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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-04-22
(45)【発行日】2025-05-01
(54)【発明の名称】抗ＧＩＴＲ抗体およびその用途
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20250423BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20250423BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20250423BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20250423BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250423BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20250423BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20250423BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20250423BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
A61K39/395 N
A61K39/395 T
A61K39/395 U
A61P29/00
A61P31/00
A61P35/00
A61P37/04
A61P37/06
A61P43/00 105
A61P43/00 107
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2023569897
(86)(22)【出願日】2022-05-10
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-19
(86)【国際出願番号】 KR2022006697
(87)【国際公開番号】W WO2022240161
(87)【国際公開日】2022-11-17
【審査請求日】2023-12-27
(31)【優先権主張番号】10-2021-0060012
(32)【優先日】2021-05-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】523425120
【氏名又は名称】メディマブバイオ インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＤＩＭＡＢＢＩＯ ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】＃７２１， ５４， Ｃｈａｎｇｅｏｐ－ｒｏ， Ｓｕｊｅｏｎｇ－ｇｕ， Ｓｅｏｎｇｎａｍ－ｓｉ， Ｇｙｅｏｎｇｇｉ－ｄｏ， Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002952
【氏名又は名称】弁理士法人鷲田国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】カン ユヒ
(72)【発明者】
【氏名】チョ ホンソク
【審査官】團野 克也
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１７－５２６６１５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０２０－５１０４３５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１９－５３７４４９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５２３７７１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５０３６３２（ＪＰ，Ａ）
【文献】Adam D. COHEN et al.，“Agonist Anti-GITR Monoclonal Antibody Induces Melanoma Tumor Immunity in Mice by Altering Regulatory T Cell Stability and Intra-Tumor Accumulation”，PLoS ONE，2010年05月03日，Vol. 5, No. 5, e10436，pp. 1-12，DOI: 10.1371/journal.pone.0010436
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
ＩＰＣ Ｃ０７Ｋ、Ｃ１２Ｎ
ＤＢ名 ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ
／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ），
ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＣＡｐｌｕｓ
／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ１）、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ２）、
配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ３）、
配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ１）、
配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ２）、および
配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ３）
を含む、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項2】
配列番号７、８または９のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ１）、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ２）、
配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ３）、
配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ１）、
配列番号１０、１１、または１２のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ２）、および
配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ３）
を含む、請求項１に記載の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項3】
（１）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３；（２）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３；または
（３）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３
を含む、請求項１に記載の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項4】
配列番号１３、１４、１５、１６、１７、または１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および配列番号１９、２０、２１、２２、２３、または２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項１に記載の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項5】
ＧＩＴＲタンパク質のアミノ酸残基９２－１３２のうちから選択された一つ以上のアミノ酸残基に結合する、請求項１に記載の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項6】
前記抗ＧＩＴＲ抗体は、動物抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体である、請求項１に記載の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項7】
前記抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片は抗原結合断片であり、前記抗原結合断片は、前記抗ＧＩＴＲ抗体のｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２である、請求項１に記載の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項8】
請求項１～７のうちのいずれか一項に記載の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片を含む、癌の予防または治療用薬学組成物。
【請求項9】
前記癌は、固形癌または血液癌である、請求項８に記載の癌の予防または治療用薬学組成物。
【請求項10】
請求項１～７のうちのいずれか一項に記載の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片を含む、免疫増強用薬学組成物。
【請求項11】
免疫細胞活性化、調節Ｔ細胞抑制、および免疫タンパク質生産増加のうちから選択された一つ以上の活性を有する、請求項１０に記載の免疫増強用薬学組成物。
【請求項12】
請求項１～７のうちのいずれか一項に記載の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片を含む、免疫関連疾病の予防または治療用薬学組成物。
【請求項13】
前記免疫関連疾病は、感染性疾患、炎症性疾患、または自己免疫疾患である、請求項１２に記載の免疫関連疾病の予防または治療用薬学組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願との相互引用
本出願は２０２１年５月１０日付大韓民国特許出願第１０－２０２１－００６００１２号に基づいた優先権の利益を主張し、当該韓国特許出願の文献に開示されたすべての内容は本明細書の一部として含まれる。
本出願は２０２１年５月１０日付大韓民国特許出願第１０－２０２１－００６００１２号に基づいた優先権の利益を主張し、当該韓国特許出願の文献に開示されたすべての内容は本明細書の一部として含まれる。
【0002】
新規な抗ＧＩＴＲ抗体およびその免疫増強、抗癌および免疫関連疾病の予防および／または治療用途に関するものである。
【背景技術】
【0003】
癌免疫療法は体内免疫作用を用いて癌を治療する方法で、化学療法、外科療法、放射線療法に次いで癌の第４治療法と呼ばれる。癌免疫療法は、免疫系を活性化させて腫瘍細胞に対する認識および反応を増加させるメカニズムを必要とする。免疫系活性化は、抗原－特異的反応の開始に重要な抗原－提示細胞および腫瘍細胞破壊を担当するエフェクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）細胞などのような多様な細胞の機能を伴う複雑なメカニズムである。
【0004】
一方、ＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質）は腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーの一員で、Ｔ細胞を活性化して免疫反応を促進する役割を果たす。
【0005】
したがって、ＧＩＴＲ作用を活性化して免疫増進効果を有する薬物の開発が要求される。
【発明の概要】
【0006】
ＧＩＴＲに結合する抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片、およびその医薬用途が提供される。
【0007】
本明細書で提供される抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片は、ＧＩＴＲに対して作動薬（ａｇｏｎｉｓｔ）として作用するものであってもよい。
【0008】
一例は、ＧＩＴＲに結合する抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【0009】
抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ１）、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ２）、および配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ３）を含む重鎖相補性決定領域領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎｓ；ＣＤＲｓ）または重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域；および
配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ１）、配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ２）、および配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む軽鎖相補性決定領域または軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域
を含むものであってもよい。
配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ１）、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ２）、および配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ３）を含む重鎖相補性決定領域領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎｓ；ＣＤＲｓ）または重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域；および
配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ１）、配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ２）、および配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む軽鎖相補性決定領域または軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域
を含むものであってもよい。
【0010】
一例で、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ１）は配列番号７、８または９のアミノ酸配列を含むものであってもよく、配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ２）は配列番号１０、１１、または１２のアミノ酸配列を含むものであってもよい。
【0011】
一具体例で、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号１３、１４、１５、１６、１７、または１８のアミノ酸配列を含むの重鎖可変領域；および
配列番号１９、２０、２１、２２、２３、または２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含むものであってもよい。
配列番号１３、１４、１５、１６、１７、または１８のアミノ酸配列を含むの重鎖可変領域；および
配列番号１９、２０、２１、２２、２３、または２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含むものであってもよい。
【0012】
他の例は、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片を有効性分として含む免疫増強剤または免疫増強用薬学組成物を提供する。
【0013】
他の例は、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片を有効性分として含む免疫関連疾病の予防および／または治療用薬学組成物を提供する。
【0014】
他の例は、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片を有効性分として含む抗癌剤または癌の予防および／または治療用薬学組成物を提供する。
【0015】
他の例は、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を免疫増強を必要とする対象に投与する段階を含む免疫増強方法を提供する。
【0016】
他の例は、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を免疫関連疾病の予防および／または治療を必要とする対象に投与する段階を含む免疫関連疾病の予防および／または治療方法を提供する。
【0017】
他の例は、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を有効性分として含む癌の予防および／または治療を必要とする対象に投与する段階を含む、癌の予防および／または治療方法を提供する。
【0018】
他の例は、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片の免疫増強用途または免疫増強剤製造のための用途を提供する。
【0019】
他の例は、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片の免疫関連疾病の予防および／または治療のための用途または免疫関連疾病の予防および／または治療用薬学組成物の製造のための用途を提供する。
【0020】
他の例は、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片の癌の予防および／または治療のための用途または癌の予防および／または治療用薬物の製造のための用途を提供する。
【0021】
他の例は、抗ＧＩＴＲ抗体の重鎖相補性決定領域、重鎖可変領域または重鎖を暗号化する核酸分子を提供する。
【0022】
他の例は、抗ＧＩＴＲ抗体の軽鎖相補性決定領域、軽鎖可変領域または軽鎖を暗号化する核酸分子を提供する。
【0023】
他の例は、抗ＧＩＴＲ抗体の重鎖相補性決定領域、重鎖可変領域または重鎖を暗号化する核酸分子および抗ＧＩＴＲ抗体の軽鎖相補性決定領域、軽鎖可変領域または軽鎖を暗号化する核酸分子を一つのベクターに共に含むか、それぞれ別個のベクターに含む組換えベクターを提供する。組換えベクターは、核酸分子の発現のための発現ベクターであってもよい。
【0024】
他の例は、組換えベクターを含む組換え細胞を提供する。
【0025】
他の例は、核酸分子を宿主細胞で発現させる段階を含む抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片の生産方法を提供する。核酸分子を宿主細胞で発現させる段階は、核酸分子またはこれを含む組換えベクターを含む細胞を培養する段階を含むものであってもよい。方法は、発現させる段階以後に培地から抗体を分離および／または精製する段階を追加的に含むことができる。
【0026】
本明細書で、ＧＩＴＲに結合する抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片、およびこれらの医薬用途が提供される。抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片はＧＩＴＲに対して作動薬（ａｇｏｎｉｓｔ）として作用することによって、免疫を活性化（ｅ．ｇ．、エフェクターＴ細胞機能強化、Ｔｒｅｇ活性制御、サイトカイン分泌増加など）させる機能を有し、多様な免疫活性化剤および／または免疫治療剤として適用できる。
【0027】
本明細書で、用語「ＧＩＴＲ（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＴＮＦＲ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲ－Ｌ）に結合するＴＮＦ－受容体スーパーファミリーの構成員のうちの一つの受容体を称する。ＧＩＴＲはまた、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、構成員１８（ＴＮＦＲＳＦ１８）、ＡＩＴＲおよびＣＤ３５７とも称することができる。ＧＩＴＲは細胞によって自然発現されるＧＩＴＲだけでなく、その任意の変異体またはイソ型を含むことができる。一例で、ＧＩＴＲはヒトＧＩＴＲまたはそのイソ型であってもよく、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｑ９Ｙ５Ｕ５－１（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００４１８６．１；ＮＭ＿００４１９５．３によって暗号化される）、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿６８３６９９．１（ＮＭ＿１４８９０１．２によって暗号化される）、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿６８３７００．１（ＮＭ＿１４８９０２．１によって暗号化される）などであってもよいが、これに制限されるわけではない。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1a】一実施例によるキメラおよびヒト化抗体の重鎖（１ａ）および軽鎖（１ｂ）の配列整列結果を示す。
【図1b】同上
【図2】一実施例による抗ＧＩＴＲ抗体のエピトープマッピング結果を示す。
【図3a】一実施例による抗ＧＩＴＲ抗体の抗原（ヒトＧＩＴＲ）に対する結合力を示すグラフである。
【図3b】一実施例による抗ＧＩＴＲ抗体のヒト初代免疫細胞でのＧＩＴＲに対する結合度を示すグラフである。
【図4】一実施例による抗ＧＩＴＲ抗体のＧＩＴＲ作用性効能を示すグラフである。
【図5a】一実施例による抗ＧＩＴＲ抗体処理時のヒト初代T細胞のサイトカイン生産水準を示すグラフであって、ＣＤ４＋ Ｔ細胞でのＩＬ－２水準を示す。
【図5b】一実施例による抗ＧＩＴＲ抗体処理時のヒト初代T細胞のサイトカイン生産水準を示すグラフであって、ＣＤ４＋ Ｔ細胞でのＩＦＮ－ｇａｍｍａ水準を示す。
