特許 7660102 Ｎヘテロ五員環含有カプシドタンパク質集合阻害剤の結晶形及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-04-02

(45)【発行日】2025-04-10

(54)【発明の名称】Ｎヘテロ五員環含有カプシドタンパク質集合阻害剤の結晶形及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C07D 207/34 20060101AFI20250403BHJP

   A61K 31/40 20060101ALI20250403BHJP

   A61P 31/20 20060101ALI20250403BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20250403BHJP

   A61K 9/20 20060101ALI20250403BHJP

   A61K 9/48 20060101ALI20250403BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20250403BHJP

   A61K 9/10 20060101ALI20250403BHJP

【ＦＩ】

C07D207/34

A61K31/40

A61P31/20

A61P1/16

A61K9/20

A61K9/48

A61K9/08

A61K9/10

【請求項の数】 20

(21)【出願番号】P 2022519535

(86)(22)【出願日】2020-09-28

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-11-29

(86)【国際出願番号】 CN2020118427

(87)【国際公開番号】W WO2021058002

(87)【国際公開日】2021-04-01

【審査請求日】2023-09-20

(31)【優先権主張番号】201910934549.0

(32)【優先日】2019-09-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】517285024

【氏名又は名称】正大天晴▲藥▼▲業▼集▲団▼股▲フン▼有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】▲陸▼ ▲銀▼

(72)【発明者】

【氏名】郭 猛

(72)【発明者】

【氏名】胡 明通

(72)【発明者】

【氏名】李 元

(72)【発明者】

【氏名】敖 汪▲偉▼

(72)【発明者】

【氏名】▲張▼ 寅生

【審査官】宮田 透

(56)【参考文献】

【文献】特表２０２１－５１９３２５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０２２－５１８２５８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０２１－５２７６３８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１７－５０７９２７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１６－５２５１４１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０２１－５１４９６６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｄ、Ａ６１Ｋ、Ａ６１Ｐ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式Ｉ：

【化1】

で表される化合物の結晶であって、そのＸ線粉末回折パターンは、９．２１±０．２０°、１６．４７±０．２０°、１８．１１±０．２０°、２４．４８±０．２０°、及び２６．７９±０．２０°である２θ角度に特徴的な回折ピークを有する、式Ｉの化合物の結晶。

【請求項2】

請求項１に記載の式Ｉの化合物の結晶であって、そのＸ線粉末回折パターンは、９．２１±０．２０°、１２．７２±０．２０°、１５．７１±０．２０°、１６．４７±０．２０°、１８．１１±０．２０°、１９．７９±０．２０°、２４．４８±０．２０°、及び２６．７９±０．２０°である２θ角度に特徴的な回折ピークを有する、式Ｉの化合物の結晶。

【請求項3】

請求項１に記載の式Ｉの化合物の結晶であって、そのＸ線粉末回折パターンは、９．２１±０．２０°、１０．４４±０．２０°、１２．７２±０．２０°、１５．０６±０．２０°、１５．７１±０．２０°、１６．４７±０．２０°、１８．１１±０．２０°、１９．７９±０．２０°、２０．４６±０．２０°、２４．４８±０．２０°、２６．７９±０．２０°、及び３１．４６±０．２０°である２θ角度に特徴的な回折ピークを有する、式Ｉの化合物の結晶。

【請求項4】

請求項１に記載の式Ｉの化合物の結晶であって、そのＸ線粉末回折パターンは、９．２１±０．２０°、９．６８±０．２０°、１０．４４±０．２０°、１２．７２±０．２０°、１５．０６±０．２０°、１５．７１±０．２０°、１６．４７±０．２０°、１８．１１±０．２０°、１９．７９±０．２０°、２０．４６±０．２０°、２４．４８±０．２０°、２６．０２±０．２０°、２６．７９±０．２０°、２７．６７±０．２０°、及び３１．４６±０．２０°である２θ角度に特徴的な回折ピークを有する、式Ｉの化合物の結晶。

【請求項5】

請求項１に記載の式Ｉの化合物の結晶であって、そのＸ線粉末回折パターンは、４．８６±０．２０°、９．２１±０．２０°、９．６８±０．２０°、１０．４４±０．２０°、１２．４７±０．２０°、１２．７２±０．２０°、１５．０６±０．２０°、１５．７１±０．２０°、１６．４７±０．２０°、１８．１１±０．２０°、１８．７４±０．２０°、１９．１９±０．２０°、１９．７９±０．２０°、２０．４６±０．２０°、２０．９４±０．２０°、２１．６５±０．２０°、２１．９６±０．２０°、２３．１２±０．２０°、２４．４８±０．２０°、２６．０２±０．２０°、２６．７９±０．２０°、２７．６７±０．２０°、２９．３６±０．２０°、３１．４６±０．２０°、及び３４．１７±０．２０°である２θ角度に特徴的な回折ピークを有する、式Ｉの化合物の結晶。

【請求項6】

請求項１に記載の式Ｉの化合物の結晶であって、前記結晶のＸＲＰＤパターンは、以下の表に示す回折ピークのピーク位置及び相対強度を有する、式Ｉの化合物の結晶。

【表1】

【請求項7】

請求項１に記載の式Ｉの化合物の結晶であって、そのＤＳＣ曲線が２３１．２６±５℃に吸熱ピークを有する、式Ｉの化合物の結晶。

【請求項8】

式Ｉ：

【化2】

で表される化合物の結晶であって、そのＸ線粉末回折パターンは、１４．０９±０．２０°、１５．８１±０．２０°、１７．４０±０．２０°、１８．８１±０．２０°、及び２２．９１±０．２°である２θ角度に特徴的な回折ピークを有する、式Ｉの化合物の結晶。

【請求項9】

請求項８に記載の式Ｉの化合物の結晶であって、そのＸ線粉末回折パターンは、８．４５±０．２０°、１３．３５±０．２０°、１４．０９±０．２０°、１４．９０±０．２０°、１５．８１±０．２０°、１７．４０±０．２０°、１８．８１±０．２０°、１９．６４±０．２０°、及び２２．９１±０．２°である２θ角度に特徴的な回折ピークを有する、式Ｉの化合物の結晶。

【請求項10】

請求項８に記載の式Ｉの化合物の結晶であって、そのＸ線粉末回折パターンは、８．４５±０．２０°、１１．１５±０．２０°、１３．３５±０．２０°、１４．０９±０．２０°、１４．９０±０．２０°、１５．８１±０．２０°、１７．４０±０．２０°、１８．８１±０．２０°、１９．６４±０．２０°、２０．９７±０．２０°、２２．９１±０．２°、２３．６８±０．２０°、及び２５．２４±０．２°である２θ角度に特徴的な回折ピークを有する、式Ｉの化合物の結晶。

【請求項11】

請求項８に記載の式Ｉの化合物の結晶であって、そのＸ線粉末回折パターンは、８．４５±０．２０°、１１．１５±０．２０°、１３．３５±０．２０°、１４．０９±０．２０°、１４．９０±０．２０°、１５．８１±０．２０°、１７．４０±０．２０°、１８．８１±０．２０°、１９．６４±０．２０°、２０．２５±０．２０°、２０．９７±０．２０°、２１．４２±０．２０°、２２．９１±０．２°、２３．６８±０．２０°、２５．２４±０．２°、２７．７２±０．２°、及び３０．００±０．２°である２θ角度に特徴的な回折ピークを有する、式Ｉの化合物の結晶。

【請求項12】

請求項８に記載の式Ｉの化合物の結晶であって、そのＸ線粉末回折パターンは、４．７４±０．２０°、７．９４±０．２０°、８．４５±０．２０°、９．４０±０．２０°、９．９１±０．２０°、１１．１５±０．２０°、１３．３５±０．２０°、１４．０９±０．２０°、１４．９０±０．２０°、１５．８１±０．２０°、１７．４０±０．２０°、１８．８１±０．２０°、１９．６４±０．２０°、２０．２５±０．２０°、２０．９７±０．２０°、２１．４２±０．２０°、２２．９１±０．２°、２３．６８±０．２０°、２５．２４±０．２°、２７．７２±０．２°、及び３０．００±０．２°である２θ角度に特徴的な回折ピークを有する、式Ｉの化合物の結晶。

【請求項13】

請求項８に記載の式Ｉの化合物の結晶であって、前記結晶のＸＲＰＤパターンは、以下の表に示す回折ピークのピーク位置及び相対強度を有する、式Ｉの化合物の結晶。

【表2】

【請求項14】

請求項８に記載の式Ｉの化合物の結晶であって、そのＤＳＣ曲線が２２５．０５±５℃に吸熱ピークを有する、式Ｉの化合物の結晶。

【請求項15】

請求項１～１４のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物の結晶を含む結晶組成物であって、前記結晶は、結晶組成物の重量の５０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上を占める、結晶組成物。

