特許 7662617 抗ＣＤ７３抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-04-07

(45)【発行日】2025-04-15

(54)【発明の名称】抗ＣＤ７３抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20250408BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20250408BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20250408BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20250408BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20250408BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20250408BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20250408BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20250408BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20250408BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20250408BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20250408BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28 ZNA

A61K39/395 N

A61P35/00

C07K16/46

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12P21/08

【請求項の数】 22

(21)【出願番号】P 2022514681

(86)(22)【出願日】2020-09-04

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-11-10

(86)【国際出願番号】 EP2020074804

(87)【国際公開番号】W WO2021044005

(87)【国際公開日】2021-03-11

【審査請求日】2023-08-31

(31)【優先権主張番号】62/896,908

(32)【優先日】2019-09-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】500287019

【氏名又は名称】レ ラボラトワール セルヴィエ

【氏名又は名称原語表記】Ｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ Ｓｅｒｖｉｅｒ

(74)【代理人】

【識別番号】110001508

【氏名又は名称】弁理士法人 津国

(74)【代理人】

【識別番号】100185694

【弁理士】

【氏名又は名称】山下 隆志

(72)【発明者】

【氏名】グランダル，ミカエル・モンラード

(72)【発明者】

【氏名】ジェッティング，トーベン

(72)【発明者】

【氏名】ラント，ヨハン

(72)【発明者】

【氏名】ヤコブセン，ヤヌス・スコウ

(72)【発明者】

【氏名】ハンセン，ランディ・ウェスト

(72)【発明者】

【氏名】フレーリク，カミラ

【審査官】長谷川 強

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１９／０２２５７０３（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １６／２８

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ｃ０７Ｋ １６／４６

Ｃ１２Ｎ １／１５

Ｃ１２Ｎ １／１９

Ｃ１２Ｎ １／２１

Ｃ１２Ｎ ５／１０

Ｃ１２Ｎ １５／１３

Ｃ１２Ｎ １５／６３

Ｃ１２Ｐ ２１／０８

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）それぞれ配列番号１７～２２；
ｂ）それぞれ配列番号２３～２８；
ｃ）それぞれ配列番号２９～３４；又は
ｄ）それぞれ配列番号３５～４０
のＨ－ＣＤＲ１～３及びＬ－ＣＤＲ１～３アミノ酸配列を含む、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合部分。

【請求項2】

ａ）それぞれ配列番号９及び１３；
ｂ）それぞれ配列番号１０及び１４；
ｃ）それぞれ配列番号１１及び１５；又は
ｄ）それぞれ配列番号１２及び１６
のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合部分。

【請求項3】

ａ）それぞれ配列番号９及び１３；
ｂ）それぞれ配列番号１０及び１４；
ｃ）それぞれ配列番号１１及び１５；又は
ｄ）それぞれ配列番号１２及び１６
のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、請求項１に記載の抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合部分。

【請求項4】

ａ）配列番号９及び４１のアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）並びに配列番号１３及び４２のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）；
ｂ）配列番号１０及び４１のアミノ酸配列を含むＨＣ並びに配列番号１４及び４２のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｃ）配列番号１１及び４１のアミノ酸配列を含むＨＣ並びに配列番号１５及び４２のアミノ酸配列を含むＬＣ；又は
ｄ）配列番号１２及び４１のアミノ酸配列を含むＨＣ並びに配列番号１６及び４２のアミノ酸配列を含むＬＣ
を含む抗ＣＤ７３抗体。

【請求項5】

ａ）インビトロで可溶性ＣＤ７３の活性を阻害する；
ｂ）インビトロでＣａｌｕ－６細胞上のＣＤ７３の活性を阻害する；
ｃ）インビトロでＨ２９２細胞上のＣＤ７３の活性を阻害する；
ｄ）ＣＨＯ－Ｓ細胞上で発現されたヒト及びカニクイザルＣＤ７３に特異的に結合する；
ｅ）ＳＰＲによって測定される１nM以下のＫ_ＤでヒトＣＤ７３のＥＣＤに結合する；
ｆ）ＳＰＲによって測定される０．７nM以下のＫ_ＤでカニクイザルＣＤ７３のＥＣＤに結合する；
ｇ）オレクルマブ、ＣＰＸ００６、及び／又は１１Ｅ１と同じＣＤ７３のエピトープに結合しない；
ｈ）１：１複合体を生じる方法でＣＤ７３ホモ二量体上のエピトープに結合する；
ｉ）インビトロでオレクルマブよりも有効に可溶性ＣＤ７３活性を阻害する；
ｊ）インビトロでＣａｌｕ－６、Ｈ２９２、及びＣｙｎｏｍ－Ｋ１細胞上のＣＤ７３活性を阻害する；
ｋ）インビトロでＣａｌｕ－６、ＮＣＩ－Ｈ１７７５、ＫＹＳＥ－３０、及びＣａｐａｎ－２細胞上のＣＤ７３活性を阻害する；
ｌ）インビトロでＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞の増殖を阻害する；
ｍ）インビトロで初代ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞並びにＣＤ１９^＋Ｂ細胞上のＣＤ７３活性を阻害する；
ｎ）インビトロでＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖を回復させる；
ｏ）インビトロでＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞を活性化する；
ｐ）抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて、ＡＭＰの存在下で一方向混合リンパ球反応（ＭＬＲ）においてＴ細胞増殖を回復させる；
ｑ）一方向ＭＬＲにおいて、抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて、ＡＭＰの存在下でＴ細胞活性化を増強する；
ｒ）インビトロでＢ細胞活性化を刺激しない；
ｓ）インビトロでＨ２９２細胞中のＣＤ７３のレベルを２５％を超えて低下させない；
ｔ）Ａ３７５細胞を移植したＰＢＭＣヒト化マウスから収穫した腫瘍におけるＣＤ７３活性を阻害する；
ｕ）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を移植したＮＯＤ－ｓｃｉｄマウスにおけるインビボでの腫瘍成長を阻害する；
ｖ）Ｃａｌｕ－６細胞を移植したＰＢＭＣヒト化マウスにおけるインビボでの腫瘍成長を阻害する；及び
ｗ）Ａ３７５細胞を移植したＰＢＭＣヒト化マウスにおけるインビボでの腫瘍成長を阻害する
から選択される少なくとも１つの特性を有する、請求項１～４のいずれか一項記載の抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分。

【請求項6】

ＩｇＧである、請求項１～４のいずれか一項記載の抗ＣＤ７３抗体。

【請求項7】

ＩｇＧ_１である、請求項６に記載の抗ＣＤ７３抗体。

【請求項8】

Ｆ_Ｃ領域に少なくとも１つの変異を含む、請求項１～７のいずれか一項記載の抗ＣＤ７３抗体。

【請求項9】

ＩｇＧ_１であり、ＥＵナンバリングスキームに従ってナンバリングされた重鎖アミノ酸２３４位及び２３５位の１つ以上に変異を含む、請求項１～８のいずれか一項記載の抗ＣＤ７３抗体。

【請求項10】

２３４位及び２３５位のアミノ酸残基の一方又は両方が、ＬｅｕからＡｌａに変異している、請求項９に記載の抗ＣＤ７３抗体。

【請求項11】

請求項１～１０のいずれか一項記載の抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合部分と、薬学的に許容し得る賦形剤とを含む、医薬組成物。

【請求項12】

免疫刺激剤、ワクチン、化学療法剤、抗新生物剤、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害剤、又はＣＤ７３経路阻害剤を更に含む、請求項１１に記載の医薬組成物。

【請求項13】

請求項１～１０のいずれか一項記載の抗ＣＤ７３抗体の、重鎖又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、及び軽鎖又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された組換え核酸分子。

【請求項14】

配列番号１～８のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載の単離された組換え核酸分子。

【請求項15】

請求項１３又は１４に記載の単離核酸分子を含むベクターであって、発現制御配列を更に含む、ベクター。

【請求項16】

請求項１～１０のいずれか一項記載の抗ＣＤ７３抗体の、重鎖又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、及び軽鎖又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を含む、宿主細胞。

【請求項17】

抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合部分を作製するための方法であって、請求項１６に記載の宿主細胞を提供することと、該宿主細胞を、該抗体又は部分の発現に適した条件下で培養することと、得られた抗体又は部分を単離することとを含む、方法。

【請求項18】

請求項１～１０のいずれか一項記載の抗ＣＤ７３抗体の抗原結合部分、及び別の異なる抗体の抗原結合部分を含む、二重特異性結合分子。

【請求項19】

ａ）患者のＣＤ７３活性を低下させる；
ｂ）患者のＣＤ４^＋Ｔ細胞増殖を増加させる；
ｃ）患者の免疫系を刺激する；又は
ｄ）患者のがんを処置する
ための医薬組成物であって、有効量の請求項１～１０のいずれか一項記載の抗ＣＤ７３抗体若しくは抗原結合部分、又は請求項１８の二重特異性結合分子を含む、医薬組成物。

【請求項20】

前記患者が、皮膚、肺、腸、結腸、卵巣、脳、前立腺、腎臓、軟部組織、造血系、頭頸部、肝臓、骨、膀胱、乳房、胃、子宮、子宮頸部、及び膵臓からなる群より選択される組織に起源を有するがんを有する、請求項１９記載の医薬組成物。

【請求項21】

前記患者が、黒色腫、頭頸部がん、乳がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、膵臓がん、卵巣がん、腎細胞癌腫、前立腺がん、結腸直腸がん、胆管癌腫、甲状腺がん、又は精巣がんを有する、請求項１９記載の医薬組成物。

【請求項22】

処置は、免疫刺激剤、ワクチン、化学療法剤、抗新生物剤、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＣＤ７３経路阻害剤、又は放射線療法を更に含む、請求項１９記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、その開示全体が参照により本明細書に援用される、２０１９年９月６日に出願された米国仮特許出願第６２／８９６９０８号に基づく優先権を主張する。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、全体が参照により本明細書に援用される配列表を含有する。２０２０年９月１日に作成された配列表の電子コピーは、０２２６７５＿ＷＯ０５５＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズが３０３５５バイトである。

【背景技術】

【0003】

腫瘍細胞は、腫瘍形成の各段階に影響を及ぼす複雑な微小環境（腫瘍微小環境又はＴＭＥ）に囲まれている。ＴＭＥにおいて、アデノシンなどの免疫調節因子の濃度の増加は、腫瘍細胞が宿主抗腫瘍免疫応答を克服するのを助ける。

【0004】

アデノシンは、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞並びにナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの様々な免疫細胞上で発現された４つの異なる受容体（ＡＲ）に結合する。これらのプリン作動性Ｇタンパク質共役型受容体、Ａ１Ｒ、Ａ２ＡＲ、Ａ２ＢＲ、及びＡ３Ｒはそれぞれ、異なる特性、並びに細胞及び組織分布を示す。ＡＲへのアデノシンの結合は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の抗腫瘍応答を抑制し、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）及び骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）などの免疫抑制細胞の発達及び活性化も促進し、したがってがんの進行を促進する。アデノシン受容体の免疫調節作用に加えて、それらのシグナル伝達はまた、がん細胞の生存及び増殖に直接影響を及ぼし得る。

【0005】

ＴＭＥにおけるアデノシンの蓄積は、細胞外ＡＴＰをアデノシンに変換する経路において働く細胞表面酵素ＣＤ７３及びＣＤ３９によって媒介される。ＣＤ７３は、５’－ＮＴとしても公知であり、α－ヘリカルリンカーによってホモ二量体に連結された２つの６５ｋＤサブユニットからなる細胞外酵素である。多くのがん細胞によって過剰発現されると、ＣＤ７３は、特に腫瘍低酸素条件下で、５’－ＡＭＰのアデノシンへの加水分解を媒介する。研究により、ＣＤ７３の高発現は、トリプルネガティブ乳がん、肺がん、卵巣がん、腎臓がん、胃がん、及び黒色腫などの様々ながんにおいて予後不良をもたらすことが示されている。ＣＤ７３の阻害は、がん治療に対する強力なアプローチとなり得る。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本開示は、ＣＤ７３を標的化する新規な組換え抗体、並びにこれらの抗体の１つ以上を含む医薬組成物、並びにがんを処置するための抗体及び医薬組成物の使用に関する。抗体処置を含む、このようながんのために現在利用可能な処置と比較して、本明細書に記載される抗体及び組成物は、単独で、又は別のがん治療薬と組み合わせて、優れた臨床応答を提供し得ることが企図される。

【課題を解決するための手段】

【0007】

いくつかの態様では、本開示は、
ａ）配列番号９及び４１のアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）並びに配列番号１３及び４２のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）；
ｂ）配列番号１０及び４１のアミノ酸配列を含むＨＣ並びに配列番号１４及び４２のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｃ）配列番号１１及び４１のアミノ酸配列を含むＨＣ並びに配列番号１５及び４２のアミノ酸配列を含むＬＣ；又は
ｄ）配列番号１２及び４１のアミノ酸配列を含むＨＣ並びに配列番号１６及び４２のアミノ酸配列を含むＬＣ
を含む抗体と同じヒトＣＤ７３のエピトープに結合する抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合部分を提供する。

【0008】

特定の実施態様では、前記抗体の重鎖が、
ｉ）それぞれ配列番号１７～１９のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域（Ｈ－ＣＤＲ）１～３；
ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨ；又は
ｉｖ）配列番号９及び４１のアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）
を含み；
前記抗体の軽鎖が、
ｉ）それぞれ配列番号２０～２２のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域（Ｌ－ＣＤＲ）１～３；
ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＬ；又は
ｉｖ）配列番号１３及び４２のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）
を含む。

【0009】

特定の実施態様では、前記抗体の重鎖が、
ｉ）それぞれ配列番号２３～２５のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域（Ｈ－ＣＤＲ）１～３；
ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
ｉｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＨ；又は
ｉｖ）配列番号１０及び４１のアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）
を含み；
前記抗体の軽鎖が、
ｉ）それぞれ配列番号２６～２８のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域（Ｌ－ＣＤＲ）１～３；
ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＬ；又は
ｉｖ）配列番号１４及び４２のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）
を含む。

【0010】

特定の実施態様では、前記抗体の重鎖が、
ｉ）それぞれ配列番号２９～３１のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域（Ｈ－ＣＤＲ）１～３；
ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨ；又は
ｉｖ）配列番号１１及び４１のアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）
を含み；
前記抗体の軽鎖が、
ｉ）それぞれ配列番号３２～３４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域（Ｌ－ＣＤＲ）１～３；
ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＬ；又は
ｉｖ）配列番号１５及び４２のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）
を含む。

【0011】

特定の実施態様では、前記抗体の重鎖が、
ｉ）それぞれ配列番号３５～３７のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域（Ｈ－ＣＤＲ）１～３；
ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
ｉｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＨ；又は
ｉｖ）配列番号１２及び４１のアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）
を含み；
前記抗体の軽鎖が、
ｉ）それぞれ配列番号３８～４０のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域（Ｌ－ＣＤＲ）１～３；
ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
ｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＬ；又は
ｉｖ）配列番号１６及び４２のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）
を含む。

【0012】

いくつかの実施態様では、本開示は、
ａ）それぞれ配列番号１７～２２；
ｂ）それぞれ配列番号２３～２８；
ｃ）それぞれ配列番号２９～３４；又は
ｄ）それぞれ配列番号３５～４０
のＨ－ＣＤＲ１～３及びＬ－ＣＤＲ１～３アミノ酸配列を含む抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合部分を提供する。

【0013】

いくつかの実施態様では、本開示は、
ａ）それぞれ配列番号９及び１３；
ｂ）それぞれ配列番号１０及び１４；
ｃ）それぞれ配列番号１１及び１５；又は
ｄ）それぞれ配列番号１２及び１６
のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合部分を提供する。

【0014】

いくつかの実施態様では、本開示は、
ａ）それぞれ配列番号９及び１３；
ｂ）それぞれ配列番号１０及び１４；
ｃ）それぞれ配列番号１１及び１５；又は
ｄ）それぞれ配列番号１２及び１６
のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合部分を提供する。

【0015】

いくつかの実施態様では、本開示は、
ａ）配列番号９及び４１のアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）並びに配列番号１３及び４２のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）；
ｂ）配列番号１０及び４１のアミノ酸配列を含むＨＣ並びに配列番号１４及び４２のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｃ）配列番号１１及び４１のアミノ酸配列を含むＨＣ並びに配列番号１５及び４２のアミノ酸配列を含むＬＣ；又は
ｄ）配列番号１２及び４１のアミノ酸配列を含むＨＣ並びに配列番号１６及び４２のアミノ酸配列を含むＬＣ
を含む抗ＣＤ７３抗体を提供する。

【0016】

いくつかの実施態様では、本開示は、
ａ）配列番号４３のアミノ酸残基Ｒ７３、Ｒ１０９、及びＤ１６８；
ｂ）配列番号４３のアミノ酸残基Ｒ１０９；又は
ｃ）配列番号４３のアミノ酸残基Ｉ３０１、Ｓ３０２、及びＨ３０４
を含む、ヒトＣＤ７３上のエピトープに結合する抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合部分を提供する。
いくつかの実施態様では、本開示は、
ａ）配列番号４３のアミノ酸残基２７～３１、６１～７５、及び１６１～１７０；
ｂ）配列番号４３のアミノ酸残基６１～７０及び１６１～１７０；又は
ｃ）配列番号４３のアミノ酸残基２７～３１、２６６～２７０、及び２９１～３０５
を含む、ヒトＣＤ７３上のエピトープに結合する抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合部分を提供する。

【0017】

特定の実施態様では、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、
ａ）インビトロで可溶性ＣＤ７３の活性を阻害する；
ｂ）インビトロでＣａｌｕ－６細胞上のＣＤ７３の活性を阻害する；
ｃ）インビトロでＨ２９２細胞上のＣＤ７３の活性を阻害する；
ｄ）ＣＨＯ－Ｓ細胞上で発現されたヒト及びカニクイザルＣＤ７３に特異的に結合する；
ｅ）ＳＰＲによって測定される１nM以下のＫ_ＤでヒトＣＤ７３のＥＣＤに結合する；
ｆ）ＳＰＲによって測定される０．７nM以下のＫ_ＤでカニクイザルＣＤ７３のＥＣＤに結合する；
ｇ）オレクルマブ、ＣＰＸ００６、及び／又は１１Ｅ１と同じＣＤ７３のエピトープに結合しない；
ｈ）１：１複合体を生じる方法でＣＤ７３ホモ二量体上のエピトープに結合する；
ｉ）インビトロでオレクルマブよりも有効に可溶性ＣＤ７３活性を阻害する；
ｊ）インビトロでＣａｌｕ－６、Ｈ２９２、及びＣｙｎｏｍ－Ｋ１細胞上のＣＤ７３活性を阻害する；
ｋ）インビトロでＣａｌｕ－６、ＮＣＩ－Ｈ１７７５、ＫＹＳＥ－３０、及びＣａｐａｎ－２細胞上のＣＤ７３活性を阻害する；
ｌ）インビトロでＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞の増殖を阻害する；
ｍ）インビトロで初代ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞並びにＣＤ１９^＋Ｂ細胞上のＣＤ７３活性を阻害する；
ｎ）インビトロでＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖を回復させる；
ｏ）インビトロでＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞を活性化する；
ｐ）抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて、ＡＭＰの存在下で一方向混合リンパ球反応（ＭＬＲ）においてＴ細胞増殖を回復させる；
ｑ）一方向ＭＬＲにおいて、抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて、ＡＭＰの存在下でＴ細胞活性化を増強する；
ｒ）インビトロでＢ細胞活性化を刺激しない；
ｓ）インビトロでＨ２９２細胞中のＣＤ７３のレベルを２５％を超えて低下させない；
ｔ）Ａ３７５細胞を移植したＰＢＭＣヒト化マウスから収穫した腫瘍におけるＣＤ７３活性を阻害する；
ｕ）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を移植したＮＯＤ－ｓｃｉｄマウスにおけるインビボでの腫瘍成長を阻害する；
ｖ）Ｃａｌｕ－６細胞を移植したＰＢＭＣヒト化マウスにおけるインビボでの腫瘍成長を阻害する；及び
ｗ）Ａ３７５細胞を移植したＰＢＭＣヒト化マウスにおけるインビボでの腫瘍成長を阻害する
から選択される少なくとも１つの特性を有する。
具体的な実施態様では、抗体又は抗原結合部分が、前記特性の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、又は２３個全てを有する。

【0018】

特定の実施態様では、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、ＩｇＧ_１などのＩｇＧである。抗体は、Ｆ_Ｃ領域に少なくとも１つの変異を含み得る。例えば、抗体は、ＩｇＧ_１であり、ＩＭＧＴ（登録商標）ナンバリングスキームに従ってナンバリングされた重鎖アミノ酸２３４位及び２３５位の１つ以上に変異を含み得る。具体的な実施態様では、２３４位及び２３５位のアミノ酸残基の一方又は両方が、ＬｅｕからＡｌａに変異している。

【0019】

いくつかの実施態様では、本開示は、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合部分と、薬学的に許容し得る賦形剤とを含む、医薬組成物を提供する。特定の実施態様では、医薬組成物が、免疫刺激剤、ワクチン、化学療法剤、抗新生物剤、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害剤、及びＣＤ７３経路阻害剤の１つ以上を更に含み得る。

【0020】

いくつかの実施態様では、本開示は、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分の、重鎖若しくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、又は軽鎖若しくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、又はその両方を含む、単離核酸分子を提供する。特定の実施態様では、核酸分子が、配列番号１～８のいずれか１つのヌクレオチド配列を含み得る。

【0021】

いくつかの実施態様では、本開示は、本明細書に記載される単離核酸分子を含むベクターであって、発現制御配列を更に含む、ベクターを提供する。

【0022】

いくつかの実施態様では、本開示は、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分の、重鎖又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、及び軽鎖又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を含む、宿主細胞を提供する。

【0023】

いくつかの実施態様では、本開示は、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合部分を作製するための方法であって、本明細書に記載される宿主細胞を提供することと、当該宿主細胞を、抗体又は部分の発現に適した条件下で培養することと、得られた抗体又は部分を単離することとを含む、方法を提供する。

【0024】

いくつかの実施態様では、本開示は、本明細書に記載される１つ又は２つの別個の抗ＣＤ７３抗体の抗原結合部分を含む、二重特異性結合分子を提供する。

【0025】

いくつかの実施態様では、本開示は、それを必要とする患者のＣＤ７３活性を低下させるための方法であって、治療上有効量の本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体若しくは抗原結合部分、医薬組成物、又は二重特異性結合分子を当該患者に投与することを含む、方法を提供する。

【0026】

いくつかの実施態様では、本開示は、それを必要とする患者のＣＤ４^＋Ｔ細胞増殖を増加させるための方法であって、治療上有効量の本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体若しくは抗原結合部分、医薬組成物、又は二重特異性結合分子を当該患者に投与することを含む、方法を提供する。

【0027】

いくつかの実施態様では、本開示は、それを必要とする患者の免疫系を刺激するための方法であって、治療上有効量の本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体若しくは抗原結合部分、医薬組成物、又は二重特異性結合分子を当該患者に投与することを含む、方法を提供する。