【図5c】一実施例による抗ＧＩＴＲ抗体処理時のヒト初代T細胞のサイトカイン生産水準を示すグラフであって、ＣＤ８＋ Ｔ細胞でのＩＬ－２水準を示す。
【図5d】一実施例による抗ＧＩＴＲ抗体処理時のヒト初代T細胞のサイトカイン生産水準を示すグラフであって、ＣＤ８＋ Ｔ細胞でのＩＦＮ－ｇａｍｍａ水準を示す。
【図6】一実施例による抗ＧＩＴＲ抗体のヒトＴ細胞でのサイトカイン生産増加効果を示すグラフである。
【図7a】一実施例による抗ＧＩＴＲ抗体のＮＫ細胞増殖効果を示すものであって、分離されたＮＫ細胞の増殖水準を示す。
【図7b】一実施例による抗ＧＩＴＲ抗体のＮＫ細胞増殖効果を示すものであって、ＮＫ細胞含有ＰＢＭＣの増殖水準を示す。
【図8】一実施例による抗ＧＩＴＲ抗体のＴ細胞増殖効果を示すグラフである。
【図9a】一実施例による抗ＧＩＴＲ抗体処理時のＮＫ細胞表面でのＣＤ１０７ａ発現水準を示すグラフである。
【図9b】一実施例による抗ＧＩＴＲ抗体処理時のＴｒｅｇ細胞数を示すグラフである。
【図10a】一実施例による抗ＧＩＴＲ抗体の腫瘍細胞（卵巣癌細胞）死滅効果を示すグラフである。
【図10b】同上
【図11】一実施例による抗ＧＩＴＲ抗体の大腸癌患者から分離されたＴ細胞でのサイトカイン生産増加効果を示すグラフである。
【図12】一実施例による抗ＧＩＴＲ抗体の肺癌患者から分離されたＴ細胞でのサイトカイン生産増加効果を示すグラフである。
【図13】一実施例による抗ＧＩＴＲ抗体の肝癌患者から分離されたＴ細胞でのサイトカイン生産増加効果を示すグラフである。
【図14】一実施例による抗ＧＩＴＲ抗体処理時の腫瘍動物モデルでの腫瘍大きさ変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0029】
以下、より詳しく説明する。
【0030】
抗体または抗原結合断片
一例は、ＧＩＴＲに結合する抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片を提供する。
抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ１）、
配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ２）、
配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ３）、
配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ１）、
配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ２）、および
配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ３）
を含むものであってもよい。
一例は、ＧＩＴＲに結合する抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片を提供する。
抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ１）、
配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ２）、
配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ３）、
配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ１）、
配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ２）、および
配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ３）
を含むものであってもよい。
【0031】
一例で、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号７、８または９のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ１）、
配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ２）、
配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ３）、
配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ１）、
配列番号１０、１１、または１２のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ２）、および
配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ３）
を含むものであってもよい。
配列番号７、８または９のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ１）、
配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ２）、
配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ３）、
配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ１）、
配列番号１０、１１、または１２のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ２）、および
配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ３）
を含むものであってもよい。
【0032】
具体例で、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片は、
（１）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３；
（２）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３；または
（３）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３
を含むものであってもよい。
（１）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３；
（２）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３；または
（３）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３
を含むものであってもよい。
【0033】
本明細書において、相補性決定領域（ＣＤＲ）はｋａｂａｔ ｓｙｓｔｅｍによるＣＤＲ定義を基準にして決定される。
【0034】
一具体例で、本明細書で提供される抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片に含むことができる６個ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３）を下記の表１に整理した。
【0035】
【表1】
【0036】
一例で、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号１（例えば、配列番号７、８、または９）のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２のＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号３のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域、および
配列番号４のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５（例えば、配列番号１０、１１、または１２）のＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号６のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域
を含むものであってもよい。
配列番号１（例えば、配列番号７、８、または９）のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２のＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号３のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域、および
配列番号４のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５（例えば、配列番号１０、１１、または１２）のＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号６のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域
を含むものであってもよい。
【0037】
一具体例で、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片は、
（１）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域、および
配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域；
（２）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域、および
配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域；または
（３）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域、および
配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域
を含むものであってもよい。
（１）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域、および
配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域；
（２）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域、および
配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域；または
（３）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域、および
配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域
を含むものであってもよい。
【0038】
一例で、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号１３、１４、１５、１６、１７、または１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
配列番号１９、２０、２１、２２、２３、または２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含むものであってもよい。
配列番号１３、１４、１５、１６、１７、または１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
配列番号１９、２０、２１、２２、２３、または２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含むものであってもよい。
【0039】
一具体例で、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片は以下のものを含むものであってもよい。
配列番号１３の重鎖可変領域および配列番号１９の軽鎖可変領域；
配列番号１４の重鎖可変領域および配列番号２０の軽鎖可変領域；
配列番号１５の重鎖可変領域および配列番号２１の軽鎖可変領域；
配列番号１６の重鎖可変領域および配列番号２２の軽鎖可変領域；
配列番号１７の重鎖可変領域および配列番号２３の軽鎖可変領域；または
配列番号１８の重鎖可変領域および配列番号２４の軽鎖可変領域。
配列番号１３の重鎖可変領域および配列番号１９の軽鎖可変領域；
配列番号１４の重鎖可変領域および配列番号２０の軽鎖可変領域；
配列番号１５の重鎖可変領域および配列番号２１の軽鎖可変領域；
配列番号１６の重鎖可変領域および配列番号２２の軽鎖可変領域；
配列番号１７の重鎖可変領域および配列番号２３の軽鎖可変領域；または
配列番号１８の重鎖可変領域および配列番号２４の軽鎖可変領域。
【0040】
場合によって（例えば、組換え的に製作時）、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域はＮ末端に適切なシグナル配列を追加的に含むことができる。
【0041】
本明細書で提供される抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片に含むことができる重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を下記の表２に例示した。
【0042】
【表2】
【0043】
一例で、本明細書で提供される抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片はＧＩＴＲタンパク質、例えば、ヒトＧＩＴＲタンパク質（配列番号３３のアミノ酸残基２６－２４１領域；アミノ酸残基１－２５はシグナル配列である）のアミノ酸残基９２～１３２領域内一つ以上のアミノ酸に結合するものであってもよく、例えば、アミノ酸残基９２－９６（ＳＧＴＦＳ、配列番号３４）、１０７－１１６（ＴＤＣＴＱＦＧＦＬＴ、配列番号３５）、および１２２－１３２（ＫＴＨＮＡＶＣＶＰＧＳ、配列番号３６）のうちから選択された一つ以上の領域および／または領域内一つ以上のアミノ酸に結合するものであってもよく、少なくとも、９２Ｓ（９２番目アミノ酸残基のＳｅｒ（Ｓ）、以下、同一に解釈）、９６Ｓ、１０７Ｔ、１１０Ｔ、１１６Ｔ、１２２Ｋおよび１３２Ｓからなる群より選択された一つ以上に結合するものであってもよいが、これに制限されるわけではない（ヒトＧＩＴＲのアミノ酸残基位置はシグナル配列（１－２５）を除いた２６番目アミノ酸残基から起算する）。
【0044】
［ヒトＧＩＴＲ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ９Ｙ５Ｕ５－１、配列番号３３、アミノ酸残基１－２５領域（イタリック体）はシグナル配列である）］
【化1】
【0045】
本明細書で「抗体」とは、特定抗原に特異的に結合するタンパク質を総称するものであって、免疫系内で抗原の刺激によって作られるタンパク質またはこれを化学的合成または組換え的に製造したタンパク質であってもよく、その種類は特に制限されない。抗体は、非自然的に生成されたもの、例えば、組換え的または合成的に生成されたものであってもよい。抗体は、動物抗体（例えば、マウス抗体など）、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であってもよい。抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってもよい。
【0046】
本明細書で提供される抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片で、先に定義した重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲ部位、または重鎖可変領域および軽鎖可変領域を除いた残り部位は全てのサブタイプの免疫グロブリン（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）、ＩｇＭ、など）に由来したものであってもよく、例えば、全てのサブタイプの免疫グロブリンのフレームワーク部位、および／または軽鎖定常領域および／または重鎖定常領域に由来したものであってもよい。一例で、本明細書で提供される抗ＧＩＴＲ抗体はヒトＩｇＧ型抗体、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４形態の抗体であってもよいが、これに制限されるわけではない。
【0047】
完全な抗体（例えば、ＩｇＧ型）は２つの全長（ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ）軽鎖および２つの全長重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は重鎖と二硫化結合で連結されている。抗体の定常領域は重鎖定常領域と軽鎖定常領域に分けられ、重鎖定常領域はガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）およびエプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）およびアルファ２（α２）を有する。軽鎖の定常領域はカッパ（κ）およびラムダ（λ）タイプを有する。
【0048】
一例で、本明細書で提供される抗ＧＩＴＲ抗体は重鎖定常領域としてＩｇＧの定常領域、軽鎖定常領域としてカッパ定常領域を含むことができるが、これに制限されるわけではない。
【0049】
一具体例で、ＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１）の定常領域は野生型であってもよい。他の具体例で、ＩｇＧの定常領域は、ヒトＩｇＧ１を基準にして、Ｎ２９８Ａ（２９８番目アミノ酸であるＮがＡに置換される）の変異を含む変異型であってもよいが、これに制限されるわけではない。
【0050】
用語、「重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）」は、抗原に特異性を付与するために十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨおよび３つの定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３とヒンジ（ｈｉｎｇｅ）を含む全長重鎖およびその断片を全て含む意味として解釈される。また、用語「軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）」は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬおよび定常領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖およびその断片を全て含む意味として解釈される。
【0051】
用語、「ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）」は抗体の可変部位中の抗原との結合特異性を付与する部位を意味するものであって、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の高可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列を意味する。重鎖および軽鎖はそれぞれ３つのＣＤＲを含むことができる（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３）。ＣＤＲは、抗体が抗原またはエピトープに結合することにおいて主要な接触残基を提供することができる。一方、本明細書において、用語、「特異的に結合」または“特異的に認識”は当業者に通常公知されている意味と同一なものであって、抗原および抗体が特異的に相互作用して免疫学的反応を行うことを意味する。
【0052】
本明細書に記載された相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ｋａｂａｔ ｓｙｓｔｅｍによるＣＤＲ定義を基準にして決定されたものである。
【0053】
本明細書で抗体は、特別な言及がない限り、抗原結合能を保有する抗体の抗原結合断片を含むものと理解できる。
【0054】
用語、「抗原結合断片」は、抗原が結合できる部分（例えば、本明細書で定義された６つのＣＤＲ）を含む全ての形態のポリペプチドを意味する。例えば、抗体のｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２であってもよいが、これに限定されない。
【0055】
抗原結合断片のうち、Ｆａｂは軽鎖および重鎖の可変領域と軽鎖の定常領域および重鎖の一番目定常領域（ＣＨ１）を有する構造で１つの抗原結合部位を有する。
【0056】
Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ－末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点からＦａｂと差がある。
【0057】
Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合を成しながら生成される。Ｆｖは重鎖可変部位および軽鎖可変部位のみを有している最小の抗体断片で、Ｆｖ断片を生成する組換え技術は当業界に広く公知されている。
【0058】
二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は非共有結合で重鎖可変部位と軽鎖可変部位が連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は一般にペプチドリンカーを通じて重鎖の可変領域と単鎖の可変領域が共有結合で連結されるかまたはＣ－末端で直ちに連結されていて二重鎖Ｆｖのようにダイマーのような構造を成すことができる。
【0059】
抗原結合断片はタンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全体抗体をパパインで制限切断するとＦａｂを得ることができ、ペプシンで切断するとＦ（ａｂ’）２断片を得ることができる）、遺伝子組換え技術を通じて製作することができる。
【0060】
用語「ヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）」は抗体の重鎖に含まれている領域であって、ＣＨ１およびＣＨ２領域の間に存在し、抗体内抗原結合部位の柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）を提供する機能を果たす領域を意味する。
【0061】
本明細書で提供される抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、当業界に広く知られた方法通りに製造できる。例えば、ファージディスプレイ技法を用いて製造できる。または、抗体は、通常の方法によって動物（例えば、マウス）由来のモノクローナル抗体から製造できる。
【0062】
