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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-03-27
(45)【発行日】2025-04-04
(54)【発明の名称】細胞の標識方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/04 20060101AFI20250328BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20250328BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/04 ZNA
G01N33/53 M
G01N33/53 U
【請求項の数】
28
(21)【出願番号】P 2023578668
(86)(22)【出願日】2023-02-02
(86)【国際出願番号】 JP2023004476
(87)【国際公開番号】W WO2023149585
(87)【国際公開日】2023-08-10
【審査請求日】2024-10-08
(31)【優先権主張番号】P 2022016576
(32)【優先日】2022-02-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 発明の新規性の喪失の例外の規定の適用を受けるための証明書（１）、令和４年６月２日、ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０２２，２９（３），１－９にて公開 発明の新規性の喪失の例外の規定の適用を受けるための証明書（２）、令和４年６月１日、ｈｔｔｐｓ：／／ｓｔａｔｉｃ１．ｓｑｕａｒｅｓｐａｃｅ．ｃｏｍ／ｓｔａｔｉｃ／６０２２９９４ｄ９ａ０ｃｄｄ５４ｂ１ｂｂａｃ８ｃ／ｔ／６２ｃ４７９７８１５９８０３６４３８ｂ４ｂ６５０／１６５７０４３３２５１１７／Ａｂｓｔｒａｃｔｓ＋ｆｏｒ＋ｔｈｅ＋３５ｔｈ＋Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ＋Ｍａｍｍａｌｉａｎ＋Ｇｅｎｏｍｅ＋Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ．１．ｐｄｆに掲載の、３５ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ（ＩＭＧＳ）の予稿集にて公開発明の新規性の喪失の例外の規定の適用を受けるための証明書（３）、令和４年７月１７日－７月２０日、３５ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ（ＩＭＧＳ）にて公開 発明の新規性の喪失の例外の規定の適用を受けるための証明書（４）、令和４年８月３０日－８月３１日、シングルゲノミクス研究会２０２２にて公開 発明の新規性の喪失の例外の規定の適用を受けるための証明書（５）、令和４年９月５日、ｈｔｔｐｓ：／／ｒｅｓｅａｒｃｈ－ｐｒｏｇｒａｍ．ｎｅｔ／ｇｓｊ９４ｗ／ｗｐ－ｃｏｎｔｅｎｔ／ｕｐｌｏａｄｓ／２０２２／０９／％Ｅ６％９７％Ａ５％Ｅ６％９Ｃ％ＡＣ％Ｅ９％８１％ＢＡ％Ｅ４％ＢＣ％９Ｄ％Ｅ５％ＡＤ％Ａ６％Ｅ４％ＢＣ％９Ａ％Ｅ７％ＡＣ％ＡＣ９４％Ｅ５％９Ｂ％９Ｅ％Ｅ５％Ａ４％Ａ７％Ｅ４％ＢＣ％９Ａ％Ｅ６％８Ａ％８４％Ｅ９％８Ｃ％Ｂ２％Ｅ９％９Ｂ％８６＿２２０９１０．ｐｄｆに掲載の、日本遺伝学会第９４回札幌大会の予稿集にて公開 発明の新規性の喪失の例外の規定の適用を受けるための証明書（６）、令和４年９月１４日－９月１６日、日本遺伝学会第９４回札幌大会にて公開
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 発明の新規性の喪失の例外の規定の適用を受けるための証明書（７）、令和４年６月２８日、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／ｐｒｅｓｓ／２０２２／２０２２０６２８／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ、国立研究開発法人理化学研究所のウェブサイトにて公開 発明の新規性の喪失の例外の規定の適用を受けるための証明書（８）、令和４年６月２８日、記者会へ発明内容を記載した電子書類を配信することにより公開
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】503359821
【氏名又は名称】国立研究開発法人理化学研究所
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100107386
【弁理士】
【氏名又は名称】泉谷 玲子
(72)【発明者】
【氏名】杉本 道彦
(72)【発明者】
【氏名】阿部 訓也
【審査官】松田 芳子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０２０／１３２０８７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】LATB Staff，ビオチン標識試薬まとめ 知っておきたい！タンパク質実験あれこれ第１１回［online]，2020年03月04日，[retreived on 2023.04.03], Retrieved from Internet:<https://www.thermofisher.com/blog/learning-at-the-bench/protein-basic11/>
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／００
Ｇ０１Ｎ ３３／５３
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
あらゆる種類の細胞をバーコードで標識する方法であって、（ｉａ）複数の単一細胞を含む細胞群について、細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化する、
（ｉｂ）単一細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化する、又は
（ｉｃ）複数の細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化し、その後、ビオチン化細胞を、複数の単一細胞を含む細胞群又は単一細胞に分離する、
そして、
（ｉｉ）各細胞群若しくは各単一細胞に、バーコード付加ビオチン結合性物質を接触させる
ことを含む、方法。
【請求項2】
（ｉａ）複数の単一細胞を含む細胞群について、細胞表面タンパク質をビオチン化する、そして、
（ｉｉ）各細胞群に、バーコード付加ビオチン結合性物質を接触させる
ことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
（ｉ）において、細胞表面タンパク質のアミノ基、スルフヒドリル基又はカルボキシル基をビオチン化する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
（ｉ）において、ビオチン化に用いる試薬が、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド－ビオチン、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド－ビオチン、及びペンタフルオロフェニル－ビオチンからなる群から選択され、ここにおいて、ビオチンとスルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、又はペンタフルオロフェニルとの結合はスペーサーを含んでいてもよい、
請求項１－３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
（ｉ）において、ビオチン化に用いる試薬が、凍結保存されていたものである、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
ビオチン結合性物質が、ストレプトアビジン、アビジン及び抗ビオチン抗体からなる群から選択される、請求項１－５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
ビオチン結合性物質が、ストレプトアビジンである、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
バーコードが、オリゴＤＮＡである、請求項１－７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
生細胞を標識する、請求項１－８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
固定した細胞を標識する、請求項１－８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化するための試薬、及びバーコード付加ビオチン結合性物質
を含む、請求項１－１０のいずれか１項に記載のあらゆる種類の細胞をバーコードで標識する方法に使用するためのキット。
【請求項12】
細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化するための試薬が、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド－ビオチンである、請求項１１に記載のキット。
【請求項13】
あらゆる種類の細胞の細胞試料の多重化分析方法であって、（ｉａ）複数の単一細胞を含む細胞群について、細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化する、
（ｉｂ）単一細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化する、又は
（ｉｃ）複数の細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化し、その後、ビオチン化細胞を、複数の単一細胞を含む細胞群又は単一細胞に分離する、
（ｉｉ）各細胞群若しくは各単一細胞に、バーコード付加ビオチン結合性物質を接触させる、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）のバーコード標識した細胞群又は単一細胞の全部又は一部を混合する、
そして、
（ｉｖ）（ｉｉｉ）の細胞の混合物について解析する
ことを含む、方法。
【請求項14】
（ｉａ）複数の単一細胞を含む細胞群について、細胞表面タンパク質をビオチン化する、そして、
（ｉｉ）各細胞群に、バーコード付加ビオチン結合性物質を接触させる
ことを含む、
請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
解析が、細胞のＲＮＡ解析である、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項16】
あらゆる種類の細胞をバーコードで標識する方法であって、
（１）複数の単一細胞を含む細胞群を、細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基、スルフヒドリル基又はカルボキシル基に結合する化合物で修飾されたバーコードと接触させる、又は
（２）単一細胞を、細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基、スルフヒドリル基又はカルボキシル基に結合する化合物で修飾されたバーコードと接触させる、
ことを含む、方法。
【請求項17】
あらゆる種類の細胞をバーコードで標識する方法であって、（１）複数の単一細胞を含む細胞群を、細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物で修飾されたバーコードと接触させる、又は
（２）単一細胞を、細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物で修飾されたバーコードと接触させる、
ことを含む、方法。
【請求項18】
細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物が、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、及びペンタフルオロフェニルからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物が、凍結保存されていたものである、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項20】
バーコードが、オリゴＤＮＡである、請求項１６－１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
生細胞を標識する、請求項１６－２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
固定した細胞を標識する、請求項１６－２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基、スルフヒドリル基又はカルボキシル基に結合する化合物で修飾されたバーコードを含む、請求項１６、２０－２２にいずれか１項に記載のあらゆる種類の細胞をバーコードで標識する方法に使用するためのキット。
【請求項24】
細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物で修飾されたバーコードを含む、請求項１７－２２にいずれか１項に記載のあらゆる種類の細胞をバーコードで標識する方法に使用するためのキット。
【請求項25】
細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物が、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドである、請求項２４に記載のキット。
【請求項26】
あらゆる種類の細胞の細胞試料の多重化分析方法であって、
（１Ａ）複数の単一細胞を含む細胞群を、細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基、スルフヒドリル基又はカルボキシル基に結合する化合物で修飾されたバーコードと接触させる、又は
（１Ｂ）単一細胞を、細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基、スルフヒドリル基又はカルボキシル基に結合する化合物で修飾されたバーコードと接触させる、
（２）（１）のバーコード標識した細胞群又は単一細胞の全部又は一部を混合する、
そして、
（３）（２）の細胞の混合物について解析する
ことを含む、方法。
【請求項27】
あらゆる種類の細胞の細胞試料の多重化分析方法であって、（１Ａ）複数の単一細胞を含む細胞群を、細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物で修飾されたバーコードと接触させる、又は
（１Ｂ）単一細胞を、細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物で修飾されたバーコードと接触させる、
（２）（１）のバーコード標識した細胞群又は単一細胞の全部又は一部を混合する、
そして、
（３）（２）の細胞の混合物について解析する
ことを含む、方法。
【請求項28】
解析が、細胞のＲＮＡ解析である、請求項２６又は２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞をバーコードで標識する方法、及び当該方法に使用するためのキットに関する。本発明はまた、細胞試料の多重化分析方法に関する。
【背景技術】
【0002】
細胞や組織の特性を解析する上で、網羅的遺伝子発現解析は、不可欠な技術である。様々な細胞や組織内の遺伝子発現プロファイルを比較することにより、存在する細胞の種類の多様性、異なる組織内のさまざまな細胞の特性や集団中の割合を明らかにすることができる。従来のバルク解析では、多数の細胞をひとまとめにして、混合サンプルからｍＲＮＡを抽出し、発現解析に供するため、それらの細胞における遺伝子発現の平均を見ていることになる。しかし、生体組織は、複雑な多種多様な細胞集団から構成される。従って、組織まるごとを用いたバルク解析では、組織内の細胞状態を把握し、発現している遺伝子群とその機能を正確に解釈することは困難である。また、均質であると考えられる培養細胞株でさえ、厳密には不均一な細胞集団でありうる。従って、バルクＲＮＡ－ｓｅｑ解析では、例えば、細胞周期又は他のモダリティによって変動する遺伝子発現の変化を正確に把握することは不可能である。
【0003】
このような問題を克服する上で、シングルセルＲＮＡ－ｓｅｑ解析（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析）は非常に有用な技術である（非特許文献１）。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑは、シングルセル（本明細書において、特に明記しない限り、「シングルセル」は「複数の単一細胞を含む細胞群又は単一細胞」の意味で使用する）を捕捉し、トランスクリプトーム解析のために各細胞からＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーを作成することを含む。しかしながら、多数の単一細胞をサンプルとして用いるには、多大な労力と莫大なコストがかかり、近年までｓｃＲＮＡ－ｓｅｑは容易に適用できる技術ではなかった。しかしながら、マイクロ流体／マイクロ液滴反応系を利用した液滴ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑやマイクロウェルを用いたｓｃＲＮＡ－ｓｅｑの技術が現在開発されており、これらの技術のための機器が開発され市販されている（例えば、ＢＤ Ｒｈａｐｓｏｄｙシステム（非特許文献２）、１０ｘクロミウム（非特許文献３）、このようなシングルセル解析技術の進展により、１０，０００個以上の細胞からｓｃＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーを調製することが可能となり、一細胞あたりの解析コストが大幅に削減できるようになった（非特許文献４）。
【0004】
しかし、１細胞当たりのコストは削減することができるが、複数のサンプルを解析する場合や、又は複数の時点での時系列解析を行う場合、全体としての解析コストは高くついてしまう。さらに、複数のサンプルでのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ実験を異なるタイミングで行いそれらを比較する場合、実験バッチごとに解析誤差（すなわちバッチ効果）が生じる可能性がある（非特許文献５）。そのため、複数のサンプルをひとまとめにして、１回のライブラリー調製で同時に処理することができれば、解析コストが大幅に削減されるのみならず、バッチ効果を低減し、より精度の高いｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析を行うことができる。複数のサンプルをひとまとめにして、１回の実験操作で解析するための技術を、「サンプル多重化」と呼称する。
【0005】
サンプル多重化法では、複数の細胞集団を、それぞれに対応した独自の配列を有するバーコードＤＮＡタグで予め標識し、次いで、ひとまとめに混合して、シングルセル解析を行う。得られたＲＮＡ－ｓｅｑデータから、バーコードＤＮＡ配列に基づいて各細胞の起源を追跡することができる。液滴ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析又はマイクロウェルを使用するｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析では、ひとつのコンパートメント中に複数の細胞が捕捉されてしまう可能性があり、そのような複数細胞混入エラーは、データの解釈を困難にする。しかし、異なるサンプルを異なるＤＮＡタグによって識別できれば、多重項に起因するエラーを低減することができる。
【0006】
この原理を用いた多重化法については、例えば、特定の細胞表面タンパク質を認識する抗体に、バーコードオリゴＤＮＡと結合させた細胞標識用抗体を用いる方法が報告されている（非特許文献６）。しかし、この細胞ハッシュ法の問題点は、当該細胞表面タンパク質が解析する対象サンプル中のすべての細胞で発現していることが前提になっていることである。細胞ハッシュタグ抗体は、成体組織起源の細胞を網羅的に標識する目的で利用される抗体カクテルである（例えば、ＴｏｔａｌＳｅｑ（登録商標） 抗マウスハッシュタグ抗体、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）。ハッシュタグの場合、ＣＤ４５及びＭＨＣクラスＩに対する抗体が用いられる（前者は免疫系の細胞を検出するためであり、後者は一般に分化細胞を検出するためである）。しかし、例えば、胚発生のモデルとしてよく用いられる多能性幹細胞では、ＣＤ４５又はＭＨＣクラスＩを発現せず、上記の方法は適用できない（非特許文献７，８）。また、上記方法は、軟骨細胞のようないくつかの非胚性細胞に対しても適用できないことを見出している。
【0007】
他にも、多重化のための標識技術として、バーコードＤＮＡを細胞内に導入する一過性バーコード法（非特許文献１１）、レンチウイルスをバーコードＤＮＡ導入に用いるセルタグインデックス法（非特許文献１２）などが開発されている。しかし、これらの方法を培養細胞以外の細胞に適用することは困難であり、そのため、その汎用性は限られている。また、クリック化学とＮＨＳ－エステル化学を組み合わせたＣｌｉｃｋＴａｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ（非特許文献１３）は、細胞タンパク質にバーコードＤＮＡタグを付着させる技術であるが、生細胞の標識効率は低く、この方法はメタノール固定細胞にのみ適用できる。ＣｅｌｌＰｌｅｘ法（３’ＣｅｌｌＰｌｅｘ Ｋｉｔ，１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）は、普遍的な細胞標識のために細胞膜の脂質にＤＮＡタグを導入する試薬を用いているが（非特許文献１４）、メタノール固定細胞に適用することは困難である。
先行技術文献
特許文献
先行技術文献
特許文献
【0008】
[特許文献１] ＷＯ ２０２０／０１０３６６ Ａ１
【0009】
［非特許文献１］Ｘ．Ｈａｎ，Ｒ．Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｚｈｏｕ，Ｌ．Ｆｅｉ，Ｈ．Ｓｕｎ，Ｓ．Ｌａｉ，Ａ．Ｓａａｄａｔｐｏｕｒ，Ｚ．Ｚｈｏｕ，Ｈ．Ｃｈｅｎ，Ｆ．Ｙｅ，Ｄ．Ｈｕａｎｇ，Ｙ．Ｘｕ，Ｗ．Ｈｕａｎｇ，Ｍ．Ｊｉａｎｇ，Ｘ．Ｊｉａｎｇ，Ｊ．Ｍａｏ，Ｙ．Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｌｕ，Ｊ．Ｘｉｅ，Ｑ．Ｆａｎｇ，Ｙ．Ｗａｎｇ，Ｒ．Ｙｕｅ，Ｔ．Ｌｉ，Ｈ．Ｈｕａｎｇ，Ｓ．Ｈ．Ｏｒｋｉｎ，Ｇ．－Ｃ．Ｙｕａｎ，Ｍ．Ｃｈｅｎ，Ｇ．Ｇｕｏ，Ｍａｐｐｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｃｅｌｌ ａｔｌａｓ ｂｙ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ－ｓｅｑ，Ｃｅｌｌ １７２（２０１８）１０９１－１１０７，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１８．０２．００１．
［非特許文献２］Ｓ．Ｊ．Ｙｏｏｎ，Ｌ．Ｓ．Ｅｌａｈｌ，Ａ．Ｍ．Ｐａｓｃａ，Ｒ．Ｍ．Ｍａｒｔｏｎ，Ａ．Ｇｏｒｄｏｎ，Ｏ．Ｒｅｖａｈ，Ｙ．Ｍｉｕｒａ，Ｅ．Ｍ．Ｗａｌｃｚａｋ，Ｇ．Ｍ．Ｈｏｌｄｇａｔｅ，Ｈ．Ｃ．Ｆａｎ，Ｊ．Ｒ．Ｈｕｇｕｅｎａｒｄ，Ｄ．Ｈ．Ｇｅｓｃｈｗｉｎｄ，Ｓ．Ｐ．Ｐａｓｃａ，Ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｏｒｇａｎｏｉｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １６（２０１９）７５－７８，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５９２－０１８－０２５５－０．
［非特許文献３］Ｇ．Ｘ．Ｙ．Ｚｈｅｎｇ，Ｊ．Ｍ．Ｔｅｒｒｙ，Ｐ．Ｂｅｌｇｒａｄｅｒ，Ｐ．Ｒｙｖｋｉｎ，Ｚ．Ｗ．Ｂｅｎｔ，Ｒ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｓ．Ｂ．Ｚｉｒａｌｄｏ，Ｔ．Ｄ．Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｇ．Ｐ．ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，Ｊ．Ｚｈｕ，Ｍ．Ｔ．Ｇｒｅｇｏｒｙ ｅｔ．ａｌ．，Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｄｉｇｉｔａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．８（２０１７ Ｊａｎ １６）１４０４９，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１４０４９．
［非特許文献４］Ｊ．Ｃｈｅｎｇ，Ｊ．Ｌｉａｏ，Ｘ．Ｓｈａｏ，Ｘ．Ｌｕ，Ｘ．Ｆａｎ，Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｓａｍｐｌｅｓ ａｔ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ａｄｖ．Ｓｃｉ．８（２０２１）２１０１２２９，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ａｄｖｓ．２０２１０１２２９．
［非特許文献５］Ｈ．Ｔ．Ｎ．Ｔｒａｎ，Ｋ．Ｓ．Ａｎｇ，Ｍ．Ｃｈｅｖｉｅｒ，Ｘ．Ｚｈａｎｇ，Ｎ．Ｙ．Ｓ．Ｌｅｅ，Ｍ．Ｇｏｈ，Ｊ．Ｃｈｅｎ，Ａ ｂｅｎｃｈｍａｒｋ ｏｆ ｂａｔｃｈ－ｅｆｆｅｃｔ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２１（２０２０）１２，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓ１３０５９－０１９－１８５０－９．
［非特許文献６］Ｍ．Ｓｔｏｅｃｋｉｕｓ，Ｓ．Ｚｈｅｎｇ，Ｂ．Ｈｏｕｃｋ－Ｌｏｏｍｉｓ，Ｓ．Ｈａｏ，Ｂ．Ｚ．Ｙｅｕｎｇ，Ｗ．Ｍ．Ｍａｕｃｋ ＩＩＩ，Ｐ．Ｓｍｉｂｅｒｔ，Ｒ．Ｓａｔｉｊａ，Ｃｅｌｌ ｈａｓｈｉｎｇ ｗｉｔｈ ｂａｒｃｏｄｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｅｎａｂｌｅｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ ａｎｄ ｄｏｕｂｌｅｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１９（２０１８）２２４，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓ１３０５９－０１８－１６０３－１．
［非特許文献７］Ｓ．Ｌ．ＭｃＫｉｎｎｅｙ－Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｏ．Ｎａｖｅｉｒａｓ，Ｆ．Ｙａｔｅｓ，Ｓ．Ｌｏｅｗｅｒ，Ｍ．Ｐｈｉｌｉｔａｓ，Ｍ．Ｃｕｒｒａｎ，Ｐ．Ｊ．Ｐａｒｋ，Ｇ．Ｑ．Ｄａｌｅｙ，Ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｅｍｂｒｙｏｓ ａｎｄ ｍｕｒｉｎｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，Ｂｌｏｏｄ １１４（２００９）２６８－２７８，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ－２００８－１２－１９３８８８．
［非特許文献８］Ａ．Ｓ．Ｂｏｙｄ，Ｋ．Ｊ．Ｗｏｏｄ，Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ＭＨＣ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｍｏｕｓｅ ＥＳ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ＥＳ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｃｅｌｌ ｃｌｕｓｔｅｒｓ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ８７（２００９）１３００－１３０４，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９７／ＴＰ．ＯｂＯ１３ｅ３１８１ａ１９４２１．
［非特許文献９］Ｔ．Ｒｅｄｍｅｒ，Ｓ．Ｄｉｅｃｋｅ，Ｔ．Ｇｒｉｇｏｒｙａｎ，Ａ．Ｑｕｉｒｏｇａ－Ｎｅｇｒｅｉｒａ，Ｗ．Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ，Ｄ．Ｂｅｓｓｅｒ，Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ ｉｓ ｃｒｕｃｉａｌ ｆｏｒ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ａｎｄ ｃａｎ ｒｅｐｌａｃｅ ＯＣＴ４ ｄｕｒｉｎｇ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ，ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．１２（２０１１）７２０－７２６，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｅｍｂｏｒ．２０１１．８８．
