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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-04-14
(45)【発行日】2025-04-22
(54)【発明の名称】核酸測定方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/68 20180101AFI20250415BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20250415BHJP
G01N 21/64 20060101ALI20250415BHJP
G01N 30/88 20060101ALI20250415BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20250415BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/68 ZNA
C12Q1/6876 Z
G01N21/64 F
G01N30/88 D
G01N33/53 M
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2024547420
(86)(22)【出願日】2023-11-29
(86)【国際出願番号】 JP2023042669
(87)【国際公開番号】W WO2024117156
(87)【国際公開日】2024-06-06
【審査請求日】2024-08-09
(31)【優先権主張番号】P 2022191121
(32)【優先日】2022-11-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】390037327
【氏名又は名称】積水メディカル株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100161207
【弁理士】
【氏名又は名称】西澤 和純
(74)【代理人】
【識別番号】100152272
【弁理士】
【氏名又は名称】川越 雄一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100147267
【弁理士】
【氏名又は名称】大槻 真紀子
(74)【代理人】
【識別番号】100188592
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 洋
(72)【発明者】
【氏名】安倍 健滋
(72)【発明者】
【氏名】竹内 一博
(72)【発明者】
【氏名】井手野 晃
【審査官】太田 雄三
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１２－５０５６４４（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／０６８０８７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１３／１４０８９０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１５－０７３５２３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１２－１４７７０４（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／６８
Ｇ０１Ｎ ２１／００
Ｇ０１Ｎ ３０／００
Ｇ０１Ｎ ３３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
標的核酸を前記標的核酸の代謝物と区別して測定する核酸測定方法であって、光架橋性人工核酸を含む蛍光標識プローブを前記標的核酸とハイブリダイズさせて標的核酸－蛍光標識プローブ複合体を形成する工程、
前記標的核酸－蛍光標識プローブ複合体に紫外線を照射して前記標的核酸と前記蛍光標識プローブとの間に共有結合を形成させて標的核酸－蛍光標識プローブ結合体を形成する工程、及び
前記標的核酸－蛍光標識プローブ結合体を高速液体クロマトグラフィーで分析し、前記蛍光標識プローブが発する蛍光波長から前記標的核酸－蛍光標識プローブ結合体のピークを検出する工程
を備え、
前記蛍光標識プローブの鎖長が、５～８ｍｅｒであり、
前記蛍光標識プローブが２個以上の人工核酸を含む、核酸測定方法。
【請求項2】
前記人工核酸がロック核酸、５－メチルシチジル酸、及び２’－デオキシ－５－メチルシチジル酸からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の核酸測定方法。
【請求項3】
前記標的核酸が、ヒト、マウス、ラット、又はサルから採取した血液又は血漿である試料に含まれる、請求項１又は２に記載の核酸測定方法。
【請求項4】
前記標的核酸のピークエリア面積と前記標的核酸とは別の蛍光色素で検出した内部標準核酸のピークエリア面積から前記標的核酸の濃度を測定する、請求項１又は２に記載の核酸測定方法。
【請求項5】
前記光架橋性人工核酸がＣＮＶ－Ｋ又はＣＮＶ－Ｄである、請求項１又は２に記載の核酸測定方法。
【請求項6】
前記標的核酸は少なくとも１つのリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート修飾されている、請求項１又は２に記載の核酸測定方法。
【請求項7】
光架橋性人工核酸を含む蛍光標識プローブであって、前記蛍光標識プローブのオリゴヌクレオチド鎖長が５～８ｍｅｒであり、ＧＣ含量が４０％以上であり、かつロック核酸、５－メチルシチジル酸、及び２’－デオキシ－５－メチルシチジル酸からなる群から選択される少なくとも１種の人工核酸を２個以上含む、蛍光標識プローブ。
【請求項8】
前記光架橋性人工核酸がＣＮＶ－Ｋ又はＣＮＶ－Ｄである、請求項７に記載の蛍光標識プローブ。
【請求項9】
請求項７又は８に記載の蛍光標識プローブと標的核酸がハイブリダイズしてなる標的核酸－蛍光標識プローブ複合体。
【請求項10】
請求項７又は８に記載の蛍光標識プローブと標的核酸が共有結合してなる標的核酸－蛍光標識プローブ結合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、核酸測定方法に関する。
本願は、２０２２年１１月３０日に、日本に出願された特願２０２２－１９１１２１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本願は、２０２２年１１月３０日に、日本に出願された特願２０２２－１９１１２１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【0002】
オリゴ核酸を基本骨格とする核酸医薬品は、これまでの創薬手法では標的とするのが難しかった遺伝性疾患等に対する新しい創薬モダリティとして注目を集めている。
核酸医薬品とは一般に、核酸又は修飾核酸が十数～数十塩基連結したオリゴ核酸で構成され、タンパク質に翻訳されることなく直接生体に作用するもので、化学合成により製造される医薬品を指す。遺伝子治療用製品も核酸で構成されるが、タンパク質に翻訳されて作用する点、また、生物学的に製造される点で核酸医薬品とは異なる。
核酸医薬品は大きく分けて、ＲＮＡに作用するものとタンパク質に作用するものに大別できる。ＲＮＡに作用するものとしては、アンチセンスとｓｉＲＮＡがあり、これらがこれまで実用化された核酸医薬品の大部分を占める。タンパク質に作用するものには、アプタマーとＣｐＧオリゴがある。実用化されているアンチセンス医薬品の作用機序は大きく分けて二つのタイプがある。一つは、ＲＮａｓｅＨ依存的にＲＮＡの分解を誘導して標的遺伝子の発現を負に制御するもので、構造的には配列の両端に糖部修飾核酸を導入し、中央部には非修飾のＤＮＡを配したｇａｐｍｅｒと呼ばれるものである。もう一方は、スプライシング調節部位に結合することでスプライシングを制御するタイプである。これはＳＳＯ（ｓｐｌｉｃｅ－ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）と呼ばれ、エクソンスキップ又はエクソンインクルージョン等のメカニズムで標的遺伝子の発現を正又は負に制御する。
核酸医薬品の実用化には、生体内での安定化や標的ＲＮＡとの結合力の向上が重要であり、これまでに様々な修飾核酸技術が開発、応用されてきた。オリゴ核酸の分解は主として生体内のヌクレアーゼによる加水分解であるため、リン酸ジエステル結合のバックボーンの安定化が必要となる。臨床開発段階にあるアンチセンス医薬品のバックボーンの修飾としては、リン酸ジエステル部分のＯ原子をＳ原子に変換したホスホロチオエート修飾（ＰＳ修飾）が用いられている。ＰＳ修飾核酸においては、糖部への化学修飾も合わせて導入されることが多く、２’－Ｏ－メチル化ＲＮＡ（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル化ＲＮＡ（２’－ＭＯＥ）、２’－フッ素化ＲＮＡ（２’－Ｆ）などの２’位への置換基の導入や、構成するリボースの２’及び４’の炭素が架橋で修飾されたヌクレオチドであるＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ：ロック核酸）等の架橋型修飾が用いられる。もう一つの代表的な化学修飾として、リン酸ジエステル結合を電荷のないホスホロジアミデート結合に変換し、リボースの代わりにモルホリン環を導入したモルホリノ核酸も広く用いられている。現在、臨床開発されているアンチセンス医薬品は、全ての核酸にＰＳ修飾核酸を用いているＳ化オリゴ核酸か、全ての核酸にモルホリノ核酸を用いているモルホリノオリゴ核酸に大別される。
化学合成品である核酸医薬品の薬物動態プロファイルは、低分子医薬品における薬物動態の考え方及び試験方法に準じて評価されている。
核酸医薬品とは一般に、核酸又は修飾核酸が十数～数十塩基連結したオリゴ核酸で構成され、タンパク質に翻訳されることなく直接生体に作用するもので、化学合成により製造される医薬品を指す。遺伝子治療用製品も核酸で構成されるが、タンパク質に翻訳されて作用する点、また、生物学的に製造される点で核酸医薬品とは異なる。
核酸医薬品は大きく分けて、ＲＮＡに作用するものとタンパク質に作用するものに大別できる。ＲＮＡに作用するものとしては、アンチセンスとｓｉＲＮＡがあり、これらがこれまで実用化された核酸医薬品の大部分を占める。タンパク質に作用するものには、アプタマーとＣｐＧオリゴがある。実用化されているアンチセンス医薬品の作用機序は大きく分けて二つのタイプがある。一つは、ＲＮａｓｅＨ依存的にＲＮＡの分解を誘導して標的遺伝子の発現を負に制御するもので、構造的には配列の両端に糖部修飾核酸を導入し、中央部には非修飾のＤＮＡを配したｇａｐｍｅｒと呼ばれるものである。もう一方は、スプライシング調節部位に結合することでスプライシングを制御するタイプである。これはＳＳＯ（ｓｐｌｉｃｅ－ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）と呼ばれ、エクソンスキップ又はエクソンインクルージョン等のメカニズムで標的遺伝子の発現を正又は負に制御する。
核酸医薬品の実用化には、生体内での安定化や標的ＲＮＡとの結合力の向上が重要であり、これまでに様々な修飾核酸技術が開発、応用されてきた。オリゴ核酸の分解は主として生体内のヌクレアーゼによる加水分解であるため、リン酸ジエステル結合のバックボーンの安定化が必要となる。臨床開発段階にあるアンチセンス医薬品のバックボーンの修飾としては、リン酸ジエステル部分のＯ原子をＳ原子に変換したホスホロチオエート修飾（ＰＳ修飾）が用いられている。ＰＳ修飾核酸においては、糖部への化学修飾も合わせて導入されることが多く、２’－Ｏ－メチル化ＲＮＡ（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル化ＲＮＡ（２’－ＭＯＥ）、２’－フッ素化ＲＮＡ（２’－Ｆ）などの２’位への置換基の導入や、構成するリボースの２’及び４’の炭素が架橋で修飾されたヌクレオチドであるＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ：ロック核酸）等の架橋型修飾が用いられる。もう一つの代表的な化学修飾として、リン酸ジエステル結合を電荷のないホスホロジアミデート結合に変換し、リボースの代わりにモルホリン環を導入したモルホリノ核酸も広く用いられている。現在、臨床開発されているアンチセンス医薬品は、全ての核酸にＰＳ修飾核酸を用いているＳ化オリゴ核酸か、全ての核酸にモルホリノ核酸を用いているモルホリノオリゴ核酸に大別される。
化学合成品である核酸医薬品の薬物動態プロファイルは、低分子医薬品における薬物動態の考え方及び試験方法に準じて評価されている。
【0003】
特許文献１には、検出プローブの使用量を減らしても検出感度（Ｓ／Ｎ比）を低下させずに標的核酸を高感度に検出できる標的核酸の検出方法として、標的核酸とハイブリダイズする検出プローブ及び支持体に固定された捕捉プローブとを用いるサンドイッチハイブリダイゼーション法による標的核酸の検出方法であって検出プローブ及び／又は捕捉プローブの核酸分子中の少なくとも一つの核酸塩基が光反応性基に置換されており標的核酸と検出プローブ及び／又は捕捉プローブとがハイブリダイズして形成された複合体に光照射して光反応性基と標的核酸中の核酸塩基との間で共有結合を形成させる工程を有する検出方法が記載されている。
【0004】
特許文献２には、光応答性核酸類を含むプローブを使用した標的核酸との光連結が停滞してしまうという問題を克服し光連結効率を向上させる方法として、核酸サンプル中に存在する標的部位と該標的部位に対して相補的な配列を有し光応答性核酸類を含む第一のプローブとを反応溶液中でハイブリダイゼーションし光照射することにより光連結させる方法であって該第一のプローブ内の該光応答性核酸類に起因する自己会合を抑制させることを特徴とする光連結方法が記載されている。
【0005】
特許文献３には、細胞内の高次構造ＲＮＡ中の検出困難な部位にある塩基配列を検出するための手段として、光架橋性人工核酸プローブをＲＮＡ分子中の標的塩基配列と二重鎖形成させて光架橋する方法であって、光架橋性人工核酸プローブとＲＮＡ分子中の標的塩基配列の二重鎖形成と同時に又は二重鎖形成に先立って光架橋性人工核酸アシストプローブをＲＮＡ分子と二重鎖形成させて光架橋する工程を含む方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【文献】国際公開第２０１４／０３４７５３号
【文献】国際公開第２０１４／０１４１０６号
【文献】特開２０２２－０３９５２６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ，Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）は、定性・定量を行うために利用されるもっともポピュラーな分析手法のひとつである。ＨＰＬＣは試料に含まれる複数の溶質成分を迅速かつ同時に定性・定量が可能で、高精度の装置群により構成されるため分析値の再現性にも優れている。また、ＨＰＬＣに注入する試料量は数μＬオーダー程度から測定が可能で、ＨＰＬＣの装置の構成やパラメーターを分析者の目的に応じて選定可能なため、幅広い試料適用性を得られる。このような特長から、世界中のあらゆる科学分野や産業の基盤を支える科学技術としてその地位を確立している。
しかし、オリゴ核酸を基本骨格とする核酸医薬品の薬物動態特性解析においては、核酸医薬品である標的核酸をその代謝物と区別して測定する必要があるところ、ＨＰＬＣの分離性能をもってしても標的核酸とその代謝物を区別して精度よく測定することが困難な場合があった。
しかし、オリゴ核酸を基本骨格とする核酸医薬品の薬物動態特性解析においては、核酸医薬品である標的核酸をその代謝物と区別して測定する必要があるところ、ＨＰＬＣの分離性能をもってしても標的核酸とその代謝物を区別して精度よく測定することが困難な場合があった。
【0008】
本発明は、高速液体クロマトグラフィーを用いて標的核酸をその代謝物と区別して精度よく測定することができる核酸測定方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明は以下の態様を含む。
［１］ 標的核酸を前記標的核酸の代謝物と区別して測定する核酸測定方法であって、 光架橋性人工核酸を含む蛍光標識プローブを前記標的核酸とハイブリダイズさせて標的核酸－蛍光標識プローブ複合体を形成する工程、
前記標的核酸－蛍光標識プローブ複合体に紫外線を照射して前記標的核酸と前記蛍光標識プローブとの間に共有結合を形成させて標的核酸－蛍光標識プローブ結合体を形成する工程、及び
