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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-04-02
(45)【発行日】2025-04-10
(54)【発明の名称】巨核球前駆細胞又は巨核球細胞の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/078 20100101AFI20250403BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20250403BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20250403BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20250403BHJP
【ＦＩ】
C12N5/078 ZNA
C12N5/10
C12N15/12
C12N15/113 Z
【請求項の数】
16
(21)【出願番号】P 2021552480
(86)(22)【出願日】2020-10-16
(86)【国際出願番号】 JP2020039162
(87)【国際公開番号】W WO2021075568
(87)【国際公開日】2021-04-22
【審査請求日】2023-10-04
(31)【優先権主張番号】P 2019190048
(32)【優先日】2019-10-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成３１年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、「再生医療実現拠点ネットワークプログラム 技術開発個別課題」「ＨＬＡクラスＩ欠失ユニバーサル血小板の産業化導出に向けた研究開発」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】304021831
【氏名又は名称】国立大学法人千葉大学
(73)【特許権者】
【識別番号】504132272
【氏名又は名称】国立大学法人京都大学
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100152331
【弁理士】
【氏名又は名称】山田 拓
(72)【発明者】
【氏名】▲高▼山 直也
(72)【発明者】
【氏名】江藤 浩之
(72)【発明者】
【氏名】曽根 正光
(72)【発明者】
【氏名】中村 壮
【審査官】西 賢二
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１２／１５７５８６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】杉本直志 et al.，iPS細胞を用いた新たな輸血医療，日本内科学会雑誌，2017年，vol.106, no.4，pp.843-849
【文献】杉本直志 et al.，iPS細胞由来血小板，日本内科学会雑誌，2019年07月，vol.108, no.7，pp.1397-1403
【文献】Besancenot R. et al.，A Senescence-Like Cell-Cycle Arrest Occures During Megakaryocytic Maturation: Implications for Physiological and Pathological Megakaryocytic Proliferation，PLoS Biology，2010年，vol.8, no.9, e1000476，pp.1-11
【文献】Chagraoui H. et al.，SCL-mediated regulation of the cell-cycle regulator p21 is critical for murine megakaryopoiesis，BLOOD，2011年，vol.118, no.3，pp.723-735
【文献】RUBINSTEIN J.D. et al.，Cyclic AMP Signaling Inhibits Megakaryocytic Differentiation by Targeting Transcription Factor 3 (E2A) Cyclin-dependent Kinase Inhibitor 1A (CDKN1A) Transcriptional Axis，The Journal of Biological Chemistry，2012年，vol.287, no.23，pp.19207-19215
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ５／００－５／２８
Ｃ１２Ｎ１５／００－１５／９０
Ａ６１Ｋ３５／００－３５／７６８
Ａ６１Ｐ ７／００－７／１２
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
生体外で、多核化前の巨核球前駆細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子から選択される癌遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現する工程、並びにＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制する工程を含む、巨核球前駆細胞又は巨核球細胞を製造する方法。
【請求項2】
ＩＮＫ４Ａ遺伝子及び／又はＡＲＦ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、あるいはそれらの発現産物の機能を抑制する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
巨核球細胞が成熟巨核球細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
巨核球細胞が不死化されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を強制発現する工程をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
癌遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子及びＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の強制発現を抑制する工程をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現、又はその発現産物の機能の抑制がＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の強制発現と同時に実施される、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項8】
ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現、又はその発現産物の機能の抑制が、ＢＭＩ１遺伝子及びＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の強制発現後の細胞の増殖低下の後に実施される、請求項５に記載の方法。
【請求項9】
細胞の増殖低下がＢＭＩ１遺伝子及びＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の強制発現から３０日以上後である、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
抑制工程が、遺伝子の発現又はその発現産物の機能を抑制する分子を細胞に導入することによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
生体外で、多核化前の巨核球前駆細胞において、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制する工程、並びにＩＮＫ４Ａ遺伝子及び／又はＡＲＦ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、あるいはそれらの発現産物の機能を抑制する工程を含む、巨核球前駆細胞又は巨核球細胞を製造する方法。
【請求項12】
巨核球細胞が成熟巨核球細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
巨核球細胞が不死化されている、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項14】
請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法により巨核球前駆細胞又は巨核球細胞を製造する工程、及び製造された巨核球前駆細胞又は巨核球細胞を培養する工程を含む、血小板を製造する方法。
【請求項15】
生体外で、多核化前の巨核球前駆細胞において、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現又はその発現産物の機能を抑制する工程、並びにＩＮＫ４Ａ遺伝子及び／又はＡＲＦ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、あるいはそれらの発現産物の機能を抑制する工程を含む、多核化前の巨核球前駆細胞の増殖を促進する方法。
【請求項16】
ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現又はその発現産物の機能を抑制する分子、並びにＩＮＫ４Ａ遺伝子及び／又はＡＲＦ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、あるいはそれらの発現産物の機能を抑制する分子を有効成分として含む、多核化前の巨核球前駆細胞の増殖促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は広く、巨核球前駆細胞又は巨核球細胞の製造方法等に関する。
【背景技術】
【0002】
血小板輸血には毎回約２０００億個の血小板が使われるが、血小板は一般に体内寿命が数日と短いため、繰返し投与することがしばしば必要となる。社会高齢化により血小板輸血の繰り返し投与が必要とされる高齢者は増加の一途を辿っているものの、若年ドナー人口は減少している。
【0003】
血小板の社会的需要に応えるべく、発明者らはヒトｉＰＳ細胞を用いて試験管内で血小板製剤の安定産生技術を確立した（非特許文献１、２）。発明者らは、ヒトｉＰＳ細胞由来の造血細胞等に３つの因子（ＭＹＣ／ＢＭＩ１／ＢＣＬ－ＸＬ）を導入して、不死化巨核球株（血小板の素になる細胞）を樹立し、培地を変更するだけで、血小板を大量産生する技術（ヒトｉＰＳ細胞由来人工血小板製剤）も確立している（特許文献１、２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】国際公開第２０１１／０３４０７３号公報
【文献】国際公開第２０１２／１５７５８６号公報
【非特許文献】
【0005】
【文献】Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ． ２０１４ Ａｐｒ ３；１４（４）：５３５－４８
【文献】Ｃｅｌｌ． ２０１８ Ｊｕｌ ２６；１７４（３）：６３６－６４８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
１０11個／血小板を含む製剤１パックを、例えば１０００パック供給するためには、少なくとも１０14-15個（増殖日数で計算するとヒトｉＰＳ細胞から誘導した１０－１４日目の造血前駆細胞にＭＹＣ、ＢＭＩ１及びＢＣＬ－ＸＬを導入後、約４～５ヶ月間）の不死化巨核球細胞が必要である。そのため、血小板製造には高い細胞増殖能力を有する巨核球前駆細胞又は巨核球細胞の製造が欠かせないが、質の悪いｉＰＳ細胞や造血前駆細胞に上記３因子（ＭＹＣ／ＢＭＩ１／ＢＣＬ－ＸＬ）を導入して得られる巨核球前駆細胞又は巨核球細胞の細胞増殖能力には限界があることが判明した。
【0007】
