特許 7662616 ウスベニアオイ発酵物及びその利用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-04-07

(45)【発行日】2025-04-15

(54)【発明の名称】ウスベニアオイ発酵物及びその利用

(51)【国際特許分類】

   C12P 1/04 20060101AFI20250408BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20250408BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20250408BHJP

   A61Q 19/02 20060101ALI20250408BHJP

   A61Q 17/04 20060101ALI20250408BHJP

   A61P 17/16 20060101ALI20250408BHJP

   A61K 8/9789 20170101ALI20250408BHJP

   A61K 8/9728 20170101ALI20250408BHJP

   A61K 36/185 20060101ALI20250408BHJP

   A61K 35/747 20150101ALI20250408BHJP

   A61K 35/744 20150101ALI20250408BHJP

   C12N 1/20 20060101ALN20250408BHJP

【ＦＩ】

C12P1/04 Z

A61P17/00

A61P43/00 111

A61Q19/02

A61Q17/04

A61P17/16

A61K8/9789

A61K8/9728

A61K36/185

A61K35/747

A61K35/744

A61P43/00 105

C12N1/20 E

【請求項の数】 6

(21)【出願番号】P 2022514083

(86)(22)【出願日】2021-04-06

(86)【国際出願番号】 JP2021014617

(87)【国際公開番号】W WO2021206086

(87)【国際公開日】2021-10-14

【審査請求日】2023-10-13

(31)【優先権主張番号】P 2020070364

(32)【優先日】2020-04-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000006884

【氏名又は名称】株式会社ヤクルト本社

(74)【代理人】

【識別番号】110000800

【氏名又は名称】デロイトトーマツ弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】倉澤 智子

(72)【発明者】

【氏名】柴田 慎也

(72)【発明者】

【氏名】伊澤 直樹

(72)【発明者】

【氏名】伊藤 雅彦

【審査官】三須 大樹

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１６－０２０３６２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１２－２１９０９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１７－００１９８５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００２－１９３７３５（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｐ

Ａ６１Ｐ

Ａ６１Ｑ

Ａ６１Ｋ

Ｃ１２Ｎ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ウスベニアオイ又はその処理物を原料とする、ラクトバチルス属（Lactobacillus属）に属する微生物、ラクトコッカス属（Lactococcus属）に属する微生物、及びペディオコッカス属（Pediococcus属）に属する微生物からなる群から選ばれた１種又は２種以上の微生物による発酵物。

【請求項2】

前記微生物は、ラクトバチルス プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス ペントーサス（Lactobacillus pentosus）、ラクトバチルス ゼアエ（Lactobacillus zeae）、ラクトバチルス マリ（Lactobacillus mali）、ラクトバチルス ファビファーメンタンス（Lactobacillus fabifermentans）、ラクトバチルス ホルデイ（Lactobacillus hordei）、ラクトコッカス ラクティス（Lactococcus lactis）、ペディオコッカス アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）、及びペディオコッカス ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）からなる群から選ばれた１種又は２種以上の微生物である、請求項１記載の発酵物。

【請求項3】

請求項１又は２に記載の発酵物を含有する皮膚外用剤。

【請求項4】

美白効果をもたらすために用いられる、請求項３記載の皮膚外用剤。

【請求項5】

前記発酵物は、メラニン産生抑制作用を有するものである、請求項３又は４記載の皮膚外用剤。

【請求項6】

前記発酵物は、チロシナーゼ阻害作用を有するものである、請求項３～５のいずれか１項に記載の皮膚外用剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、皮膚外用剤等として有用な植物発酵物に関し、より詳細には、ウスベニアオイ発酵物、及びこれを含有する皮膚外用剤に関する。

【背景技術】

【0002】

ウスベニアオイ（ゼニアオイと呼ばれる場合もある。）は、ヨーロッパ原産の多年草で野生種であるが、ハーブや生薬用として広く栽培されている。従来、植物エキスや発酵物を化粧料等に用いることが行われているが、ウスベニアオイについては皮膚外用剤としての利用が報告されている。すなわち、例えば、特許文献１には、ウスベニアオイ抽出物によって、紫外線照射により発現が上昇するｂＦＧＦｍＲＮＡの発現上昇を抑制することが記載されている。これにより、シミ、ソバカス、皮膚色素沈着等を予防、治療又は改善することが可能であると記載されている。また、例えば、特許文献２には、ウスベニアオイ抽出物（ゼニアオイ抽出物）によって、ヒト表皮由来色素細胞におけるキネシン発現量が抑制することが記載されている。また、シミ・ソバカス・色素沈着を改善する効果があると記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【文献】特開２０１１－１３２８号公報