前記標的核酸－蛍光標識プローブ結合体を高速液体クロマトグラフィーで分析し、前記蛍光標識プローブが発する蛍光波長から前記標的核酸－蛍光標識プローブ結合体のピークを検出する工程
を備える核酸測定方法。
［２］ 前記蛍光標識プローブの鎖長が４～１１ｍｅｒである、［１］に記載の核酸測定方法。
［３］ 前記蛍光標識プローブが２個以上の人工核酸を含む、［１］又は［２］に記載の核酸測定方法。
［４］ 前記人工核酸がロック核酸、５－メチルシチジル酸、及び２’－デオキシ－５－メチルシチジル酸からなる群から選択される少なくとも１種である、［３］に記載の核酸測定方法。
［５］ 前記標的核酸が、ヒト、マウス、ラット、又はサルから採取した血液又は血漿である試料に含まれる、［１］～［４］のいずれかに記載の核酸測定方法。
［６］ 前記標的核酸のピークエリア面積と前記標的核酸とは別の蛍光色素で検出した内部標準核酸のピークエリア面積から前記標的核酸の濃度を測定する、［１］～［５］のいずれかに記載の核酸測定方法。
［７］ 前記光架橋性人工核酸がＣＮＶ－Ｋ又はＣＮＶ－Ｄである、［１］～［６］のいずれかに記載の核酸測定方法。
［８］ 前記標的核酸は少なくとも１つのリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート修飾されている、［１］～［７］のいずれかに記載の核酸測定方法。
［９］ 光架橋性人工核酸を含む蛍光標識プローブであって、
前記蛍光標識プローブのオリゴヌクレオチド鎖長が４～１１ｍｅｒであり、ＧＣ含量が４０％以上であり、かつロック核酸、５－メチルシチジル酸、及び２’－デオキシ－５－メチルシチジル酸からなる群から選択される少なくとも１種の人工核酸を２個以上含む、蛍光標識プローブ。
［１０］ 前記光架橋性人工核酸がＣＮＶ－Ｋ又はＣＮＶ－Ｄである、［９］に記載の蛍光標識プローブ。
［１１］ ［９］又は［１０］に記載の蛍光標識プローブと標的核酸がハイブリダイズしてなる標的核酸－蛍光標識プローブ複合体。
［１２］ ［９］又は［１０］に記載の蛍光標識プローブと標的核酸が共有結合してなる標的核酸－蛍光標識プローブ結合体。
［１］ 標的核酸を前記標的核酸の代謝物と区別して測定する核酸測定方法であって、 光架橋性人工核酸を含む蛍光標識プローブを前記標的核酸とハイブリダイズさせて標的核酸－蛍光標識プローブ複合体を形成する工程、
前記標的核酸－蛍光標識プローブ複合体に紫外線を照射して前記標的核酸と前記蛍光標識プローブとの間に共有結合を形成させて標的核酸－蛍光標識プローブ結合体を形成する工程、及び
前記標的核酸－蛍光標識プローブ結合体を高速液体クロマトグラフィーで分析し、前記蛍光標識プローブが発する蛍光波長から前記標的核酸－蛍光標識プローブ結合体のピークを検出する工程
を備える核酸測定方法。
［２］ 前記蛍光標識プローブの鎖長が４～１１ｍｅｒである、［１］に記載の核酸測定方法。
［３］ 前記蛍光標識プローブが２個以上の人工核酸を含む、［１］又は［２］に記載の核酸測定方法。
［４］ 前記人工核酸がロック核酸、５－メチルシチジル酸、及び２’－デオキシ－５－メチルシチジル酸からなる群から選択される少なくとも１種である、［３］に記載の核酸測定方法。
［５］ 前記標的核酸が、ヒト、マウス、ラット、又はサルから採取した血液又は血漿である試料に含まれる、［１］～［４］のいずれかに記載の核酸測定方法。
［６］ 前記標的核酸のピークエリア面積と前記標的核酸とは別の蛍光色素で検出した内部標準核酸のピークエリア面積から前記標的核酸の濃度を測定する、［１］～［５］のいずれかに記載の核酸測定方法。
［７］ 前記光架橋性人工核酸がＣＮＶ－Ｋ又はＣＮＶ－Ｄである、［１］～［６］のいずれかに記載の核酸測定方法。
［８］ 前記標的核酸は少なくとも１つのリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート修飾されている、［１］～［７］のいずれかに記載の核酸測定方法。
［９］ 光架橋性人工核酸を含む蛍光標識プローブであって、
前記蛍光標識プローブのオリゴヌクレオチド鎖長が４～１１ｍｅｒであり、ＧＣ含量が４０％以上であり、かつロック核酸、５－メチルシチジル酸、及び２’－デオキシ－５－メチルシチジル酸からなる群から選択される少なくとも１種の人工核酸を２個以上含む、蛍光標識プローブ。
［１０］ 前記光架橋性人工核酸がＣＮＶ－Ｋ又はＣＮＶ－Ｄである、［９］に記載の蛍光標識プローブ。
［１１］ ［９］又は［１０］に記載の蛍光標識プローブと標的核酸がハイブリダイズしてなる標的核酸－蛍光標識プローブ複合体。
［１２］ ［９］又は［１０］に記載の蛍光標識プローブと標的核酸が共有結合してなる標的核酸－蛍光標識プローブ結合体。
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、高速液体クロマトグラフィーを用いて標的核酸をその代謝物と区別して精度よく測定することができる核酸測定方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【発明を実施するための形態】
【0012】
本明細書及び特許請求の範囲において「～」を用いて数値範囲を表す場合、その数値範囲は「～」の両側の数値を含むものとする。
【0013】
［核酸測定方法］
本発明の核酸測定方法は、標的核酸を前記標的核酸の代謝物と区別して測定する核酸測定方法であり、複合体形成工程、結合体形成工程、及び以下の工程を備える。
本発明の核酸測定方法は、標的核酸を前記標的核酸の代謝物と区別して測定する核酸測定方法であり、複合体形成工程、結合体形成工程、及び以下の工程を備える。
【0014】
〈複合体形成工程〉
複合体形成工程は、光架橋性人工核酸を含む蛍光標識プローブを標的核酸とハイブリダイズさせて標的核酸－蛍光標識プローブ複合体を形成する工程である。
複合体形成工程は、光架橋性人工核酸を含む蛍光標識プローブを標的核酸とハイブリダイズさせて標的核酸－蛍光標識プローブ複合体を形成する工程である。
【0015】
（標的核酸）
標的核酸は本発明によって測定しようとする核酸である。
前記標的核酸は、例えばオリゴ核酸を基本骨格とする核酸医薬品であり得る。
前記標的核酸の基本骨格であるオリゴ核酸は、リン酸ジエステル部分のＯ原子をＳ原子に置換するホスホロチオエート修飾が１箇所以上されていてもよい。
また、前記標的核酸の基本骨格であるオリゴ核酸は、リボース又はデオキシリボースの２’－Ｏ－メチル化、２’－Ｏ－メトキシエチル化、２’－フッ素化などの２’位への置換基の導入がされていてもよい。
また、前記標的核酸の基本骨格であるオリゴ核酸は、ロック核酸（ＬＮＡ，Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等の架橋型修飾を含んでいてもよい。
また、前記標的核酸の基本骨格であるオリゴ核酸は、リン酸ジエステル結合を電荷のないホスホロジアミデート結合に変換し、デオキシリボース又はリボースの代わりにモルホリン環を導入したモルホリノ核酸を含んでいてもよい。
標的核酸は本発明によって測定しようとする核酸である。
前記標的核酸は、例えばオリゴ核酸を基本骨格とする核酸医薬品であり得る。
前記標的核酸の基本骨格であるオリゴ核酸は、リン酸ジエステル部分のＯ原子をＳ原子に置換するホスホロチオエート修飾が１箇所以上されていてもよい。
また、前記標的核酸の基本骨格であるオリゴ核酸は、リボース又はデオキシリボースの２’－Ｏ－メチル化、２’－Ｏ－メトキシエチル化、２’－フッ素化などの２’位への置換基の導入がされていてもよい。
また、前記標的核酸の基本骨格であるオリゴ核酸は、ロック核酸（ＬＮＡ，Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等の架橋型修飾を含んでいてもよい。
また、前記標的核酸の基本骨格であるオリゴ核酸は、リン酸ジエステル結合を電荷のないホスホロジアミデート結合に変換し、デオキシリボース又はリボースの代わりにモルホリン環を導入したモルホリノ核酸を含んでいてもよい。
【0016】
前記標的核酸は、ヒト、マウス、ラット、又はサルから採取した血液又は血漿である試料に含まれることが好ましい。
【0017】
前記標的核酸の鎖長は、その用途等によって適宜選択することができ、特に限定されないが、１０～１５０ｍｅｒが好ましく、１０～５０ｍｅｒがより好ましく、１０～２０ｍｅｒがさらに好ましい。
【0018】
このような核酸医薬品の非限定的な例としては、Ｖｉｔｒａｖｅｎｅ（商品名，登録商標；一般名 ｆｏｍｉｖｉｒｓｅｎ）、Ｍａｃｕｇｅｎ（商品名，登録商標；一般名 ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ）、Ｋｙｎａｍｒｏ（商品名，登録商標；一般名 ｍｉｐｏｍｅｒｓｅｎ）、Ｅｘｏｎｄｙｓ ５１（商品名，登録商標；一般名 ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎ）、Ｓｐｉｎｒａｚａ（商品名，登録商標；一般名 ｎｕｓｉｎｅｒｓｅｎ）、ＨＥＰＬＩＳＡＶ－Ｂ（商品名，登録商標；一般名 ＣｐＧ１０１８）、Ｔｅｇｓｅｄｉ（商品名，登録商標；一般名 ｉｎｏｔｅｒｓｅｎ）、Ｏｎｐａｔｔｒｏ（商品名，登録商標；一般名 ｐａｔｉｓｉｒａｎ）、Ｗａｙｌｉｖｒａ（商品名，登録商標；一般名 ｖｏｌａｎｅｓｏｒｓｅｎ）、Ｇｉｖｌａａｒｉ（商品名，登録商標；一般名 ｇｉｖｏｓｉｒａｎ）、Ｖｙｏｎｄｙｓ ５３（商品名，登録商標；一般名 ｇｏｌｏｄｉｒｓｅｎ）、Ｖｉｌｔｅｐｓｏ（商品名，登録商標；一般名 ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）、及びＯｘｌｕｍｏ（商品名，登録商標；一般名 ｌｕｍａｓｉｒａｎ）が挙げられる。
【0019】
（蛍光標識プローブ）
蛍光標識プローブは上述した標的核酸とハイブリダイズして複合体を形成することができ、かつ、光架橋性人工核酸を含む。
蛍光標識プローブは上述した標的核酸とハイブリダイズして複合体を形成することができ、かつ、光架橋性人工核酸を含む。
【0020】
前記蛍光標識プローブの塩基配列は前記標的核酸の塩基配列の少なくとも一部と相補的である。前記蛍光標識プローブは前記標的核酸の５’側又は３’側にハイブリダイズすることが好ましい。
前記蛍光標識プローブとしては、前記標的核酸の５’側にハイブリダイズするものと、３’側にハイブリダイズするものとを併用することが好ましい。
前記蛍光標識プローブとしては、前記標的核酸の５’側にハイブリダイズするものと、３’側にハイブリダイズするものとを併用することが好ましい。
【0021】
前記蛍光標識プローブの標識に用いる蛍光色素は、特に限定されず、従来オリゴ核酸の標識に用いられているものから適宜選択すればよい。前記蛍光標識プローブとしては、前記標的核酸の５’側にハイブリダイズするものと、３’側にハイブリダイズするものとを併用する場合、蛍光色が異なる組合せとすることが好ましい。
前記蛍光色素の非限定的な例としては、ＤｙＬｉｇｈｔ ４０５（励起波長４００ｎｍ，蛍光波長４２０ｎｍ）、ＤＹ－４０５（励起波長４００，蛍光波長４２０ｎｍ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５（励起波長４０１ｎｍ，蛍光波長４２１ｎｍ）、ＡＭＣＡ（励起波長３５３ｎｍ，蛍光波長４４０ｎｍ）、ＡＭＣＡ－Ｘ（励起波長３４７ｎｍ，蛍光波長４４７ｎｍ）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（励起波長４０５ｎｍ，蛍光波長４５５ｎｍ）、ＤＹ－４１５（励起波長４１８ｎｍ，蛍光波長４６７ｎｍ）、Ｒｏｙａｌ Ｂｌｕｅ（励起波長４２６ｎｍ，蛍光波長４８０ｎｍ）、ＡＴＴＯ ４２５（励起波長４３６ｎｍ，蛍光波長４８４ｎｍ）、Ｃｙ２（励起波長４８９ｎｍ，蛍光波長５０５ｎｍ）、ＡＴＴＯ ４６５（励起波長４５３ｎｍ，蛍光波長５０８ｎｍ）、ＤＹ－４７５ＸＬ（励起波長４９２ｎｍ，蛍光波長５０９ｎｍ）、ＮｏｒｔｈｅｒｎＬｉｇｈｔｓ ４９３（励起波長４９３ｎｍ，蛍光波長５１４ｎｍ）、ＤＹ－４９０（励起波長４９０ｎｍ，蛍光波長５１６ｎｍ）、ＤｙＬｉｇｈｔ ４８８（励起波長４９３ｎｍ，蛍光波長５１８ｎｍ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（励起波長４９５ｎｍ，蛍光波長５１９ｎｍ）、５－ＦＩＴＣ（励起波長４９４ｎｍ，蛍光波長５１９ｎｍ）、５－ＦＡＭ（励起波長４９５ｎｍ，蛍光波長５２０ｎｍ）、ＤＹ－４９５－Ｘ５（励起波長４９５ｎｍ，蛍光波長５２０ｎｍ）、ＤＹ－４９５（励起波長４９３ｎｍ，蛍光波長５２１ｎｍ）、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（励起波長４９４ｎｍ，蛍光波長５２１ｎｍ）、ＦＩＴＣ（励起波長４９８ｎｍ，蛍光波長５２２ｎｍ）、ＡＴＴＯ ４８８（励起波長５０１ｎｍ，蛍光波長５２３ｎｍ）、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｏｕｒ ４８８（励起波長４９９ｎｍ，蛍光波長５２３ｎｍ）、ＭＦＰ４８８（励起波長５０１ｎｍ，蛍光波長５２３ｎｍ）、ＡＴＴＯ ４９５（励起波長４９５ｎｍ，蛍光波長５２７ｎｍ）、Ｏｙｓｔｅｒ ５００（励起波長５０５ ５３０ｎｍ）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｇｒｅｅｎ ４９７ ５３８ｎｍ）、ＡＴＴＯ ５２０（励起波長５２５ｎｍ，蛍光波長５４５ｎｍ）、ＡＴＴＯ ５３２（励起波長５３２ｎｍ，蛍光波長５５３ｎｍ）、ＤＹ－５００ＸＬ（励起波長５０５ｎｍ，蛍光波長５５５ｎｍ）、ＤＹ－４８５ＸＬ（励起波長４８５ｎｍ，蛍光波長５６０ｎｍ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５（励起波長５５５ｎｍ，蛍光波長５６５ｎｍ）、ＨｉＬｙｔｅ Ｐｌｕｓ ５５５（励起波長５５２ｎｍ，蛍光波長５６７ｎｍ）、ＤｙＬｉｇｈｔ ５４９（励起波長５５０ｎｍ，蛍光波長５６８ｎｍ）、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ５５５（励起波長５５３ｎｍ，蛍光波長５６８ｎｍ）、Ｃｙ３（励起波長５５０ｎｍ，蛍光波長５７０ｎｍ）、ＤｙＬｉｇｈｔ ５４７（励起波長５５７ｎｍ，蛍光波長５７０ｎｍ）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（励起波長５５０ｎｍ，蛍光波長５７０ｎｍ）、ＴＲＩＴＣ（励起波長５５０ｎｍ，蛍光波長５７０ｎｍ）、ＤＹ－５４８（励起波長５５８ｎｍ，蛍光波長５７２ｎｍ）、ＤＹ－５５４（励起波長５５１ｎｍ，蛍光波長５７２ｎｍ）、ＤＹ－５５５（励起波長５４７ｎｍ，蛍光波長５７２ｎｍ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６（励起波長５５６ｎｍ，蛍光波長ｎｍ，蛍光波長５７３ｎｍ）、ＤＹ－５５６（励起波長５４８ｎｍ，蛍光波長５７３ｎｍ）、ＮｏｒｔｈｅｒｎＬｉｇｈｔｓ ５５７（励起波長５５７ｎｍ，蛍光波長５７４ｎｍ）、Ｏｙｓｔｅｒ ５５０（励起波長５５５ｎｍ，蛍光波長５７４ｎｍ）、５－ＴＡＭＲＡｎｍ，蛍光波長５４７（励起波長５７４ｎｍ）、ＤＹ－５０５－Ｘ５（励起波長５０５ｎｍ，蛍光波長５７４ｎｍ）、ＤＹ－５４７（励起波長５５７ｎｍ，蛍光波長５７４ｎｍ）、Ｏｙｓｔｅｒ ５５６（励起波長５６２ｎｍ，蛍光波長５７５ｎｍ）、ＤＹ－５４９（励起波長５６０ｎｍ，蛍光波長５７５ｎｍ）、ＡＴＴＯ ５５０（励起波長５５４ｎｍ，蛍光波長５７６ｎｍ）、ＰＥ（励起波長４８８ｎｍ，蛍光波長５７８ｎｍ）、Ｂ－ＰＥ（励起波長５４５ｎｍ，蛍光波長５７８ｎｍ）、Ｒ－ＰＥ（励起波長５６６ｎｍ，蛍光波長５７８ｎｍ）、ＤＹ－５６０（励起波長５５９ｎｍ，蛍光波長５７８ｎｍ）、ＴＡＭＲＡ（励起波長５５５ｎｍ，蛍光波長５８０ｎｍ）、ＭＦＰ５５５（励起波長５６０ｎｍ，蛍光波長５８５ｎｍ）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｏｒａｎｇｅ（励起波長５５９ｎｍ，蛍光波長５８８ｎｍ）、ＤＹ－５１０ＸＬ（励起波長５０９ｎｍ，蛍光波長５９０ｎｍ）、ＡＴＴＯ ５６５（励起波長５６３ｎｍ，蛍光波長５９２ｎｍ）、Ｃｙ３．