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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-03-27
(45)【発行日】2025-04-04
(54)【発明の名称】Ｂ細胞抗体受容体、及びその利用
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20250328BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20250328BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20250328BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20250328BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20250328BHJP
A61K 35/17 20250101ALI20250328BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20250328BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20250328BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20250328BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20250328BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00
C12N15/12 ZNA
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N5/10
A61K35/17
A61P3/00
A61P43/00
A61K47/68
A61K38/17
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2021553671
(86)(22)【出願日】2020-10-28
(86)【国際出願番号】 JP2020040515
(87)【国際公開番号】W WO2021085504
(87)【国際公開日】2021-05-06
【審査請求日】2023-10-26
(31)【優先権主張番号】P 2019199624
(32)【優先日】2019-11-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】509349141
【氏名又は名称】京都府公立大学法人
(73)【特許権者】
【識別番号】598086844
【氏名又は名称】株式会社メディネット
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】五條 理志
(72)【発明者】
【氏名】上 大介
(72)【発明者】
【氏名】星野 温
(72)【発明者】
【氏名】南 喜人
(72)【発明者】
【氏名】志熊 明
【審査官】吉門 沙央里
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１８／１４０５７３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】PARVATHANENI, K. and SCOTT, D. W.，Blood Advances，2018年，Vol.2, No.18，P.2332-2340
【文献】松本雅則，III. 診断と医療 ４．血栓性血小板減少性紫斑病，日本内科学会雑誌，2014年，Vol.103, No.7，P.1613-1621
【文献】Adair P. R. et al.，Front. Immunol.，2017年，Vol. 8, Article 1117，pp. 1-10
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １９／００
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ）抗体結合ドメインとｂ）細胞膜貫通ドメインとｃ）共刺激因子の細胞内ドメインとｄ）活性化受容体の細胞内ドメインとが結合したＢ細胞抗体受容体であって、
前記ａ）抗体結合ドメインがα－ＧＡＬの全長タンパク質を含み、該α－ＧＡＬの全長タンパク質をコードする塩基配列が配列番号１に記載の塩基配列、又は同一の機能を有する、配列番号１に記載の塩基配列と９５％以上の同一の塩基配列を含む、或いは
前記ａ）抗体結合ドメインがα－ＧＡＬの抗体認識配列領域（Ｄ１ ｒｅｇｉｏｎ）を含み、該α－ＧＡＬの抗体認識配列領域（Ｄ１ ｒｅｇｉｏｎ）をコードする塩基配列が配列番号２に記載の塩基配列、又は同一の機能を有する、配列番号２に記載の塩基配列と９５％以上の同一の塩基配列を含む、
Ｂ細胞抗体受容体。
【請求項2】
前記ａ）、ｂ）、ｃ）又はｄ）の結合部分にリンカーが挿入されている請求項１に記載のＢ細胞抗体受容体。
【請求項3】
前記ａ）抗体結合ドメインが、抗体が特異的に認識する抗体認識配列を含むタンパク質又はペプチドである請求項１又は２に記載のＢ細胞抗体受容体。
【請求項4】
前記ｂ）膜貫通ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８αからなる群から選択される請求項１乃至３のいずれか一項に記載のＢ細胞抗体受容体。
【請求項5】
前記ｃ）共刺激因子の細胞内ドメインが、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２７８及びＣＤ２８からなる群から選択される請求項１～４のいずれか一項に記載のＢ細胞抗体受容体。
【請求項6】
前記ｄ）活性化受容体がＴＣＲ又はＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される請求項１～５のいずれか一項に記載のＢ細胞抗体受容体。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか一項に記載のＢ細胞抗体受容体をコードする核酸。
【請求項8】
請求項７に記載の核酸を含むベクター。
【請求項9】
請求項７に記載の核酸又は請求項８に記載のベクターを用いて遺伝子導入されたＢ細胞抗体受容体を発現する免疫細胞。
【請求項10】
前記免疫細胞が、αβＴ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞、γδＴ細胞又はＮＫ細胞である請求項９に記載の免疫細胞。
【請求項11】
請求項９又は１０に記載の免疫細胞を有効成分とする再生医療等製品（細胞医薬品）。
【請求項12】
ライソゾーム病を治療及び／又は予防するための、請求項１１に記載の再生医療等製品（細胞医薬品）。
【請求項13】
ライソゾーム病がファブリー病である、請求項１２に記載の再生医療等製品（細胞医薬品）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規の人工受容体（Ｂ細胞抗体受容体（Ｂ－ｃｅｌｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＢＡＲ）、免疫細胞及び再生医療等製品（細胞医薬品）に関する。
【背景技術】
【0002】
生物の体内には様々なタンパク質が存在し、その機能によって、生命活動を維持している。タンパク質をコードする遺伝子に変異が起こると、そのタンパク質が産生できなくなったり、活性が低下してしまったりして、疾患を発症することがある。
【0003】
血友病は、血液凝固因子の量的、質的異常による遺伝性の疾患であり、原因となる血液凝固因子の種類によって血友病Ａ、血友病Ｂ等に分類される。血液凝固因子の活性の度合いによって症状は異なるが、重症になると関節内出血、筋肉内出血等が生じ、関節機能や運動に障害を起こすことがある。血友病の治療としては、不足している血液凝固因子を体外から補充する補充療法が行われる。
【0004】
血栓性血小板減少性紫斑病は、フォンビルブラント因子（ＶＷＦ）の切断酵素であるＡＤＡＭＴＳ１３の量的、質的異常による機能不全が原因の疾患で、先天性と後天性のものがあり、この機能不全は過剰な微小血栓を誘発し、血小板が血栓形成で消費され減少し、様々な末梢臓器での虚血性変化に伴う臓器不全を引き起こす。先天性の場合は当該タンパクをコードする遺伝子の変異、後天性の場合はこのタンパク質への自己抗体によると報告されている。治療法としては、先天性に対しては、２週間毎に新鮮凍結血漿１０ｍｌ／ｋｇ体重を輸注し、ＡＤＡＭＴＳ１３酵素を補充する事により発症を予防する。後天性に対しては血漿交換療法がおこなわれている。
【0005】
ライソゾーム病は、細胞内小器官であるライソゾーム内の酸性分解酵素の遺伝的欠損により、ライソゾーム内に大量の脂質あるいはムコ多糖などを蓄積し、肝臓、脾臓の腫大、骨変性、中枢神経障害など、種々な症状を呈する疾患群であり、現在６０種の疾患が含まれる（非特許文献１）。
【0006】
ライソゾーム病に分類される疾患は、欠損する酵素の種類によって区別されており、例えば、ファブリー病、ゴーシェ病、ポンぺ病、ムコ多糖症が挙げられる。
【0007】
ライソゾーム病の１つであるファブリー病は、α－ガラクトシダーゼ（α－ＧＡＬ、以下単に「ＧＬＡ」ともいう）という酵素の遺伝的欠損や活性低下によりＧＬ－３やＧｂ３という糖たんぱく質が分解されず、分解されなかった糖たんぱく質が組織・臓器に蓄積することで発症する疾患である。症状としては、神経症状（疼痛）、角膜混濁、皮膚症状、心機能障害、腎機能障害等が認められる。治療法としては、製剤化したα－ＧＡＬを点滴により補充して、糖たんぱく質を分解することにより症状の改善や進行の抑制を行う（非特許文献２）。
【0008】
血友病やライソゾーム病のように、遺伝子変異によりタンパク質の機能を発揮できないことを原因とする疾患の治療としては、補充療法（Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｔｈｅｒａｐｙ）が施行されているが、凝固因子又は責任酵素のタンパク質が欠落もしくは大きな欠損を有している変異の場合は、体外から補充する凝固因子又は責任酵素が患者体内の免疫により異物とみなされ、体外から補充した凝固因子又は責任酵素に対する中和抗体が産生されるケースが少なからず存在する。患者体内で抗体が産生されるケースでは、酵素が機能を十分に発揮できないため、治療効果が減弱してしまうことになる。例えば、ファブリー病の治療では、患者体内でα－ＧＡＬに対する中和抗体が産生され、当該抗体が投与されたα－ＧＡＬに結合することで治療効果が減弱するケースが確認されている（非特許文献３、４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0009】
【文献】難病情報センター ライソゾーム病（指定難病１９）の項：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｎｂｙｏｕ．ｏｒ．ｊｐ／ｅｎｔｒｙ／４０６１
【文献】大日本住友製薬Ｗｅｂページ：ｈｔｔｐｓ：／／ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ．ｄｓ－ｐｈａｒｍａ．ｊｐ／ｄｉｓｅａｓｅ／ｆａｂｒｙ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ
【文献】Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２７：２５６－２６４，２０１６
【文献】Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍａｔｏｌ ２００５；９４：７６０－７６９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
先に述べた通り、凝固因子や責任酵素に対する抗体が患者体内で産生されることにより疾患が発生することや治療法が十分な効果を発揮することができない状況が発生するため、それらの抗体の機能を制御する技術が求められている。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本件発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意研究を重ねた結果、原因となる中和抗体を産生するＢ細胞を新規のＢ細胞抗体受容体を発現する免疫細胞で排除することで解決できることを見出した。すなわち、本件発明は以下の通りである。