【文献】特開２０１２－２１９０９１号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

しかしながら、従来の抽出物による方法では、ウスベニアオイによる活性を十分に引き出すことができなかった。

【0005】

よって、本発明の目的は、活性向上のため改良されたウスベニアオイ由来素材を提供することにある。また、これにより、新規な皮膚外用剤を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0006】

上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究し、本発明を完成するに至った。

【0007】

本発明の第１は、ウスベニアオイ又はその処理物を原料とする、ラクトバチルス属（Lactobacillus属）に属する微生物、ラクトコッカス属（Lactococcus属）に属する微生物、及びペディオコッカス属（Pediococcus属）に属する微生物からなる群から選ばれた１種又は２種以上の微生物による発酵物を提供するものである。

【0008】

本発明に係る発酵物においては、前記微生物は、ラクトバチルス プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス ペントーサス（Lactobacillus pentosus）、ラクトバチルス ゼアエ（Lactobacillus zeae）、ラクトバチルス マリ（Lactobacillus mali）、ラクトバチルス ファビファーメンタンス（Lactobacillus fabifermentans）、ラクトバチルス ホルデイ（Lactobacillus hordei）、ラクトコッカス ラクティス（Lactococcus lactis）、ペディオコッカス アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）、及びペディオコッカス ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）からなる群から選ばれた１種又は２種以上の微生物であることが好ましい。

【0009】

本発明の第２は、上記の発酵物を含有する皮膚外用剤を提供するものである。

【0010】

本発明に係る皮膚外用剤においては、該皮膚外用剤は、美白効果をもたらすために用いられることが好ましい。

【0011】

本発明に係る皮膚外用剤においては、前記発酵物は、メラニン産生抑制作用を有するものであることが好ましい。

【0012】

本発明に係る皮膚外用剤においては、前記発酵物は、チロシナーゼ阻害作用を有するものであることが好ましい。

【発明の効果】

【0013】

本発明によれば、ウスベニアオイ又はその処理物を原料とし、これを特定の微生物で処理した発酵物であるので、メラニン産生抑制活性、チロシナーゼ阻害活性等、美白効果をもたらす活性に優れている。よって、これにより新規な皮膚外用剤を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】試験例４においてメラニン産生抑制活性を調べた結果を示す図表であり、（Ａ）はウスベニアオイ発酵物についてメラニン産生細胞に添加した終濃度ごとに細胞内メラニン産生量の変化を調べた結果（未発酵のウスベニアオイ抽出物を同じ終濃度で添加したときの細胞内メラニン量に対する百分率割合で示す結果）を示す図表であり、（Ｂ）は同様の試験をハイビスカス又はブラックマロウについて行った結果を示す図表である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本明細書において「ウスベニアオイ」は、通常当業者に理解される植物と同義であり、具体的には、アオイ科ゼニアオイ属のウスベニアオイ（学名：Ｍａｌｖａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、ブルーマロウとも呼ばれる。）や、あるいはその変種とされるゼニアオイ（学名：Ｍａｌｖａ ｍａｕｒｉｔｉａｎａ、コモンマロウとも呼ばれる。）をも含む意味である。ウスベニアオイは、ヨーロッパ原産の植物であり、ハーブや生薬用としても広く栽培されており、容易に入手可能である。

【0016】

本発明においては、ウスベニアオイに微生物を作用させて、その微生物による発酵物となす。微生物に作用させるウスベニアオイの植物体の部位としては、花部、葉部、幹部、地上部、根部、全草、又はこれらの部位の混合物等が挙げられるが、好ましくは花部、葉部、又はこれらの部位の混合物等であり、より好ましくは花部である。微生物に作用させる植物体の形状としては、植物原体又はその乾燥物の破砕物、搾汁液、抽出物、又はこれらの混合物等であり、特に限定されない。好ましくは搾汁液、抽出物、又はこれらの混合物等であり、より好ましくは抽出物である。

