、ナノオニオン、ナノロッド、ナノロープ、または量子ドットを含む。いくつかの例では、本明細書に記載されるポリ核酸分子または結合部分は、ナノ粒子に直接的または間接的にコンジュゲートする。いくつかの例では、本明細書に記載される少なくとも１、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上のポリ核酸分子または結合部分は、ナノ粒子に直接的または間接的にコンジュゲートする。

【0359】

いくつかの実施形態では、医薬製剤は、送達ベクター、例えば、細胞へのポリ核酸分子の送達のための組換えベクターを含む。いくつかの例では、組換えベクターはＤＮＡプラスミドである。他の例では、組換えベクターはウイルスベクターである。例示的なウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアルファウイルスに由来するベクターを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子を発現することができる組換えベクターは、標的細胞中での安定した発現をもたらす。さらなる例では、ポリ核酸分子の一時的発現をもたらすウイルスベクターが使用される。

【0360】

いくつかの実施形態では、医薬製剤は、本明細書に開示される組成物との適合性と所望の剤形の放出プロファイル特性とに基づいて選択された担体または担体材料を含む。例示的な担体材料としては、例えば、結合剤、懸濁剤、崩壊剤、充填剤、界面活性剤、可溶化剤、安定化剤、潤滑剤、湿潤剤、希釈剤などが挙げられる。薬学的に適合可能な担体材料としては、限定されないが、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、マルトデキストリン、グリセリン、ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、コレステロール、コレステロールエステル、カゼイン酸ナトリウム、大豆レシチン、タウロコール酸、ホスファチジルコリン、塩化ナトリウム、リン酸三カルシウム、リン酸二カリウム、セルロースおよびセルロースコンジュゲート、糖ステアロイル乳酸ナトリウム（ｓｕｇａｒｓ ｓｏｄｉｕｍ ｓｔｅａｒｏｙｌ ｌａｃｔｙｌａｔｅ）、カラギーナン、モノグリセリド、ジグリセリド、α化デンプンなどが挙げられる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｎｉｎｅｔｅｅｎｔｈ Ｅｄ （Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．： Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９５）； Ｈｏｏｖｅｒ， Ｊｏｈｎ Ｅ．， Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ １９７５； Ｌｉｂｅｒｍａｎ， Ｈ．Ａ． ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎ， Ｌ．， Ｅｄｓ．， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， １９８０、およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｅｄ． （Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ１９９９）を参照。

【0361】

いくつかの例では、医薬製剤はさらに、酢酸、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸、および、塩酸などの酸、水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、およびトリスヒドロキシメチルアミノメタンなどの塩基、ならびに、クエン酸塩／デキストロース、重炭酸ナトリウム、および塩化アンモニウムなどの緩衝剤を含む、ｐＨ調節剤または緩衝剤をさらに含む。このような酸、塩基、および緩衝液は、組成物のｐＨを許容可能な範囲で維持するのに必要な量で含まれる。

【0362】

いくつかの例では、医薬製剤は、組成物の浸透圧を許容可能な範囲にするのに必要な量の１つ以上の塩を含む。こうした塩は、ナトリウム、カリウム、またはアンモニウムのカチオン、および塩化物、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸水素塩、硫酸塩、チオ硫酸塩、または重亜硫酸塩のアニオンを含み、適切な塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、および、硫酸アンモニウムを含む。

【0363】

治療レジメン
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は治療用途のために投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１日に１回、１日に２回、１日に３回、またはそれ以上投与される。医薬組成物は、毎日、１日おき、週５日、週１回、１週おき、月２週間、月３週間、月１回、月２回、月３回、またはそれ以上投与される。医薬組成物は、少なくとも１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１８か月、２年、３年、またはそれ以上の間、投与される。

【0364】

いくつかの実施形態では、１つ以上の医薬組成物は、同時に、順次、または一定の時間間隔で投与される。いくつかの実施形態では、１つ以上の医薬組成物が同時に投与される。場合によっては、１つ以上の医薬組成物が順次投与される。さらなる場合には、１つ以上の医薬組成物は、一定の時間間隔で投与される（例えば、第１の医薬組成物の第１回の投与は１日目であり、その後、少なくとも第２の医薬組成物の投与前に少なくとも１、２、３、４、５日またはそれ以上の間隔を空ける）。

【0365】

いくつかの実施形態では、２つ以上の様々な医薬組成物が同時投与される。いくつかの例では、２つ以上の異なる医薬組成物が同時に同時投与される。場合によっては、２つ以上の異なる医薬組成物は、投与間の時間的な隔たりなく、順次、同時投与される。他の場合には、２つ以上の異なる医薬組成物は、投与間に約０．５時間、１時間、２時間、３時間、１２時間、１日、２日の隔たりをあけて、順次、同時投与される。

【0366】

患者の状態が改善している場合には、医師の判断で、組成物の投与は継続的に行われ、代替的に、投与されている組成物の用量は、一時的に減らされるか、または特定の期間、一時的に中断される（つまり、「休薬期間」）。いくつかの例では、休薬期間の長さは、ほんの一例として、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１２日、１５日、２０日、２８日、３５日、５０日、７０日、１００日、１２０日、１５０日、１８０日、２００日、２５０日、２８０日、３００日、３２０日、３５０日、または３６５日を含む、２日～１年の間で変わる。休薬期間の用量の減少は、ほんの一例として、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％を含む、１０％～１００％である。

【0367】

いったん患者の状態が改善すると、必要に応じて維持用量が投与される。その後、投与量または投与頻度、あるいはその両方は、症状に応じて、改善された疾患、障害、または疾病が保持されるレベルにまで減らすことができる。

【0368】

いくつかの実施形態では、このような量に対応する所定の薬剤の量は、特定の化合物、疾患の重症度、処置を必要としている被験体または宿主の独自性（例えば、体重）などの要因に左右されて変動するが、それにもかかわらず、例えば、投与されている特定の薬剤、投与経路、および処置されている被験体または宿主を含む、症例を取り囲む特定の環境に従って、当該技術分野で既知の手法で日常的に判定される。いくつかの例では、所望の用量は一回量で、または同時に（あるいは短時間にわたって）、または適切な間隔を置いて投与された分割量、例えば、１日当たり２、３、４回またはそれ以上の副用量（ｓｕｂ－ｄｏｓｅｓ）として、都合よく提示される。

【0369】

個々の処置レジメンに関する変数の数が大きいため、前述の範囲は単なる示唆的なものに過ぎず、これらの推奨値から大きく逸脱することは珍しいことではない。そのような投与量は、限定されないが、使用される化合物の活性、処置される疾患または疾病、投与の様式、個々の被験体の必要条件、処置されている疾患または疾病の重症度、および医師の判断を含む、多くの変数に依存して変更される。

【0370】

いくつかの実施形態では、こうした治療レジメンの毒性と治療の有効性は、限定されないが、ＬＤ５０（母集団の５０％に致死的な用量）と、ＥＤ５０（母集団の５０％に治療上有効な用量）の決定を含む、細胞培養または実験動物における標準的な製薬手順によって決定される。毒性効果と治療効果との間の用量比が治療指数であり、これは、ＬＤ５０とＥＤ５０との間の比として表される。高い治療指数を示す化合物が好ましい。細胞培養アッセイと動物研究から得られたデータは、ヒトで使用される一連の投与量を製剤化するのに使用される。こうした化合物の投与量は、最小限の毒性を有するＥＤ５０を含む一連の循環濃度内に位置するのが好ましい。投与量は、使用される剤形と利用される投与経路に応じて、この範囲内で変わる。

【0371】

キット／製品
特定の実施形態では、本明細書に記載される１つ以上の組成物と方法とともに使用されるキットおよび製品が本明細書で開示される。このようなキットは、バイアル、チューブなどの１つ以上の容器を収容するために仕切られた運搬装置、包装容器、または容器を含み、容器の各々は、本明細書に記載されている方法で使用される別の要素の１つを含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、注射器、および試験管を含む。１つの実施形態では、容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成される。

【0372】

本明細書で提供される製品は包装材料を含む。製薬用包装材料の例としては、限定されないが、ブリスターパック、ボトル、チューブ、バッグ、容器、ボトル、および選択された製剤と意図した投与および処置の様式に適する任意の包装材料が挙げられる。

【0373】

例えば、容器は、抗トランスフェリン受容体抗体と、随意に、本明細書に記載された１つ以上の標的核酸分子とを含む。そのようなキットは随意に、識別用の記載またはラベル、あるいは本明細書に記載される方法における使用に関する説明書を含む。

【0374】

キットは典型的には、内容物および／または使用説明書を列挙するラベルと、使用説明書を備えた添付文書とを含んでいる。説明書のセットも通常含まれる。

【0375】

１つの実施形態では、ラベルは容器上にあるか、容器に付属する。１つの実施形態では、ラベルを形成する文字、数字、または他の表示が容器自体に貼り付けられ、成形され、または刻まれている場合は、ラベルは容器上にある。ラベルは、例えば、添付文書として、容器を保持するレセプタクルまたは運搬装置内に存在場合には、容器に付属する。１つの実施形態では、ラベルは、内容物が特定の治療用途に用いられるべきものであるということを示すために使用される。ラベルは、例えば、本明細書に記載される方法などで、内容物の使用方法も示している。