［非特許文献１０］Ｓ．Ｓｈｉｃｈｉｎｏ，Ｓ．Ｕｅｈａ，Ｓ．Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．Ｏｇａｗａ，Ｈ．Ａｏｋｉ，Ｗ．Ｂｉｎ，Ｃ．－Ｙ．Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｋｉｔａｂａｔａｋｅ，Ｎ．Ｏｕｊｉ－Ｓａｇｅｓｈｉｍａ，Ｓ．Ｈｏｎｔｓｕ，Ｎ．Ｓａｗａｂａｔａ，Ｔ．Ｋａｗａｇｕｃｈｉ，Ｔ．Ｏｋａｙａｍａ，Ｅ．Ｓｕｇｉｈａｒａ，Ｔ．Ｉｔｏ，Ｋ．Ｉｋｅｏ，Ｔ．Ｓａｔｏ，Ｋ．Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ，ＴＡＳ－Ｓｅｑ：ａ ｒｏｂｕｓｔ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｂｅａｄｓ－ｂａｓｅｄ ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ，ｂｉｏＲｘｉｖ（２０２１），ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２１．０８．０３．４５４７３５．
［非特許文献１１］Ｄ．Ｓｈｉｎ，Ｗ．Ｌｅｅ，Ｊ．Ｈ．Ｌｅｅ，Ｄ．Ｂａｎｇ，Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｖｉａ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｂａｒｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｄｒｕｇ ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎｓ，Ｓｃｉ．Ａｄｖ．５（２０１９）ｅａａｖ２２４９，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２６／ｓｃｉａｄｖ．ａａｖ２２４９．
［非特許文献１２］Ｃ．Ｇｕｏ，Ｗ．Ｋｏｎｇ，Ｋ．Ｋａｍｉｍｏｔｏ，Ｇ．Ｃ．Ｒｉｖｅｒａ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｘ．Ｙａｎｇ，Ｙ．Ｋｉｒｉｔａ，Ｓ．Ａ．Ｍｏｒｒｉｓ，ＣｅｌｌＴａｇ Ｉｎｄｅｘｉｎｇ：ｇｅｎｅｔｉｃ ｂａｒｃｏｄｅ－ｂａｓｅｄ ｓａｍｐｌｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２０（２０１９）９０，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓ１３０５９－０１９－１６９９－ｙ．
［非特許文献１３］Ｊ．Ｇｅｈｒｉｎｇ，Ｊ．Ｈ．Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｌ．Ｐａｃｈｔｅｒ，Ｈｉｇｈｌｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｂｙ ＤＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔａｇｇｉｎｇ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８（２０２０）３５－３８，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５８７－０１９－０３７２－ｚ．
［非特許文献１４］Ｃ．ＭｃＧｉｎｎｉｓ，Ｄ．Ｍ．Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｗｉｎｋｌｅｒ，Ｄ．Ｎ．Ｃｏｎｒａｄ，Ｍ．Ｙ．Ｈｅｉｎ，Ｖ．Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｊ．Ｌ．Ｈｕ，Ｌ．Ｍ．Ｍｕｒｒｏｗ，Ｊ．Ｓ．Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｚ．Ｗｅｒｂ，Ｅ．Ｄ．Ｃｈｏｗ，Ｚ．Ｊ．Ｇａｒｔｎｅｒ，ＭＵＬＴＩ－ｓｅｑ：ｓａｍｐｌｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｌｉｐｉｄ－ｔａｇｇｅｄ ｉｎｄｉｃｅｓ，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １６（２０１９）６１９－６２６，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５９２－０１９－０４３３－８．
［非特許文献１５］Ｈ．Ｎｉｗａ，Ｓ．Ｍａｓｕｉ，Ｉ．Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ａ．Ｇ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｓ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＯＵ ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ ｇｅｎｅｒｉｃ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｃｔ－３／４ ｉｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２２（２００２）１５２６－１５３６，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２８／ＭＣＢ．２２．５．１５２６－１５３６．２００２．
［非特許文献１６］Ｋ．Ｏｇａｗａ，Ｈ．Ｍａｔｓｕｉ，Ｓ．Ｏｈｔｓｕｋａ，Ｈ．Ｎｉｗａ，Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｃｌｏｎａｌ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ＥＳ ｃｅｌｌｓ，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ ９（２００４）４７１－４７７，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／ｊ．１３５６－９５９７．２００４．００７３６．ｘ．
［非特許文献１７］Ｍ．Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｍ．Ｋｏｎｄｏ，Ｍ．Ｈｉｒｏｓｅ，Ｍ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．Ｍｅｋａｄａ，Ｔ．Ａｂｅ，Ｈ．Ｋｉｙｏｎａｒｉ，Ａ．Ｏｇｕｒａ，Ｎ．Ｔａｋａｇｉ，Ｋ．Ａｒｔｚｔ，Ｋ．Ａｂｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔ▲ｗ５▼：Ｖｐｓ５２ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｅｌｌ－ｃｅｌｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２（２０１２）１３６３－１３７４，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０１２．１０．００４．
［非特許文献１８］Ｐａｃｋａｇｅ ‘Ｓｅｕｒａｔ’ Ｊａｎｕａｒｙ １４，２０２２ Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．１．０，Ｔｉｔｌｅ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ｈｔｔｐ：／／ｆｔｐ１．ｕｓ．ｄｅｂｉａｎ．ｏｒｇ／ｐｕｂ／ｃｒａｎ／ｗｅｂ／ｐａｃｋａｇｅｓ／Ｓｅｕｒａｔ／Ｓｅｕｒａｔ．ｐｄｆ
発明の概要
発明が解決しようとする課題
［非特許文献２］Ｓ．Ｊ．Ｙｏｏｎ，Ｌ．Ｓ．Ｅｌａｈｌ，Ａ．Ｍ．Ｐａｓｃａ，Ｒ．Ｍ．Ｍａｒｔｏｎ，Ａ．Ｇｏｒｄｏｎ，Ｏ．Ｒｅｖａｈ，Ｙ．Ｍｉｕｒａ，Ｅ．Ｍ．Ｗａｌｃｚａｋ，Ｇ．Ｍ．Ｈｏｌｄｇａｔｅ，Ｈ．Ｃ．Ｆａｎ，Ｊ．Ｒ．Ｈｕｇｕｅｎａｒｄ，Ｄ．Ｈ．Ｇｅｓｃｈｗｉｎｄ，Ｓ．Ｐ．Ｐａｓｃａ，Ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｏｒｇａｎｏｉｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １６（２０１９）７５－７８，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５９２－０１８－０２５５－０．
［非特許文献３］Ｇ．Ｘ．Ｙ．Ｚｈｅｎｇ，Ｊ．Ｍ．Ｔｅｒｒｙ，Ｐ．Ｂｅｌｇｒａｄｅｒ，Ｐ．Ｒｙｖｋｉｎ，Ｚ．Ｗ．Ｂｅｎｔ，Ｒ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｓ．Ｂ．Ｚｉｒａｌｄｏ，Ｔ．Ｄ．Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｇ．Ｐ．ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，Ｊ．Ｚｈｕ，Ｍ．Ｔ．Ｇｒｅｇｏｒｙ ｅｔ．ａｌ．，Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｄｉｇｉｔａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．８（２０１７ Ｊａｎ １６）１４０４９，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１４０４９．
［非特許文献４］Ｊ．Ｃｈｅｎｇ，Ｊ．Ｌｉａｏ，Ｘ．Ｓｈａｏ，Ｘ．Ｌｕ，Ｘ．Ｆａｎ，Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｓａｍｐｌｅｓ ａｔ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ａｄｖ．Ｓｃｉ．８（２０２１）２１０１２２９，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ａｄｖｓ．２０２１０１２２９．
［非特許文献５］Ｈ．Ｔ．Ｎ．Ｔｒａｎ，Ｋ．Ｓ．Ａｎｇ，Ｍ．Ｃｈｅｖｉｅｒ，Ｘ．Ｚｈａｎｇ，Ｎ．Ｙ．Ｓ．Ｌｅｅ，Ｍ．Ｇｏｈ，Ｊ．Ｃｈｅｎ，Ａ ｂｅｎｃｈｍａｒｋ ｏｆ ｂａｔｃｈ－ｅｆｆｅｃｔ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２１（２０２０）１２，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓ１３０５９－０１９－１８５０－９．
［非特許文献６］Ｍ．Ｓｔｏｅｃｋｉｕｓ，Ｓ．Ｚｈｅｎｇ，Ｂ．Ｈｏｕｃｋ－Ｌｏｏｍｉｓ，Ｓ．Ｈａｏ，Ｂ．Ｚ．Ｙｅｕｎｇ，Ｗ．Ｍ．Ｍａｕｃｋ ＩＩＩ，Ｐ．Ｓｍｉｂｅｒｔ，Ｒ．Ｓａｔｉｊａ，Ｃｅｌｌ ｈａｓｈｉｎｇ ｗｉｔｈ ｂａｒｃｏｄｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｅｎａｂｌｅｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ ａｎｄ ｄｏｕｂｌｅｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１９（２０１８）２２４，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓ１３０５９－０１８－１６０３－１．
［非特許文献７］Ｓ．Ｌ．ＭｃＫｉｎｎｅｙ－Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｏ．Ｎａｖｅｉｒａｓ，Ｆ．Ｙａｔｅｓ，Ｓ．Ｌｏｅｗｅｒ，Ｍ．Ｐｈｉｌｉｔａｓ，Ｍ．Ｃｕｒｒａｎ，Ｐ．Ｊ．Ｐａｒｋ，Ｇ．Ｑ．Ｄａｌｅｙ，Ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｅｍｂｒｙｏｓ ａｎｄ ｍｕｒｉｎｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，Ｂｌｏｏｄ １１４（２００９）２６８－２７８，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ－２００８－１２－１９３８８８．
［非特許文献８］Ａ．Ｓ．Ｂｏｙｄ，Ｋ．Ｊ．Ｗｏｏｄ，Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ＭＨＣ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｍｏｕｓｅ ＥＳ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ＥＳ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｃｅｌｌ ｃｌｕｓｔｅｒｓ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ８７（２００９）１３００－１３０４，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９７／ＴＰ．ＯｂＯ１３ｅ３１８１ａ１９４２１．
［非特許文献９］Ｔ．Ｒｅｄｍｅｒ，Ｓ．Ｄｉｅｃｋｅ，Ｔ．Ｇｒｉｇｏｒｙａｎ，Ａ．Ｑｕｉｒｏｇａ－Ｎｅｇｒｅｉｒａ，Ｗ．Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ，Ｄ．Ｂｅｓｓｅｒ，Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ ｉｓ ｃｒｕｃｉａｌ ｆｏｒ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ａｎｄ ｃａｎ ｒｅｐｌａｃｅ ＯＣＴ４ ｄｕｒｉｎｇ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ，ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．１２（２０１１）７２０－７２６，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｅｍｂｏｒ．２０１１．８８．
［非特許文献１０］Ｓ．Ｓｈｉｃｈｉｎｏ，Ｓ．Ｕｅｈａ，Ｓ．Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．Ｏｇａｗａ，Ｈ．Ａｏｋｉ，Ｗ．Ｂｉｎ，Ｃ．－Ｙ．Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｋｉｔａｂａｔａｋｅ，Ｎ．Ｏｕｊｉ－Ｓａｇｅｓｈｉｍａ，Ｓ．Ｈｏｎｔｓｕ，Ｎ．Ｓａｗａｂａｔａ，Ｔ．Ｋａｗａｇｕｃｈｉ，Ｔ．Ｏｋａｙａｍａ，Ｅ．Ｓｕｇｉｈａｒａ，Ｔ．Ｉｔｏ，Ｋ．Ｉｋｅｏ，Ｔ．Ｓａｔｏ，Ｋ．Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ，ＴＡＳ－Ｓｅｑ：ａ ｒｏｂｕｓｔ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｂｅａｄｓ－ｂａｓｅｄ ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ，ｂｉｏＲｘｉｖ（２０２１），ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２１．０８．０３．４５４７３５．
［非特許文献１１］Ｄ．Ｓｈｉｎ，Ｗ．Ｌｅｅ，Ｊ．Ｈ．Ｌｅｅ，Ｄ．Ｂａｎｇ，Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｖｉａ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｂａｒｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｄｒｕｇ ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎｓ，Ｓｃｉ．Ａｄｖ．５（２０１９）ｅａａｖ２２４９，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２６／ｓｃｉａｄｖ．ａａｖ２２４９．
［非特許文献１２］Ｃ．Ｇｕｏ，Ｗ．Ｋｏｎｇ，Ｋ．Ｋａｍｉｍｏｔｏ，Ｇ．Ｃ．Ｒｉｖｅｒａ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｘ．Ｙａｎｇ，Ｙ．Ｋｉｒｉｔａ，Ｓ．Ａ．Ｍｏｒｒｉｓ，ＣｅｌｌＴａｇ Ｉｎｄｅｘｉｎｇ：ｇｅｎｅｔｉｃ ｂａｒｃｏｄｅ－ｂａｓｅｄ ｓａｍｐｌｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２０（２０１９）９０，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓ１３０５９－０１９－１６９９－ｙ．
［非特許文献１３］Ｊ．Ｇｅｈｒｉｎｇ，Ｊ．Ｈ．Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｌ．Ｐａｃｈｔｅｒ，Ｈｉｇｈｌｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｂｙ ＤＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔａｇｇｉｎｇ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８（２０２０）３５－３８，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５８７－０１９－０３７２－ｚ．
［非特許文献１４］Ｃ．ＭｃＧｉｎｎｉｓ，Ｄ．Ｍ．Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｗｉｎｋｌｅｒ，Ｄ．Ｎ．Ｃｏｎｒａｄ，Ｍ．Ｙ．Ｈｅｉｎ，Ｖ．Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｊ．Ｌ．Ｈｕ，Ｌ．Ｍ．Ｍｕｒｒｏｗ，Ｊ．Ｓ．Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｚ．Ｗｅｒｂ，Ｅ．Ｄ．Ｃｈｏｗ，Ｚ．Ｊ．Ｇａｒｔｎｅｒ，ＭＵＬＴＩ－ｓｅｑ：ｓａｍｐｌｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｌｉｐｉｄ－ｔａｇｇｅｄ ｉｎｄｉｃｅｓ，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １６（２０１９）６１９－６２６，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５９２－０１９－０４３３－８．
［非特許文献１５］Ｈ．Ｎｉｗａ，Ｓ．Ｍａｓｕｉ，Ｉ．Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ａ．Ｇ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｓ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＯＵ ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ ｇｅｎｅｒｉｃ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｃｔ－３／４ ｉｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２２（２００２）１５２６－１５３６，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２８／ＭＣＢ．２２．５．１５２６－１５３６．２００２．
［非特許文献１６］Ｋ．Ｏｇａｗａ，Ｈ．Ｍａｔｓｕｉ，Ｓ．Ｏｈｔｓｕｋａ，Ｈ．Ｎｉｗａ，Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｃｌｏｎａｌ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ＥＳ ｃｅｌｌｓ，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ ９（２００４）４７１－４７７，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／ｊ．１３５６－９５９７．２００４．００７３６．ｘ．
［非特許文献１７］Ｍ．Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｍ．Ｋｏｎｄｏ，Ｍ．Ｈｉｒｏｓｅ，Ｍ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．Ｍｅｋａｄａ，Ｔ．Ａｂｅ，Ｈ．Ｋｉｙｏｎａｒｉ，Ａ．Ｏｇｕｒａ，Ｎ．Ｔａｋａｇｉ，Ｋ．Ａｒｔｚｔ，Ｋ．Ａｂｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔ▲ｗ５▼：Ｖｐｓ５２ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｅｌｌ－ｃｅｌｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２（２０１２）１３６３－１３７４，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０１２．１０．００４．
［非特許文献１８］Ｐａｃｋａｇｅ ‘Ｓｅｕｒａｔ’ Ｊａｎｕａｒｙ １４，２０２２ Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．１．０，Ｔｉｔｌｅ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ｈｔｔｐ：／／ｆｔｐ１．ｕｓ．ｄｅｂｉａｎ．ｏｒｇ／ｐｕｂ／ｃｒａｎ／ｗｅｂ／ｐａｃｋａｇｅｓ／Ｓｅｕｒａｔ／Ｓｅｕｒａｔ．ｐｄｆ
発明の概要
発明が解決しようとする課題
【0010】
本発明者らは、上記問題解決のため鋭意研究に努めた結果、特異的細胞表面抗原に依存しない多重ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析のための新たな細胞標識技術を開発し、本発明を想到した。本発明の方法は、細胞の細胞表面タンパク質に直接又は間接的に、修飾されたバーコードを接触させる、工程を含むことを特徴の１つとする。１つの側面において、本発明は、ユニバーサル表面ビオチン化（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｓｕｒｆａｃｅ Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ）（ＵＳＢ）法である。別の側面において、本発明の方法は、細胞の細胞表面タンパク質に直接バーコードを結合させる方法（シングル工程法）である。
課題を解決するための手段
限定されるわけではないが、本発明は、以下の態様を含む。
課題を解決するための手段
限定されるわけではないが、本発明は、以下の態様を含む。
【0011】
［１］
細胞をバーコードで標識する方法であって、
（１）複数の単一細胞を含む細胞群について、細胞の細胞表面タンパク質を直接又は間接的に、修飾されたバーコードと接触させる、又は
（２）単一細胞の細胞表面タンパク質を直接又は間接的に、修飾されたバーコードと接触させる
ことを含む、方法。
［２］
細胞をバーコードで標識する方法であって、
（ｉａ）複数の単一細胞を含む細胞群について、細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化する、
（ｉｂ）単一細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化する、又は
（ｉｃ）複数の細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化し、その後、ビオチン化細胞を、複数の単一細胞を含む細胞群又は単一細胞に分離する、
そして、
（ｉｉ）各細胞群若しくは各単一細胞に、バーコード付加ビオチン結合性物質を接触させる
ことを含む、方法。
［３］
（ｉａ）複数の単一細胞を含む細胞群について、細胞表面タンパク質をビオチン化する、
そして、
（ｉｉ）各細胞群に、バーコード付加ビオチン結合性物質を接触させる
ことを含む、［２］に記載の方法。
［４］
（ｉ）において、細胞表面タンパク質のアミノ基、スルフヒドリル基又はカルボキシル基をビオチン化する、［２］又は［３］に記載の方法。
［５］
（ｉ）において、ビオチン化に用いる試薬が、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド－ビオチン、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド－ビオチン、及びペンタフルオロフェニル－ビオチンからなる群から選択され、
ここにおいて、ビオチンとスルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、又はペンタフルオロフェニルとの結合はスペーサーを含んでいてもよい、
［２］－［４］のいずれか１項に記載の方法。
［６］
（ｉ）において、ビオチン化に用いる試薬が、凍結保存されていたものである、［５］に記載の方法。
［７］
ビオチン結合性物質が、ストレプトアビジン、アビジン及び抗ビオチン抗体からなる群から選択される、［２］－［６］のいずれか１項に記載の方法。
［８］
ビオチン結合性物質が、ストレプトアビジンである、［７］に記載の方法。
［９］
バーコードが、オリゴＤＮＡである、［１］－［８］のいずれか１項に記載の方法。
［１０］
生細胞を標識する、［１］－［９］のいずれか１項に記載の方法。
［１１］
固定した細胞を標識する、［１］－［９］のいずれか１項に記載の方法。
［１２］
細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化するための試薬、及び
バーコード付加ビオチン結合性物質
を含む、細胞をバーコードで標識する方法に使用するためのキット。
［１３］
細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化するための試薬が、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド－ビオチンである、［１２］に記載のキット。
［１４］
細胞試料の多重化分析方法であって、
（ｉａ）複数の単一細胞を含む細胞群について、細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化する、
（ｉｂ）単一細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化する、又は
（ｉｃ）複数の細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化し、その後、ビオチン化細胞を、複数の単一細胞を含む細胞群又は単一細胞に分離する、
（ｉｉ）各細胞群若しくは各単一細胞に、バーコード付加ビオチン結合性物質を接触させる、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）のバーコード標識した細胞群又は単一細胞の全部又は一部を混合する、
そして、
（ｉｖ）（ｉｉｉ）の細胞の混合物について解析する
ことを含む、方法。
［１５］
（ｉａ）複数の単一細胞を含む細胞群について、細胞表面タンパク質をビオチン化する、
そして、
（ｉｉ）各細胞群に、バーコード付加ビオチン結合性物質を接触させる
ことを含む、
［１４］に記載の方法。
［１６］
解析が、細胞のＲＮＡ解析である、［１５］に記載の方法。
［１７］
細胞をバーコードで標識する方法であって、
（１）複数の単一細胞を含む細胞群を、細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物で修飾されたバーコードと接触させる、又は
（２）単一細胞を、細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物で修飾されたバーコードと接触させる、
ことを含む、方法。
［１８］
細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物が、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、及びペンタフルオロフェニルからなる群から選択される、［１７］に記載の方法。
［１９］
細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物が、凍結保存されていたものである、［１８］に記載の方法。
［２０］
バーコードが、オリゴＤＮＡである、［１７］－［１９］のいずれか１項に記載の方法。
［２１］
生細胞を標識する、［１７］－［２０］に記載の方法。
［２２］
固定した細胞を標識する、［１７］－［２１］のいずれか１項に記載の方法。
［２３］
細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物で修飾されたバーコードを含む、細胞をバーコードで標識する方法に使用するためのキット。
［２４］
