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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-04-11
(45)【発行日】2025-04-21
(54)【発明の名称】ヘリカーゼ阻害剤に対するがん細胞の感受性を予測する方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/68 20180101AFI20250414BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20250414BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20250414BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20250414BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250414BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALN20250414BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/68 ZNA
G01N33/15 Z
C12N15/113 130Z
A61K31/713
A61P35/00
C12Q1/6869 Z
【請求項の数】
18
(21)【出願番号】P 2021558479
(86)(22)【出願日】2020-11-20
(86)【国際出願番号】 JP2020043487
(87)【国際公開番号】W WO2021100869
(87)【国際公開日】2021-05-27
【審査請求日】2023-11-15
(31)【優先権主張番号】P 2019210304
(32)【優先日】2019-11-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000003311
【氏名又は名称】中外製薬株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110001047
【氏名又は名称】弁理士法人セントクレスト国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】坂本 洋
(72)【発明者】
【氏名】加島 健史
(72)【発明者】
【氏名】小笠原 清基
(72)【発明者】
【氏名】大手 友貴
(72)【発明者】
【氏名】曽我 真弓
【審査官】西 賢二
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１９－０１９０８２（ＪＰ，Ａ）
【文献】LIEB, Simone et al.，Werner syndrome helicase is a selective vulnerability of microsatellite instability-high tumor cells，eLIFE，2019年03月25日，8:e43333，1-22
【文献】MEISS, Alice E. et al.，Clinicopathologic characterization of breast carcinomas in patients with non-BRCA germline mutations: results from a single institution's high-risk population，Human Pathology，2018年，Volume 82，20-31
【文献】WESSENDORF , Petra et al.，Deficiency of the DNA repair protein nibrin increases the basal but not the radiation induced mutation frequency in vivo，Mutat Res.，2014年，769，11-16
【文献】JIA, Pan-Pan et al.，Role of human DNA2 (hDNA2) as a potential target for cancer and other diseases: A systematic review，DNA Repair，2017年，Volume 59，9-19
【文献】UCHIZAKA, Naoki，MRE11 point mutation from two brothers with lung cancer，日本小児血液学会・日本小児がん学会・日本小児がん看護学会・財団法人がんの子供を守る会公開シンポジウム，Vol.51st-25th-7th-14th，2009年，101
【文献】CHENG, Wen-Hsing et al.，Targeting Werner syndrome protein sensitizes U-2 OS osteosarcoma cells to selenium-induced DNA damage response and necrotic death，Biochemical and Biophysical Research Communications，2012年，420，24-28
【文献】Moles R. et al.，WRN-targeted therapy using inhibitors NSC 19630 and NSC 617145 induce apoptosis in HTLV-1-transformed adult T-cell leukemia cells，Journal of Hematolology & Oncology，2016年，9:121，pp.1-11
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ１５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｑ １／００－ １／７０
Ｇ０１Ｎ３３／００－３３／９８
Ａ６１Ｋ４５／００－４５／０８
Ａ６１Ｐ３５／００－３５／０４
Ａ６１Ｐ４３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
がん細胞の、ヘリカーゼ阻害剤に対する感受性を予測する方法であり、ＴＴＫの機能欠失型変異及びＲＡＤ５０の機能欠失型変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異が検出されたがん細胞を、ヘリカーゼ阻害剤に対して感受性があると予測する工程、
を含み、
前記ヘリカーゼ阻害剤がＷＲＮ阻害剤である、方法。
【請求項2】
がん細胞の、ヘリカーゼ阻害剤に対する感受性を予測する方法であり、（ａ）がん細胞におけるＴＴＫの機能欠失型変異及びＲＡＤ５０の機能欠失型変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記変異が検出されたがん細胞を、ヘリカーゼ阻害剤に対して感受性があると予測する工程と、
を含み、
前記ヘリカーゼ阻害剤がＷＲＮ阻害剤である、方法。
【請求項3】
がん患者の、ヘリカーゼ阻害剤による治療に対する感受性を予測する方法であり、がん患者由来の試料に含まれるがん細胞においてＴＴＫの機能欠失型変異及びＲＡＤ５０の機能欠失型変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異が検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤による治療に対して感受性があると予測する工程、
を含み、
前記ヘリカーゼ阻害剤がＷＲＮ阻害剤である、方法。
【請求項4】
がん患者の、ヘリカーゼ阻害剤による治療に対する感受性を予測する方法であり、（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＴＴＫの機能欠失型変異及びＲＡＤ５０の機能欠失型変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記がん細胞において前記変異が検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤による治療に対して感受性があると予測する工程と、
を含み、
前記ヘリカーゼ阻害剤がＷＲＮ阻害剤である、方法。
【請求項5】
ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象とするがん患者を選別する方法であり、がん患者由来の試料に含まれるがん細胞においてＴＴＫの機能欠失型変異及びＲＡＤ５０の機能欠失型変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異が検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象として選別する工程、
を含み、
前記ヘリカーゼ阻害剤がＷＲＮ阻害剤である、方法。
【請求項6】
ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象とするがん患者を選別する方法であり、（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＴＴＫの機能欠失型変異及びＲＡＤ５０の機能欠失型変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記がん細胞において前記変異が検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象として選別する工程と、
を含み、
前記ヘリカーゼ阻害剤がＷＲＮ阻害剤である、方法。
【請求項7】
前記がん細胞が、ＭＳＨ３の機能欠失型変異がさらに検出されるがん細胞である、請求項１～６のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
ＴＴＫの機能欠失型変異及びＲＡＤ５０の機能欠失型変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異が検出されるがん細胞を含むがんの治療に用いる化合物のスクリーニング方法であり、ヘリカーゼを阻害するか否かを指標として化合物を選別する工程
を含み、
前記ヘリカーゼがＷＲＮである、方法。
【請求項9】
ヘリカーゼを阻害する化合物を有効成分として含有し、がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＴＴＫの機能欠失型変異及びＲＡＤ５０の機能欠失型変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出し、前記がん細胞において前記変異が検出されたがん患者に投与するための、がんの治療剤であり、
前記ヘリカーゼがＷＲＮである、がん治療剤。
【請求項10】
がん細胞の、ヘリカーゼ阻害剤に対する感受性を予測する方法であり、ＲＡＤ５０の機能欠失型変異、ＭＲＥ１１の機能欠失型変異、ＮＢＮの機能欠失型変異、ＤＮＡ２の機能欠失型変異、及びＲＢＢＰ８の機能欠失型変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異が検出されたがん細胞を、ヘリカーゼ阻害剤に対して感受性があると予測する工程、
を含み、
前記ヘリカーゼ阻害剤がＷＲＮ阻害剤である、方法。
【請求項11】
がん細胞の、ヘリカーゼ阻害剤に対する感受性を予測する方法であり、（ａ）がん細胞におけるＲＡＤ５０の機能欠失型変異、ＭＲＥ１１の機能欠失型変異、ＮＢＮの機能欠失型変異、ＤＮＡ２の機能欠失型変異、及びＲＢＢＰ８の機能欠失型変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記変異が検出されたがん細胞を、ヘリカーゼ阻害剤に対して感受性があると予測する工程と、
を含み、
前記ヘリカーゼ阻害剤がＷＲＮ阻害剤である、方法。
【請求項12】
がん患者の、ヘリカーゼ阻害剤による治療に対する感受性を予測する方法であり、がん患者由来の試料に含まれるがん細胞においてＲＡＤ５０の機能欠失型変異、ＭＲＥ１１の機能欠失型変異、ＮＢＮの機能欠失型変異、ＤＮＡ２の機能欠失型変異、及びＲＢＢＰ８の機能欠失型変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異が検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤による治療に対して感受性があると予測する工程、
を含み、
前記ヘリカーゼ阻害剤がＷＲＮ阻害剤である、方法。
【請求項13】
がん患者の、ヘリカーゼ阻害剤による治療に対する感受性を予測する方法であり、（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＲＡＤ５０の機能欠失型変異、ＭＲＥ１１の機能欠失型変異、ＮＢＮの機能欠失型変異、ＤＮＡ２の機能欠失型変異、及びＲＢＢＰ８の機能欠失型変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記がん細胞において前記変異が検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤による治療に対して感受性があると予測する工程と、
を含み、
前記ヘリカーゼ阻害剤がＷＲＮ阻害剤である、方法。
【請求項14】
ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象とするがん患者を選別する方法であり、がん患者由来の試料に含まれるがん細胞においてＲＡＤ５０の機能欠失型変異、ＭＲＥ１１の機能欠失型変異、ＮＢＮの機能欠失型変異、ＤＮＡ２の機能欠失型変異、及びＲＢＢＰ８の機能欠失型変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異が検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象として選別する工程、
を含み、
前記ヘリカーゼ阻害剤がＷＲＮ阻害剤である、方法。
【請求項15】
ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象とするがん患者を選別する方法であり、（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＲＡＤ５０の機能欠失型変異、ＭＲＥ１１の機能欠失型変異、ＮＢＮの機能欠失型変異、ＤＮＡ２の機能欠失型変異、及びＲＢＢＰ８の機能欠失型変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記がん細胞において前記変異が検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象として選別する工程と、
を含み、
前記ヘリカーゼ阻害剤がＷＲＮ阻害剤である、方法。
【請求項16】
前記がん細胞が、ＥＸＯ１の機能欠失型変異、ＲＰＡ１の機能欠失型変異、ＲＰＡ２の機能欠失型変異、及びＲＰＡ３の機能欠失型変異からなる第３群から選択される少なくとも１種の変異がさらに検出されるがん細胞である、請求項１０～１５のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
ＲＡＤ５０の機能欠失型変異、ＭＲＥ１１の機能欠失型変異、ＮＢＮの機能欠失型変異、ＤＮＡ２の機能欠失型変異、及びＲＢＢＰ８の機能欠失型変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異が検出されるがん細胞を含むがんの治療に用いる化合物のスクリーニング方法であり、ヘリカーゼを阻害するか否かを指標として化合物を選別する工程
を含み、
前記ヘリカーゼがＷＲＮである、方法。
【請求項18】
ヘリカーゼを阻害する化合物を有効成分として含有し、がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＲＡＤ５０の機能欠失型変異、ＭＲＥ１１の機能欠失型変異、ＮＢＮの機能欠失型変異、ＤＮＡ２の機能欠失型変異、及びＲＢＢＰ８の機能欠失型変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出し、前記がん細胞において前記変異が検出されたがん患者に投与するための、がんの治療剤であり、
前記ヘリカーゼがＷＲＮである、がん治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヘリカーゼ阻害剤に対するがん細胞の感受性を予測する方法に関する。また本発明は、ヘリカーゼ阻害剤による治療に対するがん患者の感受性を予測する方法、ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象とするがん患者を選別する方法、がんの治療方法、がんの治療に用いる化合物のスクリーニング方法、及びがん治療剤に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、ゲノムシークエンス技術の急速な進歩によって、がん細胞における固有の遺伝子変異を含むゲノム情報を解読することが可能となっている。その中で、抗がん剤開発では、ＥＧＦＲ遺伝子変異、ＢＲＡＦ遺伝子変異、ＡＬＫ融合遺伝子等に代表されるような、機能獲得型の遺伝子変異が生じたがん細胞に特異的に、その機能を阻害する阻害剤の創薬がなされている（非特許文献１～３）。これらの遺伝子変異を有するがん細胞を標的とする、同がん細胞に特異的な治療方法は、がんへの選択性が高く、効果の高い治療方法である。
【0003】
また、例えば、ＭＳＩ－Ｈ（高頻度マイクロサテライト不安定性）を示すがん細胞においては、その生存がＷＲＮ（ウェルナーシンドロームプロテイン）に依存することが報告されており（非特許文献４～７）、ＷＲＮを阻害する治療が、かかるＭＳＩ－Ｈを示すがん細胞を特異的に標的にできると考えられている。
【0004】
一方で、ヒトのがん細胞で発見される遺伝子変異には、上記の機能獲得型のみならず、逆に機能欠失型の遺伝子変異も含まれる。機能欠失型の遺伝子変異は、その遺伝子変異特異的な創薬が困難であり、機能獲得型の遺伝子変異を有するがん細胞を標的とする治療とは異なる治療戦略が必要である。
【0005】
機能欠失型変異が生じているがん細胞を特異的に標的化できた数少ない成功例としては、ＢＲＣＡ１／２欠損型腫瘍に対するＰＡＲＰ阻害剤が挙げられる（非特許文献８）。しかしながら、これ以外の機能欠失型変異が生じているがん細胞を特異的に標的とする治療戦略は、現在のところ、依然として開発されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【文献】Ｍａｋｏｔｏ Ｍａｅｍｏｎｄｏら，ＮＥＪＭ ２０１０ Ｊｕｎ ２４；３６２（２５），ｐ．２３８０－２３８８
【文献】Ｐａｕｌ Ｂ．Ｃｈａｐｍａｎら，ＮＥＪＭ ２０１１ Ｊｕｎ ３０；３６４（２６），ｐ．２５０７－２５１６
【文献】Ｄ．Ｒｏｓｓ Ｃａｍｉｄｇｅら，Ｊ Ｔｈｏｒａｃ Ｏｎｃｏｌ．２０１９ Ｊｕｌ；１４（７），ｐ．１２３３－１２４３
【文献】Ｌｏｒｎ Ｋａｔｅｇａｙａら，ｉＳｃｉｅｎｃｅ １３，Ｍａｒｃｈ ２９，２０１９，ｐ．４８８－４９７
【文献】Ｓｉｍｏｎｅ Ｌｉｅｂら，ｅＬｉｆｅ ２０１９，８：ｅ４３３３３，ＤＯＩ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．４３３３３
【文献】Ｅｄｍｏｎｄ Ｍ．Ｃｈａｎら，Ｎａｔｕｒｅ．２０１９ Ａｐｒｉｌ，５６８（７７５３），ｐ．５５１－５５６
【文献】Ｆｉｏｎａ Ｍ Ｂｅｈａｎら，Ｎａｔｕｒｅ．２０１９ Ａｐｒｉｌ，５６８（７７５３），ｐ．５１１－５１６
【文献】Ｋ．Ｍｏｏｒｅら，ＮＥＪＭ ２０１８ Ｄｅｃ ２７；３７９（２６），ｐ．２４９５－２５０５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は上記状況に鑑みてなされたものである。本発明は、機能欠失型変異が生じているがん細胞をも特異的に標的とすることが可能な治療戦略の開発を目的とするものであり、より具体的には、ＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異、及び／又は、ＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異が検出されるがん細胞を特異的に標的とする治療戦略の開発を目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ね、先ず、約７０株のがん細胞株について網羅的に、ｓｉＲＮＡによるＷＲＮの発現抑制をおこない、増殖の抑制が確認された細胞株に共通する変異を解析した。その結果、ＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異（好ましくは、機能欠失型変異）が生じているがん細胞に共通して、ＷＲＮ等のヘリカーゼの発現抑制や機能阻害を行うと、当該がん細胞の増殖が顕著に抑制される一方、ＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異のうちのいずれも生じていない細胞においては、このような増殖抑制が生じないことを見出した。
【0009】
さらに本発明者らは、対象のがん細胞株を追加し、上記約７０株のがん細胞株を含む約２００株のがん細胞株について網羅的に解析した。その結果、上記第１群から選択される変異に加えて、ＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異（好ましくは、機能欠失型変異）が生じているがん細胞においても共通して、ヘリカーゼの発現抑制や機能阻害を行うと、当該がん細胞の増殖が抑制されることを見出した。
【0010】
また、上記の変異は、例えば、ＭＳＩ－Ｈを示すがん細胞でも高頻度で確認される変異の一部である。上記のように、ＭＳＩ－Ｈは、ヘリカーゼであるＷＲＮを阻害する治療の標的となるがん細胞選択のための指標とできると考えられている（例えば、非特許文献４～７）。しかしながら、本発明者らは、ＭＳＩ－Ｈを示していても、上記の変異、特に、上記第２群から選択される変異のうちのいずれも生じていないがん細胞においては、上記の増殖抑制が生じないことを見出した。よって、上記の新たに見出された変異は、ＭＳＩ－Ｈを示すか否かに関わらず、ヘリカーゼを阻害する治療の標的となるがん細胞選択のための指標とすることができ、かつ、ＭＳＩ－Ｈよりも前記がん細胞選択のためのより特異的な指標とすることができる。
【0011】
そのため、本発明者らは、ヘリカーゼを阻害する治療が、ＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異、及び／又は、ＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異が生じているがん細胞を標的とする治療のための有望なアプローチとなることを見出した。また、この治療戦略においては、がん患者を前記変異を指標に選別した上で、ヘリカーゼ阻害剤を投与できるため、コンパニオン診断に基づく効率的な治療が可能であることも明らかとなった。
【0012】
さらに、本発明者らは、前記変異が生じているがんの治療に有用な薬剤のスクリーニングを、ヘリカーゼを阻害するか否かを指標に行うことができることをも見出し、本発明を完成するに至った。
【0013】
したがって、本発明は、ＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異、及び／又は、ＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異が生じているがん細胞を特異的に標的とする治療方法及び当該治療方法のためのコンパニオン診断にも関するものであり、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
［１］
がん細胞の、ヘリカーゼ阻害剤に対する感受性を予測する方法であり、
ＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異が検出されたがん細胞を、ヘリカーゼ阻害剤に対して感受性があると予測する工程、
を含む、方法。
［２］
がん細胞の、ヘリカーゼ阻害剤に対する感受性を予測する方法であり、
（ａ）がん細胞におけるＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記変異が検出されたがん細胞を、ヘリカーゼ阻害剤に対して感受性があると予測する工程と、
を含む、方法。
［３］
がん患者の、ヘリカーゼ阻害剤による治療に対する感受性を予測する方法であり、
がん患者由来の試料に含まれるがん細胞においてＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異が検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤による治療に対して感受性があると予測する工程、
を含む、方法。
［４］
がん患者の、ヘリカーゼ阻害剤による治療に対する感受性を予測する方法であり、
（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記がん細胞において前記変異が検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤による治療に対して感受性があると予測する工程と、
を含む、方法。
［５］
ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象とするがん患者を選別する方法であり、
がん患者由来の試料に含まれるがん細胞においてＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異が検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象として選別する工程、
を含む、方法。
［６］
ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象とするがん患者を選別する方法であり、
（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記がん細胞において前記変異が検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象として選別する工程と、
を含む、方法。
［７］
がんを治療する方法であり、
がん患者由来の試料に含まれるがん細胞においてＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異が検出されたがん患者に対して、ヘリカーゼ阻害剤を投与する工程、
を含む、方法。
［８］
がんを治療する方法であり、
（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記がん細胞において前記変異が検出されたがん患者に対して、ヘリカーゼ阻害剤を投与する工程と、
を含む、方法。
［９］
前記ヘリカーゼ阻害剤が、ＷＲＮ阻害剤である、［１］～［８］のうちのいずれかに記載の方法。
［１０］
前記がん細胞が、ＭＳＨ３の変異がさらに検出されるがん細胞である、［１］～［９］のうちのいずれかに記載の方法。
［１１］
ＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異が検出されるがん細胞を含むがんの治療に用いる化合物のスクリーニング方法であり、
ヘリカーゼを阻害するか否かを指標として化合物を選別する工程
を含む、方法。
［１２］
ヘリカーゼを阻害する化合物を有効成分として含有し、ＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる群から選択される少なくとも１種の変異が検出されるがん細胞を含むがんの治療剤である、がん治療剤。
［１３］
前記ヘリカーゼが、ＷＲＮである、［１１］に記載の方法。
［１４］
前記ヘリカーゼが、ＷＲＮである、［１２］に記載のがん治療剤。
［１５］
がん細胞の、ヘリカーゼ阻害剤に対する感受性を予測する方法であり、
ＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異が検出されたがん細胞を、ヘリカーゼ阻害剤に対して感受性があると予測する工程、
を含む、方法。
［１６］
がん細胞の、ヘリカーゼ阻害剤に対する感受性を予測する方法であり、
（ａ）がん細胞におけるＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記変異が検出されたがん細胞を、ヘリカーゼ阻害剤に対して感受性があると予測する工程と、
を含む、方法。
［１７］
がん患者の、ヘリカーゼ阻害剤による治療に対する感受性を予測する方法であり、
がん患者由来の試料に含まれるがん細胞においてＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異が検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤による治療に対して感受性があると予測する工程、
を含む、方法。
［１８］
がん患者の、ヘリカーゼ阻害剤による治療に対する感受性を予測する方法であり、
（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記がん細胞において前記変異が検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤による治療に対して感受性があると予測する工程と、
を含む、方法。
［１９］
ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象とするがん患者を選別する方法であり、
がん患者由来の試料に含まれるがん細胞においてＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異が検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象として選別する工程、
を含む、方法。
［２０］
ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象とするがん患者を選別する方法であり、
（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記がん細胞において前記変異が検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象として選別する工程と、
を含む、方法。
［２１］
がんを治療する方法であり、
がん患者由来の試料に含まれるがん細胞においてＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異が検出されたがん患者に対して、ヘリカーゼ阻害剤を投与する工程、
を含む、方法。
［２２］
がんを治療する方法であり、
（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記がん細胞において前記変異が検出されたがん患者に対して、ヘリカーゼ阻害剤を投与する工程と、
を含む、方法。
［２３］
前記ヘリカーゼ阻害剤が、ＷＲＮ阻害剤である、請求項［１５］～［２２］のうちのいずれか一項に記載の方法。
［２４］
前記がん細胞が、ＥＸＯ１の変異、ＲＰＡ１の変異、ＲＰＡ２の変異、及びＲＰＡ３の変異からなる第３群から選択される少なくとも１種の変異がさらに検出されるがん細胞である、［１５］～［２３］のうちのいずれか一項に記載の方法。
［２５］
ＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異が検出されるがん細胞を含むがんの治療に用いる化合物のスクリーニング方法であり、
ヘリカーゼを阻害するか否かを指標として化合物を選別する工程
を含む、方法。
［２６］
ヘリカーゼを阻害する化合物を有効成分として含有し、ＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異が検出されるがん細胞を含むがんの治療剤である、がん治療剤。
［２７］
前記ヘリカーゼが、ＷＲＮである、［２５］に記載の方法。
［２８］
前記ヘリカーゼが、ＷＲＮである、［２６］に記載のがん治療剤。
［１］
がん細胞の、ヘリカーゼ阻害剤に対する感受性を予測する方法であり、
ＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異が検出されたがん細胞を、ヘリカーゼ阻害剤に対して感受性があると予測する工程、
を含む、方法。
［２］
がん細胞の、ヘリカーゼ阻害剤に対する感受性を予測する方法であり、
（ａ）がん細胞におけるＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記変異が検出されたがん細胞を、ヘリカーゼ阻害剤に対して感受性があると予測する工程と、
を含む、方法。
［３］
がん患者の、ヘリカーゼ阻害剤による治療に対する感受性を予測する方法であり、
がん患者由来の試料に含まれるがん細胞においてＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異が検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤による治療に対して感受性があると予測する工程、
を含む、方法。
［４］
がん患者の、ヘリカーゼ阻害剤による治療に対する感受性を予測する方法であり、
（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記がん細胞において前記変異が検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤による治療に対して感受性があると予測する工程と、
を含む、方法。
［５］
ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象とするがん患者を選別する方法であり、
がん患者由来の試料に含まれるがん細胞においてＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異が検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象として選別する工程、
を含む、方法。
［６］
ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象とするがん患者を選別する方法であり、
（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記がん細胞において前記変異が検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象として選別する工程と、
を含む、方法。
［７］
がんを治療する方法であり、
がん患者由来の試料に含まれるがん細胞においてＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異が検出されたがん患者に対して、ヘリカーゼ阻害剤を投与する工程、
を含む、方法。
［８］
がんを治療する方法であり、
（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記がん細胞において前記変異が検出されたがん患者に対して、ヘリカーゼ阻害剤を投与する工程と、
を含む、方法。
［９］
前記ヘリカーゼ阻害剤が、ＷＲＮ阻害剤である、［１］～［８］のうちのいずれかに記載の方法。
［１０］
前記がん細胞が、ＭＳＨ３の変異がさらに検出されるがん細胞である、［１］～［９］のうちのいずれかに記載の方法。
［１１］
ＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異が検出されるがん細胞を含むがんの治療に用いる化合物のスクリーニング方法であり、
ヘリカーゼを阻害するか否かを指標として化合物を選別する工程
を含む、方法。
［１２］
ヘリカーゼを阻害する化合物を有効成分として含有し、ＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる群から選択される少なくとも１種の変異が検出されるがん細胞を含むがんの治療剤である、がん治療剤。
［１３］
前記ヘリカーゼが、ＷＲＮである、［１１］に記載の方法。
［１４］
前記ヘリカーゼが、ＷＲＮである、［１２］に記載のがん治療剤。
［１５］
がん細胞の、ヘリカーゼ阻害剤に対する感受性を予測する方法であり、
ＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異が検出されたがん細胞を、ヘリカーゼ阻害剤に対して感受性があると予測する工程、
を含む、方法。
［１６］
がん細胞の、ヘリカーゼ阻害剤に対する感受性を予測する方法であり、
（ａ）がん細胞におけるＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記変異が検出されたがん細胞を、ヘリカーゼ阻害剤に対して感受性があると予測する工程と、
を含む、方法。
［１７］
がん患者の、ヘリカーゼ阻害剤による治療に対する感受性を予測する方法であり、
がん患者由来の試料に含まれるがん細胞においてＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異が検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤による治療に対して感受性があると予測する工程、
を含む、方法。
［１８］
がん患者の、ヘリカーゼ阻害剤による治療に対する感受性を予測する方法であり、
（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記がん細胞において前記変異が検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤による治療に対して感受性があると予測する工程と、
を含む、方法。
［１９］
ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象とするがん患者を選別する方法であり、
がん患者由来の試料に含まれるがん細胞においてＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異が検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象として選別する工程、
を含む、方法。
［２０］
ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象とするがん患者を選別する方法であり、
（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記がん細胞において前記変異が検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象として選別する工程と、
を含む、方法。
［２１］
がんを治療する方法であり、
がん患者由来の試料に含まれるがん細胞においてＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異が検出されたがん患者に対して、ヘリカーゼ阻害剤を投与する工程、
を含む、方法。
［２２］
がんを治療する方法であり、
（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記がん細胞において前記変異が検出されたがん患者に対して、ヘリカーゼ阻害剤を投与する工程と、
を含む、方法。
［２３］
前記ヘリカーゼ阻害剤が、ＷＲＮ阻害剤である、請求項［１５］～［２２］のうちのいずれか一項に記載の方法。
［２４］
前記がん細胞が、ＥＸＯ１の変異、ＲＰＡ１の変異、ＲＰＡ２の変異、及びＲＰＡ３の変異からなる第３群から選択される少なくとも１種の変異がさらに検出されるがん細胞である、［１５］～［２３］のうちのいずれか一項に記載の方法。
［２５］
ＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異が検出されるがん細胞を含むがんの治療に用いる化合物のスクリーニング方法であり、
ヘリカーゼを阻害するか否かを指標として化合物を選別する工程
を含む、方法。
［２６］
ヘリカーゼを阻害する化合物を有効成分として含有し、ＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異が検出されるがん細胞を含むがんの治療剤である、がん治療剤。
［２７］
前記ヘリカーゼが、ＷＲＮである、［２５］に記載の方法。
［２８］
前記ヘリカーゼが、ＷＲＮである、［２６］に記載のがん治療剤。
【発明の効果】
【0014】
本発明によれば、ＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異、及び／又は、ＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異を指標として、効率的に、ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療への感受性を予測することが可能となる。また、本発明によれば、がん患者由来の試料における前記変異の有無を検出し、当該変異が検出された患者を選別した上で、当該患者に対してヘリカーゼ阻害剤によるがんの治療を施すことができる。このため、がんの治療成績を大きく向上させることが可能となる。また、ＴＴＫ及びＲＡＤ５０からなる第１群から選択される少なくとも１種の遺伝子、及び／又は、ＲＡＤ５０、ＭＲＥ１１、ＮＢＮ（ＮＢＳ１をコードする遺伝子）、ＤＮＡ２、及びＲＢＢＰ８（ＣｔＩＰをコードする遺伝子）からなる第２群から選択される少なくとも１種の遺伝子に対するオリゴヌクレオチドプローブやプライマー、並びに、ＴＴＫタンパク質及びＲＡＤ５０タンパク質からなる第１群から選択される少なくとも１種のタンパク質、及び／又は、ＲＡＤ５０タンパク質、ＭＲＥ１１タンパク質、ＮＢＳ１タンパク質、ＤＮＡ２タンパク質、及びＣｔＩＰタンパク質からなる第２群から選択される少なくとも１種のタンパク質に対する抗体を用いることで、上記変異の有無の検出によるコンパニオン診断を効率的に行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】試験例１における、がん細胞株のＷＲＮ発現抑制による細胞生存率を示すグラフである。
【図2】試験例２における、がん細胞株のＷＲＮ発現抑制による細胞生存率を示すグラフである。
【図3】試験例３における、がん細胞株のＷＲＮ発現抑制による細胞生存率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0016】
以下、本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。
【0017】
＜ヘリカーゼ阻害剤に対するがん細胞の感受性を予測する方法、ヘリカーゼ阻害剤による治療に対するがん患者の感受性を予測する方法、ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象とするがん患者を選別する方法＞
本発明において、ＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異（本明細書中、場合により「ＴＴＫ変異及び／又はＲＡＤ５０変異」又は「第１群の変異」という）、好ましくは、機能欠失型変異、が生じているがん細胞において、ヘリカーゼを阻害すると、当該がん細胞の増殖を抑制しうることが見出された。さらに追加して、ＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異（本明細書中、場合により「第２群の変異」という）、好ましくは、機能欠失型変異、が生じているがん細胞においても、ヘリカーゼを阻害すると、当該がん細胞の増殖を抑制しうることが見出された。
本発明において、ＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異（本明細書中、場合により「ＴＴＫ変異及び／又はＲＡＤ５０変異」又は「第１群の変異」という）、好ましくは、機能欠失型変異、が生じているがん細胞において、ヘリカーゼを阻害すると、当該がん細胞の増殖を抑制しうることが見出された。さらに追加して、ＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異（本明細書中、場合により「第２群の変異」という）、好ましくは、機能欠失型変異、が生じているがん細胞においても、ヘリカーゼを阻害すると、当該がん細胞の増殖を抑制しうることが見出された。
【0018】
これらの知見に基づけば、第１群の変異及び／又は第２群の変異を指標として、がん細胞の、ヘリカーゼ阻害剤に対する感受性を予測することができる。したがって、本発明は、
（ａ）がん細胞におけるＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記変異が検出されたがん細胞を、ヘリカーゼ阻害剤に対して感受性があると予測する工程と、
を含む、がん細胞の、ヘリカーゼ阻害剤に対する感受性を予測する方法；並びに、
（ａ）がん細胞におけるＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記変異が検出されたがん細胞を、ヘリカーゼ阻害剤に対して感受性があると予測する工程と、
を含む、がん細胞の、ヘリカーゼ阻害剤に対する感受性を予測する方法（以下、これらを総称して、場合により、「がん細胞感受性予測方法」という）を提供する。
（ａ）がん細胞におけるＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記変異が検出されたがん細胞を、ヘリカーゼ阻害剤に対して感受性があると予測する工程と、
を含む、がん細胞の、ヘリカーゼ阻害剤に対する感受性を予測する方法；並びに、
（ａ）がん細胞におけるＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記変異が検出されたがん細胞を、ヘリカーゼ阻害剤に対して感受性があると予測する工程と、
を含む、がん細胞の、ヘリカーゼ阻害剤に対する感受性を予測する方法（以下、これらを総称して、場合により、「がん細胞感受性予測方法」という）を提供する。
【0019】
また、上記知見に基づけば、第１群の変異及び／又は第２群の変異を指標として、ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療への感受性を予測することができる。したがって、本発明は、
（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記がん細胞において前記変異が検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤による治療に対して感受性があると予測する工程と、
を含む、がん患者のヘリカーゼ阻害剤による治療に対する感受性を予測する方法；並びに、
（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記がん細胞において前記変異が検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤による治療に対して感受性があると予測する工程と、
を含む、がん患者のヘリカーゼ阻害剤による治療に対する感受性を予測する方法（以下、これらを総称して、場合により、「がん患者感受性予測方法」という）を提供する。
（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記がん細胞において前記変異が検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤による治療に対して感受性があると予測する工程と、
を含む、がん患者のヘリカーゼ阻害剤による治療に対する感受性を予測する方法；並びに、
（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記がん細胞において前記変異が検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤による治療に対して感受性があると予測する工程と、
を含む、がん患者のヘリカーゼ阻害剤による治療に対する感受性を予測する方法（以下、これらを総称して、場合により、「がん患者感受性予測方法」という）を提供する。
【0020】
さらに、こうして第１群の変異及び／又は第２群の変異が検出された患者は、ヘリカーゼ阻害剤によるがんの治療に適しているといえるため、第１群の変異及び／又は第２群の変異を指標として、ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療が有効な患者と有効でない患者とを選別し、効率的な治療を行うことができる。したがって、本発明は、
（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記がん細胞において前記変異が検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象として選別する工程と、
を含む、ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象とするがん患者を選別する方法；並びに、
（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記がん細胞において前記変異が検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象として選別する工程と、
を含む、ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象とするがん患者を選別する方法（以下、これらを総称して、場合により、「がん患者選別方法」という）を提供する。
（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記がん細胞において前記変異が検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象として選別する工程と、
を含む、ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象とするがん患者を選別する方法；並びに、
（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記がん細胞において前記変異が検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象として選別する工程と、
を含む、ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象とするがん患者を選別する方法（以下、これらを総称して、場合により、「がん患者選別方法」という）を提供する。
【0021】
（試料等）
本発明において、癌（上皮性腫瘍）、白血病、悪性リンパ腫、骨髄腫、肉腫、癌肉腫などの悪性新生物等を総称して「がん」といい、前記がんを構成する細胞を「がん細胞」という。第１群の変異及び／又は第２群の変異の有無を検出しうるがん細胞を含むがんとしては、例えば、大腸がん、胃がん、子宮頸がん、子宮体がん、前立腺がん、食道がん、乳がん、肺がん、膀胱がん、頭頸部癌、腎臓がん、卵巣がん、リンパ腫、腺様嚢胞がん、膵臓がんが挙げられるが、これらに限定されない。本発明において、前記がん細胞としては、後述するＭＳＨ３の変異をさらに生じているがん細胞や、ＥＸＯ１の変異、ＲＰＡ１の変異、ＲＰＡ２の変異、及びＲＰＡ３の変異からなる第３群から選択される少なくとも１種の変異をさらに生じているがん細胞であってもよく、第１群の変異を検出する場合には、ＭＳＨ３の変異をさらに生じているがん細胞であることが好ましく、第２群の変異を検出する場合には、第３群の変異をさらに生じているがん細胞であることが好ましい。
本発明において、癌（上皮性腫瘍）、白血病、悪性リンパ腫、骨髄腫、肉腫、癌肉腫などの悪性新生物等を総称して「がん」といい、前記がんを構成する細胞を「がん細胞」という。第１群の変異及び／又は第２群の変異の有無を検出しうるがん細胞を含むがんとしては、例えば、大腸がん、胃がん、子宮頸がん、子宮体がん、前立腺がん、食道がん、乳がん、肺がん、膀胱がん、頭頸部癌、腎臓がん、卵巣がん、リンパ腫、腺様嚢胞がん、膵臓がんが挙げられるが、これらに限定されない。本発明において、前記がん細胞としては、後述するＭＳＨ３の変異をさらに生じているがん細胞や、ＥＸＯ１の変異、ＲＰＡ１の変異、ＲＰＡ２の変異、及びＲＰＡ３の変異からなる第３群から選択される少なくとも１種の変異をさらに生じているがん細胞であってもよく、第１群の変異を検出する場合には、ＭＳＨ３の変異をさらに生じているがん細胞であることが好ましく、第２群の変異を検出する場合には、第３群の変異をさらに生じているがん細胞であることが好ましい。
【0022】
本発明において「がん患者」とは、前記がんに罹患しているヒトのみならず、前記がんに罹患していると疑いのあるヒトであってもよい。本発明の方法において、第１群の変異及び／又は第２群の変異を検出する対象となるがん患者としては特に制限はなく、全てのがん患者を対象とすることができる。
【0023】
本発明において用いられる「がん患者由来の試料」としては、第１群の変異及び／又は第２群の変異の有無を検出しうる生物学的試料であれば、特に制限はないが、好ましくはがん生検検体、血液、尿、体腔液、腫瘍細胞由来循環ＤＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ：ｃｔＤＮＡ）等の検体である。また、前記検体から得られるタンパク質抽出物や核酸抽出物（ｍＲＮＡ抽出物、ｍＲＮＡ抽出物から調製されたｃＤＮＡ調製物やｃＲＮＡ調製物等）であってもよい。本明細書において、「生物学的試料」には、がん患者由来の試料及びがん細胞培養物由来の試料が含まれる。
【0024】
（ヘリカーゼ阻害剤）
本発明における「ヘリカーゼ阻害剤」は、ヘリカーゼを阻害する化合物を少なくとも１種含有する組成物を示し、前記化合物又はその組み合わせのみからなるものであっても、下記の添加成分をさらに含むものであってもよい。本発明における「ヘリカーゼを阻害する化合物」には、ヘリカーゼの活性及びヘリカーゼの発現のうちの少なくともいずれかを阻害する化合物が含まれる。
本発明における「ヘリカーゼ阻害剤」は、ヘリカーゼを阻害する化合物を少なくとも１種含有する組成物を示し、前記化合物又はその組み合わせのみからなるものであっても、下記の添加成分をさらに含むものであってもよい。本発明における「ヘリカーゼを阻害する化合物」には、ヘリカーゼの活性及びヘリカーゼの発現のうちの少なくともいずれかを阻害する化合物が含まれる。
