特許 7664854 タウオパチーのモデル

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-04-10

(45)【発行日】2025-04-18

(54)【発明の名称】タウオパチーのモデル

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20250411BHJP

   A01K 67/027 20240101ALI20250411BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20250411BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20250411BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20250411BHJP

   C12N 15/88 20060101ALI20250411BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20250411BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20250411BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20250411BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20250411BHJP

   A61K 47/54 20170101ALI20250411BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20250411BHJP

   A61K 38/43 20060101ALI20250411BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20250411BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20250411BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20250411BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20250411BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12

A01K67/027 ZNA

C12N15/09 100

C12N15/09 110

C12N15/864 100Z

C12N15/867 Z

C12N15/88 Z

C12N15/113 Z

C12N5/10

A61P25/28

A61K35/76

A61K47/54

A61K31/7088

A61K38/43

A61K31/713

A61K48/00

G01N33/50 Z

G01N33/15 Z

【請求項の数】 41

(21)【出願番号】P 2021568884

(86)(22)【出願日】2020-06-12

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-08-18

(86)【国際出願番号】 US2020037533

(87)【国際公開番号】W WO2020252340

(87)【国際公開日】2020-12-17

【審査請求日】2023-05-19

(31)【優先権主張番号】62/861,553

(32)【優先日】2019-06-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】597160510

【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】マクウィルター， ジョン

(72)【発明者】

【氏名】ボウミック， アリジット

(72)【発明者】

【氏名】プリセット， マリーヌ

(72)【発明者】

【氏名】コス， マシュー

(72)【発明者】

【氏名】デクロー， マシュー

(72)【発明者】

【氏名】フレンドウェイ， デイビッド

(72)【発明者】

【氏名】ザンブロウィッツ， ブライアン

(72)【発明者】

【氏名】ラチョッピ， クラウディア

【審査官】上條 のぶよ

(56)【参考文献】

【文献】Cell Reports，2018年，Vol.23, No.7，p.2211-2224

【文献】The Journal of Neuroscience，2010年，Vol.30, No.10，p.3839-3848

【文献】Scientific Reports，Vol.7, No.1，7:46359，DOI: 10.1038/srep46359

【文献】Nature Communications，2018年，Vol.9, No.1，DOI: 10.1038/s41467-018-04252-2

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－９０

Ａ０１Ｋ ６７／００－６８

Ｃ１２Ｎ ５／００－２８

Ａ６１Ｋ ３１／００－３３／４４

Ａ６１Ｋ ３８／００－５８

Ａ６１Ｋ ４７／００－６９

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｋ ３５／００－７６８

Ｇ０１Ｎ ３３／５０

Ｇ０１Ｎ ３３／１５

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

げっ歯動物、動物組織、または動物細胞の集団であって、
（ａ）１つ以上の細胞における微小管関連タンパク質タウコード配列と、
（ｂ）（ｉ）前記１つ以上の細胞において、ＢＡＮＦ１およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つもしくは両方の発現をそれぞれ低減させる前記ＢＡＮＦ１およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つもしくは両方の遺伝子改変、ならびに／または（ｉｉ）前記１つ以上の細胞において、ＢＡＮＦ１およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つもしくは両方の発現を低減させる１つ以上の薬剤と、を含み、ただし、前記動物細胞の集団がヒトの生殖細胞を含まず、かつ、ヒトの胚細胞を含まない、げっ歯動物、動物組織、または動物細胞の集団。

【請求項2】

前記１つ以上の細胞が、神経細胞である、請求項１に記載のげっ歯動物、動物組織、または動物細胞の集団。

【請求項3】

前記微小管関連タンパク質タウコード配列が、外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列である、
請求項１または２に記載のげっ歯動物、動物組織、または動物細胞の集団。

【請求項4】

（Ｉ）前記外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列が、ゲノムに組み込まれている、および／または
（ＩＩ）前記外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列が、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列を含む、および／または
（ＩＩＩ）前記外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列が、前記げっ歯動物、前記動物組織、もしくは前記動物細胞の集団における発現のためにコドン最適化されている、および／または
（ＩＶ）前記外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列が、異種プロモーター、マウスプリオンタンパク質プロモーター、ニューロン特異的プロモーターもしくはシナプシン－１プロモーターに作動可能に連結されている、
請求項３に記載のげっ歯動物、動物組織、または動物細胞の集団。

【請求項5】

前記微小管関連タンパク質タウが、タウオパチー関連変異を含み、
（Ｉ）前記タウオパチー関連変異が、Ｐ３０１Ｓ変異を含むか、もしくは、前記微小管関連タンパク質タウが、配列番号９８に記載の配列を含む、または
（ＩＩ）前記タウオパチー関連変異が、Ａ１５２Ｔ／Ｐ３０１Ｌ／Ｓ３２０Ｆ三重変異を含むか、もしくは、前記微小管関連タンパク質タウコード配列が、配列番号８３に記載の配列を含むか、もしくは、前記微小管関連タンパク質タウが配列番号８４に記載の配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のげっ歯動物、動物組織、または動物細胞の集団。

【請求項6】

前記げっ歯動物、前記動物組織、または前記動物細胞の集団が、前記１つ以上の細胞において、前記ＢＡＮＦ１およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つもしくは両方の発現をそれぞれ低減させる、前記ＢＡＮＦ１およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つもしくは両方の前記遺伝子改変を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のげっ歯動物、動物組織、動物細胞の集団。

【請求項7】

前記げっ歯動物、前記動物組織、または前記動物細胞の集団が、前記１つ以上の細胞において、前記ＢＡＮＦ１およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つもしくは両方の発現を低減させる前記１つ以上の薬剤を含み、前記１つ以上の薬剤が、
（Ｉ）ＢＡＮＦ１もしくはＡＮＫＬＥ２を標的とするヌクレアーゼ剤、または前記ヌクレアーゼ剤をコードする核酸であって、前記ヌクレアーゼ剤が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、もしくはクラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質およびガイドＲＮＡである、ヌクレアーゼ剤、または前記ヌクレアーゼ剤をコードする核酸、
（ＩＩ）ＢＡＮＦ１もしくはＡＮＫＬＥ２を標的とする転写抑制因子、または前記転写抑制因子をコードする核酸であって、前記転写抑制因子が、ガイドＲＮＡと、転写抑制因子ドメインに融合された触媒的に不活性なＣａｓタンパク質とを含む、転写抑制因子、もしくは前記転写抑制因子をコードする核酸、または
（ＩＩＩ）ＢＡＮＦ１もしくはＡＮＫＬＥ２を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはＲＮＡｉ剤、または前記アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは前記ＲＮＡｉ剤をコードする核酸
を含む、
請求項１～６のいずれか一項に記載のげっ歯動物、動物組織、または動物細胞の集団。

【請求項8】

前記ヌクレアーゼ剤が、前記Ｃａｓタンパク質および前記ガイドＲＮＡであり、前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質であり、前記Ｃａｓタンパク質が、触媒的に活性なＣａｓタンパク質である、請求項７に記載のげっ歯動物、動物組織、または動物細胞の集団。

【請求項9】

（Ｉ）前記ガイドＲＮＡが、マウスＢａｎｆ１を標的とし、配列番号４４～４６に記載の配列のうちのいずれか１つを含むか、もしくは前記ガイドＲＮＡが、ヒトＢＡＮＦ１を標的とし、配列番号２７～３０に記載の配列のうちのいずれか１つを含む、または
（ＩＩ）前記ガイドＲＮＡが、マウスＡｎｋｌｅ２を標的とし、配列番号５０～５２に記載の配列のうちのいずれか１つを含むか、もしくは前記ガイドＲＮＡが、ヒトＡＮＫＬＥ２を標的とし、配列番号３８に記載の配列を含む、
請求項８に記載のげっ歯動物、動物組織、または動物細胞の集団。

【請求項10】

（Ｉ）前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１０５～１２６、１６９～２３６もしくは２７９～３２４のいずれか１つに記載の配列もしくはその改変バージョンを含む、または
（ＩＩ）前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１０５、１０６、１１０～１１３、１１５、１２０～１２２、１２４、１２５、１６９、１７１～１７３、１７５、１７７、１８１～１８４、１８７、１９４、１９７、２１１、２１３、２１５、２１６、２２０～２２３、２２５、２３０～２３２、２３４、２３５、２７９、２８１～２８３、２８５、２８７、２９１～２９４、２９７、３０４、３０７、３２１および３２３のいずれか１つに記載の配列もしくはその改変バージョンを含み、
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１つ以上のホスホロチオエート結合および／または１つ以上の２’－メトキシエチル修飾塩基を含むか、または、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエート骨格、２’－メトキシエチル修飾塩基の５’ウィング、ＤＮＡの中央１０ヌクレオチドコア、および２’－メトキシエチル修飾塩基の３’ウィングを含む、５－１０－５ギャップマーである、
請求項７に記載のげっ歯動物、動物組織、または動物細胞の集団。

【請求項11】

タウオパチーの少なくとも１つの徴候または症状が、前記ＢＡＮＦ１およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つもしくは両方の前記遺伝子改変を含まないか、または、前記ＢＡＮＦ１およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つもしくは両方の発現を低減させる前記１つ以上の薬剤を含まないげっ歯動物、動物組織、または動物細胞の集団と比較して、前記げっ歯動物、前記動物組織、または前記動物細胞の集団において増加し、前記少なくとも１つの徴候または症状が、
（Ｉ）タウの過剰リン酸化もしくはタウの凝集、および／または
（ＩＩ）細胞分画後の不溶性画分におけるタウおよび／もしくはホスホタウの増加、ニューロンの細胞体樹状突起コンパートメントにおけるホスホタウの増加、ニューロンの核周囲領域におけるホスホタウの増加、ニューロンにおける核膜孔複合体タンパク質Ｎｕｐ９８－Ｎｕｐ９６（Ｎｕｐ９８）の核対細胞質比の減少、ニューロンにおけるＧＴＰ結合核タンパク質Ｒａｎ（Ｒａｎ）の核対細胞質比の減少、またはニューロンにおけるＲａｎ ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質１（ＲａｎＧＡＰ１）の核対細胞質比の減少
を含む、
請求項１～１０のいずれか一項に記載のげっ歯動物、動物組織、または動物細胞の集団。

【請求項12】

前記細胞が、インビトロにあり、
（Ｉ）前記細胞が、ヒト細胞もしくはげっ歯動物細胞である、および／または
（ＩＩ）前記細胞が、神経細胞を含む、
請求項１～１１のいずれか一項に記載の動物細胞の集団。

【請求項13】

前記げっ歯動物細胞が、マウス細胞もしくはラット細胞である、請求項１２に記載の動物細胞の集団。

【請求項14】

前記神経細胞が、ヒト人工多能性幹細胞に由来するニューロン、マウス胚性幹細胞に由来するニューロンもしくは一次マウスニューロンを含む、請求項１２に記載の動物細胞の集団。

【請求項15】

前記組織が、エクスビボにあり、
（Ｉ）前記動物が、げっ歯動物である、および／または
（ＩＩ）前記組織が、神経系組織である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の動物組織。

【請求項16】

前記げっ歯動物が、マウスもしくはラットである、請求項１５に記載の動物組織。

【請求項17】

前記組織が、脳スライスを含む、請求項１５に記載の動物組織。

【請求項18】

（Ｉ）ＢＡＮＦ１およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つもしくは両方の前記遺伝子改変が、１つ以上の神経細胞内にあり、かつ／またはＢＡＮＦ１およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つもしくは両方の発現を低減させる前記１つ以上の薬剤が、１つ以上の神経細胞にある、ならびに／または
（ＩＩ）前記げっ歯動物が、マウスもしくはラットである、
請求項１～１１のいずれか一項に記載のげっ歯動物。

【請求項19】

前記げっ歯動物が、マウスであり、前記マウスが、前記１つ以上の細胞において、前記ＢＡＮＦ１およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つもしくは両方の発現をそれぞれ低減させる、前記ＢＡＮＦ１およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つもしくは両方の前記遺伝子改変をさらに含み、かつ／または前記１つ以上の細胞においてＢＡＮＦ１およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つもしくは両方の発現を低減させる前記１つ以上の薬剤をさらに含む、ＰＳ１９トランスジェニックマウスである、
請求項１８に記載のげっ歯動物。

【請求項20】

タウオパチーの治療のための治療薬候補を評価するための方法であって、
（ａ）請求項１～１１および１８～１９のいずれか一項に記載のげっ歯動物、請求項１～１１および１５～１７のいずれか一項に記載の動物組織、または請求項１～１４のいずれか一項に記載の動物細胞の集団に、候補薬剤を投与することと、
（ｂ）前記候補薬剤が、タウオパチーに関連する１つ以上の徴候または症状に対して効果を有するかどうかを決定するために１つ以上のアッセイを実行することと、
（ｃ）タウオパチーに関連する前記１つ以上の徴候または症状に対して効果を有する前記候補薬剤を治療薬候補として特定することと、を含み、ただし、前記動物組織がエクスビボにあり、前記動物細胞の集団がインビトロにあり、前記動物細胞の集団がヒトの生殖細胞を含まず、かつ、ヒトの胚細胞を含まない方法。

【請求項21】

前記１つ以上の徴候または症状が、
（Ｉ）タウの過剰リン酸化もしくはタウの凝集、または
（ＩＩ）細胞分画後の不溶性画分におけるタウおよび／もしくはホスホタウの増加、ニューロンの細胞体樹状突起コンパートメントにおけるホスホタウの増加、ニューロンの核周囲領域におけるホスホタウの増加、ニューロンにおける核膜孔複合体タンパク質Ｎｕｐ９８－Ｎｕｐ９６（Ｎｕｐ９８）の核対細胞質比の減少、ニューロンにおけるＧＴＰ結合核タンパク質Ｒａｎ（Ｒａｎ）の核対細胞質比の減少、またはニューロンにおけるＲａｎ ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質１（ＲａｎＧＡＰ１）の核対細胞質比の減少
を含む、
請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

請求項１～１１および１８～１９のいずれか一項に記載のげっ歯動物、請求項１～１１および１５～１７のいずれか一項に記載の動物組織、または請求項１～１４のいずれか一項に記載の動物細胞の集団を作製する方法であって、
（Ｉ）
（ａ）ＢＡＮＦ１およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つもしくは両方の発現を低減させる前記１つ以上の薬剤を、前記微小管関連タンパク質タウコード配列を含むげっ歯動物、エクスビボにある動物組織、またはインビトロにある動物細胞の集団に導入することと、
（ｂ）前記げっ歯動物、前記動物組織、または前記動物細胞の集団をスクリーニングして、前記１つ以上の薬剤の存在を確認することと、を含む、または
（ＩＩ）
（ａ）げっ歯動物、エクスビボにある動物組織、またはインビトロにある動物細胞の集団に、
（ｉ）外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列と、
（ｉｉ）ＢＡＮＦ１およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つもしくは両方の発現を低減させる前記１つ以上の薬剤と、を導入することと、
（ｂ）前記げっ歯動物、前記動物組織、または前記動物細胞の集団をスクリーニングして、前記１つ以上の薬剤および前記外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列の存在を確認することと、を含み、ただし、前記動物細胞の集団がヒトの生殖細胞を含まず、かつ、ヒトの胚細胞を含まない、
方法。

【請求項23】

（Ｉ）前記外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列が、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、もしくは脂質ナノ粒子を介して送達される、および／または
（ＩＩ）前記１つ以上の薬剤が、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、もしくは脂質ナノ粒子を介して送達される、および／または
（ＩＩＩ）前記方法が、前記げっ歯動物を作製するためのものであり、前記１つ以上の薬剤が、髄腔内注射、頭蓋内注射、または脳室内注射によって前記げっ歯動物に投与されるか、もしくは、前記１つ以上の薬剤が、脳への定位的注入によって前記げっ歯動物に投与される、
請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

タウオパチーモデルげっ歯動物、タウオパチーモデル動物組織、または動物細胞のタウオパチーモデル集団におけるタウ凝集を加速または悪化させるための方法であって、前記タウオパチーモデルげっ歯動物、前記タウオパチーモデル動物組織、または前記動物細胞のタウオパチーモデル集団に、ＢＡＮＦ１およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つもしくは両方の発現を低下させる１つ以上の薬剤を導入することを含み、ただし、前記タウオパチーモデル動物組織がエクスビボにあり、前記動物細胞のタウオパチーモデル集団がインビトロにあり、前記動物細胞のタウオパチーモデル集団がヒトの生殖細胞を含まず、かつ、ヒトの胚細胞を含まない、方法。

【請求項25】

前記タウオパチーモデルげっ歯動物、前記タウオパチーモデル動物組織、または前記動物細胞のタウオパチーモデル集団が、外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列を含む、
請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

（Ｉ）前記外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列が、ゲノムに組み込まれている、および／または
（ＩＩ）前記外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列が、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列を含む、および／または
（ＩＩＩ）前記外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列が、前記げっ歯動物、前記動物組織、もしくは前記動物細胞の集団における発現のためにコドン最適化されている、および／または
（ＩＶ）前記外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列が、異種プロモーター、マウスプリオンタンパク質プロモーター、ニューロン特異的プロモーターもしくはシナプシン－１プロモーターに作動可能に連結されている、
請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記外因性ヒト微小管関連タンパク質タウが、タウオパチー関連変異を含み、
（Ｉ）前記タウオパチー関連変異が、Ｐ３０１Ｓ変異を含むか、もしくは、前記外因性ヒト微小管関連タンパク質タウが、配列番号９８に記載の配列を含む、または
（ＩＩ）前記タウオパチー関連変異が、Ａ１５２Ｔ／Ｐ３０１Ｌ／Ｓ３２０Ｆ三重変異を含むか、もしくは、前記外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列が、配列番号８３に記載の配列を含むか、もしくは、前記外因性ヒト微小管関連タンパク質タウが配列番号８４に記載の配列を含む、
請求項２５または２６に記載の方法。

【請求項28】

前記１つ以上の薬剤が、
（Ｉ）ＢＡＮＦ１もしくはＡＮＫＬＥ２を標的とするヌクレアーゼ剤、または前記ヌクレアーゼ剤をコードする核酸であって、前記ヌクレアーゼ剤が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、もしくはクラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質およびガイドＲＮＡである、ヌクレアーゼ剤、または前記ヌクレアーゼ剤をコードする核酸、
（ＩＩ）ＢＡＮＦ１もしくはＡＮＫＬＥ２を標的とする転写抑制因子、または前記転写抑制因子をコードする核酸であって、前記転写抑制因子が、ガイドＲＮＡと、転写抑制因子ドメインに融合された触媒的に不活性なＣａｓタンパク質とを含む、転写抑制因子、または前記転写抑制因子をコードする核酸、または
（ＩＩＩ）ＢＡＮＦ１もしくはＡＮＫＬＥ２を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉ剤、あるいは前記アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは前記ＲＮＡｉ剤をコードする核酸
を含む、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記ヌクレアーゼ剤が、前記Ｃａｓタンパク質および前記ガイドＲＮＡであり、前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質であり、前記Ｃａｓタンパク質が、触媒的に活性なＣａｓタンパク質である、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

（Ｉ）前記ガイドＲＮＡが、マウスＢａｎｆ１を標的とし、配列番号４４～４６に記載の配列のうちのいずれか１つを含むか、または前記ガイドＲＮＡが、ヒトＢＡＮＦ１を標的とし、配列番号２７～３０に記載の配列のうちのいずれか１つを含む、または
（ＩＩ）前記ガイドＲＮＡが、マウスＡｎｋｌｅ２を標的とし、配列番号５０～５２に記載の配列のうちのいずれか１つを含むか、または前記ガイドＲＮＡが、ヒトＡＮＫＬＥ２を標的とし、配列番号３８に記載の配列を含む、
請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

（Ｉ）前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１０５～１２６、１６９～２３６もしくは２７９～３２４のうちのいずれか１つに記載の配列またはその改変バージョンを含む、または
（ＩＩ）前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１０５、１０６、１１０～１１３、１１５、１２０～１２２、１２４、１２５、１６９、１７１～１７３、１７５、１７７、１８１～１８４、１８７、１９４、１９７、２１１、２１３、２１５、２１６、２２０～２２３、２２５、２３０～２３２、２３４、２３５、２７９、２８１～２８３、２８５、２８７、２９１～２９４、２９７、３０４、３０７、３２１および３２３のいずれか１つに記載の配列またはその改変バージョンを含み、
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１つ以上のホスホロチオエート結合および／または１つ以上の２’－メトキシエチル修飾塩基を含むか、または、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエート骨格、２’－メトキシエチル修飾塩基の５’ウィング、ＤＮＡの中央１０ヌクレオチドコア、および２’－メトキシエチル修飾塩基の３’ウィングを含む、５－１０－５ギャップマーである、
請求項２８に記載の方法。

【請求項32】

（Ｉ）前記１つ以上の薬剤が、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、もしくは脂質ナノ粒子を介して送達される、および／または
（ＩＩ）前記１つ以上の薬剤が、髄腔内注入、頭蓋内注入、もしくは脳室内注入によって前記げっ歯動物に投与されるか、もしくは、前記１つ以上の薬剤が、脳への定位的注入によって前記げっ歯動物に投与される、
請求項２４～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

タウオパチーの少なくとも１つの徴候または症状が、ＢＡＮＦ１およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つもしくは両方の発現を低減させる前記１つ以上の薬剤を含まないげっ歯動物、動物組織、または動物細胞の集団と比較して、前記げっ歯動物、前記動物組織、または動物細胞の集団において増加し、前記少なくとも１つの徴候または症状が、
（Ｉ）タウの過剰リン酸化もしくはタウの凝集、および／または
（ＩＩ）細胞分画後の不溶性画分におけるタウおよび／もしくはホスホタウの増加、ニューロンの細胞体樹状突起コンパートメントにおけるホスホタウの増加、ニューロンの核周囲領域におけるホスホタウの増加、ニューロンにおける核膜孔複合体タンパク質Ｎｕｐ９８－Ｎｕｐ９６（Ｎｕｐ９８）の核対細胞質比の減少、ニューロンにおけるＧＴＰ結合核タンパク質Ｒａｎ（Ｒａｎ）の核対細胞質比の減少、またはニューロンにおけるＲａｎ ＧＴＰａｓｅ活性化のタンパク質１（ＲａｎＧＡＰ１）の核対細胞質比の減少
を含む、
請求項２４～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

（Ｉ）前記細胞が、ヒト細胞もしくはげっ歯動物細胞である、および／または
（ＩＩ）前記細胞が、神経細胞を含む、
請求項２４～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記げっ歯動物細胞が、マウス細胞もしくはラット細胞である、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記神経細胞が、ヒト人工多能性幹細胞に由来するニューロン、マウス胚性幹細胞に由来するニューロンもしくは一次マウスニューロンを含む、請求項３４に記載の方法。

【請求項37】

（Ｉ）前記動物が、げっ歯動物である、および／または
（ＩＩ）前記組織が、神経系組織である、
請求項２４～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記げっ歯動物が、マウスもしくはラットである、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記組織が、脳スライスを含む、請求項３７に記載の方法。

【請求項40】

前記げっ歯動物が、マウスまたはラットである、請求項２４～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記げっ歯動物が、マウスであり、前記マウスが、ＢＡＮＦ１およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つもしくは両方の発現を低減させる、前記１つ以上の薬剤をさらに含むＰＳ１９トランスジェニックマウスである、請求項４０に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
この出願は、２０１９年６月１４日に出願された米国出願第６２／８６１，５５３号の利益を主張し、これはすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

ＥＦＳ ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列表への参照
ファイル５４８６７３ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔに記述された配列表は２０３キロバイトであり、２０２０年６月１２日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0003】

タウなどのタンパク質の異常な凝集または線維化は、多くの疾患の特徴であり、特にアルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）などの多くの神経変性疾患が含まれる。これらの疾患の多くでは、ある特定のタンパク質の不溶性凝集体への線維化は、疾患の特徴であるだけでなく、神経毒性の原因因子としても関係している。さらに、これらの疾患は、ステレオタイプのパターンに従って中枢神経系を介する凝集の病状の伝播によって特徴付けられ、このプロセスは疾患の進行と相関している。したがって、異常なタンパク質凝集のプロセス、または凝集体の細胞間増殖を変更する遺伝子および遺伝子経路の同定は、神経変性疾患の病因をよりよく理解する上で、ならびに治療的介入のための戦略を考案する上で大いに価値がある。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

本明細書で提供されるのは、改善されたタウオパチーモデルである非ヒト動物、動物組織、および動物細胞の集団ならびにそのようなモデルを作製および使用する方法である。このような改善されたタウオパチーモデルは、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上もしくはすべての発現をそれぞれ低減させるＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上のもしくはすべての遺伝子改変を有することができるかならびに／または１つ以上の細胞においてＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上のもしくはすべての発現を低減させる１つ以上の薬剤を含むことができる。いくつかのそのような改善されたタウオパチーモデルはまた、微小管関連タンパク質タウコード配列（例えば、内因性または外因性）を含み得る。いくつかのそのような改善されたタウオパチーモデルはまた、外因性微小管関連タンパク質タウコード配列（例えば、外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列）を含み得る。あるいは、いくつかのそのような改善されたタウオパチーモデルは、タウオパチー関連変異またはタウ病原性変異を含むタウタンパク質をコードするタウコード配列（内因性または外因性）を含み得る。

【0005】

一態様では、以下を含む非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団であって、（ａ）１つ以上の細胞における微小管関連タンパク質タウコード配列と、（ｂ）（ｉ）１つ以上の細胞において、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上もしくはすべての発現をそれぞれ低減させる、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡおよびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上もしくはすべての遺伝子改変と、ならびに／または（ｉｉ）１つ以上の細胞においてＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上もしくはすべての発現を低減させる１つ以上の薬剤と、を含む、非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団を提供する。任意選択で、微小管関連タンパク質タウコード配列は、ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列である。任意選択で、微小管関連タンパク質タウコード配列は、外因性のヒト微小管関連タンパク質タウコード配列である。一態様では、以下を含む非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団であって、（ａ）１つ以上の細胞における外部ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列と、（ｂ）（ｉ）１つ以上の細胞において、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上もしくはすべての発現をそれぞれ低減させる、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上もしくはすべての遺伝子改変、ならびに／または（ｉｉ）１つ以上の細胞においてＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上もしくはすべての発現を低減させる１つ以上の薬剤と、を含む、非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団を提供する。任意選択で、１つ以上の細胞は神経細胞である。

【0006】

いくつかのそのような非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団では、外因性のヒト微小管関連タンパク質タウコード配列がゲノムに組み込まれている。いくつかのそのような非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団では、外因性のヒト微小管関連タンパク質タウコード配列は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列を含む。いくつかのそのような非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団では、外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列は、非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団における発現のためにコドン最適化されている。

【0007】

いくつかのそのような非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団では、外因性のヒト微小管関連タンパク質タウコード配列は、異種プロモーターに作動可能に連結されている。任意選択で、異種プロモーターはマウスプリオンタンパク質プロモーターである。任意選択で、異種プロモーターはニューロン特異的プロモーターである。必要に応じて、ニューロン特異的プロモーターはシナプシン－１プロモーターである。

【0008】

いくつかのそのような非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団では、微小管関連タンパク質タウは、タウオパチー関連変異を含む。いくつかのそのような非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団では、タウオパチー関連変異は、Ｐ３０１Ｓ変異を含む。任意選択で、微小管関連タンパク質タウは、配列番号９８に示される配列を含む。いくつかのそのような非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団では、タウオパチー関連変異は、Ａ１５２Ｔ／Ｐ３０１Ｌ／Ｓ３２０Ｆ三重変異を含む。任意選択で、微小管関連タンパク質タウコード配列は、配列番号８３に示される配列を含むか、または微小管関連タンパク質タウは、配列番号８４に示される配列を含む。

【0009】

いくつかのそのような非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団では、外因性のヒト微小管関連タンパク質タウは、タウオパチー関連変異を含む。いくつかのそのような非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団では、タウオパチー関連変異は、Ｐ３０１Ｓ変異を含む。任意選択で、外因性ヒト微小管関連タンパク質タウは、配列番号９８に記載の配列を含む。いくつかのそのような非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団では、タウオパチー関連変異は、Ａ１５２Ｔ／Ｐ３０１Ｌ／Ｓ３２０Ｆ三重変異を含む。任意選択で、外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列は、配列番号８３に記載の配列を含むか、または外因性ヒト微小管関連タンパク質タウは、配列番号８４に記載の配列を含む。

【0010】

いくつかのそのような非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団では、非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団は、１つ以上の細胞において、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上もしくはすべての発現をそれぞれ低減させる、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上もしくは遺伝子改変を含む。いくつかのそのような非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団では、非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団は、１つ以上の細胞において、ＢＡＮＦ１、Ｐｐｐ２ｃａ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上もしくはすべての発現を低減させる１つ以上の薬剤を含む。

【0011】

いくつかのそのような非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団では、１つ以上の薬剤は、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、もしくはＡＮＫＬＥ２を標的とするヌクレアーゼ剤、またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸を含む。いくつかのそのような非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団では、ヌクレアーゼ剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはクラスター化等間隔短鎖回文リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ ）（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質およびガイドＲＮＡである。任意選択で、ヌクレアーゼ剤は、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡである。任意選択で、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。任意選択で、Ｃａｓタンパク質は触媒的に活性なＣａｓタンパク質である。任意選択で、Ｃａｓタンパク質は、転写抑制因子ドメインに融合された触媒的に不活性なＣａｓタンパク質であり、任意選択で、転写抑制因子ドメインは、クルッペル関連ボックス（Ｋｒｕｐｐｅｌ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂｏｘ）（ＫＲＡＢ）ドメインである。いくつかのそのような非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団では、ガイドＲＮＡはマウスＢａｎｆ１を標的とし、配列番号４４～４６に記載の配列のうちのいずれか１つを含むか、またはガイドＲＮＡはヒトＢＡＮＦ１を標的とし、配列番号２７～３０に記載の配列のうちのいずれか１つを含む。いくつかのそのような非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団では、ガイドＲＮＡは、マウスＰｐｐ２ｃａを標的とし、配列番号４７～４９に記載の配列のいずれか１つを含むか、またはガイドＲＮＡは、ヒトＰＰＰ２ＣＡを標的とし、配列番号３１～３２に記載の配列のいずれか１つを含む。いくつかのそのような非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団では、ガイドＲＮＡは、マウスＡｎｋｌｅ２を標的とし、配列番号５０～５２に記載の配列のいずれか１つを含むか、またはガイドＲＮＡは、ヒトＡＮＫＬＥ２を標的とし、配列番号３８に記載の配列を含む。

【0012】

いくつかのそのような非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団では、１つ以上の薬剤は、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、もしくはＡＮＫＬＥ２を標的とする転写抑制因子、または転写抑制因子コードする核酸を含む。任意選択で、転写抑制因子は、転写抑制因子ドメインに融合された触媒的に不活性なＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）を含み、任意選択で、転写抑制因子ドメインは、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメインである。いくつかのそのような非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団では、ガイドＲＮＡはマウスＢａｎｆ１を標的とし、配列番号４４－４６に記載の配列のうちのいずれか１つを含むか、またはガイドＲＮＡはヒトＢＡＮＦ１を標的とし、配列番号２７～３０に記載の配列のうちのいずれか１つを含む。いくつかのそのような非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団では、ガイドＲＮＡは、マウスＰｐｐ２ｃａを標的とし、配列番号４７～４９に記載の配列のいずれか１つを含むか、またはガイドＲＮＡは、ヒトＰＰＰ２ＣＡを標的とし、配列番号３１～３２に記載の配列のいずれか１つを含む。いくつかのそのような非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団では、ガイドＲＮＡは、マウスＡｎｋｌｅ２を標的とし、配列番号５０～５２に記載の配列のいずれか１つを含むか、またはガイドＲＮＡは、ヒトＡＮＫＬＥ２を標的とし、配列番号３８に記載の配列を含む。

【0013】

いくつかのそのような非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団では、１つ以上の薬剤は、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、またはＡＮＫＬＥ２を標的とする、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む。いくつかのそのような非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団では、１つ以上の薬剤は、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、もしくはＡＮＫＬＥ２を標的とする、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはＲＮＡｉ剤を含むかまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはＲＮＡｉ剤をコードする核酸を含む。任意選択で、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉ剤は、配列番号１０５～３２４のいずれか１つに記載の配列またはその改変バージョンを含む。任意選択で、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉ剤は、配列番号１０５、１０６、１１０～１１３、１１５、１２０～１２２、１２４、１２５、１３０、１３３、１３６、１３７、１５０、１５２、１５３、１５５、１５８～１６０、１６２、１６５、１６６、１６９、１７１～１７３、１７５、１７７、１８１～１８４、１８７、１９４、１９７、２１１、２１３、２１５、２１６、２２０～２２３、２２５、２３０～２３２、２３４、２３５、２４０、２４３、２４６、２４７、２６０、２６２、２６３、２６５、２６８～２７０、２７２、２７５、２７６、２７９、２８１－２８３、２８５、２８７、２９１～２９４、２９７、３０４、３０７、３２１、および３２３のいずれか１つに記載の配列またはその改変バージョンを含む。場合により、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉ剤は、１つ以上のホスホロチオエート結合および／または１つ以上の２’－メトキシエチル修飾塩基を含む。任意選択で、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格、２’－メトキシエチル修飾塩基の５’ウィング、ＤＮＡの中央１０ヌクレオチドコア、および２’－メトキシエチル修飾塩基の３’ウィングを含む５－１０－５ギャップマーである。

【0014】

いくつかのそのような非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団では、タウオパチーの少なくとも１つの徴候または症状が、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上もしくはすべての遺伝子改変を含まないか、または、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上もしくはすべての発現を低減させる１つ以上の薬剤を含まない非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団と比較して、非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団において増加する。任意選択で、少なくとも１つの徴候または症状は、タウの過剰リン酸化またはタウの凝集を含む。任意選択で、少なくとも１つの徴候または症状は、タウの過剰リン酸化およびタウの凝集を含む。場合により、症状の少なくとも１つの徴候は、細胞分画後の不溶性画分におけるタウおよび／またはホスホタウの増加、ニューロンの細胞体樹状突起（ｓｏｍａｔｏｄｅｎｄｒｉｔｉｃ）コンパートメントにおけるホスホタウの増加、ニューロンの核周囲領域におけるホスホタウの増加、ニューロンにおける核膜孔複合体タンパク質Ｎｕｐ９８－Ｎｕｐ９６（Ｎｕｐ９８）の核対細胞質比の減少、ニューロンにおけるＧＴＰ結合核タンパク質Ｒａｎ（Ｒａｎ）の核対細胞質比の減少、またはニューロンにおけるＲａｎ ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質１（ＲａｎＧＡＰ１）の核対細胞質比の減少、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0015】

いくつかのそのような動物細胞の集団では、細胞はインビボである。いくつかのそのような動物細胞の集団では、細胞はインビトロである。いくつかのそのような動物細胞の集団では、細胞はヒト細胞である。いくつかのそのような動物細胞の集団では、細胞はげっ歯動物細胞であり、任意選択で、げっ歯動物細胞はマウス細胞またはラット細胞である。任意選択で、細胞はマウス細胞である。いくつかのそのような動物細胞の集団では、細胞は神経細胞を含む。任意選択で、ニューロン細胞は、ヒト人工多能性幹細胞に由来するニューロンを含む。任意選択で、ニューロン細胞は、マウス胚性幹細胞に由来するニューロンを含む。任意選択で、神経細胞は一次マウスニューロンを含む。

【0016】

いくつかのそのような動物組織では、組織はインビボである。いくつかのそのような動物組織では、組織はエクスビボである。いくつかのそのような動物組織では、動物はげっ歯動物であり、任意選択で、げっ歯動物はマウスまたはラットである。任意選択で、動物はマウスである。いくつかのそのような動物組織では、組織は神経系組織である。任意選択で、組織は脳切片を含む（例えば、器官型脳切片培養）。

【0017】

いくつかのそのような非ヒト動物では、非ヒト動物はげっ歯動物であり、任意選択で、げっ歯動物はマウスまたはラットである。任意選択で、非ヒト動物はマウスである。任意選択で、マウスは、１つ以上の細胞において、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上もしくはすべての発現をそれぞれ低減させるＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上もしくはすべての遺伝子改変をさらに含み、かつ／または１つ以上の細胞において、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上もしくはすべての発現を低減させる１つ以上の薬剤をさらに含む、ＰＳ１９トランスジェニックマウスである。

【0018】

別の態様では、上記の非ヒト動物、動物組織、および動物細胞の集団のいずれかを使用して、タウオパチーの治療のための治療薬候補（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃａｎｄｉｄａｔｅ）を評価するための方法が提供される。いくつかのそのような方法は、（ａ）上記の非ヒト動物、動物組織、および動物細胞の集団のいずれかに候補薬剤を投与することと、（ｂ）候補薬剤がタウオパチーに関連する１つ以上の徴候または症状に対して効果を有するかどうかを決定するために１つ以上のアッセイを実行することと、（ｃ）タウオパチーに関連する１つ以上の徴候または症状に対して効果を有する候補薬剤を治療薬候補として特定することと、を含む。いくつかのそのような方法では、１つ以上の徴候または症状は、タウの過剰リン酸化またはタウの凝集を含む。任意選択で、１つ以上の徴候または症状は、タウの過剰リン酸化およびタウの凝集を含む。いくつかのそのような方法では、１つ以上の徴候または症状は、細胞分画後の不溶性画分におけるタウおよび／またはホスホタウの増加、ニューロンの細胞体樹状突起コンパートメントにおけるホスホタウの増加、ニューロンの核周囲領域におけるホスホタウの増加、ニューロンにおける核膜孔複合体タンパク質Ｎｕｐ９８－Ｎｕｐ９６（Ｎｕｐ９８）の核対細胞質比の減少、ニューロンにおけるＧＴＰ結合核タンパク質Ｒａｎ（Ｒａｎ）の核対細胞質比の減少、ニューロンにおけるＲａｎ ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質１（ＲａｎＧＡＰ１）の核対細胞質比の減少、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0019】

いくつかのそのような方法では、候補薬剤は、非ヒト動物に投与される。いくつかのそのような方法では、候補薬剤は、エクスビボで動物組織に投与される。いくつかのそのような方法では、候補薬剤は、インビトロで動物細胞の集団に投与される。

【0020】

別の態様では、上記の非ヒト動物、動物組織、および動物細胞の集団のいずれかを作製する方法が提供される。いくつかのそのような方法は、（ａ）ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上またはすべての発現を低減させる１つ以上の薬剤を、微小管関連タンパク質タウコード配列を含む非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団に導入することと、（ｂ）非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団をスクリーニングして、１つ以上の薬剤の存在を確認することと、を含む。いくつかのそのような方法は、（ａ）ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上またはすべての発現を低減させる１つ以上の薬剤を、外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列を含む非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団に導入することと、（ｂ）非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団をスクリーニングして、１つ以上の薬剤の存在を確認することと、を含む。いくつかのそのような方法は、（ａ）非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団に、（ｉ）外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列と、（ｉｉ）ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上またはすべての発現を低減させる１つ以上の薬剤と、を導入することと、（ｂ）非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団をスクリーニングして、１つ以上の薬剤および外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列の存在を確認ことと、を含む。必要に応じて、外因性のヒト微小管関連タンパク質タウコード配列は、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、または脂質ナノ粒子を介して送達される。

【0021】

いくつかのそのような方法では、１つ以上の薬剤は、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、または脂質ナノ粒子を介して送達される。いくつかのそのような方法では、方法は、非ヒト動物を作製するためのものであり、１つ以上の薬剤は、髄腔内注入、頭蓋内注入、または脳室内注入によって非ヒト動物に投与される。任意選択で、方法は、非ヒト動物を作製するためのものであり、１つ以上の薬剤は、脳または脳の領域（例えば、海馬）への定位的注入によって非ヒト動物に投与される。任意選択で、この方法は、非ヒト動物を作製するためのものであり、１つ以上の薬剤は、海馬への定位的注入によって非ヒト動物に投与される。

【0022】

別の態様では、タウオパチーモデル非ヒト動物、タウオパチーモデル動物組織、またはタウオパチーモデル動物細胞の集団においてタウ凝集を加速または悪化させるための方法が提供される。いくつかのそのような方法は、タウオパチーモデルに非ヒト動物、タウオパチーモデル動物組織、または動物細胞のタウオパチーモデル集団に、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上またはすべての発現を低減させる１つ以上の薬剤を導入することを含む。

【0023】

いくつかのそのような方法では、タウオパチーモデル非ヒト動物、タウオパチーモデル動物組織、または動物細胞のタウオパチーモデル集団は、外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列を含む。いくつかのそのような方法では、外因性のヒト微小管関連タンパク質タウコード配列がゲノムに組み込まれている。いくつかのそのような方法では、外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列を含む。いくつかのそのような方法では、外因性のヒト微小管関連タンパク質タウコード配列は、非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団における発現のためにコドン最適化されている。

【0024】

いくつかのそのような方法では、外因性のヒト微小管関連タンパク質タウコード配列は、異種プロモーターに作動可能に連結されている。任意選択で、異種プロモーターはマウスプリオンタンパク質プロモーターである。任意選択で、異種プロモーターはニューロン特異的プロモーターである。必要に応じて、ニューロン特異的プロモーターはシナプシン－１プロモーターである。

【0025】

いくつかのそのような方法では、外因性のヒト微小管関連タンパク質タウは、タウオパチー関連変異を含む。いくつかのそのような方法では、タウオパチー関連変異は、Ｐ３０１Ｓ変異を含む。任意選択で、外因性ヒト微小管関連タンパク質タウは、配列番号９８に記載の配列を含む。いくつかのそのような方法では、タウオパチー関連変異は、Ａ１５２Ｔ／Ｐ３０１Ｌ／Ｓ３２０Ｆ三重変異を含む。任意選択で、外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列は、配列番号８３に記載の配列を含むか、または外因性ヒト微小管関連タンパク質タウは、配列番号８４に記載の配列を含む。

【0026】

いくつかのそのような方法では、１つ以上の薬剤は、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、もしくはＡＮＫＬＥ２を標的とするヌクレアーゼ剤、またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸を含む。いくつかのそのような方法では、ヌクレアーゼ剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはクラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質およびガイドＲＮＡである。任意選択で、ヌクレアーゼ剤は、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡである。任意選択で、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。任意選択で、Ｃａｓタンパク質は触媒的に活性なＣａｓタンパク質である。任意選択で、Ｃａｓタンパク質は、転写抑制因子ドメインに融合された触媒的に不活性なＣａｓタンパク質であり、任意選択で、転写抑制因子ドメインは、クルッペル関連ボックス（Ｋｒｕｐｐｅｌ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂｏｘ）（ＫＲＡＢ）ドメインである。いくつかのそのような方法では、ガイドＲＮＡは、マウスＢａｎｆ１を標的とし、配列番号４４～４６に記載の配列のいずれか１つを含むか、またはガイドＲＮＡは、ヒトＢＡＮＦ１を標的とし、配列番号２７～３０に記載の配列のいずれか１つを含む。いくつかのそのような方法では、ガイドＲＮＡは、マウスＰｐｐ２ｃａを標的とし、配列番号４７～４９に記載の配列のいずれか１つを含むか、またはガイドＲＮＡは、ヒトＰＰＰ２ＣＡを標的とし、配列番号３１～３２に記載の配列のいずれか１つを含む。いくつかのそのような方法では、ガイドＲＮＡは、マウスＡｎｋｌｅ２を標的とし、配列番号５０～５２に記載の配列のいずれか１つを含むか、またはガイドＲＮＡは、ヒトＡＮＫＬＥ２を標的とし、配列番号３８に記載の配列を含む。