【0017】

ウスベニアオイに作用させる微生物としては、ラクトバチルス属（Lactobacillus属）に属する微生物、ラクトコッカス属（Lactococcus属）に属する微生物、ロイコノストック属（Leuconostoc属）に属する微生物、ペディオコッカス属（Pediococcus属）に属する微生物等が挙げられる。より具体的には、ラクトバチルス プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス ペントーサス（Lactobacillus pentosus）、ラクトバチルス ゼアエ（Lactobacillus zeae）、ラクトバチルス マリ（Lactobacillus mali）、ラクトバチルス ファビファーメンタンス（Lactobacillus fabifermentans）、ラクトバチルス ホルデイ（Lactobacillus hordei）、ラクトコッカス ラクティス（Lactococcus lactis）、ペディオコッカス アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）、ペディオコッカス ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）等である。これらの微生物であれば、ウスベニアオイの発酵が良好に促進され、且つ、美白効果をもたらす活性に優れている。ただし、本発明に使用し得る微生物がこれらの菌種に限定される意味ではない。微生物は、１種類を単独で上記原料との処理に用いてもよく、２種類以上を併用して上記原料との処理に用いてもよい。すなわち、異なる２種類以上の微生物による処理を順次に行ってもよく、異なる２種類以上の微生物を一時に併用して処理を行うようにしてもよく、また、これらの処理を組み合わせてもよい。

【0018】

ウスベニアオイに上記微生物を作用させる際の条件については、ウスベニアオイの成分が上記微生物によってなにかしらの変化がもたらされるような条件であればよく、特に制限はないが、例えば、ウスベニアオイに作用させた微生物が初発菌数の２～１００００倍量、典型的には５～１０００倍量、より典型的には１０～１０００倍量に増殖する生育条件であることが好ましい。生育が乏しいと、発酵が良好に進まない。

【0019】

ウスベニアオイに上記微生物を作用させる際には、その微生物の生育の補助材として、例えばグルコース、フルクトース、ショ糖、オリゴ糖等の糖類、アラニン、アルギニン、トリプトファン、システイン等のアミノ酸類、カゼイン分解物、タンパク分解物等のペプチド類、イーストエキス、肉エキス、ダイズエキス等のエキス類、オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン等の脂肪酸を側鎖にもつ界面活性剤あるいは、標準的な乳酸菌用培地構成である、例えばラクトバシラスＭＲＳブロス（Ｄｉｆｃｏ）等を用いてもよい。

【0020】

ただし、ウスベニアオイ由来成分に加えてその他の成分が残存すると、防腐性、使用感等の観点から、得られる発酵物の品質に影響をきたす場合があるので、発酵に際しては、ウスベニアオイ由来成分以外の成分を必要以上に配合することは、望ましいとはいえない。よって、上記補助材を用いる場合には、例えば、ウスベニアオイ由来物１００質量部に対してそれ以外の構成割合を０．００１質量部以上５．０質量部以下とすることが好ましく、０．０１質量部以上０．５質量部以下とすることがより好ましい。一方、ウスベニアオイに由来しない原料を何も添加せずに、上記微生物による処理に供するようにしてもよい。

【0021】

以下、本発明に係る発酵物を得るための、限定されない任意の態様について、更に具体的に説明する。

【0022】

上記微生物に作用させる原料としては、例えば、ウスベニアオイの抽出物を得て、それを原料とすることができる。この場合、例えば植物体の乾燥粉末に対して１０～２００倍量の水や熱水（例えば、逆浸透膜処理水、イオン交換水、水道水、井水、蒸留水、超純水等を用いてもよい。）を加えて加熱処理して熱水抽出物を得て、それをそのまま抽出懸濁液の状態で原料にしたり、任意に水分を蒸発濃縮して原料にしたり、あるいは、フィルター濾過、遠心分離等の固液分離手段によって固形分を除いて上清を得て原料にしたりして、そのような原料に対して、上記微生物を適当な初発濃度接種して、作用させるようにすればよい。