【0028】

いくつかの実施態様では、本開示は、患者のがんを処置するための方法であって、治療上有効量の本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体若しくは抗原結合部分、医薬組成物、又は二重特異性結合分子を当該患者に投与することを含む、方法を提供する。特定の実施態様では、がんが、皮膚、肺、腸、結腸、卵巣、脳、前立腺、腎臓、軟部組織、造血系、頭頸部、肝臓、骨、膀胱、乳房、胃、子宮、子宮頸部、及び膵臓からなる群より選択される組織に起源を有する。特定の実施態様では、がんが、黒色腫、頭頸部がん、乳がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、膵臓がん、卵巣がん、腎細胞癌腫、前立腺がん、結腸直腸がん、胆管癌腫、甲状腺がん、又は精巣がんである。

【0029】

特定の実施態様では、本明細書に記載される処置が、免疫刺激剤、ワクチン、化学療法剤、抗新生物剤、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＣＤ７３経路阻害剤、又は放射線療法を患者に投与することを更に含む。

【0030】

いくつかの態様では、本開示は、
ａ）患者のＣＤ７３活性を低下させる；
ｂ）患者のＣＤ４^＋Ｔ細胞増殖を増加させる；
ｃ）患者の免疫系を刺激する；又は
ｄ）患者のがんを処置する
ための医薬を製造するための、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体若しくは抗原結合部分、医薬組成物、又は二重特異性結合分子の使用を提供する。

【0031】

いくつかの態様では、本開示は、
ａ）患者のＣＤ７３活性を低下させる；
ｂ）患者のＣＤ４^＋Ｔ細胞増殖を増加させる；
ｃ）患者の免疫系を刺激する；又は
ｄ）患者のがんを処置する
のに使用するための、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体若しくは抗原結合部分、医薬組成物、又は二重特異性結合分子を提供する。

【0032】

本発明の他の特徴、目的、及び利点は、以下の詳細な説明において明らかである。しかしながら、詳細な説明は、本発明の実施態様及び態様を示すが、限定ではなく例示としてのみ与えられることを理解すべきである。本発明の範囲内での様々な変更及び修正は、詳細な説明から当業者には明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】示される抗ＣＤ７３抗体で処理した後の可溶性ＣＤ７３の活性を示すグラフである。データを未処理対照に対して正規化し、平均±ＳＥＭとして表す。

【図2】示される抗ＣＤ７３抗体で処理した後にＣａｌｕ－６細胞（上）又はＨ２９２細胞（下）上で発現されたＣＤ７３の活性を示すグラフのペアである。データを未処理対照に対して正規化し、平均±ＳＥＭとして表す。

【図3】ＣＨＯ－Ｓ細胞上で発現されたヒト及びカニクイザルＣＤ７３への示される抗ＣＤ７３抗体及び参照抗体（オレクルマブ）類似体の結合を示すグラフのセットである。モックトランスフェクトＣＨＯ－Ｓ細胞を陰性対照として使用した。「対照Ａｂ」は、非ＣＤ７３特異的ＦｃγＲ欠損ＩｇＧ_１－ＬＡＬＡアイソタイプ抗体である。データを平均±ＳＥＭとして表す。

【図4】示される抗ＣＤ７３抗体について識別された競合パターン及びエピトープビンを示す概略図である。接続黒色線は、交差遮断活性を示す。接続点線は、一方向にのみ遮断する抗体を示す。抗体を、他の抗ＣＤ７３抗体との競合パターンに従ってグループ分けする。

【図5】開いた状態のＣＤ７３二量体（４Ｈ２Ｇ）の結晶構造上にマッピングされた抗体２１１２７（パネルＡ）、２１１６３（パネルＢ）、２１０４６（パネルＣ）、１１Ｅ１類似体（パネルＤ）、オレクルマブ類似体（パネルＥ）、及びＣＰＸ００６類似体（パネルＦ）の結合エピトープを示す図である。構造を表面表示として示し、Ｎ末端ドメインを淡灰色として、Ｃ末端ドメインを灰色として示す。アデノシンを白色の棒として示す（矢印で示される）。線状エピトープを濃灰色として示し、接触残基を黒色として示す。

【図6A】比ｍＡｂ：ＣＤ７３ １：１（黒色線）、０．５：１（濃灰色線）、０．１：１（淡灰色線）、０：１（灰色破線）及び１：０（黒色破線）でＣＤ７３と混合した抗体２１１２７、２１１６３、２１０４６、及び１１Ｅ１、オレクルマブ、及びＣＰＸ００６類似体の一連のＳＥＣ－ＭＡＬＳプロファイルを示す図である。様々なピークの計算したサイズを表１０に示す。

【図6B】比ｍＡｂ：ＣＤ７３ １：１（黒色線）、０．５：１（濃灰色線）、０．１：１（淡灰色線）、０：１（灰色破線）及び１：０（黒色破線）でＣＤ７３と混合した抗体２１１２７、２１１６３、２１０４６、及び１１Ｅ１、オレクルマブ、及びＣＰＸ００６類似体の一連のＳＥＣ－ＭＡＬＳプロファイルを示す図である。様々なピークの計算したサイズを表１０に示す。

【図7】示される抗ＣＤ７３抗体及び参照抗体（オレクルマブ）類似体で処理した後の可溶性ＣＤ７３の活性を示すグラフである。「対照Ａｂ」は、非ＣＤ７３特異的ＦｃγＲ欠損ＩｇＧ_１－ＬＡＬＡアイソタイプ抗体である。データを未処理対照に対して正規化し、平均±ＳＥＭとして表す。垂直の点線は、可溶性組換えＣＤ７３の抗体濃度と等モルの抗体濃度を示す。

【図8】示される抗ＣＤ７３抗体及び参照抗体（オレクルマブ）類似体で処理した後にＣａｌｕ－６細胞（上）、Ｈ２９２細胞（中央）、及びＣｙｎｏｍ－Ｋ１細胞（下）上で発現されたＣＤ７３の活性を示すグラフのセットである。「対照Ａｂ」は、非ＣＤ７３特異的ＦｃγＲ欠損ＩｇＧ_１－ＬＡＬＡアイソタイプ抗体である。データを未処理対照に対して正規化し、平均±ＳＥＭとして表す。

【図9】示される抗ＣＤ７３抗体及び参照抗体類似体（オレクルマブ）で３時間（上）、６時間（中央）、又は２４時間（下）処理した後にＨ２９２細胞上で発現されたＣＤ７３の活性を示すグラフのセットである。データを未処理対照に対して正規化し、平均±ＳＥＭとして表す。

【図10】ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイによって測定される、示される抗体の存在下で２０種の異なるがん細胞株によって発現されたＣＤ７３の活性を示すグラフである。「対照Ａｂ」は、非ＣＤ７３特異的ＦｃγＲ欠損ＩｇＧ１－ＬＡＬＡアイソタイプ抗体である。各データポイントは、３回の技術的反復の平均を表す。

【図11】３００μMのＡＭＰの存在下で成長させた２つのトリプルネガティブ乳がん細胞株ＭＢＡ－ＭＢ－２３１（上のパネル）及びＭＢＡ－ＭＢ－４６８（下のパネル）の生存率に対するＣＤ７３活性の遮断効果を示すグラフのペアである。「対照Ａｂ」は、非ＣＤ７３特異的ＦｃγＲ欠損ＩｇＧ１－ＬＡＬＡアイソタイプ抗体である。全てのカウントを未処理細胞に対して正規化し、データを３回の技術的反復の平均±ＳＥＭとして表す。

【図12】ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイによって測定される、示される抗体の存在下で健康なヒトドナー由来の初代ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞並びにＣＤ１９^＋Ｂ細胞によって発現されたＣＤ７３の活性を示すグラフのセットである。活性を未処理細胞（１００％）に対して正規化する。「対照Ａｂ」は、非ＣＤ７３特異的ＦｃγＲ欠損ＩｇＧ１－ＬＡＬＡアイソタイプ抗体である。データを３回の技術的反復の平均±ＳＥＭとして表す。

【図13】抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ、ＡＭＰ、並びに示される抗ＣＤ７３抗体及び参照抗体（オレクルマブ）類似体で処理したＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖を示すグラフである。データをＡＭＰで処理していない対照に対して正規化し、平均±ＳＥＭとして表す。

【図14】抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ、ＡＭＰ、及び２１１２７又は参照抗体（オレクルマブ）類似体で処理したＣＤ４^＋（上のパネル）及びＣＤ８^＋（下のパネル）Ｔ細胞の活性化を示すグラフのペアである。「対照Ａｂ」は、非ＣＤ７３特異的ＦｃγＲ欠損ＩｇＧ１－ＬＡＬＡアイソタイプ抗体である。データを平均±ＳＥＭとして表す。

【図15】抗ＰＤ－１抗体（１２８１９）、ＡＭＰ、及び示される抗ＣＤ７３抗体又は参照抗体（オレクルマブ）類似体とのインキュベーション時の一方向混合リンパ球反応（ＭＬＲ）におけるＴ細胞増殖を示すグラフである。「対照Ａｂ」は、非ＣＤ７３特異的ＦｃγＲ欠損ＩｇＧ１－ＬＡＬＡアイソタイプ抗体である。データをＡＭＰで処理していない対照に対して正規化し、平均±ＳＥＭとして表す。

【図16】ＡＭＰあり（下のパネル）又はなし（上のパネル）での、示される濃度の抗ＰＤ－１及び／又は抗ＣＤ７３抗体とのインキュベーション時の一方向ＭＬＲにおけるＴ細胞増殖を示すグラフのペアである。１２８１９＋２１１２７の組み合わせは、２つの抗体の１：１混合物であり、示される濃度は混合物の総濃度を示す。「対照Ａｂ」は、非ＣＤ７３特異的ＦｃγＲ欠損ＩｇＧ１－ＬＡＬＡアイソタイプ抗体である。データをＡＭＰで処理していない対照に対して正規化し、平均±ＳＥＭとして表す。

【図17A】示される抗体（１０μg/mL）及びＣＤ４０リガンド（０．５μg/mL）で一晩刺激した健康なドナー由来のＰＢＭＣにおけるＢ細胞活性化を示す図である。図１７Ａは、Ｂ細胞（ＣＤ２０^＋）上のＣＤ６９のレベルを示す一連のプロットである。

【図17B】図１７Ｂは、Ｂ細胞活性化マーカーＣＤ２５、ＣＤ６９及びＣＤ８３の抗体染色についての平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す一連のグラフである。「ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ対照」は、非ＣＤ７３特異的ＦｃγＲ欠損ＩｇＧ１－ＬＡＬＡアイソタイプ抗体である。データは１人のドナーからの反復であり、平均±ＳＥＭとして表す。

【図18】示される抗ＣＤ７３抗体又は参照抗体（オレクルマブ）類似体による２４時間の処理後にＨ２９２細胞で発現されたＣＤ７３のレベルを示すグラフである。データを未処理対照に対して正規化し、平均±ＳＥＭとして表す。

【図19】示される抗体による処置後のヒト異種移植片黒色腫モデルＡ３７５におけるＣＤ７３の活性を示すグラフのペアである。上のパネル：Ａ３７５を移植したＰＢＭＣヒト化マウスに、様々な用量の２１１２７を２週間にわたって１週間に３回投与した。最後の投与の１日後に腫瘍を収穫し、ＣＤ７３活性について分析した。下のパネル：Ａ３７５を皮下移植したＮＯＤ－ｓｃｉｄマウスを、示される抗体又は組み合わせで１週間にわたって１週間に３回処置した。最後の処置の３、７、１０、１７、及び２９日後に腫瘍を収穫し、ＣＤ７３活性について分析した。データを未処理対照に対して正規化し、平均±ＳＥＭとして表す。

【図20】ヒトトリプルネガティブ乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１を皮下移植したＮＯＤ－ｓｃｉｄマウスにおける腫瘍成長を示すグラフである。マウスを、１０mg/kgの抗体２１１２７又は参照抗体（オレクルマブ）類似体で１週間に２回処置した。灰色領域は、処置期間を示す。データを平均±ＳＥＭとして表す。

【図21】Ｃａｌｕ－６又はＡ３７５腫瘍細胞を移植したＰＢＭＣヒト化マウスにおける腫瘍成長に対する抗ＣＤ７３抗体２１１２７又はビヒクルによる処置の効果を示すグラフのペアである。灰色領域は、処置期間を示す。データを平均±ＳＥＭとして表す。^＊Ｐ＜０．０５

【発明を実施するための形態】

【0034】

本開示は、がん患者などの患者のＣＤ７３活性を抑制するために使用することができる新規な抗ヒトＣＤ７３抗体を提供する。特に明記しない限り、本明細書で使用される場合、「ＣＤ７３」はヒトＣＤ７３を指す。ヒトＣＤ７３ポリペプチド配列は、以下に示されるように、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２１５８９（５ＮＴＤ＿ＨＵＭＡＮ）（配列番号４３）で入手可能である。
10 20 30 40 50
MCPRAARAPA TLLLALGAVL WPAAGAWELT ILHTNDVHSR LEQTSEDSSK
60 70 80 90 100
CVNASRCMGG VARLFTKVQQ IRRAEPNVLL LDAGDQYQGT IWFTVYKGAE
110 120 130 140 150
VAHFMNALRY DAMALGNHEF DNGVEGLIEP LLKEAKFPIL SANIKAKGPL
160 170 180 190 200
ASQISGLYLP YKVLPVGDEV VGIVGYTSKE TPFLSNPGTN LVFEDEITAL
210 220 230 240 250
QPEVDKLKTL NVNKIIALGH SGFEMDKLIA QKVRGVDVVV GGHSNTFLYT
260 270 280 290 300
GNPPSKEVPA GKYPFIVTSD DGRKVPVVQA YAFGKYLGYL KIEFDERGNV
310 320 330 340 350
ISSHGNPILL NSSIPEDPSI KADINKWRIK LDNYSTQELG KTIVYLDGSS
360 370 380 390 400
QSCRFRECNM GNLICDAMIN NNLRHTDEMF WNHVSMCILN GGGIRSPIDE
410 420 430 440 450
RNNGTITWEN LAAVLPFGGT FDLVQLKGST LKKAFEHSVH RYGQSTGEFL
460 470 480 490 500
QVGGIHVVYD LSRKPGDRVV KLDVLCTKCR VPSYDPLKMD EVYKVILPNF
510 520 530 540 550
LANGGDGFQM IKDELLRHDS GDQDINVVST YISKMKVIYP AVEGRIKFST
560 570
GSHCHGSFSL IFLSLWAVIF VLYQ

【0035】

本明細書で使用される「抗体」（Ａｂ）又は「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、ジスルフィド結合によって相互接続された２本の重（Ｈ）鎖（約５０～７０kDa）及び２本の軽（Ｌ）鎖（約２５kDa）を含む四量体を指す。各重鎖は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成される。ＶＨ及びＶＬドメインは、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在する、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に更に細分され得る。各ＶＨ及びＶＬは、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシル末端まで配置された、３つのＣＤＲ（本明細書におけるＨ－ＣＤＲは重鎖由来のＣＤＲを示し；本明細書におけるＬ－ＣＤＲは軽鎖由来のＣＤＲを示す）及び４つのＦＲで構成される。重鎖又は軽鎖におけるアミノ酸番号、並びにＦＲ及びＣＤＲ領域の割り当ては、ＩＭＧＴ（登録商標）定義（ＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ；Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７（１）：５５－７７（２００３））；又はＫａｂａｔ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９８７ ａｎｄ １９９１））；Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８－８８３（１９８９）；ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６）；若しくはＨｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９（３）：６５７－７０（２００１）の定義に従い得る。

【0036】

「組換え抗体」という用語は、抗体をコードするヌクレオチド配列を含む細胞又は細胞株から発現される抗体を指し、前記ヌクレオチド配列は天然では細胞と関連していない。

【0037】

「単離タンパク質」、「単離ポリペプチド」又は「単離抗体」という用語は、その起源又は由来の源により、（１）その天然の状態で付随する天然に会合している成分と会合していない、（２）同じ種由来の他のタンパク質を含まない、（３）異なる種由来の細胞によって発現される、及び／又は（４）天然に存在しない、タンパク質、ポリペプチド又は抗体を指す。したがって、化学合成される、又は天然に由来する細胞とは異なる細胞系で合成されるポリペプチドは、その天然に会合している成分から「単離」される。タンパク質はまた、当技術分野において周知のタンパク質精製技術を使用して、単離によって天然に会合している成分を実質的に含まないようにされ得る。

【0038】

「親和性」という用語は、抗原と抗体との間の誘引の尺度を指す。抗原に対する抗体の固有の誘引性は、典型的には、具体的な抗体－抗原相互作用の結合親和性平衡定数（Ｋ_Ｄ）として表される。抗体は、Ｋ_Ｄが１mM以下、好ましくは１００nM以下である場合、抗原に特異的に結合すると言われる。Ｋ_Ｄ結合親和性定数は、例えば、ＩＢＩＳ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＩＢＩＳ ＭＸ９６ ＳＰＲシステム又はＦｏｒｔｅＢｉｏ製のＯｃｔｅｔ（商標）システムを使用して、例えば表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ（商標））又はバイオレイヤー干渉法によって測定され得る。

【0039】

本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、抗体又は二重特異性結合分子などの関連分子に特異的に結合する抗原の一部（決定基）を指す。エピトープ決定基は、一般的に、アミノ酸又は炭水化物又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、一般的に、特定の三次元構造特性及び特定の電荷特性を有する。エピトープは、「線状」又は「立体構造」であり得る。線状エピトープでは、タンパク質（例えば、抗原）と相互作用分子（抗体など）との間の相互作用点の全てが、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って線状に存在する。立体構造エピトープでは、相互作用点が、一次アミノ酸配列において互いに分離されているタンパク質上のアミノ酸残基にわたって存在する。抗原上の所望のエピトープが決定されると、当技術分野において周知の技術を使用してそのエピトープに対する抗体を作製することが可能である。例えば、線状エピトープに対する抗体は、例えば、線状エピトープのアミノ酸残基を有するペプチドで動物を免疫することによって作製され得る。立体構造エピトープに対する抗体は、例えば、立体構造エピトープの関連アミノ酸残基を含有するミニドメインで動物を免疫することによって作製され得る。具体的なエピトープに対する抗体はまた、例えば、対象となる標的分子（例えば、ＣＤ７３）又はその関連部分で動物を免疫化し、次いで、エピトープへの結合についてスクリーニングすることによっても作製され得る。

【0040】

競合アッセイ、エピトープビニング、及びアラニンスキャニングを含むが、これらに限定されるわけではない、当技術分野において公知の方法を使用することによって、抗体が本開示の抗ＣＤ７３抗体と同じエピトープに結合するかどうか、又はこれと結合について競合するかどうかを決定することができる。いくつかの実施態様では、本開示の抗ＣＤ７３抗体を飽和条件下でＣＤ７３に結合させ、次いで、試験抗体がＣＤ７３に結合する能力を測定する。試験抗体が参照抗ＣＤ７３抗体と同時にＣＤ７３に結合することができる場合、試験抗体は参照抗ＣＤ７３抗体とは異なるエピトープに結合する。しかしながら、試験抗体が同時にＣＤ７３に結合することができない場合、試験抗体は、本開示の抗ＣＤ７３抗体によって結合されるエピトープと同じエピトープ、重複するエピトープ、又はこれに近接するエピトープに結合する。この実験は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）、ＳＰＲ、バイオレイヤー干渉法又はフローサイトメトリーを使用して実施され得る。抗ＣＤ７３抗体が別の抗ＣＤ７３抗体と交差競合するかどうかを試験するために、２つの方向で上記の競合方法を使用することができる、すなわち、公知の抗体が試験抗体を遮断するかどうか、及びその逆を決定することができる。このような交差競合実験は、例えば、ＩＢＩＳ ＭＸ９６ ＳＰＲ機器又はＯｃｔｅｔ（商標）システムを使用して実施され得る。

【0041】

「ヒト抗体」という用語は、可変ドメイン及び定常領域配列がヒト配列に由来する抗体を指す。この用語は、ヒト遺伝子に由来するが、例えば、免疫原性を低下させる、親和性を増加させる、及び／又は安定性を増加させるように改変されている配列を有する抗体を包含する。更に、この用語は、ヒト細胞に典型的ではないグリコシル化を付与し得る非ヒト細胞で組換え産生された抗体を包含する。この用語はまた、ヒト抗体遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト生物（例えば、ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）ラット）において産生される抗体を包含する。

【0042】

本明細書で使用される抗体の「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）という用語は、抗原（例えば、ヒトＣＤ７３、又はその部分）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の部分又は断片を指す。完全長抗体の特定の断片が抗体の抗原結合機能を果たすことができることが示されている。「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片：ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片：ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬドメイン及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片；及び（ｖｉ）抗原に特異的に結合することができる単離相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。更に、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは別々の遺伝子によってコードされているが、これらは、組換え法を使用して、ＶＬドメイン及びＶＨドメインが対形成して一価分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる）を形成する単一タンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって連結され得る。ＶＨ及び／又はＶＬを含む抗原結合分子も本開示の範囲内である。ＶＨの場合、分子はまた、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、又はＣＨ３領域の１つ以上を含み得る。このような一本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることが意図されている。ダイアボディなどの一本鎖抗体の他の形態も包含される。ダイアボディは、ＶＨドメイン及びＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖上で発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎ、それによって、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対形成させ、２つの抗原結合部位を作り出すリンカーを使用した、二価の二重特異性抗体である。

【0043】

Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）_２断片などの抗体部分は、全抗体のパパイン又はペプシン消化などの従来技術を使用して全抗体から調製され得る。更に、抗体、抗体部分及び免疫接着分子は、例えば本明細書に記載される、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して得られ得る。

【0044】

抗ＣＤ７３抗体のクラス（アイソタイプ）及びサブクラスは、当技術分野において公知の任意の方法によって決定され得る。一般的に、抗体のクラス及びサブクラスは、抗体の具体的なクラス及びサブクラスに特異的な抗体を使用して決定され得る。このような抗体は市販されている。クラス及びサブクラスは、ＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロット及び他の技術によって決定され得る。或いは、クラス及びサブクラスは、抗体の重鎖及び／又は軽鎖の定常領域の全部又は一部を配列決定し、それらのアミノ酸配列を免疫グロブリンの様々なクラス及びサブクラスの公知のアミノ酸配列と比較し、抗体のクラス及びサブクラスを決定することによって決定され得る。

【0045】

別段の指示がない限り、本開示で言及される全ての抗体アミノ酸残基番号は、ＩＭＧＴ（登録商標）ナンバリングスキーム（ＥＵナンバリング）に基づくものである。

【0046】

抗ＣＤ７３抗体
本開示は、ＣＤ７３に対する抗体、及びその抗原結合部分を提供する。具体的な実施態様では、本明細書で開示される抗体が、再編成されたヒト抗体遺伝子によってコードされる抗体を産生することができるトランスジェニック動物（例えば、ラット）から作製されるヒト抗体である。特定の実施態様では、ヒト抗体が、例えば、プライマー由来の変異を生殖系列配列に戻すように変化させるための特定の変異を含有し得る（例えば、表１の「Ｓｙｍｐｌｅｘ修正」変異体参照）。

【0047】

いくつかの実施態様では、本開示の抗ＣＤ７３抗体が、Ｆｃ領域に「ＬＡＬＡ」変異（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）を有する。これらの変異は、ヒトＦｃγＲ（Ｆｃガンマ受容体）に対する抗体の結合を弱める。このような抗体は、低レベルの二次エフェクター機能を有し、エフェクターＴ細胞を枯渇させず、他の非悪性細胞を標的化もしないので有利である。

