特許 7672153 クロメン系化合物、それらの方法及び使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-04-24

(45)【発行日】2025-05-07

(54)【発明の名称】クロメン系化合物、それらの方法及び使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/4188 20060101AFI20250425BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20250425BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20250425BHJP

【ＦＩ】

A61K31/4188

A61P35/00

A61P35/02

【請求項の数】 19

(21)【出願番号】P 2021577354

(86)(22)【出願日】2020-06-29

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-09-07

(86)【国際出願番号】 IB2020056131

(87)【国際公開番号】W WO2020261242

(87)【国際公開日】2020-12-30

【審査請求日】2023-06-16

(31)【優先権主張番号】115617

(32)【優先日】2019-06-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】PT

(31)【優先権主張番号】20166501.5

(32)【優先日】2020-03-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】PCT/EP2020/059156

(32)【優先日】2020-03-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】516116507

【氏名又は名称】ユニベルズィダード ドゥ ミンホ

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＤＡＤＥ ＤＯ ＭＩＮＨＯ

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(74)【代理人】

【識別番号】230118913

【弁護士】

【氏名又は名称】杉村 光嗣

(74)【代理人】

【識別番号】100196298

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 高雄

(72)【発明者】

【氏名】マルタ シウヴィア フレイタス ダ コスタ

(72)【発明者】

【氏名】マリア ジ ファティマ モンジニョ バルタザール

(72)【発明者】

【氏名】マリア フェルナンダ ジ ジェズース ヘーゴ パイヴァ プロエンサ

(72)【発明者】

【氏名】パトリーシア マシエル

(72)【発明者】

【氏名】オリヴィア アレシャンドラ エリアス ポンチェス

【審査官】梅田 隆志

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１２／１１０８６０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】COSTA, M., et al.，Tetrahedron，2011年，Vol. 67，No. 10，pp.1799-1804.

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３１／００－３１／８０

Ａ６１Ｐ １／００－４３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

医薬又は獣医薬における使用のための薬剤であって、
以下の式で示される、化合物又は薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、Ｎ－オキシド、立体異性体、ジアステレオ異性体、鏡像異性体、アトロプ異性体からなる薬剤。

【化1】

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３は、互いに独立して選択され、
Ｒ^１は、アリールから選択され、
Ｒ^２は、Ｈ、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、ヒドロキシル又はアミンから選択され、
Ｒ^３は、Ｈ又は

【化2】

から選択される。
ただし、

【化3】

は除外される。）

【請求項2】

Ｒ^１が置換アリールである、請求項１に記載の薬剤。

【請求項3】

Ｒ^１がヒドロキシフェニル、ヒドロキシ－メトキシフェニル、ヒドロキシ－ブロモフェニル、ヒドロキシ－クロロフェニル、フルオロフェニル、ブロモフェニル、４－クロロフェニル、フェニル、メトキシフェニル、ジフルオロ－ヒドロキシフェニル、エトキシフェニル又はブロモ－ヒドロキシ－メトキシフェニルから選択される、請求項１又は２に記載の薬剤。

【請求項4】

Ｒ^１が２－ヒドロキシフェニル、２－ヒドロキシ－３－メトキシフェニル、２－ヒドロキシ－５－メトキシフェニル、２－ヒドロキシ－５－ブロモフェニル、２－ヒドロキシ－５－クロロフェニル、４－フルオロフェニル、４－ブロモフェニル、２－フルオロフェニル、３－フルオロフェニル、４－クロロフェニル、フェニル、３－ヒドロキシフェニル、２－ヒドロキシフェニル、２－メトキシフェニル、３，５－ジフルオロ－２－ヒドロキシフェニル、４－エトキシフェニル又は２－ブロモ－３－ヒドロキシ－４－メトキシフェニルである、請求項１～３のいずれか一項に記載の薬剤。

【請求項5】

Ｒ^２がＨ、５－メトキシ、７－メトキシ、７－ブロモ、７－クロロ又は７－フルオロから選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の薬剤。

