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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-04-11
(45)【発行日】2025-04-21
(54)【発明の名称】抗腫瘍溶解性ウイルス抗原抗体およびその使用方法
(51)【国際特許分類】
C07K 16/08 20060101AFI20250414BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20250414BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20250414BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20250414BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20250414BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20250414BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20250414BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20250414BHJP
C12N 5/0786 20100101ALI20250414BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20250414BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20250414BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20250414BHJP
A61K 35/17 20250101ALI20250414BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250414BHJP
【ＦＩ】
C07K16/08
C07K16/46
C07K19/00
C12N15/13 ZNA
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N5/10
C12N5/0783
C12N5/0786
C12P21/08
A61K39/395 S
A61K47/68
A61K35/17
A61P35/00
【請求項の数】
49
(21)【出願番号】P 2022516107
(86)(22)【出願日】2020-09-11
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-16
(86)【国際出願番号】 CA2020051230
(87)【国際公開番号】W WO2021046653
(87)【国際公開日】2021-03-18
【審査請求日】2023-09-07
(31)【優先権主張番号】62/900,303
(32)【優先日】2019-09-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】522096064
【氏名又は名称】アドマーレ セラピューティクス ソサイエティ
(73)【特許権者】
【識別番号】521252900
【氏名又は名称】プロビンシャル ヘルス サービシズ オーソリティー
(73)【特許権者】
【識別番号】519409604
【氏名又は名称】ユービック インダストリー パートナーシップス インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＵＶＩＣ ＩＮＤＵＳＴＲＹ ＰＡＲＴＮＥＲＳＨＩＰＳ ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100083806
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 秀和
(74)【代理人】
【識別番号】100095500
【弁理士】
【氏名又は名称】伊藤 正和
(74)【代理人】
【識別番号】100111235
【弁理士】
【氏名又は名称】原 裕子
(74)【代理人】
【識別番号】100195257
【弁理士】
【氏名又は名称】大渕 一志
(72)【発明者】
【氏名】カミンズ、 エマ ジェイ．
(72)【発明者】
【氏名】ベルグクビスト、 ジャン ピーター
(72)【発明者】
【氏名】ネルソン、 ブラッド
(72)【発明者】
【氏名】トゥマシ―ボアテン、 クワメ
(72)【発明者】
【氏名】クウォク、 イン ユ ユニス
(72)【発明者】
【氏名】スマジンスキ、 ジュリアン
(72)【発明者】
【氏名】ベナード、 フランソワ
(72)【発明者】
【氏名】ルソー、 ジュリ― マリー
(72)【発明者】
【氏名】リン、 クオ―シャン
【審査官】西 賢二
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２００７／０７５９１４（ＷＯ，Ａ２）
【文献】特表２０１０－５０７３６２（ＪＰ，Ａ）
【文献】Chen, Z. et al.，"Chimpanzee/human mAbs to vaccinia virus B5 protein neutralize vaccinia and smallpox viruses and protect mice against vaccinia virus"，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，2006年，Vol. 103，pp. 1882-1887
【文献】Benhnia, M. R. et al.，"Vaccinia virus extracellular enveloped virion neutralization in vitro and protection in vivo depend on complement"，J. Virol.，2009年，Vol. 83，pp. 1201-1215
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ワクシニアウイルスＢ５抗原（ＶＶ Ｂ５）に特異的に結合する抗体であって、
アミノ酸配列ＳＳＹＹＭＣ（配列番号３５）を含むＶＨＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＩＹＴＳＳＧＳＡＹＹＡＮＷＡＫＧ（配列番号３６）を含むＶＨＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＮＡＶＧＳＳＹＹＬＹＬ（配列番号３７）を含むＶＨＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＶＡＧＮＮＹＬＳ（配列番号３８）を含むＶＬＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＳＶＳＴＬＡＳ（配列番号３９）を含むＶＬＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＧＹＹＮＤＧＩＷＡ（配列番号４０）を含むＶＬＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド；または
アミノ酸配列ＳＹＷＭＣ（配列番号４３）を含むＶＨＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＩＹＧＧＳＳＧＳＴＹＹＳＮＷＡＫＧ（配列番号４４）を含むＶＨＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＤＧＳＴＷＤＹＦＲＬ（配列番号４５）を含むＶＨＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＩＮＴＮＹＬＳ（配列番号４６）を含むＶＬＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＱＡＳＴＬＥＳ（配列番号４７）を含むＶＬＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＧＹＹＴＶＥＮＩＧＮＰ（配列番号４８）を含むＶＬＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド
を含む、抗体。
【請求項2】
ＶＶ Ｂ５に特異的に結合する前記抗体が、配列番号３３に示されるアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および
配列番号３４に示されるアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチドを含むか、または
配列番号４１に示されるアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および
配列番号４２に示されるアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチドを含む、
請求項１に記載の抗体。
【請求項3】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項4】
前記抗体が、ヒト化抗体である、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項5】
前記抗体が、ＩｇＧである、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項6】
前記抗体が、ヒトＦｃドメインを含む、請求項５に記載の抗体。
【請求項7】
前記抗体が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦ（ａｂ’）からなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項8】
前記抗体が、単鎖抗体である、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項9】
前記単鎖抗体が、ｓｃＦｖである、請求項８に記載の抗体。
【請求項10】
前記抗体が、請求項１または２に記載のＶＨポリペプチド－ＶＬポリペプチド対を含む第１の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体である、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項11】
前記二重特異性抗体が、ワクシニアウイルス抗原以外の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む、請求項１０に記載の抗体。
【請求項12】
前記ワクシニアウイルス抗原以外の抗原が、免疫細胞表面抗原である、請求項１１に記載の抗体。
【請求項13】
前記免疫細胞表面抗原が、免疫エフェクター細胞表面抗原である、請求項１２に記載の抗体。
【請求項14】
前記免疫細胞表面抗原が、Ｔ細胞表面抗原である、請求項１３に記載の抗体。
【請求項15】
前記抗原が、Ｔ細胞刺激分子である、請求項１４に記載の抗体。
【請求項16】
前記Ｔ細胞刺激分子が、ＣＤ３またはＣＤ２８である、請求項１５に記載の抗体。
【請求項17】
前記免疫細胞表面抗原が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞表面抗原である、請求項１３に記載の抗体。
【請求項18】
前記免疫細胞表面抗原が、マクロファージ細胞表面抗原である、請求項１３に記載の抗体。
【請求項19】
融合タンパク質であって、異種アミノ酸配列に融合した、請求項１～１８のいずれか一項に記載の抗体の鎖を含む、融合タンパク質。
【請求項20】
前記異種アミノ酸配列が、前記抗体の前記鎖のＣ末端に融合している、請求項１９に記載の融合タンパク質。
【請求項21】
前記抗体が、請求項８または９に記載の単鎖抗体である、請求項１９または２０に記載の融合タンパク質。
【請求項22】
前記融合タンパク質が、前記単鎖抗体と、
膜貫通ドメインと、
細胞内シグナル伝達ドメインと
を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項２１に記載の融合タンパク質。
【請求項23】
請求項１～１８のいずれか一項に記載の抗体または請求項１９～２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、前記抗体または融合タンパク質にコンジュゲートされた薬剤と
を含む、コンジュゲート。
【請求項24】
前記薬剤が、化学療法剤、毒素、放射線増感剤、放射性同位体、検出可能な標識、および半減期延長部分からなる群から選択される、請求項２３に記載のコンジュゲート。
【請求項25】
前記薬剤は放射性同位体または検出可能な標識であり、前記放射性同位体が、治療用放射性同位体であり、前記検出可能な標識が、放射性標識である、請求項２４に記載のコンジュゲート。
【請求項26】
前記薬剤が、切断不可能なリンカーを介して、前記抗体または融合タンパク質にコンジュゲートされている、請求項２３～２５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項27】
前記薬剤が、切断可能なリンカーを介して、前記抗体または融合タンパク質にコンジュゲートされている、請求項２３～２５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項28】
請求項１～１８のいずれか一項に記載の抗体の可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチドと可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチドとをコードする核酸。
【請求項29】
請求項１９～２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項30】
請求項２８または２９に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項31】
請求項２８もしくは２９に記載の核酸、または請求項３０に記載の発現ベクター
を含む、細胞。
【請求項32】
前記細胞は請求項２９に記載の核酸を含み、前記核酸は請求項２２に記載の融合タンパク質をコードし、前記単鎖抗体はｓｃＦｖである、請求項３１に記載の細胞。
【請求項33】
前記細胞はその表面に前記融合タンパク質を発現する、請求項３２に記載の細胞。
【請求項34】
前記細胞は免疫細胞である、請求項３２または３３に記載の細胞。
【請求項35】
前記細胞は免疫エフェクター細胞である、請求項３４に記載の細胞。
【請求項36】
前記細胞はＴ細胞である、請求項３５に記載の細胞。
【請求項37】
前記細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項３５に記載の細胞。
【請求項38】
前記細胞はマクロファージである、請求項３５に記載の細胞。
【請求項39】
請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体の前記可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチドをコードする第１の核酸と、前記抗体の前記可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチドをコードする第２の核酸と
を含む、細胞。
【請求項40】
前記第１の核酸を含む第１の発現ベクターと、前記第２の核酸を含む第２の発現ベクターと
を含む、請求項３９に記載の細胞。
【請求項41】
請求項１～１８のいずれか一項に記載の抗体を産生する方法であって、前記細胞が前記抗体を発現するのに好適な条件下で、請求項３１、３９、および４０のいずれか一項に記載の細胞を培養することを含み、前記抗体が産生される、方法。
【請求項42】
請求項１～１８のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容される担体と
を含む、医薬組成物。
【請求項43】
請求項１９～２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体と
を含む、医薬組成物。
【請求項44】
請求項２３～２７のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、薬学的に許容される担体と
を含む、医薬組成物。
【請求項45】
請求項３１～４０のいずれか一項に記載の細胞と、薬学的に許容される担体と
を含む、医薬組成物。
【請求項46】
がんを有する個体に投与することを含む方法における使用のための、請求項４２～４５のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、前記個体が、ワクシニアウイルス（ＶＶ）に感染されたがん細胞を含み、前記抗体、融合タンパク質、コンジュゲート、または細胞が、前記感染されたがん細胞の表面上に発現するＶＶ抗原によって、前記感染されたがん細胞に標的指向化される、医薬組成物。
【請求項47】
前記方法は、前記医薬組成物を前記個体に投与する前に、ＶＶを前記個体に投与することによって前記がん細胞に感染させることをさらに含む、請求項４６に記載の医薬組成物。
【請求項48】
前記方法が、前記個体の前記がんを治療する方法である、請求項４６または４７に記載の医薬組成物。
【請求項49】
前記医薬組成物は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージの表面に発現された請求項２２に記載の融合タンパク質を含む、請求項４６～４８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年９月１３日に出願された、米国仮特許出願第６２／９００，３０３号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年９月１３日に出願された、米国仮特許出願第６２／９００，３０３号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
免疫療法は、複数の悪性腫瘍に対する効果的な治療選択肢となっている。腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ：oncolytic viruses）は、腫瘍組織内で選択的に複製して腫瘍組織を溶解すると同時に、正常な非腫瘍性宿主細胞を温存し、同時に抗腫瘍免疫を回復するように設計することができ、腫瘍治療のための次世代免疫療法アプローチを構成する。特定の抗原発現パターンに依存せずに悪性腫瘍を標的とするＯＶの独自の能力により、ＯＶは他の免疫療法アプローチの魅力的な代替手段となる。さらに、ＯＶは腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の動員を促進し、免疫抑制性腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を再プログラムし、全身の抗腫瘍免疫を高めることができる。
【0003】
遺伝子工学により、生きた複製ウイルスの設計は、細胞侵入および転写標的化を通じて高度に腫瘍選択的とするだけでなく、ウイルス療法の薬物動態の非侵襲的監視のため、および細胞傷害性活性もしくは免疫原性細胞死、または免疫モジュレーターの増強のためのレポーター遺伝子を装備することが可能になった。現在、がんの治療のために３つのＯＶが市販されている。これらのＯＶとしては、ラトビア、ジョージアおよびアルメニアで承認されたＲｉｇｖｉｒ、中国で承認されたＯｎｃｏｒｉｎｅ Ｈ１０１、および米国で承認されたタリモジンラヘルパレプベク（Ｔ－ＶＥＣ）が挙げられる。Ｒｉｇｖｉｒ（リガウイルス）は、未改変の腸細胞変性ヒトオーファン７型（ＥＣＨＯ－７）ピコルナウイルスであり、その有効性を説明する公開データは限られている。Ｏｎｃｏｒｉｎｅは、中国で臨床使用のための最初に承認された腫瘍溶解性ウイルスとなり、規制当局の承認を得た世界初の組換え腫瘍溶解性ウイルスとなった。これは、ウイルスＥ１Ｂ－５５ｋを欠失し、ウイルスＥ３を４つ欠失した、弱毒化血清型５のアデノウイルスベクターである。Ｏｎｃｏｒｉｎｅは、依然として、がん治療について承認された唯一のアデノウイルスであり、それも化学療法と組み合わせて投与される場合のみが承認されている。Ｔ－ＶＥＣ（Ｉｍｌｙｇｉｃ（商標））は、２０１５年に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって、切除不可能な転移性黒色腫の治療について承認され、その後、ＥＵで局所進行性または転移性皮膚黒色腫の治療について承認され、国の規制当局の承認を得た最新の腫瘍溶解性ウイルスであり、米国で承認を得た最初の腫瘍溶解性ウイルスである。Ｔ－ＶＥＣは、ＨＳＶ１ガンマ３４．５とウイルスＩＣＰ４７の両方のコピーを欠失した組換えヒト単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ１）であり、ＵＳ１１の発現を加速させ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター下でヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）の２つのコピーをコードする。Ｔ－ＶＥＣは現在、皮膚の高悪性度黒色腫病変への腫瘍内注射について承認されており、この適応症に対して単剤での有効性を示している。
【0004】
臨床開発中のＯＶとしては、麻疹ウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、ラブドウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス（ＶＶ）、ヘルペスウイルス、コクサッキーウイルス、レオウイルス、およびレトロウイルスが挙げられる。
【0005】
麻疹ウイルスはマイナス鎖ＲＮＡパラミクソウイルスであり、融合性が高く、合胞体形成の広範な細胞変性効果を誘導する。細胞間融合は、腫瘍細胞のバイスタンダー殺滅を増加させ、宿主を介した細胞の抗腫瘍活性を誘発する可能性のある免疫原性の危険信号を誘導する。ヨウ化ナトリウム共輸送体（ＭＶ－ＮＩＳ）または可溶性がん胎児性抗原（ＭＶ－ＣＥＡ）をコードする組換えＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株麻疹ウイルスは、多発性骨髄腫、卵巣がん、神経膠腫、乳がんおよび中皮腫を含む再発（ｒｅｌａｐｓｅｄ）または再発性（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ）がんの患者で第Ｉ／ＩＩ相臨床試験中である。
【0006】
ＮＤＶはトリパラミクソウイルスであり、腫瘍溶解性または腫瘍崩壊性のがんワクチンとして試験されている。ＮＤＶ株ＭＴＨ－６８／Ｈ、ＨＵＪおよびＰＶ７０１は、臨床的に試験されている。哺乳類細胞ではなく鳥類細胞の感染が損なわれＧＭ－ＣＳＦ（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ、ＭＥＤＩ５３９５）をコードするメソゲンＮＤＶ－７３Ｔ株に基づく組換えＮＤＶは、前臨床試験中である。
【0007】
ラブドウイルスはマイナス鎖ＲＮＡ（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｎｓｅ ＲＮＡ）ウイルスであり、許容細胞中で約１２時間の溶解複製サイクルを示す。最もよく研究されている腫瘍溶解性ラブドウイルス水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）は、細胞侵入に低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体を使用し、ＶＳＶがほぼすべての細胞型に感染し、多種多様な許容細胞において溶解性感染を引き起こすことを可能にする。
【0008】
アデノウイルスは、二十面体の非エンベロープ二本鎖ＤＮＡウイルスであり、各カプシドの頂点から長い繊維のノブが突出している。固形腫瘍におけるＴｅｌｏｍｅｌｙｓｉｎ、膀胱がんにおけるＣＧ００７０、悪性脳腫瘍におけるＤＮＸ－２４０１に関する臨床データが公開されている。
【0009】
ワクシニアウイルス（ＶＶ）は、長さが約１９０ｋｂの線形ゲノムを有する大きいエンベロープ二本鎖ＤＮＡウイルスである。これらのウイルスの弱毒化または腫瘍特異的標的化は、種々の欠失および挿入変異を使用して達成されており、チミジンキナーゼ機能の喪失が臨床腫瘍溶解性ワクシニアウイルスに共通する特徴である。ＪＸ－５９４はウイルスチミジンキナーゼを欠失し、ＴＧ６００２はチミジンキナーゼおよびウイルスリボヌクレオチドレダクターゼを二重欠失し、ＧＬ－ＯＮＣ１はそのチミジンキナーゼ（Ｊ２Ｒ）、血球凝集素ＨＡ（Ａ５６Ｒ）およびＦ１４．５Ｌ遺伝子に挿入変異を有する。ＴＫの機能喪失は、非分裂細胞中で複製するウイルスの能力を制限し、ウイルスリボヌクレオチドレダクターゼの欠失がこの能力をさらに制限する。腫瘍溶解効果を増強するように設計された２つの臨床ワクシニアベクターには、腫瘍細胞の殺滅を改善するように設計された導入遺伝子が含まれる。ＪＸ－５９４にはＴ－ＶＥＣと同様にＧＭ－ＣＳＦが含まれ、ＴＧ６００２には、感染細胞において５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）を５－ＦＵに変換するヌクレオシド類似体変換酵素ＦＣＵ１が組み込まれている。
【0010】
ＨＳＶ１は、長さが約１５２ｋｂの大きい二本鎖ＤＮＡウイルスである。臨床的に評価されているｇａｍｍａ３４．５欠損ウイルスには、現在ＦＤＡが承認しているＴ－ＶＥＣ、ＨＳＶ１７１６（Ｓｅｐｒｅｈｖｉｒ）、Ｇ２０７、およびＲＰ１が含まれる。転移性疾患におけるＨＳＶの抗がん効果を高める試みには、治療を受けた患者に適応性のある抗腫瘍反応を開発することを目的として、抗がん免疫と抗ウイルス免疫を同時に高めるために使用される治療用導入遺伝子を含めることが含まれる。
【0011】
コクサッキーウイルスは、二十面体カプシドに囲まれた約７．４ｋｂの一本鎖プラスＲＮＡピコルナウイルスである。腫瘍溶解性ＣＶＡ２１（Ｖｉｒａｌｙｔｉｃｓ、ＣＡＶＡＴＡＫ）は、Ｋｕｙｋｅｎｄａｌｌ株に由来し、細胞侵入の主要な受容体としてＩＣＡＭ－１を使用する。ペムブロリズマブまたはイピリムマブと組み合わせた腫瘍内ＣＶＡ２１ウイルス注射の第Ｉ相試験は、これらの薬剤の全体的な有効性を増強するために進行中である。
【0012】
レオウイルスは二本鎖ＲＮＡウイルスであり、エンベロープを持たず、外側と内側のタンパク質シェルで構成される二十面体カプシドを持っている。単剤療法としてのレオウイルスは、腫瘍内または静脈内投与としていくつかの第Ｉ相試験（Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｒｅｏｌｙｓｉｎ（商標））で調査された。
【0013】
レトロウイルス複製ベクター（Ｔｏｃａｇｅｎ、Ｔｏｃａ－５１１、ｖｏｃｉｍａｇｅｎｅ ａｍｉｒｅｔｒｏｒｅｐｖｅｃ）は、プロドラッグ５－ＦＣを抗がん剤５－ＦＵに変換する酵母シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）をコードし、それによって腫瘍において５－ＦＵの局所濃度を高め、該薬剤の全身毒性を全体的に減少する。再発性高悪性度神経膠腫患者でのＴｏｃａ－５１１の第１相試験では、全生存期間が１３．６か月であり、外部対照と比較して統計学的に改善されていた。
【発明の概要】
【0014】
ＯＶベースの療法の最近の進歩にもかかわらず、がんの治療、緩和、および／または予防のための、ならびにがんを有する対象の生存を改善する方法のための、新しく改善されたＯＶベースの方法が依然として必要である。
【0015】
ワクシニアウイルス（ＶＶまたはＶＡＣＶ）Ａ５６またはＢ５抗原に特異的に結合する抗体が提供される。抗体を含む融合タンパク質およびコンジュゲートも提供される。抗体、融合タンパク質およびコンジュゲートを含む医薬組成物およびキットも提供される。本開示の態様は、例えば、治療目的のために、抗体、融合タンパク質およびコンジュゲートを使用する方法をさらに含む。特定の実施形態では、がんを有する個体に本開示の抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートを投与することを含み、当該個体が、ＶＶに感染したがん細胞を含み、当該抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートが、感染したがん細胞の表面上に発現するＶＶ抗原によって、感染したがん細胞に標的指向化（targeted）される、方法が提供される。本開示の態様は、腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）抗原に特異的に結合する抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートを、個体のがん細胞に標的指向化（targeting）する方法をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】ＶＶ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＶＶｄｄ（ｅＧＦＰ）に感染したＡ５４９およびＣａＯＶ３細胞に結合する抗体のフローサイトメトリーデータを示す。
【図2】Ａ５６またはＢ５発現ＨＥＫ細胞（Ｗｙｅｔｈ ＶＶ配列）に結合する抗体のフローサイトメトリーデータを示す。
【図3】ＨＥＫ－Ｂ５細胞に結合する抗体に関するデータを示す。ＨＥＫ－Ｂ５への結合についてフローサイトメトリーアッセイ（上のパネル）またはＥＬＩＳＡ（下のパネル）で試験された最高濃度がプロットされ、ウサギおよびマウスのアイソタイプ対照（それぞれＲｂ ＩｇＧアイソタイプおよびｍＩｇＧアイソタイプ）、ならびに抗Ｂ５ Ｉｍｍｕｎｅｔｅｃｈ抗体、ＩＴ抗Ｂ５ ＩｇＧ（図３において抗Ｂ５ ｍＩｇＧとして識別）については５μｇ／ｍｌであり、ウサギポリクローナル抗体（ｃ－ＶＶ）については１：１０００である。
【図4】フローサイトメトリーで測定した、Ａ０４８抗体、Ｉｍｍｕｎｅｔｅｃｈ抗Ｂ５抗体、ＩＴ抗Ｂ５ ＩｇＧ（図４ではＩＴ抗Ｂ５ ｍＩｇＧとして識別）、およびヒトアイソタイプ対照の、ＶＶ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＶＶｄｄ（ｅＧＦＰ）感染Ａ５４９細胞（上のパネル）およびＨＴ２９細胞（下のパネル）への結合を示す。
【図5】ＶＶ感染細胞への抗体の結合を示す。抗体は、フローサイトメトリーによってＶＶｄｄ（ｅＧＦＰ）感染Ａ５４９細胞への結合について試験した。すべてのフォーマットは同様のＥＣ５０を有し、感染していない細胞への結合は観察されなかった。
【図6】免疫蛍光抗体法によるウイルス感染腫瘍組織への抗体Ａ０４９の結合、特にウイルス感染結腸直腸腫瘍組織へのＡ０４９抗Ａ５６ ｈＩｇＧ１の結合を示す。上２つのパネルは、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色されている。これは、感染していない組織に対して多少の非特異的な染色を示すポリクローナル抗ワクシニアウイルス抗体と比較される。
【図7】非ビオチン化抗体とプレインキュベートしたＶＶｄｄ（ｅＧＦＰ）感染細胞へのビオチン化抗体の結合を示すエピトープビニングデータを提供する。ビオチン化抗体結合の低減は、試験抗体と類似または重複するエピトープを示す。抗体Ａ０４７およびＡ０４９は、Ａ５６上の異なるエピトープと結合すると見られる。抗体Ａ０４８およびＡ０５１は、Ｂ５上の異なるエピトープと結合すると見られる。
【図8】ウイルス粒子への抗体の結合に関するデータを示す。ウイルス粒子（ＶＶｄｄ（ｅＧＦＰ））をプレートにコーティングし、抗体または陽性対照ＮＫｐ３０とともにインキュベートした。抗体Ａ０５４を除きすべての抗体がウイルスに結合した。
【図9】ウイルス感染中和を示すデータを提供する。ＶＶｄｄ（ｅＧＦＰ）感染と同時に抗体をＡ５４９細胞に添加した。抗体を使用しない感染（「抗体なし」）と同様のレベルの感染が観察された。
【図10】ＶＶＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＹＦＰ）に感染したマウス細胞株への抗体の結合を示す。各感染細胞株におけるパーセントＹＦＰ発現は、ＶＶＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＹＦＰ）に感染した細胞の割合を示す。抗Ａ５６－ＰＥおよび抗Ｂ５－ＰＥ抗体は、ＶＶＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＹＦＰ）に感染したＢ１６Ｆ１０、ＣＴ２６ＬａｃＺ、およびＭＣ３８細胞と結合する。
【図11】ＨＥＫ細胞表面に発現したＡ５６もしくはＢ５抗原またはＶＶＣｏｐｅｎｈａｇｅｎウイルスに感染されたＵ２０Ｓ細胞への抗体の特異的結合に関する免疫組織化学データを示す。Ａ５６またはＢ５に特異的なウサギ／マウスキメラ（抗体Ａ０５９およびＡ０５８）および完全ウサギＩｇＧフォーマット（抗体Ａ０５６およびＡ０７３）抗体は、それぞれ、安定して発現されたＨＥＫ－Ａ５６およびＨＥＫ－Ｂ５細胞上の標的抗原を特異的に検出することができた。抗Ａ５６抗体と抗Ｂ５抗体の両方が、ＶＶＣｏｐｅｎｈａｇｅｎに感染されたＵ２ＯＳ細胞上でのタンパク質発現を検出することができた。
【図12】免疫組織化学によるＶＶ処置腫瘍からのＡ５６およびＢ５の検出を示す。データは、ワクシニアウイルスで処理した腫瘍の表面上でのＡ５６およびＢ５タンパク質の検出を示す。
【図13】パネルＡ：抗ＶＶキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物の設計例の代表的な概略図。パネルＢ：本開示の実施形態による治療アプローチの概略図。図示されるように、ＯＶはがん細胞に感染し、続いてがん細胞の表面上にＯＶ抗原（この例では、Ａ５６またはＢ５ ＯＶ抗原であり、いくつかの実施形態ではこれはＯＶのネイティブＡ５６またはＢ５抗原であり得る）が提示される。感染したがん細胞を、提示されたＯＶ抗原に特異的なＣＡＲを含むＣＡＲＴ細胞で処置すると、感染したがん細胞が破壊される。破壊されたがん細胞によって放出されたＯＶに感染した隣接がん細胞が、続いて、提示されたＯＶ抗原に特異的なＣＡＲを含むＣＡＲ Ｔ細胞によって破壊され得る。
【図14】レンチウイルス形質導入後のＶＶ ＣＡＲ検出を示すフローサイトメトリーデータを提供する。データは、形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞上でのＶＶ－ＣＡＲ発現を示す。特異的な標的結合を示すＣＡＲの下方調節は、試験したすべてのＶＶ－ＣＡＲ構築物で明らかである。
【図15】活性化されたＡ５６－ＣＡＲ－０６陽性Ｊｕｒｋａｔ細胞上でのＣＡＲおよびｅＧＦＰの発現を示す。データは、形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞株上でのＡ５６－ＣＡＲ－０６とｅＧＦＰの共発現を示す。標的ＨＥＫ Ａ５６株とともに培養した後、ｅＧＦＰ陽性集団をゲーティングすることにより、ｓｃＦｖ陰性画分内で活性化ＣＡＲ集団（ＣＤ６９陽性）を特定することができる。
【図16】標的ＨＥＫ細胞株と共培養した場合における、ＶＶ－ＣＡＲを発現するＪｕｒｋａｔ細胞の特異的活性化を示すデータを提供する。試験したすべてのＶＶ－ＣＡＲは、ＣＤ６９の上方調節によって示される特異的オンターゲット活性化を示している。ＶＶ－ＣＡＲ株を陰性／無関係の標的細胞株と共培養した場合には最小限の交差反応性／内因性活性化が発生した。
【図17】健康ドナー初代Ｔ細胞のＡ５６－ＣＡＲ－０６発現の形質導入および濃縮を示す。データは、標準的な臨床製造プロトコルに従ったヒト初代Ｔ細胞上でのＡ５６－ＣＡＲ－０６の安定した発現を示す。Ａ５６－ＣＡＲ－０６濃縮集団は、ＣＡＲ発現に関する細胞選別とそれに続く臨床的増殖の繰り返しによって確立された。
【図18】標的発現ＨＥＫ－Ａ５６株と共培養した場合の、Ａ５６－ＣＡＲ－０６を発現するヒトＴ細胞の特異的活性化を示す。Ａ５６－ＣＡＲ－０６を発現するヒト初代Ｔ細胞は、標的ＨＥＫ－Ａ５６株との共培養後にＣＤ６９およびＣＤ１３７の有意な上方調節を示した。陰性／無関係の標的細胞株では最小限の交差反応性が観察された。
【図19】Ａ５６－ＣＡＲ－０６を発現するヒト初代Ｔ細胞が標的ＨＥＫ－Ａ５６細胞との共培養後４８時間で直接的な腫瘍殺滅の形態学的兆候を示すことを実証するデータを提供する。
【図20】Ｂ５－ＣＡＲ－０１１を発現しているヒトＴ細胞が高いパーセント特異的細胞傷害性を示すことを実証するデータを提供する。Ｂ５－ＣＡＲ－０１１を発現するヒト初代Ｔ細胞は、相対発光単位（ＲＬＵ）のパーセント減少によって決定されるように、２４時間で特異的な細胞溶解を示した。
【図21】同じマウスについての注射後１、３、５日での８９Ｚｒ－ＤＦＯ－Ａ０４９（抗Ａ５６抗体、ＤＦＯ：デフェロキサミン）の代表的な最大強度投影陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）画像を示す。脾臓と肝臓に加えて、腫瘍のタイプ：ＨＥＫ－Ａ５６（Ａ５６を発現、左肩）および親ＨＥＫ（非発現、右肩）を矢印で示している。結果は、組織１グラム当たりの注入量のパーセンテージ（％ＩＤ／ｇ）として示される。陽性腫瘍における８９Ｚｒ－ＤＦＯ－Ａ０４９の効率的かつ特異的な蓄積、および予想される放射性免疫コンジュゲートの薬物動態を伴う、明確な前臨床Ａ５６陽性腫瘍ＰＥＴイメージングが示されている。
【発明を実施するための形態】
【0017】
本開示の抗体、組成物および方法をより詳細に記載する前に、抗体、組成物および方法は、記載される特定の実施形態に限定されず、当然のことながら変動し得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載するためのものであるにすぎず、抗体、組成物および方法の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって限定されるため、用語は限定的であることは意図されないこともまた理解されたい。
【0018】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の（文脈上明確に指示されていない限り、下限の単位の１０分の１に至るまでの）各介在値、およびその記載された範囲内の他のあらゆる記載されたまたは介在する値は、当該抗体、組成物および方法内に包含されることを理解されたい。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立して、より小さい範囲に含められ得、記載された範囲内で特に除外された制限を受ける。記載される範囲に上下限の一方または両方が含まれている場合、その含まれる上下限のいずれかまたは両方を除く範囲も、当該抗体、組成物および方法に含まれる。
【0019】
特定の範囲は、数値の前に用語「約」が付された状態で本明細書に提示される。「約」という用語は、それが先行する正確な数字、およびその用語が先行する数字に近接または近似する数字に逐語的支持を提供するために本明細書において使用される。ある数が特定の列挙された数に近接または近似するかどうかを決定するにあたり、近似または近似するが列挙されていない数とは、それが提示されている文脈において具体的に列挙された数と実質的に等価な数であり得る。
【0020】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当該抗体、組成物および方法が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に説明されているものと類似または等価な任意の抗体、組成物および方法もまた、当該抗体、組成物および方法の実施または試験において使用することができるが、代表的な例示的抗体、組成物および方法をここで説明する。
【0021】
本明細書に引用されるすべての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれ、刊行物が引用されているところに関連する材料および／または方法を開示かつ記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日前のその開示についてのものであり、提供される刊行日は、個別に確認を必要とし得る実際の刊行日とは異なる場合があるので、本抗体、組成物および方法がそのような刊行物よりも先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。
【0022】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。特許請求の範囲は任意選択的な要素を排除するように起草されてもよいことにさらに留意されたい。このように、この記述は、クレーム要素の列挙に関連する「専ら」、「のみ」などのような排他的な用語の使用または「負の」限定の使用のための文言的根拠としての役割を果たすことを意図する。
【0023】
明瞭さのために別々の実施形態の文脈中で記載された、抗体、組成物および方法の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わされても提供され得ることが認識される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で説明される、抗体、組成物および方法の様々な特徴は、別々にまたは任意の好適なサブコンビネーションで提供されてもよい。実施形態のすべての組み合わせは、本開示によって具体的に包含され、このような組み合わせが実施可能なプロセスおよび／または組成物を包含する限りにおいて、まさにありとあらゆる組み合わせが個々にまたは明示的に開示されているかのように本明細書に開示される。さらに、そのような可変要素を記載している実施形態に列挙されているすべてのサブコンビネーションも、本抗体、組成物および方法によって具体的に包含され、そのようなすべてのサブコンビネーションが個々におよび明示的に開示されているかのように、本明細書に開示される。
【0024】
本開示を読むと当業者には明らかであるように、本明細書に説明され例証された個々の実施形態の各々は、本開示の方法の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得る、または組み合わせられ得る個別の構成要素および特徴を有する。いかなる列挙された方法も、列挙された事象の順序で、または論理的に可能なあらゆる他の順序で、実行され得る。
【0025】
抗体
本開示は、ワクシニアウイルス（ＶＶまたはＶＡＣＶ）抗原に特異的に結合する抗体を提供する。ワクシニアウイルスは、宿主細胞機構から独立してウイルスが複製することを可能にする多数のウイルス酵素および因子をコードする約１９２ｋｂの二本鎖ＤＮＡゲノムを特徴とするポックスウイルスファミリーのメンバーである。ＶＶは、最大２５ｋｂのクローニングされた外因性ＤＮＡを安定して収容することができる。構造的に、ＶＶは、ウイルスＤＮＡと、リポタンパク質コア膜に包まれたＲＮＡポリメラーゼおよびポリＡポリメラーゼなどの様々なウイルス酵素と、で構成されるコア領域から構成される。ウイルスの外層は、二重脂質膜エンベロープから構成される。ＶＶには、腫瘍の自然向性、強力な溶解能力、細胞から細胞への急速な拡散を伴う短いライフサイクル、効率的な遺伝子発現、および大きいクローニング能力など、腫瘍溶解性ウイルス療法での使用に好適な属性をＶＶに持たせる多くの固有の特徴がある。ＶＶは、細胞質で起こる約８時間の短いライフサイクルを有し、ゲノムへの組み込みのリスクを排除する。複製は通常、感染から約２時間後に始まり、その時点で宿主細胞の核酸合成が停止し、細胞資源がウイルス複製に向けられる。細胞溶解は１２時間～４８時間の間に起こり、パッケージ化されたウイルス粒子を放出する。ＶＶは、ｍＲＮＡ転写ために宿主メカニズムに依存しないため、宿主細胞の生物学的変化の影響を受けにくくなる。他の腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）とは異なり、ＶＶは細胞侵入のために特定の表面受容体を必要としないため、広範囲の細胞に感染することが可能になる。
本開示は、ワクシニアウイルス（ＶＶまたはＶＡＣＶ）抗原に特異的に結合する抗体を提供する。ワクシニアウイルスは、宿主細胞機構から独立してウイルスが複製することを可能にする多数のウイルス酵素および因子をコードする約１９２ｋｂの二本鎖ＤＮＡゲノムを特徴とするポックスウイルスファミリーのメンバーである。ＶＶは、最大２５ｋｂのクローニングされた外因性ＤＮＡを安定して収容することができる。構造的に、ＶＶは、ウイルスＤＮＡと、リポタンパク質コア膜に包まれたＲＮＡポリメラーゼおよびポリＡポリメラーゼなどの様々なウイルス酵素と、で構成されるコア領域から構成される。ウイルスの外層は、二重脂質膜エンベロープから構成される。ＶＶには、腫瘍の自然向性、強力な溶解能力、細胞から細胞への急速な拡散を伴う短いライフサイクル、効率的な遺伝子発現、および大きいクローニング能力など、腫瘍溶解性ウイルス療法での使用に好適な属性をＶＶに持たせる多くの固有の特徴がある。ＶＶは、細胞質で起こる約８時間の短いライフサイクルを有し、ゲノムへの組み込みのリスクを排除する。複製は通常、感染から約２時間後に始まり、その時点で宿主細胞の核酸合成が停止し、細胞資源がウイルス複製に向けられる。細胞溶解は１２時間～４８時間の間に起こり、パッケージ化されたウイルス粒子を放出する。ＶＶは、ｍＲＮＡ転写ために宿主メカニズムに依存しないため、宿主細胞の生物学的変化の影響を受けにくくなる。他の腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）とは異なり、ＶＶは細胞侵入のために特定の表面受容体を必要としないため、広範囲の細胞に感染することが可能になる。
【0026】
「抗体」（「免疫グロブリン」とも交換可能に使用される）という用語は、ポリクローナル（例えば、ウサギポリクローナル）およびモノクローナル抗体調製物を包含し、抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭなど）の抗体または免疫グロブリン、完全長抗体（例えば、重鎖および軽鎖ポリペプチドの２二量体で構成される四量体で構成される抗体）；単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）；単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、（ｓｃＦｖ’）２およびダイアボディを含むがこれらに限定されない、化合物への特異的結合を保持する、抗体の断片（例えば、完全長抗体または単鎖抗体の断片）；キメラ抗体；モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体；ならびに、抗体および非抗体タンパク質の抗原結合部分を含む融合タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ、Ｆｖ、単鎖抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦ（ａｂ’）から選択される。抗体は、特異的結合対のメンバー、例えばビオチン（ビオチン－アビジン特異的結合対のメンバー）などの他の部分とさらにコンジュゲートすることができる。
【0027】
免疫グロブリンのポリペプチドには、カッパおよびラムダの軽鎖、ならびにアルファ、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、デルタ、イプシロンおよびミューの重鎖、または他の種における等価物が含まれる。完全長の免疫グロブリン「軽鎖」（通常、約２５ｋＤａまたは約２１４アミノ酸の）は、ＮＨ２末端における約１１０アミノ酸の可変領域、およびＣＯＯＨ末端におけるカッパまたはラムダの定常領域を含む。完全長の免疫グロブリン「重鎖」（約１５０ｋＤａまたは約４４６アミノ酸の）は、同様に可変領域（約１１６アミノ酸の）および前述の重鎖定常領域のうちの１つ、例えば、ガンマ（約３３０アミノ酸の）を含む。
【0028】
免疫グロブリン軽鎖または重鎖可変領域（それぞれＶＬおよびＶＨ）は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域によって中断された「フレームワーク」領域（ＦＲ）で構成される。フレームワーク領域とＣＤＲの範囲が定義されている（Ｅ．Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ ｅｄ． Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９８７）；およびＬｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．ＩＭＧＴ，ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２００５，３３，Ｄ５９３－Ｄ５９７））。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。構成軽鎖および重鎖の組み合されたフレームワーク領域である抗体のフレームワーク領域は、ＣＤＲを位置づけて並べるために役立つ。ＣＤＲは、主に抗原のエピトープへの結合に関与する。本開示によって提供されるすべてのＣＤＲおよびフレームワークは、特に明記しない限り、上記のＫａｂａｔに従って定義される。
【0029】
したがって、「抗体」は、例えば、免疫グロブリン遺伝子またはその断片によって遺伝的にコード可能な１つ以上のポリペプチドを有するタンパク質を包含する。認識されている免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、およびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はカッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、順にそれぞれ、免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを定義する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、ＩｇＧ抗体、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体などのＩｇＧ１抗体である。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、ヒトＦｃドメインを含む。
【0030】
典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含むことが知られている。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対で構成され、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０～７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識に関与する約１００～１１０個以上のアミノ酸の可変領域を定義する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語はそれぞれ、これらの軽鎖および重鎖を指す。
【0031】
抗体は、完全免疫グロブリン、および、遺伝子的にコードされ得るかまたは様々なペプチダーゼによる消化によって産生され得る、十分に特徴付けられた多数の断片を包含する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域内のジスルフィド結合の下で抗体を消化して、Ｆ（ａｂ）’２（それ自体がジスルフィド結合によってＶＨ－ＣＨＩに結合した軽鎖であるＦａｂの二量体）を産生する。Ｆ（ａｂ）’２は、穏やかな条件下で還元されて、ヒンジ領域内のジスルフィド結合を切断し、それによって（Ｆａｂ’）２二量体をＦａｂ’単量体に変換することができる。Ｆａｂ’単量体は、本質的にヒンジ領域の一部を備えるＦａｂである（他の抗体断片のより詳細な説明については、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ，ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）を参照のこと）。完全抗体の消化に関して様々な抗体断片が定義されているが、そのようなＦａｂ’断片は、化学的にまたは組換えＤＮＡ方法論を利用することによって新たに合成され得ることを当業者は理解するであろう。したがって、本明細書で使用される場合、抗体という用語は、全抗体の改変によって産生されるか、またはＦａｂ’２、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ、ナノボディ、ユニボディ、およびダイアボディを含むがこれらに限定されない、組換えＤＮＡ方法論を使用して新たに合成される抗体断片も含む。特定の実施形態では、本開示の抗体は、ＩｇＧ、Ｆｖ、単鎖抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦａｂ’から選択される。
【0032】
いくつかの実施形態によれば、本開示の抗体は、モノクローナル抗体である。「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団（すなわち、微量で存在し得る自然発生的変異を除いて個々の抗体が同一である集団）から得られる１つ以上の抗体を含む組成物を指す。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原部位に対して、一般的には抗原上の単一のエピトープに対して向けられている。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られるものとしての抗体の性質を示し、抗体が何らかの特定の方法によって産生されることや組成物中の唯一の抗体であることは必要としない。
【0033】
特定の実施形態では、本開示の抗体は、ヒト化抗体である。本明細書で使用される場合、ヒト化抗体は、非ヒト（例えば、ウサギ、齧歯類など）抗体に由来し、ヒト抗体のフレームワークおよび／または定常領域の少なくとも一部分を含有するように改変された組換えポリペプチドである。ヒト化抗体はまた、様々な領域が異なる種に由来し得るキメラ抗体およびＣＤＲグラフト化抗体を包含する。キメラ抗体は、ヒト定常領域（例えば、ヒトＦｃドメイン）に連結された任意の供給源からの可変領域を含む抗体であり得る。したがって、キメラ抗体では、可変領域は非ヒトであり得、定常領域はヒトである。ＣＤＲグラフト化抗体は、ヒト「レシピエント」抗体のフレームワーク領域に連結された非ヒト「ドナー」抗体からのＣＤＲを含む抗体である。例えば、ｓｃＦＶの形態である本開示の抗体は、ヒト定常領域（例えば、Ｆｃドメイン）に連結されてヒト免疫グロブリンにされ得る。
【0034】
一般に、ヒト化抗体は、同じ抗体の非ヒト化バージョンと比較して、ヒト宿主において免疫応答を低下させる。抗体は、例えば、ＣＤＲグラフト化、ベニヤリングまたはリサーフェイシング（resurfacing）、および鎖シャッフリングなどを含む種々の技術を使用してヒト化することができる。特定の実施形態では、フレームワーク置換は、ＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用をモデリングして抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定することおよび配列比較をして特定の位置における特異なフレームワー残基を同定することによって同定される。
【0035】
したがって、本明細書に記載の抗体はいずれも、利用可能な方法を使用してヒト化することができる。ウサギまたはマウスＣＤＲをヒト可変ドメインフレームワークに置き換えると、それらの正しい空間的配向を保持することができ、例えば、ヒト可変ドメインフレームワークは、該ＣＤＲが由来するウサギまたはマウス可変フレームワークと同じまたは類似の立体構造を採用する。これは、ＣＤＲが由来するウサギまたはマウス可変フレームワークドメインと高度の配列同一性を示すフレームワーク配列を有するヒト抗体からヒト可変ドメインを取得することによって達成することができる。重鎖および軽鎖の可変フレームワーク領域は、同じまたは異なるヒト抗体配列に由来することができる。ヒト抗体配列は、天然に存在するヒト抗体の配列であり得、またはいくつかのヒト抗体のコンセンサス配列であり得る。
【0036】
ウサギまたはマウスドナー免疫グロブリンおよび適切なヒトアクセプター免疫グロブリンの相補性決定領域を同定したら、次のステップは、得られるヒト化抗体の特性を最適化するためにこれらの成分の残基を置換するとすればどの残基を置換するべきかを決定することである。一般に、ヒトアミノ酸残基のウサギまたはマウスによる置換は最小限に抑える必要があり、これは、ウサギまたはマウス残基の導入により、抗体がヒトにおいてヒト抗ウサギ抗体（ＨＡＲＡ）またはヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を誘発するリスクが高まるためである。免疫応答を決定する技術的に認められた方法を、特定の患者においてまたは臨床試験中にＨＡＲＡまたはＨＡＭＡ応答を監視するために実行することができる。ヒト化抗体を投与された患者は、当該療法の投与の開始時および投与期間全体を通して免疫原性評価を受けることができる。ＨＡＲＡまたはＨＡＭＡ応答は、例えば、表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡＣＯＲＥ）および／または固相ＥＬＩＳＡ分析を含む当業者に知られている方法を使用して、患者からの血清試料中のヒト化治療試薬に対する抗体を検出することによって測定される。多くの実施形態では、対象ヒト化抗体は、ヒト対象においてＨＡＲＡ応答を実質的に誘発しない。
【0037】
ヒト可変領域フレームワーク残基からの特定のアミノ酸が、ＣＤＲ立体構造および／または抗原結合に対してそれらが与え得る影響に基づいて、置換のために選択される。ウサギまたはマウスＣＤＲ領域とヒト可変フレームワーク領域の不自然な並置は、不自然な立体構造拘束をもたらす可能性があり、それは特定のアミノ酸残基の置換によって修正されない限り、結合親和性の喪失につながる。置換のためのアミノ酸残基の選択は、部分的に、コンピュータモデリングによって決定することができる。免疫グロブリン分子の三次元画像を生成するためのコンピュータハードウェアおよびソフトウェアは、当該技術分野で知られている。一般に、免疫グロブリン鎖またはそのドメインの解決された構造から開始して分子モデルが作成される。モデル化される鎖は、解決された三次元構造の鎖またはドメインとのアミノ酸配列類似性について比較され、最大の配列類似性を示す鎖またはドメインが、分子モデルの構築の開始点として選択される。少なくとも５０％の配列同一性を共有する鎖またはドメインがモデリングのために選択され、好ましくは、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％以上の配列同一性を共有するものがモデリングのために選択される。解決された開始構造が、モデル化される免疫グロブリン鎖またはドメインの実際のアミノ酸と開始構造のアミノ酸との違いを許容するように、改変される。次に、その改変された構造が複合免疫グロブリンに組み立てられる。最後に、エネルギー最小化と、すべての原子が互いに適切な距離内にあり結合長および結合角度が化学的に許容できる範囲内にあることを確認することとにより、モデルが改良される。
【0038】
例えば、Ｋａｂａｔによって定義されるフレームワーク残基が、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａによって定義される構造ループ残基を構成する場合、ウサギまたはマウス抗体に存在するアミノ酸を、ヒト化抗体への置換のために選択することができる。「ＣＤＲ領域に隣接する」残基には、ヒト化免疫グロブリン鎖の一次配列中のＣＤＲのうちの１つ以上に直接隣接する位置、例えば、Ｋａｂａｔによって定義されるＣＤＲ、または、Ｃｈｏｔｈｉａによって定義されるＣＤＲ（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ ＪＭＢ １９６：９０１（１９８７）を参照されたい）に直接隣接する位置にあるアミノ酸残基が含まれる。これらのアミノ酸は、ＣＤＲ内のアミノ酸と相互作用する可能性が特に高く、もしアクセプターから選択されると、ドナーＣＤＲを歪めて親和性を減少させる可能性が高い。さらに、これら隣接するアミノ酸は抗原と直接相互作用する可能性があり（Ａｍｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３：７４７（１９８６））、ドナーからこれらのアミノ酸を選択することは、元の抗体の親和性を提供するすべての抗原接触を維持するために望ましくなり得る。本明細書に記載の抗体のうちのいずれかをヒト化するために用いることができるアプローチとしては、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｄ．，Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｄ．＆ Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ｈｕｍａｎｉｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ＣＤＲ Ｇｒａｆｔｉｎｇ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ３１９－３３９（２０１０） ｄｏｉ：１０．１００７／９７８－３－６４２－０１１４４－３＿２１；Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ，Ｔ．，Ｉｇａｗａ，Ｔ．，Ｔｓｕｎｏｄａ，Ｈ．＆ Ｈａｔｔｏｒｉ，Ｋ．Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０６０，１２３－３７（２０１４）；Ｈｗａｎｇ，Ｗ．Ｙ．，Ａｌｍａｇｒｏ，Ｊ．Ｃ．，Ｂｕｓｓ，Ｔ．Ｎ．，Ｔａｎ，Ｐ．＆ Ｆｏｏｔｅ，Ｊ．Ｕｓｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ａ ＣＤＲ ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｂａｓｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６，３５－４２（２００５）；Ｌｏ，Ｂ．Ｋ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ＣＤＲ ｇｒａｆｔｉｎｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８，１３５－５９（２００４）；およびＬｅｆｒａｎｃ，Ｍ．－Ｐ．Ｐ．，Ｅｈｒｅｎｍａｎｎ，Ｆ．，Ｇｉｎｅｓｔｏｕｘ，Ｃ．，Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ，Ｖ．＆ Ｄｕｒｏｕｘ，Ｐ．Ｕｓｅ ｏｆ ＩＭＧＴ ｄａｔａｂａｓｅｓ ａｎｄ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９０７，３－３７（２０１２）（それらの開示は、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものが含まれるが、これらに限定されない。