【請求項16】

治療有効量の請求項１～１４のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物の結晶又は請求項１５に記載の結晶組成物を含む、医薬組成物。

【請求項17】

カプシドタンパク質集合の阻害から恩恵を受ける疾患を予防又は治療するための医薬の製造における、請求項１～１４のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物の結晶、又は請求項１５に記載の結晶組成物、又は請求項１６に記載の医薬組成物の使用。

【請求項18】

請求項１７に記載の使用であって、前記カプシドタンパク質集合の阻害から恩恵を受ける疾患はＢ型肝炎ウイルス感染に起因する疾患である、使用。

【請求項19】

Ｂ型肝炎ウイルス感染を予防又は治療するための医薬の製造における、請求項１～１４のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物の結晶、又は請求項１５に記載の結晶組成物、又は請求項１６に記載の医薬組成物の使用。

【請求項20】

カプシドタンパク質集合の阻害から恩恵を受ける疾患を予防又は治療するための、請求項１～１４のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物の結晶、又は請求項１５に記載の結晶組成物、又は請求項１６に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本願は、２０１９年９月２９日に中国国家知的財産局に出願された出願番号がＣＮ２０１９１０９３４５４９．０である中国特許出願に基づく優先権及び利益を主張し、当該中国特許出願の内容の全てを本明細書に援用する。

【0002】

本発明には、Ｎヘテロ五員環（Ｎ ｈｅｔｅｒｏ ｆｉｖｅ－ｍｅｍｂｅｒｅｄ ｒｉｎｇ）含有カプシドタンパク質集合阻害剤（ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）の結晶形に関し、具体には、式Ｉの化合物の結晶形に関し、また、カプシドタンパク質集合（カプシドタンパク質アセンブリ）の阻害から恩恵を受ける疾患を予防又は治療する医薬の製造における前記結晶形の使用に関する。

【背景技術】

【0003】

現在、慢性Ｂ型ウイルス性肝炎には、治癒することはできず、制御することしかできず、現時点では主に２種類の薬剤（インターフェロン及びヌクレオシド類似体／ウイルスポリメラーゼの阻害剤）に限定されている。ＨＢＶの治癒率が低いのは、感染した肝細胞の細胞核に共有結合で閉じた環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）が存在し、その存在が持続しているためである。現在の治療プロトコルでは、リポジトリ（ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）からｃｃｃＤＮＡを削除できず、コア阻害剤（Ｃｏｒｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、例えばウイルスカプシッドタンパク質形成又は集合阻害剤、及びｃｃｃＤＮＡ阻害剤、ならびにインターフェロン刺激遺伝子活性剤など）のようないくつかのＨＢＶの新たな標的（ターゲット）は、Ｂ型肝炎の治癒に有望であると期待されている（Ｍａｙｕｒ Ｂｒａｈｍａｎｉａ， ｅｔ ａｌ． Ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ）。ＨＢＶカプシドはコアタンパク質から集合されてなり、逆転写の前に、ＨＢＶ逆転写酵素、ｐｇＲＮＡはカプシドタンパク質で正しくカプセル化されている必要がある。したがって、カプシドタンパク質の集合を遮断したり、カプシドタンパク質の分解を加速したり、それぞれカプシドタンパク質の集合プロセスを遮断してウイルスの複製に影響する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【文献】中国特許出願番号ＣＮ２０１９１０９３４５４９．０

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

一態様によれば、本発明は、下記の式Ｉ：

【化1】

で表される化合物（式Ｉの化合物）の結晶形を提供する。

【0006】

また一態様によれば、本発明は、本発明に係る式Iの化合物の結晶形は、結晶形組成物の重量の５０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上を占める結晶形組成物を提供する。

【0007】

また一態様によれば、本発明は、治療有効量の本発明に係る式Iの化合物の結晶形又はその結晶形組成物を含む医薬組成物を提供する。

【0008】

別の一態様によれば、本発明は、本発明に係る式Iの化合物の結晶形、その結晶形組成物、又はその医薬組成物の、カプシドタンパク質集合の阻害から恩恵を受ける疾患を予防又は治療するための医薬の製造における使用をさらに提供する。

【0009】

別の一態様によれば、本発明は、本発明に係る式Iの化合物の結晶形、その結晶形組成物、又はその医薬組成物の、Ｂ型肝炎ウイルス感染を予防又は治療するための医薬の製造における使用をさらに提供する。

【0010】

別の一態様によれば、本発明は、本発明に係る式Iの化合物の結晶形、その結晶形組成物、又はその医薬組成物の、カプシドタンパク質集合の阻害から恩恵を受ける疾患の予防又は治療における使用をさらに提供する。

【0011】

別の一態様によれば、本発明は、カプシドタンパク質集合の阻害から恩恵を受ける疾患の予防又は治療方法であって、治療有効量の本発明に係る式Iの化合物の結晶形、その結晶形組成物、又はその医薬組成物を、そのような予防又は治療を必要とする哺乳類に投与することを含む方法をさらに提供する。

【0012】

別の一態様によれば、本発明は、カプシドタンパク質集合の阻害から恩恵を受ける疾患を予防又は治療するための、本発明に係る式Iの化合物の結晶形、その結晶形組成物、又はその医薬組成物をさらに提供する。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】式Iの化合物の結晶形IのＸＲＰＤパターンを示す図である。

【図2】式Iの化合物の結晶形IのＤＳＣパターンを示す図である。

【図3】式Iの化合物の結晶形IIのＸＲＰＤパターンを示す図である。

【図4】式Iの化合物の結晶形IIのＤＳＣパターンを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

一態様によれば、本発明は、下記の式Ｉ：

【化2】

で表される化合物（式Ｉの化合物）の結晶形を提供する。

【0015】

別の一態様によれば、本発明は、上記式Iの化合物の結晶形Iを提供し、そのＸ線粉末回折パターンは、９．２１±０．２０°、１６．４７±０．２０°、１８．１１±０．２０°、２４．４８±０．２０°、及び２６．７９±０．２０°である２θ角度に特徴的な回折ピークを有し、本発明のいくつかの実施形態において、上記結晶形IのＸ線粉末回折パターンには、９．２１±０．２０°、１２．７２±０．２０°、１５．７１±０．２０°、１６．４７±０．２０°、１８．１１±０．２０°、１９．７９±０．２０°、２４．４８±０．２０°、及び２６．７９±０．２０°である２θ角度に特徴的な回折ピークを有し、本発明のいくつかの実施形態において、上記結晶形IのＸ線粉末回折パターンには、９．２１±０．２０°、１０．４４±０．２０°、１２．７２±０．２０°、１５．０６±０．２０°、１５．７１±０．２０°、１６．４７±０．２０°、１８．１１±０．２０°、１９．７９±０．２０°、２０．４６±０．２０°、２４．４８±０．２０°、２６．７９±０．２０°、及び３１．４６±０．２０°である２θ角度に特徴的な回折ピークを有し、本発明のいくつかの実施形態において、上記結晶形IのＸ線粉末回折パターンには、９．２１±０．２０°、９．６８±０．２０°、１０．４４±０．２０°、１２．７２±０．２０°、１５．０６±０．２０°、１５．７１±０．２０°、１６．４７±０．２０°、１８．１１±０．２０°、１９．７９±０．２０°、２０．４６±０．２０°、２４．４８±０．２０°、２６．０２±０．２０°、２６．７９±０．２０°、２７．６７±０．２０°、及び３１．４６±０．２０°である２θ角度に特徴的な回折ピークを有し、本発明のいくつかの実施形態において、上記結晶形IのＸ線粉末回折パターンには、４．８６±０．２０°、９．２１±０．２０°、９．６８±０．２０°、１０．４４±０．２０°、１２．４７±０．２０°、１２．７２±０．２０°、１５．０６±０．２０°、１５．７１±０．２０°、１６．４７±０．２０°、１８．１１±０．２０°、１８．７４±０．２０°、１９．１９±０．２０°、１９．７９±０．２０°、２０．４６±０．２０°、２０．９４±０．２０°、２１．６５±０．２０°、２１．９６±０．２０°、２３．１２±０．２０°、２４．４８±０．２０°、２６．０２±０．２０°、２６．７９±０．２０°、２７．６７±２０°、２６．７９±０．２０°、２７．６７±０．２０°、２９．３６±０．２０°、３１．４６±０．２０°、及び３４．１７±０．２０°である２θ角度に特徴的な回折ピークを有する。