かかる事情に鑑み、本発明は、血小板の安定した産生系の確立のために、増殖能力の高い巨核球前駆細胞又は巨核球細胞を製造する新規な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、上記課題を解決するために検討を重ねた結果、細胞周期の阻害因子ｐ２１をコードするＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現を抑制することで、高い増殖能力を有する巨核球前駆細胞又は巨核球細胞が得られることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【0009】
すなわち、本願発明は以下の発明を包含する。
［１］ 造血前駆細胞又は多核化前の巨核球前駆細胞において、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制する工程を含む、巨核球前駆細胞又は巨核球細胞を製造する方法。
［２］ ＩＮＫ４Ａ遺伝子及び／又はＡＲＦ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、あるいはそれらの発現産物の機能を抑制する工程をさらに含む、［１］に記載の方法。
［３］ 巨核球細胞が成熟巨核球細胞である、［２］に記載の方法。
［４］ 巨核球細胞が不死化されている、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］ 造血前駆細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子から選択される癌遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現する工程をさらに含む、［４］に記載の方法。
［６］ ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を強制発現する工程をさらに含む、［５］に記載の方法。
［７］ 癌遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子及びＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の強制発現を抑制する工程をさらに含む、［６］に記載の方法。
［８］ ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現、又はその発現産物の機能の抑制がＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の強制発現と同時に実施される、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］ ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現、又はその発現産物の機能の抑制が、ＢＭＩ１遺伝子及びＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の強制発現後の細胞の増殖低下の後に実施される、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［１０］ 細胞の増殖低下がＢＭＩ１遺伝子及びＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の強制発現から３０日以上後である、［９］に記載の方法。
［１１］ 抑制工程が、遺伝子の発現又はその発現産物の機能を抑制する分子を細胞に導入することによって行われる、［１］～［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］ ［１］～［１１］のいずれかに記載の方法により巨核球前駆細胞又は巨核球細胞を製造する工程、及び
製造された巨核球前駆細胞又は巨核球細胞を培養する工程を含む、血小板を製造する方法。
［１３］ ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現又はその発現産物の機能を抑制する工程を含む、巨核球前駆細胞又は巨核球細胞の増殖を促進する方法。
［１４］ ＩＮＫ４Ａ遺伝子及び／又はＡＲＦ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、あるいはそれらの発現産物の機能を抑制する工程をさらに含む、［１３］に記載の方法。
［１５］ ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現又はその発現産物の機能を抑制する分子を有効成分として含む、巨核球前駆細胞又は巨核球細胞の増殖促進剤。
［１６］ ＩＮＫ４Ａ遺伝子及び／又はＡＲＦ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、あるいはそれらの発現産物の機能を抑制する分子をさらに含む、［１５］に記載の増殖促進剤。
［１］ 造血前駆細胞又は多核化前の巨核球前駆細胞において、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制する工程を含む、巨核球前駆細胞又は巨核球細胞を製造する方法。
［２］ ＩＮＫ４Ａ遺伝子及び／又はＡＲＦ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、あるいはそれらの発現産物の機能を抑制する工程をさらに含む、［１］に記載の方法。
［３］ 巨核球細胞が成熟巨核球細胞である、［２］に記載の方法。
［４］ 巨核球細胞が不死化されている、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］ 造血前駆細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子から選択される癌遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現する工程をさらに含む、［４］に記載の方法。
［６］ ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を強制発現する工程をさらに含む、［５］に記載の方法。
［７］ 癌遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子及びＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の強制発現を抑制する工程をさらに含む、［６］に記載の方法。
［８］ ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現、又はその発現産物の機能の抑制がＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の強制発現と同時に実施される、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］ ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現、又はその発現産物の機能の抑制が、ＢＭＩ１遺伝子及びＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の強制発現後の細胞の増殖低下の後に実施される、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［１０］ 細胞の増殖低下がＢＭＩ１遺伝子及びＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の強制発現から３０日以上後である、［９］に記載の方法。
［１１］ 抑制工程が、遺伝子の発現又はその発現産物の機能を抑制する分子を細胞に導入することによって行われる、［１］～［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］ ［１］～［１１］のいずれかに記載の方法により巨核球前駆細胞又は巨核球細胞を製造する工程、及び
製造された巨核球前駆細胞又は巨核球細胞を培養する工程を含む、血小板を製造する方法。
［１３］ ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現又はその発現産物の機能を抑制する工程を含む、巨核球前駆細胞又は巨核球細胞の増殖を促進する方法。
［１４］ ＩＮＫ４Ａ遺伝子及び／又はＡＲＦ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、あるいはそれらの発現産物の機能を抑制する工程をさらに含む、［１３］に記載の方法。
［１５］ ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現又はその発現産物の機能を抑制する分子を有効成分として含む、巨核球前駆細胞又は巨核球細胞の増殖促進剤。
［１６］ ＩＮＫ４Ａ遺伝子及び／又はＡＲＦ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、あるいはそれらの発現産物の機能を抑制する分子をさらに含む、［１５］に記載の増殖促進剤。
【0010】
［１７］ 造血前駆細胞又は多核化前の巨核球前駆細胞において、ｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制する工程を含む、巨核球前駆細胞又は巨核球細胞を製造する方法。
［１８］ ＩＮＫ４Ａ遺伝子及び／又はＡＲＦ遺伝子及び／又はＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現、あるいはそれらの発現産物の機能を抑制する工程をさらに含む、［１７］に記載の方法。
［１９］ 巨核球細胞が成熟巨核球細胞である、［１７］又は［１８］に記載の方法。
［２０］ 巨核球細胞が不死化されている、［１７］～［１９］のいずれかに記載の方法。
［２１］ 造血前駆細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子から選択される癌遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現する工程をさらに含む、［２０］に記載の方法。
［２２］ ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を強制発現する工程をさらに含む、［２１］に記載の方法。
［２３］ 癌遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子及びＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の強制発現を抑制する工程をさらに含む、［２２］に記載の方法。
［２４］ ｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能の抑制がＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の強制発現と同時に実施される、［１７］～［２３］のいずれかに記載の方法。
［２５］ ｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能の抑制が、ＢＭＩ１遺伝子及びＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の強制発現後の細胞の増殖低下の後に実施される、［１７］～［２３］のいずれかに記載の方法。
［２６］ 細胞の増殖低下がＢＭＩ１遺伝子及びＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の強制発現から３０日以上後である、［２５］に記載の方法。
［２７］ 抑制工程が、遺伝子の発現又はその発現産物の機能を抑制する分子を細胞に導入することによって行われる、［１７］～［２６］のいずれかに記載の方法。
［２８］ ［１７］～［２７］のいずれかに記載の方法により巨核球前駆細胞又は巨核球細胞を製造する工程、及び
製造された巨核球前駆細胞又は巨核球細胞を培養する工程を含む、血小板を製造する方法。
［２９］ ｐ５３遺伝子の発現又はその発現産物の機能を抑制する工程を含む、巨核球前駆細胞又は巨核球細胞の増殖を促進する方法。
［３０］ ＩＮＫ４Ａ遺伝子及び／又はＡＲＦ遺伝子及び／又はＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現、あるいはそれらの発現産物の機能を抑制する工程をさらに含む、［２９］に記載の方法。
［３１］ ｐ５３遺伝子の発現又はその発現産物の機能を抑制する分子を有効成分として含む、巨核球前駆細胞又は巨核球細胞の増殖促進剤。