【請求項6】

Ｒ^３がクロメン単位又はＨである、請求項１～５のいずれか一項に記載の薬剤。

【請求項7】

Ｒ^３がＨ、２－（４－フルオロフェニル）－５－メトキシ－１，９－ジヒドロクロメノ［２，３－ｄ］イミダゾール単位、２－（４－ブロモフェニル）－５－メトキシ－１，９－ジヒドロクロメノ［２，３－ｄ］イミダゾール単位又は２－（２－フルオロフェニル）－５－メトキシ－１，９－ジヒドロクロメノ［２，３－ｄ］イミダゾール単位から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の薬剤。

【請求項8】

前記化合物が

【化4-1】

【化4-2】

から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の薬剤。

【請求項9】

医薬又は獣医薬における使用のための、請求項２～８のいずれか一項に記載の薬剤。

【請求項10】

良性若しくは悪性細胞の過増殖を特徴とする若しくは新血管形成若しくは過血管形成の領域を特徴とする疾患又はがんの治療、療法又は診断における使用のための、請求項１～９のいずれか一項に記載の薬剤。

【請求項11】

過増殖組織又は新生物の治療、療法又は診断における使用のための、請求項１～１０のいずれか一項に記載の薬剤。

【請求項12】

乳がん、腎細胞がん、白血病、神経膠腫若しくは神経膠芽腫の治療、療法又は診断に使用される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の薬剤。

【請求項13】

腎細胞がん、白血病、神経膠腫、神経膠芽腫、乳がんの治療、療法又は診断における使用のための、請求項１～１２のいずれか一項に記載の薬剤。

【請求項14】

トリプルネガティブ乳がん、腎細胞がん、管腔乳がん、基底様乳がん、急性白血病の治療、療法又は診断における使用のための、請求項１～１３のいずれか一項に記載の薬剤。

【請求項15】

請求項１～１４のいずれか一項に記載の化合物の少なくとも１つを含む医薬組成物。

【請求項16】

抗ウイルス剤、鎮痛剤、抗炎症剤、化学療法剤、放射線療法剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤、抗生物質、利尿剤又はそれらの混合物をさらに含む、請求項１５に記載の医薬組成物。

【請求項17】

皮内若しくは局所若しくは全身若しくは経皮療法若しくは静脈内療法又はそれらの組み合わせにおける使用のための、請求項１５又は１６に記載の医薬組成物。

【請求項18】

請求項１～１４のいずれか一項に記載の化合物及び／又は請求項１５～１７のいずれか一項に記載の医薬組成物を含むナノ粒子。

【請求項19】

以下の構造を有する請求項１に記載の化合物

【化5】

を生成するためのプロセスであって、以下の構造を有する化合物

【化6】

を、有機溶媒中で濃塩酸と反応させて、以下の構造を有する化合物

【化7】

を生成し、次いで、これを、有機溶媒中で構造Ｒ１－ＣＨＯを有するアルデヒドと反応させて、以下の構造を有する化合物

【化8】

を生成する工程を含む、プロセス、
又は
以下の構造を有する請求項１に記載の化合物

【化9】

を生成するためのプロセスであって、以下の構造を有する化合物

【化10】

を、有機溶媒中で構造Ｒ１－ＣＨＯを有するアルデヒドと反応させて、以下の構造を有する化合物

【化11】

を生成する工程を含む、プロセス。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、新規クラスのクロメン系抗がん化合物に関するものである。本開示は、新規クラスのクロメン系抗がん化合物の抗がん特性について記載する。本開示はさらに、新規クラスのクロメン系抗がん化合物を合成し、及び単離する方法を記載する。

【背景技術】

【0002】

２０１８年に世界で約１，０００万人が死亡した原因はがんであり、同年に新たに１，８１０万人のがん患者が認められた。^１５年後のこの病気の有病率は、４，３００万人を超えると予想されている。これは、新しく、より良い治療法を見つけることの緊急性を正当化するものである。この問題は、症例数及びそれに伴う死亡率が全体的に増加していることから、世界規模で取り組まなければならない。２０１８年のがんによる死亡者数の６．６％を乳がんが占めている。乳がんは５番目に致死率の高いがんの種類であり、２０１８年には１１．６％の新規症例が認められた（２００万症例超）。^２これは、罹患率では２番目に多いがんの種類である。治療の種類は常にがんの病期によって異なるが、基本的には手術、放射線、従来の化学療法、免疫療法又はＥＲ、ＰＲ及びＨＥＲ－２などの分子マーカーが検出された場合には分子療法で構成される。しかし、乳がんの中でも非常に侵攻性が高く、乳がん全体の約１５％～２０％を占めるトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）の場合、従来の治療法では効果が限定的で、分子療法や個別療法もまだ開発されていない。このような予後の悪さから、この乳がんのサブタイプでは高い死亡率が認められている。^３