（１） ａ）抗体結合ドメインとｂ）細胞膜貫通ドメインとｃ）共刺激因子の細胞内ドメインとｄ）活性化受容体の細胞内ドメインとが結合したＢ細胞抗体受容体。
（２） 前記ａ）、ｂ）、ｃ）又はｄ）の結合部分にリンカーが挿入されている（１）に記載のＢ細胞抗体受容体。
（３） 前記ａ）抗体結合ドメインが、抗体が特異的に認識する抗体認識配列を含むタンパク質又はペプチドである（１）又は（２）に記載のＢ細胞抗体受容体。
（４） 前記ｂ）膜貫通ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８αからなる群から選択される（１）～（３）のいずれかに記載のＢ細胞抗体受容体。
（５） 前記ｃ）共刺激因子の細胞内ドメインが、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２７８及びＣＤ２８からなる群から選択される（１）～（４）のいずれかに記載のＢ細胞抗体受容体。
（６） 前記ｄ）活性化受容体がＴＣＲ又はＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される（１）～（５）のいずれかに記載のＢ細胞抗体受容体。
（７）前記ａ）抗体結合ドメインがα－ＧＡＬの全長タンパク質を含み、該α－ＧＡＬの全長タンパク質をコードする塩基配列が配列番号１に記載の塩基配列、又は同一の機能を有する、配列番号１に記載の塩基配列と９５％以上の同一の塩基配列を含む、（１）～（６）のいずれかに記載のＢ細胞抗体受容体。
（８）前記ａ）抗体結合ドメインがα－ＧＡＬの抗体認識配列領域（Ｄ１ ｒｅｇｉｏｎ）を含み、該α－ＧＡＬの抗体認識配列領域（Ｄ１ ｒｅｇｉｏｎ）をコードする塩基配列が配列番号２に記載の塩基配列、又は同一の機能を有する、配列番号２に記載の塩基配列と９５％以上の同一の塩基配列を含む、（１）～（６）のいずれかに記載のＢ細胞抗体受容体。
（９）前記ａ）抗体結合ドメインがＡＤＡＭＴＳ１３のスペーサードメインタンパク質を含み、該ＡＤＡＭＴＳ１３のスペーサードメインタンパク質をコードする塩基配列が配列番号３もしくは３７に記載の塩基配列、又は同一の機能を有する、配列番号３もしくは３７に記載の塩基配列と９５％以上の同一の塩基配列を含む、（１）～（６）のいずれかに記載のＢ細胞抗体受容体。
（１０）前記ａ）抗体結合ドメインがＡＤＡＭＴＳ１３のスペーサードメイン及びシステインリッチドメインを含み、該ＡＤＡＭＴＳ１３のスペーサードメインをコードする塩基配列が、配列番号３もしくは３７に記載の塩基配列、又は同一の機能を有する、配列番号３もしくは３７に記載の塩基配列と９５％以上の同一の塩基配列を含み、及びシステインリッチドメインをコードする塩基配列が、配列番号４に記載の塩基配列、又は同一の機能を有する、配列番号４に記載の塩基配列と９５％以上の同一の塩基配列を含む、（１）～（６）のいずれかに記載のＢ細胞抗体受容体。
（１１）前記ａ）抗体結合ドメインが血液凝固第VIII因子もしくは血液凝固第IX因子の全長タンパク質又は抗体認識配列を含む、（１）～（６）のいずれかに記載のＢ細胞抗体受容体。
（１２） （１）～（８）のいずれかに記載のＢ細胞抗体受容体をコードする核酸。
（１３） （１２）に記載の核酸を含むベクター。
（１４） （１２）に記載の核酸又は（１３）に記載のベクターを用いて遺伝子導入されたＢ細胞抗体受容体を発現する免疫細胞。
（１５） 前記免疫細胞が、αβＴ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞、γδＴ細胞又はＮＫ細胞である（１４）に記載の免疫細胞。
（１６） （１４）又は（１５）に記載の免疫細胞を有効成分とする再生医療等製品（細胞医薬品）。
（１７） ライソゾーム病を治療及び／又は予防するための、（１６）に記載の再生医療等製品（細胞医薬品）。
（１８） ライソゾーム病がファブリー病である、（１７）に記載の再生医療等製品（細胞医薬品）。
（１９） 治療を必要とする対象に、（１４）又は（１５）に記載の免疫細胞、或いは（１７に記載の再生医療等製品（細胞医薬品）を投与することを特徴とする、ライソゾーム病を治療及び／又は予防する方法。
（２０） ライソゾーム病がファブリー病である、（１９）に記載の方法。
（２１） （１）～（６）、（９）又は（１０）に記載のＢ細胞抗体受容体をコードする核酸。
（２２） （２１）に記載の核酸を含むベクター。
（２３） （２１）に記載の核酸又は（２２）に記載のベクターを用いて遺伝子導入されたＢ細胞抗体受容体を発現する免疫細胞。
（２４） 前記免疫細胞が、αβＴ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞、γδＴ細胞又はＮＫ細胞である（２３）に記載の免疫細胞。
（２５） （２３）又は（２４）に記載の免疫細胞を有効成分とする再生医療等製品（細胞医薬品）。
（２６） 血栓性血小板減少性紫斑病を治療及び／又は予防するための、（２５）に記載の再生医療等製品（細胞医薬品）。
（２７） 治療を必要とする対象に、（２３）又は（２４）に記載の免疫細胞、或いは（２６）に記載の再生医療等製品（細胞医薬品）を投与することを特徴とする、血栓性血小板減少性紫斑病を治療及び／又は予防する方法。
（２８） （１）～（６）又は（１１）に記載のＢ細胞抗体受容体をコードする核酸。
（２９） （２８）に記載の核酸を含むベクター。
（３０） （２８）に記載の核酸又は（２９）に記載のベクターを用いて遺伝子導入されたＢ細胞抗体受容体を発現する免疫細胞。
（３１） 前記免疫細胞が、αβＴ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞、γδＴ細胞又はＮＫ細胞である（３０）に記載の免疫細胞。
（３２） （３０）又は（３１）に記載の免疫細胞を有効成分とする再生医療等製品（細胞医薬品）。
（３３） 血友病を治療及び／又は予防するための、（３２）に記載の再生医療等製品（細胞医薬品）。
（３４） 治療を必要とする対象に、（３０）又は（３１）に記載の免疫細胞、或いは（３３）に記載の再生医療等製品（細胞医薬品）を投与することを特徴とする、血友病を治療及び／又は予防する方法。
（１） ａ）抗体結合ドメインとｂ）細胞膜貫通ドメインとｃ）共刺激因子の細胞内ドメインとｄ）活性化受容体の細胞内ドメインとが結合したＢ細胞抗体受容体。
（２） 前記ａ）、ｂ）、ｃ）又はｄ）の結合部分にリンカーが挿入されている（１）に記載のＢ細胞抗体受容体。
（３） 前記ａ）抗体結合ドメインが、抗体が特異的に認識する抗体認識配列を含むタンパク質又はペプチドである（１）又は（２）に記載のＢ細胞抗体受容体。
（４） 前記ｂ）膜貫通ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８αからなる群から選択される（１）～（３）のいずれかに記載のＢ細胞抗体受容体。
（５） 前記ｃ）共刺激因子の細胞内ドメインが、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２７８及びＣＤ２８からなる群から選択される（１）～（４）のいずれかに記載のＢ細胞抗体受容体。
（６） 前記ｄ）活性化受容体がＴＣＲ又はＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される（１）～（５）のいずれかに記載のＢ細胞抗体受容体。
（７）前記ａ）抗体結合ドメインがα－ＧＡＬの全長タンパク質を含み、該α－ＧＡＬの全長タンパク質をコードする塩基配列が配列番号１に記載の塩基配列、又は同一の機能を有する、配列番号１に記載の塩基配列と９５％以上の同一の塩基配列を含む、（１）～（６）のいずれかに記載のＢ細胞抗体受容体。
（８）前記ａ）抗体結合ドメインがα－ＧＡＬの抗体認識配列領域（Ｄ１ ｒｅｇｉｏｎ）を含み、該α－ＧＡＬの抗体認識配列領域（Ｄ１ ｒｅｇｉｏｎ）をコードする塩基配列が配列番号２に記載の塩基配列、又は同一の機能を有する、配列番号２に記載の塩基配列と９５％以上の同一の塩基配列を含む、（１）～（６）のいずれかに記載のＢ細胞抗体受容体。
（９）前記ａ）抗体結合ドメインがＡＤＡＭＴＳ１３のスペーサードメインタンパク質を含み、該ＡＤＡＭＴＳ１３のスペーサードメインタンパク質をコードする塩基配列が配列番号３もしくは３７に記載の塩基配列、又は同一の機能を有する、配列番号３もしくは３７に記載の塩基配列と９５％以上の同一の塩基配列を含む、（１）～（６）のいずれかに記載のＢ細胞抗体受容体。
（１０）前記ａ）抗体結合ドメインがＡＤＡＭＴＳ１３のスペーサードメイン及びシステインリッチドメインを含み、該ＡＤＡＭＴＳ１３のスペーサードメインをコードする塩基配列が、配列番号３もしくは３７に記載の塩基配列、又は同一の機能を有する、配列番号３もしくは３７に記載の塩基配列と９５％以上の同一の塩基配列を含み、及びシステインリッチドメインをコードする塩基配列が、配列番号４に記載の塩基配列、又は同一の機能を有する、配列番号４に記載の塩基配列と９５％以上の同一の塩基配列を含む、（１）～（６）のいずれかに記載のＢ細胞抗体受容体。
（１１）前記ａ）抗体結合ドメインが血液凝固第VIII因子もしくは血液凝固第IX因子の全長タンパク質又は抗体認識配列を含む、（１）～（６）のいずれかに記載のＢ細胞抗体受容体。
（１２） （１）～（８）のいずれかに記載のＢ細胞抗体受容体をコードする核酸。
（１３） （１２）に記載の核酸を含むベクター。
（１４） （１２）に記載の核酸又は（１３）に記載のベクターを用いて遺伝子導入されたＢ細胞抗体受容体を発現する免疫細胞。
（１５） 前記免疫細胞が、αβＴ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞、γδＴ細胞又はＮＫ細胞である（１４）に記載の免疫細胞。
（１６） （１４）又は（１５）に記載の免疫細胞を有効成分とする再生医療等製品（細胞医薬品）。
（１７） ライソゾーム病を治療及び／又は予防するための、（１６）に記載の再生医療等製品（細胞医薬品）。
（１８） ライソゾーム病がファブリー病である、（１７）に記載の再生医療等製品（細胞医薬品）。
（１９） 治療を必要とする対象に、（１４）又は（１５）に記載の免疫細胞、或いは（１７に記載の再生医療等製品（細胞医薬品）を投与することを特徴とする、ライソゾーム病を治療及び／又は予防する方法。
（２０） ライソゾーム病がファブリー病である、（１９）に記載の方法。
（２１） （１）～（６）、（９）又は（１０）に記載のＢ細胞抗体受容体をコードする核酸。
（２２） （２１）に記載の核酸を含むベクター。
（２３） （２１）に記載の核酸又は（２２）に記載のベクターを用いて遺伝子導入されたＢ細胞抗体受容体を発現する免疫細胞。
（２４） 前記免疫細胞が、αβＴ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞、γδＴ細胞又はＮＫ細胞である（２３）に記載の免疫細胞。
（２５） （２３）又は（２４）に記載の免疫細胞を有効成分とする再生医療等製品（細胞医薬品）。
（２６） 血栓性血小板減少性紫斑病を治療及び／又は予防するための、（２５）に記載の再生医療等製品（細胞医薬品）。
（２７） 治療を必要とする対象に、（２３）又は（２４）に記載の免疫細胞、或いは（２６）に記載の再生医療等製品（細胞医薬品）を投与することを特徴とする、血栓性血小板減少性紫斑病を治療及び／又は予防する方法。
（２８） （１）～（６）又は（１１）に記載のＢ細胞抗体受容体をコードする核酸。
（２９） （２８）に記載の核酸を含むベクター。
（３０） （２８）に記載の核酸又は（２９）に記載のベクターを用いて遺伝子導入されたＢ細胞抗体受容体を発現する免疫細胞。
（３１） 前記免疫細胞が、αβＴ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞、γδＴ細胞又はＮＫ細胞である（３０）に記載の免疫細胞。
（３２） （３０）又は（３１）に記載の免疫細胞を有効成分とする再生医療等製品（細胞医薬品）。
（３３） 血友病を治療及び／又は予防するための、（３２）に記載の再生医療等製品（細胞医薬品）。