５（励起波長５８１ｎｍ，蛍光波長５９６ｎｍ）、ＲＯＸ（Ｘ－Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ，Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ Ｘ）（励起波長５８７ｎｍ，蛍光波長５９９ｎｍ）、ＤＹ－５９０（励起波長５８０ｎｍ，蛍光波長５９９ｎｍ）、５－ＲＯＸ（励起波長５７３ｎｍ，蛍光波長６０２ｎｍ）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｒｅｄ（励起波長５８７ｎｍ，蛍光波長６１２ｎｍ）、ＥＣＤ（励起波長４８８ｎｍ，蛍光波長６１３ｎｍ）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（励起波長５９６ｎｍ，蛍光波長６１５ｎｍ）、ＤｙＬｉｇｈｔ ５９４（励起波長５９３ｎｍ，蛍光波長６１８ｎｍ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４（励起波長５９０ｎｍ，蛍光波長６１９ｎｍ）、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ＴＲ（励起波長５９１ｎｍ，蛍光波長６２２ｎｍ）、ＡＴＴＯ ５９０（励起波長５９４ｎｍ，蛍光波長６２４ｎｍ）、ＭＦＰ５９０（励起波長５９７ｎｍ，蛍光波長６２４ｎｍ）、ＤＹ－６１０（励起波長６１０ｎｍ，蛍光波長６３０ｎｍ）、ＤＹ－４８０ＸＬ（励起波長５００ｎｍ，蛍光波長６３０ｎｍ）、ＡＴＴＯ ６１０（励起波長６１５ｎｍ，蛍光波長６３４ｎｍ）、ＤＹ－６１５（励起波長６２１ｎｍ，蛍光波長６４１ｎｍ）、Ｃ－ＰＣ（Ｃ－Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）（励起波長６１６ｎｍ，蛍光波長６４７ｎｍ）、ＡＴＴＯ ６２０（励起波長６１９ｎｍ，蛍光波長６４３ｎｍ）、Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（励起波長６２０ｎｍ，蛍光波長６５０ｎｍ）、ＤＹ－４８１ＸＬ（励起波長５１５ｎｍ，蛍光波長６５０ｎｍ）、ＡＴＴＯ ６３３（励起波長６２９ｎｍ，蛍光波長６５７ｎｍ）、ＤＹ－６３０（励起波長６３６ｎｍ，蛍光波長６５７ｎｍ）、ＤＹ－６３２（励起波長６３７ｎｍ，蛍光波長６５７ｎｍ）、ＤＹ－６３３（励起波長６３７ｎｍ，蛍光波長６５７ｎｍ）、ＭＦＰ６３１（励起波長６３３ｎｍ，蛍光波長６５８ｎｍ）、ＤｙＬｉｇｈｔ ６３３（励起波長６３８ｎｍ，蛍光波長６５８ｎｍ）、ＮｏｒｔｈｅｒｎＬｉｇｈｔｓ ６３７（励起波長６３７ｎｍ，蛍光波長６５８ｎｍ）、ＤＹ－６３１（励起波長６３７ｎｍ，蛍光波長６５８ｎｍ）、ＤＹ－６３４（励起波長６３５ｎｍ，蛍光波長６５８ｎｍ）、ＡＰＣ（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）（励起波長６５０ｎｍ，蛍光波長６６０ｎｍ）、ＡＰＣ－ＸＬ（励起波長６５０ｎｍ，蛍光波長６６２ｎｍ）、ＤＹ－５２０ＸＬ（励起波長５２０ｎｍ，蛍光波長６６４ｎｍ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（励起波長６５０ｎｍ，蛍光波長６６５ｎｍ）、Ｃｙ５（励起波長６４３ｎｍ，蛍光波長６６７ｎｍ）、ＤＹ－５２１ＸＬ（励起波長５２３ｎｍ，蛍光波長６６８ｎｍ）、Ｏｙｓｔｅｒ ６４５（励起波長６５０ｎｍ，蛍光波長６６９ｎｍ）、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｒｅｄ（励起波長４８８ｎｍ，蛍光波長６７０ｎｍ）、Ｔｒｉ－Ｃｏｌｏｒ（励起波長４８８ｎｍ，蛍光波長６７０ｎｍ）、ＤＹ－６３５（励起波長６４７ｎｍ，蛍光波長６７１ｎｍ）、ＤＹ－６３６（励起波長６４５ｎｍ，蛍光波長６７１ｎｍ）、ＤＹ－６４７（励起波長６５３ｎｍ，蛍光波長６７２ｎｍ）、ＤｙＬｉｇｈｔ ６４７（励起波長６５２ｎｍ，蛍光波長６７３ｎｍ）、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ６４７（励起波長６５３ｎｍ，蛍光波長６７３ｎｍ）、ＤｙＬｉｇｈｔ ６４９（励起波長６４６ｎｍ，蛍光波長６７４ｎｍ）、ＨｉＬｙｔｅ Ｐｌｕｓ ６４７（励起波長６４９ｎｍ，蛍光波長ｎｍ，蛍光波長６７４ｎｍ）、Ｏｙｓｔｅｒ ６５０（励起波長６５５ｎｍ，蛍光波長６７４ｎｍ）、ＤＹ－６４８（励起波長６５３ｎｍ，蛍光波長６７４ｎｍ）、ＤＹ－６５０（励起波長６５３ｎｍ，蛍光波長６７４ｎｍ）、ＰｅｒＣＰ（励起波長４８８ｎｍ，蛍光波長６７５ｎｍ）、ＤＹ－６５２（励起波長６５４ｎｍ，蛍光波長６７５ｎｍ）、ＤＹ－６４９（励起波長６５５ｎｍ，蛍光波長６７６ｎｍ）、ＤＹ－６５１（励起波長６５６ｎｍ，蛍光波長６７８ｎｍ）、Ｏｙｓｔｅｒ ６５６（励起波長６６２ｎｍ，蛍光波長６７９ｎｍ）、ＡＴＴＯ ６５５（励起波長６６３ｎｍ，蛍光波長６８４ｎｍ）、Ｃｙ５．５（励起波長６７５ｎｍ，蛍光波長６９４ｎｍ）、ＤＹ－６７７（励起波長６７３ｎｍ，蛍光波長６９４ｎｍ）、ＤＹ－６７８（励起波長６７４ｎｍ，蛍光波長６９８ｎｍ）、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ６８０（励起波長６７８ｎｍ，蛍光波長６９９ｎｍ）、ＤＹ－６７５（励起波長６７４ｎｍ，蛍光波長６９９ｎｍ）、ＤＹ－６７６（励起波長６７４ｎｍ，蛍光波長６９９ｎｍ）、ＩＲＤｙｅ７００ＤＸ（励起波長６８９ｎｍ，蛍光波長７００ｎｍ）、ＤＹ－６８１（励起波長６９１ｎｍ，蛍光波長７０８ｎｍ）、ＤＹ－６８０（励起波長６９０ｎｍ，蛍光波長７０９ｎｍ）、ＤＹ－６８２（励起波長６９０ｎｍ，蛍光波長７０９ｎｍ）、ＤｙＬｉｇｈｔ ６８０（励起波長６８２ｎｍ，蛍光波長７１５ｎｍ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００（励起波長７０２ｎｍ，蛍光波長７２３ｎｍ）、ＤＹ－７００（励起波長７０７ｎｍ，蛍光波長７３０ｎｍ）、ＤＹ－７０１（励起波長７０６ｎｍ，蛍光波長７３１ｎｍ）、ＰＲＥＸ７１０（励起波長７１０ｎｍ，蛍光波長７４０ｎｍ）、ＤＹ－７３０（励起波長７３２ｎｍ，蛍光波長７５８ｎｍ）、ＤＹ－７３２（励起波長７３６ｎｍ，蛍光波長７５９ｎｍ）、ＤＹ－７３４（励起波長７３６ｎｍ，蛍光波長７５９ｎｍ）、ＤＹ－７３１（励起波長７３６ｎｍ，蛍光波長７６０ｎｍ）、ＤＹ－７５２（励起波長７４８ｎｍ，蛍光波長７７２ｎｍ）、ＤＹ－７５０（励起波長７４７ｎｍ，蛍光波長７７６ｎｍ）、ＤｙＬｉｇｈｔ ７５０（励起波長７５２ｎｍ，蛍光波長７７８ｎｍ）、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ７５０（励起波長７５４ｎｍ，蛍光波長７７８ｎｍ）、ＤＹ－７４９（励起波長７５２ｎｍ，蛍光波長７７８ｎｍ）、ＨｉＬｙｔｅ Ｐｌｕｓ ７５０（励起波長７５１ｎｍ，蛍光波長ｎｍ，蛍光波長７７９ｎｍ）、ＤＹ－７５１（励起波長７５１ｎｍ，蛍光波長７７９ｎｍ）、ＤｙＬｉｇｈｔ ８００（励起波長７７０ｎｍ，蛍光波長７９４ｎｍ）、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ（励起波長７７４ｎｍ，蛍光波長８００ｎｍ）、ＤＹ－７８０（励起波長７８２ｎｍ，蛍光波長８００ｎｍ）、ＤＹ－７８１（励起波長７８３ｎｍ，蛍光波長８００ｎｍ）、ＤＹ－７８２（励起波長７８４ｎｍ，蛍光波長８００ｎｍ）、ＤＹ－７７６（励起波長７７１ｎｍ，蛍光波長８０１ｎｍ）、ＤＹ－７７７（励起波長７７１ｎｍ，蛍光波長８０１ｎｍ）、及びＩＲＤｙｅ８００（励起波長７７８ｎｍ，蛍光波長８０６ｎｍ）が挙げられる。
前記蛍光色素の非限定的な例としては、ＤｙＬｉｇｈｔ ４０５（励起波長４００ｎｍ，蛍光波長４２０ｎｍ）、ＤＹ－４０５（励起波長４００，蛍光波長４２０ｎｍ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５（励起波長４０１ｎｍ，蛍光波長４２１ｎｍ）、ＡＭＣＡ（励起波長３５３ｎｍ，蛍光波長４４０ｎｍ）、ＡＭＣＡ－Ｘ（励起波長３４７ｎｍ，蛍光波長４４７ｎｍ）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（励起波長４０５ｎｍ，蛍光波長４５５ｎｍ）、ＤＹ－４１５（励起波長４１８ｎｍ，蛍光波長４６７ｎｍ）、Ｒｏｙａｌ Ｂｌｕｅ（励起波長４２６ｎｍ，蛍光波長４８０ｎｍ）、ＡＴＴＯ ４２５（励起波長４３６ｎｍ，蛍光波長４８４ｎｍ）、Ｃｙ２（励起波長４８９ｎｍ，蛍光波長５０５ｎｍ）、ＡＴＴＯ ４６５（励起波長４５３ｎｍ，蛍光波長５０８ｎｍ）、ＤＹ－４７５ＸＬ（励起波長４９２ｎｍ，蛍光波長５０９ｎｍ）、ＮｏｒｔｈｅｒｎＬｉｇｈｔｓ ４９３（励起波長４９３ｎｍ，蛍光波長５１４ｎｍ）、ＤＹ－４９０（励起波長４９０ｎｍ，蛍光波長５１６ｎｍ）、ＤｙＬｉｇｈｔ ４８８（励起波長４９３ｎｍ，蛍光波長５１８ｎｍ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（励起波長４９５ｎｍ，蛍光波長５１９ｎｍ）、５－ＦＩＴＣ（励起波長４９４ｎｍ，蛍光波長５１９ｎｍ）、５－ＦＡＭ（励起波長４９５ｎｍ，蛍光波長５２０ｎｍ）、ＤＹ－４９５－Ｘ５（励起波長４９５ｎｍ，蛍光波長５２０ｎｍ）、ＤＹ－４９５（励起波長４９３ｎｍ，蛍光波長５２１ｎｍ）、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（励起波長４９４ｎｍ，蛍光波長５２１ｎｍ）、ＦＩＴＣ（励起波長４９８ｎｍ，蛍光波長５２２ｎｍ）、ＡＴＴＯ ４８８（励起波長５０１ｎｍ，蛍光波長５２３ｎｍ）、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｏｕｒ ４８８（励起波長４９９ｎｍ，蛍光波長５２３ｎｍ）、ＭＦＰ４８８（励起波長５０１ｎｍ，蛍光波長５２３ｎｍ）、ＡＴＴＯ ４９５（励起波長４９５ｎｍ，蛍光波長５２７ｎｍ）、Ｏｙｓｔｅｒ ５００（励起波長５０５ ５３０ｎｍ）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｇｒｅｅｎ ４９７ ５３８ｎｍ）、ＡＴＴＯ ５２０（励起波長５２５ｎｍ，蛍光波長５４５ｎｍ）、ＡＴＴＯ ５３２（励起波長５３２ｎｍ，蛍光波長５５３ｎｍ）、ＤＹ－５００ＸＬ（励起波長５０５ｎｍ，蛍光波長５５５ｎｍ）、ＤＹ－４８５ＸＬ（励起波長４８５ｎｍ，蛍光波長５６０ｎｍ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５（励起波長５５５ｎｍ，蛍光波長５６５ｎｍ）、ＨｉＬｙｔｅ Ｐｌｕｓ ５５５（励起波長５５２ｎｍ，蛍光波長５６７ｎｍ）、ＤｙＬｉｇｈｔ ５４９（励起波長５５０ｎｍ，蛍光波長５６８ｎｍ）、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ５５５（励起波長５５３ｎｍ，蛍光波長５６８ｎｍ）、Ｃｙ３（励起波長５５０ｎｍ，蛍光波長５７０ｎｍ）、ＤｙＬｉｇｈｔ ５４７（励起波長５５７ｎｍ，蛍光波長５７０ｎｍ）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（励起波長５５０ｎｍ，蛍光波長５７０ｎｍ）、ＴＲＩＴＣ（励起波長５５０ｎｍ，蛍光波長５７０ｎｍ）、ＤＹ－５４８（励起波長５５８ｎｍ，蛍光波長５７２ｎｍ）、ＤＹ－５５４（励起波長５５１ｎｍ，蛍光波長５７２ｎｍ）、ＤＹ－５５５（励起波長５４７ｎｍ，蛍光波長５７２ｎｍ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６（励起波長５５６ｎｍ，蛍光波長ｎｍ，蛍光波長５７３ｎｍ）、ＤＹ－５５６（励起波長５４８ｎｍ，蛍光波長５７３ｎｍ）、ＮｏｒｔｈｅｒｎＬｉｇｈｔｓ ５５７（励起波長５５７ｎｍ，蛍光波長５７４ｎｍ）、Ｏｙｓｔｅｒ ５５０（励起波長５５５ｎｍ，蛍光波長５７４ｎｍ）、５－ＴＡＭＲＡｎｍ，蛍光波長５４７（励起波長５７４ｎｍ）、ＤＹ－５０５－Ｘ５（励起波長５０５ｎｍ，蛍光波長５７４ｎｍ）、ＤＹ－５４７（励起波長５５７ｎｍ，蛍光波長５７４ｎｍ）、Ｏｙｓｔｅｒ ５５６（励起波長５６２ｎｍ，蛍光波長５７５ｎｍ）、ＤＹ－５４９（励起波長５６０ｎｍ，蛍光波長５７５ｎｍ）、ＡＴＴＯ ５５０（励起波長５５４ｎｍ，蛍光波長５７６ｎｍ）、ＰＥ（励起波長４８８ｎｍ，蛍光波長５７８ｎｍ）、Ｂ－ＰＥ（励起波長５４５ｎｍ，蛍光波長５７８ｎｍ）、Ｒ－ＰＥ（励起波長５６６ｎｍ，蛍光波長５７８ｎｍ）、ＤＹ－５６０（励起波長５５９ｎｍ，蛍光波長５７８ｎｍ）、ＴＡＭＲＡ（励起波長５５５ｎｍ，蛍光波長５８０ｎｍ）、ＭＦＰ５５５（励起波長５６０ｎｍ，蛍光波長５８５ｎｍ）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｏｒａｎｇｅ（励起波長５５９ｎｍ，蛍光波長５８８ｎｍ）、ＤＹ－５１０ＸＬ（励起波長５０９ｎｍ，蛍光波長５９０ｎｍ）、ＡＴＴＯ ５６５（励起波長５６３ｎｍ，蛍光波長５９２ｎｍ）、Ｃｙ３．５（励起波長５８１ｎｍ，蛍光波長５９６ｎｍ）、ＲＯＸ（Ｘ－Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ，Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ Ｘ）（励起波長５８７ｎｍ，蛍光波長５９９ｎｍ）、ＤＹ－５９０（励起波長５８０ｎｍ，蛍光波長５９９ｎｍ）、５－ＲＯＸ（励起波長５７３ｎｍ，蛍光波長６０２ｎｍ）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｒｅｄ（励起波長５８７ｎｍ，蛍光波長６１２ｎｍ）、ＥＣＤ（励起波長４８８ｎｍ，蛍光波長６１３ｎｍ）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（励起波長５９６ｎｍ，蛍光波長６１５ｎｍ）、ＤｙＬｉｇｈｔ ５９４（励起波長５９３ｎｍ，蛍光波長６１８ｎｍ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４（励起波長５９０ｎｍ，蛍光波長６１９ｎｍ）、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ＴＲ（励起波長５９１ｎｍ，蛍光波長６２２ｎｍ）、ＡＴＴＯ ５９０（励起波長５９４ｎｍ，蛍光波長６２４ｎｍ）、ＭＦＰ５９０（励起波長５９７ｎｍ，蛍光波長６２４ｎｍ）、ＤＹ－６１０（励起波長６１０ｎｍ，蛍光波長６３０ｎｍ）、ＤＹ－４８０ＸＬ（励起波長５００ｎｍ，蛍光波長６３０ｎｍ）、ＡＴＴＯ ６１０（励起波長６１５ｎｍ，蛍光波長６３４ｎｍ）、ＤＹ－６１５（励起波長６２１ｎｍ，蛍光波長６４１ｎｍ）、Ｃ－ＰＣ（Ｃ－Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）（励起波長６１６ｎｍ，蛍光波長６４７ｎｍ）、ＡＴＴＯ ６２０（励起波長６１９ｎｍ，蛍光波長６４３ｎｍ）、Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（励起波長６２０ｎｍ，蛍光波長６５０ｎｍ）、ＤＹ－４８１ＸＬ（励起波長５１５ｎｍ，蛍光波長６５０ｎｍ）、ＡＴＴＯ ６３３（励起波長６２９ｎｍ，蛍光波長６５７ｎｍ）、ＤＹ－６３０（励起波長６３６ｎｍ，蛍光波長６５７ｎｍ）、ＤＹ－６３２（励起波長６３７ｎｍ，蛍光波長６５７ｎｍ）、ＤＹ－６３３（励起波長６３７ｎｍ，蛍光波長６５７ｎｍ）、ＭＦＰ６３１（励起波長６３３ｎｍ，蛍光波長６５８ｎｍ）、ＤｙＬｉｇｈｔ ６３３（励起波長６３８ｎｍ，蛍光波長６５８ｎｍ）、ＮｏｒｔｈｅｒｎＬｉｇｈｔｓ ６３７（励起波長６３７ｎｍ，蛍光波長６５８ｎｍ）、ＤＹ－６３１（励起波長６３７ｎｍ，蛍光波長６５８ｎｍ）、ＤＹ－６３４（励起波長６３５ｎｍ，蛍光波長６５８ｎｍ）、ＡＰＣ（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）（励起波長６５０ｎｍ，蛍光波長６６０ｎｍ）、ＡＰＣ－ＸＬ（励起波長６５０ｎｍ，蛍光波長６６２ｎｍ）、ＤＹ－５２０ＸＬ（励起波長５２０ｎｍ，蛍光波長６６４ｎｍ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（励起波長６５０ｎｍ，蛍光波長６６５ｎｍ）、Ｃｙ５（励起波長６４３ｎｍ，蛍光波長６６７ｎｍ）、ＤＹ－５２１ＸＬ（励起波長５２３ｎｍ，蛍光波長６６８ｎｍ）、Ｏｙｓｔｅｒ ６４５（励起波長６５０ｎｍ，蛍光波長６６９ｎｍ）、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｒｅｄ（励起波長４８８ｎｍ，蛍光波長６７０ｎｍ）、Ｔｒｉ－Ｃｏｌｏｒ（励起波長４８８ｎｍ，蛍光波長６７０ｎｍ）、ＤＹ－６３５（励起波長６４７ｎｍ，蛍光波長６７１ｎｍ）、ＤＹ－６３６（励起波長６４５ｎｍ，蛍光波長６７１ｎｍ）、ＤＹ－６４７（励起波長６５３ｎｍ，蛍光波長６７２ｎｍ）、ＤｙＬｉｇｈｔ ６４７（励起波長６５２ｎｍ，蛍光波長６７３ｎｍ）、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ６４７（励起波長６５３ｎｍ，蛍光波長６７３ｎｍ）、ＤｙＬｉｇｈｔ ６４９（励起波長６４６ｎｍ，蛍光波長６７４ｎｍ）、ＨｉＬｙｔｅ Ｐｌｕｓ ６４７（励起波長６４９ｎｍ，蛍光波長ｎｍ，蛍光波長６７４ｎｍ）、Ｏｙｓｔｅｒ ６５０（励起波長６５５ｎｍ，蛍光波長６７４ｎｍ）、ＤＹ－６４８（励起波長６５３ｎｍ，蛍光波長６７４ｎｍ）、ＤＹ－６５０（励起波長６５３ｎｍ，蛍光波長６７４ｎｍ）、ＰｅｒＣＰ（励起波長４８８ｎｍ，蛍光波長６７５ｎｍ）、ＤＹ－６５２（励起波長６５４ｎｍ，蛍光波長６７５ｎｍ）、ＤＹ－６４９（励起波長６５５ｎｍ，蛍光波長６７６ｎｍ）、ＤＹ－６５１（励起波長６５６ｎｍ，蛍光波長６７８ｎｍ）、Ｏｙｓｔｅｒ ６５６（励起波長６６２ｎｍ，蛍光波長６７９ｎｍ）、ＡＴＴＯ ６５５（励起波長６６３ｎｍ，蛍光波長６８４ｎｍ）、Ｃｙ５．