【0039】
本開示の抗体は、ＶＶ Ａ５６またはＶＶ Ｂ５抗原に特異的に結合する。抗体は、（例えば試料中の）他の物質に結合するよりも、より高い親和性、結合力で、より容易に、および／またはより長い持続時間で結合する場合、標的に「特異的に結合する」または「優先的に結合する」。特定の実施形態では、抗体は、例えば、約１０４Ｍ－１以上の親和性またはＫａ（すなわち、１／Ｍの単位による特定の結合相互作用の平衡会合定数）で抗原に結合または会合する場合、抗原と「特異的に結合」する。代替的に、親和性は、Ｍの単位による特定の結合相互作用の平衡解離定数（ＫＤ）（例えば、１０－５Ｍ～１０－１３Ｍ、またはそれ未満）として定義され得る。特定の態様では、特異的結合は、抗体が、約１０－５Ｍ以下、約１０－６Ｍ以下、約１０－７Ｍ以下、約１０－８Ｍ以下、または約１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ、もしくは１０－１２Ｍ以下のＫＤで抗原に結合することを意味する。抗原に対する抗体の結合親和性は、従来の技術を使用して、例えば、競合ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、平衡透析によって、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、製造業者によって概説された一般的な手順を使用するＢＩＡｃｏｒｅ ２０００またはＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００機器）を使用することによって、ラジオイムノアッセイによって容易に決定することができる。
【0040】
本開示の抗体が、抗原に結合することについて第２の抗体と「競合する」かどうかは、当該技術分野で知られている競合結合アッセイを使用して容易に決定することができる。競合する抗体は、例えば、抗体競合アッセイを介して特定することができる。例えば、第１の抗体の試料を固体支持体に結合させ得る。次に、そのような第１の抗体と競合することができると疑われる第２の抗体の試料を加える。２つの抗体のうちの１つは標識される。標識抗体と非標識抗体が抗原上の離れた別個の部位に結合する場合、競合すると疑われる抗体が存在するかどうかに関係なく、標識抗体は同じレベルに結合する。しかしながら、相互作用の部位が同一であるかまたは重複している場合、非標識抗体が競合し、抗原に結合する標識抗体の量が低下する。非標識抗体が過剰に存在する場合、標識抗体は、たとえあったとしてもごくわずかしか結合しない。
【0041】
本開示の目的のために、競合する抗体は、抗原への抗体の結合を約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、または約９９％以上減少させるものである。このような競合アッセイを実施するための手順の詳細は知られており、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８，５６７－５６９，１９８８，ＩＳＢＮ ０－８７９６９－３１４－２に見出すことができる。このようなアッセイは、精製された抗体を使用して定量的に行うことができる。１つの抗体をそれ自体に対して滴定することによって標準曲線を確立することができる。つまり、同じ抗体が標識と競合物の両方に使用される。プレートへの標識抗体の結合を阻害する非標識競合抗体の能力を滴定することができる。結果をプロットし、所望の程度の結合阻害を達成するために必要な濃度を比較することができる。
【0042】
抗ＶＶ Ａ５６抗体
いくつかの実施形態によれば、ＶＶ Ａ５６抗原（ＶＶ Ａ５６）に特異的に結合する抗体が提供される。ワクシニアウイルスＡ５６タンパク質はもともと血球凝集素タンパク質として特徴付けられていたが、Ａ５６は他の機能も有する。Ａ５６タンパク質は、セリンプロテアーゼ阻害剤（Ｋ２）とワクシニアウイルス補体制御タンパク質（ＶＣＰ）の２つのウイルスタンパク質に結合し、それらを感染細胞の表面に固定することができる。両方のタンパク質は細胞表面で生物学的に関連する機能を有するが、どちらもそれ自体ではそこに位置することができない。Ａ５６－Ｋ２複合体は、感染細胞に重感染するウイルスの量を低減し、感染細胞による合胞体の形成も防ぐ。Ａ５６－ＶＣＰ複合体は、感染細胞を補体攻撃から保護することができる。Ａ５６Ｒ遺伝子の欠失は、ワクシニアウイルスの病原性に様々な影響を及ぼす。Ａ５６タンパク質をコードする遺伝子は必須ではないため、外来遺伝子の挿入点として使用される可能性があり、腫瘍溶解剤として臨床開発中である一部のウイルスでは欠失されている。
いくつかの実施形態によれば、ＶＶ Ａ５６抗原（ＶＶ Ａ５６）に特異的に結合する抗体が提供される。ワクシニアウイルスＡ５６タンパク質はもともと血球凝集素タンパク質として特徴付けられていたが、Ａ５６は他の機能も有する。Ａ５６タンパク質は、セリンプロテアーゼ阻害剤（Ｋ２）とワクシニアウイルス補体制御タンパク質（ＶＣＰ）の２つのウイルスタンパク質に結合し、それらを感染細胞の表面に固定することができる。両方のタンパク質は細胞表面で生物学的に関連する機能を有するが、どちらもそれ自体ではそこに位置することができない。Ａ５６－Ｋ２複合体は、感染細胞に重感染するウイルスの量を低減し、感染細胞による合胞体の形成も防ぐ。Ａ５６－ＶＣＰ複合体は、感染細胞を補体攻撃から保護することができる。Ａ５６Ｒ遺伝子の欠失は、ワクシニアウイルスの病原性に様々な影響を及ぼす。Ａ５６タンパク質をコードする遺伝子は必須ではないため、外来遺伝子の挿入点として使用される可能性があり、腫瘍溶解剤として臨床開発中である一部のウイルスでは欠失されている。
【0043】
特定の実施形態では、本開示の抗体は、ＶＶ Ａ５６に特異的に結合し、本明細書でＡ０４７／Ａ０５７、Ａ０４９／Ａ０５９／Ａ０５６、Ａ０５０およびＡ０５４と呼ばれる抗ＶＶ Ａ５６抗体のうちの１つ以上の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つすべての相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗体と、ＶＶ Ａ５６への結合について競合する。いくつかの実施形態によれば、本開示の抗体は、ＶＶ Ａ５６に特異的に結合し、本明細書でＡ０４７／Ａ０５７、Ａ０４９／Ａ０５９／Ａ０５６、Ａ０５０もしくはＡ０５４と呼ばれる抗ＶＶ Ａ５６抗体の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つすべてのＣＤＲを含む。Ａ０４７／Ａ０５７、Ａ０４９／Ａ０５９／Ａ０５６、Ａ０５０およびＡ０５４抗体の可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド、およびＣＤＲのアミノ酸配列を以下の表１に示す。本開示を通して記載されるすべてのＣＤＲおよびフレームワーク領域は、特に明記しない限り、Ｋａｂａｔに従って定義される。
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【0044】
特定の実施形態では、本開示の抗体は、ＶＶ Ａ５６に特異的に結合し、ＶＶ Ａ５６への結合について、
アミノ酸配列ＳＳＹＷＩＣ（配列番号３）を含むＶＨＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＩＹＡＧＳＧＧＳＴＹＹＡＴＷＡＫＧ（配列番号４）を含むＶＨＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＡＹＳＤＲＳＧＧＹＳＦＮＬ（配列番号５）を含むＶＨＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＶＤＮＮＮＹＬＡ（配列番号６）を含むＶＬＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＳＡＳＳＬＡＳ（配列番号７）を含むＶＬＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＬＧＳＹＤＣＳＤＡＤＣＹＡ（配列番号８）を含むＶＬＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド、を含む抗体と競合する。
アミノ酸配列ＳＳＹＷＩＣ（配列番号３）を含むＶＨＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＩＹＡＧＳＧＧＳＴＹＹＡＴＷＡＫＧ（配列番号４）を含むＶＨＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＡＹＳＤＲＳＧＧＹＳＦＮＬ（配列番号５）を含むＶＨＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＶＤＮＮＮＹＬＡ（配列番号６）を含むＶＬＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＳＡＳＳＬＡＳ（配列番号７）を含むＶＬＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＬＧＳＹＤＣＳＤＡＤＣＹＡ（配列番号８）を含むＶＬＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド、を含む抗体と競合する。
【0045】
特定の実施形態では、そのような抗体は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８に示される６つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態によれば、抗体は、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド、または両方を含む。
【0046】
いくつかの実施形態によれば、本開示の抗体は、ＶＶ Ａ５６に特異的に結合し、ＶＶ Ａ５６への結合について、
アミノ酸配列ＤＩＹＹＩＳ（配列番号１１）を含むＶＨＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＴＹＡＧＳＳＧＳＴＹＹＡＴＷＡＫＧ（配列番号１２）を含むＶＨＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＤＲＹＰＧＴＳＧＲＶＹＧＭＤＬ（配列番号１３）を含むＶＨＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＩＳＤＬＬＳ（配列番号１４）を含むＶＬＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＳＡＳＴＬＡＳ（配列番号１５）を含むＶＬＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＣＮＹＹＳＰＴＹＧＮＧ（配列番号１６）を含むＶＬＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド、を含む抗体と競合する。
アミノ酸配列ＤＩＹＹＩＳ（配列番号１１）を含むＶＨＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＴＹＡＧＳＳＧＳＴＹＹＡＴＷＡＫＧ（配列番号１２）を含むＶＨＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＤＲＹＰＧＴＳＧＲＶＹＧＭＤＬ（配列番号１３）を含むＶＨＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＩＳＤＬＬＳ（配列番号１４）を含むＶＬＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＳＡＳＴＬＡＳ（配列番号１５）を含むＶＬＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＣＮＹＹＳＰＴＹＧＮＧ（配列番号１６）を含むＶＬＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド、を含む抗体と競合する。
【0047】
特定の実施形態では、そのような抗体は、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６に示される６つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態によれば、抗体は、配列番号９に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、配列番号１０に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド、または両方を含む。特定の実施形態では、抗体は、配列番号９に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、配列番号６２に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド、または両方を含む。いくつかの実施形態によれば、抗体は、配列番号９に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、配列番号６３に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド、または両方を含む。
【0048】
特定の実施形態では、本開示の抗体は、ＶＶ Ａ５６に特異的に結合し、ＶＶ Ａ５６への結合について、
アミノ酸配列ＳＳＹＷＬＣ（配列番号１９）を含むＶＨＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＩＹＮＧＤＧＳＴＨＹＡＳＷＡＫＧ（配列番号２０）を含むＶＨＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＤＹＴＹＮＦＹＴＹＧＦＮＬ（配列番号２１）を含むＶＨ ＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＶＮＩＷＡＳ（配列番号２２）を含むＶＬＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＫＡＳＴＬＡＳ（配列番号２３）を含むＶＬＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＧＧＹＰＳＳＳＳＧＷＡ（配列番号２４）を含むＶＬＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド、を含む抗体と競合する。
アミノ酸配列ＳＳＹＷＬＣ（配列番号１９）を含むＶＨＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＩＹＮＧＤＧＳＴＨＹＡＳＷＡＫＧ（配列番号２０）を含むＶＨＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＤＹＴＹＮＦＹＴＹＧＦＮＬ（配列番号２１）を含むＶＨ ＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＶＮＩＷＡＳ（配列番号２２）を含むＶＬＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＫＡＳＴＬＡＳ（配列番号２３）を含むＶＬＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＧＧＹＰＳＳＳＳＧＷＡ（配列番号２４）を含むＶＬＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド、を含む抗体と競合する。
【0049】
特定の実施形態では、そのような抗体は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４に示される６つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態によれば、抗体は、配列番号１７に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、配列番号１８に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド、または両方を含む。
【0050】
いくつかの実施形態によれば、本開示の抗体は、ＶＶ Ａ５６に特異的に結合し、ＶＶ Ａ５６への結合について、
アミノ酸配列ＳＳＹＷＩＣ（配列番号２７）を含むＶＨＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＴＹＮＧＤＧＳＴＨＹＡＳＷＡＫＧ（配列番号２８）を含むＶＨＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＤＹＴＤＡＦＹＴＹＧＦＮＬ（配列番号２９）を含むＶＨＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＴＳＳＹＬＡ（配列番号３０）を含むＶＬＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＲＡＳＳＬＡＳ（配列番号３１）を含むＶＬＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＴＧＦＹＧＳＳＧＨＴ（配列番号３２）を含むＶＬＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド、を含む抗体と競合する。
アミノ酸配列ＳＳＹＷＩＣ（配列番号２７）を含むＶＨＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＴＹＮＧＤＧＳＴＨＹＡＳＷＡＫＧ（配列番号２８）を含むＶＨＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＤＹＴＤＡＦＹＴＹＧＦＮＬ（配列番号２９）を含むＶＨＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＴＳＳＹＬＡ（配列番号３０）を含むＶＬＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＲＡＳＳＬＡＳ（配列番号３１）を含むＶＬＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＴＧＦＹＧＳＳＧＨＴ（配列番号３２）を含むＶＬＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド、を含む抗体と競合する。
【0051】
特定の実施形態では、そのような抗体は、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１および配列番号３２に示される６つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態によれば、抗体は、配列番号２５に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、配列番号２６に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド、または両方を含む。
【0052】
本開示の抗ＶＶ Ａ５６抗体が、ＶＶ Ａ５６抗原への結合について第２の抗体と「競合する」かどうかを決定するための好適なＶＶ Ａ５６抗原としては、以下の表２に示されるアミノ酸配列を有するＷｙｅｔｈ、Ｗｅｓｔｅｒｎ ＲｅｓｅｒｖｅおよびＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ Ａ５６抗原が挙げられる。
【表2】
【0053】
抗ＶＶ Ｂ５抗体
いくつかの実施形態によれば、ＶＶ Ｂ５抗原（ＶＶ Ｂ５）に特異的に結合する抗体が提供される。ＶＶ Ｂ５タンパク質は、補体制御タンパク質に特徴的な４つの短いコンセンサスリピート（ＳＣＲ）で構成される細胞外ドメインを有する４２ｋＤａのＩ型膜貫通型糖タンパク質である。ＳＣＲの後、Ｂ５は膜貫通ドメインの前にストーク領域と、短い細胞質尾部（ＣＴ）と、を有する。ＳＣＲとＣＴはいずれも、Ｂ５を細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）膜にターゲティングするために不可欠ではないが、後者は細胞表面へのその輸送およびエンドソームを介したリサイクルに影響を与える。Ｂ５は、細胞内成熟ウイルス（ＩＭＶ）がラッピングして細胞内エンベロープウイルス（ＩＥＶ）を形成するために必要である。
いくつかの実施形態によれば、ＶＶ Ｂ５抗原（ＶＶ Ｂ５）に特異的に結合する抗体が提供される。ＶＶ Ｂ５タンパク質は、補体制御タンパク質に特徴的な４つの短いコンセンサスリピート（ＳＣＲ）で構成される細胞外ドメインを有する４２ｋＤａのＩ型膜貫通型糖タンパク質である。ＳＣＲの後、Ｂ５は膜貫通ドメインの前にストーク領域と、短い細胞質尾部（ＣＴ）と、を有する。ＳＣＲとＣＴはいずれも、Ｂ５を細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）膜にターゲティングするために不可欠ではないが、後者は細胞表面へのその輸送およびエンドソームを介したリサイクルに影響を与える。Ｂ５は、細胞内成熟ウイルス（ＩＭＶ）がラッピングして細胞内エンベロープウイルス（ＩＥＶ）を形成するために必要である。
【0054】
特定の実施形態では、本開示の抗体は、ＶＶ Ｂ５に特異的に結合し、本明細書でＡ０４８／Ａ０５８／Ａ０７３およびＡ０５１と呼ばれる抗ＶＶ Ｂ５抗体のうちの１つ以上の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つすべての相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗体と、ＶＶ Ｂ５への結合について競合する。いくつかの実施形態によれば、本開示の抗体は、ＶＶ Ｂ５に特異的に結合し、本明細書でＡ０４８／Ａ０５８／Ａ０７３もしくはＡ０５１と呼ばれる抗ＶＶ Ｂ５抗体の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つすべてのＣＤＲを含む。Ａ０４８／Ａ０５８／Ａ０７３およびＡ０５１抗体の可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド、ならびにＣＤＲのアミノ酸配列を以下の表３に示す。
【表3】
【0055】
特定の実施形態では、本開示の抗体は、ＶＶ Ｂ５に特異的に結合し、ＶＶ Ｂ５への結合について、
アミノ酸配列ＳＳＹＹＭＣ（配列番号３５）を含むＶＨＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＩＹＴＳＳＧＳＡＹＹＡＮＷＡＫＧ（配列番号３６）を含むＶＨＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＮＡＶＧＳＳＹＹＬＹＬ（配列番号３７）を含むＶＨＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＶＡＧＮＮＹＬＳ（配列番号３８）を含むＶＬＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＳＶＳＴＬＡＳ（配列番号３９）を含むＶＬＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＧＹＹＮＤＧＩＷＡ（配列番号４０）を含むＶＬＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプド、を含む抗体と競合する。
アミノ酸配列ＳＳＹＹＭＣ（配列番号３５）を含むＶＨＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＩＹＴＳＳＧＳＡＹＹＡＮＷＡＫＧ（配列番号３６）を含むＶＨＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＮＡＶＧＳＳＹＹＬＹＬ（配列番号３７）を含むＶＨＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＶＡＧＮＮＹＬＳ（配列番号３８）を含むＶＬＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＳＶＳＴＬＡＳ（配列番号３９）を含むＶＬＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＧＹＹＮＤＧＩＷＡ（配列番号４０）を含むＶＬＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプド、を含む抗体と競合する。
【0056】
特定の実施形態では、そのような抗体は、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９および配列番号４０に示される６つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態によれば、抗体は、配列番号３３に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、配列番号３４に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド、または両方を含む。
【0057】
いくつかの実施形態によれば、本開示の抗体は、ＶＶ Ｂ５に特異的に結合し、ＶＶ Ｂ５への結合について、
アミノ酸配列ＳＹＷＭＣ（配列番号４３）を含むＶＨＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＩＹＧＧＳＳＧＳＴＹＹＳＮＷＡＫＧ（配列番号４４）を含むＶＨＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＤＧＳＴＷＤＹＦＲＬ（配列番号４５）を含むＶＨＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＩＮＴＮＹＬＳ（配列番号４６）を含むＶＬＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＱＡＳＴＬＥＳ（配列番号４７）を含むＶＬＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＧＹＹＴＶＥＮＩＧＮＰ（配列番号４８）を含むＶＬＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド、を含む抗体と競合する。
アミノ酸配列ＳＹＷＭＣ（配列番号４３）を含むＶＨＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＩＹＧＧＳＳＧＳＴＹＹＳＮＷＡＫＧ（配列番号４４）を含むＶＨＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＤＧＳＴＷＤＹＦＲＬ（配列番号４５）を含むＶＨＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＩＮＴＮＹＬＳ（配列番号４６）を含むＶＬＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＱＡＳＴＬＥＳ（配列番号４７）を含むＶＬＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＧＹＹＴＶＥＮＩＧＮＰ（配列番号４８）を含むＶＬＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド、を含む抗体と競合する。
【0058】
特定の実施形態では、そのような抗体は、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７および配列番号４８に示される６つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態によれば、抗体は、配列番号４１に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、配列番号４２に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド、または両方を含む。
【0059】
本開示の抗ＶＶ Ｂ５抗体が、ＶＶ Ｂ５抗原への結合について第２の抗体と「競合する」かどうかを決定するための好適なＶＶ Ｂ５抗原としては、以下の表４に示されるアミノ酸配列を有するＷｙｅｔｈ、Ｗｅｓｔｅｒｎ ＲｅｓｅｒｖｅおよびＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ Ｂ５抗原が挙げられる。
【表4】
【0060】
二重特異性抗体
二重特異性抗体も提供される。特定の実施形態では、本開示の二重特異性抗体は、上記のような抗体などの本開示の抗ＶＶ Ａ５６および抗ＶＶ Ｂ５抗体のうちのいずれかのＶＨポリペプチド－ＶＬポリペプチド対を含む第１の抗原結合ドメインを含む。二重特異性抗体は、第１の抗原結合ドメインによって結合されたＶＶ抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含み得る。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、第１の抗原結合ドメインによって結合されたＶＶ抗原以外のＶＶ抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む。
二重特異性抗体も提供される。特定の実施形態では、本開示の二重特異性抗体は、上記のような抗体などの本開示の抗ＶＶ Ａ５６および抗ＶＶ Ｂ５抗体のうちのいずれかのＶＨポリペプチド－ＶＬポリペプチド対を含む第１の抗原結合ドメインを含む。二重特異性抗体は、第１の抗原結合ドメインによって結合されたＶＶ抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含み得る。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、第１の抗原結合ドメインによって結合されたＶＶ抗原以外のＶＶ抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む。
【0061】
いくつかの実施形態によれば、本開示の二重特異性抗体は、ＶＶ抗原以外の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む。特定の実施形態では、ＶＶ抗原以外の抗原は、免疫細胞表面抗原である。免疫細胞表面抗原の非限定的な例としては、免疫エフェクター細胞表面抗原、例えば、Ｔ細胞表面抗原、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞表面抗原、マクロファージ細胞表面抗原などが挙げられる。第２の抗原結合ドメインによって結合され得るＴ細胞表面抗原の例としては、Ｔ細胞刺激分子、例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0062】
本開示の二重特異性抗体としては、全長抗体構造を有する抗体、および二重特異性抗体断片が挙げられる。本明細書で使用される場合、「全長」は、２つの全長抗体重鎖および２つの全長抗体軽鎖を有する抗体を指す。全長抗体重鎖（ＨＣ）は、よく知られている重鎖可変ドメインと、定常ドメインＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３と、から構成されている。全長抗体軽鎖（ＬＣ）は、よく知られている軽鎖可変ドメインと、定常ドメインＶＬおよびＣＬと、から構成されている。全長抗体は、一方または両方の重鎖のＣ末端リジンを欠いている可能性がある。「Ｆａｂアーム」という用語は、抗原に特異的に結合する１つの重鎖：軽鎖の対を指す。
【0063】
全長二重特異性抗体は、例えば、各半分子の重鎖ＣＨ３界面において置換を導入して、別個の特異性を有する２つの抗体半分子の無細胞環境下でインビトロでのまたは共発現を使用したヘテロ二量体形成が促進するようにすることによる、２つの単一特異性二価抗体間のＦａｂアーム交換（もしくは半分子交換）を使用して、生成され得る。Ｆａｂアーム交換反応は、ジスルフィド結合の異性化反応とＣＨ３ドメインの解離－会合の結果である。親単一特異性抗体のヒンジ領域における重鎖ジスルフィド結合が還元される。親単一特異性抗体のうちの１つから得られる遊離システインは、第２の親単一特異性抗体分子のシステイン残基と重鎖間ジスルフィド結合を形成し、同時に親抗体のＣＨ３ドメインが解離－会合によって離れ再形成される。ＦａｂアームのＣＨ３ドメインは、ホモ二量体化よりもヘテロ二量体化を優先するように設計され得る。得られる産物は、各々が別個のエピトープと結合する２つのＦａｂアームまたは半分子を有する二重特異性抗体である。
【0064】
「ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ）」戦略（例えば、ＷＯ２００６／０２８９３６を参照のこと）を使用して、全長二重特異性抗体を生成し得る。簡単に説明すると、ヒトＩｇＧにおけるＣＨＳドメインの界面を形成する選択されたアミノ酸が、ＣＨ３ドメイン相互作用に影響を与える位置において変異され、ヘテロ二量体形成を促進することができる。小さい側鎖（ホール）を有するアミノ酸が、第１の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖に導入され、大きい側鎖（ノブ）を有するアミノ酸が、第２の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖に導入される。２つの抗体の共発現後、「ホール」を有する重鎖と「ノブ」を有する重鎖との優先的な相互作用の結果として、ヘテロ二量体が形成される。ノブおよびホールを形成する例示的なＣＨ３置換対は、以下のとおりである（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにおける改変位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける改変位置として表される）：Ｔ３６６Ｙ７Ｆ４０５Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３９４５／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ｗ／Ｔ３９４ＳおよびＴ３６６Ｗ／Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖ。
【0065】
ＵＳ２０１０／００１５１３３、ＵＳ２００９／０１８２１２７、ＵＳ２０１０／０２８６３７またはＵＳ２０１１／０１２３５３２に記載されるように、１つのＣＨ３表面で正に帯電した残基を置換し第２のＣＨ３表面で負に帯電した残基を置換することにより、静電相互作用を使用して重鎖ヘテロ二量体化を促進するなどの他の戦略を使用してもよい。他の戦略では、ヘテロ二量体化は、（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにおける改変位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける改変位置として表される）以下の置換によって促進され得る：ＵＳ２０１２／０１４９８７６またはＵＳ２０１３／０１９５８４９に記載されるようなＬ３５１ Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１ Ｙ＿Ｙ４０７Ａ’Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９ＦもしくはＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。
【0066】
単鎖二重特異性抗体も提供される。いくつかの実施形態では、本開示の単鎖二重特異性抗体は、二重特異性ｓｃＦｖである。二重特異性ｓｃＦｖに関する詳細は、例えば、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８（１８）：３６８９－３６９６に見出され得る。
【0067】
本明細書に記載の抗体から多重特異性（例えば、二重特異性）抗体を産生するために用いられ得るアプローチとしては、Ｅｌｌｅｒｍａｎ，Ｄ．（２０１９）．”Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒｓ：Ｔｏｗａｒｄｓ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｖａｒｉａｂｌｅｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｏｔｅｎｃｙ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅｉｒ ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ．”Ｍｅｔｈｏｄｓ １５４：１０２－１１７；Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｕ．ａｎｄ Ｒ．Ｅ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ （２０１７）．”Ｔｈｅ ｍａｋｉｎｇ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．”ｍＡｂｓ ９（２）：１８２－２１２；およびＳｕｕｒｓ，Ｆ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ．（２０１９）．”Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．”Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１：１０３－１１９（それらの開示は、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられるが、これに限定されない。
【0068】
融合タンパク質
融合タンパク質も提供される。特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、異種アミノ酸配列に融合された、本開示の抗ＶＶ Ａ５６または抗ＶＶ Ｂ５抗体のうちのいずれかの鎖を含む。異種アミノ酸配列は、抗体の鎖のＣ末端または抗体の鎖のＮ末端に融合され得る。特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、抗体の鎖のＣ末端に異種配列と、抗体の鎖のＮ末端に異種配列と、を含み、これら異種配列は、同じ配列であっても異なる配列であってもよい。核酸またはポリペプチドの文脈で使用される場合、「異種」は一般に、核酸またはポリペプチドが、自然界には見られないものであるように、会合もしくは接合されているものとは異なる起源（例えば、異なる配列、異なる種の起源などの分子）に由来することを意味する。例えば、融合タンパク質では、軽鎖ポリペプチドとレポーターポリペプチド（例えば、ＧＦＰ、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＣｈｅｒｒｙ）、ルシフェラーゼなど）は、互いに「異種」であると言われる。同様に、マウス抗体からのＣＤＲとヒト抗体からの定常領域は互いに「異種」である。
融合タンパク質も提供される。特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、異種アミノ酸配列に融合された、本開示の抗ＶＶ Ａ５６または抗ＶＶ Ｂ５抗体のうちのいずれかの鎖を含む。異種アミノ酸配列は、抗体の鎖のＣ末端または抗体の鎖のＮ末端に融合され得る。特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、抗体の鎖のＣ末端に異種配列と、抗体の鎖のＮ末端に異種配列と、を含み、これら異種配列は、同じ配列であっても異なる配列であってもよい。核酸またはポリペプチドの文脈で使用される場合、「異種」は一般に、核酸またはポリペプチドが、自然界には見られないものであるように、会合もしくは接合されているものとは異なる起源（例えば、異なる配列、異なる種の起源などの分子）に由来することを意味する。例えば、融合タンパク質では、軽鎖ポリペプチドとレポーターポリペプチド（例えば、ＧＦＰ、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＣｈｅｒｒｙ）、ルシフェラーゼなど）は、互いに「異種」であると言われる。同様に、マウス抗体からのＣＤＲとヒト抗体からの定常領域は互いに「異種」である。
【0069】
抗ＶＶ Ａ５６または抗ＶＶ Ｂ５抗体の鎖は、目的の任意の異種配列に融合され得る。目的の異種ポリペプチドとしては、アルブミン、トランスフェリン、ＸＴＥＮ、ホモアミノ酸ポリマー、プロリン－アラニン－セリンポリマー、エラスチン様ペプチド、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。特定の態様では、異種ポリペプチドは、抗体がそれを必要とする個体に投与されたときに、異種配列に融合されていない同じ抗体と比較して、抗体の安定性および／または血清半減期を増加させる。
【0070】
特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、単鎖抗体、例えば、上記のような抗体のうちのいずれかを含む、本開示の抗ＶＶ Ａ５６および抗ＶＶＢ５抗体のうちのいずれかのＶＨポリペプチド－ＶＬポリペプチド対を含む単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。本開示のｓｃＦｖとしては、以下の表５に記載のｓｃＦｖの６つのＣＤＲを含むｓｃＦｖが含まれるが、これらに限定されず、いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、表５に記載のｓｃＦｖのＶＨのアミノ酸配列に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチドと、表５に記載のｓｃＦｖのＶＬのアミノ酸配列に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチドと、を含む。表５では、ポリペプチドのセグメント／ドメインが交互の下線で示され、セグメント／ドメインのＩＤが左側の列に示されている。
【表5-1】
【表5-2】
【0071】
いくつかの実施形態によれば、融合タンパク質が単鎖抗体（例えば、本明細書に記載のｓｃＦｖのうちのいずれかを含む、本開示の単鎖抗体のうちのいずれか）を含む場合、融合タンパク質は、単鎖抗体、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。
【0072】
本開示のＣＡＲは、様々なドメイン間の１つ以上のリンカー配列を含み得る。「可変領域連結配列」は、重鎖可変領域を軽鎖可変領域に接続し、得られたポリペプチドが、同じ軽鎖および重鎖可変領域を含む抗体と同じ標的分子に対する特異的結合親和性を保持するように２つのサブ結合ドメインの相互作用と適合性のあるスペーサー機能を提供するアミノ酸配列である。可変領域連結配列の非限定的な例は、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ （Ｇ４Ｓ）３（配列番号４９）を含むセリン－グリシンリンカーなどのセリン－グリシンリンカーである。特定の態様では、リンカーは、１つ以上の重鎖または軽鎖可変ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および／または一次シグナル伝達ドメインを分離する。特定の実施形態では、ＣＡＲは、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以上のリンカーを含む。特定の実施形態では、リンカーの長さは、約１～約２５アミノ酸、約５～約２０アミノ酸、もしくは約１０～約２０アミノ酸、または任意の介在するアミノ酸の長さである。いくつかの実施形態では、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、またはそれ超の長さのアミノ酸である。
【0073】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインの後に、適切な細胞／細胞接触、抗原結合および／または活性化を可能にするために、抗原結合ドメインをエフェクター細胞表面（例えば、ＣＡＲを発現するＴ細胞の表面）から遠ざける１つ以上のスペーサードメインが続く。スペーサードメイン（ならびに、本明細書に記載の他の任意のスペーサードメイン、リンカーおよび／または同様のもの）は、天然、合成、半合成または組換えのいずれかの供給源に由来し得る。特定の実施形態では、スペーサードメインは、免疫グロブリンの一部分であり、１つ以上の重鎖定常領域、例えば、ＣＨ２およびＣＨ３を含むが、これらに限定されない。スペーサードメインは、天然に存在する免疫グロブリンヒンジ領域または改変された免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。一実施形態では、スペーサードメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４もしくはＩｇＤのＣＨ２および／またはＣＨ３を含む。本明細書に記載のＣＡＲでの使用に好適である例示的なスペーサードメインには、ＣＤ８αおよびＣＤ４などの１型膜タンパク質の細胞外領域に由来するヒンジ領域が含まれ、この領域は、これらの分子またはその変異体に由来する野生型ヒンジ領域であり得る。特定の態様では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジは、ＰＤ－１ヒンジまたはＣＤ１５２ヒンジである。
【0074】
「膜貫通ドメイン」（Ｔｍドメイン）は、細胞外結合部分と細胞内シグナル伝達ドメインを融合し、ＣＡＲを細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）の原形質膜に固定するＣＡＲの部分である。Ｔｍドメインは、天然、合成、半合成、または組換えのいずれかの供給源に由来し得る。いくつかの実施形態では、Ｔｍドメインは、Ｔ細胞受容体、ＣＤ３５、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４またはＰＤ－１のアルファまたはベータ鎖の（例えば、少なくとも膜貫通領域またはその機能的部分を含む）由来である。
【0075】
一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８αに由来するＴｍドメインを含む。特定の態様では、ＣＡＲは、ＣＤ８αに由来するＴｍドメインと、例えば、長さが１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０アミノ酸間の短いオリゴまたはポリペプチドリンカーと、を含む。これは、ＣＡＲのＴｍドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを連結する。例えば、グリシン－セリンリンカーをそのようなリンカーとして用いてもよい。
【0076】
ＣＡＲの「細胞内シグナル伝達」ドメインは、標的分子／抗原に結合するＣＡＲからのシグナルを免疫エフェクター細胞の内部に伝達して、エフェクター細胞機能、例えば、活性化、サイトカイン産生、増殖および／または細胞傷害活性（ＣＡＲ結合標的細胞への細胞傷害性因子の放出、もしくは細胞外ＣＡＲドメインへの標的分子／抗原結合によって誘発される他の細胞応答を含む）を誘発することに関与するＣＡＲの一部を指す。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊な機能を実行するように指示するタンパク質の部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮部分が使用される場合には、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、そのような短縮部分は、全長細胞内シグナル伝達ドメインの代わりに使用され得る。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮部分を含むことを意味する。
【0077】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）だけで生成されたシグナルは、Ｔ細胞を完全に活性化するには不十分であり、二次シグナルまたは共刺激シグナルも必要である。したがって、Ｔ細胞の活性化は２つの別個のクラスの細胞内シグナル伝達ドメインによって媒介される：ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）を介して抗原依存性の一次活性化を開始する一次シグナル伝達ドメインと、二次または共刺激信号を提供するために抗原非依存的に作用する共刺激シグナル伝達ドメイン。したがって、本開示のＣＡＲは、１つ以上の「共刺激シグナル伝達ドメイン」および「一次シグナル伝達ドメイン」を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。
【0078】
一次シグナル伝達ドメインは、刺激的にまたは阻害的にのいずれかで、ＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する。刺激的に作用する一次シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（または「ＩＴＡＭ」）として知られているシグナル伝達モチーフを含有し得る。本開示のＣＡＲでの使用に好適なＩＴＡＭ含有一次シグナル伝達ドメインの非限定的な例としては、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９α、ＣＤ７９βおよびＣＤ６６δに由来するものが挙げられる。特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインおよび１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。細胞内一次シグナル伝達および共刺激シグナル伝達ドメインは、膜貫通ドメインのカルボキシル末端に作動可能に連結されている。
【0079】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の有効性および増殖を増強するために、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「共刺激シグナル伝達ドメイン」または「共刺激ドメイン」という用語は、共刺激分子またはその活性断片の細胞内シグナル伝達ドメインを指す。特定の実施形態で企図されるＣＡＲでの使用に好適である例示的な共刺激分子としては、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭおよびＺＡＰ７０が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２８およびＣＤ１３４からなる群から選択される１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインと、を含む。
【0080】
本開示のＣＡＲは、リーダー配列を含むがこれらに限定されない、任意の種々の好適なドメイン；ヒンジ、スペーサーおよび／もしくはリンカードメイン；膜貫通ドメイン；共刺激ドメイン；シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζドメイン）；リボソームスキップエレメント；制限酵素配列；レポータータンパク質ドメイン；ならびに／または同様のものを含み得る。本開示のＣＡＲに含まれ得るそのようなドメインの非限定的な例としては、以下の表６に示されるものが挙げられる。当業者によって理解されるように、表６に示されるドメインのうちの１つ以上のアミノ酸配列（例えば、リンカー、ヒンジ、膜貫通、共刺激、シグナル伝達、リボソームスキップエレメント；制限酵素配列；レポータータンパク質など）は、例えば、ＣＡＲの機能性などを改善するために、必要に応じて改変され得る。
【表6-1】
【表6-2】
【表6-3】
【0081】
特定の態様では、本開示のＣＡＲは、目的の抗原（例えば、ＶＶ Ａ５６抗原またはＶＶ Ｂ５抗原）に結合する単鎖抗体（例えば、本開示のｓｃＦｖのうちのいずれか）；ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１５４およびＰＤ－１からなる群から選択されるポリペプチドからの膜貫通ドメイン；４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２８およびＣＤ１３４からなる群から選択されるポリペプチドからの１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびに、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９α、ＣＤ７９βおよびＣＤ６６δからなる群から選択されるポリペプチドからの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。そのようなＣＡＲは、抗原結合部分と膜貫通ドメインとの間にスペーサードメイン、例えば、ＣＤ８アルファヒンジをさらに含み得る。
【0082】
いくつかの実施形態によれば、提供されるのは、Ｎ末端からＣ末端までの間に、本明細書に記載の抗体の可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、リンカー、抗体の可変軽鎖（ＶＬ）、ＣＤ８ヒンジ領域（いくつかの実施形態では、拡張ＣＤ８ヒンジ領域である）、ＣＤ８膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲである。特定の実施形態によれば、提供されるのは、Ｎ末端からＣ末端までの間に、本明細書に記載の抗体の可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド、リンカー、抗体の可変重鎖（ＶＨ）、ＣＤ８ヒンジ領域（いくつかの実施形態では、拡張ＣＤ８ヒンジ領域である）、ＣＤ８膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲである。特定の実施形態では、提供されるのは、Ｎ末端からＣ末端までの間に、本明細書に記載の抗体の可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、リンカー、抗体の可変軽鎖（ＶＬ）、ＣＤ２８ヒンジ領域、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲである。いくつかの実施形態によれば、提供されるのは、Ｎ末端からＣ末端までの間に、本明細書に記載の抗体の可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド、リンカー、抗体の可変重鎖（ＶＨ）、ＣＤ２８ヒンジ領域、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲである。本開示のＣＡＲはいずれも、ＶＨポリペプチドのＮ末端ドメインを含み得る。例えば、リーダー配列（例えば、ＧＭ－ＣＳＦＲリーダー配列）は、本開示のＣＡＲのＮ末端に存在し得る。
【0083】
本開示の例示的な抗Ａ５６ ＣＡＲのアミノ酸配列は、以下の表７および８に示され、表７のＣＡＲのアミノ酸配列は、Ｎ末端リーダー配列（ここでは、Ｎ末端ＧＭ－ＣＳＦＲリーダー配列）のアミノ酸配列を含み、表８のＣＡＲのアミノ酸配列は、リーダー配列のアミノ酸配列を含まない。任意の所望のリーダー配列（例えば、ＧＭ－ＣＳＦＲリーダー配列）は、そのようなＣＡＲのＮ末端に存在し得る。当業者によって理解されるように、表７および８に示されるドメインのうちの１つ以上（例えば、リンカー、ヒンジ、膜貫通、共刺激、シグナル伝達など）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＡＲの機能性などを改善するために、必要に応じて改変され得る。表７および８では、ポリペプチドのセグメント／ドメインが交互の下線で示され、セグメント／ドメインのＩＤが左側の列に示されている。
【表7-1】
【表7-2】
【表7-3】
【表7-4】
【表7-5】
【表8-1】
【表8-2】
【表8-3】
【表8-4】
【表8-5】
【0084】
本開示のＣＡＲは、必要に応じて、１つ以上の追加のドメインを含み得る。そのような追加のドメインの非限定的な例としては、リボソームスキップエレメント、酵素ドメイン（例えば、ヌクレアーゼ活性を有するドメイン、例えば、制限エンドヌクレアーゼ活性）、ＣＡＲの検出を可能にするドメイン（例えば、レポータータンパク質ドメイン（例えば、蛍光タンパク質（例えば、ｅＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙなど）、発光タンパク質および／または同様のもの））などが挙げられる。例えば、特定の実施形態では、提供されるのは、リボソームスキップエレメント、制限酵素ドメインおよび／またはレポータータンパク質ドメインを含むＣＡＲである。これらの特徴のうちの１つ以上を有する本開示の例示的な抗Ａ５６ ＣＡＲのアミノ酸配列は、以下の表９に示されている。当業者によって理解されるように、表９に示されるドメインのうちの１つ以上のアミノ酸配列（例えば、リンカー、ヒンジ、膜貫通、共刺激、シグナル伝達、制限酵素配列、レポータータンパク質など）は、例えば、ＣＡＲの機能性、検出などを改善するために、必要に応じて改変され得る。表９では、ＣＡＲ部分が太字で示され、ポリペプチドのセグメント／ドメインが交互の下線で示されている。セグメント／ドメインのＩＤは、左側の列に示されている。
【表9-1】
【表9-2】
【表9-3】
【表9-4】
【表9-5】
【表9-6】
【表9-7】
【0085】
特定の実施形態では、提供されるのは、１つ以上のマウスＣＡＲドメインを含むＣＡＲである。本開示のＣＡＲに含まれ得るマウスＣＡＲドメインの非限定的な例としては、以下の表１０に示されるマウスＣＡＲドメインのうちの１つ以上が含まれる。当業者によって理解されるように、表１０に示されるドメインのうちの１つ以上のアミノ酸配列（例えば、リーダー配列、リンカー、ヒンジ、膜貫通、共刺激、シグナル伝達、リボソームスキップエレメント；制限酵素配列；レポータータンパク質など）は、必要に応じて改変され得る。
【表10】
【0086】
いくつかの実施形態によれば、１つ以上のマウスＣＡＲドメイン（例えば、上記の表１０に記載のドメインのいずれかのうちの１つ以上）を含むマウスＣＡＲが提供される。本開示のマウスＣＡＲの非限定的な例としては、以下の表１１に示されるものが挙げられる。当業者によって理解されるように、表１１に示されるドメインのうちの１つ以上のアミノ酸配列（例えば、リーエアー配列、ＶＨ、リンカー、ＶＬ、ヒンジ、膜貫通、共刺激、シグナル伝達、リボソームスキップエレメントなど）は、必要に応じて改変され得る。表１１では、ＣＡＲ部分が太字で示されている。ポリペプチドのセグメント／ドメインが交互の下線で示され、セグメント／ドメインのＩＤが左の列に示されている。
【表11-1】
【表11-2】
【0087】
いくつかの実施形態によれば、本開示のＣＡＲは、単一のポリペプチドによって提供される。特定の実施形態では、本開示のＣＡＲは、２つ以上のポリペプチドによって提供される。ＣＡＲが２つ以上のポリペプチドによって提供される場合、ＣＡＲは、ビオチン結合免疫受容体（ＢＢＩＲ）フォーマット（例えば、Ｕｒｂａｎｓｋａ Ｋ，Ｐｏｗｅｌｌ ＤＪ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｏ ｉｎｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１２；１（５）：７７７－７７９．ｄｏｉ：１０．４１６１／ｏｎｃｉ．１９７３０およびＵｒｂａｎｓｋａ Ｋ，Ｌａｎｉｔｉｓ Ｅ，Ｐｏｕｓｓｉｎ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｒｏｕｇｈ ｕｓｅ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ Ｔ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．２０１３；７２（７）：１８４４－１８５２．ｄｏｉ：１０．１１５８／０００８－５４７２．ＣＡＮ－１１－３８９０．Ａを参照のこと）；ペプチドＮｅｏＥｐｉｔｏｐｅ（ＰＮＥ）を用いる切り替え可能なＣＡＲフォーマット（例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２０１５；１３７（８）：２８３２－２８３５；Ｍａ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １１３（４）：Ｅ４５０－８；Ｒｏｄｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．１１３（４）：Ｅ４５９－Ｅ４６８；Ｖｉａｕｄ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １１５（４６）：Ｅ１０８９８－Ｅ１０９０６を参照のこと）；ロイシンジッパーを備えるＳＵＰＲＡ ＣＡＲフォーマット（例えば、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（２１０８）Ｃｅｌｌ １７３（６）：１４２６－１４３８．ｅ１１を参照のこと）；ＦＩＴＣ－葉酸を用いるＣＡＲ－Ｔアダプター分子（ＣＡＭ）ベースのフォーマット（例えば、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７９（２）：３８７－３９６およびＬｕ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ．９：１５１を参照のこと）；抗ＦＩＴＣ－葉酸アダプターフォーマット（例えば、Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｂｉｏｓｃｉ Ｔｒｅｎｄｓ．１２（３）：２９８－３０８を参照のこと）；抗ＦＩＴＣ抗体アダプターＣＡＲフォーマット（例えば、Ｔａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１８（２３）：６４３６－６４４５を参照のこと）；Ｆｃ標的化（例えば、抗ＣＤ１６）ＣＡＲ＋抗腫瘍抗体フォーマット（例えば、Ｋｕｄｏ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７４（１）：９３－１０３を参照のこと）；ならびに同様のものを含む、普遍的なＣＡＲフォーマットを含む任意の有用なマルチポリペプチドフォーマットで提供され得る。
【0088】
コンジュゲート