【0003】

クロメン系骨格は、自然界に広く存在し、様々な生物学的特性を持っていることから、医薬化学者にインスピレーションを与えてきた。^４この天然の骨格及びその合成誘導体の合成並びに生物学的重要性に関する研究は、ここ数年で注目を集めている。

【0004】

Ｃｏｓｔａらによる文書「Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ」には、サリチルアルデヒドとアリーリデンアミノアセトニトリルを用いたワンポットカスケード反応による２－アリール－１，９－ジヒドロクロメノ［３，２－ｄ］イミダゾールの調製が記載されている。さらに、この文書では、薬理学的特性が改善された代替薬候補として、クロメンとイミダゾールを組み合わせた新規融合三環系について記載している。しかし、記載の系では、芳香族単位に異なる置換基を組み込んだ分子を生成することはできない。

【0005】

これらの事実は、本開示によって対処される技術的問題を説明するために開示されている。

【発明の概要】

【0006】

本開示は、新規クラスのクロメン系抗がん化合物に関するものである。本開示は、新規クラスのクロメン系抗がん化合物の抗がん特性について記載する。本開示はさらに、新規クラスのクロメン系抗がん化合物を合成し、及び単離する方法を記載する。

【0007】

具体的には、本開示では、少なくとも２つの異なる分子を組み合わせることにより、興味深い関連する生物学的プロファイルを持つ化合物を生み出す新規クロメン系化合物の合成方法を記載している。

【0008】

先行技術に記載されているクロメン系化合物の合成プロセスでは、これらの新規化合物を単離することができない。本開示に記載の方法により、乳がん、腎細胞がん、急性白血病及び神経膠腫などのいくつかのがんのサブタイプにおいて、抗がん化合物として使用した場合に驚くほど効果的である新規クロメン系化合物の合成及び単離が可能となる。これらの化合物は、特に乳がん及び腎細胞がんに対して有効である。

【0009】

一実施形態では、合成された化合物を、適切な細胞株を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングにより、その抗がん作用について試験した。化合物の活性は、細胞の生存率、増殖、移動、侵攻性、細胞死及び代謝への影響など、様々なレベルで検討した。

【0010】

一実施形態では、クロメン系化合物の毒性効果を非新生物細胞株でも試験した。

【0011】

一実施形態では、クロメン系化合物の初期段階のｉｎ ｖｉｖｏ毒性スクリーニングに、セノラブディティス・エレガンス（Ｃ．エレガンス線虫）モデルを使用した。また、モデルとしてマウスを用いて、ｉｎ ｖｉｖｏ毒性を評価した。

【0012】

一実施形態では、クロメン系化合物の抗がん特性を、ｉｎ ｖｉｖｏ ＣＡＭ（ニワトリ絨毛尿膜）アッセイを用いても特性評価し、新規クロメンの有効性及び血管新生特性を評価した。さらにモデルとしてマウスを用いてｉｎ ｖｉｖｏ有効性を評価した。

【0013】

本主題の化合物は、ユニークで有望な抗がんプロファイルを示す。

【0014】

本開示の一態様は、以下の式を含む化合物又は薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、Ｎ－オキシド、立体異性体、ジアステレオ異性体、鏡像異性体、アトロプ異性体、二量体若しくは多形体に関するものである。

【化1】

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３は、互いに独立して選択され、
Ｒ^１は、Ｈ、アルキル、アリール、アルコキシル、アシル、ハロゲン、ニトロ、ヒドロキシル、アミン、アミド、ケトン、エステル、複素環から選択され、
Ｒ^２は、Ｈ、アルキル、アリール、アルコキシル、アシル、ハロゲン、ニトロ、ヒドロキシル、アミン、アミド、カルボニル、ケトン、エステル、複素環から選択され、
Ｒ^３は、Ｈ、アルキル、アリール、アルコキシル、アシル、ハロゲン、ニトロ、ヒドロキシル、アミン、アミド、ケトン、エステル、複素環又は

