特許 7668411 無傷のタンパク質レベルでのＬＣ－ＭＳに基づくＨｂＡ１ｃ測定の自動化試料ワークフロー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-04-16

(45)【発行日】2025-04-24

(54)【発明の名称】無傷のタンパク質レベルでのＬＣ－ＭＳに基づくＨｂＡ１ｃ測定の自動化試料ワークフロー

(51)【国際特許分類】

   G01N 27/62 20210101AFI20250417BHJP

   G01N 33/483 20060101ALI20250417BHJP

   G01N 30/06 20060101ALI20250417BHJP

   G01N 30/26 20060101ALI20250417BHJP

【ＦＩ】

G01N27/62 V

G01N27/62 X

G01N33/483 E

G01N30/06 Z

G01N30/26 A

【請求項の数】 14

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024089775

(22)【出願日】2024-06-03

(62)【分割の表示】P 2021541225の分割

【原出願日】2020-01-16

(65)【公開番号】P2024113021

(43)【公開日】2024-08-21

【審査請求日】2024-06-03

(31)【優先権主張番号】19152310.9

(32)【優先日】2019-01-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】591003013

【氏名又は名称】エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100157923

【弁理士】

【氏名又は名称】鶴喰 寿孝

(72)【発明者】

【氏名】コボルト，ウーベ

(72)【発明者】

【氏名】ライネンバッハ，アンドレアス

(72)【発明者】

【氏名】ミトラ，インドラニル

(72)【発明者】

【氏名】ブスカンプ，ホルガー

【審査官】嶋田 行志

(56)【参考文献】

【文献】特開昭６１－２８０５７１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表平０５－５００１１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許第０５６７４６９９（ＵＳ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１８／００３１５７８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】中国特許出願公開第１０５４４５４０９（ＣＮ，Ａ）

【文献】Analysis and Quantitation of Glycated Hemoglobin by Matrix Assisted Lase Desorption/Ionization Time，Journal of American Society for Mass Spectrometry，American Scoiety for Mass Spectrometry，2016年01月05日，Volume 27, Issue 3，Pages 532-541，doi: 10.1007/s13361-015-1316-6

【文献】Approved IFCC Reference Method for the Measurement of HbA1c in Human Blood，Clinical Chemistry and Laboratory Medcine，Vol. 40, No. 1，Walter de Gruyter GmbH & Co. KG，2005年06月01日，pp. 79-89，doi: 10.1515/CCLM.2002.016

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ２７／６０－Ｇ０１Ｎ ２７／７０

Ｇ０１Ｎ ２７／９２

Ｇ０１Ｎ ３３／４８－Ｇ０１Ｎ ３３／９８

Ｇ０１Ｎ ３０／００－Ｇ０１Ｎ ３０／９６

Ｇ０１Ｎ １／００－Ｇ０１Ｎ １／４４

Ｇ０１Ｎ １５／００－Ｇ０１Ｎ １５／１４９２

Ｃ１２Ｑ １／００－Ｃ１２Ｑ ３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＪＳＴＣｈｉｎａ（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｒｅｃｔ

Ｎａｔｕｒｅ

Ｓｃｉｅｎｃｅ

Ｏｘｆｏｒｄ Ｊｏｕｒｎａｌｓ

ＰｕｂＭｅｄ

ＡＣＳ ＰＵＢＬＩＣＡＴＩＯＮＳ

ＫＡＫＥＮ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料中の糖化ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ１ｃ）を決定するための方法であって、
（ａ）ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）分子を含む試料を用意する工程、
（ｂ）前記試料中の未消化のヘモグロビンＡβ鎖分子を、ヘモグロビンＡα鎖分子に対して富化する工程、該富化工程（ｂ）が、
未消化のヘモグロビンＡβ鎖分子が固体相に結合する条件下で、試料をヘモグロビンＡのβ鎖の選択的結合のための表面を有する固体相に接触させる工程、および結合した断片を固体相から選択的に溶出する工程を含む第１の富化工程（ｂ）（ｉ）
を含み、そして
（ｃ）未消化のヘモグロビンＡβ鎖分子を含む試料に質量分析（ＭＳ）による分析を施す工程であって、試料中のＨｂＡ１ｃ分子の量または濃度が決定される、工程
を含む方法。

【請求項2】

工程（ａ）における試料が、溶血した全血試料、または溶血したヒト全血試料である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

富化工程（ｂ）において、未消化のヘモグロビンＡβ鎖分子が、アルブミン分子に対しても富化されている、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

富化工程（ｂ）において、未消化のヘモグロビンＡβ鎖分子が、少なくとも１０倍、ヘモグロビンＡα鎖分子に対して富化されている、かつ／または未消化のヘモグロビンＡβ鎖分子が、少なくとも１０倍、アルブミン分子に対して富化されている、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

工程（ｃ）が、未消化のヘモグロビンＡβ鎖分子の分析を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

未消化のヘモグロビンＡ分子のβ鎖に、プロテアーゼによる消化が施されていない、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

工程（ｃ）が、ヘモグロビンＡのα鎖および／またはβ鎖の分析を含む、請求項５または６に記載の方法。

【請求項8】

ヘモグロビンＡのα鎖および／またはβ鎖に、プロテアーゼによる消化が施されていない、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

非糖化ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ０）または全ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）に対する糖化ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ１ｃ）の比が決定される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

比が、２．５％以下または２．０％以下の変動係数（ＣＶ）で決定される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法に用いるキットであって、
（ｉ）未消化の糖化ＨｂＡ１ｃβ鎖分子の選択的結合のための疎水性表面を有する固体相を含む、未消化の糖化ＨｂＡ１ｃβ鎖分子を富化するための富化手段、
（ｉｉ）溶血全血試料を希釈し、試料構成成分を固体相（ｉ）に結合させる際に使用するためのｐＨ５～７の固体相結合媒体、および
（ｉｉｉ）富化手段（ｉ）から試料成分を溶出する際に使用するための、水混和性有機溶媒を含む溶出媒体
を含むキット。

【請求項12】

溶出媒体が５０％（ｖ／ｖ）の量の水混和性有機溶媒を含む、請求項１１に記載のキット。

【請求項13】

水混和性有機溶媒はアセトニトリルである、請求項１１または１２に記載のキット。

【請求項14】

請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法に用いる、試料中の糖化ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ１ｃ）を決定するための診断システムであって、
（ｉ）全血試料の溶血を含む、未消化のＨｂＡ１ｃ分子を含む試料を調製するための少なくとも１つのステーション、
（ｉｉ）試料から、未消化のヘモグロビンＡβ鎖分子を選択的に富化するように適合されている少なくとも１つの富化ステーションであって、未消化の糖化ＨｂＡ１ｃβ鎖分子の選択的結合のための疎水性表面を有する固体相を含む、富化ステーション、ならびに
（ｉｉｉ）質量分析（ＭＳ）により未消化のヘモグロビンＡβ鎖分子を分析し、試料中のＨｂＡ１ｃの量または濃度を決定するように適合されている少なくとも１つのステーション
を含む診断システム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、質量分析（ＭＳ）による無傷の糖化ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ１ｃ）分子を決定するための方法、キットおよび本方法を実施するように適合されている診断システムを指す。

【背景技術】

【0002】

循環血中グルコースレベルの制御の障害は、糖尿病の指標である。血糖は、非酵素的な統計的プロセスで、ポリペプチドのリジン残基に結合し、これにより糖化ポリペプチドをもたらす恐れがある。ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）の場合、グルコースとβ鎖のＮ末端との間に反応が起こる。生じた糖化ヘモグロビンＡβ鎖は、ＨｂＡ１ｃと表される。

【0003】

ＨｂＡ１ｃは、ヒト血液中の主要な糖化ヘモグロビン種である。包括的な糖尿病の管理および合併症の治験（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｔｒｉａｌ：ＤＣＣＴ）は、網膜症、腎障害および神経症などの合併症が、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）を有する患者において高血糖の程度に直接、関係するという証拠を提示し、血液中のＨｂＡ１ｃの測定が、糖尿病患者の血糖状態を長期間にわたりモニタリングする優れた手段となることを示した（Ｎａｔｈａｎら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ ３２９巻（１９９３年）９７７～９８６頁；Ｓａｎｔｉａｇｏ，Ｊ．Ｖ．、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４２巻（１９９３年）１５４９～１５５４頁；Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｊ．およびＳａｃｋｓ，Ｄ．Ｂ．、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４０巻（１９９４年）６８３～６８７頁；およびＧｏｌｄｓｔｅｉｎ Ｄ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ４０巻（１９９４年）１６３７～１６４０頁）。ＤＣＣＴの検討により、それぞれ、ＨｂＡ１ｃおよびＨｂＡ０（すなわち非糖化ヘモグロビン）の信頼性の高いかつ再現性の高い測定の必要性がまた明確に実証された。