【0023】

上記微生物による処理は、通常の通気、静置培養に準じた方法で行うことができる。この場合、初発菌数濃度としては、好ましくは１×１０^４ＣＦＵ／ｍＬ以上５×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ以下であり、より好ましくは１×１０^５ＣＦＵ／ｍＬ以上１×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ以下である。温度条件としては、２０℃～４０℃、より好ましくは２５℃～３７℃である。処理期間としては１２時間～１０日間、より好ましくは１～３日間である。このような静置培養により、例えば初発菌数の２～１００００倍量、典型的には５～１０００倍量、より典型的には１０～１０００倍量に微生物を増殖させてなる、発酵物を得ることができる。微生物による処理の後には、使用した微生物を含むままで、本発明に係る発酵物となしてもよいが、上述した防腐性、使用感等の観点からは、発酵に使用した微生物の菌体は、フィルター濾過、遠心分離等の固液分離手段によって除き、得られた上清を発酵物となすことが好ましい。また、微生物による処理の後には、その処理物に各種溶媒を加えて、抽出物ないし希釈物を調製し、本発明の発酵物として使用することも可能である。ここで使用する溶媒は、水、エタノール、プロパノール等の低級アルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール等の高級アルコール、１，３-ブチレングリコール、１，３-プロパンジオール、グリセリン等の多価アルコールなど、化粧品に汎用される溶媒があげられるが、これらに限定されたものではなく、単独あるいは二種以上混合して用いることができる。

【0024】

本発明に係る発酵物は、それをそのまま皮膚外用剤として用いてもよく、あるいは皮膚外用剤の製造工程で配合するようにして用いてもよい。具体的には、例えば、乳液、クリーム、クレンジング、マッサージ、サンスクリーン、化粧下地、クリームファンデーション等の形態の化粧料あるいはその原料として、好適に用いられ得る。なお、ここでいう化粧料は、医薬品、医療機器等の品質、有効性及び安全性の確保等に関する法律で定義されている医薬品、医薬部外品、化粧品を含む意味である。

【0025】

また、皮膚外用剤の形態としては、皮膚に作用させる成分を適当な基材部に担持してなる、パック、マスク、ジェル等であってもよい、すなわち、そのような皮膚外用剤の、皮膚に作用させる成分として、好適に用いられ得る。

【0026】

また、本発明の限定されない任意の態様において、上記皮膚外用剤は、美白効果をもたらすために用いられることや、メラニン産生抑制作用を有することや、チロシナーゼ阻害作用を有すること等の機能性を表示した製品であってもよい。

【実施例】

【0027】

以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。

【0028】

〔１．ウスベニアオイ抽出物の調製〕
１－１．植物
市販のウスベニアオイ（学名：Malva sylvestris）の花部の乾燥物を試験に用いた。

【0029】

１－２．抽出
前培養用のウスベニアオイ抽出物を、次のとおり調製した。すなわち、植物粉末：水＝１：２０（質量比）、となるよう水（逆浸透膜処理水、以下「ＲＯ水」という。）を加え、終濃度が０．２ｗ／ｖ％となるようにグルコースを、及び終濃度が０．１ｗ／ｖ％となるようにイーストエキス（Ｄｉｆｃｏ）を添加し、よく攪拌して懸濁液を調製した。懸濁液を３ｍＬずつ試験管に分注し、アルミキャップをして１２１℃、１５分間オートクレーブにかけて熱水抽出物を得た。

【0030】

本培養用のウスベニアオイ抽出物としては、（１）無添加、及び（２）０．２ｗ／ｖ％グルコース及び０．１ｗ／ｖ％イーストエキス添加の２種類を調製した。すなわち、植物粉末：水＝１：２０（質量比）となるようＲＯ水を加え、上記（１）としては無添加で、又は上記（２）としては終濃度が０．２ｗ／ｖ％となるようにグルコースを、及び終濃度が０．１ｗ／ｖ％となるようにイーストエキス（Ｄｉｆｃｏ）を添加し、よく攪拌して、それぞれ懸濁液を調製した。その懸濁液を１０ｍＬずつ試験管に分注して、シリコ栓をして９８℃、１００分間オートクレーブにかけて熱水抽出物を得た。