（３４） 治療を必要とする対象に、（３０）又は（３１）に記載の免疫細胞、或いは（３３）に記載の再生医療等製品（細胞医薬品）を投与することを特徴とする、血友病を治療及び／又は予防する方法。
【発明の効果】
【0012】
本発明により、患者体内で産生される抗体に起因する疾患、例えばライソゾーム病の治療に有効な手段が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】本発明に係るＢＡＲ－Ｔ細胞による治療概念図を示す。
【図2】ＢＡＲ－Ｔ細胞によるＢＡＲの発現を示す。
【図3】ＭａｘＣｙｔｅ ｍＲＮＡ導入プロトコルでヒトＴ細胞にＢＡＲ ｍＲＮＡを導入したＢＡＲ－Ｔ細胞によるＢＡＲの発現を示す。
【図4】抗ＧＬＡモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製方法を示す。
【図5】抗ＧＬＡ抗体のｓｃＦｖの配列の作出を示す。
【図6】抗ＧＬＡ抗体のｓｃＦｖの塩基配列（配列番号９）を挿入したプラスミドベクターの１例を示す。
【図7】Ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害性活性試験の概要を示す。
【図8】Ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害性活性の結果（フローサイトメトリーの結果）を示す。
【図9】ａ）抗体結合ドメインの１例であるα－ＧＡＬの全長タンパク質（Ｆｕｌｌ Ｌｅｎｇｔｈ）のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号１）と、これを挿入したＢＡＲのレンチウイルスベクターマップが示される。
【図10】ａ）抗体結合ドメインの１例であるα－ＧＡＬの抗体認識配列のアミノ酸配列（Ｄ１ ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号２）と、これを挿入したＢＡＲのレンチウイルスベクターマップが示される。
【図11】抗ＧＬＡ抗体のｓｃＦｖを強制発現させたＴｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔを対象としたＧＬＡ－ｍＣｈｅｒｒｙの結合アッセイの結果を示す。
【図12】ＧＬＡの全長タンパク質（ＦＬ）ＢＡＲのｍＲＮＡ合成用プラスミドベクターマップの１例を示す。
【図13】ａ）抗体結合ドメインの１例であるＡＤＡＭＴＳ１３のスペーサードメインのアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号３）と、これを挿入したＢＡＲのプラスミドベクターマップの１例が示される。
【図14】ａ）抗体結合ドメインの１例であるＡＤＡＭＴＳ１３のスペーサードメインのアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号３）及びＡＤＡＭＴＳ１３のシステインリッチドメインのアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号４）と、これを挿入したＢＡＲのプラスミドベクターマップの１例が示される。
【図15】ａ）抗体結合ドメインの１例であるα－ＧＡＬの全長タンパク質（Ｆｕｌｌ Ｌｅｎｇｔｈ）のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号１）と、これを挿入したＢＡＲのレトロウイルスベクターマップが示される。
【図16】ａ）抗体結合ドメインの１例であるα－ＧＡＬの抗体認識配列のアミノ酸配列（Ｄ１ ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号２）と、これを挿入したＢＡＲのレトロウイルスベクターマップが示される。
【図17】ＧＬＡの全長タンパク質（ＦＬ）ＢＡＲのｍＲＮＡ合成用プラスミドベクターマップの１例を示す。
【図18】ａ）抗体結合ドメインの１例であるＡＤＡＭＴＳ１３のスペーサードメインのアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号３）と、これを挿入したＢＡＲのプラスミドベクターマップの１例が示される。
【図19】ａ）抗体結合ドメインの１例であるＡＤＡＭＴＳ１３のスペーサードメインのアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号３）及びＡＤＡＭＴＳ１３のシステインリッチドメインのアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号４）と、これを挿入したＢＡＲのプラスミドベクターマップの１例が示される。
【図20】抗体結合ドメインの一例であるα－ＧＡＬの全長タンパク質（Ｆｕｌｌ Ｌｅｎｇｔｈ）のアミノ酸配列をコードした塩基配列（配列番号１）と、これを挿入したＢＡＲのレトロウイルスベクターマップが示される。
【図21】抗ＧＬＡ抗体のｓｃＦｖの塩基配列（配列番号３６）を挿入したレトロウイルスベクターマップが示される。
【図22】抗体結合ドメインの一例であるＡＤＡＭＴＳ１３のアミノ酸配列をコードした塩基配列（配列番号３７）と、これを挿入したＢＡＲのレトロウイルスベクターマップが示される。
【図23】抗ＡＤＡＭＴＳ１３抗体のｓｃＦｖの塩基配列（配列番号４１）を挿入したレトロウイルスベクターマップが示される。
【図24】抗ＧＬＡ抗体のｓｃＦｖを発現させたＮａｌｍ６を対象としたｈＧＬＡ－ｍＣｈｅｒｒｙの結合アッセイの結果を示す。
【図25】ＨＡ ＴＡＧを用いた、ｈＧＬＡ ＢＡＲの発現確認の結果を示す。
【図26】抗ＧＬＡ抗体を用いた、ｈＧＬＡ ＢＡＲの発現確認の結果を示す。
【図27】ＢＡＲ Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ－ＧＬＡ－ＢＡＲ２－ＥＧＦＰ：Ｅｆｆｅｃｔｏｒ）と標的細胞（ＮＡＬＭ６－ｓｃＦｖ－ＧＬＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ：Ｔａｒｇｅｔ）を混合比率１：０、２：１、１：１で２４時間混合培養した時のＣＤ６９の検出試験の結果である。
【図28】ＨＡ ＴＡＧを用いたＡＤＡＭＴＳ１３ ＢＡＲの発現確認の結果を示す。
【図29】ＨＡ ＴＡＧを用いたＡＤＡＭＴＳ１３ ＢＡＲの発現確認の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本発明は、体外から補充された治療用酵素又は凝固因子或いは内在性のタンパク質に対する抗体が患者体内で産生されることにより発生する疾患を治療するためのＢ細胞抗体受容体－免疫細胞を提供し、該細胞を用いた免疫療法に関する。ここで、「Ｂ細胞抗体受容体－免疫細胞」（以下単に「ＢＡＲ－免疫細胞」とも言う。）とは、Ｂ細胞抗体受容体（ＢＡＲ）を発現させた免疫細胞を意味し、免疫細胞がＴ細胞である場合、「Ｂ細胞抗体受容体－Ｔ細胞」（以下単に「ＢＡＲ－Ｔ細胞」とも言う）と呼ぶ。
【0015】
［１］Ｂ細胞抗体受容体（ＢＡＲ）
本発明のＢＡＲは、ａ）抗体結合ドメインとｂ）細胞膜貫通ドメインとｃ）共刺激因子の細胞内ドメイン、ｄ）活性化受容体の細胞内ドメインを含むことを特徴とする。ａ）抗体結合ドメインが結合する抗体を過剰発現する細胞に対して高い特異性と細胞障害活性を有する。
本発明のＢＡＲは、ａ）抗体結合ドメインとｂ）細胞膜貫通ドメインとｃ）共刺激因子の細胞内ドメイン、ｄ）活性化受容体の細胞内ドメインを含むことを特徴とする。ａ）抗体結合ドメインが結合する抗体を過剰発現する細胞に対して高い特異性と細胞障害活性を有する。
【0016】
ａ）抗体結合ドメインは、疾患の原因となる抗体が特異的に結合する物質であれば特に制限はされない。ライソゾーム病等の酵素補充療法の治療効果を阻害するＢ細胞を傷害・排除するならば、例えば、ファブリー病の場合はα－ＧＡＬ、ゴーシェ病の場合はグルコセレブロシダーゼ、ポンぺ病の場合はα－グルコシダーゼ、ムコ多糖症の場合はα－Ｌ－イズロニダーゼの全長タンパク質、又は抗体認識配列を含むペプチド等が選択される。これらタンパク質のアミノ酸配列又は塩基配列は、一般に公開されており、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ＮＣＢＩ）のデータベースからキーワード検索で取得可能である。
この抗体結合ドメインは、疾患の原因となる抗体と結合し、相互作用することにより、斯かる抗体を産生するＢ細胞を傷害・排除する。
この抗体結合ドメインは、疾患の原因となる抗体と結合し、相互作用することにより、斯かる抗体を産生するＢ細胞を傷害・排除する。
【0017】
また、血友病のように血液凝固因子の投与による治療効果を阻害する抗体を産生するＢ細胞を傷害・排除するならば、例えば、血液凝固第VIII因子、血液凝固第IX因子、の全長タンパク質、又は抗体認識配列を含むペプチド等が選択される。
【0018】
また、血栓性血小板減少性紫斑病の場合にはＡＤＡＭＴＳ１３の全長タンパク質、又は抗体認識配列を含むペプチド等が挙げられる。
【0019】
抗体結合ドメインの一態様として、α－ＧＡＬの全長タンパク質（Ｆｕｌｌ Ｌｅｎｇｔｈ）又は抗体認識配列領域（Ｄ１ ｒｅｇｉｏｎ）を含むペプチドが挙げられ、α－ＧＡＬの全長タンパク質（Ｆｕｌｌ Ｌｅｎｇｔｈ）のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列は、配列番号１０、配列番号１に、その抗体認識配列領域（Ｄ１ ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列は、配列番号１１、配列番号２に示される。
なお、上記α－ＧＡＬの全長タンパク質（Ｆｕｌｌ Ｌｅｎｇｔｈ）又は抗体認識配列領域（Ｄ１ ｒｅｇｉｏｎ）をコードする塩基配列は、同一の機能を有する実質的に相同な塩基配列であってもよい。ここで、用語「実質的に相同」は、一次塩基配列レベルで互いに有意に類似した２つ以上の生物分子配列を包含する。例えば、２つ以上の核酸配列の文脈で、「実質的に相同」とは、少なくとも約７５％同一、好ましくは少なくとも約８０％同一、及びより好ましくは少なくとも約８５％同一又は少なくとも約９０％同一であり、並びにさらにより好ましくは少なくとも約９５％同一、より好ましくは少なくとも９７％同一である、より好ましくは少なくとも約９８％同一である、より好ましくは少なくとも９９％同一であることを意味する。
なお、上記α－ＧＡＬの全長タンパク質（Ｆｕｌｌ Ｌｅｎｇｔｈ）又は抗体認識配列領域（Ｄ１ ｒｅｇｉｏｎ）をコードする塩基配列は、同一の機能を有する実質的に相同な塩基配列であってもよい。ここで、用語「実質的に相同」は、一次塩基配列レベルで互いに有意に類似した２つ以上の生物分子配列を包含する。例えば、２つ以上の核酸配列の文脈で、「実質的に相同」とは、少なくとも約７５％同一、好ましくは少なくとも約８０％同一、及びより好ましくは少なくとも約８５％同一又は少なくとも約９０％同一であり、並びにさらにより好ましくは少なくとも約９５％同一、より好ましくは少なくとも９７％同一である、より好ましくは少なくとも約９８％同一である、より好ましくは少なくとも９９％同一であることを意味する。
【0020】
抗体結合ドメインの一態様として、ＡＤＡＭＴＳ１３が挙げられる。ＡＤＡＭＴＳ１３は、多数のドメインが連結したタンパク質であるが、ＡＤＡＭＴＳ１３に対する抗体は、その大半がスペーサードメインに結合することが報告されているため、抗体結合ドメインとしてはスペーサードメインを用いることが好ましいと考えられる。ＡＤＡＭＴＳ１３のスペーサードメインのアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列は、配列番号１２及び３に示される（図１３、図１８）。なお、上記ＡＤＡＭＴＳ１３のスペーサードメインをコードする塩基配列は、同一の機能を有する実質的に相同な塩基配列であってもよい。また、スペーサードメインとそれ以外の部分を組み合わせて用いることも可能である。それ以外の部分の一態様として、システインリッチドメインが挙げられ、システインリッチドメインのアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列は、配列番号１３及び４に示される（図１４、図１９）。
【0021】
