特許 7662635 抗ＰＤ－１－抗ＶＥＧＦＡ二重特異性抗体、その医薬組成物および使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-04-07

(45)【発行日】2025-04-15

(54)【発明の名称】抗ＰＤ－１－抗ＶＥＧＦＡ二重特異性抗体、その医薬組成物および使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20250408BHJP

   C07K 16/24 20060101ALI20250408BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20250408BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20250408BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20250408BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20250408BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20250408BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20250408BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20250408BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20250408BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46 ZNA

C07K16/24

C07K16/28

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12N5/10

A61K39/395 T

A61P35/00

A61P35/02

C12P21/08

【請求項の数】 40

(21)【出願番号】P 2022530820

(86)(22)【出願日】2020-11-25

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-02-01

(86)【国際出願番号】 CN2020131447

(87)【国際公開番号】W WO2021104302

(87)【国際公開日】2021-06-03

【審査請求日】2023-11-24

(31)【優先権主張番号】201911164156.2

(32)【優先日】2019-11-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】519063026

【氏名又は名称】中山康方生物医▲藥▼有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＡＫＥＳＯ ＢＩＯＰＨＡＲＭＡ，ＩＮＣ．

【住所又は居所原語表記】６ Ｓｈｅｎｎｏｎｇ Ｒｏａｄ，Ｔｏｒｃｈ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｚｏｎｅ Ｚｈｏｎｇｓｈａｎ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ５２８４３７ （ＣＮ）

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(74)【代理人】

【識別番号】100221545

【弁理士】

【氏名又は名称】白江 雄介

(72)【発明者】

【氏名】張 鵬

(72)【発明者】

【氏名】李 百 勇

(72)【発明者】

【氏名】夏 瑜

(72)【発明者】

【氏名】王 忠 民

【審査官】西 賢二

(56)【参考文献】

【文献】中国特許出願公開第１０９０５３８９５（ＣＮ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１７／１１７４６４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１７－５２０５１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１８／０２６６００（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２０１５－２２１８２９（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＶＥＧＦＡおよびＰＤ－１を標的とする二重特異性抗体であって、
（ａ）ＶＥＧＦＡに結合するヒトＩｇＧ１免疫グロブリンであって、ここで前記ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンは２対のポリペプチド鎖を含む、ここで前記ポリペプチド鎖の各対は重鎖および軽鎖を含む、ここで前記ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンの前記重鎖のアミノ酸配列は配列番号２４に記載される、および前記ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンの前記軽鎖のアミノ酸配列は配列番号２６に記載される、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン；および
（ｂ）ＰＤ－１に結合する２つの一本鎖抗体であって、ここで各一本鎖抗体のＶＨ領域のアミノ酸配列は配列番号９に記載されている、および各一本鎖抗体のＶＬ領域のアミノ酸配列は配列番号１７に記載されている、一本鎖抗体、
を含み、
ここで各一本鎖抗体の１つの末端は第１のリンカー断片によって前記ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンの各重鎖のＣ末端に連結される、ここで各一本鎖抗体の前記ＶＨ領域および前記ＶＬ領域は第２のリンカー断片によって連結されている、ここで前記第１のリンカー断片および前記第２のリンカー断片は同一であるかまたは異なる、好ましくはここで前記第１のリンカー断片および第２のリンカー断片のアミノ酸配列は独立して配列番号１８および配列番号１９から選択される、および好ましくはここで前記第１のリンカー断片および第２のリンカー断片のアミノ酸配列が、配列番号１８に記載されている、
二重特異性抗体。

【請求項2】

第１のリンカー断片および第２のリンカー断片のアミノ酸配列が配列番号１８に記載されている、請求項１に記載の二重特異性抗体。

【請求項3】

第１のリンカー断片および第２のリンカー断片のアミノ酸配列が配列番号１９に記載されている、請求項１に記載の二重特異性抗体。

【請求項4】

第１のリンカー断片のアミノ酸配列が配列番号１８に記載されており、第２のリンカー断片のアミノ酸配列が配列番号１９に記載されている、請求項１に記載の二重特異性抗体。

【請求項5】

第１のリンカー断片のアミノ酸配列が配列番号１９に記載されており、第２のリンカー断片のアミノ酸配列が配列番号１８に記載されている、請求項１に記載の二重特異性抗体。

【請求項6】

請求項１～５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体をコードする、単離された核酸分子。

【請求項7】

ＤＮＡを含む、請求項６に記載の単離された核酸分子。

【請求項8】

請求項６または７に記載の前記単離された核酸分子を含む、ベクター。

【請求項9】

発現ベクターである、請求項８に記載のベクター。

【請求項10】

プラスミド、ファージミド、コスミドおよび人工染色体から選択される、請求項８または９に記載のベクター。

【請求項11】

人工染色体が、酵母人工染色体、細菌人工染色体またはＰ１由来の人工染色体である、請求項１０に記載のベクター。

【請求項12】

ベクターが、ラムダファージおよびＭ１３ファージから選択される、バクテリオファージである、請求項８または９に記載のベクター。

【請求項13】

ベクターが動物ウイルスである、請求項８または９に記載のベクター。

【請求項14】

ベクターが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、バキュロウィルス、パピローマウイルス、およびパポバウイルスから選択される、請求項１３に記載に記載のベクター。

【請求項15】

ベクターが、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択エレメントおよびレポーター遺伝子、複製開始部位、またはその任意の組合せを含む、請求項８に記載のベクター。

【請求項16】

請求項６または７に記載の前記単離された核酸分子または請求項８～１５のいずれか１項に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項17】

請求項８～１５のいずれか１項に記載のベクターで宿主細胞を形質転換、形質導入またはトランスフェクションすることを含む方法。

【請求項18】

第１のベクターおよび第２のベクターで宿主細胞を形質転換、形質導入またはトランスフェクションすることを含む方法であって、
ここで前記第１のベクターが二重特異性抗体の重鎖ポリペプチドをコードし、前記第２のベクターが前記二重特異性抗体の軽鎖ポリペプチドをコードし、ここで
（ｉ）前記二重特異性抗体の重鎖ポリペプチドが、配列番号２４に記載のアミノ酸配列および一本鎖抗体を含み、ここで前記一本鎖抗体の１つの末端は第１のリンカー断片によって前記配列番号２４に記載のアミノ酸配列のＣ末端に連結され、前記一本鎖抗体のＶＨ領域のアミノ酸配列が配列番号９に記載されており、前記一本鎖抗体のＶＬ領域のアミノ酸配列が配列番号１７に記載されており、前記一本鎖抗体の前記ＶＨ領域および前記ＶＬ領域は第２のリンカー断片によって連結されており、および前記第１のリンカー断片および前記第２のリンカー断片は同一であるかまたは異なり；かつ
（ｉｉ）前記二重特異性抗体の軽鎖ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号２６に記載されており、
好ましくはここで、前記第１のリンカー断片および前記第２のリンカー断片のアミノ酸配列が独立して配列番号１８および配列番号１９から選択され、好ましくはここで、前記第１のリンカー断片および第２のリンカー断片のアミノ酸配列が、配列番号１８に記載されている、
方法。

【請求項19】

第１のリンカー断片および第２のリンカー断片のアミノ酸配列が配列番号１８に記載されている、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

第１のリンカー断片および第２のリンカー断片のアミノ酸配列が配列番号１９に記載されている、請求項１８に記載の方法。

【請求項21】

第１のリンカー断片のアミノ酸配列が配列番号１８に記載されており、第２のリンカー断片のアミノ酸配列が配列番号１９に記載されている、請求項１８に記載の方法。

【請求項22】

第１のリンカー断片のアミノ酸配列が配列番号１９に記載されており、第２のリンカー断片のアミノ酸配列が配列番号１８に記載されている、請求項１８に記載の方法。

【請求項23】

宿主細胞が、原核細胞、真菌細胞、昆虫細胞および動物細胞から選択される、請求項１６に記載の宿主細胞。

【請求項24】

宿主細胞が、大腸菌、枯草菌、酵母細胞、アスペルギルス属、Ｓ２ショウジョウバエ細胞、Ｓｆ９細胞、線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞および単離されたヒト細胞から選択される、請求項２３に記載の宿主細胞。

【請求項25】

宿主細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項２４に記載の宿主細胞。

【請求項26】

宿主細胞が、原核細胞、真菌細胞、昆虫細胞および動物細胞から選択される、請求項１７～２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

宿主細胞が、大腸菌、枯草菌、酵母細胞、アスペルギルス属、Ｓ２ショウジョウバエ細胞、Ｓｆ９細胞、線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞および単離されたヒト細胞から選択される、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

宿主細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

請求項１～５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を含む医薬組成物であって、薬学的に許容されるベクターおよび／または賦形剤をさらに含む、医薬組成物。

【請求項30】

悪性腫瘍を治療および／または予防するための医薬の調製における、請求項１～５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体または請求項２９に記載の医薬組成物の使用。

【請求項31】

悪性腫瘍が、結腸がん、直腸がん、肺がん、肝臓がん、卵巣がん、皮膚がん、神経膠腫、黒色腫、リンパ腫、腎腫瘍、前立腺がん、膀胱がん、消化器がん、乳がん、脳腫瘍、子宮頸がん、食道がん、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）およびミスマッチ修復の欠損（ｄＭＭＲ）のがん、尿路上皮がん、中皮腫、子宮内膜がん、胃腺癌、食道胃接合部腺癌および白血病から選択され；
好ましくは、前記肺がんは非小細胞肺がんまたは小細胞肺がんであり；好ましくは、前記非小細胞肺がんはＥＧＦＲおよび／またはＡＬＫ感受性変異型非小細胞肺がんであり；
好ましくは、前記肝臓がんは肝細胞がんであり；
好ましくは、前記腎腫瘍は腎細胞がんであり；
好ましくは、前記乳がんはトリプルネガティブ乳がんであり；
好ましくは、前記尿路上皮がんは膀胱がんである、
請求項３０に記載の使用。

【請求項32】

肺がんが非小細胞肺がんである、請求項３１に記載の使用。

【請求項33】

肺がんがＥＧＦＲおよび／またはＡＬＫ感受性変異型非小細胞肺がんである、請求項３１に記載の使用。

【請求項34】

（１）ＶＥＧＦＡのＶＥＧＦＲ２への結合を遮断するための医薬もしくは薬剤、
ＶＥＧＦＡの活性もしくはレベルをダウンレギュレートするための医薬もしくは薬剤、
血管内皮細胞増殖に対するＶＥＧＦＡの刺激を軽減するための医薬もしくは薬剤、
血管内皮細胞増殖を抑制するための医薬もしくは薬剤、または、
腫瘍血管新生を遮断するための医薬もしくは薬剤；
ならびに／または
（２）ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合を遮断するための医薬もしくは薬剤、
ＰＤ－１の活性もしくはレベルをダウンレギュレートするための医薬もしくは薬剤、
生体におけるＰＤ－１の免疫抑制を軽減するための医薬もしくは薬剤、
Ｔリンパ球におけるＩＦＮ－γ分泌を促進するための医薬もしくは薬剤、または、
Ｔリンパ球におけるＩＬ－２分泌を促進するための医薬もしくは薬剤
の調製における、請求項１～５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体の使用。

【請求項35】

悪性腫瘍の治療および／または予防において使用するための、請求項１～５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体または請求項２９に記載の医薬組成物。

【請求項36】

悪性腫瘍が結腸がん、直腸がん、肺がん、肝臓がん、卵巣がん、皮膚がん、神経膠腫、黒色腫、リンパ腫、腎腫瘍、前立腺がん、膀胱がん、消化器がん、乳がん、脳腫瘍、子宮頸がん、食道がん、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）およびミスマッチ修復の欠損（ｄＭＭＲ）のがん、尿路上皮がん、中皮腫、子宮内膜がん、胃腺癌、食道胃接合部腺癌および白血病から選択され；
好ましくは、前記肺がんが非小細胞肺がんまたは小細胞肺がんであり；好ましくは、前記非小細胞肺がんがＥＧＦＲおよび／またはＡＬＫ感受性変異型非小細胞肺がんであり；
好ましくは、前記肝臓がんが肝細胞がんであり；
好ましくは、前記腎腫瘍が腎細胞がんであり；
好ましくは、前記乳がんがトリプルネガティブ乳がんであり；
好ましくは、前記尿路上皮がんが膀胱がんである、請求項３５に記載の二重特異性抗体または医薬組成物。

【請求項37】

肺がんが非小細胞肺がんである、請求項３６に記載の二重特異性抗体または医薬組成物。

【請求項38】

肺がんがＥＧＦＲおよび／またはＡＬＫ感受性変異型非小細胞肺がんである、請求項３６に記載の二重特異性抗体または医薬組成物。

【請求項39】

（１）ＶＥＧＦＡのＶＥＧＦＲ２への結合の遮断、
ＶＥＧＦＡの活性もしくはレベルのダウンレギュレート、
血管内皮細胞増殖に対するＶＥＧＦＡの刺激の軽減、
血管内皮細胞増殖の抑制、または、
腫瘍血管新生の遮断；
ならびに／または
（２）ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合の遮断、
ＰＤ－１の活性もしくはレベルのダウンレギュレート、
生体におけるＰＤ－１の免疫抑制の軽減、
Ｔリンパ球におけるＩＦＮ－γ分泌の促進、または、
Ｔリンパ球におけるＩＬ－２分泌の促進、
における使用のための、請求項１～５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体または請求項２９に記載の医薬組成物。

【請求項40】

請求項１～５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を調製する方法であって、請求項１６に記載の宿主細胞を好適な条件で培養すること、および細胞培養物から前記二重特異性抗体を単離すること、を含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

技術分野
本発明は、腫瘍治療および免疫生物学の分野に属し、抗ＰＤ－１－抗ＶＥＧＦＡ二重特異性抗体、その医薬組成物およびその使用に関する。詳しくは、本発明は、抗ヒトＰＤ－１－抗ヒトＶＥＧＦＡ二重特異性抗体、その医薬組成物およびその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

背景
腫瘍、特に悪性腫瘍は、今日の世の中では健康を脅かす重篤な疾患であり、各種疾患の中で死亡の第２の主要原因である。近年、その発病率は著しく増加している。悪性腫瘍は、治療反応性が悪く、後期の転移率が高く、予後が不良であることが特徴である。現在臨床的に採用されている従来の治療方法（例えば、放射線療法、化学療法および外科治療など）は、疼痛を大幅に緩和し、生存時間を延ばすが、それらの方法には大きな制限があり、さらにそれらの効果を向上させるのは困難である。

【0003】

腫瘍増殖の２つの異なる段階、すなわち、血管が関与しない緩慢な成長段階から血管が関与する急速な増殖段階がある。血管新生によって、血管切り替え段階を完了するのに十分な栄養を腫瘍は獲得することができ、血管新生が生じない場合、原発腫瘍は１～２ｍｍ未満になり、したがって、転移は起こり得ない。

【0004】

血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、内皮細胞の分裂および増殖を促進し、新しい血管の形成を促進し、血管透過性を改良することができる増殖因子であり、またこれは、細胞表面上の血管内皮細胞増殖因子受容体に結合し、チロシンキナーゼシグナル伝達経路の活性化によって役割を果たす。腫瘍組織において、腫瘍細胞、ならびに腫瘍へ侵入するマクロファージおよびマスト細胞は高レベルのＶＥＧＦを分泌し、パラクリン様式で腫瘍血管内皮細胞を刺激し、内皮細胞の増殖および移動を促進し、血管新生を誘導し、腫瘍の連続的な増殖を促進し、血管透過性を強化し、周囲組織内の線維素沈着を引き起こし、単核細胞、繊維芽細胞および内皮細胞の浸潤を促進し、これは腫瘍ストロマの形成と腫瘍細胞の新たな血管への侵入を容易にし、また腫瘍転移を促進することができる。したがって、腫瘍血管新生を抑制することが、現在最も有望な腫瘍治療方法の１つであると考えられる。ＶＥＧＦファミリーには、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＶＥＧＦＤおよびＰＩＧＦが含まれる。血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）には、ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ１としても知られている）、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲまたはＦｌｋ１としても知られている）、ＶＥＧＦＲ３（Ｆｌｔ４としても知られている）、およびニューロピリン－１（ＮＲＰ－１）が含まれる。最初の３つの受容体は構造において類似しており、チロシンキナーゼスーパーファミリーに属し、膜外領域、膜貫通セグメントおよび膜内領域から構成されており、膜外領域は免疫グロブリン様ドメインから構成され、膜内領域はチロシンキナーゼ領域である。ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２は、主として血管内皮細胞の表面に位置しており、ＶＥＧＦＲ３は、主としてリンパ内皮細胞の表面に位置している。

【0005】

ＶＥＧＦファミリーの分子は、これらの受容体に対して異なる親和性を有する。ＶＥＧＦＡは、主に、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２およびＮＲＰ－１と共に作用する。ＶＥＧＦＲ１は、最も初期に発見された受容体であり、通常の生理学的条件下でＶＥＧＦＲ２よりもｐＶＥＧＦＡに対して高い親和性を有しているが、細胞内セグメント内のチロシナーゼ活性はＶＥＧＦＲ２より低い（Ｍａ Ｌｉ、 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｒｔｈ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｅｒｅｄｉｔｙ、２０１６、２４巻（５号）：１４６～１４８頁）。

【0006】

ＶＥＧＦＲ２は血管新生および血管工学の主要な制御因子であり、ＶＥＧＦＲ１よりもはるかに高いチロシンキナーゼ活性を有する。ＶＥＧＦＲ２は、リガンドＶＥＧＦＡに結合した後、血管内皮細胞の増殖、分化など、ならびに血管の形成プロセスおよび血管の浸透性を媒介する（Ｒｏｓｋｏｓｋｉ Ｒ Ｊｒ．ら、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｌ Ｈｅｍａｔｏｌ、２００７、６２巻（３号）：１７９～２１３頁）。ＶＥＧＦＡは、ＶＥＧＦＲ２に結合した後、下流のＰＬＣ－γ－ＰＫＣ－Ｒａｆ－ＭＥＫ－ＭＡＰＫシグナル経路を介して細胞内の関連タンパク質遺伝子の転写発現を媒介し、それにより血管内皮細胞の増殖を促進する（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｔら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１９９９、１８巻（１３号）：２２２１～２２３０頁）。

【0007】

ＶＥＧＦＲ３はチロシンキナーゼファミリーメンバーのうちの１つであり、主に胚血管内皮細胞および成体リンパ内皮細胞を発現し、またＶＥＧＦＣおよびＶＥＧＦＤはＶＥＧＦＲ３に結合してリンパ内皮細胞の増殖および移動を刺激し、リンパ管の新生を促進する；ＮＲＰ－１は非チロシンキナーゼ膜貫通型タンパク質であり、生体シグナルを独立して伝達することはできず、ＶＥＧＦチロシンキナーゼ受容体と複合体を形成した後でのみ、シグナル伝達を媒介することができる（Ｍａ Ｌｉ、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｒｔｈ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｅｒｅｄｉｔｙ、２０１６、２４巻（５号）：１４６～１４８頁）。

【0008】

ＶＥＧＦＡおよびＶＥＧＦＲ２は、主に、ＶＥＧＦＡがＶＥＧＦＲ２に結合する前後の血管新生の調節に関与しており、上流および下流の経路での多数の中間シグナルのカスケード反応が形成され、最後に、生理機能が、内皮細胞の増殖、生存、移動、浸透性増加および末梢組織への浸潤などで変化する（Ｄｏｎｇ Ｈｏｎｇｃｈａｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｄｅｒｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２０１４年９月、２２巻（９号）：２２３１～３）。

【0009】

現在、ヒトＶＥＧＦ、特にＶＥＧＦＡ、例えばベバシズマブを標的とするいくつかのヒト化モノクローナル抗体があり、ベバシズマブは、２００４年に連続して様々な腫瘍、例えば、非小細胞肺がん、腎細胞がん、子宮頸がんおよび転移性結腸直腸がんなどの治療用として米国食品医薬品局によって承認されている。

【0010】

ＣＤ２７９としても知られている、プログラム細胞死受容体－１（ＰＤ－１）は、Ｉ型膜貫通糖タンパク質膜表面受容体であり、ＣＤ２８免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、一般に、Ｔ細胞、Ｂ細胞および骨髄細胞において発現される。ＰＤ－１には、２つの天然リガンド、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２がある。ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２は両方ともＢ７スーパーファミリーに属しており、非造血細胞および様々な腫瘍細胞を含む、様々な細胞の膜表面で構成的または誘導的に発現される。ＰＤ－Ｌ１は、主に、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＤＣおよび微小血管内皮細胞、ならびに様々な腫瘍細胞で発現されるが、ＰＤ－Ｌ２は、抗原提示細胞、例えば樹状細胞およびマクロファージでのみ発現される。ＰＤ－１とそのリガンドとの間の相互作用は、リンパの活性化、Ｔ細胞の増殖、ならびにサイトカイン、例えばＩＬ－２およびＩＦＮ－γの分泌を抑制することができる。

【0011】

多くの研究から、腫瘍微細環境は腫瘍細胞を免疫細胞による損傷から保護することができること、腫瘍微細環境に浸潤したリンパ球におけるＰＤ－１の発現がアップレギュレートされること、肺がん、肝臓がん、卵巣がん、皮膚がん、結腸がんおよび神経膠腫などの様々な原発腫瘍組織が免疫組織化学分析においてＰＤ－Ｌ１陽性であることが明らかになっている。それと同時に、腫瘍におけるＰＤ－Ｌ１の発現は、がん患者の予後不良と有意に関連している。ＰＤ－１とそのリガンドとの間の相互作用の遮断は、腫瘍特異的Ｔ細胞免疫を促進し、腫瘍細胞の免疫除去効率を増強し得る。多数の臨床試験からは、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１を標的とする抗体がＣＤ８^＋ Ｔ細胞の腫瘍組織への浸潤を促進し、抗腫瘍免疫エフェクター因子、例えばＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、グランザイムＢおよびパーフォリンなどをアップレギュレートし、それによって腫瘍の増殖を効果的に抑制することができることが明らかである。

