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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-04-08
(45)【発行日】2025-04-16
(54)【発明の名称】細胞透過性ペプチド
(51)【国際特許分類】
C07K 7/08 20060101AFI20250409BHJP
C07K 7/06 20060101ALI20250409BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20250409BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20250409BHJP
A61K 47/65 20170101ALI20250409BHJP
A61P 21/04 20060101ALI20250409BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20250409BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20250409BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20250409BHJP
A61K 38/12 20060101ALI20250409BHJP
A61K 38/02 20060101ALI20250409BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20250409BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20250409BHJP
【ＦＩ】
C07K7/08 ZNA
C07K7/06
C12N15/113 Z
A61K45/00
A61K47/65
A61P21/04
A61P21/00
A61P43/00 105
A61K48/00
A61K38/12
A61K38/02
A61K31/7088
A61K31/7105
【請求項の数】
18
(21)【出願番号】P 2021506986
(86)(22)【出願日】2019-08-09
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-12-09
(86)【国際出願番号】 GB2019052247
(87)【国際公開番号】W WO2020030927
(87)【国際公開日】2020-02-13
【審査請求日】2022-08-05
(31)【優先権主張番号】1812972.6
(32)【優先日】2018-08-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(73)【特許権者】
【識別番号】516245900
【氏名又は名称】オックスフォード ユニバーシティ イノベーション リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＯＸＦＯＲＤ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＩＮＮＯＶＡＴＩＯＮ ＬＩＭＩＴＥＤ
(73)【特許権者】
【識別番号】518160355
【氏名又は名称】ユナイテッド キングダム リサーチ アンド イノベーション
(74)【代理人】
【識別番号】100083389
【弁理士】
【氏名又は名称】竹ノ内 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100198317
【弁理士】
【氏名又は名称】横堀 芳徳
(72)【発明者】
【氏名】マシュー ウッド
(72)【発明者】
【氏名】ラケル マンサノ
(72)【発明者】
【氏名】キャロライン ゴドフリー
(72)【発明者】
【氏名】グラハム マクローリー
(72)【発明者】
【氏名】リチャード ラズ
(72)【発明者】
【氏名】マイケル ゲート
(72)【発明者】
【氏名】アンドレー アルズマノフ
(72)【発明者】
【氏名】リズ オドノヴァン
(72)【発明者】
【氏名】ガレス ヘイゼル
(72)【発明者】
【氏名】アシュリング ホーランド
(72)【発明者】
【氏名】ミゲル ヴァレラ
【審査官】田中 晴絵
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１３／０３０５６９（ＷＯ，Ａ２）
【文献】国際公開第２０１５／０２２５０４（ＷＯ，Ａ２）
【文献】特表２０１１－５２３５５７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５３１９８８（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
式［カチオン性ドメイン］－［疎水性ドメイン］－［カチオン性ドメイン］
［ここで、カチオン性ドメインは、ＲＢＲＲＢＲＲ（配列番号１）、ＲＢＲＢＲ（配列番号２）、ＲＢＲＲ（配列番号３）、ＲＢＲＲＢＲ（配列番号４）、ＲＲＢＲＢＲ（配列番号５）、ＲＢＲＲＢ（配列番号６）、ＢＲＢＲ（配列番号７）、ＲＢＨＢＨ（配列番号８）、ＨＢＨＢＲ（配列番号９）、ＲＢＲＨＢＨＲ（配列番号１０）、ＲＢＲＢＢＨＲ（配列番号１１）、ＲＢＲＲＢＨ（配列番号１２）、ＨＢＲＲＢＲ（配列番号１３）、ＨＢＨＢＨ（配列番号１４）、ＢＨＢＨ（配列番号１５）、ＢＲＢＳＢ（配列番号１６）、ＢＲＢ［Ｈｙｐ］Ｂ（配列番号１７）、Ｒ［Ｈｙｐ］Ｈ［Ｈｙｐ］ＨＢ（配列番号１８）、Ｒ［Ｈｙｐ］ＲＲ［Ｈｙｐ］Ｒ（配列番号１９）（ここで、Ｂはβ-アラニンであり、［Ｈｙｐ］はヒドロキシプロリンである）から選ばれるアミノ酸配列からなり；及び疎水性ドメインは、ＹＱＦＬＩ（配列番号２０）、ＦＱＩＬＹ（配列番号２１）、ＩＬＦＱＹ（配列番号２２）、ＦＱＩＹ（配列番号２３）、ＷＷＷ,ＷＷＰＷＷ（配列番号２４）、ＷＰＷＷ（配列番号２５）、ＷＷＰＷ（配列番号２６）から選ばれるアミノ酸配列からなる］で表される、細胞透過性ペプチド。
【請求項2】
細胞透過性ペプチドがＮ末端でＮ－アセチル化されている、請求項１に記載の細胞透過性ペプチド。
【請求項3】
配列：ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＲＢＲＢＲ（配列番号２７）、ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＲＢＲＢＲ（配列番号２９）、ＲＢＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＲＲＢＲＲ（配列番号３０）、ＲＢＲＲＢＲＲＹＱＦＬＩＲＢＲＢＲ（配列番号３１）、ＲＢＲＲＢＲＲＩＬＦＱＹＲＢＲＢＲ（配列番号３２）、ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＲＢＲ（配列番号３３）、ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）、ＲＢＲＲＢＦＱＩＬＹＲＢＲＢＲ（配列番号３６）、ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号３７）、ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＨＢＨＢＲ（配列番号３８）、ＲＢＲＲＢＲＲＹＱＦＬＩＲＢＨＢＨ（配列番号４０）、ＲＢＲＲＢＲＲＩＬＦＱＹＲＢＨＢＨ（配列番号４１）、ＲＢＲＨＢＨＲＦＱＩＬＹＲＢＲＢＲ（配列番号４２）、ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）、ＲＢＲＲＢＲＷＷＷＢＲＢＲ（配列番号１０４）、及びＲＢＲＲＢＲＷＷＰＷＷＢＲＢＲ（配列番号１０５）の１つからなる、請求項１又は２に記載の細胞透過性ペプチド。
【請求項4】
配列ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＲＢＲＢＲ（配列番号２７）からなる請求項１～３のいずれかに記載の細胞透過性ペプチド。
【請求項5】
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）からなる請求項１～３のいずれかに記載の細胞透過性ペプチド。
【請求項6】
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）からなる請求項１～３のいずれかに記載の細胞透過性ペプチド。
【請求項7】
アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合されている請求項１～６のいずれかに記載の細胞透過性のペプチドを含んでなる、コンジュゲート。
【請求項8】
さらにリンカーを含み、前記リンカーが細胞透過性ペプチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドに連結する、請求項７に記載のコンジュゲート。
【請求項9】
リンカーがＧ、ＢＣ、ＸＣ、Ｃ、ＧＧＣ、ＢＢＣ、ＢＸＣ、ＸＢＣ、Ｘ、ＸＸ、Ｂ、ＢＢ、ＢＸ及びＸＢから選択される、請求項８に記載のコンジュゲート。
【請求項10】
医薬としての使用のための請求項７～９のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項11】
筋神経系又は筋骨格系の疾患、筋神経系又は筋骨格系の遺伝疾患、筋神経系又は筋骨格系の遺伝性遺伝疾患、又は筋神経系又は筋骨格系の遺伝性Ｘ連鎖遺伝疾患の治療における医薬としての使用のための請求項１０に記載のコンジュゲート。
【請求項12】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療における医薬としての使用のための請求１０又は１１に記載のコンジュゲート。
【請求項13】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ジストロフィン遺伝子におけるエクソンスキッピングを誘導するための配列からなるものである、請求項１０に記載のコンジュゲート。
【請求項14】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ジストロフィン遺伝子の単一エクソンのエクソンスキッピングを誘導するための配列からなるものである、請求項１０に記載のコンジュゲート。
【請求項15】
エクソンがジストロフィン遺伝子のエクソン４５、５１、又は５３である、請求項１３又は１４に記載のコンジュゲート。
【請求項16】
アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合された細胞透過性ペプチドを含んでなるコンジュゲートであって、前記細胞透過性ペプチドが、配列：ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＲＢＲＢＲ（配列番号２７）、ＲＢＲＲＢＲＲＹＱＦＬＩＲＢＲＢＲ（配列番号３１）、ＲＢＲＲＢＲＲＩＬＦＱＹＲＢＲＢＲ（配列番号３２）、ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）、ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号３７）、ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＨＢＨＢＲ（配列番号３８）、ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）の１つからなり、前記コンジュゲートは、筋神経系又は筋骨格系の疾患、筋神経系又は筋骨格系の遺伝疾患、筋神経系又は筋骨格系の遺伝性遺伝疾患、又は筋神経系又は筋骨格系の遺伝性Ｘ連鎖遺伝疾患の治療における使用のためのものである、コンジュゲート。
【請求項17】
さらにリンカーを含み、前記リンカーが細胞透過性ペプチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドに連結する、請求項１６に記載のコンジュゲート。
【請求項18】
疾患がデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である、請求項１６又は１７に記載のコンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ペプチド、特に細胞透過性ペプチド、およびそのような細胞透過性ペプチドと治療用分子とのコンジュゲートに関する。本発明は、さらに、処置方法における、または医薬としての、とりわけ遺伝障害、特に筋ジストロフィー、例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィーの処置における、そのようなペプチドまたはコンジュゲートの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
核酸薬は、ヒトにおける医療を変容させる可能性を秘めたゲノム薬である。研究からは、そのような治療薬が神経筋疾患を含む広範囲の疾患領域にわたり適用され得ることが示唆されている。プレｍＲＮＡスプライシングをモジュレートするアンチセンスオリゴヌクレオチドベースの方法が神経筋疾患であるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）に適用されるようになり、この単一遺伝子障害はプレシジョン・メディシンの最先端に置かれている。
【0003】
しかし、これらの有望なアンチセンス治療薬の治療上の開発は、不十分な細胞透過度と不十分な分布特性が原因で妨げられてきた。この課題は、ＤＭＤでは、筋組織基質が大量であることと、その分散特性とによりさらに重要視されている。
【0004】
ＤＭＤは、３５００人に１人の新生男児が罹患している。この重篤なＸ連鎖劣性疾患は、ジストロフィンタンパク質をコードするＤＭＤ遺伝子内の変異によってもたらされる。この障害は、呼吸不全と心臓の合併症の出現を伴った進行性の筋肉変性および萎縮を特徴としており、最終的には早死につながる。ＤＭＤの根底にある変異の大部分は、オープンリーディングフレーム内の早期トランケーションを誘発するゲノムのアウトオブフレーム欠失であり、これがジストロフィンタンパク質を欠乏させる。
【0005】
エクソンスキッピング療法は、スプライススイッチングアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）を利用してＤＭＤ転写物の特定領域を標的とし、個々のエクソンの排除を誘導し、異常リーディングフレームを回復させ、内部的に欠失されているが部分的には機能するジストロフィンタンパク質の生成をもたらす。ＤＭＤに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドエクソンスキッピング療法の可能性は疑う余地がないにもかかわらず、このアプローチの適用の成功は、現在のところ、骨格筋のターゲッティングが比較的非効率であること、ならびに、心臓などの他の罹患組織への一本鎖オリゴヌクレオチドの標的化が不十分であることによって制限されている。
【0006】
２０１６年９月に、食品医薬品局（ＦＤＡ）は、エクソン５１のスプライシングをモジュレートするための一本鎖オリゴヌクレオチドである「ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎ」を早期承認した。これは、米国においてスプライシングをモジュレートする最初に承認されたオリゴヌクレオチドの先駆けとなったが、ジストロフィンの回復レベルは、正常なジストロフィンレベルのわずか約１％であり、期待外れであった。対立遺伝子障害のベッカー型筋ジストロフィーとの比較と、ｍｄｘマウスにおける実験からは、運動による損傷から筋肉を保護するためには、少なくとも約１５％の野性型の均一な筋線維鞘ジストロフィン発現が必要であることが示唆されている。
【0007】
したがって、ＤＭＤなどの深刻な遺伝疾患に対してより有効な治療法を提供するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドの送達を改良することが早急に強く求められている。
【0008】
送達ビヒクルとしてウイルスを使用することが示唆されているが、しかしながら、それらの使用は、ウイルスコートタンパク質の免疫毒性と発がん性作用により制限されている。代替として、様々な非ウイルス送達ベクターが開発されており、そのうちペプチドは、それらのサイズが小さく、大きなバイオカーゴの経毛細管性送達の標的特異性および能力から最も有望であることが明らかとなっている。いくつかのペプチドは、単独で、またはバイオカーゴ担持状態で細胞に透過するそれらの能力が報告されている。
【0009】
数年にわたり、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）がＳＳＯ（特に電荷中性ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）およびペプチド核酸（ＰＮＡ））にコンジュゲートされてきており、そのようなオリゴヌクレオチド類似体の細胞送達が、細胞膜を通過し細胞核内のプレｍＲＮＡ標的部位に到達するようそれらを効果的に運ぶことにより強化されてきた。ある特定のアルギニンリッチＣＰＰ（Ｐ－ＰＭＯまたはペプチド－ＰＭＯとしても公知である）にコンジュゲートされているＰＭＯ治療薬は、ＤＭＤのｍｄｘマウスモデルにおいて、全身投与後に骨格筋でのジストロフィン生成を増強できることが示されている。
【0010】
特に、ＰＮＡ／ＰＭＯ内部移行ペプチド（Ｐｉｐ）が既に開発されており、これは中央の短い疎水性配列によって分けられた２つのアルギニンリッチ配列から構成されているアルギニンリッチＣＰＰである。これらの「Ｐｉｐ」ペプチドは、最初にＰＮＡカーゴに結合させることによって、高レベルのエクソンスキッピングを維持しながら血清の安定性を改良するように設計された。これらのペプチドのさらなる誘導体がＰＭＯのコンジュゲートとして設計されたが、これらの誘導体は、マウスへの全身投与後に、全身に及ぶ骨格筋ジストロフィン産生をもたらし、また重要なことには、これには心臓も含まれることが明らかにされた。しかしこれらのペプチドが有効であるにもかかわらず、これらの治療への適用は、それらに関連する毒性によって妨げられてきた。
【0011】
Ｒ６Ｇｌｙなどの単一アルギニンリッチドメインを有する代替の細胞透過性ペプチドも生産されている。これらのＣＰＰは、毒性が低いペプチドコンジュゲートの生成に使用されてきたが、これらのコンジュゲートはＰｉｐペプチドと比較して低い有効性を示した。
【0012】
したがって、現在利用可能なＣＰＰは、ＤＭＤなどの疾患のヒト処置における使用に適していることは未だ示されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
細胞透過性ペプチド技術の分野における課題は、有効性と毒性を切り離すことであった。本発明者らは、今回、少なくともこの問題に対処する、本発明に記載の特定の構造を有するいくつかの改良型ＣＰＰを同定し、合成し、試験した。
【0014】
これらのペプチドを、カーゴ治療分子を使用し、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで試験した場合、骨格筋において良好なレベルの有効性を維持する。さらに、これらのペプチドは、既に利用可能なＣＰＰと比較して、同じコンジュゲートで使用した場合、有効性の改善が実証された。同時に、これらのペプチドは、全身注射後にｉｎ ｖｉｖｏで有効に作用し、臨床徴候が軽減し、生化学的マーカーの測定を通じて観察した場合に毒性が低下する。重要なことには、本ペプチドは、以前のＣＰＰと比較した場合、マウスへの同様の全身注射後に、毒性が驚くほど減少することが実証された。したがって、本発明のペプチドは、既に利用可能なペプチドよりも、ヒトに対する治療薬として使用するための適合性の改善を提示し、ヒト対象における安全で有効な処置のための治療用コンジュゲートで使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【0015】
本発明の第１の態様によれば、
少なくとも４アミノ酸残基をそれぞれ含む２つ以上のカチオン性ドメインと、
少なくとも３アミノ酸残基をそれぞれ含む１つまたは複数の疎水性ドメイン
を含む、４０アミノ酸残基以下の全長を有するペプチドであって、
人工アミノ酸残基を含まないペプチドが提供される。
少なくとも４アミノ酸残基をそれぞれ含む２つ以上のカチオン性ドメインと、
少なくとも３アミノ酸残基をそれぞれ含む１つまたは複数の疎水性ドメイン
を含む、４０アミノ酸残基以下の全長を有するペプチドであって、
人工アミノ酸残基を含まないペプチドが提供される。
【0016】
本発明の第２の態様によれば、治療用分子に共有結合されている第１の態様のペプチドを含むコンジュゲートが提供される。
【0017】
本発明の第３の態様によれば、イメージング分子に共有結合されている第１の態様のペプチドを含むコンジュゲートが提供される。
【0018】
本発明の第４の態様によれば、第２の態様のコンジュゲートを含む医薬組成物が提供される。
【0019】
本発明の第５の態様によれば、医薬としての使用のための、第２の態様に記載のコンジュゲートが提供される。
【0020】
第５の態様の一実施形態では、医薬としての使用のための、第４の態様に記載の医薬組成物が提供される。
【0021】
本発明の第６の態様によれば、第２の態様のコンジュゲートを対象に治療有効量で投与することを含む、対象の疾患を処置する方法が提供される。
【0022】
第６の態様の一実施形態では、第４の態様に記載の医薬組成物を対象に治療有効量で投与することを含む、対象の疾患を処置する方法が提供される。
【0023】
本発明の第７の態様によれば、第１の態様のペプチドまたは第２の態様のコンジュゲートまたは第３の態様のコンジュゲートをコードする単離された核酸が提供される。
【0024】
本発明の第８の態様によれば、第７の態様の核酸配列を含む発現ベクターが提供される。
【0025】
本発明の第９の態様によれば、第８の態様の発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図1】Ｈ２Ｋ－ｍｄｘ細胞においてネステッドＲＴ－ＰＣＲのデンシトメトリー分析により測定された、アンチセンス療法用ＰＭＯにコンジュゲートしたＤＰＥＰ１系の一部のペプチドの０．２５μＭ、０．５μＭおよび１μＭでの、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの第２３番エクソンスキッピングの有効性を示す（エラーバー：標準偏差、ｎ≧３）。
【図2】Ｈ２Ｋ－ｍｄｘ細胞においてネステッドＲＴ－ＰＣＲのデンシトメトリー分析により測定された、アンチセンス療法用ＰＭＯにコンジュゲートしたＤＰＥＰ３系の一部のペプチドの０．２５μＭ、０．５μＭおよび１μＭでの、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの第２３番エクソンスキッピングの有効性を示す（エラーバー：標準偏差、ｎ≧３）。
【図3】アンチセンス療法用ＰＭＯにコンジュゲートしたＤＰＥＰ１系の一部のペプチドについての、ｍｄｘマウスへの単一１０ｍｇ／ｋｇ静脈内用量の後に（Ａ）前脛骨筋、（Ｂ）横隔膜および（Ｃ）心筋におけるウェスタンブロットおよびｑＲＴ－ＰＣＲにより測定されたｉｎ ｖｉｖｏでの有効性を示す（エラーバー：標準偏差、ｎ＝３）。
【図4】アンチセンス療法用ＰＭＯにコンジュゲートしたＤＰＥＰ３系の一部のペプチドについての、ｍｄｘマウスへの単一１０ｍｇ／ｋｇ静脈内用量の後に（Ａ）前脛骨筋、（Ｂ）横隔膜および（Ｃ）心筋におけるウェスタンブロットおよびｑＲＴ－ＰＣＲにより測定されたｉｎ ｖｉｖｏでの有効性を示す（エラーバー：標準偏差、ｎ＝３）。
【図5】アンチセンス療法用ＰＭＯにコンジュゲートした様々なＤＰＥＰペプチドの３０ｍｇ／ｋｇの単一用量を投与した２日および７日後にＣ５７ＢＬ／６マウスの尿中で測定された、同じアンチセンス療法用ＰＭＯにコンジュゲートした現在利用可能なペプチド担体、および食塩水との比較での、相対ＫＩＭ－１レベルを示す（エラーバー：標準偏差、ｎ＝６）。
【図6】アンチセンス療法用ＰＭＯにコンジュゲートした様々なＤＰＥＰペプチドの３０ｍｇ／ｋｇの単一用量を投与した２日および７日後にＣ５７ＢＬ／６マウスの尿中で測定された、同じアンチセンス療法用ＰＭＯにコンジュゲートした現在利用可能なペプチド担体、および食塩水との比較での、相対ＮＧＡＬレベルを示す（エラーバー：標準偏差、ｎ＝６）。
【図7】アンチセンス療法用ＰＭＯにコンジュゲートした様々なＤＰＥＰペプチドの３０ｍｇ／ｋｇの単一用量を投与した７日後にＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて測定された血清中ＢＵＮレベルを、同じアンチセンス療法用ＰＭＯにコンジュゲートした現在利用可能なペプチド担体、および食塩水と比較して示す（エラーバー：標準偏差、ｎ＝６）。
