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特許7665727特にＣＣＫＢ受容体陽性の癌もしくは腫瘍の処置および／または診断に使用するための、ラパログと放射標識ガストリンアナログとを含む組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-04-11
(45)【発行日】2025-04-21
(54)【発明の名称】特にＣＣＫＢ受容体陽性の癌もしくは腫瘍の処置および／または診断に使用するための、ラパログと放射標識ガストリンアナログとを含む組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 51/08 20060101AFI20250414BHJP
A61K 31/436 20060101ALI20250414BHJP
A61K 38/10 20060101ALI20250414BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250414BHJP
C07K 7/06 20060101ALN20250414BHJP
【ＦＩ】
A61K51/08 100
A61K31/436
A61K38/10 ZNA
A61P35/00
C07K7/06
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2023506232
(86)(22)【出願日】2021-07-30
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-24
(86)【国際出願番号】 EP2021071422
(87)【国際公開番号】W WO2022023541
(87)【国際公開日】2022-02-03
【審査請求日】2023-03-30
(31)【優先権主張番号】PCT/EP2020/071730
(32)【優先日】2020-07-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】501494414
【氏名又は名称】パウル・シェラー・インスティトゥート
(74)【代理人】
【識別番号】100114890
【弁理士】
【氏名又は名称】アインゼル・フェリックス＝ラインハルト
(74)【代理人】
【識別番号】100098501
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 拓
(74)【代理人】
【識別番号】100116403
【弁理士】
【氏名又は名称】前川 純一
(74)【代理人】
【識別番号】100134315
【弁理士】
【氏名又は名称】永島 秀郎
(74)【代理人】
【識別番号】100162880
【弁理士】
【氏名又は名称】上島 類
(72)【発明者】
【氏名】ミハル グルズミル
(72)【発明者】
【氏名】ローガー シブリ
(72)【発明者】
【氏名】マーティン ベーエ
(72)【発明者】
【氏名】アラン ブラン
(72)【発明者】
【氏名】ユン チン
【審査官】高橋 樹理
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１７－５０１１１６（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１９／０５７４４５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】The Journal of Nuclear Medicine，2013年，Vol.54, No.5，p.762-769
【文献】Eur J Nucl Med Mol Imaging，2016年，Vol.43, Suppl.1，S175, OP585
【文献】The Journal of Nuclear Medicine，2016年，Vol.57, Suppl.2，Abstract No.1435
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣＣＫＢ受容体陽性の癌もしくは腫瘍の処置における使用のための、（ｉ）ラパマイシンおよび／またはラパログと、
（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログと
を含む、組成物であって、
前記ラパログが、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、テムシロリムス（ＣＣＩ－７７９）、リダホロリムス（ＡＰ－２３５７３）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物であり、かつ
前記放射標識ガストリンアナログが、下記式（２）：
Ｙ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｔｒｐ－Ｄｘｘ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－ＮＨ２ （２）
［式中、Ｄｘｘは、Ｎｌｅ、２－アミノ－５－ヘプテン酸、ホモＮｌｅ、２－アミノ－４－メトキシブタン酸、Ｔｅ－Ｍｅ、Ｓｅ－ＭｅｔおよびＰｈｇから選択されるアミノ酸を表し、Ｙは、放射性核種を含む部分を表す］
を有する、組成物。
【請求項2】
ＤｘｘがＮｌｅであり、かつ／またはＹが、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸（ＮＯＴＡ）または１，４，７－トリアザシクロノナン，１－グルタル酸－４，７－酢酸（ＮＯＤＡＧＡ）である、請求項１記載の組成物。
【請求項3】
前記放射性核種が、１８Ｆ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、８６Ｙ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、１１１Ｉｎ、１８８Ｒｅ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、１４９Ｔｂ、１６１Ｔｂ、８９Ｓｒ、４４／４３Ｓｃ、４７Ｓｃおよび１５３Ｓｍからなる群から選択される、請求項１または２記載の組成物。
【請求項4】
前記放射性核種が、１７７Ｌｕ、９０Ｙおよび１１１Ｉｎからなる群から選択される、請求項１から３までのいずれか１項記載の組成物。
【請求項5】
前記放射性核種が１７７Ｌｕである、請求項１から４までのいずれか１項記載の組成物。
【請求項6】
前記ラパログがエベロリムス（ＲＡＤ００１）であり、前記放射標識ガストリンアナログが、下記式（３）：ＤＯＴＡ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｔｒｐ－Ｎｌｅ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－ＮＨ２ （３）
［式中、ＤＯＴＡが１７７Ｌｕをキレートする］
を有する、請求項１から５までのいずれか１項記載の組成物。
【請求項7】
前記（ｉ）ラパマイシンおよび／またはラパログと、前記（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログとが、同時にかつ／または順次に、投与され得る分離した剤形に製剤化され、共包装、または別々の包装で共呈示される、請求項１から６までのいずれか１項記載の組成物。
【請求項8】
（ｉ）ラパマイシンおよび／またはラパログと、（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログと
を含む、キット・オブ・パーツであって、
前記（ｉ）ラパログおよび／または前記（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログが、請求項１から７までのいずれかにおいて定義されるとおりである、ＣＣＫＢ受容体陽性の癌もしくは腫瘍の処置における使用のためのキット・オブ・パーツ。
【請求項9】
（ｉ）ラパマイシンおよび／またはラパログと、（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログと
を含む、組み合わせ製品であって、
前記（ｉ）ラパログおよび／または前記（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログが、請求項１から７までのいずれかにおいて定義されるとおりである、ＣＣＫＢ受容体陽性の癌もしくは腫瘍の処置における使用のための組み合わせ製品。
【請求項10】
請求項８記載のキット・オブ・パーツ、または請求項９記載の組み合わせ製品であって、前記（ｉ）ラパマイシンおよび／またはラパログが、前記（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログと共に投与されるか、または前記（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログの前に投与される、キット・オブ・パーツ、または組み合わせ製品。
【請求項11】
前記（ｉ）ラパマイシンおよび／またはラパログが、前記（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログの２ヶ月前までに投与される、請求項１０記載の使用のためのキット・オブ・パーツまたは組み合わせ製品。
【請求項12】
前記（ｉ）ラパマイシンおよび／またはラパログが、前記（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログが投与される前に、１～１４日間連続で１日１回投与される、請求項１０記載の使用のためのキット・オブ・パーツまたは組み合わせ製品。
【請求項13】
前記ＣＣＫＢ受容体陽性の癌または腫瘍が、甲状腺髄様癌（ＭＴＣ）、グリオーマ、胃腸膵神経内分泌腫瘍（ＧＥＰ－ＮＥＴ）、星細胞腫、胃癌、結腸癌、卵巣癌、乳癌、および任意のＣＣＫＢ受容体陽性の腫瘍または癌から選択される、請求項１０から１２までのいずれか１項記載の使用のためのキット・オブ・パーツまたは組み合わせ製品。
【請求項14】
前記ＣＣＫＢ受容体陽性の癌または腫瘍がＭＴＣである、請求項１０から１３までのいずれか１項記載の使用のためのキット・オブ・パーツまたは組み合わせ製品。
【請求項15】
前記（ｉ）ラパマイシンおよび／もしくはラパログまたは前記（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログが、化学療法剤または免疫調節剤などの１つ以上の他の治療剤または治療薬と同時に、その前またはその後に投与される、請求項１０から１４までのいずれか１項記載の使用のためのキット・オブ・パーツまたは組み合わせ製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、疾患の処置および／または診断のための、ラパマイシンおよび／またはラパログと放射標識ガストリンアナログとを含む組成物に関する。特に、本発明は、ペプチド受容体放射性核種療法（ＰＲＲＴ）用途の組成物に関し、これは、哺乳類ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）の阻害を介して放射標識ガストリンアナログの優れた腫瘍取り込みをもたらし、結果として、細胞毒性副作用を防止および／または低減できる一方で、送達および治療効果を改善する。
【0002】
発明の背景
Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、細胞膜を横切って化学シグナルを伝達する機能を担う膜タンパク質のスーパーファミリーを構成している。ＧＰＣＲにリガンドが結合すると、ＧＰＣＲの立体構造に変化が起こり、Ｇタンパク質が活性化および放出できるようになり、その後シグナル伝達経路がトリガーされる。
Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、細胞膜を横切って化学シグナルを伝達する機能を担う膜タンパク質のスーパーファミリーを構成している。ＧＰＣＲにリガンドが結合すると、ＧＰＣＲの立体構造に変化が起こり、Ｇタンパク質が活性化および放出できるようになり、その後シグナル伝達経路がトリガーされる。
【0003】
ペプチドリガンドと選択的に結合するＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の過剰発現により、ヒトの癌に対するペプチド受容体放射性核種療法（ＰＲＲＴ）の開発が可能になる（Lappano et al. Nat Rev Drug Discov. 2011, 10(1), 47-60）。ＰＲＲＴの最も重要な目標の一つは、放射標識リガンドの高い腫瘍取り込みを達成することである。したがって、健康な臓器を細胞毒性副作用から守る一方で、腫瘍または癌組織における放射性医薬品の取り込みを増加させる戦略が検討されてきた。
【0004】
アゴニストリガンドベースの治療薬の標的となるＧＰＣＲは立体構造の変化を受け、Ｇタンパク質アルファサブユニット（Ｇａ）上でＧＤＰからＧＴＰへの交換をもたらす。その後、ＧαおよびＧβγサブユニットが受容体から解離すると、プロテインキナーゼＡおよびＣ（ＰＫＡ；ＰＫＣ）ならびにホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）を含む様々なキナーゼシグナル経路が活性化する（O’Hayre et al. Curr Opin Cell Biol. 2014, 27, 126-135）。その後、活性化されたＧＰＣＲは、アレスチン媒介性の内在化プロセスを介して脱感作を受け、それによってＧＰＣＲは、分解のためにリソゾームへ、または細胞表面へリサイクルし戻すためにエンドゾームへ輸送され得る（Rajagopal et al. Cell Signal. 2018, 41, 9-16）。この内在化プロセスにより、リガンド結合型の放射性核種を標的細胞、例えば癌細胞へ送達することが可能になる。
【0005】
甲状腺髄様癌（ＭＴＣ）は、カルシトニン産生Ｃ細胞に由来する神経内分泌腫瘍である。甲状腺癌全体の３～５％を占めており、ＭＴＣは比較的稀な癌である（Hadoux et al. Lancet Diabetes Endocrinol. 2016, 4(1), 64-71）。残念ながら、従来の化学療法（通常はドキソルビシン単独またはシスプラチンとの併用）に対する反応は一過性に過ぎず、有用性は少数の患者に限られている。さらに、ＭＴＣ細胞はヨウ素を集積しないため、放射性ヨウ素処置には反応しない（Verburg et al. Methods. 201, 55(3), 230- 237）。現在、ＭＴＣは甲状腺癌関連死亡の１４％を占めており、これは、特に転移した患者においてより良好な処置が必要であることを示唆している（Roman et al. Cancer. 2006, 107(9), 2134-2142）。
【0006】
ＧＰＣＲファミリーに属するコレシストキニンＢ受容体（ＣＣＫＢＲ、時にＣＣＫ２Ｒとも呼ばれる）の高発現が、ＭＴＣ、グリオーマの他に、結腸癌、卵巣癌等も含む様々な癌で検証されている（Reubi et al. Cancer Res. 1997, 57(7), 1377-1386）。さらに、小さなペプチドホルモンミニガストリンは、ＣＣＫＢＲと高い親和性で結合することが知られている。したがって、これまでの研究では、ＰＲＲＴ、特に「セラノスティクス（theranostics）」（治療と診断）用途のための放射標識ガストリンアナログの使用が提案されている（Behr et al. Semin Nucl Med. 2002, 32(2), 97-109; Kolenc-Peitl et al. J Med Chem. 2011, 54(8), 2602-2609; Laverman et al. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 2011, 38(8), 1410-1416）。
【0007】
国際公開第２０１５／０６７４７３号は、１７７Ｌｕで放射標識された式ＤＯＴＡ－（ＤＧｌｕ）６－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｔｒｐ－Ｎｌｅ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－ＮＨ２（ＰＰ－Ｆ１１Ｎ）を有するガストリンアナログを開示している。この放射標識ガストリンアナログ（以下、「１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎ」）は化学的に安定（例えば、タンパク質分解に抵抗性）で、高い腫瘍取り込みの他に、腎臓への低集積性を示す。しかしながら、最近の研究では、１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎは、胃および大腸を含む健康な組織でも、それらの内因性ＣＣＫＢＲの発現により集積する可能性があることが分かっている（Sauter et al. J Nucl Med. 2019, 60(3), 393-399）。
【0008】
上記に鑑みて、本発明の目的は、ＣＣＫＢＲ陽性の癌または腫瘍における放射標識ガストリンアナログの優れた取り込みを達成し、したがって、健康な組織における集積による細胞毒性副作用を防止および／または低減できる一方で、送達および治療効果の改善をもたらすＰＲＲＴ用途の組成物（キット・オブ・パーツ）を提供することである。
【0009】
