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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-04-07
(45)【発行日】2025-04-15
(54)【発明の名称】ノロウイルスを検出するためのオリゴヌクレオチド
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6837 20180101AFI20250408BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20250408BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20250408BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20250408BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20250408BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6837 Z ZNA
C12Q1/686 Z
C12M1/00 A
C12M1/34 Z
C12N15/09 Z
【請求項の数】
27
(21)【出願番号】P 2020127372
(22)【出願日】2020-07-28
(65)【公開番号】P2021023286
(43)【公開日】2021-02-22
【審査請求日】2023-07-13
(31)【優先権主張番号】P 2019139567
(32)【優先日】2019-07-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000003160
【氏名又は名称】東洋紡株式会社
(72)【発明者】
【氏名】寺内 謙太
【審査官】千葉 直紀
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０８５４６７８１（ＣＮ，Ａ）
【文献】特開２０１６－１５４４６８（ＪＰ，Ａ）
【文献】ロシア国登録特許２５０６３１７（ＲＵ，Ｃ２）
【文献】国際公開第２０１８／１９８６８２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１６－０１９４９５（ＪＰ，Ａ）
【文献】Journal of Virological Methods，2010年，Vol.167，pp. 90-94
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／００－３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の工程を含むことを特徴とする、試料中のＧＩＩ型ノロウイルスの存在を検出する方法：（１）以下の（Ｉ）及び（ＩＩ）の組合せからなる一対の核酸プライマーセットを用意する工程：
（Ｉ）配列番号６～３７若しくは配列番号４２～５４のいずれかで示される塩基配列からなる核酸プライマー：及び
（ＩＩ）配列番号４で示される塩基配列からなる核酸プライマー、
（２）前記試料と、前記工程（１）で用意した一対の核酸プライマーセット及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液（但し、有機極性溶媒を含むものを除く）とを混合した混合液を調製する工程、及び
（３）反応容器を密閉後、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程：
ここで、前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液が、更に以下の（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）の組合せからなるＧＩ型ノロウイルスを検出するための一対の核酸プライマーセット：
（ＩＩＩ）配列番号２で示される塩基配列からなる核酸プライマー；及び
（ＩＶ）配列番号３で示される塩基配列からなる核酸プライマーを含む、方法。
【請求項2】
ノロウイルスＧＩ型およびＧＩＩ型をそれぞれ検出可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液が、更に配列番号３８、配列番号３９、若しくは配列番号４０で示される塩基配列からなる核酸を含むプローブを含有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記プローブがＴａｑＭａｎプローブである、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記試料が、核酸の単離処理も加熱処理も行っていない試料である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項6】
前記工程（２）及び（３）が同一容器で行われることを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項7】
前記工程（３）において反応容器を密閉後、一度も蓋を開閉することなく１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施することを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項8】
前記工程（３）において、サイクル反応の前及び／又はサイクル反応中に、ウイルスを破砕してウイルス内の核酸を露出させるため及び／又は核酸増幅反応においてホットスタート酵素を活性化させるために熱処理を実施することを含む請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項9】
前記試料が血液試料、糞便試料、及び／又は拭き取り検査試料である請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項10】
前記試料が水、生理食塩水または緩衝液に懸濁された懸濁液である請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項11】
前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、ファミリーＡに属する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項12】
前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｈａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ、及びそれらの変異体よりなる群より選択される少なくとも１つであることを特徴とする請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項13】
前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液が、更に１ｍＭ以上の２価陽イオンを含む、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項14】
前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応が、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ法である、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項15】
配列番号６～３７若しくは配列番号４２～５４のいずれかで示される塩基配列からなる核酸プライマーと、配列番号４で示される塩基配列からなる核酸プライマーとを組み合わせてなる、ＧＩＩ型ノロウイルスを検出するための核酸プライマーセットと、配列番号２で示される塩基配列からなる核酸プライマー及び配列番号３で示される塩基配列からなる核酸プライマーを組み合わせてなるＧＩ型ノロウイルスを検出するための核酸プライマーセットと、
を含有する、有機極性溶媒を含まない１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を用いての１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応に用いるための、ＧＩ型ノロウイルス及びＧＩＩ型ノロウイルスをそれぞれ検出可能な核酸プライマーセット組成物。
【請求項16】
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを更に含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項17】
ノロウイルスＧＩ型およびＧＩＩ型をそれぞれ検出可能である、請求項１５または１６に記載の組成物。
【請求項18】
前記組成物が、更に配列番号３８、配列番号３９、若しくは配列番号４０で示される塩基配列からなる核酸を含むプローブを含有する、請求項１５から１７のいずれかに記載の組成物。
【請求項19】
前記プローブがＴａｑＭａｎプローブである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項20】
前記試料が、核酸の単離処理も加熱処理も行っていない試料である、請求項１５から１９のいずれかに記載の組成物。
【請求項21】
前記試料が血液試料、糞便試料、及び／又は拭き取り検査試料である、請求項１５から２０のいずれかに記載の組成物。
【請求項22】
前記試料が水、生理食塩水または緩衝液に懸濁された懸濁液である、請求項１５から２１のいずれかに記載の組成物。
【請求項23】
前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、ファミリーＡに属する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１５から２２のいずれかに記載の組成物。
【請求項24】
前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｈａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ、及びそれらの変異体よりなる群より選択される少なくとも１つであることを特徴とする請求項１５から２３のいずれかに記載の組成物。
【請求項25】
前記組成物が、更に１ｍＭ以上の２価陽イオンを含む、請求項１５から２４のいずれかに記載の組成物。
【請求項26】
前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応が、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ法である、請求項１５から２５のいずれかに記載の組成物。
【請求項27】
請求項１５から２６のいずれかに記載の組成物を含む、試料中のＧＩＩ型ノロウイルスの検査を行うためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、試料中に含まれるＧＩＩ型ノロウイルスを検出するための核酸プライマーとして使用され得るオリゴヌクレオチドに関する。更に、該オリゴヌクレオチドを用いて、試料中に含まれるノロウイルスＧＩＩ型を検出する方法及びそのためのキット等に関する。本発明により、例えば、糞便試料、血液試料、環境拭き取り試料等におけるノロウイルスを高感度にて検出することが可能である。本発明は、生命科学研究、臨床診断や食品衛生検査、環境検査等に利用できる。
【背景技術】
【0002】
ノロウイルスは、食中毒の原因ウイルスであり、日本での食中毒患者の半数はノロウイルスが原因と言われている（非特許文献１）。したがって、ノロウイルスを簡便、迅速、高感度に検出することは、臨床診断、食品衛生検査、環境検査等で重要であることは言うまでもない。
【0003】
ノロウイルスの病原体検査では、組織培養法が確立できておらず、電子顕微鏡法、ＥＬＩＳＡによる免疫学的抗原検出法、または核酸増幅技術を利用したウイルス遺伝子の検出法が開発されてきた。これらの検査法の中で、高感度にノロウイルスを検出可能な核酸増幅技術は、汎く使われている。ノロウイルスのＲＮＡゲノムの塩基配列は多様性に富んでいるため、核酸増幅法で検出するためにいくつかの技術が開発されてきた（例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５）。このうち、日本においては、厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）に基づくリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）法が公定法として普及している。
【0004】
ノロウイルスの感染の原因としては、主にノロウイルスに汚染された食品を飲食することによる。また、ヒトの手を介した感染も多いため、調理施設、医療現場、老人介護施設及び保育園などでは定期的な検便検査が求められている。大量調理施設衛生管理マニュアルには、調理従事者等の定期的な検便検査に、月に１回以上又は必要に応じて、ノロウイルスの流行期である１０月から３月にかけてノロウイルスの検査を含めることが追加されている。
【0005】
また、定期的な検便検査に加えて、汚染経路の解明や施設環境等の汚染状況の把握には、ふき取り検査が有用である。ふき取り検査は、例としては、まな板や包丁、ふきん、食器などの調理器具類、冷蔵庫の取手、浴室のドアノブ、洗面所、厨房、トイレ、浴室などの蛇口、調理者の手や指、浴室、洗面、手すり、居室などの施設などを綿棒等で拭き取り、水や緩衝液に溶出したものを試料とした検査である。検便検査やふき取り検査の試料は、糞便や、検査場所の汚れやほこりを多量に含むため、ＲＴ－ＰＣＲを阻害する夾雑物や、非特異的な増幅を引き起こすノロウイルス由来以外の核酸を多く含んでいる。
【0006】
夾雑物を多く含む検体から、ＲＴ－ＰＣＲ法を用いて特定の遺伝子を増幅し、高感度に検出するために重要となる要素のひとつに核酸プライマーがある。プライマー対の例として、ノロウイルス検出用のプライマーとしては、厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）に記載のプライマー（配列番号１～５）が挙げられており、汎用されている。
