特許 7659654 抗ＳＥＭＡ３Ａ抗体およびその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-04-01

(45)【発行日】2025-04-09

(54)【発明の名称】抗ＳＥＭＡ３Ａ抗体およびその用途

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/18 20060101AFI20250402BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20250402BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20250402BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20250402BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20250402BHJP

   C12N 1/15 20060101ALN20250402BHJP

   C12N 1/19 20060101ALN20250402BHJP

   C12N 1/21 20060101ALN20250402BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20250402BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20250402BHJP

   A61P 13/12 20060101ALN20250402BHJP

   A61P 3/10 20060101ALN20250402BHJP

   A61P 11/00 20060101ALN20250402BHJP

   A61P 9/04 20060101ALN20250402BHJP

   A61P 13/02 20060101ALN20250402BHJP

   A61P 7/06 20060101ALN20250402BHJP

   A61P 7/00 20060101ALN20250402BHJP

   A61P 3/00 20060101ALN20250402BHJP

   A61P 9/00 20060101ALN20250402BHJP

   A61P 9/10 20060101ALN20250402BHJP

   A61P 27/02 20060101ALN20250402BHJP

   A61P 25/00 20060101ALN20250402BHJP

   A61P 25/02 20060101ALN20250402BHJP

   A61P 25/04 20060101ALN20250402BHJP

   A61P 25/28 20060101ALN20250402BHJP

   A61P 25/16 20060101ALN20250402BHJP

   A61P 25/14 20060101ALN20250402BHJP

   A61P 21/02 20060101ALN20250402BHJP

   A61P 35/00 20060101ALN20250402BHJP

   A61P 35/02 20060101ALN20250402BHJP

   A61P 43/00 20060101ALN20250402BHJP

   C12N 15/63 20060101ALN20250402BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20250402BHJP

【ＦＩ】

C07K16/18 ZNA

C07K19/00

A61K45/00

A61K39/395 N

A61K39/395 T

A61K47/68

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

A61P13/12

A61P3/10

A61P11/00

A61P9/04

A61P13/02

A61P7/06

A61P7/00

A61P3/00

A61P9/00

A61P9/10

A61P27/02

A61P25/00

A61P25/02

A61P25/04

A61P25/28

A61P25/16

A61P25/14

A61P21/02

A61P35/00

A61P35/02

A61P43/00 121

C12N15/63 Z

C12N15/13

【請求項の数】 9

(21)【出願番号】P 2023560024

(86)(22)【出願日】2022-03-28

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-19

(86)【国際出願番号】 EP2022058123

(87)【国際公開番号】W WO2022207554

(87)【国際公開日】2022-10-06

【審査請求日】2025-02-13

(31)【優先権主張番号】21165960.2

(32)【優先日】2021-03-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】313006625

【氏名又は名称】バイエル・アクチエンゲゼルシヤフト

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山 賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉 道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森 一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 健司

(74)【代理人】

【識別番号】100143823

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 英彦

(74)【代理人】

【識別番号】100183519

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻田 芳恵

(74)【代理人】

【識別番号】100196483

【弁理士】

【氏名又は名称】川嵜 洋祐

(74)【代理人】

【識別番号】100160749

【弁理士】

【氏名又は名称】飯野 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100160255

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬 吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100127812

【弁理士】

【氏名又は名称】城山 康文

(72)【発明者】

【氏名】シェーンフェルト，ドリアン

(72)【発明者】

【氏名】ドレブナー，カロリーネ

(72)【発明者】

【氏名】ヴェーバー，エルンスト

(72)【発明者】

【氏名】フィラスキー，カタリーナ

(72)【発明者】

【氏名】エリンガー，フィリップ

(72)【発明者】

【氏名】マカリース・エセル，フィオヌアラ・メアリー

(72)【発明者】

【氏名】フランメ，インゴ

(72)【発明者】

【氏名】ヴンダーリッヒ，ヴィンフリート

(72)【発明者】

【氏名】シュミット，アンチェ

(72)【発明者】

【氏名】ゼダガット，ヤルダ

(72)【発明者】

【氏名】ヤング・ケニース

【審査官】齋藤 光介

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１９－５００８８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０２０／２２５４００（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１４／１２３１８６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０２０／２６１２８１（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

Ｃ０７Ｋ

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトＳｅｍａ３Ａに結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、配列番号１４２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号１４３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号１４４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号１４６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１４７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号１４８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域を含む、前記単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。

【請求項2】

配列番号１４１に対して少なくとも９８％同一である可変重鎖ドメイン、および配列番号１４５に対して少なくとも９８％である可変軽鎖ドメインを含む、請求項１記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。

【請求項3】

配列番号１４１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号１４５を含む可変軽鎖ドメインを含む、請求項１記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。

【請求項4】

ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体である、請求項１記載の単離された抗体。

【請求項5】

配列番号１５７を含む重鎖および配列番号１５８を含む軽鎖を含む、請求項１記載の単離された抗体。

【請求項6】

ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’フラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントである、請求項１記載の抗原結合性フラグメント。

【請求項7】

請求項１～６のいずれか１項記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメントを含む抗体コンジュゲート。

【請求項8】

請求項１～６のいずれか１項記載の単離された抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたは請求項７記載の抗体コンジュゲートを含む医薬組成物。

【請求項9】

請求項１～６のいずれか１項記載の単離された抗体もしくは抗原結合性フラグメント、請求項７記載のコンジュゲート、または請求項８記載の医薬組成物と使用説明とを含むキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野
本発明は、ヒトセマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａ３Ａ）に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、ｉ）配列番号６００の配列のヒトＳｅｍａ３Ａに５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下または０．１ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）で結合し、ｉｉ）マウス、カニクイザル、ラット、ブタおよび／またはイヌＳｅｍａ３Ａと交差反応し、特に、該単離抗体またはその抗原結合性フラグメントはマウス、カニクイザル、ラット、ブタおよび／またはイヌＳｅｍａ３Ａに５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下または０．１ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）で結合し、ｉｉｉ）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定された場合に６０％以上、７０％以上、８０％以上または９０％以上の結合活性で配列番号６００の配列のヒトＳｅｍａ３Ａに結合し、ｉｖ）インビトロメサンギウム細胞遊走アッセイにおいて、配列番号６００の配列のヒトＳｅｍａ３Ａの活性を１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２．５ｎＭ以下または１ｎＭ以下のＥＣ５０で阻害し、ｖ）インビトロ成長円錐崩壊アッセイにおいて、配列番号６００の配列のヒトＳｅｍａ３Ａの活性を５０ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下または５ｎＭ以下のＥＣ５０で阻害し、および／またはｖｉ）インビトロＨＵＶＥＣ反発（ｒｅｐｕｌｓｉｏｎ）アッセイにおいて、配列番号６００の配列のヒトＳｅｍａ３Ａの活性を１ｎＭ以下または０．３ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０７ｎＭ以下、０．０６ｎＭ以下のＥＣ５０で阻害し、および／またはｖｉｉ）配列番号６００の配列の細胞Ｓｅｍａ３Ａによって誘発されるＨＵＶＥＣ反発に対する効力の増強を示す。本発明は更に、該抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードする単離された核酸配列、およびそれを含むベクター、該抗体またはその抗原結合性フラグメントを発現する単離された細胞、該抗体またはその抗原結合性フラグメントの製造方法、ならびに該抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物およびキットを提供する。

【0002】

本発明による抗体は、Ｓｅｍａ３Ａのレベルまたは活性の増強に関連する疾患、例えばアルポート症候群、急性腎障害（ＡＫＩ）、原発性巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）または慢性腎疾患（ＣＫＤ）の治療において使用されうる。

【背景技術】

【0003】

発明の背景
セマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａ３Ａ）は、ガイダンスタンパク質として機能する分泌型二量体タンパク質である。それは、種々のシグナル伝達経路の活性化を招く、ニューロピリン－１および種々のプレキシンとの三元複合体を形成する。それは細胞遊走、接着、細胞骨格安定化およびアポトーシスの重要な調節因子である。Ｓｅｍａ３Ａは、損傷後にそれが誘導される成体腎臓における有足細胞において発現される。

【0004】

過剰なＳｅｍａ３Ａは糸球体濾過障壁を妨げて、濾過障壁の超微細構造変化を誘発して、有足細胞足突起消失およびアルブミン尿を招く。また、Ｓｅｍａ３ＡはＡＫＩ後に高度に誘導され、尿細管炎症、尿細管上皮細胞アポトーシス、および濾過障壁の超微細構造異常を促進することによって損傷を悪化させる。齧歯動物におけるＳｅｍａ３Ａの遺伝的欠損または薬理学的阻害は腎疾患の種々の動物モデルにおける腎損傷の低減をもたらす。

【0005】

更に、Ｓｅｍａ３Ａは網膜ニューロンおよび内皮において発現される。それは、齧歯類モデルにおいて、血管透過性を高めること、網膜炎症および細胞老化を促進すること、ならびに網膜血管再生を阻害することが示されている。Ｓｅｍａ３ＡはＣＮＳ障害においても或る役割を果たしている。Ｓｅｍａ３Ａの阻害は損傷軸索の再生および／または維持の促進、アポトーシス細胞数の減少ならびに血管新生の増強をもたらして、相当に更に良好な機能的回復をもたらす。

【0006】

ＷＯ ２０１４１／２３１８６はトリ－マウスキメラ抗体（クローン番号４－２株由来）およびその２つのヒト化ＩｇＧ１変異体を開示しており、アルツハイマー病の治療におけるそれらの適合性を示唆している。

【0007】

ＷＯ ２０１７／０７４０１３は抗Ｓｅｍａ３Ａ ＩｇＧ抗体Ａ０８、Ｃ１０およびＦ１１を開示しており、がん（以下、癌と表記される）の治療におけるそれらの適合性を示唆している。

【0008】

現在、Ｓｅｍａ３Ａとその受容体との相互作用を阻害する治療選択肢は、例えばアルポート症候群のようなタンパク尿性腎疾患を有する患者の治療には利用できず、治療用Ｓｅｍａ３Ａモノクローナル抗体がこれに最適であると考えられている。したがって、Ｓｅｍａ３Ａのレベルまたは活性の増強に関連する疾患、例えばアルポート症候群、急性腎障害（ＡＫＩ）、原発性巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）または慢性腎疾患（ＣＫＤ）の治療に有用な新規治療用Ｓｅｍａ３Ａ抗体に対する、これまでに満たされていない多大なニーズが存在する。

【発明の概要】

【0009】

発明の目的
先行技術を考慮して、先行技術のＳｅｍａ３Ａ抗体の欠点を克服する新規治療用Ｓｅｍａ３Ａ抗体を提供することが本発明の目的である。特に、Ｓｅｍａ３Ａ活性を効率的に遮断するヒトＳｅｍａ３Ａの高アフィニティ結合物質である新規Ｓｅｍａ３Ａ抗体を提供することが本発明の目的である。望ましいＳｅｍａ３Ａ抗体は、前臨床実験が可能となるように、複数の種のＳｅｍａ３Ａに対して交差反応性である。それらはヒトの治療においては非免疫原性であり、すなわち、それらはヒト抗体またはヒト化抗体である。望ましいＳｅｍａ３Ａ抗体はＳｅｍａ３Ａに対して選択的であり、それらはオフターゲットに結合せず、特に、他のセマフォリンタンパク質ファミリーメンバーと交差反応しない。

【0010】

そのような新規Ｓｅｍａ３Ａ抗体は、Ｓｅｍａ３Ａのレベルまたは活性の増強に関連する疾患、例えばアルポート症候群、急性腎障害（ＡＫＩ）、原発性巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）または慢性腎疾患（ＣＫＤ）の治療において大きな進歩をもたらすであろう。

【0011】

発明の概括
前記の目的および他の目的は本発明の教示によって達成される。本発明は、Ｓｅｍａ３Ａに対うる特異的アフィニティを有し対象に治療的利益をもたらしうる新規抗体の発見に基づく。

【0012】

したがって、第１の態様においては、本発明は、ヒトＳｅｍａ３Ａに結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントに関するものであり、ここで、該単離抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ｉ）配列番号６００の配列のヒトＳｅｍａ３Ａに５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下または０．１ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）で結合し、ｉｉ）マウス、カニクイザル、ラット、ブタおよび／またはイヌＳｅｍａ３Ａと交差反応し、特に、該単離抗体またはその抗原結合性フラグメントはマウス、カニクイザル、ラット、ブタおよび／またはイヌＳｅｍａ３Ａに５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下または０．１ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）で結合し、ｉｉｉ）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定された場合に６０％以上、７０％以上、８０％以上または９０％以上の結合活性で配列番号６００の配列のヒトＳｅｍａ３Ａに結合し、ｉｖ）インビトロメサンギウム細胞遊走アッセイにおいて、配列番号６００の配列のヒトＳｅｍａ３Ａの活性を１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２．５ｎＭ以下または１ｎＭ以下のＥＣ５０で阻害し、ｖ）インビトロ成長円錐崩壊アッセイにおいて、配列番号６００の配列のヒトＳｅｍａ３Ａの活性を５０ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下または５ｎＭ以下のＥＣ５０で阻害し、ｖｉ）インビトロＨＵＶＥＣ反発（ｒｅｐｕｌｓｉｏｎ）アッセイにおいて、配列番号６００の配列のヒトＳｅｍａ３Ａの活性を１ｎＭ以下または０．３ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０７ｎＭ以下、０．０６ｎＭ以下のＥＣ５０で阻害し、および／またはｖｉｉ）配列番号６００の配列の細胞Ｓｅｍａ３Ａによって誘発されるＨＵＶＥＣ反発に対する効力の増強を示す。

【0013】

本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントはヒトＳｅｍａ３Ａに高いアフィニティで結合し、その機能を阻害する。したがって、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、Ｓｅｍａ３Ａのレベルまたは活性の増強に関連する疾患、例えば以下の疾患の治療において使用されうる：ｉ）腎疾患、特に、急性および慢性腎疾患、糖尿病性腎疾患、アルポート症候群、急性および慢性腎不全、多発性嚢胞腎疾患（ＰＣＫＤ）ならびにＡＤＨ分泌不全症候群（ＳＩＡＤＨ）；ｉｉ）腎不全の続発症、特に肺水腫、心不全、尿毒症、貧血、電解質障害、例えば高カリウム血症および低ナトリウム血症、ならびに骨および炭水化物代謝の障害；ｉｉｉ）血管透過性亢進、糖尿病性網膜症、血液網膜関門の悪化、黄斑浮腫、特に加齢黄斑浮腫、非増殖性加齢黄斑浮腫および非増殖性糖尿病性黄斑浮腫；ｉｖ）中枢神経系または末梢神経系の疾患、特に神経因性疼痛、脊髄損傷、多発性硬化症、外傷性脳損傷、脳浮腫および神経変性疾患、特にアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上麻痺、黒色物質変性症、シャイ－ドレーガー症候群、オリーブ橋小脳萎縮症および脊髄小脳変性症；ｖ）癌、特に腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、脳癌、黒色腫、腎細胞癌、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頸部の扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌および喉頭癌。

【0014】

本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは更に、Ｓｅｍａ３Ａ関連障害の診断において使用されうる。

【0015】

もう１つの態様においては、本発明は、本発明による抗体または抗原結合性フラグメントをコードする単離された核酸配列に関する。

【0016】

もう１つの態様においては、本発明は、本発明による核酸配列を含むベクターに関する。

【0017】

もう１つの態様においては、本発明は、本発明による抗体もしくは抗原結合性フラグメントを発現する、および／または本発明による核酸もしくは本発明によるベクターを含む単離された細胞に関する。

【0018】

もう１つの態様においては、本発明は、本発明による細胞を培養すること、および所望により抗体またはその抗原結合性フラグメントを精製することを含む、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントの製造方法に関する。

【0019】

もう１つの態様においては、本発明は、本発明による単離された抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたは本発明による抗体コンジュゲートを含む医薬組成物に関する。

【0020】

もう１つの態様においては、本発明は、本発明による単離された抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたは本発明によるコンジュゲートおよび使用説明を含むキットに関する。
一態様において、本発明は以下を提供する。
[項目１]
ヒトＳｅｍａ３Ａに結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、前記の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントが、
ｉ）配列番号６００の配列のヒトＳｅｍａ３Ａに５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下または０．１ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）で結合し、
ｉｉ）マウス、カニクイザル、ラット、ブタおよび／またはイヌＳｅｍａ３Ａと交差反応し、特に、該単離抗体またはその抗原結合性フラグメントはマウス、カニクイザル、ラット、ブタおよび／またはイヌＳｅｍａ３Ａに５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下または０．１ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）で結合し、
ｉｉｉ）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定された場合に６０％以上、７０％以上、８０％以上または９０％以上の結合活性で配列番号６００の配列のヒトＳｅｍａ３Ａに結合し、
ｉｖ）インビトロメサンギウム細胞遊走アッセイにおいて、配列番号６００の配列のヒトＳｅｍａ３Ａの活性を１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２．５ｎＭ以下または１ｎＭ以下のＥＣ５０で阻害し、
ｖ）インビトロ成長円錐崩壊アッセイにおいて、配列番号６００の配列のヒトＳｅｍａ３Ａの活性を５０ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下または５ｎＭ以下のＥＣ５０で阻害し、および／または
ｖｉ）インビトロＨＵＶＥＣ反発アッセイにおいて、配列番号６００の配列のヒトＳｅｍａ３Ａの活性を１ｎＭ以下または０．３ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０７ｎＭ以下、０．０６ｎＭ以下のＥＣ５０で阻害する、前記の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
[項目２]
前記の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントがマウス、カニクイザル、ラット、ブタおよび／またはイヌＳｅｍａ３Ａと交差反応し、特に、ヒトＳｅｍａ３Ａに対するアフィニティと比較して１００倍未満、特に５０倍未満、より詳細には２５倍未満、更により詳細には１０倍未満、最も詳細には５倍未満異なる、マウス、カニクイザル、ラット、ブタおよび／またはイヌＳｅｍａ３Ａに対するアフィニティを有する、項目１記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
[項目３]
前記の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントがヒトＳｅｍａ３Ｂ、Ｓｅｍａ３Ｃ、Ｓｅｍａ３Ｄ、Ｓｅｍａ３Ｅ、Ｓｅｍａ３Ｆおよび／またはＳｅｍａ３Ｇと有意に交差反応せず、特に、前記の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントがヒトＳｅｍａ３Ｇと有意に交差反応しない、項目１または２記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
[項目４]
前記の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントがＳｅｍａ３Ａ誘発性アルブミン尿および／またはタンパク尿を抑制する、前記請求項のいずれか１項記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
[項目５]
前記の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントがＳｅｍａ３Ａ誘発性線維症を抑制する、前記請求項のいずれか１項記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
[項目６]
前記請求項のいずれか１項記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメントとＳｅｍａ３Ａへの結合に関して競合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、前記の単離された抗体または抗原結合性フラグメントが、ｉ）配列番号８００および配列番号８０４、またはｉｉ）配列番号８１０および配列番号８１１を含む抗体の、Ｓｅｍａ３Ａへの結合とは競合しない、前記の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
[項目７]
ｉ）配列番号１４１に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号１４５に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％同一である軽鎖可変ドメイン、または
ｉｉ）配列番号６１に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号６５に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％同一である軽鎖可変ドメイン
を含む、項目１または２記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
[項目８]
ｉ）ａ）配列ＲＤＤＹＴＳＲＤＡＦＤＸ（配列番号５９４）（ここで、Ｘは、ＹおよびＶからなる群から選択され、特に、ＸはＹである）を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域、およびｂ）配列Ｘ１ＡＷＤＤＳＬＮＸ２Ｘ３Ｘ４Ｖ（配列番号５９８）（ここで、Ｘ１は、ＡおよびＨからなる群から選択され、Ｘ２は、Ｖ、ＤおよびＧからなる群から選択され、特に、Ｘ２は、ＶおよびＤからなる群から選択され、Ｘ３は、ＩおよびＹからなる群から選択され、Ｘ４は、ＰおよびＶからなる群から選択される）を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｉｉ）ａ）配列ＳＧＹＳＳＳＷＦＤＰＤＦＤＹ（配列番号６４）を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域、およびｂ）配列Ｘ１ＳＹＸ２ＧＸ３ＮＰＹＶＶ（配列番号５９９）（ここで、Ｘ１は、ＳおよびＱからなる群から選択され、Ｘ２は、ＥおよびＡからなる群から選択され、Ｘ３は、Ｐ、ＩおよびＳからなる群から選択され、特に、Ｘ３は、ＰおよびＩからなる群から選択される）を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域を含む、前記請求項のいずれか１項記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
[項目９]
ｉ）配列ＳＹＸ１ＭＸ２（配列番号５８８）（ここで、Ｘ１はＧおよびＡから選択され、Ｘ２はＨ、ＳおよびＬから選択される）を含むＨ－ＣＤＲ１、特に、配列ＳＹＡＭＸ（配列番号５８９）（ここで、ＸはＳおよびＬから選択される）を含むＨ－ＣＤＲ１；配列ＡＩＧＸ１ＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＸ２Ｇ（配列番号５９０）（ここで、Ｘ１はＴおよびＹから選択され、Ｘ２はＫおよびＭから選択される）を含むＨ－ＣＤＲ２、特に、配列ＡＩＧＸＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５９１）（ここで、ＸはＴおよびＹから選択される）を含むＨ－ＣＤＲ２；および配列ＲＤＤＹＴＳＲＤＡＦＤＸ（配列番号５９４）（ここで、Ｘは、ＹおよびＶからなる群から選択され、特に、ＸはＹである）を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域；ならびにｂ）配列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＴＶＮ（配列番号４６）を含むＬ－ＣＤＲ１；配列ＹＤＤＬＸＰＳ（配列番号５９６）（ここで、ＸはＬおよびＲから選択される）を含むＬ－ＣＤＲ２、特に、配列ＹＤＤＬＲＰＳ（配列番号１２７）を含むＬ－ＣＤＲ２；および配列Ｘ１ＡＷＤＤＳＬＮＸ２Ｘ３Ｘ４Ｖ（配列番号５９８）（ここで、Ｘ１は、ＡおよびＨからなる群から選択され、Ｘ２は、Ｖ、ＤおよびＧからなる群から選択され、特に、Ｘ２は、ＶおよびＤからなる群から選択され、Ｘ３は、ＩおよびＹからなる群から選択され、Ｘ４は、ＰおよびＶからなる群から選択される）を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｉｉ）配列ＳＹＥＭＮ（配列番号６２）を含むＨ－ＣＤＲ１；配列ＧＩＳＷＮＳＧＸ１ＩＸ２ＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５９２）（ここで、Ｘ１はＷおよびＳから選択され、Ｘ２はＧおよびＤから選択される）を含むＨ－ＣＤＲ２、特に、配列ＧＩＳＷＮＳＧＷＩＸＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５９３）（ここで、ＸはＧおよびＤから選択される）を含むＨ－ＣＤＲ２；および配列ＳＧＹＳＳＳＷＦＤＰＤＦＤＹ（配列番号６４）を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域；ならびにｂ）配列ＴＧＳＳＳＸＩＧＡＧＹＤＶＨ（配列番号５９５）（ここで、Ｘは、ＮおよびＤから選択される）を含むＬ－ＣＤＲ１；配列ＧＸＳＮＲＰＳ（配列番号５９７）（ここで、ＸはＮおよびＡから選択される）を含むＬ－ＣＤＲ２；および配列Ｘ１ＳＹＸ２ＧＸ３ＮＰＹＶＶ（配列番号５９９）（ここで、Ｘ１は、ＳおよびＱからなる群から選択され、Ｘ２は、ＥおよびＡからなる群から選択され、Ｘ３は、Ｐ、ＩおよびＳからなる群から選択され、特に、Ｘ３は、ＰおよびＩからなる群から選択される）を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域
を含む、前記請求項のいずれか１項記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
[項目１０]
項目８の選択肢ｉ）による単離された抗体または抗原結合性フラグメントにおいて、Ｈ－ＣＤＲ１にその５’末端で直接隣接するアミノ酸残基がＳまたがＹである；あるいは、項目８の選択肢ｉｉ）による単離された抗体または抗原結合性フラグメントにおいて、Ｈ－ＣＤＲ１にその５’末端で直接隣接する３つのアミノ酸残基がＸ１ＦＸ２であり、ここで、Ｘ１がＴおよびＤから選択され、Ｘ２がＳおよびＤから選択される、項目８記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
[項目１１]
ｉ）配列番号４２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号４３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号４４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号４６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号４７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号４８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｉｉ）配列番号６２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号６３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号６４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号６６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号６７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号６８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｉｉｉ）配列番号１０２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号１０３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号１０４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号１０６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１０７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号１０８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｉｖ）配列番号１２２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号１２３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号１２４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号１２６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１２７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号１２８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｖ）配列番号１４２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号１４３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号１４４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号１４６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１４７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号１４８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｖｉ）配列番号１６２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号１６３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号１６４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号１６６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１６７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号１６８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｖｉｉ）配列番号１８２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号１８３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号１８４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号１８６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１８７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号１８８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｖｉｉｉ）配列番号２０２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号２０３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号２０４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号２０６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号２０７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号２０８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｉｘ）配列番号２２２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号２２３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号２２４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号２２６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号２２７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号２２８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘ）配列番号２４２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号２４３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号２４４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号２４６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号２４７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号２４８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｉ）配列番号２６２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号２６３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号２６４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号２６６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号２６７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号２６８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｉｉ）配列番号２８２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号２８３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号２８４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号２８６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号２８７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号２８８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｉｉｉ）配列番号３０２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号３０３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号３０４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号３０６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号３０７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号３０８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｉｖ）配列番号３２２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号３２３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号３２４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号３２６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号３２７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号３２８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｖ）配列番号３４２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号３４３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号３４４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号３４６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号３４７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号３４８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｖｉ）配列番号３６２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号３６３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号３６４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号３６６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号３６７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号３６８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｖｉｉ）配列番号３８２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号３８３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号３８４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号３８６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号３８７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号３８８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｖｉｉｉ）配列番号４０２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号４０３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号４０４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号４０６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号４０７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号４０８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｉｘ）配列番号４２２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号４２３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号４２４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号４２６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号４２７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号４２８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｘ）配列番号４４２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号４４３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号４４４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号４４６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号４４７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号４４８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｘｉ）配列番号４６２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号４６３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号４６４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号４６６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号４６７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号４６８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｘｉｉ）配列番号４８２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号４８３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号４８４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号４８６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号４８７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号４８８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｘｉｉｉ）配列番号５０２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号５０３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号５０４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号５０６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号５０７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号５０８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｘｉｖ）配列番号５２２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号５２３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号５２４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号５２６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号５２７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号５２８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｘｖ）配列番号５４２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号５４３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号５４４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号５４６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号５４７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号５４８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｘｖｉ）配列番号５６２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号５６３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号５６４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号５６６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号５６７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号５６８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域
を含む、前記請求項のいずれか１項記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
[項目１２]
ｉ）配列番号４１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号４５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｉｉ）配列番号６１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号６５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｉｉｉ）配列番号１０１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号１０５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｉｖ）配列番号１２１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号１２５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｖ）配列番号１４１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号１４５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｖｉ）配列番号１６１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号１６５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｖｉｉ）配列番号１８１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号１８５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｖｉｉｉ）配列番号２０１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号２０５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｉｘ）配列番号２２１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号２２５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘ）配列番号２４１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号２４５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｉ）配列番号２６１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号２６５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｉｉ）配列番号２８１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号２８５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｉｉｉ）配列番号３０１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３０５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｉｖ）配列番号３２１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３２５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｖ）配列番号３４１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３４５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｖｉ）配列番号３６１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３６５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｖｉｉ）配列番号３８１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３８５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｖｉｉｉ）配列番号４０１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号４０５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｉｘ）配列番号４２１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号４２５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｘ）配列番号４４１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号４４５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｘｉ）配列番号４６１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号４６５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｘｉｉ）配列番号４８１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号４８５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｘｉｉｉ）配列番号５０１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号５０５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｘｉｖ）配列番号５２１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号５２５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｘｖ）配列番号５４１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号５４５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｘｖｉ）配列番号５６１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号５６５を含む可変軽鎖ドメイン
を含む、前記請求項のいずれか１項記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
[項目１３]
ＩｇＧ抗体、特に、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体である、前記請求項のいずれか１項記載の単離された抗体。
[項目１４]
ｉ）配列番号５７を含む重鎖および配列番号５８を含む軽鎖；または
ｉｉ）配列番号７７を含む重鎖および配列番号７８を含む軽鎖；または
ｉｉｉ）配列番号１１７を含む重鎖および配列番号１１８を含む軽鎖；または
ｉｖ）配列番号１３７を含む重鎖および配列番号１３８を含む軽鎖；または
ｖ）配列番号１５７を含む重鎖および配列番号１５８を含む軽鎖；または
ｖｉ）配列番号１７７を含む重鎖および配列番号１７８を含む軽鎖；または
ｖｉｉ）配列番号１９７を含む重鎖および配列番号１９８を含む軽鎖；または
ｖｉｉｉ）配列番号２１７を含む重鎖および配列番号２１８を含む軽鎖；または
ｉｘ）配列番号２３７を含む重鎖および配列番号２３８を含む軽鎖；または
ｘ）配列番号２５７を含む重鎖および配列番号２５８を含む軽鎖；または
ｘｉ）配列番号２７７を含む重鎖および配列番号２７８を含む軽鎖；または
ｘｉｉ）配列番号２９７を含む重鎖および配列番号２９８を含む軽鎖；または
ｘｉｉｉ）配列番号３１７を含む重鎖および配列番号３１８を含む軽鎖；または
ｘｉｖ）配列番号３３７を含む重鎖および配列番号３３８を含む軽鎖；または
ｘｖ）配列番号３５７を含む重鎖および配列番号３５８を含む軽鎖；または
ｘｖｉ）配列番号３７７を含む重鎖および配列番号３７８を含む軽鎖；または
ｘｖｉｉ）配列番号３９７を含む重鎖および配列番号３９８を含む軽鎖；または
ｘｖｉｉｉ）配列番号４１７を含む重鎖および配列番号４１８を含む軽鎖；または
ｘｉｘ）配列番号４３７を含む重鎖および配列番号４３８を含む軽鎖；または
ｘｘ）配列番号４５７を含む重鎖および配列番号４５８を含む軽鎖；または
ｘｘｉ）配列番号４７７を含む重鎖および配列番号４７８を含む軽鎖；または
ｘｘｉｉ）配列番号４９７を含む重鎖および配列番号４９８を含む軽鎖；または
ｘｘｉｉｉ）配列番号５１７を含む重鎖および配列番号５１８を含む軽鎖；または
ｘｘｉｖ）配列番号５３７を含む重鎖および配列番号５３８を含む軽鎖；または
ｘｘｖ）配列番号５５７を含む重鎖および配列番号５５８を含む軽鎖；または
ｘｘｖｉ）配列番号５７７を含む重鎖および配列番号５７８を含む軽鎖
を含む、前記請求項のいずれか１項記載の単離された抗体。
[項目１５]
ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’フラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントである、前記請求項のいずれか１項記載の抗原結合性フラグメント。
[項目１６]
モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントである、前記請求項のいずれか１項記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
[項目１７]
ヒト抗体、ヒト化抗体もしくはキメラ抗体またはその抗原結合性フラグメントである、前記請求項のいずれか１項記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
[項目１８]
ヒトＳｅｍａ３Ａへの結合に関して、前記請求項のいずれか１項記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメントと競合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
[項目１９]
前記請求項のいずれか１項記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメントを含む抗体コンジュゲート。
[項目２０]
項目１～１７のいずれか１項記載の抗体または抗原結合性フラグメントをコードする単離された核酸配列。
[項目２１]
項目１９記載の核酸配列を含むベクター。
[項目２２]
項目１～１７のいずれか１項記載の抗体もしくは抗原結合性フラグメントを発現する、および／または項目１９記載の核酸もしくは項目２０記載のベクターを含む単離された細胞。
[項目２３]
前記細胞が原核細胞または真核細胞である、項目２１記載の単離された細胞。
[項目２４]
項目２１または２２のいずれか１項記載の細胞を培養し、所望により、抗体またはその抗原結合性フラグメントを精製することを含む、項目１～１７のいずれか１項記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメントの製造方法。
[項目２５]
項目１～１７のいずれか１項記載の単離された抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたは項目１８記載の抗体コンジュゲートを含む医薬組成物。
[項目２６]
医薬としての使用のための、項目１～１７のいずれか１項記載の単離された抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたは項目１８記載のコンジュゲートまたは項目２４記載の医薬組成物。
[項目２７]
診断剤としての使用のための、項目１～１７のいずれか１項記載の単離された抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたは項目１８記載の抗体コンジュゲート。
[項目２８]
ｉ）腎疾患、特に、急性および慢性腎疾患、糖尿病性腎疾患、アルポート症候群、急性および慢性腎不全、多発性嚢胞腎疾患（ＰＣＫＤ）ならびにＡＤＨ分泌不全症候群（ＳＩＡＤＨ）；ｉｉ）腎不全の続発症、特に肺水腫、心不全、尿毒症、貧血、電解質障害、例えば高カリウム血症および低ナトリウム血症、ならびに骨および炭水化物代謝の障害；ｉｉｉ）血管透過性亢進、糖尿病性網膜症、血液網膜関門の悪化、黄斑浮腫、特に加齢黄斑浮腫、非増殖性加齢黄斑浮腫および非増殖性糖尿病性黄斑浮腫；ｉｖ）中枢神経系または末梢神経系の疾患、特に神経因性疼痛、脊髄損傷、多発性硬化症、外傷性脳損傷、脳浮腫および神経変性疾患、特にアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上麻痺、黒色物質変性症、シャイ－ドレーガー症候群、オリーブ橋小脳萎縮症および脊髄小脳変性症；またはｖ）癌、特に腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、脳癌、黒色腫、腎細胞癌、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頸部の扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌および喉頭癌の治療および／または予防における使用のための、項目１～１７のいずれか１項記載の単離された抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたは項目１８記載のコンジュゲートまたは項目２４記載の医薬組成物。
[項目２９]
１以上の追加的な治療活性化合物との同時投与、別々の投与または連続的投与のための組合せにおける使用のための、項目１～１７のいずれか１項記載の単離された抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたは項目１８記載のコンジュゲートまたは項目２４記載の医薬組成物。
[項目３０]
項目１～１７のいずれか１項記載の単離された抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたは項目１８記載のコンジュゲートと使用説明とを含むキット。