本発明の更なる目的は、ＣＣＫＢＲ陽性の癌もしくは腫瘍を処置および／または診断する方法において使用することができる組成物（キット・オブ・パーツ）を提供することである。
【0010】
発明の概要
本発明は、ＰＲＲＴ用途、特にＭＴＣもしくはグリオーマなどのＣＣＫＢＲ陽性の癌もしくは腫瘍を処置および／または診断する方法において使用することができる組成物（キット・オブ・パーツ、組み合わせ製品）を提供する。本発明者らは、ＣＣＫＢＲ発現腫瘍細胞をラパマイシンおよび／またはラパログ、例えばエベロリムス（ＲＡＤ００１）で（前）処置することにより、インビトロおよびインビボの両方で、これらの腫瘍細胞における放射標識ガストリンアナログの優れた取り込みをもたらし、結果として送達および治療効果が改善することを見出した。
本発明は、ＰＲＲＴ用途、特にＭＴＣもしくはグリオーマなどのＣＣＫＢＲ陽性の癌もしくは腫瘍を処置および／または診断する方法において使用することができる組成物（キット・オブ・パーツ、組み合わせ製品）を提供する。本発明者らは、ＣＣＫＢＲ発現腫瘍細胞をラパマイシンおよび／またはラパログ、例えばエベロリムス（ＲＡＤ００１）で（前）処置することにより、インビトロおよびインビボの両方で、これらの腫瘍細胞における放射標識ガストリンアナログの優れた取り込みをもたらし、結果として送達および治療効果が改善することを見出した。
【0011】
さらに、驚くべきことに、放射標識ガストリンアナログのインビボでの優れた取り込みは、腫瘍細胞では特異的に起こるが、ＣＣＫＢＲを内因性に発現する消化管などの健康な組織では起こらないことが分かった。その結果、放射標識ガストリンアナログの健康な組織への特異的、または非特異的な集積により生じ得る副作用が防止および／または低減されるようになる。
【0012】
したがって、本発明は、
（ｉ）ラパマイシンおよび／またはラパログと、
（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログと
を含む、組成物、キット・オブ・パーツ、および組み合わせ製品に関する。
（ｉ）ラパマイシンおよび／またはラパログと、
（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログと
を含む、組成物、キット・オブ・パーツ、および組み合わせ製品に関する。
【0013】
本発明はまた、ＣＣＫＢＲ陽性の癌または腫瘍、特にＭＴＣ、グリオーマ、胃腸膵神経内分泌腫瘍（ＧＥＰ－ＮＥＴ）、星細胞腫、胃癌、結腸癌、卵巣癌、乳癌、ならびに任意のＣＣＫＢＲ陽性の癌および腫瘍を処置および／または診断する方法における使用のための、上に記載される組成物、キット・オブ・パーツ、および組み合わせ製品に関する。
【0014】
本発明は、特に、以下の実施形態（「項目」）を含む：
１．（ｉ）ラパマイシンおよび／またはラパログと、
（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログと
を含む、組成物。
１．（ｉ）ラパマイシンおよび／またはラパログと、
（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログと
を含む、組成物。
【0015】
２．ラパログが、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、テムシロリムス（ＣＣＩ－７７９）、リダホロリムス（ＡＰ－２３５７３）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物であり、好ましくはエベロリムス（ＲＡＤ００１）である、項目１記載の組成物。
【0016】
３．放射標識ガストリンアナログが、下記式（１）：
Ｙ－Ｓ－Ａｘｘ－Ｂｘｘ－Ｃｘｘ－Ｇｌｙ－Ｔｒｐ－Ｄｘｘ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－ＮＨ２ （１）
［式中、
Ａｘｘは、Ｇｌｕ、Ｄ－Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、ＳｅｒおよびＡｓｎから選択されるアミノ酸、好ましくはＧｌｕまたはＤ－Ｇｌｕを表し、
Ｂｘｘは、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、ＴｈｒおよびＧｌｙから選択されるアミノ酸、好ましくはＡｌａまたはＳｅｒを表し、
Ｃｘｘは、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、ＴｒｐおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸、好ましくはＴｙｒを表し、
Ｄｘｘは、メチオニンと等価なアミノ酸、好ましくは、ノルロイシン、２－アミノ－５－ヘプテン酸、ホモノルロイシン（ホモＮｌｅ）、２－アミノ－４－メトキシブタン酸、テルロメチオニン（Ｔｅ－Ｍｅｔ）、セレノメチオニン（Ｓｅ－Ｍｅｔ）およびフェニルグリシン（Ｐｈｇ）から選択されるアミノ酸、より好ましくはＮｌｅまたはＰｈｇを表し、
Ｓは、負電荷を含有するアミノ酸、ＧｌｎおよびＤ－Ｇｌｎから選択される少なくとも１つを含むスペーサー、好ましくは、Ｇｌｕ、Ｄ－Ｇｌｕ、β－グルタミン酸（β－Ｇｌｕ）、Ｇｌｎ、Ｄ－Ｇｌｎ、ＡｓｐおよびＤ－Ａｓｐから選択される少なくとも１つのアミノ酸を含むテトラまたはペンタペプチド、より好ましくは、Ｇｌｕ、Ｄ－Ｇｌｕ、β－Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｄ－Ｇｌｎ、ＡｓｐおよびＤ－Ａｓｐから選択される少なくとも１つのアミノ酸を含むペンタペプチドであり、
Ｙは、放射性核種を含む部分、例えば、放射性核種をキレートする部分、または放射性核種を共有結合する部分を表す］
を有する、項目１または２記載の組成物。
Ｙ－Ｓ－Ａｘｘ－Ｂｘｘ－Ｃｘｘ－Ｇｌｙ－Ｔｒｐ－Ｄｘｘ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－ＮＨ２ （１）
［式中、
Ａｘｘは、Ｇｌｕ、Ｄ－Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、ＳｅｒおよびＡｓｎから選択されるアミノ酸、好ましくはＧｌｕまたはＤ－Ｇｌｕを表し、
Ｂｘｘは、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、ＴｈｒおよびＧｌｙから選択されるアミノ酸、好ましくはＡｌａまたはＳｅｒを表し、
Ｃｘｘは、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、ＴｒｐおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸、好ましくはＴｙｒを表し、
Ｄｘｘは、メチオニンと等価なアミノ酸、好ましくは、ノルロイシン、２－アミノ－５－ヘプテン酸、ホモノルロイシン（ホモＮｌｅ）、２－アミノ－４－メトキシブタン酸、テルロメチオニン（Ｔｅ－Ｍｅｔ）、セレノメチオニン（Ｓｅ－Ｍｅｔ）およびフェニルグリシン（Ｐｈｇ）から選択されるアミノ酸、より好ましくはＮｌｅまたはＰｈｇを表し、
Ｓは、負電荷を含有するアミノ酸、ＧｌｎおよびＤ－Ｇｌｎから選択される少なくとも１つを含むスペーサー、好ましくは、Ｇｌｕ、Ｄ－Ｇｌｕ、β－グルタミン酸（β－Ｇｌｕ）、Ｇｌｎ、Ｄ－Ｇｌｎ、ＡｓｐおよびＤ－Ａｓｐから選択される少なくとも１つのアミノ酸を含むテトラまたはペンタペプチド、より好ましくは、Ｇｌｕ、Ｄ－Ｇｌｕ、β－Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｄ－Ｇｌｎ、ＡｓｐおよびＤ－Ａｓｐから選択される少なくとも１つのアミノ酸を含むペンタペプチドであり、
Ｙは、放射性核種を含む部分、例えば、放射性核種をキレートする部分、または放射性核種を共有結合する部分を表す］
を有する、項目１または２記載の組成物。
【0017】
４．放射標識ガストリンアナログが、下記式（２）：
Ｙ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｔｒｐ－Ｄｘｘ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－ＮＨ２ （２）
［式中、Ｄｘｘは、メチオニンと等価なアミノ酸、好ましくは、Ｎｌｅ、２－アミノ－５－ヘプテン酸、ホモＮｌｅ、２－アミノ－４－メトキシブタン酸、Ｔｅ－Ｍｅ、Ｓｅ－ＭｅｔおよびＰｈｇから選択されるアミノ酸を表し、Ｙは、放射性核種を含む部分、例えば、放射性金属などの放射性核種をキレートする部分、または放射性核種を共有結合する部分を表す］
を有する、項目１から３までのいずれか１つ記載の組成物。
Ｙ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｔｒｐ－Ｄｘｘ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－ＮＨ２ （２）
［式中、Ｄｘｘは、メチオニンと等価なアミノ酸、好ましくは、Ｎｌｅ、２－アミノ－５－ヘプテン酸、ホモＮｌｅ、２－アミノ－４－メトキシブタン酸、Ｔｅ－Ｍｅ、Ｓｅ－ＭｅｔおよびＰｈｇから選択されるアミノ酸を表し、Ｙは、放射性核種を含む部分、例えば、放射性金属などの放射性核種をキレートする部分、または放射性核種を共有結合する部分を表す］
を有する、項目１から３までのいずれか１つ記載の組成物。
【0018】
５．ＤｘｘがＮｌｅであり、かつ／またはＹが、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸（ＮＯＴＡ）または１，４，７－トリアザシクロノナン，１－グルタル酸－４，７－酢酸（ＮＯＤＡＧＡ）、好ましくはＮＯＤＡＧＡである、項目１から４までのいずれか１つ記載の組成物。
【0019】
６．放射性核種が、１８Ｆ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、８６Ｙ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、１１１Ｉｎ、１８８Ｒｅ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、１４９Ｔｂ、１６１Ｔｂ、８９Ｓｒ、４４／４３Ｓｃ、４７Ｓｃおよび１５３Ｓｍからなる群から選択される、項目１から５までのいずれか１つ記載の組成物。
【0020】
７．放射性核種が、１７７Ｌｕ、９０Ｙおよび１１１Ｉｎからなる群から選択される、項目１から６までのいずれか１つ記載の組成物。
【0021】
８．放射性核種が１７７Ｌｕである、項目１から７までのいずれか１つ記載の組成物。
【0022】
９．ラパログがエベロリムス（ＲＡＤ００１）であり、放射標識ガストリンアナログが、下記式（３）：
ＤＯＴＡ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｔｒｐ－Ｎｌｅ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－ＮＨ２ （３）
［式中、ＤＯＴＡが１７７Ｌｕをキレートする］
を有する、項目１から８までのいずれか１つ記載の組成物。
ＤＯＴＡ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｔｒｐ－Ｎｌｅ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－ＮＨ２ （３）
［式中、ＤＯＴＡが１７７Ｌｕをキレートする］
を有する、項目１から８までのいずれか１つ記載の組成物。
【0023】
１０．（ｉ）ラパマイシンおよび／またはラパログと（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログとが、同時にかつ／または連続して、好ましくは連続して投与され得る分離した剤形に製剤化され、共包装、または別々の包装で共呈示される、項目１から９までのいずれか１つ記載の組成物。
【0024】
１１．（ｉ）ラパマイシンおよび／またはラパログと、
（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログと
を含む、キット・オブ・パーツ。
（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログと
を含む、キット・オブ・パーツ。
【0025】
１２．（ｉ）ラパログおよび／または（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログが、項目２から９までのいずれか１つに定義されるとおりである、項目１１記載のキット・オブ・パーツ。
【0026】
１３．（ｉ）ラパマイシンおよび／またはラパログと、
（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログと
を含む、組み合わせ製品。
（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログと
を含む、組み合わせ製品。
【0027】
１４．（ｉ）ラパログおよび／または（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログが、項目２から９までのいずれか１つに定義されるとおりである、項目１３記載の組み合わせ製品。
【0028】
１５．ＣＣＫＢ受容体陽性の癌もしくは腫瘍の処置における使用のための、項目１から１０までのいずれか１つ記載の組成物、項目１１もしくは１２記載のキット・オブ・パーツ、または項目１３もしくは１４記載の組み合わせ製品であって、（ｉ）ラパマイシンおよび／またはラパログが、（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログと共に投与されるか、または（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログの前に投与される、組成物、キット・オブ・パーツ、または組み合わせ製品。
【0029】
１６．（ｉ）ラパマイシンおよび／またはラパログが、（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログの２ヶ月前まで、好ましくは１～１４日前に投与される、項目１５記載の使用のための組成物、キット・オブ・パーツまたは組み合わせ製品。
【0030】
１７．（ｉ）ラパマイシンおよび／またはラパログが、（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログが投与される前に、１～１４日間連続で、好ましくは２～７日間連続で、例えば５日間連続で１日１回投与される、使用のための組成物、キット・オブ・パーツまたは組み合わせ製品。
【0031】
１８．ＣＣＫＢ受容体陽性の癌または腫瘍が、甲状腺髄様癌（ＭＴＣ）、グリオーマ、胃腸膵神経内分泌腫瘍（ＧＥＰ－ＮＥＴ）、星細胞腫、胃癌、結腸癌、卵巣癌、乳癌、および任意のＣＣＫＢ受容体陽性の腫瘍または癌から選択される、項目１５から１７までのいずれか１つ記載の使用ための組成物、キット・オブ・パーツまたは組み合わせ製品。
【0032】
１９．ＣＣＫＢ受容体陽性の癌または腫瘍がＭＴＣである、項目１５から１８までのいずれか１つ記載の使用のための組成物、キット・オブ・パーツまたは組み合わせ製品。
【0033】
２０．（ｉ）ラパマイシンおよび／もしくはラパログまたは（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログが、化学療法剤または免疫調節剤などの１つ以上の他の治療剤または治療薬と同時に、その前または後に投与される、項目１５から１９までのいずれか１つ記載の使用のための組成物、キット・オブ・パーツまたは組み合わせ製品。
【0034】
２１．ＣＣＫＢ受容体陽性の癌または腫瘍を処置する方法であって、項目１から１０までのいずれか１つ記載の組成物、項目１１もしくは１２記載のキット・オブ・パーツ、または項目１３もしくは１４記載の組み合わせ製品に含まれる（ｉ）ラパマイシンおよび／またはラパログならびに（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログの治療有効量を、当該治療有効量を必要としている患者へ投与する、方法。
【図面の簡単な説明】
【0035】
【図1】
１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎの細胞取り込みを高めるキナーゼ阻害剤の同定を示す図であり、（１Ａ）実験デザイン：キナーゼ阻害剤処置および対照未処置のＡ４３１／ＣＣＫＢＲ細胞を、以下の「材料および方法」のセクションに記載されているように、１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎの細胞取り込みの解析に供し、（１Ｂ、Ｃ）ボルケーノプロットは、１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎの細胞取り込みの変化を表し、増殖はそれぞれｌｏｇ２［比：処置／対照］として示し、ＢＭＬ－２５７、ＳＣ－５１４およびラパマイシンと記されたドットは、１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎの取り込みを有意に増加させたキナーゼ阻害剤を表す（Ｐ＜０．０５）。