【0016】

本発明のいくつかの実施形態において、上記結晶形IのＸＲＰＤパターンにおいて、回折ピークのピーク位置及び相対強度を下記の表１に示す。

【0017】

【表1】

【0018】

本発明のいくつかの実施形態において、上記結晶形IのＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）パターンを図１に示す。
本発明のいくつかの実施形態において、上記結晶形Iの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）曲線には２３１．２６±５℃に吸熱ピークを有する。
本発明のいくつかの実施形態において、上記結晶形IのＤＳＣパターンを図２に示す。

【0019】

また一態様によれば、本発明は、上記式Iの化合物を溶媒に加えた後、固体を分離する工程を含む結晶形Iの製造方法を提供する。
本発明のいくつかの実施形態において、結晶形Iの製造方法には、上記式Iの化合物を溶媒に加えて晶析させた後、固体を分離する工程を含む。
本発明のいくつかの実施形態において、上記結晶形Iの製造方法には、溶媒はメタノール、アセトニトリル又は水の１種以上の混合物から選ばれる。本発明のいくつかの実施形態において、上記結晶形Iの製造方法には、溶媒はメタノール、又はアセトニトリルと水との混合物から選ばれる。

【0020】

本発明のいくつかの実施形態において、上記結晶形Iの製造方法には、前記溶媒と式Iの化合物との体積質量比が１～１００ｍＬ／ｇであり、本発明のいくつかの実施形態において、前記溶媒と式Iの化合物との体積質量比が１ｍＬ／ｇ、５ｍＬ／ｇ、１０ｍＬ／ｇ、１５ｍＬ／ｇ、２０ｍＬ／ｇ、２５ｍＬ／ｇ、３０ｍＬ／ｇ、３５ｍＬ／ｇ、４０ｍＬ／ｇ、４５ｍＬ／ｇ、５０ｍＬ／ｇ、５５ｍＬ／ｇ、６０ｍＬ／ｇ、６５ｍＬ／ｇ、７０ｍＬ／ｇ、７５ｍＬ／ｇ、８０ｍＬ／ｇ、８５ｍＬ／ｇ、９０ｍＬ／ｇ、１００ｍＬ／ｇ、又はこれらのいずれかの比からなる範囲である。

【0021】

本発明のいくつかの実施形態において、上記結晶形Iの製造方法には、前記メタノールと式Iの化合物との体積質量比が１～２０ｍＬ／ｇであり、本発明のいくつかの実施形態において、前記メタノールと式Iの化合物との体積質量比が１ｍＬ／ｇ、２ｍＬ／ｇ、３ｍＬ／ｇ、４ｍＬ／ｇ、５ｍＬ／ｇ、６ｍＬ／ｇ、７ｍＬ／ｇ、８ｍＬ／ｇ、９ｍＬ／ｇ、１０ｍＬ／ｇ、１１ｍＬ／ｇ、１２ｍＬ／ｇ、１３ｍＬ／ｇ、１４ｍＬ／ｇ、１５ｍＬ／ｇ、１６ｍＬ／ｇ、１７ｍＬ／ｇ、１８ｍＬ／ｇ、１９ｍＬ／ｇ、２０ｍＬ／ｇ、又はこれらのいずれかの比からなる範囲であり、本発明のいくつかの実施形態において、前記メタノールと式Iの化合物との体積質量比が１～１０ｍＬ／ｇ又は２～８ｍＬ／ｇであり、本発明のいくつかの実施形態において、前記メタノールと式Iの化合物との体積質量比が５ｍＬ／ｇである。

【0022】

本発明のいくつかの実施形態において、上記結晶形Iの製造方法には、前記アセトニトリルと式Iの化合物との体積質量比が１～２０ｍＬ／ｇであり、本発明のいくつかの実施形態において、前記アセトニトリルと式Iの化合物との体積質量比が１ｍＬ／ｇ、２ｍＬ／ｇ、３ｍＬ／ｇ、４ｍＬ／ｇ、５ｍＬ／ｇ、６ｍＬ／ｇ、７ｍＬ／ｇ、８ｍＬ／ｇ、９ｍＬ／ｇ、１０ｍＬ／ｇ、１１ｍＬ／ｇ、１２ｍＬ／ｇ、１３ｍＬ／ｇ、１４ｍＬ／ｇ、１５ｍＬ／ｇ、１６ｍＬ／ｇ、１７ｍＬ／ｇ、１８ｍＬ／ｇ、１９ｍＬ／ｇ、２０ｍＬ／ｇ、又はこれらのいずれかの比からなる範囲であり、本発明のいくつかの実施形態において、前記アセトニトリルと式Iの化合物との体積質量比が５～１８ｍＬ／ｇ又は８～１６ｍＬ／ｇであり、本発明のいくつかの実施形態において、前記アセトニトリルと式Iの化合物との体積質量比が１２．５ｍＬ／ｇである。

【0023】

本発明のいくつかの実施形態において、上記結晶形Iの製造方法には、前記アセトニトリルと水との体積比が１：１～１：１０であり、本発明のいくつかの実施形態において、前記アセトニトリルと水との体積比が１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、又はこれらのいずれかの比からなる範囲であり、本発明のいくつかの実施形態において、前記アセトニトリルと水との体積比が１：１～１：５であり、本発明のいくつかの実施形態において、前記アセトニトリルと水との体積比が１：５である。

【0024】

本発明のいくつかの実施形態において、上記結晶形Iの製造方法において、固体を分離する手段が濾過から選ばれる。
本発明のいくつかの実施形態において、上記結晶形Iの製造方法には、上記式Iの化合物を溶媒に加え、撹拌して清澄化させ、必要に応じて加熱して溶液に清澄化させる工程を含む。
本発明のいくつかの実施形態において、上記結晶形Iの製造方法には、室温まで冷却する工程、及び／又は氷水浴中で冷却して晶析させる工程、及び／又は水を必要に応じて加えて晶析させる工程を任意に含む。

【0025】

別の一態様によれば、本発明は、上記式Iの化合物の結晶形IIをさらに提供し、そのＸ線粉末回折パターンは、１４．０９±０．２０°、１５．８１±０．２０°、１７．４０±０．２０°、１８．８１±０．２０°、及び２２．９１±０．２°である２θ角度に特徴的な回折ピークを有し、本発明のいくつかの実施形態において、上記結晶形IIのＸ線粉末回折パターンには、８．４５±０．２０°、１３．３５±０．２０°、１４．０９±０．２０°、１４．９０±０．２０°、１５．８１±０．２０°、１７．４０±０．２０°、１８．８１±０．２０°、１９．６４±０．２０°、及び２２．９１±０．２°である２θ角度に特徴的な回折ピークを有し、本発明のいくつかの実施形態において、上記結晶形IIのＸ線粉末回折パターンには、８．４５±０．２０°、１１．１５±０．２０°、１３．３５±０．２０°、１４．０９±０．２０°、１４．９０±０．２０°、１５．８１±０．２０°、１７．４０±０．２０°、１８．８１±０．２０°、１９．６４±０．２０°、２０．９７±０．２０°、２２．９１±０．２°、２３．６８±０．２０°、及び２５．２４±０．２°である２θ角度に特徴的な回折ピークを有し、本発明のいくつかの実施形態において、上記結晶形IIのＸ線粉末回折パターンには、８．４５±０．２０°、１１．１５±０．２０°、１３．３５±０．２０°、１４．０９±０．２０°、１４．９０±０．２０°、１５．８１±０．２０°、１７．４０±０．２０°、１８．８１±０．２０°、１９．６４±０．２０°、２０．２５±０．２０°、２０．９７±０．２０°、２１．４２±０．２０°、２２．９１±０．２°、２３．６８±０．２０°、２５．２４±０．２°、２７．７２±０．２°、及び３０．００±０．２°である２θ角度に特徴的な回折ピークを有し、本発明のいくつかの実施形態において、上記結晶形IIのＸ線粉末回折パターンには、４．７４±０．２０°、７．９４±０．２０°、８．４５±０．２０°、９．４０±０．２０°、９．９１±０．２０°、１１．１５±０．２０°、１３．３５±０．２０°、１４．０９±０．２０°、１４．９０±０．２０°、１５．８１±０．２０°、１７．４０±０．２０°、１８．８１±０．２０°、１９．６４±０．２０°、２０．２５±０．２０°、２０．９７±０．２０°、２１．４２±０．２０°、２２．９１±０．２°、２３．６８±０．２０°、２５．２４±０．２°、２７．７２±０．２°、及び３０．００±０．２°である２θ角度に特徴的な回折ピークを有する。