【0025】
本発明においてヘリカーゼ阻害剤の標的となる「ヘリカーゼ」としては、特に制限されず、例えば、ＲｅｃＱヘリカーゼ（ＲｅｃＱＬ１、ＢＬＭ、ＷＲＮ、ＲｅｃＱＬ４／ＲＴＳ、ＲｅｃＱＬ５）が挙げられ、ＲｅｃＱヘリカーゼであることが好ましく、ＷＲＮ（ウェルナーシンドロームプロテイン）であることがより好ましい。ヒト由来の天然型ＷＲＮをコードするゲノムＤＮＡの典型的な塩基配列を配列番号：１に、ヒト由来の天然型ＷＲＮの典型的なアミノ酸配列を配列番号：２に、それぞれ示す。なお、アミノ酸配列の置換、欠失、挿入、及び付加等を伴う変異を生じていないＷＲＮ遺伝子（ＷＲＮをコードする遺伝子）であっても、多型などによって、配列には個体差が生じうる。
【0026】
化合物が前記ヘリカーゼの活性を阻害することは、例えば、蛍光分子と、消光分子で各鎖を標識した二本鎖ＤＮＡと、前記ヘリカーゼとを含む系であって、当該ヘリカーゼ活性により一本鎖ＤＮＡにほどかれると蛍光分子と消光分子が離れて蛍光を発する系に、被検化合物を添加して、当該蛍光の発生の抑制を検出することにより確認できる（Ｓｏｍｍｅｒｓ ＪＡら，Ａ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｎｏｖｅｌ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｅｒｎｅｒ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｈｅｌｉｃａｓｅ－Ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＷＲＮ），ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１９ Ｊａｎ ９；１４（１）：ｅ０２１０５２５）。
【0027】
また、化合物が前記ヘリカーゼの発現を阻害することは、例えば、被検化合物で処理した細胞におけるヘリカーゼ（好ましくはＷＲＮ）の発現低下を検出することにより確認することができる。ヘリカーゼの発現低下の検出法としては、通常、ヘリカーゼの発現量を転写レベル又は翻訳レベルで検出し、対照（例えば、被検化合物で処理していない細胞の発現量）との比較において、それよりも発現量が少ないことを確認する方法が挙げられる。
【0028】
前記ヘリカーゼの発現量を転写レベルで検出する方法においては、先ず、被検化合物で処理した細胞からＲＮＡ又はｃＤＮＡを調製する。前記細胞からＲＮＡを抽出する方法としては特に制限はなく、公知の方法を適宜選択して用いることができ、例えば、フェノールとカオトロピック塩とを用いた抽出方法（より具体的には、トリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、アイソジェン（和光純薬社製）等の市販キットを用いた抽出方法）や、その他市販キット（ＲＮＡＰｒｅｐトータルＲＮＡ抽出キット（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）等）を用いた方法が挙げられる。さらに、抽出したＲＮＡからのｃＤＮＡの調製に用いる逆転写酵素としては、特に制限されることなく、例えば、ＲＡＶ（Ｒｏｕｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）やＡＭＶ（Ａｖｉａｎ ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）等のレトロウィルス由来の逆転写酵素や、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）等のマウスのレトロウィルス由来の逆転写酵素が挙げられる。
【0029】
次いで、オリゴヌクレオチドプライマー又はオリゴヌクレオチドプローブをそれぞれ増幅反応又はハイブリダイゼーション反応に用い、その増幅産物又はハイブリッド産物を検出する。このような方法としては、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ法、ノザンブロット法、ドットブロット法、ＤＮＡアレイ法、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ法、ｍＲＮＡ－ｓｅｑなどを利用できる。当業者であれば、前記ヘリカーゼをコードするｃＤＮＡの塩基配列を基に、各方法に適したオリゴヌクレオチドプライマーやオリゴヌクレオチドプローブを常法により設計することができる。
【0030】
前記ヘリカーゼの発現量を翻訳レベルで検出する方法においては、先ず、被検化合物で処理した細胞からタンパク質試料を調製する。次いで、前記ヘリカーゼに特異的な抗体を用いて抗原抗体反応を行い、当該ヘリカーゼを検出する。このような抗体を用いたタンパク質の検出法においては、例えば、前記タンパク質試料に対して、ヘリカーゼに特異的な抗体を添加して抗原抗体反応を行い、ヘリカーゼに対する前記抗体の結合を検出する。ヘリカーゼに特異的な抗体が標識されている場合には、直接的にヘリカーゼを検出することができるが、標識されていない場合には、さらに、当該抗体を認識する標識された分子（例えば、二次抗体やプロテインＡ）を作用させて、当該分子の標識を利用して、間接的にヘリカーゼを検出することができる。このような方法としては、例えば、免疫組織化学（免疫染色）法、ウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー、イメージングサイトメトリー、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法、抗体アレイを用いた解析法等を利用することができる。
【0031】
使用する抗体の種類や由来などは特に制限はないが、好ましくはモノクローナル抗体である。十分な特異性でヘリカーゼを検出可能である限り、オリゴクローナル抗体（数種～数十種の抗体の混合物）やポリクローナル抗体を用いることもできる。また、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、ｄｓＦｖ、及びダイアボディー等の、抗体の機能的断片やその多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）を用いることもできる。抗ヘリカーゼ抗体としては、市販品であってもよい。
【0032】
前記ヘリカーゼの検出は、質量分析法（ＭＳ）を使用して行うこともできる。特に液体クロマトグラフィーと連結した質量分析計（ＬＣ／ＭＳ）による解析は鋭敏であるため有利である。質量分析法による検出は、例えば、前記タンパク質試料に対して、当該タンパク質を標識し、標識したタンパク質を分画し、分画したタンパク質を質量分析に供し、質量分析値からヘリカーゼを同定することにより、行うことができる。標識としては、当技術分野で公知の同位体標識試薬を用いることができ、適当な標識試薬を市販品として入手することができる。また分画も当技術分野で公知の方法により行うことができ、例えば市販の強陽イオンカラム等を用いて行うことができる。
【0033】
本発明における「ヘリカーゼを阻害する化合物」としては特に制限はなく、公知の化合物であってもよく、後述のスクリーニングにより同定される化合物であってもよいが、化合物、ポリペプチド、及びポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。
【0034】
前記化合物としては、低分子化合物（分子量９００未満）、中分子化合物（分子量９００～２０００）が挙げられる。前記ポリペプチドには、遺伝子にコードされる完全長のポリペプチドの他、その断片や合成したポリペプチド、環状ポリペプチド、糖ペプチド、非天然型のポリペプチドも含まれる。また、前記ポリペプチドには抗体及び抗原ペプチドも含み、前記抗体としては、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。前記抗体には、完全抗体の他、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、ｄｓＦｖ、及びダイアボディー等）やその多量体、抗体の可変領域を結合させた低分子化抗体も含む。前記ポリヌクレオチドとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡが挙げられ、完全長のポリヌクレオチドの他、その断片や合成したポリヌクレオチドも含む。
【0035】
本発明における「ヘリカーゼ阻害剤」は、その特性に応じて、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤などの各種剤型とすることができ、また、その剤型に応じて、薬理学上許容される、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤などの添加成分をさらに含有していてもよく、これらを用いて公知の製剤学的方法により製造することができる。
【0036】
また、本発明に係るヘリカーゼ阻害剤において、前記ヘリカーゼを阻害する化合物の含有量（前記化合物が２種以上である場合にはそれらの合計含有量）は、その剤型や使用目的に応じて適宜調整することができる。
【0037】
（第１群の変異、第２群の変異）
〔ＴＴＫ〕
本発明における「ＴＴＫ」は、中心体複製や有糸分裂チェックポイント応答の制御に関与するセリンスレオニンキナーゼ（本明細書中、場合により「ＴＴＫタンパク質」という）をコードする遺伝子である。ヒト由来の天然型ＴＴＫゲノムＤＮＡの典型的な塩基配列を配列番号：３に、ヒト由来の天然型ＴＴＫタンパク質の典型的なアミノ酸配列を配列番号：４に、それぞれ示す。なお、アミノ酸配列の置換、欠失、挿入、及び付加等を伴う変異を生じていないＴＴＫであっても、多型などによって、配列には個体差が生じうる。
〔ＴＴＫ〕
本発明における「ＴＴＫ」は、中心体複製や有糸分裂チェックポイント応答の制御に関与するセリンスレオニンキナーゼ（本明細書中、場合により「ＴＴＫタンパク質」という）をコードする遺伝子である。ヒト由来の天然型ＴＴＫゲノムＤＮＡの典型的な塩基配列を配列番号：３に、ヒト由来の天然型ＴＴＫタンパク質の典型的なアミノ酸配列を配列番号：４に、それぞれ示す。なお、アミノ酸配列の置換、欠失、挿入、及び付加等を伴う変異を生じていないＴＴＫであっても、多型などによって、配列には個体差が生じうる。
【0038】
本発明における「ＴＴＫの変異」としては、ＴＴＫタンパク質のアミノ酸配列におけるアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び付加が挙げられる。このようなＴＴＫの変異としては、ＴＴＫタンパク質が本来有している活性が変化しているものである限り特に制限されないが、ＴＴＫタンパク質活性の低下（ＴＴＫタンパク質活性の完全な喪失（不活性化）を含む）を引き起こす変異、すなわち、機能欠失型変異であることが好ましい。ＴＴＫタンパク質活性の低下は、例えば、ＴＴＫにおけるミスセンス変異、全領域にわたるナンセンス変異、又はＴＴＫの全体若しくは部分的な欠失等の遺伝子構造の変化、遺伝子発現量の変化により生じうるが、これらに制限されない。
【0039】
ＴＴＫが本来有している遺伝子構造や遺伝子発現量が変化しているか否かは、例えば、次の方法：ゲノムＤＮＡのシークエンスによるＴＴＫの塩基配列の取得；ＴＴＫのヌクレオチド配列に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブによる蛍光検出；ＴＴＫのヌクレオチドに特異的に結合するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ法による検出等により、対照（例えば、健常者や同一患者の非がん組織）との比較において変化しているか否か（好ましくは機能欠失型変異が生じているか否か、ｍＲＮＡの発現量の場合には減少しているか否か）によって確認及び判定できる。
【0040】
ＴＴＫタンパク質が本来有している活性（機能活性）が変化しているか否かは、例えば、次の方法：ＴＴＫタンパク質に特異的に結合する抗体を用いた免疫染色法又はウェスタンブロッティング法による検出；及び免疫沈降法などにより精製した細胞内ＴＴＫタンパク質が基質ペプチドをリン酸化するかをウェスタンブロット法などにより判別する方法等により、対照（例えば、健常者や同一患者の非がん組織）との比較において変化しているか否か（好ましくは低下しているか否か、すなわち、免疫染色法やウェスタンブロッティング法により検出されるタンパク質の発現量の場合には対照に比べて低下しているか否か、ウェスタンブロッティング法により検出されるタンパク質の分子量の場合には対照と比べて変化しているか否か、リン酸化活性の場合には活性が対照に比べて低下しているか否か）によって確認及び判定できる。
【0041】
このようなＴＴＫタンパク質活性の変化を引き起こす具体的なＴＴＫの変異の例としては、例えば、ｐ．Ｌ８４＊（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ１６４３１５０）、ｐ．Ｓ１６２Ｖｆｓ＊９（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ３１７６１３７）、ｐ．Ｋ１９２Ｓｆｓ＊１８（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ１４４６０７９）、ｐ．Ｑ１９３Ａｆｓ＊３３（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ３１７６１４３）、ｐ．Ｒ２３２Ｓｆｓ＊２６（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ５８９５４１８）、ｐ．Ｑ４８０Ｈｆｓ＊３０（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ１５０９０２）、ｐ．Ｎ６０６Ｋｆｓ＊３（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ７７４１４０６）、ｐ．Ｓ６１８Ｉｆｓ＊３（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ６８１１３８２）、ｐ．Ｅ８５１Ｋｆｓ＊４２（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ３１７６２１４）、ｐ．Ｒ８５４Ｇｆｓ＊１０（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ１４４６０９７）、ｐ．Ｒ８５４Ｇｆｓ＊１０（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ３１７６２１８）、ｐ．Ｒ８５４Ｇｆｓ＊３９（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ２５２８９６）、ｐ．Ｒ８５４Ｋｆｓ＊１１（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ２５３１５９）、ｐ．Ｋ８５７Ｎｆｓ＊３６（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ２７３３９７）等が挙げられる。
【0042】
〔ＲＡＤ５０〕
本発明における「ＲＡＤ５０」は、下記のＭＲＥ１１タンパク質及びＮＢＳ１タンパク質と共に複合体（ＭＲＮ複合体）を形成してＤＮＡ修復機構（特に、二本鎖ＤＮＡ相同末端修復機構）に関与するタンパク質（本明細書中、場合により「ＲＡＤ５０タンパク質」という）をコードする遺伝子である。ヒト由来の天然型ＲＡＤ５０ゲノムＤＮＡの典型的な塩基配列を配列番号：５に、ヒト由来の天然型ＲＡＤ５０タンパク質の典型的なアミノ酸配列を配列番号：６に、それぞれ示す。なお、アミノ酸配列の置換、欠失、挿入、及び付加等を伴う変異を生じていないＲＡＤ５０であっても、多型などによって、配列には個体差が生じうる。
本発明における「ＲＡＤ５０」は、下記のＭＲＥ１１タンパク質及びＮＢＳ１タンパク質と共に複合体（ＭＲＮ複合体）を形成してＤＮＡ修復機構（特に、二本鎖ＤＮＡ相同末端修復機構）に関与するタンパク質（本明細書中、場合により「ＲＡＤ５０タンパク質」という）をコードする遺伝子である。ヒト由来の天然型ＲＡＤ５０ゲノムＤＮＡの典型的な塩基配列を配列番号：５に、ヒト由来の天然型ＲＡＤ５０タンパク質の典型的なアミノ酸配列を配列番号：６に、それぞれ示す。なお、アミノ酸配列の置換、欠失、挿入、及び付加等を伴う変異を生じていないＲＡＤ５０であっても、多型などによって、配列には個体差が生じうる。
【0043】
本発明における「ＲＡＤ５０の変異」としては、ＲＡＤ５０タンパク質のアミノ酸配列におけるアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び付加が挙げられる。このようなＲＡＤ５０の変異としては、ＲＡＤ５０タンパク質が本来有している活性が変化しているものである限り特に制限されないが、ＲＡＤ５０タンパク質活性の低下（ＲＡＤ５０タンパク質活性の完全な喪失（不活性化）を含む）を引き起こす変異、すなわち、機能欠失型変異であることが好ましい。ＲＡＤ５０タンパク質活性の低下は、例えば、ＲＡＤ５０におけるミスセンス変異、全領域にわたるナンセンス変異、又はＲＡＤ５０の全体若しくは部分的な欠失等の遺伝子構造の変化、遺伝子発現量の変化により生じうるが、これらに制限されない。
【0044】
ＲＡＤ５０が本来有している遺伝子構造や遺伝子発現量が変化しているか否かは、例えば、次の方法：ゲノムＤＮＡのシークエンスによるＲＡＤ５０の塩基配列の取得；ＲＡＤ５０のヌクレオチド配列に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブによる蛍光検出；ＲＡＤ５０のヌクレオチドに特異的に結合するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ法による検出等により、対照（例えば、健常者や同一患者の非がん組織）との比較において変化しているか否か（好ましくは機能欠失型変異が生じているか否か、ｍＲＮＡの発現量の場合には減少しているか否か）によって確認及び判定できる。
【0045】
ＲＡＤ５０タンパク質が本来有している活性（機能活性）が変化しているか否かは、例えば、次の方法：ＲＡＤ５０タンパク質に特異的に結合する抗体を用いた免疫染色法又はウェスタンブロッティング法による検出；及び免疫沈降法などにより精製した細胞内ＲＡＤ５０タンパク質がＭＲＮ複合体の構成タンパク質であるＭＲＥ１１タンパク質やＮＢＳ１タンパク質と結合しているかをウェスタンブロット法などにより判別する方法；及び免疫沈降法などにより精製した細胞内ＲＡＤ５０タンパク質がＡＴＰａｓｅ活性を有しているかをＡＴＰａｓｅ活性測定法により判別する方法等により、対照（例えば、健常者や同一患者の非がん組織）との比較において変化しているか否か（好ましくは低下しているか否か、すなわち、免疫染色法やウェスタンブロッティング法により検出されるＲＡＤ５０タンパク質の発現量の場合には対照に比べて低下しているか否か、ウェスタンブロッティング法により検出されるタンパク質の分子量の場合には対照と比べて変化しているか否か、ウェスタンブロッティング法により検出されるＲＡＤ５０タンパク質に結合しているＭＲＮ複合体の構成タンパク質であるＭＲＥ１１タンパク質又はＮＢＳ１タンパク質の量が対照と比べて低下しているか否か、ＡＴＰａｓｅ活性の場合には対照と比べて活性が低下しているか否か）によって確認及び判定できる。
【0046】
このようなＲＡＤ５０タンパク質活性の変化を引き起こす具体的なＲＡＤ５０の変異の例としては、例えば、ｐ．Ａ１４９Ｇｆｓ＊１０（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ７０８７３９８）、ｐ．Ｃ１５７Ｌｆｓ＊７（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ９００１１９８）、ｐ．Ｓ１８１Ｆｆｓ＊７（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ９００８４４５）、ｐ．Ｋ２７９Ｅｆｓ＊７（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ５０１６０９９）、ｐ．Ｔ４１０Ｌｆｓ＊５（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ６９４１４１４）、ｐ．Ｋ４２５Ｔｆｓ＊４（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ９４９４１７４）、ｐ．Ｌ４３９Ｋｆｓ＊４（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ１１５８９７８）、ｐ．Ｎ４５９Ｍｆｓ＊２（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ８５１５３１２）、ｐ．Ｌ５４１Ａｆｓ＊７（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ６９７１８５３）、ｐ．Ｒ６１７Ｅｆｓ＊２６（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ４７４７８８９）、ｐ．Ｄ６７５Ｔｆｓ＊４５（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ５０１６１０１）、ｐ．Ｑ６８９Ｒｆｓ＊３１（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ６７６１８９４）、ｐ．Ｋ７２２Ｇｆｓ＊５（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ６０４８２６５）、ｐ．Ｋ７２２Ｒｆｓ＊１４（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ１４３３０４５）、ｐ．Ｅ７２３Ｇｆｓ＊５（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ４６１１４５９）、ｐ．Ｋ７２２Ｎｆｓ＊６、ｐ．Ｌ９２９Ｓｆｓ＊１０（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ１７４０８８１）、ｐ．Ｎ９３４Ｉｆｓ＊６（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ１４３３０４９）、ｐ．Ｎ９３４Ｋｆｓ＊１０（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ１２８７５１８）、ｐ．Ｅ９９５Ｒｆｓ＊２（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ６９６２２７９）、ｐ．Ｌ１０４２Ｆｆｓ＊１５（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ５６１７２４８）、ｐ．Ｙ１１８２Ｌｆｓ＊２（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ１６３３９２６）等が挙げられる。
【0047】
〔ＭＲＥ１１、ＮＢＮ〕
本発明における「ＭＲＥ１１（「ＭＲＥ１１Ａ」としても知られている）」は、上記のＲＡＤ５０タンパク質と共に複合体（ＭＲＮ複合体）を形成するタンパク質（本明細書中、場合により「ＭＲＥ１１タンパク質」という）をコードする遺伝子である。ＭＲＥ１１タンパク質は、ＤＮＡの端部ではエキソヌクレアーゼとして、内部部位ではエンドヌクレアーゼとして、ＤＮＡを分解できるヌクレアーゼである。また、本発明における「ＮＢＮ」は、上記のＲＡＤ５０タンパク質と共に複合体（ＭＲＮ複合体）を形成するタンパク質であるＮＢＳ１（本明細書中、場合により「ＮＢＳ１タンパク質」という）をコードする遺伝子である。これらのタンパク質は互いに関連しあってＤＮＡ修復機構（特に、二本鎖ＤＮＡ相同末端修復機構）に関与する（例えば、Ｌｅｉ Ｂｉａｎら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ，（２０１９）１８：１６９，ＤＯＩ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓ１２９４３－０１９－１１００－５；Ｋｗｉ Ｈ Ｋｏｈら，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，（２００５）８５，ｐ．１１３０－１１３８等）。これらのうちのいずれか１種の機能が欠失しても、ＭＲＮ複合体自体の機能が低下して上記ＤＮＡ修復機構が正常に機能しないことから、第２群の変異のうち、かかるＭＲＮ複合体を形成するタンパク質をコードするＲＡＤ５０、ＭＲＥ１１、及びＮＢＮについては特に、これらのうちの少なくとも１種の変異を検出することが好ましく、ＲＡＤ５０の変異及びＮＢＮの変異のうちの少なくとも１種の変異を検出することがより好ましい。
本発明における「ＭＲＥ１１（「ＭＲＥ１１Ａ」としても知られている）」は、上記のＲＡＤ５０タンパク質と共に複合体（ＭＲＮ複合体）を形成するタンパク質（本明細書中、場合により「ＭＲＥ１１タンパク質」という）をコードする遺伝子である。ＭＲＥ１１タンパク質は、ＤＮＡの端部ではエキソヌクレアーゼとして、内部部位ではエンドヌクレアーゼとして、ＤＮＡを分解できるヌクレアーゼである。また、本発明における「ＮＢＮ」は、上記のＲＡＤ５０タンパク質と共に複合体（ＭＲＮ複合体）を形成するタンパク質であるＮＢＳ１（本明細書中、場合により「ＮＢＳ１タンパク質」という）をコードする遺伝子である。これらのタンパク質は互いに関連しあってＤＮＡ修復機構（特に、二本鎖ＤＮＡ相同末端修復機構）に関与する（例えば、Ｌｅｉ Ｂｉａｎら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ，（２０１９）１８：１６９，ＤＯＩ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓ１２９４３－０１９－１１００－５；Ｋｗｉ Ｈ Ｋｏｈら，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，（２００５）８５，ｐ．１１３０－１１３８等）。これらのうちのいずれか１種の機能が欠失しても、ＭＲＮ複合体自体の機能が低下して上記ＤＮＡ修復機構が正常に機能しないことから、第２群の変異のうち、かかるＭＲＮ複合体を形成するタンパク質をコードするＲＡＤ５０、ＭＲＥ１１、及びＮＢＮについては特に、これらのうちの少なくとも１種の変異を検出することが好ましく、ＲＡＤ５０の変異及びＮＢＮの変異のうちの少なくとも１種の変異を検出することがより好ましい。
【0048】
ヒト由来の天然型ＭＲＥ１１ゲノムＤＮＡの典型的な塩基配列を配列番号：９に、ヒト由来の天然型ＭＲＥ１１タンパク質の典型的なアミノ酸配列を配列番号：１０に、それぞれ示す。また、ヒト由来の天然型ＮＢＮゲノムＤＮＡ（ＮＢＳ１をコードするゲノムＤＮＡ）の典型的な塩基配列を配列番号：１１に、ヒト由来の天然型ＮＢＳ１タンパク質の典型的なアミノ酸配列を配列番号：１２に、それぞれ示す。なお、アミノ酸配列の置換、欠失、挿入、及び付加等を伴う変異を生じていないＭＲＥ１１及びＮＢＮであっても、それぞれ、多型などによって、配列には個体差が生じうる。
【0049】
