特許 7668549 がん免疫療法におけるＡＳＣスペック

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-04-17

(45)【発行日】2025-04-25

(54)【発明の名称】がん免疫療法におけるＡＳＣスペック

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/02 20060101AFI20250418BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20250418BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20250418BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20250418BHJP

【ＦＩ】

A61K38/02

A61P35/00

A61K39/00 H

A61K39/39

【請求項の数】 9

(21)【出願番号】P 2022527996

(86)(22)【出願日】2019-11-14

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-01-26

(86)【国際出願番号】 TR2019050952

(87)【国際公開番号】W WO2021096446

(87)【国際公開日】2021-05-20

【審査請求日】2022-07-11

(73)【特許権者】

【識別番号】522039474

【氏名又は名称】ボアズィチ ウニヴェルシテシ

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】オゾレン、ネスリン

【審査官】六笠 紀子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第０１／０２９２３５（ＷＯ，Ａ２）

【文献】特表２０１５－５１５４８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１８／０８１４５９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Cancer Research，2000年，Vol.60, No.22，pp.6236-6242

【文献】Neuro-Oncology，2019年04月，Vol.21, No.7 ，pp.854-866

【文献】Japanese Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery，2002年，Vol.50, 増刊(9月)，Page.269, LF1-2

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３８／００－３８／５８

Ａ６１Ｋ ３９／００－３９／４４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

腫瘍抗原と、Ｃ末端カスパーゼ動員ドメイン（ＣＡＲＤ）を含むアポトーシス関連スペック様タンパク質（ＡＳＣタンパク質）によって形成されたＣ末端カスパーゼ動員ドメイン（ＣＡＲＤ）を含むアポトーシス関連スペック様タンパク質スペック（ＡＳＣ ｓｐｅｃｋ）とを含む、
がん治療の方法に使用するための組成物。

【請求項2】

前記方法が、哺乳動物のがん疾患に対して免疫応答を誘導及び／又は刺激することを含み、該誘導又は刺激が、がん進行の抑制又はがん細胞の増殖停止を引き起こす、請求項１に記載の使用のための組成物。

【請求項3】

前記がんが胸腺がんである、請求項１又は２に記載の使用のための組成物。

【請求項4】

腫瘍抗原が、ＡＳＣスペックを形成するＡＳＣタンパク質と疎水性相互作用を形成することによって、ＡＳＣスペックによって担持される、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項5】

腫瘍抗原が、該腫瘍抗原とＡＳＣスペックを形成する少なくとも１つのＡＳＣタンパク質とが融合して形成される融合タンパク質を含むＡＳＣスペックによって担持される、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項6】

腫瘍抗原が、ＡＳＣタンパク質のＮ末端又はＣ末端でＡＳＣタンパク質と融合している、請求項５に記載の使用のための組成物。

【請求項7】

前記がんが腫瘍を形成するがんであり、かつ前記方法が、腫瘍進行の抑制又は腫瘍サイズの減少を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項8】

ＡＳＣタンパク質によって形成されるＡＳＣスペックと、
腫瘍抗原と
を含む、哺乳動物においてがんに対する免疫応答を生成するための組成物。

【請求項9】

腫瘍抗原が、該腫瘍抗原とＡＳＣスペックを形成する少なくとも１つのＡＳＣタンパク質とが融合して形成される融合タンパク質を含むＡＳＣスペックによって担持される、請求項８に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、がん治療におけるＡＳＣスペック（ＡＳＣ ｓｐｅｃｋ）の使用、ならびにＡＳＣスペック担体を含む組成物、特にＡＳＣスペック及び腫瘍抗原の組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

世界保健機関（ＷＨＯ）によれば、がんは世界中の主要な死因であり、２０１８年には９６０万人が死亡したと推定されている。同年に新規症例数は１８００万例に増加しており、肺がんが最も頻繁に診断されるがん型であり、次いで乳がんであった。

【0003】

今日、がん治療の選択肢には、手術、放射線療法、化学療法、標的薬物療法、骨髄移植、ホルモン療法及び免疫療法が含まれる。当技術分野でよく知られているように、これらの治療方法のほとんどは、重篤な副作用があり、死亡率から明らかなように、今もなお全てのがん型を効率的に治癒させることはできない。免疫療法は、身体特有の防御機構を使用してがんと戦うため、比較的安全である。

【0004】

伝統的ながん治療方法は、化学物質（化学療法）、放射線又は腫瘍の外科的切除によってがんを攻撃するという原理に基づいている。化学療法は、一次治療又は二次治療のいずれかとして使用される非常に一般的な方法である。これは急速に増殖する細胞を攻撃し、該細胞には、がん細胞、及び骨髄細胞などの正常細胞も含まれる。したがって、主な副作用として、化学療法は患者の免疫系を抑制する。一方、免疫療法は、身体特有の免疫系ががん細胞を攻撃するのを助け、複数のがん型を効果的に治療することを可能にする。化学療法とは異なり、免疫療法は全体的な免疫系機能を改善する。

【0005】

免疫系は、器官、組織、細胞及びタンパク質のネットワークである。免疫系の主な機能は、細菌、ウイルス、真菌又は任意の他の異物などの侵入物から身体を保護することである。がんの機構に関する研究により、がん細胞も免疫系によって認識されることが長年知られている。しかしながら、それらは身体自身の細胞に由来するため、防御機構ががん細胞を異物として同定することは容易ではない。

【0006】

別の重要な態様は、免疫系が侵入物又は異常細胞から身体を首尾よく保護するためには、そのような身体を認識し、必要な防御機構を産生し、それらを破壊するのに十分な時間を要することである。がん細胞が急速に増殖し、また非常に複雑であることを考慮すると、身体の防御細胞は通常、がん細胞に対してそれらの機能を完了する前に停止する。したがって、免疫系は、急速に増殖するがん細胞から身体を保護することができるための援助を必要とすることが認められている。

【0007】

免疫療法は、多くの未知数を有する比較的新しい治療方法である。第一に、がんにおける免疫系の役割は完全には解明されていない。第２に、この自然防御機構に関与するタンパク質は、環境変化に対する感度が高く、その機能を失いやすい。これは、新しい治療選択肢の開発及び患者に対するこれらの治療の使用の両方において課題である。

【0008】

免疫学及び腫瘍生物学における最近の研究は、免疫系と腫瘍細胞との相互作用の理解に新しい洞察を提供する。多くの研究により、抗腫瘍免疫を媒介するためのＴ細胞の重要性が確立されている。発がんの過程は、宿主Ｔ細胞によって認識され得る腫瘍細胞に対する抗原の発現変化をもたらす（Ｄｅｒｍｉｍｅ，Ｓ．，Ａ．Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｒ．Ｅ．Ｈａｗｋｉｎｓ ａｎｄ Ｐ．Ｌ．Ｓｔｅｒｎ，’’Ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ’’，Ｂｒｉｔｉｓｈ ｍｅｄｉｃａｌ ｂｕｌｌｅｔｉｎ，Ｖｏｌ．６２，Ｎｏ．１，ｐｐ．１４９－１６２，２００２）。

【0009】

現在、免疫チェックポイント阻害剤、改変Ｔ細胞、モノクローナル抗体及びがんワクチンは、多くのがん型に対する免疫療法として一般的に使用されている（Ｋａｍｔａ，Ｊ．，Ｍ．Ｃｈａａｒ，Ａ．Ａｎｄｅ，Ｄ．Ａ．Ａｌｔｏｍａｒｅ ａｎｄ Ｓ．Ａｉｔ－Ｏｕｄｈｉａ，’’Ａｄｖａｎｃｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｐｒｅｓｅｎｔ ａｎｄ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏ－ｏｎｃｏｌｏｇｙ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ’’，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７，ｐ．６４，２０１７）。

【0010】

がんワクチンは、予防ワクチン又は治療ワクチンという２つの主な群に分けることができる。理論的には、がん予防ワクチンは腫瘍の発生を予防し、持続する免疫を提供すべきである。予防ワクチンの最初の例は、ＨＢＶ及びＨＰＶの感染に対するものである（Ｃｈａｎｇ，Ｍ．－Ｈ．，’’Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ’’，Ｒｅｃｅｎｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｆｏｒｔｓｃｈｒｉｔｔｅ ｄｅｒ Ｋｒｅｂｓｆｏｒｓｃｈｕｎｇ．Ｐｒｏｇｒｅｓ ｄａｎｓ ｌｅｓ ｒｅｃｈｅｒｃｈｅｓ ｓｕｒ ｌｅ ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ．１８８，ｐｐ．７５－８４，２０１０）。

【0011】

治療ワクチンは、その組成に従って４つの主な下位群に分けることができ、全菌体（ｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌ）腫瘍、樹状細胞、ＤＮＡ及びサブユニットのワクチンである。全菌体（ｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌ）腫瘍ワクチンは、ほとんどが同種異系であり、患者間で観察された腫瘍不均一性の規模が大きいため、ある程度有効である（Ｓｒｉｖａｔｓａｎ，Ｓ．，Ｊ．Ｍ．Ｐａｔｅｌ，Ｅ．Ｎ．Ｂｏｚｅｍａｎ，Ｉ．Ｅ．Ｉｍａｓｕｅｎ，Ｓ．Ｈｅ，Ｄ．Ｄａｎｉｅｌｓ ａｎｄ Ｐ．Ｓｅｌｖａｒａｊ，’’Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｖａｃｃｉｎｅｓ’’，Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ＆Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．１，ｐｐ．５２－６３，１ ２０１４）。樹状細胞ワクチンは、患者から細胞を抽出し、特異的抗原及び／又はアジュバントで細胞を刺激することによって産生される（Ｋａｍｔａ，Ｊ．，Ｍ．Ｃｈａａｒ，Ａ．Ａｎｄｅ，Ｄ．Ａ．Ａｌｔｏｍａｒｅ ａｎｄ Ｓ．Ａｉｔ－Ｏｕｄｈｉａ，’’Ａｄｖａｎｃｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ Ｐｒｅｓｅｎｔ ａｎｄ Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｏ－Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．「、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．７，ｐ．６４，２０１７）。前立腺がんに対する、ＦＤＡに認可された１つの樹状細胞ワクチンのシプロイセルがある（Ｇｕｏ，Ｃ．，Ｍ．Ｈ．Ｍａｎｊｉｌｉ，Ｊ．Ｒ．Ｓｕｂｊｅｃｋ，Ｄ．Ｓａｒｋａｒ，Ｐ．Ｂ．Ｆｉｓｈｅｒ ａｎｄ Ｘ．－Ｙ．Ｗａｎｇ，’’Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ’’，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１１９，ｐｐ．４２１－４７５，２０１３）。がん免疫療法においてＤＮＡワクチンが新たに登場し、基本的に腫瘍関連抗原の配列を必要とする。

【0012】

がん免疫療法のためのサブユニットワクチンには、典型的ワクチンにおけるような抗原又は抗原のエピトープが含まれる。黒色腫、前立腺がん、精巣がん及び乳がんを治癒するためにサブユニットワクチンが適用される。サブユニットワクチンの免疫ブースター効果は、全腫瘍ワクチンよりも穏やかであるが、アジュバントでそれらの効果を高めることが可能である（Ｔｅｍｉｚｏｚ，Ｂ．，Ｅ．Ｋｕｒｏｄａ ａｎｄ Ｋ．Ｊ．Ｉｓｈｉｉ，’’Ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ’’，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．７，ｐｐ．３２９－３８，２０１６）。

【0013】

ワクチンは、特定のワクチン製剤のアジュバントを使用することによって増強され得る適応免疫を誘導することを目的とする。無機塩、サイトカイン、乳濁液、微生物粒子及びリポソームをアジュバントとして使用することができる（Ｇｕｙ，Ｂ．，’’Ｔｈｅ ｐｅｒｆｅｃｔ ｍｉｘ：ｒｅｃｅｎｔ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ａｄｊｕｖａｎｔ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．７，ｐｐ．５０５－１７，６ ２００７）。アジュバントの作用機序は、８０年超使用されているにもかかわらず、明らかになり始めている（Ａｗａｔｅ，Ｓ．，Ｌ．Ａ．Ｂａｂｉｕｋ ａｎｄ Ｇ．Ｍｕｔｗｉｒｉ，’’Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｊｕｖａｎｔｓ．「、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．４，ｐ．１１４，２０１３）。

【0014】

アルミニウム塩（ミョウバン）は、ヒトワクチンで最も頻繁に使用されるワクチンアジュバントである。ジフテリアに対する水酸化アルミニウムの誘導効果は、１９２６年にモルモットで最初に示され、１９３１年以来、様々なミョウバン製剤がヒトワクチンに使用されている（Ｍａｒｒａｃｋ，Ｐ．，Ａ．Ｓ．ＭｃＫｅｅ ａｎｄ Ｍ．Ｗ．Ｍｕｎｋｓ，’’Ｔｏｗａｒｄｓ ａｎ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｕｍｉｎｉｕｍ．’’，Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．４，ｐｐ．２８７－９３，２００９）。