【0048】

いくつかの実施態様では、抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、
ａ）配列番号９及び４１のアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）並びに配列番号１３及び４２のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）；
ｂ）配列番号１０及び４１のアミノ酸配列を含むＨＣ並びに配列番号１４及び４２のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｃ）配列番号１１及び４１のアミノ酸配列を含むＨＣ並びに配列番号１５及び４２のアミノ酸配列を含むＬＣ；又は
ｄ）配列番号１２及び４１のアミノ酸配列を含むＨＣ並びに配列番号１６及び４２のアミノ酸配列を含むＬＣ
を含む抗体とヒトＣＤ７３への結合について競合若しくは交差競合する、又はこれを含む抗体と同じヒトＣＤ７３のエピトープに結合する。

【0049】

いくつかの実施態様では、抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、配列番号１９、２５、３１、又は３７の重鎖ＣＤＲ３（Ｈ－ＣＤＲ３）アミノ酸配列を有する。

【0050】

いくつかの実施態様では、抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、それぞれ配列番号１７～１９、２３～２５、２９～３１、又は３５～３７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３（Ｈ－ＣＤＲ１～３）を有する。

【0051】

いくつかの実施態様では、抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、配列番号９～１２のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を有する。

【0052】

いくつかの実施態様では、抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、配列番号９～１２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨを有する。

【0053】

いくつかの実施態様では、抗ＣＤ７３抗体が、配列番号９～１２のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のＶＨアミノ酸配列；及び配列番号４１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の重鎖定常領域アミノ酸配列を有する。

【0054】

いくつかの実施態様では、抗ＣＤ７３抗体が、配列番号９～１２のいずれか１つのＶＨアミノ酸配列及び配列番号４１の重鎖定常領域アミノ酸配列を含む。

【0055】

いくつかの実施態様では、抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、配列番号２２、２８、３４、又は４０の軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ－ＣＤＲ３）アミノ酸配列を有する。

【0056】

いくつかの実施態様では、抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、それぞれ配列番号２０～２２、２６～２８、３２～３４、又は３８～４０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３（Ｌ－ＣＤＲ１～３）を有する。

【0057】

いくつかの実施態様では、抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、配列番号１３～１６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列を有する。

【0058】

いくつかの実施態様では、抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、配列番号１３～１６のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＬを有する。

【0059】

いくつかの実施態様では、抗ＣＤ７３抗体が、配列番号１３～１６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のＶＬアミノ酸配列；及び配列番号４２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の軽鎖定常領域アミノ酸配列を有する。

【0060】

いくつかの実施態様では、抗ＣＤ７３抗体が、配列番号１３～１６のいずれか１つのＶＬアミノ酸配列及び配列番号４２の軽鎖定常領域アミノ酸配列を含む。

【0061】

特定の実施態様では、抗ＣＤ７３抗体が、上記の重鎖のいずれか１つ及び上記の軽鎖のいずれか１つを含む。

【0062】

いくつかの実施態様では、本開示の抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、
ａ）それぞれ配列番号１７～２２；
ｂ）それぞれ配列番号２３～２８；
ｃ）それぞれ配列番号２９～３４；又は
ｄ）それぞれ配列番号３５～４０
のＨ－ＣＤＲ１～３及びＬ－ＣＤＲ１～３アミノ酸配列を含む。

【0063】

いくつかの実施態様では、本開示の抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、
ａ）それぞれ配列番号９及び１３；
ｂ）それぞれ配列番号１０及び１４；
ｃ）それぞれ配列番号１１及び１５；又は
ｄ）それぞれ配列番号１２及び１６
のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のＶＨ及びＶＬを含む。

【0064】

いくつかの実施態様では、本開示の抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、
ａ）それぞれ配列番号９及び１３；
ｂ）それぞれ配列番号１０及び１４；
ｃ）それぞれ配列番号１１及び１５；又は
ｄ）それぞれ配列番号１２及び１６
のアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。

【0065】

いくつかの実施態様では、本開示の抗ＣＤ７３抗体が、
ａ）配列番号９及び４１のアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）並びに配列番号１３及び４２のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）；
ｂ）配列番号１０及び４１のアミノ酸配列を含むＨＣ並びに配列番号１４及び４２のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｃ）配列番号１１及び４１のアミノ酸配列を含むＨＣ並びに配列番号１５及び４２のアミノ酸配列を含むＬＣ；又は
ｄ）配列番号１２及び４１のアミノ酸配列を含むＨＣ並びに配列番号１６及び４２のアミノ酸配列を含むＬＣ
を含む。

【0066】

本開示はまた、抗体２１０２８、２１０４６、２１１２７、又は２１１６３と結合について競合若しくは交差競合する、又はこれと同じエピトープに結合する抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合部分を提供する。

【0067】

いくつかの実施態様では、本開示の抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、抗体２１０２８、２１０４６、２１１２７、又は２１１６３のＨ－ＣＤＲ１～３及びＬ－ＣＤＲ１～３アミノ酸配列を含む。

【0068】

いくつかの実施態様では、本開示の抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、抗体２１０２８、２１０４６、２１１２７、又は２１１６３のＶＨ及びＶＬとアミノ酸配列がそれぞれ少なくとも９０％同一のＶＨ及びＶＬを含む。

【0069】

いくつかの実施態様では、本開示の抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、抗体２１０２８、２１０４６、２１１２７、又は２１１６３のそれぞれＶＨ及びＶＬであるＶＨ及びＶＬを含む。

【0070】

いくつかの実施態様では、本開示の抗ＣＤ７３抗体が、抗体２１０２８、２１０４６、２１１２７、若しくは２１１６３、又は前記抗体と同じアミノ酸配列を含む抗体である。

【0071】

本明細書に記載される方法によって得られる抗ＣＤ７３抗体のクラスは、別のクラス又はサブクラスで変更され得る、又はスイッチされ得る。本開示のいくつかの実施態様では、ＶＬ又はＶＨをコードする核酸分子が、それぞれＣＬ又はＣＨをコードする核酸配列を含まないように、当技術分野において周知の方法を使用して単離される。次いで、ＶＬ又はＶＨをコードする核酸分子が、異なるクラスの免疫グロブリン分子由来のＣＬ又はＣＨをそれぞれコードする核酸配列に作動可能に連結される。これは、上記の、ＣＬ又はＣＨ配列を含むベクター又は核酸分子を使用して達成され得る。例えば、元々ＩｇＭであった抗ＣＤ７３抗体は、ＩｇＧにクラススイッチされ得る。更に、クラススイッチングを使用して、あるＩｇＧサブクラスを別のサブクラスに、例えばＩｇＧ_１からＩｇＧ_２に変換することができる。κ軽鎖定常領域を、例えばλ軽鎖定常領域に変更することができる、又は逆もまた同様である。所望のＩｇアイソタイプを有する本開示の抗体を作製する例示的な方法は、抗ＣＤ７３抗体の重鎖をコードする核酸分子及び抗ＣＤ７３抗体の軽鎖をコードする核酸分子を単離するステップと、重鎖の可変ドメインを得るステップと、重鎖の可変ドメインのコード配列を所望のアイソタイプの重鎖の定常領域のコード配列と連結するステップと、細胞内で連結された配列によってコードされる軽鎖及び重鎖を発現させるステップと、所望のアイソタイプを有する抗ＣＤ７３抗体を回収するステップとを含む。

【0072】

本開示の抗ＣＤ７３抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、又はＩｇＤ分子であり得るが、典型的にはＩｇＧアイソタイプ、例えばＩｇＧサブクラスＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２ａ若しくはＩｇＧ_２ｂ、ＩｇＧ_３又はＩｇＧ_４のものである。いくつかの実施態様では、抗体がアイソタイプサブクラスＩｇＧ_１のものである。いくつかの実施態様では、抗体がアイソタイプサブクラスＩｇＧ_２のものである。

【0073】

いくつかの実施態様では、抗ＣＤ７３抗体が、Ｆｃ領域に少なくとも１つの変異を含み得る。いくつかの異なるＦｃ変異が公知であり、これらの変異は抗体のエフェクター機能を変化させる。例えば、多くの場合、例えばリガンド／受容体相互作用が望ましくない場合、又は抗体－薬物コンジュゲートの場合、エフェクター機能を低下させる、又は排除することが望ましいであろう。

【0074】

いくつかの実施態様では、抗ＣＤ７３抗体が、エフェクター機能を低下させるＦｃ領域の少なくとも１つの変異、例えば２２８位、２３３位、２３４位及び２３５位の１つ以上の変異を含み、アミノ酸位置はＩＭＧＴ（登録商標）ナンバリングスキームに従ってナンバリングされる。

【0075】

いくつかの実施態様では、例えば、抗体がＩｇＧ_１サブクラスのものである場合、２３４位及び２３５位のアミノ酸残基の一方又は両方が、例えば、ＬｅｕからＡｌａに変異され得る（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）。これらの変異は、ＩｇＧ_１抗体のＦｃ領域のエフェクター機能を低下させる。アミノ酸位置は、ＩＭＧＴ（登録商標）ナンバリングスキームに従ってナンバリングされる。

【0076】

いくつかの実施態様では、例えば、抗体がＩｇＧ_４サブクラスのものである場合、変異Ｓ２２８Ｐを含み得、アミノ酸位置はＩＭＧＴ（登録商標）ナンバリングスキームに従ってナンバリングされる。この突然は、望ましくないＦａｂアーム交換を減少させることが知られている。

【0077】

いくつかの実施態様では、本発明の抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合部分が、配列番号４３の以下の残基：Ｒ７３、Ｒ１０９、Ｄ１６８、Ｉ３０１、Ｓ３０２、及びＨ３０４の少なくとも１つ（例えば、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つ）を含むＣＤ７３のエピトープに結合する。特定の実施態様では、抗体又は抗原結合部分が、残基Ｒ７３、Ｒ１０９、及びＤ１６８を含む、又はからなるＣＤ７３のエピトープに結合する（抗体２１１２７など）。特定の実施態様では、抗体又は抗原結合部分が、残基Ｒ１０９を含む、又はからなるＣＤ７３のエピトープに結合する（抗体２１１６３など）。特定の実施態様では、抗体又は抗原結合部分が、残基Ｉ３０１、Ｓ３０２、及びＨ３０４を含む、又はからなるＣＤ７３のエピトープに結合する（抗体２１０４６など）。

【0078】

いくつかの実施態様では、本発明の抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合部分が、配列番号４３の残基２７～３１、６１～７０、６１～７５、１６１～１７０、２６６～２７０、及び／又は２９１～３０５を含むＣＤ７３のエピトープに結合する。特定の実施態様では、抗体又は抗原結合部分が、残基２７～３１、６１～７５、及び１６１～１７０を含む、又はからなるＣＤ７３のエピトープに結合する（抗体２１１２７など）。特定の実施態様では、抗体又は抗原結合部分が、残基６１～７０及び１６１～１７０を含む、又はからなるＣＤ７３のエピトープに結合する（抗体２１１６３など）。特定の実施態様では、抗体又は抗原結合部分が、残基２７～３１、２６６～２７０、及び２９１～３０５を含む、又はからなるＣＤ７３のエピトープに結合する（抗体２１０４６など）。

【0079】

いくつかの実施態様では、抗体又は部分が、配列番号４３の残基２７～３１（又はその断片、例えば１、２、３、若しくは４残基断片）を含むエピトープに結合する（抗体２１１２７及び２１０４６など）。いくつかの実施態様では、抗体又は部分が、配列番号４３の残基６１～７５（又はその断片、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、若しくは１４残基断片、例えば残基６１～７０）を含むエピトープに結合する（抗体２１１２７及び２１１６３など）。いくつかの実施態様では、抗体又は部分が、配列番号４３の残基１６１～１７０（又はその断片、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、若しくは９残基断片）を含むエピトープに結合する（抗体２１１２７及び２１１６３など）。いくつかの実施態様では、抗体又は部分が、配列番号４３の残基２６６～２７０（又はその断片、例えば１、２、３、若しくは４残基断片）を含むエピトープに結合する（抗体２１０４６など）。いくつかの実施態様では、抗体又は部分が、配列番号４３の残基２９１～３０５（又はその断片、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、若しくは１４残基断片）を含むエピトープに結合する（抗体２１０４６など）。

【0080】

上記残基又は表９に示される残基の任意の組み合わせを含むエピトープも企図される。

【0081】

いくつかの実施態様では、本明細書に記載されるＣＤ７３エピトープを含むアミノ酸配列を免疫原として使用して（例えば、動物に投与する、又は抗体ライブラリーをスクリーニングするための抗原として）、前記エピトープに結合する抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合部分を作製又は識別することができる。

【0082】

いくつかの実施態様（例えば、１０μg/mLの濃度で）では、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、可溶性ＣＤ７３の活性を少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％（例えば、少なくとも４０％）阻害する。いくつかの実施態様では、１、２、３、４、５、７、１０、１５、２０、３０、４０、５０、又は１００μg/mLの濃度で、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、可溶性ＣＤ７３の活性を少なくとも９０％阻害する。

【0083】

いくつかの実施態様（例えば、１０μg/mLの濃度で）では、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、Ｃａｌｕ－６細胞上のＣＤ７３の活性を少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％（例えば、少なくとも７５％）阻害する。

【0084】

いくつかの実施態様（例えば、１０μg/mLの濃度で）では、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、Ｈ２９２細胞上のＣＤ７３の活性を少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％（例えば、少なくとも８０％）阻害する。

【0085】

いくつかの実施態様では、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、ＣＨＯ－Ｓ細胞上で発現されたヒトＣＤ７３、カニクイザルＣＤ７３、又はその両方に特異的に結合する。

【0086】

いくつかの実施態様では、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される、１nM、０．９nM、０．８nM、０．７nM、０．６nM、０．５nM、０．４nM、０．３nM、０．２nM、０．１nM、０．０９nM、０．０８nM、０．０７nM、０．０６nM、０．０５nM、０．０４nM、０．０３nM、０．０２nM、又は０．０１nM以下（例えば、１nM以下）のＫ_ＤでヒトＣＤ７３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に、結合する。

【0087】

いくつかの実施態様では、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される、１nM、０．９nM、０．８nM、０．７nM、０．６nM、０．５nM、０．４nM、０．３nM、０．２nM、０．１nM、０．０９nM、０．０８nM、０．０７nM、０．０６nM、０．０５nM、０．０４nM、０．０３nM、０．０２nM、又は０．０１nM以下（例えば、０．７nM以下）のＫ_ＤでカニクイザルＣＤ７３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に結合する。

【0088】

いくつかの実施態様では、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、オレクルマブ、ＣＰＸ００６、１１Ｅ１、又はこれらの任意の組み合わせと同じＣＤ７３のエピトープに結合しない。

【0089】

いくつかの実施態様では、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、１：１複合体を生じる方法でＣＤ７３ホモ二量体上のエピトープに結合する。特定の実施態様では、抗体／ＣＤ７３の結合が、１：１複合体のみを生じる。特定の実施態様では、抗体／ＣＤ７３の結合が、主に１：１複合体を生じる。具体的な実施態様では、ＣＤ７３への抗体又は抗原結合部分の結合が、ＣＤ７３濃度とは無関係に１：１複合体を生じる。

【0090】

いくつかの実施態様では、例えば１、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００μg/mL以下の濃度（１０μg/mL以下の濃度など）で、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、可溶性ＣＤ７３活性を阻害する。特定の実施態様では（例えば、１０μg/mLの濃度で）、抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、前記ＣＤ７３活性をオレクルマブよりも有効に阻害する。具体的な実施態様では（例えば、上記の濃度の１つの抗体又は抗原結合部分を用いる）、ＣＤ７３活性が少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％阻害される。例えば、抗体又は抗原結合部分は、３μg/mLの濃度でＣＤ７３活性を１００％阻害し得る。

【0091】

いくつかの実施態様では、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、又は１００μg/mL以下の濃度（３μg/mL以下の濃度など）で、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、Ｃａｌｕ－６、Ｈ２９２、Ｃｙｎｏｍ－Ｋ１細胞、又はこれらの任意の組み合わせ上のＣＤ７３活性を阻害する。特定の実施態様では、抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、前記ＣＤ７３活性をオレクルマブよりも有効に阻害する。特定の実施態様では、抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、３、６、又は２４時間の追加のインキュベーション後に、オレクルマブよりも有効なままである。具体的な実施態様では（例えば、上記の濃度の１つの抗体又は抗原結合部分を用いる）、ＣＤ７３活性が少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％阻害される。

【0092】

いくつかの実施態様（例えば、２５μg/mLの濃度で）では、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、表１１に示される任意の細胞株又は細胞株の組み合わせ上のＣＤ７３活性を阻害する。特定の実施態様では、抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、Ｃａｌｕ－６、ＮＣＩ－Ｈ１７７５細胞、ＫＹＳＥ－３０細胞、Ｃａｐａｎ－２細胞、又はこれらの任意の組み合わせ上のＣＤ７３活性を阻害する。特定の実施態様では、抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、前記ＣＤ７３活性をオレクルマブよりも有効に阻害する。

【0093】

いくつかの実施態様では、例えば０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、又は２５μg/mL以下の濃度（０．０１μg/mL以下の濃度など）で、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、インビトロでＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞、又はその両方の生存及び／又は増殖を阻害する。特定の実施態様では（例えば、０．５μg/mL以上の濃度で）、抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、前記生存／増殖をオレクルマブよりも有効に阻害する。具体的な実施態様では（例えば、上記の濃度の１つの抗体又は抗原結合部分を用いる）、生細胞の数が少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％減少する。

【0094】

いくつかの実施態様では、例えば０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、又は２５μg/mL以下の濃度（０．１μg/mL以下の濃度など）で、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、初代ＣＤ４^＋細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ１９^＋Ｂ細胞、又はこれらの任意の組み合わせ上のＣＤ７３活性を阻害する。具体的な実施態様では（例えば、上記の濃度の１つの抗体又は抗原結合部分を用いる）、ＣＤ７３活性が例えば少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％阻害される。

【0095】

いくつかの実施態様では、例えば０．０５、０．１、０．５、又は１μg/mL以下の濃度（０．０１μg/mL以下の濃度など）で、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖を回復させる。いくつかの実施態様では、例えば０．１、０．５、１、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、又は１００μg/mL以下の濃度（２５μg/mL以下の濃度など）で、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖を１００％に回復させる。いくつかの実施態様では（例えば、０．１μg/mL以上の濃度で）、抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖をオレクルマブよりも有効に回復させる。特定の実施態様では（例えば、上記の濃度の１つの抗体又は抗原結合部分を用いる）、Ｔ細胞の増殖が少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％に回復される。

【0096】

いくつかの実施態様では、例えば０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、１、５、１０、１５、又は２５μg/mL以下の濃度（１μg/mL以下の濃度など）で、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞を活性化する。いくつかの実施態様では（例えば、０．１μg/mL以上の濃度で）、抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞をオレクルマブよりも有効に活性化する。

【0097】

いくつかの実施態様では、例えば０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５、又は１０μg/mL以下の濃度（０．０１μg/mL以下の濃度など）で、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて、一方向混合リンパ球反応（ＭＬＲ）において、ＡＭＰの存在下でＴ細胞増殖を回復させる。特定の実施態様では（例えば、１μg/mL以下の濃度で）、抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて、Ｔ細胞増殖を完全に回復させる。特定の実施態様では（例えば、０．１μg/mL以上の濃度で）、抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて、Ｔ細胞増殖をオレクルマブよりも有効に回復させる。具体的な実施態様では（例えば、抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて、上記の濃度の１つの抗体又は抗原結合部分を用いる）、Ｔ細胞増殖が少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％に回復される。

【0098】

いくつかの実施態様では、例えば０．５、１、５、１０、１５、又は２５μg/mL以下の濃度（１μg/mL以下の濃度など）で、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、一方向ＭＬＲにおいて、ＡＭＰの存在下でＴ細胞活性化を増強する。いくつかの実施態様では、抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、抗ＰＤ－１抗体（１２８１９など）と組み合わせて、一方向ＭＬＲにおいて、ＡＭＰの存在下でＴ細胞活性化を増強する。

【0099】

いくつかの実施態様では（例えば、１０μg/mLの濃度で）、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、インビトロでＢ細胞活性化を刺激しない。いくつかの実施態様では（例えば、１０μg/mLの濃度で）、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、インビトロでＢ細胞活性化を刺激する。Ｂ細胞活性化は、例えば、ＣＤ２５、ＣＤ６９、及び／又はＣＤ８３などのマーカーを見ることによって決定され得る。

【0100】

いくつかの実施態様では（例えば、２５μg/mLの濃度で）、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、インビトロでＨ２９２細胞中のＣＤ７３のレベルを低下させない。いくつかの実施態様では（例えば、２５μg/mLの濃度で）、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、インビトロでＨ２９２細胞中のＣＤ７３のレベルを、例えば、未処理対照と比較して４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％以下に低下させる。いくつかの実施態様では（例えば、２５μg/mLの濃度で）、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、インビトロでＨ２９２細胞中のＣＤ７３のレベルをわずかに低下させるだけである。例えば、特定の実施態様では、ＣＤ７３のレベルが、例えば、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、又は３５％（例えば、２５％）以下低下する。

【0101】

いくつかの実施態様では、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、Ａ３７５細胞を移植したＰＢＭＣヒト化マウスから収穫した腫瘍におけるＣＤ７３活性を阻害する（例えば、マウスに５mg/kg、２０mg/kg、又は５０mg/kgの抗体又は抗原結合部分を１週間又は２週間にわたって１週間に３回投与する場合）。特定の実施態様では、ＣＤ７３活性の阻害が、処置が終了した後少なくとも２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、又は２００日間（例えば、少なくとも２８日間）にわたって維持される。

【0102】

いくつかの実施態様では、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を移植したＮＯＤ－ｓｃｉｄマウスにおける腫瘍成長を阻害する（例えば、マウスに１０mg/kgの抗体又は抗原結合部分を合計１６回の処置にわたって１週間に２回投与する場合）。特定の実施態様では、腫瘍成長阻害が、処置が終了した後少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、又は２００日間（例えば、少なくとも６０日間）にわたって、腫瘍体積の増加が制限された状態で維持される（例えば、１０、２０、３０、４０、又は５０mm³未満）。

【0103】

いくつかの実施態様では、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、Ｃａｌｕ－６又はＡ３７５細胞を移植したＰＢＭＣヒト化マウスにおける腫瘍成長を阻害する（例えば、マウスに１０mg/kgの抗体又は抗原結合部分を合計６回の処置にわたって１週間に３回投与する場合）。

【0104】

本開示はまた、上記の特性の任意の組み合わせを有する抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分を企図する。