【図8】アンチセンス療法用ＰＭＯにコンジュゲートした様々なＤＰＥＰペプチドの３０ｍｇ／ｋｇの単一用量を投与した７日後にＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて測定された血清中クレアチニンレベルを、同じアンチセンス療法用ＰＭＯにコンジュゲートした現在利用可能なペプチド担体、および食塩水と比較して示す（エラーバー：標準偏差、ｎ＝６）。
【図9】アンチセンス療法用ＰＭＯにコンジュゲートした様々なＤＰＥＰペプチドの３０ｍｇ／ｋｇの単一用量を投与した７日後にＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて測定された（Ａ）アラニントランスフェラーゼ、（Ｂ）アルカリホスファターゼおよび（Ｃ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ血清レベルを、同じアンチセンス療法用ＰＭＯにコンジュゲートした現在利用可能なペプチド担体、および食塩水と比較して示す（エラーバー：標準偏差、ｎ＝６）。
【図10】アンチセンス療法用ＰＭＯにコンジュゲートした様々なＤＰＥＰペプチドの単一３０ｍｇ／ｋｇ静脈内投与後にＣ５７ＢＬ／６マウスの（Ａ）前脛骨筋、（Ｂ）横隔膜および（Ｃ）心臓においてｑＲＴ－ＰＣＲにより評定された第２３番エクソンスキッピングのｉｎ ｖｉｖｏでの有効性を、同じアンチセンス療法用ＰＭＯにコンジュゲートした現在利用可能なペプチド担体、および食塩水と比較して示す。
【図11】８～１０週齢Ｃ５７ＢＬ６マウス（ｎ＝４～６）への２．５から５０ｍｇ／ｋｇの間の異なる量のペプチド－ＰＭＯの単一用量投与後２日目および７日目の尿ＫＩＭ－１レベルについての、同じアンチセンス療法用ＰＭＯにコンジュゲートした現在利用可能なペプチド担体との比較での評定。ＫＩＭ－１レベルは、ＥＬＩＳＡにより判定され、尿中クレアチニンレベルに対して正規化された。データは、食塩水を注射したマウスの対照ＫＩＭ－１レベル（ｎ＝１０）に対する変化倍数として提示されている。
【図12】８～１０週齢Ｃ５７ＢＬ６マウス（ｎ＝３～６）への２．５から５０ｍｇ／ｋｇの間の漸増量の単一用量投与後のペプチド－ＰＭＯのｉｎ ｖｉｖｏでのエクソンスキッピングの有効性についての、同じアンチセンス療法用ＰＭＯにコンジュゲートした現在利用可能なペプチド担体と比較での、用量応答比較研究。第２３番エクソンエクスクルージョンのｑＰＣＲ分析は、投与後７日目に（Ａ）前脛骨筋、（Ｂ）横隔膜および（Ｃ）心臓において評定された。
【図13】様々な濃度の、ＤＭＰＫ遺伝子に２６００のリピートを有するＤＭ１患者に由来するＤＭ１患者筋芽細胞（ｎ＝１～３）における、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＭｂｎｌ１転写物のスプライシング欠陥を修正する異なるＤＰＥＰ１／３－［ＣＡＧ］７ＰＭＯコンジュゲートを示す。
【図14】様々な濃度の、ＤＭＰＫ遺伝子に２６００のリピートを有するＤＭ１患者に由来するＤＭ１患者筋芽細胞における、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＤＭＤ転写物のスプライシング欠陥を修正する異なるＤＰＥＰ１／３－［ＣＡＧ］７ＰＭＯコンジュゲートを示す（エラーバー：平均±ＳＥＭ、ｎ＝１～３）。
【図15】異なるＤＰＥＰ１／３－［ＣＡＧ］７ＰＭＯコンジュゲートについての注射後２日目および７日目にメスＣ５７ＢＬ６マウスの尿で評定された相対ＫＩＭ－１レベルであって、標準曲線内に当てはまるように希釈された試料を用いてＥＬＩＳＡにより測定されたレベルを示す。値は、尿中タンパク質濃度を説明するために尿中クレアチニンレベルに対して正規化された。ＫＩＭ－１レベルは、以前のＰｉｐ系のペプチド担体により誘導された増加倍数と比較して食塩水対照注射と同様であった（エラーバー：平均±ＳＥＭ、ｎ＝４～１０）。
【図16】異なるＤＰＥＰ１／３－［ＣＡＧ］７ＰＭＯコンジュゲートについての注射後２日目および７日目にメスＣ５７ＢＬ６マウスの尿で測定された相対ＮＧＡＬレベルであって、標準曲線内に当てはまるように希釈された試料を用いてＥＬＩＳＡにより測定されたレベルを示す。値は、尿中タンパク質濃度を説明するために尿中クレアチニンレベルに対して正規化された。ＮＧＡＬレベルは、以前のＰｉｐ系のペプチド担体により誘導された増加倍数と比較して食塩水対照注射と同様であった（エラーバー：平均±ＳＥＭ、ｎ＝４～１０）。
【図17】異なるＤＰＥＰ１／３－［ＣＡＧ］７ＰＭＯコンジュゲートについての注射後７日目にメスＣ５７ＢＬ６マウスの血清において食塩水と比較して評定されたＢＵＮレベルを示す。ＢＵＮレベルは、以前のＰｉｐ系のペプチド担体により誘導された増加倍数と比較して食塩水対照注射と同様であった（エラーバー：平均±ＳＥＭ、ｎ＝４～１０）。
【図18】異なるＤＰＥＰ１／３－［ＣＡＧ］７ＰＭＯコンジュゲートについての注射後７日目にメスＣ５７ＢＬ６マウスの血清において食塩水と比較して評定されたクレアチニンレベルを示す。クレアチニンレベルは、以前のＰｉｐ系のペプチド担体により誘導された増加倍数と比較して食塩水対照注射と同様であった（エラーバー：平均±ＳＥＭ、ｎ＝４～１０）。
【図19】異なるＤＰＥＰ１／３－［ＣＡＧ］７ＰＭＯコンジュゲートのボーラスＩＶ（尾静脈）注射による投与を受けたメスＣ５７ＢＬ６マウスからの血清において注射後７日目の採取時に食塩水と比較して評定された（Ａ）アラニントランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、（Ｂ）アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）および（Ｃ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベルを示す。ＡＬＰ、ＡＬＴ、ＡＳＴレベルは、以前のＰｉｐ系のペプチド担体により誘導された増加倍数と比較して食塩水対照注射と同様であった。
【発明を実施するための形態】
【0027】
詳細な説明
本発明者らは、治療用分子を細胞に送達するための細胞透過性ペプチドとしての使用に適する一連のペプチドを生成した。
本発明者らは、治療用分子を細胞に送達するための細胞透過性ペプチドとしての使用に適する一連のペプチドを生成した。
【0028】
驚いたことに、本発明者らは、現在利用可能な細胞透過性ペプチドと比較して、筋肉への細胞透過性が増強された、いかなる人工アミノ酸も含まない、規定された長さの少なくとも２つのカチオン性ドメインと少なくとも１つの疎水性ドメインを有するペプチド群を見出した。この効果は、アンチセンスオリゴヌクレオチド治療薬とのコンジュゲートとして細胞に送達された場合、またはｉｎ ｖｉｖｏで投与された場合に観察される。
【0029】
疾患ＤＭＤの状況下において、適切な治療用分子に連結された本発明のペプチドによる細胞透過性の増強は、転写物内の特定のエクソン排除によって示すことができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを適切な配列へ方向付けると、エクソンの強制的なスキッピング、オープンリーディングフレームの修正、および内部的に欠失されているが部分的には機能するジストロフィンのアイソフォームの回復がもたらされる。
【0030】
本発明のペプチドは、ジストロフィン遺伝子を標的とするように設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチド治療薬とのコンジュゲートとして使用される場合に、高レベルのエクソン排除とジストロフィンタンパク質回復を有することが本明細書で示されている。
【0031】
特に、本発明のペプチドを含むコンジュゲートは、同じアンチセンスオリゴヌクレオチド治療薬にコンジュゲートされた現在利用可能なペプチドと比較した場合、細胞透過の有意な増加を示す。これは、本発明において、様々な異なる筋肉群におけるジストロフィン遺伝子内のエクソンスキッピングの増加によって実証されている。
【0032】
ｉｎ ｖｉｖｏでは、本明細書に記載した結果は、本発明のペプチドコンジュゲートを使用する場合のエクソンスキッピングおよび機能的ジストロフィン発現のレベルが、既に利用可能な細胞透過性ペプチドにコンジュゲートされた同じアンチセンスオリゴヌクレオチド治療薬の使用から得られているレベルの２倍近くであることを示す。
【0033】
これは、そのようなペプチド担体が筋肉細胞に透過する有効性での有意な改善であり、神経筋疾患で効果がある。
【0034】
理論によって拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、人工アミノ酸、例えば、典型的には細胞透過性ペプチドで使用される６－アミノヘキサン酸残基の除去と、例えば天然に存在するベータアラニン残基による置き換えが、全体的な毒性の低下とペプチドの細胞透過性の増加に有益な効果を有すると考える。
【0035】
しかし、人工アミノ酸残基を含まないこのようなペプチド構造が、オリゴヌクレオチドなどの治療用分子カーゴを筋肉内に輸送するという、既に報告されている細胞透過性ペプチドの送達特性を向上させることは全く予期されていなかった。ペプチドの有効性は、ペプチドが細胞内に入るのに要する時間の長さの間、血清安定性であるその能力に大きく依存する。人工アミノ酸を含まずに形成されるペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏで不安定であり、プロテアーゼ分解を受けやすく、十分な量を筋肉細胞および組織に透過させて治療効果を高めることができないと予想されていた。この予想に反して、本発明者らは、特許請求の範囲に記載した特定の構造を有するペプチドが、細胞に入り、良好で改善された効果を維持するのに十分な安定性があり、しかも、人工アミノ酸を欠いているために毒性プロファイルが低減されているという利点を有することを見出した。
【0036】
そのような輸送が増強され、本明細書で実証されたような、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの治療用分子がエクソンスキッピングと機能的ジストロフィンタンパク質産生を様々な異なる筋肉において順調に向上させる結果となるようなことは予期されなかった。
【0037】
さらに、そのようなコンジュゲートによるヒトの処置が実現できる程度までｉｎ ｖｉｖｏで治療用カーゴを輸送する場合、そのようなペプチド構造が細胞透過性ペプチドの毒性を有意に低減することは予期されなかった。ｉｎ ｖｉｖｏでは、本明細書に記載した結果は、生化学的マーカーによって決定した場合に腎毒性の減少を示す。
【0038】
誤解を避けるため、また本開示が解釈される方向を明確にするために、本発明に従って使用されるある特定の用語をここでさらに定義する。
【0039】
本発明は、そのような組合せが明白に許容されないか、明らかに回避される場合を除き、記載した態様および特徴の任意の組合せを含む。
【0040】
本明細書で使用したセクションの見出しは、単なる構成の目的のためであり、記載した主題を限定するものと解釈されるものではない。
【0041】
「Ｘ」への言及は、全体を通して、人工の合成的に生成されたアミノ酸であるアミノヘキサン酸の任意の形態を示す。
【0042】
「Ｂ」への言及は、全体を通して、天然であるが遺伝的にコードされていないアミノ酸のベータアラニンを示す。
【0043】
「Ａｃ」への言及は、全体を通して、関連ペプチドのアセチル化を示す。
【0044】
「Ｈｙｐ」への言及は、全体を通して、天然であるが遺伝的にコードされていないアミノ酸のヒドロキシプロリンを示す。
【0045】
他の大文字への言及は、全体を通して、関連する遺伝的にコードされたアミノ酸残基を、認められているアルファベットのアミノ酸コードに従って示す。
【0046】
人工アミノ酸
本発明は、人工アミノ酸残基が存在しない特定の構造を有する短い細胞透過性ペプチドに関する。
本発明は、人工アミノ酸残基が存在しない特定の構造を有する短い細胞透過性ペプチドに関する。
【0047】
本明細書での「人工」アミノ酸または残基への言及は、自然界に存在しないあらゆるアミノ酸を意味し、また、合成アミノ酸、修飾アミノ酸（例えば糖で修飾したもの）、非天然アミノ酸、人為的アミノ酸、スペーサー、および非ペプチド結合スペーサーを含む。
【0048】
合成アミノ酸は、人間によって化学的に合成されるものであり得る。
【0049】
誤解を避けるために、アミノヘキサン酸（Ｘ）は、本発明の文脈における人工アミノ酸である。誤解を避けるために、ベータアラニン（Ｂ）およびヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）は自然界に存在しており、したがって、本発明の文脈においては人工アミノ酸ではなく、天然アミノ酸である。
【0050】
人工アミノ酸は、例えば、６－アミノヘキサン酸（Ｘ）、テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸（ＴＩＣ）、１－（アミノ）シクロヘキサンカルボン酸（Ｃｙ）、および３－アゼチジン－カルボン酸（Ａｚ）、１１－アミノウンデカン酸を含み得る。
【0051】
適切には、ペプチドは、アミノヘキサン酸残基を含まない。適切には、ペプチドは、アミノヘキサン酸残基のいかなる形態も含まない。適切には、ペプチドは、６－アミノヘキサン酸残基を含まない。
【0052】
適切には、ペプチドは天然アミノ酸残基のみを含み、したがって、天然アミノ酸残基からなる。
【0053】
適切には、細胞透過性ペプチドで典型的に使用される人工アミノ酸、例えば６－アミノヘキサン酸は、天然アミノ酸に置き換えられる。適切には、細胞透過性ペプチドで典型的に使用される人工アミノ酸、例えば６－アミノヘキサン酸は、ベータアラニン、セリン、プロリン、アルギニンおよびヒスチジンまたはヒドロキシプロリンから選択されるアミノ酸に置き換えられる。
【0054】
一実施形態では、アミノヘキサン酸は、ベータアラニンに置き換えられる。適切には、６－アミノヘキサン酸は、ベータアラニンに置き換えられる。
【0055】
一実施形態では、アミノヘキサン酸は、ヒスチジンに置き換えられる。適切には、６－アミノヘキサン酸は、ヒスチジンに置き換えられる。
【0056】
一実施形態では、アミノヘキサン酸は、ヒドロキシプロリンに置き換えられる。適切には、６－アミノヘキサン酸は、ヒドロキシプロリンに置き換えられる。
【0057】
適切には、細胞透過性ペプチドで典型的に使用される人工アミノ酸、例えば６－アミノヘキサン酸は、ベータアラニン、セリン、プロリン、アルギニンおよびヒスチジンまたはヒドロキシプロリンのいずれかの組合せ、適切にはベータアラニン、ヒスチジン、およびヒドロキシプロリンのいずれかの組合せに置き換えることができる。
【0058】
一実施形態では、
少なくとも４アミノ酸残基をそれぞれ含む２つ以上のカチオン性ドメインと、
少なくとも３アミノ酸残基をそれぞれ含む１つまたは複数の疎水性ドメイン
を含む、４０アミノ酸残基以下の全長を有するペプチドであって、
少なくとも１つのカチオン性ドメインがヒスチジン残基を含むペプチドが提供される。
少なくとも４アミノ酸残基をそれぞれ含む２つ以上のカチオン性ドメインと、
少なくとも３アミノ酸残基をそれぞれ含む１つまたは複数の疎水性ドメイン
を含む、４０アミノ酸残基以下の全長を有するペプチドであって、
少なくとも１つのカチオン性ドメインがヒスチジン残基を含むペプチドが提供される。
【0059】
適切には、少なくとも１つのカチオン性ドメインはヒスチジンリッチである。
【0060】
適切には、ヒスチジンリッチによって意味されるものは、カチオン性ドメインに関連して本明細書で定義されている。
【0061】
カチオン性ドメイン
本発明は、ある特定の長さを有する少なくとも２つのカチオン性ドメインが存在する特定の構造を有する短い細胞透過性ペプチドに関する。
本発明は、ある特定の長さを有する少なくとも２つのカチオン性ドメインが存在する特定の構造を有する短い細胞透過性ペプチドに関する。
【0062】
「カチオン性」への言及は、本明細書では、生理学的ｐＨで全体的に正電荷を有するアミノ酸またはアミノ酸のドメインを示す。
【0063】
適切には、ペプチドは、最大４つのカチオン性ドメイン、最大３つのカチオン性ドメインを含む。
【0064】
適切には、ペプチドは、２つのカチオン性ドメインを含む。
【0065】
上記で定義したように、ペプチドは、少なくとも４アミノ酸残基の長さをそれぞれ有する２つ以上のカチオン性ドメインを含む。
【0066】
適切には、それぞれのカチオン性ドメインは、４アミノ酸残基から１２アミノ酸残基の間の長さ、適切には４アミノ酸残基から７アミノ酸残基の間の長さを有する。
【0067】
適切には、それぞれのカチオン性ドメインは、４、５、６、または７アミノ酸残基の長さを有する。
【0068】
適切には、それぞれのカチオン性ドメインは同様の長さであり、適切には、それぞれのカチオン性ドメインは同じ長さである。
【0069】
適切には、それぞれのカチオン性ドメインはカチオン性アミノ酸を含み、極性アミノ酸および／または非極性アミノ酸も含み得る。
【0070】
非極性アミノ酸は、アラニン、ベータアラニン、プロリン、グリシン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニンから選択することができる。適切には、非極性アミノ酸は電荷を有していない。
【0071】
極性アミノ酸は、セリン、アスパラギン、ヒドロキシプロリン、ヒスチジン、アルギニン、スレオニン、チロシン、グルタミンから選択することができる。適切には、選択された極性アミノ酸は、負電荷を有していない。
【0072】
カチオン性アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン、リシンから選択することができる。適切には、カチオン性アミノ酸は、生理学的ｐＨで正電荷を有する。
【0073】
適切には、それぞれのカチオン性ドメインは、アニオン性アミノ酸残基または負電荷アミノ酸残基を含まない。
【0074】
適切には、それぞれのカチオン性ドメインは、アルギニン、ヒスチジン、ベータアラニン、ヒドロキシプロリンおよび／またはセリン残基を含む。
【0075】
適切には、それぞれのカチオン性ドメインは、アルギニン、ヒスチジン、ベータアラニン、ヒドロキシプロリンおよび／またはセリン残基からなる。
【0076】
適切には、それぞれのカチオン性ドメインは、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％のカチオン性アミノ酸を含む。
【0077】
適切には、それぞれのカチオン性ドメインは、大多数のカチオン性アミノ酸を含む。適切には、それぞれのカチオン性ドメインは、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％のカチオン性アミノ酸を含む。
【0078】
適切には、それぞれのカチオン性ドメインは、少なくとも７．５、少なくとも８．０、少なくとも８．５、少なくとも９．０、少なくとも９．５、少なくとも１０．０、少なくとも１０．５、少なくとも１１．０、少なくとも１１．５、少なくとも１２．０の等電点（ｐＩ）を含む。
【0079】
適切には、それぞれのカチオン性ドメインは、少なくとも１０．０の等電点（ｐＩ）を含む。
【0080】
適切には、それぞれのカチオン性ドメインは、１０．０から１３．０の間の等電点（ｐＩ）を含む。
【0081】
一実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、１０．４から１２．５の間の等電点（ｐＩ）を含む。
【0082】
適切には、カチオン性ドメインの等電点は、当技術分野において利用可能な任意の適切な手段によって、適切には、ＩＰＣ（ｗｗｗ．ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ．ｏｒｇ）のＬｕｋａｓｚ Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉ、Ｂｉｏｌ Ｄｉｒｅｃｔ． ２０１６；１１：５５．ＤＯＩ：１０．１１８６／ｓ１３０６２－０１６－０１５９－９によって開発されたｗｅｂベースのアルゴリズムを使用することによって生理学的ｐＨで算出される。
【0083】
適切には、それぞれのカチオン性ドメインは、少なくとも１つのカチオン性アミノ酸、適切には１カチオン性アミノ酸から５カチオン性アミノ酸の間のカチオン性アミノ酸を含む。適切には、それぞれのカチオン性ドメインは、少なくとも２つのカチオン性アミノ酸、適切には２カチオン性アミノ酸から５カチオン性アミノ酸の間のカチオン性アミノ酸を含む。
【0084】
適切には、それぞれのカチオン性ドメインは、アルギニンリッチおよび／またはヒスチジンリッチである。適切には、カチオン性ドメインは、ヒスチジンおよびアルギニンの両方を含み得る。
【0085】
「アルギニンリッチ」または「ヒスチジンリッチ」とは、カチオン性ドメインの少なくとも４０％が前記残基で形成されていることを意味する。
【0086】
適切には、それぞれのカチオン性ドメインは、大多数のアルギニン残基および／またはヒスチジン残基を含む。
【0087】
適切には、それぞれのカチオン性ドメインは、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％のアルギニン残基および／またはヒスチジン残基を含む。
【0088】
適切には、カチオン性ドメインは、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％のアルギニン残基を含み得る。
【0089】
適切には、カチオン性ドメインは、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％のヒスチジン残基を含み得る。
【0090】
適切には、カチオン性ドメインは、合計で１ヒスチジン残基から５ヒスチジン残基の間のヒスチジン残基と、１アルギニン残基から５アルギニン残基の間のアルギニン残基を含み得る。適切には、カチオン性ドメインは、１アルギニン残基から５アルギニン残基の間のアルギニン残基を含み得る。適切には、カチオン性ドメインは、１ヒスチジン残基から５ヒスチジン残基の間のヒスチジン残基を含み得る。適切には、カチオン性ドメインは、合計で２ヒスチジン残基から５ヒスチジン残基の間のヒスチジン残基と、３アルギニン残基から５アルギニン残基の間のアルギニン残基を含み得る。適切には、カチオン性ドメインは、３アルギニン残基から５アルギニン残基の間のアルギニン残基を含み得る。適切には、カチオン性ドメインは、２ヒスチジン残基から５ヒスチジン残基の間のヒスチジン残基を含み得る。
【0091】
適切には、それぞれのカチオン性ドメインは、１つまたは複数のベータアラニン残基を含む。適切には、それぞれのカチオン性ドメインは、合計で２ベータアラニン残基から５ベータアラニン残基の間のベータアラニン残基、適切には合計で２ベータアラニン残基または３ベータアラニン残基を含み得る。
【0092】
適切には、カチオン性ドメインは、１つまたは複数のヒドロキシプロリン残基またはセリン残基を含み得る。
【0093】
適切には、カチオン性ドメインは、１ヒドロキシプロリン残基から２ヒドロキシプロリン残基の間のヒドロキシプロリン残基を含み得る。適切には、カチオン性ドメインは、１セリン残基から２セリン残基の間のセリン残基を含み得る。
【0094】
適切には、所定のカチオン性ドメイン内の全てのカチオン性アミノ酸はヒスチジンであり得るか、あるいは、適切には、所定のカチオン性ドメイン内の全てのカチオン性アミノ酸はアルギニンであり得る。
【0095】
適切には、ペプチドは、少なくとも１つのヒスチジンリッチカチオン性ドメインを含み得る。適切には、ペプチドは、少なくとも１つのアルギニンリッチカチオン性ドメインを含み得る。
【0096】
適切には、ペプチドは、少なくとも１つのアルギニンリッチカチオン性ドメインと、少なくとも１つのヒスチジンリッチカチオン性ドメインを含み得る。
【0097】
一実施形態では、ペプチドは、２つのアルギニンリッチカチオン性ドメインを含む。
【0098】
一実施形態では、ペプチドは、２つのヒスチジンリッチカチオン性ドメインを含む。
【0099】
一実施形態では、ペプチドは、２つのアルギニンおよびヒスチジンリッチカチオン性ドメインを含む。
【0100】
一実施形態では、ペプチドは、１つのアルギニンリッチカチオン性ドメインと１つのヒスチジンリッチカチオン性ドメインを含む。
【0101】
適切には、それぞれのカチオン性ドメインは、３つ以下の連続するアルギニン残基、適切には２つ以下の連続するアルギニン残基を含む。
【0102】
適切には、それぞれのカチオン性ドメインは、連続するヒスチジン残基を含まない。
【0103】
適切には、それぞれのカチオン性ドメインは、アルギニン、ヒスチジン、および／またはベータアラニン残基を含む。適切には、それぞれのカチオン性ドメインは、大多数のアルギニン、ヒスチジン、および／またはベータアラニン残基を含む。適切には、それぞれのカチオン性ドメイン内のアミノ酸残基の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％は、アルギニン、ヒスチジン、および／またはベータアラニン残基である。適切には、それぞれのカチオン性ドメインは、アルギニン、ヒスチジン、および／またはベータアラニン残基からなる。