【0012】

さらに、抗ＰＤ－１抗体はまた、ウイルス慢性感染症の治療においても使用することができる。ウイルス慢性感染症は、多くの場合、ウイルス特異的エフェクターＴ細胞の機能の喪失とその数の減少を伴っている。ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用はＰＤ－１抗体を注射することにより遮断され、それによって、ウイルス慢性感染症におけるエフェクターＴ細胞の枯渇を有効に抑制することができる。

【0013】

ＰＤ－１抗体の広範囲の抗腫瘍に関する可能性と驚くべき効果により、ＰＤ－１経路を標的とする抗体が様々な腫瘍の治療で：非小細胞肺がん、腎細胞がん、卵巣がんおよび黒色腫の治療において（Ｈｏｍｅｔ Ｍ．Ｂ．，Ｐａｒｉｓｉ Ｇ．ら、Ａｎｔｉ－ＰＤ－１ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｍｅｌａｎｏｍａ． Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ． ２０１５年６月；４２巻（３号）：４６６～４７３頁）、ならびにリンパ腫および貧血において（Ｈｅｌｄ ＳＡ，Ｈｅｉｎｅ Ａら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ＣＭＬ． Ｃｕｒｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ２０１３年９月；１３巻（７号）：７６８～７４頁）、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）またはミスマッチ修復の欠損（ｄＭＭＲ）の腫瘍（いくつかの抗ＰＤ－１抗体薬剤が、ＭＳＩ－Ｈ／ｄＭＭＲ特性を有する腫瘍の治療のためにＦＤＡらによって承認されている）において、飛躍的進歩をもたらすことが業界において広く容認されている。

【0014】

抗血管新生療法および免疫チェックポイント抑制剤の現在の組合せは、多くの腫瘍において良好な効果を示す。例えば、卵巣がん（Ｊｏｙｃｅ Ｆ．Ｌｉｕら、ＪＡＭＡ Ｏｎｃｏｌ．、２０１９；５巻（１２号）：１７３１～１７３８頁）、非小細胞肺がん（ＥＧＦＲおよび／またはＡＬＫ感受性変異型を含む非小細胞肺がん）（Ｍａｎｅｇｏｌｄ Ｃ，ら、Ｊ Ｔｈｏｒａｃ Ｏｎｃｏｌ．、２０１７年２月；１２巻（２号）：１９４～２０７頁）、腎細胞がん（Ｄｕｄｅｋ ＡＺら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．、２０１８年；３６巻（補遺；要約、４５５８頁））、肝細胞がん（Ｓｔｅｉｎ Ｓら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ、２０１８年、３６巻（１５＿補遺）：４０７４頁；２０２０年にＦＤＡによって承認された肝細胞がんの治療において使用するためのアテゾリズマブと組み合わせたベバシズマブ）、結腸直腸がん（ＭＳＩ－Ｈ／ｄＭＭＲおよび非ＭＳＩ－Ｈ／ｄＭＭＲ型を含む）（Ｂｅｎｄｅｌｌ ＪＣら、Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ＭＰＤＬ３２８０Ａ （ａｎｔｉ－ＰＤＬ１） ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ （ｂｅｖ） ａｎｄ／ｏｒ ＦＯＬＦＯＸ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ （ｐｔｓ） ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ （ｍＣＲＣ）．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ；２０１５年５月２９日～６月２日；Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ． ２０１５年；要約７０４頁で示された；Ｈｏｃｈｓｔｅｒ ＨＳら、Ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ （ａｔｅｚｏ） ａｎｄ ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ （ｂｅｖ） ｉｎ ａ ｐｈａｓｅ Ｉｂ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ （ＭＳＩ）－ｈｉｇｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ （ｍＣＲＣ）．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｃａｎｃｅｒｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ；２０１７年１月１９日～２１日；Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ． ２０１７年；要約６７３頁で示された）、乳がん（Ｙｕｋｉｎｏｒｉ Ｏｚａｋｉら、Ａ ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ ｐｈａｓｅ ＩＩ ｓｔｕｄｙ ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｎｉｖｏｌｕｍａｂ ｐｌｕｓ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｐｌｕｓ ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｔｒｉｐｌｅ－ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ ａｓ ａ ｆｉｒｓｔ－ｌｉｎｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＨＥＲ２－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ：ＷＪＯＧ９９１７Ｂ ＮＥＷＢＥＡＴ ｔｒｉａｌ ［要約］．ｔｈｅ ２０１９ Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍの会議記録中；２０１９年１２月１０～１４日；Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ． Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（ＰＡ）：ＡＡＣＲ；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０２０年；８０巻（４補遺）：要約ｎｒ ＰＤ１－０３）の治療において使用するための抗ＶＥＧＦ抗体（例えばベバシズマブ）およびＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体（例えばニボルマブ、ペムブロリズマブおよびアテゾリズマブ）の組合せ；ＶＥＧＦＲ２抗体およびＰＤ－１抗体の組合せはまた、胃および食道胃接合部の腺癌における良好な抗腫瘍効果を示し（Ｈｅｒｂｓｔ ＲＳら、Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．２０１９年；２０巻（８号）：１１０９～１１２３）頁；また、ＰＤ－１抗体（ペムブロリズマブ）および血管新生抑制剤（レンバチニブ）の併用レジメンは、子宮内膜がんの治療において良好な効果を示し、子宮内膜がんの治療において使用するために２０１９年にＦＤＡによって承認された。黒色腫（ＰＤ－１抗体のニボルマブおよびペムブロリズマブは、黒色腫の治療において使用するためにＦＤＡによって承認されている）、子宮頸がん（Ｋｒｉｓｈｎａｎｓｕ Ｓ．ら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．、２０１４年；３７０巻：７３４～７４３頁）、神経膠腫、前立腺がん（Ａｎｔｏｎａｒａｋｉｓ ＥＳ．ら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．、２０２０年２月１０日；３８巻（５号）：３９５～４０５頁）、尿路上皮がん（Ｊｏａｑｕｉｍ Ｂｅｌｌｍｕｎｔ．ら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．、２０１７年；３７６巻：１０１５～１０２６頁；２０１７年にＦＤＡによって承認された膀胱がんの治療において使用するためのニボルマブ）、食道がん（Ｋａｔｏ Ｋら、Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．、２０１９年；２０巻（１１号）：１５０６～１７頁）、中皮腫（Ｓｃｈｅｒｐｅｒｅｅｌ Ａら、Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．、２０１９年；２０巻（２号）：２３９～２５３頁）などのために、ＰＤ－１／ＰＤＬ－１抗体は良好な効果を示し、ＰＤ－１経路は腫瘍発生においてＶＥＧＦ経路との相乗効果を有することを考えると、ＰＤ－１およびＶＥＧＦ経路の両方を遮断する薬剤は良好な抗腫瘍効果を有すると予期され得る。

【0015】

二重特異性抗体としても知られている二重特異性抗体は、２つの異なる抗原を同時に標的とする特定の医薬であり、免疫選択精製によって製造することができる。さらに、二重特異性抗体はまた、遺伝子工学によっても製造することができ、それは結合部位の最適化、合成の型の検討および収量などの面における対応の柔軟性から特定の利点を有する。現在、二重特異性抗体は、４５種を超えて存在することが示されている（Ｍｕｌｌｅｒ Ｄ， Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＲＥ． Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ： ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ． ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２０１０；２４巻：８９～９８頁）。多くの二重特異性抗体は、ＩｇＧ－ＳｃＦｖ型、すなわちＭｏｒｒｉｓｏｎ型で開発されており（Ｃｏｌｏｍａ Ｍ． Ｊ．， Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｓ． Ｌ． Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９７；１５巻：１５９～１６３頁）、天然に存在するＩｇＧ型とのその類似性と、抗体の操作、発現および精製における利点から、二重特異性抗体の理想の型のうちの１つであることが実証されている（Ｍｉｌｌｅｒ Ｂ． Ｒ．， Ｄｅｍａｒｅｓｔ Ｓ． Ｊ．ら、Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｓｃＦｖｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２０１０；２３巻：５４９～５７頁； Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｊ， Ｌｕｇｏｖｓｋｏｙ Ａ． Ｒａｔｉｏｎａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｐａｔｈｗａｙｓ． ＭＡｂｓ ２０１１；３巻：２９９～３０９頁）。

【0016】

ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性傷害）とは、抗体のＦａｂ断片のウイルス感染細胞もしくは腫瘍細胞のエピトープへの結合、および抗体のＦｃ断片のキラー細胞の表面上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合によって媒介されるキラー細胞（ＮＫ細胞、マクロファージなど）による標的細胞の死滅を意味する。

【0017】

ＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）とは、抗体の対応する細胞膜表面上の抗原への特異的結合が複合体を形成し、補体系を活性化することを意味し、これは、標的細胞の表面上でＭＡＣをさらに形成し、その後の標的細胞の溶解をもたらす。補体は、様々な細菌および他の病原体の溶解を引き起こし得、病原体の感染に対する重要な防御機構である。

【0018】

Ｆｃ受容体は、免疫グロブリンファミリーに属し、これは、特異的な免疫細胞の表面で発現されて、抗体のＦｃ領域を認識し、免疫応答を媒介する。Ｆａｂ領域が抗原を認識した後、抗体のＦｃ領域は、免疫細胞（例えば、キラー細胞）上のＦｃ受容体に結合して、食作用およびＡＤＣＣなどの免疫細胞の応答機能を開始する。

【0019】

Ｆｃ受容体によって認識される抗体の種類および発現細胞の種類により、Ｆｃ受容体は、主に、３つの種類、ＦｃγＲ、ＦｃαＲおよびＦｃεＲに分類される。ＦｃγＲは、４つのサブタイプ、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）およびＦｃＲｎ（新生児Ｆｃ受容体）にさらに分類することができる。これらの中でも、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩは、ＡＤＣＣ効果に密接に関連する。ＦｃγＲＩＩＩは、ＡＤＣＣを媒介する最も主たる分子であり、異なる細胞型において、２つの非常に相同なサブタイプ、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂを有する。ＦｃγＲＩＩＩａ集団において、一塩基多型（ＳＮＰ）の部位によって区別される２つのサブタイプ、高親和性を有するＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８、および低親和性を有するＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８が存在する。ＦｃγＲＩは、ＩｇＧのＦｃ領域に対してより高い親和性を有し、ＡＤＣＣプロセスに関与する；ＦｃγＲＩＩは、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂおよびＦｃγＲＩＩｃ（それぞれ、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂおよびＣＤ３２ｃとも称される）の３つのサブタイプを含み、その中でも、ＦｃγＲＩＩａはＡＤＣＣ活性を有する；ＦｃγＲＩＩａについて、ヒトにおいて、単一ヌクレオチド変異により、ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１およびＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１の２つのサブタイプが存在する（Ｈｏｇａｒｔｈ ＰＭ、Ｐｉｅｔｅｒｓｚ ＧＡ． ２０１２年、ＮＡＴＵＲＥ ＲＥＶＩＥＷＳ ＤＲＵＧ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ、１１巻（４号）：３１１～３３１頁）。

【0020】

ＩｇＧファミリーは、４つのメンバー、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含み、これは、重鎖定常領域の断片結晶化可能（Ｆｃ）領域中のアミノ酸において異なり、ＦｃγＲに対するそれらの異なる親和性をもたらす。ＩｇＧ１は、ヒトにおいて最も大量のサブタイプであり、モノクローナル抗体医薬において使用される最も一般的なサブタイプでもある。ＩｇＧ１は、様々なＦｃγＲと結合することができ、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ効果を誘導することができる。ＩｇＧ２は、ＦｃγＲに対して最も低い親和性を有するが、ＦｃγＲＩＩａとの結合によって、単球媒介ＡＤＣＣをさらに誘導することができる。ＩｇＧ３は、ＦｃγＲに対する最も高い結合能力を特徴とし、ＡＤＣＣ、およびＩｇＧ１よりも高いＣＤＣ効果を誘導することができる。ＩｇＧ４分子は、ＦｃγＲＩ以外のＦｃγＲに弱く結合し、ＩｇＧ４分子は、ＣＤＣおよびＮＫ細胞媒介ＡＤＣＣを引き起こすより低い可能性を有する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0021】

現在のところ、抗ＰＤ－１－抗ＶＥＧＦＡ二重特異性抗体が結合する免疫細胞に対する抗体媒介性のＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性によって引き起こされる損傷を低減または排除し、抗体薬剤の効果を改善する、新規な抗ＰＤ－１－抗ＶＥＧＦＡ二重特異性抗体を開発する必要性が依然として存在する。

【課題を解決するための手段】

【0022】

概要
集中的な研究および創意的取り組みによって、本発明者らは、それに応じて、抗ＰＤ－１－抗ＶＥＧＦＡ抗体構造のＦｃ断片を改変して、Ｆｃ領域のＦｃ受容体への結合能力を低減し、それによって、免疫細胞におけるＡＤＣＣおよびＣＤＣの毒性および副作用を低減し、抗ＰＤ－１－抗ＶＥＧＦＡ抗体薬剤の薬剤効果を増加させた。

【0023】

本発明を以下に詳述する。
本発明の一態様は、
ＰＤ－１を標的とする第１のタンパク質機能領域と、
ＶＥＧＦＡを標的とする第２のタンパク質機能領域
を含む二重特異性抗体であって；
第１のタンパク質機能領域が免疫グロブリンであり、第２のタンパク質機能領域が一本鎖抗体であるか；または第１のタンパク質機能領域が一本鎖抗体であり、第２のタンパク質機能領域が免疫グロブリンであり；
免疫グロブリンについて、重鎖可変領域が、配列番号２８～３０にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域が、配列番号３１～３３にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含み；一本鎖抗体について、重鎖可変領域が、配列番号３４～３６にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域が、配列番号３７～３９にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含み；
または、
免疫グロブリンについて、重鎖可変領域が、配列番号３４～３６にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域が、配列番号３７～３９にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含み；一本鎖抗体について、重鎖可変領域が、配列番号２８～３０にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域が、配列番号３１～３３にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含み；
免疫グロブリンがヒトＩｇＧ１サブタイプのものであり；
ＥＵ番号方式に従って、免疫グロブリンの重鎖定常領域が、２３４、２３５および２３７位のいずれか２または３つに変異を有し、二重特異性抗体のＦｃγＲＩＩＩａおよび／またはＣ１ｑに対する親和定数が、変異前の親和定数と比較して、変異後に低減されており；好ましくは、親和定数が、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムによって測定される、
二重特異性抗体に関する。

【0024】

本発明の１つまたは複数の実施形態では、二重特異性抗体について、ＥＵ番号方式に従って、免疫グロブリンの重鎖定常領域は、以下の変異：
Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ；または
Ｌ２３４ＡおよびＧ２３７Ａ；または
Ｌ２３５ＡおよびＧ２３７Ａ；
または
Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＧ２３７Ａ
を有する。

【0025】

本発明では、別段の定めがない限り、位置番号の前の文字は変異前のアミノ酸を表し、位置番号の後の文字は変異後のアミノ酸を表す。

【0026】

本発明は、
ＰＤ－１を標的とする第１のタンパク質機能領域と、
ＶＥＧＦＡを標的とする第２のタンパク質機能領域
を含む二重特異性抗体であって；
第１のタンパク質機能領域が免疫グロブリンであり、第２のタンパク質機能領域が一本鎖抗体であるか；または第１のタンパク質機能領域が一本鎖抗体であり、第２のタンパク質機能領域が免疫グロブリンであり；
免疫グロブリンについて、重鎖可変領域が、配列番号２８～３０にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域が、配列番号３１～３３にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含み；一本鎖抗体について、重鎖可変領域が、配列番号３４～３６にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域が、配列番号３７～３９にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含み；
または、
免疫グロブリンについて、重鎖可変領域が、配列番号３４～３６にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域が、配列番号３７～３９にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含み；一本鎖抗体について、重鎖可変領域が、配列番号２８～３０にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域が、配列番号３１～３３にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含み；
免疫グロブリンがヒトＩｇＧ１サブタイプのものである、
二重特異性抗体にさらに関する。

【0027】

本発明は、
ＰＤ－１を標的とする第１のタンパク質機能領域と、
ＶＥＧＦＡを標的とする第２のタンパク質機能領域
を含む二重特異性抗体であって；
第１のタンパク質機能領域が免疫グロブリンであり、第２のタンパク質機能領域が一本鎖抗体であるか；または第１のタンパク質機能領域が一本鎖抗体であり、第２のタンパク質機能領域が免疫グロブリンであり；
免疫グロブリンについて、重鎖可変領域が、配列番号２８～３０にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域が、配列番号３１～３３にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含み；一本鎖抗体について、重鎖可変領域が、配列番号３４～３６にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域が、配列番号３７～３９にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含み；
または、
免疫グロブリンについて、重鎖可変領域が、配列番号３４～３６にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域が、配列番号３７～３９にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含み；一本鎖抗体について、重鎖可変領域が、配列番号２８～３０にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域が、配列番号３１～３３にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含み；
免疫グロブリンがヒトＩｇＧ１サブタイプのものであり；
ＥＵ番号方式に従って、免疫グロブリンの重鎖定常領域が、以下の変異：
Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ；または
Ｌ２３４ＡおよびＧ２３７Ａ；または
Ｌ２３５ＡおよびＧ２３７Ａ；または
Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＧ２３７Ａ
を有する、
二重特異性抗体にさらに関する。

【0028】

本発明の１つまたは複数の実施形態では、二重特異性抗体について、ＥＵ番号方式に従って、免疫グロブリンの重鎖定常領域は、
Ｎ２９７Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｐ２３８Ｄ、Ｌ３２８Ｅ、Ｅ２３３Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、Ａ３３０Ｒ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｌ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｎ２９７Ｑ、Ｐ２３８Ｓ、Ｐ２３８Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ａ３２７Ｇ、Ｐ３２９Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｔ３９４Ｄ、Ｇ２３６Ｒ、Ｇ２３６Ａ、Ｌ３２８Ｒ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｅ３１８ＡおよびＫ３２０Ａ
から選択される１つまたは複数の変異を有するか、またはさらに有する。

【0029】

本発明の１つまたは複数の実施形態では、
免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１に記載されており、免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３に記載されており；一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号５および配列番号９から選択され、一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号７、配列番号１１および配列番号１７から選択され；
または、
免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号５および配列番号９から選択され、免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号７、配列番号１１および配列番号１７から選択され；一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１に記載されており、一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３に記載されている、
二重特異性抗体が提供される。

【0030】

本発明の１つまたは複数の実施形態では、二重特異性抗体は、以下の（１）～（１２）：
（１）免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１に記載されており、免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３に記載されており；一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号５に記載されており、一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号７に記載されている；
（２）免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１に記載されており、免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３に記載されており；一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号５に記載されており、一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１１に記載されている；
（３）免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１に記載されており、免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３に記載されており；一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号５に記載されており、一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１７に記載されている；
（４）免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１に記載されており、免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３に記載されており；一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号９に記載されており、一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号７に記載されている；
（５）免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１に記載されており、免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３に記載されており；一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号９に記載されており、一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１１に記載されている；
（６）免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１に記載されており、免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３に記載されており；一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号９に記載されており、一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１７に記載されている；
（７）免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号５に記載されており、免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号７に記載されており；一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１に記載されており、一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３に記載されている；
（８）免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号５に記載されており、免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１１に記載されており；一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１に記載されており、一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３に記載されている；
（９）免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号５に記載されており、免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１７に記載されており；一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１に記載されており、一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３に記載されている；
（１０）免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号９に記載されており、免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号７に記載されており；一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１に記載されており、一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３に記載されている；
（１１）免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号９に記載されており、免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１１に記載されており；一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１に記載されており、一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３に記載されている；および
（１２）免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号９に記載されており、免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１７に記載されており；一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１に記載されており、一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３に記載されている
のいずれか１つから選択される。

【0031】

本発明の１つまたは複数の実施形態では、
免疫グロブリンの重鎖のアミノ酸配列が配列番号２４に記載されており、免疫グロブリンの軽鎖のアミノ酸配列が配列番号２６に記載されている、
二重特異性抗体が提供される。

【0032】

本発明の１つまたは複数の実施形態では、二重特異性抗体は、ＩｇＧ－ｓｃＦｖの形態、すなわち、Ｍｏｒｒｉｓｏｎフォーマットである。

【0033】

本発明のいくつかの実施形態では、本発明の１つまたは複数の実施形態における二重特異性抗体について、
免疫グロブリンの重鎖定常領域は、ヒトＩｇガンマ－１鎖Ｃ領域またはヒトＩｇガンマ－４鎖Ｃ領域であり、免疫グロブリンの軽鎖定常領域はヒトＩｇカッパ鎖Ｃ領域である。

【0034】

本発明のいくつかの実施形態では、免疫グロブリンの定常領域はヒト化されている。例えば、重鎖定常領域はＩｇガンマ－１鎖Ｃ領域、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８５７であり、軽鎖定常領域はＩｇカッパ鎖Ｃ領域、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８３４であるか；または、免疫グロブリンの重鎖定常領域はＩｇガンマ－４鎖Ｃ領域、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８６１．１であり、免疫グロブリンの軽鎖定常領域はＩｇカッパ鎖Ｃ領域、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８３４である。

