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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-04-08
(45)【発行日】2025-04-16
(54)【発明の名称】蛍光ＧＴＰ類似体および使用
(51)【国際特許分類】
C07H 23/00 20060101AFI20250409BHJP
G01N 33/533 20060101ALI20250409BHJP
G01N 33/542 20060101ALI20250409BHJP
【ＦＩ】
C07H23/00 CSP
G01N33/533
G01N33/542 A
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2021544495
(86)(22)【出願日】2020-01-30
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-04-22
(86)【国際出願番号】 FR2020050149
(87)【国際公開番号】W WO2020157439
(87)【国際公開日】2020-08-06
【審査請求日】2023-01-19
(31)【優先権主張番号】1900856
(32)【優先日】2019-01-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR
(73)【特許権者】
【識別番号】514064671
【氏名又は名称】シスビオ バイオアッセイズ
(74)【代理人】
【識別番号】110000914
【氏名又は名称】弁理士法人ＷｉｓｅＰｌｕｓ
(72)【発明者】
【氏名】ラマルク， ローラン
(72)【発明者】
【氏名】ブリエ， エマニュエル
(72)【発明者】
【氏名】ルー， トマ
(72)【発明者】
【氏名】トリンケ， エリック
(72)【発明者】
【氏名】デュピュイ， エロディ
【審査官】早川 裕之
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２００８／０６３７２１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００９／０６８７５１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Anal. Chem.，2009年，81，5033-5038
【文献】DDT，2002年，18，S150-156
【文献】Inorg. Chem.，2013年，52，8461-8466
【文献】Chem. Rev.，2010年，110，2729-2755
【文献】Applied Spectroscopy Reviews，2005年，40，1-31
【文献】Chem. Rev.，2014年，114，4496-4539
【文献】Journal of Fluorescence，2005年，15，559-568
【文献】Eur. J. Inorg. Chem.，2005年，3918-3927
【文献】Sci. China Tech. Sci.，2018年，61，1265-1285
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｈ
Ｇ０１Ｎ ３３／
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記式：【化1】
【化2】
【化3】
【化4】
【化5】
【化6】
【化7】
【化8】
【化9】
【請求項2】
下記式：【化10】
【請求項3】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の活性化を変化させられる分子を同定する方法であって、ａ）（ｉ）請求項１または２に記載の化合物と（ｉｉ）受容体フルオロフォアで標識された抗Ｇαタンパク質抗体とで構成された一対のＦＲＥＴパートナー、および、試験分子の存在下で、ＧＰＣＲおよびＧαタンパク質を含む膜調製物をインキュベートする工程、および、
ｂ）ＦＲＥＴ信号が現れるかどうかを判定する工程
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｇタンパク質共役受容体の活性化を変化させられる分子をエネルギー移動技術によって検出するのに有用な蛍光ＧＴＰ類似体に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、哺乳類および動物界全体に見られる膜受容体ファミリーである。Ｇタンパク質は、ＧＰＣＲにより活性化されるヘテロ三量体タンパク質（α、β、およびγの３つのサブユニット）である。ＧＰＣＲを介して、Ｇタンパク質は、細胞外からのシグナルを細胞内に伝達する役割（すなわち、外的刺激に対する細胞応答）を果たす。一般的に述べられるその作用機序を図１に示し、以下に概要を示す。
・休止している不活性状態では、Ｇタンパク質のαサブユニットはヌクレオチドＧＤＰに結合している（ＧＤＰに結合した完全なＧタンパク質）。
・ＧＰＣＲの活性化後、ＧＰＣＲはＧタンパク質のαサブユニットに結合し、以下の２段階で構成されるＧタンパク質活性化プロセスを開始する：
１）Ｇタンパク質からＧＤＰが放出されて空のＧタンパク質となり、不活性なＧＰＣＲ／空のＧタンパク質複合体が形成される。
２）ＧＴＰが結合してＧＴＰ型の活性Ｇタンパク質（ＧＴＰに結合した完全なＧタンパク質）が形成される。
第一段階では、受容体に結合したＧタンパク質は「空（から）型」と呼ばれる形態である。文献では、この状態は一過性とされている。というのは、ヌクレオチドＧＴＰが、Ｇタンパク質のαサブユニットへすぐに結合するといわれているからである。また、活性化Ｇタンパク質のβ／γサブユニットがαサブユニットから解離する。
・次いで、ＧＴＰに結合した完全なＧタンパク質のαサブユニットは、エフェクターに結合してエフェクターを活性化する。すると、エフェクターはシグナル伝達経路を活性化し、その結果、細胞応答が起こる。
・次いで、ＧＴＰはＧタンパク質のαサブユニットにより加水分解されてＧＤＰを形成し、αサブユニットはβ／γサブユニットと再結合して、ＧＤＰに結合した完全なＧタンパク質を再形成する（不活性状態）。
・休止している不活性状態では、Ｇタンパク質のαサブユニットはヌクレオチドＧＤＰに結合している（ＧＤＰに結合した完全なＧタンパク質）。
・ＧＰＣＲの活性化後、ＧＰＣＲはＧタンパク質のαサブユニットに結合し、以下の２段階で構成されるＧタンパク質活性化プロセスを開始する：
１）Ｇタンパク質からＧＤＰが放出されて空のＧタンパク質となり、不活性なＧＰＣＲ／空のＧタンパク質複合体が形成される。
２）ＧＴＰが結合してＧＴＰ型の活性Ｇタンパク質（ＧＴＰに結合した完全なＧタンパク質）が形成される。
第一段階では、受容体に結合したＧタンパク質は「空（から）型」と呼ばれる形態である。文献では、この状態は一過性とされている。というのは、ヌクレオチドＧＴＰが、Ｇタンパク質のαサブユニットへすぐに結合するといわれているからである。また、活性化Ｇタンパク質のβ／γサブユニットがαサブユニットから解離する。
・次いで、ＧＴＰに結合した完全なＧタンパク質のαサブユニットは、エフェクターに結合してエフェクターを活性化する。すると、エフェクターはシグナル伝達経路を活性化し、その結果、細胞応答が起こる。
・次いで、ＧＴＰはＧタンパク質のαサブユニットにより加水分解されてＧＤＰを形成し、αサブユニットはβ／γサブユニットと再結合して、ＧＤＰに結合した完全なＧタンパク質を再形成する（不活性状態）。
【0003】
異なるエフェクターに対して異なる選択性プロファイルを示し（非特許文献１）、それによって優先的シグナル伝達経路の活性化を誘導するＧαタンパク質サブタイプがいくつか存在する。
【0004】
ＧＰＣＲは多くの重要な生理学的機能に関与しており、多くの病態に対する好ましい治療標的の１つと見なされている。したがって、ＧＰＣＲを変化させられる分子を同定するために多くのインビトロスクリーニング試験が開発されている。開発された試験は、それぞれ異なるＧタンパク質活性化機構を利用し、様々な技術を採用したものである（非特許文献２）。特に、放射性標識リガンドを用いてＧＰＣＲに対するリガンドの親和性を測定する親和性試験、ＧＰＣＲに結合させたシンチグラフィービーズを用いる近接性シンチグラフィー試験、あるいはＧＴＰγＳ（ＧＴＰ－ガンマ－Ｓ）などの低加水分解性もしくは非加水分解性ＧＴＰを用いる機能性試験が挙げられる。しかしながら、これらの試験は実施が難しく、膜ろ過工程を必要とする場合もあるため、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）試験として用いることが制限される場合もある。ＧＰＣＲ活性化を確認する他の試験も開発されている。これらの試験は、特に、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）（非特許文献３参照）または生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）（非特許文献４）などのエネルギー移動技術（共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ））に基づいている。これら２つの技術には、エネルギーを付与できる分子（供与体という）またはエネルギーを受け取れる分子（受容体という）という概念が関与する（非特許文献５参照）。例えば、ＧＰＣＲに共役した供与体とＧタンパク質に共役した受容体とを用いて（特許文献１および特許文献２）、またはＧタンパク質のαサブユニットに共役した受容体とＧタンパク質のβおよび／またはγサブユニットに共役した供与体とを用いて（非特許文献６）、ＧＰＣＲとＧタンパク質との相互作用を明らかにするエネルギー移動技術が挙げられる。しかしながら、これらの技術は融合タンパク質の調製を必要とし、細胞により内因的に発現された（すなわち、未修飾および非過剰発現の）ＧＰＣＲおよびＧタンパク質の研究が可能でないため、限定的である。一方、受容体により活性化されるＧαタンパク質の各種サブタイプを識別するために、これらの技術は複数の膜試料の調製（Ｇαタンパク質のサブタイプごとの特定の調製）を必要とする。また、エネルギー移動技術は、Ｇタンパク質のＧＴＰ（活性）型またはＧタンパク質のＧＤＰ（不活性）型の変化を視覚化することを目的とした試験の開発にも使用されている。例えば、シアニン型分子に結合したＧＴＰ類似体を採用する特許文献３および特許文献４が挙げられる。
【0005】
特許文献５には、標識されたＡＴＰ誘導体を用いてエネルギー移動信号を検出する方法が記載されている。しかしながら、該誘導体はＧタンパク質に結合できない。非特許文献７には、ＧＴＰ類似体が時間分解蛍光検出法で使用可能であることが記載されている。この類似体は、ＧＴＰのガンマ位にあるリン酸原子に窒素原子を介して結合したユウロピウムキレートで構成されている。しかしながら、ユウロピウムキレートの構造は開示されておらず、当該類似体を合成するのに使用される方法も同様である。非特許文献８には別のＧＴＰ類似体が記載されており、これは、ガンマ－［（８－アミノオクチル）イミド］グアノシン－５’－三リン酸と｛２，２’，２’’，２’’’－｛［［２－（４－イソチオシアナトフェニル）エチル］イミノ］ビス（メチレン）ビス｛４－｛［４－（Ｒ－Ｄ－グルコピラノキシ）フェニル］エチニル｝ピリジン－６，２－ジイル｝ビス（メチレンニトリロ）｝テトラキス（アセタト）｝ユウロピウム（ＩＩＩ）との結合で得られ、その合成は非特許文献９に記載されている。
【0006】
従って、Ｇタンパク質に結合可能な化合物であって、Ｇタンパク質共役受容体の活性化を変化させられる分子をエネルギー移動技術によって検出する方法で実際に使用できる化合物を利用したいというニーズが実際に存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】国際公開第２００６／０８６８８３号
【文献】国際公開第２００３／００８４３５号
【文献】国際公開第２００６／０３５２０８号
【文献】米国特許出願公開第２００７／０２８７１６２号明細書
【文献】国際公開第２００９／０６８７５１号
【非特許文献】
【0008】
【文献】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１６，４２８，３８５０
【文献】Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．；Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ＧＰＣＲ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ；Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ，２０１２，３３，３７２
【文献】Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，４１，１３９１
【文献】Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９９，９６（１），１５１
【文献】Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ，２００７，９，５８４７
【文献】Ｂｕｎｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００３，２６，１６０７７
【文献】Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ，２００２，７（１８），Ｓ１５０