【0021】

発明の詳細な説明
本発明は、以下の本発明の詳細な説明およびそれに含まれる実施例を参照することによって、より容易に理解されうる。

【0022】

定義
特に示されていない限り、本明細書中で用いる全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味を有する。しかし、以下の参考文献は、本発明に関連する技術分野の当業者に、本発明において用いる用語の多くの一般的な定義を提供しうるものであり、そのような定義が、当技術分野で一般的に理解されている意味に合致する限り、該参照文献が参照され用いられうる。そのような参考文献には以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ ｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ編，１９８８）；Ｈａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）；Ｌａｃｋｉｅら，Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（３ｄ ｅｄ．１９９９）；ならびにＣｅｌｌｕｌａｒおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ａｂｂａｓ，ＬｉｃｈｔｍａｎおよびＰｏｂｅｒ編，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ。当技術分野で一般的に理解されている意味を有する本明細書中で用いる用語の定義を提供する、当業者に利用可能な追加的な技術的資料が参照されうる。本発明の目的においては、以下の用語が更に定義される。追加的な用語は該説明における別の箇所で定義される。本明細書および添付の特許請求の範囲において用いる単数形は、文脈が別段の定めを明らかに示していない限り、複数形対象物を含む。したがって、例えば、「遺伝子」に対する言及は１以上の遺伝子に対する言及であり、当業者に公知のその同等物を含む、などである。

【0023】

本発明の文脈においては、「含む」または「含み」なる語は「限定的ではなく包含する」を意味する。この用語は、示されている任意の特徴、要素、整数、工程または成分の存在を特定する非限定的（オープン・エンド）なものであると意図され、１以上の他の特徴、要素、整数、工程、成分またはそれらの群の存在または追加を排除するとは意図されない。したがって、「含む」なる語は、より限定的な用語である「からなる」および「から本質的になる」を含む。１つの実施形態においては、本出願の全体、特に特許請求の範囲において用いる「含む」なる語は「からなる」なる語によって置換されうる。

【0024】

この文脈においては、「約」または「おおよそ」なる語は所与の値または範囲の８０％～１２０％以内、あるいは９０％～１１０％以内（９５％～１０５％以内を含む）を意味する。

【0025】

「ポリペプチド」および「タンパク質」なる語は本明細書において互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマー（重合体）を意味する。この用語は、１以上のアミノ酸残基が対応天然アミノ酸の人工化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーに適用される。特に示されていない限り、特定のポリペプチド配列はその保存的修飾変異体をも暗黙裡に包含する。

【0026】

本明細書中で用いる「Ｓｅｍａ３Ａ」は「セマフォリン３Ａ」を意味し、これは「ＨＨ１６」、「ＳｅｍＤ」、「ＣＯＬＬ１」、「ＳＥＭＡ１」、「ＳＥＭＡＤ」、「ＳＥＭＡＬ」、「ｃｏｌｌ－１」、「Ｈｓｅｍａ－Ｉ」、「ＳＥＭＡＩＩＩ」、「Ｈｓｅｍａ－ＩＩＩ」、「コラプシン１」、「セマフォリンＤ」、「セマフォリンＩＩＩ」および「セマフォリンＬ」としても公知である。

【0027】

「抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体」および「Ｓｅｍａ３Ａに結合する抗体」なる語は、Ｓｅｍａ３Ａを標的とする診断用および／または治療用物質として該抗体が有用となるように十分なアフィニティでＳｅｍａ３Ａに結合しうる抗体を意味する。１つの実施形態においては、無関係な非Ｓｅｍａ３Ａタンパク質に対する抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体の結合の程度は、例えば標準的なＥＬＩＳＡ法で測定された場合、Ｓｅｍａ３Ａへの該抗体の結合の約１０％未満、約５％未満または約２％未満である。特定の実施形態においては、Ｓｅｍａ３Ａに結合する抗体は１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭまたは０．００１ｎＭ以下（例えば、１０^－８Ｍ以下、例えば１０^－８Ｍ～１０^－１３Ｍ、例えば１０^－９Ｍ～１０^－１３Ｍ）の結合活性（ＥＣ５０）を有する。特定の実施形態においては、抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体は、種々の種からのＳｅｍａ３Ａの間で保存されているＳｅｍａ３Ａのエピトープに結合する。

【0028】

本明細書中で用いる「抗体」なる語は免疫グロブリン分子を意味すると意図される。抗体は、典型的にはジスルフィド結合によって互いに連結されている２つの重（Ｈ）鎖（約５０～７０ｋＤａ）および２つの軽（Ｌ）鎖（約２５ｋＤａ）である４つのポリペプチド鎖を含みうる。特定の実施形態においては、抗体は、ポリペプチド鎖の、２つの同一ペアから構成される。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識をもたらす約１００～１１０個以上のアミノ酸の「可変」領域を含む。重鎖可変領域は本明細書においてはＶＨと略称され、軽鎖可変領域は本明細書においてはＶＬと略称される。各鎖のカルボキシル末端部分は、主にエフェクター機能をもたらす定常領域を定める。重鎖定常領域は、例えばＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３の３つのドメインを含みうる。軽鎖定常領域は１つのドメイン（ＣＬ）から構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域に更に細分可能であり、ＣＤＲは、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された複数の領域の間に散在する。各ＶＨおよびＶＬは、典型的には、３つのＣＤＲと４つまでのＦＲから構成され、これらは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、例えば以下の順序で配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。

【0029】

本明細書中で用いる「相補性決定領域」（ＣＤＲ；例えばＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）なる語は、抗原結合のために存在が必要である抗体可変ドメインのアミノ酸残基を意味する。各可変ドメインは、典型的には、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として特定される３つのＣＤＲ領域を有する。各相補性決定領域は、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））によって定義された「相補性決定領域」からのアミノ酸残基、および／または「超可変ループ」（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ；Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１－９１７（１９８７））からのアミノ酸残基を含みうる。幾つかの場合には、相補性決定領域は、Ｋａｂａｔに従い定義されたＣＤＲ領域と超可変ループとの両方からのアミノ酸を含みうる。

【0030】

「フレームワーク」またはＦＲ残基は超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。

【0031】

「定常領域」なる語は、エフェクター機能を付与する抗体分子の部分を意味する。

【0032】

本明細書における「Ｆｃ領域」なる語は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定めるために用いられる。この用語は天然配列Ｆｃ領域および変異体Ｆｃ領域を含む。１つの実施形態においては、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで伸長している。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在しても存在しなくてもよい。本明細書中で特に示されていない限り、Ｆｃ領域または定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されている、ＥＵインデックスとも称されるＥＵ番号付け系に準拠している。

【0033】

免疫グロブリンは、その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて異なるクラスに割り当てられうる。重鎖はミュー（μ）、デルタ（Δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）およびイプシロン（ε）として分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとして定める。特定の実施形態においては、本発明による抗体はＩｇＧ抗体である。これらの幾つかはサブクラスまたはアイソタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に更に分類されうる。特定の実施形態においては、本発明による抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体、より詳細にはＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体である。アイソタイプが異なれば、それらが有するエフェクター機能も異なりうる。ヒト軽鎖はカッパ（κ）軽鎖およびラムダ（λ）軽鎖に分類される。軽鎖および重鎖内で、可変領域と定常領域とは約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結されており、重鎖は更に約１０個のアミノ酸の「Ｄ」領域をも含みうる。全般的には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたい。

【0034】

抗体／免疫グロブリンの「機能的フラグメント」または「抗原結合性抗体フラグメント」は、本明細書においては、抗原結合性領域を保持する抗体／免疫グロブリンのフラグメント（例えば、ＩｇＧの可変領域）として定義される。抗体の「抗原結合性領域」は、典型的には、抗体の、１以上の超可変領域、例えばＣＤＲ１、２および／または３領域において見出されるが、可変「フレームワーク」領域も、例えばＣＤＲにスカフォールドを提供することにより、抗原結合において重要な役割を果たしうる。好ましくは、「抗原結合性領域」は、少なくとも、可変軽鎖（ＶＬ）のアミノ酸残基４～１０３および可変重鎖（ＶＨ）のアミノ酸残基５～１０９、より好ましくは、ＶＬのアミノ酸残基３～１０７およびＶＨのアミノ酸残基４～１１１を含み、特に好ましいのは完全なＶＬ鎖およびＶＨ鎖（ＶＬのアミノ酸１～１０９位およびＶＨの１～１１３位；番号付けはＷＯ ９７／０８３２０に基づく）である。

【0035】

「機能的フラグメント」または「抗原結合性抗体フラグメント」の非限定的な例には以下のものが含まれる：Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体フラグメント、ジアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、線状抗体（Ｚａｐａｔａら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，８（１０）：１０５７－１０６２（１９９５））；キレート化組換え抗体、トリボディまたはビボディ、イントラボディ、ナノボディ、小型モジュラー免疫医薬（ＳＭＩＰ）、抗原結合性ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化抗体、ＶＨＨ含有抗体またはムテインまたはその誘導体、および例えばＣＤＲ配列のような、特異的抗原結合をポリペプチドにもたらすのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部分を含有するポリペプチド（ただし、該抗体は所望の生物活性を保持していなければならない）；ならびに多重特異性抗体、例えば、抗体フラグメントから形成される二重特異性抗体および三重特異性抗体（Ｃ．Ａ．Ｋ Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編，（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｒ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＆ Ｓ．Ｄｕｅｂｅｌ編，（２００１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ）。「二重特異性」または「二機能性」抗体以外の抗体は、その結合部位のそれぞれが同一であると理解される。Ｆ（ａｂ’）_２またはＦａｂは、Ｃ_Ｈ１ドメインとＣ_Ｌドメインとの間で生じる分子間ジスルフィド相互作用を最小にする又は完全に除去するように操作されうる。抗体のパパイン消化は、単一の抗原結合性部位をそれぞれが有する２つの同一の抗原結合性フラグメント（「Ｆａｂ」フラグメントと称される）と、容易に結晶化する能力を反映した名称を有する残りの「Ｆｃ」フラグメントとを生成する。ペプシン処理は、２つの「Ｆｖ」フラグメントを有するＦ（ａｂ’）２フラグメントを生成する。「Ｆｖ」フラグメントは、完全な抗原認識および結合部位を含有する最小抗体フラグメントである。この領域は、緊密な非共有結合によって結合した１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとの二量体からなる。該ＶＨ－ＶＬ二量体の表面上の抗原結合性部位を定めるように各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用するのは、この配置においてである。全体として、６つのＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）であっても、抗原を認識しそれに結合する能力を有する。

【0036】

「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖内に存在する。

【0037】

好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、抗原結合のための望ましい構造をＦｖが形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーを更に含む。Ｆｖの総説は、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。

【0038】

Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメインと重鎖の最初の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含有する。Ｆａｂフラグメントは、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に数個の残基（抗体ヒンジ領域からの１以上のシステイン残基を含む）が付加されている点で、Ｆａｂ’フラグメントとは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を含有するＦａｂ’の本明細書における名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは元々は、ヒンジシステイン残基をお互いの間に有するＦａｂ’フラグメントのペアとして生成された。

【0039】

「ムテイン」または「変異体」なる語は互換的に使用可能であり、可変領域または可変領域と同等の部分に少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失または挿入を含有する抗体または抗原結合性フラグメントを意味する。ただし、ムテインまたは変異体は所望の結合アフィニティまたは生物活性を保持していなければならない。本発明において想定される抗体または抗原結合性抗体フラグメントの変異体は、抗体または抗原結合性抗体フラグメントの結合活性が維持されている分子である。

【0040】

「キメラ抗体」またはその抗原結合性フラグメントは、本明細書においては、可変ドメインが非ヒト由来であり、定常ドメインの一部または全部がヒト由来であるものとして定義される。

【0041】

「ヒト化抗体」は、例えば、必要なフレームワーク復帰突然変異と共にヒト配列由来Ｖ領域内に移植された、マウスのような非ヒト種に由来するＣＤＲ領域を含有する。したがって、ほとんどの場合、ヒト化抗体は、所望の特異性、アフィニティおよび能力を有する、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類のような非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基によって、レシピエントの超可変領域からの残基が置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号、第５，８５９，２０５号（それぞれを参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。幾つかの場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク残基は対応非ヒト残基によって置換されている（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号（それぞれを参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい）。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含みうる。これらの修飾は、抗体の性能を更に改良するために（例えば、所望のアフィニティを得るために）施される。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、超可変領域の全てまたは実質的に全ては非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、フレームワーク領域の全てまたは実質的に全てはヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、所望により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部をも含んでいてもよい。更なる詳細は、Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３３１：５２２－２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－２７（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３－９６（１９９２）（それぞれを参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。

【0042】

「ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」は、ヒト由来ＣＤＲ、すなわち、ヒト起源のＣＤＲを含む。完全ヒト抗体は、ＩＭＧＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）に基づいて決定された最も近いヒト生殖系列参照と比較して少数の生殖系列逸脱（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）を含みうる。例えば、本発明による完全ヒト抗体は、最も近いヒト生殖細胞系参照と比較して、ＣＤＲにおいて最大１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の生殖細胞系逸脱を含みうる。完全ヒト抗体は、細胞富化または不死化工程と組合されたクローニング技術によってヒト由来Ｂ細胞から発生可能である。しかし、完全ヒト抗体の大部分は、ヒトＩｇＧ遺伝子座に関してトランスジェニックである免疫化マウスから、またはファージディスプレイによる精巧なコンビナトリアルライブラリーから単離される（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ Ｍ．，Ｏｓｂｏｒｎ Ｍ．Ｊ．，Ｍａ Ｂ．，Ｈａｙｒｅ Ｊ．，Ａｖｉｓ Ｓ．，Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ Ｂ．およびＢｕｅｌｏｗ Ｒ．，Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ，Ａｒｃｈ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｈｅｒ Ｅｘｐ（Ｗａｒｓｚ．）６３（２０１５），１０１－１０８；Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．Ｊ．，Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｂｙ ｄｅｓｉｇｎ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６（２００６），３４３－３５７；Ｆｒｅｎｚｅｌ Ａ．，Ｓｃｈｉｒｒｍａｎｎ Ｔ．およびＨｕｓｔ Ｍ．，Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ，ＭＡｂｓ ８（２０１６），１１７７－１１９４；Ｎｅｌｓｏｎ Ａ．Ｌ．，Ｄｈｉｍｏｌｅａ Ｅ．およびＲｅｉｃｈｅｒｔ Ｊ．Ｍ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｔｒｅｎｄｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ９（２０１０），７６７－７７４）。

【0043】

完全ヒト抗体を生成させるためには幾つかの技術が利用可能である（ＷＯ ２００８／１１２６４０ Ａ３を参照されたい）。Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＣＡＴ）およびＤｙａｘは、免疫化されたヒトから単離された末梢Ｂ細胞から抗体ｃＤＮＡ配列を得、特定の特異性のヒト可変領域配列を特定するためのファージディスプレイライブラリーを案出した。簡潔に説明すると、抗体可変領域配列をＭ１３バクテリオファージのＧｅｎｅ ＩＩＩまたはＧｅｎｅ ＶＩＩＩ構造体のいずれかと融合させる。これらの抗体可変領域配列を、それぞれの配列を担持するファージの先端においてＦａｂまたは単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）構造体として発現させる。種々のレベルの抗原結合条件（ストリンジェンシー）を用いるパンニングプロセスのラウンドを通じて、目的の抗原に特異的なＦａｂまたはｓｃＦｖ構造体を発現するファージを選択し、単離することが可能である。ついで、選択されたファージの抗体可変領域ｃＤＮＡ配列は、標準的な配列決定法を用いて明らかにされうる。ついで、これらの配列は、確立された抗体操作技術を用いて、所望のアイソタイプを有する完全抗体の再構築のために使用されうる。この方法に従い構築された抗体は完全ヒト抗体（ＣＤＲを含む）とみなされる。選択された抗体の免疫反応性（抗原結合アフィニティおよび特異性）を改善するために、異なる重鎖と軽鎖のと組合せ（コンビナトリアル）結合、（Ｖ－ＪおよびＶ－Ｄ－Ｊ組換えを模倣するための）重鎖および軽鎖のＣＤＲ３における欠失／付加／突然変異ならびに（体細胞超突然変異を模倣するための）ランダム突然変異を含むインビトロ成熟プロセスが導入されうる。この方法によって生成される「完全ヒト」抗体の一例は抗腫瘍壊死因子α抗体ヒュミラ（Ｈｕｍｉｒａ）（アダリムマブ）である。

【0044】

「Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）」抗体は、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら，米国特許第５，７６６，８８６号に記載されている方法に従い親配列を改変することによって生成される。

【0045】

本発明の抗体は組換え抗体遺伝子ライブラリーから誘導されうる。組換えヒト抗体遺伝子のレパートリーの作製および糸状バクテリオファージの表面上のコード化抗体フラグメントの提示のための技術の開発は、ヒト抗体を直接的に作製し選択するための組換え手段を提供しており、これはヒト化抗体、キメラ抗体、マウス抗体またはムテイン抗体にも適用されうる。ファージ技術によって生成される抗体は細菌において抗原結合性フラグメント（通常はＦｖまたはＦａｂフラグメント）として生成され、したがって、エフェクター機能を欠いている。エフェクター機能は２つの方法の１つによって導入されうる。フラグメントは、哺乳類細胞における発現の場合には完全抗体へと操作可能であり、またはエフェクター機能を誘発しうる第２の結合部位を有する二重特異性抗体フラグメントへと操作可能である。典型的には、抗体の重鎖ＶＨ－ＣＨ１および軽鎖ＶＬ－ＣＬはＰＣＲによって個別にクローニングされ、コンビナトリアル・ファージ・ディスプレイ・ライブラリーにおいてランダムに組換えられ、ついでこれは特定の抗原への結合に関して選択されうる。Ｆａｂフラグメントはファージ表面上で発現され、すなわち、該フラグメントをコードする遺伝子に物理的に連結されて発現される。したがって、抗原結合によるＦａｂの選択は、後で増幅されうるＦａｂコード配列に関して同時選択する。数ラウンドの抗原結合および再増幅、すなわち、パンニングと称される方法により、抗原に特異的なＦａｂが富化され、最終的に単離される。

【0046】

ファージ・ディスプレイ・ライブラリーから誘導されるヒト抗体に関しては、種々の方法が記載されている。そのようなライブラリーは単一のマスターフレームワーク上で構築可能であり、そのフレームワーク内に、多様なインビボで形成される（すなわち、ヒト由来の）ＣＤＲが組換え可能であり、これはＣａｒｌｓｓｏｎおよびＳｏｄｅｒｌｉｎｄ Ｅｘｐ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．１（１），１０２－１０８（２００１）；Ｓｏｄｅｒｌｉｎら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８，８５２－８５６（２０００）；ならびに米国特許第６，９８９，２５０号に記載されている。あるいは、そのような抗体ライブラリーは、インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）で設計された、合成作製核酸によってコードされるアミノ酸配列に基づくものでありうる。抗体配列のインシリコ設計は、例えば、ヒト配列のデータベースを分析すること、およびそれから得られたデータを利用してポリペプチド配列を案出することによって達成される。インシリコ作製配列を設計し得るための方法は、例えば、Ｋｎａｐｐｉｋら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００）２９６：５７；Ｋｒｅｂｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２００１）２５４：６７；および米国特許第６，３００，０６４号に記載されている。ファージ・ディスプレイ・スクリーニングの総説は例えば以下のものを参照されたい：Ｈｏｅｔ ＲＭら，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００５；２３（３）：３４４－８）、十分に確立されたハイブリドーマ技術（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ Ｎａｔｕｒｅ．１９７５ Ａｕｇ ７；２５６（５５１７）：４９５－７を参照されたい）、またはマウスの免疫化、とりわけｈＭＡｂマウス（例えば、ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅマウス（登録商標））の免疫化。

【0047】

本明細書中で用いる「モノクローナル抗体」なる語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、該集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる可能な突然変異、例えば天然で生じる突然変異以外は同一である。したがって、「モノクローナル」なる語は、異なる抗体の混合物ではないという、抗体の性質を示す。ポリクローナル抗体調製物は、典型的に、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むが、そのようなポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対するものである。モノクローナル抗体調製物は、その特異性に加えて、典型的に、他の免疫グロブリンが混入していないという点でも有利である。「モノクローナル」なる語は、いずれかの特定の方法による抗体の製造を要するものとして解釈されるべきではな。例えば、使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５［１９７５］に最初に記載されたハイブリドーマ法によって製造可能であり、あるいは組換えＤＮＡ法によって製造可能である（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、組換えモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）または抗体フラグメントでありうる。

【0048】

「単離された」抗体は、同定（特定）され、それを発現した細胞の成分から分離された抗体である。細胞の汚染成分は、抗体の診断的または治療的使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含みうる。

【0049】

「単離された」核酸は、同定され、自然環境の成分から分離された核酸である。単離された核酸には、核酸分子を通常含有する細胞に含有されている核酸分子が含まれるが、核酸分子は染色体外に存在し、または天然染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。

【0050】

本明細書中で用いる、目的の抗原、例えばＳｅｍａ３Ａ「に特異的に結合する」、「に特異的である」または「を特異的に認識する」抗体は、該抗原を発現する細胞または組織を標的化する際に抗体が治療用物質として有用となるように十分なアフィニティで該抗原に結合する抗体である。本明細書中で用いる、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピトープ「を特異的に認識する」または「に特異的に結合する」または「に特異的である」なる語は、例えば、約１０^－４Ｍ未満、あるいは約１０^－５Ｍ未満、あるいは約１０^－６Ｍ未満、あるいは約１０^－７Ｍ未満、あるいは約１０^－８Ｍ未満、あるいは約１０^－９Ｍ未満、あるいは約１０^－１０Ｍ未満、あるいは約１０^－１１Ｍ未満、あるいは約１０^－１２Ｍ未満の、抗原に対する１価Ｋ_Ｄを有する抗体またはその抗原結合性フラグメントによって示されうる。

【0051】

抗体が抗原「に選択的に結合する」、「に選択的である」または「を選択的に認識する」と言えるのは、そのような抗体がそのような抗原と１以上の参照抗原とを識別しうる場合である。特に、抗原「に選択的に結合する」抗体は、前記の抗原標的のオルソログおよび変異体（例えば、突然変異体、スプライス変異体またはタンパク質分解トランケート化形態）以外のタンパク質とは有意に交差反応しない。「選択的結合」、「選択的に結合する」、「選択的である」または「選択的に認識する」は、その最も一般的な形態においては、例えば以下の方法の１つに従い決定される、目的の抗原と無関係な抗原とを識別する抗体の能力を指す。そのような方法には、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ試験、ＲＩＡ試験、ＥＣＬ試験、ＩＲＭＡ試験およびペプチドスキャンが含まれるが、これらに限定されるものではない。例えば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイが行われうる。スコア化は標準的な発色（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼの存在下の二次抗体、および過酸化水素の存在下のテトラメチルベンジジン）によって行われうる。特定のウェルにおける反応は、例えば４５０ｎｍにおける光学密度によってスコア化される。典型的なバックグラウンド（＝陰性反応）は０．１ ＯＤでありうる。典型的な陽性反応は１ ＯＤでありうる。これは、陽性／陰性の差異が５倍超（すなわち、５倍を超える）、１０倍超、５０倍超、好ましくは１００倍超であることを意味する。典型的には、結合選択性の決定は、単一の参照抗原ではなく約３～５個の無関係な抗原の組合せ（例えば、粉乳、ＢＳＡ、トランスフェリンなど）を使用して行われる。

【0052】

「結合アフィニティ」または「アフィニティ」は或る分子の単一結合部位とその結合パートナーとの間の非共有結合性相互作用の総和の強度を意味する。特に示されていない限り、本明細書中で用いる「結合アフィニティ」は、結合ペア（例えば、抗体および抗原）のメンバーの間の１：１相互作用を反映する固有の結合アフィニティを意味する。解離定数「Ｋ_Ｄ」は、分子（例えば、抗体）とその結合パートナー（例えば、抗原）との間のアフィニティ、すなわち、リガンドが特定のタンパク質にどのくらい強固に結合するのかを表すために一般に用いられる。リガンド－タンパク質のアフィニティは２つの分子の間の非共有結合性分子間相互作用によって影響される。アフィニティは、本明細書に記載されている方法を含む、当技術分野で公知の一般的方法によって測定されうる。１つの実施形態においては、本発明による「Ｋ_Ｄ」または「Ｋ_Ｄ値」は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用する表面プラズモン共鳴アッセイを用いることによって測定される。他の適切な装置としては、ＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ１００、ＢＩＡＣＯＲＥ（Ｒ）－２０００、ＢＩＡＣＯＲｅ ４０００、ＢＩＡＣＯＲＥ（Ｒ）－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）またはＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。