本開示はまた、コンジュゲートを提供する。いくつかの実施形態によれば、本開示のコンジュゲートは、本開示の抗体または融合タンパク質のうちのいずれかと、抗体または融合タンパク質にコンジュゲートされた薬剤と、を含む。「コンジュゲートされた」という用語は一般に、共有結合または非共有結合のいずれか、通常は共有結合であり、目的の１つの分子を目的の第２の分子と近位に会合させる化学結合を指す。特定の実施形態では、抗体または融合タンパク質にコンジュゲートされた薬剤は、化学療法剤、毒素、放射線増感剤、放射性同位体（例えば、治療用放射性同位体）、検出可能な標識、および半減期拡張部分から選択される。
本開示はまた、コンジュゲートを提供する。いくつかの実施形態によれば、本開示のコンジュゲートは、本開示の抗体または融合タンパク質のうちのいずれかと、抗体または融合タンパク質にコンジュゲートされた薬剤と、を含む。「コンジュゲートされた」という用語は一般に、共有結合または非共有結合のいずれか、通常は共有結合であり、目的の１つの分子を目的の第２の分子と近位に会合させる化学結合を指す。特定の実施形態では、抗体または融合タンパク質にコンジュゲートされた薬剤は、化学療法剤、毒素、放射線増感剤、放射性同位体（例えば、治療用放射性同位体）、検出可能な標識、および半減期拡張部分から選択される。
【0089】
いくつかの実施形態によれば、薬剤は、治療薬、例えば、化学療法剤である。目的の治療薬は、コンジュゲートの抗体部分の細胞／組織の抗原への特異的結合を介してコンジュゲートが結合する細胞／組織の機能に影響を及ぼすことができる薬剤を含む。細胞／組織の機能が病理的である場合、細胞／組織の機能を低下させる薬剤を用いてもよい。特定の態様では、本開示のコンジュゲートは、細胞増殖の阻害および／または細胞／組織の殺滅によって標的細胞／組織の機能を低下させる薬剤を含む。そのような薬剤は、様々であり、細胞増殖抑制剤および細胞傷害性剤、例えば、標的細胞への内在化ありまたはなしで標的細胞組織を殺滅することができる薬剤を含み得る。
【0090】
特定の態様では、治療薬は、エンジイン、レキシトロプシン、デュオカルマイシン、タキサン、ピューロマイシン、ドラスタチン、メイタンシノイド、およびビンカアルカロイドから選択される細胞傷害性剤である。いくつかの実施形態では、細胞傷害性剤は、パクリタキセル、ドセタキセル、ＣＣ－１０６５、ＣＰＴ－１１（ＳＮ－３８）、トポテカン、ドキソルビシン、モルホリノ－ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、ドラスタチン－１０、エキノマイシン、コンブレタスタチン、カリケアマイシン、メイタンシン、メイタンシンＤＭ１、メイタンシンＤＭ４、ＤＭ－１、アウリスタチンＥもしくはアウリスタチンＦのような、アウリスタチンもしくは他のドラスタチン誘導体、ＡＥＢ（ＡＥＢ－０７１）、ＡＥＶＢ（５－ベンゾイルバレリン酸－ＡＥエステル）、ＡＥＦＰ（抗体－エンドスタチン融合タンパク質）、ＭＭＡＥ（モノメチルアウリスタチンＥ）、ＭＭＡＦ（モノメチルアウリスタチンＦ）、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、エレウテロビン、ネットロプシン、またはこれらの任意の組み合わせである。
【0091】
いくつかの実施形態によれば、薬剤は、ＨＴＩ－２８６などのヘミアステリンおよびヘミアステリン類似体（例えば、それらの全開示が参照により本明細書に組み込まれるＵＳＰＮ７，５７９，３２３、ＷＯ２００４／０２６２９３、およびＵＳＰＮ８，１２９，４０７を参照）、アブリン、ブルシン、シクトキシン、ジフテリア毒素、バトラコトキシン、ボツリヌス毒素、志賀毒素、内毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ内毒素、破傷風毒素、百日咳毒素、炭疽毒素、コレラ毒素、ファルカリノール、フモニシンＢ１、フモニシンＢ２、アフラトキシン、マウロトキシン（ｍａｕｒｏｔｏｘｉｎ）、アジトキシン、カリブドトキシン、マルガトキシン（ｍａｒｇａｔｏｘｉｎ）、スロトキシン（ｓｌｏｔｏｘｉｎ）、シラトキシン（ｓｃｙｌｌａｔｏｘｉｎ）、ヘフトキシン、カルシセプチン、タイカトキシン（ｔａｉｃａｔｏｘｉｎ）、カルシクルジン、ゲルダナマイシン、ゲロニン、ロタウストラリン、オクラトキシン（ｏｃｒａｔｏｘｉｎ）Ａ、パツリン、リシン、ストリキニーネ、トリコテセン、ゼアラレノン（ｚｅａｒｌｅｎｏｎｅ）、およびテトラドトキシン（ｔｅｔｒａｄｏｔｏｘｉｎ）から選択されるタンパク質毒素である。用いることができる酵素的に活性な毒素およびその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、アルファ－サルシン（ｓａｒｃｉｎ）、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ－Ｓ）、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン、Ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）およびトリコテセンが含まれる。
【0092】
特定の実施形態では、薬剤は放射線増感剤である。本明細書で使用される場合、「放射線増感剤」は、腫瘍細胞を殺滅する放射線の能力を増強する薬剤である。抗体または融合タンパク質にコンジュゲートされ得る放射線増感剤の非限定的な例としては、シスプラチン、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、ＡＺＤ７７６２、セルメチニブなどが挙げられる。
【0093】
特定の実施形態では、薬剤は、例えば、療法および／または検出（例えば、イメージング）に有用な放射性同位体である。抗体または融合タンパク質にコンジュゲートされ得る放射性同位体の非限定的な例としては、２２５Ａｃ、１１１Ａｇ、１１４Ａｇ、７１Ａｓ、７２Ａｓ、７７Ａｓ、２１１Ａｔ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、１１Ｃ、１３Ｃ、５５Ｃｏ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、１６５Ｄｙ、１６６Ｄｙ、１６９Ｅｒ、１８Ｆ、１９Ｆ、５２Ｆｅ、５９Ｆｅ、６６Ｇａ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ｇａ、１５４－１５８Ｇｄ、１５７Ｇｄ、１５９Ｇｄ、１６６Ｈｏ、１２０Ｉ、１２１Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１９４Ｉｒ、８１ｍＫｒ、１７７Ｌｕ、５１Ｍｎ、５２Ｍｎ、９９Ｍｏ、１３Ｎ、１５Ｎ、１５Ｏ、１７Ｏ、３２Ｐ、３３Ｐ、２１１Ｐｂ、２１２Ｐｂ、１０９Ｐｄ、１４９Ｐｍ、１５１Ｐｍ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１９１ＰＴ、１９３ｍＰＴ、１９５ｍＰｔ、２２３Ｒａ、１４２Ｒｂ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１０５Ｒｈ、４７Ｓｃ、７５Ｓｅ、１５３Ｓｍ、１１７ｍＳｎ、１２１Ｓｎ、８３Ｓｒ、８９Ｓｒ、１６１Ｔｂ、９４Ｔｃ、９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ、２２７Ｔｈ、２０１Ｔｌ、１７２Ｔｍ、１２７Ｔｅ、９０Ｙ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１３３Ｘおよび８９Ｚｒが挙げられるが、これらに限定されない。
【0094】
特定の実施形態では、放射性同位体は、キレート剤、例えば、二機能性キレート剤を介して抗体または融合タンパク質にコンジュゲートされる。二官能性キレート剤は、安定な配位錯体において放射性同位体と結合する金属キレート部分と、本開示の抗体または融合タンパク質のうちのいずれかなどの標的指向化部分に共有結合している反応性官能基と、を含有し得、それにより、放射性同位体はインビボで望ましい分子標的に適切に向けられ得る。本開示の抗体または融合タンパク質を放射性同位体にコンジュゲートするために用いられ得る二機能性キレート剤の非限定的な例としては、ｐ－ＳＣＮ－Ｂｎ－ＤＯＴＡおよびｐ－ＳＣＮ－Ｂｎ－デフェロキサミンが挙げられる。本開示の抗体または融合タンパク質を放射性同位体にコンジュゲートするために用いられ得る二官能性キレート剤の追加の例としては、Ｐｒｉｃｅ＆Ｏｒｖｉｇ（２０１４）Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．４３：２６０；およびＢｒｅｃｈｂｉｅｌ（２００８）Ｑ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ ５２（２）：１６６－１７３に記載のものが挙げられる。
【0095】
いくつかの実施形態によれば、放射性同位体は治療用放射性同位体である。特定の実施形態では、放射性同位体は、アルファ放出放射性同位体、例えば、２２５Ａｃ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ／２１２Ｐｂ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａ、または２２７Ｔｈである。他の実施形態では、放射性同位体は、ベータマイナス放出放射性同位体、例えば、３２Ｐ、３３Ｐ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１３１Ｉまたは１７７Ｌｕである。
【0096】
いくつかの実施形態によれば、薬剤は標識剤である。「標識剤」（または「検出可能な標識」）とは、抗体または融合タンパク質が目的の用途（例えば、インビトロおよび／もしくはインビボ研究ならびに／または臨床用途）において検出され得るように、薬剤が抗体または融合タンパク質を検出可能に標識することを意味する。目的の検出可能な標識は、放射性同位体（例えば、ガンマまたは陽電子放出体）、検出可能な産物を生成する酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼなど）、蛍光タンパク質、常磁性原子などを含む。特定の態様では、抗体または融合タンパク質は、検出可能な標識の特異的結合パートナーにコンジュゲートされる（例えば、アビジン／ストレプトアビジンを含む検出可能な標識を介して検出が起こり得るように、ビオチンにコンジュゲートされる）。
【0097】
特定の実施形態によれば、薬剤は、近赤外（ＮＩＲ）光学イメージング、単一光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）±ＣＴイメージング、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）±ＣＴイメージング、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法などのインビボイメージングでの使用が見出される標識剤である。そのような用途での使用に見出される標識剤として、蛍光標識、放射性同位体などが挙げられるが、これらに限定されない。特定の態様では、標識剤は、２つ以上のイメージング手法を使用してインビボイメージングを可能にするマルチモーダルインビボイメージング剤である（例えば、Ｔｈｏｒｐ－Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ ａｎｄ Ｃｏｏｇａｎ（２０１１）Ｄａｌｔｏｎ Ｔｒａｎｓ．４０：６１２９－６１４３を参照されたい）。
【0098】
特定の実施形態では、標識剤は、近赤外線（ＮＩＲ）イメージング用途での使用が見出されるインビボイメージング剤である。このような薬剤としては、Ｋｏｄａｋ Ｘ－ＳＩＧＨＴ色素、Ｐｚ ２４７、ＤｙＬｉｇｈｔ７５０および８００Ｆｌｕｏｒｓ、Ｃｙ５．５および７Ｆｌｕｏｒｓ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６８０および７５０Ｄｙｅｓ、ＩＲＤｙｅ６８０および８００ＣＷ Ｆｌｕｏｒｓが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態によれば、標識剤は、ＳＰＥＣＴイメージング用途での使用が見出されるインビボイメージング剤であり、その非限定的な例としては、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、２０１Ｔ１、および１３３Ｘｅが挙げられる。特定の実施形態では、標識剤は、ＰＥＴイメージング用途、例えば、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、６４Ｃｕ、６２Ｃｕ、１２４Ｉ、７６Ｂｒ、８２Ｒｂ、６８Ｇａなどでの使用が見出されるインビボイメージング剤である。
【0099】
半減期を延長するために、本開示の抗体および融合タンパク質は、改善された薬物動態プロファイルを提供する薬剤にコンジュゲートされ得る（例えば、ＰＥＧ化、高グリコシル化などによる）。血清半減期を延長することができる改変は興味深いものである。対象の抗体または融合タンパク質は、１つ以上のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分を含有するものとして「ＰＥＧ化」され得る。タンパク質のＰＥＧ化に好適な方法および試薬は当該技術分野で周知であり、例えば、米国特許第５，８４９，８６０号に見出すことができる。タンパク質へのコンジュゲーションに好適なＰＥＧは一般に、室温で水溶性であり、一般式Ｒ（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎＯ－Ｒを有し、式中、Ｒは水素、またはアルキル基もしくはアルカノール基などの保護基であり、ｎは１～１０００の整数である。Ｒが保護基である場合、それは一般に１～８個の炭素を有する。対象の抗体または融合タンパク質にコンジュゲートされたＰＥＧは線形であり得る。対象の抗体または融合タンパク質にコンジュゲートされたＰＥＧはまた分岐であり得る。米国特許第５，６４３，５７５号に記載されるもの、「スターＰＥＧ」およびマルチアームＰＥＧなどの分岐ＰＥＧ誘導体。スターＰＥＧは、例えば、米国特許第６，０４６，３０５号を含む当該技術分野において説明されている。
【0100】
対象の抗体または融合タンパク質が供給源から単離される場合、抗体または融合タンパク質は、特異的結合対のメンバー、例えば、ビオチン（ビオチン－アビジン特異的結合対のメンバー）、レクチンなどの精製を容易にする１つ以上の部分にコンジュゲートされ得る。抗体はまた、ポリスチレンプレートまたはビーズ、磁気ビーズ、試験ストリップ、膜などを含むがこれらに限定されない固体支持体に結合する（例えば、固定化する）ことができる。
【0101】
抗体または融合タンパク質がアッセイで検出される場合、抗体または融合タンパク質は、検出可能な標識、例えば、放射性同位体（例えば、８９Ｚｒ、１１１Ｉｎなど）、検出可能な産物を生成する酵素（例えば、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、蛍光タンパク質、発色性タンパク質、色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリンなど）；ＥＤＴＡなどの金属キレート基を介してタンパク質に結合した蛍光発光金属、例えば１５２Ｅｕまたは他のランタニド系；化学発光化合物、例えば、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウム塩など；生物発光化合物、例えば、ルシフェリン；蛍光タンパク質などを含有し得る。間接標識としては、対象タンパク質に特異的な抗体が含まれ、抗体は二次抗体および特異的結合対のメンバー、例えば、ビオチン－アビジンなどを介して検出され得る。
【0102】
上記の薬剤はいずれも、リンカーを介して抗体または融合タンパク質にコンジュゲートされ得る。存在する場合、リンカー分子は、抗体または融合タンパク質および連結薬剤（ｌｉｎｋｅｄ ａｇｅｎｔ）が抗体または融合タンパク質と連結薬剤との間でのいくらかの柔軟な動きを可能にするのに十分な長さであり得る。リンカー分子は、例えば、約６～５０原子の長さであり得る。リンカー分子はまた、例えば、アリルアセチレン、２～１０個の単量体単位を含むエチレングリコールオリゴマー、ジアミン、二酸、アミノ酸、またはそれらの組み合わせであり得る。
【0103】
リンカーがペプチドである場合、リンカーは、１アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）～２０アミノ酸以上、２アミノ酸～１５アミノ酸、３アミノ酸～１２アミノ酸（４アミノ酸～１０アミノ酸、５アミノ酸～９アミノ酸、６アミノ酸～８アミノ酸、または７アミノ酸～８アミノ酸を含む）などの任意の好適な長さのものであることができ、長さが１、２、３、４、５、６、または７アミノ酸であり得る。
【0104】
柔軟なリンカーには、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン－セリンポリマー、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、および当該技術分野で知られている他の柔軟なリンカーが含まれる。グリシンおよびグリシン－セリンポリマーは、比較的構造化されていないアミノ酸が目的のものである場合に使用され得、成分間の中性テザーとして機能し得る。当業者は、上記の任意の薬剤にコンジュゲートされた抗体または融合タンパク質の設計が全体的または部分的に柔軟なリンカーを含み得、それにより、リンカーが柔軟なリンカーおよび柔軟性の低い構造を付与する１つ以上の部分を含み得ることを認識するであろう。
【0105】
いくつかの実施形態によれば、抗体または融合タンパク質は、切断不可能なリンカーを介して薬剤にコンジュゲートされる。目的の切断不可能なリンカーとしては、限定されないが、チオエーテルリンカーが挙げられる。用いられ得るチオエーテルリンカーの例としては、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）リンカーが含まれる。
【0106】
特定の実施形態では、抗体は、切断可能なリンカーを介して薬剤にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態によれば、リンカーは、中性ｐＨ（血流ｐＨ７．３～７．５）で安定であるが、標的細胞（例えば、がん細胞）の弱酸性エンドソーム（ｐＨ５．０～６．５）およびリソソーム（ｐＨ４．５～５．０）への内部移行時に加水分解を受ける酸切断可能なリンカーなどの、化学的に不安定なリンカーである。化学的に不安定なリンカーとしては、ヒドラゾン系リンカー、オキシム系リンカー、カーボネート系リンカー、エステル系リンカーなどが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、リンカーは、血流中で安定であるが、例えば、標的細胞（例えば、がん細胞）のリソソーム中のリソソームプロテアーゼ（カテプシンまたはプラスミンなど）によって標的細胞への内部移行時に酵素的切断を受ける、酵素不安定性リンカーなどの酵素不安定性リンカーである。酵素不安定性リンカーとしては、ペプチド結合を含むリンカー、例えば、ジペプチドベースのリンカー、例えばバリン－シトルリン（ＶＣ）リンカー、例えばマレイミドカプロイル－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジル（ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ）リンカー、バリル－アラニル－パラ－アミノベンジルオキシ（Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ）リンカーなどが挙げられるが、これらに限定されない。化学的に不安定なリンカー、酵素不安定性リンカーおよび切断不可能なリンカーは既知であり、例えば、Ｄｕｃｒｙ ＆ Ｓｔｕｍｐ（２０１０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２１：５－１３；Ｎｏｌｔｉｎｇ，Ｂ．２０１３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１０４５：７１－１００；Ｔｓｕｃｈｉｋａｍａ ａｎｄ Ａｎ（２０１８）Ｐｒｏｔｅｉｎ＆Ｃｅｌｌ ９（１）：３３－４６などに詳細に記載されている。
【0107】
薬剤を抗体もしくは融合タンパク質に直接、またはリンカーを介して間接的に連結させるための多くの戦略が利用可能である。例えば、薬剤は、リンカーを薬剤に共有結合させることによって誘導体化され得、リンカーは、抗体または融合タンパク質上の「化学的ハンドル」と反応することができる官能基を有する。リンカー上の官能基は、様々であり得、抗体または融合タンパク質上の化学的ハンドルとの適合性に基づいて選択され得る。一実施形態によれば、抗体または融合タンパク質上の化学的ハンドルは、化学的ハンドルを有する非天然アミノ酸を抗体または融合タンパク質に組み込むことによって提供される。本開示のコンジュゲートを調製するための使用が見出される非天然アミノ酸としては、アジド、アルキン、アルケン、アミノオキシ、ヒドラジン、アルデヒド（例えば、ホルミルグリシン、例えば、Ｃａｔａｌｅｎｔ Ｐｈａｒｍａ ＳｏｌｕｔｉｏｎｓのＳＭＡＲＴａｇ（商標）技術）、ニトロン、ニトリルオキシド、シクロプロペン、ノルボルネン、イソシアニド、ハロゲン化アリール、およびボロン酸官能基から選択される官能基を有するものが挙げられる。本開示のコンジュゲートの抗体に組み込まれ得る非天然アミノ酸（その非天然アミノ酸は、目的の官能基を提供するために選択され得る）は、既知であり、例えば、Ｍａｚａ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２６（９）：１８８４－９；Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９：５９２－６０５；Ａｄｕｍｅａｕ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ Ｂｉｏｌ．（２）：１５３－６５などに記載されている。そのような非天然アミノ酸は、例えば、化学合成または組換え手法を介して、例えば、宿主細胞における抗体または融合タンパク質の翻訳中に非天然アミノ酸を組み込むために好適な直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を使用して、抗体または融合タンパク質に組み込むことができる。
【0108】
抗体または融合タンパク質中に存在する非天然アミノ酸の官能基は、アジド、アルキン、アルケン、アミノオキシ、ヒドラジン、アルデヒド、アスアルデヒド（ａｓａｌｄｅｈｙｄｅ）、ニトロン、ニトリルオキシド、シクロプロペン、ノルボルネン、イソシアニド、ハロゲン化アリール、ボロン酸、ジアゾ、テトラジン、テトラゾール、クアドロシクラン（ｑｕａｄｒｏｃｙｃｌａｎｅ）、ヨードベンゼン、または他の好適な官能基あってもよく、リンカー上の官能基は、非天然アミノ酸の官能基と反応するように選択される（逆もまた同様である）。ほんの一例として、アジドを有する非天然アミノ酸（例えば、５－アジド－Ｌ－ノルバリンなど）を抗体または融合タンパク質に組み込んでもよく、リンカー－薬剤部分のリンカー部分は、抗体または融合タンパク質とリンカー－薬剤部分とがアジド－アルキン環状付加により共有コンジュゲートされるように、アルキン官能基を含み得る。コンジュゲーションは、例えば、銅触媒によるアジド－アルキン付加環化反応を使用して実施されてもよい。
【0109】
特定の実施形態では、抗体または融合タンパク質上の化学的ハンドルは、非天然アミノ酸を含まない。非天然アミノ酸を含有しない抗体は、反応性脱離基または他の求電子性基を有する部分との置換反応における求核試薬として、例えば、抗体または融合タンパク質の求核性官能基（例えば、Ｎ末端アミンもしくはリジンの一級アミン、または任意の他の求核性アミノ酸残基）を利用することによって、薬剤にコンジュゲートされ得る。例としては、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルを有する薬剤－リンカー部分を調製し、高ｐＨ（約１０）の水性条件下またはＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンなどの非求核性塩基が追加されたＤＭＳＯなどの極性有機溶媒中で、薬剤－リンカー部分を抗体または融合タンパク質と反応させることである。
【0110】
リンカー、薬剤および／または抗体もしくは融合タンパク質を互いに結合するための特定のアプローチは、特定のリンカー、薬剤および／または抗体もしくは融合タンパク質、ならびに様々な成分を互いにコンジュゲートするために選択および用いられる官能基に応じて変化し得ることが理解されよう。
【0111】
抗体を産生する方法
本明細書で提供される情報を使用して、本開示の抗ＶＶ Ａ５６および抗ＶＶ Ｂ５抗体ならびに融合タンパク質は、当業者に周知の標準的な技術を使用して調製され得る。例えば、本開示の抗体または融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列を使用して、抗体または融合タンパク質を発現させることができる。本明細書で提供されるポリペプチド配列（例えば、表１、３、５～１１を参照のこと）を使用して、抗体または融合タンパク質をコードする適切な核酸配列を決定することができ、次いで、該核酸配列を使用して、ＶＶ Ａ５６またはＶＶ Ｂ５に特異的な１つ以上の抗体または融合タンパク質を発現することができる。核酸配列は、当業者に周知の標準的な方法に従って、様々な発現系の特定のコドン「選好」を反映するように最適化することができる。提供された配列情報を使用して、当業者に知られているいくつかの標準的な方法に従って核酸を合成し得る。
本明細書で提供される情報を使用して、本開示の抗ＶＶ Ａ５６および抗ＶＶ Ｂ５抗体ならびに融合タンパク質は、当業者に周知の標準的な技術を使用して調製され得る。例えば、本開示の抗体または融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列を使用して、抗体または融合タンパク質を発現させることができる。本明細書で提供されるポリペプチド配列（例えば、表１、３、５～１１を参照のこと）を使用して、抗体または融合タンパク質をコードする適切な核酸配列を決定することができ、次いで、該核酸配列を使用して、ＶＶ Ａ５６またはＶＶ Ｂ５に特異的な１つ以上の抗体または融合タンパク質を発現することができる。核酸配列は、当業者に周知の標準的な方法に従って、様々な発現系の特定のコドン「選好」を反映するように最適化することができる。提供された配列情報を使用して、当業者に知られているいくつかの標準的な方法に従って核酸を合成し得る。
【0112】
対象の抗体をコードする核酸が合成されると、標準的な方法に従って該核酸を増幅および／またはクローニングすることができる。これらの目的を達成するための分子クローニング技術は、当該技術分野で知られている。組換え核酸の構築に好適である多種多様なクローニングおよびインビトロ増幅方法は、当業者に知られており、多数の教科書および実験室マニュアルの主題である。
【0113】
本開示の抗体および融合タンパク質をコードする天然または合成の核酸の発現は、抗体または融合タンパク質をコードする核酸をプロモーター（構成的または誘導性のいずれか）に作動可能に連結し、構築物を発現ベクターに組み込んで組換え発現ベクターを生成することによって達成することができる。ベクターは、原核生物、真核生物またはその両方での複製および組込みに好適であり得る。典型的なクローニングベクターは、抗体をコードする核酸の発現の調節に有用な、機能的に適切に配向された転写および翻訳ターミネーター、開始配列、およびプロモーターを含有する。ベクターは、少なくとも１つの独立した終結配列、例えばシャトルベクターに見られるような真核生物と原核生物の両方でカセットの複製を可能にする配列、および原核生物系と真核生物系の両方の選択マーカーを含有する、一般的な発現カセットを任意選択で含有する。
【0114】
クローニングされた核酸の高レベルの発現を得るためには、通常、転写を指示する強力なプロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写／翻訳ターミネーターを、各々互いに対しておよびタンパク質をコードする配列に対して機能的に配向して含有する発現プラスミドを構築するのが一般的である。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるこの目的に好適な調節領域の例としては、Ｅ．ｃｏｌｉトリプトファン生合成経路のプロモーターおよびオペレーター領域、ファージラムダの左向きプロモーター（ＰＬ）、ならびにＬ－アラビノース（ａｒａＢＡＤ）オペロンである。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて形質転換されるＤＮＡベクターに選択マーカーを含めることも有用である。このようなマーカーの例としては、アンピシリン、テトラサイクリンまたはクロラムフェニコールに対する耐性を指定する遺伝子が含まれる。抗体を発現するための発現系は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａを使用して利用可能である。また、Ｅ．ｃｏｌｉ系を使用してもよい。
【0115】
抗体遺伝子はまた、抗体（例えば、ＩｇＧ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなど）のＣ末端またはＮ末端でのタグ（例えば、ＦＬＡＧ、ヘキサヒスチジンなど）の付加を可能にする発現ベクターにサブクローニングされ得る。哺乳類細胞において遺伝子をトランスフェクトおよび発現する方法は、当該技術分野で知られている。細胞に核酸を形質導入することは、例えば、核酸を含有する脂質微粒子を細胞とインキュベートすること、または核酸を含有するウイルスベクターをベクターの宿主範囲内の細胞とインキュベートすることを含み得る。組織（例えば、腫瘍）または血液試料からの細胞株および培養細胞を含む、本開示で使用される細胞の培養は、当該技術分野でよく知られている。
【0116】
対象の抗体をコードする核酸が単離およびクローニングされると、当業者に知られている種々の組換え操作された細胞において核酸を発現させることができる。そのような細胞の例としては、細菌、酵母、糸状菌、昆虫（例えば、バキュロウイルスベクターを用いるもの）、および哺乳類細胞が含まれる。
【0117】
対象の抗体の単離および精製は、当該技術分野で知られている方法に従って達成することができる。例えば、タンパク質は、タンパク質を構成的におよび／または誘導時に発現するように遺伝子改変された細胞の溶解物から、または合成反応混合物から、免疫親和性精製（もしくはタンパク質ＬまたはＡを使用する沈殿）、非特異的に結合した材料を除去するための洗浄、ならびに特異的に結合した抗体の溶出によって単離することができる。単離された抗体は、タンパク質精製法で通常用いられる透析および他の方法によってさらに精製することができる。一実施形態では、抗体は、金属キレートクロマトグラフィー法を使用して単離されてもよい。本開示の抗体は、上で考察されたように、単離を容易にするための特定の改変を含み得る。
【0118】
抗体は、実質的に純粋な形態または単離された形態（例えば、他のポリペプチドを含まない）で調製されてもよい。タンパク質は、存在する可能性のある他の成分（例えば、他のポリペプチドまたは他の宿主細胞成分）と比較して、当該ポリペプチドが濃縮された組成物中に存在することができる。精製された抗体は、抗体が他の発現タンパク質を実質的に含まない組成物、例えば、組成物の９０％未満、通常は６０％未満、より通常は５０％未満が他の発現タンパク質で構成されるように提供され得る。
【0119】
原核細胞によって産生される抗体は、適切な折り畳みのためにカオトロピック剤への曝露を必要とする場合がある。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉからの精製中に、発現されたタンパク質を任意選択で変性させてから再生させることができる。これは、例えば、細菌によって産生された抗体をグアニジンＨＣｌなどのカオトロピック剤に可溶化させることによって達成することができる。次に、ゆっくりとした透析またはゲル濾過のいずれかによって、抗体が再生される。代替的に、抗体をコードする核酸は、抗体が正しく折り畳まれた形でペリプラズム内に分泌されるように、ｐｅｌＢなどの分泌シグナル配列に作動可能に連結され得る。
【0120】
本開示はまた、本開示の抗体を産生する細胞を提供し、好適な細胞は、真核細胞、例えば、哺乳類細胞を含む。細胞は、インビトロで抗体（例えば、ＩｇＧなどのモノクローナル抗体）を複製することができるハイブリッド細胞または「ハイブリドーマ」であり得る。例えば、本開示は、本開示の抗体の重鎖および／または軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で遺伝子改変された組換え宿主細胞（本明細書では「遺伝子改変宿主細胞」とも称される）を提供する。
【0121】
ハイブリドーマの生成をバイパスする、抗体分子の抗原結合領域の組換えＤＮＡバージョンを作製するための技術もまた、本明細書において企図される。ＤＮＡは、細菌（バクテリオファージなど）、酵母（例えば、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓまたはＰｉｃｈｉａ）、昆虫または哺乳類の発現系などにクローニングされる。好適な技術の一例は、発現された抗体（例えば、ＦａｂもしくはｓｃＦｖ）をペリプラズム空間（細菌細胞膜と細胞壁との間）に移動させるか、または分泌させるリーダー配列を有するバクテリオファージラムダベクター系を使用する。目的の抗原と結合するものについて、多数の機能的断片（例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖ）を迅速に生成することができる。
【0122】
ＶＶ Ａ５６およびＶＶ Ｂ５に特異的に結合する抗体は、ハイブリドーマ、組換え、ファージディスプレイ技術、選択リンパ球抗体法（ＳＬＡＭ）（１）、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当該技術分野で知られている多種多様な技術を使用して調製することができる。例えば、抗体は、ファージディスプレイの方法を使用して作製および単離され得る。ファージディスプレイは、タンパク質相互作用のハイスループットスクリーニングに使用される。ファージは、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現される抗原結合ドメインを提示するために利用され得る。ＶＶ Ａ５６またはＶＶ Ｂ５と結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、ＶＶ Ａ５６またはＶＶ Ｂ５を用いて、例えば、固体表面またはビーズに結合または捕捉された標識ＶＶ Ａ５６またはＶＶ Ｂ５を使用して選択または同定することができる。これらの方法で使用されるファージは、典型的には、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換え融合されたＦａｂ、Ｆｖ（軽鎖または重鎖からの個別のＦｖ領域）またはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを伴いファージから発現されるｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む繊維状ファージである。大規模なファージライブラリーを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染およびインビボ組換えと同様に、鎖シャッフリングによる高親和性ヒト抗体の産生が知られている。別の実施形態では、リボソームディスプレイが、ディスプレイプラットフォームとしてバクテリオファージを置き換えるために使用することができる。細胞表面ライブラリーが抗体についてスクリーニングされ得る。そのような手順は、モノクローナル抗体の単離およびその後のクローニングのための従来のハイブリドーマ技法の代替物を提供する。
【0123】
ファージ選択後、ファージ由来の抗体コード領域を単離し、ヒト抗体または任意の所望の抗原結合断片を含む完全抗体を生成するように使用され得、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む任意の所望の宿主内で発現され得る。例えば、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦａｂ’断片を組換え産生する技法は、当該技術分野で知られる方法を使用して用いることができる。
【0124】
核酸、発現ベクターおよび細胞
本開示の抗体および融合タンパク質を産生する方法に関する上記のセクションを考慮して、本開示はまた、核酸、発現ベクターおよび細胞を提供することが理解されるであろう。
本開示の抗体および融合タンパク質を産生する方法に関する上記のセクションを考慮して、本開示はまた、核酸、発現ベクターおよび細胞を提供することが理解されるであろう。
【0125】
特定の実施形態では、提供されるのは、本開示の抗ＶＶ Ａ５６および抗ＶＶ Ｂ５抗体のうちのいずれか、例えば、上記のような抗体のうちのいずれかを含め、本開示の抗体または融合タンパク質の可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド、またはその両方をコードする核酸である。いくつかの実施形態によれば、抗体は単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）であり、核酸は単鎖抗体をコードする。
【0126】
いくつかの実施形態によれば、抗ＶＶ Ａ５６抗体であるＡ０４７／Ａ０５７、Ａ０４９／Ａ０５９／Ａ０５６、Ａ０５０またはＡ０５４の可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド、またはその両方をコードする核酸が提供される。そのようなヌクレオチド配列の例は、以下の表１２に示されている。フレームワーク領域とＣＤＲをコードする配列は、それぞれ大文字と小文字で示されている。
【表12-1】
【表12-2】
【0127】
いくつかの実施形態によれば、抗ＶＶ Ｂ５の抗体であるＡ０４８／Ａ０５８／Ａ０７３またはＡ０５１の可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド、またはその両方をコードする核酸が提供される。そのようなヌクレオチド配列の例は、以下の表１３に示されている。フレームワーク領域とＣＤＲをコードする配列は、それぞれ大文字と小文字で示されている。
【表13】
【0128】
いくつかの実施形態によれば、提供されるのは、本開示のＣＡＲ、例えば、本開示の抗ＶＶ Ａ５６または抗ＶＶ Ｂ５抗体のＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドを含む単鎖抗体と、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むＣＡＲをコードする、核酸である。そのような単鎖抗体、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインの例は、上記で詳細に説明されている。
【0129】
本明細書に記載のＡ５６－ＣＡＲ－０１をコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号１５５に記載されている。本明細書に記載のＡ５６－ＣＡＲ－０２をコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号１５６に記載されている。本明細書に記載のＡ５６－ＣＡＲ－０５をコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号１５７に記載されている。本明細書に記載のＡ５６－ＣＡＲ－０６をコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号１５８に記載されている。本明細書に記載のＡ５６－ＣＡＲ－０７をコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号１５９に記載されている。本明細書に記載のＡ５６－ＣＡＲ－０８をコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号１６０に記載されている。本明細書に記載のＡ５６－ＣＡＲ－０１０をコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号１６１に記載されている。本明細書に記載のＡ５６－ＣＡＲ－０２０をコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号１６２に記載されている。本明細書に記載のＡ５６－ＣＡＲ－０２１をコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号１６３に記載されている。本明細書に記載のＡ５６－ＣＡＲ－０２７をコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号１６４に記載されている。本明細書に記載のＡ５６－ＣＡＲ－０２８をコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号１６５に記載されている。本明細書に記載のＡ５６－ＣＡＲ－０２９をコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号１６６に記載されている。本明細書に記載のＡ５６－ＣＡＲ－０３０をコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号１６７に記載されている。本明細書に記載のＢ５－ＣＡＲ－０３をコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号１６８に記載されている。本明細書に記載のＢ５－ＣＡＲ－０４をコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号１６９に記載されている。本明細書に記載のＢ５－ＣＡＲ－０１１をコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号１７０に記載されている。本明細書に記載のＢ５－ＣＡＲ－０１３をコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号１７１に記載されている。本明細書に記載のＢ５－ＣＡＲ－０１４をコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号１７２に記載されている。本明細書に記載のＢ５－ＣＡＲ－０１６をコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号１７３に記載されている。本明細書に記載のＢ５－ＣＡＲ－０１９をコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号１７４に記載されている。本明細書に記載のＢ５－ＣＡＲ－０２２をコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号１７５に記載されている。表１１に示されるマウスＣＡＲをコードするヌクレオチド配列の例は、配列番号１７６～１７９に記載されている。
【0130】
本開示の核酸のうちのいずれかを含む発現ベクターも提供される。本開示の抗体および融合タンパク質をコードする天然または合成の核酸の発現は、該抗体または融合タンパク質をコードする核酸をプロモーター（構成的または誘導性のいずれか）に作動可能に連結し、構築物を発現ベクターに組み込んで組換え発現ベクターを生成することによって達成することができる。ベクターは、原核生物、真核生物またはその両方での複製および組込みに好適であり得る。典型的なクローニングベクターは、抗体をコードする核酸の発現の調節に有用な、機能的に適切に配向された転写および翻訳ターミネーター、開始配列、およびプロモーターを含有する。ベクターは、少なくとも１つの独立した終結配列、例えばシャトルベクターに見られるような真核生物と原核生物の両方でカセットの複製を可能にする配列、および原核生物系と真核生物系の両方の選択マーカーを含有する、一般的な発現カセットを任意選択で含有する。
【0131】
本開示の核酸および／または発現ベクターのうちのいずれかを含む細胞も提供される。いくつかの実施形態によれば、本開示の細胞は、抗体のＶＨポリペプチドおよび抗体のＶＬポリペプチドをコードする核酸を含む。特定のそのような実施形態では、抗体は単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）であり、核酸は単鎖抗体をコードする。いくつかの実施形態によれば、提供されるのは、本開示の抗体の可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチドをコードする第１の核酸、と抗体の可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチドをコードする第２の核酸と、を含む細胞である。特定の実施形態では、例えば細胞は、第１の核酸を含む第１の発現ベクターと、第２の核酸を含む第２の発現ベクターと、を含む。
【0132】
本開示の抗体または融合タンパク質を作製する方法であって、細胞が抗体または融合タンパク質を発現するために好適な条件下で本開示の細胞を培養することを含み、そこで抗体または融合タンパク質が産生される、方法も提供される。抗体または融合タンパク質が発現されるように細胞を培養するための条件は、変化し得る。そのような条件は、好適な容器（例えば、細胞培養プレートまたはそのウェル）内で、好適な培地（例えば、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、ＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２などの細胞培養培地）中で、好適な温度（例えば、３２℃～４２℃（３７℃など））およびｐＨ（例えば、ｐＨ７．０～７．７（ｐＨ７．４など））で、好適なＣＯ２のパーセンテージ、例えば、３％～１０％（５％など））を有する環境において、細胞を培養することを含み得る。
【0133】
腫瘍溶解性ウイルス抗原に結合するキメラ抗原受容体
上記の融合タンパク質のセクションに記載されている本開示のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に加えて、本開示の態様は、抗腫瘍溶解性ウイルス抗原ＣＡＲをさらに含む。特定の実施形態では、そのようなＣＡＲは、腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む。このようなＣＡＲには種々の用途が見出される。例えば、本開示の利点により、そのようなＣＡＲには、抗ＯＶ抗原ＣＡＲを含む医薬組成物をがんを有する個体に投与することを含む方法における使用が見出され、個体中のがん細胞がＯＶに感染しその表面上にＯＶ抗原を発現させることにより、ＣＡＲをがん細胞に標的指向化して個体のがんを治療することが理解されよう。
上記の融合タンパク質のセクションに記載されている本開示のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に加えて、本開示の態様は、抗腫瘍溶解性ウイルス抗原ＣＡＲをさらに含む。特定の実施形態では、そのようなＣＡＲは、腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む。このようなＣＡＲには種々の用途が見出される。例えば、本開示の利点により、そのようなＣＡＲには、抗ＯＶ抗原ＣＡＲを含む医薬組成物をがんを有する個体に投与することを含む方法における使用が見出され、個体中のがん細胞がＯＶに感染しその表面上にＯＶ抗原を発現させることにより、ＣＡＲをがん細胞に標的指向化して個体のがんを治療することが理解されよう。
【0134】
本明細書で使用される場合、「腫瘍溶解性ウイルス抗原」または「ＯＶ抗原」は、腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）のゲノムによってコードされる抗原である。いくつかの実施形態では、ＯＶ抗原は、ネイティブＯＶ抗原であり、「ネイティブ」とは、抗原がＯＶの野生型ゲノムによってコードされるタンパク質であることを意味する。
【0135】
いくつかの実施形態では、ＯＶ抗原は、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ科、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ科、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科、またはＣｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスの野生型ゲノムによってコードされる抗原である。そのようなＯＶ抗原は、ＯＶに対してネイティブまたは異種であり得る。
【0136】
特定の実施形態では、ＯＶ抗原は、以下の表１４に記載されるファミリーからのウイルスの野生型ゲノムによってコードされる抗原であり、表１４は、そのようなファミリー内のウイルス種／株の非限定的な例、ならびにそのような抗原の非限定的な例をさらに含む。
【表14】
【0137】
いくつかの実施形態によれば、ＯＶ抗原は、Ａｍｓａｃｔａ ｍｏｏｒｅｉエントモポックスウイルス、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｌｕｒｉｄｕｓエントモポックスウイルス、鶏痘ウイルス、Ｍｅｌｏｌｏｎｔｈａ ｍｅｌｏｌｏｎｔｈａエントモポックスウイルス、Ｍｏｌｌｕｓｃｕｍ ｃｏｎｔａｇｉｏｓｕｍウイルス、ミュールジカ痘ウイルス、粘液腫ウイルス、ナイルワニ痘ウイルス、オルフウイルス、ヒツジ痘ウイルス、ブタ痘ウイルス、ワクシニアウイルス、Ｙａｂａサル腫瘍ウイルス、ヨカポックス（Ｙｏｋａｐｏｘ）ウイルス、Ａｃｒｏｂａｓｉｓ ｚｅｌｌｅｒｉエントモポックスウイルス、Ａｄｏｘｏｐｈｙｅｓ ｈｏｎｍａｉエントモポックスウイルス、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉエントモポックスウイルス、Ａｎｏｍａｌａ ｃｕｐｒｅａエントモポックスウイルス、Ａｐｈｏｄｉｕｓ ｔａｓｍａｎｉａｅエントモポックスウイルス、Ａｒｐｈｉａ ｃｏｎｓｐｅｒｓａエントモポックスウイルス、ウシ丘疹性口炎ウイルス、ラクダ痘ウイルス、Ｃａｍｐｔｏｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓエントモポックスウイルス、カナリア痘ウイルス、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ａｔｔｅｎｕａｔｕｓエントモポックスウイルス、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｐｌｕｍｏｓｕｓエントモポックスウイルス、Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｂｉｅｎｎｉｓエントモポックスウイルス、Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｃｏｎｆｌｉｃｔａエントモポックスウイルス、Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｄｉｖｅｒｓｕｍａエントモポックスウイルス、Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａエントモポックスウイルス、Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｒｏｓａｃｅａｎａエントモポックスウイルス、Ｃｈｏｒｉｚａｇｒｏｔｉｓ ａｕｘｉｌｉａｒｉｓエントモポックスウイルス、牛痘ウイルス、Ｄｅｍｏｄｅｍａ ｂｏｎａｒｉｅｎｓｉｓエントモポックスウイルス、Ｄｅｒｍｏｌｅｐｉｄａ ａｌｂｏｈｉｒｔｕｍエントモポックスウイルス、Ｄｉａｃｈａｓｍｉｍｏｒｐｈａエントモポックスウイルス、エクトロメリアウイルス、Ｆｉｇｕｌｕｓ ｓｕｂｌａｅｖｉｓエントモポックスウイルス、Ｇｅｏｔｒｕｐｅｓ ｓｙｌｖａｔｉｃｕｓエントモポックスウイルス、ヤギ痘ウイルス、Ｇｏｅｌｄｉｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｈｏｌｏｐｒａｓｉｎｕｓエントモポックスウイルス、野ウサギ線維腫ウイルス、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ａｒｍｉｇｅｒａエントモポックスウイルス、ジュンコ痘（Ｊｕｎｃｏｐｏｘ）ウイルス、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ昆虫ポックスウイルス、Ｌｕｍｐｙ皮膚疾患ウイルス、Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｐｅｓエントモポックスウイルス、サル痘ウイルス、キュウカンチョウ痘（Ｍｙｎａｈｐｏｘ）ウイルス、Ｍｙｔｈｉｍｎａ ｓｅｐａｒａｔａエントモポックスウイルス、Ｏｅｄａｌｅｕｓ ｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｉｓエントモポックスウイルス、Ｏｐｅｒｏｐｈｔｅｒａ ｂｒｕｍａｔａエントモポックスウイルス、ニュージーランドアカシカＰａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓ、ハト痘ウイルス、偽牛痘ウイルス、Ｐｓｉｔｔａｃｉｎｅｐｏｘウイルス、Ｐｔｅｒｏｐｏｘウイルス、ウズラ痘（Ｑｕａｉｌｐｏｘ）ウイルス、ウサギ線維腫ウイルス、アライグマ痘ウイルス、Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ ｇｒｅｇａｒｉａエントモポックスウイルス、スカンク痘ウイルス、スズメ痘ウイルス、リス線維腫ウイルス、リス痘ウイルス、ムクドリ痘ウイルス、タナ痘ウイルス、オオハダシアレチネズミ痘（Ｔａｔｅｒａｐｏｘ）ウイルス、シチメンチョウ痘ウイルス、痘そうウイルス、およびハタネズミ痘ウイルスから選択されるＰｏｘｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスの野生型ゲノムによりコードされる抗原である。そのようなＯＶ抗原は、ＯＶに対してネイティブまたは異種であり得る。
【0138】
特定の実施形態では、ＯＶ抗原は、トリアルファヘルペスウイルス１型、オウムアルファヘルペスウイルス１型、トリアルファヘルペスウイルス２型、ガン・カモ類アルファヘルペスウイルス１型、ハトアルファヘルペスウイルス１型、トリアルファヘルペスウイルス３型、シチメンチョウアルファヘルペスウイルス１型、ウミガメアルファヘルペスウイルス５型、ヒトアルファヘルペスウイルス１型、クモザルアルファヘルペスウイルス１型、ウシアルファヘルペスウイルス２型、オナガザルアルファヘルペスウイルス２型、ヒトアルファヘルペスウイルス２型、ウサギアルファヘルペスウイルス４型、マカシン（Ｍａｃａｃｉｎｅ）アルファヘルペスウイルス１型、カンガルー（Ｍａｃｒｏｐｏｄｉｄ）アルファヘルペスウイルス１型、カンガルーアルファヘルペスウイルス２型、Ｐａｎｉｎｅアルファヘルペスウイルス３型、ヒヒアルファヘルペスウイルス２型、リスザルアルファヘルペスウイルス１型、ヒトベータヘルペスウイルス５型、ヨザルベータヘルペスウイルス１型、オマキザルベータヘルペスウイルス１型、アフリカミドリザルベータヘルペスウイルス５型、マカシンベータヘルペスウイルス３型、パニン（Ｐａｎｉｎｅ）ベータヘルペスウイルス２型、ヒヒベータヘルペスウイルス３型、リスザルベータヘルペスウイルス４型、ネズミベータヘルペスウイルス１型、ネズミベータヘルペスウイルス２型、ネズミベータヘルペスウイルス８型、ヒトベータヘルペスウイルス６Ａ型、ヒトベータヘルペスウイルス６Ｂ型、ヒトベータヘルペスウイルス７型、ゾウベータヘルペスウイルス１型、ヒトガンマヘルペスウイルス４型、マーモセットガンマヘルペスウイルス３型、オナガザルガンマヘルペスウイルス１４型、ゴリラガンマヘルペスウイルス１型、マカシンガンマヘルペスウイルス４型、パニンガンマヘルペスウイルス１型、ヒヒガンマヘルペスウイルス１型、オランウータンガンマヘルペスウイルス２型、リスザルガンマヘルペスウイルス２型、クモザルガンマヘルペスウイルス２型、クモザルガンマヘルペスウイルス３型、ウシガンマヘルペスウイルス４型、キヌゲネズミガンマヘルペスウイルス２型、ヒトガンマヘルペスウイルス８型、マカシンガンマヘルペスウイルス５型、ネズミガンマヘルペスウイルス４型、ネズミガンマヘルペスウイルス７型、ハーテビーストガンマヘルペスウイルス１型、ハーテビーストガンマヘルペスウイルス２型、ウシガンマヘルペスウイルス６型、ヤギガンマヘルペスウイルス２型、ブルーバックガンマヘルペスウイルス１型、ヒツジガンマヘルペスウイルス２型、ブタガンマヘルペスウイルス３型、ブタガンマヘルペスウイルス４型、ブタガンマヘルペスウイルス５型、ウマガンマヘルペスウイルス２型、ウマガンマヘルペスウイルス５型、およびイタチガンマヘルペスウイルス１型から選択されるＨｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスの野生型ゲノムによってコードされる抗原である。そのようなＯＶ抗原は、ＯＶに対してネイティブまたは異種であり得る。
【0139】
いくつかの実施形態によれば、ＯＶ抗原は、ニワトリアビアデノウイルスＡ、カエルシアデノウイルスＡ、ヒトマストアデノウイルスＣ、ヒツジアタデノウイルスＤ、チョウザメイクタデノウイルス（ｉｃｈｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）Ａ、コウモリマストアデノウイルスＡ、コウモリマストアデノウイルスＢ、コウモリマストアデノウイルスＣ、コウモリマストアデノウイルスＤ、コウモリマストアデノウイルスＥ、コウモリマストアデノウイルスＦ、コウモリマストアデノウイルスＧ、ウシアタデノウイルスＤ、ウシマストアデノウイルスＡ、ウシマストアデノウイルスＢ、ウシマストアデノウイルスＣ、イヌマストアデノウイルスＡ、シカアタデノウイルスＡ、シカマストアデノウイルスＢ、イルカマストアデノウイルスＡ、イルカマストアデノウイルスＢ、アヒルアタデノウイルスＡ、アヒルアビアデノウイルスＢ、ウママストアデノウイルスＡ、ウママストアデノウイルスＢ、ハヤブサアビアデノウイルスＡ、ニワトリアビアデノウイルスＢ、ニワトリアビアデノウイルスＣ、ニワトリアビアデノウイルスＤ、ニワトリアビアデノウイルスＥ、ガチョウアビアデノウイルスＡ、シジュウカラシアデノウイルスＡ、ヒトマストアデノウイルスＡ、ヒトマストアデノウイルスＢ、ヒトマストアデノウイルスＤ、ヒトマストアデノウイルスＥ、ヒトマストアデノウイルスＦ、ヒトマストアデノウイルスＧ、トカゲアタデノウイルスＡ、ネズミマストアデノウイルスＡ、ネズミマストアデノウイルスＢ、ネズミマストアデノウイルスＣ、ヒツジマストアデノウイルスＡ、ヒツジマストアデノウイルスＢ、ペンギンシアデノウイルスＡ、ハトアビアデノウイルスＡ、ハトアビアデノウイルスＢ、オマキザルマストアデノウイルスＡ、ブタマストアデノウイルスＡ、ブタマストアデノウイルスＢ、ブタマストアデノウイルスＣ、フクロネズミアタデノウイルスＡ、オウムアタデノウイルスＡ、オウムアビアデノウイルスＢ、猛禽類シアデノウイルスＡ、アシカマストアデノウイルスＡ、サルマストアデノウイルスＡ、サルマストアデノウイルスＢ、サルマストアデノウイルスＣ、サルマストアデノウイルスＤ、サルマストアデノウイルスＥ、サルマストアデノウイルスＦ、サルマストアデノウイルスＧ、サルマストアデノウイルスＨ、サルマストアデノウイルスＩ、トウゾクカモメシアデノウイルスＡ、スカンクマストアデノウイルスＡ、ヘビアタデノウイルスＡ、リスマストアデノウイルスＡ、ツパイマストアデノウイルスＡ、シチメンチョウアビアデノウイルスＢ、シチメンチョウアビアデノウイルスＣ、シチメンチョウアビアデノウイルスＤ、およびシチメンチョウシアデノウイルスＡから選択されるＡｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスの野生型ゲノムによってコードされる抗原である。そのようなＯＶ抗原は、ＯＶに対してネイティブまたは異種であり得る。
【0140】
特定の実施形態では、ＯＶ抗原は、トリアブラウイルス１、ヘンドラヘニパウイルス、麻疹モルビリウイルス、ムンプスルブラウイルス、ネズミレスピロウイルス、爬虫類フェルラウイルス、サケアクアパラミクソウイルス、アキモタ（Ａｃｈｉｍｏｔａ）ルブラウイルス１型、アキモタルブラウイルス２型、トリトリアブラウイルス１０型、トリトリアブラウイルス１１型、トリトリアブラウイルス１２型、トリトリアブラウイルス１３型、トリトリアブラウイルス１４型、トリトリアブラウイルス１５型、トリトリアブラウイルス１６型、トリトリアブラウイルス１７型、トリトリアブラウイルス１８型、トリトリアブラウイルス１９型、トリトリアブラウイルス２トリアブラウイルス３型、トリアブラウイルス４型、トリアブラウイルス５型、トリアブラウイルス６型、トリアブラウイルス７型、トリアブラウイルス８型、トリアブラウイルス９型、コウモリムンプスルブラウイルス、ウシレスピロウイルス３型、イヌモルビリウイルス、シダーヘニパウイルス、セタセアンモルビリウイルス、ネコモルビリウイルス、ガーナコウモリ（Ｇｈａｎａｉａｎ ｂａｔ）ヘニパウイルス、ヒトレスピロウイルス１型、ヒトレスピロウイルス３型、ヒトルブラウイルス２型、ヒトルブラウイルス４型、哺乳類ルブラウイルス５型、マプエラ（Ｍａｐｕｅｒａ）ルブラウイルス、メナングル（Ｍｅｎａｎｇｌｅ）ルブラウイルス、モジャン（Ｍｏｊｉａｎｇ）ヘニパウイルス、ニパ（Ｎｉｐａｈ）ヘニパウイルス、アザラシモルビリウイルス、ブタレスピロウイルス１型、ブタルブラウイルス、牛疫ウイルス（Ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）、サルルブラウイルス、小型反芻動物（Ｓｍａｌｌ ｒｕｍｉｎａｎｔ）モルビリウイルス、スソガ（Ｓｏｓｕｇａ）ルブラウイルス、テビオト（Ｔｅｖｉｏｔ）ルブラウイルス、ティオマンルブラウイルス、ツホコ（Ｔｕｈｏｋｏ）ルブラウイルス１型、ツホコルブラウイルス２型、およびツホコルブラウイルス３型から選択されるＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスの野生型ゲノムによってコードされる抗原である。そのようなＯＶ抗原は、ＯＶに対してネイティブまたは異種であり得る。
【0141】