【文献】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００９，８１，５０３３
【文献】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，７５，３１９３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明は、ランタニド錯体に結合する、一般式（Ｉ）：
（式中、
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、またはＣＨ２であり、
Ｙは、Ｏ、ＮＨ、またはＣＨ２であり、
Ｌは、二価の連結基であり、
Ｌｎ３＋は、反応性基Ｇ３（下記で定義する）を有していてもよいランタニド錯体であるが、
ＸがＮＨでありＬ－Ｙがオクチルアミノ基である場合、Ｌｎ３＋は｛２，２’，２’’，２’’’－｛［［２－（４－イソチオシアナトフェニル）エチル］イミノ］ビス（メチレン）ビス｛４－｛［４－（Ｒ－Ｄ－グルコピラノキシ）フェニル］エチニル｝ピリジン－６，２－ジイル｝ビス（メチレンニトリロ）｝テトラキス（アセタト）｝ユウロピウム（ＩＩＩ）ではないことが理解される）で表されるＧＴＰまたはその誘導体の新規な分子を提供することを目的とする。
【化1】
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、またはＣＨ２であり、
Ｙは、Ｏ、ＮＨ、またはＣＨ２であり、
Ｌは、二価の連結基であり、
Ｌｎ３＋は、反応性基Ｇ３（下記で定義する）を有していてもよいランタニド錯体であるが、
ＸがＮＨでありＬ－Ｙがオクチルアミノ基である場合、Ｌｎ３＋は｛２，２’，２’’，２’’’－｛［［２－（４－イソチオシアナトフェニル）エチル］イミノ］ビス（メチレン）ビス｛４－｛［４－（Ｒ－Ｄ－グルコピラノキシ）フェニル］エチニル｝ピリジン－６，２－ジイル｝ビス（メチレンニトリロ）｝テトラキス（アセタト）｝ユウロピウム（ＩＩＩ）ではないことが理解される）で表されるＧＴＰまたはその誘導体の新規な分子を提供することを目的とする。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】Ｇタンパク質の作用機序を表す。
【図2】本発明の化合物とＧタンパク質との結合を検出するのに使用されるアッセイフォーマットを表す。
【図3】本発明の化合物をＧαｉタンパク質に結合させる試験を表す。
【図4】本発明の化合物をＧαｉタンパク質に結合させる試験を表す。
【図5】本発明の化合物をＧαｉタンパク質に結合させる試験を表す。
【図6】本発明の化合物をＧαｉタンパク質に結合させる試験を表す。
【図7】本発明の化合物をＧαｉタンパク質に結合させる試験を表す。
【図8】本発明の化合物をＧαｉタンパク質に結合させる試験を表す。
【図9】本発明の化合物をＧαｉタンパク質に結合させる試験を表す。
【図10】本発明の化合物をＧαｉタンパク質に結合させる試験を表す。
【図11】膜および試験化合物の濃度が該化合物とＧαｉタンパク質との結合に与える効果を表す。
【図12】本発明の化合物をＧαｉタンパク質に結合させる試験を表す。
【発明を実施するための形態】
【0011】
一態様によれば、本発明は、式（Ｉ）：
（式中、
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、またはＣＨ２であり、
Ｙは、Ｏ、ＮＨ、またはＣＨ２であり、
Ｌは、二価の連結基であり、
Ｌｎ３＋は、反応性基Ｇ３（下記で定義する）を有していてもよいランタニド錯体であるが、
但し、ＸがＮＨでありＬ－Ｙがオクチルアミノ基である場合、Ｌｎ３＋は｛２，２’，２’’，２’’’－｛［［２－（４－イソチオシアナトフェニル）エチル］イミノ］ビス（メチレン）ビス｛４－｛［４－（Ｒ－Ｄ－グルコピラノキシ）フェニル］エチニル｝ピリジン－６，２－ジイル｝ビス（メチレンニトリロ）｝テトラキス（アセタト）｝ユウロピウム（ＩＩＩ）ではない）で表される化合物に関する。
【化2】
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、またはＣＨ２であり、
Ｙは、Ｏ、ＮＨ、またはＣＨ２であり、
Ｌは、二価の連結基であり、
Ｌｎ３＋は、反応性基Ｇ３（下記で定義する）を有していてもよいランタニド錯体であるが、
但し、ＸがＮＨでありＬ－Ｙがオクチルアミノ基である場合、Ｌｎ３＋は｛２，２’，２’’，２’’’－｛［［２－（４－イソチオシアナトフェニル）エチル］イミノ］ビス（メチレン）ビス｛４－｛［４－（Ｒ－Ｄ－グルコピラノキシ）フェニル］エチニル｝ピリジン－６，２－ジイル｝ビス（メチレンニトリロ）｝テトラキス（アセタト）｝ユウロピウム（ＩＩＩ）ではない）で表される化合物に関する。
【0012】
「ランタニド錯体」という語は、ランタニドファミリーの原子を錯体化できるキレート、大環状分子、クリプテート、または任意の有機種を意味するものと理解され、ランタニド（Ｌｎ）は、Ｅｕ、Ｓｍ、Ｔｂ、Ｇｄ、Ｄｙ、Ｎｄ、またはＥｒから選択される。ランタニドは、Ｔｂ、Ｓｍ、またはＥｕであることが好ましく、ＥｕまたはＴｂであることがより好ましい。
【0013】
式（Ｉ）の各種化合物のファミリーは、式（Ｉａ）～（Ｉｇ）：
（式中、ＬおよびＬｎ３＋は、上で示した意味を有する）で表される。
【化3】
【0014】
本発明に係る化合物の第１のファミリーは、式（Ｉａ）、（Ｉｄ）、および（Ｉｆ）の化合物で構成される。このファミリーはＧＴＰ－ガンマ－Ｏファミリーと呼ばれる（二価の連結基が酸素原子を介してＧＴＰのガンマ位にあるリン酸に結合しているため）。本発明に係る化合物の第２のファミリーは、式（Ｉｂ）、（Ｉｅ）、および（Ｉｇ）の化合物で構成される。このファミリーはＧＴＰ－ガンマ－Ｎファミリーと呼ばれる（二価の連結基が窒素原子を介してＧＴＰのガンマ位にあるリン酸に結合しているため）。本発明に係る化合物の第３のファミリーは、式（Ｉｃ）の化合物で構成される。このファミリーはＧＴＰ－ガンマ－Ｃファミリーと呼ばれる（二価の連結基が炭素原子を介してＧＴＰのガンマ位にあるリン酸に結合しているため）。
【0015】
一実施形態において、ＸはＯである。別の実施形態において、ＸはＮＨである。別の実施形態において、ＸはＣＨ２である。
【0016】
一実施形態において、二価の連結基Ｌは、
・直接結合；
・１つ以上の二重または三重結合を含んでいてもよい直鎖状または分岐鎖状の炭素数１～２０、好ましくは炭素数１～８のアルキレン基；
・炭素数５～８のシクロアルキレン基；または
・炭素数６～１４のアリーレン基
から選択され、
上記アルキレン基、シクロアルキレン基、またはアリーレン基は、酸素、窒素、硫黄、もしくはリン等のヘテロ原子を１個以上、またはカルバモイル基もしくはカルボキサミド基を１個以上含んでいてもよく、上記アルキレン基、シクロアルキレン基、またはアリーレン基は、１～５個、好ましくは１～３個の炭素数１～８のアルキル基、炭素数６～１４のアリール基、スルホネート基、またはオキソ基で置換されていてもよい。
・直接結合；
・１つ以上の二重または三重結合を含んでいてもよい直鎖状または分岐鎖状の炭素数１～２０、好ましくは炭素数１～８のアルキレン基；
・炭素数５～８のシクロアルキレン基；または
・炭素数６～１４のアリーレン基
から選択され、
上記アルキレン基、シクロアルキレン基、またはアリーレン基は、酸素、窒素、硫黄、もしくはリン等のヘテロ原子を１個以上、またはカルバモイル基もしくはカルボキサミド基を１個以上含んでいてもよく、上記アルキレン基、シクロアルキレン基、またはアリーレン基は、１～５個、好ましくは１～３個の炭素数１～８のアルキル基、炭素数６～１４のアリール基、スルホネート基、またはオキソ基で置換されていてもよい。
【0017】
二価の連結基Ｌは、以下の基：
（式中、ｎ、ｍ、ｐ、およびｑは１～１６、好ましくは１～５の整数であり、ｅは１～６、好ましくは１～４の範囲の整数である）から選択されることが有利である。
【化4】
【0018】
特に有利な方法では、二価の連結基Ｌは、直接結合、直鎖状または分岐鎖状の炭素数１～８のアルキレン基、または下記式：
の基から選択される。
【化5】
【0019】
二価の連結基Ｌは、以下：
から選択されることが好ましく、－（ＣＨ２）ｎ－基が特に好ましい。
【化6】
【0020】
別の実施形態によれば、二価の連結基Ｌは、式：
（式中、ｍ、ｎ、およびｐは、１～１６、好ましくは１～５の整数である）の基である。
【化7】
【0021】
一実施形態において、ランタニド錯体Ｌｎ３＋は、下記錯体のうちの１つから選択される。
【化8】
【化9】
【化10】
【化11】
【化12】
【化13】
【化14】
【化15】
【化16】
【化17】
【化18】
【化19】
【化20】
【化21】
【化22】
【化23】
【化24】
【化25】
【化26】
【化27】
【化28】
【化29】
【化30】
【化31】
【化32】
【化33】
【化34】
【化35】
【化36】
【化37】
【化38】
【化39】
【化40】
【化41】
【化42】
【化43】
【0022】
ｐＨに応じて、－ＳＯ３Ｈ基、－ＣＯ２Ｈ基、および－ＰＯ（ＯＨ）２基は脱プロトン化された形態またはされていない形態である。従って、これらの基は、－ＳＯ３
－基、－ＣＯ２
－基、および－ＰＯ（ＯＨ）Ｏ－基とも表される。
【0023】
ランタニド錯体Ｌｎ３＋は、錯体Ｃ１～Ｃ１７、Ｃ２４～Ｃ３２、およびＣ３６～Ｃ４４のうちの１つから選択されることが有利である。ランタニド錯体Ｌｎ３＋は、錯体Ｃ１～Ｃ１７およびＣ３６～Ｃ４４のうちの１つから選択されることがより有利である。ランタニド錯体Ｌｎ３＋は、錯体Ｃ１～Ｃ１７のうちの１つから選択されることが更に有利である。ランタニド錯体Ｌｎ３＋は、錯体Ｃ１～Ｃ４およびＣ１１～Ｃ１７のうちの１つから選択されることが更に有利である。ランタニド錯体Ｌｎ３＋は、錯体Ｃ１～Ｃ４およびＣ１１のうちの１つから選択されることが更に有利である。ランタニド錯体Ｌｎ３＋は、錯体Ｃ２または錯体Ｃ３であることが非常に有利である。
【0024】
ランタニド錯体Ｃ１～Ｃ９０は、以下の出版物に記載されている。これらの錯体は、市販されているか、あるいは下記出版物に記載された合成経路で得られる。
Ｃ１：国際公開第０３／０７６９３８号
Ｃ２：欧州特許出願公開第０ ２０３ ０４７号明細書
Ｃ３～Ｃ４：国際公開第２００８／０２５８８６号
Ｃ５：Ｓｐｅｃｔｒｏｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ；Ｐａｒｔ Ａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，２００１，５７（１１），２１９７．
Ｃ６：Ｓｐｅｃｔｒｏｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ；Ｐａｒｔ Ａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，２００１，５７（１１），２１９７．
Ｃ７：Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０００，２８６（１），１７．
Ｃ８：国際公開第０１／９６８７７号
Ｃ９：Ｓｐｅｃｔｒｏｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ；Ｐａｒｔ Ａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，２００１，５７（１１），２１９７．
Ｃ１０：国際公開第０１／９６８７７号
Ｃ１１：国際公開第２００８／０６３７２１号
Ｃ１２～Ｃ１７：国際公開第２０１７／０９８１８０号
Ｃ１８～Ｃ２０：国際公開第２０１３／０１１２３６号
Ｃ２１～Ｃ３５：国際公開第２０１４／１１１６６１号
Ｃ３６～Ｃ４４：国際公開第２０１８／２２９４０８号
Ｃ４５～Ｃ４７：Ｏｒｇａｎｉｃ＆Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１２，１０，８５０９．
Ｃ４８：国際公開第２０１０／０８４０９０号
Ｃ４９：国際公開第２００９／０１０５８０号
Ｃ５０～Ｃ５１：Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２００７，３８４１
Ｃ５２：国際公開第２００６／１２０４４４号
Ｃ５３：Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１０，３９６１．
Ｃ５４：Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００９，２０（３），６２５．
Ｃ５５：欧州特許出願公開第０ ７７０ ６１０号明細書
Ｃ５６：国際公開第２０１６／１０６２４１号
Ｃ５７～Ｃ５８：欧州特許出願公開第０ ７７０ ６１０号明細書
Ｃ５９～Ｃ６０：Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，７５，３１９３－３２０１
Ｃ６１：Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７，８（２），１２７
Ｃ６２：国際公開第９３／１１４３３号
Ｃ６３：米国特許出願公開第５ ６９６ ２４０号明細書
Ｃ６４ａ～Ｃ８１ｂ：国際公開第２０１８／２２９３２号
Ｃ８２：国際公開第２０１０／０７０２３２号
Ｃ８３～Ｃ８５：国際公開第２０１８／０４５３８５号
Ｃ８６ａ～ｂ：Ａｎａｌｙｓｔ，２０１０，１３５（１），４２
Ｃ８７～Ｃ８９：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ－Ａ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１１，１７，９１６４