【0031】

〔２．乳酸菌〕
使用した１３種類の乳酸菌を表１に示す。菌は、－８０℃ ＤＭＳＯ保存株をＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳ Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）に接種し、至適培養温度にて２０時間培養後、同条件で更に１代継代したものを菌液として、ウスベニアオイ抽出物の前培養に供した。なお、使用した１１種類の乳酸菌（Ｎｏ．５およびＮｏ．１１以外）は、いずれも各乳酸菌の属種を代表する基準株を入手して使用した。使用した１３種類の株は、表１に記載した寄託先から入手できる。

【0032】

【表1】

【0033】

［試験例１］
前培養は、前培養用のウスベニアオイ抽出物３ｍＬに菌液を０．５ｖ／ｖ％接種し（初発菌数濃度：およそ０．５×１０^６～２×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ）、好気下にて至適温度で４８時間、静置培養した。

【0034】

本培養は、本培養用のウスベニアオイ抽出物１０ｍＬに前培養後の培養物を１ｖ／ｖ％接種し（初発菌数濃度：およそ０．５×１０^５～５×１０^６ＣＦＵ／ｍＬ）、好気下にて至適温度で７２時間、静置培養した。

【0035】

本培養後、生菌数を確認した。具体的には、本培養後の培養物を原液あるいは０．１ｗ／ｖ％イーストエキスで適宜希釈した液を、スパイラルプレーターEDDY JET2（IUL Instruments）にてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳ寒天平板培地に１００μＬ播種し、至適温度で３日間培養後、形成したコロニーをコロニーカウンター ProtoCOL3（SYNBIOSIS）にて計数して、ＣＦＵ（コロニー形成単位）／ｍＬの値を算出した。なお、本培養前の初発菌数についても、同様にして確認した。

【0036】

【表2】

【0037】

その結果、乳酸菌Ｎｏ．１３（Streptococcus thermophilus）は、前培養後に生菌が検出されずに、ウスベニアオイを原料とする発酵物の調製には適さない菌種又は菌株であった。

【0038】

上記以外の乳酸菌１２株では、ウスベニアオイ抽出物での培養により、生菌数が初発菌数に比べて少なくとも１０倍以上増加していた。ウスベニアオイ抽出物にグルコース及びイーストエキスを添加したときの影響は、生菌数が増加する傾向（例；乳酸菌Ｎｏ．７（Lactobacillus hordei））、ほぼ同等（例；乳酸菌Ｎｏ．８（Lactococcus lactis subsp. lactis））、抑制する傾向（例；乳酸菌Ｎｏ．３（Lactobacillus zeae））と、乳酸菌の種類によって様々であり、一様な傾向はみられなかった。菌の生育に対する影響の程度は、いずれもそれほど顕著ではなかった。

【0039】

以上から、上記乳酸菌１２株、すなわち乳酸菌Ｎｏ．１（Lactobacillus plantarum subsp. plantarum）、乳酸菌Ｎｏ．２（Lactobacillus pentosus）、乳酸菌Ｎｏ．３（Lactobacillus zeae）、乳酸菌Ｎｏ．４（Lactobacillus mali）、乳酸菌Ｎｏ．５（Lactobacillus casei）、乳酸菌Ｎｏ．６（Lactobacillus fabifermentans）、乳酸菌Ｎｏ．７（Lactobacillus hordei）、乳酸菌Ｎｏ．８（Lactococcus lactis subsp. lactis）、乳酸菌Ｎｏ．９（Leuconostoc pseudomesenteroides）、乳酸菌Ｎｏ．１０（Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides）、乳酸菌Ｎｏ．１１（Pediococcus acidilactici）、及び乳酸菌Ｎｏ．１２（Pediococcus pentosaceus）は、ウスベニアオイを原料とする発酵物の調製に適することが明らかとなった。

【0040】

［試験例２］
試験例１において培養後の生菌数が１×１０^６ＣＦＵ／ｍＬ以上を示した１２種類の乳酸菌（Ｎｏ．１～１２）のうち、Ｎｏ．１、２、４、６、９、１０の乳酸菌を選択して、各乳酸菌による培養物について、メラニン産生抑制活性を調べた。