【0104】
一実施形態では、ペプチドは、アルギニン残基およびベータアラニン残基を含む第１のカチオン性ドメインと、アルギニン残基およびベータアラニン残基を含む第２のカチオン性ドメインを含む。
【0105】
一実施形態では、ペプチドは、アルギニン残基およびベータアラニン残基を含む第１のカチオン性ドメインと、ヒスチジン残基、ベータアラニン残基、および必要に応じてアルギニン残基を含む第２のカチオン性ドメインを含む。
【0106】
一実施形態では、ペプチドは、アルギニン残基およびベータアラニン残基を含む第１のカチオン性ドメインと、ヒスチジン残基およびベータアラニン残基を含む第２のカチオン性ドメインを含む。
【0107】
一実施形態では、ペプチドは、アルギニン残基およびベータアラニン残基からなる第１のカチオン性ドメインと、アルギニン残基およびベータアラニン残基からなる第２のカチオン性ドメインを含む。
【0108】
一実施形態では、ペプチドは、アルギニン残基およびベータアラニン残基からなる第１のカチオン性ドメインと、アルギニン残基、ヒスチジン残基およびベータアラニン残基からなる第２のカチオン性ドメインを含む。
【0109】
適切には、ペプチドは、少なくとも２つのカチオン性ドメインを含み、適切にはこれらのカチオン性ドメインはペプチドのアームを形成する。適切には、カチオン性ドメインは、ペプチドのＮ末端およびＣ末端に位置している。適切には、したがって、カチオン性ドメインは、カチオン性アームドメインとして公知であり得る。
【0110】
一実施形態では、ペプチドは、２つのカチオン性ドメインを含み、１つはペプチドのＮ末端に位置しており、もう１つはペプチドのＣ末端に位置している。適切には、ペプチドのいずれかの末端に位置している。適切には、末端修飾、リンカーおよび／または治療用分子などの他の基を除き、さらなるアミノ酸またはドメインは、ペプチドのＮ末端およびＣ末端に存在しない。誤解を避けるために、そのような他の基は、本明細書で記載され、特許請求されている「ペプチド」に加えて存在し得る。適切には、したがって、それぞれのカチオン性ドメインは、ペプチドの末端を形成する。適切には、これは、本明細書で記載されているさらなるリンカー基の存在を排除するものではない。
【0111】
適切には、ペプチドは、最大４つのカチオン性ドメインを含み得る。適切には、ペプチドは、２つのカチオン性ドメインを含む。
【0112】
一実施形態では、ペプチドは、両方ともアルギニンリッチである２つのカチオン性ドメインを含む。
【0113】
一実施形態では、ペプチドは、アルギニンリッチである１つのカチオン性ドメインを含む。
【0114】
一実施形態では、ペプチドは、両方がアルギニンリッチおよびヒスチジンリッチである２つのカチオン性ドメインを含む。
【0115】
一実施形態では、ペプチドは、アルギニンリッチである１つのカチオン性ドメインと、ヒスチジンリッチである１つのカチオン性ドメインを含む。
【0116】
適切には、カチオン性ドメインは、以下のＲ、Ｈ、Ｂ、ＲＲ、ＨＨ、ＢＢ、ＲＨ、ＨＲ、ＲＢ、ＢＲ、ＨＢ、ＢＨ、ＲＢＲ、ＲＢＢ、ＢＲＲ、ＢＢＲ、ＢＲＢ、ＲＢＨ、ＲＨＢ、ＨＲＢ、ＢＲＨ、ＨＲＲ、ＲＲＨ、ＨＲＨ、ＨＢＢ、ＢＢＨ、ＲＨＲ、ＢＨＢ、ＨＢＨから選択されるアミノ酸単位、またはその任意の組合せを含む。
【0117】
適切には、カチオン性ドメインはまた、セリン残基、プロリン残基および／またはヒドロキシプロリン残基を含み得る。適切には、カチオン性ドメインは、以下のＲＰ、ＰＲ、ＲＰＲ、ＲＲＰ、ＰＲＲ、ＰＲＰ、Ｈｙｐ；Ｒ［Ｈｙｐ］Ｒ、ＲＲ［Ｈｙｐ］、［Ｈｙｐ］ＲＲ、［Ｈｙｐ］Ｒ［Ｈｙｐ］、［Ｈｙｐ］［Ｈｙｐ］Ｒ、Ｒ［Ｈｙｐ］［Ｈｙｐ］、ＳＢ、ＢＳから選択されるアミノ酸単位、またはその任意の組合せ、または上記で列挙したアミノ酸単位との任意の組合せをさらに含み得る。
【0118】
適切には、それぞれのカチオン性ドメインは、以下の配列：ＲＢＲＲＢＲＲ（配列番号１）、ＲＢＲＢＲ（配列番号２）、ＲＢＲＲ（配列番号３）、ＲＢＲＲＢＲ（配列番号４）、ＲＲＢＲＢＲ（配列番号５）、ＲＢＲＲＢ（配列番号６）、ＢＲＢＲ（配列番号７）、ＲＢＨＢＨ（配列番号８）、ＨＢＨＢＲ（配列番号９）、ＲＢＲＨＢＨＲ（配列番号１０）、ＲＢＲＢＢＨＲ（配列番号１１）、ＲＢＲＲＢＨ（配列番号１２）、ＨＢＲＲＢＲ（配列番号１３）、ＨＢＨＢＨ（配列番号１４）、ＢＨＢＨ（配列番号１５）、ＢＲＢＳＢ（配列番号１６）、ＢＲＢ［Ｈｙｐ］Ｂ（配列番号１７）、Ｒ［Ｈｙｐ］Ｈ［Ｈｙｐ］ＨＢ（配列番号１８）、Ｒ［Ｈｙｐ］ＲＲ［Ｈｙｐ］Ｒ（配列番号１９）のいずれかまたはその任意の組合せを含む。
【0119】
適切には、それぞれのカチオン性ドメインは、以下の配列：ＲＢＲＲＢＲＲ（配列番号１）、ＲＢＲＢＲ（配列番号２）、ＲＢＲＲ（配列番号３）、ＲＢＲＲＢＲ（配列番号４）、ＲＲＢＲＢＲ（配列番号５）、ＲＢＲＲＢ（配列番号６）、ＢＲＢＲ（配列番号７）、ＲＢＨＢＨ（配列番号８）、ＨＢＨＢＲ（配列番号９）、ＲＢＲＨＢＨＲ（配列番号１０）、ＲＢＲＢＢＨＲ（配列番号１１）、ＲＢＲＲＢＨ（配列番号１２）、ＨＢＲＲＢＲ（配列番号１３）、ＨＢＨＢＨ（配列番号１４）、ＢＨＢＨ（配列番号１５）、ＢＲＢＳＢ（配列番号１６）、ＢＲＢ［Ｈｙｐ］Ｂ、Ｒ［Ｈｙｐ］Ｈ［Ｈｙｐ］ＨＢ、Ｒ［Ｈｙｐ］ＲＲ［Ｈｙｐ］Ｒ（配列番号１９）のいずれかまたはその任意の組合せからなる。
【0120】
適切には、それぞれのカチオン性ドメインは、以下の配列：ＲＢＲＲＢＲＲ（配列番号１）、ＲＢＲＢＲ（配列番号２）、ＲＢＲＲＢＲ（配列番号４）、ＢＲＢＲ（配列番号７）、ＲＢＨＢＨ（配列番号８）、ＨＢＨＢＲ（配列番号９）のうちの１つからなる。
【0121】
適切には、ペプチドのそれぞれのカチオン性ドメインは、同一であってもよく、または異なっていてもよい。適切には、ペプチドのそれぞれのカチオン性ドメインは異なる。
【0122】
疎水性ドメイン
本発明は、ある特定の長さを有する少なくとも１つの疎水性ドメインが存在する特定の構造を有する短い細胞透過性ペプチドに関する。
本発明は、ある特定の長さを有する少なくとも１つの疎水性ドメインが存在する特定の構造を有する短い細胞透過性ペプチドに関する。
【0123】
「疎水性」への言及は、本明細書では、水をはじく能力を有するか、または水と混じり合わないアミノ酸またはアミノ酸のドメインを示す。
【0124】
適切には、ペプチドは、最大３つの疎水性ドメイン、最大２つの疎水性ドメインを含む。
【0125】
適切には、ペプチドは、１つの疎水性ドメインを含む。
【0126】
上記で定義したように、ペプチドは、少なくとも３アミノ酸残基の長さをそれぞれ有する１つまたは複数の疎水性ドメインを含む。
【0127】
適切には、それぞれの疎水性ドメインは、３アミノ酸から６アミノ酸の間の長さを有する。適切には、それぞれの疎水性ドメインは、５アミノ酸の長さを有する。
【0128】
適切には、それぞれの疎水性ドメインは、非極性アミノ酸残基、極性アミノ酸残基、および疎水性アミノ酸残基を含み得る。
【0129】
疎水性アミノ酸残基は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、およびトリプトファンから選択することができる。
【0130】
非極性アミノ酸残基は、プロリン、グリシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンから選択することができる。
【0131】
極性アミノ酸残基は、セリン、アスパラギン、ヒドロキシプロリン、ヒスチジン、アルギニン、スレオニン、チロシン、グルタミンから選択することができる。
【0132】
適切には、疎水性ドメインは、親水性アミノ酸残基を含まない。
【0133】
適切には、それぞれの疎水性ドメインは、大多数の疎水性アミノ酸残基を含む。適切には、それぞれの疎水性ドメインは、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の疎水性アミノ酸を含む。適切には、それぞれの疎水性ドメインは、疎水性アミノ酸残基からなる。
【0134】
適切には、それぞれの疎水性ドメインは、少なくとも０．３、少なくとも０．４、少なくとも０．５、少なくとも０．６、少なくとも０．７、少なくとも０．８、少なくとも０．８、少なくとも１．０、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３の疎水性を含む。
【0135】
適切には、それぞれの疎水性ドメインは、少なくとも０．３、少なくとも０．３５、少なくとも０．４、少なくとも０．４５の疎水性を含む。
【0136】
適切には、それぞれの疎水性ドメインは、少なくとも１．２、少なくとも１．２５、少なくとも１．３、少なくとも１．３５の疎水性を含む。
【0137】
適切には、それぞれの疎水性ドメインは、０．４から１．４の間の疎水性を含む。
【0138】
一実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、０．４５から０．４８の間の疎水性を含む。
【0139】
一実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、１．２７から１．３９の間の疎水性を含む。
【0140】
適切には、疎水性は、ＷｈｉｔｅおよびＷｉｍｌｅｙ：Ｗ．Ｃ． Ｗｉｍｌｅｙ ａｎｄ Ｓ．Ｈ． Ｗｈｉｔｅ、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ ｓｃａｌｅ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ」 Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ３：８４２（１９９６）によって測定されるものである。
【0141】
適切には、それぞれの疎水性ドメインは、少なくとも３疎水性アミノ酸残基、少なくとも４疎水性アミノ酸残基を含む。
【0142】
適切には、それぞれの疎水性ドメインは、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、トリプトファン、プロリン、およびグルタミン残基を含む。適切には、それぞれの疎水性ドメインは、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、トリプトファン、プロリン、および／またはグルタミン残基からなる。
【0143】
一実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、チロシンおよび／またはグルタミン残基からなる。
【0144】
一実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、トリプトファンおよび／またはプロリン残基からなる。
【0145】
適切には、ペプチドは、１つの疎水性ドメインを含む。適切には、上記疎水性ドメインまたはそれぞれの疎水性ドメインは、ペプチドの中央に位置する。適切には、したがって、疎水性ドメインは、コア疎水性ドメインとして公知であり得る。適切には、上記疎水性コアドメインまたはそれぞれの疎水性コアドメインは、両側がアームドメインによって挟まれている。適切には、アームドメインは、１つまたは複数のカチオン性ドメインと、１つまたは複数のさらなる疎水性ドメインを含み得る。適切には、それぞれのアームドメインは、カチオン性ドメインを含む。
【0146】
一実施形態では、ペプチドは、疎水性コアドメインを挟んでいる２つのアームドメインを含み、それぞれのアームドメインはカチオン性ドメインを含む。
【0147】
一実施形態では、ペプチドは、疎水性コアドメインを挟んでいる２つのカチオン性アームドメインからなる。
【0148】
適切には、上記疎水性ドメインまたはそれぞれの疎水性ドメインは、以下の配列：ＹＱＦＬＩ（配列番号２０）、ＦＱＩＬＹ（配列番号２１）、ＩＬＦＱＹ（配列番号２２）、ＦＱＩＹ（配列番号２３）、ＷＷＷ、ＷＷＰＷＷ（配列番号２４）、ＷＰＷＷ（配列番号２５）、ＷＷＰＷ（配列番号２６）のうちの１つまたはそれらの任意の組合せを含む。
【0149】
適切には、上記疎水性ドメインまたはそれぞれの疎水性ドメインは、以下の配列：ＹＱＦＬＩ（配列番号２０）、ＦＱＩＬＹ（配列番号２１）、ＩＬＦＱＹ（配列番号２２）、ＦＱＩＹ（配列番号２３）、ＷＷＷ、ＷＷＰＷＷ（配列番号２４）、ＷＰＷＷ（配列番号２５）、ＷＷＰＷ（配列番号２６）のうちの１つまたはそれらの任意の組合せからなる。
【0150】
適切には、上記疎水性ドメインまたはそれぞれの疎水性ドメインは、以下の配列ＦＱＩＬＹ（配列番号２１）、ＹＱＦＬＩ（配列番号２０）、ＩＬＦＱＹ（配列番号２２）のうちの１つからなる。
【0151】
適切には、上記疎水性ドメインまたはそれぞれの疎水性ドメインは、ＦＱＩＬＹ（配列番号２１）からなる。
【0152】
適切には、ペプチド内のそれぞれの疎水性ドメインは、同じ配列または異なる配列を有し得る。
【0153】
ペプチド
本発明は、病状の処置における治療用カーゴ分子の輸送で使用するための短い細胞透過性ペプチドに関する。
本発明は、病状の処置における治療用カーゴ分子の輸送で使用するための短い細胞透過性ペプチドに関する。
【0154】
ペプチドは、連続する単一分子である配列を有し、したがって、ペプチドのドメインは連続している。適切には、ペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の間に直線的に配置されたいくつかのドメインを含む。適切には、ドメインは、上記で記載したカチオン性ドメインおよび疎水性ドメインから選択される。適切には、ペプチドは、カチオン性ドメインおよび疎水性ドメインからなり、ドメインは上記で定義した通りである。
【0155】
それぞれのドメインは、上記の関連セクションで記載した共通の配列特性を有するが、それぞれのドメインの正確な配列は変形形態および修飾が可能である。したがって、それぞれのドメインに対して様々な配列が可能である。それぞれの可能なドメイン配列の組合せは、様々なペプチド構造をもたらし、それらのそれぞれが本発明の一部を形成する。ペプチド構造の特徴は以下に記載されている。
【0156】
適切には、疎水性ドメインは、任意の２つのカチオン性ドメインを分ける。適切には、それぞれの疎水性ドメインは、その両側でカチオン性ドメインにより挟まれる。
【0157】
適切には、カチオン性ドメインは、別のカチオン性ドメインと連続していない。
【0158】
一実施形態では、ペプチドは、以下の配置で２つのカチオン性ドメインにより挟まれている１つの疎水性ドメインを含む：
［カチオン性ドメイン］－［疎水性ドメイン］－［カチオン性ドメイン］。
［カチオン性ドメイン］－［疎水性ドメイン］－［カチオン性ドメイン］。
【0159】
したがって、適切には、疎水性ドメインはコアドメインとして公知であり得、それぞれのカチオン性ドメインはアームドメインとして公知であり得る。適切には、疎水性アームドメインは、カチオン性コアドメインをその両側から挟む。
【0160】
一実施形態では、ペプチドは、２つのカチオン性ドメインおよび１つの疎水性ドメインからなる。
【0161】
一実施形態では、ペプチドは、２つのカチオン性アームドメインに挟まれた１つの疎水性コアドメインからなる。
【0162】
一実施形態では、ペプチドは、ＲＢＲＲＢＲＲ（配列番号１）、ＲＢＲＢＲ（配列番号２）、ＲＢＲＲ（配列番号３）、ＲＢＲＲＢＲ（配列番号４）、ＲＲＢＲＢＲ（配列番号５）、ＲＢＲＲＢ（配列番号６）、ＢＲＢＲ（配列番号７）、ＲＢＨＢＨ（配列番号８）、ＨＢＨＢＲ（配列番号９）、ＲＢＲＨＢＨＲ（配列番号１０）、ＲＢＲＢＢＨＲ（配列番号１１）、ＲＢＲＲＢＨ（配列番号１２）、ＨＢＲＲＢＲ（配列番号１３）、ＨＢＨＢＨ（配列番号１４）、ＢＨＢＨ（配列番号１５）、ＢＲＢＳＢ（配列番号１６）、ＢＲＢ［Ｈｙｐ］Ｂ（配列番号１７）、Ｒ［Ｈｙｐ］Ｈ［Ｈｙｐ］ＨＢ（配列番号１８）、およびＲ［Ｈｙｐ］ＲＲ［Ｈｙｐ］Ｒ（配列番号１９）から選択される配列をそれぞれ含む２つのカチオン性アームドメインに挟まれた、ＹＱＦＬＩ（配列番号２０）、ＦＱＩＬＹ（配列番号２１）、ＩＬＦＱＹ（配列番号２２）、ＦＱＩＹ（配列番号２３）、ＷＷＷ、ＷＷＰＷＷ（配列番号２４）、ＷＰＷＷ（配列番号２５）、およびＷＷＰＷ（配列番号２６）から選択される配列を含む１つの疎水性コアドメインからなる。
【0163】
一実施形態では、ペプチドは、ＲＢＲＲＢＲＲ（配列番号１）、ＲＢＲＢＲ（配列番号２）、ＲＢＲＲＢＲ（配列番号４）、ＢＲＢＲ（配列番号７）、ＲＢＨＢＨ（配列番号８）、ＨＢＨＢＲ（配列番号９）から選択される配列を含む２つのカチオン性アームドメインに挟まれた、ＦＱＩＬＹ（配列番号２１）、ＹＱＦＬＩ（配列番号２０）、およびＩＬＦＱＹ（配列番号２２）から選択される配列を含む１つの疎水性コアドメインからなる。
【0164】
一実施形態では、ペプチドは、ＲＢＲＲＢＲＲ（配列番号１）、ＲＢＲＢＲ（配列番号２）、ＲＢＲＲＢＲ（配列番号４）、ＢＲＢＲ（配列番号７）、ＲＢＨＢＨ（配列番号８）から選択される配列を含む２つのカチオンのアームドメインに挟まれた、配列：ＦＱＩＬＹ（配列番号２１）を含む１つの疎水性コアドメインからなる。
【0165】
いずれかのそのような実施形態では、さらなる基、例えば、リンカー、末端修飾および／または治療用分子が存在し得る。
【0166】
適切には、ペプチドは、Ｎ末端が修飾されている。
【0167】
適切には、ペプチドは、Ｎ－アセチル化、Ｎ－メチル化、Ｎ－トリフルオロアセチル化、Ｎ－トリフルオロメチルスルホニル化、またはＮ－メチルスルホニル化されている。適切には、ペプチドは、Ｎ－アセチル化されている。
【0168】
必要に応じて、ペプチドのＮ末端は修飾されていなくてもよい。
【0169】
一実施形態では、ペプチドは、Ｎ－アセチル化されている。
【0170】
適切には、ペプチドは、Ｃ末端が修飾されている。
【0171】
適切には、ペプチドは、カルボキシ基、チオ酸基、アミノオキシ基、ヒドラジノ基、チオエステル基、アジド基、歪みアルキン、歪みアルケン、アルデヒド基、チオール基またはハロアセチル基から選択されるＣ末端修飾を含む。
【0172】
有利なことには、Ｃ末端修飾は、ペプチドを治療用分子に連結させるための手段を提供する。
【0173】
したがって、Ｃ末端修飾はリンカーを含むことができ、その逆も同様である。適切には、Ｃ末端修飾はリンカーからなっていてもよく、その逆も同様である。適切なリンカーは、本明細書の他の箇所に記載されている。
【0174】
適切には、ペプチドは、Ｃ末端カルボキシル基を含む。
【0175】
適切には、Ｃ末端カルボキシル基は、グリシンまたはベータアラニン残基によって提供される。
【0176】
一実施形態では、Ｃ末端カルボキシル基は、ベータアラニン残基によって提供される。
【0177】
適切には、Ｃ末端のベータアラニン残基は、リンカーである。
【0178】
適切には、したがって、それぞれのカチオン性ドメインは、Ｎ末端修飾またはＣ末端修飾をさらに含み得る。適切には、Ｃ末端のカチオン性ドメインは、Ｃ末端修飾を含む。適切には、Ｎ末端のカチオン性ドメインは、Ｎ末端修飾を含む。適切には、Ｃ末端のカチオン性ドメインはリンカー基を含み、適切には、Ｃ末端のカチオン性ドメインはＣ末端ベータアラニンを含む。適切には、Ｎ末端のカチオン性ドメインは、Ｎ－アセチル化されている。
【0179】
本発明のペプチドは、４０アミノ酸残基以下の全長を有するものと定義される。ペプチドは、したがって、オリゴペプチドと見なすことができる。
【0180】
適切には、ペプチドは、３アミノ酸残基から３０アミノ酸残基の間、適切には、５アミノ酸残基から２５アミノ酸残基の間、１０アミノ酸残基から２５アミノ酸残基の間、１３アミノ酸残基から２３アミノ酸残基の間、１５アミノ酸残基から２０アミノ酸残基の間の全長を有する。
【0181】
適切には、ペプチドは、少なくとも１２アミノ酸残基、少なくとも１３アミノ酸残基、少なくとも１４アミノ酸残基、少なくとも１５アミノ酸残基、少なくとも１６アミノ酸残基、少なくとも１７アミノ酸残基の全長を有する。
【0182】
適切には、ペプチドは、細胞に透過することが可能である。ペプチドは、したがって、細胞透過性ペプチドと見なすことができる。
【0183】
適切には、ペプチドは、治療用分子に付着させるためのものである。適切には、ペプチドは、治療用分子を標的細胞に輸送するためのものである。適切には、ペプチドは、治療用分子を標的細胞に送達するためのものである。ペプチドは、したがって、担体ペプチドと見なすことができる。
【0184】
適切には、ペプチドは、細胞および組織に、適切には細胞の核に透過することが可能である。適切には、筋肉組織に透過することが可能である。
【0185】
適切には、ペプチドは、以下の配列のいずれかから選択することができる：
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＲＢＲＢＲ（配列番号２７）
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＲＢＲＲ（配列番号２８）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＲＢＲＢＲ（配列番号２９）
ＲＢＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＲＲＢＲＲ（配列番号３０）
ＲＢＲＲＢＲＲＹＱＦＬＩＲＢＲＢＲ（配列番号３１）
ＲＢＲＲＢＲＲＩＬＦＱＹＲＢＲＢＲ（配列番号３２）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＲＢＲ（配列番号３３）
ＲＢＲＲＢＦＱＩＬＹＲＢＲＲＢＲ（配列番号３４）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）
ＲＢＲＲＢＦＱＩＬＹＲＢＲＢＲ（配列番号３６）
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号３７）
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＨＢＨＢＲ（配列番号３８）
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＨＢＲＢＨ（配列番号３９）
ＲＢＲＲＢＲＲＹＱＦＬＩＲＢＨＢＨ（配列番号４０）
ＲＢＲＲＢＲＲＩＬＦＱＹＲＢＨＢＨ（配列番号４１）
ＲＢＲＨＢＨＲＦＱＩＬＹＲＢＲＢＲ（配列番号４２）
ＲＢＲＢＢＨＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４３）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＨＢＨＢＨ（配列番号４５）
ＲＢＲＲＢＨＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４６）
ＨＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４７）
ＲＢＲＲＢＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４８）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＨＢＨ（配列番号４９）
ＲＢＲＲＢＲＹＱＦＬＩＨＢＨＢＨ（配列番号５０）
ＲＢＲＲＢＲＩＬＦＱＹＨＢＨＢＨ（配列番号５１）
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＨＢＨＢＨ（配列番号５２）
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＲＢＲＢＲ（配列番号２７）
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＲＢＲＲ（配列番号２８）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＲＢＲＢＲ（配列番号２９）
ＲＢＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＲＲＢＲＲ（配列番号３０）
ＲＢＲＲＢＲＲＹＱＦＬＩＲＢＲＢＲ（配列番号３１）
ＲＢＲＲＢＲＲＩＬＦＱＹＲＢＲＢＲ（配列番号３２）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＲＢＲ（配列番号３３）
ＲＢＲＲＢＦＱＩＬＹＲＢＲＲＢＲ（配列番号３４）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）
ＲＢＲＲＢＦＱＩＬＹＲＢＲＢＲ（配列番号３６）
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号３７）
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＨＢＨＢＲ（配列番号３８）