細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物が、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドである、［２３］に記載のキット。
［２５］
細胞試料の多重化分析方法であって、
（１Ａ）複数の単一細胞を含む細胞群を、細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物で修飾されたバーコードと接触させる、又は
（１Ｂ）単一細胞を、細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物で修飾されたバーコードと接触させる、
（２）（１）のバーコード標識した細胞群又は単一細胞の全部又は一部を混合する、
そして、
（３）（２）の細胞の混合物について解析する
ことを含む、方法。
［２６］
解析が、細胞のＲＮＡ解析である、［２５］に記載の方法。
細胞をバーコードで標識する方法であって、
（１）複数の単一細胞を含む細胞群について、細胞の細胞表面タンパク質を直接又は間接的に、修飾されたバーコードと接触させる、又は
（２）単一細胞の細胞表面タンパク質を直接又は間接的に、修飾されたバーコードと接触させる
ことを含む、方法。
［２］
細胞をバーコードで標識する方法であって、
（ｉａ）複数の単一細胞を含む細胞群について、細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化する、
（ｉｂ）単一細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化する、又は
（ｉｃ）複数の細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化し、その後、ビオチン化細胞を、複数の単一細胞を含む細胞群又は単一細胞に分離する、
そして、
（ｉｉ）各細胞群若しくは各単一細胞に、バーコード付加ビオチン結合性物質を接触させる
ことを含む、方法。
［３］
（ｉａ）複数の単一細胞を含む細胞群について、細胞表面タンパク質をビオチン化する、
そして、
（ｉｉ）各細胞群に、バーコード付加ビオチン結合性物質を接触させる
ことを含む、［２］に記載の方法。
［４］
（ｉ）において、細胞表面タンパク質のアミノ基、スルフヒドリル基又はカルボキシル基をビオチン化する、［２］又は［３］に記載の方法。
［５］
（ｉ）において、ビオチン化に用いる試薬が、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド－ビオチン、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド－ビオチン、及びペンタフルオロフェニル－ビオチンからなる群から選択され、
ここにおいて、ビオチンとスルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、又はペンタフルオロフェニルとの結合はスペーサーを含んでいてもよい、
［２］－［４］のいずれか１項に記載の方法。
［６］
（ｉ）において、ビオチン化に用いる試薬が、凍結保存されていたものである、［５］に記載の方法。
［７］
ビオチン結合性物質が、ストレプトアビジン、アビジン及び抗ビオチン抗体からなる群から選択される、［２］－［６］のいずれか１項に記載の方法。
［８］
ビオチン結合性物質が、ストレプトアビジンである、［７］に記載の方法。
［９］
バーコードが、オリゴＤＮＡである、［１］－［８］のいずれか１項に記載の方法。
［１０］
生細胞を標識する、［１］－［９］のいずれか１項に記載の方法。
［１１］
固定した細胞を標識する、［１］－［９］のいずれか１項に記載の方法。
［１２］
細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化するための試薬、及び
バーコード付加ビオチン結合性物質
を含む、細胞をバーコードで標識する方法に使用するためのキット。
［１３］
細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化するための試薬が、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド－ビオチンである、［１２］に記載のキット。
［１４］
細胞試料の多重化分析方法であって、
（ｉａ）複数の単一細胞を含む細胞群について、細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化する、
（ｉｂ）単一細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化する、又は
（ｉｃ）複数の細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化し、その後、ビオチン化細胞を、複数の単一細胞を含む細胞群又は単一細胞に分離する、
（ｉｉ）各細胞群若しくは各単一細胞に、バーコード付加ビオチン結合性物質を接触させる、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）のバーコード標識した細胞群又は単一細胞の全部又は一部を混合する、
そして、
（ｉｖ）（ｉｉｉ）の細胞の混合物について解析する
ことを含む、方法。
［１５］
（ｉａ）複数の単一細胞を含む細胞群について、細胞表面タンパク質をビオチン化する、
そして、
（ｉｉ）各細胞群に、バーコード付加ビオチン結合性物質を接触させる
ことを含む、
［１４］に記載の方法。
［１６］
解析が、細胞のＲＮＡ解析である、［１５］に記載の方法。
［１７］
細胞をバーコードで標識する方法であって、
（１）複数の単一細胞を含む細胞群を、細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物で修飾されたバーコードと接触させる、又は
（２）単一細胞を、細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物で修飾されたバーコードと接触させる、
ことを含む、方法。
［１８］
細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物が、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、及びペンタフルオロフェニルからなる群から選択される、［１７］に記載の方法。
［１９］
細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物が、凍結保存されていたものである、［１８］に記載の方法。
［２０］
バーコードが、オリゴＤＮＡである、［１７］－［１９］のいずれか１項に記載の方法。
［２１］
生細胞を標識する、［１７］－［２０］に記載の方法。
［２２］
固定した細胞を標識する、［１７］－［２１］のいずれか１項に記載の方法。
［２３］
細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物で修飾されたバーコードを含む、細胞をバーコードで標識する方法に使用するためのキット。
［２４］
細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物が、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドである、［２３］に記載のキット。
［２５］
細胞試料の多重化分析方法であって、
（１Ａ）複数の単一細胞を含む細胞群を、細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物で修飾されたバーコードと接触させる、又は
（１Ｂ）単一細胞を、細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物で修飾されたバーコードと接触させる、
（２）（１）のバーコード標識した細胞群又は単一細胞の全部又は一部を混合する、
そして、
（３）（２）の細胞の混合物について解析する
ことを含む、方法。
［２６］
解析が、細胞のＲＮＡ解析である、［２５］に記載の方法。
【0012】
本発明の細胞をバーコードで標識する方法は、ＵＳＢ法、シングル工程法のいずれの場合も、細胞の細胞表面タンパク質を標的とするため、細胞表面タンパク質が存在すればどのような状態の細胞も標識が可能である。例えば、カドヘリン１（ＣＤＨ１）の発現に依存しないため、未分化状態の細胞、分化状態の細胞のいずれも標的可能である。また、標識する細胞の種類も限定されず、あらゆる種類の細胞に適用可能である。さらに、メタノール等で固定した細胞に対しても適用可能である。
ＵＳＢ法について、ビオチン化は、特定の細胞表面タンパク質に依存せず、どんな細胞表面タンパク質にも行うことが可能である。細胞表面タンパク質のビオチン化を利用する本発明の方法は、網羅的な細胞の標識を可能にするユニバーサル標識技術である。本発明の技術（以後、「ＵＳＢ法」と呼ぶ）は非常に汎用性が高く、どのタイプの細胞にも適用できる。
ＵＳＢ法について、ビオチン化は、特定の細胞表面タンパク質に依存せず、どんな細胞表面タンパク質にも行うことが可能である。細胞表面タンパク質のビオチン化を利用する本発明の方法は、網羅的な細胞の標識を可能にするユニバーサル標識技術である。本発明の技術（以後、「ＵＳＢ法」と呼ぶ）は非常に汎用性が高く、どのタイプの細胞にも適用できる。
【0013】
本発明の方法は、あらゆる細胞表面タンパク質に導入可能なビオチンを利用することにより、すべての種類の細胞の標識を可能にする。ＵＳＢ法は、試験した細胞の生育やコロニー形成能に対する有害な影響を及ぼさない。さらに、サンプル多重化を行い、ＵＳＢ法をシングルセル解析に適用すると、様々な分化細胞を首尾よく捕捉し、各細胞における遺伝子の検出力やトランスクリプトームの取得に悪影響を及ぼすことがないことが、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞の分化プロセスをモデルとした実験において明らかにされた。ＵＳＢ法は、これまで通常の細胞ハッシング法が上手く適用できなかったヒトｉＰＳ由来軟骨細胞及びラット肺由来細胞を含む、多くのタイプの細胞に使用できる。ＵＳＢ法は、理論的にはあらゆるタイプの細胞に適用することができ、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを多重化するための簡便で、高効率かつ費用対効果の高い方法である。
【0014】
シングル工程法は、細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物で修飾されたバーコードと接触させる、工程を含む。シングル工程法も、ＵＳＢ法と同様に細胞の細胞表面タンパク質を標的とするため、すべての種類の細胞の標識を可能にする。シングル工程法は、試験した細胞の生育やコロニー形成能に対する有害な影響を及ぼさない。さらに、サンプル多重化を行い、シングル工程法をシングルセル解析に適用すると、様々な分化細胞を首尾よく捕捉し、各細胞における遺伝子の検出力やトランスクリプトームの取得に悪影響を及ぼすことがないことが、本明細書中の実施例で確認された。
【0015】
本発明は、がん組織でｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを行うなど疾患の解析に利用することができる。本発明はまた、ｉＰＳ細胞を使った移植医療において、ｉＰＳ細胞が目的の種類の細胞に分化できているかを確認するために利用することができる。本発明はさらに、遺伝性疾患の治療薬の候補をスクリーニングする際に、患者由来ｉＰＳ細胞に対する薬剤の効果を検証するために利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0016】
[図１] 図１は、ＵＳＢ及び抗体法（Ａｂ法）の原理を図示したものである。ＵＳＢ法では、細胞表面タンパク質（青色）を普遍的にＳ－ＮＨＳ－ビオチンでビオチン化（赤褐色）し、バーコードＤＮＡ標識ストレプトアビジンで処理する。Ａｂ法では、特異的細胞表面タンパク質（赤）に対するビオチン結合抗体で細胞を処理し、続いてバーコードＤＮＡ標識ストレプトアビジンで処理する。特定のタンパク質が一部の細胞で発現していない場合、それらの細胞はＡｂ法では標識されないが、ＵＳＢ法ではすべての細胞を標識できる。
[図２] 図２は、ＵＳＢ法及びＡｂ法で標識した未分化ＥＳ細胞と分化細胞のフローサイトメトリーの結果を示す。図２の縦軸は細胞数、横軸はＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）の蛍光強度を示す。フローサイトメトリーの結果、ＵＳＢ法は細胞標識の効率が非常に高く、未分化細胞（左上）の９９．６％、分化細胞（右上）の９６．４％がＰＥ陽性であった。対照的に、Ａｂ法を用いると、未分化細胞の８７．８％（左下）及び分化細胞の９．９％（右下）がＰＥ陽性であった。
[図３] 図３は、ＵＳＢ法（上部パネル）及びＡｂ法（下部パネル）により細胞標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である（倍率 ｘ２００）。Ａｂ法はマウスＣＤＨ１に対する抗体を用いた。ＣＤＨ１は未分化ＥＳ細胞で発現することが知られているが、発現は未分化状態の細胞に限定された。（上）ＵＳＢ法、（下）Ａｂ法。（左）未分化ＥＳ細胞、（右）分化細胞（分化誘導１２日後）。Ｐｈ、位相差画像； ＰＥ、ＴｏｔａｌＳｅｑ（登録商標）－ＰＥ－ストレプトアビジンの蛍光画像；左図の矢印ヘッド、ＰＥ陰性細胞；右図の矢印、ＰＥ陽性細胞。
[図４] 図４は、ＥＳ細胞及びその分化誘導体のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析の結果を示す。細胞標識にはＵＳＢ多重化法又はＣＤＨ１抗体によるＡｂ多重化法を用いた。（Ａ）ＵＭＡＰ（ｕｎｉｆｏｒｍ ｍａｎｉｆｏｌｄ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）解析で、細胞は１１のクラスターに分類された：０：多能性細胞；１：ナイーブ細胞；２：血管平滑筋細胞；３：プライム型多能性細胞；４：ドパミンニューロン；５：上皮細胞；６：ＭＥＦ（フィーダー細胞）；７：神経細胞；８：マクロファージ；９：グリア細胞；１０：血管内皮細胞。（Ｂ）ＵＭＡＰ上の細胞サンプルの分布を示す。各サンプルのカラーコードは、図の下に示している。（Ｃ）ＵＭＡＰ上のＣｄｈ１陽性細胞の分布を示す。
[図５] 図５は、図４におけるＣｄｈ１陽性（左）とＣｄｈ１陰性（右）のクラスターにおいて、ＵＳＢ法又はＡｂ法で検出された細胞数の比較を示した図である。
[図６] 図６は、（Ａ）未分化ＥＳ細胞及び（Ｂ）分化細胞に対するＣＤＨ１の免疫染色の結果である。ＣＤＨ１シグナルは、未分化ＥＳ細胞では全ての細胞表面において観察されたが、分化細胞では少数の細胞においてのみ検出された。緑、ＣＤＨ１；赤、ＯＣＴ４；青、ＤＡＰＩ（核）。
[図７] 図７は、Ｓ－ＮＨＳ－ビオチン処理が未分化ＥＳ細胞の生存能力に影響しないことを調べた結果である。（右）Ｓ－ＮＨＳ－ビオチンで処理した細胞及び（左）対照の未処理細胞。（下段）拡大図 ｘ７．３。
[図８] 図８は、ＴＡＳ－ｓｅｑプロトコルにより増幅した全トランスクリプトームｃＤＮＡ（Ａ）、及び、ＴＡＳ－ｓｅｑプロトコルにより増幅したバーコードＤＮＡ（Ｂ）について、電気泳動により品質チェックを行ったものである。電気泳動図によれば、ｃＤＮＡ及びバーコードＤＮＡの収量及びサイズ分布は、その後の解析に十分であった。
[図９] 図９は、ＵＳＢ法及びＡｂ法で標識した未分化ＥＳ細胞と分化細胞について、ＵＭＡＰ法により、分布を調べた結果である。（Ａ）ＵＳＢ法標識未分化ＥＳ細胞のＵＭＡＰ分布；（Ｂ）Ａｂ法標識未分化ＥＳ細胞のＵＭＡＰ分布；（Ｃ）ＵＳＢ法標識分化細胞のＵＭＡＰ分布；及び（Ｄ）Ａｂ法標識分化細胞のＵＭＡＰ分布。
[図１０] 図１０は、多重化サンプルのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析の結果を示す。サンプルとして、ＵＳＢ法又はＡｂ法のいずれかで標識されたＲ１ ＥＳ細胞由来の未分化細胞及び分化細胞４つのサンプル、並びに、ＵＳＢ法で標識されたＥＢ３ ＥＳ細胞株由来の未分化細胞及び分化細胞の２つのサンプルの合計６サンプルを使用した。ＵＭＡＰ法により細胞クラスターを解析し、各サンプルの分布を（Ａ）に示した。（Ｂ）１１のクラスターが以下のように同定された。０：血管平滑筋；１：多能性細胞；２：ナイーブＥＳ細胞；３：上皮細胞；４：ドパミンニューロン；５：プライム型多能性幹細胞；６：マクロファージ；７：ＭＥＦ（フィーダー細胞）；８：神経細胞；９：グリア細胞；１０：血管内皮細胞。（Ｃ）Ｃｄｈ１発現レベルを（Ａ）のＵＭＡＰの分布へ重ね合わせた結果である。
[図１１] 図１１は、既存試薬を用いたＡｂ法では標識不可能な軟骨細胞に対してＵＳＢ法を用いて標識した後にフローサイトメトリー解析を行った結果である。図１１の縦軸は側方散乱光シグナル（ＳＳＣ）、横軸はＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）の蛍光強度を示す。マウス成長板由来の軟骨細胞を、ＭＨＣクラスＩ抗体（左）、ＣＤ４５抗体（中央）、及びＵＳＢ法（右）で各々標識し、フローサイトメトリーで解析した。ＭＨＣ及びＣＤ４５抗体ではほとんど染色されないマウス成長板軟骨細胞が、ＵＳＢ法では効率的に標識されている。
[図１２] 図１２も、図１１と同様に、既存試薬を用いたＡｂ法では標識不可能なラット細胞に対してＵＳＢ法を用いて標識した後にフローサイトメトリー解析を行った結果である。図１２の上段は、ＰＥ標識ＣＤ３１抗体とＰｅｒＣＰ標識ＣＤ４５抗体で二重染色したラット肺細胞のフローサイトメトリー解析の結果を示し、図１２の下段はＣＤ３１陽性細胞、ＣＤ４５陽性細胞及び二重陰性細胞におけるＵＳＢ法による細胞標識効率を検証したフローサイトメトリー解析の結果を示す。ＵＳＢ法による細胞標識効率の検証実験においては、ＡＰＣ標識ストレプトアビジンを使用した。図１２上段の縦軸はＰＥの蛍光強度、横軸はＰｅｒＣＰの蛍光強度を示し、図１２下段の縦軸は側方散乱光シグナル（ＳＳＣ）、横軸はＡＰＣの蛍光強度を示す。ラット肺より解離した肺細胞をＣＤ３１陽性、ＣＤ４５陽性及び二重陰性の３つの集団に分画した。分画した細胞はすべてＵＳＢ法で標識されていることがわかった。ラットは、Ａｂ法に基づくサンプル多重化キットが市販されていない種である。
[図１３] 図１３は、フローサイトメトリー解析による抗体の非特異結合の有無の検証結果を示す。図１３の縦軸は細胞数、横軸はＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）の蛍光強度を示す。（Ａ）未標識未分化ＥＳ細胞；（Ｂ）ビオチン－アイソタイプコントロール抗体及びＴｏｔａｌＳｅｑ（登録商標）－ストレプトアビジン（ＰＥ結合型）で処理された未分化ＥＳ細胞。フローサイトメトリー解析ではアイソタイプコントロール抗体の非特異結合は検出されなかった。
[図１４] 図１４は、ＴＡＳ－ｓｅｑ法により検出された、アイソタイプコントロール抗体及びバーコードタグ付きストレプトアビジン（ＴｏｔａｌＳｅｑ（登録商標）－ストレプトアビジン）の非特異的結合を示す。各サンプルにおいてｃＤＮＡ合成反応を行い、ＴＡＳ－ｓｅｑ法によりバーコードＤＮＡを増幅した。次いで、サンプルをアジレントバイオアナライザーを用いて解析した。（Ａ）抗体とＴｏｔａｌＳｅｑ（登録商標）－ストレプトアビジンでの処理を行っていない細胞（陰性対照サンプル）；（Ｂ）ＴｏｔａｌＳｅｑ（登録商標）－ストレプトアビジンのみで処理した細胞；（Ｃ）アイソタイプコントロール抗体処理に続いてＴｏｔａｌＳｅｑ（登録商標）－ストレプトアビジンで処理した細胞、並びに、（Ｄ）ビオチン修飾抗ＣＤＨ１抗体処理に続いてＴｏｔａｌＳｅｑ（登録商標）－ストレプトアビジンで処理した細胞（陽性対照サンプル）。（Ａ）－（Ｄ）の各パネルの下部に、サンプル試薬の関係を模式的に示した（図１も参照）。陰性対照サンプル（Ａ）では、バーコードＤＮＡの増幅を認めなかったが、陽性対照サンプル（Ｄ）では明瞭なピーク（矢印）が認められた。他のサンプル（Ｂ及びＣ）では（Ｄ）より小さいが、ピークが観察され（矢印）、ＴｏｔａｌＳｅｑ（登録商標）－ストレプトアビジン及び／又はイソタイプコントロール抗体の非特異的結合の存在が確認された。高い検出力を持つＴＡＳ－ｓｅｑ法を用いると、フローサイトメトリー解析では検出できない弱いレベルのＴｏｔａｌＳｅｑ（登録商標）－ストレプトアビジン及び／又は抗体の非特異結合が確認された。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析におけるサンプル多重化の目的においては、Ａｂ法においてＴｏｔａｌＳｅｑ（登録商標）－ストレプトアビジン及び／又は抗体の非特異結合が障害になることはないものの、技術の厳密性においてＵＳＢ法がＡｂ法に勝っていることを示す。
[図１５] 図１５は、スルホ－ＮＨＳ－エステル化オリゴＤＮＡ（ＮＥＯ）を用いて細胞を標識し（シングル工程法）、フローサイトメトリー解析により標識効率を検証した結果を示す。シングル工程法での標識効率の検証に用いたＮＥＯの３’末端には６－ＦＡＭ（６－カルボキシフルオレセイン）を付加した。図１５の縦軸は細胞数、横軸は６－ＦＡＭ（６－カルボキシフルオレセイン）の蛍光強度を示す。
[図１６] 図１６は、シングル工程法標識された各種細胞の多重ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析の結果を示す。
[図１７] 図１７は、図１６の多重ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析により検出された９種類の各細胞の細胞数を示す棒グラフである。
[図２] 図２は、ＵＳＢ法及びＡｂ法で標識した未分化ＥＳ細胞と分化細胞のフローサイトメトリーの結果を示す。図２の縦軸は細胞数、横軸はＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）の蛍光強度を示す。フローサイトメトリーの結果、ＵＳＢ法は細胞標識の効率が非常に高く、未分化細胞（左上）の９９．６％、分化細胞（右上）の９６．４％がＰＥ陽性であった。対照的に、Ａｂ法を用いると、未分化細胞の８７．８％（左下）及び分化細胞の９．９％（右下）がＰＥ陽性であった。
[図３] 図３は、ＵＳＢ法（上部パネル）及びＡｂ法（下部パネル）により細胞標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である（倍率 ｘ２００）。Ａｂ法はマウスＣＤＨ１に対する抗体を用いた。ＣＤＨ１は未分化ＥＳ細胞で発現することが知られているが、発現は未分化状態の細胞に限定された。（上）ＵＳＢ法、（下）Ａｂ法。（左）未分化ＥＳ細胞、（右）分化細胞（分化誘導１２日後）。Ｐｈ、位相差画像； ＰＥ、ＴｏｔａｌＳｅｑ（登録商標）－ＰＥ－ストレプトアビジンの蛍光画像；左図の矢印ヘッド、ＰＥ陰性細胞；右図の矢印、ＰＥ陽性細胞。
[図４] 図４は、ＥＳ細胞及びその分化誘導体のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析の結果を示す。細胞標識にはＵＳＢ多重化法又はＣＤＨ１抗体によるＡｂ多重化法を用いた。（Ａ）ＵＭＡＰ（ｕｎｉｆｏｒｍ ｍａｎｉｆｏｌｄ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）解析で、細胞は１１のクラスターに分類された：０：多能性細胞；１：ナイーブ細胞；２：血管平滑筋細胞；３：プライム型多能性細胞；４：ドパミンニューロン；５：上皮細胞；６：ＭＥＦ（フィーダー細胞）；７：神経細胞；８：マクロファージ；９：グリア細胞；１０：血管内皮細胞。（Ｂ）ＵＭＡＰ上の細胞サンプルの分布を示す。各サンプルのカラーコードは、図の下に示している。（Ｃ）ＵＭＡＰ上のＣｄｈ１陽性細胞の分布を示す。
[図５] 図５は、図４におけるＣｄｈ１陽性（左）とＣｄｈ１陰性（右）のクラスターにおいて、ＵＳＢ法又はＡｂ法で検出された細胞数の比較を示した図である。
[図６] 図６は、（Ａ）未分化ＥＳ細胞及び（Ｂ）分化細胞に対するＣＤＨ１の免疫染色の結果である。ＣＤＨ１シグナルは、未分化ＥＳ細胞では全ての細胞表面において観察されたが、分化細胞では少数の細胞においてのみ検出された。緑、ＣＤＨ１；赤、ＯＣＴ４；青、ＤＡＰＩ（核）。
[図７] 図７は、Ｓ－ＮＨＳ－ビオチン処理が未分化ＥＳ細胞の生存能力に影響しないことを調べた結果である。（右）Ｓ－ＮＨＳ－ビオチンで処理した細胞及び（左）対照の未処理細胞。（下段）拡大図 ｘ７．３。
[図８] 図８は、ＴＡＳ－ｓｅｑプロトコルにより増幅した全トランスクリプトームｃＤＮＡ（Ａ）、及び、ＴＡＳ－ｓｅｑプロトコルにより増幅したバーコードＤＮＡ（Ｂ）について、電気泳動により品質チェックを行ったものである。電気泳動図によれば、ｃＤＮＡ及びバーコードＤＮＡの収量及びサイズ分布は、その後の解析に十分であった。
[図９] 図９は、ＵＳＢ法及びＡｂ法で標識した未分化ＥＳ細胞と分化細胞について、ＵＭＡＰ法により、分布を調べた結果である。（Ａ）ＵＳＢ法標識未分化ＥＳ細胞のＵＭＡＰ分布；（Ｂ）Ａｂ法標識未分化ＥＳ細胞のＵＭＡＰ分布；（Ｃ）ＵＳＢ法標識分化細胞のＵＭＡＰ分布；及び（Ｄ）Ａｂ法標識分化細胞のＵＭＡＰ分布。
[図１０] 図１０は、多重化サンプルのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析の結果を示す。サンプルとして、ＵＳＢ法又はＡｂ法のいずれかで標識されたＲ１ ＥＳ細胞由来の未分化細胞及び分化細胞４つのサンプル、並びに、ＵＳＢ法で標識されたＥＢ３ ＥＳ細胞株由来の未分化細胞及び分化細胞の２つのサンプルの合計６サンプルを使用した。ＵＭＡＰ法により細胞クラスターを解析し、各サンプルの分布を（Ａ）に示した。（Ｂ）１１のクラスターが以下のように同定された。０：血管平滑筋；１：多能性細胞；２：ナイーブＥＳ細胞；３：上皮細胞；４：ドパミンニューロン；５：プライム型多能性幹細胞；６：マクロファージ；７：ＭＥＦ（フィーダー細胞）；８：神経細胞；９：グリア細胞；１０：血管内皮細胞。（Ｃ）Ｃｄｈ１発現レベルを（Ａ）のＵＭＡＰの分布へ重ね合わせた結果である。
[図１１] 図１１は、既存試薬を用いたＡｂ法では標識不可能な軟骨細胞に対してＵＳＢ法を用いて標識した後にフローサイトメトリー解析を行った結果である。図１１の縦軸は側方散乱光シグナル（ＳＳＣ）、横軸はＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）の蛍光強度を示す。マウス成長板由来の軟骨細胞を、ＭＨＣクラスＩ抗体（左）、ＣＤ４５抗体（中央）、及びＵＳＢ法（右）で各々標識し、フローサイトメトリーで解析した。ＭＨＣ及びＣＤ４５抗体ではほとんど染色されないマウス成長板軟骨細胞が、ＵＳＢ法では効率的に標識されている。
[図１２] 図１２も、図１１と同様に、既存試薬を用いたＡｂ法では標識不可能なラット細胞に対してＵＳＢ法を用いて標識した後にフローサイトメトリー解析を行った結果である。図１２の上段は、ＰＥ標識ＣＤ３１抗体とＰｅｒＣＰ標識ＣＤ４５抗体で二重染色したラット肺細胞のフローサイトメトリー解析の結果を示し、図１２の下段はＣＤ３１陽性細胞、ＣＤ４５陽性細胞及び二重陰性細胞におけるＵＳＢ法による細胞標識効率を検証したフローサイトメトリー解析の結果を示す。ＵＳＢ法による細胞標識効率の検証実験においては、ＡＰＣ標識ストレプトアビジンを使用した。図１２上段の縦軸はＰＥの蛍光強度、横軸はＰｅｒＣＰの蛍光強度を示し、図１２下段の縦軸は側方散乱光シグナル（ＳＳＣ）、横軸はＡＰＣの蛍光強度を示す。ラット肺より解離した肺細胞をＣＤ３１陽性、ＣＤ４５陽性及び二重陰性の３つの集団に分画した。分画した細胞はすべてＵＳＢ法で標識されていることがわかった。ラットは、Ａｂ法に基づくサンプル多重化キットが市販されていない種である。
[図１３] 図１３は、フローサイトメトリー解析による抗体の非特異結合の有無の検証結果を示す。図１３の縦軸は細胞数、横軸はＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）の蛍光強度を示す。（Ａ）未標識未分化ＥＳ細胞；（Ｂ）ビオチン－アイソタイプコントロール抗体及びＴｏｔａｌＳｅｑ（登録商標）－ストレプトアビジン（ＰＥ結合型）で処理された未分化ＥＳ細胞。フローサイトメトリー解析ではアイソタイプコントロール抗体の非特異結合は検出されなかった。
[図１４] 図１４は、ＴＡＳ－ｓｅｑ法により検出された、アイソタイプコントロール抗体及びバーコードタグ付きストレプトアビジン（ＴｏｔａｌＳｅｑ（登録商標）－ストレプトアビジン）の非特異的結合を示す。各サンプルにおいてｃＤＮＡ合成反応を行い、ＴＡＳ－ｓｅｑ法によりバーコードＤＮＡを増幅した。次いで、サンプルをアジレントバイオアナライザーを用いて解析した。（Ａ）抗体とＴｏｔａｌＳｅｑ（登録商標）－ストレプトアビジンでの処理を行っていない細胞（陰性対照サンプル）；（Ｂ）ＴｏｔａｌＳｅｑ（登録商標）－ストレプトアビジンのみで処理した細胞；（Ｃ）アイソタイプコントロール抗体処理に続いてＴｏｔａｌＳｅｑ（登録商標）－ストレプトアビジンで処理した細胞、並びに、（Ｄ）ビオチン修飾抗ＣＤＨ１抗体処理に続いてＴｏｔａｌＳｅｑ（登録商標）－ストレプトアビジンで処理した細胞（陽性対照サンプル）。（Ａ）－（Ｄ）の各パネルの下部に、サンプル試薬の関係を模式的に示した（図１も参照）。陰性対照サンプル（Ａ）では、バーコードＤＮＡの増幅を認めなかったが、陽性対照サンプル（Ｄ）では明瞭なピーク（矢印）が認められた。他のサンプル（Ｂ及びＣ）では（Ｄ）より小さいが、ピークが観察され（矢印）、ＴｏｔａｌＳｅｑ（登録商標）－ストレプトアビジン及び／又はイソタイプコントロール抗体の非特異的結合の存在が確認された。高い検出力を持つＴＡＳ－ｓｅｑ法を用いると、フローサイトメトリー解析では検出できない弱いレベルのＴｏｔａｌＳｅｑ（登録商標）－ストレプトアビジン及び／又は抗体の非特異結合が確認された。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析におけるサンプル多重化の目的においては、Ａｂ法においてＴｏｔａｌＳｅｑ（登録商標）－ストレプトアビジン及び／又は抗体の非特異結合が障害になることはないものの、技術の厳密性においてＵＳＢ法がＡｂ法に勝っていることを示す。