【0053】

本明細書中で用いる「エピトープ」なる語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合しうる任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は通常、アミノ酸もしくは糖側鎖またはそれらの組合せのような、分子の化学的に活性な表面群からなり、通常、特定の三次元構造特性および特定の電荷特性を有する。

【0054】

参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」または参照抗体への「結合に関して競合する抗体」は、競合アッセイにおいて参照抗体のその抗原への結合を１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上遮断する抗体を意味し、逆に、参照抗体は競合アッセイにおいて該抗体のその抗原への結合を１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上遮断する。

【0055】

「成熟抗体」または「成熟抗原結合性フラグメント」（例えば、成熟Ｆａｂ変異体または「最適化」変異体）なる語は、例えば標的タンパク質の細胞外ドメインのような所与の抗原への、より強力な結合、すなわち、増加したアフィニティでの結合を示す、抗体または抗体フラグメントの誘導体を含む。成熟は、このアフィニティの増加を招く、抗体または抗体フラグメントの６つのＣＤＲ内の少数の突然変異を特定するプロセスである。成熟プロセスは、抗体への突然変異の導入のための、および改善した結合物質の特定用のスクリーニングのための分子生物学的方法の組合せである。

【0056】

それぞれ参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対する「配列同一性の割合（％）」は、配列を整列（アライメント）させ、最大配列同一性割合が得られるように必要に応じてギャップを導入した後の、それぞれ参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列におけるそれぞれ核酸またはアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるそれぞれ核酸またはアミノ酸残基の百分率として定義される。保存的置換は配列同一性の一部とはみなされない。ギャップ無しのアライメントが好ましい。アミノ酸配列同一性の割合を決定する目的のためのアラインメントは、例えば、公に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用する、当技術分野における技量の範囲内である種々の方法で達成されうる。当業者は、比較される配列の全長にわたる最大アラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインメントするための適切なパラメーターを決定しうる。

【0057】

「配列相同性」は、同一である又は保存的アミノ酸置換に相当するアミノ酸の百分率を示す。

【0058】

「アンタゴニスト」抗体または「遮断性」抗体は、それが結合する抗原の生物活性を（部分的または完全に）有意に阻害する抗体である。特定の実施形態においては、本発明による抗体または抗原結合性フラグメントはＳｅｍａ３Ａ遮断性抗体またはその抗原結合性フラグメントである。

【0059】

「抗体コンジュゲート」なる語は、１以上の分子にコンジュゲート化（結合）された抗体を意味し、前記の１以上の分子には、薬物［この場合、抗体コンジュゲートは「抗体薬物コンジュゲート」（「ＡＤＣ」）と称される］および高分子量分子、例えばペプチドまたはタンパク質が含まれる。

【0060】

「抗体薬物コンジュゲート」または「ＡＤＣ」なる語は、１以上の細胞毒性または細胞増殖抑制性物質、例えば化学療法剤、薬物、増殖抑制物質、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物もしくは動物に由来する酵素的に活性な毒素またはその断片）または放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）にコンジュゲート化された抗体を意味する。免疫コンジュゲートは、癌の治療において、細胞毒性物質、すなわち、細胞を殺滅し又は細胞の成長もしくは増殖を抑制する薬物の局所送達に使用されている（例えば、Ｌｉｕら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９６），９３，８６１８－８６２３）。免疫コンジュゲートは腫瘍への薬物部分の標的送達およびそれにおける細胞内蓄積を可能にし、この場合、未コンジュゲート化薬物の全身投与は正常な細胞および／または組織に対して許容できないレベルの毒性をもたらしうる。抗体－毒素コンジュゲートにおいて使用される毒素には、細菌毒素、例えばジフテリア毒素、植物毒素、例えばリシン、小分子毒素、例えばゲルダナマイシンが含まれる。毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合またはトポイソメラーゼ阻害を含むメカニズムによって、その細胞毒性効果を発揮しうる。

【0061】

アミノ酸は、本明細書においては、それらの一般に公知である３文字記号によって、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会により推奨されている１文字記号によって言及されうる。ヌクレオチドも同様に、それらの一般に受け入れられている１文字記号によって言及されうる。

【0062】

本明細書中で用いる「ベクター」なる語は、それが連結している別の核酸を増殖させうる核酸分子を意味する。この用語は、自己複製性核酸構造体としてのベクター、およびそれが導入された宿主細胞のゲノム内に組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それが機能的に連結されている核酸の発現を導きうる。そのようなベクターは本明細書においては「発現ベクター」と称される。

【0063】

「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養」なる語は互換的に用いられ、少なくとも１つの外因性核酸が導入されている細胞（そのような細胞の後代を含む）を意味する。宿主細胞には、「形質転換体」および「形質転換細胞」、「トランスフェクタント」および「トランスフェクト化細胞」および「形質導入細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換／トランスフェクト化／形質導入細胞、および継代数には無関係にそれに由来する後代が含まれる。後代は、核酸含有量において、親細胞と完全に同一でなくてもよく、突然変異を含有していてもよい。元の形質転換細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物活性を有する突然変異後代が本明細書に含まれる。

【0064】

本明細書中で用いる「治療的有効量」なる語は、所望の治療レジメンに従って投与された場合に疾患のそのような症状の一部もしくは全部を緩和すること又は疾患に対する素因を軽減することを含む、治療または予防の所望の効果または応答を誘発するのに適切である、治療用抗体または予防用抗体の量を意味すると意図される。

【0065】

「医薬製剤」／「医薬組成物」なる語は、それに含有されている有効成分の生物活性が有効となることを可能にするような形態であり、該製剤が投与される対象に対して許容できないほど毒性である追加的な成分を含有しない調製物（製剤）を意味する。

【0066】

本発明による抗体
１つの態様においては、本発明は、ヒトＳｅｍａ３Ａに結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントに関するものであり、ここで、該単離抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号６００の配列のヒトＳｅｍａ３Ａに５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下または０．１ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）で結合する。特に、該単離抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号５８２のＨｉｓタグ付きヒトＳｅｍａ３Ａドメインに５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下または０．１ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）で結合する。

【0067】

もう１つの態様においては、本発明は、ヒトＳｅｍａ３Ａに結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントに関するものであり、ここで、該単離抗体またはその抗原結合性フラグメントは、マウス、カニクイザル、ラット、ブタおよび／またはイヌＳｅｍａ３Ａと交差反応し、特に、該単離抗体またはその抗原結合性フラグメントはマウス、カニクイザル、ラット、ブタおよび／またはイヌＳｅｍａ３Ａに５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下または０．１ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）で結合する。

【0068】

特定のそのような実施形態においては、該アフィニティは配列番号６０１のマウスＳｅｍａ３Ａ、配列番号６０２のカニクイザルＳｅｍａ３Ａ、配列番号６０３のラットＳｅｍａ３Ａ、配列番号６０４のブタＳｅｍａ３Ａおよび配列番号６０５のイヌに対するものである。特定の実施形態においては、該アフィニティは配列番号５８３のＨｉｓタグ付きマウスＳｅｍａ３Ａドメイン、配列番号５８６のＨｉｓタグ付きカニクイザルＳｅｍａ３Ａドメイン、配列番号５８４のＨｉｓタグ付きラットＳｅｍａ３Ａドメイン、配列番号５８７のＨｉｓタグ付きブタＳｅｍａ３Ａドメインおよび配列番号５８５のＨｉｓタグ付きイヌＳｅｍａ３Ａドメインに対するものである。

【0069】

もう１つの態様においては、本発明は、ヒトＳｅｍａ３Ａに結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントに関するものであり、該単離抗体またはその抗原結合性フラグメントは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定された場合に６０％以上、７０％以上、８０％以上または９０％以上の結合活性でヒトＳｅｍａ３Ａに結合する。特定の実施形態においては、該単離抗体またはその抗原結合性フラグメントは、表面プラスミン共鳴（ＳＰＲ）によって測定された場合に６０％以上、７０％以上、８０％以上または９０％以上の結合活性で配列番号６００の配列のヒトＳｅｍａ３Ａに結合する。特定の実施形態においては、該単離抗体またはその抗原結合性フラグメントは、表面プラスミン共鳴（ＳＰＲ）によって測定された場合に６０％以上、７０％以上、８０％以上または９０％以上の結合活性で配列番号５８２の配列のＨｉｓタグ付きヒトＳｅｍａ３Ａドメインに結合する。

【0070】

もう１つの態様においては、本発明は、ヒトＳｅｍａ３Ａに結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントに関するものであり、該単離抗体またはその抗原結合性フラグメントは、インビトロメサンギウム細胞遊走アッセイにおいて、配列番号６００の配列のヒトＳｅｍａ３Ａの活性を１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２．５ｎＭ以下または１ｎＭ以下のＥＣ５０で阻害する。

【0071】

特に、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、ヒト初代メサンギウム細胞を使用する実施例９に更に詳細に記載されているインビトロスクラッチアッセイにおいて、配列番号６００の配列のヒトＳｅｍａ３Ａの活性を阻害しする。

【0072】

もう１つの態様においては、本発明は、ヒトＳｅｍａ３Ａに結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントに関するものであり、該単離抗体またはその抗原結合性フラグメントは、インビトロ成長円錐崩壊アッセイにおいて、配列番号６００の配列のヒトＳｅｍａ３Ａの活性を５０ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下または５ｎＭ以下のＥＣ５０で阻害する。

【0073】

特に、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、実施例１０に更に詳細に記載されているとおり、マウス後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンを使用するインビトロ成長円錐崩壊アッセイにおいてＳｅｍａ３Ａ誘発細胞骨格崩壊を阻害する。実施例１０に記載されているインビトロ成長円錐アッセイは、Ｍｉｋｕｌｅら（ＰＭＩＤ：１２０７７１９０）に記載されている成長円錐アッセイの修飾形態である。

【0074】

もう１つの態様においては、本発明は、ヒトＳｅｍａ３Ａに結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントに関するものであり、該単離抗体またはその抗原結合性フラグメントは、インビトロＨＵＶＥＣ反発アッセイにおいて、配列番号６００の配列のヒトＳｅｍａ３Ａの活性を１ｎＭ以下または０．３ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０７ｎＭ以下、０．０６ｎＭ以下のＥＣ５０で阻害する。

【0075】

特に、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、実施例１１に記載されているヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のコンフルエント単層上に播種された、配列番号６００の配列のＳｅｍａ３Ａを発現するＨＥＫ２９３細胞を使用するインビトロ反発アッセイにおいて、Ｓｅｍａ３Ａ誘発性細胞反発を阻害する。

【0076】

もう１つの態様においては、本発明は、配列番号６００の配列のＳｅｍａ３Ａに結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントに関するものであり、該単離抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＨＵＶＥＣ反発アッセイにおいて、効力の改善を示し、ここで、ｉ）該単離抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号８１、８５、９７、９８を有するＴＰＰ－１７７５５、または配列番号１、５、１７、１８を有するＴＰＰ－１１４８９、または配列番号８００、８０４、８１０、８１１を有するＴＰＰ－３０７８８、または配列番号８１４、８１８、８２４、８２５を有するＴＰＰ－３０７８９、または配列番号８２８、８３２、８３８、８３９を有するＴＰＰ－３０７９０、または配列番号８４２、８４６、８５２、８５３を有するＴＰＰ－３０７９１と比較して、ＨＵＶＥＣ反発アッセイにおいて、効力の改善を示し、ｉｉ）該単離抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号８１、８５、９７、９８を有するＴＰＰ－１７７５５、または配列番号１、５、１７、１８を有するＴＰＰ－１１４８９、または配列番号８００、８０４、８１０、８１１を有するＴＰＰ－３０７８８、または配列番号８１４、８１８、８２４、８２５を有するＴＰＰ－３０７８９、または配列番号８２８、８３２、８３８、８３９を有するＴＰＰ－３０７９０、または配列番号８４２、８４６、８５２、８５３を有するＴＰＰ－３０７９１と比較して、ＥＣ５０値に基づいて、細胞性Ｓｅｍａ３Ａ誘発性ＨＵＶＥＣ反発に対して、好ましくは４００倍超（すなわち、４００倍を超える）、好ましくは５０倍超、好ましくは５倍超、好ましくは２倍超増強した効力を示し、ｉｉｉ）該単離抗体またはその抗原結合性フラグメントは、前記配列を有するＴＰＰ－１７７５５、ＴＰＰ－１１４８９、ＴＰＰ－３０７８８、ＴＰＰ－３０７８９、ＴＰＰ－３０７９０またはＴＰＰ－３０７９１と比較して、少なくとも３０％増加したＳｅｍａ３Ａ阻害率、好ましくは少なくとも５０％増加したＳｅｍａ３Ａ阻害率を示し、ｉｖ）該単離抗体またはその抗原結合性フラグメントは、インビトロＨＵＶＥＣ反発アッセイにおいて、ヒトＳｅｍａ３Ａに対する２桁のピコモル活性を有するが、前記配列を有するＴＰＰ－１７７５５、ＴＰＰ－１１４８９、ＴＰＰ－３０７８８、ＴＰＰ－３０７８９、ＴＰＰ－３０７９０またはＴＰＰ－３０７９１の先行技術抗体の効力は３桁のピコモルまたは更にはナノモルの範囲であり、ｖ）該単離抗体またはその抗原結合性フラグメントは、実施例１１に記載されているとおり、インビトロＨＵＶＥＣ反発アッセイにおいて、ヒトＳｅｍａ３Ａの活性を１ｎＭ以下または０．３ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０７ｎＭ以下、０．０６ｎＭ以下のＥＣ５０で阻害する。

【0077】

本発明の単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、ＴＰＰ－３０７８８～ＴＰＰ－３０７９１（ＢＩクローンＩ～ＩＶ）と比較して、ＨＵＶＥＣ反発アッセイにおいて、改善された効力を示し、これはヒトＳｅｍａ３Ａの異なるエピトープへの結合によるものでありうる。

【0078】

もう１つの態様においては、本発明は、Ｓｅｍａ３Ａに結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントに関するものであり、ここで、該単離抗体またはその抗原結合性フラグメントはインビボでＳｅｍａ３Ａの活性を阻害する。なぜなら、本発明による抗体はＳｅｍａ３Ａ誘発性尿アルブミン排泄を低減するからである。したがって、もう１つの態様においては、本発明は、Ｓｅｍａ３Ａに結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントに関するものであり、該単離抗体またはその抗原結合性フラグメントはインビボでＳｅｍａ３Ａの阻害活性の改善を示し、ここで、ｉ）該抗体は、ＴＰＰ－３０７８８（ＢＩクローンＩ）と比較して、Ｓｅｍａ３Ａ誘発性尿アルブミン排泄の減少の増強を示し、ｉｉ）該抗体は、ＴＰＰ－１７７５５（Ｓａｍｓｕｎｇ）と比較して、Ｓｅｍａ３Ａ誘発性尿アルブミン排泄の減少の増強を示し、ｉｉｉ）該抗体は、実施例１２に記載されているとおり、ＴＰＰ－１１４８９（Ｃｈｉｏｍｅ）と比較して、Ｓｅｍａ３Ａ誘発性尿アルブミン排泄の減少の増強を示す。

【0079】

本発明の単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、ＴＰＰ－３０７８８～ＴＰＰ－３０７９１（ＢＩクローンＩ～ＩＶ）と比較して、誘発性尿アルブミン排泄に関するインビボモデルにおいて、有効性の改善を示し、これはヒトＳｅｍａ３Ａの異なるエピトープへの結合によるものでありうる。

【0080】

したがって、もう１つの態様においては、本発明は、ヒトＳｅｍａ３Ａに結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントに関するものであり、ここで、該単離抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ｉ）ＴＰＰ－３０７８８（ＢＩクローンＩ）と比較して、増強した安定性（例えば、ＰＢＳ中で２５ｍｇ／ｍｌに希釈され、７００ｒｐｍ、４０℃で２週間インキュベートされた場合の、増強したストレス安定性）を示し、ｉｉ）増強した安定性は、ＳＥＣによって測定された場合に、ＴＰＰ－３０７８８（ＢＩクローンＩ）と比較して、単量体抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体の量の増加を示し、ｉｉｉ）増強した安定性は、ｃＧＥによって測定された場合に、ＴＰＰ－３０７８８（ＢＩクローンＩ）と比較して、抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体のＬＣおよびＨＣの割合の減少を示し、これは、残存ＬＣおよびＨＣの存在によって測定される分解速度の低下を証明しており、ｉｖ）増強した安定性は、単量体抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体の量が維持される（例えば、４０℃、７００ｒｐｍで２週間インキュベートされた後、Δ％単量体＝１である）ことを示し、ｖ）増強した安定性は、抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体のＬＣおよびＨＣの量が維持される（例えば、４０℃、７００ｒｐｍで２週間インキュベートされた後、Δ％ＬＣ＋ＨＣ＜１）ことを示す。

【0081】

したがって、もう１つの態様においては、本発明は、ヒトＳｅｍａ３Ａに結合するＴＰＰ－２３２９８に関するものであり、ここで、該単離抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ｉ）ＴＰＰ－３０７８８（ＢＩクローンＩ）と比較して、増強した安定性（例えば、ＰＢＳ中で２５ｍｇ／ｍｌに希釈され、７００ｒｐｍ、４０℃で２週間インキュベートされた場合の、増強したストレス安定性）を示し、ｉｉ）増強した安定性は、ＳＥＣによって測定された場合に、ＴＰＰ－３０７８８（ＢＩクローンＩ）と比較して、単量体抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体の量の増加を示し、ｉｉｉ）増強した安定性は、ｃＧＥによって測定された場合に、ＴＰＰ－３０７８８（ＢＩクローンＩ）と比較して、抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体のＬＣおよびＨＣの割合の減少を示し、これは、残存ＬＣおよびＨＣの存在によって測定される分解速度の低下を証明しており、ｉｖ）増強した安定性は、単量体抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体の量が維持される（例えば、４０℃、７００ｒｐｍで２週間インキュベートされた後、Δ％単量体＝１である）ことを示し、ｖ）増強した安定性は、抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体のＬＣおよびＨＣの量が維持される（例えば、４０℃、７００ｒｐｍで２週間インキュベートされた後、Δ％ＬＣ＋ＨＣ＜１）ことを示す。

【0082】

したがって、もう１つの態様においては、本発明は、ヒトＳｅｍａ３Ａに結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントに関するものであり、ここで、該単離抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ｉ）増加した溶解度を示し、ｉｉ）増加した溶解度は、９０％の回収率での濃縮の後、ｍｇ／ｍｌの単位で測定され、ｉｉｉ）溶解度は、ＴＰＰ－３０７８８（ＢＩクローンＩ）と比較して増加しており、ｉｖ）溶解度は、ＴＰＰ－３０７８８（ＢＩクローンＩ）と比較して、１倍以下、１．５倍以下、２倍以下増加しており、ｖ）増加した溶解度は、単量体抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体の割合が濃縮後に増加していない（例えば、ＳＥＣによって測定された場合、Δ％単量体＜１）ことを示す。

【0083】

したがって、もう１つの態様においては、本発明は、ヒトＳｅｍａ３Ａに結合するＴＰＰ－２３２９８に関するものであり、ここで、該単離抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ｉ）増加した溶解度を示し、ｉｉ）増加した溶解度は、９０％の回収率での濃縮の後、ｍｇ／ｍｌの単位で測定され、ｉｉｉ）溶解度は、ＴＰＰ－３０７８８（ＢＩクローンＩ）と比較して増加しており、ｉｖ）溶解度は、ＴＰＰ－３０７８８（ＢＩクローンＩ）と比較して、１倍以下、１．５倍以下、２倍以下増加しており、ｖ）増加した溶解度は、単量体抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体の割合が濃縮後に増加していない（例えば、ＳＥＣによって測定された場合、Δ％単量体＜１）ことを示す。

【0084】

したがって、もう１つの態様においては、本発明は、ヒトＳｅｍａ３Ａに結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントに関するものであり、ここで、該単離抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ｉ）水またはＰＢＳと比較して増加した粘度を示し、ｉｉ）ＴＰＰ－３０７８８（ＢＩクローンＩ）と比較して、ＰＢＳ中の粘度の低下を示し、ｉｉｉ）ここで、粘度はビスコサイザー（Ｖｉｓｃｏｓｉｚｅｒ）によって測定され、５．１（１５０ｍｇ／ｍｌ）のｃＰ値を示す。

【0085】

したがって、もう１つの態様においては、本発明は、ヒトＳｅｍａ３Ａに結合するＴＰＰ－２３２９８に関するものであり、ここで、該単離抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ｉ）水またはＰＢＳと比較して増加した粘度を示し、ｉｉ）ＴＰＰ－３０７８８（ＢＩクローンＩ）と比較して、ＰＢＳ中の粘度の低下を示し、ｉｉｉ）ここで、粘度はビスコサイザー（Ｖｉｓｃｏｓｉｚｅｒ）によって測定され、５．１（１５０ｍｇ／ｍｌ）のｃＰ値を示す。

【0086】

特に、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、実施例１７に記載されているとおり、ＴＰＰ－３０７８８より遥かに高い溶解度および安定性を示し、熱ストレスに対して、より耐性であり、ＰＢＳバッファー中で、より低粘度である。

【0087】

特に、ＴＰＰ－２３２９８は、実施例１７に記載されているとおり、ＴＰＰ－３０７８８より遥かに高い溶解度および安定性を示し、熱ストレスに対して、より耐性であり、ＰＢＳバッファー中で、より低粘度である。

【0088】

もう１つの態様においては、本発明は、哺乳類細胞において高力価で産生されうる、ヒトＳｅｍａ３Ａに結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントに関するものであり、ｉ）ここで、高力価は、実施例１６に記載されているとおり、２００ｍｇ／Ｌ以下である。

【0089】

もう１つの態様においては、本発明は、ヒトＳｅｍａ３Ａに結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントに関するものであり、ここで、該抗体は、切断型Ｓｅｍａ３Ａ ＴＰＰ－１９０６８と比較して、活性Ｓｅｍａ３Ａ（ＴＰＰ－１３２１１）に対して、より高い結合選択性を示し、ｉ）ここで、該抗体は、実施例８に記載されているとおり、活性Ｓｅｍａ３Ａに対するＴＰＰ－３０７８８～ＴＰＰ－３０７９１の結合選択性と比較して、活性Ｓｅｍａ３Ａ（ＴＰＰ－１３２１１）に対して、より高い結合選択性を示す。

【0090】

もう１つの態様においては、本発明は、ヒトＳｅｍａ３Ａに結合するＴＰＰ－２３２９８に関するものであり、ここで、該抗体は、切断型Ｓｅｍａ３Ａ ＴＰＰ－１９０６８と比較して、活性Ｓｅｍａ３Ａ（ＴＰＰ－１３２１１）に対して、より高い結合選択性を示し、ｉ）ここで、該抗体は、実施例８に記載されているとおり、活性Ｓｅｍａ３Ａに対するＴＰＰ－３０７８８～ＴＰＰ－３０７９１の結合選択性と比較して、活性Ｓｅｍａ３Ａ（ＴＰＰ－１３２１１）に対して、より高い結合選択性を示す。

【0091】

もう１つの態様においては、本発明は、ヒトＳｅｍａ３Ａに結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントに関するものであり、ここで、該抗体は、ＴＰＰ－３０７８８と比較して、Ｓｅｍａ３Ａ上の異なるエピトープに結合し、ｉ）ここで、エピトープ結合は、実施例５ａに記載されているとおり、ＳＰＲアッセイにおいて測定される。同じエピトープに結合し、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントの結合と競合する全ての抗体は、本発明に含まれる。

【0092】

もう１つの態様においては、本発明は、ヒトＳｅｍａ３Ａに結合するＴＰＰ－２３２９８に関するものであり、ここで、該抗体は、ＴＰＰ－３０７８８と比較して、Ｓｅｍａ３Ａ上の異なるエピトープに結合し、ｉ）ここで、エピトープ結合は、実施例５ａに記載されているとおり、ＳＰＲアッセイにおいて測定される。同じエピトープに結合し、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントの結合と競合する全ての抗体は、本発明に含まれる。

【0093】

もう１つの態様においては、本発明は、前記請求項のいずれか１項記載の単離抗体または抗原結合性フラグメントとＳｅｍａ３Ａへの結合に関して競合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントに関するものであり、ここで、該単離抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号８００、配列番号８０４、配列番号８１０または配列番号８１１を有する抗体の、Ｓｅｍａ３Ａへの結合とは競合しない。

【0094】

本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは前記の特徴の任意の組合せを示しうる。

【0095】

本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントはＳｅｍａ３Ａ遮断性抗体またはその抗原結合性フラグメントである。特定の実施形態においては、該抗体は、セマフォリン３ＡのＳｅｍａ３Ａドメインに、特異的に、そしてより詳細には選択的に結合し、その受容体ニューロピリン１の相互作用を妨げる。

【0096】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントはマウス、カニクイザル、ラット、ブタおよび／またはイヌＳｅｍａ３Ａと交差反応し、特に、ヒトＳｅｍａ３Ａに対するアフィニティと比較して１００倍未満、特に５０倍未満、より詳細には２５倍未満、更により詳細には１０倍未満、最も詳細には５倍未満異なる、マウス、カニクイザル、ラット、ブタおよび／またはイヌＳｅｍａ３Ａに対するアフィニティを有する。

【0097】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントはヒトＳｅｍａ３Ｂ、Ｓｅｍａ３Ｃ、Ｓｅｍａ３Ｄ、Ｓｅｍａ３Ｅ、Ｓｅｍａ３Ｆおよび／またはＳｅｍａ３Ｇと有意に交差反応しない。特に、該単離抗体またはその抗原結合性フラグメントはヒトＳｅｍａ３Ｇと有意に交差反応しない。

【0098】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントはＳｅｍａ３Ａ誘発性アルブミン尿および／またはタンパク尿を抑制する。

【0099】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントはＳｅｍａ３Ａ誘発性線維症を抑制する。

【0100】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、配列番号１４１に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一である重鎖可変ドメインと、配列番号１４５に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一である軽鎖可変ドメインとを含む。

【0101】

特定の他の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、配列番号６１に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一である重鎖可変ドメインと、配列番号６５に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一である軽鎖可変ドメインとを含む。

【0102】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、配列ＲＤＤＹＴＳＲＤＡＦＤＸ（配列番号５９４）（ここで、Ｘは、ＹおよびＶからなる群から選択され、特に、ＸはＹである）を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域を含む。

【0103】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、配列Ｘ_１ＡＷＤＤＳＬＮＸ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｖ（配列番号５９８）（ここで、Ｘ_１は、ＡおよびＨからなる群から選択され、Ｘ_２は、Ｖ、ＤおよびＧからなる群から選択され、特に、Ｘ_２は、ＶおよびＤからなる群から選択され、Ｘ_３は、ＩおよびＹからなる群から選択され、Ｘ_４は、ＰおよびＶからなる群から選択される）を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域を含む。

【0104】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、前記で定義されたＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域と、前記で定義されたＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域とを含む。

【0105】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、配列ＳＧＹＳＳＳＷＦＤＰＤＦＤＹ（配列番号６４）を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域を含む。

【0106】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、配列Ｘ_１ＳＹＸ_２ＧＸ_３ＮＰＹＶＶ（配列番号５９９）（ここで、Ｘ_１は、ＳおよびＱからなる群から選択され、Ｘ_２は、ＥおよびＡからなる群から選択され、特に、Ｘ_３は、Ｐ、ＩおよびＳからなる群から選択される）を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域を含む。

【0107】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、前記で定義されたＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域と、前記で定義されたＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域とを含む。

【0108】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、配列ＳＹＸ_１ＭＸ_２（配列番号５８８）（ここで、Ｘ_１はＧおよびＡから選択され、Ｘ_２はＨ、ＳおよびＬから選択される）を含むＨ－ＣＤＲ１を含む重鎖抗原結合性領域を含む。特に、重鎖抗原結合性領域は、配列ＳＹＡＭＸ（配列番号５８９）（ここで、ＸはＳおよびＬから選択される）を含むＨ－ＣＤＲ１を含む。

【0109】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、配列ＡＩＧＸ_１ＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＸ_２Ｇ（配列番号５９０）（ここで、Ｘ_１はＴおよびＹから選択され、Ｘ_２はＫおよびＭから選択される）を含むＨ－ＣＤＲ２を含む重鎖抗原結合性領域を含む。特に、重鎖抗原結合性領域は、配列ＡＩＧＸＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５９１）（ここで、ＸはＴおよびＹから選択される）を含むＨ－ＣＤＲ２を含む。

【0110】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、配列ＲＤＤＹＴＳＲＤＡＦＤＸ（配列番号５９４）（ここで、Ｘは、ＹおよびＶからなる群から選択される）を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域を含む。特に、ＸはＹである。

【0111】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、前記で定義されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２およびＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域を含む。

【0112】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、配列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＴＶＮ（配列番号４６）を含むＬ－ＣＤＲ１を含む軽鎖抗原結合性領域を含む。

【0113】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、配列ＹＤＤＬＸＰＳ（配列番号５９６）（ここで、ＸはＬおよびＲから選択される）を含むＬ－ＣＤＲ２を含む軽鎖抗原結合性領域を含む。特に、軽鎖抗原結合性領域は、配列ＹＤＤＬＲＰＳ（配列番号１２７）を含むＬ－ＣＤＲ２を含む。