【0004】

糖化ヘモグロビンを決定する様々な方法、すなわちクロマトグラフィーおよび／または質量分析（ＭＳ）、化学的方法ならびに免疫学的方法を含めた、物理化学的方法が多数、存在する。国際臨床化学連合（ＩＦＣＣ）により承認を受けているヒト血液中のＨｂＡ１ｃの測定に関する基準法は、１８～２０時間の期間、酵素のエンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃによる、ヘモグロビンのペプチドへの酵素による切断、その後のＨＰＬＣおよびエレクトロスプレーイオン化質量分析によって、またはＵＶ検出を備えるＨＰＬＣおよびキャピラリー電気泳動を使用する二次元手法での、β鎖の糖化Ｎ末端ヘキサペプチドおよび非糖化Ｎ末端ヘキサペプチドの分離および定量を含む（Ｊｅｐｐｓｓｏｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．４０巻（２００２年）、７８～８９頁）。

【0005】

しかし、ヘモグロビンＡの酵素消化を含む方法は、通常、十分な量の切断生成物を得て、こうして安定な測定シグナルを得るために、一晩のインキュベートを必要とする。さらに、試料にＭＳ検出を施す前に、従来のクロマトグラフィーを用いるマトリックス成分を含む複合体ペプチド混合物の分離が必要である。したがって、これらの方法は、患者の試料をハイスループット測定するには、時間を要し、使用には制限がある。

【0006】

無傷のヘモグロビン分子を使用するＭＳによる糖化ヘモグロビンを決定するいくつかの試みが記載されている。Roberts et al. (Clin. Chem. 43 (1997), 771-778)によれば、
全血試料を水で５０倍に希釈し、次いで、ギ酸およびアセトニトリルを含む酸性変性溶媒でさらに希釈し、陽イオンモードで操作した質量分析計のエレクトロスプレー源に直接導入した。得られたスペクトルは、試料中の糖化ヘモグロビンの割合を決定するために処理
された。

【0007】

Biroccio et al. (Anal. Biochem. 336 (2005), 279-288)は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型ＭＳにより、無傷の糖化ヘモグロビンおよびグルタチオニル化ヘモグロビンを分析するための方法を開示している。この目的の場合、試料は、アセトニトリルおよびトリフルオロ酢酸を含むシナピン酸マトリックス中のサンドイッチ層法で調製された。

【0008】

Davison et al. (Clin. Chem. Lab. Med. 46 (2008), 1230-1238)は、糖化胎児ヘモグ
ロビンおよびアセチル化胎児ヘモグロビンの測定のためにエレクトロスプレーイオン化ＭＳを記載している。血液試料は、ギ酸およびアセトニトリルを含む酸性変性溶媒中で希釈された。試料は、ＮａおよびＫを削除するために陽イオン交換ビーズを用いて洗浄した後に、陽イオンモードで操作された質量分析計のエレクトロスプレー源に直接、導入された。

【0009】

飛行時間型ＭＳによる臍帯血中の糖化ヘモグロビンおよびアセチル化ヘモグロビンの決定が、Dupont et al. (Anal. Chem. 83 (2011), 5245-5252)によって記載されている。試料は、水により全臍帯血を希釈し、アセトニトリル、水およびギ酸を含む混合物を添加することによって調製された。最終溶液は、質量分析計に注入される前に、陽イオン交換樹脂により処理された。分析は、ポジティブモードおよびＷ－Ｏｐｔｉｃｓで稼働するエレクトロスプレーイオン化源を使用して、四重極直交加速飛行時間型ＭＳで行われた。

【0010】

Hattan et al. (J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27 (2016), 532-541)は、マトリックス
支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型ＭＳによって、糖化ヘモグロビンの分析および定量的決定を記載している。全血試料は水中に希釈され、遠心分離された。上清は、シナピン酸と混合されて、ＭＡＬＤＩ標的上にスポットで載せられた。質量スペクトルは、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析計で、線形ポジティブイオンモードで生成された。

【0011】

しかし、上記方法は、申し分のないかつ再現性の高い結果をもたらさないので、欠点を伴う。特に、所与の試料を繰り返し試験すると、高い変動係数が観察された。したがって、ＭＳによるＨｂＡ１ｃを決定するための迅速かつ信頼性の高い方法を提供することが必要とされている。

【発明の概要】

【0012】

本発明の第１の態様は、試料中の糖化ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ１ｃ）の無傷の分子を決定するための方法であって、
（ａ）ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）分子、特に、無傷のＨｂＡ分子を含む試料を用意する工程、
（ｂ）前記試料中の無傷のヘモグロビンＡ、特に、ヘモグロビンＡのα鎖および／またはβ鎖の分子を富化する工程、および
（ｃ）無傷のヘモグロビンＡ、特にヘモグロビンＡのα鎖および／またはβ鎖の分子を含む試料に質量分析（ＭＳ）による分析を施す工程であって、試料中のＨｂＡ１ｃ分子の量または濃度が決定される、工程
を含む方法を指す。

【0013】

本発明の第２の態様は、
（ｉ）無傷の糖化ＨｂＡ１ｃ分子の選択的結合のための疎水性表面を有する固体相を特に含む、無傷の糖化ＨｂＡ１ｃ分子を富化するための富化手段、
（ｉｉ）溶血全血試料を希釈し、試料構成成分を固体相（ｉ）に結合させる際に使用するための実質的に中性の固体相結合媒体、および
（ｉｉｉ）富化手段（ｉ）から試料成分を溶出する際に使用するための、特に約２０％～約６０％（ｖ／ｖ）の量、特に約５０％（ｖ／ｖ）の量のアセトニトリルなどの水混和性有機溶媒を含む溶出媒体
を含むキットを指す。

【0014】

本キットは、上記の方法に使用するのに特に好適である。

【0015】

本発明の第３の態様では、上記の方法を行うように適合されている診断システムが提供される。診断システムは、特に、上記のキットと一緒に使用するためのものである。

【0016】

本発明により、ＭＳによって、試料中の無傷の糖化ＨｂＡ１ｃ分子および場合により無傷の非糖化ＨｂＡ０分子の迅速なかつ信頼性の高い決定が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】図１では、事前富化のない溶血血液のＬＣ－ＭＳスペクトルを示している（１：アルブミン；２ＨｂＡα鎖；３：ＨｂＡβ鎖）。

【図2】図２は、ロードしたビーズ（バッファーのｐＨは６）の回分に由来する、０％画分、１０％画分、２０％画分、３０％画分および４０％画分のＬＣ－ＭＳ分析を示しており、多量に存在するアルブミンからＨｂＡ鎖が分離されていることを実証している。

【図3】図３は、タンパク質の異なる荷電状態を分析することによって、試料の１０の複製物を試験した場合の、それぞれ、ＨｂＡ１ｃ（Ｇｌｃを含む）／ＨｂＡ０（Ｇｌｃを含まない）の比が１．５６％および１．７４％となる変動係数（ＣＶ）となることを実証する、全血溶血血液のビーズをベースとする精製からの結果を示している。

【発明を実施するための形態】

【0018】

「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、ならびに「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、明記した整数もしくは工程、または整数もしくは工程の群を含むことを意味するが、他のいかなる整数もしくは工程、または整数もしくは工程の群を除外することを意味するものではないことが理解されよう。

【0019】

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その内容が特に明白に示さない限り、個々の複数の用語も含む。

【0020】

百分率、濃度、量および他の数値データは、「範囲」形式で本明細書において表現または提示することができる。このような範囲の形式は、便宜上および簡潔にするために単に使用されているに過ぎないこと、したがって、その範囲を限定するものとして明示的に列挙されている数値を含むだけではなく、各数値および部分範囲があたかも明示的に列挙されているかのごとくその範囲に包含される個々の数値のすべてまたは部分範囲を含むことを柔軟に解釈するべきであると理解される。例示として、「４％～２０％」の数値範囲は、４％～２０％という明示的に列挙されている値を含むだけではなく、表示されている範囲内の個々の値および部分範囲を含むと解釈されるべきである。したがって、４、５、６、７、８、９、１０、．．．１８、１９、２０％などの個々の値、および４～１０％、５～１５％、１０～２０％などの部分範囲がこの数値範囲に含まれる。この同じ原理が、最低値または最高値を列挙する範囲に当てはまる。さらに、このような解釈は、その範囲の幅または記載されている特性に関わらず、当てはまるはずである。