[図１５] 図１５は、スルホ－ＮＨＳ－エステル化オリゴＤＮＡ（ＮＥＯ）を用いて細胞を標識し（シングル工程法）、フローサイトメトリー解析により標識効率を検証した結果を示す。シングル工程法での標識効率の検証に用いたＮＥＯの３’末端には６－ＦＡＭ（６－カルボキシフルオレセイン）を付加した。図１５の縦軸は細胞数、横軸は６－ＦＡＭ（６－カルボキシフルオレセイン）の蛍光強度を示す。
[図１６] 図１６は、シングル工程法標識された各種細胞の多重ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析の結果を示す。
[図１７] 図１７は、図１６の多重ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析により検出された９種類の各細胞の細胞数を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【0017】
非限定的に本発明は、以下の態様を含む。本明細書において他に断りがない限り、本明細書で使用される技術及び科学用語は、当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。本明細書に開示された物質、材料及び例は単なる例示であり、制限することを意図していない。本明細書において「一態様において」と言及する場合は、その態様に限定されない、即ち、非限定的であることを意味する。
【0018】
本発明は一態様において、細胞をバーコードで標識する方法に関する。非限定的に、本発明の方法は、
（１）複数の単一細胞を含む細胞群について、細胞の細胞表面タンパク質を直接又は間接的に、修飾されたバーコードと接触させる、又は
（２）単一細胞の細胞表面タンパク質を直接又は間接的に、修飾されたバーコードと接触させる
ことを含む。
（１）複数の単一細胞を含む細胞群について、細胞の細胞表面タンパク質を直接又は間接的に、修飾されたバーコードと接触させる、又は
（２）単一細胞の細胞表面タンパク質を直接又は間接的に、修飾されたバーコードと接触させる
ことを含む。
【0019】
本発明の方法は、細胞の細胞表面タンパク質を直接又は間接的に、修飾されたバーコードと接触させる、ことを特徴の１つとする。
【0020】
１つの側面において、本発明は、ユニバーサル表面ビオチン化（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｓｕｒｆａｃｅ Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ）（ＵＳＢ）法である。ＵＳＢ法では、細胞の細胞表面タンパク質を間接的に（ビオチン－ビオチン結合性物質を介して）バーコードと接触させる。ＵＳＢ法では、細胞表面タンパク質をビオチン化されており、バーコードは、ビオチン結合性物質で修飾されている。ＵＳＢ法において、「修飾されたバーコード」は、ビオチン結合物質が付加されたバーコード、即ち、バーコード付加ビオチン結合性物質を意味する。
【0021】
別の側面において、本発明の方法は、細胞の細胞表面タンパク質に直接バーコードを結合させる方法（シングル工程法（又はダイレクト法））である。シングル工程法では、細胞の細胞表面タンパク質を直接、修飾されたバーコードと接触させる。シングル工程法では、バーコードは、細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物で修飾されている。シングル工程法において、「修飾されたバーコード」は、細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物で修飾されたバーコードを意味する。
【0022】
１．細胞をバーコードで標識する方法（１）（ＵＳＢ法）
本発明は、一態様において、細胞をバーコードで標識する方法に関する。非限定的に、前記方法は、
（ｉａ）複数の単一細胞を含む細胞群について、細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化する、
（ｉｂ）単一細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化する、又は
（ｉｃ）複数の細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化し、その後、ビオチン化細胞を、複数の単一細胞を含む細胞群又は単一細胞に分離する、
そして、
（ｉｉ）各細胞群若しくは各単一細胞に、バーコード付加ビオチン結合性物質を接触させる
ことを含む。
前記方法は、細胞表面に存在する細胞表面タンパク質をビオチン化することを含む。ビオチン化は、どんな細胞表面タンパク質にも適用可能であり、細胞の種類に依存せず、細胞の網羅的な標識が可能である。すなわち、標識は特定の細胞表面タンパク質に依存しないため、前記方法の対象となる細胞の種類は限定されない。動物細胞、植物細胞、培養細胞、あらゆる細胞が対象となる。
前記方法は、まず、細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化することを含む。
（ｉａ）複数の単一細胞を含む細胞群について、細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化する、
（ｉｂ）単一細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化する、又は
（ｉｃ）複数の細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化し、その後、ビオチン化細胞を、複数の単一細胞を含む細胞群又は単一細胞に分離する。
タンパク質のビオチン化は、複数の単一細胞を含む細胞群又は単一細胞について行ってもよく、あるいは、複数の細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化してから、その後、ビオチン化細胞を、複数の単一細胞を含む細胞群又は単一細胞に分離してもよい。（ｉｉ）バーコード付加ビオチン結合性物質を接触させる工程の前に、細胞が、複数の単一細胞を含む細胞群又は単一細胞に分離されていることが必要である。好ましくは、タンパク質のビオチン化は、複数の単一細胞を含む細胞群又は単一細胞について行う。
「複数の単一細胞を含む細胞群」とは、例えば、共通する特性を有する複数の単一細胞からなる細胞群、共通する臓器より取得された複数の単一細胞からなる細胞群、のように特性や由来が共通する単一細胞の塊を細胞群としたものである。
一態様において、前記方法は、
（ｉａ）複数の単一細胞を含む細胞群について、細胞表面タンパク質をビオチン化する、
そして、
（ｉｉ）各細胞群に、バーコード付加ビオチン結合性物質を接触させる
ことを含む。
複数種の細胞を含む細胞の塊（例えば、臓器等）から、複数の単一細胞を含む細胞群、又は単一細胞に単離する方法は公知の方法を利用することができ、特に限定されない。細胞の塊、細胞の塊に含まれる細胞の種類、取得したい（標識したい）単離したい複数の単一細胞を含む細胞群、又は単一細胞の種類に応じて、当業者は公知の方法を利用可能である。ビオチン化後に単離を行う場合も同様である。
ビオチンは、ビタミンＢ類に分類される水溶性ビタミンの一種で、ビタミンＢ７とも呼称される。ビオチン化とは、タンパク質や巨大分子類へのビオチンを結合させる処理を意味する。
ビオチン化は、ビオチン標識試薬を用いて、アミノ基、スルフヒドリル基、カルボキシル基又はアルデヒド基（糖鎖の酸化）の、タンパク質上の官能基に、化学的に結合させる方法がある。多くの種類のビオチン標識試薬が公知であり、当業者は、利用する官能基、標識試薬の親水性、標識反応後の切断の有無等から、適切なビオチン標識試薬を選択可能である。
アミノ基（主に、一級アミン：－ＮＨ２）は多くのタンパク質に含まれているリジン残基の側鎖やアミノ末端に存在する。特にリジン残基のεアミノ基は反応性が高く、また多くの場合、タンパク質三次構造の表面にリジン残基が存在することから、アミノ基はビオチン化に特に利用しやすい官能基である。アミノ基反応性のビオチン標識試薬の代表はＮ－ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ－Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、略称：ＮＨＳ）－エステルを持つビオチンである。ＮＨＳ－エステルはアミノ基と反応してアミド結合を形成する。ＮＨＳ－エステル ビオチンには、スルホン酸基を有するスルホ－ＮＨＳ－エステル ビオチンと、スルホン酸基を有しないＮＨＳ－エステル ビオチンとがある。前者には、例えば、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド－ビオチンが含まれ、後者には、例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド－ビオチンが含まれる。
また、ビオチンとＮＨＳ－エステルとの間のスペーサーが長いものも利用可能である。スペーサーの長さは非限定的に、０～３００Å、好ましくは、１０～５０Åである。あるいは、スペーサー部分にＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を導入したもの（例えば、ＮＨＳ－ＰＥＧ４－ビオチン）も利用可能である。あるいは、ビオチンを適宜切り離すことができるタイプのものも利用可能である。スペーサーによりビオチンと標識タンパク質との間の結合を切断できる場合がある。
その他、ペンタフルオロフェニル－ビオチン、ビオチン化イソチオシアネート等もアミノ基のビオチン化に利用可能である。ペンタフルオロフェニル－ビオチン、ビオチン化イソチオシアネートは、１級アミンと２級アミンの双方に結合可能である。システイン残基のスルフヒドリル基（－ＳＨ）もビオチン化に利用可能である。特にタンパク質の活性部位にアミノ基が存在し、アミノ基を標識することによるタンパク質の失活が懸念される、などの場合には、スルフヒドリル基をビオチン化してもよい。ただし、標識反応を行う際には、スルフヒドリル基は還元状態、つまり酸化によるジスルフィド結合（Ｓ－Ｓ結合）形成を行っていないことが必要である。還元状態のスルフヒドリル基が存在しない場合は、還元剤によってジスルフィド結合を開裂させる。細胞表面タンパク質がシステイン残基を含まない場合は、リジン残基を修飾してスルフヒドリル基を生成させて利用してもよい。スルフヒドリル基反応性のビオチン標識試薬としては、例えば、マレイミド基を持つビオチン、ブロモアセトアミド基を持つビオチン等を利用しうる。
カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）はアスパラギン酸やグルタミン酸の側鎖の他、カルボキシル末端に存在する。カルボキシル基を標的とする場合、カルボジイミド基を持つクロスリンカーを介してアミノ基（－ＮＨ２）を持つビオチンやヒドラジド誘導体化ビオチンを反応させてアミド結合を形成させる。カルボジイミド基を持つクロスリンカーとして、例えば、ＥＤＣ（１－エチル－３－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド ヒドロクロライド）等が利用可能である。
糖鎖上のシアル酸のシス－ジオールは、例えば、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）を用いた穏やかな酸化開裂によりアルデヒド基（－ＣＨＯ）を生成する。アルデヒド基は、ヒドラジドと反応してヒドラゾン結合を形成しうる。糖タンパク質を穏やかに酸化してアルデヒド基を生成させることにより、ヒドラジド誘導体化ビオチンを標識することが可能である。
あるいは、紫外線（ＵＶ）光への曝露の際に非特異的に反応する、光反応性ビオチン化合物の利用により、非特異的なビオチン化を行うことも可能である。例えば、アリールアジド基を持つ光反応性のビオチン標識試薬の利用である。アリールアジド基は紫外光照射により活性化され、アリールニトレン（半減期は１０－４秒）は、近傍に存在する二重結合や水素結合の電子密度の高い領域や、アミノ基、スルフヒドリル基と非特異的に反応する。光反応性ビオチン化合物の利用は、非特異的な標識が必要な場合などに有用である。
一態様において、（ｉ）において、細胞表面タンパク質のアミノ基、スルフヒドリル基又はカルボキシル基をビオチン化する。
一態様において、細胞表面タンパク質のアミノ基をビオチン化する。一態様において、（ｉ）において、ビオチン化に用いる試薬（ビオチン標識試薬、細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化するための試薬）が、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド－ビオチン、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド－ビオチン、及びペンタフルオロフェニル－ビオチンからなる群から選択される。
ビオチンとスルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、又はペンタフルオロフェニルとの結合はスペーサーを含んでいてもよい。非限定的に、スペーサーの長さは非限定的に０～３００Å、好ましくは、１０～５０Åである。
一態様において、
（ｉ）において、ビオチン化に用いる試薬が、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド－ビオチン、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド－ビオチン、及びペンタフルオロフェニル－ビオチンからなる群から選択され、
ここにおいて、ビオチンとスルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、又はペンタフルオロフェニルとの結合はスペーサーを含んでいてもよい。
一態様において、ビオチン化に用いる試薬の濃度は、使用する細胞の種類に応じて、適宜適用可能である。実施例でのＳ－ＮＨＳ－ビオチン濃度は１０μｇ／ｍＬであったが、使用する細胞の種類に応じて、例えば、１－５０μｇ／ｍＬとすることができる。
前記方法の一態様において、（ｉ）において、ビオチン化に用いる試薬が、凍結保存されていたものであってよい。例えば、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド－ビオチンは、事前に調整し凍結保存したものを適時に利用可能である。
前記方法は、（ｉ）の工程により、細胞表面タンパク質をビオチン化したのち、（ｉｉ）各細胞群若しくは各単一細胞に、バーコード付加ビオチン結合性物質を接触させる。
「ビオチン結合性物質」は、ビオチンに結合する特性を有するものであれば特に限定されない。ビオチンを介した細胞表面タンパク質への結合により細胞の成長、生存への影響が小さい、細胞の成長、生存への影響がない物質であることが好ましい。
非限定的に、ビオチン結合性物質は、例えば、ストレプトアビジン、アビジン、抗ビオチン抗体等が含まれる。一態様において、ビオチン結合性物質は、ストレプトアビジン、アビジン及び抗ビオチン抗体等からなる群から選択される。一態様において、ビオチン結合性物質は、ストレプトアビジンである。
「バーコード」は、各細胞群若しくは各単一細胞を識別するための情報を含む物質である。バーコードは、ビオチン結合性物質に付加することができ、各細胞群若しくは各単一細胞を識別できるような情報を含む物質であれば、種類は特に限定されない。非限定的に、バーコードの例は、オリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡを含む。一態様において、バーコードは、オリゴＤＮＡである。
「バーコード付加ビオチン結合性物質」は、ビオチン結合性物質（例えば、ストレプトアビジン）にバーコード（例えば、オリゴＤＮＡ）を付加した物質である。バーコード付加ビオチン結合性物質にさらに検出用の標識を付加してもよい。例えば、バーコード付加ビオチン結合性物質に蛍光物質を付加することにより、標識した細胞をフローサイトメトリーで解析することが可能となる。あるいは、バーコード付加ビオチン結合性物質に特定タンパク質等を含むエピトープを付加し、そのエピトープに結合する抗体等を用いて蛍光等で検出することにより、免疫蛍光分析を行うことが可能になる。
各細胞群若しくは各単一細胞へのバーコード付加ビオチン結合性物質を接触させる方法は特に限定されない。例えば、バーコード付加ビオチン結合性物質を含む溶液に、ビオチンを付加した各細胞群若しくは各単一細胞を懸濁することで実施する。
前記方法の一態様において、標識される細胞は、生体外又は生体内の生細胞であってもよい。あるいは、標識される細胞は、ビオチン化の前に固定されている細胞であってもよい。前記方法の一態様において、標識される細胞は、ビオチン化の前に固定され保存されていた細胞であってもよい。細胞の固定化、保存は細胞の種類に応じた公知の方法によって行うことができる。例えば、メタノール固定したサンプルを低温で（例えば－８０℃）で保存した細胞を利用してもよい。あるいは、ビオチン化の前に凍結保存されていた細胞であってもよい。細胞の凍結保存は細胞の種類に応じた公知の方法によって行うことができる。
前記方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれであってもよい。好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの方法である。
本発明は、一態様において、細胞をバーコードで標識する方法に関する。非限定的に、前記方法は、
（ｉａ）複数の単一細胞を含む細胞群について、細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化する、
（ｉｂ）単一細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化する、又は
（ｉｃ）複数の細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化し、その後、ビオチン化細胞を、複数の単一細胞を含む細胞群又は単一細胞に分離する、
そして、
（ｉｉ）各細胞群若しくは各単一細胞に、バーコード付加ビオチン結合性物質を接触させる
ことを含む。
前記方法は、細胞表面に存在する細胞表面タンパク質をビオチン化することを含む。ビオチン化は、どんな細胞表面タンパク質にも適用可能であり、細胞の種類に依存せず、細胞の網羅的な標識が可能である。すなわち、標識は特定の細胞表面タンパク質に依存しないため、前記方法の対象となる細胞の種類は限定されない。動物細胞、植物細胞、培養細胞、あらゆる細胞が対象となる。
前記方法は、まず、細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化することを含む。
（ｉａ）複数の単一細胞を含む細胞群について、細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化する、
（ｉｂ）単一細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化する、又は
（ｉｃ）複数の細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化し、その後、ビオチン化細胞を、複数の単一細胞を含む細胞群又は単一細胞に分離する。
タンパク質のビオチン化は、複数の単一細胞を含む細胞群又は単一細胞について行ってもよく、あるいは、複数の細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化してから、その後、ビオチン化細胞を、複数の単一細胞を含む細胞群又は単一細胞に分離してもよい。（ｉｉ）バーコード付加ビオチン結合性物質を接触させる工程の前に、細胞が、複数の単一細胞を含む細胞群又は単一細胞に分離されていることが必要である。好ましくは、タンパク質のビオチン化は、複数の単一細胞を含む細胞群又は単一細胞について行う。
「複数の単一細胞を含む細胞群」とは、例えば、共通する特性を有する複数の単一細胞からなる細胞群、共通する臓器より取得された複数の単一細胞からなる細胞群、のように特性や由来が共通する単一細胞の塊を細胞群としたものである。
一態様において、前記方法は、
（ｉａ）複数の単一細胞を含む細胞群について、細胞表面タンパク質をビオチン化する、
そして、
（ｉｉ）各細胞群に、バーコード付加ビオチン結合性物質を接触させる
ことを含む。
複数種の細胞を含む細胞の塊（例えば、臓器等）から、複数の単一細胞を含む細胞群、又は単一細胞に単離する方法は公知の方法を利用することができ、特に限定されない。細胞の塊、細胞の塊に含まれる細胞の種類、取得したい（標識したい）単離したい複数の単一細胞を含む細胞群、又は単一細胞の種類に応じて、当業者は公知の方法を利用可能である。ビオチン化後に単離を行う場合も同様である。
ビオチンは、ビタミンＢ類に分類される水溶性ビタミンの一種で、ビタミンＢ７とも呼称される。ビオチン化とは、タンパク質や巨大分子類へのビオチンを結合させる処理を意味する。
ビオチン化は、ビオチン標識試薬を用いて、アミノ基、スルフヒドリル基、カルボキシル基又はアルデヒド基（糖鎖の酸化）の、タンパク質上の官能基に、化学的に結合させる方法がある。多くの種類のビオチン標識試薬が公知であり、当業者は、利用する官能基、標識試薬の親水性、標識反応後の切断の有無等から、適切なビオチン標識試薬を選択可能である。
アミノ基（主に、一級アミン：－ＮＨ２）は多くのタンパク質に含まれているリジン残基の側鎖やアミノ末端に存在する。特にリジン残基のεアミノ基は反応性が高く、また多くの場合、タンパク質三次構造の表面にリジン残基が存在することから、アミノ基はビオチン化に特に利用しやすい官能基である。アミノ基反応性のビオチン標識試薬の代表はＮ－ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ－Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、略称：ＮＨＳ）－エステルを持つビオチンである。ＮＨＳ－エステルはアミノ基と反応してアミド結合を形成する。ＮＨＳ－エステル ビオチンには、スルホン酸基を有するスルホ－ＮＨＳ－エステル ビオチンと、スルホン酸基を有しないＮＨＳ－エステル ビオチンとがある。前者には、例えば、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド－ビオチンが含まれ、後者には、例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド－ビオチンが含まれる。
また、ビオチンとＮＨＳ－エステルとの間のスペーサーが長いものも利用可能である。スペーサーの長さは非限定的に、０～３００Å、好ましくは、１０～５０Åである。あるいは、スペーサー部分にＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を導入したもの（例えば、ＮＨＳ－ＰＥＧ４－ビオチン）も利用可能である。あるいは、ビオチンを適宜切り離すことができるタイプのものも利用可能である。スペーサーによりビオチンと標識タンパク質との間の結合を切断できる場合がある。
その他、ペンタフルオロフェニル－ビオチン、ビオチン化イソチオシアネート等もアミノ基のビオチン化に利用可能である。ペンタフルオロフェニル－ビオチン、ビオチン化イソチオシアネートは、１級アミンと２級アミンの双方に結合可能である。システイン残基のスルフヒドリル基（－ＳＨ）もビオチン化に利用可能である。特にタンパク質の活性部位にアミノ基が存在し、アミノ基を標識することによるタンパク質の失活が懸念される、などの場合には、スルフヒドリル基をビオチン化してもよい。ただし、標識反応を行う際には、スルフヒドリル基は還元状態、つまり酸化によるジスルフィド結合（Ｓ－Ｓ結合）形成を行っていないことが必要である。還元状態のスルフヒドリル基が存在しない場合は、還元剤によってジスルフィド結合を開裂させる。細胞表面タンパク質がシステイン残基を含まない場合は、リジン残基を修飾してスルフヒドリル基を生成させて利用してもよい。スルフヒドリル基反応性のビオチン標識試薬としては、例えば、マレイミド基を持つビオチン、ブロモアセトアミド基を持つビオチン等を利用しうる。
カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）はアスパラギン酸やグルタミン酸の側鎖の他、カルボキシル末端に存在する。カルボキシル基を標的とする場合、カルボジイミド基を持つクロスリンカーを介してアミノ基（－ＮＨ２）を持つビオチンやヒドラジド誘導体化ビオチンを反応させてアミド結合を形成させる。カルボジイミド基を持つクロスリンカーとして、例えば、ＥＤＣ（１－エチル－３－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド ヒドロクロライド）等が利用可能である。
糖鎖上のシアル酸のシス－ジオールは、例えば、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）を用いた穏やかな酸化開裂によりアルデヒド基（－ＣＨＯ）を生成する。アルデヒド基は、ヒドラジドと反応してヒドラゾン結合を形成しうる。糖タンパク質を穏やかに酸化してアルデヒド基を生成させることにより、ヒドラジド誘導体化ビオチンを標識することが可能である。
あるいは、紫外線（ＵＶ）光への曝露の際に非特異的に反応する、光反応性ビオチン化合物の利用により、非特異的なビオチン化を行うことも可能である。例えば、アリールアジド基を持つ光反応性のビオチン標識試薬の利用である。アリールアジド基は紫外光照射により活性化され、アリールニトレン（半減期は１０－４秒）は、近傍に存在する二重結合や水素結合の電子密度の高い領域や、アミノ基、スルフヒドリル基と非特異的に反応する。光反応性ビオチン化合物の利用は、非特異的な標識が必要な場合などに有用である。
一態様において、（ｉ）において、細胞表面タンパク質のアミノ基、スルフヒドリル基又はカルボキシル基をビオチン化する。
一態様において、細胞表面タンパク質のアミノ基をビオチン化する。一態様において、（ｉ）において、ビオチン化に用いる試薬（ビオチン標識試薬、細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化するための試薬）が、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド－ビオチン、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド－ビオチン、及びペンタフルオロフェニル－ビオチンからなる群から選択される。
ビオチンとスルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、又はペンタフルオロフェニルとの結合はスペーサーを含んでいてもよい。非限定的に、スペーサーの長さは非限定的に０～３００Å、好ましくは、１０～５０Åである。
一態様において、
（ｉ）において、ビオチン化に用いる試薬が、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド－ビオチン、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド－ビオチン、及びペンタフルオロフェニル－ビオチンからなる群から選択され、
ここにおいて、ビオチンとスルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、又はペンタフルオロフェニルとの結合はスペーサーを含んでいてもよい。
一態様において、ビオチン化に用いる試薬の濃度は、使用する細胞の種類に応じて、適宜適用可能である。実施例でのＳ－ＮＨＳ－ビオチン濃度は１０μｇ／ｍＬであったが、使用する細胞の種類に応じて、例えば、１－５０μｇ／ｍＬとすることができる。
前記方法の一態様において、（ｉ）において、ビオチン化に用いる試薬が、凍結保存されていたものであってよい。例えば、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド－ビオチンは、事前に調整し凍結保存したものを適時に利用可能である。
前記方法は、（ｉ）の工程により、細胞表面タンパク質をビオチン化したのち、（ｉｉ）各細胞群若しくは各単一細胞に、バーコード付加ビオチン結合性物質を接触させる。
「ビオチン結合性物質」は、ビオチンに結合する特性を有するものであれば特に限定されない。ビオチンを介した細胞表面タンパク質への結合により細胞の成長、生存への影響が小さい、細胞の成長、生存への影響がない物質であることが好ましい。
非限定的に、ビオチン結合性物質は、例えば、ストレプトアビジン、アビジン、抗ビオチン抗体等が含まれる。一態様において、ビオチン結合性物質は、ストレプトアビジン、アビジン及び抗ビオチン抗体等からなる群から選択される。一態様において、ビオチン結合性物質は、ストレプトアビジンである。
「バーコード」は、各細胞群若しくは各単一細胞を識別するための情報を含む物質である。バーコードは、ビオチン結合性物質に付加することができ、各細胞群若しくは各単一細胞を識別できるような情報を含む物質であれば、種類は特に限定されない。非限定的に、バーコードの例は、オリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡを含む。一態様において、バーコードは、オリゴＤＮＡである。