【0114】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、配列Ｘ_１ＡＷＤＤＳＬＮＸ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｖ（配列番号５９８）（ここで、Ｘ_１は、ＡおよびＨからなる群から選択され、Ｘ_２は、Ｖ、ＤおよびＧからなる群から選択され、特に、Ｘ_２は、ＶおよびＤからなる群から選択され、Ｘ_３は、ＩおよびＹからなる群から選択され、Ｘ_４は、ＰおよびＶからなる群から選択される）を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域を含む。

【0115】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、前記で定義されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２およびＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域を含む。

【0116】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、前記で定義されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２およびＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域と、前記で定義されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２およびＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域とを含む。

【0117】

特定のそのような実施形態においては、（配列番号１２１の参照ＶＨドメインの残基３０に対応する）Ｈ－ＣＤＲ１の５’末端に直接隣接するアミノ酸残基はＳまたはＹである。

【0118】

特定の他の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、配列ＳＹＥＭＮ（配列番号６２）を含むＨ－ＣＤＲ１を含む重鎖抗原結合性領域を含む。

【0119】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、配列ＧＩＳＷＮＳＧＸ_１ＩＸ_２ＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５９２）（ここで、Ｘ_１はＷおよびＳから選択され、Ｘ_２はＧおよびＤから選択される）を含むＨ－ＣＤＲ２を含む重鎖抗原結合性領域を含む。特に、重鎖抗原結合性領域は、配列ＧＩＳＷＮＳＧＷＩＸＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５９３）（ここで、ＸはＧおよびＤから選択される）を含むＨ－ＣＤＲ２を含む。

【0120】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、配列ＳＧＹＳＳＳＷＦＤＰＤＦＤＹ（配列番号６４）を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域を含む。

【0121】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、前記で定義されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２およびＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域を含む。

【0122】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、配列ＴＧＳＳＳＸＩＧＡＧＹＤＶＨ（配列番号５９５）（ここで、Ｘは、ＮおよびＤから選択される）を含むＬ－ＣＤＲ１を含む軽鎖抗原結合性領域を含む。

【0123】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、配列ＧＸＳＮＲＰＳ（配列番号５９７）（ここで、ＸはＮおよびＡから選択される）を含むＬ－ＣＤＲ２を含む軽鎖抗原結合性領域を含む。

【0124】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、配列Ｘ_１ＳＹＸ_２ＧＸ_３ＮＰＹＶＶ（配列番号５９９）（ここで、Ｘ_１は、ＳおよびＱからなる群から選択され、Ｘ_２は、ＥおよびＡからなる群から選択され、Ｘ_３は、Ｐ、ＩおよびＳからなる群から選択される）を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域を含む。特に、Ｘ_３は、ＰおよびＩからなる群から選択される。

【0125】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、前記で定義されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２およびＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域を含む。

【0126】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、前記で定義されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２およびＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域と、前記で定義されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２およびＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域とを含む。

【0127】

特定のそのような実施形態においては、（配列番号１０１の参照ＶＨドメインの残基２８～３０に対応する）Ｈ－ＣＤＲ１の５’末端に直接隣接する３つのアミノ酸残基はＸ_１ＦＸ_２であり、ここで、Ｘ_１はＴおよびＤから選択され、Ｘ_２はＳおよびＤから選択される。

【0128】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは以下のものを含む：
ｉ）配列番号４４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域および配列番号４８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｉｉ）配列番号６４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域および配列番号６８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または。

【0129】

ｉｉｉ）配列番号１０４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域および配列番号１０８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｉｖ）配列番号１２４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域および配列番号１２８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｖ）配列番号１４４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域および配列番号１４８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｖｉ）配列番号１６４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域および配列番号１６８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｖｉｉ）配列番号１８４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域および配列番号１８８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｖｉｉｉ）配列番号２０４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域および配列番号２０８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｉｘ）配列番号２２４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域および配列番号２２８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘ）配列番号２４４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域および配列番号２４８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｉ）配列番号２６４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域および配列番号２６８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｉｉ）配列番号２８４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域および配列番号２８８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｉｉｉ）配列番号３０４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域および配列番号３０８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｉｖ）配列番号３２４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域および配列番号３２８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｖ）配列番号３４４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域および配列番号３４８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｖｉ）配列番号３６４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域および配列番号３６８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｖｉｉ）配列番号３８４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域および配列番号３８８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｖｉｉｉ）配列番号４０４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域および配列番号４０８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｉｘ）配列番号４２４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域および配列番号４２８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｘ）配列番号４４４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域および配列番号４４８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｘｉ）配列番号４６４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域および配列番号４６８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｘｉｉ）配列番号４８４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域および配列番号４８８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｘｉｉｉ）配列番号５０４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域および配列番号５０８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｘｉｖ）配列番号５２４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域および配列番号５２８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｘｖ）配列番号５４４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域および配列番号５４８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｘｖｉ）配列番号５６４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域および配列番号５６８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域。

【0130】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、配列番号４２、６２、１０２、１２２、１４２、１６２、１８２、２０２、２２２、２４２、２６２、２８２、３０２、３２２、３４２、３６２、３８２、４０２、４２２、４４２、４６２、４８２、５０２、５２２、５４２および５６２のいずれか１つを含むＨ－ＣＤＲ１を含む重鎖抗原結合性領域を含む。。

【0131】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、配列番号４３、６３、１０３、１２３、１４３、１６３、１８３、２０３、２２３、２４３、２６３、２８３、３０３、３２３、３４３、３６３、３８３、４０３、４２３、４４３、４６３、４８３、５０３、５２３、５４３および５６３のいずれか１つを含むＨ－ＣＤＲ２を含む重鎖抗原結合性領域を含む。。

【0132】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、配列番号４６、６６、１０６、１２６、１４６、１６６、１８６、２０６、２２６、２４６、２６６、２８６、３０６、３２６、３４６、３６６、３８６、４０６、４２６、４４６、４６６、４８６、５０６、５２６、５４６および５６６のいずれか１つを含むＬ－ＣＤＲ１を含む軽鎖抗原結合性領域を含む。

【0133】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、配列番号４７、６７、１０７、１２７、１４７、１６７、１８７、２０７、２２７、２４７、２６７、２８７、３０７、３２７、３４７、３６７、３８７、４０７、４２７、４４７、４６７、４８７、５０７、５２７、５４７および５６７のいずれか１つを含むＬ－ＣＤＲ２を含む軽鎖抗原結合性領域を含む。

【0134】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは以下のものを含む：
ｉ）配列番号４２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号４３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号４４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号４６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号４７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号４８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｉｉ）配列番号６２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号６３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号６４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号６６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号６７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号６８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｉｉｉ）配列番号１０２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号１０３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号１０４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号１０６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１０７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号１０８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｉｖ）配列番号１２２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号１２３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号１２４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号１２６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１２７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号１２８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｖ）配列番号１４２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号１４３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号１４４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号１４６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１４７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号１４８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｖｉ）配列番号１６２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号１６３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号１６４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号１６６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１６７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号１６８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｖｉｉ）配列番号１８２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号１８３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号１８４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号１８６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１８７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号１８８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｖｉｉｉ）配列番号２０２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号２０３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号２０４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号２０６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号２０７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号２０８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｉｘ）配列番号２２２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号２２３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号２２４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号２２６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号２２７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号２２８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘ）配列番号２４２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号２４３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号２４４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号２４６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号２４７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号２４８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｉ）配列番号２６２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号２６３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号２６４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号２６６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号２６７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号２６８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｉｉ）配列番号２８２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号２８３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号２８４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号２８６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号２８７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号２８８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｉｉｉ）配列番号３０２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号３０３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号３０４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号３０６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号３０７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号３０８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｉｖ）配列番号３２２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号３２３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号３２４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号３２６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号３２７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号３２８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｖ）配列番号３４２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号３４３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号３４４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号３４６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号３４７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号３４８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｖｉ）配列番号３６２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号３６３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号３６４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号３６６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号３６７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号３６８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｖｉｉ）配列番号３８２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号３８３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号３８４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号３８６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号３８７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号３８８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｖｉｉｉ）配列番号４０２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号４０３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号４０４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号４０６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号４０７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号４０８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｉｘ）配列番号４２２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号４２３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号４２４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号４２６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号４２７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号４２８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｘ）配列番号４４２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号４４３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号４４４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号４４６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号４４７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号４４８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｘｉ）配列番号４６２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号４６３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号４６４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号４６６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号４６７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号４６８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｘｉｉ）配列番号４８２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号４８３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号４８４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号４８６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号４８７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号４８８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｘｉｉｉ）配列番号５０２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号５０３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号５０４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号５０６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号５０７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号５０８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｘｉｖ）配列番号５２２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号５２３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号５２４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号５２６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号５２７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号５２８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｘｖ）配列番号５４２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号５４３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号５４４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号５４６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号５４７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号５４８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域；または
ｘｘｖｉ）配列番号５６２を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号５６３を含むＨ－ＣＤＲ２および配列番号５６４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合性領域ならびに配列番号５６６を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号５６７を含むＬ－ＣＤＲ２および配列番号５６８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合性領域。

【0135】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは以下のものを含む：
ｉ）配列番号４１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号４５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｉｉ）配列番号６１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号６５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｉｉｉ）配列番号１０１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号１０５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｉｖ）配列番号１２１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号１２５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｖ）配列番号１４１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号１４５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｖｉ）配列番号１６１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号１６５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｖｉｉ）配列番号１８１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号１８５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｖｉｉｉ）配列番号２０１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号２０５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｉｘ）配列番号２２１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号２２５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘ）配列番号２４１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号２４５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｉ）配列番号２６１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号２６５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｉｉ）配列番号２８１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号２８５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｉｉｉ）配列番号３０１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３０５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｉｖ）配列番号３２１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３２５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｖ）配列番号３４１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３４５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｖｉ）配列番号３６１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３６５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｖｉｉ）配列番号３８１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３８５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｖｉｉｉ）配列番号４０１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号４０５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｉｘ）配列番号４２１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号４２５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｘ）配列番号４４１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号４４５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｘｉ）配列番号４６１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号４６５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｘｉｉ）配列番号４８１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号４８５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｘｉｉｉ）配列番号５０１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号５０５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｘｉｖ）配列番号５２１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号５２５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｘｖ）配列番号５４１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号５４５を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｘｖｉ）配列番号５６１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号５６５を含む可変軽鎖ドメイン。

【0136】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体はＩｇＧ抗体である。特定のそのような実施形態においては、本発明による単離された抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体である。最も詳細には、本発明による単離された抗体はＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体である。

【0137】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体は以下のものを含む：
ｉ）配列番号５７を含む重鎖および配列番号５８を含む軽鎖；または
ｉｉ）配列番号７７を含む重鎖および配列番号７８を含む軽鎖；または
ｉｉｉ）配列番号１１７を含む重鎖および配列番号１１８を含む軽鎖；または
ｉｖ）配列番号１３７を含む重鎖および配列番号１３８を含む軽鎖；または
ｖ）配列番号１５７を含む重鎖および配列番号１５８を含む軽鎖；または
ｖｉ）配列番号１７７を含む重鎖および配列番号１７８を含む軽鎖；または
ｖｉｉ）配列番号１９７を含む重鎖および配列番号１９８を含む軽鎖；または
ｖｉｉｉ）配列番号２１７を含む重鎖および配列番号２１８を含む軽鎖；または
ｉｘ）配列番号２３７を含む重鎖および配列番号２３８を含む軽鎖；または
ｘ）配列番号２５７を含む重鎖および配列番号２５８を含む軽鎖；または
ｘｉ）配列番号２７７を含む重鎖および配列番号２７８を含む軽鎖；または
ｘｉｉ）配列番号２９７を含む重鎖および配列番号２９８を含む軽鎖；または
ｘｉｉｉ）配列番号３１７を含む重鎖および配列番号３１８を含む軽鎖；または
ｘｉｖ）配列番号３３７を含む重鎖および配列番号３３８を含む軽鎖；または
ｘｖ）配列番号３５７を含む重鎖および配列番号３５８を含む軽鎖；または
ｘｖｉ）配列番号３７７を含む重鎖および配列番号３７８を含む軽鎖；または
ｘｖｉｉ）配列番号３９７を含む重鎖および配列番号３９８を含む軽鎖；または
ｘｖｉｉｉ）配列番号４１７を含む重鎖および配列番号４１８を含む軽鎖；または
ｘｉｘ）配列番号４３７を含む重鎖および配列番号４３８を含む軽鎖；または
ｘｘ）配列番号４５７を含む重鎖および配列番号４５８を含む軽鎖；または
ｘｘｉ）配列番号４７７を含む重鎖および配列番号４７８を含む軽鎖；または
ｘｘｉｉ）配列番号４９７を含む重鎖および配列番号４９８を含む軽鎖；または
ｘｘｉｉｉ）配列番号５１７を含む重鎖および配列番号５１８を含む軽鎖；または
ｘｘｉｖ）配列番号５３７を含む重鎖および配列番号５３８を含む軽鎖；または
ｘｘｖ）配列番号５５７を含む重鎖および配列番号５５８を含む軽鎖；または
ｘｘｖｉ）配列番号５７７を含む重鎖および配列番号５７８を含む軽鎖。

【0138】

特定の実施形態においては、本発明による抗原結合性フラグメントはｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’フラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントである。

【0139】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントはモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントである。

【0140】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントはヒト抗体、ヒト化抗体もしくはキメラ抗体またはその抗原結合性フラグメント、より詳細には、完全ヒト抗体またはその抗原結合性フラグメントである。

【0141】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは単一特異性抗体である。特定の他の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、Ｓｅｍａ３Ａおよび少なくとも１つの追加的な抗原に結合する多重特異性抗体、例えば二重特異性、三重特異性または四重特異性抗体である。

【0142】

もう１つの態様においては、本発明は、ヒトＳｅｍａ３Ａへの結合に関して本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントと競合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントに関する。

【0143】

もう１つの態様においては、本発明は、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントを含む抗体コンジュゲートに関する。例えば、抗体は細胞毒性物質、免疫毒素、トキソフォア（毒素族）または放射性同位体にコンジュゲート化されうる。検出可能なマーカーにコンジュゲート化された抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体も提供する。好ましいマーカーは放射能標識、酵素、発色団または発蛍光団である。抗体は、高分子量分子、例えばペプチドまたはタンパク質、例えばインターロイキンにもコンジュゲート化されうる。

【0144】

本発明によるＡＤＣは、１以上の細胞毒性物質、例えば化学療法剤または薬物、増殖抑制物質、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物もしくは動物に由来する酵素的に活性な毒素またはその断片）または放射性同位体にコンジュゲート化された抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体を含む。

【0145】

１つの実施形態においては、本発明によるＡＤＣは、メイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号、第５，４１６，０６４号および欧州特許第ＥＰ０４２５２３５号を参照されたい）（これらに限定されるものではない）；アウリスタチン、例えばモノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥおよびＤＦ（ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦ）（米国特許第５，６３５，４８３号、第５，７８０，５８８号および第７，４９８，２９８号を参照されたい）；ドラスタチン；カリケアマイシンまたはその誘導体；アントラサイクリン、例えばダウノマイシンまたはドキソルビシン；メトトレキサート；ビンデシン；タキサン、例えばドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセルおよびオルタタキセル；トリコテセン；ならびにＣＣ１０６５を含む１以上の薬物にコンジュゲート化された、本明細書に記載されている抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体を含む。

【0146】

もう１つの実施形態においては、本発明によるＡＤＣは、酵素的に活性な毒素またはその断片、限定的なものではないが例えばジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖［シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来］、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、アメリカヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（Ｐ ＡＰＩ、Ｐ ＡＰＩＩおよびＰＡＰ－Ｓ）、ニガウリ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）インヒビター、クルシン、クロチン、サボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビター、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンにコンジュゲート化された、本明細書に記載されている抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体を含む。

【0147】

もう１つの実施形態においては、本発明によるＡＣＤは、放射性コンジュゲートを形成するように放射性原子にコンジュゲート化された、本明細書に記載されている抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体を含む。放射性コンジュゲートの製造には、種々の放射性同位体が利用可能である。具体例には、２２７Ｔｈ、２２５Ａｃ、２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ、２１２Ｐｂ、およびＬｕの放射性同位体が含まれる。放射性コンジュゲートを検出に使用する場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばＴｃ９９ｍ、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング用のスピンラベル、例えば、再びヨウ素１２３、ヨウ素１３１、インジウム１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄を含みうる。

【0148】

抗体と細胞毒性物質とのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミダートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス－アジド化合物（例えば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアナート（例えば、トルエン２，６－ジイソシアナート）、およびビス－活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）を使用して製造されうる。

【0149】

リンカーは、細胞内での細胞毒性薬の遊離を促進する「切断可能リンカー」でありうる。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：１２７－１３１（１９９２））が挙げられる。

【0150】

本発明によるＡＣＤには、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣおよびスルホ－ＳＭＰＢならびにＳＶＳＢ（スクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）ベンゾアート）（これらは、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａから商業的に入手可能である）（これらに限定されるものではない）を含む架橋試薬を使用して製造されるものが含まれる。

【0151】

本発明による好ましい抗体および３つの従来技術の抗体のアミノ酸配列および核酸配列を表１および表１Ａに列挙する。

【0152】

ペプチド変異体
本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、本明細書において提供される特定のペプチド配列に限定されるものではない。むしろ、本発明はこれらのポリペプチドの変異体をも包含する。本開示および従来利用可能な技術および参考文献を参照して、当業者は、本明細書に開示されている抗体の機能的変異体を製造し、試験し、および使用することが可能であり、一方、Ｓｅｍａ３Ａに結合する能力を有するこれらの変異体は本発明の範囲内に含まれると理解される。

【0153】

変異体には、例えば、開示されているペプチド配列と比較して改変した少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）（超可変）および／またはフレームワーク（ＦＲ）（可変）ドメイン／位置を有する抗体が含まれうる。

【0154】

ＣＤＲまたはＦＲ領域内の１以上のアミノ酸残基を改変することによって、当業者は、突然変異または多様化した抗体配列を常套的に生成させることが可能であり、これを、例えば新規特性または改善された特性に関して、抗原に対してスクリーニングすることが可能である。

【0155】

本発明のもう１つの好ましい実施形態は、ＶＨ配列およびＶＬ配列が、表１および表１Ａに示されているとおりに選択される、抗体またはその抗原結合性フラグメントである。当業者は表１および表１Ａにおけるデータを使用して、本発明の範囲内であるペプチド変異体を設計することが可能である。変異体は、１以上のＣＤＲ領域におけるアミノ酸を変化させることによって構築されることが好ましく、変異体は１以上の改変フレームワーク領域をも有しうる。例えば、生殖系列配列と比較して残基における逸脱が存在する、ペプチドＦＲドメインが変更されうる。

【0156】

あるいは、当業者は、例えばＫｎａｐｐｉｋ Ａ．ら，ＪＭＢ ２０００，２９６：５７－８６に記載されている手順を用いて、本明細書に開示されているアミノ酸配列をそのような抗体の同じクラスの既知配列と比較することによって、同じ分析を行うことが可能であろう。

【0157】

更に、更なる最適化のための出発点として１つの抗体を使用し、該抗体における１以上のアミノ酸残基、好ましくは、１以上のＣＤＲにおけるアミノ酸残基を多様化させることによって、そして、得られた抗体変異体集合体を、改善した特性を有する変異体に関してスクリーニングすることによって、変異体が得られうる。特に好ましいのは、ＶＬおよび／またはＶＨのＣＤＲ３における１以上のアミノ酸残基の多様化である。多様化は、例えば、トリヌクレオチド突然変異誘発（ＴＲＩＭ）技術を用いてＤＮＡ分子の集合体を合成することによって行われうる（Ｖｉｒｎｅｋａｓ Ｂ．ら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４，２２：５６００）。抗体またはその抗原結合性フラグメントには、例えば、半減期の変化をもたらす修飾（例えば、Ｆｃ部分の修飾、またはＰＥＧのような追加的な分子の結合）、結合アフィニティの変化をもたらす修飾またはＡＤＣＣもしくはＣＤＣ活性の変化をもたらす修飾（これらに限定されるものではない）を含む修飾／変異を有する分子が含まれる。

【0158】

保存的アミノ酸変異体
本明細書に記載されている抗体ペプチド配列の全体的な分子構造を保持するポリペプチド変異体が製造されうる。個々のアミノ酸の特性を考慮して、幾つかの合理的な置換が当業者によって認識されるであろう。アミノ酸置換、すなわち「保存的置換」は、例えば、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性における類似性に基づいて行われうる。

【0159】

例えば、（ａ）無極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる。（ｂ）極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。（ｃ）正荷電（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが含まれる。（ｄ）負荷電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。置換は、典型的には、グループ（ａ）～（ｄ）内で行われうる。また、グリシンおよびプロリンは、α－ヘリックスを破壊するそれらの能力に基づいて、相互に置換されうる。同様に、アラニン、システイン、ロイシン、メチオニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジンおよびリジンのような特定のアミノ酸は、αヘリックスにおいて、より一般的に見出され、一方、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびスレオニンは、β－プリーツシートにおいて、より一般的に見出される。グリシン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギンおよびプロリンが順によく見出される。幾つかの好ましい置換は以下のグループ内で行われうる：（ｉ）ＳおよびＴ；（ｉｉ）ＰおよびＧ；ならびに（ｉｉｉ）Ａ、Ｖ、ＬおよびＩ。既知の遺伝暗号ならびに組換えおよび合成ＤＮＡ技術があれば、熟練した科学者は、保存的アミノ酸変異体をコードするＤＮＡを容易に構築することが可能である。

【0160】

グリコシル化変異体
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合している炭水化物は改変されうる。哺乳類細胞によって産生される天然抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＫａｂａｔ ＥＵ番号付けを用いた場合のＡｓｎ２９７へのＮ結合によって一般に結合している分枝状二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：２６－３２（１９９７）を参照されたい。

【0161】

特定の実施形態においては、本明細書において提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるために改変される。抗体に対するグリコシル化部位の付加または欠失は、発現系（例えば、宿主細胞）を改変することによって、および／または１以上のグリコシル化部位が生成もしくは除去されるようにアミノ酸配列を改変することによって、簡便に達成されうる。

【0162】

本発明の１つの実施形態においては、低下したエフェクター機能を有するアグリコシル抗体または抗体誘導体が原核生物宿主における発現によって製造される。適切な原核生物宿主には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ならびにシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属内の種々の種が含まれるが、これらに限定されるものではない。

【0163】

１つの実施形態においては、低下したエフェクター機能を有する抗体変異体を提供し、これは、該抗体のＦｃ部分のＣＨ２ドメイン内の保存されたＮ結合部位における修飾によって特徴付けられる。本発明の１つの実施形態においては、修飾は、重鎖グリコシル化部位におけるグリコシル化を妨げるための、その部位における突然変異を含む。したがって、本発明の好ましい１つの実施形態においては、アグリコシル抗体または抗体誘導体は、重鎖グリコシル化部位の突然変異、すなわち、Ｋａｂａｔ ＥＵ番号付けを用いた場合のＮ２９７の突然変異によって製造され、適切な宿主細胞において発現される。

【0164】

本発明のもう１つの実施形態においては、アグリコシル抗体または抗体誘導体は、低下したエフェクター機能を有し、ここで、該抗体または抗体誘導体のＦｃ部分のＣＨ２ドメイン内の保存されたＮ結合部位における修飾は、ＣＨ２ドメイングリカンの除去、すなわち、脱グリコシル化を含む。これらのアグリコシル抗体は通常の方法によって作製され、次いで酵素的に脱グリコシル化されうる。抗体の酵素的脱グリコシル化の方法は当技術分野で周知である（例えば、Ｗｉｎｋｅｌｈａｋｅ ＆ Ｎｉｃｏｌｓｏｎ（１９７６），Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２５１（４）：１０７４－８０）。

【0165】

本発明のもう１つの実施形態においては、脱グリコシル化は、グリコシル化インヒビターであるツニカマイシンを使用して達成されうる（Ｎｏｓｅ ＆ Ｗｉｇｚｅｌｌ（１９８３），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８０（２１）：６６３２－６）。すなわち、修飾は、該抗体のＦｃ部分のＣＨ２ドメイン内の保存されたＮ結合部位におけるグリコシル化の防止である。

【0166】

１つの実施形態においては、Ｆｃ領域に（直接的または間接的に）結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体変異体を提供する。例えば、そのような抗体におけるフコースの量は１％～８０％、１％～６５％、５％～６５％、または２０％～４０％でありうる。フコースの量は、例えばＷＯ ２００８／０７７５４６に記載されているとおりに、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法で測定される、Ａｓｎ２９７に結合した全ての糖構造（例えば、複合体、ハイブリッドおよび高マンノース構造）の合計に対するＡｓｎ２９７における糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域における約２９７位（Ｆｃ領域残基のＥｕ番号付け）に位置するアスパラギン残基を意味する。しかし、Ａｓｎ２９７は、抗体におけるわずかな配列変異ゆえに、２９７位の約±３アミノ酸上流または下流、すなわち２９４位と３００位との間に位置しうる。そのようなフコシル化変異体は、改善したＡＤＣＣ機能を有しうる。

【0167】

「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体変異体に関連する刊行物の例には、Ｏｋａｚａｋｉら Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９－１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉら Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が含まれる。

【0168】

脱フコシル化抗体を産生しうる細胞株の例には、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３－５４５（１９８６）；およびＷＯ ２００４／０５６３１２）およびノックアウト細胞株、α－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉら Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０－６８８（２００６））が含まれる。

【0169】

更に、二分岐（ｂｉｓｅｃｔｅｄ）オリゴ糖を有する抗体変異体を提供し、例えば、この場合、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている。そのような抗体変異体は、低減したフコシル化および／または改善したＡＤＣＣ機能を有しうる。そのような抗体変異体の例は、例えば、ＷＯ ２００３／０１１８７８、米国特許第６，６０２，６８４号およびＵＳ ２００５／０１２３５４６に記載されている。

【0170】

Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖における少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体変異体も提供する。そのような抗体変異体は、改善したＣＤＣ機能を有しうる。そのような抗体変異体は、例えば、ＷＯ １９９７／３００８７、ＷＯ １９９８／５８９６４およびＷＯ １９９９／２２７６４に記載されている。

【0171】

ＦＣ領域変異体
特定の実施形態においては、本明細書において提供される抗体のＦｃ領域（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃ領域）内に１以上のアミノ酸修飾（例えば、置換）を導入し、それにより、Ｆｃ領域変異体を生成させることが可能である。

【0172】

特定の実施形態においては、本発明は、必ずしも全てではないが一部のエフェクター機能を有する抗体変異体を想定しており、これにより、それは、インビボでの抗体の半減期は重要であるが特定のエフェクター機能（例えば、補体およびＡＤＣＣ）は不要または有害である用途のための望ましい候補となる。ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性の低下／枯渇を確認するために、インビトロおよび／またはインビボ細胞傷害性アッセイが行われうる。例えば、抗体がＦｃγＲ結合を欠いている（したがってＡＤＣＣ活性を欠いている可能性がある）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確認するために、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイが行われうる。幾つかの実施形態においては、Ｃ１ｑ結合および／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）の変化（すなわち、改善または減少）をもたらす改変がＦｃ領域に施される。

【0173】

特定の実施形態においては、本発明は、増加または減少した半減期を有する抗体変異体を想定している。増加した半減期、および新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合［これは胎児への母体ＩｇＧの移行をもたらす（Ｇｕｙｅｒら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））］の改善を伴う抗体が、ＵＳ２００５／００１４９３４（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載されている。それらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する１以上の置換をそれにおいて有するＦｃ領域を含む。

【0174】

抗体の作製
本発明の抗体は、多数の健康なボランティアの抗体から単離されたアミノ酸配列に基づく組換え抗体ライブラリーから誘導されうる。例えば、ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）技術を用いて、完全ヒトＣＤＲを新たな抗体分子へと組換える（Ｃａｒｌｓｏｎ ＆ Ｓｏｄｅｒｌｉｎｄ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ．２００１ Ｍａｙ；１（１）：１０２－８）。あるいは、例えば、Ｈｏｅｔ ＲＭら，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００５；２３（３）：３４４－８に記載されている完全ヒト抗体ファージディスプレイライブラリーとしての抗体ライブラリーを使用して、Ｓｅｍａ３Ａ特異的抗体を単離することが可能である。ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体フラグメントは本明細書においてヒト抗体またはヒト抗体フラグメントとみなされる。

【0175】

更に、ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答して無傷ヒト抗体またはヒト可変領域含有無傷抗体を産生するように修飾されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって製造されうる。そのような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座と置き換わる又は染色体外に存在する若しくは動物の染色体内にランダムに組み込まれるヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含む。例えば、遺伝子操作されたマウスの免疫化、とりわけ、ｈＭＡｂマウス（例えば、ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅマウス（登録商標）またはＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標））の免疫化が行われうる。

【0176】

更に、ハイブリドーマ技術（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ Ｎａｔｕｒｅ．１９７５ Ａｕｇ ７；２５６（５５１７）：４９５－７を参照されたい）を使用して抗体が製造可能であり、それにより、例えば、キメラ抗体またはヒト化抗体に変換されうるマウス、ラットまたはウサギ抗体が得られうる。ヒト化抗体およびその製造方法は、例えば、ＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）に概説されており、以下のものに更に詳細に記載されている：Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９－１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、第７，５２７，７９１号、第６，９８２，３２１号および第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５－３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）グラフティングを記載している）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９－４９８（１９９１）（「リサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）」を記載している）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３－６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記載している）；ならびにＯｓｂｏｕｍら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６１－６８（２００５）、およびＫｌｉｍｋａら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングのための「ガイド化（ｇｕｉｄｅｄ）選択」アプローチを記載している）。

