特許 7668737 生物学的および生物工学的用途向けに最適化された受容スプライス部位モジュール

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-04-17

(45)【発行日】2025-04-25

(54)【発明の名称】生物学的および生物工学的用途向けに最適化された受容スプライス部位モジュール

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20250418BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20250418BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

C12N15/864 100Z

【請求項の数】 22

(21)【出願番号】P 2021534372

(86)(22)【出願日】2019-12-19

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-21

(86)【国際出願番号】 EP2019086454

(87)【国際公開番号】W WO2020127831

(87)【国際公開日】2020-06-25

【審査請求日】2022-12-16

(31)【優先権主張番号】18214415.4

(32)【優先日】2018-12-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】520128255

【氏名又は名称】ビゲネロン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100092624

【弁理士】

【氏名又は名称】鶴田 準一

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100108903

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 和広

(74)【代理人】

【識別番号】100114018

【弁理士】

【氏名又は名称】南山 知広

(72)【発明者】

【氏名】スタイリアノス ミヒャラキス

(72)【発明者】

【氏名】マルティン ビエル

(72)【発明者】

【氏名】エルビール ベツィロビク

【審査官】福間 信子

(56)【参考文献】

【文献】特開２００９－０００１２０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１６－５１６４２４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００５－５１８２１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００２－５３９７９７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００２－５３９７６４（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

プレｍＲＮＡトランススプライシング分子であって、
（ｉ）配列番号３または配列番号４の配列と少なくとも９０％同一である配列を含む受容スプライス領域（acceptor splice region）であって、さらに以下を含む受容スプライス領域（acceptor splice region）、
（ｉａ）以下を含むピリミジン域（pyrimidine tract）、
（ｉａａ）５～２５ヌクレオチド；
（ｉａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；および
（ｉａｃ）ここで前記ピリミジン域（pyrimidine tract）の前記５～２５ヌクレオチドはＴＴＴＴＴＴまたはＴＣＴＴＴＴの配列を含む；および
（ｉｂ）受容スプライス部位（acceptor splice site）、
（ｉｂａ）ここで前記受容スプライス部位（acceptor splice site）は前記ピリミジン域（pyrimidine tract）の３’側に位置しており；および
（ｉｂｂ）ここで前記受容スプライス部位（acceptor splice site）は、５’から３’にＣＡＧＧの配列を含み；
（ｉｉ）目的のヌクレオチド配列；ここで前記受容スプライス領域（acceptor splice region）は、前記目的のヌクレオチド配列の３’側または５’側に位置している；および
（ｉｉｉ）前記目的の核酸配列の３’側または５’側に位置するプレｍＲＮＡを標的とする結合ドメイン、
を含む、プレｍＲＮＡトランススプライシング分子。

【請求項2】

スペーサー配列、ここで該スペーサーは、結合ドメインと前記受容スプライス領域（acceptor splice region）との間に位置している、
を含む、請求項１に記載のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子。

【請求項3】

前記受容スプライス領域（acceptor splice region）は、前記目的のヌクレオチド配列の５’側に位置しており、前記結合ドメインは前記受容スプライス領域（acceptor splice region）の５’側に位置している、請求項１または２に記載のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子。

【請求項4】

終止配列、好ましくはポリＡ配列をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子。

【請求項5】

前記受容スプライス領域（acceptor splice region）は、配列番号３または４の配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子。

【請求項6】

前記受容スプライス領域（acceptor splice region）は、
（ａ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも４ヌクレオチドを有する前記ピリミジン域（pyrimidine tract）の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡである；または
（ｂ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも５ヌクレオチドを有する前記ピリミジン域（pyrimidine tract）の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡＣである；
をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子。

【請求項7】

プロモーターおよび請求項１～６のいずれか一項に記載のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子をコードする配列を含む、ＤＮＡ分子。

【請求項8】

核酸配列を作製する方法であって、当該方法は、
（Ａ）一つまたは複数の供与スプライス部位（donor splice site）配列を含む第一の核酸配列を提供する工程；
（Ｂ）以下を含む第二の核酸配列を提供する工程；
（ｉ）配列番号３または配列番号４の配列と少なくとも９０％同一である配列を含む受容スプライス領域（acceptor splice region）配列であって、さらに以下を含む受容スプライス領域（acceptor splice region）配列、
（ｉａ）以下を含むピリミジン域（pyrimidine tract）、
（ｉａａ）５～２５ヌクレオチド；
（ｉａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；および
（ｉａｃ）ここで前記ピリミジン域（pyrimidine tract）の前記５～２５ヌクレオチドはＴＴＴＴＴＴまたはＴＣＴＴＴＴの配列を含む；および
（ｉｂ）受容スプライス部位（acceptor splice site）、
（ｉｂａ）ここで前記受容スプライス部位（acceptor splice site）は前記ピリミジン域（pyrimidine tract）の３’側に位置しており；および
（ｉｂｂ）ここで前記受容スプライス部位（acceptor splice site）は、５’から３’にＣＡＧＧの配列を含み；
（Ｃ）前記一つまたは複数の供与スプライス部位（donor splice site）配列で前記第一の核酸配列を切断し、前記受容スプライス部位（acceptor splice site）の前記第二の核酸配列を切断する工程、
（Ｄ）切断された前記第一の核酸配列を切断された前記第二の核酸配列に連結し、それによって核酸配列を得る工程、
を含む、方法。

【請求項9】

前記第一の核酸配列は目的のヌクレオチド配列をさらに含み、ここで該目的のヌクレオチド配列の少なくとも一部分は、前記供与スプライス部位（donor splice site）の５’側に位置しており、ここで前記第二の核酸配列は目的のヌクレオチド配列をさらに含み、ここで該目的のヌクレオチド配列の少なくとも一部分は、前記受容スプライス領域（acceptor splice region）の３’側に位置している、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記第一および前記第二の核酸配列は宿主細胞に導入され、好ましくは前記第一および前記第二の核酸配列は組換え核酸配列である、請求項８または９に記載の方法。

【請求項11】

目的の核酸配列を作製する方法であって、当該方法は、
（Ａ）プレｍＲＮＡトランススプライシング分子配列を含む第一の核酸配列または前記プレｍＲＮＡトランススプライシング分子をコードする核酸配列を宿主細胞に導入する工程であって、ここで前記第一のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子は５’から３’に以下を含む工程、
（ａ）目的のヌクレオチド酸配列の５’部分；
（ｂ）供与スプライス部位（donor splice site）；および
（ｃ）第一の結合ドメイン；および
（ｄ）終止配列、好ましくはポリＡ配列、および
（Ｂ）プレｍＲＮＡトランススプライシング分子配列を含む第二の核酸配列または前記プレｍＲＮＡトランススプライシング分子をコードする核酸配列を宿主細胞に導入する工程であって、ここで前記第二のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子は５’から３’に以下を含む工程；
（ｉ）前記第一の核酸配列の前記第一の標的ドメインに相補的な第二の結合ドメイン；
（ｉｉ）配列番号３または配列番号４の配列と少なくとも９０％同一である配列を含む受容スプライス領域（acceptor splice region）配列であって、さらに以下を含む受容スプライス領域（acceptor splice region）配列；
（ｉｉａ）以下を含むピリミジン域（pyrimidine tract）、
（ｉｉａａ）５～２５ヌクレオチド；
（ｉｉａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；および
（ｉｉａｃ）ここで前記ピリミジン域（pyrimidine tract）の前記５～２５ヌクレオチドはＴＴＴＴＴＴまたはＴＣＴＴＴＴの配列を含む；および
（ｉｉｂ）受容スプライス部位（acceptor splice site）、
（ｉｉｂａ）ここで前記受容スプライス部位（acceptor splice site）はピリミジン域（pyrimidine tract）の３’側に位置しており；および
（ｉｉｂｂ）ここで前記受容スプライス部位（acceptor splice site）は、５’から３’にＣＡＧＧの配列を含む；
（ｉｉｉ）前記目的のヌクレオチド配列の３’部分、および
（ｉｖ）終止配列、好ましくはポリＡ配列、
（Ｃ）前記供与スプライス部位（donor splice site）配列で前記第一の核酸配列を切断し、前記受容スプライス部位（acceptor splice site）の前記第二の核酸配列を切断する工程、
（Ｄ）前記目的のヌクレオチド配列の５’部分を含む切断された前記第一の核酸配列を、前記目的のヌクレオチド配列の３’部分を含む切断された前記第二の核酸配列に連結し、それによって前記目的の核酸配列を得る工程、
を含む、方法。

【請求項12】

少なくとも２つの逆方向末端反復を含み、これら２つの逆方向末端反復間に核酸配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、ここで前記核酸配列は５’から３’に、
（ｉ）プロモーター；
（ｉｉ）結合ドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号３または配列番号４の配列と少なくとも９０％同一である配列を含む受容スプライス領域（acceptor splice region）配列であって、さらに以下を含む受容スプライス領域（acceptor splice region）配列
（ａ）以下を含むピリミジン域（pyrimidine tract）、
（ａａ）５～２５ヌクレオチド；
（ａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；および
（ａｃ）ここで前記ピリミジン域（pyrimidine tract）の前記５～２５ヌクレオチドはＴＴＴＴＴＴまたはＴＣＴＴＴＴの配列を含む；
（ｂ）受容スプライス部位（acceptor splice site）、
（ｂａ）ここで前記受容スプライス部位（acceptor splice site）はピリミジン域（pyrimidine tract）の３’側に位置しており；および、
（ｂｂ）ここで前記受容スプライス部位（acceptor splice site）は、５’から３’にＣＡＧＧの配列を含み；
（ｉｖ）目的のヌクレオチド配列；および
（ｖ）ポリＡ配列
を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。

【請求項13】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系であって、
（Ｉ）少なくとも２つの逆方向末端反復を含み、これら２つの逆方向末端反復間に核酸配列を含む第一のＡＡＶベクターであって、ここで前記これら２つの逆方向末端反復間の核酸配列が５’から３’に、
（ａ）プロモーター、
（ｂ）目的のポリペプチドのＮ末端部分をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）供与スプライス部位（donor splice site）；
（ｄ）第一の結合ドメイン；および
（ｅ）終止配列、好ましくはポリＡ配列；
を含む、第一のＡＡＶベクター、
（ＩＩ）少なくとも２つの逆方向末端反復を含み、これら２つの逆方向末端反復間に核酸配列を含む第二のＡＡＶベクターであって、ここで前記これら２つの逆方向末端反復間の核酸配列が５’から３’に
（ｉ）プロモーター；
（ｉｉ）前記第一のＡＡＶベクターの前記第一の結合ドメインに相補的な、第二の結合ドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号３または配列番号４の配列と少なくとも９０％同一である配列を含む受容スプライス領域（acceptor splice region）配列であって、さらに以下を含む受容スプライス領域（acceptor splice region）配列、
（ａ）以下を含むピリミジン域（pyrimidine tract）、
（ａａ）５～２５ヌクレオチド；
（ａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；および
（ａｃ）ここで前記ピリミジン域（pyrimidine tract）の前記５～２５ヌクレオチドはＴＴＴＴＴＴまたはＴＣＴＴＴＴの配列を含む；および
（ｂ）受容スプライス部位（acceptor splice site）、
（ｂａ）ここで前記受容スプライス部位（acceptor splice site）はピリミジン域（pyrimidine tract）の３’側に位置しており；および
（ｂｂ）ここで前記受容スプライス部位（acceptor splice site）は、５’から３’にＣＡＧＧの配列を含む；
（ｉｖ）前記目的のポリペプチドのＣ末端部分をコードするヌクレオチド配列；
（ｉｖａ）ここで前記目的のポリペプチドのＣ末端部分および前記目的のポリペプチドのＮ末端部分は前記目的のポリペプチドを再構成する；および
（ｖ）終止配列、好ましくはポリＡ配列
を含む、第二のＡＡＶベクター、
を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系。

【請求項14】

前記ポリペプチドは全長ポリペプチドであって、前記第一のＡＡＶベクターは目的の全長ポリペプチドのＮ末端部分を含み、前記第二のＡＡＶベクターは前記目的のポリペプチドのＣ末端部分を含む、請求項１３に記載のＡＡＶベクター系。

【請求項15】

核酸分子であって、
（ｉ）配列番号３または配列番号４の配列と少なくとも９０％同一である配列を含む受容スプライス領域（acceptor splice region）配列であって、さらに以下を含む受容スプライス領域（acceptor splice region）配列、
（ｉａ）以下を含むピリミジン域（pyrimidine tract）、
（ａａ）５～２５ヌクレオチド；
（ａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；
（ａｃ）ここで前記ピリミジン域（pyrimidine tract）の前記５～２５ヌクレオチドはＴＴＴＴＴＴまたはＴＣＴＴＴＴの配列を含む；
（ｉｂ）受容スプライス部位（acceptor splice site）、
（ｂａ）ここで前記受容スプライス部位（acceptor splice site）は前記ピリミジン域（pyrimidine tract）の３’側に位置しており；および
（ｂｂ）ここで前記受容スプライス部位（acceptor splice site）は、５’から３’にＣＡＧＧの配列を含み；および、
（ｉｉ）目的のヌクレオチド配列、ここで該目的のヌクレオチド配列は、
（ｉｉａ）前記受容スプライス領域（acceptor splice region）の３’側または５’側に位置している、
を含む、核酸分子。

【請求項16】

（ａ）前記ピリミジン域（pyrimidine tract）の前記５～２５ヌクレオチドはＴＴＴＴＴＴまたはＴＣＴＴＴＴの配列を含む；
（ｂ）前記受容スプライス部位（acceptor splice site）は、ＣＡＧＧの配列を有する；
（ｃ）前記受容スプライス領域（acceptor splice region）は、配列番号３または４の配列を含む；および／または
（ｄ）前記第一のＡＡＶベクターは、前記供与スプライス部位（donor splice site）と第一の結合ドメインとの間にスペーサー配列をさらに含む、および／または前記第二のＡＡＶベクターは、前記第二の結合ドメインと前記受容スプライス部位（acceptor splice site）との間にスペーサー配列をさらに含む、
請求項１３または１４に記載のＡＡＶベクター系。

【請求項17】

請求項１～６のいずれか一項に記載のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子、請求項１２に記載のアデノ随伴ウイルスベクター、または請求項１３、１４および１６のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルスベクター系を含む、医薬組成物。

【請求項18】

（ａ）前記核酸配列が、前記結合ドメインと前記受容スプライス領域（acceptor splice region）との間に局在しているスペーサー配列を含み；および／または
（ｂ）前記受容スプライス領域（acceptor splice region）が、配列番号３または４の配列を含む、
請求項１２に記載のＡＡＶベクター。

【請求項19】

前記第一のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子は、前記供与スプライス部位（donor splice site）と前記第一の結合ドメインとの間にスペーサーをさらに含む、および／または前記第二のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子は、前記第二の結合ドメインと前記受容スプライス部位（acceptor splice site）との間にスペーサーをさらに含む、
請求項１１に記載の方法。

【請求項20】

前記受容スプライス領域（acceptor splice region）が、配列番号３または４の配列を含む、請求項８～１１および１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

プレｍＲＮＡトランススプライシング分子であって、
（ｉ）配列番号３または配列番号４の配列と少なくとも９０％同一である配列を含む受容スプライス領域（acceptor splice region）であって、さらに以下を含む受容スプライス領域（acceptor splice region）、
（ｉａ）以下を含むピリミジン域（pyrimidine tract）、
（ｉａａ）５～２５ヌクレオチド；
（ｉａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；および
（ｉａｃ）ここで前記ピリミジン域（pyrimidine tract）の前記５～２５ヌクレオチドはＴＴＴＴＴＴまたはＴＣＴＴＴＴの配列を含む；および
（ｉａｄ）前記ピリミジン域（pyrimidine tract）の５’側の７ヌクレオチドはＣＡＡＣＧＡＧの配列を有する；および
（ｉｂ）受容スプライス部位（acceptor splice site）、
（ｉｂａ）ここで前記受容スプライス部位（acceptor splice site）は前記ピリミジン域（pyrimidine tract）の３’側に位置しており；および
（ｉｂｂ）ここで前記受容スプライス部位（acceptor splice site）は、５’から３’にＣＡＧＧの配列を含み；
（ｉｉ）目的のヌクレオチド配列；ここで前記受容スプライス領域（acceptor splice region）は、前記目的のヌクレオチド配列の３’側または５’側に位置している；および
（ｉｉｉ）前記目的の核酸配列の３’側または５’側に位置するプレｍＲＮＡを標的とする結合ドメイン、
を含む、プレｍＲＮＡトランススプライシング分子。

【請求項22】

少なくとも２つの逆方向末端反復を含み、これら２つの逆方向末端反復間に核酸配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、ここで前記核酸配列は５’から３’に、
（ｉ）プロモーター；
（ｉｉ）結合ドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号３または配列番号４の配列と少なくとも９０％同一である配列を含む受容スプライス領域（acceptor splice region）配列であって、さらに以下を含む受容スプライス領域（acceptor splice region）配列
（ａ）以下を含むピリミジン域（pyrimidine tract）、
（ａａ）５～２５ヌクレオチド；
（ａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；
（ａｃ）ここで前記ピリミジン域（pyrimidine tract）の前記５～２５ヌクレオチドはＴＴＴＴＴＴまたはＴＣＴＴＴＴの配列を含む；
（ａｄ）前記ピリミジン域（pyrimidine tract）の５’側の７ヌクレオチドはＣＡＡＣＧＡＧの配列を有する；および
（ｂ）受容スプライス部位（acceptor splice site）、
（ｂａ）ここで前記受容スプライス部位（acceptor splice site）はピリミジン域（pyrimidine tract）の３’側に位置しており；および、
（ｂｂ）ここで前記受容スプライス部位（acceptor splice site）は、５’から３’にＣＡＧＧの配列を含み；
（ｉｖ）目的のヌクレオチド配列；および
（ｖ）ポリＡ配列
を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規の受容スプライス領域（ｎｏｖｅｌ ａｃｃｅｐｔｏｒ ｓｐｌｉｃｅ ｒｅｇｉｏｎ）、ならびにその使用および用途に関する。

【背景技術】

【0002】

ほとんどの真核生物遺伝子はノンコーディングイントロンを含んでいる。「スプライシング」と呼ばれるプロセスで翻訳可能な成熟メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を生成するには、これらを前駆体メッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）から除去する必要がある。スプライシングは、５つの保存された核内低分子リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）、すなわちＵ１、Ｕ２、Ｕ４、Ｕ５、およびＵ６ ｓｎＲＮＰからなる大きなリボ核タンパク質複合体（ｌａｒｇｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ）、スプライソソーム、ならびに３００超のタンパク質を介して媒介される。スプライソソームは、非常に動的なプロセスで各イントロンの構築および分解を行う。この目的のために、特定のスプライシング配列を認識する必要があるため、エクソンとイントロンの境界は、ｍＲＮＡスプライシングの調節に関与するリボ核タンパク質の結合位置として機能する異なる配列モチーフによって明確化される。

【0003】

最も関連性の高いスプライスモチーフは、エクソン－イントロン境界を明確化する、標準的な供与スプライス部位および受容スプライス部位である。５’供与スプライス部位（ＤＳＳ）は、エクソンの３’末端および下流のイントロンの５’末端にあり、３’受容スプライス部位（ＡＳＳ）は、イントロンの３’末端および下流のエクソンの５’末端にある。機能的な受容スプライス部位（ＡＳＳ）は、通常約５０ｂｐの範囲に位置する３つの異なる配列（ｅｌｅｍｅｎｔ）、分岐点（ＢＰ）、ポリピリミジン域（ＰＰＴ）、および標準的なＡＳＳ配列を必要とする。

【0004】

いわゆるＧＴ－ＡＧスプライシングは、哺乳類のｍＲＮＡスプライシングの最も一般的なタイプであり、ＤＮＡレベルでイントロンの最初の２ヌクレオチドと最後の２ヌクレオチドを明確化する。したがって、標準的なＤＳＳ配列の一部は、ＤＮＡ配列のグアニンおよびそれに続くチミン（ＧＴ）である（ＲＮＡ配列のＧＵに対応する）、５’イントロン配列の最初の２つの塩基、ならびにアデニンおよびそれに続くグアニン（ＡＧ）である、最後の２塩基（コンセンサスＡＳＳの最も保存された部分を表す）を表す。ＧＴ－ＡＧヌクレオチドは、効果的なスプライス反応に不可欠であり、それらの破損または置換は機能的なスプライス部位の損失につながる。

【0005】

各スプライシングサイクルは、２つのエステル交換反応で構成される。分岐点として知られる第一の反応では、分岐点ヌクレオシド（通常はアデノシン）が５’エクソン－イントロン接合部のリン酸結合を攻撃する。これにより、イントロンのラリアット－３’エクソン中間体（スプライス部位の下流のエクソンおよびイントロンを含む）および遊離の５’エクソン末端（スプライス部位の上流のエクソンを含む）が形成される。エクソンライゲーションと呼ばれる第二の反応では、５’エクソンの遊離端がイントロン－３’エクソン接合部のリン酸を攻撃し、２つのエクソンのライゲーションおよびイントロンラリアット構造の放出を引き起こす。スプライシング反応は最大１０個のヌクレオチドで構成されるプレｍＲＮＡの補助的なシス作用性スプライシング調節エレメントによって制御される。それらは、その機能および位置によって、エクソン内スプライシング促進配列（ＥＳＥ）、エクソン内スプライシング促進配列（ＥＳＳ）、イントロン内スプライシング促進配列（ＩＳＥ）、およびイントロン内スプライシング抑制配列（ＩＳＳ）に分類することができる。これらのエレメントは、エクソン包含の促進または防止のためにトランス作用タンパク質を動員することができるため、選択的スプライシングにおいて重要な役割を果たすことが提唱されている。

【0006】

特定のエクソンのスプライシング効率は、供与スプライス部位および受容スプライス部位の強度に依存すると予想される。このＤＳＳまたはＡＳＳの強度は、ＧＴまたはＡＧの上流または下流のイントロン配列エレメントまたはエクソン配列エレメントに依存する。機能的なＤＳＳの強度は、標準のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ予測ソフトウェアを使用して確実に予測できる（たとえば、ＮＮＳｐｌｉｃｅ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｒｕｉｔｆｌｙ．ｏｒｇ／ｓｅｑ＿ｔｏｏｌｓ／ｓｐｌｉｃｅ．ｈｔｍｌまたはＨｕｍａｎ Ｓｐｌｉｃｅ Ｆｉｎｄｅｒ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｍｄ．ｂｅ／ＨＳＦ３／）。対照的に、その複雑さのために、ＡＳＳ強度のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ予測は、信頼性の低い結果につながる（たとえば、Ｋｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， （２０１１） “Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｅｘｏｎ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ．” Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ． ３９：ｅ１０８； Ｌｏｒａｉｎ ｅｔ ａｌ．， （２０１３） “Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｒｅｓｃｕｅ ｂｙ ｔｒａｎｓ－ｓｐｌｉｃｉｎｇ： ａ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ＤＭＤ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｎｏｔ ｅｌｉｇｉｂｌｅ ｆｏｒ ｅｘｏｎ ｓｋｉｐｐｉｎｇ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．” Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ． ４１：８３９１－８４０２）。したがって、実際のＡＳＳ強度は、実験的に検証する必要がある。多くの生物学的、生物工学的および治療的アプリケーションは、古典的なＧＴ－ＡＧ ｍＲＮＡスプライシングの効率に依存しており、したがって、強力なスプライス部位の使用に依存している。

【0007】

ノンコーディングイントロンを除去することによってプレｍＲＮＡから翻訳可能な成熟ｍＲＮＡを生成する通常のシススプライシングイベントとは別に、スプライシングはトランスでも発生し、それによって２つの別々のプレｍＲＮＡ分子を組み合わせて非共線性（ｎｏｎ－ｃｏ－ｌｉｎｅａｒ）キメラＲＮＡを作成する（Ｌｅｉ ｅｔ ａｌ．， （２０１６） “Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ＲＮＡ ｔｒａｎｓ－ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｉｎ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ”， Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ． Ｅｖｏｌ． ８（３）：５６２－５７７）。このプロセスは、トリパノソーマで最初に見出された。それ以来、トランススプライシングイベントは、マウス（Ｈｉｒａｎｏ Ｍ ａｎｄ Ｎｏｄａ Ｔ．， （２００４） “Ｇｅｎｏｍｉｃ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ Ｍｓｈ４ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｄ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｍＲＮＡ”， Ｇｅｎｅ ３４２： １６５－１７７）やヒト細胞（Ｃｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．， （２０１８） “Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｒａｎｓ－ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｎｄ ｃｉｓ－ｂａｃｋ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ”． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ４６（７）： ３６７１－３６９１）を含む多くの種でも確認されているが、トランススプライシングは高等脊椎動物でのみ発生する頻度は低いようである。

【0008】

遺伝子治療のためにトランススプライシングを利用する試みがなされてきた。ウイルスベクターは遺伝子治療の魅力的な媒体であるが、多くの場合、負荷容量が制限されているため、交換できる遺伝子には制限がある。たとえば、アデノ随伴ウイルスベクターは、最大約５．０ｋｂのパッケージング能力を有し、これにより、約４ｋｂ以下の導入遺伝子が可能になる。トランススプライシング、すなわち物理的に離れた２つのプレｍＲＮＡを結合して成熟ｍＲＮＡを形成することは、これらの制限を克服する１つの方法でありうる。たとえば、例えば、突然変異した内因性プレｍＲＮＡの一部のみを置換するために標的細胞に導入される外因性プレｍＲＮＡトランススプライシング分子を含む、スプライソソームを介したＲＮＡトランススプライシング（ＳＭａＲＴ）は、遺伝子治療のためのツールとして使用できる。これにより、ウイルスベクターでのより短いコード配列の送達が可能になる可能性がある。

【0009】

ウイルスベクター、特にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースのベクターのサイズ制限に対処する別の方法は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）デュアルベクター技術の使用である。ＡＡＶは一本鎖ＤＮＡウイルスである。ｒＡＡＶデュアルベクターテクノロジーの場合、導入遺伝子（目的の遺伝子）のコード配列は少なくとも２つの部分に分割され、２つ以上の個別のｒＡＡＶベクターにパッケージ化される。分割ゲノムベクターによる標的細胞の同時形質導入後、完全長コード配列が再構成される。網膜の光受容細胞等の多くの細胞は、９０％を超える高い同時形質導入効率を示すため、同一の標的細胞への両方のｒＡＡＶの効率的な送達は制限的ではないようである。ただし、２つの導入遺伝子の半分の効率的な再構成は困難なままである。ｒＡＡＶデュアルベクター系の開発後数年間、再構成はＤＮＡレベルでのみ対処されており、このアプローチを改善するためにいくつかの戦略が検討されている（ＭｃＣｌｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ ＭａｃＬａｒｅｎ， （２０１７） “Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ （ＡＡＶ） ｄｕａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｌａｒｇｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ， Ｙａｌｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９０： ６１１－６２３）。

【0010】

これらのｒＡＡＶデュアルベクター系は、紛らわしく「トランススプライシングデュアルベクター」と呼ばれることがよくあるが、これらのアプローチにおけるｍＲＮＡのスプライシングは実際にはトランスで行われない。むしろ、前述のｒＡＡＶデュアルベクター系での再構成は、ＩＴＲ構造のコンカテマー化および／または重複する配列の相同組換えに依存しており、コンカテマー化されたＩＴＲエレメントおよび／または人工的な組換えエレメントを除去するためにシスにスプライシングされた単一のプレｍＲＮＡが生成される。このようなｒＡＡＶデュアル ベクター系は、たとえばＴｒａｐａｎｉらによって開示されている（“Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｇｅｎｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｒｅｔｉｎａ ｂｙ ｄｕａｌ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒｓ”， （２０１４） ＥＭＢＯ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ６（２）： １９４－２１１）。ＤＮＡレベルでのｒＡＡＶデュアルベクター系の再構成は、第一のＡＡＶベクターのコード配列の５’部分の発現を駆動するプロモーターの存在、および第二のＡＡＶベクターのコード配列の３’部分の発現を駆動するプロモーターの不在によって認識できる。このようなｒＡＡＶデュアルベクター系の再構成について報告されているｉｎ ｖｉｖｏでの効率は比較的低く、１０％未満である（Ｃａｒｖａｌｈｏ ｅｔ ａｌ．， “Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ ｏｆ ｄｕａｌ ＡＡＶ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ ｒｅｔｉｎａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ”， （２０１７） Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ， １１（５０３）： １－８）。対照的に、プレｍＲＮＡスプライシングがトランス配置で起こるためには、ｒＡＡＶデュアルベクター系の両方のベクターは、２つの別々のプレｍＲＮＡ分子を生成するためのプロモーターを必要とする。

【0011】

ｍＲＮＡスプライシング、特にｍＲＮＡトランススプライシングの最適なパフォーマンスのために、最適化され、実験的に検証された強力なＡＳＳの同定に対する満たされていないニーズがある。特に、強力なＡＳＳ領域に対するニーズがあり、この強力なＡＳＳ領域は特に、次世代のｒＡＡＶデュアルベクター系または高度に特異的かつ効率的なプレｍＲＮＡトランススプライシング分子を送達するＡＡＶ等のさらなるＡＡＶベクターの開発に使用することができ、遺伝子治療に使用することができる。

【発明の概要】

【0012】

本発明は、本明細書に記載され、実施例、図および特許請求の範囲に記載されているように、このニーズに適合する。

【0013】

本明細書で提供しているのは、以下を含むプレｍＲＮＡトランススプライシング分子である： （ｉ）以下を含む受容スプライス領域（ａｃｃｅｐｔｏｒ ｓｐｌｉｃｅ ｒｅｇｉｏｎ）、（ｉａ）以下を含むピリミジン域、（ｉａａ）５～２５ヌクレオチド；（ｉａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；（ｉｂ）受容スプライス部位（ａｃｃｅｐｔｏｒ ｓｐｌｉｃｅ ｓｉｔｅ）、（ｉｂａ）ここで受容スプライス部位はピリミジン域の３’側に位置しており；および（ｉｂｂ）ここで受容スプライス部位は、５’から３’にＮＡＧＧの配列を含み、ここでＮはＡ、Ｃ、Ｔ／Ｕ、またはＧである；（ｉｉ）目的のヌクレオチド配列またはその一部分；ここで受容スプライス領域は、目的のヌクレオチド配列またはその一部分の３’側または５’側に局在している；（ｉｉｉ）目的の核酸配列またはその一部分の３’側または５’側に局在するプレｍＲＮＡを標的とする結合ドメイン；および（ｉｖ）任意選択でスペーサー配列、ここで該スペーサー配列は結合ドメインおよび受容スプライス領域の間に局在している。一つの実施形態では、請求項１のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子は、以下を含む： （ｉｉ）目的のヌクレオチド配列またはその一部分、ここで該受容スプライス領域は、目的のヌクレオチド配列またはその一部分の３’側または５’側に局在している；（ｉｉｉ）供与スプライス部位、ここで該供与スプライス部位は、目的のヌクレオチド配列またはその一部分の３’側に局在している；（ｉｖ）目的のヌクレオチド配列またはその一部分の５’側に位置するプレｍＲＮＡを標的とする第一の結合ドメイン；（ｖ）目的のヌクレオチド配列またはその一部分の３’側に位置するプレｍＲＮＡを標的とする第二の結合ドメイン；（ｖｉ）任意選択で、第一のスペーサー配列、ここで該第一のスペーサーは、第一の結合ドメインと受容スプライス領域との間に局在している；（ｖｉｉ）任意選択で、第二のスペーサー配列、ここで第二のスペーサーは、第二の結合ドメインと供与スプライス部位との間に局在している、

【0014】

好ましくは、受容スプライス領域は、目的のヌクレオチド配列またはその部分の５’側に局在しており、結合ドメインは受容スプライス領域の５’側に局在している。プレｍＲＮＡトランススプライシング分子は、終止配列、好ましくはポリＡ配列をさらに含んでもよい。好ましくは、本発明によるプレｍＲＮＡトランススプライシング分子は、ピリミジン域を含み、ここでピリミジン域の５～２５ヌクレオチドは、ＴＴＴＴＴＴまたはＴＣＴＴＴＴの配列によってコードされる配列を含む。付加的にまたは代替的に、ピリミジン域の最後のピリミジンと受容スプライス部位との間の配列は、１０塩基未満、好ましくは５塩基未満、より好ましくは３塩基未満である。付加的にまたは代替的に、受容スプライス部位は、ＣＡＧＧの配列を有する。

【0015】

受容スプライス領域は、以下を含んでもよい： （ａ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも４ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣである；（ｂ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも５ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣである；（ｃ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも４ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡである；または（ｄ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも５ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡＣである。一つの実施形態では、受容スプライス領域は、配列番号：３または４の配列を有するヌクレオチド配列または配列番号：３または４に少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一なヌクレオチド配列によってコードされる。プロモーター、および本発明によるプレｍＲＮＡトランススプライシング分子をコードする配列を含むＤＮＡ分子も提供される。ここでＤＮＡ分子は好ましくはベクターまたはプラスミドである。

【0016】

本発明の別の態様は、核酸配列を作製する方法に関し、該方法は以下を含む： （Ａ）一つまたは複数の供与スプライス部位配列を含む第一の核酸配列を提供する工程；（Ｂ）以下を含む第二の核酸配列を提供する工程 （ｉ）以下を含む受容スプライス領域 （ｉａ）以下を含むピリミジン域、（ｉａａ）５～２５ヌクレオチド；（ｉａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；（ｉｂ）受容スプライス部位、（ｉｂａ）ここで受容スプライス部位はピリミジン域の３’側に位置しており；および（ｉｂｂ）ここで受容スプライス部位は、５’から３’にＮＡＧＧの配列を含み、ここでＮはＡ、Ｃ、Ｔ／Ｕ、またはＧである；（Ｃ）一つまたは複数の供与スプライス部位配列で第一の核酸配列を切断し、受容スプライス部位で第二の核酸配列を切断する工程、（Ｄ）第一の切断された核酸配列を第二の切断された核酸配列に連結し、それによって核酸配列を得る工程。第一の核酸配列は、目的のヌクレオチド配列またはその一部分をさらに含み、ここで目的のヌクレオチド配列の少なくとも一部は供与スプライス部位の５’側に位置しており、ここで第二の核酸配列は、目的のヌクレオチド配列またはその一部分をさらに含み、ここで目的のヌクレオチド配列の少なくとも一部は受容スプライス領域の３’側に位置している。好ましくは、第一および第二の核酸配列は宿主細胞に導入され、好ましくは第一および第二の核酸配列は組換え核酸配列である。