一方、典型的なＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）フォーマットを用いてＧＩＴＲの受容体結合ドメインとの結合能に基づいて個別モノクローナル抗体をスクリーニングすることができる。結合体に対して分子的相互作用を検定するための競争的ＥＬＩＳＡ（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ）のような機能性分析または細胞ベースアッセイ（ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ）のような機能性分析を通じて阻害活性に対して検定することができる。その後、強い阻害活性に基づいて選択されたモノクローナル抗体メンバーに対してＧＩＴＲの受容体結合ドメインに対するそれぞれの親和度（Ｋｄ値）を検定することができる。
【0063】
最終選択された抗体は、抗原結合部位を除いた残り部分がヒトの免疫グロブリン抗体化された抗体だけでなく、ヒト化抗体として製造して使用することができる。ヒト化抗体の製造方法は当業界によく知られている。
【0064】
本明細書で提供される抗ＧＩＴＲ抗体の抗原結合断片は抗ＧＩＴＲ抗体に由来し抗原（ＧＩＴＲ）に対する結合力を保有する断片を意味するものであって、抗ＧＩＴＲ抗体の６つのＣＤＲを含む任意のポリペプチド、例えば、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ｓｃＦｖ－Ｃｋ（カッパ定常領域）、ｓｃＦｖ－Ｃλ（ラムダ定常領域）、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２であってもよいが、これに限定されるのではない。一例で、抗原結合断片はｓｃＦｖ、またはｓｃＦｖが免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４など）のＦｃ部位と融合された融合ポリペプチド（ｓｃＦｖ－Ｆｃ）または軽鎖の定常領域（例えば、カッパまたはラムダ）と融合された融合ポリペプチド（ｓｃＦｖ－ＣｋまたはｓｃＦｖ－Ｃλ）であってもよいが、これに制限されるわけではない。
【0065】
本明細書で、抗体（例えば、ＣＤＲ、可変領域、または重鎖／軽鎖、抗原結合断片など）が「特定アミノ酸配列を含む、または特定アミノ酸配列からなるまたは表現される」とは、アミノ酸配列を必須的に含む場合、およびアミノ酸配列に抗体活性（例えば、抗原親和度、薬理的活性など）に有意な影響がない無意味な変異（例えば、アミノ酸残基の置換、欠失、および／または追加）が導入された場合を全て意味するものであってもよい。
【0066】
本明細書で提供される抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片はＧＩＴＲ（ｅ．ｇ．、ヒトＧＩＴＲ）に対する結合親和度（ＫＤ）が、例えば、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲ；例：Ｂｉａｃｏｒｅ）で測定された場合を基準にして、１０ｍＭ以下、５ｍＭ以下、１ｍＭ以下、０．５ｍＭ以下、０．２ｍＭ以下、０．１ｍＭ以下、０．０５ｍＭ以下、０．０１ｍＭ以下、０．００５ｍＭ以下、または０．００１ｍＭ以下であってもよく、例えば、０．０００１ｎＭ～１０ｍＭ、０．０００５ｎＭ～１０ｍＭ、０．００１ｎＭ～１０ｍＭ、０．００５ｎＭ～１０ｍＭ、０．０１ｎＭ～１０ｍＭ、０．０５ｎＭ～１０ｍＭ、０．１ｎＭ～１０ｍＭ、０．５ｎＭ～１０ｍＭ、１ｎＭ～１０ｍＭ、０．０００１ｎＭ～５ｍＭ、０．０００５ｎＭ～５ｍＭ、０．００１ｎＭ～５ｍＭ、０．００５ｎＭ～５ｍＭ、０．０１ｎＭ～５ｍＭ、０．０５ｎＭ～５ｍＭ、０．１ｎＭ～５ｍＭ、０．５ｎＭ～５ｍＭ、１ｎＭ～５ｍＭ、０．０００１ｎＭ～１ｍＭ、０．０００５ｎＭ～１ｍＭ、０．００１ｎＭ～１ｍＭ、０．００５ｎＭ～１ｍＭ、０．０１ｎＭ～１ｍＭ、０．０５ｎＭ～１ｍＭ、０．１ｎＭ～１ｍＭ、０．５ｎＭ～１ｍＭ、１ｎＭ～１ｍＭ、０．０００１ｎＭ～０．５ｍＭ、０．０００５ｎＭ～０．５ｍＭ、０．００１ｎＭ～０．５ｍＭ、０．００５ｎＭ～０．５ｍＭ、０．０１ｎＭ～０．５ｍＭ、０．０５ｎＭ～０．５ｍＭ、０．１ｎＭ～０．５ｍＭ、０．５ｎＭ～０．５ｍＭ、１ｎＭ～０．５ｍＭ、０．０００１ｎＭ～０．２ｍＭ、０．０００５ｎＭ～０．２ｍＭ、０．００１ｎＭ～０．２ｍＭ、０．００５ｎＭ～０．２ｍＭ、０．０１ｎＭ～０．２ｍＭ、０．０５ｎＭ～０．２ｍＭ、０．１ｎＭ～０．２ｍＭ、０．５ｎＭ～０．２ｍＭ、１ｎＭ～０．２ｍＭ、０．０００１ｎＭ～０．１ｍＭ、０．０００５ｎＭ～０．１ｍＭ、０．００１ｎＭ～０．１ｍＭ、０．００５ｎＭ～０．１ｍＭ、０．０１ｎＭ～０．１ｍＭ、０．０５ｎＭ～０．１ｍＭ、０．１ｎＭ～０．１ｍＭ、０．５ｎＭ～０．１ｍＭ、１ｎＭ～０．１ｍＭ、０．０００１ｎＭ～０．０５ｍＭ、０．０００５ｎＭ～０．０５ｍＭ、０．００１ｎＭ～０．０５ｍＭ、０．００５ｎＭ～０．０５ｍＭ、０．０１ｎＭ～０．０５ｍＭ、０．０５ｎＭ～０．０５ｍＭ、０．１ｎＭ～０．０５ｍＭ、０．５ｎＭ～０．０５ｍＭ、１ｎＭ～０．０５ｍＭ、０．０００１ｎＭ～０．０１ｍＭ、０．０００５ｎＭ～０．０１ｍＭ、０．００１ｎＭ～０．０１ｍＭ、０．００５ｎＭ～０．０１ｍＭ、０．０１ｎＭ～０．０１ｍＭ、０．０５ｎＭ～０．０１ｍＭ、０．１ｎＭ～０．０１ｍＭ、０．５ｎＭ～０．０１ｍＭ、または１ｎＭ～０．０１ｍＭであってもよいが、これに制限されるわけではない。
【0067】
他の例で、先に説明した抗ＧＩＴＲ抗体の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、またはこれらの組み合わせ）、軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、またはこれらの組み合わせ）、またはこれらの組み合わせ；または重鎖可変領域、軽鎖可変領域、またはこれらの組み合わせを含むポリペプチド分子が提供される。
【0068】
ポリペプチド分子は、抗体の前駆体として抗体製作に使用できるだけでなく、抗体と類似の構造を有するタンパク質骨格体（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄ；例えば、ぺプチボディー、ナノボディー、など）、二重特異抗体、多重特異抗体の構成成分（例えば、ＣＤＲまたは可変領域）として含まれてもよい。
【0069】
用語「ぺプチボディー（ｐｅｐｔｉｄｅ＋ａｎｔｉｂｏｄｙ）」はペプチドと抗体のＦｃ部分などの定常部位の全部または一部が融合された融合タンパク質であって、抗体と類似の骨格と機能を有するタンパク質を意味する。ここで、先に説明した１種以上のペプチドが抗原結合部位（重鎖および／または軽鎖ＣＤＲまたは可変領域）として作用できる。
【0070】
用語「ナノボディー」は単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）とも呼ばれ、抗体の単一可変ドメインをモノマー形態で含む抗体断片を意味し、完全な構造の抗体と同様に特定抗原に対して選択的に結合する特性を有する。ナノボディーの分子量は一般に約１２ｋＤａ～約１５ｋＤａ程度で、完全な抗体（二つの重鎖と二つの軽鎖を含む）の一般的な分子量（約１５０ｋＤａ～約１６０ｋＤａ）と比較して非常に小さく、場合によってはＦａｂ断片やｓｃＦｖ断片より小さい。
【0071】
用語「多重結合抗体」（二重結合抗体を含む意味である）は２つまたはそれ以上の異なる抗原を認識および／または結合するか、同一抗原の互いに異なる部位を認識および／または結合する抗体を意味するもので、多重結合抗体のうちの一つの抗原結合部位が先に説明したＧＩＴＲに結合するポリペプチド、抗体、または抗原結合断片を含むものであってもよい。
【0072】
本明細書に提供されるＧＩＴＲに結合するポリペプチド、抗体、または抗原結合断片は、有用な重合体、標識物質などからなる群より選択された１種以上と接合された接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）形態で使用できる。
【0073】
有用な重合体は、例えば、ポリペプチド、抗体、および／または抗原結合断片の体内半減期を増加させる、タンパク質以外の重合体であってもよく、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１２ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａまたは４０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧ）、デキストラン、モノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）などからなる群より選択された１種以上の親水性重合体を例示することができるが、これに制限されない。
【0074】
標識物質は、希土類キレート剤、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、イソチオシアネート、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ－フタルアルデヒド、フルオレスカミン、１５２Ｅｕ、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェリン、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、オキサレートエステル標識、エクオリン標識、２，３－ジヒドロフタラジンジオン、ビオチン／アビジン、スピン標識、安定な遊離ラジカルなどからなる群より選択された１種以上の蛍光または化学発光性小分子化合物（ｃｈｅｍｉｃａｌ）、放射性同位元素などであってもよいが、これに制限されるわけではない。
【0075】
医薬用途
本明細書で提供される抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片は、ＧＩＴＲに対して作動薬（ａｇｏｎｉｓｔ）として作用（ＧＩＴＲ活性化）して免疫を活性化（ｅ．ｇ．、エフェクターＴ細胞機能強化、Ｔｒｅｇ活性制御、サイトカイン分泌増加など）させる機能を有する。したがって、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片は、免疫増強、免疫関連疾病の予防および／または治療、特に癌の予防および／または治療に有用に適用できる。
本明細書で提供される抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片は、ＧＩＴＲに対して作動薬（ａｇｏｎｉｓｔ）として作用（ＧＩＴＲ活性化）して免疫を活性化（ｅ．ｇ．、エフェクターＴ細胞機能強化、Ｔｒｅｇ活性制御、サイトカイン分泌増加など）させる機能を有する。したがって、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片は、免疫増強、免疫関連疾病の予防および／または治療、特に癌の予防および／または治療に有用に適用できる。
【0076】
他の例は、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片を有効性分として含む免疫増強剤または免疫増強用薬学組成物を提供する。
【0077】
他の例は、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片を有効性分として含む免疫関連疾病の予防および／または治療用薬学組成物を提供する。
【0078】
他の例は、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片を有効性分として含む抗癌剤または癌の予防および／または治療用薬学組成物を提供する。
【0079】
他の例は、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を免疫増強を必要とする対象に投与する段階を含む免疫増強方法を提供する。免疫増強方法は、投与する段階以前に、免疫増強を必要とする対象を確認する段階を追加的に含むことができる。
【0080】
他の例は、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を免疫関連疾病の予防および／または治療を必要とする対象に投与する段階を含む免疫関連疾病の予防および／または治療方法を提供する。免疫関連疾病の予防および／または治療方法は、投与する段階以前に、免疫関連疾病の予防および／または治療を必要とする対象を確認する段階を追加的に含むことができる。
【0081】
他の例は、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を癌の予防および／または治療を必要とする対象に投与する段階を含む、癌の予防および／または治療方法を提供する。癌の予防および／または治療方法は、投与する段階以前に、癌の予防および／または治療を必要とする対象を確認する段階を追加的に含むことができる。
【0082】
他の例は、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片の免疫増強用途または免疫増強剤製造のための用途を提供する。
【0083】
他の例は、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片の免疫関連疾病の予防および／または治療のための用途または免疫関連疾病の予防および／または治療用薬学組成物の製造のための用途を提供する。
【0084】
他の例は、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片の癌の予防および／または治療のための用途または癌の予防および／または治療用薬物の製造のための用途を提供する。
【0085】
本明細書で、用語「免疫増強（または免疫強化）」は抗原に対する初期免疫反応を誘導するか既存の免疫反応を増加させることを意味することができ、免疫刺激、免疫強化、免疫活性化などの用語と同等な意味として互換できる。一例で、免疫増強は免疫細胞（エフェクターＴ細胞、例えば、細胞毒性Ｔ細胞；ＣＤ３＋ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞など）機能強化（活性化）および／または増殖、調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）活性抑制および／または枯渇（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）、免疫タンパク質（例えば、サイトカインなど）生産および／または分泌増加などからなる群より選択された一つ以上を意味することができるが、これに制限されるわけではない。
【0086】
本明細書で、用語「免疫関連疾病」は免疫系の障害および／または不充分な活性によって誘発される全ての疾病を包括するもので、例えば、癌、感染疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患などからなる群より選択された一つ以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。
【0087】
癌は固形癌または血液癌であってもよく、これに制限されないが、扁平上皮細胞癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌など）、腹膜癌、皮膚癌、黒色腫（例えば、皮膚または眼球内黒色腫など）、直腸癌、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、慢性または急性白血病、リンパ球リンパ腫、肝癌、胃癌、膵臓癌、膠芽腫、頚部癌、卵巣癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌（例えば、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌など）、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、陰門癌、頭頸部癌、脳癌、骨肉腫などからなる群より選択された１種以上であってもよい。
【0088】
癌の予防および／または治療効果は癌細胞の発生および／または成長を抑制する効果だけでなく、移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）、浸湿（ｉｎｖａｓｉｏｎ）、転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）などによる癌の悪化を抑制する効果などを含む。
【0089】
感染性疾患、自己免疫疾患、および炎症性疾患は、先に説明した免疫強化（例えば、免疫細胞（エフェクターＴ細胞、例えば、細胞毒性Ｔ細胞；ＣＤ３＋ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞など）機能強化（活性化）および／または増殖、調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）活性抑制および／または枯渇（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）、免疫タンパク質（例えば、サイトカイン（ＩＬ－２、ＩＦＮ－ｇａｍｍａなど）など）生産および／または分泌増加など）によって治療、緩和、および／または予防可能な全ての感染性疾患、自己免疫疾患、および炎症性疾患のうちから選択されたものであってもよい。例えば、感染性疾患はウイルス、細菌、真菌、寄生虫のように疾病を起こす病原体が生物体（例、人間を含む動物）内に伝播、侵入して発生する疾病を総称するもので、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫などからなる群より選択された一つ以上の病原体の感染または感染による疾病（感染症）であってもよい。自己免疫疾患はリウマチ関節炎、１型糖尿病、クローン病、潰瘍性大腸炎、ベーチェット症候群、ループス、シェーグレン症候群、重症筋無力症、強皮症、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、乾癬、白斑症、多発性硬化症、自己免疫性肝炎、自己免疫性腎臓炎、自己免疫性膵臓炎、自己免疫性脳炎、サイトカインストームなどからなる群より選択できるが、これに制限されるわけではない。炎症性疾患は炎症（例、慢性炎症または急性炎症）または炎症による疾病を総称するもので、例えば、心臓炎症（例、冠状動脈疾患、狭心症、心筋梗塞、心臓膜炎、心筋炎など）、血管炎症（例、粥状硬化症、血管炎、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、免疫性血小板減少紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、貧血など）、上気道炎症（例、急性鼻咽頭炎、アレルギー鼻炎、副鼻腔炎、咽頭炎、扁桃炎、喉頭炎など）、下気道および／または肺炎症（例、気管支炎、気管支拡張症、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺炎、てんかん性肺疾患、結核など）、上部胃腸管炎症（例、胃炎、食道炎など）、下部胃腸管炎症（例、小腸炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、セリアック病、憩室炎、過敏性大腸症候群、虫垂炎、痔瘻など）、肝、胆道および／または膵臓炎症（例、肝炎、脂肪肝、胆管炎、胆嚢炎、膵臓炎、第１型糖尿病など）、腎臓（上部尿路）炎症（例、腎盂腎炎、糸球体腎炎、尿路感染症など）、下部尿路炎症（例、尿路感染症、尿管炎、尿道炎、膀胱炎、前立腺炎／慢性骨盤痛症候群など）、甲状腺および／または副甲状腺炎症（例、甲状腺炎、副甲状腺炎など）、副腎炎症（例、副腎炎など）、生殖器官炎症（例、骨盤内炎症性疾患、卵巣炎、睾丸炎、副睾丸炎など）、骨および／または関節炎症（例、骨関節炎、リウマチ関節炎、骨髄炎、滑膜炎など）、皮膚炎症（例、皮膚：蜂巣炎、丹毒（Ｅｒｙｓｉｐｅｌａｓ）、癜風、水虫、にきびなど）、筋肉炎症（例、筋炎など）、脳炎症（例、脳炎、大鬱病性障害など）、神経炎症（例、目、耳など多様な部位の神経炎、複合性局所疼痛症候群、ギランバレー症候群など）、目炎症（例、麦粒腫、ぶどう膜炎、結膜炎など）、耳炎症（例、中耳炎、乳様突起炎など）、口腔炎症（例、口内炎、歯周炎、歯肉炎など）、全身性炎症（例、全身性炎症反応症候群（敗血症など）、代謝症候群関連疾患など）、腹膜炎、再かん流傷害、移植拒絶反応、過敏反応などからなる群より選択された一つ以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。
【0090】
本明細書で提供される抗ＧＩＴＲ抗体、その抗原結合断片、および／またはこれを含む薬学組成物の投与対象は全ての動物または細胞であってもよく、例えば、人間、猿などの霊長類、ラット、マウス、などの齧歯類などを含む哺乳類から選択される動物、または動物に由来する（分離された）細胞、組織、体液（例えば、血清）、またはその培養物であってもよく、例えば、人間または人間から分離された細胞、組織、体液（例えば、血清）であってもよい。
【0091】
薬学的組成物は、有効成分としての抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片に加えて、薬学的に許容可能な担体を追加的に含むことができ、担体はタンパク質薬物の製剤化に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイルなどからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに限定されるのではない。薬学的組成物はまた、薬学組成物製造に通常使用される希釈剤、賦形剤、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などからなる群より選択された１種以上を追加的に含むことができる。
【0092】
抗ＧＩＴＲ抗体、その抗原結合断片および／または薬学組成物の投与は、経口または非経口経路を通じて行うことができる。非経口投与の場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与および直臓内投与などで投与することができる。経口投与時、タンパク質またはペプチドは消化されるため、経口用組成物は活性薬剤をコーティングするか胃での分解から保護されるように剤形化されなければならない。
【0093】
また、抗ＧＩＴＲ抗体、その抗原結合断片および／または薬学組成物はオイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤または乳化液形態であるか、エキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤、注射剤などの形態に剤形化でき、剤形化のために分散剤または安定化剤を追加的に含むことができる。
【0094】