いくつかの実施形態によれば、ＯＶ抗原は、ウシ熱エフェメロウイルス、コイスプリビウイルス、クリオノポリスクリオウイルス（Ｃｕｒｉｏｎｏｐｏｌｉｓ ｃｕｒｉｏｖｉｒｕｓ）、ショウジョウバエメラノガスターシグマウイルス、ダーラムツパウイルス（Ｄｕｒｈａｍ ｔｕｐａｖｉｒｕｓ）、フランダースハパウイルス、インディアナベシクロウイルス、Ｌｅ Ｄａｎｔｅｃレダンテウイルス、レタスビッグベイン関連バリコサウイルス（ｖａｒｉｃｏｓａｖｉｒｕｓ）、レタス壊死性黄色（Ｌｅｔｔｕｃｅ ｎｅｃｒｏｔｉｃ ｙｅｌｌｏｗｓ）サイトラブドウイルス、Ｎｉａｋｈａスリプウイルス、ランえそ斑紋ウイルス、パーチペルハブドウイルス、ポテトイエロー萎縮ヌクレオラブドウイルス、プエルトアルメンドラスアルメンドラウイルス、狂犬病リッサウイルス、Ｐｕｅｒｔｏ Ａｌｍｅｎｄｒａｓアルメンドラウイルス、狂犬病ウイルス、サケ科魚ノビラブドウイルス、チブロガルガンチブロウイルス、アデレード川エフェメロウイルス、アラゴアスベシクロウイルス、アルファルファ萎縮サイトラブドウイルス、アルムピウォー（Ａｌｍｐｉｗａｒ）スリプウイルス、アメリカコウモリベシクロウイルス、ウナギペルハブドウイルス、アラバン（Ａｒａｖａｎ）リッサウイルス、Ａｒｂｏｒｅｔｕｍアルメンドラウイルス、オーストラリアコウモリッサウイルス、バルサ（Ｂａｌｓａ）アルメンドラウイルス、オオムギ黄色線条体（Ｂａｒｌｅｙ ｙｅｌｌｏｗ ｓｔｒｉａｔｅ ｍｏｓａｉｃ）モザイクサイトラブドウイルス、バルールレダンテウイルス、バス－コンゴ（Ｂａｓ－Ｃｏｎｇｏ）チブロウイルス、ベアトリスヒル（Ｂｅａｔｒｉｃｅ Ｈｉｌｌ）チブロウイルス、ベリマー（Ｂｅｒｒｉｍａｈ）エフェメロウイルス、ボケロー（Ｂｏｋｅｌｏｈ）コウモリリッサウイルス、ブロッコリー壊死性黄色サイトラブドウイルス、カラハス（Ｃａｒａｊａｓ）ベシクロウイルス、チャコ（Ｃｈａｃｏ）スリプウイルス、チャンディプラ（Ｃｈａｎｄｉｐｕｒａ）ベシクロウイルス、コースタルプレインズ（Ｃｏａｓｔａｌ Ｐｌａｉｎｓ）チブロウイルス、球菌（Ｃｏｃａｌ）ベシクロウイルス、コーヒーリングスポットジコルハウイルス（Ｃｏｆｆｅｅ ｒｉｎｇｓｐｏｔ ｄｉｃｈｏｒｈａｖｉｒｕｓ）、コロカシアボボン病関連サイトラブドシグマウイルス、クートベイアルメンドラウイルス（Ｃｏｏｔ Ｂａｙ ａｌｍｅｎｄｒａｖｉｒｕｓ）、Ｄａｔｕｒａ黄色葉脈ヌクレオラブドウイルス、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ａｆｆｉｎｉｓシグマウイルス、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ａｎａｎａｓｓａｅシグマウイルス、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｉｍｍｉｇｒａｎｓシグマウイルス、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｏｂｓｃｕｒａシグマウイルス、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｔｒｉｓｔｉｓシグマウイルス、ドゥベンヘイグ（Ｄｕｖｅｎｈａｇｅ）リッサウイルス、ナス斑紋萎縮（Ｅｇｇｐｌａｎｔ ｍｏｔｔｌｅｄ ｄｗａｒｆ）ヌクレオラブドウイルス、Ｅｋｐｏｍａ１チブロウイルス、Ｅｋｐｏｍａ２チブロウイルス、ヨーロッパコウモリ１リッサウイルス、ヨーロッパコウモリ２リッサウイルス、Ｆｅｓｔｕｃａ ｌｅａｆ ｓｔｒｅａｋサイトラブドウイルス、Ｆｉｋｉｒｉｎｉレダンテウイルス、Ｆｕｋｕｏｋａレダンテウイルス、ガンノルワ（Ｇａｎｎｏｒｕｗａ）コウモリリッサウイルス、グレイロッジ（Ｇｒａｙ Ｌｏｄｇｅ）ハパウイルス、ハートパーク（Ｈａｒｔ Ｐａｒｋ）ハパウイルス、ヒラメ（Ｈｉｒａｍｅ）ノビラブドウイルス、イコマ（Ｉｋｏｍａ）リッサウイルス、イリリ（Ｉｒｉｒｉ）クリオウイルス、イルカット（Ｉｒｋｕｔ）リッサウイルス、イスファハン（Ｉｓｆａｈａｎ）ベシクロウイルス、イタカイウナス（Ｉｔａｃａｉｕｎａｓ）クリオウイルス、ジョインジャカカ（Ｊｏｉｎｊａｋａｋａ）ハパウイルス、ジュルナ（Ｊｕｒｏｎａ）ベシクロウイルス、カメセ（Ｋａｍｅｓｅ）ハパウイルス、カニャワラ（Ｋａｎｙａｗａｒａ）レダンテウイルス、カーンキャニオン（Ｋｅｒｎ Ｃａｎｙｏｎ）レダンテウイルス、ケウラリバ（Ｋｅｕｒａｌｉｂａ）レダンテウイルス、クジャンド（Ｋｈｕｊａｎｄ）リッサウイルス、キンバリー（Ｋｉｍｂｅｒｌｅｙ）エフェメロウイルス、クラマス（Ｋｌａｍａｔｈ）ツパウイルス、コレンテ（Ｋｏｌｅｎｔｅ）レダンテウイルス、クールピニャ（Ｋｏｏｌｐｉｎｙａｈ）エフェメロウイルス、コトンカン（Ｋｏｔｏｎｋａｎ）エフェメロウイルス、クマシ（Ｋｕｍａｓｉ）レダンテウイルス、ラホヤ（Ｌａ Ｊｏｙａ）ハパウイルス、ラゴス（Ｌａｇｏｓ）コウモリリッサウイルス、ランジャ（Ｌａｎｄｊｉａ）ハパウイルス、レタス黄色斑紋Ｌｅｔｔｕｃｅ ｙｅｌｌｏｗ ｍｏｔｔｌｅサイトラブドウイルス、リェイダ（Ｌｌｅｉｄａ）コウモリリッサウイルス、トウモロコシイランモザイク（Ｍａｉｚｅ Ｉｒａｎｉａｎ ｍｏｓａｉｃ）ヌクレオラブドウイルス、トウモロコシ縞葉枯病（Ｍａｉｚｅ ｆｉｎｅ ｓｔｒｅａｋ）ヌクレオラブドウイルス、トウモロコシモザイクヌクレオラブドウイルス、マルペススプリング（Ｍａｌｐａｉｓ Ｓｐｒｉｎｇ）ベシクロウイルス、マニトバ（Ｍａｎｉｔｏｂａ）ハパウイルス、マラバ（Ｍａｒａｂａ）ベシクロウイルス、マルコ（Ｍａｒｃｏ）ハパウイルス、モコラ（Ｍｏｋｏｌａ）リッサウイルス、モレトン（Ｍｏｒｒｅｔｏｎ）ベシクロウイルス、モスケイロ（Ｍｏｓｑｕｅｉｒｏ）ハパウイルス、モッスリル（Ｍｏｓｓｕｒｉｌ）ハパウイルス、マウントエルゴンコウモリレダンテウイルス、モウサ（Ｍｏｕｓｓａ）ウイルス、Ｍｕｓｃｉｎａ ｓｔａｂｕｌａｎｓシグマウイルス、ニュージャージーベシクロウイルス、ヌガイガン（Ｎｇａｉｎｇａｎ）ハパウイルス、ニシムロ（Ｎｉｓｈｉｍｕｒｏ）レダンテウイルス、ヌコルビッソン（Ｎｋｏｌｂｉｓｓｏｎ）レダンテウイルス、ムギ北地モザイク病サイトラブドウイルス、オボジアン（Ｏｂｏｄｈｉａｎｇ）エフェメロウイルス、オイタ（Ｏｉｔａ）レダンテウイルス、オードリバー（Ｏｒｄ Ｒｉｖｅｒ）ハパウイルス、パリークリーク（Ｐａｒｒｙ Ｃｒｅｅｋ）ハパウイルス、ペリネット（Ｐｅｒｉｎｅｔ）ベシクロウイルス、パイクフライ（Ｐｉｋｅ ｆｒｙ）スプリビウイルス、ピリベシクロウイルス、ピスチン（Ｐｉｓｃｉｎｅ）ノビラブドウイルス、ラディ（Ｒａｄｉ）ベシクロウイルス、イネ黄葉ヌクレオラブドウイルス、リオチコ（Ｒｉｏ Ｃｈｉｃｏ）アルメンドラウイルス、ロシャンボー（Ｒｏｃｈａｍｂｅａｕ）クリオウイルス、シートラウト（Ｓｅａ ｔｒｏｕｔ）ペルハブドウイルス、セナ・マドゥレイラ（Ｓｅｎａ Ｍａｄｕｒｅｉｒａ）スリプウイルス、シモニ（Ｓｈｉｍｏｎｉ）コウモリリッサウイルス、スネークヘッドノビラブドウイルス、ソンクス（Ｓｏｎｃｈｕｓ）サイトラブドウイルス１、ソンクスイエローネットヌクレオラブドウイルス、ノゲシ黄色葉脈ヌクレオラブドウイルス、イチゴクリンクルサイトラブドウイルス、スイートウォーターブランチチブロウイルス、タロ葉脈白化（Ｔａｒｏ ｖｅｉｎ ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ）ヌクレオラブドウイルス、ツパイツパウイルス、西コーカサスコウモリリッサウイルス、小麦アメリカ線条体モザイクサイトラブドウイルス、ウォンガベル（Ｗｏｎｇａｂｅｌ）ハパウイルス、ウーハンレダンテウイルス、ヤタ（Ｙａｔａ）エフェメロウイルス、ヨンジア（Ｙｏｎｇｊｉａ）レダンテウイルスおよびヤグボグダノバク（Ｙｕｇ Ｂｏｇｄａｎｏｖａｃ）ベシクロウイルスから選択されるＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスの野生型ゲノムによってコードされる抗原である。そのようなＯＶ抗原は、ＯＶに対してネイティブまたは異種であり得る。
【0142】
特定の実施形態では、ＯＶ抗原は、Ａｅｄｅｓ ｐｓｅｕｄｏｓｃｕｔｅｌｌａｒｉｓレオウイルス、アクアレオウイルスＡ型、バンナ（Ｂａｎｎａ）ウイルス、ブルータング（Ｂｌｕｅｔｏｎｇｕｅ）ウイルス、コロラドダニ熱ウイルス、サイポウイルス１、Ｅｒｉｏｃｈｅｉｒ ｓｉｎｅｎｓｉｓレオウイルス、フィジー病ウイルス、イドノレオウイルス（Ｉｄｎｏｒｅｏｖｉｒｕｓ）１、哺乳類オルソレオウイルス、Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ ｐｕｓｉｌｌａレオウイルス、マイコレオウイルス１、イネラギッドスタントウイルス、ロタウイルスＡ、創傷腫瘍ウイルス、アフリカ馬疫ウイルス、アクアレオウイルスＢ、アクアレオウイルスＣ、アクアレオウイルスＤ、アクアレオウイルスＥ、アクアレオウイルスＦ、アクアレオウイルスＧ、トリオルソレオウイルス、ヒヒオルソレオウイルス、チャングイノラウイルス、チェヌダウイルス、チョバーゴルジウイルス、コリパルタウイルス、サイポウイルス１０、サイポウイルス１１、サイポウイルス１２、サイポウイルス１３、サイポウイルス１４、サイポウイルス１５、サイポウイルス１６、サイポウイルス２、サイポウイルス３、サイポウイルス４、サイポウイルス５、サイポウイルス６、サイポウイルス７、サイポウイルス８、サイポウイルス９、Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａラギッドスタントウイルス、流行性出血病ウイルス、ウマ脳症ウイルス、ユーベナンジーウイルス、ヤッチ（Ｅｙａｃｈ）ウイルス、ニンニク萎縮ウイルス、グレートアイランドウイルス、イドノレオウイルス２、イドノレオウイルス３、イドノレオウイルス４、イドノレオウイルス５、イエリウイルス、カディピロウイルス、レボンボウイルス、リアオニン（Ｌｉａｏ ｎｉｎｇ）ウイルス、マラピツィ（Ｍａｈｌａｐｉｔｓｉ）オルソレオウイルス、Ｍａｉｚｅ ｒｏｕｇｈ ｄｗａｒｆウイルス、リオクワルト病（Ｍａｌ ｄｅ Ｒｉｏ Ｃｕａｒｔｏ）ウイルス、マイコレオウイルス２、マイコレオウイルス３、ネルソンベイ（Ｎｅｌｓｏｎ Ｂａｙ）オルソレオウイルス、Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓレオウイルス、Ｏａｔ ｓｔｅｒｉｌｅ ｄｗａｒｆウイルス、オルンゴ（Ｏｒｕｎｇｏ）ウイルス、パリアム（Ｐａｌｙａｍ）ウイルス、パンゴラスタント（Ｐａｎｇｏｌａ ｓｔｕｎｔ）ウイルス、ペルー馬疫ウイルス、魚類オルソレオウイルス、爬虫類オルソレオウイルス、イネ黒条萎縮ウイルス、イネ萎縮ウイルス、Ｒｉｃｅ ｇａｌｌ ｄｗａｒｆウイルス、ロタウイルスＢ、ロタウイルスＣ、ロタウイルスＤ、ロタウイルスＥ、ロタウイルスＦ、ロタウイルスＧ、ロタウイルスＨ、ロタウイルスＩ、イネ南方黒条萎縮ウイルス、セント・クロア川ウイルス、ウマティラ（Ｕｍａｔｉｌｌａ）ウイルス、ワドメダニ（Ｗａｄ Ｍｅｄａｎｉ）ウイルス、ウォーラル（Ｗａｌｌａｌ）ウイルス、ヴァレゴ（Ｗａｒｒｅｇｏ）ウイルス、ウォンゴア（Ｗｏｎｇｏｒｒ）ウイルス、および雲南（Ｙｕｎｎａｎ）オルビウイルスから選択されるＲｅｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスの野生型ゲノムによってコードされる抗原である。そのようなＯＶ抗原は、ＯＶに対してネイティブまたは異種であり得る。
【0143】
いくつかの実施形態によれば、ＯＶ抗原は、アアリウイルスＡ、アイチウイルスＡ、アンピウイルスＡ、アクアマウイルスＡ、アビヘパトウイルスＡ、アビシウイルスＡ、ボピウイルスＡ、カディシウイルスＡ、カルジオウイルスＡ、コサウイルスＡ、クロヒウイルスＢ、エンテロウイルスＣ、エルボウイルスＡ、足口病ウイルス、ガリウイルスＡ、ハルカウイルスＡ、ヘパトウイルスＡ、フンニウイルスＡ、クンサギウイルスＡ、リムニピウイルスＡ、メグリウイルスＡ、ミシウイルスＡ、モサウイルスＡ、オリウイルスＡ、オシウイルスＡ、パレコウイルスＡ、パシウイルスＡ、パッセリウイルスＡ、ポタミピウイルスＡ、ラボウイルスＡ、ロサウイルスＡ、サコブウイルスＡ、サリウイルスＡ、サペロウイルスＡ、セネカウイルスＡ、シャンバウイルスＡ、シチニウイルスＡ、テシオウイルス（Ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ）Ａ、トーチウイルス（Ｔｏｒｃｈｉｖｉｒｕｓ）Ａ、トレモウイルスＡ、アイチウイルスＢ、アイチウイルスＣ、アイチウイルスＤ、アイチウイルスＥ、アイチウイルスＦ、トリサペロウイルス、アビシウイルスＢ、アビシウイルスＣ、ウシ鼻炎Ａウイルス、ウシ鼻炎Ｂウイルス、カルジオウイルスＢ、カルジオウイルスＣ、コサウイルスＢ、コサウイルスＤ、コサウイルスＥ、コサウイルスＦ、クロヒウイルスＡ、エンテロウイルスＡ、エンテロウイルスＢ、エンテロウイルスＤ、エンテロウイルスＥ、エンテロウイルスＦ、エンテロウイルスＧ、エンテロウイルスＨ、エンテロウイルスＩ、エンテロウイルスＪ、エンテロウイルスＫ、エンテロウイルスＬ、ウマ鼻炎Ａウイルス、ヘパトウイルスＢ、ヘパトウイルスＣ、ヘパトウイルスＤ、ヘパトウイルスＥ、ヘパトウイルスＦ、ヘパトウイルスＧ、ヘパトウイルスＨ、ヘパトウイルスＩ、クンサギウイルスＢ、クンサギウイルスＣ、リムニピウイルスＢ、リムニピウイルスＣ、メグリウイルスＢ、メグリウイルスＣ、メグリウイルスＤ、メグリウイルスＥ、ミシウイルスＢ、ミシウイルスＣ、パレコウイルスＢ、パレコウイルスＣ、パレコウイルスＤ、ライノウイルスＡ、ライノウイルスＢ、ライノウイルスＣ、およびサペロウイルスＢから選択されるＰｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスの野生型ゲノムによってコードされる抗原である。このようなＯＶ抗原は、ＯＶに対してネイティブまたは異種であり得る。
【0144】
特定の実施形態では、ＯＶ抗原は、アデノ関連ディペンドパルボウイルスＡ、肉食動物アムドパルボウイルス１型、十脚目（Ｄｅｃａｐｏｄ）ヘパンデンソウイルス１型、十脚目ペンスチルデンソウイルス１型、双翅類ブレビデンソウイルス１型、キジ目アベパルボウイルス１型、鱗翅目アンビデンソウイルス１型、鱗翅目イテラデンソウイルス１型、霊長類エリスロパルボウイルス１型、霊長類テトラパルボウイルス１型、齧歯類プロトパルボウイルス１型、有蹄類ボカパルボウイルス１型、有蹄類コピパルボウイルス１型、アデノ関連ディペンドウイルスＢ型、ガン・カモ目ディペンドウイルス１型、星状（Ａｓｔｅｒｏｉｄ）アンビデンソウイルス１型、トリディペンドパルボウイルス１型、ゴキブリ（Ｂｌａｔｔｏｄｅａｎ）アンビデンソウイルス１型、ゴキブリ（Ｂｌａｔｔｏｄｅａｎ）アンビデンソウイルス２型、肉食動物アムドパルボウイルス２型、肉食動物アムドパルボウイルス３型、肉食動物アムドパルボウイルス４型、肉食動物ボカパルボウイルス１型、肉食動物ボカパルボウイルス２型、肉食動物ボカパルボウイルス３型、肉食動物ボカパルボウイルス４型、肉食動物ボカパルボウイルス５型、肉食動物ボカパルボウイルス６型、肉食動物プロトパルボウイルス１型、翼手類ボカパルボウイルス１型、翼手類ボカパルボウイルス２型、翼手類ボカパルボウイルス３型、翼手類ボカパルボウイルス４型、翼手類ディペンドパルボウイルス１型、翼手類プロトパルボウイルス１型、翼手類テトラパルボウイルス１型、十脚目アムビデンソウイルス１型、十脚目アンビデンソウイルス１型、双翅類アンビデンソウイルス１型、双翅類ブレビデンソウイルス１型、真無盲腸目プロトパルボウイルス１型、半翅目アンビデンソウイルス１型、半翅目アンビデンソウイルス２型、半翅目アンビデンソウイルス３型、膜翅類アンビデンソウイルス１型、、直翅類デンソウイルスボカパルボウイルス１型、鰭脚類ボカパルボウイルス１型、鰭脚類ボカパルボウイルス２型、鰭脚類デンソパルボウイルス１型、霊長類ボカパルボウイルス１型、霊長類ボカパルボウイルス２型、霊長類エリスロパルボウイルス２型、霊長類エリスロパルボウイルス３型、霊長類エリスロパルボウイルス４型、霊長類プロトパルボウイルス１型、霊長類プロトパルボウイルス２型、霊長類プロトパルボウイルス３型、齧歯類エリスロパルボウイルス１型、齧歯類プロトパルボウイルス２型、齧歯類プロトパルボウイルス３型、鱗片（Ｓｑｕａｍａｔｅ）ディペンドパルボウイルス１型、有蹄類ボカパルボウイルス２型、有蹄類ボカパルボウイルス３型、有蹄類ボカパルボウイルス４型、有蹄類ボカパルボウイルス５型、有蹄類ボカパルボウイルス６型、有蹄類コピパルボウイルス２型、有蹄類エリスロパルボウイルス１型、有蹄類プロトパルボウイルス１型、有蹄類プロトパルボウイルス２型、有蹄類テトラパルボウイルス３型、および有蹄類テトラパルボウイルス４から選択されるＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスの野生型ゲノムによってコードされる抗原である。そのようなＯＶ抗原は、ＯＶに対してネイティブまたは異種であり得る。
【0145】
いくつかの実施形態によれば、ＯＶ抗原は、アルファコロナウイルス１型、トリコロナウイルス、ヒヨドリ（Ｂｕｌｂｕｌ）コロナウイルスＨＫＵ１１、ウマトロウイルス、マウスコロナウイルス、ホワイトブリーム（Ｗｈｉｔｅ ｂｒｅａｍ）ウイルス、ボールニシキヘビニドウイルス１型、コウモリコロナウイルスＣＤＰＨＥ１５、コウモリコロナウイルスＨＫＵ１０、イロイルカコロナウイルスＳＷ１、ベータコロナウイルス１型、ウシニドウイルス１型、ウシトロウイルス、キングサーモンニドウイルス１型、バン（Ｃｏｍｍｏｎ ｍｏｏｒｈｅｎ）コロナウイルスＨＫＵ２１、コロナウイルスＨＫＵ１５、ファットヘッドミノーニドウイルス１型、ヘッジホッグコロナウイルス１型、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１、ヒトコロナウイルスＮＬ６３、ヒトトロウイルス、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス、Ｍｉｎｉｏｐｔｅｒｕｓコウモリコロナウイルス１型、ＭｉｎｉｏｐｔｅｒｕｓコウモリコロナウイルスＨＫＵ８、ミンクコロナウイルス１型、ムニア（Ｍｕｎｉａ）コロナウイルスＨＫＵ１３型、ナイトヘロン（Ｎｉｇｈｔ ｈｅｒｏｎ）コロナウイルスＨＫＵ１９、ＰｉｐｉｓｔｒｅｌｌｕｓコウモリコロナウイルスＨＫＵ５、ブタ流行性下痢ウイルス、ブタトロウイルス、ＲｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓコウモリコロナウイルスＨＫＵ２、ＲｏｕｓｅｔｔｕｓコウモリコロナウイルスＨＫＵ９、ＳＡＲＳコロナウイルス２型、Ｓｃｏｔｏｐｈｉｌｕｓコウモリコロナウイルス５１２、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス、ツグミコロナウイルスＨＫＵ１２、ＴｙｌｏｎｙｃｔｅｒｉｓコウモリコロナウイルスＨＫＵ４、ホワイトアイ（Ｗｈｉｔｅ－ｅｙｅ）コロナウイルスＨＫＵ１６、ヒドリガモ（Ｗｉｇｅｏｎ）コロナウイルスＨＫＵ２０、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択されるＣｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスの野生型ゲノムによってコードされる抗原である。そのようなＯＶ抗原は、ＯＶに対してネイティブまたは異種であり得る。
【0146】
特定の実施形態では、ＯＶ抗原は、ワクシニアウイルス（例えば、抗原Ａ３３、Ａ３４、Ａ３６、Ａ５６、Ｂ５、Ｆ１２、Ｆ１３など、例えば、改変ＶＶ株、ＪＸ－５９４、ＧＬ－ＯＮＣ１、またはＷｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ、Ｗｙｅｔｈ、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｔｅｍｐｌｅ ｏｆ Ｈｅａｖｅｎ、Ｐａｔｗａｄａｎｇａｒ、および改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａなどから選択されたＶＶ株）、アデノウイルス、ＨＳＶ、レオウイルス、小胞性口内炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、セネカバレーウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、およびマラバウイルスのゲノムによってコードされる抗原である。そのようなＯＶ抗原は、ＯＶに対してネイティブまたは異種であり得る。
【0147】
特定の実施形態では、ＯＶ抗原は、ネイティブＯＶ抗原の改変されたバージョン（または誘導体）である。例えば、いくつかの実施形態によれば、ＯＶ抗原は、ネイティブ抗原の同じまたは実質的に類似のエピトープを含むが、所望の特性、例えば、ウイルスの感染力の改善などを与えるように改変／操作される。特定の実施形態では、例えば、既存の抗体（例えば、治療的使用が承認された抗体）が改変／操作されたＯＶ抗原に結合するがネイティブ抗原には結合しないように、ＯＶ抗原は、ネイティブ抗原と比較して異なるエピトープを有するように改変／操作される。
【0148】
いくつかの実施形態によれば、ＯＶのゲノムは、ＯＶの野生型ゲノムによってコードされない１つ以上のタンパク質をコードおよび発現するように改変され得、このようなタンパク質は、本明細書では、ＯＶ抗原に対して「異種」またはＯＶに「ネイティブではない」と称される場合がある。ＯＶのゲノムは、目的の異種ＯＶ抗原をコードおよび発現するように改変され得る。特定の実施形態では、異種ＯＶ抗原は、抗原を発現するＯＶに対して異種であるウイルス抗原（例えば、本明細書の他の場所に記載されるウイルスのうちのいずれかの野生型ゲノムによってコードされる抗原）である。いくつかの実施形態によれば、異種ＯＶ抗原は腫瘍抗原であり、その非限定的な例には、５Ｔ４、ＡＸＬ受容体チロシンキナーゼ（ＡＸＬ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ｃ－ＭＥＴ、Ｃ４．４ａ、炭酸アンヒドラーゼ６（ＣＡ６）、炭酸アンヒドラーゼ９（ＣＡ９）、カドヘリン－６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、がん胚性抗原（ＣＥＡ）、ｃＫｉｔ、Ｃｒｉｐｔｏタンパク質、ＣＳ１、デルタ様カノニカルノッチリガンド３（ＤＬＬ３）、エンドセリン受容体タイプＢ（ＥＤＮＲＢ）、エフリンＡ４（ＥＦＮＡ４）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ３（ＥＮＰＰ３）、ＥＰＨ受容体Ａ２（ＥＰＨＡ２）、線維芽細胞成長因子受容体２（ＦＧＦＲ２）、線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ３）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、糖タンパク質非転移性Ｂ（ＧＰＮＭＢ）、グアニル酸シクラーゼ２Ｃ（ＧＵＣＹ２Ｃ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒト上皮成長因子受容体３（ＨＥＲ３）、インテグリンアルファ、リソソーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ－１）、ルイスＹ、ＬＩＶ－１、ロイシンリッチリピート含有１５（ＬＲＲＣ１５）、メソセリン（ＭＳＬＮ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、ナトリウム依存性リン酸輸送タンパク質２Ｂ（ＮａＰｉ２ｂ）、ネクチン－４、ＮＭＢ、ＮＯＴＣＨ３、ｐ－カドヘリン（ｐ－ＣＡＤ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、タンパク質チロシンキナーゼ７（ＰＴＫ７）、溶質担体ファミリー４４メンバー４（ＳＬＣ４４Ａ４）、ＳＬＩＴ様ファミリーメンバー６（ＳＬＩＴＲＫ６）、ＳＴＥＡＰファミリーメンバー１（ＳＴＥＡＰ１）、組織因子（ＴＦ）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンタンパク質－１（ＴＩＭ－１）、および栄養芽細胞表面抗原（ＴＲＯＰ－２）が含まれる。
【0149】
ＯＶゲノムを改変してコードおよび発現させることができる腫瘍抗原に特異的に結合し、本開示の抗ＯＶ ＣＡＲまたは抗ＯＶコンジュゲートにおいて利用され得る抗原結合ドメインの非限定的な例としては、以下の抗体：アデカツムマブ（Ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）、アスクリンバクマブ（Ａｓｃｒｉｎｖａｃｕｍａｂ）、シクツムマブ（Ｃｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ）、コナツムマブ（Ｃｏｎａｔｕｍｕｍａｂ）、ダラツムマブ（Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ）、ドロジツマブ（Ｄｒｏｚｉｔｕｍａｂ）、デュリゴツマブ（Ｄｕｌｉｇｏｔｕｍａｂ）、デュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、デュシジツマブ（Ｄｕｓｉｇｉｔｕｍａｂ）、エンフォルツマブ（Ｅｎｆｏｒｔｕｍａｂ）、エノチクマブ（Ｅｎｏｔｉｃｕｍａｂ）、フィギツムマブ（Ｆｉｇｉｔｕｍｕｍａｂ）、ガニツマブ（Ｇａｎｉｔｕｍａｂ）、グレムバツムマブ（Ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ）、インテツムマブ（Ｉｎｔｅｔｕｍｕｍａｂ）、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、イラツムマブ（Ｉｒａｔｕｍｕｍａｂ）、イクルクマブ（Ｉｃｒｕｃｕｍａｂ）、レキサツムマブ（Ｌｅｘａｔｕｍｕｍａｂ）、ルカツムマブ（Ｌｕｃａｔｕｍｕｍａｂ）、マパツムマブ（Ｍａｐａｔｕｍｕｍａｂ）、ナルナツマブ（Ｎａｒｎａｔｕｍａｂ）、ネシツムマブ（Ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）、ネスバクマブ（Ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ）、オファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、オララツマブ（Ｏｌａｒａｔｕｍａｂ）、パニツムマブ（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、パトリツマブ（Ｐａｔｒｉｔｕｍａｂ）、プリツムマブ（Ｐｒｉｔｕｍｕｍａｂ）、ラドレツマブ（Ｒａｄｒｅｔｕｍａｂ）、ラムシルマブ（Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）、リロツムマブ（Ｒｉｌｏｔｕｍｕｍａｂ）、ロバツムマブ（Ｒｏｂａｔｕｍｕｍａｂ）、セリバンツマブ（Ｓｅｒｉｂａｎｔｕｍａｂ）、タレクスツマブ（Ｔａｒｅｘｔｕｍａｂ）、テプロツムマブ（Ｔｅｐｒｏｔｕｍｕｍａｂ）、トベツマブ（Ｔｏｖｅｔｕｍａｂ）、バンチクツマブ（Ｖａｎｔｉｃｔｕｍａｂ）、ベセンクマブ（Ｖｅｓｅｎｃｕｍａｂ）、ボツムマブ（Ｖｏｔｕｍｕｍａｂ）、ザルツムマブ（Ｚａｌｕｔｕｍｕｍａｂ）、フランボツマブ（Ｆｌａｎｖｏｔｕｍａｂ）、アルツモマブ（Ａｌｔｕｍｏｍａｂ）、アナツモマブ（Ａｎａｔｕｍｏｍａｂ）、アルシツモマブ（Ａｒｃｉｔｕｍｏｍａｂ）、ベクツモマブ（Ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）、デツモマブ（Ｄｅｔｕｍｏｍａｂ）、イブリツモマブ（Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ）、ミンレツモマブ（Ｍｉｎｒｅｔｕｍｏｍａｂ）、ミツモマブ（Ｍｉｔｕｍｏｍａｂ）、モキセツモマブ（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂ）、ナプツモマブ（Ｎａｐｔｕｍｏｍａｂ）、ノフェツモマブ（Ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂ）、ペムツモマブ（Ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）、ピンツモマブ（Ｐｉｎｔｕｍｏｍａｂ）、ラコツモマブ（Ｒａｃｏｔｕｍｏｍａｂ）、サツモマブ（Ｓａｔｕｍｏｍａｂ）、ソリトマブ（Ｓｏｌｉｔｏｍａｂ）、タプリツモマブ（Ｔａｐｌｉｔｕｍｏｍａｂ）、テナツモマブ（Ｔｅｎａｔｕｍｏｍａｂ）、トシツモマブ（Ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）、トレメリムマブ（Ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）、アバゴボマブ（Ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）、イゴボマブ（Ｉｇｏｖｏｍａｂ）、オレゴボマブ（Ｏｒｅｇｏｖｏｍａｂ）、カプロマブ（Ｃａｐｒｏｍａｂ）、エドレコロマブ（Ｅｄｒｅｃｏｌｏｍａｂ）、ナコロマブ（Ｎａｃｏｌｏｍａｂ）、アマツキシマブ（Ａｍａｔｕｘｉｍａｂ）、バビツキシマブ（Ｂａｖｉｔｕｘｉｍａｂ）、ブレンツキシマブ（Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、デルロツキシマブ（Ｄｅｒｌｏｔｕｘｉｍａｂ）、ジヌツキシマブ（Ｄｉｎｕｔｕｘｉｍａｂ）、エンシツキシマブ（Ｅｎｓｉｔｕｘｉｍａｂ）、フツキシマブ（Ｆｕｔｕｘｉｍａｂ）、ギレンツキシマブ（Ｇｉｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、インダツキシマブ（Ｉｎｄａｔｕｘｉｍａｂ）、イサツキシマブ（Ｉｓａｔｕｘｉｍａｂ）、マージツキシマブ（Ｍａｒｇｅｔｕｘｉｍａｂ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、シルツキシマブ（Ｓｉｌｔｕｘｉｍａｂ）、ウブリツキシマブ（Ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ）、エクロメキシマブ（Ｅｃｒｏｍｅｘｉｍａｂ）、アビツズマブ（Ａｂｉｔｕｚｕｍａｂ）、アレムツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、ビバツズマブ（Ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）、ブロンチクツズマブ（Ｂｒｏｎｔｉｃｔｕｚｕｍａｂ）、カンツズマブ（Ｃａｎｔｕｚｕｍａｂ）、カンツズマブ（Ｃａｎｔｕｚｕｍａｂ）、シタツズマブ（Ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ）、クリバツズマブ（Ｃｌｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）、ダセツズマブ（Ｄａｃｅｔｕｚｕｍａｂ）、デムシズマブ（Ｄｅｍｃｉｚｕｍａｂ）、ダロツズマブ（Ｄａｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、デニンツズマブ（Ｄｅｎｉｎｔｕｚｕｍａｂ）、エロツズマブ（Ｅｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、エマンクツズマブ（Ｅｍａｃｔｕｚｕｍａｂ）、エミベツズマブ（Ｅｍｉｂｅｔｕｚｕｍａｂ）、エノブリツズマブ（Ｅｎｏｂｌｉｔｕｚｕｍａｂ）、エタラシズマブ（Ｅｔａｒａｃｉｚｕｍａｂ）、ファルレツズマブ（Ｆａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂ）、フィクラツズマブ（Ｆｉｃｌａｔｕｚｕｍａｂ）、ゲムツズマブ（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、イムガツズマブ（Ｉｍｇａｔｕｚｕｍａｂ）、イノツズマブ（Ｉｎｏｔｕｚｕｍａｂ）、ラベツズマブ（Ｌａｂｅｔｕｚｕｍａｂ）、リファツズマブ（Ｌｉｆａｓｔｕｚｕｍａｂ）、リンツズマブ（Ｌｉｎｔｕｚｕｍａｂ）、ロルボツズマブ（Ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ）、ルムレツズマブ（Ｌｕｍｒｅｔｕｚｕｍａｂ）、マツズマブ（Ｍａｔｕｚｕｍａｂ）、ミラツズマブ（Ｍｉｌａｔｕｚｕｍａｂ）、ニモツズマブ（Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ）、オビヌツズマブ（Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）、オカラツズマブ（Ｏｃａｒａｔｕｚｕｍａｂ）、オトレルツズマブ（Ｏｔｌｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、オナルツズマブ（Ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂ）、オポルツズマブ（Ｏｐｏｒｔｕｚｕｍａｂ）、パルサツズマブ（Ｐａｒｓａｔｕｚｕｍａｂ）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、ピナツズマブ（Ｐｉｎａｔｕｚｕｍａｂ）、ポラツズマブ（Ｐｏｌａｔｕｚｕｍａｂ）、シブロツズマブ（Ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）、シムツズマブ（Ｓｉｍｔｕｚｕｍａｂ）、タカツズマブ（Ｔａｃａｔｕｚｕｍａｂ）、チガツズマブ（Ｔｉｇａｔｕｚｕｍａｂ）、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ツコツズマブ（Ｔｕｃｏｔｕｚｕｍａｂ）、バンドルツズマブ（Ｖａｎｄｏｒｔｕｚｕｍａｂ）、バヌシズマブ（Ｖａｎｕｃｉｚｕｍａｂ）、ベルツズマブ（Ｖｅｌｔｕｚｕｍａｂ）、ボルセツズマブ（Ｖｏｒｓｅｔｕｚｕｍａｂ）、ソフィツズマブ（Ｓｏｆｉｔｕｚｕｍａｂ）、カツマキソマブ（Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ）、エルツマキソマブ（Ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）、デパツキシズマブ（Ｄｅｐａｔｕｘｉｚｕｍａｂ）、オンツキシズマブ（Ｏｎｔｕｘｉｚｕｍａｂ）、ブロンツベトマブ（Ｂｌｏｎｔｕｖｅｔｍａｂ）、タムツベトマブ（Ｔａｍｔｕｖｅｔｍａｂ）の抗原結合ドメイン、またはその腫瘍抗原結合変異体が挙げられる。本明細書で使用される場合、「変異体」は、抗原結合ドメインが特定の抗原（例えば、トラスツズマブにとってのＨＥＲ２）に特異的に結合するが、親抗体よりも少ないもしくは多いアミノ酸を有するか（例えば、親抗体の断片（例えば、ｓｃＦｖ）であるか）、親抗体と比較して１つ以上のアミノ酸置換を有するか、またはそれらの組み合わせであることを意味する。
【0150】
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＯＶ抗原ＣＡＲまたは抗ＯＶ抗原コンジュゲートの抗原結合ドメインは、治療用抗体としての使用（例えば、患者の特定の疾患関連細胞を標的とするためなど）について米国食品医薬品局（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）および／もしくは欧州医薬品庁（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ａｇｅｎｃｙ）（ＥＭＡ）によって承認された抗体、または標的抗原に特異的に結合する能力を保持するその断片（例えば、抗体のｓｃＦｖバージョンなどのそのような抗体の単鎖バージョン）に由来する。
【0151】
本開示のＣＡＲの抗原結合ドメインは、任意の好適なフォーマット、例えば、ｓｃＦｖなどであり得る。上記の融合タンパク質のセクションで説明した膜貫通および細胞内シグナル伝達ドメイン、ならびに共刺激ドメイン、リンカー配列／スペーサードメインなどのうちのいずれかを含む、任意の好適な膜貫通および細胞内シグナル伝達ドメインを用いることができる。
【0152】
本開示のＣＡＲは、単一のペプチドによって提供され得るか、または２つ以上のポリペプチドによって提供され得る。ＣＡＲが２つ以上のポリペプチドによって提供される場合、ＣＡＲは、本開示の融合タンパク質のセクションで上記に記載されたそのようなマルチペプチドフォーマットを含む、任意の有用なマルチポリペプチドフォーマットで提供され得る。
【0153】
本開示の抗ＯＶ抗原ＣＡＲのうちのいずれかをコードする核酸、そのような核酸を含む発現ベクター、ならびにそのような核酸および発現ベクターを含む細胞もまた提供される。
【0154】
いくつかの実施形態によれば、提供されるのは、その表面上に抗ＯＶ抗原ＣＡＲを発現する細胞である。目的とする細胞としては、免疫細胞が挙げられるが、これに限定されない。特定の実施形態では、免疫細胞は、免疫エフェクター細胞である。本開示の抗ＯＶ抗原ＣＡＲをその表面に発現し得る免疫エフェクター細胞の非限定的な例としては、Ｔ細胞（すなわち、細胞はＣＡＲ Ｔ細胞であり得る）、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージなどが挙げられる。また、その表面上に抗ＯＶ抗原ＣＡＲを発現する本開示の細胞のうちのいずれかを含む医薬組成物も提供される。そのような組成物は、細胞および薬学的に許容される担体を含み得る。好適な薬学的に許容される担体の例を以下で詳細に説明する。
【0155】
腫瘍溶解性ウイルス抗原と結合するコンジュゲート
上記のコンジュゲートのセクションに記載された本開示の抗ＶＶ Ａ５６および抗ＶＶ Ｂ５抗体ならびに融合タンパク質コンジュゲートに加えて、本開示の態様は、抗腫瘍溶解性ウイルス抗原抗体コンジュゲートをさらに含む。特定の実施形態では、そのようなコンジュゲートは、腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）抗原に特異的に結合する抗体、およびその抗体にコンジュゲートされた薬剤を含む。いくつかの実施形態によれば、抗体にコンジュゲートされた薬剤は、化学療法剤、毒素、放射線増感剤、および放射性同位体（例えば、治療用放射性同位体）から選択される。薬剤は、上記のコンジュゲートのセクションで説明されているそのような薬剤のうちのいずれかである可能性がある。
上記のコンジュゲートのセクションに記載された本開示の抗ＶＶ Ａ５６および抗ＶＶ Ｂ５抗体ならびに融合タンパク質コンジュゲートに加えて、本開示の態様は、抗腫瘍溶解性ウイルス抗原抗体コンジュゲートをさらに含む。特定の実施形態では、そのようなコンジュゲートは、腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）抗原に特異的に結合する抗体、およびその抗体にコンジュゲートされた薬剤を含む。いくつかの実施形態によれば、抗体にコンジュゲートされた薬剤は、化学療法剤、毒素、放射線増感剤、および放射性同位体（例えば、治療用放射性同位体）から選択される。薬剤は、上記のコンジュゲートのセクションで説明されているそのような薬剤のうちのいずれかである可能性がある。
【0156】
本開示の抗ＯＶ抗体コンジュゲートには、種々の用途が見出される。例えば、本開示の利点により、そのようなコンジュゲートには、抗ＯＶ抗原コンジュゲートを含む医薬組成物をがんを有する個体に投与することを含む方法における使用が見出され、個体中のがん細胞がＯＶに感染しその表面上にＯＶ抗原を発現させることにより、コンジュゲートをがん細胞に標的指向化して個体のがんを治療することが理解されよう。
【0157】
コンジュゲートが目的のＯＶ抗原に特異的に結合するように、抗体（またはそれを含む融合タンパク質）が選択され得る。ＯＶ抗原は、ネイティブＯＶ抗原であり得る。特定の実施形態では、コンジュゲートの抗体部分は、ワクシニアウイルス（例えば、抗原Ａ３３、Ａ３４、Ａ３６、Ａ５６、Ｂ５、Ｆ１２、Ｆ１３など、例えば、ＪＸ－５９４、ＧＬ－ＯＮＣ１、またはＷｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ、Ｗｙｅｔｈ、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｔｅｍｐｌｅ ｏｆ Ｈｅａｖｅｎ、Ｐａｔｗａｄａｎｇａｒ、および改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａなどから選択されたＶＶ株）、アデノウイルス、ＨＳＶ、レオウイルス、小胞性口内炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、セネカバレーウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、ならびにマラバウイルスから選択されたＯＶによってコードされるネイティブ抗原に特異的に結合し得る。
【0158】
特定の実施形態では、ＯＶ抗原は、ＯＶに対して異種である。例えば、抗体（または抗体を含む融合タンパク質）は、コンジュゲートの抗体部分が上記のＣＡＲセクションに記載された異種ＯＶ抗原のうちのいずれかに特異的に結合するように選択され得る。
【0159】
本開示の抗ＯＶ抗体コンジュゲートの抗体部分は、本開示の抗体、抗ＶＶ Ａ５６および抗ＶＶ Ｂ５抗体ならびに融合タンパク質コンジュゲートに関連する上記のセクションに記載されているように、任意の所望のフォーマット、例えば、四量体フォーマット、単鎖（例えば、ｓｃＦｖ）フォーマットなどで提供され得る。
【0160】
本開示の抗ＯＶ抗体コンジュゲートは、リンカー、例えば、本開示の抗－ＶＶ Ａ５６および抗ＶＶ Ｂ５抗体ならびに融合タンパク質コンジュゲートに関連する上記のセクションに記載された切断不可能または切断可能なリンカーのうちのいずれかを介して、抗体（または抗体を含む融合タンパク質）にコンジュゲートされた薬剤を含み得る。
【0161】
本開示の抗ＯＶ抗体コンジュゲートのうちのいずれかを含む医薬組成物も提供される。そのような組成物は、コンジュゲートおよび薬学的に許容される担体を含み得る。好適な薬学的に許容される担体の例を以下で詳細に説明する。
【0162】
組成物
上で要約したように、本開示は組成物も提供する。いくつかの実施形態によれば、本開示の組成物は、本開示の抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートを含む。例えば、抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートは、上記の抗体のセクションに記載されている抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートのうちのいずれかであり得、その記載は組み込まれるが、簡潔にするためにここでは繰り返されない。
上で要約したように、本開示は組成物も提供する。いくつかの実施形態によれば、本開示の組成物は、本開示の抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートを含む。例えば、抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートは、上記の抗体のセクションに記載されている抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートのうちのいずれかであり得、その記載は組み込まれるが、簡潔にするためにここでは繰り返されない。
【0163】
特定の態様では、本開示の組成物は、液体培地中に存在する抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートを含む。液体媒体は、水、緩衝溶液などの水性液体媒体であり得る。１つ以上の添加剤、例えば、塩（例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４）、緩衝剤（トリス緩衝液、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（２－エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ－トリス［ヒドロキシメチル］メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）など）、溶解剤、洗浄剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ－２０などの非イオン性洗浄剤）、ヌクレアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、グリセロール、キレート剤などが、このような組成物に存在してもよい。
【0164】
本開示の態様は、医薬組成物をさらに含む。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、本開示の抗ＶＶ Ａ５６抗体もしくは抗ＶＶ Ｂ５抗体（またはそれを含むコンジュゲートもしくは融合タンパク質）、および薬学的に許容される担体を含む。
【0165】
抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートは、治療投与のための種々の製剤に組み込むことができる。より具体的には、抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートは、適切な薬学的に許容される賦形剤または希釈剤との組み合わせによって、医薬組成物に製剤化することができ、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、注射剤、吸入剤、エアロゾルなどの固体、半固体、液体またはガス状形態の製剤に製剤化することができる。
【0166】
個体への投与のための（例えば、ヒト投与に好適な）抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートの製剤は、一般に無菌であり、さらに、検出可能な発熱物質、または選択された投与経路による患者への投与が禁忌である他の混入物を含んでいない状態とし得る。
【0167】
薬学的剤形において、抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートは、それらの薬学的に許容される塩の形態で投与することができ、またはそれらは、単独でもしくは他の薬学的に活性な化合物との、適切な会合、および組み合わせでも使用され得る。以下の方法および担体／賦形剤は単なる例であり、決して限定するものではない。
【0168】
経口製剤の場合、ラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプンまたはジャガイモデンプンなどの従来の添加剤、結晶セルロース、セルロース誘導体、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチンなどの結合剤、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプンまたはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの崩壊剤、タルク、またはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、所望により、希釈剤、湿潤剤、防腐剤および香味剤を用いて、錠剤、散剤、顆粒またはカプセル剤を製造するために、抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートを単独でまたは適切な添加剤と組み合わせて使用することができる。
【0169】
抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートは、非経口（例えば、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、大脳内、脳室内、髄腔内、皮下など）投与用に製剤化することができる。特定の態様では、抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートは、植物油もしくは他の類似の油、合成脂肪族グリセリド、高級脂肪酸のエステル、またはプロピレングリコールなどの水性溶媒または非水性溶媒に抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートを溶解、懸濁もしくは乳化することによって、また必要であれば、可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤および防腐剤等の通常の添加剤を用いて、注射用に製剤化することができる。
【0170】
抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートを含む医薬組成物は、所望の純度を有する抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートを任意の生理学的に許容される担体、賦形剤、安定剤、界面活性剤、緩衝剤および／または等張化剤と混合することによって調製することができる。許容される担体、賦形剤および／または安定剤は、用いられる投与量および濃度ではレシピエントに無毒であり、緩衝剤、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸；アスコルビン酸、グルタチオン、システイン、メチオニンおよびクエン酸を含む抗酸化剤、防腐剤（例えば、エタノール、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ－クレゾール、ｐ－クロロ－ｍ－クレゾール、メチルまたはプロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、またはそれらの組み合わせ）、アルギニン、グリシン、オルニチン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリン、およびそれらの組み合わせなどのアミノ酸、単糖、二糖、および他の糖類、低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド、ゼラチンまたは血清アルブミンなどのタンパク質、ＥＤＴＡなどのキレート剤、トレハロース、ショ糖、ラクトース、グルコース、マンノース、マルトース、ガラクトース、フラクトース、ソルボース、ラフィノース、グルコサミン、Ｎ－メチルグルコサミン、ガラクトサミン、およびノイラミン酸などの糖、ならびに／または、Ｔｗｅｅｎ、Ｂｒｉｊ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【0171】
医薬組成物は、液体形態、凍結乾燥形態、または凍結乾燥形態から再構成された液体形態であり得、凍結乾燥調製物は投与前に滅菌溶液で再構成されることになる。凍結乾燥組成物を再構成するための標準的な手順は、一定量の純水（典型的には、凍結乾燥中に除去された体積と等量である）を加え戻すことであるが、非経口投与用の医薬組成物の製造のために抗菌剤を含む溶液が使用されてもよい。
【0172】
抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートの水性製剤は、例えば、約４．０～約７．０、または約５．０～約６．０の範囲、または代替的に、約５．５のｐＨで、ｐＨ緩衝溶液中で調製することができる。この範囲内のｐＨに好適である緩衝剤の例には、リン酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、クエン酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、および他の有機酸緩衝剤が含まれる。緩衝剤の濃度は、例えば、緩衝剤および製剤の所望の張性に応じて、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、または約５ｍＭ～約５０ｍＭであり得る。
【0173】
製剤の張度を調節するために、等張化剤を製剤に含めることができる。例示的な等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、およびアミノ酸、糖の群からの任意の成分、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、高張または低張溶液が好適であり得るが、水性製剤は等張性である。「等張性」という用語は、生理的食塩水または血清など、それが比較されるいくつかの他の溶液と同じ張性を有する溶液を意味する。等張化剤は、約５ｍＭ～約３５０ｍＭの量で、例えば、１００ｍＭ～３５０ｍＭの量で使用され得る。
【0174】
凝集を減少させるために、および／または製剤中の微粒子の形成を最小限にするために、および／または吸着を低減するために、界面活性剤が製剤に添加されてもよい。界面活性剤の例としては、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ）、アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ）、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンコポリマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が挙げられる。好適なポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの例は、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ ２０（商標）の商標で販売）、およびポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ ８０（商標）の商標で販売）である。好適なポリエチレン－ポリプロピレンコポリマーの例は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８またはＰｏｌｏｘａｍｅｒ １８８（商標）の名称で販売されているものである。好適なポリオキシエチレンアルキルエーテルの例は、Ｂｒｉｊ（商標）の商標で販売されているものである。界面活性剤の濃度の例は、約０．００１％～約１％ｗ／ｖの範囲であり得る。
【0175】
凍結乾燥プロセス中の不安定化条件から抗体および／またはＴ細胞活性化剤を保護するために、凍結保護剤を添加してもよい。例えば、既知の凍結保護剤には、糖（グルコースおよびスクロースを含む）、ポリオール（マンニトール、ソルビトールおよびグリセロールを含む）、ならびにアミノ酸（アラニン、グリシンおよびグルタミン酸を含む）が含まれる。凍結保護剤は、約１０ｍＭ～５００ｎＭの量で含まれることができる。
【0176】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、抗体、融合タンパク質またはコンジュゲート、および上記で特定される成分（例えば、界面活性剤、緩衝剤、安定剤、等張化剤）のうちの１つ以上を含み、エタノール、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ－クレゾール、ｐ－クロロ－ｍ－クレゾール、メチルまたはプロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、およびこれらの組み合わせなどの、１つ以上の防腐剤を本質的に含まない。他の実施形態において、防腐剤が、製剤中に、例えば約０．００１～約２％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度で含まれる。
【0177】
キット
本開示の態様は、キットをさらに含む。特定の実施形態では、キットは、本開示の方法、例えば、本開示の医薬組成物を個体に投与して抗体、融合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）またはコンジュゲートを該個体中の腫瘍溶解性ウイルス（例えばＶＶ）感染がん細胞に向けさせることを含む方法を実施する際の使用が見出される。
本開示の態様は、キットをさらに含む。特定の実施形態では、キットは、本開示の方法、例えば、本開示の医薬組成物を個体に投与して抗体、融合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）またはコンジュゲートを該個体中の腫瘍溶解性ウイルス（例えばＶＶ）感染がん細胞に向けさせることを含む方法を実施する際の使用が見出される。
【0178】
したがって、特定の実施形態では、本開示のキットは、本開示の医薬組成物のうちのいずれかと、それを必要とする個体に医薬組成物を投与するための説明書と、を含む。キットに含まれる医薬組成物は、本開示の抗体、融合タンパク質、および／またはコンジュゲートのうちのいずれか、例えば、上記の抗体、融合タンパク質、および／またはコンジュゲートのうちのいずれかを含み得る。理解されるように、本開示のキットは、簡潔にするために本明細書で繰り返されない、主題の抗体、融合タンパク質、コンジュゲートおよび組成物に関連するセクションで上記に記載された薬剤および特徴のうちのいずれかを含み得る。
【0179】
本開示のキットは、単位投与量、例えば、アンプル、または複数回投与量形式で存在する、ある量の組成物を含み得る。したがって、特定の実施形態では、キットは、本開示の抗体、融合タンパク質、および／またはコンジュゲートを含む組成物の１つ以上の（例えば、２つ以上の）単位投与量（例えば、アンプル）を含み得る。「単位投与量」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトおよび動物対象のための単一の投与量として好適な物理的に別個の単位を指し、各単位は、所望の効果をもたらすのに十分な量で計算された所定量の組成物を含有する。単位投与量の量は、用いられる特定の抗体、融合タンパク質および／またはコンジュゲート、達成されるべき効果、ならびに個体における抗体、融合タンパク質および／またはコンジュゲートと関連する薬力学などの様々な要因に依存する。さらに他の実施形態では、キットは組成物の単一の複数回投与量を含み得る。
【0180】
特定の実施形態では、本開示のキットは、例えば医薬組成物を個体に投与することにより、がんを有する個体中のＶＶ感染がん細胞に、該医薬組成物中に存在する抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートを向けさせること（例えば、個体のがんを治療するために）についての説明書を含み、ここで個体はＶＶに感染されたがん細胞を含み、抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートは、感染されたがん細胞の表面上に発現するＶＶ抗原によって、感染されたがん細胞に標的指向化される。
【0181】
いくつかの実施形態によれば、本開示のキットは、ＶＶ（例えば、ＪＸ－５９４、ＧＬ－ＯＮＣ１、ウエスタンリザーブ、ワイス、リスター、コペンハーゲン、天壇、パトワダンガル、および改変ワクシニアウイルスアンカラなどから選択されるＶＶの株）を含む医薬組成物を含む。そのようなキットは、例えば、本開示の抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートを含む医薬組成物を投与する前に、個体のがん細胞に感染するのに有効な量のＶＶを含む医薬組成物を、がんを有する個体に投与するための説明書をさらに含み得る。
【0182】
キットに含まれる説明書（例えば、使用についての説明書（ＩＦＵ））は、好適な記録媒体に記録され得る。例えば、説明書は、紙またはプラスチックなどの基材上に印刷することができる。そのようなものとして、説明書は、添付文書としてキット内に、キットの容器またはその構成要素のラベル（すなわち、包装またはサブ包装に付随）などに存在し得る。他の実施形態において、説明書は、ポータブルフラッシュドライブ、ＤＶＤ、ＣＤ－ＲＯＭ、ディスケットなどの好適なコンピュータ可読記憶媒体上に存在する、電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態において、実際の説明書は、キット中には存在しないが、例えばインターネットを介してリモートソースから説明書を取得するための手段が提供される。この実施形態の一例は、説明書を閲覧することができ、かつ／または説明書をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。説明書と同様に、説明書を得るための手段は、好適な基材上に記録される。
【0183】
方法
本開示の態様は、本開示の抗体、融合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）およびコンジュゲートを使用する方法を含む。本方法は、インビトロおよび／もしくはインビボ研究ならびに／または臨床用途を含む種々の状況で有用である。
本開示の態様は、本開示の抗体、融合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）およびコンジュゲートを使用する方法を含む。本方法は、インビトロおよび／もしくはインビボ研究ならびに／または臨床用途を含む種々の状況で有用である。
【0184】
特定の態様では、提供されるのは、本開示の抗ＶＶ Ａ５６または抗ＶＶ Ｂ５抗体（そのような抗体を含む融合タンパク質またはコンジュゲートのうちのいずれかを含む）のうちのいずれかを含む有効量の医薬組成物を、がんを有する個体に投与することを含む方法であって、個体が、抗体が結合するＶＶ Ａ５６またはＶＶ Ｂ５抗原をコードするＯＶに感染されたがん細胞を含み（ＶＶ Ａ５６またはＶＶ Ｂ５抗原は、ＯＶに対してネイティブまたは異種であり得る）、抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートが、感染されたがん細胞の表面上に発現するＶＶ抗原によって、感染されたがん細胞に標的指向化される、方法である。いくつかの実施形態によれば、そのような方法は、医薬組成物を個体に投与する前に、有効量のＯＶを個体に投与することによってがん細胞に感染させることをさらに含む。そのような方法は、例えば、個体のがんを治療する上での使用が見出される。
【0185】
特定の実施形態では、医薬組成物は、本開示の抗ＶＶ Ａ５６または抗ＶＶ Ｂ５抗体コンジュゲートのうちのいずれかを含む。例えば、医薬組成物は、抗ＶＶ Ａ５６または抗ＶＶ Ｂ５抗体が、インビボイメージング剤である検出可能な標識または放射性同位体にコンジュゲートされているコンジュゲートを含み得る。そのような方法は、インビボイメージング剤を使用して、個体の感染したがん細胞をイメージングすることをさらに含み得る。検出可能な標識または放射性同位体を含むコンジュゲートを個体に投与する方法は、例えば、診断、予後および／または抗がん療法を監視する目的で、個体のがん細胞をイメージングする上での使用が見出される。
【0186】
いくつかの態様によれば、腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）抗原に特異的に結合する抗体を個体のがん細胞に標的指向化する方法が提供される。そのような方法は、ＯＶ抗原に特異的に結合する抗体（または抗体を含む融合タンパク質もしくはコンジュゲート）を含む有効量の医薬組成物を個体に投与することを含み、個体内のがん細胞は、ＯＶに感染し、それらの表面上にＯＶ抗原を発現する。ＯＶ抗原は、本明細書の他の場所に記載されているＯＶ抗原のうちのいずれかであり得る。特定の実施形態では、ＯＶ抗原は、ネイティブＯＶ抗原である。例えば、ＯＶは、上記の「腫瘍溶解性ウイルス抗原に結合するキメラ抗原受容体」と題するセクションに記載されたウイルスのうちのいずれか、またはその操作された変異体（例えば、以下に記載されるＯＶ改変、例えば、ヒトＧＭ－ＣＳＦについてのトランスジェニック、チミジンキナーゼ遺伝子の欠失、および／またはその他のうちの１つ以上を有する操作された変異体）であり得、ＯＶ抗原は該ＯＶにネイティブである。いくつかの実施形態によれば、ＯＶ抗原は、該ＯＶに対して異種であり、例えば、該ＯＶに対して異種であるウイルス抗原（例えば、上記の「腫瘍溶解性ウイルス抗原に結合するキメラ抗原受容体」と題するセクションに記載されたウイルスＯＶ抗原のうちのいずれか）、腫瘍抗原、または本明細書の他の場所に記載されている他の任意の異種ＯＶ抗原である。いくつかの実施形態によれば、そのような方法は、医薬組成物を個体に投与する前に、有効量のＯＶを個体に投与することによってがん細胞に感染させることをさらに含む。そのような方法は、例えば、個体のがんを治療する上での使用が見出される。