【0017】

本発明の方法の一つの実施形態の別の態様では、方法は以下の工程を含む： 工程（Ａ）プレｍＲＮＡトランススプライシング分子配列を含む第一の核酸配列または該プレｍＲＮＡトランススプライシング分子をコードする核酸配列を宿主細胞に導入する工程であって、ここで第一のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子は５’から３’に以下を含む工程、（ａ）目的のヌクレオチド酸配列の５’部分；（ｂ）供与スプライス部位；（ｃ）任意選択でスペーサー配列；（ｄ）第一の結合ドメイン；および（ｅ）任意選択で終止配列、好ましくはポリＡ配列；工程（Ｂ）プレｍＲＮＡトランススプライシング分子配列を含む第二の核酸配列または該プレｍＲＮＡトランススプライシング分子をコードする核酸配列を宿主細胞に導入する工程であって、ここで第二のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子は５’から３’に以下を含む工程、（ｉ）第一の核酸配列の第一の標的ドメインに相補的な第二の結合ドメイン；（ｉｉ）以下を含む受容スプライス領域配列；（ｉｉａ）以下を含むピリミジン域；（ｉｉａａ）５～２５ヌクレオチド；（ｉｉａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；（ｉｉｂ）受容スプライス部位、（ｉｉｂａ）ここで受容スプライス部位はピリミジン域の３’側に位置しており；および（ｉｉｂｂ）ここで受容スプライス部位は、５’から３’にＮＡＧＧの配列を含み、ここで、ＮはＡ、Ｃ、Ｔ／Ｕ、またはＧである；（ｉｉｉ）目的のヌクレオチド配列の３’部分、および（ｉｖ）終止配列、好ましくはポリＡ配列；工程（Ｃ）供与スプライス部位配列で第一の核酸配列を切断し、受容スプライス部位で第二の核酸配列を切断する工程；および工程（Ｄ）目的のヌクレオチド配列の５’部分を含む第一の切断された核酸配列を、目的のヌクレオチド配列の３’部分を含む第二の切断された核酸配列に連結し、それによって目的の核酸配列を得る工程。

【0018】

さらに別の態様では、本発明は少なくとも２つの逆方向末端反復を含み、これら２つの逆方向末端反復間に核酸配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、ここで該核酸配列は５’から３’に以下を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに関する： （ｉ）プロモーター；（ｉｉ）結合ドメイン；（ｉｉｉ）任意選択でスペーサー配列；（ｉｖ）以下を含む受容スプライス領域配列 （ａ）以下を含むピリミジン域、 （ａａ）５～２５ヌクレオチド；（ａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；（ｂ）受容スプライス部位、ここで該受容スプライス部位はピリミジン域の３’側に位置しており；およびここで該受容スプライス部位は、５’から３’にＮＡＧＧの配列を含み、ここでＮはＡ、Ｃ、Ｔ／Ｕ、またはＧである；（ｖ）目的のヌクレオチド配列またはその一部分；および（ｖｉ）任意選択でポリＡ配列。ＡＡＶベクターはまた、以下を含むＡＡＶベクター系の一部であってもよい： （Ｉ）これら２つの逆方向末端反復間の核酸配列を含む少なくとも２つの逆方向末端反復を含む第一のＡＡＶベクターであって、ここで該これら２つの逆方向末端反復間の核酸配列が５’から３’に （ａ）プロモーター、（ｂ）目的のポリペプチドのＮ末端部分をコードするヌクレオチド配列；（ｃ）供与スプライス部位；（ｄ）任意選択でスペーサー配列；（ｅ）第一の結合ドメイン；および（ｆ）任意選択で終止配列、好ましくはポリＡ配列；を含む、第一のＡＡＶベクター； （ＩＩ）これら２つの逆方向末端反復間の核酸配列を含む少なくとも２つの逆方向末端反復を含む核酸配列を含む第二のＡＡＶベクターであって、ここで該これら２つの逆方向末端反復間の核酸配列が５’から３’に （ｉ）プロモーター；（ｉｉ）第一のＡＡＶベクターの第一の結合ドメインに相補的な、第二の結合ドメイン；（ｉｉ）任意選択でスペーサー配列 （ｉｉｉ）以下を含む受容スプライス領域配列 （ａ）以下を含むピリミジン域、（ａａ）５～２５ヌクレオチド；（ａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；（ｂ）受容スプライス部位、ここで該受容スプライス部位はピリミジン域の３’側に位置しており；およびここで該受容スプライス部位は、５’から３’にＮＡＧＧの配列を含み、ここでＮはＡ、Ｃ、Ｔ／Ｕ、またはＧである；（ｉｖ）目的のポリペプチドのＣ末端部分をコードするヌクレオチド配列；（ｉｖａ）ここで目的のポリペプチドのＣ末端部分および目的のポリペプチドのＮ末端部分は目的のポリペプチドを再構成する；および（ｖ）終止配列、好ましくはポリＡ配列。一つの実施形態では、ポリペプチドは全長ポリペプチドであって、第一のＡＡＶベクターは目的の全長ポリペプチドのＮ末端部分を含み、第二のＡＡＶベクターは目的のポリペプチドのＣ末端部分を含む。

【0019】

以下を含む受容スプライス領域配列 （ｉａ）以下を含むピリミジン域、（ａａ）５～２５ヌクレオチド；（ａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；（ｉｂ）受容スプライス部位、ｂａ）ここで受容スプライス部位はピリミジン域の３’側に位置しており；およびｂｂ）ここで受容スプライス部位は、５’から３’にＮＡＧＧの配列を含み、ここでＮはＡ、Ｃ、Ｔ／Ｕ、またはＧである；および（ｉｉ）目的のヌクレオチド配列、ここで該目的のヌクレオチド配列（ｉｉａ）は受容スプライス領域の３’側または５’側に位置している、を含む、核酸配列もまた提供される。

【0020】

本発明による特定の実施形態では、本明細書に記載される受容スプライス領域はピリミジン域を含み、ここで該ピリミジン域の５～２５ヌクレオチドはＴＴＴＴＴＴまたはＴＣＴＴＴＴの配列によってコードされる配列を含む。ピリミジン域の最後のピリミジンと受容スプライス部位との間の配列は、１０塩基未満、好ましくは５塩基未満、より好ましくは３塩基未満である。さらに、受容スプライス部位は、好ましくは、ＣＡＧＧの配列を有する。受容スプライス領域は、配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも４ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチドをさらに含み、ここで第一の５’ヌクレオチドはＣである。好ましい実施形態では、スプライス受容領域は、配列番号：３、または４の配列を含むもしくはからなる、または配列番号：３、または４の配列を含むもしくはからなる核酸配列によってコードされている。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】ＨＥＫ２９３細胞および形質導入光受容体におけるＲＨＯミニ遺伝子のｍＲＮＡスプライシング。Ａ，ＲＨＯ遺伝子の縮尺通りの模式図。ボックスはエクソンを表し、その間の太い線はイントロンを表し、それぞれの開始コドンと停止コドンを示す。アスタリスクは、エクソン３のｃ．６２０Ｔ＞Ｇ変異を表す。ＢおよびＣ，エクソンのコーディング部分および隣接するイントロンを含むロドプシンミニ遺伝子は、ＨＥＫ２９３細胞での発現のためのＣＭＶプロモーター（Ｂ）または光受容体での発現のためのヒトロドプシン（ｈＲＨＯ）プロモーター（Ｃ）のいずれかによって駆動された。ＲＨＯミニ遺伝子のＡＡＶベクターへのパッケージングを可能にするために、イントロン１を示しているように短縮した。タンパク質の視覚化および検出のために、ＲＨＯをＣ末端でシトリン（Ｂの場合）またはｍｙｃタグ（Ｃの場合）に融合した。ＢおよびＣの矢印として示されるプライマーは、ＨＥＫ２９３細胞（Ｄ）または形質導入された光受容体（Ｅ）に由来する野生型（ＷＴ）または変異型のスプライシング産物の特異的検出に使用した。Ｄ，ＷＴおよび変異ＲＨＯミニ遺伝子を一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からのＲＴ－ＰＣＲ分析。Ｅ，左、生後１４日目（Ｐ１４）のマウス網膜への網膜下ＲＨＯミニ遺伝子送達の模式図。右、それぞれのＷＴまたは変異型ＲＨＯミニ遺伝子を含む注入されたマウス網膜からのＲＴ－ＰＣＲ。ＲＴ－ＰＣＲは、注射の４週間後に行った。すべての実験は１回繰り返した。

【図2】最も効率的なＡＳＳ＿６２０配列の同定。Ａ，機能的なＡＳＳの単一エレメント（ｓｉｎｇｌｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）の構成。分岐点（ＢＰ）には、ヒトの分岐点のコンセンサス配列を表す下線を付し、分岐点のヌクレオシドアデノシンを太字で強調表示している。ポリピリミジン域（Ｐｏｌｙ－Ｃ／Ｔ）は空のボックスとして表し、イントロン－エクソン境界にまたがるＡＳＳは灰色の塗りつぶされたボックスで表す。Ｂ，野生型（ＷＴ、上部パネル）およびｃ．６２０Ｔ＞Ｇ変異型（下部パネル）のヒトＲＨＯ遺伝子のエクソン－イントロン構成およびヒトＲＨＯ遺伝子のエクソン３のＤＮＡ配列の拡大図。イントロン配列は小文字で示し、エクソン配列は大文字（太字）で示す。単一のＡＳＳ要素はＡに示すスキームに従って強調表示し、ＢＰ配列に下線を付し（太線）、Ｐｏｌｙ－Ｃ／Ｔ配列は空のボックスでマークし、ＡＳＳ配列は塗りつぶされた灰色のボックスでマークしている。ｃ．６２０Ｔ＞Ｇ変異型のＡＧＧ配列に変換されたＷＴのＡＴＧ配列は、細い下線でマークしている。ｃ．６２０Ｔ＞Ｇ変異型は、新しい標準的なＡＳＳ配列を生成することに注意されたい。機能的なＡＳＳに必要な他の２つの要素（ＢＰおよびＰｏｌｙ－Ｃ／Ｔ）は、ＷＴ ＲＨＯエクソン３にすでに存在する。Ｃ，スプライシング実験に使用したヒトリボソームタンパク質２７（ＲＰＳ２７）ミニ遺伝子の構造。（Ｄ）に示すＲＴ－ＰＣＲに使用されるプライマーを矢印で示す。以下に示すＲＨＯ＿Ｅ3ａ－ｇと呼ばれるＡＳＳ＿６２０の潜在的なエレメントを含む個々の配列を、示したようにＲＰＳ２７遺伝子のエクソン３に挿入した。ＲＨＯ＿Ｅ３ａは、機能的なＡＳＳがないＷＴ ＲＨＯ配列である。潜在的なＢＰ、Ｐｏｌｙ－Ｃ／ＴまたはＡＳＳ配列を上記のように示す。Ｄ，示されているように、単一のキメラＲＰＳ２７ミニ遺伝子でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からのＲＴ－ＰＣＲ。ＣＳ，正しくスプライスされたＲＰＳ２７ミニ遺伝子（すなわち、ネイティブのエクソン３ ＡＳＳを使用）。ＡＳ，以上にスプライスされたＲＰＳ２７ミニ遺伝子（すなわち、ＡＳＳ＿６２０を使用）。

【図3】ＡＳＳ＿６２０は強力な受容スプライス部位である。Ａ，２つの一般的に利用可能な予測ツール、ＮＮＳｐｌｉｃｅ（０．９ ｖｅｒｓｉｏｎ； Ｊａｎｕａｒｙ １９９７）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｒｕｉｔｆｌｙ．ｏｒｇ／ｓｅｑ＿ｔｏｏｌｓ／ｓｐｌｉｃｅ．ｈｔｍｌ）またはｈｕｍａｎ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｆｉｎｄｅｒ（ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１）（ＨＳＦ， ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｍｄ．ｂｅ／ＨＳＦ３／）を使用したｉｎ ｓｉｌｉｃｏ受容スプライス部位（ＡＳＳ）強度予測。Ｂ，ＡＳＳ、ＰｏｌｙＣ／Ｔ、およびＰｏｌｙＣ／Ｔの５’に７つの追加のヌクレオチドを含むｖｇＡＳＳ＿６２０と呼ばれる２６ｂｐの配列の単一エレメントの構成および配列。Ｃ，ｖｇＡＳＳ＿６２０の強度を決定するために使用されるさまざまなミニ遺伝子の模式図。単一のミニ遺伝子内のｖｇＡＳＳ＿６２０挿入の位置を、アスタリスクおよび破線で表す。Ｄに示したＲＴ－ＰＣＲに用いたプライマーの結合位置を矢印で示す。Ｄ，ネイティブ（ｎａｔ）受容スプライス部位のみ、またはネイティブ受容スプライス部位およびｖｇＡＳＳ＿６２０（６２０）の両方を含むそれぞれのミニ遺伝子でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からのＲＴ－ＰＣＲ。すべてのバンドは、シーケンシングによって確認した。

【図4】様々な結合ドメインを試験するセルリアン再構成分析（Ｃｅｒｕｌｅａｎ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）。Ａ，ｍＲＮＡのトランススプライシングによるセルリアンの再構成のための結合ドメインとして使用されるＲＨＯイントロン２配列の概略図。ＲＨＯイントロン２配列全体（ａ）、および異なる５’（ｂ、ｄ、ｆ、ｈ）および３’（ｃ、ｅ、ｇ、ｉ）部分、またはイントロン２の小さな３’部分（ｈ＋ｉ）に融合した小さな５’部分を試験し、Ｂ～Ｇに示す結果を得た。ＢおよびＣ，Ａに示す異なる結合ドメインを含む単一の構築物のｍＲＮＡレベルを比較するためのトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からのコントロールｑＲＴ－ＰＣＲ（ｎ＝３）。ハウスキーパーのアミノレブリン酸シンターゼ（ＡＬＡＳ）に関連したデルタＣＴ（ΔＣＴ）値を示す。プライマーの結合位置（Ｂのｐ１＋ｐ２およびＣのｐ３＋ｐ４）をＤに表す。統計分析（各トランスフェクションについてｎ＝３）は、一元配置分散分析およびそれに続く多重比較のためのテューキー検定によって行った。Ｄ，ｈ＋ｉ結合ドメイン、供与スプライス部位（ＤＳＳ）および受容スプライス部位ＡＳＳ＿６２０の例を使用したセルリアン再構成アッセイの原理。セルリアンは、破線で示すように、完全長セルリアン配列（ｃ１）の開始コドンの下流のヌクレオチド位置１５４で分割された。対照構築物（ｃ２）では、２つの人工セルリアンエクソンを作成するために、人工イントロンをセルリアンコード配列の示された位置１５４に導入した。ウエスタンブロッティングに使用される抗体（α－ｃｅｒＮＴ）は、Ｎ末端のセルリアンの半分に結合する。対照構築物（ｃ２）は、共焦点イメージングおよびウエスタンブロッティング実験における定量化の参照として機能した。（Ａ）に示されている様々な配列は、デュアルベクターアプローチを使用して結合ドメインとして試験した。セルリアン再構成のためのデュアルベクターアプローチのスキームは、ｖｇＡＳＳ＿６２０（ｃ３）またはネイティブのＲＨＯエクソン３（ＲＨＯ＿Ｅ３）受容スプライス部位（ｃ４）と組み合わせたｈ＋ｉ結合ドメインについて例示的に示される。Ｅ，異なる結合ドメインのセルリアン再構成効率（ＣＲＥ）は、３つの独立したトランスフェクションから得られたウエスタンブロットバンド強度から計算した。定量化のために、バンド強度は最初に内部チューブリン対照に対して正規化した。正規化された値は、参照構築物強度（ｃ２）のパーセンテージとして与えられる。Ｆ，ＣＭＶプロモーターによって駆動されるｃ１、ｃ２、ｃ３、またはｃ４構築物でトランスフェクトされた生きているＨＥＫ２９３細胞の代表的な共焦点イメージング。イメージングには、セルリアン固有のレーザーおよびフィルターの設定を使用した。スケールバー、５０μｍ。Ｇ，トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞のタンパク質溶解物からの代表的なウエスタンブロット（φ、非トランスフェクト細胞；ＩＢ、イムノブロッティング；α－Ｔｕｂ、ベータチューブリン特異的抗体)。

【図5】ＡＢＣＡ４の５’コード配列を含む第一のデュアルＡＡＶの配列（配列番号：１９）： ５’末端および３’末端のＩＴＲ配列は、下線なしで灰色で強調表示されている（ＮＮＮ）。スペーサー配列は小文字で表記されている。ＣＭＶプロモーターは灰色で強調表示され、実線を使用して下線が付されている（ＮＮＮ）。ＡＢＣＡ４タンパク質の５’コード配列には、点線の下線が付されている（ＮＮＮ）。ＤＳＳはイタリック体で示され、下線が付されている(Ｎｎｎ、大文字はコード配列を表し、小文字は非コード配列を表す)。結合ドメインは灰色で強調表示され、中断線で下線が付されている（ＮＮＮ）。

【図6】ＡＢＣＡ４の３’コード配列を含む第二のデュアルＡＡＶの配列（配列番号：２０）： ５’末端および３’末端のＩＴＲ配列は、下線なしで灰色で強調表示されている（ＮＮＮ）。スペーサー配列は小文字で表記されている。ＣＭＶプロモーターは灰色で強調表示され、実線を使用して下線が付されている（ＮＮＮ）。結合ドメインは灰色で強調表示され、中断線で下線が付されている（ＮＮＮ）。受容スプライス部位はイタリック体で示され、下線が付されている（ＮＮＮ）。ＡＢＣＡ４タンパク質の３’コード配列には、点線（ＮＮＮ）を使用して下線が付されている。ポリＡ配列は濃い灰色で強調表示され、波の下線が付されている（ＮＮＮ）。

【図7】ＡＢＣＡ４の５’コード配列およびＡＢＣＡ４プロモーターを含む第一のデュアルＡＡＶの配列（配列番号：２１）： ５’末端および３’末端のＩＴＲ配列は、下線なしで灰色で強調表示されている（ＮＮＮ）。スペーサー配列は小文字で表記されている。ＡＢＣＡ４プロモーターは灰色で強調表示され、実線を使用して下線が付されている（ＮＮＮ）。ＡＢＣＡ４タンパク質の５’コード配列には、点線を使用して下線が付されている（ＮＮＮ）。ＤＳＳはイタリック体で示され、下線が付されている（Ｎｎｎ、大文字はコード配列を表し、小文字は非コード配列を表す)。結合ドメインには、中断線を使用して下線が付されている（ＮＮＮ）。

【図8】ＡＢＣＡ４の３’コード配列およびＡＢＣＡ４プロモーターを含む第二のデュアルＡＡＶの配列（配列番号：２２）： ５’末端および３’末端のＩＴＲ配列は、下線なしで灰色で強調表示されている（ＮＮＮ）。スペーサー配列は小文字で表記されている。ＡＢＣＡ４プロモーターは灰色で強調表示され、実線を使用して下線が付されている（ＮＮＮ）。結合ドメインには、中断線を使用して下線が付されている（ＮＮＮ）。ＡＳＳはイタリック体で示され、下線が付されている（ＮＮＮ）。ＡＢＣＡ４タンパク質の ３’コード配列は灰色で強調表示され、点線を使用して下線が付されている（ＮＮＮ）。ポリＡ配列は濃い灰色で強調表示され、波の下線が付されている（ＮＮＮ）。

【図9】セルリアン再構成効率に対する受容スプライス部位および結合ドメインの影響。Ａ，この実験では、結合ドメイン（ＢＤ）および受容スプライス部位（ＡＳＳ）を試験した。すべてのＢＤ配列は、ヒトＲＨＯ遺伝子に由来している。高い効率が期待できるＢＤおよびＡＳＳを、太字と斜体で示す。Ｂ，３つのＢＤおよびＡに示す３つのＡＳＳの異なる組み合わせを含む構築物をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の共焦点ライブ画像。それぞれのＢＤおよびＡＳＳの強度を示す。スケールバー、５０μｍ。Ｃ，上のパネル、異なるＢＤおよびＡＳＳの組み合わせのＲＴ－ＰＣＲ。下のパネル、異なるＢＤおよびＡＳＳの組み合わせのウエスタンブロット。ＧＡＰＤＨおよびベータチューブリンは、ローディング参照として機能した。Ｄ，ｃｉｓ－ｃｔｒｌ（ｎ＝３～８）に関連したセルリアンタンパク質バンドの放射分析による再構成効率の定量化。すべてのタンパク質バンドは、定量化の前にベータチューブリンに対して正規化された。

【図10】ｉｎ ｖｉｖｏでのｍＲＮＡトランススプライシングｒＡＡＶデュアルベクターアプローチ。Ａ，ｉｎ ｖｉｖｏ発現で使用した５’ベクター構築物および３’ベクター構築物。発現参照として、シトリンおよびｍＣｈｅｒｒｙ配列を、セルリアン５’コード配列（ＣＤＳ）の５’およびセルリアン３’ ＣＤＳの３’にそれぞれ融合した。Ｂ，ＢＤ＿ｈ＋ｉを含む構築物を発現する注入後２週間の網膜切片の代表的な共焦点画像。フルオロフォアの発現は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）に存在する。ＯＮＬ、外顆粒層。スケールバー、２０μｍ。Ｃ，５１４ｎｍレーザーを使用したシトリンおよびｍＣｈｅｒｒｙフルオロフォアの選択的光退色の前（上部パネル）および後（下部パネル）の網膜色素上皮細胞の共焦点画像。スケールバー、２μｍ。

【図11】ｌａｃＺ遺伝子由来の好適なＢＤの同定。Ａ，細菌のｌａｃＺ遺伝子から取得され、ヒトゲノムに対して検出可能な相同性を持たないように改変された結合ドメイン（ＢＤ）。Ｂ，Ａに示すＢＤを含む構築物で一過的に共トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の共焦点ライブ画像。スケールバー、５０μｍ。Ｃ，トランスフェクトされた ＨＥＫ２９３細胞溶解物から得られたウエスタンブロット。Ｄ，ウエスタンブロットバンド強度のレシオメトリック分析に基づくセルリアン再構成効率の定量化（ｎ＝３～８）。ＢＤ＿ｇ効率は、これまでに得られた最高の再構成の尺度として機能した（図９を参照）。

【図12】調節エレメントの除去およびｍＲＮＡスプライシング効率への影響。Ａ，示されているように、ＢＤ＿ｋ．５’^polyAdel、ポリＡシグナルのない５’ベクター．３’^promdel、プロモーター配列のない３’ベクターを含むセルリアン構築物で一過性に共トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の共焦点ライブ画像。スケールバー、５０μｍ。Ｂ，Ａに示されているトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞から得たウエスタンブロット。ベータチューブリンはローディング参照として機能した。

【図13】ＳｐＣａｓ９－ＶＰＲの再構成。Ａ，ＨＥＫ２９３細胞のＳｐＣａｓ９－ＶＰＲのｍＲＮＡトランススプライシングに使用したプラスミド（５’および３’ベクター）。陽性対照として、全長（ＦＬ） ＳｐＣａｓ９－ＶＰＲ ＣＤＳ（ＦＬベクター）を含むプラスミドを使用した。接続にまたがるプライマーペアをＲＴ－ＰＣＲに使用した（黒い矢印）。Ｂ，ＢＤ＿ｋ（ｎ＝３）またはＦＬベクター（ｎ＝３）を含む５’および３’ベクターで共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からのＲＴ－ＰＣＲ。Ｃ，再構成されたＳｐＣａｓ９－ＶＰＲ産物の代表的なシーケンシング結果。Ｄ，それぞれのトランスフェクションからのタンパク質溶解物のウエスタンブロット。φ、トランスフェクトされていない細胞。ベータチューブリンは、ローディング対照として機能した。

【図14】ＡＢＣＡ４の再構成。Ａ，ＨＥＫ２９３細胞のＡＢＣＡ４のｍＲＮＡトランススプライシングに使用したプラスミド（５’および３’ベクター）。さらに、６つの異なる遺伝子の６つの短いイントロンがＡＢＣＡ４のＣＤＳ内に組み込まれた。すなわち、３つが５’ＣＤＳ（イントロンを有する５’ベクター、５’ｗｉ）に、３つが３’ＣＤＳ（イントロンを有する３’ベクター、３’ｗｉ）に、それぞれ組み込まれた。接続にまたがるプライマーペアをＲＴ－ＰＣＲに使用した（黒い矢印）。ｍｙｃ、ｍｙｃタグ。Ｂ，示されているように、それぞれの構築物で共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞から、様々なサイクル数でＲＴ－ＰＣＲを行う。ＧＡＰＤＨはローディング対照として機能した。φ、トランスフェクトされていない細胞。Ｃ，再構成されたＡＢＣＡ４の代表的なシーケンシング結果。

【図15】ｉｎ ｖｉｖｏのＡＢＣＡ４のｒＡＡＶデュアルベクターｍＲＮＡトランススプライシング。Ａ，ｉｎ ｖｉｖｏ発現に使用されるＢＤ＿ｋを含む５’ベクターおよび３’ベクター構築物。ｈＲｈｏ、ヒトロドプシンプロモーター。Ｂ，ＲＴ－ＰＣＲは、Ｃ５４Ｂｌ／６Ｊ野生型マウスの網膜溶解物から異なるサイクル数で行われ、示されているように、それぞれの構築物で同時形質導入されている。陰性対照として、注射されていない野生型（ＷＴ）マウスを使用した。ＮＮ／ＧＬ、ＡＡＶ２のキャプシドバリアント。－ＲＴ、逆転写酵素を含まない陰性対照。ＧＡＰＤＨをローディング対照として使用した。Ｃ，再構成したＡＢＣＡ４の代表的なシーケンシング結果。Ｄ，Ｂに示すのと同じ網膜からｑＲＴ－ＰＣＲを実施した予備的な結果。同時形質導入時に得られたＡＢＣＡ４発現は、非注射ＷＴ網膜に対して正規化した。Ｅ，Ｂ～Ｄに示す同じマウスの網膜溶解物からのウエスタンブロット。ヒトＡＢＣＡ４タンパク質は抗ｍｙｃ抗体で検出され、矢印で示される。 ベータチューブリンをローディング対照として使用した。

【図16】セルリアンの５’コード配列および結合ドメインＢＤ＿ｇをコードするミニ遺伝子の配列（配列番号３５）。ＣＭＶプロモーターは灰色で強調表示されている。セルリアンタンパク質の５’コード配列（太字）は灰色で強調表示され、太い実線を使用して下線が付されている（ＮＮＮ）。ＤＳＳには、波線を使用して下線が付されている（ＮＮＮ）。結合ドメインは斜体でマークされ、点線を使用して下線が付され（ＮＮＮ）、ポリアデニル化シグナルは二重線を使用して下線が付されている（ＮＮＮ）。

【図17】セルリアンの３’コード配列および結合ドメインＢＤ＿ｇをコードするミニ遺伝子の配列 （配列番号３６）。ＣＭＶプロモーターは灰色で強調表示されている。結合ドメインは斜体でマークされ、点線を使用して下線が付されている（ＮＮＮ）。ＡＳＳには、波線と太字を使用して下線が付されている（ＮＮＮ）。セルリアンタンパク質の３’コード配列は灰色で強調表示され、太い実線を使用して下線が付され（ＮＮＮ）、ポリアデニル化信号は二重線を使用して下線が付されている（ＮＮＮ）。

【図18】ＳｐＣａｓ９－ＶＰＲの５’コード配列および結合ドメインＢＤ＿ｋをコードするミニ遺伝子の配列（配列番号３７）。ＣＭＶプロモーターは灰色で強調表示されている。ＳｐＣａｓ９－ＶＰＲタンパク質の５’コード配列は太字で強調表示され、太い実線を使用して下線が付されている（ＮＮＮ）。ＤＳＳには、波線を使用して下線が付されている（ＮＮＮ）。斜体でマークされ、点線を使用して下線が付されている結合ドメイン（ＮＮＮ）、二重線を使用してポリアデニル化シグナルに下線が付されている（ＮＮＮ）。

【図19】ＳｐＣａｓ９－ＶＰＲの３’コード配列および結合ドメインＢＤ＿ｋをコードするミニ遺伝子の配列（配列番号３８）。ＣＭＶプロモーターは灰色で強調表示されている。斜体でマークされ、点線を使用して下線が引かれている結合ドメイン（ＮＮＮ）。ＡＳＳには、波線および太字を使用して下線が付されている（ＮＮＮ）。ＳｐＣａｓ９－ＶＰＲタンパク質の３’コード配列は灰色で強調表示され、太い実線を使用して下線が付され（ＮＮＮ）、ポリアデニル化シグナルは二重線を使用して下線が付されている（ＮＮＮ）。

【図20】イントロンを含むＡＢＣＡ４の５’コード配列を含む第一のデュアルＡＡＶの配列（配列番号３９）： ５’末端および３’末端のＩＴＲ配列は下線なしで灰色で強調表示されている（ＮＮＮ）。スペーサー配列は小文字で表記されている。ＣＭＶプロモーターは灰色で強調表示され、実線を使用して下線が付されている（ＮＮＮ）。ＡＢＣＡ４タンパク質の５’コード配列には、波線の下線で示されたイントロンによって中断された点線の下線が付されている（ＮＮＮＮＮＮＮＮＮ）。ＤＳＳは斜体で示され、下線が付されている（Ｎｎｎ、大文字はコード配列を表し、小文字は非コード配列を表す）。結合ドメインは灰色で強調表示され、中断線で下線が付されている（ＮＮＮ）。ポリＡ配列は濃い灰色で強調表示され、波の下線が付されている（ＮＮＮ）。

【図21】ＡＢＣＡ４の３’コード配列を含む第二のデュアルＡＡＶの配列（配列番号４０）： ５’末端および３’末端のＩＴＲ配列は、下線なしで灰色で強調表示されている（ＮＮＮ）。スペーサー配列は小文字で表記されている。ＣＭＶプロモーターは灰色で強調表示され、実線を使用して下線が付されている（ＮＮＮ）。結合ドメインは灰色で強調表示され、中断線で下線が付されている（ＮＮＮ）。受容スプライス部位は斜体で示され、下線が付されている（ＮＮＮ）。ＡＢＣＡ４タンパク質の３’コード配列には、波状の下線で示されたイントロンによって中断された点線を使用して下線が付されている（ＮＮＮＮＮＮＮＮＮ）。ポリＡ配列は濃い灰色で強調表示され、波の下線が付されている（ＮＮＮ）。

【発明を実施するための形態】

【0022】

発明の詳細な説明
本発明者らは、実施例に記載されているように、新規な受容スプライス領域を見出した。この受容スプライス領域は非常に効率的であり、スプライシングが利用される様々なアプリケーションで使用できる。したがって、本発明の受容スプライス領域は、とりわけ、分割ＡＡＶベクターの再構成、２つのＡＡＶベクターおよび／またはトラップベクターを含むＡＡＶベクター系のために、プレｍＲＮＡトランススプライシング分子を使用するトランススプライシング、シススプライシング、ＳＭａＲＴ技術（スプライソソーム媒介ＲＮＡトランススプライシング）に使用することができる。しかしながら、本明細書に記載の受容スプライス領域は、スプライシングが目的であるさらなる用途に使用することもできる。

【0023】

本発明は、
（ｉ）以下を含む受容スプライス領域、
（ｉａ）以下を含むピリミジン域、
（ａａ）５～２５ヌクレオチド；
（ａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；
（ｉｂ）受容スプライス部位、
ｂａ）ここで受容スプライス部位はピリミジン域の３’側に位置しており；および
ｂｂ）ここで受容スプライス部位は、５’から３’にＮＡＧＧの配列を含み、ここでＮはＡ、Ｃ、Ｔ／Ｕ、またはＧである；
（ｉｉ）目的のヌクレオチド配列；ここで目的のヌクレオチド配列は
（ｉｉａ）受容スプライス領域の３’側または５’側に、好ましくは受容スプライス領域の３’側に局在している；
を含む核酸配列に関し、ここで本発明による核酸配列は、好ましくは受容スプライス領域で切断され、それにより目的のヌクレオチド配列を受容スプライス領域配列から分離する。
本発明は、本発明はさらに、受容スプライス領域を切断し、それにより目的のヌクレオチド配列を受容スプライス領域配列から分離するための上記核酸配列の使用に関する。

【0024】

用語「核酸分子」、「核酸配列」、または「ヌクレオチド配列」は、本明細書において同義語として使用され、上記核酸分子／配列に含まれるプリン塩基およびピリミジン塩基を含むヌクレオチド配列を有する任意の核酸分子を包含し、それによって上記塩基は核酸分子の一次構造を表す。核酸配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでもよい。ＲＮＡは、たとえばプレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、またはｒＲＮＡであってもよい。本発明のポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドで構成することができ、未修飾のＲＮＡまたはＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい。当業者は、ポリデオキシヌクレオチド中のチミン（Ｔ）がポリリボヌクレオチド中のウラシル（Ｕ）に転写されることを理解するであろう。本明細書で言及される配列は、典型的には、（スプライシングイベントの前に）対応するＲＮＡ配列に転写されうるＤＮＡ配列として提供される。したがって、Ｔを含む核酸配列は、対応する（転写された）ＲＮＡ配列、好ましくはＵを含むプレｍＲＮＡ配列も開示する。