Ｃ９０：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，２００４，１２６（１５），４８８８
Ｃ１：国際公開第０３／０７６９３８号
Ｃ２：欧州特許出願公開第０ ２０３ ０４７号明細書
Ｃ３～Ｃ４：国際公開第２００８／０２５８８６号
Ｃ５：Ｓｐｅｃｔｒｏｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ；Ｐａｒｔ Ａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，２００１，５７（１１），２１９７．
Ｃ６：Ｓｐｅｃｔｒｏｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ；Ｐａｒｔ Ａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，２００１，５７（１１），２１９７．
Ｃ７：Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０００，２８６（１），１７．
Ｃ８：国際公開第０１／９６８７７号
Ｃ９：Ｓｐｅｃｔｒｏｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ；Ｐａｒｔ Ａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，２００１，５７（１１），２１９７．
Ｃ１０：国際公開第０１／９６８７７号
Ｃ１１：国際公開第２００８／０６３７２１号
Ｃ１２～Ｃ１７：国際公開第２０１７／０９８１８０号
Ｃ１８～Ｃ２０：国際公開第２０１３／０１１２３６号
Ｃ２１～Ｃ３５：国際公開第２０１４／１１１６６１号
Ｃ３６～Ｃ４４：国際公開第２０１８／２２９４０８号
Ｃ４５～Ｃ４７：Ｏｒｇａｎｉｃ＆Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１２，１０，８５０９．
Ｃ４８：国際公開第２０１０／０８４０９０号
Ｃ４９：国際公開第２００９／０１０５８０号
Ｃ５０～Ｃ５１：Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２００７，３８４１
Ｃ５２：国際公開第２００６／１２０４４４号
Ｃ５３：Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１０，３９６１．
Ｃ５４：Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００９，２０（３），６２５．
Ｃ５５：欧州特許出願公開第０ ７７０ ６１０号明細書
Ｃ５６：国際公開第２０１６／１０６２４１号
Ｃ５７～Ｃ５８：欧州特許出願公開第０ ７７０ ６１０号明細書
Ｃ５９～Ｃ６０：Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，７５，３１９３－３２０１
Ｃ６１：Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７，８（２），１２７
Ｃ６２：国際公開第９３／１１４３３号
Ｃ６３：米国特許出願公開第５ ６９６ ２４０号明細書
Ｃ６４ａ～Ｃ８１ｂ：国際公開第２０１８／２２９３２号
Ｃ８２：国際公開第２０１０／０７０２３２号
Ｃ８３～Ｃ８５：国際公開第２０１８／０４５３８５号
Ｃ８６ａ～ｂ：Ａｎａｌｙｓｔ，２０１０，１３５（１），４２
Ｃ８７～Ｃ８９：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ－Ａ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１１，１７，９１６４
Ｃ９０：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，２００４，１２６（１５），４８８８
【0025】
以下のスキーム１～１９で、式（Ｉ）の化合物の合成をより詳細に説明する。これらの化合物は、典型的には、反応性基の使用に基づいて２つの有機分子を共役させる手法によって得られる。上記手法は当業者の一般知識の範囲内にあり、例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００８，ｐｐ．１６９－２１１に記載されている。ＧＴＰ－ガンマ－Ｏ化合物を得るために、まずはＧＴＰを式Ｇ２－Ｌ－Ｇ１の化合物と反応させ、こうして形成された中間体化合物をランタニド錯体と共役させる。上記式Ｇ２－Ｌ－Ｇ１中、
Ｌは、上で定義した二価の連結基であり、
Ｇ１は、ＧＴＰのガンマ位にあるリン酸のＯＨ官能基と反応可能な反応性求電子基であり、
Ｇ２は、ランタニド錯体Ｌｎ３＋が有する反応性基（Ｇ３）と反応可能な反応性基である。
Ｌは、上で定義した二価の連結基であり、
Ｇ１は、ＧＴＰのガンマ位にあるリン酸のＯＨ官能基と反応可能な反応性求電子基であり、
Ｇ２は、ランタニド錯体Ｌｎ３＋が有する反応性基（Ｇ３）と反応可能な反応性基である。
【0026】
中間体化合物（反応性基Ｇ２を有する）とランタニド錯体（反応性基Ｇ３を有する）との共役反応の結果、反応性基の原子を１個以上有する共有結合が形成される。
【0027】
一実施形態において、求電子基Ｇ１は、
・ガンマ位にあるリン酸のヒドロキシ官能基と反応できる反応種を中間体として形成する反応物質により活性化されるＯＨ基、または、
・例えば、脂肪族塩化物、脂肪族臭化物、脂肪族ヨウ化物、脂肪族メシレート、脂肪族トシレート、および脂肪族トリフレート等の脱離基タイプの反応性基である。
・ガンマ位にあるリン酸のヒドロキシ官能基と反応できる反応種を中間体として形成する反応物質により活性化されるＯＨ基、または、
・例えば、脂肪族塩化物、脂肪族臭化物、脂肪族ヨウ化物、脂肪族メシレート、脂肪族トシレート、および脂肪族トリフレート等の脱離基タイプの反応性基である。
【0028】
一実施形態において、反応性基Ｇ２およびＧ３は、互いに独立して以下の基：アクリルアミド、活性化されていてもよいアミン（例えば、カダベリンまたはエチレンジアミン）、活性化エステル、アルデヒド、ハロゲン化アルキル、無水物、アニリン、アジド、アジリジン、カルボン酸、ジアゾアルカン、ハロアセトアミド、モノクロロトリアジンもしくはジクロロトリアジン等のハロトリアジン、ヒドラジン（ヒドラジドを含む）、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ハロゲン化スルホニル、チオール、ケトン、酸ハロゲン化物、スクシンイミジルエステル、ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、アジドニトロフェニル、アジドフェニル、３－（２－ピリジルジチオ）プロピオンアミド、グリオキサール、トリアジン、アセチレン基のうちの１つから選択され、特に、式：
（式中、ｗは０～８まで変化し、ｖは０または１に等しく、Ａｒは１～３個のヘテロ原子を含む飽和または不飽和の５または６員複素環であり、ハロゲン原子で置換されていてもよい）の基から選択される基である。
【化44】
【0029】
Ｇ２およびＧ３は、適合する保護基で保護されたそれらの形態に由来したものであってもよい。
【0030】
反応性基Ｇ２およびＧ３は、互いに独立して、アミン（－ＮＨＢｏｃの形態で保護されていてもよい）、スクシンイミジルエステル、ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ハロアセトアミド、ヒドラジン、ハロトリアジン、イソチオシアネート、マレイミド基、またはカルボン酸（－ＣＯ２Ｍｅまたは－ＣＯ２ｔＢｕ基の形態で保護されていてもよい）から選択されることが好ましい。後者の場合、求核種と反応可能とするために、酸をエステルの形態で活性化することが必要となる。
【0031】
ＧＴＰ－ガンマ－Ｎ化合物を得るために、ランタニド錯体がＮＨ２基を有する場合、ＧＴＰをランタニド錯体と直接反応させることができる。また、ＧＴＰは、式２ＨＮ－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２（式中、ｎは上で定義した通りであり、アミノ基のうち１つは保護基で保護されていてもよい）の化合物と反応させることができ、次いで、得られた中間体化合物を、上で定義した反応性基Ｇ３で官能化したランタニド錯体と結合させることができる。
【0032】
本発明に係る化合物は、Ｇタンパク質に結合できる。この性質は、ＦＲＥＴ原理に基づくイムノアッセイによって、受容体フルオロフォアで標識された抗Ｇαタンパク質抗体と本発明に係る化合物とで構成された一対のＦＲＥＴパートナーの存在下、ＧＰＣＲおよびＧαタンパク質を含む膜調製物をインキュベートすることで確認される。インキュベーションは、ＧＴＰγＳ等の非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰ類似体の存在下または非存在下で実施される。ＦＲＥＴペアの各パートナーが同じＧαタンパク質に結合すると、ＦＲＥＴシグナルが現れ、それにより、本発明の化合物がＧαタンパク質へ結合したことが確認される。したがって、本発明の化合物は、Ｇタンパク質共役受容体の活性化を変化させられる分子をＦＲＥＴ法によって同定するのに使用でき、有利である。
【0033】
（合成）
ガンマ位でランタニド錯体に結合したＧＴＰの合成をスキーム１～１９で説明する。
ガンマ位でランタニド錯体に結合したＧＴＰの合成をスキーム１～１９で説明する。
【0034】
（ＧＴＰ－ガンマ－Ｏ（ＧＴＰγＯ）ファミリー化合物の合成）
本発明の化合物（ランタニド錯体ＧＴＰ）の前駆体である化合物２は、当業者に知られているプロトコルに従って合成できる。市販のＧＴＰを出発物質とし、アルファ位に脱離基（Ｉ、Ｂｒ、メシル、トシル）を有し、そのオメガ位に保護されたアミノ基を有する連結基とＧＴＰとの求核置換によって、ＧＴＰのガンマ位に連結基「Ｌ１」を導入することで、化合物１が得られる。Ｐ＝ＣＢｚまたはＣＯＣＦ３の場合、類似した結合例を利用できる（国際公開第２００９／１０５０７７号または国際公開第２００９／０９１８４７号を参照）。保護基に対応した脱保護条件を用いて保護基を除去する（国際公開第２００９／０１４６１２を参照）。次いで、当業者に知られている従来の方法を用いて、アミド結合を介して化合物２をランタニド錯体に共有結合させる（スキーム１）。
本発明の化合物（ランタニド錯体ＧＴＰ）の前駆体である化合物２は、当業者に知られているプロトコルに従って合成できる。市販のＧＴＰを出発物質とし、アルファ位に脱離基（Ｉ、Ｂｒ、メシル、トシル）を有し、そのオメガ位に保護されたアミノ基を有する連結基とＧＴＰとの求核置換によって、ＧＴＰのガンマ位に連結基「Ｌ１」を導入することで、化合物１が得られる。Ｐ＝ＣＢｚまたはＣＯＣＦ３の場合、類似した結合例を利用できる（国際公開第２００９／１０５０７７号または国際公開第２００９／０９１８４７号を参照）。保護基に対応した脱保護条件を用いて保護基を除去する（国際公開第２００９／０１４６１２を参照）。次いで、当業者に知られている従来の方法を用いて、アミド結合を介して化合物２をランタニド錯体に共有結合させる（スキーム１）。
【化45】
【0035】
ＧＴＰのガンマ位でランタニド錯体を結合させるための別の選択肢としては、「クリックケミストリー」の使用が挙げられる。そのためには、まず初めに、アジド基（スキーム２）またはアセチレン基（スキーム３）のいずれかを導入する必要がある。上記の通り、これらの基は、連結基Ｌ２またはＬ３とＧＴＰとの求核置換反応を介して導入される（スキーム２および３）。ヌクレオチドと連結基との結合例は、例えば、Ｈａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１２，７７（２２），１７４５０）により記載されている。
【化46】
【化47】
【0036】
逆に、アセチレン基を第１段階でＧＴＰに導入することができ、６系の化合物が得られる。他のヌクレオチドへの結合例は文献から入手できる（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，２００３，１２５，９５８８）。次いで、アジド形態に官能化されたランタニド錯体で環化付加反応を実施して、ＣＬｎ３＋－７ａ～ｄ化合物を得ることができる。
【0037】
（ＧＴＰ－ガンマ－Ｎファミリー化合物の合成）
ＧＴＰ－ガンマ－Ｏファミリーの場合と同じように、類似した戦略に従ってＧＴＰ－ガンマ－Ｎ化合物を調製できる。ＮＨ２官能化ランタニド錯体は、リンカーを挿入することなくＧＴＰ分子へ直接縮合される（スキーム４）。
ＧＴＰ－ガンマ－Ｏファミリーの場合と同じように、類似した戦略に従ってＧＴＰ－ガンマ－Ｎ化合物を調製できる。ＮＨ２官能化ランタニド錯体は、リンカーを挿入することなくＧＴＰ分子へ直接縮合される（スキーム４）。
【化48】
【0038】
ランタニド錯体は、前もって導入された末端ＮＨ２連結基を既に含むＧＴＰ－ガンマ－Ｎ分子９ａ～ｅを用いて結合できる。
【化49】
【0039】
ジアミノ連結基のいくつかの等価物の使用を避けるために、例えばＣＢｚやトリフルオロ酢酸（ＣＯＣＦ３）基で官能基の１つが保護される。続いて、（ＧＴＰの化学的加水分解を回避する条件下で）保護基を除去することで、同じ化合物９ａ～ｅが得られる。これらの化合物に、当業者に知られている従来の方法を用いてランタニド錯体を結合させる（スキーム６）。
【化50】
【0040】
（ＧＴＰ－ガンマ－Ｃファミリー化合物の合成）