【0105】

いくつかの実施態様では、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、以下の特性：
ａ）インビトロで可溶性ＣＤ７３の活性を阻害する；
ｂ）インビトロでＣａｌｕ－６細胞上のＣＤ７３の活性を阻害する；
ｃ）インビトロでＨ２９２細胞上のＣＤ７３の活性を阻害する；
ｄ）ＣＨＯ－Ｓ細胞上で発現されたヒト及びカニクイザルＣＤ７３に特異的に結合する；
ｅ）ＳＰＲによって測定される１nM以下のＫ_ＤでヒトＣＤ７３のＥＣＤに結合する；
ｆ）ＳＰＲによって測定される０．７nM以下のＫ_ＤでカニクイザルＣＤ７３のＥＣＤに結合する；
ｇ）オレクルマブ、ＣＰＸ００６、及び／又は１１Ｅ１と同じＣＤ７３のエピトープに結合しない；
ｈ）１：１複合体を生じる方法でＣＤ７３ホモ二量体上のエピトープに結合する；
ｉ）インビトロでオレクルマブよりも有効に可溶性ＣＤ７３活性を阻害する；
ｊ）インビトロでＣａｌｕ－６、Ｈ２９２、及びＣｙｎｏｍ－Ｋ１細胞上のＣＤ７３活性を阻害する；
ｋ）インビトロでＣａｌｕ－６、ＮＣＩ－Ｈ１７７５、ＫＹＳＥ－３０、及びＣａｐａｎ－２細胞上のＣＤ７３活性を阻害する；
ｌ）インビトロでＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞の増殖を阻害する；
ｍ）インビトロで初代ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞並びにＣＤ１９^＋Ｂ細胞上のＣＤ７３活性を阻害する；
ｎ）インビトロでＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖を回復させる；
ｏ）インビトロでＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞を活性化する；
ｐ）抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて、ＡＭＰの存在下で一方向混合リンパ球反応（ＭＬＲ）においてＴ細胞増殖を回復させる；
ｑ）一方向ＭＬＲにおいて、抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて、ＡＭＰの存在下でＴ細胞活性化を増強する；
ｒ）インビトロでＢ細胞活性化を刺激しない；
ｓ）インビトロでＨ２９２細胞中のＣＤ７３のレベルを２５％を超えて低下させない；
ｔ）Ａ３７５細胞を移植したＰＢＭＣヒト化マウスから収穫した腫瘍におけるＣＤ７３活性を阻害する；
ｕ）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を移植したＮＯＤ－ｓｃｉｄマウスにおけるインビボでの腫瘍成長を阻害する；
ｖ）Ｃａｌｕ－６細胞を移植したＰＢＭＣヒト化マウスにおけるインビボでの腫瘍成長を阻害する；及び
ｗ）Ａ３７５細胞を移植したＰＢＭＣヒト化マウスにおけるインビボでの腫瘍成長を阻害する
の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、又は２３個全て）を有する。
いくつかの実施態様では、抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、特性ａ）～ｗ）の全てを有する。いくつかの実施態様では、抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、少なくとも特性ａ）～ｋ）、ｎ）、及びｓ）を有する。いくつかの実施態様では、抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、少なくとも特性ａ）～ｇ）、ｉ）～ｋ）、及びｎ）を有する。いくつかの実施態様では、抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、少なくとも特性ａ）～ｄ）、ｉ）～ｋ）、ｎ）、及びｓ）を有する。

【0106】

いくつかの実施態様では、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、インビボで腫瘍成長を阻害及び／若しくは腫瘍成長退縮を誘導し得る、がん患者における転移を減速若しくは逆転させ得る、並びに／又はがん患者の生存を延長させ得る。上記の特性の任意の組み合わせも企図される。

【0107】

いくつかの実施態様では、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、現在臨床試験中の抗ＣＤ７３抗体よりも有効にＴ細胞増殖を増加させる、及び／又はＣＤ７３活性を低下させる。例えば、特定の実施態様では、抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分が、以下の特性：
－０．１μg/mLの濃度で、
－米国特許出願公開第２０１６／０１２９１０８号のそれぞれ配列番号１７及び１９；
－米国特許出願公開第２０１８／０００９８９９号のそれぞれ配列番号１４及び１３；若しくは
－米国特許出願公開第２０１８／００３０１４４号のそれぞれ配列番号３及び４
を含むＨＣ及びＬＣアミノ酸配列を含む抗体よりも１００μMのＡＭＰと培養した活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖を増加させる；
及び／又は
－１０μg/mL以上の濃度で、
－米国特許出願公開第２０１６／０１２９１０８号のそれぞれ配列番号１７及び１９；
－米国特許出願公開第２０１８／０００９８９９号のそれぞれ配列番号１４及び１３；若しくは
－米国特許出願公開第２０１８／００３０１４４号のそれぞれ配列番号３及び４
を含むＨＣ及びＬＣアミノ酸配列を含む抗体よりも２４時間のインキュベーション後にＨ２９２細胞中のＣＤ７３活性を低下させる
の少なくとも１つを有する。

【0108】

特定の実施態様では、本開示の抗体又はその抗原結合部分が、抗体又は抗体部分と１つ以上の他のタンパク質又はペプチドの共有結合的又は非共有結合的会合によって形成されるより大きなイムノアドヘシン分子の一部であり得る。このようなイムノアドヘシン分子の例としては、四量体ｓｃＦｖ分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ６：９３－１０１（１９９５））、並びに二価及びビオチン化ｓｃＦｖ分子を作製するためのシステイン残基、マーカーペプチド及びＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７－１０５８（１９９４））が挙げられる。他の例としては、抗体由来の１つ以上のＣＤＲを共有結合的又は非共有結合的に分子に組み込んで、分子を対象となる抗原に特異的に結合するイムノアドヘシンにする場合が挙げられる。このような実施態様では、ＣＤＲが、より大きなポリペプチド鎖の一部として組み込まれてもよく、別のポリペプチド鎖に共有結合的に連結されてもよく、又は非共有結合的に組み込まれてもよい。

【0109】

いくつかの実施態様では、別のポリペプチドに連結された本開示の抗ＣＤ７３抗体の全部又は一部を含む融合抗体又はイムノアドヘシンが作製され得る。特定の実施態様では、抗ＣＤ７３抗体の可変ドメインのみがポリペプチドに連結される。特定の実施態様では、抗ＣＤ７３抗体のＶＨドメインが第１のポリペプチドに連結され、抗ＣＤ７３抗体のＶＬドメインが、ＶＨドメイン及びＶＬドメインが互いに相互作用して抗原結合部位を形成することができるように第１のポリペプチドと会合する第２のポリペプチドに連結される。いくつかの実施態様では、ＶＨドメインが、ＶＨドメイン及びＶＬドメインが互いに相互作用することができるように、リンカーによってＶＬドメインから分離される（例えば、一本鎖抗体）。次いで、ＶＨ－リンカー－ＶＬ抗体が対象となるポリペプチドに連結される。更に、２つ（以上）の一本鎖抗体が互いに連結されている融合抗体を作製することができる。これは、単一ポリペプチド鎖上に二価若しくは多価抗体を作製したい場合、又は二重特異性抗体を作製したい場合に有用である。

【0110】

一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を作製するために、ＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ断片は、ＶＨ及びＶＬ配列が連続した一本鎖タンパク質として発現され得、ＶＬ及びＶＨドメインが可動性リンカーによって連結されているように、可動性リンカーをコードする、例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）３（配列番号４４）をコードする別の断片に作動可能に連結される。例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３（１９８８）；及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４（１９９０）を参照されたい。一本鎖抗体は、単一のＶＨ及びＶＬのみが使用される場合、一価；２つのＶＨ及びＶＬが使用される場合、二価；又は３つ以上のＶＨ及びＶＬが使用される場合、多価であり得る。例えば、ヒトＣＤ７３及び別の分子に特異的に結合する二重特異性又は多価抗体が作製され得る。

【0111】

他の実施態様では、抗ＣＤ７３抗体をコードする核酸分子を使用して他の修飾抗体が調製され得る。例えば、「カッパボディ（ｋａｐｐａ ｂｏｄｙ）」（Ｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１０：９４９－５７（１９９７））、「ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）」（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１３：５３０３－９（１９９４））、「ダイアボディ」（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８（１９９３））、又は「ジャヌシン（Ｊａｎｕｓｉｎ）」（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５－３６５９（１９９１）ａｎｄ Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（Ｓｕｐｐｌ．）７：５１－５２（１９９２））が、本明細書の教示に従って、標準的な分子生物学的技術を使用して調製され得る。

【0112】

本開示の抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分は、別の分子（例えば、別のペプチド又はタンパク質）に誘導体化又は連結され得る。一般的に、抗体又はその部分は、ＣＤ７３結合が誘導体化又は標識によって悪影響を受けないように誘導体化される。したがって、本開示の抗体及び抗体部分は、本明細書に記載されるヒト抗ＣＤ７３抗体のインタクト形態と修飾形態の両方を含むことが意図される。例えば、本開示の抗体又は抗体部分は、別の抗体（例えば、二重特異性抗体若しくはダイアボディ）、検出剤、医薬品、及び／又は抗体若しくは抗体部分と別の分子（ストレプトアビジンコア領域若しくはポリヒスチジンタグなど）の会合を媒介することができるタンパク質若しくはペプチドなどの１つ以上の他の分子実体に（化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的会合又はその他によって）機能的に連結され得る。

【0113】

誘導体化抗体の１つのタイプは、（例えば、二重特異性抗体を作製するために、同じタイプ又は異なるタイプの）２つ以上の抗体を架橋することによって作製される。適切な架橋剤には、適切なスペーサーによって分離された２つの別個の反応性基を有するヘテロ二官能性（例えば、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）又はホモ二官能性（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）であるものが含まれる。このようなリンカーは、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、イリノイ州ロックフォードから入手可能である。

【0114】

抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチル若しくはエチル基、又は炭水化物基などの化学基で誘導体化することもできる。これらの基は、抗体の生物学的特徴を改善するために、例えば血清半減期を増加させるために有用であり得る。

【0115】

本開示による抗体又は抗原結合部分は、標識されていてもよい。本明細書で使用される場合、「標識」又は「標識された」という用語は、抗体への別の分子の組み込みを指す。いくつかの実施態様では、標識が、検出可能なマーカー、例えば、放射標識アミノ酸の組み込み、又はマーキングされたアビジン（例えば、光学的方法若しくは比色法によって検出することができる蛍光マーカー若しくは酵素活性を含有するストレプトアビジン）によって検出することができるビオチニル部分のポリペプチドへの結合である。いくつかの実施態様では、標識又はマーカーが、治療薬、例えば薬物コンジュゲート又は毒素であり得る。ポリペプチド及び糖タンパク質を標識する様々な方法が当技術分野において公知であり、使用され得る。ポリペプチドに対する標識の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されるわけではない：放射性同位体若しくは放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）、磁性剤、例えばガドリニウムキレート、毒素、例えば百日咳毒素、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン並びにこれらの類似体又はホモログ。いくつかの実施態様では、標識が、潜在的な立体障害を低減するために様々な長さのスペーサーアームによって取り付けられる。

【0116】

いくつかの実施態様では、本開示による抗体又は抗原結合部分を細胞傷害剤にコンジュゲートさせて免疫複合体を形成することができる。いくつかの実施態様では、本開示による抗体又は抗原結合部分を放射性同位体にコンジュゲートさせることができる。

【0117】

特定の実施態様では、本開示の抗体が、中性形態（双性イオン形態を含む）で、又は正若しくは負に帯電した種として存在し得る。いくつかの実施態様では、抗体を対イオンと複合体化して、薬学的に許容し得る塩を形成することができる。

【0118】

「薬学的に許容し得る塩」という用語は、１つ以上の抗体と１つ以上の対イオンを含む複合体を指し、対イオンは薬学的に許容し得る無機及び有機の酸及び塩基に由来する。

【0119】

抗ＣＤ７３抗体組成物
本開示はまた、１、２、３、４、又はそれを超える数の本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合部分を含む併用療法（例えば、組成物）を提供する。特定の実施態様では、併用療法（例えば、組成物）が、２つの抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分を含む。併用療法は、例えば、前記抗体若しくは抗原結合部分又は前記抗体若しくは抗原結合部分を含む医薬組成物を使用する処置方法の形態をとり得る。

【0120】

いくつかの実施態様では、本開示は、第１及び第２の抗体が、
－それぞれ抗体２１０２８及び２１０４６；
－それぞれ抗体２１０２８及び２１１２７；
－それぞれ抗体２１０２８及び２１１６３；
－それぞれ抗体２１０４６及び２１１２７；
－それぞれ抗体２１０４６及び２１１６３；又は
－それぞれ抗体２１１２７及び２１１６３
である、第１の抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合部分と第２の抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合部分とを含む組成物を提供する。

【0121】

いくつかの実施態様では、組成物が、前記第１及び第２の抗体と同じエピトープに結合する、又はこれらと結合について競合する抗体又はその抗原結合部分を含む。

【0122】

いくつかの実施態様では、組成物が、前記第１の抗体のＨ－ＣＤＲ１～３及びＬ－ＣＤＲ１～３アミノ酸配列を含む抗体又はその抗原結合部分と、前記第２の抗体のＨ－ＣＤＲ１～３及びＬ－ＣＤＲ１～３アミノ酸配列を含む抗体又はその抗原結合部分とを含む。

【0123】

いくつかの実施態様では、組成物が、前記第１の抗体のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列とそれぞれ少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む抗体又はその抗原結合部分と、前記第２の抗体のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列とそれぞれ少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む抗体又はその抗原結合部分とを含む。

【0124】

いくつかの実施態様では、組成物が、前記第１の抗体のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を含む抗体又はその抗原結合部分と、前記第２の抗体のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を含む抗体又はその抗原結合部分とを含む。

【0125】

いくつかの実施態様では、組成物が、前記第１の抗体のＨＣ及びＬＣアミノ酸配列を含む抗体又はその抗原結合部分と、前記第２の抗体のＨＣ及びＬＣアミノ酸配列を含む抗体又はその抗原結合部分とを含む。

【0126】

特定の実施態様では、前記組成物が、
ａ）それぞれ配列番号１７～１９、２３～２５、２９～３１、又は３５～５７のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ１～３を含む抗体；
ｂ）そのＶＨが配列番号９、１０、１１、又は１２のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一の抗体；
ｃ）そのＶＨが配列番号９、１０、１１、又は１２のアミノ酸配列を含む抗体；
ｄ）そのＨＣが配列番号９及び４１、１０及び４１、１１及び４１、又は１２及び４１のアミノ酸配列を含む抗体；
ｅ）それぞれ配列番号２０～２２、２６～２８、３２～３４、又は３８～４０のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ１～３を含む抗体；
ｆ）そのＶＬが配列番号１３、１４、１５、又は１６のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一の抗体；
ｇ）そのＶＬが配列番号１３、１４、１５、又は１６のアミノ酸配列を含む抗体；
ｈ）そのＬＣが配列番号１３及び４２、１４及び４２、１５及び４２、又は１６及び４２のアミノ酸配列を含む抗体；
ｉ）そのＨ－ＣＤＲ１～３及びＬ－ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号１７～２２、２３～２８、２９～３４、又は３５～４０のアミノ酸配列を含む抗体；
ｊ）それぞれ配列番号９及び１３、１０及び１４、１１及び１５、又は１２及び１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む抗体；
ｋ）それぞれ配列番号９及び１３、１０及び１４、１１及び１５、又は１２及び１６のアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む抗体；及び
ｌ）それぞれ配列番号９及び４１、並びに１３及び４２；１０及び４１、並びに１４及び４２；１１及び４１、並びに１５及び４２；又は１２及び４１、並びに１６及び４２のアミノ酸配列を含むＨＣ及びＬＣを含む抗体
からなる群から選択される１つ、２つ、又はこれを超える数の抗体又はその抗原結合部分を含み得る。

【0127】

いくつかの実施態様では、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体組成物が、インビボで腫瘍成長を阻害及び／若しくは腫瘍成長退縮を誘導し得る、がん患者における転移を減速若しくは逆転させ得る、並びに／又はがん患者の生存を延長させ得る。上記の特性の任意の組み合わせも企図される。

【0128】

本開示はまた、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体組成物を作製する方法であって、第１の抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分及び第２の抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分を用意するステップと、２つの抗体又は部分を混和するステップとを含む方法を提供する。

【0129】

二重特異性結合分子
本開示はまた、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体の結合特異性を有する二重特異性結合分子（例えば、６つのＣＤＲ又はＶＨ及びＶＬなどの抗原結合部分を含む）を提供する。いくつかの実施態様では、二重特異性結合分子が、別の異なる抗ＣＤ７３抗体（例えば、本明細書中に記載される別の抗ＣＤ７３抗体）、又はその活性が、がんなどの疾患状態を媒介するがん抗原若しくは別の細胞表面分子などの異なるタンパク質を標的化する抗体の結合特異性を更に有する。このような二重特異性結合分子は当技術分野において公知であり、異なる種類の二重特異性結合分子の例は本明細書の他の箇所に与えられる。特定の実施態様では、二重特異性結合分子が、ＣＤ７３及びＰＤ－１、ＣＤ７３及びＰＤ－Ｌ１、又はＣＤ７３及びＣＴＬＡ－４に結合し得る。

【0130】

核酸分子及びベクター
本開示はまた、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合部分をコードする核酸分子及び配列を提供する。いくつかの実施態様では、異なる核酸分子が、抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分の重鎖及び軽鎖アミノ酸配列をコードする。他の実施態様では、同じ核酸分子が、抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分の重鎖及び軽鎖アミノ酸配列をコードする。

【0131】

ヌクレオチド配列への言及は、特に明記しない限り、その相補物を包含する。したがって、具体的な配列を有する核酸への言及は、その相補配列を含むその相補鎖を包含すると理解されるべきである。本明細書で言及される「ポリヌクレオチド」という用語は、少なくとも１０塩基長の、リボヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチド、又はいずれかの種類のヌクレオチドの修飾形態のヌクレオチドのポリマー形態を意味する。この用語は、一本鎖及び二本鎖形態を含む。

【0132】

いくつかの実施態様では、本開示は、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合部分の、重鎖若しくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、又は軽鎖若しくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、又はその両方を含む核酸分子を提供する。

【0133】

本開示はまた、本明細書に列挙される１つ以上のヌクレオチド配列、例えば、配列番号１～８からなる群より選択されるヌクレオチド配列、又は配列番号９～１６からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のヌクレオチド配列を提供する。核酸配列の文脈における「パーセント配列同一性」という用語は、最大の対応のために整列された場合に同じである２つの配列中の残基を指す。配列同一性比較の長さは、少なくとも約９ヌクレオチド、通常少なくとも約１８ヌクレオチド、より通常には少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６、４８又はこれを超える数のヌクレオチドの伸長にわたり得る。ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用することができる当技術分野において公知のいくつかの異なるアルゴリズムがある。例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、ウィスコンシン州マディソンのプログラムであるＦＡＳＴＡ、Ｇａｐ又はＢｅｓｔｆｉｔを使用してポリヌクレオチド配列を比較することができる。例えばプログラムＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３を含むＦＡＳＴＡは、クエリー配列と検索配列との間の最良の重複の領域のアラインメント及びパーセント配列同一性を提供する（例えば、参照により本明細書に援用される、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３－９８（１９９０）；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３２：１８５－２１９（２０００）；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２２７－２５８（１９９６）；及びＰｅａｒｓｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７６：７１－８４（１９９８）を参照されたい）。特に明記しない限り、具体的なプログラム又はアルゴリズムのデフォルトパラメータが使用される。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、参照により本明細書に援用される、そのデフォルトパラメータ（ワードサイズ６及びスコアリング行列のＮＯＰＡＭファクター）を用いたＦＡＳＴＡを使用して、又はＧＣＧバージョン６．１で提供されるそのデフォルトパラメータを用いたＧａｐを使用して決定することができる。

【0134】

いくつかの実施態様では、本開示は、配列番号１～８からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。特定の実施態様では、核酸分子が、配列番号１及び５、配列番号２及び６、配列番号３及び７、又は配列番号４及び８のヌクレオチド配列を含む。

【0135】

上記の実施態様のいずれにおいても、核酸分子が単離され得る。本明細書で「単離」又は「精製」と呼ばれる核酸分子は、（１）それらの起源のゲノムＤＮＡ若しくは細胞ＲＮＡの核酸から分離されている；及び／又は（２）天然に存在しない、核酸である。

【0136】

いくつかの実施態様では、本開示は、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合部分の鎖の一方又は両方を発現するのに適したベクターを提供する。本明細書で使用される「ベクター」という用語は、これが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。いくつかの実施態様では、ベクターが、プラスミド、すなわち追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされ得るＤＮＡの環状二本鎖片である。いくつかの実施態様では、ベクターが、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲーションされ得るウイルスベクターである。いくつかの実施態様では、ベクターが、これらが導入される宿主細胞（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）において自律複製することができる。他の実施態様では、ベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）が、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、それによって宿主ゲノムと共に複製される。更に、特定のベクターは、これらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（又は単に「発現ベクター」）と呼ばれる。

【0137】

本開示は、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合部分の重鎖、軽鎖、又は重鎖と軽鎖の両方をコードする核酸分子を含むベクターを提供する。特定の実施態様では、本開示のベクターが、本明細書に記載される核酸分子を含む。本開示は更に、融合タンパク質、修飾抗体、抗体断片、及びこれらのプローブをコードする核酸分子を含むベクターを提供する。ベクターは、発現制御配列を更に含み得る。

【0138】

本明細書で使用される「発現制御配列」という用語は、これらがライゲーションされているコード配列の発現及びプロセシングを行うのに必要なポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列は、適切な転写開始、終結、プロモーター及びエンハンサー配列；スプライシング及びポリアデニル化シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増強する配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）；タンパク質安定性を増強する配列；並びに所望であれば、タンパク質分泌を増強する配列を含む。このような制御配列の性質は、宿主生物に応じて異なる；原核生物では、このような制御配列は、一般的に、プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列を含む；真核生物では、一般的に、このような制御配列は、プロモーター及び転写終結配列を含む。「制御配列」という用語は、少なくとも、その存在が発現及びプロセシングに必須である全ての成分を含むことを意図しており、その存在が有利である追加の成分、例えばリーダー配列及び融合パートナー配列も含むことができる。

【0139】

本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合部分の重鎖及び／又は軽鎖をコードする核酸分子は、このような抗体又は部分を産生する任意の供給源から単離され得る。いくつかの実施態様では、核酸分子が、ヒトＣＤ７３抗原で免疫された動物から、又はこのようなＢ細胞から作製された不死化細胞から単離された抗ＣＤ７３抗体を発現するＢ細胞から単離される。抗体をコードする核酸を単離する方法は当技術分野において周知である。ｍＲＮＡを単離し、抗体遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又はｃＤＮＡクローニングに使用するためのｃＤＮＡを作製するために使用することができる。特定の実施態様では、本明細書中に記載される核酸分子を、単離するのではなく、合成することができる。

【0140】

いくつかの実施態様では、本明細書に記載される核酸分子が、任意の供給源由来の重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列にインフレームで連結された本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分由来のＶＨドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。同様に、本明細書に記載される核酸分子は、任意の供給源由来の軽鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列にインフレームで連結された本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分由来のＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。

【0141】

本開示のいくつかの実施態様では、ＶＨ及び／又はＶＬをコードする核酸分子が、完全長抗体遺伝子に「変換」され得る。特定の実施態様では、ＶＨ又はＶＬドメインをコードする核酸分子が、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントに作動可能に連結される、及び／又はＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントに作動可能に連結されるように、それぞれ重鎖定常（ＣＨ）又は軽鎖定常（ＣＬ）領域を既にコードする発現ベクターに挿入することによって完全長抗体遺伝子に変換される。いくつかの実施態様では、ＶＨ及び／又はＶＬドメインをコードする核酸分子が、標準的な分子生物学的技術を使用して、ＶＨ及び／又はＶＬドメインをコードする核酸分子をＣＨ及び／又はＣＬ領域をコードする核酸分子に連結、例えばライゲーションすることによって、完全長抗体遺伝子に変換される。次いで、完全長重鎖及び／又は軽鎖をコードする核酸分子が、これらが導入された細胞から発現され、抗ＣＤ７３抗体が単離され得る。

【0142】

核酸分子は、大量の抗ＣＤ７３抗体を組換え発現するために使用され得る。核酸分子はまた、本明細書に記載されるキメラ抗体、二重特異性抗体、一本鎖抗体、イムノアドヘシン、ダイアボディ、変異抗体及び抗体誘導体を作製するために使用され得る。