【化2】

から選択される。）

【0015】

本開示の別の態様は、以下の式を含む化合物又は薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、Ｎ－オキシド、立体異性体、ジアステレオ異性体、鏡像異性体、アトロプ異性体、二量体若しくは多形体に関するものであり、
Ｒ^１は、アリール又は複素環から選択され、
Ｒ^２は、Ｈ、アルキル、アリール、アルコキシル、ハロゲン、ヒドロキシル、アミン、カルボニル又は複素環から選択され、
Ｒ^３は、Ｈ又は

【化3】

から選択される。
ただし、好ましくは、

【化4】

は除外される。

【0016】

一実施形態では、Ｒ^１がアリールから選択され、Ｒ^２がＨ、アルキル、アルコキシル、ハロゲン、ヒドロキシル又はアミンから選択される、前記化合物又は薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、Ｎ－オキシド、立体異性体、ジアステレオ異性体、鏡像異性体、アトロプ異性体、二量体若しくは多形体。

【0017】

一実施形態では、前記二量体が好ましくはホモ二量体である、前記化合物又は薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、Ｎ－オキシド、立体異性体、ジアステレオ異性体、鏡像異性体、アトロプ異性体、二量体若しくは多形体。

【0018】

一実施形態では、Ｒ^１が置換アリールである、前記化合物又は薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、Ｎ－オキシド、立体異性体、ジアステレオ異性体、鏡像異性体、アトロプ異性体、二量体若しくは多形体。

【0019】

一実施形態では、Ｒ^１がヒドロキシフェニル、ヒドロキシ－メトキシフェニル、ヒドロキシ－ブロモフェニル、ヒドロキシ－クロロフェニル、フルオロフェニル、ブロモフェニル、２４－クロロフェニル、フェニル、メトキシフェニル、ジフルオロ－ヒドロキシフェニル、エトキシフェニル又はブロモ－ヒドロキシ－メトキシフェニルから選択される、前記化合物又は薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、Ｎ－オキシド、立体異性体、ジアステレオ異性体、鏡像異性体、アトロプ異性体、二量体若しくは多形体。

【0020】

一実施形態では、Ｒ^１が２－ヒドロキシフェニル、２－ヒドロキシ－３－メトキシフェニル、２－ヒドロキシ－５－メトキシフェニル、２－ヒドロキシ－５－ブロモフェニル、２－ヒドロキシ－５－クロロフェニル、４－フルオロフェニル、４－ブロモフェニル、２－フルオロフェニル、３－フルオロフェニル、４－クロロフェニル、フェニル、３－ヒドロキシフェニル、２－ヒドロキシフェニル、２－メトキシフェニル、３，５－ジフルオロ－２－ヒドロキシフェニル、４－エトキシフェニル又は２－ブロモ－３－ヒドロキシ－４－メトキシフェニルである、前記化合物又は薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、Ｎ－オキシド、立体異性体、ジアステレオ異性体、鏡像異性体、アトロプ異性体、二量体若しくは多形体。

【0021】

一実施形態では、Ｒ^２が置換又は非置換アリールである、前記化合物又は薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、Ｎ－オキシド、立体異性体、ジアステレオ異性体、鏡像異性体、アトロプ異性体、二量体若しくは多形体。

【0022】

一実施形態では、Ｒ^２がＨ、５－メトキシ、７－メトキシ、７－ブロモ、７－クロロ又は７－フルオロから選択される、前記化合物又は薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、Ｎ－オキシド、立体異性体、ジアステレオ異性体、鏡像異性体、アトロプ異性体、二量体若しくは多形体。

【0023】

一実施形態では、Ｒ^３がクロメン単位又はＨである、前記化合物又は薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、Ｎ－オキシド、立体異性体、ジアステレオ異性体、鏡像異性体、アトロプ異性体、二量体若しくは多形体。