【0025】

ＤＮＡおよびＲＮＡには様々な修飾を加えることができる。したがって、用語「核酸分子」または「ヌクレオチド」は、化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形態を含んでもよい。「修飾」塩基／ヌクレオチドは、たとえば、トリチル化塩基およびイノシン等の異常な塩基を含む。

【0026】

本発明の受容スプライス領域配列は、受容スプライス部位およびピリミジン域という２つの特徴を含む。ピリミジン域は５～２５ヌクレオチドを含み、これら（合計）５～２５ヌクレオチド内の少なくとも６０％のヌクレオチドは、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）および／またはウラシル（Ｕ）等のピリミジン塩基である。ピリミジン域が５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド、好ましくは１０～１８ヌクレオチド、より好ましくは１２～１６ヌクレオチドを含むことも想定されている。追加的にまたは代替的に、これら（合計）５～２５ヌクレオチド内の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％のヌクレオチドは、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）および／またはウラシル（Ｕ）等のピリミジン塩基である。たとえば、ピリミジン域は６ヌクレオチドを含んでもよい。ピリミジン域は、配列ＴＴＴＴＴＴを含むか、またはそれからなることがさらに想定される。ピリミジン域は、配列ＴＣＴＴＴＴを含むか、またはそれからなることがさらに企図される。ピリミジン域は、配列ＴＴＴＴＴＴＧＴＣＡＴＴＴ（配列番号：１１）を含むか、またはそれからなることがさらに企図される。ピリミジン域は、配列ＴＣＴＴＴＴＧＴＣＡＴＣＴＡ（配列番号：１２）を含むか、またはそれからなることがさらに企図される。さらに、ピリミジン域の前に、配列ＣＡＡＣＧＡＧＴＣＴＴＴＴＧＴＣＡＴＣＴＡ（配列番号：１３）を含むか、またはそれからなる７ヌクレオチドが先行することが企図されている。ピリミジン域はまた、ＴＣＴＴＴＴＧＴＣＡＴＣＴ（配列番号：１）の配列を含むか、またはそれからなっていてもよい。本明細書に記載のピリミジン域は、配列番号：１、１１、１２、または１３の配列、または配列ＴＴＴＴＴＴ、またはＴＣＴＴＴＴと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であることも企図されている。一つの実施形態では、ピリミジン域の５～２５ヌクレオチドは、配列ＴＴＴＴＴＴ、またはＴＣＴＴＴＴを含む。好ましくは、ピリミジン域の最後のピリミジンと受容スプライス部位との間の配列は、１０塩基未満、好ましくは５塩基未満、より好ましくは３塩基未満である。用語「ピリミジン域」は、本明細書において「ポリピリミジン域」と互換的に使用され、ＰＰＴまたはＰｏｌｙＣ／Ｔと略される。「ピリミジン域の最後のピリミジン」は、ピリミジン域の５～２５ヌクレオチドの最も３’側のピリミジンを指す。

【0027】

本発明によれば、２つ以上の核酸分子の文脈における用語「同一である（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」または「パーセント同一性（ｐｅｒｃｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、比較ウィンドウ全体、または当技術分野で既知の配列比較アルゴリズムを使用して測定される指定領域にわたって、または手動アラインメントおよび目視検査によって測定された指定領域にわたって、最大の対応を得るために比較およびアラインメントしたときの、同一であるか、または同一のヌクレオチドの特定のパーセンテージ（たとえば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性）を有する２つ以上の配列または部分配列を指す。たとえば、８０％から９５％以上の配列同一性を有する配列は、実質的に同一であると考えられる。このような定義は、テスト配列の補数（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）にも適用される。当業者は、当技術分野で知られているように、たとえばＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２ （１９９４）， ４６７３－４６８０）、またはＦＡＳＴＤＢ（Ｂｒｕｔｌａｇ Ｃｏｍｐ． Ａｐｐ． Ｂｉｏｓｃｉ． ６ （１９９０）， ２３７－２４５）に基づくアルゴリズム等を使用して、配列間／配列間で（ｂｅｔｗｅｅｎ／ａｍｏｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）パーセント同一性を決定する方法を知っているであろう。

【0028】

ＢＬＡＳＴおよび ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５ （１９７７）， ３３８９－３４０２）も当業者に利用可能である。核酸配列のＢＬＡＳＴＮプログラムは、デフォルトとして、ワードサイズ（Ｗ）２８、期待しきい値（Ｅ）１０、一致／不一致スコア１、－２、ギャップコスト線形、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムはデフォルトとしてワードサイズ（Ｗ）６、期待しきい値（Ｅ）１０を使用し、ギャップコストはＥｘｉｓｔｅｎｃｅ：１１および Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：１です。さらに、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用することもできる（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ８９， （１９８９）， １０９１５）。

【0029】

たとえば、ＢＬＡＳＴ２．０は、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５ （１９９７）， ３３８９－３４０２； Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ３６ （１９９３）， ２９０－３００； Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５ （１９９０）， ４０３－４１０）の略で、ローカル配列アラインメントを検索するために使用することができる。

【0030】

本明細書で概説するように、ピリミジン域に加えて、本発明の受容スプライス領域配列は、受容スプライス部位を含む。本明細書で使用する「受容スプライス部位」は、当業者に既知であり、とりわけ「ＤＮＡからＲＮＡへ」という見出しの下にＡｌｂｅｒｔｓ Ｂ， Ｊｏｈｎｓｏｎ Ａ， Ｌｅｗｉｓ Ｊ， ｅｔ ａｌ． （２００２） “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ． ４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ．” ニューヨーク：Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅに記載されている意味を有する。本発明の受容スプライス部位は、ヌクレオチドＮＡＧＧ、好ましくはＣＡＧＧまたはＣＡＧＧＴ（またはＲＮＡ中のＣＡＧＧまたはＣＡＧＧＵ）を含むかまたはそれらからなる。受容スプライス部位は、通常、「受容スプライス領域」として定義される配列内に位置する。本明細書で使用する用語「受容スプライス部位」（略してＡＳＳ）は、コンセンサス受容スプライス配列を指し、「スプライス受容部位」（ＳＡＳと略称）とも呼ばれる。本発明の文脈において、用語「受容スプライス領域」および「受容スプライス部位」は、この領域とコンセンサス受容スプライス部位とを区別するために別個の用語として使用され、受容スプライス領域は受容スプライス部位を含む。文献では、受容スプライス領域および受容スプライス部位は、ＡＳＳまたはＳＡＳと呼ばれることがある。

【0031】

受容スプライス部位は、この部位で核酸がいわゆるスプライソソームまたはその人工バリアントによって切断されるため、受容スプライス部位と呼ばれる。スプライソソームおよびそれがどのように機能するかは、当業者にも知られている。ヒトのスプライソソームの構造は、たとえばＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ. （２０１７） “Ａｎ ａｔｏｍｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍｅ” Ｃｅｌｌ １６９， ９１８－９２６に記載されている。人工スプライソソームは、たとえば、スプライソソームと同じ切断をスプライス部位に仲介する酵素を含む。Ｃｏｐｐｉｎｓ ａｎｄ Ｓｉｌｖｅｒｍａｎｎ （２００５） “Ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｅｐ ｏｆ ＲＮＡ Ｓｐｌｉｃｉｎｇ： Ａｎ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ＤＮＡ Ｅｎｚｙｍｅ Ｃａｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ Ｂｒａｎｃｈｅｄ ＲＮＡ Ｕｓｉｎｇ ａｎ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｌｅａｖｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ ａｓ ａ ５’－Ｅｘｏｎ Ａｎａｌｏｇｕｅ” Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４４ （４１）， ｐｐ １３４３９－１３４４６およびＭｕｌｌｅｒ （２０１７） “Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓ－Ｓｐｌｉｃｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ Ｉ Ｉｎｔｒｏｎ Ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ．” Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． ２２（１）． ｐｉｉ： Ｅ７５． ｄｏｉ： １０．３３９０／ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２２０１００７５に記載されているように、人工スプライソソームはＤＮＡ酵素を含でもよい。本明細書に記載の受容スプライス部位は、ＮＡＧＧの配列を有し、Ｎは任意のヌクレオチドであってもよい。たとえば、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｔ、ＧまたはＵから選択されるヌクレオチドである。本明細書に記載される受容スプライス部位は、ＣＡＧＧの配列を有してもよい。本明細書に記載の受容スプライス部位はまた、ＣＡＧＧＴ（またはＲＮＡの場合はＣＡＧＧＵ）の配列を有してもよい。

【0032】

本発明の受容スプライス部位での切断は、ＮＡＧＧおよび／またはＮＡＧＧＴスプライス部位のＮＡＧ、又はＣＡＧＧスプライス部位および／またはＣＡＧＧＴスプライス部位のＣＡＧを含む２つの断片をもたらす。ＮＡＧＧまたはＣＡＧＧスプライス部位の最後のＧ、またはＮＡＧＧＴまたはＣＡＧＧＴスプライス部位の最後のＧＴを含む他の断片。したがって、本明細書に記載の使用、核酸配列、ＡＡＶベクター、ＡＡＶベクター系、および方法において、（切断／スプライシング後に）最終的に得られる（目的の）ヌクレオチド配列は、ＮＡＧＧまたはＣＡＧＧ配列の最後のＧ、またはＮＡＧＧＴまたはＣＡＧＧＴ配列のＧＴを含むことが想定される。当業者は、本明細書で言及されるスプライシングがＲＮＡレベルで起こり、したがって（切断／スプライシング後に）最終的に得られる（目的の）ＲＮＡヌクレオチド配列がＮＡＧＧまたはＣＡＧＧ配列の最後のＧ、またはプレｍＲＮＡヌクレオチド配列のＣＡＧＧＵ配列のＧＵを含むことを理解するだろう。しかしながら、本方法および使用において、（目的の）最終核酸配列は、ＮＡＧＧスプライス部位配列のＮＡＧ、および／またはＣＡＧＧまたはＣＡＧＧＴスプライス部位配列のＣＡＧを含むことも企図される。したがって、受容スプライス部位での切断は、ＮＡＧＧ、ＣＡＧＧおよび／またはＣＡＧＧＴ（またはＣＡＧＧＵ）の受容スプライス部位配列ＧとＧの間の切断を含み、それによって（目的の）ヌクレオチド配列をイントロン受容スプライス領域配列から分離することが想定される。

【0033】

本発明の受容スプライス領域は、とりわけ、トランススプライシングだけでなくシススプライシングまたは他のスプライシングを含む用途に使用することができる。たとえば、Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （２０１６） “ｍＲＮＡ ｔｒａｎｓ－ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｉｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅｓ” ＷＩＲＥｓ ＲＮＡ ７： ４８７－４９８に記載されているように、スプライシングの発生を測定することができる。たとえば、スプライシングされたヌクレオチド配列は、特定のプライマーおよびプローブを使用してエンドポイント定量的ＲＴ－ＰＣＲによって定量化でき、目的のスプライシングされた産物を識別できる。スプライシングのさらなる測定は、本明細書の実施例に記載されているように行うことができる。たとえば、スプライシングは、Ｏｒｅｎｇｏ ｅｔ ａｌ． （２００６） “Ａ ｂｉｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｆｏｒ ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ｓｃｒｅｅｎｓ ｏｆ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ．” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４（２２）：ｅ１４８に記載されているマーカー遺伝子を使用して測定することができる。Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， （２０１６） “Ｒｅｐａｉｒ ｏｆ ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ ｍＲＮＡ ｂｙ ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＲＮＡ ｔｒａｎｓ－ｓｐｌｉｃｉｎｇ： ａ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．”， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．； ２３（５）：９１８－９３０に記載されているように、制限酵素分析を使用して、さらなるスプライシングを検出することができる。

【0034】

プレｍＲＮＡに存在する場合の受容スプライス部位は、通常、イントロンの３’末端および次のエクソンの５’末端に対応する。受容スプライス部位、好ましくは受容スプライス領域を人工的に導入する場合、受容スプライス部位がイントロン－エクソン境界に位置することは必ずしも必要ではなく、オープンリーディングフレーム内、イントロン内、または完全または部分的なオープンリーディングフレームの５’末端に位置していてもよい。また、受容スプライス部位がイントロンの５’末端に位置することも想定されている。受容スプライス部位は、プレｍＲＮＡ分子ではなく、任意の核酸分子等の人工分子内に位置することがさらに想定される。

【0035】

本発明の受容スプライス部位は、受容スプライス領域に含まれる。特に、本発明の受容スプライス部位は、ピリミジン域の３’側に位置する。

【0036】

受容スプライス領域 (または受容スプライス部位モジュール) は、分岐点および／または分岐点配列をさらに含んでもよい。原則として、本発明は、任意の好適な分岐点または分岐点配列を想定している。例示的な分岐点または分岐点配列は、とりわけ、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ． （２００８） “Ｈｕｍａｎ ｂｒａｎｃｈ ｐｏｉｎｔ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｓ ｙＵｎＡｙ” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｖｏｌ． ３６， ｎｏ．７， ｐｐ．２２５７－２２６７； Ｍｅｒｃｅｒ ｅｔ ａｌ． （２０１６） “Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｒａｎｃｈ ｐｏｉｎｔｓ” Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５： ２９０－３０３に記載されている。

【0037】

たとえば、分岐点配列は、配列ＵＡＣＵＡＡＣを含むか、またはそれからなっていてもよい。追加的にまたは代替的に、分岐点配列は、ＹがＵまたはＣであり、ＲがＡまたはＧである配列ＹＮＹＵＲＡＹを含むか、またはそれからなっていてもよい。追加的にまたは代替的に、分岐点配列は、ＹがＵまたはＣであり、ＲがＡまたはＧである配列ＹＮＣＵＲＡＹを含むか、またはそれからなっていてもよい。追加的にまたは代替的に、分岐点配列は、ＹがＵまたはＣであり、ＲがＡまたはＧである配列ＣＵＲＡＹを含むか、またはそれからなっていてもよい。追加的にまたは代替的に、分岐点配列は、ＹがＵまたはＣであり、ＲがＡまたはＧであり、ＶがＡ、ＣまたはＧである配列ＹＵＶＡＹを含むか、またはそれからなっていてもよい。追加的にまたは代替的に、分岐点配列は、ＹがＵまたはＣであり、ＳがＧまたはＣである配列ＣＵＳＡＹを含むか、またはそれからなっていてもよい。追加的にまたは代替的に、分岐点配列は、配列ＣＵＧＡＣを含むか、またはそれからなっていてもよい。追加的にまたは代替的に、分岐点配列は、配列ＣＵＡＡＣを含むか、またはそれからなっていてもよい。分岐点は、Ｃ／Ｕ－Ｕ－Ｎ－Ａ－Ｃ／Ｕ、ＣＡＡＣＧＡまたはＣＵＣＡＡまたはＧＵＣＡＡの分岐点シーケンス内に存在していてもよい（ここで、分岐点配列は、Ｃ／Ｔ－Ｔ－Ｎ－Ａ－Ｃ／Ｔ、ＣＡＡＣＧＡまたはＣＴＣＡＡまたはＧＴＣＡＡのそれぞれのＤＮＡ配列によってコードされている。）。すべての各配列において下線を引いたアデノシンは、分岐点ヌクレオチドを表す。

【0038】

本発明の受容スプライス領域は、分岐点ヌクレオチド配列（ｃ）をさらに含んでもよく、分岐点ヌクレオチド配列は、
（ｃａ）１～１５ヌクレオチドを含む；
（ｃｂ）分岐点ヌクレオチド、好ましくはアデノシン（Ａ）を含む；および
（ｃｃ）ピリミジン域および受容スプライス部位の５’側に位置する。

【0039】

分岐点配列が約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上のヌクレオチドを含むことも企図される。分岐点配列は、６～８ヌクレオチドを含むことがさらに企図される。分岐点配列が８ヌクレオチドを含むことも想定される。しかしながら、特に、分岐点配列のヌクレオチドは連続して存在することができ、そのため、合計で１５を超えるヌクレオチド、たとえば例として合計で３０（１５＋１５）、４０、５０、１００、２００以上のヌクレオチドを含んでもよい。

【0040】

分岐点ヌクレオチドは、任意のヌクレオチドであってもよい。したがって、分岐点ヌクレオチドは、Ａ（アデノシン）、Ｔ（チミン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）、およびＵ（ウラシル）のいずれかであってもよい。好ましくは、分岐点ヌクレオチドはＡ（アデノシン）である。分岐点ヌクレオチドは、分岐点配列内に位置している。

【0041】

受容スプライス領域は、追加または代替として、イントロンスプライスエンハンサーを含んでもよい。そのようなスプライスエンハンサーは当業者に知られており、とりわけＷａｎｇ ｅｔ ａｌ． （２０１２） “Ｉｎｔｒｏｎｉｃ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｅｎｈａｎｃｅｒｓ， ｃｏｇｎａｔｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｃｏｎｔｅｘｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｒｕｌｅｓ” Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ． １９， ｎｏ． １０， ｐｐ． １０４４－１０５３に記載されている。２つの例は、スプライスエンハンサー配列「ＡＡＣＧ」（グループＦ）および「ＣＧＡＧ」（グループＤ）である。ただし、この用語は、任意の好適なイントロンスプライス領域を含む。

【0042】

例示的なイントロンスプライスエンハンサーは、ＴＧＧＧＧＧＧＡＧＧ（配列番号：２）の配列を有する。別の例示的なイントロンスプライスエンハンサーは、ＧＴＡＡＣＧＧＣの配列を有する。イントロンスプライスエンハンサーは、ＡＡＣＧの配列を有することがさらに企図される。本明細書に記載の受容スプライス領域は、配列番号：２、ＧＴＡＡＣＧＧＣまたはＡＡＣＧの配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有することも企図される。

【0043】

本発明の受容スプライス領域は、好ましくは、ポリピリミジン域の５’側に約７ヌクレオチド（たとえば、５～１２ヌクレオチド、好ましくは６～１０ヌクレオチド、より好ましくは６～８ヌクレオチド）をさらに含む。好ましい実施形態では、受容スプライス領域は、（ａ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも４ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣである；（ｂ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも５ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣである；（ｃ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも６ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣである；（ｄ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも４ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡである；（ｅ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも４ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡＣである；（ｆ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも５ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡである；（ｇ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも５ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡＣである；（ｈ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも６ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡである；（ｉ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも６ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡＣである、または（ｊ）配列ＣＡＡＣＧＡＧを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチドをさらに含む。理論に拘束されるものではないが、この配列はスプライスエンハンサーとして機能する可能性がある。

【0044】

受容スプライス領域は、１、２、３、４、５、またはそれ以上の異なる／同一の分岐点配列を含むことがさらに想定される。受容スプライス領域は、１、２、３、４、５、またはそれ以上の異なるまたは同一のイントロンスプライスエンハンサー（配列）を含むことがさらに想定される。

【0045】

ピリミジン域、受容スプライス部位、および任意でさらに分岐点配列および／またはイントロンスプライスエンハンサーが想定され、したがって、受容スプライス領域全体は、合計で約１０００、５００、２５０、１００、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５以下のヌクレオチド、好ましくは２６ヌクレオチドを含む。

【0046】

一部の実施形態では、特定の受容スプライス部位によって使用される分岐点配列または分岐点ヌクレオチドは、フレキシブルであってもよい。これは、３以上、５以上、７以上、９以上、または１１以上等、様々な分岐点を使用できることを意味する。一つの実施形態では、各分岐点の使用頻度は、３０％未満または２０％未満である。特定の受容スプライス部位によって使用される分岐点配列または分岐点ヌクレオチドの選択がフレキシブルである場合、受容スプライス領域の強度は、含まれる特定の分岐点配列または分岐点ヌクレオチドの存在に由来せず、その存在に依存しない（ｉｓ ｎｏｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｆｒｏｍ）。任意の分岐点配列または分岐点ヌクレオチドを使用するフレキシビリティにより、受容スプライス領域が非常に効率的かつ用途が広くなり、配列に依存しない方法で効率的なスプライシングを誘導するために、様々な核酸配列での使用に特に適している可能性がある。

【0047】

本明細書に記載され、核酸、プレｍＲＮＡトランススプライシング分子、ＡＶＶベクター、ＡＶＶベクター系、および本発明による方法で使用されるものの中に存在する受容スプライス領域は、受容スプライス部位およびポリピリミジン域に加えて、さらにポリピリミジン域の５’側にヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、受容スプライス領域は、ポリピリミジン域の５’側に約７ヌクレオチド（たとえば、５～１２ヌクレオチド、好ましくは６～１０ヌクレオチド、より好ましくは６～８ヌクレオチド）を含む。特に好ましい実施形態では、受容スプライス領域は、ポリピリミジン域の５’側に配列ＣＡＡＣＧＡＧを含む。受容スプライス部位を含む受容スプライス領域、ポリピリミジン域、およびさらなるポリピリミジン域の５’側のヌクレオチド、好ましくはポリピリミジン域の５’側のさらなる約７ヌクレオチドは、最小受容スプライス領域として機能し、非常に強力な機能的受容スプライス領域を導入するために、任意の核酸配列に挿入することができる。

【0048】

本発明の受容スプライス領域は、ＣＡＡＣＧＡＧＴＣＴＴＴＴＧＴＣＡＴＣＴＡＣＡＧＧＴ（配列番号：３）の配列を含むか、またはそれからなることがさらに想定される。本発明の受容スプライス領域は、ＣＡＡＣＧＡＧＴＴＴＴＴＴＧＴＣＡＴＣＴＡＣＡＧＧＴ（配列番号：４）の配列を含むか、またはそれからなることがさらに企図される。本発明の受容スプライス領域は、ＣＴＡＣＡＣＧＣＴＣＡＡＧＣＣＧＧＡＧＧＴＣＡＡＣＡＡＣＧＡＧＴＣＴＴＴＴＧＴＣＡＴＣＴＡＣＡＧＧＴ（配列番号：５）、ＧＣＣＧＧＡＧＧＴＣＡＡＣＡＡＣＧＡＧＴＣＴＴＴＴＧＴＣＡＴＣＴＡＣＡＧＧＴ（配列番号：６）、ＧＴＣＴＴＴＴＧＴＣＡＴＣＴＡＣＡＧＧＴ（配列番号：７）、ＧＴＣＴＴＴＴＧＴＣＡＴＣＴＡＣＡＧＧＴＧＴＴＣＧＴＧ（配列番号：２６）、またはＧＴＣＴＴＴＴＧＴＣＡＴＣＴＡＣＡＧＧＴＧＴＴＣＧＴＧＧＴＴＣＧＴＧＧＴＣＣＡ（配列番号：８）のいずれかの配列を含むか、またはそれからなることもまた想定される。好ましくは、本発明の受容スプライス領域は、ＣＡＡＣＧＡＧＴＣＴＴＴＴＧＴＣＡＴＣＴＡＣＡＧＧＴ（配列番号：３）またはＣＡＡＣＧＡＧＴＴＴＴＴＴＧＴＣＡＴＣＴＡＣＡＧＧＴ（配列番号：４）の配列を含むか、またはそれからなる（または、配列番号：３または配列番号：４の配列を含むか、またはそれからなる核酸配列によってコードされる）。

【0049】

本明細書に記載の受容スプライス領域は、配列番号：３、４、５、６、７、２６、または８のいずれか一つの任意の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有することも企図される。好ましくは、受容スプライス領域は、配列番号：３、４、５、６、７、２６、または８のいずれか一つの任意の配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。より好ましくは、受容スプライス領域は、配列番号：３または４の任意の配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。さらにより好ましくは、受容スプライス領域は、配列番号：３または４の任意の配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0050】

本発明による核酸配列は、受容スプライス部位に加えて、目的のヌクレオチド配列をさらに含んでもよい。目的のヌクレオチド配列は、任意の好適なヌクレオチド配列であってもよい。用語「目的のヌクレオチド配列」および「目的の核酸配列」は、本明細書において互換的に使用する。典型的には、この用語を本発明による核酸配列または核酸分子とよりよく区別するために、「目的ヌクレオチド配列」と呼ばれる。たとえば、目的のヌクレオチド配列は、イントロンまたはエクソンのヌクレオチド配列であってもよく、またはイントロンおよびエクソン（すなわち、非コードおよびコード）配列の両方を含んでもよい。目的のヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、又はｔＲＮＡであることがさらに企図される。目的のヌクレオチド配列またはその一部分は、受容スプライス領域の３’または５’、好ましくは３’に位置していてもよい。特定の実施形態では、核酸配列、プレｍＲＮＡトランススプライシング分子、ＡＡＶベクター、ＡＡＶベクター系のいずれかに含まれる、または本発明による方法のいずれかで使用される目的のヌクレオチド配列またはその一部分は、導入遺伝子またはその一部分であってもよい。スプライシング効率、特にトランススプライシング効率は、目的のヌクレオチド配列またはその一部分にイントロンが存在することによって改善できることが見出されている。特に、目的のヌクレオチド配列またはその一部分が１０００ｂｐを超える場合、配列にイントロンを導入または保持することが有利である可能性がある。好ましくは、イントロンは、目的のヌクレオチド配列またはその一部分の約２００～１０００ｂｐごとに存在するが、より低いまたはより高い配列間隔で発生することもある。イントロンは、目的のヌクレオチド配列および／または異なる遺伝子のヌクレオチド配列および／または人工のヌクレオチド配列に由来してもよい。

【0051】

本明細書で使用する目的のヌクレオチド配列（目的の核酸配列とも呼ばれる）は、コード配列、たとえば目的のポリペプチドをコードする配列、またはその部分であってもよい。好ましい実施形態では、目的のヌクレオチド配列はコード配列であり、より好ましくは導入遺伝子、目的のポリペプチドをコードする配列またはその一部分である。

【0052】

目的のヌクレオチド配列が治療用ポリペプチド、治療用核酸（たとえば治療用ＲＮＡ）またはその一部分をコードすることが本発明によってさらに想定される。

【0053】

治療用核酸または治療用ポリペプチドは、眼疾患、たとえば常染色体劣性重症早発性網膜変性［ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ ｓｅｖｅｒｅ ｅａｒｌｙ－ｏｎｓｅｔ ｒｅｔｉｎａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ］（レーバー先天黒内障）、先天性色覚異常、シュタルガルト病、ベスト病（卵黄様黄斑変性症）、Ｄｏｙｎｅ病（Ｄｏｙｎｅ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、網膜色素変性症（特に、常染色体優性、常染色体劣性、Ｘ連鎖、2遺伝子性または多遺伝子性網膜色素変性症）、（Ｘ連鎖）網膜分離症、黄斑変性症（ＡＭＤ）、加齢性黄斑変性症、萎縮性加齢黄斑変性症、血管新生ＡＭＤ、糖尿病黄斑症、増殖糖尿病網膜症（ＰＤＲ）、類嚢胞黄斑浮腫、中心性漿液性網膜症、網膜剥離、眼内炎、緑内障、後部ぶどう膜炎、先天性停止性夜盲症、全脈絡膜萎縮、早発性網膜ジストロフィー、錐体ジストロフィー、桿体錐体ジストロフィーまたは錐体桿体ジストロフィー［ｒｏｄ－ｃｏｎｅ ｏｒ ｃｏｎｅ－ｒｏｄ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ］、模様黄斑ジストロフィー［ｐａｔｔｅｒｎ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｅｓ］、アッシャー症候群および他の症候性繊毛関連疾患［ｓｙｎｄｒｏｍｉｃ ｃｉｌｉｏｐａｔｈｉｅｓ］、たとえばバルデ・ビードル症候群、ジュベール症候群、セニオール・ローケン症候群［Ｓｅｎｉｏｒ－Ｌｏｋｅｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ］またはアルストレーム症候群［Ａｌｓｔｒｏｍ ｓｙｎｄｒｏｍｅ］を治療するために使用できる。

【0054】

核酸、治療用核酸、治療用タンパク質／ポリペプチドまたは治療用分子は、桿体および／または錐体等の視細胞に影響を及ぼす障害（視細胞疾患）を治療するために使用することができる。光受容細胞疾患の非限定的な例は、色覚異常、加齢性黄斑変性症、網膜変性症、網膜ジストロフィー、網膜色素変性症、錐体ジストロフィー、桿体錐体ジストロフィー、色覚障害［ｃｏｌｏｒ ｂｌｉｎｄｎｅｓｓ］、黄斑変性症、夜盲症、網膜分離症、全脈絡膜萎縮、糖尿病性網膜症、遺伝性視神経症、Ｉ型小口病、白点状網膜炎（ＲＰＡ）、進行性網膜萎縮症（ＰＲＡ）、白点状眼底（ＦＡ）、または先天性停止性夜盲症（ＣＳＮＢ）を含む。

【0055】

治療用核酸または治療用ポリペプチドは、遺伝性網膜疾患（ＩＲＤ）を治療するために使用することができる。ＩＲＤは、遺伝的にも表現型的にも不均一な障害の群である。ＩＲＤは、１５歳から４５歳の人の失明の主な原因であり、推定有病率は１，５００人に１人から ３，０００人に１人である。ＩＲＤは、主に影響を受ける網膜細胞の種類、すなわち、桿体または錐体光受容体、および疾患の状態に従って分類することができる。ＩＲＤの非限定的な例は、色覚異常、加齢性黄斑変性症、網膜変性症、網膜ジストロフィー、網膜色素変性症、錐体ジストロフィー、桿体錐体ジストロフィー、色覚障害［ｃｏｌｏｒ ｂｌｉｎｄｎｅｓｓ］、黄斑変性症、網膜分離症、全脈絡膜萎縮、糖尿病性網膜症、遺伝性視神経症、Ｉ型小口病、白点状網膜炎（ＲＰＡ）、進行性網膜萎縮症（ＰＲＡ）、白点状眼底（ＦＡ）、または先天性停止性夜盲症（ＣＳＮＢ）である。

【0056】

主に錐体に影響を及ぼす最も一般的な進行性ＩＲＤは、シュタルガルト黄斑ジストロフィーである。これは常染色体劣性遺伝形式で遺伝し、主に網膜トランスポーターＡＢＣＲをコードするＡＢＣＡ４遺伝子の変異によって引き起こされる。一つの実施形態では、治療用核酸はＡＢＣＡ４またはその一部分をコードし、治療用核酸はシュタルガルト黄斑ジストロフィーを治療するために使用される。

【0057】

主に桿体に影響を及ぼす最も一般的な進行性ＩＲＤは、網膜色素変性症（ＲＰ）である。ＲＰは、夜盲症および視野狭窄につながる進行性疾患である。後の段階では、二次錐体光受容体細胞死が誘導され、最終的に完全な視力喪失が引き起こされる。網膜色素変性症の一部の形態は、ロドプシンをコードする遺伝子の変異に関連している。一つの実施形態では、治療用核酸はロドプシンまたはその一部分をコードし、治療用核酸は網膜色素変性症を治療するために使用される。

【0058】

本発明による核酸配列はまた、供与スプライス部位を含んでもよく、ここで、供与スプライス部位は、目的のヌクレオチド配列またはその一部分の３’に局在している。用語「供与スプライス領域」は、本明細書では「供与スプライス部位」（ＤＳＳと略される）または「スプライス供与部位」（ＳＤＳと略される）と交換可能に使用される。したがって、本発明の核酸配列は、供与スプライス部位も含んでもよい。供与スプライス部位は当業者に既知であり、とりわけＢｕｃｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ． （２００９） “Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｏｒ ｃｒｙｐｔｉｃ ｄｏｎｏｒ ｓｐｌｉｃｅ ｓｉｔｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｍＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ａｍｏｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｒｏｍ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ， ｅｃｈｉｎｏｄｅｒｍｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｇｒｏｕｐｓ” ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １０： ３１８およびＱｕ ｅｔ ａｌ． （２０１７） “Ａ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ－Ｂａｓｅｄ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｍＲＮＡ Ｓｐｌｉｃｉｎｇ Ｃｏｄｅ ｔｈａｔ Ｍａｙ Ｅｘｐｌａｉｎ Ｓｏｍｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ Ｉｓ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｉｎ Ａｎｉｍａｌｓ” Ｆｒｏｎｔ． Ｇｅｎｅｔ．， ｖｏｌ． ８ Ａｒｔ． ３８に記載されている。ここで、任意の適切な供与スプライス部位がこの用語によって企図される。供与スプライス部位は通常、エクソンの３’末端と隣接するイントロンの５’末端に位置する。しかしながら、本発明の文脈において、供与スプライス部位はまた、目的のヌクレオチド配列内のどこかに位置していてもよい。受容スプライス部位と同様に、供与スプライス部位はスプライソソームがその部位で切断することを可能にする。

【0059】

原則として、本明細書に記載の供与スプライス部位は、核酸分子の任意の位置に位置していてもよい。供与スプライス部位が（第一の）核酸配列の３’末端に位置することも想定されている。たとえば、供与スプライス部位配列は、ＡＡＧＧＴＡＡＧＴ、ＡＡＧＧＴＧＡＧＴ、ＣＡＧＧＴＡＡＧＴ、ＣＡＧＧＴＧＡＧＴ、ＡＡＧＧＴＡＡＧ、ＡＡＧＧＴＧＡＧ、ＣＡＧＧＴＡＡＧ、またはＣＡＧＧＴＧＡＧの配列を含むか、またはそれからなっていてもよい。供与スプライス部位配列は、ＡＡＧＧＴＡＡＧＴ、ＡＡＧＧＴＧＡＧＴ、ＣＡＧＧＴＡＡＧＴ、ＣＡＧＧＴＧＡＧＴ、ＡＡＧＧＴＡＡＧ、ＡＡＧＧＴＧＡＧ、ＣＡＧＧＴＡＡＧ、またはＣＡＧＧＴＧＡＧの配列に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を有することも想定される。

【0060】

同様に、本明細書に記載の受容スプライス領域は、核酸分子の任意の位置に位置していてもよい。受容スプライス部位が（第二の）核酸配列の５’末端に位置することも想定されている。