ＧＴＰ－ガンマ－Ｃ系は、末端位置がさまざまな方法で置換できるホスホン酸とグアノシン二リン酸（ＧＤＰ）との縮合によって合成される。末端位置が保護された（トリフルオロアセトアミド１５ａ～ｆまたはＣＢｚ１６ａ～ｆ）アミン官能基である場合、これらの化合物は、文献（欧州特許出願公開第０ ９５９ ０７７号明細書（ＴＦＡ）、国際公開第２０１２／１５０８６６号明細書、およびＴｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８４，４９，１１５８（ＣＢｚ））に記載された方法を用いて調製される。第１段階では、Ｎ－フタルイミドアルキルブロミド（１２ａ～ｆ）を亜リン酸トリエチルと縮合し、続いてヒドラジンで処理することで、アミン官能基を脱保護する。ホスホン酸エチルを臭化水素酸の存在下で加水分解することで、化合物１４ａ～ｆが得られる。ＧＤＰとの結合反応中の自己縮合反応を防ぐために、第一級アミン官能基をＣＢｚまたはトリフルオロアセトアミドのいずれかで保護する。この反応シーケンスによって、中間体化合物１５ａ～ｆおよび１６ａ～ｆを得ることができる。
ＧＴＰ－ガンマ－Ｃ系は、末端位置がさまざまな方法で置換できるホスホン酸とグアノシン二リン酸（ＧＤＰ）との縮合によって合成される。末端位置が保護された（トリフルオロアセトアミド１５ａ～ｆまたはＣＢｚ１６ａ～ｆ）アミン官能基である場合、これらの化合物は、文献（欧州特許出願公開第０ ９５９ ０７７号明細書（ＴＦＡ）、国際公開第２０１２／１５０８６６号明細書、およびＴｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８４，４９，１１５８（ＣＢｚ））に記載された方法を用いて調製される。第１段階では、Ｎ－フタルイミドアルキルブロミド（１２ａ～ｆ）を亜リン酸トリエチルと縮合し、続いてヒドラジンで処理することで、アミン官能基を脱保護する。ホスホン酸エチルを臭化水素酸の存在下で加水分解することで、化合物１４ａ～ｆが得られる。ＧＤＰとの結合反応中の自己縮合反応を防ぐために、第一級アミン官能基をＣＢｚまたはトリフルオロアセトアミドのいずれかで保護する。この反応シーケンスによって、中間体化合物１５ａ～ｆおよび１６ａ～ｆを得ることができる。
【化51】
【0041】
マスクされた第一級アミン官能基を導入する代わりに、リンカーの末端部がアセチレン単位であるＧＴＰ－ガンマ－Ｃを利用することもできる。この官能基によって、結合反応に利用できるアジド官能基を有するランタニド錯体とアセチレン系ＧＴＰ－ガンマ－Ｃとの「クリックケミストリー」反応を実施できる。スキーム８には、文献で入手できるプロトコルに従って調製された各種中間体を簡潔に記載している（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１８，２６，１９１およびＡｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１１，５０，１０６９９）。市販のアセチレン系臭化アルキル誘導体を亜リン酸トリメチルシリルと縮合させた後、加水分解することで、１８ａ～ｆ系が得られる。
【化52】
【0042】
生体共役反応を可能にする官能基をＧＴＰ－ガンマ－Ｃ化合物のリンカーに導入する別の選択肢も考えられる。このアプローチでは、スキーム９に記載されたシーケンスを用いてアジド基をホスホン酸に導入する。プロトコルは、例えば、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１０，１６，１２７１８、Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２０１０，２６，１０７２５、あるいはＴｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１２，７７，１０４５０等の文献に記載されている。二臭素化誘導体を亜リン酸トリエチルと反応させて、化合物２０ａ～ｆが得られる。続いて、アジ化ナトリウムとの単純な求核置換によってアジド官能基が導入される。続いて、ＴＭＳ－Ｂｒの存在下でジエステルを加水分解すると、誘導体２２ａ～ｆが得られる。
【化53】
【0043】
化合物１５ａ～ｆ、１６ａ～ｆ、１８ａ～ｆ、または２２ａ～ｆとランタニド錯体との結合は、当業者に知られている従来の方法を用いて実施される（スキーム１０～１３）。
【化54】
【化55】
【化56】
【化57】
【0044】
ＧＴＰの場合と同様に、同じ合成戦略を採用して、ＧＰＰＮＨＰ類似体（市販品、ＣＡＳ：６４５６４－０３－０）をガンマ位でランタニド錯体と結合させることができる。ガンマＯで置換された誘導体の場合、合成は、例えばスキーム１４に記載されている。ガンマＮで置換された誘導体の場合、合成はスキーム１５および１６に記載されている。また、これらの結合は国際公開第２００９／０６８７５１号にも例示されており、該文献ではＡＴＰ類似体を使用している。
【化58】
【化59】
【化60】
【0045】
ＧＴＰの場合と同様に、同じ合成戦略を採用して、ＧＰＰＣＨ２Ｐ類似体（市販品、ＣＡＳ：１３９１２－９３－１または１０４７０－５７－２、Ｎａ塩形態）をガンマ位でランタニド錯体と結合させることができる。ガンマＯで置換された誘導体の場合、合成は、例えばスキーム１７に記載されている。ガンマＮで置換された誘導体の場合、合成はスキーム１８および１９に記載されている。また、これらの結合は国際公開第２００９／０６８７５１号にも例示されており、該文献ではＡＴＰ類似体を使用している。
【化61】
【化62】
【化63】
【実施例】
【0046】
例示として示した以下の実施例によって本発明を説明する。
【0047】
（使用した略語）
ＢＲＥＴ：生物発光共鳴エネルギー移動
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＥＤＣ：Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド
ｅｑ：当量
ＥＳＩ＋：ポジティブエレクトロスプレーイオン化モード
ＦＲＥＴ：フェルスター共鳴エネルギー移動
ＧＤＰ：グアノシン二リン酸
ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質共役受容体
ＧＴＰ：グアノシン三リン酸
ＧＴＰγＳ：グアノシン５’－［γ－チオ］三リン酸
ｈ：時間
ＨＥＰＥＳ：４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ＬＣ－ＭＳ：質量分析と組み合わせた高速液体クロマトグラフィー
ＬＲＭＳ：低分解能質量分析
ＭＥＳ：２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸
ＭＯＰＳ：３－モルホリノ－１－プロパンスルホン酸
ＮＣＳ：イソチオシアネート
ＮＨＳ：Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド
Ｐｙ：ピリジン
ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質共役受容体
ＡＴ：周囲温度
ＴＥＡ：トリエチルアミン
ＴＲＩＳ：トリスヒドロキシメチルアミノメタン
ＵＰＬＣ：超高速液体クロマトグラフィー
ＵＰＬＣ－ＭＳ：質量分析と組み合わせた超高速液体クロマトグラフィー
ＵＶ：紫外線
ＢＲＥＴ：生物発光共鳴エネルギー移動
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＥＤＣ：Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド
ｅｑ：当量
ＥＳＩ＋：ポジティブエレクトロスプレーイオン化モード
ＦＲＥＴ：フェルスター共鳴エネルギー移動
ＧＤＰ：グアノシン二リン酸
ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質共役受容体
ＧＴＰ：グアノシン三リン酸
ＧＴＰγＳ：グアノシン５’－［γ－チオ］三リン酸
ｈ：時間
ＨＥＰＥＳ：４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ＬＣ－ＭＳ：質量分析と組み合わせた高速液体クロマトグラフィー
ＬＲＭＳ：低分解能質量分析
ＭＥＳ：２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸
ＭＯＰＳ：３－モルホリノ－１－プロパンスルホン酸
ＮＣＳ：イソチオシアネート
ＮＨＳ：Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド
Ｐｙ：ピリジン
ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質共役受容体
ＡＴ：周囲温度
ＴＥＡ：トリエチルアミン
ＴＲＩＳ：トリスヒドロキシメチルアミノメタン
ＵＰＬＣ：超高速液体クロマトグラフィー
ＵＰＬＣ－ＭＳ：質量分析と組み合わせた超高速液体クロマトグラフィー
ＵＶ：紫外線
【0048】
（クロマトグラフィー）
分析用および分取用高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の手順は、次の２つの機器で実行した。
分析ＨＰＬＣ：ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐ４０００クォータナリポンプ、重水素ランプ（１９０～３５０ｎｍ）を有するＵＶ１０００検出器、Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８分析カラム（３．５μｍ、４．６×１００ｍｍ）
分取ＨＰＬＣ：島津製作所、ＬＣ－８Ａポンプ２個、Ｖａｒｉａｎ ＰｒｏＳｔａｒダイオードアレイＵＶ検出器、Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８分取カラム（５μｍ：１９×１００ｍｍまたは５０×１５０ｍｍ）
分析用および分取用高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の手順は、次の２つの機器で実行した。
分析ＨＰＬＣ：ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐ４０００クォータナリポンプ、重水素ランプ（１９０～３５０ｎｍ）を有するＵＶ１０００検出器、Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８分析カラム（３．５μｍ、４．６×１００ｍｍ）
分取ＨＰＬＣ：島津製作所、ＬＣ－８Ａポンプ２個、Ｖａｒｉａｎ ＰｒｏＳｔａｒダイオードアレイＵＶ検出器、Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８分取カラム（５μｍ：１９×１００ｍｍまたは５０×１５０ｍｍ）
【0049】
分析用超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）の手順は、検出器としてＰＤＡ型ダイオードアレイＵＶ検出器またはＳＱＤ２型シングル四重極質量検出器のいずれかを備えたＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＨＣｌａｓｓ機器で実行した。プローブは、ポジティブモードのエレクトロスプレーをキャピラリー電圧３．２ｋＶ、コーン電圧３０Ｖで使用した。
【0050】
勾配Ａ：Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム（５μｍ、１０×１００ｍｍ）、Ａ／水 ２５ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ７、Ｂ／アセトニトリル、ｔ＝０～５分：１％Ｂ、ｔ＝１０分：１０％Ｂ、２０ｍｌ．ｍｉｎ－１（２６０ｎｍ）
【0051】
勾配Ｂ
Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム（５μｍ、４．６×１００ｍｍ）、Ａ／水 ２５ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ７、Ｂ／アセトニトリル、ｔ＝０～２分：２％Ｂ、ｔ＝１９分：４０％Ｂ、１ｍｌ．ｍｉｎ－１
Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム（５μｍ、４．６×１００ｍｍ）、Ａ／水 ２５ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ７、Ｂ／アセトニトリル、ｔ＝０～２分：２％Ｂ、ｔ＝１９分：４０％Ｂ、１ｍｌ．ｍｉｎ－１
【0052】
勾配Ｃ
Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム（３．５μｍ、４．６×１００ｍｍ）、Ａ／水 ５ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ５、Ｂ／アセトニトリル、ｔ＝０分：２％Ｂ、ｔ＝１分：２％Ｂ、ｔ＝１５分：４０％Ｂ、１ｍｌ．ｍｉｎ－１
Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム（３．５μｍ、４．６×１００ｍｍ）、Ａ／水 ５ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ５、Ｂ／アセトニトリル、ｔ＝０分：２％Ｂ、ｔ＝１分：２％Ｂ、ｔ＝１５分：４０％Ｂ、１ｍｌ．ｍｉｎ－１
【0053】
勾配Ｄ
Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム（５μｍ、１９×１００ｍｍ）、Ａ／水 ５ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ６．６、Ｂ／アセトニトリル、ｔ＝０分：２％Ｂ、ｔ＝２．５分：２％Ｂ、ｔ＝２７分：４０％Ｂ、１２ｍｌ．ｍｉｎ－１（２８０および３２０ｎｍ）
Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム（５μｍ、１９×１００ｍｍ）、Ａ／水 ５ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ６．６、Ｂ／アセトニトリル、ｔ＝０分：２％Ｂ、ｔ＝２．５分：２％Ｂ、ｔ＝２７分：４０％Ｂ、１２ｍｌ．ｍｉｎ－１（２８０および３２０ｎｍ）
【0054】
勾配Ｅ
Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム（５μｍ、１９×１００ｍｍ）、Ａ／水 ２５ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ７、Ｂ／アセトニトリル、ｔ＝０分：２％Ｂ、ｔ＝２分：２％Ｂ、ｔ＝２０分：５０％Ｂ、２０ｍｌ．ｍｉｎ－１（２８０および３２０ｎｍ）
Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム（５μｍ、１９×１００ｍｍ）、Ａ／水 ２５ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ７、Ｂ／アセトニトリル、ｔ＝０分：２％Ｂ、ｔ＝２分：２％Ｂ、ｔ＝２０分：５０％Ｂ、２０ｍｌ．ｍｉｎ－１（２８０および３２０ｎｍ）
【0055】
勾配Ｆ
Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｃ１８カラム（３００Å、１．７μｍ、２．１×５０ｍｍ）、Ａ／水 ５ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ５、Ｂ／アセトニトリル、ｔ＝０分：２％Ｂ、ｔ＝０．２分：２％Ｂ、ｔ＝５分：４０％Ｂ、０．６ｍｌ．ｍｉｎ－１
Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｃ１８カラム（３００Å、１．７μｍ、２．１×５０ｍｍ）、Ａ／水 ５ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ５、Ｂ／アセトニトリル、ｔ＝０分：２％Ｂ、ｔ＝０．２分：２％Ｂ、ｔ＝５分：４０％Ｂ、０．６ｍｌ．ｍｉｎ－１
【0056】
勾配Ｇ
Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム（３００Å、５μｍ、１０×１００ｍｍ）、Ａ／水 ２５ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム、Ｂ／アセトニトリル、ｔ＝０分：２％Ｂ、ｔ＝１９分：２０％Ｂ、５ｍｌ．ｍｉｎ－１
Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム（３００Å、５μｍ、１０×１００ｍｍ）、Ａ／水 ２５ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム、Ｂ／アセトニトリル、ｔ＝０分：２％Ｂ、ｔ＝１９分：２０％Ｂ、５ｍｌ．ｍｉｎ－１
【0057】
勾配Ｈ
Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム（５μｍ、４．６×１００ｍｍ）、Ａ／水 ２５ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ７、Ｂ／アセトニトリル、ｔ＝０～２分：２％Ｂ、ｔ＝１９分：５０％Ｂ、１ｍｌ．ｍｉｎ－１
Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム（５μｍ、４．６×１００ｍｍ）、Ａ／水 ２５ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ７、Ｂ／アセトニトリル、ｔ＝０～２分：２％Ｂ、ｔ＝１９分：５０％Ｂ、１ｍｌ．ｍｉｎ－１
【0058】
勾配Ｉ
Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム（５μｍ、１０×１００ｍｍ）、Ａ／水 ２５ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ７、Ｂ／アセトニトリル、ｔ＝０分：２％Ｂ、ｔ＝２分：２％Ｂ、ｔ＝２７分：５０％Ｂ、３．５ｍｌ．ｍｉｎ－１（２８０ｎｍ）
Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム（５μｍ、１０×１００ｍｍ）、Ａ／水 ２５ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ７、Ｂ／アセトニトリル、ｔ＝０分：２％Ｂ、ｔ＝２分：２％Ｂ、ｔ＝２７分：５０％Ｂ、３．５ｍｌ．ｍｉｎ－１（２８０ｎｍ）
【0059】
勾配Ｊ
Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム（５μｍ、１９×１００ｍｍ）、Ａ／水 ２５ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム、Ｂ／アセトニトリル、ｔ＝０分：５％Ｂ、ｔ＝１７分：４５％Ｂ、２０ｍｌ．ｍｉｎ－１
Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム（５μｍ、１９×１００ｍｍ）、Ａ／水 ２５ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム、Ｂ／アセトニトリル、ｔ＝０分：５％Ｂ、ｔ＝１７分：４５％Ｂ、２０ｍｌ．ｍｉｎ－１
【0060】
勾配Ｋ
Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム（３００Å、５μｍ、１０×１００ｍｍ）、水 ２５ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム、Ｂ／アセトニトリル、ｔ＝０分：２％Ｂ、ｔ＝１９分：４０％Ｂ、５ｍｌ．ｍｉｎ－１
Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム（３００Å、５μｍ、１０×１００ｍｍ）、水 ２５ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム、Ｂ／アセトニトリル、ｔ＝０分：２％Ｂ、ｔ＝１９分：４０％Ｂ、５ｍｌ．ｍｉｎ－１
【0061】
（化合物の調製）
調製例１：ＧＴＰガンマ－Ｎ－ペンチル－ＮＨ２（９ｃ）
ＥＤＣ（４０ｍｇ；２１０μｍｏｌ、１１ｅｑ）とカダベリン（５８ｍｇ、５７３μｍｏｌ、３０ｅｑ）のＭＯＰＳ溶液（ｐＨ８）とを、ＧＴＰ（１０ｍｇ；１９．１μｍｏｌ、１ｅｑ）の水（５００μｌ）溶液が入った丸底フラスコに添加した。この反応混合物をＡＴで一晩撹拌した後、分取ＨＰＬＣ（勾配Ａ）で精製した。化合物９ｃ（５ｍｇ）に対応する白色固体が得られた。（ＥＳＩ＋）：ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ Ｃ１５Ｈ２８Ｎ７Ｏ１３Ｐ３［Ｍ＋Ｈ］＋，ｍ／ｚ＝６０８．１０，ｆｏｕｎｄ ６０８．５５．
調製例１：ＧＴＰガンマ－Ｎ－ペンチル－ＮＨ２（９ｃ）
【化64】
【0062】
調製例２：ＧＴＰガンマ－Ｏ－ヘキシル－Ｃ２
ＮＣＳ（イソチオシアネート）形態に官能化された錯体Ｃ２（４７３μｇ、７００ｎｍｏｌ）のＤＭＳＯ（２００μｌ）溶液を、化合物２ｃ（０．４５４ｍｇ、７００ｎｍｏｌ）の１００ｍＭ炭酸バッファ（ｐＨ９、５００μｌ）溶液に一度で全て添加した。混合物をＡＴで一晩撹拌した。反応の進行をＨＰＬＣ（勾配Ｂ）およびＵＰＬＣ－ＭＳ（勾配Ｃ）でモニタリングした。本期間の後、反応は完了していた。反応混合物をそのままセミ分取ＨＰＬＣ（勾配Ｄ）で精製して、化合物ＧＴＰ－ガンマ－Ｏ－ヘキシル－Ｃ２（１２５μｇ、９６ｎｍｏｌ、１４％）を白色粉末として得た。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ４０Ｈ４７ＥｕＮ１０Ｏ２２Ｐ３Ｓ－［Ｍ＋３Ｈ］２＋，ｍ／ｚ＝６５０．０６，ｆｏｕｎｄ ６５０．３２．
【化65】
【0063】
調製例３：ＧＴＰガンマ－Ｏ－ヘキシル－Ｃ３
ジクロロトリアジン形態に官能化された錯体Ｃ３（０．６４７ｍｇ、７０８ｎｍｏｌ）の１００ｍＭ炭酸バッファ（ｐＨ９、２００μｌ）溶液を、化合物２ｃ（０．４４２ｍｇ、７１０ｎｍｏｌ）の１００ｍＭ炭酸バッファ（ｐＨ９、２００μｌ）溶液に一度で全て添加した。混合物を４℃で一晩撹拌した。反応の進行をＵＰＬＣ－ＭＳ（勾配Ｃ）でモニタリングした。本期間の後、反応は完了していた。反応混合物をそのまま分取ＨＰＬＣ（勾配Ｅ）で精製して、化合物ＧＴＰ－ガンマ－Ｏ－ヘキシル－Ｃ３（０．１１ｍｇ、７０ｎｍｏｌ、１０％）を白色粉末として得た。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ５０Ｈ５３ＣｌＥｕＮ１５Ｏ２２Ｐ３
－［Ｍ＋３Ｈ］２＋，ｍ／ｚ＝７４９．５９，ｆｏｕｎｄ ７５０．２９．
【化66】
【0064】
調製例４：ＧＴＰ－ガンマ－Ｎ－Ｃ２
錯体Ｃ２（０．３６６ｍｇ、２μｍｏｌ）を５００ｍＭ ＭＥＳバッファ（ｐＨ５．５、１５０μｌ）に溶解させて、黄色溶液を得た。反応混合物に、ＧＴＰ（１．３２ｍｇ、２．４μｍｏｌ）、次いでＥＤＣ（１．９２ｍｇ、１０μｍｏｌ）を一度で全て添加した。混合物をＡＴで４０ｈ撹拌した。反応の進行をＵＰＬＣ－ＭＳ（勾配Ｆ）でモニタリングした。本期間の後、反応は部分的であり、それ以上進行しなかった。反応混合物をそのまま分取ＨＰＬＣ（勾配Ｇ）で精製して、ＧＴＰ－ガンマ－Ｎ－Ｃ２（６０ｎｍｏｌ、３％）を無色油として得た。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ３３Ｈ３４Ｎ９Ｏ２１Ｐ３Ｅｕ－［Ｍ］－，ｍ／ｚ＝１１３７．６，ｆｏｕｎｄ １１３８．２．
【化67】
【0065】
調製例５：ＧＴＰ－ガンマ－Ｎ－Ｃ３
錯体Ｃ３（０．３６６ｍｇ、４８０ｎｍｏｌ）を５００ｍＭ ＭＥＳバッファ（ｐＨ５．５、１５０μｌ）に溶解させて、黄色溶液を得た。反応混合物に、ＧＴＰ（０．３１７ｍｇ、５７６ｎｍｏｌ）、次いでＥＤＣ（０．４６０ｍｇ、２．４μｍｏｌ）を一度で全て添加した。混合物をＡＴで一晩撹拌した。反応の進行をＵＰＬＣ－ＭＳ（勾配Ｆ）でモニタリングした。本期間の後、反応は部分的であり、それ以上進行しなかった。反応混合物をそのまま分取ＨＰＬＣ（勾配Ｇ）で精製して、ＧＴＰ－ガンマ－Ｎ－Ｃ３（４５．６ｎｍｏｌ、９．５％）を無色油として得た。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ４１Ｈ４０Ｎ１１Ｏ２１Ｐ３Ｅｕ－［Ｍ＋２Ｈ］＋，ｍ／ｚ＝１２６９．７，ｆｏｕｎｄ １２６９．
【化68】
【0066】
調製例６：ＧＴＰ－ガンマ－Ｎ－オクチル－Ｃ２
化合物９ｅ（５０．０μｌ、５００ｎｍｏｌ）を水（１００μｌ）に溶解させた。反応混合物にピリジン（３００μｌ）およびトリエチルアミン（６μｌ）を添加した。反応混合物を、ＮＣＳ（イソチオシアネート）形態に官能化された錯体Ｃ２（０．４３８ｍｇ、６５０ｎｍｏｌ）を含む試験管に一度で全て添加した。混合物を２４℃で１２ｈ撹拌した。反応の進行をＵＰＬＣ－ＭＳ（勾配Ｆ）でモニタリングした。本期間の後、反応は部分的であった。反応混合物をそのまま分取ＨＰＬＣ（勾配Ｇ）で精製して、ＧＴＰ－ガンマ－Ｎ－オクチル－Ｃ２（１６．９ｎｍｏｌ、３．４％）を無色油として得た。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ４２Ｈ５２Ｎ１１Ｏ２１Ｐ３ＳＥｕ－［Ｍ＋３Ｈ］２＋，ｍ／ｚ＝６６３．５，ｆｏｕｎｄ ６６３．９．
【化69】
【0067】
調製例７：ＧＴＰ－ガンマ－Ｎ－オクチル－Ｃ３
ジクロロトリアジン形態に官能化された錯体Ｃ３（４００μｇ、４３８ｎｍｏｌ）の水（２００μｌ）溶液を、化合物９ｅ（０．５４５ｍｇ、８４０ｎｍｏｌ）の１００ｍＭ炭酸バッファ（ｐＨ９、５００μｌ）溶液に一度で全て添加した。混合物を２０℃で一晩撹拌した。反応の進行をＨＰＬＣ（勾配Ｈ）およびＵＰＬＣ－ＭＳ（勾配Ｃ）でモニタリングした。本期間の後、反応は完了していた。反応混合物をそのままセミ分取ＨＰＬＣ（勾配Ｉ）で精製して、化合物ＧＴＰ－ガンマ－Ｎ－オクチル－Ｃ３（７．６μｇ、５ｎｍｏｌ、１％）を白色粉末として得た。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ５２Ｈ５８ＣｌＥｕＮ１６Ｏ２１Ｐ３
－［Ｍ＋３Ｈ］２＋，ｍ／ｚ＝７６３．１１，ｆｏｕｎｄ ７６３．２９．
【化70】
【0068】
調製例８：ＧＴＰ－ガンマ－Ｎ－ヘキシル－Ｃ１１
ＮＨＳエステル形態に官能化された錯体Ｃ１１（１．４７ｍｇ、１μｍｏｌ）の無水ＤＭＳＯ（１２２μｌ）溶液を、化合物９ｄ（０．６２ｍｇ、１μｍｏｌ）の５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ８、９００μｌ）溶液に一度で全て添加した。混合物を２４℃で１ｈ撹拌した。反応の進行をＵＰＬＣ－ＭＳ（勾配Ｆ）でモニタリングした。本期間の後、反応は完了していた。反応混合物をそのまま分取ＨＰＬＣ（勾配Ｊ）で精製して、化合物ＧＴＰ－ガンマ－Ｎ－ヘキシル－Ｃ１１（０．５２ｍｇ、２５８ｎｍｏｌ、２６％）を白色粉末として得た。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ８０Ｈ１０９Ｎ２０Ｏ２７Ｐ３Ｔｂ３＋［Ｍ－Ｈ］２＋，ｍ／ｚ＝１０１８．９，ｆｏｕｎｄ １０１９．６、［Ｍ＋２Ｎａ＋－３Ｈ］２＋，ｍ／ｚ＝１０４０．８，ｆｏｕｎｄ １０４１．６．
【化71】
【0069】
調製例９：ＧＴＰ－ガンマ－Ｎ－オクチル－Ｃ１１