５（励起波長６７５ｎｍ，蛍光波長６９４ｎｍ）、ＤＹ－６７７（励起波長６７３ｎｍ，蛍光波長６９４ｎｍ）、ＤＹ－６７８（励起波長６７４ｎｍ，蛍光波長６９８ｎｍ）、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ６８０（励起波長６７８ｎｍ，蛍光波長６９９ｎｍ）、ＤＹ－６７５（励起波長６７４ｎｍ，蛍光波長６９９ｎｍ）、ＤＹ－６７６（励起波長６７４ｎｍ，蛍光波長６９９ｎｍ）、ＩＲＤｙｅ７００ＤＸ（励起波長６８９ｎｍ，蛍光波長７００ｎｍ）、ＤＹ－６８１（励起波長６９１ｎｍ，蛍光波長７０８ｎｍ）、ＤＹ－６８０（励起波長６９０ｎｍ，蛍光波長７０９ｎｍ）、ＤＹ－６８２（励起波長６９０ｎｍ，蛍光波長７０９ｎｍ）、ＤｙＬｉｇｈｔ ６８０（励起波長６８２ｎｍ，蛍光波長７１５ｎｍ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００（励起波長７０２ｎｍ，蛍光波長７２３ｎｍ）、ＤＹ－７００（励起波長７０７ｎｍ，蛍光波長７３０ｎｍ）、ＤＹ－７０１（励起波長７０６ｎｍ，蛍光波長７３１ｎｍ）、ＰＲＥＸ７１０（励起波長７１０ｎｍ，蛍光波長７４０ｎｍ）、ＤＹ－７３０（励起波長７３２ｎｍ，蛍光波長７５８ｎｍ）、ＤＹ－７３２（励起波長７３６ｎｍ，蛍光波長７５９ｎｍ）、ＤＹ－７３４（励起波長７３６ｎｍ，蛍光波長７５９ｎｍ）、ＤＹ－７３１（励起波長７３６ｎｍ，蛍光波長７６０ｎｍ）、ＤＹ－７５２（励起波長７４８ｎｍ，蛍光波長７７２ｎｍ）、ＤＹ－７５０（励起波長７４７ｎｍ，蛍光波長７７６ｎｍ）、ＤｙＬｉｇｈｔ ７５０（励起波長７５２ｎｍ，蛍光波長７７８ｎｍ）、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ７５０（励起波長７５４ｎｍ，蛍光波長７７８ｎｍ）、ＤＹ－７４９（励起波長７５２ｎｍ，蛍光波長７７８ｎｍ）、ＨｉＬｙｔｅ Ｐｌｕｓ ７５０（励起波長７５１ｎｍ，蛍光波長ｎｍ，蛍光波長７７９ｎｍ）、ＤＹ－７５１（励起波長７５１ｎｍ，蛍光波長７７９ｎｍ）、ＤｙＬｉｇｈｔ ８００（励起波長７７０ｎｍ，蛍光波長７９４ｎｍ）、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ（励起波長７７４ｎｍ，蛍光波長８００ｎｍ）、ＤＹ－７８０（励起波長７８２ｎｍ，蛍光波長８００ｎｍ）、ＤＹ－７８１（励起波長７８３ｎｍ，蛍光波長８００ｎｍ）、ＤＹ－７８２（励起波長７８４ｎｍ，蛍光波長８００ｎｍ）、ＤＹ－７７６（励起波長７７１ｎｍ，蛍光波長８０１ｎｍ）、ＤＹ－７７７（励起波長７７１ｎｍ，蛍光波長８０１ｎｍ）、及びＩＲＤｙｅ８００（励起波長７７８ｎｍ，蛍光波長８０６ｎｍ）が挙げられる。
【0022】
前記光架橋性人工核酸は、紫外線照射によって標的核酸の塩基と架橋を形成するものであれば特に限定されない。
前記光架橋性人工核酸の非限定的な例としては、デオキシリボースを基本骨格とするＣＮＶ－Ｋ（下記式（１））及びＤ－トレオニノールを基本骨格とするＣＮＶ－Ｄ（下記式（２））が挙げられる（いずれも日華化学（株）製）。なお、下記式（１）及び下記式（２）は、ホスホロアミダイト体として示す。
前記光架橋性人工核酸の非限定的な例としては、デオキシリボースを基本骨格とするＣＮＶ－Ｋ（下記式（１））及びＤ－トレオニノールを基本骨格とするＣＮＶ－Ｄ（下記式（２））が挙げられる（いずれも日華化学（株）製）。なお、下記式（１）及び下記式（２）は、ホスホロアミダイト体として示す。
【0023】
【化1】
【0024】
前記蛍光標識プローブは、前記光架橋性人工核酸とは別に、２個以上の人工核酸を含むことが好ましい。
前記人工核酸の非限定的な例としては、ロック核酸（ＬＮＡ）、５－メチルシチジル酸、及び２’－デオキシ－５－メチルシチジル酸が挙げられ、これらからなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。
前記人工核酸の非限定的な例としては、ロック核酸（ＬＮＡ）、５－メチルシチジル酸、及び２’－デオキシ－５－メチルシチジル酸が挙げられ、これらからなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。
【0025】
前記蛍光標識プローブの鎖長は、特に限定されないが、４～１１ｍｅｒが好ましく、５～１０ｍｅｒがより好ましい。鎖長がこの範囲内であると、前記標的核酸により特異的にハイブリダイズしやすくなる。
【0026】
（ハイブリダイゼーション）
複合体形成工程において、標的核酸と蛍光標識プローブのハイブリダイゼーションは、標的核酸と蛍光標識プローブを緩衝液中でインキュベートすることによって行うことができるが、これに限定されるものではない。
複合体形成工程において、標的核酸と蛍光標識プローブのハイブリダイゼーションは、標的核酸と蛍光標識プローブを緩衝液中でインキュベートすることによって行うことができるが、これに限定されるものではない。
【0027】
〈結合体形成工程〉
結合体形成工程は、複合体形成工程で形成した標的核酸－蛍光標識プローブ複合体に紫外線を照射して前記標的核酸と前記蛍光標識プローブとの間に共有結合を形成させて標的核酸－蛍光標識プローブ結合体を形成する工程である。
結合体形成工程は、複合体形成工程で形成した標的核酸－蛍光標識プローブ複合体に紫外線を照射して前記標的核酸と前記蛍光標識プローブとの間に共有結合を形成させて標的核酸－蛍光標識プローブ結合体を形成する工程である。
【0028】
（光架橋による共有結合の形成）
結合体形成工程において、標的核酸－蛍光標識プローブ複合体の標的核酸と蛍光標識プローブとの間の共有結合は、標的核酸－蛍光標識プローブ複合体に紫外線を照射することにより行う。
紫外線の波長及び照射時間は、光架橋性人工核酸の種類に応じて適宜設定することができる。
光架橋性人工核酸がＣＮＶ－Ｋ又はＣＮＶ－Ｄである場合、紫外線の波長は３１３～３８０ｎｍが好ましく、３２０～３８０ｎｍがより好ましい。また、紫外線の照射時間は、１～３０分間が好ましく、５～１５分間がより好ましい。
結合体形成工程において、標的核酸－蛍光標識プローブ複合体の標的核酸と蛍光標識プローブとの間の共有結合は、標的核酸－蛍光標識プローブ複合体に紫外線を照射することにより行う。
紫外線の波長及び照射時間は、光架橋性人工核酸の種類に応じて適宜設定することができる。
光架橋性人工核酸がＣＮＶ－Ｋ又はＣＮＶ－Ｄである場合、紫外線の波長は３１３～３８０ｎｍが好ましく、３２０～３８０ｎｍがより好ましい。また、紫外線の照射時間は、１～３０分間が好ましく、５～１５分間がより好ましい。
【0029】
〈ピーク検出工程〉
ピーク検出工程は、結合体形成工程で形成した標的核酸－蛍光標識プローブ結合体を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析し、前記蛍光標識プローブが発する蛍光波長から前記標的核酸－蛍光標識プローブ結合体のピークを検出する工程である。
ピーク検出工程は、結合体形成工程で形成した標的核酸－蛍光標識プローブ結合体を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析し、前記蛍光標識プローブが発する蛍光波長から前記標的核酸－蛍光標識プローブ結合体のピークを検出する工程である。
【0030】
ＨＰＬＣの条件は特に限定されず、適宜設定することができる。
標的核酸のピークエリア面積と標的核酸とは別の蛍光色素で検出した内部標準核酸のピークエリア面積から標的核酸の濃度を測定することができる。
標的核酸のピークエリア面積と標的核酸とは別の蛍光色素で検出した内部標準核酸のピークエリア面積から標的核酸の濃度を測定することができる。
【0031】
［蛍光標識プローブ、複合体、及び結合体］
蛍光標識プローブ、標的核酸、複合体、及び結合体は上述したとおりである。
本発明の蛍光標識プローブは、蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブのオリゴヌクレオチド鎖長が５～１０ｍｅｒであり、ＧＣ含量が４０％以上であり、かつロック核酸、５－メチルシチジル酸、及び２’－デオキシ－５－メチルシチジル酸からなる群から選択される少なくとも１種の人工核酸を２個以上含む。前記光架橋性人工核酸は、ＣＮＶ－Ｋ又はＣＮＶ－Ｄであることが好ましい。これらの条件を満たす蛍光標識プローブは、未変化体と５’代謝物、及び３’代謝物が共存している場合においても、１塩基のみが欠損している５’代謝物、及び３’代謝物には欠損側に対応する蛍光標識プローブは結合せず、未変化体にのみに５’及び３’側に対応する蛍光標識プローブの両方がハイブリダイズすることができる。
本発明の標的核酸－蛍光標識プローブ複合体は、上述した蛍光標識プローブと標的核酸がハイブリダイズしてなるものである。
本発明の標的核酸－蛍光標識プローブ結合体は、上述した蛍光標識プローブと標的核酸が共有結合してなるものである。
蛍光標識プローブ、標的核酸、複合体、及び結合体は上述したとおりである。
本発明の蛍光標識プローブは、蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブのオリゴヌクレオチド鎖長が５～１０ｍｅｒであり、ＧＣ含量が４０％以上であり、かつロック核酸、５－メチルシチジル酸、及び２’－デオキシ－５－メチルシチジル酸からなる群から選択される少なくとも１種の人工核酸を２個以上含む。前記光架橋性人工核酸は、ＣＮＶ－Ｋ又はＣＮＶ－Ｄであることが好ましい。これらの条件を満たす蛍光標識プローブは、未変化体と５’代謝物、及び３’代謝物が共存している場合においても、１塩基のみが欠損している５’代謝物、及び３’代謝物には欠損側に対応する蛍光標識プローブは結合せず、未変化体にのみに５’及び３’側に対応する蛍光標識プローブの両方がハイブリダイズすることができる。
本発明の標的核酸－蛍光標識プローブ複合体は、上述した蛍光標識プローブと標的核酸がハイブリダイズしてなるものである。
本発明の標的核酸－蛍光標識プローブ結合体は、上述した蛍光標識プローブと標的核酸が共有結合してなるものである。
【0032】
［作用効果］
標的核酸の未変化体、５’代謝物、及び３’代謝物が共存している場合、これら三者のオリゴヌクレオチド鎖長の違いはしばしばヌクレオチド１～２個に過ぎないため、そのままではＨＰＬＣで分離することが困難である。本発明の一実施形態では、標的核酸の５’側及び３’側のそれぞれに特異的にハイブリダイズする蛍光標識プローブを用い、さらに標的核酸と蛍光標識プローブとの間で架橋して共有結合させることで、安定して精度よく、未変化体、５’代謝物、３’代謝物を分離して検出することができる。
図１によれば、未変化体の５’側には蛍光色素Ａで標識されたプローブが結合するとともに３’側には蛍光色素Ｂで標識されたプローブが結合し、５’代謝物の３’側には蛍光色素Ｂで標識されたプローブが結合し、３’代謝物の５’側には蛍光色素Ａで標識されたプローブが結合する。これらをＨＰＬＣで分離すると、未変化体では蛍光色素Ａ及び蛍光色素Ｂの蛍光が測定されるのに対し、代謝物ではいずれか一方のみが測定される。
標的核酸の未変化体、５’代謝物、及び３’代謝物が共存している場合、これら三者のオリゴヌクレオチド鎖長の違いはしばしばヌクレオチド１～２個に過ぎないため、そのままではＨＰＬＣで分離することが困難である。本発明の一実施形態では、標的核酸の５’側及び３’側のそれぞれに特異的にハイブリダイズする蛍光標識プローブを用い、さらに標的核酸と蛍光標識プローブとの間で架橋して共有結合させることで、安定して精度よく、未変化体、５’代謝物、３’代謝物を分離して検出することができる。
図１によれば、未変化体の５’側には蛍光色素Ａで標識されたプローブが結合するとともに３’側には蛍光色素Ｂで標識されたプローブが結合し、５’代謝物の３’側には蛍光色素Ｂで標識されたプローブが結合し、３’代謝物の５’側には蛍光色素Ａで標識されたプローブが結合する。これらをＨＰＬＣで分離すると、未変化体では蛍光色素Ａ及び蛍光色素Ｂの蛍光が測定されるのに対し、代謝物ではいずれか一方のみが測定される。
【実施例】
【0033】
以下では実験例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲は後述する実験例に限定されるものではない。
【0034】
［材料］
（１）標的核酸（（株）日本遺伝子研究所に委託して合成）
・Ｔ－ＰＴ１－５’ａ（未変化体１６ｍｅｒ）：配列番号１
核酸配列（５’→３’）：A(L)^G(L)^A(L)^G^C^T^G^A^C^T^T^G^A^T(L)^G(L)^5(L)
（２）標的核酸の模擬代謝物（（株）日本遺伝子研究所に委託して合成）
・Ｔ－ＰＴ１－５’ａ－３ｎ－１（３’ｎ－１体：１５ｍｅｒ）：配列番号２
核酸配列（５’→３’）：A(L)^G(L)^A(L)^G^C^T^G^A^C^T^T^G^A^T(L)^G(L)
・Ｔ－ＰＴ１－５ｎ－１（５’ｎ－１体：１５ｍｅｒ）：配列番号３
核酸配列（５’→３’）：G(L)^A(L)^G^C^T^G^A^C^T^T^G^A^T(L)^G(L)^5(L)
（３）内部標準核酸（（株）日本遺伝子研究所に委託して合成）
Ｔ－ＩＳ－１６ｍｅｒ（内標核酸：１６ｍｅｒ）：配列番号４
核酸配列（５’→３’）：A(L)GCTTCGAGCTAATCG(L)
（４）蛍光標識プローブ（北海道システム・サイエンス（株）に委託して合成）
・７ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３）（５’ｎ－１体判別用、ＦＡＭ標識（３’修飾）、ＣＮＶ－Ｄ挿入プローブ）：配列番号５
核酸配列（５’→３’）：5(L)AD5(L)TCT(L)-FAM
・６ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３）（５’ｎ－１体判別用、ＦＡＭ標識（３’修飾）、ＣＮＶ－Ｄ挿入プローブ）：配列番号６
核酸配列（５’→３’）：A(L)D5(L)TCT(L)-FAM
・５ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３）（５’ｎ－１体判別用、ＦＡＭ標識（３’修飾）、ＣＮＶ－Ｄ挿入プローブ）：配列番号７
核酸配列（５’→３’）：D5(L)TCT(L)-FAM
・ＲＯＸ－７ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’（３’ｎ－１体判別用、ＲＯＸ標識（５’修飾）、ＣＮＶ－Ｄ挿入プローブ）：配列番号８
核酸配列（５’→３’）：ROX-G(L)CAD5(L)AA(L)
・ＲＯＸ－８ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’（３’ｎ－１体判別用、ＲＯＸ標識（５’修飾）、ＣＮＶ－Ｄ挿入プローブ）：配列番号９
核酸配列（５’→３’）：ROX-G(L)CAD5(L)AA(L)G
・ＲＯＸ－８Ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’（３’ｎ－１体判別用、ＲＯＸ標識（５’修飾）、ＣＮＶ－Ｋ挿入プローブ）：配列番号１０
核酸配列（５’→３’）：ROX-G(L)CAK5(L)AA(L)G
・ＲＯＸ－１０ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’（３’ｎ－１体判別用、ＲＯＸ標識（５’修飾）、ＣＮＶ－Ｄ挿入プローブ）：配列番号１１
核酸配列（５’→３’）：ROX-G(L)CAD5(L)AA(L)GTC
・Ｃｙ５－ＩＳ－１６ｍｅｒ（Ｄ）（内標核酸用、Ｃｙ５標識（５’修飾）、ＣＮＶ－Ｄ挿入プローブ：配列番号１２
核酸配列（５’→３’）：Cy5-5(L)GATTAGCTCGADGCT(L)
（１）標的核酸（（株）日本遺伝子研究所に委託して合成）
・Ｔ－ＰＴ１－５’ａ（未変化体１６ｍｅｒ）：配列番号１
核酸配列（５’→３’）：A(L)^G(L)^A(L)^G^C^T^G^A^C^T^T^G^A^T(L)^G(L)^5(L)
（２）標的核酸の模擬代謝物（（株）日本遺伝子研究所に委託して合成）
・Ｔ－ＰＴ１－５’ａ－３ｎ－１（３’ｎ－１体：１５ｍｅｒ）：配列番号２