【0376】

特定の実施形態では、医薬組成物は、本明細書で提供される化合物を含む１つ以上の単位剤形を含むパックまたはディスペンサー装置で提示される。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属ホイルまたはプラスチックホイルを含む。１つの実施形態では、パックまたはディスペンサー装置には、投与のための説明書が添付してある。１つの実施形態では、パックまたはディスペンサーには、医薬品の製造、使用、または販売を管理する政府機関によって規定された形態の容器に付属の通知書も添付してあり、この通知書は、ヒトまたは動物への投与のための薬物の形態に関して政府機関の承認を反映するものである。このような通知書は、例えば、処方薬または承認された添付文書に関して、米国食品医薬品局により承認されたラベルである。１つの実施形態では、適合する医薬担体で製剤化される本明細書で提供される化合物を含む組成物も調製され、適切な容器に入れられ、示された疾病の処置のためにラベルが付けられる。

【0377】

特定の用語
他に定義されていない限り、本明細書で使用されているすべての技術的および科学的用語は、主張された主題が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。前述の一般的な記載および以下の詳細な記載は、例示的かつ説明的なものに過ぎず、任意の主題に限定されるものではないことが理解されよう。本出願では、単数の使用は、特別に別記しない限り複数を含む。明細書および添付の請求項内で用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他のことを定めていない限り、複数の指示対象を含む。本出願において、「または」の使用は、特に明記しない限り、「および／または」を意味する。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語の使用は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」といった他の形態と同じく、限定的なものではない。

【0378】

本明細書で使用されるように、範囲と量は、「約」特定の値または範囲として表現可能である。「約」は正確な量も含んでいる。したがって、「約５μＬ」は、「約５μＬ」と「５μＬ」も意味する。一般に、「約」という用語は、実験誤差内であると予想されることになる量を含んでいる。

【0379】

本明細書で使用されている段落の見出しは、整理を目的としたもの過ぎず、記載されている主題を限定するものとして解釈されるべきではない。

【0380】

「抗体」および「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同じ構造特徴を有する糖タンパク質である。これらの用語は同義的に使用される。いくつかの例では、免疫グロブリンの抗原特異性は既知である。

【0381】

「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、完全に組み立てられた抗体、抗原を結合することができる抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、単鎖抗体、ダイアボディ、抗体キメラ、ハイブリッド抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体など）、および前述のものを含む組換えペプチドを包含する。

【0382】

本明細書で使用されるように、「モノクローナル抗体」および「ｍＡｂ」という用語は、抗体の実質的に均質な集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在することもある起こりうる自然発生突然変異を除いて、同一である。

【0383】

「天然の（Ｎａｔｉｖｅ）抗体」および「天然の免疫グロブリン」は通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は１つの共有結合のジスルフィド結合により重鎖に結合するが、その一方で、ジスフィルド結合の数は、異なる免疫グロブリンのアイソタイプの重鎖の中で変動する。重鎖と軽鎖はそれぞれ規則的に距離をおいた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は一方の端部に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、その後に多くの定常ドメインを有する。各軽鎖は一方の端部に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、もう一方の端部に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは重鎖の最初の定常ドメインと位置合わせされ、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと位置合わせされる。特定のアミノ酸残基は、軽鎖および重鎖の可変ドメインの間に界面を形成すると考えられている。

【0384】

本明細書で使用されるように、「可変」という用語は、可変ドメインの特定の部分が抗体中の配列で大きく異なるという事実を指す。可変領域は抗原結合特異性を付与する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメイン全体に均一に分布していない。可変性は、双方とも軽鎖および重鎖の可変性ドメインにある、相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つの区域に集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）領域と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々、４つのＦＲ領域を含み、その大部分がβ－プリーツシート構成を採用し、ループ接続を形成する３つのＣＤＲによって接続され、場合によっては、β－プリーツシート構成の一部を形成する。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲ領域によって近接して共に保持され、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１） ＮＩＨ ＰｕｂＬ．Ｎｏ．９１－３２４２，Ｖｏｌ．Ｉ，ｐａｇｅｓ ６４７－６６９を参照）。定常ドメインは、抗体を抗原に結合することに直接関与しないが、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合、抗体依存性細胞傷害への抗体の関与、補体依存性細胞傷害の導入、および肥満細胞脱顆粒などの様々なエフェクター機能を呈する。

【0385】

本明細書で使用されるように、「超可変領域」という用語は、本明細書で使用される時、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基２４－３４（Ｌ１）、５０－５６（Ｌ２）、および８９－９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおける３１－３５（Ｈ１）、５０－６５（Ｈ２）、および９５－１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ．）、ならびに／あるいは、「超可変ループ」からのアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基２６－３２（Ｌ１）、５０－５２（Ｌ２）、および９１－９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおける（Ｈ１）、５３－５５（Ｈ２）、および９６－１０１（１３）；Ｃｌｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， １９６：９０１－９１７）を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書でみなされるように、超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。

【0386】

「抗体フラグメント」は、無傷の抗体の一部、好ましくは、無傷の抗体の抗原結合または可変領域を含む。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント、ダイアボディ、線状抗体（Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １０：１０５７－１０６２）、単鎖抗体分子、および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体を含む。抗体のパパイン消化は、各々が単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメントと、その名前が容易に結晶させる能力を反映している残基「Ｆｃ」フラグメントとを生成する。ペプシン処置により、２つの抗原結合部位を有するとともに依然として抗原を架橋結合することができるＦ（ａｂ’）２フラグメントが生成される。

【0387】

「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および結合部位を含む小さな抗体フラグメントである。この領域は、緊密な非共有結合的会合における、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌ二量体の表面上の抗原結合部位を定義するために、この構造内において、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用する。まとめて、６つのＣＤＲが抗体に対する抗原結合特異性を付与する。しかしながら、結合部位全体よりも親和性は低いが、１つの可変ドメイン（または、抗原に特異的なわずか３つのＣＤＲしか含まないＦｖの半分）でも、抗原を認識して結合する能力を有している。

【0388】

Ｆａｂフラグメントは、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１）も含む。Ｆａｂフラグメントは、抗体ヒンジ領域の１つ以上のシステインを含む、重鎖Ｃ_Ｈ１ドメインのカルボキシ末端における少数の残基の添加により、Ｆａｂ’フラグメントとは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有しているＦａｂ’に関する本明細書での命名である。Ｆａｂ’フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの重鎖ジスルフィド架橋の還元により生成される。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも知られている。

【0389】

任意の脊椎動物種の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、定常領域のアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる、２つの明らかに異なるタイプの１つに割り当てることができる。

【0390】

重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存し、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てることができる。ヒト免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＹがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けられてもよい。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。様々なクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元構造は周知である。異なるアイソタイプは異なるエフェクター機能を有する。例えば、ヒトＩｇＧ１とＩｇＧ３のアイソタイプは、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）活性を有している。

【0391】

いくつかの例では、抗体のＣＤＲは、（ｉ）Ｋａｂａｔナンバリングシステム（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ． （１９７ ） Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １９０：３８２－３９１ ａｎｄ， Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ９１－３２４２）、または、（ｉｉ）Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ， １９８７， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １９６：９０１－９１７； Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２７３ ：９２７－９４８； Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２７：７９９－８１７； Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ Ａ ｅｔ ａｌ． ， １９９０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５（１）： １７５－８２； ａｎｄ Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ７，７０９，２２６を参照）；または、（ｉｉｉ）例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｍ．－Ｐ．， １９９９， Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ， ７： １３２－１３６ ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｍ．－Ｐ． ｅｔ ａｌ， １９９９， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２７：２０９－２１２ （“ＩＭＧＴ ＣＤＲｓ”）に記載されるようなＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ （ＩＭＧＴ）ナンバリングシステム；または、（ｉｖ）ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ， １９９６， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２６２：７３２－７４５に従って、決定される。例えば、Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．， “Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ，” ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｉｉｂｅｌ， ｅｄｓ．， Ｃｈａｐｔｅｒ ３１， ｐｐ． ４２２－４３９， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－ Ｖｅｒｌａｇ， Ｂｅｒｌｉｎ （２００１）をさらに参照。

【0392】

Ｋａｂａｔナンバリングシステムに関して、抗体重鎖分子内のＣＤＲは、典型的には、随意に３５（Ｋａｂａｔナンバリングスキームでは、３５Ａおよび３５Ｂと呼ばれる）後に１つまたは２つの追加のアミノ酸を含むことができるアミノ酸位置３１～３５（ＣＤＲ１）、アミノ酸位置５０～６５（ＣＤＲ２）、およびアミノ酸位置９５～１０２（ＣＤＲ３）に存在する。Ｋａｂａｔナンバリングシステムを使用すると、抗体軽鎖分子内のＣＤＲは典型的には、アミノ酸位置２４～３４（ＣＤＲ１）、アミノ酸位置５０～５６（ＣＤＲ２）、およびアミノ酸位置８９～９７（ＣＤＲ３）に存在する。当業者に周知であるように、Ｋａｂａｔナンバリングシステムを使用すると、抗体可変ドメインの実際の線状アミノ酸配列は、ＦＲおよび／またはＣＤＲの短縮または延長に起因して、より少ないアミノ酸または追加のアミノ酸を含むことができ、そのため、アミノ酸のＫａｂａｔナンバーは、その線状アミノ酸番号と必ずしも同じわけではない。