【0041】

具体的には、無添加のウスベニアオイ抽出物による本培養終了後、培養物を３０００ｒｐｍ（１６００×ｇ）で１０分間遠心し、上清を０．２２μｍフィルターで無菌濾過して発酵上清を得た。発酵上清は、４℃遮光保存の後、測定まで－２０℃で冷凍保存した。表３には、使用した発酵上清又は未発酵のウスベニアオイ抽出物について、ｐＨ測定の結果と、１０５℃で３時間加熱後、デシケーター内にて放冷することにより測定したときの蒸発残留物濃度（ｍｇ／ｍＬ）を示す。

【0042】

【表3】

【0043】

メラニン産生抑制活性の測定は、以下に示す試験方法により実施した。
〔１．試験方法〕
（１）細胞
細胞は、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞（Ｂ１６－Ｆ１）を使用した。試験には、購入時から数えて継代数５～１０回目の細胞を使用した。培地は、５または１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを用いた。

【0044】

（２）メラニン産生抑制試験
２４ウェルプレートに５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地５００μＬを入れ、Ｂ１６メラノーマ細胞を１．４×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（７．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２）播種後、５％ＣＯ_２、３７℃で２４時間培養した。その後、被験試料を含む０．５ｍＭテオフィリン含有培地１ｍＬに交換して、更に３日間培養した。

【0045】

被検試料としては、各乳酸菌による発酵上清又は未発酵のウスベニアオイ抽出物を、サンプル原液を１００％として、培地中に０．５％、１％、２％、５％の配合割合（体積比）となるように添加した。コントロールとしては、各乳酸菌による発酵上清又は未発酵のウスベニアオイ抽出物の代わりにＲＯ水を同配合割合で培地に添加した。また、陽性対照として、医薬部外品の美白原料として知られているアルブチンの水溶液を培地に１％添加した（終濃度０．１５～２．４４ｍＭ）。

【0046】

（３）細胞内メラニン産生量
培養終了後に細胞をＰＢＳ（－）で２回洗浄し、９９．５％エタノールで細胞を固定した。エタノールを風乾で除去後、１Ｎ ＮａＯＨをウェルに加え８０℃、３０分間加熱し、細胞及びメラニンを溶解させてなる細胞溶解液を得た。放冷後、細胞溶解液全量を９６ウェルプレートに移し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。培養ウェルあたりの細胞内メラニン産生量を、合成メラニンを用いた検量線から求め、コントロールに対する細胞内メラニン産生量を次式により求めた。

【0047】

【数1】

【0048】

（４）細胞内蛋白質量
上記細胞溶解液を超純水（ミリＱ水）で１０倍に希釈し、ＢＳＡを標準蛋白質としたＢＣＡ法（Pierce BCA Protein assay kit）で定量し、次式により、コントロールに対する細胞内蛋白質量を求めた。

【0049】

【数2】

【0050】

（５）ＩＣ５０値
各乳酸菌による発酵上清又は未発酵のウスベニアオイ抽出物、及び所定の配合割合について、２～５回の試験を行った結果に基づき、細胞内メラニン産生量及び細胞内蛋白質量のそれぞれについて、５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）を求めた。ＩＣ５０値の算出は、披験試料未添加の各値を１００％とし、５０％となる濃度ないしその推定値とした。なお、各発酵上清及び未発酵のウスベニアオイ抽出物の濃度は、上記表３に示した蒸発残留物濃度で換算した。

【0051】

〔２．結果〕
結果を表４にまとめて示す。

【0052】

【表4】

【0053】

その結果、陽性対照であるアルブチンでは、細胞内メラニン産生量のＩＣ５０値が３４０μｇ／ｍＬであったのに対して、未発酵のウスベニアオイ抽出物では、ＩＣ５０値が１２００μｇ／ｍＬを超え、抑制効果に乏しかった。

【0054】

また、乳酸菌Ｎｏ．９（Leuconostoc pseudomesenteroides）や乳酸菌Ｎｏ．１０（Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides）について、これらの乳酸菌による発酵上清では、未発酵のウスベニアオイ抽出物と同様に、メラニン産生抑制効果に乏しかった。