【0177】

組換え抗体ライブラリーを使用する抗体の作製の例が提供される。

【0178】

本発明によるＤＮＡ分子
本発明はまた、本発明による抗体または抗原結合性フラグメントをコードする単離された核酸配列に関する。本発明による抗体または抗原結合性フラグメントをコードする単離された核酸配列は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９およびＡｕｓｕｂｅｌら，１９８９に記載されている技術によって、あるいは化学合成［例えば、オリゴヌクレオチド合成（１９８４，Ｇａｉｔ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）に記載されている技術］によって製造されうる。発現される抗体に使用されるＤＮＡ配列およびそれぞれの配列番号を表１および１Ａに示す。これらの配列は、特定の場合には、哺乳類発現用に最適化される。本発明のＤＮＡ分子は、本明細書に開示されている配列に限定されず、その変異体をも含む。本発明に含まれるＤＮＡ変異体は、ハイブリダイゼーションにおけるそれらの物理的特性を参照することによって記載されうる。ＤＮＡを使用して、その相補体を特定することが可能であり、ＤＮＡは二本鎖であるため、核酸ハイブリダイゼーション技術を用いて、その同等物またはホモログを特定することが可能である、と当業者は認識するであろう。また、ハイブリダイゼーションは１００％未満の相補性で生じうることも認識されるであろう。しかし、条件を適切に選択すれば、ハイブリダイゼーション技術を用いて、特定のプローブに対するそれらの構造的関連性に基づいてＤＮＡ配列を識別することが可能である。そのような条件に関する指針は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９（前掲）およびＡｕｓｕｂｅｌら，１９９５（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｄ．，Ｓｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ａ．，＆ Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ．編（１９９５）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）を参照されたい。

【0179】

２つのポリヌクレオチド配列間の構造的類似性は、２つの配列が互いにハイブリダイズする条件の「ストリンジェンシー」の関数として表されうる。本明細書中で用いる「ストリンジェンシー」なる語は、条件がハイブリダイゼーションを妨げる程度を意味する。ストリンジェントな条件はハイブリダイゼーションを強く妨げ、そのような条件下では、最も構造的に関連した分子のみが互いにハイブリダイズする。逆に、非ストリンジェントな条件は、より低い構造的関連性の程度を示す分子のハイブリダイゼーションを促進する。したがって、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、２つの核酸配列の構造的関係と直接的に相関する。

【0180】

ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、全ＤＮＡ濃度、イオン強度、温度、プローブサイズ、および水素結合を破壊する物質の存在を含む多くの因子の関数である。ハイブリダイゼーションを促進する因子には、高いＤＮＡ濃度、高いイオン強度、低い温度、より長いプローブサイズ、および水素結合を破壊する物質の非存在が含まれる。ハイブリダイゼーションは、典型的には、「結合」段階と「洗浄」段階との２つの段階で行われる。

【0181】

機能的に同等なＤＮＡ変異体
本発明の範囲内の更にもう１つのクラスのＤＮＡ変異体は、それらがコードする産物を参照して記載されうる。これらの機能的に同等なポリヌクレオチドは、それらが遺伝暗号の縮重ゆえに同じペプチド配列をコードすることによって特徴付けられる。

【0182】

本明細書で提供されるＤＮＡ分子の変異体は幾つかの異なる方法で構築されうると認識される。例えば、それらは完全合成ＤＮＡとして構築されうる。オリゴヌクレオチドを効率的に合成する方法が広範に利用可能である。Ａｕｓｕｂｅｌら，ｓｅｃｔｉｏｎ ２．１１，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２１（１９９３）を参照されたい。Ｋｈｏｒａｎａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７２：２０９ ２１７（１９７１）に最初に報告された方法で、重複オリゴヌクレオチドが合成され、合体されうる。Ａｕｓｕｂｅｌら（前掲），Ｓｅｃｔｉｏｎ ８．２も参照されたい。合成ＤＮＡは、好ましくは、適切なベクター内へのクローニングを促進するために、遺伝子の５’末端および３’末端に設けられた簡便な制限部位を含有するように設計される。

【0183】

示されているとおり、変異体の作製方法は、本明細書に開示されているＤＮＡの１つから開始し、次いで部位特異的突然変異誘発を行うことである。Ａｕｓｕｂｅｌら（前掲），ｃｈａｐｔｅｒ ８，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ３７（１９９７）を参照されたい。典型的な方法においては、標的ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡバクテリオファージビヒクル内にクローニングする。一本鎖ＤＮＡを単離し、所望のヌクレオチド改変を含有するオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる。相補鎖を合成し、二本鎖ファージを宿主内に導入する。得られた子孫の幾つかは所望の突然変異体を含有し、これを、ＤＮＡ配列決定を用いて確認することが可能である。また、子孫ファージが所望の突然変異体である確率を増加させる種々の方法が利用可能である。これらの方法は当業者によく知られており、そのような突然変異体を作製するためのキットが商業的に入手可能である。

【0184】

組換えＤＮＡ構築物および発現
本発明は更に、本発明によるヌクレオチド配列の１以上を含む組換えＤＮＡ構築物を提供する。本発明の組換え構築物は、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントまたはその変異体をコードするＤＮＡ分子が挿入されるベクター、例えばプラスミド、ファージミド、ファージまたはウイルスベクターと組合せて使用されうる。

【0185】

したがって、１つの態様においては、本発明は、本発明による核酸配列を含むベクターに関する。

【0186】

本明細書において提供される抗体、抗原結合性部分またはその変異体は、軽鎖および重鎖またはその一部をコードする核酸配列の、宿主細胞における組換え発現によって製造されうる。抗体、抗原結合性部分またはその変異体を組換え発現させるために、軽鎖および／または重鎖またはその一部をコードするＤＮＡ断片を含有する１以上の組換え発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトして、宿主細胞内で軽鎖および重鎖を発現させる。標準的な組換えＤＮＡ法を用いて、重鎖および軽鎖をコードする核酸を調製および／または入手し、これらの核酸を組換え発現ベクター内に組み込み、該ベクターを宿主細胞内に導入する。そのような方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ（編），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９）、およびＢｏｓｓらの米国特許第４，８１６，３９７号に記載されている。

【0187】

また、重鎖および／または軽鎖の可変領域をコードする核酸配列は、例えば、完全長抗体鎖、ＦａｂフラグメントまたはｓｃＦｖをコードする核酸配列に変換されうる。ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡ断片は、例えば抗体定常領域または柔軟性リンカーをコードする別のＤＮＡ断片に（それらの２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームとなるように）機能的に連結されうる。ヒト重鎖および軽鎖定常領域の配列は当技術分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２を参照されたい）、これらの領域を含むＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって得られうる。

【0188】

ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチド配列を作製するためには、柔軟性リンカーによって連結されたＶＬ領域とＶＨ領域とを含有する連続的な一本鎖タンパク質としてＶＨ配列およびＶＬ配列が発現されるように、ＶＨおよびＶＬをコードする核酸を、柔軟性リンカーをコードする別の断片に機能的に連結することが可能である（例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２－５５４を参照されたい）。

【0189】

抗体、その抗原結合性フラグメントまたはその変異体を発現させるためには、標準的な組換えＤＮＡ発現法が用いられうる（例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）を参照されたい）。例えば、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを発現ベクター内に挿入し、次いでこれを適切な宿主細胞内にトランスフェクトすることが可能である。適切な宿主細胞は原核細胞および真核細胞である。原核宿主細胞の例としては、例えば細菌が挙げられ、真核宿主細胞の例としては、酵母、昆虫および昆虫細胞、植物および植物細胞、トランスジェニック動物または哺乳類細胞が挙げられる。宿主細胞内への組換え構築物の導入は、標準的な技術、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入またはファージ感染を用いて行われうる。

【0190】

幾つかの実施形態においては、重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡを別々のベクター内に挿入する。他の実施形態においては、重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡを同じベクター内に挿入する。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計は、宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル、発現が構成的であるか誘導的であるかのような要因によって影響を受けると理解される。

【0191】

したがって、もう１つの態様においては、本発明は、本発明による抗体もしくは抗原結合性フラグメントを発現するおよび／または本発明による核酸もしくは本発明によるベクターを含む単離された細胞に関する。

【0192】

単離された細胞は、発現ベクターが利用可能である実質的に任意の細胞でありうる。単離された細胞は、例えば、高等真核宿主細胞、例えば哺乳類細胞、下等真核宿主細胞、例えば酵母細胞であることが可能であり、原核細胞、例えば細菌細胞であることも可能である。

【0193】

もう１つの態様においては、本発明は、本発明による細胞を培養することを含む、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントの製造方法に関する。特定の実施形態においては、本発明による細胞を抗体発現のための適切な条件下で培養し、抗体またはその抗原結合性フラグメントを回収する。特定の実施形態においては、抗体またはその抗原結合性フラグメントを、特に少なくとも９５重量％の均質性まで、精製する。

【0194】

細菌発現
細菌の使用に有用な発現ベクターは、機能的プロモーターの存在下の機能的リーディングフェーズにおける適切な翻訳開始および終結シグナルと共に、所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を挿入することによって構築される。ベクターは、ベクターの維持が確保され、必要に応じて宿主内での増幅がもたらされるように、１以上の表現型選択マーカーおよび複製起点を含む。形質転換のための適切な原核生物宿主には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ならびにシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属内の種々の種が含まれるが、これらに限定されるものではない。

【0195】

細菌ベクターは、例えば、バクテリオファージ、プラスミドまたはファージミドに基づくものでありうる。これらのベクターは、選択マーカーと、よく知られたクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）のエレメントを典型的に含有する商業的に入手可能なプラスミドに由来する細菌複製起点とを含有しうる。適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度への宿主株の増殖の後、選択されたプロモーターを適切な手段（例えば、温度変化または化学的誘導）によって抑制解除／誘導し、細胞を追加的な期間にわたって培養する。典型的には、細胞を遠心分離によって採集し、物理的または化学的手段によって破壊し、得られた粗抽出物を更なる精製のために保存する。

【0196】

細菌系においては、発現されるタンパク質に意図される用途に応じて、多数の発現ベクターが有利に選択されうる。例えば、抗体の作製またはペプチドライブラリーのスクリーニングのためにそのようなタンパク質を大量に製造する場合には、例えば、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を導くベクターが望ましいかもしれない。

【0197】

したがって、本発明の１つの実施形態は、本発明の新規抗体をコードする核酸配列を含む発現ベクターである。

【0198】

本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントまたはその変異体には、天然に精製された産物、化学合成法の産物、および原核生物宿主［例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ならびにシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属内の種々の種を含む］から組換え技術によって産生された産物が含まれる。

【0199】

哺乳類発現
哺乳類宿主細胞発現のための好ましい調節配列には、哺乳類細胞における高レベルのタンパク質発現を導くウイルスエレメント、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーターおよび／またはエンハンサー（例えば、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマが含まれる。抗体の発現は構成的または調節性でありうる（例えば、Ｔｅｔ系と組合されたテトラサイクリンのような小分子誘導因子の添加または除去によって誘導可能）。ウイルス調節エレメントおよびその配列の更なる説明は、例えば、ＳｔｉｎｓｋｉによるＵ．Ｓ．５，１６８，０６２、ＢｅｌｌらによるＵ．Ｓ．４，５１０，２４５およびＳｃｈａｆｆｎｅｒらによるＵ．Ｓ．４，９６８，６１５を参照されたい。組換え発現ベクターは複製起点および選択マーカーをも含みうる（例えば、Ｕ．Ｓ．４，３９９，２１６、４，６３４，６６５およびＵ．Ｓ．５，１７９，０１７を参照されたい）。適切な選択マーカーには、ベクターが導入された宿主細胞における、薬物に対する耐性を付与する遺伝子、例えばＧ４１８、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ブラストサイジン、ゼオシン／ブレオマイシンもしくはメトトレキサート、または栄養要求性を利用する選択マーカー、例えばグルタミンシンセターゼ（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）．１９９２ Ｆｅｂ；１０（２）：１６９－７５）が含まれる。例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子はメトトレキサートに対する耐性を付与し、ｎｅｏ遺伝子はＧ４１８に対する耐性を付与し、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）からのｂｓｄ遺伝子はブラストサイジンに対する耐性を付与し、ピューロマイシンＮ－アセチルトランスフェラーゼはピューロマイシンに対する耐性を付与し、Ｓｈ ｂｌｅ遺伝子産物はゼオシンに対する耐性を付与し、ハイグロマイシンに対する耐性は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｙｇまたはｈｐｈ）によって付与される。また、ＤＨＦＲまたはグルタミンシンセターゼのような選択マーカーは、ＭＴＸおよびＭＳＸと組合された増幅技術に有用である。

【0200】

宿主細胞内への発現ベクターのトランスフェクションは、標準的な技術、縦えばエレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リン酸カルシウム沈降、リポフェクション、ポリカチオンに基づくトランスフェクション、例えばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）に基づくトランスフェクション、およびＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクションを用いて行われうる。

【0201】

本明細書において提供される抗体、その抗原結合性フラグメントまたはその変異体を発現させるための適切な哺乳類宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）、例えばＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ［ＤＨＦＲマーカー、例えばＲ．Ｊ．ＫａｕｆｍａｎおよびＰ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１－６２１に記載されているものと共に使用される、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６－４２２０ならびにＵｒｌａｕｂら，Ｃｅｌｌ．１９８３ Ｊｕｎ；３３（２）：４０５－１２に記載されているｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞；ならびにＦａｎら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２０１２ Ａｐｒ；１０９（４）：１００７－１５に例示されている他のノックアウト細胞を含む］、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＫＢ１１細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＣＡＰ細胞、ＥＢ６６細胞およびＳＰ２細胞が含まれる。

【0202】

また、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ、ＨＥＫ２９３Ｅ、ＨＥＫ２９３－６Ｅ、ＨＥＫ２９３－Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ、ＨＫＢ１１、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ、２９３ＥＢＮＡＬＴ７５、ＣＨＯ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ、ＣＨＯＥＢＮＡＬＴ８５、ＣＨＯＳ－ＸＥ、ＣＨＯ－３Ｅ７またはＣＡＰ－Ｔ細胞のような発現系においては、発現は一過性または半安定性でありうる（例えば、Ｄｕｒｏｃｈｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００２ Ｊａｎ １５；３０（２）：Ｅ９）。

【0203】

幾つかの実施形態においては、発現ベクターは、宿主細胞が増殖する培地内に発現タンパク質が分泌されるように設計される。抗体、その抗原結合性フラグメントまたはその変異体は、標準的なタンパク質精製方法を用いて、培地から回収されうる。

【0204】

精製
本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントまたはその変異体は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、プロテインＡクロマトグラフィー、プロテインＧクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホ－セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィー（これらに限定されるものではない）を含む周知の方法により、組換え細胞培養から回収され、精製されうる。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）も精製に使用されうる。例えば、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｏｒ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．，（１９９７－２００１），例えばＣｈａｐｔｅｒｓ １，４，６，８，９，１０（それぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。

【0205】

本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントまたはその変異体は、天然に精製された産物、化学合成法の産物、ならびに例えば酵母、高等植物、昆虫および哺乳類細胞を含む真核宿主から組換え技術によって産生された産物が含まれる。組換え生産法において使用される宿主に応じて、本発明の抗体はグリコシル化またはアグリコシル化されうる。そのような方法は、多数の標準的な実験マニュアル、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ（前掲），Ｓｅｃｔｉｏｎｓ １７．３７－１７．４２；Ａｕｓｕｂｅｌ（前掲），Ｃｈａｐｔｅｒｓ １０，１２，１３，１６，１８および２０に記載されている。

【0206】

好ましい実施形態においては、抗体は以下の程度まで精製される：（１）例えばローリー（Ｌｏｗｒｙ）法、ＵＶ－Ｖｉｓ分光法またはＳＤＳ－キャピラリーゲル電気泳動（例えば、Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ、ＧＸ９０またはＢｉｏｒａｄ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ装置上）による測定で、９５重量％超の抗体、更に好ましい実施形態においては、９９重量％超の抗体、（２）Ｎ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度、あるいは（３）クーマシーブルーまたは好ましくは銀染色を使用する還元条件または非還元条件下のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる均質状態。単離された天然に存在する抗体には、組換え細胞内のインサイチュの抗体が含まれる。なぜなら、抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないからである。しかし、通常、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程によって調製される。

【0207】

治療方法
治療方法は、本発明によって意図される抗体またはその抗原結合性フラグメントまたはその変異体の治療的有効量を、治療を要する対象に投与することを含む。本明細書における「治療的有効」量は、単独で又は他の物質と組合されて、単一用量として又は複数用量レジメンに従い、対象におけるＳｅｍａ３Ａ活性を低下させるのに十分な量である、抗体またはその抗原結合性フラグメントの量であって、有害状態の軽減をもたらすが毒物学的に許容される量として定義される。対象はヒトまたは非ヒト動物（例えば、ウサギ、ラット、マウス、イヌ、サルまたは他の下等霊長類）でありうる。

【0208】

したがって、１つの態様においては、本発明は、医薬としての使用のための、本発明による単離された抗体もしくは抗原結合性フラグメント、または本発明による単離された抗体もしくは抗原結合性フラグメントを含むコンジュゲート、または本発明による単離された抗体もしくは抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物に関する。

【0209】

本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは種々のＳｅｍａ３Ａ関連障害における治療または診断手段として使用されうる。

【0210】

したがって、もう１つの態様においては、本発明は、腎疾患、特に、急性および慢性腎疾患、糖尿病性腎疾患、アルポート症候群ならびに急性および慢性腎不全の治療および／または予防における使用のための、本発明による単離された抗体もしくは抗原結合性フラグメント、または本発明による単離された抗体もしくは抗原結合性フラグメントを含むコンジュゲート、または本発明による単離された抗体もしくは抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物に関する。一般用語の「腎疾患」または「腎臓疾患」は、腎臓が血液から老廃物を濾過し除去できない病態のクラスを示す。腎疾患には、急性腎疾患（急性腎障害、ＡＫＩ）と慢性腎疾患（ＣＫＤ）との２つの主要な形態がある。本発明による単離された抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたはそれを含むコンジュゲートもしくは医薬組成物は更に、虚血再灌流傷害、放射線造影剤の投与、心肺バイパス手術、ショックおよび敗血症のような複数の傷害から生じる急性腎障害の続発症の治療および／または予防に使用されうる。本発明の文脈においては、腎不全および腎機能不全なる語は以下のものを含む：腎不全の急性および慢性の両方の症状発現、ならびに基礎疾患または関連腎疾患、例えば腎低灌流、透析中低血圧、閉塞性尿路障害、糸球体症、ＩｇＡ腎症、糸球体腎炎、急性糸球体腎炎、糸球体硬化症、尿細管間質性疾患、腎症疾患、例えば原発性腎疾患および先天性腎疾患、腎炎、アルポート症候群、腎炎症、免疫性腎疾患、例えば腎移植拒絶反応、免疫複合体誘発性腎疾患、有毒物質誘発性腎症、造影剤誘発性腎症；微小変化型糸球体腎炎（リポイド）；膜性糸球体腎炎；巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）；溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、アミロイドーシス、グッドパスチャー症候群、ウェゲナー肉芽腫症、シェーンライン－ヘノッホ紫斑病、糖尿病性および非糖尿病性腎症、腎盂腎炎、腎嚢胞、腎硬化症、高血圧性腎硬化症およびネフローゼ症候群；これらは、例えば、クレアチニンおよび／または水分排泄の異常な減少、尿素、窒素、カリウムおよび／またはクレアチニンの血中濃度の異常な増加、グルタミルシンテターゼのような腎酵素の活性の変化、尿浸透圧または尿量の変化、微量アルブミン尿、マクロアルブミン尿の増加、糸球体および細動脈の病変、尿細管拡張、高リン血症および／または透析の必要性によって、診断において特徴付けられうる。本発明はまた、腎不全の続発症、特に肺水腫、心不全、尿毒症、貧血、電解質障害（例えば、高カリウム血症、低ナトリウム血症）、および骨および炭水化物代謝の障害の治療および／または予防における使用のための、本発明による単離された抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたはそれを含むコンジュゲートもしくは医薬組成物に関する。本発明による化合物はまた、多発性嚢胞腎疾患（ＰＣＫＤ）およびＡＤＨ不適切分泌症候群（ＳＩＡＤＨ）の治療および／または予防にも適している。

【0211】

また、本発明による単離された抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたはそれを含むコンジュゲートもしくは医薬組成物は、血管透過性亢進、糖尿病性網膜症、血液網膜関門の悪化および結果として生じる黄斑浮腫、好ましくは加齢黄斑浮腫、非増殖性加齢黄斑浮腫および非増殖性糖尿病性黄斑浮腫の治療および／または予防に使用されうる。

【0212】

更に、本発明による単離された抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたはそれを含むコンジュゲートもしくは医薬組成物は、中枢神経系または末梢神経系の疾患、例えば神経因性疼痛、脊髄損傷、多発性硬化症、外傷性脳損傷、脳浮腫および神経変性疾患の予防または治療に適しており、ここで、神経変性疾患はアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上麻痺、黒色物質変性症、シャイ－ドレーガー症候群、オリーブ橋小脳萎縮症および脊髄小脳変性症である。

【0213】

更に、本発明による単離された抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたはそれを含むコンジュゲートもしくは医薬組成物は癌の治療および／または予防に有用でありうる。ここで、癌は腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、脳癌、黒色腫、腎細胞癌、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頸部の扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌および喉頭癌である。

【0214】

前記の障害はヒトにおいて十分に特徴付けられているが、哺乳動物を含む他の動物にも類似した病因が存在し、本発明による医薬組成物を投与することによって治療されうる。

【0215】

本発明による抗体または抗原結合性フラグメントまたはその変異体は公知医薬と共投与（ｃｏ－ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）されることが可能であり、幾つかの場合には、該抗体またはその抗原結合性フラグメント自体が修飾されうる。例えば、抗体またはその抗原結合性フラグメントまたはその変異体を薬物または別のペプチドもしくはタンパク質に結合させて、有効性を潜在的に更に増強することが可能である。

【0216】

本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントまたはその変異体は、単独の薬剤として、または許容し得ない有害作用を引き起こさない、１以上の追加的な治療用物質との組合せとして投与されうる。

【0217】

したがって、もう１つの態様においては、本発明は、１以上の追加的な治療活性化合物との同時投与、別々の投与または連続的投与のための組合せにおける使用のための、本発明による単離された抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたは本発明によるコンジュゲートまたは本発明による医薬組成物に関する。

【0218】

本発明による抗体または抗原結合性フラグメントと組合せて使用される治療活性化合物の非限定的な例は以下のとおりである。

【0219】

－ 血圧降下剤、例えば、好ましくは、カルシウムアンタゴニスト、アンジオテンシンＩＩアンタゴニスト、ＡＣＥインヒビター、ＮＥＰインヒビター、バソペプチダーゼインヒビター、エンドセリンアンタゴニスト、レニンインヒビター、アルファ－ブロッカー、ベータ－ブロッカー、ミネラルコルチコイド受容体アンタゴニスト及び利尿薬の群からのもの；
－ 抗糖尿病剤（血糖降下または抗高血糖剤）、例えば、好ましくは、インスリンおよび誘導体、スルホニル尿素、ビグアニド、チアゾリジンジオン、アカルボース、ＤＰＰ４インヒビター、ＧＬＰ－１類似体またはＳＧＬＴインヒビター（グリフロジン）；
－ シグナル伝達カスケードを阻害する化合物、特に、チロシンおよび／またはセリン／スレオニンキナーゼインヒビター、例えばニンテダニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ボスチニブ、レゴラフェニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、セジラニブ、アキシチニブ、テラチニブ、イマチニブ、ブリバニブ、パゾパニブ、バタラニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、カネルチニブ、レスタウルチニブ、ペリチニブ、セマキサニブまたはタンデュチニブ；
－ 抗炎症薬、例えば非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、例えばアセチルサリチル酸（アスピリン）、イブプロフェンおよびナプロキセン、グルココルチコイド、例えば、好ましくは、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、デキサメタゾン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、フルニソリド、ブデソニドもしくはフルチカソン、または５－アミノサリチル酸誘導体、ロイコトリエンアンタゴニスト、ＴＮＦ－アルファインヒビターおよびケモカイン受容体アンタゴニスト、例えばＣＣＲ１、２および／または５インヒビター、ＮＦ－κＢインヒビターおよびＮｅｒｆ２アクチベーター；
－ 抗線維化薬、例えばＴＧＦベータアンタゴニストまたはマイクロＲＮＡ－２１インヒビター；
－ 有機ニトラートおよびＮＯ供与体、例えばニトロプルシドナトリウム、ニトログリセリン、一硝酸イソソルビド、二硝酸イソソルビド、モルシドミンまたはＳＩＮ－１および吸入性ＮＯ；
－ 環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）の分解を阻害する化合物、例えば、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）１、２、５および／または９のインヒビター、特にＰＤＥ－５インヒビター、例えばシルデナフィル、バルデナフィル、タダラフィル、ウデナフィル、ダサンタフィル、アバナフィル、ミロデナフィル、ロデナフィル、ＣＴＰ－４９９またはＰＦ－００４８９７９１；
－ カルシウム増感剤、例えば、好ましくは、レボシメンダン；
－ 抗血栓剤、特に、血小板凝集インヒビター、抗凝固剤および線維素溶解物質からなる群から選択されるもの；
－ ＮＯおよびヘム依存性ならびにＮＯおよびヘム非依存性のｃＧＭＰ合成を刺激する物質、例えば、好ましくは、可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）モジュレーター、例えば、好ましくは、リオシグアト、シナシグアト、ベリシグアトまたはＢＡＹ１１０１０４２；
－ 脂肪代謝改変剤、例えば、好ましくは、甲状腺受容体アゴニスト、コレステロール合成インヒビター、例えば、好ましくは、ＨＭＧ－ＣｏＡ－レダクターゼまたはスクアレン合成インヒビター、ＡＣＡＴインヒビター、ＣＥＴＰインヒビター、ＭＴＰインヒビター、ＰＰＡＲ－アルファ、ＰＰＡＲ－ガンマおよび／またはＰＰＡＲ－デルタアゴニスト、コレステロール吸収インヒビター、リパーゼインヒビター、ポリマー胆汁酸吸着剤、胆汁酸再吸収インヒビターおよびリポタンパク質（ａ）アンタゴニストから選択されるもの。

【0220】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、血小板凝集インヒビター、特にアスピリン、クロピドグレル、チクロピジンまたはジピリダモールと組合せて投与される。

【0221】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、トロンビンインヒビター、特にキシメラガトラン、ダビガトラン、メラガトラン、ビバリルジンまたはエノキサパリンと組合せて投与される。

【0222】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト、特にチロフィバンまたはアブシキシマブと組合せて投与される。

【0223】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、第Ｘａ因子インヒビター、特にリバーロキサバン、アピキサバン、オタミキサバン、フィデキサバン、ラザキサバン、フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス、ＤＵ－１７６ｂ、ＰＭＤ－３１１２、ＹＭ－１５０、ＫＦＡ－１９８２、ＥＭＤ－５０３９８２、ＭＣＭ－１７、ＭＬＮ－１０２１、ＤＸ９０６５ａ、ＤＰＣ９０６、ＪＴＶ８０３、ＳＳＲ－１２６５１２およびＳＳＲ－１２８４２８から選択されるものと組合せて投与される。

【0224】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、ヘパリンまたは低分子量（ＬＭＷ）ヘパリン誘導体と組合せて投与される。

【0225】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、ビタミンＫアンタゴニスト、特にクマリンから選択されるものと組合せて投与される。

【0226】

血圧降下剤は、特に、カルシウムアンタゴニスト、アンジオテンシンＡＩＩアンタゴニスト、ＡＣＥインヒビター、ＮＥＰインヒビター、バソペプチダーゼインヒビター、エンドセリンアンタゴニスト、レニンインヒビター、アルファ－ブロッカー、ベータ－ブロッカー、ミネラルコルチコイド受容体アンタゴニストおよび利尿薬からなる群から選択される。

【0227】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、カルシウムアンタゴニスト、特にニフェジピン、アムロジピン、ベラパミルおよびジルチアゼムから選択されるものと組合せて投与される。

【0228】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、アンジオテンシンＡＩＩ受容体アンタゴニスト、特にロサルタン、カンデサルタン、バルサルタン、テルミサルタン、イルベサルタン、オルメサルタン、エプロサルタン、エンブルサルタンおよびアジルサルタンからなる群から選択されるものと組合せて投与される。

【0229】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、ＡＣＥインヒビター、特にエナラプリル、カプトプリル、リシノプリル、ラミプリル、デラプリル、フォシノプリル、キノプリル、ペリンドプリル、ベナゼプリルおよびトランドプリルからなる群から選択されるものと組合せて投与される。

【0230】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、エンドセリンアンタゴニスト、特にボセンタン、ダルセンタン、アンブリセンタン、テゾセンタン、シタクスセンタン、アボセンタン、マシテンタンおよびアトラセンタンからなる群から選択されるものと組合せて投与される。

【0231】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、レニンインヒビター、特にアリスキレン、ＳＰＰ－６００およびＳＰＰ－８００からなる群から選択されるものと組合せて投与される。