【0035】

本発明の一実施形態では、重鎖定常領域Ｉｇガンマ－１鎖Ｃ領域（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８５７）のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号４０）
本発明の一実施形態では、重鎖定常領域Ｉｇガンマ－４鎖Ｃ領域（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８６１．１）のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（配列番号４１）
本発明の一実施形態では、軽鎖定常領域Ｉｇカッパ鎖Ｃ領域（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８３４）のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号４２）
本発明のいくつかの実施形態では、一本鎖抗体が免疫グロブリンの重鎖のＣ末端に連結されている、二重特異性抗体が提供される。免疫グロブリンは２つの重鎖を有するので、２つの一本鎖抗体分子は１つの免疫グロブリン分子に連結される。好ましくは、２つの一本鎖抗体分子は同一である。

【0036】

本発明のいくつかの実施形態では、２つの一本鎖抗体が存在し、それぞれの一本鎖抗体の１つの末端が免疫グロブリンの２つの重鎖のうちの１つのＣ末端またはＮ末端に連結されている、二重特異性抗体が提供される。

【0037】

本発明のいくつかの実施形態では、ジスルフィド結合は、一本鎖抗体のＶ_ＨとＶ_Ｌの間に存在する。抗体のＶＨとＶＬの間にジスルフィド結合を導入する方法は、当技術分野においては周知であり、例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７４７，６５４号；Ｒａｊａｇｏｐａｌら、Ｐｒｏｔ． Ｅｎｇｉｎ．、１０巻（１９９７）１４５３～１４５９頁；Ｒｅｉｔｅｒら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１４巻（１９９６）１２３９～１２４５頁；Ｒｅｉｔｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８巻（１９９５）１３２３～１３３１頁；Ｗｅｂｂｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３２巻（１９９５）２４９～２５８頁；Ｒｅｉｔｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２巻（１９９５）２８１～２８７頁；Ｒｅｉｔｅｒら、ＪＢＣ、２６９巻（１９９４）１８３２７～１８３３１頁；Ｒｅｉｔｅｒら、Ｉｎｔｅｒ． Ｊ． ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、５８巻（１９９４）１４２～１４９頁；またはＲｅｉｔｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４巻（１９９４）２７１４～２７１８頁を参照されたい。

【0038】

本発明の１つまたは複数の実施形態では、第１のタンパク質機能領域が、直接的に、またはリンカー断片によって、第２のタンパク質機能領域に連結されているか；および／または一本鎖抗体の重鎖可変領域が、直接的に、またはリンカー断片によって、一本鎖抗体の軽鎖可変領域に連結されている、二重特異性抗体が提供される。

【0039】

本発明の１つまたは複数の実施形態では、二重特異性抗体について、リンカー断片は（ＧＧＧＧＳ）ｎであり、ｎは正の整数である；好ましくは、ｎは１、２、３、４、５、または６である。

【0040】

本発明の１つまたは複数の実施形態では、二重特異性抗体について、第１のタンパク質機能領域および第２のタンパク質機能領域の数は、それぞれ独立して、１、２またはそれ以上である。

【0041】

本発明の１つまたは複数の実施形態では、一本鎖抗体が免疫グロブリンの重鎖のＣ末端に連結されている、二重特異性抗体が提供される。

【0042】

本発明は、
ＰＤ－１を標的とする第１のタンパク質機能領域と、
ＶＥＧＦＡを標的とする第２のタンパク質機能領域
を含む二重特異性抗体であって；
第１のタンパク質機能領域の数が１であり、第２のタンパク質機能領域の数が２であり；
第１のタンパク質機能領域が免疫グロブリンであり、第２のタンパク質機能領域が一本鎖抗体であり；
免疫グロブリンの重鎖のアミノ酸配列が配列番号２４に記載されており、免疫グロブリンの軽鎖のアミノ酸配列が配列番号２６に記載されており；
一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号９に記載されており、一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１７に記載されており；
一本鎖抗体が免疫グロブリンの重鎖のＣ末端に連結されており；
第１のタンパク質機能領域が、第１のリンカー断片によって、第２のタンパク質機能領域に連結されており；一本鎖抗体の重鎖可変領域が、第２のリンカー断片によって、一本鎖抗体の軽鎖可変領域に連結されており；第１のリンカー断片および第２のリンカー断片が同一または異なり；
好ましくは、第１のリンカー断片および第２のリンカー断片のアミノ酸配列が、独立して、配列番号１８および配列番号１９から選択され；
好ましくは、第１のリンカー断片および第２のリンカー断片のアミノ酸配列が、配列番号１８に記載されている、
二重特異性抗体にさらに関する。

【0043】

本発明の１つまたは複数の実施形態では、免疫グロブリンまたはその抗原結合断片が、約１０^－６Ｍ未満、例えば約１０^－７Ｍ、１０^－８Ｍ未満または１０^－９Ｍ以下の親和定数でＦｃγＲＩに結合し；好ましくは、親和定数が、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムによって測定される、二重特異性抗体が提供される。

【0044】

本発明の１つまたは複数の実施形態では、免疫グロブリンまたはその抗原結合断片が、約１０^－９Ｍ未満、例えば約１０^－７Ｍ、１０^－８Ｍ未満または１０^－９Ｍ以下の親和定数でＣ１ｑに結合し；好ましくは、親和定数が、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムによって測定される、二重特異性抗体が提供される。

【0045】

本発明のいくつかの実施形態では、二重特異性抗体が１０^－５Ｍ未満、例えば１０^－６Ｍ、１０^－７Ｍ、１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍまたは１０^－１０Ｍ以下または未満のＫ_ＤでＶＥＧＦＡタンパク質および／またはＰＤ－１タンパク質に結合し；好ましくは、Ｋ_ＤがＦｏｒｔｅｂｉｏシステムによって測定される、二重特異性抗体が提供される。

【0046】

本発明のいくつかの実施形態では、二重特異性抗体が１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．２ｎＭ未満、０．１５ｎＭ未満、または０．１４ｎＭ未満のＥＣ_５０でＶＥＧＦＡタンパク質に結合し；好ましくは、ＥＣ_５０が間接的ＥＬＩＳＡによって検出され；
および／または、
二重特異性抗体が１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．２ｎＭ未満、０．１７ｎＭ未満、０．１６ｎＭ未満または０．１５ｎＭ未満のＥＣ_５０でＰＤ－１タンパク質に結合し；好ましくは、ＥＣ_５０が間接的ＥＬＩＳＡによって検出される、
二重特異性抗体が提供される。

【0047】

本発明の１つまたは複数の実施形態では、二重特異性抗体はモノクローナル抗体である。

【0048】

本発明の１つまたは複数の実施形態では、二重特異性抗体はヒト化抗体である。
本発明の別の態様は、本発明のいずれかの実施形態に記載の二重特異性抗体をコードする単離された核酸分子に関する。

【0049】

本発明のさらに別の態様は、本明細書に開示される単離された核酸分子を含むベクターに関する。

【0050】

本発明のさらに別の態様は、本明細書に記載される単離された核酸分子またはベクターを含む宿主細胞に関する。

【0051】

本発明の別の態様は、抗体またはその抗原結合断片と複合部分を含む複合体であって、免疫グロブリンが本発明のいずれかの実施形態に記載の二重特異性抗体であり、複合部分が検出可能な標識であり；好ましくは、複合部分が放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、発色物質または酵素である、複合体に関する。

【0052】

本発明の別の態様は、本発明のいずれかの実施形態に記載の二重特異性抗体を含むか、または本発明の複合体を含むキットであって；
好ましくは、キットが、免疫グロブリンまたはその抗原結合断片を特異的に認識することが可能な二次抗体をさらに含み；任意選択で、二次抗体が、検出可能な標識、例えば、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、発色物質または酵素をさらに含む、
キットに関する。

【0053】

本発明のさらに別の態様は、サンプル中のＰＤ－１および／またはＶＥＧＦＡの存在またはレベルを検出するためのキットの調製における、本発明のいずれかの実施形態に記載の二重特異性抗体または複合体の使用に関する。

【0054】

本発明の別の態様は、本発明のいずれかの実施形態に記載の二重特異性抗体または複合体を含む、医薬組成物に関し；任意選択で、医薬組成物は、薬学的に許容されるベクターおよび／または賦形剤をさらに含む。

【0055】

本発明の二重特異性抗体または本発明の医薬組成物は、製薬の分野において公知の任意の剤形、例えば、錠剤、丸剤、懸濁液、エマルジョン、溶液、ゲル、カプセル、粉末、顆粒、エリキシル、トローチ、坐薬、注射剤（注射溶液、注射用滅菌粉末および注射用濃縮溶液を含む）、吸入剤、ならびに噴霧剤などに製剤化することができる。好ましい剤形は、投与および治療用途の意図した様式によって決まる。本発明の医薬組成物は、製造条件および保存条件下で無菌であり安定化するものとする。好ましい剤形の１つは、注射剤である。そのような注射剤は、無菌注射溶液であり得る。例えば、無菌注射溶液は、以下の方法によって調製することができる：本発明の必要量の二重特異性抗体が適切な溶媒に加えられ、任意選択で、他の所望する成分（限定するものではないが、ｐＨ調節剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度増強剤、等張剤、保存剤、希釈剤、またはそれら任意の組合せを含む）が同時に加えられ、続いて濾過および滅菌される。さらに、滅菌注射溶液は、便利な保存および使用のために、無菌凍結乾燥粉末剤（例えば真空乾燥または凍結乾燥による）として調製することができる。そのような無菌凍結乾燥粉末剤は、使用前に、適切なベクター（例えば、無菌発熱性物質除去蒸留水）に分散させることができる。

【0056】

さらに、本発明の二重特異性抗体は、投与を容易にするために、単位用量剤形の医薬組成物中に存在させることができる。いくつかの実施形態では、単位用量は、少なくとも１ｍｇ、少なくとも５ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２０ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも３０ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、少なくとも７５ｍｇ、または少なくとも１００ｍｇである。医薬組成物が液体（例えば注射）剤形である場合、それは本発明の二重特異性抗体を少なくとも０．１ｍｇ／ｍＬ、例えば、少なくとも０．２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも７５ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも１００ｍｇ／ｍＬなどの濃度で含むことができる。

【0057】

本発明の二重特異性抗体または医薬組成物は、限定するものではないが、経口経路、口腔経路、舌下経路、眼内経路、局所経路、非経口経路、直腸経路、髄腔内経路、嚢内経路、鼠蹊部経路、膀胱内経路、局所経路（例えば粉末剤、軟膏もしくは点滴剤）、または経鼻経路を含む、当技術分野において公知の任意の適切な方法によって投与され得る。しかし、多くの治療用途においては、投与の好ましい経路／形式は、非経口である（例えば、静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射および筋肉内注射）。投与の経路および／または形式が意図した目的に応じて変わるということは、当業者には認識されよう。好ましい実施形態では、本発明の二重特異性抗体または医薬組成物は、静脈点滴または注射によって投与される。

【0058】

本明細書で提供された二重特異性抗体または医薬組成物は、単独でもしくは組合せて使用することができるか、または追加の薬学的に有効な薬剤（例えば腫瘍化学療法剤）と組み合わせて使用することができる。そのような追加の薬学的に有効な薬剤は、本発明の二重特異性抗体または本発明の医薬組成物の投与前に、その投与と同時に、あるいはその投与後に投与することができる。

【0059】

本発明では、投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答または予防応答）を達成するように調節され得る。例えば、それは単回投与であってもよく、ある期間にわたっての複数回投与であってもよく、また、治療の緊急程度に伴って用量を比例して低減または増加させることを特徴とし得る。

【0060】

本発明のまたさらなる態様は、悪性腫瘍を治療および／または予防するための医薬の調製における、本発明のいずれかの実施形態に記載の二重特異性抗体または本発明に記載の複合体の使用であって；好ましくは、悪性腫瘍が結腸がん、直腸がん、肺がん、肝臓がん、卵巣がん、皮膚がん、神経膠腫、黒色腫、リンパ腫、腎腫瘍、前立腺がん、膀胱がん、消化器がん、乳がん、脳腫瘍、子宮頸がん、食道がん、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）およびミスマッチ修復の欠損（ｄＭＭＲ）のがん、尿路上皮がん、中皮腫、子宮内膜がん、胃腺癌、食道胃接合部腺癌ならびに白血病から選択され；
好ましくは、肺がんが非小細胞肺がんまたは小細胞肺がんであり；好ましくは、非小細胞肺がんがＥＧＦＲおよび／またはＡＬＫ感受性変異型非小細胞肺がんであり；
好ましくは、肝臓がんが肝細胞がんであり；
好ましくは、腎腫瘍が腎細胞がんであり；
好ましくは、乳がんがトリプルネガティブ乳がんであり；
好ましくは、尿路上皮がんが膀胱がんである、
使用に関する。

【0061】

本発明のさらに別の態様は、以下の医薬の調製における、本発明のいずれかの実施形態に記載の二重特異性抗体または本発明に記載の複合体の使用に関する：
（１）サンプル中のＶＥＧＦＡのレベルを検出するための医薬もしくは薬剤、
ＶＥＧＦＡのＶＥＧＦＲ２への結合を遮断するための医薬もしくは薬剤、
ＶＥＧＦＡの活性もしくはレベルをダウンレギュレートするための医薬もしくは薬剤、
血管内皮細胞増殖に対するＶＥＧＦＡの刺激を軽減するための医薬もしくは薬剤、
血管内皮細胞増殖を抑制するための医薬もしくは薬剤、または、
腫瘍血管新生を遮断するための医薬もしくは薬剤；
ならびに／あるいは、
（２）ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合を遮断するための医薬もしくは薬剤、
ＰＤ－１の活性もしくはレベルをダウンレギュレートするための医薬もしくは薬剤、
生体におけるＰＤ－１の免疫抑制を軽減するための医薬もしくは薬剤、
Ｔリンパ球におけるＩＦＮ－γ分泌を促進するための医薬もしくは薬剤、または、
Ｔリンパ球におけるＩＬ－２分泌を促進するための医薬もしくは薬剤
の調製における、本発明のいずれかの実施形態に記載の二重特異性抗体または本発明の複合体の使用に関する。

【0062】

本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では、抗ＶＥＧＦＡ抗体および抗ＶＥＧＦＡ抗ＰＤ－１二重特異性抗体は両方とも、ＨＵＶＥＣ細胞の増殖を抑制することができ、抗ＰＤ－１抗体および抗ＶＥＧＦＡ抗ＰＤ－１二重特異性抗体は両方とも、ＩＦＮ－γおよび／またはＩＬ－２の分泌を促進し、免疫反応を活性化することができる。

【0063】

本発明のさらに別の態様は、悪性腫瘍を治療および／または予防する方法であって、有効量の本発明のいずれかの実施形態に記載の二重特異性抗体、または本発明に記載の複合体をそれを必要とする対象に投与するステップを含み；好ましくは、悪性腫瘍が結腸がん、直腸がん、肺がん、肝臓がん、卵巣がん、皮膚がん、神経膠腫、黒色腫、リンパ腫、腎腫瘍、前立腺がん、膀胱がん、消化器がん、乳がん、脳腫瘍、子宮頸がん、食道がん、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）およびミスマッチ修復の欠損（ｄＭＭＲ）のがん、尿路上皮がん、中皮腫、子宮内膜がん、胃腺癌、食道胃接合部腺癌ならびに白血病から選択され；
好ましくは、肺がんが非小細胞肺がんまたは小細胞肺がんであり；好ましくは、非小細胞肺がんがＥＧＦＲおよび／またはＡＬＫ感受性変異型非小細胞肺がんであり；
好ましくは、肝臓がんが肝細胞がんであり；
好ましくは、腎腫瘍が腎細胞がんであり；
好ましくは、乳がんがトリプルネガティブ乳がんであり；
好ましくは、尿路上皮がんが膀胱がんである、
方法に関する。

【0064】

本発明の二重特異性抗体の治療有効量または予防有効量の非限定的な典型的範囲は、０．０２～５０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．１～５０ｍｇ／ｋｇ、０．１～２５ｍｇ／ｋｇまたは１～１０ｍｇ／ｋｇである。用量は、治療しようとする病状のタイプおよび重症度に応じて変わり得ることに留意されたい。さらに、任意の特定の患者に関して、特定の投与レジメンが患者の必要性および医師の専門的判断によって経時的に調節され；本明細書で示した用量範囲が単なる説明目的のためであり、本発明の医薬組成物の使用および範囲を限定するものではないことは、当業者には理解されよう。

【0065】

本発明では、対象は哺乳動物、例えばヒトであり得る。
本発明のさらに別の態様は、
（１）サンプル中のＶＥＧＦＡのレベルを検出する方法、
ＶＥＧＦＡのＶＥＧＦＲ２への結合を遮断する方法、
ＶＥＧＦＡの活性もしくはレベルをダウンレギュレートする方法、
血管内皮細胞増殖に対するＶＥＧＦＡの刺激を軽減する方法、
血管内皮細胞増殖を抑制するための医薬または薬剤を調製する方法、または、
腫瘍血管新生を遮断する方法；
ならびに／あるいは、
（２）ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合を遮断する方法、
ＰＤ－１の活性もしくはレベルをダウンレギュレートする方法、
生体におけるＰＤ－１の免疫抑制を軽減する方法、
Ｔリンパ球におけるＩＦＮ－γ分泌を促進する方法、または、
Ｔリンパ球におけるＩＬ－２分泌を促進する方法
から選択される、ｉｎ ｖｉｖｏでの方法またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法に関する。

【0066】

本発明の１つまたは複数の実施形態では、二重特異性抗体または複合体は、悪性腫瘍の治療および／または予防において使用され；好ましくは、悪性腫瘍は結腸がん、直腸がん、肺がん、肝臓がん、卵巣がん、皮膚がん、神経膠腫、黒色腫、リンパ腫、腎腫瘍、前立腺がん、膀胱がん、消化器がん、乳がん、脳腫瘍、子宮頸がん、食道がん、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）およびミスマッチ修復の欠損（ｄＭＭＲ）のがん、尿路上皮がん、中皮腫、子宮内膜がん、胃腺癌、食道胃接合部腺癌ならびに白血病から選択され；
好ましくは、肺がんが非小細胞肺がんまたは小細胞肺がんであり；好ましくは、非小細胞肺がんがＥＧＦＲおよび／またはＡＬＫ感受性変異型非小細胞肺がんであり；
好ましくは、肝臓がんが肝細胞がんであり；
好ましくは、腎腫瘍が腎細胞がんであり；
好ましくは、乳がんがトリプルネガティブ乳がんであり；
好ましくは、尿路上皮がんが膀胱がんである。

【0067】

本発明の１つまたは複数の実施形態では、二重特異性抗体または複合体は、
（１）サンプル中のＶＥＧＦＡのレベルの検出、
ＶＥＧＦＡのＶＥＧＦＲ２への結合の遮断、
ＶＥＧＦＡの活性もしくはレベルのダウンレギュレート、
血管内皮細胞増殖に対するＶＥＧＦＡの刺激の軽減、
血管内皮細胞増殖の抑制、または、
腫瘍血管新生の遮断；
ならびに／あるいは、
（２）ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合の遮断、
ＰＤ－１の活性もしくはレベルのダウンレギュレート、
生体におけるＰＤ－１の免疫抑制の軽減、
Ｔリンパ球におけるＩＦＮ－γ分泌の促進、または、
Ｔリンパ球におけるＩＬ－２分泌の促進
のために使用される。

【0068】

抗体薬剤、特にモノクローナル抗体は、各種疾患の治療において良好な効果を達成した。これらの治療用抗体を取得するための従来の実験方法は、動物を抗原で免疫にすること、免疫動物において抗原を標的とする抗体を得ること、または抗原に対して親和性の低いそれらの抗体を親和性成熟によって改良することである。

【0069】

軽鎖および重鎖の可変領域は、抗原の結合を決定する；それぞれの鎖の可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの超可変領域を含む。重鎖（Ｈ鎖）のＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、軽鎖（Ｌ鎖）のＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、なお、これらはＫａｂａｔらによって命名されており、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍ．ｄ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ １９９１、（１～３巻）：９１～３２４２頁を参照されたい。

【0070】

好ましくは、ＣＤＲはまたＩＭＧＴ番号方式によっても規定することができ、Ｅｈｒｅｎｍａｎｎ， Ｆｒａｎｃｏｉｓ， Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｋａａｓ，およびＭａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ． 「ＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ＤＢ ａｎｄ ＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ：ａ ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｄ ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ， ＭＨＣ， ＩｇＳＦ ａｎｄ ＭｈｃＳＦ．」 Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３８巻．補遺１（２００９）：Ｄ３０１～Ｄ３０７頁を参照されたい。

【0071】

下記の（１）～（１３）のモノクローナル抗体配列のＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、当業者に周知の技術的手段によって、例えばＶＢＡＳＥ２データベースによって、またＩＭＧＴ規定に従って分析されたが、それらの結果は以下のとおりである：
（１）ベバシズマブ
重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１に記載されており、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号３に記載されている。