［３２］ ＩＮＫ４Ａ遺伝子及び／又はＡＲＦ遺伝子及び／又はＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現、あるいはそれらの発現産物の機能を抑制する分子をさらに含む、［３１］に記載の増殖促進剤。
［１８］ ＩＮＫ４Ａ遺伝子及び／又はＡＲＦ遺伝子及び／又はＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現、あるいはそれらの発現産物の機能を抑制する工程をさらに含む、［１７］に記載の方法。
［１９］ 巨核球細胞が成熟巨核球細胞である、［１７］又は［１８］に記載の方法。
［２０］ 巨核球細胞が不死化されている、［１７］～［１９］のいずれかに記載の方法。
［２１］ 造血前駆細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子から選択される癌遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現する工程をさらに含む、［２０］に記載の方法。
［２２］ ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を強制発現する工程をさらに含む、［２１］に記載の方法。
［２３］ 癌遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子及びＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の強制発現を抑制する工程をさらに含む、［２２］に記載の方法。
［２４］ ｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能の抑制がＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の強制発現と同時に実施される、［１７］～［２３］のいずれかに記載の方法。
［２５］ ｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能の抑制が、ＢＭＩ１遺伝子及びＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の強制発現後の細胞の増殖低下の後に実施される、［１７］～［２３］のいずれかに記載の方法。
［２６］ 細胞の増殖低下がＢＭＩ１遺伝子及びＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の強制発現から３０日以上後である、［２５］に記載の方法。
［２７］ 抑制工程が、遺伝子の発現又はその発現産物の機能を抑制する分子を細胞に導入することによって行われる、［１７］～［２６］のいずれかに記載の方法。
［２８］ ［１７］～［２７］のいずれかに記載の方法により巨核球前駆細胞又は巨核球細胞を製造する工程、及び
製造された巨核球前駆細胞又は巨核球細胞を培養する工程を含む、血小板を製造する方法。
［２９］ ｐ５３遺伝子の発現又はその発現産物の機能を抑制する工程を含む、巨核球前駆細胞又は巨核球細胞の増殖を促進する方法。
［３０］ ＩＮＫ４Ａ遺伝子及び／又はＡＲＦ遺伝子及び／又はＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現、あるいはそれらの発現産物の機能を抑制する工程をさらに含む、［２９］に記載の方法。
［３１］ ｐ５３遺伝子の発現又はその発現産物の機能を抑制する分子を有効成分として含む、巨核球前駆細胞又は巨核球細胞の増殖促進剤。
［３２］ ＩＮＫ４Ａ遺伝子及び／又はＡＲＦ遺伝子及び／又はＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現、あるいはそれらの発現産物の機能を抑制する分子をさらに含む、［３１］に記載の増殖促進剤。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、出発細胞におけるＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現を抑制することで、従来技術よりも増殖期間が長く、増殖能力が高い巨核球前駆細胞又は巨核球細胞であって、安定した血小板の産生が可能な巨核球前駆細胞又は巨核球細胞の製造が可能になる。
【0012】
ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子に加え、更に癌抑制遺伝子であるｐ５３遺伝子及び／又はＩＮＫ４Ａ／ＡＲＦ遺伝子の発現を抑制することで、巨核球前駆細胞又は巨核球細胞の増殖期間が更に長くなり、増殖能力も更に増大する。
【0013】
出発細胞におけるｐ５３遺伝子の発現を抑制することでも、従来技術よりも増殖期間が長く、増殖能力が高い巨核球前駆細胞又は巨核球細胞であって、安定した血小板の産生が可能な巨核球前駆細胞又は巨核球細胞の製造が可能になる。
【0014】
ｐ５３遺伝子に加え、更にＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はＩＮＫ４Ａ／ＡＲＦ遺伝子の発現を抑制することで、巨核球前駆細胞又は巨核球細胞の増殖期間が更に長くなり、増殖能力も更に増大する。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】図１は、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現を抑制した後の巨核球前駆細胞又は巨核球細胞（ＭＫＣＬ１）の増殖を解析した結果を示す。縦軸は遺伝子の発現を抑制してからの細胞の増殖数、横軸は発現抑制からの日数を示す。
【図2】図２は、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子、ＩＮＫ４Ａ／ＡＲＦ遺伝子及びｐ５３遺伝子の発現を抑制した後の巨核球前駆細胞又は巨核球細胞（ＭＫＣＬ２３）の増殖を解析した結果を示す。縦軸は遺伝子の発現を抑制してからの細胞の増殖数、横軸は発現抑制からの日数を示す。
【図3】図３は、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子、ＩＮＫ４Ａ／ＡＲＦ遺伝子及びｐ５３遺伝子の発現を抑制した後の巨核球前駆細胞又は巨核球細胞（ＭＫＣＬ２６）の増殖を解析した結果を示す。縦軸は遺伝子の発現を抑制してからの細胞の増殖数、横軸は発現抑制からの日数を示す。
【図4】図４は、ＢＣＬ－ＸＬ導入と同時又はその２週間後にＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及びｐ５３遺伝子の発現を抑制した後の巨核球細胞（ＭＫＣＬ１）の増殖を解析した結果を示す。縦軸は遺伝子の発現を抑制してからの細胞の増殖数、横軸は発現抑制からの日数を示す。
【図6】図６は、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現を抑制した巨核球細胞（ＭＫＣＬ２１）の血小板産生能を従来の３因子（ＭＹＣ／ＢＭＩ１／ＢＣＬ－ＸＬ）強制発現によるもっとも優れた血小板放出能のある巨核球細胞株（ＳｅＶ２）と比較した結果を示す。上パネル：ドキシサイクリンを加え、ＭＹＣ／ＢＭＩ１／ＢＣＬ－ＸＬの３因子の発現をさせた状態。下パネル：培養液からドキシサイクリンを除去し、ＭＹＣ／ＢＭＩ１／ＢＣＬ－ＸＬの３因子の発現を抑制して５日目の状態。
【図8】図８は、コントロールベクター感染後のＭＫＣＬ７株と、ＣＤＫＮ１Ａ抑制後のＭＫＣＬ２１株と、ＣＤＫＮ１Ａ及びｐ５３抑制後のＭＫＣＬ３０株とで、それぞれ、無刺激、或いは０．４μＭのＰＭＡ又は１００μＭのＡＤＰ＋４０μＭのＴＲＡＰ－６存在下での血小板放出能を比較した結果を示す。
【図9】図９は、ｃ－ＭＹＣ／ＢＭＩ１の２遺伝子を導入した巨核球前駆細胞株を１４日間後に、そのまま培養した株（ＭＢ）、ＭＢ株に更にドキシサイクリン誘導レンチウイルスベクターを用いてＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を導入した株（ＭＢＸ）、ＭＢ株に持続的に発現するｓｈ ｐ２１／ｐ５３レンチウイルスベクターを感染させた株（ＭＢ－ｐ２１／ｐ５３＿ＫＤ）、及びＭＢＸ株に持続的に発現するｓｈ ｐ２１／ｐ５３レンチウイルスベクターを感染させた株（ＭＢＸ－ｐ２１／ｐ５３＿ＫＤ）の巨核球前駆細胞株について、１４日目と３１日目と４３日目における細胞の増殖数の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0016】
（巨核球前駆細胞又は巨核球細胞の製造方法）
本実施形態に係る巨核球前駆細胞又は巨核球細胞を製造する方法は、造血前駆細胞又は多核化前の巨核球前駆細胞において、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制する工程を含む。本明細書で使用する場合、「遺伝子の発現」とは、対象の遺伝子をコードするＤＮＡがｍＲＮＡへ転写されること、及び／又はｍＲＮＡがタンパク質へ翻訳されることを意味する。
本実施形態に係る巨核球前駆細胞又は巨核球細胞を製造する方法は、造血前駆細胞又は多核化前の巨核球前駆細胞において、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制する工程を含む。本明細書で使用する場合、「遺伝子の発現」とは、対象の遺伝子をコードするＤＮＡがｍＲＮＡへ転写されること、及び／又はｍＲＮＡがタンパク質へ翻訳されることを意味する。
【0017】
ＣＤＫＮ１Ａ（ｃｙｃｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １Ａ）遺伝子は細胞周期の阻害因子ｐ２１をコードしており、癌抑制遺伝子であるｐ５３遺伝子の下流遺伝子としても知られている。活性化したｐ５３タンパク質は転写因子として働き、ｐ５３下流遺伝子群の発現を増加させる。そのため、本明細書で使用する場合、「遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制する」とは、対象の遺伝子の発現やその発現産物（例えば、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の場合にはｐ２１）の機能を直接抑制することによって達成してもよいし、対象の遺伝子の上流にある遺伝子の発現やそれらの発現産物の機能を制御することで達成することもできる。ただし、本明細書においては、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制する場合、その対象となるＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の上流遺伝子の中に、ｐ５３遺伝子、更にはｐ５３遺伝子の上流にある別の癌抑制遺伝子であるＩＮＫ４Ａ遺伝子及びＡＲＦ遺伝子は含まれない。
【0018】
ＩＮＫ４（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ＣＤＫ４）Ａ遺伝子及びＡＲＦ（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）遺伝子は同じ遺伝子座に存在する遺伝子であり、癌抑制遺伝子として知られている。両遺伝子は一部のエクソンを共有しており、どちらも増殖抑制に働くと考えられている。共通のエクソンを標的とするｓｉＲＮＡなどの分子を使用することで、両遺伝子の発現を抑制することができる。本明細書で使用する場合、「ＩＮＫ４Ａ／ＡＲＦ遺伝子」とは両方の遺伝子か、いずれか一方の遺伝子、つまり「ＩＮＫ４Ａ遺伝子及び／又はＡＲＦ遺伝子」として解釈される。
【0019】
ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子のみならず、ＩＮＫ４Ａ／ＡＲＦ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、あるいはそれらの発現産物の機能を抑制することが好ましい。ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子とｐ５３遺伝子の組み合わせがより好ましい。
【0020】
本明細書で使用する場合のＣＤＫＮ１Ａ遺伝子、ＩＮＫ４Ａ／ＡＲＦ遺伝子、ｐ５３遺伝子等の各遺伝子は、それらの公知の核酸配列、例えばｃＤＮＡ配列でコードされるものを意味する。各遺伝子には、公知の核酸配列の相同性に基づいて同定されるホモログも含まれ得る。
【0021】
ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子のホモログとは、そのｃＤＮＡ配列が、例えば、配列番号１で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなる遺伝子のことである。配列番号１で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなるｃＤＮＡとは、配列番号１で表される配列からなるＤＮＡと、約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、例えば８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、よりさらに好ましくは約９０％以上、例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、最も好ましくは約９９％以上の同一性を有する配列からなるＤＮＡ、もしくは、配列番号１で表わされる核酸配列に相補的な配列からなるＤＮＡ又はＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡであって、これらのＤＮＡによってコードされるタンパク質が、細胞周期を阻害するもののことである。あるいは、配列番号１で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなるｃＤＮＡとは、配列番号１で表される配列中の１又は複数個、例えば１～１０個、好ましくは数個、例えば１～５個、１～４個、１～３個、１～２個の塩基が欠失、置換若しくは付加された配列からなるＤＮＡであって、これらのＤＮＡによってコードされるタンパク質が、細胞周期を阻害するもののことである。
【0022】
また、本発明で用いられるＩＮＫ４Ａ遺伝子のホモログとは、そのｃＤＮＡ配列が、例えば、配列番号２で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなる遺伝子のことである。配列番号２で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなるｃＤＮＡとは、配列番号２で表される配列からなるＤＮＡと、約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、例えば８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、よりさらに好ましくは約９０％以上、例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、最も好ましくは約９９％以上の同一性を有する配列からなるＤＮＡ、もしくは、配列番号２で表わされる核酸配列に相補的な配列からなるＤＮＡ又はＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡであって、そのＤＮＡによってコードされるタンパク質が、癌を抑制するもののことである。あるいは、配列番号２で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなるｃＤＮＡとは、配列番号２で表される配列中の１又は複数個、例えば１～１０個、好ましくは数個、例えば１～５個、１～４個、１～３個、１～２個の塩基が欠失、置換若しくは付加された配列からなるＤＮＡであって、これらのＤＮＡによってコードされるタンパク質が、癌を抑制するもののことである。
【0023】
また、本発明で用いられるＡＲＦ遺伝子のホモログとは、そのｃＤＮＡ配列が、例えば、配列番号３で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなる遺伝子のことである。配列番号３で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなるｃＤＮＡとは、配列番号３で表される配列からなるＤＮＡと、約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、例えば８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、よりさらに好ましくは約９０％以上、例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、最も好ましくは約９９％以上の同一性を有する配列からなるＤＮＡ、もしくは、配列番号３で表わされる核酸配列に相補的な配列からなるＤＮＡ又はＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡであって、そのＤＮＡによってコードされるタンパク質が、癌を抑制するもののことである。あるいは、配列番号３で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなるｃＤＮＡとは、配列番号３で表される配列中の１又は複数個、例えば１～１０個、好ましくは数個、例えば１～５個、１～４個、１～３個、１～２個の塩基が欠失、置換若しくは付加された配列からなるＤＮＡであって、これらのＤＮＡによってコードされるタンパク質が、癌を抑制するもののことである。
【0024】
ｐ５３遺伝子とは、そのｃＤＮＡ配列が、例えば、配列番号４で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなる遺伝子のことである。配列番号４で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなるｃＤＮＡとは、配列番号４で表される配列からなるＤＮＡと、約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、例えば８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、よりさらに好ましくは９０％以上、例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、最も好ましくは約９９％以上の同一性を有する配列からなるＤＮＡ、もしくは、配列番号４で表わされる核酸配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡであって、そのＤＮＡによってコードされるタンパク質が、癌を抑制するもののことである。あるいは、配列番号４で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなるｃＤＮＡとは、配列番号４で表される配列中の１又は複数個、例えば１～１０個、好ましくは数個、例えば１～５個、１～４個、１～３個、１～２個の塩基が欠失、置換若しくは付加された配列からなるＤＮＡであって、これらのＤＮＡによってコードされるタンパク質が、癌を抑制するもののことである。
【0025】
ここで、ストリンジェントな条件とは、当業者によって容易に決定されるハイブリダイゼーションの条件のことであり、一般的に核酸の塩基長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な実験条件である。一般に、塩基が長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、塩基が短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補的鎖がその融点よりやや低い環境における再アニール能力に依存する。
【0026】
具体的には、例えば、低ストリンジェントな条件として、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄段階において、３７℃～４２℃の温度条件下、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中で洗浄することなどが上げられる。また、高ストリンジェントな条件として、例えば、洗浄段階において、６５℃、５×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で洗浄することなどが挙げられる。ストリンジェントな条件をより高くすることにより、相同性の高いポリヌクレオチドを得ることができる。
【0027】
遺伝子の発現又はその発現産物の機能の抑制は、既知の方法により行うことができ、例えば、各遺伝子の発現を特異的に抑制し得るｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、又はこれらの核酸分子を発現し得る発現ベクターなどの、種々の分子を細胞に導入することにより行うことができる。あるいは、それ以外の技術、例えばゲノム編集技術などを利用し、遺伝子をノックダウンしてもよい。例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを利用して遺伝子をノックダウンする場合、その遺伝子を標的とするガイドＲＮＡと、ｄＣａｓのような不活化Ｃａｓとリプレッサードメインの融合タンパク質などが用いられる。
【0028】
ｓｉＲＮＡは、典型的には、標的遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列又はその部分配列と相補的な配列を有するＲＮＡとその相補鎖からなる２本鎖オリゴＲＮＡである。これらのＲＮＡのヌクレオチド配列は、発現が抑制される遺伝子の配列情報により当業者が適宜設計することができる。ｓｉＲＮＡの代わりにｓｈＲＮＡを使用することもできる。
【0029】
アンチセンス核酸とは、標的ｍＲＮＡ（成熟ｍＲＮＡ又は初期転写産物）を発現する細胞の生理的条件下で標的ｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、かつハイブリダイズした状態で標的ｍＲＮＡにコードされるポリペプチドの翻訳を阻害し得る核酸を意味する。アンチセンス核酸の種類は、ＤＮＡ又はＲＮＡであってもよいし、あるいはＤＮＡとＲＮＡのキメラであってもよい。アンチセンス核酸のヌクレオチド配列は、発現が抑制される遺伝子の配列情報により当業者が適宜設計することができる。
【0030】
上記の技術に加え、各遺伝子の発現を抑制することが知られている化合物を使用することもできる。例えば、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現を抑制する化合物として、ＵＣ２２８８、ブチロラクトンＩ、ＬＬＷ１０、ソラフェニブ、ステリグマトシスチンなどのｐ２１阻害剤が知られている。また、ｐ５３阻害剤としては、ピフィスリンα、ナトリン－３、ＲｅＡＣｐ５３、ＲＧ７３８８などが知られている。
【0031】
あるいは、遺伝子の発現又はその発現産物の機能の抑制のために、公知の技術を用いて対象の遺伝子をノックアウトしてもよい。遺伝子のノックアウトとは、遺伝子の全部又は一部がその本来の機能を発揮しないように破壊又は変異されていることを意味する。遺伝子は、ゲノム上の一つの対立遺伝子が機能しないように破壊又は変異されていてもよい。また、複数の対立遺伝子が破壊又は変異されていてもよい。ノックアウトは、既知の方法により行うことができ、例えば、標的遺伝子との間で遺伝的組換えが起こるように作られたＤＮＡコンストラクトを細胞に導入することによりノックアウトする方法や、ＴＡＬＥＮやＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムなどのゲノム編集技術を利用して、塩基の挿入、欠失、置換導入によりノックアウトする方法が挙げられる。
【0032】
その他、各遺伝子の転写及び転写産物を抑制する化合物、又は産生されたタンパクの標的タンパクとの結合阻害剤 (ｐ５３結合阻害： ピフィスリンα、ナトリン－３、ＲｅＡＣｐ５３、ＲＧ７３８８等；ｐ２１結合阻害：ＵＣ２２８８、ブチロラクトンＩ、ＬＬＷ１０、ソラフェニブ、ステリグマトシスチン等)などを使用してもよい。
【0033】
上記遺伝子の発現又はその発現産物の機能の抑制は、巨核球細胞へ分化する前の細胞、例えば、造血前駆細胞又は多核化前の巨核球前駆細胞において行われる。本明細書で使用する場合、「造血前駆細胞」とは、ＣＤ３４陽性細胞として特徴付けられる造血系の細胞であり、例えば、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞由来の細胞、特に、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞から調製されるネット様構造物（ＥＳ－ｓａｃ又はｉＰＳ－ｓａｃとも称する）から得られる細胞（特に、ネット様構造物から分離した直後の細胞）が好ましい。ここで、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞から調製される「ネット様構造物」とは、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞由来の立体的な嚢状（内部に空間を伴うもの）構造体で、内皮細胞集団などで形成され、内部に造血前駆細胞を含むもののことである。