ＮＨＳエステル形態に官能化された錯体Ｃ１１（０．７６ｍｇ、５００ｎｍｏｌ）の無水ＤＭＳＯ（１０２μｌ）溶液を、化合物９ｅ（０．３２ｍｇ、５００ｎｍｏｌ）の５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ８、３００μｌ）溶液に一度で全て添加した。混合物を２４℃で１ｈ撹拌した。反応の進行をＵＰＬＣ－ＭＳ（勾配Ｆ）でモニタリングした。本期間の後、反応は完了していた。反応混合物をそのまま分取ＨＰＬＣ（勾配Ｋ）で精製して、化合物ＧＴＰ－ガンマ－Ｎ－オクチル－Ｃ１１（０．２２ｍｇ、１０５ｎｍｏｌ、２１％）を白色粉末として得た。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ８２Ｈ１１７Ｎ２０Ｏ２７Ｐ３Ｔｂ３＋［Ｍ－２Ｈ］＋，ｍ／ｚ＝２０６４．８，ｆｏｕｎｄ ２０６４．１．
【化72】
【0070】
調製例１０：ＧＴＰ－ガンマ－Ｎ－オクチル－チオスクシンイミジル－Ｃ２
化合物９ｅ（０．６４９ｍｇ、１μｍｏｌ）の水（１００μｌ）溶液を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ８、７５７μｌ）で希釈して、無色溶液を得た。反応混合物に、ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）形態に官能化された錯体Ｃ２（７５０μｌ、１μｍｏｌ）の無水ＤＭＳＯ（１４３μｌ）溶液を１回で添加した。反応物を２５℃で１ｈ撹拌した。反応の進行をＵＰＬＣ－ＭＳ（勾配Ｂ）でモニタリングした。本期間の後、反応は完了していなかった。そうではあったが、反応混合物を分取ＨＰＬＣ（勾配Ｅ）で２回精製した。所期の生成物に対応する画分を回収した後、減圧下で濃縮して、化合物ＧＴＰ－ガンマ－Ｎ－オクチル－チオスクシンイミジル－Ｃ２（０．２４１μｍｏｌ、２４％）を無色溶液として得た。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ５１Ｈ６８ＥｕＮ１３Ｏ２４Ｐ３Ｓ２
＋［Ｍ＋Ｈ］＋，ｍ／ｚ＝１５５５．８，ｆｏｕｎｄ １５５５．８．
【化73】
【0071】
（結合試験）
（材料）
・ＧＰＣＲおよびＧ－アルファ－ｉタンパク質（Ｇαｉ）を発現する細胞の膜標本をＰｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒまたはＥｕｒｏｓｃｒｅｅｎから購入した。以下の表に、使用した各種試料の細胞バックグラウンドおよび参照番号をまとめる。
・ＤＳＶ３６Ｓ抗体はＣｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓが作製したものであり、要望に応じてＣｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓから入手できる（番号ＤＳＶ３６Ｓ）。抗体はＴＲ－ＦＲＥＴ検出に適合した蛍光プローブｄ２（赤色受容体）で標識した。ＤＳＶ３６Ｓ抗体は、Ｇαｉタンパク質のスイッチＩＩに結合する。
・ＧＴＰおよびＧＴＰγＳヌクレオチドはＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した（それぞれカタログ番号Ｇ８８７７およびＧ８６３４）。
・白色底の３８４ウェル低容量白色プレートはＧｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅから購入した（カタログ番号７８４０７５）。
・ランタニド錯体型の供与体フルオロフォアで標識した非加水分解性／徐加水分解性ＧＴＰ類似体は、Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓで合成したものである。
（材料）
・ＧＰＣＲおよびＧ－アルファ－ｉタンパク質（Ｇαｉ）を発現する細胞の膜標本をＰｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒまたはＥｕｒｏｓｃｒｅｅｎから購入した。以下の表に、使用した各種試料の細胞バックグラウンドおよび参照番号をまとめる。
【表1】
・ＧＴＰおよびＧＴＰγＳヌクレオチドはＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した（それぞれカタログ番号Ｇ８８７７およびＧ８６３４）。
・白色底の３８４ウェル低容量白色プレートはＧｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅから購入した（カタログ番号７８４０７５）。
・ランタニド錯体型の供与体フルオロフォアで標識した非加水分解性／徐加水分解性ＧＴＰ類似体は、Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓで合成したものである。
【0072】
（方法）
（試薬の調製）
特に言及のない限り、試薬はいずれも５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ＢＳＡ、１０ｍＭ ＮａＣｌで希釈した。膜は４Ｘで調製して、１ウェルあたり１μｇまたは１０μｇ分配した（量は各図の凡例に規定）。ＧＴＰγＳヌクレオチド（非特異的シグナル条件）は６．６７Ｘで調製して、ウェル中の最終濃度を１００μＭとした。検出に使用した抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２は４Ｘで調製して、ウェル中の最終濃度１０ｎＭを目標とした。蛍光供与体プローブ（ランタニド錯体）で標識した非加水分解性／徐加水分解性ＧＴＰ類似体は４Ｘで調製して、各図の凡例に記載したウェル中の最終濃度を目標とした。
（試薬の調製）
特に言及のない限り、試薬はいずれも５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ＢＳＡ、１０ｍＭ ＮａＣｌで希釈した。膜は４Ｘで調製して、１ウェルあたり１μｇまたは１０μｇ分配した（量は各図の凡例に規定）。ＧＴＰγＳヌクレオチド（非特異的シグナル条件）は６．６７Ｘで調製して、ウェル中の最終濃度を１００μＭとした。検出に使用した抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２は４Ｘで調製して、ウェル中の最終濃度１０ｎＭを目標とした。蛍光供与体プローブ（ランタニド錯体）で標識した非加水分解性／徐加水分解性ＧＴＰ類似体は４Ｘで調製して、各図の凡例に記載したウェル中の最終濃度を目標とした。
【0073】
（３８４ウェルプレートにおける試薬の分配）
・ＧＰＣＲおよびＧタンパク質を発現する膜：５μｌ
・ＧＴＰγＳバッファまたはヌクレオチド（非特異的シグナル条件の場合）：３μｌ
・非加水分解性／徐加水分解性ＧＴＰ類似体－供与体：５μｌ
・抗Ｇαｉ抗体－受容体（ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２）：５μｌ
・バッファ：２μｌ
・ＧＰＣＲおよびＧタンパク質を発現する膜：５μｌ
・ＧＴＰγＳバッファまたはヌクレオチド（非特異的シグナル条件の場合）：３μｌ
・非加水分解性／徐加水分解性ＧＴＰ類似体－供与体：５μｌ
・抗Ｇαｉ抗体－受容体（ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２）：５μｌ
・バッファ：２μｌ
【0074】
非特異的シグナル（バックグラウンド蛍光ノイズ）を、過剰量のＧＴＰγＳ（１０または１００μＭ）を含むウェルで測定した。
【0075】
（ＨＴＲＦシグナルの読取り）
プレートを２１℃で２０ｈインキュベートした後、ＰＨＥＲＡｓｔａｒリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いて以下の構成でＨＴＲＦシグナルを測定した。
・モジュール：ＨＴＲＦ（励起３３７ｎｍ、発光６６５ｎｍおよび６２０ｎｍ）
・励起：レーザー４０フラッシュまたはランプ１００フラッシュ
・読取りウインドウ：遅延６０μｓ、積分４００μｓ
プレートを２１℃で２０ｈインキュベートした後、ＰＨＥＲＡｓｔａｒリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いて以下の構成でＨＴＲＦシグナルを測定した。
・モジュール：ＨＴＲＦ（励起３３７ｎｍ、発光６６５ｎｍおよび６２０ｎｍ）
・励起：レーザー４０フラッシュまたはランプ１００フラッシュ
・読取りウインドウ：遅延６０μｓ、積分４００μｓ
【0076】
（シグナル処理）
６６５ｎｍおよび６２０ｎｍでの生シグナルから、以下の式に従ってＨＴＲＦ比を算出した。
ＨＴＲＦ比＝［（６６５ｎｍでのシグナル）／（６２０ｎｍでのシグナル）］×１００００
６６５ｎｍおよび６２０ｎｍでの生シグナルから、以下の式に従ってＨＴＲＦ比を算出した。
ＨＴＲＦ比＝［（６６５ｎｍでのシグナル）／（６２０ｎｍでのシグナル）］×１００００
【0077】
（試験フォーマット）
図２は、式（Ｉ）の化合物とＧタンパク質との結合を検出するのに使用した試験フォーマットを表す。非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰ類似体（典型的にはＧＴＰγＳ）の存在下または非存在下、試験化合物と受容体フルオロフォアで標識した抗Ｇαタンパク質抗体との存在下でＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を含む膜標本をインキュベートした。２つのＦＲＥＴパートナー（試験化合物および抗Ｇαタンパク質抗体）が同じＧαタンパク質に結合する場合、ＦＲＥＴシグナルが現れ（図の左側：「全シグナル」）、これは、大過剰量の未標識ＧＴＰγＳ（蛍光ＧＴＰ類似体の置換）を含む非特異的シグナル（図の右側：「非特異的シグナル」に対応するバックグラウンドノイズ）とは区別される。
図２は、式（Ｉ）の化合物とＧタンパク質との結合を検出するのに使用した試験フォーマットを表す。非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰ類似体（典型的にはＧＴＰγＳ）の存在下または非存在下、試験化合物と受容体フルオロフォアで標識した抗Ｇαタンパク質抗体との存在下でＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を含む膜標本をインキュベートした。２つのＦＲＥＴパートナー（試験化合物および抗Ｇαタンパク質抗体）が同じＧαタンパク質に結合する場合、ＦＲＥＴシグナルが現れ（図の左側：「全シグナル」）、これは、大過剰量の未標識ＧＴＰγＳ（蛍光ＧＴＰ類似体の置換）を含む非特異的シグナル（図の右側：「非特異的シグナル」に対応するバックグラウンドノイズ）とは区別される。
【0078】
（実施例１：ＧＴＰｇＮ－Ｃ２類似体結合試験）
デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞の膜標本（１ウェルあたり１０μｇ）を用いて、ＧＴＰｇＮ－Ｃ２（調製例２）／抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２ペアのＧタンパク質への結合による特異的ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル生成能を確認した。ＧＴＰｇＮ－Ｃ２は、ウェル中の最終濃度６ｎＭで使用した。大過剰量のＧＴＰγＳ（１００μＭ）の非存在下または存在下で膜をインキュベートした。これら２つの条件間で見られたＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの差（ＨＴＲＦ比、全シグナル／非特異的シグナル＝１６．６）から、ＧＴＰｇＮ－Ｃ２類似体はＧαｉタンパク質に結合でき、抗Ｇαｉ抗体－受容体と共にＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成できることが分かる（図３）。
デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞の膜標本（１ウェルあたり１０μｇ）を用いて、ＧＴＰｇＮ－Ｃ２（調製例２）／抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２ペアのＧタンパク質への結合による特異的ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル生成能を確認した。ＧＴＰｇＮ－Ｃ２は、ウェル中の最終濃度６ｎＭで使用した。大過剰量のＧＴＰγＳ（１００μＭ）の非存在下または存在下で膜をインキュベートした。これら２つの条件間で見られたＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの差（ＨＴＲＦ比、全シグナル／非特異的シグナル＝１６．６）から、ＧＴＰｇＮ－Ｃ２類似体はＧαｉタンパク質に結合でき、抗Ｇαｉ抗体－受容体と共にＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成できることが分かる（図３）。
【0079】
（実施例２：ＧＴＰｇＮ－Ｃ３類似体結合試験）
デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞の膜標本（１ウェルあたり１μｇ）を用いて、ＧＴＰｇＮ－Ｃ３（調製例５）／抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２ペアのＧタンパク質への結合による特異的ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル生成能を確認した。ＧＴＰｇＮ－Ｃ３は、ウェル中の最終濃度１ｎＭで使用した。大過剰量のＧＴＰγＳ（１００μＭ）の非存在下または存在下で膜をインキュベートした。これら２つの条件間で見られたＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの差（ＨＴＲＦ比、全シグナル／非特異的シグナル＝１．７）から、ＧＴＰｇＮ－Ｃ３類似体はＧαｉタンパク質に結合でき、抗Ｇα抗体－受容体と共にＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成できることが分かる（図４）。
デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞の膜標本（１ウェルあたり１μｇ）を用いて、ＧＴＰｇＮ－Ｃ３（調製例５）／抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２ペアのＧタンパク質への結合による特異的ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル生成能を確認した。ＧＴＰｇＮ－Ｃ３は、ウェル中の最終濃度１ｎＭで使用した。大過剰量のＧＴＰγＳ（１００μＭ）の非存在下または存在下で膜をインキュベートした。これら２つの条件間で見られたＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの差（ＨＴＲＦ比、全シグナル／非特異的シグナル＝１．７）から、ＧＴＰｇＮ－Ｃ３類似体はＧαｉタンパク質に結合でき、抗Ｇα抗体－受容体と共にＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成できることが分かる（図４）。
【0080】
（実施例３：ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２類似体結合試験）
デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞の膜標本（１ウェルあたり１０μｇ）を用いて、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２（調製例６）／抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２ペアのＧタンパク質への結合による特異的ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル生成能を確認した。ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２は、ウェル中の最終濃度６ｎＭで使用した。大過剰量のＧＴＰγＳ（１００μＭ）の非存在下または存在下で膜をインキュベートした。これら２つの条件間で見られたＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの差（ＨＴＲＦ比、全シグナル／非特異的シグナル＝１２．４）から、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２類似体はＧαｉタンパク質に結合でき、抗Ｇαｉ抗体－受容体と共にＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成できることが分かる（図５）。
デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞の膜標本（１ウェルあたり１０μｇ）を用いて、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２（調製例６）／抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２ペアのＧタンパク質への結合による特異的ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル生成能を確認した。ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２は、ウェル中の最終濃度６ｎＭで使用した。大過剰量のＧＴＰγＳ（１００μＭ）の非存在下または存在下で膜をインキュベートした。これら２つの条件間で見られたＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの差（ＨＴＲＦ比、全シグナル／非特異的シグナル＝１２．４）から、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２類似体はＧαｉタンパク質に結合でき、抗Ｇαｉ抗体－受容体と共にＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成できることが分かる（図５）。
【0081】
（実施例４：ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ１１類似体結合試験）
デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞の膜標本（１ウェルあたり１０μｇ）を用いて、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ１１（調製例９）／抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２ペアのＧタンパク質への結合による特異的ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル生成能を確認した。ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ１１は、ウェル中の最終濃度６ｎＭで使用した。大過剰量のＧＴＰγＳ（１００μＭ）の非存在下または存在下で膜をインキュベートした。これら２つの条件間で見られたＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの差（ＨＴＲＦ比、全シグナル／非特異的シグナル＝７．６）から、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ１１類似体はＧαｉタンパク質に結合でき、抗Ｇαｉ抗体－受容体と共にＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成できることが分かる（図６）。
デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞の膜標本（１ウェルあたり１０μｇ）を用いて、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ１１（調製例９）／抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２ペアのＧタンパク質への結合による特異的ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル生成能を確認した。ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ１１は、ウェル中の最終濃度６ｎＭで使用した。大過剰量のＧＴＰγＳ（１００μＭ）の非存在下または存在下で膜をインキュベートした。これら２つの条件間で見られたＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの差（ＨＴＲＦ比、全シグナル／非特異的シグナル＝７．６）から、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ１１類似体はＧαｉタンパク質に結合でき、抗Ｇαｉ抗体－受容体と共にＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成できることが分かる（図６）。
【0082】
（実施例５：ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ３類似体結合試験）
デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞の膜標本（１ウェルあたり１μｇ）を用いて、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ３（調製例７）／抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２ペアのＧタンパク質への結合による特異的ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル生成能を確認した。ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ３は、ウェル中の最終濃度１ｎＭで使用した。大過剰量のＧＴＰγＳ（１００μＭ）の非存在下または存在下で膜をインキュベートした。これら２つの条件間で見られたＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの差（ＨＴＲＦ比、全シグナル／非特異的シグナル＝１．４）から、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ３類似体はＧαｉタンパク質に結合でき、抗Ｇαｉ抗体－受容体と共にＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成できることが分かる（図７）。
デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞の膜標本（１ウェルあたり１μｇ）を用いて、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ３（調製例７）／抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２ペアのＧタンパク質への結合による特異的ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル生成能を確認した。ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ３は、ウェル中の最終濃度１ｎＭで使用した。大過剰量のＧＴＰγＳ（１００μＭ）の非存在下または存在下で膜をインキュベートした。これら２つの条件間で見られたＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの差（ＨＴＲＦ比、全シグナル／非特異的シグナル＝１．４）から、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ３類似体はＧαｉタンパク質に結合でき、抗Ｇαｉ抗体－受容体と共にＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成できることが分かる（図７）。
【0083】
（実施例６：ＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ２類似体結合試験）
デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞の膜標本（１ウェルあたり１０μｇ）を用いて、ＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ２（調製例２）／抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２ペアのＧタンパク質への結合による特異的ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル生成能を確認した。ＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ２は、ウェル中の最終濃度６ｎＭで使用した。大過剰量のＧＴＰγＳ（１００μＭ）の非存在下または存在下で膜をインキュベートした。これら２つの条件間で見られたＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの差（ＨＴＲＦ比、全シグナル／非特異的シグナル＝７．１）から、ＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ２類似体はＧαｉタンパク質に結合でき、抗Ｇαｉ抗体－受容体と共にＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成できることが分かる（図８）。
デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞の膜標本（１ウェルあたり１０μｇ）を用いて、ＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ２（調製例２）／抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２ペアのＧタンパク質への結合による特異的ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル生成能を確認した。ＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ２は、ウェル中の最終濃度６ｎＭで使用した。大過剰量のＧＴＰγＳ（１００μＭ）の非存在下または存在下で膜をインキュベートした。これら２つの条件間で見られたＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの差（ＨＴＲＦ比、全シグナル／非特異的シグナル＝７．１）から、ＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ２類似体はＧαｉタンパク質に結合でき、抗Ｇαｉ抗体－受容体と共にＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成できることが分かる（図８）。