【0072】

重鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
ＨＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＮＹＧ（配列番号２８）
ＨＣＤＲ２：ＩＮＴＹＴＧＥＰ（配列番号２９）
ＨＣＤＲ３：ＡＫＹＰＨＹＹＧＳＳＨＷＹＦＤＶ（配列番号３０）
軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
ＬＣＤＲ１：ＱＤＩＳＮＹ（配列番号３１）
ＬＣＤＲ２：ＦＴＳ（配列番号３２）
ＬＣＤＲ３：ＱＱＹＳＴＶＰＷＴ（配列番号３３）
（２）１４Ｃ１２、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１または１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（Ｍ）
重鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
ＨＣＤＲ１：ＧＦＡＦＳＳＹＤ（配列番号３４）
ＨＣＤＲ２：ＩＳＧＧＧＲＹＴ（配列番号３５）
ＨＣＤＲ３：ＡＮＲＹＧＥＡＷＦＡＹ（配列番号３６）
軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
ＬＣＤＲ１：ＱＤＩＮＴＹ（配列番号３７）
ＬＣＤＲ２：ＲＡＮ（配列番号３８）
ＬＣＤＲ３：ＬＱＹＤＥＦＰＬＴ（配列番号３９）
（３）ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）またはＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）
重鎖の９つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
ＨＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＮＹＧ（配列番号２８）
ＨＣＤＲ２：ＩＮＴＹＴＧＥＰ（配列番号２９）
ＨＣＤＲ３：ＡＫＹＰＨＹＹＧＳＳＨＷＹＦＤＶ（配列番号３０）
ＨＣＤＲ４：ＧＦＡＦＳＳＹＤ（配列番号３４）
ＨＣＤＲ５：ＩＳＧＧＧＲＹＴ（配列番号３５）
ＨＣＤＲ６：ＡＮＲＹＧＥＡＷＦＡＹ（配列番号３６）
ＨＣＤＲ７：ＱＤＩＮＴＹ（配列番号３７）
ＨＣＤＲ８：ＲＡＮ（配列番号３８）
ＨＣＤＲ９：ＬＱＹＤＥＦＰＬＴ（配列番号３９）
軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
ＬＣＤＲ１：ＱＤＩＳＮＹ（配列番号３１）
ＬＣＤＲ２：ＦＴＳ（配列番号３２）
ＬＣＤＲ３：ＱＱＹＳＴＶＰＷＴ（配列番号３３）
本発明の抗体ＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）について、アミノ酸の変異は、ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）の非可変領域に導入される。ＥＵ番号方式に従って、アミノ酸の変異は、２３４および２３５位に導入され、ＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）は、重鎖のヒンジ領域において、２３４位にロイシンとアラニンの点変異（Ｌ２３４Ａ）、および２３５位にロイシンとアラニンの点変異（Ｌ２３５Ａ）を導入することによって得られる。

【0073】

本発明では、別段の規定のない限り、本明細書で使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。さらに、本明細書で使用される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学および免疫学の実験室での操作は、対応する分野で広く使用されている日常的な方法である。それと同時に、本発明をより理解するために、関連用語の規定および説明を以下で提供する。

【0074】

本明細書で使用される場合、ＶＥＧＦＡタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＮＰ＿００１１６５０９７．１）のアミノ酸配列に言及する場合には、これは完全長のＶＥＧＦＡタンパク質、ならびにＶＥＧＦＡの融合タンパク質、例えば、マウスＩｇＧまたはヒトＩｇＧのＦｃタンパク質断片（ｍＦｃまたはｈＦｃ）に融合された断片を含む。しかし、ＶＥＧＦＡタンパク質のアミノ酸配列で、変異または変種（限定するものではないが、置換、欠失および／または付加を含む）が、その生物学的機能に影響を及ぼすことなく、天然で生成され得るか、または人工的に導入され得ることは当業者には理解されよう。したがって、本発明では、用語「ＶＥＧＦＡタンパク質」とは、それらの天然バリアントまたは人工バリアントを含む、すべてのそのような配列を含んでいるものとする。さらに、ＶＥＧＦＡタンパク質の配列断片を記載する場合、これはまたその天然バリアントまたは人工バリアントの対応する配列断片も含む。本発明の一実施形態では、ＶＥＧＦＡタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３３の下線部分として示されている（最後の６個のＨｉｓがない、合計で３０２アミノ酸）。

【0075】

本明細書で使用される場合、ＶＥＧＦＲ２タンパク質（ＫＤＲとしても知られている、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＮＰ＿００２２４４）のアミノ酸配列に言及する場合には、これは完全長のＶＥＧＦＲ２タンパク質、またはＶＥＧＦＲ２の細胞外断片ＶＥＧＦＲ２－ＥＣＤ、またはＶＥＧＦＲ２－ＥＣＤを含む断片を含み、またさらに、これはＶＥＧＦＲ２－ＥＣＤの融合タンパク質、例えば、マウスＩｇＧまたはヒトＩｇＧのＦｃタンパク質断片（ｍＦｃまたはｈＦｃ）に融合された断片を含む。しかし、ＶＥＧＦＲ２タンパク質のアミノ酸配列で、変異または変種（限定するものではないが、置換、欠失および／または付加を含む）が、その生物学的機能に影響を及ぼすことなく、天然で生成され得るか、または人工的に導入され得ることは当業者には理解されよう。したがって、本発明では、用語「ＶＥＧＦＲ２タンパク質」とは、それらの天然バリアントまたは人工バリアントを含む、すべてのそのような配列を含んでいるものとする。さらに、ＶＥＧＦＲ２タンパク質の配列断片を記載する場合、これはまたその天然バリアントまたは人工バリアントの対応する配列断片も含む。本発明の一実施形態では、ＶＥＧＦＲ２の細胞外断片ＶＥＧＦＲ２－ＥＣＤのアミノ酸配列は、配列番号３４に記載されている（７６６アミノ酸）。

【0076】

本明細書で使用される場合、別段の明示のない限り、ＶＥＧＦＲは、ＶＥＧＦＲ１および／またはＶＥＧＦＲ２である；その特定のタンパク質配列は先行技術において公知の配列であり、既存の文献またはＧｅｎＢａｎｋで開示されている配列を参照することができる。例えば、ＶＥＧＦＲ１（ＶＥＧＦＲ１、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：２３２１）；ＶＥＧＦＲ２（ＶＥＧＦＲ２、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：３７９１）。

【0077】

本明細書で使用される場合、ＰＤ－１タンパク質（プログラム細胞死タンパク質１、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿００５０１８）のアミノ酸配列に言及する場合には、これは完全長のＰＤ－１タンパク質、またはＰＤ－１の細胞外断片ＰＤ－１ＥＣＤ、またはＰＤ－１ＥＣＤを含む断片を含み、これは、ＰＤ－１ＥＣＤの融合タンパク質、例えば、マウスＩｇＧまたはヒトＩｇＧのＦｃタンパク質断片（ｍＦｃまたはｈＦｃ）に融合された断片をさらに含む。しかし、ＰＤ－１タンパク質のアミノ酸配列で、変異または変種（限定するものではないが、置換、欠失および／または付加を含む）が、その生物学的機能に影響を及ぼすことなく、天然で生成され得るか、または人工的に導入され得ることは当業者には理解されよう。したがって、本発明では、用語「ＰＤ－１タンパク質」とは、それらの天然バリアントまたは人工バリアントを含む、すべてのそのような配列を含んでいるものとする。さらに、ＰＤ－１タンパク質の配列断片を記載する場合、これはまたその天然バリアントまたは人工バリアントの対応する配列断片も含む。

【0078】

本明細書で使用される場合、用語のＥＣ_５０とは、最大効果の５０％に対する濃度、すなわち、最大効果の５０％を引き起こす濃度を意味する。

【0079】

本明細書で使用される場合、用語「抗体」とは、一般に２対のポリペプチド鎖（各対は「軽」（Ｌ）鎖および「重」（Ｈ）鎖を有する）からなる免疫グロブリン分子を意味する。一般的な意味において、重鎖は、抗体中のより大きな分子量を有するポリペプチド鎖として解釈することができ、軽鎖は、抗体中のより小さな分子量を有するポリペプチド鎖を意味する。軽鎖は、κ軽鎖およびλ軽鎖として分類される。重鎖は、μ、δ、γ、αまたはεとして一般に分類され、抗体のアイソタイプは、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとして規定される。軽鎖および重鎖において、可変領域および定常領域は、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結されており、重鎖はまた、約３個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。各重鎖は、重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）および重鎖定常領域（Ｃ_Ｈ）からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン（Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）および軽鎖定常領域（Ｃ_Ｌ）からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣ_Ｌからなる。抗体の定常領域は、古典的補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）への免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）の結合を含む、免疫グロブリンの宿主組織または因子への結合を媒介し得る。Ｖ_Ｈ領域およびＶ_Ｌ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存領域の間に分散される、高度可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる）へとさらに細分化され得る。それぞれのＶ_ＨおよびＶ_Ｌは、以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で、アミノ末端からカルボキシル末端へ配置されている３個のＣＤＲおよび４個のＦＲからなる。各重鎖／軽鎖対の可変領域（Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ）は、抗体結合部位を形成する。領域またはドメインに対するアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ．（１９８７および１９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６巻（１９８７）：９０１～９１７頁；Ｃｈｏｔｈｉａら Ｎａｔｕｒｅ ３４２巻（１９８９）：８７８～８８３頁、あるいはＩＭＧＴ番号方式の規定、Ｅｈｒｅｎｍａｎｎ， Ｆｒａｎｃｏｉｓ， Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｋａａｓ，およびＭａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ． 「ＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ＤＢ ａｎｄ ＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ： ａ ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｄ ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ， ＭＨＣ， ＩｇＳＦ ａｎｄ ＭｈｃＳＦ．」 Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３８巻 補遺１（２００９）：Ｄ３０１～Ｄ３０７頁を参照、に基づき得る。特に、重鎖はまた、３個よりも多くの、例えば６、９、または１２個のＣＤＲを含んでいてもよい。例えば、本発明の二重特異性抗体では、重鎖は、別の抗体に連結されたＩｇＧ抗体の重鎖のＣ末端を有するＳｃＦｖであってもよく、またこの場合、重鎖は９個のＣＤＲを含む。用語「抗体」は、抗体を産生するためのいずれかの特定の方法によって限定されるものではない。例えば、抗体は、特に、組換え抗体、モノクローナル抗体およびポリクロナール抗体を含む。抗体は、異なるアイソタイプの抗体、例えばＩｇＧ（例えば、サブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭであり得る。

【0080】

本明細書で使用される場合、「抗原結合部分」としても知られている、用語「抗原結合断片」とは、完全長抗体が結合するのと同じ抗原に特異的に結合し、および／または抗原への特異的結合について完全長抗体と競合する能力を維持する、完全長抗体の断片を含むポリペプチドを意味している。全体的には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ， Ｗ．編、第２版、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、 Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照されたい。抗体の抗原結合断片は、組換えＤＮＡ技術により、またはインタクト抗体の酵素的切断または化学的切断によって生成することができる。いくつかの場合には、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体断片（例えばｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ダイアボディ、およびポリペプチドに特異的抗原結合能力を付与するのに十分な抗体の少なくとも一部を含むポリペプチドを含む。

【0081】

本明細書で使用される場合、用語「Ｆｄ断片」とは、Ｖ_ＨドメインおよびＣ_Ｈ１ドメインからなる抗体断片を意味し；用語「Ｆｖ断片」とは、抗体の単一アームのＶ_ＬドメインおよびＶ_Ｈドメインからなる抗体断片を意味し；用語「ｄＡｂ断片」は、Ｖ_Ｈドメインからなる抗体断片を意味し（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１巻（１９８９）：５４４～５４６頁）；用語「Ｆａｂ断片」とは、Ｖ_Ｌドメイン、Ｖ_Ｈドメイン、Ｃ_ＬドメインおよびＣ_Ｈ１ドメインからなる抗体断片を意味し；用語「Ｆ（ａｂ’）_２断片」とは、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結されている２つのＦａｂ断片を含む抗体断片を意味する。

【0082】

いくつかの場合においては、抗体の抗原結合断片は、Ｖ_ＬドメインとＶ_Ｈドメインが対形成され、単一ポリペプチド鎖の生成を可能にするリンカーを介して１価分子を形成されている、一本鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）である（例えば、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２巻（１９８８）：４２３～４２６頁、およびＨｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５巻（１９８８）：５８７９～５８８３頁を参照）。このようなｓｃＦｖ分子は、一般構造：ＮＨ_２－Ｖ_Ｌ－リンカー－Ｖ_Ｈ－ＣＯＯＨまたはＮＨ_２－Ｖ_Ｈ－リンカー－Ｖ_Ｌ－ＣＯＯＨを有し得る。先行技術における適切なリンカーは、反復ＧＧＧＧＳアミノ酸配列またはそのバリアントからなる。例えば、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）_４を有するリンカーを使用することができ、また、そのバリアントも使用することができる（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０巻（１９９３）：６４４４～６４４８頁）。本発明において有用である他のリンカーは、Ａｌｆｔｈａｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ８巻（１９９５）：７２５～７３１頁、Ｃｈｏｉら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３１巻（２００１）：９４～１０６頁、Ｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６巻（１９９６）：３０５５～３０６１頁、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２９３巻（１９９９）：４１～５６頁、およびＲｏｏｖｅｒｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１）によって開示されている。

【0083】

いくつかの場合においては、抗体の抗原結合断片は、Ｖ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインが単一ポリペプチド鎖で発現される、ダイアボディ、すなわち二価抗体である。しかし、使用されるリンカーが短すぎるので同じ鎖の２つのドメインは対形成することができず、そのため、ドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対形成することとなり、２つの抗原結合部位が生成される（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０巻（１９９３）：６４４４～６４４８頁、およびＰｏｌｊａｋ Ｒ．Ｊ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２巻（１９９４）：１１２１～１１２３頁を参照）。

【0084】

抗体の抗原結合断片（例えば、上記で言及した抗体断片）は、当業者に公知の従来の技術（例えば、組換えＤＮＡ技術、または酵素的もしくは化学的切断）を使用することにより、所定の抗体から得ることができ、抗体の抗原結合断片は、インタクト抗体の場合と同じように特異性についてスクリーニングすることができる。

【0085】

本明細書で使用される場合、文脈において明らかに規定されない限り、用語「抗体」に言及する場合には、それはインタクト抗体だけでなく、抗体の抗原結合断片も含む。

【0086】

本明細書で使用される場合、用語の「ｍＡｂ」および「モノクローナル抗体」とは、自然発生的に起こり得る自然突然変異を除き、非常に同種な抗体の群に由来する、すなわち、同一の抗体分子の群に由来する抗体またはその断片を意味する。モノクローナル抗体は、抗原上の単一エピトープに対して高特異的である。ポリクロナール抗体は、モノクローナル抗体に対して、一般に抗原上の異なるエピトープを認識する少なくとも２つ以上の異なる抗体を一般に含む。モノクローナル抗体は、一般に、Ｋｏｈｌｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ、２５６号：４９５頁、１９７５）によって最初に報告されたハイブリドーマ技術によって得ることができ、また組換えＤＮＡ技術によっても得ることができる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）。

【0087】

本明細書で使用される場合、用語「キメラ抗体」とは、軽鎖および／または重鎖の一部が（特定の種に由来し得るか、特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属し得る）抗体に由来し、軽鎖および／または重鎖の別の部分が（同一のもしくは異なる種に由来し得るか、同一のもしくは異なる抗体クラスもしくはサブクラスに属し得る）別の抗体に由来する、抗体を意味する。しかしいずれの場合にも、これは、標的抗原に対する結合活性を保持する米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙら）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８１号（１９８４）：６８５１～６８５５頁）。

【0088】

本明細書で使用される場合、用語「ヒト化抗体」とは、ヒト免疫グロブリン（受容体抗体）のＣＤＲ領域のすべてまたは一部が、ヒト以外の抗体（ドナー抗体）のＣＤＲ領域と置き換えられる場合に得られた抗体または抗体断片であって、そのドナー抗体が、予期した特異性、親和性または反応性を有する非ヒト（例えばマウス、ラットまたはウサギ）抗体であり得る、抗体または抗体断片を意味する。さらに、受容体抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）の一部のアミノ酸残基はまた、対応する非ヒト抗体のアミノ酸残基と置き換えることができるか、または抗体の性能をさらに改善もしくは最適化する他の抗体のアミノ酸残基と置き換えることができる。ヒト化抗体についてのさらなる詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８６、３２１巻：５２２～５２５頁；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８、３３２巻：３２３～３２９頁；Ｐｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．、１９９２、２巻：５９３～５９６頁、およびＣｌａｒｋ、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ ２０００、２１巻：３９７～４０２頁を参照されたい。

【0089】

本明細書で使用される場合、用語「エピトープ」とは、免疫グロブリンまたは抗体が特に結合する抗原上の部位を意味する。「エピトープ」はまた、本分野において「抗原決定基」とも称される。エピトープまたは抗原決定基は、一般に、分子の化学的に活性のある表面基、例えばアミノ酸または炭水化物または糖側鎖などからなり、通常、特異的な三次元構造特性および特異的な電荷特性を有する。例えば、エピトープは、一般に、特有の空間的立体構造に少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の連続または非連続のアミノ酸を含んでおり、これは「直鎖状」または「立体構造的」であり得る。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、６６巻、Ｇ． Ｅ． Ｍｏｒｒｉｓ編（１９９６）を参照されたい。直鎖エピトープにおいて、タンパク質と相互作用分子（例えば抗体）との間のすべての相互作用部位は、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直鎖状に位置する。立体構造的なエピトープにおいては、相互作用部位は、相互に隔てられているタンパク質のアミノ酸残基にわたって位置する。

【0090】

本明細書で使用される場合、用語の「単離された」とは、自然状態から人工的手段によって得られることを意味する。ある特定の「単離された」物質または成分が天然に生じる場合、その自然環境に変化が生じる場合、または自然環境から単離される場合、またはその両方の場合であり得る。例えば、ある特定の単離されていないポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、ある特定の生存動物において自然に起こり、そのような自然状態で単離された高純度の同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドと称される。用語の「単離された」は、その物質の活性に影響を及ぼさない、人工物質もしくは合成物質、または他の不純物の存在を除外しない。

【0091】

本明細書で使用される場合、用語「ベクター」とは、ポリヌクレオチドが挿入され得る核酸ビヒクルを意味する。挿入されたポリヌクレオチドによってコードされたタンパク質をベクターが発現させることができる場合、そのベクターは発現ベクターとして言及される。ベクターは、ベクターによって保有された遺伝物質エレメントを宿主細胞において発現することができるように、形質転換、形質導入またはトランスフェクションによって宿主細胞へ導入することができる。ベクターは当業者に周知であり、限定するものではないが、プラスミド；ファージミド；コスミド；人工染色体、例えば酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１由来の人工染色体（ＰＡＣ）；ファージ、例えばラムダファージまたはＭ１３ファージ、および動物ウイルスなどが含まれる。ベクターとして使用することができる動物ウイルスは、限定するものではないが、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウィルス、パピローマウイルス、およびパポバウイルス（例えばＳＶ４０）を含む。ベクターは、限定するものではないが、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択エレメントおよびレポーター遺伝子を含む、発現を調節する様々なエレメントを含有していてもよい。さらに、ベクターは複製開始部位を含んでいてもよい。

【0092】

本明細書に使用される場合、用語「宿主細胞」とは、ベクターが導入され得る細胞を意味し、限定するものではないが、原核細胞、例えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）もしくは枯草菌（ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、真菌細胞、例えば酵母細胞もしくはアスペルギルス属（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、昆虫細胞、例えばＳ２ショウジョウバエ細胞もしくはＳｆ９、または動物細胞、例えば繊維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはヒト細胞が含まれる。

【0093】

本明細書で使用される場合、用語の「特異的に結合する」とは、２つの分子間の非無作為の結合反応、例えば、抗体とそれが標的とする抗原との間の反応を意味する。いくつかの実施形態では、抗原（または抗原に特異的な抗体）に特異的に結合する抗体とは、抗体が約１０^－５Ｍ未満、例えば約１０^－６Ｍ、１０^－７Ｍ、１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍ未満または１０^－１０Ｍ以下の親和性（Ｋ_Ｄ）で抗原に結合することを意味する。本発明のいくつかの実施形態では、用語「標的」とは、特異的結合を意味する。

【0094】

本明細書で使用される場合、用語「Ｋ_Ｄ」とは、特異的抗体－抗原相互作用の解離平衡定数を意味し、これは抗体と抗原との間の結合親和性を説明するために使用される。より小さな平衡解離定数は、より強い抗体－抗原結合、および抗体と抗原との間のより高い親和性を示す。一般に、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）装置またはＦｏｒｔｅｂｉｏシステムで決定した場合、抗体は、約１０^－５Ｍ未満、例えば約１０^－６Ｍ、１０^－７Ｍ、１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍ未満または１０^－１０Ｍ以下の解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）で抗原に結合する。

【0095】

本明細書で使用される場合、用語の「モノクローナル抗体」および「ｍＡｂ」は同じ意味を有しており、交換可能に使用することができる；用語の「ポリクロナール抗体」および「ｐＡｂ」は同じ意味を有しており、交換可能に使用することができる；用語の「ポリペプチド」および「タンパク質」は同じ意味を有しており、交換可能に使用することができる。さらに、本明細書においては、アミノ酸は、一般に、当技術分野で公知の１文字および３文字の略語によって表される。例えば、アラニンは、ＡまたはＡｌａによって表すことができる。

【0096】

本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される補助物質」とは、対象および活性成分と薬理学的におよび／または生理学的に適合性のあるベクターおよび／または賦形剤を意味し、それは当技術分野において周知であり（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ． Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ編、第１９版 Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ： Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５を参照）、限定するものではないが、ｐＨ調節剤、界面活性剤、アジュバントおよびイオン強度促進剤が含まれる。例えば、ｐＨ調節剤は、限定するものではないが、リン酸塩緩衝液を含み；界面活性剤は、限定するものではないが、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤または非イオン界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ－８０を含み；イオン強度促進剤は、限定するものではないが、塩化ナトリウムを含む。

【0097】

本明細書で使用される場合、用語「アジュバント」とは、非特異的免疫促進剤を意味し、これは抗原への生体の免疫応答を促進することができるか、または抗原と一緒にまたは事前に生体に送達される場合に、免疫応答のタイプを変化させることができる。限定するものではないが、アルミニウムアジュバント（例えば水酸化アルミニウム）、フロイントアジュバント（例えば完全フロイントアジュバントおよび不完全フロイントアジュバント）、コリネバクテリウム・パルヴム（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、リポ多糖類、サイトカインなどを含む、様々なアジュバントがある。フロイントアジュバントは、動物実験において最も一般的に使用されているアジュバントである。水酸化アルミニウムアジュバントは、臨床試験においてより頻繁に使用されている。