【0024】

一実施形態では、Ｒ^３がＨ、２－（４－フルオロフェニル）－５－メトキシ－１，９－ジヒドロクロメノ［２，３－ｄ］イミダゾール単位、２－（４－ブロモフェニル）－５－メトキシ－１，９－ジヒドロクロメノ［２，３－ｄ］イミダゾール単位又は２－（２－フルオロフェニル）－５－メトキシ－１，９－ジヒドロクロメノ［２，３－ｄ］イミダゾール単位から選択される、前記化合物又は薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、Ｎ－オキシド、立体異性体、ジアステレオ異性体、鏡像異性体、アトロプ異性体、二量体若しくは多形体。

【0025】

一実施形態では、

【化5-1】

【化5-2】

【化5-3】

から選択される、前記化合物又は薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、Ｎ－オキシド、立体異性体、ジアステレオ異性体、鏡像異性体、アトロプ異性体、二量体若しくは多形体。

【0026】

本開示の一態様では、本開示の化合物は、医学又は獣医学で使用される。

【0027】

本開示の一態様では、本化合物は、良性若しくは悪性細胞の過増殖を特徴とする若しくは新血管形成若しくは過血管形成の領域を特徴とする疾患又はがんの治療、療法又は診断に使用され得る。

【0028】

本開示の一態様では、本化合物は、過増殖組織又は新生物の治療、療法又は診断に使用され得る。

【0029】

本開示の一態様では、本化合物は、乳がん、腎細胞がん、白血病、神経膠腫若しくは神経膠芽腫の治療、療法又は診断に使用され得る。

【0030】

本開示の一態様では、本化合物は、腎細胞がん、白血病、神経膠腫、神経膠芽腫、乳がんの治療、療法又は診断に使用され得る。

【0031】

本開示の一態様では、本化合物は、トリプルネガティブ乳がん、急性腎細胞がん、管腔乳がん、基底様乳がん、急性白血病の治療、療法又は診断に使用され得る。

【0032】

本開示の別の態様は、本開示の化合物の少なくとも１つを含む医薬組成物に関する。

【0033】

一実施形態では、薬学的に許容される担体をさらに含む本開示の医薬組成物。

【0034】

一実施形態では、抗ウイルス剤、鎮痛剤、抗炎症剤、化学療法剤、放射線療法剤、抗生物質、抗真菌剤、抗寄生虫剤若しくは利尿剤又はそれらの混合物をさらに含む本開示の医薬組成物。

【0035】

一実施形態では、充填剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤又はそれらの混合物をさらに含む本開示の医薬組成物。

【0036】

一実施形態では、皮内若しくは経皮療法又は局所若しくは全身若しくは静脈内療法又はそれらの組み合わせで使用される本開示の医薬組成物。

【0037】

本開示の別の態様は、本開示の化合物を得るための方法であって、以下の工程を含む方法に関する。
ＣＨ_３ＣＮ１ｍＬ中の２－イミノ－８－メトキシ－２Ｈ－クロメン－３－アミン（０．１５０ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）のオレンジ色溶液に、濃ＨＣｌ（１．１当量）を加える工程と、
混合液を室温（２０℃）で１０～１５分間撹拌する（すぐに沈殿が観察される）工程と、
固体を、好ましくは単純な濾過によって濾過し、３－アミノ－８－メトキシ－２Ｈ－クロメン－２－イミニウムクロリドを得る工程と、
ＣＨ_３ＣＮ（１～２ｍＬ）中の３－アミノ－８－メトキシ－２Ｈ－クロメン－２－イミニウムクロリド（０．２５～０．３５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、アルデヒド（１．１～１．７当量）を加える工程と、
懸濁液を６０℃で２４～４８時間撹拌する工程と、
得られた固体を濾過して純粋な生成物を分離し、好ましくはＣＨ_３ＣＮで洗浄する工程と、
任意選択で、１Ｈ ＮＭＲスペクトルでＨＣｌの混入が観察された場合、固体をＮａＨＣＯ_３（０．０５Ｍ）水溶液で洗浄し、濾過し、水で洗浄し、純粋な生成物２－（５－メトキシ－３，９－ジヒドロクロメノ［２，３－ｄ］イミダゾールを得る工程。