核酸配列（５’→３’）：A(L)^G(L)^A(L)^G^C^T^G^A^C^T^T^G^A^T(L)^G(L)
・Ｔ－ＰＴ１－５ｎ－１（５’ｎ－１体：１５ｍｅｒ）：配列番号３
核酸配列（５’→３’）：G(L)^A(L)^G^C^T^G^A^C^T^T^G^A^T(L)^G(L)^5(L)
（３）内部標準核酸（（株）日本遺伝子研究所に委託して合成）
Ｔ－ＩＳ－１６ｍｅｒ（内標核酸：１６ｍｅｒ）：配列番号４
核酸配列（５’→３’）：A(L)GCTTCGAGCTAATCG(L)
（４）蛍光標識プローブ（北海道システム・サイエンス（株）に委託して合成）
・７ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３）（５’ｎ－１体判別用、ＦＡＭ標識（３’修飾）、ＣＮＶ－Ｄ挿入プローブ）：配列番号５
核酸配列（５’→３’）：5(L)AD5(L)TCT(L)-FAM
・６ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３）（５’ｎ－１体判別用、ＦＡＭ標識（３’修飾）、ＣＮＶ－Ｄ挿入プローブ）：配列番号６
核酸配列（５’→３’）：A(L)D5(L)TCT(L)-FAM
・５ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３）（５’ｎ－１体判別用、ＦＡＭ標識（３’修飾）、ＣＮＶ－Ｄ挿入プローブ）：配列番号７
核酸配列（５’→３’）：D5(L)TCT(L)-FAM
・ＲＯＸ－７ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’（３’ｎ－１体判別用、ＲＯＸ標識（５’修飾）、ＣＮＶ－Ｄ挿入プローブ）：配列番号８
核酸配列（５’→３’）：ROX-G(L)CAD5(L)AA(L)
・ＲＯＸ－８ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’（３’ｎ－１体判別用、ＲＯＸ標識（５’修飾）、ＣＮＶ－Ｄ挿入プローブ）：配列番号９
核酸配列（５’→３’）：ROX-G(L)CAD5(L)AA(L)G
・ＲＯＸ－８Ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’（３’ｎ－１体判別用、ＲＯＸ標識（５’修飾）、ＣＮＶ－Ｋ挿入プローブ）：配列番号１０
核酸配列（５’→３’）：ROX-G(L)CAK5(L)AA(L)G
・ＲＯＸ－１０ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’（３’ｎ－１体判別用、ＲＯＸ標識（５’修飾）、ＣＮＶ－Ｄ挿入プローブ）：配列番号１１
核酸配列（５’→３’）：ROX-G(L)CAD5(L)AA(L)GTC
・Ｃｙ５－ＩＳ－１６ｍｅｒ（Ｄ）（内標核酸用、Ｃｙ５標識（５’修飾）、ＣＮＶ－Ｄ挿入プローブ：配列番号１２
核酸配列（５’→３’）：Cy5-5(L)GATTAGCTCGADGCT(L)
【0035】
核酸配列において各記号は以下の意味である。
Ａ：デオキシアデニル酸
Ｃ：デオキシシチジル酸
Ｇ：デオキシグアニル酸
Ｔ：デオキシチミジル酸
５：２’－デオキシ－５－メチルシチジル酸
（Ｌ）：ロック核酸（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）（左側の核酸を構成するリボースの２’位の酸素原子と４’位の炭素原子をメチレンで架橋していることを示す）
＾：ホスホロチオエート修飾（ホスホジエステル結合の酸素原子の1つが硫黄原子に置換されていることを示す）
Ｄ：ＣＮＶ－Ｄ（日華化学（株））
Ｋ：ＣＮＶ－Ｋ（日華化学（株））
ＦＡＭ：フルオレセイン（励起波長：４９４ｎｍ，蛍光波長：５２１ｎｍ；緑色蛍光） ＲＯＸ：Ｘ－ローダミン（励起波長：５８７ｎｍ，蛍光波長：５９９ｎｍ；オレンジ色蛍光）
Ｃｙ５：スルホン化シアニン色素（励起波長：６４３ｎｍ，蛍光波長：６６７ｎｍ；赤色蛍光）
Ａ：デオキシアデニル酸
Ｃ：デオキシシチジル酸
Ｇ：デオキシグアニル酸
Ｔ：デオキシチミジル酸
５：２’－デオキシ－５－メチルシチジル酸
（Ｌ）：ロック核酸（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）（左側の核酸を構成するリボースの２’位の酸素原子と４’位の炭素原子をメチレンで架橋していることを示す）
＾：ホスホロチオエート修飾（ホスホジエステル結合の酸素原子の1つが硫黄原子に置換されていることを示す）
Ｄ：ＣＮＶ－Ｄ（日華化学（株））
Ｋ：ＣＮＶ－Ｋ（日華化学（株））
ＦＡＭ：フルオレセイン（励起波長：４９４ｎｍ，蛍光波長：５２１ｎｍ；緑色蛍光） ＲＯＸ：Ｘ－ローダミン（励起波長：５８７ｎｍ，蛍光波長：５９９ｎｍ；オレンジ色蛍光）
Ｃｙ５：スルホン化シアニン色素（励起波長：６４３ｎｍ，蛍光波長：６６７ｎｍ；赤色蛍光）
【0036】
［試薬・反応液・資材等］
１０％ＳＤＳ溶液（ＳＤＳ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｇｒａｄｅ（１０％ ｗ／ｖ），Ｐｒｏｍｅｇａ，＃Ｖ６５５１）
Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ，＃９０３４）
２０×ＳＳＣ（Ｐｒｏｍｅｇａ，＃Ｖ４２６１）
１０×ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ：５００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ／ｐＨ８．０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，＃１５５６８－０２５）、４０ｍＭ ＥＤＴＡ／ｐＨ８．０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，＃１５５７５－０３８）
１０％ツイーン２０（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）
１％ツイーン２０（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）
１７．５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００）溶液（ＳＩＧＭＡ）
Ｎｕｃｌｅａｓｅフリー水（ＤＥＰＣ処理ではない）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃ＡＭ９９３７）
ＴＥ緩衝液（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１２０９００１５）
Ｔｒｉｓ（富士フイルム和光純薬（株），＃２０７－０６２７５）
１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液（富士フイルム和光純薬（株），＃１９２－０２１７５）
過塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ４）（富士フイルム和光純薬（株），＃１９２－０９２５５）
１ｍｏｌ／Ｌ塩酸（ＨＣｌ）（富士フイルム和光純薬（株），＃０８３－０１０９５）
ボトルトップフィルター １０００ｍＬ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，＃５９７－４５２０）
ＢｉｏＰｒｏ ＩＥＸ ＱＦ陰イオン交換カラム（ＹＭＣ，ＱＦ００Ｓ０５－０５４６ＷＰ）
Ｈａｒｄ－Ｓｈｅｌｌ ９６ウェルスカート付きＰＣＲプレート（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，＃ＨＳＰ９６５５）
ＲＡＰＩＤ Ｓｌｉｔ Ｓｅａｌ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，ＲＳＳ－Ｓ９６－８０１２２）
ＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄ ｔｕｂｅｓ，１．５ｍＬ，ＰＣＲ ｃｌｅａｎ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，＃００３０１０８０５１）
Ａｄｈｅｓｉｖｅ ＰＣＲ Ｐｌａｔｅ Ｓｅａｌｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，＃ＡＢ０５５８）
ＤＮＡ Ｌｏｂｉｎｄ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ９６／Ｖ－ＰＰ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，＃００３０６０３３０３）
１０％ＳＤＳ溶液（ＳＤＳ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｇｒａｄｅ（１０％ ｗ／ｖ），Ｐｒｏｍｅｇａ，＃Ｖ６５５１）
Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ，＃９０３４）
２０×ＳＳＣ（Ｐｒｏｍｅｇａ，＃Ｖ４２６１）
１０×ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ：５００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ／ｐＨ８．０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，＃１５５６８－０２５）、４０ｍＭ ＥＤＴＡ／ｐＨ８．０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，＃１５５７５－０３８）
１０％ツイーン２０（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）
１％ツイーン２０（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）
１７．５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００）溶液（ＳＩＧＭＡ）
Ｎｕｃｌｅａｓｅフリー水（ＤＥＰＣ処理ではない）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃ＡＭ９９３７）
ＴＥ緩衝液（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１２０９００１５）
Ｔｒｉｓ（富士フイルム和光純薬（株），＃２０７－０６２７５）
１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液（富士フイルム和光純薬（株），＃１９２－０２１７５）
過塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ４）（富士フイルム和光純薬（株），＃１９２－０９２５５）
１ｍｏｌ／Ｌ塩酸（ＨＣｌ）（富士フイルム和光純薬（株），＃０８３－０１０９５）
ボトルトップフィルター １０００ｍＬ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，＃５９７－４５２０）
ＢｉｏＰｒｏ ＩＥＸ ＱＦ陰イオン交換カラム（ＹＭＣ，ＱＦ００Ｓ０５－０５４６ＷＰ）
Ｈａｒｄ－Ｓｈｅｌｌ ９６ウェルスカート付きＰＣＲプレート（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，＃ＨＳＰ９６５５）
ＲＡＰＩＤ Ｓｌｉｔ Ｓｅａｌ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，ＲＳＳ－Ｓ９６－８０１２２）
ＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄ ｔｕｂｅｓ，１．５ｍＬ，ＰＣＲ ｃｌｅａｎ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，＃００３０１０８０５１）
Ａｄｈｅｓｉｖｅ ＰＣＲ Ｐｌａｔｅ Ｓｅａｌｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，＃ＡＢ０５５８）
ＤＮＡ Ｌｏｂｉｎｄ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ９６／Ｖ－ＰＰ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，＃００３０６０３３０３）
【0037】
［実験機器］
Ｔｈｅｒｍｏ Ｍｉｘｅｒ ｃｏｍｆｏｒｔ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）
Ｔｈｅｒｍｏ Ｍｉｘｅｒ Ｆ１．５（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）
紫外線照射スタンド（オプトコード（株），＃ＦＬ３６５－ＳＤ）
ＨＰＬＣ（（株）島津製作所，ＬＣ２０５０Ｃ）
乾熱滅菌器（ヤマト科学（株），ＳＧ４００）
Ｔｈｅｒｍｏ Ｍｉｘｅｒ ｃｏｍｆｏｒｔ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）
Ｔｈｅｒｍｏ Ｍｉｘｅｒ Ｆ１．５（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）
紫外線照射スタンド（オプトコード（株），＃ＦＬ３６５－ＳＤ）
ＨＰＬＣ（（株）島津製作所，ＬＣ２０５０Ｃ）
乾熱滅菌器（ヤマト科学（株），ＳＧ４００）
【0038】
［実験例１］ＵＶ照射有り無しでピーク比較（条件Ａ）
〈ハイブリダイゼーション反応〉
（１）標的核酸の調製
標的核酸（未変化体；Ｔ－ＰＴ１－５’ａ）を、０．０１％ツイーン２０を含むＮｕｃｌｅａｓｅフリー水を用いて１５００ｎｇ／ｍＬに調製した。
内部標準核酸（内標核酸；Ｔ－ＩＳ－１６ｍｅｒ）についても同様の溶液で３０００ｎｇ／ｍＬに調製した。
〈ハイブリダイゼーション反応〉
（１）標的核酸の調製
標的核酸（未変化体；Ｔ－ＰＴ１－５’ａ）を、０．０１％ツイーン２０を含むＮｕｃｌｅａｓｅフリー水を用いて１５００ｎｇ／ｍＬに調製した。
内部標準核酸（内標核酸；Ｔ－ＩＳ－１６ｍｅｒ）についても同様の溶液で３０００ｎｇ／ｍＬに調製した。
【0039】
（２）蛍光標識プローブの調製
ＦＡＭ５’プローブ（７ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３））及びＣｙ５－ＩＳプローブ（Ｃｙ５－ＩＳ－１６ｍｅｒ（Ｄ））を、ＴＥ緩衝液で５μＭに希釈調製した。（３）ハイブリダイゼーションバッファーの調製
１サンプルあたり内標核酸（Ｔ－ＩＳ－１６ｍｅｒ）５μＬ、ＦＡＭ５’プローブ（７ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３））１．４μＬ（終濃度：０．２μＭ）、Ｃｙ５－ＩＳプローブ（Ｃｙ５－ＩＳ－１６ｍｅｒ（Ｄ））１．４μＬ（終濃度：０．２μＭ）、２０×ＳＳＣ ８．７５μＬ（終濃度：５×）、１０×Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ５．２５μＬ（終濃度：１．５×）、１７．５％ ＰＥＧ８０００を含むＮｕｃｌｅａｓｅフリー水 ４μＬ（終濃度：２％）、及び１％ツイーン２０を含むＮｕｃｌｅａｓｅフリー水 ０．３５μＬ（終濃度：０．０１％）を混合し、ＴＥ緩衝液でトータル３０μＬになるように調製した。
ＦＡＭ５’プローブ（７ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３））及びＣｙ５－ＩＳプローブ（Ｃｙ５－ＩＳ－１６ｍｅｒ（Ｄ））を、ＴＥ緩衝液で５μＭに希釈調製した。（３）ハイブリダイゼーションバッファーの調製
１サンプルあたり内標核酸（Ｔ－ＩＳ－１６ｍｅｒ）５μＬ、ＦＡＭ５’プローブ（７ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３））１．４μＬ（終濃度：０．２μＭ）、Ｃｙ５－ＩＳプローブ（Ｃｙ５－ＩＳ－１６ｍｅｒ（Ｄ））１．４μＬ（終濃度：０．２μＭ）、２０×ＳＳＣ ８．７５μＬ（終濃度：５×）、１０×Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ５．２５μＬ（終濃度：１．５×）、１７．５％ ＰＥＧ８０００を含むＮｕｃｌｅａｓｅフリー水 ４μＬ（終濃度：２％）、及び１％ツイーン２０を含むＮｕｃｌｅａｓｅフリー水 ０．３５μＬ（終濃度：０．０１％）を混合し、ＴＥ緩衝液でトータル３０μＬになるように調製した。