【0098】

本明細書で使用される場合、用語「有効量」とは、所望の効果を得るか、または少なくとも部分的に得るのに十分な量を意味する。例えば、予防的有効量（例えば、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合またはＶＥＧＦの過剰発現に関連した疾患、例えば腫瘍に対する）は、その疾患（例えば、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合またはＶＥＧＦの過剰発現に関連した疾患、例えば腫瘍）の発症を予防、抑止または遅延するのに十分な量であり；治療有効量とは、その病気に罹患している患者の疾患およびその合併症を治癒するか、または少なくとも部分的に抑止するのに十分な量である。そのような有効量を決定することは、疑いもなく当業者の範囲内である。例えば、治療目的のための有効量は、治療しようとする疾患の重症度、患者自身の免疫系の全体的な状態、患者の一般的状態、例えば年齢、体重および性別、投与経路、ならびに同時に与えられる他の治療などによって決まる。

【0099】

用語「ＭＳＩ」はマイクロサテライト不安定性を意味する。マイクロサテライトは、ヒトゲノム全体にわたる短いタンデムリピートであり、１、２またはそれ以上のヌクレオチドの１０～５０リピートを含む。腫瘍などのある特定の異常な細胞中のマイクロサテライトは、正常な細胞と比較して、リピート単位の挿入または欠失によって長さが変更されている。そのような変更はＭＳＩと称される。不安定性および範囲に基づいて、ＭＳＩは、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）、低頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｌ）、およびマイクロサテライト安定性（ＭＳＳ）として分類することができる。ＭＳＩの主な原因は、ＤＮＡのミスマッチ修復（ＭＭＲ）の欠損である。ヒトのミスマッチ修復遺伝子（ＭＭＲ遺伝子）は、転写および翻訳により対応するミスマッチ修復タンパク質を発現することができる。任意のＭＭＲタンパク質の非存在は、ミスマッチ修復の欠損をもたらし得、塩基対のミスマッチは、そのような欠損によりＤＮＡ複製のプロセスにおいて蓄積し、最終的にＭＳＩをもたらす。結腸直腸がんの約１５％はＭＳＩ経路が原因である。これは、結腸直腸がんにおいて最初に報告され、胃がん、食道がん、副腎皮質がんなどにおいても起こり得る（Ｂａｒｅｔｔｉ Ｍら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ．、２０１８年；１８９巻：４５～６２頁）。ＭＳＩ－Ｈ／ｄＭＭＲ特性はまた、その後の研究において、中皮腫、肉腫、副腎皮質がん、悪性黒色腫および卵巣の胚細胞新生物においても見出された。

【0100】

ＭＳＩ－ＨおよびｄＭＭＲは、２つの異なるアッセイの結果を表し、生物学的に一致し、ＭＳＩ－Ｈ／ｄＭＭＲまたはＭＳＩ－ｈｉｇｈ／ｄＭＭＲと呼ばれるが、ＭＳＩ－ＬおよびＭＳＳは、能力のあるミスマッチ修復（ｐＭＭＲ）の表現型である。ｄＭＭＲの検出は、腫瘍検体（外科手術検体および吸引検体を含む）に基づいて、ＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＭＳＨ６およびＰＭＳ２の４つのミスマッチ遺伝子についてのタンパク質発現の免疫組織化学的アッセイを実施することである。４つのタンパク質のいずれかの非存在はｄＭＭＲを確認し、４つのタンパク質すべての陽性の結果は、ｐＭＭＲ、すなわち、完全なミスマッチ修復機能を示す。ＭＳＩの検出は、腫瘍細胞および体細胞中の反復ＤＮＡ配列（マイクロサテライト配列）の長さをマッチさせること、および長さを比較することである。５つの標準遺伝子座が、Ａｍｅｒｉｃａｎ ＮＣＩ標準に基づいてＰＣＲを使用して検出される場合、２つ以上の遺伝子座における不一致は、不安定性を示し、ＭＳＩ－Ｈとして規定され、１つの不一致の遺伝子座はＭＳＩ－Ｌを示し、５つの一致した遺伝子座はＭＳＳを示す。ハイスループット配列決定（次世代配列決定またはＮＧＳとも称される）をマイクロサテライト不安定性を検出する方法として使用することもできる。ＰＣＲアッセイのために、より多くのマイクロサテライト遺伝子座、例えば５より多くの遺伝子座または追加のマイクロサテライト遺伝子座が選択されると、≧３０％の遺伝子座における不一致はＭＳＩ－Ｈとして規定され、すべての遺伝子座における一致はＭＳＳとして規定され、０～３０％の不一致はＭＳＩ－Ｌとして規定される。

【0101】

有利な効果
本発明は、以下の技術的効果（１）～（４）の１つまたは複数を達成する：
（１）本発明の抗体のＦｃ断片の改変は、ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）、ならびにＦＣ受容体のＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８の結合活性を完全に除去し、それによってＡＤＣＣ活性を完全に除去する。

【0102】

（２）本発明の抗体のＦｃ断片の改変は、ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）、ならびに補体Ｃ１ｑの結合活性を完全に除去し、それによってＣＤＣ活性を完全に除去する。

【0103】

（３）本発明の二重特異性抗体は、ＶＥＧＦＡに十分に特異的に結合することができ、ＶＥＧＦＡのＶＥＧＦＡ２への結合を効果的に遮断することができ、生体におけるＶＥＧＦＡの免疫抑制および血管新生におけるＶＥＧＦＡの促進効果を特異的に軽減する。

【0104】

（４）本発明の二重特異性抗体は、ＰＤ－１に十分に特異的に結合することができ、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合を効果的に遮断することができ、生体におけるＰＤ－１の免疫抑制を特異的に軽減し、免疫応答を活性化する。

【図面の簡単な説明】

【0105】

【図1】ＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）のＦｃγＲＩに対する親和定数アッセイ。上から下への曲線の対についての抗体濃度は、それぞれ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭおよび３．１２ｎＭである。

【図2】ベバシズマブのＦｃγＲＩに対する親和定数アッセイ。上から下への曲線の対についての抗体濃度は、それぞれ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭおよび３．１２ｎＭである。

【図3】ニボルマブのＦｃγＲＩに対する親和定数アッセイ。上から下への曲線の対についての抗体濃度は、それぞれ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭおよび３．１２ｎＭである。

【図4】ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）のＦｃγＲＩに対する親和定数アッセイ。上から下への曲線の対についての抗体濃度は、それぞれ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭおよび３．１２ｎＭである。

【図5】ＶＰ１０１（ｈＧ４ＷＴ）のＦｃγＲＩに対する親和定数アッセイ。上から下への曲線の対についての抗体濃度は、それぞれ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭおよび３．１２ｎＭである。

【図6】ＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）のＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に対する親和定数アッセイ。上から下への曲線の対についての抗体濃度は、それぞれ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭおよび１２．５ｎＭである。

【図7】ベバシズマブのＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に対する親和定数アッセイ。上から下への曲線の対についての抗体濃度は、それぞれ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭおよび１２．５ｎＭである。

【図8】ニボルマブのＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に対する親和定数アッセイ。上から下への曲線の対についての抗体濃度は、それぞれ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭおよび１２．５ｎＭである。

【図9】ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）のＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に対する親和定数アッセイ。上から下への曲線の対についての抗体濃度は、それぞれ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭおよび１２．５ｎＭである。

【図10】ＶＰ１０１（ｈＧ４ＷＴ）のＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に対する親和定数アッセイ。上から下への曲線の対についての抗体濃度は、それぞれ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭおよび１２．５ｎＭである。

【図11】ＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）のＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１に対する親和定数アッセイ。上から下への曲線の対についての抗体濃度は、それぞれ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭおよび１２．５ｎＭである。

【図12】ベバシズマブのＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１に対する親和定数アッセイ。上から下への曲線の対についての抗体濃度は、それぞれ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭおよび１２．５ｎＭである。

【図13】ニボルマブのＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１に対する親和定数アッセイ。上から下への曲線の対についての抗体濃度は、それぞれ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭおよび１２．５ｎＭである。

【図14】ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）のＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１に対する親和定数アッセイ。上から下への曲線の対についての抗体濃度は、それぞれ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭおよび１２．５ｎＭである。

【図15】ＶＰ１０１（ｈＧ４ＷＴ）のＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１に対する親和定数アッセイ。上から下への曲線の対についての抗体濃度は、それぞれ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭおよび１２．５ｎＭである。

【図16】ＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）のＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８に対する親和定数アッセイ。上から下への曲線の対についての抗体濃度は、それぞれ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、６２．５ｎＭおよび３１．２５ｎＭである。

【図17】ベバシズマブのＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８に対する親和定数アッセイ。上から下への曲線の対についての抗体濃度は、それぞれ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、６２．５ｎＭおよび３１．２５ｎＭである。

【図18】ニボルマブのＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８に対する親和定数アッセイ。上から下への曲線の対についての抗体濃度は、それぞれ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、６２．５ｎＭおよび３１．２５ｎＭである。

【図19】ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）のＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８に対する親和定数アッセイ。上から下への曲線の対についての抗体濃度は、それぞれ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、６２．５ｎＭおよび３１．２５ｎＭである。

【図20】ＶＰ１０１（ｈＧ４ＷＴ）のＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８に対する親和定数アッセイ。上から下への曲線の対についての抗体濃度は、それぞれ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、６２．５ｎＭおよび３１．２５ｎＭである。

【図21】ＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）のＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に対する親和定数アッセイ。上から下への曲線の対についての抗原濃度は、それぞれ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、６２．５ｎＭおよび３１．２５ｎＭである。

【図22】ベバシズマブのＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に対する親和定数アッセイ。上から下への曲線の対についての抗体濃度は、それぞれ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、６２．５ｎＭおよび３１．２５ｎＭである。

【図23】ニボルマブのＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に対する親和定数アッセイ。上から下への曲線の対についての抗体濃度は、それぞれ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、６２．５ｎＭおよび３１．２５ｎＭである。

【図24】ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）のＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に対する親和定数アッセイ。上から下への曲線の対についての抗体濃度は、それぞれ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、６２．５ｎＭおよび３１．２５ｎＭである。

【図25】ＶＰ１０１（ｈＧ４ＷＴ）のＦｃγＲＩＩａ＿Ｆ１５８に対する親和定数アッセイ。上から下への曲線の対についての抗体濃度は、それぞれ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、６２．５ｎＭおよび３１．２５ｎＭである。

【図26】ＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）のＣ１ｑに対する親和定数アッセイ。上から下への曲線の対についての抗体濃度は、それぞれ、１０ｎＭ、５ｎＭ、２．５ｎＭ、１．２５ｎＭおよび０．６２５ｎＭである。

【図27】ベバシズマブのＣ１ｑに対する親和定数アッセイ。上から下への曲線の対についての抗体濃度は、それぞれ、１０ｎＭ、５ｎＭ、２．５ｎＭ、１．２５ｎＭおよび０．６２５ｎＭである。

【図28】ニボルマブのＣ１ｑに対する親和定数アッセイ。上から下への曲線の対についての抗体濃度は、それぞれ、１０ｎＭ、５ｎＭ、２．５ｎＭ、１．２５ｎＭおよび０．６２５ｎＭである。

【図29】ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）のＣ１ｑに対する親和定数アッセイ。上から下への曲線の対についての抗体濃度は、それぞれ、１０ｎＭ、５ｎＭ、２．５ｎＭ、１．２５ｎＭおよび０．６２５ｎＭである。

【図30】ＶＰ１０１（ｈＧ４ＷＴ）のＣ１ｑに対する親和定数アッセイ。上から下への曲線の対についての抗原濃度は、それぞれ、１０ｎＭ、５ｎＭ、２．５ｎＭ、１．２５ｎＭおよび０．６２５ｎＭである。

【図31】ＰＤ－１抗原を発現するＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１標的細胞系におけるＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）のＡＤＣＣ活性アッセイ。

【図32】ＰＤ－１抗原を発現するＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１標的細胞系におけるＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）のＣＤＣ活性アッセイ。

【図33】ＥＬＩＳＡ法によって検出された、ＰＢＭＣ細胞およびＲａｊｉ－ＰＤＬ１細胞の混合培養によって誘導されたサイトカインＩＦＮ－γの分泌に対する抗体ＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）の効果。

【図34】ＥＬＩＳＡ法によって検出された、ＰＢＭＣ細胞およびＲａｊｉ－ＰＤＬ１細胞の混合培養によって誘導されたサイトカインＩＬ－２の分泌に対する抗体ＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）の効果。

【図35】ＰＤ－１抗原を発現するＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１標的細胞系におけるＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）のＡＤＣＰ活性アッセイ。

【発明を実施するための形態】

【0106】

詳細な説明
本発明の実施形態を、実施例を参照して以下で詳細に説明する。以下の実施例が本発明を例示するためだけのものであって、本発明の範囲の限定として解釈されないことは、当業者には理解されよう。技術または条件の明確な説明のない場合は、当技術分野の文献に開示されている技術または条件に従って（例えば、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ、Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、およびＨｕａｎｇ Ｐｅｉｔａｎｇら訳、第３版、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓを参照）または製品マニュアルに従って実施した。使用した試薬または機器は、それらの製造業者が明示されていない場合、すべて市販されている従来の製品である。

【0107】

本発明の以下の実施例において、同一標的用の市販抗体ベバシズマブ（商品名アバスチン（登録商標））は、対照抗体としてＲｏｃｈｅから購入したか、または調製実施例１に従って調製した。

【0108】

本発明の以下の実施例において、同一標的用の市販抗体ニボルマブ（商品名Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））は、対照抗体としてＢＭＳから購入した。

【0109】

本発明の以下の実施例では、使用されるアイソタイプ対照抗体は、ヒト抗ニワトリ卵白リゾチームＩｇＧ（抗ＨＥＬ、またはｈＩｇＧと略称されるヒトＩｇＧ）であり、その可変領域配列は、Ａｃｉｅｒｎｏらによって公表された研究、標題「Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｖ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ａｎｔｉ－ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」（Ａｃｉｅｒｎｏら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、２００７年；３７４巻（１号）：１３０～４６頁）に由来する。実施例において使用されるｈＩｇＧ１ＤＭおよびｈＩｇＧ４ＷＴは、ｈＧ１ＤＭおよびｈＧ４ＷＴの定常領域配列を有する抗ＨＥＬのアイソタイプ対照抗体である。アイソタイプ対照抗体は、Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．の実験室で調製された。

【0110】

調製実施例１：抗ＶＥＧＦＡ抗体ベバシズマブの調製
中国公開特許公報第ＣＮ１２５９９６２Ａ号には、市販の抗ＶＥＧＦＡモノクローナル抗体アバスチン（ベバシズマブ）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列が言及されている。Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔに、重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列の合成を委託した。
ベバシズマブの重鎖可変領域のアミノ酸配列（ベバシズマブ－Ｈｖ）：（１２３ａａ）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS（配列番号１）
ベバシズマブの重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列：（３６９ｂｐ）
GAGGTGCAGCTGGTCGAGTCCGGGGGGGGGCTGGTGCAGCCAGGCGGGTCTCTGAGGCTGAGTTGCGCCGCTTCAGGGTACACCTTCACAAACTATGGAATGAATTGGGTGCGCCAGGCACCAGGAAAGGGACTGGAGTGGGTCGGCTGGATCAACACTTACACCGGGGAACCTACCTATGCAGCCGACTTTAAGCGGCGGTTCACCTTCAGCCTGGATACAAGCAAATCCACTGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGAGCTGAGGACACCGCAGTCTACTATTGTGCTAAATATCCCCACTACTATGGGAGCAGCCATTGGTATTTTGACGTGTGGGGGCAGGGGACTCTGGTGACAGTGAGCAGC（配列番号２）
ベバシズマブの軽鎖可変領域のアミノ酸配列（ベバシズマブ－Ｌｖ）：（１０７ａａ）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIK（配列番号３）
ベバシズマブの軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列：（３２１ｂｐ）
GATATTCAGATGACTCAGAGCCCCTCCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGGGTCACCATCACATGCAGTGCTTCACAGGATATTTCCAACTACCTGAATTGGTATCAGCAGAAGCCAGGAAAAGCACCCAAGGTGCTGATCTACTTCACTAGCTCCCTGCACTCAGGAGTGCCAAGCCGGTTCAGCGGATCCGGATCTGGAACCGACTTTACTCTGACCATTTCTAGTCTGCAGCCTGAGGATTTCGCTACATACTATTGCCAGCAGTATTCTACCGTGCCATGGACATTTGGCCAGGGGACTAAAGTCGAGATCAAG（配列番号４）
重鎖定常領域は、すべてＩｇガンマ－１鎖Ｃ領域、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８５７であった；軽鎖定常領域は、すべてＩｇカッパ鎖Ｃ領域、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８３４であった。

【0111】

ベバシズマブの重鎖ｃＤＮＡおよび軽鎖ｃＤＮＡをベクターｐｃＤＮＡ３．１にクローニングし、抗体ベバシズマブの組換え発現プラスミドを得た。組換えプラスミドを２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。２９３Ｆ細胞の培養培地を精製し、次いで検出した。

【0112】

抗ＶＥＧＦＡモノクローナル抗体アバスチン（ベバシズマブ）をこのようにして得た。
調製実施例２：抗ＰＤ－１抗体１４Ｃ１２およびそのヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１、ならびに変異体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（Ｍ）の配列設計
抗ＰＤ－１抗体１４Ｃ１２およびそのヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびコードするヌクレオチド配列は、それぞれ、中国公開特許公報第ＣＮ１０６９６７１７２Ａ号における１４Ｃ１２および１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１のものと同一である。

【0113】

（１）１４Ｃ１２の重鎖および軽鎖可変領域配列
１４Ｃ１２の重鎖可変領域のアミノ酸配列：（１１８ａａ）
EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVATISGGGRYTYYPDSVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLRSEDTALYYCANRYGEAWFAYWGQGTLVTVSA（配列番号５）
１４Ｃ１２の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列：（３５４ｂｐ）
GAGGTCAAACTGGTGGAGAGCGGCGGCGGGCTGGTGAAGCCCGGCGGGTCACTGAAACTGAGCTGCGCCGCTTCCGGCTTCGCCTTTAGCTCCTACGACATGTCATGGGTGAGGCAGACCCCTGAGAAGCGCCTGGAATGGGTCGCTACTATCAGCGGAGGCGGGCGATACACCTACTATCCTGACTCTGTCAAAGGGAGATTCACAATTAGTCGGGATAACGCCAGAAATACTCTGTATCTGCAGATGTCTAGTCTGCGGTCCGAGGATACAGCTCTGTACTATTGTGCAAACCGGTACGGCGAAGCATGGTTTGCCTATTGGGGACAGGGCACCCTGGTGACAGTCTCTGCC（配列番号６）
１４Ｃ１２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列：（１０７ａａ）
DIKMTQSPSSMYASLGERVTFTCKASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPLTFGAGTKLELK（配列番号７）
１４Ｃ１２の軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列：（３２１ｂｐ）
GACATTAAGATGACACAGTCCCCTTCCTCAATGTACGCTAGCCTGGGCGAGCGAGTGACCTTCACATGCAAAGCATCCCAGGACATCAACACATACCTGTCTTGGTTTCAGCAGAAGCCAGGCAAAAGCCCCAAGACCCTGATCTACCGGGCCAATAGACTGGTGGACGGGGTCCCCAGCAGATTCTCCGGATCTGGCAGTGGGCAGGATTACTCCCTGACCATCAGCTCCCTGGAGTATGAAGACATGGGCATCTACTATTGCCTGCAGTATGATGAGTTCCCTCTGACCTTTGGAGCAGGCACAAAACTGGAACTGAAG（配列番号８）
（２）ヒト化モノクローナル抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の重鎖および軽鎖可変領域ならびに重鎖および軽鎖の配列
１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の重鎖可変領域のアミノ酸配列：（１１８ａａ）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKGLDWVATISGGGRYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNNLYLQMNSLRAEDTALYYCANRYGEAWFAYWGQGTLVTVSS（配列番号９）
１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列：（３５４ｂｐ）
GAAGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGGGGAGGGCTGGTGCAGCCCGGCGGGTCACTGCGACTGAGCTGCGCAGCTTCCGGATTCGCCTTTAGCTCCTACGACATGTCCTGGGTGCGACAGGCACCAGGAAAGGGACTGGATTGGGTCGCTACTATCTCAGGAGGCGGGAGATACACCTACTATCCTGACAGCGTCAAGGGCCGGTTCACAATCTCTAGAGATAACAGTAAGAACAATCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCTGAGGACACCGCACTGTACTATTGTGCCAACCGCTACGGGGAAGCATGGTTTGCCTATTGGGGGCAGGGAACCCTGGTGACAGTCTCTAGT（配列番号１０）
１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列：（１０７ａａ）
DIQMTQSPSSMSASVGDRVTFTCRASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDMATYYCLQYDEFPLTFGAGTKLELK（配列番号１１）
１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列：（３２１ｂｐ）
GACATTCAGATGACTCAGAGCCCCTCCTCCATGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGGGTCACCTTCACATGCCGCGCTAGTCAGGATATCAACACCTACCTGAGCTGGTTTCAGCAGAAGCCAGGGAAAAGCCCCAAGACACTGATCTACCGGGCTAATAGACTGGTGTCTGGAGTCCCAAGTCGGTTCAGTGGCTCAGGGAGCGGACAGGACTACACTCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCTGAGGACATGGCAACCTACTATTGCCTGCAGTATGATGAGTTCCCACTGACCTTTGGCGCCGGGACAAAACTGGAGCTGAAG（配列番号１２）
１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の重鎖（１４Ｃ１２Ｈ１）のアミノ酸配列：（４４８ａａ）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKGLDWVATISGGGRYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNNLYLQMNSLRAEDTALYYCANRYGEAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号１３）
１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の重鎖（１４Ｃ１２Ｈ１）をコードするヌクレオチド配列：（１３４４ｂｐ）
GAAGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGGGGAGGGCTGGTGCAGCCCGGCGGGTCACTGCGACTGAGCTGCGCAGCTTCCGGATTCGCCTTTAGCTCCTACGACATGTCCTGGGTGCGACAGGCACCAGGAAAGGGACTGGATTGGGTCGCTACTATCTCAGGAGGCGGGAGATACACCTACTATCCTGACAGCGTCAAGGGCCGGTTCACAATCTCTAGAGATAACAGTAAGAACAATCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCTGAGGACACCGCACTGTACTATTGTGCCAACCGCTACGGGGAAGCATGGTTTGCCTATTGGGGGCAGGGAACCCTGGTGACAGTCTCTAGTGCCAGCACCAAAGGACCTAGCGTGTTTCCTCTCGCCCCCTCCTCCAAAAGCACCAGCGGAGGAACCGCTGCTCTCGGATGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAACCCGTCACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTCTGACAAGCGGAGTCCATACATTCCCTGCTGTGCTGCAAAGCAGCGGACTCTATTCCCTGTCCAGCGTCGTCACAGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTCAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTGGAGCCCAAATCCTGCGACAAGACACACACCTGTCCCCCCTGTCCTGCTCCCGAACTCCTCGGAGGCCCTAGCGTCTTCCTCTTTCCTCCCAAACCCAAGGACACCCTCATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTCACCTGTGTCGTCGTGGATGTCAGCCATGAGGACCCCGAGGTGAAATTCAACTGGTATGTCGATGGCGTCGAGGTGCACAACGCCAAAACCAAGCCCAGGGAGGAACAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACAGTCCTCCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCTCTCCCTGCCCCCATTGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAAGGCCAACCCAGGGAGCCCCAGGTCTATACACTGCCTCCCTCCAGGGACGAACTCACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAGGGCTTTTATCCCAGCGACATCGCCGTCGAGTGGGAGTCCAACGGACAGCCCGAGAATAACTACAAGACCACCCCTCCTGTCCTCGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAAAGCAGGTGGCAGCAGGGAAACGTGTTCTCCTGCAGCGTGATGCACGAAGCCCTCCACAACCACTACACCCAGAAAAGCCTGTCCCTGAGCCCCGGCAAA（配列番号１４）
１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の軽鎖（１４Ｃ１２Ｌ１）のアミノ酸配列：（２１４ａａ）
DIQMTQSPSSMSASVGDRVTFTCRASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDMATYYCLQYDEFPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号１５）
１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の軽鎖（１４Ｃ１２Ｌ１）をコードするヌクレオチド配列：（６４２ｂｐ）
GACATTCAGATGACTCAGAGCCCCTCCTCCATGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGGGTCACCTTCACATGCCGCGCTAGTCAGGATATCAACACCTACCTGAGCTGGTTTCAGCAGAAGCCAGGGAAAAGCCCCAAGACACTGATCTACCGGGCTAATAGACTGGTGTCTGGAGTCCCAAGTCGGTTCAGTGGCTCAGGGAGCGGACAGGACTACACTCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCTGAGGACATGGCAACCTACTATTGCCTGCAGTATGATGAGTTCCCACTGACCTTTGGCGCCGGGACAAAACTGGAGCTGAAGCGAACTGTGGCCGCTCCCTCCGTCTTCATTTTTCCCCCTTCTGACGAACAGCTGAAATCAGGCACAGCCAGCGTGGTCTGTCTGCTGAACAATTTCTACCCTAGAGAGGCAAAAGTGCAGTGGAAGGTCGATAACGCCCTGCAGTCCGGCAACAGCCAGGAGAGTGTGACTGAACAGGACTCAAAAGATAGCACCTATTCCCTGTCTAGTACACTGACTCTGTCCAAGGCTGATTACGAGAAGCACAAAGTGTATGCATGCGAAGTGACACATCAGGGACTGTCAAGCCCCGTGACTAAGTCTTTTAACCGGGGCGAATGT（配列番号１６）
（３）１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（Ｍ）の重鎖および軽鎖可変領域配列
フレームワーク領域（軽鎖）中の個々のアミノ酸は、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１に基づいて変異させて、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（Ｍ）を得た。