【0021】

用語「約」は、数値に関連して使用される場合、表示数値よりも５％小さい下限値、および表示数値より５％大きな上限値を有する範囲内の数値を包含することを意味する。

【0022】

用語「質量分析」（「Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ」または「ＭＳ」）は、その質量によって化合物を特定するために使用する分析技術に関する。ＭＳは、その質量対電荷比または「ｍ／ｚ」に基づいて、イオンをフィルターにかけ、検出し、測定する方法のことである。ＭＳ技術は、一般に、（１）化合物をイオン化し、電荷を帯びた化合物を形成すること、および（２）電荷を帯びた化合物の分子量を検出して、質量対電荷比を計算することを含む。化合物は、任意の好適な手段によってイオン化されて、検出され得る。「質量分析計」は、一般に、イオン化装置およびイオン検出器を含む。一般に、１つまたは複数の目的の分子がイオン化されて、続いて、このイオンは、質量分析機器に導入されて、この機器において、磁場および電場の組合せにより、イオンは、質量（「ｍ」）および電荷（「ｚ」）に依存して空間の経路をたどる。用語「イオン化」または「イオン化する」とは、１つまたは複数の電子単位に等しい正味の電荷を有する被分析物のイオンを発生させるプロセスを指す。陰イオンは、１つまたは複数の電子単位の正味の負電荷を有するものである一方、陽イオンは、１つまたは複数の電子単位の正味の正電荷を有するものである。ＭＳ方法は、陰イオンが発生してこれが検出される「陰イオンモード」、または陽イオンが発生してこれが検出される「陽イオンモード」のどちらか一方で行うことができる。

【0023】

「飛行時間型」（ＴＯＦ）ＭＳは、イオンの質量対電荷比が飛行時間の測定により決定される方法である。イオンは、既知強度の電場によって加速される。イオンの速度は、質量対電荷比に依存する。イオンが既知の距離にある検出器に到達する時間が測定される。この測定に基づいて、イオンを同定することができる。

【0024】

ＭＳにおける大部分の試料のワークフローは、試料調製および／または富化工程をさらに含み、例えば、目的の被分析物は、例えばガスまたは液体クロマトグラフィーを使用して、マトリックスから、例えば被分析物とは異なる試料構成成分から分離される。通常、質量分析測定の場合、以下の３つの工程が行われる：
（１．）目的の被分析物を含む試料が、通常は陽イオンとの付加物を形成することによって、多くの場合、陽イオンへのプロトン化によってイオン化される。イオン化源は、以下に限定されないが、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）および大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）を含む。
（２．）イオンは分類されて、その質量および電荷に従い分離される。高電場非対称波形イオン移動度分光分析（ＦＡＩＭＳ）をイオンフィルターとして使用することができる。（３．）次に、分離したイオンは、例えば、多重反応モード（ＭＲＭ）で検出され、結果がチャートに表示される。

【0025】

用語「エレクトロスプレーイオン化」または「ＥＳＩ」とは、溶液を長さの短いキャピラリー管に沿って通過させて、キャピラリー管の端部に高い正電位または負電位を印加する、方法を指す。管の端部に到達した溶液は、溶媒蒸気中で非常に小さな溶液の液滴のジェットまたはスプレーへと気化（噴霧化）される。液滴のこの霧は、エバポレーションチャンバーを通り、このチャンバーは、わずかに加熱されて、縮合を予防して溶媒をエバポレートする。液滴が小さくなるほど、同じ電荷間の自然な反発によってイオンと中性分子が放出されるまで、電気的な表面電荷密度が向上する。

【0026】

用語「大気圧化学イオン化」または「ＡＰＣＩ」は、ＥＳＩに類似した質量分析方法を指す。しかし、ＡＰＣＩは、大気圧においてプラズマ内で発生するイオン－分子反応によってイオンを生成する。プラズマは、スプレーキャピラリーと対電極との間の電気放電により維持される。イオンは、通常、一連の差動ポンプ式スキマーステージ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｐｕｍｐｅｄ ｓｋｉｍｍｅｒ ｓｔａｇｅｓ）の使用により質量分析装置に抽出される。向流の乾燥および予熱Ｎ_２ガスを用いて、溶媒の除去を改善することができる。ＡＰＣＩにおける気相イオン化は、極性がより低い実体を分析するためにＥＳＩよりも有効となり得る。

【0027】

「多重反応モード」または「ＭＲＭ」は、前駆体イオンおよび１つまたは複数のフラグメントイオンが選択的に検出される、ＭＳ機器用の検出モードである。

【0028】

質量分析計は、わずかに異なる質量のイオンを分離して検出するので、所与の元素からなる異なる同位体を容易に区別する。したがって、質量分析は、以下に限定されないが、低分子量の被分析物、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含めた、被分析物の正確な質量決定および特徴づけにとって重要な方法である。その用途は、タンパク質およびその翻訳後修飾の同定、タンパク質複合体、そのサブユニットおよび機能的相互作用の解明、ならびにプロテオミクスにおけるタンパク質の全測定を含む。質量分析によるペプチドまたはタンパク質のデノボ配列決定は、通常、アミノ酸配列のこれまでの知識なしに行うことができる。

【0029】

質量分析決定は、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、特にＨＰＬＣ、および／またはイオン移動度に基づく分離技法などのクロマトグラフィー法を含めた追加の分析法と組み合わされてもよい。

【0030】

本開示の文脈において、用語「被分析物」、「被分析物分子」または「目的の被分析物」は、互換的に使用されて、質量分析により分析される化学種を指す。質量分析により分析されるのに好適な化学種、すなわち被分析物は、生存生物において存在する任意の種類の分子とすることができ、以下に限定されないが、核酸（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡなど）、アミノ酸、ペプチド、タンパク質（例えば、細胞表面受容体、サイトゾルタンパク質など）、代謝産物またはホルモン（例えば、テストステロン、エストロゲン、エストラジオールなど）、脂肪酸、脂質、炭水化物、ステロイド、ケトステロイド、セコステロイド（例えば、ビタミンＤ）、別の分子のある種の修飾に特徴的な分子（例えば、タンパク質上の糖部分またはホスホリル残基、ゲノムＤＮＡ上のメチル残基）、または生物体により内部移行された物質（例えば、治療薬、乱用薬物、毒素など）、またはそのような物質の代謝産物とすることができる。このような被分析物は、バイオマーカーとして役立つことがある。本発明の文脈において、用語「バイオマーカー」とは、前記システムの生物学的状態の指標として使用される、生物学的システム内の物質を指す。

【0031】

被分析物は、目的の試料中、例えば、生体試料または臨床試料中に存在することがある。用語「試料」または「目的の試料」は、本明細書において互換的に使用され、組織、器官もしくは個体の部分または片を指し、通常、組織、器官または個体の全体を表すことが意図されているこのような組織、器官または個体よりも小さい。分析に際して、試料は、組織状態、あるいは器官もしくは個体の健康状態または疾患状態に関する情報を提供する。試料の例は、以下に限定されないが、血液、血清、血漿、滑液、髄液、尿、唾液およびリンパ液などの液体試料、または乾燥血液スポットおよび組織抽出物などの固体試料を含む。試料のさらなる例は、細胞培養物または組織培養物である。

【0032】

本開示の文脈において、試料は、「個体」または「対象」に由来し得る。通常、対象は、哺乳動物である。哺乳動物には、以下に限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌおよびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギおよびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が含まれる。

【0033】

質量分析による分析前に、試料は、試料および／または被分析物に特有の方法で前処理されてもよい。本開示の文脈において、用語「前処理」とは、質量分析による所望の被分析物の後の分析を可能にするために必要な任意の手段を指す。前処理手段は、通常、以下に限定されないが、固体試料の溶出（例えば、乾燥血液スポットの溶出）、全血試料への
溶血試薬（ＨＲ）の添加および尿試料への酵素試薬の添加を含む。同様に、内標準（ＩＳＴＤ）の添加は、試料の前処理と見なされる。

【0034】

用語「溶血試薬」（ＨＲ）は、試料中に存在する細胞を溶解する試薬を指す。本発明の文脈において、溶血試薬は、特に、以下に限定されないが、全血試料中に存在する赤血球を含めた、血液試料中に存在する細胞を溶解する試薬を指す。周知の溶血試薬は、水（Ｈ_２Ｏ）、例えば脱イオン水またまたは蒸留水である。溶血試薬のさらなる例は、以下に限定されないが、高いオスモル濃度の液体（例えば、８Ｍ尿素）、イオン性液体および異なる洗剤を含む。