【0034】
「多核化前の巨核球前駆細胞」とは、多核化した巨核球細胞よりも未分化な細胞であって、巨核球系列の特異的マーカーであるＣＤ４１ａ陽性／ＣＤ４２ａ陽性／ＣＤ４２ｂ陽性で、核の多倍体化を起こしていない単核又は二核の細胞を意味する。
【0035】
造血前駆細胞又は多核化前の巨核球前駆細胞は、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血から単離して得ることもできるし、さらにより未分化な細胞であるＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞から分化誘導して得ることもできる。
【0036】
巨核球細胞は、公知の手法により、造血前駆細胞又は多核化前の巨核球前駆細胞から更に分化誘導することで製造される。巨核球細胞は、細胞表面マーカーであるＣＤ４１ａ、ＣＤ４２ａ、及びＣＤ４２ｂが陽性であることを特徴としている。巨核球細胞は、これらのマーカーに加え、ＣＤ９、ＣＤ６１、ＣＤ６２ｐ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５１、ＣＤ１１０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３１、及びＣＤ２０３ｃからなる群より選択される少なくとも１つのマーカーをさらに発現していることもある。巨核球細胞は、多核化（多倍体化）し成熟すると、血小板を放出する。多核化した巨核球細胞は、通常の細胞の１６～３２倍のゲノムを有する。
【0037】
本明細書において単に「巨核球細胞」という場合、特に断らない限り、未成熟な巨核球細胞や、多核化が進んで成熟した巨核球細胞（成熟巨核球細胞）など、あらゆる巨核球細胞を包含する意味として使用される。
【0038】
巨核球細胞は更に不死化されていることが好ましい。不死化巨核球細胞の製造方法の非限定的な例として、国際公開第２０１１／０３４０７３号（上掲）及び米国特許出願公開第２０１２／０２３８０２３号に記載された方法が挙げられる。同方法では、巨核球細胞より未分化な細胞において、癌遺伝子とポリコーム遺伝子を強制発現させることにより、無限に増殖する不死化巨核球細胞株を得ることができる。
【0039】
また、国際公開第２０１２／１５７５８６号（上掲）及び米国特許出願公開第２０１４／０１２７８１５号に記載された方法に従って、巨核球細胞より未分化な細胞においてアポトーシス抑制遺伝子を強制発現させることによっても、不死化巨核球細胞を得ることができる。これらの不死化巨核球細胞は、遣伝子の強制発現を解除することにより、自己複製能を獲得するとともに、多核化が進み、血小板を放出するようになる。
【0040】
癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、及び／又はアポトーシス抑制遺伝子の強制発現は、同時に行ってもよく、順次行ってもよい。例えば、癌遺伝子とポリコーム遺伝子を強制発現させ、その後この強制発現を抑制し、続いてアポトーシス抑制遺伝子を強制発現させ、その後この強制発現を抑制して、多核化巨核球細胞を得てもよい。また、癌遺伝子とポリコーム遺伝子とアポトーシス抑制遺伝子を同時に強制発現させ、これらの強制発現を同時に抑制して、多核化巨核球細胞を得ることもできる。まず、癌遣伝子とポリコーム遺伝子を強制発現させ、続いてアポトーシス抑制遺伝子を強制発現させ、これらの強制発現を同時に抑制して、多核化巨核球細胞を得ることもできる。
【0041】
ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現、又はその発現産物の機能の抑制は、癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、又はアポトーシス抑制遺伝子のいずれかの強制発現と同時、好ましくはアポトーシス抑制遺伝子の強制発現と同時か、あるいはその後、例えば細胞増殖の低下、例えば、ある時点の細胞増殖率を直近の細胞増殖率と比較し（例えば、一週間ごとに細胞の増殖を確認したとして、ある週の細胞増殖率をその一週間前の増殖率と比較して）、増殖率が１／２以下になった状態が確認された後に実施することができる。細胞増殖の低下は、限定することを意図するものではないが、癌遺伝子又はポリコーム遺伝子の強制発現直後から約３０日後、約４０日後、約５０日後、約６０日後、約７０日後、約８０日後、又は約９０日後まで見られる。
【0042】
本明細書において「癌遺伝子」とは、生体内において細胞の癌化を誘導する遺伝子のことをいい、例えば、ＭＹＣファミリー遺伝子（例えば、ｃ－ＭＹＣ、Ｎ－ＭＹＣ、Ｌ－ＭＹＣ）、ＳＲＣファミリー遺伝子、ＲＡＳファミリー遺伝子、ＲＡＦファミリー遺伝子、ｃ－Ｋｉｔ、ＰＤＧＦＲ、Ａｂｌなどのプロテインキナーゼファミリー遺伝子が挙げられる。これらの中でもＭＹＣファミリー遺伝子、特にｃ－ＭＹＣが好ましい。
【0043】
本明細書において「ポリコーム遣伝子」とは、ＣＤＫＮ２ａ（ＩＮＫ４Ａ／ＡＲＦ）遺伝子を負に制御し、細胞老化を回避するために機能する遺伝子をいう（小倉ら， 再生医療，ｖｏｌ．６，Ｎｏ．４，ｐｐ２６－３２；Ｊｓｅｕｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊｓｅｕｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．７，ｐｐ６６７－６７７，２００６；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．１００，ｐｐ２１１－２１６，２００３）。ポリコーム遺伝子の非限定的な例として、ＢＭＩ１、Ｍｅｌ１８、Ｒｉｎｇ１ａ／ｂ、Ｐｈｃ１／２／３、Ｃｂｘ２／４／６／７／８、Ｅｚｈ２、Ｅｅｄ、Ｓｕｚ１２、ＨＡＤＣ、Ｄｎｍｔｌ／３ａ／３ｂが挙げられる。これらの中でもＢＭＩ１が好ましい。
【0044】
本明細書において「アポトーシス抑制遺伝子」とは、細胞のアポトーシスを抑制する機能を有する遣伝子をいい、例えば、ＢＣＬ２遺伝子、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ遺伝子、ＭＣＬｌ遺伝子などが挙げられる。これらの中でもＢＣＬ－ＸＬ遺伝子が好ましい。
【0045】
遺伝子の強制発現及び強制発現の解除は、国際公開第２０１１／０３４０７３号（上掲）及び米国特許出願公開第２０１２／０２３８０２３号、国際公開第２０１２／１５７５８６号（上掲）及び米国特許出願公開第２０１４／０１２７８１５号、国際公開第２０１４／１２３２４２号及び米国特許出願公開第２０１６／０００２５９９号、又はＮａｋａｍｕｒａ Ｓ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ． １４， ５３５－５４８， ２０１４に記載された方法、その他の公知の方法又はそれに準ずる方法で行うことができる。
【0046】
上記強制発現の期間は当業者が適宜決定することができるが、癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、及び／又はアポトーシス抑制遺伝子の強制発現については、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現を抑制した後、所望の期間経過後に強制発現を抑制（解除）することが好ましい。なお、強制発現後に、細胞を継代培養してもよく、最後の継代から強制発現を解除する日までの期間も特に限定されないが、例えば、１日間、２日間又は３日間以上としてもよい。
【0047】
遺伝子の強制発現及びその解除のためにＴｅｔ－ｏｎ（登録商標）又はＴｅｔ－ｏｆｆ（登録商標）システムのような薬剤応答性の遺伝子発現誘導システムを用いる場合、強制発現する工程においては、対応する薬剤、例えば、テトラサイクリン又はドキシサイクリンを培地に含有させ、これらを培地から除くことによって強制発現を抑制してもよい。
【0048】
更なる局面において、巨核球前駆細胞又は巨核球細胞を製造する方法は、造血前駆細胞又は多核化前の巨核球前駆細胞において、ｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制する工程を含む。
【0049】
本局面において、ｐ５３遺伝子のみならず、ＩＮＫ４Ａ／ＡＲＦ遺伝子及び／又はＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現、あるいはそれらの発現産物の機能を抑制することが好ましい。ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子とｐ５３遺伝子の組み合わせがより好ましい。
【0050】
本局面において、遺伝子の発現又はその発現産物の機能の抑制は、上述の方法により行うことができる。
【0051】
本局面において、上記遺伝子の発現又はその発現産物の機能の抑制は、巨核球細胞へ分化する前の細胞、例えば、造血前駆細胞又は多核化前の巨核球前駆細胞において行われる。
【0052】
本局面において、巨核球細胞は更に不死化されていることが好ましい。不死化巨核球細胞の製造方法の非限定的な例として、国際公開第２０１１／０３４０７３号（上掲）及び米国特許出願公開第２０１２／０２３８０２３号に記載された方法が挙げられる。同方法では、巨核球細胞より未分化な細胞において、癌遺伝子とポリコーム遺伝子を強制発現させることにより、無限に増殖する不死化巨核球細胞株を得ることができる。
【0053】
また、国際公開第２０１２／１５７５８６号（上掲）及び米国特許出願公開第２０１４／０１２７８１５号に記載された方法に従って、巨核球細胞より未分化な細胞においてアポトーシス抑制遺伝子を強制発現させることによっても、不死化巨核球細胞を得ることができる。これらの不死化巨核球細胞は、遣伝子の強制発現を解除することにより、自己複製能を獲得するとともに、多核化が進み、血小板を放出するようになる。
【0054】
本局面において、癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、及び／又はアポトーシス抑制遺伝子の強制発現は、同時に行ってもよく、順次行ってもよい。例えば、癌遺伝子とポリコーム遺伝子を強制発現させ、その後この強制発現を抑制し、続いてアポトーシス抑制遺伝子を強制発現させ、その後この強制発現を抑制して、多核化巨核球細胞を得てもよい。また、癌遺伝子とポリコーム遺伝子とアポトーシス抑制遺伝子を同時に強制発現させ、これらの強制発現を同時に抑制して、多核化巨核球細胞を得ることもできる。まず、癌遣伝子とポリコーム遺伝子を強制発現させ、続いてアポトーシス抑制遺伝子を強制発現させ、これらの強制発現を同時に抑制して、多核化巨核球細胞を得ることもできる。
【0055】
本局面において、ｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能の抑制は、癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、又はアポトーシス抑制遺伝子のいずれかの強制発現と同時、好ましくはアポトーシス抑制遺伝子の強制発現と同時か、あるいはその後、例えば細胞増殖の低下、例えば、ある時点の細胞増殖率を直近の細胞増殖率と比較し（例えば、一週間ごとに細胞の増殖を確認したとして、ある週の細胞増殖率をその一週間前の増殖率と比較して）、増殖率が１／２以下になった状態が確認された後に実施することができる。細胞増殖の低下は、限定することを意図するものではないが、癌遺伝子又はポリコーム遺伝子の強制発現直後から約３０日後、約４０日後、約５０日後、約６０日後、約７０日後、約８０日後、又は約９０日後まで見られる。
【0056】
本局面において、癌遺伝子としては、ＭＹＣファミリー遺伝子、特にｃ－ＭＹＣが好ましい。ポリコーム遣伝子としては、ＢＭＩ１が好ましい。アポトーシス抑制遺伝子としては、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子が好ましい。
【0057】