【0026】

本発明のいくつかの実施形態において、上記結晶形IIのＸＲＰＤパターンにおいて、回折ピークのピーク位置及び相対強度を下記表２に示す。

【0027】

【表2】

【0028】

本発明のいくつかの実施形態において、上記結晶形IIのＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）パターンを図３に示す。
本発明のいくつかの実施形態において、上記結晶形IIの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）曲線は２２５．０５±５℃に吸熱ピークを有する。
本発明のいくつかの実施形態において、上記結晶形IIのＤＳＣパターンを図４に示す。

【0029】

また一態様によれば、本発明は、式Iの化合物を溶媒に加えた後固体を析出させる工程を含む上記結晶形IIの製造方法を提供する。
いくつかの実施形態において、上記結晶形IIの製造方法には、溶媒がアセトン、テトラヒドロフラン及び水からなる群から選ばれる１種又は２種以上の混合物である。いくつかの実施形態において、上記結晶形IIの製造方法には、溶媒がアセトンと水との混合物、又はテトラヒドロフランと水との混合物から選ばれる。

【0030】

本発明のいくつかの実施形態において、上記結晶形IIの製造方法には、前記溶媒と式Iの化合物との体積質量比が１～１００ｍＬ／ｇであり、本発明のいくつかの実施形態において、前記溶媒と式Iの化合物との体積質量比が１ｍＬ／ｇ、５ｍＬ／ｇ、１０ｍＬ／ｇ、１５ｍＬ／ｇ、２０ｍＬ／ｇ、２５ｍＬ／ｇ、３０ｍＬ／ｇ、３５ｍＬ／ｇ、４０ｍＬ／ｇ、４５ｍＬ／ｇ、５０ｍＬ／ｇ、５５ｍＬ／ｇ、６０ｍＬ／ｇ、６５ｍＬ／ｇ、７０ｍＬ／ｇ、７５ｍＬ／ｇ、８０ｍＬ／ｇ、８５ｍＬ／ｇ、９０ｍＬ／ｇ、１００ｍＬ／ｇ、又はこれらのいずれかの比からなる範囲である。

【0031】

本発明のいくつかの実施形態において、上記結晶形IIの製造方法には、前記アセトンと式Iの化合物との体積質量比が１～５０ｍＬ／ｇであり、本発明のいくつかの実施形態において、前記アセトンと式Iの化合物との体積質量比が１ｍＬ／ｇ、５ｍＬ／ｇ、１０ｍＬ／ｇ、１５ｍＬ／ｇ、２０ｍＬ／ｇ、２５ｍＬ／ｇ、３０ｍＬ／ｇ、３５ｍＬ／ｇ、４０ｍＬ／ｇ、４５ｍＬ／ｇ、５０ｍＬ／ｇ、又はこれらのいずれかの比からなる範囲であり、本発明のいくつかの実施形態において、前記アセトンと式Iの化合物との体積質量比が５～４０ｍＬ／ｇ又は１０～３０ｍＬ／ｇであり、本発明のいくつかの実施形態において、前記アセトンと式Iの化合物との体積質量比が２０ｍＬ／ｇである。

【0032】

本発明のいくつかの実施形態において、上記結晶形IIの製造方法には、前記アセトンと水との体積比が１：０．５～１：５であり、本発明のいくつかの実施形態において、前記アセトンと水との体積比が１：０．５、１：１、１：１．５、１：２、１：２．５、１：３、１：３．５、１：４、１：４．５、１：５、又はこれらのいずれかの比からなる範囲であり、本発明のいくつかの実施形態において、前記アセトンと水との体積比が１：０．５～１：２であり、本発明のいくつかの実施形態において、前記アセトンと水との体積比が１：１．２５である。

【0033】

いくつかの実施形態において、上記結晶形IIの製造方法には、固体を析出させた後、固体を濾過で分離することが選択できる。
本発明のいくつかの実施形態において、上記結晶形IIの製造方法には、上記式Iの化合物を溶媒に加え、撹拌して清澄化させ、必要に応じて加熱して溶液に清澄化させる。
本発明のいくつかの実施形態において、上記結晶形IIの製造方法には、室温まで冷却する工程、及び／又は氷水浴中で冷却して晶析させる工程、及び／又は水を必要に応じて加えて晶析させる工程を任意に含む。

【0034】

本発明のいくつかの具体的実施形態において、上記結晶形I又は結晶形IIの製造方法には、分離された固体を乾燥させ、例えば３０℃～９０℃で乾燥させ、又は５０℃～６０℃で乾燥させる工程をさらに含む。

【0035】

本発明において、ＸＲＰＤはＢｒｕｋｅｒ Ｄ８ ＡＤＶＡＮＣＥ Ｘ線粉末回折計（ライト管：Ｃｕ－Ｋα線（λ＝１．５４０５６Å）、ライト管電圧：４０ｋＶ，ライト管電流：４０ｍＡ、発散スリット：０．６１８ｍｍ、スキャン範囲：３～６０°、ステップ幅：０．０２°、ステップ時間：０．１ｓ）を用いて検出する。
本発明において、ＤＳＣは、Ｍｅｔｔｌｅｒ ＤＳＣ１型示差走査熱量計（温度範囲：５０～３００℃、昇温速度：１０．００Ｋ／ｍｉｎ）を用いて検出する。

【0036】

また一態様によれば、本発明は、本発明に係る式Iの化合物の結晶形は、結晶形組成物の重量の５０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上を占める結晶形組成物を提供する。

【0037】

また一態様によれば、本発明は、上記の結晶形I及び／又は結晶形IIを含む結晶形組成物であって、前記結晶形I及び／又は結晶形IIは、結晶形組成物の重量の５０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上を占める結晶形組成物を提供する。

【0038】

また一態様によれば、本発明は、治療有効量の本発明に係る式Iの化合物の結晶形又はその結晶形組成物を含む医薬組成物を提供する。本発明に係る医薬組成物には、薬学的に許容される補助剤を含んでも含まなくてもよい。本発明に係る医薬組成物には、１種以上の他の治療剤をさらに含んでもよい。

【0039】

別の一態様によれば、本発明は、本発明に係る式Iの化合物の結晶形、その結晶形組成物、又はその医薬組成物の、カプシドタンパク質集合の阻害から恩恵を受ける疾患を予防又は治療するための医薬の製造における使用をさらに提供する。

【0040】

別の一態様によれば、本発明は、本発明に係る式Iの化合物の結晶形、その結晶形組成物、又はその医薬組成物の、Ｂ型肝炎ウイルス感染を予防又は治療するための医薬の製造における使用をさらに提供する。

【0041】

別の一態様によれば、本発明は、本発明に係る式Iの化合物の結晶形、その結晶形組成物、又はその医薬組成物の、カプシドタンパク質集合の阻害から恩恵を受ける疾患の予防又は治療における使用をさらに提供する。

【0042】

別の一態様によれば、本発明は、カプシドタンパク質集合の阻害から恩恵を受ける疾患の予防又は治療方法であって、治療有効量の本発明に係る式Iの化合物の結晶形、その結晶形組成物、又はその医薬組成物を、そのような予防又は治療を必要とする哺乳類（好ましくはヒト）に投与することを含む方法をさらに提供する。

【0043】

別の一態様によれば、本発明は、カプシドタンパク質集合の阻害から恩恵を受ける疾患を予防又は治療するための、本発明に係る式Iの化合物の結晶形、その結晶形組成物、又はその医薬組成物をさらに提供する。

【0044】

本発明に用いられるように、本発明に係る式Iの化合物の結晶形は、式Iの化合物の結晶形、式Iの化合物の結晶形I、式Iの化合物の結晶形II、式Iの化合物の結晶形Iと結晶形IIとの混合物からなる群から選ばれる。

【0045】

本発明のいくつかの実施形態において、前記カプシドタンパク質の集合の阻害から恩恵を受ける疾患とは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染に起因する疾患を意味する。
本発明のいくつかの実施形態において、前記カプシドタンパク質集合の阻害から恩恵を受ける疾患とは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染に起因する肝疾患を意味する。

【0046】

本発明のいくつかの実施形態において、前記カプシドタンパク質集合の阻害から恩恵を受ける疾患の予防又は治療とは、感染した患者の肝疾患を予防、緩和又は治癒するためにＨＢＶを制御、低減又は除去することを意味する。