【0143】

いくつかの実施態様では、本開示の核酸分子が、特定の抗体配列に対するプローブ又はＰＣＲプライマーとして使用される。例えば、核酸は、診断方法におけるプローブとして、又はとりわけ抗ＣＤ７３抗体の可変ドメインをコードする追加の核酸分子を単離するために使用することができるＤＮＡの領域を増幅するためのＰＣＲプライマーとして使用され得る。いくつかの実施態様では、核酸分子がオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドが、対象となる抗体の重鎖及び軽鎖の高度可変ドメインに由来する。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドが、本明細書に記載される本開示の抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合部分のＣＤＲの１つ以上の全部又は一部を包含する。

【0144】

いくつかの実施態様では、核酸分子及びベクターを使用して、変異抗ＣＤ７３抗体を作製することができる。抗体は、例えば抗体の結合特性を変化させるために、重鎖及び／又は軽鎖の可変ドメインで変異され得る。例えば、抗ＣＤ７３抗体のＫ_Ｄを増加若しくは減少させるため、ｋ_ｏｆｆを増加若しくは減少させるため、又は抗体の結合特異性を変化させるために、ＣＤＲの１つ以上で突然変異が行われ得る。いくつかの実施態様では、本開示のモノクローナル抗体において生殖細胞系列と比較して変化することが知られているアミノ酸残基で１つ以上の変異が行われる。可変ドメインのＣＤＲ若しくはフレームワーク領域、又は定常領域で変異が行われ得る。特定の実施態様では、可変ドメインで変異が行われる。具体的な実施態様では、本開示の抗体又はその抗原結合部分の可変ドメインのＣＤＲ又はフレームワーク領域において生殖系列と比較して変化することが知られているアミノ酸残基で１つ以上の変異が行われる。

【0145】

いくつかの実施態様では、得られたフレームワーク領域が対応する生殖系列遺伝子のアミノ酸配列を有するように、フレームワーク領域が変異される。例えば、抗ＣＤ７３抗体の半減期を増加させるために、フレームワーク領域又は定常領域で変異が行われ得る。例えば、国際公開第００／０９５６０号を参照されたい。フレームワーク領域又は定常領域における変異はまた、抗体の免疫原性を変化させるため、及び／又は別の分子への共有結合的若しくは非共有結合的結合のための部位を提供するために行われ得る。本開示によると、抗体は、可変ドメインのＣＤＲ若しくはフレームワーク領域のいずれか１つ以上又は定常領域に変異を有し得る。

【0146】

いくつかの実施態様では、本開示の抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合部分が、遺伝子が転写及び翻訳制御配列などの必要な発現制御配列に作動可能に連結されるように、上記のように得られた部分的又は完全長の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入することによって発現される。発現ベクターには、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、植物ウイルス、例えばカリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソームなどが含まれる。抗体コード配列は、ベクター内の転写及び翻訳制御配列が抗体コード配列の転写及び翻訳を調節する意図した機能を果たすように、ベクターにライゲーションされ得る。発現ベクター及び発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択され得る。抗体軽鎖コード配列及び抗体重鎖コード配列は、同じ又は別個のベクターに挿入され得、同じ又は異なる発現制御配列（例えば、プロモーター）に作動可能に連結され得る。いくつかの実施態様では、両コード配列が同じ発現ベクターに挿入され、同じ発現制御配列（例えば、共通のプロモーター）、別個の同一の発現制御配列（例えば、プロモーター）、又は異なる発現制御配列（例えば、プロモーター）に作動可能に連結され得る。抗体コード配列は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片及びベクター上の相補的制限部位のライゲーション、又は制限部位が存在しない場合は平滑末端ライゲーション）によって発現ベクターに挿入され得る。

【0147】

簡便なベクターは、任意のＶＨ又はＶＬ配列が上記のように容易に挿入及び発現され得るように操作された適切な制限部位を有する、機能的に完全なヒトＣＨ又はＣＬ免疫グロブリン配列をコードするものである。このようなベクター中のＨＣ及びＬＣコード遺伝子は、関連するｍＲＮＡを安定化することによって全体的な抗体タンパク質収率増強をもたらすイントロン配列を含有し得る。イントロン配列は、ＲＮＡスプライシングがどこで起こるかを決定するスプライスドナー及びスプライスアクセプター部位に隣接している。イントロン配列の位置は、抗体鎖の可変領域若しくは定常領域のいずれか、又は複数のイントロンが使用される場合は可変領域と定常領域の両方にあり得る。ポリアデニル化及び転写終結は、コード領域の下流の天然の染色体部位に存在し得る。組換え発現ベクターはまた、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドが免疫グロブリン鎖のアミノ末端にインフレームで連結されるように、抗体鎖遺伝子をベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であり得る。

【0148】

抗体鎖遺伝子に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を有し得る。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等のような因子に依存し得ることが当業者には理解されよう。哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい調節配列には、レトロウイルスＬＴＲ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ポリオーマ並びに天然免疫グロブリン及びアクチンプロモーターなどの強力な哺乳動物プロモーターに由来するプロモーター及び／又はエンハンサーなどの、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメントが含まれる。ウイルス調節エレメント及びその配列のさらなる説明については、例えば、米国特許第５１６８０６２号、同第４５１０２４５号及び同第４９６８６１５号を参照されたい。プロモーター及びベクター、並びに植物の形質転換の説明を含む、植物において抗体を発現させる方法は、当技術分野において公知である。例えば、米国特許第６５１７５２９号を参照されたい。細菌細胞又は真菌細胞、例えば酵母細胞においてポリペプチドを発現させる方法も、当技術分野において周知である。

【0149】

抗体鎖遺伝子及び調節配列に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）及び選択マーカー遺伝子などの追加の配列を有し得る。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４３９９２１６号、同第４６３４６６５号及び同第５１７９０１７号参照）。例えば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する。例えば、選択マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅を用いたｄｈｆｒ宿主細胞での使用のため）、ｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）、及びグルタミン酸合成酵素遺伝子が含まれる。

【0150】

宿主細胞並びに抗体及び抗体組成物の作製方法
本開示はまた、本明細書に記載される抗体組成物並びに抗体及びその抗原結合部分を作製する方法を提供する。いくつかの実施態様では、本開示は、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分を作製する方法であって、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分の、重鎖又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、及び軽鎖又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を含む組換え宿主細胞を用意するステップと；抗体又は抗原結合部分の発現に適した条件下で前記宿主細胞を培養するステップと；得られた抗体又は抗原結合部分を単離するステップとを含む方法に関する。このような組換え宿主細胞におけるこのような発現によって産生される抗体又は抗原結合部分は、本明細書では「組換え」抗体又は抗原結合部分と呼ばれる。本開示はまた、このような宿主細胞の子孫細胞、及び同細胞よって産生される抗体又は抗原結合部分を提供する。

【0151】

本明細書で使用される「組換え宿主細胞」（又は単に「宿主細胞」）という用語は、組換え発現ベクターが導入された細胞を意味する。定義により、組換え宿主細胞は天然に存在しない。本開示は、例えば、本明細書に記載されるベクターを含み得る宿主細胞を提供する。本開示はまた、例えば、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合部分の、重鎖若しくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、軽鎖若しくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、又はその両方を含む宿主細胞を提供する。「組換え宿主細胞」及び「宿主細胞」は、具体的な対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫も意味することを理解すべきである。変異又は環境の影響のいずれかにより後続の世代で特定の改変が起こり得るので、このような子孫は、実際には、親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に依然として含まれる。

【0152】

抗ＣＤ７３抗体及びその抗原結合部分をコードする核酸分子並びにこれらの核酸分子を含むベクターは、適切な哺乳動物、植物、細菌又は酵母宿主細胞のトランスフェクションに使用され得る。形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための任意の公知の方法によるものであり得る。哺乳動物細胞に異種ポリヌクレオチドを導入する方法は当技術分野において周知であり、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔法、リポソームへのポリヌクレオチドのカプセル化、及び核へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションが含まれる。更に、核酸分子は、ウイルスベクターによって哺乳動物細胞に導入され得る。細胞を形質転換する方法は、当技術分野において周知である。例えば、米国特許第４３９９２１６号、同第４９１２０４０号、同第４７４０４６１号、及び同第４９５９４５５号を参照されたい。例えば、アグロバクテリウム媒介形質転換、バイオリステック形質転換、直接注入、電気穿孔法及びウイルス形質転換を含む、植物細胞を形質転換する方法は、当技術分野において周知である。細菌及び酵母細胞を形質転換する方法も当技術分野において周知である。

【0153】

発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当技術分野において周知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株を含む。これらには、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞、２９３ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＮＩＨ－３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、Ａ５４９細胞、及びいくつかの他の細胞株が含まれる。どの細胞株が高い発現レベルを有するかを決定することによって、特に好ましい細胞株が選択される。使用され得る他の細胞株は、Ｓｆ９又はＳｆ２１細胞などの昆虫細胞株である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入される場合、抗体は、宿主細胞における抗体の発現、又はより好ましくは、宿主細胞が増殖される培養培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間にわたって宿主細胞を培養することによって産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を使用して培養培地から回収することができる。植物宿主細胞には、例えば、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アオウキクサ、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモ等が含まれる。細菌宿主細胞には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種が含まれる。酵母宿主細胞には、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、及びピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）が含まれる。

【0154】

更に、産生細胞株からの本開示の抗体又はその抗原結合部分の発現を、いくつかの公知の技術を使用して増強することができる。例えば、グルタミン合成酵素遺伝子発現系（ＧＳ系）は、特定の条件下で発現を増強するための一般的なアプローチである。ＧＳ系は、欧州特許第０２１６８４６号、同第０２５６０５５号、同第０３２３９９７号及び同第０３３８８４１号に関連して全体的又は部分的に論じられている。

【0155】

異なる細胞株又はトランスジェニック動物によって発現される抗体は、互いに異なるグリコシル化パターンを有する可能性がある。しかしながら、本明細書で提供される核酸分子によってコードされる、又は本明細書で提供されるアミノ酸配列を含む全ての抗体は、抗体のグリコシル化状態にかかわらず、より一般的には翻訳後修飾の有無にかかわらず、本開示の一部である。

【0156】

医薬組成物
本開示の別の態様は、本開示の抗ＣＤ７３抗体若しくはその抗原結合部分、二重特異性結合分子、又は抗体組成物を有効成分として（又は唯一の有効成分として）含む医薬組成物である。医薬組成物は、薬学的に許容し得る賦形剤を更に含み得る。いくつかの実施態様では、医薬組成物が、がん、例えば本明細書に記載されるがんの改善、予防、及び／又は処置を意図している。特定の実施態様では、がんが、皮膚、肺、腸、結腸、卵巣、脳、前立腺、腎臓、軟部組織、造血系、頭頸部、肝臓、骨、膀胱、乳房、胃、子宮、子宮頸部、及び膵臓などの組織中にある。特定の実施態様では、がんが、黒色腫、頭頸部がん、乳がん（例えば、トリプルネガティブ乳がん）、膀胱がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、膵臓がん（例えば、膵管腺癌）、卵巣がん、腎細胞癌腫、前立腺がん、結腸直腸がん、胆管癌腫、甲状腺がん、又は精巣がんである。

【0157】

本開示の医薬組成物は、１つ以上の本開示の抗ＣＤ７３抗体、抗原結合部分、抗体組成物、又は二重特異性結合分子、例えば、１つ又は２つの抗ＣＤ７３抗体、抗原結合部分、又は二重特異性結合分子を含む。いくつかの実施態様では、組成物が、単一の本開示の抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合部分を含む。いくつかの実施態様では、組成物が、２つの別個の本開示の抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合部分を含む。

【0158】

いくつかの実施態様では、医薬組成物が、少なくとも１つの本開示の抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合部分、例えば１つの抗ＣＤ７３抗体又は部分と、１つ以上の関連細胞表面受容体、例えば１つ以上のがん関連受容体を標的化する１つ以上の追加の抗体とを含み得る。

【0159】

一般的に、本開示の抗体、抗原結合部分及び二重特異性結合分子は、例えば以下に記載される、１つ以上の薬学的に許容し得る賦形剤と合わせて製剤として投与するのに適している。

【0160】

「賦形剤」という用語は、本明細書では、本開示の化合物以外の任意の成分を説明するために使用される。賦形剤の選択は、具体的な投与様式、溶解性及び安定性に対する賦形剤の効果、並びに剤形の性質などの因子に大きく依存する。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容し得る賦形剤」が、生理学的に適合性のあるありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。薬学的に許容し得る賦形剤のいくつかの例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、並びにこれらの組み合わせである。多くの場合、等張剤、例えば糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール又は塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。薬学的に許容し得る物質の追加の例は、抗体の貯蔵寿命又は有効性を増強する、湿潤剤又は少量の補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、保存剤又は緩衝剤である。

【0161】

本開示の医薬組成物及びこれらの調製方法は、当業者には容易に明らかであろう。このような組成物及びその調製方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５）に見出され得る。医薬組成物は、好ましくはＧＭＰ（医薬品の製造管理及び品質管理の基準）条件下で製造される。

【0162】

本開示の医薬組成物は、バルクで、単一単位用量として、又は複数の単一単位用量として調製、包装、又は販売され得る。本明細書で使用される場合、「単位用量」は、所定量の有効成分を含む医薬組成物の離散量である。有効成分の量は、一般的に、対象に投与されるであろう有効成分の投与量、又はこのような投与量の好都合な割合、例えばこのような投与量の２分の１若しくは３分の１に等しい。

【0163】

非経口投与に適した医薬組成物の製剤は、典型的には、滅菌水又は滅菌等張生理食塩水などの薬学的に許容し得る担体と組み合わせた有効成分を含む。このような製剤は、ボーラス投与又は連続投与に適した形態で調製、包装又は販売され得る。注射用製剤は、保存剤を含有するアンプル又は複数回投与用容器などの単位剤形で調製、包装又は販売され得る。非経口投与のための製剤には、懸濁液、溶液、油性又は水性ビヒクル中のエマルジョン、ペーストなどが含まれるがこれらに限定されない。このような製剤は、懸濁化剤、安定剤、又は分散剤を含むがこれらに限定されない１つ以上の追加の成分を更に含み得る。非経口投与用の製剤のいくつかの実施態様では、有効成分が、再構成された組成物の非経口投与の前に適切なビヒクル（例えば、無菌パイロジェンフリー水）で再構成するための乾燥（すなわち、粉末又は粒状）形態で提供される。非経口製剤はまた、塩、炭水化物及び緩衝剤（好ましくは、ｐＨ３～９まで）などの賦形剤を含有し得る水溶液を含むが、いくつかの用途では、これらは滅菌非水溶液として、又は滅菌パイロジェンフリー水などの適切なビヒクルと合わせて使用される乾燥形態としてより適切に製剤化され得る。例示的な非経口投与形態には、滅菌水溶液、例えばプロピレングリコール水溶液又はデキストロース水溶液中の溶液又は懸濁液が含まれる。このような剤形は、所望であれば適切に緩衝化され得る。有用な他の非経口投与可能な製剤には、微結晶形態又はリポソーム調製物中に有効成分を含むものが含まれる。非経口投与用の製剤は、即時放出及び／又は修飾放出されるように製剤化され得る。修飾放出製剤には、遅延放出、持続放出、パルス放出、制御放出、標的放出及びプログラム放出が含まれる。

【0164】

いくつかの実施態様では、滅菌注射液が、抗ＣＤ７３抗体、その抗原結合部分、二重特異性結合分子、又は抗体組成物を、必要に応じて、上に列挙される成分の１つ又は組み合わせを含む適切な溶媒に必要な量で組み込み、引き続いて濾過滅菌することによって調製され得る。一般的に、分散液は、活性化合物を、基礎分散媒及び上に列挙されるものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、有効成分及び任意の追加の所望の成分の粉末をその以前に滅菌濾過した溶液から生成する真空乾燥及び凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。注射用組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸塩若しくはゼラチンを組成物に含めることによって、及び／又は修飾放出コーティング（例えば、遅延放出コーティング）を使用することによってもたらされ得る。

【0165】

本開示の抗体はまた、鼻腔内又は吸入によって、典型的には乾燥粉末吸入器から乾燥粉末（単独で、混合物として、若しくは例えば適切な薬学的に許容し得る賦形剤と混合された混合成分粒子として）の形態で；適切な噴射剤を使用して、若しくは使用しないで、加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー（好ましくは、電気流体力学を使用して微細なミストを生成するアトマイザー）、若しくはネブライザーからエアロゾルスプレーとして；又は点鼻薬として投与され得る。

【0166】

本開示の抗体及び抗体部分はまた、経口経路投与のために製剤化され得る。経口投与は、化合物が消化管に入るように嚥下すること、及び／又は化合物が口から直接血流に入る頬側、舌若しくは舌下投与を伴い得る。経口投与に適した製剤には、錠剤；多粒子若しくはナノ粒子、液体、又は粉末を含有するソフトカプセル又はハードカプセル；ロゼンジ（液体充填を含む）；咀嚼錠；ゲル；高速分散剤形；フィルム；オビュール；スプレー；及び頬側／粘膜付着性パッチなどの固体、半固体及び液体系が含まれる。液体製剤には、懸濁液、溶液、シロップ及びエリキシルが含まれる。このような製剤は、ソフトカプセル又はハードカプセル（例えば、ゼラチン若しくはヒドロキシプロピルメチルセルロースから作製される）中の充填剤として使用され得、典型的には、担体、例えば、水、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、メチルセルロース、又は適切な油、並びに１つ以上の乳化剤及び／又は懸濁化剤を含む。液体製剤はまた、例えばサシェからの固体の再構成によって調製され得る。

【0167】

本開示の抗体及び組成物の治療的使用
いくつかの実施態様では、本開示の抗ＣＤ７３抗体及びその抗原結合部分、抗ＣＤ７３組成物、並びに二重特異性結合分子が、それを必要とする哺乳動物（例えば、ヒト）のＣＤ７３活性を低下させるために使用される。例えば、医師は、本開示の抗ＣＤ７３抗体を単独で、又は他の治療薬と組み合わせて（順次若しくは同時に）投与することによって、患者の抗腫瘍活性を増強することができる。抗ＣＤ７３抗体は、ＣＤ７３の活性を低下させ、患者の抗腫瘍応答を抑制する経路を阻害する。

【0168】

特定の実施態様では、抗体若しくはその抗原結合部分、組成物、又は二重特異性結合分子が、ＣＤ７３陽性がんの処置に使用するためのものである。がんは、皮膚、肺、腸、結腸、卵巣、脳、前立腺、腎臓、軟部組織、造血系、頭頸部、肝臓、骨、膀胱、乳房、胃、子宮、子宮頸部、及び膵臓などの１つ以上の組織中にあり得る。

【0169】

いくつかの実施態様では、本開示の抗ＣＤ７３抗体、抗原結合部分、二重特異性結合分子、及び／又は抗体組成物によって処置されるがんが、例えば、黒色腫（例えば、進行性又は転移性黒色腫）、皮膚基底細胞がん、神経膠芽腫、神経膠腫、神経膠肉腫、星状細胞腫、髄膜腫、神経芽腫、副腎皮質がん、頭頸部扁平上皮がん、口腔がん、唾液腺がん、鼻咽頭がん、乳がん、甲状腺がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、及び扁平上皮肺がん）、食道がん、胃食道接合部がん、胃がん、胃腸がん、原発性腹膜がん、肝臓がん、肝細胞癌、胆道がん、胆管癌腫、結腸がん、結腸直腸癌、卵巣がん、卵管がん、膀胱がん、上部尿路がん、尿路上皮がん、腎細胞癌腫、腎臓がん、尿生殖器がん、子宮頸がん、前立腺がん、精巣がん、線維肉腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、組織球腫、膵臓がん、子宮内膜がん、虫垂がん、進行性メルケル細胞がん、多発性骨髄腫、肉腫、絨毛癌、赤白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性単球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、肥満細胞白血病、小リンパ球性リンパ腫、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、単球性リンパ腫、ＨＴＬＶ関連Ｔ細胞白血病／リンパ腫、中皮腫、及び固形腫瘍を含み得る。がんは、例えば、初期、中間、後期、局所進行、又は転移段階であり得、他の治療薬（例えば、他の抗ＣＤ７３治療薬）に対して再発性若しくは難治性であり得る、又は利用可能な標準治療がない場合がある。

【0170】

いくつかの実施態様では、本開示の抗ＣＤ７３抗体、抗原結合部分、組成物、及び／又は二重特異性結合分子によって処置されるがんが、例えば、黒色腫、頭頸部がん、乳がん（例えば、トリプルネガティブ乳がん）、膀胱がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、膵臓がん（例えば、膵管腺癌）、卵巣がん、腎細胞癌腫、前立腺がん、結腸直腸がん、胆管癌腫、甲状腺がん、及び精巣がんを含み得る。

【0171】

「処置する」、「処置すること」及び「処置」は、生物学的障害及び／又はそれに付随する症状の少なくとも１つを緩和又は抑止する方法を指す。本明細書で使用される場合、疾患、障害又は状態を「緩和する」ことは、疾患、障害、又は状態の症状の重症度及び／又は発生頻度を減少させることを意味する。更に、本明細書における「処置」への言及は、治癒的、姑息的及び予防的処置への言及を含む。

【0172】

「治療上有効量」は、処置されている障害の症状の１つ以上をある程度軽減する、投与されている治療薬の量を指す。治療上有効量の抗がん治療薬は、例えば、腫瘍成長の遅延、腫瘍縮小、生存率の増加、がん細胞の排除、疾患進行の遅延若しくは減少、転移の逆転、又は医療専門家によって望まれる他の臨床エンドポイントをもたらし得る。

【0173】

本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体若しくはその抗原結合部分、抗体組成物、又は二重特異性結合分子は、単独で、又は１つ以上の複数の他の薬物若しくは抗体と組み合わせて（又はこれらの任意の組み合わせとして）投与され得る。したがって、本明細書に記載される医薬組成物、方法及び使用はまた、以下に詳述される、他の活性剤との組み合わせ（共投与）の実施態様を包含する。

【0174】

本明細書で使用される場合、本開示の抗ＣＤ７３抗体及びその抗原結合部分、抗体組成物、並びに二重特異性結合分子と１つ以上の治療薬を指す「共投与」、「共投与される」及び「と組み合わせて」という用語は、以下を意味することを意図しており、以下を指し、以下を含む：
ａ）処置を必要とする患者への本開示の抗体／抗原結合部分／抗体組成物／二重特異性結合分子と治療薬とのこのような組み合わせの同時投与であって、このような成分が、前記成分を実質的に同時に前記患者に放出する単一剤形に一緒に製剤化される投与、
ｂ）処置を必要とする患者への本開示の抗体／抗原結合部分／抗体組成物／二重特異性結合分子と治療薬とのこのような組み合わせの実質的同時投与であって、このような成分が、前記患者によって実質的に同時に服用される別個の剤形に互いに別々に製剤化され、その際、前記成分が前記患者に実質的に同時に放出される投与、
ｃ）処置を必要とする患者への本開示の抗体／抗原結合部分／抗体組成物／二重特異性結合分子と治療薬とのこのような組み合わせの逐次投与であって、このような成分が、各投与間で有意な時間間隔を空けて前記患者によって連続した時間で服用される別個の剤形に互いに別々に製剤化され、その際、前記成分が前記患者に実質的に異なる時間に放出される投与；及び
ｄ）処置を必要とする患者への本開示の抗体／抗原結合部分／抗体組成物／二重特異性結合分子と治療薬とのこのような組み合わせの逐次投与であって、このような成分が、制御された方法で前記成分を放出する単一剤形に一緒に製剤化され、その際、これらが前記患者に同じ及び／又は異なる時間に、同時に、連続的に、及び／又は重複して放出され、各部分が同じ又は異なる経路によって投与され得る投与。