【0114】

１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（Ｍ）の重鎖可変領域１４Ｃ１２Ｈ１（Ｍ）は、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の重鎖可変領域１４Ｃ１２Ｈ１と同一であり、すなわち、アミノ酸配列は、配列番号９に記載されている。

【0115】

１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（Ｍ）の軽鎖可変領域１４Ｃ１２Ｌ１（Ｍ）：（１０８ａａ、変異位置は１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１に基づいてアミノ酸配列中に下線を付けた）
DIQMTQSPSSMSASVGDRVTFTCRASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDMATYYCLQYDEFPLTFGAGTKLELKR（配列番号１７）
調製実施例３：二重特異性抗体の配列設計
１．配列設計
本発明の二重特異性抗体の構造は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ型（ＩｇＧ－ｓｃＦｖ）であり、すなわち、ＩｇＧ抗体の２つの重鎖のＣ末端がそれぞれ別の抗体のｓｃＦｖ断片に結合されており、重鎖および軽鎖の主な構成設計は下記の表１に示した通りである。

【0116】

ベバシズマブに基づいて、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（Ｍ）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列がＳｃＦｖ断片部分と考えられるＶＰ１０１抗体は、ＶＰ１０１（Ｍ）と称される。１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１と比較して、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（Ｍ）は、効果的に、二重特異性抗体の構造が最適化され、有効性が改善された。

【0117】

【表1】

【0118】

上記の表１において：
（１）右下方の角に表示された「Ｖ」を有するものは、対応する重鎖の可変領域または対応する軽鎖の可変領域を意味する。「Ｖ」表示のないものについては、対応する重鎖または軽鎖は、定常領域を含む完全長である。上記の調製例で説明した対応する配列は、これらの可変領域または完全長のアミノ酸配列と、それらをコードするヌクレオチド配列について言及されている。

【0119】

（２）リンカー１のアミノ酸配列はGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS（配列番号１８）である。
任意選択で、アミノ酸配列GGGGSGGGGSGGGGS（配列番号１９）を、前述のリンカー１の代わりに、リンカー２として使用することができる。

【0120】

（３）ベバシズマブ－Ｈは、重鎖定常領域としてＩｇガンマ－１鎖Ｃ領域（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８５７）を使用した。

【0121】

（４）ベバシズマブ－Ｇ４Ｈは、重鎖定常領域としてＩｇガンマ－４鎖Ｃ領域（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８６１．１）を使用した。

【0122】

２．抗体ＶＰ１０１（Ｍ）の発現および精製
ＶＰ１０１の重鎖ｃＤＮＡ配列および軽鎖ｃＤＮＡ配列を、それぞれ、ベクターｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔにより提供）にクローニングし、それぞれ、プラスミドｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－ＶＰ１０１ＨおよびｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－ＶＰ１０１Ｌを得た。

【0123】

プラスミドｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－ＶＰ１０１ＨおよびｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－ＶＰ１０１Ｌを酵素消化し（ＨｉｎｄＩＩＩ＆ＥｃｏＲＩ）、電気泳動によって単離した重鎖および軽鎖をベクターｐｃＤＮＡ３．１にサブクローニングし、組換えプラスミドを抽出して２９３Ｆ細胞にコトランスフェクトした。７日間細胞培養した後、培養培地を高速の遠心分離にかけ、上清を濃縮し、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラムにロードした。溶出バッファーを用いてタンパク質を１ステップでさらに溶出させ、標的サンプル抗体ＶＰ１０１を単離し、ＰＢＳにバッファー交換した。

【0124】

３．抗体ＶＰ１０１（Ｍ）の検出
精製したサンプルを、還元性タンパク質電気泳動ローディングバッファーおよび非還元性タンパク質電気泳動ローディングバッファーの両方に加え、次いで、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動検出のためにボイルした。

【0125】

調製実施例４の変異した抗体からの区別のために、ＶＰ１０１（Ｍ）は、本発明ではＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）とも称される。上記に記載されるＶＰ１０１（Ｍ）は「野生型」であり、重鎖定常領域としてＩｇガンマ－１鎖Ｃ領域（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８５７）、および軽鎖定常領域としてＩｇカッパ鎖Ｃ領域（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８３４）を含む。

【0126】

ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）中の免疫グロブリン部分の重鎖のアミノ酸配列：（４５３ａａ）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号２０）
ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）中の免疫グロブリン部分の重鎖をコードするヌクレオチド配列：（１３５９ｂｐ）
GAGGTGCAGCTGGTCGAGTCCGGGGGGGGGCTGGTGCAGCCAGGCGGGTCTCTGAGGCTGAGTTGCGCCGCTTCAGGGTACACCTTCACAAACTATGGAATGAATTGGGTGCGCCAGGCACCAGGAAAGGGACTGGAGTGGGTCGGCTGGATCAACACTTACACCGGGGAACCTACCTATGCAGCCGACTTTAAGCGGCGGTTCACCTTCAGCCTGGATACAAGCAAATCCACTGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGAGCTGAGGACACCGCAGTCTACTATTGTGCTAAATATCCCCACTACTATGGGAGCAGCCATTGGTATTTTGACGTGTGGGGGCAGGGGACTCTGGTGACAGTGAGCAGCGCAAGCACCAAAGGGCCCAGCGTGTTTCCTCTCGCCCCCTCCTCCAAAAGCACCAGCGGAGGAACCGCTGCTCTCGGATGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAACCCGTCACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTCTGACAAGCGGAGTCCATACATTCCCTGCTGTGCTGCAAAGCAGCGGACTCTATTCCCTGTCCAGCGTCGTCACAGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTCAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTGGAGCCCAAATCCTGCGACAAGACACACACCTGTCCCCCCTGTCCTGCTCCCGAACTCCTCGGAGGCCCTAGCGTCTTCCTCTTTCCTCCCAAACCCAAGGACACCCTCATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTCACCTGTGTCGTCGTGGATGTCAGCCATGAGGACCCCGAGGTGAAATTCAACTGGTATGTCGATGGCGTCGAGGTGCACAACGCCAAAACCAAGCCCAGGGAGGAACAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACAGTCCTCCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCTCTCCCTGCCCCCATTGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAAGGCCAACCCAGGGAGCCCCAGGTCTATACACTGCCTCCCTCCAGGGACGAACTCACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAGGGCTTTTATCCCAGCGACATCGCCGTCGAGTGGGAGTCCAACGGACAGCCCGAGAATAACTACAAGACCACCCCTCCTGTCCTCGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACAGCAAACTGACCGTCGATAAATCTAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCTTGTTCCGTGATGCATGAAGCACTGCACAACCATTATACCCAGAAGTCTCTGAGCCTGTCCCCCGGCAAG（配列番号２１）
調製実施例４の変異した抗体からの区別のために、ＶＰ１０１（Ｇ４Ｍ）は、本発明ではＶＰ１０１（ｈＧ４ＷＴ）とも称される。上記に記載されるＶＰ１０１（Ｇ４Ｍ）は「野生型」であり、重鎖定常領域としてＩｇガンマ－４鎖Ｃ領域（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８６１．１）、および軽鎖定常領域としてＩｇカッパ鎖Ｃ領域（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８３４）を含む。

【0127】

ＶＰ１０１（ｈＧ４ＷＴ）中の免疫グロブリン部分の重鎖のアミノ酸配列：（４５０ａａ）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（配列番号２２）
ＶＰ１０１（ｈＧ４ＷＴ）中の免疫グロブリン部分の重鎖をコードするヌクレオチド配列：（１３５０ｂｐ）
GAGGTGCAGCTGGTCGAGTCCGGGGGGGGGCTGGTGCAGCCAGGCGGGTCTCTGAGGCTGAGTTGCGCCGCTTCAGGGTACACCTTCACAAACTATGGAATGAATTGGGTGCGCCAGGCACCAGGAAAGGGACTGGAGTGGGTCGGCTGGATCAACACTTACACCGGGGAACCTACCTATGCAGCCGACTTTAAGCGGCGGTTCACCTTCAGCCTGGATACAAGCAAATCCACTGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGAGCTGAGGACACCGCAGTCTACTATTGTGCTAAATATCCCCACTACTATGGGAGCAGCCATTGGTATTTTGACGTGTGGGGGCAGGGGACTCTGGTGACAGTGAGCAGCGCAAGCACCAAAGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGTCTCTGAGCCTGTCCCTCGGCAAG（配列番号２３）
調製実施例４：ヒト化二重特異性抗体ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）に基づく非可変領域アミノ酸変異設計
調製実施例３で得られたＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）に基づいて、ＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）を、重鎖において、２３４位にロイシンとアラニンの点変異（Ｌ２３４Ａ）、および２３５位にロイシンとアラニンの点変異（Ｌ２３５Ａ）を導入することによって得た。

【0128】

ＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）中の免疫グロブリン部分の重鎖のアミノ酸配列：（４５３ａａ、変異位置に下線を付けた）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号２４）
ＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）中の免疫グロブリン部分の重鎖をコードするヌクレオチド配列：（１３５９ｂｐ、変異位置に下線を付けた）
GAGGTGCAGCTGGTCGAGTCCGGGGGGGGGCTGGTGCAGCCAGGCGGGTCTCTGAGGCTGAGTTGCGCCGCTTCAGGGTACACCTTCACAAACTATGGAATGAATTGGGTGCGCCAGGCACCAGGAAAGGGACTGGAGTGGGTCGGCTGGATCAACACTTACACCGGGGAACCTACCTATGCAGCCGACTTTAAGCGGCGGTTCACCTTCAGCCTGGATACAAGCAAATCCACTGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGAGCTGAGGACACCGCAGTCTACTATTGTGCTAAATATCCCCACTACTATGGGAGCAGCCATTGGTATTTTGACGTGTGGGGGCAGGGGACTCTGGTGACAGTGAGCAGCGCAAGCACCAAAGGGCCCAGCGTGTTTCCTCTCGCCCCCTCCTCCAAAAGCACCAGCGGAGGAACCGCTGCTCTCGGATGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAACCCGTCACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTCTGACAAGCGGAGTCCATACATTCCCTGCTGTGCTGCAAAGCAGCGGACTCTATTCCCTGTCCAGCGTCGTCACAGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTCAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTGGAGCCCAAATCCTGCGACAAGACACACACCTGTCCCCCCTGTCCTGCTCCCGAAGCTGCTGGAGGCCCTAGCGTCTTCCTCTTTCCTCCCAAACCCAAGGACACCCTCATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTCACCTGTGTCGTCGTGGATGTCAGCCATGAGGACCCCGAGGTGAAATTCAACTGGTATGTCGATGGCGTCGAGGTGCACAACGCCAAAACCAAGCCCAGGGAGGAACAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACAGTCCTCCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCTCTCCCTGCCCCCATTGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAAGGCCAACCCAGGGAGCCCCAGGTCTATACACTGCCTCCCTCCAGGGACGAACTCACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAGGGCTTTTATCCCAGCGACATCGCCGTCGAGTGGGAGTCCAACGGACAGCCCGAGAATAACTACAAGACCACCCCTCCTGTCCTCGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACAGCAAACTGACCGTCGATAAATCTAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCTTGTTCCGTGATGCATGAAGCACTGCACAACCATTATACCCAGAAGTCTCTGAGCCTGTCCCCCGGCAAG（配列番号２５）
ＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）、ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ４ＷＴ）の免疫グロブリン部分の軽鎖のアミノ酸配列およびコードするヌクレオチド配列は同一である。

【0129】

ＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）中の免疫グロブリン部分の軽鎖のアミノ酸配列：（２１４ａａ）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号２６）
ＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）中の免疫グロブリン部分の軽鎖をコードするヌクレオチド配列：（６４２ｂｐ）
GATATTCAGATGACTCAGAGCCCCTCCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGGGTCACCATCACATGCAGTGCTTCACAGGATATTTCCAACTACCTGAATTGGTATCAGCAGAAGCCAGGAAAAGCACCCAAGGTGCTGATCTACTTCACTAGCTCCCTGCACTCAGGAGTGCCAAGCCGGTTCAGCGGATCCGGATCTGGAACCGACTTTACTCTGACCATTTCTAGTCTGCAGCCTGAGGATTTCGCTACATACTATTGCCAGCAGTATTCTACCGTGCCATGGACATTTGGCCAGGGGACTAAAGTCGAGATCAAGCGGACCGTGGCCGCTCCCAGTGTCTTCATTTTTCCCCCTAGCGACGAACAGCTGAAATCCGGGACAGCCTCTGTGGTCTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCTAGAGAGGCAAAAGTGCAGTGGAAGGTCGATAACGCCCTGCAGAGTGGCAATTCACAGGAGAGCGTGACAGAACAGGACTCCAAAGATTCTACTTATAGTCTGTCAAGCACACTGACTCTGAGCAAGGCTGACTACGAAAAGCATAAAGTGTATGCATGTGAGGTCACCCACCAGGGGCTGAGCAGTCCAGTCACCAAGTCATTCAACAGAGGCGAGTGC（配列番号２７）

【実施例】

【0130】

実施例１：ＦｃγｒＲＩのＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）に対する親和定数アッセイ
ＣＤ６４としても知られているＦｃ受容体ＦｃγＲＩは、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片に結合することができ、抗体依存性細胞媒介性傷害（ＡＤＣＣ）に関与する。治療用モノクローナル抗体のＦｃ受容体への結合能力は抗体の安全性および効果に影響を与える。

【0131】

ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）のＦｃγＲＩに対する親和定数を、この実施例では、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを使用して決定し、各抗体のＡＤＣＣ活性を評価した。

【0132】

Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを使用する抗体のＦｃγＲＩに対する親和定数を決定する方法は、簡潔には以下のとおり記載される：サンプル希釈バッファーはＰＢＳ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ－２０、および０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４の溶液であった。１μｇ／ｍＬのＦｃγＲＩａを５０秒間ＨＩＳ１Ｋセンサーに固定化した。センサーを６０秒間バッファー中で平衡化し、センサーに固定化したＣＤ６４の３．１２～５０ｎＭ（連続２倍希釈）の濃度での抗体への結合を１２０秒間決定した。抗体を１２０秒間バッファー中で解離させた。センサーを、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．５中で４回、それぞれ５秒間リフレッシュした。検出温度は３０℃であり、周波数は０．３Ｈｚであった。データを１：１モデルでフィッティングすることにより分析し、親和定数を得た。

【0133】

ＦｃγＲＩのＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）、ＶＰ１０１（ｈＧ４ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）、ならびに対照抗体のニボルマブおよびベバシズマブに対する親和定数を表１および図１～５に示す。

【0134】

【表2】

【0135】

Ｎ／Ａは、抗体が抗原への結合を有さないか、または極めて弱い結合シグナルを有することを示し、したがって、結果は、分析されず、対応するデータは得られなかった。

【0136】

結果は、ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）が３．９５Ｅ－０９Ｍの親和定数でＦｃγＲＩに結合することができ；ＶＰ１０１（ｈＧ４ＷＴ）が８．５２Ｅ－０９Ｍの親和定数でＦｃγＲＩに結合することができ；ベバシズマブが３．６８Ｅ－０９Ｍの親和定数でＦｃγＲＩに結合することができ；ニボルマブが６．２０Ｅ－０９Ｍの親和定数でＦｃγＲＩに結合することができ；ＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）がＦｃγＲＩへの結合を有さないか、または極めて弱い結合シグナルを有し、したがって結果は分析されず、対応するデータは得られなかったことを示す。

【0137】

結果は、他の抗体のＦｃγＲＩに対する親和性が、ＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）のＦｃγＲＩへの結合なしを除いて、類似している。ＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）の結合活性は効果的に除去された。

【0138】

実施例２：ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１のＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）に対する親和定数アッセイ
Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１（ＣＤ３２ａ＿Ｈ１３１としても知られている）は、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片に結合し、ＡＤＣＣ効果を媒介することができる。

【0139】

ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）のＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に対する親和定数を、この実施例では、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを使用して決定し、各抗体のＡＤＣＣ活性を評価した。

【0140】

Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを使用するＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）のＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に対する親和定数を決定する方法は、簡潔には以下のとおり記載される：固定化希釈バッファーはＰＢＳ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ－２０、および０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４の溶液であり、分析物希釈バッファーはＰＢＳ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ－２０、０．０２％カゼイン、および０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４の溶液であった。５μｇ／ｍＬのＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１を、６０秒の固定化時間の間、ＮＴＡセンサーに固定化した。センサーを、６００秒のブロッキングの間、ＰＢＳ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ－２０、０．０２％カゼイン、および０．１％ＢＳＡ（ｐＨ７．４）のバッファー中で平衡化し、センサーに固定化したＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１の１２．５～２００ｎＭ（連続２倍希釈）の濃度での抗体への結合を６０秒間決定した。抗体を６０秒間バッファー中で解離させた。センサーを１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．７および１０ｎＭの硫酸ニッケル中でリフレッシュした。検出温度は３０℃であり、周波数は０．６Ｈｚであった。データを１：１モデルでフィッティングすることにより分析し、親和定数を得た。

【0141】

ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１のＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）、ＶＰ１０１（ｈＧ４ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）、ならびに対照抗体のニボルマブおよびベバシズマブに対する親和定数を表２および図６～１０に示す。

【0142】

【表3】

【0143】

Ｎ／Ａは、抗体が抗原への結合を有さないか、または極めて弱い結合シグナルを有することを示し、したがって、結果は、分析されず、対応するデータは得られなかった。

【0144】

結果は、ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）が２．２８Ｅ－０８Ｍの親和定数でＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に結合することができ；ＶＰ１０１（ｈＧ４ＷＴ）が３．６８Ｅ－０８Ｍの親和定数でＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に結合することができ；ベバシズマブが６．４４Ｅ－０８Ｍの親和定数でＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に結合することができ；ＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）が３．５７Ｅ－０８Ｍの親和定数でＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に結合することができるが；ニボルマブがＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１への結合を有さないか、または極めて弱い結合シグナルを有し、したがって結果は分析されず、対応するデータは得られなかったことを示す。