【0061】

目的のヌクレオチド配列は、本明細書に記載のポリアデニル化シグナルおよび／またはプロモーターを追加的または代替的に含んでいてもよい。

【0062】

本発明はまた、
（Ａ）一つまたは複数の供与スプライス部位配列を含む第一の核酸配列を提供する工程；
（Ｂ）以下を含む第二の核酸配列を提供する工程；
（ｉ）以下を含む受容スプライス領域、
（ｉａ）以下を含むピリミジン域、
（ｉａａ）５～２５ヌクレオチド；
（ｉａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；
（ｉｂ）受容スプライス部位、
（ｉｂａ）ここで受容スプライス部位はピリミジン域の３’側に位置しており；および
（ｉｂｂ）ここで受容スプライス部位は、５’から３’にＮＡＧＧの配列を含み、ここでＮはＡ、Ｃ、Ｔ／Ｕ、またはＧである；
を含み、それによって核酸配列を得る、核酸配列を作製する方法にも関する。方法は、（Ｃ）一つまたは複数の供与スプライス部位配列で第一の核酸配列を切断し、受容スプライス部位で第二の核酸配列を切断する工程、および（Ｄ）第一の切断された核酸配列を第二の切断された核酸配列に連結する工程も含んでいてもよい。

【0063】

この方法は、いわゆるトランススプライシングを反映している。特に、トランススプライシングは、２つの別々の核酸分子（好ましくはプレｍＲＮＡ分子）由来のエクソンが一緒に結合されて１つの核酸分子を形成するタイプのスプライシングである。たとえば、プレｍＲＮＡが最終的なｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、またはｒＲＮＡにスプライシングされる場合のである。このプロセスは当業者にも既知であり、とりわけ「ＤＮＡからＲＮＡへ」という見出しの下にＡｌｂｅｒｔｓ Ｂ， Ｊｏｈｎｓｏｎ Ａ， Ｌｅｗｉｓ Ｊ， ｅｔ ａｌ． （２００２） “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ． ４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ．” ニューヨーク：Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅに記載されている。したがって、スプライシングされた核酸配列は、好ましくは、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、またはｔＲＮＡ配列である。したがって、目的のヌクレオチド配列はプレｍＲＮＡであってもよい。

【0064】

第一および第二の核酸配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列であってもよい。第一および第二の核酸配列がＤＮＡ配列である場合、第一および第二の核酸配列の両方はさらにプロモーターを含み、少なくとも第二の、好ましくは両方の核酸配列はポリＡ配列等の転写終結配列も含む。第一および第二の核酸配列がＲＮＡ配列である場合、少なくとも第二の、好ましくは両方の核酸配列は、ポリＡ配列等の終結配列を含む。好ましくは、核酸配列は、ＤＮＡ配列であり、より好ましくは、ＤＮＡ配列を含むベクターまたはプラスミドである。

【0065】

一つの実施形態では、第一および第二の核酸配列は、結合ドメインをさらに含む。さらに別の実施形態では、第一および第二の核酸配列は、本明細書に記載のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子またはプレｍＲＮＡトランススプライシング分子をコードするＤＮＡ配列である。

【0066】

理論に拘束されることなく、一つまたは複数の供与スプライス部位配列での第一の核酸配列の切断、および受容スプライス領域配列での第二の核酸配列の切断、および第一の切断された核酸配列と第二の切断された核酸配列との連結は、シススプライシングおよびトランススプライシングにおける２つのエステル交換反応を使用して行われ、本明細書では「スプライシング」と呼ばれる。本明細書で使用する用語「トランススプライシング」は、ＲＮＡスプライシング、特に、最終ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡまたはｒＲＮＡ等の成熟ＲＮＡを形成するための２つの別個のＲＮＡまたはプレＲＮＡ分子のプレＲＮＡスプライシングを指す。

【0067】

用語「ｉｎ ｖｉｔｒｏ法」は、体、すなわち、ヒトまたは動物の体の外の方法を指すが、体外の細胞株または一次細胞を含む。

【0068】

本明細書に記載の方法および使用は、細胞溶解物等の任意の好適な無細胞系または任意の好適な宿主細胞で実施することができる。

【0069】

そのような好適な宿主細胞は当業者に既知である。たとえば、好適な宿主細胞はスプライシング機構、すなわちスプライソソームを含む。当業者は適切な宿主、たとえば哺乳動物またはヒト宿主細胞における使用のための調節エレメントを選択することができる。調節エレメントは、たとえば、プロモーター、終結配列（たとえば、転写終結配列、翻訳終結配列）、エンハンサー、およびポリアデニル化エレメントを含む。さらに、導入遺伝子（目的の核酸配列）の発現レベルは、エンハンサー配列またはウッドチャック肝炎ウイルスの転写後応答エレメント（ＷＰＲＥ）等の調節エレメントを使用することによって増強することができる。ただし、これらのエレメントにより、ｒＡＡＶのパッケージ容量がさらに制限される。したがって、場合によっては、特にサイズ制限が重要な場合は、そのような任意のエレメントを省略し、好ましくは、本発明によるＡＡＶベクター、および特にデュアルｒＡＡＶベクター系の終止配列として短いポリアデニル化シグナル等の小さな必須の調節エレメントを使用することが推奨される。宿主細胞は、真核細胞、またはヒトまたはげっ歯類の細胞株等の哺乳動物細胞であってもよい。宿主細胞は、ＨＥＫ細胞、たとえばＨＥＫ２９３（Ｔ）細胞、Ｃｏｓ７細胞、ＣＨＯ細胞、線維芽細胞、たとえばヒトまたはマウス由来の線維芽細胞、網膜芽細胞腫細胞、６６１Ｗ細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、たとえばヒトｉＰＳＣ、光受容体細胞、たとえば脊椎動物由来の光受容体細胞、神経細胞、またはグリア細胞から得られる。

【0070】

一つの実施形態では、方法はｉｎ ｖｉｔｒｏで（すなわち、体外で）宿主細胞で行われ、上記第一の核酸配列を導入すること、および上記第二の核酸配列を導入することを含む。上記第一の核酸配列および上記第二の核酸配列は、トランスフェクションまたは形質導入によって導入されてもよく、より具体的には共トランスフェクトまたは同時形質導入によって導入されてもよい。

【0071】

したがって、一つの実施形態では、方法は
（Ａ）一つまたは複数の供与スプライス部位配列を含む第一の核酸配列を提供する工程；
（Ｂ）以下を含む第二の核酸配列を提供する工程；
（ｉ）以下を含む受容スプライス領域、
（ｉａ）以下を含むピリミジン域、
（ｉａａ）５～２５ヌクレオチド；
（ｉａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；
（ｉｂ）受容スプライス部位、
（ｉｂａ）ここで受容スプライス部位はピリミジン域の３’側に位置しており；および
（ｉｂｂ）ここで受容スプライス部位は、５’から３’にＮＡＧＧの配列を含み、ここでＮはＡ、Ｃ、Ｔ／Ｕ、またはＧである；
（ｉｉ）目的のヌクレオチド配列、ここで該目的のヌクレオチド配列
（ｉｉａ）は受容スプライス領域の３’側に位置している、
を含み、それによって核酸配列を得る。方法は、（Ｃ）一つまたは複数の供与スプライス部位配列で第一の核酸配列を切断し、受容スプライス部位で第二の核酸配列を切断する工程、および（Ｄ）第一の切断された核酸配列を第二の切断された核酸配列に連結し、それによって核酸配列を得る工程も含んでいてもよい。

【0072】

両方の核酸配列が目的のヌクレオチド配列を含む場合、この方法は、第一のヌクレオチド配列が（ｉｉ）目的のヌクレオチド配列を含み、ここで、目的のヌクレオチド配列が供与スプライス部位の５’側に位置しているという特徴をさらに含む。

【0073】

第二および第一の核酸配列の両方は、本明細書に記載されるように、目的のヌクレオチド配列を含んでもよい。そのような目的のヌクレオチド配列は、供与スプライス部位の５’に位置していてもよい。目的のヌクレオチド配列は、追加的または代替的に、受容スプライス領域の３’に位置していてもよい。本発明の別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、以下の配置順序を含む：好ましくは、５’－（目的の配列）－（供与スプライス部位）－３’と５’の結合－（受容スプライス領域）－（目的の配列）－３’。あるいは、５’－（目的の配列）－（受容スプライス領域）－３’と５’の結合－（供与スプライス部位）－（目的の配列）－３’。

【0074】

好ましい実施形態では、目的のヌクレオチド配列は、ポリペプチドをコードする配列であり、第一の核酸配列は、ポリペプチドをコードする配列の５’部分を含み、第二の核酸配列は、第二の核酸配列は、ポリペプチドをコードする配列の３’部分を含み、トランススプライシングは、ポリペプチドをコードする配列の５’部分および３’部分を再構成する。

【0075】

切断された核酸配列のライゲーションは、当業者に既知のプロセスである。たとえば、このライゲーションプロセスは、ライゲーション分子（ｌｉｇａｔｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）によって実行することができる。たとえば、ライゲーション分子は、ＲＮＡリガーゼまたはＲＮＡリガーゼ機能を有するタンパク質であってもよい。そのようなＲＮＡリガーゼは当業者に既知であり、とりわけたとえばＣｈａｍｂｅｒｓ ａｎｄ Ｐａｔｒｉｃｋ （２０１５） “Ａｒｃｈａｅａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ” Ｈｉｎｄａｗｉ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ａｒｃｈａｅａ Ｖｏｌｕｍｅ ２０１５， 論文ＩＤ １７０５７１， １０ページに記載されている。いくつかの（ｔ）ＲＮＡリガーゼは、たとえばＰｏｐｏｗ ｅｔ ａｌ． （２０１２） “Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｒｏｌｅｓ ｏｆ （ｔ）ＲＮＡ ｌｉｇａｓｅｓ” Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ６９（１６）：２６５７－７０に記載されている。したがって、ライゲーション工程を含む方法は、ＲＮＡリガーゼの添加の工程をさらに含んでもよい。ＲＮＡリガーゼは、たとえば、ｍＲＮＡリガーゼ、ｔＲＮＡリガーゼ、またはｒＲＮＡリガーゼであってもよい。ライゲーションされたｍＲＮＡ分子をたとえばどのように分析できるかを説明する方法を実施例に示す。

【0076】

好ましい実施形態では、方法は宿主細胞内で行われ、より好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（すなわち、対外）で行われる。したがって、第一および第二の核酸配列は、宿主細胞に導入され、ここで第一および第二の核酸配列は組換え核酸配列および／または宿主細胞に対して異種である。第一および第二の核酸配列を宿主細胞に導入することは、トランスフェクトまたは形質導入を含む。トランスフェクトはＤＮＡまたはＲＮＡトランスフェクトであってもよく、ＤＮＡまたはＲＮＡをトランスフェクトする方法は当業者に既知である。好ましくは、核酸配列はＤＮＡ配列であり、ＤＮＡ配列は、該ＤＮＡ配列を含むプラスミドまたはベクターの形態でトランスフェクトされる。本明細書で言及される形質導入は、核酸をウイルスベクターを使用して導入することを意味し、ここでウイルスベクターはＤＮＡまたはＲＮＡを含んでもよい。好ましい実施形態では、ウイルスベクターはＤＮＡウイルスベクターであり、一本鎖ＤＮＡ（たとえばＡＡＶ）または二本鎖ＤＮＡを含んでもよい。

【0077】

一つの実施形態では、本発明による方法は、以下を含む： （Ａ）プレｍＲＮＡトランススプライシング分子配列を含む第一の核酸配列または上記プレｍＲＮＡトランススプライシング分子をコードする核酸配列を宿主細胞に導入する工程であって、ここで第一のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子は５’から３’に以下を含む工程 （ａ）目的のヌクレオチド酸配列の５’部分；（ｂ）供与スプライス部位；（ｃ）任意選択でスペーサー配列；（ｄ）第一の結合ドメイン；および（ｅ）任意選択で終止配列、好ましくはポリＡ配列、および（Ｂ）プレｍＲＮＡトランススプライシング分子配列を含む第二の核酸配列または上記プレｍＲＮＡトランススプライシング分子をコードする核酸配列を宿主細胞に導入する工程であって、ここで第二のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子は５’から３’に以下を含む工程；（ｉ）第一の核酸配列の第一の結合ドメインに相補的な第二の結合ドメイン；（ｉｉ）以下を含む受容スプライス領域配列；（ｉｉａ）以下を含むピリミジン域、（ｉｉａａ）５～２５ヌクレオチド；（ｉｉａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；（ｉｉｂ）受容スプライス部位、（ｉｉｂａ）ここで受容スプライス部位はピリミジン域の３’側に位置しており；および（ｉｉｂｂ）ここで受容スプライス部位は、５’から３’にＮＡＧＧの配列を含み、ここで、ＮはＡ、Ｃ、Ｔ／Ｕ、またはＧである；および（ｉｉｉ）目的のヌクレオチド配列の３’部分。該方法は、（Ｃ）供与スプライス部位配列で第一の核酸配列を切断し、受容スプライス部位で第二の核酸配列を切断する工程；（Ｄ）目的のヌクレオチド配列の５’部分を含む第一の切断された核酸配列を、目的のヌクレオチド配列の３’部分を含む第二の切断された核酸配列に連結し、それによって目的の核酸配列を得る工程をさらに含んでもよい。好ましい実施形態では、第一および第二の核酸配列は、上記プレｍＲＮＡトランススプライシング分子をコードするＤＮＡ配列であり、第一の核酸配列は目的の核酸配列の５’部分のプロモーター５’をさらに含み、第二の核酸配列は第二の結合ドメインのプロモーター５’をさらに含む。

【0078】

本発明は、以下を含む核酸配列にも関し、ここで、目的のヌクレオチド配列は、配列番号：９のロドプシン遺伝子のエクソン３ではないか、または目的のヌクレオチド配列は、配列番号：９および／または１０で定義される配列を含まないか、または目的の核酸配列は、配列番号：９のロドプシン遺伝子のエクソン３を含まない：
（ｉ）以下を含む受容スプライス領域配列、
（ｉａ）以下を含むピリミジン域、
（ｉａａ）５～２５ヌクレオチド；
（ｉａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；
（ｉｂ）受容スプライス部位、
（ｉｂａ）ここで受容スプライス部位はピリミジン域の３’側に位置しており；および
（ｉｂｂ）ここで受容スプライス部位は、５’から３’にＮＡＧＧの配列を含み、ここでＮはＡ、Ｃ、Ｔ／Ｕ、またはＧである；
（ｉｉ）目的のヌクレオチド配列、ここで該目的のヌクレオチド配列
（ｉｉａ）は受容スプライス領域の３’側または５’側に位置している、

【0079】

本発明は、以下を含む核酸配列にも関し、ここで、目的のヌクレオチド配列は、配列番号：１０のロドプシンｍＲＮＡではない：
（ｉ）以下を含む受容スプライス領域配列、
（ｉａ）以下を含むピリミジン域、
（ｉａａ）５～２５ヌクレオチド；
（ｉａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；
（ｉｂ）受容スプライス部位、
（ｉｂａ）ここで受容スプライス部位はピリミジン域の３’側に位置しており；および
（ｉｂｂ）ここで受容スプライス部位は、５’から３’にＮＡＧＧの配列を含み、ここでＮはＡ、Ｃ、Ｔ／Ｕ、またはＧである；
（ｉｉ）目的のヌクレオチド配列、ここで該目的のヌクレオチド配列
（ｉｉａ）は受容スプライス領域の３’側または５’側に位置している。

【0080】

本発明の核酸配列は最大で５８００ヌクレオチドの長さを有することが想定される。さらに、本発明の核酸配列は、最大で５５００、５０００、４５００、４０００、３５００、３０００、２５００、２０００、１５００、１０００、５００、４００、３００、２００、または最大で１５０ヌクレオチドの長さを有することが想定される。

【0081】

本発明の受容スプライス領域を核酸分子で使用することができるさらなる用途は、Ｓｍａｒｔ技術のためのいわゆる外因性プレｍＲＮＡトランススプライシング分子である。本発明の受容スプライス領域を導入することができるそのようなプレｍＲＮＡトランススプライシング分子は、とりわけ、国際公開第２０１１／０４２５５６号、国際公開第２０１３／０２５４６１号、ならびにＢｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （２０１６） “ｍＲＮＡ ｔｒａｎｓ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｉｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅｓ” ＷＩＲＥｓ ＲＮＡ， ７：４８７－４９８， Ｐｕｔｔａｒａｊｕ ｅｔ ａｌ． （１９９９） “Ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＲＮＡ ｔｒａｎｓ－ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｓ ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ” Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ． １７， ｐｐ． ２４６－２５２；およびＭａｎｓｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ． （２００３） “５’ Ｅｘｏｎ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｒｅｐａｉｒ ｂｙ ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＲＮＡ ｔｒａｎｓ－ｓｐｌｉｃｉｎｇ” ＲＮＡ， ｖｏｌ． ９： １２９０－１２９７に記載されている。これらの参考文献から、当業者はまた、そのようなプレｍＲＮＡトランススプライシング分子を構築する方法を知っている。いくつかの例示的なプレｍＲＮＡトランススプライシング分子核酸分子も本明細書に記載されている。

【0082】

本発明はまた、以下を含むプレｍＲＮＡトランススプライシング分子に関する：
（ｉ）以下を含む受容スプライス領域配列、
（ｉａ）以下を含むピリミジン域、
（ｉａａ）５～２５ヌクレオチド；
（ｉａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；
（ｉｂ）受容スプライス部位、
（ｉｂａ）ここで受容スプライス部位はピリミジン域の３’側に位置しており；および
（ｉｂｂ）ここで受容スプライス部位は、５’から３’にＮＡＧＧの配列を含み、ここでＮはＡ、Ｃ、Ｔ／Ｕ、またはＧである；
（ｉｉ）目的のヌクレオチド配列；ここで受容スプライス領域は目的のヌクレオチド配列の５’側に局在している；
（ｉｉｉ）目的の核酸配列の５’側に局在する、プレｍＲＮＡを標的とする結合ドメイン；および
（ｖｉ）任意選択でスペーサー配列、ここで該スペーサー配列は結合ドメインおよび受容スプライス領域の間に局在している。

【0083】

好ましい実施形態では、受容スプライス領域は目的のヌクレオチド配列の５’側に局在しており、結合ドメインは受容スプライス領域の５’に局在している。好ましくは、核酸配列またはプレｍＲＮＡトランススプライシング分子は終止配列、好ましくはポリＡ配列をさらに含む。

【0084】

本発明はさらに、以下を含むプレｍＲＮＡトランススプライシング分子に関する。
（ｉ）以下を含む受容スプライス領域配列、
（ｉａ）以下を含むピリミジン域、
（ｉａａ）５～２５ヌクレオチド；
（ｉａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；
（ｉｂ）受容スプライス部位、
（ｉｂａ）ここで受容スプライス部位はピリミジン域の３’側に位置しており；および
（ｉｂｂ）ここで受容スプライス部位は、５’から３’にＮＡＧＧの配列を含み、ここでＮはＡ、Ｃ、Ｔ／Ｕ、またはＧである；
（ｉｉ）目的のヌクレオチド配列、ここで受容スプライス領域は目的のヌクレオチド配列の５’側に局在している；
（ｉｉｉ）供与スプライス部位、ここで該供与スプライス部位は目的のヌクレオチド配列の３’側に局在している；
（ｉｖ）目的のヌクレオチド配列の５’側に位置するプレｍＲＮＡを標的とする第一の結合ドメイン；
（ｖ）目的のヌクレオチド配列の３’側に位置するプレｍＲＮＡを標的とする第二の結合ドメイン；
（ｖｉ）任意選択で第一のスペーサー配列、ここで該第一のスペーサーは第一の結合ドメインと受容スプライス領域の間に局在している；
（ｖｉｉ）任意選択で第二のスペーサー配列、ここで第二のスペーサーは第二の結合ドメインと供与スプライス部位の間に局在している。

【0085】

一つの実施形態では、第一の結合ドメインは受容スプライス領域の５’側に局在しており、第二の結合ドメインは供与スプライス部位の３’側に局在している。当業者は、プレｍＲＮＡトランススプライシング分子をコードするＤＮＡ配列が、ＲＮＡ分子であるプレｍＲＮＡトランススプライシング分子を転写するためのプロモーターを含むことを理解するであろう。用語「プレｍＲＮＡを標的とする結合ドメイン」は、「プレｍＲＮＡ標的結合ドメイン」と呼ばれることもあり、これは、目的のヌクレオチド配列の５’または３’に位置していてもよい。

【0086】

本明細書に記載の核酸配列は、プレｍＲＮＡトランススプライシング分子を反映することができる。当業者は、本明細書に記載される核酸配列およびプレｍＲＮＡトランススプライシング分子は組換え配列または組み換え分子であることを理解するであろう。これらのプレｍＲＮＡトランススプライシング分子は当技術分野で既知であり、とりわけ国際公開第２０１１／０４２５５６号、国際公開第２０１３／０２５４６１号、ならびにＢｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （２０１６） “ｍＲＮＡ ｔｒａｎｓ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｉｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅｓ” ＷＩＲＥｓ ＲＮＡ， ７：４８７－４９８， Ｐｕｔｔａｒａｊｕ ｅｔ ａｌ． （１９９９） “Ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＲＮＡ ｔｒａｎｓ－ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｓ ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ” Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ． １７， ｐｐ． ２４６－２５２；Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ． （２００３） “５’ Ｅｘｏｎ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｒｅｐａｉｒ ｂｙ ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＲＮＡ ｔｒａｎｓ－ｓｐｌｉｃｉｎｇ” ＲＮＡ， ｖｏｌ． ９： １２９０－１２９７、およびＢｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （２０１６） “ｍＲＮＡ ｔｒａｎｓ－ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｉｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅｓ” ＷＩＲＥｓ ＲＮＡ， ７：４８７－４９８に記載されている。したがって、当業者はそれらのプレｍＲＮＡトランススプライシング分子を構築する方法を知っている。プレｍＲＮＡトランススプライシング分子が標的プレｍＲＮＡに結合することが想定され、ここでプレｍＲＮＡは天然のプレｍＲＮＡ、特に宿主細胞に内因性のプレｍＲＮＡ、または組換えプレｍＲＮＡ、特に別のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子であってもよい。プレｍＲＮＡトランススプライシング分子は、シススプライシング反応よりも効率的にトランススプライシング反応を優先的に誘導することも企図されている。

【0087】

本明細書で使用される用語「プレｍＲＮＡを標的とする結合ドメイン」は、任意の好適な「プレｍＲＮＡを標的とする結合ドメイン」であってもよく、これは目的のヌクレオチド配列の５’側または３’側に位置する標的プレｍＲＮＡの配列に対して相補的であることを意味する。本明細書で使用される「プレｍＲＮＡを標的とする結合ドメイン」は、「標的結合ドメイン」、「結合ドメイン」（ＢＤと略される）、または「結合配列」と呼ばれることもある。たとえば、結合ドメインは、塩基対形成によって標的プレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡを認識することができる。たとえば、ｍＲＮＡのターゲットはイントロンであってもよい。本明細書に記載のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子の標的結合ドメインは、少なくとも１５～３０ヌクレオチド、好ましくは８０～１２０ヌクレオチド、より好ましくは約１００ヌクレオチドの１つまたは２つの結合ドメインを含んでもよい；または米国特許公開第ＵＳ ２００６－０１９４３１７ Ａ１に記載されるように、選択された（たとえば内因性の）プレｍＲＮＡの標的領域に相補的であり、アンチセンス配向である最大数百ヌクレオチドの長い標的結合ドメインを有してもよい。これにより、結合の特異性が付与され、内因性のプレｍＲＮＡが空間に密接に固定されるため、たとえば宿主細胞の核のスプライソソームは、プレｍＲＮＡトランススプライシング分子の一部分を（たとえば、内因性の）プレｍＲＮＡの一部分にトランススプライシングすることができる。あるいは、結合ドメインは、別のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子等の別の組換えプレｍＲＮＡの結合ドメインに逆相補的であってもよい。これにより、結合の特異性が付与され、２つのプレｍＲＮＡトランススプライシング分子が空間に密接に固定されるため、たとえば宿主細胞の核のスプライソソームは、１つのプレｍＲＮＡトランススプライシング分子の一部分を他のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子の一部分にトランススプライシングすることができる。したがって、結合ドメインは約１５～２５０ヌクレオチドの間、約１５～２００ヌクレオチドの間、約１００～２００ヌクレオチドの間、または５００、４００、３００、または２００ヌクレオチド未満を含むことが想定される。一つの実施形態では、結合ドメインは、５０～１５０ヌクレオチド、好ましくは８０～１２０ヌクレオチド、さらにより好ましくは９０～１１０ヌクレオチドまたは約１００ヌクレオチドを含む。代替的には、またはさらにより好ましくは、効率的な結合ドメインは、４５～６５％のＧＣ含量を有し、および／またはイントロン真核生物配列または細菌配列に由来し、および／または最後の３０ｂｐに少なくとも一つの分岐点を含む（たとえばｈｕｍａｎ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｆｉｎｄｅｒ ３．１ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｍｄ．ｂｅ／ＨＳＦ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を使用して評価するように）。

【0088】

宿主細胞内で、結合ドメインは、内因性プレｍＲＮＡまたは第二の異種性または組換えプレｍＲＮＡが標的結合ドメインに逆相補的な配列を含む限り、内因性プレｍＲＮＡまたは第二の異種性または組換えプレｍＲＮＡ（宿主細胞に提供または導入される）に結合しうる。したがって、第二の異種性または組換えプレｍＲＮＡに関して、それは第一の異種性のプレｍＲＮＡの結合ドメインに逆相補的な結合ドメインを含む。用語「内因性」および「異種性」は、本明細書においては宿主細胞に関して使用される。内因性プレｍＲＮＡを標的とすることは、スプライソソームを介したＲＮＡトランススプライシングとも呼ばれ、通常、内因性プレｍＲＮＡの一部を置換するために使用される。第二の異種性または組換えプレｍＲＮＡを標的とすることもまた、トランススプライシングと呼ばれ、一つのプレｍＲＮＡトランススプライシング分子由来の第一のヌクレオチド配列またはその一部分（５’）を別のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子の第二のヌクレオチド配列またはその一部分（３’）と連結する新規の組換えｍＲＮＡを生成する。本明細書で使用する用語「組換え」は、分子クローニング等の遺伝子組換えの実験的方法によって形成されたＤＮＡ分子または配列、ならびに上記組換えＤＮＡ分子または配列によってコードされるＲＮＡまたはポリペプチド分子／配列を指す。

【0089】

用語「プレｍＲＮＡ」または「プレＲＮＡ」は、トランススプライシング前のＲＮＡを指し、通常、シススプライシング前のＲＮＡ分子（たとえば、イントロンおよびエクソンを含む）を表すが、結合ドメインがエクソン－エクソン境界にまたがる配列を標的とする場合等、シススプライシング後のＲＮＡ分子（たとえば、エクソンのみを含む）を指す場合もある。

【0090】

本明細書で使用する用語「異種」は、実験的に細胞に移行（ｔｒａｎｓｆｅｒ）または導入され、したがってこの細胞に内因性ではないタンパク質または核酸分子または配列を指す。異種タンパク質または核酸分子または配列が、レシピエントとは異なる細胞型または異なる種に由来しうる場合、それがレシピエント宿主細胞に導入される限り、それは、レシピエントと同じ細胞型または種に由来してもよい。本明細書で言及されるように、「異種」および「組換え」という用語は交換可能に使用される。

【0091】

本発明における使用のために好適な例示的な結合ドメインは、それに限定されることなく、配列番号：２７、２８、３２、３３または１８の配列によってコードされるＲＮＡ配列を有する結合ドメインである。さらなる標的結合ドメインは、実施例２および５に記載および使用されるか、またはＲｉｅｄｍａｙｒ ＬＭ． （２０２０， ＳＭａＲＴ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０７９：２１９－３２． ｄｏｉ： １０．１００７／９７８－１－４９３９－９９０４－０＿１７）またはＤａｌｌｉｎｇｅｒ Ｇ． ｅｔ ａｌ． （２００３， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＲＮＡ ｔｒａｎｓ－ｓｐｌｉｃｉｎｇ （ＳＭａＲＴ） ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ｓｋｉｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ． Ｅｘｐ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １２：３７－４６）に記載されるように、再構成効率を決定するためのセルリアン再構成アッセイ等のレポーター再構成アッセイを使用して同定することができる。

【0092】

第二の結合領域は、分子の３’'末端に配置されてもよく、そして本発明のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子に組み込むことができる。絶対的な相補性は望ましいが、必須ではない。本明細書で言及される、内因性プレｍＲＮＡの一部分に対して「相補的」な配列は、内因性プレｍＲＮＡとハイブリダイズして安定な二重鎖を形成することができるのに十分な相補性を有する配列を意味する。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度および核酸の長さの両方に依存する（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｈ， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。

【0093】

したがって、プレｍＲＮＡを標的とする結合ドメインに関して使用される相補性は、結合ドメインが、プレｍＲＮＡ上の標的配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％相補的であることを意味し、好ましくはプレｍＲＮＡ上の標的配列に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％相補的であることを意味する

【0094】

スプライス部位を結合ドメインから分離するためのスペーサー領域もまた、好ましくは、プレｍＲＮＡトランススプライシング分子に含まれる。スペーサー配列は、プレｍＲＮＡトランススプライシング分子の領域であり、比較的弱い相補性によってプレｍＲＮＡトランススプライシング分子の３’および／または５’スプライス部位のエレメントをカバーし、それによって非特異的トランススプライシングを防止することができる。

【0095】

５’供与スプライス部位および３’末端結合ドメインを分離するスペーサーは、約１０～１００ヌクレオチドの間、好ましくは約１０～７０ヌクレオチドの間、約２０～７０ヌクレオチドの間、約２０～５０ヌクレオチドの間、より好ましくは約３０～５０ヌクレオチドの間を含んでもよい。このスペーサーは、下流イントロンスプライスエンハンサー（ＤＩＳＥ）を含んでもよい。３’受容スプライス領域を５’末端結合ドメインから分離するスペーサー配列は、約２～１００ヌクレオチドの間、または約１０～１００ヌクレオチドの間、好ましくは約２～５０ヌクレオチドの間、より好ましくは約５～２０ヌクレオチドの間を含んでもよい。

【0096】

スペーサーは非コード配列でありうるが、スプライシングされたプレｍＲＮＡトランススプライシング分子の翻訳をブロックする終止コドン等の特徴を含むように設計されてもよい。プレｍＲＮＡトランススプライシング分子に追加の特徴を追加することができ、上記のように当業者に知られている。本明細書に記載の核酸配列またはプレｍＲＮＡトランススプライシング分子が（組換え）ベクターに含まれることがさらに想定される。そのようなベクターは同様に当業者に知られている。目的のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子等の本発明のヌクレオチド配列を含むベクターは、哺乳動物細胞での複製および発現に使用されるプラスミド、ウイルス、または当技術分野で知られている他のものであってもよい。

【0097】

目的のヌクレオチド配列または本明細書に記載のヌクレオチド配列、たとえばプレｍＲＮＡトランススプライシング分子の発現は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞において作用することが当技術分野で知られている、任意のプロモーター／エンハンサー配列によって調節することができる。そのようなプロモーター／エンハンサー配列は誘導性、または構成的であってもよい。そのようなプロモーターは、本明細書の他の場所にも記載されている。一つの例示的なプロモーターは、ヒトロドプシンプロモーターまたはマウスロドプシンプロモーターまたは短波長感受性オプシンプロモーターまたは中波長感受性オプシンプロモーターまたは長波長感受性オプシンプロモーター等である。任意のタイプのプラスミド、コスミド、ＹＡＣ、またはウイルスベクターを使用して、組織部位に直接導入できる組換えＤＮＡ構築物を調製することができる。あるいは、所望の標的細胞に選択的に感染するウイルスベクターを使用することができる。本発明の実施において使用するためのベクターは、レトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスのクラスに由来するもの等のウイルス発現ベクターを含むがこれらに限定されない、任意の真核生物発現ベクターを含む。好ましい実施形態では、本発明の組換えベクターは、真核生物発現ベクターである。

【0098】

別の特定の実施形態では、本発明は、本発明のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子、または本発明のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子をコードする核酸配列等の核酸配列を標的細胞に送達することを含む。様々な送達システムが知られており、本発明の組成物を細胞に移行するために使用することができる。たとえば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルへのカプセル化、組成物を発現することができる組換え細胞、受容体を介したエンドサイトーシス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築、ＤＮＡの注入、エレクトロポレーション、リン酸カルシウムを介したトランスフェクション等。本発明はまた、本発明のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子、プレｍＲＮＡトランススプライシング分子をコードする核酸配列、または本発明のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子をコードする核酸配列を含む組換えベクター等の核酸配列を含む細胞にも関する。

【0099】

目的の核酸配列または本明細書に開示される核酸配列を使用して、機能的な生物学的に活性な分子をコードする遺伝子を、欠損遺伝子産物または変異遺伝子産物の発現は、正常な表現型を生成する遺伝性遺伝性疾患（ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）を有する個体の細胞に提供することができる。これは、とりわけ、本明細書にも開示されているように、アデノ随伴ウイルスベクターによって達成することができる。

【0100】

本発明はまた、プロモーターおよび本明細書に記載のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子をコードする配列を含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子に関する。好ましくは、ＤＮＡ分子は、ベクターまたはプラスミドであり、ここで、ベクターは、ＡＡＶ、アデノウイルス、またはレンチウイルスベクターまたはプラスミド等のウイルスベクターであってもよい。プレｍＲＮＡトランススプライシング分子またはウイルスベクター等のＤＮＡ分子は、治療、具体的には遺伝子治療、より具体的には眼疾患を治療する遺伝子治療に使用することができる。