【0007】
ところで、一般的に、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を用いて複数の種類の核酸を標的として同時に増幅し、検出を行う場合、１つのＲＴ－ＰＣＲ反応系に複数種類の核酸プライマーセットが含まれることになる。このとき複数種類の標的核酸に対する逆転写反応およびＰＣＲ反応が１液中にて行われるため、反応液中に含まれる複数種類のプライマーセットが、各核酸の増幅反応へ相互に影響しあうことが知られている。各プライマーのＴｍ値が異なる点も反応系に影響を与える。その結果、逆転写反応、ＰＣＲ反応それぞれにおいて、非特異的な増幅、または根本的な増幅不良を引き起こす。このため、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応における核酸プライマーセットの選定は、検出感度を決める重要な要素の一つとして知られている。
【0008】
ノロウイルスの検査においてもまた、ＧＩ型ノロウイルス（以下、ノロウイルスＧ１型、又は単にＧＩ、Ｇ１等ともいう）、ＧＩＩ型ノロウイルス（以下、ノロウイルスＧ２型、又は単にＧＩＩ、Ｇ２等ともいう）等の複数の標的ＲＮＡを同時に検出ことが通常求められる。この際、作業が簡便であることに加え、試料のロスや飛散リスク、他試料へのコンタミネーションリスク等を抑えることができる１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応で検査を実施できれば実用上有益である。そしてノロウイルスは感染力が強く、１０～１００個のウイルスで感染が成立するといわれている（非特許文献２）。このため、より高感度に検出できる方法が求められており、とりわけ１ステップＲＴ－ＰＣＲ法、なかでもＧＩ型、ＧＩＩ型等の複数の標的核酸を対象とするマルチプレックスでの１ステップＲＴ－ＰＣＲ法において、高感度にノロウイルスを検出できる手法の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【文献】特開２０１６－０５２２６５号公報
【文献】特開２０１５－１１９６５６号公報
【文献】特許第４４３７５２５号公報
【文献】特許第４４１４６４８号公報
【文献】特許第５３５４２１６号公報
【非特許文献】
【0010】
【文献】厚生労働省ホームページ、分野別の政策一覧＞健康・医療＞食品＞食中毒＞４．食中毒統計・調査結果、（２）過去の食中毒発生状況、平成３０年（２０１８年）食中毒発生状況（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｈｌｗ．ｇｏ．ｊｐ／ｃｏｎｔｅｎｔ／Ｈ３０ｊｏｋｙｏ．ｘｌｓ）
【文献】厚生労働省ホームページ、ノロウイルスによる食中毒の現状と対策について（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｈｌｗ．ｇｏ．ｊｐ／ｆｉｌｅ／０６－Ｓｅｉｓａｋｕｊｏｕｈｏｕ－１１１３０５００－Ｓｈｏｋｕｈｉｎａｎｚｅｎｂｕ／００００１０５６６２．ｐｄｆ）
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】試験例１の各プライマー条件における増幅曲線の代表例を示す図である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
本発明は、かかる従来技術の課題を背景になされたものである。すなわち、本発明の目的は、より高感度に試料中に含まれるＧＩＩ型ノロウイルス型を検出する手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明者は、上記事情に鑑み、鋭意研究を行った結果、特定のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いることで、より高感度に試料中に含まれるＧＩＩ型ノロウイルスを検出できることを見出し、本発明に到達した。
【0014】
即ち、本発明の概要は以下の通りである。
［項１］ 以下の工程を含むことを特徴とする、試料中のＧＩＩ型ノロウイルスの存在を検出する方法：
（１）以下の（Ｉ）及び（ＩＩ）の組合せからなる一対の核酸プライマーセットを用意する工程：
（Ｉ）配列番号６～３７若しくは配列番号４２～５４のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸プライマー：及び
（ＩＩ）配列番号４で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸プライマー、
（２）前記試料と、前記工程（１）で用意した一対の核酸プライマーセット及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合した混合液を調製する工程、及び
（３）反応容器を密閉後、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。
［項２］ 前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液が、更に以下の（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）の組合せからなるＧＩ型ノロウイルスを検出するための一対の核酸プライマーセットを含む、項１に記載の方法：
（ＩＩＩ）配列番号２で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸プライマー；及び
（ＩＶ）配列番号３で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸プライマー。
［項３］ ノロウイルスＧＩ型およびＧＩＩ型をそれぞれ検出可能である、項２に記載の方法。
［項４］ 前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液が、更に配列番号３８、配列番号３９、若しくは配列番号４０で示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸を含むプローブを含有する、項１から３のいずれかに記載の方法。
［項５］ 前記プローブがＴａｑＭａｎプローブである、項４に記載の方法。
［項６］ 前記試料が、核酸の単離処理も加熱処理も行っていない試料である、項１から５のいずれかに記載の方法。
［項７］ 前記工程（２）及び（３）が同一容器で行われることを特徴とする、項１から６のいずれかに記載の方法。
［項８］ 前記工程（３）において反応容器を密閉後、一度も蓋を開閉することなく１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施することを特徴とする項１から７のいずれかに記載の方法。
［項９］ 前記工程（３）において、サイクル反応の前及び／又はサイクル反応中に、ウイルスを破砕してウイルス内の核酸を露出させるため及び／又は核酸増幅反応においてホットスタート酵素を活性化させるために熱処理を実施することを含む項１から８のいずれかに記載の方法。
［項１０］ 前記試料が血液試料、糞便試料、及び／又は拭き取り検査試料である項１から９のいずれかに記載の方法。
［項１１］ 前記試料が水、生理食塩水または緩衝液に懸濁された懸濁液である項１から１０のいずれかに記載の方法。
［項１２］ 前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、ファミリーＡに属する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである、項１から１１のいずれかに記載の方法。
［項１３］ 前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔｔｈポリメラーゼ、ＨａｗｋＺ０５ポリメラーゼ、及びそれらの変異体よりなる群より選択される少なくとも１つであることを特徴とする項１から１２のいずれかに記載の方法。
［項１４］ 前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液が、更に１ｍＭ以上の２価陽イオンを含む、項１から１３のいずれかに記載の方法。
［項１５］ 前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応が、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ法である、項１から１４のいずれかに記載の方法。
［項１６］ 配列番号６～３７若しくは配列番号４２～５４のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる、ＧＩＩ型ノロウイルスを検出するための核酸プライマー。
［項１７］ 請求項１６に記載の核酸プライマーと、
配列番号４で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸プライマーと、
を組み合わせてなる、ＧＩＩ型ノロウイルスを検出するための核酸プライマーセット。
［項１８］ 請求項１７に記載のＧＩＩ型ノロウイルスを検出するための核酸プライマーセットと、
配列番号２で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸プライマー及び配列番号３で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸プライマーを組み合わせてなるＧＩ型ノロウイルスを検出するための核酸プライマーセットと、
を含有する、ＧＩ型ノロウイルス及びＧＩＩ型ノロウイルスをそれぞれ検出可能な核酸プライマーセット組成物。
［項１９］ 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと、
以下の（Ｉ）及び（ＩＩ）の組合せからなる一対の核酸プライマーセットとを含有する、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応で試料中のＧＩＩ型ノロウイルスの検査を行うための組成物：
（Ｉ）配列番号６～３７若しくは配列番号４２～５４のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸プライマー：及び
（ＩＩ）配列番号４で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸プライマー。
［項２０］ 前記組成物が、更に以下の（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）の組合せからなるＧＩ型ノロウイルスを検出するための一対の核酸プライマーセットを含む、項１９に記載の組成物：
（ＩＩＩ）配列番号２で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸プライマー；及び
（ＩＶ）配列番号３で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸プライマー。
［項２１］ ノロウイルスＧＩ型およびＧＩＩ型をそれぞれ検出可能である、項２０に記載の組成物。
［項２２］ 前記組成物が、更に配列番号３８、配列番号３９、若しくは配列番号４０で示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸を含むプローブを含有する、項１９から２１のいずれかに記載の組成物。
［項２３］ 前記プローブがＴａｑＭａｎプローブである、項２２に記載の組成物。
［項２４］ 前記試料が、核酸の単離処理も加熱処理も行っていない試料である、項１９から２３のいずれかに記載の組成物。
［項２５］ 前記試料が血液試料、糞便試料、及び／又は拭き取り検査試料である、項１９から２４のいずれかに記載の組成物。
［項２６］ 前記試料が水、生理食塩水または緩衝液に懸濁された懸濁液である、項１９から２５のいずれかに記載の組成物。
［項２７］ 前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、ファミリーＡに属する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである、項１９から２６のいずれかに記載の組成物。
［項２８］ 前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔｔｈポリメラーゼ、ＨａｗｋＺ０５ポリメラーゼ、及びそれらの変異体よりなる群より選択される少なくとも１つであることを特徴とする項１９から２７のいずれかに記載の組成物。
［項２９］ 前記組成物が、更に１ｍＭ以上の２価陽イオンを含む、項１９から２８のいずれかに記載の組成物。
［項３０］ 前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応が、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ法である、項１９から２９のいずれかに記載の組成物。
［項３１］ 項１６に記載の核酸プライマー、項１７に記載の核酸プライマーセット、項１８に記載の核酸プライマーセット組成物、及び／又は項１９から３０のいずれかに記載の組成物を含む、試料中のＧＩＩ型ノロウイルスの検査を行うためのキット。
［項１］ 以下の工程を含むことを特徴とする、試料中のＧＩＩ型ノロウイルスの存在を検出する方法：
（１）以下の（Ｉ）及び（ＩＩ）の組合せからなる一対の核酸プライマーセットを用意する工程：
（Ｉ）配列番号６～３７若しくは配列番号４２～５４のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸プライマー：及び
（ＩＩ）配列番号４で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸プライマー、
（２）前記試料と、前記工程（１）で用意した一対の核酸プライマーセット及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合した混合液を調製する工程、及び