【0040】
（４）ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションバッファーを３０μＬずつ９６ウェルプレート（Ｈａｒｄ－Ｓｈｅｌｌ ９６ウェルスカート付きＰＣＲプレート）に添加し、測定対象核酸を５μＬ添加した。プレートシール（ＲＡＰＩＤ Ｓｌｉｔ Ｓｅａｌ）で表面をシートし、４２０×ｇで１分間遠心した後、サーモミキサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｍｉｘｅｒ ｃｏｍｆｏｒｔ）で２５℃、８００ｒｐｍ、１時間反応させた。
ハイブリダイゼーションバッファーを３０μＬずつ９６ウェルプレート（Ｈａｒｄ－Ｓｈｅｌｌ ９６ウェルスカート付きＰＣＲプレート）に添加し、測定対象核酸を５μＬ添加した。プレートシール（ＲＡＰＩＤ Ｓｌｉｔ Ｓｅａｌ）で表面をシートし、４２０×ｇで１分間遠心した後、サーモミキサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｍｉｘｅｒ ｃｏｍｆｏｒｔ）で２５℃、８００ｒｐｍ、１時間反応させた。
【0041】
〈ＵＶ照射による光架橋〉
ハイブリダイゼーション反応を行ったプレートのシールを剥がし、紫外線照射スタンド下で１０分間静置し、光架橋させた。
ＵＶ未照射サンプルについてはウェルにアルミホイルを被せてＵＶを遮光した。
ハイブリダイゼーション反応を行ったプレートのシールを剥がし、紫外線照射スタンド下で１０分間静置し、光架橋させた。
ＵＶ未照射サンプルについてはウェルにアルミホイルを被せてＵＶを遮光した。
【0042】
〈ＨＰＬＣ分析〉
（１）溶離液（Ａ液，Ｂ液）の調製
溶離液Ａ液及びＢ液を次の通り調製した。
Ｂ液はＴｒｉｓ ９．６９ｇ及び過塩素酸ナトリウム４８９．７６ｇを秤量し、ミリＱ水約３Ｌに溶解したのち１Ｍ ＨＣｌでｐＨを８．１に調整した。その後、４Ｌまでｍｉｌｌｉ－Ｑ水でメスアップしたのち、孔径０．２μｍのボトルトップフィルターでフィルトレーションを行い、超音波処理を１５分間行い脱気した。
Ａ液はＢ液から過塩素酸ナトリウムを除いたものであり、方法はＢ液の方法に過塩素酸ナトリウムの添加を省いたものである。
組成：Ａ液 ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．１
Ｂ液 ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１Ｍ ＮａＣｌＯ４，ｐＨ８．１
（１）溶離液（Ａ液，Ｂ液）の調製
溶離液Ａ液及びＢ液を次の通り調製した。
Ｂ液はＴｒｉｓ ９．６９ｇ及び過塩素酸ナトリウム４８９．７６ｇを秤量し、ミリＱ水約３Ｌに溶解したのち１Ｍ ＨＣｌでｐＨを８．１に調整した。その後、４Ｌまでｍｉｌｌｉ－Ｑ水でメスアップしたのち、孔径０．２μｍのボトルトップフィルターでフィルトレーションを行い、超音波処理を１５分間行い脱気した。
Ａ液はＢ液から過塩素酸ナトリウムを除いたものであり、方法はＢ液の方法に過塩素酸ナトリウムの添加を省いたものである。
組成：Ａ液 ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．１
Ｂ液 ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１Ｍ ＮａＣｌＯ４，ｐＨ８．１
【0043】
（２）分析開始
（１）で調製した溶離液（Ａ液，Ｂ液）を用いて、カラム（ＢｉｏＰｒｏ ＩＥＸ ＱＦ陰イオン交換カラム）を装着し、プレートをＨＰＬＣ装置（ＬＣ２０５０Ｃ）にセットし、以下のメソッドで分析を行った。
・分離モード：陰イオン交換
・溶離液：Ａ液，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．１
Ｂ液，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１Ｍ ＮａＣｌＯ４，ｐＨ８．１
・メソッド：２０～５０％ Ｂ（０～７．５ｍｉｎ）
５０～９０％ Ｂ（７．５～８．５ｍｉｎ）
９０％ Ｂ（８．５～１０．５ｍｉｎ）
２０％ Ｂ（１０．５～１４．５ｍｉｎ）
・流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
（１）で調製した溶離液（Ａ液，Ｂ液）を用いて、カラム（ＢｉｏＰｒｏ ＩＥＸ ＱＦ陰イオン交換カラム）を装着し、プレートをＨＰＬＣ装置（ＬＣ２０５０Ｃ）にセットし、以下のメソッドで分析を行った。
・分離モード：陰イオン交換
・溶離液：Ａ液，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．１
Ｂ液，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１Ｍ ＮａＣｌＯ４，ｐＨ８．１
・メソッド：２０～５０％ Ｂ（０～７．５ｍｉｎ）
５０～９０％ Ｂ（７．５～８．５ｍｉｎ）
９０％ Ｂ（８．５～１０．５ｍｉｎ）
２０％ Ｂ（１０．５～１４．５ｍｉｎ）
・流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
【0044】
〈実験結果〉
ＵＶ照射を行なわなかった実験例が比較例（比較例１）であり、ＵＶ照射を行った実験例が実施例（実施例１）である。
比較例１の結果を図２に、実施例１の結果を図３に示す。
光架橋性人工核酸を含む蛍光標識プローブを用いることで、クロマトピークが効果的に検出できた（実施例１）。しかし、ＵＶ照射を行わなかった場合、標的核酸と蛍光標識プローブが共有結合しないため、ＨＰＬＣ分離中に解離してしまい、標的核酸を検出することができなかった（比較例１）。
ＵＶ照射を行なわなかった実験例が比較例（比較例１）であり、ＵＶ照射を行った実験例が実施例（実施例１）である。
比較例１の結果を図２に、実施例１の結果を図３に示す。
光架橋性人工核酸を含む蛍光標識プローブを用いることで、クロマトピークが効果的に検出できた（実施例１）。しかし、ＵＶ照射を行わなかった場合、標的核酸と蛍光標識プローブが共有結合しないため、ＨＰＬＣ分離中に解離してしまい、標的核酸を検出することができなかった（比較例１）。
【0045】
［実験例２］ＵＶ照射有り無しでピーク比較（条件Ｂ）
〈ハイブリダイゼーション反応〉
（１）標的核酸の調製
標的核酸（未変化体；Ｔ－ＰＴ１－５’ａ）を、０．０１％ツイーン２０を含むＮｕｃｌｅａｓｅフリー水を用いて１５００ｎｇ／ｍＬに調製した。
内部標準核酸（内標核酸；Ｔ－ＩＳ－１６ｍｅｒ）についても同様の溶液で３０００ｎｇ／ｍＬに調製した。
〈ハイブリダイゼーション反応〉
（１）標的核酸の調製
標的核酸（未変化体；Ｔ－ＰＴ１－５’ａ）を、０．０１％ツイーン２０を含むＮｕｃｌｅａｓｅフリー水を用いて１５００ｎｇ／ｍＬに調製した。
内部標準核酸（内標核酸；Ｔ－ＩＳ－１６ｍｅｒ）についても同様の溶液で３０００ｎｇ／ｍＬに調製した。
【0046】
（２）蛍光標識プローブの調製
ＦＡＭ５’プローブ（７ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３））、ＲＯＸ３’プローブ（ＲＯＸ－７ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’）、及びＣｙ５－ＩＳプローブ（Ｃｙ５－ＩＳ－１６ｍｅｒ（Ｄ））を、ＴＥ緩衝液で５μＭに希釈調製した。
ＦＡＭ５’プローブ（７ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３））、ＲＯＸ３’プローブ（ＲＯＸ－７ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’）、及びＣｙ５－ＩＳプローブ（Ｃｙ５－ＩＳ－１６ｍｅｒ（Ｄ））を、ＴＥ緩衝液で５μＭに希釈調製した。
【0047】
（３）ハイブリダイゼーションバッファーの調製
１サンプルあたり内標核酸（Ｔ－ＩＳ－１６ｍｅｒ）５μＬ、ＦＡＭ５’プローブ（７ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３））１．４μＬ（終濃度：０．２μＭ）、ＲＯＸ３’プローブ（ＲＯＸ－７ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’）１．４μＬ（終濃度：０．２μＭ）、Ｃｙ５－ＩＳプローブ（Ｃｙ５－ＩＳ－１６ｍｅｒ（Ｄ））１．４μＬ（終濃度：０．２μＭ）、２０×ＳＳＣ ８．７５μＬ（終濃度：５×）、１０×Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ５．２５μＬ（終濃度：１．５×）、１７．５％ ＰＥＧ８０００を含むＮｕｃｌｅａｓｅフリー水 ４μＬ（終濃度：２％）、及び１％ツイーン２０を含むＮｕｃｌｅａｓｅフリー水 ０．３５μＬ（終濃度：０．０１％）を混合し、ＴＥ緩衝液でトータル３０μＬになるように調製した。
１サンプルあたり内標核酸（Ｔ－ＩＳ－１６ｍｅｒ）５μＬ、ＦＡＭ５’プローブ（７ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３））１．４μＬ（終濃度：０．２μＭ）、ＲＯＸ３’プローブ（ＲＯＸ－７ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’）１．４μＬ（終濃度：０．２μＭ）、Ｃｙ５－ＩＳプローブ（Ｃｙ５－ＩＳ－１６ｍｅｒ（Ｄ））１．４μＬ（終濃度：０．２μＭ）、２０×ＳＳＣ ８．７５μＬ（終濃度：５×）、１０×Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ５．２５μＬ（終濃度：１．５×）、１７．５％ ＰＥＧ８０００を含むＮｕｃｌｅａｓｅフリー水 ４μＬ（終濃度：２％）、及び１％ツイーン２０を含むＮｕｃｌｅａｓｅフリー水 ０．３５μＬ（終濃度：０．０１％）を混合し、ＴＥ緩衝液でトータル３０μＬになるように調製した。
【0048】
（４）ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションバッファーを３０μＬずつ９６ウェルプレート（Ｈａｒｄ－Ｓｈｅｌｌ ９６ウェルスカート付きＰＣＲプレート）に添加し、測定対象核酸を５μＬ添加した。プレートシール（ＲＡＰＩＤ Ｓｌｉｔ Ｓｅａｌ）で表面をシートし、４２０×ｇで１分間遠心した後、サーモミキサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｍｉｘｅｒ ｃｏｍｆｏｒｔ）で２５℃、８００ｒｐｍ、１時間反応させた。
ハイブリダイゼーションバッファーを３０μＬずつ９６ウェルプレート（Ｈａｒｄ－Ｓｈｅｌｌ ９６ウェルスカート付きＰＣＲプレート）に添加し、測定対象核酸を５μＬ添加した。プレートシール（ＲＡＰＩＤ Ｓｌｉｔ Ｓｅａｌ）で表面をシートし、４２０×ｇで１分間遠心した後、サーモミキサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｍｉｘｅｒ ｃｏｍｆｏｒｔ）で２５℃、８００ｒｐｍ、１時間反応させた。
【0049】
〈ＵＶ照射による光架橋〉
ハイブリダイゼーション反応を行ったプレートのシールを剥がし、紫外線照射スタンド下で１０分間静置し、光架橋させた。
ＵＶ未照射サンプルについてはウェルにアルミホイルを被せてＵＶを遮光した。
ハイブリダイゼーション反応を行ったプレートのシールを剥がし、紫外線照射スタンド下で１０分間静置し、光架橋させた。
ＵＶ未照射サンプルについてはウェルにアルミホイルを被せてＵＶを遮光した。
【0050】
〈ＨＰＬＣ分析〉
（１）溶離液（Ａ液，Ｂ液）の調製
溶離液Ａ液及びＢ液を次の通り調製した。
Ｂ液は１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液４０ｍＬ、過塩素酸ナトリウム４８９．７６ｇを秤量し、ミリＱ水約３Ｌに溶解後、４ＬまでミリＱ水でメスアップしたのち、孔径０．２μｍのボトルトップフィルターでフィルトレーションを行い、超音波処理を１５分間行い脱気した。
Ａ液はＢ液から過塩素酸ナトリウムを除いたものであり、方法はＢ液の方法に過塩素酸ナトリウムの添加を省いたものである。
組成：Ａ液 １０ｍＭ ＮａＯＨ
Ｂ液 １０ｍＭ ＮａＯＨ、１Ｍ ＮａＣｌＯ４
（１）溶離液（Ａ液，Ｂ液）の調製
溶離液Ａ液及びＢ液を次の通り調製した。
Ｂ液は１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液４０ｍＬ、過塩素酸ナトリウム４８９．７６ｇを秤量し、ミリＱ水約３Ｌに溶解後、４ＬまでミリＱ水でメスアップしたのち、孔径０．２μｍのボトルトップフィルターでフィルトレーションを行い、超音波処理を１５分間行い脱気した。
Ａ液はＢ液から過塩素酸ナトリウムを除いたものであり、方法はＢ液の方法に過塩素酸ナトリウムの添加を省いたものである。
組成：Ａ液 １０ｍＭ ＮａＯＨ
Ｂ液 １０ｍＭ ＮａＯＨ、１Ｍ ＮａＣｌＯ４
【0051】
（２）分析開始
（１）で調製した溶離液を用いて、カラム（ＢｉｏＰｒｏ ＩＥＸ ＱＦ陰イオン交換カラム）を装着し、プレートをＨＰＬＣ装置（ＬＣ２０５０Ｃ）にセットし、以下のメソッドで分析を行った。
・分離モード：陰イオン交換
・溶離液：Ａ液，１０ｍＭ ＮａＯＨ
Ｂ液，１０ｍＭ ＮａＯＨ，１Ｍ ＮａＣｌＯ４
・メソッド：２０～９０％ Ｂ（０～２５ｍｉｎ）
２０％ Ｂ（２５～３０ｍｉｎ）
・流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
（１）で調製した溶離液を用いて、カラム（ＢｉｏＰｒｏ ＩＥＸ ＱＦ陰イオン交換カラム）を装着し、プレートをＨＰＬＣ装置（ＬＣ２０５０Ｃ）にセットし、以下のメソッドで分析を行った。
・分離モード：陰イオン交換
・溶離液：Ａ液，１０ｍＭ ＮａＯＨ
Ｂ液，１０ｍＭ ＮａＯＨ，１Ｍ ＮａＣｌＯ４
・メソッド：２０～９０％ Ｂ（０～２５ｍｉｎ）
２０％ Ｂ（２５～３０ｍｉｎ）
・流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
【0052】
〈実験結果〉
ＵＶ照射を行わなかった実験例が比較例（比較例２）であり、ＵＶ照射を行った実験例が実施例（実施例２）である。
比較例２の結果を図４に、実施例２の結果を図５に示す。
光架橋性人工核酸を含む蛍光標識プローブを用いることで、クロマトピークが効果的に検出できた（実施例２）。しかし、ＵＶ照射を行わなかった場合、標的核酸と蛍光標識プローブが共有結合しないため、ＨＰＬＣ分離中に解離してしまい、標的核酸を検出することができなかった（比較例２）。
ＵＶ照射を行わなかった実験例が比較例（比較例２）であり、ＵＶ照射を行った実験例が実施例（実施例２）である。
比較例２の結果を図４に、実施例２の結果を図５に示す。
光架橋性人工核酸を含む蛍光標識プローブを用いることで、クロマトピークが効果的に検出できた（実施例２）。しかし、ＵＶ照射を行わなかった場合、標的核酸と蛍光標識プローブが共有結合しないため、ＨＰＬＣ分離中に解離してしまい、標的核酸を検出することができなかった（比較例２）。
【0053】
［実験例３］ハイブリ特異性による未変化体と代謝物の測り分け
〈ハイブリダイゼーション反応〉
（１）標的核酸の調製
標的核酸（未変化体；Ｔ－ＰＴ１－５’ａ）、標的核酸の３’代謝物（Ｔ－ＰＴ１－５’ａ－３ｎ－１）、及び標的核酸の５’代謝物（Ｔ－ＰＴ１－５ｎ－１）を、それぞれ、０．０１％ツイーン２０を含むＮｕｃｌｅａｓｅフリー水を用いて１５００ｎｇ／ｍＬに調製した。
内部標準核酸（内標核酸；Ｔ－ＩＳ－１６ｍｅｒ）についても同様の溶液で３０００ｎｇ／ｍＬに調製した。
〈ハイブリダイゼーション反応〉
（１）標的核酸の調製
標的核酸（未変化体；Ｔ－ＰＴ１－５’ａ）、標的核酸の３’代謝物（Ｔ－ＰＴ１－５’ａ－３ｎ－１）、及び標的核酸の５’代謝物（Ｔ－ＰＴ１－５ｎ－１）を、それぞれ、０．０１％ツイーン２０を含むＮｕｃｌｅａｓｅフリー水を用いて１５００ｎｇ／ｍＬに調製した。
内部標準核酸（内標核酸；Ｔ－ＩＳ－１６ｍｅｒ）についても同様の溶液で３０００ｎｇ／ｍＬに調製した。
【0054】
（２）プローブの調製
ＦＡＭ５’プローブ（５ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３））、ＲＯＸ３’プローブ（ＲＯＸ－７ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’、ＲＯＸ－８ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’）、及びＣｙ５－ＩＳプローブ（Ｃｙ５－ＩＳ－１６ｍｅｒ（Ｄ））を、ＴＥ緩衝液で５μＭに希釈調製した。同様にＲＯＸ３’プローブ（ＲＯＸ－１０ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’）を、ＴＥ緩衝液で０．５μＭに希釈調製した。