【0393】

Ｃｈｏｔｉａナンバリングシステムに関して、抗体重鎖分子内のＣＤＲは、典型的には、随意に３１（Ｃｈｏｔｉａナンバリングスキームでは、３１Ａおよび３１Ｂと呼ばれる）後に１つまたは２つの追加のアミノ酸を含むことができるアミノ酸位置２６～３１（ＣＤＲ１）、アミノ酸位置５２～５６（ＣＤＲ２）、およびアミノ酸位置９５～１０２（ＣＤＲ３）に存在する。Ｃｈｏｔｉａナンバリングシステムを使用すると、抗体軽鎖分子内のＣＤＲは典型的には、アミノ酸位置２４～３４（ＣＤＲ１）、アミノ酸位置５０～５６（ＣＤＲ２）、およびアミノ酸位置８９～９７（ＣＤＲ３）に存在する。当業者に周知であるように、Ｃｈｏｔｉａナンバリングシステムを使用すると、抗体可変ドメインの実際の線状アミノ酸配列は、ＦＲおよび／またはＣＤＲの短縮または延長に起因して、より少ないアミノ酸または追加のアミノ酸を含むことができ、そのため、アミノ酸のＣｈｏｔｉａナンバーは、その線状アミノ酸番号と必ずしも同じわけではない。

【0394】

「キメラ」抗体という用語は、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の供給源または種に由来し、重鎖および／または軽鎖の残りの部分が異なる供給源または種に由来する、抗体を指す。

【0395】

「ヒト化抗体」という用語は、親免疫グロブリンのＣＤＲと比較して異なる特異性を有する免疫グロブリンのＣＤＲを構成するようにフレームワークまたはＣＤＲが改変された抗体を指す。

【0396】

本明細書で使用されるように、「個体」、「被験体」、および「患者」という用語は、任意の哺乳動物を意味する。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトである。いくつかの実施形態では、哺乳動物は非ヒトである。いかなる用語も、保健従事者（例えば、医師、正看護師、臨床看護師、医師助手、看護助手、またはホスピスの職員）の監督（例えば、常時または断続的）を特徴とする状況に限定されない。

【実施例】

【0397】

これら実施例は例示のみを目的として提供されるものであり、本明細書に提供される特許請求の範囲を制限するものではない。

【実施例1】

【0398】

ヒト化抗ＴｆＲ抗体の産生と特徴づけ
例示的な抗ＴｆＲ抗体をコードする核酸をＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳＫＯ細胞へと安定的にトランスフェクトし、生成物１つにつき３つの安定プールを作製した。この安定プールでは、トランスフェクション後８日目以降の細胞増殖とプロテインＡの力価をモニタリングした。培養物が一旦、生存率７０％で閾値０．６×１０ｅ^６細胞／ｍＬに到達したとき、安定プールを継代した。細胞の生存率が９７％を超えると、試験済みのプール中の最高産生プールを用いて、生成物１つにつき６００ｍＬの流加過剰成長培養（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｏｖｅｒｇｒｏｗ ｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＦＯＧ）を０．２×１０ｅ^６細胞／ｍＬで蒔いた。４日目と８日目にＦＯＧ培養物に給餌し、１１日目に遠心分離と濾過滅菌により採取した。滅菌細胞培養上清を、ＡＫＴＡ清浄器（１０ｍＬ／分で実行）上で並行して３×５ｍｌ ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲＥカラムを用いたプロテインＡ精製により精製した。リン酸ナトリウム５０ｍＭでカラムを平衡化した。ｐＨ７．０の塩化ナトリウム２５０ｍＭをリン酸ナトリウム５０ｍＭとｐＨ７．０の塩化ナトリウム１Ｍで洗浄し、ｐＨ３．５のギ酸ナトリウム１０ｍＭで溶出した。溶出した分画を２×ＰＢＳで１：２に希釈することで中和し、次いで希釈したＮａＯＨを用いてｐＨを７．４に調整した。

【0399】

ＳＥ－ＨＰＬＣとＳＤＳ－ＰＡＧＥにより抗体を解析した。Ｚｏｒｂａｘ ＧＦ－２５０９．４ｍｍ ＩＤ×２５ｃｍカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いてＳＥ－ＨＰＬＣにより、複製試料を解析した。試料１ｍｇ／ｍｌの８０μｌアリコートを注射し、１ｍｌ／分で１５分間、リン酸ナトリウム５０ｍＭ、塩化ナトリウム１５０ｍＭ、Ｌ－アルギニン５００ｍＭ、ｐＨ６．０で実行した。変異体すべてに１６．８９％未満の小さなピークを認め、保持時間は約７．６６分であり、可溶性凝集物と一貫していた。Ｅｍｐｏｗｅｒ ｖ３ソフトウェアを用いて可溶性凝集物濃度を解析した。

【0400】

表９では、試験済み抗ＴｆＲ抗体の構築物デザインとＨＰＬＣ解析を例示する。

【0401】

【表9】

【0402】

９個の例示的なヒト化抗ＴｆＲ抗体および親キメラ抗体の結合動態を特徴づけた。ｍＡｂ捕捉のためプロテインＡで被覆したＧＬＭセンサチップを使用してＢｉｏＲａｄ ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６光学バイオセンサ上で試験を行った。泳動用緩衝液には、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４、０．０５％のｔｗｅｅｎ－２０、０．２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡが含まれていた。２５℃でデータを集めた。得られたストック濃度に基づき、すべてのｍＡｂｓを泳動用緩衝液に入れて２ｕｇ／ｍｌに希釈した。その後、各々をプロテインＡ表面上で４０秒間捕捉した。

【0403】

ｈＴｆＲ（１００ｕｇ）を水３００ｕＬに溶かし、ストック濃度４．３ｕＭを得た。ｈＴｆＲを最高濃度として４３ｎＭに希釈（ｄｉｌｔｅｄ）し、３倍系列稀釈で試験した。ｈＴｆＲを２分かけて２００ｕｌ／分で注射し、続いて１時間の解離相に移った。

【0404】

データを内部スポット対照表面から控除することで反応データを処理し、加えて緩衝液注射により二重参照した。

【0405】

表１０では２５℃で求めた結合定数を示す。

【0406】

【表10】

【実施例2】

【0407】

ｈＩｇＧ２ ＴｆＲ１キメラ抗体ｓｉＲＮＡ（ＳＳＢ）コンジュゲートを用いたインビボでの遺伝子ダウンレギュレーション

【0408】

ｈＴｆＲ１に対するマウスＩｇＧ２抗体のＣＤＲをヒトＩｇＧ２バックグラウンドへとサブクローン化し、ＣＨＯ－Ｋ１ＳＰ細胞へとトランスフェクトした。配列は実施例４を参照。安定した細胞プールを選択し、Ｗａｖｅ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して３７℃、５％ＣＯ_２で、ｃｅｌｌｂａｇｓ（Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中のＤｙｎａｍｉｓ培地（ＧＩＢＣＯ）に播種した。最終培養物体積（２５リットル）の８％に対する給餌を４日目から２日毎に行い、計１４日間のインキュベーションを行った。培養液上清を採取し、深度濾過を行い、Ｍｏｎｏｆｉｎｉｔｙ Ａ Ｒｅｓｉｎ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を用いて流速３０ｍｌ／分で精製した。溶出したタンパク質の緩衝液をＰＢＳに入れ、還元条件下と非還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥ、およびＳＥＣ－ＨＰＬＣにより、精製したタンパク質の分子量と純度を解析した。最終タンパク質純度は９８％を超えていた。

【0409】

ビス－マレイミド（ＢｉｓＭａｌ）リンカーを用いたＴｆＲ１－ＩｇＧ２ ｍＡｂキメラとＳＳＢ ｓｉＲＮＡとのコンジュゲーション

【0410】

本実験に使用するコンジュゲートとして、ＳＳＢ ｓｉＲＮＡ二本鎖を使用した。２１量体のＳＳＢガイド／アンチセンス鎖の配列は、（５’～３’）ＵＵＡＣＡＵＵＡＡＡＧＵＣＵＧＵＵＧＵＵＵであった。標準ホスホラミダイト化学を用いて固相上に一本鎖を完全にアセンブルし、ＨＰＬＣを使用して精製した。ＲＮＡｉの分野でよく記述されている塩基、糖、およびリン酸塩の修飾を使用して二本鎖の効力を最適化し、免疫原性を低下させた。ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖には、５’末端にＣ６－ＮＨ２コンジュゲーションハンドルが包含されていた。図１を参照。相補性の１９塩基および１つの３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つブラントエンド二本鎖として、ｓｉＲＮＡ二本鎖を設計した。末端塩基上のリン酸ジエステルを介してコンジュゲーションハンドルをｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。図２を参照。

【0411】

工程１：ＴＣＥＰによる抗体減少

【0412】

抗体に対し、１ｍＭ ＤＴＰＡを含む２５ｍＭホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８）との緩衝液交換を行い、最大１０ｍｇ／ｍｌの濃度とした。この溶液に、同じホウ酸塩緩衝液中の４当量のＴＣＥＰを添加し、３７℃で２時間インキュベートした。結果として生じる反応混合物を室温（ＲＴ）でｐＨ６．０の１０ｍＭ酢酸塩緩衝液の中、ＢｉｓＭａｌ－ｓｉＲＮＡ（１．２５当量）の溶液と組み合わせ、４℃で一晩保管した。分析的ＳＡＸカラムクロマトグラフィーによる反応混合物の解析では、抗体ｓｉＲＮＡコンジュゲートを未反応抗体およびｓｉＲＮＡとともに認めた。反応混合物を１０ＥＱのＮ－エチルマレイミド（１０ｍｇ／ｍＬでＤＭＳＯ中）で処理し、残るすべての遊離システイン残基をキャッピングした。