【0047】

〔定義と説明〕
特に断りのない限り、本発明における下記の用語及びフレーズは、次の意味を有する。ある１つの特定の用語やフレーズは、特に定義されない場合、不確定又は不明瞭とが認定されておらず、一般的な意味として理解されるべきである。本明細書では、商品名が記載される場合、その対応の商品又はその活性成分を示すことである。

【0048】

なお、Ｘ線粉末回折スペクトルにおいて、ピークの位置やピークの相対強度には、測定機器、測定方法／条件等の要因によって相違が生じる場合がある。いずれの特定の結晶形についても、ピークの位置に誤差が存在する可能性があり、２θ値の測定には±０．２°の誤差があってもよい。したがって、この誤差は各結晶形を決定する際に考慮すべきであり、この誤差の範囲内での結晶形でも本発明の範囲内である。

【0049】

なお、同種の結晶形に対しても、ＤＳＣパターンにおける吸熱ピークを示す位置は、測定機器、測定方法／条件等の要因によって相違が生じる場合があることに留意すべきである。いずれの特定の結晶形においても、吸熱ピークの位置に誤差が存在する可能性があり、誤差は±５℃であってもよく、±３℃であってもよい。したがって、この誤差は各結晶形を決定する際に考慮すべきであり、この誤差の範囲内での結晶形でも本発明の範囲内である。

【0050】

用語「含む／含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、及びそれらの英語の変形（例えば「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」や「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などに相当する言い回し）は、いずれも開放（オープンエンド）式の、包含式の意味、すなわち「…を含むが、これらに限定されない」として解釈すべきである。

【0051】

「薬学的に許容される補助剤」とは、活性成分とともに投与され、活性成分の投与に寄与する不活性物質を意味し、国家食品薬品監督管理部門により許可されるヒトや動物（例えば家畜）への使用を許容可能な任意の流動促進剤、甘味剤、希釈剤、防腐剤、染料／着色剤、矯味補強剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、崩壊剤、懸濁剤、安定剤、等張化剤、溶媒又は乳化剤が挙げられるが、それらに限定されない。前記補助剤の非制限的な例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、各種類の糖及び各種類の澱粉、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、並びにポリグリコールが挙げられる。

【0052】

用語「医薬組成物」とは、本発明の１つ又は複数の化合物又はその塩と薬学的に許容される補助剤からなる混合物を意味する。医薬組成物は、本発明の化合物を有機体に投与することに有利となる目的とする。

【0053】

本発明に係る医薬組成物は、本発明に係る化合物と適切な薬学的に許容される補助剤とを組み合わせて製造することができ、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、クリーム剤、乳剤、懸濁剤、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル剤、マイクロスフェア及びエアゾールのような固体、半固体、液体又は気体の製剤として調製することができる。

【0054】

本発明に係る結晶形又はその医薬組成物の典型的な投与経路は、経口投与、直腸投与、局所投与、吸入投与、腸管外投与、舌下投与、膣内投与、鼻内投与、眼内投与、腹膜内投与、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与が挙げられるが、これらに限定されない。

【0055】

本発明に係る医薬組成物は、例えば通常の混合法、溶解法、造粒法、糖衣錠製法、粉砕法、乳化法、凍結乾燥法等の本技術分野で周知の方法によって製造することができる。

【0056】

いくつかの実施形態において、医薬組成物は経口投与の形である。経口投与については、活性化合物と当該技術分野で周知の医薬的に許容され得る補助剤とを混合して当該医薬組成物を調製してもよい。これらの補助剤は、本発明の化合物を、錠剤、丸剤、トローチ剤、糖衣剤、カプセル剤、液剤、ゲル化剤、シロップ剤、懸濁剤等として調製されて患者の経口投与に用いられてもよい。

【0057】

本発明の化合物の治療量は、例えば、治療の具体的な使用、投与される化合物の形態、患者の健康状態、及び処方医師の判断に基づいて決定される。本発明の化合物の医薬組成物における割合又は濃度は、可変であり、用量、化学的特性（例えば、疎水性）、及び投与経路を含む複数種の要素に依存する。用語「治療」とは、本発明に記載の化合物又は製剤を投与して疾患又は前記疾患関連の１つ以上の症状を緩和したり、解消したりすることを意味し、且つ（ｉ）疾患又は疾患状態を阻害し、すなわちその発生・進行を阻害することと、（ｉｉ）疾患又は疾患状態を緩和し、すなわち疾患又は疾患状態を減退させることとを含む。

【0058】

用語「予防」とは、本発明に記載の化合物又は製剤を投与して疾患又は前記疾患関連の１つ以上の症状を予防することを意味し、且つ、哺乳類において疾患又は疾患状態の発生を予防し、特に、当該哺乳類が前記疾患状態に罹りやすいが、そのような疾患状態にすでに罹患していることがまだ診断されていない場合、予防することを含む。

【0059】

薬物又は薬理活性剤について、用語「治療有効量」は、無毒なのに望ましい効果を達成可能な薬物・薬剤の十分な投与量を意味する。有効量の決定は、個人差があり、受験者（個体、対象）の年齢及び一般的な状況に依存し、具体的な活性物質にも依存して変化し、個別のケースに適合な有効量は、当業者により通常の実験に基づいて決定される。

【0060】

本発明に係る結晶形の治療有効量は、約０．０００１～２０ｍｇ／ｋｇ体重／日、例えば０．００１～１０ｍｇ／ｋｇ体重／日である。

【0061】

本発明に係る結晶形の投与頻度は、患者個体（対象）のニーズにより決められ、例えば、１日に１回か２回以上の複数回投与する。投与は断続的にしてもよく、例えば、数日間の期間において、患者がある結晶形の１日投与量を受け取り、その後数日間の期間又はより長い期間において、患者が結晶形の１日投与量を受け取らないようにしてもよい。

【0062】

本発明に用いられる全ての溶剤は、市販品であり、さらなる精製の必要がないままで使用することができる。

【0063】

本出願には下記の略語が用いられており、ＤＭＦはＮ、Ｎ－ジメチルホルムアミドを表し、ＰＥは石油エーテルを表し、ＥＡは酢酸エチルを表し、ＤＭＳＯはジメチルスルホキシドを表し、ＴＨＦはテトラヒドロフランを表し、ＤＣＭはジクロロメタンを表し、ＨＡＴＵは、２－（７－オキシベンゾトリアゾール）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートを表し、ＤＩＰＥＡはＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンを表す。

【0064】

技術的効果
本発明に係る結晶形は、良好な薬理活性を有すると共に高湿・高温又は光照射の条件下での良好な安定性を有し、その良好な薬学的性質及び創薬可能性が比較的高い見通しを有することが裏付けられている。

【0065】

以下、実施例により本発明を詳細に説明し、本発明に対していかなる限定を意味するものではない。本明細書で本発明を詳細に説明し具体な実施形態をも開示したが、当業者にとって本発明の精神及び範囲から逸脱することなく本発明の具体的な実施形態に対する様々な変更や修正は、明らかであろう。

【実施例】

【0066】

実施例１
式Iの化合物の製造

【化3】

【0067】

工程Ａ：窒素雰囲気下で５００ｍＬの一口フラスコにＤＭＦ（１００ｍＬ）、２，４－ジメチル－１Ｈ－ピロール－３－カルボン酸エチル（８．０ｇ）、ヨードメタン（８．１５ｇ）を加え、氷浴中に水素化ナトリウム（２．８７ｇ）をバッチで加えた後、反応系を室温まで加温して２．５時間反応させ、反応終了後氷水４００ｍＬに徐々に注ぎ入れてクエンチし、酢酸エチル（２×３００ｍＬ）で抽出し、有機層を合わせ、有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＰＥ：ＥＡ＝２０：１）により分離し、１，２，４－トリメチル－１Ｈ－ピロール－３－カルボン酸エチル（４．８７ｇ）を得た。^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ ６．４４（ｓ， １Ｈ）， ４．１５（ｑ， Ｊ ＝ ７．５Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４４（ｓ， ３Ｈ）， ２．３９（ｓ， ３Ｈ）， ２．０９（ｓ， ３Ｈ）， １．２５（ｔ， Ｊ ＝ ７．０Ｈｚ， ３Ｈ）． ^１３Ｃ－ＮＭＲ （１２５ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ １６５．６３， １３６．１３， １２０．７８， １１８．９１， １１０．５６， ５８．７６， ３３．５８， １４．８５， １２．９３， １１．６０． ＭＳ（ＥＳＩ＋，［Ｍ＋Ｈ］^＋）ｍ／ｚ： １８２．３．