（３）反応容器を密閉後、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。
［項２］ 前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液が、更に以下の（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）の組合せからなるＧＩ型ノロウイルスを検出するための一対の核酸プライマーセットを含む、項１に記載の方法：
（ＩＩＩ）配列番号２で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸プライマー；及び
（ＩＶ）配列番号３で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸プライマー。
［項３］ ノロウイルスＧＩ型およびＧＩＩ型をそれぞれ検出可能である、項２に記載の方法。
［項４］ 前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液が、更に配列番号３８、配列番号３９、若しくは配列番号４０で示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸を含むプローブを含有する、項１から３のいずれかに記載の方法。
［項５］ 前記プローブがＴａｑＭａｎプローブである、項４に記載の方法。
［項６］ 前記試料が、核酸の単離処理も加熱処理も行っていない試料である、項１から５のいずれかに記載の方法。
［項７］ 前記工程（２）及び（３）が同一容器で行われることを特徴とする、項１から６のいずれかに記載の方法。
［項８］ 前記工程（３）において反応容器を密閉後、一度も蓋を開閉することなく１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施することを特徴とする項１から７のいずれかに記載の方法。
［項９］ 前記工程（３）において、サイクル反応の前及び／又はサイクル反応中に、ウイルスを破砕してウイルス内の核酸を露出させるため及び／又は核酸増幅反応においてホットスタート酵素を活性化させるために熱処理を実施することを含む項１から８のいずれかに記載の方法。
［項１０］ 前記試料が血液試料、糞便試料、及び／又は拭き取り検査試料である項１から９のいずれかに記載の方法。
［項１１］ 前記試料が水、生理食塩水または緩衝液に懸濁された懸濁液である項１から１０のいずれかに記載の方法。
［項１２］ 前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、ファミリーＡに属する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである、項１から１１のいずれかに記載の方法。
［項１３］ 前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔｔｈポリメラーゼ、ＨａｗｋＺ０５ポリメラーゼ、及びそれらの変異体よりなる群より選択される少なくとも１つであることを特徴とする項１から１２のいずれかに記載の方法。
［項１４］ 前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液が、更に１ｍＭ以上の２価陽イオンを含む、項１から１３のいずれかに記載の方法。
［項１５］ 前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応が、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ法である、項１から１４のいずれかに記載の方法。
［項１６］ 配列番号６～３７若しくは配列番号４２～５４のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる、ＧＩＩ型ノロウイルスを検出するための核酸プライマー。
［項１７］ 請求項１６に記載の核酸プライマーと、
配列番号４で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸プライマーと、
を組み合わせてなる、ＧＩＩ型ノロウイルスを検出するための核酸プライマーセット。
［項１８］ 請求項１７に記載のＧＩＩ型ノロウイルスを検出するための核酸プライマーセットと、
配列番号２で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸プライマー及び配列番号３で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸プライマーを組み合わせてなるＧＩ型ノロウイルスを検出するための核酸プライマーセットと、
を含有する、ＧＩ型ノロウイルス及びＧＩＩ型ノロウイルスをそれぞれ検出可能な核酸プライマーセット組成物。
［項１９］ 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと、
以下の（Ｉ）及び（ＩＩ）の組合せからなる一対の核酸プライマーセットとを含有する、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応で試料中のＧＩＩ型ノロウイルスの検査を行うための組成物：
（Ｉ）配列番号６～３７若しくは配列番号４２～５４のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸プライマー：及び
（ＩＩ）配列番号４で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸プライマー。
［項２０］ 前記組成物が、更に以下の（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）の組合せからなるＧＩ型ノロウイルスを検出するための一対の核酸プライマーセットを含む、項１９に記載の組成物：
（ＩＩＩ）配列番号２で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸プライマー；及び
（ＩＶ）配列番号３で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸プライマー。
［項２１］ ノロウイルスＧＩ型およびＧＩＩ型をそれぞれ検出可能である、項２０に記載の組成物。
［項２２］ 前記組成物が、更に配列番号３８、配列番号３９、若しくは配列番号４０で示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸を含むプローブを含有する、項１９から２１のいずれかに記載の組成物。
［項２３］ 前記プローブがＴａｑＭａｎプローブである、項２２に記載の組成物。
［項２４］ 前記試料が、核酸の単離処理も加熱処理も行っていない試料である、項１９から２３のいずれかに記載の組成物。
［項２５］ 前記試料が血液試料、糞便試料、及び／又は拭き取り検査試料である、項１９から２４のいずれかに記載の組成物。
［項２６］ 前記試料が水、生理食塩水または緩衝液に懸濁された懸濁液である、項１９から２５のいずれかに記載の組成物。
［項２７］ 前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、ファミリーＡに属する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである、項１９から２６のいずれかに記載の組成物。
［項２８］ 前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔｔｈポリメラーゼ、ＨａｗｋＺ０５ポリメラーゼ、及びそれらの変異体よりなる群より選択される少なくとも１つであることを特徴とする項１９から２７のいずれかに記載の組成物。
［項２９］ 前記組成物が、更に１ｍＭ以上の２価陽イオンを含む、項１９から２８のいずれかに記載の組成物。
［項３０］ 前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応が、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ法である、項１９から２９のいずれかに記載の組成物。
［項３１］ 項１６に記載の核酸プライマー、項１７に記載の核酸プライマーセット、項１８に記載の核酸プライマーセット組成物、及び／又は項１９から３０のいずれかに記載の組成物を含む、試料中のＧＩＩ型ノロウイルスの検査を行うためのキット。
【発明の効果】
【0015】
本発明によって、ノロウイルスを含み得る試料から、高感度にＧＩＩ型ノロウイルスを検出することが可能となる。また、本発明のＧＩＩ型ノロウイルス検出用核酸プライマーを、ＧＩ型ノロウイルス検出用プライマーと組み合わせて、マルチプレックスＲＴ－ＰＣＲ反応を行う場合に、意外にも、ＧＩＩ型ノロウイルスの検出感度が向上するだけでなく、ＧＩ型ノロウイルスの検出感度も向上するという優れた効果が奏され得る。更に、本発明によれば、糞便試料、血液試料、環境拭き取り試料等の夾雑物を多く含む試料からの、ノロウイルスの高感度の検出も可能とする。本発明は、生命科学研究、臨床診断や食品衛生検査、環境検査等にも利用できる。
【発明を実施するための形態】
【0016】
以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説するが、本発明はこれらに限定されない。
【0017】
本発明の一つの実施態様は、試料中に含まれるＧＩＩ型ノロウイルスを検出するための核酸プライマーであって、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、若しくは配列番号５４のいずれかで示される塩基配列（本明細書では、これらを総称して「配列番号６～３７若しくは配列番号４２～５４のいずれかで示される塩基配列」ともいう）又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸プライマーである。本発明の核酸プライマーは、縮重プライマーであってもよく、その混合塩基対の表記は当該技術分野の慣用に従って、以下を示すものとする：Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｍ＝ＡまたはＣ、Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｓ＝ＣまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｈ＝ＡまたはＴまたはＣ、Ｂ＝ＧまたはＴまたはＣ、Ｄ＝ＧまたはＡまたはＴ、Ｖ＝ＡまたはＣまたはＧ、Ｎ＝ＡまたはＣまたはＧまたはＴ。
【0018】
本発明の前記ＧＩＩ型ノロウイルスを検出するための核酸プライマーは、ＧＩＩ型ノロウイルスＲＮＡの塩基配列の一部（配列番号４１の４９８８～５０４８番目に対応）に対応する。本発明の核酸プライマーを用いてＰＣＲ反応（ＲＴ－ＰＣＲ反応等を含む）を行う場合、ＰＣＲ反応に用いるプライマー対としては、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種一対のプライマーであり得る。また、別の実施形態として、上記プライマーが２対以上含まれる、いわゆるマルチプレックスＰＣＲとすることもできる。さらに、ターゲットとする核酸が亜型からなる場合、縮重プライマーを含んでもよい。本発明においては、特定の好ましい実施形態として、前記の各配列番号で示される塩基配列からなるＧＩＩ型ノロウイルスを検出するための核酸プライマーをフォワードプライマーとし、従来公知のＧＩＩ型ノロウイルス検出用核酸プライマーをリバースプライマーとする一対の核酸プライマーセットとして用いることができる。
【0019】
従来公知のノロウイルス検出用核酸プライマーの例としては、例えば、厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）に記載のプライマー（ＧＩＩ型ノロウイルス検出のためのフォワードプライマーとして、配列番号１の核酸プライマー（ＣＯＧ２Ｆ）、配列番号５の核酸プライマー（ＡＬＰＦ）；ＧＩＩ型ノロウイルス検出のためのリバースプライマーとして、配列番号４の核酸プライマー（ＣＯＧ２Ｒ）；ＧＩ型ノロウイルス検出のためのフォワードプライマーとして、配列番号２の核酸プライマー（ＣＯＧ１Ｆ）；ＧＩ型ノロウイルス検出のためのリバースプライマーとして、配列番号３の核酸プライマー（配列番号３））が挙げられるが、これらに限るものではない。好ましい実施形態では、配列番号６～３７若しくは配列番号４２～５４のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる本発明の核酸プライマーと、配列番号４（ＣＯＧ２Ｒ）で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸プライマーとで構成される一対の核酸プライマーセットとして用いることで、より高感度にＧＩＩ型ノロウイルスを検出することができる。
【0020】
更なる実施形態では、ＧＩＩ型ノロウイルスを検出するための本発明の前記一対の核酸プライマーセットと共に、配列番号２（ＣＯＧ１Ｆ）で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸プライマーと、配列番号３（ＣＯＧ１Ｒ）で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列とで構成される一対の核酸プライマーセットも組み合わせて、ＧＩ型及び／又はＧＩＩ型ノロウイルスを検出するためのマルチプレックスＲＴ－ＰＣＲ反応を行うこともできる。本発明の前記核酸プライマーを用いることにより、例えば、マルチプレックスでの１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応において、良好な感度でＧＩ型ノロウイルス及び／又はＧＩＩ型ノロウイルスをそれぞれ検出することができる。
【0021】
更なる本発明の実施態様の一つは、試料中に含まれるＧＩＩ型ノロウイルスを検出するための核酸プライマーセットであって、以下の（Ｉ）及び（ＩＩ）の組み合わせからなる核酸プライマーセットを提供する。