本発明における「ＭＲＥ１１の変異」及び「ＮＢＮの変異」としては、それぞれ、ＭＲＥ１１タンパク質のアミノ酸配列及びＮＢＳ１タンパク質のアミノ酸配列におけるアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び付加が挙げられる。このようなＭＲＥ１１の変異及びＮＢＮの変異としては、それぞれ、ＭＲＥ１１タンパク質及びＮＢＳ１タンパク質が本来有している活性がそれぞれ変化しているものである限り特に制限されないが、ＭＲＥ１１タンパク質活性の低下（ＭＲＥ１１タンパク質活性の完全な喪失（不活性化）を含む）及びＮＢＳ１タンパク質活性の低下（ＮＢＳ１タンパク質活性の完全な喪失（不活性化）を含む）をそれぞれ引き起こす変異、すなわち、機能欠失型変異であることが好ましい。ＭＲＥ１１タンパク質活性の低下は、例えば、ＭＲＥ１１におけるミスセンス変異、全領域にわたるナンセンス変異、又はＭＲＥ１１の全体若しくは部分的な欠失等の遺伝子構造の変化、遺伝子発現量の変化により生じうるが、これらに制限されない。ＮＢＳ１タンパク質活性の低下は、例えば、ＮＢＮにおけるミスセンス変異、全領域にわたるナンセンス変異、又はＮＢＮの全体若しくは部分的な欠失等の遺伝子構造の変化、遺伝子発現量の変化により生じうるが、これらに制限されない。
【0050】
ＭＲＥ１１が本来有している遺伝子構造や遺伝子発現量、及びＮＢＮが本来有している遺伝子構造や遺伝子発現量が、それぞれ変化しているか否か、並びに、ＭＲＥ１１タンパク質が本来有している活性（機能活性）、及びＮＢＳ１タンパク質が本来有している活性（機能活性）が、それぞれ変化しているか否かは、例えば、ＲＡＤ５０が本来有している遺伝子構造や遺伝子発現量が変化しているか否かを確認及び判定する方法、並びに、ＲＡＤ５０タンパク質が本来有している活性（機能活性）が変化しているか否かを確認及び判定する方法として挙げた方法と同様の方法によって確認及び判定することができる。ＭＲＥ１１タンパク質については、免疫沈降法などにより精製した細胞内ＭＲＥ１１タンパク質が、例えば、基質ＤＮＡを切断するかを測定して判別する方法により、対照（例えば、健常者や同一患者の非がん組織）との比較において変化しているか否か（好ましくは低下しているか否か、すなわち、活性が対照に比べて低下しているか否か）によっても確認及び判定できる。
【0051】
ＭＲＥ１１タンパク質活性の変化を引き起こす具体的なＭＲＥ１１の変異の例としては、例えば、ｐ．Ｉ９３Ｆｆｓ＊１７（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ６９７５９９３）、ｐ．Ｒ１８８Ｋｆｓ＊９（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ８９２３７０１）、ｐ．Ｖ１９８＊（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ６９３８５５１）、ｐ．Ｆ３２１Ｌｆｓ＊８（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ６９２７０４５）、ｐ．Ｎ３２２＊（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ５１７６１７６）、ｐ．Ｆ３９９Ｓｆｓ＊２９（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ２０６１３３１）、ｐ．Ｔ４８１Ｈｆｓ＊４３（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ２０６１３１３）、ｐ．Ｑ４８２Ａｆｓ＊４（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ６９０９１３６）、ｐ．Ｎ５１１Ｉｆｓ＊１３（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ１３５７９２５）、ｐ．Ａ５２６Ｇｆｓ＊１６（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ７５１３３３７）、ｐ．Ｑ６２９Ａｆｓ＊９（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ６９２０２４６）、ｐ．Ｄ６４７Ｙｆｓ＊２８（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ６９６２３１７）等が挙げられる。
【0052】
また、ＮＢＳ１タンパク質活性の変化を引き起こす具体的なＮＢＮの変異の例としては、例えば、ｐ．Ｎ３０Ｔｆｓ＊５（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ６９７８８１９）、ｐ．Ｄ６１＊（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ７４４９８６２）、ｐ．Ｓ７２Ｌｆｓ＊２０（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ８５５９５５８）、ｐ．Ｍ８３Ｃｆｓ＊９（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ６７２２４６７）、ｐ．Ｇ１０３Ｅｆｓ＊６（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ３９１６９５）、ｐ．Ｋ１２５Ｒｆｓ＊３４（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ２８４０２）、ｐ．Ｖ１５３Ｋｆｓ＊１７（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ６９５９１５５）、ｐ．Ｇ２０６Ｌｆｓ＊２６（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ６９８１００６）、ｐ．Ｋ２１９Ｎｆｓ＊１６（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ１７４０９２３）、ｐ．Ｋ２３３Ｓｆｓ＊５（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ９４９４２２３）、ｐ．Ｓ２４０Ｃｆｓ＊８（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ６９２４５８３）、ｐ．Ｆ３１６Ｓｆｓ＊２（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ７４５００３１）、ｐ．Ｎ４４０Ｋｆｓ＊２（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ７５１３５６５）、ｐ．Ｒ４６６Ｇｆｓ＊１８（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ１４５８５５０）、ｐ．Ｒ４６６Ｋｆｓ＊５（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ８４９８９４５）、ｐ．Ｌ４９０＊（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ２７９０２５７）、ｐ．Ｎ５０３Ｋｆｓ＊２（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ９０６１５５１）、ｐ．Ｅ５０５Ｇｆｓ＊６（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ７５１３８８０）、ｐ．Ｒ５５１Ｇｆｓ＊８（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ１４５８５４９）、ｐ．Ｒ５５１Ｋｆｓ＊５（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ６９１８４９９）、ｐ．Ｍ５５３Ｗｆｓ＊６（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ６９５５３５８）、ｐ．Ｌ６５４Ａｆｓ＊５（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ１４５８５４８）、ｐ．Ａ７１３Ｇｆｓ＊２９（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ６９８３８９３）、ｐ．Ｎ７３１Ｉｆｓ＊２０（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ３０４０１）等が挙げられる。
【0053】
〔ＤＮＡ２〕
本発明における「ＤＮＡ２」は、ＭＲＮ複合体と共に、ＤＮＡ修復機構（特に、二本鎖ＤＮＡ相同末端修復機構）に関与するタンパク質（本明細書中、場合により「ＤＮＡ２タンパク質」という）をコードする遺伝子である。ＤＮＡ２タンパク質は、ＤＮＡの端部ではエキソヌクレアーゼとして、内部部位ではエンドヌクレアーゼとして、ＤＮＡを分解できるヌクレアーゼであり、また２本鎖ＤＮＡを１本鎖に解きほぐすことができるヘリカーゼでもある。ヒト由来の天然型ＤＮＡ２ゲノムＤＮＡの典型的な塩基配列を配列番号：１３に、ヒト由来の天然型ＤＮＡ２タンパク質の典型的なアミノ酸配列を配列番号：１４に、それぞれ示す。なお、アミノ酸配列の置換、欠失、挿入、及び付加等を伴う変異を生じていないＤＮＡ２であっても、多型などによって、配列には個体差が生じうる。
本発明における「ＤＮＡ２」は、ＭＲＮ複合体と共に、ＤＮＡ修復機構（特に、二本鎖ＤＮＡ相同末端修復機構）に関与するタンパク質（本明細書中、場合により「ＤＮＡ２タンパク質」という）をコードする遺伝子である。ＤＮＡ２タンパク質は、ＤＮＡの端部ではエキソヌクレアーゼとして、内部部位ではエンドヌクレアーゼとして、ＤＮＡを分解できるヌクレアーゼであり、また２本鎖ＤＮＡを１本鎖に解きほぐすことができるヘリカーゼでもある。ヒト由来の天然型ＤＮＡ２ゲノムＤＮＡの典型的な塩基配列を配列番号：１３に、ヒト由来の天然型ＤＮＡ２タンパク質の典型的なアミノ酸配列を配列番号：１４に、それぞれ示す。なお、アミノ酸配列の置換、欠失、挿入、及び付加等を伴う変異を生じていないＤＮＡ２であっても、多型などによって、配列には個体差が生じうる。
【0054】
本発明における「ＤＮＡ２の変異」としては、ＤＮＡ２タンパク質のアミノ酸配列におけるアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び付加が挙げられる。このようなＤＮＡ２の変異としては、ＤＮＡ２タンパク質が本来有している活性がそれぞれ変化しているものである限り特に制限されないが、ＤＮＡ２タンパク質活性の低下（ＤＮＡ２タンパク質活性の完全な喪失（不活性化）を含む）を引き起こす変異、すなわち、機能欠失型変異であることが好ましい。ＤＮＡ２タンパク質活性の低下は、例えば、ＤＮＡ２におけるミスセンス変異、全領域にわたるナンセンス変異、又はＤＮＡ２の全体若しくは部分的な欠失等の遺伝子構造の変化、遺伝子発現量の変化により生じうるが、これらに制限されない。
【0055】
ＤＮＡ２が本来有している遺伝子構造や遺伝子発現量が変化しているか否か、並びに、ＤＮＡ２タンパク質が本来有している活性（機能活性）が変化しているか否かは、例えば、ＲＡＤ５０が本来有している遺伝子構造や遺伝子発現量が変化しているか否かを確認及び判定する方法、並びに、ＲＡＤ５０タンパク質が本来有している活性（機能活性）が変化しているか否かを確認及び判定する方法として挙げた方法と同様の方法によって確認及び判定することができる。
【0056】
このようなＤＮＡ２タンパク質活性の変化を引き起こす具体的なＤＮＡ２の変異の例としては、例えば、ｐ．Ｋ５９０Ｎｆｓ＊５（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ８４８５０７７）、ｐ．Ｌ６９７Ｆｆｓ＊２８（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ１３４８６９４）、ｐ．Ｌ７７６Ｆｆｓ＊９（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ５０８１６２９）、ｐ．Ｌ７７６Ｐｆｓ＊２４（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ７６３１０３０）、ｐ．Ｓ７７９Ｔｆｓ＊２０（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ４７４７４３５）、ｐ．Ｓ７７９Ｆｆｓ＊７（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ５０９２６２７）、ｐ．Ｓ７７９Ｈｆｓ＊６（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ２９５３２１）、ｐ．Ｓ７７９Ｆｆｓ＊２１（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ２１５９３２０）、ｐ．Ｖ８２５Ｃｆｓ＊５（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ６６４５８７２）、ｐ．Ｉ９４０Ｌｆｓ＊８（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ５４２３５３１）、ｐ．Ｓ９７５Ｖｆｓ＊４（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ１７２７５７１）等が挙げられる。
【0057】
〔ＲＢＢＰ８〕
本発明における「ＲＢＢＰ８」は、ＭＲＮ複合体と共に、ＤＮＡ修復機構（特に、二本鎖ＤＮＡ相同末端修復機構）に関与するタンパク質であるＣｔＩＰ（本明細書中、場合により「ＣｔＩＰタンパク質」という）をコードする遺伝子である。ＣｔＩＰタンパク質は、ＤＮＡの内部部位ではエンドヌクレアーゼとして、ＤＮＡを分解できるヌクレアーゼである。ヒト由来の天然型ＲＢＢＰ８ゲノムＤＮＡ（ＣｔＩＰをコードするゲノムＤＮＡ）の典型的な塩基配列を配列番号：１５に、ヒト由来の天然型ＣｔＩＰタンパク質の典型的なアミノ酸配列を配列番号：１６に、それぞれ示す。なお、アミノ酸配列の置換、欠失、挿入、及び付加等を伴う変異を生じていないＲＢＢＰ８であっても、多型などによって、配列には個体差が生じうる。
本発明における「ＲＢＢＰ８」は、ＭＲＮ複合体と共に、ＤＮＡ修復機構（特に、二本鎖ＤＮＡ相同末端修復機構）に関与するタンパク質であるＣｔＩＰ（本明細書中、場合により「ＣｔＩＰタンパク質」という）をコードする遺伝子である。ＣｔＩＰタンパク質は、ＤＮＡの内部部位ではエンドヌクレアーゼとして、ＤＮＡを分解できるヌクレアーゼである。ヒト由来の天然型ＲＢＢＰ８ゲノムＤＮＡ（ＣｔＩＰをコードするゲノムＤＮＡ）の典型的な塩基配列を配列番号：１５に、ヒト由来の天然型ＣｔＩＰタンパク質の典型的なアミノ酸配列を配列番号：１６に、それぞれ示す。なお、アミノ酸配列の置換、欠失、挿入、及び付加等を伴う変異を生じていないＲＢＢＰ８であっても、多型などによって、配列には個体差が生じうる。
【0058】
本発明における「ＲＢＢＰ８の変異」としては、ＣｔＩＰタンパク質のアミノ酸配列におけるアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び付加が挙げられる。このようなＲＢＢＰ８の変異としては、ＣｔＩＰタンパク質が本来有している活性がそれぞれ変化しているものである限り特に制限されないが、ＣｔＩＰタンパク質活性の低下（ＣｔＩＰタンパク質活性の完全な喪失（不活性化）を含む）を引き起こす変異、すなわち、機能欠失型変異であることが好ましい。ＣｔＩＰタンパク質活性の低下は、例えば、ＲＢＢＰ８におけるミスセンス変異、全領域にわたるナンセンス変異、又はＲＢＢＰ８の全体若しくは部分的な欠失等の遺伝子構造の変化、遺伝子発現量の変化により生じうるが、これらに制限されない。
【0059】
ＲＢＢＰ８が本来有している遺伝子構造や遺伝子発現量が変化しているか否か、並びに、ＣｔＩＰタンパク質が本来有している活性（機能活性）が変化しているか否かは、例えば、ＲＡＤ５０が本来有している遺伝子構造や遺伝子発現量が変化しているか否かを確認及び判定する方法、並びに、ＲＡＤ５０タンパク質が本来有している活性（機能活性）が変化しているか否かを確認及び判定する方法として挙げた方法と同様の方法によって確認及び判定することができる。
【0060】
このようなＣｔＩＰタンパク質活性の変化を引き起こす具体的なＲＢＢＰ８の変異の例としては、例えば、ｐ．Ｒ１００Ｐｆｓ＊８（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ１７４４９４３）、ｐ．Ｈ１８３Ｐｆｓ＊１１（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ９１３８７９７）、ｐ．Ｓ２３１ Ｍ２３５ｄｅｌ（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ７２０３７６５）、ｐ．Ｌ２８６Ｔｆｓ＊２４（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ１７４５５２５）、ｐ．Ｋ３５７Ｎｆｓ＊３（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ８１８８３２９）、ｐ．Ｈ３５８Ｔｆｓ＊８（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ１７４４９４１）、ｐ．Ｔ３７５Ｎｆｓ＊２（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ８１８８３２９）、ｐ．Ｅ４５５Ｔｆｓ＊２（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ４７２０５９３）、ｐ．Ｆ４７９Ｅｆｓ＊４（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ１２６３８８３）、ｐ．Ｆ６５０Ｋｆｓ＊１６（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ４１８９１００）、ｐ．Ｖ６７２Ｅｆｓ＊２（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ１１９０９２６）、ｐ．Ｋ８０１Ｅｆｓ＊１４（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ７０８８６１４）、ｐ．Ｅ８０３Ｒｆｓ＊１２（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ２８８５３２３）、ｐ．Ｌ８０８Ｔｆｓ＊７（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ７５１３２７０）等が挙げられる。
【0061】
〔変異の検出〕
本発明における「ＴＴＫの変異の検出」、「ＲＡＤ５０の変異の検出」、「ＭＲＥ１１の変異の検出」、「ＮＢＮの変異の検出」、「ＤＮＡ２の変異の検出」、及び「ＲＢＢＰ８の変異の検出」の各方法としては、いずれも特に制限はないが、それぞれ独立して、例えば、下記の方法が挙げられる。
本発明における「ＴＴＫの変異の検出」、「ＲＡＤ５０の変異の検出」、「ＭＲＥ１１の変異の検出」、「ＮＢＮの変異の検出」、「ＤＮＡ２の変異の検出」、及び「ＲＢＢＰ８の変異の検出」の各方法としては、いずれも特に制限はないが、それぞれ独立して、例えば、下記の方法が挙げられる。
【0062】
本発明において「変異の検出」とは、ゲノムＤＮＡ上の各遺伝子の変異を検出することを示し、当該ゲノムＤＮＡ上の変異が転写産物における塩基の変化や翻訳産物におけるアミノ酸の変化に反映される場合、前記遺伝子の変異の検出には、これら転写産物や翻訳産物における当該変化を検出すること（すなわち、間接的な検出）も含む。
【0063】
本発明の方法の好ましい態様は、がん細胞の各変異を検出する遺伝子領域（第１群の変異を検出する遺伝子領域：ＴＴＫ遺伝子領域及びＲＡＤ５０遺伝子領域から選択される少なくとも１種（本明細書中、場合により「第１群の遺伝子領域」という）；第２群の変異を検出する遺伝子領域：ＲＡＤ５０遺伝子領域、ＭＲＥ１１遺伝子領域、ＮＢＮ遺伝子領域、ＤＮＡ２遺伝子領域、及びＲＢＢＰ８遺伝子領域から選択される少なくとも１種（本明細書中、場合により「第２群の遺伝子領域」という））の塩基配列を直接決定することにより、変異を検出する方法である。本発明において「ＴＴＫ遺伝子領域」、「ＲＡＤ５０遺伝子領域」、「ＭＲＥ１１遺伝子領域」、「ＮＢＮ遺伝子領域」、「ＤＮＡ２遺伝子領域」、及び「ＲＢＢＰ８遺伝子領域」とは、それぞれ、ＴＴＫを含むゲノムＤＮＡ上の一定領域、ＲＡＤ５０を含むゲノムＤＮＡ上の一定領域、ＭＲＥ１１を含むゲノムＤＮＡ上の一定領域、ＮＢＮを含むゲノムＤＮＡ上の一定領域、ＤＮＡ２を含むゲノムＤＮＡ上の一定領域、及びＲＢＢＰ８を含むゲノムＤＮＡ上の一定領域を意味する。該領域には、それぞれ独立に、各遺伝子の発現制御領域（例えば、プロモーター領域、エンハンサー領域）や各遺伝子の３’末端非翻訳領域なども含まれる。
【0064】
この方法においては、先ず、生物学的試料からＤＮＡ試料を調製する。ＤＮＡ試料としては、ゲノムＤＮＡ試料、及びＲＮＡからの逆転写によって調製されるｃＤＮＡ試料が挙げられる。
【0065】
生物学的試料からゲノムＤＮＡ又はＲＮＡを抽出する方法としては特に制限はなく、公知の方法を適宜選択して用いることができ、例えば、ゲノムＤＮＡを抽出する方法としては、ＳＤＳフェノール法（尿素を含む溶液又はエタノール中に保存した組織を、タンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）、界面活性剤（ＳＤＳ）、及びフェノールで該組織のタンパク質を変性させ、エタノールで該組織からＤＮＡを沈殿させ抽出する方法）、Ｃｌｅａｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（登録商標、ＮｅｘＴｅｃ社製）、ＡｑｕａＰｕｒｅ（登録商標、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）、ＺＲ Ｐｌａｎｔ／Ｓｅｅｄ ＤＮＡ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）、ＡｑｕａＧｅｎｏｍｉｃＳｏｌｕｔｉｏｎ（登録商標、Ｍｏ Ｂｉ Ｔｅｃ社製）、ｐｒｅｐＧＥＭ（登録商標、ＺｙＧＥＭ社製）、ＢｕｃｃａｌＱｕｉｃｋ（登録商標、ＴｒｉｍＧｅｎ社製）を用いるＤＮＡ抽出方法が挙げられる。
【0066】
また、生物学的試料からＲＮＡを抽出する方法及び抽出したＲＮＡからｃＤＮＡを調製する方法としては、ヘリカーゼの発現量を転写レベルで検出する方法において挙げた方法と同様の方法が挙げられる。
【0067】
この態様においては、次いで、第１群の遺伝子領域又は第２群の遺伝子領域を含むＤＮＡを単離し、単離したＤＮＡの塩基配列を決定する。該ＤＮＡの単離は、例えば、第１群の遺伝子領域又は第２群の遺伝子領域の全て又は一部を挟み込むように設計された一対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡ、或いはＲＮＡを鋳型としたＰＣＲ等によって行うことができる。単離したＤＮＡの塩基配列の決定は、マキサムギルバート法やサンガー法など当業者に公知の方法で行うことができる。
【0068】
決定したＤＮＡ若しくはｃＤＮＡの塩基配列を対照（例えば、生物学的試料が、がん患者由来の試料である場合には、同一患者の非がん組織由来のＤＮＡ若しくはｃＤＮＡの塩基配列）と比較することにより、生物学的試料のがん細胞における第１群の遺伝子領域又は第２群の遺伝子領域の変異の有無を判別することができる。
【0069】
第１群の遺伝子領域又は第２群の遺伝子領域の変異を検出するための方法は、ＤＮＡやｃＤＮＡの塩基配列を直接決定する方法以外に、変異の検出が可能な種々の方法によって行うことができる。
【0070】
例えば、本発明における変異の検出は、以下のような方法によっても行うことができる。先ず、生物学的試料からＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、第１群の遺伝子領域又は第２群の遺伝子領域の変異部位を含む塩基配列に相補的な塩基配列を有し、レポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素が標識されたオリゴヌクレオチドプローブを調製する。そして、前記ＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ試料に、前記オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせ、さらに前記オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズした前記ＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ試料を鋳型として、第１群の遺伝子領域又は第２群の遺伝子領域の前記変異部位を含む塩基配列を増幅する。そして、前記増幅に伴うオリゴヌクレオチドプローブの分解により、前記レポーター蛍光色素が発する蛍光を検出し、次いで、検出した前記蛍光を対照と比較する。このような方法としては、ダブルダイプローブ法、いわゆるＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法が挙げられる。
【0071】
さらに別の方法においては、生物学的試料からＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＤＮＡ二重鎖間に挿入されると蛍光を発するインターカレーターを含む反応系において、前記ＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ試料を鋳型として、第１群の遺伝子領域又は第２群の遺伝子領域の変異部位を含む塩基配列を増幅する。そして、前記反応系の温度を変化させ、前記インターカレーターが発する蛍光の強度の変動を検出し、検出した前記温度の変化に伴う前記蛍光の強度の変動を対照と比較する。このような方法としては、ＨＲＭ（ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍｅｌｔｉｎｇ、高分解融解曲線解析）法が挙げられる。
【0072】
さらに別の方法においては、先ず、生物学的試料からＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、第１群の遺伝子領域又は第２群の遺伝子領域の全て又は一部を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する。このような方法としては、例えば、制限酵素断片長変異（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ／ＲＦＬＰ）を利用した方法やＰＣＲ－ＲＦＬＰ法等が挙げられる。
【0073】
さらに別の方法においては、先ず、生物学的試料からＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、第１群の遺伝子領域又は第２群の遺伝子領域の全て又は一部を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する。分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する。このような方法としては、例えばＰＣＲ－ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一本鎖高次構造変異）法が挙げられる。