「バーコード付加ビオチン結合性物質」は、ビオチン結合性物質（例えば、ストレプトアビジン）にバーコード（例えば、オリゴＤＮＡ）を付加した物質である。バーコード付加ビオチン結合性物質にさらに検出用の標識を付加してもよい。例えば、バーコード付加ビオチン結合性物質に蛍光物質を付加することにより、標識した細胞をフローサイトメトリーで解析することが可能となる。あるいは、バーコード付加ビオチン結合性物質に特定タンパク質等を含むエピトープを付加し、そのエピトープに結合する抗体等を用いて蛍光等で検出することにより、免疫蛍光分析を行うことが可能になる。
各細胞群若しくは各単一細胞へのバーコード付加ビオチン結合性物質を接触させる方法は特に限定されない。例えば、バーコード付加ビオチン結合性物質を含む溶液に、ビオチンを付加した各細胞群若しくは各単一細胞を懸濁することで実施する。
前記方法の一態様において、標識される細胞は、生体外又は生体内の生細胞であってもよい。あるいは、標識される細胞は、ビオチン化の前に固定されている細胞であってもよい。前記方法の一態様において、標識される細胞は、ビオチン化の前に固定され保存されていた細胞であってもよい。細胞の固定化、保存は細胞の種類に応じた公知の方法によって行うことができる。例えば、メタノール固定したサンプルを低温で（例えば－８０℃）で保存した細胞を利用してもよい。あるいは、ビオチン化の前に凍結保存されていた細胞であってもよい。細胞の凍結保存は細胞の種類に応じた公知の方法によって行うことができる。
前記方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれであってもよい。好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの方法である。
【0023】
２．キット（１）
本発明はまた、一態様において、細胞をバーコードで標識する方法に使用するためのキットに関する。非限定的に、前記キットは、
細胞の表面タンパク質をビオチン化するための試薬、及び
バーコード付加ビオチン結合性物質
を含む。
一態様において、前記キットは、「１．細胞をバーコードで標識する方法（１）」又は「３．細胞試料の多重化分析方法（１）」に用いることができる。
「細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化するための試薬」（ビオチン化に用いる試薬、ビオチン標識試薬）、「バーコード」、「ビオチン結合性物質」、「バーコード付加ビオチン結合性物質」については、「１．細胞をバーコードで標識する方法（１）」で説明した通りである。
一態様において、細胞の表面タンパク質をビオチン化するための試薬は、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド－ビオチンである。
一態様において、「バーコード」はオリゴＤＮＡである。一態様において、「ビオチン結合性物質」はストレプトアビジンである。
本発明はまた、一態様において、細胞をバーコードで標識する方法に使用するためのキットに関する。非限定的に、前記キットは、
細胞の表面タンパク質をビオチン化するための試薬、及び
バーコード付加ビオチン結合性物質
を含む。
一態様において、前記キットは、「１．細胞をバーコードで標識する方法（１）」又は「３．細胞試料の多重化分析方法（１）」に用いることができる。
「細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化するための試薬」（ビオチン化に用いる試薬、ビオチン標識試薬）、「バーコード」、「ビオチン結合性物質」、「バーコード付加ビオチン結合性物質」については、「１．細胞をバーコードで標識する方法（１）」で説明した通りである。
一態様において、細胞の表面タンパク質をビオチン化するための試薬は、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド－ビオチンである。
一態様において、「バーコード」はオリゴＤＮＡである。一態様において、「ビオチン結合性物質」はストレプトアビジンである。
【0024】
３．細胞試料の多重化分析方法（１）
本発明はさらに、細胞試料の多重化分析方法に関する。非限定的に、前記方法は、
（ｉａ）複数の単一細胞を含む細胞群について、細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化する、
（ｉｂ）単一細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化する、又は
（ｉｃ）複数の細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化し、その後、ビオチン化細胞を、複数の単一細胞を含む細胞群又は単一細胞に分離する、
（ｉｉ）各細胞群若しくは各単一細胞に、バーコード付加ビオチン結合性物質を接触させる、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）のバーコード標識した細胞群又は単一細胞の全部又は一部を混合する、
そして、
（ｉｖ）（ｉｉｉ）の細胞の混合物について解析する
ことを含む。
（ｉａ）、（ｉｂ）、（ｉｃ）、（ｉｉ）については、「１．細胞をバーコードで標識する方法（１）」で説明した通りである。
前記細胞試料の多重化分析方法は、工程（ｉｉ）の後、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）のバーコード標識した細胞群又は単一細胞の全部又は一部を混合する、
そして、
（ｉｖ）（ｉｉｉ）の細胞の混合物について解析する
ことを含む。
前記方法では、各細胞群若しくは各単一細胞を識別できるバーコードで標識するため、標識後に、バーコード標識した細胞群又は単一細胞の全部又は一部を混合したものを、まとめて解析することができる。即ち、まとめて解析しても、各細胞群若しくは各単一細胞を識別できるバーコードにより、どの細胞群若しくは各単一細胞についての結果であるかを識別することが可能である。
解析は、細胞を解析するための手段であれば、限定されない。解析対象には、細胞の内容物（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸）を含む。一態様において、解析は、細胞のＲＮＡ解析である。
バーコード付加ビオチン結合性物質に、直接的あるいは間接的（２次的に）蛍光等で標識することにより、フローサイトメトリー、免疫蛍光分析等を行うことができる。
あるいは、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析により得られたデータを元にＵＭＡＰ（ｕｎｉｆｏｒｍ ｍａｎｉｆｏｌｄ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）法等を用いることで、性質の近い細胞同士を複数のクラスターに分類することもできる。ＵＭＡＰは与えられた点列について次元削減（次元圧縮）を行い、高次元で「近い」点同士を、低次元上でも「近く」に配置することで可視化する解析ツールである。サンプルごとに異なるバーコードを指標にして由来となるサンプルを特定することにより、分類された各クラスターに含まれる細胞数のサンプル間の差を比較する等により、各サンプルの特性の差異を解明することも可能となる。
また、バーコード標識した細胞群又は単一細胞の全部又は一部を混合したものについて、まとめて配列決定を行い、バーコードによる識別により、どの細胞群若しくは各単一細胞についての配列であるかを区別して個別に解析することも可能である。
その他、ＲＮＡ解析以外にも、ゲノムＤＮＡ解析への適用も想定される。例えば、単一細胞でのゲノムＤＮＡ配列決定を行って単一細胞ごとのＤＮＡ塩基配列変異を検出することにより各細胞の細胞分裂系譜を作成することが可能となる。単一細胞でのゲノムＤＮＡ配列決定に際して、バーコード付加によるサンプル多重化を行うことで、複数組織由来の単一細胞群での細胞分裂系譜作成に際する解析経費を大幅に削減することが可能となる。また、例えば単一細胞においてＤＮＡ配列決定によるミトコンドリアＤＮＡの定量的検出を行うことにより、細胞群内におけるミトコンドリア数の変動を追跡することが可能となる。その際に、バーコード付加によるサンプル多重化を行うことで解析経費を削減することができる。
一態様において、前記細胞試料の多重化分析方法は、
（ｉａ）複数の単一細胞を含む細胞群について、細胞表面タンパク質をビオチン化する、
そして、
（ｉｉ）各細胞群に、バーコード付加ビオチン結合性物質を接触させる
ことを含む。
本発明者らは、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析における多重化のための、簡便かつ信頼性のある細胞標識法を新たに開発した。従来の細胞ハッシュ法は、試験される細胞の表面上で広く発現される特定のタンパク質を標的とし、従って、そのようなタンパク質がサンプル中で広く発現されない場合に使用することは困難である。しかし、ＵＳＢ法はそのような特定のタンパク質を必要とせず、どんなタンパク質も標的とすることのできる普遍的な標識を用いることで、既存の技術の欠点を克服している。
現在利用可能なマルチプレックス試薬は、ＣＤ２９８及び／又はＭＨＣクラスＩ抗原又はＣＤ４５などの細胞表面タンパク質に対する抗体を使用する。これらの抗原は、成体組織又は免疫系において普遍的に発現されると考えられているからである。しかし、胚細胞はこれらのタンパク質を発現しないので、現在の細胞ハッシュ法は適用できない。これに対し、ＵＳＢ法はすべての細胞表面タンパク質と適合性があり、細胞の種類に関係なく（細胞の表面タンパク質がある限り）多重化に用いることができる。実際、マウス、サル、ヒトのｉＰＳ細胞由来の軟骨細胞、及びＣＤ４５又はＭＨＣ抗体を用いたＡｂ法では研究できなかったラット肺細胞の多重化にＵＳＢ法を適用することに成功した（図１１、図１２）。
従来技術の、バーコードＤＮＡを細胞内に導入する一過性バーコード法、レンチウイルスをバーコードＤＮＡ導入に用いるセルタグインデックス法などの多重化のための標識技術は、培養細胞以外の細胞に適用することは困難であり、そのため、その汎用性は限られている。対照的に、ＵＳＢ方式は非常に汎用性が高く、どのタイプの細胞にも適用できる。
ＵＳＢ法は、マウスやヒト以外の動物にも適用可能である。他の種では、細胞表面タンパク質又はそれらに対する抗体に関する情報が容易に入手できない可能性があり、従って、従来のＡｂ法を適用することは困難である。しかし，ＵＳＢ法はサルとラットに適用できることが証明されており，理論的にはどのような種の細胞にも適用できる。
また、クリックケミストリーとＮＨＳ－エステルを組み合わせたＣｌｉｃｋＴａｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ（非特許文献１３）は、ＵＳＢ法と同様に、細胞タンパク質にバーコードＤＮＡタグを付着させる技術である。しかし、生細胞の標識効率は低く、この方法はメタノール固定細胞にのみ適用できる。ＣｅｌｌＰｌｅｘ法（３’ＣｅｌｌＰｌｅｘ Ｋｉｔ， １０ｘＧｅｎｏｍｉｃｓ）は、普遍的な細胞標識のために細胞膜の脂質にＤＮＡタグを導入する試薬を用いているが（非特許文献１４）、メタノール固定細胞に適用することは困難である。これに対し、ＵＳＢ法は、固定細胞にも適用可能であり、より柔軟なサンプル多重化が可能である。
実施例の「材料及び方法」の項目に記載されているように、ＵＳＢ法で使用される全てのコンポーネントは市販されており、比較的安価である。Ｓ－ＮＨＳ－ビオチンの原液は－８０℃で１年以上安定であり、５０ｍｇのＳ－ＮＨＳ－ビオチンを含むバイアルは１０，０００までのサンプルの標識に十分である。１０マイクログラムのＤＮＡバーコード化ストレプトアビジンは、１５０以上の多重化実験に用いることができる。１０種類のＤＮＡバーコード化ストレプトアビジンが市販されているので、一度に１０－ｐｌｅｘ解析を行うことができる。任意のバーコードオリゴＤＮＡを付加させたストレプトアビジンをカスタムメイドで作製することができるので、１０－ｐｌｅｘ以上の多重化実験を行うことも可能である。要約すると、ＵＳＢ法は、シングルセル多重化解析をより手頃な価格にする費用対効果の高い方法であり、ＵＳＢ法は、生細胞又は固定細胞のいずれにも適用可能であり、あらゆる種類の多重化ｓｃＲＮＡ－Ｓｅｑ解析を大幅に容易にする普遍的な標識法である。
ＵＳＢ法は、シングル工程法と比べると、既存の試薬を使えるので新規に導入しやすい、１サンプル当りのコストがシングル工程法よりも低い、等の特徴がある。
前記方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれであってもよい。好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの方法である。
本発明はさらに、細胞試料の多重化分析方法に関する。非限定的に、前記方法は、
（ｉａ）複数の単一細胞を含む細胞群について、細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化する、
（ｉｂ）単一細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化する、又は
（ｉｃ）複数の細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化し、その後、ビオチン化細胞を、複数の単一細胞を含む細胞群又は単一細胞に分離する、
（ｉｉ）各細胞群若しくは各単一細胞に、バーコード付加ビオチン結合性物質を接触させる、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）のバーコード標識した細胞群又は単一細胞の全部又は一部を混合する、
そして、
（ｉｖ）（ｉｉｉ）の細胞の混合物について解析する
ことを含む。
（ｉａ）、（ｉｂ）、（ｉｃ）、（ｉｉ）については、「１．細胞をバーコードで標識する方法（１）」で説明した通りである。
前記細胞試料の多重化分析方法は、工程（ｉｉ）の後、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）のバーコード標識した細胞群又は単一細胞の全部又は一部を混合する、
そして、
（ｉｖ）（ｉｉｉ）の細胞の混合物について解析する
ことを含む。
前記方法では、各細胞群若しくは各単一細胞を識別できるバーコードで標識するため、標識後に、バーコード標識した細胞群又は単一細胞の全部又は一部を混合したものを、まとめて解析することができる。即ち、まとめて解析しても、各細胞群若しくは各単一細胞を識別できるバーコードにより、どの細胞群若しくは各単一細胞についての結果であるかを識別することが可能である。
解析は、細胞を解析するための手段であれば、限定されない。解析対象には、細胞の内容物（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸）を含む。一態様において、解析は、細胞のＲＮＡ解析である。
バーコード付加ビオチン結合性物質に、直接的あるいは間接的（２次的に）蛍光等で標識することにより、フローサイトメトリー、免疫蛍光分析等を行うことができる。
あるいは、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析により得られたデータを元にＵＭＡＰ（ｕｎｉｆｏｒｍ ｍａｎｉｆｏｌｄ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）法等を用いることで、性質の近い細胞同士を複数のクラスターに分類することもできる。ＵＭＡＰは与えられた点列について次元削減（次元圧縮）を行い、高次元で「近い」点同士を、低次元上でも「近く」に配置することで可視化する解析ツールである。サンプルごとに異なるバーコードを指標にして由来となるサンプルを特定することにより、分類された各クラスターに含まれる細胞数のサンプル間の差を比較する等により、各サンプルの特性の差異を解明することも可能となる。
また、バーコード標識した細胞群又は単一細胞の全部又は一部を混合したものについて、まとめて配列決定を行い、バーコードによる識別により、どの細胞群若しくは各単一細胞についての配列であるかを区別して個別に解析することも可能である。
その他、ＲＮＡ解析以外にも、ゲノムＤＮＡ解析への適用も想定される。例えば、単一細胞でのゲノムＤＮＡ配列決定を行って単一細胞ごとのＤＮＡ塩基配列変異を検出することにより各細胞の細胞分裂系譜を作成することが可能となる。単一細胞でのゲノムＤＮＡ配列決定に際して、バーコード付加によるサンプル多重化を行うことで、複数組織由来の単一細胞群での細胞分裂系譜作成に際する解析経費を大幅に削減することが可能となる。また、例えば単一細胞においてＤＮＡ配列決定によるミトコンドリアＤＮＡの定量的検出を行うことにより、細胞群内におけるミトコンドリア数の変動を追跡することが可能となる。その際に、バーコード付加によるサンプル多重化を行うことで解析経費を削減することができる。
一態様において、前記細胞試料の多重化分析方法は、
（ｉａ）複数の単一細胞を含む細胞群について、細胞表面タンパク質をビオチン化する、
そして、
（ｉｉ）各細胞群に、バーコード付加ビオチン結合性物質を接触させる
ことを含む。
本発明者らは、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析における多重化のための、簡便かつ信頼性のある細胞標識法を新たに開発した。従来の細胞ハッシュ法は、試験される細胞の表面上で広く発現される特定のタンパク質を標的とし、従って、そのようなタンパク質がサンプル中で広く発現されない場合に使用することは困難である。しかし、ＵＳＢ法はそのような特定のタンパク質を必要とせず、どんなタンパク質も標的とすることのできる普遍的な標識を用いることで、既存の技術の欠点を克服している。
現在利用可能なマルチプレックス試薬は、ＣＤ２９８及び／又はＭＨＣクラスＩ抗原又はＣＤ４５などの細胞表面タンパク質に対する抗体を使用する。これらの抗原は、成体組織又は免疫系において普遍的に発現されると考えられているからである。しかし、胚細胞はこれらのタンパク質を発現しないので、現在の細胞ハッシュ法は適用できない。これに対し、ＵＳＢ法はすべての細胞表面タンパク質と適合性があり、細胞の種類に関係なく（細胞の表面タンパク質がある限り）多重化に用いることができる。実際、マウス、サル、ヒトのｉＰＳ細胞由来の軟骨細胞、及びＣＤ４５又はＭＨＣ抗体を用いたＡｂ法では研究できなかったラット肺細胞の多重化にＵＳＢ法を適用することに成功した（図１１、図１２）。
従来技術の、バーコードＤＮＡを細胞内に導入する一過性バーコード法、レンチウイルスをバーコードＤＮＡ導入に用いるセルタグインデックス法などの多重化のための標識技術は、培養細胞以外の細胞に適用することは困難であり、そのため、その汎用性は限られている。対照的に、ＵＳＢ方式は非常に汎用性が高く、どのタイプの細胞にも適用できる。
ＵＳＢ法は、マウスやヒト以外の動物にも適用可能である。他の種では、細胞表面タンパク質又はそれらに対する抗体に関する情報が容易に入手できない可能性があり、従って、従来のＡｂ法を適用することは困難である。しかし，ＵＳＢ法はサルとラットに適用できることが証明されており，理論的にはどのような種の細胞にも適用できる。
また、クリックケミストリーとＮＨＳ－エステルを組み合わせたＣｌｉｃｋＴａｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ（非特許文献１３）は、ＵＳＢ法と同様に、細胞タンパク質にバーコードＤＮＡタグを付着させる技術である。しかし、生細胞の標識効率は低く、この方法はメタノール固定細胞にのみ適用できる。ＣｅｌｌＰｌｅｘ法（３’ＣｅｌｌＰｌｅｘ Ｋｉｔ， １０ｘＧｅｎｏｍｉｃｓ）は、普遍的な細胞標識のために細胞膜の脂質にＤＮＡタグを導入する試薬を用いているが（非特許文献１４）、メタノール固定細胞に適用することは困難である。これに対し、ＵＳＢ法は、固定細胞にも適用可能であり、より柔軟なサンプル多重化が可能である。
実施例の「材料及び方法」の項目に記載されているように、ＵＳＢ法で使用される全てのコンポーネントは市販されており、比較的安価である。Ｓ－ＮＨＳ－ビオチンの原液は－８０℃で１年以上安定であり、５０ｍｇのＳ－ＮＨＳ－ビオチンを含むバイアルは１０，０００までのサンプルの標識に十分である。１０マイクログラムのＤＮＡバーコード化ストレプトアビジンは、１５０以上の多重化実験に用いることができる。１０種類のＤＮＡバーコード化ストレプトアビジンが市販されているので、一度に１０－ｐｌｅｘ解析を行うことができる。任意のバーコードオリゴＤＮＡを付加させたストレプトアビジンをカスタムメイドで作製することができるので、１０－ｐｌｅｘ以上の多重化実験を行うことも可能である。要約すると、ＵＳＢ法は、シングルセル多重化解析をより手頃な価格にする費用対効果の高い方法であり、ＵＳＢ法は、生細胞又は固定細胞のいずれにも適用可能であり、あらゆる種類の多重化ｓｃＲＮＡ－Ｓｅｑ解析を大幅に容易にする普遍的な標識法である。
ＵＳＢ法は、シングル工程法と比べると、既存の試薬を使えるので新規に導入しやすい、１サンプル当りのコストがシングル工程法よりも低い、等の特徴がある。
前記方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれであってもよい。好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの方法である。
【0025】
４．細胞をバーコードで直接標識する方法（２）（シングル工程法）
本発明は、一態様において、細胞をバーコードで標識する方法に関する。非限定的に、前記方法は、
（１Ａ）複数の単一細胞を含む細胞群を、細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物で修飾されたバーコードと接触させる、又は
（１Ｂ）単一細胞を、細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物で修飾されたバーコードと接触させる、
ことを含む。
「複数の単一細胞を含む細胞群」、「細胞」、「バーコード」、「細胞表面タンパク質」等については、「１．細胞をバーコードで標識する方法（１）」で説明した通りである。細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物で修飾されたバーコードを、細胞と接触させることにより、当該修飾バーコード中の、表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物が、細胞表面タンパク質のアミノ基に結合し、細胞がバーコードで標識される。
一態様において、細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物は、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、及びペンタフルオロフェニルンからなる群から選択される。
アミノ基（主に、一級アミン：－ＮＨ２）は多くのタンパク質に含まれているリジン残基の側鎖やアミノ末端に存在する。特にリジン残基のεアミノ基は反応性が高く、また多くの場合、タンパク質三次構造の表面にリジン残基が存在することから、アミノ基はタンパク質の修飾に特に利用しやすい官能基である。細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物の代表はＮ－ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ－Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、略称：ＮＨＳ）－エステルである。ＮＨＳ－エステル バーコードは、細胞表面タンパク質のアミノ基と反応してアミド結合を形成する。ＮＨＳ－エステルには、スルホン酸基を有するスルホ－ＮＨＳ－エステルと、スルホン酸基を有しないＮＨＳ－エステルがある。前者には、例えば、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（スルホ－ＮＨＳ）が含まれ、後者には、例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）が含まれる。
また、バーコードとＮＨＳ－エステルとの間にスペーサーを設けることも可能である。スペーサーの長さは非限定的に、０～３００Å、好ましくは、１０～５０Åである。あるいは、スペーサー部分にＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を導入したもの（例えば、ＮＨＳ－ＰＥＧ４）も利用可能である。
バーコードとＮＨＳ－エステルとの結合する方法は特に限定されず、任意の方法を用いて行うことができる。
一態様において、１－エチル－３－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド ヒドロクロライド（ＥＤＣ）、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド等のカルボジイミド化合物を利用する。スルホ－ＮＨＳ又はＮＨＳをＥＤＣ結合プロトコルへ組み込むことにより、反応効率が上昇し、乾燥安定性（アミン反応性）の中間体を生成する。具体的には、まず、例えば、５’末端をカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）で修飾されたオリゴＤＮＡ（バーコード）を準備する。オリゴＤＮＡへ のカルボキシル基付加は、公知の方法によって行うことができる。例えば、非限定的に、１０－カルボキシ－デシル－（２－シアノエチル）（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）－ホスホロアミダイト、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド エステル（例えば、試薬５’－Ｃａｒｂｏｘｙ－Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ１０（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて行ってもよい。次いで、ＥＤＣにより５’－ＣＯＯＨ－ＤＮＡの－ＣＯＯＨへＮＨＳを結合させると、Ｏ－アシルイソ尿素中間体より極めて安定性の高いＮＨＳ－エステルが形成される。「（スルホ－）ＮＨＳ－エステル化」されたＤＮＡ（活性化された状態）は、細胞表面タンパク質中のアミノ基と安定した結合を形成する。これにより、（スルホ－）ＮＨＳ－エステル化されたＤＮＡ（修飾されたバーコード）により、細胞が標識される。
あるいは、「（スルホ－）ＮＨＳ－エステル化」されたＤＮＡは、以下の方法によって、作製してもよい。
例えば、－ＮＨ２修飾したオリゴＤＮＡに対し、スベリン酸ジサクシンイミジル（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｓｕｂｅｒａｔｅ：ＤＳＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、２１６５５等）又はスベリン酸ビス（スフホサクシンイミジル）（ｂｉｓ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ） ｓｕｂｅｒａｔｅ：ＢＳ３）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、２１５８０等）を反応させることにより、「（スルホ－）ＮＨＳ－エステル化」ＤＮＡを誘導する。具体的には、まず、例えば、５’末端をアミノ基（－ＮＨ２）で修飾されたオリゴＤＮＡ（バーコード）を準備する。ＤＮＡへの－ＮＨ２付加は、公知の方法によって行うことができる。例えば、非限定的に、６－（４－モノメトキシトリチルアミノ）ヘキシル－（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）－ホスホロアミダイト（例えば、試薬５’－Ａｍｉｎｏ－Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ））を用いて行ってもよい。次いで、５’末端に－ＮＨ２を付加したＤＮＡにＤＳＳ又はＢＳ３を反応させる。ＤＳＳは２つのＮＨＳ－エステルを持つ試薬で、ＤＮＡと反応させることで一方のＮＨＳ－エステルが－ＮＨ２と結合し、もう一方が露出している状態を作り出し、ＤＮＡ末端に活性化したＮＨＳ－エステルが付加される。ＢＳ３はＤＳＳにスルホ基が付加されたものであり、ＤＳＳと同様にＤＮＡと反応させることで一方のＮＨＳ－エステルが－ＮＨ２と結合し、もう一方が露出している状態を作り出し、ＤＮＡ末端に活性化したＮＨＳ－エステルが付加される。この手法の場合、２つのＤＮＡと１つのＤＳＳ又はＢＳ３が結合すると、その後細胞に結合できなくなる。よって、１つのＤＮＡのみがＤＳＳ又はＢＳ３に結合すように、反応条件（反応時間等）の調整が必要となる。
その他、ペンタフルオロフェニル、イソチオシアネート等もバーコードを修飾し、細胞表面タンパク質のアミノ基への結合に利用可能である。ペンタフルオロフェニル、イソチオシアネートは、１級アミンと２級アミンの双方に結合可能である。
なお、バーコードのＮＨＳ－エステル修飾していない箇所に、６－ＦＡＭ（６－カルボキシフルオレセイン）、ビオチン等を結合させて、多重化分析等とは別の検出等に使用してもよい。例えば、オリゴＤＮＡの５‘末端をＮＨＳ－エステル修飾する場合、ＤＮＡの３’末端に６－ＦＡＭ又はビオチンを付加してもよい。
一態様において、細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物は、凍結保存されていたものである。
一態様において、バーコードは、オリゴＤＮＡである。
一態様において、前記方法は、生細胞を標識する。一態様において、前記方法は、固定した細胞を標識する。「生細胞」、「固定した細胞」等については、「１．細胞をバーコードで標識する方法（１）」で説明した通りである。