（Ｉ）配列番号６～３７若しくは配列番号４２～５４のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸プライマー；及び
（ＩＩ）配列番号４で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸プライマー。
一つの実施形態では、より確実に高い本発明の効果が奏されるという観点から、前記（Ｉ）に示す核酸プライマーをフォワードプライマーとし、前記（ＩＩ）に示す核酸プライマーをリバースプライマーとして用いることが好ましい。本発明の前記核酸プライマーセットは、例えば、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応において好適に使用することができる。
（Ｉ）配列番号６～３７若しくは配列番号４２～５４のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸プライマー；及び
（ＩＩ）配列番号４で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸プライマー。
一つの実施形態では、より確実に高い本発明の効果が奏されるという観点から、前記（Ｉ）に示す核酸プライマーをフォワードプライマーとし、前記（ＩＩ）に示す核酸プライマーをリバースプライマーとして用いることが好ましい。本発明の前記核酸プライマーセットは、例えば、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応において好適に使用することができる。
【0022】
また、本発明の前記核酸プライマー又は前記核酸プライマーセットは、ＧＩ型ノロウイルスを検出するための一対の任意の核酸プライマーセットを組合わせて使用されることが好ましく、なかでも以下の（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）の組合せからなるＧＩ型ノロウイルスを検出するための一対の核酸プライマーセットと組み合わせて使用することが好ましい。
（ＩＩＩ）配列番号２で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸プライマー。
（ＩＶ）配列番号３で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸プライマー。
ＧＩ型ノロウイルスを検出するための一対の核酸プライマーセットとして、前記（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）に示される一対の核酸プライマーセットを用いる場合、限定はされないが、より確実に高い本発明の効果が奏されるという観点から、前記（ＩＩＩ）に示す核酸プライマーをフォワードプライマーとし、前記（ＩＶ）に示す核酸プライマーをリバースプライマーとして用いることが好ましい。
（ＩＩＩ）配列番号２で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸プライマー。
（ＩＶ）配列番号３で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸プライマー。
ＧＩ型ノロウイルスを検出するための一対の核酸プライマーセットとして、前記（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）に示される一対の核酸プライマーセットを用いる場合、限定はされないが、より確実に高い本発明の効果が奏されるという観点から、前記（ＩＩＩ）に示す核酸プライマーをフォワードプライマーとし、前記（ＩＶ）に示す核酸プライマーをリバースプライマーとして用いることが好ましい。
【0023】
本発明で示される核酸プライマーセットは、ＧＩ型ノロウイルスを検出するための一対の核酸プライマーセットを含むことで、ＧＩ型ノロウイルスおよびＧＩＩ型ノロウイルスを１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応にて、高感度に同時に検出することが可能である。具体的に、後述の試験例の結果にも示されるように、ＧＩＩ型ノロウイルスを検出するための本発明の核酸プライマーを使用することで、ＧＩ型ノロウイルスも同時に検出する場合に、ＧＩ型ノロウイルスの検出感度を向上させ得るという全く予想外の優れた効果が発揮される。
【0024】
本発明の核酸プライマーを用いてノロウイルスを検出する場合において、使用する本発明の核酸プライマー濃度としては、本発明の効果を奏する限り、特に限定はされないが、ＲＴ－ＰＣＲ反応液全体に対して、フォワードプライマーの濃度が０．１μＭ以上３μＭ以下であり、かつ前記リバースプライマーの濃度が０．１μＭ以上３μＭ以下であることが好ましい。より好ましくは、フォワードプライマーの濃度が０．１μＭ以上２μＭ以下であり、かつ前記リバースプライマーの濃度が０．５μＭ以上２μＭ以下とすることで、より高感度なＧＩＩ型ノロウイルスの検出が可能となる。本発明の核酸プライマーと組み合わせて用いられるＧＩＩ型ノロウイルスを検出する他方の核酸プライマーの濃度、並びに、ＧＩ型ノロウイルスを検出するための一対の核酸プライマーセットを用いる場合のＧＩ型ノロウイルスを検出するための各核酸プライマーの濃度も、前記核酸プライマー濃度と同程度の使用量とすることが好ましい。
【0025】
ノロウイルスは、食中毒の原因ウイルスのひとつであり、日本での食中毒患者の半数はノロウイルスが原因である（非特許文献１）。ノロウイルスの感染は、感染者の糞便や吐瀉物、あるいは食品を介して起こると言われている。
【0026】
ノロウイルスは、大きく、ＧＩ型ノロウイルス及びＧＩＩ型ノロウイルスの遺伝子型で分類されることが知られている。そして、ＧＩ型ノロウイルスとＧＩＩ型ノロウイルスを判別することが、感染経路の推定などの疫学的データを収集する観点から望まれている。本発明の核酸プライマーを用いたノロウイルスの検査法では、ＧＩ型ノロウイルスを検出するための一対の核酸プライマーセットを組合わせても高感度な検出が可能であり、それによりＧＩＩ型ノロウイルスの存在を確認できるだけでなく、感染しているノロウイルスがＧＩ型であるかＧＩＩ型であるかの判別（鑑別）も可能であるという点で非常に有益である。
【0027】
本発明の核酸プライマーを用いて、試料中のノロウイルスの存在を検査するための方法は、少なくとも以下の工程が含まれることを特徴としたＧＩＩ型ノロウイルスの存在を検査するための方法である。
（１）ＧＩＩ型ノロウイルスを検出可能な特定の塩基配列からなる核酸プライマーの組合せで構成される一対の核酸プライマーセットを用意する工程；
（２）試料と、前記工程（１）で用意した一対の核酸プライマーセット並びに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよび任意で逆転写酵素を含む１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合した混合液を調製する工程；及び
（３）反応容器を密閉後、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。ここで、前記工程（２）における混合液を調製する工程は、例えば、試料に、本発明の核酸プライマーを含む一対の核酸プライマーセット及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等を含有する１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を添加することによって行うことができるが、配合順序は問わない。
（１）ＧＩＩ型ノロウイルスを検出可能な特定の塩基配列からなる核酸プライマーの組合せで構成される一対の核酸プライマーセットを用意する工程；
（２）試料と、前記工程（１）で用意した一対の核酸プライマーセット並びに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよび任意で逆転写酵素を含む１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合した混合液を調製する工程；及び
（３）反応容器を密閉後、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。ここで、前記工程（２）における混合液を調製する工程は、例えば、試料に、本発明の核酸プライマーを含む一対の核酸プライマーセット及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等を含有する１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を添加することによって行うことができるが、配合順序は問わない。
【0028】
更なる実施形態として、本発明の前記検査方法においては、工程（１）の前に、工程（１’）としてノロウイルスを含み得る試料に対して、核酸の単離精製処理又は化学的・熱力学的な処理等の前処理を行うことで、試料中のノロウイルスキャプシド構造からＲＮＡを露出させる工程を更に含んでもよい。前記工程（１’）は前期工程（３）の１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応中において、同時に行っても良い。前記工程（１）から（３）又は前記工程（１’）から（３）は、すべて同一容器で行われることが好ましい。すなわち、工程（１）から（３）又は前記工程（１’）から（３）の間においては、混合液の全部または一部を別容器へ移し替えないことが好ましい。更には、工程（３）においては、反応容器を密閉後、反応容器の蓋の開閉を行わないことが好ましい。また、前記工程（１）で使用する試料は、事前に遠心分離操作等を行わず不溶性物質を含みうる試料や、事前に水または緩衝液等にて懸濁した懸濁液であってよく、糞便試料等の試料を１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に直接添加してもよい。
【0029】
本発明の核酸プライマー又は核酸プライマーセットを利用したノロウイルスの検出方法の更なる実施態様としては、さらに、少なくとも１種類の標識されたハイブリダイゼーションプローブまたは２本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物を用いる検出方法である。これによって、増幅産物の分析を通常の電気泳動ではなく、蛍光シグナルのモニタリングで監視することができ、解析労力が低減される。さらには、反応容器を開放する必要がなく、コンタミネーションのリスク低減が可能である。ウイルスのサブタイプに対応する、それぞれのハイブリダイゼーションプローブを異なる蛍光色素で標識することによって、ウイルスのサブタイプを識別することも可能である。より優れた特異性を示すことができるという観点から、限定はされないが、ハイブリダイゼーションプローブを用いることが好ましい。
【0030】
２本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物としては、例えば、ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｉ，ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｏｌｄ、ＳＹＴＯ－９、ＳＹＴＰ－１３、ＳＹＴＯ－８２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標；Ｂｉｏｔｉｕｍ）、ＬＣＧｒｅｅｎ（Ｉｄａｈｏ），ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ４８０ ＲｅｓｏＬｉｇｈｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）などが挙げられる。
【0031】
本発明において用いられるハイブリダイゼーションプローブとしては、例えば、ＴａｑＭａｎプローブ（Ｔａｑ Ｍａｎ加水分解プローブ等ともいう；米国特許第５，２１０，０１５号公報、米国特許第５，５３８，８４８号公報、米国特許第５，４８７，９７２号公報、米国特許第５，８０４，３７５号公報）、モレキュラービーコン（米国特許第５，１１８，８０１号公報）、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ（国際公開第９７／４６７０７号パンフレット，国際公開第９７／４６７１２号パンフレット，国際公開第９７／４６７１４号パンフレット）などが挙げられ、なかでもＴａｑ Ｍａｎプローブを用いることが好ましい。ノロウイルス検出用のプローブの塩基配列としては、厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）に記載の配列（配列番号３８～４０）が挙げられ、本発明においても好適に使用することができるが、これに限るものではない。前記記載のプローブ配列では、配列番号３８または３９によりノロウイルスＧ１型、配列番号４０によりノロウイルスＧ２型を検出する。さらに、ターゲットとする核酸が亜型からなる場合、縮重配列を含んでもよい。蛍光標識プローブの濃度としては、０．０１μＭ以上１．０μＭ以下であることが好ましい。より好ましくは、０．０１３μＭ以上０．７５μＭ以下であり、更に好ましくは、０．０２μＭ以上０．５μＭ以下である。
【0032】
本発明を利用したにおいて用いられる試料として、例えば糞便（排泄便、直腸便）、嘔吐物、唾液などが挙げられるが、限定されるものではなく、生体に由来するもの全般に用いることが可能であり、特に糞便（排泄便、直腸便）からの検出に有用である。前記試料は直接検出に供してもよいし、夾雑物の反応への影響を低減し、より安定した検査結果を得るために、水、生理食塩水または緩衝液に前記試料を懸濁した試料であってもよい。前記緩衝液としては、特に限定されるものではないが、ハンクス緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、トリシン緩衝液などが挙げられる。
【0033】