ｂ）膜貫通ドメインの種類は、Ｂ細胞抗体受容体の機能を阻害しない限り制限されない。例えば、Ｔ細胞等で発現するＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８α等の膜貫通ドメインを用いることができる。これら膜貫通ドメインのアミノ酸配列又は塩基配列情報は一般に公開されており、ＮＣＢＩのデータベースからキーワード検索で取得可能である。これらの膜貫通ドメインは、Ｂ細胞抗体受容体の機能を阻害しない限り、適宜変異が導入されていてもよい。ここで、用語「変異」は、１個又は数個～複数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を含む任意の変異を意味する。
ａ）抗体結合ドメイン、ｂ）細胞膜貫通ドメイン、ｃ）共刺激因子の細胞内ドメイン、又はｄ）活性化受容体の細胞内ドメインの結合部分に場合によりオリゴペプチドリンカー又はポリペプチドリンカーを挿入して、互いに連結することができる。好ましくは、長さが２～１０個のアミノ酸からなるリンカーを用いることができる。例えば、アミノ酸配列「ＧＳＧＧＧ」を有するフレキシブルリンカーを使用することができる。
膜貫通ドメインの一態様として、ＣＤ３の膜貫通ドメイン（ＴＭ）のアミノ酸配列、及びそれをコードする塩基配列を、それぞれ配列番号１５及び配列番号６に示す。
本発明のＢＡＲは、細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間、又は細胞内ドメインと膜貫通ドメインの間に、スペーサー配列を配置することができる。スペーサー配列は、膜貫通ドメインと細胞外ドメイン及び／又は膜貫通ドメインと細胞内ドメインとを連結する働きをする任意のオリゴペプチド又はポリペプチドを意味する。スペーサー配列は、３００個までのアミノ酸、好ましくは１０～１００個のアミノ酸、最も好ましくは１０～５０個のアミノ酸を含む。
ａ）抗体結合ドメイン、ｂ）細胞膜貫通ドメイン、ｃ）共刺激因子の細胞内ドメイン、又はｄ）活性化受容体の細胞内ドメインの結合部分に場合によりオリゴペプチドリンカー又はポリペプチドリンカーを挿入して、互いに連結することができる。好ましくは、長さが２～１０個のアミノ酸からなるリンカーを用いることができる。例えば、アミノ酸配列「ＧＳＧＧＧ」を有するフレキシブルリンカーを使用することができる。
膜貫通ドメインの一態様として、ＣＤ３の膜貫通ドメイン（ＴＭ）のアミノ酸配列、及びそれをコードする塩基配列を、それぞれ配列番号１５及び配列番号６に示す。
本発明のＢＡＲは、細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間、又は細胞内ドメインと膜貫通ドメインの間に、スペーサー配列を配置することができる。スペーサー配列は、膜貫通ドメインと細胞外ドメイン及び／又は膜貫通ドメインと細胞内ドメインとを連結する働きをする任意のオリゴペプチド又はポリペプチドを意味する。スペーサー配列は、３００個までのアミノ酸、好ましくは１０～１００個のアミノ酸、最も好ましくは１０～５０個のアミノ酸を含む。
【0022】
ｃ）共刺激因子の細胞内ドメインの種類は、免疫細胞等が有する共刺激因子に由来する細胞内ドメインであればよく、特に限定はされない。例えば、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２７８及びＣＤ２８等の共刺激因子からなる群から選択される１種以上の細胞内ドメインを適宜選択して使用することができる。これら共刺激因子の細胞内ドメインのアミノ酸配列又は塩基配列情報は一般に公開されており、ＮＣＢＩのデータベースからキーワード検索で取得可能である。これらの共刺激因子の細胞内ドメインは、Ｂ細胞抗体受容体の機能を阻害しない限り、適宜変異が導入されていてもよい。
共刺激因子の細胞内ドメインの一態様として、４－１ＢＢが挙げられ、そのアミノ酸配列、及びそれをコードする塩基配列を、それぞれ配列番号１６及び配列番号７に示す。
共刺激因子の細胞内ドメインの一態様として、４－１ＢＢが挙げられ、そのアミノ酸配列、及びそれをコードする塩基配列を、それぞれ配列番号１６及び配列番号７に示す。
【0023】
ｄ）活性化受容体の細胞内ドメインの種類は、免疫細胞の種類によって適切なものを選択すればよく、例えば、免疫細胞としてＴ細胞を用いる場合には、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞内ドメインであるＣＤ３ζ（ＴＣＲζ鎖とも呼ばれるＣＤ３に由来する細胞内ドメイン）を選択することが好ましい。またＮＫ細胞を用いる場合には、ＮＫＧ２Ｄに由来する細胞内ドメインを選択することが好ましい。これら活性化受容体ドメインのアミノ酸配列又は塩基配列情報は一般に公開されており、ＮＣＢＩのデータベースからキーワード検索で取得可能である。これらの細胞内ドメインは、Ｂ細胞抗体受容体の機能を阻害しない限り、適宜変異が導入されていてもよい。
活性化受容体の細胞内ドメインの一態様として、ＣＤ３ζが挙げられ、そのアミノ酸配列、及びそれをコードする塩基配列を、それぞれ配列番号１７及び配列番号８に示す。
本明細書における用語「ドメイン」とは、ポリペプチド内の一領域である。本明細書において、「ドメイン」は、Ｂ細胞抗体受容体分子内の位置により、「抗体結合ドメイン」、「膜貫通ドメイン」、及び「細胞内ドメイン」のように使用される。
細胞内で発現したＢＡＲタンパク質の細胞膜への輸送などをサポートするためにシグナルシークエンスを付けることもできる。シグナルシークエンスとしては、ＣＳＦ２ＲＡという受容体遺伝子に由来するＬｅａｄｅｒ２（配列番号５及び１４）、ＣＤ８に由来するＬｅａｄｅｒ１（配列番号２４及び２５）が挙げられる。
活性化受容体の細胞内ドメインの一態様として、ＣＤ３ζが挙げられ、そのアミノ酸配列、及びそれをコードする塩基配列を、それぞれ配列番号１７及び配列番号８に示す。
本明細書における用語「ドメイン」とは、ポリペプチド内の一領域である。本明細書において、「ドメイン」は、Ｂ細胞抗体受容体分子内の位置により、「抗体結合ドメイン」、「膜貫通ドメイン」、及び「細胞内ドメイン」のように使用される。
細胞内で発現したＢＡＲタンパク質の細胞膜への輸送などをサポートするためにシグナルシークエンスを付けることもできる。シグナルシークエンスとしては、ＣＳＦ２ＲＡという受容体遺伝子に由来するＬｅａｄｅｒ２（配列番号５及び１４）、ＣＤ８に由来するＬｅａｄｅｒ１（配列番号２４及び２５）が挙げられる。
【0024】
［２］免疫細胞
Ｂ細胞抗体受容体を導入する免疫細胞の例として、αβＴ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞、γδＴ細胞又はＮＫ細胞等が用いられる。
まず、αβＴ細胞等の原料となる末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）を準備する。ＰＢＭＣｓを採取する方法は、特に限定されないが、例えば、採血により得られた末梢血を密度勾配遠心法により分離することで、ＰＢＭＣｓを取得することができる。１回の採血量は、治療法により適宜設定することが可能であるが、例えば、２４～７２ｍＬの採血を行えば、１×１＾７～３×１０＾７のＰＢＭＣｓを取得することができる。また、多量の細胞を確保する必要がある場合には、成分採血装置を用いて単核球成分を採取することが可能である。
Ｂ細胞抗体受容体を導入する免疫細胞の例として、αβＴ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞、γδＴ細胞又はＮＫ細胞等が用いられる。
まず、αβＴ細胞等の原料となる末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）を準備する。ＰＢＭＣｓを採取する方法は、特に限定されないが、例えば、採血により得られた末梢血を密度勾配遠心法により分離することで、ＰＢＭＣｓを取得することができる。１回の採血量は、治療法により適宜設定することが可能であるが、例えば、２４～７２ｍＬの採血を行えば、１×１＾７～３×１０＾７のＰＢＭＣｓを取得することができる。また、多量の細胞を確保する必要がある場合には、成分採血装置を用いて単核球成分を採取することが可能である。
【0025】
αβＴ細胞を製造する場合、採取したＰＢＭＣｓを培養液（培地）に懸濁し、得られた細胞懸濁液にインターロイキン２（ＩＬ－２）、抗ＣＤ３抗体を添加して、培養を行う。
抗ＣＤ３抗体は、培地中に添加しても、培養容器の底面に固相化してもよいが、抗ＣＤ３抗体を固相化したフラスコ等の培養容器にＰＢＭＣｓを播種することで、より好適に培養できることが知られている（例えば、特許３０５６２３０号）。ＩＬ－２の濃度は、培地中に１０００～２０００ＩＵ／ｍＬの濃度となるように添加することが好ましい。
抗ＣＤ３抗体は、培地中に添加しても、培養容器の底面に固相化してもよいが、抗ＣＤ３抗体を固相化したフラスコ等の培養容器にＰＢＭＣｓを播種することで、より好適に培養できることが知られている（例えば、特許３０５６２３０号）。ＩＬ－２の濃度は、培地中に１０００～２０００ＩＵ／ｍＬの濃度となるように添加することが好ましい。
【0026】
前項のように調製したαβＴ細胞には、ＣＤ８Ｔ細胞やＣＤ４Ｔ細胞を含んでいるため、ＣＤ８Ｔ細胞又はＣＤ４Ｔ細胞を免疫細胞として用いる場合には、磁気ビーズ等を用いた細胞分離法で、調製したαβＴ細胞からＣＤ８Ｔ細胞又はＣＤ４Ｔ細胞をポジティブセレクション又はネガティブセレクションすることで取得することができる。
【0027】
ＮＫ細胞を製造する場合、ＰＢＭＣｓを抗ＣＤ１６抗体等、ＮＫ細胞に発現する分子のアゴニストやＩＬ－２等の存在下で培養する方法が一般的である（例えば、特許４２７５６８０等）。本発明に用いるＮＫ細胞は、そのいずれの方法を用いても構わない。また、特許文献ＷＯ２００９／１５１１８３等に記載された方法により調製されたＣＤ１６＋及び／又はＣＤ５６＋細胞をＮＫ細胞として用いても構わない。
【0028】
γδＴ細胞を製造する場合、採取したＰＢＭＣｓをビスホスホネート等のリン酸抗原及びＩＬ－２の存在下で培養することにより、γδＴ細胞を選択的に増殖及び活性化させて、γδＴ細胞を高純度に含む細胞群を調製することができる（例えば、特許文献ＷＯ２００６／００６７２０等）。本発明に用いるγδＴ細胞は、いずれの方法を用いても構わない。
【0029】
培養は、温度を３４～３８℃、好ましくは３７℃で、ＣＯ２濃度を２～１０％、好ましくは５％の条件下で行い、培養期間は、１～２０日、特に１～２週間程度が好ましい。
【0030】
使用する培地は特に限定されないが、ＡＩＭ－Ｖ培地（インビトロジェン）、ＲＰＭＩ－１６４０培地（インビトロジェン）、ダルベッコ改変イーグル培地（インビトロジェン）、イスコフ培地（インビトロジェン）、ＫＢＭ培地（コージンバイオ）、ＡＬｙｓ培地（細胞科学研究所）等細胞培養に使用されている市販の培地を使用することができる。あらかじめＩＬ－２が添加された、ヒト末梢血Ｔ細胞用培地（例えば、ＡＬｙｓ５０５Ｎ；細胞科学研究所）であってもよい。また、必要に応じて５～２０％の牛血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）、牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ：ＦＣＳ）、ヒト血清（Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ）、ヒト血漿（Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍａ：ＨＢＰ）等を添加することができる。
【0031】
前述のように調製した免疫細胞；αβＴ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞、γδＴ細胞及び／又はＮＫ細胞に、Ｂ細胞抗体受容体をコードする遺伝子を導入する。導入する遺伝子は、ＤＮＡ又はＲＮＡから選択することができる。導入方法としては、ウイルスベクターによる導入、電気穿孔法による導入、リポフェクションによる導入等、適宜選択することができる。
【0032】
このようにして調製された免疫細胞は、ａ）抗体結合部分により、疾患の原因となる抗体を産生するＢ細胞に当該抗体を介して特異的に結合することで、活性化シグナル、共刺激シグナルにより活性化し、当該Ｂ細胞を傷害、排除する。その結果、疾患の原因となる抗体産生が抑制され、疾患が治療されることとなる。
【0033】
［３］再生医療等製品（細胞医薬品）及び医薬組成物又はこれらを用いた治療及び予防方法