【0027】

いくつかのそのような方法では、１つ以上の薬剤は、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、もしくはＡＮＫＬＥ２を標的とする転写抑制因子またはその転写抑制因子をコードする核酸を含む。任意選択で、転写抑制因子は、転写抑制因子ドメインに融合された触媒的に不活性なＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）を含み、任意選択で、転写抑制因子ドメインは、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメインである。いくつかのそのような非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団では、ガイドＲＮＡはマウスＢａｎｆ１を標的とし、配列番号４４－４６に記載の配列のうちのいずれか１つを含むか、またはガイドＲＮＡはヒトＢＡＮＦ１を標的とし、配列番号２７～３０に記載の配列のうちのいずれか１つを含む。いくつかのそのような非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団では、ガイドＲＮＡは、マウスＰｐｐ２ｃａを標的とし、配列番号４７～４９に記載の配列のいずれか１つを含むか、またはガイドＲＮＡは、ヒトＰＰＰ２ＣＡを標的とし、配列番号３１～３２に記載の配列のいずれか１つを含む。いくつかのそのような非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団では、ガイドＲＮＡは、マウスＡｎｋｌｅ２を標的とし、配列番号５０～５２に記載の配列のいずれか１つを含むか、またはガイドＲＮＡは、ヒトＡＮＫＬＥ２を標的とし、配列番号３８に記載の配列を含む。

【0028】

いくつかのそのような方法では、１つ以上の薬剤は、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、もしくはＡＮＫＬＥ２を標的とする、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む。いくつかのそのような方法では、１つ以上の薬剤は、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、もしくはＡＮＫＬＥ２を標的とする、アンチセンスオリゴヌクレオチド、もしくはＲＮＡｉ剤、またはそのアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはＲＮＡｉ剤をコードする核酸を含む。場合により、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉ剤は、配列番号１０５～３２４のいずれか１つに記載の配列またはその改変バージョンを含む。任意選択で、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉ剤は、配列番号１０５、１０６、１１０～１１３、１１５、１２０～１２２、１２４、１２５、１３０、１３３、１３６、１３７、１５０、１５２、１５３、１５５、１５８～１６０、１６２、１６５、１６６、１６９、１７１～１７３、１７５、１７７、１８１～１８４、１８７、１９４、１９７、２１１、２１３、２１５、２１６、２２０～２２３、２２５、２３０～２３２、２３４、２３５、２４０、２４３、２４６、２４７、２６０、２６２、２６３、２６５、２６８～２７０、２７２、２７５、２７６、２７９、２８１－２８３、２８５、２８７、２９１～２９４、２９７、３０４、３０７、３２１、および３２３のいずれか１つに記載の配列またはその改変バージョンを含む。場合により、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉ剤は、１つ以上のホスホロチオエート結合および／または１つ以上の２’－メトキシエチル修飾塩基を含む。任意選択で、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格、２’－メトキシエチル修飾塩基の５’ウィング、ＤＮＡの中央１０ヌクレオチドコア、および２’－メトキシエチル修飾塩基の３’ウィングを含む５－１０－５ギャップマーである。

【0029】

いくつかのそのような方法では、１つ以上の薬剤は、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、または脂質ナノ粒子を介して送達される。いくつかのそのような方法では、１つ以上の薬剤は、髄腔内注入、頭蓋内注入、または脳室内注入によって非ヒト動物に投与され、任意選択で、１つ以上の薬剤は、脳または脳の領域（例えば、海馬）、への定位的注入によって非ヒト動物に投与され、任意選択で、１つ以上の薬剤が、海馬への定位的注入によって非ヒト動物に投与される。

【0030】

いくつかのそのような方法では、タウオパチーの少なくとも１つの徴候または症状が、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上またはすべての発現を低減させる１つ以上の薬剤を含まない非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団と比較して、非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団において増加する。任意選択で、少なくとも１つの徴候または症状は、タウの過剰リン酸化またはタウの凝集を含む。任意選択で、少なくとも１つの徴候または症状は、タウの過剰リン酸化およびタウの凝集を含む。任意選択で、少なくとも１つの徴候または症状は、細胞分画後の不溶性画分におけるタウおよび／またはホスホタウの増加、ニューロンの細胞体樹状突起コンパートメントにおけるホスホタウの増加、ニューロンの核周囲領域におけるホスホタウの増加、ニューロンにおける核膜孔複合体タンパク質Ｎｕｐ９８－Ｎｕｐ９６（Ｎｕｐ９８）の核対細胞質比の減少、ニューロンにおけるＧＴＰ結合核タンパク質Ｒａｎ（Ｒａｎ）の核対細胞質比の減少、ニューロンにおけるＲａｎ ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質１（ＲａｎＧＡＰ１）の核対細胞質比の減少、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0031】

いくつかのそのような方法では、細胞はインビボである。いくつかのそのような方法では、細胞はインビトロである。いくつかのそのような方法では、細胞はヒト細胞である。いくつかのそのような方法では、細胞はげっ歯動物細胞であり、任意選択で、げっ歯動物細胞はマウス細胞またはラット細胞である。任意選択で、細胞はマウス細胞である。いくつかのそのような方法では、細胞は神経細胞を含む。任意選択で、ニューロン細胞は、ヒト人工多能性幹細胞に由来するニューロンを含む。任意選択で、ニューロン細胞は、マウス胚性幹細胞に由来するニューロンを含む。任意選択で、神経細胞は一次マウスニューロンを含む。

【0032】

いくつかのそのような方法では、組織はインビボである。いくつかのそのような方法では、組織はエクスビボである。いくつかのそのような方法では、動物組織はげっ歯動物組織であり、任意選択で、げっ歯動物はマウスまたはラットである。任意選択で、動物組織はマウス組織である。いくつかのそのような方法では、組織は神経系組織である。任意選択で、組織は脳切片を含む（例えば、器官型脳切片培養）。

【0033】

いくつかのそのような方法では、非ヒト動物はげっ歯動物であり、任意選択で、げっ歯動物はマウスまたはラットである。任意選択で、非ヒト動物はマウスである。任意選択で、マウスは、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上もしくはすべての発現を低減させる１つ以上の薬剤をさらに含むＰＳ１９トランスジェニックマウスである。

【0034】

別の態様では、外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列と、それぞれＢａｎｆ１、Ｐｐｐ２ｃａ、およびＡｎｋｌｅ２のうちの１つ以上またはすべての発現を低減させるＢａｎｆ１、Ｐｐｐ２ｃａ、およびＡｎｋｌｅ２のうちの１つ以上またはすべての遺伝子改変と、を含む非ヒト動物ゲノムが提供される。

【0035】

別の態様では、提供されるのは、細胞におけるＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、もしくはＡｎｋｌｅ２の発現を低減または阻害する薬剤またはこの薬剤をコードする核酸であって、任意選択で、薬剤が、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、もしくはＡＮＫＬＥ２を標的とする、ヌクレアーゼ剤またはアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。任意選択で、薬剤は、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、またはＡＮＫＬＥ２を標的とする、ヌクレアーゼ剤またはアンチセンスオリゴヌクレオチドＲＮＡｉ剤である。場合により、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉ剤は、配列番号１０５～３２４のいずれか１つに記載の配列またはその改変バージョンを含む。任意選択で、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉ剤は、配列番号１０５、１０６、１１０～１１３、１１５、１２０～１２２、１２４、１２５、１３０、１３３、１３６、１３７、１５０、１５２、１５３、１５５、１５８～１６０、１６２、１６５、１６６、１６９、１７１～１７３、１７５、１７７、１８１～１８４、１８７、１９４、１９７、２１１、２１３、２１５、２１６、２２０～２２３、２２５、２３０～２３２、２３４、２３５、２４０、２４３、２４６、２４７、２６０、２６２、２６３、２６５、２６８～２７０、２７２、２７５、２７６、２７９、２８１－２８３、２８５、２８７、２９１～２９４、２９７、３０４、３０７、３２１、および３２３のいずれか１つに記載の配列またはその改変バージョンを含む。場合により、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉ剤は、１つ以上のホスホロチオエート結合および／または１つ以上の２’－メトキシエチル修飾塩基を含む。任意選択で、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格、２’－メトキシエチル修飾塩基の５’ウィング、ＤＮＡの中央１０ヌクレオチドコア、および２’－メトキシエチル修飾塩基の３’ウィングを含む５－１０－５ギャップマーである。

【図面の簡単な説明】

【0036】

【図1】（原寸に比例していない）タウアイソフォーム２Ｎ４Ｒの概略図を示す。タウバイオセンサー株は、完全な２Ｎ４Ｒではなく、導入遺伝子としてタウ４ＲＤ－ＹＦＰおよびタウ４ＲＤ－ＣＦＰのみを含む。

【図2】タウバイオセンサー細胞株において、凝集体形成が蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によってどのように監視されるかについての概略図を示す。タウ^４ＲＤ－ＣＦＰタンパク質は紫色の光で励起され、青色の光を発する。タウ^４ＲＤ－ＹＦＰ融合タンパク質は青色の光で励起され、黄色の光を発する。凝集がない場合、紫色の光による励起はＦＲＥＴをもたらさない。タウ凝集がある場合、紫色の光による励起はＦＲＥＴおよび黄色の発光をもたらす。

【図3A】以前に単離された期待に及ばない対照Ｃａｓ９－発現ＴＣＹクローンである、クローンＣａｓ９Ｈ１に対する、レンチウイルスＣａｓ９発現コンストラクトを形質導入したタウ^４ＲＤ－ＣＦＰ／タウ^４ＲＤ－ＹＦＰ（ＴＣＹ）バイオセンサー細胞クローンにおける相対Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ発現を示す。

【図3B】ＰＥＲＫおよびＳＮＣＡをそれぞれ標的とするｓｇＲＮＡを形質導入してから３日後および７日後のＣａｓ９ ＴＣＹクローンにおけるＰＥＲＫ遺伝子座およびＳＮＣＡ遺伝子座での切断効率を示す。

【図4】ゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｇＲＮＡライブラリを使用して、Ｃａｓ９ ＴＣＹバイオセンサー細胞内の標的遺伝子を破壊するための戦略の概略図を示す。

【図5】タウ^４ＲＤ－ＹＦＰ細胞にタウ^４ＲＤ線維を播種した場合の、安定して増殖するタウ凝集体を含むタウ^４ＲＤ－ＹＦＰ Ａｇｇ［＋］サブクローンの誘導を示す概略図である。タウ凝集体を含むサブクローンを示す蛍光顕微鏡画像も示される。

【図6】コンフルエントな細胞で３日後に収集されたタウ^４ＲＤ－ＹＦＰ Ａｇｇ［＋］サブクローンからの馴化培地が、タウ凝集活性の源を提供することができるのに対し、タウ^４ＲＤ－ＹＦＰ Ａｇｇ［－］サブクローンからの培地は提供しないことを示す概略図である。馴化培地は、７５％の馴化培地および２５％の新鮮な培地としてレシピエント細胞に適用された。それぞれの蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析画像が示される。ｘ軸は、ＣＦＰ（４０５ｎｍレーザー励起）を示し、ｙ軸は、ＦＲＥＴ（ＣＦＰ発光からの励起）を示す。右上の象限はＦＲＥＴ［＋］であり、右下の象限はＣＦＰ［＋］であり、左下の象限は二重陰性である。

【図7】タウ凝集を促進する修飾因子遺伝子を同定するためのゲノムワイドＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲｎ）スクリーニングの戦略を示す概略図である。

【図8】ゲノムワイドＣＲＩＳＰＲｎスクリーニングを使用した次世代シーケンシング（ＮＧＳ）分析のための存在量および濃縮の概念を示す概略図である。

【図9】タウ凝集を促進する修飾因子遺伝子のゲノムワイドスクリーニングで同定された標的遺伝子１～１４の二次スクリーニングの概略図を示す。

【図10】標的遺伝子１～１４を標的とするｓｇＲＮＡのレンチウイルス発現コンストラクトを形質導入したＣａｓ９ ＴＣＹバイオセンサー細胞におけるタウ凝集体馴化培地によるＦＲＥＴ誘導を示すグラフである。二次スクリーニングにより、標的遺伝子２（ＢＡＮＦ１）および８（ＰＰＰ２ＣＡ）が、タウの播種／凝集に対する細胞の感受性を調節することが確認された。

【図11】ＢＡＮＦ１ ｇＲＮＡ１、ＰＰＰ２ＣＡ ｇＲＮＡ５、非標的ｇＲＮＡ、およびｇＲＮＡなしのレンチウイルス発現コンストラクトを形質導入したＣａｓ９ ＴＣＹバイオセンサー細胞のＦＡＣＳ分析画像を示す。細胞は、馴化培地または新鮮な培地で培養された。ｘ軸は、ＣＦＰ（４０５ｎｍレーザー励起）を示し、ｙ軸は、ＦＲＥＴ（ＣＦＰ発光からの励起）を示す。右上の象限はＦＲＥＴ［＋］であり、右下の象限はＣＦＰ［＋］であり、左下の象限は二重陰性である。ＢＡＮＦ１またはＰＰＰ２ＣＡの破壊は、タウ凝集体馴化培地に応答してタウ凝集体の形成を増加させるが、新鮮な培地には応答しない。

【図12】ｍＲＮＡ発現分析、タンパク質発現分析、およびＦＲＥＴ分析を含む、ＢＡＮＦ１およびＰＰＰ２ＣＡを標的とするｓｇＲＮＡのレンチウイルス発現コンストラクトを形質導入したＣａｓ９ ＴＣＹバイオセンサー細胞における二次スクリーニングの概略図を示す。ＢＡＮＦ１（ｇ１およびｇ３）に対して２つのｓｇＲＮＡを使用し、ＰＰＰ２ＣＡ（ｇ５）に対して１つのｓｇＲＮＡを使用し、非標的対照として非標的ｓｇＲＮＡ（ｇ３）を使用した。

【図13】レンチウイルスｓｇＲＮＡ発現コンストラクトの形質導入後６日目にｑＲＴ－ＰＣＲにより評価された、Ｃａｓ９ ＴＣＹバイオセンサー細胞におけるＢＡＮＦ１およびＰＰＰ２ＣＡの相対的発現を示す。

【図14】レンチウイルスｓｇＲＮＡ発現コンストラクトによる形質導入後１３日目にウエスタンブロットにより評価された、Ｃａｓ９ＴＣＹバイオセンサー細胞におけるＢＡＮＦ１タンパク質およびＰＰＰ２ＣＡタンパク質の発現を示す。

【図15】レンチウイルスｓｇＲＮＡ発現構築物の形質導入後１０日目の、Ｃａｓ９ ＴＣＹバイオセンサー細胞におけるＦＲＥＴ［＋］細胞パーセントで測定した場合のタウ凝集を示す。リポフェクタミンは使用されなかった。

【図16】ウエスタンブロットにより評価された、ノックダウンＣａｓ９ ＴＣＹ細胞クローンにおけるＢＡＮＦ１およびＰＰＰ２ＣＡの発現を示す。

【図17】ウエスタンブロットにより評価された、ノックダウンＣａｓ９ ＴＣＹ細胞クローンにおけるタウの発現、ならびにウエスタンブロットにより評価された、それらのクローンの位置Ｓ２６２およびＳ３５６でのタウのリン酸化を示す。

【図18】ＦＲＥＴにより評価された、ＢＡＮＦ１およびＰＰＰ２ＣＡノックダウンＣａｓ９ＴＣＹ細胞クローンにおけるタウ凝集を示す。

【図19】ＦＲＥＴにより評価された、ＢＡＮＦ１、ＶＲＫ１、ＣＤＫ５、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２Ｒ２Ａ、ＡＮＫＬＥ２、ＥＭＤ、ＬＥＭＤ２、ＬＥＭＤ３／ＭＡＮ１、およびＴＭＰＯ／ＬＡＰ２ノックダウンＣａｓ９ＴＣＹ細胞クローンにおけるタウ凝集を示す。

【図20】ＡＮＫＬＥ２、ＥＭＤ、またはＶＲＫ１を標的とするレンチウイルスｓｇＲＮＡ発現コンストラクトの形質導入後の、Ｃａｓ９ ＴＣＹバイオセンサー細胞におけるＦＲＥＴ［＋］細胞パーセントで測定した場合のタウ凝集を示す。

【図21A】レンチウイルスｓｇＲＮＡ発現コンストラクトによる形質導入後のｑＲＴ－ＰＣＲで評価された、Ｃａｓ９対応マウス胚性幹細胞におけるＢａｎｆ１の相対的発現を示す。

【図21B】レンチウイルスｓｇＲＮＡ発現コンストラクトによる形質導入後ｑＲＴ－ＰＣＲで評価された、Ｃａｓ９対応マウス胚性幹細胞におけるＰｐｐ２ｃａの相対的発現を示す。

【図22A】レンチウイルスｓｇＲＮＡ発現コンストラクト（Ｃａｓ９を含むオールインワン（ＡＩＯ）コンストラクト、またはｓｇＲＮＡのみ）を用いた形質導入後のｑＲＴ－ＰＣＲで評価された、Ｆ１Ｈ４マウス胚性幹細胞におけるＡｎｋｌｅ２の相対的発現を示す。

【図22B】レンチウイルスｓｇＲＮＡ発現コンストラクト（Ｃａｓ９を含むオールインワン（ＡＩＯ）コンストラクト、またはｓｇＲＮＡのみ）を用いた形質導入後のｑＲＴ－ＰＣＲで評価された、Ｆ１Ｈ４マウス胚性幹細胞におけるＢａｎｆ１の相対的発現を示す。

【図22C】レンチウイルスｓｇＲＮＡ発現コンストラクト（Ｃａｓ９を含むオールインワン（ＡＩＯ）コンストラクト、またはｓｇＲＮＡのみ）を用いた形質導入後のｑＲＴ－ＰＣＲで評価された、Ｆ１Ｈ４マウス胚性幹細胞におけるＰｐｐ２ｃａの相対的発現を示す。

【図23】ＢＡＮＦ１／ＰＰＰ２ＣＡインタラクトームを示す。

【図24A】タウ－ＣＦＰ／タウ－ＹＦＰ（ＴＣＹ）ｄＣａｓ－ＫＲＡＢクローン（ＢＡＮＦ１もしくはＡＮＫＬＥ２の標的ノックダウンまたは非標的）におけるＡＮＫＬＥ２の相対的発現を示す。

【図24B】タウ－ＣＦＰ／タウ－ＹＦＰ（ＴＣＹ）ｄＣａｓ－ＫＲＡＢクローン（ＢＡＮＦ１もしくはＡＮＫＬＥ２の標的ノックダウンまたは非標的）におけるＢＡＮＦ１の相対的発現を示す。

【図25】馴化培地タウ－ＹＦＰ Ａｇｇ［＋］で３日間処理した、タウ－ＣＦＰ／タウ－ＹＦＰ（ＴＣＹ）ｄＣａｓ－ＫＲＡＢクローン（ＢＡＮＦ１またはＡＮＫＬＥ２の標的ノックダウン）におけるＦＲＥＴ［＋］細胞の割合で測定したタウ凝集を示す。

【図26】ΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２クローンの細胞分画により、タウ－ＹＦＰ Ａｇｇ［＋］細胞溶解物を用いた２日後に不溶性画分中のタウおよびホスホタウ（セリン３５６）の検出が可能になることを示している。

【図27】ＲＮＡ－ｓｅｑ解析による４つの比較で重要な遺伝子（１．５以上の倍数変化）の遺伝子リストサイズを示す（ＢＡＮＦ１ＫＤ対非標的対照、ＢＡＮＦ１ＫＤ対親、ＡＮＫＬＥ２ＫＤ対非標的対照、およびＡＮＫＬＥ２ＫＤ対親）。

【図28】ΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２ノックダウン細胞におけるタウ凝集の増加を救助するためのｃＤＮＡ相補性を試験するための概略図を示す。

【図29】タウ－ＹＦＰＡｇｇ［＋］細胞溶解物（２μｇ）で ２日間処理したタウ－ＣＦＰ ／タウ－ＹＦＰｄＣａｓ－ＫＲＡＢΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２ノックダウン細胞のｃＤＮＡ相補後のＦＲＥＴ［＋］細胞パーセントで測定したタウ凝集を示す。Ｎｏ＿ＫＲＡＢ＿ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡが投与されていない陰性対照試料を指す。

【図30A】非標的マウス一次皮質ニューロンとΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２変異皮質ニューロンのＤＡＰＩ＋核のカウントを示す。

【図30B】非標的マウス一次皮質ニューロンとΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２変異皮質ニューロンの蛍光強度によって測定された細胞体におけるＭＡＰ２強度を示している。両側の対応のないスチューデントのｔ検定を使用した（ｎｓ ＝非有意、エラーバーは平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ）を表す）。

【図31A】非標的マウス一次皮質ニューロンおよびΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２変異皮質ニューロンの細胞体におけるホスホタウＳ３５６強度（蛍光強度で測定）を示す。

【図31B】非標的マウス一次皮質ニューロンとΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２変異皮質ニューロンにおける核周囲ホスホタウＳ３５６強度（蛍光強度で測定）を示す。両側の対応のないスチューデントのｔ検定を使用した（＊＊＊ ＝ ｐ ＜０．００４ ＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１、エラーバーは平均値の標準誤差を表す）。

【図32A】非標的マウス一次皮質ニューロンとΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２変異皮質ニューロンのＤＡＰＩ＋核のカウントを示す。

【図32B】非標的マウス一次皮質ニューロンとΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２変異皮質ニューロンの蛍光強度によって測定された細胞体におけるＭＡＰ２強度を示す。

【図32C】非標的マウス一次皮質ニューロンとΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２変異皮質ニューロンの蛍光強度によって測定された細胞体における総タウ強度を示している。両側の対応のないスチューデントのｔ検定を使用した（ｎｓ＝非有意、エラーバーは平均値の標準誤差を表す）。

【図33A】非標的マウス一次皮質ニューロンとΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２およびΔＰＰＰ２ＣＡ変異皮質ニューロンの核のカウントを示す。

【図33B】非標的マウス一次皮質ニューロンとΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２およびΔＰＰＰ２ＣＡ変異皮質ニューロンの蛍光強度によって測定された細胞体におけるＭＡＰ２強度を示す。

【図33C】非標的マウス一次皮質ニューロンとΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２およびΔＰＰＰ２ＣＡ変異皮質ニューロンの蛍光強度によって測定された細胞体におけるホスホタウＡＴ８（Ｓ２０２、Ｔ２０５）強度を示す。

【図33D】非標的マウス一次皮質ニューロンとΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２およびΔＰＰＰ２ＣＡ変異皮質ニューロンの蛍光強度によって測定された核周囲ドメインにおけるホスホタウＡＴ８（Ｓ２０２、Ｔ２０５）強度を示す。

【図33E】非標的マウス一次皮質ニューロンとΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２およびΔＰＰＰ２ＣＡ変異皮質ニューロンの蛍光強度によって測定された細胞体における総タウ強度を示す。

【図34A】非標的マウス一次皮質ニューロンとΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２変異皮質ニューロンにおけるＤＡＰＩ＋核のカウントを示す。

【図34B】非標的マウス一次皮質ニューロンとΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２変異皮質ニューロンにおけるＮｕｐ９８核／細胞質比を示す。

【図34C】非標的マウス一次皮質ニューロンおよびΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２変異皮質ニューロンの体細胞におけるホスホタウＳ３５６強度（蛍光強度で測定）を示す。

【図34D】非標的マウス一次皮質ニューロンとΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２変異皮質ニューロンにおける核周囲ホスホタウＳ３５６強度（蛍光強度で測定）を示す。両側の対応のないスチューデントのｔ検定を使用した（＊＝ｐ＜０．０５、エラーバーは平均値の標準誤差を表す）。

【図35A】非標的マウス一次皮質ニューロンとΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２変異皮質ニューロンにおけるＲａｎＧＡＰ１核／細胞質比を示す。

【図35B】非標的マウス一次皮質ニューロンとΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２変異皮質ニューロンにおける総ＲａｎＧＡＰ１レベルを示す。

【図35C】非標的マウス一次皮質ニューロンおよびΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２変異皮質ニューロンにおけるＲａｎ核／細胞質比を示す。

【図35D】非標的マウス一次皮質ニューロンとΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２変異皮質ニューロンにおける総Ｒａｎレベルを示す。両側の対応のないスチューデントのｔ検定を使用した（＊＊＝ｐ＜０．００２－ｎｓ、非有意、エラーバーは平均値の標準誤差を表す）。

【図36A】タウ－ｃＤＮＡ ３ＭＵＴを添加した場合の、非標的マウス一次皮質ニューロンとΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２変異皮質ニューロンにおけるＤＡＰＩ＋核のカウントを示す。

【図36B】タウｃＤＮＡ ３ＭＵＴを添加した場合の非標的マウス一次皮質ニューロンおよびΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２変異皮質ニューロンの細胞体におけるホスホタウＳ３５６強度（蛍光強度で測定）を示す。

【図36C】タウｃＤＮＡ ３ＭＵＴを添加した場合の非標的マウス一次皮質ニューロンおよびΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２変異皮質ニューロンにおける核周囲リン酸化タウＳ３５６強度（蛍光強度で測定）を示す。

【図36D】タウ－ｃＤＮＡ ３ＭＵＴを添加した場合の、非標的マウス一次皮質ニューロンおよびΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２変異皮質ニューロンの細胞体におけるＭＡＰ２強度（蛍光強度で測定）を示す。両側の対応のないスチューデントのｔ検定を使用した（＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．００２－ｎｓ、非有意、エラーバーは平均値の標準誤差を表す）。

【図37A】タウ－ｃＤＮＡ ３ＭＵＴを添加した場合の、非標的マウス一次皮質ニューロンとΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２変異皮質ニューロンにおけるＤＡＰＩ＋核のカウントを示す。

【図37B】タウｃＤＮＡ ３ＭＵＴを添加した場合の、非標的マウス一次皮質ニューロンおよびΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２変異皮質ニューロンの細胞体における総タウ強度（蛍光強度で測定）を示す。

【図37C】タウ－ｃＤＮＡ ３ＭＵＴを添加した場合の、非標的マウス一次皮質ニューロンおよびΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２変異皮質ニューロンの細胞体におけるＭＡＰ２強度（蛍光強度で測定）を示す。両側の対応のないスチューデントのｔ検定が使用された（ｎｓ＝非有意、エラーバーは平均値の標準誤差を表す）。

【図38A】非標的マウス一次皮質ニューロンとΔＢＡＮＦ１およびΔＰＰＰ２ＣＡ変異皮質ニューロンにおけるＤＡＰＩ＋核のカウントを示す。

【図38B】非標的マウス一次皮質ニューロンとΔＢＡＮＦ１およびΔＰＰＰ２ＣＡ変異皮質ニューロンの蛍光強度によって測定された核周囲ドメインにおけるホスホタウ（Ｓ３５６）強度を示す。

【図38C】ホスホタウ（Ｓ３５６）強度と、ΔＰＰＰ２ＣＡ変異皮質ニューロンの細胞体における誤って折り畳まれたタウの検出の増加との相関関係を示す。

【図38D】非標的マウス一次皮質ニューロンとΔＢＡＮＦ１およびΔＰＰＰ２ＣＡ変異皮質ニューロンの蛍光強度によって測定された細胞におけるホスホタウ（Ｓ３５６）強度を示す。

【図38E】非標的マウス一次皮質ニューロンおよびΔＢＡＮＦ１およびΔＰＰＰ２ＣＡ変異皮質ニューロンの細胞におけるアグリソーム検出試薬（ＡＤＲ）強度である。

【図38F】ホスホタウ（Ｓ３５６）強度と、ΔＢＡＮＦ１変異皮質ニューロンの細胞体における誤って折り畳まれたタウの検出の増加との相関関係を示す。両側の対応のないスチューデントのｔ検定を使用した（＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０２、＊＊＊＝ｐ＜０．００４、エラーバーは平均値の標準誤差を表す、ピアソン相関（ρ）－Ｒ二乗－両側Ｐ値＜０．０５）。

【図39A】非標的マウス一次皮質ニューロンとΔＢＡＮＦ１およびΔＰＰＰ２ＣＡ変異皮質ニューロンにおけるＤＡＰＩ＋核のカウントを示す。

【図39B】非標的マウス一次皮質ニューロンとΔＢＡＮＦ１およびΔＰＰＰ２ＣＡ変異皮質ニューロンの蛍光強度によって測定された核周囲ドメインにおけるホスホタウＡＴ８（Ｓ２０２、Ｔ２０５）強度を示す。

【図39C】ホスホタウＡＴ８（Ｓ２０２、Ｔ２０５）強度と、ΔＰＰＰ２ＣＡ変異皮質ニューロンの細胞体における誤って折り畳まれたタウの検出の増加との相関関係を示す。

【図39D】非標的マウス一次皮質ニューロンとΔＢＡＮＦ１およびΔＰＰＰ２ＣＡ変異皮質ニューロンの蛍光強度によって測定された細胞体におけるホスホタウＡＴ８（Ｓ２０２、Ｔ２０５）強度を示す。

【図39E】非標的マウス一次皮質ニューロンとΔＢＡＮＦ１およびΔＰＰＰ２ＣＡ変異皮質ニューロンの細胞体におけるアグリソーム検出試薬（ＡＤＲ）強度である。

【図39F】ホスホタウＡＴ８（Ｓ２０２、Ｔ２０５）強度と、ΔＢＡＮＦ１変異皮質ニューロンの細胞体における誤って折り畳まれたタウの検出の増加との相関関係を示す。両側の対応のないスチューデントのｔ検定を使用した（＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０２、＊＊＊＝ｐ＜０．００４、ｎｓ＝非有意、エラーバーは平均値の標準誤差を表す、ピアソン相関（ρ）－Ｒ二乗－両側Ｐ値＜０．０５）。

【図40】ＡＳＯがホスホロチオエート骨格を持つ５－１０－５ギャップマー、各ウィングで使用される２’メトキシエチル修飾塩基（両端から５ヌクレオチド）、および未修飾のＤＮＡ塩基の１０ヌクレオチドコアとして設計されたＡＳＯ設計の一般的な概略図を示す。

【図41A】ＡＳＯによるトランスフェクションの７２時間後のマウスＮＳＣ３４細胞でｍＡｎｋｌｅ２ ＡＳＯをスクリーニングしたｑＰＣＲの結果を示す。標的の全ｍＲＮＡのノックダウンを未処理の細胞と比較した。図４１Ａは、１００ｎＭ ＡＳＯ濃度で実施された一次スクリーニングの結果を示し（２回反復、上部の破線は７５％のノックダウンを示す）、図４１Ｂは、５０ｎＭ ＡＳＯ濃度で実施された二次スクリーニングの結果を示し（２回反復、一番下の破線は７５％のノックダウンを示す）、図４１Ｃは、５ｎＭ ＡＳＯ濃度で実施された二次スクリーニングの結果を示す（２回反復、中央の破線は２５％のノックダウンを示す）。

【図41B】同上。

【図41C】同上。

【図42A】ＡＳＯによるトランスフェクションの７２時間後にマウスＮＳＣ３４細胞でｍＰｐｐ２ｃａＡＳＯをスクリーニングしたｑＰＣＲの結果を示す。標的の全ｍＲＮＡのノックダウンを未処理の細胞と比較した。図４２Ａは、１００ｎＭ ＡＳＯ濃度で実施された一次スクリーニングの結果を示し（点線は７５％のノックダウンを示す）、図４２Ｂは、５０ｎＭ ＡＳＯ濃度で実施された二次スクリーニングの結果を示し（３回反復、下部の点線は７５％のノックダウンを示す）、図４２Ｃは、５ｎＭ ＡＳＯ濃度で実施された二次スクリーニングの結果を示す（３回反復、下部の点線は４０％のノックダウンを示す）。

【図42B】同上。

【図42C】同上。

【図43】１００ｎＭの濃度でのＡＳＯによるトランスフェクションの７２時間後にマウスＮＳＣ３４細胞でｍＢａｎｆ１ＡＳＯをスクリーニングしたｑＰＣＲの結果を示す（２反復）。標的の全ｍＲＮＡのノックダウンを未処理の細胞と比較した。点線は７５％のノックダウンを示す。

【発明を実施するための形態】

【0037】

定義
本明細書で互換的に使用される、「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、コード化および非コード化アミノ酸ならびに化学的または生化学的に修飾または誘導体化したアミノ酸を含む、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を含む。これらの用語には、修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドなどの修飾されたポリマーも含まれる。「ドメイン」という用語は、特定の機能または構造を有するタンパク質またはポリペプチドの任意の部分を指す。

【0038】

タンパク質は、「Ｎ末端」および「Ｃ末端」を有すると言われている。「Ｎ末端」という用語は、遊離アミン基（－ＮＨ２）を有するアミノ酸によって終端されたタンパク質またはポリペプチドの開始部に関する。「Ｃ末端」という用語は、遊離カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）によって終端されたアミノ酸鎖（タンパク質またはポリペプチド）の末端部に関する。

【0039】

本明細書で互換的に使用される、「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはそれらの類似体もしくは修飾バージョンを含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含む。これらには、一本鎖、二本鎖、および多重鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、ならびにプリン塩基、ピリミジン塩基、または他の天然、化学的に修飾された、生化学的に修飾された、非天然、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。

【0040】

１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸塩がホスホジエステル結合を介して一方向で、その隣の３’酸素に結合する手法でオリゴヌクレオチドを作製するように、モノヌクレオチドが反応するため、核酸は、「５’末端」および「３’末端」を有すると言われている。オリゴヌクレオチドの末端は、その５’リン酸塩がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に連結されていない場合、「５’末端」と呼ばれる。オリゴヌクレオチドの末端は、その３’酸素が別のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸塩に連結されていない場合、「３’末端」と呼ばれる。核酸配列は、より大きなオリゴヌクレオチドの内部に存在するとしても、５’および３’末端を有するとも言われ得る。線状または環状ＤＮＡ分子のいずれかにおいて、別個のエレメントは、「上流」または「下流」の５’もしくは３’エレメントであると呼ばれる。

【0041】

「ゲノムに組み込まれた」という用語は、ヌクレオチド配列が細胞のゲノムに組み込まれるように、細胞に導入されている核酸を指す。細胞のゲノムへの核酸の安定した組み込みのために、任意のプロトコルを使用してよい。

【0042】

「標的化ベクター」という用語は、相同組換え、非相同末端結合媒介ライゲーション、または細胞のゲノム中の標的位置への組換えの任意の他の手段によって導入され得る組換え核酸を指す。

【0043】

「ウイルスベクター」という用語は、ウイルス起源の少なくとも１つのエレメントを含み、かつウイルスベクター粒子へのパッケージングに十分な、またはそれを許容するエレメントを含む、組換え核酸を指す。ベクターおよび／または粒子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他の核酸を、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで細胞に導入する目的で利用することができる。ウイルスベクターの多くの形態が既知である。

【0044】

細胞、組織（例えば、脳切片）、タンパク質、および核酸に関して「分離された」という用語は、通常インサイチュで存在し得る他の細菌、ウイルス、細胞、または他の成分に関して比較的精製されている細胞、組織（例えば、脳切片）、タンパク質、および核酸を含み、細胞、組織（例えば、脳切片）、タンパク質、および核酸の実質的に純粋な調製物までを含み、ならびにそれらの実質的に純粋な調製物を含む。「単離された」という用語はまた、天然に存在する対応物を有さず、化学的に合成され、それにより他の細胞、組織（例えば、脳切片）、タンパク質、および核酸が実質的に混入していないか、またはそれらに天然に付随する（例えば、他の細胞タンパク質、ポリヌクレオチド、もしくは他の成分）ほとんどの他の成分（例えば、細胞成分）から分離もしくは精製されている細胞、組織、タンパク質および核酸も含む。

【0045】

「野生型」という用語は、（変異型、病変した、改変したなどとは対照的に）正常な状態または文脈に見られるような構造および／または活性を有する実体を指す。野生型遺伝子およびポリペプチドは、多くの場合、複数の異なる形態（例えば、対立遺伝子）で存在する。

【0046】

「内因性配列」という用語は、細胞または生物内で自然に発生する核酸配列を指す。例えば、細胞または生物の内因性ＭＡＰＴ配列は、細胞または生物のＭＡＰＴ遺伝子座で自然に発生するネイティブＭＡＰＴ配列を指す。

【0047】

「外因性」分子または配列には、その形態の細胞には通常存在しない分子または配列が含まれる。通常の存在には、細胞の特定の発生段階および環境条件に関する存在が含まれる。外因性分子または配列には、例えば、内因性配列のヒト化バージョンなど、細胞内の対応する内因性配列の変異バージョンが含まれ得るか、または細胞内であるが、異なる形態の内因性配列に対応する配列が含まれ得る（すなわち、染色体内ではない、または染色体内の異なる位置、または内因性ＭＡＰＴ遺伝子座以外のゲノム遺伝子座にランダムに挿入されたヒトタウ導入遺伝子などの異なる染色体内）。対照的に、内因性分子または配列は、その形態で、特定の細胞において、特定の発生段階で、特定の環境条件下で通常存在する分子または配列を含む。

【0048】

核酸またはタンパク質の文脈で使用される場合の「異種」という用語は、核酸またはタンパク質が、同じ分子内で一緒に自然に発生しない少なくとも２つのセグメントを含むことを示す。例えば、「異種」という用語は、核酸のセグメントまたはタンパク質のセグメントに関して使用される場合、核酸またはタンパク質が、自然界で互いに同じ関係（例えば、一緒に結合）で見出されない２つ以上のサブ配列を含むことを示す。一例として、核酸ベクターの「異種」領域は、自然界で他の分子と関連して見出されない、別の核酸分子内の、または別の核酸分子に結合した核酸のセグメントである。例えば、核酸ベクターの異種領域は、自然界のコード配列に関連して見出されない配列に隣接するコード配列を含み得る。同様に、タンパク質の「異種」領域は、自然界の他のペプチド分子（例えば、融合タンパク質、またはタグ付きタンパク質）に関連して見出されない、別のペプチド分子内にあるか、またはそれに結合しているアミノ酸のセグメントである。同様に、核酸またはタンパク質は、異種標識または異種分泌または局在化配列を含み得る。

【0049】

「コドン最適化」は、アミノ酸を指定する３塩基対のコドンの組み合わせの多様性によって示されるように、コドンの縮重を利用し、一般に、天然アミノ酸配列を維持しながら、天然配列の少なくとも１つのコドンを、宿主細胞の遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって、特定の宿主細胞における発現の増強のために核酸配列を改変するプロセスを含む。例えば、タウタンパク質をコードする核酸は、天然に存在する核酸配列と比較すると、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、げっ歯動物細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、または任意の他の宿主細胞を含む所与の原核細胞または真核細胞においてより高い使用頻度を有するコドンを置き換えるように改変することができる。コドン使用表は、例えば「コドン使用データベース」で容易に入手できる。これらの表は、様々な方法で適合させることができる。すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＮａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２を参照されたい。特定の宿主における発現のための特定の配列のコドン最適化のためのコンピュータアルゴリズム（例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅを参照のこと）もまた利用可能である。

【0050】

「遺伝子座」という用語は、遺伝子（または重要な配列）、ＤＮＡ配列、ポリペプチドコード配列、または生物のゲノムの染色体上の位置（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）の特定の位置（ｌｏｃａｔｉｏｎ）を指す。例えば、「ＭＡＰＴ遺伝子座」は、ＭＡＰＴ遺伝子の特定の位置、ＭＡＰＴ ＤＮＡ配列、微小管関連タンパク質タウコード配列、またはそのような配列がどこに存するかに関して同定された生物のゲノムの染色体上のＭＡＰＴ位置を指し得る。「ＭＡＰＴ遺伝子座」は、例えば、エンハンサー、プロモーター、５’および／もしくは３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、またはそれらの組み合わせを含む、ＭＡＰＴ遺伝子の調節エレメントを含み得る。

【0051】

「遺伝子」という用語は、自然に存在する場合、少なくとも１つのコーディング領域と少なくとも１つの非コーディング領域を含む可能性のある染色体内のＤＮＡ配列を指す。産物（例えば、非限定的に、ＲＮＡ産物および／またはポリペプチド産物）をコードする染色体中のＤＮＡ配列は、非コードイントロンで中断されたコード領域および５’端と３’端の両方のコード領域に隣接して位置する配列を含み得、遺伝子が全長のｍＲＮＡ（５’および３’の非翻訳配列を含む）に対応するようなる。さらに、調節配列を含む他の非コード配列（例えば、非限定的に、プロモーター、エンハンサー、および転写因子結合部位）、ポリアデニル化シグナル、配列内リボソーム進入部位、サイレンサー、絶縁配列、およびマトリックス結合領域も遺伝子に存在してもよい。これらの配列は、遺伝子のコード領域に近接（例えば、非限定的に、１０ｋｂ以内）してもよく、または離れていてもよく、それらは遺伝子の転写と翻訳のレベルまたは速度に影響を及ぼす。

【0052】

「対立遺伝子」という用語は、遺伝子のバリアント形態を指す。いくつかの遺伝子は、染色体上の同じ位置、または遺伝子座に位置する様々な異なる形態を有する。二倍体生物は、各遺伝子座に２つの対立遺伝子を有する。対立遺伝子の各対は、特定の遺伝子座の遺伝子型を表す。遺伝子型は、特定の遺伝子座に２つの同一の対立遺伝子がある場合はホモ接合として、および２つの対立遺伝子が異なる場合はヘテロ接合として記載されている。

【0053】

「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩが特定のポリヌクレオチド配列のための適切な転写開始部位でＲＮＡ合成を開始することを指示することができるＴＡＴＡボックスを通常含むＤＮＡの調節領域である。プロモーターは、転写開始速度に影響を及ぼす他の領域をさらに含み得る。本明細書に開示されるプロモーター配列は、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの転写を調節する。プロモーターは、本明細書に開示される１つ以上の細胞型（例えば、ヒト細胞、多能性細胞、１細胞期胚、分化細胞、またはそれらの組み合わせ）において活性であり得る。プロモーターは、例えば、構成的に活性なプロモーター、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、時間的に制限されたプロモーター（例えば、発生的に調節されたプロモーター）、または空間的に制限されたプロモーター（例えば、シンパシン－１プロモーターのようなニューロン特異的プロモーターなどの細胞特異的または組織特異的プロモーター）であり得る。プロモーターの例は、例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２において見出すことができ、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0054】

「作動可能な連結」または「作動可能に連結されている」とは、その両方の成分が正常に機能し、かつ成分の少なくとも１つが他の成分のうちの少なくとも１つに及ぶ機能を媒介し得る可能性を許すような、２つ以上の成分（例えば、プロモーターおよび別の配列エレメント）の並列を含む。例えば、プロモーターが、１つ以上の転写調節因子の存在または非存在に応じてコード配列の転写のレベルを制御する場合、そのプロモーターは、コード配列に作動可能に連結され得る。作動可能な連結は、そのような配列が相互に近接していること、またはトランスに作用する（例えば、調節配列が、コード配列の転写を制御するために離れて作用し得る）ことを含み得る。