本発明における別の態様の試料としては、拭き取り検査試料に代表される環境に由来する試料である。汚染経路の解明や施設環境等の汚染状況の把握には、ふき取り検査が有用である。本発明において、拭き取り検査とは、特に限定されるものでないが、例えば綿棒等で該当区画や設備等を拭き取り、水や緩衝液に溶出し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈澱などで濃縮した試料である。具体的な拭き取り検査の要領としては、「ふきとり検体のノロウイルス検査法の改良」（ｈｔｔｐ：／／ｉｄｓｃ．ｎｉｈ．ｇｏ．ｊｐ／ｉａｓｒ／３２／３８２／ｄｊ３８２４．ｈｔｍｌ）などが例示されるが、特に限定はされるものではなく、これに準ずる方法が広く含まれる。拭き取り箇所の例としては、まな板や包丁、ふきん、食器などの調理器具類、冷蔵庫の取手やトイレ、浴室のドアノブ、洗面所、厨房、トイレ、浴室などの蛇口、調理者の手や指、浴室、トイレ、洗面、手すり、居室などの施設などが挙げられる。また、拭き取り検査ではないが、環境検査として、下水試料の濃縮試料にも適用できる。これらの検査試料は、検査場所の汚れやほこりなどの夾雑物を多量含むことから、高感度化を達成しうる本発明の検査手法は、これらの検査に対して有益である。
【0034】
特定の好ましい実施形態では、本発明において用いられる試料（例えば、生体に由来する試料（生体からの分泌物や排泄物等を含む）、環境に由来する試料等）は、例えば事前に市販のＲＮＡ精製キット等を用いる試料からの核酸の単離操作及び／又は事前に加熱処理してＲＮＡをウイルス構造から露出させる操作を実施していない試料であってもよい。本発明の方法では、このような事前の核酸単離も加熱処理も省いた試料であっても、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応のサイクル反応の前及び／又はサイクル反応中に熱処理を内包させて、ウイルス構造からＲＮＡを露出させ、ＲＴ－ＰＣＲ反応に供することができる。このようにして事前の核酸の単離処理も加熱処理も行っていない試料を用いることで、より一層簡便に短時間でウイルスＲＮＡの検査が行えるだけでなく、試料のロスやキャリーオーバーによる他のサンプルへの汚染の危険性を低減することができる。特に糞便を試料とする多数の検体を処理するような検査において、その効果は顕著となる。
【0035】
更に特定の実施形態では、本発明に用いられる試料は、必要に応じて水、生理食塩水または緩衝液等の液体に試料を懸濁した後に、事前の遠心分離操作を行わず、不溶性物質を含むそのままの状態の試料であってもよい。前記のような、事前の遠心分離操作を行わず不溶性物質を含む試料をＲＴ－ＰＣＲ反応に用いると、濁度の高い反応液となり、その反応液中に含まれる不溶性物質が光の散乱や吸収、自家蛍光による影響等を与え、リアルタイムＰＣＲ機での測定時に検出できる蛍光強度が大幅に低下し、感度が低下することが懸念される。しかしながら、本発明の核酸プローブ又は核酸プローブセットを用いることで、高感度な検出が可能になるので、本発明はこのような不溶性物質を含む試料を用いる場合でも十分な検出感度が得られる。例えば、試料を混合後のＲＴ－ＰＣＲ反応液の濁度がＯＤ６６０において０．０１～５．０Ａｂｓ／μＬとなる場合、例えば、ＯＤ６６０において１．０～３．０Ａｂｓ／μＬ程度の濁度を示す場合にも、本発明によればＧＩＩ型ノロウイルスを良好な感度で検出可能であることが期待できる。
【0036】
前記工程（３）におけるＲＴ－ＰＣＲサイクルは、１．熱処理、２．逆転写反応、３．ＰＣＲの３ステップから成る。各ステップの前後に、ホットスタート酵素を活性化させるための熱処理工程を含んでもよい。１の熱処理工程では、ウイルスを破砕してウイルス内の核酸を露出させる、及び／もしくは核酸増幅反応においてホットスタート酵素を活性化させる工程を含む。これらの熱処理工程を含むことにより、ウイルスのキャプシド構造からＲＮＡを露出（溶出）させることが可能となる。前記熱処理工程の温度及び時間は、６０℃以上であり、かつ１秒以上であればよく、好ましくは７０℃、３０秒以上、より好ましくは８０℃、３０秒以上、特に好ましくは８５℃、３０秒以上である。２の逆転写反応の温度は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの逆転写活性と、プライマー及びプローブのＴｍ値によって決定され、少なくとも２５℃以上であればよい。より好ましくは３７℃以上である。３のＰＣＲでは、［１］熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、［２］鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、［３］ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、の３ステップを含んでいればよく、［２］と［３］を同一の温度で実施して、２ステップとしてもよい。迅速なＲＴ－ＰＣＲを実施するためには、前記ＲＴ－ＰＣＲ反応に使用するサーマルサイクラーは、前記［２］と［３］のステップの伸長時間を合わせて１５秒以下、より好ましくは１０秒以下の測定プログラムを設定することが望ましい。なお、本明細書において「ＰＣＲの伸長時間」とは、サーマルサイクラーでの設定温度を指す。
【0037】
前記工程（２）にて添加される１ステップＲＴ－ＰＣＲ溶液は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする。前記工程（２）で用いる１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液は、逆転写活性を有していない耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用してもよい。逆転写活性を有していない耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用する場合は、逆転写酵素と組み合わせて用いることにより、二酵素系の１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を行うことができる。更に、前記工程（２）で用いる１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは逆転写活性を有していてもよく、このような逆転写活性を有した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いる場合には１酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応が実施できる。逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼとは、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する能力とＤＮＡを増幅する能力を兼ね備えたＤＮＡポリメラーゼである。また、耐熱性とは、７０℃で１分以上の熱処理を実施しても、酵素活性が半分以上低下しないことをいう。由来は特に限定されるものではないが、Ｔａｑ、Ｔｔｈ，Ｂｓｔ，Ｂｃａ，ＫＯＤ，Ｐｆｕ，Ｐｗｏ、Ｔｂｒ，Ｔｆｉ，Ｔｆｌ，Ｔｍａ，Ｔｎｅ、Ｖｅｎｔ，ＤＥＥＰＶＥＮＴやこれらの変異体が挙げられる。これまでに逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼとして、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ）やＴｈｅｒｍｕｓ ｓｐ Ｚ０５由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｚ０５）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｍａ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｃａ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ）などが挙げられ、これらの逆転写活性と耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性が失われていない変異体であってもよい。また、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ）の変異体であって、逆転写活性を有するものが知られており（例えば、ＲＴＸ：ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｘｅｎｏｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、前記工程（２）にて添加されるＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、このような耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであれば、限定されるものではない。特に好ましくは、ファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼが挙げられ、好ましくは、Ｔａｑ、Ｔｔｈ、Ｚ０５及びこれらの変異体からなる群より選択・BR>ウれる逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。なかでも好ましくは、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｈａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ、及びそれらの変異体よりなる群より選択される少なくとも１つである。１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれる前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの総量は、一例として、少なくとも４．２ｎｇ／μＬ以上あればよく、５．０ｎｇ／μＬ以上であることが好ましく、５．８ｎｇ／μＬ以上であることがより好ましい。なかでも好ましくは、８．３ｎｇ／μＬ以上である。１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれる前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの総量の上限は特に限定されないが、一例として、２０ｎｇ／μＬ以下とすることができ、１６．７ｎｇ／μＬ以下であっても十分に本発明の効果を得ることができる。ポリメラーゼの量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法もしくはＮａｎｏｄｒｏｐ（サーモフィッシャー社）により定量した値であり、安全データシート（ＳＤＳ）から概算してもよい。ＢＳＡなどのタンパク質を含む場合は、後者の方法で算出することが望ましい。
【0038】
本明細書において、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの変異体とは、その由来である野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列に対して、例えば８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、なかでも好ましくは９９％以上の配列同一性を有し、且つ、野生型ＤＮＡポリメラーゼと同様にＤＮＡを増幅する活性、及び必要に応じてＲＮＡをｃＤＮＡに変換する活性を有するものをいう。ここで、アミノ酸配列の同一性を算出する方法としては、当該分野で公知の任意の手段で行うことができる。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、一例として、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出することが可能である。また、本発明に用いられ得る変異体は、その由来である野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加（以下、これらを纏めて「変異」ともいう）したアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、且つ、野生型ＤＮＡポリメラーゼと同様にＲＮＡをｃＤＮＡに変換する活性及びＤＮＡを増幅する活性を有するものであってもよい。ここで１又は数個とは、例えば、１～８０個、好ましくは１～４０個、よりこのましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、更により好ましくは１～３個であり得るが、特に限定されない。
【0039】
前記工程（２）にて添加される１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液は、非特異的反応抑制の効果を高めるため、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体との併用、あるいは化学修飾により熱不安定ブロック基のＤＮＡポリメラーゼへ導入することで、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する前に、ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を抑制され、ホットスタートＰＣＲへの適用ができることが好ましい。
【0040】
前記工程（２）にて添加される１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液には、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの他、緩衝剤、適当な塩、マグネシウム塩又はマンガン塩、デオキシヌクレオチド三リン酸、検出対象のウイルスＲＮＡの検出対象領域に対応するプライマー対、さらに必要に応じて添加剤を含んでいてもよい。
【0041】