【0068】

工程Ｂ：窒素雰囲気下で５００ｍＬの三口フラスコにＴＨＦ（１５０ｍＬ）、１，２，４－トリメチル－１Ｈ－ピロール－３－カルボン酸エチル（１５．０ｇ）、５－アミノ－２－フルオロベンゾニトリル（１４．０８ｇ）を加え、氷浴中にリチウムビス（トリメチルシリル）アミド（２７．７ｇ、ＴＨＦ溶液１６６ｍＬ）を徐々に滴下した後、反応系を室温まで加温して１６．０時間反応させた。反応終了後氷水５００ｍＬに徐々に注ぎ入れてクエンチし、酢酸エチル（２×４００ｍＬ）で抽出し、有機層を合わせ、有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＰＥ：ＥＡ＝１：１）により分離し、Ｎ－（３－シアノ－４－フルオロフェニル）－１，２，４－トリメチル－１Ｈ－ピロール－３－カルボキサミド（６．７３ｇ）を得た。^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ ９．６４（ ｓ， １Ｈ ）， ８．１８（ ｔ， Ｊ＝ ３．５Ｈｚ， １Ｈ ）， ７．９３－７．９６（ ｍ， １Ｈ ）， ７．４８（ ｔ， Ｊ＝ ９．０Ｈｚ， １Ｈ ）， ６．４９（ ｓ， １Ｈ ）， ３．４７（ ｓ， ３Ｈ ）， ２．３０（ ｓ， ３Ｈ ）， ２．１０（ ｓ， ３Ｈ ）． ^１３Ｃ－ＮＭＲ （１２５ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ １６５．５１， １５９．３０， １５７．１５， １３７．５６， １３１．７６， １２６．９７， １２３．３３， １２０．３３， １１７．３９， １１６．７７， １１４．５９， １００．１９， ３３．５３， １１．６３． ＭＳ（ＥＳＩ－，［Ｍ－Ｈ］^－）ｍ／ｚ： ２７０．２．

【0069】

工程Ｃ：窒素雰囲気下で５００ｍＬの一口フラスコにＤＣＭ（２４０ｍＬ）、（Ｎ－（３－シアノ－４－フルオロフェニル）－１，２，４－トリメチル－１Ｈ－ピロール－３－カルボキサミド（５．０ｇ）、クロロシュウ酸モノエチル（ｍｏｎｏｅｔｈｙｌ ｃｈｌｏｒｏｏｘａｌａｔｅ）（７．５５ｇ）を加え、氷浴中に塩化アルミニウム（１２．２９ｇ）をバッチで加えた後、反応系を室温まで加温して１５．０時間反応させた。反応終了後、氷水３００ｍＬに徐々に注ぎ入れてクエンチし、ＤＣＭ（２×３００ｍＬ）で抽出し、有機層を合わせ、有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、吸引ろ過し、ろ液を減圧下で溶媒を留去して得られた粗生成物に酢酸エチル（４５ｍＬ）を加え、室温で１．０時間叩解し、吸引ろ過し、ろ過ケーキを真空乾燥して２－（４－（（３－シアノ－４－フルオロフェニル）カルバモイル）－１，３，５－トリメチル－１Ｈ－ピロール－２－イル）－２－オキソ酢酸エチル（４．２５ｇ）を得た。ＭＳ（ ＥＳＩ－，［Ｍ－Ｈ］^－） ｍ／ｚ： ３７０．２．

【0070】

工程Ｄ：氷浴中に１００ｍＬの一口フラスコにメタノール（３０ｍＬ）、２－（４－（（３－シアノ－４－フルオロフェニル）カルバモイル）－１，３，５－トリメチル－１Ｈ－ピロール－２－イル）－２－オキソ酢酸エチル（４．００ｇ）、水酸化ナトリウム（０．８６２ｇ）の水（３０ｍＬ）溶液を加えた後、反応系を室温まで加温して２．０時間反応させた。反応液に水（２００ｍＬ）及びＤＣＭ（１５０ｍＬ）を加え、層分けし、有機層を除去し、水層を濃塩酸でｐＨを約２まで調整し、酢酸エチル（２×１５０ｍＬ）で抽出し、有機層を合わせ、有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、吸引ろ過し、ろ液の溶媒を減圧留去し、２－（４－（３－シアノ－４－フルオロフェニル）カルバモイル）－１，３，５－トリメチル－１Ｈ－ピロール－２－イル）－２－オキソ酢酸（３．２５ｇ）を得た。^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ １０．３２（ ｓ， １Ｈ ）， ８．１９－８．２１（ ｍ， １Ｈ ）， ７．９３－７．９７（ ｍ， １Ｈ ）， ７．５２（ｔ， Ｊ＝ ９．０Ｈｚ， １Ｈ ）， ３．８１（ ｓ， ３Ｈ ）， ２．３６（ ｓ， ３Ｈ ）， ２．２７（ ｓ， ３Ｈ ）． ^１３Ｃ－ＮＭＲ （１２５ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ １７８．８５， １６７．７９， １６３．９８， １５９．６７， １５７．６６， １４１．３１， １３６．８０， １３０．９５， １２７．２６， １２３．８４， １１７．６０， １１４．４３， １００．４１， ６０．２１， ３３．７３， ２１．２２， １４．５５．

【0071】

工程Ｅ：５０ｍＬの一口フラスコにＤＭＦ（３．０ｍＬ）、２－（４－（３－シアノ－４－フルオロフェニル）カルバモイル）－１，３，５－トリメチル－１Ｈ－ピロール－２－イル）－２－オキソ酢酸（１００ｍｇ）、ＨＡＴＵ（１３８ｍｇ）、ＤＩＰＥＡ（８３ｍｇ）を順次加え、さらに（Ｓ）－１，１，１－トリフルオロイソプロピルアミン塩酸塩（５６ｍｇ）を加え、室温で２．５時間撹拌した。反応液に水（５０ｍＬ）を加え、酢酸エチル（２×５０ｍＬ）で抽出し、有機層を合わせ、有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＰＥ：ＥＡ＝１：１）により分離し、（Ｓ）－Ｎ－（３－シアノ－４－フルオロフェニル）－１，２，４－トリメチル－５－（２－オキソ－２－（（１，１，１－トリフルオロプロパン－２－イル）アミノ）アセチル）－１Ｈ－ピロール－３－カルボキサミド（５４ｍｇ）を得た。^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）：δ １０．３１（ ｓ， １Ｈ ）， ９．３８（ ｄ， Ｊ＝ ９．０Ｈｚ， １Ｈ ）， ８．１９－８．２１（ ｍ， １Ｈ ）， ７．９３－７．９７（ ｍ， １Ｈ）， ７．５１（ ｔ， Ｊ＝ ９．５Ｈｚ， １Ｈ ）， ４．６８－４．７５（ ｍ， １Ｈ ）， ３．７９（ ｓ， ３Ｈ ）， ２．３６（ ｓ， ３Ｈ ）， ２．２１（ ｓ， ３Ｈ ）， １．３１（ ｄ， Ｊ＝ ７．０Ｈｚ， ３Ｈ ）．^１３Ｃ－ＮＭＲ （１２５ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）：δ １８０．８０， １６７．２４， １６４．０８， １５９．６６， １５７．６５， １４０．９２， １３６．８２， １３０．８１， １２７．３１， １２５．０２， １２３．８１， １２０．７１， １１７．５８， １１４．４４， １００．４０， ４６．０４， ３３．６６， １３．７５， １１．５７． ＭＳ（ＥＳＩ－，［Ｍ－Ｈ］^－） ｍ／ｚ： ４３７．３．

【0072】

実施例２ 式Iの化合物の結晶形Iの製造
室温で式Ｉの化合物１００ｇを無水メタノール５００ｍＬに加えて再結晶して白色固体を多量に析出させ、吸引ろ過し、ろ過ケーキを無水メタノールでリンスし、５０℃で８時間送風乾燥して、式Ｉの化合物の結晶形Iのオフホワイトの固体７９ｇを得た。サンプルを図１に示すようにＸＲＰＤ検出を行い、図２に示すようにＤＳＣ検出を行った。

【0073】

実施例３ 式Iの化合物の結晶形Iの製造
室温で式Iの化合物４００ｍｇをアセトニトリル５ｍＬに加えて２０分間撹拌して清澄化させ、精製水２５ｍＬを滴下して白色固体を多量に析出させ、吸引ろ過し、ろ過ケーキを６０℃で６時間送風乾燥して、式Ｉの化合物の結晶形Iのオフホワイトの固体３０３ｍｇを得た。