【0015】

しかし、ミョウバンアジュバントの作用機序は、これまで完全には理解できなかった。最近のいくつかの刊行物により、ミョウバンは、ＩＬ－１サイトカイン、及びインフラマソーム複合体の産物であるカスパーゼ１よりも免疫系を誘導することが示されている（Ｆｒａｎｃｈｉ，Ｌ．，Ｔ．Ｅｉｇｅｎｂｒｏｄ，Ｒ．Ｍｕｎｏｚ－Ｐｌａｎｉｌｌｏ ａｎｄ Ｇ．Ｎｕｎｅｚ，’’Ｔｈｅ ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ：ａ ｃａｓｐａｓｅ－１－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｔｈａｔ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．’’，Ｎａｔｕｒｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．３，ｐｐ．２４１－７，３ ２００９、１０，Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ，Ｓ．Ｃ．，Ｏ．Ｒ．Ｃｏｌｅｇｉｏ，Ｗ．Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｆ．Ｓ．Ｓｕｔｔｅｒｗａｌａ ａｎｄ Ｒ．Ａ．Ｆｌａｖｅｌｌ，’’Ｃｒｕｃｉａｌ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｎａｌｐ３ ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ ｉｎ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａｌｕｍｉｎｉｕｍ ａｄｊｕｖａｎｔｓ’’，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４５３，Ｎｏ．７１９８，ｐｐ．１１２２－１１２６，６ ２００８、Ｇｒｕｎ，Ｊ．Ｌ．ａｎｄ Ｐ．Ｈ．Ｍａｕｒｅｒ，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｔ ｈｅｌｐｅｒ ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｅｔｓ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｉｎ ｍｉｃｅ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｄｊｕｖａｎｔ ｖｅｈｉｃｌｅｓ：ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １ ｉｎ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．’’，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２１，Ｎｏ．１，ｐｐ．１３４－４５，６ １９８９）。

【0016】

ミョウバンから７０年超後、新しいアジュバントであるＡＳ０４が、ＨＰＶに関してＦＤＡによって認可された。ＡＳ０４は、ミョウバンとモノホスホリルリピドＡとの組み合わせから形成される。最後に、ＦＤＡは、流行性Ｈ５Ｎ１インフルエンザに対するＡＳ０３の使用を承認したが、それはもはや市販されていない。インフルエンザワクチンに使用されるＭＦ５９の製剤は、ＡＳ０３と非常に類似しているが、ＦＤＡによって認可されていない（Ａｗａｔｅ，Ｓ．，Ｌ．Ａ．Ｂａｂｉｕｋ ａｎｄ Ｇ．Ｍｕｔｗｉｒｉ，’’Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｊｕｖａｎｔｓ．「，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，ｐ．１１４，２０１３）。

【0017】

免疫活性化におけるアジュバントのブースター効果については、基本的に抗原取り込みの増強、注射部位への免疫細胞動員、ＰＲＲ及びインフラマソームの活性化に続くＴｈ１及びＴｈ２などの特定の免疫応答による提唱されたいくつかの機構がある（Ｒｅｅｄ，Ｓ．Ｇ．，Ｍ．Ｔ．Ｏｒｒ ａｎｄ Ｃ．Ｂ．Ｆｏｘ，’’Ｋｅｙ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｉｎ ｍｏｄｅｒｎ ｖａｃｃｉｎｅｓ’’，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．１２，ｐｐ．１５９７－１６０８，１２ ２０１３）。

【0018】

ＴＬＲのような自然免疫系の受容体は、アジュバントの標的である。アジュバントがＴＬＲを活性化すると、特定のケモカイン及びサイトカインが細胞外マトリックスに分泌される。次いで、これらの小分子は、細胞性免疫及び液性免疫の配向を助ける。例えば、ＩＬ－１２及びＩＦＮ－は、より多くの細胞性免疫応答を引き起こすため、ＡＰＣ及びナイーブＣＤ４細胞からのＩＬ－４の分泌は免疫にＩｇＧの産生を誘導させる（Ｒｅｅｄ，Ｓ．Ｇ．，Ｍ．Ｔ．Ｏｒｒ ａｎｄ Ｃ．Ｂ．Ｆｏｘ，’’Ｋｅｙ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｉｎ ｍｏｄｅｒｎ ｖａｃｃｉｎｅｓ’’，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．１２，ｐｐ．１５９７－１６０８，１２ ２０１３）。

【0019】

ヒト腫瘍細胞の特定のシグネチャー抗原を同定した後、革新的なアプローチが開発され、抗原特異的ワクチン接種の開発をもたらした。特定の腫瘍抗原と、これらの抗原を免疫系に送達するための適切な経路との組み合わせは、ヒトに基づくワクチン接種を最適化することを目的とする（Ｄｅｒｍｉｍｅ，Ｓ．，Ａ．Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｒ．Ｅ．Ｈａｗｋｉｎｓ ａｎｄ Ｐ．Ｌ．Ｓｔｅｒｎ，’’Ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ’’，Ｂｒｉｔｉｓｈ ｍｅｄｉｃａｌ ｂｕｌｌｅｔｉｎ，Ｖｏｌ．６２，Ｎｏ．１，ｐｐ．１４９－１６２，２００２）。

【0020】

腫瘍細胞をワクチンとして使用することもできる。これらの細胞自体は十分な免疫応答を引き起こすことができないため、研究者らは、共刺激分子又はサイトカイン遺伝子を腫瘍細胞のゲノムに導入することによって、この不応答性を克服することに注力し、腫瘍細胞はその後ワクチンとして使用され、同じ患者に戻される。しかしながら、この種のワクチン産生は、かなり遅く、労働集約的であり、事業計画的に困難である。

【0021】

或いは、腫瘍抗原を身体に送達するために組換えウイルスベクターを使用することができる。ウイルス感染の結果としての免疫応答の開始及び炎症反応の形成に対するウイルスベクターの固有能力は、これらのワクチンの利点である。しかしながら、ウイルスベクターは完璧に安全であるべきであり、抗腫瘍特異的免疫応答のブーストを可能にするために抗ベクター免疫応答を促進すべきではない（Ｄｅｒｍｉｍｅ，Ｓ．，Ａ．Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｒ．Ｅ．Ｈａｗｋｉｎｓ ａｎｄ Ｐ．Ｌ．Ｓｔｅｒｎ，’’Ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ’’，Ｂｒｉｔｉｓｈ ｍｅｄｉｃａｌ ｂｕｌｌｅｔｉｎ，Ｖｏｌ．６２，Ｎｏ．１，ｐｐ．１４９－１６２，２００２）。

【0022】

当技術分野で知られるがん治療方法にもかかわらず、がんの発生率及びこれと並行して、死亡率は毎年増加している。したがって、当技術分野では、新しいがん治療方法が依然として非常に必要とされている。

【0023】

ＡＳＣ（ＣＡＲＤを含むアポトーシス関連スペック様タンパク質）は、特にＮＬＲＰ３、ＮＬＲＣ４及びＡＩＭ２インフラマソームにおいて、インフラマソーム複合体の形成で機能する、Ｎ末端にＰＹＤドメインを有し、Ｃ末端にＣＡＲＤドメインを有する２２ｋＤａアダプタータンパク質である。ＡＳＣタンパク質は、炎症及びパイロトーシスのシグナル伝達経路におけるカスパーゼ－１タンパク質の活性化に役割を有する（Ｆｒａｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００９）。これは、インフラマソームの活性化時にスペック様構造を形成する細胞質タンパク質である（Ｍｉａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。

【0024】

ＡＳＣタンパク質は重合してフィラメントになり、ＡＳＣスペックと呼ばれる大きな超分子の足場形成を形成する（Ｓａｈｉｌｌｉｏｇｌｕ，Ａ．Ｃ．，Ｆ．Ｓｕｍｂｕｌ，Ｎ．Ｏｚｏｒｅｎ ａｎｄ Ｔ．Ｈａｌｉｌｏｇｌｕ，’’Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｄｙｎａｍｉｃｓ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ＡＳＣ ｓｐｅｃｋ ａｓｓｅｍｂｌｙ’’，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．１２，ｐｐ．１７２２－１７３４，２０１４）。これらのＡＳＣスペックは、細胞内部に存在し得るか、又は外部に放出され得る（Ｓａｈｉｌｌｉｏｇｌｕ，Ａ．Ｃ．ａｎｄ Ｎ．Ｏｚｏｒｅｎ，’’Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｌｏａｄｉｎｇ ｏｆ ＡＳＣ ｓｐｅｃｋ ｗｉｔｈ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ａｎｔｉｇｅｎｓ’’，ＰｌｏＳ ｏｎｅ，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．８，ｐ．ｅ ０１３４９１２，２０１５）。

【0025】

ＡＳＣタンパク質も含有するＮＬＲＰ３インフラマソームは、細胞外ＡＴＰ、膜損傷毒素（ニゲリシン）、リソソーム損傷、尿素一ナトリウム（ＭＳＵ）及び紫外線などの刺激によって誘発され得る。ＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化はＡＳＣスペックの合成を伴う。精製された組換えＡＳＣタンパク質を低張溶液（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ－Ａｌｎｅｍｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００７）でインキュベーションすることによって、ＡＳＣスペックをインビトロで合成できることが示されている。

【0026】

国際特許出願ＷＯ２００９／０１４８６３は、ＡＳＣタンパク質及びピロトソーム（ｐｙｒｏｐｔｏｓｏｍｅ）を自己免疫疾患の治療及び診断に使用できることを開示した。本出願によれば、ＡＳＣ二量体及びプロカスパーゼ－１を含有するアポトソーム及びピロトソームの構造は、マクロファージ細胞における初期炎症応答の間に生じる。カスパーゼ－１活性化は、ピロトソーム形成に依存する。炎症の状態は、マクロファージ細胞からピロトソームを単離することによって診断される。

【0027】

ＭＦ５９アジュバント添加インフルエンザワクチン接種後、ＡＳＣタンパク質は抗原特異的液性応答の誘発に役割を果たすと仮定された（Ｅｌｌｅｂｅｄｙ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。

【0028】

さらに、特許出願ＷＯ２０１３／１６０８０７号に開示されている発明では、ワクチン接種に使用するために、ＡＳＣスペック担体に抗原及び／又は生物活性分子を装填できることが分かっている。該発明は、本発明の発明者によって開発されたものである。そこでは、生物活性分子の安定性は、担体としてのＡＳＣスペックによって少なくとも３０日間増強することができ、分解することなく少なくとも８回の凍結解凍サイクルに耐え得ることが見出された。換言すれば、言及された出願は、ワクチン一般に有用な組成物を開示する。しかしながら、がん細胞又は腫瘍の治療のためのＡＳＣスペック自体又はＡＳＣスペックを含む組成物の治療効果は開示されていない。

【0029】

したがって、先行技術文献のいずれも、がんの治療におけるＡＳＣスペックの役割について言及していない。

【発明の概要】

【0030】

本発明の目的は、新規ながん治療方法を提供することである。

【0031】

本発明は、がん免疫療法におけるＡＳＣ（ＣＡＲＤを含むアポトーシス関連スペック様タンパク質）スペックの使用に関する。

【0032】

本発明の一実施形態では、ＡＳＣスペック担体及び腫瘍抗原を含む組成物が、がん細胞又は腫瘍の治療的処置のために提供される。

【0033】

本発明の別の実施形態では、ＡＳＣスペック担体を含む組成物が提供され、ＡＳＣスペックは、ＡＳＣタンパク質と腫瘍抗原との融合タンパク質によって形成される。

【0034】

本発明の別の実施形態では、ＡＳＣスペックは、がんの治療に使用され、腫瘍細胞に対して免疫系を増強する能力を有する。

【0035】

さらに、本発明の別の実施形態では、ＡＳＣスペックを含む組成物、好ましくはＡＳＣスペックと腫瘍抗原との組み合わせを含む組成物が、がんの治療に使用するために提供され、該方法は、哺乳動物、特にヒト対象において、がん疾患に対して免疫応答を誘導及び／又は刺激することを含み、該誘導又は刺激は、がん進行の抑制又はがん細胞の増殖停止を引き起こす。

【図面の簡単な説明】

【0036】

【図1】ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞株からのｔＯＶＡ－ＡＳＣスペックの産生及び精製。ａ）ｐ－Ｃ３－ｄ（１－２３８）ＯＶＡ－ＡＳＣプラスミドをコードするｔＯＶＡ－ＡＳＣ。クマシーブルー染色（ｂ）、抗ｈＡＳＣブロット（ｃ）及び精製されたｔＯＶＡ－ＡＳＣスペックの明視野画像（ｄ）。ｅ）精製されたｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣスペックの蛍光画像。

【図2】ＰＭＡで分化させたＴＨＰ－１マクロファージによるｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣスペックの貪食。ａ）処理の１２時間後にＴＨＰ－１マクロファージの明視野及び蛍光画像を撮影した。ｂ）ＰＢＳ、ｍＣｈｅｒｒｙ及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣで処理したＴＨＰ－１マクロファージの抗ｈＡＳＣブロット。ｃ）貪食されたｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣスペックのフローサイトメトリー分析。

【図3】ＴＨＰ－１マクロファージにより貪食されたｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣスペックの分解。ｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣ処理の１２時間後に、貪食され分解したｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣスペックの蛍光画像を撮影した。

【図4】ｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣスペックの完全な分解により、宿主細胞におけるインフラマソーム複合体が形成された。ＴＨＰ－１マクロファージにより貪食されたｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣスペックの抗ｈＡＳＣ染色の蛍光画像（ａ～ｂ）及びマージ画像（ｃ）。ｄ）マージ画像における青色フレームの３倍の拡大像。

【図5】ｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣ処置による炎症促進性サイトカインの分泌。ａ）ＮＬＲＰ３、プロ－カスパーゼ－１及びＡＳＣのｍＲＮＡ発現レベルを、ＲＴ－ｑＰＣＲ、ＩＬ－１β（ｂ）及びＴＮＦ－α（ｃ）分泌レベルと共に、ＴＨＰ－１マクロファージのｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣ処理後に測定した。（エラーバーは、２つの生物学的反復実験間のＳＤ値を示す。）

【図6】ＰＭＡで分化させたＴＨＰ－１マクロファージによるｔＯＶＡ－ＡＳＣスペックの貪食。ａ）ｔＯＶＡ－ＡＳＣ、ＰＢＳ、ＯＶＡと抗ｈＡＳＣ抗体との１２時間後のＴＨＰ－１マクロファージの免疫細胞化学。ＰＢＳ、ＯＶＡ及びｔＯＶＡ－ＡＳＣ処理後のＴＨＰ－１マクロファージのｂ）抗ＯＶＡ及びｃ）抗ｈＡＳＣブロット。