前記方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれであってもよい。好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの方法である。
前記方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれであってもよい。好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの方法である。
その他、特に技術的に問題がない限り、「１．細胞をバーコードで標識する方法（１）（ＵＳＢ法）」において説明した内容は、本項目の「４．細胞をバーコードで直接標識する方法（２）（シングル工程法）」にも適用される。
シングル工程法は、細胞の細胞表面タンパク質を直接に、修飾されたバーコードと接触させるため、作業工程が簡略化でき、一般にＵＳＢ法よりも作業時間が短い（２時間の処理）。作業時間が短くなることにより細胞への影響を低減できる。遠心操作の回数が減るので、作業による細胞のロスを減らすことができる。
本発明は、一態様において、細胞をバーコードで標識する方法に関する。非限定的に、前記方法は、
（１Ａ）複数の単一細胞を含む細胞群を、細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物で修飾されたバーコードと接触させる、又は
（１Ｂ）単一細胞を、細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物で修飾されたバーコードと接触させる、
ことを含む。
「複数の単一細胞を含む細胞群」、「細胞」、「バーコード」、「細胞表面タンパク質」等については、「１．細胞をバーコードで標識する方法（１）」で説明した通りである。細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物で修飾されたバーコードを、細胞と接触させることにより、当該修飾バーコード中の、表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物が、細胞表面タンパク質のアミノ基に結合し、細胞がバーコードで標識される。
一態様において、細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物は、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、及びペンタフルオロフェニルンからなる群から選択される。
アミノ基（主に、一級アミン：－ＮＨ２）は多くのタンパク質に含まれているリジン残基の側鎖やアミノ末端に存在する。特にリジン残基のεアミノ基は反応性が高く、また多くの場合、タンパク質三次構造の表面にリジン残基が存在することから、アミノ基はタンパク質の修飾に特に利用しやすい官能基である。細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物の代表はＮ－ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ－Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、略称：ＮＨＳ）－エステルである。ＮＨＳ－エステル バーコードは、細胞表面タンパク質のアミノ基と反応してアミド結合を形成する。ＮＨＳ－エステルには、スルホン酸基を有するスルホ－ＮＨＳ－エステルと、スルホン酸基を有しないＮＨＳ－エステルがある。前者には、例えば、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（スルホ－ＮＨＳ）が含まれ、後者には、例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）が含まれる。
また、バーコードとＮＨＳ－エステルとの間にスペーサーを設けることも可能である。スペーサーの長さは非限定的に、０～３００Å、好ましくは、１０～５０Åである。あるいは、スペーサー部分にＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を導入したもの（例えば、ＮＨＳ－ＰＥＧ４）も利用可能である。
バーコードとＮＨＳ－エステルとの結合する方法は特に限定されず、任意の方法を用いて行うことができる。
一態様において、１－エチル－３－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド ヒドロクロライド（ＥＤＣ）、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド等のカルボジイミド化合物を利用する。スルホ－ＮＨＳ又はＮＨＳをＥＤＣ結合プロトコルへ組み込むことにより、反応効率が上昇し、乾燥安定性（アミン反応性）の中間体を生成する。具体的には、まず、例えば、５’末端をカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）で修飾されたオリゴＤＮＡ（バーコード）を準備する。オリゴＤＮＡへ のカルボキシル基付加は、公知の方法によって行うことができる。例えば、非限定的に、１０－カルボキシ－デシル－（２－シアノエチル）（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）－ホスホロアミダイト、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド エステル（例えば、試薬５’－Ｃａｒｂｏｘｙ－Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ１０（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて行ってもよい。次いで、ＥＤＣにより５’－ＣＯＯＨ－ＤＮＡの－ＣＯＯＨへＮＨＳを結合させると、Ｏ－アシルイソ尿素中間体より極めて安定性の高いＮＨＳ－エステルが形成される。「（スルホ－）ＮＨＳ－エステル化」されたＤＮＡ（活性化された状態）は、細胞表面タンパク質中のアミノ基と安定した結合を形成する。これにより、（スルホ－）ＮＨＳ－エステル化されたＤＮＡ（修飾されたバーコード）により、細胞が標識される。
あるいは、「（スルホ－）ＮＨＳ－エステル化」されたＤＮＡは、以下の方法によって、作製してもよい。
例えば、－ＮＨ２修飾したオリゴＤＮＡに対し、スベリン酸ジサクシンイミジル（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｓｕｂｅｒａｔｅ：ＤＳＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、２１６５５等）又はスベリン酸ビス（スフホサクシンイミジル）（ｂｉｓ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ） ｓｕｂｅｒａｔｅ：ＢＳ３）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、２１５８０等）を反応させることにより、「（スルホ－）ＮＨＳ－エステル化」ＤＮＡを誘導する。具体的には、まず、例えば、５’末端をアミノ基（－ＮＨ２）で修飾されたオリゴＤＮＡ（バーコード）を準備する。ＤＮＡへの－ＮＨ２付加は、公知の方法によって行うことができる。例えば、非限定的に、６－（４－モノメトキシトリチルアミノ）ヘキシル－（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）－ホスホロアミダイト（例えば、試薬５’－Ａｍｉｎｏ－Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ））を用いて行ってもよい。次いで、５’末端に－ＮＨ２を付加したＤＮＡにＤＳＳ又はＢＳ３を反応させる。ＤＳＳは２つのＮＨＳ－エステルを持つ試薬で、ＤＮＡと反応させることで一方のＮＨＳ－エステルが－ＮＨ２と結合し、もう一方が露出している状態を作り出し、ＤＮＡ末端に活性化したＮＨＳ－エステルが付加される。ＢＳ３はＤＳＳにスルホ基が付加されたものであり、ＤＳＳと同様にＤＮＡと反応させることで一方のＮＨＳ－エステルが－ＮＨ２と結合し、もう一方が露出している状態を作り出し、ＤＮＡ末端に活性化したＮＨＳ－エステルが付加される。この手法の場合、２つのＤＮＡと１つのＤＳＳ又はＢＳ３が結合すると、その後細胞に結合できなくなる。よって、１つのＤＮＡのみがＤＳＳ又はＢＳ３に結合すように、反応条件（反応時間等）の調整が必要となる。
その他、ペンタフルオロフェニル、イソチオシアネート等もバーコードを修飾し、細胞表面タンパク質のアミノ基への結合に利用可能である。ペンタフルオロフェニル、イソチオシアネートは、１級アミンと２級アミンの双方に結合可能である。
なお、バーコードのＮＨＳ－エステル修飾していない箇所に、６－ＦＡＭ（６－カルボキシフルオレセイン）、ビオチン等を結合させて、多重化分析等とは別の検出等に使用してもよい。例えば、オリゴＤＮＡの５‘末端をＮＨＳ－エステル修飾する場合、ＤＮＡの３’末端に６－ＦＡＭ又はビオチンを付加してもよい。
一態様において、細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物は、凍結保存されていたものである。
一態様において、バーコードは、オリゴＤＮＡである。
一態様において、前記方法は、生細胞を標識する。一態様において、前記方法は、固定した細胞を標識する。「生細胞」、「固定した細胞」等については、「１．細胞をバーコードで標識する方法（１）」で説明した通りである。
前記方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれであってもよい。好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの方法である。
前記方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれであってもよい。好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの方法である。
その他、特に技術的に問題がない限り、「１．細胞をバーコードで標識する方法（１）（ＵＳＢ法）」において説明した内容は、本項目の「４．細胞をバーコードで直接標識する方法（２）（シングル工程法）」にも適用される。
シングル工程法は、細胞の細胞表面タンパク質を直接に、修飾されたバーコードと接触させるため、作業工程が簡略化でき、一般にＵＳＢ法よりも作業時間が短い（２時間の処理）。作業時間が短くなることにより細胞への影響を低減できる。遠心操作の回数が減るので、作業による細胞のロスを減らすことができる。
【0026】
５．キット（２）
本発明はまた、一態様において、細胞をバーコードで標識する方法に使用するためのキットに関する。非限定的に、前記キットは、細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物で修飾されたバーコード、を含む。
一態様において、前記キットは、「４．細胞をバーコードで直接標識する方法（２）」又は「６．細胞試料の多重化分析方法（２）に用いることができる。
「細胞をバーコードで標識する方法」、「細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物で修飾されたバーコード」等は、「４．細胞をバーコードで直接標識する方法（２）」で説明した通りである。
一態様において、細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物が、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドである。
その他、特に技術的に問題がない限り、「２．キット（１）」において説明した内容は、本項目のキット（２）にも適用される。
本発明はまた、一態様において、細胞をバーコードで標識する方法に使用するためのキットに関する。非限定的に、前記キットは、細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物で修飾されたバーコード、を含む。
一態様において、前記キットは、「４．細胞をバーコードで直接標識する方法（２）」又は「６．細胞試料の多重化分析方法（２）に用いることができる。
「細胞をバーコードで標識する方法」、「細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物で修飾されたバーコード」等は、「４．細胞をバーコードで直接標識する方法（２）」で説明した通りである。
一態様において、細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物が、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドである。
その他、特に技術的に問題がない限り、「２．キット（１）」において説明した内容は、本項目のキット（２）にも適用される。
【0027】
６．細胞試料の多重化分析方法（２）
本発明はさらに、細胞試料の多重化分析方法に関する。非限定的に、前記方法は、
（１Ａ）複数の単一細胞を含む細胞群を、細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物で修飾されたバーコードと接触させる、又は
（１Ｂ）単一細胞を、細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物で修飾されたバーコードと接触させる、
（２）（１）のバーコード標識した細胞群又は単一細胞の全部又は一部を混合する、
そして、
（３）（２）の細胞の混合物について解析する
ことを含む、方法。
（１Ａ）、（１Ｂ）は、「４．細胞をバーコードで直接標識する方法（２）」で説明した通りである。
（２）、（３）は、「３．細胞試料の多重化分析方法（１）」に記載した通りである。
一態様において、解析は、細胞のＲＮＡ解析である。
前記方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれであってもよい。好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの方法である。
その他、特に技術的に問題がない限り、「３．細胞試料の多重化分析方法（１）」において説明した内容は、本項目の細胞試料の多重化分析方法（２）にも適用される。
本発明はさらに、細胞試料の多重化分析方法に関する。非限定的に、前記方法は、
（１Ａ）複数の単一細胞を含む細胞群を、細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物で修飾されたバーコードと接触させる、又は
（１Ｂ）単一細胞を、細胞の細胞表面タンパク質のアミノ基に結合する化合物で修飾されたバーコードと接触させる、
（２）（１）のバーコード標識した細胞群又は単一細胞の全部又は一部を混合する、
そして、
（３）（２）の細胞の混合物について解析する
ことを含む、方法。
（１Ａ）、（１Ｂ）は、「４．細胞をバーコードで直接標識する方法（２）」で説明した通りである。
（２）、（３）は、「３．細胞試料の多重化分析方法（１）」に記載した通りである。
一態様において、解析は、細胞のＲＮＡ解析である。
前記方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれであってもよい。好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの方法である。
その他、特に技術的に問題がない限り、「３．細胞試料の多重化分析方法（１）」において説明した内容は、本項目の細胞試料の多重化分析方法（２）にも適用される。
【実施例】
【0028】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【0029】
材料及び方法
特に明記しない限り、実施例では以下の材料及び方法を使用した。
特に明記しない限り、実施例では以下の材料及び方法を使用した。
【0030】
１．細胞培養
Ｒ１ ＥＳ細胞は佐渡博士（近畿大学）から分与されたた。ＥＢ３ ＥＳ細胞（ＡＥＳ０１３９）（非特許文献１５、１６）は、理研バイオリソース研究センターの細胞材料開発室（Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）より入手した。
未分化ＥＳ細胞は、非特許文献１７に記載の方法に従って、若干の改変を加えて維持した。簡単に述べると、ＥＳ細胞を、マイトマイシンＣで処理したマウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞上で、１４％ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、１０８２８０２８）、１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１，０００Ｕ／ｍＬ 白血病抑制因子（ＬＩＦ）、０．１１ｍｇ／ｍＬ ピルビン酸ナトリウム（Ｎａｔａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ，２９８０６－１２）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、２１９８５０２３）、１×非必須アミノ酸（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、１１１４００７６）及び１×ＧｌｕｔａＭＡＸサプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、３５００６１）を添加した、グラスゴー最少必須培地（ＧＭＥＭ；Ｍｅｒｃｋ，Ｇ５１５４）中で培養した。継代には、０．２５％トリプシン（富士フィルム、２０１－１６９４５）を用いた。
Ｒ１ ＥＳ細胞は佐渡博士（近畿大学）から分与されたた。ＥＢ３ ＥＳ細胞（ＡＥＳ０１３９）（非特許文献１５、１６）は、理研バイオリソース研究センターの細胞材料開発室（Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）より入手した。
未分化ＥＳ細胞は、非特許文献１７に記載の方法に従って、若干の改変を加えて維持した。簡単に述べると、ＥＳ細胞を、マイトマイシンＣで処理したマウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞上で、１４％ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、１０８２８０２８）、１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１，０００Ｕ／ｍＬ 白血病抑制因子（ＬＩＦ）、０．１１ｍｇ／ｍＬ ピルビン酸ナトリウム（Ｎａｔａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ，２９８０６－１２）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、２１９８５０２３）、１×非必須アミノ酸（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、１１１４００７６）及び１×ＧｌｕｔａＭＡＸサプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、３５００６１）を添加した、グラスゴー最少必須培地（ＧＭＥＭ；Ｍｅｒｃｋ，Ｇ５１５４）中で培養した。継代には、０．２５％トリプシン（富士フィルム、２０１－１６９４５）を用いた。
【0031】
２．ＥＳ細胞の分化誘導
フィーダー細胞を除去した後、１×１０４個のＥＳ細胞を、低細胞接着Ｕ底９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｓｐｈｅｒａ ９６－Ｗｅｌｌ Ｕ－Ｓｈａｐｅｄ－Ｂｏｔｔｏｍ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、１７４９２５）中の、１００μＬの分化培地（１５％ ＦＢＳ、０．１１ｍｇ／ｍＬ ピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、１×非必須アミノ酸、及び１×ＧｌｕｔａＭＡＸサプリメントを補足したＧＭＥＭ）に播種し、２４時間培養した。プレート中で作製したスフェロイドを低細胞接着性９０ｍｍ培養ディッシュ（Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｓｐｈｅｒａ ９０ｍｍディッシュ、１７４９４５）に移し、更に４日間培養して胚様体（ＥＢ）を形成した。ＥＢをＰＢＳで３回洗浄し、０．２５％トリプシンを用いてシングルセル（単一細胞の群）に解離させ、細胞をゼラチン処理した培養ディッシュに播種し、７日間培養して、更に分化を誘導した。
フィーダー細胞を除去した後、１×１０４個のＥＳ細胞を、低細胞接着Ｕ底９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｓｐｈｅｒａ ９６－Ｗｅｌｌ Ｕ－Ｓｈａｐｅｄ－Ｂｏｔｔｏｍ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、１７４９２５）中の、１００μＬの分化培地（１５％ ＦＢＳ、０．１１ｍｇ／ｍＬ ピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、１×非必須アミノ酸、及び１×ＧｌｕｔａＭＡＸサプリメントを補足したＧＭＥＭ）に播種し、２４時間培養した。プレート中で作製したスフェロイドを低細胞接着性９０ｍｍ培養ディッシュ（Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｓｐｈｅｒａ ９０ｍｍディッシュ、１７４９４５）に移し、更に４日間培養して胚様体（ＥＢ）を形成した。ＥＢをＰＢＳで３回洗浄し、０．２５％トリプシンを用いてシングルセル（単一細胞の群）に解離させ、細胞をゼラチン処理した培養ディッシュに播種し、７日間培養して、更に分化を誘導した。
【0032】
３．ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析のためのシングルセルの調製
ＥＳ細胞をシングルセルに分散させ、ゼラチン処理した培養ディッシュ上で１時間培養し、フィーダー細胞を除去した。浮遊細胞を未分化ＥＳ細胞として回収した。
分化ＥＳ細胞をＰＢＳで３回洗浄後、０．２５％トリプシンで処理し、シングルセルに分散させた。細胞懸濁液に含まれる死細胞を、パーコール遠心法によって除去した。簡単に述べると、細胞を、５％ ＦＢＳ及び１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｎａｔａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ，１７５５７－９４）を添加したＲＰＭＩ １６４０（Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ，１８３－０２１６５）を用いて濃度を調整した２５％Ｐｅｒｃｏｌｌ ＰＬＵＳ（Ｃｙｔｉｖａ，１７５４４５０１）溶液に懸濁し、６５％ Ｐｅｒｃｏｌｌ ＰＬＵＳ溶液上に重層した。１，０００ｇで２０分間遠心後、中間相を集め分化培地で洗浄した。細胞懸濁液を４０μｍのセルストレイナーで濾過し、トリパンブルー非染色細胞率を細胞生存率として測定した。
ＥＳ細胞をシングルセルに分散させ、ゼラチン処理した培養ディッシュ上で１時間培養し、フィーダー細胞を除去した。浮遊細胞を未分化ＥＳ細胞として回収した。
分化ＥＳ細胞をＰＢＳで３回洗浄後、０．２５％トリプシンで処理し、シングルセルに分散させた。細胞懸濁液に含まれる死細胞を、パーコール遠心法によって除去した。簡単に述べると、細胞を、５％ ＦＢＳ及び１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｎａｔａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ，１７５５７－９４）を添加したＲＰＭＩ １６４０（Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ，１８３－０２１６５）を用いて濃度を調整した２５％Ｐｅｒｃｏｌｌ ＰＬＵＳ（Ｃｙｔｉｖａ，１７５４４５０１）溶液に懸濁し、６５％ Ｐｅｒｃｏｌｌ ＰＬＵＳ溶液上に重層した。１，０００ｇで２０分間遠心後、中間相を集め分化培地で洗浄した。細胞懸濁液を４０μｍのセルストレイナーで濾過し、トリパンブルー非染色細胞率を細胞生存率として測定した。
【0033】
４．ＵＳＢ標識
ＥＺ－Ｌｉｎｋスルホ－ＮＨＳ－ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、２１２１７）をＰＢＳ中に１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解することによってＳ－ＮＨＳ－ビオチンストック溶液を調製し、使用するまで－８０℃で分注保存した。
「３．ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析のためのシングルセルの調製」で調製した、０．５－２×１０６個の単一細胞を含むシングルセルを、１％ ＦＢＳを添加した氷冷ＰＢＳで１回洗浄した。洗浄した細胞を、１％ ＦＢＳを添加したＰＢＳ中の氷冷Ｓ－ＮＨＳ－ビオチン作用溶液５００μＬに懸濁し、氷上で１０分間インキュベートした。実施例でのＳ－ＮＨＳ－ビオチン濃度は１０μｇ／ｍＬであった。
氷上でのインキュベート後、３％ ＦＢＳを含む３ｍＬの氷冷ＰＢＳを反応物に添加し、細胞を４℃にて、３００ｇで５分間遠心した。細胞をさらにＣｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，４２０２０１）で２回洗浄した後、次の工程のバーコードオリゴＤＮＡ結合まで氷上に保った。
ＥＺ－Ｌｉｎｋスルホ－ＮＨＳ－ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、２１２１７）をＰＢＳ中に１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解することによってＳ－ＮＨＳ－ビオチンストック溶液を調製し、使用するまで－８０℃で分注保存した。
「３．ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析のためのシングルセルの調製」で調製した、０．５－２×１０６個の単一細胞を含むシングルセルを、１％ ＦＢＳを添加した氷冷ＰＢＳで１回洗浄した。洗浄した細胞を、１％ ＦＢＳを添加したＰＢＳ中の氷冷Ｓ－ＮＨＳ－ビオチン作用溶液５００μＬに懸濁し、氷上で１０分間インキュベートした。実施例でのＳ－ＮＨＳ－ビオチン濃度は１０μｇ／ｍＬであった。
氷上でのインキュベート後、３％ ＦＢＳを含む３ｍＬの氷冷ＰＢＳを反応物に添加し、細胞を４℃にて、３００ｇで５分間遠心した。細胞をさらにＣｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，４２０２０１）で２回洗浄した後、次の工程のバーコードオリゴＤＮＡ結合まで氷上に保った。
【0034】
５．抗ＣＤＨ１抗体による抗体標識（対照実験）
「３．ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析のためのシングルセルの調製」で調製した、０．５－２×１０６個の単一細胞を含むシングルセルを、氷冷したＣｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄し、５０μＬの氷冷したブロッキング溶液（Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ中のＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ ＰＬＵＳ抗体［ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，１５６６０３］０．０５μｇ／ｍＬ）に懸濁し、氷上で１０分間インキュベートした。氷冷した一次抗体溶液（Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ中の０．０５μｇ／ｍＬのビオチン化ＣＤＣ３２４［Ｅ－カドヘリン］ラットモノクローナル抗体［Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、１３－３２４９－８２］）を細胞懸濁液と混合し、細胞を氷上で３０分間インキュベートした。次いで、氷冷したＣｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄し、バーコードＤＮＡを結合させるまで、氷上に保持した。
アイソタイプコントロールとして、ビオチン化ラットＩｇＧ１アイソタイプコントロール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、１３－４３０１－８２）を用いた。