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＨＢＲＢＨ（配列番号３９）
ＲＢＲＲＢＲＲＹＱＦＬＩＲＢＨＢＨ（配列番号４０）
ＲＢＲＲＢＲＲＩＬＦＱＹＲＢＨＢＨ（配列番号４１）
ＲＢＲＨＢＨＲＦＱＩＬＹＲＢＲＢＲ（配列番号４２）
ＲＢＲＢＢＨＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４３）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＨＢＨＢＨ（配列番号４５）
ＲＢＲＲＢＨＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４６）
ＨＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４７）
ＲＢＲＲＢＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４８）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＨＢＨ（配列番号４９）
ＲＢＲＲＢＲＹＱＦＬＩＨＢＨＢＨ（配列番号５０）
ＲＢＲＲＢＲＩＬＦＱＹＨＢＨＢＨ（配列番号５１）
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＨＢＨＢＨ（配列番号５２）
【0186】
適切には、ペプチドは、以下のさらなる配列のいずれかから選択することができる：
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＳ（配列番号５３）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢ［Ｈｙｐ］（配列番号５４）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲ［Ｈｙｐ］Ｒ（配列番号５５）
ＲＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号５６）
ＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号５７）
ＲＢＲＲＢＲＷＷＷＢＲＢＲ（配列番号５８）
ＲＢＲＲＢＲＷＷＰＷＷＢＲＢＲ（配列番号５９）
ＲＢＲＲＢＲＷＰＷＷＢＲＢＲ（配列番号６０）
ＲＢＲＲＢＲＷＷＰＷＢＲＢＲ（配列番号６１）
ＲＢＲＲＢＲＲＷＷＷＲＢＲＢＲ（配列番号６２）
ＲＢＲＲＢＲＲＷＷＰＷＷＲＢＲＢＲ（配列番号６３）
ＲＢＲＲＢＲＲＷＰＷＷＲＢＲＢＲ（配列番号６４）
ＲＢＲＲＢＲＲＷＷＰＷＲＢＲＢＲ（配列番号６５）
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号６６）
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＲＢＲ（配列番号６７）
ＢＲＢＲＢＷＷＰＷＷＲＢＲＲＢＲ（配列番号６８）
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＢＨＢＨ（配列番号６９）
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＹＲＢＨＢＨ（配列番号７０）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＨ（配列番号７１）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲ［Ｈｙｐ］Ｈ［Ｈｙｐ］Ｈ（配列番号７２）
Ｒ［Ｈｙｐ］ＲＲ［Ｈｙｐ］ＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号７３）
Ｒ［Ｈｙｐ］ＲＲ［Ｈｙｐ］ＲＦＱＩＬＹＲ［Ｈｙｐ］Ｈ［Ｈｙｐ］Ｈ（配列番号７４）
ＲＢＲＲＢＲＷＷＷＲＢＨＢＨ（配列番号７５）
ＲＢＲＲＢＲＷＷＰＲＢＨＢＨ（配列番号７６）
ＲＢＲＲＢＲＰＷＷＲＢＨＢＨ（配列番号７７）
ＲＢＲＲＢＲＷＷＰＷＷＲＢＨＢＨ（配列番号７８）
ＲＢＲＲＢＲＷＷＰＷＲＢＨＢＨ（配列番号７９）
ＲＢＲＲＢＲＷＰＷＷＲＢＨＢＨ（配列番号８０）
ＲＢＲＲＢＲＲＷＷＷＲＢＨＢＨ（配列番号８１）
ＲＢＲＲＢＲＲＷＷＰＷＷＲＢＨＢＨ（配列番号８２）
ＲＢＲＲＢＲＲＷＰＷＷＲＢＨＢＨ（配列番号８３）
ＲＢＲＲＢＲＲＷＷＰＷＲＢＨＢＨ（配列番号８４）
ＲＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号８５）
ＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号８６）
ＲＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＨＢＨ（配列番号８７）
ＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＢＨＢＨ（配列番号８８）
ＲＢＲＲＢＨＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号８９）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹ［Ｈｙｐ］Ｒ［Ｈｙｐ］Ｒ（配列番号１０１）
Ｒ［Ｈｙｐ］ＲＲ［Ｈｙｐ］ＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号１０２）
Ｒ［Ｈｙｐ］ＲＲ［Ｈｙｐ］ＲＦＱＩＬＹ［Ｈｙｐ］Ｒ［Ｈｙｐ］Ｒ（配列番号１０３）
ＲＢＲＲＢＲＷＷＷＢＲＢＲ（配列番号１０４）
ＲＢＲＲＢＲＷＷＰＷＷＢＲＢＲ（配列番号１０５）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＳ（配列番号５３）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢ［Ｈｙｐ］（配列番号５４）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲ［Ｈｙｐ］Ｒ（配列番号５５）
ＲＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号５６）
ＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号５７）
ＲＢＲＲＢＲＷＷＷＢＲＢＲ（配列番号５８）
ＲＢＲＲＢＲＷＷＰＷＷＢＲＢＲ（配列番号５９）
ＲＢＲＲＢＲＷＰＷＷＢＲＢＲ（配列番号６０）
ＲＢＲＲＢＲＷＷＰＷＢＲＢＲ（配列番号６１）
ＲＢＲＲＢＲＲＷＷＷＲＢＲＢＲ（配列番号６２）
ＲＢＲＲＢＲＲＷＷＰＷＷＲＢＲＢＲ（配列番号６３）
ＲＢＲＲＢＲＲＷＰＷＷＲＢＲＢＲ（配列番号６４）
ＲＢＲＲＢＲＲＷＷＰＷＲＢＲＢＲ（配列番号６５）
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号６６）
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＲＢＲ（配列番号６７）
ＢＲＢＲＢＷＷＰＷＷＲＢＲＲＢＲ（配列番号６８）
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＢＨＢＨ（配列番号６９）
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＹＲＢＨＢＨ（配列番号７０）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＨ（配列番号７１）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲ［Ｈｙｐ］Ｈ［Ｈｙｐ］Ｈ（配列番号７２）
Ｒ［Ｈｙｐ］ＲＲ［Ｈｙｐ］ＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号７３）
Ｒ［Ｈｙｐ］ＲＲ［Ｈｙｐ］ＲＦＱＩＬＹＲ［Ｈｙｐ］Ｈ［Ｈｙｐ］Ｈ（配列番号７４）
ＲＢＲＲＢＲＷＷＷＲＢＨＢＨ（配列番号７５）
ＲＢＲＲＢＲＷＷＰＲＢＨＢＨ（配列番号７６）
ＲＢＲＲＢＲＰＷＷＲＢＨＢＨ（配列番号７７）
ＲＢＲＲＢＲＷＷＰＷＷＲＢＨＢＨ（配列番号７８）
ＲＢＲＲＢＲＷＷＰＷＲＢＨＢＨ（配列番号７９）
ＲＢＲＲＢＲＷＰＷＷＲＢＨＢＨ（配列番号８０）
ＲＢＲＲＢＲＲＷＷＷＲＢＨＢＨ（配列番号８１）
ＲＢＲＲＢＲＲＷＷＰＷＷＲＢＨＢＨ（配列番号８２）
ＲＢＲＲＢＲＲＷＰＷＷＲＢＨＢＨ（配列番号８３）
ＲＢＲＲＢＲＲＷＷＰＷＲＢＨＢＨ（配列番号８４）
ＲＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号８５）
ＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号８６）
ＲＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＨＢＨ（配列番号８７）
ＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＢＨＢＨ（配列番号８８）
ＲＢＲＲＢＨＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号８９）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹ［Ｈｙｐ］Ｒ［Ｈｙｐ］Ｒ（配列番号１０１）
Ｒ［Ｈｙｐ］ＲＲ［Ｈｙｐ］ＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号１０２）
Ｒ［Ｈｙｐ］ＲＲ［Ｈｙｐ］ＲＦＱＩＬＹ［Ｈｙｐ］Ｒ［Ｈｙｐ］Ｒ（配列番号１０３）
ＲＢＲＲＢＲＷＷＷＢＲＢＲ（配列番号１０４）
ＲＢＲＲＢＲＷＷＰＷＷＢＲＢＲ（配列番号１０５）
【0187】
適切には、ペプチドは、以下の配列のうちの１つからなる：
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＲＢＲＢＲ（配列番号２７）
ＲＢＲＲＢＲＲＹＱＦＬＩＲＢＲＢＲ（配列番号３１）
ＲＢＲＲＢＲＲＩＬＦＱＹＲＢＲＢＲ（配列番号３２）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号３７）
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＨＢＨＢＲ（配列番号３８）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＲＢＲＢＲ（配列番号２７）
ＲＢＲＲＢＲＲＹＱＦＬＩＲＢＲＢＲ（配列番号３１）
ＲＢＲＲＢＲＲＩＬＦＱＹＲＢＲＢＲ（配列番号３２）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号３７）
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＨＢＨＢＲ（配列番号３８）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）
【0188】
一実施形態では、ペプチドは、以下の配列からなる：ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）。
【0189】
一実施形態では、ペプチドは、以下の配列からなる：ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号３７）。
【0190】
一実施形態では、ペプチドは、以下の配列からなる：ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）。
【0191】
コンジュゲート
本発明のペプチドは、コンジュゲートを提供するため、治療用分子に共有結合され得る。
本発明のペプチドは、コンジュゲートを提供するため、治療用分子に共有結合され得る。
【0192】
治療用分子は、疾患を処置するための任意の分子であり得る。治療用分子は、核酸、ペプチド核酸、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えばＰＮＡ、ＰＭＯ）、ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡ（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術の使用において）、短鎖干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ａｎｔａｇｏｍｉＲＮＡ、ペプチド、環状ペプチド、タンパク質、医薬品、薬物、またはナノ粒子から選択することができる。
【0193】
一実施形態では、治療用分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【0194】
適切には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）から構成される。
【0195】
あるいは、オリゴヌクレオチドは、修飾されたＰＭＯ、または任意の他の電荷中性オリゴヌクレオチド、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）、化学的に修飾されたＰＮＡ、例えばガンマＰＮＡ（Ｂａｈａｌ、Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．、２０１６）、オリゴヌクレオチドホスホルアミデート（この場合、リン酸の非架橋酸素はアミンもしくはアルキルアミンで置換されている、例えばＷＯ２０１６０２８１８７Ａ１に記載されているようなもの）または任意の他の部分的または完全に電荷中和されたオリゴヌクレオチドであり得る。
【0196】
治療用アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、利用可能な任意のものから選択することができ、例えば、ＤＭＤにおけるエクソンスキッピングのためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｈｔｔｐｓ：／／ｒｅｓｅａｒｃｈ－ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ．ｕｗａ．ｅｄｕ．ａｕ／ｅｎ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ａｎｔｉｓｅｎｓｅ－ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ－ｅｘｏｎ－ｓｋｉｐｐｉｎｇ－ａｃｒｏｓｓ－ｔｈｅ－ｈｕｍａｎ－に開示されており、または、ＳＭＡを処置するためのＩＳＳＮ１もしくはＩＮ７配列に相補的な治療用アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｚｈｏｕ、ＨＧＴ、２０１３；およびＨａｍｍｏｎｄら、２０１６；およびＯｓｍａｎら、ＨＭＧ、２０１４に開示されている。
【0197】
適切には、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、ＤＭＤの処置において使用するためのエクソンスキッピングを誘導するためのものである。
【0198】
適切には、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、ＤＭＤの処置において使用するためのジストロフィン遺伝子内のエクソンスキッピングを誘導するためのものである。適切には、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、１つまたは複数のエクソンのエクソンスキッピングを誘導することができる。
【0199】
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、ＤＭＤの処置において使用するためのジストロフィン遺伝子の単一エクソンのエクソンスキッピングを誘導するためのものである。適切には、単一エクソンはＤＭＤに関係する任意のエクソンから選択され、これは、ジストロフィン遺伝子内の任意のエクソン、例えばエクソン４５、５１、または５３であり得る。任意の配列のＰＭＯオリゴヌクレオチドは、購入することができる（例えば、Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ Ｉｎｃ、米国から）。
【0200】
一実施形態では、コンジュゲートの治療用分子は、遺伝子標的のプレｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドである。
【0201】
適切には、遺伝子標的のプレｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドは、プレｍＲＮＡを変化させ、変化されたｍＲＮＡをもたらし、それによって変化された配列のタンパク質がもたらされる、立体的ブロッキング事象を生じさせる。適切には、遺伝子標的はジストロフィン遺伝子である。適切には、立体的ブロッキング事象は、エクソンインクルージョンまたはエクソンスキッピングであり得る。一実施形態では、立体的ブロッキング事象は、エクソンスキッピング、適切にはジストロフィン遺伝子の単一エクソンのエクソンスキッピングである。
【0202】
必要に応じて、ペプチドへの結合前に、治療用分子（例えばＰＭＯまたはＰＮＡ）の一端または両端にリシン残基を加え、水溶性を改善することができる。
【0203】
適切には、治療用分子は、５，０００Ｄａ未満、適切には３，０００Ｄａ未満、適切には１，０００Ｄａ未満の分子量を有する。
【0204】
適切には、ペプチドは、Ｃ末端で治療用分子に共有結合されている。
【0205】
適切には、ペプチドは、所望により、リンカーを介して治療用分子に共有結合されている。リンカーは、ペプチド配列を治療用分子から隔てるためのスペーサーとして機能することができる。
【0206】
リンカーは、任意の適切な配列から選択することができる。
【0207】
適切には、リンカーは、ペプチドと治療用分子との間に存在する。適切には、リンカーは、ペプチドおよび治療用分子とは別の群である。したがって、リンカーは、人工アミノ酸を含み得る。
【0208】
一実施形態では、コンジュゲートは、リンカーを介して治療用分子に共有結合されているペプチドを含む。一実施形態では、コンジュゲートは、以下の構造を含む：
［ペプチド］－［リンカー］－［治療用分子］。
［ペプチド］－［リンカー］－［治療用分子］。
【0209】
一実施形態では、コンジュゲートは、以下の構造からなる：
［ペプチド］－［リンカー］－［治療用分子］。
［ペプチド］－［リンカー］－［治療用分子］。
【0210】
適切には、本明細書で列挙されているペプチドのいずれかを本発明に記載のコンジュゲートで使用することができる。一実施形態では、コンジュゲートは、以下の配列のうちの１つから選択されるペプチドを含む：ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）、ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号３７）およびＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）。
【0211】
適切には、いずれの場合においても、ペプチドは、上記で記載したＮ末端修飾をさらに含み得る。
【0212】
適切なリンカーには、例えば、ジスルフィド、チオエーテルまたはチオール－マレイミド結合を形成することができるＣ末端システイン残基、ペプチド上の塩基性アミノ酸とオキシム、クリック反応もしくはモルホリノ結合形成を形成するためのＣ末端アルデヒド、またはアミノ基に共有的にコンジュゲートしてカルボキサミド結合を形成するペプチド上のカルボン酸部分が含まれる。
【0213】
適切には、リンカーは、１アミノ酸から５アミノ酸の間の長さである。適切には、リンカーは、当技術分野で公知の任意のリンカーを含み得る。
【0214】
適切には、リンカーは、以下の配列：Ｇ、ＢＣ、ＸＣ、Ｃ、ＧＧＣ、ＢＢＣ、ＢＸＣ、ＸＢＣ、Ｘ、ＸＸ、Ｂ、ＢＢ、ＢＸおよびＸＢのいずれかから選択される。適切には、ここで、Ｘは、６－アミノヘキサン酸である。
【0215】
適切には、リンカーは、ポリマー、例えばＰＥＧなどであり得る。
【0216】
一実施形態では、リンカーはベータアラニンである。
【0217】
一実施形態では、ペプチドは、カルボキサミド結合を介して治療用分子にコンジュゲートされている。
【0218】
コンジュゲートのリンカーは、ペプチドが結合される治療用分子の一部を形成し得る。あるいは、治療用分子の結合は、ペプチドのＣ末端に直接結合され得る。適切には、そのような実施形態では、リンカーは必要ではない。
【0219】
あるいは、ペプチドは、治療用分子に化学的にコンジュゲートされ得る。化学結合は、例えば、ジスルフィド、アルケニル、アルキニル、アリール、エーテル、チオエーテル、トリアゾール、アミド、カルボキサミド、尿素、チオ尿素、セミカルバジド、カルバジド、ヒドラジン、オキシム、ホスフェート、ホスホルアミデート、チオホスフェート、ボラノホスフェート、イミノホスフェート、またはチオール－マレイミドの結合を介し得る。
【0220】
必要に応じて、システインを治療用分子のＮ末端に付加してペプチドへのジスルフィド結合の形成させることができるか、またはＮ末端をブロモアセチル化させてペプチドへのチオエーテルコンジュゲーションを行うことができる。
【0221】
本発明のペプチドは、コンジュゲートを提供するために、同様に、イメージング分子に共有結合させることができる。
【0222】
適切には、イメージング分子は、コンジュゲートの可視化を可能にする任意の分子であり得る。適切には、イメージング分子は、コンジュゲートの位置を示すことができる。適切には、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでのコンジュゲートの位置である。適切には、コンジュゲートを対象に投与することと、対象をイメージングしてコンジュゲートの位置を確認することとを含む、イメージング分子を含むコンジュゲートの位置をモニターする方法が提供される。
【0223】
イメージング分子の例には、検出分子、コントラスト分子、または増強分子が含まれる。適切なイメージング分子は、放射性核種；フルオロフォア；ナノ粒子（例えばナノシェル）；ナノケージ；発色剤（例えば酵素）、放射性同位元素、色素、放射線不透性物質、蛍光性化合物、およびその組合せから選択され得る。
【0224】
適切には、イメージング分子は、イメージング技術を使用して可視化することができ、これらは細胞イメージング技術または医療用イメージング技術であってもよい。適切な細胞イメージング技術には、例えば、画像サイトメトリー、蛍光顕微鏡法、位相差顕微鏡法、ＳＥＭ、ＴＥＭが含まれる。適切な医療用イメージング技術には、例えば、Ｘ線、透視検査、ＭＲＩ、シンチグラフィー、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、ＣＴ、ＣＡＴ、ＦＮＲＩが含まれる。
【0225】
ある場合には、イメージング分子は、診断用分子と見なされ得る。適切には、診断用分子は、コンジュゲートを使用して疾患の診断を可能にする。適切には、疾患の診断は、イメージング分子を使用して、コンジュゲートの位置を決定することにより達成することができる。適切には、イメージング分子を含むコンジュゲートの有効量を対象に投与することと、コンジュゲートの位置をモニターすることとを含む、疾患の診断方法が提供される。
【0226】
適切には、イメージング分子を含むコンジュゲートの結合などのさらなる詳細は、治療用分子を含むコンジュゲートに関して上記で説明したものと同じである。
【0227】
適切には、本発明のペプチドは、コンジュゲートを提供するために、治療用分子およびイメージング分子に共有結合され得る。
【0228】
適切には、コンジュゲートは、細胞および組織に、適切には細胞の核に透過することが可能である。適切には筋組織に透過することが可能である。
【0229】
医薬組成物
本発明のコンジュゲートは、医薬組成物に製剤化することができる。
本発明のコンジュゲートは、医薬組成物に製剤化することができる。
【0230】
適切には、医薬組成物は、本発明のコンジュゲートを含む。
【0231】
適切には、医薬組成物は、薬学的に許容される希釈剤、アジュバントまたは担体をさらに含み得る。
【0232】
適切な薬学的に許容される希釈剤、アジュバントおよび担体は、当技術分野において周知である。
【0233】
本明細書で使用される場合、句「薬学的に許容される」とは、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、また他の問題もしくは合併症がなく、合理的なベネフィット／リスク比に見合った、ヒトおよび動物の組織との接触において使用するのに適したリガンド、材料、製剤、および／または剤形を意味する。
【0234】