【0055】

一方、乳酸菌Ｎｏ．１（Lactobacillus plantarum subsp. plantarum）、乳酸菌Ｎｏ．２（Lactobacillus pentosus）、乳酸菌Ｎｏ．４（Lactobacillus mali）、及び乳酸菌Ｎｏ．６（Lactobacillus fabifermentans）について、各乳酸菌による発酵上清では細胞内メラニン産生量のＩＣ５０値が未発酵よりも顕著に低下し、陽性対照であるアルブチンの値に近づく傾向を示した。一方、これらの発酵上清では、細胞内蛋白質量のＩＣ５０値は未発酵と大きな差はみられなかった。

【0056】

以上から、上記乳酸菌によるウスベニアオイ抽出物の発酵物では、未発酵の抽出物に比べて細胞数の低下を起こすことなく、メラニン産生抑制活性が高められることが明らかとなった。

【0057】

［試験例３］
試験例１において培養後の生菌数が１×１０^６ＣＦＵ／ｍＬ以上を示した１２種類の乳酸菌（Ｎｏ．１～１２）のうち、Ｎｏ．３、６、７、８、１１、１２の乳酸菌を選択して、試験例２と同様にして発酵上清を調製し（Ｎｏ．６は試験例２で用いたものを使用）、チロシナーゼ阻害活性を調べた。表５には、使用した発酵上清又は未発酵のウスベニアオイ抽出物について、ｐＨ測定の結果と、１０５℃で３時間加熱後、デシケーター内にて放冷することにより測定したときの蒸発残留物濃度（ｍｇ／ｍＬ）を示す。

【0058】

【表5】

【0059】

チロシナーゼ阻害活性の測定は、Matsudaらの方法（Matsuda H et al.；Studies of cuticle drugs from natural sources. III. Inhibitory effect of Myrica rubra on melanin biosynthesis., Biol. Pharm. Bull., 18(8), 1148-1150 (1995)）を一部改変して実施した。具体的には、各乳酸菌による発酵上清又は未発酵のウスベニアオイ抽出物を、９６穴マイクロプレートの各ウェルにそれぞれ５０μＬ入れ（サンプル原液）、各ウェルに３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）５０μＬを加えて混和した後、室温で１０分間プレインキュベートした。次いで、２７０Ｕ／ｍＬチロシナーゼ溶液（チロシナーゼ：マッシュルーム由来、シグマ アルドリッチ）２５μＬと、０．０６ｗ/ｖ％３，４―Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－Ｌ－ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ（Ｌ－ＤＯＰＡ、富士フイルム和光純薬株式会社）２５μＬを、各ウェルに加えて混合し、室温で５分間インキュベート後、ドーパクロム（メラニン生合成の中間体）の極大吸収波長である４７５ｎｍの吸光度を測定した。反応系の最終ボリュームは１５０μＬであり、そのうち発酵上清（サンプル原液）の最終配合割合は５０μＬ／１５０μＬであった。

【0060】

測定した吸光度から、次式により、チロシナーゼ阻害率を算出した。式中、「コントロール」はサンプルの代わりにＲＯ水を加えた反応系を、「ブランク」はチロシナーゼの代わりに５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液を加えた反応系を、それぞれ表す。

【0061】

【数3】

【0062】

試験は、各乳酸菌による発酵上清又は未発酵のウスベニアオイ抽出物について、３回のチロシナーゼ反応試験を行って、その平均と標準偏差を求めた。結果を表６に示す。

【0063】

【表6】

【0064】

その結果、未発酵のウスベニアオイ抽出物ではチロシナーゼ阻害率が２％（ＳＤ：±８％）であったのに対して、各乳酸菌による発酵物のうち、乳酸菌Ｎｏ．３（Lactobacillus zeae）では６％（ＳＤ：±１％）であり、乳酸菌Ｎｏ．６（Lactobacillus fabifermentans）では８％（ＳＤ：±３％）であり、Ｎｏ．７（Lactobacillus hordei）では４％（ＳＤ：±４％）であり、乳酸菌Ｎｏ．８（Lactococcus lactis subsp. lactis）では２４％（ＳＤ：±１％）であり、乳酸菌Ｎｏ．１１（Pediococcus acidilactici）では２１％（ＳＤ：±１％）であり、乳酸菌Ｎｏ．１２（Pediococcus pentosaceus）では１７％（ＳＤ：±２％）であった。