【図7】ｔＯＶＡ－ＡＳＣ処置時のＰＭＡで分化させたＴＨＰ－１マクロファージからの炎症促進性サイトカインの分泌。ＰＢＳ、１０μｇのＯＶＡ、２μｇ、５μｇ及び１０μｇのｔＯＶＡ－ＡＳＣスペックで処理したＴＨＰ－１マクロファージのＩＬ－１β（ａ）、ＴＮＦ－α（ｂ）及びＩＬ－６（ｃ）分泌レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。

【図8】ＯＶＡパルス後、ｔＯＶＡ－ＡＳＣを注射した動物の脾細胞からのサイトカイン分泌レベル。ＯＶＡをパルスされたか、又はパルスされない脾細胞。脾細胞の上清から脾細胞のサイトカインレベルをＥＬＩＳＡによって測定した（ＯＶＡ群についてはｎ＝４、ｔＯＶＡ－ＡＳＣ群についてはｎ＝６。）

【図9】腫瘍モデルに使用したＥＧ７－ＯＶＡ細胞株を産生するニワトリ卵白アルブミン。ａ）ＥＧ７－ＯＶＡ細胞株の抗ＯＶＡブロット。ｂ）ＥＧ７－ＯＶＡ腫瘍モデル実験のスケジュール。（ＯＶＡ：４３ｋＤａ）

【図10】ｔＯＶＡ－ＡＳＣ注射後のＥＧ７－ＯＶＡ腫瘍の進行。ａ）注射後の全注射の平均腫瘍体積。（各ドットは１つの腫瘍を表す。）ｂ）別々の異なる群における各腫瘍の進行。ｃ）切除された腫瘍の平均重量。（ＰＢＳについてはｎ＝３、ＯＶＡについてはｎ＝５、ｔＯＶＡ－ＡＳＣ注入についてはｎ＝８。）

【図11】ｔＯＶＡ－ＡＳＣスペックの二回腹腔内注射後の皮下接種されたＥＧ７－ＯＶＡ腫瘍の根絶。ＰＢＳ、ＯＶＡ及びｔＯＶＡ－ＡＳＣを注射した動物から切除した腫瘍の写真を撮影した。ｔＯＶＡ－ＡＳＣを注射した動物における８つの腫瘍のうち６つの腫瘍が完全に根絶された。

【図12】ＥＧ７－ＯＶＡ腫瘍を有し１００μｇのｔＯＶＡ－ＡＳＣを注射したＣ５７ＢＬ／６マウスのＯＶＡ特異的ＩｇＧ応答。動物を屠殺する直前に採取した血漿から抗ＯＶＡ ＩｇＧ応答をＥＬＩＳＡによって測定した（ＰＢＳの場合はｎ＝１、ＯＶＡの場合はｎ＝４、ｔＯＶＡ－ＡＳＣ注射の場合はｎ＝６。）

【図13】腹腔内注射されたｔＯＶＡ－ＡＳＣスペックが皮下接種されたＥＧ７－ＯＶＡ腫瘍で検出された。ｔＯＶＡ－ＡＳＣ、ＯＶＡ及びＰＢＳを注射した動物の腫瘍試料の抗ＴＭＳ１ブロット。

【図14】ｔＯＶＡ－ＡＳＣを注射した動物のＥＧ７－ＯＶＡ腫瘍へのＣＤ１１Ｃ＋樹状細胞の浸潤。ＰＢＳ、ＯＶＡ及びｔＯＶＡ－ＡＳＣを注射した動物の腫瘍の５０ｕｍ切片をクライオスタットで採取し、抗ＣＤ１１ｃ抗体で染色した。（ＣＤ１１Ｃ：樹状細胞マーカー。白い矢印はＣＤ１１ｃ＋細胞を示し、赤い矢印は腫瘍組織の間隙における非特異的抗体の残存物を示す。）

【図15】ｔＯＶＡ－ＡＳＣを注射した動物の脾臓におけるＴ細胞増殖。ＰＢＳ及びｔＯＶＡ－ＡＳＣを注射した動物の摘出脾臓からの脾細胞を抗ＣＤ４、抗ＣＤ８及び抗Ｂ２２０抗体で染色し、細胞のパーセンテージをｏｗサイトメーターで分析した。（ＣＤ４：Ｔヘルパー細胞、ＣＤ８：細胞傷害性Ｔ細胞、Ｂ２２０：Ｂ細胞マーカー、エラーバーは、ｔＯＶＡ－ＡＳＣ群の動物間のＳＤ値を示す。）

【図16】腹腔内注射したｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣが１頭の動物の腸間膜リンパ節に位置していた。ＰＢＳ、ｍＣｈｅｒｒｙ及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣを注射した動物を麻酔し、１日目（ａ）及び２日目（ｂ）にＩＶＩＳ装置下で５８０ｎｍで退出させた。

【図17】腹腔内注射されたｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣスペックの二次リンパ器官へのドレナージ。ＰＢＳ、ｍＣｈｅｒｒｙ及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣを注射した動物のリンパ節（Ａ）及び脾臓（Ｂ）を超音波処理によって溶解し、抗ＴＭＳ－１抗体でブロットした。

【図18】ＥＧ７－ＯＶＡ腫瘍を有するマウスの免疫化のワクチン接種スケジュール。

【図19】免疫化後の腫瘍の体積。免疫化後、ｔＯＶＡ－ＡＳＣ群は、他の群と比較して最も高い抗腫瘍活性を有した。ｍＣｈ－ＡＳＣ＋ＯＶＡ群は、それらのうちの１つが免疫化後に腫瘍を完全に根絶したため、議論の余地のある結果を与えた。各ドットは各マウスを表す（ｎ＝４）。

【図20】ＥＧ７－ＯＶＡモデルの実験群についてのＯＶＡ特異的ＩｇＧ応答。ＯＶＡ特異的ＩｇＧ応答は、ｔＯＶＡ－ＡＳＣ免疫マウスで最も高かった。ＯＶＡ群と比較して、ｍＣｈ－ＡＳＣ＋ＯＶＡ群は、より高いＯＶＡ特異的ＩｇＧレベルであった。ＯＶＡ、ｍＣｈ－ＡＳＣ＋ＯＶＡ及びｔＯＶＡ－ＡＳＣ群とＰＢＳ群との比較でＩｇＧレベルの有意な増加があった。（各群ｎ＝４）

【発明を実施するための形態】

【0037】

本発明の主な目的は、新規ながん免疫療法を開発することである。これは、炎症シグナル伝達経路において重要な機能を有するＡＳＣタンパク質の使用によって達成される。

【0038】

ＰＹＣＡＲＤとも呼ばれるＡＳＣタンパク質は、ＰＹＣＡＲＤ遺伝子によってコードされるアダプタータンパク質である。これは、Ｎ末端ＰＹＲＩＮドメイン、Ｃ末端カスパーゼ動員ドメイン（ＣＡＲＤ）及びそれらの間のリンカー領域を有する。ＡＳＣタンパク質は、ＣＡＲＤ－ＣＡＲＤ相互作用を介するプロカスパーゼ－１と、ＰＹＲＩＮ－ＰＹＲＩＮ相互作用を介するヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン様受容体（ＮＬＲ）タンパク質との間に架橋を形成する。

【0039】

細胞質ゾル（サイトゾル）センス病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）及び危険関連分子パターン（ＤＡＭＰ）におけるタンパク質のＮＬＲファミリー。ＮＬＲＰ３及びＡＩＭ２などの特定のＮＬＲは、インフラマソーム複合体の形成を誘導する。カスパーゼ－１は、ＡＳＣタンパク質との相互作用を介して、インフラマソーム多タンパク質複合体内で活性化される。活性化されたカスパーゼ－１は、プロＩＬ－１ベータ及びプロＩＬ－１８をそれらの成熟型に切断し、これらのサイトカインは、細胞外空間に放出され炎症を誘導する。

【0040】

未刺激細胞では、ＡＳＣは細胞質ゾル（サイトゾル）で可溶性である。刺激されると、ＡＳＣタンパク質は、一体となり、ＡＳＣスペックと呼ばれる球状構造を形成する。ＡＳＣスペックは、免疫細胞の動員を促進するために細胞の外側に分泌され得る。

【0041】

本発明の目的のために、ニワトリ卵白アルブミンタンパク質（ＯＶＡ）をモデル抗原として使用する。

【0042】

現在のアジュバントの分子作用機序の１つは、ＡＰＣによる抗原取り込みの増強であるため、ＴＨＰ－１単球細胞株を細胞培養実験に使用した。ＡＳＣスペックがＡＰＣによって貪食されたか否かを理解するために、ＰＭＡで分化させたＴＨＰ－１マクロファージをｔＯＶＡ－ＡＳＣスペック及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣスペックに別々に供した。この実験では、ｔＯＶＡ－ＡＳＣスペック及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣスペックの両方が、濃度依存的にマクロファージによって貪食されることが示された（図２）。さらに、貪食されたｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣスペックは、ＴＨＰ－１マクロファージによって分解され、蛍光顕微鏡及び共焦点顕微鏡で細胞の異なる位置に見られることが示された（図３）。

【0043】

インフラマソームは、一般的に使用されるアジュバントであるミョウバン、並びに現在製造されているアジュバントのＡＳ０３及びＭＦ５９の標的の１つである。提唱されるアジュバントであるＡＳＣスペックが、本発明によれば、ＴＨＰ－１マクロファージで炎症応答を引き起こし得るか否かを理解するために、炎症促進性タンパク質であるＮＬＲＰ３、ＡＳＣ及びプロカスパーゼ－１のｍＲＮＡ発現レベルの変化をＲＴ－ｑＰＣＲで測定した。これに関して、炎症促進性タンパク質の発現レベルは、ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質処理のみと比較した場合、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣスペック処理後に少なくとも１．５倍増加することが示されている（図５）。

【0044】

ＲＴ－ｑＰＣＲデータを裏付けるために、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α及びＩＬ－６サイトカインの分泌レベルを、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣスペック又はｔＯＶＡ－ＡＳＣスペックのいずれかによる処理後にＥＬＩＳＡによって測定した。ＩＬ－１βの分泌は、時間及び濃度依存的に増加した。ＴＮＦ－αの分泌レベルの増加は、初期（処置後１２時間）では濃度依存的であったが、後期（処置後２４時間）ではＴＮＦ－αの分泌レベルに差は観察されなかった（図６）。ｔＯＶＡ－ＡＳＣ処理により、濃度依存的にＩＬ－１βの分泌が増加した。各濃度でのｔＯＶＡ－ＡＳＣスペック処理は、１０ｕｇのＯＶＡ処理よりも多くのＩＬ－１βを生じる。ＴＮＦ－α及びＩＬ－６のレベルはｔＯＶＡ－ＡＳＣ処置後に濃度依存的に増加し、サイトカインの分泌レベルは１０ｕｇ ＯＶＡ処置より高い。その結果、抗原とＡＳＣとの融合によって形成されるＡＳＣスペックは、ＴＨＰ－１マクロファージからの炎症性サイトカイン分泌を引き起こす（図６）。これらのＲＴ－ｑＰＣＲ及びＥＬＩＳＡデータを用いて、ＡＳＣスペック処理はマクロファージにおける炎症応答の増加を引き起こすと結論付けられる。

【0045】

抗体力価は、良好なワクチンの唯一の判断基準ではなく、ＣＤ４＋細胞によるサイトカイン産生は、良好な免疫化とより強力な相関関係があり得る（Ｐｌｏｔｋｉｎ，２０１０）。免疫細胞でｔＯＶＡ－ＡＳＣスペックによって引き起こされるＴヘルパー細胞のサイトカイン産生を理解するために、生体外リコールアッセイを実施し、ＯＶＡパルスの有り無し両方でＴＮＦ－α、ＩＦＮ－ガンマ及びＩＬ－４のレベルを測定した。ＩＦＮ－ガンマは、主にＴリンパ球及びナチュラルキラー細胞によって産生されるサイトカインであり、腫瘍の進行及び転移の阻害に重要な役割を果たす（Ｆａｒｒａｒ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ Ｒ．Ｄ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，’’Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｇａｍｍａ ａｎｄ ｉｔｓ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ’’，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．１，ｐｐ．５７１－６１１，４ １９９３）。これは、直接抗ウイルス剤としても使用されてきた。これは、ワクチン接種後に１型Ｔヘルパー細胞によって特異的に産生され、遅延型過敏反応を引き起こし、結果として細胞媒介性免疫を引き起こす（Ｒｏｍａｇｎａｎｉ，Ｓ．，’’Ｔｙｐｅ １ Ｔ ｈｅｌｐｅｒ ａｎｄ ｔｙｐｅ ２ Ｔ ｈｅｌｐｅｒ ｃｅｌｌｓ：ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｏｌｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．’’，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ＆ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．２，ｐｐ．１５２－８，１９９１；Ｇｏｄｆｒｏｉｄ，Ｊ．，Ｇ．Ｃｚａｐｌｉｃｋｉ，Ｐ．Ｋｅｒｋｈｏｆｓ，Ｖ．Ｗｅｙｎａｎｔｓ，Ｇ．Ｗｅｌｌｅｍａｎｓ，Ｅ．Ｔｈｉｒｙ ａｎｄ Ｊ．Ｊ．Ｌｅｔｅｓｓｏｎ，’’Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｃａｔｔｌｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｂｏｖｉｎｅ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ４ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ｕｓｉｎｇ ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ ａｓｓａｙ．’’，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５３，Ｎｏ．１－２，ｐｐ．１３３－４１，１１ １９９６．）。生体外リコールアッセイを用いて、本発明の発明者らは、ｔＯＶＡ－ＡＳＣスペックを注射した動物のＯＶＡパルス脾細胞及び非パルス脾細胞の両方が、ＩＦＮ－ガンマを分泌し、ＯＶＡパルス後に分泌レベルが低下するのに対して、他の群は、ＯＶＡパルス後にのみＩＦＮ－ガンマを分泌することを示した。これに関して、ｔＯＶＡ－ＡＳＣスペックは、抗原特異性なしに細胞性免疫応答の形成を引き起こし得ると考えられる。