【図2】ｍＴＯＲＣ１活性の阻害が１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎの内在化を高める図を示し、（２Ａ）内在化および細胞結合活性は、図のように、対照、１００ｎＭ ＲＡＤ００１および１０ｍＭ メトホルミン処置したＡ４３１／ＣＣＫＢＲ細胞、非トランスフェクトＡ４３１（陰性対照）およびＡＲ４２Ｊ細胞において２０時間、１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎでインキュベートしてから１時間後に測定し、すべての実験は３連でアッセイし、各棒は平均値±ＳＤを表し、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１であり、（２Ｂ）Ｃで使用したライセートの平均タンパク質濃度±ＳＤであり、対照細胞における平均タンパク質濃度を１に設定し、（２Ｃ）対照細胞および２０時間のＲＡＤ００１－またはメトホルミン処置したＡ４３１／ＣＣＫＢＲ細胞から単離した全細胞ライセートについて、リン酸化部位特異的Ｓ６抗体を用いたウェスタンブロット解析であり、ブロットをストリップし、ローディング対照用にＧＡＰＤＨ抗体で再プロービングした。
【図3】
１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎの内在化を高めるためには、ＲＡＤ００１によるＣＣＫＢＲ発現の増加が必要であることを示す図であり、図のように、２０時間のＲＡＤ００１処置（３Ａ）またはルシフェラーゼｓｉＲＮＡ（対照）およびＣＣＫＢＲ ｓｉＲＮＡで４８時間トランスフェクト（３Ｂ）後、Ａ４３１／ＣＣＫＢＲ細胞からのグリコシル化および脱グリコシル化（ＰＮＧａｓｅ Ｆ処置）ライセートの抗ＣＣＫＢＲ抗体を用いたＷＢ解析であり、ブロットをストリップし、ローディング対照用にＧＡＰＤＨ抗体で再プロービングし、下図；ＧＡＰＤＨに正規化した脱グリコシル化ライセートにおけるＣＣＫＢＲシグナル強度の定量化であり、未処置または対照のトランスフェクトした細胞からのＣＣＫＢＲ／ＧＡＰＤＨ比は１に設定した。
【図4】ＲＡＤ００１がインビボでＣＣＫＢＲ依存性の１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎの腫瘍取り込みを増加させる（５日間の処置）図を示し、（４Ａ）Ａ４３１／ＣＣＫＢＲ細胞を免疫不全（ヌード）マウスに移植し、移植から５日後にＲＡＤ００１、メトホルミンおよび対照（ＰＢＳ）動物群に三角形で示すように毎日投与し、翌日に生体内分布研究を行い、各棒：尾静脈投与から４時間後に分析した１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎの生体内分布を、組織１グラム当たりの総注入放射能の％（％注入放射能）として示し、下段：ブロッキングペプチドを共注入した後の生体内分布に対応し、（４Ｂ、Ｃ）すべての群における処置前（１日目）と処置後（５日目）の腫瘍体積およびマウス体重を示し、各棒は平均値±ＳＤを表す。
【図5】ＲＡＤ００１がインビボで１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１ＮのＣＣＫＢＲ依存性の腫瘍取り込みを増加させる（５日間の処置）図を示し、（５Ａ）メトホルミン、ＲＡＤ００１および対照（ＰＢＳ）処置マウスの５日間の１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎ注入から２時間後のＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像、下図：対応する放射性腫瘍領域、（５Ｂ）１群当たり４腫瘍の放射性領域における１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎの平均および最大放射能濃度±ＳＤ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。
【図6】ＲＡＤ００１がインビボで１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１ＮのＣＣＫＢＲ依存性の腫瘍取り込みを増加させる（３日間の処置）図を示し、（６）Ａ４３１／ＣＣＫＢＲ細胞を、免疫不全ヌードマウスに移植し、ＲＡＤ００１、メトホルミンおよび対照（ＰＢＳ）の動物群に３日分の線量を投与し、翌日に生体内分布の研究が行い、各棒：尾静脈投与から４時間後に分析した１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎの生体内分布を、組織１グラム当たりの総注入放射能の％（％注入放射能）として示した。
【図7】ＲＡＤ００１がインビボで１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１ＮのＣＣＫＢＲ依存性の腫瘍取り込みを増加させる（３日間の処置）図を示し、（７Ａ）Ａ４３１／ＣＣＫＢＲ細胞を、免疫不全ヌードマウスに移植し、ＲＡＤ００１、メトホルミンおよび対照（ＰＢＳ）の動物群に３日分の線量を投与し、翌日に生体内分布の研究が行い、各棒：尾静脈投与から４時間後に分析した１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎの生体内分布を、組織１グラム当たりの総注入放射能の％（％注入放射能）として示し、（７Ｂ）３日間の処置前後の腫瘍体積およびマウス体重であり、データは平均値±ＳＤを表し、＊Ｐ＜０．０５である。
【図8】ＲＡＤ００１で処置した腫瘍におけるネクローシスの増加ならびに有糸分裂像およびＫｉ６７陽性細胞の数の減少を示す図であり、ＲＡＤ００１、メトホルミン（Ｍｅｔ）およびＰＢＳ（対照）で処置したＡ４３１／ＣＣＫＢＲ－腫瘍から調製したパラフィン切片を、材料および方法に記載したようにＨＥおよびＫｉ６７染色に供し、各棒は、ネクローシス領域のパーセント（８Ａ）、１視野当たり血管の数（８Ｂ）を、分析した腫瘍群の平均値±ＳＤとして示し、右図；代表的なＨＥ染色の画像であり、８Ｂの矢印は血管を示し、８Ａのスケールバーは０．５ｍｍであり、８Ｂでは２０μｍであり、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。
【図9】ＲＡＤ００１で処置した腫瘍におけるネクローシスの増加ならびに有糸分裂像およびＫｉ６７陽性細胞の数の減少を示す図であり、ＲＡＤ００１、メトホルミン（Ｍｅｔ）およびＰＢＳ（対照）で処置したＡ４３１／ＣＣＫＢＲ－腫瘍から調製したパラフィン切片を、材料および方法に記載したようにＨＥおよびＫｉ６７染色に供し、各棒は、有糸分裂指数（９Ａ）およびＫｉ６７陽性細胞のパーセント（９Ｂ）を、分析した腫瘍群の平均値±ＳＤとして示し、右図；代表的なＨＥおよびＫｉ６７染色の画像であり、９Ａの矢印は有糸図を示し、９ＡＢのスケールバーは２０μｍであり、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。
【図10】ＲＡＤ００１および１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎで処置したマウスにおける腫瘍成長阻害および寿命延長を示す図であり、図のとおり、（１０Ａ）実験デザイン：ヌードマウスにＡ４３１／ＣＣＫＢＲ細胞を移植した後、５または１０回の用量のＲＡＤ００１を単独または６０ｋＢｑの１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎと組み合わせて投与し、（１０Ｂ）対照群および処置群の腫瘍成長曲線である。
【0036】
発明の詳細な説明
１．定義
本明細書で使用される「組成物」という用語は、個々の成分の組み合わせ（すなわち、組み合わせ製品）、すなわち（ｉ）ラパログおよび（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログであって、互いに物理的に別々に保持されているが隣接しているものを指すと理解されるものとする。このような組成物は、「キット・オブ・パーツ」と呼ばれることがある。いくつかの態様において、本明細書で使用される「組成物」という用語は、例えば、（ｉ）ラパマイシンおよび／もしくはラパログまたは（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログが１つ以上の他の治療剤または治療薬と同時に使用される場合、個々の成分の物理的混合物を包含するが、ただし、（ｉ）ラパマイシンおよび／またはラパログと（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログとは互いに物理的に別々に保持されており、例えば、別々の剤形に製剤化されている。
１．定義
本明細書で使用される「組成物」という用語は、個々の成分の組み合わせ（すなわち、組み合わせ製品）、すなわち（ｉ）ラパログおよび（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログであって、互いに物理的に別々に保持されているが隣接しているものを指すと理解されるものとする。このような組成物は、「キット・オブ・パーツ」と呼ばれることがある。いくつかの態様において、本明細書で使用される「組成物」という用語は、例えば、（ｉ）ラパマイシンおよび／もしくはラパログまたは（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログが１つ以上の他の治療剤または治療薬と同時に使用される場合、個々の成分の物理的混合物を包含するが、ただし、（ｉ）ラパマイシンおよび／またはラパログと（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログとは互いに物理的に別々に保持されており、例えば、別々の剤形に製剤化されている。
【0037】
「ラパマイシン」（シロリムス、Ｒａｐａｍｕｎｅ（登録商標））という用語はマクロライド化合物を指し、これは、哺乳類ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）を阻害することによって免疫抑制特性を示すことが当該技術分野で知られている。ラパマイシンは、以下の化学構造：
を有する。
【化1】
【0038】
本明細書で使用される「ラパログ」（「ラパマイシンアナログ」を表す）とは、ラパマイシンに構造的に関連する化合物のクラスを指し、これらは、ＦＫ結合タンパク質１２に結合することによって複合体１（ｍＴＯＲＣ１）の哺乳類ラパマイシン標的を阻害することが知られている（MacKeigan et al. Neuro-Onc. 2015, 17(12), 1550-1559）。ラパログの例としては、エベロリムス（ＲＡＤ００１、Ａｆｉｎｉｔｏｒ（登録商標）、Ｃｅｒｔｉｃａｎ（登録商標））、テムシロリムス（ＣＣＩ－７７９、Ｔｏｒｉｓｅｌ（登録商標））およびリダホロリムス（ＡＰ－２３５７３、ＭＫ－８６６９）が挙げられる。
【0039】
ラパマイシンおよび／またはラパログのｍＴＯＲＣ１に対する阻害活性は、以下にさらに記載するように、ウェスタンブロット解析によってリボソームタンパク質Ｓ６のリン酸化レベルを測定することにより決定することができる。
【0040】
本明細書で使用される「ガストリンアナログ」という表現は、内因性ペプチドホルモンであるガストリンに構造的に関連し、ＣＣＫＢＲに結合することができる化合物（ペプチド）のクラスを指す。本明細書で使用される「ガストリンアナログ」という表現は、例えばガストリンおよびコレシストキニン（ＣＣＫ）を含むＣＣＫＢＲ結合内因性ペプチドホルモンに見られるように、Ｃ末端アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｔｒｐ－Ｄｘｘ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－ＮＨ２（ここで、Ｄｘｘは、ＭｅｔまたはＭｅｔと等価なアミノ酸である）を含有するすべての化合物を包含することが意味される。ガストリンは、十二指腸のＧ細胞および胃の幽門部で産生される線状ペプチドホルモンである。それは血流中に分泌される。コードされたポリペプチドはプレプロガストリンであり、これが翻訳後修飾で酵素により切断されてプロガストリン、次いで、主にビッグガストリン（Ｇ－３４）、リトルガストリン（Ｇ－１７）、およびミニガストリン（Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｔｒｐ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－ＮＨ２）を含む種々の形態のガストリンを産生し、これらはすべて本発明の意味における「ガストリンアナログ」を表す。ＣＣＫは、両方の化合物が５つのＣ末端アミノ酸、すなわちＧｌｙ－Ｔｒｐ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－ＮＨ２（ここで、Ｍｅｔは、ノルロイシンなどのＭｅｔと等価なアミノ酸で置き換えられ得る）を共有するという点でガストリンと構造的に関連するペプチドホルモンである。ＣＣＫは、例えばＣＣＫ８（Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ｍｅｔ－Ｇｌｙ－Ｔｒｐ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－ＮＨ２）を含むいくつかの形態で天然に存在する。ガストリンアナログは、例えば、そのＮ末端で、スペーサー、または放射性金属をキレートすることができる部分、例えば１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）、または放射性核種を（共有）結合する部分、例えば１８Ｆもしくはヨウ素同位体に共有結合するために化学的に修飾され得る。いくつかの実施態様において、ガストリンアナログは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、ＩＲＤｙｅ ６８０ＲＤもしくはＤＹ－７００などの医療用途のイメージング部分、またはＰｈｏｔｏｆｒｉｎ、ＦｏｒｓｃａｍもしくはＰｈｏｔｏｃｈｌｏｒなどの光増感剤に共有結合するために修飾され得る。
【0041】
「ガストリンアナログ」という表現はまた、ガストリン、ビッグガストリン、リトルガストリン、ＣＣＫ、ＣＣＫ８またはミニガストリン、特にミニガストリンを指し、ここで、１個、２個もしくはそれを超えるアミノ酸残基が別の天然または非天然アミノ酸残基に置き換えられるが、ただし、得られる「ガストリンアナログ」は、ＣＣＫＢＲに対して薬理活性を維持している。本発明のいくつかの態様において、前述の修飾は、例えば、ＣＣＫＢＲに対する結合親和性および／または薬理活性の向上、血漿安定性の向上、生体内分布の向上等を達成することを可能にし得る。これに関連した薬理活性とは、ガストリンアナログが、ミニガストリンの薬理（アゴニスト）活性の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも８０％を保持することを意味する。
【0042】
ＣＣＫＢＲに対するガストリンアナログの薬理活性は、Ｂｌａｅｋｅｒら（Regulatory Peptides 2004, 118, 111-117）により記載されているように、ガストリンアナログ刺激細胞におけるカルシトニンレベルの細胞内上昇を測定することにより決定することができる。
【0043】
いくつかの実施態様において、「ガストリンアナログ」という表現は、式（ＤＧｌｕ）６－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｔｒｐ－Ｘ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－ＮＨ２［式中、Ｘはメチオニンと等価なアミノ酸を表す］を有する化合物に構造的に関連する化合物（ペプチド）を指す。この化合物は、スペーサー、または放射性核種（例えば放射性金属）をキレートすることができる部分、例えばＤＯＴＡ、または放射性核種を（共有）結合する部分、例えば１８Ｆもしくはヨウ素同位体に共有結合するために修飾され得る。Ｘがノルロイシンを表し、前述の化合物がＤＯＴＡの共有結合によりそのＮ末端で修飾されている場合、その化合物は「ＰＰ－Ｆ１１Ｎ」に対応する。
【0044】
本明細書で使用される「アミノ酸」という用語は、少なくとも１つのアミノ基と少なくとも１つの酸性基、好ましくはカルボキシル基とを含むか、またはそれらから誘導される化合物を指す。アミノ基と酸性基との間の距離は、特に限定されない。α－、β－、およびγ－アミノ酸が適しているが、α－アミノ酸、特にα－アミノカルボン酸が特に好ましい。この用語は、天然に存在するアミノ酸だけでなく、天然には見られない合成アミノ酸も包含する。
【0045】
本明細書で使用される「（Ｄ）－アミノ酸」という表現は、任意の天然に存在するアミノ酸または合成アミノ酸の（Ｄ）－異性体を指す。例えば、「Ｄ－Ｇｌｕ」という表現は、グルタミン酸の（Ｄ）－異性体を指す。本明細書で使用される「（Ｄ）－アミノ酸」という表現は、グリシンなどの非キラルアミノ酸または他の非キラルアミノ酸を包含することを意味しない。
【0046】
本明細書で使用される「メチオニンと等価なアミノ酸」という表現は、メチオニンと同様の形状および／または電子的特性を有する天然もしくは非天然アミノ酸を指す。本明細書で使用される「等価」という用語は、ノルロイシン（Ｎｌｅ）などのメチオニンと本質的に等価であるアミノ酸を包含することを意味する。メチオニンと等価なアミノ酸の例としては、Ｎｌｅ、２－アミノ－５－ヘプテン酸、ホモノルロイシン（ホモＮｌｅ）、２－アミノ－４－メトキシブタン酸、テルロメチオニン（Ｔｅ－Ｍｅｔ）、セレノメチオニン（Ｓｅ－Ｍｅｔ）およびフェニルグリシン（Ｐｈｇ）が挙げられる。