【0055】

「バリアント」という用語は、集団で最も一般的な配列とは異なるヌクレオチド配列（例えば、１ヌクレオチド）、または集団で最も一般的な配列とは異なるタンパク質配列（例えば、１アミノ酸）を指す。

【0056】

「断片」という用語は、タンパク質に言及する場合、全長タンパク質よりも短いか、または少ないアミノ酸を有するタンパク質を意味する。「断片」という用語は、核酸に言及する場合、全長の核酸よりも短いか、または少ないヌクレオチドを有する核酸を意味する。断片は、例えば、Ｎ末端断片（すなわち、タンパク質のＣ末端の一部の除去）、Ｃ末端断片（すなわち、タンパク質のＮ末端の一部の除去）、または内部断片（すなわち、タンパク質のＮ末端とＣ末端のそれぞれの一部の除去）であり得る。断片は、例えば、核酸断片を指す場合、５’断片（すなわち、核酸の３’末端の一部の除去）、３’断片（すなわち、核酸の５’末端の一部の除去）、または内部断片（すなわち、核酸の５’末端と３’末端のそれぞれの一部の除去）であり得る。

【0057】

２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較ウィンドウで最大の一致のためにアラインさせる場合、同じである２つの配列の残基を指す。タンパク質に関して、配列同一性のパーセンテージを使用する場合、同一ではない残基位置は多くの場合に、保存的アミノ酸置換によって異なり、その保存的アミノ酸置換では、アミノ酸残基は同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されており、したがって、分子の機能特性を変化させない。配列が保存的置換で異なる場合、配列同一性パーセントを、置換の保存的性質について補正するために、上方に調整してもよい。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われている。この調整を行う手段は、周知である。典型的には、これは、保存的置換を完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとしてスコアリングして、それによって、配列同一性パーセンテージを増加させることを含む。したがって、例えば、同一のアミノ酸が１のスコアを与えられ、非保存的置換が０のスコアを与えられる場合に、保存的置換は、０～１のスコアを与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で実行されるように計算される。

【0058】

「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインされた配列（完全にマッチする残基の数が最大）を比較することによって決定される値を含み、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントのための（付加また欠失を含まない）参照配列と比較した場合に、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に発生する位置の数を決定して一致した位置の数を得ること、一致した位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数で割ること、および結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。別段の定めがない限り（例えば、短い方の配列が、連結された非相同配列を含む）、比較ウィンドウは、比較される２つの配列のうちの短い方の完全長である。

【0059】

別段の記載がない限り、配列同一性／類似性の値は、次のパラメータ：５０のＧＡＰ重量および３の長さ重量、およびｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを使用するヌクレオチド配列の同一性％および類似性％；８のＧＡＰ重量および２の長さ重量、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用するアミノ酸配列の同一性％および類似性％；またはその任意の同等のプログラムを使用し、ＧＡＰバージョン１０を使用して得られた値を含む。「同等のプログラム」は、問題の任意の２つの配列について、ＧＡＰバージョン１０によって生成された対応するアラインメントと比較した場合、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の一致および同一のパーセント配列同一性を有するアラインメントを生成する任意の配列比較プログラムを含む。

【0060】

「保存的アミノ酸置換」という用語は、配列中に通常存在するアミノ酸の、類似のサイズ、電荷、または極性の、異なるアミノ酸との置換を指す。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、またはロイシンなどの非極性（疎水性）残基の、別の非極性残基との置換が含まれる。同様に、保存的置換の例には、アルギニンとリシンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、またはグリシンとセリンとの間などの、１つの極性（親水性）残基の別のものとの置換が含まれる。加えて、リシン、アルギニン、もしくはヒスチジンなどの塩基性残基から別のものへの置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などのある酸性残基から別の酸性残基への置換は、保存的置換の追加の例である。非保存的置換の例には、非極性（疎水性）アミノ酸残基、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、もしくはメチオニンから極性（親水性）残基、例えば、システイン、グルタミン、グルタミン酸、もしくはリシンへの、および／または極性残基から非極性残基への置換が含まれる。典型的なアミノ酸の分類を以下で要約する。

【表1】

【0061】

「相同」配列（例えば、核酸配列）は、例えば、既知の参照配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるような、既知の参照配列と同一であるか、または実質的に同様である配列を含む。相同配列は、例えば、オルソログ配列およびパラロガス配列を含み得る。例えば、相同遺伝子は典型的には、種分化事象（オルソログ遺伝子）または遺伝子重複事象（パラロガス遺伝子）のいずれかを介して、共通の祖先ＤＮＡ配列に由来する。「オルソログ」遺伝子には、種分化によって共通の祖先遺伝子から進化した様々な種の遺伝子が含まれる。オルソログは典型的には、進化の過程で同じ機能を保持する。「パラロガス」遺伝子には、ゲノム内の重複によって関連する遺伝子が含まれる。パラログは、進化の過程で新しい機能を進化させることができる。

【0062】

「インビトロ」という用語は、人工環境、および人工環境（例えば、試験管または単離された細胞もしくは細胞株）内で生じるプロセスまたは反応を含む。「インビボ」という用語は、天然環境（例えば、細胞または生物または身体）、および天然環境内で生じるプロセスまたは反応を含む。「エクスビボ」という用語は、個体の体から取り出された細胞または組織（例えば、器官型脳切片培養などの脳切片培養）、およびそのような細胞内で起こるプロセスまたは反応を含む。

【0063】

「レポーター遺伝子」という用語は、異種プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントに作動可能に連結されたレポーター遺伝子配列を含む構築物が、プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントの活性化に必要な因子を含む（または含むように作製され得る）細胞に導入された場合に容易かつ定量的にアッセイされる遺伝子生成物（典型的には酵素）をコードする配列を有する核酸を指す。レポーター遺伝子の例には、これらに限定されないが、ベータガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）をコードする遺伝子、細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）遺伝子、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、ベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする遺伝子、および蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。「レポータータンパク質」は、レポーター遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。

【0064】

本明細書で使用される「蛍光レポータータンパク質」という用語は、蛍光に基づいて検出可能なレポータータンパク質を意味し、蛍光は、レポータータンパク質から直接、レポータータンパク質の蛍光発生基質上の活性、または蛍光タグ付き化合物への結合に親和性のあるタンパク質のいずれかからのものであり得る。蛍光タンパク質の例には、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、およびＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、およびＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＢＦＰ、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、およびＴ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＣＦＰ、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、およびＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ＲＦＰ、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、およびＪｒｅｄ）、オレンジ色蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、およびｔｄＴｏｍａｔｏ）、およびフローサイトメトリー方法により細胞内の存在を検出することができる任意の他の好適な蛍光タンパク質が挙げられる。

【0065】

１つ以上の列挙された要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物または方法は、具体的に列挙されていない他の要素を含み得る。例えば、タンパク質を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」組成物は、タンパク質を単独で、または他の成分との組み合わせで含み得る。「から本質的になる」という移行句は、請求項の範囲が、特許請求の範囲に記載された特定の要素、および特許請求された発明の基本的かつ新規の特性に実質的に影響をしない要素を包含すると解釈されることを意味する。したがって、本発明の請求項で使用される場合の「から本質的になる」という用語は、「含む」と同等であると解釈されることを意図するものではない。

【0066】

「任意選択的の」または「任意選択で」は、続いて記載された事象または状況が起こっても起こらなくてもよく、ならびに説明が、当該事象または状況が起こる場合およびそれが起こらない場合を含むことを意味する。

【0067】

値の範囲の指定は、その範囲内の、またはその範囲を定義するすべての整数、およびその範囲内の整数によって定義されるすべての部分範囲を含む。

【0068】

文脈から別段に明確ではない限り、「約」という用語は、規定の値の測定の標準誤差（例えば、ＳＥＭ）内の値を包含する。

【0069】

「および／または」という用語は、関連する列挙された項目の１つ以上のありとあらゆる可能な組み合わせ、ならびに代替物（「または」）で解釈されるときの組み合わせの欠如を指し、包含する。

【0070】

「または」という用語は、特定のリストの任意の１つのメンバーを指し、そのリストのメンバーの任意の組み合わせも含む。

【0071】

冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」の単数形は、文脈が別段に明確に規定していない限り、複数形の言及を含む。例えば、「タンパク質」または「少なくとも１つのタンパク質」という用語は、それらの混合物を含む複数のタンパク質を含み得る。

【0072】

統計的に有意とは、ｐ≦０．０５を意味する。
［発明を実施するための形態］

【0073】

Ｉ．概要
タウオパチーは、脳内の異常なタウタンパク質の沈着を特徴とする不均一な神経変性状態のグループである。例えば、アルツハイマー病の人の脳では、タウは異常に過剰リン酸化されており、神経原線維変化（ＮＦＴ）として現れる対のらせん状フィラメント（ＰＨＦ）に線維化したように見える。したがって、ＮＦＴにおける過剰リン酸化タウの細胞内凝集は、タウオパチーの神経病理学的特徴である。

【0074】

破壊されたときにタウの凝集を促進する修飾因子遺伝子を特定するために、ゲノムワイドなスクリーニングを実施した。核膜の完全性を維持するプロセスに寄与する２つの遺伝子、ＢＡＮＦ１とＰＰＰ２ＣＡについて、信頼性の高いヒットが出現した。この生物学的プロセスに関与する他のタンパク質の検査から、破壊されたときにタウ凝集を増強する１つの追加遺伝子ＡＮＫＬＥ２を特定した。

【0075】

自己統合障壁因子（Ｂａｒｒｉｅｒ－ｔｏ－ａｕｔｏｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）（ＢＡＮＦ１／ＢＡＦ）はクロマチンを核膜に接続し、セリン／スレオニンプロテインホスファターゼ２Ａ触媒サブユニットアルファアイソフォーム（ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ２Ａ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｌｐｈａ ｉｓｏｆｏｒｍ）（ＰＰＰ２ＣＡ）はＢＡＮＦ１機能を調節する。ＢＡＮＦ１は、小さく（１０ｋＤａ）、豊富で、高度に保存されたＤＮＡ結合タンパク質である。ＢＡＮＦ１は、有糸分裂、核集合、ウイルス感染、クロマチンと遺伝子の調節、およびＤＮＡ損傷応答を含む複数の経路に関与している。ＢＡＮＦ１は、クロマチンを核膜に接続し、配列に依存しない方法でＤＮＡに結合する。ＢＡＮＦ１は、核内膜（ＩＮＭ）タンパク質の１つのＬＥＭ（ＬＡＰ２／Ｅｍｅｒｉｎ／ＭＡＮ１）ドメインにも結合する。ＢＡＮＦ１の局在は、細胞周期の間に変化する。

【0076】

有糸分裂の間、核膜の破壊と再構築はタンパク質のリン酸化によって制御される。有糸分裂に入る際のＶＲＫ１によるＢＡＮＦ１のリン酸化は、クロマチン、ＢＡＮＦ１、およびＬＥＭタンパク質間のリンクを切断する。ＢＡＮＦ１は細胞全体に均一に分布している。核膜が再形成されると、アンキリンリピートおよびＬＥＭドメイン含有タンパク質２（ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ａｎｄ ＬＥＭ ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）（ＡＮＫＬＥ２）がＶＲＫ１酵素活性を阻害する。ＡＮＫＬＥ２はＰＰＰ２ＣＡにも結合し、ＢＡＮＦ１を脱リン酸化する活性を促進するため、ＬＥＭタンパク質、クロマチン、核膜と再結合できる。ＰＰＰ２ＣＡは主要なタウホスファターゼである。ＰＰＰ２ＣＡはタウ－４ＲＤに結合でき、アルツハイマー病に関連している。

【0077】

ここでは、タウオパチーのエクスビボおよびインビボ研究のためのタウ凝集の新しいモデルを明らかにする。これらの新しいモデルは、例えば、ＢＡＮＦ１および／またはＰＰＰ２ＣＡおよび／またはＡＮＫＬＥ２の変異または発現の減少／阻害をタウオパチーの既存のモデルと組み合わせることができる。本明細書に開示されるのは、改善されたタウオパチーモデル（例えば、非ヒト動物、動物組織、または動物細胞）、タウオパチーの治療のための治療薬候補を評価するためのそのような改善されたタウオパチーモデルを使用する方法、改善されたタウオパチーモデルを作製する方法、およびタウオパチーモデルにおけるタウ凝集を加速または悪化させる方法である。

【0078】

ＩＩ．改善されたタウオパチーモデル
本明細書に開示されるのは、細胞および動物におけるタウ凝集体の形成を加速するための、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、またはＡＮＫＬＥ２の遺伝子変化または発現の減少／阻害を含むタウオパチーモデルである。そのようなタウオパチーモデルは、例えば、微小管関連タンパク質タウコード配列および細胞内のタウ凝集体の形成を加速するためのＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、またはＡＮＫＬＥ２の遺伝子変化、または発現の減少／阻害を含むゲノム、細胞、組織、または動物を含み得、タウオパチーのインビトロ、エクスビボ、およびインビボモデルのより良い開発を可能にする。特定の例として、動物（例えば、非ヒト動物）、動物組織（例えば、非ヒト動物組織）、または動物細胞または動物細胞の集団（例えば、非ヒト動物細胞または複数の細胞）であって、（ａ）１つ以上の細胞における微小管関連タンパク質タウコード配列、および（ｂ）（ｉ）１つ以上の細胞において、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上もしくはすべての発現をそれぞれ低減させる、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上もしくはすべての遺伝子改変、ならびに／または（ｉｉ）１つ以上の細胞において、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上もしくはすべての発現を低減させる１つ以上の薬剤と、を含む。１つ以上の細胞は、任意のタイプの細胞型であり得る。一例では、それらは神経細胞である。

【0079】

動物、組織、または細胞の集団は、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上もしくはすべての遺伝子改変を含まないか、または、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上もしくはすべての発現を低減させる１つ以上の薬剤を含まない動物、組織、または細胞の集団と比較して増加するタウオパチーの少なくとも１つの徴候または症状を有する可能性がある。そのような徴候および症状は、本明細書の他の場所でより詳細に論じられており、例えば、タウの過剰リン酸化およびタウの凝集を含むことができる。他の徴候および症状には、例えば、細胞分画後の不溶性画分におけるタウおよび／またはホスホタウの増加、ニューロンの細胞体樹状突起コンパートメントにおけるホスホタウの増加、ニューロンの核周囲領域におけるホスホタウの増加、ニューロンにおける核膜孔複合体タンパク質Ｎｕｐ９８－Ｎｕｐ９６（Ｎｕｐ９８）の核対細胞質比の減少、ニューロンにおけるＧＴＰ結合核タンパク質Ｒａｎ（Ｒａｎ）の核対細胞質比の減少、またはニューロンにおけるＲａｎ ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質１（ＲａｎＧＡＰ１）の核対細胞質比の減少を含めることができる。ホスホタウは、例えば、ホスホタウ（Ｓ３５６）またはホスホタウＡＴ８（Ｓ２０２、Ｔ２０５）であり得る。

【0080】

微小管関連タンパク質タウコード配列は、１つ以上の細胞で発現されるものである。タウコード配列は、内因性または外因性であり得、そしてそれは、野生型タウタンパク質または変異（例えば、タウオパチー関連変異またはタウ病原性変異を含む）を含むタウタンパク質をコードし得る。タウコード配列は、外因性のヒト微小管関連タンパク質タウなどのヒト微小管関連タンパク質タウをコードすることができる。コード配列は、コード配列と非コード配列（例えば、エキソンとイントロン）の両方を含むことができ、または相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列を含むことができる。コード配列は、任意選択で、動物、組織、または細胞での発現のためにコドン最適化することができる（例えば、ヒトまたはマウス細胞での発現のためにコドン最適化する）。

【0081】

タウコード配列は、ゲノムに組み込まれることも、染色体外にあることもある。ゲノムに組み込まれている場合、コード配列はランダムにゲノムに組み込まれるか（トランスジェニック）、または標的を絞った方法で標的ゲノム遺伝子座に組み込まれる可能性がある。コード配列は、動物、組織、または細胞の集団のすべての細胞に存在するか、またはゲノムに組み込まれ得るか、または細胞の一部（例えば、ニューロン）に存在するか、またはゲノムに組み込まれ得る。ゲノムに組み込まれた配列を含む動物は、その生殖系列にゲノムに組み込まれた配列を含むことができる。

【0082】

タウコード配列は、異種プロモーターなどのプロモーターに作動可能に連結することができる。プロモーターは、細胞、組織、または動物に内因性である場合もあれば、外因性である場合もある。１つの特定の例として、プロモーターは、マウスプリオンタンパク質プロモーターなどのプリオンタンパク質プロモーターであり得る。別の例として、プロモーターはニューロン特異的プロモーターであり得る。ニューロン特異的プロモーターの例はよく知られており、例えば、シンパシン－１プロモーター（例えば、ヒトシンパシン－１プロモーターまたはマウスシナプシン－１プロモーター）が含まれる。

【0083】

微小管関連タンパク質タウは、任意のタウアイソフォームであってよい。１つの特定の例において、タウコード配列は、１Ｎ４Ｒアイソフォームをコードする。微小管関連タンパク質タウは、野生型タウタンパク質であり得るか、またはタウオパチー関連変異またはタウ病原性変異などの変異を含むことができる。そのような変異の例はよく知られており、本明細書の他の場所でより詳細に議論されている。１つの特定の例において、タウは、Ｐ３０１Ｓ変異を含む（任意選択で、タウコード配列は、マウスプリオンタンパク質プロモーターに作動可能に連結されている）。別の特定の例では、タウは、Ａ１５２Ｔ／Ｐ３０１Ｌ／Ｓ３２０Ｆ三重変異を含む（任意選択で、タウコード配列がシンパシン－１プロモーターに作動可能に連結されている）。３ＭＵＴタウ１Ｎ４Ｒ（Ａ１５２Ｔ、Ｐ３０１Ｌ、Ｓ３２０Ｆ）のＤＮＡおよびタンパク質配列は、それぞれ配列番号８３および８４に記載されている。

【0084】

ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、またはＡＮＫＬＥ２の発現を低減させることができる薬剤の例は、ヌクレアーゼ剤（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）、転写抑制因子に融合したＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＫＲＡＢに融合した触媒的に不活性なＣａｓ（ｄＣａｓ－ＫＲＡＢ）などの転写抑制因子）、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡを含む。これらの例については、本明細書の他の場所でより詳細に論じられている。

【0085】

ＢＡＮＦ１（ＢＡＦ、ＢＣＲＧ１、ＢＣＲＰ１、およびＬ２ＢＰ１とも呼ばれる）は、自己統合障壁因子（ブレークポイントクラスター領域タンパク質１およびＬＡＰ２結合タンパク質１（ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ ｃｌｕｓｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ １ ａｎｄ ＬＡＰ２－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １）とも呼ばれる）をコードする。それは、核の集合、クロマチンの組織化、遺伝子発現、および性腺の発達において基本的な役割を果たし、クロマチンの構造を強力に圧縮し、核の集合中の膜の動員およびクロマチンの脱凝縮に関与する可能性がある。例示的なヒトの自己統合障壁因子タンパク質には、アクセッション番号ＮＰ＿００１１３７４５７．１およびＮＰ＿００３８５１．１（ＮＣＢＩ）およびＯ７５５３１（ＵｎｉＰｒｏｔ）が割り当てられている。例示的なヒトＢＡＮＦ１ ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１１４３９８５．１およびＮＭ＿００３８６０．３によって指定される。例示的なヒトＢＡＮＦ１コード配列は、ＣＣＤＳ ＩＤ ＣＣＤＳ８１２５．１によって指定される。例示的なヒトＢＡＮＦ１遺伝子は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＧｅｎｅＩＤ８８１５によって指定される。例示的なマウス自己統合障壁因子タンパク質には、アクセッション番号ＮＰ＿００１０３３３２０．１、ＮＰ＿００１２７３５３７．１、およびＮＰ＿０３５９２３．１（ＮＣＢＩ）およびＯ５４９６２（ＵｎｉＰｒｏｔ）が割り当てられている。例示的なマウスＢａｎｆ１ ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１０３８２３１．２、ＮＭ＿００１２８６６０８．１、およびＮＭ＿０１１７９３．３によって指定される。例示的なマウスＢａｎｆ１コード配列は、ＣＣＤＳ ＩＤ ＣＣＤＳ２９４５８．１によって指定される。例示的なマウスＢａｎｆ１遺伝子は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＧｅｎｅＩＤ２３８２５によって指定される。例示的なラットの自己統合障壁因子タンパク質には、アクセッション番号ＮＰ＿４４６０８３．１（ＮＣＢＩ）およびＱ９Ｒ１Ｔ１（ＵｎｉＰｒｏｔ）が割り当てられている。例示的なラットＢａｎｆ１ ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０５３６３１．３によって指定される。例示的なラットＢａｎｆ１遺伝子は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＧｅｎｅＩＤ１１４０８７によって指定される。

【0086】

ＰＰＰ２ＣＡは、セリン／スレオニンプロテインホスファターゼ２Ａ触媒サブユニットアルファアイソフォーム（ＰＰ２Ａ－アルファ、複製タンパク質Ｃ、ＲＰ－Ｃ、プロテインホスファターゼ２、プロテインホスファターゼ２Ａ、またはＰＰ２Ａとも呼ばれる）をコードする。ＰＰ２Ａは、微小管関連タンパク質（ＭＡＰ）の主要なホスファターゼである。ＰＰ２Ａは、ホスホリラーゼＢキナーゼカゼインキナーゼ２、マイトジェン刺激Ｓ６キナーゼ、およびＭＡＰ－２キナーゼの活性を調節することができる。例示的なヒトセリン／スレオニンプロテインホスファターゼ２Ａ触媒サブユニットアルファアイソフォームタンパク質には、アクセッション番号ＮＰ＿００２７０６．１（ＮＣＢＩ）およびＰ６７７７５（ＵｎｉＰｒｏｔ）が割り当てられている。例示的なヒトＰＰＰ２ＣＡ ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００２７１５．２によって指定される。例示的なヒトＰＰＰ２ＣＡコード配列は、ＣＣＤＳ ＩＤ ＣＣＤＳ４１７３．１によって指定される。例示的なヒトＰＰＰ２ＣＡ遺伝子は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＧｅｎｅＩＤ５５１５によって指定される。例示的なマウスセリン／スレオニンプロテインホスファターゼ２Ａ触媒サブユニットアルファアイソフォームタンパク質には、アクセッション番号ＮＰ＿０６２２８４．１（ＮＣＢＩ）およびＰ６３３３０（ＵｎｉＰｒｏｔ）が割り当てられている。例示的なマウスＰｐｐ２ｃａ ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１９４１１．４によって指定される。例示的なマウスＰｐｐ２ｃａコード配列は、ＣＣＤＳ ＩＤ ＣＣＤＳ２４６６６．１によって指定される。例示的なマウスＰｐｐ２ｃａ遺伝子は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＧｅｎｅＩＤ１９０５２によって指定される。例示的なラットセリン／スレオニンプロテインホスファターゼ２Ａ触媒サブユニットアルファアイソフォームタンパク質には、アクセッション番号ＮＰ＿０５８７３５．１（ＮＣＢＩ）およびＰ６３３３１（ＵｎｉＰｒｏｔ）が割り当てられている。例示的なラットＰｐｐ２ｃａ ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１７０３９．２によって指定される。例示的なラットＰｐｐ２ｃａ遺伝子は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＧｅｎｅＩＤ２４６７２および１０３６９４９０３によって指定される。

【0087】

ＡＮＫＬＥ２（ＫＩＡＡ０６９２、ＬＥＭ４、およびＤ５Ｅｒｔｄ５８５ｅとも呼ばれる）は、アンキリンリピートおよびＬＥＭドメイン含有タンパク質２（ＬＥＭドメインを含むタンパク質４（ＬＥＭ ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ４）および肝臓再生関連タンパク質ＬＲＲＧ０５７（ｌｉｖｅｒ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ＬＲＲＧ０５７）とも呼ばれる）をコードする。有糸分裂終了時にＢＡＦ／ＢＡＮＦ１の脱リン酸化を促進することにより、有糸分裂核膜の再構築に関与する。これは、ＶＲＫ１キナーゼを阻害し、プロテインホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）によるＢＡＦ／ＢＡＮＦ１の脱リン酸化を促進することにより、ＢＡＦ／ＢＡＮＦ１の脱リン酸化の制御を調整し、それによって核膜の構築を促進する。例示的なヒトアンキリンリピートおよびＬＥＭドメイン含有タンパク質２タンパク質には、アクセッション番号ＮＰ＿０５５９２９．１（ＮＣＢＩ）およびＱ８６ＸＬ３（ＵｎｉＰｒｏｔ）が割り当てられている。例示的なヒトＡＮＫＬＥ２ ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１５１１４．２によって指定される。例示的なヒトＡＮＫＬＥ２コード配列は、ＣＣＤＳ ＩＤ ＣＣＤＳ４１８６９．１によって指定される。例示的なヒトＡＮＫＬＥ２遺伝子は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＧｅｎｅＩＤ２３１４１によって指定される。例示的なマウスアンキリンリピートおよびＬＥＭドメイン含有タンパク質２タンパク質には、アクセッション番号ＮＰ＿００１２４０７４３．１およびＮＰ＿０８２１９８．１（ＮＣＢＩ）およびＱ６Ｐ１Ｈ６（ＵｎｉＰｒｏｔ）が割り当てられている。例示的なマウスＡｎｋｌｅ２ ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１２５３８１４．１およびＮＭ＿０２７９２２．２によって指定される。例示的なマウスＡｎｋｌｅ２コード配列は、ＣＣＤＳ ＩＤ ＣＣＤＳ５７３７２．１およびＣＣＤＳ８０３６０．１によって指定される。例示的なマウスＡｎｋｌｅ２遺伝子は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＧｅｎｅＩＤ７１７８２によって指定される。例示的なラットアンキリンリピートおよびＬＥＭドメイン含有タンパク質２タンパク質には、アクセッション番号ＮＰ＿００１０４１３６６．１（ＮＣＢＩ）およびＱ７ＴＰ６５（ＵｎｉＰｒｏｔ）が割り当てられている。例示的なラットＡｎｋｌｅ２ ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１０４７９０１．１によって指定される。例示的なラットＡｎｋｌｅ２遺伝子は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＧｅｎｅＩＤ３６０８２９によって指定される。

【0088】

タウオパチーの様々なモデルが開発されている。これらのモデルのいずれも、ＢＡＮＦ１および／またはＰＰＰ２ＣＡおよび／またはＡＮＫＬＥ２の発現を変異または阻害／低減することにより、本明細書に開示されるように適合させることができる。これらには、細胞／細胞培養モデル（非神経細胞株、ＰＣ１２、ＳＹ５Ｙ、ＣＮ１．４細胞などの神経細胞株、または一次神経細胞）、組織モデル（例、器官型脳切片培養などの脳切片培養）、および全動物トランスジェニックモデル（例えば、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、またはマウス）が含まれる。例えば、Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １７３９：２２４－２３９、Ｂｒａｎｄｔ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １７３９：３３１－３５４、およびＬｅｅ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １７３９：２５１－２５９を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。典型的には、そのようなモデルは、野生型または変異型のヒトタウアイソフォームが様々なプロモーターの制御下で過剰発現されて神経原線維変化を引き起こすトランスジェニックモデルである。細胞ベースのモデルには、操作へのアクセス性と柔軟性が高いという利点があるが、動物モデル全体（トランスジェニックマウスモデルなど）はより完全で、人間の病気により直接的に関連している。

【0089】

動物、組織、または細胞の集団は、オスまたはメスである可能性がある。細胞の集団は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボであり得る。同様に、組織はエクスビボまたはインビボであり得る。１つの特定の例では、組織は脳切片であり得る（例えば、器官型脳切片培養などの脳切片培養）。

【0090】

細胞の集団は、任意のタイプの細胞であり得る。細胞は、モノクローナル細胞株または細胞の集団であり得る。細胞は、任意の供給源からのものであり得る。このような細胞は、線虫、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュなどのモデル生物に由来する可能性がある。そのような細胞は、魚細胞もしくは鳥細胞であり得るか、またはそのような細胞は、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、もしくはラット細胞などの哺乳動物細胞であり得る。哺乳動物には、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ウマ、雄牛、シカ、バイソン、ヒツジ、げっ歯動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット）、家畜（例えば、雌牛および去勢雄牛などのウシ種、ヒツジおよびヤギなどのヒツジ種、ブタおよびイノシシなどのブタ種）が含まれる。鳥には、例えば、鶏、七面鳥、ダチョウ、ガチョウ、およびアヒルが含まれる。家畜および農業動物も含まれる。「非ヒト動物」という用語は、ヒトを除外する。特定の例では、細胞は、ヒト細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞または神経細胞）であるか、またはマウス細胞（例えば、神経細胞）である。

【0091】

細胞は、例えば、全能性細胞または多能性細胞（例えば、げっ歯動物ＥＳ細胞、マウスＥＳ細胞、またはラットＥＳ細胞などの胚性幹（ＥＳ）細胞）であり得る。全能性細胞には、任意の細胞型を生じさせることができる未分化細胞が含まれ、多能性細胞には、複数の分化細胞型に発達する能力を有する未分化細胞が含まれる。そのような多能性および／または全能性細胞は、例えば、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞などのＥＳ細胞またはＥＳ様細胞であり得る。ＥＳ細胞には、胚への導入時に発達中の胚の任意の組織に寄与することができる胚由来の全能性または多能性細胞が含まれる。ＥＳ細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来するものであり得、３つの脊椎動物胚葉（内胚葉、外胚葉、および中胚葉）のうちのいずれかの細胞に分化することができる。

【0092】

細胞はまた、一次体細胞、または一次体細胞ではない細胞であり得る。体細胞には、配偶子、生殖細胞、配偶子細胞、または未分化幹細胞ではない任意の細胞が含まれ得る。細胞はまた、一次細胞であり得る。一次細胞には、生物、器官、または組織から直接単離された細胞または細胞の培養物が含まれる。一次細胞には、形質転換も不死化もされていない細胞が含まれる。それらには、以前に組織培養で継代されなかったか、または以前に組織培養で継代されたが、組織培養で無限に継代することができない生物、器官、または組織から得られた任意の細胞が含まれる。そのような細胞は、従来の技術によって単離することができ、例えば、ニューロンを含む。例えば、一次細胞は、神経系組織（例えば、一次マウスニューロンなどの一次ニューロン）に由来することができる。

【0093】

そのような細胞には、通常は無限に増殖することはないが、変異または改変に起因して、正常な細胞老化を回避し、代わりに分裂を続けることができるものも含まれる。そのような変異または改変は、自然に発生し得るか、または意図的に誘導され得る。不死化細胞の例には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）、およびマウス胎児線維芽細胞（例えば、３Ｔ３細胞）が挙げられる。多くの種類の不死化細胞が周知である。不死化細胞または一次細胞には、典型的には、組換え遺伝子またはタンパク質の培養または発現に使用される細胞が含まれる。神経細胞株の例には、ラットＰＣ１２褐色細胞腫、ヒトＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞、ヒトＮ－Ｔｅｒａ ２（ＮＴＥＲＡ－２またはＮＴ２）奇形癌細胞、Ｈ４ヒト神経膠腫細胞、ヒト神経ＢＥ（２）－Ｍ１７Ｄ細胞、Ｃ１．４マウス皮質ニューロン、またはＨＣＮ２Ａヒト皮質ニューロンが含まれる。

【0094】

細胞はまた、神経細胞（例えば、ヒト神経細胞）などの分化細胞であり得る。このような神経細胞は、一次神経細胞（例、マウス一次神経細胞）、ヒトｉＰＳ細胞などの人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞に由来するニューロン、または胚性幹（ＥＳ）細胞に由来するニューロン（例、マウスＥＳ細胞）である可能性がある。例えば、細胞はｉＣＥＬＬ ＧＡＢＡニューロンである可能性があり、これは、ｉＰＳ細胞に由来するヒトニューロンの非常に純粋な集団である。それらは、有糸分裂後の神経サブタイプの混合物であり、主にＧＡＢＡ作動性ニューロンで構成され、典型的な生理学的特性と応答を示す。

【0095】

本明細書に記載の非ヒト動物は、本明細書の他の場所に記載されている方法によって作製することができる。「動物」という用語は、例えば、哺乳類、魚類、爬虫類、両生類、鳥類、および虫類を含む、動物界の任意のメンバーを含む。動物は、例えば、ショウジョウバエ、線虫、またはゼブラフィッシュであり得る。特定の例では、非ヒト動物は非ヒト哺乳動物である。非ヒト哺乳動物には、例えば、非ヒト霊長類、サル、類人猿、オランウータン、ネコ、イヌ、ウマ、雄ウシ、シカ、バイソン、ヒツジ、ウサギ、げっ歯動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、およびモルモット）、および家畜（例えば、ウシおよび去勢牛などのウシ種、ヒツジおよびヤギなどのヒツジ種、ならびにブタおよびイノシシなどのブタ種）が含まれる。鳥には、例えば、鶏、七面鳥、ダチョウ、ガチョウ、およびアヒルが含まれる。家畜および農業動物も含まれる。「非ヒト動物」という用語は、ヒトを除外する。好ましい非ヒト動物には、例えば、マウスおよびラットなどのげっ歯類が含まれる。

【0096】

非ヒト動物は、あらゆる遺伝的背景からのものであってよい。例えば、適切なマウスは、１２９系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、１２９とＣ５７ＢＬ／６の雑種、ＢＡＬＢ／ｃ系統、またはスイスウェブスター系統からのものであり得る。１２９系統の例には、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／Ｓｖｌｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、および１２９Ｔ２が含まれる。例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ １０：８３６を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｃ５７ＢＬ系統の例には、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／Ｋａｌ＿ｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａが含まれる。適切なマウスはまた、前述の１２９系統と前述のＣ５７ＢＬ／６系統の雑種（例えば、５０％１２９と５０％Ｃ５７ＢＬ／６）からのものであり得る。同様に、適切なマウスは、前述の１２９系統の雑種または前述のＢＬ／６系統の雑種（例えば、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統）からのものであり得る。

【0097】

同様に、ラットは、例えば、ＡＣＩラット系統、Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統、Ｗｉｓｔａｒラット系統、ＬＥＡラット系統、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット系統、またはフィッシャーＦ３４４またはフィッシャーＦ６などのフィッシャーラット系統からのものであり得る。ラットはまた、上述の２つ以上の系統の雑種に由来する系統から得ることができる。例えば、適切なラットは、ＤＡ系統またはＡＣＩ系統からのものであり得る。ＡＣＩラット系統は、白い腹と足、およびＲＴ１^ａｖ１ハプロタイプを有する黒いアグーチを持っていることを特徴としている。このような系統は、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む様々な供給源から入手できる。Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統は、アグーチコートとＲＴ１^ａｖ１ハプロタイプを有することを特徴としている。このようなラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ ＲｉｖｅｒおよびＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む様々な供給源から入手できる。いくつかの適切なラットは近交系ラット系統に由来する可能性がある。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１４／０２３５９３３を参照されたい。

【0098】

１つの特定の例において、マウス系統は、ＰＳ１９（タウＰ３０１Ｓ（系列ＰＳ１９）；ＰＳ１９Ｔｇ；Ｂ６；Ｃ３－Ｔｇ（Ｐｒｎｐ－ＭＡＰＴ＊Ｐ３０１Ｓ）ＰＳ１９Ｖｌｅ／Ｊ）系列である。この系統の遺伝的背景はＣ５７ＢＬ／６ｘＣ３Ｈである。ＰＳ１９トランスジェニックマウスは、マウスプリオンタンパク質（Ｐｒｎｐ）プロモーターによって駆動される変異型ヒト微小管関連タンパク質タウＭＡＰＴを発現する。導入遺伝子は、疾患に関連するＰ３０１Ｓ変異をコードし、４つの微小管結合ドメインと１つのＮ末端インサート（４Ｒ／１Ｎ）を含む。Ｃｈｒ３：１４０３５４２８０－１４０６０３２８３（ビルドＧＲＣｍ３８／ｍｍ１０）に導入遺伝子が挿入され、既知の遺伝子に影響を与えない２４９Ｋｂの欠失が発生した。すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＧｏｏｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２９（３）：４９４－５０５を参照されたい。変異型ヒトタウの発現は、内因性マウスタンパク質の発現よりも５倍高い。すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＹｏｓｈｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎｅｕｒｏｎ ５３（３）：３３７－３５１を参照されたい。ＰＳ１９マウスは、生後８ヶ月までにニューロンの喪失と脳の萎縮を発症する。それらはまた、新皮質、扁桃体、海馬、脳幹、および脊髄において、神経原線維変化様封入体として知られる広範なタウ凝集体を発達させる。Ｙｏｓｈｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（２００７）を参照されたい。組織学的方法による明白なタウ病理の出現の前に、これらのマウスの脳はタウ播種活性を示すことが示された。すなわち、脳ホモジネートに存在するタウ凝集体は、おそらくプリオンのようなメカニズムを介して、さらなるタウ凝集を誘発する可能性がある。すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｏｌｍｅｓ（２０１４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１（４１）：Ｅ４３７６－Ｅ４３８５を参照されたい。

【0099】

Ａ．タウとタウオパチー
微小管関連タンパク質タウ（神経原線維変化タンパク質（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｔａｎｇｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ペアヘリカルフィラメントタウ（ｐａｉｒｅｄ ｈｅｌｉｃａｌ ｆｉｌａｍｅｎｔ－タウ）（ＰＨＦ－タウ）、またはタウとも呼ばれる）は、微小管の集合と安定性を促進するタンパク質であり、主にニューロンで発現し、軸索コンパートメントに優先的に局在する。タウはＭＡＰＴ遺伝子（ＭＡＰＴＬ、ＭＴＢＴ１、ＴＡＵ、またはＭＴＡＰＴとも呼ばれる）によってコードされている。タウは、ニューロンの微小管を安定させ、したがって軸索伸長を促進する役割を果たす。ヒトでは、１７番染色体上にある単一の遺伝子の転写産物から特異的にスプライシングされた６つのアイソフォームのセットとして表示される。各タウアイソフォームには、微小管に結合して微小管を安定化させる一連の３／４タンデムリピートユニット（アイソフォームによって異なる）が含まれている。タウの微小管結合反復領域は、様々なキナーゼによってリン酸化され、アルツハイマー病（ＡＤ）およびタウオパチーと呼ばれる関連する神経変性疾患のファミリーにおけるタウの過剰リン酸化に関連するセリン／スレオニンに富む領域に隣接している。

【0100】

本明細書に開示されるモデルおよび方法におけるタウタンパク質は、ヒト、マウス、またはラットなどの任意の動物または哺乳動物からのタウタンパク質であり得る。１つの特定の例では、タウは、ヒトタウタンパク質に由来する。例示的なヒトタウタンパク質には、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ１０６３６およびＧｅｎｅＩＤ４１３７が割り当てられている。例示的なヒトタウタンパク質には、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ１０６３７およびＧｅｎｅＩＤ１７７６２が割り当てられている。例示的なヒトタウタンパク質には、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ１９３３２が割り当てられている。

【0101】

タウタンパク質は、ヒトではＭＡＰＴ（微小管関連タンパク質タウ）と呼ばれる単一遺伝子からの選択的スプライシングの生成物である。タウリピートドメインは、凝集に関与する配列モチーフを運ぶ（すなわち、それはタウからの凝集しやすいドメインである）。スプライシングに応じて、タウタンパク質のリピートドメインは、タンパク質の凝集しやすいコアを構成する３つまたは４つのリピート領域のいずれかを有し、これは多くの場合、リピートドメイン（ＲＤ）と呼ばれる。具体的には、タウのリピートドメインは、微小管結合領域のコアを表し、タウ凝集に関与するＲ２およびＲ３のヘキサペプチドモチーフを内包する。ヒトの脳には、３５２～４４１アミノ酸長の範囲の６つのタウアイソフォームがある。これらのアイソフォームは、アミノ末端での１つまたは２つの挿入ドメインの存在または非存在に加えて、３つのリピートドメインまたは４つのリピートドメイン（Ｒ１～Ｒ４）のいずれかの存在に従ってカルボキシル末端で変化する。タウのカルボキシル末端の半分に位置するリピートドメインは、微小管結合、ならびにタウオパチーに見られる神経原線維変化のコア構成要素である対らせん状フィラメント（ＰＨＦ）へのタウの病理学的凝集に重要であると考えられている。４つのリピートドメイン（Ｒ１～Ｒ４）の例示的な配列は、それぞれ、配列番号８８～９１に提供される。４つのリピートドメイン（Ｒ１～Ｒ４）の例示的なコード配列は、配列番号９２～９５に提供される。タウ４リピートドメインの例示的な配列は、配列番号９６に提供される。タウ４リピートドメインの例示的なコード配列は、配列番号９７に提供される。Ｐ３０１Ｓ変異を有するタウ４リピートドメインの例示的な配列は、配列番号９８に提供される。Ｐ３０１Ｓ変異を有するタウ４リピートドメインの例示的なコード配列は、配列番号９９に提供される。

【0102】

タウオパチーは、脳内の異常なタウ沈着を特徴とする不均一な神経変性状態のグループである。これらには、例えば、アルツハイマー病、ダウン症候群、ピック病、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、および１７番染色体に関連するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ－１７）が含まれる。ＡＤおよび他のタウオパチーでは、タウタンパク質は、異常に過剰リン酸化され、神経原線維変化として現れるフィラメントの束（対らせん状フィラメント）に凝集する。

【0103】

タウオパチーに関連する（例えば、分離する）、またはタウオパチーを引き起こす、凝集促進変異（ｐｒｏ－ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ）などのいくつかのタウ病原性変異がある。エキソンのまたはイントロンのいずれかである可能性がある病原性タウ変異は、一般にタウアイソフォームの相対的産生を変化させ、微小管集合および／またはタウが凝集する傾向の変化をもたらす可能性がある。一例として、変異は、タウを播種に感作するが、タウがそれ自体で容易に凝集することをもたらさない凝集感作変異であり得る。例えば、変異は、疾患関連Ｐ３０１Ｓ変異であり得る。Ｐ３０１Ｓ変異とは、ヒトタウＰ３０１Ｓ変異、またはヒトタウタンパク質と最適にアラインされた場合の別のタウタンパク質の対応する変異を意味する。他の病原性タウ変異には、例えば、Ａ１５２Ｔ、Ｇ２７２Ｖ、Ｋ２８０ｄｅｌ、Ｐ３０１Ｌ、Ｓ３２０Ｆ、Ｖ３３７Ｍ、Ｒ４０６Ｗ、Ｐ３０１Ｌ／Ｖ３３７Ｍ、Ｋ２８０ｄｅｌ／Ｉ２２７Ｐ／Ｉ３０８Ｐ、Ｇ２７２Ｖ／Ｐ３０１Ｌ／Ｒ４０６Ｗ、およびＡ１５２Ｔ／Ｐ３０１Ｌ／Ｓ３２０Ｆが含まれる。ａｌｚｆｏｒｕｍ．ｏｒｇ／ｍｕｔａｔｉｏｎｓ／ｍａｐｔ，Ｂｒａｎｄｔ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １７３９：３３１－３５４、およびＷｏｌｆｅ（２００９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４（１０）：６０２１－６０２５を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。野生型タウ１Ｎ４ＲのＤＮＡおよびタンパク質配列は、それぞれ配列番号８１および８２に記載されている。３ＭＵＴタウ１Ｎ４Ｒ（Ａ１５２Ｔ、Ｐ３０１Ｌ、Ｓ３２０Ｆ）のＤＮＡおよびタンパク質配列は、それぞれ配列番号８３および８４に記載されている。