【0187】
がん細胞表面上に結合すると、抗体（または融合タンパク質）は、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）において補体を動員することによって、抗体依存性細胞ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）を介して、エピトープ拡大（epitope spreading）を介して、または他の何らかのメカニズムによって、細胞傷害を誘導し得る。抗体は、Ｆｃ領域において改変されて、所望のまたは増強されたエフェクター機能を提供し得る。これは、抗体のＦｃ領域に１つ以上のアミノ酸置換を導入することによって達成することができる。代替的に、副作用または治療上の合併症を最小限に抑えるために、エフェクター機能を排除または低減することが望ましい場合、特定の他のＦｃ領域を使用することができる。
【0188】
特定の実施形態では、医薬組成物は、抗ＶＶ Ａ５６または抗ＶＶ Ｂ５抗体が、化学療法剤、毒素、放射線増感剤、治療用放射性同位体、および抗体のインビボイメージングを可能にする放射性同位体から選択される薬剤にコンジュゲートされている、コンジュゲートを含み得る。薬剤は、上記のコンジュゲートのセクションで説明されているような薬剤のいずれかであり得る。
【0189】
コンジュゲートが目的のＯＶ抗原に特異的に結合するように、抗体（またはそれを含む融合タンパク質）が選択され得る。目的のＯＶ抗原としては、本明細書の他の場所に記載されているネイティブまたは異種のＯＶ抗原のうちのいずれかが挙げられるが、これに限定されない。特定の実施形態では、ＯＶ抗原は、ネイティブＯＶ抗原である。例えば、ＯＶは、上記の「腫瘍溶解性ウイルス抗原に結合するキメラ抗原受容体」と題するセクションに記載されたウイルスのうちのいずれか、またはその操作された変異体（例えば、以下に記載されるＯＶ改変、例えば、ヒトＧＭ－ＣＳＦについてのトランスジェニック、チミジンキナーゼ遺伝子の欠失、および／またはその他のうちの１つ以上を有する操作された変異体）であり得、ＯＶ抗原は該ＯＶにネイティブである。いくつかの実施形態によれば、ＯＶ抗原は、該ＯＶに対して異種であり、例えば、該ＯＶに対して異種であるウイルス抗原（例えば、上記の「腫瘍溶解性ウイルス抗原に結合するキメラ抗原受容体」と題するセクションに記載されたウイルスＯＶ抗原のうちのいずれか）、腫瘍抗原、または本明細書の他の場所に記載されている他の任意の異種ＯＶ抗原である。いくつかの実施形態では、抗原は、その発現が専らその抗原のためのＯＶの野生型転写調節エレメントの制御下にある、ネイティブまたは異種のＯＶ抗原である。すなわち、そのような実施形態によれば、該抗原のためのＯＶの転写調節エレメントは、野生型ＯＶと比較して改変されていない。特定の実施形態では、抗原は、ネイティブＯＶ抗原であり、その発現レベルは、ＯＶの１つ以上の野生型転写調節エレメントの改変（例えば、置換、複製など）により、野生型ＯＶによる発現と比較して変化している（例えば、増加している）。例として、抗原は、ネイティブＯＶ抗原（例えば、ネイティブＡ５６、ネイティブＢ５、または目的とする任意の他のネイティブＯＶ抗原）であり得、その発現は、ＯＶの野生型転写調節エレメントと比較してより高い発現レベルをもたらす１つ以上の異種調節エレメント（例えば、ヒトプロモーターなどのプロモーター）にネイティブのＯＶ抗原のコード領域を作動可能にカップリングすることによって、野生型ＯＶによる発現と比較して増加される。このようなＯＶは、改変ＯＶ、例えば、以下に記載されるＯＶ改変のうちの１つ以上を含むＯＶであり得る。
【0190】
特定の実施形態では、ＯＶ抗原は、該ＯＶに対して異種である。例えば、コンジュゲートの抗体部分が本明細書の他の場所に記載される異種ＯＶ抗原（例えば、該ＯＶに対して異種のウイルス抗原、腫瘍抗原など）のうちのいずれかに特異的に結合するように抗体が選択され得る。
【0191】
抗体は、本開示の前のセクションに記載されているように、任意の所望のフォーマット、例えば、四量体フォーマット、単鎖（例えば、ｓｃＦｖ）フォーマットなどで提供され得る。いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、検出可能な標識または放射性同位体にコンジュゲートされた抗体を含む。特定の実施形態では、検出可能な標識または放射性同位体は、インビボイメージング剤である。抗体がインビボイメージング剤にコンジュゲートされる方法は、例えば、診断、予後および／または抗がん療法を監視する目的で、インビボで個体のがん細胞を画像化するためのインビボイメージング剤を検出することをさらに含み得る。
【0192】
いくつかの態様によれば、腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）抗原に特異的に結合するＣＡＲを個体のがん細胞に標的指向化する方法が提供される。そのような方法は、ＯＶ抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインを含むＣＡＲを含む有効量の医薬組成物を個体に投与することを含み、個体のがん細胞は、ＯＶに感染され、それらの表面上にＯＶ抗原を発現する。ＣＡＲは、細胞、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージなどのような免疫細胞の表面上に発現され得る。例えば、ＣＡＲは、Ｔ細胞の表面上に存在し得、その場合本方法は、個体における感染したがん細胞にＣＡＲ Ｔ細胞を標的指向化する方法である。いくつかの実施形態によれば、そのような方法は、医薬組成物を個体に投与する前に、有効量のＯＶを個体に投与することによってがん細胞に感染させることをさらに含む。そのような方法は、例えば、個体のがんを治療する上での使用が見出される。
【0193】
ＣＡＲの抗原結合ドメインは、目的のＯＶ抗原に特異的に結合する。目的のＯＶ抗原としては、本明細書の他の場所に記載されているネイティブまたは異種のＯＶ抗原のうちのいずれかが挙げられるが、これに限定されない。特定の実施形態では、ＯＶ抗原は、ネイティブＯＶ抗原である。例えば、ＯＶは、上記の「腫瘍溶解性ウイルス抗原に結合するキメラ抗原受容体」と題するセクションに記載されたウイルスのうちのいずれか、またはその操作された変異体（例えば、以下に記載されるＯＶ改変、例えば、ヒトＧＭ－ＣＳＦについてのトランスジェニック、チミジンキナーゼ遺伝子の欠失および／またはその他のうちの１つ以上を有する操作された変異体）であり得、ＯＶ抗原は該ＯＶにネイティブである。いくつかの実施形態によれば、ＯＶ抗原は、該ＯＶに対して異種であり、例えば、該ＯＶに対して異種であるウイルス抗原（例えば、上記の「腫瘍溶解性ウイルス抗原に結合するキメラ抗原受容体」と題するセクションに記載されたウイルスＯＶ抗原のうちのいずれか）、腫瘍抗原、または本明細書の他の場所に記載されている他の任意の異種ＯＶ抗原である。
【0194】
表面上にＣＡＲを発現する細胞を含む医薬組成物は、種々の方法によって調製することができる。いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、ＣＡＲをコードするウイルスベクターで細胞をトランスフェクトすることによって産生される。いくつかの実施形態では、細胞はＴ細胞であり、その結果、ＣＡＲ Ｔ細胞を産生する方法が提供される。いくつかの実施形態では、そのような方法は、Ｔ細胞の集団（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞療法が投与される個体から得られるＴ細胞）を活性化することと、Ｔ細胞の集団を刺激して増殖させることと、ＣＡＲをコードするウイルスベクターをＴ細胞に形質導入することと、を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードするレトロウイルスベクター、例えば、ガンマレトロウイルスベクターを、Ｔ細胞に形質導入する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターをＴ細胞に形質導入する。
【0195】
本開示の細胞は、自家（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）／自己（ａｕｔｏｇｅｎｅｉｃ）（「自己（ｓｅｌｆ）」）または非自家（ｎｏｎ－ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）（「非自己（ｎｏｎ－ｓｅｌｆ）」、例えば、同種異系、同系もしくは異種）であり得る。本明細書で使用される「自家（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）」は、同じ個体からの細胞を指す。本明細書で使用される「同種異系」は、比較して細胞と遺伝的に異なる同じ種の細胞を指す。本明細書で使用される「同系」は、比較して細胞と遺伝的に同一である異なる個体の細胞を指す。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳類から得られたＴ細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳類は霊長類である。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。
【0196】
Ｔ細胞は、末梢血、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸膜滲出液、脾臓組織、および腫瘍を含むがこれらに限定されない多くの供給源から得ることができる。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、沈降、例えば、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離などの任意の数の既知の技術を使用して、個体から収集された血液の単位から得ることができる。
【0197】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の単離または精製された集団が使用される。いくつかの実施形態では、ＴＣＴＬおよびＴＨリンパ球は、ＰＢＭＣから精製される。いくつかの実施形態では、ＴＣＴＬおよびＴＨリンパ球は、活性化、増殖、および／または遺伝子改変の前または後のいずれかで、ナイーブ（ＴＮ）、メモリー（ＴＭＥＭ）、およびエフェクター（ＴＥＦＦ）Ｔ細胞亜集団に分類される。そのような選別のための好適なアプローチは知られており、例えば、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を含み、ＴＮはＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ９５－であり、ＴＳＣＭはＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ９５＋であり、ＴＣＭはＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ９５＋であり、ＴＥＭはＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ－ＣＤ９５＋である。このような選別のアプローチ例は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｂｌｏｏｄ １２７（２４）：２９８０－９０に記載されている。
【0198】
いくつかの実施形態では、以下のマーカー：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２、ＣＤ１２７およびＨＬＡ－ＤＲのうちの１つ以上を発現するＴ細胞の特定の亜集団は、陽性または陰性選択技術によってさらに単離され得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、またはＣＤ３８もしくはＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７およびＣＤ３８からなる群から選択されるマーカーのうちの１つ以上を発現するＴ細胞の特定の亜集団は、陽性または陰性選択技術によってさらに単離される。いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞組成物は、以下のマーカー：ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ４、ＴＩ３、およびＬＡＧ３のうちの１つ以上を発現しない。いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞組成物は、以下のマーカー：ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ４、ＴＩ３、およびＬＡＧ３のうちの１つ以上を実質的に発現しない。
【0199】
Ｔ細胞組成物の治療上有効な用量を達成するために、Ｔ細胞は、１回以上の刺激、活性化および／または増殖に供され得る。Ｔ細胞は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、第６，５３４，０５５号、第６，９０５，６８０号、第６，６９２，９６４号、第５，８５８，３５８号、第６，８８７，４６６号、第６，９０５，６８１号、第７，１４４，５７５号、第７，０６７，３１８号、第７，１７２，８６９号、第７，２３２，５６６号、第７，１７５，８４３号、第５，８８３，２２３号、第６，９０５，８７４号、第６，７９７，５１４号および第６，８６７，０４１号（これらは各々、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているような方法を一般的に使用して活性化および増殖させることができる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、約１～２１日間、例えば、約５～２１日間活性化および増殖される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＡＲをコードする核酸（例えば、発現ベクター）をＴ細胞に導入する前に、約１日～約４日、約１日～約３日、約１日～約２日、約２日～約３日、約２日～約４日、約３日～約４日、または約１日、約２日、約３日もしくは約４日間活性化および増殖される。
【0200】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＡＲをコードする核酸（例えば、発現ベクター）をＴ細胞に導入する前に、約６時間、約１２時間、約１８時間、または約２４時間活性化および増殖される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＡＲをコードする核酸（例えば、発現ベクター）がＴ細胞に導入されると同時に活性化される。
【0201】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞培養に適切な条件には、適切な培地（例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０または、Ｘ－ｖｉｖｏ １５（Ｌｏｎｚａ））、ならびに血清（例えば、ウシ胎児またはヒト血清）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－２１、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＧＦβおよびＴＮＦ－α、または当業者に知られている細胞の成長に好適な他の任意の添加剤を含むが、これらに限定されない、増殖および生存に必要な１つ以上の因子が含まれる。細胞培養培地のさらなる例示的な例には、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミンが添加され、無血清であるか、あるいは適切な量の血清（もしくは血漿）または定義されたホルモンのセット、および／またはＴ細胞の成長と増殖に十分な量のサイトカインが補充されているＲＰＭＩ １６４０、Ｃｌｉｃｋ、ＡＥＶＩ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ １５およびＸ－Ｖｉｖｏ ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒが含まれるが、これらに限定されない。
【0202】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸（例えば、発現ベクター）は、マイクロインジェクション、トランスフェクション、リポフェクション、ヒートショック、エレクトロポレーション、形質導入、遺伝子銃、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ－デキストランを介した移入などによって細胞（例えば、Ｔ細胞）内に導入される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸（例えば、発現ベクター）は、ＡＡＶ形質導入によって細胞（例えば、Ｔ細胞）内に導入される。ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２からのＩＴＲ、およびＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９またはＡＡＶ１０のうちのいずれか１つからの血清型を含み得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２からのＩＴＲおよびＡＡＶ６からの血清型を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸（例えば、発現ベクター）は、レンチウイルスまたはレトロウイルスの形質導入によって細胞（例えば、Ｔ細胞）内に導入される。レンチウイルスベクターバックボーンは、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎－脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）に由来する可能性がある。レンチウイルスベクターは、組み込み能力がある（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）か、またはインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＴＤＬＶ）であり得る。一実施形態では、ＨＩＶベースのベクターバックボーン（すなわち、ＨＩＶシス作用性配列エレメント）を含むＩＤＬＶベクターが用いられる。
【0203】
特定の態様では、腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）抗原に特異的に結合する抗体を含むコンジュゲートを個体のがん細胞に標的指向化する方法が提供される。そのような方法は、ＯＶ抗原に特異的に結合する抗体を含む有効量の医薬組成物を個体に投与することを含み、個体のがん細胞は、ＯＶに感染し、それらの表面上にＯＶ抗原を発現する。いくつかの実施形態によれば、そのような方法は、医薬組成物を個体に投与する前に、有効量のＯＶを個体に投与することによってがん細胞に感染させることをさらに含む。そのような方法は、例えば、個体のがんを治療する上での使用が見出される。
【0204】
コンジュゲートの抗体は、本明細書の他の場所に記載されているＯＶ抗原のうちのいずれかを含むがこれらに限定されない、目的のＯＶ抗原に特異的に結合する。特定の実施形態では、ＯＶ抗原は、ネイティブＯＶ抗原である。例えば、ＯＶは、上記の「腫瘍溶解性ウイルス抗原に結合するキメラ抗原受容体」と題するセクションに記載されたウイルスのうちのいずれか、またはその操作された変異体（例えば、以下に記載されるＯＶ改変、例えば、ヒトＧＭ－ＣＳＦについてのトランスジェニック、チミジンキナーゼ遺伝子の欠失および／またはその他のうちの１つ以上を有する操作された変異体）であり得、ＯＶ抗原は該ＯＶにネイティブである。いくつかの実施形態によれば、ＯＶ抗原は、該ＯＶに対して異種であり、例えば、該ＯＶに対して異種であるウイルス抗原（例えば、上記の「腫瘍溶解性ウイルス抗原に結合するキメラ抗原受容体」と題するセクションに記載されたウイルスＯＶ抗原のうちのいずれか）、腫瘍抗原、または本明細書の他の場所に記載されている他の任意の異種ＯＶ抗原である。
【0205】
本開示に従って個体に投与されるＯＶは、野生型ＯＶまたは改変ＯＶであり得る。いくつかの実施形態によれば、ＯＶは改変されたＯＶであり、改変されたＯＶは、異なるウイルスからの２つ以上のドメインを含むキメラＯＶである。いくつかの実施形態では、ＯＶは、以下の機能的カテゴリーのうちの１つ以上における１つ以上の改変を含む改変ＯＶ（例えば、非キメラまたはキメラＯＶ）である：感染、複製、向性、改善された安全性、イメージングのためのレポーター遺伝子、宿主の抗ウイルス免疫応答を阻止し、宿主の抗腫瘍免疫応答を増強するなど。いくつかの実施形態によれば、ＯＶは、以下のように改変される：ヒトＧＭ－ＣＳＦをコードおよび発現する、チミジンキナーゼ遺伝子の欠失を有する（変異したＲＡＳまたはｐ５３遺伝子を有するがん細胞に通常見られる高レベルのチミジンキナーゼを有する細胞にウイルス複製を限定または実質的に限定する）、レポーター遺伝子（例えば、Ｌａｃ Ｚ、ルシフェラーゼなど）をコード化および発現させる、リボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＲ）をコードする１つ以上の遺伝子を変更する、Ｆ２Ｌ遺伝子（ＤＮＡ複製の忠実度の維持とチミジル酸シンターゼによるＴＭＰ産生の前駆体の提供の両方に関与するウイルスｄＵＴＰａｓｅをコードする）を破壊する、治療用タンパク質（例えば、自殺遺伝子－すなわち、ＴＫ、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、チミジル酸キナーゼなどを含むがこれらに限定されない、薬物の前駆体を細胞傷害性化合物に変換することができるタンパク質をコードする遺伝子）を発現する、免疫刺激性タンパク質を発現する（「免疫刺激性タンパク質」は、サイトカイン、ケモカイン、成長因子などを含む、特異的または非特異的な方法で免疫系を刺激する能力を有するタンパク質を指す）、ならびにそれらの任意の組み合わせ。上記の改変されたＯＶのうちのいずれかは、本明細書の他の場所に記載されているＯＶ抗原のうちのいずれかをコードし得る。例えば、改変されたＯＶは、上記の「腫瘍溶解性ウイルス抗原に結合するキメラ抗原受容体」と題するセクションに記載されたウイルスのうちのいずれかから改変され得、ＯＶ抗原は、該ＯＶにネイティブである。いくつかの実施形態によれば、ＯＶ抗原は、該ＯＶに対して異種であり、例えば、改変ＯＶに対して異種であるウイルス抗原（例えば、上記の「腫瘍溶解性ウイルス抗原に結合するキメラ抗原受容体」と題するセクションに記載されたウイルスＯＶ抗原のうちのいずれか）、腫瘍抗原、または本明細書の他の場所に記載されている他の任意の異種ＯＶ抗原である。
【0206】
特定の態様では、ＯＶに感染した細胞（例えば、がん細胞）を含む医薬組成物を投与することを含む方法が提供される。医薬組成物は、感染細胞、例えば、がん細胞によって発現されるＯＶ抗原に特異的に結合する抗体、コンジュゲートまたは融合タンパク質をさらに含み得る。該細胞（例えば、がん細胞）は、手術の際に個体から除去されたものであり得る。該細胞（例えば、がん細胞）は、患者に投与されたときに免疫系によって攻撃される可能性が高くなるように、実験室で変更（および殺滅）されたものであり得る。次に、患者の免疫系は、体内に残っている該細胞および同様の細胞を攻撃する。本開示の抗体、コンジュゲートまたは融合タンパク質をこのアプローチに従って用いて、プロフェッショナルＡＰＣ上のＦｃ受容体による腫瘍粒子／抗原の取り込みを促進し、腫瘍に対する免疫応答を増強することができる。
【0207】
医薬組成物は、種々の個体のうちのいずれかに投与することができる。特定の態様では、個体は、「哺乳類」または「哺乳動物」であり、これらの用語は、肉食動物（例えば、イヌおよびネコ）、齧歯類（例えば、マウス、モルモット、およびラット）、および霊長類（例えば、ヒト、チンパンジー、およびサル）を含む、哺乳綱内の生物を表すために広く使用される。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。特定の態様では、個体は、がんなどの細胞増殖性障害の動物モデル（例えば、マウスモデル、霊長類モデルなど）である。
【0208】
それを必要としている個体は、細胞増殖性障害を有する可能性がある。「細胞増殖性障害」とは、多細胞生物の細胞における１つ以上のサブセットの望ましくない細胞増殖が起こり、生物にとっての害（例えば、痛みまたは平均余命の低下）をもたらす障害を意味する。細胞増殖性障害には、がん、前がん、良性腫瘍、血管増殖性障害（例えば、関節炎、再狭窄など）、線維性障害（例えば、肝性肝硬変、アテローム性動脈硬化症など）、乾癬、表皮および類皮嚢胞、脂肪腫、腺腫、毛細血管および皮膚血管腫、リンパ管腫、損傷性母斑（ｎｅｖｉ ｌｅｓｉｏｎｓ）、奇形腫、腎腫、筋線維腫症、骨形成腫瘍、形成異常腫瘤（ｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ ｍａｓｓｅｓ）、メサンギウム細胞増殖性障害などが含まれるが、これらに限定されない。
【0209】
いくつかの実施形態において、個体はがんを有する。対象の方法は、多種多様ながんの治療に用いることができる。本明細書で使用される「腫瘍」は、悪性または良性にかかわらず、すべての新生物細胞の増殖および増殖、ならびにすべての前がん性およびがん性の細胞および組織を指す。「がん」および「がん性」という用語は、典型的には無秩序な細胞増殖／増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指すかまたは説明する。主題の方法を使用して治療することができるがんの例には、がん腫、リンパ腫、芽細胞腫、および肉腫が含まれるが、これらに限定されない。そのようながんのより具体的な例には、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がん、肺扁平上皮がん、腹膜がん、肝細胞がん、胃腸がん、膵臓がん、膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、胆管がん、膀胱がん、肝がん、乳がん、大腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんもしくは子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん、肝臓がん、前立腺がん、外陰外陰部がん、甲状腺がん、肝臓がん、様々なタイプの頭頸部がんなどが挙げられる。特定の実施形態では、個体は、固形腫瘍、再発性多形性神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ）、非小細胞肺がん、転移性黒色腫、黒色腫、腹膜がん、上皮性卵巣がん、多形性神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ）、転移性結腸直腸がん、結腸直腸がん、膵管腺がん、扁平上皮がん、食道がん、胃がん、神経芽細胞腫、ファロピウス管がん、膀胱がん、転移性乳がん、膵臓がん、軟組織肉腫、再発性頭頸部がん扁平上皮がん、頭頸部がん、未分化星状細胞腫、悪性胸膜中皮腫、乳がん、扁平上皮非小細胞肺がん、横紋筋肉腫、転移性腎細胞がん、基底細胞がん（基底細胞上皮腫）、および神経膠肉腫から選択されるがんを有する。特定の態様では、個体は、黒色腫、ホジキンリンパ腫、腎細胞がん（ＲＣＣ）、膀胱がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、および頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）から選択されるがんを有する。
【0210】
本開示の抗体、融合タンパク質およびコンジュゲートは、経口（例えば、錠剤形態、カプセル形態、液体形態など）、非経口（例えば、静脈内、筋肉内、皮下、筋肉内、もしくは硬膜外注射）、局所、鼻腔内、または腫瘍内投与から選択される投与経路を介して投与され得る。
【0211】
本開示の抗体、融合タンパク質およびコンジュゲートは、治療有効量で医薬組成物として投与することができる。「治療有効量」とは、所望の結果をもたらすのに十分な用量を意味し、例えば、対照と比較して、がんの症状の軽減などの有益なまたは所望の治療結果（予防的な結果を含む）をもたらすのに十分な量を意味する。がんに関して、いくつかの実施形態では、治療有効量は、腫瘍の成長を遅らせる、腫瘍のサイズを縮小する、および／または同様のことをするのに十分である。有効量は１回以上の投与で投与することができる。
【0212】
上記のように、本開示の態様は、個体のがんを治療するための方法を含む。「治療」とは、少なくとも個体のがんと関連する１つ以上の症状の改善を意味し、改善は、パラメータ、例えば、少なくとも治療されるがんと関連する症状の程度の軽減を指すために広義で使用される。したがって、治療はまた、個体ががん、または少なくともがんを特徴付ける症状にそれ以上苦しまないように、がん、または少なくともそれに関連する１つ以上の症状が完全に阻害される、例えば、発生するのを防止される、または停止される、例えば、中止される状況も含む。
【0213】
本開示の抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートは、単独で、または第２の薬剤と組み合わせて、個体に投与することができる。目的の第２の薬剤には、がんの治療に使用するために米国食品医薬品局および／または欧州医薬品庁（ＥＭＡ）によって承認された薬剤が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、第２の薬剤は、免疫チェックポイント阻害剤である。目的の免疫チェックポイント阻害剤には、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ－４）阻害剤、プログラム細胞死－１（ＰＤ－１）阻害剤、プログラム細胞死リガンド－１（ＰＤ－Ｌ１）阻害剤、リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ－３）阻害剤、Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）阻害剤、インドールアミン（２，３）－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤、ＩｇおよびＩＴＩＭドメイン（ＴＩＧＩＴ）阻害剤を含むＴ細胞免疫受容体、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）阻害剤、Ｂ７－Ｈ３阻害剤、およびそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【0214】
本開示の抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートが第２の薬剤とともに投与される場合、抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートおよび第２の薬剤は、任意の好適な投与レジメンに従って個体に投与され得る。特定の実施形態によれば、抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートおよび第２の治療剤は、個々の使用のために承認された投薬レジメンに従って投与される。いくつかの実施形態では、抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートの投与は、抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートを投与せずに第２の薬剤が投与される場合に使用されるのと比較して、１回以上のより低用量および／またはより低頻度の投与、および／またはサイクル数の減少を伴う投薬レジメンに従って第２の薬剤が投与されることを可能にする。特定の態様では、第２の薬剤の投与は、第２の薬剤を投与せずに抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートが投与される場合に使用されるのと比較して、抗体、融合タンパク質、またはコンジュゲートが、１回以上のより低用量および／またはより低頻度の投与、および／またはサイクル数の減少を伴う投薬レジメンに従って投与されることを可能にする。
【0215】
いくつかの実施形態では、１回以上の用量の抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートおよび第２の薬剤は、個体に同時に投与される。「同時に」とは、抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートと第２の薬剤が同じ医薬組成物中に存在するか、または抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートと第２の薬剤が１時間以下、３０分以下、または１５分以下以内に別個の医薬組成物として投与されることを意味する。
【0216】
いくつかの実施形態では、１回以上の用量の抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートおよび第２の薬剤は、個体に連続して投与される。
【0217】
いくつかの実施形態において、抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートおよび第２の薬剤は、異なる組成でおよび／または異なる時間に個体に投与される。例えば、抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートは、第２の治療剤の投与の前に（例えば、特定のサイクルで）投与されてもよい。代替的に、第２の治療剤は、抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートの投与の前に（例えば、特定のサイクルで）投与されてもよい。投与され得る第２の薬剤は、投与され得る第１の薬剤投与後の少なくとも１時間後、３時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、または最長５日以上後に開始する期間に投与されてもよい。
【0218】
一例では、第２の薬剤は、抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートの投与前に、望ましい期間、個体に投与される。特定の態様では、そのようなレジメンは、がん細胞を「プライミング」して、抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートの抗がん効果を増強する。抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートを投与するステップから第２の薬剤を投与するステップを分離するそのような期間は、望ましくは、抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートの抗がん効果が増加するように、がん細胞のプライミングを可能にするのに十分な長さである。
【0219】
いくつかの実施形態では、１つの薬剤の投与は、別の薬剤の投与に対して特異的なタイミングである。例えば、いくつかの実施形態では、抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートは、特定の効果が観察される（または、例えば、所与の投薬レジメンと目的の特定の効果との間の相関を示す集団研究に基づいて観察されると予想される）ように投与される。
【0220】
特定の態様では、併用投与される薬剤の所望の相対的投薬レジメンは、例えばエクスビボ、インビボおよび／またはインビトロモデルを使用して、経験的に評価または決定されてもよい。いくつかの実施形態では、そのような評価または経験的決定は、インビボ、患者集団において（例えば、相関が確立されるように）、または代替的に目的の特定の個体において行われる。
【0221】
いくつかの実施形態では、抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートおよび第２の薬剤は、少なくとも２サイクルを含む断続的な投薬レジメンに従って投与される。２つ以上の薬剤が組み合わされ、各々がそのような間欠的サイクリングレジメンによって投与される場合、異なる薬剤の個別の用量が互いに組み合わされ得る。特定の態様では、第２の薬剤の１回以上の用量は、第１の薬剤の１回の用量後、ある期間に投与される。特定の実施形態では、第２の薬剤の各用量は、第１の薬剤の１回の用量後、ある期間に投与される。特定の態様では、第１の薬剤の各用量は、第２の薬剤の１回の用量によりある期間後に続く。いくつかの実施形態では、第１の薬剤の２回以上の用量は、第２の薬剤の少なくとも１対の用量の間で投与され、特定の態様では、第２の薬剤の２回以上の用量は、第１の薬剤の少なくとも１対の用量の間で投与される。いくつかの実施形態では、同じ薬剤の異なる用量は、共通の時間間隔で隔てられ、いくつかの実施形態では、同じ薬剤の異なる用量の間の時間間隔は変動する。特定の態様では、抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートおよび第２の薬剤の異なる用量は、共通の時間間隔で互いに隔てられ、いくつかの実施形態では、異なる薬剤の異なる用量は、異なる時間間隔で互いに隔てられる。
【0222】
２つの間欠的サイクル化投薬レジメンを相互に組み合わせるための１つの例示的プロトコルは、（ａ）治療有効量の抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートが患者に投与される第１の投薬期間と、（ｂ）第１の休止期間と、（ｃ）治療有効量の第２の薬剤が患者に投与される第２の投薬期間と、（ｄ）第２の休止期間と、を含むことができる。２つの間欠的サイクル化投薬レジメンを相互に組み合わせるための第２の例示的プロトコルは、（ａ）治療有効量の第２の薬剤が患者に投与される第１の投薬期間と、（ｂ）第１の休止期間と、（ｃ）治療有効量の抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートが患者に投与される第２の投薬期間と、（ｄ）第２の休止期間と、を含むことができる。
【0223】
いくつかの実施形態では、第１の休止期間および第２の休止期間は、同じ時間または日数に対応し得る。代替的に、いくつかの実施形態では、第１の休止期間および第２の休止期間は異なり、第１の休止期間が第２の休止期間よりも長いか、またはその逆のいずれかである。いくつかの実施形態では、休止期間の各々は、１２０時間、９６時間、７２時間、４８時間、２４時間、１２時間、６時間、３０時間、１時間以下に対応する。いくつかの実施形態では、第２の休止期間が第１の休止期間よりも長い場合、これは数時間よりも数日または数週間（例えば、１日、３日、５日、１週間、２週間、４週間以上）として定義され得る。
【0224】
第１の休止期間の長さが特定の生物または治療事象の存在または発生によって決定される場合、第２の休止期間の長さは、別々のまたは組み合わされた、異なる因子に基づいて決定され得る。例示的なそのような因子には、治療が投与されるがんのタイプおよび／または病期、抗体、融合タンパク質もしくはコンジュゲートの特性（例えば、薬物動態特性）、および／または抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートによる療法に対する患者の応答のうちの１つ以上の特徴が含まれ得る。いくつかの実施形態では、一方または両方の休止期間の長さは、投与薬剤の一方または他方の（例えば、血漿濃度レベルを介して評価されるような）薬物動態特性に照らして調整され得る。例えば、関連薬剤の血漿濃度が、任意選択で個体の応答の１つ以上の特徴の評価または他の考慮時に所定のレベルを下回る場合、関連休止期間は完了したとみなされ得る。
【0225】
特定の態様では、特定の薬剤が投与されるサイクル数は、経験的に決定され得る。また、いくつかの実施形態では、後に続く正確なレジメン（例えば、用量の回数、用量の間隔（例えば、互いにまたは別の療法の投与のような別の事象に対する）用量の量など）は、１つ以上のサイクルについて１つ以上の他のサイクルと比べて異なり得る。
【0226】
抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートおよび第２の薬剤は、任意の好適な投与経路を介して一緒にまたは独立して投与することができる。抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートおよび第２の薬剤は、経口、（例えば、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、もしくは硬膜外注射による）局所、または鼻腔内投与から独立して選択される投与経路を介して投与され得る。特定の実施形態によれば、抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートおよび第２の薬剤は両方とも、経口的に（例えば、錠剤形態、カプセル形態、液体形態などで）同時（同じ医薬組成物もしくは別個の医薬組成物において）または連続してかのいずれかで投与される。
【0227】
医薬組成物を個体に投与する前に、ＯＶを個体に投与することによってがん細胞に感染させることを方法がさらに含む場合、がん細胞に感染させるために任意の好適な投与レジメンを用いることができる。ポックスウイルスの複製は細胞質で起こり、これは、ウイルスが十分に複雑で、ゲノム複製に必要なすべての機能を獲得しているからである。細胞質に入ると、コアに付随するウイルス酵素によって遺伝子発現が実施される。発現は２つの段階に分けられる：初期遺伝子はゲノムの約５０％を占め、ゲノム複製の前に発現され、後期遺伝子はゲノム複製の後に発現される。発現の時間的な制御は、活性のＤＮＡ複製に依存する後期プロモーターによって提供される。ゲノム複製には、自己プライミングすることが関わり、これが高分子量コンカテマーの形成をもたらし、それがその後切断および修復されてウイルスゲノムを作製すると考えられている。ウイルスのアセンブリは細胞骨格中で起こり、おそらく細胞骨格タンパク質（例えば、アクチン結合タンパク質）との相互作用を伴う。細胞質に内包物が形成され、それがウイルス粒子に成熟する。ワクシニアウイルスは、宿主細胞の細胞質でのみ複製するため、ＤＮＡウイルスの中でも独特である。したがって、ウイルスＤＮＡ複製に必要な様々な酵素やタンパク質をコードするために大きなゲノムが必要である。複製中、ワクシニアは外膜が異なるいくつかの感染形態を生成する：細胞内成熟ビリオン（ＩＭＶ）、細胞内エンベロープビリオン（ＩＥＶ）、細胞関連エンベロープビリオン（ＣＥＶ）、および細胞外エンベロープビリオン（ＥＥＶ）。
【0228】
がん細胞をＯＶに感染させるために、ＯＶは好適な投与経路を使用して投与される。投与経路は、がんの位置および性質によって異なり得、例えば、皮内、経皮、非経口、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮下、局所（例えば、腫瘍の近く、特に腫瘍の血管系もしくは隣接する血管系））、経皮、気管内、腹腔内、動脈内、膀胱内、腫瘍内、吸入、灌流、洗浄、ならびに経口投与および製剤化を含み得る。腫瘍内注射、または腫瘍血管系への直接注射は、個別の、固形の、アクセス可能な腫瘍のために特に企図されている。局所（ｌｏｃａｌ）、局所（ｒｅｇｉｏｎａｌ）または全身投与も適切な場合がある。ウイルス粒子は、例えば、約１ｃｍ間隔で、腫瘍に複数回の注射を投与することによって有利に接触させることができる。連続投与はまた、適切な場合、例えば、腫瘍または腫瘍血管系にカテーテルを移植することによって適用され得る。そのような連続灌流は、例えば、投与開始後、約１～２時間、約２～６時間、約６～１２時間、または約１２～２４時間の期間にわたって起こり得る。投与レジメンは様々であり得、多くの場合、腫瘍のタイプ、腫瘍の位置、疾患の進行、および患者の健康と年齢に依存する。特定のタイプの腫瘍はより積極的な治療を必要とするが、同時に、特定の患者はより多くの負担となるプロトコルに耐えることができない。臨床医はそのような決定を下すのに最も適している。
【0229】
核酸構築物の注射は、発現構築物が注射に必要な針の特定のゲージを通過することができる限り、注射器または溶液の注射に使用される任意の他の方法によって送達することができる。ＯＶの投与に使用され得る例示的な無針注射システムは、米国特許第５，８４６，２３３号に例示されている。このシステムは、溶液を保持するためのアンプルチャンバーを画定するノズルと、溶液をノズルから送達部位に押し出すためのエネルギーデバイスと、を特徴とする。別の例示的な注射器システムは、任意の深さで正確に所定量の溶液の複数回の注射を可能にするものである（米国特許第５，８４６，２２５号）。ＯＶ粒子またはそれをコードする核酸の混合物は、１つ以上の賦形剤、担体、または希釈剤と好適に混合された水中で調製してもよい。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物、ならびに油中で調製されてもよい。
【0230】
医師は、所望の治療効果を達成するために必要とされるレベルよりも低いレベルでＯＶベクターの用量を処方し始め、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させてもよい。代替的に、医師は、１回の用量のＯＶベクターを投与することによって治療レジメンを開始し、その後、治療効果が達成されるまで、例えば、１つ以上の腫瘍の体積の減少まで、漸進的により低い用量を投与してもよい。
【0231】
以下の実施例は、限定ではなく例示として提供される。
【実施例】
【0232】
実験
実施例１―抗体の生成
Ｗｙｅｔｈ ＶＶ株からのＡ５６またはＢ５配列（それぞれ配列番号１８０および配列番号１８１）を使用して、ワクシニアウイルスＡ５６（ＣＨＯ－Ａ５６）またはＢ５カプシドタンパク質（ＣＨＯ－Ｂ５）のいずれかを発現する安定したＣＨＯ細胞株を生成した。水酸化アルミニウム（５ｍｇ／注射）およびＣｐＧ（カタログ番号ＯＤＮ１８２６、２０μｇ／注射）と混合したＣＨＯ－Ａ５６細胞およびＣＨＯ－Ｂ５細胞の混合物（最初の注射では細胞型当たり３０００万、その後の注射では４５００万）による連続的な半月ごとの皮下免疫により、ニュージーランドホワイトラビットにおいて抗体を育成した。１０回目の注射の１週間後、ウサギを安楽死させ、脾臓を採取した（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）。Ｂａｂｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１）に従って、Ｂ細胞を培養および単離した。ＶＶ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ株ＶＶｄｄ（ｅＧＦＰ）（Ｏｔｔａｗａ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＯＨＲＩ）のＪｏｈｎ Ｂｅｌｌ博士から贈呈、配列番号１８２および１８３）に感染したＯＶＣＡＲ３細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＴＢ－１６１）への結合についてＢ細胞上清をフローサイトメトリーによりスクリーニングすることによって抗体を同定した（データは示していない）。培養Ｂ細胞から抗体をクローニングするために、凍結細胞を解凍し、Ａ５６．ｈＦｃまたはＢ５．ｈＦｃ溶血性プラークアッセイによって分析した。ヒトＦｃ融合タンパク質は、表２および４に示すように、Ｗｙｅｔｈ ＶＶ株からのＡ５６またはＢ５配列を使用して社内で生成した。単離された単一Ｂ細胞を溶解し、抗体Ｖ遺伝子をＲＴ－ＰＣＲによって増幅した。次に、マッチした抗体の重鎖および軽鎖に対応するＰＣＲ産物を、ヒトＩｇＧ１定常領域およびＩｇκ定常領域構築物（ｐＴＴ５／ＩｇＧ１、ｐＴＴ５／Ｉｇｋ）にクローニングした。組換え抗体を産生するために、ＶＨおよびＶＬ鎖プラスミドを、２９３ｆｅｃｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号１２３４７０１９）を使用してＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞にトランスフェクトした。９６時間の分泌後、抗体を含有する上清から、遠心分離および滅菌濾過（０．２２μｍ）により細胞を除去した。ＡＫＴＡＥｘｐｒｅｓｓシステム上でＨｉＴｒａｐ Ｍａｂ Ｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム（ＧＥ、カタログ番号：１１００３４９５）およびＨｉＰｒｅｐ ２６／１０ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム（ＧＥ、カタログ番号１７５０８７０１）を使用して抗体を精製した。抗体の純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＵＰＬＣ－ＳＥＣおよびＬＣ－ＭＳによって試験した。生成された抗体の配列を表１および３に示す。抗体ＩＤおよびフォーマットを以下の表１５に示す。
実施例１―抗体の生成
Ｗｙｅｔｈ ＶＶ株からのＡ５６またはＢ５配列（それぞれ配列番号１８０および配列番号１８１）を使用して、ワクシニアウイルスＡ５６（ＣＨＯ－Ａ５６）またはＢ５カプシドタンパク質（ＣＨＯ－Ｂ５）のいずれかを発現する安定したＣＨＯ細胞株を生成した。水酸化アルミニウム（５ｍｇ／注射）およびＣｐＧ（カタログ番号ＯＤＮ１８２６、２０μｇ／注射）と混合したＣＨＯ－Ａ５６細胞およびＣＨＯ－Ｂ５細胞の混合物（最初の注射では細胞型当たり３０００万、その後の注射では４５００万）による連続的な半月ごとの皮下免疫により、ニュージーランドホワイトラビットにおいて抗体を育成した。１０回目の注射の１週間後、ウサギを安楽死させ、脾臓を採取した（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）。Ｂａｂｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１）に従って、Ｂ細胞を培養および単離した。ＶＶ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ株ＶＶｄｄ（ｅＧＦＰ）（Ｏｔｔａｗａ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＯＨＲＩ）のＪｏｈｎ Ｂｅｌｌ博士から贈呈、配列番号１８２および１８３）に感染したＯＶＣＡＲ３細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＴＢ－１６１）への結合についてＢ細胞上清をフローサイトメトリーによりスクリーニングすることによって抗体を同定した（データは示していない）。培養Ｂ細胞から抗体をクローニングするために、凍結細胞を解凍し、Ａ５６．ｈＦｃまたはＢ５．ｈＦｃ溶血性プラークアッセイによって分析した。ヒトＦｃ融合タンパク質は、表２および４に示すように、Ｗｙｅｔｈ ＶＶ株からのＡ５６またはＢ５配列を使用して社内で生成した。単離された単一Ｂ細胞を溶解し、抗体Ｖ遺伝子をＲＴ－ＰＣＲによって増幅した。次に、マッチした抗体の重鎖および軽鎖に対応するＰＣＲ産物を、ヒトＩｇＧ１定常領域およびＩｇκ定常領域構築物（ｐＴＴ５／ＩｇＧ１、ｐＴＴ５／Ｉｇｋ）にクローニングした。組換え抗体を産生するために、ＶＨおよびＶＬ鎖プラスミドを、２９３ｆｅｃｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号１２３４７０１９）を使用してＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞にトランスフェクトした。９６時間の分泌後、抗体を含有する上清から、遠心分離および滅菌濾過（０．２２μｍ）により細胞を除去した。ＡＫＴＡＥｘｐｒｅｓｓシステム上でＨｉＴｒａｐ Ｍａｂ Ｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム（ＧＥ、カタログ番号：１１００３４９５）およびＨｉＰｒｅｐ ２６／１０ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム（ＧＥ、カタログ番号１７５０８７０１）を使用して抗体を精製した。抗体の純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＵＰＬＣ－ＳＥＣおよびＬＣ－ＭＳによって試験した。生成された抗体の配列を表１および３に示す。抗体ＩＤおよびフォーマットを以下の表１５に示す。
【表15】
【0233】
実施例２―Ａ５６およびＢ５抗原への抗体の結合
Ｌｅｎｔｉ－ｘ２９３Ｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６３２１８１）細胞を使用して安定した細胞株を生成し、細胞表面上に抗原Ａ５６（Ｗｙｅｔｈ ＶＶ配列）またはＢ５（Ｗｙｅｔｈ ＶＶ配列）を発現するＨＥＫ－Ａ５６（ＧＦＰ）およびＨＥＫ－Ｂ５（ＧＦＰ）細胞を生成した。Ａ５４９（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＣＬ－１８５）およびＣａＯｖ３（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＴＢ－７５）腫瘍細胞は、適切な培地（Ａ５４９：Ｆ－１２Ｋ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２１１２７－０２２）；ＣａＯＶ３：１０％ＦＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５－０１５－ＣＶ）を補充した、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１９９５－０４０））中で８０～９０％のコンフルエンスまで成長させた。細胞を、無血清ＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ１０４９１－０１）中の感染多重度０．５でＶＶｄｄ（ｅＧＦＰ）に感染させ、５％ＣＯ２中３７℃で６．５時間インキュベートした。ウェルを増殖培地１：２で補充し、さらに一晩インキュベートした。Ａ５４９細胞をトリプシン処理し、ＣａＯＶ３細胞と一緒に、９６ウェルＶ底プレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、カタログ番号８２．１５８３．００１）にウェル当たり約１×１０５個の細胞でプレーティングした。対応する非感染Ａ５４９およびＣａＯＶ３細胞、ならびにＨＥＫ－Ａ５６（ＧＦＰ）、ＨＥＫ－Ｂ５（ＧＦＰ）およびＨＥＫ－ＷＴ細胞株もウェル当たり４×１０４個の細胞でプレーティングした。抗ワクシニアウイルスウサギポリクローナル抗体（ＣｅｄａｒＬａｎｅ、カタログ番号ＬＳ－Ｃ１０３２８９）を陽性対照として使用した。
Ｌｅｎｔｉ－ｘ２９３Ｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６３２１８１）細胞を使用して安定した細胞株を生成し、細胞表面上に抗原Ａ５６（Ｗｙｅｔｈ ＶＶ配列）またはＢ５（Ｗｙｅｔｈ ＶＶ配列）を発現するＨＥＫ－Ａ５６（ＧＦＰ）およびＨＥＫ－Ｂ５（ＧＦＰ）細胞を生成した。Ａ５４９（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＣＬ－１８５）およびＣａＯｖ３（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＴＢ－７５）腫瘍細胞は、適切な培地（Ａ５４９：Ｆ－１２Ｋ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２１１２７－０２２）；ＣａＯＶ３：１０％ＦＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５－０１５－ＣＶ）を補充した、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１９９５－０４０））中で８０～９０％のコンフルエンスまで成長させた。細胞を、無血清ＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ１０４９１－０１）中の感染多重度０．５でＶＶｄｄ（ｅＧＦＰ）に感染させ、５％ＣＯ２中３７℃で６．５時間インキュベートした。ウェルを増殖培地１：２で補充し、さらに一晩インキュベートした。Ａ５４９細胞をトリプシン処理し、ＣａＯＶ３細胞と一緒に、９６ウェルＶ底プレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、カタログ番号８２．１５８３．００１）にウェル当たり約１×１０５個の細胞でプレーティングした。対応する非感染Ａ５４９およびＣａＯＶ３細胞、ならびにＨＥＫ－Ａ５６（ＧＦＰ）、ＨＥＫ－Ｂ５（ＧＦＰ）およびＨＥＫ－ＷＴ細胞株もウェル当たり４×１０４個の細胞でプレーティングした。抗ワクシニアウイルスウサギポリクローナル抗体（ＣｅｄａｒＬａｎｅ、カタログ番号ＬＳ－Ｃ１０３２８９）を陽性対照として使用した。
【0234】
抗Ａ５６抗体（Ａ０４７、Ａ０４９、Ａ０５０またはＡ０５４）、抗Ｂ５抗体（Ａ０４８またはＡ０５１）、およびヒトＩｇＧアイソタイプ対照（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ５１５４）を細胞に添加し、氷上で２５分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４５０Ｇで４分間遠心分離し、１：１００ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７コンジュゲート抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１１５－６０５－０４６）またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１０９－６０５－０９８）と、１：１０００の固定可能生存率色素ｅＦｌｕｏｒ ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５－０８６５－１４）と室温（ＲＴ）で１５分間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞をＩＣ固定緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００－８２２２－４９）で１０分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中の１％ＦＢＳに再懸濁させ、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０ ＨＴＳシステム上でフローサイトメトリーにより分析し、ＦｌｏｗＪｏ Ｖ １０．５．３ Ｓｏｆｔｗａｒｅでデータ処理した。データは、ＶＶ ＶＶｄｄ（ｅＧＦＰ）感染細胞への抗体の結合を示している（図１）。抗Ａ５６抗体はＨＥＫ－Ａ５６（ＧＦＰ）細胞に、抗Ｂ５抗体はＨＥＫ－Ｂ５（ＧＦＰ）細胞に、特異的に結合する（図２）。陰性対照（ＨＥＫ親細胞、感染していないＡ５４９またはＣａＯＶ３細胞、および、やはりＨＥＫ細胞中で発現された無関係なＶＶ抗原Ａ３３）への結合は観察されなかった（データは示していない）。アイソタイプ対照ｈＩｇＧは、細胞への結合を示さなかった。
【0235】
市販の抗Ｂ５抗体（Ｉｍｍｕｎｅｔｅｃｈ、カタログ番号ＩＴ－０１２－００９Ｍ１、ＶＶ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ免疫原を使用して育成）を、Ｂ５抗原への結合について試験した。フローサイトメトリーにより、抗ワクシニアウサギポリクローナル抗体の希釈系列を、上記と同様のアッセイ条件で、Ｉｍｍｕｎｅｔｅｃｈ抗Ｂ５抗体（「ＩＴ抗Ｂ５ ＩｇＧ」）およびアイソタイプ対照と比較した。ＩＴ抗Ｂ５ ＩｇＧおよびマウスアイソタイプ対照のマウス抗体検出には、ヤギ抗マウスＡ６４７（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１１５－００５－１４６）を使用した。ＩＴ抗Ｂ５ ＩｇＧは、ＨＥＫ－Ｂ５細胞に結合しなかった（図３、上部パネル）。Ｂ５．ｈＦｃ可溶性抗原への結合を評価するためのＥＬＩＳＡにより、この抗体はＶＶ ＷｙｅｔｈＢ５配列に基づいて作製されたＢ５試薬と結合しないことが確認された。このアッセイでは、Ｂ５．ｈＦｃをｍａｘｉｓｏｒｐプレート上に２μｇ／ｍｌでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。標準的なＥＬＩＳＡ手順に従って、プレートを洗浄し、５％脱脂粉乳でブロックし、一次抗体をブロック中で１時間ＲＴインキュベートし、洗浄した。二次検出は、ヤギ抗ｍＩｇＧ Ｆｃ ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１１５－０３５－０７１）または抗Ｒｂ ＩｇＧ Ｆｃ ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１１－０３５－０４６）を使用して、ＲＴで１時間行い、その後洗浄し、５０μｌ／ウェルのＴＭＢＫ－Ｂｌｕｅ（Ｎｅｏｇｅｎ、＃３０８１７５）を添加し、次に５０μｌ／ウェルの１Ｎ ＨＣｌを添加した。標準的なＥＬＩＳＡにより、ＩＴ抗Ｂ５ ＩｇＧは、Ｂ５．ｈＦｃ可溶性抗原への結合について陰性であった（図３、下のパネル）。
【0236】