【0046】

ＴＮＦ－αは炎症促進性サイトカインであり、液性及び細胞性の両免疫応答の形成に必要とされ得る。しかしながら、ＴＮＦ－αはまた、ＮＫ細胞で機能喪失を引き起こし、それによってＩＦＮ－ガンマの分泌及びある種のがんに対する細胞傷害活性の低下を引き起こす（Ｒｏｍｅｒｏ－Ｒｅｙｅｓ，Ｍ．，Ｃ．Ｈｅａｄ，Ｎ．Ａ．Ｃａｃａｌａｎｏ ａｎｄ Ａ．Ｊｅｗｅｔｔ，’’Ｐｏｔｅｎｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ－α ｄｕｒｉｎｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｏｒａｌ ｔｕｍｏｒｓ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｌｏｓｓ ｏｆ ＮＫ ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ’’，Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，Ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．１１，ｐｐ．２０６３－２０７５，９ ２００７．）。

【0047】

本発明の実験では、各動物の脾細胞は、ＯＶＡパルス後にＴＮＦ－αを分泌するが、ｔＯＶＡ－ＡＳＣを注射した動物及びミョウバン＋ＯＶＡを注射した動物の両脾細胞からの分泌は、ＯＶＡを注射した動物の分泌よりも少なかった。

【0048】

ＩＬ－４サイトカインは、主に２型Ｔヘルパー細胞によって産生され、ＩＦＮ－ガンマの相互アンタゴニストとして知られている。これは、インビボでＢ細胞の増殖及び好酸球の動員を調節する（Ｓｍｉｌｅｙ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｇｒｕｓｂｙ，’’Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ４’’，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１４５１－１４５３，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９９８．）各動物の脾細胞からのＩＬ－４の分泌は、ＯＶＡパルス後に減少するが、ｔＯＶＡ－ＡＳＣを注射した動物の脾細胞は、ＯＶＡパルスの有り無し両方で最高量のサイトカインを分泌する。

【0049】

その結果、本発明の発明者らは、ｔＯＶＡ－ＡＳＣを注射した動物の脾細胞からのＴＮＦ－α及びＩＬ－４の分泌レベルが、一般的に使用されるアジュバントであるミョウバン＋ＯＶＡを注射したものと非常に類似していることを示した（図８）。提唱されたアジュバント、ＡＳＣスペック、及びミョウバンアジュバントの違いは、ＯＶＡパルス前のＩＦＮ－ガンマの分泌である。ＩＦＮ－ガンマはより多くの細胞媒介性免疫応答を引き起こすため、ＡＳＣスペックを使用して細胞性免疫を増強することができる。

【0050】

上述のように、免疫療法は、主に研究されているがんに対する研究領域の１つである。ワクチンアジュバントは、がんに対する患者の細胞性免疫応答を増強するために開発が試みられており、ＩＦＮ－ガンマは、主に細胞性免疫部分に免疫系を向かわせる主要なサイトカインの１つである。ｔＯＶＡ－ＡＳＣスペックは、脾細胞からのＩＦＮ－ガンマ分泌を引き起こすため、Ｃ５７ＢＬ／６でＥＧ７－ＯＶＡ腫瘍モデルを実施することによって、腫瘍形成に及ぼすｔＯＶＡ－ＡＳＣスペックのインビボ効果を確認した。この目的のために、２．５ １０６個のＥＧ７－ＯＶＡ細胞をマウスの背側わき腹に皮下接種し、腫瘍が触知可能なサイズに達すると、腹腔内ｔＯＶＡ－ＡＳＣスペック注射を開始した。腫瘍サイズは不均一性を示し、動物の数は限られていたため、各群が少なくとも１つの小さい腫瘍、１つの中間サイズ及び１つの大きい腫瘍を有するように、マウスを実験群と対照群に分けた。ＰＢＳ及びＯＶＡの注射を陰性対照として行った。

【0051】

ｔＯＶＡ－ＡＳＣを注射した動物の４つの腫瘍は、初回注射の７日後に完全に根絶されたが、ＯＶＡを注射した動物では同じ期間中にもう１つの腫瘍が形成された。その後、７日目にブースター注射を行った。ブースター注射の２日後、ｔＯＶＡ－ＡＳＣ群ではさらに２つの腫瘍が完全に根絶された。ＰＢＳ群では１頭の動物が死亡した。ｔＯＶＡ－ＡＳＣを注射した動物における腫瘍の進行は、ｔＯＶＡ－ＡＳＣスペックが何らかの理由でＥＧ７－ＯＶＡ腫瘍に治療効果を及ぼし、ｔＯＶＡ－ＡＳＣ群には２つの腫瘍のみが残存することを示したため、ＡＳＣスペックのこの治療効果の細胞機構及び分子機構を理解するために実験を終了した。動物の剖検中、腫瘍が剖検前に完全に根絶された動物の腫瘍接種部位では、結合組織のみに遭遇し、いかなる残存腫瘍組織にも遭遇しなかった。ＰＢＳ及びＯＶＡ群における腫瘍の平均重量は、約２ｇであったが、ｔＯＶＡ－ＡＳＣ群では０．０３ｇであった（図９）。

【0052】

動物の血清を用いたさらなる実験は、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ応答がＰＢＳ群及びＯＶＡ群ではそれぞれ５ｕｇ／ｍｌ及び８ｕｇ／ｍｌであったため、ｔＯＶＡ－ＡＳＣを注射した動物では、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ応答が首尾よく約１８ｕｇ／ｍｌに増加したことを示した（図１２）。ｔＯＶＡ－ＡＳＣ群におけるＩｇＧ応答の増加は、主に２つの理由によって引き起こされ得る。第１に、ＥＧ７－ＯＶＡ腫瘍は連続的にＯＶＡタンパク質を産生するため、ｔＯＶＡ－ＡＳＣスペックがマウスで般的な免疫バーストを引き起こす場合、それはＯＶＡに対する抗体産生を引き起こす可能性がある。第２に、これは、腹腔内注射されたｔＯＶＡ－ＡＳＣスペックの量が２倍になることによって引き起こされる可能性がある。

【0053】

さらに、本発明の発明者らは、腹腔内注射されたｔＯＶＡ－ＡＳＣスペックが、該動物のうちの一頭において皮下接種されたＥＧ７－ＯＶＡ腫瘍部位に移動し、少なくともｔＯＶＡ－ＡＳＣタンパク質形態で無傷のままであったことを認識した（図１３）。基本的には、腫瘍微小環境の周囲の血管新生強化及びこれらの血管の漏出のために、ｔＯＶＡ－ＡＳＣスペックが腹腔内部位から循環に入り、腫瘍に漏出することによって引き起こされる可能性がある。他の理由は、ｔＯＶＡ－ＡＳＣスペックがＡＰＣによって貪食され、これらのＡＰＣが何らかの理由で腫瘍に蓄積することであり得る。腫瘍に浸潤する成熟ＤＣは、免疫活性化の増加及び免疫エフェクター細胞の動員をもたらすため、ＤＣｓが腫瘍に浸潤するか否かをＩＨＣ染色で確認した。従来の／古典的なＤＣサブタイプを染色するＣＤ１１Ｃ＋抗体を使用した。

【0054】

このサブタイプは、ＭＨＣクラスＩＩ発現を有する定義された特徴的な形態を有する（Ｃｏｌｌｉｎ，Ｍ．，Ｎ．ＭｃＧｏｖｅｒｎ ａｎｄ Ｍ．Ｈａｎｉｆｆａ，’’Ｈｕｍａｎ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｅｔｓ．’’，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１４０，Ｎｏ．１，ｐｐ．２２－３０，９ ２０１３．）。本発明者らは、ＣＤ１１Ｃ＋ＤＣが、ｔＯＶＡ－ＡＳＣを注射した動物のうちの一頭の腫瘍クライオスタットに局在していることを示した（図１４）。興味深いことに、ｔＯＶＡ－ＡＳＣは、ＣＤ１１Ｃ＋ＤＣ浸潤腫瘍で見出された。ＩＨＣ及びウェスタンブロットのデータは、ｔＯＶＡ－ＡＳＣスペックがＤＣによって腫瘍微小環境に運ばれた可能性を高める。

【0055】

ｔＯＶＡ－ＡＳＣスペックの治療効果の分子機構及び細胞機構を理解するために、ＥＧ７－ＯＶＡ腫瘍モデルを繰り返した。ＥＧ７－ＯＶＡ細胞を２４頭のマウスの各背側わき腹に接種したが、４つの腫瘍のみが形成された。免疫細胞の増殖及び腫瘍浸潤に及ぼすｔＯＶＡ－ＡＳＣスペックの効果を理解するために、これら４つの腫瘍を有する動物にＰＢＳ及びｔＯＶＡ－ＡＳＣを注射した。初回注射の７日後、ｔＯＶＡ－ＡＳＣを注射した動物の１つの腫瘍は縮小し始め、１０日目にはもはや触知できなかった。次いで、実験を終了して、フローサイトメトリー分析を用いて、脾臓におけるヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞及びＢ細胞のパーセンテージを測定した。ｔＯＶＡ－ＡＳＣを注射した動物の脾臓におけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の割合は、ＰＢＳを注射した動物の割合と比較すると増加した（図１５）。脾細胞からのサイトカイン分泌及びフローサイトメトリー分析の両方により、ｔＯＶＡ－ＡＳＣ注射がＣ５７ＢＬ／６マウスでヘルパーＴ細胞活性化の形成を引き起こすと結論付けることができる。

【0056】

ワクチンは、一般に、免疫を刺激するために皮下、筋肉内又は腹腔内に注射される。ワクチンの成功は、ＡＰＣがリンパ球と相互作用するリンパ節への抗原の流入によって増加する（Ｊｏｈａｎｓｅｎ，Ｐ．ａｎｄ Ｔ．Ｍ．Ｋｕｎｄｉｇ，’’Ｉｎｔｒａｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ．’’，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ：ＪｏＶＥ，Ｎｏ．８４，ｐ．ｅ５１０３１，２ ２０１４；Ｔｏｚｕｋａ，Ｍ．，Ｔ．Ｏｋａ，Ｎ．Ｊｏｕｎａｉ，Ｇ．Ｅｇａｗａ，Ｋ．Ｊ．Ｉｓｈｉｉ，Ｋ．Ｋａｂａｓｈｉｍａ ａｎｄ Ｆ．Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，’’Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｔｈｅ ｄｒａｉｎｉｎｇ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅｓ ｉｓ ａ ｋｅｙ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ ｖａｃｃｉｎｅ’’，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．８２，Ｎｏ．１，ｐｐ．３８－４５，４ ２０１６．）。さらに、遊走性ＤＣによる注射部位からリンパ器官への抗原の送達は、ＣＴＬプライミングの効率を高める（Ａｌｌａｎ，Ｒ．Ｓ．，Ｊ．Ｗａｉｔｈｍａｎ，Ｓ．Ｂｅｄｏｕｉ，Ｃ．Ｍ．Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．Ａ．Ｖｉｌｌａｄａｎｇｏｓ，Ｙ．Ｚｈａｎ，Ａ．Ｍ．Ｌｅｗ，Ｋ．Ｓｈｏｒｔｍａｎ，Ｗ．Ｒ．Ｈｅａｔｈ ａｎｄ Ｆ．Ｒ．Ｃａｒｂｏｎｅ，’’Ｍｉｇｒａｔｏｒｙ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ａｎｔｉｇｅｎ ｔｏ ａ ＬｙｍｐｈＮｏｄｅ－Ｒｅｓｉｄｅｎｔ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＣＴＬ Ｐｒｉｍｉｎｇ’’，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．１，ｐｐ．１５３－１６２，７ ２００６．）。ＡＳＣスペックが二次リンパ節への抗原流入を誘発するか否かを理解するために、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣスペックをＣ５７ＢＬ／６マウスに腹腔内注射し、ＩＶＩＳ技術で可視化した。興味深いことに、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣを注射した動物の脾臓及び腸間膜リンパ節からの赤色蛍光シグナルは、免疫化の１日後に認識されたが、５８０ｎｍで励起した場合、蛍光シグナルは、ＰＢＳではなく、ｍＣｈｅｒｒｙを注射した動物のみにあった（図１６）。さらに、本発明者らは、注射の２日後に動物を屠殺した後、腸間膜リンパ節及び脾臓組織から抗ｈＡＳＣブロットを行うことによってＩＶＩＳ結果を検証した（図１７）。

【0057】

試験の詳細は、本明細書の実験部分で説明する。これらの実験及びその結果に関する簡潔な情報を以下に説明する。

【0058】

最初に、ｔＯＶＡ－ＡＳＣタンパク質（２３９～３８６のアミノ酸配列を含むＯＶＡの切断型の融合タンパク質、及びヒトＡＳＣタンパク質）がｐ－Ｃ３－ｄ（１～２３８）ＯＶＡ－ＡＳＣプラスミドによって産生される。