句「薬学的に許容される担体」とは、本明細書で使用される場合、体内のある臓器または部分から体内の別の臓器または部分へコンジュゲートの運搬または輸送に関与する、薬学的に許容される材料、製剤またはビヒクル、例えば、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化材料などを意味する。それぞれの細胞透過性ペプチドは、組成物の他の成分、例えばペプチドと治療用分子と適合性があるという意味において「許容され」なければならず、また個体にとって有害でない。復元および投与され得る凍結乾燥組成物もまた、本組成物の範囲内である。
【0235】
薬学的に許容される担体は、例えば、賦形剤、ビヒクル、希釈剤、およびその組合せであり得る。例えば、組成物が経口的に投与される場合、それらは、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、粉末剤、もしくはシロップ剤として製剤化することができ、または非経口投与の場合、それらは注射剤、点滴注入剤、もしくは坐剤として製剤化することができる。これらの組成物は、従来の手段によって調製することができ、必要に応じて、活性化合物（すなわちコンジュゲート）を任意の従来の添加剤、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、矯味剤、可溶化剤、懸濁助剤、乳化剤、コーティング剤、またはその組合せと混合することができる。
【0236】
本開示の医薬組成物は、本明細書に記載されている疾患、障害、および状態を医療上の使用の下で緩和、媒介、予防、および処置するために、追加の公知の治療剤、薬物、化合物のプロドラッグへの修飾などをさらに含むことができると理解されたい。
【0237】
適切には、医薬組成物は、医薬として使用するためのものである。適切には、コンジュゲートについて本明細書に記載されているのと同じ方法で医薬として使用するためのものである。コンジュゲートを使用する医療処置に関して本明細書に記載されている全ての特徴は、本医薬組成物に適用される。
【0238】
したがって、本発明のさらなる態様では、医薬として使用するための第４の態様に記載の医薬組成物が提供される。さらなる態様では、第４の態様に記載の医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む、疾患状態について対象を処置する方法が提供される。
【0239】
医療上の使用
本発明のペプチドを含むコンジュゲートは、疾患を処置するための医薬として使用することができる。
本発明のペプチドを含むコンジュゲートは、疾患を処置するための医薬として使用することができる。
【0240】
医薬は、上記で定義した医薬組成物の剤形であり得る。
【0241】
疾患状態の処置を必要とする患者または対象を処置する方法であって、治療有効量のコンジュゲートを患者または対象に投与するステップを含む方法も提供される。
【0242】
適切には、医療処置は、細胞への、適切には細胞の核への治療用分子の送達を必要とする。
【0243】
処置しようとする疾患には、治療用分子による細胞および／または核膜の透過の改善が治療効果の改善をもたらし得る任意の疾患が含まれ得る。
【0244】
適切には、コンジュゲートは、筋神経系の疾患の処置で使用するためのものである。
【0245】
本発明のペプチドを含むコンジュゲートは、筋神経系の遺伝疾患の処置に適している。本発明のペプチドを含むコンジュゲートは、遺伝性筋神経疾患の処置に適している。適切な実施形態では、筋神経系の遺伝疾患の処置で使用するための第２の態様に記載のコンジュゲートが提供される。適切には、コンジュゲートは、遺伝性遺伝疾患の処置で使用するためのものである。適切には、コンジュゲートは、筋神経系の遺伝性遺伝疾患の処置で使用するためのものである。適切には、コンジュゲートは、遺伝性遺伝筋神経疾患の処置で使用するためのものである。適切には、コンジュゲートは、筋神経系の遺伝性Ｘ連鎖遺伝疾患の処置で使用するためのものである。適切には、コンジュゲートは、遺伝性Ｘ連鎖筋神経疾患の処置で使用するためのものである。
【0246】
適切には、コンジュゲートは、スプライシング欠損によって引き起こされる疾患の処置で使用するためのものである。そのような実施形態では、治療用分子は、スプライシング欠陥を予防もしくは修正することが可能であり、および／または正しくスプライシングされたｍＲＮＡ分子の産生を増加させることが可能なオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【0247】
適切には、コンジュゲートは、以下の疾患：デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ブッチャー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、メンケス病、ベータサラセミア、認知症、パーキンソン病、脊髄筋萎縮症（ＳＭＡ）、筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ）、ハンチントン舞踏病、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群、毛細血管拡張性運動失調、またはがんのうちのいずれかの処置で使用するためのものである。
【0248】
一実施形態では、コンジュゲートは、ＤＭＤの処置において使用するためのものである。
【0249】
一実施形態では、ＤＭＤの処置において使用するための第２の態様に記載のコンジュゲートが提供される。適切には、そのような実施形態では、コンジュゲートの治療用分子は、ジストロフィンタンパク質の発現を増加させるように作動可能である。適切には、そのような実施形態では、コンジュゲートの治療用分子は、機能性ジストロフィンタンパク質の発現を増加させるように作動可能である。
【0250】
適切には、コンジュゲートは、ジストロフィン発現を１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％増加させる。適切には、コンジュゲートは、ジストロフィンの発現を最大５０％増加させる。
【0251】
適切には、コンジュゲートは、ジストロフィンタンパク質の発現を１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％回復させる。適切には、コンジュゲートは、ジストロフィンタンパク質の発現を最大５０％回復させる。
【0252】
適切には、コンジュゲートは、ジストロフィンタンパク質の機能を１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％回復させる。適切には、コンジュゲートは、ジストロフィンタンパク質の機能を最大５０％回復させる。
【0253】
適切には、コンジュゲートの治療用分子は、ジストロフィン転写中に１つまたは複数のエクソンのスキッピングを引き起こすことによってそうするように作動可能である。
【0254】
適切には、コンジュゲートの治療用分子は、ジストロフィン遺伝子の１つまたは複数のエクソンの１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％のスキッピングを引き起こす。適切には、コンジュゲートの治療用分子は、ジストロフィン遺伝子の１つまたは複数のエクソンの最大５０％のスキッピングを引き起こす。
【0255】
適切には、処置しようとする患者または対象は、任意の動物またはヒトであり得る。適切には、患者または対象は、非ヒト哺乳動物であり得る。適切には、患者または対象は、男性または女性であり得る。一実施形態では、対象は男性である。
【0256】
適切には、処置しようとする患者または対象は、任意の年齢であり得る。適切には、処置しようとする患者または対象は、０から４０歳、適切には０から３０歳、適切には０から２５歳、適切には０から２０歳の間の年齢である。
【0257】
適切には、コンジュゲートは、例えば、髄内、髄腔内、脳室内、硝子体内、経腸、非経口、静脈内、動脈内、筋肉内、腫瘍内、皮下、口腔内、鼻腔内の経路によって対象者に全身投与される。
【0258】
一実施形態では、コンジュゲートは、対象に静脈内投与するためのものである。
【0259】
一実施形態では、コンジュゲートは、対象に注射により静脈内投与するためのものである。
【0260】
適切には、コンジュゲートは、「治療有効量」で対象に投与するためのものであり、それによって、その量が個体に利益性を示すのに十分であることが意味される。投与される実際の量、ならびに投与の速度および時間経過は、処置しようとする疾患の性質および重症度に依存する。用量についての決定は、一般開業医および他の医師の責任の範囲内である。技術およびプロトコールの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２０版、２０００、ｐｕｂ． Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓで確認することができる。
【0261】
例示的な用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇと５０ｍｇ／ｋｇの間、０．０５ｍｇ／ｋｇと４０ｍｇ／ｋｇの間、０．１ｍｇ／ｋｇと３０ｍｇ／ｋｇの間、０．５ｍｇ／ｋｇと１８ｍｇ／ｋｇの間、１ｍｇ／ｋｇと１６ｍｇ／ｋｇの間、２ｍｇ／ｋｇと１５ｍｇ／ｋｇの間、５ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇの間、１０ｍｇ／ｋｇと２０ｍｇ／ｋｇの間、１２ｍｇ／ｋｇと１８ｍｇ／ｋｇの間、１３ｍｇ／ｋｇと１７ｍｇ／ｋｇの間であり得る。
【0262】
有利なことには、本発明のコンジュゲートの用量は、治療用分子単独からのいずれかの効果を見るために必要とされる用量よりも低いオーダーまたは程度である。
【0263】
適切には、本発明のコンジュゲートを投与した後、毒性の１つまたは複数のマーカーは、現在利用可能なペプチド担体を使用する以前のコンジュゲートと比較して有意に減少する。
【0264】
毒性の適切なマーカーは、腎毒性のマーカーであり得る。
【0265】
毒性の適切なマーカーとしては、ＫＩＭ－１、ＮＧＡＬ、ＢＵＮ、クレアチニン、アルカリホスファターゼ、アラニントランスフェラーゼ、およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼが挙げられる。
【0266】
適切には、ＫＩＭ－１、ＮＧＡＬ、およびＢＵＮのうちの少なくとも１つのレベルは、現在利用可能なペプチド担体を使用する以前のコンジュゲートと比較した場合、本発明のコンジュゲートを投与した後に減少する。
【0267】
適切には、ＫＩＭ－１、ＮＧＡＬ、およびＢＵＮのそれぞれのレベルは、現在利用可能なペプチド担体を使用する以前のコンジュゲートと比較した場合、本発明のコンジュゲートを投与した後に減少する。
【0268】
適切には、前記のマーカーまたはそれぞれのマーカーのレベルは、現在利用可能なペプチド担体を使用する以前のコンジュゲートと比較した場合、有意に減少する。
【0269】
適切には、前記のマーカーまたはそれぞれのマーカーのレベルは、現在利用可能なペプチド担体を使用する以前のコンジュゲートと比較した場合、本発明のコンジュゲートを投与した後、最大５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％減少する。
【0270】
有利なことには、ペプチドと、それによって得られるコンジュゲートの毒性は、以前の細胞透過性ペプチドおよびコンジュゲートと比較して有意に減少する。特に、ＫＩＭ－１およびＮＧＡＬ－１は毒性のマーカーであり、これらは、現在利用可能なペプチド担体を使用する以前のコンジュゲートと比較して最大１２０倍有意に減少する。
【0271】
核酸および宿主
本発明のペプチドは、任意の標準のタンパク質合成方法、例えば、化学合成、半化学合成によって、または発現系の使用を介して、生成することができる。
本発明のペプチドは、任意の標準のタンパク質合成方法、例えば、化学合成、半化学合成によって、または発現系の使用を介して、生成することができる。
【0272】
したがって、本発明はまた、ペプチドをコードするＤＮＡを含むかまたはそれからなるヌクレオチド配列、発現系、例えば、発現および発現の制御に必要な配列と一緒に前記配列を含むベクター、ならびに前記発現系によって形質転換された宿主細胞および宿主生物に関する。
【0273】
したがって、本発明に記載のペプチドをコードする核酸もまた提供される。
【0274】
適切には、核酸は、単離または精製された形態で提供することができる。
【0275】
本発明に記載のペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターもまた提供される。
【0276】
適切には、ベクターはプラスミドである。
【0277】
適切には、ベクターは、制御配列、例えば、本発明に記載のペプチドをコードする核酸に作動可能に連結したプロモーターを含む。適切には、発現ベクターは、適切な細胞、例えば哺乳動物、細菌または真菌の細胞にトランスフェクトされた場合にペプチドを発現することが可能である。
【0278】
本発明の発現ベクターを含む宿主細胞もまた提供される。
【0279】
発現ベクターは、本発明の核酸が挿入され得る宿主細胞に応じて選択することができる。宿主細胞のそのような形質転換は、従来の技術、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら［Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．、Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｄ． （２００１） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、ＵＳＡ］で教示されているものを含む。適切なベクターの選択は、本技術分野の当業者の技術範囲内である。適切なベクターには、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、およびウイルスが含まれる。
【0280】
生成されたペプチドは、任意の適切な方法、例えば沈殿またはクロマトグラフィー分離、例えばアフィニティークロマトグラフィーによって、宿主細胞から単離および精製することができる。
【0281】
適切なベクター、宿主および組換え技術は、当技術分野において周知である。
【0282】
本明細書において、用語「作動可能に連結した」とは、選択されたヌクレオチド配列および制御ヌクレオチド配列が、ヌクレオチドコード配列の発現を制御配列の調節下に置くように共有結合されている状況を含むことができ、そのため、制御配列は、選択されたヌクレオチド配列の一部または全部を形成するヌクレオチドコード配列の転写を達成することが可能である。適切な場合には、次いで、得られた転写物は所望のペプチドに翻訳さる得る。
【0283】
本発明のある特定の実施形態は、次に、以下の図および表に関して説明されることになる。
【0284】
本明細書の説明および特許請求の範囲を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」という語、ならびにこれらの語尾変化形は、「含むがこれらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」という意味であり、他の部分、添加剤、成分、整数またはステップを除外するように意図されていない（および除外しない）。本明細書の説明および特許請求の範囲を通して、単数形は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、本明細書は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単数性ばかりでなく複数性も企図していると理解されたい。
【0285】
本発明の特定の態様、実施形態または例とともに記載される特徴、整数、特性、化合物、化学的部分または化学基は、本明細書に記載の任意の他の態様、実施形態または例に、それらと矛盾しない限り、適用可能であると理解されたい。本明細書（任意の添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）で開示される特徴の全て、および／またはそのように開示される任意の方法もしくはプロセスのステップの全ては、そのような特徴および／またはステップの少なくとも一部が相互排他的である組合せを除き、任意の組合せで組み合わせることができる。
【0286】
本発明は、いずれの上記実施形態の詳細にも限定されない。本発明は、本明細書（任意の添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）で開示される特徴の任意の新規の１つもしくは任意の新規の組合せにまで、またはそのように開示される任意の方法もしくはプロセスのステップの任意の新規の１つもしくは任意の新規の組合せにまで及ぶ。読者の注意は、本願に関連して本明細書と同時にまたは本明細書より前に出願される、および本明細書とともに公開される、全ての論文および文献に向けられ、そのような論文および文献の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【0287】
１．材料および方法
１．１ Ｐ－ＰＭＯ合成および調製
９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護Ｌ－アミノ酸、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシ－トリス－ピロリジノ－ホスホニウム（ＰｙＢＯＰ）、２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、およびＦｍｏｃ－β－Ａｌａ－ＯＨがプレローディングされているＷａｎｇ樹脂（０．１９または０．４６ｍｍｏｌ・ｇ－１）は、Ｍｅｒｃｋ（Ｈｏｈｅｎｂｒｕｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル、メタノールおよび合成グレードのＮ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）から購入した。ペプチド合成グレードのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびジエチルエーテルは、ＶＷＲ（Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）から入手した。ピペリジンおよびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（Ｈｅｙｓｈａｍ、Ｅｎｇｌａｎｄ）から入手した。ＰＭＯは、Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ Ｉｎｃ．（Ｐｈｉｌｏｍａｔｈ、ＵＳＡ）から購入した。ニワトリ胚抽出物およびウマ血清は、Ｓｅｒａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ（Ｗｅｓｔ Ｓｕｓｓｅｘ、ＵＫ）から入手した。インターフェロンは、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｐｅｎｚｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。全ての他の試薬は、別段の記述がない限り、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から入手した。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析は、Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ Ｐｒｏ ＢｉｏＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙワークステーションを使用して行った。水中５０％アセトニトリル中の１０ｍｇ・ｍＬ－１のα－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸またはシナピン酸の保存液を鋳型として使用した。エラーバーは、±０．１％である。
１．１ Ｐ－ＰＭＯ合成および調製
９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護Ｌ－アミノ酸、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシ－トリス－ピロリジノ－ホスホニウム（ＰｙＢＯＰ）、２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、およびＦｍｏｃ－β－Ａｌａ－ＯＨがプレローディングされているＷａｎｇ樹脂（０．１９または０．４６ｍｍｏｌ・ｇ－１）は、Ｍｅｒｃｋ（Ｈｏｈｅｎｂｒｕｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル、メタノールおよび合成グレードのＮ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）から購入した。ペプチド合成グレードのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびジエチルエーテルは、ＶＷＲ（Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）から入手した。ピペリジンおよびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（Ｈｅｙｓｈａｍ、Ｅｎｇｌａｎｄ）から入手した。ＰＭＯは、Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ Ｉｎｃ．（Ｐｈｉｌｏｍａｔｈ、ＵＳＡ）から購入した。ニワトリ胚抽出物およびウマ血清は、Ｓｅｒａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ（Ｗｅｓｔ Ｓｕｓｓｅｘ、ＵＫ）から入手した。インターフェロンは、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｐｅｎｚｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。全ての他の試薬は、別段の記述がない限り、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から入手した。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析は、Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ Ｐｒｏ ＢｉｏＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙワークステーションを使用して行った。水中５０％アセトニトリル中の１０ｍｇ・ｍＬ－１のα－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸またはシナピン酸の保存液を鋳型として使用した。エラーバーは、±０．１％である。
【0288】
１．２ Ｈ２ｋ ｍｄｘ細胞におけるスクリーニングのためのＰ－ＰＭＯペプチドの合成
ａ）ペプチド変異体のライブラリーの調製