ＩＴ抗Ｂ５ ＩｇＧを、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＶＶｄｄｅＧＦＰに感染したＡ５４９およびＨＴ２９細胞への結合についても試験した。Ａ５４９およびＨＴ２９細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＨＴＢ－３８、ＭｃＣｏｙ ５Ａ培地（Ｇｉｂｃｏ＃１６６００－０８２）＋１０％ＦＢＳ中で培養）を８０～９０％のコンフルエンスまで培養した。細胞を、無血清ＲＰＭＩ中感染多重度１におけるＶＶｄｄ（ｅＧＦＰ）で感染させた。細胞を５％ＣＯ２中３７℃で６．５時間インキュベートし、増殖培地１：２を補充し、さらに一晩インキュベートした。細胞をトリプシン処理し、９６ウェルＶ底プレートにウェル当たり約１×１０５個の細胞でプレーティングした。抗Ｂ５抗体Ａ０４８ ｈＩｇＧ１およびＩＴ抗Ｂ５ ＩｇＧ、ならびにヒトアイソタイプ対照を細胞に添加し、氷上で２５分間インキュベートした。細胞を洗浄し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７コンジュゲート化抗ヒトＩｇＧおよび抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、＃１１５－６０５－１６４）、続いて１：１０００固定可能生存率色素ｅＦｌｕｏｒ７８０を使用して、上記のように抗体を検出した。ＰＢＳ中の１％ＦＢＳで２回洗浄、固定および再懸濁させた後、試料をＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０ ＨＴＳシステム上でフローサイトメトリーによって分析した。データは、Ａ０４８抗体がＩＴ抗Ｂ５ ＩｇＧよりも強く、ウエスタンリザーブＶＶｄｄｅＧＦＰに感染したＡ５４９およびＨＴ２９細胞に結合することを示している（図４）。感染したＡ５４９細胞およびＨＴ２９細胞へのＡ０４８抗体の結合に関するＥＣ５０は、それぞれ６ｎＭおよび１．１ｎＭである。感染したＡ５４９細胞およびＨＴ２９細胞へのＩＴ抗Ｂ５ ＩｇＧの結合に関するＥＣ５０は、それぞれ７８ｎＭおよび１５．８ｎＭである。
【0237】
実施例３―マウスおよびウサギ抗体への再フォーマット
抗体を完全ウサギＩｇＧまたはキメラウサギ／マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃ抗体に再フォーマットし、ＨＥＫ２９３細胞で発現させ、前述のように精製した。上記のように、ＶＶｄｄ（ｅＧＦＰ）に感染したＡ５４９細胞を、ウサギＩｇＧ、またはマウスもしくはヒトのキメラとしての抗体による結合について試験した。抗Ａ５６抗体（Ａ０５６、Ａ０４９、Ａ０５９）および抗Ｂ５抗体（Ａ０７３、Ａ０４８、Ａ０５８）、ならびにウサギＩｇＧアイソタイプ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号０１１－０００－００３）、ヒトＩｇＧアイソタイプ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｉ５１５４）およびマウスＩｇＧアイソタイプ（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＭＡＢ００４）を感染細胞に添加し、氷上で２５分間インキュベートした。細胞を洗浄し、１：１００ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７コンジュゲート化抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１１５－６０５－０４６）、または抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１０９－６０５－０９８）、または抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１１５－６０５－１６４）、１：１０００ ＤＡＰＩ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２２８０１）とＲＴで１５分間インキュベートした、洗浄および固定に続いて、試料をフローサイトメトリーで分析した。データは、すべてのフォーマットが同様のＥＣ５０でＶＶ ＶＶｄｄ（ｅＧＦＰ）感染細胞に結合することを確認する（図５、表１６）。感染していない細胞への結合、またはアイソタイプ対照による結合は観察されなかった。
抗体を完全ウサギＩｇＧまたはキメラウサギ／マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃ抗体に再フォーマットし、ＨＥＫ２９３細胞で発現させ、前述のように精製した。上記のように、ＶＶｄｄ（ｅＧＦＰ）に感染したＡ５４９細胞を、ウサギＩｇＧ、またはマウスもしくはヒトのキメラとしての抗体による結合について試験した。抗Ａ５６抗体（Ａ０５６、Ａ０４９、Ａ０５９）および抗Ｂ５抗体（Ａ０７３、Ａ０４８、Ａ０５８）、ならびにウサギＩｇＧアイソタイプ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号０１１－０００－００３）、ヒトＩｇＧアイソタイプ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｉ５１５４）およびマウスＩｇＧアイソタイプ（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＭＡＢ００４）を感染細胞に添加し、氷上で２５分間インキュベートした。細胞を洗浄し、１：１００ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７コンジュゲート化抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１１５－６０５－０４６）、または抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１０９－６０５－０９８）、または抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１１５－６０５－１６４）、１：１０００ ＤＡＰＩ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２２８０１）とＲＴで１５分間インキュベートした、洗浄および固定に続いて、試料をフローサイトメトリーで分析した。データは、すべてのフォーマットが同様のＥＣ５０でＶＶ ＶＶｄｄ（ｅＧＦＰ）感染細胞に結合することを確認する（図５、表１６）。感染していない細胞への結合、またはアイソタイプ対照による結合は観察されなかった。
【表16】
【0238】
実施例４―ウイルス感染組織への抗体の結合
第０日目において、ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスに１×１０６個のＭＣ３８細胞を移植した。一部のマウスでは、ＭＣ３８移植後１１日目と１３日目にＶＶｄｄ（ｅＧＦＰ）をＩＴ投与し（１００μｌ中２．５×１０７ｐｆｕ）、１６日目にマウスを安楽死させた。ＭＣ３８腫瘍を有する対照マウスをＶＶｄｄ（ｅＧＦＰ）の代わりにＰＢＳで処理し、移植後１２日目に安楽死させた。腫瘍組織を１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）中に収集した。組織をホルマリン固定し、パラフィン包埋し、切片化し、染色した。Ｈ＆Ｅ染色画像を、Ａｐｅｒｉｏ ＳｃａｎＳｃｏｐｅ ＡＴ２デジタルスライドスキャナーを使用してスキャンした。標準的なプロトコルに従って、組織を脱パラフィン化し、再水和した。熱誘導エピトープ回復（ｈｅａｔ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）のために、組織を抗原レトリバー（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｃ９９９－１００ＭＬ）中で１２１℃で２０分間オートクレーブ処理した。冷却後、スライドをＰＢＳで２回すすぎ、疎水性バリアを作製するためにＰＡＰペンを用いて切片を隔離した。組織を２００μｌの洗浄緩衝液（ＰＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０、０．１％ＢＳＡ）で水和させた。ＰＢＳ中の０．２％Ｔｒｉｔｏｎを使用して組織をＲＴで１０分間透過処理し、３回洗浄した。切片をブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中５％正常ヤギ血清、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、０．１％ＢＳＡ）で６０分間ブロックした。ブロッキング緩衝液を除去した後、抗体希釈液（ＰＢＳ中１％正常ヤギ血清、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、０．１％ＢＳＡ）中の一次抗体を切片に適用し、４℃で一晩インキュベートした。Ａ０４９（Ａｎｔｉ－Ａ５６）ｈＩｇＧ１は１２．５μｇ／ｍｌで使用し、陽性対照のポリクローナルウサギ抗ワクシニアウイルス抗体（ＣｅｄａｒＬａｎｅ、カタログ番号ＬＳ－Ｃ１０３２８９）は１：１００で使用した。ヒトＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ５１５４）およびウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号０１１－０００－００３）アイソタイプ対照は２５μｇ／ｍｌで使用した。翌日、組織を洗浄し、二次抗体（２００μｌ）を抗体希釈液中に調製し、暗所で室温で１．５時間インキュベートした。ヒト一次抗体で染色された組織は、１：１００におけるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５４９コンジュゲート化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１０９－５８５－００３）を用いて検出され、ウサギ一次抗体は１０μｇ／ｍｌにおけるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ Ｐｌｕｓ ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号Ａ３２７３１）を用いて検出した。インキュベーション後、スライドを３回、各５分間洗浄した。Ｈｏｅｃｈｓｔ染色（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｂ２２６１）を１μｇ／ｍｌで組織に添加し、１０分間インキュベートした後、過剰分を除去した。カバースリップにＦｌｕｏｒｏｍｏｎｔ－Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号０１００－０１）を追加し、Ｌｅｉｃａ ＳＰ５Ｘ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅを使用してイメージングした。データは、Ａ０４９のＶＶ ＶＶｄｄ（ｅＧＦＰ）感染腫瘍組織への結合を確認し、感染していない腫瘍組織への結合は観察されなかった（図６）。ポリクローナルウサギ抗ワクシニアウイルス抗体は、感染していない腫瘍組織への非特異的結合を示す。
第０日目において、ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスに１×１０６個のＭＣ３８細胞を移植した。一部のマウスでは、ＭＣ３８移植後１１日目と１３日目にＶＶｄｄ（ｅＧＦＰ）をＩＴ投与し（１００μｌ中２．５×１０７ｐｆｕ）、１６日目にマウスを安楽死させた。ＭＣ３８腫瘍を有する対照マウスをＶＶｄｄ（ｅＧＦＰ）の代わりにＰＢＳで処理し、移植後１２日目に安楽死させた。腫瘍組織を１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）中に収集した。組織をホルマリン固定し、パラフィン包埋し、切片化し、染色した。Ｈ＆Ｅ染色画像を、Ａｐｅｒｉｏ ＳｃａｎＳｃｏｐｅ ＡＴ２デジタルスライドスキャナーを使用してスキャンした。標準的なプロトコルに従って、組織を脱パラフィン化し、再水和した。熱誘導エピトープ回復（ｈｅａｔ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）のために、組織を抗原レトリバー（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｃ９９９－１００ＭＬ）中で１２１℃で２０分間オートクレーブ処理した。冷却後、スライドをＰＢＳで２回すすぎ、疎水性バリアを作製するためにＰＡＰペンを用いて切片を隔離した。組織を２００μｌの洗浄緩衝液（ＰＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０、０．１％ＢＳＡ）で水和させた。ＰＢＳ中の０．２％Ｔｒｉｔｏｎを使用して組織をＲＴで１０分間透過処理し、３回洗浄した。切片をブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中５％正常ヤギ血清、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、０．１％ＢＳＡ）で６０分間ブロックした。ブロッキング緩衝液を除去した後、抗体希釈液（ＰＢＳ中１％正常ヤギ血清、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、０．１％ＢＳＡ）中の一次抗体を切片に適用し、４℃で一晩インキュベートした。Ａ０４９（Ａｎｔｉ－Ａ５６）ｈＩｇＧ１は１２．５μｇ／ｍｌで使用し、陽性対照のポリクローナルウサギ抗ワクシニアウイルス抗体（ＣｅｄａｒＬａｎｅ、カタログ番号ＬＳ－Ｃ１０３２８９）は１：１００で使用した。ヒトＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ５１５４）およびウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号０１１－０００－００３）アイソタイプ対照は２５μｇ／ｍｌで使用した。翌日、組織を洗浄し、二次抗体（２００μｌ）を抗体希釈液中に調製し、暗所で室温で１．５時間インキュベートした。ヒト一次抗体で染色された組織は、１：１００におけるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５４９コンジュゲート化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１０９－５８５－００３）を用いて検出され、ウサギ一次抗体は１０μｇ／ｍｌにおけるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ Ｐｌｕｓ ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号Ａ３２７３１）を用いて検出した。インキュベーション後、スライドを３回、各５分間洗浄した。Ｈｏｅｃｈｓｔ染色（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｂ２２６１）を１μｇ／ｍｌで組織に添加し、１０分間インキュベートした後、過剰分を除去した。カバースリップにＦｌｕｏｒｏｍｏｎｔ－Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号０１００－０１）を追加し、Ｌｅｉｃａ ＳＰ５Ｘ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅを使用してイメージングした。データは、Ａ０４９のＶＶ ＶＶｄｄ（ｅＧＦＰ）感染腫瘍組織への結合を確認し、感染していない腫瘍組織への結合は観察されなかった（図６）。ポリクローナルウサギ抗ワクシニアウイルス抗体は、感染していない腫瘍組織への非特異的結合を示す。
【0239】
実施例５―Ｂ５およびＡ５６タンパク質に対する抗体親和性
抗体親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００を使用して評価した。Ｓｅｒｉｅｓ ＳＣＭ５チップ上で、ＦＣ２上にＡ０４８を固定化し、ＦＣ３上にＡ０５１を固定化し、ＦＣ１はブランク固定化をした。ＥＤＣおよびＮＨＳを注入することによってセンサー表面を活性化させた。リガンドは次のように固定化した：２００μＬの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中で抗Ｂ５ Ａ０４８ ｈＩｇＧ１（１２μｇ／ｍＬ）を調製し、２００μｌの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中でＡ０５１（１２μｇ／ｍＬ）を調製した。残りの活性化基は、エタノールアミンを注入することによってブロックした。最後に、チップを５０ｍＭ ＮａＯＨで洗浄した。各抗体の約１０００ＲＵをアミン結合させた後、緩衝液でチップを平衡化した。すべての結合研究は、新たに調製され濾過されたランニング緩衝液ＨＢＳ－ＥＰ＋（ＧＥ、カタログ番号ＢＲ１００１８８）中で実行した。上昇していく濃度の抗原（１．５ｎＭ、４．６ｎＭ、１３．８ｎＭ、４１．４ｎＭ、および１２４ｎＭ）において分析物としてＢ５．ｈＦｃ（ＭＷ：１５０ｋＤａ）を３０μｌ／分の会合で２００秒間流し、その後３０分間の解離を１回行った。各サイクルの終わりに、ｐＨ１．５、１０ｍＭグリシンを３０μｌ／分で６０秒間注入することにより、ＩｇＧ捕捉表面を再生した。分析物を含まないランニング緩衝液を注入して、二重参照減算を行った。１：１ラングミュア結合を使用して曲線をフィットさせた。
抗体親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００を使用して評価した。Ｓｅｒｉｅｓ ＳＣＭ５チップ上で、ＦＣ２上にＡ０４８を固定化し、ＦＣ３上にＡ０５１を固定化し、ＦＣ１はブランク固定化をした。ＥＤＣおよびＮＨＳを注入することによってセンサー表面を活性化させた。リガンドは次のように固定化した：２００μＬの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中で抗Ｂ５ Ａ０４８ ｈＩｇＧ１（１２μｇ／ｍＬ）を調製し、２００μｌの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中でＡ０５１（１２μｇ／ｍＬ）を調製した。残りの活性化基は、エタノールアミンを注入することによってブロックした。最後に、チップを５０ｍＭ ＮａＯＨで洗浄した。各抗体の約１０００ＲＵをアミン結合させた後、緩衝液でチップを平衡化した。すべての結合研究は、新たに調製され濾過されたランニング緩衝液ＨＢＳ－ＥＰ＋（ＧＥ、カタログ番号ＢＲ１００１８８）中で実行した。上昇していく濃度の抗原（１．５ｎＭ、４．６ｎＭ、１３．８ｎＭ、４１．４ｎＭ、および１２４ｎＭ）において分析物としてＢ５．ｈＦｃ（ＭＷ：１５０ｋＤａ）を３０μｌ／分の会合で２００秒間流し、その後３０分間の解離を１回行った。各サイクルの終わりに、ｐＨ１．５、１０ｍＭグリシンを３０μｌ／分で６０秒間注入することにより、ＩｇＧ捕捉表面を再生した。分析物を含まないランニング緩衝液を注入して、二重参照減算を行った。１：１ラングミュア結合を使用して曲線をフィットさせた。
【0240】
Ａ５６抗体についても同様の実験条件を設定したが、ただし異なる濃度（０．６ｎＭ、１．９ｎＭ、５．６ｎＭ、１６．７ｎＭおよび５０ｎＭ）のＡ５６．ｈＦｃをセンサー上に流した。二価抗原Ｂ５．ｈＦｃおよびＡ５６．ｈＦｃを使用しているため、抗体との相互作用は単純な１：１結合ではない可能性があるため、見かけのＫＤが記載されている（表１７）。Ａ０５１の親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００の検出限界に達していたため、これらの条件下では測定できなかった。
【表17】
【0241】
Ａ５６．ｈＦｃまたはＢ５．ｈＦｃに対する親和性について抗体を評価した。
【0242】
実施例６―エピトープビニング
抗体は、ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号２１３４３）を使用して、製造元のプロトコルに従って２０：１の比率でビオチン化した。Ａ５４９細胞は、ＶＶｄｄ（ｅＧＦＰ）を使用してＭＯＩ ０．５で感染させ、アッセイの前日に固定した。アッセイの日に、ウイルスに感染したＡ５４９細胞を２５μｇ／ｍＬの非ビオチン化抗体とプレインキュベートし、１時間インキュベートした。次に、ビオチン化抗体（１０μｇ／ｍｌ）を９６ウェルＶ底プレートのウェルにスパイクして最終濃度を５μｇ／ｍｌにし、１時間インキュベートした。最後に、ストレプトアビジン－Ａｌｅｘａ６４７（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号０１６－６００－０８４）を使用して検出を実行し、結合したビオチン化抗体を検出した。Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ＨＴＦＣハイスループットフローサイトメーターで試料を取得した。抗オボアルブミン抗体（医薬品研究開発センター（ＣＤＲＤ）社内品）を無関係な対照ＩｇＧとして使用した。２番目の抗体をＶＡＶＣコーティングプレートに追加すると、最初の被験抗体と同様の結合が観察されるため、データは、これらの抗Ａ５６抗体がＡ５６上の異なるエピトープに結合すると見られることを示している。同様に、データは、これらの抗Ｂ５抗体がＢ５上の異なるエピトープに結合すると見られることを示している（図７）。
抗体は、ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号２１３４３）を使用して、製造元のプロトコルに従って２０：１の比率でビオチン化した。Ａ５４９細胞は、ＶＶｄｄ（ｅＧＦＰ）を使用してＭＯＩ ０．５で感染させ、アッセイの前日に固定した。アッセイの日に、ウイルスに感染したＡ５４９細胞を２５μｇ／ｍＬの非ビオチン化抗体とプレインキュベートし、１時間インキュベートした。次に、ビオチン化抗体（１０μｇ／ｍｌ）を９６ウェルＶ底プレートのウェルにスパイクして最終濃度を５μｇ／ｍｌにし、１時間インキュベートした。最後に、ストレプトアビジン－Ａｌｅｘａ６４７（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号０１６－６００－０８４）を使用して検出を実行し、結合したビオチン化抗体を検出した。Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ＨＴＦＣハイスループットフローサイトメーターで試料を取得した。抗オボアルブミン抗体（医薬品研究開発センター（ＣＤＲＤ）社内品）を無関係な対照ＩｇＧとして使用した。２番目の抗体をＶＡＶＣコーティングプレートに追加すると、最初の被験抗体と同様の結合が観察されるため、データは、これらの抗Ａ５６抗体がＡ５６上の異なるエピトープに結合すると見られることを示している。同様に、データは、これらの抗Ｂ５抗体がＢ５上の異なるエピトープに結合すると見られることを示している（図７）。
【0243】
実施例７―ウイルス粒子への抗体の結合
９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３３６８）に、重曹緩衝液（ｐＨ９．６）中の９×１０６ｐｆｕ／ｍＬのＶＶｄｄ（ｅＧＦＰ）をコーティングした（５０μｌ／ウェル）。４℃で一晩インキュベートした後、コーティングしたウェルをＰＢＳで３回洗浄し、固定緩衝液を加えて１０分間インキュベートした。次に、コーティングしたウェルを蒸留水で４回洗浄した。ウェルをＰＢＳ中の５％脱脂粉乳でＲＴで１時間ブロックした。抗体（Ａ０４９、Ａ０４７、Ａ０５０、Ａ０５４、Ａ０４８、Ａ０５１）を、２０μｇ／ｍｌの開始濃度からブロッキング緩衝液で１：４に希釈しタイトレートした。ＮＫ細胞の細胞傷害性受容体であるＮＫｐ３０は、ＶＶ Ａ５６と結合することが示されている（２）。陽性対照としてＮＫｐ３０－Ｈｉｓ（社内）可溶性タンパク質を２０μｇ／ｍＬまたは１μｇ／ｍｌで、陰性対照としてｈＩｇＧ１を試験した。ウェルを水で４回洗浄し、５０μｌ／ウェルの抗体を加え、ＲＴで１時間インキュベートした。続いて、ウェルを水で洗浄し、ブロッキング緩衝液中の０．２μｇ／ｍＬのＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗ｈＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１０９－０３５－０９８）を添加し、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄後、５０μｌ／ウェルのＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ、カタログ番号３０８１７７）を添加し、プレートをＲＴで３０分間インキュベートした。１Ｍ ＨＣｌ、５０μｌで発色を停止させた。Ｓｐｅｃｔｒｏｍａｘプレートリーダーを使用して４５０ｎｍでの吸光度を測定し、ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏを使用してデータを処理した。データは、Ａ０５４を除き試験されたすべての抗体がＶＶｄｄ（ｅＧＦＰ）のウイルス粒子に結合することを示している（図８）。
９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３３６８）に、重曹緩衝液（ｐＨ９．６）中の９×１０６ｐｆｕ／ｍＬのＶＶｄｄ（ｅＧＦＰ）をコーティングした（５０μｌ／ウェル）。４℃で一晩インキュベートした後、コーティングしたウェルをＰＢＳで３回洗浄し、固定緩衝液を加えて１０分間インキュベートした。次に、コーティングしたウェルを蒸留水で４回洗浄した。ウェルをＰＢＳ中の５％脱脂粉乳でＲＴで１時間ブロックした。抗体（Ａ０４９、Ａ０４７、Ａ０５０、Ａ０５４、Ａ０４８、Ａ０５１）を、２０μｇ／ｍｌの開始濃度からブロッキング緩衝液で１：４に希釈しタイトレートした。ＮＫ細胞の細胞傷害性受容体であるＮＫｐ３０は、ＶＶ Ａ５６と結合することが示されている（２）。陽性対照としてＮＫｐ３０－Ｈｉｓ（社内）可溶性タンパク質を２０μｇ／ｍＬまたは１μｇ／ｍｌで、陰性対照としてｈＩｇＧ１を試験した。ウェルを水で４回洗浄し、５０μｌ／ウェルの抗体を加え、ＲＴで１時間インキュベートした。続いて、ウェルを水で洗浄し、ブロッキング緩衝液中の０．２μｇ／ｍＬのＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗ｈＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１０９－０３５－０９８）を添加し、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄後、５０μｌ／ウェルのＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ、カタログ番号３０８１７７）を添加し、プレートをＲＴで３０分間インキュベートした。１Ｍ ＨＣｌ、５０μｌで発色を停止させた。Ｓｐｅｃｔｒｏｍａｘプレートリーダーを使用して４５０ｎｍでの吸光度を測定し、ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏを使用してデータを処理した。データは、Ａ０５４を除き試験されたすべての抗体がＶＶｄｄ（ｅＧＦＰ）のウイルス粒子に結合することを示している（図８）。
【0244】
実施例８―ウイルス感染に対する抗体の影響
Ａ５４９細胞を９６ウェル平底プレート（Ｆｌａｃｏｎ、カタログ番号３５３０７５）にウェル当たり５×１０４個の細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩接着させた。異なるＭＯＩ（１．５×１０６ｐｆｕ／ｍＬ（ＭＯＩ １）、１．５×１０５ｐｆｕ／ｍＬ（ＭＯＩ ０．１）および１．５×１０４ｐｆｕ／ｍＬ（ＭＯＩ ０．０１））のＶＶｄｄ（ｅＧＦＰ）を、無血清Ｆ－１２Ｋ栄養素混合物（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２１１２７－０２２）中の等体積、２０μｇ／ｍＬのＡ０４７、Ａ０４８、Ａ０４９、Ａ０５０、Ａ０５１、Ａ０５４、ｈＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ５１５４）または１：１００ワクシニアウイルスポリクローナル抗体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、カタログ番号ＬＳ－Ｃ１０３２８９）と、ＲＴで１５分間インキュベートした。細胞をＶＶｄｄ（ｅＧＦＰ）／抗体混合物で３７℃、５％ＣＯ２にて６．５時間感染させた後、１０％ＦＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３５－０１５－ＣＶロット３５０１５１２４））を補充したＦ－１２Ｋ栄養素混合物（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２１１２７－０２２）を１：２希釈で添加し、一晩培養した。インキュベーション後、付着細胞をトリプシン処理し、９６ウェルＶ底プレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、カタログ番号８２．１５８３．００１）に移された非付着細胞と並べてプレーティングした。細胞を４５０Ｇで４分間遠心分離し、１：１０００の固定可能生存率色素ｅＦｌｕｏｒ ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５－０８６５－１４）で再懸濁させ、ＲＴで１５分間インキュベートした。次に細胞をＰＢＳで洗浄し、ＩＣ固定緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００－８２２２－４９）で１０分間ＲＴで固定し、ＰＢＳで洗浄し、最後にＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ絶対数カウントビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｃ３６９５０）のウェル当たり６０００ビーズを伴う１×ＰＢＳに再懸濁させた。ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０ ＨＴＳシステム上でフローサイトメトリーによって試料を分析し、データはＦｌｏｗＪｏ Ｖ １０．５．３ Ｓｏｆｔｗａｒｅで処理した。データは、これらの抗体の添加が腫瘍細胞のＶＶｄｄ（ｅＧＦＰ）感染を阻害または低減しないことを示している（図９）。
Ａ５４９細胞を９６ウェル平底プレート（Ｆｌａｃｏｎ、カタログ番号３５３０７５）にウェル当たり５×１０４個の細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩接着させた。異なるＭＯＩ（１．５×１０６ｐｆｕ／ｍＬ（ＭＯＩ １）、１．５×１０５ｐｆｕ／ｍＬ（ＭＯＩ ０．１）および１．５×１０４ｐｆｕ／ｍＬ（ＭＯＩ ０．０１））のＶＶｄｄ（ｅＧＦＰ）を、無血清Ｆ－１２Ｋ栄養素混合物（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２１１２７－０２２）中の等体積、２０μｇ／ｍＬのＡ０４７、Ａ０４８、Ａ０４９、Ａ０５０、Ａ０５１、Ａ０５４、ｈＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ５１５４）または１：１００ワクシニアウイルスポリクローナル抗体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、カタログ番号ＬＳ－Ｃ１０３２８９）と、ＲＴで１５分間インキュベートした。細胞をＶＶｄｄ（ｅＧＦＰ）／抗体混合物で３７℃、５％ＣＯ２にて６．５時間感染させた後、１０％ＦＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３５－０１５－ＣＶロット３５０１５１２４））を補充したＦ－１２Ｋ栄養素混合物（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２１１２７－０２２）を１：２希釈で添加し、一晩培養した。インキュベーション後、付着細胞をトリプシン処理し、９６ウェルＶ底プレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、カタログ番号８２．１５８３．００１）に移された非付着細胞と並べてプレーティングした。細胞を４５０Ｇで４分間遠心分離し、１：１０００の固定可能生存率色素ｅＦｌｕｏｒ ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５－０８６５－１４）で再懸濁させ、ＲＴで１５分間インキュベートした。次に細胞をＰＢＳで洗浄し、ＩＣ固定緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００－８２２２－４９）で１０分間ＲＴで固定し、ＰＢＳで洗浄し、最後にＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ絶対数カウントビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｃ３６９５０）のウェル当たり６０００ビーズを伴う１×ＰＢＳに再懸濁させた。ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０ ＨＴＳシステム上でフローサイトメトリーによって試料を分析し、データはＦｌｏｗＪｏ Ｖ １０．５．３ Ｓｏｆｔｗａｒｅで処理した。データは、これらの抗体の添加が腫瘍細胞のＶＶｄｄ（ｅＧＦＰ）感染を阻害または低減しないことを示している（図９）。
【0245】
実施例９―抗体の熱安定性
抗体の変性温度（Ｔｍ）は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｈｉｆｔ Ｄｙｅ Ｋｉｔ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号４４６１１４６）を使用した示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）から決定した。簡単に説明すると、３１μｇ／ｍＬの抗体を各反応で使用した。キットのマニュアルに記載されている推奨設定で、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ７ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用して抗体の融解曲線を生成した。次に、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｈｉｆｔソフトウェア（ｖ．１．３）を使用して、抗体のＴｍ（表１８）を決定した。抗体のＴｍ１は、ＤＳＦによって決定した。
抗体の変性温度（Ｔｍ）は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｈｉｆｔ Ｄｙｅ Ｋｉｔ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号４４６１１４６）を使用した示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）から決定した。簡単に説明すると、３１μｇ／ｍＬの抗体を各反応で使用した。キットのマニュアルに記載されている推奨設定で、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ７ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用して抗体の融解曲線を生成した。次に、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｈｉｆｔソフトウェア（ｖ．１．３）を使用して、抗体のＴｍ（表１８）を決定した。抗体のＴｍ１は、ＤＳＦによって決定した。
【表18】
【0246】
実施例１０―ワクシニアＣｏｐｅｎｈａｇｅｎに感染したマウス細胞株への抗体の結合
Ｂ１６Ｆ１０（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ－６４７５）、ＣＴ２６ＬａｃＺ（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ－２６３９）およびＭＣ３８（ＯＨＲＩのＪｏｈｎ Ｂｅｌｌ博士から贈呈）腫瘍細胞を、１０ｃｍ組織培養プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１２－５５６－００２）において、適切な培地（Ｂ１６Ｆ１０：ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１９９５－０４０）、ＭＣ３８：ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１９９５－０４０）、ＣＴ２６ＬａｃＺ：ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１８７５－０９３）、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１２４８３０２０）で補足）中で８０～９０％のコンフルエンスまで成長させた。無血清ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１９９５－０４０）中０．５の感染多重度でのＶＶＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＹＦＰ）（Ｊｏｈｎ Ｂｅｌｌ博士（ＯＨＲＩ）から贈呈）で細胞を感染させ、５％ＣＯ２中６．５時間、３７℃で培養した。プレートに１：２の比率で増殖培地を補充し、さらに一晩（約１６時間）インキュベートした。Ｂ１６Ｆ１０細胞をトリプシン処理し（ＴｒｙｐＬＥ、カタログ番号１２６０４０２１）、９６ウェルＵ底プレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、カタログ番号８３．３９２５）中にウェル当たり約１×１０５個の細胞で、ＣＴ２６ＬａｃＺおよびＭＣ３８細胞と並べてプレーティングした。対応する感染していないＢ１６Ｆ１０、ＣＴ２６ＬａｃＺおよびＭＣ３８細胞も、ウェル当たり１×１０５個の細胞でプレーティングした。細胞をＰＢＳ３％ＦＢＳ（ＦＡＣｓ Ｂｕｆｆｅｒ）で２回洗浄し、１８００ｒｐｍで３分間遠心分離した。細胞をＰＢＳに再懸濁させ、１：３０００の固定可能生存率色素Ｚｏｍｂｉｅ ＮＩＲ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２３１０６）とともにＲＴで１５分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、マウスＦｃブロック（ＢＤ、カタログ番号５５３１４１）を含むＦＡＣＳ緩衝液に細胞を再懸濁させ、ＲＴで５分間インキュベートした。さらに洗浄することなく、細胞を、１：１００の抗Ａ５６－ＰＥ（Ａ０５６、Ｒｂ ＩｇＧ）、１：１００の抗Ｂ５－ＰＥ（Ａ０７３、Ｒｂ ＩｇＧ）、または１：１００の抗ワクシニアウイルスウサギポリクローナル抗体（ＣｅｄａｒＬａｎｅ、カタログ番号ＬＳ－Ｃ１０３２８９）（陽性対照として機能）のいずれかで直接染色し、４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、再懸濁させた。抗ワクシニアウイルス一次抗体を受け取ったウェルは次に１：１００の抗ウサギＩｇＧ－ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４０６４２１）で染色し、４℃でさらに２０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣ緩衝液でさらに洗浄した後、ＩＣ固定緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００－８２２２－４９）で１０分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させ、ＣｙｔｅｋＡｕｒｏｒａフローサイトメーター上でフローサイトメトリーにより分析した。ＦｌｏｗＪｏＶ１０．５．３ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してデータを処理した。データは、各感染細胞株におけるパーセントＹＦＰ発現を示し、ＶＶＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＹＦＰ）に感染した細胞の割合を示している（図１０Ａ）。抗Ａ５６－ＰＥおよび抗Ｂ５－ＰＥ抗体は、ＹＦＰ陽性によればＶＶＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＹＦＰ）に感染されていたＢ１６Ｆ１０、ＣＴ２６ＬａｃＺ、およびＭＣ３８細胞と結合することが見出された（図１０Ｂ）。予想された通り、抗ワクシニアウイルスウサギポリクローナル抗体も、感染された（ＹＦＰ陽性の）細胞に結合した。感染していない陰性対照細胞への結合は観察されなかった。
Ｂ１６Ｆ１０（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ－６４７５）、ＣＴ２６ＬａｃＺ（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ－２６３９）およびＭＣ３８（ＯＨＲＩのＪｏｈｎ Ｂｅｌｌ博士から贈呈）腫瘍細胞を、１０ｃｍ組織培養プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１２－５５６－００２）において、適切な培地（Ｂ１６Ｆ１０：ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１９９５－０４０）、ＭＣ３８：ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１９９５－０４０）、ＣＴ２６ＬａｃＺ：ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１８７５－０９３）、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１２４８３０２０）で補足）中で８０～９０％のコンフルエンスまで成長させた。無血清ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１９９５－０４０）中０．５の感染多重度でのＶＶＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＹＦＰ）（Ｊｏｈｎ Ｂｅｌｌ博士（ＯＨＲＩ）から贈呈）で細胞を感染させ、５％ＣＯ２中６．５時間、３７℃で培養した。プレートに１：２の比率で増殖培地を補充し、さらに一晩（約１６時間）インキュベートした。Ｂ１６Ｆ１０細胞をトリプシン処理し（ＴｒｙｐＬＥ、カタログ番号１２６０４０２１）、９６ウェルＵ底プレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、カタログ番号８３．３９２５）中にウェル当たり約１×１０５個の細胞で、ＣＴ２６ＬａｃＺおよびＭＣ３８細胞と並べてプレーティングした。対応する感染していないＢ１６Ｆ１０、ＣＴ２６ＬａｃＺおよびＭＣ３８細胞も、ウェル当たり１×１０５個の細胞でプレーティングした。細胞をＰＢＳ３％ＦＢＳ（ＦＡＣｓ Ｂｕｆｆｅｒ）で２回洗浄し、１８００ｒｐｍで３分間遠心分離した。細胞をＰＢＳに再懸濁させ、１：３０００の固定可能生存率色素Ｚｏｍｂｉｅ ＮＩＲ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２３１０６）とともにＲＴで１５分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、マウスＦｃブロック（ＢＤ、カタログ番号５５３１４１）を含むＦＡＣＳ緩衝液に細胞を再懸濁させ、ＲＴで５分間インキュベートした。さらに洗浄することなく、細胞を、１：１００の抗Ａ５６－ＰＥ（Ａ０５６、Ｒｂ ＩｇＧ）、１：１００の抗Ｂ５－ＰＥ（Ａ０７３、Ｒｂ ＩｇＧ）、または１：１００の抗ワクシニアウイルスウサギポリクローナル抗体（ＣｅｄａｒＬａｎｅ、カタログ番号ＬＳ－Ｃ１０３２８９）（陽性対照として機能）のいずれかで直接染色し、４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、再懸濁させた。抗ワクシニアウイルス一次抗体を受け取ったウェルは次に１：１００の抗ウサギＩｇＧ－ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４０６４２１）で染色し、４℃でさらに２０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣ緩衝液でさらに洗浄した後、ＩＣ固定緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００－８２２２－４９）で１０分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させ、ＣｙｔｅｋＡｕｒｏｒａフローサイトメーター上でフローサイトメトリーにより分析した。ＦｌｏｗＪｏＶ１０．５．３ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してデータを処理した。データは、各感染細胞株におけるパーセントＹＦＰ発現を示し、ＶＶＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＹＦＰ）に感染した細胞の割合を示している（図１０Ａ）。抗Ａ５６－ＰＥおよび抗Ｂ５－ＰＥ抗体は、ＹＦＰ陽性によればＶＶＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＹＦＰ）に感染されていたＢ１６Ｆ１０、ＣＴ２６ＬａｃＺ、およびＭＣ３８細胞と結合することが見出された（図１０Ｂ）。予想された通り、抗ワクシニアウイルスウサギポリクローナル抗体も、感染された（ＹＦＰ陽性の）細胞に結合した。感染していない陰性対照細胞への結合は観察されなかった。
【0247】
実施例１１―ワクシニアＡ５６およびＢ５の免疫組織化学検出
ＨＥＫ－Ｂ５（ＧＦＰ）細胞株を、１０枚の１５ｃｍ組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５３０２５）において、適切な培地（１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１２４８３０２０）を補充したＨＥＫ－ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１９９５－０４０））中で９０％コンフルエンスまで成長させた。それに加えて、Ｕ２ＯＳ細胞（Ｊｏｈｎ Ｂｅｌｌ博士（ＯＨＲＩ）から贈呈）を、９０％のコンフルエンスまで成長させ、感染多重度０．０２５でＶＶＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＹＦＰ）に感染させ、５％ＣＯ２中３７℃で７２時間インキュベートした。ＨＥＫ－Ａ５６、ＨＥＫ－Ｂ５、ＨＥＫ－ＷＴおよびＵ２ＯＳ細胞をトリプシン処理し（ＴｒｙｐＬＥ、カタログ番号１２６０４０２１）、カウントし、１５ｍｌポリプロピレンチューブ（ＦｒｏｇｇａＢｉｏ、カタログ番号ＴＢ１５－５００）内で２×１０８個の細胞／ｍｌの濃度となるように再懸濁させた。細胞を１５００ＲＰＭで５分間遠心分離し、１ｍｌの溶融ヒストゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＨＧ－４０００－０１２）に再懸濁させ、氷上に１０分間置いて、ヒストゲルを固化させた。ヒストゲルペレットを１０ｍｌの１０％中性緩衝ホルマリン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＨＴ５０１１２８）に移し、ＲＴで２４時間放置した。免疫組織化学（ＩＨＣ）のために、ヒストゲル切片（４μｍ）を３７℃で一晩インキュベートし、脱パラフィン化し、キシレンとエタノール勾配を使用して再水和し、Ｂｉｏｃａｒｅデクローキングチャンバー（１１０℃で１５分間）においてＤｉｖａデクローカー試薬（Ｂｉｏｃａｒｅ、カタログ番号ＤＶ２００４）を使用して抗原を回復させ、Ｉｎｔｅｌｌｉｐａｔｈ ＦＬＸ Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒにロードした。Ｂｉｏｃａｒｅ試薬を使用して室温で明視野ＩＨＣを実行した。スライドを、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｄ－１（Ｂｉｏｃａｒｅ、カタログ番号ＰＸ９６８）で５分間、およびＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ Ｓｎｉｐｅｒ（Ｂｉｏｃａｒｅ、カタログ番号ＢＳ９６６）で１０分間処理した。ＤａＶｉｎｃｉ Ｇｒｅｅｎ（Ｂｉｏｃａｒｅ、カタログ番号ＰＤ９００）で希釈した一次抗体を３０分間適用した後、Ｍａｃｈ２ ＨＲＰ Ｐｏｌｙｍｅｒ（一次抗体の種に基づいてマウスまたはウサギのどちらか）（Ｂｉｏｃａｒｅ、カタログ番号ＲＨＲＰ５２０およびＭＨＲＰ５２０）を３０分間適用した。ＤＡＢ西洋ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｂｉｏｃａｒｅ、カタログ番号ＩＰＫ５０１０Ｇ８０）色原体基質をスライドに添加した。ｄＨ２Ｏで１：５に希釈したＣＡＴヘマトキシリン（Ｂｉｏｃａｒｅ、カタログ番号ＣＡＴＨＥ）をＲＴで５分間添加した。染色されたスライドを水で洗浄し、風乾し、Ｅｃｏｍｏｕｎｔ（Ｂｉｏｃａｒｅ、カタログ番号ＥＭ８９７Ｌ）を使用してカバースリップをかけた。抗体の希釈率は次の通りである：Ａ０５８抗Ｂ５、Ｒｂ／Ｍｕ ＩｇＧ２ａ：１／２８０（１０μｇ／ｍＬ）；Ａ０５９抗Ａ５６、Ｒｂ／Ｍｕ ＩｇＧ２ａ：１／５４０（１０μｇ／ｍＬ）；Ａ０５６抗Ａ５６、Ｒｂ ＩｇＧ：１／８４０（１０μｇ／ｍＬ）；Ａ０７３抗Ｂ５、Ｒｂ ＩｇＧ：１／５５０（１０μｇ／ｍＬ）。Ａ５６またはＢ５に特異的な抗体は、安定にトランスフェクトされたＨＥＫ－Ａ５６細胞およびＨＥＫ－Ｂ５細胞上の標的抗原をそれぞれ特異的に検出することができた（図１１）。代替抗原またはＨＥＫ－ＷＴ細胞に対する交差反応性は観察されなかった。抗Ａ５６抗体と抗Ｂ５抗体の両方が、感染したＵ２ＯＳ細胞上のタンパク質発現を検出することができ、感染していないＵ２ＯＳ細胞上でバックグラウンド染色は検出されなかった（図１１）。
ＨＥＫ－Ｂ５（ＧＦＰ）細胞株を、１０枚の１５ｃｍ組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５３０２５）において、適切な培地（１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１２４８３０２０）を補充したＨＥＫ－ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１９９５－０４０））中で９０％コンフルエンスまで成長させた。それに加えて、Ｕ２ＯＳ細胞（Ｊｏｈｎ Ｂｅｌｌ博士（ＯＨＲＩ）から贈呈）を、９０％のコンフルエンスまで成長させ、感染多重度０．０２５でＶＶＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＹＦＰ）に感染させ、５％ＣＯ２中３７℃で７２時間インキュベートした。ＨＥＫ－Ａ５６、ＨＥＫ－Ｂ５、ＨＥＫ－ＷＴおよびＵ２ＯＳ細胞をトリプシン処理し（ＴｒｙｐＬＥ、カタログ番号１２６０４０２１）、カウントし、１５ｍｌポリプロピレンチューブ（ＦｒｏｇｇａＢｉｏ、カタログ番号ＴＢ１５－５００）内で２×１０８個の細胞／ｍｌの濃度となるように再懸濁させた。細胞を１５００ＲＰＭで５分間遠心分離し、１ｍｌの溶融ヒストゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＨＧ－４０００－０１２）に再懸濁させ、氷上に１０分間置いて、ヒストゲルを固化させた。ヒストゲルペレットを１０ｍｌの１０％中性緩衝ホルマリン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＨＴ５０１１２８）に移し、ＲＴで２４時間放置した。免疫組織化学（ＩＨＣ）のために、ヒストゲル切片（４μｍ）を３７℃で一晩インキュベートし、脱パラフィン化し、キシレンとエタノール勾配を使用して再水和し、Ｂｉｏｃａｒｅデクローキングチャンバー（１１０℃で１５分間）においてＤｉｖａデクローカー試薬（Ｂｉｏｃａｒｅ、カタログ番号ＤＶ２００４）を使用して抗原を回復させ、Ｉｎｔｅｌｌｉｐａｔｈ ＦＬＸ Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒにロードした。Ｂｉｏｃａｒｅ試薬を使用して室温で明視野ＩＨＣを実行した。スライドを、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｄ－１（Ｂｉｏｃａｒｅ、カタログ番号ＰＸ９６８）で５分間、およびＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ Ｓｎｉｐｅｒ（Ｂｉｏｃａｒｅ、カタログ番号ＢＳ９６６）で１０分間処理した。ＤａＶｉｎｃｉ Ｇｒｅｅｎ（Ｂｉｏｃａｒｅ、カタログ番号ＰＤ９００）で希釈した一次抗体を３０分間適用した後、Ｍａｃｈ２ ＨＲＰ Ｐｏｌｙｍｅｒ（一次抗体の種に基づいてマウスまたはウサギのどちらか）（Ｂｉｏｃａｒｅ、カタログ番号ＲＨＲＰ５２０およびＭＨＲＰ５２０）を３０分間適用した。ＤＡＢ西洋ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｂｉｏｃａｒｅ、カタログ番号ＩＰＫ５０１０Ｇ８０）色原体基質をスライドに添加した。ｄＨ２Ｏで１：５に希釈したＣＡＴヘマトキシリン（Ｂｉｏｃａｒｅ、カタログ番号ＣＡＴＨＥ）をＲＴで５分間添加した。染色されたスライドを水で洗浄し、風乾し、Ｅｃｏｍｏｕｎｔ（Ｂｉｏｃａｒｅ、カタログ番号ＥＭ８９７Ｌ）を使用してカバースリップをかけた。抗体の希釈率は次の通りである：Ａ０５８抗Ｂ５、Ｒｂ／Ｍｕ ＩｇＧ２ａ：１／２８０（１０μｇ／ｍＬ）；Ａ０５９抗Ａ５６、Ｒｂ／Ｍｕ ＩｇＧ２ａ：１／５４０（１０μｇ／ｍＬ）；Ａ０５６抗Ａ５６、Ｒｂ ＩｇＧ：１／８４０（１０μｇ／ｍＬ）；Ａ０７３抗Ｂ５、Ｒｂ ＩｇＧ：１／５５０（１０μｇ／ｍＬ）。Ａ５６またはＢ５に特異的な抗体は、安定にトランスフェクトされたＨＥＫ－Ａ５６細胞およびＨＥＫ－Ｂ５細胞上の標的抗原をそれぞれ特異的に検出することができた（図１１）。代替抗原またはＨＥＫ－ＷＴ細胞に対する交差反応性は観察されなかった。抗Ａ５６抗体と抗Ｂ５抗体の両方が、感染したＵ２ＯＳ細胞上のタンパク質発現を検出することができ、感染していないＵ２ＯＳ細胞上でバックグラウンド染色は検出されなかった（図１１）。
【0248】
実施例１２―ＶＶ処理腫瘍からのＡ５６およびＢ５の免疫組織化学的検出
Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、カタログ番号０００６６４）の右後部の脇腹に、１×１０６個のＢ１６Ｆ１０（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ－６４７５）腫瘍細胞を皮下移植した。マウスは次のようにグループ化した：１用量のＶＶＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＹＦＰ）、２用量のＶＶ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＹＦＰ）、ＰＢＳ、および水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）（Ｊｏｈｎ Ｂｅｌｌ博士（ＯＨＲＩ）から贈呈）。すべての注射は、１００μｌの容量中１×１０７ＰＦＵの用量で行い、腫瘍が３５～４０ｍｍ２のサイズに達したときに腫瘍内に送達された。動物は、最初の注射から１、２、３、または７日後に安楽死させた。腫瘍を収集し、１０％中性緩衝ホルマリンで２４時間固定した。固定後、腫瘍をパラフィンワックスに包埋し、各切除腫瘍から１～５個の２ｍｍ腫瘍パンチを採取した。腫瘍パンチを配列して腫瘍組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を作製し、スライドガラス上に切片化した。ＩＨＣのために、ＴＭＡ切片（４μｍ）を３７℃で一晩インキュベートし、脱パラフィン化し、キシレンとエタノール勾配を使用して再水和し、Ｂｉｏｃａｒｅデクローキングチャンバー（１１０℃で１５分間）においてＤｉｖａデクローカー試薬（Ｂｉｏｃａｒｅ、カタログ番号ＤＶ２００４）を使用して抗原を回復させ、Ｉｎｔｅｌｌｉｐａｔｈ ＦＬＸ Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒにロードした。Ｂｉｏｃａｒｅ試薬を使用してＲＴで明視野ＩＨＣを実行した。Ｐｅｒｏｘｉｄａｚｅｄ－１（Ｂｉｏｃａｒｅ、カタログ番号ＰＸ９６８）で５分間、およびＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ Ｓｎｉｐｅｒ（Ｂｉｏｃａｒｅ、カタログ番号ＢＳ９６６）で１０分間、スライドを処理した。ＤａＶｉｎｃｉ Ｇｒｅｅｎ（Ｂｉｏｃａｒｅ、カタログ番号ＰＤ９００）で希釈した一次抗体を３０分間適用した後、Ｍａｃｈ２ ＨＲＰ Ｐｏｌｙｍｅｒ（一次抗体の種に基づいてマウスまたはウサギのどちらか）（Ｂｉｏｃａｒｅ、カタログ番号ＲＨＲＰ５２０およびＭＨＲＰ５２０）を３０分間適用した。ＤＡＢ西洋ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｂｉｏｃａｒｅ、カタログ番号ＩＰＫ５０１０Ｇ８０）色原体基質をスライドに添加した。ｄＨ２Ｏで１／５に希釈したＣＡＴヘマトキシリン（Ｂｉｏｃａｒｅ、カタログ番号ＣＡＴＨＥ）をＲＴで５分間添加した。染色されたスライドを水で洗浄し、風乾し、Ｅｃｏｍｏｕｎｔ（Ｂｉｏｃａｒｅ、カタログ番号ＥＭ８９７Ｌ）を使用してカバースリップをかけた。スライドを抗Ａ５６（Ａ０５６）または抗Ｂ５（Ａ０７３）Ｒｂ ＩｇＧで染色し、抗ウサギ二次抗体で検出した。抗体の希釈率は次の通りである：Ａ０５６抗Ａ５６、Ｒｂ ＩｇＧ：１／８４０（１０μｇ／ｍＬ）；Ａ０７３抗Ｂ５、Ｒｂ ＩｇＧ：１／５５０（１０μｇ／ｍＬ）。ＤＡＢ染色（濃い灰色）は、陽性のタンパク質検出を示す（図１２）。Ａ５６またはＢ５に対する抗体は、処理された腫瘍から採取されたコアの大部分で標的抗原を特異的に検出することができた。ＶＶＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＹＦＰ）の複数回用量を受けた腫瘍ではタンパク質検出の増加が明らかであった。ＰＢＳまたはＶＳＶで処理された腫瘍に対する交差反応性は見られなかった。これらの発見は、ワクシニアウイルスの腫瘍内送達後の、ウイルス由来のＡ５６およびＢ５タンパク質発現の特異的な検出および程度を実証している。
Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、カタログ番号０００６６４）の右後部の脇腹に、１×１０６個のＢ１６Ｆ１０（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ－６４７５）腫瘍細胞を皮下移植した。マウスは次のようにグループ化した：１用量のＶＶＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＹＦＰ）、２用量のＶＶ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＹＦＰ）、ＰＢＳ、および水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）（Ｊｏｈｎ Ｂｅｌｌ博士（ＯＨＲＩ）から贈呈）。すべての注射は、１００μｌの容量中１×１０７ＰＦＵの用量で行い、腫瘍が３５～４０ｍｍ２のサイズに達したときに腫瘍内に送達された。動物は、最初の注射から１、２、３、または７日後に安楽死させた。腫瘍を収集し、１０％中性緩衝ホルマリンで２４時間固定した。固定後、腫瘍をパラフィンワックスに包埋し、各切除腫瘍から１～５個の２ｍｍ腫瘍パンチを採取した。腫瘍パンチを配列して腫瘍組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を作製し、スライドガラス上に切片化した。ＩＨＣのために、ＴＭＡ切片（４μｍ）を３７℃で一晩インキュベートし、脱パラフィン化し、キシレンとエタノール勾配を使用して再水和し、Ｂｉｏｃａｒｅデクローキングチャンバー（１１０℃で１５分間）においてＤｉｖａデクローカー試薬（Ｂｉｏｃａｒｅ、カタログ番号ＤＶ２００４）を使用して抗原を回復させ、Ｉｎｔｅｌｌｉｐａｔｈ ＦＬＸ Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒにロードした。Ｂｉｏｃａｒｅ試薬を使用してＲＴで明視野ＩＨＣを実行した。Ｐｅｒｏｘｉｄａｚｅｄ－１（Ｂｉｏｃａｒｅ、カタログ番号ＰＸ９６８）で５分間、およびＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ Ｓｎｉｐｅｒ（Ｂｉｏｃａｒｅ、カタログ番号ＢＳ９６６）で１０分間、スライドを処理した。ＤａＶｉｎｃｉ Ｇｒｅｅｎ（Ｂｉｏｃａｒｅ、カタログ番号ＰＤ９００）で希釈した一次抗体を３０分間適用した後、Ｍａｃｈ２ ＨＲＰ Ｐｏｌｙｍｅｒ（一次抗体の種に基づいてマウスまたはウサギのどちらか）（Ｂｉｏｃａｒｅ、カタログ番号ＲＨＲＰ５２０およびＭＨＲＰ５２０）を３０分間適用した。ＤＡＢ西洋ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｂｉｏｃａｒｅ、カタログ番号ＩＰＫ５０１０Ｇ８０）色原体基質をスライドに添加した。ｄＨ２Ｏで１／５に希釈したＣＡＴヘマトキシリン（Ｂｉｏｃａｒｅ、カタログ番号ＣＡＴＨＥ）をＲＴで５分間添加した。染色されたスライドを水で洗浄し、風乾し、Ｅｃｏｍｏｕｎｔ（Ｂｉｏｃａｒｅ、カタログ番号ＥＭ８９７Ｌ）を使用してカバースリップをかけた。スライドを抗Ａ５６（Ａ０５６）または抗Ｂ５（Ａ０７３）Ｒｂ ＩｇＧで染色し、抗ウサギ二次抗体で検出した。抗体の希釈率は次の通りである：Ａ０５６抗Ａ５６、Ｒｂ ＩｇＧ：１／８４０（１０μｇ／ｍＬ）；Ａ０７３抗Ｂ５、Ｒｂ ＩｇＧ：１／５５０（１０μｇ／ｍＬ）。ＤＡＢ染色（濃い灰色）は、陽性のタンパク質検出を示す（図１２）。Ａ５６またはＢ５に対する抗体は、処理された腫瘍から採取されたコアの大部分で標的抗原を特異的に検出することができた。ＶＶＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＹＦＰ）の複数回用量を受けた腫瘍ではタンパク質検出の増加が明らかであった。ＰＢＳまたはＶＳＶで処理された腫瘍に対する交差反応性は見られなかった。これらの発見は、ワクシニアウイルスの腫瘍内送達後の、ウイルス由来のＡ５６およびＢ５タンパク質発現の特異的な検出および程度を実証している。
【0249】
実施例１３―ＶＶキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の設計およびレンチウイルス形質導入後の検出
ヒトＶＶ－ＣＡＲ構築物はすべて、ＧＭ－ＣＳＦＲαリーダー配列、それに続くＡ５６またはＢ５ｓｃＦｖ（Ａ５６：Ａ０４９、Ｂ５：Ａ０４８に由来）、ヒトＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメイン、ヒト４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメイン、およびヒトＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含有する（図１３Ａ）（３）。一部のＣＡＲ構築物には、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列によって分離されたレポータータンパク質（例えばｅＧＦＰ）が含まれていた。ＣＡＲのアミノ酸配列を表７に示す。