【0038】

一実施形態では、５，５’－ジメトキシ－２，２’－ジフェニル－１，１’，９，９’－テトラヒドロ－９，９’－ビクロメノ［２，３－ｄ］イミダゾールの調製のために、ＣＨ_３ＣＮ（１－２ｍＬ）中の２－イミノ－８－メトキシ－２Ｈ－クロメン－３－アミンの溶液にアルデヒド（１－１．２当量）を加え、溶液を８０℃で７－２４時間撹拌した。固体生成物が徐々に沈殿し始めたため、濾過し、ＣＨ_３ＣＮで洗浄し、純粋生成物である５，５’－ジメトキシ－２，２’－ジフェニル－１，１’’，９，９’－テトラヒドロ－９，９’－ビクロメノ［２，３－ｄ］イミダゾールとして同定した。

【0039】

本開示の別の態様は、本開示の化合物及び／又は本開示の医薬組成物を含むナノ粒子に関する。

【0040】

一実施形態では、本開示の化合物及び／又は医薬組成物を含むナノ粒子は、ナノ粒子によってカプセル化されている。

【0041】

本開示の別の態様は、本化合物及び／又は本開示の医薬組成物を含むキットに関する。

【0042】

本開示の別の態様は、医学又は獣医学における使用のための、本化合物又は薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、Ｎ－オキシド、立体異性体、ジアステレオ異性体、鏡像異性体、アトロプ異性体、二量体若しくは多形体の使用に関する。具体的には、良性若しくは悪性細胞の過増殖を特徴とする若しくは新血管形成の領域を特徴とする疾患又はがんの治療又は療法に使用するためのものである。特に、がんに関連する過増殖組織などの過増殖組織の治療、療法又は診断に使用するためのものである。さらに、乳がん、腎細胞がん、急性白血病及び神経膠腫の治療、療法又は診断に使用するためのものである。さらに、神経膠芽腫及びトリプルネガティブ乳がんの治療、療法又は診断に使用するためのものである。

【0043】

国際純正応用化学連合（ＩＵＰＡＣ）の定義に基づき、アルキル基は、アルカンの任意の炭素原子から水素原子を除去して得られる一価の基－_ｎＣＨ_２ｎ＋１と定義されている。分岐していないアルカンの末端炭素原子から水素原子を除去して得られる基は、通常のアルキル（ｎ－アルキル）基Ｈ（ＣＨ_２）_ｎのサブクラスを形成する。ＲＣＨ_２基、Ｒ_２ＣＨ基（Ｒ≠Ｈ）及びＲ_３Ｃ（Ｒ≠Ｈ）基は、それぞれ第一級、第二級及び第三級アルキル基である。アリール基は、アレーン（単環式及び多環式芳香族炭化水素）の環炭素原子から水素原子を除去して得られる。

【0044】

「アルキル」には「低級アルキル」が含まれ、最大３０個の炭素原子を持つ炭素断片を包含するように拡大して適用される。アルキル基の例としては、オクチル、ノニル、ノルボルニル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、エイコシル、３，７－ジエチル－２，２－ジメチル－４－プロピルノニル、２－（シクロドデシル）エチル、アダマンチルなどが挙げられる。

【0045】

「低級アルキル」とは、炭素原子数１～７のアルキル基を意味する。低級アルキル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ－及びｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、２－メチルシクロプロピル、シクロプロピルメチルなどが挙げられる。

【0046】

本開示において、ハロゲンとは、フッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、ヨウ素（Ｉ）、アスタチン（Ａｔ）からなるリストより選択される元素を指す。

【0047】

本開示において、用語「複素環」は、環骨格を形成する原子の少なくとも１つが炭素ではない環を意味する。特に明記しない限り、複素環は、飽和、部分的不飽和又は完全不飽和の環であり得る。「飽和複素環」とは、環員間に単結合のみを含む複素環を指す。「部分的に飽和した複素環」とは、少なくとも１つの二重結合を含む非芳香族複素環を指す。用語「芳香族複素環」とは、環骨格を形成する少なくとも１つの原子が炭素ではない完全な不飽和芳香族環を意味する。典型的には、芳香族複素環は、４個以下の窒素、１個以下の酸素及び１個以下の硫黄を含む。特に明記しない限り、芳香族複素環は、利用可能な任意の炭素又は窒素を介して、当該炭素又は窒素上の水素原子を置換することによって結合することができる。用語「芳香族複素二環式環系」は、２つの環のうち少なくとも１つが上記で定義された芳香族複素環である２つの縮合環からなる環系を意味する。