【0074】

実施例４ 式Iの化合物の結晶形IIの製造
室温で式Iの化合物１０ｇをアセトン２００ｍＬに加えて撹拌して清澄化させ、精製水２５０ｍＬを徐々に滴下して白色固体を多量に析出させ、吸引ろ過し、ろ過ケーキを６０℃で７時間送風乾燥して、式Ｉの化合物の結晶形IIのオフホワイトの固体７．２ｇを得た。サンプルを図３に示すようにＸＲＰＤ検出を行い、図４に示すようにＤＳＣ検出を行った。

【0075】

実験例１ 結晶形の安定性実験
１．１ サンプル調製
実施例２で調製された式Iの化合物の結晶形I、実施例４で調製された式Iの化合物の結晶形IIを、それぞれ５００ｍｇ秤量し、それぞれ乾燥清浄な秤量瓶に入れ、薄層に広げて被験サンプルとした。サンプルは、影響因子試験条件（４０℃、６０℃、７５％ＲＨ、９２．５％ＲＨ、高温高湿（４０℃、７５％ＲＨ））に放置して完全に暴露された。１０日目、３０日目にサンプリングして分析した。サンプルは、室温で光照条件（可視光１２００，０００Ｌｕｘ・ｈｒ、紫外光２１６Ｗ・ｈｒ／ｍ^２）に放置して完全に暴露された。

【0076】

１．２ 機器と分析方法
クロマトグラフカラムはＡｇｉｌｅｎｔ ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、３．５μｍ）を用いた。
水分の含有量は、Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｖ２０型水分計で測定した。

【0077】

１．３ サンプル溶液の調製
サンプルを約１０ｍｇ取り出し、希釈剤であるアセトニトリル－水（７０：３０）適量に溶解した。関連物質の濃度を検出するために用いた。

【0078】

【表3-1】

【0079】

表３－１の結果から、結晶形Iの関連物質と水分が上記の複数の考察項目において安定していることが示され、該結晶形が良好な高湿・高温安定性／光照安定性を持つことが裏付けられている。

【0080】

【表3-2】

【0081】

表３－２の結果から、結晶形IIの関連物質と水分が上記の複数の考察項目において安定していることが示され、該結晶形が良好な高湿・高温安定性／光照安定性を持つことが裏付けられている。

【0082】

実験例２ インビトロ活性の研究
２．１ インビトロ細胞ＨＢＶ ＤＮＡ阻害活性
指数増殖期における状態が良好なＨｅｐＧ２．２．１５細胞（Ｗｕｈａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）又はＨｅｐＡＤ３８細胞をボトル１本で取り、ＰＢＳ ５ｍＬを加えて１回洗浄した後、トリプシン３ｍＬを加えた。室温で５分間消化した後、２ｍＬのトリプシンを廃棄し、細胞培養インキュベーターに入れて１０分間消化し、細胞を取り出し、顕微鏡下で観察（細胞が単一の円形であるかどうか、細胞間に接着がなかったかどうか）を行った後、完全培地１０ｍＬを加えて消化を停止した。単細胞懸濁液になるようにピペッティングした後、細胞懸濁液１０μＬを取り出してセルカウンターで細胞数を計数し、完全培地で希釈し、細胞密度を１×１０^５個細胞／ｍＬに調整した。次に、マルチチャンネルピペットを用いて細胞懸濁液を２４ウェルプレートに１ｍＬ／ウェルで播種し（２４ウェルプレートに対して予め５０μｇ／ｍＬコラーゲンＩ（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉ）溶液で被覆した）、恒温ＣＯ_２インキュベーターに４８時間インキュベートした。

【0083】

ＤＭＳＯに溶解させた化合物を、完全培地を用いて２倍勾配で希釈して合計１０個の濃度にし、化合物のサンプルをローディングし、７２時間ごとに化合物含有新鮮培地を交換し、細胞を化合物で６日間処理した。上清を吸い出した後、各ウェルに溶解液（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、及び１％ＮＰ－４０）３００μＬを加え、室温で１０分間放置して溶解した後、ＤＮＡを抽出し、リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ計で細胞内ウイルスキャプシド中のＨＢＶ ＤＮＡを測定し、Ｃｔ値から阻害率を算出し、ＥＣ５０値は４パラメーター法で算出した。結果を表４及び表５に示す。

【0084】

【表4】

【0085】

【表5】

【0086】

２．２ インビトロ細胞毒性
指数増殖期における状態が良好なＨｅｐＧ２．２．１５細胞（Ｗｕｈａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）又はＨｅｐＡＤ３８細胞をボトル１本で取り、ＰＢＳ ５ｍＬを加えて１回洗浄した後、トリプシン２ｍＬを加えた。細胞インキュベーターに入れて消化を行い、時々取り出して顕微鏡下で観察し、細胞が脱落した直後に、１ｍＬのトリプシンを廃棄し、残液のみを残し、３７℃のインキュベーターに入れて８～１５分間消化し、顕微鏡下に取り出して細胞を観察し（細胞が単一の円形であるかどうか、細胞間に接着がなかったかどうか）、ＭＥＭ培地５ｍＬを加えて細胞を再懸濁した。セルカウンターで細胞数を計数し、完全培地で希釈し、細胞密度を２×１０^５個細胞／ｍＬに調整した。マルチチャネルピペットを用いて９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで接種し（９６ウェルプレートに対して予め５０μｇ／ｍＬコラーゲンＩ溶液で被覆した）、恒温ＣＯ_２インキュベーターに置いて２４時間インキュベートし、投薬処理し、化合物含有新鮮培地を３日間ごとに交換し、薬物を含まないＤＭＳＯ濃度が０．５％である培地を対照ウェルに加え、また通常の培地での対照ウェルを設け、投与処理６日間後、１０μＬ／ウェルでＣＣＫ－８を加え、１～２時間後マイクロプレートリーダーにより４５０ｎｍでの吸光値を検出し、阻害率を算出し、且つＣＣ５０を算出した。結果を表６に示す。

【0087】

【表6】

【0088】

２．３ ＣＹＰ４５０酵素誘導研究
５００μＬの最終インキュベーション系には、ヒト肝ミクロソーム（タンパク質濃度：０．２ｍｇ／ｍＬ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）５０μＬ、混合ＣＹＰ４５０特異的基質（ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、及びＣＹＰ３Ａ４）１μＬ、ＰＢＳバッファー（ＰＨ７．４）３９８μＬ、特異的陽性阻害剤（陽性対照群）１μＬ又は被験化合物（アセトニトリルで調製）１μＬ、及びＮＡＤＰＨ^＋ＭｇＣｌ_２ ５０μＬが含まれていた。各ＣＹＰ４５０サブタイプ（亜型）に対して、それぞれ０．５ｍＬの重複したインキュベーション系を作成した。各チューブに予め基質と酵素と均一に混合された溶液（総体積４５０μＬ）をよく配合し、ＮＡＤＰＨ溶液とそれぞれ３７℃で５分間プレインキュベートした後、ＮＡＤＰＨ^＋ＭｇＣｌ_２の混合溶液５０μＬを加えて反応させ、３０分で反応液５０μＬを取り出し、内部標準物質含有氷アセトニトリル３００μＬで反応を停止した。また、ＮＡＤＰＨを加えずに、２つのブランク対照群を５００μＬずつ平行して作製して陰性対照群とした。

【0089】

サンプル前処理：インキュベートしたサンプル５０μＬに、内部標準物質含有アセトニトリル３００μＬを加えて沈殿させ、５分間ボルテックスした後、サンプルを１０分間遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、４℃）した。上清７５μＬをピペットで吸引して取り、超純水７５μＬで希釈して均一に混合し、得られた溶液１μＬを検体として注入し分析した。結果を表７に示す。

【0090】

【表7】

【0091】

２．４ 血漿タンパク質結合試験
血漿サンプルの調製：対応する種（マウス、ラット、イヌ、サル及びヒト）のブランク血漿４９５μＬをそれぞれ採取し、対応する被験化合物溶液又は陽性対照５μＬを加え、化合物の血漿薬物濃度がそれぞれ１μＭ、１０μＭ（アセトニトリルで調製）となるように血漿サンプル溶液を得た。

【0092】

よく前処理された透析膜をハイスループット平衡透析装置に入れ、それぞれ１００μＬの血漿サンプル溶液とＰＢＳバッファー溶液を吸引して取り、透析膜の両側（サンプル側とバッファー側）に加え（ｎ＝３）、平衡装置をフィルムで密封した後、３７℃で一晩インキュベートし（１００ｒｐｍ）、透析平衡に達した後、それぞれサンプル側とバッファー側からサンプル５０μＬを吸引して取り、内部標準物質含有氷アセトニトリルで反応を停止させた。