ＦＡＭ５’プローブ（５ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３））、ＲＯＸ３’プローブ（ＲＯＸ－７ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’、ＲＯＸ－８ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’）、及びＣｙ５－ＩＳプローブ（Ｃｙ５－ＩＳ－１６ｍｅｒ（Ｄ））を、ＴＥ緩衝液で５μＭに希釈調製した。同様にＲＯＸ３’プローブ（ＲＯＸ－１０ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’）を、ＴＥ緩衝液で０．５μＭに希釈調製した。
【0055】
（３）ハイブリダイゼーションバッファーの調製
１サンプルあたり内標核酸５μＬ、ＦＡＭ５’プローブ（５ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３））１．４μＬ（終濃度：０．２μＭ）、ＲＯＸ３’プローブ（ＲＯＸ－７ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’ １．４μＬ（終濃度：０．２μＭ）、ＲＯＸ－８ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’ １．４μＬ（終濃度：０．２μＭ）、又はＲＯＸ－１０ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’ １．４μＬ（終濃度：０．０２μＭ））、Ｃｙ５－ＩＳプローブ（Ｃｙ５－ＩＳ－１６ｍｅｒ（Ｄ））１．４μＬ（終濃度：０．２μＭ）、２０×ＳＳＣ ８．７５μＬ（終濃度：５×）、１０×Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ５．２５μＬ（終濃度：１．５×）、１７．５％ ＰＥＧ８０００を含むＮｕｃｌｅａｓｅフリー水 ４μＬ（終濃度：２％）、及び１％ツイーン２０を含むＮｕｃｌｅａｓｅフリー水 ０．３５μＬ（終濃度：０．０１％）を混合し、ＴＥ緩衝液でトータル３０μＬになるように調製した。
１サンプルあたり内標核酸５μＬ、ＦＡＭ５’プローブ（５ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３））１．４μＬ（終濃度：０．２μＭ）、ＲＯＸ３’プローブ（ＲＯＸ－７ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’ １．４μＬ（終濃度：０．２μＭ）、ＲＯＸ－８ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’ １．４μＬ（終濃度：０．２μＭ）、又はＲＯＸ－１０ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’ １．４μＬ（終濃度：０．０２μＭ））、Ｃｙ５－ＩＳプローブ（Ｃｙ５－ＩＳ－１６ｍｅｒ（Ｄ））１．４μＬ（終濃度：０．２μＭ）、２０×ＳＳＣ ８．７５μＬ（終濃度：５×）、１０×Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ５．２５μＬ（終濃度：１．５×）、１７．５％ ＰＥＧ８０００を含むＮｕｃｌｅａｓｅフリー水 ４μＬ（終濃度：２％）、及び１％ツイーン２０を含むＮｕｃｌｅａｓｅフリー水 ０．３５μＬ（終濃度：０．０１％）を混合し、ＴＥ緩衝液でトータル３０μＬになるように調製した。
【0056】
（４）ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションバッファーを３０μＬずつ９６ウェルプレート（Ｈａｒｄ－Ｓｈｅｌｌ ９６ウェルスカート付きＰＣＲプレート）に添加し、測定対象核酸（未変化体及び代謝物）を５μＬ添加した。プレートシール（ＲＡＰＩＤ Ｓｌｉｔ Ｓｅａｌ）で表面をシートし、４２０×ｇで１分間遠心した後、サーモミキサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｍｉｘｅｒ ｃｏｍｆｏｒｔ）で２５℃、８００ｒｐｍ、１時間反応させた。
ハイブリダイゼーションバッファーを３０μＬずつ９６ウェルプレート（Ｈａｒｄ－Ｓｈｅｌｌ ９６ウェルスカート付きＰＣＲプレート）に添加し、測定対象核酸（未変化体及び代謝物）を５μＬ添加した。プレートシール（ＲＡＰＩＤ Ｓｌｉｔ Ｓｅａｌ）で表面をシートし、４２０×ｇで１分間遠心した後、サーモミキサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｍｉｘｅｒ ｃｏｍｆｏｒｔ）で２５℃、８００ｒｐｍ、１時間反応させた。
【0057】
〈ＵＶ照射による光架橋〉
ハイブリダイゼーション反応を行ったプレートのシールを剥がし、紫外線照射スタンド下で１０分間静置し、光架橋させた。
ハイブリダイゼーション反応を行ったプレートのシールを剥がし、紫外線照射スタンド下で１０分間静置し、光架橋させた。
【0058】
〈ＨＰＬＣ分析〉
（１）溶離液（Ａ液，Ｂ液）の調製
溶離液Ａ液及びＢ液を次の通り調製した。
Ｂ液はＴｒｉｓ９．６９ｇ及び過塩素酸ナトリウム４８９．７６ｇを秤量し、ミリＱ水約３Ｌに溶解したのち１Ｍ ＨＣｌでｐＨを８．１に調整した。その後、４ＬまでミリＱ水でメスアップしたのち、孔径０．２μｍのボトルトップフィルターでフィルトレーションを行い、超音波処理を１５分間行い脱気した。
Ａ液はＢ液から過塩素酸ナトリウムを除いたものであり、方法はＢ液の方法に過塩素酸ナトリウムの添加を省いたものである。
組成：Ａ液 ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．１
Ｂ液 ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１Ｍ ＮａＣｌＯ４，ｐＨ８．１
（１）溶離液（Ａ液，Ｂ液）の調製
溶離液Ａ液及びＢ液を次の通り調製した。
Ｂ液はＴｒｉｓ９．６９ｇ及び過塩素酸ナトリウム４８９．７６ｇを秤量し、ミリＱ水約３Ｌに溶解したのち１Ｍ ＨＣｌでｐＨを８．１に調整した。その後、４ＬまでミリＱ水でメスアップしたのち、孔径０．２μｍのボトルトップフィルターでフィルトレーションを行い、超音波処理を１５分間行い脱気した。
Ａ液はＢ液から過塩素酸ナトリウムを除いたものであり、方法はＢ液の方法に過塩素酸ナトリウムの添加を省いたものである。
組成：Ａ液 ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．１
Ｂ液 ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１Ｍ ＮａＣｌＯ４，ｐＨ８．１
【0059】
（２）分析開始
（１）で調製した溶離液（Ａ液，Ｂ液）を用いて、カラム（ＢｉｏＰｒｏ ＩＥＸ ＱＦ陰イオン交換カラム）を装着し、プレートをＨＰＬＣ装置（ＬＣ２０５０Ｃ）にセットし、以下のメソッドで分析を行った。
・分離モード：陰イオン交換
・溶離液：Ａ液，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．１
Ｂ液，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．１，１Ｍ ＮａＣｌＯ４
・メソッド：２０～５０％ Ｂ（０～７．５ｍｉｎ）
５０～９０％ Ｂ（７．５～８．５ｍｉｎ）
９０％ Ｂ（８．５～１０．５ｍｉｎ）
２０％ Ｂ（１０．５～１４．５ｍｉｎ）
・流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
（１）で調製した溶離液（Ａ液，Ｂ液）を用いて、カラム（ＢｉｏＰｒｏ ＩＥＸ ＱＦ陰イオン交換カラム）を装着し、プレートをＨＰＬＣ装置（ＬＣ２０５０Ｃ）にセットし、以下のメソッドで分析を行った。
・分離モード：陰イオン交換
・溶離液：Ａ液，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．１
Ｂ液，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．１，１Ｍ ＮａＣｌＯ４
・メソッド：２０～５０％ Ｂ（０～７．５ｍｉｎ）
５０～９０％ Ｂ（７．５～８．５ｍｉｎ）
９０％ Ｂ（８．５～１０．５ｍｉｎ）
２０％ Ｂ（１０．５～１４．５ｍｉｎ）
・流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
【0060】
〈実験結果〉
標的核酸（未変化体；Ｔ－ＰＴ１－５’ａ）とＦＡＭ５’プローブ（５ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３））１．４μＬ（終濃度：０．２μＭ）及びＲＯＸ３’プローブ（ＲＯＸ－７ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’）１．４μＬ（終濃度：０．２μＭ）とを用いた実験例（実施例３－１）の結果を図６に示す。
標的核酸（未変化体；Ｔ－ＰＴ１－５’ａ）とＦＡＭ５’プローブ（５ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３））１．４μＬ（終濃度：０．２μＭ）及びＲＯＸ３’プローブ（ＲＯＸ－７ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’）１．４μＬ（終濃度：０．２μＭ）とを用いた実験例（実施例３－１）の結果を図６に示す。
【0061】
標的核酸（５’代謝物；Ｔ－ＰＴ１－５ｎ－１）とＦＡＭ５’プローブ（５ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３））１．４μＬ（終濃度：０．２μＭ）及びＲＯＸ３’プローブ（ＲＯＸ－７ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’）１．４μＬ（終濃度：０．２μＭ）とを用いた実験例（実施例３－２）の結果を図７に示す。
【0062】
標的核酸（３’代謝物；Ｔ－ＰＴ１－５’ａ－３ｎ－１）とＦＡＭ５’プローブ（５ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３））１．４μＬ（終濃度：０．２μＭ）及びＲＯＸ３’プローブ（ＲＯＸ－７ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’）１．４μＬ（終濃度：０．２μＭ）とを用いた実験例（実施例３－３）の結果を図８に示す。
【0063】
標的核酸（未変化体；Ｔ－ＰＴ１－５’ａ）とＦＡＭ５’プローブ（５ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３））１．４μＬ（終濃度：０．２μＭ）及びＲＯＸ３’プローブ（ＲＯＸ－８ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’）１．４μＬ（終濃度：０．２μＭ）とを用いた実験例（実施例３－４）の結果を図９に示す。
【0064】
標的核酸（３’代謝物；Ｔ－ＰＴ１－５’ａ－３ｎ－１）とＦＡＭ５’プローブ（５ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３））１．４μＬ（終濃度：０．２μＭ）及びＲＯＸ３’プローブ（ＲＯＸ－８ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’）１．４μＬ（終濃度：０．２μＭ）とを用いた実験例（実施例３－５）の結果を図１０に示す。
【0065】
標的核酸（未変化体；Ｔ－ＰＴ１－５’ａ）とＦＡＭ５’プローブ（５ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３））１．４μＬ（終濃度：０．２μＭ）及びＲＯＸ３’プローブ（ＲＯＸ－１０ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’）１．４μＬ（終濃度：０．０２μＭ）とを用いた実験例（実施例３－６）の結果を図１１に示す。
【0066】
標的核酸（３’代謝物；Ｔ－ＰＴ１－５’ａ－３ｎ－１）とＦＡＭ５’プローブ（５ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３））１．４μＬ（終濃度：０．２μＭ）及びＲＯＸ３’プローブ（ＲＯＸ－１０ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’）１．４μＬ（終濃度：０．０２μＭ）とを用いた実験例（実施例３－７）の結果を図１２に示す。
【0067】
実験例３－１（標的核酸の未変化体を用いた実験例）では、図６に示すとおり、ＦＡＭ及びＲＯＸのいずれのピークも検出された。
【0068】
実験例３－２（標的核酸の５’代謝物を用いた実験例）では、図７に示すとおり、ＲＯＸのピークのみ検出され、ＦＡＭのピークは検出されなかった。
【0069】
実験例３－３（標的核酸の３’代謝物を用いた実験例）では、図８に示すとおり、ＦＡＭのピークのみ検出され、ＲＯＸのピークは検出されなかった。
【0070】
実施例３－４（標的核酸の未変化体を用いた実験例）では、図９に示すとおり、ＦＡＭ及びＲＯＸのいずれのピークも検出された。
【0071】
実施例３－５（標的核酸の３’代謝物を用いた実験例）では、図１０に示すとおり、ＦＡＭのピークのみ検出され、ＲＯＸのピークは検出されなかった。
【0072】
実施例３－６（標的核酸を用いた実験例）では、図１１に示すとおり、ＦＡＭ及びＲＯＸのいずれのピークも検出された。
【0073】
実施例３－７（標的核酸の３’代謝物を用いた実験例）では、図１２に示すとおり、ＦＡＭのピークのみ検出され、ＲＯＸのピークは検出されなかった。
【0074】
以上の結果からわかるとおり、未変化体に特異的な蛍光標識プローブ（ＦＡＭ５’プローブ、ＲＯＸ３’プローブ）は１塩基のみが欠損している５’代謝物、及び３’代謝物には欠損側に対応する蛍光標識プローブは結合せず、未変化体にのみに５’及び３’側に対応する蛍光標識プローブの両方がハイブリダイズすることで、代謝物と未変化体とを精度よく区別して測定できることが示唆された。
【0075】
［実験例４］ラット血漿を用いて調製したサンプルの測定
〈ハイブリダイゼーション反応〉
（１）標的核酸の調製
標的核酸（未変化体；Ｔ－ＰＴ１－５’ａ）、標的核酸の５’代謝物（Ｔ－ＰＴ１－５’ａ－３ｎ－１）、及び標的核酸の３’代謝物（Ｔ－ＰＴ１－５ｎ－１）を、それぞれ、０．０１％ツイーン２０を含むＮｕｃｌｅａｓｅフリー水を用いて１００μｇ／ｍＬに調製した。
内部標準核酸（内標核酸；Ｔ－ＩＳ－１６ｍｅｒ）についても同様の溶液で１０μｇ／ｍＬに調製した。
〈ハイブリダイゼーション反応〉
（１）標的核酸の調製
標的核酸（未変化体；Ｔ－ＰＴ１－５’ａ）、標的核酸の５’代謝物（Ｔ－ＰＴ１－５’ａ－３ｎ－１）、及び標的核酸の３’代謝物（Ｔ－ＰＴ１－５ｎ－１）を、それぞれ、０．０１％ツイーン２０を含むＮｕｃｌｅａｓｅフリー水を用いて１００μｇ／ｍＬに調製した。
内部標準核酸（内標核酸；Ｔ－ＩＳ－１６ｍｅｒ）についても同様の溶液で１０μｇ／ｍＬに調製した。
【0076】
（２）プローブの調製
ＦＡＭ５’プローブ（５ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３））、ＲＯＸ３’プローブ（ＲＯＸ－８ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’）、及びＣｙ５－ＩＳプローブ（Ｃｙ５－ＩＳ－１６ｍｅｒ（Ｄ））を、ＴＥ緩衝液で５０μＭに希釈調製した。
ＦＡＭ５’プローブ（５ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３））、ＲＯＸ３’プローブ（ＲＯＸ－８ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’）、及びＣｙ５－ＩＳプローブ（Ｃｙ５－ＩＳ－１６ｍｅｒ（Ｄ））を、ＴＥ緩衝液で５０μＭに希釈調製した。
【0077】
（３）添加血漿の調製
（１）で１００μｇ／ｍＬに調製した的核酸（未変化体；Ｔ－ＰＴ１－５’ａ）、標的核酸の５’代謝物（Ｔ－ＰＴ１－５’ａ－３ｎ－１）、及び標的核酸の３’代謝物（Ｔ－ＰＴ１－５ｎ－１）を、それぞれ、プールラットＥＤＴＡ血漿で１μｇ／ｍＬに希釈調製した。