【0104】

細胞レベルでのタウオパチーの徴候および症状のいくつかの例には、タウの過剰リン酸化（例えば、ニューロンの細胞体樹状突起コンパートメント内での、なぜならば一般に軸索タンパク質と考えられているが、タウは変性ニューロンの樹状コンパートメントに見られ、この再分布はアルツハイマー病の神経変性の引き金となると考えられている）、タウの凝集、核ラミナの異常な形状、および核細胞質間輸送の障害が含まれる。生物レベルでの他の徴候および症状には、神経原線維変化（例えば、新皮質、扁桃体、海馬、脳幹、または脊髄）、ニューロン喪失（例えば、海馬、扁桃体、または新皮質）、小神経膠細胞症、シナプス喪失、認知障害、または運動障害が含まれ得る。他の徴候および症状には、例えば、細胞分画後の不溶性画分におけるタウおよび／またはホスホタウの増加、ニューロンの細胞体樹状突起コンパートメントにおけるホスホタウの増加、ニューロンの核周囲領域におけるホスホタウの増加、ニューロンにおける核膜孔複合体タンパク質Ｎｕｐ９８－Ｎｕｐ９６（Ｎｕｐ９８）の核対細胞質比の減少、ニューロンにおけるＧＴＰ結合核タンパク質Ｒａｎ（Ｒａｎ）の核対細胞質比の減少、またはニューロンにおけるＲａｎ ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質１（ＲａｎＧＡＰ１）の核対細胞質比の減少を含めることができる。ホスホタウは、例えば、ホスホタウ（Ｓ３５６）またはホスホタウＡＴ８（Ｓ２０２、Ｔ２０５）であり得る。

【0105】

Ｂ．ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、またはＡＮＫＬＥ２の発現を低減させるための薬剤
ＢＡＮＦ１、 ＰＰＰ２ＣＡ、またはＡＮＫＬＥ２の発現を減少または阻害するために、任意の適切な薬剤を使用することができる。ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、またはＡＮＫＬＥ２の発現を低減させることができる薬剤の例は、ヌクレアーゼ剤（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）、転写抑制因子に融合したＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＫＲＡＢドメインに融合した触媒的に不活性／死滅Ｃａｓ（ｄＣａｓ）（ｄＣａｓ－ＫＲＡＢ）などの転写抑制因子）、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡを含む。ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、またはＡＮＫＬＥ２の発現を低減させることができる薬剤の他の例は、ヌクレアーゼ剤（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）、転写抑制因子に融合したＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＫＲＡＢドメインに融合した触媒的に不活性／死滅Ｃａｓ（ｄＣａｓ）（ｄＣａｓ－ＫＲＡＢ）などの転写抑制因子）、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡをコードする核酸を含む。これらの例については、以下で詳しく説明する。

【0106】

１．ヌクレアーゼ剤と転写抑制因子
ヌクレアーゼ剤は、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、またはＡＮＫＬＥ２の発現を減少させるために使用できる。例えば、そのようなヌクレアーゼ剤は、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、またはＡＮＫＬＥ２遺伝子の発現を破壊するＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、またはＡＮＫＬＥ２遺伝子の領域を標的にして切断するように設計することができる。特定の例として、ヌクレアーゼ剤は、開始コドンの近くのＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、またはＡＮＫＬＥ２の領域を切断するように設計することができる。例えば、標的配列は、開始コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、または１，０００ヌクレオチド以内にあり得、ヌクレアーゼ剤による切断は、開始コドンを破壊し得る。あるいは、開始コドンおよび終止コドンの近くの領域を切断するように設計されたヌクレアーゼ剤を使用して、２つのヌクレアーゼ標的配列間のコード配列を削除することができる。転写抑制因子ドメインに融合したＤＮＡ結合タンパク質を使用して、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、またはＡＮＫＬＥ２の発現を低減させることもできる。例えば、転写抑制因子ドメインに融合したＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＫＲＡＢ転写抑制因子ドメインに融合された触媒的に不活性なＣａｓ）は、開始コドンの近くの、例えば、開始コドンから約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、または１，０００ヌクレオチド以内のＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、またはＡＮＫＬＥ２の領域を標的とするように設計することができる）。

【0107】

ヌクレアーゼ剤による切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復できる二本鎖切断を引き起こす可能性がある。ＮＨＥＪには、相同テンプレートを必要とせずに、切断末端を相互に、または外因性配列に直接ライゲーションすることによる、核酸における二本鎖切断の修復が含まれる。ＮＨＥＪによる非隣接配列のライゲーションは、多くの場合、二本鎖切断の部位の近くで欠失、挿入、または転座をもたらし得る。これらの挿入および欠失（インデル）は、例えば、フレームシフト変異または開始コドンの破壊を介して、標的遺伝子の発現を破壊する可能性がある。

【0108】

所望の認識部位へのニックまたは二本鎖切断を誘導する任意のヌクレアーゼ剤を、本明細書に開示される方法および組成物で使用することができる。ヌクレアーゼ剤が所望の認識部位にニックまたは二本鎖切断を誘導する限り、天然に存在するまたは天然のヌクレアーゼ剤を使用することができる。代替的に、改変または操作されたヌクレアーゼ剤を使用することができる。「操作されたヌクレアーゼ剤」は、その天然の形態から操作された（改変または誘導された）ヌクレアーゼを含み、所望の認識部位においてニックまたは二本鎖切断を特異的に認識および誘導する。したがって、操作されたヌクレアーゼ剤は、天然の天然に存在するヌクレアーゼ剤から誘導することができ、または人工的に作成または合成することができる。操作されたヌクレアーゼは、例えば、認識部位においてニックまたは二本鎖切断を誘導することができ、認識部位は、天然の（非操作または非修飾）ヌクレアーゼ剤によって認識されたであろう配列ではない。ヌクレアーゼ剤の修飾は、タンパク質切断剤中のわずか１アミノ酸または核酸切断剤中の１ヌクレオチドであってよい。認識部位または他のＤＮＡにニックまたは二本鎖切断を生じさせることは、本明細書では、認識部位または他のＤＮＡを「切断する（ｃｕｔｔｉｎｇ）」または「切断する（ｃｌｅａｖｉｎｇ）」と呼ぶことができる。

【0109】

例示された認識部位の活性バリアントおよび断片も提供される。そのような活性バリアントは、所与の標的配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の配列同一性を含むことができ、活性バリアントは生物学的活性を保持し、したがって配列特異的様式でヌクレアーゼ剤によって認識および切断され得る。ヌクレアーゼ剤による認識部位の二本鎖切断を測定するアッセイは、当該技術分野で知られている（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ｑＰＣＲアッセイ、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＦｒｅｎｄｅｗｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４７６：２９５－３０７）。

【0110】

ヌクレアーゼ剤の認識部位は、標的遺伝子座の中または近くのどこにでも配置することができる。認識部位は、遺伝子のコード領域内、または遺伝子の発現に影響を及ぼす調節領域内（例えば、開始コドンの近く）に位置してもよい。ヌクレアーゼ剤の認識部位は、イントロン、エキソン、プロモーター、エンハンサー、調節領域、または任意の非タンパク質コード領域に位置してもよい。あるいは、認識部位は、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド内に配置することができる。そのような位置は、選択マーカーのコード領域内または調節領域内に位置することができ、これらは選択マーカーの発現に影響を及ぼす。したがって、ヌクレアーゼ剤の認識部位は、選択マーカーのイントロン、プロモーター、エンハンサー、調節領域、または選択マーカーをコードするポリヌクレオチドの任意の非タンパク質コード領域に位置してもよい。認識部位でのニックまたは二本鎖切断は、選択マーカーの活性を破壊してもよく、機能的選択マーカーの存在または非存在をアッセイする方法が知られている。

【0111】

ヌクレアーゼ剤の１つの種類は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、原核生物または真核生物のゲノム内の特定の標的配列で二本鎖切断を行うために使用できる配列特異的ヌクレアーゼのクラスである。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、天然または操作された転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター、またはその機能的部分を、例えば、ＦｏｋＩなどのエンドヌクレアーゼの触媒ドメインに融合することによって作成される。独自のモジュラーＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインにより、特定のＤＮＡ認識特異性を備えたタンパク質の設計が可能になる。したがって、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、特定のＤＮＡ標的部位を認識するように操作することができ、したがって、所望の標的配列で二本鎖切断を行うために使用することができる。すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１０／０７９４３０、Ｍｏｒｂｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０７（５０）：２１６１７－２１６２２、Ｓｃｈｏｌｚｅ ＆ Ｂｏｃｈ（２０１０）Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ １：４２８－４３２、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１０）１８６：７５７－７６１、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１１）３９（１）：３５９－３７２、およびＭｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９：１４３－１４８を参照されたい。

【0112】

適切なＴＡＬヌクレアーゼの例、および適切なＴＡＬヌクレアーゼを調製するための方法は、例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１１／０２３９３１５Ａ１、ＵＳ２０１１／０２６９２３４Ａ１、ＵＳ２０１１／０１４５９４０Ａ１、ＵＳ２００３／０２３２４１０Ａ１、ＵＳ２００５／０２０８４８９Ａ１、ＵＳ２００５／００２６１５７Ａ１、ＵＳ２００５／００６４４７４Ａ１、ＵＳ２００６／０１８８９８７Ａ１、およびＵＳ２００６／００６３２３１Ａ１に開示されている。様々な実施形態では、例えば、目的の遺伝子座または目的のゲノム遺伝子座において標的核酸配列内またはその近くを切断するＴＡＬエフェクターヌクレアーゼが操作され、ここで、標的核酸配列は、標的化ベクターによって改変される配列またはその近くにある。本明細書で提供される様々な方法および組成物での使用に適したＴＡＬヌクレアーゼには、本明細書に記載の標的化ベクターによって改変される標的核酸配列またはその近くに結合するように特別に設計されたものが含まれる。

【0113】

一部のＴＡＬＥＮでは、ＴＡＬＥＮの各モノマーは、２つの超可変残基を介して単一の塩基対を認識する３３～３５のＴＡＬリピートを含む。一部のＴＡＬＥＮでは、ヌクレアーゼ剤は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼなどの独立したヌクレアーゼに作動可能に連結されたＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。例えば、ヌクレアーゼ剤は、第１のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインおよび第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含むことができ、第１および第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインのそれぞれは、ＦｏｋＩヌクレアーゼに作動可能に連結され、第１および第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインは、様々な長さ（１２～２０ｂｐ）のスペーサー配列によって分離された標的ＤＮＡ配列の各鎖における２つの隣接する標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットは二量体化して、標的配列で二本鎖切断を行う活性ヌクレアーゼを作成する。

【0114】

本明細書に開示される様々な方法および組成物で使用されるヌクレアーゼ剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をさらに含むことができる。一部のＺＦＮでは、ＺＦＮの各モノマーは３つ以上のジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含み、各ジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインは３ｂｐのサブサイトに結合する。他のＺＦＮでは、ＺＦＮは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼなどの独立したヌクレアーゼに作動可能に連結されたジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。例えば、ヌクレアーゼ剤は、第１のＺＦＮおよび第２のＺＦＮを含むことができ、第１および第２のＺＦＮのそれぞれは、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットに作動可能に連結され、第１および第２のＺＦＮは、約５～７ｂｐのスペーサーで分離された標的ＤＮＡ配列の各鎖における２つの隣接する標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットは二量体化して、二本鎖切断を行う活性ヌクレアーゼを生成する。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００６／０２４６５６７、ＵＳ２００８／０１８２３３２、ＵＳ２００２／００８１６１４、ＵＳ２００３／００２１７７６、ＷＯ／２００２／０５７３０８Ａ２、ＵＳ２０１３／０１２３４８４、ＵＳ２０１０／０２９１０４８、ＷＯ／２０１１／０１７２９３Ａ２、およびＧａｊ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３１（７）：３９７－４０５を参照されたい。

【0115】

ヌクレアーゼ剤（すなわち、操作されたヌクレアーゼ剤）の活性バリアントおよび断片も提供される。そのような活性バリアントは、天然のヌクレアーゼ剤に対して、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有していてもよく、活性バリアントは、所望の認識部位で切断する能力を保持し、したがって、ニックまたは二本鎖切断誘導活性を保持する。例えば、本明細書に記載のヌクレアーゼ剤のいずれも、天然エンドヌクレアーゼ配列から改変され得、天然ヌクレアーゼ剤によって認識されなかった認識部位でニックまたは二本鎖切断を認識および誘導するように設計してもよい。したがって、いくつかの操作されたヌクレアーゼは、対応する天然のヌクレアーゼ剤認識部位とは異なる認識部位でニックまたは二本鎖切断を誘導する特異性を有する。ニックまたは二本鎖切断誘導活性のためのアッセイは知られており、一般に、認識部位を含むＤＮＡ基質上のエンドヌクレアーゼの全体的な活性および特異性を測定する。

【0116】

ヌクレアーゼ剤は、任意の知られている手段によって細胞に導入してもよい。ヌクレアーゼ剤をコードするポリペプチドは、細胞に直接導入してもよい。代替的に、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入してもよい。ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドが細胞に導入されると、ヌクレアーゼ剤は、細胞内で一過性に、条件付きで、または構成的に発現され得る。したがって、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、発現カセットに含まれ得、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターに作動可能に連結され得る。目的のそのようなプロモーターは、本明細書のいずこかでさらに詳細に論じられている。代替的に、ヌクレアーゼ剤は、ヌクレアーゼ剤をコードするｍＲＮＡとして細胞に導入される。

【0117】

ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、細胞のゲノムに安定して組み込まれ、細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結され得る。代替的に、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、標的化ベクター（例えば、挿入ポリヌクレオチドを含む標的化ベクター、または挿入ポリヌクレオチドを含む標的化ベクターとは別のベクターもしくはプラスミド）にあってよい。

【0118】

ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドの導入によりヌクレアーゼ剤が細胞に提供される場合、ヌクレアーゼ剤をコードするそのようなポリヌクレオチドは、天然に存在するヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチド配列と比較して、目的の細胞においてより高い使用頻度を有するコドンを置換するように改変され得る。例えば、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、または任意の他の目的の宿主細胞を含む所与の原核細胞または真核細胞においてより頻度高く使用される代替コドンへと改変することができる。

【0119】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム。本明細書に開示される方法および組成物は、クラスター化された規則的に散在する短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システムまたはそのようなシステムの構成要素を利用して、ゲノムを改変するか、または細胞内の遺伝子の発現を変更することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系には、Ｃａｓ遺伝子の発現に関与する、またはその活性を指示する転写産物および他のエレメントが含まれる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、例えば、タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩ系、またはタイプＶ系（例えば、サブタイプＶ－ＡまたはサブタイプＶ－Ｂ）であり得る。本明細書に開示される方法および組成物は、核酸の部位特異的結合または切断のためにＣＲＩＳＰＲ複合体（Ｃａｓタンパク質と複合体化したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む）を利用することによってＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いることができる。

【0120】

本明細書に開示される組成物および方法で使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、非天然発生型であり得る。「非天然発生型」系には、自然発生状態から改変もしくは変異されているか、それらが本質的に自然に関連付けられている少なくとも１つの他の構成要素から少なくとも実質的に自由であるか、またはそれらが自然に関連付けられていない少なくとも１つの他の構成要素に関連付けられている、系の１つ以上の構成要素など、人間の助けの関与を示すものが含まれる。例えば、一部のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、天然に発生しないｇＲＮＡおよびＣａｓタンパク質を一緒に含む非天然発生型ＣＲＩＳＰＲ複合体を用いるか、天然に発生しないＣａｓタンパク質を用いるか、または天然に発生しないｇＲＮＡを用いる。

【0121】

Ｃａｓタンパク質Ｃａｓタンパク質は一般に、ガイドＲＮＡと相互作用し得る少なくとも１つのＲＮＡ認識または結合ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質はまた、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＤＮａｓｅドメインまたはＲＮａｓｅドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質－タンパク質相互作用ドメイン、二量体化ドメイン、および他のドメインを含み得る。いくつかのそのようなドメイン（例えば、ＤＮａｓｅドメイン）は、ネイティブのＣａｓタンパク質に由来し得る。他のそのようなドメインを追加して、修飾されたＣａｓタンパク質を作製することができる。ヌクレアーゼドメインは、核酸分子の共有結合の切断を含む、核酸切断に対する触媒活性を有する。切断は、平滑末端または千鳥状の末端を生成することができ、それは一本鎖または二本鎖であり得る。例えば、野生型のＣａｓ９タンパク質は、通常、平滑端切断産物を生成する。あるいは、野生型Ｃｐｆ１タンパク質（例、ＦｎＣｐｆ１）は、５ヌクレオチドの５’オーバーハングを含む切断産物をもたらすことができ、切断は、非標的化鎖のＰＡＭ配列から１８番目の塩基対の後および標的化鎖の２３番目の塩基後に発生する。Ｃａｓタンパク質は、完全な切断活性を有し、標的ゲノム遺伝子座で二本鎖切断を作成することができるか（例えば、平滑末端を含む二本鎖切断）、またはそれは標的ゲノム遺伝子座で一本鎖切断を作成するニッカーゼであり得る。

【0122】

Ｃａｓタンパク質の例には、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｕ１９６６、ならびにそれらの相同体または修飾バージョンが挙げられる。

【0123】

例示的なＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質に由来するタンパク質である。Ｃａｓ９タンパク質は、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来するものであり、典型的には、保存されたアーキテクチャを有する４つの重要なモチーフを共有する。モチーフ１、２、および４は、ＲｕｖＣ様モチーフであり、モチーフ３は、ＨＮＨモチーフである。例示的なＣａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、またはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉに由来する。Ｃａｓ９ファミリーメンバーの追加の例は、ＷＯ２０１４／１３１８３３に記載されており、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳｐＣａｓ９）由来のＣａｓ９（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２が割り当てられている）は、例示的なＣａｓ９タンパク質である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＳａＣａｓ９）由来のＣａｓ９（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｊ７ＲＵＡ５が割り当てられている）は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（ＣｊＣａｓ９）由来のＣａｓ９（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ０Ｐ８９７が割り当てられている）は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．８：１４５００を参照されたい。ＳａＣａｓ９は、ＳｐＣａｓ９よりも小さく、ＣｊＣａｓ９は、ＳａＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９の両方よりも小さい。ＳｐＣａｓ９の例示的なＤＮＡおよびタンパク質配列は、それぞれ、配列番号８６および８７に示されている。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９（Ｎｍｅ２Ｃａｓ９）は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。例えば、Ｅｄｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ７３（４）：７１４－７２６を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座（Ｓｔ１Ｃａｓ９）によってコードされるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＬＭＤ－９ Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ３遺伝子座（Ｓｔ３Ｃａｓ９）由来のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９）は、他の例示的なＣａｓ９タンパク質である。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣａｓ９（ＦｎＣａｓ９）または代替ＰＡＭを認識するＲＨＡ Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃａｓ９バリアント（Ｅ１３６９Ｒ／Ｅ１４４９Ｈ／Ｒ１５５６Ａ置換）は、他の例示的なＣａｓ９タンパク質である。これらおよび他の例示的なＣａｓ９タンパク質は、例えば、Ｃｅｂｒｉａｎ－Ｓｅｒｒａｎｏ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ（２０１７）Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ ２８（７）：２４７－２６１で概説されており、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0124】

Ｃａｓタンパク質の別の例は、Ｃｐｆ１（ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａおよびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ １のＣＲＩＳＰＲ）タンパク質である。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９の対応するドメインに相同なＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを、Ｃａｓ９の特徴的なアルギニンに富むクラスターの対応物とともに含む大きなタンパク質（約１３００アミノ酸）である。しかしながら、Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９タンパク質に存在するＨＮＨヌクレアーゼドメインを欠いており、ＨＮＨドメインを含む長い挿入を含むＣａｓ９とは対照的に、ＲｕｖＣ様ドメインは、Ｃｐｆ１配列において隣接している。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ １６３（３）：７５９－７７１を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。例示的なＣｐｆ１タンパク質は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ １、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＣ２０１７ １、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ ｓｐ．ＳＣＡＤＣ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ ３、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、およびＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅに由来する。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２由来のＣｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１；ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ａ０Ｑ７Ｑ２が割り当てられている）は、例示的なＣｐｆ１タンパク質である。

【0125】

Ｃａｓタンパク質は、野生型タンパク質（すなわち、本質的に発生するもの）、修飾Ｃａｓタンパク質（すなわち、Ｃａｓタンパク質バリアント）、または野生型もしくは修飾Ｃａｓタンパク質の断片であり得る。Ｃａｓタンパク質はまた、野生型または改変されたＣａｓタンパク質の触媒活性に関して、活性なバリアントまたは断片であり得る。触媒活性に関する活性なバリアントまたは断片は、野生型または修飾されたＣａｓタンパク質またはその一部に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を含み得、活性なバリアントは、所望の切断部位で切断する能力を保持し、したがってニック誘導または二本鎖切断誘導活性を保持する。ニック誘導または二本鎖切断誘導活性のアッセイは知られており、一般に、切断部位を含むＤＮＡ基質上のＣａｓタンパク質の全体的な活性および特異性を測定する。

【0126】

修飾Ｃａｓタンパク質の一例は、修飾ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１タンパク質であり、これは、非特異的ＤＮＡ接触を低減するように設計された改変を内包するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の忠実度の高いバリアント（Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ）である。例えば、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ ５２９（７５８７）：４９０－４９５を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。修飾Ｃａｓタンパク質の別の例は、オフターゲット効果を低減するように設計された修飾ｅＳｐＣａｓ９バリアント（Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）である。例えば、Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１（６２６８）：８４－８８を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。他のＳｐＣａｓ９バリアントには、Ｋ８５５ＡおよびＫ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａが含まれる。これらおよび他の改変されたＣａｓタンパク質は、例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｅｂｒｉａｎ－Ｓｅｒｒａｎｏ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ（２０１７）Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ ２８（７）：２４７－２６１で概説されており、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。修飾Ｃａｓ９タンパク質の別の例は、ｘＣａｓ９であり、これは拡大された範囲のＰＡＭ配列を認識することができるＳｐＣａｓ９バリアントである。例えば、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｎａｔｕｒｅ ５５６：５７－６３を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0127】

Ｃａｓタンパク質は、核酸結合親和性、核酸結合特異性、および酵素活性のうちの１つ以上を増加または減少させるように修飾され得る。Ｃａｓタンパク質は、安定性など、タンパク質の他の活性または特性を変更するように改変することもできる。例えば、Ｃａｓタンパク質の１つ以上のヌクレアーゼドメインを改変、欠失、または不活性化することができ、またはＣａｓタンパク質を短縮して、タンパク質の機能に必須ではないドメインを除去するか、またはＣａｓタンパク質の活性または特性を最適化（例えば、増強または低減）することができる。

【0128】

Ｃａｓタンパク質は、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも１つのヌクレアーゼドメインを含み得る。例えば、野生型Ｃｐｆ１タンパク質は、一般に、おそらく二量体立体配座で、標的ＤＮＡの両方の鎖を切断するＲｕｖＣ様ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質はまた、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも２つのヌクレアーゼドメインを含み得る。例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質は、一般に、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含む。ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインは各々、二本鎖ＤＮＡの異なる鎖を切断して、ＤＮＡに二本鎖切断を行うことができる。例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６－８２１を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0129】

ヌクレアーゼドメインの１つ以上またはすべてを欠失または変異させることで、それらがもはや機能しなくさせたり、ヌクレアーゼ活性が低下させたりすることができる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質でヌクレアーゼドメインの１つが欠失または変異している場合、結果として得られるＣａｓ９タンパク質はニッカーゼと呼ばれ、二本鎖標的ＤＮＡ内で一本鎖切断を生成できるが、二本鎖切断は生成できない（すなわち、相補鎖または非相補鎖を切断できるが、両方を切断することはできない）。ヌクレアーゼドメインの両方が削除または変異された場合、得られたＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖（例えば、ヌクレアーゼヌルまたはヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質、または触媒活性を伴わないＣａｓタンパク質（ｄＣａｓ））を切断する能力が低減される。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する変異の例は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＲｕｖＣドメインにおけるＤ１０Ａ（Ｃａｓ９の１０位でのアスパラギン酸塩からアラニンへ）変異である。同様に、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＨＮＨドメインにあるＨ９３９Ａ（アミノ酸８３９位でのヒスチジンからアラニンへ）、Ｈ８４０Ａ（アミノ酸８４０位でのヒスチジンからアラニンへ）、またはＮ８６３Ａ（アミノ酸Ｎ８６３位でのアスパラギンからアラニンへ）は、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換し得る。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する変異の他の例には、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９への対応する変異が挙げられる。例えば、Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３９）：９２７５－９２８２およびＷＯ２０１３／１４１６８０を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。そのような変異は、部位特異的変異導入、ＰＣＲを介した変異導入、または全遺伝子合成などの方法を使用して生成され得る。ニッカーゼを生成する他の変異の例は、例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２およびＷＯ２０１３／１４２５７８において見出すことができ、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｃａｓタンパク質においてすべてのヌクレアーゼドメインが欠失または変異している（例えば、Ｃａｓ９タンパク質において両方のヌクレアーゼドメインが欠失または変異している）場合、結果として生じるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を切断する能力が低下する（例えば、ヌクレアーゼヌル、またはヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質）。１つの特定の例は、Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９二重変異体、またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９と最適にアラインされた場合の別の種からのＣａｓ９の対応する二重変異体である。別の具体的な例は、Ｄ１０Ａ／Ｎ８６３ＡのＳ． ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９の二重変異体、またはＳ． ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９と最適に整列した場合の別の種由来のＣａｓ９の対応する二重変異体である。

【0130】

ｘＣａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例は、ＳｐＣａｓ９について前述したものと同じである。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのＣａｓ９タンパク質の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も知られている。例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのＣａｓ９酵素（ＳａＣａｓ９）は、位置Ｎ５８０での置換（例えば、Ｎ５８０Ａ置換）および位置Ｄ１０での置換（例えば、Ｄ１０Ａ置換）を含み得、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質をもたらす。例えば、ＷＯ２０１６／１０６２３６を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も知られている（例えば、Ｄ１６ＡとＨ５８８Ａの組み合わせ）。Ｓｔ１Ｃａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も既知である（例えば、Ｄ９Ａ、Ｄ５９８Ａ、Ｈ５９９Ａ、およびＮ６２２Ａの組み合わせ）。Ｓｔ３Ｃａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も既知である（例えば、Ｄ１０ＡおよびＮ８７０Ａの組み合わせ）。ＣｊＣａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も既知である（例えば、Ｄ８ＡおよびＨ５５９Ａの組み合わせ）。ＦｎＣａｓ９およびＲＨＡ ＦｎＣａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も既知である（例えば、Ｎ９９５Ａ）。

【0131】

Ｃｐｆ１タンパク質の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も既知である。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２（ＦｎＣｐｆ１）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６（ＡｓＣｐｆ１）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）、およびＭｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７（ＭｂＣｐｆ１ Ｃｐｆ１）由来のＣｐｆ１タンパク質に関して、そのような変異には、ＡｓＣｐｆ１の９０８、９９３、もしくは１２６３位またはＣｐｆ１オルソログの対応する位置、あるいはＬｂＣｐｆ１の８３２、９２５、９４７、もしくは１１８０位またはＣｐｆ１オルソログの対応する位置での変異が含まれ得る。そのような変異は、例えば、ＡｓＣｐｆ１の変異Ｄ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、およびＤ１２６３ＡもしくはＣｐｆ１オルソログの対応する変異、またはＬｂＣｐｆ１のＤ８３２Ａ、Ｅ９２５Ａ、Ｄ９４７Ａ、およびＤ１１８０ＡもしくはＣｐｆ１オルソログの対応する変異のうちの１つ以上を含み得る。例えば、ＵＳ２０１６／０２０８２４３を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0132】

Ｃａｓタンパク質はまた、融合タンパク質として異種ポリペプチドに作動可能に連結され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質は、切断ドメイン、エピジェネティック修飾ドメイン、または転写抑制因子ドメインに融合され得る。ＷＯ２０１４／０８９２９０を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。転写抑制因子ドメインの例には、誘導性ｃＡＭＰ初期抑制因子（ＩＣＥＲ）ドメイン、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックスＡ（ＫＲＡＢ－Ａ）（またはＫｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ））抑制因子ドメイン、ＹＹ１グリシンリッチ抑制因子ドメイン、Ｓｐ１様抑制因子、Ｅ（ｓｐｌ）抑制因子、ΙκΒ抑制因子、およびＭｅＣＰ２が挙げられる。他の例には、Ａ／Ｂ、ＫＯＸ、ＴＧＦ－ベータ誘導性初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ－ｅｒｂＡ、ＳＩＤ、ＳＩＤ４Ｘ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＧ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、Ｒｂ、ＲＯＭ２由来の転写抑制因子ドメインが挙げられる。例えば、ＥＰ３０４５５３７およびＷＯ２０１１／１４６１２１を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。Ｃａｓタンパク質はまた、安定性の増加または減少を提供する異種ポリペプチドに融合され得る。融合ドメインまたは異種ポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＣａｓタンパク質の内部に位置し得る。

【0133】

一例として、Ｃａｓタンパク質は、細胞内局在化を提供する１つ以上の異種ポリペプチドに融合され得る。そのような異種ポリペプチドには、例えば、核を標的とするための単節型（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）ＳＶ４０ ＮＬＳおよび／または双節型（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）アルファ－インポーチンＮＬＳなどの１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリアを標的とするためのミトコンドリア局在化シグナル、ＥＲ保持シグナルなどが含まれ得る。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：５１０１－５１０５を参照されたい。そのような細胞内局在化シグナルは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＣａｓタンパク質内の任意の場所に位置し得る。ＮＬＳは、一続きの塩基性アミノ酸を含むことができ、単節型配列または双節型配列であり得る。任意に、Ｃａｓタンパク質は、Ｎ末端にＮＬＳ（例えば、アルファ－インポーチンＮＬＳまたは単節型ＮＬＳ）およびＣ末端にＮＬＳ（例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳまたは双節型ＮＬＳ）を含む２つ以上のＮＬＳを含み得る。Ｃａｓタンパク質はまた、Ｎ末端に２つ以上のＮＬＳおよび／またはＣ末端に２つ以上のＮＬＳを含み得る。

【0134】

Ｃａｓタンパク質はまた、細胞透過性ドメインまたはタンパク質導入ドメインに作動可能に連結され得る。例えば、細胞透過性ドメインは、ＨＩＶ－１ ＴＡＴタンパク質、ヒトＢ型肝炎ウイルスからのＴＬＭ細胞透過性モチーフ、ＭＰＧ、Ｐｅｐ－１、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルスからの細胞透過性ペプチド、またはポリアルギニンペプチド配列に由来し得る。例えば、ＷＯ２０１４／０８９２９０およびＷＯ２０１３／１７６７７２を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。細胞透過性ドメインは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＣａｓタンパク質内の任意の場所に位置し得る。

【0135】

Ｃａｓタンパク質はまた、追跡または精製を容易にするために、蛍光タンパク質、精製タグ、またはエピトープタグなどの異種ポリペプチドに作動可能に連結され得る。蛍光タンパク質の例には、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、オレンジ色蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、および任意の他の好適な蛍光タンパク質が挙げられる。タグの例には、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ １、Ｓｏｆｔａｇ ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ－Ｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）、およびカルモジュリンが挙げられる。

【0136】

Ｃａｓタンパク質は、標識された核酸に係留してもよい。そのような係留（すなわち、物理的結合）は、共有相互作用または非共有相互作用を介して達成することができ、係留は、直接（例えば、タンパク質またはインテイン修飾上のシステインまたはリジン残基の修飾によって達成することができる直接融合または化学的結合を介して）、またはストレプトアビジンまたはアプタマーなどの１つ以上の介在するリンカーまたはアダプター分子を介して達成することができる。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｉｅｒｃｅ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５（１）：４１－５５、Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４６（４６）：８８１９－８８２２、Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ ａｎｄ Ｄｉｘｏｎ （２００９） Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｊ．Ｃｈｅｍ．６２（１０）：１３２８－１３３２、Ｇｏｏｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００９） Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．１０（９）：１５５１－１５５７、およびＫｈａｔｗａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０（１４）：４５３２－４５３９を参照されたい。タンパク質－核酸コンジュゲートを合成するための非共有戦略には、ビオチン－ストレプトアビジンおよびニッケル－ヒスチジン法が含まれる。共有結合タンパク質－核酸コンジュゲートは、様々な化学物質を使用して適切に機能化された核酸とタンパク質を接続することによって合成できる。これらの化学物質のいくつかは、タンパク質表面のアミノ酸残基（例えば、リジンアミンまたはシステインチオール）へのオリゴヌクレオチドの直接結合を含むが、他のより複雑なスキームは、タンパク質の翻訳後修飾または触媒もしくは反応性タンパク質ドメインの関与を必要とする。タンパク質の核酸への共有結合の方法には、例えば、オリゴヌクレオチドのタンパク質リジンまたはシステイン残基への化学的架橋、発現されたタンパク質ライゲーション、化学酵素的方法、および光アプタマーの使用が含まれ得る。標識された核酸は、Ｃａｓタンパク質のＣ末端、Ｎ末端、または内部領域に係留されていてもよい。一例では、標識された核酸は、Ｃａｓタンパク質のＣ末端またはＮ末端に係留される。同様に、Ｃａｓタンパク質は、標識された核酸の５’末端、３’末端、または内部領域に係留されていてもよい。すなわち、標識された核酸は、任意の方向および極性で係留してもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質は、標識された核酸の５’末端または３’末端に係留されていてもよい。

【0137】

Ｃａｓタンパク質は、任意の形態で提供され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質は、ｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓタンパク質などのタンパク質の形態で提供してもよい。代替的に、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））またはＤＮＡなどの、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の形態で提供してもよい。任意に、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、特定の細胞または生物におけるタンパク質への効率的な翻訳のためにコドン最適化することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、または任意の他の目的の宿主細胞においてより頻度高く使用される代替コドンへと改変することができる。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸が細胞に導入されると、Ｃａｓタンパク質は、一時的、条件付き、または構成的に細胞内で発現され得る。

【0138】

ｍＲＮＡとして提供されるＣａｓタンパク質は、安定性および／または免疫原性の特性の改善のために修飾され得る。修飾は、ｍＲＮＡ内の１つ以上のヌクレオシドに対して行われ得る。ｍＲＮＡ核酸塩基への化学修飾の例には、シュードウリジン、１－メチル－シュードウリジン、および５－メチル－シチジンが挙げられる。例えば、Ｎ１－メチルシュードウリジンを含むキャップされポリアデニル化されたＣａｓ ｍＲＮＡを使用することができる。同様に、Ｃａｓ ｍＲＮＡは、同義コドンを使用してウリジンを枯渇させることによって修飾され得る。

【0139】

Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、細胞のゲノムにおいて安定して組み込まれ、細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結され得る。代替的に、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、発現コンストラクト中のプロモーターに作動可能に連結され得る。発現コンストラクトは、遺伝子または他の目的の核酸配列（例えば、Ｃａｓ遺伝子）の発現を指示することができ、そのような目的の核酸配列を標的細胞に導入することができる任意の核酸コンストラクトを含む。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクター内に存在してもよい。代替的に、それは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターとは別のベクターまたはプラスミドであってもよい。発現コンストラクトにおいて使用することができるプロモーターとしては、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、発生が制限された前駆細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、または１細胞期胚のうちの１つ以上において活性なプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであってよい。任意選択で、プロモーターは、一方向のＣａｓタンパク質と他の方向のガイドＲＮＡの両方の発現を駆動する双方向プロモーターであってもよい。このような双方向プロモーターは、（１）遠位配列要素（ＤＳＥ）、近位配列要素（ＰＳＥ）、およびＴＡＴＡボックスの３つの外部制御要素を含む完全な従来の一方向Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、ならびに（２）ＤＳＥの５’末端に逆方向に融合されたＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを含む第２の基本的なＰｏｌ ＩＩＩプロモーターで構成してもよい。例えば、Ｈ１プロモーターでは、ＤＳＥはＰＳＥとＴＡＴＡボックスに隣接しており、プロモーターは、Ｕ６プロモーターに由来するＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを追加することによって逆方向の転写が制御されるハイブリッドプロモーターを作成することにより、双方向にすることができる。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／００７４５３５を参照されたい。双方向プロモーターを使用してＣａｓタンパク質とガイドＲＮＡをコードする遺伝子を同時に発現させることにより、コンパクトな発現カセットを生成して送達を容易にすることができる。

【0140】

ガイドＲＮＡ「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）に結合し、かつＣａｓタンパク質を標的ＤＮＡ内の特定の位置に標的化するＲＮＡ分子である。ガイドＲＮＡは、「ＤＮＡ標的化セグメント」および「タンパク質結合セグメント」の２つのセグメントを含み得る。「セグメント」は、ＲＮＡ中のヌクレオチドの連続したストレッチなどの、分子のセクションまたは領域を含む。Ｃａｓ９のものなど、いくつかのｇＲＮＡは、「アクチベーターＲＮＡ」（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）および「ターゲッターＲＮＡ」（例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ）の２つの別個のＲＮＡ分子を含み得る。他のｇＲＮＡは、単一ＲＮＡ分子（単一ＲＮＡポリヌクレオチド）であり、これはまた「単一分子ｇＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ」、または「ｓｇＲＮＡ」と呼ばれ得る。例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２、ＷＯ２０１４／０６５５９６、ＷＯ２０１４／０８９２９０、ＷＯ２０１４／０９３６２２、ＷＯ２０１４／０９９７５０、ＷＯ２０１３／１４２５７８、およびＷＯ２０１４／１３１８３３を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、Ｃａｓ９の場合、単一ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡに融合したｃｒＲＮＡを含み得る（例えば、リンカーを介して）。例えば、Ｃｐｆ１の場合、標的配列への結合を達成するためにｃｒＲＮＡのみが必要とされる。「ガイドＲＮＡ」および「ｇＲＮＡ」という用語は、二重分子（すなわち、モジュラー）ｇＲＮＡおよび単一分子ｇＲＮＡの両方を含む。

【0141】

例示的な２分子ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「ターゲッターＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡリピート」）分子および対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス作用性ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「アクチベーターＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）分子を含む。ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（一本鎖）、およびｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の半分を形成するヌクレオチドのストレッチの両方を含む。ＤＮＡ標的化セグメントの下流（３’）に位置するｃｒＲＮＡテールの例は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号６５）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。本明細書に開示されるＤＮＡ標的化セグメント（ガイド配列）のいずれも、配列番号６５の５’末端に結合して、ｃｒＲＮＡを形成することができる。このようなＤＮＡ標的化セグメントには、例えば、配列番号４４～４６（マウスＢａｎｆ１）、配列番号２７～３０（ヒトＢＡＮＦ１）、配列番号４７～４９（マウスＰｐｐ２ｃａ）、配列番号３１～３２（ヒトＰＰＰ２ＣＡ）、配列番号５０～５２（マウスＡｎｋｌｅ２）、および配列番号３８（ヒトＡＮＫＬＥ２）が含まれる。

【0142】

対応するｔｒａｃｒＲＮＡ（アクチベーターＲＮＡ）は、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の残りの半分を形成するヌクレオチドのストレッチを含む。ｃｒＲＮＡのヌクレオチドのストレッチは、ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチドのストレッチと相補的であり、それをハイブリダイズして、ｇＲＮＡのタンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する。したがって、各ｃｒＲＮＡは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡを有すると言われ得る。例示的なｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵ（配列番号６６）、ＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号１００）、またはＧＵＵＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号１０１）を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる。

【0143】

ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方が必要とされる系では、ｃｒＲＮＡおよび対応するｔｒａｃｒＲＮＡは、ハイブリダイズしてｇＲＮＡを形成する。ｃｒＲＮＡのみが必要な系では、ｃｒＲＮＡはｇＲＮＡであってもよい。ｃｒＲＮＡはさらに、標的ＤＮＡの相補鎖にハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡ標的セグメントを提供する。細胞内での修飾に使用される場合、所与のｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列は、ＲＮＡ分子が使用される種に特異的になるように設計され得る。例えば、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８２３－８２６、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６－８２１、Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２２７－２２９、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２３３－２３９、およびＣｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９－８２３を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0144】

所与のｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（ｃｒＲＮＡ）は、以下により詳細に記載されるように、標的ＤＮＡの相補鎖上の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対合）を介して配列特異的様式で標的ＤＮＡと相互作用する。したがって、ＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列は変化してもよく、ｇＲＮＡおよび標的ＤＮＡが相互作用する標的ＤＮＡ内の位置を決定する。目的のｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、標的ＤＮＡ内の任意の所望の配列にハイブリダイズするように修飾され得る。天然発生型ｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および生物によって異なるが、２１～４６ヌクレオチドの長さの２つのダイレクトリピート（ＤＲ）が隣接する、２１～７２ヌクレオチド長の標的化セグメントを含むことが多い（例えば、ＷＯ２０１４／１３１８３３を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの場合、ＤＲは３６ヌクレオチド長であり、標的化セグメントは３０ヌクレオチド長である。３’に位置するＤＲは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡと相補的であり、それをハイブリダイズし、それは順にＣａｓタンパク質と結合する。

【0145】

ＤＮＡ標的化セグメントは、例えば、少なくとも約１２、１５、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、または４０ヌクレオチドの長さを有し得る。そのようなＤＮＡ標的セグメントは、例えば、約１２～約１００、約１２～約８０、約１２～約５０、約１２～約４０、約１２～約３０、約１２～約２５、または約１２～約２０ヌクレオチド長を有することができる。例えば、ＤＮＡ標的化セグメントは、約１５～約２５ヌクレオチド（例えば、約１７～約２０ヌクレオチド、または約１７、１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド）であり得る。例えば、ＵＳ２０１６／００２４５２３を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９の場合、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、１６～２０ヌクレオチド長、または１７～２０ヌクレオチド長である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９の場合、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、２１～２３ヌクレオチド長である。Ｃｐｆ１の場合、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、少なくとも１６ヌクレオチド長または少なくとも１８ヌクレオチド長さである。

【0146】

ＴｒａｃｒＲＮＡは、任意の形態（例えば、完全長ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性な部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、および様々な長さであり得る。それらには、一次転写物または処理された形態が含まれ得る。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡの一部として、または２分子ｇＲＮＡの一部としての別個の分子として）は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の約２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５、またはそれ以上のヌクレオチド）のすべてまたは一部を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例には、１７１ヌクレオチド、８９ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、および６５ヌクレオチドのバージョンが挙げられる。例えば、Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ４７１：６０２－６０７、ＷＯ２０１４／０９３６６１を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）内のｔｒａｃｒＲＮＡの例には、ｓｇＲＮＡの＋４８、＋５４、＋６７、および＋８５のバージョン内に見出されるｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが挙げられ、「＋ｎ」は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡの最大＋ｎヌクレオチドがｓｇＲＮＡに含まれることを示す。ＵＳ８，６９７，３５９を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0147】

ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖との間の相補性パーセントは、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であり得る。ＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖との間の相補性パーセントは、約２０個の連続するヌクレオチドにわたって少なくとも６０％であり得る。一例として、ＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖との間の相補性パーセントは、標的ＤＮＡの相補鎖の５’末端にある１４個の連続するヌクレオチドにわたって１００％であり得、残りの部分にわたって０％まで低くなり得る。そのような場合、ＤＮＡ標的化セグメントは、１４ヌクレオチド長であるとみなされ得る。別の例として、ＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖との間の相補性パーセントは、標的ＤＮＡの相補鎖の５’末端にある７個の連続するヌクレオチドにわたって１００％であり得、残りの部分にわたって０％まで低くなり得る。このような場合、ＤＮＡ標的セグメントは７ヌクレオチド長であるとみなすことができる。一部のガイドＲＮＡでは、ＤＮＡ標的セグメント内の少なくとも１７ヌクレオチドがターゲットＤＮＡの相補鎖に相補的である。例えば、ＤＮＡ標的セグメントは、２０ヌクレオチド長であってもよく、標的ＤＮＡの相補鎖との１、２、または３つのミスマッチを含むことができる。一例では、ミスマッチは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に対応する相補鎖（すなわち、ＰＡＭ配列の逆相補体）の領域に隣接していない（例えば、ミスマッチは、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントの５’末端にあるか、またはミスマッチは、ＰＡＭ配列に対応する相補鎖の領域から、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、もしくは１９塩基対離れている）。

【0148】

ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いに相補的であるヌクレオチドの２つのストレッチを含み得る。タンパク質結合セグメントの相補的ヌクレオチドは、ハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ）を形成する。目的のｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、Ｃａｓタンパク質と相互作用し、ｇＲＮＡは、結合したＣａｓタンパク質を、ＤＮＡ標的化セグメントを介して標的ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列に配向する。

【0149】

単一ガイドＲＮＡは、ＤＮＡ標的化セグメントおよび足場配列（すなわち、ガイドＲＮＡのタンパク質結合またはＣａｓ結合配列）を含み得る。例えば、そのようなガイドＲＮＡは、３’足場配列に結合された５’ＤＮＡ標的化セグメントを有することができる。例示的な足場配列は、以下を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる：ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵ（バージョン１、配列番号６７）、ＧＵＵＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン２、配列番号６８）、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン３、配列番号６９）、ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン４、配列番号７０）、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（バージョン５、配列番号１０２）、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（バージョン６、配列番号１０３）、またはＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵ（バージョン７、配列番号１０４）。本明細書に開示されるガイドＲＮＡ標的配列のうちのいずれかを標的化するガイドＲＮＡは、例えば、ガイドＲＮＡの３’末端の例示的なガイドＲＮＡ足場配列のうちのいずれかに融合したガイドＲＮＡの５’末端のＤＮＡ標的化セグメントを含み得る。すなわち、本明細書に開示されるＤＮＡ標的化セグメント（ガイドＲＮＡ）のうちのいずれかは、上記の足場配列のうちのいずれか１つの５’末端に結合して、単一ガイドＲＮＡ（キメラガイドＲＮＡ）を形成することができる。このようなＤＮＡ標的化セグメントには、例えば、配列番号４４～４６（マウスＢａｎｆ１）、配列番号２７～３０（ヒトＢＡＮＦ１）、配列番号４７～４９（マウスＰｐｐ２ｃａ）、配列番号３１～３２（ヒトＰＰＰ２ＣＡ）、配列番号５０～５２（マウスＡｎｋｌｅ２）、および配列番号３８（ヒトＡＮＫＬＥ２）が含まれる。

【0150】

ガイドＲＮＡは、追加の望ましい特徴（例えば、修飾または調節された安定性；細胞内標的化；蛍光標識による追跡；タンパク質またはタンパク質複合体の結合部位など）を提供する修飾または配列を含み得る。そのような修飾の例には、例えば、５’キャップ（例えば、７－メチルグアニレートキャップ（ｍ７Ｇ））、３’ポリアデニル化テール（すなわち、３’ポリ（Ａ）テール）、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質および／またはタンパク質複合体による調節された安定性および／または調節されたアクセス可能性を可能にするため）、安定性制御配列、ｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列、ＲＮＡを細胞内の位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化する修飾または配列、追跡を提供する修飾または配列（例えば、蛍光分子への直接結合、蛍光検出を容易にする部分への複合体化、蛍光検出を可能にする配列など）、タンパク質（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）の結合部位を提供する修飾または配列、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。修飾の他の例には、操作されたステムループ二重構造、操作されたバルジ領域、ステムループ二重構造の操作されたヘアピン３’、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。例えば、ＵＳ２０１５／０３７６５８６を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。バルジは、ｃｒＲＮＡ様領域と最小のｔｒａｃｒＲＮＡ様領域で構成される二重鎖内のヌクレオチドの対になっていない領域であり得る。バルジは、二重鎖の片側に、対になっていない５’－ＸＸＸＹ－３’を含むことができ、Ｘは、任意のプリンであり、Ｙは、反対側の鎖のヌクレオチドおよび二重鎖の反対側の対になっていないヌクレオチドの領域とゆらぎ対を形成し得るヌクレオチドであり得る。

【0151】

修飾されていない核酸は、分解されやすい場合がある。外因性核酸はまた、自然免疫応答を誘導し得る。修飾は、安定性を導入し、免疫原性を低減するのに役立ち得る。ガイドＲＮＡは、例えば、以下：（１）ホスホジエステル骨格結合において、非結合リン酸酸素の一方または両方および／もしくは結合リン酸酸素の１つ以上の改変または置換、（２）リボース糖の２’ヒドロキシルの改変または置換などのリボース糖の構成要素の改変または置換、（３）リン酸部分のデホスホリンカーによる置換、（４）天然発生型核酸塩基の修飾または置換、（５）リボース－リン酸骨格の置換または修飾、（６）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾（例えば、末端リン酸基の除去、修飾、もしくは置換、または部分の複合体化）、ならびに（７）糖の修飾のうちの１つ以上を含む修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドを含み得る。他の可能なガイドＲＮＡ修飾には、ウラシルまたはポリ－ウラシルトラクトの修飾または置換が含まれる。例えば、ＷＯ２０１５／０４８５７７およびＵＳ２０１６／０２３７４５５を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。同様の修飾を、Ｃａｓ ｍＲＮＡなどのＣａｓコード核酸に行うことができる。例えば、Ｃａｓ ｍＲＮＡは、同義のコドンを使用してウリジンを枯渇させることによって修飾することができる。

【0152】

一例として、ガイドＲＮＡの５’または３’末端のヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を含み得る（例えば、塩基は、ホスホロチオエート基である修飾リン酸基を有し得る）。例えば、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’または３’末端の２、３、または４つの末端ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含み得る。別の例として、ガイドＲＮＡの５’および／または３’末端のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を有し得る。例えば、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’および／または３’末端（例えば、５’末端）の２、３、または４つの末端ヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル修飾を含み得る。例えば、ＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１およびＦｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２２：（９）：２２２７－２２３５を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。他の可能な修飾は、本明細書の他の場所でより詳細に説明されている。特定の例では、ガイドＲＮＡには、最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡ残基に２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間結合が含まれる。そのような化学修飾は、例えば、エキソヌクレアーゼからガイドＲＮＡへのより優れた安定性および保護を提供し、それらが修飾されていないガイドＲＮＡよりも長く細胞内に持続することを可能にする。そのような化学修飾はまた、例えば、ＲＮＡを積極的に分解し得るかまたは細胞死につながる免疫カスケードを引き起こし得る自然細胞内免疫応答から保護することもできる。

【0153】

ガイドＲＮＡは、任意の形態で提供され得る。例えば、ｇＲＮＡは、２つの分子（別個のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）または１つの分子（ｓｇＲＮＡ）のいずれかとしてＲＮＡの形態で、および任意にＣａｓタンパク質との複合体の形態で提供され得る。ｇＲＮＡはまた、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で提供され得る。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、単一ＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）または別個のＲＮＡ分子（例えば、別個のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードすることができる。後者の場合、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、１つのＤＮＡ分子として、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをそれぞれコードする別個のＤＮＡ分子として提供され得る。

【0154】

ｇＲＮＡがＤＮＡの形態で提供される場合、ｇＲＮＡは、一時的、条件付き、または構成的に細胞内で発現され得る。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、細胞のゲノムにおいて安定して組み込まれ、細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結され得る。あるいは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、発現構築物中のプロモーターに作動可能に連結され得る。例えば、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸などの異種核酸を含むベクター内にあり得る。あるいは、それは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を含むベクターとは別個のベクターまたはプラスミドであり得る。そのような発現構築物において使用され得るプロモーターには、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、発達的に制限された前駆細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、または１細胞期胚のうちの１つ以上において活性なプロモーターが含まれる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであり得る。そのようなプロモーターはまた、例えば、双方向プロモーターであり得る。好適なプロモーターの特定の例には、ヒトＵ６プロモーター、ラットＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーター、またはマウスＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを挙げられる。

【0155】

あるいは、ｇＲＮＡは、他の様々な方法で調製され得る。例えば、ｇＲＮＡは、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写によって調製され得る（例えば、ＷＯ２０１４／０８９２９０およびＷＯ２０１４／０６５５９６を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ガイドＲＮＡはまた、化学的合成によって調製された合成的に生成された分子であり得る。例えば、ガイドＲＮＡを化学的に合成して、２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡ残基に含めてもよい。

【0156】

ガイドＲＮＡ（またはガイドＲＮＡをコードする核酸）は、１つ以上のガイドＲＮＡ（例えば、１、２、３、４、またはそれ以上のガイドＲＮＡ）およびガイドＲＮＡの安定性を増加させる（例えば、所与の貯蔵条件下（例えば、－２０℃、４℃、または周囲温度）で、分解生成物が、出発核酸またはタンパク質の０．５重量％を下回るままであるような、閾値を下回る期間を延長するか、またはインビボで安定性を増加させる）担体を含む組成物中にあり得る。そのような担体の非限定的な例には、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）ミクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－コグリコール－酸）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コキレート（ｃｏｃｈｌｅａｔｅｓ）、および脂質微小管が挙げられる。そのような組成物は、Ｃａｓ９タンパク質などのＣａｓタンパク質、またはＣａｓタンパク質をコードする核酸をさらに含み得る。

【0157】

ガイドＲＮＡ標的配列。ガイドＲＮＡの標的ＤＮＡには、結合に十分な条件が存在する場合に、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的セグメントが結合するＤＮＡに存在する核酸配列が含まれる。好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件には、細胞に通常存在する生理学的条件が含まれる。他の好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件（例えば、無細胞系における条件）は、当該技術分野で知られている（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ｇＲＮＡに相補的であり、かつそれとハイブリダイズする標的ＤＮＡの鎖は、「相補的鎖」と呼ばれることができ、「相補的鎖」に相補的である（したがって、Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡに相補的ではない）標的ＤＮＡの鎖は、「非相補鎖」または「テンプレート鎖」と呼ばれることができる。

【0158】

標的ＤＮＡは、ガイドＲＮＡがハイブリダイズする相補鎖上の配列と非相補鎖上の対応する配列（例えば、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する）の両方を含む。本明細書で使用される「ガイドＲＮＡ標的配列」という用語は、具体的には、特に、ガイドＲＮＡが相補鎖上でハイブリダイズする配列に対応する（すなわち、その逆相補体）非相補鎖上の配列を指す。すなわち、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＰＡＭに隣接する非相補鎖上の配列を指す（例えば、Ｃａｓ９の場合、ＰＡＭの上流または５’）。ガイドＲＮＡ標的配列は、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと同等であるが、ウラシルの代わりにチミンを含む。一例として、ＳｐＣａｓ９酵素のガイドＲＮＡ標的配列は、非相補鎖上の５’－ＮＧＧ－３’ＰＡＭの上流の配列を指し得る。ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡの相補鎖に対して相補性を有するように設計されており、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖との間のハイブリダイゼーションは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性があれば、完全な相補性は必ずしも必要ではない。ガイドＲＮＡが本明細書でガイドＲＮＡ標的配列を標的とするものとして言及される場合、それは、ガイドＲＮＡが、非相補鎖上のガイドＲＮＡ標的配列の逆相補体である標的ＤＮＡの相補鎖配列にハイブリダイズすることを意味する。

【0159】

標的ＤＮＡまたはガイドＲＮＡ標的配列は、任意のポリヌクレオチドを含むことができ、例えば、細胞の核もしくは細胞質内、またはミトコンドリアもしくは葉緑体などの細胞の細胞小器官内に位置し得る。標的ＤＮＡまたはガイドＲＮＡ標的配列は、細胞に対して内因性または外因性の任意の核酸配列であり得る。ガイドＲＮＡ標的配列は、遺伝子生成物（例えば、タンパク質）をコードする配列もしくは非コード配列（例えば、調節配列）であり得るか、または両方を含み得る。

【0160】

Ｃａｓタンパク質による標的ＤＮＡの部位特異的結合および切断は、（ｉ）ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡの相補鎖との間の塩基対合相補性、および（ｉｉ）標的ＤＮＡの非相補鎖にある、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる短いモチーフの両方によって決定される位置で起こり得る。ＰＡＭは、ガイドＲＮＡ標的配列に隣接し得る。任意に、ガイドＲＮＡ標的配列は、３’末端でＰＡＭが隣接し得る（例えば、Ｃａｓ９の場合）。あるいは、ガイドＲＮＡ標的配列は、５’末端でＰＡＭが隣接し得る（例えば、Ｃｐｆ１の場合）。例えば、Ｃａｓタンパク質の切断部位は、ＰＡＭ配列の上流または下流（例えば、ガイドＲＮＡ標的配列内）の約１～約１０または約２～約５塩基対（例えば、３塩基対）であり得る。ＳｐＣａｓ９の場合、ＰＡＭ配列（すなわち、非相補鎖上）は、５’－Ｎ_１ＧＧ－３’であり得、Ｎ_１は、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、ＰＡＭは、標的ＤＮＡの非相補鎖上のガイドＲＮＡ標的配列の３’のすぐ近くである。したがって、相補鎖上のＰＡＭに対応する（すなわち、逆相補体）配列は、５’－ＣＣＮ_２－３’であり、Ｎ_２は、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが標的ＤＮＡの相補鎖にハイブリダイズする配列の５’のすぐ近くである。いくつかのそのような場合、Ｎ_１およびＮ_２は、相補的であることができ、Ｎ_１～Ｎ_２塩基対は、任意の塩基対であり得る（例えば、Ｎ_１＝ＣおよびＮ_２＝Ｇ、Ｎ_１＝ＧおよびＮ_２＝Ｃ、Ｎ_１＝ＡおよびＮ_２＝Ｔ、またはＮ_１＝ＴおよびＮ_２＝Ａ）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９の場合、ＰＡＭは、ＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲであり得、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴであり得、Ｒは、ＧまたはＡであり得る。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ由来のＣａｓ９の場合、ＰＡＭは、例えば、ＮＮＮＮＡＣＡＣまたはＮＮＮＮＲＹＡＣであり得、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴであり得、Ｒは、ＧまたはＡであり得る。いくつかの場合（例えば、ＦｎＣｐｆ１の場合）では、ＰＡＭ配列は、５’の上流にあり、配列５’－ＴＴＮ－３’を有し得る。

【0161】

ガイドＲＮＡ標的配列の例は、ＳｐＣａｓ９タンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前の２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。例えば、ガイドＲＮＡ標的配列＋ＰＡＭの２つの例は、ＧＮ_１９ＮＧＧ（配列番号７１）またはＮ_２０ＮＧＧ（配列番号７２）である。例えば、ＷＯ２０１４／１６５８２５を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。５’末端のグアニンは、細胞内のＲＮＡポリメラーゼによる転写を促進することができる。ガイドＲＮＡ標的配列＋ＰＡＭの他の例は、インビトロでのＴ７ポリメラーゼによる効率的な転写を促進するための、５’末端に２つのグアニンヌクレオチドを含み得る（例えば、ＧＧＮ_２０ＮＧＧ；配列番号７３）。例えば、ＷＯ２０１４／０６５５９６を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。他のガイドＲＮＡ標的配列＋ＰＡＭは、５’ＧまたはＧＧおよび３’ＧＧまたはＮＧＧを含む、配列番号７１～７３の４～２２ヌクレオチド長を有し得る。さらに他のガイドＲＮＡ標的配列＋ＰＡＭは、配列番号７１～７３の１４～２０ヌクレオチド長を有し得る。ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のガイドＲＮＡ標的配列の例には、配列番号１～４（ヒトＢＡＮＦ１）、配列番号５～６（ヒトＰＰＰ２ＣＡ）、配列番号１２（ヒトＡＮＫＬＥ２）、配列番号１８～２０（マウスＢａｎｆ１）、配列番号２１～２３（マウスＰｐｐ２ｃａ）、および配列番号２４～２６（マウスＡｎｋｌｅ２）が含まれる。

【0162】

標的ＤＮＡにハイブリダイズしたＣＲＩＳＰＲ複合体の形成は、ガイドＲＮＡ標的配列（すなわち、標的ＤＮＡの非相補鎖上のガイドＲＮＡ標的配列およびガイドＲＮＡがハイブリダイズする相補鎖上の逆相補体）に対応する領域内または領域の近くの標的ＤＮＡの一方または両方の鎖の切断をもたらし得る。例えば、切断部位は、ガイドＲＮＡ標的配列内にあり得る（例えば、ＰＡＭ配列に対して定義された位置に）。「切断部位」は、Ｃａｓタンパク質が一本鎖切断または二本鎖切断を生成する標的ＤＮＡの位置を含む。切断部位は、一本鎖のみ（例えば、ニッカーゼが使用される場合）または二本鎖ＤＮＡの両方の鎖上にあり得る。切断部位は、両方の鎖上の同じ位置にあり得るか（平滑末端を生成する；例えば、Ｃａｓ９）、または各鎖上の異なる部位にあり得る（千鳥状の末端を生成する（すなわち、オーバーハング）；例えば、Ｃｐｆ１）。千鳥状の末端は、例えば、各々が異なる鎖上の異なる切断部位で一本鎖切断を生成し、それによって二本鎖切断を生成する２つのＣａｓタンパク質を使用することによって生成され得る。例えば、第１のニッカーゼは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の第１の鎖上に一本鎖切断を作成することができ、第２のニッカーゼは、オーバーハング配列が作成されるようにｄｓＤＮＡの第２の鎖上に一本鎖切断を作成することができる。いくつかの場合では、第１の鎖のニッカーゼのガイドＲＮＡ標的配列または切断部位は、第２の鎖のニッカーゼのガイドＲＮＡ標的配列または切断部位から少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、または１，０００塩基対分離されている。

【0163】

２．アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡ
アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を使用して、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、またはＡＮＫＬＥ２の発現を減少させることもできる。このようなアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、またはＡＮＫＬＥ２ ｍＲＮＡの任意の領域を標的にするように設計できる。

【0164】

「アンチセンスＲＮＡ」という用語は、細胞内で転写されたメッセンジャーＲＮＡ鎖に相補的な一本鎖ＲＮＡを指す。「低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）」という用語は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘導する典型的な二本鎖ＲＮＡ分子を指す。これらの分子は長さが異なり（一般に１８～３０塩基対の間）、アンチセンス鎖の標的ｍＲＮＡに対して様々な程度の相補性を含む。すべてではないが、一部のｓｉＲＮＡは、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の５’または３’末端に不対オーバーハング塩基を有している。「ｓｉＲＮＡ」という用語は、２本の別々の鎖の二本鎖、ならびに二本鎖領域を含むヘアピン構造を形成することができる一本鎖を含む。二本鎖構造は、例えば、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ヌクレオチド未満の長さであり得る。例えば、二本鎖構造は、長さが約２１～２３ヌクレオチド、長さが約１９～２５ヌクレオチド、または長さが約１９～２３ヌクレオチドであり得る。「ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）」という用語は、ヘアピン構造で自己ハイブリダイズし、処理時にＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘導できるＲＮＡ塩基の一本鎖を指す。これらの分子の長さは様々である（通常、約５０～９０ヌクレオチドの長さ、場合によっては最大２５０ヌクレオチドを超える長さである（例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡに適合したｓｈＲＮＡの場合））。ｓｈＲＮＡ分子は細胞内で処理されてｓｉＲＮＡを形成し、それが遺伝子発現をノックダウンする可能性がある。ｓｈＲＮＡはベクターに組み込むことができる。「ｓｈＲＮＡ」という用語は、短いヘアピンＲＮＡ分子が転写される可能性のあるＤＮＡ分子も指す。

【0165】

アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡｉ剤を使用して、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、またはＡＮＫＬＥ２の発現を減少させることもできる。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉ剤は、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、またはＡＮＫＬＥ２ ｍＲＮＡの任意の領域を標的とするように設計することができる。

【0166】

「ＲＮＡｉ剤」は、配列特異的方法で、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などの標的ＲＮＡの翻訳の分解または阻害を促進することができる小さい二本鎖ＲＮＡまたはＲＮＡ様（例えば、化学的に修飾されたＲＮＡ）オリゴヌクレオチド分子を含む組成物である。ＲＮＡｉ剤のオリゴヌクレオチドは、結合したヌクレオシドのポリマーであり、それぞれを独立して修飾することも、修飾しないこともできる。ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡ干渉メカニズムを介して機能する（つまり、哺乳動物細胞のＲＮＡ干渉経路機構（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体またはＲＩＳＣ）との相互作用を介してＲＮＡ干渉を誘導する）。ＲＮＡｉ剤は、その用語が本明細書で使用されるように、主にＲＮＡ干渉メカニズムを介して作用すると考えられているが、開示されたＲＮＡｉ剤は、特定の経路または作用メカニズムに拘束または限定されない。本明細書に開示されるＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、これらに限定されないが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、およびダイサー基質が含まれる。本明細書に記載のＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、標的ＲＮＡの配列（すなわち、標準的な命名法を使用して一連の文字で記載された核酸塩基またはヌクレオチドの連続または順序）に少なくとも部分的に相補的である。

【0167】

一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）とＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、オリゴヌクレオチドがワトソン－クリック塩基対を介して標的ＲＮＡに結合するという基本原理を共有している。理論に縛られることを望まないが、ＲＮＡｉの間に、低分子ＲＮＡ二重鎖（ＲＮＡｉ剤）がＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合し、一方の鎖（パッセンジャー鎖）が失われ、残りの鎖（ガイド鎖）が失われるＲＩＳＣと協力して相補的ＲＮＡに結合する。次に、ＲＩＳＣの触媒成分であるアルゴノート２（Ａｇｏ２）が標的ＲＮＡを切断する。ガイド鎖は常に相補的センス鎖またはタンパク質（ＲＩＳＣ）のいずれかに関連付けられている。対照的に、ＡＳＯは生き残り、一本鎖として機能する必要がある。ＡＳＯは標的ＲＮＡに結合し、リボソームまたはスプライシング因子などの他の因子がＲＮＡに結合するのをブロックしたり、ヌクレアーゼなどのタンパク質を動員したりする。目的の作用メカニズムに基づいて、ＡＳＯに対して様々な改変と標的領域が選択される。ギャップマーは、ＤＮＡの中央の８～１０塩基ギャップに隣接する各末端に２～５個の化学修飾ヌクレオチド（例えば、ＬＮＡまたは２’－ＭＯＥ）を含むＡＳＯオリゴヌクレオチドである。標的ＲＮＡに結合した後、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドはＲＮａｓｅ Ｈの基質として機能する。

【0168】

ＡＳＯはＤＮＡオリゴであり、通常１５～２５塩基長で、目的のＲＮＡに対してアンチセンス方向に設計されている。ＡＳＯのターゲットＲＮＡへのハイブリダイゼーションは、ＲＮＡのＲＮａｓｅ Ｈ切断を仲介し、ｍＲＮＡのタンパク質翻訳を妨げる可能性がある。ヌクレアーゼ耐性を高めるために、ホスホロチオエート（ＰＳ）修飾をオリゴに加えることができる。ホスホロチオエート結合はまた、血清タンパク質への結合を促進し、ＡＳＯの生物学的利用能を高め、生産的な細胞取り込みを促進する。ホスホロチオエートでは、硫黄原子がオリゴリン酸骨格の非架橋酸素に置き換わる。ＡＳＯは、ＤＮＡ塩基と修飾ＲＮＡ塩基の両方を含むキメラである可能性がある。キメラアンチセンスデザインにおける２’－Ｏ－メトキシ－エチル（２’－ＭＯＥ）ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）ＲＮＡ、またはアフィニティープラスロックド核酸（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｌｕｓ Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）塩基などの修飾ＲＮＡの使用がヌクレアーゼの安定性とアンチセンスオリゴの標的ＲＮＡへの親和性（Ｔ_ｍ）の両方を増加させる。ただし、これらの修飾はＲＮａｓｅ Ｈ切断を活性化しない（つまり、糖修飾ＲＮＡ様ヌクレオチド（２’－ＭＯＥなど）で完全に構成されるＡＳＯは、相補的ＲＮＡのＲＮａｓｅ Ｈ切断をサポートしない）。したがって、１つのアンチセンス戦略は、ＲＮａｓｅ－Ｈ活性化ドメインを保持するキメラアンチセンスオリゴに２’－Ｏ修飾ＲＮＡまたはアフィニティープラスロックド核酸塩基を組み込む「ギャップマー」設計である。標準的なギャップマーは、ＲＮａｓｅ Ｈ切断を誘導するのに十分なＰＳ修飾ＤＮＡ塩基の中央領域を保持する。これらの塩基は、標的への結合親和性を高める２’修飾のブロックが両側に隣接している。例えば、ギャップマーは、ＲＮａｓｅ Ｈ切断の誘導を可能にするデオキシヌクレオチドの中央セクションを含むことができ、中央部分は、ヌクレアーゼ分解から中央セクションを保護する２’－Ｏ－アルキル修飾リボヌクレオチドのブロックに隣接している。細胞に送達されると、ＡＳＯは核に入り、相補的な内因性ＲＮＡ標的に結合する。ＡＳＯギャップマーの標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーションは、中央領域にＤＮＡ：ＲＮＡヘテロ二本鎖を形成し、これが酵素ＲＮａｓｅ Ｈ１による切断の基質になる。

【0169】

一例では、５－１０－５ギャップマーであるＡＳＯが使用され、ＤＮＡの中央１０ヌクレオチドコアに隣接する５つの化学修飾ヌクレオチドの５’および３’ウィングが含まれている。特定の例では、５－１０－５ギャップマーであるＡＳＯが使用され、ホスホロチオエート骨格、ウィングの２’メトキシエチル修飾塩基（両端から５ヌクレオチド）、および未修飾ＤＮＡ塩基の１０ヌクレオチドコアが含まれている。例えば、図４０を参照されたい。

【0170】

一例では、ｍＢａｎｆ１を標的とするＡＳＯは、配列番号２１５～２３６のいずれか１つに示される親アンチセンスＲＮＡ配列の改変バージョンを含むことができる。別の例では、ｍＢａｎｆ１を標的とするＡＳＯは、配列番号２１５、２１６、２２０～２２３、２２５、２３０～２３２、２３４、および２３５のうちのいずれか１つに記載の親アンチセンスＲＮＡ配列の改変バージョンを含むことができる。そのような改変は、例えば、以下のうちの１つ以上を含み得る：１つ以上のＲＮＡ塩基の１つ以上のＤＮＡ塩基への置換、１つ以上のホスホロチオエート結合の付加、または例えば２’－Ｏ－メトキシ－エチル（２’－ＭＯＥ）ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）ＲＮＡ、もしくはアフィニティープラスロックド核酸塩基などの修飾されたＲＮＡによる１つ以上の塩基の置換。一例では、ｍＢａｎｆ１を標的とするＡＳＯは、配列番号１０５～１２６のいずれか１つに記載の配列またはその改変バージョンを含むことができる。別の例では、ｍＢａｎｆ１を標的とするＡＳＯは、配列番号１０５、１０６、１１０～１１３、１１５、１２０～１２２、１２４、および１２５のうちのいずれか１つに記載の配列またはそれらの改変バージョンを含むことができる。そのような修飾は、例えば、１つ以上のホスホロチオエート結合の付加および／または２’－Ｏ－メトキシ－エチル（２’－ＭＯＥ）ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）ＲＮＡ、もしくはアフィニティープラスロックド核酸塩基などの修飾されたＲＮＡ塩基による１つ以上の塩基の置換を含み得る。別の例では、ｍＢａｎｆ１を標的とするＡＳＯは、表１３に記載されている配列および／または修飾パターンのいずれかを含むことができる。上記の配列のいずれにおいても、最初の５ヌクレオチドまたは最後の５ヌクレオチドの任意の「Ｔ」を「Ｕ」に置き換えることができる。

【0171】

一例では、ｍＰｐｐ２ｃａを標的とするＡＳＯは、配列番号２３７～２７８のいずれか１つに記載の親アンチセンスＲＮＡ配列の改変バージョンを含むことができる。別の例では、ｍＰｐｐ２ｃａを標的とするＡＳＯは、配列番号２４０、２４３、２４６、２４７、２６０、２６２、２６３、２６５、２６８～２７０、２７２、２７５、および２７６のうちのいずれか１つに記載の親アンチセンスＲＮＡ配列の改変バージョンを含むことができる。そのような改変は、例えば、以下のうちの１つ以上を含み得る：１つ以上のＲＮＡ塩基の１つ以上のＤＮＡ塩基への置換、１つ以上のホスホロチオエート結合の付加、または例えば２’－Ｏ－メトキシ－エチル（２’－ＭＯＥ）ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）ＲＮＡ、もしくはアフィニティープラスロックド核酸塩基などの修飾されたＲＮＡによる１つ以上の塩基の置換。一例では、ｍＰｐｐ２ｃａを標的とするＡＳＯは、配列番号１２７～１６８のうちのいずれか１つに記載の配列またはその改変バージョンを含むことができる。別の例では、ｍＰｐｐ２ｃａを標的とするＡＳＯは、配列番号１３０、１３３、１３６、１３７、１５０、１５２、１５３、１５５、１５８～１６０、１６２、１６５、および１６６のうちのいずれか１つに記載の配列またはその改変バージョンを含むことができる。そのような修飾は、例えば、１つ以上のホスホロチオエート結合の付加および／または２’－Ｏ－メトキシ－エチル（２’－ＭＯＥ）ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）ＲＮＡ、もしくはアフィニティープラスロックド核酸塩基などの修飾されたＲＮＡ塩基による１つ以上の塩基の置換を含み得る。別の例では、ｍＰｐｐ２ｃａを標的とするＡＳＯは、表１４に記載されている配列および／または修飾パターンのいずれかを含むことができる。上記の配列のいずれにおいても、最初の５ヌクレオチドまたは最後の５ヌクレオチドの任意の「Ｔ」を「Ｕ」に置き換えることができる。

【0172】

一例では、ｍＡｎｋｌｅ２を標的とするＡＳＯは、配列番号２７９～３２４のうちのいずれか１つに記載の親アンチセンスＲＮＡ配列の改変バージョンを含むことができる。別の例では、ｍＡｎｋｌｅ２を標的とするＡＳＯは、配列番号２７９、２８１～２８３、２８５、２８７、２９１～２９４、２９７、３０４、３０７、３２１、および３２３のうちのいずれか１つに記載の親アンチセンスＲＮＡ配列の改変バージョンを含むことができる。そのような改変は、例えば、以下のうちの１つ以上を含み得る：１つ以上のＲＮＡ塩基の１つ以上のＤＮＡ塩基への置換、１つ以上のホスホロチオエート結合の付加、または例えば２’－Ｏ－メトキシ－エチル（２’－ＭＯＥ）ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）ＲＮＡ、もしくはアフィニティープラスロックド核酸塩基などの修飾されたＲＮＡによる１つ以上の塩基の置換。一例では、ｍＡｎｋｌｅ２を標的とするＡＳＯは、配列番号１６９～２１４のうちのいずれか１つに記載の配列またはその改変バージョンを含むことができる。別の例では、ｍＡｎｋｌｅ２を標的とするＡＳＯは、配列番号１６９、１７１～１７３、１７５、１７７、１８１～１８４、１８７、１９４、１９７、２１１、および２１３のうちのいずれか１つに記載の配列またはその改変バージョンを含むことができる。そのような修飾は、例えば、１つ以上のホスホロチオエート結合の付加および／または２’－Ｏ－メトキシ－エチル（２’－ＭＯＥ）ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）ＲＮＡ、もしくはアフィニティープラスロックド核酸塩基などの修飾されたＲＮＡ塩基による１つ以上の塩基の置換を含み得る。別の例では、ｍＡｎｋｌｅ２を標的とするＡＳＯは、表１５に記載されている配列および／または修飾パターンのいずれかを含むことができる。上記の配列のいずれにおいても、最初の５ヌクレオチドまたは最後の５ヌクレオチドの任意の「Ｔ」を「Ｕ」に置き換えることができる。

【0173】

ＩＩＩ．改善されたタウオパチーモデルを作製する方法およびタウオパチーモデルにおいてタウ凝集を加速するための方法
本明細書の他の場所で詳細に開示されている改善されたタウオパチーモデルを作製する方法も提供される。そのような方法は、既存のタウオパチーモデル（例えば、外因性のヒトタウコード配列を含むトランスジェニック細胞、組織、または動物）から始めることができる。すなわち、そのような方法は、既存のタウオパチーモデル（例えば、タウオパチーモデル非ヒト動物、タウオパチーモデル動物組織、またはタウオパチーモデル動物細胞）においてタウ凝集を加速または悪化させるための方法であり得る。例えば、そのような方法は、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上またはすべての発現を低減させる１つ以上の薬剤を、既存のタウオパチーモデル細胞（複数可）、組織、または動物（例えば、外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列を含む非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団）に、導入することを含むことができる。本明細書の他の場所でより詳細に論じられているタウオパチーモデルのいずれかを使用することができる。

【0174】

タウオパチーの様々なモデルが開発されている。これらには、細胞／細胞培養モデル（非神経細胞株、ＰＣ１２、ＳＹ５Ｙ、ＣＮ１．４細胞などの神経細胞株、一次神経細胞）、組織モデル（例えば、器官型脳切片培養などの脳切片培養）、および全動物トランスジェニックモデル（例えば、線虫、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、またはマウス）が含まれる。例えば、Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １７３９：２２４－２３９，Ｂｒａｎｄｔ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １７３９：３３１－３５４、およびＬｅｅ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １７３９：２５１－２５９を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。典型的には、そのようなモデルは、野生型または変異型のヒトタウアイソフォームが様々なプロモーターの制御下で過剰発現されて神経原線維変化を引き起こすトランスジェニックモデルである。細胞ベースのモデルには、操作へのアクセス性と柔軟性が高いという利点があるが、動物モデル全体（トランスジェニックマウスモデルなど）はより完全で、人間の病気により直接的に関連している。

【0175】

１つの特定のタウオパチーモデルは、ＰＳ１９（タウ Ｐ３０１Ｓ（系列ＰＳ１９）；ＰＳ１９Ｔｇ；Ｂ６；Ｃ３－Ｔｇ（Ｐｒｎｐ－ＭＡＰＴ＊Ｐ３０１Ｓ）ＰＳ１９Ｖｌｅ／Ｊ）マウス系列である。この系統の遺伝的背景はＣ５７ＢＬ／６ｘＣ３Ｈである。ＰＳ１９トランスジェニックマウスは、マウスプリオンタンパク質（Ｐｒｎｐ）プロモーターによって駆動される変異型ヒト微小管関連タンパク質タウＭＡＰＴを発現する。導入遺伝子は、疾患に関連するＰ３０１Ｓ変異をコードし、４つの微小管結合ドメインと１つのＮ末端インサート（４Ｒ／１Ｎ）を含む。Ｃｈｒ３：１４０３５４２８０－１４０６０３２８３（ビルドＧＲＣｍ３８／ｍｍ１０）に導入遺伝子が挿入され、既知の遺伝子に影響を与えない２４９Ｋｂの欠失が発生した。すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＧｏｏｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２９（３）：４９４－５０５を参照されたい。変異型ヒトタウの発現は、内因性マウスタンパク質の発現よりも５倍高い。すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＹｏｓｈｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎｅｕｒｏｎ ５３（３）：３３７－３５１を参照されたい。ＰＳ１９マウスは、生後８ヶ月までにニューロンの喪失と脳の萎縮を発症する。それらはまた、新皮質、扁桃体、海馬、脳幹、および脊髄において、神経原線維変化様封入体として知られる広範なタウ凝集体を発達させる。Ｙｏｓｈｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（２００７）を参照されたい。組織学的方法による明白なタウ病理の出現の前に、これらのマウスの脳はタウ播種活性を示すことが示された。すなわち、脳ホモジネートに存在するタウ凝集体は、おそらくプリオンのようなメカニズムを介して、さらなるタウ凝集を誘発する可能性がある。すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｏｌｍｅｓ（２０１４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１（４１）：Ｅ４３７６－Ｅ４３８５を参照されたい。

【0176】

他のそのような方法は、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上またはすべての発現を低減させる１つ以上の薬剤を、非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団に導入するだけでなく、外因性微小管関連タンパク質タウコード配列（例えば、外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列）にも導入することを含むことができる。そのようなコード配列の例は、改善されたタウオパチーモデルに関するセクションなど、本明細書の他の場所でより詳細に議論されている。そのような配列はどれでも使用できる。

【0177】

薬剤（および任意選択でタウコード配列）は、任意の既知の手段によって導入することができる。「導入すること」は、配列が、組織または動物内の細胞（複数可）または細胞（複数可）の内部にアクセスするような方法で、細胞または動物に薬剤（例えば、核酸またはタンパク質）を提示することが含まれる。本明細書で提供される方法は、薬剤を導入するための特定の方法に依存せず、核酸またはタンパク質が少なくとも１つの細胞の内部にアクセスすることのみに依存する。核酸およびタンパク質を様々な細胞型に導入するための方法は既知であり、例えば、安定したトランスフェクション法、一過性トランスフェクション法、およびウイルス媒介法が含まれる。

【0178】

非ヒト動物または細胞に導入された分子（例えば、Ｃａｓタンパク質またはガイドＲＮＡまたはＲＮＡｉ剤またはＡＳＯ）は、導入された分子の安定性を増加させる担体（例えば、所与の貯蔵条件下（例えば、－２０℃、４℃、または周囲温度）での、分解産物が閾値未満、例えば出発核酸またはタンパク質の０．５重量％未満のままである期間を延長する、またはインビボでの安定性を増加させる）を含む組成物で提供することができる。そのような担体の非限定的な例には、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）ミクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－コグリコール－酸）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コキレート（ｃｏｃｈｌｅａｔｅｓ）、および脂質微小管が挙げられる。

【0179】

細胞または非ヒト動物への分子（例えば、核酸またはタンパク質）の導入を可能にするために、様々な方法および組成物が本明細書で提供される。分子を様々な細胞型に導入するための方法は既知であり、例えば、安定したトランスフェクション法、一過性トランスフェクション法、およびウイルス媒介法が含まれる。

【0180】

トランスフェクションプロトコル、ならびに分子（例えば、核酸またはタンパク質）を細胞に導入するためのプロトコルは異なり得る。非限定的なトランスフェクション法には、リポソーム、ナノ粒子、リン酸カルシウム（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２（２）：４５６－６７、Ｂａｃｃｈｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７４ （４）： １５９０－４、およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ（１９９１）．Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ． ｐｐ．９６－９７、これらのそれぞれは、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、デンドリマー、またはＤＥＡＥ－デキストランやポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーを使用する化学ベースのトランスフェクション法が含まれる。非化学的方法には、電気穿孔法、ソノポレーション、および光トランスフェクションが含まれる。粒子ベースのトランスフェクションには、遺伝子銃の使用、またはマグネットアシストトランスフェクション（Ｂｅｒｔｒａｍ（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７，２７７－２８、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）が含まれる。ウイルス法もトランスフェクションに使用することができる。

【0181】

細胞への分子（例えば、核酸またはタンパク質）の導入はまた、電気穿孔法、細胞質内注射、ウイルス感染、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、トランスフェクション、脂質媒介トランスフェクション、またはヌクレオフェクションによって媒介され得る。ヌクレオフェクションは、核酸基質を細胞質だけでなく核膜を介して核に送達することを可能にする改善された電気穿孔法技術である。さらに、本明細書に開示される方法でのヌクレオフェクションの使用は、典型的には、通常の電気穿孔法よりもはるかに少ない細胞を必要とする（例えば、通常の電気穿孔法による７００万に対してわずか約２００万）。一例では、ヌクレオフェクションは、ＬＯＮＺＡ（登録商標）ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標）システムを使用して行われる。

【0182】

細胞への分子（例えば、核酸またはタンパク質）の導入は、マイクロインジェクションによっても達成され得る。ｍＲＮＡのマイクロインジェクションは、好ましくは細胞質へ（例えば、ｍＲＮＡを翻訳機構に直接送達するために）のものであるが、一方で、タンパク質またはタンパク質をコードするＤＮＡのマイクロインジェクションは、好ましくは、核へのものである。あるいは、マイクロインジェクションは、核および細胞質の両方への注射によって実施することができ、針を最初に核に導入し、最初の量を注射することができ、細胞から針を取り除きながら、２番目の量を細胞質に注射することができる。マイクロインジェクションを実施する方法は周知である。例えば、Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｇｙ Ａ，Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ Ｍ，Ｖｉｎｔｅｒｓｔｅｎ Ｋ，Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｒ．，２００３，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、 Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０７：１５０２２－１５０２６およびＭｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０９：９３５４－９３５９を参照されたく、それぞれがすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0183】

分子（例えば、核酸またはタンパク質）を細胞に導入するための他の方法には、例えば、ベクター送達、粒子媒介送達、エクソソーム媒介送達、脂質ナノ粒子媒介送達、細胞透過性ペプチド媒介送達、または埋め込み型デバイス媒介配達が含まれ得る。インビボで細胞を修飾するために対象に核酸またはタンパク質を投与する方法は、本明細書の他の場所に開示されている。具体的な例として、分子（例えば、核酸またはタンパク質）は、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）マイクロスフェア、ポリ（Ｄ、Ｌ－乳酸－コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質渦巻状物、または脂質微小管などの担体中で、細胞または非ヒト動物に導入することができる。非ヒト動物への送達のいくつかの具体的な例には、流体力学的送達、ウイルス媒介送達（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達）、および脂質ナノ粒子媒介送達が含まれる。

【0184】

一例では、薬剤（および場合によりタウコード配列）は、レンチウイルス形質導入またはアデノ随伴ウイルス形質導入などのウイルス形質導入を介して導入することができる。

【0185】

いくつかの方法では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの構成要素が非ヒト動物または細胞に導入される。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ（例えば、インビトロ転写されたＲＮＡ）の形態で、またはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で非ヒト動物または細胞に導入することができる。ＤＮＡの形態で導入されると、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、非ヒト動物の細胞内で活性のあるプロモーターに作動可能に連結することができる。例えば、ガイドＲＮＡは、ＡＡＶを介して送達され、Ｕ６プロモーターの下でインビボで発現できる。そのようなＤＮＡは、１つ以上の発現コンストラクト中にあり得る。例えば、そのような発現コンストラクトは、単一の核酸分子の構成要素であり得る。代替的に、それらは、２つ以上の核酸分子の間で任意の組み合わせで分離することができる（すなわち、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードするＤＮＡおよび１つ以上のｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、別個の核酸分子の構成要素であり得る）。