「３．ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析のためのシングルセルの調製」で調製した、０．５－２×１０６個の単一細胞を含むシングルセルを、氷冷したＣｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄し、５０μＬの氷冷したブロッキング溶液（Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ中のＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ ＰＬＵＳ抗体［ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，１５６６０３］０．０５μｇ／ｍＬ）に懸濁し、氷上で１０分間インキュベートした。氷冷した一次抗体溶液（Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ中の０．０５μｇ／ｍＬのビオチン化ＣＤＣ３２４［Ｅ－カドヘリン］ラットモノクローナル抗体［Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、１３－３２４９－８２］）を細胞懸濁液と混合し、細胞を氷上で３０分間インキュベートした。次いで、氷冷したＣｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄し、バーコードＤＮＡを結合させるまで、氷上に保持した。
アイソタイプコントロールとして、ビオチン化ラットＩｇＧ１アイソタイプコントロール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、１３－４３０１－８２）を用いた。
【0035】
６．バーコードオリゴＤＮＡ結合
５種類のＴｏｔａｌＳｅｑ（登録商標） ＰＥストレプトアビジン（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、４０５２５１，４０５２５３，４０５２５５，４０５２５７，４０５２５９）又はＴｏｔａｌＳｅｑ（登録商標） 抗ビオチン抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、４０９００８）を用いて、「４．ＵＳＢ標識」で調製したビオチン標識細胞、又は、「５．抗ＣＤＨ１抗体による抗体標識（対照実験）」で調製した抗体標識細胞、に以下のようにしてバーコードオリゴＤＮＡを結合させた。使用したバーコードオリゴＤＮＡの情報を以下の表に示す。
細胞を氷冷した０．６μｇ／ｍＬ ＴｏｔａｌＳｅｑ（登録商標） ＰＥストレプトアビジン又は２μｇ／ｍＬ ＴｏｔａｌＳｅｑ（登録商標） 抗ビオチン抗体を含む溶液１００μＬに懸濁し、Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで希釈し、氷上で３０分間インキュベートし、次いで、３回洗浄した。細胞懸濁液を４０μｍのセルストレイナーで濾過し、各サンプルからの同数の細胞を単一チューブにまとめ、ＢＤ Ｒｈａｐｓｏｄｙ（商標）装置を用いて細胞捕捉及びｃＤＮＡ合成に使用した。
５種類のＴｏｔａｌＳｅｑ（登録商標） ＰＥストレプトアビジン（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、４０５２５１，４０５２５３，４０５２５５，４０５２５７，４０５２５９）又はＴｏｔａｌＳｅｑ（登録商標） 抗ビオチン抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、４０９００８）を用いて、「４．ＵＳＢ標識」で調製したビオチン標識細胞、又は、「５．抗ＣＤＨ１抗体による抗体標識（対照実験）」で調製した抗体標識細胞、に以下のようにしてバーコードオリゴＤＮＡを結合させた。使用したバーコードオリゴＤＮＡの情報を以下の表に示す。
【表1】
【0036】
７．フローサイトメトリー
先ず、上記１－３と同様の方法により、未分化ＥＳ細胞及び分化ＥＳ細胞のシングルセル懸濁液を調製した。
具体的には、正常なＦ３４４ラット肺を、カミソリ刃を用いて０．５ｍｍ２に切り刻み、１０％ ＦＢＳ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２－７．４、０．２５ｍｇ／ｍｌ Ｌｉｂｅｒａｓｅ（商標）（Ｒｏｃｈｅ）、及び２０００Ｕ／ｍＬ ＤＮａｓｅ Ｉ（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）を添加したＬｉｂｅｒａｓｅ溶液［ＲＰＭＩ－１６４０（Ｎａｔａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）］で６０分間、３７℃で消化し、シングルセル懸濁液を調製した。死細胞をパーコールで除去した。あるいは、近位脛骨からの成長板軟骨を３週齢のマウスから収集し、１～２ｍｍの小片に細かく切断した。次いで、１２０～２１０分間、持続的に振盪しながら、ＬｉｂｅｒｓｅＴＭ（Ｒｏｃｈｅ）溶液でシングルセル（単一細胞の群）に分散させた。
細胞染色用の試薬は、ビオチン化ＣＤＣ３２４（Ｅ－カドヘリン）ラットモノクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、１３－３２４９－８２）、ＴｏｔａｌＳｅｑ（登録商標） ＰＥストレプトアビジン（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、４０５２５１）、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５抗ラットＣＤ４５（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、クローンＯＸ－１）、ＰＥ抗ラットＣＤ３１（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、クローンＴＬＤ－３Ａ１２）、ストレプトアビジン－ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、４０５２０７）、ＡＰＣラット抗マウスＣＤ４５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５９８６４）及びＰＥ抗マウスＨ－２抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｉｎｃ．１２５５０５）であった。
染色された細胞を、ＥＣ８００ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ソニー）、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、又はＦＡＣＳ Ａｒｒｉａ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたフローサイトメトリーにより解析した。
全ての動物実験は、京都大学施設内動物委員会、東京理科大学動物実験委員会（承認番号：Ｓ１７０３４，Ｓ１８０２９，Ｓ１９０２４，Ｓ２００１９）により審査・承認された。
先ず、上記１－３と同様の方法により、未分化ＥＳ細胞及び分化ＥＳ細胞のシングルセル懸濁液を調製した。
具体的には、正常なＦ３４４ラット肺を、カミソリ刃を用いて０．５ｍｍ２に切り刻み、１０％ ＦＢＳ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２－７．４、０．２５ｍｇ／ｍｌ Ｌｉｂｅｒａｓｅ（商標）（Ｒｏｃｈｅ）、及び２０００Ｕ／ｍＬ ＤＮａｓｅ Ｉ（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）を添加したＬｉｂｅｒａｓｅ溶液［ＲＰＭＩ－１６４０（Ｎａｔａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）］で６０分間、３７℃で消化し、シングルセル懸濁液を調製した。死細胞をパーコールで除去した。あるいは、近位脛骨からの成長板軟骨を３週齢のマウスから収集し、１～２ｍｍの小片に細かく切断した。次いで、１２０～２１０分間、持続的に振盪しながら、ＬｉｂｅｒｓｅＴＭ（Ｒｏｃｈｅ）溶液でシングルセル（単一細胞の群）に分散させた。
細胞染色用の試薬は、ビオチン化ＣＤＣ３２４（Ｅ－カドヘリン）ラットモノクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、１３－３２４９－８２）、ＴｏｔａｌＳｅｑ（登録商標） ＰＥストレプトアビジン（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、４０５２５１）、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５抗ラットＣＤ４５（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、クローンＯＸ－１）、ＰＥ抗ラットＣＤ３１（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、クローンＴＬＤ－３Ａ１２）、ストレプトアビジン－ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、４０５２０７）、ＡＰＣラット抗マウスＣＤ４５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５９８６４）及びＰＥ抗マウスＨ－２抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｉｎｃ．１２５５０５）であった。
染色された細胞を、ＥＣ８００ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ソニー）、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、又はＦＡＣＳ Ａｒｒｉａ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたフローサイトメトリーにより解析した。
全ての動物実験は、京都大学施設内動物委員会、東京理科大学動物実験委員会（承認番号：Ｓ１７０３４，Ｓ１８０２９，Ｓ１９０２４，Ｓ２００１９）により審査・承認された。
【0037】
８．免疫蛍光法
ゼラチン処理した培養ディッシュで培養した細胞を、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで４℃一晩固定した後、洗浄緩衝液（０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。細胞をブロッキング緩衝液（１％ ＢＳＡ及び０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＰＢＳ）中でインキュベートし、次いでブロッキング緩衝液中で希釈した一次抗体と一晩インキュベートした。
洗浄緩衝液で洗浄した後、ブロッキング緩衝液で希釈した二次抗体で、細胞を室温で１時間インキュベートした。次いで、４０％グリセロールを含むＰＢＳで２％ ＤＡＢＣＯ（Ｓｉｇｍａ、Ｄ２５２２）に調整した溶液でマウントした。ＬＥＩＣＡ ＡＦ６５００蛍光イメージングシステム（Ｌｅｉｃａ）を用いて画像を撮影した。
実施例で用いた抗体及び希釈率は以下の通りであった。
一次抗体－ビオチン化ＣＤＣ３２４（Ｅ－カドヘリン：ＣＤＨ１）ラットモノクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、１３－３２４９－８２）（１：２００）及び抗ＯＣＴ４ウサギポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ， ａｂ１９８５７）（１：４００）；
二次抗体－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗ラットロバＩｇＧ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、 Ａ２１２０８）（１：５００）及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５抗ウサギロバＩｇＧ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、 Ａ３１５７２）（１：５００）。
ゼラチン処理した培養ディッシュで培養した細胞を、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで４℃一晩固定した後、洗浄緩衝液（０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。細胞をブロッキング緩衝液（１％ ＢＳＡ及び０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＰＢＳ）中でインキュベートし、次いでブロッキング緩衝液中で希釈した一次抗体と一晩インキュベートした。
洗浄緩衝液で洗浄した後、ブロッキング緩衝液で希釈した二次抗体で、細胞を室温で１時間インキュベートした。次いで、４０％グリセロールを含むＰＢＳで２％ ＤＡＢＣＯ（Ｓｉｇｍａ、Ｄ２５２２）に調整した溶液でマウントした。ＬＥＩＣＡ ＡＦ６５００蛍光イメージングシステム（Ｌｅｉｃａ）を用いて画像を撮影した。
実施例で用いた抗体及び希釈率は以下の通りであった。
一次抗体－ビオチン化ＣＤＣ３２４（Ｅ－カドヘリン：ＣＤＨ１）ラットモノクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、１３－３２４９－８２）（１：２００）及び抗ＯＣＴ４ウサギポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ， ａｂ１９８５７）（１：４００）；
二次抗体－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗ラットロバＩｇＧ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、 Ａ２１２０８）（１：５００）及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５抗ウサギロバＩｇＧ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、 Ａ３１５７２）（１：５００）。
【0038】
９．細胞生死判別試験
未分化ＥＳ細胞を１００μｇ／ｍＬのＳ－ＮＨＳ－ビオチン（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑに用いられる濃度の１０倍）及びＴｏｔａｌＳｅｑ（登録商標） ＰＥストレプトアビジンで処理し、３×１０３個の細胞をゼラチン処理３．５ｃｍ培養ディッシュに播種した。並行して、同数の未処理細胞を播種した。５日間の培養後、細胞をヘマトキシリンで染色し、未処理対照及び処理サンプルのコロニー形成効率を調べた。
未分化ＥＳ細胞を１００μｇ／ｍＬのＳ－ＮＨＳ－ビオチン（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑに用いられる濃度の１０倍）及びＴｏｔａｌＳｅｑ（登録商標） ＰＥストレプトアビジンで処理し、３×１０３個の細胞をゼラチン処理３．５ｃｍ培養ディッシュに播種した。並行して、同数の未処理細胞を播種した。５日間の培養後、細胞をヘマトキシリンで染色し、未処理対照及び処理サンプルのコロニー形成効率を調べた。
【0039】
１０．ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ
ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーの調製には、ＢＤ Ｒｈａｐｓｏｄｙ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＴａｒｇｅｔｅｄ ｍＲＮＡ ａｎｄ ＡｂＳｅｑ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，６３３７７１）の一部を使用した。
バーコードオリゴＤＮＡで標識した細胞（１．６×１０４）をマイクロウェルカートリッジに捕捉し、シングルセル由来のｍＲＮＡ及びバーコードオリゴＤＮＡが結合した細胞捕捉ビーズを回収し、ｃＤＮＡ合成に使用した。
ｃＤＮＡ合成はＢＤ Ｒｈａｐｓｏｄｙ Ｅｘｐｒｅｓｓのマニュアルに従って行った。ｃＤＮＡ及びバーコードオリゴＤＮＡはＴＡＳ－ｓｅｑプロトコル（非特許文献１０）に従って増幅した。簡単に述べると、０．７５Ｕ／μＬのＴｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＴｄＴ；Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ，Ｐ７０７０Ｌ）溶液（１×ＴｄＴ緩衝液［Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、１６３１４０１５］中に１ｍＭ ｄＣＴＰ［ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，２８４０６５１２］、及び０．０５ｍＭ ｄｄＣＴＰ［ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，２７２０６１０１］を含む）で、１，２００ｒｐｍで混合しながら、３０分間処理することによって、ｃＤＮＡ及びバーコードオリゴＤＮＡが結合された細胞捕捉ビーズに、ポリ－Ｃテールを付加した。第二鎖ｃＤＮＡ配列を合成するために、ポリ－Ｃテール ｃＤＮＡビーズを［９８℃で２０秒間、４７℃で１分間、７２℃で２分間］×１６サイクルのプログラムにて、５’－ＢＤＷＴＡｖ２－９Ｇプライマーを用いて１×ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨＳ ＲｅａｄｙＭｉｘ（Ｒｏｃｈｅ，７９５８９３５００１）で処理した。
次に、３種類のプライマー（５’－ＢＤＷＴＡｖ２、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｏｌｉｇｏ－ｌｏｎｇ、及びＴｏｔａｌＳｅｑ－ＡＤＴ－ｏｌｉｇｏ １）を用いた１×ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨＳ ＲｅａｄｙＭｉｘを反応に加え、［９８℃で２０秒、６３℃で２０秒、７２℃で５分］×７サイクルのプログラムを用いて全トランスクリプトームを増幅した。増幅されたｃＤＮＡ及びバーコードオリゴＤＮＡを、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａ６３８８１）を用いたサイズ選別によって分取した。
ｃＤＮＡは更に、［９８℃で２０秒間、６５℃で２０秒間、７２℃で５分間］×５サイクルのプログラムを用いて、２種類のプライマー（５’－ＢＤＷＴＡｖ２及びＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｏｌｉｇｏ－ｌｏｎｇ）を用いた１× ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨＳ ＲｅａｄｙＭｉｘで処理した。バーコードオリゴＤＮＡは更に、［９８℃で２０秒間、６５℃で２０秒間、７２℃で５分間］×１２サイクルのプログラムを用いて、２種類のプライマー（ＴｏｔａｌＳｅｑ－ＡＤＴ－ｏｌｉｇｏ ２及びＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｏｌｉｇｏ－ｌｏｎｇ）を用いて増幅した。
プライマーの配列は以下の表の通りである。
配列番号８及び９の５’末端には、ＮＨ２－Ｃ１２が結合している。
増幅されたｃＤＮＡならびにバーコードオリゴＤＮＡ配列をＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを用いて精製し、サイズ分布及び収量を、Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＤＮＡ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ，５０６７－４６２６）を用いてバイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ）によるチェックを行った。配列データの収集は、ＩｍｍｕｎｏＧｅｎｅＴｅｑｓ， Ｉｎｃ．にてＮｏｖａＳｅｑ ６０００ Ｓ４フローセル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて行った。
ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーの調製には、ＢＤ Ｒｈａｐｓｏｄｙ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＴａｒｇｅｔｅｄ ｍＲＮＡ ａｎｄ ＡｂＳｅｑ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，６３３７７１）の一部を使用した。
バーコードオリゴＤＮＡで標識した細胞（１．６×１０４）をマイクロウェルカートリッジに捕捉し、シングルセル由来のｍＲＮＡ及びバーコードオリゴＤＮＡが結合した細胞捕捉ビーズを回収し、ｃＤＮＡ合成に使用した。
ｃＤＮＡ合成はＢＤ Ｒｈａｐｓｏｄｙ Ｅｘｐｒｅｓｓのマニュアルに従って行った。ｃＤＮＡ及びバーコードオリゴＤＮＡはＴＡＳ－ｓｅｑプロトコル（非特許文献１０）に従って増幅した。簡単に述べると、０．７５Ｕ／μＬのＴｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＴｄＴ；Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ，Ｐ７０７０Ｌ）溶液（１×ＴｄＴ緩衝液［Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、１６３１４０１５］中に１ｍＭ ｄＣＴＰ［ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，２８４０６５１２］、及び０．０５ｍＭ ｄｄＣＴＰ［ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，２７２０６１０１］を含む）で、１，２００ｒｐｍで混合しながら、３０分間処理することによって、ｃＤＮＡ及びバーコードオリゴＤＮＡが結合された細胞捕捉ビーズに、ポリ－Ｃテールを付加した。第二鎖ｃＤＮＡ配列を合成するために、ポリ－Ｃテール ｃＤＮＡビーズを［９８℃で２０秒間、４７℃で１分間、７２℃で２分間］×１６サイクルのプログラムにて、５’－ＢＤＷＴＡｖ２－９Ｇプライマーを用いて１×ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨＳ ＲｅａｄｙＭｉｘ（Ｒｏｃｈｅ，７９５８９３５００１）で処理した。
次に、３種類のプライマー（５’－ＢＤＷＴＡｖ２、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｏｌｉｇｏ－ｌｏｎｇ、及びＴｏｔａｌＳｅｑ－ＡＤＴ－ｏｌｉｇｏ １）を用いた１×ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨＳ ＲｅａｄｙＭｉｘを反応に加え、［９８℃で２０秒、６３℃で２０秒、７２℃で５分］×７サイクルのプログラムを用いて全トランスクリプトームを増幅した。増幅されたｃＤＮＡ及びバーコードオリゴＤＮＡを、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａ６３８８１）を用いたサイズ選別によって分取した。
ｃＤＮＡは更に、［９８℃で２０秒間、６５℃で２０秒間、７２℃で５分間］×５サイクルのプログラムを用いて、２種類のプライマー（５’－ＢＤＷＴＡｖ２及びＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｏｌｉｇｏ－ｌｏｎｇ）を用いた１× ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨＳ ＲｅａｄｙＭｉｘで処理した。バーコードオリゴＤＮＡは更に、［９８℃で２０秒間、６５℃で２０秒間、７２℃で５分間］×１２サイクルのプログラムを用いて、２種類のプライマー（ＴｏｔａｌＳｅｑ－ＡＤＴ－ｏｌｉｇｏ ２及びＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｏｌｉｇｏ－ｌｏｎｇ）を用いて増幅した。
プライマーの配列は以下の表の通りである。
【表2】
増幅されたｃＤＮＡならびにバーコードオリゴＤＮＡ配列をＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを用いて精製し、サイズ分布及び収量を、Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＤＮＡ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ，５０６７－４６２６）を用いてバイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ）によるチェックを行った。配列データの収集は、ＩｍｍｕｎｏＧｅｎｅＴｅｑｓ， Ｉｎｃ．にてＮｏｖａＳｅｑ ６０００ Ｓ４フローセル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて行った。
【0040】
１１．データ解析
脱多重化（デマルチプレッックス）及びＤＢＥＣ処理された配列データをＲ（４．０．２）にインポートし、タグカウント解析から「ダブレット」又は「検出されない」と決定された細胞、及び配列読み取り数の少ない細胞を削除した。また、リード数の少ない遺伝子や、十分な数の細胞に見つからなかった遺伝子も削除した。その後の解析にはＳｅｕｒａｔパッケージ（４．０．５）を使用し、チュートリアルのワークフローに従い、パラメーターを修正した（非特許文献１８）。チュートリアルのワークフローは、典型的には、「発現テーブルを使用してＳｅｕｒａｔ ｏｂｊｅｃｔを作成する。そのデータのクオリティチェックをした後、正規化して、特徴遺伝子を抽出する。次元圧縮し、細胞の種類や状態が同じ細胞のクラスターを形成する。クラスター解析により、データセット内の細胞を分類しラベル化する。細胞型を判定しアノテーションするために、クラスターごとに、マーカー遺伝子や、発現変動遺伝子を確認する。」というものである。
本実施例では、ミトコンドリアの遺伝子数が１０％を超える細胞は除外した。次に、カウントマトリックスを用いて、デフォルトのグローバルスケーリング正規化法であるＬｏｇＮｏｒｍａｌｉｚｅを実行した。抽出法としてｖｓｔを用いた。「ｖｓｔ」では、基本的に、すべての細胞で得られた平均発現量に対して、発現量の分散が大きい遺伝子を検出する。まず、ｌｏｇ（分散）とｌｏｇ（平均）の関係に局所多項式回帰（ｌｏｅｓｓ）を用いて直線をフィッティングする。これにより、予想以上のばらつきを除去することなく、特徴量の標準化を行うことができる。次に、観測された平均と予想される分散（フィットした直線で与えられる）を使って、特徴量を標準化する。最大値にクリッピングした後、標準化された値に対して特徴量の分散を計算する。技術的な外れ値の影響を減らすために、標準化された値を最大値で切り詰めている。ＦｉｎｄＶａｒｉａｂｌｅＦｅａｔｕｒｅｓ（「平均変動プロット」上で外れ値となる特徴量（フィーチャー、例えば、遺伝子）を特定するコマンド）により上位２，０００個の高変動遺伝子を算出した。
データのスケーリング後、ＰＣＡを実施した。同定した最初の３０個の主成分によって占有された空間におけるユークリッド距離に基づいて、Ｋ－最近傍（ＫＮＮ）グラフを構築し、Ｌｏｕｖａｉｎアルゴリズムをクラスターの同定に適用した。最初のクラスタリングでは、１１個のクラスターが得られた。加えて、２，０００の高変動遺伝子と３０の主成分を用いてＵＭＡＰを実行し、１１のサブクラスターを得た。ＦｉｎｄＡｌｌＭａｒｋｅｒ（形成された各クラスターにおいて濃縮された遺伝子を同定するコマンド、本実施例ではデフォルトでＷｉｌｃｏｘｏｎ Ｒａｎｋ Ｓｕｍ検定を適用）（ｍｉｎ．ｐｃｔ＝０．２５、ｌｏｇｆｃ．ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝０．２５、ｓｅｔ．ｏｎｌｙ．ｐｏｓ＝ＴＲＵＥ）を用いて、各クラスターのマーカー遺伝子を同定した。ＦｅａｔｕｒｅＰｌｏｔ（次元削減プロット上で「特徴」を可視化するコマンド）でＥ－カドヘリン遺伝子（Ｃｄｈ１）の発現をプロットした。
脱多重化（デマルチプレッックス）及びＤＢＥＣ処理された配列データをＲ（４．０．２）にインポートし、タグカウント解析から「ダブレット」又は「検出されない」と決定された細胞、及び配列読み取り数の少ない細胞を削除した。また、リード数の少ない遺伝子や、十分な数の細胞に見つからなかった遺伝子も削除した。その後の解析にはＳｅｕｒａｔパッケージ（４．０．５）を使用し、チュートリアルのワークフローに従い、パラメーターを修正した（非特許文献１８）。チュートリアルのワークフローは、典型的には、「発現テーブルを使用してＳｅｕｒａｔ ｏｂｊｅｃｔを作成する。そのデータのクオリティチェックをした後、正規化して、特徴遺伝子を抽出する。次元圧縮し、細胞の種類や状態が同じ細胞のクラスターを形成する。クラスター解析により、データセット内の細胞を分類しラベル化する。細胞型を判定しアノテーションするために、クラスターごとに、マーカー遺伝子や、発現変動遺伝子を確認する。」というものである。
本実施例では、ミトコンドリアの遺伝子数が１０％を超える細胞は除外した。次に、カウントマトリックスを用いて、デフォルトのグローバルスケーリング正規化法であるＬｏｇＮｏｒｍａｌｉｚｅを実行した。抽出法としてｖｓｔを用いた。「ｖｓｔ」では、基本的に、すべての細胞で得られた平均発現量に対して、発現量の分散が大きい遺伝子を検出する。まず、ｌｏｇ（分散）とｌｏｇ（平均）の関係に局所多項式回帰（ｌｏｅｓｓ）を用いて直線をフィッティングする。これにより、予想以上のばらつきを除去することなく、特徴量の標準化を行うことができる。次に、観測された平均と予想される分散（フィットした直線で与えられる）を使って、特徴量を標準化する。最大値にクリッピングした後、標準化された値に対して特徴量の分散を計算する。技術的な外れ値の影響を減らすために、標準化された値を最大値で切り詰めている。ＦｉｎｄＶａｒｉａｂｌｅＦｅａｔｕｒｅｓ（「平均変動プロット」上で外れ値となる特徴量（フィーチャー、例えば、遺伝子）を特定するコマンド）により上位２，０００個の高変動遺伝子を算出した。