【0047】
他に規定がない限り、または文脈によって他に指示されない限り、隣接するアミノ酸基の間のすべての接続は、ペプチド（アミド）結合によって形成される。
【0048】
本明細書で使用される「放射性核種をキレートまたは（共有）結合する部分」という表現は、（ｉ）放射性核種、特に放射性金属に電子を供与してそれと配位錯体を形成することができる、すなわち、少なくとも１つの座標共有結合（双極結合）をそれと形成することによって、または（ｉｉ）１８Ｆもしくはヨウ素同位体などの放射性核種を共有結合することができる部分（キレート剤もしくはリガンド）を指す。キレート機構は、キレート剤および／または放射性核種に依存する。例えば、ＤＯＴＡは、カルボキシレート基およびアミノ基（供与基）を介して放射性核種を配位させ、そうすることで高い安定性を有する錯体を形成すると考えられている（Dai et al. Nature Com. 2018, 9, 857）。
【0049】
「負電荷を含有するアミノ酸」（または「負に帯電したアミノ酸」）という表現は、本明細書では、側鎖が負電荷を持つイオン化可能な基（溶液中）、特にカルボン酸基を含有する、天然または非天然アミノ酸を特徴付けるために使用される。負電荷を含有する天然または非天然アミノ酸の例としては、Ｇｌｕ、Ｄ－Ｇｌｕ、β－グルタミン酸（β－Ｇｌｕ）、Ａｓｐ、Ｄ－Ａｓｐ、２－アミノアジピン酸、２－アミノピメリン酸、および２－アミノスベリン酸が挙げられる。
【0050】
本明細書で使用される「癌」という用語は、哺乳類の組織において、細胞が異常に成長して悪性腫瘍を形成することを特徴とする病理状態を意味し、この腫瘍は、他の組織または身体の一部に浸潤するかまたは広がり、転移として知られる「二次」腫瘍を形成する可能性がある。腫瘍は１つ以上の癌細胞を含む。本明細書で使用される「ＣＣＫＢＲ陽性の癌または腫瘍」という表現は、細胞表面上のＣＣＫＢＲの過剰発現によって特徴付けられる癌または腫瘍を指す（Reubi et al. Cancer Res. 1997, 57(7), 1377-1386）。ＣＣＫＢＲ陽性の癌または腫瘍の例としては、ＭＴＣ、グリオーマ、胃腸膵神経内分泌腫瘍（ＧＥＰ－ＮＥＴ）、星細胞腫、胃癌、結腸癌、卵巣癌および乳癌が挙げられる。
【0051】
本明細書で使用される「内在化」という用語は、分子（例えば放射標識ガストリンアナログ）が細胞膜に抱き込まれ、細胞内に引き込まれる生物学的プロセスを指す。その結果、分子（例えば放射標識ガストリンアナログ）は、細胞内に存在するようになる。
【0052】
（放射性医薬品の）「細胞取り込み」という表現は、分子（例えば放射標識ガストリンアナログ）が細胞膜に内在化および／または結合される生物学的プロセスを指す。その結果、分子（例えば放射標識ガストリンアナログ）は、細胞内だけでなく細胞膜にも存在することができるようになる。
【0053】
（放射性医薬品の）「腫瘍取り込み」という表現は、分子（例えば放射標識ガストリンアナログ）が腫瘍（癌）細胞によって取り込まれる生物学的プロセスを指す。腫瘍への取り込みとしては、分子（例えば放射標識ガストリンアナログ）の腫瘍細胞への取り込みおよび／または腫瘍微小環境におけるその保持が挙げられる。その結果、分子（例えば放射標識ガストリンアナログ）は、腫瘍（癌）細胞内、細胞膜および／または腫瘍微小環境内に存在することができるようになる。
【0054】
本明細書で使用される「共投与」という表現は、（ｉ）ラパマイシンおよび／またはラパログと（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログとの両方の並行（同時）投与の他に、（ｉ）ラパマイシンおよび／またはラパログとそれに続いて（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログとの連続投与も指す。さらに、「共投与」という表現は、ｉ）ラパマイシンおよび／もしくはラパログならびに／または（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログのそれぞれの投薬量が、投与の過程において変化（増加または減少）させられる投薬スケジュールを包含することを意味する。好ましくは、（ｉ）ラパマイシンおよび／またはラパログと（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログとは、（ｉ）ラパマイシンおよび／またはラパログが最初に一定期間にわたって投与され、それに続いて（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログが投与されるという連続パターンに従って投与される。
【0055】
本明細書で「好ましい」実施形態／特徴に言及する場合、これらの「好ましい」実施形態／特徴の組み合わせも、この「好ましい」実施形態／特徴の組み合わせが技術的に意味を持つ限り、開示されているとみなされるものとする。
【0056】
以下、本発明の説明および特許請求の範囲において、「含有する」、「含む」および「備える」という用語の使用は、言及された要素に加えて、追加の言及されていない要素が存在し得るように理解されるものとする。しかしながら、これらの用語は、より限定された実施形態として、技術的に意味がある限り、追加の言及されていない要素が存在しなくてもよいように、「からなる」という用語も開示するものと理解されたい。
【0057】
文脈が他に指示せず、かつ／または代替的な意味が本明細書に明示的に提供されない限り、すべての用語は、ｌＵＰＡＣゴールドブック（２０１７年１１月１日のステータス）、またはＴｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，６ｔｈ Ｅｄ．によって反映される、当該技術分野で一般的に受け入れられている意味を有することが意図される。
【0058】
２．概要
本発明は、ＣＣＫＢＲ発現腫瘍細胞をラパマイシンおよび／またはラパログ、例えばエベロリムス（ＲＡＤ００１）で（前）処置することにより、ＣＣＫＢＲタンパク質レベルの有意な増加および放射標識ガストリンアナログの優れた取り込みをもたらし、結果として、健康な組織における集積による細胞毒性副作用が防止および／または低減される一方で、送達および治療効果を改善するという発見に基づいている。
本発明は、ＣＣＫＢＲ発現腫瘍細胞をラパマイシンおよび／またはラパログ、例えばエベロリムス（ＲＡＤ００１）で（前）処置することにより、ＣＣＫＢＲタンパク質レベルの有意な増加および放射標識ガストリンアナログの優れた取り込みをもたらし、結果として、健康な組織における集積による細胞毒性副作用が防止および／または低減される一方で、送達および治療効果を改善するという発見に基づいている。
【0059】
効率的なＰＲＲＴの最も重要な目標の１つは、放射性化合物の高い腫瘍取り込みであり、これは、標的受容体の発現レベルおよび内在化関連活性に大きく依存する。本発明者らは、驚くべきことに、ＣＣＫＢＲ陽性の腫瘍細胞（例えばＡ４３１／ＣＣＫＢＲ細胞）における放射標識ガストリンアナログの取り込みを高めることができる一群のキナーゼ阻害剤を同定した。特に、ＣＣＫＢＲ陽性の腫瘍細胞をラパログ（例えばＲＡＤ００１）で（前）処置すると、ＣＣＫＢＲレベルが有意に上昇し、それに続いて放射標識ガストリンアナログのＣＣＫＢＲ特異的内在化が増加し、その結果、送達および治療効果が改善することが分かった。
【0060】
さらに、放射標識ガストリンアナログのＣＣＫＢＲ特異的な取り込みの向上は、腫瘍細胞で観察されたが、ＣＣＫＢＲを内因性に発現する消化管などの健康な臓器では観察されず、これは、ラパログ処置が優れた腫瘍細胞標的化をもたらすことを示唆していた。その結果、放射標識ガストリンアナログの健康な組織への集積により生じ得る細胞毒性副作用を防止および／または低減することができる。
【0061】
いかなる理論にも縛られることなく、腫瘍細胞は健康な組織と比較して高いｍＴＯＲＣ１活性を示すため、それによって、健康な組織へのその集積が防止および／または低減される一方で、腫瘍細胞における優れた効果がもたされると考えられる。
【0062】
３．組成物
本発明の組成物（キット・オブ・パーツ、組み合わせ製品）は、ヒトおよび獣医学において、ヒトまたは動物の使用のための医薬組成物（製剤）の形態で提供される。典型的には、（ｉ）ラパマイシンおよび／またはラパログと（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログとは、共投与のための別々の医薬組成物として提示され（キット・オブ・パーツ）、各それぞれの組成物は、治療有効量の（ｉ）ラパマイシンおよび／またはラパログと（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログとを含む。
本発明の組成物（キット・オブ・パーツ、組み合わせ製品）は、ヒトおよび獣医学において、ヒトまたは動物の使用のための医薬組成物（製剤）の形態で提供される。典型的には、（ｉ）ラパマイシンおよび／またはラパログと（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログとは、共投与のための別々の医薬組成物として提示され（キット・オブ・パーツ）、各それぞれの組成物は、治療有効量の（ｉ）ラパマイシンおよび／またはラパログと（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログとを含む。
【0063】
本発明のいくつかの態様において、個々の成分（ｉ）および（ｉｉ）は、分離した剤形に製剤化され、これらは、共包装されてもよいし、別々の包装で共呈示されてもよい。いくつかの例において、包装された成分（ｉｉ）は、非標識ガストリンアナログを含んでもよく、これは、投与の直前に、例えば、以下にさらに記載するように放射性核種をキレートすることによって、放射性核種で標識することができる。
【0064】
組成物（またはキットの各部分）は、担体、希釈剤および他の賦形剤から選択される１つ以上の成分をさらに含むことができる。医薬組成物に使用するための適切な担体、希釈剤および他の賦形剤は、当該技術分野において周知であり、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (Gennaro AR, 1985)に記載されている。担体、希釈剤および／または他の賦形剤は、意図された投与経路および薬学的実践に関して選択することができる。組成物は、担体、希釈剤および／もしくは他の賦形剤として、またはそれに加えて、任意の適切な結合剤、潤滑剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤を含むことができる。
【0065】
治療有効量の（ｉ）ラパマイシンおよび／もしくはラパログならびに／または（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログは、日常的に医師によって決定可能である。任意の特定の対象／患者に対する特定の線量レベルおよび投薬頻度は変化し得、使用される特定の薬物化合物の活性、その化合物の代謝安定性および作用時間、患者の年齢、体重、総合的な健康状態、性別、食事、投与の方式および時間、排泄率、薬物の組み合わせ、特定の症状の重症度、ならびに治療を受けている個体を含む様々な要因に依存する。これらの要因は、治療有効線量を決定する際に医師によって考慮される。
【0066】
本明細書で使用されるラパログは、それがｍＴＯＲＣ１阻害活性を示し、細胞表面上のＣＣＫＢＲレベルの向上をもたらすものであれば、特に限定されない。細胞表面上のＣＣＫＢＲのレベルは、当該技術分野で公知の方法、例えば、以下にさらに説明するように、ウェスタンブロット解析によって決定することができる。ラパマイシンおよび／またはラパログのｍＴＯＲＣ１阻害剤活性は、以下にさらに説明するように、ウェスタンブロット解析によってリボソームタンパク質Ｓ６のリン酸化レベルを測定することにより決定することができる。
【0067】
一実施形態によれば、ラパログは、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、テムシロリムス（ＣＣＩ－７７９）、リダホロリムス（ＡＰ－２３５７３）、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。好ましい一実施形態によれば、ラパログは、エベロリムス（ＲＡＤ００１）である。これらの化合物のいくつかは、Ｒａｐａｍｕｎｅ（登録商標）（シロリムス）、Ａｆｉｎｉｔｏｒ（登録商標）またはＣｅｒｔｉｃａｎ（登録商標）（エベロリムス）、Ｔｏｒｉｓｅｌ（登録商標）（テムシロリムス）という商品名で商業的に入手可能である。
【0068】
例えば、エベロリムス（ＲＡＤ００１）などのラパログは、エベロリムスなどのラパログを含む（分散性）錠剤の形態で、例えば固体分散体として０．１ｍｇ～２０ｍｇ、例えば０．１ｍｇ～１５ｍｇ、好ましくは０．５ｍｇ～１０ｍｇ、例えば５ｍｇの範囲の１日投与量で、例えば経口投与することができる。
【0069】
本明細書で使用される放射標識ガストリンアナログは、ＣＣＫＢＲと結合し、それに対してアゴニスト活性を示すものであれば、特に限定されない。一実施形態において、ガストリンアナログは、下記式（１）：
Ｙ－Ｓ－Ａｘｘ－Ｂｘｘ－Ｃｘｘ－Ｇｌｙ－Ｔｒｐ－Ｄｘｘ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－ＮＨ２ （１）
［式中、
Ａｘｘは、Ｇｌｕ、Ｄ－Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、ＳｅｒおよびＡｓｎから選択されるアミノ酸、好ましくはＧｌｕまたはＤ－Ｇｌｕを表し、
Ｂｘｘは、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、ＴｈｒおよびＧｌｙから選択されるアミノ酸、好ましくはＡｌａまたはＳｅｒを表し、
Ｃｘｘは、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、ＴｒｐおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸、好ましくはＴｙｒを表し、
Ｄｘｘは、メチオニンと等価なアミノ酸、好ましくは、ノルロイシン、２－アミノ－５－ヘプテン酸、ホモノルロイシン（ホモＮｌｅ）、２－アミノ－４－メトキシブタン酸、テルロメチオニン（Ｔｅ－Ｍｅｔ）およびセレノメチオニン（Ｓｅ－Ｍｅｔ）から選択されるアミノ酸、より好ましくはＮｌｅを表し、
Ｓは、
・負電荷を含有するアミノ酸、
・Ｇｌｎおよび
・Ｄ－Ｇｌｎ
から選択される少なくとも１つを含むスペーサーであり、好ましくは、Ｓは、Ｇｌｕ、Ｄ－Ｇｌｕ、β－グルタミン酸（β－Ｇｌｕ）、Ｇｌｎ、Ｄ－Ｇｌｎ、ＡｓｐおよびＤ－Ａｓｐから選択される少なくとも１つのアミノ酸を含むテトラまたはペンタペプチド、より好ましくは、Ｇｌｕ、Ｄ－Ｇｌｕ、β－Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｄ－Ｇｌｎ、ＡｓｐおよびＤ－Ａｓｐから選択される少なくとも１つのアミノ酸を含むペンタペプチドであり、
Ｙは、放射性核種を含む部分、例えば、放射性核種（例えば放射性金属）をキレートする部分、または放射性核種を（共有）結合する部分を表す］で表される。
Ｙ－Ｓ－Ａｘｘ－Ｂｘｘ－Ｃｘｘ－Ｇｌｙ－Ｔｒｐ－Ｄｘｘ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－ＮＨ２ （１）
［式中、
Ａｘｘは、Ｇｌｕ、Ｄ－Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、ＳｅｒおよびＡｓｎから選択されるアミノ酸、好ましくはＧｌｕまたはＤ－Ｇｌｕを表し、
Ｂｘｘは、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、ＴｈｒおよびＧｌｙから選択されるアミノ酸、好ましくはＡｌａまたはＳｅｒを表し、
Ｃｘｘは、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、ＴｒｐおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸、好ましくはＴｙｒを表し、
Ｄｘｘは、メチオニンと等価なアミノ酸、好ましくは、ノルロイシン、２－アミノ－５－ヘプテン酸、ホモノルロイシン（ホモＮｌｅ）、２－アミノ－４－メトキシブタン酸、テルロメチオニン（Ｔｅ－Ｍｅｔ）およびセレノメチオニン（Ｓｅ－Ｍｅｔ）から選択されるアミノ酸、より好ましくはＮｌｅを表し、
Ｓは、
・負電荷を含有するアミノ酸、
・Ｇｌｎおよび
・Ｄ－Ｇｌｎ
から選択される少なくとも１つを含むスペーサーであり、好ましくは、Ｓは、Ｇｌｕ、Ｄ－Ｇｌｕ、β－グルタミン酸（β－Ｇｌｕ）、Ｇｌｎ、Ｄ－Ｇｌｎ、ＡｓｐおよびＤ－Ａｓｐから選択される少なくとも１つのアミノ酸を含むテトラまたはペンタペプチド、より好ましくは、Ｇｌｕ、Ｄ－Ｇｌｕ、β－Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｄ－Ｇｌｎ、ＡｓｐおよびＤ－Ａｓｐから選択される少なくとも１つのアミノ酸を含むペンタペプチドであり、
Ｙは、放射性核種を含む部分、例えば、放射性核種（例えば放射性金属）をキレートする部分、または放射性核種を（共有）結合する部分を表す］で表される。
【0070】
好ましい一実施形態において、ガストリンアナログは、下記式（２）：