【0186】

同様に、Ｃａｓタンパク質は任意の形態で提供してもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質は、ｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓタンパク質などのタンパク質の形態で提供してもよい。代替的に、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））またはＤＮＡなどの、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の形態で提供してもよい。任意に、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、特定の細胞または生物におけるタンパク質への効率的な翻訳のためにコドン最適化することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、または任意の他の目的の宿主細胞においてより頻度高く使用される代替コドンへと改変することができる。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸が非ヒト動物に導入されると、Ｃａｓタンパク質は、一時的、条件付き、または構成的に細胞内で発現され得る。

【0187】

Ｃａｓタンパク質またはガイドＲＮＡをコードする核酸は、発現コンストラクト中のプロモーターに作動可能に連結され得る。発現構築物は、遺伝子または他の目的の核酸配列（例えば、Ｃａｓ遺伝子）の発現を指示することができ、かつそのような目的の核酸配列を標的細胞に移すことができる任意の核酸構築物を含む。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、１つ以上のｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクター内に存在してもよい。あるいは、それは、１つ以上のｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターとは別のベクターまたはプラスミドであってもよい。発現コンストラクトにおいて使用することができる適切プロモーターとしては、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、発生が制限された前駆細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、または１細胞期胚のうちの１つ以上において活性なプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであり得る。任意選択で、プロモーターは、一方向のＣａｓタンパク質と他の方向のガイドＲＮＡの両方の発現を駆動する双方向プロモーターであってもよい。このような双方向プロモーターは、（１）遠位配列要素（ＤＳＥ）、近位配列要素（ＰＳＥ）、およびＴＡＴＡボックスの３つの外部制御要素を含む完全な従来の一方向Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、ならびに（２）ＤＳＥの５’末端に逆方向に融合されたＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを含む第２の基本的なＰｏｌ ＩＩＩプロモーターで構成してもよい。例えば、Ｈ１プロモーターでは、ＤＳＥはＰＳＥとＴＡＴＡボックスに隣接しており、プロモーターは、Ｕ６プロモーターに由来するＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを追加することによって逆方向の転写が制御されるハイブリッドプロモーターを作成することにより、双方向にすることができる。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／００７４５３５を参照されたい。双方向プロモーターを使用してＣａｓタンパク質とガイドＲＮＡをコードする遺伝子を同時に発現させることにより、コンパクトな発現カセットを生成して送達を容易にすることができる。

【0188】

ヌクレアーゼ剤の導入は、ＡＡＶ媒介送達またはレンチウイルス媒介送達などのウイルス媒介送達によっても達成することができる。他の例示的なウイルス／ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、および単純ヘルペスウイルスが含まれる。ウイルスは、分裂細胞、非分裂細胞、または分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染できる。ウイルスは宿主ゲノムに組み込まれてもよく、または代替的に宿主ゲノムに組み込まれなくてもよい。このようなウイルスは、免疫力が低下するように操作することもできる。ウイルスは、複製可能であってもよく、複製欠損（例えば、ビリオン複製および／またはパッケージングの追加ラウンドに必要な１つ以上の遺伝子に欠陥がある）であってもよい。ウイルスは、一過性の発現、長期的な発現（例えば、少なくとも１週間、２週間、１ヶ月、２ヶ月、または３ヶ月）、または永続的な発現（例えば、Ｃａｓ９および／またはｇＲＮＡの）を引き起こし得る。例示的なウイルス力価（例えば、ＡＡＶ力価）には、約１０^１２、約１０^１３、約１０^１４、約１０^１５、および約１０^１６ベクターゲノム／ｍＬが含まれる。他の例示的なウイルス力価（例えば、ＡＡＶ力価）には約１０^１２、約１０^１３、約１０^１４、約１０^１５、および約１０^１６ベクターゲノム（ｖｇ）／ｋｇ体重が含まれる。

【0189】

ｓｓＤＮＡ ＡＡＶゲノムは、２つのオープンリーディングフレーム、ＲｅｐとＣａｐで構成され、相補ＤＮＡ鎖の合成を可能にする２つの末端逆位配列が隣接している。ＡＡＶトランスファープラスミドを構築する場合、導入遺伝子は２つのＩＴＲの間に配置され、ＲｅｐとＣａｐはトランスで供給される。ＲｅｐとＣａｐに加えて、ＡＡＶはアデノウイルス由来の遺伝子を含むヘルパープラスミドを必要とする場合がある。これらの遺伝子（Ｅ４、Ｅ２ａ、およびＶＡ）はＡＡＶ複製を媒介する。例えば、トランスファープラスミド、Ｒｅｐ／Ｃａｐ、およびヘルパープラスミドをアデノウイルス遺伝子Ｅ１＋を含むＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトして、感染性ＡＡＶ粒子を生成することができる。代替的に、Ｒｅｐ、Ｃａｐ、およびアデノウイルスヘルパー遺伝子を組み合わせて単一のプラスミドとすることもできる。同様のパッケージングセルおよび方法は、レトロウイルスなどの他のウイルスにも使用できる。

【0190】

ＡＡＶの複数の血清型が確認されている。これらの血清型は、感染する細胞の種類（すなわち、それらの指向性）が異なり、特定の細胞型の優先的な形質導入を可能にする。ＣＮＳ組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９が含まれる。心臓組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９が含まれる。腎臓組織に対する血清型にはＡＡＶ２が含まれる。肺組織に対する血清型には、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、およびＡＡＶ９が含まれる。膵臓組織に対する血清型にはＡＡＶ８が含まれる。光受容細胞に対する血清型には、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ８が含まれる。網膜色素上皮組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ８が含まれる。骨格筋組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９が含まれる。肝臓組織に対する血清型には、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９、特にＡＡＶ８が含まれる。ニューロンにおける遺伝子送達のためのＡＡＶ血清型の選択性は、例えば、Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．（２０１７）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １２（１２）：ｅ０１８８８３０で議論されており、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0191】

指向性は、キャプシドと異なるウイルス血清型からのゲノムの混合である偽型付けによってさらに洗練することができる。例えば、ＡＡＶ２／５は、血清型５のキャプシドにパッケージされた血清型２のゲノムを含むウイルスを示す。偽型ウイルスの使用は、形質導入効率を改善するだけでなく、指向性を変えることができる。異なる血清型に由来するハイブリッドキャプシドを使用して、ウイルスの指向性を改変することもできる。例えば、ＡＡＶ－ＤＪには、８つの血清型由来のハイブリッドキャプシドが含まれており、インビボで幅広い細胞型にわたって高い感染力を示す。ＡＡＶ－ＤＪ８は、ＡＡＶ－ＤＪの特性を示すが、脳への取り込みが強化された別の例である。ＡＡＶ血清型は、変異によっても改変できる。ＡＡＶ２の変異改変の例には、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、およびＳ６６２Ｖが含まれる。ＡＡＶ３の変異改変の例には、Ｙ７０５Ｆ、Ｙ７３１Ｆ、およびＴ４９２Ｖが含まれる。ＡＡＶ６の変異改変の例には、Ｓ６６３ＶおよびＴ４９２Ｖが含まれる。他の偽型／改変ＡＡＶ変異体には、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ８．２、およびＡＡＶ／ＳＡＳＴＧが含まれる。

【0192】

導入遺伝子の発現を加速するために、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）バリアントを使用することができる。ＡＡＶは細胞のＤＮＡ複製機構に依存して、ＡＡＶの一本鎖ＤＮＡゲノムの相補鎖を合成するため、導入遺伝子の発現が遅れる可能性がある。この遅延に対処するために、感染時に自発的にアニーリングすることができる相補的配列を含むｓｃＡＡＶを使用することができ、宿主細胞のＤＮＡ合成の必要性を排除する。しかしながら、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクターも使用できる。

【0193】

パッケージング容量を増やすために、より長い導入遺伝子を、１つ目は３’スプライスドナー、２つ目は５’スプライスアクセプターである２つのＡＡＶトランスファープラスミドに分割することができる。細胞の共感染時に、これらのウイルスはコンカテマーを形成し、一緒にスプライシングされ、完全長の導入遺伝子を発現させることができる。これにより、より長い導入遺伝子の発現が可能になるが、発現の効率は低下する。容量を増やすための同様の方法は、相同組換えを利用する。例えば、導入遺伝子は２つのトランスファープラスミドに分割できるが、共発現が相同組換えと全長導入遺伝子の発現を誘導するように、実質的な配列の重複がある。

【0194】

核酸とタンパク質の導入は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介送達によっても達成できる。例えば、ＬＮＰ媒介送達は、Ｃａｓ ｍＲＮＡとガイドＲＮＡの組み合わせ、またはＣａｓタンパク質とガイドＲＮＡの組み合わせを送達するために使用することができる。このような方法による送達は、一過性のＣａｓ発現をもたらす可能性があり、生分解性脂質は、クリアランスを改善し、忍容性を改善し、免疫原性を減少させる可能性がある。脂質製剤は、生体分子を分解から保護すると同時に、細胞への取り込みを改善することができる。脂質ナノ粒子は、分子間力によって互いに物理的に結合した複数の脂質分子を含む粒子である。これらには、ミクロスフェア（単層および多層ベシクル、例えばリポソームを含む）、エマルジョン中の分散相、ミセル、または懸濁液中の内相が含まれる。そのような脂質ナノ粒子は、送達のために１つ以上の核酸またはタンパク質をカプセル化するために使用することができる。カチオン性脂質を含む製剤は、核酸などのポリアニオンを送達するのに有用である。含めることができる他の脂質は、中性脂質（すなわち、非荷電または両性イオン脂質）、陰イオン脂質、トランスフェクションを増強するヘルパー脂質、およびナノ粒子がインビボで存在できる時間を増加させるステルス脂質である。適切なカチオン性脂質、中性脂質、アニオン性脂質、ヘルパー脂質、およびステルス脂質の例は、すべての目的のために全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１６／０１０８４０Ａ１に見出すことができる。例示的な脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質および１つ以上の他の成分を含むことができる。一例では、他の成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質を含むことができる。別の例では、他の成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質およびＤＳＰＣなどの中性脂質を含むことができる。別の例では、他の成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質、ＤＳＰＣなどの任意の中性脂質、およびＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３などのステルス脂質を含むことができる。

【0195】

ＬＮＰは、以下の１つ以上またはすべてを含み得る：（ｉ）カプセル化およびエンドソーム脱出のための脂質、（ｉｉ）安定化のための中性脂質、（ｉｉｉ）安定化のためのヘルパー脂質、および（ｉｖ）ステルス脂質を含む。例えば、それらの各々が、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｅｌｌ．２２（９）：２２２７－２２３５およびＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１を参照されたい。特定のＬＮＰでは、カーゴはガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含むことができる。特定のＬＮＰにおいて、カーゴは、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、およびガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含み得る。

【0196】

カプセル化およびエンドソーム脱出のための脂質は、カチオン性脂質であり得る。脂質はまた、生分解性イオン化可能脂質などの生分解性脂質であり得る。適切な脂質の一例は、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノアートとも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノアートである脂質ＡまたはＬＰ０１である。例えば、それらの各々が、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｅｌｌ．２２（９）：２２２７－２２３５およびＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１を参照されたい。適切な脂質の別の例は、（（５－（（ジメチルアミノ）メチル）－１，３－フェニレン）ビス（オキシ））ビス（オクタン－８，１－ジイル）ビス（デカノアート）とも呼ばれる、（（５－（（ジメチルアミノ）メチル）－１，３－フェニレン）ビス（オキシ））ビス（オクタン－８，１－ジイル）ビス（デカノアート）である脂質Ｂである。適切な脂質の別の例は、２－（（４－（（（３－（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン－１，３－ジイル（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（オクタデカ－９，１２－ジエノアート）である脂質Ｃである。適切な脂質の別の例は、３－（（（３－（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）－１３－（オクタノイルオキシ）トリデシル３－オクチルウンデカノアートである脂質Ｄである。他の適切な脂質としては、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）としても知られる）））が含まれる。

【0197】

本明細書に記載のＬＮＰでの使用に適したいくつかのそのような脂質は、インビボで生分解性である。例えば、そのような脂質を含むＬＮＰには、脂質の少なくとも７５％が、８、１０、１２、２４、もしくは４８時間以内、または３、４、５、６、７、もしくは１０日以内に血漿から除去されるものが含まれる。別の例として、ＬＮＰの少なくとも５０％が、８、１０、１２、２４、もしくは４８時間以内、または３、４、５、６、７、もしくは１０日以内に血漿から除去される。

【0198】

このような脂質は、それらが含まれる培地のｐＨに応じてイオン化可能であってよい。例えば、わずかに酸性の培地では、脂質はプロトン化され、したがって正電荷を帯びることができる。逆に、例えば、ｐＨが約７．３５である血液などのわずかに塩基性の媒体では、脂質はプロトン化されない可能性があり、したがって電荷を帯びない可能性がある。いくつかの実施形態では、脂質は、少なくとも約９、９．５、または１０のｐＨでプロトン化され得る。そのような脂質が電荷を帯びる能力は、その固有のｐＫａに関連している。例えば、脂質は、独立して、約５．８～約６．２の範囲のｐＫａを有し得る。

【0199】

中性脂質は、ＬＮＰを安定化し、その加工を改善するよう機能する。適切な中性脂質の例には、様々な中性、非荷電、または双性イオン性脂質が含まれる。本開示における使用に好適な中性リン脂質の例は、５－ヘプタデシルベンゼン－１，３－ジオール（レゾルシノール）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＬＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＡＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジラウリロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１－ミリストイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１－パルミトイル－２－ミリストイルホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－ステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１，２－ジアラキドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１－ステアロイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１，２－ジエイコセノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、リソホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジリノレオイルホスファチジルコリンジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、パルミトイルロレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、リソホスファチジルエタノールアミンおよびこれらの組み合わせを含むが、これらには限定されない。例えば、中性リン脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、およびジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）からなる群から選択され得る。

【0200】

ヘルパー脂質には、トランスフェクションを促進する脂質が含まれる。ヘルパー脂質がトランスフェクションを強化する機序は、粒子安定性を増強することを含んでもよい。場合によっては、ヘルパー脂質が膜の融合性を高めることができる。ヘルパー脂質は、ステロイド、ステロール、およびアルキルレゾルシノールを含む。適切なヘルパー脂質の例には、コレステロール、５－ヘプタデシルレゾルシノール、およびヘミコハク酸コレステロールが含まれる。一例では、ヘルパー脂質はコレステロールまたはヘミコハク酸コレステロールであり得る。

【0201】

ステルス脂質には、ナノ粒子がインビボで存在できる時間の長さを変える脂質が含まれる。ステルス脂質は、例えば、粒子凝集を低減し、粒子サイズを制御することによって製剤化プロセスにおいて有用である。ステルス脂質は、ＬＮＰの薬物動態特性を調節し得る。適切なステルス脂質には、脂質部分に連結された親水性頭部基を有する脂質が含まれる。

【0202】

ステルス脂質の親水性頭部基は、例えば、ＰＥＧ（しばしばポリ（エチレンオキシド）と呼ばれる）、ポリ（オキサゾリン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（グリセロール）、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ポリアミノ酸、およびポリＮ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドに基づくポリマーから選択されるポリマー部分を含んでもよい。ＰＥＧという用語は、ポリエチレングリコールまたは他のポリアルキレンエーテルポリマーを意味する。特定のＬＮＰ製剤では、ＰＥＧはＰＥＧ２０００とも呼ばれるＰＥＧ－２Ｋであり、平均分子量は約２，０００ダルトンである。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１を参照されたい。

【0203】

ステルス脂質の脂質部分は、例えば、独立して約Ｃ４～約Ｃ４０の飽和または不飽和の炭素原子を含むアルキル鎖長を有するジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基を含むものを含むジアシルグリセロールまたはジアシルグリカミドから由来し得、ここで鎖は１つ以上の、例えばアミドまたはエステルなどの官能基を含み得る。ジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基は、１つ以上の置換アルキル基をさらに含み得る。

【0204】

一例として、ステルス脂質は、ＰＥＧ－ジラウロイルグリセロール、ＰＥＧ－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ－ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド、およびＰＥＧ－ジステアロイルグリカミド、ＰＥＧ－コレステロール（ｌ－［８’－（コレスト－５－エン－３［ベータ］－オキシ）カルボキシアミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ－ＤＭＢ（３，４－ジテトラデコキシルベンジル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＧ）、ポリ（エチレングリコール）－２０００－ジメタクリレート（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＡ））、および１，２－ジステアリルオキシプロピル－３－アミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＡ）から選択してもよい。１つの具体的な例において、ステルス脂質は、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧであってよい。

【0205】

ＬＮＰは、製剤中の成分脂質の異なるそれぞれのモル比を含むことができる。ＣＣＤ脂質のモル％は、例えば、約３０モル％～約６０モル％、約３５モル％～約５５モル％、約４０モル％～約５０モル％、約４２モル％～約４７モル％、または約４５％であってよい。ヘルパー脂質のモル％は、例えば、約３０モル％～約６０モル％、約３５モル％～約５５モル％、約４０モル％～約５０モル％、約４１モル％～約４６モル％、または約４４モル％であってよい。中性脂質のモル％は、例えば、約１モル％～約２０モル％、約５モル％～約１５モル％、約７モル％～約１２モル％、または約９モル％であってよい。ステルス脂質のモル％は、例えば、約１モル％～約１０モル％、約１モル％～約５モル％、約１モル％～約３モル％、約２モル％、または約１モル％であってよい。

【0206】

ＬＮＰは、生分解性脂質（Ｎ）の正に帯電したアミン基と、カプセル化される核酸の負に帯電したリン酸基（Ｐ）との間で異なる比を有することができる。これは、方程式Ｎ／Ｐで数学的に表すことができる。例えば、Ｎ／Ｐ比は、約０．５～約１００、約１～約５０、約１～約２５、約１～約１０、約１～約７、約３～約５、約４～約５、約４、約４．５、または約５であってよい。Ｎ／Ｐ比はまた、約４～約７または約４．５～約６であり得る。特定の例では、Ｎ／Ｐ比は４．５または６にすることができる。

【0207】

一部のＬＮＰでは、カーゴはＣａｓ ｍＲＮＡとｇＲＮＡを含むことができる。Ｃａｓ ｍＲＮＡとｇＲＮＡは、異なる比であってよい。例えば、ＬＮＰ製剤は、約２５：１～約１：２５の範囲、約１０：１～約１：１０の範囲、約５：１～約１：５の範囲、または約１：１のＣａｓ ｍＲＮＡとｇＲＮＡの比を含んでもよい。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１～約１：５、または約１０：１のＣａｓ ｍＲＮＡとｇＲＮＡ核酸の比を含んでもよい。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１０、２５：１、１０：１、５：１、３：１、１：１、１：３、１：５、１：１０、または１：２５のＣａｓ ｍＲＮＡとｇＲＮＡ核酸の比を含んでもよい。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１～約１：２の、Ｃａｓ ｍＲＮＡとｇＲＮＡ核酸の比を含んでもよい。具体的な例において、Ｃａｓ ｍＲＮＡとｇＲＮＡとの比は、約１：１または約１：２であってよい。

【0208】

ＬＮＰを使用して脳に送達する特定の例は、Ｎａｂｈａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．６：２００１９に開示され、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0209】

インビボでの投与は、例えば、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、局所、鼻腔内、または筋肉内を含む任意の適切な経路によることができる。全身投与様式には、例えば、経口および非経口経路が含まれる。非経口経路の例には、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、皮内、皮下、鼻腔内、および腹腔内経路が含まれる。具体的な例は静脈内注入である。鼻腔内注入および硝子体内注射は、他の特定の例である。局所投与様式には、例えば、髄腔内、脳室内、実質内（例えば、線条体（例えば、尾状核または被殻へ）、大脳皮質、前中心回旋、海馬（例えば、歯状回またはＣＡ３領域）、側頭皮質、扁桃体、前頭皮質、視床、小脳、髄質、視床、視蓋、被殻、またはニグラ実質への局所的な実質内送達）、眼内、眼窩内、結膜下、硝子体内、網膜下、および強膜を介した経路が含まれる。（全身的アプローチと比較して）有意に少量の成分は、全身的に投与された場合（例えば、静脈内）と比較して、局所的に投与された場合（例えば、実質内または硝子体内）に効果を発揮し得る。局所投与様式はまた、治療有効量の成分が全身投与されるときに起こり得る潜在的に毒性の副作用の発生率を低減または排除し得る。特定の例では、動物への投与は、髄腔内注入または頭蓋内注入（例えば、海馬および他の脳領域への注入のための定位的手術、または脳室内注入）によるものである。

【0210】

投与の頻度と投与回数は、他の要因の中でもとりわけ、薬剤の半減期と投与経路に依存する可能性がある。細胞または非ヒト動物への核酸またはタンパク質の導入は、ある期間にわたって１回または複数回実施することができる。例えば、導入は、ある期間にわたって少なくとも２回、ある期間にわたって少なくとも３回、ある期間にわたって少なくとも４回、ある期間にわたって少なくとも５回、ある期間にわたって少なくとも６回、ある期間にわたって少なくとも７回、ある期間にわたって少なくとも８回、ある期間にわたって少なくとも９回、ある期間にわたって少なくとも１０回、ある期間にわたって少なくとも１１回、ある期間にわたって少なくとも１２回、ある期間にわたって少なくとも１３回、ある期間にわたって少なくとも１４回、ある期間にわたって少なくとも１５回、ある期間にわたって少なくとも１６回、ある期間にわたって少なくとも１７回、ある期間にわたって少なくとも１８回、ある期間にわたって少なくとも１９回、またはある期間にわたって少なくとも２０回、実施することができる。

【0211】

そのような方法は、細胞、組織、または動物をスクリーニングして、１つ以上の薬剤（および任意選択でタウコード配列）の存在を確認することをさらに含むことができる。薬剤（および任意選択でタウコード配列）を含む細胞、組織、または動物のスクリーニングは、任意の既知の手段によって実施することができる。

【0212】

一例として、レポーター遺伝子を使用して、薬剤（または任意選択でタウコード配列）を有する細胞をスクリーニングすることができる。例えば、タウコード配列は、蛍光タンパク質などのレポーター遺伝子に融合したタウタンパク質をコードすることができる。例示的なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、強化黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、強化青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＭｍＧＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－Ｒｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、およびアルカリホスファターゼをコードするものが含まれる。例えば、第１のレポーターおよび第２のレポーターが蛍光タンパク質（例えば、ＣＦＰおよびＹＦＰ）である場合、これらのレポーターを含む細胞は、二重陽性細胞を選択するためにフローサイトメトリーによって選択され得る。次いで、二重陽性細胞を組み合わせて、ポリクローナル統を生成するか、またはモノクローナル株は、単一の二重陽性細胞から生成され得る。

【0213】

別の例として、選択マーカーを使用して、薬剤（または任意選択でタウコード配列）を有する細胞をスクリーニングすることができる。例示的な選択マーカーには、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ^ｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ^ｒ）、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏ^ｒ）、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒ^ｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、または単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｋ）が含まれる。

【0214】

次に、細胞または組織に、任意の適切な手段によってタウ凝集体を播種することができる。これは、例えば、１つ以上の薬剤（および任意選択でタウコード配列）を導入した後、培養で約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約１週間、約２週間、または約３週間後（例えば、培養で約１週間後）に行うことができる。あるいは、細胞または組織は、１つ以上の薬剤（および任意選択でタウコード配列）を導入する前にタウ凝集体を播種することができる。例えば、細胞または組織を組換え線維化タウ（例えば、組換え線維化タウリピートドメイン）で処理して、これらの細胞によって安定して発現されるタウリピートドメインタンパク質の凝集を播種することができる。タウの細胞間増殖はまた、凝集体含有細胞によって分泌されるタウ凝集活性からも生じ得る。例えば、細胞または組織は、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する培養タウ凝集陽性細胞から採取された馴化培地を使用して培養することができる。馴化培地とは、培養された細胞から採取された使用済み培地を指す。それは、培養された細胞から培地に分泌される代謝物、成長因子、および細胞外マトリックスタンパク質が含まれる。一例として、馴化培地は、コンフルエントなタウ凝集陽性Ａｇｇ［＋］細胞上にある培地を収集することにより生成され得る。培地は、約１２時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、または約１０日間、コンフルエントなＡｇｇ［＋］細胞上にあり得る。例えば、培地は、約１～約７、約２～約６、約３～約５、または約４日間、コンフルエントなＡｇｇ［＋］細胞上にあり得る。次に、馴化培地を新鮮な培地と組み合わせて細胞または組織に適用することができる。馴化培地と新鮮な培地との比は、例えば、約１０：１、約９：１、約８：１、約７：１、約６：１、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、または約１：１０であり得る。例えば、馴化培地と新鮮な培地との比率は、約５：１～約１：１、約４：１～約２：１、または約３：１であり得る。例えば、それは、約９０％の馴化培地および約１０％の新鮮な培地、約８５％の馴化培地および約１５％の新鮮な培地、約８０％の馴化培地および約２０％の新鮮な培地、約７５％の馴化培地および約２５％の新鮮な培地、約７０％の馴化培地および約３０％の新鮮な培地、約６５％の馴化培地および約３５％の新鮮な培地、約６０％の馴化培地および約４０％の新鮮な培地、約５５％の馴化培地および約４５％の新鮮な培地、約５０％の馴化培地および約５０％の新鮮な培地、約４５％の馴化培地および約５５％の新鮮な培地、約４０％の馴化培地および約６０％の新鮮な培地、約３５％の馴化培地および約６５％の新鮮な培地、約３０％の馴化培地および約７０％の新鮮な培地、約２５％の馴化培地および約７５％の新鮮な培地、約２０％の馴化培地および約８０％の新鮮な培地、約１５％の馴化培地および約８５％の新鮮な培地、または約１０％の馴化培地および約９０％の新鮮な培地で、遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含み得る。一例では、それは、少なくとも約５０％の馴化培地および約５０％以下の新鮮な培地を含む培地で、遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含み得る。特定の例では、それは、約７５％の馴化培地および約２５％の新鮮な培地で、遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含み得る。

【0215】

馴化培地は共培養せずに使用できる。共培養のない馴化培地は、これまで播種剤としてこの状況で使用されたことがない。しかしながら、インビトロで生成されたタウ線維は限られた供給源であるため、馴化培地は大規模なゲノムワイドスクリーニングに特に有用である。さらに、馴化培地は、インビトロではなく細胞によって産生されるため、より生理学的に適切である。本明細書に記載されるような馴化培地の使用は、細胞をタウ凝集に感作するためのタウ播種活性のブースト（例えば、本明細書の他の場所に開示されるようにＦＲＥＴ誘導によって測定される場合、約０．１％）を提供する。

【0216】

次に、タウオパチーの１つ以上の兆候または症状を、任意の適切な手段で評価することができる。そのような徴候および症状の例は、本明細書の他の場所でより詳細に論じられており、例えば、タウの過剰リン酸化またはタウの凝集が含まれる。他の徴候および症状には、例えば、細胞分画後の不溶性画分におけるタウおよび／またはホスホタウの増加、ニューロンの細胞体樹状突起コンパートメントにおけるホスホタウの増加、ニューロンの核周囲領域におけるホスホタウの増加、ニューロンにおける核膜孔複合体タンパク質Ｎｕｐ９８－Ｎｕｐ９６（Ｎｕｐ９８）の核対細胞質比の減少、ニューロンにおけるＧＴＰ結合核タンパク質Ｒａｎ（Ｒａｎ）の核対細胞質比の減少、またはニューロンにおけるＲａｎ ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質１（ＲａｎＧＡＰ１）の核対細胞質比の減少を含めることができる。ホスホタウは、例えば、ホスホタウ（Ｓ３５６）またはホスホタウＡＴ８（Ｓ２０２、Ｔ２０５）であり得る。これは、例えば、タウ播種後または１つ以上の薬剤（および任意選択でタウコード配列）を導入した後、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、またはそれ以上行うことができる。例えば、評価は、タウ播種後、または１つ以上の薬剤（および任意選択でタウコード配列）を導入した後、約２週間～約６週間または約３週間～約５週間で行うことができる。

【0217】

ＩＶ．候補タウオパチー治療薬を試験する方法
本明細書の他の場所で詳細に開示されている改善されたタウオパチーモデルを使用して、タウオパチーの治療のための治療薬候補を特定または評価するための様々な方法が提供される。そのような方法は、例えば、本明細書の他の場所に開示されるような改善されたタウオパチーモデル（例えば、本明細書の他の場所に開示される動物、組織、または細胞）に候補薬剤を投与することと、候補薬剤がタウオパチーに関連する１つ以上の徴候または症状に対して効果を有するかどうかを決定するために１つ以上のアッセイを実行することと、タウオパチーに関連する１つ以上の徴候または症状に対して効果を有する場合は候補薬剤を治療薬候補として特定することと、を含むことができる。

【0218】

任意の候補薬剤を試験できる。そのような候補は、例えば、ｓｉＲＮＡ、抗体、もしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｇＲＮＡなどの大きな分子または小分子を含み得る。候補薬剤は、任意の適切な経路による任意の手段によって、非ヒト動物または非ヒト動物細胞に投与することができる。

【0219】

タウオパチーに関連する徴候または症状を測定する任意のアッセイを使用することができる。そのような徴候および症状の例は、本明細書の他の場所に開示されている。第１の例として、徴候または症状は、タウの過剰リン酸化である可能性がある（例えば、実施例に記載されているＡＴ８染色）。第２の例として、徴候または症状は、タウ凝集（例えば、実施例に記載されているチオフラビンＳ染色）であり得る。他の徴候および症状には、例えば、細胞分画後の不溶性画分におけるタウおよび／またはホスホタウの増加、ニューロンの細胞体樹状突起コンパートメントにおけるホスホタウの増加、ニューロンの核周囲領域におけるホスホタウの増加、ニューロンにおける核膜孔複合体タンパク質Ｎｕｐ９８－Ｎｕｐ９６（Ｎｕｐ９８）の核対細胞質比の減少、ニューロンにおけるＧＴＰ結合核タンパク質Ｒａｎ（Ｒａｎ）の核対細胞質比の減少、またはニューロンにおけるＲａｎ ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質１（ＲａｎＧＡＰ１）の核対細胞質比の減少を含めることができる。ホスホタウは、例えば、ホスホタウ（Ｓ３５６）またはホスホタウＡＴ８（Ｓ２０２、Ｔ２０５）であり得る。

【0220】

候補薬剤は、インビボで動物に投与することができ、１つ以上のアッセイを動物で実行することができる。あるいは、候補薬剤を動物にインビボで投与することができ、候補薬剤の投与後に動物から単離された細胞において１つ以上のアッセイをインビトロで実行することができる。あるいは、候補薬剤は、インビトロで細胞（例えば、ニューロン）に、またはエクスビボで組織（例えば、器官型脳切片培養物などの脳切片）に投与することができ、アッセイは、細胞でインビトロでまたは組織でエクスビボで実行することができる。

【0221】

任意選択で、細胞または組織は、候補薬剤を投与する前または後に、任意の適切な手段によってタウ凝集体を播種することができる。例えば、細胞または組織を組換え線維化タウ（例えば、組換え線維化タウリピートドメイン）で処理して、これらの細胞によって安定して発現されるタウリピートドメインタンパク質の凝集を播種することができる。タウの細胞間増殖はまた、凝集体含有細胞によって分泌されるタウ凝集活性からも生じ得る。例えば、細胞または組織は、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する培養タウ凝集陽性細胞から採取された馴化培地を使用して培養することができる。馴化培地とは、培養された細胞から採取された使用済み培地を指す。それは、培養された細胞から培地に分泌される代謝物、成長因子、および細胞外マトリックスタンパク質が含まれる。一例として、馴化培地は、コンフルエントなタウ凝集陽性Ａｇｇ［＋］細胞上にある培地を収集することにより生成され得る。培地は、約１２時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、または約１０日間、コンフルエントなＡｇｇ［＋］細胞上にあり得る。例えば、培地は、約１～約７、約２～約６、約３～約５、または約４日間、コンフルエントなＡｇｇ［＋］細胞上にあり得る。次に、馴化培地を新鮮な培地と組み合わせて細胞または組織に適用することができる。馴化培地と新鮮な培地との比は、例えば、約１０：１、約９：１、約８：１、約７：１、約６：１、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、または約１：１０であり得る。例えば、馴化培地と新鮮な培地との比率は、約５：１～約１：１、約４：１～約２：１、または約３：１であり得る。例えば、それは、約９０％の馴化培地および約１０％の新鮮な培地、約８５％の馴化培地および約１５％の新鮮な培地、約８０％の馴化培地および約２０％の新鮮な培地、約７５％の馴化培地および約２５％の新鮮な培地、約７０％の馴化培地および約３０％の新鮮な培地、約６５％の馴化培地および約３５％の新鮮な培地、約６０％の馴化培地および約４０％の新鮮な培地、約５５％の馴化培地および約４５％の新鮮な培地、約５０％の馴化培地および約５０％の新鮮な培地、約４５％の馴化培地および約５５％の新鮮な培地、約４０％の馴化培地および約６０％の新鮮な培地、約３５％の馴化培地および約６５％の新鮮な培地、約３０％の馴化培地および約７０％の新鮮な培地、約２５％の馴化培地および約７５％の新鮮な培地、約２０％の馴化培地および約８０％の新鮮な培地、約１５％の馴化培地および約８５％の新鮮な培地、または約１０％の馴化培地および約９０％の新鮮な培地で、遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含み得る。一例では、それは、少なくとも約５０％の馴化培地および約５０％以下の新鮮な培地を含む培地で、遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含み得る。特定の例では、それは、約７５％の馴化培地および約２５％の新鮮な培地で、遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含み得る。

【0222】

次に、タウオパチーの１つ以上の徴候または症状を、播種後または候補薬剤の投与後の任意の適切な時期に、任意の適切な手段によって評価することができる。これは、例えば、タウ播種後または候補薬剤の投与後、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、またはそれ以上で行うことができる。例えば、評価は、タウ播種後または候補薬剤の投与後、約２週間から約６週間、または約３週間から約５週間で行うことができる。

【0223】

上記または下記で引用されているすべての特許出願、ウェブサイト、他の刊行物、アクセッション番号などは、各項目が、参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されたのと同じ程度に、すべての目的に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。配列の異なるバージョンが違う時間にアクセッション番号に関連付けられている場合、本出願の有効な出願日においてアクセッション番号に関連付けられるバージョンを意味する。有効な出願日とは、該当する場合、アクセッション番号に関する実際の出願日以前または優先出願の出願日を意味する。同様に、刊行物、ウェブサイトなどの異なるバージョンが違う時間に公開されている場合、別段の指定のない限り、本出願の有効な出願日の直近に公開されたバージョンを意味する。別段に他の指示がない限り、本発明の任意の特徴、ステップ、要素、実施形態、または態様を、任意の他のものと組み合わせて使用することができる。本発明は、明瞭さおよび理解の目的に対し図表および例を介していくつかの詳細が記載されているが、添付の特許請求の範囲内で、ある特定の変化および改変を実施することができることが明らかになろう。

【0224】

配列の簡単な説明
添付の配列表に列記されているヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基のための標準的な文字略語、およびアミノ酸のための三文字表記を使用して示されている。ヌクレオチド配列は、配列の５’末端から始まって先へ（すなわち、各行で左から右へ）進み３’末端に至る標準規則に従っている。各ヌクレオチド配列の１本の鎖のみが示されているが、相補鎖は、示されている鎖を任意に参照することによって含まれると理解される。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が提供される場合、同じアミノ酸配列をコードするそのコドン縮重バリアントもまた提供されることが理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端から始まって先へ（すなわち、各行で左から右へ）進みカルボキシ末端に至る標準規則に従っている。

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【実施例】

【0225】

実施例１．タウ凝集の遺伝的修飾因子を同定するためのゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９スクリーニングプラットフォームの開発
タンパク質の異常な凝集または線維化は、特にアルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）などのいくつかの神経変性疾患を含む、多くの疾患の決定的な特徴である。これらの疾患の多くでは、ある特定のタンパク質の不溶性凝集体への線維化は、疾患の特徴であるだけでなく、神経毒性の原因因子としても関係している。さらに、これらの疾患は、ステレオタイプのパターンに従って中枢神経系を介する凝集の病状の伝播によって特徴付けられ、このプロセスは疾患の進行と相関している。したがって、異常なタンパク質凝集のプロセス、または凝集体の細胞間増殖を変更する遺伝子および遺伝子経路の同定は、神経変性疾患の病因をよりよく理解する上で、ならびに治療的介入のための戦略を考案する上で大いに価値がある。

【0226】

異常なタウタンパク質凝集のプロセスを変更する遺伝子および経路を同定するために、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲｎ）ｓｇＲＮＡライブラリを使用してゲノムワイドスクリーニングを行い、タウ疾患関連タンパク質凝集体によって「播種される」細胞の可能性を調節する遺伝子（すなわち、破壊された場合に、タウ線維化タンパク質の供給源に曝露されたときに細胞をタウ凝集体形成により感受性にさせる遺伝子）を同定するためのプラットフォームが開発された。そのような遺伝子の同定は、神経変性疾患の状況においてタウ凝集体を形成するニューロンの感受性を支配するタウ細胞間凝集体増殖のメカニズムおよび遺伝的経路を解明し得る。

【0227】

スクリーニングは、ＣＦＰまたはＹＦＰのいずれかに融合したＰ３０１Ｓ病原性変異を有するタウ微小管結合ドメイン（ＭＢＤ）を含む、タウ４リピートドメインであるタウ＿４ＲＤを安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞からなるタウバイオセンサーヒト細胞株を用いた。つまり、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株は、蛍光タンパク質ＣＦＰまたは蛍光タンパク質ＹＦＰに融合した疾患関連タンパク質バリアントを安定して発現する２つの導入遺伝子：タウ^４ＲＤ－ＣＦＰ／タウ^４ＲＤ－ＹＦＰ（ＴＣＹ）を含み、タウリピートドメイン（４ＲＤ）は、Ｐ３０１Ｓ病原性変異を含む。図１を参照されたい。これらのバイオセンサー株では、タウ－ＣＦＰ／タウ－ＹＦＰタンパク質の凝集により、ドナーＣＦＰからアクセプターＹＦＰへの蛍光エネルギーの移動の結果であるＦＲＥＴシグナルが生成される。図２を参照されたい。タウ凝集体を含むＦＲＥＴ陽性細胞は、フローサイトメトリーによって選別および単離され得る。ベースラインでは、刺激されていない細胞は、最小限のＦＲＥＴシグナルで安定した可溶性状態でレポーターを発現する。刺激（例えば、種粒子のリポソームトランスフェクション）により、レポータータンパク質は凝集体を形成し、ＦＲＥＴシグナルを生成する。凝集体含有細胞はＦＡＣＳによって単離され得る。安定して増殖する凝集体含有細胞株Ａｇｇ［＋］は、Ａｇｇ［－］細胞株のクローン連続希釈によって単離され得る。

【0228】

このタウバイオセンサー細胞株には、遺伝子スクリーニングに役立つようにいくつかの修飾がなされた。まず、これらのタウバイオセンサー細胞を、レンチウイルスベクターを介してＣａｓ９発現導入遺伝子（ＳｐＣａｓ９）を導入することによって修飾した。Ｃａｓ９を発現するクローントランスジェニック細胞株をブラストサイジンで選択し、クローン連続希釈によって単離して、単一細胞由来のクローンを得た。クローンを、ｑＲＴ－ＰＣＲによるＣａｓ９発現のレベル（図３Ａ）およびデジタルＰＣＲによるＤＮＡ切断活性（図３Ｂ）について評価した。相対Ｃａｓ９発現レベルも表３に示される。

【表3】

【0229】

具体的には、Ｃａｓ９変異効率を、２つの選択された標的遺伝子に対するｇＲＮＡをコードするレンチウイルスの形質導入の３日後および７日後にデジタルＰＣＲによって評価した。切断効率は、低発現クローンのＣａｓ９レベルによって制限された。最大活性を達成するには、適切なレベルのＣａｓ９発現を伴うクローンが必要であった。Ｃａｓ９発現がより低いいくつかの派生クローンは、標的配列を効率的に切断することはできなかったが、発現がより高いクローン（スクリーニングに使用されたものを含む）は、培養物において３日後に約８０％の効率で、ＰＥＲＫおよびＳＮＣＡ遺伝子における標的配列に変異を生成することができた。効率的な切断は、ｇＲＮＡ形質導入の３日後にすでに観察され、７日後にはわずかな改善しかなかった。クローン７Ｂ１０－Ｃ３を、後続のライブラリスクリーニングで使用する高性能クローンとして選択した。

【0230】

次に、細胞をタウ播種活性に感作するための試薬および方法が開発された。タウの細胞間増殖は、凝集体含有細胞によって分泌されるタウ凝集活性からも生じ得る。タウ凝集の細胞増殖を研究するために、ＹＦＰに融合したＰ３０１Ｓ病原性変異を有するタウ微小管結合ドメイン（ＭＢＤ）を含む、タウリピートドメインであるタウ＿４ＲＤを安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞からなるタウ－ＹＦＰ細胞株のサブクローンを得た。図５を参照されたい。タウ－ＹＦＰタンパク質が凝集状態で安定して存在する細胞（Ａｇｇ［＋］）は、これらの細胞によって安定して発現されるタウ－ＹＦＰタンパク質の凝集を播種するために、リポフェクタミン試薬と混合した組換え線維化タウでこれらのタウ－ＹＦＰ細胞を処理することによって得た。次いで、「播種された」細胞を連続希釈して、単一細胞由来のクローンを得た。次いで、これらのクローンを拡大させて、タウ－ＹＦＰ凝集体がすべての細胞において安定して持続し、経時的に増殖および複数回継代するクローン細胞株を同定した。これらのタウ－ＹＦＰ＿Ａｇｇ［＋］クローンの１つであるＣｌｏｎｅ＿１８を使用して、コンフルエントなタウ－ＹＦＰ＿Ａｇｇ［＋］細胞上に４日間存在している培地を収集することにより、馴化培地を生成した。次いで、馴化培地（ＣＭ）をナイーブバイオセンサータウ－ＣＦＰ／タウ－ＹＦＰ細胞に３：１のＣＭ：新鮮な培地の比率で適用し、これらのレシピエント細胞のごく一部の割合でタウ凝集が誘導され得るようにした。リポフェクタミンは使用されなかった。リポフェクタミンは、レシピエント細胞をだましてリポフェクタミンを使用してタウ凝集を強制／増加させることなく、可能な限り生理学的であるアッセイを行うために使用されなかった。フローサイトメトリーを使用して凝集の尺度としてＦＲＥＴシグナルを生成する細胞の割合を評価することによって測定されるように、馴化培地は一貫して約０．１％の細胞においてＦＲＥＴを誘導した。図６を参照されたい。結論として、タウ－ＹＦＰ＿Ａｇｇ［＋］細胞は、ＦＲＥＴシグナルを生成することができないが、それらはタウの播種の供給源を提供することができる。