【0074】
さらに別の方法においては、先ず、生物学的試料からＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、第１群の遺伝子領域又は第２群の遺伝子領域の全て又は一部を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを、ＤＮＡ変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する。次いで、分離したＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する。このような方法としては、例えば、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＧＧＥ）法が挙げられる。
【0075】
さらに別の方法としては、生物学的試料から調製した第１群の遺伝子領域又は第２群の遺伝子領域の変異部位を含むＤＮＡ、及び、該ＤＮＡにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが固定された基板、を用いる方法がある。このような方法としては、例えば、ＤＮＡアレイ法等が挙げられる。
【0076】
さらに別の方法においては、先ず、生物学的試料からＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ試料を調製する。また、「第１群の遺伝子領域又は第２群の遺伝子領域の全て又は一部の塩基の１塩基３’側の塩基及びその３’側の塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー」を調製する。次いで、該ＤＮＡを鋳型とし、該プライマーを用いて、蛍光標識ｄｄＮＴＰプライマー伸長反応を行う。次いで、プライマー伸長反応産物をＤＮＡシークエンサーにかけ、伸長反応物の長さと蛍光に基づき塩基配列決定を行う。次いで、ＤＮＡシークエンサーの結果から遺伝子型を決定する。次いで、決定した遺伝子型を対照と比較する。このような方法としては、例えば、サンガー法が挙げられる。
【0077】
さらに別の方法においては、先ず、生物学的試料からＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、５’－「第１群の遺伝子領域又は第２群の遺伝子領域の全て又は一部の塩基及びその５’側の塩基配列と相補的な塩基配列」－「第１群の遺伝子領域又は第２群の遺伝子領域の全て又は一部の１塩基３’側の塩基及びその３’側の塩基配列とハイブリダイズしない塩基配列」－３’（フラップ）からなるオリゴヌクレオチドプローブを調製する。また、「第１群の遺伝子領域又は第２群の遺伝子領域の全て又は一部の塩基及びその３’側の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ」を調製する。次いで、調製したＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ試料に、上記２種類のオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる。次いで、ハイブリダイズしたＤＮＡを一本鎖ＤＮＡ切断酵素で切断し、フラップを遊離させる。一本鎖ＤＮＡ切断酵素としては、特に制限はなく、例えばｃｌｅａｖａｓｅが挙げられる。本方法においては、次いで、フラップと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドプローブであって、レポーター蛍光及びクエンチャー蛍光が標識されたオリゴヌクレオチドプローブをフラップにハイブリダイズさせる。次いで、発生する蛍光の強度を測定する。次いで、測定した蛍光の強度を対照と比較する。このような方法としては、例えば、Ｉｎｖａｄｅｒ法が挙げられる。
【0078】
さらに別の方法においては、先ず、生物学的試料からＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、第１群の遺伝子領域又は第２群の遺伝子領域の全て又は一部を含むＤＮＡを増幅する。そして、増幅したＤＮＡを一本鎖に解離させ、解離させた一本鎖ＤＮＡのうち、片鎖のみを分離する。次いで、第１群の遺伝子領域又は第２群の遺伝子領域の全て又は一部の塩基の近傍より１塩基ずつ伸長反応を行い、その際に生成されるピロリン酸を酵素的に発光させ、発光の強度を測定する。そして、測定した蛍光の強度を対照と比較する。このような方法としては、例えば、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法が挙げられる。
【0079】
さらに別の方法においては、先ず、生物学的試料からＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、第１群の遺伝子領域又は第２群の遺伝子領域の全て又は一部を含むＤＮＡを増幅する。次いで、「第１群の遺伝子領域又は第２群の遺伝子領域の全て又は一部の塩基の１塩基３’側の塩基及びその３’側の塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー」を調製する。次いで、蛍光偏光色素ラベルしたヌクレオチド存在下で、増幅したＤＮＡを鋳型とし、調製したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う。そして、蛍光の偏光度を測定する。次いで、測定した蛍光の偏光度を対照と比較する。このような方法としては、例えば、ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ法が挙げられる。
【0080】
さらに別の方法においては、先ず、生物学的試料からＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、第１群の遺伝子領域又は第２群の遺伝子領域の全て又は一部を含むＤＮＡを増幅する。次いで、「第１群の遺伝子領域又は第２群の遺伝子領域の全て又は一部の塩基の１塩基３’側の塩基及びその３’側の塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー」を調製する。次いで、蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、増幅したＤＮＡを鋳型とし、調製したプライマーを用いて、一塩基伸長反応を行う。次いで、一塩基伸長反応に使われた塩基種を判定する。次いで、判定された塩基種を対照と比較する。このような方法として、例えば、ＳＮｕＰＥ法が挙げられる。
【0081】
なお、変異が各タンパク質（第１群の変異を検出する場合：ＴＴＫタンパク質及びＲＡＤ５０タンパク質から選択される少なくとも１種（本明細書中、場合により「第１群のタンパク質」という）；第２群の変異を検出する場合：ＲＡＤ５０タンパク質、ＭＲＥ１１タンパク質、ＮＢＳ１タンパク質、ＤＮＡ２タンパク質、及びＣｔＩＰタンパク質から選択される少なくとも１種（本明細書中、場合により「第２群のタンパク質」という））におけるアミノ酸の変化（例えば、置換、欠失、挿入、付加）を伴うものであれば、生物学的試料から調製される試料はタンパク質であってもよい。このような場合、変異を検出するには、上記変異によりアミノ酸の変化が生じた部位に特異的に結合する分子（例えば、抗体）を用いる方法等を利用することができる。
【0082】
例えば、抗体を用いたタンパク質の検出法においては、先ず、生物学的試料からタンパク質試料を調製する。次いで、第１群のタンパク質又は第２群のタンパク質に特異的な抗体を用いて抗原抗体反応を行い、第１群のタンパク質又は第２群のタンパク質を検出する。このような抗体を用いたタンパク質の検出法としては、ヘリカーゼの発現量を翻訳レベルで検出する方法において、抗体を用いたタンパク質の検出法として挙げた方法と同様の方法を第１群のタンパク質又は第２群のタンパク質に合わせ調整して適宜採用することができる。この方法においては、免疫組織化学によれば、組織におけるがん細胞の形態や分布状態などの付加的な情報も同時に入手しうるという利点もある。
【0083】
使用する抗体の種類や由来などは特に制限はないが、好ましくはモノクローナル抗体である。十分な特異性で第１群のタンパク質又は第２群のタンパク質を検出可能である限り、オリゴクローナル抗体（数種～数十種の抗体の混合物）やポリクローナル抗体を用いることもできる。また、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、ｄｓＦｖ、及びダイアボディー等の、抗体の機能的断片やその多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）を用いることもできる。抗ＴＴＫタンパク質抗体、抗ＲＡＤ５０タンパク質抗体、抗ＭＲＥ１１タンパク質抗体、抗ＮＢＳ１タンパク質抗体、抗ＤＮＡ２タンパク質抗体、及び抗ＣｔＩＰタンパク質抗体としては、それぞれ、市販品であってもよい。
【0084】
第１群のタンパク質又は第２群のタンパク質の検出は、質量分析法（ＭＳ）を使用して行うこともできる。特に液体クロマトグラフィーと連結した質量分析計（ＬＣ／ＭＳ）による解析は鋭敏であるため有利である。質量分析法による検出法としては、ヘリカーゼの発現量を翻訳レベルで検出する方法において、質量分析法による検出法として挙げた方法と同様の方法を第１群のタンパク質又は第２群のタンパク質に合わせ調整して適宜採用することができる。
【0085】
第１群のタンパク質又は第２群のタンパク質の検出は、各タンパク質の活性を測定することによって行うこともできる。これらの活性は適宜公知の方法又はそれに準じた方法を採用することができるが、例えば、ＴＴＫタンパク質のリン酸化活性の測定は、リン酸基を蛍光物質等で検出することで測定することができる。また、ＲＡＤ５０タンパク質のＡＴＰａｓｅ活性の測定は、発光ＡＤＰアッセイを利用することで測定することができる。例えば、ＡＤＰ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いることでＡＴＰａｓｅ活性を測定することができる。さらに、ＭＲＥ１１タンパク質のヌクレアーゼ活性の測定は、ＨｅＬａ Ｓ３アッセイ法、活性ゲル法、プラスミドアッセイ法等により測定することができる。
【0086】
〔感受性の予測・がん患者の選別〕
こうして生物学的試料から第１群の変異の検出及び／又は第２群の変異の検出がされた場合、当該生物学的試料が仮にがん細胞と判定された場合には、当該細胞は、ヘリカーゼ阻害剤に対して感受性があると予測することができ、また、当該生物学的試料ががん患者由来の試料に含まれるがん細胞である場合には、当該がん細胞において前記変異が検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤による治療に対して感受性があると予測することができ、さらに、当該がん患者を、ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象として選別することができる。
こうして生物学的試料から第１群の変異の検出及び／又は第２群の変異の検出がされた場合、当該生物学的試料が仮にがん細胞と判定された場合には、当該細胞は、ヘリカーゼ阻害剤に対して感受性があると予測することができ、また、当該生物学的試料ががん患者由来の試料に含まれるがん細胞である場合には、当該がん細胞において前記変異が検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤による治療に対して感受性があると予測することができ、さらに、当該がん患者を、ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象として選別することができる。
【0087】
ここで、「ヘリカーゼ阻害剤に対する感受性」及び「ヘリカーゼ阻害剤による治療に対する感受性」は、ヘリカーゼ阻害剤ががん細胞に対して治療的効果を発揮し得るか否かを示す指標である。前記感受性には、前記ヘリカーゼ阻害剤によって前記がん細胞の死滅が促進されること及び増殖が抑制されることが含まれる。当該感受性の予測には、感受性の有無の判定のみならず、感受性が期待できる／できない等の評価、感受性がある場合におけるその程度の評価（例えば、高い感受性が期待できる、中程度の感受性が期待できる等の評価）を含めてもよい。したがって、第１群の変異及び／又は第２群の変異の種類や程度に応じて、例えば、中程度の感受性が期待できるレベルで、がん治療の対象となる患者を選別してもよい。
【0088】
一方、がん患者由来の試料から第１群の変異及び／又は第２群の変異が認められなかった場合には、当該患者をヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象から除外することができる。これにより治療の奏功率を向上させることができる。
【0089】
（ＭＳＨ３）
また、本発明において、ヘリカーゼ阻害剤の標的とするがん細胞が、第１群の変異及び／又は第２群の変異、より好ましくは第１群の変異（ＴＴＫ変異及び／又はＲＡＤ５０変異）を有することに加えて、ＭＳＨ３の変異をさらに有するがん細胞である場合、ヘリカーゼ阻害剤は当該がん細胞の増殖を同等かそれ以上に抑制しうることが見出された。したがって、がん細胞感受性予測方法、がん患者感受性予測方法、及びがん患者選別方法においては、それぞれ独立に、ＭＳＨ３の変異の検出の有無も指標に加えることができ、本発明は、
がん細胞の、ヘリカーゼ阻害剤に対する感受性を予測する方法であり、
（ａ）がん細胞におけるＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｃ）がん細胞におけるＭＳＨ３の変異の有無を検出する工程と、
（ｄ）ＴＴＫ変異及び／又はＲＡＤ５０変異に加えてＭＳＨ３の変異も検出されたがん細胞を、ヘリカーゼ阻害剤に対して感受性があると予測する工程と、
を含む、方法（がん細胞感受性予測方法）；
がん患者のヘリカーゼ阻害剤による治療に対する感受性を予測する方法であり、
（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｃ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＭＳＨ３の変異の有無を検出する工程と、
（ｄ）前記がん細胞においてＴＴＫ変異及び／又はＲＡＤ５０変異に加えてＭＳＨ３の変異も検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤による治療に対して感受性があると予測する工程と、
を含む、方法（がん患者感受性予測方法）；
ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象とするがん患者を選別する方法であり、
（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｃ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＭＳＨ３の変異の有無を検出する工程と、
（ｄ）前記がん細胞においてＴＴＫ変異及び／又はＲＡＤ５０変異に加えてＭＳＨ３の変異も検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象として選別する工程と、
を含む、方法（がん患者選別方法）；
も提供する。
また、本発明において、ヘリカーゼ阻害剤の標的とするがん細胞が、第１群の変異及び／又は第２群の変異、より好ましくは第１群の変異（ＴＴＫ変異及び／又はＲＡＤ５０変異）を有することに加えて、ＭＳＨ３の変異をさらに有するがん細胞である場合、ヘリカーゼ阻害剤は当該がん細胞の増殖を同等かそれ以上に抑制しうることが見出された。したがって、がん細胞感受性予測方法、がん患者感受性予測方法、及びがん患者選別方法においては、それぞれ独立に、ＭＳＨ３の変異の検出の有無も指標に加えることができ、本発明は、
がん細胞の、ヘリカーゼ阻害剤に対する感受性を予測する方法であり、
（ａ）がん細胞におけるＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｃ）がん細胞におけるＭＳＨ３の変異の有無を検出する工程と、
（ｄ）ＴＴＫ変異及び／又はＲＡＤ５０変異に加えてＭＳＨ３の変異も検出されたがん細胞を、ヘリカーゼ阻害剤に対して感受性があると予測する工程と、
を含む、方法（がん細胞感受性予測方法）；
がん患者のヘリカーゼ阻害剤による治療に対する感受性を予測する方法であり、
（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｃ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＭＳＨ３の変異の有無を検出する工程と、
（ｄ）前記がん細胞においてＴＴＫ変異及び／又はＲＡＤ５０変異に加えてＭＳＨ３の変異も検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤による治療に対して感受性があると予測する工程と、
を含む、方法（がん患者感受性予測方法）；
ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象とするがん患者を選別する方法であり、
（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｃ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＭＳＨ３の変異の有無を検出する工程と、
（ｄ）前記がん細胞においてＴＴＫ変異及び／又はＲＡＤ５０変異に加えてＭＳＨ３の変異も検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象として選別する工程と、
を含む、方法（がん患者選別方法）；
も提供する。
【0090】
本発明における「ＭＳＨ３」は、ミスマッチ修復タンパク質（本明細書中、場合により「ＭＳＨ３タンパク質」という）をコードする遺伝子である。ヒト由来の天然型ＭＳＨ３ゲノムＤＮＡの典型的な塩基配列を配列番号：７に、ヒト由来の天然型ＭＳＨ３タンパク質の典型的なアミノ酸配列を配列番号：８に、それぞれ示す。なお、アミノ酸配列の置換、欠失、挿入、及び付加等を伴う変異を生じていないＭＳＨ３であっても、多型などによって、配列には個体差が生じうる。
【0091】
本発明における「ＭＳＨ３の変異」としては、ＭＳＨ３タンパク質のアミノ酸配列におけるアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び付加が挙げられる。このようなＭＳＨ３の変異としては、ＭＳＨ３タンパク質が本来有している活性が変化しているものである限り特に制限されないが、ＭＳＨ３タンパク質活性の低下（ＭＳＨ３タンパク質活性の完全な喪失（不活性化）を含む）を引き起こす変異、すなわち、機能欠失型変異であることが好ましい。ＭＳＨ３タンパク質活性の低下は、例えば、ＭＳＨ３におけるミスセンス変異、全領域にわたるナンセンス変異、又はＭＳＨ３の全体若しくは部分的な欠失等の遺伝子構造の変化、遺伝子発現量の変化により生じうるが、これらに制限されない。
【0092】
ＭＳＨ３が本来有している遺伝子構造や遺伝子発現量が変化しているか否かは、例えば、次の方法：ゲノムＤＮＡのシークエンスによるＭＳＨ３の塩基配列の取得；ＭＳＨ３のヌクレオチド配列に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブによる蛍光検出；ＭＳＨ３のヌクレオチドに特異的に結合するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ法による検出等により、対照（例えば、健常者や同一患者の非がん組織）との比較において変化しているか否か（好ましくは機能欠失型変異が生じているか否か、ｍＲＮＡの発現量の場合には減少しているか否か）によって確認及び判定できる。
【0093】
ＭＳＨ３タンパク質が本来有している活性（機能活性）が変化しているか否かは、例えば、次の方法：ＭＳＨ３タンパク質に特異的に結合する抗体を用いた免疫染色法又はウェスタンブロッティング法による検出；免疫沈降法などにより精製した細胞内ＭＳＨ３タンパク質がＭｕｔＳβ複合体の構成タンパク質であるＭＳＨ２と結合しているかをウェスタンブロット法などにより判別する方法；及び免疫沈降法などにより精製した細胞内ＭＳＨ３タンパク質がＡＴＰａｓｅ活性を有しているかをＡＴＰａｓｅ活性測定法により判別する方法等により、対照（例えば、健常者や同一患者の非がん組織）との比較において変化しているか否か（好ましくは低下しているか否か、すなわち、免疫染色法やウェスタンブロッティング法により検出されるＭＳＨ３タンパク質の発現量の場合には対照に比べて低下しているか否か、ウェスタンブロッティング法により検出されるタンパク質の分子量の場合には対照と比べて変化しているか否か、ウェスタンブロッティング法により検出されるＭＳＨ３タンパク質に結合しているＭｕｔＳβ複合体の構成タンパク質であるＭＳＨ２の量が対照と比べて低下しているか否か、ＡＴＰａｓｅ活性の場合には対照と比べて活性が低下しているか否か）によって確認及び判定できる。
【0094】
このようなＭＳＨ３タンパク質活性の変化を引き起こす具体的なＭＳＨ３の変異の例としては、例えば、ｐ．Ａ２２Ｒｆｓ＊３（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ７２１２４１８）、ｐ．Ｐ６７Ｑｆｓ＊１３（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ５９８９６３０）、ｐ．Ｐ６７Ｑｆｓ＊１３（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ５３５６３４２）、ｐ．Ｖ２９２Ｍｆｓ＊１５（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ９４９４１７８）、ｐ．Ｋ３８３Ｇｆｓ＊２０（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ１５６８１７８）、ｐ．Ｋ３８３Ｒｆｓ＊３２（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ１４３８８８８）、ｐ．Ｌ５０３Ｗｆｓ＊５（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ５８３５０８１）、ｐ．Ｐ７８３Ｆｆｓ＊１９（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ４１８８４６８）、ｐ．Ｅ７９７Ｓｆｓ＊３（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ８４６８８９６）、ｐ．Ｎ８６１Ｍｆｓ＊６（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ１４３８８９１）、ｐ．Ｌ１００６Ｖｆｓ＊１０（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ３１３９２５９）、ｐ．Ｎ１０２０ＩＭｆｓ＊４０（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ１４３８８９２）、ｐ．Ｇ１０６２Ｎｆｓ＊１２（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ９３５８４１８）、ｐ．Ｎ２１２Ｓｆｓ＊２（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ９１７８６４６）、ｐ．Ｅ２６１Ｇｆｓ＊４３（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ５８６８８８３）、ｐ．Ｎ３８５Ｑｆｓ＊１９（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ１７３５４５３）、ｐ．Ｑ４０６Ｐｆｓ＊４２（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ９４９４２５９）、ｐ．Ｐ７４０Ａｆｓ＊２８（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ５７０１２３８）、ｐ．Ｉ７８５Ｙｆｓ＊１８（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ７５１３８２１）、ｐ．Ｌ８２１Ｆｆｓ＊３（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ４６０３９１５）、ｐ．Ｎ８６１Ｋｆｓ＊８（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ８１８３４４７）、ｐ．Ｎ１０２０Ｋｆｓ＊１７（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ８５６５４８１）、ｐ．Ｅ１０９２Ｒｆｓ＊２４（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ８８５１６８５）等が挙げられる。
【0095】
ＭＳＨ３の変異の検出法としては、上記〔変異の検出〕において「ＴＴＫの変異の検出」等の方法として挙げた方法と同様の方法をＭＳＨ３の変異に合わせ調整して適宜採用することができる。
【0096】
（第３群の変異）
さらに、本発明において、ヘリカーゼ阻害剤の標的とするがん細胞が、第１群の変異及び／又は第２群の変異、より好ましくは第２群の変異を有することに加えて、ＥＸＯ１の変異、ＲＰＡ１の変異、ＲＰＡ２の変異、及びＲＰＡ３の変異からなる第３群から選択される少なくとも１種の変異（本明細書中、場合により「第３群の変異」という）をさらに有するがん細胞である場合、ヘリカーゼ阻害剤は当該がん細胞の増殖を同等かそれ以上に抑制しうることが見出された。したがって、がん細胞感受性予測方法、がん患者感受性予測方法、及びがん患者選別方法においては、それぞれ独立に、第３群の変異の検出の有無も指標に加えることができ、本発明は、
がん細胞の、ヘリカーゼ阻害剤に対する感受性を予測する方法であり、
（ａ）がん細胞におけるＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｃ）がん細胞におけるＥＸＯ１の変異、ＲＰＡ１の変異、ＲＰＡ２の変異、及びＲＰＡ３の変異からなる第３群の有無を検出する工程と、
（ｄ）第２群の変異に加えて第３群の変異も検出されたがん細胞を、ヘリカーゼ阻害剤に対して感受性があると予測する工程と、
を含む、方法（がん細胞感受性予測方法）；
がん患者のヘリカーゼ阻害剤による治療に対する感受性を予測する方法であり、
（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｃ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＥＸＯ１の変異、ＲＰＡ１の変異、ＲＰＡ２の変異、及びＲＰＡ３の変異からなる第３群の変異の有無を検出する工程と、
（ｄ）前記がん細胞において第２群の変異に加えて第３群の変異も検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤による治療に対して感受性があると予測する工程と、