前記工程（２）にて添加される１ステップＲＴ－ＰＣＲ溶液は、逆転写酵素を含んでいても良い。なかでも、前記工程（１）における１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液が、逆転写活性を有していない耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いる場合には、逆転写酵素を更に含むことが好ましい。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとは異なる逆転写酵素を含む場合、２酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応が実施できる。前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれる逆転写酵素としては、ＲＮＡをＤＮＡに変換できれば特に限定されないが、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）－ＲＴ、ＡＭＶ－ＲＴ（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ）、ＨＩＶ－ＲＴ、ＲＡＶ２－ＲＴ、ＥＩＡＶ－ＲＴ、カルボキシドサーマス・ハイドロゲノフォルマン（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｍ）ＤＮＡポリメラーゼ）やその変異体が例示される。より好ましい例としては、ＭＭＬＶ－ＲＴ、ＡＭＶ－ＲＴ、またはそれらの変異体である。逆転写酵素の変異体としては、前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ変異体と同様に、アミノ酸配列の同一性等の観点から、野生型の逆転写酵素のアミノ酸配列と相同性の高い変異体（例えば、９０％以上のアミノ酸配列同一性を示す変異体、又は野生型のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の改変を有する変異体等）を挙げることができるが、これらに限定されない。
【0042】
前記工程（２）にて添加される１ステップＲＴ－ＰＣＲ溶液に含まれる緩衝剤としては、特に限定されないが、トリス（Ｔｒｉｓ），トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ），ビスートリシン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅ），ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）などが挙げられる。硫酸、塩酸、酢酸、リン酸などでｐＨを６～９、より好ましくはｐＨ７～９に調整されたものである。また、添加する緩衝剤の濃度としては、１０～２００ｍＭ，より好ましくは２０～１５０ｍＭで使用される。この際、反応に適当なイオン条件とするために、塩溶液が加えられる。塩溶液としては、塩化カリウム、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウムなどが挙げられる。
【0043】
前記工程（２）にて添加される１ステップＲＴ－ＰＣＲ溶液に含まれるｄＮＴＰとしては、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰがそれぞれ０．１～０．５ｍＭ、最も一般的には０．２ｍＭ程度加えられる。ｄＴＴＰの代わり及び／又は一部としてｄＵＴＰを使用することによって、クロスコンタミネーションに対する予防処置をとってもよい。クロスコンタミネーションに対する予防処置を講じる場合、Ｕｒａｃｉｌ－Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ＵＮＧ）を含むことが好ましい。
【0044】
更に、前記工程（２）にて添加される１ステップＲＴ－ＰＣＲ溶液には、２価陽イオンを含むことが好ましい。このように２価陽イオンを含むことで、より安定して高い夾雑耐性が得られ高感度な検出が可能となる。２価陽イオンとしては、特に限定されないが、マグネシウムイオン、マンガンイオン、カルシウムイオン、銅イオン、鉄イオン、ニッケルイオン、亜鉛イオン等を挙げることができる。好ましくは、２価陽イオンとして、マグネシウムイオン、マンガンイオンを含むことが好ましい。本発明において、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液にマグネシウムイオンやマンガンイオン等を添加する場合は、マグネシウムやマンガンを添加してもよいし、これらの塩を添加してもよい。マグネシウム又はその塩としては、マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム等が例示され、マンガン又はその塩としては、マンガン、塩化マンガン、硫酸マンガン、酢酸マンガンなどが例示される。このようなマグネシウム、マンガン、又はこれらの塩は、ＲＴ－ＰＣＲ反応液中に１～１０ｍＭ程度加えられることが好ましい。本発明のＲＮＡウイルス検査方法において安定的に高い感度が得られ易いという観点からは、マンガン又はその塩を含むことが好ましい。特定の実施態様では、ＲＴ－ＰＣＲ反応液において１ｍＭ以上のマンガン又はその塩を含むことが好ましく、１．５ｍＭ以上のマンガン又はその塩を含むことが好ましく、２．０ｍＭ以上のマンガン又はその塩を含むことがより好ましい。
【0045】
さらに１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれる添加剤として、アミノ酸におけるアミノ基に３個のメチル基を付加した構造を有する第４級アンモニウム塩（以下、「ベタイン様４級アンモニウム」という）、ウシ血清アルブミン、セリシン、ＢＦＰ、グリセロール、グリコール、ゼラチン及び界面活性剤よりなる群から選択された少なくとも１つを含んでいてもよい。
【0046】
前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれるウシ血清アルブミンの濃度は特に限定されないが、ＲＴ－ＰＣＲ反応液全体に対して、好ましくは少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ以上、より好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｍｌ以上である。夾雑物の多い試料では、ウシ血清アルブミンの濃度が好ましくは２ｍｇ／ｍｌ以上、さらに好ましくは３ｍｇ／ｍｌ以上で、良好な検出が可能となる。上限は特に限定されないが、一例として、１０ｍｇ／ｍｌ以下とすることができる。
【0047】
前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれる界面活性剤としては、トリトンＸ－１００（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）、トリトンＸ－１１４（ＴｒｉｔｏｎＸ－１１４）、ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０），ノニデットＰ４０、Ｂｒｉｊｉ３５、Ｂｒｉｊｉ５８、ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、Ｅｍｕｌｇｅｎ４２０などが挙げられるが、特に限定されない。ＲＴ－ＰＣＲ反応液中の前記界面活性剤の濃度も特に限定はされないが、好ましくは０．０００１％以上、より好ましくは０．００２％以上、さらに好ましくは０．００５％以上で、良好な検出が可能となる。上限は特に限定されないが、一例として、０．１％以下とすることができる。
【0048】
前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれるベタイン様４級アンモニウムとしては、ベタイン（トリメチルグリシン）、カルニチンなどが挙げられるが、特に限定されるものではない。ベタイン構造は分子内に安定な正、負の両電荷を持つ化合物で、界面活性剤のような性質を示し、ウイルス構造の不安定化を引き起こすと考えられる。さらに、ＤＮＡポリメラーゼの核酸増幅を促進することが知られる。好ましい前記ベタイン様４級アンモニウム濃度は、０．１Ｍ～２Ｍ、より好ましくは０．２Ｍ～１．２Ｍである。
【0049】
さらには、当該技術分野でＲＴ－ＰＣＲを促進することが知られる物質と組み合わせて使用することもできる。有用な促進物質とは、例えば、グリセロール、ポリオール、プロテアーゼインヒビター、シングルストランド結合タンパク質（ＳＳＢ）、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ｔＲＮＡ、硫黄または酢酸含有化合物類、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチレングリコール、ホルムアミド、アセトアミド、エクトイン、トレハロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ），塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ）、酢酸テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＡ）、ポリエチレングリコールなどが挙げられるが、これらに限定されない。さらに反応阻害を低減するように、エチレングリコール-ビス(２－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＥＧＴＡ）、１，２－ビス（ｏ－アミノフェノキシ）エタン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＢＡＰＴＡ）のようなキレート剤を含んでいてもよい。
【0050】
本発明の別の一態様は、本発明の核酸プライマー又は核酸プライマーセットを含むＧＩＩ型ノロウイルスＲＮＡの検査用キットまたは組成物である。前記キットは更に、ＧＩ型ノロウイルスＲＮＡを検出可能な核酸プライマー又は核酸プライマーセットも含むことができ、これにより、ＧＩＩ型ノロウイルス及びＧＩ型ノロウイルスをそれぞれ検出可能な検査用キット又は組成物とすることもできる。特定の好ましい実施形態では、これらの本発明の検査用キット又は組成物は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを更に含有することができる。ここで耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが逆転写活性を有していないものである場合には、逆転写酵素を更に含有することが好ましい。更なる好ましい実施形態としては、本発明のノロウイルス検査用キット又は組成物は、１ステップＲＴ－ＰＣＲを実施できる反応液（１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液）を含むことを特徴とする、検査用キットまたは組成物である。
【0051】
この実施態様において使用される、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼまたは任意で逆転写酵素の種類や量、プライマー又はプローブの種類や量、検査対象となるＲＮＡウイルス等は、前記のＲＮＡ検査方法において詳述したものと同様であり得る。本発明の検査用キットは、例えば、本発明の使用方法を説明する使用説明書等を含むことができる。例えば、本発明の検査用キットは、ＧＩＩ型ノロウイルスを検出するための本発明の核酸プライマー又は核酸プライマーセットと、必要に応じて含まれ得る、ＧＩ型ノロウイルスを検出するための核酸プライマー又は核酸プライマーセットと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと、逆転写酵素とを同じ容器に封入したもの又は別々の容器に封入したものを、例えば一つの包装体に梱包し、当該キットの使用方法に関する情報を含む態様で提供することができる。
【実施例】
【0052】
以下、実施例をもって、本発明を具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【0053】
試験例１．各プライマーを用いた検討１
（１）ノロウイルス液の調製
ノロウイルスのサンプルとして、ノロウイルス検体であるＮｏｒｏｖｉｒｕｓ ＧＩおよびＧＩＩ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ、ｉｎｔａｃｔ）を利用した。Ｇ１型およびＧ２型ノロウイルスの各検体を、１反応当たり２５０、５０、２５、１０コピー相当添加した。１０コピーの条件はＮ＝３の測定を実施した。
（２）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、１酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおいて、反応液中のノロウイルスを検出した。プライマーに関しては、（３）に記載した濃度にて各プライマーを添加した。
反応液
２ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭＲｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（東洋紡）添付品）
１０ｘ プローブ液（ＴａｑＭａｎプローブ）
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）２０ｘ Ｍｎ（ＯＡｃ）２（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（東洋紡）添付品）
前記各試薬および、（３）にて記載するプライマー液を混合し、最終液量が４９μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。ＲＴ－ＰＣＲ反応液に、ノロウイルス液を１μＬずつ添加し、５０μＬ反応系としてＲＴ－ＰＣＲを実施した。
（３）プライマー
以下のプライマーをＰＣＲ時の最終濃度が下記の濃度となるように反応液中に添加した。また、表１で記載したプライマーを同様に添加した。
０．５μＭ ＣＯＧ１Ｆ（配列番号２）
０．５μＭ ＣＯＧ１Ｒ（配列番号３）
０．５μＭ ＣＯＧ２Ｒ（配列番号４）
０．１μＭ ＡＬＰＦ（配列番号５）
０．５μＭ ［表１で記載のプライマー]