【0413】

工程２：精製

【0414】

陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳＡＸ）方法－１を使用してＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ ＦＰＬＣにより、粗製の反応混合物を精製した。ＤＡＲ１抗体－ｓｉＲＮＡコンジュゲートを含有する分画を単離し、濃縮し、ｐＨ７．４のＰＢＳとの緩衝液交換を行った。

【0415】

陰イオン交換クロマトグラフィー方法（ＳＡＸ）－１

【0416】

カラム：Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＴＳＫＧｅｌ ＳｕｐｅｒＱ－５ＰＷ、２１．５ｍｍ ＩＤ Ｘ １５ｃｍ、１３μｍ

【0417】

溶媒Ａ：ｐＨ８．０の２０ｍＭトリス緩衝液、溶媒Ｂ：２０ｍＭのトリス、１．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０、流速：６．０ｍＬ／分：

【0418】

勾配：
ａ）％Ａ ％Ｂ カラム体積
ｂ）１００ ０ １
ｃ）８１１ ９ ０．５
ｄ）５０ ５０ １３
ｅ）４０ ６０ ０．５
ｆ）０ １００ ０．５
ｇ）１００ ０ ２

【0419】

強力な陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳＡＸ）方法－２

【0420】

カラム：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰｒｏＰａｃＴＭ ＳＡＸ－１０、Ｂｉｏ ＬＣＴＭ、４ Ｘ ２５０ｍｍ

【0421】

溶媒Ａ：８０％の１０ｍＭトリスｐＨ８、２０％エタノール、溶媒Ｂ：８０％の１０ｍＭのトリスｐＨ８、２０％エタノール、１．５ＭのＮａＣｌ、流速：０．７５ｍＬ／分：

【0422】

勾配：
ａ）時間 ％Ａ ％Ｂ
ｂ）．０ ９０ １０
ｃ）３．００ ９０ １０
ｄ）１１．００ ４０ ６０
ｅ）１４．００ ４０ ６０
ｆ）１５．００ ２０ ８０
ｇ）１６．００ ９０ １０
ｈ）２０．００ ９０ １０

【0423】

ＳＡＸ方法－２を使用して分析的ＨＰＬＣによりコンジュゲートの純度を評価した（表１１）。

【0424】

【表11】

【0425】

本実施例で使用するコンジュゲートの解析データ表：分で表すＨＰＬＣ保持時間（ＲＴ）、およびクロマトグラフィーピーク面積による純度％。

【0426】

ｈＴｆＲ１－ＩｇＧ２ ｍＡｂ ｓｉＲＮＡ ＤＡＲ１コンジュゲートのインビトロ活性

【0427】

ｈＴｆＲ１－ＩｇＧ２ ｍＡｂ ｓｉＲＮＡコンジュゲートのヒトおよびカニクイザルのＴｆＲ１に対する結合能を、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して評価した。半ウェルの高結合９６ウェルプレート（Ｈａｌｆ－ｗｅｌｌ ｈｉｇｈ－ｂｉｎｄｉｎｇ ９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅｓ）（Ｃｏｓｔａｒ ＃３６９０）を、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ １４１９０）の中１ｎｇ／μＬで組換えヒトトランスフェリン受容体タンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ １１０２０－Ｈ０７Ｈ）または組換えカニクイザルトランスフェリン受容体タンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ９０２５３－Ｃ０７Ｈ）により被覆し、４℃で一晩インキュベートした。プレートを１００μＬのＴｒｉｓ緩衝生理食塩水＋Ｔｗｅｅｎ（２０ｘＴＢＳＴ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ９９９７Ｓ）で４回洗浄した。Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＰＩ－３７５３５）１００μＬを各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄工程を繰り返してから、試料を添加した。最大１０ｎＭ、５０μＬ／ウェルの濃度で、試料を添加した。プレートを室温でさらに１時間（ａｎｏｔｈｅｒ ｈｏｕｒ）インキュベートし、洗浄工程を繰り返した。二次抗体（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、１０９－０３５－０９８）を、添加したＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋおよび５０μＬ／ウェルの中で１：５０００に希釈した。プレートを室温で１時間培養し、もう１回洗浄した。５０μＬの１－Ｓｔｅｐ（商標）Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，３４０２８）を添加することで結合を測定し、５分間インキュベーションを行い、２５μＬのＳｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２Ｎ ｓｕｌｆｕｒｉｃ Ａｃｉｄ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＤＹ９９４）を添加して反応を止めた。吸収度を４５０ｎｍで測定し、対照波長５７０ｎｍを控除した。Ｈｉｌｌ Ｓｌｏｐｅを伴うＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂｉｎｄｉｎｇを使用して結合定数を求めた。

【0428】

非コンジュゲーションおよびコンジュゲーションｈＴｆＲ１．ＩｇＧ２ ｍＡｂ抗体は、同様の親和性をもって組換えヒトおよびカニクイザルＴｆＲ１に結合する（図３Ａ～図３Ｂ）。

【0429】

ＴｆＲ１．ＩｇＧ２ ｍＡｂ－ＳＳＢコンジュゲートがＳＳＢ発現をダウンレギュレートする能力を、ＨＥＬ９２．１．７およびヒト骨格筋細胞を対象にモニタリングした。ＨＥＬ９２．１．７細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ－１８０（商標））を、１０％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ１６４０の中で培養した（Ｎｕｃｌｅｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ＦＢＳ１８２４）。細胞を１００，０００／ｍＬに希釈し、１００μＬをプレートの各ウェルに添加した。抗体コンジュゲートを１００ｎＭの最大濃度に希釈した。陰性対照としてコンジュゲートまたはＰＢＳ２０μＬを９６ウェルプレートの複数のウェルに添加し、処理した細胞を３７℃と５％ＣＯ_２で７２時間静置した。

【0430】

２４ウェルのコラーゲンプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ａ１１４２８０２）上の５００μｌ骨格筋細胞増殖培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ Ｃ－２３２６０）の中で、不死化ヒト骨格筋細胞（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｙｏｌｏｇｙ， Ｐａｒｉｓ）を播種し、筋芽細胞がコンフルエントになるまで５％ＣＯ_２の中３７℃でインキュベートした。この時点で、５００μｌの分化培地（インスリン１０ｕｇ／ｍｌとゲンタマイシン５０μｇ／ｍｌを補足したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ １０５６６－０１６））の中で４日間インキュベーションを行うことで筋管の分化を誘導した。培地をリフレッシュし、ＰＢＳ中で希釈した５０μｌのＴｆＲ１．ＩｇＧ２ ｍＡｂ－ＳＳＢコンジュゲートを添加した。処理した細胞を７２時間インキュベートした。いずれかの細胞型を採取かつ解析するために、ウェルから培地を取り除き、１５０μＬのＴｒｉｚｏｌ（Ａｍｂｉｏｎ １５５９６０１８）を添加した。プレートを－８０℃で一晩以上冷凍してから解析を行った。製造者の指示に従いＤｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ９６ ＲＮＡキットを使用してＲＮＡを単離し、分光学的に定量化した。Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃４３６８８１３）を使用して、製造者の指示に従いＲＮＡ（１００＝２００ｎｇ）を逆転写した。適宜設計したプライマーとプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して、ｍＲＮＡ濃度を定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡローディング対照として使用した。ΔΔＣ_ｔ方法を使用してｍＲＮＡの％を算出し、ＰＢＳで処理した細胞を１００％発現に設定した。これら実験では、ＴｆＲ１．ＩｇＧ２ ｍＡｂ－ＳＳＢコンジュゲートはＳＳＢを最大６０％ダウンレギュレートし、一方でＳＳＢは、ＴｆＲ１．ＩｇＧ２ ｍＡｂ－ＭＳＴＮコンジュゲート（陰性対照）で処理した細胞において最大２５％ダウンレギュレートされた（図４Ａ～図４Ｂ）。

【0431】

カニクイザルにおけるｈＴｆＲ１－ＩｇＧ２ ｍＡｂ ＳＳＢ ｓｉＲＮＡコンジュゲートの活性と安全性

【0432】

ｈＩｇＧ２ ＴｆＲ１．ｍＡｂ－ｓｉＳＳＢコンジュゲートのＰＫ、ＰＤ、および安全特徴をカニクイザルにおいて評価した。カニクイザルは２～３歳のオス、体重２～３ｋｇであった。カニクイザルに３０ｍｇ／ｋｇあるいは６０ｍｇ／ｋｇ（ｍＡｂ濃度）のコンジュゲート、またはＰＢＳを３０分（＋／－３分）の静脈内（ＩＶ）注入により投与した。表１２に概説するような異なる時間に、意識のある拘束した動物の末梢静脈、または鎮静させた動物の腓腹筋と大腿四頭筋からそれぞれ血液試料と筋生検を採取した。

【0433】

【表12】

【0434】

ステムループｑＰＣＲアッセイを使用して、ｈＩｇＧ２ ＴｆＲ１．ｍＡｂ－ｓｉＳＳＢコンジュゲートの血漿中濃度を求めた。簡潔的に、ＴＥ緩衝液＋０．１％ｖ／ｖ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の中で血漿試料を直接希釈した。ｓｉＲＮＡを未処置動物の血漿へとスパイクし（ｓｐｉｋｉｎｇ）、次いでＴＥ緩衝液＋０．１％ｖ／ｖ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で連続希釈を行うことで、標準曲線を生成した。２５ｎＭの配列特異的ステムループＲＴプライマーを伴うＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を逆転写した。フォワードプライマー１．５μＭ、リバースプライマー０．７５μＭ、およびプローブ０．２μＭを伴うＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用したリアルタイムＰＣＲに、ＲＴ工程から得たｃＤＮＡを利用した。測定に使用されるＳＳＢ ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖の配列、ならびにすべてのプライマーおよびプローブを表１３に示す。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ７ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中の標準サイクル条件を用いて、量的ＰＣＲ反応を行った。標準曲線から得た線形方程式を使用して、Ｃｔ値を血漿中または組織中濃度に変換した。