Ｙ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｔｒｐ－Ｘ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－ＮＨ２ （２）
［式中、Ｘは、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、２－アミノ－５－ヘプテン酸、ホモノルロイシン（ホモＮｌｅ）、２－アミノ－４－メトキシブタン酸、テルロメチオニン（Ｔｅ－Ｍｅｔ）、セレノメチオニン（Ｓｅ－Ｍｅｔ）またはＰｈｇなどのメチオニンと等価なアミノ酸を表し、Ｙは、放射性核種を含む部分、例えば、放射性核種（例えば放射性金属）をキレートする部分、例えばＤＯＴＡ、ＮＯＴＡもしくはＮＯＤＡＧＡ、好ましくはＮＯＤＡＧＡ、または放射性核種を（共有）結合する部分を表す］で表される。
Ｙ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｔｒｐ－Ｘ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－ＮＨ２ （２）
［式中、Ｘは、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、２－アミノ－５－ヘプテン酸、ホモノルロイシン（ホモＮｌｅ）、２－アミノ－４－メトキシブタン酸、テルロメチオニン（Ｔｅ－Ｍｅｔ）、セレノメチオニン（Ｓｅ－Ｍｅｔ）またはＰｈｇなどのメチオニンと等価なアミノ酸を表し、Ｙは、放射性核種を含む部分、例えば、放射性核種（例えば放射性金属）をキレートする部分、例えばＤＯＴＡ、ＮＯＴＡもしくはＮＯＤＡＧＡ、好ましくはＮＯＤＡＧＡ、または放射性核種を（共有）結合する部分を表す］で表される。
【0071】
いくつかの態様において、Ｙ（式（１）および（２）で定義される）は、ペプチドに共有結合するための、すなわち、ペプチド鎖のＮ末端に共有結合するための、またはＮ末端アミノ酸の側鎖に共有結合するためのカルボン酸などの官能基を含む。
【0072】
放射性核種をキレートすることができる部分（キレーター）の例としては、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、デフェロキサミン（ＤＦＯ）、１，４，７－トリアザシクロノナン，１－グルタル酸－４，７－酢酸（ＮＯＤＡＧＡ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１－グルタル酸－４，７，１０－三酢酸（ＤＯＴＡＧＡ）、２，２’－（１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４－ジイル）二酢酸（ＮＯ２Ａ）、１，４、７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸（ＮＯＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン二酢酸、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン（ＣＹＣＬＡＭ）、１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン－１，４，８，１１－四酢酸（ＴＥＴＡ）、１，４，８，１１－テトラアザビシクロ［６．６．２］ヘキサデカン－４，１１－二酢酸（ＣＢ－ＴＥ２Ａ）、２，２’，２’’－（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７－トリイル）トリアセトアミド（ＤＯ３ＡＭ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，７－二酢酸（ＤＯ２Ａ）、１，５，９－トリアザシクロドデカン（ＴＡＣＤ）、（３ａ１ｓ，５ａ１ｓ）－ドデカヒドロ－３ａ，５ａ，８ａ，１０ａ－テトラアザピレン（ｃｉｓ－グリオキサール－シクラム）、１，４，７－トリアザシクロノナン（ＴＡＣＮ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン（シクレン）、トリ（ヒドロキシピリジノン）（ＴＨＰ）、３－（（（４，７－ビス（（ヒドロキシ（ヒドロキシメチル）ホスホリル）メチル）－１，４，７－トリアゾナン－１－イル）メチル）（ヒドロキシ）ホスホリル）プロパン酸（ＮＯＰＯ）、３，６，９，１５－テトラアザビシクロ［９．３．１］ペンタデカ－１（１５），１１，１３－トリエン－３，６，９－三酢酸（ＰＣＴＡ），２，２’，２’’，２’’’－（１，４，７，１０－テトラアザシクロトリデカン－１，４，７，１０－テトライル）四酢酸（ＴＲＩＴＡ），２，２’，２’’，２’’’－（１，４，７，１０－テトラアザシクロトリデカン－１，４，７，１０－テトライル）テトラアセトアミド（ＴＲＩＴＡＭ）、２，２’，２’’－（１，４，７，１０－テトラアザシクロトリデカン－１，４，７－トリイル）トリアセトアミド（ＴＲＩＴＲＡＭ）、ｔｒａｎｓ－Ｎ－ジメチルシクラム、２，２’，２’’－（１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－トリイル）トリアセトアミド（ＮＯＴＡＭ）、オキソシクラム、ジオキソシクラム、１，７－ジオキサ－４，１０－ジアザシクロドデカン、クロスブリジッドシクラム（ＣＢ－シクラム）、トリアザシクロノナンホスフィン酸（ＴＲＡＰ）、ジピリドキシル二リン酸（ＤＰＤＰ）、ｍｅｓｏ－テトラ－（４－スルホナトフェニル）ポルフィン（ＴＰＰＳ４）、エチレンビスヒドロキシフェニルグリシン（ＥＨＰＧ）、ヘキサメチレンジアミン四酢酸、ジメチルホスフィノメタン（ＤＭＰＥ）、メチレンジリン酸、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＰＡ）、およびそれらの誘導体が挙げられる。
【0073】
一実施形態において、Ｘは、Ｎｌｅ、２－アミノ－４－メトキシブタン酸、Ｔｅ－Ｍｅｔ、Ｓｅ－Ｍｅｔ、２－アミノ－５－ヘプテン酸、ホモＮｌｅおよびＰｈｇから選択されるメチオニンと等価なアミノ酸、好ましくはＮｌｅを表し、かつ／またはＹは、ＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ、ＮＯＴＡ、ＮＯＤＡＧＡおよびＴＥＴＡから選択される部分、好ましくはＤＯＴＡ、ＮＯＴＡまたはＮＯＤＡＧＡ、より好ましくはＮＯＤＡＧＡを表す。一実施形態によれば、ＸはＮｌｅを表し、ＹはＤＯＴＡを表す。
【0074】
式（１）または（２）のガストリンアナログは、プロテアーゼによる分解に対して優れた抵抗性を示し、全身循環において安定である。さらに、式（１）または（２）のガストリンアナログは、腎臓への取り込みおよび集積も非常に少なく、したがって、健康な組織（例えば腎臓）への非特異的な集積による副作用をより一層低減することができる。
【0075】
好ましい一実施形態において、放射標識ガストリンアナログは、下記式（３）：
ＤＯＴＡ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｔｒｐ－Ｎｌｅ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－ＮＨ２ （３）
［式中、ＤＯＴＡは、好ましくは１７７Ｌｕである放射性核種をキレートする］で表される。
ＤＯＴＡ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－ＤＧｌｕ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｔｒｐ－Ｎｌｅ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－ＮＨ２ （３）
［式中、ＤＯＴＡは、好ましくは１７７Ｌｕである放射性核種をキレートする］で表される。
【0076】
本明細書で使用される放射性核種は、ベータ線および／またはガンマ線を放出する、過剰な核エネルギーを有する任意の天然に存在するまたは人工的に生成された原子から選択され得る。一実施形態において、放射性核種は、１８Ｆ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、８６Ｙ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、１１１Ｉｎ、１８８Ｒｅ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、１４９Ｔｂ、１６１Ｔｂ、８９Ｓｒ、４４／４３Ｓｃ、４７Ｓｃおよび１５３Ｓｍからなる群から選択される。
【0077】
好ましい一実施形態によれば、放射性核種は、１７７Ｌｕ、９０Ｙおよび１１１Ｉｎからなる群から選択され、より好ましくは、１７７Ｌｕである。
【0078】
４．疾患を処置および／または診断する方法における組成物の使用
ｉ）ラパマイシンおよび／またはラパログならびに（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログを含む本発明の組成物（キット・オブ・パーツ）は、疾患を処置および／または診断するために、特にＣＣＫＢＲ陽性の癌または腫瘍を処置および／または診断するために使用することができる。いくつかの態様において、処置は、処置を受けない場合の対象の予想される生存期間と比較して、対象の生存期間を延ばすことができる。
ｉ）ラパマイシンおよび／またはラパログならびに（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログを含む本発明の組成物（キット・オブ・パーツ）は、疾患を処置および／または診断するために、特にＣＣＫＢＲ陽性の癌または腫瘍を処置および／または診断するために使用することができる。いくつかの態様において、処置は、処置を受けない場合の対象の予想される生存期間と比較して、対象の生存期間を延ばすことができる。
【0079】
組成物（キット・オブ・パーツ）によって処置される疾患は、ＣＣＫＢＲの発現によって特徴付けられる癌などの任意の新生物疾患とすることができる。ＣＣＫＢＲ陽性の癌または腫瘍の非限定的な例としては、甲状腺髄質癌（ＭＴＣ）、グリオーマ、胃腸膵神経内分泌腫瘍（ＧＥＰ－ＮＥＴ）、星細胞腫、胃癌、結腸癌、卵巣癌および乳癌が挙げられる。例示的な疾患はＭＴＣである。
【0080】
一実施形態によれば、本発明の組成物は、（ｉ）ラパマイシンおよび／またはラパログと（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログとを、（ｉ）ラパマイシンおよび／またはラパログと（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログとを必要としている患者へ共投与することにより、ＣＣＫＢＲ陽性の癌もしくは腫瘍を処置または診断する方法において使用される。本発明のすべての態様において、１つ以上のラパログと１つ以上の放射標識ガストリンアナログとを共投与することができる。ラパログと放射標識ガストリンアナログとの共投与は、（ｉ）ラパマイシンおよび／またはラパログと（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログとの両方の並行（同時）投与の他に、（ｉ）ラパマイシンおよび／またはラパログとそれに続いて（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログとの連続投与も含む。２つ以上のラパログが存在する場合、これらは、個々に各々単独で、かつ／またはラパマイシン／ラパログカクテルとして一緒に投与することができる。同様に、２つ以上の放射標識ガストリンアナログが存在する場合、これらもまた、個々に各々単独で、かつ／またはカクテルとして一緒に投与することができる。
【0081】
いかなる理論にも縛られることなく、共投与は、ｍＴＯＲ経路を阻害するためにＣＣＫＢＲ陽性の腫瘍細胞をラパログに十分に曝露し、放射標識ガストリンアナログに同じ腫瘍細胞を曝露する前に細胞表面上のＣＣＫＢＲ密度の増加を達成することを可能し、それによって腫瘍細胞への放射標識ガストリンアナログの優れた標的化が達成されると考えられる。したがって、共投与は、この結果を達成する放射標識ガストリンアナログと組み合わせてラパログを投与する任意の方法を含む。
【0082】
ラパマイシンおよび／またはラパログと放射標識ガストリンアナログとは、並行（同時）または互いに独立して、例えば、（ｉ）ｍＴＯＲ阻害剤、特にラパマイシンおよび／またはラパログが、（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログの前に所定の時間にわたって投与されるという連続投与パターンに従って投与することができる。
【0083】
一実施形態によれば、（ｉ）ラパマイシンおよび／またはラパログは、（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログと同時に、または（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログの前に投与される。したがって、（ｉ）ラパマイシンおよび／またはラパログは、（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログと同じ日に、一緒にまたは互いに数時間以内に投与することができるが、約２ヶ月前まで投与することもできる。
【0084】
好ましい一実施形態によれば、（ｉ）ラパマイシンおよび／またはラパログは、（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログの前に最初に投与される。投与スケジュールは、ラパログおよび放射標識ガストリンアナログと同様に、患者ニーズおよび疾患状態（進行）に合わせて調整することができる。投与スケジュールによって追求される目的は、成分（ｉ）を投与して、ＣＣＫＢＲ陽性の腫瘍細胞の表面上のＣＣＫＢＲ発現を増加させ、それによって放射標識ガストリンアナログの標的化および取り込みを向上させることである。
【0085】
好ましくは、ラパマイシンおよび／またはラパログは、（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログの投与前に、予め２ヶ月までの期間、好ましくは１～１４日間にわたって、例えば、３日間などの２～５日間連続で投与される。特に、成分（ｉ）は、（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログが投与される前に、１～１４日間連続で、好ましくは２～７日間連続で、例えば３日間または５日間連続で、１日１回または数回、好ましくは１日１回投与することができる。
【0086】
さらに、共投与は、ラパログの１回以上の用量の投与後、数週間以内に（ｉｉ）放射標識ガストリンアナログを２回以上投与することを含む。したがって、ラパマイシンおよび／またはラパログは、放射標識ガストリンアナログのその後の投与の度に再投与する必要はないが、放射標識ガストリンアナログ処置の過程において１回だけ、または間欠的に投与することもできる。
【0087】
ラパログは、ラパログを含む（分散性）錠剤の形態で、例えば固体分散体として０．１ｍｇ～２０ｍｇ、例えば０．１ｍｇ～１５ｍｇ、好ましくは０．５ｍｇ～１０ｍｇ、例えば５ｍｇの範囲の１日投与量で、例えば経口投与することができる。
【0088】
放射標識ガストリンアナログは、１日１回または数回投与することができる。
【0089】
一実施形態において、本発明の組成物は、化学療法剤および／または免疫調節剤などの１つ以上の他の治療剤または治療薬と同時に、その前またはその後に投与することができる。使用できる治療剤または治療薬の例としては、アルキル化剤、アルカロイドまたはキナーゼ阻害剤などの抗腫瘍剤、免疫調節剤、ならびにそれらの薬学的に許容される塩および誘導体が挙げられる。
【0090】
５．放射標識ガストリンアナログの調製
以下では、放射標識ガストリンアナログの調製のための方法を提供する。ガストリンアナログは、オンレジンペプチドカップリングおよび収束戦略を含む、標準的なＦｍｏｃベースの固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）に依存して合成することができる。本発明のガストリンアナログを調製し、放射標識するために使用することができる一般的な戦略および方法論は、当業者によく知られており、また、以下にさらに記載される。
以下では、放射標識ガストリンアナログの調製のための方法を提供する。ガストリンアナログは、オンレジンペプチドカップリングおよび収束戦略を含む、標準的なＦｍｏｃベースの固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）に依存して合成することができる。本発明のガストリンアナログを調製し、放射標識するために使用することができる一般的な戦略および方法論は、当業者によく知られており、また、以下にさらに記載される。
【0091】
６．実施例
６．１略語のリスト
ＤＩＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＥＭ：ダルベッコ変法イーグル培地
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＤＴＴ：ジチオスレイトール
ＥＳＩ：エレクトロスプレーイオン化法
ＦＣＳ：ウシ胎児血清
ＨＡＴＵ：１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート
ＨＢＴＵ：３－［ビス（ジメチルアミノ）メチリウミル］－３Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－オキシドヘキサフルオロホスファート
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ＩＵ：国際単位
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＲＰＭＩ：ロズウェルパーク記念研究所
ＳＱＤ：シングル四重極検出器
ＳＰＥＣＴ：単光子放射型コンピュータ断層撮影法
ＳＰＰＳ：固相ペプチド合成法
ＴＢＳＴ：Ｔｗｅｅｎ２０入りトリス緩衝生理食塩水
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＩＳ：トリイソプロピルシラン
ＵＰＬＣ：超高速液体クロマトグラフィー
６．１略語のリスト
ＤＩＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＥＭ：ダルベッコ変法イーグル培地
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＤＴＴ：ジチオスレイトール
ＥＳＩ：エレクトロスプレーイオン化法
ＦＣＳ：ウシ胎児血清
ＨＡＴＵ：１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート
ＨＢＴＵ：３－［ビス（ジメチルアミノ）メチリウミル］－３Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－オキシドヘキサフルオロホスファート
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ＩＵ：国際単位
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＲＰＭＩ：ロズウェルパーク記念研究所
ＳＱＤ：シングル四重極検出器
ＳＰＥＣＴ：単光子放射型コンピュータ断層撮影法
ＳＰＰＳ：固相ペプチド合成法
ＴＢＳＴ：Ｔｗｅｅｎ２０入りトリス緩衝生理食塩水
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＩＳ：トリイソプロピルシラン
ＵＰＬＣ：超高速液体クロマトグラフィー
【0092】
６．２ 材料および方法
本発明の組成物を評価するために、以下の材料および方法を使用した。
本発明の組成物を評価するために、以下の材料および方法を使用した。
【0093】
６．２．１ 細胞培養、トランスフェクションおよび処理
前述（Aloj et al., J Nucl Med 2004, 45(3), 485-94）のとおり生成されたＣＣＫＢＲを過剰発現するヒト類表皮癌Ａ４３１安定細胞株をＤＭＥＭ中で培養し、一方、ラット膵腺房細胞株ＡＲ４２Ｊを、１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミンおよび抗生物質（０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、１００ＩＵペニシリン）を添加したＲＰＭＩ培地中で、３７℃および、５％ＣＯ２にて培養した。
前述（Aloj et al., J Nucl Med 2004, 45(3), 485-94）のとおり生成されたＣＣＫＢＲを過剰発現するヒト類表皮癌Ａ４３１安定細胞株をＤＭＥＭ中で培養し、一方、ラット膵腺房細胞株ＡＲ４２Ｊを、１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミンおよび抗生物質（０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、１００ＩＵペニシリン）を添加したＲＰＭＩ培地中で、３７℃および、５％ＣＯ２にて培養した。
【0094】
ＣＣＫＢＲ特異的ノックダウンのために、ＣＣＫＢＲに対する二重鎖ｓｉＲＮＡまたはルシフェラーゼに対する対照二重鎖（Microsynth社）をＯｐｔｉｍｅｍ（Gibco社）中で最終濃度１００ｎＭにて使用した：ＣＣＫＢＲｓｅｑ１センスＲＮＡ５’－ＵＡＵＡＣＧＡＧＵＡＧＵＡＧＣＡＣＣＡｄＴｄＴ－３’、ＣＣＫＢＲｓｅｑ２センスＲＮＡ５’－ＣＣＧＣＣＡＡＡＧＧＡＵＧＧＡＧＵＡＣｄＴｄＴ－３’および対照センスＲＮＡ５’－ＣＧＵＡＣＧＣＧＧＡＡＵＡＣＵＵＣＧＡｄＴｄＴ－３’。６０～８０％コンフルエントの細胞に、ユーザーマニュアルに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ３０００を使用してｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。全タンパク質ライセートをＷＢ解析に供した。
【0095】
ＤＭＳＯまたは水で希釈したＲＡＤ００１またはメトホルミン（いずれもSelleckchem製）による処置をそれぞれ指示された時点で行い、ＰＢＳ洗浄した細胞を後述の解析に使用した。
【0096】
６．２．２ ガストリンアナログの調製
本明細書に記載されるガストリンアナログは、Ａｃｔｉｖｏ－Ｐ－１１自動ペプチド合成装置（Activotec社）およびリンクアミドレジン（投入：０．６０ｍｍｏｌ／ｇ；Novabiochem社）を用いたオンレジンペプチドカップリングおよび収束戦略を含む標準ＦｍｏｃベースのＳＰＰＳによって調製した。
本明細書に記載されるガストリンアナログは、Ａｃｔｉｖｏ－Ｐ－１１自動ペプチド合成装置（Activotec社）およびリンクアミドレジン（投入：０．６０ｍｍｏｌ／ｇ；Novabiochem社）を用いたオンレジンペプチドカップリングおよび収束戦略を含む標準ＦｍｏｃベースのＳＰＰＳによって調製した。
【0097】
アミド結合形成のためのカップリング反応は、ＤＩＥＡ（６当量）の存在下、ＨＢＴＵ（２．９当量）で活性化した３当量のＦｍｏｃアミノ酸を用いて室温で３０分かけて行った。Ｆｍｏｃ脱保護は、ＤＭＦ中の２０％ピペリジン溶液で行う。Ｎ末端標識部分のカップリングは、ＤＩＥＡ（６当量）の存在下、ＨＡＴＵ（２．９当量）で活性化した３当量のＤＯＴＡトリス－ｔ－Ｂｕエステル（Novabiochem社）を用いて室温で３０分かけて行うことができる。
【0098】
ＴＦＡ／ＴＩＳ／水（９５／２．５／２．５、ｖ／ｖ／ｖ）で６０分間処理し、側鎖を同時に脱保護した状態でレジンからペプチドを切断した。切断混合物を濃縮した後、粗ペプチドを冷ジエチルエーテルで沈殿させ、遠心分離を行った。
【0099】
ペプチドは、ＸＳｅｌｅｃｔペプチドＣＳＨ Ｃ１８ ＯＢＤ Ｐｒｅｐカラム（１３０Å、５μｍ、１９ｍｍ×１５０ｍｍ）を備えたＳＱＤ質量分析計に結合したＷａｔｅｒｓ Ａｕｔｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＨＰＬＣシステムで、溶媒系 （水中０．１％ＴＦＡ）およびＢ（アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ）を用いて流速２５ｍＬ／分で３０分にわたってＢの２０～６０％グラジエントで精製した。適切なフラクションを関連付け、濃縮し、凍結乾燥した。純度は、ＣＳＨ Ｃ１８カラム（１３０Å、１．７μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ）を備えたＳＱＤ質量分析計に結合したＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムで、溶媒系Ａ（水中０．１％ＴＦＡ）および （アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ）を用いて流速０．６ｍＬ／分で５分にわたってＢの５～８５％グラジエントで決定した。
【0100】
ＭＳ分析は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）インターフェースを用いて、ポジティブモードおよびネガティブモードで行った。
【0101】
６．２．３ ガストリンアナログの放射標識化
上記のように調製したＮ末端ＤＯＴＡコンジュゲート型のガストリンアナログＰＰ－Ｆ１１Ｎ（ＤＯＴＡ－（ＤＧｌｕ）６－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｔｒｐ－Ｎｌｅ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ）と１７７Ｌｕ（ITG GmbH社から入手可能）との核種／ペプチド比１：３０の溶液を、０．４Ｍ 酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．５）で調製し、９０℃で１５分標識化を行った。
上記のように調製したＮ末端ＤＯＴＡコンジュゲート型のガストリンアナログＰＰ－Ｆ１１Ｎ（ＤＯＴＡ－（ＤＧｌｕ）６－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｔｒｐ－Ｎｌｅ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ）と１７７Ｌｕ（ITG GmbH社から入手可能）との核種／ペプチド比１：３０の溶液を、０．４Ｍ 酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．５）で調製し、９０℃で１５分標識化を行った。
【0102】
ルテチウムの組み込みはＣ１８カラムを用いた標準ＨＰＬＣで解析し、９５％を上回る効率に達した。標識後すぐに、ガンマカウンターを用いて、標的放射線実験用に放射標識ガストリンアナログの適切な希釈液を調製した。
【0103】
６．２．４ キナーゼ阻害剤ライブラリースクリーン
Ｉｓｏｐｌａｔｅ ９６ ＴＣ（PerkinElmer社）に１ウェル当たり２５，０００個の細胞を播種し、１０μＭのキナーゼ阻害剤（ＫＩｓ）で１８時間処置した（Ｓｃｒｅｅｎ－ｗｅｌｌ（登録商標）キナーゼ阻害剤ライブラリー、Enzo Life Sciences AG社）。翌日、１０，０００ｃｐｍの１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎ（上記のように調製）を各ウェルに添加し、標準的な組織培養条件で２時間プレートをインキュベートした。ブロッキング対照は、４μＭのミニガストリンＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦ（PSL GmbH社）の存在下で行った。
Ｉｓｏｐｌａｔｅ ９６ ＴＣ（PerkinElmer社）に１ウェル当たり２５，０００個の細胞を播種し、１０μＭのキナーゼ阻害剤（ＫＩｓ）で１８時間処置した（Ｓｃｒｅｅｎ－ｗｅｌｌ（登録商標）キナーゼ阻害剤ライブラリー、Enzo Life Sciences AG社）。翌日、１０，０００ｃｐｍの１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎ（上記のように調製）を各ウェルに添加し、標準的な組織培養条件で２時間プレートをインキュベートした。ブロッキング対照は、４μＭのミニガストリンＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦ（PSL GmbH社）の存在下で行った。
【0104】
放射性上清を除去した後、細胞をＵＬＴＩＭＡ ＧＯＬＤ高引火点ＬＳＣカクテル（Sigma社）５０ｐｉに再懸濁し、水平シェーカー上で２時間室温にてインキュベートした。ＭｉｃｒｏＢｅｔａ ２４５０マイクロプレートカウンター（PerkinElmer社）を用いて、１ウェル当たり３０秒以内に放射能を測定した。３連でスクリーンアッセイした。
【0105】
６．２．５ 増殖アッセイ
上記のように処置前の細胞を９６ウェルプレートに播種し、細胞増殖をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ非放射性細胞増殖アッセイ（Promega社）により製造元の指示に従って解析した。ホルマザンに生体内還元されたＭＴＳの吸光度を、マイクロプレートリーダー（PerkinElmer社）を用いて、６５０ｎｍを基準として５７０ｎｍで測定した。アッセイは３連で行った。
上記のように処置前の細胞を９６ウェルプレートに播種し、細胞増殖をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ非放射性細胞増殖アッセイ（Promega社）により製造元の指示に従って解析した。ホルマザンに生体内還元されたＭＴＳの吸光度を、マイクロプレートリーダー（PerkinElmer社）を用いて、６５０ｎｍを基準として５７０ｎｍで測定した。アッセイは３連で行った。
【0106】
６．２．６ インビトロ放射標識ペプチド内在化アッセイ
２．５×１０５個の細胞を６ウェルプレートに播種した。８時間後、細胞を適切な阻害剤（指示どおり）で２０時間処理した。翌日、ＰＢＳで洗浄した細胞を１００，０００ｃｐｍの１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎ（０．１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ中）と共に標準ＴＣ条件でインキュベートした。ブロッキング実験のために、ミニガストリン（PSL GmbH社）を４μＭの濃度で使用した。１時間または２時間のインキュベーション後、放射性培地（ＰＢＳ洗浄と一緒に）を回収し、細胞をグリシン緩衝液（ｐＨ＝２）で５分間、室温にて２回洗浄に供した後、１Ｍ ＮａＯＨで１５分間、３７℃にて溶解ステップに供した。３つの回収したフラクション（培地／ＰＢＳ；グリシン洗浄；溶解した細胞）をすべてＣｏｂｒａ ＩＩオートガンマカウンター（Packard社）で測定した；１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎの内在化および膜結合フラクションを総放射能に対する％で示した。総放射能の０．１％未満のブロッキングペプチド（それぞれグリシン洗浄細胞またはＮａＯＨ溶解細胞の非特異的結合または内在化の対照）を用いた実験の結果（データは示さず）を、得られた結果から差し引いた。ＮａＯＨ溶解細胞ライセートのタンパク質濃度を、ＮａｎｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（登録商標）ＵＶ－Ｖｉｓ Ｐ－Ｃｌａｓｓ（Implen社）を用いた分光光度計により測定した。
２．５×１０５個の細胞を６ウェルプレートに播種した。８時間後、細胞を適切な阻害剤（指示どおり）で２０時間処理した。翌日、ＰＢＳで洗浄した細胞を１００，０００ｃｐｍの１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎ（０．１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ中）と共に標準ＴＣ条件でインキュベートした。ブロッキング実験のために、ミニガストリン（PSL GmbH社）を４μＭの濃度で使用した。１時間または２時間のインキュベーション後、放射性培地（ＰＢＳ洗浄と一緒に）を回収し、細胞をグリシン緩衝液（ｐＨ＝２）で５分間、室温にて２回洗浄に供した後、１Ｍ ＮａＯＨで１５分間、３７℃にて溶解ステップに供した。３つの回収したフラクション（培地／ＰＢＳ；グリシン洗浄；溶解した細胞）をすべてＣｏｂｒａ ＩＩオートガンマカウンター（Packard社）で測定した；１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎの内在化および膜結合フラクションを総放射能に対する％で示した。総放射能の０．１％未満のブロッキングペプチド（それぞれグリシン洗浄細胞またはＮａＯＨ溶解細胞の非特異的結合または内在化の対照）を用いた実験の結果（データは示さず）を、得られた結果から差し引いた。ＮａＯＨ溶解細胞ライセートのタンパク質濃度を、ＮａｎｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（登録商標）ＵＶ－Ｖｉｓ Ｐ－Ｃｌａｓｓ（Implen社）を用いた分光光度計により測定した。
【0107】
６．２．７ ＷＢ解析
Ｓ２３５／Ｓ２３６におけるｐｈｏｓｐｈｏ－Ｓ６（Ｄ５７．２．２Ｆ）およびＧＡＰＤＨ（１４Ｃ１０）に対する抗体をCell Signaling Technology社から得て、一方、抗ＣＣＫＢＲ（ａｂ７７０７７）をAbcam社から得た。細胞を溶解緩衝液（５０ｍＭトリス－ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１ｍＭ ＮａＦおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche社）を添加したＳＤＳ０．１％）中でホモジナイズした。５０μｇのタンパク質抽出物のアリコートをＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、エレクトロブロッティングによりＰＶＤＦ膜（Millipore社）に転写した。膜はＴＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０）中の５％スキムミルクで１時間ブロックし、ＴＢＳＴ中の２％ＢＳＡで一晩一次抗体をインキュベートし、その後ＨＲＰコンジュゲート型の二次抗体で２時間インキュベートした。タンパク質特異的なシグナルは化学発光試薬（ＥＣＬ）によって検出し、シグナルはＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＲＴ ＥＣＬ Ｉｍａｇｅｒ（GE Healthcare社）を用いて取得した。