ヒトＶＶ－ＣＡＲ構築物はすべて、ＧＭ－ＣＳＦＲαリーダー配列、それに続くＡ５６またはＢ５ｓｃＦｖ（Ａ５６：Ａ０４９、Ｂ５：Ａ０４８に由来）、ヒトＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメイン、ヒト４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメイン、およびヒトＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含有する（図１３Ａ）（３）。一部のＣＡＲ構築物には、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列によって分離されたレポータータンパク質（例えばｅＧＦＰ）が含まれていた。ＣＡＲのアミノ酸配列を表７に示す。
【0250】
Ａ５６－ＣＡＲ－０１、Ａ５６－ＣＡＲ－０２、Ｂ５－ＣＡＲ－０３、Ｂ５－ＣＡＲ－０４、またはＡ５６－ＣＡＲ－０６をコードする遺伝子断片は、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって合成された。遺伝子断片を、第２世代トランスファープラスミド（Ｒｏｂｅｒｔ Ｈｏｌｔ博士（ＢＣ Ｃａｎｃｅｒ）から贈呈）にクローニングした。ＶＶ－ＣＡＲ構築物をコードするレンチウイルスは、標準的なリン酸カルシウムトランスフェクションプロトコル（４）および第２世代パッケージングベクター（Ｒｏｂ Ｈｏｌｔ博士（ＢＣ Ｃａｎｃｅｒ）から贈呈）を使用して生成した。各レンチウイルストランスフェクションからの５００μｌの上清を用いて、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＴＩＢ－１５２）に形質導入した。次に、Ｊｕｒｋａｔ細胞を１週間増殖させ、１×１０６個のＣＡＲ陽性細胞を、ヤギ抗Ｒｂ ＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７検出（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号１１１－６０５－０４７）に基づいて選別した。濃縮されたＪｕｒｋａｔ ＣＡＲ陽性集団を、さらに１週間増殖させ、ＨＥＫ－Ａ５６、ＨＥＫ－Ｂ５またはＨＥＫ－ＷＴ細胞との共培養アッセイにおいてプレーティングした。細胞は、１：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比（１×１０５個の総細胞数）で一晩（１６時間）培養した。翌日、細胞をＰＢＳで洗浄し、正常ヤギ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号００５－０００－００１）でブロックし、ＣＤ４５ ｖ４５０（ＢＤ、カタログ番号５６０３６７）、ＣＤ６９ ＰＥ－Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１０９１２））、抗Ｒｂ ＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７で染色した。Ａ５６－ＣＡＲ－０１、Ａ５６－ＣＡＲ－０２およびＡ５６－ＣＡＲ－０６は、標的ＨＥＫ－Ａ５６株と培養すると、細胞表面ＣＡＲ分子の下方調節を示した。細胞表面ＣＡＲ分子のそのような下方調節は、ＣＡＲの活性化を示している（図１４）。同様に、Ｂ５特異的ＣＡＲであるＢ５－ＣＡＲ－０３およびＢ５－ＣＡＲ－０４は、標的ＨＥＫ－Ｂ５株と培養した場合、表面ＣＡＲの下方調節を示した。ＣＡＲ－Ｔ細胞をＨＥＫ ＷＴ株または無関係な標的抗原と培養した場合、ＣＡＲの下方調節は存在しなかった。これらのデータは、Ａ５６特異的またはＢ５特異的ＣＡＲを発現するように形質導入されたエフェクターＴ細胞が、適切な抗原（それぞれＡ５６またはＢ５）を有する標的細胞と遭遇すると、活性化を受けることを示している（細胞表面ＣＡＲ発現の下方調節によって証明される）。
【0251】
実施例１４―活性化されたＡ５６－ＣＡＲ－０６陽性Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞上でのＣＡＲおよびｅＧＦＰの発現
ｅＧＦＰを共発現するＪｕｒｋａｔ Ａ５６－ＣＡＲ－０６株を、ＨＥＫ－Ａ５６株と一晩（１６時間）培養し、そして実施例１３の結果から予想されるように、ＣＡＲ発現が減少することが観察された（図１５）。しかしながら、ＣＡＲ「陰性」集団内に、ｅＧＦＰ陽性集団が観察された。さらに、該ｅＧＦＰ陽性集団は、Ｔ細胞活性化マーカーであるＣＤ６９の発現増加を示したが、ｅＧＦＰ陰性集団が示すＣＤ６９発現は最小限であった。ＣＤ６９の上方調節は、適切な抗原（この場合はＡ５６）を有する標的細胞のＣＡＲ－Ｔ細胞認識を示す。これらの結果によれば、適切な抗原（この場合はＡ５６）を有する標的細胞との遭遇後、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、細胞表面のＣＡＲ発現の下方調節を示すが、それでもまだｅＧＦＰおよびＣＤ６９発現によって識別可能であり、後者はＣＡＲによる標的細胞認識の独立した証拠となる。
ｅＧＦＰを共発現するＪｕｒｋａｔ Ａ５６－ＣＡＲ－０６株を、ＨＥＫ－Ａ５６株と一晩（１６時間）培養し、そして実施例１３の結果から予想されるように、ＣＡＲ発現が減少することが観察された（図１５）。しかしながら、ＣＡＲ「陰性」集団内に、ｅＧＦＰ陽性集団が観察された。さらに、該ｅＧＦＰ陽性集団は、Ｔ細胞活性化マーカーであるＣＤ６９の発現増加を示したが、ｅＧＦＰ陰性集団が示すＣＤ６９発現は最小限であった。ＣＤ６９の上方調節は、適切な抗原（この場合はＡ５６）を有する標的細胞のＣＡＲ－Ｔ細胞認識を示す。これらの結果によれば、適切な抗原（この場合はＡ５６）を有する標的細胞との遭遇後、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、細胞表面のＣＡＲ発現の下方調節を示すが、それでもまだｅＧＦＰおよびＣＤ６９発現によって識別可能であり、後者はＣＡＲによる標的細胞認識の独立した証拠となる。
【0252】
実施例１５―ＶＶ－ＣＡＲを発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、適切な標的抗原を有するＨＥＫ細胞株と共培養すると特異的な活性化を示す
Ａ５６－ＣＡＲ－０１、Ａ５６－ＣＡＲ－０２、Ｂ５－ＣＡＲ－０３、Ｂ５－ＣＡＲ－０４またはＡ５６－ＣＡＲ－０６のうちのいずれかを発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、１：１のＥ：Ｔ比、条件当たり１×１０５の総細胞数で、ＨＥＫ－ＷＴ、ＨＥＫ－Ａ５６、またはＨＥＫ－Ｂ５安定株と三重実験で共培養した。細胞を５％ＣＯ２中３７℃で一晩（１６時間）培養した。翌日、細胞をＰＢＳで洗浄し、正常ヤギ血清でブロックし、ＣＤ４５、ＣＤ６９、抗ＲＢＩｇＧで染色した。次に、ＣＤ４５＋Ｊｕｒｋａｔ集団のＣＤ６９発現を評価した。試験したすべてのＣＡＲは、適切な標的抗原を発現する細胞と共培養するとＣＤ６９発現の増加を示したが、ＨＥＫ ＷＴ細胞または無関係の標的抗原を発現するＨＥＫ細胞と共培養するとＣＤ６９の発現は最小限であった（図１６）。これらの発見は、Ａ５６およびＢ５に向けられたＣＡＲ－Ｔ細胞が、適切な抗原（それぞれＡ５６およびＢ５）を発現する標的細胞の特異的認識を示し、最小限の交差反応性および／または構成的活性（持続性（tonic）シグナル伝達）を示すことを実証する。
Ａ５６－ＣＡＲ－０１、Ａ５６－ＣＡＲ－０２、Ｂ５－ＣＡＲ－０３、Ｂ５－ＣＡＲ－０４またはＡ５６－ＣＡＲ－０６のうちのいずれかを発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、１：１のＥ：Ｔ比、条件当たり１×１０５の総細胞数で、ＨＥＫ－ＷＴ、ＨＥＫ－Ａ５６、またはＨＥＫ－Ｂ５安定株と三重実験で共培養した。細胞を５％ＣＯ２中３７℃で一晩（１６時間）培養した。翌日、細胞をＰＢＳで洗浄し、正常ヤギ血清でブロックし、ＣＤ４５、ＣＤ６９、抗ＲＢＩｇＧで染色した。次に、ＣＤ４５＋Ｊｕｒｋａｔ集団のＣＤ６９発現を評価した。試験したすべてのＣＡＲは、適切な標的抗原を発現する細胞と共培養するとＣＤ６９発現の増加を示したが、ＨＥＫ ＷＴ細胞または無関係の標的抗原を発現するＨＥＫ細胞と共培養するとＣＤ６９の発現は最小限であった（図１６）。これらの発見は、Ａ５６およびＢ５に向けられたＣＡＲ－Ｔ細胞が、適切な抗原（それぞれＡ５６およびＢ５）を発現する標的細胞の特異的認識を示し、最小限の交差反応性および／または構成的活性（持続性（tonic）シグナル伝達）を示すことを実証する。
【0253】
実施例１６―Ａ５６－ＣＡＲ－０６発現について形質導入され濃縮された健康ドナー初代Ｔ細胞
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団を、健康なドナーＰＢＭＣ試料から単離した。５×１０５個の健康ドナーＴ細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－１１１－１６０）で活性化し、３％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ４５２２）、硫酸ゲンタマイシン（Ｓａｎｄｏｚ、ＤＩＮ：０２２６８５３１）、ならびにヒトインターロイキン－７（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９５－３６７）およびインターロイキン－１５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９５－７６４））（１０μｇ／ｍｌ）を補充したＭｉｌｔｅｎｙｉ ＴｅｘＭＡＣＳ ＧＭＰ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１７０－０７６－３０９）培地で成長させた。活性化の２４時間後、Ｔ細胞にＡ５６－ＣＡＲ－０６レンチウイルスを０．２５のＭＯＩで形質導入した。次の１２日間にわたり、細胞を１ｍｌ当たり１×１０６細胞未満の密度で増殖させた。増殖後、フローサイトメーターを使用して、Ａ５６－ＣＡＲ－０６で形質導入されたＴ細胞の画分をｅＧＦＰ陽性により選別した。２×１０５個の細胞を高純度に選別し、９６ウェル丸底プレートの単一ウェルにプレーティングした。選別した集団は、上記のように活性化させ、細胞密度を１×１０６／ｍｌ未満に維持しながらさらに１２日間増殖させた。増殖され濃縮された最終的な集団は、フローサイトメトリーによると、＞９５％ＣＡＲ陽性であった（図１７）。これらの発見は、初代ＰＢＭＣ由来のヒトＴ細胞がＶＶ－ＣＡＲ構築物を発現するように容易に形質導入され、形質導入後に濃縮および増殖され得ることを示す。
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団を、健康なドナーＰＢＭＣ試料から単離した。５×１０５個の健康ドナーＴ細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－１１１－１６０）で活性化し、３％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ４５２２）、硫酸ゲンタマイシン（Ｓａｎｄｏｚ、ＤＩＮ：０２２６８５３１）、ならびにヒトインターロイキン－７（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９５－３６７）およびインターロイキン－１５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９５－７６４））（１０μｇ／ｍｌ）を補充したＭｉｌｔｅｎｙｉ ＴｅｘＭＡＣＳ ＧＭＰ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１７０－０７６－３０９）培地で成長させた。活性化の２４時間後、Ｔ細胞にＡ５６－ＣＡＲ－０６レンチウイルスを０．２５のＭＯＩで形質導入した。次の１２日間にわたり、細胞を１ｍｌ当たり１×１０６細胞未満の密度で増殖させた。増殖後、フローサイトメーターを使用して、Ａ５６－ＣＡＲ－０６で形質導入されたＴ細胞の画分をｅＧＦＰ陽性により選別した。２×１０５個の細胞を高純度に選別し、９６ウェル丸底プレートの単一ウェルにプレーティングした。選別した集団は、上記のように活性化させ、細胞密度を１×１０６／ｍｌ未満に維持しながらさらに１２日間増殖させた。増殖され濃縮された最終的な集団は、フローサイトメトリーによると、＞９５％ＣＡＲ陽性であった（図１７）。これらの発見は、初代ＰＢＭＣ由来のヒトＴ細胞がＶＶ－ＣＡＲ構築物を発現するように容易に形質導入され、形質導入後に濃縮および増殖され得ることを示す。
【0254】
実施例１７―Ａ５６－ＣＡＲ－０６を発現するヒトＴ細胞は、Ａ５６を発現するＨＥＫ２９３Ｔ株と共培養すると特異的な活性化を示す
Ａ５６－ＣＡＲ－０６を発現するヒトＴ細胞を、ＨＥＫ－ＷＴ、ＨＥＫ－Ａ５６またはＨＥＫ－Ｂ５株と、１：１のＥ：Ｔ比で、条件当たり１×１０５個の総細胞数で一晩（１６時間）、三重実験で共培養した。翌日、細胞をＰＢＳで洗浄し、正常ヤギ血清でブロックし、ＣＤ３ ＢＶ５１０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７３３２）、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７ ＢＶ６５０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号５６４０９２）、抗ＲＢＩｇＧの発現を検出するために染色した。ＣＤ３＋ｅＧＦＰ＋Ｔ細胞集団を、フローサイトメトリーによってＣＤ６９およびＣＤ１３７の発現について評価した。Ａ５６－ＣＡＲ－０６で形質導入されたＴ細胞は、Ａ５６標的抗原を発現する細胞と共培養するとＣＤ６９とＣＤ１３７の発現が増加したが、ＨＥＫ－ＷＴ細胞または無関係な抗原を発現するＨＥＫ細胞と共培養するとＣＤ６９とＣＤ１３７の発現は最小限であった（図１８）。これらの発見は、Ａ５６－ＣＡＲ－０６を発現するように形質導入された初代Ｔ細胞が、表面上にＡ５６抗原を発現する標的細胞とともに培養されると特異的な活性化を示すことを実証する。
Ａ５６－ＣＡＲ－０６を発現するヒトＴ細胞を、ＨＥＫ－ＷＴ、ＨＥＫ－Ａ５６またはＨＥＫ－Ｂ５株と、１：１のＥ：Ｔ比で、条件当たり１×１０５個の総細胞数で一晩（１６時間）、三重実験で共培養した。翌日、細胞をＰＢＳで洗浄し、正常ヤギ血清でブロックし、ＣＤ３ ＢＶ５１０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７３３２）、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７ ＢＶ６５０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号５６４０９２）、抗ＲＢＩｇＧの発現を検出するために染色した。ＣＤ３＋ｅＧＦＰ＋Ｔ細胞集団を、フローサイトメトリーによってＣＤ６９およびＣＤ１３７の発現について評価した。Ａ５６－ＣＡＲ－０６で形質導入されたＴ細胞は、Ａ５６標的抗原を発現する細胞と共培養するとＣＤ６９とＣＤ１３７の発現が増加したが、ＨＥＫ－ＷＴ細胞または無関係な抗原を発現するＨＥＫ細胞と共培養するとＣＤ６９とＣＤ１３７の発現は最小限であった（図１８）。これらの発見は、Ａ５６－ＣＡＲ－０６を発現するように形質導入された初代Ｔ細胞が、表面上にＡ５６抗原を発現する標的細胞とともに培養されると特異的な活性化を示すことを実証する。
【0255】
実施例１８―Ａ５６－ＣＡＲ－０６を発現するヒトＴ細胞は、Ａ５６発現標的細胞において細胞死の形態学的兆候を誘導する
ＨＥＫ－ＷＴ、ＨＥＫ－Ａ５６、またはＨＥＫ－Ｂ５細胞（各２×１０５個）を２４ウェル組織培養プレートに播種し、一晩放置して接着させた。翌日、１×１０５個のＡ５６－ＣＡＲ－０６ Ｔ細胞を各ウェルに添加し、細胞をさらに４８時間培養した。画像は、Ａ５６－ＣＡＲ－０６陽性Ｔ細胞と共培養した場合のＨＥＫ－Ａ５６標的細胞株に明確な形態学的変化を示しており、これは直接的な腫瘍細胞殺滅を示す。対照的に、ＨＥＫ－ＷＴおよびＨＥＫ－Ｂ５株は、形態学的変化を伴わずに完全にコンフルエントのままであった（図１９）。これらの発見は、Ａ５６－ＣＡＲ－０６ Ｔ細胞との共培養後にＨＥＫ－Ａ５６細胞単層が破壊されることを示しており、直接的な細胞変性効果の証拠を提供している。
ＨＥＫ－ＷＴ、ＨＥＫ－Ａ５６、またはＨＥＫ－Ｂ５細胞（各２×１０５個）を２４ウェル組織培養プレートに播種し、一晩放置して接着させた。翌日、１×１０５個のＡ５６－ＣＡＲ－０６ Ｔ細胞を各ウェルに添加し、細胞をさらに４８時間培養した。画像は、Ａ５６－ＣＡＲ－０６陽性Ｔ細胞と共培養した場合のＨＥＫ－Ａ５６標的細胞株に明確な形態学的変化を示しており、これは直接的な腫瘍細胞殺滅を示す。対照的に、ＨＥＫ－ＷＴおよびＨＥＫ－Ｂ５株は、形態学的変化を伴わずに完全にコンフルエントのままであった（図１９）。これらの発見は、Ａ５６－ＣＡＲ－０６ Ｔ細胞との共培養後にＨＥＫ－Ａ５６細胞単層が破壊されることを示しており、直接的な細胞変性効果の証拠を提供している。
【0256】
実施例１９―Ｂ５－ＣＡＲ－０１１を発現するヒトＴ細胞は、Ｂ５発現標的細胞に対して細胞傷害性を示す
ホタルルシフェラーゼをコードする哺乳類発現伝達プラスミドｐＣＣＬ Ｌｕｃピューロマイシン（Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｂｒａｍｓｏｎ博士（ＭｃＭａｓｔｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から贈呈）を使用して、実施例１３で前述したようにレンチウイルスを生成した。このルシフェラーゼをコードするレンチウイルスでＨＥＫ－ＷＴ、Ａ５６およびＢ５株に形質導入し、ピューロマイシン（１．５μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ８８３３）に対する耐性について２週間にわたって選択した。ピューロマイシン耐性細胞培養物を増殖し、ＶＶ－ＣＡＲ殺滅アッセイのための標的集団として使用した。ルシフェラーゼを発現する標的ＨＥＫ株を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３９１７）のウェル当たり２×１０４細胞、１００μｌで播種し、一晩インキュベートして接着させた。以前に増殖させた初代ヒトＢ５－ＣＡＲ－０１１Ｔ細胞のソーティングされた集団を、９６ウェルプレートに三連でプレーティングし（ウェル当たり１００μｌ）、２倍希釈系列に分割して、１０：１～０．６２５：１のＥ：Ｔ比範囲を達成した。次に、希釈したＴ細胞懸濁液を付着性ＨＥＫ細胞に移して、総量を２００μｌにした。さらに、最大および最小の相対発光単位（ＲＬＵ）を決定するために、標的細胞のみの３ウェルと培地のみの３ウェルをプレーティングした。細胞を５％ＣＯ２中３７℃で２４時間培養した。翌日、各ウェルにＸｅｎｏｌｉｇｈｔ（商標）Ｄ－ルシフェリン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号１２２７９９）の１０Ｘストック２２μｌを入れ、暗所で室温で１０分間インキュベートした。次に、プレートを発光プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｗａｌｌａｃ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ ２１０４ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ）でスキャンした。図２０Ａは、２４時間の時点での各Ｅ：Ｔ比における三連ウェルからの平均ＲＬＵを示す。三連のウェルを平均し、パーセント特異的細胞傷害性を次の式で決定した： パーセント特異的細胞傷害性＝１００×（最大発光ＲＬＵ－試験発光ＲＬＵ）／（最小発光ＲＬＵ－最大発光ＲＬＵ）。Ｂ５－ＣＡＲ－０１１ Ｔ細胞は、複数のＥ：Ｔ比で高いパーセント特異的細胞傷害性を示した（図２０Ｂ）。さらに、Ｂ５－ＣＡＲ－０１１ Ｔ細胞と共培養したＢ５発現標的細胞は、２４時間で細胞死の明らかな形態学的兆候を示したが、Ｂ５－ＣＡＲ－０１１Ｔ細胞はＨＥＫ２９３ＷＴまたはＨＥＫ２９３Ａ５６細胞に対しては細胞傷害性の兆候を示さなかった（図２０Ｃ）。結果は、Ｂ５－ＣＡＲ－０１１Ｔ細胞がＨＥＫ－Ｂ５腫瘍細胞を効率的かつ特異的に殺滅することを示す。（図２０）。腫瘍細胞の表面上に発現するＯＶ抗原を標的化することにより、標的細胞がＯＶ－ＣＡＲによる破壊を受けやすくすることができる。
ホタルルシフェラーゼをコードする哺乳類発現伝達プラスミドｐＣＣＬ Ｌｕｃピューロマイシン（Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｂｒａｍｓｏｎ博士（ＭｃＭａｓｔｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から贈呈）を使用して、実施例１３で前述したようにレンチウイルスを生成した。このルシフェラーゼをコードするレンチウイルスでＨＥＫ－ＷＴ、Ａ５６およびＢ５株に形質導入し、ピューロマイシン（１．５μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ８８３３）に対する耐性について２週間にわたって選択した。ピューロマイシン耐性細胞培養物を増殖し、ＶＶ－ＣＡＲ殺滅アッセイのための標的集団として使用した。ルシフェラーゼを発現する標的ＨＥＫ株を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３９１７）のウェル当たり２×１０４細胞、１００μｌで播種し、一晩インキュベートして接着させた。以前に増殖させた初代ヒトＢ５－ＣＡＲ－０１１Ｔ細胞のソーティングされた集団を、９６ウェルプレートに三連でプレーティングし（ウェル当たり１００μｌ）、２倍希釈系列に分割して、１０：１～０．６２５：１のＥ：Ｔ比範囲を達成した。次に、希釈したＴ細胞懸濁液を付着性ＨＥＫ細胞に移して、総量を２００μｌにした。さらに、最大および最小の相対発光単位（ＲＬＵ）を決定するために、標的細胞のみの３ウェルと培地のみの３ウェルをプレーティングした。細胞を５％ＣＯ２中３７℃で２４時間培養した。翌日、各ウェルにＸｅｎｏｌｉｇｈｔ（商標）Ｄ－ルシフェリン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号１２２７９９）の１０Ｘストック２２μｌを入れ、暗所で室温で１０分間インキュベートした。次に、プレートを発光プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｗａｌｌａｃ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ ２１０４ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ）でスキャンした。図２０Ａは、２４時間の時点での各Ｅ：Ｔ比における三連ウェルからの平均ＲＬＵを示す。三連のウェルを平均し、パーセント特異的細胞傷害性を次の式で決定した： パーセント特異的細胞傷害性＝１００×（最大発光ＲＬＵ－試験発光ＲＬＵ）／（最小発光ＲＬＵ－最大発光ＲＬＵ）。Ｂ５－ＣＡＲ－０１１ Ｔ細胞は、複数のＥ：Ｔ比で高いパーセント特異的細胞傷害性を示した（図２０Ｂ）。さらに、Ｂ５－ＣＡＲ－０１１ Ｔ細胞と共培養したＢ５発現標的細胞は、２４時間で細胞死の明らかな形態学的兆候を示したが、Ｂ５－ＣＡＲ－０１１Ｔ細胞はＨＥＫ２９３ＷＴまたはＨＥＫ２９３Ａ５６細胞に対しては細胞傷害性の兆候を示さなかった（図２０Ｃ）。結果は、Ｂ５－ＣＡＲ－０１１Ｔ細胞がＨＥＫ－Ｂ５腫瘍細胞を効率的かつ特異的に殺滅することを示す。（図２０）。腫瘍細胞の表面上に発現するＯＶ抗原を標的化することにより、標的細胞がＯＶ－ＣＡＲによる破壊を受けやすくすることができる。
【0257】
実施例２０―放射性標識抗Ａ５６抗体は、陽電子放出断層撮影法によるインビボでのＡ５６発現腫瘍細胞の明確な視覚化を可能にする
抗Ａ５６抗体（Ａ０４９）を選択し、生体内分布研究とｍｉｃｒｏＰＥＴイメージングのためにジルコニウム－８９（８９Ｚｒ）で放射性標識した。これにより、生きたマウスの深部組織イメージングが高感度かつ高空間分解能で可能になる（５、６）。８９Ｚｒは、半減期が長く（７８時間）、減衰特性が良好であるため（６、７）、ｍＡｂとの使用によく適している。２ミリグラムのＡ０４９を、３：１のキレート剤：ｍＡｂの分子比で、ｐ－ＳＣＮ－Ｂｎ－デフェロキサミン（１－（４－イソチオシアナトフェニル）－３－［６，１７－ジヒドロキシ－７，１０，１８，２１－テトラオキソ－２７－（Ｎ－アセチルヒドロキシルアミノ）－６，１１，１７，２２－テトラアザヘプテイコシン］チオ尿素、ＤＦＯ（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ、米国、ＴＺ、プレイノ）とコンジュゲート化した。反応は、抗体の最終濃度を２ｍｇ／ｍＬとしてＰＢＳ ｐＨ９中で３７℃で１時間実行した。次に、５０ｋＤａの分子量カットオフの遠心フィルターユニット（Ａｍｉｃｏｎ超遠心フィルター、Ｕｌｔｒａｃｅｌ－５０：再生セルロース、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．（米国、マサチューセッツ州、ビレリカ））を使用して、コンジュゲート抗体（ＤＦＯ－Ａ０４９）を非コンジュゲートデフェロキサミンから精製し、０．２５Ｍ酢酸ナトリウム溶液中の５ｍｇ／ｍＬ ２，５－ジヒドロキシ安息香酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（カナダ、オンタリオ、オークビル））で１回洗浄した。精製された免疫コンジュゲート溶液の濃度は、製造元の推奨事項（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に従ってブラッドフォードアッセイによって決定した。
抗Ａ５６抗体（Ａ０４９）を選択し、生体内分布研究とｍｉｃｒｏＰＥＴイメージングのためにジルコニウム－８９（８９Ｚｒ）で放射性標識した。これにより、生きたマウスの深部組織イメージングが高感度かつ高空間分解能で可能になる（５、６）。８９Ｚｒは、半減期が長く（７８時間）、減衰特性が良好であるため（６、７）、ｍＡｂとの使用によく適している。２ミリグラムのＡ０４９を、３：１のキレート剤：ｍＡｂの分子比で、ｐ－ＳＣＮ－Ｂｎ－デフェロキサミン（１－（４－イソチオシアナトフェニル）－３－［６，１７－ジヒドロキシ－７，１０，１８，２１－テトラオキソ－２７－（Ｎ－アセチルヒドロキシルアミノ）－６，１１，１７，２２－テトラアザヘプテイコシン］チオ尿素、ＤＦＯ（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ、米国、ＴＺ、プレイノ）とコンジュゲート化した。反応は、抗体の最終濃度を２ｍｇ／ｍＬとしてＰＢＳ ｐＨ９中で３７℃で１時間実行した。次に、５０ｋＤａの分子量カットオフの遠心フィルターユニット（Ａｍｉｃｏｎ超遠心フィルター、Ｕｌｔｒａｃｅｌ－５０：再生セルロース、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．（米国、マサチューセッツ州、ビレリカ））を使用して、コンジュゲート抗体（ＤＦＯ－Ａ０４９）を非コンジュゲートデフェロキサミンから精製し、０．２５Ｍ酢酸ナトリウム溶液中の５ｍｇ／ｍＬ ２，５－ジヒドロキシ安息香酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（カナダ、オンタリオ、オークビル））で１回洗浄した。精製された免疫コンジュゲート溶液の濃度は、製造元の推奨事項（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に従ってブラッドフォードアッセイによって決定した。
【0258】
８９Ｚｒによる免疫コンジュゲートの放射性標識
前述のように（８）、ＡＣＳＩ（カナダ、リッチモンド）ＴＲ－１９サイクロトロンにおいてイットリウム８９ディスク（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ（米国、カリフォルニア州、ロサンゼルス）上に１３ ＭｅＶで陽子照射することによって、８９Ｚｒを生成した。照射後、ディスクをＨＣｌ（１０ｍＬ、２Ｍ）に溶解し、Ｔｒｉｓｋｅｍ（Ｂｒｕｚ、Ｆｒａｎｃｅ）から供給されたヒドロキサメートベースのＺＲ樹脂を使用して精製した。簡単に説明すると、ディスク溶液を樹脂上にロードし、１０ｍＬの２Ｍ ＨＣｌ溶液、続いて１０ｍＬの水で洗浄し、次に０．５ ｍＬのシュウ酸（０．０５ Ｍ）で溶出した。
前述のように（８）、ＡＣＳＩ（カナダ、リッチモンド）ＴＲ－１９サイクロトロンにおいてイットリウム８９ディスク（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ（米国、カリフォルニア州、ロサンゼルス）上に１３ ＭｅＶで陽子照射することによって、８９Ｚｒを生成した。照射後、ディスクをＨＣｌ（１０ｍＬ、２Ｍ）に溶解し、Ｔｒｉｓｋｅｍ（Ｂｒｕｚ、Ｆｒａｎｃｅ）から供給されたヒドロキサメートベースのＺＲ樹脂を使用して精製した。簡単に説明すると、ディスク溶液を樹脂上にロードし、１０ｍＬの２Ｍ ＨＣｌ溶液、続いて１０ｍＬの水で洗浄し、次に０．５ ｍＬのシュウ酸（０．０５ Ｍ）で溶出した。
【0259】
放射性標識のために、免疫コンジュゲートＤＦＯ－Ａ０４９（０．４ｍｇ）および８９Ｚｒ溶液（０．４ｍＬ、ｐＨ７、２３２ＭＢｑ）をＰＢＳ（最終容量：１ｍＬ、ｐＨ７）に添加し、得られた溶液を室温で１時間インキュベートした。放射化学的収率（ＲＣＹ）は、溶媒として５０ｍＭ ＤＴＰＡ ｐＨ７（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用したインスタント薄層クロマトグラフィーシリカゲル（ｉＴＬＣ－ＳＧ、Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国、カリフォルニア州、サンタクララ））を使用して決定した。８９Ｚｒ標識抗体および遊離８９ＺｒのＲｆ値はそれぞれ０および１であった。９６％のＲＣＹによる効率的な標識が観察された。次に、８９Ｚｒ標識抗体をＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（英国、ロンドン））によって遊離８９Ｚｒから分離し、５０ｋＤａ分子量カットオフフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．）を使用して濃縮した。８９Ｚｒ－ＤＦＯ－Ａ０４９の比活性は、サイズ排除ＨＰＬＣカラム（ＢｉｏＳｅｐ－ＳＥＣ－ｓ３０００、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（米国、カリフォルニア州、トーランス）を使用して、モデル１２００クォータナリポンプ、モデル１２００ ＵＶ吸光度検出器、およびＢｉｏｓｃａｎ（米国、ワシントンＤＣ）ＮａＩシンチレーション検出器を装備したＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣシステム（米国、カリフォルニア州、サンタクララ）で測定した。ＨＰＬＣ緩衝液は、０．１Ｍリン酸ナトリウム一塩基二水和物、０．１Ｍリン酸ナトリウム二塩基十二水和物、０．１Ｍアジ化ナトリウムおよび０．１５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ６．２～７．０）のアイソクラティック勾配であった。０．１ＭＢｑ／μｇの比放射能が得られ、放射性免疫コンジュゲートのインビボ特性評価には十分であった。最終的な放射化学的純度は、前述のようにｉＴＬＣ－ＳＧを使用して決定し、＞９９．９％であった。
【0260】
抗体の免疫反応性
８９Ｚｒ－ＤＦＯ－Ａ０４９の免疫反応性画分は、Ａ５６抗原（Ｗｙｅｔｈ ＶＶ配列）（ＨＥＫ－Ａ５６）を発現するように安定的に改変されたＨＥＫ－２９３細胞を使用したＬｉｎｄｍｏ細胞結合法に従って推定した。簡単に説明すると、ＨＥＫ－Ａ５６細胞を１．０～２４．６×１０６細胞／ｍＬの様々な濃度でＰＢＳ（ｐＨ７．４）に懸濁した。残りの手順は、前述のように（９）実行した。結果は、８９Ｚｒ－ＤＦＯ－Ａ０４９の５２％が依然として効率的にＡ５６タンパク質に結合することを示した。
８９Ｚｒ－ＤＦＯ－Ａ０４９の免疫反応性画分は、Ａ５６抗原（Ｗｙｅｔｈ ＶＶ配列）（ＨＥＫ－Ａ５６）を発現するように安定的に改変されたＨＥＫ－２９３細胞を使用したＬｉｎｄｍｏ細胞結合法に従って推定した。簡単に説明すると、ＨＥＫ－Ａ５６細胞を１．０～２４．６×１０６細胞／ｍＬの様々な濃度でＰＢＳ（ｐＨ７．４）に懸濁した。残りの手順は、前述のように（９）実行した。結果は、８９Ｚｒ－ＤＦＯ－Ａ０４９の５２％が依然として効率的にＡ５６タンパク質に結合することを示した。
【0261】
動物の腫瘍モデルおよび抗体注射
すべての動物実験は、ブリティッシュコロンビア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ）の動物管理委員会（Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（カナダ、ブリティッシュコロンビア州、バンクーバー）の制度的ガイドラインに従い、認定研究者の監督下で、ＢＣがん研究センター（ＢＣ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ）の動物資源センター（Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｒｅ）で実行した。１２週齢の雌免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｒａｇ１ｔｍ１Ｍｏｍ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＲＧ）マウス（所内繁殖コロニーから取得）の左肩にＨＥＫ－Ａ５６細胞を、または右肩にＡ５６非発現ＨＥＫ－２９３親細胞を皮下注射した。（ｎ＝８匹のマウス）。両方の細胞株について、マトリゲル（比率１：１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（カナダ、オンタリオ州、ミシサガ）中５×１０６個の細胞を注入した。
すべての動物実験は、ブリティッシュコロンビア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ）の動物管理委員会（Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（カナダ、ブリティッシュコロンビア州、バンクーバー）の制度的ガイドラインに従い、認定研究者の監督下で、ＢＣがん研究センター（ＢＣ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ）の動物資源センター（Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｒｅ）で実行した。１２週齢の雌免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｒａｇ１ｔｍ１Ｍｏｍ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＲＧ）マウス（所内繁殖コロニーから取得）の左肩にＨＥＫ－Ａ５６細胞を、または右肩にＡ５６非発現ＨＥＫ－２９３親細胞を皮下注射した。（ｎ＝８匹のマウス）。両方の細胞株について、マトリゲル（比率１：１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（カナダ、オンタリオ州、ミシサガ）中５×１０６個の細胞を注入した。
【0262】
陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）
腫瘍がイメージングサイズ（約１００ｍｍ３）に達したとき、マウスを酸素中の２％イソフルランで麻酔し、８９Ｚｒ－ＤＦＯ－Ａ０４９（４０．９±１．５μｇ、４．１±０．２ＭＢｑ）を静脈内注射した。Ｓｉｅｍｅｎｓ（米国、テネシー州、ノックスビル）Ｉｎｖｅｏｎ ｍｉｃｒｏＰＥＴ／ＣＴスキャナーを使用して、１匹のマウスについて注射の１日、３日、および５日後にＰＥＴ画像を取得した。マウスには、減衰補正のためのＣＴスキャンを施し、続いて、１日目と３日目には２０分間の静的ＰＥＴ取得を行い、５日目には３０分間のスキャンを行った。３次元条件付きサブセット期待値最大化（３－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｏｒｄｅｒｅｄ－ｓｕｂｓｅｔｓ ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ（ＯＳＥＭ３Ｄ）、２回反復）と、それに続く高速最大化事前アルゴリズム（ｆａｓｔ ｍａｘｉｍｕｍ ａ ｐｒｉｏｒｉ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（ＦａｓｔＭＡＰ）：１８回反復）を使用して、画像を再構成した。最大強度の投影画像は、マウス（特に長骨骨端などの高骨リモデリング領域）における８９Ｚｒ－ＤＦＯコンジュゲートの既知の脱金属に起因する骨の取り込みに加えて、抗体のプロセシングおよび代謝による肝臓および脾臓などの正常臓器での予想された蓄積を示している（１０）。より重要なことに、ＰＥＴ画像は、陰性対照腫瘍（ＨＥＫ－２９３）と比較してＨＥＫ－Ａ５６腫瘍について、より高い腫瘍取り込み率および腫瘍対バックグラウンド比を示しており、８９Ｚｒ－ＤＦＯ－Ａ０４９抗体の特異的かつ効率的な腫瘍取り込みを示している（図２１）。
腫瘍がイメージングサイズ（約１００ｍｍ３）に達したとき、マウスを酸素中の２％イソフルランで麻酔し、８９Ｚｒ－ＤＦＯ－Ａ０４９（４０．９±１．５μｇ、４．１±０．２ＭＢｑ）を静脈内注射した。Ｓｉｅｍｅｎｓ（米国、テネシー州、ノックスビル）Ｉｎｖｅｏｎ ｍｉｃｒｏＰＥＴ／ＣＴスキャナーを使用して、１匹のマウスについて注射の１日、３日、および５日後にＰＥＴ画像を取得した。マウスには、減衰補正のためのＣＴスキャンを施し、続いて、１日目と３日目には２０分間の静的ＰＥＴ取得を行い、５日目には３０分間のスキャンを行った。３次元条件付きサブセット期待値最大化（３－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｏｒｄｅｒｅｄ－ｓｕｂｓｅｔｓ ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ（ＯＳＥＭ３Ｄ）、２回反復）と、それに続く高速最大化事前アルゴリズム（ｆａｓｔ ｍａｘｉｍｕｍ ａ ｐｒｉｏｒｉ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（ＦａｓｔＭＡＰ）：１８回反復）を使用して、画像を再構成した。最大強度の投影画像は、マウス（特に長骨骨端などの高骨リモデリング領域）における８９Ｚｒ－ＤＦＯコンジュゲートの既知の脱金属に起因する骨の取り込みに加えて、抗体のプロセシングおよび代謝による肝臓および脾臓などの正常臓器での予想された蓄積を示している（１０）。より重要なことに、ＰＥＴ画像は、陰性対照腫瘍（ＨＥＫ－２９３）と比較してＨＥＫ－Ａ５６腫瘍について、より高い腫瘍取り込み率および腫瘍対バックグラウンド比を示しており、８９Ｚｒ－ＤＦＯ－Ａ０４９抗体の特異的かつ効率的な腫瘍取り込みを示している（図２１）。
【0263】
８９Ｚｒ－ＤＦＯ－Ａ０４９生体内分布の評価
５日目に、すべてのマウスを安楽死させ、以前に記載されたように（９）、生体内分布研究のために目的の器官を収集した。８９Ｚｒ－ＤＦＯ－Ａ０４９についての結果を表１９に示す。
５日目に、すべてのマウスを安楽死させ、以前に記載されたように（９）、生体内分布研究のために目的の器官を収集した。８９Ｚｒ－ＤＦＯ－Ａ０４９についての結果を表１９に示す。
【表19】
【0264】
生体内分布の結果は、正常な臓器において予想された放射性免疫コンジュゲートの生体内分布を伴って、ＰＥＴ画像観察を確認している。腫瘍に関しては、Ａ５６非発現ＨＥＫ腫瘍における１．４４±０．２５％ＩＤ／ｇと比較して、Ａ５６発現ＨＥＫ腫瘍においては７．７１±４．５２％ＩＤ／ｇの高い取り込みが得られた（ｎ＝８、ｐ＜０．０５）。したがって、これらの生体内結果（ＰＥＴイメージングおよび生体内分布研究）は、８９Ｚｒ－ＤＦＯ－Ａ０４９をＡ５６発現腫瘍に効果的かつ選択的に送達することができることを立証している。
【0265】
ＯＶ感染腫瘍細胞の表面上に発現する、腫瘍溶解性ウイルスにコードされたタンパク質を標的とする抗体は、放射性核種で標識された場合、例えば、ＰＥＴイメージングによるＯＶ感染のインビボイメージング、ならびに、放射免疫療法により治療用放射性同位体を局所送達してＯＶ感染細胞および感染していない隣接腫瘍細胞を殺滅することにおいて、診断、治療およびセラノスティクス用途を可能にするように使用することができる（１１，１２）。
【0266】
参考文献
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８．Ｄｉａｓ ＧＭ，Ｒａｍｏｇｉｄａ ＣＦ，Ｒｏｕｓｓｅａｕ Ｊ，Ｚａｃｃｈｉａ ＮＡ，Ｈｏｅｈｒ Ｃ，Ｓｃｈａｆｆｅｒ Ｐ，Ｌｉｎ Ｋ－Ｓ，Ｂｅｎａｒｄ Ｆ．８９Ｚｒ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｓｔｕｄｉｅｓ － Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｌｉｑｕｉｄ ａｎｄ ｓｏｌｉｄ ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ．２０１８ Ｍａｒ；５８：１－７．
９．Ｒｏｕｓｓｅａｕ Ｊ，Ｚｈａｎｇ Ｚ，Ｗａｎｇ Ｘ，Ｚｈａｎｇ Ｃ，Ｌａｕ Ｊ，Ｒｏｕｓｓｅａｕ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅ ｃｈｅｌａｔｏｒｓ ｆｏｒ ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ（８９）Ｚｒ ｆｏｒ ｉｍａｇｉｎｇ ｗｉｔｈ ｐｏｓｉｔｒｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ．Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．２０１８；２８（５）：８９９－９０５．
１０．Ｒｏｕｓｓｅａｕ Ｊ，Ｚｈａｎｇ Ｚ，Ｄｉａｓ ＧＭ，Ｚｈａｎｇ Ｃ，Ｃｏｌｐｏ Ｎ，Ｂｅｎａｒｄ Ｆ，Ｌｉｎ Ｋ－Ｓ．Ｄｅｓｉｇｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅ ｃｈｅｌａｔｏｒｓ ｆｏｒ ＰＥＴ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ８９Ｚｒ－ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．２０１７；２７（４）：７０８－７１２．
１１．Ｍａｋｖａｎｄｉ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ａｌｐｈａ－Ｅｍｉｔｔｅｒｓ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ａｌｐｈａ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ：ｆｒｏｍ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ．Ｔａｒｇｅｔ Ｏｎｃｏｌ．２０１８ Ａｐｒ；１３（２）：１８９－２０３．
１２．Ｋｒａｅｂｅｒ－Ｂｏｄｅｒｅ Ｆ，Ｂｏｄｅｔ－Ｍｉｌｉｎ Ｃ，Ｒｏｕｓｓｅａｕ Ｃ，Ｅｕｇｅｎｅ Ｔ，Ｐａｌｌａｒｄｙ Ａ，Ｆｒａｍｐａｓ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ．Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２０１４；４１（５）：６１３－２２．
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１０．Ｒｏｕｓｓｅａｕ Ｊ，Ｚｈａｎｇ Ｚ，Ｄｉａｓ ＧＭ，Ｚｈａｎｇ Ｃ，Ｃｏｌｐｏ Ｎ，Ｂｅｎａｒｄ Ｆ，Ｌｉｎ Ｋ－Ｓ．Ｄｅｓｉｇｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅ ｃｈｅｌａｔｏｒｓ ｆｏｒ ＰＥＴ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ８９Ｚｒ－ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．２０１７；２７（４）：７０８－７１２．
１１．Ｍａｋｖａｎｄｉ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ａｌｐｈａ－Ｅｍｉｔｔｅｒｓ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ａｌｐｈａ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ：ｆｒｏｍ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ．Ｔａｒｇｅｔ Ｏｎｃｏｌ．２０１８ Ａｐｒ；１３（２）：１８９－２０３．
１２．Ｋｒａｅｂｅｒ－Ｂｏｄｅｒｅ Ｆ，Ｂｏｄｅｔ－Ｍｉｌｉｎ Ｃ，Ｒｏｕｓｓｅａｕ Ｃ，Ｅｕｇｅｎｅ Ｔ，Ｐａｌｌａｒｄｙ Ａ，Ｆｒａｍｐａｓ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ．Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２０１４；４１（５）：６１３－２２．
【0267】
本開示は以下の実施形態を含む。
実施形態１
ワクシニアウイルスＡ５６抗原（ＶＶ Ａ５６）に特異的に結合し、ＶＶ Ａ５６への結合について、
アミノ酸配列ＳＳＹＷＩＣ（配列番号３）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＩＹＡＧＳＧＧＳＴＹＹＡＴＷＡＫＧ（配列番号４）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＡＹＳＤＲＳＧＧＹＳＦＮＬ（配列番号５）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＶＤＮＮＮＹＬＡ（配列番号６）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＳＡＳＳＬＡＳ（配列番号７）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＬＧＳＹＤＣＳＤＡＤＣＹＡ（配列番号８）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（Ｖ Ｌ ）ポリペプチド；
アミノ酸配列ＤＩＹＹＩＳ（配列番号１１）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＴＹＡＧＳＳＧＳＴＹＹＡＴＷＡＫＧ（配列番号１２）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＤＲＹＰＧＴＳＧＲＶＹＧＭＤＬ（配列番号１３）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＩＳＤＬＬＳ（配列番号１４）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＳＡＳＴＬＡＳ（配列番号１５）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＣＮＹＹＳＰＴＹＧＮＧ（配列番号１６）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（Ｖ Ｌ ）ポリペプチド；
アミノ酸配列ＳＳＹＷＬＣ（配列番号１９）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＩＹＮＧＤＧＳＴＨＹＡＳＷＡＫＧ（配列番号２０）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＤＹＴＹＮＦＹＴＹＧＦＮＬ（配列番号２１）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（Ｖ Ｈ ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＶＮＩＷＡＳ（配列番号２２）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＫＡＳＴＬＡＳ（配列番号２３）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＧＧＹＰＳＳＳＳＧＷＡ（配列番号２４）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（Ｖ Ｌ ）ポリペプチド；または
アミノ酸配列ＳＳＹＷＩＣ（配列番号２７）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＴＹＮＧＤＧＳＴＨＹＡＳＷＡＫＧ（配列番号２８）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＤＹＴＤＡＦＹＴＹＧＦＮＬ（配列番号２９）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＴＳＳＹＬＡ（配列番号３０）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＲＡＳＳＬＡＳ（配列番号３１）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＴＧＦＹＧＳＳＧＨＴ（配列番号３２）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド
を含む抗体と競合する、抗体。
実施形態２
前記抗体が、
アミノ酸配列ＳＳＹＷＩＣ（配列番号３）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＩＹＡＧＳＧＧＳＴＹＹＡＴＷＡＫＧ（配列番号４）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＡＹＳＤＲＳＧＧＹＳＦＮＬ（配列番号５）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＶＤＮＮＮＹＬＡ（配列番号６）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＳＡＳＳＬＡＳ（配列番号７）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＬＧＳＹＤＣＳＤＡＤＣＹＡ（配列番号８）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド；
アミノ酸配列ＤＩＹＹＩＳ（配列番号１１）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＴＹＡＧＳＳＧＳＴＹＹＡＴＷＡＫＧ（配列番号１２）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＤＲＹＰＧＴＳＧＲＶＹＧＭＤＬ（配列番号１３）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＩＳＤＬＬＳ（配列番号１４）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＳＡＳＴＬＡＳ（配列番号１５）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＣＮＹＹＳＰＴＹＧＮＧ（配列番号１６）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド；
アミノ酸配列ＳＳＹＷＬＣ（配列番号１９）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＩＹＮＧＤＧＳＴＨＹＡＳＷＡＫＧ（配列番号２０）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＤＹＴＹＮＦＹＴＹＧＦＮＬ（配列番号２１）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（Ｖ Ｈ ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＶＮＩＷＡＳ（配列番号２２）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＫＡＳＴＬＡＳ（配列番号２３）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＧＧＹＰＳＳＳＳＧＷＡ（配列番号２４）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド；または
アミノ酸配列ＳＳＹＷＩＣ（配列番号２７）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＴＹＮＧＤＧＳＴＨＹＡＳＷＡＫＧ（配列番号２８）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＤＹＴＤＡＦＹＴＹＧＦＮＬ（配列番号２９）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＴＳＳＹＬＡ（配列番号３０）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＲＡＳＳＬＡＳ（配列番号３１）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＴＧＦＹＧＳＳＧＨＴ（配列番号３２）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド
を含む、実施形態１に記載の抗体。
実施形態３
前記抗体が、
配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（Ｖ Ｈ ）ポリペプチド、および
配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（Ｖ Ｌ ）ポリペプチドを含む、実施形態１または２に記載の抗体。
実施形態４
前記抗体が、
配列番号９に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（Ｖ Ｈ ）ポリペプチド、および
配列番号１０に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（Ｖ Ｌ ）ポリペプチドを含む、実施形態１または２に記載の抗体。
実施形態５
前記抗体が、
配列番号１７に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（Ｖ Ｈ ）ポリペプチド、および
配列番号１８に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（Ｖ Ｌ ）ポリペプチドを含む、実施形態１または２に記載の抗体。
実施形態６
前記抗体が、
配列番号２５に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（Ｖ Ｈ ）ポリペプチド、および
配列番号２６に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（Ｖ Ｌ ）ポリペプチドを含む、実施形態１または２に記載の抗体。
実施形態７
前記抗体が、
配列番号９に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（Ｖ Ｈ ）ポリペプチド、および
配列番号６２に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（Ｖ Ｌ ）ポリペプチドを含む、実施形態１または２に記載の抗体。
実施形態８
前記抗体が、
配列番号９に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（Ｖ Ｈ ）ポリペプチド、および
配列番号６３に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（Ｖ Ｌ ）ポリペプチドを含む、実施形態１または２に記載の抗体。
実施形態９
ワクシニアウイルスＢ５抗原（ＶＶ Ｂ５）に特異的に結合し、ＶＶ Ｂ５への結合について、
アミノ酸配列ＳＳＹＹＭＣ（配列番号３５）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＩＹＴＳＳＧＳＡＹＹＡＮＷＡＫＧ（配列番号３６）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＮＡＶＧＳＳＹＹＬＹＬ（配列番号３７）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＶＡＧＮＮＹＬＳ（配列番号３８）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＳＶＳＴＬＡＳ（配列番号３９）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＧＹＹＮＤＧＩＷＡ（配列番号４０）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（Ｖ Ｌ ）ポリペプチド；または
アミノ酸配列ＳＹＷＭＣ（配列番号４３）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＩＹＧＧＳＳＧＳＴＹＹＳＮＷＡＫＧ（配列番号４４）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＤＧＳＴＷＤＹＦＲＬ（配列番号４５）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＩＮＴＮＹＬＳ（配列番号４６）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＱＡＳＴＬＥＳ（配列番号４７）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＧＹＹＴＶＥＮＩＧＮＰ（配列番号４８）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド
を含む抗体と競合する、抗体。
実施形態１０
前記抗体が、
アミノ酸配列ＳＳＹＹＭＣ（配列番号３５）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＩＹＴＳＳＧＳＡＹＹＡＮＷＡＫＧ（配列番号３６）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＮＡＶＧＳＳＹＹＬＹＬ（配列番号３７）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＶＡＧＮＮＹＬＳ（配列番号３８）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＳＶＳＴＬＡＳ（配列番号３９）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＧＹＹＮＤＧＩＷＡ（配列番号４０）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド；または
アミノ酸配列ＳＹＷＭＣ（配列番号４３）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＩＹＧＧＳＳＧＳＴＹＹＳＮＷＡＫＧ（配列番号４４）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＤＧＳＴＷＤＹＦＲＬ（配列番号４５）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＩＮＴＮＹＬＳ（配列番号４６）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＱＡＳＴＬＥＳ（配列番号４７）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＧＹＹＴＶＥＮＩＧＮＰ（配列番号４８）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド
を含む、実施形態９に記載の抗体。
実施形態１１
前記抗体が、
配列番号３３に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（Ｖ Ｈ ）ポリペプチド、および
配列番号３４に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（Ｖ Ｌ ）ポリペプチドを含む、実施形態９または１０に記載の抗体。
実施形態１２
前記抗体が、
配列番号４１に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（Ｖ Ｈ ）ポリペプチド、および
配列番号４２に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（Ｖ Ｌ ）ポリペプチドを含む、実施形態９または１０に記載の抗体。
実施形態１３
前記抗体が、モノクローナル抗体である、実施形態１～１２のいずれか一項に記載の抗体。
実施形態１４
前記抗体が、ヒト化抗体である、実施形態１～１３のいずれか一項に記載の抗体。
実施形態１５
前記抗体が、ＩｇＧである、実施形態１～１４のいずれか一項に記載の抗体。
実施形態１６
前記抗体が、ヒトＦｃドメインを含む、実施形態１５に記載の抗体。
実施形態１７
前記抗体が、ヒトＩｇＧ１である、実施形態１６に記載の抗体。
実施形態１８
前記抗体が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’） ２ 、およびＦ（ａｂ’）からなる群から選択される、実施形態１～１４のいずれか一項に記載の抗体。
実施形態１９
前記抗体が、単鎖抗体である、実施形態１～１４のいずれか一項に記載の抗体。
実施形態２０
前記単鎖抗体が、ｓｃＦｖである、実施形態１９に記載の抗体。
実施形態２１
前記抗体が、実施形態１～１２のいずれか一項に記載のＶ Ｈ ポリペプチド－Ｖ Ｌ ポリペプチド対を含む第１の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体である、実施形態１～２０のいずれか一項に記載の抗体。
実施形態２２
前記二重特異性抗体が、ワクシニアウイルス抗原以外の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む、実施形態２１に記載の抗体。
実施形態２３
前記ワクシニアウイルス抗原以外の抗原が、免疫細胞表面抗原である、実施形態２２に記載の抗体。
実施形態２４
前記免疫細胞表面抗原が、免疫エフェクター細胞表面抗原である、実施形態２３に記載の抗体。