【0145】

結果は、ニボルマブのＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１への結合なしを除いて、他の抗体が以下の強い～弱い親和性：ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）、ＶＰ１０１（ｈＧ４ＤＭ）、ＶＰ１０１（ｈＧ４ＷＴ）およびベバシズマブでＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に結合したことを示す。

【0146】

実施例３：ＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１のＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）に対する親和定数アッセイ
Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１（ＣＤ３２ａ＿Ｒ１３１としても知られている）は、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片に結合し、ＡＤＣＣ効果を媒介することができる。

【0147】

ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）のＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１に対する親和定数を、この実施例では、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを使用して決定し、各抗体のＡＤＣＣ活性を評価した。

【0148】

Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを使用するＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）の親和定数を決定する方法は、簡潔には以下のとおり記載される：固定化希釈バッファーはＰＢＳ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ－２０、および０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４の溶液であり、分析物希釈バッファーはＰＢＳ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ－２０、０．０２％カゼイン、および０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４の溶液であった。５μｇ／ｍＬのＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１を、６０秒の固定化時間の間、ＮＴＡセンサーに固定化した。センサーを、６００秒のブロッキングの間、ＰＢＳ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ－２０、０．０２％カゼイン、および０．１％ＢＳＡ（ｐＨ７．４）のバッファー中で平衡化し、センサーに固定化したＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１の１２．５～２００ｎＭ（連続２倍希釈）の濃度での抗体への結合を６０秒間決定した。抗体を６０秒間バッファー中で解離させた。センサーを１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．７および１０ｎＭの硫酸ニッケル中でリフレッシュした。検出温度は３０℃であり、周波数は０．６Ｈｚであった。データを１：１モデルでフィッティングすることにより分析し、親和定数を得た。

【0149】

ＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１のＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）、ＶＰ１０１（ｈＧ４ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）、ならびに対照抗体のニボルマブおよびベバシズマブに対する親和定数を表３および図１１～１５に示す。

【0150】

【表4】

【0151】

Ｎ／Ａは、抗体が抗原への結合を有さないか、または極めて弱い結合シグナルを有することを示し、したがって、結果は、分析されず、対応するデータは得られなかった。

【0152】

結果は、ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）が２．４２Ｅ－０８Ｍの親和定数でＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１に結合することができ；ＶＰ１０１（ｈＧ４ＷＴ）が３．５７Ｅ－０８Ｍの親和定数でＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１に結合することができ；ベバシズマブが５．１６Ｅ－０８Ｍの親和定数でＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１に結合することができ；ニボルマブが６．９３Ｅ－０８Ｍの親和定数でＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１に結合することができ；ＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）が３．３５Ｅ－０８Ｍの親和定数でＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に結合することができることを示す。

【0153】

結果は、抗体が以下の強い～弱い親和性：ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）、ＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）、ＶＰ１０１（ｈＧ４ＷＴ）、ベバシズマブおよびニボルマブでＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１に結合したことを示す。

【0154】

実施例４：ＦｃγＲＩＩｂのＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）に対する親和定数アッセイ
Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂとしても知られている）は、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片に結合し、免疫細胞の機能をレギュレートすることができる。

【0155】

ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）のＦｃγＲＩＩｂに対する親和定数を、この実施例では、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを使用して決定し、ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）のＦｃ受容体への結合能力を評価した。

【0156】

Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを使用するＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）のＦｃγＲＩＩｂに対する親和定数を決定する方法は、簡潔には以下のとおり記載される：固定化希釈バッファーはＰＢＳ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ－２０、および０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４の溶液であり、分析物希釈バッファーはＰＢＳ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ－２０、０．０２％カゼイン、および０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４の溶液であった。５μｇ／ｍＬのｈＦＣＧＲ２Ｂ－ｈｉｓを、６０秒の固定化時間の間、ＮＴＡセンサーに固定化した。センサーを、６００秒のブロッキングの間、ＰＢＳ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ－２０、０．０２％カゼイン、および０．１％ＢＳＡ（ｐＨ７．４）のバッファー中で平衡化し、センサーに固定化したｈＦＣＧＲ２Ｂ－ｈｉｓの１２．５～２００ｎＭ（連続２倍希釈）の濃度での抗体への結合を６０秒間決定した。抗体を６０秒間バッファー中で解離させた。センサーを１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．７および１０ｎＭの硫酸ニッケル中でリフレッシュした。検出温度は３０℃であり、周波数は０．６Ｈｚであった。データを１：１モデルでフィッティングすることにより分析し、親和定数を得た。

【0157】

実施例５：ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８のＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）に対する親和定数アッセイ
Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８（ＣＤ１６ａ＿Ｖ１５８としても知られている）は、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片に結合し、ＡＤＣＣ効果を媒介することができる。

【0158】

ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）のＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８に対する親和定数を、この実施例では、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを使用して決定し、各抗体のＡＤＣＣ活性を評価した。

【0159】

Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムによる抗体のＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８に対する親和定数を決定する方法は、簡潔には以下のとおり記載される：サンプル希釈バッファーはＰＢＳ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ－２０、および０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４の溶液であった。５μｇ／ｍＬのＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８を１２０秒間ＨＩＳ１Ｋセンサーに固定化した。センサーを６０秒間バッファー中で平衡化し、センサーに固定化したｈＦｃＧＲ３Ａ（Ｖ１５８）－ｈｉｓの３１．２５～５００ｎＭ（連続２倍希釈）の濃度での抗体への結合を６０秒間決定した。抗体を６０秒間バッファー中で解離させた。センサーを、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．５中で４回、それぞれ５秒間リフレッシュした。検出温度は３０℃であり、周波数は０．３Ｈｚであった。データを１：１モデルでフィッティングすることにより分析し、親和定数を得た。

【0160】

ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８のＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）、ＶＰ１０１（ｈＧ４ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）、ならびに対照抗体のニボルマブおよびベバシズマブに対する親和定数を表４および図１６～２０に示す。

【0161】

【表5】

【0162】

Ｎ／Ａは、抗体が抗原への結合を有さないか、または極めて弱い結合シグナルを有することを示し、したがって、結果は、分析されず、対応するデータは得られなかった。

【0163】

結果は、ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）が４．３５Ｅ－０８Ｍの親和定数でＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８に結合することができ；ＶＰ１０１（ｈＧ４ＤＭ）が１．３４Ｅ－０７Ｍの親和定数でＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８に結合することができ；ベバシズマブが２．７６Ｅ－０８Ｍの親和定数でＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８に結合することができるが；ニボルマブおよびＶＰ１０１（ｈＧ４ＷＴ）がＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８への結合を有さないか、または極めて低い結合シグナルを有し、したがって結果は分析されず、対応するデータは得られなかったことを示す。

【0164】

結果は、ニボルマブおよびＶＰ１０１（ｈＧ４ＷＴ）のＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８への結合なしを除いて、他の抗体が以下の強い～弱い親和性：ベバシズマブ、ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）でＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８に結合したことを示す。

【0165】

実施例６：ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８のＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）に対する親和定数アッセイ
Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８（ＣＤ１６ａ＿Ｆ１５８としても知られている）は、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片に結合し、ＡＤＣＣ効果を媒介することができる。

【0166】

ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）のＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に対する親和定数を、この実施例では、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを使用して決定し、各抗体のＡＤＣＣ活性を評価した。

【0167】

Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを使用するＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）のＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に対する親和定数を決定する方法は、簡潔には以下のとおり記載される：サンプル希釈バッファーはＰＢＳ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ－２０、および０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４の溶液であった。５μｇ／ｍＬのＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８を１２０秒間ＨＩＳ１Ｋセンサーに固定化した。センサーを６０秒間バッファー中で平衡化し、センサーに固定化したｈＦｃＧＲ３Ａ（Ｆ１５８）－ｈｉｓの３１．２５～５００ｎＭ（連続２倍希釈）の濃度での抗体への結合を６０秒間決定した。抗体を６０秒間バッファー中で解離させた。センサーを、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．５中で４回、それぞれ５秒間リフレッシュした。検出温度は３０℃であり、周波数は０．３Ｈｚであった。データを１：１モデルでフィッティングすることにより分析し、親和定数を得た。

【0168】

ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８のＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）、ＶＰ１０１（ｈＧ４ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）、ならびに対照抗体のニボルマブおよびベバシズマブに対する親和定数を表５および図２１～２５に示す。

【0169】

【表6】

【0170】

Ｎ／Ａは、抗体が抗原への結合を有さないか、または極めて弱い結合シグナルを有することを示し、したがって、結果は、分析されず、対応するデータは得られなかった。

【0171】

結果は、ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）が７．４１Ｅ－０８Ｍの親和定数でＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に結合することができ；ベバシズマブが９．３２Ｅ－０８Ｍの親和定数でＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に結合することができるが；ニボルマブ、ＶＰ１０１（ｈＧ４ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）がＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８への結合を有さないか、または極めて低い結合シグナルを有し、したがって結果は分析されず、対応するデータは得られなかったことを示す。

【0172】

結果は、ニボルマブ、ＶＰ１０１（ｈＧ４ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）のＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８への結合なしを除いて、他の抗体が以下の強い～弱い親和性：ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）およびベバシズマブでＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に結合したことを示す。

【0173】

実施例７：Ｃ１ｑのＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）に対する親和定数アッセイ
血清補体Ｃ１ｑは、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片に結合し、ＣＤＣ効果を媒介することができる。治療用モノクローナル抗体のＣ１ｑへの結合能力は抗体の安全性および効果に影響を与える。

【0174】

ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）のＣ１ｑに対する親和定数を、この実施例では、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを使用して決定し、各抗体のＣＤＣ活性を評価した。

【0175】

Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを使用する抗体のＣ１ｑに対する親和定数を決定する方法は、簡潔には以下のとおり記載される：サンプル希釈バッファーはＰＢＳ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ－２０、および０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４の溶液であった。５０μｇ／ｍＬの抗体を約２．０ｎｍの固定化高さでＦＡＢ２Ｇセンサーに固定化した。センサーを６０秒間バッファー中で平衡化し、センサーに固定化した抗体の０．６２５～１０ｎＭ（連続２倍希釈）の濃度でのＣ１ｑへの結合を６０秒間決定した。抗原および抗体を６０秒間バッファー中で解離させた。センサーを、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．７中で４回、それぞれ５秒間リフレッシュした。サンプルプレートの振とう速度は１０００ｒｐｍであり、温度は３０℃であり、周波数は０．６Ｈｚであった。データを１：１モデルでフィッティングすることにより分析し、親和定数を得た。データ収集ソフトウェアはＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｄａｔａ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ７．０であり、データ分析ソフトウェアはＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ７．０であった。

【0176】

Ｃ１ｑのＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）、ＶＰ１０１（ｈＧ４ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）、ならびに対照抗体のニボルマブおよびベバシズマブに対する親和定数を表６および図２６～３０に示す。

【0177】

【表7】

【0178】

Ｎ／Ａは、抗体が抗原への結合を有さないか、または極めて弱い結合シグナルを有することを示し、したがって、結果は、分析されず、対応するデータは得られなかった。

【0179】

結果は、ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）が９．７６Ｅ－１０Ｍの親和定数でＣ１ｑに結合することができ；ベバシズマブが１．１４Ｅ－０９Ｍの親和定数でＣ１ｑに結合することができるが；ニボルマブ、ＶＰ１０１（ｈＧ４ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）がＣ１ｑへの結合を有さないか、または極めて低い結合シグナルを有し、したがって結果は分析されず、対応するデータは得られなかったことを示す。

【0180】

結果は、ニボルマブ、ＶＰ１０１（ｈＧ４ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）がＣ１ｑへ結合せず、ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）およびベバシズマブが類似の親和性でＣ１ｑへと結合することを示す。

【0181】

実施例８：ＰＤ－１抗原を発現するＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１細胞におけるＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）のＡＤＣＣ活性アッセイ
抗体ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）の細胞レベルでのＡＤＣＣ効果を検出するために、発明者らはＰＤ－１抗原を発現するＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１細胞を構築し、細胞学的レベルで抗体のＡＤＣＣ活性を検出するための正常ヒトＰＢＭＣおよび標的細胞の共培養の系を確立した。

【0182】

ＰＤ－１抗原を発現するＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１細胞におけるＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）のＡＤＣＣ活性を検出する方法を以下のとおり明示する：
この実験では、ヒトＰＤ－１過剰発現ベクターｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＰＤ１ＦＬ－Ｐｕｒｏ（Ｙｏｕｂｉｏから購入したｐＣＤＨ－ＣＭＶ－Ｐｕｒｏ）を最初に構築し、発現ベクターをウイルスにパッケージングし、次いでＣＨＯ－Ｋ１細胞に感染させ、薬剤耐性安定発現膜ＰＤ－１タンパク質のＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１安定細胞株を、ピューロマイシン（２μｇ／ｍＬ）による投薬およびスクリーニングの後、得た。正常ヒトＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ末梢血単核細胞単離装置に従って単離した。単離ＰＢＭＣを、１６４０完全培地に再懸濁し、トリパンブルーで染色し、細胞をカウントし、細胞の生存率を決定した。細胞を、飽和湿度のインキュベーター内で、３７℃および５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。翌日、ＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１細胞およびＰＢＭＣを回収し、遠心分離にかけ、上清を除去し、次いで細胞ペレットをＲＰＭＩ－１６４０（１％ＢＳＡを含有）（本明細書の以下で、アッセイ培地と称される）に再懸濁し、遠心分離にかけ、２回洗浄した；細胞をカウントし、細胞の生存率を決定し、細胞の濃度をアッセイ培地を使用することによって適正範囲に調節し、ＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１細胞懸濁液（３０，０００細胞／ウェル）を実験設計に従って９６ウェルプレートに加えた；５０μＬの抗体を加え、十分に混合し、室温で１時間プレインキュベートした：プレインキュベーション後、細胞にＰＢＭＣ（９００，０００／５０μＬ／ウェル）を加え、十分に混合し、インキュベーター内で、３７℃および５％ＣＯ_２で４時間インキュベートした。４時間後、９６ウェルプレートを取り出し、２５０×ｇで５分間遠心分離にかけ、１００μＬの細胞上清を注意深く新たな９６ウェル平底マイクロプレートに移した（細胞沈殿物をピペッティングしない）。１００μＬの新鮮な調製した反応溶液を、細胞傷害性検出キットの使用説明書に従って各ウェルに加えた。細胞を、暗所で、室温で３０分間インキュベートした。４９０ｎｍおよび６５０ｎｍのＯＤ値を測定し、ここで各群のＯＤ値＝ＯＤ_{４９０ｎｍ}－ＯＤ_{６５０ｎｍ}であった。ＡＤＣＣ活性を、式ＡＤＣＣ（％）＝（処理群－陰性対照群）／（標的細胞における最大ＬＤＨ放出－標的細胞における自発的ＬＤＨ放出）×１００％に従って、各群について算出した。

【0183】

ＰＤ－１抗原を発現するＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１細胞におけるＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）のＡＤＣＣ活性の検出結果は、ＡＤＣＣ％として表され、結果を図３１に示す。

【0184】

結果は、陽性対照１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（Ｇ１ＷＴ）がＰＢＭＣおよびＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１の混合培養系において有意なＡＤＣＣ活性を有し、ＡＤＣＣ系が正常であることを示す。アイソタイプ対照抗体ｈＩｇＧ１ＤＭと比較して、ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）は、有意なＡＤＣＣ活性を示し、用量依存性を示したが、ＶＰ１０１（Ｇ１ＤＭ）はＡＤＣＣ活性を示さなかった。結果は、ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）に基づく変異によって産生されたＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）が、細胞学的レベルでＡＤＣＣ活性を有さず、ＡＤＣＣ効果が除去されていることを示す。

【0185】

実施例９：ＰＤ－１抗原を発現するＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１細胞におけるＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）のＣＤＣ活性アッセイ
抗体ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）の細胞学的レベルでのＣＤＣ効果を検出するために、発明者らはＰＤ－１抗原を発現するＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１細胞を構築し（構築方法について実施例８を参照）、細胞学的レベルで抗体のＣＤＣ活性を検出するための標的細胞および正常ヒト補体血清の共培養の系を確立した。

【0186】

ＰＤ－１抗原を発現するＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１細胞におけるＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）のＣＤＣ活性を検出する方法を以下のとおり明示する：
検出の日に、ＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１細胞をトリプシン化によって回収し、１７０×ｇで５分間遠心分離にかけた；細胞ペレットをＲＰＭＩ－１６４０（１％ＢＳＡを含有）（本明細書の以下で、アッセイ培地と称される）に再懸濁し、繰り返し遠心分離にかけ、２回洗浄した；細胞をカウントし、細胞の生存率を決定し、細胞の濃度をアッセイ培地を使用することによって適正範囲に調節し、ＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１細胞懸濁液（３０，０００細胞／ウェル）を実験設計に従って９６ウェルプレートに加えた；５０μＬの抗体を加え、十分に混合し、室温で１０分間プレインキュベートした：プレインキュベーション後、細胞に５０μＬ／ウェルの正常ヒト補体血清（最終濃度：２％）を加え、十分に混合し、インキュベーター内で、３７℃および５％ＣＯ_２で４時間インキュベートした。４時間後、細胞を、２５０×ｇで５分間遠心分離にかけた；１００μＬの細胞上清を注意深く新たな９６ウェル平底プレートに移した（細胞沈殿物をピペッティングしない）。１００μＬの新鮮な調製した反応溶液を、細胞傷害性検出キットの使用説明書に従って各ウェルに加えた。細胞を、暗所で、室温で３０分間インキュベートした。４９０ｎｍおよび６５０ｎｍのＯＤ値を測定し、ここで各群のＯＤ値＝ＯＤ_{４９０ｎｍ}－ＯＤ_{６５０ｎｍ}であった。ＣＤＣ活性を、式ＣＤＣ（％）＝（処理群－陰性対照群）／（標的細胞における最大ＬＤＨ放出－標的細胞における自発的ＬＤＨ放出）×１００％に従って、各群について算出した。

【0187】

ＰＤ－１抗原を発現するＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１細胞におけるＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）のＣＤＣ活性の検出結果は、ＣＤＣ％として表され、結果を図３２に示す。

【0188】

結果は、陽性対照抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（Ｇ１ＷＴ）のＣＤＣ％は、正常ヒト補体血清およびＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１の混合培養系において、アイソタイプ対照抗体ｈＩｇＧ１ＤＭ群のものから有意差を有していたことを示し、ＣＤＣ検出系が正常であることを示す。同等の用量レベルで、アイソタイプ対照と比較して、ＶＰ１０１（ｈＧ１ＷＴ）およびＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）の両方についてＣＤＣ％に有意差はなかった。

【0189】

実施例１０：末梢血単核細胞およびＲａｊｉ－ＰＤＬ１細胞の混合培養系（ＭＬＲ）におけるＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）の薬力学的活性
この実験では、ヒトＰＤ－Ｌ１過剰発現ベクターｐｌｅｎｔｉ６．３－ＰＤ－Ｌ１－ＢＳＤ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入したｐｌｅｎｔｉ６．３－ＢＳＤ）を最初に構築し、発現ベクターをウイルスにパッケージングし、次いでＲａｊｉ細胞に感染させ、膜ＰＤ－Ｌ１タンパク質を安定に発現するためのＲａｊｉ－ＰＤＬ１安定細胞株を、ＢＳＤ（１０μｇ／ｍＬ）による投薬およびスクリーニングの後、得た。正常ヒトＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ末梢血単核細胞単離装置に従って単離し、単離ＰＢＭＣを、１６４０完全培地に再懸濁し、カウントし、凍結した。ＰＢＭＣを回復し、ＳＥＢ（黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢ）を加え、刺激して、２日間培養した。２日後、対数期のＲａｊｉ－ＰＤＬ１細胞を回収し、マイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ、操作濃度は２５μｇ／ｍＬであった）を加え、インキュベーター内で６０分間インキュベートし、マイトマイシンＣ処理Ｒａｊｉ－ＰＤＬ１細胞を遠心分離にかけ、洗浄した；ＳＥＢで２日間刺激されたＰＢＭＣを回収し、洗浄した；これらの細胞を混合し、抗体の存在または非存在の条件下で、１：１の細胞数の割合に従って培養した。３日後、細胞上清を遠心分離により回収し、上清中のＩＬ－２およびＩＦＮ－γ濃度をＥＬＩＳＡによって検出した。

【0190】

ＩＦＮ－γの分泌の結果を図３３に示す。結果は、ＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）が、ＩＦＮ－γの分泌を効果的に促進することができ、その活性はニボルマブの活性よりも有意に優れていることを示す。

【0191】

ＩＬ－２の分泌の結果を図３４に示す。結果は、ＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）が、用量依存的関係でＩＬ－２の分泌を効果的に促進することができ、その活性はニボルマブの活性よりも有意に優れていることを示す。

【0192】

実施例１１：ＰＤ－１陽性細胞におけるＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）の抗体依存性食作用活性なし
抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）は、細胞表面抗原に結合した抗体のＦｃ断片が、食作用的活性細胞（マクロファージなど）のＦｃ受容体に結合し、このようにして、抗体結合細胞の食作用を媒介することを意味する。ＰＤ－１抗体などの免疫チェックポイント抑制剤抗体について、ＡＤＣＰ活性の存在は、抗腫瘍死滅効果を発揮するＰＤ－１を発現する免疫細胞に対する損傷を引き起こし、それによってそれらの抗腫瘍活性に影響を及ぼす。