ペプチドは、Ｆｍｏｃ－β－Ａｌａ－ＯＨがプレローディングされているＷａｎｇ樹脂（０．１９もしくは０．４６ｍｍｏｌ・ｇ－１、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、標準的なＦｍｏｃ化学を適用し、製造業者の推奨手順に従うことにより、Ｉｎｔａｖｉｓ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを使用して１０μｍｏｌスケールで調製するか、またはＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ（商標）Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ、ＵＫ）を使用して１００μｍｏｌスケールで調製した。Ｉｎｔａｖｉｓ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを使用して合成する場合、ＰｙＢＯＰ／ＮＭＭカップリング混合物での二重カップリングステップを使用し、続いて、それぞれのステップ後に無水酢酸のキャッピングを行った。ＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを使用する場合、二重カップリングによって行ったアルギニンを除いて、全てのアミノ酸に対して一本鎖カップリングを実行した。カップリングは、それぞれ２回カップリングしたアルギニン残基を除いて、１回、７５℃で５分間、６０ワットのマイクロ波出力で行った。それぞれの脱保護反応は、７５℃で２回、１回は３０秒間、次いで３分間、３５ワットのマイクロ波出力で行った。合成が完了したら、樹脂をＤＭＦ（３×５０ｍＬ）で洗浄し、固相結合ペプチドのＮ末端をＤＩＰＥＡの存在下、室温で、無水酢酸でアセチル化した。Ｎ末端のアセチル化後、ペプチド樹脂をＤＭＦ（３×２０ｍＬ）およびＤＣＭ（３×２０ｍＬ）で洗浄した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）（９５％：２．５％：２．５％：３～１０ｍＬ）からなる切断カクテルでの３時間、室温での処理により、ペプチドを固体支持体から切断した。ペプチド放出後、過剰なＴＦＡを窒素でのスパージングにより除去した。粗ペプチドを冷ジエチルエーテル（合成規模に依存して１５～４０ｍＬ）の添加および３２００ｒｐｍで５分間の遠心分離により沈殿させた。粗ペプチドペレットを、３回、冷ジエチルエーテル（３×１５ｍＬ）で洗浄し、４４５－ＬＣ Ｓｃａｌｅ－ｕｐモジュールと４４０－ＬＣフラクションコレクターとを取り付けたＶａｒｉａｎ ９４０－ＬＣ ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍを使用してＲＰ－ＨＰＬＣにより精製した。０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ中のＣＨ３ＣＮの線形勾配を使用して１５ｍＬ・分－１の流速でＲＰ－Ｃ１８カラム（１０×２５０ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ）を用いて半分取ＨＰＬＣによりペプチドを精製した。検出は、２２０ｎｍおよび２６０ｎｍで行った。所望のペプチドを含有する画分を併せ、凍結乾燥させて、ペプチドを白色固体として得た。
表１：Ｎ末端アセチル化およびＣ末端ベータ－アラニンリンカーを有する、実施例で試験するために合成したペプチド。Ｐｉｐ９ｂ２およびＲ６Ｇｌｙは、比較ペプチドである。Ｒ６Ｇｌｙは、Ｃ末端グリシンをリンカーとして使用する。
ａ）ペプチド変異体のライブラリーの調製
ペプチドは、Ｆｍｏｃ－β－Ａｌａ－ＯＨがプレローディングされているＷａｎｇ樹脂（０．１９もしくは０．４６ｍｍｏｌ・ｇ－１、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、標準的なＦｍｏｃ化学を適用し、製造業者の推奨手順に従うことにより、Ｉｎｔａｖｉｓ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを使用して１０μｍｏｌスケールで調製するか、またはＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ（商標）Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ、ＵＫ）を使用して１００μｍｏｌスケールで調製した。Ｉｎｔａｖｉｓ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを使用して合成する場合、ＰｙＢＯＰ／ＮＭＭカップリング混合物での二重カップリングステップを使用し、続いて、それぞれのステップ後に無水酢酸のキャッピングを行った。ＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを使用する場合、二重カップリングによって行ったアルギニンを除いて、全てのアミノ酸に対して一本鎖カップリングを実行した。カップリングは、それぞれ２回カップリングしたアルギニン残基を除いて、１回、７５℃で５分間、６０ワットのマイクロ波出力で行った。それぞれの脱保護反応は、７５℃で２回、１回は３０秒間、次いで３分間、３５ワットのマイクロ波出力で行った。合成が完了したら、樹脂をＤＭＦ（３×５０ｍＬ）で洗浄し、固相結合ペプチドのＮ末端をＤＩＰＥＡの存在下、室温で、無水酢酸でアセチル化した。Ｎ末端のアセチル化後、ペプチド樹脂をＤＭＦ（３×２０ｍＬ）およびＤＣＭ（３×２０ｍＬ）で洗浄した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）（９５％：２．５％：２．５％：３～１０ｍＬ）からなる切断カクテルでの３時間、室温での処理により、ペプチドを固体支持体から切断した。ペプチド放出後、過剰なＴＦＡを窒素でのスパージングにより除去した。粗ペプチドを冷ジエチルエーテル（合成規模に依存して１５～４０ｍＬ）の添加および３２００ｒｐｍで５分間の遠心分離により沈殿させた。粗ペプチドペレットを、３回、冷ジエチルエーテル（３×１５ｍＬ）で洗浄し、４４５－ＬＣ Ｓｃａｌｅ－ｕｐモジュールと４４０－ＬＣフラクションコレクターとを取り付けたＶａｒｉａｎ ９４０－ＬＣ ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍを使用してＲＰ－ＨＰＬＣにより精製した。０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ中のＣＨ３ＣＮの線形勾配を使用して１５ｍＬ・分－１の流速でＲＰ－Ｃ１８カラム（１０×２５０ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ）を用いて半分取ＨＰＬＣによりペプチドを精製した。検出は、２２０ｎｍおよび２６０ｎｍで行った。所望のペプチドを含有する画分を併せ、凍結乾燥させて、ペプチドを白色固体として得た。
【表1】
表１：Ｎ末端アセチル化およびＣ末端ベータ－アラニンリンカーを有する、実施例で試験するために合成したペプチド。Ｐｉｐ９ｂ２およびＲ６Ｇｌｙは、比較ペプチドである。Ｒ６Ｇｌｙは、Ｃ末端グリシンをリンカーとして使用する。
【0289】
ｂ）ＰＭＯ－ペプチドコンジュゲートのライブラリーの合成
マウスジストロフィン第２３番エクソンの２５－ｍｅｒ ＰＭＯアンチセンス配列（ＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴＧＡＡＡＴ（配列番号９０））を使用した。ペプチドをそのＣ末端カルボキシル基によってＰＭＯの３’末端にコンジュゲートした。これは、ペプチドに対して２．３当量のＤＩＰＥＡ、およびＤＭＳＯに溶解したＰＭＯに対して２．５倍過剰のペプチドの存在下、ＮＭＰ中の２．３および２当量のＰｙＢＯＰおよびＨＯＡｔをそれぞれ使用して達成した。少数の例では、ペプチドのＣ末端カルボキシル基の活性化のために２．３当量のＨＢＴＵをＰｙＢＯＰの代わりに使用した。一般に、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ、８０μＬ）中のペプチド（２５００ｎｍｏｌ）の溶液に、ＰｙＢＯＰ（ＮＭＰ中０．３Ｍの１９．２μＬ）、（１６．７μＬの０．３Ｍ ＮＭＰ）中のＨＯＡｔ、ＤＩＰＥＡ（１．０μＬ）、およびＰＭＯ（ＤＭＳＯ中１０ｍＭの１００μＬ）を添加した。混合物を２．５時間、４０℃で放置し、Ｈ２Ｏ（３００μＬ）中の０．１％ＴＦＡの添加により反応を停止させた。この溶液を、改造Ｇｉｌｓｏｎ ＨＰＬＣシステムを使用してイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。２０％ＣＨ３ＣＮを含有するリン酸ナトリウム緩衝剤（２５ｍＭ、ｐＨ７．０）中の塩化ナトリウム（０～１Ｍ）の線形勾配を使用して４ｍＬ・分－１の流速でイオン交換カラム（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｓ ４ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＰＭＯ－ペプチドコンジュゲートを精製した。所望のペプチドを含有する画分を併せ、凍結乾燥させて、ペプチド－ＰＭＯ誘導体を白色固体として得た。ペプチド－ＰＭＯコンジュゲートからの過剰な塩の除去は、イオン交換後に回収した画分を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ｕｌｔｒａ－１５ ３Ｋ遠心式フィルターデバイスを使用して濾過することにより行った。コンジュゲートを凍結乾燥させ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦにより分析した。使用前に、コンジュゲートを滅菌水に溶解し、０．２２μｍ酢酸セルロース膜に通して濾過した。ペプチド－ＰＭＯの濃度は、０．１Ｎ ＨＣｌ溶液中のコンジュゲートの２６５ｎｍでのモル吸収により判定した。（収率については表２を参照されたい）。
表２．細胞培養分析のためのＰ－ＰＭＯコンジュゲートの収率（収率は、凍結乾燥させた精製ｐｐｍｏの乾燥重量に基づく。Ｐ－ＰＭＯの純度は、２２０ｎｍおよび２６０ｎｍで順相ＨＰＬＣにより確認して９５％より高い。（ａ）Ｐ－ＰＭＯは、ＰｙＢＯＰの代わりにＨＢＴＵ活性化を使用して合成した）。
マウスジストロフィン第２３番エクソンの２５－ｍｅｒ ＰＭＯアンチセンス配列（ＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴＧＡＡＡＴ（配列番号９０））を使用した。ペプチドをそのＣ末端カルボキシル基によってＰＭＯの３’末端にコンジュゲートした。これは、ペプチドに対して２．３当量のＤＩＰＥＡ、およびＤＭＳＯに溶解したＰＭＯに対して２．５倍過剰のペプチドの存在下、ＮＭＰ中の２．３および２当量のＰｙＢＯＰおよびＨＯＡｔをそれぞれ使用して達成した。少数の例では、ペプチドのＣ末端カルボキシル基の活性化のために２．３当量のＨＢＴＵをＰｙＢＯＰの代わりに使用した。一般に、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ、８０μＬ）中のペプチド（２５００ｎｍｏｌ）の溶液に、ＰｙＢＯＰ（ＮＭＰ中０．３Ｍの１９．２μＬ）、（１６．７μＬの０．３Ｍ ＮＭＰ）中のＨＯＡｔ、ＤＩＰＥＡ（１．０μＬ）、およびＰＭＯ（ＤＭＳＯ中１０ｍＭの１００μＬ）を添加した。混合物を２．５時間、４０℃で放置し、Ｈ２Ｏ（３００μＬ）中の０．１％ＴＦＡの添加により反応を停止させた。この溶液を、改造Ｇｉｌｓｏｎ ＨＰＬＣシステムを使用してイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。２０％ＣＨ３ＣＮを含有するリン酸ナトリウム緩衝剤（２５ｍＭ、ｐＨ７．０）中の塩化ナトリウム（０～１Ｍ）の線形勾配を使用して４ｍＬ・分－１の流速でイオン交換カラム（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｓ ４ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＰＭＯ－ペプチドコンジュゲートを精製した。所望のペプチドを含有する画分を併せ、凍結乾燥させて、ペプチド－ＰＭＯ誘導体を白色固体として得た。ペプチド－ＰＭＯコンジュゲートからの過剰な塩の除去は、イオン交換後に回収した画分を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ｕｌｔｒａ－１５ ３Ｋ遠心式フィルターデバイスを使用して濾過することにより行った。コンジュゲートを凍結乾燥させ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦにより分析した。使用前に、コンジュゲートを滅菌水に溶解し、０．２２μｍ酢酸セルロース膜に通して濾過した。ペプチド－ＰＭＯの濃度は、０．１Ｎ ＨＣｌ溶液中のコンジュゲートの２６５ｎｍでのモル吸収により判定した。（収率については表２を参照されたい）。
【表2】
表２．細胞培養分析のためのＰ－ＰＭＯコンジュゲートの収率（収率は、凍結乾燥させた精製ｐｐｍｏの乾燥重量に基づく。Ｐ－ＰＭＯの純度は、２２０ｎｍおよび２６０ｎｍで順相ＨＰＬＣにより確認して９５％より高い。（ａ）Ｐ－ＰＭＯは、ＰｙＢＯＰの代わりにＨＢＴＵ活性化を使用して合成した）。
【0290】
１．３ 細胞培養
マウスＨ２ｋ ｍｄｘ筋芽細胞を、ゼラチン（０．０１％）被覆フラスコ内で２０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ Ｇｏｌｄ、ＰＡＡ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と、２％ニワトリ胚抽出物（Ｓｅｒａｌａｂ）と、１％ペニシリン－ストレプトマイシン－ネオマイシン抗生物質混合物（ＰＳＮ、Ｇｉｂｃｏ）と、３ｐｇ／μＬのγ－インターフェロン（Ｒｏｃｈｅ）とを補充したダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ ＰＰＡ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において１０％ＣＯ２下、３３℃で培養した。細胞をゼラチン（０．０１％）被覆２４ウェルプレートに２×１０５細胞／ｍＬの密度で播種し、２日間、３３℃、１０％ＣＯ２で放置した。筋管への分化後、５％ウマ血清（Ｓｉｇｍａ）と１％ＰＳＮとを補充したＤＭＥＭにおいて３７℃で、５％ＣＯ２下、２日間細胞をさらに増殖させた。
マウスＨ２ｋ ｍｄｘ筋芽細胞を、ゼラチン（０．０１％）被覆フラスコ内で２０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ Ｇｏｌｄ、ＰＡＡ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と、２％ニワトリ胚抽出物（Ｓｅｒａｌａｂ）と、１％ペニシリン－ストレプトマイシン－ネオマイシン抗生物質混合物（ＰＳＮ、Ｇｉｂｃｏ）と、３ｐｇ／μＬのγ－インターフェロン（Ｒｏｃｈｅ）とを補充したダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ ＰＰＡ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において１０％ＣＯ２下、３３℃で培養した。細胞をゼラチン（０．０１％）被覆２４ウェルプレートに２×１０５細胞／ｍＬの密度で播種し、２日間、３３℃、１０％ＣＯ２で放置した。筋管への分化後、５％ウマ血清（Ｓｉｇｍａ）と１％ＰＳＮとを補充したＤＭＥＭにおいて３７℃で、５％ＣＯ２下、２日間細胞をさらに増殖させた。
【0291】
１．４ 細胞トランスフェクション
無血清Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ中で作製した、上記の通り調製したペプチド－ＰＭＯコンジュゲートとともに、細胞をインキュベートし、３５０μＬをそれぞれのウェルに二重反復で添加し、３７℃で４時間インキュベートした。次いで、トランスフェクション培地を、５％ウマ血清と１％ＰＳＮとを補充したＤＭＥＭで置換し、細胞をさらに２０時間、３７℃でインキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、０．５ｍＬのＴＲＩ ＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ）単離試薬をそれぞれのウェルに添加した。細胞を－８０℃で１時間、凍結させた。
無血清Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ中で作製した、上記の通り調製したペプチド－ＰＭＯコンジュゲートとともに、細胞をインキュベートし、３５０μＬをそれぞれのウェルに二重反復で添加し、３７℃で４時間インキュベートした。次いで、トランスフェクション培地を、５％ウマ血清と１％ＰＳＮとを補充したＤＭＥＭで置換し、細胞をさらに２０時間、３７℃でインキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、０．５ｍＬのＴＲＩ ＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ）単離試薬をそれぞれのウェルに添加した。細胞を－８０℃で１時間、凍結させた。
【0292】
１．５ ＲＮＡ抽出およびネステッドＲＴ－ＰＣＲ分析
全細胞ＲＮＡを、ＴＲＩ試薬を使用して抽出し、エタノールでの追加のさらなる沈殿を行った。精製されたＲＮＡを、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（登録商標）ＮＤ－１０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量した。ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ）を使用するＲＴ－ＰＣＲの鋳型として、ＲＮＡ（４００ｎｇ）を使用した。プライマー配列については、表４を参照されたい。最初の逆転写のサイクル条件は、３０分間５０℃および７分間９４℃を１サイクル、その後、２０秒間９４℃、４０秒間５５℃および８０秒間６８℃を３０サイクルであった。１マイクロリットルのＲＴ－ＰＣＲ産物を第２のＰＣＲステップの鋳型として使用した。０．５ＵのＳｕｐｅｒＴＡＱを使用して、９４℃で３０秒間、５５℃で１分間および７２℃で１分間での２５サイクルで、増幅を行った。１．５％アガロースゲルを使用して電気泳動により産物を分離した。アガロースゲルの画像をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ ＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＸＲＳ＋イメージングシステム（ＢｉｏＲａｄ、ＵＫ）で撮影し、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ（Ｖ４．１）を使用して画像を解析した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌを使用してエクソンスキッピングアッセイデータを解析してプロットし、少なくとも３回の独立した実験からの第２３番エクソンスキッピングのパーセンテージとして表した。
全細胞ＲＮＡを、ＴＲＩ試薬を使用して抽出し、エタノールでの追加のさらなる沈殿を行った。精製されたＲＮＡを、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（登録商標）ＮＤ－１０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量した。ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ）を使用するＲＴ－ＰＣＲの鋳型として、ＲＮＡ（４００ｎｇ）を使用した。プライマー配列については、表４を参照されたい。最初の逆転写のサイクル条件は、３０分間５０℃および７分間９４℃を１サイクル、その後、２０秒間９４℃、４０秒間５５℃および８０秒間６８℃を３０サイクルであった。１マイクロリットルのＲＴ－ＰＣＲ産物を第２のＰＣＲステップの鋳型として使用した。０．５ＵのＳｕｐｅｒＴＡＱを使用して、９４℃で３０秒間、５５℃で１分間および７２℃で１分間での２５サイクルで、増幅を行った。１．５％アガロースゲルを使用して電気泳動により産物を分離した。アガロースゲルの画像をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ ＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＸＲＳ＋イメージングシステム（ＢｉｏＲａｄ、ＵＫ）で撮影し、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ（Ｖ４．１）を使用して画像を解析した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌを使用してエクソンスキッピングアッセイデータを解析してプロットし、少なくとも３回の独立した実験からの第２３番エクソンスキッピングのパーセンテージとして表した。
【0293】
１．６ Ｈ２ｋ ｍｄｘマウスにおける試験のためのＰＭＯ－ペプチドコンジュゲートの合成
ａ）ペプチド変異体の合成
ＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ（商標）マイクロ波Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ、ＵＫ）およびＦｍｏｃ化学を製造業者の推奨手順に従って使用して、ペプチドを１００μｍｏｌ規模で合成した。使用した側鎖保護基は、トリフルオロ酢酸処理に対して不安定であり、ＤＩＰＥＡの存在下、ＰｙＢＯＰ（５倍過剰）を使用して活性化させた５倍過剰のＦｍｏｃ保護アミノ酸（０．２５ｍｍｏｌ）を使用してペプチドを合成した。ピペリジン（ＤＭＦ中２０％ ｖ／ｖ）を使用して、Ｎ－Ｆｍｏｃ保護基を除去した。カップリングは、それぞれ２回カップリングしたアルギニン残基を除いて、１回、７５℃で５分間、６０ワットのマイクロ波出力で行った。それぞれの脱保護反応は、７５℃で２回、１回は３０秒間、次いで１回は３分間、３５ワットのマイクロ波出力で行った。合成が完了したら、樹脂をＤＭＦ（３×５０ｍＬ）で洗浄し、固相結合ペプチドのＮ末端をＤＩＰＥＡの存在下、室温で、無水酢酸でアセチル化した。Ｎ末端のアセチル化後、ペプチド樹脂をＤＭＦ（３×２０ｍＬ）およびＤＣＭ（３×２０ｍＬ）で洗浄した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）（９５％：２．５％：２．５％、１０ｍＬ）からなる切断カクテルでの３時間、室温での処理により、ペプチドを固体支持体から切断した。過剰なＴＦＡを窒素でのスパージングにより除去した。切断されたペプチドを氷冷ジエチルエーテルの添加によって沈殿させ、３０００ｒｐｍで５分間、遠心分離した。粗ペプチドペレットを、３回、冷ジエチルエーテル（３×４０ｍＬ）で洗浄し、４４５－ＬＣ Ｓｃａｌｅ－ｕｐモジュールと４４０－ＬＣフラクションコレクターとを取り付けたＶａｒｉａｎ ９４０－ＬＣ ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍを使用してＲＰ－ＨＰＬＣにより精製した。０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ中のＣＨ３ＣＮの線形勾配を使用して１５ｍＬ・分－１の流速でＲＰ－Ｃ１８カラム（１０×２５０ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ）を用いて半分取ＨＰＬＣによりペプチドを精製した。検出は、２２０ｎｍおよび２６０ｎｍで行った。
ａ）ペプチド変異体の合成
ＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ（商標）マイクロ波Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ、ＵＫ）およびＦｍｏｃ化学を製造業者の推奨手順に従って使用して、ペプチドを１００μｍｏｌ規模で合成した。使用した側鎖保護基は、トリフルオロ酢酸処理に対して不安定であり、ＤＩＰＥＡの存在下、ＰｙＢＯＰ（５倍過剰）を使用して活性化させた５倍過剰のＦｍｏｃ保護アミノ酸（０．２５ｍｍｏｌ）を使用してペプチドを合成した。ピペリジン（ＤＭＦ中２０％ ｖ／ｖ）を使用して、Ｎ－Ｆｍｏｃ保護基を除去した。カップリングは、それぞれ２回カップリングしたアルギニン残基を除いて、１回、７５℃で５分間、６０ワットのマイクロ波出力で行った。それぞれの脱保護反応は、７５℃で２回、１回は３０秒間、次いで１回は３分間、３５ワットのマイクロ波出力で行った。合成が完了したら、樹脂をＤＭＦ（３×５０ｍＬ）で洗浄し、固相結合ペプチドのＮ末端をＤＩＰＥＡの存在下、室温で、無水酢酸でアセチル化した。Ｎ末端のアセチル化後、ペプチド樹脂をＤＭＦ（３×２０ｍＬ）およびＤＣＭ（３×２０ｍＬ）で洗浄した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）（９５％：２．５％：２．５％、１０ｍＬ）からなる切断カクテルでの３時間、室温での処理により、ペプチドを固体支持体から切断した。過剰なＴＦＡを窒素でのスパージングにより除去した。切断されたペプチドを氷冷ジエチルエーテルの添加によって沈殿させ、３０００ｒｐｍで５分間、遠心分離した。粗ペプチドペレットを、３回、冷ジエチルエーテル（３×４０ｍＬ）で洗浄し、４４５－ＬＣ Ｓｃａｌｅ－ｕｐモジュールと４４０－ＬＣフラクションコレクターとを取り付けたＶａｒｉａｎ ９４０－ＬＣ ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍを使用してＲＰ－ＨＰＬＣにより精製した。０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ中のＣＨ３ＣＮの線形勾配を使用して１５ｍＬ・分－１の流速でＲＰ－Ｃ１８カラム（１０×２５０ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ）を用いて半分取ＨＰＬＣによりペプチドを精製した。検出は、２２０ｎｍおよび２６０ｎｍで行った。
【0294】
ｂ）ＰＭＯ－ペプチドコンジュゲートの合成