を含む、方法（がん患者感受性予測方法）；
ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象とするがん患者を選別する方法であり、
（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｃ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＥＸＯ１の変異、ＲＰＡ１の変異、ＲＰＡ２の変異、及びＲＰＡ３の変異からなる第３群の変異の有無を検出する工程と、
（ｄ）前記がん細胞において第２群の変異に加えて第３群の変異も検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象として選別する工程と、
を含む、方法（がん患者選別方法）；
も提供する。
さらに、本発明において、ヘリカーゼ阻害剤の標的とするがん細胞が、第１群の変異及び／又は第２群の変異、より好ましくは第２群の変異を有することに加えて、ＥＸＯ１の変異、ＲＰＡ１の変異、ＲＰＡ２の変異、及びＲＰＡ３の変異からなる第３群から選択される少なくとも１種の変異（本明細書中、場合により「第３群の変異」という）をさらに有するがん細胞である場合、ヘリカーゼ阻害剤は当該がん細胞の増殖を同等かそれ以上に抑制しうることが見出された。したがって、がん細胞感受性予測方法、がん患者感受性予測方法、及びがん患者選別方法においては、それぞれ独立に、第３群の変異の検出の有無も指標に加えることができ、本発明は、
がん細胞の、ヘリカーゼ阻害剤に対する感受性を予測する方法であり、
（ａ）がん細胞におけるＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｃ）がん細胞におけるＥＸＯ１の変異、ＲＰＡ１の変異、ＲＰＡ２の変異、及びＲＰＡ３の変異からなる第３群の有無を検出する工程と、
（ｄ）第２群の変異に加えて第３群の変異も検出されたがん細胞を、ヘリカーゼ阻害剤に対して感受性があると予測する工程と、
を含む、方法（がん細胞感受性予測方法）；
がん患者のヘリカーゼ阻害剤による治療に対する感受性を予測する方法であり、
（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｃ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＥＸＯ１の変異、ＲＰＡ１の変異、ＲＰＡ２の変異、及びＲＰＡ３の変異からなる第３群の変異の有無を検出する工程と、
（ｄ）前記がん細胞において第２群の変異に加えて第３群の変異も検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤による治療に対して感受性があると予測する工程と、
を含む、方法（がん患者感受性予測方法）；
ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象とするがん患者を選別する方法であり、
（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｃ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＥＸＯ１の変異、ＲＰＡ１の変異、ＲＰＡ２の変異、及びＲＰＡ３の変異からなる第３群の変異の有無を検出する工程と、
（ｄ）前記がん細胞において第２群の変異に加えて第３群の変異も検出されたがん患者を、ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療の対象として選別する工程と、
を含む、方法（がん患者選別方法）；
も提供する。
【0097】
〔ＥＸＯ１〕
本発明における「ＥＸＯ１」は、ＤＮＡのリン酸化エステル結合の加水分解を触媒することにより、一本鎖ＤＮＡの３’－ＯＨ末端から５’－モノヌクレオチドを遊離させる３’→５’エキソヌクレアーゼであり、またＲＮａｓｅ活性を有するタンパク質（本明細書中、場合により「ＥＸＯ１タンパク質」という）をコードする遺伝子である。ＥＸＯ１タンパク質のエキソヌクレアーゼ活性は、ＭＲＥ１１タンパク質のエンドヌクレアーゼ活性と協調して、ＤＮＡ修復機構（特に、二本鎖ＤＮＡ相同末端修復機構）に関与することが報告されている。ヒト由来の天然型ＥＸＯ１ゲノムＤＮＡの典型的な塩基配列を配列番号：１７に、ヒト由来の天然型ＥＸＯ１タンパク質の典型的なアミノ酸配列を配列番号：１８に、それぞれ示す。なお、アミノ酸配列の置換、欠失、挿入、及び付加等を伴う変異を生じていないＥＸＯ１であっても、多型などによって、配列には個体差が生じうる。
本発明における「ＥＸＯ１」は、ＤＮＡのリン酸化エステル結合の加水分解を触媒することにより、一本鎖ＤＮＡの３’－ＯＨ末端から５’－モノヌクレオチドを遊離させる３’→５’エキソヌクレアーゼであり、またＲＮａｓｅ活性を有するタンパク質（本明細書中、場合により「ＥＸＯ１タンパク質」という）をコードする遺伝子である。ＥＸＯ１タンパク質のエキソヌクレアーゼ活性は、ＭＲＥ１１タンパク質のエンドヌクレアーゼ活性と協調して、ＤＮＡ修復機構（特に、二本鎖ＤＮＡ相同末端修復機構）に関与することが報告されている。ヒト由来の天然型ＥＸＯ１ゲノムＤＮＡの典型的な塩基配列を配列番号：１７に、ヒト由来の天然型ＥＸＯ１タンパク質の典型的なアミノ酸配列を配列番号：１８に、それぞれ示す。なお、アミノ酸配列の置換、欠失、挿入、及び付加等を伴う変異を生じていないＥＸＯ１であっても、多型などによって、配列には個体差が生じうる。
【0098】
本発明における「ＥＸＯ１の変異」としては、ＥＸＯ１タンパク質のアミノ酸配列におけるアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び付加が挙げられる。このようなＥＸＯ１の変異としては、ＥＸＯ１タンパク質が本来有している活性が変化しているものである限り特に制限されないが、ＥＸＯ１タンパク質活性の低下（ＥＸＯ１タンパク質活性の完全な喪失（不活性化）を含む）を引き起こす変異、すなわち、機能欠失型変異であることが好ましい。ＥＸＯ１タンパク質活性の低下は、例えば、ＥＸＯ１におけるミスセンス変異、全領域にわたるナンセンス変異、又はＥＸＯ１の全体若しくは部分的な欠失等の遺伝子構造の変化、遺伝子発現量の変化により生じうるが、これらに制限されない。
【0099】
ＥＸＯ１が本来有している遺伝子構造や遺伝子発現量が変化しているか否かは、例えば、次の方法：ゲノムＤＮＡのシークエンスによるＥＸＯ１の塩基配列の取得；ＥＸＯ１のヌクレオチド配列に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブによる蛍光検出；ＥＸＯ１のヌクレオチドに特異的に結合するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ法による検出等により、対照（例えば、健常者や同一患者の非がん組織）との比較において変化しているか否か（好ましくは機能欠失型変異が生じているか否か、ｍＲＮＡの発現量の場合には減少しているか否か）によって確認及び判定できる。
【0100】
ＥＸＯ１タンパク質が本来有している活性（機能活性）が変化しているか否かは、例えば、次の方法：ＥＸＯ１タンパク質に特異的に結合する抗体を用いた免疫染色法又はウェスタンブロッティング法による検出；及び免疫沈降法などにより精製した細胞内ＥＸＯ１タンパク質が基質一本鎖ＤＮＡの３’末端を切断するかを測定して判別する方法等により、対照（例えば、健常者や同一患者の非がん組織）との比較において変化しているか否か（好ましくは低下しているか否か、すなわち、免疫染色法やウェスタンブロッティング法により検出されるタンパク質の発現量の場合には対照に比べて低下しているか否か、ウェスタンブロッティング法により検出されるタンパク質の分子量の場合には対照と比べて変化しているか否か、エキソヌクレアーゼ活性の場合には活性が対照に比べて低下しているか否か）によって確認及び判定できる。
【0101】
このようなＥＸＯ１タンパク質活性の変化を引き起こす具体的なＥＸＯ１の変異の例としては、例えば、ｐ．Ｅ８９Ｄｆｓ＊４４（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ５８３２５４２）、ｐ．Ｖ１４２＊（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ６６５７０４８）、ｐ．Ｎ１５９Ｔｆｓ＊９（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ５６６１７７８）、ｐ．Ｇ１９０Ｗｆｓ＊５（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ３９２３０３）、ｐ．Ｆ２１５Ｌｆｓ＊９（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ１６６０４５）、ｐ．Ｃ５０８Ａｆｓ＊１３（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ１３４０６７５）、ｐ．Ｃ５０８Ｌｆｓ＊７（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ５２０７７３９）、ｐ．Ｒ７２３Ｆｆｓ＊２０（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ９２２６８０６）、ｐ．Ｄ７３１Ｔｆｓ＊４（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ６６５７０５３）等が挙げられる。
【0102】
ＥＸＯ１の変異の検出法としては、上記〔変異の検出〕において「ＴＴＫの変異の検出」等の方法として挙げた方法と同様の方法をＥＸＯ１の変異に合わせ調整して適宜採用することができる。
【0103】
〔ＲＰＡ１、ＲＰＡ２、ＲＰＡ３〕
本発明における「ＲＰＡ１」、「ＲＰＡ２」、及び「ＲＰＡ３」は、それぞれ、互いに相互作用することで複製タンパク質ＲＰＡ（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）を形成して、ＭＲＮ複合体と相互作用することが報告されている（例えば、Ｇｒｅｇ Ｏａｋｌｅｙら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．，２００９ Ａｕｇｕｓｔ １１，４８（３１），ｐ．７４７３－７４８１；Ｔｉｎｇ Ｌｉｕら，Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｓｉｎ，２０１６，４８（７），ｐ．６６５－６７０等）タンパク質（本明細書中、場合により、それぞれ、「ＲＰＡ１タンパク質」、「ＲＰＡ２タンパク質」、及び「ＲＰＡ１タンパク質」といい、これらを総称して、場合により「ＲＰＡ１～３タンパク質」という）をコードする遺伝子である。これらのうちのいずれか１種のタンパク質の機能が欠失しても、前記複合体自体の機能が低下して上記ＤＮＡ修復機構が正常に機能しないことから、第３群の変異のうち、かかる複合体を形成するタンパク質をコードするＲＰＡ１、ＲＰＡ２、及びＲＰＡ３（以下、場合により「ＲＰＡ１～３」と総称する）においては特に、これらのうちの少なくとも１種の変異を検出することが好ましい。
本発明における「ＲＰＡ１」、「ＲＰＡ２」、及び「ＲＰＡ３」は、それぞれ、互いに相互作用することで複製タンパク質ＲＰＡ（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）を形成して、ＭＲＮ複合体と相互作用することが報告されている（例えば、Ｇｒｅｇ Ｏａｋｌｅｙら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．，２００９ Ａｕｇｕｓｔ １１，４８（３１），ｐ．７４７３－７４８１；Ｔｉｎｇ Ｌｉｕら，Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｓｉｎ，２０１６，４８（７），ｐ．６６５－６７０等）タンパク質（本明細書中、場合により、それぞれ、「ＲＰＡ１タンパク質」、「ＲＰＡ２タンパク質」、及び「ＲＰＡ１タンパク質」といい、これらを総称して、場合により「ＲＰＡ１～３タンパク質」という）をコードする遺伝子である。これらのうちのいずれか１種のタンパク質の機能が欠失しても、前記複合体自体の機能が低下して上記ＤＮＡ修復機構が正常に機能しないことから、第３群の変異のうち、かかる複合体を形成するタンパク質をコードするＲＰＡ１、ＲＰＡ２、及びＲＰＡ３（以下、場合により「ＲＰＡ１～３」と総称する）においては特に、これらのうちの少なくとも１種の変異を検出することが好ましい。
【0104】
ヒト由来の天然型ＲＰＡ１～３ゲノムＤＮＡの典型的な塩基配列を、それぞれ、配列番号：１９、２１、２３に示し、ヒト由来の天然型ＲＰＡ１～３タンパク質の典型的なアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号：２０、２２、２４に示す。なお、アミノ酸配列の置換、欠失、挿入、及び付加等を伴う変異を生じていないＲＰＡ１、ＲＰＡ２、又はＲＰＡ３であっても、それぞれ、多型などによって、配列には個体差が生じうる。
【0105】
本発明における「ＲＰＡ１の変異」、「ＲＰＡ２の変異」、及び「ＲＰＡ３の変異」（以下、「ＲＰＡ１～３の変異」という）としては、それぞれ、ＲＰＡ１～３タンパク質のアミノ酸配列におけるアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び付加が挙げられる。このようなＲＰＡ１～３の変異としては、それぞれ、ＲＰＡ１～３タンパク質が本来有している活性が変化しているものである限り特に制限されないが、ＲＰＡ１～３タンパク質活性の低下（ＲＰＡ１～３タンパク質活性の完全な喪失（不活性化）を含む）を引き起こす変異、すなわち、機能欠失型変異であることが好ましい。ＲＰＡ１～３タンパク質活性の低下は、それぞれ、例えば、ＲＰＡ１～３におけるミスセンス変異、全領域にわたるナンセンス変異、又はＲＰＡ１～３の全体若しくは部分的な欠失等の遺伝子構造の変化、遺伝子発現量の変化により生じうるが、これらに制限されない。
【0106】
ＲＰＡ１～３が本来有している遺伝子構造や遺伝子発現量が変化しているか否かは、例えば、次の方法：ゲノムＤＮＡのシークエンスによるＲＰＡ１～３の塩基配列の取得；ＲＰＡ１～３のヌクレオチド配列に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブによる蛍光検出；ＲＰＡ１～３のヌクレオチドに特異的に結合するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ法による検出等により、対照（例えば、健常者や同一患者の非がん組織）との比較において変化しているか否か（好ましくは機能欠失型変異が生じているか否か、ｍＲＮＡの発現量の場合には減少しているか否か）によって確認及び判定できる。
【0107】
ＲＰＡ１～３タンパク質が本来有している活性（機能活性）が変化しているか否かは、例えば、次の方法：ＲＰＡ１～３タンパク質に特異的に結合する抗体を用いた免疫染色法又はウェスタンブロッティング法による検出；及び免疫沈降法などにより精製した細胞内ＲＰＡ１～３タンパク質が複合体の構成タンパク質であるそれ以外のＲＰＡ１～３タンパク質と結合しているかをウェスタンブロット法などにより判別する方法等により、対照（例えば、健常者や同一患者の非がん組織）との比較において変化しているか否か（好ましくは低下しているか否か、すなわち、免疫染色法やウェスタンブロッティング法により検出されるＲＰＡ１～３タンパク質の発現量の場合には対照に比べて低下しているか否か、ウェスタンブロッティング法により検出されるタンパク質の分子量の場合には対照と比べて変化しているか否か、ウェスタンブロッティング法により検出される複合体の構成タンパク質であるそれ以外のＲＰＡ１～３タンパク質が結合している量が対照と比べて低下しているか否か）によって確認及び判定できる。
【0108】
このようなＲＰＡ１～３タンパク質活性の変化を引き起こす具体的なＲＰＡ１の変異の例としては、例えば、ｐ．Ｎ２７４Ｍｆｓ＊５（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ４７２２５０２）、ｐ．Ｎ３３８Ｋｆｓ＊２８（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ１７４５３２２）、ｐ．Ｅ３６３Ｇｆｓ＊４（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ６０４８７１５）、ｐ．Ｅ４１８Ｋｆｓ＊５（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ１１１５４１）、ｐ．Ｅ６０１Ｖｆｓ＊５３（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ８５１５０５４）、ｐ．Ｓ６０９Ｒｆｓ＊４６（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ１１２０２５）等が挙げられる。また、ＲＰＡ２の変異の例としては、例えば、ｐ．Ｇ３４Ａｆｓ＊６９（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ８５３７４２９）、ｐ．Ｖ１２７Ｇｆｓ＊２６（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ９０７９３９）、ｐ．Ｅ１５８Ｇｆｓ＊５（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ８２２０４６１）等が挙げられる。さらに、ＲＰＡ３の変異の例としては、例えば、ｐ．Ｎ５０Ｍｆｓ＊６（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ３０２９０８２）、ｐ．Ｓ６４Ｎｆｓ＊２６（ＣＯＳＭＩＣ Ｌｅｇａｃｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＩＤ：ＣＯＳＭ６８４８１８１）等が挙げられる。
【0109】
ＲＰＡ１～３の変異の検出法としては、上記〔変異の検出〕において「ＴＴＫの変異の検出」等の方法として挙げた方法と同様の方法をＲＰＡ１～３の変異にそれぞれ合わせ調整して適宜採用することができる。
【0110】
（ヘリカーゼ）
さらに、本発明に係るヘリカーゼ阻害剤の標的であるヘリカーゼが正常に発現していない場合及び／又は正常に機能していない場合には、ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療を効果的に実施することができないおそれがある。したがって、がん細胞感受性予測方法、がん患者感受性予測方法、及びがん患者選別方法においては、さらに、ヘリカーゼをコードする遺伝子の変異及びヘリカーゼの発現低下の検出も指標に加えることができる。
さらに、本発明に係るヘリカーゼ阻害剤の標的であるヘリカーゼが正常に発現していない場合及び／又は正常に機能していない場合には、ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療を効果的に実施することができないおそれがある。したがって、がん細胞感受性予測方法、がん患者感受性予測方法、及びがん患者選別方法においては、さらに、ヘリカーゼをコードする遺伝子の変異及びヘリカーゼの発現低下の検出も指標に加えることができる。
【0111】
ヘリカーゼをコードする遺伝子の変異の検出法としては、上記〔変異の検出〕において「ＴＴＫの変異の検出」等の方法として挙げた方法と同様の方法をヘリカーゼをコードする遺伝子（例えば、ＷＲＮ遺伝子）の変異に合わせ調整して適宜採用することができる。また、ヘリカーゼの発現低下の検出法としては、上述のとおりである。
【0112】
＜がんを治療する方法＞
本発明は、
（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記がん細胞において前記変異が検出されたがん患者に対して、ヘリカーゼ阻害剤を投与する工程と、
を含む、がんを治療する方法；並びに、
（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記がん細胞において前記変異が検出されたがん患者に対して、ヘリカーゼ阻害剤を投与する工程と、
を含む、がんを治療する方法（本明細書中、これらを総称して、場合により「がん治療方法」という）も提供する。
本発明は、
（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記がん細胞において前記変異が検出されたがん患者に対して、ヘリカーゼ阻害剤を投与する工程と、
を含む、がんを治療する方法；並びに、
（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異の有無を検出する工程と、
（ｂ）前記がん細胞において前記変異が検出されたがん患者に対して、ヘリカーゼ阻害剤を投与する工程と、
を含む、がんを治療する方法（本明細書中、これらを総称して、場合により「がん治療方法」という）も提供する。
【0113】
本発明のがん治療方法において、第１群の変異の検出、第２群の変異の検出、及びヘリカーゼ阻害剤としては、それぞれ、上述のとおりである。
【0114】
がん患者に対するヘリカーゼ阻害剤の投与は、経口的な投与であっても非経口的な投与（例えば、静脈投与、動脈投与、局所投与）であってもよい。
【0115】
また、がん患者に対するヘリカーゼ阻害剤の投与量は、ヘリカーゼを阻害してがんを治療するのに有効な量であればよく、ヘリカーゼを阻害する化合物の性質、がん患者の年齢、体重、症状、健康状態、がんの進行状況などに応じて、適宜選択されるものであるため一概にはいえないが、例えば、ヒトに投与する場合、ヘリカーゼを阻害する化合物の量で、１日当たり、０．００１～１００，０００ｍｇ、好ましくは、０．０１～５，０００ｍｇである。がん患者に対するヘリカーゼ阻害剤の投与頻度としても同様に、一概にはいえないが、例えば、１日あたり１回、又は２～４回に分けて投与され、適当な間隔で繰り返すのが好ましい。前記投与量及び投与頻度は、医師の判断によって必要により適宜増減されうる。
【0116】
これにより、がん患者における第１群の変異及び／又は第２群の変異を有するがん細胞において、さらにヘリカーゼが阻害され、がん細胞の死滅の促進及び／又は増殖の抑制により、がんを治療することができる。
【0117】
治療対象となるがんとしては、例えば、大腸がん、胃がん、子宮頸がん、子宮体がん、前立腺がん、乳がん、肺がん、膀胱がん、食道がん、頭頸部癌、腎臓がん、卵巣がん、リンパ腫、腺様嚢胞がん、膵臓がんが挙げられるが、これらのがんに限定されない。
【0118】
＜変異の有無を検出するための試薬＞
また、本発明は、上記の方法において、第１群の変異及び／又は第２群の変異の有無を検出するための試薬であり、
（ｉ）ＴＴＫ及びＲＡＤ５０からなる第１群から選択される１種の遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプライマー、
（ｉｉ）ＴＴＫ及びＲＡＤ５０からなる第１群から選択される１種の遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブ、及び
（ｉｉｉ）ＴＴＫタンパク質及びＲＡＤ５０タンパク質からなる第１群から選択される１種のタンパク質に特異的に結合する抗体、
のうちの少なくともいずれかの分子を有効成分とする試薬；並びに、
（ｉ）ＲＡＤ５０、ＭＲＥ１１、ＮＢＮ、ＤＮＡ２、及びＲＢＢＰ８からなる第２群から選択される１種の遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプライマー、
（ｉｉ）ＲＡＤ５０、ＭＲＥ１１、ＮＢＮ、ＤＮＡ２、及びＲＢＢＰ８からなる第２群から選択される１種の遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブ、及び
（ｉｉｉ）ＲＡＤ５０タンパク質、ＭＲＥ１１タンパク質、ＮＢＳ１タンパク質、ＤＮＡ２タンパク質、及びＣｔＩＰタンパク質からなる第２群から選択される１種のタンパク質に特異的に結合する抗体、
のうちの少なくともいずれかの分子を有効成分とする試薬を提供する。
また、本発明は、上記の方法において、第１群の変異及び／又は第２群の変異の有無を検出するための試薬であり、
（ｉ）ＴＴＫ及びＲＡＤ５０からなる第１群から選択される１種の遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプライマー、
（ｉｉ）ＴＴＫ及びＲＡＤ５０からなる第１群から選択される１種の遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブ、及び
（ｉｉｉ）ＴＴＫタンパク質及びＲＡＤ５０タンパク質からなる第１群から選択される１種のタンパク質に特異的に結合する抗体、
のうちの少なくともいずれかの分子を有効成分とする試薬；並びに、
（ｉ）ＲＡＤ５０、ＭＲＥ１１、ＮＢＮ、ＤＮＡ２、及びＲＢＢＰ８からなる第２群から選択される１種の遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプライマー、
（ｉｉ）ＲＡＤ５０、ＭＲＥ１１、ＮＢＮ、ＤＮＡ２、及びＲＢＢＰ８からなる第２群から選択される１種の遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブ、及び
（ｉｉｉ）ＲＡＤ５０タンパク質、ＭＲＥ１１タンパク質、ＮＢＳ１タンパク質、ＤＮＡ２タンパク質、及びＣｔＩＰタンパク質からなる第２群から選択される１種のタンパク質に特異的に結合する抗体、
のうちの少なくともいずれかの分子を有効成分とする試薬を提供する。
【0119】
上記オリゴヌクレオチドプライマーは、各遺伝子のゲノムＤＮＡやｃＤＮＡの塩基配列情報（例えば、配列番号：３、５、９、１１、１３、１５）に基づき、上記した方法や増幅する領域に即したプライマーとなるように、また、目的の遺伝子以外の遺伝子の増幅産物が極力生じないように設計すればよい。このようなオリゴヌクレオチドプライマー設計は、当業者であれば、常法により行うことができる。オリゴヌクレオチドプライマーの長さは、通常１５～５０塩基長、好ましくは１５～３０塩基長であるが、方法及び目的によってはこれより長くても短くてもよい。
【0120】
上記オリゴヌクレオチドプローブは、各遺伝子のゲノムＤＮＡやｃＤＮＡの塩基配列情報（例えば、配列番号：３、５、９、１１、１３、１５）に基づき、上記した方法やハイブリダイズさせる領域に即したプローブとなるように、また、目的の遺伝子以外の遺伝子へのハイブリダイズが極力生じないように設計すればよい。このようなオリゴヌクレオチドプローブ設計は、当業者であれば、常法により行うことができる。オリゴヌクレオチドプローブの長さは、通常、１５～２００塩基長、好ましくは１５～１００塩基長、さらに好ましくは１５～５０塩基長であるが、方法及び目的によってはこれより長くても短くてもよい。
【0121】
オリゴヌクレオチドプローブは、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５’端を３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法、及びクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、又はビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