本発明によれば、Ｂ細胞抗体受容体（ＢＡＲ）を発現する細胞は、疾患を治療及び／又は予防するために使用することができ、典型的には、再生医療等製品（細胞医薬品）及び医薬組成物が提供され得る。ここで、「治療」とは、標的疾患に特徴的な症状又は随伴症状を緩和すること（軽症化）、症状の悪化を阻止ないし遅延することなどが含まれ、治療の中には疾患の改善も含まれる。「予防」とは、疾病（障害）又はその症状の発症／発現を防止若しくは遅延すること、又は発症／発現の危険性を低下させることをいう。
一態様において、本発明の再生医療等製品（細胞医薬品）は、ＢＡＲを発現する本発明の細胞を活性成分として含み、さらに、適切な賦形剤などを含んでもよい。
別の態様において、本発明の医薬組成物は、有効量の本発明の細胞を活性成分として含み、さらに、適切な医薬として許容される賦形剤などを含んでもよい。該細胞製剤及び医薬組成物に含まれる賦形剤には、種々の細胞培養培地、リン酸緩衝生理食塩水、等張食塩水などが挙げられる。
本明細書における用語「再生医療等製品」には、
１）（ｉ）人又は動物の体の構造又は機能の再建、修復又は形成、或いは
（ｉｉ）人又は動物の疾病の治療又は予防、
に使用されることが目的とされている物のうち、人又は動物の細胞に培養その他の加工を施したもの；或いは
２）人又は動物の疾病の治療に使用されることが目的とされている物のうち、人又は動物の細胞に導入され、これらの体内で発現する遺伝子を含有させたもの
を指す。特に限定しないが、
１）ヒト細胞加工製品
ア ヒト体細胞加工製品
イ ヒト体性幹細胞加工製品
ウ ヒト胚性幹細胞加工製品
エ ヒト人工多能性幹細胞加製品
２）動物 細胞加工製品
ア 動物体細胞加工製品
イ 動物体性幹細胞加工製品
ウ 動物胚性幹細胞加工製品
エ 動物人工多能性幹細胞加製品
３）遺伝子治療用製品
ア プラスミドベクター製品
イ ウイルスベクター製品
ウ 遺伝子発現治療製品（ア・イを除く。）
が挙げられ、本願発明のＢ細胞抗体受容体を発現する免疫細胞を有効成分とする再生医療等製品はヒト体細胞加工製品に該当する。
本発明によれば、Ｂ細胞抗体受容体（ＢＡＲ）を発現する細胞は、疾患を治療及び／又は予防するために使用することができ、典型的には、再生医療等製品（細胞医薬品）及び医薬組成物が提供され得る。ここで、「治療」とは、標的疾患に特徴的な症状又は随伴症状を緩和すること（軽症化）、症状の悪化を阻止ないし遅延することなどが含まれ、治療の中には疾患の改善も含まれる。「予防」とは、疾病（障害）又はその症状の発症／発現を防止若しくは遅延すること、又は発症／発現の危険性を低下させることをいう。
一態様において、本発明の再生医療等製品（細胞医薬品）は、ＢＡＲを発現する本発明の細胞を活性成分として含み、さらに、適切な賦形剤などを含んでもよい。
別の態様において、本発明の医薬組成物は、有効量の本発明の細胞を活性成分として含み、さらに、適切な医薬として許容される賦形剤などを含んでもよい。該細胞製剤及び医薬組成物に含まれる賦形剤には、種々の細胞培養培地、リン酸緩衝生理食塩水、等張食塩水などが挙げられる。
本明細書における用語「再生医療等製品」には、
１）（ｉ）人又は動物の体の構造又は機能の再建、修復又は形成、或いは
（ｉｉ）人又は動物の疾病の治療又は予防、
に使用されることが目的とされている物のうち、人又は動物の細胞に培養その他の加工を施したもの；或いは
２）人又は動物の疾病の治療に使用されることが目的とされている物のうち、人又は動物の細胞に導入され、これらの体内で発現する遺伝子を含有させたもの
を指す。特に限定しないが、
１）ヒト細胞加工製品
ア ヒト体細胞加工製品
イ ヒト体性幹細胞加工製品
ウ ヒト胚性幹細胞加工製品
エ ヒト人工多能性幹細胞加製品
２）動物 細胞加工製品
ア 動物体細胞加工製品
イ 動物体性幹細胞加工製品
ウ 動物胚性幹細胞加工製品
エ 動物人工多能性幹細胞加製品
３）遺伝子治療用製品
ア プラスミドベクター製品
イ ウイルスベクター製品
ウ 遺伝子発現治療製品（ア・イを除く。）
が挙げられ、本願発明のＢ細胞抗体受容体を発現する免疫細胞を有効成分とする再生医療等製品はヒト体細胞加工製品に該当する。
【0034】
［４］本発明のＢ細胞抗体受容体（ＢＡＲ）をコードする核酸
本発明によれば、上記［１］に記載するＢＡＲのアミノ酸配列をコードする核酸が提供される。別段の規定がない限り、「アミノ酸配列をコードする核酸（又は塩基配列）」には、相互に縮重型であり、同じアミノ酸配列をコードするすべての塩基配列が含まれる。
ＢＡＲをコードする核酸は、特定された責任酵素のｃＤＮＡ配列から常法により容易に作製することができる。例えば、ＢＡＲを構成するａ）～ｄ）のうち、ａ）をコードする核酸は、例えば、体細胞から、ｍＲＮＡを抽出し、そのｍＲＮＡから逆転写によりｃＤＮＡを作製し、そのｃＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲ法等を用いることにより増幅・取得することが出来る。ｂ）、ｃ）及びｄ）をコードする核酸は、例えば、免疫細胞からｍＲＮＡを抽出し、そのｍＲＮＡから逆転写によりｃＤＮＡを作製し、そのｃＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲ法等を用いることにより増幅・取得することが出来る。
ＢＡＲをコードする核酸は、上記の通り取得した各ドメインをコードする核酸を連結することにより、得ることができる。各ドメインをコードする核酸の連結は、例えば、相同組換えによるクローニング、オーバーラップ伸長法等の公知の方法を用いて行うことができる。
作製したＢＡＲの核酸は、プラスミドやウイルスベクターに組み込んで用いたり、ｍＲＮＡを合成して用いたりすることができる。
本発明によれば、上記［１］に記載するＢＡＲのアミノ酸配列をコードする核酸が提供される。別段の規定がない限り、「アミノ酸配列をコードする核酸（又は塩基配列）」には、相互に縮重型であり、同じアミノ酸配列をコードするすべての塩基配列が含まれる。
ＢＡＲをコードする核酸は、特定された責任酵素のｃＤＮＡ配列から常法により容易に作製することができる。例えば、ＢＡＲを構成するａ）～ｄ）のうち、ａ）をコードする核酸は、例えば、体細胞から、ｍＲＮＡを抽出し、そのｍＲＮＡから逆転写によりｃＤＮＡを作製し、そのｃＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲ法等を用いることにより増幅・取得することが出来る。ｂ）、ｃ）及びｄ）をコードする核酸は、例えば、免疫細胞からｍＲＮＡを抽出し、そのｍＲＮＡから逆転写によりｃＤＮＡを作製し、そのｃＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲ法等を用いることにより増幅・取得することが出来る。
ＢＡＲをコードする核酸は、上記の通り取得した各ドメインをコードする核酸を連結することにより、得ることができる。各ドメインをコードする核酸の連結は、例えば、相同組換えによるクローニング、オーバーラップ伸長法等の公知の方法を用いて行うことができる。
作製したＢＡＲの核酸は、プラスミドやウイルスベクターに組み込んで用いたり、ｍＲＮＡを合成して用いたりすることができる。
【0035】
［５］本発明のＢ細胞抗体受容体（ＢＡＲ）を発現する免疫細胞の製造方法
本発明のＢＡＲを発現する免疫細胞の製造方法は、上記［４］に記載するＢＡＲをコードする核酸を免疫細胞に導入する工程を含む。該工程は、ＢＡＲをコードする核酸を含むウイルスベクター又は非ウイルスベクターを利用して、免疫細胞を生体外で形質転換する方法や、エレクトロポレーション法で実施される。
例えば、本発明に係るＢＡＲをコードする核酸を含むウイルスベクター又はプラスミドベクターもしくは核酸そのものを利用して、免疫細胞を生体外で形質転換することにより製造することができる。
ベクターの種類及び用途は特に限定されないが、プラスミドベクター、又はウイルスベクター（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、又はレトロウイルス）であり得る。また、ベクターは、例えば、クローニング用ベクター又は発現用ベクターであり得る。発現用ベクターとしては、大腸菌、又は放線菌等の原核細胞用のベクター、或いは、酵母細胞、昆虫細胞、又は哺乳類細胞等の真核細胞用のベクターを挙げることができる。
本発明のＢＡＲを発現する免疫細胞の製造方法は、上記［４］に記載するＢＡＲをコードする核酸を免疫細胞に導入する工程を含む。該工程は、ＢＡＲをコードする核酸を含むウイルスベクター又は非ウイルスベクターを利用して、免疫細胞を生体外で形質転換する方法や、エレクトロポレーション法で実施される。
例えば、本発明に係るＢＡＲをコードする核酸を含むウイルスベクター又はプラスミドベクターもしくは核酸そのものを利用して、免疫細胞を生体外で形質転換することにより製造することができる。
ベクターの種類及び用途は特に限定されないが、プラスミドベクター、又はウイルスベクター（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、又はレトロウイルス）であり得る。また、ベクターは、例えば、クローニング用ベクター又は発現用ベクターであり得る。発現用ベクターとしては、大腸菌、又は放線菌等の原核細胞用のベクター、或いは、酵母細胞、昆虫細胞、又は哺乳類細胞等の真核細胞用のベクターを挙げることができる。
【0036】
エレクトロポレーションに用いる機器や方法は特に限定されないが、ＭａｘＣｙｔｅ ＧＴ（ＭａｘＣｙｔｅ社）、Ｎｅｐａｇｅｎｅ（ネッパジーン社）、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ社）、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏｒａｄ社）などを用いることができる。
Ｂ細胞抗体受容体（ＢＡＲ）を発現する免疫細胞はａ）抗体結合ドメインでＢ細胞上の抗体を認識した後、その認識シグナルを、ζ鎖を通じてＴ細胞等の内部に伝達し、膜貫通ドメイン、及び共刺激因子を介して細胞内にて細胞傷害活性を惹起させるシグナルを作動させ、疾患の原因となる抗体を産生するＢ細胞に対して細胞障害活性を発揮する。
Ｂ細胞抗体受容体（ＢＡＲ）を発現する免疫細胞はａ）抗体結合ドメインでＢ細胞上の抗体を認識した後、その認識シグナルを、ζ鎖を通じてＴ細胞等の内部に伝達し、膜貫通ドメイン、及び共刺激因子を介して細胞内にて細胞傷害活性を惹起させるシグナルを作動させ、疾患の原因となる抗体を産生するＢ細胞に対して細胞障害活性を発揮する。
【0037】
［６］本発明のＢ細胞抗体受容体（ＢＡＲ）を発現する免疫細胞
本発明のＢＡＲを発現する免疫細胞は、上記［５］の製造方法により、上記［４］のＢＡＲをコードする核酸が導入及び発現された免疫細胞である。
本発明のＢＡＲを発現する免疫細胞は、上記［５］の製造方法により、上記［４］のＢＡＲをコードする核酸が導入及び発現された免疫細胞である。
【0038】
本発明の再生医療等製品（細胞医薬品）は、本発明の免疫細胞を医薬品として利用可能な液体（例えば、生理食塩水）に懸濁させた注射剤（細胞懸濁液）であり、疾患を治療及び／又は予防するために使用することができる。この注射剤は、静脈内、皮内又は皮下等に注射されてもよいし、病変部に直接注入されてもよいし、点滴として全身投与されてもよい。生理学的に許容できる担体又は賦形剤を含んでもよい。
【0039】
本発明の再生医療等製品（細胞医薬品）に含まれる免疫細胞の数は、投与方法や疾患の種類、患者の症状、患者の年齢、性別、体重、疾患の重篤度等に応じて適宜設定されうる。通常は１０＾８～１０＾１２個／人（好ましくは１０＾９個／人）となるように設定すればよい。
【0040】
本発明の再生医療等製品（細胞医薬品）の製造方法は、特に限定されない。例えば、１）本発明の免疫細胞を遠心分離等により培地から回収し；２）回収した免疫細胞を洗浄液（例えば、生理食塩水やＰＢＳ等）で洗浄し；３）洗浄した免疫細胞を遠心分離等により洗浄液から回収し；４）回収した免疫細胞を医薬品として利用可能な液体（例えば、生理食塩水）に懸濁させることで、経静脈投与が可能な点滴剤として製造されうる。
【0041】
本発明の再生医療等製品（細胞医薬品）の対象となる疾患としては、ライソゾーム病が挙げられる。ライソゾーム病は、ファブリー病、ゴーシェ病、ポンぺ病、ムコ多糖症を含む。また、血友病、血栓性血小板減少性紫斑病等の補充療法が施行される疾患が挙げられる。
【0042】