（１）で１００μｇ／ｍＬに調製した的核酸（未変化体；Ｔ－ＰＴ１－５’ａ）、標的核酸の５’代謝物（Ｔ－ＰＴ１－５’ａ－３ｎ－１）、及び標的核酸の３’代謝物（Ｔ－ＰＴ１－５ｎ－１）を、それぞれ、プールラットＥＤＴＡ血漿で１μｇ／ｍＬに希釈調製した。
【0078】
（４）Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ処理液の調製
ＤｉｒｅｃｔＰＣＲ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔａｉｌ）３５．５μＬ、１０％ＳＤＳ溶液３５．５μＬ（終濃度：２％）、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ ３５．５ μＬ（終濃度：１／２０）及び１０ μｇ／ｍＬ内標核酸（Ｔ－ＩＳ－１６ｍｅｒ）３５．５ μＬ（終濃度：０．４ μｇ／ｍＬ）を混合し（総量５０μＬ）、調製した。
ＤｉｒｅｃｔＰＣＲ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔａｉｌ）３５．５μＬ、１０％ＳＤＳ溶液３５．５μＬ（終濃度：２％）、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ ３５．５ μＬ（終濃度：１／２０）及び１０ μｇ／ｍＬ内標核酸（Ｔ－ＩＳ－１６ｍｅｒ）３５．５ μＬ（終濃度：０．４ μｇ／ｍＬ）を混合し（総量５０μＬ）、調製した。
【0079】
（５）Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ処理法
添加血漿５０μＬにＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ処理液５０ｕＬを添加後、サーモミキサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｍｉｘｅｒ Ｆ１．５）で５５℃、１５００ｒｐｍ、１時間反応させた。
添加血漿５０μＬにＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ処理液５０ｕＬを添加後、サーモミキサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｍｉｘｅｒ Ｆ１．５）で５５℃、１５００ｒｐｍ、１時間反応させた。
【0080】
（６）ＳＤＳ沈殿法
３Ｍ ＫＣｌを２０μＬ添加後、５分間氷冷下で静置した。静置後、遠心分離（１００００×ｇ，２５℃，５分間）し、上清６０μＬを９６ウェルプレート（ＤＮＡ Ｌｏｂｉｎｄ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ９６／Ｖ－ＰＰ）に採取した。
３Ｍ ＫＣｌを２０μＬ添加後、５分間氷冷下で静置した。静置後、遠心分離（１００００×ｇ，２５℃，５分間）し、上清６０μＬを９６ウェルプレート（ＤＮＡ Ｌｏｂｉｎｄ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ９６／Ｖ－ＰＰ）に採取した。
【0081】
（７）ハイブリダイゼーションバッファーの調製
２０×ＳＳＣ １６．５μＬ（終濃度：３×）、５０μＭ ＦＡＭ５’プローブ（５ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３））０．５μＬ（終濃度：０．４μＭ）、５０μＭ ＲＯＸ３’プローブ（ＲＯＸ－８ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’）０．５μＬ（終濃度：０．４μＭ）、及び５０μＭ Ｃｙ５－ＩＳプローブ（Ｃｙ５－ＩＳ－１６ｍｅｒ（Ｄ））０．５μＬ（終濃度：０．４μＭ）を混合し、０．０１％ツイーン２０を含むＮｕｃｌｅａｓｅフリー水で全量５０μＬになるように調製した。
２０×ＳＳＣ １６．５μＬ（終濃度：３×）、５０μＭ ＦＡＭ５’プローブ（５ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３））０．５μＬ（終濃度：０．４μＭ）、５０μＭ ＲＯＸ３’プローブ（ＲＯＸ－８ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’）０．５μＬ（終濃度：０．４μＭ）、及び５０μＭ Ｃｙ５－ＩＳプローブ（Ｃｙ５－ＩＳ－１６ｍｅｒ（Ｄ））０．５μＬ（終濃度：０．４μＭ）を混合し、０．０１％ツイーン２０を含むＮｕｃｌｅａｓｅフリー水で全量５０μＬになるように調製した。
【0082】
（８）ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションバッファーを５０μＬずつ９６ウェルプレート（ＤＮＡ Ｌｏｂｉｎｄ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ９６／Ｖ－ＰＰ）に添加した。プレートシール（Ａｄｈｅｓｉｖｅ ＰＣＲ Ｐｌａｔｅ Ｓｅａｌｓ）で表面をシートし、恒温槽（乾熱滅菌器（ＳＧ４００））で９５℃、５分間反応させた後、サーモミキサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｍｉｘｅｒ ｃｏｍｆｏｒｔ）で２５℃、９００ｒｐｍ、１時間反応させた。
ハイブリダイゼーションバッファーを５０μＬずつ９６ウェルプレート（ＤＮＡ Ｌｏｂｉｎｄ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ９６／Ｖ－ＰＰ）に添加した。プレートシール（Ａｄｈｅｓｉｖｅ ＰＣＲ Ｐｌａｔｅ Ｓｅａｌｓ）で表面をシートし、恒温槽（乾熱滅菌器（ＳＧ４００））で９５℃、５分間反応させた後、サーモミキサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｍｉｘｅｒ ｃｏｍｆｏｒｔ）で２５℃、９００ｒｐｍ、１時間反応させた。
【0083】
〈ＵＶ照射による光架橋〉
ハイブリダイゼーション反応を行ったプレートのシールを剥がし、液を別の９６ウェルプレート（Ｈａｒｄ－Ｓｈｅｌｌ ９６ウェルスカート付きＰＣＲプレート）に移し、紫外線照射スタンド下で１０分間静置し、光架橋させた。
ハイブリダイゼーション反応を行ったプレートのシールを剥がし、液を別の９６ウェルプレート（Ｈａｒｄ－Ｓｈｅｌｌ ９６ウェルスカート付きＰＣＲプレート）に移し、紫外線照射スタンド下で１０分間静置し、光架橋させた。
【0084】
〈ＨＰＬＣ分析〉
（１）溶離液（Ａ液，Ｂ液）の調製
溶離液Ａ液及びＢ液を次の通り調製した。
Ｂ液はＴｒｉｓ９．６９ｇ及び過塩素酸ナトリウム４８９．７６ｇを秤量し、ミリＱ水約３Ｌに溶解したのち１Ｍ ＨＣｌでｐＨを８．１に調整した。その後、４ＬまでミリＱ水でメスアップしたのち、孔径０．２μｍのボトルトップフィルターでフィルトレーションを行い、超音波処理を１５分間行い脱気した。
Ａ液はＢ液から過塩素酸ナトリウムを除いたものであり、方法はＢ液の方法に過塩素酸ナトリウムの添加を省いたものである。
組成：Ａ液 ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．１
Ｂ液 ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．１，１Ｍ ＮａＣｌＯ４
（１）溶離液（Ａ液，Ｂ液）の調製
溶離液Ａ液及びＢ液を次の通り調製した。
Ｂ液はＴｒｉｓ９．６９ｇ及び過塩素酸ナトリウム４８９．７６ｇを秤量し、ミリＱ水約３Ｌに溶解したのち１Ｍ ＨＣｌでｐＨを８．１に調整した。その後、４ＬまでミリＱ水でメスアップしたのち、孔径０．２μｍのボトルトップフィルターでフィルトレーションを行い、超音波処理を１５分間行い脱気した。
Ａ液はＢ液から過塩素酸ナトリウムを除いたものであり、方法はＢ液の方法に過塩素酸ナトリウムの添加を省いたものである。
組成：Ａ液 ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．１
Ｂ液 ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．１，１Ｍ ＮａＣｌＯ４
【0085】
（２）分析開始
（１）で調製した溶離液（Ａ液，Ｂ液）を用いて、カラム（ＢｉｏＰｒｏ ＩＥＸ ＱＦ陰イオン交換カラム）を装着し、プレートをＨＰＬＣ装置（ＬＣ２０５０Ｃ）にセットし、以下のメソッドで分析を行った。
・分離モード：陰イオン交換
・溶離液：Ａ液，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．１
Ｂ液，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．１，１Ｍ ＮａＣｌＯ４
・メソッド：２０～５０％ Ｂ（０～７．５ｍｉｎ）
５０～９０％ Ｂ（７．５～８．５ｍｉｎ）
９０％ Ｂ（８．５～１０．５ｍｉｎ）
２０％ Ｂ（１０．５～１４．５ｍｉｎ）
・流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
（１）で調製した溶離液（Ａ液，Ｂ液）を用いて、カラム（ＢｉｏＰｒｏ ＩＥＸ ＱＦ陰イオン交換カラム）を装着し、プレートをＨＰＬＣ装置（ＬＣ２０５０Ｃ）にセットし、以下のメソッドで分析を行った。
・分離モード：陰イオン交換
・溶離液：Ａ液，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．１
Ｂ液，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．１，１Ｍ ＮａＣｌＯ４
・メソッド：２０～５０％ Ｂ（０～７．５ｍｉｎ）
５０～９０％ Ｂ（７．５～８．５ｍｉｎ）
９０％ Ｂ（８．５～１０．５ｍｉｎ）
２０％ Ｂ（１０．５～１４．５ｍｉｎ）
・流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
【0086】
〈実験結果〉
標的核酸（未変化体：Ｔ－ＰＴ１－５’ａ）とＦＡＭ５’プローブ（５ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３））０．５μＬ（終濃度：０．４μＭ）及びＲＯＸ’プローブ（ＲＯＸ－８ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’）０．５μＬ（終濃度：０．４μＭ）とを用いた実験例（実施例４－１）の結果を図１３に示す。
標的核酸（未変化体：Ｔ－ＰＴ１－５’ａ）とＦＡＭ５’プローブ（５ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３））０．５μＬ（終濃度：０．４μＭ）及びＲＯＸ’プローブ（ＲＯＸ－８ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’）０．５μＬ（終濃度：０．４μＭ）とを用いた実験例（実施例４－１）の結果を図１３に示す。
【0087】
標的核酸（５’代謝物；Ｔ－ＰＴ１－５ｎ－１）とＦＡＭ５’プローブ（５ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３））０．５μＬ（終濃度：０．４μＭ）及びＲＯＸ３’プローブ（ＲＯＸ－８ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’）０．５μＬ（終濃度：０．４μＭ）とを用いた実験例（実施例４－２）の結果を図１４に示す。
【0088】
標的核酸（３’代謝物；Ｔ－ＰＴ１－５’ａ－３ｎ－１）とＦＡＭ５’プローブ（５ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３））０．５μＬ（終濃度：０．４μＭ）及びＲＯＸ３’プローブ（ＲＯＸ－８ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’）０．５μＬ（終濃度：０．４μＭ）とを用いた実験例（実施例４－３）の結果を図１５に示す。
【0089】
実施例４－１（標的核酸の未変化体を用いた実験例）では、図１３に示すとおり、ＦＡＭ及びＲＯＸのいずれのピークも検出された。
【0090】
実施例４－２（標的核酸の５’代謝物を用いた実験例）では、図１４に示すとおり、ＲＯＸのピークのみ検出され、ＦＡＭのピークは検出されなかった。
【0091】
実施例４－３（標的核酸の３’代謝物を用いた実験例）では、図１５に示すとおり、ＦＡＭのピークのみ検出され、ＲＯＸのピークは検出されなかった。
【0092】
以上の結果からわかるとおり、ラット血漿を実サンプルとして用いた場合であっても、未変化体に特異的な蛍光標識プローブ（ＦＡＭ５’プローブ、ＲＯＸ３’プローブ）は１塩基のみが欠損している５’代謝物、及び３’代謝物には欠損側に対応する蛍光標識プローブは結合せず、未変化体にのみに５’及び３’側に対応する蛍光標識プローブの両方がハイブリダイズすることで、代謝物と未変化体とを精度よく区別して測定できることが示唆された。
【0093】
［実験例５］ＣＮＶ－Ｋを挿入した蛍光標識プローブを用いた測定
〈実験の概要〉
ＲＯＸ３’プローブとして、ＲＯＸ－８ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’（配列番号９）に代えて、ＲＯＸ－８ｍｅｒ（３Ｌ１Ｋ）－３’（配列番号１０）を使用したこと以外は、実験例３と同様に処理をして、ＨＰＬＣ分析を行った。
〈実験の概要〉
ＲＯＸ３’プローブとして、ＲＯＸ－８ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－３’（配列番号９）に代えて、ＲＯＸ－８ｍｅｒ（３Ｌ１Ｋ）－３’（配列番号１０）を使用したこと以外は、実験例３と同様に処理をして、ＨＰＬＣ分析を行った。
【0094】
〈実験結果〉
標的核酸（未変化体：Ｔ－ＰＴ１－５’ａ）とＦＡＭ５’プローブ（５ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３））０．５μＬ（終濃度：０．４μＭ）及びＲＯＸ’プローブ（ＲＯＸ－８ｍｅｒ（３Ｌ１Ｋ）－３’）０．５μＬ（終濃度：０．４μＭ）とを用いた実験例（実施例５－１）の結果を図１６に示す。
標的核酸（未変化体：Ｔ－ＰＴ１－５’ａ）とＦＡＭ５’プローブ（５ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３））０．５μＬ（終濃度：０．４μＭ）及びＲＯＸ’プローブ（ＲＯＸ－８ｍｅｒ（３Ｌ１Ｋ）－３’）０．５μＬ（終濃度：０．４μＭ）とを用いた実験例（実施例５－１）の結果を図１６に示す。
【0095】
標的核酸（５’代謝物；Ｔ－ＰＴ１－５ｎ－１）とＦＡＭ５’プローブ（５ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３））０．５μＬ（終濃度：０．４μＭ）及びＲＯＸ３’プローブ（ＲＯＸ－７ｍｅｒ（３Ｌ１Ｋ）－３’）０．５μＬ（終濃度：０．４μＭ）とを用いた実験例（実施例５－２）の結果を図１７に示す。
【0096】
標的核酸（３’代謝物；Ｔ－ＰＴ１－５’ａ－３ｎ－１）とＦＡＭ５’プローブ（５ｍｅｒ（３Ｌ１Ｄ）－５’－ＦＡＭ（３））０．５μＬ（終濃度：０．４μＭ）及びＲＯＸ３’プローブ（ＲＯＸ－７ｍｅｒ（３Ｌ１Ｋ）－３’）０．５μＬ（終濃度：０．４μＭ）とを用いた実験例（実施例５－３）の結果を図１８に示す。
【0097】
実施例５－１（標的核酸の未変化体を用いた実験例）では、図１６に示すとおり、ＦＡＭ及びＲＯＸのいずれのピークも検出された。
【0098】
実施例５－２（標的核酸の５’代謝物を用いた実験例）では、図１７に示すとおり、ＲＯＸのピークのみ検出され、ＦＡＭのピークは検出されなかった。
【0099】
実施例５－３（標的核酸の３’代謝物を用いた実験例）では、図１８に示すとおり、ＦＡＭのピークのみ検出され、ＲＯＸのピークは検出されなかった。
【0100】
以上の結果からわかるとおり、ＣＮＶ－Ｋを挿入した蛍光標識プローブを用いた場合であっても、実施例３－１から実施例３－３までと同様に、未変化体に特異的な蛍光標識プローブ（ＦＡＭ５’プローブ、ＲＯＸ３’プローブ）は１塩基のみが欠損している５’代謝物、及び３’代謝物には欠損側に対応する蛍光標識プローブは結合せず、未変化体にのみに５’及び３’側に対応する蛍光標識プローブの両方がハイブリダイズすることで、代謝物と未変化体とを精度よく区別して測定できることが示唆された。
【0101】
［配列一覧］
本明細書に開示した核酸配列を以下の表に示す。
本明細書に開示した核酸配列を以下の表に示す。
【0102】
【表1】
【産業上の利用可能性】
【0103】
本発明の核酸測定方法は、例えば核酸医薬品の薬物動態解析において有用である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】