【0035】

通常、内標準（ＩＳＴＤ）は、質量スペクトル検出のワークフローに施すと、目的の被分析物と類似の特性を示す、既知量の物質である（すなわち、任意の前処理、富化および実際の検出工程を含む）。ＩＳＴＤは、目的の被分析物と類似の特性を示すが、目的の被分析物とはやはり明確に区別可能である。例証すると、ガスクロマトグラフィーまたは液体クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー分離の間に、ＩＳＴＤは、試料に由来する目的の被分析物とほぼ同じ保持時間を有する。したがって、被分析物とＩＳＴＤのどちらも、同時に質量分析計に入る。しかし、ＩＳＴＤは、試料に由来する目的の被分析物とは異なる分子量を示す。これにより、ＩＳＴＤ由来のイオンと被分析物由来のイオンを、それらの異なる質量／電荷（ｍ／ｚ）比により質量スペクトルの区別が可能となる。どちらもフラグメント化を受け、娘イオンをもたらす。これらの娘イオンは、互いに、およびそれぞれの親イオンとは、それらのｍ／ｚ比により区別することができる。したがって、ＩＳＴＤおよび被分析物に由来するシグナルの個々の決定および定量を行うことができる。ＩＳＴＤは、既知量で添加されるので、試料に由来する被分析物のシグナル強度は、被分析物の具体的な定量的量に起因し得る。したがって、ＩＳＴＤの添加により、検出される被分析物の量の相対比較が可能となり、被分析物が質量分析計に到達すると、試料中に存在する目的の被分析物の明確な同定および定量が可能となる。通常、必ずではないが、ＩＳＴＤは、目的の被分析物の同位体標識されている変形体（例えば、少なくとも１個の^２Ｈ、^１３Ｃおよび／または^１５Ｎなどの標識を含む）。

【0036】

前処理に加えて、試料はまた、１つまたは複数の富化工程が施されてもよく、試料に、１つまたは複数の「富化方法」または「富化ワークフロー」が施される。周知の富化方法は、以下に限定されないが、化学沈殿、固体相の使用およびクロマトグラフィー法を含む。

【0037】

化学沈殿とは、試料に化学成分を添加し、これにより、試料のある特定の構成成分が関与することを指す。例証すると、周知の沈殿方法は、試料へのアセトニトリルの添加である。

【0038】

固体相は、以下に限定されないが、固体相抽出（ＳＰＥ）カートリッジ、およびビーズを含む。用語「ビーズ」は、非磁性、磁性または常磁性球状粒子を指す。ビーズは、目的の被分析物に特異的であるように異なってコーティングされていてもよい。コーティングは、所期の使用、すなわち所期の捕捉分子に応じて様々となり得る。コーティングがどの被分析物に好適かは当業者に周知である。ビーズは、様々な異なる物質で作製されていてもよい。ビーズは、様々なサイズを有することができ、細孔を有するまたはこれを有さない表面を備える。

【0039】

用語「クロマトグラフィー」とは、液体または気体により運ばれる化学混合物が、それらが固定液体相もしくは固体相の周りまたは上を流れると、化学実体の示差的分布の結果として、成分に分離されるプロセスを指す。

【0040】

用語「液体クロマトグラフィー」または「ＬＣ」とは、流体が、微粉砕物質のカラムまたはキャピラリー流通路を一様に浸透する際に、流体溶液の１つまたは複数の成分が選択的に遅延するプロセスを指す。遅延は、この流体が固定相に対して移動するので、１種または複数の固定相とバルク流体（すなわち、移動相）との間の混合物の成分の分布に起因する。固定相が移動相よりも極性となる方法（例えば、移動相としてのトルエン、固定相としてのシリカ）は、順相液体クロマトグラフィー（ＮＰＬＣ）と呼ばれ、固定相が移動相ほど極性ではない方法（例えば、移動相として水－メタノール混合物および固定相としてＣ１８（オクタデシルシリル））においては、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）と呼ばれる。

【0041】

「高速液体クロマトグラフィー」または「ＨＰＬＣ」とは、分離度が、通常の密に充填したカラムである固定相を加圧下で移動相を強制することにより向上する、液体クロマトグラフィーの方法を指す。通常、カラムには、不規則な形状の粒子または球形状の粒子、多孔質モノリシック層または多孔質膜からなる固定相が充填されている。ＨＰＬＣは、移動相および固定相の極性に基づいた２種の異なる部分クラス、すなわちＮＰ－ＨＰＬＣおよびＲＰ－ＨＰＬＣに歴史的に分類されている。

【0042】

マイクロＬＣとは、狭いカラム内径、通常１ｍｍ未満、例えば約０．５ｍｍを有するカラムを使用するＨＰＬＣ法を指す。「超高速液体クロマトグラフィー」または「ＵＨＰＬＣ」とは、例えば、１２０ＭＰａ（１７，４０５ｌｂｆ／ｉｎ^２）または約１２００気圧の高圧を使用するＨＰＬＣ法を指す。

【0043】

迅速ＬＣとは、＜２ｃｍ、例えば１ｃｍの長さの短い、上記の内径を有するカラムを使用するＬＣ法を指し、上記の流速を適用し、上記の圧力を用いる（マイクロＬＣ、ＵＨＰＬＣ）。短い迅速ＬＣプロトコールは、単一分析用カラムを使用する、捕捉／洗浄／溶出工程を含み、＜１分間という非常に短い時間でＬＣを実現する。

【0044】

さらなる周知のＬＣ方法は、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、サイズ排除ＬＣ、イオン交換ＬＣおよび親和性ＬＣを含む。

【0045】

ＬＣ分離は、単一チャネルＬＣ、または平行して配列されている複数のＬＣチャネルを含む多重チャネルＬＣとすることができる。ＬＣでは、被分析物は、一般に当業者に公知の通り、その極性またはｌｏｇＰ値、サイズまたは親和性に従い分離され得る。

【0046】

本開示の文脈において、用語「第１の富化プロセス」、「第１の富化工程」または「第１の富化ワークフロー」とは、試料の前処理に続いて行われ、最初の試料に比べて富化された被分析物を含む試料をもたらす、富化プロセスを指す。

【0047】

本開示の文脈において、用語「第２の富化プロセス」、「第２の富化工程」または「第２の富化ワークフロー」とは、試料の前処理および第１の富化プロセスに続いて行われ、最初の試料および第１の富化プロセス後の試料に比べて富化された被分析物を含む試料をたらす、富化プロセスを指す。

【0048】

「キット」は、少なくとも１つの試薬、例えば障害を治療するための医薬、または本発明の被分析物を特異的に検出するためのプローブを含む任意の製造物品（例えば、パッケージまたは容器）のことである。本キットは、本発明の方法を行うための単位として、好ましくは販売促進される、配布されるまたは販売される。通常、キットは、バイアル、チューブなどの１つまたは複数の容器手段を厳重に封をされて受け取るようコンパートメント化されている担体手段をさらに備えることができる。特に、容器手段は、第１の態様の方法に使用する個別の要素の１つを備えてもよい。キットは、以下に限定されないが、バ
ッファー、希釈剤、フィルター、ニードル、シリンジ、および使用説明書を備える添付文書を含めた、さらなる物質を含む１つまたは複数の他の容器をさらに備えてもよい。ラベルは、その組成物が、特定の用途に使用されることを表示するよう容器に提示されてもよく、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのどちらかで使用するための指示も表示し得る。本キットはまた、光学的保存媒体（例えば、コンパクトディスク）などのデータ保管用媒体もしくはデバイスに、またはコンピュータもしくはデータ処理デバイスに直接、設けられたコンピュータプログラムコードを含んでもよい。さらに、本キットは、較正目的で、本明細書の他の箇所に記載されているバイオマーカーの標準量を含むことができる。

【0049】

「添付文書」は、適応症、利用、成績、および／またはこのような診断製品の使用に関する注意書きに関する情報を含む、診断製品の市販パッケージに慣用的に含まれている指示書を指すために使用される。

【0050】

実施形態
本発明の第１の態様は、試料中の糖化ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ１ｃ）の無傷の分子を決定するための方法であって、
（ａ）ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）分子、特に、無傷のヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）分子を含む試料を用意する工程、
（ｂ）前記試料中のヘモグロビンＡ分子、特にα鎖および／またはβ鎖分子を富化する工程、および
（ｃ）無傷のヘモグロビンＡ分子、特にα鎖および／またはβ鎖分子を含む試料に質量分析（ＭＳ）による分析を施す工程であって、試料中のＨｂＡ１ｃの量または濃度が決定される、工程
を含む方法を指す。