薬学組成物内の有効成分である抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片の含有量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、食べ物、投与時間、投与間隔、投与経路、排泄速度および反応感応性のような要因によって多様に処方できる。薬学組成物の１日投与量は、有効成分（抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片）を基準にして０．００００１～１０００ｍｇ／ｋｇ、０．００００１～５００ｍｇ／ｋｇ、０．００００１～１００ｍｇ／ｋｇ、０．００００１～５０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１～１０００ｍｇ／ｋｇ、０．０００１～５００ｍｇ／ｋｇ、０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇ、０．０００１～５０ｍｇ／ｋｇ、０．００１～１０００ｍｇ／ｋｇ、０．００１～５００ｍｇ／ｋｇ、０．００１～１００ｍｇ／ｋｇ、０．００１～５０ｍｇ／ｋｇ、０．０１～１０００ｍｇ／ｋｇ、０．０１～５００ｍｇ／ｋｇ、０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ、０．０１～５０ｍｇ／ｋｇ、０．１～１０００ｍｇ／ｋｇ、０．１～５００ｍｇ／ｋｇ、０．１～１００ｍｇ／ｋｇ、または０．１～５０ｍｇ／ｋｇ範囲であってもよいが、これに制限されるわけではない。１日投与量は単位容量形態で一つの製剤として製剤化されるか、適切に分量して製剤化されるか、多用量容器内に入れて製造できる。また、本明細書で薬学的有効量は有効成分が目的とする薬学的活性を示すことができる有効成分の量を意味するもので、投与量範囲であってもよい。
【0095】
ポリヌクレオチド、発現ベクター、および抗体の製造
他の例は、抗ＧＩＴＲ抗体の重鎖相補性決定領域、重鎖可変領域または重鎖を暗号化する核酸分子を提供する。一例で、核酸分子は、配列番号８または配列番号１２の核酸配列を含むものであってもよい。
他の例は、抗ＧＩＴＲ抗体の重鎖相補性決定領域、重鎖可変領域または重鎖を暗号化する核酸分子を提供する。一例で、核酸分子は、配列番号８または配列番号１２の核酸配列を含むものであってもよい。
【0096】
他の例は、抗ＧＩＴＲ抗体の軽鎖相補性決定領域、軽鎖可変領域または軽鎖を暗号化する核酸分子を提供する。一例で、核酸分子は、配列番号１０または配列番号１４の核酸配列を含むものであってもよい。
【0097】
他の例は、抗ＧＩＴＲ抗体の重鎖相補性決定領域、重鎖可変領域または重鎖を暗号化する核酸分子および抗ＧＩＴＲ抗体の軽鎖相補性決定領域、軽鎖可変領域または軽鎖を暗号化する核酸分子を一つのベクターに共に含むか、それぞれ別個のベクターに含む組換えベクターを提供する。組換えベクターは、核酸分子の発現のための発現ベクターであってもよい。
【0098】
他の例は、組換えベクターを含む組換え細胞を提供する。
【0099】
用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段を意味する。例えば、プラスミドベクター、コスミドベクターおよびバクテリオファージベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターのようなウイルスベクターを含む。組換えベクターとして使用できるベクターは、当業界で時々使用されるプラスミド（例えば、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズおよびｐＵＣ１９など）、ファージ（例えば、λｇｔ４λＢ、λ－Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１およびＭ１３など）またはウイルス（例えば、ＳＶ４０など）を操作して製作できる。
【0100】
組換えベクターで、核酸分子はプロモーターに作動可能に連結できる。用語“作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）”は、ヌクレオチド発現調節配列（例えば、プロモーター配列）と他のヌクレオチド配列の間の機能的な結合を意味する。調節配列は、「作動可能に連結（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」されることによって他のヌクレオチド配列の転写および／または解読を調節することができる。
【0101】
組換えベクターは、典型的にクローニングのためのベクターまたは発現のためのベクターとして構築できる。発現用ベクターは、当業界で植物、動物または微生物で外来のタンパク質を発現するのに使用される通常のものを使用することができる。組換えベクターは、当業界に公知された多様な方法を通じて構築できる。
【0102】
組換えベクターは、原核細胞または真核細胞を宿主にして構築できる。例えば、使用されるベクターが発現ベクターであり、原核細胞を宿主にする場合には、転写を行わせることができる強力なプロモーター（例えば、ｐＬλプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなど）、解読の開始のためのリボソーム結合部位および転写／解読終結配列を含むことが一般的である。真核細胞を宿主にする場合には、ベクターに含まれる真核細胞で作動する複製原点はｆ１複製原点、ＳＶ４０複製原点、ｐＭＢ１複製原点、アデノ複製原点、ＡＡＶ複製原点、およびＢＢＶ複製原点などを含むが、これに限定されるのではない。また、哺乳動物細胞のゲノムに由来したプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来したプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、およびＨＳＶのｔｋプロモーター）が使用でき、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般に有する。
【0103】
組換え細胞は、組換えベクターを適切な宿主細胞に導入させることによって得られたものであってもよい。宿主細胞は組換えベクターを安定的且つ連続的にクローニングまたは発現させることができる細胞として当業界に公知されたいかなる宿主細胞も用いることができ、原核細胞としては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲ１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＥ３９２、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、バチルスサブティリス、バチルスチューリンゲンシスのようなバシラス属菌株、そしてサルモネラティフィムリウム、セラチアマルセッセンス、および多様なシュードモナス種のような臓内菌と菌株などがあり、真核細胞に形質転換させる場合には、宿主細胞として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、植物細胞および動物細胞、例えば、Ｓｐ２／０、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ） Ｋ１、ＣＨＯ ＤＧ４４、ＣＨＯ Ｓ、ＣＨＯ ＤＸＢ１１、ＣＨＯ ＧＳ－ＫＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ－７、２９３、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ細胞株などが使用できるが、これに制限されるわけではない。
【0104】
核酸分子またはこれを含む組換えベクターの宿主細胞内への運搬（導入）は、当業界に広く知られた運搬方法を使用することができる。運搬方法は例えば、宿主細胞が原核細胞である場合、ＣａＣｌ２方法または電気穿孔方法などを使用することができ、宿主細胞が真核細胞である場合には、微細注入法、カルシウムホスフェート沈殿法、電気穿孔法、リポソーム－媒介形質感染法および遺伝子ボンバードメントなどを使用することができるが、これに限定しない。
【0105】
形質転換された宿主細胞を選別する方法は選択標識によって発現される表現型を用いて、当業界に広く知られた方法によって容易に実施することができる。例えば、選択標識が特定抗生剤耐性遺伝子である場合には、抗生剤が含まれている培地で形質転換体を培養することによって形質転換体を容易に選別することができる。
【0106】
他の例は、核酸分子を宿主細胞で発現させる段階を含む抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片の生産方法を提供する。核酸分子を宿主細胞で発現させる段階は、核酸分子またはこれを含む組換えベクターを含む細胞を培養する段階を含むものであってもよい。製造方法は、培養する段階以後に、任意に、培養培地から抗体または抗原結合断片を分離および／または精製する段階を追加的に含むことができる。
【0107】
本明細書で提供される抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片は、ＧＩＴＲに対して作動薬（ａｇｏｎｉｓｔ）として作用して免疫を活性化（例えば、エフェクターＴ細胞機能強化、Ｔｒｅｇ活性制御、サイトカイン分泌増加など）させる機能を有し、多様な免疫活性化剤および／または免疫治療剤として適用できる。
【0108】
以下では実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これは例示的なものに過ぎず、本発明の範囲を制限しようとするのではない。下記の実施例は発明の本質的な要旨を逸脱しない範囲で変形できるのは当業者において自明である。
【実施例】
【0109】
実施例１：抗ＧＩＴＲ抗体の製作
１．１．抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体の生成
１０匹のマウス（５ Ｂａｌｂ／ｃ及び５ Ｃ５７／ｂｌ６）を免疫原（ＧＩＴＲタンパク質、純度＞９０％、哺乳動物で発現されたもの；Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）で免疫化させた。
免疫化スケジュールは以下の通りである：
初代免疫：１匹当たり５０μｇのヒトＧＩＴＲタンパク質のｓ．ｃ．注射（Ｑ９Ｙ５Ｕ５－１）；
１回目のブースター：Ｔ＝１４日、１匹当たり２５μｇのヒトＧＩＴＲタンパク質のｉ．ｐ．注射；
２回目のブースター：Ｔ＝２８日、１匹当たり２５μｇのヒトＧＩＴＲタンパク質のｉ．ｐ．注射；および
最後のブースター：Ｔ＝５６±７日、１匹当たり２５μｇのヒトＧＩＴＲタンパク質のｉ．ｐ．注射。
１．１．抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体の生成
１０匹のマウス（５ Ｂａｌｂ／ｃ及び５ Ｃ５７／ｂｌ６）を免疫原（ＧＩＴＲタンパク質、純度＞９０％、哺乳動物で発現されたもの；Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）で免疫化させた。
免疫化スケジュールは以下の通りである：
初代免疫：１匹当たり５０μｇのヒトＧＩＴＲタンパク質のｓ．ｃ．注射（Ｑ９Ｙ５Ｕ５－１）；
１回目のブースター：Ｔ＝１４日、１匹当たり２５μｇのヒトＧＩＴＲタンパク質のｉ．ｐ．注射；
２回目のブースター：Ｔ＝２８日、１匹当たり２５μｇのヒトＧＩＴＲタンパク質のｉ．ｐ．注射；および
最後のブースター：Ｔ＝５６±７日、１匹当たり２５μｇのヒトＧＩＴＲタンパク質のｉ．ｐ．注射。
【0110】
細胞融合およびスクリーニング
免疫化されたマウスの脾臓からＢリンパ球を収集し、これをＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合させて（Ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ）ハイブリドーマを製作した。細胞融合は電気細胞融合によって行った。融合効率は大略１のハイブリドーマ／３０００のＢ細胞程度に観察された。それぞれの細胞融合から得られた全ての融合された細胞を９６ウェルプレートにプレーティングした。各融合で最大５０個プレートを使用した。
免疫化されたマウスの脾臓からＢリンパ球を収集し、これをＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合させて（Ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ）ハイブリドーマを製作した。細胞融合は電気細胞融合によって行った。融合効率は大略１のハイブリドーマ／３０００のＢ細胞程度に観察された。それぞれの細胞融合から得られた全ての融合された細胞を９６ウェルプレートにプレーティングした。各融合で最大５０個プレートを使用した。
【0111】
その後、タンパク質１次スクリーニングおよびＦＡＣＳ確認スクリーニングを行った。タンパク質１次スクリーニングは免疫化抗原（可溶性ＧＩＴＲタンパク質）に対するＥＬＩＳＡによって行った。ＧＩＴＲを安定的に発現する細胞株（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を使用してＦＡＣＳを行って、１次スクリーニング結果から陽性の上澄みをスクリーニングした。
【0112】
その後、リガンド結合スクリーニングを行った。スクリーニングされた陽性クローンをＥＬＩＳＡによってスクリーニングして、クローンがＧＩＴＲがＧＩＴＲＬに結合することを遮断するかまたは促進するかどうかをチェックした。特定ｓｐｅｃｉｆｉｃ 陽性クローンを選定して次のｏｎｅ－ｒｏｕｎｄ ｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇに使用した。
【0113】
サブクローニング及び拡張
１ラウンドのサブクローニングおよびハイブリドーマ培養上清液の収集：選定されたクローン（親クローン）それぞれのモノクロ－ナル細胞を試験試料用として選定した。２４ウェルプレートからそれぞれの拡張クローン（ｅｘｐａｎｄｅｄ ｃｌｏｎｅ）の培養上清液を１ｍｌの量で収集し、培養上清液中の抗体濃度を測定した。
１ラウンドのサブクローニングおよびハイブリドーマ培養上清液の収集：選定されたクローン（親クローン）それぞれのモノクロ－ナル細胞を試験試料用として選定した。２４ウェルプレートからそれぞれの拡張クローン（ｅｘｐａｎｄｅｄ ｃｌｏｎｅ）の培養上清液を１ｍｌの量で収集し、培養上清液中の抗体濃度を測定した。
【0114】
Ｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇ：選択されたそれぞれの融合から得られたｐｏｓｉｔｉｖｅ 初代 ｃｌｏｎｅｓをｌｉｍｉｔｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎによってサブクローニングしてサブクローンが単一母細胞に由来したものであるのを確実にした。クローンを最大３世代まで伝達した。
【0115】
サブクローニングとスクリーニング：サブクローニングされたサブクローンをＥＬＩＳＡまたはＨＴＰ ＦＡＣＳによってスクリーニングした。
【0116】
ハイブリドーマ組織培養の上清液を２ラウンドの間接ＥＬＩＳＡ（ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ）を使用して免疫原（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）に対してスクリーニングした。陽性クローンに対して間接ＥＬＩＳＡを使用する競合アッセイ（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）を通じてリガンド結合抑制を追加的に試験した。選択されたクローンをＧＩＴＲ過発現ＣＨＯ細胞と共に培養しＦＡＣＳを行ってＧＩＴＲ結合を試験した。
【0117】
完全サブクローニング：各細胞融合から得られた選別されたモノクローンに対してサブクローニングを追加的に２ラウンド行って安定なサブクローンを得た。
【0118】
抗体配列シーケンシング
ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ａｍｂｉｏｎ、 Ｃａｔ．１５５９６－０２６）を使用して製造者技術指針に従ってハイブリドーマ細胞から総 ＲＮＡを分離した。その後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ、 Ｃａｔ．６１１０Ａ）を使用して製造者技術指針に従ってユニバーサルプライマーまたはアイソタイプ特異的抗センスプライマーを使用して総ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。重鎖および軽鎖の抗体断片を増幅しそれぞれ標準クローニングベクターにクローニングした。コロニーＣｏｌｏｎｙ ＰＣＲを行って正確な大きさの挿入体（ｉｎｓｅｒｔ）を有するクローンを選別した。
ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ａｍｂｉｏｎ、 Ｃａｔ．１５５９６－０２６）を使用して製造者技術指針に従ってハイブリドーマ細胞から総 ＲＮＡを分離した。その後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ、 Ｃａｔ．６１１０Ａ）を使用して製造者技術指針に従ってユニバーサルプライマーまたはアイソタイプ特異的抗センスプライマーを使用して総ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。重鎖および軽鎖の抗体断片を増幅しそれぞれ標準クローニングベクターにクローニングした。コロニーＣｏｌｏｎｙ ＰＣＲを行って正確な大きさの挿入体（ｉｎｓｅｒｔ）を有するクローンを選別した。
【0119】
選別されたクローンを代表して、抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体クローン５１Ｂの軽鎖および重鎖の可変領域のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列分析結果を下記の表３に示した：
【0120】
【表3-1】
【表3-2】
【0121】
１．２．マウス抗ＧＩＴＲクローンのヒト化
Ｓｗｉｓｓ ＰＤＢを使用して抗体可変領域（Ｖ ｒｅｇｉｏｎｓ）の構造モデルを生成し、抗体の結合特性に必須的である可能性があるＶ領域の重要な「拘束性（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｉｎｇ）」の”アミノ酸を確認するための分析を行った。多数のフレームワーク残基と共にＣＤＲ（ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ定義両方とも使用）内に含まれている大部分の残基が重要なものと評価された。
Ｓｗｉｓｓ ＰＤＢを使用して抗体可変領域（Ｖ ｒｅｇｉｏｎｓ）の構造モデルを生成し、抗体の結合特性に必須的である可能性があるＶ領域の重要な「拘束性（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｉｎｇ）」の”アミノ酸を確認するための分析を行った。多数のフレームワーク残基と共にＣＤＲ（ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ定義両方とも使用）内に含まれている大部分の残基が重要なものと評価された。
【0122】
構造分析に基づいてヒト化変異体を生成するのに使用することができるヒト配列断片を選別し、ヒトＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に結合するペプチドのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分析のためにｉＴｏｐｅ－ＡＩ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＡＢＺＥＮＡ ｐｌｃ）を使用して分析した。ＣＤＲ外部および側面領域の場合、広範囲に選択されたヒト配列断片が新規なヒト化可変領域の構成要素として使用可能であると確認された反面、ＣＤＲ領域の場合には使用可能な配列の選択範囲が縮小される。可能な場合、ヒトＭＨＣクラスＩＩに対して有意な非ヒト生殖細胞系結合体と確認された配列断片は廃棄した。これによって断片セットが減少し、これら組み合わせを方法で再び分析して、断片の間の接合部が潜在的Ｔ細胞エピトープを含まないことを確認した。
【0123】
有意なＴ細胞エピトープがないか（可能な場合）減少した完全な可変領域配列を生成するために、選択された配列断片を組み立てた。５個の重鎖（ＶＨ１～ＶＨ５）および５個の軽鎖（ＶＬ１～ＶＬ５）配列は哺乳動物細胞発現用遺伝子合成およびペアリングのために設計された（表４）。
【0124】
一つのキメラ抗体（ＶＨ０／ＶＬ０）および２５個ヒト化抗体を生成するための重鎖と軽鎖の組み合わせを下記の表４に例示的に示した。
【0125】
【表4】
【0126】
表３の５１Ｂクローンに表４の組み合わせを適用したキメラ抗体（ＶＨ０ｘＶＬ０）およびヒト化抗体の配列を表５、表６、および図１ａおよび１ｂに示した。配列を表５、表６、および図１ａ（重鎖可変領域）および１ｂ（軽鎖可変領域）で、Ｋａｂａｔ定義によりアミノ酸配列ナンバリングおよびＣＤＲ部位を決定し、図１ａおよび１ｂに上述したように決定されたＣＤＲおよび親配列（ＶＨ０またはＶＬ０）において変更されたアミノ酸残基を陰影で表示した。
【0127】
【表5】
【0128】
【表6】
【0129】
以下、実施例で、同一の軽鎖クローンがＶＬまたはＶｋで全て表示でき、例えば、ＶＬ０、ＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、およびＶＬ５はそれぞれＶｋ０、Ｖｋ１、Ｖｋ２、Ｖｋ３、Ｖｋ４、およびＶｋ５と同一なクローンを指す。
【0130】
製作された抗体のうち、５１Ｂ ＶＨ０／ＶＬ０キメラ抗体の重鎖のＦｃ領域にＮ２９８Ａ点変異を導入してＦｃ組換え変異体を製作した。
【0131】
Ｆｃ組換え変異体を含む抗体の重鎖および軽鎖配列を表７に記載した。
【0132】
【表7】
【0133】
１．３．キメラおよびヒト化ＩｇＧ１抗体の一過性発現（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）
ＶＨ０／ＶＬ０キメラ抗体コードＤＮＡ、２個の対照抗体コードＤＮＡ、およびヒト化の重鎖および軽鎖コードＤＮＡの組み合わせ（総２５個ヒト化ペアリング）を６ウェルプレートを用い、ＰＥＩトランスフェクション方法でＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ付着細胞（ＬＧＣ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、Ｔｅｄｄｉｎｇｔｏｎ、ＵＫ）に一過性トランスフェクションさせた後、７日間培養した。サンプルを収集し、ヒトＩｇＧ１抗体を基準にして、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａバイオセンサー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｗｏｋｉｎｇｈａｍ、Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を使用してＯｃｔｅｔ ＱＫ３８４上で抗体濃度を測定した。