【0101】

本発明の受容スプライス部位を使用することができるさらなる用途は、任意のＡＡＶベクターまたはＡＡＶベクター系にある。そのようなベクター系およびそれらがどのように構築されうるかは、当業者に知られており、とりわけ、Ｃａｒｖａｌｈｏ ｅｔ ａｌ． （２０１７） “Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ ｏｆ ｄｕａｌ ＡＡＶ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ ｒｅｔｉｎａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ” Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ， ｖｏｌ． １１， Ａｒｔｉｃｌｅ ５０３、米国特許出願第２０１４／０２５６８０２号、またはＴｒａｐａｎｉ ｅｔ ａｌ． （２０１３） “Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｇｅｎｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｒｅｔｉｎａ ｂｙ ｄｕａｌ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒｓ” ＥＭＢＯ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ｖｏｌ． ６， ｎｏ． ２， ｐｐ． １９４－２１１に記載されている。一部の例示的なＡＡＶベクターおよびＡＡＶベクター系もまた本明細書に記載されている。

【0102】

本発明はまた、これら２つの逆方向末端反復間の核酸配列を含む少なくとも２つの逆方向末端反復を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに関し、ここで該核酸配列は、５’から３’に
（ｉ）プロモーター；
（ｉｉ）結合ドメイン；
（ｉｉｉ）任意選択でスペーサー配列；
（ｉｖ）以下を含む受容スプライス領域
（ａ）以下を含むピリミジン域
（ａａ）５～２５ヌクレオチド；
（ａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；
（ｂ）受容スプライス部位、
ｂａ）ここで受容スプライス部位はピリミジン域の３’側に位置しており；および
ｂｂ）ここで受容スプライス部位は、５’から３’にＮＡＧＧの配列を含み、ここでＮはＡ、Ｃ、Ｔ／Ｕ、またはＧである；
（ｖ）目的のヌクレオチド配列
（ｖｉ）任意選択で終止配列、たとえばポリＡ配列
を含む。

【0103】

構造的に、ＡＡＶは小さい（２５ｎｍ）、二十面体キャプシドを有する一本鎖ＤＮＡ非エンベロープウイルスである。キャプシド（ｃａｐ）タンパク質の組成および構造が異なる天然または改変ＡＡＶバリアント（ＡＡＶセロタイプも）は、様々な指向性、すなわち異なる（網膜）細胞型を形質導入する能力を有する（Ｂｏｙｅ ｅｔ ａｌ． （２０１３） “Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｒｅｔｉｎａｌ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ” Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ ２１ ５０９－５１９）。遍在的に活性なプロモーターと組み合わせると、この指向性は遺伝子発現の部位を明確化する。一方、細胞型特異的プロモーターとの組み合わせでは、部位特異性の程度（すなわち、桿体または錐体光受容体でのみ導入遺伝子の発現）は、ＡＡＶセロタイプの指向性およびプロモーターの特異性の両方の組み合わせによって明確化される（Ｓｃｈｏｎ ｅｔ ａｌ． （２０１５） “Ｒｅｔｉｎａｌ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｂｙ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ （ＡＡＶ） ｖｅｃｔｏｒｓ： Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ” Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ． ９５（Ｐｔ Ｂ）：３４３－５２）。

【0104】

すべて互換的に使用される用語「アデノ随伴ウイルスベクター」または「組換えＡＡＶ」または「ｒＡＡＶ」は、そのウイルスゲノム中に異種ポリヌクレオチド配列（本明細書において目的のヌクレオチド配列とも呼ばれる）を含む任意のＡＡＶを含むことを意味する。一般に、目的の異種ポリヌクレオチド／ヌクレオチド配列には、少なくとも１つ、一般に２つの天然またはバリアントのＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接している。用語ｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶベクター粒子およびｒＡＡＶベクタープラスミドの両方を包含する。したがって、たとえば、異種ポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶは、天然に存在する野生型ＡＡＶに通常含まれない核酸配列、たとえば導入遺伝子（たとえば、非ＡＡＶＲＮＡコードポリヌクレオチド配列、非ＡＡＶタンパク質コードポリヌクレオチド配列）、非ＡＡＶプロモーター配列、非ＡＡＶポリアデニル化配列等を含むｒＡＡＶであってもよい。

【0105】

そのような組換えＡＡＶベクターは当技術分野における技術常識であり、当業者はそのような組換えＡＡＶの構築方法も知っている。

【0106】

「ｒＡＡＶベクターゲノム」または「ｒＡＡＶゲノム」は、一つまたは複数の異種核酸配列を含むＡＡＶゲノム（すなわち、ｖＤＮＡ）である。ｒＡＡＶベクターは通常、ウイルスを生成するために末端反復（ＴＲ）のみを必要とする。他のすべてのウイルス配列は不要と見なされ、トランスで供給される場合がある（Ｍｕｚｙｃｚｋａ， （１９９２） Ｃｕｒｒ Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５８：９７）。通常、ｒＡＡＶベクターゲノムは、ベクター／キャプシドによって効率的にパッケージ化できる導入遺伝子／目的のヌクレオチド配列／異種核酸配列のサイズを最大化するために、一つまたは複数のＴＲ配列のみを保持している。構造的および非構造的タンパク質コード配列は、（たとえば、プラスミド等のベクターから、または配列をパッケージング細胞に安定して組み込むことによって）トランスで提供される場合がある。本発明の実施形態では、ｒＡＶＶベクターゲノムは、少なくとも１つのＴＲ配列（たとえば、ＡＡＶ ＴＲ配列）、任意選択で２つのＴＲ（たとえば、２つのＡＡＶ ＴＲ）を含み、これらは通常、ベクターゲノムの５’末端および３’末端にあり、異種核酸に隣接しているが、それに隣接している必要はない。ＴＲは互いに同一であっても、異なっていてもよい。

【0107】

すべて互換的に使用される用語「逆方向末端反復」、「末端反復」または「ＴＲ」は、ヘアピン構造を形成し、逆方向末端反復として機能する（すなわち、複製、ウイルスパッケージング、組み込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）および／またはプロウイルスレスキュー等の所望の機能を介する場合）任意のウイルス末端反復または合成配列を含む。ＴＲはＡＡＶ ＴＲまたは非ＡＡＶ ＴＲであってもよい。たとえば、他のパルボウイルス（たとえば、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＶＭ）、ヒトパルボウイルスＢ－１９）のような非ＡＡＶ ＴＲ配列、または任意の他の好適なウイルス配列（たとえば、ＳＶ４０複製の起点として機能するＳＶ４０ヘアピン）をＴＲとして使用することができ、さらにトランケーション、置換、欠失、挿入、および／または付加により改変することができる。さらに、ＴＲは米国特許第５，４７８，７４５号に記載される「ダブルＤ配列」のように、部分的にまたは完全に合成であってもよい。末端反復は、約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００以上の長さのヌクレオチドを有してもよい。たとえば、末端反復は約１４５ヌクレオチドを有する。たとえば、逆方向末端反復は、配列番号：１４および／または１５の配列を有してもよい。逆方向末端反復は、配列番号：１４および／または１５の配列と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％の配列同一性を有しうることも想定される。好ましくは、ＡＡＶベクターは配列番号：１４および１５の両方、または配列番号：１４および１５に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む。

【0108】

「ＡＡＶ末端反復」または「ＡＡＶ ＴＲ」は、現在知られている、または今後見出される任意のＡＡＶ由来であってよく、セロタイプ１、２、３、３Ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３または任意の他のＡＡＶを含むが、これらに限定されない。末端反復が所望の機能、たとえば複製、ウイルスパッケージング、組み込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）および／またはプロウイルスレスキュー等を媒介する限り、ＡＡＶ末端反復はネイティブな末端反復配列を有する必要はない（たとえば、ネイティブなＡＡＶ ＴＲ配列は挿入、欠失、トランケーションおよび／またはミスセンス変異によって変更されてもよい）。本発明のウイルスベクターは、さらに国際特許公開第００／２８００４に記載されているように、「標的とする」ウイルスベクター（たとえば、定方向の指向性を有する）および／または「ハイブリッド」パルボウイルス（すなわち、ウイルスＴＲおよびウイルスキャプシドが異なるパルボウイルスに由来する）であってもよい。

【0109】

組換えＡＡＶまたはＡＡＶベクターは、天然に存在するＡＡＶ ｔｙｐｅ １（ＡＡＶ－１）、ＡＡＶ ｔｙｐｅ ２（ＡＡＶ－２）、ＡＡＶ ｔｙｐｅ ３（ＡＡＶ－３）、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ ｔｙｐｅ ４（ＡＡＶ－４）、ＡＡＶ ｔｙｐｅ ５（ＡＡＶ－５）、ＡＡＶ ｔｙｐｅ ６（ＡＡＶ－６）、ＡＡＶ ｔｙｐｅ ７（ＡＡＶ－７）、ＡＡＶ ｔｙｐｅ ８（ＡＡＶ－８）、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むか、またはそれを有することも想定される。

【0110】

本発明によると、２つの逆方向末端反復の間の核酸配列は、本明細書に記載のプロモーターをさらに含む。ＡＡＶで使用されるプロモーターの選択は、所望の標的細胞において目的の選択された導入遺伝子／ヌクレオチド配列を発現することができる多数の構成的または誘導性プロモーターの中からすることができる。プロモーターは、ヒトを含む任意の種由来であってよい。

【0111】

本明細書に記載のプロモーターは「細胞特異的」であってもよい。用語「細胞特異的」は、組換えベクターのために選択された特定のプロモーターが、特定の細胞または眼細胞型における目的の選択された導入遺伝子／ヌクレオチド配列の発現を指示できることを意味する。有用なプロモーターは、桿体オプシンプロモーター、赤緑オプシンプロモーター、青オプシンプロモーター、ｃＧＭＰ－Ｐ－ホスホジエステラーゼプロモーター、マウスオプシンプロモーター（Ｂｅｌｔｒａｎ ｅｔ ａｌ． （２０１０） “ｒＡＡＶ２／５ ｇｅｎｅ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｏ ｒｏｄｓ：ｄｏｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．” Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １７（９）：１１６２－７４）、ロドプシンプロモーター（Ｍｕｓｓｏｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ， Ｊｕｌｙ ２０１１， １８（７）：６３７－４５）；錐体トランスデューシンのアルファサブユニット（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ， ＢＭＣ Ｄｅｖ， Ｂｉｏｌ， Ｊａｎ ２０１１，１１：３）；ベータホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）プロモーター；網膜色素変性症（ＲＰ１）プロモーター（Ｎｉｃｏｒｄ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ， Ｄｅｃ ２００７， ９（１２）： １０１５－２３）；ＮＸＮＬ２／ＮＸＮＬ１プロモーター（Ｌａｍｂａｒｄ ｅｔ ａｌ， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ， Ｏｃｔ． ２０１０， ５（１０）：ｅｌ３０２５）、ＰＥ６５プロモーター；ｒｅｔｉｎａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｌｏｗ／ｐｅｒｉｐｈｅｒｉｎ ２ （Ｒｄｓ／ｐｅｒｐｈ２）プロモーター（Ｃａｉ ｅｔ ａｌ， Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ． ２０１０ Ａｕｇ；９１（２）： １８６－９４）；およびＶＭＤ２プロモーター（Ａｃｈｉ ｅｔ ａｌ， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， （２００９） ２０：３－９）を含むが、これらに限定されない。

【0112】

本発明で使用される有用なプロモーターはまた、桿体オプシンプロモーター（ＲＨＯ）、赤緑オプシンプロモーター、青オプシンプロモーター、ｃＧＭＰ－ホスホジエステラーゼプロモーター、ＳＷＳプロモーター（青短波長感受性（ＳＷＳ）オプシンプロモーター）、マウスオプシンプロモーター（上記のＢｅｌｔｒａｎ ｅｔ ａｌ． ２０１０）、ロドプシンプロモーター（Ｍｕｓｓｏｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ， Ｊｕｌｙ ２０１１， １８（７）：６３７－４５）；錐体トランスデューシンのアルファサブユニット（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ， ＢＭＣ Ｄｅｖ， Ｂｉｏｌ， Ｊａｎ ２０１１，１１：３）；錐体アレスチン（ＡＲＲ３）プロモーター（Ｋａｈｌｅ ＮＡ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ， Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１８， ２９（３）：１２１－１３１）、ベータホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）プロモーター；網膜色素変性症（ＲＰ１）プロモーター（Ｎｉｃｏｒｄ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ， Ｄｅｃ ２００７， ９（１２）： １０１５－２３）；ＮＸＮＬ２／ＮＸＮＬ１プロモーター（Ｌａｍｂａｒｄ ｅｔ ａｌ， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ， Ｏｃｔ． ２０１０， ５（１０）：ｅｌ３０２５）、ＲＰＥプロモーター；ｒｅｔｉｎａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｌｏｗ／ｐｅｒｉｐｈｅｒｉｎ ２ （Ｒｄｓ／ｐｅｒｐｈ２）プロモーター（Ｃａｉ ｅｔ ａｌ， Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ． ２０１０ Ａｕｇ；９１（２）： １８６－９４）；ＶＭＤ２プロモーター（Ａｃｈｉ ｅｔ ａｌ， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ２００９ （２０：３－９））、およびＡＢＣＡ４プロモーターまたは少なくとも２つの異なるプロモーターからなる任意のハイブリッドプロモーターを含むが、これらに限定されない。

【0113】

２つの逆方向末端反復の間の核酸配列は、目的の核酸配列の３’側に位置するポリアデニル化シグナル等の終結シグナルをさらに含むことも企図される。プレＲＮＡは内因性プレＲＮＡまたはさらなる組換えプレＲＮＡにトランススプライシングされて、成熟ｍＲＮＡ等の成熟ＲＮＡの５’末端を形成する可能性があるため、目的の核酸配列の３’側に位置するポリアデニル化シグナル等の終結シグナルは任意選択である。しかし、トランススプライシングの有効性は、ポリアデニル化シグナルの存在下でより高いことが示されている。

【0114】

プレＲＮＡを転写するためにプロモーターが必要であるが、核酸配列は必ずしもＡＴＧ（翻訳開始）および／またはコザックコンセンサス配列を必要としない。プレＲＮＡが内因性プレＲＮＡまたはさらなる組換えプレＲＮＡにトランススプライシングされて、成熟ｍＲＮＡなどの成熟ＲＮＡの３’末端を形成しうる場合、ＡＴＧの欠如および／またはコザックコンセンサス配列は、トランススプライシングの前のプレＲＮＡからの望ましくない翻訳を回避するのに有利な場合がある。

【0115】

これらおよび他の一般的なベクターおよび調節エレメントの選択は従来通りであり、そのような配列の多くが利用可能である。たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９を参照されたい。もちろん、すべてのベクターおよび発現調節配列が、本明細書に記載されるように、すべての導入遺伝子を発現するために等しくうまく機能するわけではない。しかしながら、当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、これらおよび他の発現調節配列の中から選択を行うことができる。

【0116】

本発明はまた、以下を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系にも関する：
（Ｉ）これら２つの逆方向末端反復間の核酸配列を含む核酸配列少なくとも２つの逆方向末端反復を含む第一のＡＡＶベクターであって、ここで上記これら２つの逆方向末端反復間の核酸配列が５’から３’に
（ａ）プロモーター、
（ｂ）目的のポリペプチドのＮ末端部分をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）供与スプライス部位；
（ｄ）任意選択でスペーサー配列；
（ｅ）第一の結合ドメイン；および
（ｆ）任意選択で終止配列、好ましくはポリＡ配列；
を含む、第一のＡＡＶベクター、
（ＩＩ）これら２つの逆方向末端反復間の核酸配列を含む少なくとも２つの逆方向末端反復を含む核酸配列を含む第二のＡＡＶベクターであって、
ここで上記これら２つの逆方向末端反復間の核酸配列が５’から３’に
（ｉ）プロモーター；
（ｉｉ）第一のＡＡＶベクターの第一の結合ドメインに相補的な、第二の結合ドメイン；
（ｉｉｉ）任意選択でスペーサー配列、
（ｉｖ）以下を含む受容スプライス領域配列、
（ａ）以下を含むピリミジン域、
（ａａ）５～２５ヌクレオチド；
（ａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；
（ｂ）受容スプライス部位、
（ｂａ）ここで受容スプライス部位はピリミジン域の３’側に位置しており；および
（ｂｂ）ここで受容スプライス部位は、５’から３’にＮＡＧＧの配列を含み、ここでＮはＡ、Ｃ、Ｔ／Ｕ、またはＧである；
（ｖ）目的のポリペプチドのＣ末端部分をコードするヌクレオチド配列；
（ｖｂ）ここで目的のポリペプチドのＣ末端部分および目的のポリペプチドのＮ末端部分は目的のポリペプチドを再構成する；および
（ｖｉ）終止配列、好ましくはポリＡ配列
を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系。

【0117】

したがって、目的のポリペプチドのＣ末端部分は、第一のＡＡＶベクターに含まれるポリペプチドのＮ末端部分から欠損している目的のポリペプチドの部分に対応する。一つの実施形態では、ポリペプチドは完全長ポリペプチドであり、第一のＡＡＶベクターは、目的の完全長ポリペプチドのＮ末端部分を含み、第二のＡＡＶベクターは、目的の完全長ポリペプチドのＣ末端部分を含み、目的の完全長ポリペプチドのＣ末端部分および目的の完全長ポリペプチドのＮ末端部分は、目的のポリペプチドを再構成する。したがって、目的の完全長ポリペプチドのＣ末端部分は、第一のＡＡＶベクターに含まれる完全長ポリペプチドのＮ末端部分から欠損している目的の完全長ポリペプチドの部分に対応する。より具体的には、トランススプライシングに続いて、ｍＲＮＡは、目的のポリペプチドのＮ末端部分および目的のポリペプチドのＣ末端部分を（フレーム内に）コードする配列を含み、ここで、ｍＲＮＡは、目的の（完全長）ポリペプチドをコードし、したがって、目的のポリペプチドが再構成される。

【0118】

特に、ｒＡＡＶまたはＡＡＶベクターゲノムのパッケージング容量には約５ｋｂまでのサイズ制限がある。多くの治療用タンパク質のｃＤＮＡは大きいため、ｒＡＡＶベクターを使用して大きな導入遺伝子を送達する戦略を考案することで、ｒＡＡＶを介した遺伝子治療の臨床応用を大幅に拡大することができる。したがって、一つの実施形態では、目的のポリペプチドは、導入遺伝子によってコードされるポリペプチドである。すでにＡＡＶパッケージング容量を超えている導入遺伝子を提供するために、トランススプライシングアプローチが開発された。簡単に言えば、２つの別々のｒＡＡＶベクターが導入遺伝子の２つの部分を標的細胞に送達する。１つの部分は導入遺伝子の５’部分の３’末端にスプライシング供与シグナルを含み、他の部分は導入遺伝子の３’部分の５’末端にスプライシング受容シグナルを含む。従来の系では、２つのベクターゲノム間の分子間組換えにより、介在するＩＴＲジャンクションまたは組換え遺伝子配列を含む介在配列が生成される。これは、次の工程で、単一のプレｍＲＮＡ分子から細胞のシススプライシング機構によって切り出されて完全な完全長の導入遺伝子カセットを形成する。本発明によるＡＡＶベクター系において、２つのベクターゲノムは別々に転写され、プレｍＲＮＡはそれらの相補的結合ドメインを介して相互作用し、２つのプレｍＲＮＡはトランスでスプライシングされて完全な（完全長の）導入遺伝子転写物を形成する。

【0119】

ベクター系の効率は、（完全長の）目的のタンパク質またはデュアルＡＡＶベクターアプローチによって提供される目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現を測定することによって、たとえば本明細書に記載されているか、または当業者に知られている手段および技術によって、評価することができる。

【0120】

第二の結合ドメインは、第一のＡＡＶベクターの第一の結合ドメインに相補的である。完全な相補性は、好ましいが、要求はされない。本明細書で言及される、第一の結合ドメインの一部に対して「相補的」な配列は、第一の結合ドメインとハイブリダイズして安定な二重鎖を形成することができるのに十分な相補性を有する配列を意味する。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度および核酸の長さの両方に依存する（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｈ， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。したがって、第二の結合ドメインに関して使用される相補性は、第二の結合ドメインが、第一のＡＡＶに含まれる第一の結合ドメインに少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％相補的であり、好ましくは第一のＡＡＶに含まれる第一の結合ドメインに少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％相補的である配列を含むことを意味する。

【0121】

第一の結合ドメインは、配列番号：１７に示される配列、または配列番号：１７の配列に対し６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を有し、または含んでもよい。第二の結合ドメインは、配列番号：１８に示される配列、または配列番号：１８の配列に対し６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を有し、または含んでもよい。当業者は、第二の結合ドメインが第一の結合ドメインに相補的である限り、第一の結合ドメインおよび第二の結合ドメインは交換可能であることを理解するだろう。したがって、第一の結合ドメインは、配列番号：１８に示される配列、または配列番号：１７に対し６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を有し、または含んでもよい。第一の結合ドメインは、配列番号：１７に示される配列、または配列番号：１８に対し６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を有し、または含んでもよい。

【0122】

あるいは、第二の結合ドメインは、配列番号：１８、２７、２８、３２、および３３のいずれか一つの配列、または配列番号：１８、２７、２８、３２、および３３のいずれか一つの配列に対し６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を有し、または含み、第一の結合ドメインは、第二の結合ドメインに相補的な配列、好ましくは第二の結合ドメインに相補的な配列、好ましくは第二の結合ドメインに少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％相補的な配列、より好ましくは第二の結合ドメインに少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％相補的な配列、さらにより好ましくは第二の結合ドメインに９８％、９９％、または１００％相補的な配列を有する、または含む。当業者は、結合ドメインが互いに相補的である限り、第一および第二の結合ドメインが交換されてもよいことを理解するであろう。したがって、第一の結合ドメインは、配列番号：１８、２７、２８、３２、および３３のいずれか一つの配列、または配列番号：１８、２７、２８、３２、および３３のいずれか一つの配列に対して６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を有してもよく、または含んでもよく、第二の結合ドメインは、第一の結合ドメインに対して相補的な配列、好ましくは第一の結合ドメインに少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％相補的な配列、より好ましくは第一の結合ドメインに少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％相補的な配列、さらにより好ましくは第一の結合ドメインに９８％、９９％、または１００％相補的な配列を有する、または含む。

【0123】

さらに、配列番号：２７または２８のヌクレオチド５０～１００が結合ドメインとして有効であることが示されている。したがって、一つの実施形態では、第二または第一の結合ドメインは、配列番号：２７または２８のヌクレオチド５０～１００の配列、または配列番号：２７または２８のヌクレオチド５０～１００の配列に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含む。好ましくは、結合ドメインは、配列番号：２７または２８のヌクレオチド５０～１００の配列、または配列番号：２７または２８のヌクレオチド５０～１００の配列に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含む少なくとも８０ヌクレオチドを有する。当業者は、他の結合ドメインが、それぞれ、第一または第二の結合ドメインに相補的である、好ましくは、それぞれ、第一または第二の結合ドメインに少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％相補的である、より好ましくは、それぞれ第一または第二の結合ドメインに少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％相補的である、さらにより好ましくは、それぞれ第一または第二の結合ドメインにそれぞれ９８％、９９％、または１００％相補的である配列を有する、または含むことを理解するであろう。

【0124】

別の実施形態では、第二または第一の結合ドメインは、配列番号：１８、３２、または３３のヌクレオチド１～５０、または配列番号：１８、３２、または３３のヌクレオチド１～５０に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含む。好ましくは、結合ドメインは、配列番号：１８、３２、または３３のヌクレオチド１～５０、または配列番号：１８、３２、または３３のヌクレオチド１～５０に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含む少なくとも８０ヌクレオチドを有する。当業者は、他の結合ドメインが、それぞれ、第一または第二の結合ドメインに相補的である、好ましくは、それぞれ、第一または第二の結合ドメインに少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％相補的である、より好ましくは、それぞれ第一または第二の結合ドメインに少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％相補的である、さらにより好ましくは、それぞれ第一または第二の結合ドメインにそれぞれ９８％、９９％、または１００％相補的である配列を有する、または含むことを理解するであろう。

【0125】

結合ドメインは、約１５～２５０ヌクレオチドの間、約１５～２００ヌクレオチドの間、約１００～２００ヌクレオチドの間、または５００、４００、３００、または未満を有していてもよい。一つの実施形態では、結合ドメインは、５０～１５０ヌクレオチド、好ましくは８０～１２０ヌクレオチド、さらにより好ましくは９０～１１０ヌクレオチド、または約１００ヌクレオチドを含む。本明細書に記載の結合ドメインはまた、プレｍＲＮＡトランススプライシング分子または本発明による方法において使用することができる。

【0126】

本発明に従って使用される第一および第二の結合ドメインは、ヒト配列または細菌配列等の非ヒト配列に由来していてもよい。治療（特に遺伝子治療）等におけるヒトでの使用では、ヒト細胞でのオフターゲット効果を回避するために、非ヒト配列が好ましい。

【0127】

本明細書に記載の第二のＡＡＶベクターおよび任意選択で第一のＡＡＶベクターは、核酸配列の３’側に位置するポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの終結シグナルを含んでもよい。ポリＡシグナル／配列は当業者に知られており、ＳＶ－４０、ヒトおよびウシを含むがこれらに限定されない多くの好適な種に由来してもよい。「ポリＡ」（Ａ＝アデニル酸）は、プロセスされた転写物のポリアデニル化を可能にするＡＡＵＡＡＡコンセンサス配列を含む核酸配列等、複数のアデノシン一リン酸を含む核酸配列を指す。遺伝子破壊または選択カセット（ＧＤＳＣ）では、ポリＡ配列はレポーターおよび／または選択可能なマーカー遺伝子の下流に位置し、転写産物の終わりをＲＮＡポリメラーゼにシグナル伝達する。ＡＡＶベクターは、配列番号：１６のポリＡ配列、または配列番号：１６に示される配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％の配列同一性を有する配列を含みうることが想定される。

【0128】

本発明のＡＡＶベクターまたは他のベクターは、任意選択で一つまたは複数の転写終結配列、一つまたは複数の翻訳終結配列、一つまたは複数のシグナルペプチド配列、一つまたは複数の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、および／または一つまたは複数のエンハンサーエレメント、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含んでもよい。転写終結領域は、通常、真核生物またはウイルスの遺伝子配列の３’'非翻訳領域から取得できる。転写終結配列は、コード配列の下流に配置して、効率的な終結を提供することができる。シグナルペプチド配列は、たとえば、特定のオルガネラコンパートメントを含む一つまたは複数の翻訳後細胞目的地、またはタンパク質合成および／または活性の部位、さらには細胞外環境への作動可能に連結されたポリペプチドの位置に関与する情報をコードするアミノ末端ペプチド配列である。

【0129】

エンハンサー－遺伝子転写を増加させるシス作用性調節エレメント－は、開示されたＡＡＶベクターまたはベクターの一つに含まれていてもよい。種々のエンハンサーエレメントは当業者に公知であり、ＣａＭＶ ３５Ｓエンハンサーエレメント、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期プロモーターエンハンサーエレメント、ＳＶ４０エンハンサーエレメント、ならびにそれらの組み合わせおよび／またはそれらの誘導体を含むが、これらに限定されない。目的の構造遺伝子によってコードされるｍＲＮＡのポリアデニル化を指示または調節する一つまたは複数の核酸配列もまた、本発明の一つまたは複数のベクターに任意選択でてもよい。

【0130】

開示されたデュアルベクター系は、遺伝子治療および／またはウイルス技術の当業者に知られている方法のいずれか一つまたは複数を使用して、一つまたは複数の選択された哺乳動物細胞に導入されうる。そのような方法は、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、細胞融合、およびリン酸カルシウム沈殿、ならびに微粒子銃法を含むが、これらに限定されない。一つの実施形態では、本発明のベクターは、たとえば、リポフェクション（すなわち、一つまたは複数のカチオン性脂質から調製されたリポソームを介したＤＮＡトランスフェクション）を含む、ｉｎ ｖｉｖｏで導入してもよい。合成カチオン性脂質（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、ラホヤ、カリフォルニア州、米国）を使用して、ベクターをカプセル化し、一つまたは複数の選択された細胞への導入を容易にするリポソームを調製することができる。本発明のベクター系はまた、当業者に知られている方法を使用して、「ネイキッドな」ＤＮＡとしてｉｎ ｖｉｖｏで導入することができる。

【0131】

本発明はまた、本発明の核酸配列および／またはＡＡＶベクターおよび／またはＡＡＶベクター系を含むキットにも関する。

【0132】

本発明はまた、目的の核酸配列を作製する方法にも関し、該方法は以下の工程を含む：
（Ａ）核酸配列を宿主細胞と接触させる工程であって、該核酸配列は以下を含む工程
（ｉ）一つまたは複数の供与スプライス部位配列；
（ｉｉ）以下を含む受容スプライス領域配列
（ａ）以下を含むピリミジン域；
（ａａ）５～２５ヌクレオチド；
（ａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；
（ｂ）受容スプライス部位、
ｂａ）ここで受容スプライス部位はピリミジン域の３’側に位置しており；および
ｂｂ）ここで受容スプライス部位は、５’から３’にＮＡＧＧの配列を含み、ここでＮはＡ、Ｃ、Ｔ／Ｕ、またはＧである；
（ＩＩＩ）目的の核酸配列またはその一部分であって、該目的のヌクレオチド配列またはその一部
（ａ）は供与スプライス部位の３’側および受容スプライス領域の５’側に位置しており；および
（Ｂ）（ｉ）の一つまたは複数の供与スプライス部位配列、および（ｉｉ）の受容スプライス領域で核酸配列を切断し、それによって目的のヌクレオチド配列またはその一部を供与スプライス部位および受容スプライス領域から分離する工程。

【0133】

当業者には知られているように、スプライシングは様々な方法で行われうる。当業者に知られているのは、たとえば、シススプライシングおよびトランススプライシングである。シススプライシングは、シスのＲＮＡ転写産物（ｍＲＮＡまたはその他のＲＮＡ）からイントロン配列を切り出すプロセスである。宿主細胞におけるこのプロセスは核内で起こる。シススプライシングは当業者に知られており、とりわけ「ＤＮＡからＲＮＡへ」という見出しの下にＡｌｂｅｒｔｓ Ｂ， Ｊｏｈｎｓｏｎ Ａ， Ｌｅｗｉｓ Ｊ， ｅｔ ａｌ． （２００２） “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ． ４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ．” ニューヨーク：Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅに記載されている。

【0134】

一般に、疾患の治療（ｔｈｅｒａｐｙ）または治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）または予防は、それを必要とする哺乳動物対象に、有効量のＡＡＶベクター、ＡＡＶベクター系、ベクター、または本明細書に記載の核酸分子、たとえば眼細胞等の対象の標的細胞において遺伝子産物を発現する調節配列の制御下で、目的の導入遺伝子／ヌクレオチド配列またはその断片をコードする核酸配列を保有するプレｍＲＮＡトランススプライシング分子等、および任意選択でさらに薬学的に許容される担体を含む組成物を投与することを含む。

【0135】

本発明は、したがって、本発明に記載のＡＡＶベクター、ＡＡＶベクター系、ベクターまたは核酸配列（たとえば、プレｍＲＮＡトランススプライシング分子）を含む医薬組成物にも関する。そのような医薬組成物は、担体、好ましくは薬学的に許容される担体をさらに含んでもよい。

【0136】

医薬組成物は、注射可能な溶液の形態であってもよい。注射可能な溶液または懸濁液は、マンニトール、１，３－ブタンジオール、水、リンゲル液または等張塩化ナトリウム溶液等の好適な非毒性の薬学的に許容される希釈剤または溶媒、または好適な分散剤または湿潤剤および懸濁剤、たとえば滅菌の、無菌の、合成モノグリセリド、合成ジグリセリド、オレイン酸を含む脂肪酸を含む固定油を使用して、既知の技術に従って製剤化することができる。

【0137】

注射可能な製剤の場合、医薬組成物は、好適なバイアルまたはチューブ内の好適な賦形剤と混合した凍結乾燥粉末にすることができる。クリニックで使用する前に、凍結乾燥粉末を好適な溶媒系に溶解して、静脈内または筋肉内注射、または網膜下、硝子体内または結膜下注射に好適な組成物を形成することにより、薬物を再構成することができる。

【0138】

本発明の医薬組成物は、点眼薬として製剤化／投与されることも想定されている。

【0139】

本発明に記載のＡＡＶベクター、ＡＡＶベクター系、ベクター、または核酸配列（たとえば、プレｍＲＮＡトランススプライシング分子）、または本発明の医薬組成物は、治療有効量で投与することができる。ＡＡＶベクター、ＡＡＶベクター系、プレｍＲＮＡトランススプライシング分子等の核酸配列またはベクターの「治療有効量」は、当業者に明らかであるように、患者の体内の活性化合物の安定性、軽減される状態の重症度、治療される患者の総重量、投与経路、身体による活性化合物の吸収、分配、および排泄の容易さ、治療される患者の年齢および感受性、有害事象等を含むがこれらに限定されない要因によって変化しうる。

【0140】

原則として、本発明のＡＡＶベクター、ＡＡＶベクター系、ベクター、またはプレｍＲＮＡトランススプライシング分子等の核酸配列、または本発明の医薬組成物は、任意の好適な方法で投与することができる。たとえば光受容細胞の標的管使用するための所望のトランス遺伝子（すなわち、目的のヌクレオチド配列）を含む本発明のＡＡＶベクター、ＡＡＶベクター系、ベクター、核酸配列または医薬組成物は、網膜下または硝子体内注射を目的とした医薬組成物に製剤化することができる。本明細書に記載の方法において有用でありうる他の投与形態は、所望の器官への直接送達（たとえば、眼、たとえば点眼薬）、経口、吸入、鼻腔内、気管内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、および他の非経口経路を含むが、これらに限定されない。投与経路は必要に応じて組み合わせることができる。