【0435】

【表13】

【0436】

コンジュゲートのクリアランスと半減期は表１４に示す。これらコンジュゲートのＰＫ特性は、マウスを対象に試験したマウス抗トランスフェリンｍＡｂコンジュゲートと同様であった。

【0437】

【表14】

【0438】

ｓｉＲＮＡ濃度と筋肉内のコンジュゲートの活性を評価するために、表１２に示すスケジュールに従い筋生検（腓腹筋と大腿四頭筋）を得た。筋生検を６ｍｍ穿刺により採取し、計量し、液体窒素で急速冷凍した。冷凍した組織試料を１ｍｌの冷たいＴＲＩＺＯｌ（供給業者）の中で均質化させた。ｍＲＮＡノックダウンを求めるために、製造者の指示に従いＤｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ９６ ＲＮＡキットを使用して全ＲＮＡを組織から控除し、分光学的に定量化した。Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃４３６８８１３）を使用して、製造者の指示に従いＲＮＡ（１００＝２００ｎｇ）を逆転写した。適宜設計したプライマーとプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して、ＳＳＢ ｍＲＮＡ濃度を定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡローディング対照として使用した。ΔΔＣ_ｔ方法を使用してｍＲＮＡの％を算出し、処置前の同じ動物のＳＳＢ ｍＲＮＡ濃度またはＰＢＳで処置した動物のＳＳＢ濃度を１００％発現に設定した。

【0439】

組織ｓｉＲＮＡ濃縮の定量化を、ステムループｑＰＣＲアッセイを使用して求めた。簡潔的に、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩ ｐｌａｔｅ－ｂａｓｅｄ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して組織片１５～５０ｍｇを５００ｕＬのＴｒｉｚｏｌの中で均質化し、次いでＴＥ緩衝液＋０．１％ｖ／ｖ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の中で希釈した。ｓｉＲＮＡを未処置動物の均質化組織へとスパイクし、次いでＴＥ緩衝液＋０．１％ｖ／ｖ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で連続希釈を行うことで、標準曲線を生成した。２５ｎＭの配列特異的ステムループＲＴプライマーを伴うＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を逆転写した。フォワードプライマー１．５μＭ、リバースプライマー０．７５μＭ、およびプローブ０．２μＭを伴うＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用したリアルタイムＰＣＲに、ＲＴ工程から得たｃＤＮＡを利用した。測定に使用されるＳＳＢ ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖の配列、ならびにすべてのプライマーおよびプローブを表１３に示す。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ７ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中の標準サイクル条件を用いて、量的ＰＣＲ反応を行った。標準曲線から得た線形方程式を使用して、Ｃｔ値を血漿中または組織中濃度に変換した。

【0440】

カニクイザルをコンジュゲートで処置した結果、腓腹筋では最大６２％、大腿四頭筋では最大７５％にＳＳＢ ｍＲＮＡのダウンレギュレーションを認めた（図５Ａと図５Ｂ）。これら組織中のｓｉＲＮＡ濃度は用量依存性であり、３０ｍｇ／ｋｇと６０ｍｇ／ｋｇの投与量ではそれぞれ０．６～１．９ｎＭと２．０～６．５ｎＭであった。組織中のコンジュゲート活性とｓｉＲＮＡ濃度は、投与後２１または２８日目に調べたときは同様であった。これらの結果より、選択されたＴｆＲ１抗体はｓｉＲＮＡｓをサル筋組織へと効果的に送達可能であり、トランスフェリン受容体標的化ＡＯＣの活性は種間を移行する（ｔｒａｎｓｌａｔｅ）ことを実証した。

【0441】

霊長類の選択された抗ｈＴｆＲ１抗体の安全性をモニタリングするために、表ｘに示すスケジュールに従い血液学と臨床化学を解析した。網状赤血球の用量依存性であるが一時的な枯渇（図６）は例外とし、投与後最大２８日間でその血液学的または臨床化学的パラメータにも処置関連の効果を認めなかった。網状赤血球で認めた一時的なダウンレギュレーションは、ＴｆＲ１抗体の副作用と評した。無傷の作用因子機能または補体結合能を持つマウスＴｆＲ１抗体がＴｆＲ発現網状赤血球を重度に枯渇させることを認めた（Ｄａｎｉｅｌｓ－Ｗｅｌｌｓ， ｅｔ ａｌ．，“Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １：ａ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ８（９）：９９１－９９４（２０１６））。霊長類では高ＴｆＲ１レベルを発現する網状赤血球の分画が低いため、網状赤血球の枯渇は一時的なものにすぎず、げっ歯類ほど明白ではなかった。重要なことに、その他の試験では、抗体のＡＤＣＣ／ＣＤＣ活性を取り除く突然変異によりこの活性を上手く抑えることが可能であることを認めた。

【実施例3】

【0442】

ヒト／カニクイザル交差反応抗ＴｆＲ１抗体の生成、特徴づけ、ヒト化

【0443】

当該技術分野で十分に記載される現代のインシリコの抗体ヒト化と脱免疫化のプログラムを用いて、実施例１のＮＨＰ試験を行ったキメラ抗トランスフェリン１ ｍＡｂの１６変異体を設計した。変異体の配列については表ＸＹＺを参照。設計の一部として、高リスク翻訳後修飾（ＰＴＭ）の同定による製造可能性の評価を試み、実行可能な場合には、アミノ酸置換を介してそれらをヒト化活性の一部として取り除いた。免疫原性リスクの評価も試み、高リスクのエピトープを同定し、実行可能な場合にはこれを取り除いた。さらに変異体のＦｃドメインに突然変異を導入して、作用因子機能（ＡＤＣＣとＣＤＣ）を取り除いた。その後、当該技術分野で十分に説明される技法を用いて１６変異体を哺乳動物細胞培養物に発現させ、プロテインＡレジンに基づく親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。次いでｍＡｂ変異体を完全に特徴づけ、ｓｉＲＮＡコンジュゲートを下記のように作製した。

【0444】

ヒトおよびカニクイザルのＴｆＲ１ ＥＬＩＳＡアッセイ

【0445】

これらアッセイの目標は、１６変異体ヒト抗ＴｆＲ１抗体がヒトとカニクイザル両方のＴｆＲ１に結合することを確認することであった。ヒトまたはカニクイザルのトランスフェリン受容体ＥＬＩＳＡアッセイプロトコルを後述する。

【0446】

半ウェルの高結合９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ ＃３６９０）を、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ １４１９０）の中１ｎｇ／μＬで組換えヒトトランスフェリン受容体タンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ １１０２０－Ｈ０７Ｈ）または組換えカニクイザルトランスフェリン受容体タンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ９０２５３－Ｃ０７Ｈ）により被覆し、４℃で一晩インキュベートした。プレートを１００μＬのＴｒｉｓ緩衝生理食塩水＋Ｔｗｅｅｎ（２０ｘＴＢＳＴ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ９９９７Ｓ）で４回洗浄した。Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＰＩ－３７５３５）１００μＬを各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄工程を繰り返してから、試料を添加した。最大１０ｎＭ、５０μＬ／ウェルの濃度で、試料を添加した。プレートを室温でさらに１時間インキュベートし、洗浄工程を繰り返した。二次抗体（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、１０９－０３５－０９８）を、添加したＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋおよび５０μＬ／ウェルの中で１：５０００に希釈した。プレートを室温で１時間培養し、もう１回洗浄した。５０μＬの１－Ｓｔｅｐ（商標）Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，３４０２８）を添加することで結合を測定し、５分間インキュベーションを行い、２５μＬのＳｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２Ｎ ｓｕｌｆｕｒｉｃ Ａｃｉｄ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＤＹ９９４）を添加して反応を止めた。吸収度を４５０ｎｍで測定し、対照波長５７０ｎｍを控除した。Ｈｉｌｌ Ｓｌｏｐｅを伴うＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂｉｎｄｉｎｇを使用して結合定数を求めた。