ＶＨ０／ＶＬ０キメラ抗体コードＤＮＡ、２個の対照抗体コードＤＮＡ、およびヒト化の重鎖および軽鎖コードＤＮＡの組み合わせ（総２５個ヒト化ペアリング）を６ウェルプレートを用い、ＰＥＩトランスフェクション方法でＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ付着細胞（ＬＧＣ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、Ｔｅｄｄｉｎｇｔｏｎ、ＵＫ）に一過性トランスフェクションさせた後、７日間培養した。サンプルを収集し、ヒトＩｇＧ１抗体を基準にして、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａバイオセンサー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｗｏｋｉｎｇｈａｍ、Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を使用してＯｃｔｅｔ ＱＫ３８４上で抗体濃度を測定した。
【0134】
得られた結果を下記の表８に示した。
【0135】
【表8】
【0136】
上記表８はキメラ抗体（ＶＨ０／ＶＬ０）および２５個ヒト化抗体のＨＥＫ細胞での発現後の上澄み液内のＩｇＧ濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。
【0137】
表８に示されているように、試験された全ての抗体が大体よく発現することを確認した。
【0138】
１．４．キメラおよびヒト化抗ＧＩＴＲ抗体のＳｉｎｇｌｅ ｃｙｃｌｅ ｋｉｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ
選別された全ての変異体（ヒト化抗体）のヒトＧＩＴＲ抗原に対する結合を評価しキメラ（ＶＨ０／ＶＬ０）抗体に最も近い親和度を有する先導ヒト化ＩｇＧ抗体を選別するために、形質感染された細胞培養物の上澄み液に対してシングルサイクル動力学的解析を行った。動力学実験は２５℃温度条件下でＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖ３．０．１２．１５６５５およびＢｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖ３．０．１２．１５６５５（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を実行するＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋを使用して行った。
選別された全ての変異体（ヒト化抗体）のヒトＧＩＴＲ抗原に対する結合を評価しキメラ（ＶＨ０／ＶＬ０）抗体に最も近い親和度を有する先導ヒト化ＩｇＧ抗体を選別するために、形質感染された細胞培養物の上澄み液に対してシングルサイクル動力学的解析を行った。動力学実験は２５℃温度条件下でＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖ３．０．１２．１５６５５およびＢｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖ３．０．１２．１５６５５（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を実行するＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋを使用して行った。
【0139】
１％ ＢＳＡ ｗ／ｖ（Ｓｉｇｍａ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）（参照表面に対する非特異的結合を減少させるために）補充されたＨＢＳ－Ｐ＋（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）をランニングバッファーとして使用し、リガンドと分析物の希釈にも使用した。ＩｇＧを含む上澄み液をランニングバッファーで１μｇ／ｍＬに希釈した。各サイクルの開始時に、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａセンサーチップ（Ｃｙｔｉｖａ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）のチャンネル１～８上のＦｃ２にローディングした。ＩｇＧ抗体を１０μｌ／ｍｉｎの流速で捕獲して、固定水準（ｉｍｍｏｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌ；ＲＬ）が～１３０ＲＵになるようにした。その後、表面を安定化させた。
【0140】
潜在的質量伝達効果（ｍａｓｓ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｅｆｆｅｃｔｓ）を最少化するために４０μｌ／ｍｉｎ流速で注入された組換えヒトＧＩＴＲ（Ｃａｔ Ｎｏ．１３６４３－Ｈ０８Ｈ、Ｌｏｔ Ｎｏ．ＬＣ１２ＪＡ２５０９、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ）を分析物（ａｎａｌｙｔｅ）として使用してシングルサイクル動力学データを得た。抗原はランニングバッファーに０．６１２５ｎＭ～１０ｎＭ濃度範囲で２倍ずつ希釈（５個地点）し、各濃度の間に再生が無いようにして使用した。抗原濃度が増加する５個地点のそれぞれの注入に対して２００秒間の会合相をモニタリングし、最後の抗原注入以後６００秒間の単一解離相を測定した。１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）の単回注入によってセンサーチップ表面を再生させた。
【0141】
二重準拠センサーグラムはＬａｎｇｍｕｉｒ（１：１）結合モデルでフィッティングし、実験曲線とフィットした（観測および予想）曲線の間の偏差を説明するＣｈｉ二乗値を使用してモデルに対するデータの正確度（ｃｌｏｓｅｎｅｓｓ）を評価した。フィッティングアルゴリズムはＣｈｉ二乗値を最少化するようにした。
【0142】
得られた結果を表９に示した。
【0143】
【表9】
【0144】
表９はＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋを使用して測定されたヒトＧＩＴＲ抗原に結合するキメラ（ＶＨ０／ＶＬ０）およびヒト化変異体（細胞培養上澄み液で試験）のシングルサイクル動力学的パラメータを示す。相対ＫＤは、ヒト化変異体のＫＤを同一実験で分析されたＶＨ０／ＶＬ０キメラ抗体のＫＤで割って計算した。
【0145】
表９に示したように、試験された全てのヒト化変異体（抗体）のヒトＧＩＴＲに対する結合と関連したＫＤ値はＶＨ０／ＶＬ０と比較して５．９倍以内と示された。相対的発現水準、ヒト化のパーセンテージ、ＭＨＣクラスＩＩ結合リスクおよび相対的ＫＤ値（上澄み液に対するＢｉａｃｏｒｅシングルサイクル動力学的解析で得られる）を考慮して、６個ヒト化変異体（ＶＨ３／ＶＬ１、ＶＨ３／ＶＬ３、ＶＨ３／ＶＬ４、ＶＨ３／ＶＬ５、ＶＨ４／ＶＬ３、およびＶＨ４／ＶＬ４）を選択して以後熱安定性分析に使用した。
【0146】
１．５．熱安定性評価（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）
本来状態から変性状態にアンフォールディング（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）される温度から抗体の熱安定性情報を得るために、温度勾配安定性試験（Ｔｈｅｒｍａｌ ｒａｍｐ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）（ＴｍおよびＴａｇｇ）を行った。このようなアンフォールディング過程は狭い温度範囲で発生し、このような転移の中間地点を‘溶融温度’または‘Ｔｍ’という。この時、タンパク質が形態的変化を経るので、Ｓｙｐｒｏ Ｒａｎｇｅ（タンパク質の露出された疎水性領域に結合する）の蛍光を測定して、タンパク質の溶融温度を決定した。
本来状態から変性状態にアンフォールディング（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）される温度から抗体の熱安定性情報を得るために、温度勾配安定性試験（Ｔｈｅｒｍａｌ ｒａｍｐ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）（ＴｍおよびＴａｇｇ）を行った。このようなアンフォールディング過程は狭い温度範囲で発生し、このような転移の中間地点を‘溶融温度’または‘Ｔｍ’という。この時、タンパク質が形態的変化を経るので、Ｓｙｐｒｏ Ｒａｎｇｅ（タンパク質の露出された疎水性領域に結合する）の蛍光を測定して、タンパク質の溶融温度を決定した。
【0147】
サンプルをＰＢＳで最終試験濃度である０．５ｍｇ／ｍｌまで希釈し、ＳｙｐｒｏＴＭ Ｏｒａｎｇｅ（１６０ｘストック溶液；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を２０ｘ溶液の最終濃度で添加した。各サンプル混合物は９μＬずつＵＮｉマイクロキュベットに二回ずつローディングした。サンプルに対して１５～９５℃の温度勾配を実施した（勾配速度が０．３℃／分及び励起が４７３ｎｍ）。２５０～７２０ｎｍで全体放出スペクトルを収集し、５１０－６８０ｎｍの間の曲線下面積を使用して転移曲線の変曲点（ＴｏｎｓｅｔおよびＴｍ）を計算した。４７３ｎｍで静的光散乱法（ＳＬＳ）をモニタリングしてタンパク質凝集を検出し、Ｔａｇｇ（凝集開始）は結果ＳＬＳプロファイルから計算した。データ分析はＵＮｃｌｅＴＭ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０（ＡＢＺＥＮＡ）を使用して行った。
【0148】
上述したようにＵＮｃｌｅ ｂｉｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｐｌａｔｆｏｒｍを使用して得られたヒト化抗体およびキメラ抗体の熱安定性数値を表１０に示した。
【0149】
【表10】
【0150】
表１０で確認されるように、大部分のヒト化抗体はキメラ抗体と同等以上の熱安定性を示した。
【0151】
１．６．マルチサイクル動力学的解析を用いたヒト化変異体の親和度測定
キメラ抗体と６個先導ヒト化変異体（ＶＨ３／ＶＬ１、ＶＨ３／ＶＬ３、ＶＨ３／ＶＬ４、ＶＨ３／ＶＬ５、ＶＨ４／ＶＬ３、およびＶＨ４／ＶＬ４）のヒトＧＩＴＲ抗原に対する結合親和度を測定するために、精製されたタンパク質（抗体）に対するマルチサイクル動力学的解析を行った。動力学的実験は２５℃でＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖ３．０．１２．１５６５５およびＢｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖ３．０．１２．１５６５５（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して行った。
キメラ抗体と６個先導ヒト化変異体（ＶＨ３／ＶＬ１、ＶＨ３／ＶＬ３、ＶＨ３／ＶＬ４、ＶＨ３／ＶＬ５、ＶＨ４／ＶＬ３、およびＶＨ４／ＶＬ４）のヒトＧＩＴＲ抗原に対する結合親和度を測定するために、精製されたタンパク質（抗体）に対するマルチサイクル動力学的解析を行った。動力学的実験は２５℃でＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖ３．０．１２．１５６５５およびＢｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖ３．０．１２．１５６５５（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して行った。
【0152】
１％ ＢＳＡ ｗ／ｖ（Ｓｉｇｍａ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）が補充されたＨＢＳ－ＥＰ＋（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）をランニングバッファーとして使用し、リガンドと分析物希釈にも使用した。精製された先導抗体をランニングバッファーで１μｇ／ｍＬまで希釈し、各サイクルの開始時に、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａセンサーチップ（Ｃｙｔｉｖａ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）のチャンネル１～８上のＦｃ２にローディングした。抗体を１０μｌ／ｍｉｎ流速でキャプチャーして固定化水準（ＲＬ）が～１２０ＲＵになるようにした。その後、表面が安定化されるように置いた。
【0153】
潜在的物質移動効果を最少化するために３０μｌ／分流速で注入された組換えヒトＧＩＴＲ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ）を分析物として使用してマルチサイクル動力学的データを得た。抗原（ＧＩＴＲ）はランニングバッファーに１．２５ｎＭ～４０ｎＭ濃度範囲で２倍ずつ希釈（６個地点）した。各濃度で、２１０秒間、会合相をモニタリングし、１２００秒間、解離相を測定した。１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）を１回で注入してサイクルの間にセンサーチップ表面再生を行った。動力学的サイクルにわたって表面と分析物全ての安定性を確認するために、ブランクの多回反復および２つ濃度の分析物の反復を動力学的ランでプログラミングした。
【0154】
得られた結果のうちのキメラ抗体（ＶＨ０／ＶＬ０）と６個先導抗体に対する結果を表１１に示した。
【0155】
【表11】
【0156】
上記表１１は、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋを使用して測定した精製された６個のヒト化抗体およびキメラ抗体（ＶＨ０／ＶＬ０）のヒトＧＩＴＲ抗原に対する結合パラメータを示す。
【0157】
表１１に示されているように、試験された抗体全てヒトＧＩＴＲに対する結合力が優れると示され、ヒト化抗体は全てＶＨ０／ＶＬ０キメラ抗体と比較して１．５倍以内の高い結合力を示した。
【0158】
１．７．エピトープマッピング
高解像度でＧＩＴＲ／５１Ｂ複合体のエピトープを決定するためにタンパク質複合体を重水素架橋剤と共にインキュベーションし、多重酵素切断（ｍｕｌｔｉ－ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ）を行った。このように架橋されたペプチドを強化した後、サンプルを高分解能質量分析器（ｎＬＣ－Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＭＳ）で分析し生成されたデータをＸＱｕｅｓｔおよびＳｔａｖｒｏｘソフトウェアを使用して分析した。
高解像度でＧＩＴＲ／５１Ｂ複合体のエピトープを決定するためにタンパク質複合体を重水素架橋剤と共にインキュベーションし、多重酵素切断（ｍｕｌｔｉ－ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ）を行った。このように架橋されたペプチドを強化した後、サンプルを高分解能質量分析器（ｎＬＣ－Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＭＳ）で分析し生成されたデータをＸＱｕｅｓｔおよびＳｔａｖｒｏｘソフトウェアを使用して分析した。
【0159】
分析は、ｎＬＣクロマトグラフィーをＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析装置と共に使用して行った。
【0160】
ｈＧＩＴＲ（Ｈｉｓ ｔａｇ含む；Ｃａｔ．ＧＩＲ－Ｈ５２２８、Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および５１Ｂ抗体の混合物を下記の濃度で準備した。
【0161】
【表12】
【0162】
上述したように準備したＧＩＴＲ／５１Ｂ混合物２０μＬを室温で１８０分培養時間前にＤＳＳ ｄ０／ｄ１２（２ｍｇ／ｍＬ、ＤＭＦ）２μＬと混合した後、室温で１８０分間培養した。培養後、重炭酸アンモニウム １μＬ（最終濃度２０ｍＭ）を添加して反応を中止させた後、室温で１時間培養した。その後、溶液をｓｐｅｅｄｖａｃで乾燥させた後、Ｈ２Ｏで８Ｍの尿素を懸濁した（２０μＬ）。混合後、ＤＴＴ（５００ｍＭ）２μｌを上記溶液に添加した。その後、混合物を３７℃で１時間インキュベーションした。その後、ヨードアセトアミド（１Ｍ）２μｌを添加した後、暗室および室温条件で１時間インキュベーションした。インキュベーション後、タンパク質バッファー８０μｌを添加した。タンパク質バッファーにおいて、トリプシンバッファー（ｔｒｙｐｓｉｎ ｂｕｆｆｅｒ）は５０ｍＭのＡｍｂｉｃ ｐＨ８．５および５％のアセトニトリルを含み；キモトリプシンバッファー（Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ ｂｕｆｆｅｒ）はＴｒｉｓ ＨＣｌ １００ｍＭおよびＣａＣｌ２ １０ｍＭ ｐＨ７．８を含み；ＡＳＰ－Ｎバッファーはリン酸バッファー ５０ｍＭ ｐＨ７．８を含み；エラスターゼバッファーはＴｒｉｓ ＨＣｌ ５０ｍＭ ｐＨ８．０を含み；サーモリシンバッファーはＴｒｉｓ ＨＣｌ ５０ｍＭおよびＣａＣｌ２ ０．５ｍＭ ｐＨ９．０を含む。
【0163】
タンパク質分解酵素反応を以下の通り行った。
－トリプシンタンパク質分解（Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ）
準備された還元／アルキル化ＧＩＴＲ／５１Ｂ混合物 １００μｌをトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．７μｌと１／１００の比率で混合した。タンパク質分解混合物を３７℃で一晩インキュベーションした。
－トリプシンタンパク質分解（Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ）
準備された還元／アルキル化ＧＩＴＲ／５１Ｂ混合物 １００μｌをトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．７μｌと１／１００の比率で混合した。タンパク質分解混合物を３７℃で一晩インキュベーションした。
【0164】
－キモトリプシンタンパク質分解（Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ）
準備された還元／アルキル化ＧＩＴＲ／５１Ｂ混合物 １００μｌをキモトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．５μｌと１／２００の比率で混合した。タンパク質分解混合物を２５℃で一晩インキュベーションした。
準備された還元／アルキル化ＧＩＴＲ／５１Ｂ混合物 １００μｌをキモトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．５μｌと１／２００の比率で混合した。タンパク質分解混合物を２５℃で一晩インキュベーションした。
【0165】
－ＡＳＰ－Ｎ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ
準備された還元／アルキル化ＧＩＴＲ／５１Ｂ混合物 １００μｌをＡＳＰ－Ｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．５μｌと１／２００の比率で混合した。タンパク質分解混合物を３７℃で一晩インキュベーションした。
準備された還元／アルキル化ＧＩＴＲ／５１Ｂ混合物 １００μｌをＡＳＰ－Ｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．５μｌと１／２００の比率で混合した。タンパク質分解混合物を３７℃で一晩インキュベーションした。
【0166】
－エラスターゼタンパク質分解（ＥｌａｓｔａｓｅＰｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ）
準備された還元／アルキル化ＧＩＴＲ／５１Ｂ混合物 １００μｌをエラスターゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．７μｌと１／１００の比率で混合した。タンパク質分解混合物を３７℃で一晩インキュベーションした。
準備された還元／アルキル化ＧＩＴＲ／５１Ｂ混合物 １００μｌをエラスターゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．７μｌと１／１００の比率で混合した。タンパク質分解混合物を３７℃で一晩インキュベーションした。
【0167】
－Ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ
準備された還元／アルキル化ＧＩＴＲ／５１Ｂ混合物 １００μｌをサーモリシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）１．４μｌと１／５０の比率で混合した。タンパク質分解混合物を７０℃で一晩インキュベーションした。
準備された還元／アルキル化ＧＩＴＲ／５１Ｂ混合物 １００μｌをサーモリシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）１．４μｌと１／５０の比率で混合した。タンパク質分解混合物を７０℃で一晩インキュベーションした。
【0168】
分解後、ホルム酸を最終濃度１％（ｖ／ｖ）の量で添加した。
【0169】
架橋ペプチドをＸｑｕｅｓｔ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０を使用して分析した。
【0170】
タンパク質複合体ＧＩＴＲ／５１Ｂのトリプシン、キモトリプシン、ＡＳＰ－Ｎ、エラスターゼ、およびサーモリシンタンパク質分解（重水素化ｄ０ｄ１２使用）後、ｎＬＣ－ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳ／ＭＳ分析を通じてＧＩＴＲと５１Ｂの間に１２個の架橋ペプチドを検出した。
【0171】
分析結果、ＧＩＴＲアミノ酸配列（配列番号３３の２６－２４１部位のアミノ酸配列）の９２Ｓ（配列番号３３の２６番目アミノ酸から起算して、９２番目アミノ酸残基であるＳｅｒ（Ｓ）、以下、同一に解釈）、９６Ｓ、１０７Ｔ、１１０Ｔ、１１６Ｔ、１２２Ｋおよび１３２Ｓは５１Ｂ抗体と特異的に架橋されたことを確認し、下記のアミノ酸配列をＧＩＴＲ上のエピトープで確認した；
１）アミノ酸残基９２－９６（ＳＧＴＦＳ、配列番号３４）
２）アミノ酸残基１０７－１１６（ＴＤＣＴＱＦＧＦＬＴ、配列番号３５）
３）アミノ酸残基１２２－１３２（ＫＴＨＮＡＶＣＶＰＧＳ、配列番号３６）
１）アミノ酸残基９２－９６（ＳＧＴＦＳ、配列番号３４）