本局面の一態様において、癌遺伝子（例、ｃ－ＭＹＣ）及びポリコーム遺伝子（例、ＢＭＩ１）を強制発現させることにより、不死化巨核球細胞株を得る。アポトーシス抑制遺伝子（例、ＢＣＬ－ＸＬ）の強制発現は行っても行わなくてもよい。
【0058】
本局面において、遺伝子の強制発現及び強制発現の解除は、上述した方法により行うことができる。
【0059】
本局面において、上記強制発現の期間は当業者が適宜決定することができるが、癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、及び／又はアポトーシス抑制遺伝子の強制発現については、ｐ５３遺伝子の発現を抑制した後、所望の期間経過後に強制発現を抑制（解除）することが好ましい。なお、強制発現後に、細胞を継代培養してもよく、最後の継代から強制発現を解除する日までの期間も特に限定されないが、例えば、１日間、２日間又は３日間以上としてもよい。
【0060】
造血前駆細胞又は多核化前の巨核球前駆細胞、更には巨核球前駆細胞又は巨核球細胞の培養条件は、細胞の種類やその状態に応じて当業者が適宜決定することができる。例えば、培養温度は約３５℃～約４２℃、約３６℃～約４０℃、又は約３７℃～約３９℃とすることができ、二酸化炭素濃度は例えば５％ＣＯ2、酸素濃度は例えば２０％０2とすることができる。静置培養であっても、振とう培養であってもよい。振とう培養の場合の振とう速度も特に限定されず、例えば、１０ｒｐｍ～２００ｒｐｍ、３０ｒｐｍ～１５０ｒｐｍ等とすることができる。
【0061】
培地は、血清、インスリン、トランスフェリン、セリン、チオールグリセロール、アスコルビン酸、ＴＰＯを含むイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）培地であってもよい。この場合、ＩＭＤＭ培地はさらにＳＣＦを含んでいてもよく、さらにヘパリンを含んでいてもよい。それぞれの濃度も特に限定されないが、例えば、ＴＰＯは、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、又は約５０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬとすることができ、ＳＣＦは、約１０ｇ／ｍＬ～約２００ｇ／ｍＬ、又は約５０ｇ／ｍＬとすることができ、ヘパリンは、約１０Ｕ／ｍＬ～約１００Ｕ／ｍＬ、又は約２５Ｕ／ｍＬとすることができる。ホルボールエステル（例えば、ホルボール－１２－ミリスタート－１３－アセタート；ＰＭＡ）を加えてもよい。
【0062】
細胞の培養工程は、フィーダー細胞の存在下又は不在下で実施することができる。本明細書において、「フィーダー細胞」とは、増殖又は分化させようとしている標的細胞の培養に必要な環境を整えるために、標的細胞と共培養される細胞をいう。フィーダー細胞は、標的細胞と識別できる細胞である限り、同種由来の細胞であっても異種由来の細胞であってもよい。フィーダー細胞は、抗生物質やガンマ線により増殖しないよう処理した細胞であっても、処理されていない細胞であってもよい。
【0063】
培地は、血清又は血漿を含有していてもよく、あるいは無血清でもよい。血清を用いる場合は、ヒト血清が好ましい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、２－メルカプトエタノール、チオールグリセロール、モノチオグリセロール（ＭＴＧ）、脂質、アミノ酸（例えばＬ－グルタミン）、アスコルビン酸、ヘパリン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、サイトカインなどの１つ以上の物質も含有してもよい。サイトカインとしては、例えば、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、各種ＴＰＯ様作用物質、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＴＳ（インスリンートランスフェリンーセレナイト）サプリメント、ＡＤＡＭ（Ａ Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ Ａｎｄ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ）阻害剤などが例示される。
【0064】
芳香族炭化水素受容体（Ａｒｙｌ Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＡｈＲ）アンタゴニスト単独、又はＲＯＣＫ（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ ｆｏｒｍｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ）阻害剤との組み合わせを添加した培地で巨核球細胞を培養すると、フィーダー細胞を使用しない場合でも、フィーダー細胞を使用した場合に匹敵する血小板産生促進効果を得ることができる（国際公開２０１６／２０４２５６号公報及び米国特許出願公開第２０１９／００４８３１７号）。
【0065】
（血小板の製造方法）
本実施形態に係る血小板を製造する方法は、上記方法に従い製造された巨核球前駆細胞又は巨核球細胞を更に培養する工程を含む。
本実施形態に係る血小板を製造する方法は、上記方法に従い製造された巨核球前駆細胞又は巨核球細胞を更に培養する工程を含む。
【0066】
巨核球細胞を培養する際の培地は特に限定されず、巨核球細胞から血小板を産生するのに好適な公知の培地やそれに準ずる培地を適宜使用することができる。例えば、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）培地、１９９培地、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）培地、ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、フィッシャー培地、ニューロベーサル培地（ライフテクノロジーズ）及びこれらの混合培地が挙げられる。
【0067】
高品質な血小板を大量に製造する観点からは、撹拌羽根や撹拌子を備えた培養容器内で巨核球細胞を培養することが好ましい（国際公開２０１７／０４７４９２号公報及び米国特許出願公開第２０１８／０２５８３９５号、国際公開２０１７／０７７９６４号公報及び米国特許出願公開第２０１８／０３１８３５２号）。
【0068】
製造した血小板を用いて、更に血小板製剤又は血液製剤を製造することもできる。血小板製剤の製造方法は、血小板が豊富に存在する画分を回収する工程と、血小板が豊富に存在する画分から血小板以外の血球系細胞成分を除去する工程とを含む。血球系細胞成分を除去する工程は、白血球除去フィルター（例えば、テルモ社製、旭化成メディカル社製）などを使用して、巨核球細胞を含む血小板以外の血球系細胞成分を除去することによって行うことができる。血小板製剤のより具体的な製造方法は、例えば、国際公開第２０１１／０３４０７３号（上掲）及び米国特許出願公開第２０１２／０２３８０２３号に記載されている。血液製剤の製造方法は、血小板製剤を製造する工程と、当該血小板製剤を他の成分と混合する工程とを含む。他の成分としては、例えば赤血球細胞が挙げられる。血小板製剤及び血液製剤は、その他、細胞の安定化に資する他の成分を含んでもよい。
【0069】
（巨核球前駆細胞又は巨核球細胞の増殖促進方法）
本実施形態に係る巨核球前駆細胞又は巨核球細胞の増殖を促進する方法は、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現又はその発現産物の機能を抑制する工程、及び、任意に、ＩＮＫ４Ａ／ＡＲＦ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、あるいはそれらの発現産物の機能を抑制する工程を含む。
本実施形態に係る巨核球前駆細胞又は巨核球細胞の増殖を促進する方法は、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現又はその発現産物の機能を抑制する工程、及び、任意に、ＩＮＫ４Ａ／ＡＲＦ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、あるいはそれらの発現産物の機能を抑制する工程を含む。
【0070】
更なる局面において、巨核球前駆細胞又は巨核球細胞の増殖を促進する方法は、ｐ５３遺伝子の発現又はその発現産物の機能を抑制する工程、及び、任意に、ＩＮＫ４Ａ／ＡＲＦ遺伝子及び／又はＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現、あるいはそれらの発現産物の機能を抑制する工程を含む。
【0071】
（巨核球前駆細胞又は巨核球細胞の増殖促進剤）
本実施形態に係る巨核球前駆細胞又は巨核球細胞の増殖促進剤は、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現又はその発現産物の機能を抑制する分子を有効成分として含み、更に、任意に、ＩＮＫ４Ａ／ＡＲＦ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、あるいはそれらの発現産物の機能を抑制する分子を含む。
本実施形態に係る巨核球前駆細胞又は巨核球細胞の増殖促進剤は、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現又はその発現産物の機能を抑制する分子を有効成分として含み、更に、任意に、ＩＮＫ４Ａ／ＡＲＦ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、あるいはそれらの発現産物の機能を抑制する分子を含む。
【0072】
更なる局面において、巨核球前駆細胞又は巨核球細胞の増殖促進剤は、ｐ５３遺伝子の発現又はその発現産物の機能を抑制する分子を有効成分として含み、更に、任意に、ＩＮＫ４Ａ／ＡＲＦ遺伝子及び／又はＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現、あるいはそれらの発現産物の機能を抑制する分子を含む。
【0073】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。
【実施例】
【0074】
実施例１：ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現抑制
ヒトｉＰＳ細胞（ＴＫＤＮ ＳｅＶ２：センダイウイルスを用いて樹立されたヒト胎児皮膚繊維芽細胞由来ｉＰＳ細胞）から、Ｔａｋａｙａｍａ Ｎ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． ２８１７－２８３０（２０１０）に記載の方法に従って、血球細胞への分化培養を実施した。即ち、ヒトｉＰＳ細胞コロニー（ＮＣ１３Ｘ株）を２０ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ）存在下でＣ３Ｈ１０Ｔ１／２フィーダー細胞と１４日間共培養して造血前駆細胞（Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ；ＨＰＣ）を作製した。培養条件は２０％Ｏ2、５％ＣＯ2で実施した。
ヒトｉＰＳ細胞（ＴＫＤＮ ＳｅＶ２：センダイウイルスを用いて樹立されたヒト胎児皮膚繊維芽細胞由来ｉＰＳ細胞）から、Ｔａｋａｙａｍａ Ｎ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． ２８１７－２８３０（２０１０）に記載の方法に従って、血球細胞への分化培養を実施した。即ち、ヒトｉＰＳ細胞コロニー（ＮＣ１３Ｘ株）を２０ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ）存在下でＣ３Ｈ１０Ｔ１／２フィーダー細胞と１４日間共培養して造血前駆細胞（Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ；ＨＰＣ）を作製した。培養条件は２０％Ｏ2、５％ＣＯ2で実施した。
【0075】
得られた造血前駆細胞にｃ－ＭＹＣ／ＢＭＩ１／ＢＣＬ－ＸＬの３遺伝子を導入することで不死化巨核球細胞株を樹立した。培養１４日目の造血前駆細胞にドキシサイクリン制御によりｃ－ＭＹＣ／ＢＭＩ１を強制発現するレンチウイルスベクターを導入し、感染２４時間後にドキシサイクリン１μｇ／ｍｌを添加して、遺伝子発現を行った。さらに２週間後に、ドキシサイクリン制御によりＢＣＬ－ＸＬを強制発現するレンチウイルスベクターを導入し、不死化巨核球細胞株を樹立した。