【0447】

図７と図８では、カニクイザルＣＤ７１とヒトＣＤ７１それぞれの結合結果を例示する。

【0448】

Ｔｆ－ＴｆＲ遮断ＥＬＩＳＡアッセイ

【0449】

このアッセイの目標は、ＴｆＲ抗体がホロ－トランスフェリンの存在下でＴｆＲに結合することを確認することであった。

【0450】

製造者の指示に従いＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｎｏ ｗｅｉｇｈ ＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａ３９２５６）の５０倍モル過剰を使用して、抗体をビオチン化した。ＰＢＳの中４℃で一晩かけて、５００ｎｇ／ｍの生成ヒト・ホロ－トランスフェリン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ２９１４－ＨＴ）で半ウェル高結合プレート（Ｃｏｓｔａｒ ＃３６９０）を被覆した。比較のためにプレートをｈＴｆＲで直接被覆した。プレートを１００μＬのＴｒｉｓ緩衝生理食塩水＋Ｔｗｅｅｎ（２０ｘＴＢＳＴ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ９９９７Ｓ）で４回洗浄した。Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＰＩ－３７５３５）１００μＬを各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄工程を繰り返してから、ｈＴｆＲ（２５μｌ中２００ｎｇ／ｍＬ）をトランスフェリンプレートに添加、またはＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋをｈＴｆＲプレートに添加し、３０分間インキュベートした。ビオチン化抗体を高濃度にするために２０ｎＭに希釈し、３倍系列希釈でプレートに添加した。既にプレートにある２５μｌに２５μｌ／ウェルを添加した。プレートを１時間インキュベートし、洗浄工程を繰り返した。添付文書で推奨される希釈に従いＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＤＹ９９８）を添加し、最終洗浄工程を行った。５０μＬの１－Ｓｔｅｐ（商標）Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，３４０２８）を添加することで結合を測定し、５分間インキュベーションを行い、２５μＬのＳｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２Ｎ ｓｕｌｆｕｒｉｃ Ａｃｉｄ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＤＹ９９４）を添加して反応を止めた。吸収度を４５０ｎｍで測定し、対照波長５７０ｎｍを控除した。Ｈｉｌｌ Ｓｌｏｐｅを伴うＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂｉｎｄｉｎｇを使用して結合定数を求めた。トランスフェリンの存在下と不在下での抗体結合定数の変化は、トランスフェリンと重複するエピトープを持つと知られる市販の抗体（ＡＦ２４７４，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に対して考慮する。図９Ａ～図９Ｂを参照。

【0451】

ＨＦＥ－ＴｆＲ結合ＥＬＩＳＡアッセイ

【0452】

このアッセイの目標は、ＴｆＲがＨＦＥに結合したときにＴｆＲ抗体が結合を維持することを確認することであった。

【0453】

トランスフェリン存在下でのＴｆＲ結合と同じ方法に従いこのアッセイを実行し、トランスフェリンの代わりに補助因子ＨＦＥ（遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質、ｍｙｂｉｏｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ、ＭＢＳ９５３８９１）を用いた。図１０Ａ～図１０Ｂを参照。

【0454】

ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）ＥＬＩＳＡ

【0455】

このアッセイの目標は、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）遺伝子型Ｖ１５８への結合を測定することにより抗体のＡＤＣＣ活性に対する候補（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を求めることであった。半ウェルの高結合９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ ＃３６９０）を、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ １４１９０）の中２ｎｇ／μＬで組換えＣＤ１６ａタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ １０３８９－Ｈ２７Ｈ１）により被覆し、４℃で一晩インキュベートした。プレートを１００μＬのＴｒｉｓ緩衝生理食塩水＋Ｔｗｅｅｎ（２０ｘＴＢＳＴ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ９９９７Ｓ）で４回洗浄した。Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＰＩ－３７５３５）１００μＬを各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄工程を繰り返してから、試料を添加した。最大１μＭ、５０μＬ／ウェルの濃度で、試料を添加した。プレートを室温でさらに１時間インキュベートし、洗浄工程を繰り返した。二次抗体（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、１０９－０３５－０９８）を、添加したＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋおよび５０μＬ／ウェルの中で１：５０００に希釈した。プレートを室温で１時間培養し、もう１回洗浄した。５０μＬの１－Ｓｔｅｐ（商標）Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，３４０２８）を添加することで結合を測定し、５分間インキュベーションを行い、２５μＬのＳｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２Ｎ ｓｕｌｆｕｒｉｃ Ａｃｉｄ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＤＹ９９４）を添加して反応を止めた。吸収度を４５０ｎｍで測定し、対照波長５７０ｎｍを控除した。Ｈｉｌｌ Ｓｌｏｐｅを伴うＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂｉｎｄｉｎｇを使用して結合定数を求めた。図１１を参照。

【0456】

ＨＥＬ９２．１．７細胞におけるインビトロ効力アッセイ

【0457】

このアッセイの目標は、ＴｆＲ ｍＡｂコンジュゲートがｓｉＲＮＡの送達および遺伝子特異的ダウンレギュレーションを行うことが可能であることを実証することであった。ｍＡｂ変異体を、活性ｓｉＲＮＡ（ＳＳＢ）またはスクランブル対照（Ｓｃｒ）にコンジュゲートさせた。ＨＥＬ９２．１．７細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ－１８０（商標））を、１０％ウシ胎仔血清（Ｎｕｃｌｅｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ＦＢＳ１８２４）を含有するＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ Ａ１０４９１）の中で培養した。抗体ｓｉＲＮＡコンジュゲートを１００ｎＭの最大用量に希釈した。コンジュゲート２０μｌを９６ウェルプレートのウェルに添加した。ＰＢＳ２０μｌを追加の陰性対照として一部のウェルに添加した。細胞を１００，０００／ｍＬに希釈し、１００μＬをプレートの各ウェルに添加した。細胞を３７℃と５％ＣＯ_２で、７２時間静置させた。培地をウェルから取り除き、１５０μｌのＴｒｉｚｏｌ（Ａｍｂｉｏｎ １５５９６０１８）を添加した。プレートを－８０℃で一晩以上冷凍してから解析を行った。製造者の指示に従いＤｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ９６ ＲＮＡ単離キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒ２０５６）を使用してＲＮＡを単離した。製造者の指示に従いＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡキット（Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３６８８１４）を使用してＲＮＡを逆転写し、ＳＳＢおよびＰＰＩＢ Ｔａｑｍａｎプローブセット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｈｓ０４１８７３６２＿ｇ１およびＨｓ００１６８７１９＿ｍ１）を伴うＴａｑｍａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４４４４５５８）によりｑＰＣＲを行った。ΔΔＣｔ方法を使用してｍＲＮＡの％を算出し、ＰＢＳで処理した細胞を１００％発現に設定した。

【0458】

活性ｓｉＲＮＡ（ＳＳＢ）または不活性あるいはスクランブルｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒ）を含有するＤＡＲ１を作製し、実施例２に記載するように特徴づけた。これらコンジュゲートでは、ＳＳＢ ｓｉＲＮＡは、リボース２’ヒドロキシル上のパッセンジャー鎖の位置１１にてコンジュゲートされるＣｙ５蛍光タグを包含していた。これを固相合成中に導入し、ガイド鎖の活性は阻害されなかったが、取り込みアッセイの実施は可能となった。イオン交換クロマトグラフィー方法－２を使用した分析的ＨＰＬＣによりコンジュゲートの純度を評価し、クロマトグラフィー保持時間と純度を以下の表１５に記載する。

【0459】

【表15】

【0460】

本実施例で使用するコンジュゲートの解析データ表：分で表すＨＰＬＣ保持時間（ＲＴ）、およびクロマトグラフィーピーク面積による純度％。

【0461】

ＰＢＭＣ中でＴｆＲ１抗体および抗体ｓｉＲＮＡコンジュゲート（ＡＳＣ）により媒介される抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）

【0462】

マウスと非ヒト霊長類（ＮＨＰ）を対象とした試験では、作用因子機能および／または補体結合能を持つマウス／カニクイザルＴｆＲに結合する抗体がＴｆＲ発現網状赤血球を選択的に枯渇させることを実証している。変異体に作用因子機能があったかどうか確認するために、エフェクター細胞として健康なヒトドナーから得た末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を使用してＡＤＣＣアッセイを行った。

【0463】

材料：

【0464】

ＳＴＲＯＮＧ ＡＤＣＣ活性を持つＢＵＹＰＢＭＣ．ＣＯＭ， ｌｏｔ＃２０１０１１３３７８のＰＢＭＣ。

【0465】

標的細胞：ＨＥＬ－９２．１．７（ＡＴＣＣ、＃ＴＩＢ－１８０）、ＨＥＬ（＃ＪＣＲＢ００６２）

【0466】

Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ＬＤＨキット、Ｐｉｅｒｃｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、＃８８９５３

【0467】

１０％熱不活性化ＦＢＳ（５６℃で３０分間）および２％Ｌ－グルタミンを含有する血清（完全培地）ＲＰＭＩ １６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を伴う組織培養培地

【0468】

ｈＩｇＧ１ ｍＡｂ変異体

【0469】

手順：

【0470】

３７℃の水槽の中でＰＢＭＣ細胞を優しく撹拌しながら解凍する。解凍後、３０秒間の点滴により暖かい培養培地１ｍＬをバイアルドロップに添加して、細胞が環境変化に調整されることを可能にする。暖かい培養培地９ｍＬを含有する１５または５０ｍＬの円錐管に細胞を徐々に添加する。細胞含有培地１ｍＬを含む最初のバイアルをすすいで、側面に付着した細胞を回収する。すすぎ培地を円錐管に添加する。３５０ｘｇで８～１２分間の遠心分離により細胞をペレット状にする。上清を捨てる。軽く叩いて細胞ペレットを浮遊させる（過度の剪断力を避ける）。暖かい培養培地１０ｍＬを円錐管に添加して細胞を再びすすぐ。３５０ｘｇで８～１２分間の遠心分離により細胞をペレット状にする。２回目の洗浄から上清を捨てる。軽く叩いて細胞ペレットを浮遊させる（過度の剪断力を避ける）。必要に応じて暖かい培養培地１０ｍＬの中で細胞を浮遊させる。Ｔ７５の中３７℃で一晩インキュベーションを行い、細胞を順応させる。