マウスジストロフィン第２３番エクソンの２５－ｍｅｒ ＰＭＯアンチセンス配列（ＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴＧＡＡＡＴ（配列番号９０））を使用した。ペプチドをそのＣ末端カルボキシル基によってＰＭＯの３’末端にコンジュゲートした。これは、ペプチドに対して２．３当量のＤＩＰＥＡ、およびＤＭＳＯに溶解したＰＭＯに対して２．５倍過剰のペプチドの存在下、ＮＭＰ中の２．３および２倍当量のＰｙＢＯＰおよびＨＯＡｔをそれぞれ使用して達成した。少数の例では、ペプチドのＣ末端カルボキシル基の活性化のためにＨＢＴＵ（２．３当量）をＰｙＢＯＰの代わりに使用した。一般に、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ、１００μＬ）中のペプチド（１０μｍｏｌ）の溶液に、ＰｙＢＯＰ（ＮＭＰ中０．３Ｍの７６．６μＬ）、（６６．７μＬの０．３Ｍ ＮＭＰ）中のＨＯＡｔ、ＤＩＰＥＡ（４．０μＬ）、およびＰＭＯ（ＤＭＳＯ中１０ｍＭの４００μＬ）を添加した。混合物を２時間、４０℃で放置し、０．１％ＴＦＡ（１ｍＬ）の添加により反応を停止させた。２０％ＣＨ３ＣＮを含有するリン酸ナトリウム緩衝剤（２５ｍＭ、ｐＨ７．０）中の塩化ナトリウム（０～１Ｍ）の線形勾配を使用して６ｍＬ・分－１の流速でカチオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｓ ６ｍＬ ｃｏｌｕｍｎ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて反応物を精製した。ペプチド－ＰＭＯコンジュゲートからの過剰な塩の除去は、イオン交換後に回収した画分を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ｕｌｔｒａ－１５ ３Ｋ遠心式フィルターデバイスを使用して濾過することにより行った。コンジュゲートを凍結乾燥させ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦにより分析した。使用前に、コンジュゲートを滅菌水に溶解し、０．２２μｍ酢酸セルロース膜に通して濾過した。ペプチド－ＰＭＯの濃度は、０．１Ｎ ＨＣｌ溶液中のコンジュゲートの２６５ｎｍでのモル吸収により判定した。全収率（表３）は、ＰＭＯに基づいて２５～３６％であった。
表３．ｉｎ ｖｉｖｏでの分析のためにより大きい規模で合成したＰ－ＰＭＯコンジュゲートの収率（収率は、凍結乾燥させた精製ｐｐｍｏの乾燥重量に基づく。ＰＰＭＯの純度は、２２０ｎｍおよび２６０ｎｍで順相ＨＰＬＣにより確認して９５％より高い。（ａ）ＰＰＭＯは、ＰｙＢＯＰの代わりにＨＢＴＵ活性化を使用して合成した）。
マウスジストロフィン第２３番エクソンの２５－ｍｅｒ ＰＭＯアンチセンス配列（ＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴＧＡＡＡＴ（配列番号９０））を使用した。ペプチドをそのＣ末端カルボキシル基によってＰＭＯの３’末端にコンジュゲートした。これは、ペプチドに対して２．３当量のＤＩＰＥＡ、およびＤＭＳＯに溶解したＰＭＯに対して２．５倍過剰のペプチドの存在下、ＮＭＰ中の２．３および２倍当量のＰｙＢＯＰおよびＨＯＡｔをそれぞれ使用して達成した。少数の例では、ペプチドのＣ末端カルボキシル基の活性化のためにＨＢＴＵ（２．３当量）をＰｙＢＯＰの代わりに使用した。一般に、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ、１００μＬ）中のペプチド（１０μｍｏｌ）の溶液に、ＰｙＢＯＰ（ＮＭＰ中０．３Ｍの７６．６μＬ）、（６６．７μＬの０．３Ｍ ＮＭＰ）中のＨＯＡｔ、ＤＩＰＥＡ（４．０μＬ）、およびＰＭＯ（ＤＭＳＯ中１０ｍＭの４００μＬ）を添加した。混合物を２時間、４０℃で放置し、０．１％ＴＦＡ（１ｍＬ）の添加により反応を停止させた。２０％ＣＨ３ＣＮを含有するリン酸ナトリウム緩衝剤（２５ｍＭ、ｐＨ７．０）中の塩化ナトリウム（０～１Ｍ）の線形勾配を使用して６ｍＬ・分－１の流速でカチオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｓ ６ｍＬ ｃｏｌｕｍｎ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて反応物を精製した。ペプチド－ＰＭＯコンジュゲートからの過剰な塩の除去は、イオン交換後に回収した画分を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ｕｌｔｒａ－１５ ３Ｋ遠心式フィルターデバイスを使用して濾過することにより行った。コンジュゲートを凍結乾燥させ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦにより分析した。使用前に、コンジュゲートを滅菌水に溶解し、０．２２μｍ酢酸セルロース膜に通して濾過した。ペプチド－ＰＭＯの濃度は、０．１Ｎ ＨＣｌ溶液中のコンジュゲートの２６５ｎｍでのモル吸収により判定した。全収率（表３）は、ＰＭＯに基づいて２５～３６％であった。
【表3】
表３．ｉｎ ｖｉｖｏでの分析のためにより大きい規模で合成したＰ－ＰＭＯコンジュゲートの収率（収率は、凍結乾燥させた精製ｐｐｍｏの乾燥重量に基づく。ＰＰＭＯの純度は、２２０ｎｍおよび２６０ｎｍで順相ＨＰＬＣにより確認して９５％より高い。（ａ）ＰＰＭＯは、ＰｙＢＯＰの代わりにＨＢＴＵ活性化を使用して合成した）。
【0295】
１．７ Ｐ－ＰＭＯによるジストロフィン修復のｉｎ ｖｉｖｏでの評定
実験は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＯｘｆｏｒｄのＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵｎｉｔにおいてＨｏｍｅ Ｏｆｆｉｃｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｌｉｃｅｎｃｅ ａｕｔｈｏｒｉｓａｔｉｏｎのもとで施設内倫理審査に従って行った。マウスを最小疾患施設で飼育し、環境を１２時間の昼夜サイクルで温度制御した。動物は、市販の齧歯動物用固形飼料および水を自由に摂取した。
実験は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＯｘｆｏｒｄのＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵｎｉｔにおいてＨｏｍｅ Ｏｆｆｉｃｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｌｉｃｅｎｃｅ ａｕｔｈｏｒｉｓａｔｉｏｎのもとで施設内倫理審査に従って行った。マウスを最小疾患施設で飼育し、環境を１２時間の昼夜サイクルで温度制御した。動物は、市販の齧歯動物用固形飼料および水を自由に摂取した。
【0296】
実験は、メス１０～１２週齢ｍｄｘマウスで行った。ｍｄｘマウスを拘束した後、１０ｍｇ／ｋｇのＰ－ＰＭＯの単回尾静脈注射を行った。注射の１週間後、マウスを屠殺し、ＴＡ、心臓および横隔膜筋を除去し、ドライアイス冷却イソペンタンで急速凍結させ、－８０℃で保管した。
【0297】
１．８ ウェスタンブロット分析
単回投与後のジストロフィン修復期間を評定するために、筋肉の３分の１（ＴＡおよび横隔膜について）または７μｍ厚の横断凍結切片（心臓について）を３００μｌの緩衝剤（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１０％ＳＤＳおよびプロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤）に溶解した後、１０分間、１３０００ｒｐｍで遠心分離した（Ｈｅｒａｅｕｓ、＃３３２５Ｂ）。上清を回収し、１００℃で３分間、加熱した。ＢＣＡ法によりタンパク質を定量し、４０μｇタンパク質／試料をＮｕＰａｇｅ ３～８％Ｔｒｉｓ酢酸塩ゲルで以前に記載された（１９）ように分離した。タンパク質を、孔径０．４５μｍのＰＶＤＦ膜に１時間、３０Ｖで、その後、１時間１００Ｖで転写し、モノクローナル抗ジストロフィン（１：２００、ＮＣＬ－ＤＹＳ１、Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ）および抗ビンキュリン（ローディング対照、１：１０００００、ｈＶＩＮ－１、Ｓｉｇｍａ）抗体で以前に記載された（３７）ようにプローブした。二次抗体ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷヤギ抗マウスを１：２００００の希釈で使用した（ＬｉＣＯＲ）。
単回投与後のジストロフィン修復期間を評定するために、筋肉の３分の１（ＴＡおよび横隔膜について）または７μｍ厚の横断凍結切片（心臓について）を３００μｌの緩衝剤（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１０％ＳＤＳおよびプロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤）に溶解した後、１０分間、１３０００ｒｐｍで遠心分離した（Ｈｅｒａｅｕｓ、＃３３２５Ｂ）。上清を回収し、１００℃で３分間、加熱した。ＢＣＡ法によりタンパク質を定量し、４０μｇタンパク質／試料をＮｕＰａｇｅ ３～８％Ｔｒｉｓ酢酸塩ゲルで以前に記載された（１９）ように分離した。タンパク質を、孔径０．４５μｍのＰＶＤＦ膜に１時間、３０Ｖで、その後、１時間１００Ｖで転写し、モノクローナル抗ジストロフィン（１：２００、ＮＣＬ－ＤＹＳ１、Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ）および抗ビンキュリン（ローディング対照、１：１０００００、ｈＶＩＮ－１、Ｓｉｇｍａ）抗体で以前に記載された（３７）ようにプローブした。二次抗体ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷヤギ抗マウスを１：２００００の希釈で使用した（ＬｉＣＯＲ）。
【0298】
Ｐ－ＰＭＯ処置ｍｄｘマウスにおけるジストロフィン修復レベルを、１００％と見なしたＣ５７ＢＬ／１０野生型対照マウスのレベルに対する相対レベルとして表した。このために、Ｐ－ＰＭＯ処置ｍｄｘ試料と並行して５系列のＣ５７ＢＬ／１０タンパク質希釈物を含めることにより、標準曲線を作成した。希釈系列は、次の通りであった：レーンごとにローディングした総タンパク質４０μｇのそれぞれ７５％、４０％、１５％、５％または０％は、Ｃ５７ＢＬ／１０タンパク質溶解物からのものであり、残部は、未処置ｍｄｘタンパク質溶解物からのものであった。これらの標準物質を分取し、処置ｍｄｘ試料と並行してそれぞれのウェスタンブロットに使用した。全ての標準物質および処置試料について、ジストロフィン強度の定量をＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｏｄｙｓｓｅｙイメージングシステムにより行い、全ての試料におけるビンキュリン蛍光強度に対する比を算出することにより正規化した。標準正規化値をそれらの既知のジストロフィン濃度に対してプロットして最もよく当てはまる数式を得、この式を使用して、Ｐ－ＰＭＯ処置ｍｄｘマウスのそれぞれの試料の正規化値を補間した。
【0299】
１．９ ｉｎ ｖｉｖｏでのＤｍｄ第２３エクソンスキッピングのＲＴ－ｑＰＣＲ分析
ペプチド－ＰＭＯで処理した骨格筋および心臓組織を用いて、マウスＤｍｄ転写物からの第２３番エクソンのエクスクルージョンの定量を行った。手短に述べると、均質化された組織からＴｒｉｚｏｌに基づく抽出法を使用してＲＮＡを抽出し、ランダムプライマーを使用してｃＤＮＡを合成した。プライマー／プローブは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成され、非スキップ産物を表す第２３～２４番エクソンにわたる領域を増幅するように設計された（ｍＤＭＤ２３－２４、表４を参照されたい）または第２２番エクソンと第２４番エクソンの境界にわたるプローブを使用して第２３番エクソンを欠いている転写物を特異的に増幅するように設計された（ｍＤＭＤ２２－２４）。既知の転写物量を使用して作成した標準曲線に対してそれぞれの転写物レベルを較正し、［スキップ］／［スキップ＋非スキップ］によりスキッピングパーセンテージを導出した。
表４：ネステッドＲＴ－ＰＣＲ法または定量的ＲＴ－ＰＣＲ法による第２３番エクソンスキッピングの定量のためのプライマーおよびプローブ配列
ペプチド－ＰＭＯで処理した骨格筋および心臓組織を用いて、マウスＤｍｄ転写物からの第２３番エクソンのエクスクルージョンの定量を行った。手短に述べると、均質化された組織からＴｒｉｚｏｌに基づく抽出法を使用してＲＮＡを抽出し、ランダムプライマーを使用してｃＤＮＡを合成した。プライマー／プローブは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成され、非スキップ産物を表す第２３～２４番エクソンにわたる領域を増幅するように設計された（ｍＤＭＤ２３－２４、表４を参照されたい）または第２２番エクソンと第２４番エクソンの境界にわたるプローブを使用して第２３番エクソンを欠いている転写物を特異的に増幅するように設計された（ｍＤＭＤ２２－２４）。既知の転写物量を使用して作成した標準曲線に対してそれぞれの転写物レベルを較正し、［スキップ］／［スキップ＋非スキップ］によりスキッピングパーセンテージを導出した。
【表4】
表４：ネステッドＲＴ－ＰＣＲ法または定量的ＲＴ－ＰＣＲ法による第２３番エクソンスキッピングの定量のためのプライマーおよびプローブ配列
【0300】
１．１０ ペプチド－ＰＭＯの毒物学的評定
８～１０週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウスに０．９％食塩水中のペプチド－ＰＭＯの単一用量３０ｍｇ／ｋｇを尾静脈へのボーラス静脈内注射により投与した。投与後２日目および７日目に、代謝ケージ（Ｔｅｃｎｉｐｌａｓｔ、ＵＫ）に２０時間収容した後、冷却条件下で尿を非侵襲的に採取した。７日目の剖検時に頸静脈から血清を採取し、前脛骨筋、横隔膜および心臓組織も採取した。
８～１０週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウスに０．９％食塩水中のペプチド－ＰＭＯの単一用量３０ｍｇ／ｋｇを尾静脈へのボーラス静脈内注射により投与した。投与後２日目および７日目に、代謝ケージ（Ｔｅｃｎｉｐｌａｓｔ、ＵＫ）に２０時間収容した後、冷却条件下で尿を非侵襲的に採取した。７日目の剖検時に頸静脈から血清を採取し、前脛骨筋、横隔膜および心臓組織も採取した。
【0301】
尾静脈への静脈内注射による０．９％食塩水中のペプチド－ＰＭＯの２．５ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇまでにわたる異なる単一投薬量で同じ手順を踏んだ。
【0302】
標準曲線に当てはまるように尿を適切に希釈した後、ＥＬＩＳＡによりＫＩＭ－１（腎損傷分子－１）およびＮＧＡＬ（好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン）の尿中レベルを定量した（ＫＩＭ－１ Ｒ＆Ｄカタログ番号ＭＫＭ１００、ＮＧＡＬ Ｒ＆Ｄカタログ番号ＭＬＣＮ２０）。ＭＲＣ Ｈａｒｗｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｍａｒｙ Ｌｙｏｎ Ｃｅｎｔｒｅ、Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、ＵＫで定量した尿中クレアチニンレベルに対して値を正規化した。血清血中尿素窒素レベルは、ＭＲＣ Ｈａｒｗｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｍａｒｙ Ｌｙｏｎ Ｃｅｎｔｒｅ、Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、ＵＫで定量した。
【0303】
全てのレベルをＡＵ６８０ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎａｌｙｓｅｒ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒで定量した。
【0304】
エクソンスキッピングの有効性の定量を第２３番エクウソンスキップおよび非スキップ転写物の定量的ＲＴ－ＰＣＲにより判定し、スキップ転写物の全（スキップおよび非スキップ）転写物（配列については表４を参照されたい）に対するパーセンテージとして表した。
【0305】
２．結果
ここで提供する結果は、細胞内でのエクソンスキッピング活性においてここで生成したペプチド－ＰＭＯコンジュゲートの明らかな用量応答効果を実証する（図１、２および１２）。これらの図は、ＤＰＥＰ１およびＤＰＥＰ３系の全て、すなわち本発明のペプチドが、治療上の使用の考慮に足る細胞内への十分な細胞透過有効性を有することも強調する。
ここで提供する結果は、細胞内でのエクソンスキッピング活性においてここで生成したペプチド－ＰＭＯコンジュゲートの明らかな用量応答効果を実証する（図１、２および１２）。これらの図は、ＤＰＥＰ１およびＤＰＥＰ３系の全て、すなわち本発明のペプチドが、治療上の使用の考慮に足る細胞内への十分な細胞透過有効性を有することも強調する。
【0306】
ここで提供する結果は、疾患の適切なマウスモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでのペプチド－ＰＭＯコンジュゲートの活性をさらに強調する（図３～４）。全体的に見て、これらの結果は、このようなコンジュゲートの活性が、前脛骨筋で最大であり、次に横隔膜、その次に心臓であることを示唆している。これらの図は、本発明のＤＰＥＰペプチドコンジュゲートが、ｉｎ ｖｉｖｏで良好なエクソンスキッピング活性を有すること、およびｉｎ ｖｉｖｏでジストロフィンタンパク質発現の増加をもたらすことを実証する。さらに、本発明のＤＰＥＰコンジュゲートは、同じコンジュゲートを使用したとき、両方の点で、「ＰＩＰ」ペプチドおよびＲ６Ｇｌｙなどの以前の細胞透過性ペプチドと比べて勝るとも劣らない。
【0307】
ＤＰＥＰペプチドコンジュゲート化合物の投与後のＫＩＭ－１およびＮＧＡＬ（これらは腎毒性の指標である）のレベルが、以前の細胞透過性ペプチドとのコンジュゲートより有意に低いことも、ここで実証される。ＤＰＥＰ １．９および３．８コンジュゲートは、そのようなマーカーの最低レベルを示した（図５、６および１１）。血清血中尿素窒素レベル（腎機能障害のもう１つのマーカー）も、Ｐｉｐ９ｂ２とのコンジュゲートについてのみ上昇し、本発明のＤＰＥＰペプチドとのコンジュゲートについては上昇しなかった（図７）。第２の主要な発見は、投与の７日後、ＫＩＭ－１およびＮＧＡＬレベルが全てのＤＰＥＰペプチドコンジュゲートについてほぼ食塩水レベルに低下することであり、これは、腎臓関連毒性の何らかの逆転および改善もあることを示唆している。このような効果は、以前の細胞透過性ペプチドを使用するコンジュゲートでは見られなかった。毒性のこの逆転効果は、本発明のＤＥＤＰペプチドでは５０ｍｇ／ｋｇの高用量で与えたときでさえ見られる（図１１）。以前の細胞透過性ペプチドは、７日後には毒性の減少を示さず、全体を通して毒性マーカーがはるかに高いままであった。
【0308】
エクソンスキッピング活性が、ＤＰＥＰペプチドコンジュゲートの全てについて３０および５０ｍｇ／ｋｇのより高用量でＴＡおよび横隔膜において高いままであり（図１０および１２）、これは、腎障害マーカーのレベル低下で裏付けられ、毒性マーカーが何倍も低いのでこれらの化合物のより広い治療指数を示唆する。ＤＰＥＰペプチドコンジュゲートの全てが、コンジュゲート中の公知Ｒ６Ｇｌｙコンパレーターより高い活性を有し、その上、同様の毒性マーカーレベルを少なくとも維持すること、およびコンジュゲート中の公知ＰＩＰペプチドコンパレーターと同様の活性を有し、その上、はるかに低い毒性マーカーレベルを有することも、注目に値する。一部の場合には、本発明のＤＰＥＰペプチドコンジュゲートは、公知Ｒ６Ｇｌｙコンジュゲートと比較して活性の増加ばかりでなく、毒性マーカーの低減も示す。
【0309】
したがって、本発明のＤＰＥＰ１および３ペプチドは、ヒトにおける神経筋障害の処置のための治療用コンジュゲートの有効性を改善し、毒性を低下させるために有望な細胞透過性ペプチドを提供する。
【0310】
３．さらなる実施例
Ｐ－ＰＭＯ合成および調製
９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護Ｌ－アミノ酸、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシ－トリス－ピロリジノ－ホスホニウム（ＰｙＢＯＰ）、２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、およびＦｍｏｃ－β－Ａｌａ－ＯＨがプレローディングされているＷａｎｇ樹脂（０．１９または０．４６ｍｍｏｌ・ｇ－１）は、Ｍｅｒｃｋ（Ｈｏｈｅｎｂｒｕｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル、メタノールおよび合成グレードのＮ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）から購入した。ペプチド合成グレードのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびジエチルエーテルは、ＶＷＲ（Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）から入手した。ピペリジンおよびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（Ｈｅｙｓｈａｍ、Ｅｎｇｌａｎｄ）から入手した。ＰＭＯは、Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ Ｉｎｃ．（Ｐｈｉｌｏｍａｔｈ、ＵＳＡ）から購入した。全ての他の試薬は、別段の記述がない限り、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から入手した。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析は、Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ Ｐｒｏ ＢｉｏＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙワークステーションを使用して行った。水中５０％アセトニトリル中の１０ｍｇ・ｍＬ－１のα－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸またはシナピン酸の保存液を鋳型として使用した。エラーバーは、±０．１％である。
Ｐ－ＰＭＯ合成および調製
９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護Ｌ－アミノ酸、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシ－トリス－ピロリジノ－ホスホニウム（ＰｙＢＯＰ）、２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、およびＦｍｏｃ－β－Ａｌａ－ＯＨがプレローディングされているＷａｎｇ樹脂（０．１９または０．４６ｍｍｏｌ・ｇ－１）は、Ｍｅｒｃｋ（Ｈｏｈｅｎｂｒｕｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル、メタノールおよび合成グレードのＮ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）から購入した。ペプチド合成グレードのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびジエチルエーテルは、ＶＷＲ（Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）から入手した。ピペリジンおよびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（Ｈｅｙｓｈａｍ、Ｅｎｇｌａｎｄ）から入手した。ＰＭＯは、Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ Ｉｎｃ．（Ｐｈｉｌｏｍａｔｈ、ＵＳＡ）から購入した。全ての他の試薬は、別段の記述がない限り、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から入手した。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析は、Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ Ｐｒｏ ＢｉｏＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙワークステーションを使用して行った。水中５０％アセトニトリル中の１０ｍｇ・ｍＬ－１のα－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸またはシナピン酸の保存液を鋳型として使用した。エラーバーは、±０．１％である。