実施形態２５
前記免疫細胞表面抗原が、Ｔ細胞表面抗原である、実施形態２４に記載の抗体。
実施形態２６
前記抗原が、Ｔ細胞刺激分子である、実施形態２５に記載の抗体。
実施形態２７
前記Ｔ細胞刺激分子が、ＣＤ３またはＣＤ２８である、実施形態２６に記載の抗体。
実施形態２８
前記免疫細胞表面抗原が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞表面抗原である、実施形態２４に記載の抗体。
実施形態２９
前記免疫細胞表面抗原が、マクロファージ細胞表面抗原である、実施形態２４に記載の抗体。
実施形態３０
融合タンパク質であって、
異種アミノ酸配列に融合した、実施形態１～２９のいずれか一項に記載の抗体の鎖を含む、融合タンパク質。
実施形態３１
前記異種アミノ酸配列が、前記抗体の前記鎖のＣ末端に融合している、実施形態３０に記載の融合タンパク質。
実施形態３２
前記抗体が、実施形態１９または２０に記載の単鎖抗体である、実施形態３０または３１に記載の融合タンパク質。
実施形態３３
前記融合タンパク質が、
前記単鎖抗体と、
膜貫通ドメインと、
細胞内シグナル伝達ドメインと
を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、実施形態３２に記載の融合タンパク質。
実施形態３４
実施形態１～２９のいずれか一項に記載の抗体または実施形態３０～３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、
前記抗体または融合タンパク質にコンジュゲートされた薬剤と
を含む、コンジュゲート。
実施形態３５
前記薬剤が、化学療法剤、毒素、放射線増感剤、放射性同位体、検出可能な標識、および半減期延長部分からなる群から選択される、実施形態３４に記載のコンジュゲート。
実施形態３６
前記放射性同位体が、治療用放射性同位体である、実施形態３５に記載のコンジュゲート。
実施形態３７
前記検出可能な標識が、放射性標識である、実施形態３５に記載のコンジュゲート。
実施形態３８
前記放射性標識が、ジルコニウム－８９（ ８９ Ｚｒ）である、実施形態３７に記載のコンジュゲート。
実施形態３９
前記薬剤が、切断不可能なリンカーを介して、前記抗体または融合タンパク質にコンジュゲートされている、実施形態３４～３８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
実施形態４０
前記薬剤が、切断可能なリンカーを介して、前記抗体または融合タンパク質にコンジュゲートされている、実施形態３４～３８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
実施形態４１
前記切断可能なリンカーが、酵素切断可能なリンカーである、実施形態４０に記載のコンジュゲート。
実施形態４２
前記リンカーが、リソソームプロテアーゼによって切断可能である、実施形態４１に記載のコンジュゲート。
実施形態４３
前記リンカーが、カテプシンまたはプラスミンによって切断可能である、実施形態４２に記載のコンジュゲート。
実施形態４４
実施形態１～２９のいずれか一項に記載の抗体の可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、可変軽鎖（Ｖ Ｌ ）ポリペプチド、またはその両方をコードする核酸。
実施形態４５
実施形態３０～３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
実施形態４６
実施形態４４または４５に記載の核酸を含む、発現ベクター。
実施形態４７
実施形態４４もしくは４５に記載の核酸、または
実施形態４６に記載の発現ベクター
を含む、細胞。
実施形態４８
実施形態１～１８のいずれか一項に記載の抗体の前記可変重鎖（Ｖ Ｈ ）ポリペプチドをコードする第１の核酸と、
前記抗体の前記可変軽鎖（Ｖ Ｌ ）ポリペプチドをコードする第２の核酸と
を含む、細胞。
実施形態４９
前記第１の核酸を含む第１の発現ベクターと、
前記第２の核酸を含む第２の発現ベクターと
を含む、実施形態４８に記載の細胞。
実施形態５０
実施形態１～２８のいずれか一項に記載の抗体を産生する方法であって、前記細胞が前記抗体を発現するのに好適な条件下で、実施形態４７～４９のいずれか一項に記載の細胞を培養することを含み、前記抗体が産生される、方法。
実施形態５１
実施形態１～２８のいずれか一項に記載の抗体と、
薬学的に許容される担体と
を含む、医薬組成物。
実施形態５２
実施形態３０～３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、
薬学的に許容される担体と
を含む、医薬組成物。
実施形態５３
実施形態３４～４３のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、
薬学的に許容される担体と
を含む、医薬組成物。
実施形態５４
実施形態５１～５３のいずれか一項に記載の医薬組成物と、
前記医薬組成物をそれを必要とする個体に投与するための説明書と
を含む、キット。
実施形態５５
前記医薬組成物が、１つ以上の単位剤形で存在する、実施形態５４に記載のキット。
実施形態５６
前記医薬組成物が、２つ以上の単位剤形で存在する、実施形態５４に記載のキット。
実施形態５７
実施形態５１～５３のいずれか一項に記載の医薬組成物を、がんを有する個体に投与することを含み、前記個体が、ワクシニアウイルス（ＶＶ）に感染されたがん細胞を含み、前記抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートが、前記感染されたがん細胞の表面上に発現するＶＶ抗原によって、前記感染されたがん細胞に標的指向化される、方法。
実施形態５８
前記医薬組成物を前記個体に投与する前に、ＶＶを前記個体に投与することによって前記がん細胞に感染させることをさらに含む、実施形態５７に記載の方法。
実施形態５９
前記方法が、前記個体の前記がんを治療する方法である、実施形態５７または５８に記載の方法。
実施形態６０
実施形態５３に記載の医薬組成物が前記個体に投与され、前記コンジュゲートが、インビボイメージング剤である検出可能な標識または放射性同位体にコンジュゲートされた前記抗体を含み、前記方法が、前記インビボイメージング剤を使用して、前記個体の前記感染したがん細胞をイメージングすることを含む、実施形態５７～５９のいずれか一項に記載の方法。
実施形態６１
腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）抗原に特異的に結合する抗体を、個体のがん細胞に標的指向化する方法であって、
前記ＯＶ抗原に特異的に結合する抗体を含む医薬組成物を前記個体に投与することを含み、前記個体中の前記がん細胞はＯＶに感染され、それらの表面上に前記ＯＶ抗原を発現する、方法。
実施形態６２
前記医薬組成物を前記個体に投与する前に、前記ＯＶを前記個体に投与することによって、前記がん細胞に感染させることをさらに含む、実施形態６１に記載の方法。
実施形態６３
前記ＯＶ抗原が、前記ＯＶにネイティブである、実施形態６１または６２に記載の方法。
実施形態６４
前記ＯＶ抗原が、前記ＯＶに対して異種である、実施形態６１または６２に記載の方法。
実施形態６５
前記ＯＶが、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、レオウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、セネカバレーウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、およびマラバウイルスからなる群から選択される、実施形態６１～６４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態６６
前記ＯＶが、ワクシニアウイルス（ＶＶ）である、実施形態６１～６４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態６７
前記ＶＶが、ＪＸ－５９４またはＧＬ－ＯＮＣ１である、実施形態６６に記載の方法。
実施形態６８
前記ＶＶの株が、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ、Ｗｙｅｔｈ、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｔｅｍｐｌｅ ｏｆ Ｈｅａｖｅｎ、Ｐａｔｗａｄａｎｇａｒ、および改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａからなる群から選択される、実施形態６６に記載の方法。
実施形態６９
前記抗体が、モノクローナル抗体である、実施形態６１～６８のいずれか一項に記載の方法。
実施形態７０
前記抗体が、ヒト化抗体である、実施形態６１～６９のいずれか一項に記載の方法。
実施形態７１
前記抗体が、ＩｇＧである、実施形態６１～７０のいずれか一項に記載の方法。
実施形態７２
前記抗体が、ヒトＦｃドメインである、実施形態７１に記載の方法。
実施形態７３
前記抗体がヒトＩｇＧ１である、実施形態７２に記載の方法。
実施形態７４
前記抗体が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’） ２ 、およびＦ（ａｂ’）からなる群から選択される、実施形態６１～７０のいずれか一項に記載の方法。
実施形態７５
前記抗体が、単鎖抗体である、実施形態６１～７０のいずれか一項に記載の方法。
実施形態７６
前記単鎖抗体が、ｓｃＦｖである、実施形態７５に記載の方法。
実施形態７７
前記ＯＶ抗原が、ＶＶ Ａ５６抗原である、実施形態６６～７６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態７８
前記医薬組成物が、実施形態１～８のいずれか一項に記載の抗体を含む、実施形態７７に記載の方法。
実施形態７９
前記ＯＶ抗原が、ＶＶ Ｂ５抗原である、実施形態６６～７６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態８０
前記医薬組成物が、実施形態９～１２のいずれか一項に記載の抗体を含む、実施形態７９に記載の方法。
実施形態８１
前記医薬組成物が、検出可能な標識または放射性同位体にコンジュゲートされた前記抗体を含む、実施形態５７～８０のいずれか一項に記載の方法。
実施形態８２
前記検出可能な標識または放射性同位体が、インビボイメージング剤である、実施形態８１に記載の方法。
実施形態８３
前記がん細胞をインビボでイメージングするための前記インビボイメージング剤を検出することを含む、実施形態８２に記載の方法。
実施形態８４
前記方法が、前記個体の前記がんを治療する方法である、実施形態６１～８３のいずれか一項に記載の方法。
実施形態８５
腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインと、
膜貫通ドメインと、
細胞内シグナル伝達ドメインと
を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
実施形態８６
前記ＯＶ抗原が前記ＯＶにネイティブである、実施形態８５に記載のＣＡＲ。
実施形態８７
前記ＯＶ抗原が前記ＯＶに対して異種である、実施形態８５に記載のＣＡＲ。
実施形態８８
前記ＯＶが、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、レオウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、セネカバレーウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、およびマラバウイルスからなる群から選択される、実施形態８５～８７のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
実施形態８９
前記ＯＶ抗原が、ワクシニアウイルス（ＶＶ）によってコードされる抗原である、実施形態８５～８７のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
実施形態９０
前記ＶＶが、ＪＸ－５９４またはＧＬ－ＯＮＣ１である、実施形態８９に記載のＣＡＲ。
実施形態９１
前記ＶＶの株が、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ、Ｗｙｅｔｈ、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｔｅｍｐｌｅ ｏｆ Ｈｅａｖｅｎ、Ｐａｔｗａｄａｎｇａｒ、および改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａからなる群から選択される、実施形態８９に記載のＣＡＲ。
実施形態９２
前記ＯＶ抗原がＶＶ Ａ５６抗原である、実施形態８９に記載のＣＡＲ。
実施形態９３
前記抗原結合ドメインが、実施形態１～８のいずれか一項に記載の抗体のＶ Ｈ ポリペプチド－Ｖ Ｌ ポリペプチド対を含む、実施形態９２に記載のＣＡＲ。
実施形態９４
前記ＯＶ抗原がＶＶ Ｂ５抗原である、実施形態８９に記載のＣＡＲ。
実施形態９５
前記抗原結合ドメインが、実施形態９～１２のいずれか一項に記載の抗体のＶ Ｈ ポリペプチド－Ｖ Ｌ ポリペプチド対を含む、実施形態９４に記載のＣＡＲ。
実施形態９６
前記抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖを含む、実施形態８５～９５のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
実施形態９７
前記ＣＡＲが、単一のポリペプチドによって提供される、８５～９６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
実施形態９８
前記ＣＡＲが、２つ以上のポリペプチドによって提供される、８５～９６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
実施形態９９
実施形態８５～９８のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする、核酸。
実施形態１００
実施形態９９に記載の核酸を含む、細胞。
実施形態１０１
前記細胞が、その表面上に前記ＣＡＲを発現する、実施形態１００に記載の細胞。
実施形態１０２
前記細胞が、免疫細胞である、実施形態１００または１０１に記載の細胞。
実施形態１０３
前記細胞が、免疫エフェクター細胞である、実施形態１０２に記載の細胞。
実施形態１０４
前記細胞が、Ｔ細胞である、実施形態１０３に記載の細胞。
実施形態１０５
前記細胞が、ＮＫ細胞である、実施形態１０３に記載の細胞。
実施形態１０６
前記細胞が、マクロファージである、実施形態１０３に記載の細胞。
実施形態１０７
実施形態１００～１０５のいずれか一項に記載の細胞を含む、医薬組成物。
実施形態１０８
腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）抗原に特異的に結合するＣＡＲを、個体のがん細胞に標的指向化する方法であって、
実施形態１０７に記載の医薬組成物を前記個体に投与することを含み、前記個体の前記がん細胞はＯＶに感染され、それらの表面上に前記ＯＶ抗原を発現する、方法。
実施形態１０９
前記医薬組成物を前記個体に投与する前に、前記ＯＶを前記個体に投与することによって、前記がん細胞に感染させることをさらに含む、実施形態１０８に記載の方法。
実施形態１１０
前記方法が、前記個体の前記がんを治療する方法である、実施形態１０８または１０９に記載の方法。
実施形態１１１
コンジュゲートであって、
腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）抗原に特異的に結合する抗体と、
前記抗体にコンジュゲートされた薬剤と
を含み、前記薬剤が、化学療法剤、毒素、放射線増感剤、および放射性同位体からなる群から選択される、コンジュゲート。
実施形態１１２
前記放射性同位体が、治療用放射性同位体である、実施形態１１１に記載のコンジュゲート。
実施形態１１３
前記ＯＶ抗原が、前記ＯＶにネイティブである、実施形態１１１または１１２に記載のコンジュゲート。
実施形態１１４
前記ＯＶ抗原が、前記ＯＶに対して異種である、実施形態１１１または１１２に記載のコンジュゲート。
実施形態１１５
前記ＯＶ抗原が、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ＨＳＶ、レオウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、セネカバレーウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、およびマラバウイルスからなる群から選択されるＯＶによってコードされる抗原である、実施形態１１１～１１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
実施形態１１６
前記ＯＶ抗原が、ワクシニアウイルス（ＶＶ）によってコードされる抗原である、実施形態１１１～１１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
実施形態１１７
前記ＶＶが、ＪＸ－５９４またはＧＬ－ＯＮＣ１である、実施形態１１６に記載のコンジュゲート。
実施形態１１８
前記ＶＶの株が、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ、Ｗｙｅｔｈ、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｔｅｍｐｌｅ ｏｆ Ｈｅａｖｅｎ、Ｐａｔｗａｄａｎｇａｒ、および改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａからなる群から選択される、実施形態１１６に記載のコンジュゲート。
実施形態１１９
前記ＯＶ抗原が、ＶＶ Ａ５６抗原である、実施形態１１６に記載のコンジュゲート。
実施形態１２０
前記抗体が、実施形態１～８のいずれか一項に記載の抗体である、実施形態１１９に記載のコンジュゲート。
実施形態１２１
前記ＯＶ抗原が、ＶＶ Ｂ５抗原である、実施形態１１６に記載のコンジュゲート。
実施形態１２２
前記抗体が、実施形態９～１２のいずれか一項に記載の抗体である、実施形態１２１に記載のコンジュゲート。
実施形態１２３
前記抗体が、モノクローナル抗体である、実施形態１１１～１２２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
実施形態１２４
前記抗体が、ヒト化抗体である、実施形態１１１～１２３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
実施形態１２５
前記抗体が、ＩｇＧである、実施形態１１１～１２４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
実施形態１２６
前記抗体が、ヒトＦｃドメインを含む、実施形態１２５に記載のコンジュゲート。
実施形態１２７
前記抗体が、ヒトＩｇＧ１である、実施形態１２６に記載のコンジュゲート。
実施形態１２８
前記抗体が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’） ２ 、およびＦ（ａｂ’）からなる群から選択される、実施形態１１１～１２４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
実施形態１２９
前記抗体が、単鎖抗体である、実施形態１１１～１２４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
実施形態１３０
前記単鎖抗体が、ｓｃＦｖである、実施形態１２９に記載のコンジュゲート。
実施形態１３１
前記薬剤が、切断不可能なリンカーを介して、前記抗体にコンジュゲートされている、実施形態１１１～１３０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
実施形態１３２
前記薬剤が、切断可能なリンカーを介して、前記抗体にコンジュゲートされている、実施形態１１１～１３０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
実施形態１３３
前記切断可能なリンカーが、酵素切断可能なリンカーである、実施形態１３２に記載のコンジュゲート。
実施形態１３４
前記リンカーが、リソソームプロテアーゼによって切断可能である、実施形態１３３に記載のコンジュゲート。
実施形態１３５
前記リンカーが、カテプシンまたはプラスミンによって切断可能である、実施形態１３４に記載のコンジュゲート。
実施形態１３６
実施形態１１１～１３５のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む、医薬組成物。
実施形態１３７
腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）抗原に特異的に結合する抗体を含むコンジュゲートを、個体のがん細胞に標的指向化する方法であって、
実施形態１３６に記載の医薬組成物を前記個体に投与することを含み、前記個体の前記がん細胞はＯＶに感染され、それらの表面上に前記ＯＶ抗原を発現する、方法。
実施形態１３８
前記医薬組成物を前記個体に投与する前に、前記ＯＶを前記個体に投与することによって、前記がん細胞に感染させることをさらに含む、実施形態１３７に記載の方法。
実施形態１３９
前記方法が、前記個体の前記がんを治療する方法である、実施形態１３７または１３８に記載の方法。
このように、上記は、単に本開示の原理を説明しているにすぎない。本明細書に明示的には記載または図示していないが、本発明の原理を具現化しその趣旨および範囲内に含まれる様々な構成を当業者が工夫することができることが理解されよう。さらに、本明細書に列挙されたすべての例および条件的文言は、主として本発明の原理および発明者らにより当該技術分野の促進のために寄与された概念を理解する上で読者を助けることを意図しており、このような具体的に列挙された例および条件への限定ではないと解釈されるべきである。また、本発明の原理、態様、および実施形態、ならびにその具体的な例を列挙する本明細書におけるすべての記述は、その構造的および機能的等価物の両方を包含することを意図する。加えて、そのような等価物は、現在知られている等価物および将来開発される等価物の両方、すなわち、構造にかかわらず同じ機能を果たすあらゆる開発要素も含むことが意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書に図示および記載された例示的な実施形態に限定されることを意図しない。
実施形態１
ワクシニアウイルスＡ５６抗原（ＶＶ Ａ５６）に特異的に結合し、ＶＶ Ａ５６への結合について、
アミノ酸配列ＳＳＹＷＩＣ（配列番号３）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＩＹＡＧＳＧＧＳＴＹＹＡＴＷＡＫＧ（配列番号４）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＡＹＳＤＲＳＧＧＹＳＦＮＬ（配列番号５）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＶＤＮＮＮＹＬＡ（配列番号６）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＳＡＳＳＬＡＳ（配列番号７）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＬＧＳＹＤＣＳＤＡＤＣＹＡ（配列番号８）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（Ｖ Ｌ ）ポリペプチド；
アミノ酸配列ＤＩＹＹＩＳ（配列番号１１）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＴＹＡＧＳＳＧＳＴＹＹＡＴＷＡＫＧ（配列番号１２）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＤＲＹＰＧＴＳＧＲＶＹＧＭＤＬ（配列番号１３）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＩＳＤＬＬＳ（配列番号１４）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＳＡＳＴＬＡＳ（配列番号１５）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＣＮＹＹＳＰＴＹＧＮＧ（配列番号１６）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（Ｖ Ｌ ）ポリペプチド；
アミノ酸配列ＳＳＹＷＬＣ（配列番号１９）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＩＹＮＧＤＧＳＴＨＹＡＳＷＡＫＧ（配列番号２０）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＤＹＴＹＮＦＹＴＹＧＦＮＬ（配列番号２１）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（Ｖ Ｈ ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＶＮＩＷＡＳ（配列番号２２）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＫＡＳＴＬＡＳ（配列番号２３）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＧＧＹＰＳＳＳＳＧＷＡ（配列番号２４）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（Ｖ Ｌ ）ポリペプチド；または
アミノ酸配列ＳＳＹＷＩＣ（配列番号２７）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＴＹＮＧＤＧＳＴＨＹＡＳＷＡＫＧ（配列番号２８）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＤＹＴＤＡＦＹＴＹＧＦＮＬ（配列番号２９）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＴＳＳＹＬＡ（配列番号３０）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＲＡＳＳＬＡＳ（配列番号３１）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＴＧＦＹＧＳＳＧＨＴ（配列番号３２）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド
を含む抗体と競合する、抗体。
実施形態２
前記抗体が、
アミノ酸配列ＳＳＹＷＩＣ（配列番号３）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＩＹＡＧＳＧＧＳＴＹＹＡＴＷＡＫＧ（配列番号４）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＡＹＳＤＲＳＧＧＹＳＦＮＬ（配列番号５）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＶＤＮＮＮＹＬＡ（配列番号６）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＳＡＳＳＬＡＳ（配列番号７）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＬＧＳＹＤＣＳＤＡＤＣＹＡ（配列番号８）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド；
アミノ酸配列ＤＩＹＹＩＳ（配列番号１１）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＴＹＡＧＳＳＧＳＴＹＹＡＴＷＡＫＧ（配列番号１２）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＤＲＹＰＧＴＳＧＲＶＹＧＭＤＬ（配列番号１３）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＩＳＤＬＬＳ（配列番号１４）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＳＡＳＴＬＡＳ（配列番号１５）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＣＮＹＹＳＰＴＹＧＮＧ（配列番号１６）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド；
アミノ酸配列ＳＳＹＷＬＣ（配列番号１９）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＩＹＮＧＤＧＳＴＨＹＡＳＷＡＫＧ（配列番号２０）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＤＹＴＹＮＦＹＴＹＧＦＮＬ（配列番号２１）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（Ｖ Ｈ ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＶＮＩＷＡＳ（配列番号２２）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＫＡＳＴＬＡＳ（配列番号２３）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＧＧＹＰＳＳＳＳＧＷＡ（配列番号２４）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド；または
アミノ酸配列ＳＳＹＷＩＣ（配列番号２７）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＴＹＮＧＤＧＳＴＨＹＡＳＷＡＫＧ（配列番号２８）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＤＹＴＤＡＦＹＴＹＧＦＮＬ（配列番号２９）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＴＳＳＹＬＡ（配列番号３０）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＲＡＳＳＬＡＳ（配列番号３１）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＴＧＦＹＧＳＳＧＨＴ（配列番号３２）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド
を含む、実施形態１に記載の抗体。
実施形態３
前記抗体が、
配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（Ｖ Ｈ ）ポリペプチド、および
配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（Ｖ Ｌ ）ポリペプチドを含む、実施形態１または２に記載の抗体。
実施形態４
前記抗体が、
配列番号９に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（Ｖ Ｈ ）ポリペプチド、および
配列番号１０に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（Ｖ Ｌ ）ポリペプチドを含む、実施形態１または２に記載の抗体。
実施形態５
前記抗体が、
配列番号１７に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（Ｖ Ｈ ）ポリペプチド、および
配列番号１８に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（Ｖ Ｌ ）ポリペプチドを含む、実施形態１または２に記載の抗体。
実施形態６
前記抗体が、
配列番号２５に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（Ｖ Ｈ ）ポリペプチド、および
配列番号２６に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（Ｖ Ｌ ）ポリペプチドを含む、実施形態１または２に記載の抗体。
実施形態７
前記抗体が、
配列番号９に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（Ｖ Ｈ ）ポリペプチド、および
配列番号６２に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（Ｖ Ｌ ）ポリペプチドを含む、実施形態１または２に記載の抗体。
実施形態８
前記抗体が、
配列番号９に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（Ｖ Ｈ ）ポリペプチド、および
配列番号６３に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（Ｖ Ｌ ）ポリペプチドを含む、実施形態１または２に記載の抗体。
実施形態９
ワクシニアウイルスＢ５抗原（ＶＶ Ｂ５）に特異的に結合し、ＶＶ Ｂ５への結合について、
アミノ酸配列ＳＳＹＹＭＣ（配列番号３５）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＩＹＴＳＳＧＳＡＹＹＡＮＷＡＫＧ（配列番号３６）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＮＡＶＧＳＳＹＹＬＹＬ（配列番号３７）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＶＡＧＮＮＹＬＳ（配列番号３８）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＳＶＳＴＬＡＳ（配列番号３９）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＧＹＹＮＤＧＩＷＡ（配列番号４０）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（Ｖ Ｌ ）ポリペプチド；または
アミノ酸配列ＳＹＷＭＣ（配列番号４３）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＩＹＧＧＳＳＧＳＴＹＹＳＮＷＡＫＧ（配列番号４４）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＤＧＳＴＷＤＹＦＲＬ（配列番号４５）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＩＮＴＮＹＬＳ（配列番号４６）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＱＡＳＴＬＥＳ（配列番号４７）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＧＹＹＴＶＥＮＩＧＮＰ（配列番号４８）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド
を含む抗体と競合する、抗体。
実施形態１０
前記抗体が、
アミノ酸配列ＳＳＹＹＭＣ（配列番号３５）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＩＹＴＳＳＧＳＡＹＹＡＮＷＡＫＧ（配列番号３６）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＮＡＶＧＳＳＹＹＬＹＬ（配列番号３７）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＶＡＧＮＮＹＬＳ（配列番号３８）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＳＶＳＴＬＡＳ（配列番号３９）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＧＹＹＮＤＧＩＷＡ（配列番号４０）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド；または
アミノ酸配列ＳＹＷＭＣ（配列番号４３）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＩＹＧＧＳＳＧＳＴＹＹＳＮＷＡＫＧ（配列番号４４）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＤＧＳＴＷＤＹＦＲＬ（配列番号４５）を含むＶ Ｈ ＣＤＲ３と、を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＩＮＴＮＹＬＳ（配列番号４６）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＱＡＳＴＬＥＳ（配列番号４７）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＧＹＹＴＶＥＮＩＧＮＰ（配列番号４８）を含むＶ Ｌ ＣＤＲ３と、を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド
を含む、実施形態９に記載の抗体。
実施形態１１
前記抗体が、
配列番号３３に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（Ｖ Ｈ ）ポリペプチド、および
配列番号３４に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（Ｖ Ｌ ）ポリペプチドを含む、実施形態９または１０に記載の抗体。
実施形態１２
前記抗体が、
配列番号４１に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（Ｖ Ｈ ）ポリペプチド、および
配列番号４２に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（Ｖ Ｌ ）ポリペプチドを含む、実施形態９または１０に記載の抗体。
実施形態１３
前記抗体が、モノクローナル抗体である、実施形態１～１２のいずれか一項に記載の抗体。
実施形態１４
前記抗体が、ヒト化抗体である、実施形態１～１３のいずれか一項に記載の抗体。
実施形態１５
前記抗体が、ＩｇＧである、実施形態１～１４のいずれか一項に記載の抗体。
実施形態１６
前記抗体が、ヒトＦｃドメインを含む、実施形態１５に記載の抗体。
実施形態１７
前記抗体が、ヒトＩｇＧ１である、実施形態１６に記載の抗体。
実施形態１８
前記抗体が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’） ２ 、およびＦ（ａｂ’）からなる群から選択される、実施形態１～１４のいずれか一項に記載の抗体。
実施形態１９
前記抗体が、単鎖抗体である、実施形態１～１４のいずれか一項に記載の抗体。
実施形態２０
前記単鎖抗体が、ｓｃＦｖである、実施形態１９に記載の抗体。
実施形態２１
前記抗体が、実施形態１～１２のいずれか一項に記載のＶ Ｈ ポリペプチド－Ｖ Ｌ ポリペプチド対を含む第１の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体である、実施形態１～２０のいずれか一項に記載の抗体。
実施形態２２
前記二重特異性抗体が、ワクシニアウイルス抗原以外の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む、実施形態２１に記載の抗体。
実施形態２３
前記ワクシニアウイルス抗原以外の抗原が、免疫細胞表面抗原である、実施形態２２に記載の抗体。
実施形態２４
前記免疫細胞表面抗原が、免疫エフェクター細胞表面抗原である、実施形態２３に記載の抗体。
実施形態２５
前記免疫細胞表面抗原が、Ｔ細胞表面抗原である、実施形態２４に記載の抗体。
実施形態２６
前記抗原が、Ｔ細胞刺激分子である、実施形態２５に記載の抗体。
実施形態２７
前記Ｔ細胞刺激分子が、ＣＤ３またはＣＤ２８である、実施形態２６に記載の抗体。
実施形態２８
前記免疫細胞表面抗原が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞表面抗原である、実施形態２４に記載の抗体。
実施形態２９
前記免疫細胞表面抗原が、マクロファージ細胞表面抗原である、実施形態２４に記載の抗体。
実施形態３０
融合タンパク質であって、
異種アミノ酸配列に融合した、実施形態１～２９のいずれか一項に記載の抗体の鎖を含む、融合タンパク質。
実施形態３１
前記異種アミノ酸配列が、前記抗体の前記鎖のＣ末端に融合している、実施形態３０に記載の融合タンパク質。
実施形態３２
前記抗体が、実施形態１９または２０に記載の単鎖抗体である、実施形態３０または３１に記載の融合タンパク質。
実施形態３３
前記融合タンパク質が、
前記単鎖抗体と、
膜貫通ドメインと、
細胞内シグナル伝達ドメインと
を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、実施形態３２に記載の融合タンパク質。
実施形態３４
実施形態１～２９のいずれか一項に記載の抗体または実施形態３０～３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、
前記抗体または融合タンパク質にコンジュゲートされた薬剤と
を含む、コンジュゲート。
実施形態３５
前記薬剤が、化学療法剤、毒素、放射線増感剤、放射性同位体、検出可能な標識、および半減期延長部分からなる群から選択される、実施形態３４に記載のコンジュゲート。
実施形態３６
前記放射性同位体が、治療用放射性同位体である、実施形態３５に記載のコンジュゲート。
実施形態３７
前記検出可能な標識が、放射性標識である、実施形態３５に記載のコンジュゲート。
実施形態３８
前記放射性標識が、ジルコニウム－８９（ ８９ Ｚｒ）である、実施形態３７に記載のコンジュゲート。
実施形態３９
前記薬剤が、切断不可能なリンカーを介して、前記抗体または融合タンパク質にコンジュゲートされている、実施形態３４～３８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
実施形態４０
前記薬剤が、切断可能なリンカーを介して、前記抗体または融合タンパク質にコンジュゲートされている、実施形態３４～３８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
実施形態４１
前記切断可能なリンカーが、酵素切断可能なリンカーである、実施形態４０に記載のコンジュゲート。
実施形態４２
前記リンカーが、リソソームプロテアーゼによって切断可能である、実施形態４１に記載のコンジュゲート。
実施形態４３
前記リンカーが、カテプシンまたはプラスミンによって切断可能である、実施形態４２に記載のコンジュゲート。
実施形態４４
実施形態１～２９のいずれか一項に記載の抗体の可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、可変軽鎖（Ｖ Ｌ ）ポリペプチド、またはその両方をコードする核酸。
実施形態４５
実施形態３０～３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
実施形態４６
実施形態４４または４５に記載の核酸を含む、発現ベクター。
実施形態４７
実施形態４４もしくは４５に記載の核酸、または
実施形態４６に記載の発現ベクター
を含む、細胞。
実施形態４８
実施形態１～１８のいずれか一項に記載の抗体の前記可変重鎖（Ｖ Ｈ ）ポリペプチドをコードする第１の核酸と、
前記抗体の前記可変軽鎖（Ｖ Ｌ ）ポリペプチドをコードする第２の核酸と
を含む、細胞。
実施形態４９
前記第１の核酸を含む第１の発現ベクターと、
前記第２の核酸を含む第２の発現ベクターと
を含む、実施形態４８に記載の細胞。
実施形態５０
実施形態１～２８のいずれか一項に記載の抗体を産生する方法であって、前記細胞が前記抗体を発現するのに好適な条件下で、実施形態４７～４９のいずれか一項に記載の細胞を培養することを含み、前記抗体が産生される、方法。
実施形態５１
実施形態１～２８のいずれか一項に記載の抗体と、
薬学的に許容される担体と
を含む、医薬組成物。
実施形態５２
実施形態３０～３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、
薬学的に許容される担体と
を含む、医薬組成物。
実施形態５３
実施形態３４～４３のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、
薬学的に許容される担体と
を含む、医薬組成物。
実施形態５４
実施形態５１～５３のいずれか一項に記載の医薬組成物と、
前記医薬組成物をそれを必要とする個体に投与するための説明書と
を含む、キット。
実施形態５５
前記医薬組成物が、１つ以上の単位剤形で存在する、実施形態５４に記載のキット。
実施形態５６
前記医薬組成物が、２つ以上の単位剤形で存在する、実施形態５４に記載のキット。
実施形態５７
実施形態５１～５３のいずれか一項に記載の医薬組成物を、がんを有する個体に投与することを含み、前記個体が、ワクシニアウイルス（ＶＶ）に感染されたがん細胞を含み、前記抗体、融合タンパク質またはコンジュゲートが、前記感染されたがん細胞の表面上に発現するＶＶ抗原によって、前記感染されたがん細胞に標的指向化される、方法。
実施形態５８
前記医薬組成物を前記個体に投与する前に、ＶＶを前記個体に投与することによって前記がん細胞に感染させることをさらに含む、実施形態５７に記載の方法。
実施形態５９
前記方法が、前記個体の前記がんを治療する方法である、実施形態５７または５８に記載の方法。
実施形態６０
実施形態５３に記載の医薬組成物が前記個体に投与され、前記コンジュゲートが、インビボイメージング剤である検出可能な標識または放射性同位体にコンジュゲートされた前記抗体を含み、前記方法が、前記インビボイメージング剤を使用して、前記個体の前記感染したがん細胞をイメージングすることを含む、実施形態５７～５９のいずれか一項に記載の方法。
実施形態６１
腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）抗原に特異的に結合する抗体を、個体のがん細胞に標的指向化する方法であって、
前記ＯＶ抗原に特異的に結合する抗体を含む医薬組成物を前記個体に投与することを含み、前記個体中の前記がん細胞はＯＶに感染され、それらの表面上に前記ＯＶ抗原を発現する、方法。
実施形態６２
前記医薬組成物を前記個体に投与する前に、前記ＯＶを前記個体に投与することによって、前記がん細胞に感染させることをさらに含む、実施形態６１に記載の方法。
実施形態６３
前記ＯＶ抗原が、前記ＯＶにネイティブである、実施形態６１または６２に記載の方法。
実施形態６４
前記ＯＶ抗原が、前記ＯＶに対して異種である、実施形態６１または６２に記載の方法。
実施形態６５
前記ＯＶが、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、レオウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、セネカバレーウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、およびマラバウイルスからなる群から選択される、実施形態６１～６４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態６６
前記ＯＶが、ワクシニアウイルス（ＶＶ）である、実施形態６１～６４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態６７
前記ＶＶが、ＪＸ－５９４またはＧＬ－ＯＮＣ１である、実施形態６６に記載の方法。
実施形態６８
前記ＶＶの株が、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ、Ｗｙｅｔｈ、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｔｅｍｐｌｅ ｏｆ Ｈｅａｖｅｎ、Ｐａｔｗａｄａｎｇａｒ、および改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａからなる群から選択される、実施形態６６に記載の方法。
実施形態６９
前記抗体が、モノクローナル抗体である、実施形態６１～６８のいずれか一項に記載の方法。
実施形態７０
前記抗体が、ヒト化抗体である、実施形態６１～６９のいずれか一項に記載の方法。
実施形態７１
前記抗体が、ＩｇＧである、実施形態６１～７０のいずれか一項に記載の方法。
実施形態７２
前記抗体が、ヒトＦｃドメインである、実施形態７１に記載の方法。
実施形態７３
前記抗体がヒトＩｇＧ１である、実施形態７２に記載の方法。
実施形態７４
前記抗体が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’） ２ 、およびＦ（ａｂ’）からなる群から選択される、実施形態６１～７０のいずれか一項に記載の方法。
実施形態７５
前記抗体が、単鎖抗体である、実施形態６１～７０のいずれか一項に記載の方法。
実施形態７６
前記単鎖抗体が、ｓｃＦｖである、実施形態７５に記載の方法。
実施形態７７
前記ＯＶ抗原が、ＶＶ Ａ５６抗原である、実施形態６６～７６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態７８
前記医薬組成物が、実施形態１～８のいずれか一項に記載の抗体を含む、実施形態７７に記載の方法。
実施形態７９
前記ＯＶ抗原が、ＶＶ Ｂ５抗原である、実施形態６６～７６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態８０
前記医薬組成物が、実施形態９～１２のいずれか一項に記載の抗体を含む、実施形態７９に記載の方法。
実施形態８１
前記医薬組成物が、検出可能な標識または放射性同位体にコンジュゲートされた前記抗体を含む、実施形態５７～８０のいずれか一項に記載の方法。
実施形態８２
前記検出可能な標識または放射性同位体が、インビボイメージング剤である、実施形態８１に記載の方法。
実施形態８３
前記がん細胞をインビボでイメージングするための前記インビボイメージング剤を検出することを含む、実施形態８２に記載の方法。
実施形態８４
前記方法が、前記個体の前記がんを治療する方法である、実施形態６１～８３のいずれか一項に記載の方法。
実施形態８５
腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインと、
膜貫通ドメインと、
細胞内シグナル伝達ドメインと
を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
実施形態８６
前記ＯＶ抗原が前記ＯＶにネイティブである、実施形態８５に記載のＣＡＲ。
実施形態８７
前記ＯＶ抗原が前記ＯＶに対して異種である、実施形態８５に記載のＣＡＲ。
実施形態８８
前記ＯＶが、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、レオウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、セネカバレーウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、およびマラバウイルスからなる群から選択される、実施形態８５～８７のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
実施形態８９
前記ＯＶ抗原が、ワクシニアウイルス（ＶＶ）によってコードされる抗原である、実施形態８５～８７のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
実施形態９０
前記ＶＶが、ＪＸ－５９４またはＧＬ－ＯＮＣ１である、実施形態８９に記載のＣＡＲ。
実施形態９１
前記ＶＶの株が、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ、Ｗｙｅｔｈ、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｔｅｍｐｌｅ ｏｆ Ｈｅａｖｅｎ、Ｐａｔｗａｄａｎｇａｒ、および改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａからなる群から選択される、実施形態８９に記載のＣＡＲ。
実施形態９２
前記ＯＶ抗原がＶＶ Ａ５６抗原である、実施形態８９に記載のＣＡＲ。
実施形態９３
前記抗原結合ドメインが、実施形態１～８のいずれか一項に記載の抗体のＶ Ｈ ポリペプチド－Ｖ Ｌ ポリペプチド対を含む、実施形態９２に記載のＣＡＲ。
実施形態９４
前記ＯＶ抗原がＶＶ Ｂ５抗原である、実施形態８９に記載のＣＡＲ。
実施形態９５
前記抗原結合ドメインが、実施形態９～１２のいずれか一項に記載の抗体のＶ Ｈ ポリペプチド－Ｖ Ｌ ポリペプチド対を含む、実施形態９４に記載のＣＡＲ。
実施形態９６
前記抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖを含む、実施形態８５～９５のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
実施形態９７
前記ＣＡＲが、単一のポリペプチドによって提供される、８５～９６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
実施形態９８
前記ＣＡＲが、２つ以上のポリペプチドによって提供される、８５～９６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
実施形態９９
実施形態８５～９８のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする、核酸。
実施形態１００
実施形態９９に記載の核酸を含む、細胞。
実施形態１０１
前記細胞が、その表面上に前記ＣＡＲを発現する、実施形態１００に記載の細胞。
実施形態１０２
前記細胞が、免疫細胞である、実施形態１００または１０１に記載の細胞。
実施形態１０３
前記細胞が、免疫エフェクター細胞である、実施形態１０２に記載の細胞。
実施形態１０４
前記細胞が、Ｔ細胞である、実施形態１０３に記載の細胞。
実施形態１０５
前記細胞が、ＮＫ細胞である、実施形態１０３に記載の細胞。
実施形態１０６
前記細胞が、マクロファージである、実施形態１０３に記載の細胞。
実施形態１０７
実施形態１００～１０５のいずれか一項に記載の細胞を含む、医薬組成物。
実施形態１０８
腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）抗原に特異的に結合するＣＡＲを、個体のがん細胞に標的指向化する方法であって、
実施形態１０７に記載の医薬組成物を前記個体に投与することを含み、前記個体の前記がん細胞はＯＶに感染され、それらの表面上に前記ＯＶ抗原を発現する、方法。
実施形態１０９
前記医薬組成物を前記個体に投与する前に、前記ＯＶを前記個体に投与することによって、前記がん細胞に感染させることをさらに含む、実施形態１０８に記載の方法。
実施形態１１０
前記方法が、前記個体の前記がんを治療する方法である、実施形態１０８または１０９に記載の方法。
実施形態１１１
コンジュゲートであって、
腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）抗原に特異的に結合する抗体と、
前記抗体にコンジュゲートされた薬剤と
を含み、前記薬剤が、化学療法剤、毒素、放射線増感剤、および放射性同位体からなる群から選択される、コンジュゲート。
実施形態１１２
前記放射性同位体が、治療用放射性同位体である、実施形態１１１に記載のコンジュゲート。
実施形態１１３
前記ＯＶ抗原が、前記ＯＶにネイティブである、実施形態１１１または１１２に記載のコンジュゲート。
実施形態１１４
前記ＯＶ抗原が、前記ＯＶに対して異種である、実施形態１１１または１１２に記載のコンジュゲート。
実施形態１１５
前記ＯＶ抗原が、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ＨＳＶ、レオウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、セネカバレーウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、およびマラバウイルスからなる群から選択されるＯＶによってコードされる抗原である、実施形態１１１～１１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
実施形態１１６
前記ＯＶ抗原が、ワクシニアウイルス（ＶＶ）によってコードされる抗原である、実施形態１１１～１１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
実施形態１１７
前記ＶＶが、ＪＸ－５９４またはＧＬ－ＯＮＣ１である、実施形態１１６に記載のコンジュゲート。
実施形態１１８
前記ＶＶの株が、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ、Ｗｙｅｔｈ、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｔｅｍｐｌｅ ｏｆ Ｈｅａｖｅｎ、Ｐａｔｗａｄａｎｇａｒ、および改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａからなる群から選択される、実施形態１１６に記載のコンジュゲート。
実施形態１１９
前記ＯＶ抗原が、ＶＶ Ａ５６抗原である、実施形態１１６に記載のコンジュゲート。
実施形態１２０
前記抗体が、実施形態１～８のいずれか一項に記載の抗体である、実施形態１１９に記載のコンジュゲート。
実施形態１２１
前記ＯＶ抗原が、ＶＶ Ｂ５抗原である、実施形態１１６に記載のコンジュゲート。
実施形態１２２
前記抗体が、実施形態９～１２のいずれか一項に記載の抗体である、実施形態１２１に記載のコンジュゲート。
実施形態１２３
前記抗体が、モノクローナル抗体である、実施形態１１１～１２２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
実施形態１２４
前記抗体が、ヒト化抗体である、実施形態１１１～１２３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
実施形態１２５
前記抗体が、ＩｇＧである、実施形態１１１～１２４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
実施形態１２６
前記抗体が、ヒトＦｃドメインを含む、実施形態１２５に記載のコンジュゲート。
実施形態１２７
前記抗体が、ヒトＩｇＧ１である、実施形態１２６に記載のコンジュゲート。
実施形態１２８
前記抗体が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’） ２ 、およびＦ（ａｂ’）からなる群から選択される、実施形態１１１～１２４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
実施形態１２９
前記抗体が、単鎖抗体である、実施形態１１１～１２４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
実施形態１３０
前記単鎖抗体が、ｓｃＦｖである、実施形態１２９に記載のコンジュゲート。
実施形態１３１
前記薬剤が、切断不可能なリンカーを介して、前記抗体にコンジュゲートされている、実施形態１１１～１３０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
実施形態１３２
前記薬剤が、切断可能なリンカーを介して、前記抗体にコンジュゲートされている、実施形態１１１～１３０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
実施形態１３３
前記切断可能なリンカーが、酵素切断可能なリンカーである、実施形態１３２に記載のコンジュゲート。
実施形態１３４
前記リンカーが、リソソームプロテアーゼによって切断可能である、実施形態１３３に記載のコンジュゲート。
実施形態１３５
前記リンカーが、カテプシンまたはプラスミンによって切断可能である、実施形態１３４に記載のコンジュゲート。
実施形態１３６
実施形態１１１～１３５のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む、医薬組成物。
実施形態１３７
腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）抗原に特異的に結合する抗体を含むコンジュゲートを、個体のがん細胞に標的指向化する方法であって、
実施形態１３６に記載の医薬組成物を前記個体に投与することを含み、前記個体の前記がん細胞はＯＶに感染され、それらの表面上に前記ＯＶ抗原を発現する、方法。
実施形態１３８
前記医薬組成物を前記個体に投与する前に、前記ＯＶを前記個体に投与することによって、前記がん細胞に感染させることをさらに含む、実施形態１３７に記載の方法。
実施形態１３９
前記方法が、前記個体の前記がんを治療する方法である、実施形態１３７または１３８に記載の方法。
このように、上記は、単に本開示の原理を説明しているにすぎない。本明細書に明示的には記載または図示していないが、本発明の原理を具現化しその趣旨および範囲内に含まれる様々な構成を当業者が工夫することができることが理解されよう。さらに、本明細書に列挙されたすべての例および条件的文言は、主として本発明の原理および発明者らにより当該技術分野の促進のために寄与された概念を理解する上で読者を助けることを意図しており、このような具体的に列挙された例および条件への限定ではないと解釈されるべきである。また、本発明の原理、態様、および実施形態、ならびにその具体的な例を列挙する本明細書におけるすべての記述は、その構造的および機能的等価物の両方を包含することを意図する。加えて、そのような等価物は、現在知られている等価物および将来開発される等価物の両方、すなわち、構造にかかわらず同じ機能を果たすあらゆる開発要素も含むことが意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書に図示および記載された例示的な実施形態に限定されることを意図しない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図13A】
【図13B】
【図14-1】
【図14-2】
【図14-3】
【図14-4】
【図14-5】
【図15A】
【図15B】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20A】
【図20B】
【図20C】
【図21】
【配列表】