【0471】

標的細胞ＨＥＬ－９２を採取し、冷たいアッセイ培地で２回洗浄する。高生存率を確保する。９６ウェル丸底プレートの中、氷の上で４×１０^４／ウェルで、冷たい５０μｌ（８ｘ１０^５）アッセイ培地（１％ＢＳＡと１００ユニット／ｍＬのペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ－１６４０）に標的細胞を蒔く。以下の表に記載する標的細胞を含有するプレートに、試験および対照の抗体／ＡＳＣ（１０μｌ）の稀釈物（６倍、１０μｇ／ｍｌから出発）を添加し、次いで氷の上で３０分間インキュベートし、オプソニン作用を可能にした。培地１０μｌを対照ウェルに添加し、体積を維持する。

【0472】

対照：

【0473】

－バックグラウンド低対照：標的細胞の自発的ＬＤＨ放出対照により標的細胞（低対照）からの自発的放出を修正する。実験用ウェルに使用される同数の標的細胞を添加する。培養培地により最終体積を１００μＬ／ウェルに調整する。

【0474】

－陽性高対照：ＬＤＨの１００％放出を判定する計算には標的細胞最大ＬＤＨ放出対照が必要となる。実験用ウェルに使用される同数の標的細胞を添加する。最終体積は１００μＬ／ウェルでなければならない（工程５で１０Ｘ溶解バッファー１０μＬを添加する）。

【0475】

－抗体を添加せずに標的およびエフェクター細胞を含有するウェルの中で抗体非依存性細胞傷害性（ＡＩＣＣ）を測定する。

【0476】

以下２つの対照をアッセイ条件のモニタリングに使用するが、ＡＤＣＣ計算には不要である。

【0477】

－エフェクター細胞の自発的ＬＤＨ放出対照によりエフェクター細胞からのＬＤＨの自発的放出を修正する。実験用ウェルに使用されるエフェクター細胞を様々な数で添加する。培養培地により最終体積を１００μＬ／ウェルに調整する。

【0478】

－培養培地バックグラウンド対照は、培養培地を含有する血清中に存在し得るＬＤＨ活性による寄与を修正する必要がある。培養培地１００μＬを３通りのウェル（細胞を含まない）に添加する。

【0479】

氷の上で３０分間インキュベートした後、暖かいアッセイ培地５０μｌ（１％ＢＳＡと１００ユニット／ｍＬのペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ－１６４０）に入った８×１０^５ＰＢＭＣエフェクター細胞を各ウェルに添加し、２０：１の比で作用因子：標的細胞を得て、３７℃でさらに４時間プレートをインキュベートする。

【0480】

上清を採取する４５分前に、溶解緩衝液（１０Ｘ）１０μＬを標的細胞最大ＬＤＨ放出対照（陽性対照）と体積補正対照に添加する。ＰＢＳ１０μＬを、細胞、試料、および他の対照を含むバックグラウンド低対照に添加する。インキュベーション（３５０ｇ、１０分）後にプレートを遠心分離する。９６ウェルの透明平底プレートに上清５０μＬを移し、反応混合物５０μＬを各試料ウェルに添加し、軽く叩いて混合する。光から保護した状態で室温で３０分間、プレートをインキュベートする。停止溶液５０μＬを各試料ウェルに添加し、軽く叩いて混合する。吸収度を４９０ｎｍと６８０ｎｍで測定する。ＬＤＨ活性の判定には、４９０ｎｍの吸収度から６８０ｎｍの吸収度（器機からのバックグラウンドシグナル）を控除する。

【0481】

特異的ＡＤＣＣ活性を次のように算出した。

【0482】

％ＡＤＣＣ＝１００×（（Ａ_４９０（試料）－Ａ_４９０（ＡＩＣＣ））／（Ａ_４９０（高対照）－Ａ_４９０（低対照））

【0483】

結果を図１４に示す。

【0484】

ウサギ血清中でＴｆＲ１抗体および抗体ｓｉＲＮＡコンジュゲート（ＡＳＣ）により媒介される補体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）

【0485】

材料：

【0486】

凍結乾燥したウサギ補体。氷冷の蒸留水で再構成する。全凍結乾燥材料が確実に溶けるように優しく撹拌する。再構成の１時間以内に使用する。再構成材料は常に氷の上で維持する。１／２稀釈で完全に活性でない場合、アリコートを捨てる。

【0487】

標的細胞：ＨＥＬ－９２．１．７（ＡＴＣＣ、＃ＴＩＢ－１８０）

【0488】

Ｖｉｏｂｉｌｉｔｙ ４０５／４５２固定可能染料。

【0489】

１０％熱不活性化ＦＢＳ（５６℃で３０分間）および２％Ｌ－グルタミンを含有する血清（完全培地）ＲＰＭＩ １６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を伴う組織培養培地

【0490】

ｈＩｇＧ１変異体

【0491】

手順：

【0492】

ＨＥＬ９２．１．７標的細胞を採取し、冷たいアッセイ培地で２回洗浄した。９６ウェル丸底プレートの中、５×１０^４／ウェルで、冷たい２５μｌアッセイ培地（１％ＢＳＡと１００ユニット／ｍＬのペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ－１６４０）に細胞を蒔いた。２５μｌの標的細胞を含有するプレートに、試験および対照の抗体（２５μｌ）の稀釈物（５倍、最終５０ｕｇ／ｍｌでは１００ｕｇ／ｍｌから出発）を添加し、次いで氷の上で３０分間インキュベートし、オプソニン作用を可能にする。

【0493】

対照：

【0494】

－バックグラウンド低対照：標的細胞の自発的ＬＤＨ放出対照により標的細胞（低い調節）からの自発的放出を修正する。実験用ウェルに使用される同数の標的細胞を添加する。培養培地により最終体積を１００μＬ／ウェルに調整する。

【0495】

－抗体を添加せずに標的およびＣＤＣ細胞を含有するウェルの中で抗体非依存性細胞傷害性（ＡＩＣＣ）を測定する。

【0496】

３０分のインキュベーション後、補体５０μＬを各ウェルに添加し、培地と低対照（５０μＬの培地を有する）を除き、プレートを３７℃でさらに６０分間インキュベートした。インキュベーション（３５０ｇ、１０分）の終わりにプレートを遠心分離にかけた。希釈したＶｉｏｂｉｌｉｔｙ ４０５／４５２染料（染色緩衝液１００μＬ中に染料０．５μＬ）を添加した。光から保護した状態で室温で１５分間、プレートをインキュベートした。細胞を洗浄して固定した。流れ解析を行い、死細胞を測定した。

【0497】

特異的ＣＤＣ活性を次のように算出する。

【0498】

％ＣＤＣ＝試料中の死細胞％－対照中の死細胞％

【0499】

結果を図１５に示す。

【0500】

ヒト抗ＴｆＲ１ ＩｇＧ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲート（ＡＳＣ）のヒト骨格筋管へのインビトロ取り込み

【0501】

筋細胞へのＡＳＣの取り込みをモニタリングするために、１０％ＦＢＳ（Ｎｕｃｌｅｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ＦＢＳ１８２４）および１ｘＩＴＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ４１４０００４５）を補足した１ｍＬのＤＭＥＭ（ＡＴＣＣ ３０－２００２）の中、初代ヒト骨格筋芽細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａ１１４４０）を２４ウェルコラーゲンプレート上で播種した。筋芽細胞がコンフルエントになるまで、細胞を３７℃と５％ＣＯ_２でインキュベートした。この時点で、２％のウマ血清（ＡＴＣＣ ３０－２０４０）および１ｘＩＴＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ４１４０００４５）を補足した１０００μｌの１ｍＬ ＤＭＥＭ（ＡＴＣＣ３０－２００２）を対象に２日間インキュベートすることで、筋管への分化を誘導した。培地を５００ｕｌ分化培地と交換し、ＰＢＳ中で希釈した５０μｌのＴｆＲ１．ＩｇＧ２ ｍＡｂ－ＳＳＢ（Ｃｙ５）コンジュゲートを１および１０ｎＭの最終濃度に添加した。細胞を３７℃と５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートし、５００ｕｌのＰＢＳで３回洗浄し、凍結融解サイクルを使用して１５０ｕｌのＴ－ＰＥＲ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ７８５１０）の中で溶解した。溶解した細胞７５ｕｌをヌクレアーゼフリーの水７５μｌで希釈し、ＴＥＣＡＮプレートリーダーを使用して蛍光を求めた（Ｅｘ ６３５ｎＭ－Ｅｍ ６７５ｎＭ）。入力に対する細胞中の蛍光として結果を示す（図１６）。

【0502】

ヒト骨格筋管中のヒト抗ＴｆＲ１ ＩｇＧ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲート（ＡＳＣ）により媒介されるインビトロ遺伝子ダウンレギュレーション