本発明の再生医療等製品（細胞医薬品）の投与対象（被験体）は、例えば、上記疾患に罹患した動物又は罹患する可能性がある動物である。動物とは、例えば、哺乳類動物であり、好ましくはヒトである。
【0043】
以下、本発明について実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
【実施例】
【0044】
１．ＧＬＡの塩基配列・アミノ酸配列の同定
ＧＬＡの塩基配列・アミノ酸配列は一般に公開されており、発明者らは、国立生物工学情報センターＮＣＢＩのデータベースから配列情報を入手した（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／４ＮＸＳ＿Ａ）。抗体認識配列領域であるＤ１ ｄｏｍａｉｎの塩基配列は、非特許文献（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００４ Ｍａｒ １９；３３７（２）：３１９－３５．）に従って同定した。ＧＬＡ全長タンパク質をコードする塩基配列を配列番号１に、ＧＬＡの抗体認識配列領域（Ｄ１ ｄｏｍａｉｎ）をコードする塩基配列を配列番号２に示す。ＧＬＡの配列がプラスミドに挿入されたＭＧＣ Ｈｕｍａｎ ＧＬＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｖｅｒｉｆｉｅｄ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｅ ＩＤ：３６０９２３５）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）を購入し、そのプラスミドをテンプレートにし、全長タンパク質（Ｆｕｌｌ Ｌｅｎｇｔｈ）の塩基配列は配列番号１９及び配列番号２０に示すプライマーセット、抗体認識配列領域（Ｄ１ ｒｅｇｉｏｎ）の塩基配列は配列番号１９及び配列番号２１に示すプライマーセットを用いて単離した。
ＧＬＡの塩基配列・アミノ酸配列は一般に公開されており、発明者らは、国立生物工学情報センターＮＣＢＩのデータベースから配列情報を入手した（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／４ＮＸＳ＿Ａ）。抗体認識配列領域であるＤ１ ｄｏｍａｉｎの塩基配列は、非特許文献（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００４ Ｍａｒ １９；３３７（２）：３１９－３５．）に従って同定した。ＧＬＡ全長タンパク質をコードする塩基配列を配列番号１に、ＧＬＡの抗体認識配列領域（Ｄ１ ｄｏｍａｉｎ）をコードする塩基配列を配列番号２に示す。ＧＬＡの配列がプラスミドに挿入されたＭＧＣ Ｈｕｍａｎ ＧＬＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｖｅｒｉｆｉｅｄ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｅ ＩＤ：３６０９２３５）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）を購入し、そのプラスミドをテンプレートにし、全長タンパク質（Ｆｕｌｌ Ｌｅｎｇｔｈ）の塩基配列は配列番号１９及び配列番号２０に示すプライマーセット、抗体認識配列領域（Ｄ１ ｒｅｇｉｏｎ）の塩基配列は配列番号１９及び配列番号２１に示すプライマーセットを用いて単離した。
【0045】
２．２種類のＢＡＲの塩基配列の特定
ＢＡＲを構成する共刺激因子（４－１ＢＢ）の細胞内ドメインと活性化因子（ＣＤ３ζ）の細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン（ＴＭ）とスペーサー配列のアミノ酸配列は、ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞ではすでに有効性が実証されているもの（特許文献；ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１ 配列番号８）を採用した。膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ及びＣＤ３ζを結合した塩基配列は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社の人工遺伝子合成受託サービスにて合成し、それをテンプレートにして、配列番号２２及び配列番号２３に示すプライマーセットを用いて、膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ及びＣＤ３ζをコードする塩基配列を取得した。
上述した全長タンパク質（Ｆｕｌｌ Ｌｅｎｇｔｈ）又は抗体認識配列領域（Ｄ１ ｒｅｇｉｏｎ）の塩基配列と、膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ及びＣＤ３ζを結合した塩基配列を、Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎクローニング法によりｐＭＳＣＶプラスミドのＸｈｏＩ－ＥｃｏＲＩに挿入して、ＢＡＲの塩基配列をクローニングした。
ＢＡＲを構成する共刺激因子（４－１ＢＢ）の細胞内ドメインと活性化因子（ＣＤ３ζ）の細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン（ＴＭ）とスペーサー配列のアミノ酸配列は、ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞ではすでに有効性が実証されているもの（特許文献；ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１ 配列番号８）を採用した。膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ及びＣＤ３ζを結合した塩基配列は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社の人工遺伝子合成受託サービスにて合成し、それをテンプレートにして、配列番号２２及び配列番号２３に示すプライマーセットを用いて、膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ及びＣＤ３ζをコードする塩基配列を取得した。
上述した全長タンパク質（Ｆｕｌｌ Ｌｅｎｇｔｈ）又は抗体認識配列領域（Ｄ１ ｒｅｇｉｏｎ）の塩基配列と、膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ及びＣＤ３ζを結合した塩基配列を、Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎクローニング法によりｐＭＳＣＶプラスミドのＸｈｏＩ－ＥｃｏＲＩに挿入して、ＢＡＲの塩基配列をクローニングした。
【0046】
３．ＧＬＡ ＢＡＲ－Ｔ細胞の作製
上記２で特定した２種類のＢＡＲの塩基配列は、汎用プラスミドにサブクローニングされ、この配列のＳｐａｃｅｒの５’側に複数の制限酵素サイトが導入されている。この制限酵素サイトを利用して抗原の配列を組換えた。抗体結合ドメインであるＧＬＡの全長タンパク質又はＤ１ ｒｅｇｉｏｎの塩基配列は、ＰＣＲにより増幅され、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇにて配列に変異が入っていないことを確認した上で、前記のプラスミドに組換えを行った。
前述の通り組換えを行ったプラスミドを用いて、ＧＬＡの全長タンパク質（Ｆｕｌｌ Ｌｅｎｇｔｈ：ＦＬ） ＢＡＲをコードする塩基配列とＤ１ ｒｅｇｉｏｎのＧＬＡ ＢＡＲをコードする塩基配列をそれぞれレトロウイルスベクター（図１５、１６）もしくはレンチウイルスベクター（図９、図１０）に挿入し、ウイルスベクターを作製した。
このベクターを用いてヒトＴ細胞に遺伝子導入し、ＦＬ ＢＡＲ－Ｔ細胞とＤ１ ＢＡＲ－Ｔ細胞を作製した。抗ＧＬＡ抗体を用いてＦＡＣＳを行なった。結果を図２に示す。平均蛍光強度の右方偏移を認め、ＦＬ ＢＡＲ－Ｔ細胞とＤ１ ＢＡＲ－Ｔ細胞において、ＢＡＲが発現され、蛍光強度が増強したと判断できる。
別の遺伝子導入方法として、ｍＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎを行なった。ＢＡＲを構成する塩基配列をＩｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ行うためのプラスミドベクター（ｐｍＲＮＡｅｘ、図１２、図１７）にサブクローニングし、ｍＭＥＳＳＡＧＥｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ Ｕｌｔｒａ ｋｉｔ， Ｃａｔａｌｏｇ＃ＡＭ１３４５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いてＢＡＲ ｍＲＮＡフラグメントを単離した。ＭａｘＣｙｔｅ社のエレクトロポレーション装置によりＢＡＲをコードするｍＲＮＡを、ヒトＴ細胞に導入し、タンパク発現量をウエスタンブロッティングにて確認した。エレクトロポレーションから１４時間後にβアクチンをハウスキーピング・プロテインとして、ＢＡＲの発現量の測定を行なった。この結果からＧＬＡ ＢＡＲのｍＲＮＡをエレクトロポレーション法によりヒトＴ細胞へ導入することで、ＢＡＲが発現することが確認された。なお、Ｄ１ ｒｅｇｉｏｎを抗体結合ドメインとしたＢＡＲはＦＬを抗体結合ドメインとしたＢＡＲと比較して、極めて強い発現を示した（図３）。
上記２で特定した２種類のＢＡＲの塩基配列は、汎用プラスミドにサブクローニングされ、この配列のＳｐａｃｅｒの５’側に複数の制限酵素サイトが導入されている。この制限酵素サイトを利用して抗原の配列を組換えた。抗体結合ドメインであるＧＬＡの全長タンパク質又はＤ１ ｒｅｇｉｏｎの塩基配列は、ＰＣＲにより増幅され、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇにて配列に変異が入っていないことを確認した上で、前記のプラスミドに組換えを行った。
前述の通り組換えを行ったプラスミドを用いて、ＧＬＡの全長タンパク質（Ｆｕｌｌ Ｌｅｎｇｔｈ：ＦＬ） ＢＡＲをコードする塩基配列とＤ１ ｒｅｇｉｏｎのＧＬＡ ＢＡＲをコードする塩基配列をそれぞれレトロウイルスベクター（図１５、１６）もしくはレンチウイルスベクター（図９、図１０）に挿入し、ウイルスベクターを作製した。
このベクターを用いてヒトＴ細胞に遺伝子導入し、ＦＬ ＢＡＲ－Ｔ細胞とＤ１ ＢＡＲ－Ｔ細胞を作製した。抗ＧＬＡ抗体を用いてＦＡＣＳを行なった。結果を図２に示す。平均蛍光強度の右方偏移を認め、ＦＬ ＢＡＲ－Ｔ細胞とＤ１ ＢＡＲ－Ｔ細胞において、ＢＡＲが発現され、蛍光強度が増強したと判断できる。
別の遺伝子導入方法として、ｍＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎを行なった。ＢＡＲを構成する塩基配列をＩｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ行うためのプラスミドベクター（ｐｍＲＮＡｅｘ、図１２、図１７）にサブクローニングし、ｍＭＥＳＳＡＧＥｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ Ｕｌｔｒａ ｋｉｔ， Ｃａｔａｌｏｇ＃ＡＭ１３４５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いてＢＡＲ ｍＲＮＡフラグメントを単離した。ＭａｘＣｙｔｅ社のエレクトロポレーション装置によりＢＡＲをコードするｍＲＮＡを、ヒトＴ細胞に導入し、タンパク発現量をウエスタンブロッティングにて確認した。エレクトロポレーションから１４時間後にβアクチンをハウスキーピング・プロテインとして、ＢＡＲの発現量の測定を行なった。この結果からＧＬＡ ＢＡＲのｍＲＮＡをエレクトロポレーション法によりヒトＴ細胞へ導入することで、ＢＡＲが発現することが確認された。なお、Ｄ１ ｒｅｇｉｏｎを抗体結合ドメインとしたＢＡＲはＦＬを抗体結合ドメインとしたＢＡＲと比較して、極めて強い発現を示した（図３）。
【0047】
４．抗ＧＬＡ抗体過剰発現細胞（ａｎｔｉ－ＧＬＡ ｓｃＦｖ 過剰発現Ｍ１細胞）の作製