【0311】
細胞におけるスクリーニングのためのＰ－ＰＭＯペプチドの合成
ａ）ペプチド変異体のライブラリーの調製
ペプチドは、Ｆｍｏｃ－β－Ａｌａ－ＯＨがプレローディングされているＷａｎｇ樹脂（０．１９もしくは０．４６ｍｍｏｌ・ｇ－１、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、標準的なＦｍｏｃ化学を適用し、製造業者の推奨手順に従うことにより、Ｉｎｔａｖｉｓ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを使用して１０μｍｏｌスケールで調製するか、またはＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ（商標）Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ、ＵＫ）を使用して１００μｍｏｌスケールで調製した。Ｉｎｔａｖｉｓ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを使用して合成する場合、ＰｙＢＯＰ／ＮＭＭカップリング混合物での二重カップリングステップを使用し、続いて、それぞれのステップ後に無水酢酸のキャッピングを行った。ＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを使用する場合、二重カップリングによって行ったアルギニンを除いて、全てのアミノ酸に対して一本鎖カップリングを実行した。カップリングは、それぞれ２回カップリングしたアルギニン残基を除いて、１回、７５℃で５分間、６０ワットのマイクロ波出力で行った。それぞれの脱保護反応は、７５℃で２回、１回は３０秒間、次いで３分間、３５ワットのマイクロ波出力で行った。合成が完了したら、樹脂をＤＭＦ（３×５０ｍＬ）で洗浄し、固相結合ペプチドのＮ末端をＤＩＰＥＡの存在下、室温で、無水酢酸でアセチル化した。Ｎ末端のアセチル化後、ペプチド樹脂をＤＭＦ（３×２０ｍＬ）およびＤＣＭ（３×２０ｍＬ）で洗浄した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）（９５％：２．５％：２．５％：３～１０ｍＬ）からなる切断カクテルでの３時間、室温での処理により、ペプチドを固体支持体から切断した。ペプチド放出後、過剰なＴＦＡを窒素でのスパージングにより除去した。粗ペプチドを冷ジエチルエーテル（合成規模に依存して１５～４０ｍＬ）の添加および３２００ｒｐｍで５分間の遠心分離により沈殿させた。粗ペプチドペレットを、３回、冷ジエチルエーテル（３×１５ｍＬ）で洗浄し、４４５－ＬＣ Ｓｃａｌｅ－ｕｐモジュールと４４０－ＬＣフラクションコレクターとを取り付けたＶａｒｉａｎ ９４０－ＬＣ ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍを使用してＲＰ－ＨＰＬＣにより精製した。０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ中のＣＨ３ＣＮの線形勾配を使用して１５ｍＬ・分－１の流速でＲＰ－Ｃ１８カラム（１０×２５０ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ）を用いて半分取ＨＰＬＣによりペプチドを精製した。検出は、２２０ｎｍおよび２６０ｎｍで行った。所望のペプチドを含有する画分を併せ、凍結乾燥させて、ペプチドを白色固体として得た（収率について表５を参照されたい）。
表５：Ｎ末端アセチル化（Ａｃ）、Ｃ末端β－アラニンリンカー（Ｂ）を有する、実施例で試験するために合成したペプチド。Ｓ＊は、グルコシル化セリン残基である。ＤＰＥＰ５．７、Ｐｉｐ９ｂ２、およびＰｉｐ６ａは、比較ペプチドである。
ａ）ペプチド変異体のライブラリーの調製
ペプチドは、Ｆｍｏｃ－β－Ａｌａ－ＯＨがプレローディングされているＷａｎｇ樹脂（０．１９もしくは０．４６ｍｍｏｌ・ｇ－１、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、標準的なＦｍｏｃ化学を適用し、製造業者の推奨手順に従うことにより、Ｉｎｔａｖｉｓ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを使用して１０μｍｏｌスケールで調製するか、またはＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ（商標）Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ、ＵＫ）を使用して１００μｍｏｌスケールで調製した。Ｉｎｔａｖｉｓ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを使用して合成する場合、ＰｙＢＯＰ／ＮＭＭカップリング混合物での二重カップリングステップを使用し、続いて、それぞれのステップ後に無水酢酸のキャッピングを行った。ＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを使用する場合、二重カップリングによって行ったアルギニンを除いて、全てのアミノ酸に対して一本鎖カップリングを実行した。カップリングは、それぞれ２回カップリングしたアルギニン残基を除いて、１回、７５℃で５分間、６０ワットのマイクロ波出力で行った。それぞれの脱保護反応は、７５℃で２回、１回は３０秒間、次いで３分間、３５ワットのマイクロ波出力で行った。合成が完了したら、樹脂をＤＭＦ（３×５０ｍＬ）で洗浄し、固相結合ペプチドのＮ末端をＤＩＰＥＡの存在下、室温で、無水酢酸でアセチル化した。Ｎ末端のアセチル化後、ペプチド樹脂をＤＭＦ（３×２０ｍＬ）およびＤＣＭ（３×２０ｍＬ）で洗浄した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）（９５％：２．５％：２．５％：３～１０ｍＬ）からなる切断カクテルでの３時間、室温での処理により、ペプチドを固体支持体から切断した。ペプチド放出後、過剰なＴＦＡを窒素でのスパージングにより除去した。粗ペプチドを冷ジエチルエーテル（合成規模に依存して１５～４０ｍＬ）の添加および３２００ｒｐｍで５分間の遠心分離により沈殿させた。粗ペプチドペレットを、３回、冷ジエチルエーテル（３×１５ｍＬ）で洗浄し、４４５－ＬＣ Ｓｃａｌｅ－ｕｐモジュールと４４０－ＬＣフラクションコレクターとを取り付けたＶａｒｉａｎ ９４０－ＬＣ ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍを使用してＲＰ－ＨＰＬＣにより精製した。０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ中のＣＨ３ＣＮの線形勾配を使用して１５ｍＬ・分－１の流速でＲＰ－Ｃ１８カラム（１０×２５０ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ）を用いて半分取ＨＰＬＣによりペプチドを精製した。検出は、２２０ｎｍおよび２６０ｎｍで行った。所望のペプチドを含有する画分を併せ、凍結乾燥させて、ペプチドを白色固体として得た（収率について表５を参照されたい）。
【表5】
表５：Ｎ末端アセチル化（Ａｃ）、Ｃ末端β－アラニンリンカー（Ｂ）を有する、実施例で試験するために合成したペプチド。Ｓ＊は、グルコシル化セリン残基である。ＤＰＥＰ５．７、Ｐｉｐ９ｂ２、およびＰｉｐ６ａは、比較ペプチドである。
【0312】
ｂ）ペプチド－ＰＭＯコンジュゲートのライブラリーの合成
別名［ＣＡＧ］７として公知のトリプレットリピート配列（ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ（配列番号１０７））の２１－ｍｅｒ ＰＭＯアンチセンス配列を使用した。ペプチドをそのＣ末端カルボキシル基によってＰＭＯの３’末端にコンジュゲートした。これは、２．５当量のＤＩＰＥＡ、およびＤＭＳＯに溶解したＰＭＯに対して２．５倍過剰のペプチドの存在下、ＮＭＰ中の２．５および２当量のＰｙＢＯＰおよびＨＯＡｔをそれぞれ使用して達成した。一般に、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ、８０μＬ）中のペプチド（２５００ｎｍｏｌ）の溶液に、ＰｙＢＯＰ（ＮＭＰ中０．３Ｍの１９．２μＬ）、（１６．７μＬの０．３Ｍ ＮＭＰ）中のＨＯＡｔ、ＤＩＰＥＡ（１．０ｍＬ）、およびＰＭＯ（ＤＭＳＯ中１０ｍＭの１８０μＬ）を添加した。混合物を２．５時間、４０℃で放置し、Ｈ２Ｏ（３００μＬ）中の０．１％ＴＦＡの添加により反応を停止させた。この溶液を、改造Ｇｉｌｓｏｎ ＨＰＬＣシステムを使用してイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。２０％ＣＨ３ＣＮを含有するリン酸ナトリウム緩衝剤（２５ｍＭ、ｐＨ７．０）の線形勾配を使用してイオン交換カラム（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｓ ４ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＰＭＯ－ペプチドコンジュゲートを精製した。塩化ナトリウム溶液（１Ｍ）を使用してコンジュゲートをカラムから４ｍＬ・分－１または６ｍＬ・分－１のどちらかの流速で溶出した。所望の化合物を含有する画分を併せ、直ちに脱塩した。ペプチド－ＰＭＯコンジュゲートからの過剰な塩の除去は、イオン交換後に回収した画分を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ｕｌｔｒａ－１５ ３Ｋ遠心式フィルターデバイスを使用して濾過することにより行った。コンジュゲートを凍結乾燥させ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦにより分析した。使用前に、コンジュゲートを滅菌水に溶解し、０．２２μｍ酢酸セルロース膜に通して濾過した。ペプチド－ＰＭＯの濃度は、０．１Ｎ ＨＣｌ溶液中のコンジュゲートの２６５ｎｍでのモル吸収により判定した。（収率については表６を参照されたい）。
表６．細胞培養分析およびｉｎ ｖｉｖｏでの実験のためのＰ－ＰＭＯコンジュゲートの収率（収率は、凍結乾燥させた精製Ｐ－ＰＭＯの乾燥重量に基づく。Ｐ－ＰＭＯの純度は、２２０ｎｍおよび２６０ｎｍで順相ＨＰＬＣにより確認して９５％より高い。
別名［ＣＡＧ］７として公知のトリプレットリピート配列（ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ（配列番号１０７））の２１－ｍｅｒ ＰＭＯアンチセンス配列を使用した。ペプチドをそのＣ末端カルボキシル基によってＰＭＯの３’末端にコンジュゲートした。これは、２．５当量のＤＩＰＥＡ、およびＤＭＳＯに溶解したＰＭＯに対して２．５倍過剰のペプチドの存在下、ＮＭＰ中の２．５および２当量のＰｙＢＯＰおよびＨＯＡｔをそれぞれ使用して達成した。一般に、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ、８０μＬ）中のペプチド（２５００ｎｍｏｌ）の溶液に、ＰｙＢＯＰ（ＮＭＰ中０．３Ｍの１９．２μＬ）、（１６．７μＬの０．３Ｍ ＮＭＰ）中のＨＯＡｔ、ＤＩＰＥＡ（１．０ｍＬ）、およびＰＭＯ（ＤＭＳＯ中１０ｍＭの１８０μＬ）を添加した。混合物を２．５時間、４０℃で放置し、Ｈ２Ｏ（３００μＬ）中の０．１％ＴＦＡの添加により反応を停止させた。この溶液を、改造Ｇｉｌｓｏｎ ＨＰＬＣシステムを使用してイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。２０％ＣＨ３ＣＮを含有するリン酸ナトリウム緩衝剤（２５ｍＭ、ｐＨ７．０）の線形勾配を使用してイオン交換カラム（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｓ ４ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＰＭＯ－ペプチドコンジュゲートを精製した。塩化ナトリウム溶液（１Ｍ）を使用してコンジュゲートをカラムから４ｍＬ・分－１または６ｍＬ・分－１のどちらかの流速で溶出した。所望の化合物を含有する画分を併せ、直ちに脱塩した。ペプチド－ＰＭＯコンジュゲートからの過剰な塩の除去は、イオン交換後に回収した画分を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ｕｌｔｒａ－１５ ３Ｋ遠心式フィルターデバイスを使用して濾過することにより行った。コンジュゲートを凍結乾燥させ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦにより分析した。使用前に、コンジュゲートを滅菌水に溶解し、０．２２μｍ酢酸セルロース膜に通して濾過した。ペプチド－ＰＭＯの濃度は、０．１Ｎ ＨＣｌ溶液中のコンジュゲートの２６５ｎｍでのモル吸収により判定した。（収率については表６を参照されたい）。
【表6】
表６．細胞培養分析およびｉｎ ｖｉｖｏでの実験のためのＰ－ＰＭＯコンジュゲートの収率（収率は、凍結乾燥させた精製Ｐ－ＰＭＯの乾燥重量に基づく。Ｐ－ＰＭＯの純度は、２２０ｎｍおよび２６０ｎｍで順相ＨＰＬＣにより確認して９５％より高い。
【0313】
ペプチド－ＰＭＯコンジュゲート合成。
前記の通りにペプチドを合成し、ＰＭＯにコンジュゲートした。ＣＵＧ／ＣＴＧ伸長リピート（５’－ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ－３’（配列番号１０７））を標的とするＰＭＯ配列は、Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ ＬＬＣから購入した。これを本明細書の他の箇所では［ＣＡＧ］７ ＰＭＯと呼ぶ。
前記の通りにペプチドを合成し、ＰＭＯにコンジュゲートした。ＣＵＧ／ＣＴＧ伸長リピート（５’－ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ－３’（配列番号１０７））を標的とするＰＭＯ配列は、Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ ＬＬＣから購入した。これを本明細書の他の箇所では［ＣＡＧ］７ ＰＭＯと呼ぶ。
【0314】
細胞培養およびペプチド－ＰＭＯ処理
健常個体または２６００のＣＴＧリピートを有するＤＭ１患者からの不死化筋芽細胞を、２０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、２５μｇ／ｍｌのフェチュインと、０．５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦと、５ｎｇ／ｍｌのＥＧＦと、０．２μｇ／ｍｌのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）とを補充した、Ｍ１９９：ＤＭＥＭの混合物（１：４比、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からなる増殖培地で培養した。コンフルエントな細胞培養物を、筋芽細胞用の５μｇ／ｍｌのインスリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＤＭＥＭ培地に切替えることにより、筋分化を誘導した。処理のために、ＷＴまたはＤＭ１細胞を４日間、分化させた。次いで、培地を、１、２、５、１０、２０または４０μＭ濃度のペプチド－ＰＭＯコンジュゲートを含有する新鮮分化培地と交換した。処理の４８時間後に分析のために細胞を回収した。ヒト肝細胞への４０ｕＭのまたはヒト筋芽細胞への１、２、５、１０、２０もしくは４０μＭ濃度のペプチド－ＰＭＯのトランスフェクションの２日後に、ヒト肝細胞およびヒト筋芽細胞における細胞生存率を、蛍光ベースアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して定量した。
健常個体または２６００のＣＴＧリピートを有するＤＭ１患者からの不死化筋芽細胞を、２０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、２５μｇ／ｍｌのフェチュインと、０．５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦと、５ｎｇ／ｍｌのＥＧＦと、０．２μｇ／ｍｌのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）とを補充した、Ｍ１９９：ＤＭＥＭの混合物（１：４比、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からなる増殖培地で培養した。コンフルエントな細胞培養物を、筋芽細胞用の５μｇ／ｍｌのインスリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＤＭＥＭ培地に切替えることにより、筋分化を誘導した。処理のために、ＷＴまたはＤＭ１細胞を４日間、分化させた。次いで、培地を、１、２、５、１０、２０または４０μＭ濃度のペプチド－ＰＭＯコンジュゲートを含有する新鮮分化培地と交換した。処理の４８時間後に分析のために細胞を回収した。ヒト肝細胞への４０ｕＭのまたはヒト筋芽細胞への１、２、５、１０、２０もしくは４０μＭ濃度のペプチド－ＰＭＯのトランスフェクションの２日後に、ヒト肝細胞およびヒト筋芽細胞における細胞生存率を、蛍光ベースアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して定量した。
【0315】
ＲＮＡ単離、ＲＴ－ＰＣＲおよびｑＰＣＲ分析。
マウス組織の場合：ＲＮＡ抽出前に、ＦａｓｔｐｒｅｐシステムおよびＬｙｓｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ Ｄチューブ（ＭＰ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を使用してＴｒｉＲｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で筋肉を破壊した。ヒト細胞の場合：ＲＮＡ抽出前に、細胞をプロテインキナーゼＫ緩衝剤（５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．２、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２％ＳＤＳおよび０．５ｍｇ／ｍｌのプロテインキナーゼＫ）に４５分間、５５℃で溶解した。ＴｒｉＲｅａｇｅｎｔを製造業者のプロトコールに従って使用して全ＲＮＡを単離した。合計２０μＬのＭ－ＭＬＶ第１鎖合成系（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の使用説明書に従って使用して、１マイクログラムのＲＮＡを逆転写した。その後、１マイクロリットルのｃＤＮＡ調製物を半定量的ＰＣＲ分析において標準プロトコール（ＲｅｄｄｙＭｉｘ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って使用した。それぞれの遺伝子について線形増幅範囲内で２５～３５サイクルのＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ産物を１．５～２％アガロースゲルで分離し、臭化エチジウム染色し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアで定量した。エクソンインクルージョン率を、アイソフォームシグナルの全強度に対するインクルージョンのパーセンテージとして定量した。プライマーを次の表７に示す。
表７：ＰＣＲ用のプライマー
マウス組織の場合：ＲＮＡ抽出前に、ＦａｓｔｐｒｅｐシステムおよびＬｙｓｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ Ｄチューブ（ＭＰ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を使用してＴｒｉＲｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で筋肉を破壊した。ヒト細胞の場合：ＲＮＡ抽出前に、細胞をプロテインキナーゼＫ緩衝剤（５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．２、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２％ＳＤＳおよび０．５ｍｇ／ｍｌのプロテインキナーゼＫ）に４５分間、５５℃で溶解した。ＴｒｉＲｅａｇｅｎｔを製造業者のプロトコールに従って使用して全ＲＮＡを単離した。合計２０μＬのＭ－ＭＬＶ第１鎖合成系（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の使用説明書に従って使用して、１マイクログラムのＲＮＡを逆転写した。その後、１マイクロリットルのｃＤＮＡ調製物を半定量的ＰＣＲ分析において標準プロトコール（ＲｅｄｄｙＭｉｘ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って使用した。それぞれの遺伝子について線形増幅範囲内で２５～３５サイクルのＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ産物を１．５～２％アガロースゲルで分離し、臭化エチジウム染色し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアで定量した。エクソンインクルージョン率を、アイソフォームシグナルの全強度に対するインクルージョンのパーセンテージとして定量した。プライマーを次の表７に示す。
【表7】
表７：ＰＣＲ用のプライマー
【0316】
毒物学
上のセクション１．１０で説明したように毒物学評定を行った。
上のセクション１．１０で説明したように毒物学評定を行った。
【0317】
結果
処置したＤＭ１患者由来の筋肉細胞（筋芽細胞）は、ＤＰＥＰ１または３ペプチド－［ＣＡＧ］７ＰＭＯコンジュゲートが特異的に突然変異型ＣＵＧｅｘｐ－ＤＭＰＫ転写物を標的として、スプライシング欠陥および筋ジストロフィーの原因となる、核ＲＮＡ病巣によるＭＢＮＬ１スプライシング因子の有害な隔離およびその結果としてのＭＢＮＬ１機能低下を抑止することを示した。ＤＰＥＰ１／３ペプチド－［ＣＡＧ］７ＰＭＯコンジュゲートは、細胞を透過し、高い有効性でスプライシング正常化を誘導する（図１３）。いわゆる「ＤＰＥＰ１およびＤＰＥＰ３」ペプチドのこれらの新規生成は、ＣＡＧ７リピートアンチセンスオリゴヌクレオチドＰＭＯとコンジュゲートしたときｉｎ ｖｉｔｒｏでスプライシング欠陥を修正する高い有効性を示した。これは、ＤＭ１の処置のための治療に使用できる可能性があることを示す。
処置したＤＭ１患者由来の筋肉細胞（筋芽細胞）は、ＤＰＥＰ１または３ペプチド－［ＣＡＧ］７ＰＭＯコンジュゲートが特異的に突然変異型ＣＵＧｅｘｐ－ＤＭＰＫ転写物を標的として、スプライシング欠陥および筋ジストロフィーの原因となる、核ＲＮＡ病巣によるＭＢＮＬ１スプライシング因子の有害な隔離およびその結果としてのＭＢＮＬ１機能低下を抑止することを示した。ＤＰＥＰ１／３ペプチド－［ＣＡＧ］７ＰＭＯコンジュゲートは、細胞を透過し、高い有効性でスプライシング正常化を誘導する（図１３）。いわゆる「ＤＰＥＰ１およびＤＰＥＰ３」ペプチドのこれらの新規生成は、ＣＡＧ７リピートアンチセンスオリゴヌクレオチドＰＭＯとコンジュゲートしたときｉｎ ｖｉｔｒｏでスプライシング欠陥を修正する高い有効性を示した。これは、ＤＭ１の処置のための治療に使用できる可能性があることを示す。
【0318】
さらに、ＤＰＥＰ１／３を用いて形成したコンジュゲートの予備的な毒物学的評価は、ＡＬＰ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＫＩＭ－１、ＢＵＮ、ＮＧＡＬおよびクレアチニンレベルが、Ｐｉｐ系からの現在利用可能なペプチド担体により典型的に誘導される増加倍数とは対照的に、食塩水対照注射と同様であったことを示す。この予備的データにより、本発明者らは、ＤＰＥＰペプチドと［ＣＡＧ］７ＰＭＯから形成したコンジュゲートが、Ｐｉｐ６ａなどの以前のペプチドを用いて形成されたコンジュゲートと同様に活性であるが、毒性が低いため、より広い治療域を有することを明らかにした（図１５～１９）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【配列表】