【0059】

ＯＶＡの切断型には、ＯＶＡの両Ｔ細胞エピトープが含まれ、２５７～２６８アミノ酸のＯＶＡペプチド及び３２３～３３９アミノ酸のＯＶＡペプチドは、それぞれ、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩエピトープである（Ｌｉｐｆｏｒｄ，Ｇ．Ｂ．，Ｍ．Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｈ．Ｗａｇｎｅｒ ａｎｄ Ｋ．Ｈｅｅｇ，’’Ｐｒｉｍａｒｙ ｉｎ ｖｉｖｏ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｏｖａｌｂｕｍｉｎ．Ｐｒｏｂｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｋｂ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｆ．’’，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．：１９５０），Ｖｏｌ．１５０，Ｎｏ．４，ｐｐ．１２１２－２２，２ １９９３；ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｂ．Ｊ．，Ａ．Ｊ．Ｓａｎｔ，Ｔ．Ｐ．Ｌｙｂｒａｎｄ ａｎｄ Ｃ．Ｂｅｅｓｏｎ，’’Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（３２３－３３９）ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｉｎｄｓ ｔｏ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ ＩＩ Ｉ－Ａ（ｄ）ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｓｉｎｇ ｔｗｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｒｅｇｉｓｔｅｒｓ．’’，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３８，Ｎｏ．５０，ｐｐ．１６６６３－７０，１２ １９９９）。ｔＯＶＡ－ＡＳＣタンパク質を使用して、ｔＯＶＡ－ＡＳＣスペックを産生する。

【0060】

さらに、ｔＯＶＡ＋ＡＳＣスペックは、ｔＯＶＡタンパク質をＡＳＣスペックに装填することによって産生され、次いで、これはがん免疫療法におけるＡＳＣスペックのアジュバント効果の調査に使用される。

【0061】

本明細書では、腫瘍抗原をＡＳＣスペックに装填する様々な方法があることに留意することが重要である。一般に生物活性分子、本発明に従って具体的には腫瘍抗原を、ＡＳＣスペックに装填する方法のいくつかについては、公開された特許出願ＷＯ２０１３／１６０８０７（抗原送達方法）を参照されたい。

【0062】

例えば、腫瘍抗原は、疎水性相互作用を介して、又はＡＳＣスペック担体を形成するＡＳＣタンパク質と少なくとも１つの抗原との融合タンパク質を形成することによって、ＡＳＣスペック担体に装填され得る。

【0063】

親水性を有する抗原は、疎水性相互作用のみによってＡＳＣスペック担体で担持できない。したがって、一実施形態では、少なくとも１３アミノ酸長及び疎水性配列を含むペプチドと抗原との融合タンパク質を作製することによって、親水性を有する抗原を疎水性相互作用を介してＡＳＣスペック担体に装填することができる。

【0064】

第２に、国際公開第２０１３／１６０８０７号に記載されている方法に従って、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣスペックを産生及び精製する。ｍＣｈｅｒｒｙは、イメージングシステム用のトラッカーとして使用される赤色蛍光タンパク質である。

【0065】

上記のＡＳＣスペックを用いて行われた実験は、精製されたＡＳＣスペックがマクロファージに貪食され、分解されることを示した。さらに、精製されたＡＳＣスペックによるＴＨＰ－１マクロファージの刺激が、炎症性サイトカインであるＩＬ－１β、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αの分泌を誘導することが実証されている。さらに、ｔＯＶＡ－ＡＳＣスペック注射は、免疫化された野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾細胞からＩ型及びＩＩ型のサイトカインの分泌を引き起こすことが示されている。最後に、本発明者らは、ｔＯＶＡ－ＡＳＣ注射が、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでＥＧ７－ＯＶＡ腫瘍の完全な根絶又はサイズの縮小を引き起こすことを証明した。

【0066】

上述のように、ニワトリ卵白アルブミンタンパク質（ＯＶＡ）は、本発明の目的のためのモデル抗原として使用される。ｔＯＶＡ－ＡＳＣ（２３９～３８６のアミノ酸配列を含むニワトリ卵アルブミンタンパク質であるＯＶＡの切断型と、ヒトＡＳＣタンパク質との融合タンパク質）を産生するために、ｐ－Ｃ３－ｄ（１～２３８）ＯＶＡ－ＡＳＣプラスミドをクローニングする。

【0067】

インビボ及びＴＨＰ－１細胞株に及ぼすＡＳＣスペックの免疫刺激効果を試験するために、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞株でｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣスペック及びｔＯＶＡ－ＡＳＣスペックを産生した。ｔＯＶＡ－ＡＳＣスペックの純度及び濃度を測定するために、精製されたスペック及び所定濃度のＢＳＡをＳＤＳ－ＰＡＧＥにローディングし、図１に見られるようにクマシーブルーで染色した。精製タンパク質がｔＯＶＡ－ＡＳＣであるか否かを理解するために、単離タンパク質の抗ｈＡＳＣブロットを行った。

【0068】

抗原取り込みに及ぼすＡＳＣスペックの効果を調べるために、ＰＭＡで分化させたＴＨＰ－１マクロファージを１０ｕｇ／ｍｌ、２５ｕｇ／ｍｌ、５０ｕｇ／ｍｌ及び１００ｕｇ／ｍｌのｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣスペックで処理した。ＰＢＳ及び５０ｕｇ／ｍｌの市販ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質を陰性対照として使用した。処理の１２時間後、ＰＢＳ及びｍＣｈｅｒｒｙタンパク質で処理したウェルではｍＣｈｅｒｒｙシグナルは観察されなかったが、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣスペックで処理した細胞は、図２に見られるようにｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣスペックを貪食した。処理細胞のｈＡＳＣブロットはまた、貪食され、分解されたｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣタンパク質を示す。

【0069】

蛍光データを確認し、それを定量するために、同じ実験を繰り返し、処理の１２時間後にｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞をフローサイトメトリーで計数した。ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の数は、処理におけるｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣスペック濃度の増加と共に増加する。これらの実験では、ＡＳＣスペックがＴＨＰ－１マクロファージによるｍＣｈｅｒｒｙタンパク質の貪食を促進することが示されている。

【0070】

ＴＨＰ－１マクロファージによる貪食されたｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣスペックの分解が、蛍光顕微鏡下で検出された（図３）。ｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣ処理の４時間後、蛍光顕微鏡の４０倍対物レンズを使用した場合、赤色蛍光シグナルは細胞の細胞質から生じ、スペック様構造ではなく細胞の細胞質を介して広がっていた。

【0071】

ＮＬＲＰ３ＡＳＣ及びプロカスパーゼ－１（炎症促進性タンパク質）の発現レベルを、１０μｇのｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣスペック、１０μｇのｍＣｈｅｒｒｙ及び１０μｇのＰＢＳによる処理後にＲＴ－ｑＰＣＲによって測定した。ハウスキーピング遺伝子であるＨＰＲＴをｑＰＣＲの対照として使用し、全ての遺伝子発現をＨＰＲＴ発現に従って正規化した。図５に見られるように、ＮＬＲＰ３、プロカスパーゼ－１及びＡＳＣの発現レベルは、ｍＣｈｅｒｒｙ処置と比較して、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣ処置後に有意に増加した。

【0072】

ＡＳＣスペックが貪食後に炎症促進性応答を引き起こすか否かを理解するために、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣ処置の１２時間後及び２４時間後に、ＰＭＡで分化させたＴＨＰ－１マクロファージの培地から分泌サイトカインを測定した。ＰＢＳ、モック精製試料及び市販のｍＣｈｅｒｒｙタンパク質を陰性対照として使用した。ｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣスペック処理は、時間及び濃度依存的にＩＬ－１β及びＴＮＦ－αレベルの分泌を増加させたが、ｍＣｈｅｒｒｙ及びモック精製試料で処理した細胞は、図５に見られるように基底レベルのサイトカインを分泌した。

【0073】

その結果、使用されるペプチドがＴＨＰ－１マクロファージのＡＳＣスペックによって抗原性でなくても、ペプチドの貪食が増強され、炎症応答が形成され得ると推測されている。

【0074】

さらに、ｔＯＶＡ－ＡＳＣスペックもＡＰＣによって貪食されるか否かを調べるために、ＰＭＡで分化させたＴＨＰ－１マクロファージを１０ｕｇ／ｍｌのｔＯＶＡ－ＡＳＣスペックで処理し、処理の１２時間後に抗ｈＡＳＣ抗体を用いて免疫細胞化学アッセイを行った。１０ｕｇ／ｍｌのＯＶＡ及びＰＢＳを陰性対照として使用した。Ａｌｅｘａ－４８８に結合した抗マウスＩｇＧを二次抗体として使用した。図６の不十分な緑色蛍光シグナルは、内因性ＡＳＣを示し、これは、通常、細胞質を介して分布するように細胞で見られるが、炎症の活性化後にスペック様構造を形成するためである。図６の斑状の強い緑色蛍光シグナルは、ＴＨＰ－１マクロファージによるｔＯＶＡ－ＡＳＣスペックの貪食を示す。

【0075】

全てのスペックが内因的に形成されないことを確実にするために、抗ＴＭＳ１（ウサギで産生されるｈＡＳＣ抗体）を用いたウェスタンブロット分析を行った。ウェスタンブロット分析用に、ＴＨＰ－１マクロファージを２．５ｕｇ／ｍｌ、５ｕｇ／ｍｌ及び１０ｕｇ／ｍｌのｔＯＶＡ－ＡＳＣで処理した。１０ｕｇ／ｍｌのＯＶＡ及びＰＢＳを陰性対照として再び使用した。処理の１２時間後、ウェルをＰＢＳで３回洗浄して、まだ貪食されていないｔＯＶＡ－ＡＳＣスペックを除去し、抗ＴＭＳ１及び抗ＯＶＡを用いてウェスタンブロット分析を行った。

【0076】

図６に見られるように、バンドのサイズは約３９ｋＤａであり、これはｔＯＶＡ－ＡＳＣスペックから発せられる斑状緑色蛍光シグナルを示す。また、ＯＶＡは、アジュバント又はワクチン担体を必要とせずにマクロファージによって貪食され得る（図６の第３レーン）。

【0077】

細胞の培地も回収して、分泌されたＩＬ－１β、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。ｔＯＶＡ－ＡＳＣスペック処理は、ＩＬ－１β及びＩＬ－６の分泌を有意に増加させた（図７）。ＴＨＰ－１マクロファージからのＩＬ－１βの分泌は、ｔＯＶＡ－ＡＳＣ処理の各濃度で１０μｇのＯＶＡ処理よりも高く、濃度依存的に増加した。ｔＯＶＡ－ＡＳＣ処置後のＩＬ－６分泌レベルは、用量依存的に増加し、１０μｇ／ｍｌのＯＶＡ処置単独よりも１０μｇ／ｍｌのｔＯＶＡ－ＡＳＣ処置で高い。ＴＮＦ－αレベルはまた、ｔＯＶＡ－ＡＳＣ量の濃度増加と共に増加する。しかしながら、１０μｇ／ｍｌのＯＶＡ処理と１０μｇ／ｍｌのｔＯＶＡ－ＡＳＣ処理との間にＴＮＦ－α分泌の有意差はない。

【0078】

ニワトリ卵白アルブミンを合成するＣ５７ＢＬ／６マウス胸腺腫細胞株であるＥＧ７－ＯＶＡは、抗原に特異的な腫瘍ワクチン研究のために主に使用される腫瘍モデルの１つである。Ｇ４１８で処理すると、ＯＶＡを発現する。マウスへの接種前に、図９に示すように、抗ＯＶＡブロットを用いて、ＥＧ７－ＯＶＡ細胞株のＯＶＡ発現が示された。

【0079】

８～１０週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに腫瘍を形成させるために、２５０万個のＥＧ７－ＯＶＡ細胞をマウスの各背側のわき腹に接種した。接種の１２日後、１８個の腫瘍が触知可能なサイズに達し、図９に示すように、１００μｇのｔＯＶＡ－ＡＳＣを含む３００μｌのＰＢＳの腹腔内注射を開始した。５０μｇのＯＶＡ及びＰＢＳを陰性対照として使用した。初回免疫化後に２つのデジタルノギスを用いて２日毎に腫瘍の２つのサイズを測定した。

【0080】

ｔＯＶＡ－ＡＳＣを注射した動物の１つの腫瘍は、初回注射後４日目に完全に根絶された。ｔＯＶＡ－ＡＳＣを注射した動物のさらに３つの腫瘍は、初回注射後７日目に完全に根絶され、ＯＶＡを注射した動物のうちの１頭でもう１つの腫瘍が形成された。初回免疫化の１週間後、初回と同様にブースター注射を繰り返した。２回目の免疫化の１日後、ＰＢＳを注射した動物のうちの１頭は、おそらく動物が有する腫瘍のサイズのために死亡した。図１０に見られるように、ｔＯＶＡ－ＡＳＣを注射した動物のさらに２つの腫瘍は、２回目の注射後２日目に完全に根絶された。

【0081】

２回目の免疫化後４日目に２回目の注射後に２つの腫瘍のみが残存したため、ｔＯＶＡ－ＡＳＣを注射した動物の腫瘍を用いてさらなる分析を行うために実験を終了した。各群における各腫瘍の進行を示した。全ての動物を屠殺した。腫瘍が既に根絶されているｔＯＶＡ－ＡＳＣを注射した動物では、腫瘍組織は認められなかった。ＯＶＡを注射した動物のうちの１頭には、同じ背側わき腹に２つの別個の腫瘍組織があった。図１１に示すように、注射されたＰＢＳ、ＯＶＡ及びｔＯＶＡ－ＡＳＣの切除腫瘍の平均体積は、それぞれ、１９３５ｍｍ^３、１６９０ｍｍ^３及び６２ｍｍ^３である。図１１に示すように、ＰＢＳ、ＯＶＡ及びｔＯＶＡ－ＡＳＣを注射した腫瘍の平均腫瘍重量は、それぞれ、２．５ｇ、２．１１ｇ及び０．０７ｇであった。

【0082】

その結果、図１０に示すように、ＰＢＳ及びＯＶＡを注射した動物の腫瘍がＣ５７ＢＬ／６マウスの背側わき腹で増殖し続けるため、ｔＯＶＡ－ＡＳＣスペックの２回のショットは、各腫瘍サイズの縮小及び８個のうち６個のＥＧ７－ＯＶＡ腫瘍の完全な根絶を生じる。