２）アミノ酸残基１０７－１１６（ＴＤＣＴＱＦＧＦＬＴ、配列番号３５）
３）アミノ酸残基１２２－１３２（ＫＴＨＮＡＶＣＶＰＧＳ、配列番号３６）
【0172】
確認されたＧＩＴＲ上のエピトープ領域を図２に示した。図２はＧＩＴＲと５１Ｂ間相互作用部位を示す。ＧＩＴＲ ＰＤＢ構造７ＫＨＤにおいてエピトープ部位を濃い陰影で表示した。ＧＩＴＲタンパク質構造において濃い陰影で表示されたアミノ酸はＧＩＴＲ配列の９２－９６（ＳＧＴＰＳ、配列番号３４）、１０７－１１６（ＴＤＣＴＱＦＧＦＬＴ、配列番号３５）、および１２２－１３２（ＫＴＨＮＡＶＣＶＰＧＳ、配列番号３６）に該当する。図２で、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅはそれぞれ前面図（Ａ）、後面図（Ｂ）、側面図１（Ｃ）、側面図２（Ｄ）および平面図（Ｅ）のリボン／表面形状を示し、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、およびＪはそれぞれ正面図（Ｆ）、後面図（Ｇ）、側面図１（Ｈ）、側面図２（Ｉ）、および平面図（Ｊ）のリボン形状を示す。
【0173】
１．８．抗ＧＩＴＲ抗体のヒトＧＩＴＲタンパク質に対する特異性および結合親和度測定
１．８．１．抗ＧＩＴＲ抗体のヒトＧＩＴＲ（ｈＧＩＴＲ）タンパク質に対する結合力分析（ＥＬＩＳＡによる）
ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌ濃度の組換えヒトＧＩＴＲタンパク質（ＰＢＳ内）でコーティングし４℃で一晩インキュベーションした。プレートを遮断緩衝液（ＰＢＳ内の３％のスキムミルク）で１時間遮断し、連続希釈された抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ ＶＨ０／Ｖｋ０（キメラ ａＧＩＴＲ ５１Ｂ ｍＡｂ）および抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ ＶＨ３／Ｖｋ４（ヒト化抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ ｍＡｂ）抗体（出発濃度 ３μｇ／ｍｌ；１：３連続希釈）をコーティングされたプレートに添加した。インキュベーション後、抗マウス／ヒトＩｇＧ－ＨＲＰ抗体（Ａｂｃａｍ）（１：１００００希釈）を各ウェルに添加した。プレートにＴＭＢ溶液を添加し、１Ｎ ＨＣｌで中止させた。ＯＤ値は、４５０ｎＭでＧｌｏＭａｘ（登録商標） Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｆｕｌｌ Ｌｏａｄｅｄで測定した。
１．８．１．抗ＧＩＴＲ抗体のヒトＧＩＴＲ（ｈＧＩＴＲ）タンパク質に対する結合力分析（ＥＬＩＳＡによる）
ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌ濃度の組換えヒトＧＩＴＲタンパク質（ＰＢＳ内）でコーティングし４℃で一晩インキュベーションした。プレートを遮断緩衝液（ＰＢＳ内の３％のスキムミルク）で１時間遮断し、連続希釈された抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ ＶＨ０／Ｖｋ０（キメラ ａＧＩＴＲ ５１Ｂ ｍＡｂ）および抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ ＶＨ３／Ｖｋ４（ヒト化抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ ｍＡｂ）抗体（出発濃度 ３μｇ／ｍｌ；１：３連続希釈）をコーティングされたプレートに添加した。インキュベーション後、抗マウス／ヒトＩｇＧ－ＨＲＰ抗体（Ａｂｃａｍ）（１：１００００希釈）を各ウェルに添加した。プレートにＴＭＢ溶液を添加し、１Ｎ ＨＣｌで中止させた。ＯＤ値は、４５０ｎＭでＧｌｏＭａｘ（登録商標） Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｆｕｌｌ Ｌｏａｄｅｄで測定した。
【0174】
得られた結果を図３ａに示した。図３ａに示されているように、試験された抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ ＶＨ０／Ｖｋ０キメラ抗体および抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ ＶＨ３／Ｖｋ４ヒト化抗体のｈＧＩＴＲタンパク質結合の特異性を確認した。キメラおよびヒト化抗体両方とも容量依存的方式でｈＧＩＴＲタンパク質に対する相当な結合を示した。
【0175】
１．８．２．ヒト初代免疫細胞での抗ＧＩＴＲ抗体のｈＧＩＴＲに対する特異性および結合親和度
Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞を含むヒト初代リンパ球で発現するＧＩＴＲ分子に対する抗ＧＩＴＲ抗体結合を測定するために、ＡＰＥＸＴＭ抗体標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造者指針に従って抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ ＶＨ０／Ｖｋ０（キメラｍＡｂ）および５１ＢＶＨ３／Ｖｋ４（ヒト化ｍＡｂ）をそれぞれＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８（ＡＦ４８８）と接合させた。健康な供与者から分離されたヒト末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）をＳｔｅｍＣｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入し、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下で１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳおよび４００Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ－２を含むＰＲＭＩ１６４０培地と共に５％ ＣＯ２および３７℃条件で２日間培養した。培養中に、ＩＬ－２ ４００Ｕ／ｍｌおよびＩＬ－１５ ２０ｎｇ／ｍｌを２または３日ごとに添加した。培養後、細胞を、Ｔ細胞表面マーカ（ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８）およびＮＫまたはＮＫＴ細胞表面マーカ（ＣＤ５６）に対する蛍光体結合抗体および多様な容量（５０、２５０、７５０、１２５０、および２５００ｎｇ／ｍｌ）のＡＦ４８８－標識された抗ＧＩＴＲ抗体で染色した。細胞をフローサイトメーター（ＣｙｔｏＦＬＥＸ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析し、データはＦｌｏｗｊｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ）を使用して分析した。全体Ｔ細胞（ＣＤ３＋）、ＣＤ４＋ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８－）、ＣＤ８＋ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４－）、ＣＤ５６＋ ＮＫ細胞（ＣＤ３－ＣＤ５６＋）およびＮＫＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ５６＋）での抗ＧＩＴＲ抗体のＧＩＴＲ結合を測定した。
Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞を含むヒト初代リンパ球で発現するＧＩＴＲ分子に対する抗ＧＩＴＲ抗体結合を測定するために、ＡＰＥＸＴＭ抗体標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造者指針に従って抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ ＶＨ０／Ｖｋ０（キメラｍＡｂ）および５１ＢＶＨ３／Ｖｋ４（ヒト化ｍＡｂ）をそれぞれＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８（ＡＦ４８８）と接合させた。健康な供与者から分離されたヒト末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）をＳｔｅｍＣｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入し、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下で１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳおよび４００Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ－２を含むＰＲＭＩ１６４０培地と共に５％ ＣＯ２および３７℃条件で２日間培養した。培養中に、ＩＬ－２ ４００Ｕ／ｍｌおよびＩＬ－１５ ２０ｎｇ／ｍｌを２または３日ごとに添加した。培養後、細胞を、Ｔ細胞表面マーカ（ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８）およびＮＫまたはＮＫＴ細胞表面マーカ（ＣＤ５６）に対する蛍光体結合抗体および多様な容量（５０、２５０、７５０、１２５０、および２５００ｎｇ／ｍｌ）のＡＦ４８８－標識された抗ＧＩＴＲ抗体で染色した。細胞をフローサイトメーター（ＣｙｔｏＦＬＥＸ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析し、データはＦｌｏｗｊｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ）を使用して分析した。全体Ｔ細胞（ＣＤ３＋）、ＣＤ４＋ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８－）、ＣＤ８＋ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４－）、ＣＤ５６＋ ＮＫ細胞（ＣＤ３－ＣＤ５６＋）およびＮＫＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ５６＋）での抗ＧＩＴＲ抗体のＧＩＴＲ結合を測定した。
【0176】
得られた結果を図３ｂに示した。抗ＧＩＴＲ ５１Ｂキメラおよびヒト化抗体は容量依存的に初代 Ｔ細胞、ＮＫおよびＮＫＴ細胞に結合することを確認した。結果は、免疫細胞で発現されたＧＩＴＲタンパク質に対する抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ抗体の特異性を示す。
【0177】
実施例２．細胞ベースのレポーターアッセイを通じた抗ＧＩＴＲ抗体の生物学的活性（抗ＧＩＴＲ作動薬の活性）試験
Ｐｒｏｍｅｇａ ＧＩＴＲ ｂｉｏａｓｓａｙ ｋｉｔをＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）から購入して使用した。ＧＩＴＲエフェクター細胞（Ｐｒｏｍｅｇ）の一つのバイアル（０．５ｍＬ）をアッセイバッファー（９９％ ＲＰＭＩ、１％ ＦＢＳ）９．５ｍＬに添加し、細胞懸濁液（５０μＬ）を９６ウェル白色の平底アッセイプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－ｏｎｅ、Ｃｈｏｎｂｕｒｉ、Ｔｈａｉｌａｎｄ）に移して入れた。アッセイバッファーを使用して抗ＧＩＴＲ抗体の連続希釈液（出発濃度：５μｇ／ｍｌ）を製造した後、最終抗体濃度０．００３２７６８μｇ／ｍｌまでアッセイバッファーで２．５倍ずつ追加的に希釈した。希釈された抗ＧＩＴＲ抗体２５μＬをアッセイプレートに添加した。３７℃および５％ ＣＯ２条件で６時間インキュベーション後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ Ｒｅａｇｅｎｔを添加し周囲温度（ａｍｂｉｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）で１０分間インキュベーションした。発光性はＰｒｏｍｅｇａＴＭ ＧｌｏＭａｘ（登録商標）プレートリーダーを使用して発光水準（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を測定した。ＲＬＵ対Ｌｏｇ１０［抗体］およびフォールド誘導対Ｌｏｇ１０［抗体］データをグラフで表示した。フィット曲線と抗体反応性のＥＣ５０値はｃｕｒｖｅ ｆｉｔｔｉｎｇ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｓｕｃｈ ａｓ ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標） ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して測定した。エッセイを通じて、ＧＩＴＲ作用型抗体（試験抗体）添加後に検出されるＧＩＴＲ－媒介発光水準を測定し、試験抗体の作用剤活性を確認した。比較抗体として、抗ＧＩＴＲ ２８Ｆ３抗体（ＢＭＳ；ＷＯ２０１５／１８７８３５参照）、抗ＧＩＴＲ １１０４１６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；“Ｈｅｉｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１７ ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｅｄｅｌ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１３”参照）および陽性対照群抗ＧＩＴＲ抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃａｔ． ＃ Ｋ１１７１）を使用した。
Ｐｒｏｍｅｇａ ＧＩＴＲ ｂｉｏａｓｓａｙ ｋｉｔをＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）から購入して使用した。ＧＩＴＲエフェクター細胞（Ｐｒｏｍｅｇ）の一つのバイアル（０．５ｍＬ）をアッセイバッファー（９９％ ＲＰＭＩ、１％ ＦＢＳ）９．５ｍＬに添加し、細胞懸濁液（５０μＬ）を９６ウェル白色の平底アッセイプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－ｏｎｅ、Ｃｈｏｎｂｕｒｉ、Ｔｈａｉｌａｎｄ）に移して入れた。アッセイバッファーを使用して抗ＧＩＴＲ抗体の連続希釈液（出発濃度：５μｇ／ｍｌ）を製造した後、最終抗体濃度０．００３２７６８μｇ／ｍｌまでアッセイバッファーで２．５倍ずつ追加的に希釈した。希釈された抗ＧＩＴＲ抗体２５μＬをアッセイプレートに添加した。３７℃および５％ ＣＯ２条件で６時間インキュベーション後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ Ｒｅａｇｅｎｔを添加し周囲温度（ａｍｂｉｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）で１０分間インキュベーションした。発光性はＰｒｏｍｅｇａＴＭ ＧｌｏＭａｘ（登録商標）プレートリーダーを使用して発光水準（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を測定した。ＲＬＵ対Ｌｏｇ１０［抗体］およびフォールド誘導対Ｌｏｇ１０［抗体］データをグラフで表示した。フィット曲線と抗体反応性のＥＣ５０値はｃｕｒｖｅ ｆｉｔｔｉｎｇ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｓｕｃｈ ａｓ ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標） ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して測定した。エッセイを通じて、ＧＩＴＲ作用型抗体（試験抗体）添加後に検出されるＧＩＴＲ－媒介発光水準を測定し、試験抗体の作用剤活性を確認した。比較抗体として、抗ＧＩＴＲ ２８Ｆ３抗体（ＢＭＳ；ＷＯ２０１５／１８７８３５参照）、抗ＧＩＴＲ １１０４１６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；“Ｈｅｉｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１７ ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｅｄｅｌ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１３”参照）および陽性対照群抗ＧＩＴＲ抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃａｔ． ＃ Ｋ１１７１）を使用した。
【0178】
得られた結果を図４に示した。抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ ＶＨ３／Ｖｋ５抗体（抗ＧＩＴＲ ５１Ｂと表示）の架橋によって抗ＧＩＴＲ抗体の作用剤活性を通じてＴ細胞活性化信号伝達が増加することを確認した。このような効能は比較抗体と比較して非常に優れることと示された。
【0179】
実施例３：抗ＧＯＴＲ抗体のサイトカイン生産効果
３．１．ヒト初代T細胞での抗ＧＩＴＲ抗体の容量依存的抗腫瘍サイトカイン生産誘導確認
サイトカイン生産のために、ヒトＰＢＭＣ（実施例１．８．２参照）を９６ウェル丸底プレート内の１０％の熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ １６４０培地で０．５×１０６細胞／ウェルの量で培養した。抗ＧＩＴＲ抗体（キメラ抗体および６種の先導ヒト化抗体、それぞれ１０μｇ／ｍｌおよび２０μｇ／ｍｌ）の存在下で、３７℃および５％ ＣＯ２条件で細胞を抗ＣＤ３モノクローナル抗体０．２μｇ／ｍｌおよび抗ＣＤ２８モノクローナル抗体１μｇ／ｍｌで１９時間活性化させた。比較抗体として抗ＧＩＴＲ抗体 １１０４１６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、培地単独（抗体無添加）は陰性対照群として使用した。共刺激抗体（抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体）処理された細胞にＢｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａを添加してサイトカイン分泌を遮断した。収穫した細胞をＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ固定死細胞染色溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色して室温で２０分間細胞の生存力を測定した。細胞を３０分間氷の上で表面マーカＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８それぞれに対するフルオロフォア接合抗体で標識された抗体（全てＢｉｏｌｅｇｅｎｄから入手）で染色した。ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＴＭ Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ａｎｄ Ｄｉｌｕｅｎｔ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で細胞固定および透過化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）後、細胞内サイトカイン染色を行った。その次に、透過バッファーで細胞内染色のためのＩＬ－２およびＩＦＮ－γそれぞれに対するフルオロフォア接合抗体（全てＢｉｏｌｅｇｅｎｄから入手）を使用して室温で３０分間細胞を染色した。その後、細胞をフローサイトメーター（ＣｙｔｏＦＬＥＸ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で測定し、データはｆｌｏｗｊｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ）を使用して分析した。比較抗体として抗ＧＩＴＲ １１０４１６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。
３．１．ヒト初代T細胞での抗ＧＩＴＲ抗体の容量依存的抗腫瘍サイトカイン生産誘導確認
サイトカイン生産のために、ヒトＰＢＭＣ（実施例１．８．２参照）を９６ウェル丸底プレート内の１０％の熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ １６４０培地で０．５×１０６細胞／ウェルの量で培養した。抗ＧＩＴＲ抗体（キメラ抗体および６種の先導ヒト化抗体、それぞれ１０μｇ／ｍｌおよび２０μｇ／ｍｌ）の存在下で、３７℃および５％ ＣＯ２条件で細胞を抗ＣＤ３モノクローナル抗体０．２μｇ／ｍｌおよび抗ＣＤ２８モノクローナル抗体１μｇ／ｍｌで１９時間活性化させた。比較抗体として抗ＧＩＴＲ抗体 １１０４１６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、培地単独（抗体無添加）は陰性対照群として使用した。共刺激抗体（抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体）処理された細胞にＢｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａを添加してサイトカイン分泌を遮断した。収穫した細胞をＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ固定死細胞染色溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色して室温で２０分間細胞の生存力を測定した。細胞を３０分間氷の上で表面マーカＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８それぞれに対するフルオロフォア接合抗体で標識された抗体（全てＢｉｏｌｅｇｅｎｄから入手）で染色した。ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＴＭ Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ａｎｄ Ｄｉｌｕｅｎｔ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で細胞固定および透過化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）後、細胞内サイトカイン染色を行った。その次に、透過バッファーで細胞内染色のためのＩＬ－２およびＩＦＮ－γそれぞれに対するフルオロフォア接合抗体（全てＢｉｏｌｅｇｅｎｄから入手）を使用して室温で３０分間細胞を染色した。その後、細胞をフローサイトメーター（ＣｙｔｏＦＬＥＸ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で測定し、データはｆｌｏｗｊｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ）を使用して分析した。比較抗体として抗ＧＩＴＲ １１０４１６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。