（１）ノロウイルス液の調製
ノロウイルスのサンプルとして、ノロウイルス検体であるＮｏｒｏｖｉｒｕｓ ＧＩおよびＧＩＩ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ、ｉｎｔａｃｔ）を利用した。Ｇ１型およびＧ２型ノロウイルスの各検体を、１反応当たり２５０、５０、２５、１０コピー相当添加した。１０コピーの条件はＮ＝３の測定を実施した。
（２）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、１酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおいて、反応液中のノロウイルスを検出した。プライマーに関しては、（３）に記載した濃度にて各プライマーを添加した。
反応液
２ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭＲｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（東洋紡）添付品）
１０ｘ プローブ液（ＴａｑＭａｎプローブ）
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）２０ｘ Ｍｎ（ＯＡｃ）２（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（東洋紡）添付品）
前記各試薬および、（３）にて記載するプライマー液を混合し、最終液量が４９μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。ＲＴ－ＰＣＲ反応液に、ノロウイルス液を１μＬずつ添加し、５０μＬ反応系としてＲＴ－ＰＣＲを実施した。
（３）プライマー
以下のプライマーをＰＣＲ時の最終濃度が下記の濃度となるように反応液中に添加した。また、表１で記載したプライマーを同様に添加した。
０．５μＭ ＣＯＧ１Ｆ（配列番号２）
０．５μＭ ＣＯＧ１Ｒ（配列番号３）
０．５μＭ ＣＯＧ２Ｒ（配列番号４）
０．１μＭ ＡＬＰＦ（配列番号５）
０．５μＭ ［表１で記載のプライマー]
【表1】
【0054】
（４）ＲＴ－ＰＣＲ反応条件
これをＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。６０℃、４０サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
９０℃ １分（熱処理条件）
５８℃ ５分（逆転写条件）
９５℃ １秒－６０℃ １０秒 １０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－６０℃ １０秒 ４０サイクル（ＰＣＲ－蛍光読み取り）
（５）結果
結果の評価は、基準となる条件１（従来のＧＩＩ型ノロウイルス検出用フォワードプライマー；ＣＯＧ２Ｆ）との比較にて行った。測定にて得られたＣｔ値は表２および表３にて記載した。条件１では１０コピー／反応の検出が不可能であったが、条件６および条件１７以外において１０コピー／反応の検出を確認した。また、図１には増幅曲線の代表例を記載した。条件６のように、１０コピー／反応の検出数としては変化がないものであっても、非特異増幅量が低減されたことにより、反応性が向上し増幅曲線の立ち上がりが改善していた。また、本発明の核酸プライマーを用いることで、予想外に、ＧＩＩ型のみならず、ＧＩ型の検出感度も良好になる傾向が示された。
これをＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。６０℃、４０サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
９０℃ １分（熱処理条件）
５８℃ ５分（逆転写条件）
９５℃ １秒－６０℃ １０秒 １０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－６０℃ １０秒 ４０サイクル（ＰＣＲ－蛍光読み取り）
（５）結果
結果の評価は、基準となる条件１（従来のＧＩＩ型ノロウイルス検出用フォワードプライマー；ＣＯＧ２Ｆ）との比較にて行った。測定にて得られたＣｔ値は表２および表３にて記載した。条件１では１０コピー／反応の検出が不可能であったが、条件６および条件１７以外において１０コピー／反応の検出を確認した。また、図１には増幅曲線の代表例を記載した。条件６のように、１０コピー／反応の検出数としては変化がないものであっても、非特異増幅量が低減されたことにより、反応性が向上し増幅曲線の立ち上がりが改善していた。また、本発明の核酸プライマーを用いることで、予想外に、ＧＩＩ型のみならず、ＧＩ型の検出感度も良好になる傾向が示された。
【表2】
【表3】
【0055】
試験例２．実検体における感度比較検討１
（１）検体
ノロウイルス陰性および陽性を含む９０検体の糞便を１０％糞便懸濁液とした。糞便懸濁液は遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、５分間）を実施し、上清を得た。
（２）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、１酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおいて、反応液中のノロウイルスを検出した。
反応液
２ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭＲｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（東洋紡）添付品）
１０ｘ プローブ液（ＴａｑＭａｎプローブ）
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
２０ｘ Ｍｎ（ＯＡｃ）２（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（東洋紡）添付品）
前記各試薬および、（３）にて記載するプライマー液を混合し、最終液量が４９μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。ＲＴ－ＰＣＲ反応液に（１）にて調製した糞便懸濁液の上清を１μＬずつ添加し、５０μＬ反応系としてＲＴ－ＰＣＲに供した。
（３）プライマー
以下のプライマーをＰＣＲ時の最終濃度が下記の濃度となるように反応液中に添加した。また、表４で記載したプライマーを同様に添加した。
０．５μＭ ＣＯＧ１Ｆ（配列番号２）
０．５μＭ ＣＯＧ１Ｒ（配列番号３）
０．５μＭ ＣＯＧ２Ｒ（配列番号４）
０．１μＭ ＡＬＰＦ（配列番号５）
０．５μＭ ［表４で記載のプライマー]
（１）検体
ノロウイルス陰性および陽性を含む９０検体の糞便を１０％糞便懸濁液とした。糞便懸濁液は遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、５分間）を実施し、上清を得た。
（２）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、１酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおいて、反応液中のノロウイルスを検出した。
反応液
２ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭＲｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（東洋紡）添付品）
１０ｘ プローブ液（ＴａｑＭａｎプローブ）
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
２０ｘ Ｍｎ（ＯＡｃ）２（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（東洋紡）添付品）
前記各試薬および、（３）にて記載するプライマー液を混合し、最終液量が４９μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。ＲＴ－ＰＣＲ反応液に（１）にて調製した糞便懸濁液の上清を１μＬずつ添加し、５０μＬ反応系としてＲＴ－ＰＣＲに供した。
（３）プライマー
以下のプライマーをＰＣＲ時の最終濃度が下記の濃度となるように反応液中に添加した。また、表４で記載したプライマーを同様に添加した。
０．５μＭ ＣＯＧ１Ｆ（配列番号２）
０．５μＭ ＣＯＧ１Ｒ（配列番号３）
０．５μＭ ＣＯＧ２Ｒ（配列番号４）
０．１μＭ ＡＬＰＦ（配列番号５）
０．５μＭ ［表４で記載のプライマー]
【表4】
【0056】
（４）ＲＴ－ＰＣＲ反応条件
これをＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。６０℃、４０サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
９０℃ １分（熱処理条件）
５８℃ ５分（逆転写条件）
９５℃ １秒－６０℃ １０秒 １０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－６０℃ １０秒 ４０サイクル（ＰＣＲ－蛍光読み取り）
（５）結果
各プライマーの条件における陰性検体数および陽性検体数の比較をおこなった。結果は条件１（従来のＧＩＩ型ノロウイルス検出用フォワードプライマー；ＣＯＧ２Ｆ）との比較にておこなった。表５で示す通り、条件３、４、５ではＧ１およびＧ２両者において陽性検体数は増加し、感度の向上を確認した。条件２においては、Ｇ１検体の陽性数が条件１と比較し減少していたものの、Ｇ２陽性数に関しては条件１と比較し上昇していた。
これをＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。６０℃、４０サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
９０℃ １分（熱処理条件）
５８℃ ５分（逆転写条件）
９５℃ １秒－６０℃ １０秒 １０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－６０℃ １０秒 ４０サイクル（ＰＣＲ－蛍光読み取り）
（５）結果
各プライマーの条件における陰性検体数および陽性検体数の比較をおこなった。結果は条件１（従来のＧＩＩ型ノロウイルス検出用フォワードプライマー；ＣＯＧ２Ｆ）との比較にておこなった。表５で示す通り、条件３、４、５ではＧ１およびＧ２両者において陽性検体数は増加し、感度の向上を確認した。条件２においては、Ｇ１検体の陽性数が条件１と比較し減少していたものの、Ｇ２陽性数に関しては条件１と比較し上昇していた。
【表5】
【0057】
試験例３．実検体における感度比較検討２
（１）検体
ノロウイルス陰性および陽性を含む８５検体の糞便を１０％糞便懸濁液とした。糞便懸濁液は遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、５分間）を実施し、上清を得た。
（２）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、２酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおいて、反応液中のノロウイルスを検出した。
２ｘ反応液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出 Ｑｕｉｃｋ ｓｔｅｐ－（東洋紡）添付品）
１０ｘ プローブ液（ＴａｑＭａｎプローブ）
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出 Ｑｕｉｃｋ ｓｔｅｐ－（東洋紡）添付品）
１０ｘ 酵素液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出 Ｑｕｉｃｋ ｓｔｅｐ－（東洋紡）添付品）
前記各試薬および、（３）にて記載するプライマー液を混合し、最終液量が４５μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出 Ｑｕｉｃｋ ｓｔｅｐ－（東洋紡）添付品の前処理液３μＬに、糞便懸濁液の上清を１μＬずつ添加し、前処理液と糞便懸濁液上清の混合物の上から、ＲＴ－ＰＣＲ反応液４５μＬを添加し、４９μＬ反応系としてＲＴ－ＰＣＲに供した。
（３）プライマー
以下のプライマーをＰＣＲ時の最終濃度が下記の濃度となるように反応液中に添加した。また、表６で記載したプライマーを同様に添加した。
０．５μＭ ＣＯＧ１Ｆ（配列番号２）
０．５μＭ ＣＯＧ１Ｒ（配列番号３）
０．５μＭ ＣＯＧ２Ｒ（配列番号４）
０．１μＭ ＡＬＰＦ（配列番号５）
０．５μＭ ［表６で記載のプライマー]
（１）検体
ノロウイルス陰性および陽性を含む８５検体の糞便を１０％糞便懸濁液とした。糞便懸濁液は遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、５分間）を実施し、上清を得た。
（２）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、２酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおいて、反応液中のノロウイルスを検出した。
２ｘ反応液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出 Ｑｕｉｃｋ ｓｔｅｐ－（東洋紡）添付品）
１０ｘ プローブ液（ＴａｑＭａｎプローブ）
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出 Ｑｕｉｃｋ ｓｔｅｐ－（東洋紡）添付品）
１０ｘ 酵素液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出 Ｑｕｉｃｋ ｓｔｅｐ－（東洋紡）添付品）
前記各試薬および、（３）にて記載するプライマー液を混合し、最終液量が４５μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出 Ｑｕｉｃｋ ｓｔｅｐ－（東洋紡）添付品の前処理液３μＬに、糞便懸濁液の上清を１μＬずつ添加し、前処理液と糞便懸濁液上清の混合物の上から、ＲＴ－ＰＣＲ反応液４５μＬを添加し、４９μＬ反応系としてＲＴ－ＰＣＲに供した。