【0141】

さらに、治療の対象となる特定の眼細胞の領域を特定するために、非侵襲的網膜画像および機能的研究を行うことが望ましい場合もある。

【0142】

本明細書に記載のＡＡＶベクター、ＡＡＶベクター系、ベクター、またはプレｍＲＮＡトランススプライシング分子等の核酸配列、または本発明の医薬組成物は、本明細書に記載されるように、生理学的に許容される担体で対象に投与することができる。医薬組成物中または投与時のＡＡＶの濃度は、１μｌあたり１０Ｅ８～１０Ｅ１２の総ベクターゲノム、好ましくは１μｌあたり６×１０Ｅ８から６×０Ｅ１０の間でありうる。ＡＡＶベクターは、１μｌあたり約１０Ｅ９ベクターゲノムの濃度で投与することもできる。

【0143】

本発明のＡＡＶベクター、ＡＡＶベクター系、ベクター、または核酸配列（たとえば、プレｍＲＮＡトランススプライシング分子）または医薬組成物は、担体で、または他の治療と組み合わせて投与してもよい。したがって、医薬組成物はまた追加的にまたは代替的に一つまたは複数のさらなる活性成分を含んでもよい。

【0144】

本発明の使用のための医薬組成物、ＡＡＶベクター、ＡＡＶベクター系、ベクター、プレｍＲＮＡトランススプライシング分子、または核酸配列は、対象に投与することができる。本明細書に記載のＡＡＶベクター、ＡＡＶベクター系、ベクター、プレｍＲＮＡトランススプライシング分子、核酸配列、または医薬組成物は、ヒト治療および動物用用途の両方に、好ましくは眼疾患の治療、特に眼疾患の遺伝子治療に適用可能である。好適な眼疾患の例は、常染色体劣性重症早発性網膜変性［ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ ｓｅｖｅｒｅ ｅａｒｌｙ－ｏｎｓｅｔ ｒｅｔｉｎａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ］（レーバー先天黒内障）、先天性色覚異常、シュタルガルト病、ベスト病（卵黄様黄斑変性症）、Ｄｏｙｎｅ病（Ｄｏｙｎｅ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、網膜色素変性症（特に、常染色体優性、常染色体劣性、Ｘ連鎖、２遺伝子性または多遺伝子性網膜色素変性症）、（Ｘ連鎖）網膜分離症、黄斑変性症（ＡＭＤ）、加齢性黄斑変性症、萎縮性加齢性黄斑変性症、血管新生ＡＭＤ、糖尿病黄斑症、増殖糖尿病網膜症（ＰＤＲ）、類嚢胞黄斑浮腫、中心性漿液性網膜症、網膜剥離、眼内炎、緑内障、後部ぶどう膜炎、先天性停止性夜盲症、全脈絡膜萎縮、早発性網膜ジストロフィー、錐体ジストロフィー、桿体錐体ジストロフィーまたは錐体桿体ジストロフィー［ｒｏｄ－ｃｏｎｅ ｏｒ ｃｏｎｅ－ｒｏｄ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ］、模様黄斑ジストロフィー［ｐａｔｔｅｒｎ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｅｓ］、アッシャー症候群および他の症候性繊毛関連疾患［ｓｙｎｄｒｏｍｉｃ ｃｉｌｉｏｐａｔｈｉｅｓ］、たとえばバルデ・ビードル症候群、ジュベール症候群、セニオール・ローケン症候群［Ｓｅｎｉｏｒ－Ｌｏｋｅｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ］またはアルストレーム症候群［Ａｌｓｔｒｏｍ ｓｙｎｄｒｏｍｅ］であるが、これらに限定されない。

【0145】

対象は、哺乳動物、または任意の他の脊椎動物である。好適な哺乳動物の例は、マウス、ラット、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ（ｄｏｇ）、ネコ、ウマ、モルモット、イヌ（ｃａｎｉｎｅ）、ハムスター、ミンク、アザラシ、クジラ、ラクダ、チンパンジー、アカゲザル、およびヒトを含むがこれらに限定されず、ヒトが好ましい。他の脊椎動物の例は、ゼブラフィッシュ、サンショウウオ、シチメンチョウ、ニワトリ、ガチョウ、アヒル、コガモ、マガモ、ムクドリ、オナガガモ、カモメ、ハクチョウ、ホロホロチョウ、またはいくつかの例を挙げる水鳥を含むが、これらに限定されない。

【0146】

本発明はまた、光受容体細胞疾患の治療における使用のための本発明のＡＡＶベクター、ＡＡＶベクター系、ベクター、核酸配列（たとえばプレｍＲＮＡトランススプライシング分子）または医薬組成物にも関する。これらの実施形態では、ＡＡＶベクター（たとえばｒＡＡＶ）ＡＡＶベクター、ＡＡＶベクター系、ベクター、核酸配列（たとえばプレｍＲＮＡトランススプライシング分子）、または医薬組成物は治療用ポリペプチドまたはその一部、治療用核酸またはその一部、治療用タンパク質／ポリペプチドまたはその一部、または治療用分子またはその一部をコードする異種核酸である目的のヌクレオチド配列を含んでもよい。

【0147】

非コードＲＮＡ配列を除去するために進化したｍＲＮＡスプライシングと同様に、タンパク質スプライシングとして知られるプロセス中に、不要なタンパク質配列を切除することができる。これに関連して、エクステイン（エクソンのアナログ）と呼ばれるタンパク質断片は、いわゆるインテイン（イントロンのアナログ）の除去時に一緒にスプライシングすることができる。複雑なスプライシング機構を必要とするｍＲＮＡスプライシングとは対照的に、タンパク質スプライシングは自己触媒化学プロセスである。タンパク質のスプライシングは、２つの異なるタンパク質間でも発生する可能性がある。これは、タンパク質のトランススプライシングとして知られるプロセスである。この目的のために、インテインは２つの部分に分割され、これらの各部分は融合されるタンパク質にタグ付けされる。このアプローチは、追加の因子を必要とせずに、２つのタンパク質またはポリペプチドまたはそれらの一部の傷のない融合をもたらす。スプリットインテイン技術は、タンパク質の再構成効率をさらに高めるために、ｍＲＮＡトランススプライシングとさらに組み合わせることができる。したがって、一つの実施形態では、第一の核酸配列または第一のＡＡＶベクターは、目的のポリペプチドのＮ末端部分をコードするヌクレオチド配列の間のインテインのＮ末端部分をコードする核酸配列（または目的の核酸の５’部分）および供与スプライス部位をさらに含み、ならびに第二の核酸配列または第二のＡＡＶベクターは、目的のポリペプチドのＣ末端部分をコードするヌクレオチド配列間のインテインのＣ末端部分をコードする核酸配列（または目的の核酸の３’部分）および受容スプライス領域をさらに含む。

【0148】

本発明のＡＳＳについて記載されたすべての可能な実施形態が、本明細書に記載の方法、プレｍＲＮＡトランススプライシング分子等の核酸配列、キット、ＡＡＶベクター、ＡＡＶベクター系、および使用において必要な変更を加えて使用することができることは明らかである。

【0149】

本発明は、以下の項目によってさらに特徴づけられる：

【0150】

１． 受容スプライス領域の切断によって目的のヌクレオチド配列を受容スプライス領域配列から分離させるための、以下を含む核酸配列の使用
（ｉ）以下を含む受容スプライス領域配列、
（ｉａ）以下を含むピリミジン域、
（ｉａａ）５～２５ヌクレオチド；
（ｉａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；
（ｉｂ）受容スプライス部位、
ｂａ）ここで受容スプライス部位はピリミジン域の３’側に位置しており；および
ｂｂ）ここで受容スプライス部位は、５’から３’にＮＡＧＧの配列を含み、ここでＮはＡ、Ｃ、Ｔ／Ｕ、またはＧである；
（ｉｉ）目的のヌクレオチド配列；ここで目的のヌクレオチド配列は、
（ｉｉａ）スプライス領域の３’側または５’側に局在している。

【0151】

２． 任意選択で受容スプライス領域の切断によって目的のヌクレオチド配列を受容スプライス領域配列から分離させるための、以下を含む核酸配列：
（ｉ）以下を含む受容スプライス領域配列、
（ｉａ）以下を含むピリミジン域、
（ｉａａ）５～２５ヌクレオチド；
（ｉａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；
（ｉｂ）受容スプライス部位、
ｂａ）ここで受容スプライス部位はピリミジン域の３’側に位置しており；および
ｂｂ）ここで受容スプライス部位は、５’から３’にＮＡＧＧの配列を含み、ここでＮはＡ、Ｃ、Ｔ／Ｕ、またはＧである。

【0152】

３． 受容スプライス領域は分岐点ヌクレオチド、好ましくはアデノシンおよび／またはイントロンスプライスエンハンサーをさらに含む、項目１の核酸配列または項目２の核酸配列の使用。

【0153】

４． 受容スプライス領域は分岐点ヌクレオチド配列（ｃ）をさらに含み、分岐点ヌクレオチド配列は、
（ｃａ）１～１５ヌクレオチドを含む；
（ｃｂ）分岐点ヌクレオチド、好ましくはアデノシン（Ａ）を含む；および
（ｃｃ）ピリミジン域および受容スプライス部位の５’側に位置する、
項目１～３のいずれか一つに記載の使用または核酸配列。

【0154】

５． ピリミジン域、受容スプライス領域、および任意でさらに分岐点配列および／またはイントロンスプライスエンハンサーは、全体で約２００、１５０、１０００、５００、２５０、１００、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５以下のヌクレオチド、好ましくは２６ヌクレオチドを含む、項目１～４のいずれか一つに記載の核酸配列の使用または核酸配列。

【0155】

６． （ａ）ピリミジン域の５～２５ヌクレオチドは、ＴＴＴＴＴＴまたはＴＣＴＴＴＴの配列を含む；
（ｂ）ピリミジン域の最後のピリミジンと受容スプライス部位との間の配列は、１０塩基未満、好ましくは５塩基未満、より好ましくは３塩基未満である；および／または
（ｃ）受容スプライス部位は、ＣＡＧＧの配列を有する、
項目１～５のいずれか一つに記載の核酸配列の使用または核酸配列。

【0156】

７． 受容スプライス領域は以下をさらに含む、項目１～６のいずれか一つに記載の核酸配列の使用または核酸配列：
（ａ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも４ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣである；
（ｂ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも５ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣである；
（ｃ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも６ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣである；
（ｄ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも４ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡである；
（ｅ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも４ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡＣである；
（ｆ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも５ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡである；
（ｇ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも５ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡＣである；
（ｈ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも６ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡである；または
（ｉ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも６ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡＣである。

【0157】

８． 受容スプライス領域は配列番号：３または４の配列を有する、項目１～７のいずれか一つに記載の核酸配列の使用または核酸配列。

【0158】

９． 核酸配列は、供与スプライス部位をさらに含む、項目１～８のいずれか一つに記載の核酸配列の使用または核酸配列。

【0159】

１０． 核酸配列はプロモーターをさらに含み、好ましくはここで核酸配列はＤＮＡ配列であり、プロモーターをさらに含む、項目１～９のいずれか一つに記載の核酸配列の使用または核酸配列。

【0160】

１１． 核酸配列は以下を含む、項目１～１０のいずれか一つに記載の核酸配列の使用または核酸配列：
（ｉ）以下を含む受容スプライス領域配列、
（ｉｉａ）以下を含むピリミジン域、
（ｉｉａａ）５～２５ヌクレオチド；
（ｉｉａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；
（ｉｉｂ）受容スプライス部位、
（ｉｉｂａ）ここで受容スプライス部位はピリミジン域の３’側に位置しており；および
（ｉｉｂｂ）ここで受容スプライス部位は、５’から３’にＮＡＧＧの配列を含み、ここでＮはＡ、Ｃ、Ｔ／Ｕ、またはＧである；
（ｉｉ）目的のヌクレオチド配列；ここで受容スプライス領域は目的のヌクレオチド配列の３’側または５’側に局在している；
（ｉｉｉ）目的のヌクレオチド配列の３’側または５’側に局在している、プレｍＲＮＡを標的とする結合ドメイン；および
（ｉｖ）任意選択でスペーサー配列、ここでスペーサー配列は結合ドメインと受容スプライス領域の間に局在している。

【0161】

１２． 核酸配列は以下を含む、項目１～１１のいずれか一つに記載の核酸配列の使用または核酸配列：
（ｉ）以下を含む受容スプライス領域配列、
（ｉａ）以下を含むピリミジン域、
（ｉｉｉａａ）５～２５ヌクレオチド；
（ｉｉｉａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；
（ｉｂ）受容スプライス部位、
（ｉｂａ）ここで受容スプライス部位はピリミジン域の３’側に位置しており；および
（ｉｂｂ）ここで受容スプライス部位は、５’から３’にＮＡＧＧの配列を含み、ここでＮはＡ、Ｃ、Ｔ／Ｕ、またはＧである；
（ｉｉ）目的のヌクレオチド配列；ここで受容スプライス領域は目的のヌクレオチド配列の５’側に局在している；
（ｉｉｉ）目的のヌクレオチド配列の３’側に局在している供与スプライス部位；
（ｉｖ）目的の核酸配列の５’側に位置している、プレｍＲＮＡを標的とする第一の結合ドメイン；
（ｖ）目的の核酸配列の３’側に位置している、プレｍＲＮＡを標的とする第二の結合ドメイン；
（ｖｉ）任意選択で第一のスペーサー配列、ここで第一のスペーサー配列は第一の結合ドメインと受容スプライス領域の間に局在している；および
（ｖｉｉ）任意選択で第二のスペーサー配列、ここで第二のスペーサー配列は第二の結合ドメインと受容スプライス領域の間に局在している。

【0162】

１３． 核酸配列は、少なくとも２つの逆方向末端反復を含み、これら２つの逆方向末端反復間に核酸配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含み、ここで上記核酸配列は５’から３’に
（ｉ）プロモーター；
（ｉｉ）任意選択で結合ドメイン；
（ｉｉｉ）以下を含む受容スプライス領域配列
（ａ）以下を含むピリミジン域、
（ａａ）５～２５ヌクレオチド；
（ａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；
（ｂ）受容スプライス部位、
ｂａ）ここで受容スプライス部位はピリミジン域の３’側に位置しており；および
ｂｂ）ここで受容スプライス部位は、５’から３’にＮＡＧＧの配列を含み、ここでＮはＡ、Ｃ、Ｔ／Ｕ、またはＧである；
（ｖ）目的のヌクレオチド配列；
（ｖｉ）任意選択で終結配列、好ましくはポリＡ配列
を含む、項目１～１２のいずれか一つに記載の核酸配列の使用または核酸配列。

【0163】

１４． 受容スプライス領域はベクター内、ＡＡＶベクター内、またはプレｍＲＮＡトランススプライシング分子内に局在している、項目１～１３のいずれか一つに記載の核酸配列の使用または核酸配列。

【0164】

１５． 受容スプライス領域はトランススプライシングのために使用される、項目１～１４のいずれか一つに記載の核酸配列の使用または核酸配列。

【0165】

１６． 以下を含む、核酸配列の作製方法：
（Ａ）一つまたは複数の供与スプライス部位配列を含む第一の核酸配列を提供する工程；
（Ｂ）以下を含む第二の核酸配列を提供する工程；
（ｉ）以下を含む受容スプライス領域配列、
（ｉａ）以下を含むピリミジン域、
（ｉａａ）５～２５ヌクレオチド；
（ｉａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；
（ｉｂ）受容スプライス部位、
（ｉｂａ）ここで受容スプライス部位はピリミジン域の３’側に位置しており；および
（ｉｂｂ）ここで受容スプライス部位は、５’から３’にＮＡＧＧの配列を含み、ここでＮはＡ、Ｃ、Ｔ／Ｕ、またはＧである；
（ｉｉ）目的のヌクレオチド配列、ここで目的のヌクレオチド配列は
（ｉｉａ）受容スプライス領域の３’側に位置している；および
（Ｃ）核酸配列を得る工程。

【0166】

１７． 以下の工程をさらに含む、項目１６に記載の方法：
（Ｄ）一つまたは複数の供与スプライス部位配列で第一の核酸配列を切断し、受容スプライス部位の第二の核酸配列を切断する工程、
（Ｅ）第一の切断された核酸配列を第二の切断された核酸配列に連結し、それによって核酸配列を得る工程。

【0167】

１８． 第一の核酸配列は目的のヌクレオチド配列またはその一部分をさらに含み、ここで目的のヌクレオチド配列の少なくとも一部分は、供与スプライス部位の５’側に位置しており、ここで第二の核酸配列は目的のヌクレオチド配列またはその一部分をさらに含み、ここで目的のヌクレオチド配列の少なくとも一部分は、スプライス受容スプライス領域の３’側に位置している、項目１６または１７に記載の方法。

【0168】

１９． 第一および第二の核酸配列は宿主細胞に導入され、好ましくは第一および第二の核酸配列は組換え核酸配列である、項目１６～１８のいずれか一つに記載の方法。

【0169】

２０． 以下を含む、核酸配列の作製方法：
（Ａ）一つまたは複数の供与スプライス部位配列を含む第一の核酸配列を提供する工程；
（Ｂ）以下を含む第二の核酸配列を提供する工程；
（ｉ）以下を含む受容スプライス領域配列、
（ｉａ）以下を含むピリミジン域、
（ｉａａ）５～２５ヌクレオチド；
（ｉａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；
（ｉｂ）受容スプライス部位、
（ｉｂａ）ここで受容スプライス部位はピリミジン域の３’側に位置しており；および
（ｉｂｂ）ここで受容スプライス部位は、５’から３’にＮＡＧＧの配列を含み、ここでＮはＡ、Ｃ、Ｔ／Ｕ、またはＧである；
（Ｃ）一つまたは複数の供与スプライス部位配列で第一の核酸配列を切断し、受容スプライス部位の第二の核酸配列を切断する工程、
（Ｄ）第一の切断された核酸配列を第二の切断された核酸配列に連結し、それによって核酸配列を得る工程。

【0170】

２１． 第一の核酸配列は目的のヌクレオチド配列またはその一部分をさらに含み、ここで目的のヌクレオチド配列の少なくとも一部分は、供与スプライス部位の５’側に位置しており、ここで第二の核酸配列は目的のヌクレオチド配列またはその一部分をさらに含み、ここで目的のヌクレオチド配列の少なくとも一部分は、スプライス受容スプライス領域の３’側に位置している、項目１６～２０のいずれか一つに記載の方法。

【0171】

２２． 以下を含む、核酸配列の作製方法または項目１６～２１のいずれか一つに記載の方法：
（Ａ）プレｍＲＮＡトランススプライシング分子配列を含む第一の核酸配列または上記プレｍＲＮＡトランススプライシング分子をコードする核酸配列を宿主細胞に導入する工程であって、ここで第一のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子は５’から３’に以下を含む工程
（ａ）目的のヌクレオチド酸配列の５’部分；
（ｂ）供与スプライス部位；
（ｃ）任意選択でスペーサー配列；
（ｄ）第一の結合ドメイン；および
（ｅ）任意選択で終止配列、好ましくはポリＡ配列、および
（Ｂ）プレｍＲＮＡトランススプライシング分子配列を含む第二の核酸配列または上記プレｍＲＮＡトランススプライシング分子をコードする核酸配列を宿主細胞に導入する工程であって、ここで第二のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子は５’から３’に以下を含む工程；
（ｉ）第一の核酸配列の第一の標的ドメインに相補的な第二の結合ドメイン；
（ｉｉ）以下を含む受容スプライス領域配列；
（ｉｉａ）以下を含むピリミジン域、
（ｉｉａａ）５～２５ヌクレオチド；
（ｉｉａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；
（ｉｉｂ）受容スプライス部位、
（ｉｉｂａ）ここで受容スプライス部位はピリミジン域の３’側に位置しており；および
（ｉｉｂｂ）ここ記受容スプライス部位は、５’から３’にＮＡＧＧの配列を含み、ここで、ＮはＡ、Ｃ、Ｔ／Ｕ、またはＧである；
（ｉｉｉ）目的のヌクレオチド配列の３’部分、および
それにより目的の核酸配列を取得する工程、任意選択で
（Ｃ）供与スプライス部位配列で第一の核酸配列を切断し、受容スプライス部位の第二の核酸配列を切断する工程；および
（Ｄ）目的のヌクレオチド配列の５’部分を含む第一の切断された核酸配列を、目的のヌクレオチド配列の３’部分を含む第二の切断された核酸配列に連結し、それによって目的の核酸配列を得る工程、
をさらに含む。

【0172】

２３． （ａ）ピリミジン域の５～２５ヌクレオチドは、ＴＴＴＴＴＴまたはＴＣＴＴＴＴの配列を含む；
（ｂ）ピリミジン域の最後のピリミジンと受容スプライス部位との間の配列は、１０塩基未満、好ましくは５塩基未満、より好ましくは３塩基未満である；および／または
（ｃ）受容スプライス部位は、ＣＡＧＧの配列を有する、
項目１６～２２のいずれか一つに記載の方法。

【0173】

２４． 受容スプライス領域は以下をさらに含む、項目１６～２３のいずれか一つに記載の方法：
（ａ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも４ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣである；
（ｂ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも５ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣである；
（ｃ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも６ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣである；
（ｄ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも４ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡである；
（ｅ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも４ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡＣである；
（ｆ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも５ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡである；
（ｇ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも５ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡＣである；
（ｈ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも６ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡである；または
（ｉ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも６ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡＣである。

【0174】

２５． 以下を含む核酸配列：
（ｉ）以下を含む受容スプライス領域配列、
（ｉａ）以下を含むピリミジン域、
（ｉａａ）５～２５ヌクレオチド；
（ｉａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；
（ｉｂ）受容スプライス部位、
（ｉｂａ）ここで受容スプライス部位はピリミジン域の３’側に位置しており；および
（ｉｂｂ）ここで受容スプライス部位は、５’から３’にＮＡＧＧの配列を含み、ここでＮはＡ、Ｃ、Ｔ／Ｕ、またはＧである；
（ｉｉ）目的のヌクレオチド配列；ここで目的のヌクレオチド配列は、
（ｉｉａ）受容スプライス領域の３’側または５’側に局在している。

【0175】

２６． 以下を含み：
（ｉ）以下を含む受容スプライス領域配列、
（ｉａ）以下を含むピリミジン域、
（ｉａａ）５～２５ヌクレオチド；
（ｉａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；
（ｉｂ）受容スプライス部位、
（ｉｂａ）ここで受容スプライス部位はピリミジン域の３’側に位置しており；および
（ｉｂｂ）ここで受容スプライス部位は、５’から３’にＮＡＧＧの配列を含み、ここでＮはＡ、Ｃ、Ｔ／Ｕ、またはＧである；
（ｉｉ）目的のヌクレオチド配列；ここで目的のヌクレオチド配列は、
（ｉｉａ）受容スプライス領域の３’側または５’側に局在している；
および任意選択でここで目的のヌクレオチド配列は配列番号：１０のロドプシン遺伝子ではない、および／または配列番号：９のロドプシン遺伝子のエクソン３ではない、および／または配列番号：９のロドプシン遺伝子のエクソン３ではない、および／またはここで目的のヌクレオチド配列は配列番号：９および／または配列番号：１０に示される配列を含まない、核酸配列。

【0176】

２７． 核酸配列は最大１５０ヌクレオチドの長さを有する、項目２５または２６に記載の核酸配列。

【0177】

２８． 核酸配列は、最大５５００ヌクレオチドの長さを有する、項目２５～２７のいずれか一つに記載の核酸配列。

【0178】

２９． （ａ）ピリミジン域の５～２５ヌクレオチドは配列ＴＴＴＴＴＴまたはＴＣＴＴＴＴを含む、および／または（ｂ）ピリミジン域の最後のピリミジンと受容スプライス部位の間の配列は、１０塩基未満、好ましくは５塩基未満、より好ましくは３塩基未満である、項目２５～２８のいずれか一つに記載の核酸配列。

【0179】

３０． 以下を含む受容スプライス領域配列：
（ｉａ）以下を含むピリミジン域、
（ｉａａ）５～２５ヌクレオチド；
（ｉａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；
（ｉｂ）受容スプライス部位、
（ｉｂａ）ここで受容スプライス部位はピリミジン域の３’側に位置しており；および
（ｉｂｂ）ここで受容スプライス部位は、５’から３’にＮＡＧＧの配列を含み、ここでＮはＡ、Ｃ、Ｔ／Ｕ、またはＧである。

【0180】

３１． （ａ）ピリミジン域の５～２５ヌクレオチドは、配列ＴＴＴＴＴＴまたはＴＣＴＴＴＴを含む；
（ｂ）ピリミジン域の最後のピリミジンと受容スプライス部位との間の配列は、１０塩基未満、好ましくは５塩基未満、より好ましくは３塩基未満である；および／または
（ｃ）受容スプライス部位は、ＣＡＧＧの配列を有する、
項目２５～３０のいずれか一つに記載の核酸または受容スプライス領域配列。

【0181】

３２． 受容スプライス領域は、以下をさらに含む、項目２５～３１のいずれか一つに記載の核酸または受容スプライス領域配列：
（ａ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも４ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣである；
（ｂ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも５ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣである；
（ｃ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも６ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣである；
（ｄ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも４ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡである；
（ｅ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも４ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡＣである；
（ｆ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも５ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡである；
（ｇ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも５ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡＣである；
（ｈ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも６ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡである；または
（ｉ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも６ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡＣである。

【0182】

３３． 以下を含む、プレｍＲＮＡトランススプライシング分子：
（ｉ）以下を含む受容スプライス領域
（ｉｉａ）以下を含むピリミジン域、
（ｉｉａａ）５～２５ヌクレオチド；
（ｉｉａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；
（ｉｉｂ）受容スプライス部位、
（ｉｉｂａ）ここで受容スプライス部位はピリミジン域の３’側に位置しており；および
（ｉｉｂｂ）ここで受容スプライス部位は、５’から３’にＮＡＧＧの配列を含み、ここでＮはＡ、Ｃ、Ｔ／Ｕ、またはＧである；
（ｉｉ）目的のヌクレオチド配列またはその一部分；ここで受容スプライス領域は、目的のヌクレオチド配列またはその一部分の３’側または５’側に局在している；
（ｉｉｉ）目的の核酸配列またはその一部分の５’側に局在するプレｍＲＮＡを標的とする結合ドメイン；および
（ｉｖ）任意選択でスペーサー配列、ここで該スペーサー配列は結合ドメインおよび受容スプライス領域の間に局在している。

【0183】

３４． 核酸分子および受容スプライス領域の３’側に供与スプライス部位をさらに含む、項目３３に記載のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子。

【0184】

３５． 以下を含む項目３３または３４に記載のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子：
（ｉ）以下を含む受容スプライス領域
（ｉａ）以下を含むピリミジン域、
（ｉｉｉａａ）５～２５ヌクレオチド；
（ｉｉｉａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；
（ｉｂ）受容スプライス部位、
（ｉｂａ）ここで受容スプライス部位はピリミジン域の３’側に位置しており；および
（ｉｂｂ）ここで受容スプライス部位は、５’から３’にＮＡＧＧの配列を含み、ここでＮはＡ、Ｃ、Ｔ／Ｕ、またはＧである；
（ｉｉ）目的のヌクレオチド配列、ここで受容スプライス領域は、目的のヌクレオチド配列の５’側に局在している；
（ｉｉｉ）目的のヌクレオチド配列の３’側に局在する供与スプライス部位；
（ｉｖ）目的のヌクレオチド配列の５’側に位置しているプレｍＲＮＡを標的とする第一の結合ドメイン；
（ｖ）目的のヌクレオチド配列の３’側に位置しているプレｍＲＮＡを標的とする第二の結合ドメイン；
（ｖｉ）任意選択で第一のスペーサー配列、ここで該第一のスペーサーは第一の結合ドメインおよび受容スプライス領域の間に局在している；
（ｖｉｉ）任意選択で第二のスペーサー配列、ここで該第二のスペーサーは第二の結合ドメインおよび受容スプライス領域の間に局在している。

【0185】

３６． 受容スプライス領域は目的のヌクレオチド配列またはその一部分の５’側に局在している、および結合ドメインは受容スプライス領域の５’側に局在している、項目３３～３５のいずれか一つに記載のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子。

【0186】

３７． 終止配列、好ましくはポリＡ配列をさらに含む、項目３３～３６のいずれか一つに記載のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子。

【0187】

３８． （ａ）ピリミジン域の５～２５ヌクレオチドは、配列ＴＴＴＴＴＴまたはＴＣＴＴＴＴを含む；
（ｂ）ピリミジン域の最後のピリミジンと受容スプライス部位との間の配列は、１０塩基未満、好ましくは５塩基未満、より好ましくは３塩基未満である；および／または
（ｃ）受容スプライス部位は、ＣＡＧＧの配列を有する、
項目３３～３７のいずれか一つに記載のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子。

【0188】

３９． 受容スプライス領域は以下をさらに含む、項目３３～３８のいずれか一つに記載のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子：
（ａ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも４ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣである；
（ｂ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも５ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣである；
（ｃ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも６ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣである；
（ｄ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも４ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡである；
（ｅ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも４ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡＣである；
（ｆ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも５ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡである；
（ｇ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも５ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡＣである；
（ｈ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも６ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡである；または
（ｉ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも６ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡＣである。

【0189】

４０． プロモーターおよび項目３３～３９のいずれか一つに記載のプレｍＲＮＡトランススプライシング分子をコードする配列を含むＤＮＡ分子。

【0190】

４１． 以下を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系：
（Ｉ）これら２つの逆方向末端反復間の核酸配列を含む少なくとも２つの逆方向末端反復を含む第一のＡＡＶベクターであって、ここで上記これら２つの逆方向末端反復間の核酸配列が５’から３’に
（ａ）プロモーター、
（ｂ）目的のポリペプチドのＮ末端部分をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）供与スプライス部位；
（ｄ）任意選択でスペーサー配列；
（ｅ）第一の結合ドメイン；および
（ｆ）任意選択で終止配列、好ましくはポリＡ配列；
を含む、第一のＡＡＶベクター、
（ＩＩ）これら２つの逆方向末端反復間の核酸配列を含む少なくとも２つの逆方向末端反復を含む核酸配列を含む第二のＡＡＶベクターであって、ここで上記これら２つの逆方向末端反復間の核酸配列が５’から３’に
（ｉ）プロモーター；
（ｉｉ）第一のＡＡＶベクターの第一の結合ドメインに相補的な、第二の結合ドメイン；
（ｉｉｉ）以下を含む受容スプライス領域配列、
（ａ）以下を含むピリミジン域、
（ａａ）５～２５ヌクレオチド；
（ａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；
（ｂ）受容スプライス部位、
（ｂａ）ここで受容スプライス部位はピリミジン域の３’側に位置しており；および
（ｂｂ）ここで受容スプライス部位は、５’から３’にＮＡＧＧの配列を含み、ここでＮはＡ、Ｃ、Ｔ／Ｕ、またはＧである；
（ｉｖ）目的のポリペプチドのＣ末端部分をコードする目的のヌクレオチド配列；
（ｉｖａ）ここで目的のポリペプチドのＣ末端部分および目的のポリペプチドのＮ末端部分は目的のポリペプチドを再構成する；および
（ｖ）終止配列、好ましくはポリＡ配列。

【0191】

４２． ポリペプチドは全長ポリペプチドである、および第一のＡＡＶベクターは目的の全長ポリペプチドのＮ末端部分を含む、および第二のＡＡＶベクターは目的の全長ポリペプチドのＣ末端部分を含む、項目４１に記載のＡＡＶベクター系。

【0192】

４３． 目的のポリペプチドのＣ末端部分は、目的のポリペプチドの一部分、任意選択で第一のＡＡＶベクターに含まれるＮ末端部分から欠失している目的の全長タンパク質に対応する、項目４１または４２に記載のＡＡＶベクター系。

【0193】

４４． 第一および第二のＡＡＶベクターは終止配列、好ましくはポリＡ配列を含む、項目４１～４３のいずれか一つに記載のＡＡＶベクター系。

【0194】

４５． これら２つの逆方向末端反復間に核酸配列を含む、少なくとも２つの逆方向末端反復を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、上記核酸配列は５’から３’に
（ｉ）プロモーター；
（ｉｉ）任意選択でスペーサー配列；
（ＩＩＩ）結合ドメイン；
（ｉｖ）以下を含む受容スプライス領域配列
（ａ）以下を含むピリミジン域、
（ａａ）５～２５ヌクレオチド；
（ａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；
（ｂ）受容スプライス部位、
ｂａ）ここで受容スプライス部位はピリミジン域の３’側に位置しており；および
ｂｂ）ここで受容スプライス部位は、５’から３’にＮＡＧＧの配列を含み、ここでＮはＡ、Ｃ、Ｔ／Ｕ、またはＧである；
（ｉｖ）目的のヌクレオチド配列；および
（ｖ）任意選択で終止配列、好ましくはポリＡ配列
を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。

【0195】

４６． （ａ）ピリミジン域の５～２５ヌクレオチドは、配列ＴＴＴＴＴＴまたはＴＣＴＴＴＴを含む；
（ｂ）ピリミジン域の最後のピリミジンと受容スプライス部位との間の配列は、１０塩基未満、好ましくは５塩基未満、より好ましくは３塩基未満である；および／または
（ｃ）受容スプライス部位は、ＣＡＧＧの配列を有する、
項目４１～４５のいずれか一つに記載のＡＡＶベクターまたはＡＡＶベクター系。

【0196】

４７． 受容スプライス領域は以下をさらに含む、項目４１～４６のいずれか一つに記載のＡＡＶベクターまたはＡＡＶベクター系：
（ａ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも４ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣである；
（ｂ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも５ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣである；
（ｃ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも６ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣである；
（ｄ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも４ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡである；
（ｅ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも４ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡＣである；
（ｆ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも５ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡである；
（ｇ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも５ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡＣである；
（ｈ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも６ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡである；または
（ｉ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも６ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡＣである。