【0180】
得られた結果を図５ａ（ＣＤ４＋ Ｔ細胞でのＩＬ－２水準）、５ｂ（ＣＤ４＋ Ｔ細胞でのＩＦＮ－ｇａｍｍａ水準）、５ｃ（ＣＤ８＋ Ｔ細胞でのＩＬ－２水準）、および５ｄ（ＣＤ８＋ Ｔ細胞でのＩＦＮ－ｇａｍｍａ水準）に示した。図５ａ～５ｄで、各抗体に対する二つの結果のうち、左側は抗体濃度が１０μｇ／ｍｌである場合の結果、右側は抗体濃度が２０μｇ／ｍｌである場合の結果をそれぞれ示す。
【0181】
図５ａ～５ｄで示されるように、試験された全ての抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ抗体（キメラおよびヒト化）は免疫細胞表面のＧＩＴＲとの架橋を通じてＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞でのＴｈ１／Ｔｃ１サイトカイン生産を増加（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ）させ、これを通じて免疫反応を向上させることができる。抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ抗体処理時のサイトカイン（ＩＬ－２およびＩＦＮ－ガンマ）の水準は、比較抗体（クローン１１０４１６、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）と比較して顕著に高く示された。このような結果は、試験された全ての抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ抗体が強力且つ容量依存的にＴ細胞機能を向上させるのを示す。
【0182】
３．２．ヒトＴ細胞での抗ＧＩＴＲ抗体のサイトカイン生産増加効果確認
ヒトＰＢＭＣ（実施例１．８．２参照）でのサイトカイン生産を測定した。細胞（５００，０００細胞／反応）を抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ ＶＨ３／Ｖｋ４－ＩｇＧ１ヒト化抗体（試験抗体、１０μｇ／ｍｌ）の存在下で抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ ｎｏ．５５５３３６；０．２μｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ ｎｏ ５５５７２５；１μｇ／ｍｌ）と共に培養した。比較抗体として先に記載した抗ＧＩＴＲ抗体２８Ｆ３（ＢＭＳ）を試験抗体と同一な容量（１０μｇ／ｍｌ）で使用した。培養後、細胞を４℃で１０分間４００ｘｇでスピンダウンし、ＣＤ４＋ Ｔ細胞内のサイトカイン水準を測定した。このために次の方法で細胞内サイトカインを染色した：細胞をＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ ｆｉｘａｂｌｅ ｄｅａｄ ｃｅｌｌ ｄｙｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、３０分間氷の上でＣＤ４＋とＣＤ８＋ Ｔ細胞表面マーカに対するフルオロフォア（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）－接合抗体で標識した（抗ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、および抗ＣＤ８抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用してＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞表面を染色する）。ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＴＭ Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ａｎｄ Ｄｉｌｕｅｎｔ ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して製造者指針に従って細胞を固定化し浸透化させた（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ）。細胞を細胞内ＩＬ－２およびＩＦＮγに対するフルオロフォア－接合抗体で染色した。細胞をフローサイトメーター（ＣｙｔｏＦＬＥＸ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析し、データはＦｌｏｗｊｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ）で分析した。
ヒトＰＢＭＣ（実施例１．８．２参照）でのサイトカイン生産を測定した。細胞（５００，０００細胞／反応）を抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ ＶＨ３／Ｖｋ４－ＩｇＧ１ヒト化抗体（試験抗体、１０μｇ／ｍｌ）の存在下で抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ ｎｏ．５５５３３６；０．２μｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ ｎｏ ５５５７２５；１μｇ／ｍｌ）と共に培養した。比較抗体として先に記載した抗ＧＩＴＲ抗体２８Ｆ３（ＢＭＳ）を試験抗体と同一な容量（１０μｇ／ｍｌ）で使用した。培養後、細胞を４℃で１０分間４００ｘｇでスピンダウンし、ＣＤ４＋ Ｔ細胞内のサイトカイン水準を測定した。このために次の方法で細胞内サイトカインを染色した：細胞をＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ ｆｉｘａｂｌｅ ｄｅａｄ ｃｅｌｌ ｄｙｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、３０分間氷の上でＣＤ４＋とＣＤ８＋ Ｔ細胞表面マーカに対するフルオロフォア（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）－接合抗体で標識した（抗ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、および抗ＣＤ８抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用してＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞表面を染色する）。ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＴＭ Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ａｎｄ Ｄｉｌｕｅｎｔ ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して製造者指針に従って細胞を固定化し浸透化させた（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ）。細胞を細胞内ＩＬ－２およびＩＦＮγに対するフルオロフォア－接合抗体で染色した。細胞をフローサイトメーター（ＣｙｔｏＦＬＥＸ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析し、データはＦｌｏｗｊｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ）で分析した。
【0183】
得られた結果を図６に示した。図６で示されるように、抗ＧＩＴＲ ５１ＢＶＨ３／Ｖｋ４－ＩｇＧ１抗体はＣＤ４＋ Ｔ細胞でＴｈ１／Ｔｃ１サイトカイン生産を増加（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）させ、これによって免疫反応を向上させることができる。また、抗ＧＩＴＲ ５１ＢＶＨ３／Ｖｋ４－ＩｇＧ１抗体のサイトカイン生産水準は、比較抗体である２８Ｆ３と比較して高く示された。このような結果は、抗ＧＩＴＲ ５１ＢＶＨ３／Ｖｋ５－ＩｇＧ１抗体が比較抗体２８Ｆ３より非常に強力にエフェクターＴ細胞機能を増加させるのを示唆する。
【0184】
実施例４．抗ＧＩＴＲ抗体の免疫細胞増殖効果
４．１．ＩＬ－１５に対する反応においてＧＩＴＲ 架橋によるＮＫ細胞増殖強化
ＥＬＩＳＡプレートを抗ＧＩＴＲ ５１Ｂヒト化抗体（ＶＨ３／Ｖｋ１、ＶＨ３／Ｖｋ３、ＶＨ３／Ｖｋ４）１０μｇ／ｍｌでコーティングした。ＮＫ細胞はＮＫ分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して製造者指針に従ってヒトＰＢＭＣ（実施例１．８．２参照）から分離しｃｅｌｌ ｔｒａｃｋｅｒ ｖｉｏｌｅｔ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で３７℃で２０分間染色した。分離されたＮＫ細胞（図７ａ参照）またはＮＫ細胞を含有するＰＢＭＣ（図７ｂ参照、５００，０００細胞／反応）を抗ＧＩＴＲ抗体コーティングされたプレートに添加した後、ＩＬ－１５（５ｎｇ／ｍｌ）と共に６日間培養した。培養後、細胞をｌｉｖｅ／ｄｅａｄ ｒｅａｇｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤＴＭ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ）、ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ５６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）抗体で染色し、フローサイトメーター（ＣｙｔｏＦｌｅｘ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析した。その次に、データをＦｌｏｗｊｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ）で分析した。
４．１．ＩＬ－１５に対する反応においてＧＩＴＲ 架橋によるＮＫ細胞増殖強化
ＥＬＩＳＡプレートを抗ＧＩＴＲ ５１Ｂヒト化抗体（ＶＨ３／Ｖｋ１、ＶＨ３／Ｖｋ３、ＶＨ３／Ｖｋ４）１０μｇ／ｍｌでコーティングした。ＮＫ細胞はＮＫ分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して製造者指針に従ってヒトＰＢＭＣ（実施例１．８．２参照）から分離しｃｅｌｌ ｔｒａｃｋｅｒ ｖｉｏｌｅｔ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で３７℃で２０分間染色した。分離されたＮＫ細胞（図７ａ参照）またはＮＫ細胞を含有するＰＢＭＣ（図７ｂ参照、５００，０００細胞／反応）を抗ＧＩＴＲ抗体コーティングされたプレートに添加した後、ＩＬ－１５（５ｎｇ／ｍｌ）と共に６日間培養した。培養後、細胞をｌｉｖｅ／ｄｅａｄ ｒｅａｇｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤＴＭ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ）、ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ５６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）抗体で染色し、フローサイトメーター（ＣｙｔｏＦｌｅｘ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析した。その次に、データをＦｌｏｗｊｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ）で分析した。
【0185】
得られた結果を図７ａ（分離されたＮＫ細胞）および７ｂ（ＮＫ細胞を含有するＰＢＭＣ）に示した。ＧＩＴＲが架橋される時、ＩＬ－１５－誘導増殖は分離されたＮＫ細胞（Ａ）およびＰＢＭＣ内のＮＫ細胞（Ｂ）で増加する。試験された全ての抗ＧＩＴＲ抗体はヒト初代Ｔ細胞でＮＫ細胞増殖を増加させた。このような結果は、抗ＧＩＴＲ抗体がＧＩＴＲとのｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｉｎｇを通じて強化された免疫機能を有するのを立証し、これによって抗腫瘍活性を有することができるのを示唆する。
【0186】
４．２．抗ＧＩＴＲ抗体のＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖強化効果
Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｋｉｔｓを使用して製造者指針に従ってヒトＰＢＭＣ（実施例１．８．２参照）からＣＤ８＋ Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ、およびＮＫ細胞を分離した（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｋｉｔｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）：ＣＤ８＋ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ｈｕｍａｎ（１３０－０９６－４９５）、ＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ ＣＤ１２７－ｄｉｍ Ｔｒｅｇ ｃｅｌｌ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ ＩＩ（１３０－０９４－７７５）、およびＮＫ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ｈｕｍａｎ（１３０－０９２－６５７））。分離されたＴｒｅｇ細胞の数はｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎを通じて測定し、ＬＵＮＡ－ＩＩＴＭ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒを使用した。ＮＫ細胞：ＣＤ８細胞：Ｔｒｅｇ細胞の比率が４：４：１になるように細胞をシーディングし、抗ＧＩＴＲ抗体５１Ｂ ＶＨ０／Ｖｋ０、ＶＨ３／Ｖｋ５、ＶＨ４／Ｖｋ３、およびＶＧ４／Ｖｋ４をそれぞれ１０μｇ／ｍＬの量でウェルに添加した。準備された細胞および抗ＧＩＴＲ抗体の混合物をＩＬ－２（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下でＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）と共に９６時間培養した。培養後、細胞をＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４およびｌｉｖｅ／ｄｅａｄマーカに対して染色した後、４℃で２０分間ＣｙｔｏＦｉｘ／ＣｙｔｏＰｅｒｍ（ＢＤ ｎ．５５４７２２）を使用して固定および透過化した。その後、Ｋｉ６７の検出のためにＫｉ６７抗体で細胞内染色を行い、細胞をフローサイトメーター（ＣｙｔｏＦｌｅｘ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析した。
Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｋｉｔｓを使用して製造者指針に従ってヒトＰＢＭＣ（実施例１．８．２参照）からＣＤ８＋ Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ、およびＮＫ細胞を分離した（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｋｉｔｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）：ＣＤ８＋ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ｈｕｍａｎ（１３０－０９６－４９５）、ＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ ＣＤ１２７－ｄｉｍ Ｔｒｅｇ ｃｅｌｌ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ ＩＩ（１３０－０９４－７７５）、およびＮＫ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ｈｕｍａｎ（１３０－０９２－６５７））。分離されたＴｒｅｇ細胞の数はｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎを通じて測定し、ＬＵＮＡ－ＩＩＴＭ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒを使用した。ＮＫ細胞：ＣＤ８細胞：Ｔｒｅｇ細胞の比率が４：４：１になるように細胞をシーディングし、抗ＧＩＴＲ抗体５１Ｂ ＶＨ０／Ｖｋ０、ＶＨ３／Ｖｋ５、ＶＨ４／Ｖｋ３、およびＶＧ４／Ｖｋ４をそれぞれ１０μｇ／ｍＬの量でウェルに添加した。準備された細胞および抗ＧＩＴＲ抗体の混合物をＩＬ－２（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下でＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）と共に９６時間培養した。培養後、細胞をＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４およびｌｉｖｅ／ｄｅａｄマーカに対して染色した後、４℃で２０分間ＣｙｔｏＦｉｘ／ＣｙｔｏＰｅｒｍ（ＢＤ ｎ．５５４７２２）を使用して固定および透過化した。その後、Ｋｉ６７の検出のためにＫｉ６７抗体で細胞内染色を行い、細胞をフローサイトメーター（ＣｙｔｏＦｌｅｘ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析した。
【0187】
得られた結果を図８に示した。図８に示されるように、抗ＧＩＴＲ抗体はｈｕｍａｎ 初代 ＰＢＭＣｓでＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖を増加させ、これは抗ＧＩＴＲ抗体によって人間の免疫細胞機能が向上できるのを示唆する。
【0188】
４．３．抗ＧＩＴＲ抗体によるＴ調節細胞（Ｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ）およびＮＫ細胞の免疫調節（Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）
抗ＧＩＴＲ ５１ＢＶＨ３／Ｖｋ４抗体と共にＰＢＭＣ（実施例１．８．２参照）をインキュベーションした後、ＮＫ細胞でＣＤ１０７ａを測定してＮＫ細胞活性化を測定し（図９ａ参照）、Ｔｒｅｇ枯渇（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）に対する抗ＧＩＴＲ抗体の効果を評価した（図９ｂ参照）。より具体的に、抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ ＶＨ３／Ｖｋ４抗体（５μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌ）をＣＤ３およびＣＤ２８抗体の存在下でヒトＰＢＭＣと共培養し、Ｔｒｅｇ細胞の頻度をフローサイトメトリーで評価した。抗ＧＩＴＲ未処理群を対照群にしてＴｒｅｇ細胞数を比較した。
抗ＧＩＴＲ ５１ＢＶＨ３／Ｖｋ４抗体と共にＰＢＭＣ（実施例１．８．２参照）をインキュベーションした後、ＮＫ細胞でＣＤ１０７ａを測定してＮＫ細胞活性化を測定し（図９ａ参照）、Ｔｒｅｇ枯渇（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）に対する抗ＧＩＴＲ抗体の効果を評価した（図９ｂ参照）。より具体的に、抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ ＶＨ３／Ｖｋ４抗体（５μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌ）をＣＤ３およびＣＤ２８抗体の存在下でヒトＰＢＭＣと共培養し、Ｔｒｅｇ細胞の頻度をフローサイトメトリーで評価した。抗ＧＩＴＲ未処理群を対照群にしてＴｒｅｇ細胞数を比較した。
【0189】
得られた結果（抗体濃度１０μｇ／ｍｌ）を図９ａ（ＣＤ１０７ａ水準）および９ｂ（Ｔｒｅｇの枯渇）に示した。抗ＧＩＴＲ ５１ＢＶＨ３／Ｖｋ４抗体を通じたＧＩＴＲ 架橋はＣＤ１０７ａのＮＫ細胞表面発現を誘導する。したがって、抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ ＶＨ３／Ｖｋ４抗体はＮＫ細胞を有意に活性化させる（図９ａ参照）。また、抗ＧＩＴＲ抗体（抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ ＶＨ３／Ｖｋ４）とヒトＰＢＭＣの共培養によってＴｒｅｇ数が減少し（図９ｂ参照）、これは抗ＧＩＴＲ抗体のＧＩＴＲとの架橋によってＮＫ細胞によるＴｒｅｇ除去を誘導するのを示唆する。したがって、抗ＧＩＴＲ抗体は、ＮＫ細胞活性化を誘導しＴｒｅｇに対するＮＫ細胞のＴｒｅｇ細胞毒性を促進する。腫瘍微小環境で、Ｔｒｅｇ細胞の数と機能が増加すれば免疫機能を抑制して抗腫瘍効果を抑制することを考慮する時、試験された抗ＧＩＴＲ抗体はＴｒｅｇ細胞数を減少させて抗腫瘍効果を向上させることができる。
【0190】
実施例５．抗ＧＩＴＲ抗体の癌細胞死滅効果
抗ＧＩＴＲ抗体ヒト化変異体（抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ ＶＨ３／Ｖｋ４および５１Ｂ ＶＨ３／Ｖｋ３抗体）のＳＫＯＶ－３卵巣癌細胞に対する細胞毒性を試験した。このために、エフェクター細胞とターゲット細胞比率（Ｅ：Ｔ）が１０：１になるようにＳＫＯＶ－３ ｃｅｌｌｓ（ＡＴＣＣ、２．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）とＰＢＭＣｓ（実施例１．８．２参照）を抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ抗体（各１０μｇ／ｍＬ）と共に共培養した。Ｔ細胞を活性化させるために、Ｃｙｔｏｓｔｉｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を各ウェルに添加した。比較抗体として、先に説明した抗ＧＩＴＲ抗体１１０４１６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して同一の方式で試験した。ＩｎｃｕＣｙｔｅ ｎａｔｉｖｅ ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してターゲット細胞を計数した。