【0051】

こうして、試料中の、ＨｂＡ１ｃの量または濃度、特にＨｂＡ１ｃの相対量、すなわち非糖化ＨｂＡ０分子に対するまたはＨｂＡ分子全体に対する糖化ＨｂＡ１ｃ分子の比を決定することができる。本方法は、非常に正確であり、所与の試料中のＨｂＡ１ｃの量、ＨｂＡ１ｃ／ＨｂＡの比またはＨｂＡ１ｃ／ＨｂＡ０の比を繰り返し決定すると、２．５％以下、より詳細には２．０％以下の変動係数（ＣＶ）をもたらすことができる。

【0052】

工程（ａ）によれば、ヘモグロビン分子を含む試料が用意される。試料は、好ましくは、溶血した全血試料、特に、例えば、糖化ヘモグロビンＡの量に関してその血液を検査する対象に由来する溶血したヒト全血試料である。溶血は、特に、水（Ｈ_２Ｏ）、例えば脱イオン水または蒸留水を用いて、特に、約１：２～約１：２０、例えば、約１：５、約１：１０または特に約１：９（ｖ／ｖ）となる試料：水の比で希釈することにより行われる。試料は、約３０分未満、約１０分未満、約５分未満の時間の間に溶血され得、または約２分未満でも溶血し得る。特定の実施形態では、試料は、約１０～約６０秒の時間の間に溶血される。

【0053】

特定の実施形態では、溶血は、試料および水を混合することによって、特に試料と水をボルテックスすることによって行われる。特に、試料および水は、１～６０秒間、特に５～３０秒間、特に、１０秒間、混合され、特にボルテックスされる。

【0054】

溶血の間、試料は、２０℃～３０℃、特に２２～２５℃の温度、特に室温で維持され得る。

【0055】

特定の実施形態では、試料の溶血は、室温で１０秒間、ボルテックスすることによって、１：９の比で試料と水を混合することにより行われる。

【0056】

特定の実施形態では、工程（ａ）中で得られた試料に、富化ワークフロー、すなわち試料中の無傷のヘモグロビンＡ分子、特にα鎖および／またはβ鎖分子を富化する工程を含む、富化工程（ｂ）が施される。富化工程は、ＭＳによる分析を試料に施す前に、他の試料構成成分に対する、無傷のヘモグロビンＡ分子、特にヘモグロビンＡ分子のα鎖および／またはβ鎖の相対量を増大させる。

【0057】

特定の実施形態では、富化工程（ｂ）は、ヘモグロビンＡα鎖分子に対する、無傷のヘモグロビンＡβ鎖分子を特に少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、もしくは少なくとも約１０倍、富化すること、および／またはアルブミン分子に対する無傷のヘモグロビンＡβ鎖分子を特に少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、もしくは少なくとも約１０倍、富化することを含む。

【0058】

富化工程（ｂ）は、１つまたは複数の富化方法、特に第１および／または第２の富化工程を含むことができる。富化方法は、当分野で周知であり、以下に限定されないが、化学沈殿を含めた化学的富化方法、および以下に限定されないが、固体相抽出方法、ビーズワークフローおよびクロマトグラフィー法（例えばガスクロマトグラフィーまたは液体クロマトグラフィー）を含めた固体相を使用する富化方法を含む。したがって、特定の実施形態では、富化工程（ｂ）は、化学沈殿、固体相抽出方法を使用する方法、ビーズワークフローおよびクロマトグラフィー法からなる群から選択される１つまたは複数の富化方法を含む。

【0059】

実施形態では、富化工程（ｂ）は、１種または２種の富化方法を含み、すなわち、富化工程（ｂ）（ｉ）および／または富化工程（ｂ）（ｉｉ）を含む。本方法が富化工程（ｂ）（ｉ）および富化工程（ｂ）（ｉｉ）を含む実施形態では、富化工程（ｂ）（ｉ）は富化工程（ｂ）（ｉｉ）の前に行われる。

【0060】

実施形態では、富化工程（ｂ）（ｉ）は、前処理した試料への被分析物に選択的な群を有する固体相の添加を含む、結合／遊離分離工程を含む。固体相は、固体粒子または非特異的固体相、例えば、容器またはウェル内でコーティングされた表面からなることができる。特定の実施形態では、固体相は、磁性粒子または常磁性粒子、特に、磁性コアまたは常磁性コアを有する粒子からなる。実施形態では、前記磁性コアまたは常磁性コアは、金属酸化物および／または金属炭化物を含む。とりわけ特定の実施形態では、コアはＦｅ_３Ｏ_４を含む。

【0061】

固体相の表面、特に、磁性ビーズまたは常磁性ビーズは、特に、Ｃ_３～Ｃ_１８アルキル基、より詳細にはＣ_４アルキル基などの疎水性有機基を含む、疎水性表面とすることができる。さらに、固体相の疎水性表面、特に磁性ビーズまたは超常磁性ビーズの表面は、細孔を備える。細孔サイズは、１ｎｍ～２００ｎｍ、特に約１００ｎｍ未満、特に約１０ｎｍ未満の範囲にあることができる。好適な疎水性表面は、例えば、「Ｔｈｅ ＨＰＬＣ Ｅｘｐｅｒｔ：Ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ ａｎｄ Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｏｄｅｒｎ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」ＤＯＩ：１０．１００２／９７８３５２７６７７６１０に見出すことができる。

【0062】

実施形態では、富化工程（ｂ）は、磁性ビーズまたは常磁性ビーズを使用する第１の富化工程（ｂ）（ｉ）を含む。実施形態では、第１の富化工程（ｂ）（ｉ）は、試料中に存在する無傷のヘモグロビンＡ分子、特にヘモグロビンＡのα鎖および／またはβ鎖の選択的結合のための基を有する磁性ビーズまたは常磁性ビーズの添加を含む。実施形態では、磁気ビーズの添加は、撹拌または混合を含む。ビーズ上で、無傷のヘモグロビンＡ分子、特にヘモグロビンＡのα鎖および／またはβ鎖を捕捉するための事前に規定されたインキ
ュベーション期間が続く。実施形態では、ワークフローは、磁気ビーズと共にインキュベートした後に洗浄工程（Ｗ１）を含む。被分析物に応じて、１つまたは複数の追加の洗浄工程（Ｗ２）が行われる。１つの洗浄工程（Ｗ１、Ｗ２）は、磁石または電磁石を備える磁気ビーズ取り扱いユニットによる磁気ビーズ分離、液体の吸引、洗浄用バッファーの添加、磁気ビーズの再懸濁、別の磁気ビーズの分離工程および液体の別の吸引を含む、一連の工程を含む。さらに、洗浄工程は、溶媒のタイプ（水／有機／塩／ｐＨ）に関して、分量および数、または洗浄サイクルの組合せとは異なり得る。個々のパラメーターの選択方法は、当業者に周知である。最後の洗浄工程（Ｗ１、Ｗ２）の後に、溶出試薬の添加、次いで、磁気ビーズの再懸濁、および磁気ビーズから目的の被分析物を放出するための事前に規定されたインキュベーション期間が続く。結合していない磁気ビーズは、次に、分離されて、無傷のヘモグロビンＡ分子、特にヘモグロビンＡのα鎖および／またはβ鎖を含有する上清が捕捉される。

【0063】

特定の実施形態では、無傷のヘモグロビンＡ分子、特にヘモグロビンＡのα鎖および／またはβ鎖を含む試料の固体相への接触は、実質的に中性のｐＨ、例えば約５～約７のｐＨ、特に約６のｐＨで行われる。この目的のため、試料、例えば、溶血した全血試料は、固体相結合媒体中で希釈されてもよい。バッファーは、好ましくはＮａ^＋またはＫ^＋イオンを含まないバッファー、例えば、アンモニウム、一置換、二置換または三置換アンモニウムイオンを含むバッファーである。陰イオンは、好ましくは、ギ酸などのカルボキシレート陰イオンである。とりわけ好ましいバッファーは、ギ酸アンモニウム、例えばｐＨ６のギ酸アンモニウムバッファーである。

【0064】

固体相からの結合した構成成分の選択的溶出は、試料構成成分をロードした固体相に、２０～６０％（ｖ／ｖ）の量、特に約２０、３０、４０または５０％（ｖ／ｖ）の量の水混和性有機溶媒、例えばアセトニトリルなどの非プロトン性溶媒を含む溶出媒体に接触させることによって行われ得る。溶出媒体のｐＨ、および溶出媒体の水性部分の構成成分は、固体相結合媒体に関して記載されているものと同じであってもよい。