【0122】
上記のオリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。オリゴヌクレオチドプローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖ＤＮＡ断片として作製することもできる。また、本発明のオリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブは、天然のヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）やリボヌクレオチド（ＲＮＡ））のみから構成されていなくともよく、非天然型のヌクレオチドにてその一部又は全部が構成されていてもよい。非天然型のヌクレオチドとしては、ＰＮＡ（ｐｏｌｙａｍｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（登録商標、ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（登録商標、２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）、及びこれらの複合体が挙げられる。
【0123】
上記第１群のタンパク質又は第２群のタンパク質に特異的に結合する抗体は、ポリクローナル抗体であれば、抗原（各タンパク質（例えば、ＴＴＫタンパク質等）、その部分ペプチド、又はこれらを発現する細胞など）で免疫動物を免疫し、その抗血清から、従来の手段（例えば、塩析、遠心分離、透析、カラムクロマトグラフィーなど）によって、精製して取得することができる。また、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法や組換えＤＮＡ法によって作製することができる。
【0124】
ハイブリドーマ法としては、代表的には、コーラー及びミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ １９７５；２５６：４９５）が挙げられる。この方法における細胞融合工程に使用される抗体産生細胞は、抗原（各タンパク質（例えば、ＴＴＫタンパク質等）、その部分ペプチド、又はこれらを発現する細胞など）で免疫された動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギ）の脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球などである。免疫されていない動物から予め単離された上記の細胞又はリンパ球などに対して、抗原を培地中で作用させることによって得られた抗体産生細胞も使用することが可能である。ミエローマ細胞としては公知の種々の細胞株を使用することが可能である。抗体産生細胞及びミエローマ細胞は、それらが融合可能であれば、異なる動物種起源のものでもよいが、好ましくは、同一の動物種起源のものである。ハイブリドーマは、例えば、抗原で免疫されたマウスから得られた脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞との間の細胞融合により産生され、その後のスクリーニングにより、第１群のタンパク質又は第２群のタンパク質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。第１群のタンパク質又は第２群のタンパク質に対するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを培養することにより、又はハイブリドーマを投与した哺乳動物の腹水から、取得することができる。
【0125】
組換えＤＮＡ法は、上記抗体をコードするＤＮＡをハイブリドーマやＢ細胞等からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞（例えば哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞など）に導入し、本発明の抗体を組換え抗体として産生させる方法である（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７ ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０００ ＯＸＦＯＲＤ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＰＲＥＳＳ，Ｖａｎｄａｍｍｅ ＡＭら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９０；１９２：７６７－７７５）。抗体をコードするＤＮＡの発現においては、重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよく、重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよい（ＷＯ９４／１１５２３号公報等）。抗体は、上記宿主細胞を培養し、宿主細胞内又は培養液から分離・精製し、実質的に純粋で均一な形態で取得することができる。抗体の分離・精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている方法を使用することができる。トランスジェニック動物作製技術を用いて、抗体遺伝子が組み込まれたトランスジェニック動物（ウシ、ヤギ、ヒツジ又はブタなど）を作製すれば、そのトランスジェニック動物のミルクから、抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である。
【0126】
こうして得られた抗体若しくはその遺伝子を基に、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、ｄｓＦｖ、及びダイアボディー等の、抗体の機能的断片やその多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）を調製することができる。
【0127】
直接的に第１群のタンパク質又は第２群のタンパク質に結合した抗体量を検出する場合、得られた抗ＴＴＫタンパク質抗体、抗ＲＡＤ５０タンパク質抗体、抗ＭＲＥ１１タンパク質抗体、抗ＮＢＳ１タンパク質抗体、抗ＤＮＡ２タンパク質抗体、抗ＣｔＩＰタンパク質抗体等は、直接、酵素、放射性同位体、蛍光色素又はアビジン－ビオチン系等により標識して用いられる。一方、第１群のタンパク質又は第２群のタンパク質に結合した抗体量を、二次抗体などを利用して検出する間接的検出方法を実施する場合、得られた抗タンパク質抗体（例えば、抗ＴＴＫタンパク質抗体等）（一次抗体）は標識する必要はなく、検出に際しては、当該抗体を認識する標識された分子（例えば、二次抗体やプロテインＡ）を用いればよい。
【0128】
本発明の試薬においては、有効成分としての上記分子の他、必要に応じて、滅菌水や生理食塩水、緩衝剤、保存剤など、試薬として許容される他の成分を含むことができる。さらに、ＭＳＨ３の変異又は第３群の変異の検出のための各オリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプローブ、及び抗体のうちの少なくともいずれかの分子をさらに含むか、当該分子を含む試薬をさらに組み合わせてもよい。
【0129】
＜がんの治療に用いる化合物のスクリーニング方法・がん治療剤＞
本発明は、
ヘリカーゼを阻害するか否かを指標として化合物を選別する工程
を含む、ＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異が検出されるがん細胞を含むがんの治療に用いる化合物のスクリーニング方法；並びに、
ヘリカーゼを阻害するか否かを指標として化合物を選別する工程
を含む、ＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異が検出されるがん細胞を含むがんの治療に用いる化合物のスクリーニング方法；（以下、これらを総称して、場合により「化合物のスクリーニング方法」という）も提供する。
本発明は、
ヘリカーゼを阻害するか否かを指標として化合物を選別する工程
を含む、ＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異が検出されるがん細胞を含むがんの治療に用いる化合物のスクリーニング方法；並びに、
ヘリカーゼを阻害するか否かを指標として化合物を選別する工程
を含む、ＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異が検出されるがん細胞を含むがんの治療に用いる化合物のスクリーニング方法；（以下、これらを総称して、場合により「化合物のスクリーニング方法」という）も提供する。
【0130】
また、上記化合物のスクリーニング方法でスクリーニングされたヘリカーゼを阻害する化合物をそれぞれ用いて、
ヘリカーゼを阻害する化合物を有効成分として含有し、ＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異が検出されるがん細胞を含むがんの治療剤である、がん治療剤；並びに、
ヘリカーゼを阻害する化合物を有効成分として含有し、ＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異が検出されるがん細胞を含むがんの治療剤である、がん治療剤（以下、これらを総称して、場合により「がん治療剤」という）も提供することができる。
ヘリカーゼを阻害する化合物を有効成分として含有し、ＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異が検出されるがん細胞を含むがんの治療剤である、がん治療剤；並びに、
ヘリカーゼを阻害する化合物を有効成分として含有し、ＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異が検出されるがん細胞を含むがんの治療剤である、がん治療剤（以下、これらを総称して、場合により「がん治療剤」という）も提供することができる。
【0131】
本発明の化合物のスクリーニング方法に適用する被験化合物としては特に制限はなく、例えば、上記のヘリカーゼを阻害する化合物の例として挙げた化合物、ポリペプチド、及びポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種（ただしヘリカーゼを阻害するか否かは既知でなくてよい）が挙げられる。また、前記被検化合物としてより具体的には、例えば、合成低分子化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、ペプチドライブラリー、ｓｉＲＮＡ、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）の抽出液及び培養上清、精製又は部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物又は動物由来の抽出物、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーが挙げられる。また、前記被験化合物は、公知のヘリカーゼ阻害剤の誘導体であってもよい。
【0132】
ヘリカーゼを阻害するか否かを指標として化合物を選別する方法（スクリーニング）においては、上記のヘリカーゼの活性又は発現の阻害の確認系に、被験化合物を作用させて、その後のヘリカーゼ活性又は発現を検出すればよい。検出の結果、対照（例えば、被験化合物を添加しない場合）におけるヘリカーゼ活性又は発現と比較して、当該活性又は発現が低下していれば、ヘリカーゼが阻害されたと評価することができる。
【0133】
前記スクリーニングにおいて、化合物による阻害の有無を評価される「ヘリカーゼ」としては、特に制限されず、例えば、ＲｅｃＱヘリカーゼ（ＲｅｃＱＬ１、ＢＬＭ、ＷＲＮ、ＲｅｃＱＬ４／ＲＴＳ、ＲｅｃＱＬ５）が挙げられ、ＲｅｃＱヘリカーゼであることが好ましく、ＷＲＮ（ウェルナーシンドロームプロテイン）であることがより好ましい。
【0134】
本発明の化合物のスクリーニング方法により同定された化合物は、薬理学上許容される上記のヘリカーゼ阻害剤で挙げた添加成分等と適宜混合し、公知の製剤学的方法で製剤化することにより、医薬品として、がん治療剤とすることができる。
【実施例】
【0135】
以下、試験例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0136】
（試験例１）
１．実験材料及び方法
（１）細胞株
先ず、約７０株のがん細胞株について、ｓｉＲＮＡによるＷＲＮの発現抑制をおこない、増殖の抑制が確認された細胞株と増殖が抑制されなかった細胞株とをそれぞれ選択した。以下の試験では、選択した細胞株の一部として、ＨＣＴ １１６、ＫＭ１２、ＳＷ４８、ＣＷ－２、ＨＴ－２９、ＮＣＩ－Ｈ７１６（大腸がん）、ＲＬ９５－２、Ｃ－３３Ａ、ＣＯＬＯ－６８４（子宮がん）、ＳＮＵ－１、ＧＳＵ（胃がん）を、試験対象のがん細胞株として用いた例を示す。
１．実験材料及び方法
（１）細胞株
先ず、約７０株のがん細胞株について、ｓｉＲＮＡによるＷＲＮの発現抑制をおこない、増殖の抑制が確認された細胞株と増殖が抑制されなかった細胞株とをそれぞれ選択した。以下の試験では、選択した細胞株の一部として、ＨＣＴ １１６、ＫＭ１２、ＳＷ４８、ＣＷ－２、ＨＴ－２９、ＮＣＩ－Ｈ７１６（大腸がん）、ＲＬ９５－２、Ｃ－３３Ａ、ＣＯＬＯ－６８４（子宮がん）、ＳＮＵ－１、ＧＳＵ（胃がん）を、試験対象のがん細胞株として用いた例を示す。
【0137】
ＨＣＴ １１６は、ＴＴＫ、ＲＡＤ５０、及びＭＳＨ３の全てに変異を有するがん細胞株である。ＫＭ１２、ＲＬ９５－２、及びＣ－３３Ａは、少なくともＴＴＫ及びＲＡＤ５０に変異を有するがん細胞株である。ＳＮＵ－１は、少なくともＴＴＫ及びＭＳＨ３に変異を有するがん細胞株である。ＳＷ４８は、少なくともＴＴＫに変異を有するがん細胞株である。ＣＷ－２は、少なくともＲＡＤ５０に変異を有するがん細胞株である。ＣＯＬＯ－６８４、ＧＳＵ、ＨＴ－２９、及びＮＣＩ－Ｈ７１６は、ＴＴＫ及びＲＡＤ５０のいずれにも変異を有さず、かつ、ＭＳＨ３の変異が報告されていないがん細胞株である。これらのがん細胞株及びその由来組織（Ｔｉｓｓｕｅ）と、各がん細胞株におけるＴＴＫ、ＲＡＤ５０、及びＭＳＨ３の変異の情報（機能欠失型変異を生じさせる遺伝子変異の情報）とを下記の表１に示す。
【0138】
【表1】
【0139】
表１中、「＊１」はＢｒｏａｄ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅが作成しているがん細胞株データベース：「Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ（ＣＣＬＥ）」に、「＊２」はＭｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１８ Ｊｕｌ １９；７１（２）、ｐ．３１９－３３１．ｅ３に、「＊３」はＥｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０００ Ｍａｙ；３６（７）、ｐ．９２５－９３１に、それぞれ開示された変異であることを示し、「Ｎ．Ｉ．」は、変異に関する情報が公知になっていないことを示す。
【0140】
（２）短鎖干渉（ｓｉ）ＲＮＡ
ＷＲＮの発現抑制には、ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製）を用いた。トランスフェクションには、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。また、被験物質にはＷＲＮ ｓｉＲＮＡ（ＷＲＮ ｓｉＲＮＡ１、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社商品コード：Ｊ－０１０３７８－０６、配列番号：２５）を、陰性対照には非標的化ｓｉＲＮＡ（ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｓｉＲＮＡ１、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社商品コード：Ｄ－００１８１０－０１、配列番号：２６）を、それぞれ用いた。各ｓｉＲＮＡは、５×ｓｉＲＮＡ ｂｕｆｆｅｒ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製：Ｂ－００２０００－ＵＢ－１００）をｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ社製：ＡＭ９９３２）を用いて５倍希釈した１×ｓｉＲＮＡ ｂｕｆｆｅｒを用いて溶解した。
ＷＲＮの発現抑制には、ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製）を用いた。トランスフェクションには、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。また、被験物質にはＷＲＮ ｓｉＲＮＡ（ＷＲＮ ｓｉＲＮＡ１、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社商品コード：Ｊ－０１０３７８－０６、配列番号：２５）を、陰性対照には非標的化ｓｉＲＮＡ（ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｓｉＲＮＡ１、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社商品コード：Ｄ－００１８１０－０１、配列番号：２６）を、それぞれ用いた。各ｓｉＲＮＡは、５×ｓｉＲＮＡ ｂｕｆｆｅｒ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製：Ｂ－００２０００－ＵＢ－１００）をｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ社製：ＡＭ９９３２）を用いて５倍希釈した１×ｓｉＲＮＡ ｂｕｆｆｅｒを用いて溶解した。
【0141】
（３）ＷＲＮの発現抑制試験
各がん細胞株において、ＷＲＮ発現抑制による細胞障害活性を評価した。各細胞株を下記の表２に記載の培養液を用いてそれぞれ細胞培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製：４３０６４１Ｕ）にて培養し、細胞表面をＰＢＳ（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社製：１４２４９－２４）で洗浄した後に、トリプシン（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社製：３５５５４－６４）を添加し、３７℃で５分間インキュベーションした後、各培養液を用いて懸濁した。自動セルカウンター（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ社製：ＮＣ－２００）及びＶｉａ１－Ｃａｓｅｔｔｅ（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ社製：９４１－００１１）を用いて細胞数を測定した後、下記の表３に示す細胞濃度となるように各細胞株液を各培養液で調整した。９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ社製）に各細胞株液を１００μＬ／ウェルずつ播種し、細胞数が表３に示す播種数となるようにそれぞれ播種した。
各がん細胞株において、ＷＲＮ発現抑制による細胞障害活性を評価した。各細胞株を下記の表２に記載の培養液を用いてそれぞれ細胞培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製：４３０６４１Ｕ）にて培養し、細胞表面をＰＢＳ（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社製：１４２４９－２４）で洗浄した後に、トリプシン（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社製：３５５５４－６４）を添加し、３７℃で５分間インキュベーションした後、各培養液を用いて懸濁した。自動セルカウンター（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ社製：ＮＣ－２００）及びＶｉａ１－Ｃａｓｅｔｔｅ（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ社製：９４１－００１１）を用いて細胞数を測定した後、下記の表３に示す細胞濃度となるように各細胞株液を各培養液で調整した。９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ社製）に各細胞株液を１００μＬ／ウェルずつ播種し、細胞数が表３に示す播種数となるようにそれぞれ播種した。
【0142】
次いで、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｔｉｆｉｃ社製：１３７７８１５０）をＯｐｔｉ－ＭｅＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製：３１９８５－０６２）を用いて５０倍希釈した後に、１２０ｎＭの被検物質（ＷＲＮ ｓｉＲＮＡ１）又は非標的化ｓｉＲＮＡ（ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｓｉＲＮＡ１）と等量混合した。混合液を２０μＬ／ウェルずつ上記の細胞を播種したプレートに添加した後、プレートを振盪し、終濃度１０ｎＭのｓｉＲＮＡをそれぞれトランスフェクションした。
【0143】
３７℃インキュベータにて７日間培養後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ２．０ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製：Ｇ９２４３）を５０μＬ／ウェルずつ添加し、室温で５分間インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いてルミネッセンスを測定し、細胞生存のマーカーである細胞内ＡＴＰ量を測定した。ＷＲＮ発現抑制による細胞生存率は、陰性対照をトランスフェクションして７日間培養後の各がん細胞株における細胞内ＡＴＰ量を１００％として算出した。各がん細胞株のＷＲＮ発現抑制による細胞生存率（％ｓｕｒｖｉｖａｌ）を図１に示す。
【0144】
【表2】
【0145】
【表3】
【0146】
２．結果
図１に示したように、ＷＲＮの発現抑制試験では、ＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異のうちの少なくともいずれかの変異を有する７つのがん細胞株全てにおいて、細胞生存率が７０％以下（図１では特に４０％以下）と、顕著な細胞生存率の低下が認められた。また、試験を行った他のがん細胞株についても同様に、ＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異のうちの少なくともいずれかの変異を有するがん細胞株において、顕著な細胞生存率の低下が認められた。この結果から、ＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる群（第１群）から選択される少なくとも１種の変異が生じているがん細胞株の生存は、ヘリカーゼの機能に強く依存していることが示され、これらのがん細胞において、ヘリカーゼの発現抑制を行うと、当該がん細胞の増殖が顕著に抑制されることが明らかとなった。
図１に示したように、ＷＲＮの発現抑制試験では、ＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異のうちの少なくともいずれかの変異を有する７つのがん細胞株全てにおいて、細胞生存率が７０％以下（図１では特に４０％以下）と、顕著な細胞生存率の低下が認められた。また、試験を行った他のがん細胞株についても同様に、ＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異のうちの少なくともいずれかの変異を有するがん細胞株において、顕著な細胞生存率の低下が認められた。この結果から、ＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる群（第１群）から選択される少なくとも１種の変異が生じているがん細胞株の生存は、ヘリカーゼの機能に強く依存していることが示され、これらのがん細胞において、ヘリカーゼの発現抑制を行うと、当該がん細胞の増殖が顕著に抑制されることが明らかとなった。
【0147】
（試験例２）
１．実験材料及び方法
（１）細胞株
さらに、上記約７０株のがん細胞株を含む約２００株のがん細胞株について、ｓｉＲＮＡによるＷＲＮの発現抑制をおこない、増殖の抑制が確認された細胞株と増殖が抑制されなかった細胞株とをそれぞれ選択した。以下の試験では、選択した細胞株の一部として、ＨＣＴ １１６、ＫＭ１２、ＬＳ４１１Ｎ、ＳＮＵ－４０７、ＳＮＵ－Ｃ５、ＲＫＯ、ＣＷ－２、ＣＣＫ－８１、ＨＴ－２９（大腸がん）、ＲＬ９５－２、ＡＮ３ ＣＡ、Ｃ－３３Ａ、ＳＩＨＡ、ＪＨＵＥＭ－３（子宮がん）、ＩＭ９５、ＭＫＮ１（胃がん）、ＴＯＶ－２１Ｇ、ＰＡ－１（卵巣がん）を、以下の試験対象のがん細胞株として用いた例を示す。
１．実験材料及び方法
（１）細胞株
さらに、上記約７０株のがん細胞株を含む約２００株のがん細胞株について、ｓｉＲＮＡによるＷＲＮの発現抑制をおこない、増殖の抑制が確認された細胞株と増殖が抑制されなかった細胞株とをそれぞれ選択した。以下の試験では、選択した細胞株の一部として、ＨＣＴ １１６、ＫＭ１２、ＬＳ４１１Ｎ、ＳＮＵ－４０７、ＳＮＵ－Ｃ５、ＲＫＯ、ＣＷ－２、ＣＣＫ－８１、ＨＴ－２９（大腸がん）、ＲＬ９５－２、ＡＮ３ ＣＡ、Ｃ－３３Ａ、ＳＩＨＡ、ＪＨＵＥＭ－３（子宮がん）、ＩＭ９５、ＭＫＮ１（胃がん）、ＴＯＶ－２１Ｇ、ＰＡ－１（卵巣がん）を、以下の試験対象のがん細胞株として用いた例を示す。
【0148】