【0232】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、ミネラロコルチコイド受容体アンタゴニスト、特にフィネレノン、スピロノラクトン、カンレノン、カンレノ酸カリウム、エプレレノン、エサキセレノン（ＣＳ－３１５０）またはアパラレノン（ＭＴ－３９９５）、ＣＳ－３１５０およびＭＴ－３９９５からなる群から選択されるものと組合せて投与される。

【0233】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、利尿薬、特にフロセミド、ブメタニド、ピレタニド、トルセミド、ベンドロフルメチアジド、クロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、キシパミド、インダパミド、ヒドロフルメチアジド、メチクロチアジド、ポリチアジド、トリクロロメチアジド、クロロタリドン、メトラゾン、キネタゾン、アセタゾラミド、ジクロロフェンアミド、メタゾラミド、グリセリン、イソソルビド、マンニトール、アミロリドおよびトリアムテレンからなる群から選択されるものと組合せて投与される。

【0234】

脂肪代謝改変剤は、特に、ＣＥＴＰインヒビター、甲状腺受容体アゴニスト、コレステロール合成インヒビター、例えばＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼインヒビターまたはスクアレン合成インヒビター、ＡＣＡＴインヒビター、ＭＴＰインヒビター、ＰＰＡＲ－アルファ、ＰＰＡＲ－ガンマおよび／またはＰＰＡＲ－デルタアゴニスト、コレステロール吸収インヒビター、ポリマー胆汁酸吸着剤、胆汁酸再吸収インヒビター、リパーゼインヒビターおよびリポタンパク質（ａ）アンタゴニストからなる群から選択される。

【0235】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、Ｎｅｒｆ２アクチベーター、特にバルドキソロンメチルから選択されるものと組合せて投与される。

【0236】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、甲状腺受容体アゴニスト、特に、Ｄ－チロキシン、３，５，３’－トリヨードサイロニン（Ｔ３）、ＣＧＳ ２３４２５およびアクシチローム（ＣＧＳ ２６２１４）からなる群から選択されるものと組合せて投与される。

【0237】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、スタチンのクラスからのＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼインヒビター、特にロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチンおよびピタバスタチンからなる群から選択されるものと組合せて投与される。

【0238】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、ＰＰＡＲ－ガンマモジュレーター、特にピオグリタゾンおよびロシグリタゾンから選択されるものと組合せて投与される。

【0239】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、ＰＰＡＲ－デルタモジュレーター、特にＡＳＰ１１２８、ＧＷ ５０１５１６およびＢＡＹ ６８－５０４２からなる群から選択されるものと組合せて投与される。

【0240】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、コレステロール吸収インヒビター、特にエゼチミブ、チクエシドおよびパマクエシドからなる群から選択されるものと組合せて投与される。

【0241】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、リパーゼインヒビター、特にオルリスタットから選択されるものと組合せて投与される。

【0242】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、ポリマー胆汁酸吸着剤、特にコレスチラミン、コレスチポール、コレソルバム、コレスタゲル（ＣｈｏｌｅｓｔａＧｅｌ）およびコレスチミドからなる群から選択されるものと組合せて投与される。

【0243】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、胆汁酸再吸収インヒビター、特にＡＳＢＴ（ＩＢＡＴ）インヒビター、例えばＡＺＤ－７８０６、Ｓ－８９２１、ＡＫ－１０５、ＢＡＲＩ－１７４１、ＳＣ－４３５およびＳＣ－６３５からなる群から選択されるものと組合せて投与される。

【0244】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、リポタンパク質（ａ）アンタゴニスト、特にゲムカベンカルシウム（ＣＩ－１０２７）およびニコチン酸からなる群から選択されるものと組合せて投与される。

【0245】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、ＴＧＦベータアンタゴニスト、特にピルフェニドンおよびフレソリムマブから選択されるものと組合せて投与される。

【0246】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、抗マイクロＲＮＡ－２１オリゴヌクレオチド、特にラデミルセンから選択されるものと組合せて投与される。

【0247】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、ＨＩＦ－ＰＨインヒビター、特にモリダスタットおよびロキサデュスタットから選択されるものと組合せて投与される。

【0248】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、ＣＣＲ２アンタゴニスト、特にＣＣＸ－１４０から選択されるものと組合せて投与される。

【0249】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、ＴＮＦアルファアンタゴニスト、特にアダリムマブから選択されるものと組合せて投与される。

【0250】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、ガレクチン－３インヒビター、特にＧＣＳ－１００から選択されるものと組合せて投与される。

【0251】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、肝細胞増殖因子模倣物、特にレファナリンから選択されるものと組合せて投与される。

【0252】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、ｐ５３モジュレーター、特にＱＰＩ－１００２から選択されるものと組合せて投与される。

【0253】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、ＮＯＸ１／４インヒビター、特にＧＫＴ－１３７８３１から選択されるものと組合せて投与される。

【0254】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、ビタミンＤ代謝に影響を及ぼす医薬、特にコレカルシフェロールおよびパラカルシトールから選択されるものと組合せて投与される。

【0255】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、細胞増殖抑制剤、特にシクロホスファミドから選択されるものと組合せて投与される。

【0256】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、抗ＶＥＧＦ療法、特にラニビズマブ、ベバシズマブおよびアフリベルセプトからなる群から選択されるものと組合せて投与される。

【0257】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、免疫抑制剤、特にシクロスポリンから選択されるものと組合せて投与される。

【0258】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、ホスファート結合性物質、特にセベラマーおよび炭酸ランタンから選択されるものと組合せて投与される。

【0259】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、副甲状腺機能亢進症の治療のためにカルシウム模倣薬と組合せて投与される。

【0260】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、鉄欠乏治療用物質、特に鉄製品から選択されるものと組合せて投与される。

【0261】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、高尿酸血症治療用物質、特にアロプリノールおよびラスブリカーゼから選択されるものと組合せて投与される。

【0262】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、貧血の治療のための糖タンパク質ホルモン、特にエリスロポエチンから選択されるものと組合せて投与される。

【0263】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、免疫療法用の生物製剤、特にアバタセプト、リツキシマブ、エクリズマブおよびベリムマブからなる群から選択されるものと組合せて投与される。

【0264】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、Ｊａｋインヒビター、特にルキソリチニブ、トファシチニブ、バリシチニブ、ＣＹＴ３８７、ＧＳＫ２５８６１８４、レスタウルチニブ、パクリチニブ（ＳＢ１５１８）およびＴＧ１０１３４８からなる群から選択されるものと組合せて投与される。

【0265】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、微小血栓の治療のためにプロスタサイクリン類似体と組合せて投与される。

【0266】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、アルカリ療法、特に重炭酸ナトリウムから選択されるものと組合せて投与される。

【0267】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、ｍＴＯＲインヒビター、特にエベロリムスおよびラパマイシンから選択されるものと組合せて投与される。

【0268】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、ＮＨＥ３インヒビター、特にＡＺＤ１７２２から選択されるものと組合せて投与される。

【0269】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、ｅＮＯＳモジュレーター、特にサプロプテリンから選択されるものと組合せて投与される。

【0270】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、ＣＴＧＦインヒビター、特にＦＧ－３０１９から選択されるものと組合せて投与される。

【0271】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、利尿薬、アンジオテンシンＡＩＩアンタゴニスト、ＡＣＥインヒビター、ベータ受容体ブロッカー、ミネラルコルチコイド受容体アンタゴニスト、抗糖尿病薬、有機ニトラートおよびＮＯ供与体、可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）のアクチベーターおよび刺激物質ならびに陽性変力剤からなる群から選択される１以上の追加的な治療用物質と組合せて投与される。

【0272】

特定の実施形態においては、本発明による単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、利尿薬、アンジオテンシンＡＩＩアンタゴニスト、ＡＣＥインヒビター、ベータ受容体ブロッカー、ミネラルコルチコイド受容体アンタゴニスト、抗糖尿病薬、有機ニトラートおよびＮＯ供与体、可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）のアクチベーターおよび刺激物質、陽性変力剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、リン酸結合物質、およびビタミンＤ代謝を調節する抗体からなる群から選択される１以上の追加的な治療用物質と組合せて投与される。

【0273】

併用（組合せ）療法は、本発明による抗体または抗原結合性フラグメントまたはその変異体と１以上の追加的な治療用物質とを含む単一の医薬投与製剤の投与、および本発明による抗体または抗原結合性フラグメントとそれぞれの追加的な治療用物質との、それ自体の別々の医薬投与製剤における投与を含む。例えば、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントまたはその変異体と治療用物質とは単一の液体組成物において一緒に患者に投与可能であり、あるいは各物質は別々の投与製剤において投与可能である。

【0274】

別々の投薬製剤を使用する場合、本発明による抗体または抗原結合性フラグメントまたはその変異体と１以上の追加的な治療用物質とは、実質的に同じ時点で（例えば、同時に）または別々に時間差を付けて（例えば、連続的に）投与されうる。

【0275】

本発明による抗体または抗原結合性フラグメントまたはその変異体は、以下のもの（それらに限定されるものではない）を含む外科的介入と組合せて使用されうる：
－ 主要な心臓血管手術、例えば冠状動脈バイパス移植術（ＣＡＢＧ）、心臓弁の修復または置換、ペースメーカーまたは植込み型除細動器（ＩＣＤ）の挿入、メイズ（ｍａｚｅ）手術、動脈瘤修復、頸動脈手術／血管内膜切除術および血栓除去術；
－ 主要な非心臓手術、例えば、胸部、整形外科、泌尿器科手術。

【0276】

診断方法
更に、本発明による抗体または抗原結合性フラグメントは、それ自体で又は組成物として、研究および診断において又は分析参照標準などとして使用されうる。

【0277】

抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体またはその抗原結合性フラグメントは、Ｓｅｍａ３Ａの存在を検出するために使用されうる。したがって、もう１つの態様においては、本発明は、診断剤としての使用のための、本発明による単離された抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたは本発明による抗体コンジュゲートに関する。

【0278】

医薬組成物および投与
もう１つの態様においては、本発明は、本発明による単離された抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたは本発明による抗体コンジュゲートを含む医薬組成物に関する。前記障害のいずれかを治療するために、本発明による使用のための医薬組成物は、１以上の生理的に許容される担体、賦形剤または補助剤を使用して、任意の通常方法で製剤化されうる。製剤化および投与の技術に関する更なる詳細はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｅｄ．Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）の最新版に見出されうる。

【0279】

本発明による抗体または抗原結合性フラグメントは、治療される障害のタイプに応じて変動しうる任意の適切な手段によって投与されうる。可能な投与経路には、経口、非経口および局所投与が含まれる。非経口送達の方法には、動脈内、筋肉内、皮下、髄内、くも膜下腔内、脳室内、静脈内、腹腔内または鼻腔内投与が含まれる。また、本発明による抗体または抗原結合性フラグメントは、例えば抗体の用量を減少させながら、パルス注入によって投与される。好ましくは、投与は注射によるものであり、最も好ましくは、静脈内注射または皮下注射であり、これは、投与が短期間であるか長期間であるかに部分的に左右される。投与量は、例えば、臨床症状、個体の体重、他の薬剤が投与されるかどうかなどのような種々の要因に左右される。投与経路は、治療される障害または状態に応じて変動する、と当業者は認識するであろう。

【0280】

本発明による医薬組成物は、本発明による抗体または抗原結合性フラグメントを、単独で、または少なくとも１つの他の物質、例えば安定化化合物と共に含む。本発明による抗体または抗原結合性フラグメントは、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロースおよび水（これらに限定されるものではない）を含む任意の無菌の生体適合性医薬担体中で投与されうる。特定の実施形態においては、本発明による医薬組成物は、１以上の追加的な薬学的活性化合物、特に、Ｓｅｍａ３Ａ関連障害を治療するのに適した１以上の追加的な薬学的活性化合物を含みうる。これらの物質はいずれも、賦形剤もしくは薬学的に許容される担体と混合された医薬組成物として、他の物質または薬物と組合せて、または単独で、患者に投与されうる。特定の実施形態においては、薬学的に許容される担体は、薬学的に不活性である。

【0281】

経口投与用の医薬組成物は、当技術分野で周知の薬学的に許容される担体を経口投与に適した量で使用して製剤化されうる。そのような担体は、患者による摂取のための錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして医薬組成物が製剤化されることを可能にする。

【0282】

経口使用のための医薬製剤は、活性化合物を固体賦形剤と一緒にすることによって、そして所望により、得られた混合物を粉砕し、必要に応じて適切な補助剤を添加した後、顆粒混合物を加工して錠剤または糖衣錠コアを得ることによって、得られうる。適切な賦形剤としては、炭水化物またはタンパク質充填剤、例えば糖、例えばラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトール；トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモまたは他の植物からのデンプン；セルロース、例えばメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはカルボキシメチルセルロースナトリウム；およびガム、例えばアラビアゴムおよびトラガカントガム；ならびにタンパク質、例えばゼラチンおよびコラーゲンが挙げられる。所望により、崩壊剤または可溶化剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムが添加されうる。

【0283】

糖衣錠コアには、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液および適切な有機溶媒または溶媒混合物をも含有しうる濃縮糖溶液のような適切なコーティングが施されうる。製品の識別のために、または活性化合物の量、すなわち投与量を特徴付けるために、錠剤または糖衣錠コーティングに染料または色素が添加されうる。

【0284】

経口的に使用されうる医薬製剤には、ゼラチン製のプッシュ－フィット（押込嵌め）カプセル、およびゼラチンとコーティング（例えば、グリセロールまたはソルビトール）とから構成される密封軟カプセルが含まれる。プッシュ－フィットカプセルは、充填剤または結合剤、例えばラクトースまたはデンプン、滑沢剤、例えばタルクまたはステアリン酸マグネシウム、および所望により安定剤と混合された有効成分を含有しうる。軟カプセルにおいては、活性化合物は、安定剤の存在下または非存在下、適切な液体、例えば脂肪油、流動パラフィンまたは液体ポリエチレングリコールに溶解または懸濁されうる。

【0285】

非経口投与用の医薬製剤には、活性化合物の水溶液が含まれる。注射の場合、本発明の医薬組成物は、水溶液、好ましくは、生理的に適合するバッファー、例えばハンクス液、リンガー液または生理緩衝食塩水において製剤化されうる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を高める物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランを含有しうる。また、活性化合物の懸濁液は適切な油性注射懸濁液として調製されうる。適切な親油性溶媒またはビヒクルには、脂肪油、例えばゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチルまたはトリグリセリド、あるいはリポソームが含まれる。所望により、懸濁液は、高濃度溶液の調製を可能にするために化合物の溶解度を増加させる物質または適切な安定剤をも含有しうる。

【0286】

局所または経鼻投与の場合、浸透すべき特定の障壁に適した浸透剤が製剤中で使用される。そのような浸透剤は当技術分野で一般に公知である。

【0287】

本発明の医薬組成物は、当技術分野で公知の方法、例えば、通常の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠製造、粉砕、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥プロセスによって製造されうる。

【0288】

医薬組成物は塩として提供されることが可能であり、酸、例えば塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸など（これらに限定されるものではない）と共に形成されうる。塩は、対応遊離塩基形態である水性溶媒または他のプロトン性溶媒に、より可溶性となる傾向にある。他の場合には、好ましい製剤は、使用前にバッファーと一緒にされる、ポリソルベートのような追加的な物質を所望により含んでいてもよい、４．５～７．５のｐＨ範囲における、１ｍＭ～５０ｍＭのヒスチジンまたはホスファートまたはトリス、０．１％～２％のスクロースおよび／または２％～７％のマンニトール中の凍結乾燥粉末でありうる。

【0289】

許容可能な担体中で製剤化された本発明の化合物を含む医薬組成物を製造した後、それらは適切な容器内に配置され、適応病態の治療に関してラベル表示されうる。抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体またはその抗原結合性フラグメントの投与の場合、そのようなラベルは投与の量、頻度および方法を含むであろう。

【0290】

治療的有効量
本発明による使用に適した医薬組成物には、意図される目的、例えば、Ｓｅｍａ３Ａのレベルまたは活性の増強によって特徴付けられる個々の病態の治療を達成するための有効量の有効成分を含有する組成物が含まれる。

【0291】

有効量の決定は当業者の能力の範囲内に十分に含まれる。本発明の新規抗体またはその抗原結合性フラグメントまたはその変異体の治療的有効量の決定は、個々の患者の特徴、投与経路および治療される障害の性質に大きく左右される。一般的な指針は、例えば、ハーモナイゼーション国際会議（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ）の刊行物およびＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，ｃｈａｐｔｅｒｓ ２７および２８，ｐｐ．４８４－５２８（１８ｔｈ ｅｄ．，Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，１９９０）に見出されうる。より詳細には、治療的有効量の決定は医薬の毒性および有効性のような要因に左右される。毒性は、当技術分野で周知であり前記参考文献において見出される方法を用いて決定されうる。有効性は、後記実施例に記載されている方法と共に同じ指針を用いて決定される。

【0292】

任意の化合物に関して、治療的有効量は、まず、細胞培養アッセイまたは動物モデル（通常はマウス、ウサギ、イヌ、ブタまたはサル）において推定されうる。動物モデルは、望ましい濃度範囲および投与経路を得るためにも使用される。次いでそのような情報は、ヒトにおける有用な用量および投与経路を決定するために使用されうる。

【0293】

治療的有効量は、症状または状態を改善する、抗体またはその抗原結合性フラグメントの量を意味する。そのような化合物の治療的有効性および毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的方法、例えば、ＥＤ_５０（集団の５０％において治療的に有効である用量）およびＬＤ_５０（集団の５０％に致死的な用量）によって決定されうる。治療効果と毒性効果との間の用量比は治療指数であり、それはＥＤ_５０／ＬＤ_５０なる比として表されうる。大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトでの使用のための投与量範囲を決定する際に使用される。そのような化合物の投与量は、好ましくは、毒性をほとんど又は全く伴わないＥＤ_５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用される剤形、患者の感受性および投与経路に応じて、この範囲内で変動する。

【0294】

厳密な投与量は、治療されるべき患者を考慮して個々の医師によって選択される。投与量および投与は、十分なレベルの活性部分を供与するように、または所望の効果を維持するように調整される。考慮されうる追加的な要因には、患者の病態の重症度、年齢、体重および性別；食事；投与の時間および頻度、薬物の組合せ、反応感受性ならびに治療に対する耐性／応答が含まれる。長時間作用型医薬組成物は、個々の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて、例えば３～４日ごと、毎週、２週間に１回または３週間に１回投与されうる。

【0295】

通常の投与量は、投与経路に応じて、総用量約１０ｇまでで、０．１～１００，０００マイクログラムで変動しうる。個々の投与量および送達方法に関する指針は文献に記載されている。米国特許第４，６５７，７６０号、第５，２０６，３４４号または第５，２２５，２１２号を参照されたい。

【0296】

キット
もう１つの態様においては、本発明は、本発明による単離された抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたは本発明によるコンジュゲートと使用説明とを含むキットに関する。特定の実施形態においては、キットは、本発明の前記組成物の成分の１以上が充填された１以上の容器を含む。そのような容器には、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって定められた形式の通知が付属しうる。該通知はヒトへの投与のための製品の製造、使用または販売の政府機関による承認を示すものである。

【図面の簡単な説明】

【0297】

【図1】図１Ａ：マウスにおけるＳｅｍａ３Ａ誘発性アルブミン排泄に対する、ＴＰＰ－１５３７０（灰色のバー）、ＴＰＰ－１１４８９（縞模様のバー）およびＴＰＰ－１７７５５（正方形模様のバー）によるＳｅｍａ３Ａ阻害の効果。平均値±ＳＤ（ｎ＝１０）を示す。^＊＊＊、^＊＊＊＊：ｐ＜０．００１、ｐ＜０．０００１対アイソタイプ対照。ダネットの事後検定。

【0298】

図１Ｂ：マウスにおけるＳｅｍａ３Ａ誘発性アルブミン排泄に対する、ＴＰＰ－２３２９８（灰色のバー）、ＴＰＰ－１１４８９（点模様のバー）およびＴＰＰ－１７７５５（縞模様のバー）によるＳｅｍａ３Ａ阻害の効果。平均値±ＳＤ（ｎ＝１０）を示す。^＊＊＊、^＊＊＊＊：ｐ＜０．００１、ｐ＜０．０００１対アイソタイプ対照。ダネットの事後検定。

【図2】図２Ａ：ＴＰＰ－１１４８９（黒三角）と比較した、ＴＰＰ－１５３７０（白丸）およびＴＰＰ－２３２９８（黒丸）での処置後のマウスにおけるＳｅｍａ３Ａ誘発性アルブミン尿。比較は２つの別々の実験で行われた。平均値を示す。（ｎ＝１０）。ｎ．ｓ．＝ＴＰＰ－１５３７０に対して統計的に有意ではない；^＊＝ｐ＜０．０５対ＴＰＰ－２３２９８。独立Ｔ検定。

【0299】

図２Ｂ：ＴＰＰ－１７７５５（黒四角）と比較した、ＴＰＰ－１５３７０（白丸）およびＴＰＰ－２３２９８（黒丸）での処置後のマウスにおけるＳｅｍａ３Ａ誘発性アルブミン尿。比較は２つの別々の実験で行われた。平均値を示す。（ｎ＝１０）。ｎ．ｓ．＝ＴＰＰ－１５３７０に対して統計的に有意ではない；^＊＝ｐ＜０．０５対ＴＰＰ－２３２９８。独立Ｔ検定。

【0300】

図２Ｃ：ＴＰＰ－３０７８８（黒菱形）と比較した、ＴＰＰ－１５３７０（白丸）およびＴＰＰ－２３２９８（黒丸）での処置後のマウスにおけるＳｅｍａ３Ａ誘発性アルブミン尿。比較は２つの別々の実験で行われた。平均値を示す。（ｎ＝１０）。ｎ．ｓ．＝ＴＰＰ－１５３７０に対して統計的に有意ではない；^＊＝ｐ＜０．０５対ＴＰＰ－２３２９８。独立Ｔ検定。

【図3】マウスにおけるＩ／Ｒ損傷後の、Ａ：血清クレアチニンレベル、Ｂ：血清尿素レベル、およびＣ：尿アルブミン排泄に対する、ＴＰＰ－２３３７４（点模様のバー）、ＴＰＰ－２３２９８（灰色のバー）およびＴＰＰ－１５３７０（縞模様のバー）によるＳｅｍａ３Ａ阻害の効果。平均値±ＳＤを示す（ｎ＝８～１０）。^＊、^＊＊、^＊＊＊＊：ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．０００１対アイソタイプ対照。ダネットの事後検定。

【図4】マウスにおけるＩ／Ｒ損傷後の、Ａ：血清クレアチニンレベル、Ｂ：血清尿素レベルおよびＣ：尿アルブミン排泄に対する、ＴＰＰ－１５３７０（灰色のバー）、ＴＰＰ－１１４８９（縞模様のバー）およびＴＰＰ－１７７５５（正方形模様のバー）によるＳｅｍａ３Ａ阻害の効果。平均値±ＳＤを示す（ｎ＝８～１０）。^＊、^＊＊、^＊＊＊＊：ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．０００１対アイソタイプ対照。ダネットの事後検定。

【図5】マウスにおけるＩ／Ｒ損傷後の、Ａ：血清クレアチニンレベル、Ｂ：血清尿素レベルおよびＣ：尿アルブミン排泄に対する、ＴＰＰ－２３２９８（灰色のバー）、ＴＰＰ－１１４８９（縞模様のバー）およびＴＰＰ－１７７５５（正方形模様のバー）によるＳｅｍａ３Ａ阻害の効果。平均値±ＳＤ（ｎ＝１０－１２）を示す。^＊、^＊＊、^＊＊＊＊：アイソタイプ対照に対してｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．０００１。ダネットの事後検定。

【図6】マウスにおけるＩ／Ｒ損傷後の、Ａ：血清クレアチニンレベル、Ｂ：血清尿素レベルおよびＣ：尿アルブミン排泄に対する、ＴＰＰ－１５３７４（灰色のバー）、ＴＰＰ－１１４８９（縞模様のバー）によるＳｅｍａ３Ａ阻害の効果。平均値±ＳＤを示す（ｎ＝１０～１２）。^＊、^＊＊、^＊＊＊、^＊＊＊＊：ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１ｐ＜０．０００１対アイソタイプ対照。ダネットの事後検定。

【図7】アルポートマウスにおけるタンパク尿に対する、ＴＰＰ－１５３７０（灰色のバー）、ＴＰＰ－１１４８９（縞模様のバー）によるＳｅｍａ３Ａ阻害の効果。平均値±ＳＤを示す（ｎ＝８～１０）。^＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１対アイソタイプ対照。ダネットの事後検定。

【図8】アルポートマウスにおける、Ａ：血清クレアチニンレベル、Ｂ：血清尿素レベルおよび線維症、Ｃ：筋線維芽細胞およびＤ：コラーゲン沈着に対する、ＴＰＰ－１５３７０（灰色のバー）、ＴＰＰ－１１４８９（縞模様のバー）によるＳｅｍａ３Ａ阻害の効果。平均値±ＳＤを示す（ｎ＝８～１０）。^＊、^＊＊＊、^＊＊＊＊：ｐ＜０．０５、ｐ＜０．００１、ｐ＜０．０００１対アイソタイプ対照。ダネットの事後検定。

【図9】ブタの片側腎臓ＩＲＩモデルにおける単一用量予防設定での、１０５分間の虚血におけるＴＰＰ－２３２９８によるＳｅｍａ３Ａ阻害の効果。ＴＰＰ－２３２９８（Ａ；黒点）または対照ＩｇＧ（白丸）（１０ｍｇ／ｋｇ）を、左腎動脈においてバルーンを膨張させる３０分前に投与した。ＳＨＡＭ動物からの値は菱形で示されている。個々の動物の血漿クレアチニン濃度の時間経過（Ａ）、および実験開始時（０時間）のベースライン値に対するクレアチニン血漿濃度の平均変化の時間経過（Ｂ）。２４～２７時間間隔のクレアチニンクリアランスの平均値。左（損傷）および右（非損傷）の腎臓ならびに偽（ｓｈａｍ）動物からの腎臓のの側別のクレアチニンクリアランス（Ｃ）。総クレアチニンクリアランス（Ｄ）；平均値±ＳＥＭ、ｔ検定からの（Ｂ）におけるｐ値、（Ｃ）および（Ｄ）における^＊／^＊＊＊：ｐ＜０．０５／０．００１、対応対照に対する一元配置分散分析およびそれに続くダネット多重比較。

【図10】ＳＰＲを使用したサンドイッチベースのエピトープビニング実験の概略図（実施例５Ａも参照されたい）。

【図11】ＨＲＡイメージ解析工程：１１Ａ）ＤＡＰＩ／ＣＭ細胞の蛍光顕微鏡イメージ。１１Ｂ）選択された領域における細胞の特定。１１Ｃ）無細胞領域サイズ（灰色の面積）の計算。

【図12】８０ｐＭの抗体濃度でのＨＵＶＥＣ反発アッセイにおけるＳｅｍａ３Ａの阻害率（％）を示す（実施例１１を参照されたい）。各柱状グラフは以下の左から右の順序での１つの抗体を表す：ＴＰＰ－２３２９８（黒柱状グラフ）、ＴＰＰ－３０７８８、ＴＰＰ－ＴＰＰ－３０７８９、ＴＰＰ－３０７９０およびＴＰＰ－３０７９１。

【0301】

実施例
実施例１：Ｓｅｍａ３Ａ配列および材料作製

【表1】

【0302】

一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ Ｃａｎａｄａ）を使用する哺乳類細胞培養によって、Ｓｅｍａ３Ａドメインを製造した。全ての構築物はＣＭＶプロモーターの制御下にあり、配列はＣ末端ＦＸａ切断部位およびそれに続く６×ｈｉｓタグを含有する。０．１％ プルロニック（登録商標）Ｆ６８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および４ｍＭ グルタマックス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で補足されたＦ１７培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、細胞培養を行った。トランスフェクションの２４時間後、１％ ＦＣＳ超低ＩｇＧ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および０．５ｍＭ バルプロ酸（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。細胞上清を滅菌濾過し、次いで精製し、または精製前にクロスフロー濾過によって濃縮した。

【0303】

アフィニティクロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーからなる２段階精製を用いて、Ｓｅｍａ３Ａドメインを精製した。簡潔に説明すると、Ａｋｔａ Ａｖａｎｔ系（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に接続されたＮｉ^２＋－ＮＴＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に細胞培養上清をローディングした。カラムを４ＣＶの５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８）で平衡化し、次いで、ベースラインに達するまで１０ＣＶのランニングバッファーで洗浄した。２５０ｍＭ イミダゾール（ｐＨ８．０）を含有する６ＣＶのランニングバッファーを使用して溶出を行った。溶出ピークの画分を集め、Ｖｉｖａｆｌｏｗ ２００ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ膜（カットオフ１０ｋＤａ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して濃縮し、Ａｋｔａ Ｐｕｒｅ２５系に接続されたＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するサイズ排除クロマトグラフィーに付した。カラムを平衡化し、ＤＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で移動させた。ドメイン溶出ピークの画分を集め、Ｖｉｖａｆｌｏｗ ２００ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ膜（カットオフ１０ｋＤａ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して濃縮した。最終的なタンパク質の品質を、純度および単分散性に関して分析用サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００）により、そしてＳＤＳ－ＰＡＧＥにより評価した。Ｓｅｍａドメインをアリコート化し、液体窒素中で急速冷凍し、更なる使用まで－８０℃で保存した。