【0065】

代替としてまたはさらに、富化工程（ｂ）は、第２の富化工程（ｂ）（ｉｉ）を含んでもよい。第２の富化工程（ｂ）（ｉｉ）では、無傷のヘモグロビンＡ分子、特にヘモグロビンＡのα鎖および／またはβ鎖が、試料中でさらに富化される。特定の実施形態では、富化工程（ｂ）（ｉｉ）は、クロマトグラフィー工程を含み、この場合、試料の個々の構成成分が互いに分離される。特に、第２の富化工程（ｂ）（ｉｉ）では、ヘモグロビンＡのα鎖および／またはβ鎖が、互いに分離される。実施形態では、第２の富化工程（ｂ）（ｉｉ）は、上で詳述されている通り、第１の富化工程（ｂ）（ｉ）に続いて行われてもよい。

【0066】

実施形態では、クロマトグラフィー分離は、ガスクロマトグラフィーまたは液体クロマトグラフィーである。どちらの方法も当業者に周知である。実施形態では、液体クロマトグラフィーは、ＨＰＬＣ、迅速ＬＣ、マイクロＬＣ、フローインジェクションならびにトラップおよび溶出からなる群から選択される。特定の実施形態では、クロマトグラフィー分離は、単一クロマトカラム（ｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｃｏｌｕｍｎ）の使用、または２本以上のクロマトカラムの使用を含む。特定の実施形態では、２本以上のクロマトカラムが使用される場合、これらのカラムは、互いに下流に位置しており、すなわち、第２のカラムは、第１のカラムの下流に位置しており、任意選択の第３のカラムは、第２のカラムの下流に位置するなどである。２本以上のカラムが使用される実施形態では、これらのカラムは、同一であってもよく、または所望の機能に応じて、互いに異なっていてもよい。正しいカラムの選択および設定は、当業者に周知である。

【0067】

実施形態では、工程（ａ）または第１の富化工程（ｂ）（ｉ）における溶血後に得られ
た試料は、ＬＣステーションに移送されるか、または希釈液体の添加による希釈工程後にＬＣステーションに移送される。異なる溶出手順／試薬もまた、例えば溶媒の種類（水／有機／塩／ｐＨ）および体積を変更することによって使用されてもよい。様々なパラメーターが、当業者に周知であり、容易に選択される。

【0068】

ある種の実施形態では、富化工程（ｂ）は、第１の富化工程（ｂ）（ｉ）および第２の富化工程（ｂ）（ｉｉ）を含み、この場合、第２の富化工程（ｂ）（ｉｉ）は、第１の富化工程（ｂ）（ｉ）の後に行われる。特定の実施形態では、第１の富化工程（ｂ）（ｉ）は、上で詳述されているビーズワークフローを含み、第２の富化工程（ｂ）（ｉｉ）は、特に、ＨＰＬＣ、迅速ＬＣ、マイクロＬＣ、フローインジェクションならびに／またはトラップおよび溶出からなる群から選択される液体クロマトグラフィーを含む。

【0069】

本発明によれば、本発明の方法の工程（ｃ）は、無傷のヘモグロビンＡ分子、特にヘモグロビンＡのα鎖および／またはβ鎖の分析、すなわちトリプシンまたはＧｌｕ－Ｃなどのプロテアーゼによる消化が施されていない、無傷のヘモグロビンＡ分子、特にヘモグロビンＡのα鎖および／またはβ鎖の分子の分析を含む。

【0070】

工程（ｃ）による分析は、ＭＳにより行われる。原理的に、異なるＭＳ分析手順が、使用されてもよい。好ましくは、ＭＳ分析手順は、飛行時間型（ＴＯＦ）ＭＳ分析、特に四重極（Ｑ）ＴＯＦ ＭＳ分析を含む。さらに、ＭＳ分析は、ポジティブモードで実施される、および／または特にＭ＋１７Ｈ～Ｍ＋１３Ｈの荷電状態を含めた、無傷のヘモグロビンＡβ鎖分子のいくつかの荷電状態のシグナル統合が行われるのが好ましい。

【0071】

本発明の方法は、試料中のＨｂＡ１ｃの定量的決定を含む。特に、非糖化ＨｂＡ０分子に対する、またはＨｂＡ分子の全量に対する糖化ＨｂＡ１ｃ分子の相対量が決定される。とりわけ好ましい実施形態では、この相対量は、２．５％以下、特に２．０％以下の変動係数（ＣＶ）で決定される。

【0072】

とりわけ好ましい実施形態では、本発明の方法は、以下のワークフロー：
（ａ）全血試料を、例えばＨ_２Ｏで希釈することにより溶血させる工程
（ｂ）無傷のヘモグロビンＡβ鎖分子が固体相に結合する条件下で、試料を特に疎水性表面を有する磁性粒子または常磁性粒子からなる固体相に接触させ、ロードした固体相から結合分子を選択的に溶出することにより、工程（ａ）において生成した溶血試料中の無傷のヘモグロビンＡ分子、特にヘモグロビンＡのα鎖およびβ鎖を富化する工程、および
（ｃ）無傷のヘモグロビンＡβ鎖分子を含む工程（ｂ）からの試料にＴＯＦ－ＭＳによる分析を施す工程であって、試料中のＨｂＡ１ｃの量または濃度が決定される工程
を含む。

【0073】

特定の実施形態では、このワークフローは、時間あたり１００を超える試料のハイスループット分析を可能にする。

【0074】

とりわけ好ましい実施形態では、本発明の方法は、以下のワークフロー：
（ａ）全血試料を、例えばＨ_２Ｏで希釈することにより溶血させる工程
（ｂ）無傷のヘモグロビンＡβ鎖分子が固体相に結合する条件下で、試料に液体クロマトグラフィー、特にＨＰＬＣまたは迅速ＬＣを施し、ロードした固体相から結合分子を選択的に溶出することにより、工程（ａ）において生成した溶血試料中の無傷のヘモグロビンＡ分子、特にヘモグロビンＡのβ鎖を富化する工程、および
（ｃ）ヘモグロビンＡ分子を含む工程（ｂ）からの試料にＴＯＦ－ＭＳによる分析を施す工程であって、試料中のＨｂＡ１ｃの量または濃度が決定される工程
を含む。

【0075】

特定の実施形態では、このワークフローにより、ヘモグロビンＡのα鎖およびβ鎖の特異的な分離が可能となる。

【0076】

とりわけ好ましい実施形態では、本発明の方法は、以下のワークフロー：
（ａ）全血試料を、例えばＨ_２Ｏで希釈することにより溶血させる工程
（ｂ）（ｉ）無傷のヘモグロビンＡβ鎖分子が固体相に結合する条件下で、試料を特に疎水性表面を有する磁性粒子または常磁性粒子からなる固体相に接触させ、ロードした固体相から結合分子を選択的に溶出することにより、工程（ａ）において生成した溶血試料中の無傷のヘモグロビンＡ分子、特にヘモグロビンＡのα鎖およびβ鎖を富化する工程、および
（ｉｉ）無傷のヘモグロビンＡβ鎖分子が固体相に結合する条件下で、試料に液体クロマトグラフィー、特にＨＰＬＣまたは迅速ＬＣを施し、ロードした固体相から結合分子を選択的に溶出することにより、工程（ｂ）（ｉ）において生成した溶血試料中の無傷のヘモグロビンＡ分子、特にヘモグロビンＡのβ鎖をさらに富化する工程、および
（ｃ）無傷のヘモグロビンＡ分子を含む工程（ｂ）からの試料にＴＯＦ－ＭＳによる分析を施す工程であって、試料中のＨｂＡ１ｃの量または濃度が決定される工程
を含む。

【0077】

第一の態様のさらなる実施形態では、試料中の糖化ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ１ｃ）を決定するための方法は、試料に内標準（ＩＳＴＤ）を添加する追加の工程を含む。内標準は、好ましくは、同位体標識されているＨｂＡ１ｃ分子である。実施形態では、同位体標識されているＩＳＴＤは、少なくとも１個の^２Ｈ、^１３Ｃおよび／または^１５Ｎ標識を含む。

【0078】

本発明の第２の態様は、
（ｉ）無傷の糖化ＨｂＡ１ｃ分子を富化するための富化手段、特に無傷の糖化ＨｂＡ１ｃ分子の選択的結合のための疎水性表面を有する固体相、
（ｉｉ）溶血全血試料を希釈し、試料構成成分を固体相（ｉ）に結合させる際に使用するための実質的に中性の固体相結合媒体、および
（ｉｉｉ）富化手段（ｉ）から試料成分を溶出する際に使用するための、特に２０％～６０％（ｖ／ｖ）の量、特に約２０、３０、４０または５０％（ｖ／ｖ）の量のアセトニトリルなどの水混和性有機溶媒を含む溶出媒体
を含むキットを指す。