【0175】

本開示の抗ＣＤ７３抗体若しくはその抗原結合部分、抗体組成物、又は二重特異性結合分子は、追加の治療的処置なしで、すなわち、スタンドアローン療法（単剤療法）として投与され得る。或いは、本開示の抗ＣＤ７３抗体若しくはその抗原結合部分、抗体組成物、又は二重特異性結合分子による処置は、少なくとも１つの追加の治療的処置（併用療法）、例えば、免疫刺激剤、抗がん剤（例えば、化学療法剤、抗新生物剤、抗血管新生剤、若しくはチロシンキナーゼ阻害剤）、又はワクチン（例えば、腫瘍ワクチン）を含み得る。

【0176】

いくつかの実施態様では、抗体若しくはその抗原結合部分、抗体組成物、又は二重特異性結合分子が、がんを処置するための別の医薬／薬物と共投与又は製剤化され得る。追加の治療的処置は、例えば、免疫刺激剤、ワクチン、化学療法剤、抗新生物剤、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害剤、及び／又は放射線療法を含み得る。いくつかの実施態様では、追加の治療的処置が、異なる抗がん抗体を含み得る。

【0177】

本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体若しくはその抗原結合部分、抗体組成物、又は二重特異性結合分子と、少なくとも１つの他の薬剤（例えば、化学療法剤、抗新生物剤、又は抗血管新生剤）とを含む医薬品は、がん治療における同時、別個又は連続投与のための併用処置として使用され得る。他の薬剤は、当の具体的ながんの処置に適した任意の薬剤、例えばアルキル化剤、例えばシスプラチン、カルボプラチン及び／又はオキサリプラチンなどの白金誘導体；植物性アルカロイド（ａｌｋｏｉｄｓ）、例えばパクリタキセル、ドセタキセル及び／又はイリノテカン；抗腫瘍抗生物質、例えば、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシンミトキサントロン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、アクチノマイシン、ルテオマイシン、及び／又はマイトマイシン；トポテカンなどのトポイソメラーゼ阻害剤；代謝拮抗薬、例えばフルオロウラシル及び／又は他のフルオロピリミジン；ＦＯＬＦＯＸ；オシメルチニブ；シクロホスファミド；アントラサイクリン；ダカルバジン；ゲムシタビン；或いはこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される薬剤によるものであり得る。いくつかの実施態様では、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体若しくはその抗原結合部分、抗体組成物、又は二重特異性結合分子が、他の薬剤に対する応答性を再確立する。

【0178】

本開示の抗ＣＤ７３抗体若しくはその抗原結合部分、抗体組成物、又は二重特異性結合分子はまた、ワクチン、サイトカイン、酵素阻害剤、免疫刺激化合物、及びＴ細胞療法などの他の抗がん療法と組み合わせて使用され得る。ワクチンの場合、これは、例えば、処置されるがんに関連する１つ以上の抗原を含有するタンパク質、ペプチド若しくはＤＮＡワクチン、又は抗原と共に樹状細胞を含むワクチンであり得る。適切なサイトカインには、例えば、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ及びＧＭ－ＣＳＦが含まれる。抗がん活性を有する種類の酵素阻害剤の一例は、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤、例えば１－メチル－Ｄ－トリプトファン（１－Ｄ－ＭＴ）である。養子Ｔ細胞療法は、腫瘍を認識及び攻撃するように患者自身のＴ細胞を増殖又は操作することを伴う様々な免疫療法技術を指す。

【0179】

本開示の抗ＣＤ７３抗体若しくはその抗原結合部分、抗体組成物、又は二重特異性結合分子が、チロシンキナーゼ阻害剤に関連する補助療法に使用され得ることも企図される。これらは、受容体の細胞内チロシンキナーゼドメインと相互作用し、例えば細胞内Ｍｇ－ＡＴＰ結合部位について競合することによって、リガンド誘導性受容体リン酸化を阻害する、合成の、主にキナゾリン由来の低分子量分子である。

【0180】

いくつかの実施態様では、抗体若しくはその抗原結合部分、抗体組成物、又は二重特異性結合分子が、Ａ２ＡＲ、Ａ１ＡＲ、Ａ２ＢＲ、Ａ３ＡＲ、ＡＤＡ、ＡＬＰ、ＢＴＬＡ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４７、ＣＤ５５、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ－１５０４９、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、ＣＴＬＡ－３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１及び／又はＣＥＡＣＡＭ－５）、ＧＡＬ９、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＬＡＧ－３、ＬＹ１０８、ＬＡＩＲ１、ＩＣＯＳ、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＰＡＰ、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２、ＯＸ４０、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＴＧＦＲ－β、ＴＮＦＲ２、ＶＩＳＴＡ、ＬＩＬＲＢ２、ＣＭＴＭ６及び／又は２Ｂ４の発現又は活性を調節する薬剤を含むがこれに限定されない、免疫系活性化を媒介する医薬／薬物と組み合わせて使用され得る。いくつかの実施態様では、薬剤が、ＣＤ３９、ＮＫＧ２Ａ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、又はＴＮＦＲ２の発現を調節する。特定の実施態様では、薬剤が低分子阻害剤である。特定の実施態様では、薬剤が、上記分子の１つに結合する抗体又はその抗原結合断片である。具体的な実施態様では、薬剤が、抗ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、デュルバルマブ若しくはアテゾリズマブ）、抗ＰＤ－１抗体、又は抗ＣＴＬＡ－４抗体である。本開示の抗ＣＤ７３抗体若しくはその抗原結合部分、抗体組成物、又は二重特異性結合分子が、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５又はＩＬ－２１）、ＥＧＦＲ阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤等と組み合わせて使用され得ることも企図される。

【0181】

特定の実施態様では、本開示の抗体及び抗原結合部分、抗体組成物、又は二重特異性結合分子が、例えばＣＤ７３、ＣＤ３９、若しくはＣＤ３８、又はＡ１Ｒ、Ａ２ＡＲ、Ａ２ＢＲ、及び／若しくはＡ３Ｒから選択されるアデノシン受容体を標的化し得るアデノシン作動性経路の別の阻害剤と組み合わせて投与され得る。このような阻害剤には、ＡＲ１阻害剤（例えば、ＤＰＣＰＸ、ＳＣＨ５８２６１、及びＦＳＰＴＰ）、Ａ２ＡＲ阻害剤（例えば、ＰＢＦ－５０９、ＣＰＩ－４４４、ＡＺＤ４６３５、ＺＭ２４１３８５、ＡＢ９２８、イストラデフィリン、ＳＹＮ－１１５、ＡＮＲ９４、ＰＳＢ１１１５、ＰＳＢ６０３、及びＮＩＲ１７８）、Ａ２Ｂ阻害剤（例えば、ｍｉＲ－１２８ｂ、ＡＴＬ８０１、アミノフィリン、ＭＲＳ１７５４、ＩＰＤＸ、及びＰＢＦ－１１２９）、及びＡ３Ｒ阻害剤（例えば、ＭＲＳ１１９１、ＭＲＳ１２２０、ＭＲＳ１５２３、及びＣＦ－１０２）が含まれるがこれらに限定されない。このような阻害剤の他の例としては、他の抗ＣＤ７３抗体、並びに抗ＣＤ３９及び抗ＣＤ３８抗体が挙げられる。いくつかの実施態様では、本開示の抗ＣＤ７３抗体若しくはその抗原結合部分、二重特異性抗体、又は抗体組成物が、Ａ００１４２１、ＡＰＣＰ、オレクルマブ、ＣＰＸ－００６／ＣＰＩ－００６、ＣＰＸ－０１６、ＮＺＶ－９３０、ＢＭＳ－９８６１７９、ＩＰＨ５３、ＰＴ１９９、デュルバルマブ、アテゾリズマブ、ダラツムマブ、又はイサツキシマブと組み合わせて投与され得る。

【0182】

本開示はまた、ＣＡＲ－Ｔ技術に使用するためであり得る、キメラ抗原受容体の調製における本明細書中に記載される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合部分の配列（例えば、６つのＣＤＲ又はＶＨ及びＶＬ配列）の使用を企図する。

【0183】

本開示の抗体及びその抗原結合部分、抗体組成物、並びに二重特異性結合分子が、本明細書に記載される処置方法に使用され得る、本明細書に記載される処置に使用され得る、及び／又は本明細書に記載される処置のための医薬の製造に使用するためのものであり得ることが理解される。本開示はまた、本明細書に記載される抗体及びその抗原結合部分、抗体組成物、並びに二重特異性結合分子を含むキット及び製品を提供する。

【0184】

用量及び投与経路
本開示の抗体若しくはその抗原結合部分、抗体組成物、又は二重特異性結合分子は、当の状態の処置に有効な量で、すなわち所望の結果を達成するのに必要な投与量及び期間で投与され得る。治療上有効量は、処置されている具体的な状態、患者の年齢、性別及び体重、並びに抗体がスタンドアローン処置として投与されているか、又は１つ以上の追加の抗がん処置と組み合わせて投与されているかなどの因子に応じて変動し得る。

【0185】

投与レジメンは、最適な所望の応答を提供するように調整され得る。例えば、単回ボーラスを投与してもよく、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよく、又は治療状況の緊急性によって示されるように用量を比例的に減少若しくは増加させてもよい。投与の容易さ及び投与量の均一性のために、非経口組成物を投与単位形態で製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される投与単位形態は、処置される患者／対象のための単位投与量として適した物理的に離散した単位を指し；各単位は、必要とされる医薬担体と会合して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を含有する。本開示の投与単位形態の仕様は、一般的に、（ａ）治療剤の固有の特徴及び達成されるべき具体的な治療効果又は予防効果、並びに（ｂ）個体における感受性を処置するためにこのような活性化合物を配合する技術分野において固有の制限によって指示され、これらに直接依存する。

【0186】

したがって、当業者は、本明細書で提供される開示に基づいて、用量及び投与レジメンが治療分野で周知の方法に従って調整されることを理解するであろう。すなわち、最大許容用量を容易に確立することができ、検出可能な治療上の利益を患者に提供する有効量も、検出可能な治療上の利益を患者に提供するために各薬剤を投与するための時間的要件が決定され得るように決定され得る。したがって、特定の用量及び投与レジメンが本明細書に例示されているが、これらの例は、本開示を実施する際に患者に提供され得る用量及び投与レジメンを決して限定しない。

【0187】

投与量値は、緩和される状態の種類及び重症度によって変動し、単回又は複数回投与を含み得ることに留意すべきである。任意の具体的な対象について、特定の投与レジメンは、個々の必要性及び組成物の投与を管理又は監督する者の専門的判断に従って経時的に調整されるべきであり、本明細書に示される投与量範囲は例示的なものにすぎず、具体化された組成物の範囲又は実施を限定することを意図するものではないことが更に理解されるべきである。更に、本開示の組成物を用いた投与レジメンは、疾患の種類、患者の年齢、体重、性別、医学的状態、状態の重症度、投与経路、及び使用される具体的な抗体を含む様々な因子に基づき得る。したがって、投与レジメンは大きく変動し得るが、標準的な方法を使用して日常的に決定され得る。例えば、用量は、毒性効果及び／又は実験値などの臨床効果を含み得る薬物動態学的又は薬力学的パラメータに基づいて調整され得る。したがって、本開示は、当業者によって決定される患者内用量漸増を包含する。適切な投与量及びレジメンの決定は、関連技術において周知であり、本明細書に開示される教示が提供されると、当業者によって包含されることが理解されるであろう。

【0188】

腫瘍治療の有効量は、患者の疾患進行を安定化する、及び／又は症状を改善する能力、好ましくは例えば腫瘍サイズを減少させることによって、疾患進行を逆転させる能力によって測定され得る。本開示の抗体、抗原結合部分、抗体組成物、又は二重特異性結合分子が、がんを阻害する能力は、例えば実施例に記載される、インビトロアッセイによって、並びにヒト腫瘍における有効性を予測する適切な動物モデルにおいて評価され得る。適切な投与レジメンは、各具体的な状況において最適な治療応答を提供するために選択され、例えば、単回ボーラスとして、又は連続注入として、及び各症例の緊急性によって示される投与量の可能な調整を伴って投与され得る。

【0189】

本開示の抗体若しくはその抗原結合部分、抗体組成物、又は二重特異性結合分子は、当技術分野において受け入れられているペプチド、タンパク質又は抗体を投与する任意の方法によって投与され得、典型的には非経口投与に適している。本明細書で使用される場合、「非経口投与」は、対象の組織の物理的な破壊及び組織の破壊を通した投与を特徴とする任意の投与経路を含み、したがって一般的に血流、筋肉、又は内臓への直接投与をもたらす。したがって、非経口投与には、注射による投与、外科的切開を通した適用、組織貫通非外科的創傷を通した適用などが含まれるがこれらに限定されない。特に、非経口投与には、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内、大槽内、静脈内、動脈内、髄腔内、尿道内、頭蓋内、腫瘍内、及び関節滑液嚢内注射又は注入が含まれるがこれらに限定されないことが企図される。特定の実施態様は、静脈内経路及び皮下経路を含む。

【0190】

診断用途及び組成物
本開示の抗体及び抗原結合部分はまた、診断プロセス（例えば、インビトロ、エクスビボ）において有用である。例えば、抗体及び抗原結合部分を使用して、患者からの試料（例えば、組織試料、又は炎症性滲出液、血液、血清、腸液、唾液、若しくは尿などの体液試料）中のＣＤ７３のレベルを検出及び／又は測定することができる。適切な検出及び測定方法には、フローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、化学発光アッセイ、ラジオイムノアッセイ、及び免疫組織学などの免疫学的方法が含まれる。本開示は更に、本明細書に記載される抗体及び抗原結合部分を含むキット（例えば、診断キット）を包含する。

【0191】

製品及びキット
本開示はまた、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体若しくはその抗原結合部分、組成物、又は二重特異性結合分子、場合により追加の生物学的活性分子（例えば、別の治療薬）の医薬組成物、及び使用説明書を含有する１つ以上の容器（例えば、単回使用又は複数回使用容器）を含む製品、例えばキットを提供する。抗体若しくは抗原結合部分、組成物、又は二重特異性結合分子、及び任意の追加の生物学的活性分子は、非反応性ガラス又はプラスチックから作製されたバイアル又はアンプルなどの適切なパッキングに別々に包装され得る。特定の実施態様では、バイアル又はアンプルが、抗体若しくは抗原結合部分、組成物、又は二重特異性結合分子、及び場合により生物学的活性分子の濃縮ストック（例えば、２倍、５倍、１０倍以上）を保持する。特定の実施態様では、キットなどの製品が、抗体若しくは抗原結合部分、組成物、又は二重特異性結合分子並びに／或いは生物学的活性分子（例えば、シリンジ及び針）；並びに／或いは適切な希釈剤（例えば、滅菌水及び生理食塩水）を投与するための医療機器を含む。本開示はまた、前記製品を製造する方法を含む。

【0192】

本明細書で他に定義されない限り、本開示に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。例示的な方法及び材料を以下に記載するが、本明細書に記載される方法及び材料と類似の又は等価な方法及び材料を本開示の実施又は試験に使用することもできる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。

【0193】

一般的に、本明細書に記載される細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、分析化学、合成有機化学、医学品化学及び創薬化学、並びにタンパク質及び核酸化学並びにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法及びこれらの技術は、当技術分野において周知であり、一般に使用されるものである。酵素反応及び精製技術は、当技術分野において一般的に達成される、又は本明細書に記載される、製造業者の仕様に従って実施される。

【0194】

更に、文脈上別段の要求がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書及び実施態様を通して、「有する（ｈａｖｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、又は「有する（ｈａｓ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」若しくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、明言される整数又は整数群を含むが、任意の他の整数又は整数群を除外しないことを意味すると理解される。

【0195】

本明細書で言及される全ての刊行物及び他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に援用される。本明細書ではいくつかの文献が引用されているが、この引用は、これらの文献のいずれかが当技術分野における共通の一般知識の一部を形成することの自認を構成するわけではない。

【0196】

本開示がより良く理解され得るように、以下の実施例が示される。これらの実施例は、例示のみを目的としており、本開示の範囲を限定するものと決して解釈されるべきではない。

【実施例】

【0197】

実施例１．ラットＢ細胞からの抗ＣＤ７３抗体のクローニング
材料及び方法
ヒトＣＤ７３に対する抗体を、完全ヒト型イディオタイプを有する抗体を産生するＬｉｇａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．製のトランスジェニックラット系統であるＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）ラット（Ｏｓｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９０（４）：１４８１－９０（２０１３））に由来する抗体レパートリーから単離した。単一細胞選別抗体分泌Ｂ細胞（ＡＳＣ）からのラット由来抗体遺伝子のクローニングを、Ｓｙｍｐｌｅｘ（商標）抗体発見技術（Ｍｅｉｊｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３５８（３）：７６４－７２（２００６））によって実施した。

【0198】

ＩｇＧ_１－ＬＡＬＡフォーマット（下記参照）の完全ヒト免疫グロブリンをコードする抗体レパートリー構築物をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。細胞上清を、ハイスループットフォーマットでフローサイトメトリーを使用してＣＨＯ細胞の表面上で発現されたＣＤ７３への結合についてスクリーニングした。ＣＤ７３反応性クローンをＤＮＡ配列決定によって分析し、抗体をコードするＤＮＡ配列を抽出した。選択された抗体クローンを発現させ、下記のように機能的に試験した。

【0199】

抗体をコードするｃＤＮＡ断片のＳｙｍｐｌｅｘ（商標）クローニングにおいて縮重プライマーの使用によって導入された重鎖及び軽鎖のアミノ末端におけるミスセンス変異を生殖系列配列に戻し修正した。表１は、２１０２８、２１０４６、２１１２７、及び２１１６３と呼ばれる生殖細胞系抗体の重鎖可変ドメインヌクレオチド配列及び軽鎖可変ドメインヌクレオチド配列を示す。修正プロセスは、生殖系列に対するアミノ末端配列修正及びコドン使用頻度最適化を伴う。ヒト生殖系列配列とのマッチングのための標的を、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域についてのｂｌａｓｔ相同性検索によって識別した。

【0200】

抗体２１０２８、２１０４６、２１１２７及び２１１６３の可変ドメイン、定常領域及び相補性決定領域（ＣＤＲ）のタンパク質配列をそれぞれ表２、表３及び表４に示す。

【0201】

結果
表１は、抗体２１０２８、２１０４６、２１１２７及び２１１６３の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を示す。

【表1】

【0202】

表２は、抗体２１０２８、２１０４６、２１１２７及び２１１６３の推定アミノ酸配列を示す。ＣＤＲは太字／下線である。

【表2】

【0203】

表３は、重鎖定常領域アミノ酸配列及び軽鎖定常領域アミノ酸配列（それぞれＣＨ及びＣＬ）を示す。「ＩｇＧ_１ ＬＡＬＡ」は、ＩｇＧ_１抗体のＦｃ領域のエフェクター機能を低下させることが知られている重鎖中の「ＬＡＬＡ」変異（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｋａｂａｔナンバリングスキームに従ってナンバリング）の存在を指す（Ｈｅｚａｒｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７５（２４）：１２１６１－６８（２００１）；Ｈｅｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４４９（７１５８）：１０１－０４（２００７））。

【表3】

【0204】

表４は、抗体２１０２８、２１０４６、２１１２７、及び２１１６３の重鎖及び軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を示し、ＣＤＲはＩＭＧＴシステムに従って定義される。

【表4】

【0205】

表５は、抗体２１０２８、２１０４６、２１１２７及び２１１６３の配列番号情報を示す。特に明記しない限り、配列はアミノ酸配列である。

【表5】

【0206】

実施例２．可溶性ＣＤ７３活性アッセイにおける抗ＣＤ７３抗体のスクリーニング
抗ＣＤ７３抗体のパネルを、可溶性組換えＣＤ７３の酵素活性を阻害する能力について評価した。抗ＣＤ７３抗体を１０μg/mLの濃度で組換えＣＤ７３（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）、ＡＭＰ、及びＡＴＰと共に３７℃で３０分間インキュベートした。Ｓａｃｈｓｅｎｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ １７（７）：９９３－９９８（２０１２）に記載されるようにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、ＡＴＰ検出のＡＭＰ阻害を測定することによって、ＣＤ７３活性を調査した。

【0207】

抗ＣＤ７３抗体で処理した後のＣＤ７３酵素活性の阻害を図１に示す。異なる抗ＣＤ７３抗体で処理した後のＣＤ７３活性が強く変化したことが明らかであり、一部の抗体はこのアッセイで機能性を有さなかったが、他の抗体はＣＤ７３活性を強く阻害したことを示している。

【0208】

実施例３．細胞ベースのＣＤ７３活性アッセイにおける抗ＣＤ７３抗体のスクリーニング
抗ＣＤ７３抗体のパネルを、がん細胞株上で発現されたＣＤ７３の活性を阻害する能力について評価した。抗ＣＤ７３抗体を１０μg/mLの濃度でＣＤ７３発現細胞株と共に３７℃で３０分間インキュベートし、引き続いてＣＤ７３基質、ＡＭＰを添加し、３７℃で３時間更にインキュベートした。Ｓａｃｈｓｅｎｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．、前記に記載されるように、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、ＡＴＰを上清に添加し、ＡＴＰ検出のＡＭＰ阻害を測定することによって、ＣＤ７３活性を調査した。

【0209】

抗ＣＤ７３抗体で処理した後に２つの異なるがん細胞株上で発現されたＣＤ７３の活性を図２に示す。異なる抗ＣＤ７３抗体で処理した後のＣＤ７３活性が強く変化したことが明らかである；一部の抗体はこのアッセイで機能性を有さなかったが、他の抗体はＣＤ７３活性を強く阻害した。注目すべきことに、同じ１０個の抗体が両細胞株において最も高い活性を示した。

【0210】

実施例４．抗ＣＤ７３参照抗体類似体のクローニング
材料及び方法
表６の抗体類似体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインをコードするアミノ酸配列を、列挙した特許又は特許出願から得た。タンパク質配列を、ヒトコドン使用頻度でＤＮＡ配列に逆翻訳した。対応するＤＮＡ配列を遺伝子合成し、ヒト重鎖定常領域又はヒト軽鎖定常領域を含有する発現ベクターにクローニングし、完全長抗体鎖の発現を得た。発現のために選択されたヒト抗体アイソタイプを、該当する場合にはＦｃ領域に導入された追加の変異と共に抗体フォーマット欄に列挙する。標準的なタンパク質発現系を使用して、得られた発現プラスミドでＣＨＯ細胞をトランスフェクトした。対応する抗体上清を、標準的なプロテインＡ精製カラムクロマトグラフィーを使用して精製した。

【表6】

【0211】

実施例５．ヒト又はカニクイザルＣＤ７３タンパク質でトランスフェクトしたＣＨＯ－Ｓ細胞への抗ＣＤ７３抗体の直接結合
ＣＨＯ－Ｓ細胞上で発現されたヒト又はカニクイザルＣＤ７３タンパク質への抗ＣＤ７３抗体２１０２８、２１０４６、２１１２７、及び２１１６３の結合を評価し、オレクルマブ類似体の結合と比較した。