【0193】

この実験では、マウスマクロファージをエフェクター細胞として利用し、ＰＤ－１過剰発現ＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１細胞株（構築方法について実施例８を参照）を標的細胞として利用した。細胞によって媒介されるＡＤＣＰ効果を検出した。この実験では、フローサイトメトリーを適用して、ＰＤ－１を発現する細胞におけるＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）のＡＤＣＰ活性を検出し、結果は、ＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）がＡＤＣＰ活性を有していなかったが、同じ標的に対する市販の抗体のニボルマブは有意なＡＤＣＰ活性を有していたことを示す。その方法は、詳しくは以下のとおりである：
Ｃ５７マウス（Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒから購入）の大腿骨の骨髄を最初に無菌で回収し、氷上で５分間、赤血球溶解バッファーによって溶解した。溶解をＤＭＥＭ完全培地（１０％ＦＢＳを含有）で終了し、溶解物を１０００ｒｐｍで遠心分離にかけ、２回洗浄した。細胞ペレットを１０ｍＬのＤＭＥＭ完全培地に再懸濁し、Ｍ－ＣＳＦを１００ｎｇ／ｍＬの操作濃度で加えた。細胞を、誘導のために、細胞培養チャンバー内で、３７℃および５％ＣＯ_２で７日間培養した。培地の半分を交換し、Ｍ－ＣＳＦを３および５日目に加えた。細胞の誘導を７日目に終了した。細胞を０．２５％トリプシンで消化した。マクロファージを回収し、７５０×ｇで５分間遠心分離にかけた。上清を除去し、細胞をＤＭＥＭ完全培地（１０％ＦＢＳを含有）に再懸濁し、カウントした。細胞を適正密度に調整し、後の使用のために、９６ウェルのコニカル平底プレートに満たした。

【0194】

ＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１細胞を従来法によって回収し、１７０×ｇで５分間遠心分離にかけ、再懸濁し、カウントし、生存率を決定した。細胞をＰＢＳで１回洗浄した。カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）をＰＢＳで２．５μＭに希釈し、細胞を適切な量の希釈ＣＦＳＥで再懸濁し（染色密度：１０，０００，０００細胞／ｍＬ）、インキュベーター内で、２０分間インキュベートした。６ｍＬのＤＭＥＭ完全培地（１０％ＦＢＳを含有）を加え、染色を停止した。細胞を１７０×ｇで５分間遠心分離にかけ、上清を除去した；１ｍＬのＤＭＥＭ完全培地を加えた。細胞を、インキュベーター内で、１０分間インキュベートした。抗体を、ＤＭＥＭ完全培地で、２０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬおよび０．２μｇ／ｍＬ（操作濃度は１０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬおよび０．１μｇ／ｍＬであった）に希釈し、アイソタイプ対照抗体ｈＩｇＧ１ＤＭおよびｈＩｇＧ４を設計した。新鮮な誘導された成熟マクロファージを回収し、７５０×ｇで５分間遠心分離にかけ、上清を除去した；細胞をカウントし、９６ウェルのコニカル平底プレートに移し、１０００×ｇで５分間遠心分離にかけ、上清を除去した；ＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１－ＣＦＳＥの細胞密度を調整した；希釈された抗体および標的細胞を、実験設計に従い、マクロファージを含有する９６ウェルのコニカル平底プレートに５０μＬ：５０μＬの割合に従って混合した。細胞を、再懸濁し、十分に混合し、インキュベーター内で、３７℃で２時間インキュベートした。１５０μＬの正常温度の１％ＰＢＳＡを各ウェルに加え、１０００×ｇで５分間遠心分離にかけ、上清を除去した；細胞を２００μＬのＰＢＳＡで１回洗浄した；ＡＰＣ抗マウス／ヒトＣＤ１１ｂ抗体（ＰＢＳＡで５００倍希釈）を１００μＬ／サンプルで対応するサンプルに加え、十分に混合し、氷上で４０分間インキュベートした。１５０μＬの１％ＰＢＳＡを各ウェルに加え、１０００×ｇで５分間遠心分離にかけ、上清を除去した；各ウェルを２００μＬのＰＢＳＡで１回洗浄した。２００μＬの１％ＰＢＳＡを再懸濁のために各ウェルに加え、続いてＢｅｃｋｍａｎフローサイトメーターを使用して分析した。

【0195】

系中のマクロファージはＡＰＣ^＋陽性であり、食作用に関与するマクロファージはＡＰＣおよびＣＦＳＥ二重陽性であった。食作用率を、二重陽性細胞の数のＡＰＣ陽性細胞の数に対する比として決定し、抗体依存性ＡＤＣＰ活性を評価した。Ｐ％として表される各群のＡＤＣＰ活性を、以下の式に従って算出した：

【0196】

【数1】

【0197】

結果を図３５に示す。
結果は、ニボルマブがマクロファージ＋ＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１系において有意なＡＤＣＰ効果を有していたことを示す；ＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）の食作用率は、アイソタイプ対照抗体の食作用率と同等であり、ＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）がＡＤＣＰ効果を有していなかったことを示した。結果は、ＶＰ１０１（ｈＧ１ＤＭ）が良好な抗腫瘍効果を有する可能性があることを示す。

【0198】

本発明の特定の実施形態を詳細に記載したが、当業者は理解するであろう。様々な改変および置換を、開示されているすべての教示に従って詳細に行うことができ、これらの変更は、すべて本発明の保護範囲内である。本発明の完全な範囲は、添付の特許請求の範囲およびそれらの任意の等価物により提供される。
本開示は、例えば以下を提供する。
［項１］
ＰＤ－１を標的とする第１のタンパク質機能領域と、
ＶＥＧＦＡを標的とする第２のタンパク質機能領域
を含む二重特異性抗体であって；
前記第１のタンパク質機能領域が免疫グロブリンであり、前記第２のタンパク質機能領域が一本鎖抗体であるか；または前記第１のタンパク質機能領域が一本鎖抗体であり、前記第２のタンパク質機能領域が免疫グロブリンであり；
前記免疫グロブリンについて、重鎖可変領域が、配列番号２８～３０にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域が、配列番号３１～３３にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含み；前記一本鎖抗体について、重鎖可変領域が、配列番号３４～３６にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域が、配列番号３７～３９にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含み；
または、
前記免疫グロブリンについて、重鎖可変領域が、配列番号３４～３６にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域が、配列番号３７～３９にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含み；前記一本鎖抗体について、重鎖可変領域が、配列番号２８～３０にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域が、配列番号３１～３３にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含み；
前記免疫グロブリンがヒトＩｇＧ１サブタイプのものであり；
ＥＵ番号方式に従って、前記免疫グロブリンの重鎖定常領域が、２３４、２３５および２３７位のいずれか２または３つに変異を有し、前記二重特異性抗体のＦｃγＲＩＩＩａおよび／またはＣ１ｑに対する親和定数が、変異前の親和定数と比較して、変異後に低減されており；好ましくは、前記親和定数が、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムによって測定される、
二重特異性抗体。
［項２］
ＥＵ番号方式に従って、前記免疫グロブリンの前記重鎖定常領域が、以下の変異：
Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ；または
Ｌ２３４ＡおよびＧ２３７Ａ；または
Ｌ２３５ＡおよびＧ２３７Ａ；
または
Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＧ２３７Ａ
を有する、項１に記載の二重特異性抗体。
［項３］
ＰＤ－１を標的とする第１のタンパク質機能領域と、
ＶＥＧＦＡを標的とする第２のタンパク質機能領域
を含む二重特異性抗体であって；
前記第１のタンパク質機能領域が免疫グロブリンであり、前記第２のタンパク質機能領域が一本鎖抗体であるか；または前記第１のタンパク質機能領域が一本鎖抗体であり、前記第２のタンパク質機能領域が免疫グロブリンであり；
前記免疫グロブリンについて、重鎖可変領域が、配列番号２８～３０にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域が、配列番号３１～３３にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含み；前記一本鎖抗体について、重鎖可変領域が、配列番号３４～３６にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域が、配列番号３７～３９にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含み；
または、
前記免疫グロブリンについて、重鎖可変領域が、配列番号３４～３６にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域が、配列番号３７～３９にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含み；前記一本鎖抗体について、重鎖可変領域が、配列番号２８～３０にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域が、配列番号３１～３３にそれぞれ記載されたアミノ酸配列のＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含み；
前記免疫グロブリンがヒトＩｇＧ１サブタイプのものであり；
ＥＵ番号方式に従って、前記免疫グロブリンの重鎖定常領域が、以下の変異：
Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ；または
Ｌ２３４ＡおよびＧ２３７Ａ；または
Ｌ２３５ＡおよびＧ２３７Ａ；または
Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＧ２３７Ａ
を有する、
二重特異性抗体。
［項４］
ＥＵ番号方式に従って、前記免疫グロブリンの前記重鎖定常領域が、
Ｎ２９７Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｐ２３８Ｄ、Ｌ３２８Ｅ、Ｅ２３３Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、Ａ３３０Ｒ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｌ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｎ２９７Ｑ、Ｐ２３８Ｓ、Ｐ２３８Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ａ３２７Ｇ、Ｐ３２９Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｔ３９４Ｄ、Ｇ２３６Ｒ、Ｇ２３６Ａ、Ｌ３２８Ｒ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｅ３１８ＡおよびＫ３２０Ａ
から選択される１つまたは複数の変異を有する、項１～３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
［項５］
前記免疫グロブリンの前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号１に記載されており、前記免疫グロブリンの前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号３に記載されており；前記一本鎖抗体の前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号５および配列番号９から選択され、前記一本鎖抗体の前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号７、配列番号１１および配列番号１７から選択され；
または、
前記免疫グロブリンの前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号５および配列番号９から選択され、前記免疫グロブリンの前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号７、配列番号１１および配列番号１７から選択され；前記一本鎖抗体の前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号１に記載されており、前記一本鎖抗体の前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号３に記載されている、
項１～４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
［項６］
前記二重特異性抗体が、以下の（１）～（１２）：
（１）前記免疫グロブリンの前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号１に記載されており、前記免疫グロブリンの前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号３に記載されており；前記一本鎖抗体の前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号５に記載されており、前記一本鎖抗体の前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号７に記載されている；
（２）前記免疫グロブリンの前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号１に記載されており、前記免疫グロブリンの前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号３に記載されており；前記一本鎖抗体の前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号５に記載されており、前記一本鎖抗体の前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号１１に記載されている；
（３）前記免疫グロブリンの前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号１に記載
されており、前記免疫グロブリンの前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号３に記載されており；前記一本鎖抗体の前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号５に記載されており、前記一本鎖抗体の前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号１７に記載されている；
（４）前記免疫グロブリンの前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号１に記載されており、前記免疫グロブリンの前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号３に記載されており；前記一本鎖抗体の前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号９に記載されており、前記一本鎖抗体の前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号７に記載されている；
（５）前記免疫グロブリンの前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号１に記載されており、前記免疫グロブリンの前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号３に記載されており；前記一本鎖抗体の前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号９に記載されており、前記一本鎖抗体の前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号１１に記載されている；
（６）前記免疫グロブリンの前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号１に記載されており、前記免疫グロブリンの前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号３に記載されており；前記一本鎖抗体の前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号９に記載されており、前記一本鎖抗体の前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号１７に記載されている；
（７）前記免疫グロブリンの前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号５に記載されており、前記免疫グロブリンの前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号７に記載されており；前記一本鎖抗体の前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号１に記載されており、前記一本鎖抗体の前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号３に記載されている；
（８）前記免疫グロブリンの前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号５に記載されており、前記免疫グロブリンの前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号１１に記載されており；前記一本鎖抗体の前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号１に記載されており、前記一本鎖抗体の前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号３に記載されている；
（９）前記免疫グロブリンの前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号５に記載されており、前記免疫グロブリンの前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号１７に記載されており；前記一本鎖抗体の前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号１に記載されており、前記一本鎖抗体の前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号３に記載されている；
（１０）前記免疫グロブリンの前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号９に記載されており、前記免疫グロブリンの前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号７に記載されており；前記一本鎖抗体の前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号１に記載されており、前記一本鎖抗体の前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号３に記載されている；
（１１）前記免疫グロブリンの前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号９に記載されており、前記免疫グロブリンの前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号１１に記載されており；前記一本鎖抗体の前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号１に記載されており、前記一本鎖抗体の前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号３に記載されている；および
（１２）前記免疫グロブリンの前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号９に記載されており、前記免疫グロブリンの前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号１７に記載されており；前記一本鎖抗体の前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号１に記載されており、前記一本鎖抗体の前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号３に記載されている
のいずれか１つから選択される、項１～５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
［項７］
前記免疫グロブリンの前記重鎖の前記アミノ酸配列が配列番号２４に記載されており、前記免疫グロブリンの前記軽鎖の前記アミノ酸配列が配列番号２６に記載されている、項１～６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
［項８］
前記免疫グロブリンまたはその抗原結合断片が、約１０^－６Ｍ未満、例えば約１０^－７Ｍ、１０^－８Ｍ未満または１０^－９Ｍ以下の親和定数でＦｃγＲＩに結合し；好ましくは、前記親和定数が、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムによって測定される、
項１～７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
［項９］
前記免疫グロブリンまたはその前記抗原結合断片が、約１０^－９Ｍ未満、例えば約１０^－７Ｍ、１０^－８Ｍ未満または１０^－９Ｍ以下の親和定数でＣ１ｑに結合し；好ましくは、前記親和定数が、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムによって測定される、
項１～８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
［項１０］
前記第１のタンパク質機能領域が、直接的に、またはリンカー断片によって、前記第２のタンパク質機能領域に連結されているか；および／または前記一本鎖抗体の前記重鎖可変領域が、直接的に、またはリンカー断片によって、前記一本鎖抗体の前記軽鎖可変領域に連結されている、項１～９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
［項１１］
前記リンカー断片が（ＧＧＧＧＳ）ｎであり、ｎが正の整数である；好ましくは、ｎが１、２、３、４、５、または６である、項１０に記載の二重特異性抗体。
［項１２］
前記第１のタンパク質機能領域および第２のタンパク質機能領域の数が、それぞれ独立して、１、２またはそれ以上である、項１～１１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
［項１３］
前記一本鎖抗体が、前記免疫グロブリンの前記重鎖のＣ末端に連結されている、項１～１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
［項１４］
ＰＤ－１を標的とする第１のタンパク質機能領域と、
ＶＥＧＦＡを標的とする第２のタンパク質機能領域
を含む二重特異性抗体であって；
前記第１のタンパク質機能領域の数が１であり、前記第２のタンパク質機能領域の数が２であり；
前記第１のタンパク質機能領域が免疫グロブリンであり、前記第２のタンパク質機能領域が一本鎖抗体であり；
前記免疫グロブリンの重鎖のアミノ酸配列が配列番号２４に記載されており、前記免疫グロブリンの軽鎖のアミノ酸配列が配列番号２６に記載されており；
前記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号９に記載されており、前記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１７に記載されており；
前記一本鎖抗体が前記免疫グロブリンの前記重鎖のＣ末端に連結されており；
前記第１のタンパク質機能領域が、第１のリンカー断片によって、前記第２のタンパク質機能領域に連結されており；前記一本鎖抗体の前記重鎖可変領域が、第２のリンカー断片によって、前記一本鎖抗体の前記軽鎖可変領域に連結されており；前記第１のリンカー断片および前記第２のリンカー断片が同一または異なり；
好ましくは、前記第１のリンカー断片および第２のリンカー断片のアミノ酸配列が、独立して、配列番号１８および配列番号１９から選択され；
好ましくは、前記第１のリンカー断片および第２のリンカー断片の前記のアミノ酸配列が、配列番号１８に記載されている、
二重特異性抗体。
［項１５］
項１～１４のいずれか１項に記載の前記二重特異性抗体をコードする、単離された核酸分子。
［項１６］
項１５に記載の前記単離された核酸分子を含む、ベクター。
［項１７］
項１５に記載の前記単離された核酸分子または項１６に記載の前記ベクターを含む、宿主細胞。
［項１８］
抗体またはその抗原結合断片と複合部分を含む複合体であって、免疫グロブリンが項１～１４のいずれか１項に記載の前記二重特異性抗体であり、前記複合部分が検出可能な標識であり；好ましくは、前記複合部分が放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、発色物質または酵素である、複合体。
［項１９］
項１～１４のいずれか１項に記載の前記二重特異性抗体、または項１８に記載の前記複合体を含む、キットであって；
好ましくは、前記キットが、前記免疫グロブリンまたはその抗原結合断片を特異的に認識することが可能な二次抗体をさらに含み；任意選択で、前記二次抗体が、検出可能な標識、例えば、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、発色物質または酵素をさらに含む、キット。
［項２０］
サンプル中のＰＤ－１および／またはＶＥＧＦＡの存在またはレベルを検出するためのキットの調製における、項１～１４のいずれか１項に記載の前記二重特異性抗体、または項１８に記載の前記複合体の使用。
［項２１］
項１～１４のいずれか１項に記載の前記二重特異性抗体、または項１８に記載の前記複合体を含む医薬組成物であって、任意選択で、前記医薬組成物が、薬学的に許容されるベクターおよび／または賦形剤をさらに含む、医薬組成物。
［項２２］
悪性腫瘍を治療および／または予防するための医薬の調製における、項１～１４のいずれか１項に記載の前記二重特異性抗体、または項１８に記載の前記複合体の使用であって；好ましくは、前記悪性腫瘍が結腸がん、直腸がん、肺がん、肝臓がん、卵巣がん、皮膚がん、神経膠腫、黒色腫、リンパ腫、腎腫瘍、前立腺がん、膀胱がん、消化器がん、乳がん、脳腫瘍、子宮頸がん、食道がん、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）およびミスマッチ修復の欠損（ｄＭＭＲ）のがん、尿路上皮がん、中皮腫、子宮内膜がん、胃腺癌、食道胃接合部腺癌ならびに白血病から選択され；
好ましくは、前記肺がんが非小細胞肺がんまたは小細胞肺がんであり；好ましくは、前記非小細胞肺がんがＥＧＦＲおよび／またはＡＬＫ感受性変異型非小細胞肺がんであり；
好ましくは、前記肝臓がんが肝細胞がんであり；
好ましくは、前記腎腫瘍が腎細胞がんであり；
好ましくは、前記乳がんがトリプルネガティブ乳がんであり；
好ましくは、前記尿路上皮がんが膀胱がんである、
使用。
［項２３］
有効量の項１～１４のいずれか１項に記載の前記二重特異性抗体、または項１８に記載の前記複合体をそれを必要とする対象に投与するステップを含む、悪性腫瘍を治療および／または予防する方法であって；好ましくは、前記悪性腫瘍が結腸がん、直腸がん、肺がん、肝臓がん、卵巣がん、皮膚がん、神経膠腫、黒色腫、リンパ腫、腎腫瘍、前立腺がん、膀胱がん、消化器がん、乳がん、脳腫瘍、子宮頸がん、食道がん、高頻度マイ
クロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）およびミスマッチ修復の欠損（ｄＭＭＲ）のがん、尿路上皮がん、中皮腫、子宮内膜がん、胃腺がん、食道胃接合部腺癌ならびに白血病から選択され；
好ましくは、前記肺がんが非小細胞肺がんまたは小細胞肺がんであり；好ましくは、前記非小細胞肺がんがＥＧＦＲおよび／またはＡＬＫ感受性変異型非小細胞肺がんであり；
好ましくは、前記肝臓がんが肝細胞がんであり；
好ましくは、前記腎腫瘍が腎細胞がんであり；
好ましくは、前記乳がんがトリプルネガティブ乳がんであり；
好ましくは、前記尿路上皮がんが膀胱がんである、
方法。
［項２４］
悪性腫瘍の治療および／または予防において使用するための、項１～１４のいずれか１項に記載の前記二重特異性抗体であって；好ましくは、前記悪性腫瘍が結腸がん、直腸がん、肺がん、肝臓がん、卵巣がん、皮膚がん、神経膠腫、黒色腫、リンパ腫、腎腫瘍、前立腺がん、膀胱がん、消化器がん、乳がん、脳腫瘍、子宮頸がん、食道がん、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）およびミスマッチ修復の欠損（ｄＭＭＲ）のがん、尿路上皮がん、中皮腫、子宮内膜がん、胃腺癌、食道胃接合部腺癌ならびに白血病から選択され；
好ましくは、前記肺がんが非小細胞肺がんまたは小細胞肺がんであり；好ましくは、前記非小細胞肺がんがＥＧＦＲおよび／またはＡＬＫ感受性変異型非小細胞肺がんであり；
好ましくは、前記肝臓がんが肝細胞がんであり；
好ましくは、前記腎腫瘍が腎細胞がんであり；
好ましくは、前記乳がんがトリプルネガティブ乳がんであり；
好ましくは、前記尿路上皮がんが膀胱がんである、
二重特異性抗体。
［項２５］
悪性腫瘍の治療および／または予防において使用するための、項１８に記載の前記複合体であって；好ましくは、前記悪性腫瘍が結腸がん、直腸がん、肺がん、肝臓がん、卵巣がん、皮膚がん、神経膠腫、黒色腫、リンパ腫、腎腫瘍、前立腺がん、膀胱がん、消化器がん、乳がん、脳腫瘍、子宮頸がん、食道がん、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）およびミスマッチ修復の欠損（ｄＭＭＲ）のがん、尿路上皮がん、中皮腫、子宮内膜がん、胃腺癌、食道胃接合部腺癌ならびに白血病から選択され；
好ましくは、前記肺がんが非小細胞肺がんまたは小細胞肺がんであり；好ましくは、前記非小細胞肺がんがＥＧＦＲおよび／またはＡＬＫ感受性変異型非小細胞肺がんであり；
好ましくは、前記肝臓がんが肝細胞がんであり；
好ましくは、前記腎腫瘍が腎細胞がんであり；
好ましくは、前記乳がんがトリプルネガティブ乳がんであり；
好ましくは、前記尿路上皮がんが膀胱がんである、
複合体。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【配列表】

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