Ｓ２３５／Ｓ２３６におけるｐｈｏｓｐｈｏ－Ｓ６（Ｄ５７．２．２Ｆ）およびＧＡＰＤＨ（１４Ｃ１０）に対する抗体をCell Signaling Technology社から得て、一方、抗ＣＣＫＢＲ（ａｂ７７０７７）をAbcam社から得た。細胞を溶解緩衝液（５０ｍＭトリス－ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１ｍＭ ＮａＦおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche社）を添加したＳＤＳ０．１％）中でホモジナイズした。５０μｇのタンパク質抽出物のアリコートをＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、エレクトロブロッティングによりＰＶＤＦ膜（Millipore社）に転写した。膜はＴＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０）中の５％スキムミルクで１時間ブロックし、ＴＢＳＴ中の２％ＢＳＡで一晩一次抗体をインキュベートし、その後ＨＲＰコンジュゲート型の二次抗体で２時間インキュベートした。タンパク質特異的なシグナルは化学発光試薬（ＥＣＬ）によって検出し、シグナルはＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＲＴ ＥＣＬ Ｉｍａｇｅｒ（GE Healthcare社）を用いて取得した。
【0108】
６．２．８ 脱グリコシル化
ＣＣＫＢＲ検出の前に、タンパク質ライセートを脱グリコシル化に供した。簡単に言うと、１８μＬの全細胞ライセート（約５０μｇ）を２μＬの１０×変性緩衝液（５％ＳＤＳ、０．４Ｍ ＤＴＴ）と混合し、室温で１０分間インキュベートした。次に、４μＬの１０×Ｇｌｙｃｏｂｕｆｆｅｒ（０．５Ｍ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）、４μＬの１０％ Ｔｗｅｅｎ－２０および１０μＬの水を加えた。最後に２μＬのＰＮＧａｓｅ Ｆ（Sigma社）を加え、混合し、遠心分離で回収した。反応は３７℃で一晩行い、その後にＷＢ解析を行った。
ＣＣＫＢＲ検出の前に、タンパク質ライセートを脱グリコシル化に供した。簡単に言うと、１８μＬの全細胞ライセート（約５０μｇ）を２μＬの１０×変性緩衝液（５％ＳＤＳ、０．４Ｍ ＤＴＴ）と混合し、室温で１０分間インキュベートした。次に、４μＬの１０×Ｇｌｙｃｏｂｕｆｆｅｒ（０．５Ｍ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）、４μＬの１０％ Ｔｗｅｅｎ－２０および１０μＬの水を加えた。最後に２μＬのＰＮＧａｓｅ Ｆ（Sigma社）を加え、混合し、遠心分離で回収した。反応は３７℃で一晩行い、その後にＷＢ解析を行った。
【0109】
６．２．９ 動物実験
本研究では、ヒトＡ４３１／ＣＣＫＢＲ異種移植マウスモデルを使用した。重要なのは、Ａ４３１－ＣＣＫ２Ｒ異種移植片を持つ免疫不全マウスが、甲状腺髄様癌（ＭＴＣ）患者における第１相臨床試験の規制承認に必要な放射標識ミニガストリンアナログの薬物動態、生体内分布、線量測定または毒性の前臨床評価に以前に使用されたことである（Maina et al., Eur J Pharm Sci. 2016;91:236-42）。
本研究では、ヒトＡ４３１／ＣＣＫＢＲ異種移植マウスモデルを使用した。重要なのは、Ａ４３１－ＣＣＫ２Ｒ異種移植片を持つ免疫不全マウスが、甲状腺髄様癌（ＭＴＣ）患者における第１相臨床試験の規制承認に必要な放射標識ミニガストリンアナログの薬物動態、生体内分布、線量測定または毒性の前臨床評価に以前に使用されたことである（Maina et al., Eur J Pharm Sci. 2016;91:236-42）。
【0110】
免疫不全のＣＤ－１雌ヌードマウス（Charles Rivers社、ドイツ国）を実験の１週間前飼育した。腫瘍移植の前に、Ａ４３１／ＣＣＫＢＲ細胞を採取し、０．９％ＮａＣｌを含有する０．１ｍＬの滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の５００万個の細胞を、イソフルラン／酸素吸入で麻酔したマウスに皮下注射した（動物１匹当たり２個の腫瘍）。５日後、動物を３つの実験群に無作為に振り分け、腫瘍サイズをキャリパーで非侵襲的に測定した。ＲＡＤ００１（３ｍｇ／ｋｇ）、メトホルミン（２００ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳ（対照）を、指示どおりに、３日間または５日間連続して腹腔内注射により毎日投与した。処置サイクル中、いずれの群においても急性毒性の兆候は観察されなかった。処置後、マウスは１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎを尾静脈に投与され（マウス１匹当たり約１５０ｋＢｑを０．１ｍＬの滅菌ＰＢＳの容量で）、４時間後にマウスはＣＯ２で人道的安楽死に供した。死後解剖した腫瘍および臓器の重量を測定し、ガンマカウンターでその放射能を測定した。終了時、身体または臓器の重量、総合的な健康状態、または解剖学的構造における有意な差は観察されなかった。すべての実験はスイスの動物保護法に従って行った。
【0111】
６．２．１０ ＳＰＥＣＴ／ＩＴ
静脈内注射の前に、１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１ＮをＨＰＬＣで精製し、ＳｐｅｅｄＶａｃで濃縮後、ＰＢＳで希釈した（１００μｌで１０ＭＢｑ）。メトホルミン、ＲＡＤ００１またはＰＢＳ（対照）で処置したＡ４３１／ＣＣＫＢＲ腫瘍を持つヌードマウスにおける１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎの腫瘍取り込みを、製造元の指示に従ってＸ線コンピュータ断層撮影（ｍｕｌｔｉｐｉｎｈｏｌｅ ｓｍａｌｌ－ａｎｉｍａｌ ＮａｎｏＳＰＥＣＴ／ＣＴカメラ、Mediso Medical Imaging Systems社）と組み合わせた単光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）によって監視した。すべてのマウスを注射の２時間後に犠牲にし、１０分間のＣＴ後に５時間のＳＰＥＣＴスキャンに直接使用した。画像再構成、加工および相対的定量化は、ＶｉｖｏＱｕａｎｔ ３．０ Ｐａｔｃｈ１ソフトウェアを使用して行った。放射性腫瘍領域の選択および解析には大津の二値化および結合閾値を適用した。
静脈内注射の前に、１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１ＮをＨＰＬＣで精製し、ＳｐｅｅｄＶａｃで濃縮後、ＰＢＳで希釈した（１００μｌで１０ＭＢｑ）。メトホルミン、ＲＡＤ００１またはＰＢＳ（対照）で処置したＡ４３１／ＣＣＫＢＲ腫瘍を持つヌードマウスにおける１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎの腫瘍取り込みを、製造元の指示に従ってＸ線コンピュータ断層撮影（ｍｕｌｔｉｐｉｎｈｏｌｅ ｓｍａｌｌ－ａｎｉｍａｌ ＮａｎｏＳＰＥＣＴ／ＣＴカメラ、Mediso Medical Imaging Systems社）と組み合わせた単光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）によって監視した。すべてのマウスを注射の２時間後に犠牲にし、１０分間のＣＴ後に５時間のＳＰＥＣＴスキャンに直接使用した。画像再構成、加工および相対的定量化は、ＶｉｖｏＱｕａｎｔ ３．０ Ｐａｔｃｈ１ソフトウェアを使用して行った。放射性腫瘍領域の選択および解析には大津の二値化および結合閾値を適用した。
【0112】
６．２．１１ 免疫化学
ホルマリン固定したＡ４３１／ＣＣＫＢＲ腫瘍のパラフィン切片を脱パラフィン化に供した。再水和したスライドは、１０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ６．０、９８℃で６０分間前処理した後、ＰＢＳ中４％無脂肪乳で９０分間インキュベートした。アビジン／ビオチンブロッカー（Invitrogen社）処理および検出には、製造元の指示に従いＡＢＣ法を用いた。Ｋｉ６７に対するモノクローナル抗体（Thermo Scientific社、ＳＰ６）については、ユーザーマニュアルに従い、自動機器試薬システム（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＸＴ、Ventana Medical System Inc.社）を使用してシグナルを記録した。ヘマトキシリンでカウンター染色した切片の画像を撮影し（ニコン社、ＹＴＨＭ）、ＩｍａｇｅＡｃｃｅｓｓ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ７およびＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて解析した（Schneider et al. Nat Methods 2012, 9(7), 671-675）。
ホルマリン固定したＡ４３１／ＣＣＫＢＲ腫瘍のパラフィン切片を脱パラフィン化に供した。再水和したスライドは、１０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ６．０、９８℃で６０分間前処理した後、ＰＢＳ中４％無脂肪乳で９０分間インキュベートした。アビジン／ビオチンブロッカー（Invitrogen社）処理および検出には、製造元の指示に従いＡＢＣ法を用いた。Ｋｉ６７に対するモノクローナル抗体（Thermo Scientific社、ＳＰ６）については、ユーザーマニュアルに従い、自動機器試薬システム（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＸＴ、Ventana Medical System Inc.社）を使用してシグナルを記録した。ヘマトキシリンでカウンター染色した切片の画像を撮影し（ニコン社、ＹＴＨＭ）、ＩｍａｇｅＡｃｃｅｓｓ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ７およびＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて解析した（Schneider et al. Nat Methods 2012, 9(7), 671-675）。
【0113】
６．２．１２ 統計解析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．００ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓを用い、２群の解析には両側Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を行い、一方、３群以上の解析には一元配置分散分析の後に多重比較検定を行った。Ｐ＜０．０５の値は、統計的に有意であるとみなされた。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．００ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓを用い、２群の解析には両側Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を行い、一方、３群以上の解析には一元配置分散分析の後に多重比較検定を行った。Ｐ＜０．０５の値は、統計的に有意であるとみなされた。
【0114】
実施例１：放射標識ガストリンアナログのインビトロでの内在化－キナーゼ阻害剤ライブラリースクリーン
ガストリンアナログの内在化率に影響を与える経路を調べるために、キナーゼ阻害剤のライブラリー（８０個の化合物）を、ＭＴＣ Ａ４３１／ＣＣＫＢＲ細胞における１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎ取り込みを測定するために、上記の手順に従ってスクリーニングした。スクリーニングアッセイの概要を図１Ａに示している。
ガストリンアナログの内在化率に影響を与える経路を調べるために、キナーゼ阻害剤のライブラリー（８０個の化合物）を、ＭＴＣ Ａ４３１／ＣＣＫＢＲ細胞における１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎ取り込みを測定するために、上記の手順に従ってスクリーニングした。スクリーニングアッセイの概要を図１Ａに示している。
【0115】
簡単に言うと、細胞を１０μＭのキナーゼ阻害剤による処理に１８時間供した。翌日、１０．０００ｃｐｍの１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎ（上記のように調製）を各ウェルに添加し、プレートを標準組織培養条件で２時間インキュベートした。放射性上清を除去した後、細胞を再懸濁し、水平シェーカー上で２時間、室温にてインキュベートした。ＭｉｃｒｏＢｅｔａ ２４５０マイクロプレートカウンターを用いることにより、１ウェル当たり３０秒以内に放射能を測定した。
【0116】
３つの阻害剤、すなわち、ＢＭＬ２５７、ＳＣ－５１４およびラパマイシンにより、１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎの取り込みが未処置の対照と比較して２４～２６％向上することが分かった（図１Ｂ）。マッチング増殖アッセイでは、これら３つの阻害剤の細胞増殖に有意な変化は示されず、これは、キナーゼ阻害後の細胞数が増加したことに起因して取り込みが向上したのではないことを示唆していた（図１Ｃ）。ＢＭＬ－２５７およびラパマイシンは、ＡＫＴ／ｍＴＯＲＣ１経路を標的化することが知られている。
【0117】
ＢＭＬ２５７およびＳＣ－５１４は、以下の化学構造：
を有するキナーゼ阻害剤である。
【化2】
【0118】
実施例２：ＲＡＤ００１およびメトホルミンにより誘発された放射標識ガストリンアナログのインビトロでの内在化
ＡＫＴ／ｍＴＯＲＣ１シグナル伝達への干渉をさらに調べるために、ＭＴＣ Ａ４３１／ＣＣＫＢＲ細胞における１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎの内在化を、十分に特徴付けられ臨床的に承認されたｍＴＯＲＣ１阻害剤ＲＡＤ００１（エベロリムス）およびメトホルミンを使用して評価した。
ＡＫＴ／ｍＴＯＲＣ１シグナル伝達への干渉をさらに調べるために、ＭＴＣ Ａ４３１／ＣＣＫＢＲ細胞における１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎの内在化を、十分に特徴付けられ臨床的に承認されたｍＴＯＲＣ１阻害剤ＲＡＤ００１（エベロリムス）およびメトホルミンを使用して評価した。
【0119】
アッセイのために、細胞をメトホルミンまたはＲＡＤ００１で２０時間処理し、１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎの内在化を上記の手順に従って測定した。
【0120】
Ａ４３１／ＣＣＫＢＲ細胞をメトホルミンおよびＲＡＤ００１で処置すると、１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎの内在化が、対照細胞の１６．２％と比較して、それぞれ２１．１％および２４．３％増加した（１．３および１．５の比［処置／対照］）。さらに、ＡＲ４２Ｊ細胞をＲＡＤ００１で処置すると、１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎの内在化が、対照細胞の５．７％と比較して１０％増加し、［ＲＡＤ００１／対照］の比は１．７であった。ＲＡＤ００１またはメトホルミン処置された細胞では、膜結合活性に有意な差はなかった（図２Ａ）。ＲＡＤ００１およびメトホルミンで処置されたＡ４３１／ＣＣＫＢＲ細胞の他に、ＲＡＤ００１で処置されたＡＲ４２Ｊ細胞のタンパク質レベルは、対照と比較して、それぞれ８０％、７９％および８４％に減少した（図２Ｂ）。
【0121】
ＲＡＤ００１およびメトホルミン処置の効果をＷＢ解析によって調べ、処置された細胞から得られたタンパク質ライセートにおいて、リボソームタンパク質Ｓ６のＳｅｒ２３５／２３６におけるｍＴＯＲＣ１制御されたリン酸化の欠如を示した（図２Ｃ）。
【0122】
実施例３．ＲＡＤ００１により誘発されたＣＣＫＢＲ発現およびインビトロでの１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎの内在化
Ａ４３１ ／ＣＣＫＢＲ細胞におけるＣＣＫＢＲの発現を、ＲＡＤ００１で処置した細胞で評価した。結果は図３Ａに示している。
Ａ４３１ ／ＣＣＫＢＲ細胞におけるＣＣＫＢＲの発現を、ＲＡＤ００１で処置した細胞で評価した。結果は図３Ａに示している。
【0123】
５０ｎＭまたは１００ｎＭのＲＡＤ００１で処置すると、ＣＣＫＢＲ発現が増加することが分かり（約２．２倍）、これは、ＲＡＤ００１で処置した細胞における放射標識ガストリンアナログの内在化の増加が、ＣＣＫＢＲ発現上昇に起因していることを示唆していた。内因性ＣＣＫＢＲの検出はＲＮＡ干渉によって確認され、それによってＣＣＫＢＲに対する二重ｓｉＲＮＡをトランスフェクションすると、ルシフェラーゼ遺伝子に対する二重ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした対照細胞と比較して、ＣＣＫＢＲ発現レベルが５５％に減少した（図３Ｂ）。