【0093】

サンプル前処理：血漿側のサンプル５０μＬに、内部標準物質含有アセトニトリル４５０μＬを加えて沈殿させ、５分間ボルテックスした後、サンプルを１０分間遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、４℃）した。上清７５μＬをピペットで吸引して取り、超純水７５μＬで希釈して均一に混合し、得られた溶液１μＬを検体として注入し分析した。ＰＢＳ側のサンプル５０μＬ、内部標準物質含有氷アセトニトリル２５０μＬを加えてを沈殿させ、５分間ボルテックスした後、サンプルを１０分間遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、４℃）した。上清７５μＬをピペットで吸引して取り、超純水７５μＬで希釈して均一に混合し、得られた溶液２μＬを検体として注入し分析した。結果を表８に示す。

【0094】

【表8】

【0095】

実験例３ インビトロ肝ミクロソームの安定性
最終インキュベーション系３００μＬには、肝ミクロソーム（タンパク質濃度：０．１５ｍｇ／ｍＬ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）３０μＬ、ＮＡＤＰＨ^＋ＭｇＣｌ_２ ３０μＬ、基質（アセトニトリルで調製）３μＬ、及びＰＢＳバッファー２３７μＬが含まれていた。各種に対して、それぞれ０．３ｍＬの重複したインキュベーション系を作成した。各チューブに予め基質と酵素と均一に混合された溶液（総体積２７０μＬ）をよく配合し、ＮＡＤＰＨ溶液とそれぞれ３７℃で５分間プレインキュベートした後、ＮＡＤＰＨ^＋ＭｇＣｌ_２の混合溶液３０μＬを加えて反応させ、それぞれ０、１０、３０、６０分間で反応液５０μＬを取り出し、内部標準物質含有氷アセトニトリル３００μＬで反応を停止した。

【0096】

サンプル前処理：インキュベートしたサンプル５０μＬに、内部標準物質であるジアゼパム含有アセトニトリル３００μＬを加えて沈殿させ、５分間ボルテックスした後、サンプルを１０分間遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、４℃）した。上清７５μＬを９６ウェルプレートに吸引して取り出し、超純水７５μＬで希釈して均一に混合し、０．５μＬを検体として注入してＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行った。結果を表９に示す。

【0097】

【表9】

【0098】

実験例４ ｐＨ７．４でのＰＢＳ緩衝液への溶解度
最終系１０００μＬには、ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液９９０μＬ、被験化合物（アセトニトリルで調製）１０μＬを含んでいた。２５℃で１６時間静置した後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、室温）を１０分間行い、上清２０μＬを取り出し、内部標準物質（ジアゼパム２０ｎｇ／ｍＬ）含有アセトニトリル４００μＬで反応を停止した。上清３０μＬを吸引して取り、５０％アセトニトリル水溶液１５０μＬで希釈して均一に混合し、得られた溶液０．５μＬをサンプル注入して分析した。結果を表１０に示す。

【0099】

【表10】

【0100】

実験例５ インビボ動物薬効
５．１ ＡＡＶマウスモデルによる抗ウイルス効果の評価
６～８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）を取り、用量１×１０^１１ｖｇでｒＡＡＶ８－１．３ＨＢＶウイルス（Ｂｅｉｊｉｎｇ ＦｉｖｅＰｌｕｓ Ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．、ａｄｒサブタイプ）を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに尾静脈注射した。ウイルス注射後２週目、４週目にマウスの眼窩から採血し、血清を分離し、血清中のＨＢｅＡｇとＨＢｓＡｇの発現レベル、及びＨＢＶ ＤＮＡコピー数を検出し、モデル構築の成否について評価した。血清学的ＨＢｅＡｇ、ＨＢｓＡｇ、及びＨＢＶ ＤＮＡの定量的検出の結果と組み合わせると、選択したマウスのそれぞれのＨＢＶ ＤＮＡ発現レベルは１×１０^４ＩＵ／ｍＬを超え、ＨＢｅＡｇ発現レベルは１×１０^３ＮＣＵ／ｍＬを超え、ＨＢｓＡｇ発現レベルは１×１０^３ｎｇ／ｍＬを超えた。マウスをブランク対照群、溶媒対照群、被験物質群として群分けた。各群のマウスには、１日１回で連続的に２～３週間胃内投与した。実験中、１週間おきに眼窩から採血し、血清を分離し、蛍光定量ＰＣＲ法によりＤＮＡ含有量を検出した。結果を表１１に示す。

【0101】

【表11】

【0102】

５．２ ＨＤＩマウスモデルによる抗ウイルス効果の評価
６～８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）を取り、精製した組換えプラスミドｐＨＢＶｌ．３（１０μｇ）をＰＢＳに溶解し、各マウスに対してそれぞれの体重の約１０％である体積量で３～８秒以内に尾静脈注射した。プラスミド注射２４時間後に、マウスの眼窩から採血し、血清ＨＢＶ ＤＮＡを検出し、血清ＤＮＡの均一なモデルマウスを選択し、ブランク対照群、溶媒対照群、及び被験物質群として分けた。各群のマウスには、用量３０ｍｇ／ｋｇで１日１回で連続的に６日間胃内投与した。注射後の１、３、５、７日間に、マウス血清をそれぞれ採取し、７日目にマウスを犠牲にさせて肝臓組織サンプルを採取し、蛍光定量ＰＣＲ法によりマウス血清と肝臓中のＨＢＶ ＤＮＡコピー数を検出した。結果を表１２に示す。

【0103】

【表12】

【0104】

実験例６ インビボ薬物動態学
６．１ ラットのインビボ薬物動態学的（ＰＫ）研究
体重１８０～２２０ｇのＳＤラット（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｘｉｐｕｅｒ－Ｂｉｋａｉ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）を用い、３日～５日間適応性飼育を行った後、群ごとに３匹で無作為に群分け、それぞれ一連の化合物を用量２０ｍｇ／ｋｇで胃内投与した。
被験動物（ＳＤラット）には、投与前１２時間から絶食させ、投与後４時間から給餌し、実験前後も実験中も自由に水を飲んだ。

【0105】

投与後、０分、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、２４時間、３０時間、４８時間の時点で眼窩から約０．２ｍＬの血液を採取し、ＥＤＴＡ－Ｋ２で抗凝固した後、３０分間以内に４℃、４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して血漿を分離した。すべての血漿を採取した直後、すぐに－２０℃で保存して測定用に用意した。

【0106】

５０μＬの被験血漿サンプルと検量線サンプルをピペットで吸引して取り、内部標準物質（ジアゼパム：２０ｍｇ／ｍＬ）含有アセトニトリル溶液５００μＬを加え、得られた混合物を振動させて５分間均一に混合し、その後１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清７５μＬを取り、超純水７５μＬで希釈し、均一に混合し、得られた溶液１μＬをピペットで吸引し取ってＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定に用いた。結果を表１３に示す。

【0107】

【表13】

【0108】

６．２ ビーグル犬のインビボ薬物動態学的（ＰＫ）研究
ビーグル犬は、体重９～１１ｋｇであり、群ごとに３匹で無作為に２群に分け、それぞれ式Ｉの化合物を用量５ｍｇ／ｋｇで胃内投与した。
被験動物（ビーグル犬）には、投与前１２時間から絶食させ、投与後４時間から給餌し、実験前後も実験中も自由に水を飲んだ。

【0109】

胃内投与後、０分、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、２４時間、４８時間、７２時間の時点で、ＥＤＴＡ－Ｋ２抗凝固真空採血管内に、左前肢静脈から全血０．５ｍＬ程度を採取し、３０分間以内に４℃、４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して血漿を分離した。すべての血漿を採取した直後、すぐに－２０℃で保存して測定に用意した。すべての血漿を採取した直後、すぐに－２０℃で保存して測定に用意した。

【0110】

５０μＬの被験血漿サンプルと検量線サンプルをピペットで吸引して取り、内部標準物質（ジアゼパム：２０ｍｇ／ｍＬ）含有アセトニトリル溶液５００μＬを加え、得られた混合物を振動させて５分間均一に混合し、その後１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清７５μＬを取り、超純水７５μＬで希釈し、均一に混合し、得られた溶液１μＬをピペットで吸引し取ってＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定に用いた。結果を表１４に示す。

【0111】

【表14】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】