【0076】
ＭＹＣ／ＢＭＩ１／ＢＣＬ－ＸＬを導入してから５０日目の細胞増殖が低下した巨核球前駆細胞又は巨核球株（ＭＫＣＬ２１株）にｓｈＣＤＫＮ１Ａ（クローン１（配列番号５）またはクローン２（配列番号６））－ＲＦＰレンチウイルスベクターを感染させた。感染３日後にＲＦＰ（Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）陽性感染細胞をＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩＩｕを用いて分取した。クローン１と２の推定二次構造を以下に示す。
【化1】
【0077】
１５％ＦＢＳを含む培養液中で分取した細胞の培養を継続したところ、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現抑制から３００日以上の細胞増殖が確認され、また、発現抑制時の細胞との比較で巨核球前駆細胞又は巨核球細胞が１０66倍に増殖した（図１）。
【0078】
実施例２：ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子、ＩＮＫ４Ａ／ＡＲＦ遺伝子及びｐ５３遺伝子の発現抑制（細胞増殖低下段階）
実施例１で使用したものとは別のヒトｉＰＳ細胞株（ＹＺＷＪ株）由来造血前駆細胞にＭＹＣ／ＢＭＩ１／ＢＣＬ－ＸＬの３遺伝子を導入することで不死化巨核球細胞株を樹立した。
実施例１で使用したものとは別のヒトｉＰＳ細胞株（ＹＺＷＪ株）由来造血前駆細胞にＭＹＣ／ＢＭＩ１／ＢＣＬ－ＸＬの３遺伝子を導入することで不死化巨核球細胞株を樹立した。
【0079】
ＭＹＣ／ＢＭＩ１／ＢＣＬ－ＸＬを導入してから６０日目の細胞増殖が低下した巨核球株（ＭＫＣＬ２３株）と、導入後９０日目の細胞増殖が低下した巨核球株（ＭＫＣＬ２６株）に、以下の遺伝子を有するレンチウイルスベクターを感染させた。手順は実施例１と同様に行った。
１：コントロール－ＲＦＰ （ＬａｃＺ）
２：ｓｈＣＤＫＮ１Ａ－ＲＦＰ＋ｓｈｐ５３－ＧＦＰ＋ｓｈＩＮＫ４Ａ／ＡＲＦ－ＧＦＰ
感染３日後にＲＦＰ／ＧＦＰ陽性感染細胞をＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩＩｕを用いて分取した。ｓｈＣＤＫＮ１Ａは上記クローン１及び２を使用した。ｓｈｐ５３の配列（配列番号７）とｓｈＩＮＫ４Ａ／ＡＲＦの配列（配列番号８）の推定二次構造を以下に記載する。
なお、ｓｈＩＮＫ４Ａ／ＡＲＦは、ＩＮＫ４Ａ遺伝子とＡＲＦ遺伝子の共通のエクソンを標的とするものである。
１：コントロール－ＲＦＰ （ＬａｃＺ）
２：ｓｈＣＤＫＮ１Ａ－ＲＦＰ＋ｓｈｐ５３－ＧＦＰ＋ｓｈＩＮＫ４Ａ／ＡＲＦ－ＧＦＰ
感染３日後にＲＦＰ／ＧＦＰ陽性感染細胞をＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩＩｕを用いて分取した。ｓｈＣＤＫＮ１Ａは上記クローン１及び２を使用した。ｓｈｐ５３の配列（配列番号７）とｓｈＩＮＫ４Ａ／ＡＲＦの配列（配列番号８）の推定二次構造を以下に記載する。
【化2】
【0080】
分取後、１５％ＦＢＳを含む培養液中で培養を継続したところ、ＭＫＣＬ２３株とＭＫＣＬ２６株のいずれも、コントロールとの比較で、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現を抑制することで３０日以上の細胞増殖期間の延長と、１０4倍の増殖が確認された（図２、図３）。ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現抑制では不十分な場合でも、ＩＮＫ４Ａ／ＡＲＦ遺伝子及びｐ５３遺伝子の発現を抑制することで増殖効果が改善することが明らかとなった。
【0081】
更に実施例１で使用したものとは別のヒトｉＰＳ細胞株（ＮＩＨ５株）由来造血前駆細胞にＭＹＣ／ＢＭＩ１／ＢＣＬ－ＸＬの３遺伝子を導入することで不死化巨核球細胞株を樹立した。
【0082】
ＭＹＣ／ＢＭＩ１／ＢＣＬ－ＸＬを導入してから４０日前後の細胞増殖が低下した巨核球株（ＭＫＣＬ１株）に以下の遺伝子を有するレンチウイルスベクターを感染させた。手順は実施例１と同様に行った。
１：コントロール－ＲＦＰ（ＬａｃＺ）
２：ｓｈＣＤＫＮ１Ａ－ＲＦＰ
３：ｓｈｐ５３－ＧＦＰ
４：ｓｈＩＮＫ４Ａ／ＡＲＦ－ＧＦＰ
５：ｓｈＣＤＫＮ１Ａ－ＲＦＰ＋ｓｈｐ５３－ＧＦＰ＋ｓｈＡＲＦ－ＧＦＰ
各ｓｈＲＮＡは上記のものを使用した。その後陽性感染細胞をＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩＩｕを用いて分取した。
１：コントロール－ＲＦＰ（ＬａｃＺ）
２：ｓｈＣＤＫＮ１Ａ－ＲＦＰ
３：ｓｈｐ５３－ＧＦＰ
４：ｓｈＩＮＫ４Ａ／ＡＲＦ－ＧＦＰ
５：ｓｈＣＤＫＮ１Ａ－ＲＦＰ＋ｓｈｐ５３－ＧＦＰ＋ｓｈＡＲＦ－ＧＦＰ
各ｓｈＲＮＡは上記のものを使用した。その後陽性感染細胞をＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩＩｕを用いて分取した。
【0083】
分取後、１５％ＦＢＳを含む培養液中で培養を継続したところ、コントロールと比較して、細胞増殖が顕著に増大した（ＩＮＫ４Ａ／ＡＲＦ除く）。特に、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子、ＩＮＫ４Ａ遺伝子、ＡＲＦ遺伝子及びｐ５３遺伝子の全ての発現を抑制した細胞は２０日の細胞増殖期間の延長と、１０4倍の増殖が確認された。
【0084】
実施例３：ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子、ＩＮＫ４Ａ／ＡＲＦ遺伝子及びｐ５３遺伝子の発現抑制（ＢＣＬ－ＸＬ導入時）
実施例２でＢＣＬ－ＸＬを導入したのと同時に、従来のMBX強制発現では樹立できなかったYZWJ516ヒトiPS細胞株由来巨核球株（ＭＫＣＬ３０株）に以下の遺伝子を有するレンチウイルスベクターを感染させた。手順は実施例１と同様に行った。
１：コントロール－ＲＦＰ（ＬａｃＺ）
２：ｓｈＣＤＫＮ１Ａ－ＲＦＰ
３：ｓｈｐ５３－ＧＦＰ
４：ｓｈＩＮＫ４Ａ／ＡＲＦ－ＧＦＰ
５：ｓｈＣＤＫＮ１Ａ－ＲＦＰ＋ｓｈｐ５３－ＧＦＰ
６：ｓｈＣＤＫＮ１Ａ－ＲＦＰ＋ｓｈＡＲＦ－ＧＦＰ
７：ｓｈｐ５３－ＧＦＰ＋ｓｈＡＲＦ－ＧＦＰ
８：ｓｈＣＤＫＮ１Ａ－ＲＦＰ＋ｓｈｐ５３－ＧＦＰ＋ｓｈＡＲＦ－ＧＦＰ各ｓｈＲＮＡは上記のものを使用した。その後陽性感染細胞をＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩＩｕを用いて分取した。
実施例２でＢＣＬ－ＸＬを導入したのと同時に、従来のMBX強制発現では樹立できなかったYZWJ516ヒトiPS細胞株由来巨核球株（ＭＫＣＬ３０株）に以下の遺伝子を有するレンチウイルスベクターを感染させた。手順は実施例１と同様に行った。
１：コントロール－ＲＦＰ（ＬａｃＺ）
２：ｓｈＣＤＫＮ１Ａ－ＲＦＰ
３：ｓｈｐ５３－ＧＦＰ
４：ｓｈＩＮＫ４Ａ／ＡＲＦ－ＧＦＰ
５：ｓｈＣＤＫＮ１Ａ－ＲＦＰ＋ｓｈｐ５３－ＧＦＰ
６：ｓｈＣＤＫＮ１Ａ－ＲＦＰ＋ｓｈＡＲＦ－ＧＦＰ
７：ｓｈｐ５３－ＧＦＰ＋ｓｈＡＲＦ－ＧＦＰ
８：ｓｈＣＤＫＮ１Ａ－ＲＦＰ＋ｓｈｐ５３－ＧＦＰ＋ｓｈＡＲＦ－ＧＦＰ各ｓｈＲＮＡは上記のものを使用した。その後陽性感染細胞をＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩＩｕを用いて分取した。
【0085】
分取後、１５％ＦＢＳを含む培養液中で培養を継続したところ、コントロールと比較して、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現を抑制することで８週間以上の細胞増殖期間の延長と、１０15倍の増殖が確認された。ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子とｐ５３遺伝子の両方の発現を抑制した場合の細胞増殖効果が最も高かった（８週間で２.５x１０17倍）。本願の優先日（２０１９年１０月１７日、ｃ－ＭＹＣ／ＢＭＩ１感染後１２７日目）において増殖中である。これに続いてＩＮＫ４Ａ遺伝子、ＡＲＦ遺伝子及びｐ５３遺伝子の全ての発現を抑制した細胞の細胞増殖効果が高かった。
【0086】
さらに、ノックダウンの時期を検証するために、ＢＣＬ－ＸＬの導入と同時及び導入の２週間後に、以下のノックダウン実験を行った。
９：コントロール－ＲＦＰ（ＬａｃＺ）
１０：ｓｈＣＤＫＮ１Ａ－ＲＦＰ＋ｓｈｐ５３－ＧＦＰ
９：コントロール－ＲＦＰ（ＬａｃＺ）
１０：ｓｈＣＤＫＮ１Ａ－ＲＦＰ＋ｓｈｐ５３－ＧＦＰ
【0087】
結果を図４に示す。感染時期としては、ＢＣＬ－ＸＬ導入と同時の感染の方が、ＢＣＬ－ＸＬの導入２週間後の感染よりも１０4倍以上増殖が良い（ｓｈＣＤＫＮ１Ａ－ＲＦＰ＋ｓｈｐ５３－ＧＦＰ同時 ２.５x１０17倍 vs ｓｈＣＤＫＮ１Ａ－ＲＦＰ＋ｓｈｐ５３－ＧＦＰ同時 ５.８x１０12倍）ことが確認された。
【0088】
ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子制御とｐ５３遺伝子制御の組み合わせよりも増殖効果は劣るものの、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子制御単独又はｐ５３遺伝子制御単独についてもＢＣＬ－ＸＬ導入と同時にノックダウンした方が細胞の増殖能が増大することが分かった。
【0089】
実施例４：ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現を抑制した巨核球細胞による血小板産生の検討
実施例１でクローン２（配列番号６）を用いて増殖を促進させたＣＤＫＮ１Ａ抑制後のＭＫＣＬ２１株とコントロールベクター感染後のＭＫＣＬ２１株での血小板放出を比較した。
実施例１でクローン２（配列番号６）を用いて増殖を促進させたＣＤＫＮ１Ａ抑制後のＭＫＣＬ２１株とコントロールベクター感染後のＭＫＣＬ２１株での血小板放出を比較した。
【0090】
両細胞の培養液からドキシサイクリンを除去し、ＭＹＣ／ＢＭＩ１／ＢＣＬ－ＸＬの３因子の発現を抑制後、５日目に巨核球、及び培養上清に放出された血小板をＦＡＣＳで解析した。抗体はＡＰＣ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ４１ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号：３０３７１０）及びＰＥ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ４２ｂ Ｃｌｏｎｅ ＨＩＰ１（ＢＤ、カタログ番号：５５５４７３）を使用した。ＦＡＣＳドットプロットを図５に示す。
【0091】
また、ＦＡＣＳを用いてカウントされた血小板数を比較したところ、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現を抑制することで血小板産生が亢進することが明らかとなった。
【0092】
続いて、実施例２でＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現を抑制したＭＫＣＬ２１株の血小板産生能を、従来の３因子（ＭＹＣ／ＢＭＩ１／ＢＣＬ－ＸＬ）強制発現によるもっとも優れた血小板放出能のある巨核球株（ＳｅＶ２）とで比較した。それらのＦＡＣＳドットプロットを図６に示す。抗体はＡＰＣ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ４１ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号：３０３７１０）及びＰＥ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ４２ｂ Ｃｌｏｎｅ ＨＩＰ１（ＢＤ、カタログ番号：５５５４７３）を使用した。
【0093】
図６の上パネルは、ドキシサイクリンを加え、ＭＹＣ／ＢＭＩ１／ＢＣＬ－ＸＬの３因子の発現をさせた状態のものである。どちらの株も未成熟なため、ＣＤ４１陽性／ＣＤ４２ｂ陽性の血小板（４分割された図の右上部分）が少ない。一方、図６の下パネルは、培養液からドキシサイクリンを除去し、ＭＹＣ／ＢＭＩ１／ＢＣＬ－ＸＬの３因子の発現を抑制して５日目の状態であり、ＣＤ４１ａ陽性／ＣＤ４２ｂ陽性の血小板（４分割された図の右上部分）が増大している。これらの結果から、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現を抑制することで血小板産生能が増大したことが分かる。