【0231】

実施例２．タウ凝集の遺伝的修飾因子を同定するためのゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９スクリーニング
ＦＲＥＴ［＋］細胞における濃縮ｓｇＲＮＡとしてのタウ凝集の修飾因子遺伝子を明らかにするために、凝集物のないＣａｓ９発現タウ－ＣＦＰ／タウ－ＹＦＰバイオセンサー細胞（Ａｇｇ［－］）に、各標的遺伝子にノックアウト変異を導入するためのレンチウイルス送達アプローチを使用して、２つのヒトゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡライブラリを用いて形質導入した。図４を参照されたい。各ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡライブラリは、機能的ノックアウトのために５’構成的エキソンを標的とし、遺伝子当たり平均約３のｓｇＲＮＡをカバーする（組み合わせた２つのライブラリにおいて遺伝子当たり合計６のｇＲＮＡ）。読み取りカウントの分布（つまり、ライブラリ内の各ｇＲＮＡの表現）は正常であり、各ライブラリで同様であった。ｓｇＲＮＡは、オフターゲットゲノム配列とのミスマッチが２つ以下のｓｇＲＮＡを回避することにより、オフターゲット効果を回避するように設計された。ライブラリは、１０００の非標的化対照ｓｇＲＮＡを含む１９，０５０のヒト遺伝子および１８６４のｍｉＲＮＡをカバーする。ライブラリを、感染多重度（ＭＯＩ）＜０．３で、ｓｇＲＮＡ当たり＞３００細胞のカバレッジで形質導入した。タウバイオセンサー細胞は、ピューロマイシンの選択の下で増殖し、細胞ごとに固有のｓｇＲＮＡの組み込みおよび発現を含む細胞を選択した。ピューロマイシンの選択は、１μｇ／ｍＬでの形質導入の２４時間後に開始した。５つの独立したスクリーニング複製を一次スクリーニングで使用した。

【0232】

完全な形質導入細胞集団の試料を、形質導入後３日目および６日目の細胞継代時に収集した。６日目の継代後、細胞を馴化培地で増殖させて、播種活性に感作させた。１０日目に、蛍光アシスト細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、ＦＲＥＴ［＋］細胞の亜集団を特異的に単離した。図７を参照されたい。スクリーニングは、５回の反復実験で構成された。組み込まれたｓｇＲＮＡ構築物のＤＮＡ単離およびＰＣＲ増幅により、各時点でのｓｇＲＮＡレパートリーの次世代シーケンシング（ＮＧＳ）による特徴付けが可能になった。

【0233】

ＮＧＳデータの統計分析により、３日目および６日目の初期の時点でのｓｇＲＮＡレパートリーと比較して、５回の実験の１０日目のＦＲＥＴ［＋］亜集団で濃縮されたｓｇＲＮＡの同定が可能になった。ＮＧＳ分析のための相対存在量および濃縮の概念は図８に例示される。潜在的なタウ修飾因子を同定する第１の戦略は、ＤＮＡシーケンシングを使用して、ＤＥＳｅｑアルゴリズムを使用して各試料のｓｇＲＮＡ読み取りカウントを生成し、１０日目対３日目または１０日目対６日目で（しかし、６日目対３日目ではない）より豊富なｓｇＲＮＡを見つけることであった（倍率変化（ｆｃ）≧１．５および負の二項検定ｐ＜０．０１）。Ｆｃ≧１．５は、（１０日目のカウントの平均）／（３日目または６日目のカウントの平均）≧１．５の比率を意味する。Ｐ＜０．０１は、１０日目および３日目または６日目のカウント＜０．０１の間に統計的差異がない可能性を意味する。ＤＥＳｅｑアルゴリズムは、「配列カウントデータの差次的発現解析」に広く使用されているアルゴリズムである。例えば、Ａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ １１：Ｒ１０６を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0234】

具体的には、各ライブラリで２つの比較１０日目対３日目、および１０日目対６日目を使用して、有意なｓｇＲＮＡを同定した。これら４つの比較の各々について、ＤＥＳｅｑアルゴリズムを使用し、有意であるとみなされるカットオフ閾値は、倍率変化≧１．５ならびに負の二項検定ｐ＜０．０１であった。各ライブラリのこれらの比較の各々で有意なガイドが同定されると、次の２つの基準のいずれかを満たす場合、遺伝子は重要であるとみなされた：（１）１つの比較（１０日目対３日目または１０日目対６日目のいずれか）でその遺伝子に対応する少なくとも２つのｓｇＲＮＡが有意であるとみなされた；および（２）両方の比較（１０日目対３日目および１０日目対６日目）で少なくとも１つのｓｇＲＮＡが有意であった。このアルゴリズムを使用して、第１のライブラリから５つの遺伝子が重要であり、第２のライブラリから４つの遺伝子が有意であると同定した。表４を参照されたい。

【表4】

【0235】

しかしながら、第１の戦略では、あるレベルの読み取りカウントを必要とし、各実験グループ内の均一性はストリンジェントでありすぎる場合がある。同じｓｇＲＮＡの場合、スクリーニングライブラリの初期ウイルスカウント、感染または遺伝子編集効率、および遺伝子編集後の相対増殖率など、多くの要因により、各実験グループ内の試料（３日目、６日目、または１０日目の試料）間で読み取りカウントのばらつきが生成され得た。したがって、正確な読み取りカウントではなく、１０日目（選択後）の各試料における遺伝子当たりのガイドの陽性発生（読み取りカウント＞３０）に基づいて、第２の戦略も使用した。ライブラリサイズ（ｘ）、遺伝子当たりのガイド数（ｎ）、および選択後の試料における陽性ガイドの総数（ｍ）を考慮して、選択後の試料におけるガイドの数（ｎ’）を積極的に観察するための正式な統計的ｐ値を計算した（「数」はｓｇＲＮＡタイプ（すなわち、固有のガイドＲＮＡ配列）を指し、読み取りカウントではない）（ｐ_ｎ’＝ｎＣｎ’＊（ｘ－ｎ’）Ｃ（ｍ－ｎ）／ｘＣｍ）。遺伝子ｇが変化によって存在するｎ’ガイド以上の確率は次のように計算された。

【数1】

選択前と比較した選択後の遺伝子の読み取りカウントの全体的な濃縮を、陽性遺伝子を同定するための追加のパラメータとして使用した：（相対存在量＝［遺伝子の読み取りカウント］／［すべての遺伝子の読み取りカウント］および選択後の濃縮＝［選択後の相対存在量］／［選択前の相対存在量］）。

【0236】

より具体的には、第２の戦略は、ＣＲＩＳＰＲ陽性選択のための新しくより感度の高い分析方法である。ＣＲＩＳＰＲ陽性選択の目標は、ＤＮＡシーケンシングを使用して、ｓｇＲＮＡによる摂動が表現型と相関している遺伝子を同定することである。ノイズバックグラウンドを低減するために、これらの実験では通常、同じ遺伝子の複数のｓｇＲＮＡと実験の複製が一緒に使用される。しかしながら、現在一般的に使用されている統計分析方法は、同じ遺伝子のｓｇＲＮＡ間ならびに技術的な繰り返し間である程度の均一性／一致を必要とし、良好に機能しない。これは、多くの考えられる理由（例えば、異なる感染または遺伝子編集効率、スクリーニングライブラリにおける初期ウイルスカウント、および同じ表現型を有する他のｓｇＲＮＡの存在）により、これらの方法では同じ遺伝子のｓｇＲＮＡおよび繰り返し間の大きな変動を処理できないためである。対照的に、大きな変動に対してロバストな方法を開発した。これは、各ｓｇＲＮＡの正確な読み取りカウントではなく、個々の実験における遺伝子当たりのガイドの陽性発生に基づいている。各実験におけるライブラリのサイズ、遺伝子当たりのｓｇＲＮＡの数、および陽性ｓｇＲＮＡの総数を考慮して、実験の繰り返しにわたってｓｇＲＮＡの数を積極的に観察するための正式な統計的ｐ値を計算する。表現型の選択前後の相対ｓｇＲＮＡ配列読み取り濃縮もパラメータとして使用される。本方法は、ＤＥＳｅｑ、ＭＡＧＥＣＫなどの最新の広く使用されている方法よりも良好に成し遂げられる。具体的には、この方法には以下の手順が含まれる。

【0237】

（１）各実験について、表現型が陽性の細胞に存在するあらゆるガイドを同定する。

【0238】

（２）遺伝子レベルで、各実験にガイドが存在するランダム確率を計算する：ｎＣｎ’＊（ｘ－ｎ’）Ｃ（ｍ－ｎ）／ｘＣｍ（ｘは、表現型選択前の様々なガイドであり、ｍは、表現型選択後の様々なガイドであり、ｎは、表現型選択前の遺伝子の様々なガイドであり、ｎ’は、表現型選択後の遺伝子の様々なガイドである）。複数の実験にわたって存在する全体的な可能性は、各実験から得られた上記の計算された可能性を乗算することによって計算される。

【0239】

（３）遺伝子レベルでのガイドの平均濃縮の計算：濃縮スコア＝選択後の相対存在量／選択前の相対存在量。相対存在量＝遺伝子のガイドの読み取りカウント／すべてのガイドの読み取りカウント。

【0240】

（４）存在するランダム確率よりも大幅に下回り、かつある特定の濃縮スコアを上回っている遺伝子を選択する。

【0241】

２つの異なるアプローチ（いずれかまたは両方）によってＦＲＥＴ［＋］細胞が濃縮されていると同定された標的遺伝子のうちの１４個を、読み取りカウントデータに基づく目視検査後のさらなる検証のための上位の候補として選択した。表５を参照されたい。３０の個々のｓｇＲＮＡを、検証のために二次スクリーニングで試験した。二次スクリーニングの概略図を図９に示し、結果を図１０に示す。複数の試験されたｓｇＲＮＡによるＢＡＮＦ１またはＰＰＰ２ＣＡのいずれかの破壊は、タウ播種活性の供給源（馴化培地）に応答してタウ凝集体を形成する細胞の感受性を増加させた。ＦＲＥＴシグナルの誘導は、これら２つの標的のいずれかの破壊とともに、細胞内で１５～２０倍増加した。これらの２つの標的遺伝子の破壊は、馴化培地に応答してタウ凝集体の形成を増加させたが、新鮮な培地には応答しなかった。図１１を参照されたい。

【表5】

【0242】

次いで、ＢＡＮＦ１およびＰＰＰ２ＣＡを用いたさらなる実験を実施し、各遺伝子の標的化がタウ凝集を促進することをさらに検証した。図１２を参照されたい。ＢＡＮＦ１に対する２つの異なるｓｇＲＮＡが試験され、ＰＰＰ２ＣＡに対する１つのｓｇＲＮＡが使用された。非標的化ｓｇＲＮＡを陰性対照として使用した。０日目に各ガイドＲＮＡに対して４つの独立したレンチウイルス形質導入を行った。６日目に、馴化培地を用いたタウ播種を、リポフェクタミンありまたはなしで行い、ｑＲＴ－ＰＣＲのために試料を収集した。ｑＲＴ－ＰＣＲのデータを図１３に示す。ＢＡＮＦ１を標的とする２つのｓｇＲＮＡはそれぞれＢＡＮＦ１ ｍＲＮＡの発現を低減させ、ＰＰＰ２ＣＡを標的とするｇＲＮＡはＰＰＰ２ＣＡの発現を低減させた。１０日目に、ＦＲＥＴシグナルの誘導を評価するためにＦＡＣＳ分析を行った。タウ凝集は、標的ＢＡＮＦ１を標的とする２つのｓｇＲＮＡおよび標的ＰＰＰ２ＣＡを標的とするｇＲＮＡの各々によって増加された。図１５を参照されたい。１３日目に、ウエスタンブロット分析のために試料を収集した。ウエスタンブロットの結果を図１４に示す。使用した抗体を表６に示す。ｍＲＮＡ発現を評価するｑＲＴ－ＰＣＲ実験と同様に、自己統合障壁因子（ｂａｒｒｉｅｒ－ｔｏ－ａｕｔｏｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）（ＢＡＮＦ１）タンパク質の発現はＢＡＮＦ１を標的とする２つのｓｇＲＮＡによって低減し、セリン／スレオニンプロテインホスファターゼ２Ａ触媒サブユニットアルファ（ＰＰＰ２ＣＡ）タンパク質の発現はＰＰＰ２ＣＡを標的とするｓｇＲＮＡによって低減する。

【表6】

【0243】

タウ凝集の修飾因子としてのＢＡＮＦ１およびＰＰＰ２ＣＡのさらなる検証は、検証のために個々のＢＡＮＦ１ノックダウンクローンおよび個々のＰＰＰ２ＣＡノックダウンクローンを単離することによって行われた。凝集体を含まないＣａｓ９発現タウ－ＣＦＰ／タウ－ＹＦＰバイオセンサー細胞（Ａｇｇ［－］）に、ＢＡＮＦ１のｓｇＲＮＡ １、ＰＰＰ２ＣＡのｓｇＲＮＡ ５、または非標的化ｓｇＲＮＡを発現するレンチウイルスを形質導入した。次いで、連続的なクローン希釈を行い、個々のクローンを選択した。ＢＡＮＦ１ ｍＲＮＡおよびＰＰＰ２ＣＡ ｍＲＮＡのレベルは、ｑＲＴ－ＰＣＲ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから取得したＴａｑＭａｎ ｑＲＴ－ＰＣＲアッセイ、アッセイＩＤ Ｈｓ００４２７８０５＿ｇ１およびＨｓ００４２７２６０＿ｍ１）によって評価され、自動統合障壁因子（ＢＡＮＦ１）タンパク質およびセリン／スレオニンプロテインホスファターゼ２Ａ触媒サブユニットアルファ（ＰＰＰ２ＣＡ）タンパク質のレベルは、ウエスタンブロットによって評価された。各ＢＡＮＦ１ ｓｇＲＮＡクローンはＢＡＮＦ１ ｍＲＮＡ発現（データは示さず）および自己統合障壁因子（ＢＡＮＦ１）タンパク質発現を低減させ（図１６）、各ＰＰＰ２ＣＡ ｓｇＲＮＡクローンはＰＰＰ２ＣＡ ｍＲＮＡ発現（データは示さず）およびセリン／スレオニンプロテインホスファターゼ２Ａ触媒サブユニットアルファ（ＰＰＰ２ＣＡ）タンパク質の発現を低減させた（図１６）。

【0244】

タウ発現およびタウのリン酸化もまた、ウエスタンブロットによって各クローンにおいて評価した。ＰＰＰ２ＣＡノックダウンにより、ホスホタウおよびタウレベルが増加した。図１７を参照されたい。

【0245】

次に、各クローンを馴化培地で３日間播種し、ＦＲＥＴ分析を行い、タウ凝集を評価した。ノックダウンクローンは、ＢＡＮＦ１とＰＰＰ２ＣＡをタウ凝集の修飾因子として検証する。図１８を参照されたい。ＦＲＥＴの強化は、ＢＡＮＦ１およびＰＰＰ２ＣＡ変異クローンにおける遺伝子編集の程度と直接相関していた。

【0246】

次いで、個々のクローンを次世代シーケンシングによってさらに特徴付けし、ＢＡＮＦ１およびＰＰＰ２ＣＡの遺伝子座にどのような修飾がなされたかを判定した。修飾を、以下の表７に要約する。ほとんどすべての変異クローンには、いくらかの割合の野生型対立遺伝子が含まれる。ＦＲＥＴ（＋）細胞（タウ凝集活性）の割合は、切断部位での非相同末端結合によって引き起こされる挿入／欠失の割合と相関していた（すなわち、タウ凝集は、野生型対立遺伝子の割合と逆相関し、野生型対立遺伝子の割合が低いほど、Ｆｒｅｔ（＋）細胞の割合が高くなる）。図１６および表７を参照されたい。

【表7】

【0247】

ＢＡＮＦ１とＰＰＰ２ＣＡが、タンパク質間相互作用ネットワークに基づくソフトウェアプログラムであるＳｔｒｉｎｇを使用して、同じ生物学的経路または機能に関与しているかどうかを調べた。すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＳｚｋｌａｒｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４３（ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ４４７－Ｄ４５２を参照されたい。入力としてＢＡＮＦ１とＰＰＰ２ＣＡを使用して、Ｒｅａｃｔｏｍｅ Ｐａｔｈｗａｙｓに基づいてＢＡＮＦ１とＰＰＰ２ＣＡの間に「触媒作用」の関係があることを発見した。図２３を参照されたい。ＢＡＮＦ１は、核膜の生物学において重要な役割を果たすいくつかのタンパク質とも相互作用する。これらの標的は、タウ凝集の潜在的な修飾因子として試験された。

【0248】

Ｃａｓ９を発現するタウバイオセンサー細胞に、これらの目的の遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡを含むレンチウイルスベクターを形質導入した。これらのｓｇＲＮＡの標的配列を表８に示す。抗生物質の選択を２４時間後に開始した。培養１週間後、コンフルエントなタウ－ＹＦＰ（Ａｇｇ［＋］）において３日後に収集した馴化培地（ＣＭ）を、７５％ＣＭ／２５％新鮮培地として形質導入細胞に適用し、播種活性をＦＲＥＴ［＋］セルのパーセントで評価した。特定の標的のノックダウンは、ｑＲＴ－ＰＣＲによって評価された。予想通り、ＢＡＮＦ１またはＰＰＰ２ＣＡの破壊はタウ凝集を強化した。ＡＮＫＬＥ２の破壊もまた、タウ凝集を促進した。図１９を参照されたい。ＡＮＫＬＥ２は、小胞体と核内膜の両方に局在する唯一のＬＥＭドメインタンパク質である。

【表8】

【0249】

次に、ＢＡＮＦ１／ＰＰＰ２ＣＡ相互作用ネットワークの遺伝子をさらに評価した。特に、ＡＮＫＬＥ２、ＥＭＤ、およびＶＲＫ１を評価した。ＢＡＮＦ１／ＰＰＰ２ＣＡ相互作用ネットワークの遺伝子を評価するために、ＡＮＫＬＥ２、ＥＭＤ、またはＶＲＫ１を標的とするｓｇＲＮＡを、非標的クローン４－１および４－１９で試験した。ＦＲＥＴ［＋］細胞の割合は、馴化培地の３日後に評価された。ＢＡＮＦ１／ＰＰＰ２ＣＡ相互作用ネットワークにおける遺伝子の破壊は、タウ凝集の修飾因子としてのＡＮＫＬＥ２（図２０を参照）およびＢＡＮＦ１誘導性凝集の増強剤としてのＶＲＫ１（データは示されていない）を明らかにした。

【0250】

これにより、タウ凝集と、核膜の完全性を調節するＢＡＮＦ１／ＰＰＰ２ＣＡ経路との間の関連がさらに支持された。これと一致して、ラミン染色は、非標的クローンと比較して、ＢＡＮＦ１およびＡＮＫＬＥ２ノックダウンｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ発現タウバイオセンサー細胞クローンにおける異常な核膜を明らかにし、同様の結果が、非標的クローンと比較して、ＢＡＮＦ１およびＡＮＫＬＥ２変異体Ｃａｓ９発現タウバイオセンサー細胞クローンにおいて観察された（データは示さず）。ＢＡＮＦ１は、核ラミナの２つの主要な構成要素であるラミンＡ／ＣとラミンＢ１と相互作用する。最近の研究では、核ラミナの異常な形態がＦＴＤおよびＡＤの神経変性プロセスに関連付けられている。ラミン核骨格の破壊は、タウオパチーのショウジョウバエモデルにおいてヘテロクロマチン弛緩と神経細胞死を引き起こす。ラミンの病理は、死後のＡＤ脳で保存されている。ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢを発現するタウバイオセンサー細胞の形質導入に続いて、ＢＡＮＦ１およびＡＮＫＬＥ２のノックダウンクローンを単離した。ラミン染色により、これらのＢＡＮＦ１およびＡＮＫＬＥ２ノックダウンクローンに、非標的ｓｇＲＮＡ用に形質導入および選択されたクローンと比較して異常な核膜が明らかになった（データは示さず）。核ラミナの形状の顕著な異常は、ＦＴＤニューロンで最近報告されたものと類似している。

【0251】

核膜孔複合体（ＮＰＣ）の異常と、結果として生じる核細胞質輸送（ＮＣＴ）の欠陥は、タウオパチーのマウスモデルの病因に寄与する。ＮＰＣの破壊と機能的な核輸送は、ヒトのニューロンに過剰リン酸化されたタウを含む細胞、ならびにマウスおよびタウオパチーの細胞モデルにも存在する可能性がある。核膜孔および核膜の欠陥は、ＡＬＳ／ＦＴＤおよびハンチントン病における神経変性の一般的なメカニズムを示している可能性がある。

【0252】

ＧＴＰ結合核タンパク質Ｒａｎ（Ｒａｎ）、Ｒａｎ ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質１（ＲａｎＧＡＰ１）、および染色体凝縮のレギュレーター（ＲＣＣ１）の免疫染色を使用して、細胞内のＮＣＴの破壊を調べることができる。Ｒａｎタンパク質勾配は、ＮＰＣを介した能動輸送にとって重要である。ほとんどのＲａｎタンパク質は核内にあり、ほとんどの場合Ｒａｎ－ＧＴＰが含まれている。ＲａｎＧＡＰ１はＮＰＣの細胞質側に局在し、Ｒａｎ－ＧＴＰをＲａｎ－ＧＤＰに変換する。ＲＣＣ１は核に局在し、Ｒａｎ－ＧＤＰをＲａｎ－ＧＴＰに変換する。

【0253】

細胞内局在を決定するために、ニューロンを、タウ、ホスホタウ、Ｒａｎ、ＲａｎＧＡＰ１、ＲＣＣ１、核膜孔複合タンパク質Ｎｕｐ９８－Ｎｕｐ９６（ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｒｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎｕｐ９８－Ｎｕｐ９６）（Ｎｕｐ９８）（ホスホタウと相互作用する）、および核膜孔糖タンパク質ｐ６２（ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｒｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｐ６２）（Ｎｕｐ６２）（ハイドロゲルを形成できるＮＰＣのコア構成要素）、ならびにＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＡＲ ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ４３）（Ｎ－ｔｅｒｍ）、ＲＮＡ結合タンパク質ＦＵＳ（ＦＵＳ）、および異種核リボヌクレオタンパク質Ａ１（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ１）（ＨＮＲＮＰＡ１）ついて染色する。核から細胞質へのＴＤＰ－４３、ＨＮＲＮＰＡ１、およびＦＵＳの誤った局在化は、ＡＬＳ／ＦＴＤに関連している。

【0254】

この検証により、タウ播種活性の外部供給源に曝露されたときにタウ播種に対する細胞の感受性を調節することができる遺伝子の同定における一次スクリーニングアプローチの価値が確認された。したがって、スクリーニングによって同定された標的は、神経変性疾患の状況でタウ病理の細胞間増殖における関連する標的であり得、さらに調査される。ＦＲＥＴバイオセンサー細胞株におけるタウ凝集の修飾因子のゲノムワイドなスクリーニングにより、核膜の完全性に関与する複数の標的（ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２）が特定された。ＢＡＮＦ１およびＡＮＫＬＥ２変異クローンは、ＦＴＤニューロンとアルツハイマー病の死後ニューロンの両方で報告されたものと同様の核ラミナ形状の顕著な異常を示した。

【0255】

実施例３．マウス細胞におけるＡｎｋｌｅ２、Ｂａｎｆ１、およびＰｐｐ２ｃａの標的化
タウオパチーのマウスモデルで推定タウ修飾因子遺伝子を検証するために、マウス細胞でこれらの遺伝子の発現を修飾できるＣＲＩＳＰＲツールを検証することが最初に必要あった。マウス遺伝子Ａｎｋｌｅ２、Ｂａｎｆ１、およびＰｐｐ２ｃａを標的とするｓｇＲＮＡ、およびどのゲノム配列とも一致しない非標的（ＮＴ）対照ｓｇＲＮＡをマウスＥＳ細胞で試験した。これらの遺伝子の発現は、その後、ｑＲＴ－ＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ ＦｉｓｃｈｅｒのＴａｑＭａｎアッセイを使用し、ハウスキーピング遺伝子Ｄｒｏｓｈａの発現に対して正規化）によって評価された。

【0256】

最初の実験では、以下のｓｇＲＮＡ含有プラスミド（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔから取得）をレンチウイルス（ＬＶ）にパッケージ化し、Ｃａｓ９発現がＲｏｓａ２６遺伝子座から駆動されるＣａｓ９対応マウスＥＳ細胞株（２６００Ａ－Ａ３）に形質導入した。ｓｇＲＮＡ標的配列を表９に提示する。

【表9】

【0257】

ピューロマイシン選択（１．５μｇ／ｍＬ）によって発現を選択した。マウスＥＳ細胞は、ポリブレン（６４μｇ／ｍＬ）の存在下で６００のＭＯＩで個々のＬＶで形質導入された。細胞は、ピューロマイシン選択下でフィーダーなしで１０日間増殖させた。ＲＮＡを細胞から収集し、標的遺伝子の発現をｑＲＴ－ＰＣＲによって評価した。この実験では、Ｂａｎｆ１ ｇ２またはＢａｎｆ１ ｇ３で細胞を標的化すると、ＮＴ対照と比較してＢａｎｆ１の発現が約３５％低減した。図２１Ａを参照されたい。同様に、Ｐｐｐ２ｃａ ｇ２で細胞を標的化すると、ＮＴ対照と比較してＰｐｐ２ｃａ発現が約６５％低減した。図２１Ｂを参照されたい。

【0258】

これらのマウス遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡをさらに評価するために、以下のプラスミド（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔから取得）をＬＶにパッケージ化し、ハイブリッドな遺伝的背景（５０％Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ ５０％１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃ）の野生型マウスＥＳ細胞であるＦ１Ｈ４マウスＥＳ細胞に形質導入した。ｐＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ－ｖ２プラスミドコンストラクトは、Ｃａｓ９コード配列と特定のｓｇＲＮＡの配列の両方を単一の「オールインワン」（ＡＩＯ）ベクターに含み、Ｃａｓ９とｓｇＲＮＡの両方の発現をピューロマイシンで選択できる。追加の陰性対照として、ｐＬｅｎｔｉＧｕｉｄｅ－ｐｕｒｏベクター（ｓｇＲＮＡを含むがＣａｓ９を欠く）のＢａｎｆ１またはＰｐｐ２ｃａを標的とするｓｇＲＮＡも使用した。ベクターを表１０に示す。

【表10】

【0259】

この実験では、マウスＥＳ細胞は、ポリブレンの存在下でＭＯＩ６００のＬＶを再度形質導入され、ピューロマイシン選択下で１０日間増殖させた。ＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析を実施した（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから入手したＴａｑＭａｎ ｑＲＴ－ＰＣＲアッセイ、アッセイＩＤ Ｍｍ０１２０５８０２＿ｍ１、Ｍｍ０１２３１５１４＿ｇ１、およびＭｍ００４７９８１６＿ｍ１）。前の実験の結果を確認すると、Ｐｐｐ２ｃａ ｇ２は再びＰｐｐ２ｃａ発現の特定の急激な低減を引き起こし（この場合は＞８０％）、このｓｇＲＮＡの特定の効果を確認する。図２２Ｃを参照されたい。さらに劇的なことに、この実験では、いくつかのｓｇＲＮＡ（Ａｎｋｌｅ２ ｇ１、Ａｎｋｌｅ２ ｇ３、Ｂａｎｆ１ ｇ１、Ｂａｎｆ１ ｇ２、Ｂａｎｆ１ ｇ３、およびＰｐｐ２ｃａ ｇ３）の発現を選択すると、広範な細胞死とすべての細胞の喪失が引き起こされ、ＲＮＡの収集は不可能になった。図２２Ａ～２２Ｃを参照されたい。特に、オールインワンベクターでのＮＴ対照ｓｇＲＮＡによる形質導入は細胞死を引き起こさず、このコンストラクトからのＣａｓ９の発現は細胞に対して本質的に毒性がないことを示している。さらに、ｐＬｅｎｔｉＧｕｉｄｅ－ｐｕｒｏベクター（Ｃａｓ９を欠いている）でのＢａｎｆ１およびＰｐｐ２ｃａを標的とするｓｇＲＮＡの発現は、同様に細胞死を引き起こさなかった。したがって、それらの標的遺伝子の特異的破壊を引き起こすこれらのｓｇＲＮＡのＣａｓ９媒介活性がこれらの細胞の細胞死の原因であり、ｓｇＲＮＡがそれらの標的をヒットするのに有効である可能性が高いことを示していると結論付けた。ＢＡＮＦ１およびＰＰＰ２ＣＡがＥＳ細胞の生存率および／または多能性に不可欠であることが報告されているため、この結果は完全に驚くべきものではなかった。

【0260】

実施例４．タウオパチーのモデルの改善
タウ封入体は、ＡＤ、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、ピック病、および１７番染色体に関連するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ－１７）を含むタウオパチーの病理学的特徴である。タウ封入体は、高度にリン酸化され、切断され、アセチル化された種を含む、多数の形態の凝集した翻訳後修飾タウで構成されている。次に、ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞に由来するニューロン（例えば、ｉＣＥＬＬ ＧＡＢＡニューロン）、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞に由来するニューロン、および一次マウスニューロン（単離されたマウス皮質ニューロン）において、エクスビボでタウ過剰リン酸化とタウ凝集を再現する新しいスクリーニングプラットフォームの開発に着手した。ヒトｉＰＳ由来ニューロンの場合、すでに有糸分裂後で、使用の準備ができているヒトｉＰＳ由来ニューロンが使用される。細胞はＩＣＥＬＬ（登録商標）ＧＡＢＡＮｅｕｒｏｎｓの確立されたプロトコルに従って解凍されプレーティングされる。

【0261】

最初に、ヒトシナプシン１プロモーターの制御下でヒトタウｃＤＮＡ（１Ｎ４Ｒ）を発現するためにいくつかのコンストラクトが生成された。これらのコンストラクトは、ヒトまたはマウスのニューロンで使用するためにコドン最適化された。７つのコンストラクトが生成された：（１）ｐＳｙｎａｐｓｉｎ１－ＧＦＰ（配列番号７４）、（２）ｐＳｙｎａｐｓｉｎ１－ｈＴＡＵ ＷＴ（配列番号７５）、（３）ｐＳｙｎａｐｓｉｎ１－ｈＴＡＵ ＷＴ－ＧＦＰ（配列番号７６）、（４）ｐＳｙｎａｐｓｉｎ１－ＧＦＰ－ｈＴＡＵ ＷＴ（配列番号７７）、（５）ｐＳｙｎａｐｓｉｎ１－ｈＴＡＵ ３ＭＵＴ（Ａ１５２Ｔ、Ｐ３０１Ｌ、Ｓ３２０Ｆ）（配列番号７８）、（６）ｐＳｙｎａｐｓｉｎ１－ｈＴＡＵ ３ＭＵＴ（Ａ１５２Ｔ、Ｐ３０１Ｌ、Ｓ３２０Ｆ）－ＧＦＰ（配列番号７９）および、（７）ｐＳｙｎａｐｓｉｎ１－ＧＦＰ－ｈＴＡＵ ３ＭＵＴ（Ａ１５２Ｔ、Ｐ３０１Ｌ、Ｓ３２０Ｆ）（配列番号８０）。シナプシン１遺伝子プロモーターはニューロン特異的な発現をもたらす。これらのコンストラクトは、レンチウイルスまたはアデノ随伴ウイルスにパッケージ化して送達することができる。野生型タウ１Ｎ４ＲのＤＮＡおよびタンパク質配列は、それぞれ配列番号８１および８２に記載されている。３ＭＵＴタウ１Ｎ４Ｒ（Ａ１５２Ｔ、Ｐ３０１Ｌ、Ｓ３２０Ｆ）のＤＮＡおよびタンパク質配列は、それぞれ配列番号８３および８４に記載されている。

【0262】

ＴａｑＭａｎアッセイは、ヒトまたはマウスのニューロンにおけるヒトタウｃＤＮＡのトランスジェニック発現を特異的に検出するように設計された。定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を実行して、特定のプライマーとプローブを使用してトランスジェニックヒトＴＡＵを検出し、野生型（ＷＴ）および変異型（ＭＵＴ）ＴＡＵ ｃＤＮＡのコドン最適化配列を検出した。Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｐｌｕｓキットを製造元のプロトコル（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）に従って使用して、全ＲＮＡを単離した。全ＲＮＡは、Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡ－ｆｒｅｅキットを製造元のプロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って使用して、ＤＮａｓｅで処理し、２０ｎｇ／μＬに希釈した。逆転写（ＲＴ）およびＰＣＲは、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ Ｐｒｏｂｅ ＲＴ－ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用した一段階反応で実行された。ｑＲＴ－ＰＣＲ反応には、２μＬのＲＮＡと、ＲＴ－ＰＣＲマスターミックス、ＲＯＸ色素、ＲＴミックス、および遺伝子特異的プライマー－プローブミックスを含む８μＬの混合物が含まれ、最終容量は１０μＬになった。逆転写後、ＰＣＲ反応溶液を３μＬのｃＤＮＡと５μＬのＰＣＲ混合物、プローブ、遺伝子特異的プライマーを含む最終容量８μＬに再構成した。特に断りのない限り、最終的なプライマーとプローブの濃度は、それぞれ０．５μＭと０．２５μＭであった。ｑＰＣＲ ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＶｉｉＡ（商標）７ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で実行された。ＰＣＲ反応は４連で、９５℃１０分および９５℃３秒、６０℃３０秒で行い、ＲＴステップで４５℃１０分、続いて９５℃１０分、ならびに９５℃５秒、６０℃３０秒を４５サイクルの２ステップサイクリングで、光学３８４ウェルプレートで行った。各分析で使用したプライマーとプローブの配列を以下の表１１に示す。

【表11】

【0263】

ニューロンは、生化学的アッセイを実行するために６ウェルプレート（ウェル当たり約３００，０００細胞）にプレーティングされ、免疫染色とそれに続くハイコンテントイメージングおよび画像分析のために９６ウェルプレート（ウェル当たり約１５，０００ニューロン）にプレーティングされる。ニューロンは、ヒトタウコンストラクトを単独で、または特定のプロモーター（例えば、ＥＦ１アルファプロモーター）ならびにＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、ＡＮＫＬＥ２、または非標的ｓｇＲＮＡの下で（例えば、Ｕ６プロモーターの制御下で）、Ｃａｓ９導入遺伝子を発現するオールインワンウイルス（配列番号８５）と組み合わせて形質導入される。Ｃａｓ９のＤＮＡおよびタンパク質配列は、それぞれ、配列番号８６および８７に記載されている。

【0264】

培養で約１週間後、細胞を５０％馴化培地タウ－ＹＦＰ（Ａｇｇ［＋］）に曝露し、培養を維持する。９６ウェルプレートの細胞を最終的に固定し、特定の抗体で免疫染色して、以下を検出する：タウの過剰リン酸化およびタウの凝集（細胞内局在（軸索、細胞体樹状突起コンパートメント）を伴うタウの過剰リン酸化を検出するＡＴ８およびＳ３５６抗体）、核ラミナの異常な形態および核細胞質輸送の障害（ラミンＡ／Ｃ、ラミンＢ１、ＦＵＳ、ＴＤＰ－４３、ＨＮＲＰＡ１、ＮＰＣ、およびＮＰＴ）、非標的ｓｇＲＮＡと比較した、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、またはＡＮＫＬＥ２ ｓｇＲＮＡで形質導入された細胞における細胞生存（ＤＡＰＩ／ＮｅｕＮ／ＭＡＰ２）。チオフラビンＳは、β－アミロイド構造の染色と視覚化にも使用される。神経機能（神経突起の収縮、シナプスの喪失、異常なカルシウム恒常性、および不均衡な神経伝達物質の放出）も評価される。ハイコンテントイメージャーＰｈｅｎｉｘ Ｏｐｅｒａ（９６ウェルフォーマット）は、細胞生存アッセイ（ＤＡＰＩ／ＮｅｕＮ／ＭＡＰ２）、ホスホタウアッセイ（ＡＴ８、Ｓ３５６）、およびチオフラビンＳアッセイに使用される。６ウェルプレートの細胞を収集して細胞分画アッセイを実行し、不溶性で誤って局在化したタウの存在を明らかにする。

【0265】

次に、マウスの脳切片培養において、エクスビボでタウの過剰リン酸化とタウの凝集を再現する新しいスクリーニングプラットフォームの開発に着手した。脳切片アッセイはよく知られている。例えば、Ｐｏｌｌｅｕｘ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｓｃｉ．ＳＴＫＥ ２００２（１３６） ｐｌ９（ｄｏｉ： １０．１１２６／ｓｔｋｅ．２００２．１３６．ｐｌ９）を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0266】

マウス新生児の脳スライス培養物は、オールインワンレンチウイルスもしくはアデノ随伴ウイルス（Ｃａｓ９および特定のｓｇＲＮＡの発現を誘導する）またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）で形質導入され、馴化培地タウ－ＹＦＰ（Ａｇｇ［＋］）に暴露され、培養で維持される。最後に、切片を固定して、上記のようにタウの過剰リン酸化とタウの凝集を明らかにする。切片はまた収集され、不溶性タウの存在を明らかにする。

【0267】

次に、インビボでタウの過剰リン酸化とタウの凝集を再現するスクリーニングプラットフォームの開発に着手した。成体ＰＳ１９マウス（６～８週間）に、頭蓋内（海馬および他の脳領域への注入または脳室内注入のための定位手術）または髄腔内（脊髄内）注射により、以下を注入する：（１）Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、（２）ｓｉＲＮＡを含むＬＮＰ、（３）レンチウイルス（ＬＶ）オールインワン（Ｃａｓ９ ＋ ｓｇＲＮＡ）、（４）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）オールインワン（Ｃａｓ９＋ｓｇＲＮＡ）、または（５）アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）。ＰＳ１９マウス（ｊａｘ．ｏｒｇ／ｓｔｒａｉｎ／００８１６９で入手可能、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）が使用される。

【0268】

ｓｇＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、遺伝子Ｂａｎｆ１、Ｐｐｐ２ｃａ、Ａｎｋｌｅ２を標的とするか、非標的制御配列で構成される。動物を屠殺し、脳の切片化および染色後、上記のようにタウの過剰リン酸化（ＡＴ８染色）およびタウの凝集を明らかにする。脳はまた収集され、不溶性で誤って局在化したタウの存在を明らかにする（チオフラビンＳ染色）。

【0269】

ＢＡＮＦ１／ＰＰＰ２ＣＡ／ＡＮＫＬＥ２は有糸分裂細胞に不可欠であるため、ノックダウン戦略により、タウ凝集とのこの新しい関連性をよりよく理解できると仮定した。タウバイオセンサー細胞における転写抑制のｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ ＣＲＩＳＰＲｉシステムを導入し、転写開始部位の直前のプロモーター領域を標的とした特定のｓｇＲＮＡを形質導入した。図２４Ａおよび２４Ｂを参照されたい。馴化培地タウ－ＹＦＰ（Ａｇｇ［＋］）で処理した後、タウ凝集を誘導できるクローン段階希釈により、ΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２ノックダウンクローンを単離した。図２５を参照されたい。これは、ＣＲＩＳＰＲｉ ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ ΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２を標的としたノックダウンクローンがタウ凝集を誘導できることを示した。

【0270】

次に、ΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２クローンの細胞分画を行い、タウ－ＹＦＰ Ａｇｇ［＋］細胞溶解物を用いた２日後に不溶性画分中のタウおよびホスホタウ（セリン３５６）の検出を可能にし、セリン３５６でタウ不溶性およびリン酸化を伴うΔＢＡＮＦ１とΔＡＮＫＬＥ２クローン間の関連の機能的証拠を提供した。図２６を参照されたい。

【0271】

また、ΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２クローンと２つの対照群（非標的および親）からＲＮＡを収集した。ＲＮＡ－ｓｅｑ分析は、ΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２ノックダウンクローンと２つの対照群の有意差を特徴とした。ＣＲＩＳＰＲｉノックダウンクローンのＲＮＡ－ｓｅｑ分析により、ΔＢＡＮＦ１ノックダウン試料はΔＡＮＫＬＥ２または非標的群の試料とはより異なることが明らかになった。図２７を参照されたい。これらの群間の１０個の転写の違いを検証した（データは示さず）。これらの１０個の標的遺伝子は、ΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２ノックダウンクローンの両方で発現が低減していた。

【0272】

次に、ＢＡＮＦ１ ｃＤＮＡ（対照としてルシフェラーゼｃＤＮＡを使用）を追加することにより、ｃＤＮＡ相補性アプローチを採用した。ｃＤＮＡ相補性実験計画の概略図を図２８に示す。

【0273】

ＢＡＮＦ１ ｃＤＮＡをｐＬＶＸ－ＥＦ１ａプラスミドにサブクローニングし、ΔＢＡＮＦ１ノックダウン細胞、ΔＡＮＫＬＥ２ノックダウン細胞、および非標的対照細胞におけるｃＤＮＡのレンチウイルス形質導入用にパッケージ化した。具体的には、ΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２ノックダウン細胞におけるタウ凝集の増加の救助についてｃＤＮＡを試験した。ｃＤＮＡ発現細胞をタウ－ＹＦＰ Ａｇｇ［＋］細胞溶解物で２日間処理した。ＢＡＮＦ１ ｃＤＮＡがΔＢＡＮＦ１とΔＡＮＫＬＥ２ノックダウン細胞の両方でタウ凝集を救助し、ＢＡＮＦ１／ＡＮＫＬＥ２とタウ凝集の間に別の機能的結びつきを提供できることを示した。図２９を参照されたい。

【0274】

次に、マウス皮質ニューロンの一次培養を使用して、有糸分裂後の細胞で、タウのリン酸化、誤った折り畳み、および不溶性に対するΔＢＡＮＦ１およびΔＡＮＫＬＥ２変異の影響を研究した。皮質ニューロンは、Ｃａｓ９とマウスＥＳＣでの有効性が以前に検証されたｓｇＲＮＡ（Ｂａｎｆ１＿ｇ３、Ａｎｋｌｅ２＿ｇ３、またはＰｐｐ２ｃａ＿ｇ２）の両方を発現するオールインワンレンチウイルス（ＡＩＯ＿ＬＶ、ＬＶ＿Ｃａｓ９＿ｓｇＲＮＡ）で形質導入された。マウス一次皮質ニューロンは、ＡＩＯ＿ＬＶでプレーティングしてから２日後に形質導入され、蛍光免疫染色およびウエスタンブロット研究（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＳｉｍｐｌｅによるＷＥＳテクノロジーを使用）のために培養で１４日間維持された。免疫蛍光抗体法では、Ｃ５７ＢＬ／６マウス一次皮質ニューロン（市販）を０日目に９６ウェルポリＤリジンコーティングプレートにウェル当たり２５，０００ニューロンの密度でプレーティングした。２日目に、Ｂａｎｆ１＿ｇ３もしくはＡｎｋｌｅ２＿ｇ３もしくはＰｐｐ２ｃａ＿ｇ２、または非標的＿ｇＲＮＡ対照のＡＩＯ＿ＬＶを使用して、ニューロン当たり４０，０００ウイルスゲノムの感染多重度でニューロンに形質導入した。培地は３～４日ごとに交換した。１６日目に、ニューロンを４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）の溶液で固定し、蛍光免疫染色で調べた。ウエスタンブロット研究では、４００，０００個のニューロンをポリＤリジン６ウェルにプレーティングし、ＡＩＯ－ＬＶ（ニューロン当たり２５，０００ＶＧ）で形質導入した。培地は３～４日ごとに交換した。培養１４日後にニューロンを収集し、タンパク質研究のために調製した。