【0083】

ｔＯＶＡ－ＡＳＣスペックの抗腫瘍効果は、ＯＶＡに対する抗体応答によって引き起こされ得るため、動物のＯＶＡ特異的ＩｇＧレベルをＥＬＩＳＡによって測定する。ＰＢＳ群の１頭は屠殺前に既に死亡しているため、動物の血液を採取することはできず、ＰＢＳ群については１頭の動物のみでさらなる実験を行う。その結果、図１２から分かるように、ｔＯＶＡ－ＡＳＣを注射した動物では、ＰＢＳ及びＯＶＡを注射した動物よりも多くのＯＶＡ ＩｇＧ応答があった。

【0084】

ＡＳＣスペックのアジュバント効果を調べるために、さらなる試験を行った。

【0085】

ＰＢＳ、ＯＶＡ、ｔＯＶＡ－ＡＳＣ及びｍＣｈ－ＡＳＣ＋ＯＶＡ実験群を含む４つの群が存在した。ＰＢＳのみ、１００μｇのＯＶＡのみ、１００μｇのｔＯＶＡ－ＡＳＣのみ、並びに１００μｇのｍＣｈ－ＡＳＣと１００μｇのＯＶＡをマウスの各群に腹腔内注射した。ＯＶＡ及びＡＳＣの両方のスペックをＰＢＳに懸濁したため、ＰＢＳは陰性対照群であった。ＡＳＣスペックのアジュバント効果を調べるために、ＯＶＡ注射を実施して、ＯＶＡ単独の免疫化が腫瘍サイズの減少に十分であるか否かを調べた。また、ｍＣｈ－ＡＳＣ及びＯＶＡ群は、ＯＶＡ群と比較してＡＳＣスペックのアジュバント特性を確認するためのモデルであった。この実験では、ｔＯＶＡ－ＡＳＣ群を、抗原特異的抗腫瘍ワクチンとしてのＡＳＣスペックの担体能力を確認するためのモデル群とした。ＥＧ７－ＯＶＡ腫瘍を有するマウスの免疫化用のワクチン接種スケジュールを図１８に見ることができる。

【0086】

ＥＧ７－ＯＶＡ細胞の接種の１４日後、腫瘍形成が触知可能なサイズに達して免疫化を開始した。図１９に見られるように、初回免疫化の７日後、ＰＢＳ、ＯＶＡ及びｍＣｈ－ＡＳＣ＋ＯＶＡ群は腫瘍サイズが増加したが、ｔＯＶＡ－ＡＳＣスペックで免疫化したマウスは腫瘍サイズの進行がほとんどなかった。次いで、２回目の用量を各群に注射した。

【0087】

２回目の免疫化の７日後、ｍＣｈ－ＡＳＣ＋ＯＶＡ免疫マウスの１頭及びｔＯＶＡ－ＡＳＣ免疫マウスの３頭は腫瘍を完全に根絶した。ＯＶＡのみを免疫したマウス由来の腫瘍の１つは、２回の注射後も同じサイズのままであった。ｍＣｈ－ＡＳＣ＋ＯＶＡ免疫マウスの１頭は、２回の注射後、安定した腫瘍サイズのままであった。最終の免疫化後、全ての動物を屠殺した。最後に、ｔＯＶＡ－ＡＳＣ免疫マウスの１頭は、注射後に腫瘍増殖パターンを示した。

【0088】

抗体は、腫瘍細胞を標的とするために臨床試験中である。これらの抗体は、腫瘍細胞の抗原に結合し、直接的な細胞溶解又は抗体が促進する食作用を誘導し、抗原のプロセシング及びＡＰＣ上のＭＨＣクラスＩ又はＩＩ分子を介した提示をもたらす。この状況は、宿主において、腫瘍に対する抗体及び／又は細胞傷害性Ｔ細胞の産生のいずれかによって宿主の抗腫瘍免疫を誘導する。ｔＯＶＡ－ＡＳＣスペックの抗腫瘍効果が観察されたため、この抗腫瘍活性は、抗体が促進する抗腫瘍免疫によって引き起こされ得る。宿主での抗原に特異的な抗体産生を示すために、ＥＬＩＳＡを実施して、ＥＧ７－ＯＶＡ腫瘍に対するＯＶＡ特異的ＩｇＧ応答を調べる。

【0089】

図２０に見られるように、ＰＢＳは陰性対照群であり、ＰＢＳを含む他の群と比較して、ＯＶＡ、ｍＣｈ－ＡＳＣ＋ＯＶＡ及びｔＯＶＡ－ＡＳＣ群についてＯＶＡ特異的ＩｇＧレベルの増加が得られた。ＯＶＡを含む群を互いに比較すると、ｍＣｈ－ＡＳＣ＋ＯＶＡ群では、ＯＶＡ群と比較して有意に高いＩｇＧ応答があった。また、ｔＯＶＡ－ＡＳＣ群では、ＯＶＡ群と比較して有意に高いＩｇＧ応答があった。これは、免疫系をアジュバントとして増強し、抗原を保有して宿主で抗腫瘍免疫を誘導することによって、ＡＳＣスペックが抗腫瘍活性を有することができることを示した。

【0090】

最後に、腹腔内注射されたｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣスペックは、適応免疫系の誘発に重要な二次リンパ節に向かうことが示されている。

【0091】

二次リンパ節がＴ細胞応答の主な位置であるため、本発明者は、腹腔内注射されたｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣスペックが、ＩＶＩＳ及びウェスタンブロット分析によって腸間膜リンパ節及び脾臓に輸送され得るか否かを確認した。この目的のために、１０ｕｇのｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣスペックを含む２００ｕｌのＰＢＳを、８頭の１６～１８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに腹腔内注射した。陰性対照として、４頭及び８頭の動物にＰＢＳ及び市販のｍＣｈｅｒｒｙタンパク質をそれぞれ注射した。注射の１日後、２日後及び１０日後、動物をＩＶＩＳ装置で観測した。２日目に、動物の半分を屠殺し、それらの脾臓、腸間膜リンパ節、肝臓及び脳をウェスタンブロット分析用に回収した。残りの半分を１０日目に屠殺し、同じ組織を回収した。

【0092】

図１６に見られるように、黄色はＩＶＩＳで高強度の赤色蛍光シグナルを示し、動物が５６～５８０ｎｍの波長で励起された場合に、Ｃ５７ＢＬ／６動物の腹部及び生殖器領域はバックグラウンド蛍光を生じる。しかし、注射の１日後に、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣを注射した動物の腸間膜リンパ節領域の１つで強い蛍光が撮られた。１０日目に、各動物で蛍光強度はほぼ同じであった。

【0093】

ＩＶＩＳデータを裏付けるために、採取した全ての組織をウサギで産生された抗ｈＡＳＣでブロットして、注射されたｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣスペックを検出した。図１７に見られるように、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣタンパク質は、一方の動物の腸間膜リンパ節及び他方の動物の脾臓で検出された。さらに、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣタンパク質の分解は、脾臓の抗ｈＡＳＣブロッティングの下方バンドに見ることができる。

【0094】

したがって、本発明の一実施形態では、実験が腫瘍細胞に対する免疫系を増強する能力を実証したため、（ＡＳＣタンパク質によって形成される）ＡＳＣスペックががんの治療に使用される。

【0095】

別の実施形態では、がん治療の方法で使用するためのＡＳＣスペックを含む組成物が提供され、該方法は、哺乳動物のがん疾患に対する免疫応答を誘導及び／又は刺激することを含み、該誘導又は刺激は、がん進行の抑制又はがん細胞の増殖停止を引き起こす。

【0096】

別の実施形態では、腫瘍抗原と、ＡＳＣタンパク質によって形成されるＡＳＣスペック分子とを含む組成物が、がん治療に使用するために提供される。

【0097】

別の実施形態では、がん治療に使用するためのＡＳＣスペックの組成物が提供され、該組成物は、ＡＳＣスペックを形成するＡＳＣタンパク質と疎水性相互作用を形成することによって、ＡＳＣスペックによって担持される腫瘍抗原を含む。

【0098】

本発明の一実施形態によれば、組成物は、腫瘍抗原と少なくとも１つのＡＳＣタンパク質との融合タンパク質によって形成されるＡＳＣスペックを含む。該組成物は、がんの治療、特に腫瘍の治療に使用される。

【0099】

上記の融合タンパク質は、Ｎ末端又はＣ末端でＡＳＣタンパク質に融合される腫瘍抗原によって形成され得る。

【0100】

本発明の別の実施形態では、組成物は、好ましくはＡＳＣスペックを形成するＡＳＣタンパク質と疎水性相互作用を形成することによって、ＡＳＣスペックの内部に担持される腫瘍抗原を含む。

【0101】

本発明は、任意の種類のがん、好ましくは腫瘍形成がん、より好ましくは胸腺がんの治療に関する。

【0102】

一実施形態によれば、本発明の組成物は、がん免疫療法に使用され、それを必要とする哺乳動物への該組成物の投与は、腫瘍進行の抑制又は腫瘍サイズの減少又は腫瘍の完全な根絶を引き起こす。

【0103】

本発明の別の実施形態では、がんを治療する方法が提供され、該方法は、がんの治療を必要とする哺乳動物に、ＡＳＣスペックを含む治療有効量の組成物を投与する工程を含む。該組成物は、好ましくは腫瘍抗原をさらに含み、好ましくは、腫瘍抗原は、ＡＳＣスペックを形成するＡＳＣタンパク質との融合タンパク質を形成することによって、ＡＳＣスペックによって担持される。

【0104】

別の実施形態では、腫瘍抗原に結合したＡＳＣスペック担体を含む組成物が提供され、ＡＳＣスペック担体は、ＡＳＣタンパク質と腫瘍抗原との融合タンパク質のオリゴマー化によって形成される。

【0105】

本発明に使用できる腫瘍抗原の例は、乳がんのＨＥＲ２＋（膜結合タンパク質）、前立腺がんのＰＳＡ（３４ｋＤａのサイズの糖タンパク質）、黒色腫がんのＭＡＧＥ（黒色腫関連抗原）、腺管糖タンパク質のＭＵＣ１（膜貫通糖タンパク質）又はネオ抗原である。これらは単に例として与えられるものであり、任意の他の腫瘍関連抗原を本発明の目的のために使用することができる。

【0106】

本発明のさらに別の実施形態では、腫瘍抗原に結合したＡＳＣスペック担体を含む組成物が胸腺腫瘍の治療に使用され、ＡＳＣスペックはＡＳＣと腫瘍抗原との融合タンパク質によって形成される。

【実施例】

【0107】

実験
材料：
実験で用いた材料の詳細を以下に示す。

【表1】

【表2】

【表3】

【表4】

【表5】

【表6】

【表7】

【表8】

【表9】

【0108】

方法：
１．ｔＯＶＡ－ＡＳＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣスペックの精製
１．１．プラスミドＤＮＡの増幅及び単離
ｐ－Ｃ３－ｄ（１－２３８）ＯＶＡ－ＡＳＣ及びｐ－Ｃ３－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣプラスミドをクローニングし、この研究に使用する。製造業者が示唆するように、ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＥＧＥＬ（ＭＮ）キットを使用して、中間量調製及び大量調製を行った。細菌培養物を、中間量調製及び大量調製物用にカナマイシンを補充した２００ｍｌ及び４００ｍｌのＬＢでそれぞれ増殖させた。

【0109】

１．２．ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞株の維持
ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞株を、１０％ＦＢＳ、ＭＥＭ－ＮＥＡ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭで維持した。細胞が９０％の集密度に達すると、プレートをＰＢＳで洗浄し、３７℃で２分間トリプシン処理して継代培養した。

【0110】

１．３．リン酸カルシウムトランスフェクション
プラスミドＤＮＡ及びリン酸カルシウムの不溶性沈殿物の形成を生じるリン酸カルシウムトランスフェクション法によって、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞株を容易にトランスフェクションした。これらの沈殿物は、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞に貪食される。１４００万個の細胞を１５０ｍｍ細胞培養プレートに播種した。実験に従って、ｄｄＨ２Ｏ中で希釈することによってプラスミド濃度を調整し、２Ｍ ＣａＣｌ２を１滴ずつ添加した。５分後、２×ＨＢＳを添加し、気泡を形成した。５分後、プラスミド及びリン酸カルシウム混合物を継代培養中のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞に１滴ずつ添加した。

【表10】

【0111】

１．４．ＡＳＣスペックの産生及び単離
１４００万個のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を計数し、６つの１５０ｍｍ細胞培養プレートのそれぞれに播種した。（ｐＣ３－（ｄ１－２３５）ＯＶＡ－ＡＳＣ）プラスミドＤＮＡをリン酸カルシウムトランスフェクション法によってトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、細胞の培地を吸引し、３ｍｌのＰＢＳを添加した。細胞を擦過によって表面から剥離し、５０ｍｌのファルコンに入れた。５０％出力下で５秒間の３０％超音波処理によって細胞を５回溶解した。溶解した細胞を、Ｂｅｃｋｍａｎ卓上遠心機を用いて４℃で２４００ｇで遠心分離した。遠心分離後、フィラメントがボルテックスによって容易に検出可能になるまでペレットを溶解した。氷上で５分間重力沈降によって、細胞の大きな断片を沈殿させた。慎重に上清を新しい５０ｍｌのファルコンに移し、３００ｇで５分間遠心分離した。上清を吸引し、ペレットを１０ｍｌのＰＢＳに溶解させた。フィラメントが見えるまで、ボルテックスによって再びペレットを溶解させた。再び重力沈降によってフィラメントを５分間沈殿させた。