【0094】
実施例５：ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及びｐ５３遺伝子の発現を抑制した巨核球細胞による血小板産生の検討
コントロールベクター感染後のＭＫＣＬ７株と、実施例１でクローン２（配列番号６）を用いて増殖を促進させたＣＤＫＮ１Ａ抑制後のＭＫＣＬ２１株と、実施例１のクローン２（配列番号６）の導入と同じ時期に、実施例３の「５：ｓｈＣＤＫＮ１Ａ－ＲＦＰ＋ｓｈｐ５３－ＧＦＰ」を用いて増殖を促進させたＣＤＫＮ１Ａ及びｐ５３抑制後のＭＫＣＬ３０株とでの血小板放出を比較した。
コントロールベクター感染後のＭＫＣＬ７株と、実施例１でクローン２（配列番号６）を用いて増殖を促進させたＣＤＫＮ１Ａ抑制後のＭＫＣＬ２１株と、実施例１のクローン２（配列番号６）の導入と同じ時期に、実施例３の「５：ｓｈＣＤＫＮ１Ａ－ＲＦＰ＋ｓｈｐ５３－ＧＦＰ」を用いて増殖を促進させたＣＤＫＮ１Ａ及びｐ５３抑制後のＭＫＣＬ３０株とでの血小板放出を比較した。
【0095】
各細胞の培養液からドキシサイクリンを除去し、ＭＹＣ／ＢＭＩ１／ＢＣＬ－ＸＬの３因子の発現を抑制後、５日目に巨核球、及び培養上清に放出された血小板をＦＡＣＳで解析した。抗体はＡＰＣ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ４１ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号：３０３７１０）及びＰＥ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ４２ｂ Ｃｌｏｎｅ ＨＩＰ１（ＢＤ、カタログ番号：５５５４７３）を使用した。
ただし、ＭＫＣＬ７株については、ドキシサイクリンを除去せず、ＭＹＣ／ＢＭＩ１／ＢＣＬ－ＸＬの３因子の発現を抑制しなかったサンプルも準備した（ＭＢＸ ＯＮ）。５日目に、上記同様に巨核球、及び培養上清に放出された血小板をＦＡＣＳで解析した。
ＦＡＣＳドットプロットを図７（Ａ）に示す。また、ＦＡＣＳを用いてカウントされた血小板数の結果を図７（Ｂ）に示す。
ただし、ＭＫＣＬ７株については、ドキシサイクリンを除去せず、ＭＹＣ／ＢＭＩ１／ＢＣＬ－ＸＬの３因子の発現を抑制しなかったサンプルも準備した（ＭＢＸ ＯＮ）。５日目に、上記同様に巨核球、及び培養上清に放出された血小板をＦＡＣＳで解析した。
ＦＡＣＳドットプロットを図７（Ａ）に示す。また、ＦＡＣＳを用いてカウントされた血小板数の結果を図７（Ｂ）に示す。
【0096】
続いて、ＭＹＣ／ＢＭＩ１／ＢＣＬ－ＸＬの３因子の発現を抑制しなかった株（ＯＮ）と、ＭＹＣ／ＢＭＩ１／ＢＣＬ－ＸＬの３因子の発現を抑制後した、ＭＫＣＬ７株、ＭＫＣＬ２１株及びＭＫＣＬ３０株とのそれぞれについて、５日目に巨核球、及び培養上清に放出された血小板を回収し、無刺激、或いは０．４μＭのＰＭＡ（Ｐｈｏｒｂｏｌ Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ Ａｃｅｔａｔｅ， Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃａｔ＃Ｐ１５８５）（ＰＭＡ）、又は１００μＭのＡＤＰ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ， Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃａｔ＃Ａ－２７５４）＋４０μＭのＴＲＡＰ－６（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ６， ＢＡＣＨＥＭ Ｃａｔ＃Ｈ－８３６５．０００５）（ＡＴ）存在下でのＰ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ抗体（Ｂｉｏ Ｌｅｇｅｎｄ／＃３０４９１０）及びＰＡＣ－１抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ／＃３４５０７）での染色行い、ＦＡＣＳで解析した。Ｐ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ及びＰＡＣ－１抗体での結果をそれぞれ図８（Ｄ）及び（Ｅ）に示す。
表中の説明は以下のとおりである。
Ｎｏ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ－ＯＮ：ＭＹＣ／ＢＭＩ１／ＢＣＬ－ＸＬの３因子の発現を抑制しなかった株を用いた、無刺激における結果
ＰＭＡ－ＯＮ：ＭＹＣ／ＢＭＩ１／ＢＣＬ－ＸＬの３因子の発現を抑制しなかった株を用いた、ＰＭＡ下における結果
ＡＴ－ＯＮ：ＭＹＣ／ＢＭＩ１／ＢＣＬ－ＸＬの３因子の発現を抑制しなかった株を用いた、ＡＴ下における結果
Ｎｏ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ＿ＭＫＣＬ７：ＭＫＣＬ７株を用いた、無刺激における結果
ＰＭＡ＿ＭＫＣＬ７：ＭＫＣＬ７株を用いた、ＰＭＡ下における結果
ＡＴ＿ＭＫＣＬ７：ＭＫＣＬ７株を用いた、ＡＴ下における結果
Ｎｏ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ＿ＭＫＣＬ２１＃：ＭＫＣＬ２１株を用いた、無刺激における結果
ＰＭＡ＿ＭＫＣＬ２１＃：ＭＫＣＬ２１株を用いた、ＰＭＡ下における結果
ＡＴ＿ＭＫＣＬ２１＃：ＭＫＣＬ２１株を用いた、ＡＴ下における結果
Ｎｏ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ＿ＭＫＣＬ３０：ＭＫＣＬ３０株を用いた、無刺激における結果
ＰＭＡ＿ＭＫＣＬ３０：ＭＫＣＬ３０株を用いた、ＰＭＡ下における結果
ＡＴ＿ＭＫＣＬ３０：ＭＫＣＬ３０株を用いた、ＡＴ下における結果
表中の説明は以下のとおりである。
Ｎｏ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ－ＯＮ：ＭＹＣ／ＢＭＩ１／ＢＣＬ－ＸＬの３因子の発現を抑制しなかった株を用いた、無刺激における結果
ＰＭＡ－ＯＮ：ＭＹＣ／ＢＭＩ１／ＢＣＬ－ＸＬの３因子の発現を抑制しなかった株を用いた、ＰＭＡ下における結果
ＡＴ－ＯＮ：ＭＹＣ／ＢＭＩ１／ＢＣＬ－ＸＬの３因子の発現を抑制しなかった株を用いた、ＡＴ下における結果
Ｎｏ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ＿ＭＫＣＬ７：ＭＫＣＬ７株を用いた、無刺激における結果
ＰＭＡ＿ＭＫＣＬ７：ＭＫＣＬ７株を用いた、ＰＭＡ下における結果
ＡＴ＿ＭＫＣＬ７：ＭＫＣＬ７株を用いた、ＡＴ下における結果
Ｎｏ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ＿ＭＫＣＬ２１＃：ＭＫＣＬ２１株を用いた、無刺激における結果
ＰＭＡ＿ＭＫＣＬ２１＃：ＭＫＣＬ２１株を用いた、ＰＭＡ下における結果
ＡＴ＿ＭＫＣＬ２１＃：ＭＫＣＬ２１株を用いた、ＡＴ下における結果
Ｎｏ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ＿ＭＫＣＬ３０：ＭＫＣＬ３０株を用いた、無刺激における結果
ＰＭＡ＿ＭＫＣＬ３０：ＭＫＣＬ３０株を用いた、ＰＭＡ下における結果
ＡＴ＿ＭＫＣＬ３０：ＭＫＣＬ３０株を用いた、ＡＴ下における結果
【0097】
以上の結果から、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子やｐ５３遺伝子の発現を抑制しても、刺激に対して良好な活性化反応を示す機能的な血小板が産生され、血小板の機能は阻害されないことが明らかになった。一方、ドキシサイクリンを除去せず、ＭＹＣ／ＢＭＩ１／ＢＣＬ－ＸＬの３因子の発現を抑制しなかった群（ＭＢＸ ＯＮ）では、巨核球の成熟が進まず、ほとんど血小板が産生されないことを確認した。
【0098】
実施例６：ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の発現とｐ２１／ｐ５３遺伝子の発現抑制
ヒト皮膚線維芽細胞由来のｉＰＳ細胞から、ｉＰＳ－Ｓａｃ法（Ｔａｋａｙａｍａ Ｎ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２８１７－２８３０（２０１０）に記載の方法）に従って、１４日間培養して造血前駆細胞を作製した。
ヒト皮膚線維芽細胞由来のｉＰＳ細胞から、ｉＰＳ－Ｓａｃ法（Ｔａｋａｙａｍａ Ｎ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２８１７－２８３０（２０１０）に記載の方法）に従って、１４日間培養して造血前駆細胞を作製した。
【0099】
得られた造血前駆細胞にドキシサイクリン誘導レンチウイルスベクターを用いて、ｃ－ＭＹＣ／ＢＭＩ１の２遺伝子（ＭＢ）を導入することで巨核球前駆細胞株を樹立した。その１４日後に、そのまま培養した株（ＭＢ）、ＭＢ導入に加えてドキシサイクリン誘導レンチウイルスベクターを用いてＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を更に導入した株（ＭＢＸ）、ＭＢ導入に加えて持続的に発現するｓｈ ｐ２１／ｐ５３レンチウイルスベクターを更に感染させた株（ＭＢ－ｐ２１／ｐ５３＿ＫＤ）、及びＭＢ導入に加えてドキシサイクリン誘導レンチウイルスベクターを用いてＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を導入し、持続的に発現するｓｈ ｐ２１／ｐ５３レンチウイルスベクターを感染させた株（ＭＢＸ－ｐ２１／ｐ５３＿ＫＤ）の巨核球前駆細胞株を作製した。各巨核球前駆細胞株について、１４日目と３１日目と４３日目の細胞の増殖性を確認した結果を図９に示す。
【0100】
また、ＭＢ株、ＭＢＸ株、ＭＢ－ｐ２１／ｐ５３＿ＫＤ株、及びＭＢＸ－ｐ２１／ｐ５３＿ＫＤ株について、３１日目と４３日目に、細胞のＣＤ３４及びＣＤ４１の発現をＦＡＣＳで解析した結果を図１０に、細胞のＣＤ３４及びＣＤ４２ｂの発現をＦＡＣＳで解析した結果を図１１に、細胞のＣＤ３４及びＧＰＡの発現をＦＡＣＳで解析した結果を図１２に、ＦＡＣＳドットプロットで示す。抗体はＡＰＣ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ４１ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号：３０３７１０）、ＰＥ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ４２ｂ Ｃｌｏｎｅ ＨＩＰ１（ＢＤ、カタログ番号：５５５４７３）、ＧＰＡ（Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ Ａ）抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号：３０６６１２）、及びＣＤ３４抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号：３４３５１４）を使用した。
【0101】
いずれの条件においても、ＣＤ４１陽性、ＣＤ４２ｂ弱陽性の巨核球前駆細胞が得られた。培養４３日目の段階では、ＭＢ－ｐ２１／ｐ５３＿ＫＤ株の結果（図９中の白丸）は、ＭＢ株の結果（黒丸）に比べて、かなり増殖性に優れることを示している。また、ＭＢＸ－ｐ２１／ｐ５３＿ＫＤ株の結果（黒三角）は、ＭＢＸ株の結果（黒四角）又はＭＢ－ ｐ２１／ｐ５３＿ＫＤ株の結果（白丸）と同等以上の増殖性であることを示している。これらの結果から、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の導入がなくても、ｃ－ＭＹＣ／ＢＭＩ１の２遺伝子を導入することにより得られた巨核球前駆細胞株の増殖がｐ２１／ｐ５３ＫＤで促進されること、すなわちＢＣＬ－ＸＬがｐ２１／ｐ５３ＫＤで置き換え可能であることが示唆された。
【0102】
刊行物、特許文献等を含む、本明細書に引用されたすべての参考文献は、引用により、それらが個々に具体的に参考として援用されかつその内容全体が具体的に記載されているのと同程度まで、本明細書に援用される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】