【0079】

本発明の第２の態様の特定の実施形態に関して、第１の態様の文脈において上で詳述されているすべての実施形態を参照する。

【0080】

実施形態では、本キットは、（ｉ）固体相、例えば、疎水的に修飾されている表面を有する粒子などの粒子、（ｉｉ）実質的に中性の固体相結合媒体、例えば溶血した全血試料を希釈し、試料構成成分を固体相（ｉ）への試料構成成分に結合させる際に使用するための、Ｎａ^＋およびＫ^＋イオンを含まないバッファー、および（ｉｉｉ）固体相（ｉ）から試料成分を溶出する際に使用するための、２０％～６０％（ｖ／ｖ）の量、特に約２０、３０、４０または５０％（ｖ／ｖ）の量のアセトニトリルなどの水混和性有機溶媒を含む媒体バッファーを含む。

【0081】

実施形態では、本キットは、少なくとも１つの富化工程、特に結合／遊離分離工程および／またはクロマトグラフィー工程を行うように適合されている富化手段を備える。実施形態では、富化手段は、固体粒子、例えば磁性粒子または常磁性粒子、または非粒子固体相からなっていてもよい固体相を含む。

【0082】

特定の実施形態では、固体相は、無傷のヘモグロビンＡ分子、特にヘモグロビンＡのα鎖および／またはβ鎖の分子の選択的結合のための基、例えば疎水性有機基を有する。さらなる特定の実施形態では、富化手段は、クロマトグラフィーカラム、特にクロマトグラフィー工程を行うためのクロマトグラフィーカラムを含むことができる。

【0083】

実施形態では、キットに場合により含まれる溶出媒体は、水混和性有機溶媒、特にアセトニトリル（ＡＣＮ）を含む水溶液を含む。水混和性有機溶媒、特にＡＣＮは、約２０～６０％（ｖ／ｖ）の量、特に約２０、３０、４０または５０％（ｖ／ｖ）の量で存在する。

【0084】

本キットは、個々の成分の容器を含む単一パッケージとして、または各々が個々の成分の容器を含む、一組のいくつかのパッケージとして提供されてもよい。

【0085】

実施形態では、本キットは、添付文書をさらに含む。実施形態では、添付文書は、適応症、利用、成績および／またはキットに関する注意書きに関する情報を含む。

【0086】

本発明の第３の態様は、特に、上記の方法を行うことによって、試料中の糖化ＨｂＡ１ｃを決定するように適合されている診断システムである。

【0087】

特定の実施形態では、診断システムは、
（ｉ）特に全血試料の溶血を含む、無傷のＨｂＡ１ｃ分子を含む試料を調製するための少なくとも１つのステーション、
（ｉｉ）試料から、無傷のヘモグロビンＡ分子、特にヘモグロビンＡのα鎖および／またはβ鎖を選択的に富化するように適合されている少なくとも１つの富化ステーション、ならびに
（ｉｉｉ）質量分析（ＭＳ）により無傷のヘモグロビンＡ分子、特にヘモグロビンＡのα鎖および／またはβ鎖を分析し、試料中のＨｂＡｃ１の量または濃度を決定するように適合されている少なくとも１つのステーション
を含む。

【0088】

本発明の第３の態様の特定の実施形態に関して、第１および第２の態様の文脈において上で詳述されているすべての実施形態を参照する。

【0089】

特定の実施形態では、診断システムは、試料のハイスループットを可能にするよう、特に最大で１００個の試料／時間以上のスループットを可能にするように適合されている。例えば、参照により本明細書に組み込まれているＷＯ２０１７／１０３１８０に記載されているシステムを使用することができる。

【0090】

特定の実施形態では、診断システムは、ランダムアクセス試料調製用の少なくとも１つのステーション、およびＭＳ分析前の無傷のヘモグロビンＡ分子、特にヘモグロビンＡのα鎖および／またはβ鎖の富化のための少なくとも１つのステーションを備える。

【0091】

実施形態では、このような診断システムは、無傷のヘモグロビンＡ分子、特にヘモグロビンＡのα鎖および／またはβ鎖を含む試料の自動化調製用の試料調製ステーションを備える。特定の実施形態では、前記ステーションは、１つまたは複数の試料を溶血するための区域を備える。

【0092】

実施形態では、前記診断システムは、富化ステーションをさらに含む。前記富化ステーションは、溶血後の１つまたは複数の試料を富化手段、特に固体相、特に磁性粒子または
常磁性粒子に接触させるための区域を備える。さらにまたは代替的に、富化ステーションは、クロマトグラフィー区域、特にＬＣ区域を備える。実施形態では、ＬＣ区域は、１つまたは複数のＬＣチャネルを備える。実施形態では、ＬＣ区域が１つより多いＬＣチャネルを含む場合、チャネルは平行して並べてられてもよい。

【0093】

実施形態では、本診断システムは、先に調製した試料をその後の区域またはステーションにインプットするための、様々な区域とステーションとの間に少なくとも１つのインターフェースを備える。

【0094】

実施形態では、本診断システムは、各々が、試料調製および富化工程の事前に規定されたシークエンスを備え、完了に対する事前に規定された時間を必要とする、事前に規定された試料調製および富化ワークフローに試料を割り当てるようプログラム化されていてもよい、コントローラーをさらに備える。

【0095】

特定の実施形態では、コントローラーは、異なる富化ステーションチャネルからの無傷のＨｂＡβ鎖分子が、予測溶出時間に基づいた重複しない溶出液アウトプットシークエンスにおいて溶出することを可能にする、調製済み試料をインプットするための富化ステーションチャネルインプットシークエンスを計画する。

【0096】

実施形態では、コントローラーは、富化ステーションチャネルインプットシークエンスに適合する試料調製ステーションからの調製済み試料のアウトプットシークエンスを生成する試料調製開始シークエンスを設定して開始し、その結果、試料の調製が完了すると、割り当てられた富化ステーションチャネルも利用可能となり、調製済み試料が、別の試料の調製が完了する前、または次の調製済み試料が試料調製／富化インターフェースに到着する前に、割り当てられた富化ステーションチャネルにインプットされ得る。

【0097】

実施形態では、コントローラーは、ワークフローの適切な時機となるよう参照期間を設定する。これにより、以下の処理工程の連係が可能となる：（１）試料調製開始シークエンスにおける連続試料の間に、可能な１つまたは複数の参照期間を伴う参照期間あたり、最大でも１つの試料の調製を開始する；および／または（２）調製済み試料アウトプットシークエンスの連続調製済み試料の間に、可能な１つまたは複数の参照期間を伴う参照期間あたり最大でも１つの試料の調製を完了する；および／または（３）連続富化ステーションチャネルインプットの間に、可能な１つまたは複数の参照期間を伴う富化ステーションチャネルの１つに参照期間あたり１つの調製済み試料をインプットする；および／または（４）連続富化ステーション溶出液の間に、可能な１つまたは複数の参照期間を伴う参照期間あたり１つの富化ステーション溶出液をアウトプットする。

【0098】

さらに、本発明は、以下の項目に関する：
１．試料中の糖化ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ１ｃ）を決定するための方法であって、
（ａ）ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）分子、特に、無傷のヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）を含む試料を用意する工程、
（ｂ）前記試料中の無傷のヘモグロビンＡ、特に、ヘモグロビンＡのα鎖および／またはβ鎖の分子を富化する工程、および
（ｃ）無傷のヘモグロビンＡ、特にヘモグロビンＡのα鎖および／またはβ鎖の分子を含む試料に質量分析（ＭＳ）による分析を施す工程であって、試料中のＨｂＡ１ｃ分子の量または濃度が決定される、工程
を含む方法。

【0099】

２．工程（ａ）における試料が、溶血した全血試料、特に溶血したヒト全血試料である、項目１の方法。

【0100】

３．工程（ａ）における試料が、特に、試料：水の比が約１：５～約１：１０の比、または約１：５、１：６、１：７、１：８、１：９もしくは１：１０（ｖ／ｖ）の比などの１：２～１：２０（ｖ／ｖ）で、水（Ｈ_２Ｏ）を使用して溶血する、項目１または２の方法。

【0101】

４．試料が、約３０分間未満、約１０分間未満、約５分間未満、または約２分間未満の期間、特に約１０～約６０秒の間に溶血する、項目１から３のいずれか１つの方法。

【0102】

５．富化工程（ｂ）が、無傷のヘモグロビンＡ、特にヘモグロビンＡのα鎖およびβ鎖が固体相に結合する条件下で、試料を無傷のヘモグロビンＡ、特にヘモグロビンＡのα鎖およびβ鎖に選択的に結合するための表面を有する固体相に接触させる工程、ならびに結合したヘモグロビンＡ、特にヘモグロビンＡのα鎖および／またはβ鎖を固体相から選択的に溶出する工程を特に含む、第１の富化工程（特に、結合／遊離分離工程）（ｂ）（ｉ）を含む、項目１から４のいずれか１つの方法。