【0112】

上清を新しいファルコンに入れ、３００ｇで遠心分離した。ボルテックス後にフィラメントがなくなるまで、最後のボルテックス、重力沈降及び遠心分離を繰り返した。最終試料を１．２又は５μｍのシリンジフィルターで濾過した。背圧が感知されるまで、各フィルターについて３～４ｍｌの試料を通過させた。２～３ｍｌのＰＢＳを２００μｌマイクロピペットで逆方向に濾過して、ＡＳＣスペックを１５ｍｌのファルコンに取り出した。逆濾液を３９００ｇで１時間遠心分離した。ペレットを５００μｌのＰＢＳに溶解した。ＰＢＳ中のＡＳＣスペックを＋４℃に保持した。ＡＳＣスペックの純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びクマシーブルー染色によって確認した。超音波処理を除く全ての工程を細胞培養フードで行った。

【0113】

１．５．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びクマシーブルー染色を用いた単離ＡＳＣスペックの純度及び量の測定
１．５ｍｌチューブで１０μｌの５×Ｌｅａｍｌｉ緩衝液と別々に混合された異なる濃度の単離された４０μｌのＡＳＣスペック及びＢＳＡ。それらを９５℃で１０分間煮沸し、１２％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに染色済タンパク質ラダーと共にローディングした。タンパク質ゲル電気泳動の部に記載されているように試料を泳動した。ゲルをプラスチック容器中のクマシーブルーで１時間染色し、クマシー脱染溶液で脱染した。ゲルの写真を撮影し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いてＢＳＡ濃度から導出された標準曲線に従ってＡＳＣスペックの濃度を算出した。

【0114】

２．ＴＨＰ－１マクロファージに及ぼすＡＳＣスペックの効果
２．１．ＴＨＰ－１単球細胞株の維持
ＴＨＰ－１は、白血病患者に由来する単球細胞株である。ＴＨＰ－１細胞を提供し、構成的にｅＧＦＰ－ＡＳＣを合成するＴＨＰ－１ ｅＧＦＰ－ＡＳＣ安定細胞株は、ｐＬｅｎｔｉ－Ｅｆ１ａ－ＥＧＦＰ－ＡＳＣのレンチウイルス形質導入によりＴＨＰ－１単球から得た。細胞株を、１０％ ＦＢＳ、ＭＥＭ－ＮＥＡ、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン及び１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０で維持した。

【0115】

２．２．ＴＨＰ－１単球のＴＨＰ－１マクロファージへの分化
ＲＰＭＩ１６４０を含有する１００ｎｍ／ｍｌのＰＭＡを含む６ウェルプレートの各ウェルで９時間、１．５×１０６個のＴＨＰ－１単球細胞をＴＨＰ－１マクロファージに分化させた。次いで、細胞の培地をＰＭＡを含有しないＲＰＭＩ１６４０と交換した。

【0116】

２．３．ＡＳＣスペックによるＴＨＰ－１マクロファージの処理
分化の４８時間後、マクロファージに及ぼすＡＳＣスペックの効果を見るために、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣ又はｔＯＶＡ－ＡＳＣスペックを異なる濃度で１ｍｌの細胞培地に与えた。細胞の培地を回収し、異なる時点でさらなるサイトカインＥＬＩＳＡアッセイ用に－２０℃で保持した。ＡＳＣスペック処理の１２時間後にフローサイトメトリー分析用にＴＨＰ－１マクロファージを調製し、細胞を氷上でＰＢＳ－ＥＤＴＡと３０分間インキュベーションした。次いで、穏やかに擦過することによって細胞培養プレートから細胞を剥離し、１５ｍｌ遠心管に入れた。細胞を３００ｇで５分間遠心分離し、ヒト血清を含むＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞表面染色及びフローサイトメトリー分析の部に記載されるように、それらの細胞表面タンパク質を染色し、分析した。

【0117】

２．４．ＴＨＰ－１マクロファージの免疫細胞化学
１．６×１０^５個のＴＨＰ－１単球を４８ウェルプレートでＴＨＰ－１マクロファージに分化させ、ＡＳＣスペックで処理した。ＡＳＣ処理の１２時間後、細胞の培地を吸引し、ウェルをＰＢＳで３回洗浄した。次いで、細胞を室温で１５分間、４％ ＰＦＡで固定した。細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、０．２５％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００界面活性剤を含むＰＢＳで透過処理した。次いで、細胞をブロッキング緩衝液（５％ ＢＳＡ（重量／体積）を含むＰＢＳ－Ｔ）で室温にて３０分間ブロッキングした。次いで、細胞を、１／５０希釈された抗ｈＡＳＣ抗体を含むブロッキング緩衝液と室温で２時間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで再度洗浄し、１／５００希釈されたＡｌｅｘａ－４８８フルオロフォア結合抗マウスＩｇＧと室温で１時間インキュベーションした。二次抗体のインキュベーション後、細胞を洗浄し、蛍光顕微鏡下で可視化した。

【0118】

２．５．サイトカインＥＬＩＳＡ
細胞培地におけるサイトカインレベルをサンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。簡潔には、ＥＬＩＳＡプレートを、製造業者が示唆する濃度の捕捉抗体を含むＰＢＳでコーティングし、室温で一晩インキュベーションした。９６ウェルプレートの３つのウェルを各上清試料についてコーティングし、３つのウェルを陰性対照としてＰＢＳのみでコーティングした。一晩のインキュベーション後、プレートを４００μｌのＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、非特異的結合を防止するために２００μｌの試薬希釈剤（１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ）で室温にて１時間ブロッキングした。プレートのブロッキング中、最終ＯＤ値が２．００未満であるように、細胞の上清を試薬希釈剤で希釈した。ブロッキング後、プレートをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、１００μｌの希釈試料及びサイトカイン標準物質をウェルに添加し、室温で２時間インキュベーションした。次いで、プレートをＰＢＳ－Ｔで再び３回洗浄し、製造業者が示唆する濃度の検出抗体を含む試薬希釈剤１００μｌと室温で２時間インキュベーションした。

【0119】

プレートを洗浄した後、１：５０希釈されたＨＲＰを含む試薬希釈剤１００μｌをウェルに添加し、室温で１時間インキュベーションした。次いで、プレートを再度洗浄し、１００μｌの１：１混合ＥＬＩＳＡ基質Ａ及びＥＬＩＳＡ基質Ｂをウェルに添加し、色が青に変わり始めた。基質添加の２０分後、反応を１Ｎ硫酸で終了させ、色を青色から黄色に変化させた。マイクロプレートリーダーを用いて、ウェルのＯＤ値を４５０ｎｍ及び５４０ｎｍで算出し、吸光度４５０から５４０で吸光度を抽出した。ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏソフトウェアを用いて標準物質の吸光度値及び濃度に従って標準曲線を描き、標準曲線から上清中のサイトカインレベルを測定した。

【0120】

２．６．ＲＴ－ｑＰＣＲによるＡＳＣスペック処理後のＴＨＰ－１マクロファージにおける炎症促進性タンパク質の発現パターンの決定
ＡＳＣスペック処理後のＰＭＡで分化させたＴＨＰ－１細胞において、ｍＲＮＡレベルでのタンパク質の発現パターンをリアルタイム定量ＰＣＲで測定した。ＴＨＰ－１マクロファージを１０、２５、５０及び１００μｇのｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣスペックで１２時間処理した。ＰＢＳ及び５０μｇのｍＣｈｅｒｒｙタンパク質のみを対照として使用した。

【0121】

２．６．１．ＲＮＡ抽出。
細胞をＰＢＳで３回洗浄し、擦過によって回収し、製造業者が示唆するようにＲＮＡをＭＮ ＲＮＡ抽出キットで抽出した。簡潔には、細胞を溶解緩衝液で溶解し、７０％エタノールと混合した後、溶解物をカラムに結合させた。数回の洗浄工程の後、カラムを室温で１５分間、ＤＮａｓｅＩを含むＤＮａｓｅインキュベーション緩衝液で処理した。カラムを再び洗浄緩衝液で洗浄し、乾燥させた。次いで、全ＲＮＡを、ＲＮａｓｅを含まない６０μｌの水で単離した。ＲＮＡの純度及び濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ分光光度計で測定した。

【0122】

２．６．２．ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．
製造業者が示唆するように、ＢＩＯＬＩＮＥ ＳｅｎｓｉＦＡＳＴ ｃＤＮＡ合成キットを使用して全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。簡潔には、５００ ｎｇの全ＲＮＡを、４μｌの５×ＴｒａｎｓＡｍｐ緩衝液及び１μｌの逆転写酵素を含むＤＥＰＣ処理Ｈ２０（最終容量：２０μｌ）と混合した。試料を、不活性化のために２５℃で１０分間、４２℃で１５℃及び８５℃で５分間インキュベーションした。

【0123】

２．６．３．定量的ＰＣＲ
各遺伝子に特異的なプライマー及び対照としてのＨＰＲ－Ｔを使用して、ＡＳＣスペック処理後に焦点となる遺伝子の相対的発現レベルを試験した。ｃＤＮＡ試料を、Ｅｘｉｃｙｃｌｅｒ ９６ ｑＰＣＲ装置を使用してＢＩＯＬＩＮＥ ＳｅｎｓｉＦＡＳＴ ＳＹＢＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘで増幅した。ＰＢＳ処理細胞における遺伝子の発現レベルを１に調整し、２^{－ｄｄｃｔ}法（Ｌｉｖａｋ ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ ２００１）を使用することによって、目的の遺伝子の相対的発現を測定した。

【0124】

３．ＥＧ７－ＯＶＡ腫瘍モデル及びｔＯＶＡ－ＡＳＣの免疫化
３．１．ＥＧ７－ＯＶＡ細胞株の維持
ＥＧ７－ＯＶＡ細胞株を提供した。ＥＧ７－ＯＶＡは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスリンパ腫細胞株ＥＬ－４に由来する。ＥＬ４細胞株を、ニワトリ卵白アルブミン（ＯＶＡ）の完全形態及びネオマイシン耐性遺伝子を含むｐＡｃ－ｎｅｏ－ＯＶＡプラスミドで安定にトランスフェクションして、Ｇ４１８で処理した場合にモデル腫瘍抗原としてＯＶＡタンパク質を構成的に合成するＥＧ７－ＯＶＡ細胞株を形成した。１０％ＦＢＳ、ＭＥＭ－ＮＥＡ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２－メルカプトエタノール及び０．４ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を補充したＲＰＭＩ１６４０で細胞株を維持した。細胞の培地を２日毎に交換した。

【0125】

３．２．ＥＧ７－ＯＶＡ腫瘍接種及びＯＶＡ、ＰＢＳ及びｔＯＶＡ－ＡＳＣによる免疫化
２５０万個のＥＧ７－ＯＶＡ細胞を含む１００μｌのＰＢＳを、１２頭のＣ５７ＢＬ／６マウスの各背側わき腹に接種した。１８個の腫瘍が１２日間で触知可能なサイズ（＜５０ｍｍ３）に達した。腹腔内注射は以下のように行った。３００μｌのＰＢＳ中、１００μｇのｔＯＶＡ－ＡＳＣ（ｎ＝１０）、５０μｇの市販ＯＶＡ（ｎ＝５）及びＰＢＳのみ（ｎ＝３）。２つのデジタルノギスを用いて腫瘍の２つのサイズを測定した。体積は、計算に基づいて算出した。１／２（（短い長さ＾２）長い長さ）。２回目の注射を１回目として繰り返した。ＰＢＳを注射した動物のうちの一頭は、おそらく２０日目に死亡した。２回目の注射後に２つの腫瘍しか残存していなかったため、ｔＯＶＡ－ＡＳＣを注射した動物の腫瘍を用いてさらなる分析を行うために実験を終了した。全ての動物の血液を眼窩洞から採取した。全ての動物を屠殺し、動物の脾臓を回収した。動物の腫瘍を切除し、その体積及び重量を算出した。腫瘍が既に根絶されているｔＯＶＡ－ＡＳＣを注射した動物では、腫瘍組織は認められなかった。各動物の血漿を－２０℃で保持した。動物の脾細胞を採取し、さらなる生体外リコールアッセイ用に９６ウェルプレートで培養した。動物の腫瘍を、さらなる免疫組織化学アッセイ用にＯＣＴに包埋した。各群の腫瘍由来の小部分をウェスタンブロット分析用に分割し、－８０℃で保持した。

【0126】

３．３．ＥＧ７－ＯＶＡ腫瘍接種及びＰＢＳ、ＯＶＡ、ｔＯＶＡ－ＡＳＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣによる免疫化
上記の実験と同様に、追加のｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣ免疫化のために別の試験を行った。２．５×１０^６個のＥＧ７－ＯＶＡ細胞を含む１００μｌの１×ＰＢＳを各マウスに接種した。接種前に、これらの細胞のＯＶＡ発現を、抗ＯＶＡ抗体を使用したウェスタンブロット分析で確認した。細胞を滅菌条件下で調製した。これらの細胞の接種を各マウスの右背側わき腹に行った。１２～１４日後に腫瘍が触知可能なサイズ（≧５０ｍｍ^３）に達すると、腹腔内注射を以下のように行った。３００μｌの１×ＰＢＳ中、１×ＰＢＳのみ、１００μｇのＯＶＡ、１００μｇのｍＣｈｅｒｒｙ ＡＳＣを含む１００μｇのＯＶＡ及び１００μｇのｔＯＶＡ ＡＳＣ。腫瘍のサイズをノギスで測定した。式１／２［（短い長さ^２）長い長さ］に従って、各腫瘍の体積を算出した。２回目の注射を初回注射と同じように繰り返した。

【0127】

ｔＯＶＡ ＡＳＣで免疫したマウスの腫瘍のほとんどが根絶されたため、２回目の注射の１週間後に実験を終了した。ノギスを用いて動物の腫瘍を算出した。その後、全ての動物を屠殺した。それらの心臓から血液を採取した。また、それらの脾臓及び肝臓をさらなる分析用に収集した。動物の腫瘍を切除し、ＯＣＴに包埋した。最後のマウスの実験が終了するまで、全ての組織を氷上に保持した。採取した血液試料を３７℃で１時間インキュベーションし、次いで、１１０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。血液の血清を新しいチューブに採取し、長期保存用に－８０℃で保持した。