【0065】

以上から、上記乳酸菌によるウスベニアオイ抽出物の発酵物では、未発酵の抽出物に比べて、チロシナーゼ阻害活性が高められることが明らかとなった。

【0066】

［試験例４］
他の種類のアオイ科植物について、ウスベニアオイと同様に、乳酸菌処理による機能性の強化がみられるかどうか調べた。

【0067】

〔４－１．植物〕
試験には、試験例１～３に使用したウスベニアオイの花部の乾燥物に加え、ハイビスカスの萼・苞部の乾燥物、及びブラックマロウの花部の乾燥物を用いた。表７には使用したアオイ科植物の属名、学名、和名、英語一般名を示す。

【0068】

【表7】

【0069】

〔４－２．植物抽出物の調製〕
前培養用の植物抽出物を、次のとおり調製した。すなわち、植物粉末：水＝１：２０（質量比）、となるよう水（逆浸透膜処理水、以下「ＲＯ水」という。）を加え、終濃度が０．２ｗ／ｖ％となるようにグルコースを、及び終濃度が０．１ｗ／ｖ％となるようにイーストエキス（Ｄｉｆｃｏ）を添加し、よく攪拌して懸濁液を調製した。懸濁液を３ｍＬずつ試験管に分注し、アルミキャップをして１２１℃、１５分間オートクレーブにかけて熱水抽出物を得た。
本培養用の植物抽出物を、次のとおり調製した。すなわち、ウスベニアオイ及びハイビスカスの場合には植物粉末：水＝１：２０（質量比）、ブラックマロウの場合には植物粉末：水＝１：５０（質量比）となるよう、それぞれ１２ｍＬのＲＯ水を加え、よく攪拌して懸濁液を調製した。その懸濁液を試験管に入れて、シリコ栓をして９８℃、１００分間オートクレーブにかけて熱水抽出物を得た。

【0070】

〔４－３．乳酸菌〕
乳酸菌Ｎо．１（Lactobacillus plantarum subsp. plantarum）を使用した。

【0071】

〔４－４．前培養・本培養〕
上記に調製した熱水抽出物を培養原料とした以外は、試験例１と同様にして、乳酸菌Ｎо．１による前培養及び本培養を行った。

【0072】

〔４－５．本培養後の生菌数と発酵上清のｐＨと蒸発残留物濃度の確認〕
試験例１と同様にして、本培養後の生菌数を確認した。また、試験例２と同様にして、本培養終了後の培養物から発酵上清を調製し、そのｐＨと蒸発残留物濃度を確認した。

【0073】

表８には、それらの結果をまとめて示す。

【0074】

【表8】

【0075】

〔４－６．メラニン産生抑制活性〕
得られた発酵上清又は未発酵の植物抽出物について、試験例２と同様に、Ｂ１６メラノーマ細胞を用いてメラニン産生抑制活性を測定した。具体的には、サンプル原液を１００％として、培地中に０．５％、１％、２％、５％の配合割合（体積比）となるように添加した。コントロールとしては、ＲＯ水を同配合割合で培地に添加した。

【0076】

表９には、各アオイ科植物の抽出物ごと、乳酸菌による発酵の有無ごと、そして培地に添加したサンプル原液の配合割合（体積比）ごとに、メラニン産生抑制活性の結果をまとめて示す。なお、表９上段（表９－１）には、コントロール（ＲＯ水）を添加したときの細胞内メラニン量を１００％として相対値で示し、表９下段（表９－２）には、未発酵の植物抽出物を同じ終濃度で添加したときの細胞内メラニン産生量を１００％として相対値で示す。また、図１には、表９下段（表９－２）の結果を、培地に添加したサンプルの終濃度を蒸発残留物換算で表して、それをｘ軸にしてグラフ化した。

【0077】

【表9】

【0078】

その結果、ウスベニアオイでは試験例２にも示されたとおり、その抽出物であって未発酵のものよりも乳酸菌で処理した発酵上清のほうが、メラニン産生抑制活性が高くなった。これに対して、他の種類のアオイ科植物であるハイビスカスやブラックマロウでは、そのような乳酸菌処理による機能性の強化はみられなかった。

【図1】