データのスケーリング後、ＰＣＡを実施した。同定した最初の３０個の主成分によって占有された空間におけるユークリッド距離に基づいて、Ｋ－最近傍（ＫＮＮ）グラフを構築し、Ｌｏｕｖａｉｎアルゴリズムをクラスターの同定に適用した。最初のクラスタリングでは、１１個のクラスターが得られた。加えて、２，０００の高変動遺伝子と３０の主成分を用いてＵＭＡＰを実行し、１１のサブクラスターを得た。ＦｉｎｄＡｌｌＭａｒｋｅｒ（形成された各クラスターにおいて濃縮された遺伝子を同定するコマンド、本実施例ではデフォルトでＷｉｌｃｏｘｏｎ Ｒａｎｋ Ｓｕｍ検定を適用）（ｍｉｎ．ｐｃｔ＝０．２５、ｌｏｇｆｃ．ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝０．２５、ｓｅｔ．ｏｎｌｙ．ｐｏｓ＝ＴＲＵＥ）を用いて、各クラスターのマーカー遺伝子を同定した。ＦｅａｔｕｒｅＰｌｏｔ（次元削減プロット上で「特徴」を可視化するコマンド）でＥ－カドヘリン遺伝子（Ｃｄｈ１）の発現をプロットした。
【0041】
１２．データ利用可用性
生のＦＡＳＴＱシークエンスファイルはすべて、受託番号ＤＲＲ３３３１９２－ＤＲＲ３３３１９３の下でＤＮＡデータバンク・オブ・ジャパン（ＤＤＢＪ）に登録した。
実施例
生のＦＡＳＴＱシークエンスファイルはすべて、受託番号ＤＲＲ３３３１９２－ＤＲＲ３３３１９３の下でＤＮＡデータバンク・オブ・ジャパン（ＤＤＢＪ）に登録した。
実施例
【0042】
実施例１ ＵＳＢ法による細胞標識
１．１ 細胞標識の原理
本発明者らは、ユニバーサル表面ビオチン化（ＵＳＢ）法（図１）と名付けられたＳ－ＮＨＳ－ビオチンを用いた多重ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑのための新しい細胞標識技術を開発した。従来法（Ａｂ法）が細胞表面上の特定のタンパク質を標的とするのに対し、ＵＳＢ法は、ほとんどすべてのタンパク質に存在するアミン基を標的とするため、特定の表面抗原を必要としない普遍的な方法である。従来法では、標的とする表面タンパク質が発現していない場合は細胞を標識することはできないが、ＵＳＢ法では表面タンパク質が存在する限り標識することができる（図１）。
本実施例では、概念実証実験として、マウスＥＳ細胞を用いて、未分化状態にある細胞と分化した細胞を対象に、解析のための２つの方法を比較した。マウスＥＳ細胞は、未分化状態では、ほとんどすべての細胞で接着分子Ｅ－カドヘリン（ＣＤＨ１）（非特許文献９）を発現するが、分化にともなってＣＤＨ１を発現しない細胞の数が増加する（図６）。従って、抗ＣＤＨ１抗体を用いた抗体アッセイでは、未分化状態の大部分の細胞が標識されるが、分化細胞ではすべての細胞が標識するわけではない。対照的に、ＵＳＢ法はＣＤＨ１発現に依存しないので、未分化及び分化状態の両方において細胞を標識することができると予測される。
１．２ ＵＳＢによる細胞標識
未分化マウスＥＳ細胞（Ｒ１系）、及びＲ１細胞を胚様体形成によって分化させた細胞からシングルセルを調製し、以下の実験に使用した。
細胞サンプルを２つに分け、一方の半分はＡｂ法、すなわちビオチン結合抗ＣＤＨ１抗体を用いて処理し、他方の半分はＵＳＢ法を用いて細胞表面タンパク質にビオチンを付加した。使用したバーコードＤＮＡ標識ストレプトアビジンは、蛍光色素フィコエリトリン（ＰＥ）と結合しているため、フローサイトメトリー解析を行い、標識効率を検討した（図２）。
抗体標識を用いると、未分化ＥＳ細胞中のＰＥ陽性細胞の割合は８７．８％であったが、分化ＥＳ細胞中のＰＥ陽性細胞の割合は約１０％であった。抗ＣＤＨ１抗体を用いて免疫染色を行ったところ、未分化ＥＳ細胞サンプル中のほぼすべての細胞がＣＤＨ１陽性であったが（図３）、分化ＥＳ細胞では一部の細胞でのみＣＤＨ１発現が検出され、これはフローサイトメトリーの結果と一致していた。
対照的に、ＵＳＢ法を用いた場合、未分化ＥＳ細胞及び分化細胞サンプル中のＰＥ陽性細胞の割合は、それぞれ９９．６％及び９６．４％であった（図２、図３）。また蛍光顕微鏡観察でも、ほぼすべての細胞が蛍光標識されていることが示された（図３、上図）。これらの結果は、ＵＳＢ法が未分化及び分化状態の両方において、大部分の細胞を効率的に標識可能であることを示す。
１．１ 細胞標識の原理
本発明者らは、ユニバーサル表面ビオチン化（ＵＳＢ）法（図１）と名付けられたＳ－ＮＨＳ－ビオチンを用いた多重ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑのための新しい細胞標識技術を開発した。従来法（Ａｂ法）が細胞表面上の特定のタンパク質を標的とするのに対し、ＵＳＢ法は、ほとんどすべてのタンパク質に存在するアミン基を標的とするため、特定の表面抗原を必要としない普遍的な方法である。従来法では、標的とする表面タンパク質が発現していない場合は細胞を標識することはできないが、ＵＳＢ法では表面タンパク質が存在する限り標識することができる（図１）。
本実施例では、概念実証実験として、マウスＥＳ細胞を用いて、未分化状態にある細胞と分化した細胞を対象に、解析のための２つの方法を比較した。マウスＥＳ細胞は、未分化状態では、ほとんどすべての細胞で接着分子Ｅ－カドヘリン（ＣＤＨ１）（非特許文献９）を発現するが、分化にともなってＣＤＨ１を発現しない細胞の数が増加する（図６）。従って、抗ＣＤＨ１抗体を用いた抗体アッセイでは、未分化状態の大部分の細胞が標識されるが、分化細胞ではすべての細胞が標識するわけではない。対照的に、ＵＳＢ法はＣＤＨ１発現に依存しないので、未分化及び分化状態の両方において細胞を標識することができると予測される。
１．２ ＵＳＢによる細胞標識
未分化マウスＥＳ細胞（Ｒ１系）、及びＲ１細胞を胚様体形成によって分化させた細胞からシングルセルを調製し、以下の実験に使用した。
細胞サンプルを２つに分け、一方の半分はＡｂ法、すなわちビオチン結合抗ＣＤＨ１抗体を用いて処理し、他方の半分はＵＳＢ法を用いて細胞表面タンパク質にビオチンを付加した。使用したバーコードＤＮＡ標識ストレプトアビジンは、蛍光色素フィコエリトリン（ＰＥ）と結合しているため、フローサイトメトリー解析を行い、標識効率を検討した（図２）。
抗体標識を用いると、未分化ＥＳ細胞中のＰＥ陽性細胞の割合は８７．８％であったが、分化ＥＳ細胞中のＰＥ陽性細胞の割合は約１０％であった。抗ＣＤＨ１抗体を用いて免疫染色を行ったところ、未分化ＥＳ細胞サンプル中のほぼすべての細胞がＣＤＨ１陽性であったが（図３）、分化ＥＳ細胞では一部の細胞でのみＣＤＨ１発現が検出され、これはフローサイトメトリーの結果と一致していた。
対照的に、ＵＳＢ法を用いた場合、未分化ＥＳ細胞及び分化細胞サンプル中のＰＥ陽性細胞の割合は、それぞれ９９．６％及び９６．４％であった（図２、図３）。また蛍光顕微鏡観察でも、ほぼすべての細胞が蛍光標識されていることが示された（図３、上図）。これらの結果は、ＵＳＢ法が未分化及び分化状態の両方において、大部分の細胞を効率的に標識可能であることを示す。
【0043】
実施例２ ＵＳＢ法操作と細胞生存
本実施例では、ＵＳＢ法操作は細胞生存に影響しないことを明らかにした。
ＵＳＢ法による一連の実験操作は、細胞の状態や増殖を損なう可能性がある。この可能性を検討するために、ＥＳ細胞をＵＳＢ法で処理し、培養ディッシュに播種し、コロニー形成能を測定した（図７）。その結果、ＵＳＢ法で用いた濃度（０．１ｍｇ／ｍＬ）より１０倍高い濃度のＳ－ＮＨＳ－ビオチンで細胞を処理した場合でも、非標識対照群とＵＳＢ群との間でコロニー形成率に差は認められなかった。従って、ＵＳＢ法は細胞生存率を変化させないと結論した。
本実施例では、ＵＳＢ法操作は細胞生存に影響しないことを明らかにした。
ＵＳＢ法による一連の実験操作は、細胞の状態や増殖を損なう可能性がある。この可能性を検討するために、ＥＳ細胞をＵＳＢ法で処理し、培養ディッシュに播種し、コロニー形成能を測定した（図７）。その結果、ＵＳＢ法で用いた濃度（０．１ｍｇ／ｍＬ）より１０倍高い濃度のＳ－ＮＨＳ－ビオチンで細胞を処理した場合でも、非標識対照群とＵＳＢ群との間でコロニー形成率に差は認められなかった。従って、ＵＳＢ法は細胞生存率を変化させないと結論した。
【0044】
実施例３ ＵＳＢ法によるサンプル多重化及びｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析の例
本発明のＵＳＢ法は、ビオチン－ストレプトアビジン結合を介してＤＮＡバーコードを種々の大半の細胞に網羅的に結合させることができ、かつ、その実験操作は細胞の生存性を損なわない。本実施例では、ＵＳＢ技術がｓｃＲＮＡ－Ｓｅｑ解析における多重化に使用できるかどうか、及び細胞の発現プロファイルが実験的操作によって影響されるかどうかを調べた。
未分化及び分化状態のＲ１ ＥＳ細胞をＵＳＢ法又はＡｂ法のいずれかで処理した。さらに、別途、別のＥＳ細胞株ＥＢ３の未分化及び分化細胞を、ＵＳＢ法を用いて標識した。これらの６つのサンプルを等量混合し、約１６，０００個のシングルセルをＢＤ Ｒｈａｐｓｏｄｙ（商標）システムを用いて捕捉した。これらの細胞の一部（～４，０００細胞）を用いて、ＴＡＳ－ｓｅｑプロトコルに従い、全トランスクリプトーム解析のためのｃＤＮＡ合成及び増幅、並びに、バーコードオリゴＤＮＡタグの増幅を行った（非特許文献１０）。増幅したｃＤＮＡ及びバーコードオリゴＤＮＡのサイズ分布及び収量を推定したところ、適切な増幅が確認された（図８）。
死細胞、ダブレット細胞、及びタグが同定できなかった細胞を除去した後、残りの２，０８９細胞についてインフォマティクス解析を行った（表３）。
ＵＳＢ法又はＡｂ法のいずれかで標識されたＲ１ ＥＳ細胞株の未分化及び分化状態から得られたデータを示す（図４）。ＵＭＡＰ（ｕｎｉｆｏｒｍ ｍａｎｉｆｏｌｄ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）法を用いて、細胞を１１のクラスターに分類した。
クラスター０、１、及び３は、発現している遺伝子から、それぞれ多能性細胞、ナイーブ細胞、及びプライム型多能性細胞に対応し、未分化状態にある細胞であると考えられた（図４、表４）。
２つの異なる方法で標識されたこれらのクラスター中の細胞が同じクラスターに分類されたことは注目に値する（図９）。すなわち、本発明のＵＳＢ法で標識された細胞の発現プロファイルは、従来法であるＡｂ法で標識された細胞の発現プロファイルと非常に類似していた。従って、ＵＳＢ法による実験操作の与える影響は、細胞の生育だけでなく、各細胞の遺伝子発現プロファイルにも無視できる程度であることが明らかとされた。
０、１、及び３以外のクラスターは分化細胞として同定され、血管平滑筋細胞（クラスター２）、ドパミンニューロン（クラスター４）、上皮細胞（クラスター５）、神経細胞（クラスター７）など、さらに、マクロファージ（クラスター８）、グリア細胞（クラスター９）、及び血管内皮細胞（クラスター１０）と考えられる細胞クラスターが検出された。完全に除去できなかったマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー細胞をクラスター６として検出した。
各クラスターに属する細胞サンプルの分析から、ＵＳＢ法で標識された細胞はすべてのクラスターに存在することが明らかになり（図４、図９）、この方法によって実際に様々なタイプの分化細胞を捕捉できることが示された。
分化細胞クラスター２、４、及び７において、ＵＢＳ法で標識した細胞に比べてＡｂ法で標識した細胞の数が減少していた（図４、図９）。これは、これら分化細胞においてＣｈｄ１遺伝子の発現が抑制されたことで、ＣＤＨ１抗体を用いたＡｂ法による標識効率の低下につながったものと考えられる。Ｃｄｈ１陽性クラスター（クラスター０、１、３、及び５）においては、ＵＳＢ法及びＡｂ法によって標識したサンプル間でほぼ同数の細胞が検出された。しかし、Ｃｄｈ１陰性クラスター（クラスター２、４、６、７、８、９、１０）では、Ａｂ法で標識された細胞の数はＵＳＢ法（図５）より明らかに少なく、分化細胞を検出するためのＡｂ法の限界が示された。
この傾向はＥＢ３株でも観察され、ＵＳＢ法は異なるＥＳ細胞株にも適用できることが示された（図１０）。
ＣＤＨ１陰性細胞は抗ＣＤＨ１抗体で標識されていないと考えられ、本来は検出されないはずである。しかし、抗体処理細胞では、数が明らかに減少したもののＣｄｈ１陰性細胞は確実に含まれていた（表５、図４、図５）。可能性として、抗体又はストレプトアビジンの細胞への非特異的結合が原因であると考えられる。実際、本発明者らは、バーコードオリゴＤＮＡがストレプトアビジン単独処理及びイソタイプコントロール抗体／ストレプトアビジン処理サンプルの両方で増幅されることを確認した（図１３、図１４）。バーコードオリゴＤＮＡは非標識サンプルでは全く増幅されなかったので、ストレプトアビジンのみ及びアイソタイプコントロール抗体処理サンプル（図１４、矢印）で観察された増幅は、細胞に対するストレプトアビジン及び／又はアイソタイプコントロール抗体の非特異的結合に起因する可能性が高い。
ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑによる増幅は、フローサイトメトリーよりも感度が高いと考えられことから、ＣＤＨ１を発現しない（又は非常に少量を発現する）細胞の一部が、ストレプトアビジン及び／又はアイソタイプコントロール抗体による非特異結合により、陽性細胞として分類されている可能性がある。しかし、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ多重化における細胞標識においては、サンプル中のすべての細胞が均一に標識されることが非常に重要であり、Ａｂ法における少量の非特異的結合それ自体は多重化の結果には影響を与えるものではないと考えられる。
本発明のＵＳＢ法は、ビオチン－ストレプトアビジン結合を介してＤＮＡバーコードを種々の大半の細胞に網羅的に結合させることができ、かつ、その実験操作は細胞の生存性を損なわない。本実施例では、ＵＳＢ技術がｓｃＲＮＡ－Ｓｅｑ解析における多重化に使用できるかどうか、及び細胞の発現プロファイルが実験的操作によって影響されるかどうかを調べた。
未分化及び分化状態のＲ１ ＥＳ細胞をＵＳＢ法又はＡｂ法のいずれかで処理した。さらに、別途、別のＥＳ細胞株ＥＢ３の未分化及び分化細胞を、ＵＳＢ法を用いて標識した。これらの６つのサンプルを等量混合し、約１６，０００個のシングルセルをＢＤ Ｒｈａｐｓｏｄｙ（商標）システムを用いて捕捉した。これらの細胞の一部（～４，０００細胞）を用いて、ＴＡＳ－ｓｅｑプロトコルに従い、全トランスクリプトーム解析のためのｃＤＮＡ合成及び増幅、並びに、バーコードオリゴＤＮＡタグの増幅を行った（非特許文献１０）。増幅したｃＤＮＡ及びバーコードオリゴＤＮＡのサイズ分布及び収量を推定したところ、適切な増幅が確認された（図８）。
死細胞、ダブレット細胞、及びタグが同定できなかった細胞を除去した後、残りの２，０８９細胞についてインフォマティクス解析を行った（表３）。
【表3】
クラスター０、１、及び３は、発現している遺伝子から、それぞれ多能性細胞、ナイーブ細胞、及びプライム型多能性細胞に対応し、未分化状態にある細胞であると考えられた（図４、表４）。
【表4】
０、１、及び３以外のクラスターは分化細胞として同定され、血管平滑筋細胞（クラスター２）、ドパミンニューロン（クラスター４）、上皮細胞（クラスター５）、神経細胞（クラスター７）など、さらに、マクロファージ（クラスター８）、グリア細胞（クラスター９）、及び血管内皮細胞（クラスター１０）と考えられる細胞クラスターが検出された。完全に除去できなかったマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー細胞をクラスター６として検出した。
各クラスターに属する細胞サンプルの分析から、ＵＳＢ法で標識された細胞はすべてのクラスターに存在することが明らかになり（図４、図９）、この方法によって実際に様々なタイプの分化細胞を捕捉できることが示された。
分化細胞クラスター２、４、及び７において、ＵＢＳ法で標識した細胞に比べてＡｂ法で標識した細胞の数が減少していた（図４、図９）。これは、これら分化細胞においてＣｈｄ１遺伝子の発現が抑制されたことで、ＣＤＨ１抗体を用いたＡｂ法による標識効率の低下につながったものと考えられる。Ｃｄｈ１陽性クラスター（クラスター０、１、３、及び５）においては、ＵＳＢ法及びＡｂ法によって標識したサンプル間でほぼ同数の細胞が検出された。しかし、Ｃｄｈ１陰性クラスター（クラスター２、４、６、７、８、９、１０）では、Ａｂ法で標識された細胞の数はＵＳＢ法（図５）より明らかに少なく、分化細胞を検出するためのＡｂ法の限界が示された。
【表5】
ＣＤＨ１陰性細胞は抗ＣＤＨ１抗体で標識されていないと考えられ、本来は検出されないはずである。しかし、抗体処理細胞では、数が明らかに減少したもののＣｄｈ１陰性細胞は確実に含まれていた（表５、図４、図５）。可能性として、抗体又はストレプトアビジンの細胞への非特異的結合が原因であると考えられる。実際、本発明者らは、バーコードオリゴＤＮＡがストレプトアビジン単独処理及びイソタイプコントロール抗体／ストレプトアビジン処理サンプルの両方で増幅されることを確認した（図１３、図１４）。バーコードオリゴＤＮＡは非標識サンプルでは全く増幅されなかったので、ストレプトアビジンのみ及びアイソタイプコントロール抗体処理サンプル（図１４、矢印）で観察された増幅は、細胞に対するストレプトアビジン及び／又はアイソタイプコントロール抗体の非特異的結合に起因する可能性が高い。
ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑによる増幅は、フローサイトメトリーよりも感度が高いと考えられことから、ＣＤＨ１を発現しない（又は非常に少量を発現する）細胞の一部が、ストレプトアビジン及び／又はアイソタイプコントロール抗体による非特異結合により、陽性細胞として分類されている可能性がある。しかし、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ多重化における細胞標識においては、サンプル中のすべての細胞が均一に標識されることが非常に重要であり、Ａｂ法における少量の非特異的結合それ自体は多重化の結果には影響を与えるものではないと考えられる。
【0045】
実施例４ バーコードオリゴＤＮＡのスルホ－ＮＨＳ－エステル化
本実施例では、バーコードオリゴＤＮＡのスルホ－ＮＨＳ－エステル化を行った。用いた材料は以下の通りである。
・５’末端を－ＣＯＯＨ修飾したオリゴＤＮＡ；
細胞標識の検証実験のために、３’末端の６－ＦＡＭ修飾も行った。（６－ＦＡＭ修飾はｓｃＲＮＡ－ｓｅｑのサンプル多重化には不要である。）
・ＥＤＣ（１－エチル－３－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド ヒドロクロライド）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（商標））、Ａ３５３９１（１０ｘ１ｍｇ、Ｎｏ－Ｗｅｉｇｈ（商標） Ｆｏｒｍａｔ）；
・スルホ－ＮＨＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（商標）），Ａ３９２６９（１０ｘ２ｍｇ，Ｎｏ－Ｗｅｉｇｈ（商標） Ｆｏｒｍａｔ）；
・活性化用緩衝液（０．１Ｍ ＭＥＳ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）；
・ＰＤ ＭｉｄｉＴｒａｐ Ｇ－２５（Ｃｙｔｉｖａ、２８９１８００８）；
及び
・ナノセップ遠心ろ過デバイス、分画分子量３Ｋ（日本ジェネティクス、ＯＤ００３Ｃ３３）
本実施例で用いた方法は以下の通りである。
（４－ｉ）反応用チューブに活性化用緩衝液を９１８μＬ装填する；
（４－ｉｉ）ＥＤＣ１ｍｇを１００μＬの活性化用緩衝液に溶解し、４０μＬを反応用チューブへ添加する；
（４－ｉｉｉ）オリゴＤＮＡ２ｎｍｏｌ（２０μＬ）を反応用チューブ添加する；
（４－ｉｖ）スルホ－ＮＨＳ２ｍｇを４０μＬの活性化用緩衝液に溶解、２２μＬを反応チューブへ添加する；
（４－ｖ）室温で１５分静置する；
（以降の操作は４℃又は氷上）
（４－ｖｉ）ＰＤ ＭｉｄｉＴｒａｐ Ｇ－２５を用いて、未反応試薬を除去する；
（４－ｖｉｉ）ナノセップ遠心ろ過デバイスを使用して緩衝液をＰＢＳに置換する（限外濾過によるバッファー置換）。この操作を２回繰り返し、スルホ－ＮＨＳ－エステル化オリゴＤＮＡ（ＮＥＯ）を濃縮する。
上記によって得られたスルホ－ＮＨＳ－エステル化オリゴＤＮＡを以降の実施例に使用するまで、－８０℃で保存した。
本実施例では、バーコードオリゴＤＮＡのスルホ－ＮＨＳ－エステル化を行った。用いた材料は以下の通りである。
・５’末端を－ＣＯＯＨ修飾したオリゴＤＮＡ；
細胞標識の検証実験のために、３’末端の６－ＦＡＭ修飾も行った。（６－ＦＡＭ修飾はｓｃＲＮＡ－ｓｅｑのサンプル多重化には不要である。）
・ＥＤＣ（１－エチル－３－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド ヒドロクロライド）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（商標））、Ａ３５３９１（１０ｘ１ｍｇ、Ｎｏ－Ｗｅｉｇｈ（商標） Ｆｏｒｍａｔ）；
・スルホ－ＮＨＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（商標）），Ａ３９２６９（１０ｘ２ｍｇ，Ｎｏ－Ｗｅｉｇｈ（商標） Ｆｏｒｍａｔ）；
・活性化用緩衝液（０．１Ｍ ＭＥＳ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）；
・ＰＤ ＭｉｄｉＴｒａｐ Ｇ－２５（Ｃｙｔｉｖａ、２８９１８００８）；
及び
・ナノセップ遠心ろ過デバイス、分画分子量３Ｋ（日本ジェネティクス、ＯＤ００３Ｃ３３）
本実施例で用いた方法は以下の通りである。
（４－ｉ）反応用チューブに活性化用緩衝液を９１８μＬ装填する；
（４－ｉｉ）ＥＤＣ１ｍｇを１００μＬの活性化用緩衝液に溶解し、４０μＬを反応用チューブへ添加する；
（４－ｉｉｉ）オリゴＤＮＡ２ｎｍｏｌ（２０μＬ）を反応用チューブ添加する；
（４－ｉｖ）スルホ－ＮＨＳ２ｍｇを４０μＬの活性化用緩衝液に溶解、２２μＬを反応チューブへ添加する；
（４－ｖ）室温で１５分静置する；
（以降の操作は４℃又は氷上）
（４－ｖｉ）ＰＤ ＭｉｄｉＴｒａｐ Ｇ－２５を用いて、未反応試薬を除去する；
（４－ｖｉｉ）ナノセップ遠心ろ過デバイスを使用して緩衝液をＰＢＳに置換する（限外濾過によるバッファー置換）。この操作を２回繰り返し、スルホ－ＮＨＳ－エステル化オリゴＤＮＡ（ＮＥＯ）を濃縮する。
上記によって得られたスルホ－ＮＨＳ－エステル化オリゴＤＮＡを以降の実施例に使用するまで、－８０℃で保存した。
【0046】
実施例５ スルホ－ＮＨＳ－エステル化オリゴＤＮＡ（ＮＥＯ）による細胞標識効率の検証
本実施例では、スルホ－ＮＨＳ－エステル化オリゴＤＮＡ（ＮＥＯ）を用いて細胞を標識し（シングル工程法）、標識効率を検証した。
本実施例の操作、反応はすべて４℃又は氷上にて行った。
（５－ｉ）「材料及び方法」の「３．ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析のためのシングルセルの調製」の方法により、単一細胞に分散した細胞１ｘ１０６を準備する。
（５－ｉｉ）スルホ－ＮＨＳ－エステル化オリゴＤＮＡ（ＮＥＯ）４ｎｇを０．１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ ２０μＬで希釈する。
（５－ｉｉｉ）（５－ｉ）で準備した分散された単一細胞を、（５－ｉｉ）で準備したＮＥＯ溶液に懸濁し、氷上で２０分間処理する。
（５－ｉｖ）３％ ＦＢＳ／ＰＢＳを３ｍＬ添加し、遠心処理（３００ｘｇ、１０分間）する。
（５－ｖ）上清を除きＣｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃａｔａｌｏｇ＃４２０２０１）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）１ｍＬに懸濁し、遠心処理（３００ｘｇ、１０分間）する。この操作を３回繰り返す。
上記の標識された細胞を、シングルセルＲＮＡ－ｓｅｑ解析（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析）に使用した。
さらに、以下の通り細胞の標識効率を検証した。
６－ＦＡＭ修飾したスルホ－ＮＨＳ－エステル化オリゴＤＮＡ（ＮＥＯ）を用いて標識した細胞の縣濁液をセルストレーナー（Ｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒ）に通してから、フローサイトメトリー解析を行った。
結果を図１５に示す。表標識対照（標識率０．０１％）と比較して、本実施例でのシングル工程法標識では、ほぼすべての細胞（約９９．６％）で十分な標識が行えていることが確認された。
本実施例では、スルホ－ＮＨＳ－エステル化オリゴＤＮＡ（ＮＥＯ）を用いて細胞を標識し（シングル工程法）、標識効率を検証した。
本実施例の操作、反応はすべて４℃又は氷上にて行った。
（５－ｉ）「材料及び方法」の「３．ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析のためのシングルセルの調製」の方法により、単一細胞に分散した細胞１ｘ１０６を準備する。
（５－ｉｉ）スルホ－ＮＨＳ－エステル化オリゴＤＮＡ（ＮＥＯ）４ｎｇを０．１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ ２０μＬで希釈する。
（５－ｉｉｉ）（５－ｉ）で準備した分散された単一細胞を、（５－ｉｉ）で準備したＮＥＯ溶液に懸濁し、氷上で２０分間処理する。
（５－ｉｖ）３％ ＦＢＳ／ＰＢＳを３ｍＬ添加し、遠心処理（３００ｘｇ、１０分間）する。
（５－ｖ）上清を除きＣｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃａｔａｌｏｇ＃４２０２０１）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）１ｍＬに懸濁し、遠心処理（３００ｘｇ、１０分間）する。この操作を３回繰り返す。
上記の標識された細胞を、シングルセルＲＮＡ－ｓｅｑ解析（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析）に使用した。
さらに、以下の通り細胞の標識効率を検証した。
６－ＦＡＭ修飾したスルホ－ＮＨＳ－エステル化オリゴＤＮＡ（ＮＥＯ）を用いて標識した細胞の縣濁液をセルストレーナー（Ｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒ）に通してから、フローサイトメトリー解析を行った。
結果を図１５に示す。表標識対照（標識率０．０１％）と比較して、本実施例でのシングル工程法標識では、ほぼすべての細胞（約９９．６％）で十分な標識が行えていることが確認された。
【0047】
実施例６ シングル工程法標識された各種細胞の多重ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析
ナイーブ型多能性幹細胞維持培地（２ｉ ｍｅｄｉｕｍ）で培養した未分化ＥＳ細胞、通常のＥＳ細胞培地（Ｎｏｒｍａｌ ＥＳＣ ｍｅｄｉｕｍ）で培養した未分化ＥＳ細胞、ＬＩＦ（－）血清培地で５日間培養した分化ＥＳ細胞（Ｄａｙ５ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ）、ＬＩＦ（－）血清培地で１０日間培養した分化ＥＳ細胞（Ｄａｙ１０ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ）を、それぞれ異なるバーコードタグをシングル工程法で標識した後、多重ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析を行った（図１６）。
ＵＭＡＰによるクラスタリングにより、９種類の細胞が検出された。９種類の各細胞の種類およびマーカー遺伝子（代表的なものトップ２０）は以下の通りである。
結果を図１７、表７に示す。
２ｉ ｍｅｄｉｕｍでは、ナイーブ多能性細胞が多く確認され、Ｎｏｒｍａｌ ＥＳＣ ｍｅｄｉｕｍでは、刺激された（ｐｒｉｍｅｄ）多能性細胞が最多であった。Ｄａｙ５ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄでは、心血管細胞多数を占め、Ｄａｙ１０ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄでは、血管平滑筋細胞を中心に、分化細胞が検出された。
［配列表］
ナイーブ型多能性幹細胞維持培地（２ｉ ｍｅｄｉｕｍ）で培養した未分化ＥＳ細胞、通常のＥＳ細胞培地（Ｎｏｒｍａｌ ＥＳＣ ｍｅｄｉｕｍ）で培養した未分化ＥＳ細胞、ＬＩＦ（－）血清培地で５日間培養した分化ＥＳ細胞（Ｄａｙ５ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ）、ＬＩＦ（－）血清培地で１０日間培養した分化ＥＳ細胞（Ｄａｙ１０ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ）を、それぞれ異なるバーコードタグをシングル工程法で標識した後、多重ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析を行った（図１６）。
ＵＭＡＰによるクラスタリングにより、９種類の細胞が検出された。９種類の各細胞の種類およびマーカー遺伝子（代表的なものトップ２０）は以下の通りである。
【表6】
【表7】
［配列表］
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【配列表】