【0103】

６．固体相が疎水性表面を備える、項目５の方法。

【0104】

７．工程（ｂ）（ｉ）において、試料を、約５～約７のｐＨ、特に約６のｐＨにおいて固体相に接触させる、項目５または６の方法。

【0105】

８．工程（ｂ）（ｉ）において、バッファーの存在下、特にギ酸アンモニウムの存在下で、試料を固体相に接触させる、項目５から７のいずれか１つの方法。

【0106】

９．固体相が、粒子、特に磁性粒子または常磁性粒子、特に金属酸化物および／または金属炭化物、特にＦｅ_３Ｏ_４を含む磁性コアまたは常磁性コアを有する粒子からなる、項目５から８のいずれか１つの方法。

【0107】

１０．固体相の疎水性表面が、Ｃ_３～Ｃ_１８アルキル基、特にＣ_４アルキル基を含む、項目５～９のいずれか１つの方法。

【0108】

１１．固体相の疎水性表面が、約１００ｎｍ未満、特に約１０ｎｍ未満の細孔サイズを有する細孔を備える、項目５～１０のいずれか１つの方法。

【0109】

１２．富化工程（ｂ）（ｉ）において、無傷のヘモグロビンＡ、特にヘモグロビンＡのα鎖およびβ鎖の分子が、特に、２０％～６０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルの存在下、より詳細には約５０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルの存在下で、固体相からの選択的溶出によって富化される、項目５～１１のいずれか１つの方法。

【0110】

１３．富化工程（ｂ）が、試料の、第２の富化工程（ｂ）（ｉｉ）、特にクロマトグラフィー工程（ｂ）（ｉｉ）、特にＨＰＬＣ、マイクロＬＣおよび迅速ＬＣからなる群から選択される、特に液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を含む、項目１～１２のいずれか１つの方法。

【0111】

１４．富化工程（ｂ）が、結合／遊離分離工程（ｂ）（ｉ）およびクロマトグラフィー工程（ｂ）（ｉｉ）を含む、項目５～１３のいずれか１つの方法。

【0112】

１５．クロマトグラフィー富化工程（ｂ）（ｉｉ）において、無傷のヘモグロビンＡβ鎖分子が、特に少なくとも１０倍、ヘモグロビンＡα鎖分子に対して富化されている、かつ／または無傷のヘモグロビンＡβ鎖分子が、特に少なくとも１０倍、アルブミン分子に
対して富化されている、項目１３から１４のいずれか１つの方法。

【0113】

１６．工程（ｃ）が、無傷のヘモグロビンＡβ鎖分子の分析を含み、特に、無傷のヘモグロビンＡβ鎖分子に、トリプシンまたはＧｌｕ－Ｃなどのプロテアーゼによる消化が施されていない、項目１から１５のいずれか１つの方法。

【0114】

１７．工程（ｃ）が、無傷のヘモグロビンＡβ鎖分子の時間飛行型（ＴＯＦ）ＭＳ分析、特に四重極（Ｑ）－ＴＯＦ ＭＳ分析を含む、項目１から１６のいずれか１つの方法。

【0115】

１８．試料中のＨｂＡ１ｃの量を決定する工程が、特に、荷電状態Ｍ＋１７Ｈ～Ｍ＋１３Ｈを含めた、無傷のヘモグロビンＡβ鎖分子のいくつかの荷電状態のシグナル統合を含む、項目１から１６のいずれか１つの方法。

【0116】

１９．非糖化ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ０）または全ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）に対する糖化ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ１ｃ）の比が決定される、項目１から１８のいずれか１つの方法。

【0117】

２０．比が、２．５％以下、特に、２．０％以下の変動係数（ＣＶ）で決定される、項目１から１９のいずれか１つの方法。

【0118】

２１．
（ｉ）無傷の糖化ＨｂＡ１ｃ分子の選択的結合のための疎水性表面を有する固体相を特に含む、無傷の糖化ＨｂＡ１ｃ分子を富化するための富化手段、
（ｉｉ）溶血全血試料を希釈し、試料構成成分を固体相（ｉ）に結合させる際に使用するための実質的に中性の固体相結合媒体、および
（ｉｉｉ）富化手段（ｉ）から試料成分を溶出する際に使用するための、特に５０％（ｖ／ｖ）の量のアセトニトリルなどの水混和性有機溶媒を含む溶出媒体
を含むキット。

【0119】

２２．項目１から２０のいずれか１つの方法における、項目２１のキットの使用。

【0120】

２３．項目１～２０のいずれか１つの方法を行うように適合されている試料における、糖化ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ１ｃ）を決定するための診断システム。

【0121】

２４．試料中の糖化ヘモグロビンＡ（ＨｂＡｃ１）を決定するための診断システムであって、
（ｉ）全血試料の溶血を含む、無傷のＨｂＡ１ｃ分子を含む試料を調製するための少なくとも１つのステーション、
（ｉｉ）試料からの、無傷のヘモグロビンＡ分子、特にヘモグロビンＡのα鎖および／またはβ鎖を選択的に富化するように適合されている少なくとも１つの富化ステーション、ならびに
（ｉｉｉ）質量分析（ＭＳ）により無傷のヘモグロビンＡ分子、特にヘモグロビンＡのβ鎖を分析し、試料中のＨｂＡｃ１の量または濃度を決定するように適合されている少なくとも１つのステーション
を含む診断システム。

【0122】

２５．項目１から２０のいずれか１つの方法における、項目２３または２４の診断システムの使用。

【0123】

以下において、本発明を、実施例によって一層詳細に説明する。

【実施例】

【0124】

実施例１
全血中の無傷のＨｂＡ１ｃの決定
１００μＬの３つの全血試料を、４００μＬの脱イオン水によりそれぞれ希釈し、濁りのない溶液が得られるまで、１０秒間、ボルテックスすることによって混合した。次に、各溶血血液を、それぞれ、２、６または１０のｐＨを有する様々なバッファー中で２０倍に希釈した。

【0125】

疎水性磁気ビーズ（各１００μＬ）の３つの回分を上で示されている３種の異なるバッファーの各々の９００μＬと混合することによって平衡にした。続いて、９００μＬの上清を廃棄し、平衡化済みビーズを回収した。

【0126】

ロードしたビーズを得るため、３つの９００μＬの全血の溶血血液試料（上で示した通り、３種の異なるバッファー中で既に希釈した）を平衡済みビーズの個々の回分に加えた。次に、この混合物を３７℃および１２００ｒｐｍで１５分間、振盪した。

【0127】

ロードしたビーズから、ＬＣ－ＭＳのための一連のいくつかの画分を以下の通り採取した：
最初に、９００μＬの上清をロードしたビーズの各回分から採取した。この「０％画分」の１００μＬを、ＬＣーＭＳのため、９００μＬの０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸（溶出液Ａ）を加えることによって１０倍に希釈した。ビーズは、さらなる画分を採取するために保持した。

【0128】

次に、「１０％画分」を、それぞれのバッファー７００μＬおよび５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル（ＡＣＮ）２００μＬをビーズの各回分に加えることによって採取した。この混合物を３７℃および１２００ｒｐｍで１分間、振盪した。

【0129】

「１０％画分」の９００μＬを採取した。続いて、１００μＬをＬＣ－ＭＳのために、０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸中で１０倍に希釈した。

【0130】

続いて、「２０％画分」、「３０％画分」および「４０％画分」を得るため、この手順を漸増濃度２０％（ｖ／ｖ）、３０％（ｖ／ｖ）および４０％（ｖ／ｖ）のＡＣＮを含有するバッファーを用いて、ロードしたビーズの各回分に対して同様に繰り返した。

【0131】

ロードしたビーズの各回分に由来する、生じた画分、０％画分、１０％画分、２０％画分、３０％画分および４０％画分に、ＬＣ－ＭＳ分析を施した。

【0132】

ＬＣ－ＭＳ測定は、Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｎａｐｔ Ｇ２－Ｓｉ ＨＤＭＳ ＱｕａｎＴｏｆデバイスで行った。ギ酸アンモニウムバッファーシステムおよび最適化されたソースパラメーターを無傷のタンパク質測定に使用した。イオン透過を最適化して、ＨｂＡ１ｃ断片化を伴わない化学ノイズをなくした。Ｃ４カラムをα鎖およびβ鎖の脱塩および分離に使用した。マニュアルおよび荷電状態（Ｍ＋１７Ｈ～Ｍ＋１３Ｈ）のソフトウェア－シグナル統合を使用した。

【図1】

【図2】

【図3】