【0212】

抗ＣＤ７３抗体を、ヒト又はカニクイザルＣＤ７３を一過的に発現するハムスターＣＨＯ－Ｓ細胞株と共に４℃で３０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、その後、ＡＦ６４７コンジュゲート二次抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体と共に更に２０分間インキュベートした。洗浄ステップ後、各ウェルのＡＦ６４７シグナルのＧｅｏＭｅａｎを測定するハイスループットフローサイトメーターｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ ＰＬＵＳ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して抗体結合を検出した。全ての濃度を３連でアッセイし、各抗体について１２点滴定曲線を作成した。

【0213】

細胞上で発現されたヒト又はカニクイザルＣＤ７３への抗体の結合曲線を図３に示す。アッセイした抗体は、異なる効力及び有効性で細胞提示ヒト及びカニクイザルＣＤ７３タンパク質に結合する。特に、ｍＡｂ２１１２７は、試験した抗体の中で最も高い効力でヒト及びカニクイザルＣＤ７３に結合する。

【0214】

実施例６．ヒト及びカニクイザルＣＤ７３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する抗体及びＦＡＢ断片親和性の測定
この実施例は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される、組換えヒト及びカニクイザルＣＤ７３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）への抗ＣＤ７３ Ｆａｂ断片及び抗体の結合を実証する。

【0215】

材料及び方法
ＩＢＩＳ ＭＸ９６ ＳＰＲ機器（ＩＢＩＳ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、オランダ）と組み合わせたＣｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｆｌｏｗ Ｍｉｃｒｏｓｐｏｔｔｅｒ（ＣＦＭ、Ｗａｓａｔｃｈ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、米国ソルトレークシティー）を使用して、抗ＣＤ７３ ｍＡｂ及びＦａｂ断片の速度論的結合分析を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって実施した。ヒト及びカニクイザルＣＤ７３の細胞外ドメインをコードするＣＤ７３ ｃＤＮＡを合成し、ＣＭＶプロモーター、及びＨｉｓタグ付きＣＤ７３ ＥＣＤのＣ末端６×ヒスチジン配列（配列番号４５）、又はヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列（ＡＡ Ｐ１０１－Ｋ３３０）のいずれかを含有するベクターにそれぞれクローニングして、クローニングＣＤ７３ ＥＣＤに対してＣ末端にＩｇＧ１ Ｆｃを融合した。Ｈｉｓタグ付き及びＦｃ融合構築物を、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現系を使用して一過的に発現させ、それぞれ標準的なＮｉ－ＮＴＡクロマトグラフィー又は標準的なＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ（商標）手順によって精製した。Ｇｅｎｏｖｉｓ（スウェーデン）によって提供されるキットを使用して、完全長ＩｇＧ１抗体をＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮ酵素で消化することによって、抗ＣＤ７３ Ｆａｂ断片を作製した。ＣＦＭを使用して、１５分間、Ｇ－ａ－ｈｕ－ＩｇＧ Ｆｃ ＳｅｎｓＥｙｅ（登録商標）上でＦｃタグ付き抗原を捕捉することによって、Ｆａｂ断片の親和性を測定した。スポッティング後、ＳｅｎｓＥｙｅ（登録商標）をＩＢＩＳ ＭＸ９６バイオセンサーに配置し、固定抗原をＳｅｎｓＥｙｅ ＦｉｘＩｔキットによって固定した。０．８nMから３００nMまで増加する濃度で単量体Ｆａｂ断片を注入することによって、速度論的分析を実施した。Ｆａｂ断片注入の各サイクルの後、表面を１０mMグリシンｐＨ３、１０％グリセロールによって再生した。Ｆａｂ会合を１５分間実施し、抗原解離を１５分間実施した。Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｆｌｏｗ Ｍｉｃｒｏｓｐｏｔｔｅｒ（ＣＦＭ、Ｗａｓａｔｃｈ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、米国ソルトレークシティー）を使用して、１５分間、Ｇ－ａ－ｈｕ－ＩｇＧ Ｆｃ ＳｅｎｓＥｙｅ（登録商標）（Ｓｓｅｎｓ ＢＶ、オランダ）上でｍＡｂを捕捉することによって、完全長モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の親和性を測定した。スポッティング後、ＳｅｎｓＥｙｅをＩＢＩＳ ＭＸ９６にドッキングし、スポッティングしたｍＡｂをＳｅｎｓＥｙｅ ＦｉｘＩｔキット（Ｓｓｅｎｓ ＢＶ、オランダ）よって固定した。２倍希釈として０．１６nMから１０nMまで増加する濃度のＨｉｓタグ付き抗原を注入する速度論的滴定シリーズを適用することによって、速度論的分析を実施した。表面を、１００mM Ｈ_３ＰＯ_４、ｐＨ３によって、カニクイザル抗原注入の次のサイクルの前に再生した。ｍＡｂ会合を１５分間実施し、抗原解離を４５分間実施した。記録された結合応答を、会合速度（ｋ_ｏｎ又はｋ_ａ）、解離速度（ｋ_ｏｆｆ又はｋ_ｄ）及び親和性（Ｋ_Ｄ）定数を計算するために、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２．０ソフトウェアを用いて単純なラングミュア１：１結合モデルに当てはめた。結合速度パラメータを、６つの独立した測定点の平均として測定した。

【0216】

結果
抗ＣＤ７３ Ｆａｂ断片及び完全長抗体の結合親和性及び速度論パラメータをそれぞれ表７及び表８に示す。完全長抗体は、ナノモル濃度以下の範囲の高い親和性でヒトＣＤ７３に結合した。全ての抗体が、ヒト及びカニクイザルＣＤ７３を、参照抗体（１１Ｅ１、オレクルマブ、及びＣＰＸ００６の類似体）と同等の結合速度で認識した。全ての抗体が、測定された高い親和性に寄与する非常に遅い解離速度定数を特徴としていた。Ｆａｂ断片の一価結合親和性は、対応する完全長抗体の一価結合親和性よりも２０～２４５倍弱かった。解離速度（ｋｄ）はフォーマットの変化によって強く影響され、Ｆａｂ断片はインタクト抗体よりもはるかに速いＣＤ７３からの解離を示す。

【0217】

インタクト抗体及びＦａｂ断片の結合速度の差は、抗体がＣＤ７３ホモ二量体に結合すること、及び完全長抗体について測定された高い親和性が結合活性効果によるものであることを示唆している。ＣＤ７３は、非共有結合性ホモ二量体として存在することが知られており（Ｋｎａｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２０（１２）：２１６１－２１７３（２０１２））、１１Ｅ１類似体及びオレクルマブ類似体の結合は、ＣＤ７３ホモ二量体への二価結合に依存することが以前に見出されており、ここに記載される完全長抗体とＦａｂ断片との間の結合速度論における類似の差を伴っている（Ｐｅｒｒｏｔ，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２７（８）：２４１１－２４２５（２０１９））。

【0218】

抗ＣＤ７３抗体及びＦａｂ断片のＳＰＲ分析は、抗ＣＤ７３抗体が二量体ＣＤ７３への二価結合に依存すること、及び本明細書に例示される完全長抗体の結合親和性が、ＣＤ７３ホモ二量体に結合する場合、参照ｍＡｂの結合親和性に匹敵することを示した。

【表7】

【表8】

【0219】

実施例７．抗ＣＤ７３抗体のエピトープビニング
この実施例は、対となる競合パターンに基づく抗ＣＤ７３抗体のエピトープビンへのグループ化を記載する。異なるエピトープビンに属する抗体は、ＣＤ７３のＥＣＤ上の異なるエピトープを認識する。

【0220】

材料及び方法
対となる抗体競合の調査を、ＩＢＩＳ－ＭＸ９６機器（ＩＢＩＳ、オランダ）を使用してＳＰＲによって実施した。抗ＣＤ７３抗体をＰＢＳ中３μg/mLに希釈し、Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｆｌｏｗ Ｍｉｃｒｏｓｐｏｔｔｅｒを使用して１５分間捕捉することによってＧ－ａ－ｈｕ－ＩｇＧ Ｆｃ ＳｅｎｓＥｙｅ（登録商標）上にスポッティングし、引き続いてＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラスツズマブ）によって残留結合部位をブロッキングし、ＳｅｎｓＥｙｅ ＦｉｘＩｔキット（ＩＢＩＳ、オランダ）によって化学的架橋した。センサー調製後、古典的なサンドイッチアッセイを使用して抗体競合分析を実施した。ＣＤ７３－Ｈｉｓ ＥＣＤ抗原をＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、及び２００nM Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ泳動緩衝液に希釈し、次いで、１０nMの濃度で注入し、抗ＣＤ７３抗体のコンジュゲートアレイによって捕捉した。次に、泳動緩衝液中１００nMに希釈したＣＤ７３抗体の各々の個々の注入を実施して、抗体競合パターンを確立した。Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｂｉｎｎｉｎｇ ２．０（Ｗａｓａｔｃｈ、米国）によってデータを分析した。

【0221】

結果
１６個の抗ＣＤ７３抗体の競合パターンを図４に示す。試験した抗ＣＤ７３抗体群は、４つの重複する主なエピトープビン：１、２、３、及び４にある。ビン１は、互いに交差遮断したオレクルマブ類似体及び１１Ｅ１類似体を含んでいた。オレクルマブ及び１１Ｅ１抗体は、Ｎ末端ドメインの最上部及びＣＤ７３の触媒部位の反対側で重複エピトープに結合することが示されている（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ＭＡＢＳ ８（３）：４５４－４６７（２０１６）、及びＰｅｒｒｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２７：２４１１－２４２５（２０１９））。ビン１の全ての抗体は、ビン２にグループ分けされた抗体を交差遮断した。ビン２は、同等の競合パターンを示した抗体２１３８５、２１１２７、及び２１１６３を含み、抗体が類似のエピトープに結合することを示唆した。ビン２の抗体は、ビン４の抗体を除く全ての試験抗体を交差遮断した。ビン４抗体を、２つのサブビン：ビン３の１つ以上の抗体と競合するビン４ａ及び４ｂに分けることができた。抗体２１０４６（ビン４ａ）及びＣＰＸ００６類似体（ビン４ｂ）は、ビン３の異なる抗体と競合し、２つの抗体が密接に関連しているが同一ではない結合エピトープを有することを示している。

【0222】

結論として、抗体２１１２７及び２１１６３（ビン２）は、１１Ｅ１類似体及びオレクルマブ類似体（ビン１）のエピトープとのいくらかの重複を有するＣＤ７３のユニークなエピトープに結合する。抗体２１１２７及び２１１６３のエピトープは、ＣＰＸ００６類似体（ビン４）のエピトープとは異なる。抗体２１０４６（ビン４ａ）は、ＣＰＸ００６類似体エピトープ（ビン４ｂ）に類似であるが、抗体２１１２７及び２１１６３（ビン２）並びに１１Ｅ１類似体及びオレクルマブ類似体（ビン１）のエピトープとは異なるエピトープに結合する。

【0223】

実施例８．ＣＤ７３変異誘発による抗ＣＤ７３抗体のエピトープマッピング
この実施例は、９４個の異なるＣＤ７３変異体に対する結合親和性及び速度論を測定することによって、どのようにして抗体２１１２７、２１１６３、及び２１０４６の結合エピトープを線状エピトープ及び個々の接触残基に分けることができるかを例示する。

【0224】

材料及び方法
ヒト及びラット（ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））ＣＤ７３のタンパク質配列をＵｎｉＰｒｏｔ（それぞれ、アクセッション番号Ｐ２１５８９及びＰ２１５８８）からダウンロードした。カニクイザル（カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））及びニワトリ（ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ））ＣＤ７３の完全長タンパク質配列をＮＣＢＩ（それぞれＸＰ＿００５５５２４８８．１、及びＸＰ＿００４９４０４５３．１）からダウンロードした。公的に入手可能なＣＤ７３構造ＰＤＢ ４Ｈ２Ｆ（開）、４Ｈ２Ｇ（オープン）、及び４Ｈ２Ｉ（閉）を使用して、表面露出アミノ酸残基をマッピングした。ヒトＣＤ７３とラットＣＤ７３との間で異なる表面露出残基位置をアラニンに変異させた。線状抗体エピトープをマッピングするために、ヒトＣＤ７３ ＥＣＤ配列中の１０個のアミノ酸を、５個のアミノ酸が重複するセグメントのニワトリ配列に順次交換したＣＤ７３キメラタンパク質を作製した。

【0225】

ヒトＣＤ７３の細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡを合成し、ＣＭＶプロモーター及びヒトＩｇ Ｆｃ配列（残基Ｐ１０１～Ｋ３３０）を含有するベクターにクローニングして、クローニングＣＤ７３ ＥＣＤに対してＣ末端にＩｇ Ｆｃを融合した。野生型（ｗｔ）及び変異ヒトＣＤ７３ Ｆｃ融合構築物を、標準的な遺伝子合成技術によって作製し、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現系を使用して、培養物２mL中でタンパク質を一過的に発現させた。

【0226】

ヒトＣＤ７３ Ｆｃ融合構築物を回収した後、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって上清を抗ＣＤ７３ Ｆａｂへの結合について試験した。Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｆｌｏｗ Ｍｉｃｒｏｓｐｏｔｔｅｒ（ＣＦＭ、Ｗａｓａｔｃｈ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、米国ソルトレークシティー）を使用して、１５分間、Ｇ－ａ－ｈｕ－ｌｇＧ Ｆｃ ＳｅｎｓＥｙｅ（登録商標）（Ｓｓｅｎｓ ＢＶ、オランダ）上にＣＤ７３融合タンパク質を含有する培養物上清を固定化した。スポッティング後、ＳｅｎｓＥｙｅ（登録商標）をＩＢＩＳ ＭＸ９６バイオセンサーに配置し、ＦｉｘＩＴキット（Ｓｓｅｎｓ ＢＶ、オランダ）を使用して捕捉タンパク質を表面に固定した。本発明の抗体の単量体Ｆａｂ断片を０．８nMから５００nMまで増加する濃度で注入する速度論的滴定シリーズを適用することによって、速度論的分析を実施した。Ｆａｂ断片注入の各サイクルの後、表面を１０mMグリシンｐＨ３、１０％グリセロールによって再生した。Ｆａｂ会合を１５分間実施し、抗原解離を１５分間実施した。記録された結合応答を、会合速度（ｋ_ｏｎ又はｋ_ａ）、解離速度（ｋ_ｏｆｆ又はｋ_ｄ）及び親和性（Ｋ_Ｄ）定数を計算するために、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２ソフトウェアを用いて単純なラングミュア１：１結合モデルに当てはめた。

【0227】

結果
抗体２１１２７、２１１６３及び２１０４６、並びに１１Ｅ１、オレクルマブ、及びＣＰＸ００６類似体によって認識されるＣＤ７３のエピトープを、ヒトＣＤ７３配列の１０アミノ酸セグメントがニワトリ配列で置き換えられたキメラ受容体構築物を使用して；又はヒトＣＤ７３とラットＣＤ７３との間で異なる表面露出アミノ酸をアラニンに変異させたアラニンスキャニングによってマッピングした。野生型ＣＤ７３及び変異体に対する抗体の結合親和性をＳＰＲによって測定し、ｗｔと比較して少なくとも５倍の親和性低下のカットオフ、又は１：１結合モデルからの偏差を、抗ＣＤ７３抗体への結合の有意な喪失を伴う構築物を見出すために使用した（表９）。

【表9】

【0228】

識別された線状エピトープ及び接触残基を、開状態のＣＤ７３ホモ二量体の結晶構造上にマッピングした（図５）。抗体２１１２７、２１１６３、及び２１０４６、並びに１１Ｅ１、オレクルマブ、及びＣＰＸ００６類似体によって認識されるエピトープは全て、ＣＤ７３のＮ末端ドメイン上にあることが分かった（図５）。抗体２１１２７及び２１１６３並びに１１Ｅ１及びオレクルマブ類似体のエピトープは、ＣＤ７３ホモ二量体の二量体化界面に垂直な表面上及び触媒中心に対して反対側に位置することが分かった（図５、パネルＡ、Ｂ、Ｄ、及びＥ）。４つの抗体のエピトープは、異なる接触残基及び線状エピトープに結合することによって異なることが分かった。ＣＤ７３の上部の表面に結合する抗体は、酵素を開いた不活性な立体構造に固定し、閉じた活性状態への移行を妨げることによって、酵素活性を遮断し得る（Ｐｅｒｒｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２７：２４１１－２４２５（２０１９））。

【0229】

抗体２１０４６及びＣＰＸ００６類似体のエピトープは、ＣＤ７３の触媒中心のすぐ上のＮ末端ドメインの前面にあることが分かった（図５、パネルＣ及びＦ）。２つの抗体は、認識される線状エピトープ及び接触残基に関して異なる。

【0230】

要約すると、単一アミノ酸分解能でのエピトープマッピングは、例示される抗ＣＤ７３抗体がそれぞれ別個の結合エピトープを有することを示した。抗体２１１２７及び２１１６３は、ＣＤ７３のＮ末端ドメインの上部の類似のエピトープに結合する；これらのエピトープは、１１Ｅ１、オレクルマブ及びＣＰＸ００６類似体のエピトープとは異なる。抗体２１０４６及びＣＰＸ００６類似体は、ＣＤ７３のＮ末端ドメインの前面の重複しているが依然として別個のエピトープに結合する。

【0231】

実施例９．溶液中で形成された抗体／ＣＤ７３複合体の化学量論
この実施例は、ＳＥＣ－ＭＡＬＳによって測定される溶液中で形成された抗体／ＣＤ７３ ＥＣＤ複合体のサイズを記載する。

【0232】

材料及び方法
抗ＣＤ７３抗体及びＨｉｓタグ付きＣＤ７３を異なる比率で、並びに個別に分析して、ＣＤ７３ホモ二量体と抗ＣＤ７３抗体との間に形成された複合体のサイズを分析した。ＣＤ７３－Ｈｉｓ ９００pmolを、ＰＢＳ、ｐＨ７．４に希釈した抗体 ９００、４５０、９０又は０pmolと混合することによって試料を調製した。試料を室温で３０分間インキュベートし、引き続いて、ＵＨＰＬＣ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＳＥＣ Ｘ－Ｂｒｉｄｇｅカラム（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して、１．２mL/分の流量で分離した。試料泳動緩衝液は、０．０１Ｍクエン酸塩、２５０mM Ｌ－アルギニン・ＨＣｌ、ｐＨ６．０であった。ＨＰＬＣ分離後、全ての試料を、ＭｉｎｉＤＡＷＮ ＴＲＥＯＳ ＭＡＬＳ検出器（Ｗｙａｔｔ）及びＯｐｔｉｌａｂ Ｔ－ｒＥＸ屈折率検出器（Ｗｙａｔｔ）を使用して分析した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用してデータプロットを作成した。

【0233】

結果
ＣＤ７３ホモ二量体に対する抗体の二価結合は、酵素を不活性な立体構造に固定し得る（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ＭＡＢＳ ８（３）：４５４－４６７（２０１６）及びＰｅｒｒｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２７：２４１１－２４２５（２０１９））。遮断機序は、ＣＤ７３ホモ二量体の架橋によるもの、又は不活性状態の単一ＣＤ７３二量体に結合することによるものであり得る。溶液中で形成された抗体／ＣＤ７３複合体の化学量論を特徴付けるために、タンパク質複合体のサイズをＳＥＣ－ＭＡＬＳによって決定した。１：１抗体／ＣＤ７３ホモ二量体複合体のサイズは、抗体及びＣＤ７３ホモ二量体の個々の分子量（それぞれおよそ１５０及び１２５kDa）から計算して２７０～２８０kDaの範囲にある。図６Ａ及び図６Ｂ並びに表１０は、様々な分子比でＣＤ７３ホモ二量体に結合する抗体２１１２７、２１１６３、及び２１０４６、並びに１１Ｅ１、オレクルマブ、及びＣＰＸ００６類似体についてのＳＥＣ－ＭＡＬＳプロファイル及び形成された複合体のサイズを示す。ＣＤ７３及び抗体の各々の個々の泳動は、タンパク質の予想サイズと一致する単分散ピークを示し、凝集体の非存在を確認する（図６Ａ及び図６Ｂ、破線）。ＣＤ７３に結合する抗体２１１２７のＳＥＣ－ＭＡＬＳプロファイルは、予測される１：１ ２１１２７：ＣＤ７３ホモ二量体複合体のサイズに対応する２７６kDaの平均サイズを有する１つの主ピーク（ピーク２）、及び過剰の２１１２７又はＣＤ７３二量体のいずれかに対応する１つのより小さなピーク（ピーク１）を示す。抗体２１１６３、並びに１１Ｅ１類似体及びＣＰＸ００６類似体は、主に１：１複合体を形成したが、最高の抗体：ＣＤ７３比（１：１）で高次複合体を形成する傾向があった。多分散高次複合体は、ＣＰＸ００６類似体及び１１Ｅ１類似体で最も顕著であった。抗体２１０４６及びオレクルマブ類似体は大きな複合体を形成し、これらの抗体が主に別個のＣＤ７３二量体を架橋することを示しており、これはオレクルマブ（ＭＥＤＩ９４４７）についても示されている（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ ｅｔ ａｌ，ＭＡＢＳ ８（３）：４５４－４６７（２０１６））。

【表10】

【0234】

表１０のピークは、図６Ａ及び図６Ｂのクロマトグラムに右から左に向かって見られるピーク１～４に対応する。ピーク１は、非結合／過剰なＣＤ７３ホモ二量体（約１２５kDa）又は非結合／過剰な抗体（約１５０kDa）のいずれかに対応する。ピーク２～４は、様々なサイズ及び化学量論のｍＡｂ：ＣＤ７３複合体に対応し、約２７５kDaの複合体サイズは１：１の化学量論を表す。

【0235】

表１０並びに図６Ａ及び図６Ｂに示されるように、抗体２１１２７は、ＣＤ７３の濃度とは無関係に１：１複合体を生じる方法でＣＤ７３ホモ二量体上のエピトープに結合する。抗体２１１６３並びに１１Ｅ１類似体及びＣＰＸ００６類似体は、主に１：１複合体としてＣＤ７３二量体に結合するが、様々な程度で高次複合体を形成する傾向も示す。抗体２１０４６及びオレクルマブ類似体は、オリゴマー複合体としてのみＣＤ７３ホモ二量体に結合し、複数のＣＤ７３二量体の架橋を示す。

【0236】

実施例１０．可溶性ＣＤ７３活性アッセイにおける抗ＣＤ７３抗体の機能性
可溶性ＣＤ７３活性アッセイにおいて、抗ＣＤ７３抗体２１０２８、２１０４６、２１１２７、及び２１１６３が可溶性組換えＣＤ７３の酵素活性を阻害する能力をより詳細に評価し、オレクルマブ類似体と比較した。抗ＣＤ７３抗体を組換えＣＤ７３、ＡＭＰ及びＡＴＰと共に３７℃で２時間インキュベートした。Ｓａｃｈｓｅｎｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．、前記に記載されるようにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、ＡＴＰ検出のＡＭＰ阻害を測定することによって、ＣＤ７３活性を調査した。