抗ＧＩＴＲ抗体ヒト化変異体（抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ ＶＨ３／Ｖｋ４および５１Ｂ ＶＨ３／Ｖｋ３抗体）のＳＫＯＶ－３卵巣癌細胞に対する細胞毒性を試験した。このために、エフェクター細胞とターゲット細胞比率（Ｅ：Ｔ）が１０：１になるようにＳＫＯＶ－３ ｃｅｌｌｓ（ＡＴＣＣ、２．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）とＰＢＭＣｓ（実施例１．８．２参照）を抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ抗体（各１０μｇ／ｍＬ）と共に共培養した。Ｔ細胞を活性化させるために、Ｃｙｔｏｓｔｉｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を各ウェルに添加した。比較抗体として、先に説明した抗ＧＩＴＲ抗体１１０４１６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して同一の方式で試験した。ＩｎｃｕＣｙｔｅ ｎａｔｉｖｅ ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してターゲット細胞を計数した。
【0191】
得られた結果（抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ ＶＨ３／Ｖｋ４抗体）を図１０ａおよび１０ｂに示した。試験された全ての抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ抗体の腫瘍細胞死滅効果は、対照群、ｃｙｔｏｓｔｉｍ処理群、および比較抗体処理群に比べて有意にさらに高かった。試験抗体抗ＧＩＴＲ ５１ＢＶＨ３／Ｖｋ４および抗ＧＩＴＲ ５１ＢＶＨ３／Ｖｋ３処理によって卵巣癌細胞死滅程度が増加し、これは抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ作用抗体（試験抗体）が強力な抗腫瘍活性を示すということを示唆する。抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ抗体（試験抗体）によるＧＩＴＲ 架橋によって、比較抗体と比較して、ＳＫＯＶ３細胞株（卵巣癌）に対してさらに高い細胞毒性を誘導する。
【0192】
実施例６．癌患者のヒトＴ細胞での抗ＧＩＴＲ抗体の強力な抗腫瘍サイトカイン誘導効果
６．１．大腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ；ＣＲＣ）患者のＴ細胞でのサイトカイン生産増加効果
ＧＩＴＲ発現免疫細胞が癌患者で機能障害を起こすので、抗ＧＩＴＲ抗体治療が癌（ＣＲＣ）患者で免疫反応を向上させて抗腫瘍効果を誘導することができるか調べてみた。
癌患者のサイトカイン生産に対する抗ＧＩＴＲ抗体の効果を確認するために、大腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ；ＣＲＣ）患者に由来したヒトＰＢＭＣ（５００，０００細胞／反応）を抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ ＶＨ３／Ｖｋ４抗体（１０μｇ／ｍＬ）または同一容量の比較抗体（抗ＧＩＴＲ ２８Ｆ３；ＢＭＳ）の存在下で抗ＣＤ３抗体（０．２μｇ／ｍｌ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および抗ＣＤ２８抗体（１μｇ／ｍｌ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に培養した。ＣＲＣ患者のＰＢＭＣはＣｕｒｅｌｉｎｅ，Ｉｎｃ．から入手した。細胞内サイトカイン生産は実施例３を参照して測定した。
６．１．大腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ；ＣＲＣ）患者のＴ細胞でのサイトカイン生産増加効果
ＧＩＴＲ発現免疫細胞が癌患者で機能障害を起こすので、抗ＧＩＴＲ抗体治療が癌（ＣＲＣ）患者で免疫反応を向上させて抗腫瘍効果を誘導することができるか調べてみた。
癌患者のサイトカイン生産に対する抗ＧＩＴＲ抗体の効果を確認するために、大腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ；ＣＲＣ）患者に由来したヒトＰＢＭＣ（５００，０００細胞／反応）を抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ ＶＨ３／Ｖｋ４抗体（１０μｇ／ｍＬ）または同一容量の比較抗体（抗ＧＩＴＲ ２８Ｆ３；ＢＭＳ）の存在下で抗ＣＤ３抗体（０．２μｇ／ｍｌ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および抗ＣＤ２８抗体（１μｇ／ｍｌ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に培養した。ＣＲＣ患者のＰＢＭＣはＣｕｒｅｌｉｎｅ，Ｉｎｃ．から入手した。細胞内サイトカイン生産は実施例３を参照して測定した。
【0193】
得られた結果を図１１に示した（バックグラウンド：細胞のみ（ＣＤ３／ＣＤ２８抗体と抗ＧＩＴＲ抗体全て無処理）、刺激あり：ＣＤ３／ＣＤ２８抗体処理および抗ＧＩＴＲ抗体無処理）。図１１に示されているように、試験抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ ＶＨ３／Ｖｋ４抗体（５１Ｂ ＶＨ３／Ｖｋ４と表示）は比較抗体である２８Ｆ３（ｒｅｆ－２８Ｆ３）に比べてＣＲＣ患者のＰＢＭＣでさらに高い水準でＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞でのサイトカイン生産を増加させた。ＩＬ－２およびＩＦＮ－γは、ＮＫおよびＴ細胞の増殖および腫瘍死滅活性を増加させて免疫系の核心機能を有するサイトカインである。したがって、結果は、試験抗ＧＩＴＲ抗体が癌（ＣＲＣ）患者に対して優れた抗癌効能を有することを示す。
【0194】
６．２．肺癌（非小細胞肺癌；ＮＳＣＬＣ）患者のＴ細胞でのサイトカイン生産増加効果
ＧＩＴＲ発現免疫細胞が癌患者で機能障害を起こすので、抗ＧＩＴＲ抗体治療が癌（ＮＳＣＬＣ）患者で免疫反応を向上させて抗腫瘍効果を誘導することができるか調べてみた。
ＧＩＴＲ発現免疫細胞が癌患者で機能障害を起こすので、抗ＧＩＴＲ抗体治療が癌（ＮＳＣＬＣ）患者で免疫反応を向上させて抗腫瘍効果を誘導することができるか調べてみた。
【0195】
癌患者のサイトカイン生産に対する抗ＧＩＴＲ抗体の効果を確認するために、非小細胞肺癌（ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ－ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ；ＮＳＣＬＣ）患者に由来したヒトＰＢＭＣ（５００，０００細胞／反応）を抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ ＶＨ３／Ｖｋ４抗体（１０μｇ／ｍＬ）または同一容量の比較抗体（抗ＧＩＴＲ ２８Ｆ３；ＢＭＳ）の存在下で抗ＣＤ３抗体（０．２μｇ／ｍｌ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および抗ＣＤ２８抗体（１μｇ／ｍｌ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に培養した。ＮＳＣＬＣ患者のＰＢＭＣはＣｕｒｅｌｉｎｅ，Ｉｎｃ．から入手した。細胞内サイトカイン生産は実施例３を参照して測定した。
【0196】
得られた結果を図１２に示した（バックグラウンド：細胞のみ（ＣＤ３／ＣＤ２８抗体と抗ＧＩＴＲ抗体全て無処理）、刺激あり：ＣＤ３／ＣＤ２８抗体処理および抗ＧＩＴＲ抗体無処理）。図１２に示されているように、試験抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ ＶＨ３／Ｖｋ４抗体（５１Ｂ ＶＨ３／Ｖｋ４と表示）は比較抗体である２８Ｆ３（ｒｅｆ－２８Ｆ３）に比べてＮＳＣＬＣ患者のＰＢＭＣでさらに高い水準でＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞でのサイトカイン生産を増加させた。ＩＬ－２およびＩＦＮ－γは、ＮＫおよびＴ細胞の増殖および腫瘍死滅活性を増加させて免疫系の核心機能を有するサイトカインである。したがって、結果は、試験抗ＧＩＴＲ抗体が癌（ＮＳＣＬＣ）患者に対して優れた抗癌効能を有することを示す。
【0197】
６．３．肝癌（肝細胞癌；ＨＣＣ）患者のＴ細胞でのサイトカイン生産増加効果
ＧＩＴＲ発現免疫細胞が癌患者で機能障害を起こすので、抗ＧＩＴＲ抗体治療が癌（ＨＣＣ）患者で免疫反応を向上させて抗腫瘍効果を誘導することができるか調べてみた。
ＧＩＴＲ発現免疫細胞が癌患者で機能障害を起こすので、抗ＧＩＴＲ抗体治療が癌（ＨＣＣ）患者で免疫反応を向上させて抗腫瘍効果を誘導することができるか調べてみた。
【0198】
癌患者のサイトカイン生産に対する抗ＧＩＴＲ抗体の効果を確認するために、肝細胞癌腫（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ；ＨＣＣ）患者に由来したヒトＰＢＭＣ（５００，０００細胞／反応）を抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ ＶＨ３／Ｖｋ４抗体（１０μｇ／ｍＬ）または同一容量の比較抗体（抗ＧＩＴＲ ２８Ｆ３；ＢＭＳ）の存在下で抗ＣＤ３抗体（０．２μｇ／ｍｌ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および抗ＣＤ２８抗体（１μｇ／ｍｌ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に培養した。ＨＣＣ患者のＰＢＭＣはＣｕｒｅｌｉｎｅ，Ｉｎｃ．から入手した。細胞内サイトカイン生産は実施例３を参照して測定した。
【0199】
得られた結果を図１３に示した（バックグラウンド：細胞のみ（ＣＤ３／ＣＤ２８抗体と抗ＧＩＴＲ抗体全て無処理）、刺激あり：ＣＤ３／ＣＤ２８抗体処理および抗ＧＩＴＲ抗体無処理）。図１３に示されているように、試験抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ ＶＨ３／Ｖｋ４抗体（５１Ｂ ＶＨ３／Ｖｋ４と表示）は比較抗体である２８Ｆ３（ｒｅｆ－２８Ｆ３）に比べてＨＣＣ患者のＰＢＭＣでさらに高い水準でＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞でのサイトカイン生産を増加させた。ＩＬ－２およびＩＦＮ－γは、ＮＫおよびＴ細胞の増殖および腫瘍死滅活性を増加させて免疫系の核心機能を有するサイトカインである。したがって、結果は、試験抗ＧＩＴＲ抗体が癌（ＨＣＣ）患者に対して優れた抗癌効能を有することを示す。
【0200】
結果で確認されるように、試験抗ＧＩＴＲ抗体は広範囲な癌患者のヒトＴ細胞で強力な抗腫瘍サイトカイン生産を誘導する。
【0201】
実施例７．ＭＣ３８大腸癌（ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）モデルでの抗ＧＩＴＲ抗体の抗癌効能確認（ｉｎ ｖｉｖｏ）
ＭＣ３８腫瘍細胞（Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ）を空気中５％ ＣＯ２および３７℃条件で１０％（ｖ／ｖ）ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）補充されたＤＭＥＭ＋４μｇ／ｍｌピューロマイシン培地で試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）維持させた。対数期（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｐｈａｓｅ）の細胞を収穫し、腫瘍接種前に細胞計数器で細胞数を測定した。
ＭＣ３８腫瘍細胞（Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ）を空気中５％ ＣＯ２および３７℃条件で１０％（ｖ／ｖ）ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）補充されたＤＭＥＭ＋４μｇ／ｍｌピューロマイシン培地で試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）維持させた。対数期（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｐｈａｓｅ）の細胞を収穫し、腫瘍接種前に細胞計数器で細胞数を測定した。
【0202】
Ｃ５７ＢＬ６ ｈＧＩＴＲ ｋｎｏｃｋ－ｉｎ マウス（Ｊｉａｎｇｓｕ Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）の右側後方横腹部位に５×１０５個の腫瘍細胞（ｉｎ ０．１ｍＬ ｏｆ ＰＢＳ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を皮下接種して腫瘍を発生させた。平均腫瘍大きさが１００－１５０ｍｍ３に到達する時、無作為化（Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ）を行った。各グループは８匹のマウスから構成した。無作為化日付を０日（Ｄａｙ０）と記録した。
【0203】
腫瘍細胞接種後動物の病的状態（ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ）、死亡率、および体重増加／減少を毎日確認した（無作為化後体重は週３回測定）。死亡率および観察された臨床兆候は個別動物に対して詳しく記録した。腫瘍体積は無作為化後週３回ずつカリパスを使用して２次元で測定し、体積は下記数式を使用してｍｍ３で計算した。
Ｖ＝（Ｌ×Ｗ×ｘＷ）／２
［Ｖは腫瘍体積（ｍｍ３）、Ｌは腫瘍長さ（腫瘍の長軸長さ）、Ｗは腫瘍広さ（Ｌの垂直中の最も長い長さ）］。
Ｖ＝（Ｌ×Ｗ×ｘＷ）／２
［Ｖは腫瘍体積（ｍｍ３）、Ｌは腫瘍長さ（腫瘍の長軸長さ）、Ｗは腫瘍広さ（Ｌの垂直中の最も長い長さ）］。
【0204】
投与量および腫瘍および体重測定はＬａｍｉｎａｒ Ｆｌｏｗ Ｃａｂｉｎｅｔで行い、体重および腫瘍体積はＳｔｕｄｙＤｉｒｅｃｔｏｒＴＭ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１．３９９．１９）を使用して測定した。
【0205】
グルーピング直後、治療を始めた。対照群（グループ１）はビヒクル（ＰＢＳ溶液）で処理し、ＣＨＯ細胞で生成された抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ ＶＨ３／Ｖｋ４抗体およびＩＮＣＡＧＮ１８７６（Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ）をグループ２およびグループ３にそれぞれ２０ｍｇ／ｋｇ容量で処理した（表１３参照）。
【0206】
【表13】
【0207】
測定された腫瘍大きさ（体積）を図１４に示した。図１４で示されるように、抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ ＶＨ３／Ｖｋ４抗体（グループ２）はＰＢＳ処理されたグループ１（対照群）と比較して相当な腫瘍成長抑制効果を示した。例えば、２４日目に、抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ ＶＨ３／Ｖｋ４抗体処理試験群（グループ２）は対照群（グループ１）と比較して腫瘍大きさが有意に減少した。また、比較抗体（ＩＮＣＡＧＮ１８７６）処理試験群（グループ３）と比較しても、抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ ＶＨ３／Ｖｋ４抗体処理試験群（グループ２）で顕著に高い腫瘍減少効能が示された。
【0208】
また、下記数式で腫瘍成長抑制（ΔＴＧＩ）を計算した。
ΔＴＧＩ（Δ阻害の平均％）＝（（平均（Ｃ）－平均（Ｃ０））－（平均（Ｔ）－平均（Ｔ０）））／（平均（Ｃ）－平均（Ｃ０））＊１００％
［Ｔ－現状グループの値／Ｔ０－現状グループの初期値／Ｃ－対照グループの値／Ｃ０－対照グループの初期値］
［Ｔ：試験群の測定時点の腫瘍大きさ、
Ｔ０：試験群の最初腫瘍大きさ、
Ｃ：対照群の測定時点の腫瘍大きさ、
Ｃ０：対照群の最初腫瘍大きさ］
ΔＴＧＩ（Δ阻害の平均％）＝（（平均（Ｃ）－平均（Ｃ０））－（平均（Ｔ）－平均（Ｔ０）））／（平均（Ｃ）－平均（Ｃ０））＊１００％
［Ｔ－現状グループの値／Ｔ０－現状グループの初期値／Ｃ－対照グループの値／Ｃ０－対照グループの初期値］
［Ｔ：試験群の測定時点の腫瘍大きさ、
Ｔ０：試験群の最初腫瘍大きさ、
Ｃ：対照群の測定時点の腫瘍大きさ、
Ｃ０：対照群の最初腫瘍大きさ］
【0209】
抗ＧＩＴＲ ５１Ｂ ＶＨ３／Ｖｋ４抗体の腫瘍成長抑制（ΔＴＧＩ）は６４．８％で、ＩＮＣＡＧＮ１８７６類似体（ΔＴＧＩ＝４４．７％）と比較して上昇した抑制効果を示した。
【0210】
本実施例に使用された試験動物は抗体の２０ｍｇ／ｋｇ容量投与（ｉ．ｖ．）に寛容的であり、研究期間中にＢＷＬが観察されなかった。
【0211】
統計処理
統計的有意性は通常の一元ＡＮＯＶＡ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いた対応あり又は対応無しのスチューデントのｔ検定）で評価した。データは平均±ＳＥＭで表示した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、ｎｓ＝有意性無し。
統計的有意性は通常の一元ＡＮＯＶＡ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いた対応あり又は対応無しのスチューデントのｔ検定）で評価した。データは平均±ＳＥＭで表示した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、ｎｓ＝有意性無し。
【配列表フリーテキスト】
【0212】
配列番号１： 合成＿ＣＤＲ－Ｈ１、但しＸはＥ、Ｎ又はＤ
配列番号２： 合成＿ＣＤＲ－Ｈ２
配列番号３： 合成＿ＣＤＲ－Ｈ３
配列番号４： 合成＿ＣＤＲ－Ｌ１
配列番号５： 合成＿ＣＤＲ－Ｌ２、但しＸはＡ、Ｑ又はＥ
配列番号６： 合成＿ＣＤＲ－Ｌ３
配列番号７： 合成＿ＣＤＲ－Ｈ１
配列番号８： 合成＿ＣＤＲ－Ｈ１
配列番号９： 合成＿ＣＤＲ－Ｈ１
配列番号１０： 合成＿ＣＤＲ－Ｌ２
配列番号１１： 合成＿ＣＤＲ－Ｌ２
配列番号１２： 合成＿ＣＤＲ－Ｌ２
配列番号１３： 合成＿重鎖可変領域
配列番号１４： 合成＿重鎖可変領域
配列番号１５： 合成＿重鎖可変領域
配列番号１６： 合成＿重鎖可変領域
配列番号１７： 合成＿重鎖可変領域
配列番号１８： 合成＿重鎖可変領域
配列番号１９： 合成＿軽鎖可変領域
配列番号２０： 合成＿軽鎖可変領域
配列番号２１： 合成＿軽鎖可変領域
配列番号２２： 合成＿軽鎖可変領域
配列番号２３： 合成＿軽鎖可変領域
配列番号２４： 合成＿軽鎖可変領域
配列番号２５： 合成＿重鎖定常領域
配列番号２６： 合成＿軽鎖定常領域
配列番号２７： 合成＿５１ＢキメラＮ２９８Ａ＿ＶＨ（重鎖）
配列番号２８： 合成＿５１ＢキメラＮ２９８Ａ＿ＶＬ（軽鎖）
配列番号２９： 合成＿シグナル配列を含む５１Ｂ重鎖可変領域であり、１～１９位のアミノ酸配列がシグナル配列
配列番号３０： 合成＿シグナル配列を含む５１Ｂ重鎖可変領域をコードするＤＮＡ
配列番号３１： 合成＿シグナル配列を含む５１Ｂ軽鎖可変領域であり、１～２２位のアミノ酸配列がシグナル配列
配列番号３２： 合成＿シグナル配列を含む５１Ｂ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ
配列番号３３： 合成＿ヒトＧＩＴＲであり、１～２５位のアミノ酸配列がシグナル配列
配列番号３４： 合成＿ヒトＧＩＴＲ上のエピトープ領域
配列番号３５： 合成＿ヒトＧＩＴＲ上のエピトープ領域
配列番号３６： 合成＿ヒトＧＩＴＲ上のエピトープ領域
配列番号２： 合成＿ＣＤＲ－Ｈ２
配列番号３： 合成＿ＣＤＲ－Ｈ３
配列番号４： 合成＿ＣＤＲ－Ｌ１
配列番号５： 合成＿ＣＤＲ－Ｌ２、但しＸはＡ、Ｑ又はＥ
配列番号６： 合成＿ＣＤＲ－Ｌ３
配列番号７： 合成＿ＣＤＲ－Ｈ１
配列番号８： 合成＿ＣＤＲ－Ｈ１
配列番号９： 合成＿ＣＤＲ－Ｈ１
配列番号１０： 合成＿ＣＤＲ－Ｌ２
配列番号１１： 合成＿ＣＤＲ－Ｌ２
配列番号１２： 合成＿ＣＤＲ－Ｌ２
配列番号１３： 合成＿重鎖可変領域
配列番号１４： 合成＿重鎖可変領域
配列番号１５： 合成＿重鎖可変領域
配列番号１６： 合成＿重鎖可変領域
配列番号１７： 合成＿重鎖可変領域
配列番号１８： 合成＿重鎖可変領域
配列番号１９： 合成＿軽鎖可変領域
配列番号２０： 合成＿軽鎖可変領域
配列番号２１： 合成＿軽鎖可変領域
配列番号２２： 合成＿軽鎖可変領域
配列番号２３： 合成＿軽鎖可変領域
配列番号２４： 合成＿軽鎖可変領域
配列番号２５： 合成＿重鎖定常領域
配列番号２６： 合成＿軽鎖定常領域
配列番号２７： 合成＿５１ＢキメラＮ２９８Ａ＿ＶＨ（重鎖）
配列番号２８： 合成＿５１ＢキメラＮ２９８Ａ＿ＶＬ（軽鎖）
配列番号２９： 合成＿シグナル配列を含む５１Ｂ重鎖可変領域であり、１～１９位のアミノ酸配列がシグナル配列
配列番号３０： 合成＿シグナル配列を含む５１Ｂ重鎖可変領域をコードするＤＮＡ
配列番号３１： 合成＿シグナル配列を含む５１Ｂ軽鎖可変領域であり、１～２２位のアミノ酸配列がシグナル配列
配列番号３２： 合成＿シグナル配列を含む５１Ｂ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ
配列番号３３： 合成＿ヒトＧＩＴＲであり、１～２５位のアミノ酸配列がシグナル配列
配列番号３４： 合成＿ヒトＧＩＴＲ上のエピトープ領域
配列番号３５： 合成＿ヒトＧＩＴＲ上のエピトープ領域
配列番号３６： 合成＿ヒトＧＩＴＲ上のエピトープ領域
【図1a】
【図1b】
【図2】
【図3a】
【図3b】
【図4】
【図5a】
【図5b】
【図5c】
【図5d】
【図6】
【図7a】
【図7b】
【図8】
【図9a】
【図9b】
【図10a】
【図10b】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】