【0124】
実施例４：ＲＡＤ００１で処置したＭＴＣ腫瘍におけるインビボでの１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１ＮのＣＣＫＢＲ特異的な内在化（５日間の処置）
ＲＡＤ００１およびメトホルミンのインビボでの効果を調べるために、Ａ４３１／ＣＣＫＢＲ細胞を免疫不全ヌードマウスに皮下移植し、腫瘍形成後５日後に、マウスを上記のようにＲＡＤ００１、メトホルミンまたはＰＢＳ（対照）による処置に供した。
ＲＡＤ００１およびメトホルミンのインビボでの効果を調べるために、Ａ４３１／ＣＣＫＢＲ細胞を免疫不全ヌードマウスに皮下移植し、腫瘍形成後５日後に、マウスを上記のようにＲＡＤ００１、メトホルミンまたはＰＢＳ（対照）による処置に供した。
【0125】
生体内分布解析は、ＲＡＤ００１で処置した動物における１７７Ｌｕ－ＰＰＦ－１１Ｎの腫瘍取り込みにおいて統計的に有意な増加を示し（Ｐ＝０．００５７）、［ＲＡＤ００１／対照］の比は１．７９であり、一方、メトホルミンでの処置は、１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎ内在化を中程度にしか増加させず、［メトホルミン／対照］の比は１．１４であり、統計的有意性に達しなかった（図４Ａ）。
【0126】
さらに、健康な臓器における１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎの生体内分布には、すべての群で有意差がなかった。放射標識ガストリンアナログを非標識ブロッキングペプチドミニガストリン（ＣＣＫＢＲ結合の競合物質）と一緒に共投与することにより、３群すべてにおいて１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎの腫瘍取り込みが大幅に減少し、放射標識ガストリンアナログがＣＣＫＢＲ特異的に結合することが実証された（図４Ａの下段）。
【0127】
図４Ｂおよび４Ｃに示すように、ＲＡＤ００１／１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎによる処置は、腫瘍体積を有意に減少させ、一方、マウス全体の重量は影響を受けなかった。対照的に、メトホルミン／１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎによる処置は、腫瘍体積またはマウスの体重に影響を与えなかった。
【0128】
観察された腫瘍取り込みの増加が、ＲＡＤ００１と対照群との腫瘍量の違いに影響されているかどうかをさらに調べるために、サイズが一致する腫瘍群で統計解析を実施した。５０～１５０ｍｇまたは５０～１８０ｍｇの範囲のＲＡＤ００１で処置した腫瘍は、腫瘍量の有意差なしに１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎの取り込みにおいて統計的に有意な増加を示すことが分かり、これは、ＲＡＤ００１処置が腫瘍量非依存的に放射標識ミニガストリンの腫瘍取り込みを増加させることを示唆していた（データは示さず）。
【0129】
更なるＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージングにより、Ａ４３１／ＣＣＫＢＲ腫瘍を持つヌードマウスにおいて、ＲＡＤ００１による処置の５日間後、対照と比較して１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎの腫瘍への取り込みが増加したことが確認された（図５Ａ）。取得した画像の相対的定量化は、対照と比較して、ＲＡＤ００１で処置した腫瘍における放射標識ミニガストリンの平均および最大濃度が有意に高い（Ｐ＜０．００１）ことを示した（図５Ｂ）。平均濃度および最大濃度の比［ＲＡＤ００１／対照］はそれぞれ３．１１および３．１７に達し、一方、メトホルミン処置では、平均濃度および最大濃度の比［メトホルミン／対照］はそれぞれ１．０３および１．１７で有意な変化を示さなかった。
【0130】
実施例５：ＲＡＤ００１で処置したＣＣＫＢＲ腫瘍のインビボにおける１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１ＮのＣＣＫＢＲ特異的な内在化（３日間の処置）
５回未満の用量のＲＡＤ００１が１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎ腫瘍取り込みを増加させるかどうかを調べるために、同じＡ４３１／ＣＣＫＢＲ異種移植マウスモデルを、ＲＡＤ００１（３回の用量）、メトホルミンまたはＰＢＳ（対照）で３日間処置に供した。
５回未満の用量のＲＡＤ００１が１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎ腫瘍取り込みを増加させるかどうかを調べるために、同じＡ４３１／ＣＣＫＢＲ異種移植マウスモデルを、ＲＡＤ００１（３回の用量）、メトホルミンまたはＰＢＳ（対照）で３日間処置に供した。
【0131】
生体内分布解析から、ＲＡＤ００１で処置した動物群では１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎの腫瘍取り込みが統計的に有意に増加し（Ｐ＝０．００１６）、［ＲＡＤ００１／対照］の比は１．５６であり（図６）、一方、ブロッキングペプチド（ミニガストリン）と一緒に共注入すると、ＣＣＫＢＲ特異的な取り込みを示す１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎ腫瘍取り込みを大幅に減少させた。メトホルミンの３回の用量は、１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎの取り込みに有意な影響を与えなかった（図７Ａ）。
【0132】
健康な臓器における１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎの生体内分布には、すべての群で有意な差はなかった。ＲＡＤ００１の１日３回の用量は、マウス全体の重量に影響を与えることなく腫瘍体積を有意に減少させたが、メトホルミン処置は、腫瘍体積またはマウスの体重に影響を与えなかった（図７Ｂ）。
【0133】
実施例６：ＲＡＤ００１で処置したＣＣＫＢＲ腫瘍のインビボにおけるネクローシス、有糸分裂像およびＫｉ６７陽性細胞数
ＲＡＤ００１、メトホルミンおよびＰＢＳ（対照）の１日５回の用量で処置したＡ４３１／ＣＣＫＢＲ腫瘍を持つヌードマウスから調製したパラフィン腫瘍切片を、免疫組織化学に供した。ＲＡＤ００１およびＰＢＳ群には５個の腫瘍が含まれ、メトホルミン群では４個の腫瘍が解析された。
ＲＡＤ００１、メトホルミンおよびＰＢＳ（対照）の１日５回の用量で処置したＡ４３１／ＣＣＫＢＲ腫瘍を持つヌードマウスから調製したパラフィン腫瘍切片を、免疫組織化学に供した。ＲＡＤ００１およびＰＢＳ群には５個の腫瘍が含まれ、メトホルミン群では４個の腫瘍が解析された。
【0134】
図８Ａに示すように、ＲＡＤ００１による処置は、ＰＢＳで処置した腫瘍（１．４±１．２％）と比較してネクローシス（１０．６±６．４％）を増加させたが、一方、メトホルミンは、対照と比較して有意差を示さなかった。血管数の解析は、解析した群間の統計的な差を示さず、これは、観察された放射標識ミニガストリンのインビボでの取り込みの増加が、ＲＡＤ００１で処置した腫瘍におけるＣＣＫＢＲ発現の増加によるものであることを示唆していた（図８Ｂ）。有糸分裂指数（０．７５±０．３６％）およびＫｉ６７陽性細胞数（６１±８．６％）の減少は、有糸分裂指数１．０８±０．２％およびＫｉ６７陽性細胞８０±３．１％を示す対照腫瘍と比較して、ＲＡＤ００１で処置した腫瘍において検出された（図９Ａおよび図９Ｂ）。
【0135】
メトホルミン処置は、対照と比較して、有糸分裂の数値またはＫｉ６７陽性細胞の数に有意な変化を引き起こさなかった。
【0136】
実施例７：Ａ４３１／ＣＣＫＢＲ腫瘍を持つヌードマウスにおけるＲＡＤ００１と１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎとの併用処置に対する治療効果の評価
併用処置の治療効果を評価するために、図１０Ａに示すように、免疫不全のＡ４３１／ＣＣＫＢＲ腫瘍を持つヌードマウスの腫瘍成長および平均生存期間を、ＲＡＤ００１単独、または１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎと組み合わせて５または１０回の用量投与後に調べた。
併用処置の治療効果を評価するために、図１０Ａに示すように、免疫不全のＡ４３１／ＣＣＫＢＲ腫瘍を持つヌードマウスの腫瘍成長および平均生存期間を、ＲＡＤ００１単独、または１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎと組み合わせて５または１０回の用量投与後に調べた。
【0137】
動物治療研究
動物実験のために、ＣＣＫＢＲを過剰発現するヒト類表皮癌Ａ４３１細胞株が、以前に生成され、Ｌｕｉｇｉ Ａｌｏｊ博士の好意により提供された。Ａ４３１／ＣＣＫＢＲ細胞は、１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミンおよび抗生物質（０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、１００ＩＵペニシリン）を添加したＤＭＥＭ中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。腫瘍移植に先立ち、０．９％ＮａＣｌを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）０．１ｍＬ中のＡ４３１／ＣＣＫＢＲ細胞５×１０６個を、イソフルラン／酸素吸入で麻酔したＣＤ－１雌ヌードマウス（Charles Rivers社、ドイツ国）に皮下注射した。６日後、動物を実験群に無作為に振り分け、腫瘍サイズをキャリパーで非侵襲的に測定した。ＲＡＤ００１（３ｍｇ／ｋｇ）、またはＰＢＳ（対照）を、指示どおりに、毎日腹腔内注射で５日または１０日間投与した。１００μＬのＰＢＳ中のＨＰＬＣ精製６０ＭＢｑの１７７Ｌｕ－ＰＰＦ１１Ｎを静脈内注射し、一方、対照群には１００μＬのＰＢＳを注射した。腫瘍の直径およびマウスの体重を毎日記録した。腫瘍体積は、式Ｖ＝（Ｗ２×Ｌ）／２を用いて計算した。腫瘍体積が１．５ｃｍ３を超えたら、ヌードマウスを犠牲にした。さらに、すべての群に存在する体調不良のマウス（合計ｎ＝２）または潰瘍化した腫瘍を持つマウス（合計ｎ＝７）は、早期に犠牲にした。これらのマウスは解析から除外した。すべての実験は、スイスの動物保護法に従って行った。
動物実験のために、ＣＣＫＢＲを過剰発現するヒト類表皮癌Ａ４３１細胞株が、以前に生成され、Ｌｕｉｇｉ Ａｌｏｊ博士の好意により提供された。Ａ４３１／ＣＣＫＢＲ細胞は、１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミンおよび抗生物質（０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、１００ＩＵペニシリン）を添加したＤＭＥＭ中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。腫瘍移植に先立ち、０．９％ＮａＣｌを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）０．１ｍＬ中のＡ４３１／ＣＣＫＢＲ細胞５×１０６個を、イソフルラン／酸素吸入で麻酔したＣＤ－１雌ヌードマウス（Charles Rivers社、ドイツ国）に皮下注射した。６日後、動物を実験群に無作為に振り分け、腫瘍サイズをキャリパーで非侵襲的に測定した。ＲＡＤ００１（３ｍｇ／ｋｇ）、またはＰＢＳ（対照）を、指示どおりに、毎日腹腔内注射で５日または１０日間投与した。１００μＬのＰＢＳ中のＨＰＬＣ精製６０ＭＢｑの１７７Ｌｕ－ＰＰＦ１１Ｎを静脈内注射し、一方、対照群には１００μＬのＰＢＳを注射した。腫瘍の直径およびマウスの体重を毎日記録した。腫瘍体積は、式Ｖ＝（Ｗ２×Ｌ）／２を用いて計算した。腫瘍体積が１．５ｃｍ３を超えたら、ヌードマウスを犠牲にした。さらに、すべての群に存在する体調不良のマウス（合計ｎ＝２）または潰瘍化した腫瘍を持つマウス（合計ｎ＝７）は、早期に犠牲にした。これらのマウスは解析から除外した。すべての実験は、スイスの動物保護法に従って行った。
【0138】
この実験では、すべての統計解析にＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．００ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓを使用した。多重比較検定のためにＢｅｎｊａｍｉｎｉ、ＫｒｉｅｇｅｒおよびＹｅｋｕｔｉｅｌｉの２段階線形ステップアップ法（two-stage linear step-up procedure）を組み合わせた一元配置分散分析をすべての処置群に使用した。Ｌｏｇ－ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定を、処置群と対照群との生存曲線の違いを比較するために行った。エンドポイントは、生存曲線における死亡と定義した。Ｐ≦０．０５の値は、統計的に有意であるとみなした。
【0139】
結果
ＲＡＤ００１および１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎの両方の単独処置の他に、それらの組み合わせも腫瘍成長を有意に阻害した（図１０Ｂ）。すべてのマウスがすべての群でまだ存在する１３日目に、対照群の平均腫瘍体積は０．９７ｃｍ３に達した。１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎ、５、１０回の用量のＲＡＤ００１、および１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎと組み合わせた５または１０回の用量のＲＡＤ００１で処置したマウスの平均腫瘍サイズは、対照群と比較して有意に減少し（Ｐ＜０．０５）、それぞれ０．６３、０．３１、０．１１および０．１５または０．０８ｃｍ３に達した（図１１）。５回または１０回のＲＡＤ００１と１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎとで処置したマウスの腫瘍成長は、１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎの単剤療法と比較して有意に減少した。
ＲＡＤ００１および１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎの両方の単独処置の他に、それらの組み合わせも腫瘍成長を有意に阻害した（図１０Ｂ）。すべてのマウスがすべての群でまだ存在する１３日目に、対照群の平均腫瘍体積は０．９７ｃｍ３に達した。１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎ、５、１０回の用量のＲＡＤ００１、および１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎと組み合わせた５または１０回の用量のＲＡＤ００１で処置したマウスの平均腫瘍サイズは、対照群と比較して有意に減少し（Ｐ＜０．０５）、それぞれ０．６３、０．３１、０．１１および０．１５または０．０８ｃｍ３に達した（図１１）。５回または１０回のＲＡＤ００１と１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎとで処置したマウスの腫瘍成長は、１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎの単剤療法と比較して有意に減少した。
【0140】
２２日目、５または１０回の用量のＲＡＤ００１と１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎとで並行処置したマウスの平均腫瘍サイズは、それぞれＲＡＤ００１のみを５または１０回の用量で投与した群と比較して有意に縮小した。２５日目、１０回の用量のＲＡＤ００１と１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎとで並行処置したマウスの平均腫瘍サイズは、１０回の用量のＲＡＤ００１での単剤療法と比較して有意に縮小した。図１２のカプラン・マイヤー曲線に示すように、すべての処置が、対照群と比較して寿命を増加させた。
【0141】
対照群のメディアン生存期間は１９．５日であり、一方、１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎ、５または１０回の用量のＲＡＤ００１、１７７Ｌｕ－ＰＰ－Ｆ１１Ｎと組み合わせた５または１０回の用量のＲＡＤ００１で処置したマウスのメディアン生存期間は、以下の表１に示すように、それぞれ２８、２７、３２、３６および４３日に延長された。
【0142】
【表1】
【0143】
治療中、体重の一定の増加があり、対照群と処置マウス群との間に有意な差はなかった（データは示さず）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】