【0237】

示される濃度の抗ＣＤ７３抗体又はオレクルマブ類似体で処理した後のＣＤ７３酵素活性の阻害を図７に示す。抗ＣＤ７３抗体の阻害機能は濃度依存的であり、異なる効力及び有効性を有するにもかかわらず、抗ＣＤ７３抗体の全てがＣＤ７３活性を阻害することが明らかである。更に、オレクルマブ類似体は、より高い抗体濃度ではＣＤ７３酵素活性をあまり有効に阻害しない。同様の結果が、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ＭＡＢＳ ８（３）：４５４－４６７（２０１６））によってオレクルマブ（以前はＭＥＤＩ９４４７）について公開されている。抗体２１０２８及び２１０４６はまた、中間濃度と比較して高い濃度でＣＤ７３酵素活性をわずかに少なく阻害する。対照的に、抗体２１１２７及び２１１６３は、およそ３μg/mLを超える全ての濃度でＣＤ７３酵素活性の最大阻害を示す。

【0238】

実施例１１．細胞ベースのＣＤ７３活性アッセイにおける抗ＣＤ７３抗体の機能性
抗ＣＤ７３抗体２１０２８、２１０４６、２１１２７、及び２１１６３が細胞上で発現されたＣＤ７３の活性を阻害する能力をより詳細に評価し、オレクルマブ類似体と比較した。抗ＣＤ７３抗体をＣＤ７３発現ヒト細胞株（Ｃａｌｕ－６及びＨ２９２）又はＣＤ７３発現カニクイザル細胞株（Ｃｙｎｏｍ－Ｋ１）と共に３７℃で３０分間インキュベートし、引き続いてＣＤ７３基質、ＡＭＰを添加し、３７℃で３時間更にインキュベートした。Ｓａｃｈｓｅｎｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．、前記に記載されるように、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、ＡＴＰを上清に添加し、ＡＴＰ検出のＡＭＰ阻害を測定することによって、ＣＤ７３活性を調査した。

【0239】

異なる抗ＣＤ７３抗体で処理した後のＣＤ７３活性の阻害を図８に示す。抗ＣＤ７３抗体の阻害機能は濃度依存的であり、異なる効力及び有効性を有するにもかかわらず、抗体の全てがヒトＣＤ７３活性とカニクイザルＣＤ７３活性の両方を阻害することが明らかである。抗体２１１２７及び２１１６３は、２つのヒト細胞株Ｃａｌｕ－６及びＨ２９２において最も高い有効性を示すが、試験した４つの抗体全てが、３つの細胞株全てにおいてオレクルマブ類似体よりも明らかに優れている。

【0240】

実施例１２．長期の細胞ベースのＣＤ７３活性アッセイにおける抗ＣＤ７３抗体の機能性
長期の細胞ベースのアッセイにおいて、抗ＣＤ７３抗体２１０２８、２１０４６、２１１２７、及び２１１６３が細胞株上で発現されたＣＤ７３の活性を阻害する能力をより詳細に評価し、オレクルマブ類似体と比較した。抗ＣＤ７３抗体をＣＤ７３発現ヒト細胞株Ｈ２９２と共に３７℃で３０分間インキュベートし、引き続いてＣＤ７３基質、ＡＭＰを添加し、３７℃で３、６又は２４時間更にインキュベートした。Ｓａｃｈｓｅｎｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．、前記に記載されるように、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、ＡＴＰを上清に添加し、ＡＴＰ検出のＡＭＰ阻害を測定することによって、ＣＤ７３活性を調査した。

【0241】

異なる抗ＣＤ７３抗体で処理した後のＣＤ７３活性の阻害を図９に示す。抗ＣＤ７３抗体の阻害機能は濃度依存的であり、異なる効力及び有効性を有するにもかかわらず、抗体の全てがＣＤ７３活性を阻害することが明らかである。特に、細胞を抗体と最大２４時間インキュベートすると、抗体２１１２７及び２１１６３がオレクルマブ類似体（及び試験した他の２つの抗ＣＤ７３抗体）と更に区別される。

【0242】

実施例１３．がん細胞株に対する抗ＣＤ７３抗体の有効性
抗ＣＤ７３抗体２１１２７、２１０４６、２１１６３を、広範囲のＣＤ７３発現及び活性レベルを表すがん細胞株の大きなパネルで発現されるＣＤ７３の活性を阻害する能力について評価した。細胞パネルは、表１１に記載される複数の起源組織にわたるいくつかのがん適応症に及ぶ。

【0243】

材料及び方法
抗ＣＤ７３抗体を２５μg/mLの濃度でＣＤ７３発現細胞株と共に３７℃で３０分間インキュベートし、引き続いてＣＤ７３基質、ＡＭＰを添加し、３７℃で３時間更にインキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、ＡＴＰを上清に添加し、ＡＴＰ検出のＡＭＰ阻害を測定することによって、細胞ＣＤ７３活性を評価した。発光を介してＣＤ７３活性を検出する。

【0244】

結果
２０種の異なるがん細胞株上で発現されたＣＤ７３の活性に対する抗ＣＤ７３抗体の効果を図１０に示す。異なる抗ＣＤ７３抗体で処理した後にＣＤ７３活性が変化したことが明らかである。いくつかの抗体（２１０４６及びオレクルマブ類似体）は、より低い細胞ＣＤ７３活性レベルでＣＤ７３を阻害するいくらかの能力を示したが、最高活性レベルで酵素を阻害することはできなかった一方、他の抗体（２１１２７及び２１１６３）は、例えばＣａｌｕ－６、ＮＣＩ－Ｈ１７７５、ＫＹＳＥ－３０及びＣａｐａｎ－２細胞株で観察される最高活性レベルでさえＣＤ７３活性を強く阻害した。

【表11】

【0245】

実施例１４．細胞ベースの生存率アッセイにおける抗ＣＤ７３抗体活性のインビトロ試験
この実施例は、３００μMのＡＭＰの存在下で成長させた２つのがん細胞株を使用した生存率アッセイにおける抗体２１１２７のインビトロ機能的特徴付けを記載する。

【0246】

材料及び方法
抗体を、トリプルネガティブ乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８の生存率（生存及び／又は増殖）を直接阻害するそれらの能力についてインビトロで評価した。細胞を、２％ＦＢＳ及び１％Ｐ／Ｓを補充したＲＰＭＩ １６４０ Ｇｌｕｔａｍａｘ（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）又はＤＭＥＭ（ＭＤＡ－ＭＢ－４６８）培地中、３８４ウェルプレートに１０００個細胞／ウェルで播種し、３００μMのＡＭＰ（アデノシン一リン酸、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下、２５μg/mLから滴定した抗体と共に３７℃の加湿インキュベーター中で４日間インキュベートした。製造業者の説明書に従って、ＷＳＴ－１細胞増殖試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して細胞生存率を定量化した。

【0247】

結果
２１１２７及びオレクルマブ類似体は、機能的読み出しに関して異なることが明らかである（図１１）。抗体２１１２７は両細胞株に対する顕著な効果を示し、ＭＢＡ－ＭＢ－２３１は未処理細胞と比較しておよそ６０％生細胞に、ＭＢＡ－ＭＢ－４６８は０％生細胞（すなわち、培地バックグラウンドで測定可能な生細胞はない）に減少した。オレクルマブ類似体は、ＭＢＡ－ＭＢ－２３１細胞株の生存率に対する有意な効果を示さなかったが、ＭＢＡ－ＭＢ－４６８はある程度影響を受け、未処理細胞と比較して生細胞数はおよそ７０～８０％に減少した。

【0248】

他の組織由来のがん細胞株においても同様の効果が期待され得る。

【0249】

実施例１５．抗ＣＤ７３抗体による健康なヒトドナー由来の初代ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞並びにＣＤ１９^＋Ｂ細胞上で発現されたＣＤ７３の阻害
健康なヒトドナー由来の初代ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞並びにＣＤ１９^＋Ｂ細胞上で発現されたＣＤ７３の活性を阻害する能力について、抗ＣＤ７３抗体を評価した。

【0250】

材料及び方法
製造業者の説明書（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に従って関連する特異性を有する磁気（ＭＡＣＳ）ビーズを使用して、バフィーコートＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）から初代ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞並びにＣＤ１９^＋Ｂ細胞を単離した。５０～０．００３μg/mLの濃度での抗ＣＤ７３抗体の４倍希釈滴定を、単離初代細胞と共に３７℃で３０分間インキュベートし、引き続いてＣＤ７３基質、ＡＭＰを添加し、３７℃で２０時間（ＣＤ１９^＋Ｂ細胞）又は４０時間（ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞）更にインキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、ＡＴＰを上清に添加し、ＡＴＰ検出のＡＭＰ阻害を測定することによって、ＣＤ７３活性を評価した。

【0251】

結果
抗ＣＤ７３抗体で処理した後に初代ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞並びにＣＤ１９^＋Ｂ細胞上で発現されたＣＤ７３の活性を図１２に示す。抗体２１１２７及びオレクルマブ類似体で処理した後のＣＤ７３活性は強く異なっていたことが明らかである。より高濃度の抗体２１１２７は、全ての初代細胞型においてＣＤ７３活性のほぼ完全な阻害を実証したが、オレクルマブ類似体は、ＣＤ１９^＋Ｂ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞においてＣＤ７３活性の非常に限定された阻害、並びにＣＤ４^＋Ｔ細胞において部分的な阻害のみを示した。健康なドナー由来の末梢血ＣＤ４^＋Ｔ細胞は平均して制限されたＣＤ７３発現を有するが、ＣＤ１９^＋Ｂ細胞は平均して高レベルのＣＤ７３を発現し、ＣＤ８^＋Ｔ細胞は平均して中レベルを発現するので、オレクルマブ類似体がＣＤ７３活性を阻害する能力はＣＤ７３発現レベルと相関する（Ａｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２７６（１）：１２１－１４４（２０１７））。

【0252】

実施例１６．Ｔ細胞増殖アッセイにおける抗ＣＤ７３抗体の機能性
抗ＣＤ７３抗体２１０２８、２１０４６、２１１２７、及び２１１６３がＣＤ４^＋Ｔ細胞上で発現されたＣＤ７３の活性を阻害する能力をインビトロアッセイで評価し、オレクルマブ類似体と比較した。ＣＤ４^＋Ｔ細胞を健康なドナーから単離し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＡＭＰ及び抗ＣＤ７３抗体で４８時間活性化し、引き続いて３Ｈ－チミジン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を更に２４時間添加した。Ｔ細胞増殖を３Ｈ－チミジン取り込みとして測定し、ＡＭＰで処理していない対照に対して正規化した。

【0253】

異なる抗ＣＤ７３抗体で処理した後のＴ細胞増殖を図１３に示す。Ｔ細胞増殖に対する抗ＣＤ７３抗体の刺激機能は濃度依存的であり、異なる効力及び有効性を有するにもかかわらず、抗体の全てがＴ細胞増殖を刺激することが明らかである。オレクルマブ類似体を除く全ての抗体がＴ細胞増殖を完全に回復させ、抗体２１１２７が最も高い効力で回復させた。

【0254】

実施例１７．Ｔ細胞活性化アッセイにおける抗ＣＤ７３抗体の機能性
抗ＣＤ７３抗体がＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞上で発現されたＣＤ７３の活性を阻害する能力をインビトロアッセイで評価し、オレクルマブ類似体と比較した。

【0255】

ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞を健康なドナーから単離し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＡＭＰ及び抗ＣＤ７３抗体で７２時間活性化し、引き続いて上清を収穫した。ＥＬＩＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、Ｔ細胞活性化を上清中のＩＦＮ－γレベルとして測定した。

【0256】

異なる抗ＣＤ７３抗体で処理した後のＴ細胞活性化を図１４に示す。Ｔ細胞活性化に対する抗体２１１２７の刺激機能は濃度依存的であり、２１１２７はオレクルマブ類似体よりも高いＩＦＮ－γレベルをもたらすことが明らかである。

【0257】

実施例１８．一方向ＭＬＲアッセイにおける抗ＣＤ７３抗体の機能性
抗ＣＤ７３抗体が一方向混合リンパ球反応（ＭＬＲ）でＣＤ７３の活性を阻害する能力をインビトロアッセイで評価し、オレクルマブ類似体と比較した。

【0258】

２人の異なる健康なドナーから単離した樹状細胞（ＤＣ）及びＣＤ４^＋Ｔ細胞を共培養して、サイトカイン産生並びにＴ細胞活性化及び／又は増殖をもたらす同種抗原特異的反応を誘導した。ＤＣを、２０ng/mLの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）及び２０ng/mLのインターロイキン－４（ＩＬ－４）との７日間の培養によってＣＤ１４^＋単球から分化させ、健康なドナー材料由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離したＣＤ４^＋Ｔ細胞と１：１０の比で混合した。一方向ＭＬＲを２５μg/mLの抗ＰＤ－１抗体（１２８１９；国際公開第２０１７／０５５５４７号参照）、５０μMのＡＭＰ及び示される濃度の抗ＣＤ７３抗体と共に４８時間インキュベートし、引き続いて３Ｈ－チミジン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を更に２４時間添加した。増殖を３Ｈ－チミジン取り込みとして測定し、ＡＭＰで処理していない対照に対して正規化した。

【0259】

異なる抗ＣＤ７３抗体で処理した後のＴ細胞増殖を図１５に示す。増殖に対する抗ＣＤ７３抗体の刺激機能は濃度依存的であり、抗体２１１２７とオレクルマブ類似体の両方がＴ細胞増殖を刺激したことが明らかである。しかしながら、抗体２１１２７のみが増殖を完全に回復させた。

【0260】

実施例１９．一方向ＭＬＲアッセイにおける抗ＣＤ７３抗体と抗ＰＤ－１抗体の組み合わせ
この実施例は、抗ＰＤ－１抗体（１２８１９）と抗ＣＤ７３抗体（２１１２７）の組み合わせが、一方向混合リンパ球反応（ＭＬＲ）においてＴ細胞活性化を増強する能力を調べる。

【0261】

２人の異なる健康なドナーから単離した樹状細胞（ＤＣ）及びＣＤ４^＋Ｔ細胞を共培養して、サイトカイン産生並びにＴ細胞活性化及び／又は増殖をもたらす同種抗原特異的反応を誘導した。ＤＣを、２０ng/mLの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）及び２０ng/mLのインターロイキン－４（ＩＬ－４）との７日間の培養によってＣＤ１４^＋単球から分化させ、健康なドナー材料由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離したＣＤ４^＋Ｔ細胞と１：１０の比で混合した。一方向ＭＬＲを、５０μMのＡＭＰの有無にかかわらず、抗ＣＤ７３抗体２１１２７及び／又は抗ＰＤ－１抗体（１２８１９；国際公開第２０１７／０５５５４７号参照）と共に７２時間インキュベートし、引き続いて上清を収穫した。抗ＣＤ７３抗体２１１２７と抗ＰＤ－１抗体１２８１９との組み合わせを、１：１比の２つの抗体で組み合わせた。ＥＬＩＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して上清中のＩＦＮ－γレベルを定量化することによって、Ｔ細胞活性化を測定し、ＡＭＰで処理していない対照に対して正規化した。

【0262】

抗体１２８１９及び／又は２１１２７による処理後のＩＦＮ－γレベルによって測定される、一方向ＭＬＲにおけるＴ細胞活性化を図１６に示す。抗ＰＤ－１抗体１２８１９が、ＡＭＰなし、及び抗体２１１２７との同時インキュベーションありとなしの両方で一方向ＭＬＲを強く活性化したことが明らかである（上のパネル）。抗ＰＤ－１抗体による一方向ＭＬＲの活性化は、ＡＭＰを一方向ＭＬＲに添加した場合にはかなり少ない（下のパネル）。しかしながら、抗ＰＤ－１抗体と抗ＣＤ７３抗体２１１２７を組み合わせると、強いＴ細胞活性化が少なくとも部分的に回復し、抗ＰＤ－１抗体／抗ＣＤ７３抗体の組み合わせの利益が強調された。

【0263】

実施例２０．Ｂ細胞活性化アッセイにおける抗ＣＤ７３抗体の機能性
抗体２１０４６及び２１１２７がＢ細胞活性化を刺激する能力をインビトロＢ細胞活性化アッセイで評価した。健康なドナー由来のＰＢＭＣを、２１０４６、２１１２７、又はオレクルマブ類似体（１０μg/mL）並びにＣＤ４０リガンド（０．５μg/mL）で一晩刺激した。フローサイトメトリー分析を、Ｂ細胞（ＣＤ２０^＋）に対するゲーティングを用いて実施し、Ｂ細胞活性化を、Ｂ細胞活性化マーカーＣＤ２５、ＣＤ６９、及びＣＤ８３の上方制御として評価した。

【0264】

図１７Ａ及び図１７Ｂに示されるように、抗体２１０４６は、Ｂ細胞活性化マーカーＣＤ２５、ＣＤ６９及びＣＤ８３の強力な上方制御を刺激するが、抗体２１１２７及びオレクルマブ類似体は、Ｂ細胞活性化に対する効果が限られている。

【0265】

実施例２１．Ｈ２９２細胞中のＣＤ７３レベルの抗ＣＤ７３抗体誘導低下
細胞株において抗ＣＤ７３抗体２１１２７、２１０２８、２１０４６、及び２１１６３がＣＤ７３レベルを調節する能力を評価し、オレクルマブ類似体と比較した。抗ＣＤ７３抗体を、２５μg/mLで、ヒト細胞株Ｈ２９２と共に３７℃で２４時間インキュベートし、引き続いて細胞溶解し、Ｓｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ技術（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）を使用してＣＤ７３レベルを評価した。

【0266】

図１８は、抗体２１１２７、２１０２８、２１０４６、若しくは２１１６３、又はオレクルマブ類似体で処理した後のＣＤ７３レベルを示す。抗ＣＤ７３抗体２１０４６又はオレクルマブ類似体とのインキュベーションは、いくらかのＣＤ７３下方制御をもたらしたが、他の抗ＣＤ７３抗体は、あるとしても、ＣＤ７３レベルに対する中程度の効果を有した。

【0267】

実施例２２．ヒト腫瘍異種移植モデルにおける抗ＣＤ７３抗体の機能性
この実施例は、抗ＣＤ７３抗体２１１２７がヒト腫瘍異種移植片から単離した細胞上で発現されたＣＤ７３の酵素活性を阻害する能力を実証する。

【0268】

材料及び方法
ヒト黒色腫細胞株Ａ３７５を、６～８週齢の雌ＮＯＧ又はＮＯＤ－ｓｃｉｄマウスの側腹部に皮下接種した。一例（図１９、上のパネル）では、ヒトＰＢＭＣを腫瘍細胞接種の１日後に腹腔内注射した。腫瘍をキャリパーによって２次元で１週間に３回測定し、腫瘍体積（mm³）を式：（幅）^２×長さ×０．５に従って計算した。マウスを、ビヒクル緩衝液、又は抗マウスＣＤ７３抗体ＴＹ／２３（ＢｉｏＸｃｅｌｌ）と組み合わせた（１）抗体２１１２７、（２）オレクルマブ類似体、若しくは（３）抗体２１１２７の腹腔内注射によって１週間に３回処置した。オレクルマブ類似体とは異なり、抗体２１１２７はマウスＣＤ７３に対して交差反応性ではない。したがって、ＣＤ７３を発現するマウス細胞（内皮細胞及び間質細胞）も含有する腫瘍塊におけるＣＤ７３活性の阻害を比較するために、抗体２１１２７を抗マウスＣＤ７３抗体ＴＹ／２３と組み合わせた。抗体を５mg/kg、２０mg/kg又は５０mg/kgで投与した。処置中止後の異なる時点で、腫瘍を収穫し、腫瘍分離キット及びｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して分離した。得られた細胞懸濁液をＣＤ７３基質ＡＭＰと共に３７℃で３時間インキュベートした。Ｓａｃｈｓｅｎｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．、前記に記載されるように、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって、ＡＴＰを上清に添加し、ＡＴＰ検出のＡＭＰ阻害を測定することによって、ＣＤ７３活性を調査した。

【0269】

結果
抗体２１１２７は、２週間にわたる反復投与後の、Ａ３７５ヒト黒色腫細胞株が移植されたＰＢＭＣヒト化マウスから収穫した腫瘍におけるＣＤ７３活性の用量依存的阻害を実証した（図１９、上のパネル）。ＣＤ７３酵素活性に対する効果は、処置中止後も長期間持続することが分かった。

【0270】

図１９、下のパネルに示されるように、オレクルマブ類似体は、ＣＤ７３活性を処置後１６日間阻害し、酵素活性は処置後２８日目に完全に回復した。対照的に、抗体２１１２７は単独で、又はＴＹ／２３と組み合わせて、処置中止後２８日間にわたってＣＤ７３活性の持続的阻害を示した。

【0271】

実施例２３．免疫細胞を含まないヒト異種移植腫瘍モデルにおける抗ＣＤ７３抗体のインビボ有効性
この実施例は、抗ＣＤ７３抗体がヒトトリプルネガティブ乳がん異種移植モデルにおいて腫瘍成長を阻害する能力を実証する。

【0272】

ヒトＭＤＡ－ＭＢ－２３１トリプルネガティブ乳がん細胞を、６～８週齢の雌ＮＯＤ－ｓｃｉｄマウスの側腹部に皮下接種した。腫瘍をキャリパーによって２次元で１週間に３回測定し、腫瘍体積（mm³）を式：（幅）^２×長さ×０．５に従って計算した。ビヒクル緩衝液、抗体２１１２７、又はオレクルマブ類似体の腹腔内注射による合計１６回の処置でマウスを１週間に２回処置し、引き続いて観察期間を設けた。抗体を１０mg/kgで投与した。ボンフェローニの多重比較検定による二元配置ＡＮＯＶＡを適用して、処置群間の各時点での腫瘍体積を比較した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用して統計分析を実施した。

【0273】

抗体２１１２７及びオレクルマブ類似体は、処置中に顕著な腫瘍阻害効果を示した（図２０）。処置中止後、オレクルマブ類似体で処置した腫瘍の再成長が観察された。対照的に、抗体２１１２７で処置したマウスは、処置中に腫瘍成長を有効に制御し、処置後６０日間の腫瘍サイズの増加は限られていた。

【0274】

実施例２４．ヒトＰＢＭＣで再構成したマウスのヒト異種移植腫瘍モデルにおける抗ＣＤ７３抗体のインビボ有効性
この実施例は、ヒト肺癌細胞又はヒト黒色腫細胞を移植したＰＢＭＣヒト化マウスにおける抗ＣＤ７３抗体２１１２７のインビボ有効性を実証する。

【0275】

ヒト肺癌細胞株Ｃａｌｕ－６又はヒトＡ３７５黒色腫細胞株由来の細胞を、ヒトＰＢＭＣの腹腔内注射の１日前にＮＯＧマウスに皮下移植した。処置をＰＢＭＣ注射の日に開始し、マウスを、１０mg/kgのビヒクル緩衝液又は抗ＣＤ７３抗体２１１２７の腹腔内注射によって、合計６回の処置にわたって１週間に３回処置した（ｎ＝１０／群）。腫瘍をキャリパーによって２次元で１週間に３回測定し、腫瘍体積（mm³）を式：（幅）^２×長さ×０．５により計算した。ボンフェローニの多重比較検定による二元配置ＡＮＯＶＡを適用して、処置群間の各時点での腫瘍体積を比較した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用して統計分析を実施した。

【0276】

図２１に示されるように、抗体２１１２７による処置は、ヒトＰＢＭＣで再構成されたマウスにおける２つのヒト腫瘍異種移植モデル（Ｃａｌｕ－６及びＡ３７５）において有意な腫瘍成長遅延（Ｐ＜０．０５対ビヒクル対照）をもたらした。図２１の各グラフは、１ニンのヒトＰＢＭＣドナーを表す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17A】

【図17B】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【配列表】

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