【0084】
（実施例７：ＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ３類似体結合試験）
デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞の膜標本（１ウェルあたり１μｇ）を用いて、ＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ３（調製例３）／抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２ペアのＧタンパク質への結合による特異的ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル生成能を確認した。ＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ３は、ウェル中の最終濃度１ｎＭで使用した。大過剰量のＧＴＰγＳ（１００μＭ）の非存在下または存在下で膜をインキュベートした。これら２つの条件間で見られたＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの差（ＨＴＲＦ比、全シグナル／非特異的シグナル＝１．３）から、ＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ３類似体はＧαｉタンパク質に結合でき、抗Ｇαｉ抗体－受容体と共にＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成できることが分かる（図９）。
デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞の膜標本（１ウェルあたり１μｇ）を用いて、ＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ３（調製例３）／抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２ペアのＧタンパク質への結合による特異的ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル生成能を確認した。ＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ３は、ウェル中の最終濃度１ｎＭで使用した。大過剰量のＧＴＰγＳ（１００μＭ）の非存在下または存在下で膜をインキュベートした。これら２つの条件間で見られたＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの差（ＨＴＲＦ比、全シグナル／非特異的シグナル＝１．３）から、ＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ３類似体はＧαｉタンパク質に結合でき、抗Ｇαｉ抗体－受容体と共にＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成できることが分かる（図９）。
【0085】
（実施例８：ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２類似体結合試験）
ドーパミンＤ２Ｓ ＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞の膜標本（１ウェルあたり１０μｇ）を用いて、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２（調製例６）／抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２ペアのＧタンパク質への結合による特異的ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル生成能を確認した。ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２は、ウェル中の最終濃度６ｎＭで使用した。大過剰量のＧＴＰγＳ（１００μＭ）の非存在下または存在下で膜をインキュベートした。これら２つの条件間で見られたＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの差（ＨＴＲＦ比、全シグナル／非特異的シグナル＝３．８）から、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２類似体はＧαｉタンパク質に結合でき、抗Ｇαｉ抗体－受容体と共にＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成できることが分かる（図１０）。
ドーパミンＤ２Ｓ ＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞の膜標本（１ウェルあたり１０μｇ）を用いて、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２（調製例６）／抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２ペアのＧタンパク質への結合による特異的ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル生成能を確認した。ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２は、ウェル中の最終濃度６ｎＭで使用した。大過剰量のＧＴＰγＳ（１００μＭ）の非存在下または存在下で膜をインキュベートした。これら２つの条件間で見られたＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの差（ＨＴＲＦ比、全シグナル／非特異的シグナル＝３．８）から、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２類似体はＧαｉタンパク質に結合でき、抗Ｇαｉ抗体－受容体と共にＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成できることが分かる（図１０）。
【0086】
（実施例９：膜の濃度およびＧＴＰ類似体－ランタニドの濃度がＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２類似体結合試験に与える影響）
デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞の膜標本（１または１０μｇ／ウェル）を用いて、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２（調製例６）／抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２ペアのＧタンパク質への結合による特異的ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル生成能を確認した。ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２は、ウェル中の最終濃度２または６ｎＭで使用した。大過剰量のＧＴＰγＳ（１００μＭ）の非存在下または存在下で膜をインキュベートした。これら２つの条件間で見られたＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの差（ＨＴＲＦ比、全シグナル（Ｓ）／非特異的シグナル（Ｎ））から、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２類似体はＧαｉタンパク質に結合でき、抗Ｇαｉ抗体－受容体と共にＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成できることが分かる（図１１Ａおよび１１Ｂ）。また、図１１Ａから、膜の量を１ウェルあたり１μｇから１０μｇに増加させると、シグナル振幅（Ｓ／Ｎ）が増大することが明らかである。図１１Ｂから、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２の濃度を２ｎＭから６ｎＭに増加させると、シグナル振幅（Ｓ／Ｎ）が増大することが明らかである。
デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞の膜標本（１または１０μｇ／ウェル）を用いて、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２（調製例６）／抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２ペアのＧタンパク質への結合による特異的ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル生成能を確認した。ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２は、ウェル中の最終濃度２または６ｎＭで使用した。大過剰量のＧＴＰγＳ（１００μＭ）の非存在下または存在下で膜をインキュベートした。これら２つの条件間で見られたＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの差（ＨＴＲＦ比、全シグナル（Ｓ）／非特異的シグナル（Ｎ））から、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２類似体はＧαｉタンパク質に結合でき、抗Ｇαｉ抗体－受容体と共にＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成できることが分かる（図１１Ａおよび１１Ｂ）。また、図１１Ａから、膜の量を１ウェルあたり１μｇから１０μｇに増加させると、シグナル振幅（Ｓ／Ｎ）が増大することが明らかである。図１１Ｂから、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２の濃度を２ｎＭから６ｎＭに増加させると、シグナル振幅（Ｓ／Ｎ）が増大することが明らかである。
【0087】
（実施例１０：ＧＴＰｇＮ－オクチル－チオスクシンイミジル－Ｃ２類似体結合試験）
デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞の膜標本（１ウェルあたり１０μｇ）を用いて、ＧＴＰｇＮ－オクチル－チオスクシンイミジル－Ｃ２（調製例１０）／抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２ペアのＧタンパク質への結合による特異的ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル生成能を確認した。試薬は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファ（ｐＨ７．４）、６０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ＢＳＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌで希釈した。ＧＴＰｇＮ－オクチル－チオスクシンイミジル－Ｃ２は、ウェル中の最終濃度７．５ｎＭで使用した。膜標本の非存在下または存在下で蛍光コンジュゲートをインキュベートした。これら２つの条件間で見られたＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの差（ＨＴＲＦ比、全シグナル／非特異的シグナル＝２．８）から、ＧＴＰｇＮ－オクチル－チオスクシンイミジル－Ｃ２類似体はＧαｉタンパク質に結合でき、抗Ｇαｉ抗体－受容体と共にＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成できることが分かる（図１２）。
デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞の膜標本（１ウェルあたり１０μｇ）を用いて、ＧＴＰｇＮ－オクチル－チオスクシンイミジル－Ｃ２（調製例１０）／抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２ペアのＧタンパク質への結合による特異的ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル生成能を確認した。試薬は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファ（ｐＨ７．４）、６０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ＢＳＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌで希釈した。ＧＴＰｇＮ－オクチル－チオスクシンイミジル－Ｃ２は、ウェル中の最終濃度７．５ｎＭで使用した。膜標本の非存在下または存在下で蛍光コンジュゲートをインキュベートした。これら２つの条件間で見られたＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの差（ＨＴＲＦ比、全シグナル／非特異的シグナル＝２．８）から、ＧＴＰｇＮ－オクチル－チオスクシンイミジル－Ｃ２類似体はＧαｉタンパク質に結合でき、抗Ｇαｉ抗体－受容体と共にＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成できることが分かる（図１２）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】