【0503】

ＴｆＲ１．ｍＡｂ－ＳＳＢコンジュゲートがＳＳＢ ｍＲＮＡレベルをダウンレギュレートする能力をモニタリングするために、１０％ＦＢＳ（Ｎｕｃｌｅｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ＦＢＳ１８２４）および１ｘＩＴＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ４１４０００４５）で補足した１ｍＬのＤＭＥＭ（ＡＴＣＣ３０－２００２）の中、初代ヒト骨格筋芽細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａ１１４４０）を２４ウェルコラーゲンプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ａ１１４２８０２）上で播種した。筋芽細胞がコンフルエントになるまで、細胞を３７℃と５％ＣＯ_２でインキュベートした。この時点で、２％のウマ血清（ＡＴＣＣ ３０－２０４０）および１ｘＩＴＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ４１４０００４５）を補足した１０００μｌの１ｍＬ ＤＭＥＭ（ＡＴＣＣ３０－２００２）を対象に２日間インキュベートすることで、筋管への分化を誘導した。培地をリフレッシュし、ＰＢＳ中で希釈した１００μｌのＴｆＲ１．ＩｇＧ２ ｍＡｂ－ＳＳＢコンジュゲートを添加した。処理した細胞を７２時間インキュベートした。採取のために培地をウェルから取り除き、１５０μｌのＴｒｉｚｏｌ（Ａｍｂｉｏｎ １５５９６０１８）を添加した。プレートを－８０℃で一晩以上冷凍してから解析を行った。製造者の指示に従いＤｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ９６ ＲＮＡキットを使用してＲＮＡを単離し、分光学的に定量化した。Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃４３６８８１３）を使用して、製造者の指示に従いＲＮＡ（１００＝２００ｎｇ）を逆転写した。適宜設計したプライマーとプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して、ｍＲＮＡ濃度を定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡローディング対照として使用した。ΔΔＣｔ方法を使用してｍＲＮＡの％を算出し、ＰＢＳで処理した細胞を１００％発現に設定した。試験したＳＳＢ ｓｉＲＮＡコンジュゲートはすべて、同様の効力をもってＳＳＢを５０％ダウンレギュレートした（図１７）。

【実施例4】

【0504】

ｈＴｆＲ１重鎖：４６１ａａ

【0505】

ＮｒｕＩ－Ｋｏｚａｋ配列－－人工シグナルペプチド－ｈＴｆＲ１ ｍＡｂ ＨＣ可変領域－ヒトＩｇＧ２定常領域（Ｐ０１８５９）－－停止コドン－－ＰｍｌＩ

【0506】

【化25】

【0507】

ｈＴｆＲ１軽鎖：２３３ａａ

【0508】

ＡｓｃＩ－Ｋｏｚａｋ配列－－人工シグナルペプチド－ｈＴｆＲ１ ｍＡｂ ＬＣ可変領域－ヒトＩｇカッパ定常領域（Ｐ０１８５９）－－停止コドン－－ＦｓｅＩ

【0509】

【化26】

【実施例5】

【0510】

カニクイザル試験での例示的な抗ＴｆＲ抗体のＳＳＢ ｓｉＲＮＡノックダウン
例示的な抗ＴｆＲ抗体でのカニクイザルの処置を試験して、腓腹筋でのＳＳＢ ｍＲＮＡダウンレギュレーションの割合を求める。３０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、および３ｍｇ／ｋｇの投与量を試験する。抗体コンジュゲートの活性を投与後２１および／または２８日目に調査する。血液学と臨床化学の解析によりカニクイザルの安全性もモニタリングする。

【実施例6】

【0511】

ｈＩｇＧ１ ＴｆＲ－Ｖａｒ２ｉｉおよびｈＩｇＧ１ ＴｆＲ－Ｖａｒ９ｉｉのＳＳＢコンジュゲートは、カニクイザルの絶対的網状赤血球値に影響を及ぼさない。
ｈＩｇＧ１ ＴｆＲ－Ｖａｒ２ｉｉおよびｈＩｇＧ１ ＴｆＲ－Ｖａｒ９ｉｉは、ｈＴｆＲ１を標的とするヒト化ＩｇＧ１抗体であり、ＩｇＧ１重鎖のヒンジ領域に突然変異を含有しており、作用因子機能（ＬＡＬＡ＋Ｌ３２８Ｒ）を取り除くように設計されている。キメラｈＩｇＧ２ ＴｆＲ１抗体とは対照的に、ｈＩｇＧ１ ＴｆＲ－Ｖａｒ２ｉｉおよびｈＩｇＧ１ ＴｆＲ－Ｖａｒ９ｉｉのＳＳＢコンジュゲートをカニクイザルへ投与後、網状赤血球値は低下しない。この結果は、ＴｆＲ１標的化抗体による未成熟網状赤血球の枯渇が、抗体のＡＤＣＣ／ＣＤＣ活性を取り除く突然変異により上手く抑えることができることを実証する他者の試験と一致している（ＷＯ２０１４／１８９９７３Ａ２）。

【0512】

方法：

【0513】

１日目、カニクイザル（オス２～３歳、ＢＷ２～３ｋｇ）に３０分（＋／－３分）の静脈内（ＩＶ）注入を行った。図１８に示すように投与後の異なる時点で、意識のある拘束した合物の末梢静脈から血液試料を採取した。

【実施例7】

【0514】

ｈＩｇＧ１ ＴｆＲ－Ｖａｒ２ｉｉ ＡｂおよびｈＩｇＧ１ ＴｆＲ－Ｖａｒ９ｉｉ ＡｂのＳＳＢコンジュゲートは、カニクイザルの筋肉のＳＳＢ ＲＮＡ値をダウンレギュレートする。
投与前のＳＳＢ ｍＲＮＡ値と比較して、１または６ｍｇ／ｋｇ（ｓｉＲＮＡ）のｈＩｇＧ１ ＴｆＲ－Ｖａｒ２ｉｉまたはｈＩｇＧ１ ＴｆＲ－Ｖａｒ９ｉｉ ＳＳＢコンジュゲートの単回投与により、投与後２１日目で腓腹筋と大腿四頭筋におけるＳＳＢ ｍＲＮＡ値を最大７２％ダウンレギュレートした（図１９）。ヒト化抗体の活性は親キメラＩｇＧ２ ＴｆＲ１抗体の活性と同様である。６０ｍｇ／ｋｇ（６ｍｇ／ｋｇのＡＯＣ投与量に等しい）で投与したコンジュゲートされていないＴｆＲ－Ｖａｒ２ｉｉ Ａｂでは、ＳＳＢの有意なダウンレギュレーションを認めなかった。

【0515】

方法：

【0516】

１日目に、カニクイザル（オス２～３歳、ＢＷ２～３ｋｇ）に３０分（＋／－３分）の静脈内（ＩＶ）注入を行った。投与後－１０日目と＋２１日目に、６ｍｍ穿刺により筋生検（腓腹筋と大腿四頭筋）を鎮静させた動物から採取し、計量し、液体窒素中で急速冷凍した。冷凍した組織試料を１ｍｌの冷たいＴＲＩＺＯｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃ １５５９６０２６）の中で均質化させた。ｍＲＮＡノックダウンを求めるために、製造者の指示に従いＤｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ９６ ＲＮＡキットを使用して全ＲＮＡを組織から控除し、分光学的に定量化した。Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃４３６８８１３）を使用して、製造者の指示に従いＲＮＡ（１００＝２００ｎｇ）を逆転写した。適宜設計したプライマーとプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して、ＳＳＢ ｍＲＮＡ濃度を定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡローディング対照として使用した。ΔΔＣｔ方法を使用してｍＲＮＡの％を算出し、処置前の同じ動物のＳＳＢ ｍＲＮＡ濃度またはＰＢＳで処置した動物のＳＳＢ濃度を１００％発現に設定した。

【実施例8】

【0517】

ｓｉＲＮＡ送達ではなくＡＯＣ媒介性ＳＳＢノックダウンが筋肉に特異的である。
６ｍｇ／ｋｇのｈＩｇＧ１ ＴｆＲ－Ｖａｒ２ｉｉ－ＳＳＢを単回投与して２１日目、大半の組織に１０～１００ｎＭのＳＳＢ ｓｉＲＮＡ濃度を認めた。最高ｓｉＲＮＡ値は肝臓と副腎であり（１０００ｎＭ以下）、最低値は脳であった（２ｎＭ）。骨格筋のｓｉＲＮＡ濃度は３～２０ｎＭであった。ｓｉＲＮＡ曝露は比較的低いにもかかわらず、骨格筋と心臓のみに５０％を超えるＳＳＢ ｍＲＮＡ値の低下を認めた。この結果から、ＴｆＲ１標的化抗体によるオリゴヌクレオチドペイロードの送達は筋肉に特異的であり、ｓｉＲＮＡ曝露ではなく細胞特異的輸送経路により導かれることを実証する。

【0518】

方法：

【0519】

１日目に、カニクイザル（オス２～３歳、ＢＷ２～３ｋｇ）に３０分（＋／－３分）の静脈内（ＩＶ）注入を行った。投与後２１日目に、６ｍｍ穿刺により筋生検を鎮静した動物から採取した。他の組織試料はすべて検死後３０分以内に集めた。組織試料を処理し、ＳＳＢ ｍＲＮＡ値を上述のように求めた（図２０Ｂ）。方法の章に記載したステムループｑＰＣＲアッセイを使用して、組織ＳＳＢ ｓｉＲＮＡ濃度を求めた（図２０Ａ）。配列特異的ステムループＲＴプライマーを用いるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを使用して、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を逆転写した。次いで、ＲＴ工程から得たｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲに利用し、標準曲線から得た線形方程式を用いてＣｔ値を血漿中または組織中濃度に変換した。

【0520】

本開示の好ましい実施形態が本明細書で示され記載されてきたが、こうした実施形態はほんの一例として提供されているに過ぎないということは当業者にとって明白である。多数の変形、変更、および置き換えは、本開示から逸脱することなく、当業者によって現在想到されるものである。本明細書に記載される開示の実施形態の様々な代案が、本開示の実施において利用されるかもしれないことを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本開示の範囲を規定すること、かつ本特許請求の範囲内の方法と構造、およびその等価物が本開示に包含されることが意図されている。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20A】

【図20B】

【配列表】

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