ヒトＧＬＡのタンパク質を接種したマウスの脾臓細胞とミエローマ細胞を融合し、ハイブリドーマを取得した。この雑多なハイブリドーマ集団をＨＡＴ培地にてポジティブセレクションして抗ＧＬＡモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得した（図４）。
次に、抗ＧＬＡモノクローナル抗体産生Ｂ細胞からＡｎｔｉｂｏｄｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを行い、抗ＧＬＡモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を取得した。取得したアミノ酸配列を元にリンカーを間に入れて抗ＧＬＡ抗体のｓｃＦｖの配列を作出した（図５）。抗ＧＬＡ抗体のｓｃＦｖのアミノ酸配列、及びそれをコードする塩基配列をそれぞれ配列番号１８及び配列番号９に示す。
上記により特定した抗ＧＬＡ抗体のｓｃＦｖの塩基配列をサブクローニングしてプラスミドベクターに組換えを行った（図６）。
得られたプラスミドベクターをサブクローニングし、レトロウイルスベクターに組換え、マウス骨髄性白血病由来の株化細胞であるＭ１細胞に感染させることにより抗ＧＬＡ抗体のｓｃＦｖを強制発現させたＴｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔを作出し、中和抗体産生Ｂ細胞のモデル細胞とした。作製したモデル細胞が抗ＧＬＡ抗体を過剰発現していることが、この細胞を対象としたＧＬＡ－ｍＣｈｅｒｒｙの結合アッセイより確認された（図１１）。
ヒトＧＬＡのタンパク質を接種したマウスの脾臓細胞とミエローマ細胞を融合し、ハイブリドーマを取得した。この雑多なハイブリドーマ集団をＨＡＴ培地にてポジティブセレクションして抗ＧＬＡモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得した（図４）。
次に、抗ＧＬＡモノクローナル抗体産生Ｂ細胞からＡｎｔｉｂｏｄｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを行い、抗ＧＬＡモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を取得した。取得したアミノ酸配列を元にリンカーを間に入れて抗ＧＬＡ抗体のｓｃＦｖの配列を作出した（図５）。抗ＧＬＡ抗体のｓｃＦｖのアミノ酸配列、及びそれをコードする塩基配列をそれぞれ配列番号１８及び配列番号９に示す。
上記により特定した抗ＧＬＡ抗体のｓｃＦｖの塩基配列をサブクローニングしてプラスミドベクターに組換えを行った（図６）。
得られたプラスミドベクターをサブクローニングし、レトロウイルスベクターに組換え、マウス骨髄性白血病由来の株化細胞であるＭ１細胞に感染させることにより抗ＧＬＡ抗体のｓｃＦｖを強制発現させたＴｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔを作出し、中和抗体産生Ｂ細胞のモデル細胞とした。作製したモデル細胞が抗ＧＬＡ抗体を過剰発現していることが、この細胞を対象としたＧＬＡ－ｍＣｈｅｒｒｙの結合アッセイより確認された（図１１）。
【0048】
５．ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の作製
非特許文献（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１４；３７１（１６）：１５０７－１５１７）のＭａｔｅｒｉａｌ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄに従って、特許文献（ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１ 配列番号８）にあるＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔをコードする塩基配列をレトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクターに挿入し、レトロウイルスもしくはレンチウイルスベクターを作製後にレトロネクチンを用いてヒトＴ細胞に遺伝子導入を行い、ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製した。
非特許文献（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１４；３７１（１６）：１５０７－１５１７）のＭａｔｅｒｉａｌ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄに従って、特許文献（ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１ 配列番号８）にあるＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔをコードする塩基配列をレトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクターに挿入し、レトロウイルスもしくはレンチウイルスベクターを作製後にレトロネクチンを用いてヒトＴ細胞に遺伝子導入を行い、ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製した。
【0049】
６．Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ細胞障害性試験
（方法）
２で作製した２種類のＧＬＡ ＢＡＲ－Ｔ細胞と、３で作製した抗ＧＬＡ抗体のｓｃＦｖを強制発現させたＭ１細胞に対する細胞障害性試験の概略を図７に示す。抗体結合ドメインとしてＧＬＡの全長タンパク質を採用した「ＦＬ ＢＡＲ－Ｔ細胞」、とＧＬＡのＤ１領域を採用した「Ｄ１ ＢＡＲ－Ｔ細胞」を検討対象とした。免疫細胞はヒトｐｒｉｍａｒｙ Ｔ細胞で、Ｔ細胞培養方法及び細胞障害性試験のプロトコルはＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞のＶａｌｉｄａｔｉｏｎにおける実験と同様の方法である（非特許文献Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８，１９５６（２０１８）又は非特許文献Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３，１７９－１８４（２０１６））。方法は、ヒト末梢血より比重遠心法により単核球分画を取得し、これをａｎｔｉ－ＣＤ３／ＣＤ２８抗体を接着させたプレートに移し、Ｔ ｃｅｌｌの選択的増殖を促した。翌日に、ＩＬ－７：２０ｕｇ／ｍｌとＩＬ－１５：１０ｕｇ／ｍｌでＴ細胞にエフェクター細胞への分化を抑え、Ｍｅｍｏｒｙ（Ｓｔｅｍ）細胞に維持しながら増殖刺激を与えた。このサイトカインは、ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞障害活性を最も強く保ち、ｉｎ ｖｉｖｏに投与した時にもその細胞障害活性が最もよく保持されていた組み合わせとして報告されている。２日目に抗ＣＤ１９ ＣＡＲ又はＢＡＲをコードする組換えレトロウイルスによって、刺激されたヒトＴ細胞に遺伝子を導入し、５日目に抗ＧＬＡ抗体のｓｃＦｖを発現したＭ１細胞、感染コントロールとしてのＧＦＰを導入したＭ１細胞と共培養を開始し、０日目と４日目にＦＡＣＳにて解析を行った。
ＢＡＲ－Ｔ細胞とＧＦＰを遺伝子導入したＭ１細胞との共培養は遺伝子導入コントロールとして、ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞と抗ＧＬＡ抗体のｓｃＦｖ過剰発現Ｍ１細胞との共培養は非特異的な障害の可能性を排除するために供した。
（方法）
２で作製した２種類のＧＬＡ ＢＡＲ－Ｔ細胞と、３で作製した抗ＧＬＡ抗体のｓｃＦｖを強制発現させたＭ１細胞に対する細胞障害性試験の概略を図７に示す。抗体結合ドメインとしてＧＬＡの全長タンパク質を採用した「ＦＬ ＢＡＲ－Ｔ細胞」、とＧＬＡのＤ１領域を採用した「Ｄ１ ＢＡＲ－Ｔ細胞」を検討対象とした。免疫細胞はヒトｐｒｉｍａｒｙ Ｔ細胞で、Ｔ細胞培養方法及び細胞障害性試験のプロトコルはＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞のＶａｌｉｄａｔｉｏｎにおける実験と同様の方法である（非特許文献Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８，１９５６（２０１８）又は非特許文献Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３，１７９－１８４（２０１６））。方法は、ヒト末梢血より比重遠心法により単核球分画を取得し、これをａｎｔｉ－ＣＤ３／ＣＤ２８抗体を接着させたプレートに移し、Ｔ ｃｅｌｌの選択的増殖を促した。翌日に、ＩＬ－７：２０ｕｇ／ｍｌとＩＬ－１５：１０ｕｇ／ｍｌでＴ細胞にエフェクター細胞への分化を抑え、Ｍｅｍｏｒｙ（Ｓｔｅｍ）細胞に維持しながら増殖刺激を与えた。このサイトカインは、ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞障害活性を最も強く保ち、ｉｎ ｖｉｖｏに投与した時にもその細胞障害活性が最もよく保持されていた組み合わせとして報告されている。２日目に抗ＣＤ１９ ＣＡＲ又はＢＡＲをコードする組換えレトロウイルスによって、刺激されたヒトＴ細胞に遺伝子を導入し、５日目に抗ＧＬＡ抗体のｓｃＦｖを発現したＭ１細胞、感染コントロールとしてのＧＦＰを導入したＭ１細胞と共培養を開始し、０日目と４日目にＦＡＣＳにて解析を行った。
ＢＡＲ－Ｔ細胞とＧＦＰを遺伝子導入したＭ１細胞との共培養は遺伝子導入コントロールとして、ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞と抗ＧＬＡ抗体のｓｃＦｖ過剰発現Ｍ１細胞との共培養は非特異的な障害の可能性を排除するために供した。
【0050】
（結果）
結果を図８に示す。共培養開始から４日後にＦＡＣＳによる解析を実施した。Ｘ軸は、ＡＰＣ 抗ＣＤ３抗体で共培養細胞を染色してＦＡＣＳにかけている。Ｍ１細胞の生細胞率は、コントロールであるＧＦＰ導入Ｍ１細胞とＢＡＲ－Ｔ細胞との共培養（図８下段 ＧＦＰ）では７２．３％を示し、抗ＧＬＡ抗体のｓｃＦｖ過剰発現したＭ１細胞とＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞との共培養（図８下段 ＣＤ１９）では６６．９％を示し、非特異的反応がないことを確認した。一方、抗ＧＬＡ抗体のｓｃＦｖ過剰発現したＭ１細胞とＦＬ ＢＡＲ－Ｔ細胞との共培養（図８下段 ＦＬ）ではＭ１細胞は５６．４％、抗ＧＬＡ抗体のｓｃＦｖ過剰発現したＭ１細胞とＤ１ ＢＡＲ－Ｔ細胞との共培養（図８下段 Ｄ１）ではＭ１細胞は５０．８％を示し、コントロールと比較し有意にＭ１細胞の細胞数を減少させることに成功した。また、この細胞障害性試験の結果、及びタンパク質発現の強度・安定性からＤ１ ｒｅｇｉｏｎを細胞外ドメインとするＧＬＡ ＢＡＲ－Ｔ細胞はより抗ＧＬＡ抗体産生Ｂ細胞の特異的除去に有効であると判断された。
結果を図８に示す。共培養開始から４日後にＦＡＣＳによる解析を実施した。Ｘ軸は、ＡＰＣ 抗ＣＤ３抗体で共培養細胞を染色してＦＡＣＳにかけている。Ｍ１細胞の生細胞率は、コントロールであるＧＦＰ導入Ｍ１細胞とＢＡＲ－Ｔ細胞との共培養（図８下段 ＧＦＰ）では７２．３％を示し、抗ＧＬＡ抗体のｓｃＦｖ過剰発現したＭ１細胞とＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞との共培養（図８下段 ＣＤ１９）では６６．９％を示し、非特異的反応がないことを確認した。一方、抗ＧＬＡ抗体のｓｃＦｖ過剰発現したＭ１細胞とＦＬ ＢＡＲ－Ｔ細胞との共培養（図８下段 ＦＬ）ではＭ１細胞は５６．４％、抗ＧＬＡ抗体のｓｃＦｖ過剰発現したＭ１細胞とＤ１ ＢＡＲ－Ｔ細胞との共培養（図８下段 Ｄ１）ではＭ１細胞は５０．８％を示し、コントロールと比較し有意にＭ１細胞の細胞数を減少させることに成功した。また、この細胞障害性試験の結果、及びタンパク質発現の強度・安定性からＤ１ ｒｅｇｉｏｎを細胞外ドメインとするＧＬＡ ＢＡＲ－Ｔ細胞はより抗ＧＬＡ抗体産生Ｂ細胞の特異的除去に有効であると判断された。