【0275】

１４日後、ＡＩＯ＿ＬＶで変換されたニューロンも収集して、遺伝子編集の程度（ＩＮＤＥＬ％）を決定した。遺伝子編集は、Ａｎｋｌｅ２＿ｇ３よりもＢａｎｆ１＿ｇ３ ｓｇＲＮＡを使用した方が一貫して高いことがわかった。表１２を参照されたい。

【表12】

【0276】

蛍光免疫染色研究では、タウの過剰リン酸化（細胞体樹状突起ドメイン）、核膜孔複合体の完全性（Ｎｕｐ９８の誤局在）、核細胞質輸送障害（Ｒａｎ／ＲａｎＧＡＰ１核／細胞質比の減少）などのタウオパチーに関連する異常な表現型に焦点を当てた。

【0277】

画像データ分析には、Ｏｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘハイコンテント共焦点イメージャー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）とＨａｒｍｏｎｙソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を組み合わせた自動化された偏りのない画像分析アプローチを使用した。各実験では、平均６つの生物学的複製が実行され、各ウェルで約７０のフィールドが画像化され、生物学的複製ごとに分析され、一次抗体の標識に蛍光標識二次抗体が使用された。二次抗体は、Ａｌｅｘａ－４８８ｎｍ（緑）、－５６８ｎｍ（オレンジ）、－６４７ｎｍ（遠赤色）と結合した。４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を核染色に使用した。

【0278】

各フィールドでは、第一にＤＡＰＩ^＋ニューロンの数をカウントした。第二に、細胞体樹状突起ドメインのニューロンマーカーである微小管関連タンパク質－２（Ｍａｐ２）の蛍光強度を使用して、細胞体樹状突起ドメインを含む細胞質をセグメント化し、健康なニューロンの数をカウントした。第三に、異なる細胞マーカー（ホスホタウＳ３５６、ホスホタウＡＴ８（Ｓ２０２、Ｔ２０５）、総タウ、Ｎｕｐ９８、ＬａｍｉｎＢ１、Ｒａｎ、ＲａｎＧＡＰ１）の蛍光強度を、細胞質、核ならびに核を取り巻く核周囲領域を含むいくつかの細胞内コンパートメントで測定した。第四に、各ウェルのすべてのフィールドのすべての細胞の平均を含む、各ウェルの平均蛍光強度（生物学的複製）を計算した。

【0279】

以下の組み合わせでバイオマーカー強度を定量化するための画像分析法を開発した：ホスホタウおよび総タウ；ホスホタウおよびＬａｍｉｎＢ１または核膜孔複合体（ＮＰＣ）；Ｎｕｐ９８、ＲａｎおよびＲａｎＧＡＰ１の核／細胞質比、およびホスホタウ強度。

【0280】

ΔＢａｎｆ１およびΔＡｎｋｌｅ２変異マウス皮質ニューロンは、非標的皮質ニューロンと同様のＭａｐ２細胞体樹状突起染色強度を示した。図３０Ａおよび３０Ｂを参照されたい。これは、Ｂａｎｆ１とＡｎｋｌｅ２の破壊が、１４日後の有糸分裂後の皮質ニューロンのニューロンの生存に影響を与えないことを示している。

【0281】

ホスホタウ（セリン３５６）染色は、非標的皮質ニューロンと比較して、ΔＢａｎｆ１（ｐ値＜０．００４）およびΔＡｎｋｌｅ２（ｐ値＜０．００１）変異皮質ニューロンの細胞体樹状突起コンパートメントで増加した。図３１Ａを参照されたい。これは、タンパク質タウが細胞体樹状突起ドメインで高リン酸化凝集体を形成するアルツハイマー病の観察を彷彿とさせる。特に、ホスホタウ染色強度の増加は、核周囲領域で特に顕著であることがわかった。図３１Ｂを参照されたい。データは平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表され、各実験条件の生物学的複製の数は点で示された。データは、２つの試料（つまり、ΔＢａｎｆ１と非標的皮質ニューロン）を比較する際、対応のないスチューデントのｔ検定によって分析された。

【0282】

対照実験として、我々は、非標的皮質ニューロンと比較して、ΔＢａｎｆ１およびΔＡｎｋｌｅ２変異体の細胞体樹状突起コンパートメントにおいて総タウ染色強度が増加しないことを決定した。図３２Ａ～３２Ｃを参照されたい。

【0283】

図３３Ａ～３３Ｅに示すように、ホスホタウＡＴ８（Ｓ２０２、Ｔ２０５）染色は、非標的皮質ニューロンと比較して、ΔＢａｎｆ１およびΔＡｎｋｌｅ２変異ニューロンの細胞体樹状突起コンパートメントで増加している。

【0284】

病理学的タウは、タウを過剰発現するトランスジェニックマウスおよびヒトＡＤ脳組織における核内輸送および核外輸送を損なう可能性がある。ホスホタウは核膜孔複合体の拡散バリア機能を破壊する。核膜孔複合体タンパク質ヌクレオポリンＮｕｐ９８は、いくつかのもつれを持ったニューロンの細胞体に蓄積し、インビトロでタウの凝集を促進することができる。Ｎｕｐ９８の細胞内局在を調べたところ、非標的皮質ニューロンと比較して、それはΔＢａｎｆ１およびΔＡｎｋｌｅ２変異体の体細胞に富むことがわかった。Ｎｕｐ９８の核／細胞質比は減少した。図３４Ａ～３４Ｄを参照されたい。

【0285】

さらに、ＲａｎおよびＲａｎＧＡＰ１の核／細胞質比の減少は、非標的皮質ニューロンと比較して、ΔＢａｎｆ１およびΔＡｎｋｌｅ２変異体における核膜孔複合体の能動輸送の障害の証拠を提供する。図３５Ａ～３５Ｄを参照されたい。

【0286】

マウス一次皮質ニューロンは、ＡＩＯ＿ＬＶ＿ＮＴ、ＡＩＯ＿ＬＶ＿Ｂａｎｆ１＿ｇ３、およびＡＩＯ＿ＬＶ＿Ｐｐｐ２ｃａ＿ｇ２でプレーティングしてから２日後に形質導入され、蛍光ホスホタウ免疫染色（セリン３５６およびセリン２０２／スレオニン２０５、ＡＴ８抗体としても知られる）および誤って折り畳まれたタウ検出のために培養で１４日間維持された。誤って折り畳まれたタンパク質凝集体とアグリソームを検出するための堅牢かつ定量的な方法としてＥＮＺＯによるＰＲＯＴＥＯＳＴＡＴ（登録商標）アグリソーム検出キットを使用し、これはアグリソーム検出試薬（ＡＤＲ）との抗体共局在研究用に最適化されている。ＰＲＯＴＥＯＳＴＡＴ（登録商標）色素は誤って折り畳まれ凝集したタンパク質に通常見出される四次タンパク質構造のクロスベータスパイン（ｃｒｏｓｓ－ｂｅｔａ ｓｐｉｎｅ）に特異的にインターカレートし、色素の回転を阻害し、強い蛍光を発する。１６日目に、ニューロンを４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）の溶液で固定し、蛍光免疫染色について調べた。ΔＢａｎｆ１（ｐ値＜０．０２６）およびΔＰｐｐ２ｃａ（ｐ値＜０．００８７）の細胞体樹状突起コンパートメントにおけるセリン３５６のタウのリン酸化の増加は、非標的皮質ニューロンと比較して変異皮質ニューロンで明らかになった。図３８Ｄを参照されたい。特に、ホスホタウ染色強度の増加は、核周囲領域として定義した核のすぐ周りの細胞質領域で特に顕著であることがわかった（ΔＢａｎｆ１ ｐ値＜０．００２およびΔＰｐｐ２ｃａ ｐ値＜０．０４）。図３８Ｂを参照されたい。同様に、ΔＢａｎｆ１（ｐ値＜０．０２６）およびΔＰｐｐ２ｃａ（ｐ値＜０．００８７）の核周囲領域でのホスホタウ（セリン２０２／スレオニン２０５）の増加が、非標的皮質ニューロンと比較して変異皮質ニューロンで観察された。図３９Ｂおよび３９Ｄを参照されたい。データは平均±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表され、各実験条件の生物学的複製の数は点で示された。データは、２つの試料（つまり、ΔＢａｎｆ１と非標的皮質ニューロン）を比較する際、対応のないスチューデントのｔ検定によって分析された。セリン３５６（ΔＢａｎｆ１の場合は、ピアソン相関（ρ）＝０．８５－Ｒ二乗＝０．７２；ΔＰｐｐ２ｃａの場合は、ρ＝０．９２－Ｒ二乗＝０．８５）ならびにセリン２０２およびスレオニン２０５（ΔＢａｎｆ１の場合はρ＝０．８６－Ｒ二乗＝０．７４；ΔＰｐｐ２ｃａの場合はρ＝０．９４－Ｒ二乗＝０．８９）でのタウリン酸化の増加は、非標的化と比較して、変異ニューロンの細胞体における誤って折り畳まれたタウの検出の増加と相関する。図３８Ａ～３８Ｆおよび３９Ａ～３９Ｆを参照されたい。相関分析は、ピアソンのパラメトリック検定を使用して行われた。＜０．０５のＰ値が有意であるとみなされた。Ｂａｎｆ１、Ａｎｋｌｅ２、またはＰｐｐ２ｃａの破壊により、タウのリン酸化と誤った折り畳みが増加する可能性があることを確認した。

【0287】

次に、タウｃＤＮＡ ３ＭＵＴまたはＰ３０１Ｓで形質導入されたマウスからの脳細胞溶解物を使用して、変異皮質ニューロンにタウ播種を使用して実験を行った。ホスホタウ（セリン３５６）染色は、タウｃＤＮＡ ３ＭＵＴを添加した場合、非標的皮質ニューロンと比較して、ΔＢａｎｆ１およびΔＡｎｋｌｅ２変異体の細胞体樹状突起ドメインで増加した。図３６Ａ～３６Ｄを参照されたい。ただし、タウｃＤＮＡ ３ＭＵＴを追加した場合、非標的皮質ニューロンと比較して、ΔＢａｎｆ１およびΔＡｎｋｌｅ２変異体の細胞体樹状突起ドメインでは総タウ染色は増加しなかった。図３７Ａ～３７Ｃを参照されたい。

【0288】

次に、器官型脳スライス培養を使用して、Ｂａｎｆ１、Ａｎｋｌｅ２、およびＰｐｐ２ｃａをタウ凝集の遺伝的修飾因子として検証する。器官型脳スライス培養物は、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスから調製され、Ｃａｓ９＿Ｂａｎｆ１＿ｇ３、Ｃａｓ９＿Ａｎｋｌｅ２＿ｇ３、Ｃａｓ９＿Ｐｐｐ２ｃａ＿ｇ２、およびＣａｓ９＿非標的＿ｇ３を含むＬＶ－Ａｌｌ－Ｉｎ－Ｏｎｅ（ＡＩＯ）コンストラクトで０日目に１０^１０ＶＧで形質導入される。あるいは、器官型脳スライス培養物は、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスから調製され、０日目にＡｎｋｌｅ２、Ｐｐｐ２ｃａ、またはＢａｎｆ１を標的とするＡＳＯで形質導入される。１４日目に、ＮＧＳ分析（ＩＮＤＥＬ％）、ホスホタウ染色（Ｓ３５６およびＡＴ８）、および誤って折り畳まれたタウのＴｈＳ染色のために試料が収集される。

【0289】

次に、マウス海馬への定位的ＡＩＯ－ＬＶ注入を使用して、タウ凝集の遺伝的修飾因子としてＢａｎｆ１、Ａｎｋｌｅ２、およびＰｐｐ２ｃａを検証した。合計２４匹のＣ５７ＢＬ／６野生型動物（ＮＴ、ＡＩＯ Ｃａｓ９＿Ｂａｎｆ１、ＡＩＯ Ｃａｓ９＿Ａｎｋｌｅ２、およびＡＩＯ Ｃａｓ９＿Ｐｐｐ２ｃａ）が注入された。注入の７日後に２匹の動物（各条件ごとに）を降ろした。ＮＧＳは有意な編集を明らかにした（ＩＮＤＥＬｓ％約＞１５％として；データは表示しない）。その後、ウエスタンブロット分析（ホスホタウ、誤って折り畳まれたタウ、総タウ）およびタウバイオセンサー細胞における海馬溶解物のタウ播種アッセイのために動物を降ろす。次に、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢとマウス海馬のＢａｎｆ１、Ａｎｋｌｅ２、またはＰｐｐ２ｃａを標的とするｇＲＮＡの定位的ＡＩＯ－ＬＶ注入を使用して、タウ凝集の遺伝的修飾因子としてＢａｎｆ１、Ａｎｋｌｅ２、およびＰｐｐ２ｃａを検証する。

【0290】

次に、マウス海馬へのＡＳＯの定位的注入を使用して、タウ凝集の遺伝的修飾因子としてＢａｎｆ１、Ａｎｋｌｅ２、およびＰｐｐ２ｃａを検証する。マウスＢａｎｆ１を標的とするＡＳＯの例を表１３に示す。マウスＰｐｐ２ｃａを標的とするＡＳＯの例を表１４に示す。マウスＡｎｋｌｅ２を標的とするＡＳＯの例を表１５に示す。表１３～１５のＡＳＯを設計するために使用される親アンチセンスＲＮＡ配列を表１６に示す。

【表13-1】

【表13-2】

【表14-1】

【表14-2】

【表14-3】

【表15-1】

【表15-2】

【表15-3】

【表16-1】

【表16-2】

【表16-3】

【0291】

すべてのＡＳＯは、ホスホロチオエート骨格を有する５－１０－５ギャップマーとして設計された。２’メトキシエチル修飾塩基が翼に使用され（両端から５ヌクレオチド）、１０ヌクレオチドコアは未修飾のＤＮＡ塩基を有していた。図４０を参照されたい。一次スクリーニングは、最初に１００ｎＭのＡＳＯ濃度にてＮＳＣ３４細胞で実施された。すべてのＡＳＯは、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡｘを使用してトランスフェクトされ、ＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲ用のＲＮＡを回収する前に、細胞を７２時間インキュベートした。標的の全ｍＲＮＡのノックダウンを未処理の細胞と比較した。一次スクリーニングデータに基づいて、５０ｎＭおよび５ｎＭの二次スクリーニングのヒットが選択された。トランスフェクションおよびＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲ分析は、一次スクリーニングと同様の方法で実施した。ｍＡｎｋｌｅ２の一次スクリーニングの結果を図４１Ａに示し、ｍＡｎｋｌｅ２の二次スクリーニングの結果を図４１Ｂおよび４１Ｃに示す。ｍＰｐｐ２ｃａの一次スクリーニングの結果を図４２Ａに示し、ｍＰｐｐ２ｃａの二次スクリーニングの結果を図４２Ｂおよび４２Ｃに示す。ｍＢａｎｆ１の一次スクリーニングの結果を図４３に示す。これらの結果に示されているように、Ｂａｎｆ１、Ａｎｋｌｅ２、またはＰｐｐ２ｃａをターゲットとするＡＳＯは、ＮＳＣ３４細胞で検証されており、発現の＞７５％低減を示す。

【0292】

結論として、Ｂａｎｆ１、Ａｎｋｌｅ２、およびＰｐｐ２ｃａをインビトロ（マウス皮質ニューロンの一次培養）、エクスビボ（器官型の脳スライス培養）、およびインビボ（海馬の定位的注入）のタウ凝集の修飾因子として検証するための３つのアプローチを開発した。Ｂａｎｆ１、Ａｎｋｌｅ２、および／またはＰｐｐ２ｃａの破壊が、タウオパチーの新しいマウスモデルの開発に使用できることを提案する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団であって、
（ａ）１つ以上の細胞における微小管関連タンパク質タウコード配列と、
（ｂ）（ｉ）前記１つ以上の細胞において、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上もしくはすべての発現をそれぞれ低減させる前記ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上もしくはすべての遺伝子改変、ならびに／または（ｉｉ）前記１つ以上の細胞において、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上もしくはすべての発現を低減させる１つ以上の薬剤と、を含む、非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団。
(項目２)
前記１つ以上の細胞が、神経細胞である、項目１に記載の非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団。
(項目３)
前記微小管関連タンパク質タウコード配列が、外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列である、項目１または２に記載の非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団。
(項目４)
前記外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列が、ゲノムに組み込まれている、項目３に記載の非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団。
(項目５)
前記外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列が、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列を含む、項目３または４に記載の非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団。
(項目６)
前記外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列が、前記非ヒト動物、前記動物組織、または前記動物細胞の集団における発現のためにコドン最適化されている、項目３～５のいずれか一項に記載の非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団。
(項目７)
前記外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列が、異種プロモーターに作動可能に連結されている、項目３～６のいずれか一項に記載の非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団。
(項目８)
前記異種プロモーターが、マウスプリオンタンパク質プロモーターである、項目７に記載の非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団。
(項目９)
前記異種プロモーターが、ニューロン特異的プロモーターである、項目７に記載の非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団。
(項目１０)
前記ニューロン特異的プロモーターが、シナプシン－１プロモーターである、項目９に記載の非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団。
(項目１１)
前記微小管関連タンパク質タウが、タウオパチー関連変異を含む、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団。
(項目１２)
前記タウオパチー関連変異が、Ｐ３０１Ｓ変異を含む、項目１１に記載の非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団。
(項目１３)
前記微小管関連タンパク質タウが、配列番号９８に記載の配列を含む、項目１１に記載の非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団。
(項目１４)
前記タウオパチー関連変異が、Ａ１５２Ｔ／Ｐ３０１Ｌ／Ｓ３２０Ｆ三重変異を含む、項目１１に記載の非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団。
(項目１５)
前記微小管関連タンパク質タウコード配列が、配列番号８３に記載の配列を含むか、または前記微小管関連タンパク質タウが、配列番号８４に記載の配列を含む、項目１４に記載の非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団。
(項目１６)
前記非ヒト動物、前記動物組織、または前記動物細胞の集団が、前記１つ以上の細胞において、前記ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上もしくはすべての発現をそれぞれ低減させる、前記ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上もしくはすべての前記遺伝子改変を含む、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物、動物組織、動物細胞の集団。
(項目１７)
前記非ヒト動物、前記動物組織、または前記動物細胞の集団が、前記１つ以上の細胞において、前記ＢＡＮＦ１、Ｐｐｐ２ｃａ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上もしくはすべての発現を低減させる前記１つ以上の薬剤を含む、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団。
(項目１８)
前記１つ以上の薬剤が、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、もしくはＡＮＫＬＥ２を標的とするヌクレアーゼ剤、または前記ヌクレアーゼ剤をコードする核酸を含む、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団。
(項目１９)
前記ヌクレアーゼ剤が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはクラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質およびガイドＲＮＡである、項目１８に記載の非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団。
(項目２０)
前記ヌクレアーゼ剤が、前記Ｃａｓタンパク質および前記ガイドＲＮＡである、項目１９に記載の非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団。
(項目２１)
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、項目２０に記載の非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団。
(項目２２)
前記Ｃａｓタンパク質が、触媒的に活性なＣａｓタンパク質である、項目２０または２１に記載の非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団。
(項目２３)
前記１つ以上の薬剤が、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、もしくはＡＮＫＬＥ２を標的とする転写抑制因子、または前記転写抑制因子をコードする核酸を含む、項目１～１７のいずれか一項に記載の非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団。
(項目２４)
前記転写抑制因子が、ガイドＲＮＡと、転写抑制因子ドメインに融合された触媒的に不活性なＣａｓタンパク質とを含み、任意選択で、前記転写抑制因子ドメインが、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメインである、項目２３に記載の非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団。
(項目２５)
前記ガイドＲＮＡが、マウスＢａｎｆ１を標的とし、配列番号４４～４６に記載の配列のうちのいずれか１つを含むか、または前記ガイドＲＮＡが、ヒトＢＡＮＦ１を標的とし、配列番号２７～３０に記載の配列のうちのいずれか１つを含む、項目２０～２４のいずれか一項に記載の非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団。
(項目２６)
前記ガイドＲＮＡが、マウスＰｐｐ２ｃａを標的とし、配列番号４７～４９に記載の配列のうちのいずれか１つを含むか、または前記ガイドＲＮＡが、ヒトＰＰＰ２ＣＡを標的とし、配列番号３１～３２に記載の配列のうちのいずれか１つを含む、項目２０～２４のいずれか一項に記載の非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団。
(項目２７)
前記ガイドＲＮＡが、マウスＡｎｋｌｅ２を標的とし、配列番号５０～５２に記載の配列のうちのいずれか１つを含むか、または前記ガイドＲＮＡが、ヒトＡＮＫＬＥ２を標的とし、配列番号３８に記載の配列を含む、項目２０～２４のいずれか一項に記載の非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団。
(項目２８)
前記１つ以上の薬剤が、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、もしくはＡＮＫＬＥ２を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉ剤を含むか、あるいは前記アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは前記ＲＮＡｉ剤をコードする核酸を含む、項目１～１７のいずれか一項に記載の非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団。
(項目２９)
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１０５～３２４のいずれか１つに記載の配列またはその改変バージョンを含む、項目２８に記載の非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団。
(項目３０)
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１０５、１０６、１１０～１１３、１１５、１２０～１２２、１２４、１２５、１３０、１３３、１３６、１３７、１５０、１５２、１５３、１５５、１５８～１６０、１６２、１６５、１６６、１６９、１７１～１７３、１７５、１７７、１８１～１８４、１８７、１９４、１９７、２１１、２１３、２１５、２１６、２２０～２２３、２２５、２３０～２３２、２３４、２３５、２４０、２４３、２４６、２４７、２６０、２６２、２６３、２６５、２６８～２７０、２７２、２７５、２７６、２７９、２８１～２８３、２８５、２８７、２９１～２９４、２９７、３０４、３０７、３２１、および３２３のうちのいずれか１つに記載の配列またはこれらの改変バージョンを含む、項目２９に記載の非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団。
(項目３１)
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１つ以上のホスホロチオエート結合および／または１つ以上の２’－メトキシエチル修飾塩基を含む、項目２９または３０に記載の非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団。
(項目３２)
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエート骨格、２’－メトキシエチル修飾塩基の５’ウィング、ＤＮＡの中央１０ヌクレオチドコア、および２’－メトキシエチル修飾塩基の３’ウィングを含む、５－１０－５ギャップマーである、項目３１に記載の非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団。
(項目３３)
タウオパチーの少なくとも１つの徴候または症状が、前記ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上もしくはすべての前記遺伝子改変を含まないか、または、前記ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上もしくはすべての発現を低減させる前記１つ以上の薬剤を含まない非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団と比較して、前記非ヒト動物、前記動物組織、または前記動物細胞の集団において増加する、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団。
(項目３４)
前記少なくとも１つの徴候または症状が、タウの過剰リン酸化またはタウの凝集を含む、項目３３に記載の非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団。
(項目３５)
前記少なくとも１つの徴候または症状が、細胞分画後の不溶性画分におけるタウおよび／もしくはホスホタウの増加、ニューロンの細胞体樹状突起コンパートメントにおけるホスホタウの増加、ニューロンの核周囲領域におけるホスホタウの増加、ニューロンにおける核膜孔複合体タンパク質Ｎｕｐ９８－Ｎｕｐ９６（Ｎｕｐ９８）の核対細胞質比の減少、ニューロンにおけるＧＴＰ結合核タンパク質Ｒａｎ（Ｒａｎ）の核対細胞質比の減少、またはニューロンにおけるＲａｎ ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質１（ＲａｎＧＡＰ１）の核対細胞質比の減少を含む、項目３３または３４に記載の非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団。
(項目３６)
前記細胞が、インビボにある、先行項目のいずれか一項に記載の動物細胞の集団。
(項目３７)
前記細胞が、インビトロにある、項目１～３５のいずれか一項に記載の動物細胞の集団。
(項目３８)
前記細胞が、ヒト細胞である、先行項目のいずれか一項に記載の動物細胞の集団。
(項目３９)
前記細胞が、げっ歯動物細胞であり、任意選択で、前記げっ歯動物細胞が、マウス細胞またはラット細胞である、項目１～３７のいずれか一項に記載の動物細胞の集団。
(項目４０)
前記細胞が、マウス細胞である、項目３９に記載の動物細胞の集団。
(項目４１)
前記細胞が、神経細胞を含む、先行項目のいずれか一項に記載の動物細胞の集団。
(項目４２)
前記神経細胞が、ヒト人工多能性幹細胞に由来するニューロンを含む、項目４１に記載の動物細胞の集団。
(項目４３)
前記神経細胞が、マウス胚性幹細胞に由来するニューロンを含む、項目４１に記載の動物細胞の集団。
(項目４４)
前記神経細胞が、一次マウスニューロンを含む、項目４１に記載の動物細胞の集団。
(項目４５)
前記組織が、インビボにある、項目１～３５のいずれか一項に記載の動物組織。
(項目４６)
前記組織が、エクスビボにある、項目１～３５のいずれか一項に記載の動物組織。
(項目４７)
前記動物が、げっ歯動物であり、任意選択で、前記げっ歯動物が、マウスまたはラットである、項目１～３５および４５～４６のいずれか一項に記載の動物組織。
(項目４８)
前記動物が、前記マウスである、項目４７に記載の動物組織。
(項目４９)
前記組織が、神経系組織である、項目１～３５および４５～４８のいずれか一項に記載の動物組織。
(項目５０)
前記組織が、脳スライスを含む、項目４９に記載の動物組織。
(項目５１)
ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上もしくはすべての前記遺伝子改変が、１つ以上の神経細胞内にあり、かつ／またはＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上もしくはすべての発現を低減させる前記１つ以上の薬剤が、１つ以上の神経細胞にあり、任意選択で、前記１つ以上の神経細胞が、海馬にある、項目１～３５のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
(項目５２)
前記非ヒト動物が、げっ歯動物であり、任意選択で、前記げっ歯動物が、マウスまたはラットである、項目１～３５および５１のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
(項目５３)
前記非ヒト動物が、前記マウスである、項目５２に記載の非ヒト動物。
(項目５４)
前記マウスが、前記１つ以上の細胞において、前記ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上もしくはすべての発現をそれぞれ低減させる、前記ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上もしくはすべての前記遺伝子改変をさらに含み、かつ／または前記１つ以上の細胞においてＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上もしくはすべての発現を低減させる１つ以上の薬剤をさらに含む、ＰＳ１９トランスジェニックマウスである、項目５３に記載の非ヒト動物。
(項目５５)
タウオパチーの治療のための治療薬候補を評価するための方法であって、
（ａ）項目１～３５および５１～５４のいずれか一項に記載の非ヒト動物、項目１～３５および４５～５０のいずれか一項に記載の動物組織、または項目１～４４のいずれか一項に記載の動物細胞の集団に、候補薬剤を投与することと、
（ｂ）前記候補薬剤が、タウオパチーに関連する１つ以上の徴候または症状に対して効果を有するかどうかを決定するために１つ以上のアッセイを実行することと、
（ｃ）タウオパチーに関連する前記１つ以上の徴候または症状に対して効果を有する前記候補薬剤を治療薬候補として特定することと、を含む方法。
(項目５６)
前記１つ以上の徴候または症状が、タウの過剰リン酸化またはタウの凝集を含む、項目５５に記載の方法。
(項目５７)
前記少なくとも１つの徴候または症状が、細胞分画後の不溶性画分におけるタウおよび／もしくはホスホタウの増加、ニューロンの細胞体樹状突起コンパートメントにおけるホスホタウの増加、ニューロンの核周囲領域におけるホスホタウの増加、ニューロンにおける核膜孔複合体タンパク質Ｎｕｐ９８－Ｎｕｐ９６（Ｎｕｐ９８）の核対細胞質比の減少、ニューロンにおけるＧＴＰ結合核タンパク質Ｒａｎ（Ｒａｎ）の核対細胞質比の減少、またはニューロンにおけるＲａｎ ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質１（ＲａｎＧＡＰ１）の核対細胞質比の減少を含む、項目５５または５６に記載の方法。
(項目５８)
前記候補薬剤が、前記非ヒト動物に投与される、項目５５～５７のいずれか一項に記載の方法。
(項目５９)
前記候補薬剤が、エクスビボで前記動物組織に投与される、項目５５～５７のいずれか一項に記載の方法。
(項目６０)
候補薬剤が、インビトロで前記動物細胞の集団に投与される、項目５５～５７のいずれか一項に記載の方法。
(項目６１)
項目１～３５および５１～５４のいずれか一項に記載の非ヒト動物、項目１～３５および４５～５０のいずれか一項に記載の動物組織、または項目１～４４のいずれか一項に記載の動物細胞の集団を作製する方法であって、
（ａ）ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上またはすべての発現を低減させる１つ以上の薬剤を、微小管関連タンパク質タウコード配列を含む非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団に導入することと、
（ｂ）前記非ヒト動物、前記動物組織、または前記動物細胞の集団をスクリーニングして、前記１つ以上の薬剤の存在を確認することと、を含む、方法。
(項目６２)
項目１～３５および５１～５４のいずれか一項に記載の非ヒト動物、項目１～３５および４５～５０のいずれか一項に記載の動物組織、または項目１～４４のいずれか一項に記載の動物細胞の集団を作製する方法であって、
（ａ）非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団に、
（ｉ）外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列と、
（ｉｉ）ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上またはすべての発現を低減させる１つ以上の薬剤と、を導入することと、
（ｂ）前記非ヒト動物、前記動物組織、または前記動物細胞の集団をスクリーニングして、前記１つ以上の薬剤および前記外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列の存在を確認することと、を含む、方法。
(項目６３)
前記外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列が、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、または脂質ナノ粒子を介して送達される、項目６２に記載の方法。
(項目６４)
前記１つ以上の薬剤が、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、または脂質ナノ粒子を介して送達される、項目６１～６３のいずれか一項に記載の方法。
(項目６５)
前記方法が、前記非ヒト動物を作製するためのものであり、前記１つ以上の薬剤が、髄腔内注射、頭蓋内注射、または脳室内注射によって前記非ヒト動物に投与され、任意選択で、前記１つ以上の薬剤が、脳への定位的注入によって前記非ヒト動物に投与される、項目６１～６４のいずれか一項に記載の方法。
(項目６６)
タウオパチーモデル非ヒト動物、タウオパチーモデル動物組織、または動物細胞のタウオパチーモデル集団におけるタウ凝集を加速または悪化させるための方法であって、前記タウオパチーモデル非ヒト動物、前記タウオパチーモデル動物組織、または前記動物細胞のタウオパチーモデル集団に、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上またはすべての発現を低下させる１つ以上の薬剤を導入することを含む、方法。
(項目６７)
前記タウオパチーモデル非ヒト動物、前記タウオパチーモデル動物組織、または前記動物細胞のタウオパチーモデル集団が、外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列を含む、項目６６に記載の方法。
(項目６８)
前記外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列が、ゲノムに組み込まれている、項目６７に記載の方法。
(項目６９)
前記外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列が、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列を含む、項目６７または６８に記載の方法。
(項目７０)
前記外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列が、前記非ヒト動物、前記動物組織、または前記動物細胞の集団における発現のためにコドン最適化されている、項目６７～６９のいずれか一項に記載の方法。
(項目７１)
前記外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列が、異種プロモーターに作動可能に連結されている、項目６７～７０のいずれか一項に記載の方法。
(項目７２)
前記異種プロモーターが、マウスプリオンタンパク質プロモーターである、項目７１に記載の方法。
(項目７３)
前記異種プロモーターが、ニューロン特異的プロモーターである、項目７１に記載の方法。
(項目７４)
前記ニューロン特異的プロモーターが、シナプシン－１プロモーターである、項目７３に記載の方法。
(項目７５)
前記外因性ヒト微小管関連タンパク質タウが、タウオパチー関連変異を含む、項目６７～７４のいずれか一項に記載の方法。
(項目７６)
前記タウオパチー関連変異が、Ｐ３０１Ｓ変異を含む、項目７５に記載の方法。
(項目７７)
前記外因性ヒト微小管関連タンパク質タウが、配列番号９８に記載の配列を含む、項目７６に記載の方法。
(項目７８)
前記タウオパチー関連変異が、Ａ１５２Ｔ／Ｐ３０１Ｌ／Ｓ３２０Ｆ三重変異を含む、項目７５に記載の方法。
(項目７９)
前記外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列が、配列番号８３に記載の配列を含むか、または前記外因性ヒト微小管関連タンパク質タウが、配列番号８４に記載の配列を含む、項目７８に記載の方法。
(項目８０)
前記１つ以上の薬剤が、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、もしくはＡＮＫＬＥ２を標的とするヌクレアーゼ剤、または前記ヌクレアーゼ剤をコードする核酸を含む、項目６６～７９のいずれか一項に記載の方法。
(項目８１)
前記ヌクレアーゼ剤が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはクラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質およびガイドＲＮＡである、項目８０に記載の方法。
(項目８２)
前記ヌクレアーゼ剤が、前記Ｃａｓタンパク質および前記ガイドＲＮＡである、項目８１に記載の方法。
(項目８３)
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、項目８２に記載の方法。
(項目８４)
前記Ｃａｓタンパク質が、触媒的に活性なＣａｓタンパク質である、項目８２または８３に記載の方法。
(項目８５)
前記１つ以上の薬剤が、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、もしくはＡＮＫＬＥ２を標的とする転写抑制因子、または前記転写抑制因子をコードする核酸を含む、項目６６～７９のいずれか一項に記載の方法。
(項目８６)
前記転写抑制因子が、ガイドＲＮＡと、転写抑制因子ドメインに融合された触媒的に不活性なＣａｓタンパク質とを含み、任意選択で、前記転写抑制因子ドメインが、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメインである、項目８５に記載の方法。
(項目８７)
前記ガイドＲＮＡが、マウスＢａｎｆ１を標的とし、配列番号４４～４６に記載の配列のうちのいずれか１つを含むか、または前記ガイドＲＮＡが、ヒトＢＡＮＦ１を標的とし、配列番号２７～３０に記載の配列のうちのいずれか１つを含む、項目８２～８６のいずれか一項に記載の方法。
(項目８８)
前記ガイドＲＮＡが、マウスＰｐｐ２ｃａを標的とし、配列番号４７～４９に記載の配列のうちのいずれか１つを含むか、または前記ガイドＲＮＡが、ヒトＰＰＰ２ＣＡを標的とし、配列番号３１～３２に記載の配列のうちのいずれか１つを含む、項目８２～８６のいずれか一項に記載の方法。
(項目８９)
前記ガイドＲＮＡが、マウスＡｎｋｌｅ２を標的とし、配列番号５０～５２に記載の配列のうちのいずれか１つを含むか、または前記ガイドＲＮＡが、ヒトＡＮＫＬＥ２を標的とし、配列番号３８に記載の配列を含む、項目８２～８６のいずれか一項に記載の方法。
(項目９０)
前記１つ以上の薬剤が、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、もしくはＡＮＫＬＥ２を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉ剤、あるいは前記アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは前記ＲＮＡｉ剤をコードする核酸を含む、項目６６～７９のいずれか一項に記載の方法。
(項目９１)
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１０５～３２４のうちのいずれか１つに記載の配列またはその改変バージョンを含む、項目９０に記載の方法。
(項目９２)
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１０５、１０６、１１０～１１３、１１５、１２０～１２２、１２４、１２５、１３０、１３３、１３６、１３７、１５０、１５２、１５３、１５５、１５８～１６０、１６２、１６５、１６６、１６９、１７１～１７３、１７５、１７７、１８１～１８４、１８７、１９４、１９７、２１１、２１３、２１５、２１６、２２０～２２３、２２５、２３０～２３２、２３４、２３５、２４０、２４３、２４６、２４７、２６０、２６２、２６３、２６５、２６８－２７０、２７２、２７５、２７６、２７９、２８１～２８３、２８５、２８７、２９１～２９４、２９７、３０４、３０７、３２１、および３２３のうちのいずれか１つに記載の配列またはそれらの改変バージョンを含む、項目９１に記載の方法。
(項目９３)
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１つ以上のホスホロチオエート結合および／または１つ以上の２’－メトキシエチル修飾塩基を含む、項目９１または９２に記載の方法。
(項目９４)
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエート骨格、２’－メトキシエチル修飾塩基の５’ウィング、ＤＮＡの中央１０ヌクレオチドコア、および２’－メトキシエチル修飾塩基の３’ウィングを含む、５－１０－５ギャップマーである、項目９３に記載の方法。
(項目９５)
前記１つ以上の薬剤が、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、または脂質ナノ粒子を介して送達される、項目６６～９４のいずれか一項に記載の方法。
(項目９６)
前記１つ以上の薬剤が、髄腔内注入、頭蓋内注入、または脳室内注入によって前記非ヒト動物に投与され、任意選択で、前記１つ以上の薬剤が、脳への定位的注入によって前記非ヒト動物に投与される、項目６６～９５のいずれか一項に記載の方法。
(項目９７)
タウオパチーの少なくとも１つの徴候または症状が、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上またはすべての発現を低減させる前記１つ以上の薬剤を含まない非ヒト動物、動物組織、または動物細胞の集団と比較して、前記非ヒト動物、前記動物組織、または動物細胞の集団において増加する、項目６６～９６のいずれか一項に記載の方法。
(項目９８)
前記少なくとも１つの徴候または症状が、タウの過剰リン酸化またはタウの凝集を含む、項目９７に記載の方法。
(項目９９)
前記少なくとも１つの徴候または症状が、細胞分画後の不溶性画分におけるタウおよび／もしくはホスホタウの増加、ニューロンの細胞体樹状突起コンパートメントにおけるホスホタウの増加、ニューロンの核周囲領域におけるホスホタウの増加、ニューロンにおける核膜孔複合体タンパク質Ｎｕｐ９８－Ｎｕｐ９６（Ｎｕｐ９８）の核対細胞質比の減少、ニューロンにおけるＧＴＰ結合核タンパク質Ｒａｎ（Ｒａｎ）の核対細胞質比の減少、またはニューロンにおけるＲａｎ ＧＴＰａｓｅ活性化のタンパク質１（ＲａｎＧＡＰ１）の核対細胞質比の減少を含む、項目９７または９８に記載の方法。
(項目１００)
前記細胞が、インビボにある、項目６６～９９のいずれか一項に記載の方法。
(項目１０１)
前記細胞が、インビトロにある、項目６６～９９のいずれか一項に記載の方法。
(項目１０２)
前記細胞が、ヒト細胞である、項目６６～１０１のいずれか一項に記載の方法。
(項目１０３)
前記細胞が、げっ歯動物細胞であり、任意選択で前記げっ歯動物細胞が、マウス細胞またはラット細胞である、項目６６～１０１のいずれか一項に記載の方法。
(項目１０４)
前記細胞が、マウス細胞である、項目１０３に記載の方法。
(項目１０５)
前記細胞が、神経細胞を含む、項目６６～１０４のいずれか一項に記載の方法。
(項目１０６)
前記神経細胞が、ヒト人工多能性幹細胞に由来するニューロンを含む、項目１０５に記載の方法。
(項目１０７)
前記神経細胞が、マウス胚性幹細胞に由来するニューロンを含む、項目１０５に記載の方法。
(項目１０８)
前記神経細胞が、一次マウスニューロンを含む、項目１０５に記載の方法。
(項目１０９)
前記組織が、インビボにある、項目６６～９９のいずれか一項に記載の方法。
(項目１１０)
前記組織が、エクスビボにある、項目６６～９９のいずれか一項に記載の方法。
(項目１１１)
前記動物組織が、げっ歯動物組織であり、任意選択で前記げっ歯動物が、マウスまたはラットである、項目６６～９９および１０９～１１０のいずれか一項に記載の方法。
(項目１１２)
前記動物組織が、マウス組織である、項目１１１に記載の方法。
(項目１１３)
前記組織が、神経系組織である、項目６６～９９および１０９～１１２のいずれか一項に記載の方法。
(項目１１４)
前記組織が、脳切片を含む、項目１１３に記載の方法。
(項目１１５)
前記非ヒト動物が、げっ歯動物であり、任意選択で前記げっ歯動物が、マウスまたはラットである、項目６６～９９のいずれか一項に記載の方法。
(項目１１６)
前記非ヒト動物が、マウスである、項目１１５に記載の方法。
(項目１１７)
前記マウスが、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、およびＡＮＫＬＥ２のうちの１つ以上またはすべての発現を低減させる、前記１つ以上の薬剤をさらに含むＰＳ１９トランスジェニックマウスである、項目１１６に記載の方法。
(項目１１８)
非ヒト動物ゲノムであって、外因性ヒト微小管関連タンパク質タウコード配列と、Ｂａｎｆ１、Ｐｐｐ２ｃａ、およびＡｎｋｌｅ２の１つ以上の発現をそれぞれ低減させる、前記Ｂａｎｆ１、Ｐｐｐ２ｃａ、およびＡｎｋｌｅ２の１つ以上の遺伝子改変と、を含む、非ヒト動物ゲノム。
(項目１１９)
細胞におけるＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、もしくはＡＮＫＬＥ２の発現を低減させるもしくは阻害する薬剤、または前記薬剤をコードする核酸であって、任意選択で、前記薬剤が、ＢＡＮＦ１、ＰＰＰ２ＣＡ、もしくはＡＮＫＬＥ２を標的とする、ヌクレアーゼ剤またはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉ剤である、薬剤、または前記薬剤をコードする核酸。
(項目１２０)
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１０５～３２４のいずれか１つに記載の配列またはその改変バージョンを含む、項目１１９に記載の薬剤。
(項目１２１)
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１０５、１０６、１１０～１１３、１１５、１２０～１２２、１２４、１２５、１３０、１３３、１３６、１３７、１５０、１５２、１５３、１５５、１５８～１６０、１６２、１６５、１６６、１６９、１７１～１７３、１７５、１７７、１８１～１８４、１８７、１９４、１９７、２１１、２１３、２１５、２１６、２２０～２２３、２２５、２３０～２３２、２３４、２３５、２４０、２４３、２４６、２４７、２６０、２６２、２６３、２６５、２６８－２７０、２７２、２７５、２７６、２７９、２８１～２８３、２８５、２８７、２９１～２９４、２９７、３０４、３０７、３２１、および３２３のうちのいずれか１つに記載の配列またはそれらの改変バージョンを含む、項目１２０に記載の薬剤。
(項目１２２)
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１つ以上のホスホロチオエート結合および／または１つ以上の２’－メトキシエチル修飾塩基を含む、項目１２０または１２１に記載の薬剤。
(項目１２３)
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエート骨格、２’－メトキシエチル修飾塩基の５’ウィング、ＤＮＡの中央１０ヌクレオチドコア、および２’－メトキシエチル修飾塩基の３’ウィングを含む５－１０－５ギャップマーである、項目１２２に記載の薬剤。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21A】

【図21B】

【図22A】

【図22B】

【図22C】

【図23】

【図24A】

【図24B】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30A】

【図30B】

【図31A】

【図31B】

【図32A】

【図32B】

【図32C】

【図33A】

【図33B】

【図33C】

【図33D】

【図33E】

【図34A】

【図34B】

【図34C】

【図34D】

【図35A】

【図35B】

【図35C】

【図35D】

【図36A】

【図36B】

【図36C】

【図36D】

【図37A】

【図37B】

【図37C】

【図38A】

【図38B】

【図38C】

【図38D】

【図38E】

【図38F】

【図39A】

【図39B】

【図39C】

【図39D】

【図39E】

【図39F】

【図40】

【図41A】

【図41B】

【図41C】

【図42A】

【図42B】

【図42C】

【図43】

【配列表】

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