【0304】

実施例２：ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ抗体ライブラリからの抗体の作製
完全ヒト抗体ファージディスプレイライブラリー（ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ ｎ－ＣｏＤｅＲ Ｆａｂラムダライブラリー）を使用して、以下のプロトコールを用いる組換えヒトＳｅｍａ３Ａ（ＴＰＰ－１３２１１、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に対する選択によって本発明のヒトモノクローナル抗体を単離した。簡潔に説明すると、イムノチューブ（Ｎｕｎｃ）を、回転させながら、１ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中の１００μｇの標的分子（ｈｕＳｅｍａ３Ａ）または無関連Ｆｃ含有オフターゲットで室温（ＲＴ）で１時間コーティングした。標的およびデプリーション（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）抗原コート化イムノチューブならびに空イムノチューブをＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で４回洗浄し、次いでＰＢＳＴ溶液中の３ｍｌの３％ 粉乳を使用して、回転させながら、室温で１時間ブロックした。ファージライブラリーのアリコートを解凍し、ＰＢＳＴ中の３％ 粉乳の溶液中で、回転させながら、室温で１時間ブロックした。非コート化ディプリーションイムノチューブを４ｍｌのＰＢＳ中で３回洗浄した後、ブロック化ファージライブラリーを添加し、回転させながら室温で３０分間インキュベートした。非標的抗原コート化デプリーションイムノチューブに関して、この工程を繰り返した。ｈｕＳｅｍａ３Ａコート化イムノチューブを４ｍｌのＰＢＳ中で３回洗浄した後、デプリート化（ｄｅｐｌｅｔｅｄ）ライブラリーを添加し、回転させながら室温で９０分間インキュベートした。ストリンジェントな洗浄（４ｍｌのＰＢＳＴで４回および４ｍｌのＰＢＳで１回）の後、コート化標的に特異的に結合するＦａｂ発現ファージを、５００μｌの１００ｎＭ ＴＥＡを使用して溶出し、室温で１０分間インキュベートし、次いで５００μｌのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）の添加により中和した。５００μｌの溶出ファージを使用して、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１株に感染させた。次いで、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を使用して、ファージを大腸菌株ＨＢ１０１内で増幅した。後続の２ラウンドの選択において、標的濃度を２５μｇ／ｍｌに減少させた。最初の定性的評価では、各選択ラウンドからランダムに選択された８８個のＦａｂ発現ファージクローンを単一ウェルにおいて発現させ、無関係なオフターゲットと比較してｈｕＳｅｍａ３Ａへの結合に関して試験した。この実施例におけるラウンド３からのクローンプールは６０％の陽性ヒット率を含むことが判明し、更なるスクリーニングのために選択された。

【0305】

次工程では、このプール内の遺伝子ＩＩＩ融合体の一括除去によって可溶性Ｆａｂの発現が可能になり、大腸菌Ｔｏｐ１０株における発現およびｈｕＳｅｍａ３Ａ結合ＥＬＩＳＡにおけるＦａｂ含有上清の評価のために２２０８個の単一クローンを選択した。２２０８個全てのクローンのＶＨ配列およびＶＬ配列も、ＮＧＳ法を用いて決定した。ｈｕＳｅｍａ３Ａへの結合に関して陽性である１５４個の異なるクローンが特定された。これらの陽性結合性Ｆａｂフラグメントを確証的（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｏｒｙ）結合ＥＬＩＳＡにおいて試験し、また、マウスＳｅｍａ３Ａ－Ｆｃ（ＴＰＰ－１３３５７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）への結合に関して、および追加的オフターゲット分子であるマウスＳｅｍａ３Ｆ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用する特異性試験で評価した。この分析に基づいて、４８個のヒト／マウス交差反応性Ｓｅｍａ３Ａ結合性Ｆａｂを優先することにした。次いでこれらのＦａｂフラグメントを、Ｃａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ ＣＨ１マトリックス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、２５ｍｌの発現培養物から精製し、ｐＨ２．５の１２．５ｍＭ クエン酸を使用して溶出し、最後に、Ｚｅｂａ（商標）Ｓｐｉｎ脱塩プレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、ＰＢＳへとバッファー交換した。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、４８個全ての精製Ｆａｂフラグメントに関して、動力学的順位付けを行って、ヒトＳｅｍａ３ＡおよびマウスＳｅｍａ３Ａの両方への結合を調べ、完全長ヒトＩｇＧ１に再フォーマット（ｒｅｆｏｒｍａｔ）し、ＳＰＲにおける結合に関して再試験した（実施例４を参照されたい）。

【0306】

実施例３：リード抗体ＴＰＰ－１５３７０およびＴＰＰ－１５３７４の配列最適化、生殖系列化およびアフィニティ成熟
ＩｇＧ１抗体ＴＰＰ－１５３７０およびＴＰＰ－１５３７４を、（ｉ）そのアフィニティを最適化する、（ｉｉ）機能的効率を増加させる、（ｉｉｉ）配列に基づく免疫原性のリスクを低減する、および（ｉｖ）下流開発プロセスとの適合性を改善する目的で、リード（ｌｅａｄ）最適化操作に付した。

【0307】

最初の単一突然変異収集（ｇａｔｈｅｒｉｎｇ）ラウンド、およびそれに続く、生殖系列化され配列最適化された抗体バックボーンにおける最もアフィニティおよび効力を増加させるアミノ酸置換の組換えによって、アフィニティ成熟を行った。

【0308】

突然変異収集のために、以下の個々のアミノ酸位置におけるＮＮＫ（Ｎ＝ＡまたはＧまたはＣまたはＴ、Ｋ＝ＧまたはＴ）ランダム化を、コドン多様化のためにＮＮＫを含む合成オリゴヌクレオチドを使用する部位特異的突然変異誘発によって行った。ＴＰＰ－１５３７０については、以下の領域をアフィニティに対するそれらの効果に関して分析した：ＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨ（ＶＨ配列番号４１の残基２６～３５）、ＷＶＳＡＩＧＴＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＭＧ（ＶＨ配列番号４１の残基４７～６５）、ＡＲＲＤＤＹＴＳＲＤＡＦＤＶ（ＶＨ配列番号４１の残基９６～１０９）、ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＴＶＮＷＹ（ＶＬ配列番号４５の残基２３～３７）、ＬＬＩＹＹＤＤＬＬＰＳ（ＶＬ配列番号４５の残基４７～５７）およびＡＡＷＤＤＳＬＮＧＹＶＶ（ＶＬ配列番号の残基９０～１０１）。

【0309】

ＴＰＰ－１５３７４については、以下の領域をアフィニティに対するそれらの効果に関して分析した：ＧＦＴＦＳＳＹＥＭＮ（ＶＨ配列番号６１の残基２６～３５）、ＷＶＳＧＩＳＷＮＳＧＳＩＧＹＡＤＳＶＫＧ（ＶＨ配列番号６１の残基４７～６６）、ＡＲＳＧＹＳＳＳＷＦＤＰＤＦＤＹ（配列番号６１の残基９７～１１２）、ＴＧＳＳＳＮＩＧＡＧＹＤＶＨＷＹ（ＶＬ配列番号６５の残基２３～３８）、ＬＬＩＹＧＮＳＮＲＰＳ（ＶＬ配列番号６５の残基４８～５８）およびＳＳＹＡＧＳＮＰＹＶ（ＶＬ配列番号６５の残基９１～１０１）。

【0310】

得られた単一のＮＮＫライブラリーを配列決定し、ＴＰＰ１５３７０およびＴＰＰ－１５３７４のそれぞれ約１０００個の単一アミノ酸置換変異体を特定した。それらを哺乳類細胞の一過性トランスフェクションによって発現させ、得られた発現上清を、表面プラズモン共鳴および競合ＥＬＩＳＡにおいてスクリーニングされる抗体濃度に関して正規化した。

【0311】

ＴＰＰ－１５３７０およびＴＰＰ－１５３７４の生殖系列化および配列最適化プロセスでは、軽鎖および重鎖に関して最も近い生殖系列ファミリーを選択し、潜在的なＣＭＣ関連残基に関して精査した。ＣＤＲ領域およびＦＷ領域における最も近いヒト生殖系列からの逸脱およびＣＤＲ領域における潜在的なＣＭＣ関連残基を部位特異的突然変異誘発によって調整し、機能的アッセイおよび生物物理学的アッセイ（非特異的結合、ＤＳＣにおける温度安定性）で試験した。得られた単一復帰体および以下の組合せ（コンビナトリアル）ＩｇＧ変異体を哺乳類細胞の一過性トランスフェクションによって発現させ、得られた発現上清を、結合アッセイ（ＳＰＲ、競合ＥＬＩＳＡ）および機能的アッセイにおいてスクリーニングされる抗体濃度に関して正規化した。これにより、生殖系列化され配列最適化された分子である、ＴＰＰ－１５３７０の場合のＴＰＰ－２１５６５、およびＴＰＰ－１５３７４の場合のＴＰＰ－１８５３３が得られた。ＴＰＰ－２１５６５は、ＴＰＰ－１５３７０と比較して、軽鎖に復帰Ｌ５５ＲおよびＲ８０Ｑを含有し、重鎖にＧ３３Ａ、Ｈ３５Ｓ、Ｍ６４ＫおよびＶ１０９Ｙを含有する。ＴＰＰ－１８５３３は、ＴＰＰ－１５３７４と比較して、軽鎖に復帰Ａ１０Ｖ、Ｔ１３Ａ、Ｓ７８Ｔ、Ｒ８１Ｑ、Ｓ８２Ａを含有する。

【0312】

ＴＰＰ－２１５６５の最終組換えライブラリーとして、ＮＮＫライブラリーのスクリーニング工程でアフィニティおよび機能効率の改善を示すことが示された８個の単一置換変異体を選択した。軽鎖突然変異Ａ９０Ｈ、Ｇ９８Ｄ、Ｇ９８Ｖ、Ｙ９９ＩおよびＶ１００Ｐならびに重鎖突然変異Ｓ３０Ｙ、Ｓ３５ＬおよびＴ５３Ｙを１つの組換えライブラリーにおいて組換えた（連続アミノ酸命名法；参照体は、配列番号１２１－ＶＨおよび配列番号１２５－ＶＬによって定義されるＴＰＰ－２１５６５である）。

【0313】

ＴＰＰ－１８５３３の最終組換えライブラリーとして、ＮＮＫライブラリーのスクリーニング工程でアフィニティおよび機能効率の改善を示すことが示された１１個の単一置換変異体を選択した。軽鎖突然変異Ｎ２８Ｄ、Ｎ５３Ａ、Ｓ９１Ｋ、Ｓ９１Ｑ、Ａ９４Ｅ、Ｓ９６ＩおよびＳ９６Ｐならびに重鎖突然変異Ｔ２８Ｄ、Ｓ３０Ｄ、Ｓ５７ＷおよびＧ５９Ｙを１つの組換えライブラリーにおいて組換えた（連続アミノ酸命名法；参照体は、配列番号１０１－ＶＨおよび配列番号１０５－ＶＬによって定義されるＴＰＰ－１８５３３である）。

【0314】

ＴＰＰ－１８５３３については、選択された突然変異または対応野生型アミノ酸を各選択位置に導入するためのオリゴヌクレオチドを作製した。連続ラウンドの重複伸長（オーバーラップ・エクステンション）ＰＣＲを用いて、ライブラリーの構築を行った。最終的なＰＣＲ産物を哺乳類ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）発現ベクター内に連結し、大規模並列配列決定技術を使用して変異体を配列決定した。ＴＰＰ－２１５６５の場合、組換え変異体を別個のクローンとして設計し、ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）含有発現プラスミド内にクローニングした。

【0315】

ＴＰＰ－１８５３３の１０００個を超えるユニーク（一意的）な組合せアミノ酸置換変異体、およびＴＰＰ－２１５６５の１００個を超えるユニークな組合せアミノ酸置換変異体をこの方法で作製し、哺乳類細胞の一過性トランスフェクションによって発現させ、得られた発現上清を、ＳＰＲ、競合ＥＬＩＳＡおよび機能的アッセイにおいて種々の数でスクリーニングされる抗体濃度に関して正規化した。これらのアッセイにおける結果に基づいて、突然変異体を「改善」または「非改善」のいずれかとして分類した。

【0316】

表１および１Ａは、とりわけ、Ｓｅｍａ３Ａへの結合に関して及びＳｅｍａ３Ａ依存性生物活性に対する拮抗に関して最も強力であるとして組合せライブラリースクリーニング工程において選択された、本発明による好ましい抗体候補、ならびに本発明による抗体のそれぞれのアミノ酸配列および核酸配列を列挙する。

【0317】

実施例４：表面プラズモン共鳴を用いたアフィニティおよび種交差反応性の決定
抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体の結合速度論およびアフィニティならびにそれらの種交差反応性プロファイルを評価するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて結合アッセイを行った。結合アッセイは、アッセイバッファーＨＢＳ Ｐ＋、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．７５ｍＭ ＣａＣｌ_２、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．０５％ ＮａＮ_３を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置またはＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋ＋装置（Ｃｙｔｉｖａ）で２５℃で行った。抗ヒトＦｃ ＩｇＧ（「ヒト抗体捕捉キット」、注文番号ＢＲ１００８３９、Ｃｙｔｉｖａ）により、またはＦｃタグ付きアナライトの場合には抗ヒトＦａｂ ＩｇＧ（「ヒトＦａｂ捕捉キット」、注文番号２８９５８３２５、Ｃｙｔｉｖａ）［シリーズＳ ＣＭ５センサーチップ（Ｃｙｔｉｖａ）に共有結合でアミンカップリングされているもの］により、抗体を捕捉した。アミンカップリングは、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）およびエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８．５）（「アミンカップリングキット」ＢＲ－１０００－５０、Ｃｙｔｉｖａ）を使用して、製造業者の説明に従い行った。ファージディスプレイヒットに関しては、Ｆｃタグ付きヒトおよびマウスＳｅｍａ３Ａを１．５６～２００ｎＭの濃度範囲でアナライトとして使用した。ヒト、マウス、カニクイザル、ラット、イヌおよびブタの一価Ｓｅｍａ３Ａドメインを、マルチ・サイクル・カイネティクス・モードで０．０２４～３．１２５ｎＭの一連の濃度で、または結合分析のみの場合には１００ｎＭで、アナライトとして使用した。センサー表面を、各抗原の注入後、グリシン（ｐＨ２．０）で再生させた。得られたセンサーグラムを二重参照し（参照フローセルシグナルの減算およびバッファー注入）、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して、速度論データを導き出すために、１：１ラングミュア結合モデルにフィットさせた。結果を表３、４および４ａに示す。

【表2】

【0318】

ファージディスプレイヒットの大部分は、より低いナノモル範囲で、ヒトおよびマウス二量体Ｓｅｍａ３Ａに結合する。

【表3】

【0319】

ＴＰＰ－１５３７０およびＴＰＰ－１５３７４の全ての誘導体抗体は、それらの親抗体およびほとんどの先行技術の抗体と比較して、より低いピコモル範囲で、Ｓｅｍａ３Ａドメインに対する有意に増加したアフィニティを有する。

【表4】

【0320】

ＳＰＲにおいてＳｅｍａ３Ａ分子への結合を示さなかった完全長３Ｈ４ ＩｇＧ１（ＴＰＰ－３０７９２）とは対照的に、ＴＰＰ－３０７９２のＦａｂ変異体であるＴＰＰ－３１３５７は、ＴＰＰ－２３２９８より低いアフィニティにおいてではあるが、ヒトＳｅｍａ３Ａへの結合を示す。

【0321】

実施例５：表面プラズモン共鳴を用いた結合活性の測定
抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体の結合活性を評価するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて結合アッセイを行った。結合アッセイは、アッセイバッファーＨＢＳ Ｐ＋、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．７５ｍＭ ＣａＣｌ_２、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．０５％ ＮａＮ_３を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置（Ｃｙｔｉｖａ）で２５℃で行った。シリーズＳ ＣＭ５センサーチップ（Ｃｙｔｉｖａ）に共有結合でアミンカップリングされている抗ヒトＦｃ ＩｇＧ（「ヒト抗体捕捉キット」、注文番号ＢＲ１００８３９、Ｃｙｔｉｖａ）により、抗体を捕捉した。アミンカップリングは、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）およびエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８．５）（「アミンカップリングキット」ＢＲ－１０００－５０、Ｃｙｔｉｖａ）を使用して、製造業者の説明に従い行った。ヒト、マウス、カニクイザル、ラット、イヌおよびブタの一価Ｓｅｍａ３Ａドメインをマルチ・サイクル・カイネティクス・モードで０．０２４～３．１２５ｎＭの一連の濃度でアナライトとして使用した。センサー表面を、各抗原の注入後、グリシン（ｐＨ２．０）で再生させた。得られたセンサーグラムを二重参照し（参照フローセルシグナルの減算およびバッファー注入）、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して、１：１ラングミュア結合モデルにフィットさせて、実験的にフィットされたＲ_Ｍａｘ値を得た。結合活性を計算するためには、まず、理論的Ｒ_Ｍａｘを以下の式１に従い計算する必要がある。

【数1】

式１：Ｒ_Ｍａｘの理論的計算。Ｒ_リガンド＝ＲＵ単位のリガンドレベル、Ｍｒ＝分子量、価数_リガンド＝抗体分子当たりの結合部位の数、ここでは２。

【0322】

式２に従い、実験的に決定されたＲ_Ｍａｘを、理論的に計算されたＲ_Ｍａｘで割り算することによって、結合活性を決定した。

【数2】

式２：結合活性（％）の計算。

【表5】

【0323】

ＳＰＲ実験において計算された結合活性は表面結合リガンドの活性の尺度である。表５から認められうるとおり、ＴＰＰ－１５３７０、ＴＰＰ－１５３７４、ＴＰＰ－２３２９８およびＴＰＰ３０７８８～３０７９１は、試験した全てのＳｅｍａ３Ａドメインに約１００％の活性で結合しうる。このことは、全ての結合領域が完全に結合しうることを意味する。先行技術の抗体ＴＰＰ－１７７５５は、種に応じて５０～６０％の活性レベルに達するに過ぎない。先行技術の抗体ＴＰＰ－１１４８９は、マウスおよびブタの場合（この場合、より高いレベルを示す）を除いて、５０％未満の、より一層低いレベルを示す。驚くべきことに、そのような活性レベルに達するには、ＴＰＰ－１１４８９のリガンドレベルは、その他の抗体と比較して、１０倍以上高いことが必要であり、このことは、一般に、ＴＰＰ－１５３７０、ＴＰＰ－１５３７４およびＴＰＰ－２３２９８と比較して遥かに低い結合活性を示している。

【0324】

実施例６：競合ＥＬＩＳＡ
競合ＥＬＩＳＡ法でのスクリーニングのために、ヒトＳｅｍａ３ａ（ＴＰＰ－１３２１１）をコーティングバッファー（カルボナートに基づくもの、ｐＨ９．６、Ｃａｎｄｏｒ １２１１２５）中で０．５μｇ／ｍｌの濃度で３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ、７８１０７７）上に１０℃で一晩コーティングした。プレートを５０μｌのＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、プレートを５０μｌのＳｍａｒｔ Ｂｌｏｃｋ（登録商標）（Ｃａｎｄｏｒ １１３５００）で２０℃で１時間ブロックし、記載されているとおりに再度３回洗浄した。

【0325】

次いで、予め混合された抗体溶液２０μｌをプレートに添加し、１０℃で１８時間インキュベートした。前記の予め混合された抗体溶液を得るためには、ウェルごとに、ＴＰＰ－１５３７０またはＴＰＰ－１５３７４のいずれかである１つのビオチン化親抗体を、ビオチンタグを含有しない及びＣＤＲ領域内に１以上のアミノ酸変異を含む抗体（組換え変異体）と、１：１、１：５または５：１の比で混合した。追加的な対照として、ヒトＳｅｍａ３Ａへの結合を示さないアイソタイプ対照抗体をも競合抗体として使用した。添加抗体溶液の総濃度は０．２５μｇ／ｍｌであった。インキュベーション時間中、それらの抗体は競合的にプレートに結合した。なぜなら、それらはヒトＳｅｍａ３Ａタンパク質上の同一エピトープに関して競合するからである。

【0326】

次いで５０μｌのＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、２０μｌのストレプトアビジン－ＨＲＰ溶液（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＹ９９８、ＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ １０％ ＳｍａｒｔＢｌｏｃｋ中１：２００）を添加し、２０℃で１時間インキュベートし、次いで、５０μｌのＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、２０μｌのＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ１２２２２；１：１００００の３０％ Ｈ２Ｏ２を含有するＮａＰバッファー５０ｍＭ（ｐＨ７．６）中、１：１０００）を添加した。２０℃で２０分間の最終インキュベーション後、５９５ｎｍの発光波長および５３０ｎｍの励起を用いてシグナルを測定した。親抗体ＴＰＰ－１５３７０およびＴＰＰ－１５３７４のビオチン化により、これらの変異体の結合のみが検出されうる。したがって、優れた結合を示す抗体変異体との競合は、例えば親抗体の、それ自体の非ビオチン化形態との競合と比較して、より低い結合シグナルを示す。

【0327】

全体として、ＴＰＰ－１５３７０の１０３個の組換え変異体、およびＴＰＰ－１５３７４の１１３６個の組換え変異体が測定された。分析のために、そしてプレート間変動の補正を可能にするために、ＥＬＩＳＡの生の値をアイソタイプ対照抗体ＴＰＰ－９８０９との競合の値に対して正規化した。

【0328】

表６は、ＴＰＰ－１５３７０およびＴＰＰ－１５３７４の選択された組換え変異体の競合ＥＬＩＳＡの値を列挙する。それぞれ１：５または１：１の比での測定におけるアイソタイプ対照抗体ＴＰＰ－９８０９に対する比率が示されている。

【表6】

【0329】

実施例５ａ：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いたエピトープビニング
古典的なサンドイッチ法を利用することにより、ＳＰＲを用いて抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体のエピトープビンを決定するために、エピトープビニング実験を行った。この実験においては、１つの抗体をＳＰＲチップに固定化し、Ｓｅｍａ３Ａを注入し、結合をモニターする（図１０Ａ）。第１抗体へのＳｅｍａ３Ａの結合に成功した後、Ｓｅｍａ３Ａに結合した固定化ｍＡｂの複合体上に第２抗体を注入し、更なる結合をモニターする（図１０Ｂおよび図１０Ｃ）。第２抗体がＳｅｍａ３Ａへの結合に関して第１抗体と競合する場合には、第２抗体の注入後に追加的な結合シグナルは検出されず、このことは、それらの２つの抗体が同一または非常に隣接するＳｅｍａ３Ａエピトープに結合することを示す（図１０Ｃ）。第２抗体がＳｅｍａ３Ａへの結合に関して第１抗体と競合しない場合には、第２抗体の注入後に追加的な結合シグナルが検出され、このことは、それらの２つの抗体が、異なるＳｅｍａ３Ａエピトープに結合することを示す（図１０Ｂ）。

【0330】

アッセイバッファーＨＢＳ Ｐ＋、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．７５ｍＭ ＣａＣｌ_２、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．０５％ ＮａＮ_３を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置（Ｃｙｔｉｖａ）で２５℃で実験を行った。抗体をシリーズＳ ＣＭ５センサーチップ（Ｃｙｔｉｖａ）に共有結合によってアミンカップリングさせた。アミンカップリングは、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）およびエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８．５）（「アミンカップリングキット」ＢＲ－１０００－５０、Ｃｙｔｉｖａ）を使用して、製造業者の説明に従い行った。ヒトの一価Ｓｅｍａ３Ａドメインを第１アナライトとして２００ｎＭの濃度で使用し、次いで競合抗体の第２の注入を行った。この設定を全ての可能な組合せで行った。センサー表面を各抗原注入後にグリシン（ｐＨ２．０）で再生させた。表６ａはビニング結果を示す。

【表7】

【0331】

ビニング実験は、ＴＰＰ－３０７８８（ＢＩクローンＩ）と比較して、ＴＰＰ－２３２９８に対する別のエピトープを強く示しており、このことは、両方の抗体がＳｅｍａ３Ａ上の独立した／異なるエピトープを標的としており、一方、ＴＰＰ－２３２９８は、ＴＰＰ－１７７５５（Ｓａｍｓｕｎｇ）と重複または隣接するエピトープを有しうることを意味する。

【0332】

実施例７：オフターゲットへの結合の評価
抗Ｓｅｍａ３Ａ ｍＡｂ（ＴＰＰ－１５３７０、親ｍＡｂ）の特異性を評価するために、Ｒｅｔｒｏｇｅｎｉｘ技術を用いてオフターゲットスクリーニングを行った。一次スクリーニングでは、ＺｓＧｒｅｅｎ１と完全長ヒト細胞膜タンパク質または細胞表面結合ヒト分泌タンパク質との両方をコードする５４８４個の発現ベクターを、１６個のマイクロアレイスライドにわたって、二重に重複して配置（ａｒｒａｙ）した。ヒトＨＥＫ２９３細胞を逆トランスフェクション／発現に使用した。

【0333】

細胞固定後に試験抗体を各スライドに添加して、最終濃度を２０μｇ／ｍｌとした。プレスクリーニングで使用したものと同じＡＦ６４７抗ｈＩｇＧ Ｆｃ検出抗体を使用して、結合の検出を行った。１６個のスライドセットのそれぞれについて、２つのレプリケート（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）スライドをスクリーニングした。ヒットを、二重重複スポットの強度に応じて、「強い、中程度、弱い、または非常に弱い」に分類した。

【0334】

５４８４個のヒト細胞膜タンパク質およびヒト分泌タンパク質を発現する固定ＨＥＫ２９３細胞に対する結合に関するスクリーニングの後、Ｒｅｔｒｏｇｅｎｉｘ技術は試験抗体ＴＰＰ－１５３７０に関する特異的オフターゲット相互作用を特定しなかった。Ｓｅｍａ３Ａ（その一次標的）への結合が観察された。これらのデータは、ＴＰＰ－１５３７０のその一次標的に対する特異性が高いことを示している。

【0335】

実施例８：抗Ｓｅｍａ３Ａ ｍＡｂの選択性
セマフォリンタンパク質は、脊椎動物において見出される５つのクラス（クラス３～７）に細分されうる。セマフォリン３クラス（Ｓｅｍａ３Ａ～Ｇ）における親抗Ｓｅｍａ３Ａ ｍＡｂであるＴＰＰ－１５３７０およびＴＰＰ－１５３７４の選択性プロファイルを評価するために、Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓのＳｅｍａ３Ａ、Ｓｅｍａ３Ｂ、Ｓｅｍａ３Ｃ、Ｓｅｍａ３Ｄ、Ｓｅｍａ３ＥおよびＳｅｍａ３Ｆ分子を使用してＥＬＩＳＡアッセイを行った。どちらの抗体もＳｅｍａ３Ｂ、Ｓｅｍａ３Ｃ、Ｓｅｍａ３Ｄ、Ｓｅｍａ３ＥおよびＳｅｍａ３Ｆへの結合を示さなかった。

【0336】

Ｓｅｍａ３Ｇは腎臓保護性であることが最近確認されたため（ＰＭＩＤ：２７１８０６２４）、該抗体がＳｅｍａ３Ｇに結合しないかどうかを試験することが重要であった。Ｓｅｍａ３Ａ対Ｓｅｍａ３Ｇに対する結合選択性を評価するために、１ｎＭの組換えヒトＳｅｍａ３Ａ－Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）または組換えヒトＧＳＴ－Ｓｅｍａ３Ｇ（Ａｂｎｏｖａ）をＭａｘｉｓｏｒｂプレート上にコーティングし、０．０００１５～１０μｇ／ｍｌの用量反応曲線における抗体と共にインキュベートし、抗体の結合を、ＨＲＰ結合抗ヒト抗血清および化学発光基質を使用して定量した。

【表8】

【0337】

表７に示されているとおり、本発明の全試験抗体および先行技術の抗体は、腎臓保護性Ｓｅｍａ３Ｇに結合しない。

【0338】

Ｓｅｍａ３Ａは、２つのフューリン切断部位を含有する分泌タンパク質であり、活性または不活性な切断型で存在する。インビボの状況では、Ｓｅｍａ３Ａは両方の形態で並んで存在する。抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体が不活性形態と活性形態とを識別しうるかどうかを試験し、Ｓｅｍａ３Ａドメインのみを含有する不活性形態（切断型Ｓｅｍａ３Ａ ＴＰＰ－１９０６８に類似している）と比較して、活性Ｓｅｍａ３Ａ（完全長Ｓｅｍａ３Ａ（ＴＰＰ－１３２１１）に類似している）への結合において、抗体がどのように機能するかを試験するために、ＥＬＩＳＡアッセイを行った。読取り結果としては、活性Ｓｅｍａ３Ａに対する試験抗体のＥＬＩＳＡシグナルが不活性Ｓｅｍａ３Ａに対する試験抗体のＥＬＩＳＡシグナルで割り算されている。

【表9】

【0339】

表７ａに示されている結合分析は、本発明の抗体（ＴＰＰ－２３２９８）が、ＴＰＰ－３０７８８～ＴＰＰ－３０７９１（ＢＩクローン）より増強した、活性Ｓｅｍａ３Ａへの結合を示すことを、明らかに示した。これは、おそらく、それらが、活性Ｓｅｍａ３Ａに対する、より高い選択性を示す、異なるエピトープを標的とするからであろう。

【0340】

実施例９：メサンギウム細胞遊走アッセイにおけるインビトロ有効性
ヒト初代メサンギウム細胞のコンフルエント単層を、血清含有培地内の細胞をイメージロックプレート内に２４時間播種することによって作製した。無血清培地に切り替えた後、ＷｏｕｎｄＭａｋｅｒツールを使用して引っ掻き傷を作り、次いで細胞を、阻害抗体の非存在下または存在下、１ｎＭ 組換えヒトＳｅｍａ３Ａ－Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で処理した。細胞をＩｎｃｕｃｙｔｅにおいてイメージングし、２４時間後、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアモジュールを使用して、創傷閉鎖の程度を評価した。