【0197】

４８． 以下を含む、受容スプライス領域：
（ｉａ）以下を含むピリミジン域、
（ｉａａ）５～２５ヌクレオチド；
（ｉａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；
（ｉｂ）受容スプライス部位、
（ｉｂａ）ここで受容スプライス部位はピリミジン域の３’側に位置しており；および
（ｉｂｂ）ここで受容スプライス部位は、５’から３’にＮＡＧＧの配列を含み、ここでＮはＡ、Ｃ、Ｔ／Ｕ、またはＧである。

【0198】

４９． 本発明によるベクター、ＡＡＶベクター、またはプレｍＲＮＡトランススプライシング分子における使用のための項目１～４８のいずれか一つに記載の受容スプライス領域。

【0199】

５０． （ａ）ピリミジン域の５～２５ヌクレオチドは、配列ＴＴＴＴＴＴまたはＴＣＴＴＴＴを含む；
（ｂ）ピリミジン域の最後のピリミジンと受容スプライス部位との間の配列は、１０塩基未満、好ましくは５塩基未満、より好ましくは３塩基未満である；および／または
（ｃ）受容スプライス部位は、ＣＡＧＧの配列を有する、
項目４８または４９のいずれか一つに記載の受容スプライス領域配列。

【0200】

５１． 受容スプライス領域は以下をさらに含む、項目４８～５０のいずれか一つに記載の受容スプライス領域配列：
（ａ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも４ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣである；
（ｂ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも５ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣである；
（ｃ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも６ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣである；
（ｄ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも４ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡである；
（ｅ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも４ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡＣである；
（ｆ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも５ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡである；
（ｇ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも５ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡＣである；
（ｈ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも６ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡである；または
（ｉ）配列ＣＡＡＣＧＡＧの少なくとも６ヌクレオチドを有するピリミジン域の５’側の７ヌクレオチド、ここで最初の５’ヌクレオチドはＣＡＡＣである。

【0201】

５２． 本発明による受容スプライス領域、ＡＡＶベクター、ＡＡＶベクター系、ベクター、ＤＮＡ、核酸配列、またはプレｍＲＮＡトランススプライシング分子を含むキット。

【0202】

５３． 以下を含む、目的の核酸配列の作製方法：
（Ａ）核酸配列は以下を含む、核酸配列を宿主細胞に提供する工程
（ｉ）一つまたは複数の供与スプライス部位配列；
（ｉｉ）以下を含む受容スプライス領域配列
（ａ）以下を含むピリミジン域、
（ａａ）５～２５ヌクレオチド；
（ａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；
（ｂ）受容スプライス部位、
ｂａ）ここで受容スプライス部位はピリミジン域の３’側に位置しており；および
ｂｂ）ここで受容スプライス部位は、５’から３’にＮＡＧＧの配列を含み、ここでＮはＡ、Ｃ、Ｔ／Ｕ、またはＧである
（ｉｉｉ）目的のヌクレオチド配列、ここで目的のヌクレオチド配列；
（ａ）は供与スプライス部位の３’側および受容スプライス領域の５’側に位置している；および
（Ｂ）（ｉ）の一つまたは複数の供与スプライス部位配列で、およびＮＡＧＧのスプライス受容配列（部位）のＧとＧの間で核酸配列を切断し、それによって目的のヌクレオチド配列を供与スプライス部位および受容スプライス領域から分離する工程。

【0203】

５４． 以下を含む、目的の核酸配列の作製方法／切断方法：
（ａ）以下を含む核酸配列を提供する工程
（ｉ）以下を含む受容スプライス領域配列
（ｉａ）以下を含むピリミジン域、
（ａａ）５～２５ヌクレオチド；
（ａｂ）ここでこれらの５～２５ヌクレオチド内のヌクレオチドの少なくとも６０％はピリミジン塩基、たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）である；
（ｉｂ）受容スプライス部位、
ｂａ）ここで受容スプライス部位はピリミジン域の３’側に位置しており；および
ｂｂ）ここで受容スプライス部位は、５’から３’にＮＡＧＧの配列を含み、ここでＮはＡ、Ｃ、Ｔ／Ｕ、またはＧである；および
（ｉｉ）目的のヌクレオチド配列、ここで目的のヌクレオチド配列は
（ｉｉａ）スプライス領域の３’側または５’側に位置している；
（ｂ）受容スプライス領域を切断し、それによって目的のヌクレオチド配列を受容スプライス領域配列から分離する工程。

【0204】

５５． 項目１～５４のいずれかに記載の核酸分子、プレｍＲＮＡトランススプライシング分子、ＡＡＶベクター、ＡＡＶベクター系、ベクターを含む医薬組成物。

【0205】

５６． 治療、好ましくは眼疾患の治療における使用のための、項目１～５４のいずれかに記載の核酸分子、プレｍＲＮＡトランススプライシング分子、ＡＡＶベクター、ＡＡＶベクター系、ベクター、ＤＮＡ分子、または医薬組成物。

【0206】

５７． 以下を含む、目的の核酸配列の￥について対象を治療する方法：
（ａ）（それを必要とする）対象に対して（治療有効量の）項目１～５６のいずれかに記載の核酸分子、プレｍＲＮＡトランススプライシング分子、ＡＡＶベクター、ＡＡＶベクター系、ベクター、ＤＮＡ分子または医薬組成物を投与する工程。

【0207】

５８． 医薬の製造のための、項目１～５７のいずれかに記載の核酸分子、プレｍＲＮＡトランススプライシング分子、ＡＡＶベクター、ＡＡＶベクター系、ベクター、ＤＮＡ分子、または医薬組成物。

【0208】

５９． 眼疾患は、常染色体劣性重症早発性網膜変性［ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ ｓｅｖｅｒｅ ｅａｒｌｙ－ｏｎｓｅｔ ｒｅｔｉｎａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ］（レーバー先天黒内障）、先天性色覚異常、シュタルガルト病、ベスト病（卵黄様黄斑変性症）、Ｄｏｙｎｅ病（Ｄｏｙｎｅ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、網膜色素変性症（特に、常染色体優性、常染色体劣性、Ｘ連鎖、2遺伝子性または多遺伝子性網膜色素変性症）、（Ｘ連鎖）網膜分離症、黄斑変性症（ＡＭＤ）、加齢性黄斑変性症、萎縮性加齢黄斑変性症、血管新生ＡＭＤ、糖尿病黄斑症、増殖糖尿病網膜症（ＰＤＲ）、類嚢胞黄斑浮腫、中心性漿液性網膜症、網膜剥離、眼内炎、緑内障、後部ぶどう膜炎、先天性停止性夜盲症、全脈絡膜萎縮、早発性網膜ジストロフィー、錐体ジストロフィー、桿体錐体ジストロフィーまたは錐体桿体ジストロフィー［ｒｏｄ－ｃｏｎｅ ｏｒ ｃｏｎｅ－ｒｏｄ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ］、模様黄斑ジストロフィー［ｐａｔｔｅｒｎ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｅｓ］、アッシャー症候群および他の症候性繊毛関連疾患［ｓｙｎｄｒｏｍｉｃ ｃｉｌｉｏｐａｔｈｉｅｓ］、たとえばバルデ・ビードル症候群、ジュベール症候群、セニオール・ローケン症候群［Ｓｅｎｉｏｒ－Ｌｏｋｅｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ］またはアルストレーム症候群［Ａｌｓｔｒｏｍ ｓｙｎｄｒｏｍｅ］からなる群から選択される、項目１～５８のいずれかに記載の使用のための核酸分子、プレｍＲＮＡトランススプライシング分子、ＡＡＶベクター、ＡＡＶベクター系、ベクター、ＤＮＡ分子、医薬組成物、または方法。

【0209】

本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数の参照を含むことに留意されたい。したがって、たとえば、「試薬」への言及は、一つまたは複数のそのような異なる試薬を含み、「方法」への言及は、本明細書に記載の方法に改変または置換することができる当業者に知られている同等の工程または方法への言及を含む。

【0210】

さらに、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の量または長さ、用量、時間、温度等の測定可能な値を指すときに本明細書で使用する用語「約」は、指定量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、または±０．１％の変動を包含することを意味する。また、本明細書で使用する場合、「および／または」は、関連する列挙された項目、ならびに代替（「または」）で解釈される場合の組み合わせの欠如を指し、および包含する。

【0211】

文脈が明らかに他のことを示さない限り、本明細書に記載の発明の様々な特徴を任意の組み合わせで使用できることを特に意図している。

【0212】

さらに、本発明はまた、本発明の一部の実施形態において、本明細書に記載の任意の特徴または特徴の組み合わせを除外または省略できることを企図する。

【0213】

本開示で引用されているすべての刊行物および特許は、参照によりその全体が組み込まれる。参照により組み込まれた資料が本明細書と矛盾または矛盾する場合、本明細書はそのような資料に優先する。

【0214】

特に明記しない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、一連の要素のすべての要素を指すと理解されるべきである。当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に相当する多くの同等物を認識し、または日常的な実験のみを使用して確認することができるであろう。そのような同等物は、本発明に包含されることを意図している。

【0215】

本明細書および以下の特許請求の範囲を通じて、文脈上別段の定めがない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変形は、記載された整数もしくは工程または整数もしくは工程の群を含むが、任意の他の整数もしくは工程または整数もしく工程の群を除外しないことを意味すると理解される。本明細書で使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、用語「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」で置換することができ、または本明細書で使用される場合、用語「有する」で置換することができる。ただし、本明細書で使用する「からなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｏｆ）」または同等の用語は、以下に定義される「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」を包含し、したがって、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」に置換することができる。

【0216】

本明細書で使用する場合、「からなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｏｆ）」は、特許請求の範囲要素で指定されていない要素、工程、または成分を除外する。本明細書で使用する場合、「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、特許請求の範囲の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない材料または工程を除外するものではない。

【0217】

本発明で使用する配列：

【0218】

１０ヌクレオチドを超える以下の配列が本明細書で参照されている：

【0219】

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

表１： 推定分岐点配列には下線を付し、分岐点には２回下線を付し、太字で示している。ピリミジン領域配列は斜体で示し、受容スプライス部位は太字で示されている。配列番号：９および１０で下線を付しているのは、620T>Gからの突然変異および開始コドンおよび終止コドンである。

【実施例】

【0220】

以下の実施例は、本発明を説明する。これらの実施例は、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。実施例は、例示の目的で含まれており、本発明は、特許請求の範囲によってのみ制限される。

【0221】

材料および方法
細胞培養およびトランスフェクション
ヒト胎児由来腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞（ＤＭＳＺ）を、３７℃および１０％ ＣＯ２でＣＯ₂インキュベーター（Ｈｅｒａｅｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内で、ＤＭＥＭ培地＋ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１ｇ／ｌグルコース＋ピルビン酸塩＋１０％ ＦＢＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）＋１％ ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）で維持した。ＨＥＫ２９３由来Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ （ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｔａｋａｒａ）を、同一の条件下でＤＭＥＭ培地＋ＧｌｕｔａＭＡＸ＋４．５ｇ／ｌグルコース＋１０％ ＦＢＳ＋１％ ペニシリン／ストレプトマイシンで培養した。両方の細胞株を約９０％のコンフルエンスで週に２回継代した。

【0222】

一過性のトランスフェクションはリン酸カルシウム法を使用して行った。この目的のために、細胞を６ｃｍの細胞培養プレートに播種した。ウエスタンブロッティングのためにＳｐＣａｓ９を含むプラスミドをトランスフェクトする場合、１０ｃｍの細胞培養プレートを使用した。細胞を、約７０％の所望のコンフルエンスに達するまで一晩インキュベートした。トランスフェクションミックス成分を、示された順序で１５ｍｌのファルコンチューブに加えた。ボルテックス中に２×ＢＢＳを滴下した。

【0223】

トランスフェクションミックスを室温で３～４分間インキュベートし、培地に滴下した。最初の実験（実施例２、図４）では、細胞を５％ ＣＯ₂設定で２４時間インキュベートし、培地を交換せずに細胞を回収した。最適化されたプロトコル（実施例３、５～８；図９および１１～１４）では、細胞を５％ ＣＯ₂設定で３～４時間インキュベートし、培地を交換して、細胞を１０％ ＣＯ₂で約４８時間維持した。フルオロフォアを含むプラスミドをトランスフェクトした場合、トランスフェクションおよび発現の成功は、ＥＶＯＳ（登録商標）ＦＬ細胞イメージングシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を介して評価した。

【0224】

６６１Ｗ細胞は、Ｍｕａｙｙａｄ Ａｌ－Ｕｂａｉｄｉ教授（ヒューストン大学）から提供された。この細胞株は、マウス網膜腫瘍からクローン化され、錐体光受容体の分子特性を示すことが見出された（ａｌ－Ｕｂａｉｄｉ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。６６１Ｗ細胞を、３７℃および１０％ ＣＯ₂でＣＯ₂インキュベーター（Ｈｅｒａｅｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内で、ＤＭＥＭ培地＋ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１ｇ／ｌグルコース＋ピルビン酸塩＋１０％ ＦＢＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）＋１％ 抗生物質－抗真菌薬で維持した。それらは約９０％のコンフルエンスで週に２回継代された。一過性のトランスフェクションは、上記のリン酸カルシウム法を使用して行った。

【0225】

マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）は、記載されているように生成された（Ｊａｔ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｘｕ， ２００５）。細胞を、３７℃および５％ ＣＯ₂でＣＯ₂インキュベーター（Ｈｅｒａｅｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内で、ＤＭＥＭ培地＋ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１ｇ／ｌグルコース＋ピルビン酸塩＋１０％ ＦＢＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）＋１％ ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）で維持した。それらは約９０％のコンフルエンスで週に１回継代された。ＭＥＦは、ＴｕｒｂｏＦｅｃｔＴＭトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して一過的にトランスフェクトされた。細胞を６ｃｍの細胞培養プレートに播種し、７０～９０％のコンフルエンスに達するまでインキュベートした。反応混合物は以下の順序で調製した。

【0226】

各成分の添加後、溶液をボルテックスにより激しく混合した。トランスフェクションミックスを室温で１５～２０分間インキュベートした後、培養プレートに滴下した。３時間後に培地を交換し、トランスフェクションの４８時間後に細胞を回収した。フルオロフォアを含むプラスミドをトランスフェクトした場合、トランスフェクションおよび発現の成功は、ＥＶＯＳ（登録商標）ＦＬ細胞イメージングシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を介して評価した。

【0227】

組換えアデノ随伴ウイルスの産生
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、目的の遺伝子、ｐＡＤを含むｐＡＡＶ２．１プラスミドの三重リン酸カルシウムトランスフェクションによって産生された。ヘルパープラスミドおよび所望のキャプシドをコードするプラスミド。マウス網膜への網膜下注射のために、光受容体およびＲＰＥの伝達効率が高いため（Ｐｅｔｒｓ－Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ， １７， ４６３－７１）、２／８Ｙ７３３Ｆキャプシドバリアントが選択された。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１５×１５ｃｍ細胞培養プレートに播種し、６０～８０％のコンフルエンスに達するまで一晩インキュベートした。トランスフェクションの前に、ＦＢＳを含む培地を無血清培地に交換した。トランスフェクション試薬を５０ｍｌのファルコンチューブに示された順序で添加した： ｐＡＡＶ２．１プラスミド２７０μｇ、ｐＡＤヘルパープラスミドＸμｇ、キャプシドプラスミドＹμｇ、Ｈ₂Ｏ ａｄ １１．８５ｍｌ、ポリブレン（８ｍｇ／ｍｌ） １５μｌ、デキストラン（１０ｍｇ／ｍｌ） １．５ｍｌ、ＣａＣｌ₂（２．５Ｍ） １．５ｍｌ、２×ＢＢＳ １５ｍｌ。必要な量のｐＡＤヘルパーおよびキャプシドプラスミドは、以下の式を使用して計算された： Ｘμｇ＝２７０μｇ×ｐＡＡＶ２．１のｐＡＤヘルパーＭＭのＭＭ Ｙμｇ＝２７０μｇ×ｐＡＡＶ２．１のキャプシドプラスミドＭＭのＭＭ。ボルテックス中にＣａＣｌ₂および２×ＢＢＳを滴下した。２ｍｌのトランスフェクションミックスを１５枚の培養プレートのそれぞれに滴下した。プレートを穏やかに揺り動かし、続いて５％ ＣＯ₂設定で２４時間置いた。その後、培地を交換し、プレートをさらに４８時間１０％ ＣＯ₂設定に置いた。

【0228】

ウイルスを含む培地を２回回収した。１回目の回収は、すべてのプレートの培地全体を収集し、新鮮な培地を追加することにより、トランスフェクションの７２時間後に行われた。２回目の回収は、さらに７２時間の培養期間の後に行われた。培地を５００ｍｌの遠心分離管に収集した。４，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離し（ＪＡ－１０ローター、Ｊ２－ＭＣ高速遠心分離機、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、０．４５μｍ ＰＥＳフィルターユニット（Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で上清をろ過することにより、残留細胞を培地から除去した。４０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）溶液をフロースルーに添加して、最終濃度を８％にし４℃で一晩保持してウイルス粒子を沈殿させた。続いて、溶液を４，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離した（ＪＡ－１０ローター、Ｊ２－ＭＣ高速遠心分離機、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）。上清を廃棄し、ウイルスを含むペレットをさらに処理するまで－２０℃で保存した。

【0229】

イオジキサノール密度勾配遠心分離では、ペレットを７．５ｍｌの滅菌ろ過ＰＢＳに再懸濁し、残留したパッケージされていないＤＮＡを除去するため、最終濃度５０Ｕ／ｍｌのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）（ＶＷＲ）および３７℃のウォーターバス（Ｈａａｋｅ）で３０分間インキュベートした。次に、ウイルス懸濁液をピペットでクイックシールポリプロピレンチューブ（３９ｍｌ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）に入れ、ウイルス懸濁液よりも低いイオジキサノール濃度の溶液を次の順序で添加することにより、密度勾配を確立した： ７ｍｌの１５％、６ｍｌの２５％、５ｍｌの４０％、および６ｍｌの６０％イオジキサノール溶液。この目的のために、ＭＩＮＩＰＵＬＳ ３蠕動ポンプ（Ｇｉｌｓｏｎ）および長いガラスピペットを使用した。続いて、チューブをベックマンチューブトッパーで密封し、Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－８０Ｋ超遠心分離機（７０ Ｔｉローター、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で７０，０００ｒｐｍ、１８℃で１時間４５分間遠心分離した。その後、空気の流れを確保するために、チューブの上部にカニューレを開けた。ウイルス粒子が豊富な４０％イオジキサノール相を、２０Ｇカニューレおよび２０ｍｌシリンジを使用して、４０％相と６０％相の境界でチューブを横方向に穿刺することにより、グラジエントから収集した。ウイルスを含む溶液を、さらに処理するまで－８０℃で保存した。

【0230】

ウイルスをさらに精製するために、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅｐｌｕｓクロマトグラフィーシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、５ｍｌ ＨｉＴｒａｐＴＭ Ｑ ＦＦ陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、およびＰｒｉｍｅＶｉｅｗ ５．３１ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。開始する前に、カラムをバッファーＡ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５）で平衡化し、ウイルス含有溶液をこのバッファーで１：１の比率で希釈した。溶液をループインジェクター（５０ｍｌ Ｓｕｐｅｒｌｏｏｐ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を介してカラムにロードした。収集した画分のＵＶ光吸収およびコンダクタンス特性をモニターして、含まれているウイルスの量に関する情報を提供した。残りの結合分子は、２．５Ｍ ＮａＣｌ溶液を使用してカラムから除去した。すべてのウイルス含有画分をプールし、その後の処理に使用した。３．５．４ ｒＡＡＶ濃度の増加

【0231】

ウイルス濃度を増加させるために、分子量カットオフが１００ｋＤａのＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ－４遠心分離フィルターユニット（Ｍｅｒｃｋ）を使用した。ウイルス含有溶液をフィルターユニットの上部にロードし、容量が５００μｌに減少するまで、４，０００ｒｐｍ（ＪＡ－１０ローター、Ｊ２－ＭＣ高速遠心分離機、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）および４℃で２０分間隔で遠心分離した。続いて、フィルターユニットを１ｍｌの０．０１４％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳ－ＭＫ（１０×ＰＢＳ ５０ｍｌ、１Ｍ ＭｇＣｌ ５００μｌ、２．５Ｍ ＫＣｌ ５００μｌ、５００ｍｌの水を添加する）で洗浄した。容量が１００μｌの濃縮ウイルス溶液に減少するまで、溶液を同じ条件下でさらに遠心分離した。１０μｌのアリコートを調製し、使用するまで－８０℃で保存した。

【0232】

生成されたｒＡＡＶの力価を決定するために、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してｑＰＣＲを実行した。参照として使用するために検量線を作成した。この目的のために、ＩＴＲの一部を含む断片を以下のプライマーを使用したＰＣＲによって増幅した。
ＩＴＲ２ ｆｏｒｗａｒｄ： ５’ ＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴ ３’ （配列番号：３０）
ＩＴＲ２ ｒｅｖｅｒｓｅ： ５’ ＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡ ３’ （配列番号：３１）

【0233】

次に、増幅産物を精製し、ＮａｎｏｄｒｏｐＴＭ ２０００ｃ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して濃度を決定した。濃度ｃの標準溶液を調製した後、１０¹⁰～１０¹コピーの範囲の希釈系列を作成した。検量線を達成するために、標準希釈系列の３つの技術的複製を使用してｑＰＣＲを実行した。この目的のために、ＭｉｃｒｏＡｍｐ（商標）高速光学９６ウェル反応プレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＰｏｗｅｒＵｐＴＭ ＳＹＢＲＴＭ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。ウイルス溶液をＨ２Ｏで１００倍に希釈し、３回の技術的複製で同じ反応プレート上で行った。反応混合物は以下のように調製した。得られたデータは、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステムソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して分析した。ベースライン設定およびサイクリング閾値位置は、必要に応じて手動で調整した。検量線は、得られたサイクル閾値（Ｃｔ）値を希釈の対数に対してプロットすることによって得られた。生成されたｒＡＡＶのμｌあたりのウイルスゲノム数（ｖｇ／μｌ）は、検量線から推測することができる。

【0234】

網膜下注射
網膜下注射の場合、生後２１日目（Ｐ２１）のＣ５７Ｂｌ６／Ｊマウスを、ケタミン（４０ｍｇ／ｋｇ体重）およびキシラジン（２０ｍｇ／ｋｇ体重）の腹腔内注射によって麻酔した。足引っ込め反射（ｐａｗ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ ｒｅｆｌｅｘ）が完全になくなった後、瞳孔は、アトロピン（1％）およびトロピカミド（０．５％）を含む点眼薬（Ｍｙｄｒｉａｔｉｃｕｍ Ｓｔｕｌｌｎ、Ｐｈａｒｍａ Ｓｔｕｌｌｎ ＧｍｂＨ）の投与によって拡張された。眼底は、手術用顕微鏡（ＯＰＭＩ １ ＦＲ ｐｒｏ、Ｚｅｉｓｓ）を使用して焦点を合わせた。１０１０ ｒＡＡＶ粒子を含む１μｌを、ＮＡＮＯＦＩＬ １０μｌシリンジ（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）および３４ Ｇベベル針（ｂｅｖｅｌｅｄ ｎｅｅｄｌｅ； Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用した１回の注射によって網膜下に注射した。注射された眼は、５ｍｇ／ｇのゲンタマイシンおよび０．３ｍｇ／ｇのデキサメタゾンを含む眼軟膏で処置した。マウスは、麻酔から完全に回復するまで、３７℃の加熱プレート（Ｌｅｉｃａ ＨＩ１１２０、Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上に置いた。注射の２～４週間後、注射されたすべての網膜を採取し、ＲＴ－ＰＣＲ分析または免疫組織化学のために処理した。

【0235】

免疫組織化学
免疫組織化学のために、網膜下注射されたマウスは、頸椎脱臼を介して安楽死させられた。眼を除去し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢ）に入れた。続いて、２１ Ｇカニューレを用いて鋸状縁で眼球を穿刺し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ｐＨ７．４に調整）で５分間固定した。次に、０．１Ｍ ＰＢを含ませたろ紙上の実体顕微鏡（Ｓｔｅｍｉ ２０００、Ｚｅｉｓｓ）の下に眼を配置した。外科用ハサミ（ＳｕｐｅｒＦｉｎｅ Ｖａｎｎａｓ、Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して鋸状縁と一緒に切断することにより、角膜、水晶体、および硝子体を除去した。網膜を含む眼球の残りの部分を４％ＰＦＡで４５分間、室温で固定し、続いて０．１Ｍ ＰＢで５分間３回洗浄した。凍結保存のために、眼球を３０％ショ糖溶液（ｗ／ｖ）に４℃で一晩入れた。

【0236】

翌日、眼球を組織凍結培地（Ｓａｋｕｒａ）に包埋し、培地が固化するまでドライアイス上で冷却した。クリオスタット（Ｌｅｉｃａ ＣＭ３０５０ Ｓ、Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して網膜を１０μｍの厚さのスライスに切断し、コーティングされたガラスオブジェクトスライド（Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓ顕微鏡スライド、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に収集し、－２０℃で保存した。

【0237】

免疫組織化学的染色のために、網膜切片を室温で解凍し、Ｓｕｐｅｒ ＰＡＰ Ｐｅｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｂｌｏｃｋｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）を使用して取り囲んだ。続いて、切片を０．１Ｍ ＰＢで５分間再水和し、４％ＰＦＡで１０分間固定した。切片を０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．４（ＰＢ）で５分間ずつ３回洗浄した後、０．１ＭＰＢ中の一次抗体、５％ ＣｈｅｍｉＢＬＯＣＫＥＲ（Ｍｅｒｃｋ）、および０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含む溶液を適用した。凍結切片を一次抗体溶液とともに４℃で一晩インキュベートした。翌日、網膜を０．１Ｍ ＰＢで５分間３回洗浄し、０．１Ｍ ＰＢ中の二次抗体および２％ ＣｈｅｍｉＢＬＯＣＫＥＲを含む溶液と室温で１．５時間インキュベートした。続いて０．１Ｍ ＰＢで５分間３回洗浄した後、細胞核を５μｇ／ｍｌＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。最後に、切片を０．１Ｍ ＰＢで洗浄し、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ－Ｇ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に包埋し、カバーガラスで覆い、４℃で保存した。

【0238】

共焦点顕微鏡
染色された網膜の画像は、それぞれＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２、Ｃｙ３、およびＣｙ５の励起に適した４０５ｎｍのダイオードならびに５５２ｎｍおよび６３３ｎｍの光ポンピングされた半導体レーザーを備えたＬｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ８倒立共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して得られた。フィルター設定は、それぞれの色素の発光スペクトルに従って選択された。画像は、ＬＡＳ Ｘソフトウェア（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＨＣ ＰＬ ＡＰＯ ４０×／１．３０オイルＣＳ２対物レンズ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびタイプＦ浸漬液（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）でｚスタック（1μｍステップ）として取得された。同じソフトウェアを使用して、最大強度の投影を適用することにより、ｚスタックを２Ｄ画像に凝縮した。画像は、ＩｍａｇｅＪ １．４８ｖソフトウェア（米国国立衛生研究所）でさらに処理された。

【0239】

一過的にトランスフェクトされた生細胞の画像は、それぞれセルリアン、シトリン、およびｍＣｈｅｒｒｙの励起に適した４４８ｎｍ、５１４ｎｍ、および５５２ｎｍの光ポンピングされた半導体レーザーを備えたＬｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ８スペクトル共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して取得した。フィルター設定は、それぞれのフルオロフォアの発光スペクトルに従って選択された。画像は、ＨＣＸ ＡＰＯ ２０×／１．００Ｗ対物レンズ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して取得した。すべての画像はＩｍａｇｅＪ １．４８ｖソフトウェアで処理された。

【0240】

ＲＮＡ抽出
注射された網膜由来のＲＮＡ抽出のために、マウスは頸椎脱臼を介して安楽死させられた。鈍い鉗子を眼の下に置き、滅菌メス（Ｓｗａｎｎ－Ｍｏｒｔｏｎ）を使用して眼球を切開し、鉗子を徐々に上方に動かすことによって網膜を収集した。コンストラクトごとに３つの網膜をプールし、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造元の指示に従って使用してＲＮＡを抽出した。破砕のために、３５０μｌのＲＬＴバッファー（Ｑｉａｇｅｎ、キットに付属）＋３.５μｌのβ－メルカプトエタノール（β－ＭＥ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、少なくとも５回、滅菌シリンジに取り付けられた２０ Ｇの針に通して組織をホモジナイズした。残りの工程はプロトコルに従って行った。ＲＮＡは３０μｌのＲＮＡｓｅフリーＨ２Ｏで溶出した。

【0241】

一過的にトランスフェクトされた細胞由来のＲＮＡ抽出には、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ Ｐｌｕｓ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用した。この目的のために、培地を６ｃｍの培養プレートから除去し、１６ｃｍのセルスクレーパー（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）を使用して細胞をそぎ落とした。細胞を５００μｌの培地に２ｍｌのセーフロックチューブ（エッペンドルフ）に回収し、３，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを６００μｌのＲＬＴ Ｐｌｕｓバッファー（Ｑｉａｇｅｎ、キットに付属）＋６μｌのβ－ＭＥ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に再懸濁した。鋼のボールを各チューブに入れ、ミキサーミルＭＭ４００（Ｒｅｔｓｃｈ）を使用して３０Ｈｚで１分間細胞を破砕した。その後、ボールを取り除き、懸濁液を２１，０００×ｇおよび室温で５分間遠心分離した。残りの工程は、ｇＤＮＡエリミネータースピンカラムを介してゲノムＤＮＡを除去するオプションの工程を含むプロトコルに従って行った。ＲＮＡは３０μｌのＲＮＡｓｅフリーＨ２Ｏで溶出した。

【0242】

ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏｄｒｏｐＴＭ ２０００ｃ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。ＲＮＡは、さらに使用するまで氷上に保持するか、短期保存の場合は－２０℃、長期保存の場合は－８０℃で保存した。

【0243】

ｃＤＮＡ合成
ｃＤＮＡ合成のために、Ｒｅｖｅｒｔ Ａｉｄ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）は、製造元の指示に従って使用した。実験ごとに等量のＲＮＡを使用した。ｃＤＮＡ反応ミックスをＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ（登録商標）ネクサスグラジエントでインキュベートした。ｃＤＮＡは、さらに使用するまで氷上に保持するか、短期保存の場合は－２０℃、長期保存の場合は－８０℃で保存した。

【0244】

逆転写ＰＣＲ
逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）は、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ ｆｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＶＷＲ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＶＷＲ）を使用して行った。

【0245】

分岐点解析
Ｎｅｓｔｅｄ Ｌａｒｉａｔ ＲＴ－ＰＣＲの場合、ＲＮＡは上記のように抽出された。製造元の指示に従って、１０μｇのＲＮＡをＲＮａｓｅ Ｒ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）とインキュベートし、非環状ＲＮＡをすべて除去した。その後のｃＤＮＡ合成（Ｒｅｖｅｒｔ Ａｉｄ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、上記のように行った。この反応では、ランダムヘキサマープライマーのみを使用しました。次に、ラリアットは、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ ｆｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用したｎｅｓｔｅｄ ＲＴ－ＰＣＲによって増幅された。１回目の増幅では、３．１２に記載されているように反応ミックスを調製した。２回目の増幅では、ｃＤＮＡの代わりに５μｌの最初のＰＣＲを反応ミックスに添加した。さらに、第一のプライマーペアの２５～３０ｂｐ下流に結合する第二のプライマーペアを使用した。適用されたサイクリング条件を表１１に示す。

【0246】

ＴＯＰＯクローニングおよびラリアット分析では、ｎｅｓｔｅｄ ＲＴ－ＰＣＲの産物をプラスミドにサブクローニングした。この目的のために、１ユニットのＴａｑポリメラーゼ（ＶＷＲ）をＰＣＲ反応とともに７２℃で１０分間インキュベートすることにより、増幅後に３’－アデニンオーバーハングをＤＮＡ断片に追加した。続いて、ラリアットを製造元の指示に従ってＴＯＰＯベクター（ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にサブクローニングした。プラスミドをバクテリアに形質転換し、小規模なプラスミド調製を行った。得られたプラスミドの配列を決定し（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、得られたラリアット配列を、ＤＮＡＭＡＮソフトウェア（Ｌｙｎｎｏｎ Ｂｉｏｓｏｆｔ）を使用して調べたイントロンとアラインメントすることにより分析した。

【0247】

タンパク質抽出
タンパク質抽出のために、培地を６ｃｍまたは１０ｃｍの培養プレートから除去した。１６ｃｍのセルスクレーパー（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）を使用して細胞をそぎ落とし、５００μｌの培地に２ｍｌのセーフロックチューブ（エッペンドルフ）に回収した。細胞懸濁液を３，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを１５０μｌおよび２５０μｌのＴｒｉｔｏｎＸ－１００（ＴＸ）溶解バッファー（２．５ｍｌ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１５ｍｌ ５ｍＭ ＮａＣｌ ｍｌ、０．４ｍｌ ２．５Ｍ ＣａＣｌ₂、５００ｍｌ水を添加する； ｃ０ｍｐｌｅｔｅ（商標） ＵＬＴＲＡプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ）を使用直前に６ｃｍおよび１０ｃｍプレートにそれぞれ添加した（１錠／１０ｍｌ））。鋼のボールを各セーフロックチューブに加え、ミキサーミルＭＭ４００（Ｒｅｔｓｃｈ）を使用して３０Ｈｚで１分間細胞を破砕した。その後、ボールを含むチューブを４℃で２０分間逆さまに回転させた（VWRTMチューブローテーター）。続いて、ボールを取り出し、ライセートを５，０００×ｇで１０分間、４℃Ｃで遠心分離した。タンパク質を含む上清を新しい反応チューブに移し、－２０℃で保存した。