【0128】

３．４．腫瘍及び脾臓の免疫組織化学
３．４．１．ＯＣＴ包埋。腫瘍試料をＯＣＴ化合物に加え、－２０℃で一晩保持し、次いで、さらなる分析用に－８０℃で維持した。

【0129】

３．４．２．凍結切片。ＯＣＴに包埋した腫瘍試料を凍結切片装置に右方向に置き、組織のない凍結ＯＣＴを刃で除去した。次いで、クライオスタットを適切に使用して、１０ミクロンの腫瘍切片を正に帯電したスライド上に採取した。スライドを５５℃で乾燥させ、さらなる分析用に－８０℃に保持した。

【0130】

３．４．３．固定及び抗原回収。スライドを５５℃で２時間乾燥させ、組織切片を疎水性バリアで囲んだ。次いで、組織を室温で１５分間４％ ＰＦＡで固定した。ＰＦＡを除去し、スライドをシェーカー上のジャーでＰＢＳ－Ｔを用いて３回洗浄した。スライドをシトラート緩衝液（ｐＨ：６．０）を充填した別のジャーに移し、７０℃で３０分間保持した。

【0131】

３．４．４．クライオスタット切片の抗体染色。スライドをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、それらをブロッキング緩衝液（３％ ＢＳＡを含むＰＢＳ－Ｔ）で室温にて３０分間シェーカー上でブロッキングした。次いで、１／４００希釈された蛍光標識一次抗体を含むブロッキング緩衝液とスライドを４℃で一晩インキュベーションした。一晩のインキュベーション後、スライドをＰＢＳ－Ｔで５分間３回洗浄し、蛍光顕微鏡下で可視化した。

【0132】

３．５．ＥＧ７－ＯＶＡ腫瘍からの単一細胞の調製
腫瘍を摘出し、全ての組織切片が１～２ｍｍの切片に加工されるまでハサミを用いて切り刻んだ。使い捨ての１０ｍｌシリンジからプランジャーを使用して、切り刻まれた試料をセルストレーナーに対して脱凝集させた。セルストレーナー上の腫瘍組織を３～５ｍｌの冷ＲＰＭＩ１６４０で洗浄した。フィルターの裏側の結合組織のごく小さな断片を観察するまで、洗浄工程を数回繰り返した。細胞をＲＰＭＩ１６４０で３回洗浄し、室温、３００ｇで５分間遠心分離した。

【0133】

３．６．ＯＶＡに特異的なＩｇＧ応答についてのＥＬＩＳＡ
ＯＶＡに特異的なＩｇＧ応答をＥＬＩＳＡによって測定した。簡潔には、１００μｌのＰＢＳに希釈した１００ｎｇ／ウェルのＯＶＡタンパク質で９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、ＰＢＳのみを含む陰性対照用に３ウェルを使用した。プレートを密封し、４℃で一晩インキュベーションした。各ウェルを吸引し、３００μｌの洗浄緩衝液（ＰＢＳ－Ｔ）で３回洗浄した。最後の洗浄後、プレートを清潔なペーパータオルに吸い取ることによって、残存する洗浄緩衝液及び気泡を除去した。２００μｌの試薬希釈剤（１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ）を各ウェルに添加し、プレートを室温で最小１時間、最大２時間インキュベーションした。洗浄工程を繰り返した。最後の洗浄後、プレートを清潔なペーパータオルに吸い取ることによって、残存する洗浄緩衝液及び気泡を除去した。１００μｌの標準物質（２５ｐｇ／ｍｌ～５０００ｐｇ／ｍｌ）又は試料（１：５００希釈）を添加し、プレートをストレッチフィルムで被覆し、室温で１時間インキュベーションした。洗浄工程を繰り返し、最後の洗浄後、同じ洗浄プロトコルを実施した。１００μｌの１：２０００抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ結合二次抗体を各ウェルに添加し、プレートをストレッチフィルムで被覆し、室温で１時間インキュベーションした。洗浄工程を繰り返し、最後の洗浄後、同じ洗浄プロトコルを実施した。プレートを直接光から避けながら、１００μｌの基質混合物（発色試薬Ａ及びＢの１：１混合物）を各ウェルに添加し、プレートを室温で２０分間インキュベーションした。次いで、２０μｌの停止溶液（２Ｎ Ｈ２ＳＯ４）を各ウェルに添加した。プレートを穏やかにタップして完全な混合を確実にした。各ウェルの吸光度を、プレートリーダーにより４５０ｎｍ及び５４０ｎｍで測定した。

【0134】

４．インビボでのｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣスペックの追跡
ｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣスペックを使用して、腹腔内注射後のＡＳＣスペックを追跡した。８頭のＣ５７ＢＬ／６マウスに、１０μｇのｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣを含む３００μｌのＰＢＳを腹腔内注射した。対照として、１０μｇのｍＣｈｅｒｒｙを含む３００μｌのＰＢＳ及び３００μｌのＰＢＳのみを対照群として注入した。８頭及び４頭のマウスをｍＣｈｅｒｒｙ注射及びＰＢＳ注射にそれぞれ使用した。

【0135】

４．１．インビボイメージング
ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍインビボイメージングシステムを使用して、注射されたｍＣｈｅｒｒｙ－ＡＳＣスペックをインビボで可視化し、１、２及び１０日目に、動物をＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ装置で観察した。

【0136】

４．２．ウェスタンブロット及び免疫組織化学用の組織試料採取
２日目に、各群の動物の半数を屠殺し、１０日目に残りの半数を屠殺した。動物の脾臓、腸間膜リンパ節、肝臓及び脳を切除した。脾臓をＩＶＩＳ下で生体外で観察した。脾臓からの代表部位をウェスタンブロット分析用に採取し、他の部分をＯＣＴ化合物に包埋し、－８０℃で保存した。動物の腸間膜リンパ節、肝臓及び脳を、さらなるウェスタンブロット分析用に－８０℃で保持した。

【0137】

５．ウェスタンブロット分析
５．１．細胞培養物からの試料調製
タンパク質レベルでの遺伝子の発現パターン及び調節は、一般に、ウェスタンブロット分析によって検出される。細胞におけるタンパク質の発現を分析するために、６ウェルプレートの各ウェルを１ｍｌのＰＢＳで洗浄するか、又は細胞を遠心分離し、接着細胞培養及び懸濁細胞培養のためにそれぞれ１ｍｌのＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳの吸引後、１６０μｌのプロアターゼ阻害剤複合体を補充した０．２％ ＮＰ４０溶解緩衝液を細胞に添加した。接着細胞株の場合、細胞をスクレーパー及びマイクロピペットを用いて１．５ｍｌチューブに収集した。回収した細胞を氷上で１時間保持し、細胞を完全に溶解させるために各１５分間ボルテックスした。細胞のより大きな断片を、１３０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離によってペレット化した。上清を別の１．５ｍｌチューブに採取した。次いで、４０μｌの５×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液を試料に添加し、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中、９５℃で１０分間タンパク質を変性させた。

【0138】

５．２．組織からの試料調製
２ｍｌチューブで、切り刻まれ、凍結された大きな組織（脾臓、肝臓、脳及び腫瘍）の代表部位及び腸間膜リンパ節全体に、２００μｌの溶解緩衝液を添加した。７０％出力下で１分間の５０％の超音波処理によって組織を溶解し、１５分間氷上に保持した。次いで、組織溶解物を１３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、より大きな断片及び結合組織部分を除去した。上清を新しい１．５ｍｌチューブに取り、希釈した。次いで、５×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液を適切に添加し、タンパク質を９５℃で１５分間変性させた。

【0139】

５．３．ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの調製
８ｍｌの１０％、％１２又は１５％分離ゲル溶液を８０μｌの１０％ＡＰＳ及び８μｌのＴＥＭＥＤと混合した。溶液を混合した後、１．５ｍｍスペーサーとショートプレートとの間にゲルをローディングした。次いで、イソプロパノールをゲル上に表面被覆した。分離ゲルの重合後、イソプロパノールを除去し、４０μｌの１０％ＡＰＳ及び４μｌのＴＥＭＥＤを混合することによって４ｍｌの４％濃縮ゲルを調製した。濃縮ゲルを分離ゲル上にローディングし、１０ウェルコームを挿入した。濃縮ゲルの重合が完了したら、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルをタンパク質ゲル電気泳動に用いた。

【0140】

５．４．タンパク質ゲル電気泳動
タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにローディングして、タンパク質のｋＤａに従って分離した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥキャストゲルを垂直タンパク質ゲル電気泳動槽に入れ、槽を泳動緩衝液で満たした。コームを慎重に取り出し、３５μｌの変性タンパク質試料を含むＬｅａｍｌｉ緩衝液及びタンパク質ラダーをウェルにローディングした。濃縮ゲルを通過するまで試料を７０Ｖで泳動し、色素が分離ゲルの下部に達するまで１２０Ｖで泳動した。

【0141】

５．５．セミドライ転写
抗体ブロッティング用に、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルのタンパク質をニトロセルロース膜に転写した。簡潔には、ニトロセルロース膜をメタノールで活性化し、膜及び２枚の濾紙を転写緩衝液で湿らせた。１枚の濾紙、膜、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル及びもう１枚の濾紙をセミドライ転写装置にそれぞれ置いた。装置のカバーを閉じ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥからニトロセルロース膜へのタンパク質の転写を１０ Ｖで５０分間完了させた。

【0142】

５．６．膜ブロッキング
タンパク質転写膜をプラスチック容器に入れ、検出抗体の非特異的結合を防止するために５％（重量／体積）スキムミルク粉末を含むＴＢＳ－Ｔで１時間ブロッキングした。

【0143】

５．７．抗体インキュベーション
５％（重量／体積）ＢＳＡを含むＴＢＳ－Ｔで一次抗体を希釈し、アジ化ナトリウムを抗体溶液に添加して４℃で微生物の増殖を阻害した。膜をブロッキングした後、膜をＴＢＳ－Ｔで５分間３回洗浄した。適切な希釈の一次抗体と膜を４℃で一晩インキュベーションした。調製した抗体希釈液を４℃で保持し、インキュベーション用に５～１０回使用した。一次抗体とインキュベーションした膜をＴＢＳ－Ｔで５分間３回洗浄した。二次抗体溶液は、ＨＲＰコンジュゲート抗マウス又は抗ウサギ抗体１／２０００（ｖ／ｖ）を、５％（重量／体積）スキムミルク粉末を含むＴＢＳ－Ｔで希釈することによって調製した。膜を二次抗体希釈物と室温で１時間インキュベーションした。

【0144】

５．８．タンパク質の可視化
二次抗体インキュベーション後、膜をＴＢＳ－Ｔで５分間３回洗浄し、膜は２ｍｌの１：１混合ＥＣＬウェスタンブロッティング基質でｏａｔであった。次いで、Ｓｙｎｇｅｎｅ Ｇｂｏｘ Ｃｈｅｍｉ化学発光イメージングデバイスを使用して、膜上のタンパク質バンドを可視化した。

【0145】

６．細胞表面染色及びフローサイトメトリー分析
１００万個の細胞をＦＡＣＳチューブで３ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。上清を捨て、５μｌのＦｃブロッカー及び１０μｌの蛍光色素に結合した抗体を添加した。細胞を抗体と＋４℃で３０分間インキュベーションした。再度、細胞を３ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。上清を捨て、細胞を１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。細胞表面マーカーのアップレギュレーションをＢＤ Ａｃｕｒｉ及びＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。
本開示には以下の好ましい態様が含まれる。
（１）がん治療の方法に使用するための、ＡＳＣタンパク質によって形成されたＡＳＣスペック（ＡＳＣ ｓｐｅｃｋ）を含む組成物。
（２）前記方法が、哺乳動物のがん疾患に対して免疫応答を誘導及び／又は刺激することを含み、該誘導又は刺激が、がん進行の抑制又はがん細胞の増殖停止を引き起こす、（１）に記載の使用のための組成物。
（３）前記がんが胸腺がんである、（１）又は（２）に記載の使用のための組成物。
（４）組成物が、腫瘍抗原をさらに含む、（１）～（３）のいずれかに記載の使用のための組成物。
（５）腫瘍抗原が、ＡＳＣスペックを形成するＡＳＣタンパク質と疎水性相互作用を形成することによって、ＡＳＣスペックによって担持される、（４）に記載の使用のための組成物。
（６）腫瘍抗原が、該腫瘍抗原とＡＳＣスペックを形成する少なくとも１つのＡＳＣタンパク質とによって形成される融合タンパク質の一部として、ＡＳＣスペックによって担持される、（４）に記載の使用のための組成物。
（７）腫瘍抗原が、Ｎ末端又はＣ末端でＡＳＣタンパク質と融合している、（６）に記載の使用のための組成物。
（８）腫瘍抗原が、ＡＳＣスペック内に担持される、（４）～（７）のいずれかに記載の使用のための組成物。
（９）がんが腫瘍を形成するがんであり、方法が、腫瘍進行の抑制又は腫瘍サイズの減少を含む、（１）～（８）のいずれかに記載の使用のための組成物。
（１０）ＡＳＣスペック担体及び腫瘍抗原を含む、哺乳動物においてがんに対する免疫応答を生成するための組成物。
（１１）腫瘍抗原が、該腫瘍抗原とＡＳＣスペックを形成する少なくとも１つのＡＳＣタンパク質とによって形成される融合タンパク質の一部としてＡＳＣスペック担体によって担持される、（１０）に記載の組成物。
（１２）がんの治療を必要とする哺乳動物に、ＡＳＣスペックを含む治療有効量の組成物を投与する工程を含む、がんを治療する方法。
（１３）組成物が、週に一回投与される、（１２）に記載の方法。
（１４）組成物が、腫瘍抗原をさらに含む、（１２）又は（１３）に記載の方法。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】