【表10】

【0341】

本発明者らは、ヒトメサンギウム細胞遊走アッセイにおいて３桁のピコモル範囲の効力を有する抗体を特定した。これは、表８に示されているとおり、先行技術の抗体よりかなり強力である。

【0342】

実施例１０：成長円錐崩壊アッセイにおけるインビトロ有効性
Ｓｅｍａ３Ａ誘発性細胞骨格崩壊に対する抗体の効力を決定するために、幾つかの変更を伴う記載されているもの（ＰＭＩＤ：１２０７７１９０）と同様にして、成長円錐崩壊アッセイを用いた。簡潔に説明すると、マウス後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンをＥ１３ Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウス胚から単離し、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地 ＋ １００ｎｇ／ｍＬ ＮＧＦ ＋ Ｂ－２７ ＋ １０％ ＦＣＳを含有する、ポリ－Ｌ－リジンおよびラミニンコート化９６ウェル上で培養した。２０時間後、細胞を、阻害抗体の非存在下または存在下、１０ｎＭ 組換えヒトＳｅｍａ３Ａ－Ｆｃキメラ（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で１時間処理し、次いでＰＦＡ固定およびＡｌｅｘａ４８８－ファロイジンでの染色を行った。ウェル当たり１００個を超える成長円錐に関して、アクチン成長円錐の面積／形状／質感により、免疫蛍光顕微鏡を使用して、成長円錐崩壊の程度を評価した。

【表11】

【0343】

特定された抗体はまた、マウス成長円錐崩壊アッセイにおいて１桁ナノモル範囲の効力を示し、表９に示されているとおり、この場合もまた、試験した先行技術の抗体（２桁～３桁のナノモル効力）よりかなり強力である。

【0344】

実施例１１：ＨＵＶＥＣ反発アッセイにおけるインビトロ有効性
組換えヒトＳｅｍａ３Ａ－Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）はヒト生物流体中のＳｅｍａ３Ａと同一ではない。なぜなら、それは幾つかの突然変異アミノ酸とカルボキシ末端における余分なタンパク質断片とを含有するからである。更に、前記アッセイ（ヒトメサンギウム細胞遊走アッセイおよびマウス成長円錐崩壊アッセイ）は、均一に分布したＳｅｍａ３Ａを使用する。これは、組織内のＳｅｍａ３Ａに関して記載されている勾配分布とは対照的である。本発明者らは、これらの相違が組換えタンパク質と内因性タンパク質とに対する抗体の異なる効力をもたらしうると仮定した。したがって、アゴニストとしてのヒト野生型Ｓｅｍａ３Ａの勾配を用いるアッセイを採用した（ＰＭＩＤ：１７５６９６７１）。簡潔に説明すると、このＨＵＶＥＣ反発アッセイにおいては、配列番号６００の配列のヒトＳｅｍａ３Ａを発現するヒト胎児腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３）細胞を、阻害抗体の非存在下または存在下、ＥＧＭ－２培地内のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のコンフルエント単層上に播種し、７２時間培養し、固定し、ＤＡＰＩで染色し、免疫蛍光顕微鏡法によって細胞反発の程度を評価した（細胞非含有面積の測定）。したがって、基質であるヒトＳｅｍａ３Ａが過剰に存在する。

【0345】

ＤＡＰＩ／ＣＭ染色細胞の免疫蛍光顕微鏡イメージ（ＣＭ＝ＨＣＳ ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｓｔａｉｎは、全細胞領域を定めるために細胞全体を染色する）に基づいて、以下のとおりにデータ分析を行う。ＤＡＰＩ／ＣＭシグナルに基づいて細胞を特定する（図１１Ｂ）。分析のための細胞領域を定め、選択する。この領域において、細胞非含有領域を計算する（図１１Ｃ）。アイソタイプ処理ウェルと比較して、抗体処理ウェルにおいてＳｅｍａ３Ａによって誘導された「細胞非含有領域」に基づいて、阻害率（％）を計算する。阻害率（％）を抗体濃度に対してプロットし、それぞれの抗体のＥＣ５０値を計算する。

【0346】

詳細には、データ分析のために以下の工程を行う。

【0347】

１．ウェルごとに４つのフィールドをイメージングする。これはウェル領域の８０％に相当する。これらのフィールドをつなぎ合わせた全体をＤＡＰＩ／ＣＭ蛍光による細胞の検出に使用する。

【0348】

２．「細胞面積」を、ＤＡＰＩ／ＣＭ面積に基づいて計算する。

【0349】

３．「細胞非含有領域」を、「総面積」から「細胞面積」を差し引いた値に基づいて計算する。

【0350】

４．阻害率（％）を、抗体処理ウェル対アイソタイプ処理ウェルにおいてＳｅｍａ３Ａによって誘導された「細胞非含有領域」に基づいて計算する。

【0351】

５．ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、非線形回帰（可変勾配モデル＝４パラメーター用量反応曲線）を用いてＥＣ５０値を決定する。

【表12】

【0352】

前記のヒトメサンギウム細胞遊走アッセイおよびマウス成長円錐崩壊アッセイにおける先行技術の抗体との効力の相違は、表１０および１０ａに示されているとおり、天然野生型Ｓｅｍａ３Ａ（処理された不活性Ｓｅｍａ３Ａと未消化の活性Ｓｅｍａ３Ａとの混合物）の勾配を用いるこのＨＵＶＥＣ反発アッセイにおいて、より一層顕著である。ＴＰＰ－１７７５５、ＴＰＰ－１１４８９、ＴＰＰ－３０７８８、ＴＰＰ－３０７８９、ＴＰＰ－３０７９０またはＴＰＰ－３０７９１と比較したＨＵＶＥＣ反発アッセイにおける改善された効力を、対応ＥＣ５０値によって示されるピコモル活性を測定して定量する。ＴＰＰ－２３２９８は２桁のピコモル活性を示すが、ＴＰＰ－１７７５５、ＴＰＰ－１１４８９、ＴＰＰ－３０７８８、ＴＰＰ－３０７８９、ＴＰＰ－３０７９０またはＴＰＰ－３０７９１の先行技術の抗体の効力は３桁ピコモルまたは更にはナノモル範囲である。

【0353】

該結果の代替的例証として、ＨＵＶＥＣ反発アッセイにおける改善された効力を、それぞれの抗体の８０ｐＭの特定された濃度における細胞非含有領域を測定することによって定量する。ＴＰＰ－２３２９８は、ＴＰＰ－３０７８８、ＴＰＰ－３０７８９、ＴＰＰ－３０７９０またはＴＰＰ－３０７９１より高いＳｅｍａ３Ａ阻害率（％）を示す（図１２）。

【0354】

表１０および１０ａに示されている両方のアッセイからのデータの分析によると、ＴＰＰ－２３２９８は細胞Ｓｅｍａ３Ａ誘発性ＨＵＶＥＣ反発に対する最高効力を示している。ＢＩ抗体であるＴＰＰ－３０７８８、ＴＰＰ－３０７９８、ＴＰＰ－３０７９０およびＴＰＰ－３０７９１は若干高いＥＣ５０値（２～５倍）を示した。Ｓａｍｓｕｎｇ抗体ＴＰＰ－１７７５５は、ＴＰＰ－２３２９８より著しく低い効力（５０倍）を有する。Ｃｈｉｏｍｅ抗体ＴＰＰ－１１４８９は最高試験濃度で阻害活性を示したに過ぎず、本発明による抗体の４００倍を超える予測ＥＣ５０値をもたらした。表１０および１０ａに示されているとおり、このことは、添加外因性組換えセマフォリン３Ａの非存在下の天然環境類似条件下では、本発明による抗体がＳｅｍａ３Ａ誘発性細胞反発を最強活性で阻害することを示している。

【0355】

実施例１２：腎臓保護効果を検出するためのインビボアッセイ：マウスにおけるＳｅｍａ３Ａ誘発性アルブミン尿の阻害
Ｓｅｍａ３Ａインヒビターは、組換えＳｅｍａ３Ａの全身注射によって誘発される尿アルブミン排泄を減少させる。アルブミン尿減少に対する該化合物の有益な効果を、以下のとおりに、Ｓｅｍａ３Ａ誘発性アルブミン尿モデルにおいて調べた。

【0356】

Ｔａｃｏｎｉｃから購入した雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（８～１０週齢）に抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体を静脈内注射した。抗体適用の３０分後、ヒト組換えＳｅｍａ３Ａ（１．０ｍｇ／ｋｇ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の静脈内注射によってアルブミン尿を誘発した。動物を代謝ケージ内に入れ、尿を４時間採集した。臨床生化学分析装置（Ｐｅｎｔｒａ４００）によって尿クレアチニンを測定した。尿アルブミンの評価には、マウス特異的アルブミンＥＬＩＳＡ（Ａｂｃａｍ）を製造業者のプロトコルに従い使用した。尿クレアチニンおよびアルブミンの両方を用いて、尿アルブミン対クレアチン比（ＡＣＲ）を計算した。グループ間の差異を、多重比較のためのダネット補正を伴う一元配置分散分析によって分析した。統計的有意性はｐ＜０．０５として定義される。全ての統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を使用して行った。

【0357】

表１１～１５ａはマウスにおけるＳｅｍａ３Ａ誘発性アルブミン尿モデルにおけるＴＰＰ－１５３７０、ＴＰＰ－１５３７４、ＴＰＰ－１１４８９、ＴＰＰ－１７７５５、ＴＰＰ－３０７８８およびＴＰＰ－２３２９８での用量反応実験を示す。ＴＰＰ－１１４８９および／またはＴＰＰ－１７７５５および／またはＴＰＰ－３０７８８と比較した、ＴＰＰ－１５３７０、ＴＰＰ－２３２９８によるアルブミン尿減少に対する効果を図１～２に示す。

【0358】

本発明による抗体はＳｅｍａ３Ａ誘発性尿アルブミン排泄を減少させる。

【表13】

【0359】

実施例１３：腎臓保護効果を検出するためのインビボアッセイ：マウスにおける急性虚血／再灌流傷害（Ｉ／ＲＩ）モデル
片側腎摘出マウスは虚血再灌流傷害後のＳｅｍａ３Ａインヒビターでの処置から利益を受けうる。腎機能に対するＳｅｍａ３Ａ抗体の有益な効果を、以下のとおりに、マウスにおける腎虚血再灌流傷害モデルにおいて調べた。

【0360】

実験室で飼育された６～８週齢の雄Ｃ５７Ｂｌ／６ＪマウスをＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒから入手した。通常の餌および飲料水を自由に摂取可能な１２時間の明暗周期の標準的な実験室条件下でマウスを維持した。虚血再灌流傷害モデルに、それぞれの対照群および実験群で合計８～１０匹を使用した。

【0361】

連続吸入イソフルランで動物を麻酔した。対側腎臓の虚血処置の７日前に、右脇腹切開により右腎摘出術を行った。腎虚血開始の１時間前に、抗体および適切なアイソタイプ対照をマウスに静脈内注射により投与した。マウスを麻酔し、左脇腹を切開した。左腎茎を切開して腎血管を露出させた。非外傷性血管クランプを使用して、虚血の２５分間（マウス）の間、血流（動脈および静脈）を停止させた。クランプを除去することによって再灌流を確立した。腹壁（筋肉層および皮膚）を５．０ポリプロピレン縫合糸で閉じた。Ｔｅｍｇｅｓｉｃ（登録商標）（ブプレノルフィン、０．０２５ｍｇ／ｋｇ皮下）を鎮痛薬として適用した。

【0362】

各動物の尿を代謝ケージ内で一晩採集した後、虚血後２４時間の時点で犠死させた。臨床生化学分析装置（Ｐｅｎｔｒａ４００）で尿クレアチニンを測定した。尿アルブミンの評価には、マウス特異的アルブミンキット（Ｈｉｔａｃｈｉ）をＰｅｎｔｒａ分析装置内で使用した。尿クレアチニンおよびアルブミンの両方を使用して、アルブミン尿（アルブミン／クレアチニン比）を測定した。犠死に際して、終末麻酔下で血液サンプルを採取した。血液サンプルの遠心分離の後、血清を単離した。血清クレアチニンおよび血清尿素の両方を臨床生化学分析装置（Ｐｅｎｔｒａ４００）で測定した。グループ間の差異を、多重比較のためのダネット補正を伴う一元配置分散分析によって分析した。統計的有意性はｐ＜０．０５として定義される。全ての統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を使用して行った。

【0363】

表１６～２０はマウスにおける急性腎虚血／再灌流傷害モデルにおけるＴＰＰ－１５３７０、ＴＰＰ－１５３７４、ＴＰＰ－１１４８９、ＴＰＰ－１７７５５およびＴＰＰ－２３２９８での用量反応実験を示す。図３はＩ／ＲＩモデルにおける１５ｍｇ／ｋｇでの処置の後のＴＰＰ－２３３７４、ＴＰＰ－２３２９８およびＴＰＰ－１５３７０の有効性を示す。ＴＰＰ－１１４８９および／またはＴＰＰ－１７７５５と比較した、ＴＰＰ－１５３７０、ＴＰＰ－２３２９８およびＴＰＰ－１５３７４による処置効果を図４～６に示す。

【0364】

該抗体は、血清クレアチニンおよび血清尿素（糸球体濾過速度の代用）および尿アルブミン排泄を減少させることにより、虚血／再灌流誘発性腎損傷を軽減した。

【表14】

【0365】

実施例１４：腎臓保護効果を検出するためのインビボアッセイ：アルポート症候群モデル（Ｃｏｌ４α３欠損マウス）
アルポートマウスの表現型は、糸球体基底膜の特徴的肥厚および分裂ならびに強いタンパク尿を含む、アルポート患者の表現型に類似している。アルポートマウスは、それらのマウスの腎臓におけるＳｅｍａ３Ａ発現の増強により、Ｓｅｍａ３Ａインヒビターでの処置から利益を受けうる。腎機能に対するＳｅｍａ３Ａ遮断性抗体の有益な効果を、以下のとおりに、アルポートマウスモデルにおいて調べた。Ｂａｙｅｒ ＡＧ，Ｗｕｐｐｅｒｔａｌ，Ｇｅｒｍａｎｙにおける飼育施設内でヘテロ接合動物を交配することによって、ノックアウトＣｏｌ４α３（１２９－Ｃｏｌ４ａ３＜ｔｍ１Ｄｅｃ＞／Ｊ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＵＳＡ）のコロニーを確立した。４～５週齢の雄および雌のホモ接合および野生型のＣｏｌ４α３マウスをＢａｙｅｒ ＡＧにおける動物飼育施設から入手し、この研究に使用した。

【0366】

ホモ接合マウス（ＨＯＭ）をそれらの年齢および性別に従い幾つかの群にランダム化した（各群ｎ＝１０）。アイソタイプ対照およびＴＰＰ－１５３７０およびＴＰＰ－２３２９８を週１回、マウスに投与した。ＴＰＰ－１１４８９を隔週で投与した。処置開始前から週１回、各動物の尿を代謝ケージ内に採集した。尿クレアチニンおよび総タンパク質を臨床生化学分析装置（Ｐｅｎｔｒａ４００）で測定した。尿クレアチニンおよびアルブミンの両方を、タンパク尿（タンパク質／クレアチニン比）を測定するために用いた。処置開始後第２１日または第２８日における犠死に際して、終末麻酔下で血液サンプルを採取した。血液サンプルの遠心分離の後、血清を単離した。血清クレアチニンおよび血清尿素の両方を臨床生化学分析装置（Ｐｅｎｔｒａ４００）によって測定した。

【0367】

腎臓を採取し、２つの部分に分けた。一方の部分をｍＲＮＡ分析のために液体窒素中で瞬間凍結した。他方の部分を組織切片の調製のためにダビッドソン（Ｄａｖｉｄｓｏｎ）固定液中に保存した。採取した腎臓の部分から全ＲＮＡを単離した。腎臓組織をホモジナイズし、ＲＮＡを得、ｃＤＮＡに転写させた。ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲを使用して、腎臓組織における線維化促進マーカーの腎臓ｍＲＮＡ発現を分析した。タンパク質レベルでの線維症の評価のため、標準的な方法を用いて、パラフィン組織切片をアルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）およびシリウスレッド／ファストグリーンコラーゲン染色で染色した。

【0368】

腎臓内のアルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）陽性およびシリウスレッド（コラーゲン）陽性の領域の定量的測定値を、ＡｘｉｏＳｃａｎ Ｚ１（Ｚｅｉｓｓ）顕微鏡とＺｅｎソフトウェアを使用するコンピュータイメージ解析によって得た。

【0369】

全てのデータは平均値±Ｓ．Ｄ．として表されている。群間の差異を、多重比較のためのダネット補正を伴う一元配置分散分析によって分析した。統計的有意性はｐ＜０．０５として定義された。全ての統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を使用して行った。

【0370】

表２１Ａ～２１Ｃおよび２２Ａ～２２Ｃは、アルポートモデルにおけるＴＰＰ－１５３７０およびＴＰＰ－２３２９８での処置の後に得られたタンパク尿、腎機能および腎線維症に対する効果を示す。タンパク尿、腎機能および腎線維症に対する、ＴＰＰ－１１４８９と比較したＴＰＰ－１５３７０での処置の後の効果を、図７および８に示す。

【0371】

本発明による抗体はアルポート症候群のマウスモデルにおいて腎疾患の進行を停止させた。本発明による抗体は尿タンパク質の排泄を減少させ、クレアチニンおよび血清尿素（糸球体濾過速度の代用）を減少させ、筋線維芽細胞染色およびコラーゲン沈着によって定量される線維症を低減した。

【表15】

【0372】

実施例１５：腎臓保護効果を検出するためのインビボアッセイ：ブタにおける片側腎臓ＩＲＩモデル
ＴＰＰ－２３２９８を成体ミニブタにおける最小侵襲性片側腎動脈バルーンカテーテル閉塞モデルで試験し、約２４時間の再灌流後追跡調査を行った。体重範囲１４～１７ｋｇの雌のゲッティンゲン（Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ）ミニブタ（Ｅｌｌｅｇａａｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を実験に使用した。動物をランダムに実験群に割り当てた。

【0373】

盲検対照研究において、ＴＰＰ－２３２９８を６頭の動物に投与し、６頭の対応するＩｇＧ処置対照と比較した。腎動脈閉塞を伴わずに全ての処置手順に付され、リン酸緩衝生理食塩水ビヒクルのみの投与を受けた動物を、偽（ｓｈａｍ）処置参照群として用いた。

【0374】

腎動脈閉塞の開始前に、ボーラスとして、最終体積１ｍｌ／ｋｇのリン酸緩衝生理食塩水中の重量調整用量で、ゆっくりとした静脈内注射により、ＴＰＰ－２３２９８を投与した（予防的な設定）。

【0375】

実験の第１日の介入のために、プロポフォールとフェンタニルとの組合せでブタを麻酔し、パンクロニウムによる筋弛緩下で経口気管チューブで人工換気した。乳酸リンゲル液の連続注入によって体積を連続的に置換した。手術の開始前に、抗生物質および血栓症予防物質を、それぞれ、エンロフロキサシンの筋肉内投与およびヘパリンの静脈内投与によって供与した。血圧および心拍数を、前脚カフを備えた非侵襲性獣医用装置を使用してモニターした。

【0376】

以下の全ての介入は、厳密な無菌条件下で行った。薬物投与のために、背頸部皮膚を通って頸静脈まで、カテーテルを皮下に通した。シース（ｓｈｅａｔｈ）を（好ましくは左側の）大腿動脈内に配置し、固定し、それを通して、バルーンカテーテルを内部に備えたホッケー・スティック・カテーテルを上流の腹部大動脈内に進め、その先端を左または右の腎動脈の開口部内に挿入した。次いでバルーンカテーテルを突き出し、バルーンを膨張させて腎臓への血流を遮断した。バルーンの正しい位置を、市販の超音波診断装置を使用したドップラー超音波によって制御した。ベースライン時および虚血開始の２時間後に血漿サンプルを収集した。

【0377】

バルーンを収縮させ、カテーテルおよびシースを引き抜くことにより、閉塞開始後の厳密に所定の時点（９０分～１２０分の範囲）で腎虚血を除去した。血管を縫合し、創傷を閉鎖した後、動物を麻酔から再び目覚めさせ、自発呼吸が始まった後、抜管した。

【0378】

腎動脈閉塞から約２２～２３時間後、ケタセット／ドルミカムおよびパンクロニウムの組合せによって動物を再麻酔し、記載されているとおりに人工換気した。血圧および心拍数を頸動脈カテーテルを介して侵襲的にモニターした。体積置換を流速１０ｍｌ／ｋｇ／ｈの乳酸リンガーの静脈内投与で行った。下腹部の小さな切開を介して、両方の尿管を膀胱壁上で切開し、体積測定および尿検査のために側別に尿を収集するために、カテーテルを挿入した。全てのパラメータが安定したら（これは、典型的には、閉塞の２４時間後であった）、記録およびサンプル収集を開始した。ベースライン時および３時間にわたる各時間に（２４～２７時間間隔）、血液サンプルを収集した。並行して、１時間の３つの間隔で尿を採取した。

【0379】

尿体積流量（Ｖ_Ｕ）および尿クレアチニン濃度（［Ｃｒｅａ］_Ｕ）を測定した後、標準式ＣＬ_Ｃｒｅａ＝Ｖ_Ｕ ^＊［Ｃｒｅａ］_Ｕ／［Ｃｒｅａ］_Ｐｌ（ここで、［Ｃｒｅａ］_Ｐｌは血漿クレアチニン濃度を表す）に従い、クレアチニンクリアランス（ＣＬ_Ｃｒｅａ）を側別に計算した。各動物の左および右の腎臓のＣＬ_Ｃｒｅａを加算することによって、総ＣＬ_Ｃｒｅａを計算した。

【0380】

結果を図９に示す。ＴＰＰ－２３２９８は、閉塞の３０分前に予防的に投与された場合、１０５分間の片側腎動脈閉塞の後のこの実験設定において、虚血／再灌流誘発性クレアチニンクリアランスの悪化を有意に予防した。

【0381】

実施例１６：哺乳類細胞培養における抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体の発現力価
ＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞を、ＴＰＰ－３０７９２のＦａｂフラグメント（ＴＰＰ－３１３５７）または抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体の重鎖および軽鎖をコードするｐＴＴ５プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの２日前に、所望の発現量の９０％を構成する、振盪フラスコ内の０．１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（Ｇｉｂｃｏ，２４０４００３２）および４ｍＭ ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ，３５０５００６１）を含有するＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）Ｆ１７発現培地（Ｇｉｂｃｏ，Ａ１３８３５０１）における５×１０?５細胞／ｍＬの密度に、ＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞を分割した。ＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞を、７５ｒｐｍで振とうしながら、３７℃、５％ ＣＯ_２で培養した。

【0382】

トランスフェクションのために、最終発現量の１０％を構成する、４ｍＭ ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ，３５０５００６１）を含有するＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）Ｆ１７発現培地（Ｇｉｂｃｏ，Ａ１３８３５０１）内で、該ＤＮＡとポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，２９３６６）とを混合する。溶液を１０分間インキュベートし、振盪フラスコに加える。トランスフェクションの２４時間後、１％（ｖ／ｖ）超低ＩｇＧ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，１６２５００７８）および０．０５％（ｖ／ｖ）１Ｎ バルプロ酸（Ｓｉｇｍａ，Ｐ４５４３）を振盪フラスコに加える。

【0383】

トランスフェクションの４日後から毎日、細胞の生存率および密度をモニターし、生存率が７０％であると決定された場合、遠心分離および滅菌濾過によって上清を採集する。生産力価を決定するために、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ，Ｓ０７５１，Ｓ９７６３）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ，Ｓ６５４６）、５％ ２－プロパノール（ｓｉｇｍａ，３４８６３）（ｐＨ７．２）をランニングバッファーとして使用するＨＰＬＣ系（Ａｇｉｌｅｎｔ，１１００ ＨＰＬＣ系）を介して、１００μＬの採集上清を０．１ｍＬのＰｏｒｏｓ Ａアフィニティカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，２１００１００）にローディングする。次いで、１２ｍＭ ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ，Ｈ９８９２）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％ ２－プロパノール（ｐＨ２）を使用して、タンパク質を溶出する。既知サイズのタンパク質を使用して、５μｇ／ｍＬから１５０μｇ／ｍＬまでの検量線を設定し、また、ＨＰＬＣ系を介してＰｏｒｏｓ Ａカラムに適用する。上清中のタンパク質のサイズおよび吸光係数を考慮して、標準曲線を使用して正確な力価が計算されうる。ＣＨＯにおける発現は、ＴＰＰ－３０７９２にプラスミドｐＴＴ２２ＡＫＴが使用されたこと以外は、ＨＥＫ細胞に類似している。

【表16】

【0384】

本発明の抗体、およびＴＰＰ－３０７９２以外の全ての先行技術抗体は、表２３に示されているとおり、哺乳類細胞において高力価で産生されうる。ＴＰＰ－３０７９２は、ＨＥＫ細胞またはＣＨＯ細胞のいずれにおいても、有意な量で発現され得なかった。合計１２５μｇのＴＰＰ－３０７９２が４．５リットルのＨＥＫ２９３細胞培養から精製可能であった。同様に、ＴＰＰ３０７９２のＦａｂフラグメント（ＴＰＰ－３１３５７）は５リットルのＨＥＫ２９３細胞培養から僅か２００μｇの精製Ｆａｂを与えたに過ぎなかった。

【0385】

実施例１７：抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体のＣＭＣパラメータの安定性および溶解度の分析
５０ｍｇ／ｍｌを超える高濃度タンパク質溶液は、通常、より低い濃度のタンパク質溶液と比較して、より高い粘度を示すことが公知である。粘度の増加は、低い適用体積の場合に特に、タンパク質溶液の送達性に悪影響を及ぼし、それは注射時間および注射部位における疼痛を増大させうる。それに加えて、高粘度は産業上の大規模タンパク質生産に影響を及ぼす。したがって、長期の貯蔵期間にわたって安定性を維持しながら高濃度タンパク質溶液の粘度を低下させることはインビボでの治療状況に特に重要である。

【0386】

高濃度溶液中のタンパク質は、しばしば、希釈溶液中のものより低い安定性を示す。なぜなら、タンパク質は、より高濃度において、凝集する傾向にあり、可逆的に自己会合しうるからである。凝集は構造の完全性に悪影響を及ぼす可能性があり、したがって、インビボでの治療状況における機能的で生物学的に利用可能なタンパク質の量にも悪影響を及ぼしうる。これは注射による送達を更に困難にする。

【0387】

タンパク質の溶解度は、もう１つの重要な品質基準である。単離されたタンパク質の溶解度の増加は、インビボでの治療状況に必要な高濃度溶液の調製を可能にする。

【0388】

したがって、低い粘度ならびに高い安定性および溶解度を有する高濃度タンパク質溶液を得ることは、治療用分子の治療適用可能性にとって有益である。

【0389】

潜在的治療用途のための抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体のＣＭＣ（化学、製造、管理）パラメータの安定性、溶解度および粘度を評価するために、抗体ＴＰＰ－２３２８９およびＴＰＰ－３０７８８（ＢＩクローンＩ）をＰＢＳ中で２５ｍｇ／ｍｌに希釈し、７００ｒｐｍ、４０℃で２週間インキュベートした。抗体は、通常、短期の場合は４～１０℃で、あるいは長期の場合は－１８℃以下または－８１℃以上で冷凍保存されるが、４０℃以上の温度（哺乳動物の平均体温は３６℃～３９℃である）に対する哺乳類抗体の曝露は熱ストレス状態に類似している。この熱ストレス条件において、加速化タンパク質安定性／ストレス安定性を試験する。ＰＢＳバッファー中のＡｋｔａ系（Ｃｙｔｉｖａ）に接続されたＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（Ｃｙｔｉｖａ）を使用するサイズ排除クロマトグラフィー、およびＣａｌｉｐｅｒ系（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用するキャピラリーゲル電気泳動によって、安定性の分析を評価した。プロファイルの変化を非ストレス化出発物質に対する割合（％）として計算された。ＰＢＳバッファー中で３０ｋＤａのカットオフを有するＡｍｉｃｏｎスピンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体を濃縮することによって、溶解度を決定した。溶解度を濃縮器からの９０％の回収率において測定し、タンパク質濃度を、ＵＶ２８０ｎｍでの吸光度を用いて測定した。

【表17】

【0390】

前記のとおり、安定性、溶解度および粘度は治療用分子にとって重要なＣＭＣパラメータである。４０℃に対する曝露のような熱ストレス条件または濃縮工程の後の構造的完全性をＳＥＣおよび／またはｃＧＥによって分析して、構造的完全性に対する負荷ストレスの影響を調べる。開始時と比較して負荷ストレス後の１％未満の変化は安定な分子を示すが、１％を超える逸脱は分子における不安定性を示す。ＴＰＰ－２３２８９は、ＴＰＰ－３０７８８と比較して、ＰＢＳ中の遥かに高い溶解度、すなわち、２倍を超える溶解度を示し、これは、例えば低い適用体積を可能にするのに、非常に有益である。更に、ＴＰＰ－２３２９８はＴＰＰ－３０７８８より安定であり、熱ストレスに対して、より耐性であり、ＰＢＳバッファー中で、より低い粘性である。

【0391】

配列

【表18】

【表19】

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図9-1】

【図9-2】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

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