【0248】

総タンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイを使用して定量された。５μｌのタンパク質溶解物を９５μｌの０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液と混合し、ＰＭＭＡ標準ディスポーザブルキュベット（ＢＲＡＮＤ）に移動した。続いて、１ｍｌのクマシーブルー溶液を添加し、ピペッティングにより完全に混合し、室温で２分間インキュベートした。ＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（エッペンドルフ）を使用して、５μｌのＴＸ溶解バッファーを含むブランク対照に対して溶液の吸収を測定した。得られた値は、５μｌのライセートに含まれるタンパク質の総量を表す。

【0249】

実施例１：最適化されたＡＳＳモジュールの識別
ｍＲＮＡスプライシングに対する疾患関連ロドプシン変異の影響は、ＨＥＫ２９３細胞および形質導入されたマウス光受容体におけるヒトロドプシン（ＲＨＯ）ミニ遺伝子を使用して分析されている。その中で、ＲＨＯ遺伝子のエクソン３に１つの変異（ｃ．６２０Ｔ＞Ｇ）があり、これが新しいＡＳＳを生み出している（図１）。ＡＳＳの配列および予測されたＡＳＳエレメントを図２ＡおよびＢに示す。

【0250】

ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ予測は、ｃ．６２０Ｔ＞Ｇ変異によって形成された受容スプライス部位（以下、ＡＳＳ_６２０と呼ぶ）が、エクソン３のネイティブロドプシン受容スプライス部位と同様のスプライススコアを有することを示した（図３Ａを参照）。これは、両方のスプライス部位がスプライシング機構によって代替的に使用できることを示唆している。しかし、実験データは、ＡＳＳ＿６２０がＨＥＫ２９３細胞（図１Ｄ）およびマウス光受容体（図１Ｅ）の両方で排他的に使用されたことを示した。これは、ＡＳＳ＿６２０が強力な受容スプライス部位であることを示している。

【0251】

生物工学的用途での有望な使用法については、ＡＳＳの強度および機能は遺伝子環境から独立している必要がある。ＡＳＳ＿６２０が別の非ネイティブ環境で機能するかどうかを試験し、最も効率的なスプライシングに必要なＡＳＳ＿６２０エレメントを決定するために、ｃ．６２０Ｔ＞Ｇ変異に隣接する可変長の配列をＲＰＳ２７遺伝子のエクソン３に導入した（図２Ｃ）。単一の配列により、ＡＳＳ＿６２０の位置でスプライシング効率が変動した（図２Ｄ）。最高のスプライシング効率（１００％に近い）は、ＲＰＳ２７ミニ遺伝子を含むＲＨＯ－Ｅ３ｄ、すなわち、５’末端に７ｂｐの配列からなる２６ｂｐの配列（ＣＡＡＣＧＡＧＴＣＴＴＴＴＧＴＣＡＴＣＴＡＣＡＧＧＴ；配列番号３）、ポリ微塵行き、および標準的なＡＳＳを含むミニ遺伝子を使用した場合に得られた。驚くべきことに、この配列は、ＲＨＯエクソン３に存在する予測分岐点が含んでいなかった。５’末端の７ｂｐ配列（ＣＡＡＣＧＡＧ）は、現在特性が明らかにされていない有効な分岐点配列、またはＡＳＳの効率的な使用に必要なイントロンスプライスエンハンサー認識部位を含む可能性がある。２６ｂｐの配列（配列番号：３）は、本明細書では「ｖｇＡＳＳ＿６２０」と呼ばれる。

【0252】

ｖｇＡＳＳ＿６２０のスプライシング効率をさらに確認するために、ランダムに選択された、受容スプライス部位の強度が可変である４つの追加遺伝子（ＨＢＱ１、Ｓ１００Ａ１２、ＣＬＲＮ１、およびＣＮＧＢ１）に導入された（図３Ｃ）。ｖｇＡＳＳ＿６２０と比較して、ネイティブエクソン受容スプライス部位の予測強度は、ＲＰＳ２７の場合に高く、Ｓ１００Ａ１２、ＣＬＲＮ１、およびＨＢＱ１の場合と同様であり、ＣＮＧＢ１の場合に低くなった（図３Ａ）。その後のＲＴ－ＰＣＲ実験では、ｖｇＡＳＳ＿６２０がＲＰＳ２７でのみ使用されるだけでなく、ここで試験されたすべての追加遺伝子でも使用されることが示された（図３Ｄ～Ｅ）。これらの結果は、ｖｇＡＳＳ＿６２０が遺伝子環境に依存しない非常に強力な受容スプライス部位であることを示している。したがって、ｖｇＡＳＳ＿６２０を利用して、ＳＭａＲＴまたはデュアルアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターハイブリッド技術における現在かなり低いトランススプライシング効率を改善できるとの仮説が立てられた。

【0253】

実施例２：ｉｎ ｖｉｔｒｏ用途のためのセルリアンレポーターアッセイ
この仮説を試験するために、セルリアンのコード配列を人工イントロンによって中断された２つの人工エクソンに分割することにより、スプライスレポーターアッセイが生成された（図４Ｄ）。このイントロンは、ｖｇＡＳＳ＿６２０、および人工的な１４５ｂｐで互いに分離された強力な供与スプライス部位を含んでいた。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の共焦点イメージングにより、両方のスプライス部位がシスで提供された場合、強力で（ｓｔｒｏｎｇ）強力な（ｒｏｂｕｓｔ）セルリアン蛍光が明らかになった（図４Ｆ（ｃ１））。ＲＴ－ＰＣＲ実験および対応するバンドのシーケンシングにより、この構成では両方のセルリアンエクソンが効率的にスプライシングされていることが確認された（データは示していない）。図４Ｇに示すように、セルリアンのＮ末端部分に対する特異抗体を使用したウエスタンブロッティング実験は、予想されるサイズ（２７ｋＤａ）で特異的な免疫シグナルを検出した。まとめると、これらの発見は、レポーターアッセイが機能的であり、シス配置において非常に効率的であることを示唆している。したがって、その後の実験では、この構築物を参照として使用して、２つのセルリアンスプライス断片がトランスで（つまり、別々のプラスミドで）提供された場合のセルリアン再構成効率を決定した。この実験で使用されたＤＳＳは、ＡＡＧＧＴＡＡＧの配列を有する。

【0254】

次に、セルリアン再構成効率に対する結合ドメインおよび受容スプライス部位強度の影響を、レポーターアッセイを使用して分析した。ここで、レポーターの再構成には、ｍＲＮＡトランススプライシングが必要である。

【0255】

この目的のために、シアン蛍光タンパク質「セルリアン」のコード配列が１５４位で再び２つに分割された蛍光レポーターベースのアッセイが開発された（図４Ｄ）。図４Ｄ（ｃ３）に示すように、ＣＭＶプロモーターの制御下にある５’部分を含む第一のＤＮＡ構築物は、強力なＤＳＳ（ＡＡＧＧＴＡＡＧ）およびそれに続く結合ドメインをさらに備え、ＣＭＶプロモーターの制御下にある３’部分を含む第二のＤＮＡ構築物は第一のＤＮＡ構築物の結合ドメインに相補的な結合ドメインに続くＡＳＳとしてｖｇＡＳＳ＿６２０がを備えていた。転写後、ＢＤの塩基対形成により、スプライシングエレメントが近接し、トランススプライシングが容易になり、完全長の成熟セルリアンｍＲＮＡが得られる。セルリアンの再構成は、光学的に、たとえば、顕微鏡検査（図４Ｆのように）またはフローサイトメトリーによって、ｍＲＮＡレベル（たとえば、ＲＴ－ＰＣＲを使用）またはタンパク質レベル（たとえば、図４Ｇのようにウエスタンブロットを使用し）で検出することができる。

【0256】

結合ドメインの最適化のための例示的なテンプレートとして、ヒトロドプシン遺伝子のイントロン２が２つの理由で選択された： （１）ｃ．６２０Ｔ＞Ｇスプライス変異はエクソン３に局在しているため、最適化されたタイプのＲＨＯイントロン２結合ドメインをｃ．６２０Ｔ＞Ｇスプライス変異のＳＭａＲＴベースの置換に使用できる（図１）。 （２）ＲＨＯイントロン２配列は、マウスゲノム内のどの配列とも相同ではないため（データは示していない）、オフターゲット効果を引き起こすとは予想されていない。その結果、最適化されたＲＨＯイントロン２結合ドメインは、デュアルＡＡＶベクターアプローチを使用して、マウス網膜内の他の大きなヒト遺伝子の再構成にも利用できる。

【0257】

ＨＥＫ２９３細胞は、上記のように第一および第二のＤＮＡ構築物で一過性にコトランスフェクトされ、図４Ｄ（ｃ３）のＢＤ＿ｈ＋ｉの例として示され、セルリアン蛍光の存在が共焦点生細胞イメージングによって評価された。同じスプライシングエレメントを含む人工イントロンが介在するシスの両方のセルリアン部分を含む構築物を、シススプライシング参照対照（ｃｉｓ－ｃｔｒｌ）として使用した。２つの半分を別々にトランスフェクトした場合、蛍光は検出できなかった。両方の構築物をコトランスフェクトすると、蛍光細胞が観察され、セルリアンコード配列のトランススプライシングと再構成が成功したことを示している。

【0258】

ＲＨＯイントロン２結合ドメインは、そのサイズと位置を変えることによって最適化された（図４Ａ）。さらに、人工ＢＤは、ＢＤ＿ｈ＋ｉと同様に、イントロンの５’および３’末端に由来する配列を融合することによって作成および試験された。

【0259】

ＨＥＫ２９３細胞のコトランスフェクトに続いて、５’構築物のプライマーｐ１およびｐ２ならびに３’構築物のプライマーｐ３およびｐ４を使用して、プレｍＲＮＡレベルでの小さな差のみを示し、ハウスキーピング遺伝子ＡＬＡＳと比較して２つの構築物のｍＲＮＡ発現を分析した（図４ＢおよびＣ）。再構成効率は、ｃｉｓ－ｃｔｒｌと比較したセルリアンタンパク質バンドの放射分析によって決定され、さまざまなＢＤを使用して大きく変化した（図４Ｅ）。すべてのタンパク質バンドは、定量化の前にベータチューブリンに正規化された。２つの結合ドメインＢＤ＿ｇ（配列番号：２７）およびＢＤ＿ｈ＋ｉ（配列番号：２８）は、両方とも長さが約１００ｂｐであり、＞３０％に達する高いセルリアン再構成効率をもたらした。重要なことに、この高効率は、ゲノムレベルでの分割遺伝子の再構成に基づく代替アプローチ（ハイブリッド、オーバーラップ、およびゲノム「トランス」スプライシングアプローチ）を使用した以前の研究から知られているものをはるかに上回った（Ｃａｒｖａｌｈｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１７， Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， １１， Ａｒｔｉｃｌｅ ５０３）。３つの戦略はすべて、レポーター遺伝子ｌａｃＺを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで試験されました。この設定でレポートされた最高の再構成効率は１７．７％であった。

【0260】

最近の研究では、トランススプライシングの効率はスプライス部位の強度に影響されないと仮定されている（Ｌｏｒａｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。この仮定を試験するために、ｖｇＡＳＳ＿６２０のセルリアン再構成効率を、最も効率的な結合ドメインＢＤ＿ｈ＋ｉ（配列番号：２８）と組み合わせたＲＨＯエクソン３のネイティブ受容スプライス部位と比較した。図４Ｅからわかるように、ｖｇＡＳＳ＿６２０と比較して、ネイティブＡＳＳに由来する再構成効率は著しく低かった（３５．７±４．６％対０．７±０．１％）。この知見は、デュアルベクターアプローチにおけるトランススプライシング効率が受容スプライス部位の強度に強く依存するという明確な証拠を提供する（図４Ｄ～Ｇ）。

【0261】

再構成効果は、後の実験で増加する可能性がある（たとえば、実施例３、図９Ｄを参照）。まず第一に、独立したサンプルの数（ｎ）は、最初の実験ではまだ非常に少ない。独立したサンプルの数（ｎ）を増やし、トランスフェクションプロトコルを最適化することにより、再構成効率をより確実に定量することができ、そしてコトランスフェクト効率の向上によって６０％またはさらに高い再構成効率（図９）等のより高い値に達することができる。

【0262】

ＨＥＫ２９３細胞に加えて、トランススプライシングの再構成効果も６６１Ｗ細胞およびＭＥＦ細胞で試験されている。結合ドメインを使用すると、６６１Ｗ細胞で＞４０％、ＭＥＦ細胞で＞５０％のＢＤ＿ｇ再構成効果が観察された（データは示していない）。２つの細胞株を比較した場合、トランススプライシング効果に有意差は検出できなかった。これは、ｍＲＮＡトランススプライシングアプローチが細胞型に依存しないことを示唆している。

【0263】

まとめると、ｉｎ ｖｉｔｒｏの結果は、結合ドメインの配列および長さを変えることによってだけでなく、受容スプライス部位の強度を最適化することによっても、トランススプライシング効率を著しく増加させることができることを示している。これらの有望な知見は、トランススプライシングベースの技術をさらに最適化するための新しい道を開く。

【0264】

ｖｇＡＳＳ＿６２０と組み合わせて、図４に示す結合ドメイン「ｇ」を使用して、エクソン３内またはその下流のロドプシン変異のＳＭａＲＴベースの遺伝子治療アプローチを確立することができる。さらに、ｖｇＡＳＳ＿６２０を他の様々な結合ドメインと組み合わせて、ＳＭａＲＴまたはデュアルＡＡＶベクターアプローチを介して他の遺伝性網膜疾患（ＩＲＤ）遺伝子を治療することもできる。本明細書で提供される開示は、その天然に存在する状況とは別に（すなわち、ｃ．６２０Ｔ＞Ｇ変異を有する患者におけるロドプシン遺伝子とは別に）、ｖｇＡＳＳ＿６２０スプライスモジュールを含む任意のＤＮＡまたはＲＮＡ配列の使用に適用される。配列番号：３のｖｇＡＳＳ＿６２０または配列番号：３に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列は、以下の用途に使用することができる：
１）ミニ遺伝子のデザイン（たとえば、ｍＲＮＡスプライシングの変異の解析のため）
２）（たとえば、ＳＭａＲＴ技術を使用して）生物学的または治療的文脈で内因性ｍＲＮＡを標的にする
３）トランスでの２つのｍＲＮＡ断片の再構成。これは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの限られたゲノムパッケージング容量（約５．０ｋｂ、好ましくは＜４．７ｋｂ）を克服する上で特に重要である。図５～８は、本明細書に記載のデュアルＡＡＶベクター系で使用することができるＡＡＶベクターの配列を示す。
４）弱いＡＳＳ部位を含む選択的スプライシング遺伝子における特定のスプライス産物の存在を選択的に増加させるための遺伝子発現またはターゲティングカセットの設計。

【0265】

実施例３：再構成効果に対する受容スプライス部位および結合ドメイン（ＢＤ）の影響。
ＢＤの長さおよび配列は、再構成効率の重要な決定要因を表している。ＢＤは、ｍＲＮＡの緊密な結合、および場合によってはフォールディングに影響を与える可能性が最も高いが、後続のスプライシングプロセスの効率または精度を直接促進することは期待されていない。上記のように、ＤＳＳは十分に特性が明らかにされており、その強度の予測は実験性能とよく一致している。したがって、分割フルオロフォア再構成アッセイの枠組みにおいて、このスプライス部位を最適化する必要は明らかではない。対照的に、それらの複雑さのために、ＡＳＳの強度は確実に予測することができない。結果は、ｖｇＡＳＳ＿６２０が非常に強力な受容スプライス部位であることを示唆している。スプライス部位の強度が分割フルオロフォアアッセイの再構成効率に影響を与える可能性があることを考えると、ｖｇＡＳＳ＿６２０は、他の受容スプライス部位と比較した場合に高い値をもたらすはずである。

【0266】

これを分析するために、ｖｇＡＳＳ＿６２０または他の２つのＡＳＳ、すなわちＲＨＯエクソン３のネイティブＡＳＳ（Ｓ３、図９）およびｖｇＡＳＳ＿６２０のポリピリミジン域（ＰＰＴ）をネイティブＲＨＯエクソン３ＡＳＳのＰＰＴで置換することによって作成されたハイブリッドＡＳＳ（Ｓ２）の存在下での再構成効率を比較した。さらに、各ＡＳＳを、３つの異なる結合ドメインと組み合わせた： この研究に由来する強い（ＢＤ＿ｇ、Ｂ１；配列番号：２７）および弱い（ＢＤ＿ｆ、Ｂ３）結合ドメイン、およびＲＨＯイントロン１（配列番号：２９）から得られた公開されたＢＤ配列（ＰＴＭ１、Ｂ２）。この配列は、スプライソソームを介したｍＲＮＡトランススプライシングを介した変異ＲＨＯ転写物の修復に高い効率をもたらすことが示された（Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， “Ｒｅｐａｉｒ ｏｆ ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ ｍＲＮＡ ｂｙ ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＲＮＡ ｔｒａｎｓ－ｓｐｌｉｃｉｎｇ： Ａ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ”， （２０１５） Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． ２３（５）：９１８－９３０）。すべての組み合わせは、共焦点生細胞イメージング、ＲＴ－ＰＣＲ、およびウエスタンブロッティングによって分析された（図９）。この実験の結果、いくつかの重要な知見が得られた。まず、ＢＤおよびＡＳＳの両方が再構成効率を決定する重要な要素であることを明らかにした。第二に、この研究で特定された最も強力なＢＤ（ＢＤ＿ｇ、Ｂ１）は、公開されているＲＨＯ結合ドメイン（Ｂ２）よりも優れている。第三に、最強のＢＤと最強のＡＳＳを組み合わせると（Ｂ３＋Ｓ１）、検出可能なトランススプライシングが得られるのに対し、最強のＢＤと最弱のＡＳＳ（ Ｂ１＋Ｓ３）は、コード配列の検出可能な再構成を引き起こさない。

【0267】

ｖｇＡＳＳ＿６２０は、ＡＳＳ、ＰＰＴ、および上流の追加の７ｂｐ配列でからなり、これらを削除するとＡＳＳ＿６２０の認識が損なわれる。したがって、この７ｂｐの配列には、遺伝子環境に依存しないｖｇＡＳＳ＿６２０の普遍的かつ効率的な認識を説明する可能性のある非常に強力な分岐点を含む可能性があると推測されている。しかし、この配列内で予測される強力な分岐点はなかった。代わりに、他のいくつかの配列は、ｃ．６２０Ｔ＞ＧＡＳＳの最大４０ｂｐ上流に配置された分岐点として機能すると予測された。それにもかかわらず、ＰＰＴの上流の７ｂｐ配列に含まれるすべての予測分岐点ヌクレオチドおよびすべての可能性のある分岐点アデニンを同時に変異させると、ｃ．６２０Ｔ＞Ｇ変異体のスプライシングを変更できなかった（データは示していない）。この知見は、分岐点が他の場所にあるか、ｃ．６２０Ｔ＞ＧＡＳＳが分岐点の選択において高い柔軟性を持っていることを示している。ｃ．６２０Ｔ＞ＧＡＳＳでのスプライシングに利用される分岐点をより直接的に特定するために、ＲＨＯ ｃ．６２０Ｔ＞Ｇミニ遺伝子を一過的に発現するＨＥＫ２９３細胞を使用してネストされたラリアットＲＴ－ＰＣＲを実行した。ＲＨＯ ＷＴミニ遺伝子でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞が参照として機能した。ラリアットＲＴ－ＰＣＲを実行すると、ＷＴと変異ミニ遺伝子でそれぞれ１つのバンドが得られ、どちらもサイズが異なった。両方のバンドはやや拡散しているように見え、対応するラリアットのサイズが異なることを示唆していた。これらの拡散バンドに含まれる単一の配列を特定するために、ラリアットＲＴ－ＰＣＲ産物をＴＯＰＯベクターにサブクローニングし、得られたクローンをシーケンシングによって個別に分析した。ＲＨＯ ＷＴラリアットを研究すると、２つの主要な分岐点（４２％および３３％のケースで使用）および３つのマイナーな分岐点（それぞれ８％のケース）が特定された（表２）。２つの主要な分岐点はコンセンサス配列に非常に類似しており、高い予測スコアが得られた。すべてのＲＨＯ ＷＴ分岐点は、イントロン－エクソンジャンクションの５７～１８４ｂｐ上流で見出された。ヒトの分岐点の９０％以上がＡＳＳ配列の５０ｂｐ上流にあるため、ＲＨＯエクソン３のｍＲＮＡスプライシングは特殊なようである（Ｃｏｒｖｅｌｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ． Ｂｉｏｌ．， ６（１１）： ｅ１００１０１６）。

【0268】

【表2】

【0269】

それにもかかわらず、ＷＴミニ遺伝子と比較した場合、ＲＨＯ ｃ．６２０Ｔ＞Ｇで得られた分岐点プロファイルは著しく異なっていた。第一に、ｃ．６２０Ｔ＞Ｇ変異体の様々な分岐点が特定されている。しかし、主要な分岐点は検出できず、ＷＴミニ遺伝子で得られたものと同一のものはなかった。第二に、分岐点は、使用されたＡＳＳのさらに上流、つまり、ネイティブエクソン３ ＡＳＳの２１～１５９ｂｐ上流に対応する１０７～２４５ｂｐに位置していた。第三に、検出された分岐点のほぼ半分はコンセンサス配列にほとんど類似しておらず、したがって、ヒトスプライスファインダー（ＨＳＦ）スプライス予測ツールを使用して予測されなかった。全体として、これらのデータは、ｖｇＡＳＳ＿６２０の強度が、含まれている非常に強力な分岐点の存在に起因するのではなく、分岐点の選択における高い柔軟性によって部分的に引き起こされる可能性があることを示唆している。これは、その異常に効率的な性能を説明することができ、効率的なスプライシングを必要とする生物工学的用途にとって非常に魅力的なツールになる。

【0270】

実施例４：ｉｎ ｖｉｖｏにおけるｍＲＮＡトランススプライシングベースのｒＡＡＶデュアルベクターの研究
前のセクションで評価されたｍＲＮＡトランススプライシングベースのアッセイの最も強力な用途は、デュアルｒＡＡＶベクターのフレームワークでの大きな遺伝子の再構成である。その結果、ｍＲＮＡトランススプライシングアプローチは、ｒＡＡＶを使用してマウス網膜で試験された。この目的のために、分割フルオロフォアアッセイのわずかに修正されたバージョンが使用された。単一ウイルスで形質導入された細胞におけるｒＡＡＶベクター由来の発現を制御するために、両方のデュアルｒＡＡＶベクターカセットにフルオロフォア配列、すなわち５’ベクターのコード配列の５’末端にあるシトリンおよび３’'ベクターのコード配列の３’末端にあるｍＣｈｅｒｒｙを備えた。ｉｎ ｖｉｔｒｏで最高の再構成効率をもたらすＢＤの１つ、すなわちＢＤ＿ｈ＋ｉをｉｎ ｖｉｖｏで使用した（図１０Ａ）。この実験設定では、セルリアン蛍光は、シトリンならびにｍＣｈｅｒｒｙを発現する細胞にも存在するはずである。

【0271】

力価が一致したウイルスは、生後２１日目（Ｐ２１）に網膜下にＷＴ Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊマウスに注射された。注射の２週間後に網膜を採取した後、ＲＰＥで固形のフルオロフォアの発現を検出できた（図１０Ｂ）。さらに、セルリアン蛍光は、シトリンおよびｍＣｈｅｒｒｙが発現したすべての領域で観察でき、両方のＡＡＶで同時形質導入された細胞でのｍＲＮＡトランススプライシングの成功を示している。しかし、シトリンおよびセルリアンは、部分的に重複する励起スペクトルおよび発光スペクトルを有している。セルリアン蛍光がたとえばシトリンまたはｍＣｈｅｒｒｙのブリードスルーによって引き起こされるアーチファクトである可能性を排除するために、両方のフルオロフォアは、高強度５１４ｎｍレーザーでフルオロフォアを励起することにより、ＲＰＥの小さな領域で選択的にブリーチされた。この手順により、シトリンおよびｍＣｈｅｒｒｙの蛍光を完全に除去することができた（図１０Ｃ）。それにもかかわらず、セルリアン蛍光は変化せず、トランススプライシングされたセルリアンｍＲＮＡのみに由来することを示している。この実験は、ｉｎ ｖｉｖｏでＡＡＶから発現された遺伝子の再構成のためのｍＲＮＡトランススプライシングの有用性の原理の証明を提供する。

【0272】

実施例５：ヒト遺伝子治療に適した強力な結合ドメインの同定
これまでのところ、すべての結合ドメイン（ＢＤ）配列はヒトイントロン領域から得られた。したがって、ヒト遺伝子治療に使用される場合、それらは内因性ｍＲＮＡに結合し、これらの転写物とのトランススプライシングを誘発する可能性もある。したがって、ヒト遺伝子治療にｍＲＮＡトランススプライシングを適用するには、ヒトゲノムに相同な配列を含まないＢＤを特定する必要がある。この目的のために、細菌のｌａｃＺ遺伝子からランダムな１００ｂｐの配列を取得し、ランダムな挿入、欠失、および置換を介して改変して、ヒトゲノムとの相同性のない４つの配列を取得した（図１１Ａ）。

【0273】

ＨＥＫ２９３細胞をそれぞれの結合ドメインを含む５’ベクターおよび３’ベクター構築物でコトランスフェクトすると、ＢＤの１つで７８．３％±２．１％の非常に高いセルリアン再構成効率が観察された（ＢＤ＿ｋ、図１１Ｂ～Ｄ）。したがって、ＢＤ＿ｋは、図４に示す最高のパフォーマンスを発揮するヒトＢＤよりも効率的であったため、ｍＲＮＡトランススプライシングによる大きな遺伝子の再構成を評価する予備実験に使用された。

【0274】

実施例６：再構成効率に対するポリアデニル化シグナルの影響およびｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおけるＤＮＡベースの再構成の関与
５’および３’ベクターに由来する２つのプレｍＲＮＡ分子の再構成は核内で行われるはずであるので、成熟したｍＲＮＡの安定化および翻訳に必要なポリアデニル化シグナル（ｐＡ）は、理論的には５’ベクターでは除去できる。この欠失の利点は、スプライシングされていない残りの５’プレｍＲＮＡがトランケートされたタンパク質の翻訳を引き起こさないことである。したがって、セルリアン再構成効率に対する５’ベクターのｐＡの欠失の影響を研究した。この目的のために、ｐＡを欠失する５’ベクターを通常の３’ベクターとコトランスフェクトした。コトランスフェクトされた両方ともｐＡを含むベクターと比較して、再構成はわずかに減少しているようである（図１２ＡおよびＢ）。しかし、この実験では、必要に応じてｐＡシグナルを除去できることが示されている。さらに、これまでに観察された成功した再構成は、すべての必要な構成要素、すなわち、シススプライシングを介してこの配列を除去するための組換え配列およびスプライシングエレメントが、ｍＲＮＡトランススプライシングベクターに存在するため、理論的には、従来技術のハイブリッドデュアルベクターアプローチのように、ＤＮＡレベルでの相同組換えによって媒介される可能性もある（Ｃａｒｖａｌｈｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１７）。この可能性を排除するために、３’ベクターのプロモーターを欠失させてプレｍＲＮＡへの転写を防止し、よってこれまでに知られているハイブリッドデュアルベクターアプローチに使用される３’ベクターに類似している。この構築物を通常の５’ベクターでコトランスフェクトした後、再構成は観察できなかった。この結果は、セルリアンの観察されたすべての再構成が、ｍＲＮＡトランススプライシングを介してのみ媒介されることを確認している。

【0275】

実施例７：ｍＲＮＡトランススプライシングを介した大きな遺伝子の再構成の原理の証明
ＡＡＶセルリアン分割レポーターアッセイに加えて、治療的に有望なタンパク質をトランススプライシングするｍＲＮＡを評価するためのアッセイが試験されている。転写活性化因子ドメインＶＰ６４－ｐ６５－Ｒｔａ（ＶＰＲ）に融合した触媒的に不活性なヌクレアーゼである転写活性化因子ＳｐＣａｓ９－ＶＰＲは、遺伝子治療のために最近開発された新しいツールである。サイズが大きい（５．８ｋｂ）ため、ｉｎ ｖｉｖｏ用途ではデュアルベクターを介して送達する必要がある。したがって、ＳｐＣａｓ９－ＶＰＲは、ｍＲＮＡトランススプライシングを介した再構成に好適な候補である。ＳｐＣａｓ９－ＶＰＲのコード配列はｃ．２１８５で２つに分割され、コード配列の２つの半分には、ＢＤ＿ｋまたはその相補配列、および適切なスプライシングエレメント、すなわちＤＳＳまたはｖｇＡＳＳ＿６２０が備えられていた。全長（ＦＬ）ＳｐＣａｓ９－ＶＰＲ構築物を陽性対照として使用した。分割構築物でコトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からのＲＴ－ＰＣＲにより、ＳｐＣａｓ９－ＶＰＲ ｍＲＮＡが正常に再構成され、不要な副産物が生成されなかったことが明らかになった（図１３Ｂ）。ＰＣＲ産物のシーケンシングにより、リーディングフレームの正確な回復が確認された（図１３Ｃ）。さらに、ＦＬ ＳｐＣａｓ９－ＶＰＲタンパク質はウエスタンブロッティングで検出できた（図１３Ｄ）。ＳｐＣａｓ９－ＶＰＲの再構成効率は１３．２％±０．９％であった。これは、大きな遺伝子の再構成のためのｍＲＮＡトランススプライシングアプローチの適用可能性の原理の証明を提供する。

【0276】

実施例８：ＡＢＣＡ４の再構成（図１４）
最後に、ヒト由来の大きな遺伝子の再構成も研究するために、網膜ＡＴＰ結合カセットトランスポーターをコードするＡＢＣＡ４遺伝子（６．８ｋｂ）を選択した。この遺伝子は、その変異が遺伝性網膜ジストロフィーのシュタルガルト黄斑ジストロフィーを引き起こすため、遺伝子治療の好適な候補である。ＡＢＣＡ４はｃ．３２４３で２つに分割され、ＢＤ＿ｋ、ＤＳＳ、およびｖｇＡＳＳ＿６２０が備えられていた（図１４Ａ）。両方の半分は、エクソンおよびイントロンで構成されるネイティブのプレｍＲＮＡに類似していない長いイントロンのないＡＢＣＡ４コード配列（ＣＤＳ）を含む。したがって、これはプレｍＲＮＡへのスプライス因子の動員を妨げる可能性があり、その結果、ｍＲＮＡトランススプライシング効率も低下させる可能性がある。分割された遺伝子が内因性のヒトプレｍＲＮＡにより類似するように、両方の半分のＣＤＳに３つの短い（８０ｂｐ）介在イントロンを含む追加の構築物を設計した。ＨＥＫ２９３細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの再構成能力を調べるために、イントロンのないまたはイントロンを含む構築物で一過的にコトランスフェクトした。
ＲＴ－ＰＣＲにより、イントロンが介在する場合としない場合で、分割構築物のｍＲＮＡレベルでＡＢＣＡ４が正常に再構成されたことが明らかになった（図１４Ｂ）。興味深いことに、イントロンを含む分割構築物はより効率的にトランススプライシングされているように見える。この場合も、不特定のスプライス産物は検出できず、リーディングフレームは正しく復元された（図１４Ｃ）。

【0277】

実施例９：ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＡＢＣＡ４のｒＡＡＶデュアルベクターｍＲＮＡトランススプライシング（図１５）
最後の実験では、ＡＢＣＡ４の再構成がｉｎ ｖｉｖｏでさらに試験された。この目的のために、ＣＭＶプロモーターをヒトロドプシン（ｈＲＨＯ）プロモーターに置換して、光受容体特異的発現を確保した（図１５Ａ）。ＡＡＶは、国際公開第２０１９／０７６８５６号に記載されているように、野生型ＡＡＶ２キャプシドに由来するインハウスで最適化されたＮＮおよびＧＬキャプシドバリアントを使用して生成された。ＡＢＣＡ４の５’または３’ＣＤＳを含む力価が一致したウイルスを、１ヶ月齢のＣ５７Ｂｌ６／Ｊ野生型マウスに網膜下に同時注射した。４週間後、網膜を採取し、再構成の成功をｍＲＮＡおよびタンパク質レベルで評価した。ジャンクションスパニングプライマーペアを使用して実行されたＲＴ－ＰＣＲにより、両方のキャプシドバリアント、すなわちＮＮおよびＧＬが、ＮＮキャプシドとの再構成に成功し、おそらくより高い（共）形質導入効率のために、より高いレベルの再構成されたｍＲＮＡが得られることが明らかになった（図１５Ｂ）。２つの別々のプレｍＲＮＡ分子のシームレスなライゲーションは、シーケンシングによって確認された（図１５Ｃ）。より正確な定量化のために、ｑＲＴ－ＰＣＲを行った。これらの予備的な結果（ｎ＝１）は、注入されていないＣ５７Ｂｌ６／Ｊ野生型網膜と比較して１０倍から４２倍の範囲の相対的なＡＢＣＡ４発現に達したことを示しており、ｍＲＮＡレベルでの再構成が成功して効率的であることを再度確認している（図１５Ｄ）。最後に、タンパク質レベルでＡＢＣＡ４の再構成を研究するために、注入された網膜のタンパク質ライセートをウエスタンブロッティングに使用した。導入遺伝子由来タンパク質の特異的検出を確実にするために、抗ｍｙｃ抗体が使用された。結果は、両方の場合において、再構成されたｍＲＮＡがｉｎ ｖｉｖｏタンパク質発現の成功をもたらしたことを示している（図１５Ｅ）。

【図1-1】

【図1-2】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図3-1】

【図3-2】

【図4-1】

【図4-2】

【図5-1】

【図5-2】

【図6-1】

【図6-2】

【図7-1】

【図7-2】

【図8-1】

【図8-2】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15-1】

【図15-2】

【図16】

【図17】

【図18-1】

【図18-2】

【図19-1】

【図19-2】

【図20-1】

【図20-2】

【図20-3】

【図21-1】

【図21-2】

【図21-3】

【配列表】

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