【0051】
７．標的細胞（ａｎｔｉ－ＧＬＡ ｓｃＦｖ発現細胞）の調製
白血病のヒト前駆Ｂ細胞株であるＮａｌｍ６（ＲＣＢ１９３３）（理研セルバンクより購入）に、抗ＧＬＡ抗体のｓｃＦｖをコードしたレトロウイルスベクター（図２１）を導入し、ＢＡＲ－Ｔ細胞の標的モデル細胞を作製した。レトロウイルスベクター導入後ｍＣｈｅｒｒｙでソーティングを行い、ビオチン標識した抗Ｆａｂ２抗体を反応させた後、蛍光標識したストレプトアビジンを反応させ、解析した結果、作成した標的モデル細胞による抗ＧＬＡ抗体の発現が確認された（図２４）。
白血病のヒト前駆Ｂ細胞株であるＮａｌｍ６（ＲＣＢ１９３３）（理研セルバンクより購入）に、抗ＧＬＡ抗体のｓｃＦｖをコードしたレトロウイルスベクター（図２１）を導入し、ＢＡＲ－Ｔ細胞の標的モデル細胞を作製した。レトロウイルスベクター導入後ｍＣｈｅｒｒｙでソーティングを行い、ビオチン標識した抗Ｆａｂ２抗体を反応させた後、蛍光標識したストレプトアビジンを反応させ、解析した結果、作成した標的モデル細胞による抗ＧＬＡ抗体の発現が確認された（図２４）。
【0052】
８．ＧＬＡ ＢＡＲ－Ｔ細胞の調製
ヒト白血病Ｔ細胞株であるＪｕｒｋａｔに、ｈＧＬＡのアミノ酸配列（配列番号１０、ＤＮＡ配列は配列番号１）をコードしたレトロウイルスベクター（図２０）を導入し、ＢＡＲ－Ｔ細胞を作製した。レトロウイルスベクターで遺伝子導入後、ＧＦＰでソーティングし（図２５）、抗ＧＬＡ抗体を反応させた後、蛍光標識した二次抗体を反応させ、解析した結果、ＢＡＲの発現を確認した（図２６）。
ヒト白血病Ｔ細胞株であるＪｕｒｋａｔに、ｈＧＬＡのアミノ酸配列（配列番号１０、ＤＮＡ配列は配列番号１）をコードしたレトロウイルスベクター（図２０）を導入し、ＢＡＲ－Ｔ細胞を作製した。レトロウイルスベクターで遺伝子導入後、ＧＦＰでソーティングし（図２５）、抗ＧＬＡ抗体を反応させた後、蛍光標識した二次抗体を反応させ、解析した結果、ＢＡＲの発現を確認した（図２６）。
【0053】
９．混合培養によるＢＡＲ－Ｔ細胞の活性化確認
８で作製したＢＡＲ－Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ－ＧＬＡ－ＢＡＲ２－ＥＧＦＰ：Ｅｆｆｅｃｔｏｒ）と７で作製した標的細胞（ＮＡＬＭ６－ｓｃＦｖ－ＧＬＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ：Ｔａｒｇｅｔ）を混合比率１：０、２：１、１：１で２４時間混合培養し、ＣＤ６９の検出試験を行った。Ｊｕｒｋａｔは活性化するとＣＤ６９の発現が増加することが知られており、Ｊｕｒｋａｔに導入したＢＡＲ－Ｔ細胞が、標的細胞の抗ＧＬＡ抗体のｓｃＦｖと結合し、活性化シグナルが入るならば、混合比に依存して、ＣＤ６９の発現が増加すると考えられた。混合培養を実施した結果、標的細胞が存在していないコントロール（Ｅ：Ｔ＝１：０）と比較して、標的細胞の存在下では、ＣＤ６９の発現が増加しており、標的細胞が増加（Ｅ：Ｔ＝２：１→１：１）するとＣＤ６９の発現はさらに増加した（図２７）。このことより、ＢＡＲ－Ｔ細胞は、抗原特異的に活性化することが確認された。
８で作製したＢＡＲ－Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ－ＧＬＡ－ＢＡＲ２－ＥＧＦＰ：Ｅｆｆｅｃｔｏｒ）と７で作製した標的細胞（ＮＡＬＭ６－ｓｃＦｖ－ＧＬＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ：Ｔａｒｇｅｔ）を混合比率１：０、２：１、１：１で２４時間混合培養し、ＣＤ６９の検出試験を行った。Ｊｕｒｋａｔは活性化するとＣＤ６９の発現が増加することが知られており、Ｊｕｒｋａｔに導入したＢＡＲ－Ｔ細胞が、標的細胞の抗ＧＬＡ抗体のｓｃＦｖと結合し、活性化シグナルが入るならば、混合比に依存して、ＣＤ６９の発現が増加すると考えられた。混合培養を実施した結果、標的細胞が存在していないコントロール（Ｅ：Ｔ＝１：０）と比較して、標的細胞の存在下では、ＣＤ６９の発現が増加しており、標的細胞が増加（Ｅ：Ｔ＝２：１→１：１）するとＣＤ６９の発現はさらに増加した（図２７）。このことより、ＢＡＲ－Ｔ細胞は、抗原特異的に活性化することが確認された。
【0054】
１０． ＢＡＲ－Ｔ細胞の調製（ＡＤＡＭＴＳ１３）
ヒト白血病Ｔ細胞株であるＪｕｒｋａｔに、ＡＤＡＭＴＳ１３のアミノ酸配列をコードしたレトロウイルスベクター（図２２）を導入し、ＢＡＲ－Ｔ細胞を作製した。レトロウイルスベクターで遺伝子導入後、ＧＦＰでソーティングし、ＨＡ－ＴＡＧでＡＤＡＭＴＳ１３の発現を確認した（図２８、２９）。
ヒト白血病Ｔ細胞株であるＪｕｒｋａｔに、ＡＤＡＭＴＳ１３のアミノ酸配列をコードしたレトロウイルスベクター（図２２）を導入し、ＢＡＲ－Ｔ細胞を作製した。レトロウイルスベクターで遺伝子導入後、ＧＦＰでソーティングし、ＨＡ－ＴＡＧでＡＤＡＭＴＳ１３の発現を確認した（図２８、２９）。
【産業上の利用可能性】
【0055】
本件発明を用いることにより、特定の抗体を産生するＢ細胞を特異的に傷害・排除することができるため、酵素補充療法を行っているにもかかわらず、当該酵素に対する抗体が産生され、十分な治療効果を得られないライソゾーム病等の患者の改善が期待できる。また、本件発明は、抗体に起因する疾患に対する治療薬としても期待できる。
【配列表フリーテキスト】
【0056】
配列番号 １ ＜２２３＞ α-ＧＡＬ全長タンパク質をコードするＤＮＡ
配列番号 ２ ＜２２３＞ α-ＧＡＬ Ｄ１領域タンパク質をコードするＤＮＡ
配列番号 ３ ＜２２３＞ ＡＤＡＭＴＳ１３のスペーサードメインをコードするＤＮＡ
配列番号 ４ ＜２２３＞ ＡＤＡＭＴＳ１３のシステインリッチドメインをコードするＤＮＡ
配列番号 ５ ＜２２３＞ シグナル配列Ｌｅａｄｅｒ２をコードするＤＮＡ
配列番号 ６ ＜２２３＞ 膜貫通ドメインをコードするＤＮＡ
配列番号 ７ ＜２２３＞ ４-１ＢＢをコードするＤＮＡ
配列番号 ８ ＜２２３＞ ＣＤ３ζをコードするＤＮＡ
配列番号 ９ ＜２２３＞ 抗ＧＬＡ抗体のｓｃＦｖをコードするＤＮＡ
配列番号 １０ ＜２２３＞ α-ＧＡＬ全長タンパク質
配列番号 １１ ＜２２３＞ α-ＧＡＬ Ｄ１領域タンパク質
配列番号 １２ ＜２２３＞ ＡＤＡＭＴＳ１３のスペーサードメイン
配列番号 １３ ＜２２３＞ ＡＤＡＭＴＳ１３のシステインリッチドメイン
配列番号 １４ ＜２２３＞ シグナル配列Ｌｅａｄｅｒ２タンパク質
配列番号 １５ ＜２２３＞ 膜貫通ドメインタンパク質
配列番号 １６ ＜２２３＞ ４-１ＢＢタンパク質
配列番号 １７ ＜２２３＞ ＣＤ３ζタンパク質
配列番号 １８ ＜２２３＞ 抗ＧＬＡ抗体のｓｃＦｖタンパク質
配列番号 １９ ＜２２３＞ α-ＧＡＬのプライマー（前）
配列番号 ２０ ＜２２３＞ α-ＧＡＬのプライマー（後：全長用）
配列番号 ２１ ＜２２３＞ α-ＧＡＬのプライマー（後：Ｄ１領域用）
配列番号 ２２ ＜２２３＞ ＴＭ, ４-１ＢＢ, ＣＤ３ζのプライマー（前）
配列番号 ２３ ＜２２３＞ ＴＭ, ４-１ＢＢ, ＣＤ３ζのプライマー（後）
配列番号 ２４ ＜２２３＞ シグナル配列Ｌｅａｄｅｒ１をコードするＤＮＡ
配列番号 ２５ ＜２２３＞ シグナル配列Ｌｅａｄｅｒ１タンパク質
配列番号 ２６ ＜２２３＞ ヒトＣＤ８シグナルペプチドをコードするＤＮＡ
配列番号 ２７ ＜２２３＞ ヒトＣＤ８シグナルペプチド
配列番号 ２８ ＜２２３＞ ＨＡをコードするＤＮＡ
配列番号 ２９ ＜２２３＞ ＨＡタンパク質
配列番号 ３０ ＜２２３＞ ＩｇＧ４抗体ヒンジ領域をコードするＤＮＡ
配列番号 ３１ ＜２２３＞ ＩｇＧ４抗体ヒンジ領域タンパク質
配列番号 ３２ ＜２２３＞ ヒトＩｇＧ抗ＧＬＡ抗体Ｌ鎖をコードするＤＮＡ
配列番号 ３３ ＜２２３＞ ヒトＩｇＧ抗ＧＬＡ抗体Ｌ鎖タンパク質
配列番号 ３４ ＜２２３＞ ｍＣｈｅｒｒｙをコードするＤＮＡ
配列番号 ３５ ＜２２３＞ ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質
配列番号 ３６ ＜２２３＞ 抗ＧＬＡ抗体のｓｃＦｖをコードするＤＮＡ
配列番号 ３７ ＜２２３＞ ＡＤＡＭＴＳ１３のスペーサードメインをコードするＤＮＡ
配列番号 ３８ ＜２２３＞ ＡＤＡＭＴＳ１３のスペーサードメイン
配列番号 ３９ ＜２２３＞ ヒトＩｇＧ抗ＡＤＡＭＴＳ１３抗体Ｌ鎖シグナルペプチドをコードするＤＮＡ
配列番号 ４０ ＜２２３＞ ヒトＩｇＧ抗ＡＤＡＭＴＳ１３抗体Ｌ鎖シグナルペプチド
配列番号 ４１ ＜２２３＞ 抗ＡＤＡＭＴＳ１３抗体のｓｃＦｖをコードするＤＮＡ
配列番号 ４２ ＜２２３＞ 抗ＡＤＡＭＴＳ１３抗体のｓｃＦｖ
配列番号 ４３ ＜２２３＞ ヒトＣＤ８ａ膜貫通ドメインをコードするＤＮＡ
配列番号 ４４ ＜２２３＞ ヒトＣＤ８ａ膜貫通ドメイン
配列番号 ２ ＜２２３＞ α-ＧＡＬ Ｄ１領域タンパク質をコードするＤＮＡ
配列番号 ３ ＜２２３＞ ＡＤＡＭＴＳ１３のスペーサードメインをコードするＤＮＡ
配列番号 ４ ＜２２３＞ ＡＤＡＭＴＳ１３のシステインリッチドメインをコードするＤＮＡ
配列番号 ５ ＜２２３＞ シグナル配列Ｌｅａｄｅｒ２をコードするＤＮＡ
配列番号 ６ ＜２２３＞ 膜貫通ドメインをコードするＤＮＡ
配列番号 ７ ＜２２３＞ ４-１ＢＢをコードするＤＮＡ
配列番号 ８ ＜２２３＞ ＣＤ３ζをコードするＤＮＡ
配列番号 ９ ＜２２３＞ 抗ＧＬＡ抗体のｓｃＦｖをコードするＤＮＡ
配列番号 １０ ＜２２３＞ α-ＧＡＬ全長タンパク質
配列番号 １１ ＜２２３＞ α-ＧＡＬ Ｄ１領域タンパク質
配列番号 １２ ＜２２３＞ ＡＤＡＭＴＳ１３のスペーサードメイン
配列番号 １３ ＜２２３＞ ＡＤＡＭＴＳ１３のシステインリッチドメイン
配列番号 １４ ＜２２３＞ シグナル配列Ｌｅａｄｅｒ２タンパク質
配列番号 １５ ＜２２３＞ 膜貫通ドメインタンパク質
配列番号 １６ ＜２２３＞ ４-１ＢＢタンパク質
配列番号 １７ ＜２２３＞ ＣＤ３ζタンパク質
配列番号 １８ ＜２２３＞ 抗ＧＬＡ抗体のｓｃＦｖタンパク質
配列番号 １９ ＜２２３＞ α-ＧＡＬのプライマー（前）
配列番号 ２０ ＜２２３＞ α-ＧＡＬのプライマー（後：全長用）
配列番号 ２１ ＜２２３＞ α-ＧＡＬのプライマー（後：Ｄ１領域用）
配列番号 ２２ ＜２２３＞ ＴＭ, ４-１ＢＢ, ＣＤ３ζのプライマー（前）
配列番号 ２３ ＜２２３＞ ＴＭ, ４-１ＢＢ, ＣＤ３ζのプライマー（後）
配列番号 ２４ ＜２２３＞ シグナル配列Ｌｅａｄｅｒ１をコードするＤＮＡ
配列番号 ２５ ＜２２３＞ シグナル配列Ｌｅａｄｅｒ１タンパク質
配列番号 ２６ ＜２２３＞ ヒトＣＤ８シグナルペプチドをコードするＤＮＡ
配列番号 ２７ ＜２２３＞ ヒトＣＤ８シグナルペプチド
配列番号 ２８ ＜２２３＞ ＨＡをコードするＤＮＡ
配列番号 ２９ ＜２２３＞ ＨＡタンパク質
配列番号 ３０ ＜２２３＞ ＩｇＧ４抗体ヒンジ領域をコードするＤＮＡ
配列番号 ３１ ＜２２３＞ ＩｇＧ４抗体ヒンジ領域タンパク質
配列番号 ３２ ＜２２３＞ ヒトＩｇＧ抗ＧＬＡ抗体Ｌ鎖をコードするＤＮＡ
配列番号 ３３ ＜２２３＞ ヒトＩｇＧ抗ＧＬＡ抗体Ｌ鎖タンパク質
配列番号 ３４ ＜２２３＞ ｍＣｈｅｒｒｙをコードするＤＮＡ
配列番号 ３５ ＜２２３＞ ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質
配列番号 ３６ ＜２２３＞ 抗ＧＬＡ抗体のｓｃＦｖをコードするＤＮＡ
配列番号 ３７ ＜２２３＞ ＡＤＡＭＴＳ１３のスペーサードメインをコードするＤＮＡ
配列番号 ３８ ＜２２３＞ ＡＤＡＭＴＳ１３のスペーサードメイン
配列番号 ３９ ＜２２３＞ ヒトＩｇＧ抗ＡＤＡＭＴＳ１３抗体Ｌ鎖シグナルペプチドをコードするＤＮＡ
配列番号 ４０ ＜２２３＞ ヒトＩｇＧ抗ＡＤＡＭＴＳ１３抗体Ｌ鎖シグナルペプチド
配列番号 ４１ ＜２２３＞ 抗ＡＤＡＭＴＳ１３抗体のｓｃＦｖをコードするＤＮＡ
配列番号 ４２ ＜２２３＞ 抗ＡＤＡＭＴＳ１３抗体のｓｃＦｖ
配列番号 ４３ ＜２２３＞ ヒトＣＤ８ａ膜貫通ドメインをコードするＤＮＡ
配列番号 ４４ ＜２２３＞ ヒトＣＤ８ａ膜貫通ドメイン
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
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【図28】
【図29】
【配列表】