ＨＣＴ １１６は、上記のＴＴＫ、ＲＡＤ５０、及びＭＳＨ３に加えて、少なくともＤＮＡ２に変異（ｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異）を有するがん細胞株である。ＫＭ１２は、上記のＴＴＫ及びＲＡＤ５０に加えて、少なくともＤＮＡ２、ＲＢＢＰ８、及びＥＸＯ１に変異（ｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異）を有するがん細胞株である。ＬＳ４１１Ｎは、少なくともＭＲＥ１１、ＤＮＡ２、ＲＢＢＰ８、及びＥＸＯ１に変異（ｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異）を有するがん細胞株である。ＳＮＵ－４０７は、少なくともＤＮＡ２、ＲＢＢＰ８、及びＥＸＯ１に変異（ｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異）を有するがん細胞株である。ＳＮＵ－Ｃ５は、少なくともＲＡＤ５０に変異（ｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異）を有するがん細胞株である。ＲＫＯは、少なくともＲＡＤ５０及びＲＰＡ３に変異（ｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異）を有するがん細胞株である。ＣＷ－２は、上記のＲＡＤ５０に加えて、少なくともＲＰＡ１に変異（ｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異）を有するがん細胞株である。ＣＣＫ－８１は、少なくともＲＢＢＰ８に変異（ｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異）を有するがん細胞株である。ＲＬ９５－２は、上記のＲＡＤ５０に加えて、少なくともＤＮＡ２に変異（ｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異）を有するがん細胞株である。ＡＮ３ ＣＡは、少なくともＤＮＡ２に変異（ｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異）を有するがん細胞株である。Ｃ－３３Ａは、上記のＲＡＤ５０に加えて、少なくともＤＮＡ２、ＲＰＡ１に変異（ｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異）を有するがん細胞株である。ＩＭ９５は、少なくともＲＡＤ５０、ＮＢＮ、ＤＮＡ２、及びＲＢＢＰ８に変異（ｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異）を有するがん細胞株である。ＴＯＶ－２１Ｇは、少なくともＮＢＮに変異（ｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異）を有するがん細胞株である。ＨＴ－２９、ＳＩＨＡ、ＪＨＵＥＭ－３、ＭＫＮ１、及びＰＡ－１は、ＴＴＫ、ＲＡＤ５０、ＭＲＥ１１、ＮＢＮ、ＤＮＡ２、ＲＢＢＰ８、ＥＸＯ１、ＲＰＡ１、ＲＰＡ２、及びＲＰＡ３のいずれにも変異を有さないがん細胞株である。これらのがん細胞株及びその由来組織（Ｔｉｓｓｕｅ）と、各がん細胞株におけるＲＡＤ５０、ＭＲＥ１１、ＮＢＮ、ＤＮＡ２、ＲＢＢＰ８、ＥＸＯ１、ＲＰＡ１、及びＲＰＡ３のｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異の有無の情報とを下記の表４に示す。
【0149】
表４に記載の各変異は、Ｂｒｏａｄ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅが作成しているがん細胞株データベース：「Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ（ＣＣＬＥ）」にそれぞれ開示された変異である。また、表４において「Ｎ．Ｉ．」は、少なくとも機能欠失型変異を生じさせるＴｒｕｎｃａｔｉｎｇ 変異に関する情報が公知になっていないことを示す。
【0150】
【表4】
【0151】
（２）短鎖干渉（ｓｉ）ＲＮＡ
ＷＲＮの発現抑制には、ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製）を用いた。トランスフェクションには、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。また、被験物質にはＷＲＮ ｓｉＲＮＡ（ＷＲＮ ｓｉＲＮＡ１、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社商品コード：Ｊ－０１０３７８－０６、配列番号：２５）を、陰性対照には、非標的化ｓｉＲＮＡ（ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｓｉＲＮＡ１、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社商品コード：Ｄ－００１８１０－０１、配列番号：２６）又は非標的化ｓｉＲＮＡ（ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｓｉＲＮＡ２、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社商品コード：Ｄ－００１８１０－０３、配列番号：２７）を用いた。各ｓｉＲＮＡは、５×ｓｉＲＮＡ ｂｕｆｆｅｒ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製：Ｂ－００２０００－ＵＢ－１００）をｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ社製：ＡＭ９９３２）を用いて５倍希釈した１×ｓｉＲＮＡ ｂｕｆｆｅｒを用いて溶解した。
ＷＲＮの発現抑制には、ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製）を用いた。トランスフェクションには、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。また、被験物質にはＷＲＮ ｓｉＲＮＡ（ＷＲＮ ｓｉＲＮＡ１、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社商品コード：Ｊ－０１０３７８－０６、配列番号：２５）を、陰性対照には、非標的化ｓｉＲＮＡ（ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｓｉＲＮＡ１、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社商品コード：Ｄ－００１８１０－０１、配列番号：２６）又は非標的化ｓｉＲＮＡ（ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｓｉＲＮＡ２、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社商品コード：Ｄ－００１８１０－０３、配列番号：２７）を用いた。各ｓｉＲＮＡは、５×ｓｉＲＮＡ ｂｕｆｆｅｒ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製：Ｂ－００２０００－ＵＢ－１００）をｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ社製：ＡＭ９９３２）を用いて５倍希釈した１×ｓｉＲＮＡ ｂｕｆｆｅｒを用いて溶解した。
【0152】
（３）ＷＲＮの発現抑制試験
各がん細胞株において、ＷＲＮ発現抑制による細胞障害活性を評価した。各細胞株を下記の表５に記載の培養液を用いてそれぞれ細胞培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製：４３０６４１Ｕ）にて培養し、細胞表面をＰＢＳ（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社製：１４２４９－２４）で洗浄した後に、トリプシン（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社製：３５５５４－６４）を添加し、３７℃で５分間インキュベーションした後、各培養液を用いて懸濁した。自動セルカウンター（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ社製：ＮＣ－２００）及びＶｉａ１－Ｃａｓｅｔｔｅ（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ社製：９４１－００１１）を用いて細胞数を測定した後、細胞数が下記の表６に示す播種数となるように、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ社製）に１００μＬ／ウェルずつそれぞれ播種した。
各がん細胞株において、ＷＲＮ発現抑制による細胞障害活性を評価した。各細胞株を下記の表５に記載の培養液を用いてそれぞれ細胞培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製：４３０６４１Ｕ）にて培養し、細胞表面をＰＢＳ（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社製：１４２４９－２４）で洗浄した後に、トリプシン（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社製：３５５５４－６４）を添加し、３７℃で５分間インキュベーションした後、各培養液を用いて懸濁した。自動セルカウンター（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ社製：ＮＣ－２００）及びＶｉａ１－Ｃａｓｅｔｔｅ（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ社製：９４１－００１１）を用いて細胞数を測定した後、細胞数が下記の表６に示す播種数となるように、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ社製）に１００μＬ／ウェルずつそれぞれ播種した。
【0153】
次いで、ＨＣＴ １１６、ＫＭ１２、ＬＳ４１１Ｎ、ＳＮＵ－４０７、ＳＮＵ－Ｃ５、ＲＫＯ、ＣＷ－２、ＣＣＫ－８１、ＨＴ－２９、ＲＬ９５－２、ＡＮ３ ＣＡ、Ｃ－３３Ａ、ＳＩＨＡ、ＪＨＵＥＭ－３、ＩＭ９５、及びＴＯＶ－２１Ｇに関しては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｔｉｆｉｃ社製：１３７７８１５０）をＯｐｔｉ－ＭｅＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製：３１９８５－０６２）を用いて５０倍希釈した後に、１２０ｎＭの被検物質（ＷＲＮ ｓｉＲＮＡ１）又は非標的化ｓｉＲＮＡ（ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｓｉＲＮＡ１）と等量混合した。混合液を２０μＬ／ウェルずつ上記の細胞を播種したプレートに添加した後、プレートを振盪し、終濃度１０ｎＭのｓｉＲＮＡをそれぞれトランスフェクションした。また、ＭＫＮ１及びＰＡ－１に関しては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｔｉｆｉｃ社製：１３７７８１５０）をＯｐｔｉ－ＭｅＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製：３１９８５－０６２）を用いて５０倍希釈した後に、１２ｎＭの被検物質（ＷＲＮ ｓｉＲＮＡ１）又は非標的化ｓｉＲＮＡ（ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｓｉＲＮＡ２）と等量混合した。混合液を２０μＬ／ウェルずつ上記の細胞を播種したプレートに添加した後、プレートを振盪し、終濃度１ｎＭのｓｉＲＮＡをそれぞれトランスフェクションした。
【0154】
３７℃インキュベータにて７日間培養後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ２．０ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製：Ｇ９２４３）を２０μＬ／ウェルずつ添加し、室温で５分間インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いてルミネッセンスを測定し、細胞生存のマーカーである細胞内ＡＴＰ量を測定した。ＷＲＮ発現抑制による細胞生存率は、陰性対照をトランスフェクションして７日間培養後の各がん細胞株における細胞内ＡＴＰ量を１００％として算出した。各がん細胞株のＷＲＮ発現抑制による細胞生存率（％ｓｕｒｖｉｖａｌ）を図２に示す。
【0155】
【表5】
【0156】
【表6】
【0157】
２．結果
図２に示したように、ＷＲＮの発現抑制試験では、ＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異のうちの少なくともいずれか、特に、ＲＡＤ５０の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異のうちの少なくともいずれかの変異を有する１３のがん細胞株全てにおいて、細胞生存率が７０％以下と、細胞生存率の低下が認められた。また、試験を行った他のがん細胞株についても同様に、ＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異のうちの少なくともいずれかの変異を有するがん細胞株において、顕著な細胞生存率の低下が認められた。この結果から、ＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる群（第２群）から選択される少なくとも１種の変異が生じているがん細胞株の生存は、ヘリカーゼの機能に強く依存していることが示され、これらのがん細胞において、ヘリカーゼの発現抑制を行うと、当該がん細胞の増殖が顕著に抑制されることが明らかとなった。
図２に示したように、ＷＲＮの発現抑制試験では、ＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異のうちの少なくともいずれか、特に、ＲＡＤ５０の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異のうちの少なくともいずれかの変異を有する１３のがん細胞株全てにおいて、細胞生存率が７０％以下と、細胞生存率の低下が認められた。また、試験を行った他のがん細胞株についても同様に、ＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異のうちの少なくともいずれかの変異を有するがん細胞株において、顕著な細胞生存率の低下が認められた。この結果から、ＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる群（第２群）から選択される少なくとも１種の変異が生じているがん細胞株の生存は、ヘリカーゼの機能に強く依存していることが示され、これらのがん細胞において、ヘリカーゼの発現抑制を行うと、当該がん細胞の増殖が顕著に抑制されることが明らかとなった。
【0158】
（試験例３）
１．実験材料及び方法
（１）細胞株
ＨＣＴ １１６を試験対象のがん細胞株として用いた。ＨＣＴ １１６は、上記のとおり、少なくともＴＴＫ、ＲＡＤ５０、ＭＳＨ３、及びＤＮＡ２に変異（ｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異）を有するがん細胞株である。
１．実験材料及び方法
（１）細胞株
ＨＣＴ １１６を試験対象のがん細胞株として用いた。ＨＣＴ １１６は、上記のとおり、少なくともＴＴＫ、ＲＡＤ５０、ＭＳＨ３、及びＤＮＡ２に変異（ｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異）を有するがん細胞株である。
【0159】
（２）短鎖干渉（ｓｉ）ＲＮＡ
ＷＲＮの発現抑制には、ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製）を用いた。トランスフェクションには、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。また、ｓｉＲＮＡにはＷＲＮ ｓｉＲＮＡ（ＷＲＮ ｓｉＲＮＡ２、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社商品コード：Ｊ－０１０３７８－０７、配列番号：２８）を用いた。ｓｉＲＮＡは、５×ｓｉＲＮＡ ｂｕｆｆｅｒ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製：Ｂ－００２０００－ＵＢ－１００）をｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ社製：ＡＭ９９３２）を用いて５倍希釈した１×ｓｉＲＮＡ ｂｕｆｆｅｒを用いて溶解した。
ＷＲＮの発現抑制には、ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製）を用いた。トランスフェクションには、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。また、ｓｉＲＮＡにはＷＲＮ ｓｉＲＮＡ（ＷＲＮ ｓｉＲＮＡ２、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社商品コード：Ｊ－０１０３７８－０７、配列番号：２８）を用いた。ｓｉＲＮＡは、５×ｓｉＲＮＡ ｂｕｆｆｅｒ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製：Ｂ－００２０００－ＵＢ－１００）をｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ社製：ＡＭ９９３２）を用いて５倍希釈した１×ｓｉＲＮＡ ｂｕｆｆｅｒを用いて溶解した。
【0160】
（３）トランスフェクション
ＷＲＮの過剰発現には、ＶｉａＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いた。ｓｉＲＮＡ耐性型の野生型ＷＲＮ遺伝子（配列番号：２９）をｐＣＭＶ－３Ｔａｇ－１ａベクターにクローニングしたプラスミドを対照物質、ｓｉＲＮＡ非耐性型の野生型ＷＲＮ遺伝子としての上記ヒト由来の天然型ＷＲＮをコードするゲノムＤＮＡの典型的な塩基配列（配列番号：１）をｐＣＭＶ－３Ｔａｇ－１ａベクターにクローニングしたプラスミドを被験物質１、Ｋ５７７Ｍの変異を導入したヘリカーゼ活性を欠失したｓｉＲＮＡ耐性型のＫ５７７ＭＷＲＮ遺伝子（Ｋ５７７ＭＷＲＮ、配列番号：３０）をｐＣＭＶ－３Ｔａｇ－１ａベクターにクローニングしたプラスミドを被験物質２、としてそれぞれ用いた。
（４）ＷＲＮのレスキュー試験
ＨＣＴ １１６がん細胞株において、ＷＲＮ発現抑制を行いつつ、ｓｉＲＮＡ耐性型の野生型ＷＲＮ遺伝子、又はｓｉＲＮＡ非耐性型の野生型ＷＲＮ遺伝子、又はｓｉＲＮＡ耐性型のＫ５７７ＭＷＲＮ遺伝子を過剰発現させたときの細胞障害活性をそれぞれ評価した。先ず、ＨＣＴ １１６細胞株を上記の表２に記載の培養液を用いてそれぞれ細胞培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製：４３０６４１Ｕ）にて培養し、細胞表面をＰＢＳ（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社製：１４２４９－２４）で洗浄した後に、トリプシン（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社製：３５５５４－６４）を添加し、３７℃で５分間インキュベーションした後、前記培養液を用いて懸濁した。自動セルカウンター（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ社製：ＮＣ－２００）及びＶｉａ１－Ｃａｓｅｔｔｅ（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ社製：９４１－００１１）を用いて細胞数を測定した後、各培養液で７５００個／７６μＬとなるように調整し、７６μＬ／ウェルずつ播種した。
ＷＲＮの過剰発現には、ＶｉａＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いた。ｓｉＲＮＡ耐性型の野生型ＷＲＮ遺伝子（配列番号：２９）をｐＣＭＶ－３Ｔａｇ－１ａベクターにクローニングしたプラスミドを対照物質、ｓｉＲＮＡ非耐性型の野生型ＷＲＮ遺伝子としての上記ヒト由来の天然型ＷＲＮをコードするゲノムＤＮＡの典型的な塩基配列（配列番号：１）をｐＣＭＶ－３Ｔａｇ－１ａベクターにクローニングしたプラスミドを被験物質１、Ｋ５７７Ｍの変異を導入したヘリカーゼ活性を欠失したｓｉＲＮＡ耐性型のＫ５７７ＭＷＲＮ遺伝子（Ｋ５７７ＭＷＲＮ、配列番号：３０）をｐＣＭＶ－３Ｔａｇ－１ａベクターにクローニングしたプラスミドを被験物質２、としてそれぞれ用いた。
（４）ＷＲＮのレスキュー試験
ＨＣＴ １１６がん細胞株において、ＷＲＮ発現抑制を行いつつ、ｓｉＲＮＡ耐性型の野生型ＷＲＮ遺伝子、又はｓｉＲＮＡ非耐性型の野生型ＷＲＮ遺伝子、又はｓｉＲＮＡ耐性型のＫ５７７ＭＷＲＮ遺伝子を過剰発現させたときの細胞障害活性をそれぞれ評価した。先ず、ＨＣＴ １１６細胞株を上記の表２に記載の培養液を用いてそれぞれ細胞培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製：４３０６４１Ｕ）にて培養し、細胞表面をＰＢＳ（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社製：１４２４９－２４）で洗浄した後に、トリプシン（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社製：３５５５４－６４）を添加し、３７℃で５分間インキュベーションした後、前記培養液を用いて懸濁した。自動セルカウンター（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ社製：ＮＣ－２００）及びＶｉａ１－Ｃａｓｅｔｔｅ（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ社製：９４１－００１１）を用いて細胞数を測定した後、各培養液で７５００個／７６μＬとなるように調整し、７６μＬ／ウェルずつ播種した。
【0161】
次いで、Ｏｐｔｉ－ＭｅＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製：３１９８５－０６２）を用いて、ｓｉＲＮＡ（ＷＲＮ ｓｉＲＮＡ２）の終濃度が５ｎＭ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｔｉｆｉｃ社製：１３７７８１５０）が１００倍希釈となるようにこれらを混合した。混合液を室温で２０分間インキュベートした後、１９μＬ／ウェルずつ上記の細胞を播種したプレートに添加し、プレートを振盪することで、終濃度１ｎＭのｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。
【0162】
翌日、対照物質（ｓｉＲＮＡ耐性型の野生型ＷＲＮ遺伝子のプラスミド）、又は被験物質１（ｓｉＲＮＡ非耐性型の野生型ＷＲＮ遺伝子のプラスミド）若しくは被検物質２（ｓｉＲＮＡ耐性型のＫ５７７ＭＷＲＮ遺伝子のプラスミド）を０．１μｇと、ＶｉａＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ ０．３μＬとを、１０μＬのＯｐｔｉ－ＭｅＭに混合した。混合液を室温で２０分間インキュベートした後、１０μＬ／ウェルずつ上記のｓｉＲＮＡをトランスフェクションしたウェルに添加し、プレートを振盪することで、ｓｉＲＮＡ耐性型の野生型ＷＲＮ遺伝子、ｓｉＲＮＡ非耐性型の野生型ＷＲＮ遺伝子、又はｓｉＲＮＡ耐性型のＫ５７７ＭＷＲＮ遺伝子を、それぞれ過剰発現させた。
【0163】
３７℃インキュベータにて６日間培養後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ２．０ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製：Ｇ９２４３）を５０μＬ／ウェルずつ添加し、室温で５分間インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いてルミネッセンスを測定し、細胞生存のマーカーである細胞内ＡＴＰ量を測定し、その平均を算出した（ｎ＝３（Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３））。ＷＲＮ発現抑制による細胞生存率は、対照物質をトランスフェクションして６日間培養後の各がん細胞株における細胞内ＡＴＰ量を１００％として算出した。各がん細胞株に対照物質、被験物質１、又は被検物質２をトランスフェクションしたときの、各細胞生存率（％ｓｕｒｖｉｖａｌ）を図３に示す。対照物質と被験物質１又は２との間、並びに、被験物質１と被検物質２との間にてそれぞれＴ検定を行った。Ｔ検定の結果、ｐ＜０．０１の場合に有意差があると判定した。
【0164】
２．結果
図３に示したように、対照物質（ｓｉＲＮＡ耐性型の野生型ＷＲＮ遺伝子のプラスミドをトランスフェクションした株）と、被験物質１（ｓｉＲＮＡ非耐性型の野生型ＷＲＮ遺伝子のプラスミドをトランスフェクションした株）又は被検物質２（ｓｉＲＮＡ耐性型のＫ５７７ＭＷＲＮ遺伝子のプラスミドをトランスフェクションした株）と、の間で有意差が認められ、被験物質１と被検物質２との間では有意差が認められなかった。これらの結果及び上記試験例１～２の結果から、少なくとも上記変異が生じているがん細胞の生存は、確かに、ＷＲＮのヘリカーゼの機能に強く依存していることが示され、かかるがん細胞においてヘリカーゼの発現抑制を行うと、当該がん細胞の増殖が顕著に抑制されることが示された。
図３に示したように、対照物質（ｓｉＲＮＡ耐性型の野生型ＷＲＮ遺伝子のプラスミドをトランスフェクションした株）と、被験物質１（ｓｉＲＮＡ非耐性型の野生型ＷＲＮ遺伝子のプラスミドをトランスフェクションした株）又は被検物質２（ｓｉＲＮＡ耐性型のＫ５７７ＭＷＲＮ遺伝子のプラスミドをトランスフェクションした株）と、の間で有意差が認められ、被験物質１と被検物質２との間では有意差が認められなかった。これらの結果及び上記試験例１～２の結果から、少なくとも上記変異が生じているがん細胞の生存は、確かに、ＷＲＮのヘリカーゼの機能に強く依存していることが示され、かかるがん細胞においてヘリカーゼの発現抑制を行うと、当該がん細胞の増殖が顕著に抑制されることが示された。
【産業上の利用可能性】
【0165】
以上説明したように、本発明によれば、ＴＴＫの変異及びＲＡＤ５０の変異からなる第１群から選択される少なくとも１種の変異、及び／又は、ＲＡＤ５０の変異、ＭＲＥ１１の変異、ＮＢＮの変異、ＤＮＡ２の変異、及びＲＢＢＰ８の変異からなる第２群から選択される少なくとも１種の変異を指標として、効率的に、ヘリカーゼ阻害剤によるがん治療への感受性を予測することが可能となる。また、本発明によれば、がん患者由来の試料における前記変異の有無を検出し、当該変異が検出された患者を選別した上で、当該患者に対してヘリカーゼ阻害剤によるがんの治療を施すことができる。このため、がんの治療成績を大きく向上させることが可能となる。また、ＴＴＫ及びＲＡＤ５０からなる第１群から選択される少なくとも１種の遺伝子、及び／又は、ＲＡＤ５０、ＭＲＥ１１、ＮＢＮ、ＤＮＡ２、及びＲＢＢＰ８からなる第２群から選択される少なくとも１種の遺伝子に対するオリゴヌクレオチドプローブやプライマー、並びに、ＴＴＫタンパク質及びＲＡＤ５０タンパク質からなる第１群から選択される少なくとも１種のタンパク質、及び／又は、ＲＡＤ５０タンパク質、ＭＲＥ１１タンパク質、ＮＢＳ１タンパク質、ＤＮＡ２タンパク質、及びＣｔＩＰタンパク質からなる第２群から選択される少なくとも１種のタンパク質に対する抗体を用いることで、上記変異の有無の検出によるコンパニオン診断を効率的に行うことが可能となる。
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】