（３）プライマー
以下のプライマーをＰＣＲ時の最終濃度が下記の濃度となるように反応液中に添加した。また、表６で記載したプライマーを同様に添加した。
０．５μＭ ＣＯＧ１Ｆ（配列番号２）
０．５μＭ ＣＯＧ１Ｒ（配列番号３）
０．５μＭ ＣＯＧ２Ｒ（配列番号４）
０．１μＭ ＡＬＰＦ（配列番号５）
０．５μＭ ［表６で記載のプライマー]
【表6】
【0058】
（４）ＲＴ－ＰＣＲ反応条件
これをＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。５２℃、４０サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
４２℃ ４分（逆転写条件）
９５℃ １分
９５℃ １秒－５２℃ １０秒 １０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５２℃ １０秒 ４０サイクル（ＰＣＲ－蛍光読み取り）
（５）結果
各プライマーの条件における陰性検体数および陽性検体数の比較をおこなった。結果は条件１（従来のＧＩＩ型ノロウイルス検出用フォワードプライマー；ＣＯＧ２Ｆ）との比較にておこなった。表７で示す通り、条件２、３ともにＧ１およびＧ２両者において陽性検体数は増加し、感度の向上を確認した。
これをＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。５２℃、４０サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
４２℃ ４分（逆転写条件）
９５℃ １分
９５℃ １秒－５２℃ １０秒 １０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５２℃ １０秒 ４０サイクル（ＰＣＲ－蛍光読み取り）
（５）結果
各プライマーの条件における陰性検体数および陽性検体数の比較をおこなった。結果は条件１（従来のＧＩＩ型ノロウイルス検出用フォワードプライマー；ＣＯＧ２Ｆ）との比較にておこなった。表７で示す通り、条件２、３ともにＧ１およびＧ２両者において陽性検体数は増加し、感度の向上を確認した。
【表7】
【0059】
試験例４．各プライマーを用いた検討２
（１）ノロウイルス液の調製
ノロウイルスのサンプルとして、ノロウイルス検体であるＮｏｒｏｖｉｒｕｓ ＧＩおよびＧＩＩ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ、ｉｎｔａｃｔ）を利用した。Ｇ１型およびＧ２型ノロウイルスの各検体を、１反応当たり５０、２５、１０コピー相当添加した。
（２）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、１酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおいて、反応液中のノロウイルスを検出した。プライマーに関しては、（３）に記載した濃度にて各プライマーを添加した。
反応液
２ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（東洋紡）添付品）
１０ｘ プローブ液（ＴａｑＭａｎプローブ）
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
２０ｘ Ｍｎ（ＯＡｃ）２（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（東洋紡）添付品）
前記各試薬および、（３）にて記載するプライマー液を混合し、最終液量が４９μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。ＲＴ－ＰＣＲ反応液に、ノロウイルス液を１μＬずつ添加し、５０μＬ反応系としてＲＴ－ＰＣＲを実施した。
（３）プライマー
以下のプライマーをＰＣＲ時の最終濃度が下記の濃度となるように反応液中に添加した。
また、表１で記載したプライマーを同様に添加した。
０．５μＭ ＣＯＧ１Ｆ（配列番号２）
０．５μＭ ＣＯＧ１Ｒ（配列番号３）
０．５μＭ ＣＯＧ２Ｒ（配列番号４）
０．１μＭ ＡＬＰＦ（配列番号５）
０．５μＭ [表８に記載のプライマー]
（１）ノロウイルス液の調製
ノロウイルスのサンプルとして、ノロウイルス検体であるＮｏｒｏｖｉｒｕｓ ＧＩおよびＧＩＩ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ、ｉｎｔａｃｔ）を利用した。Ｇ１型およびＧ２型ノロウイルスの各検体を、１反応当たり５０、２５、１０コピー相当添加した。
（２）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、１酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおいて、反応液中のノロウイルスを検出した。プライマーに関しては、（３）に記載した濃度にて各プライマーを添加した。
反応液
２ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（東洋紡）添付品）
１０ｘ プローブ液（ＴａｑＭａｎプローブ）
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
２０ｘ Ｍｎ（ＯＡｃ）２（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（東洋紡）添付品）
前記各試薬および、（３）にて記載するプライマー液を混合し、最終液量が４９μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。ＲＴ－ＰＣＲ反応液に、ノロウイルス液を１μＬずつ添加し、５０μＬ反応系としてＲＴ－ＰＣＲを実施した。
（３）プライマー
以下のプライマーをＰＣＲ時の最終濃度が下記の濃度となるように反応液中に添加した。
また、表１で記載したプライマーを同様に添加した。
０．５μＭ ＣＯＧ１Ｆ（配列番号２）
０．５μＭ ＣＯＧ１Ｒ（配列番号３）
０．５μＭ ＣＯＧ２Ｒ（配列番号４）
０．１μＭ ＡＬＰＦ（配列番号５）
０．５μＭ [表８に記載のプライマー]
【表8】
【0060】
（４）ＲＴ－ＰＣＲ反応条件
これをＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。６０℃、４０サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
９０℃ １分（熱処理条件）
５８℃ ５分（逆転写条件）
９５℃ １秒－６０℃ １０秒 １０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－６０℃ １０秒 ４０サイクル（ＰＣＲ－蛍光読み取り）
（５）結果
結果の評価は、基準となる条件１（従来のＧＩＩ型ノロウイルス検出用フォワードプライマー；ＣＯＧ２Ｆ）との比較にて行った。測定にて得られたＣｔ値は表９にて記載した。条件１では１０コピー／反応の検出が不可能であったが、条件２から条件１４すべてにおいて１０コピー／反応の検出を確認した。また、本発明の核酸プライマーを用いることで、予想外に、ＧＩＩ型のみならず、ＧＩ型の検出感度も良好になる傾向が示された。
これをＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。６０℃、４０サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
９０℃ １分（熱処理条件）
５８℃ ５分（逆転写条件）
９５℃ １秒－６０℃ １０秒 １０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－６０℃ １０秒 ４０サイクル（ＰＣＲ－蛍光読み取り）
（５）結果
結果の評価は、基準となる条件１（従来のＧＩＩ型ノロウイルス検出用フォワードプライマー；ＣＯＧ２Ｆ）との比較にて行った。測定にて得られたＣｔ値は表９にて記載した。条件１では１０コピー／反応の検出が不可能であったが、条件２から条件１４すべてにおいて１０コピー／反応の検出を確認した。また、本発明の核酸プライマーを用いることで、予想外に、ＧＩＩ型のみならず、ＧＩ型の検出感度も良好になる傾向が示された。
【表9】
【0061】
試験例５．実検体における感度比較検討３
（１）検体
ノロウイルス陰性および陽性を含む２４検体の糞便を１０％糞便懸濁液とした。糞便懸濁液は遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、５分間）を実施し、上清を得た。
（２）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、１酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおいて、反応液中のノロウイルスを検出した。
反応液
２ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（東洋紡）添付品）
１０ｘ プローブ液（ＴａｑＭａｎプローブ）
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
２０ｘ Ｍｎ（ＯＡｃ）２（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（東洋紡）添付品）
前記各試薬および、（３）にて記載するプライマー液を混合し、最終液量が４９μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。ＲＴ－ＰＣＲ反応液に（１）にて調製した糞便懸濁液の上清を１μＬずつ添加し、５０μＬ反応系としてＲＴ－ＰＣＲに供した。
（３）プライマー
以下のプライマーをＰＣＲ時の最終濃度が下記の濃度となるように反応液中に添加した。
また、表１０で記載したプライマーを同様に添加した。
０．５μＭ ＣＯＧ１Ｆ（配列番号２）
０．５μＭ ＣＯＧ１Ｒ（配列番号３）
０．５μＭ ＣＯＧ２Ｒ（配列番号４）
０．１μＭ ＡＬＰＦ（配列番号５）
０．５μＭ [表１０に記載のプライマー]
（１）検体
ノロウイルス陰性および陽性を含む２４検体の糞便を１０％糞便懸濁液とした。糞便懸濁液は遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、５分間）を実施し、上清を得た。
（２）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、１酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおいて、反応液中のノロウイルスを検出した。
反応液
２ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（東洋紡）添付品）
１０ｘ プローブ液（ＴａｑＭａｎプローブ）
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
２０ｘ Ｍｎ（ＯＡｃ）２（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（東洋紡）添付品）
前記各試薬および、（３）にて記載するプライマー液を混合し、最終液量が４９μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。ＲＴ－ＰＣＲ反応液に（１）にて調製した糞便懸濁液の上清を１μＬずつ添加し、５０μＬ反応系としてＲＴ－ＰＣＲに供した。
（３）プライマー
以下のプライマーをＰＣＲ時の最終濃度が下記の濃度となるように反応液中に添加した。
また、表１０で記載したプライマーを同様に添加した。
０．５μＭ ＣＯＧ１Ｆ（配列番号２）
０．５μＭ ＣＯＧ１Ｒ（配列番号３）
０．５μＭ ＣＯＧ２Ｒ（配列番号４）
０．１μＭ ＡＬＰＦ（配列番号５）
０．５μＭ [表１０に記載のプライマー]
【表10】
【0062】
（４）ＲＴ－ＰＣＲ反応条件
これをＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。６０℃、４０サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
９０℃ １分（熱処理条件）
５８℃ ５分（逆転写条件）
９５℃ １秒－６０℃ １０秒 １０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－６０℃ １０秒 ４０サイクル（ＰＣＲ－蛍光読み取り）
（５） 結果
各プライマーの条件における陰性検体数および陽性検体数の比較をおこなった。結果は従来のＧＩＩ型ノロウイルス検出用フォワードプライマー（ＣＯＧ２Ｆ）との比較にておこなった。表１１で示す通り、条件１～６全てにおいてＧ１およびＧ２両者の陽性検体数は増加し、感度の向上を確認した。（Ｇ１およびＧ２の共感染検体を含むため表内の検体数の合計は２４検体を超える。）
これをＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。６０℃、４０サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
９０℃ １分（熱処理条件）
５８℃ ５分（逆転写条件）
９５℃ １秒－６０℃ １０秒 １０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－６０℃ １０秒 ４０サイクル（ＰＣＲ－蛍光読み取り）
（５） 結果
各プライマーの条件における陰性検体数および陽性検体数の比較をおこなった。結果は従来のＧＩＩ型ノロウイルス検出用フォワードプライマー（ＣＯＧ２Ｆ）との比較にておこなった。表１１で示す通り、条件１～６全てにおいてＧ１およびＧ２両者の陽性検体数は増加し、感度の向上を確認した。（Ｇ１およびＧ２の共感染検体を含むため表内の検体数の合計は２４検体を超える。）
【表11】
【産業上の利用可能性】
【0063】
本発明は、分子生物学研究、さらに臨床検査や食品衛生管理などを目的とした検査において、好適に用いられる。
【図1】
【配列表】