【0048】

用語「炭素環」は、環骨格を形成する原子が炭素からのみ選択される環を意味する。特に明記しない限り、炭素環は、飽和、部分的不飽和又は完全不飽和の環である。完全不飽和の炭素環がヒュッケル則を満たす場合、当該環は「芳香族環」とも呼ばれる。「飽和炭素環」とは、単結合で互いに結合した炭素原子からなる骨格を有する環を指し、特に指定のない限り、残りの炭素原子価は水素原子で占められる。

【図面の簡単な説明】

【0049】

以下の図は、本開示を説明するための好ましい実施形態を提供するものであり、本発明の範囲を限定するものと見なされるべきではない。

【図1】創傷治癒アッセイで評価したＭＣＦ－７細胞の遊走に対するクロメン系化合物の効果（１２、２４、４８、７２時間の処理で、各化合物についてそれぞれの１／２ＩＣ_５０及びＩＣ_５０値）を示す図である。

【図2】創傷治癒アッセイで評価したＣａｋｉ－２細胞株の遊走に対するクロメン系化合物の効果（１２、２４、３６、４８時間の処理で、各化合物についてそれぞれのＩＣ_５０値）を示す図である。

【図3】４８時間の処理後の７８６－Ｏ細胞の増殖に対するクロメン系化合物の効果を示す図である。

【図4】アネキシンＶ／ＰＩアッセイで評価したＭＣＦ－７細胞の生存率のフローサイトメトリー分析を示す図である。図４Ａは、０．５％ＤＭＳＯ（対照）で処理したＭＣＦ－７細胞又はＩＣ_５０濃度の化合物で１２時間及び２４時間処理したＭＣＦ－７細胞の代表的なドットプロットである。図４Ｂは、ドットプロットの各象限にある細胞の割合の定量化を示している。

【図5】アネキシンＶ／ＰＩアッセイで評価したＨｓ５７８ｔ細胞の生存率のフローサイトメトリー分析を示す図である。図５Ａは、０．５％ＤＭＳＯ（対照）で処理したＨｓ５７８ｔ細胞又はＩＣ_５０濃度の薬剤で１２時間及び２４時間処理したＨｓ５７８ｔ細胞の代表的なドットプロットである。図５Ｂは、ドットプロットの各象限にある細胞の割合の定量化を示している。

【図6】ＭＣＦ－７細胞を、化合物ＭＣ４０９、ＭＣ４０８、ＭＣ４０６及びＭＣ４２１で（Ａ）２４時間及び（Ｂ）４８時間、対応するＩＣ_５０濃度を用いて処理した後の完全長ＰＡＲＰ、カスパーゼ３及び９、ＢＩＭ並びにＢｃｌ－ｘＬについてのウェスタンブロット分析を示す図である。１２％ポリアクリルアミドゲルを用いた、溶解液におけるウェスタンブロッティングによるタンパク質レベルの検出。

【図7】Ｈｓ５７８ｔ細胞を、化合物ＭＣ４０９、ＭＣ４０８、ＭＣ４０６及びＭＣ４２１で（Ａ）２４時間及び（Ｂ）４８時間、対応するＩＣ_５０濃度を用いて処理した後の完全長ＰＡＲＰ、カスパーゼ３及び９、ＢＩＭ、Ｂｃｌ－ｘＬ並びにＢａｘについてのウェスタンブロット分析を示す図である。１２％ポリアクリルアミドゲルを用いた、溶解液におけるウェスタンブロッティングによるタンパク質レベルの検出。

【図8】ＭＣＦ－７細胞のＤＮＡ含量のフローサイトメトリー分析を示す図である。図８Ａは、０．５％ＤＭＳＯ（対照）で処理したＭＣＦ－７細胞又はＩＣ_５０濃度の薬剤で１２時間及び２４時間処理したＭＣＦ－７細胞の細胞周期プロファイルを示す代表的なヒストグラムである。図８Ｂは、細胞周期の異なる段階にある細胞の定量化を示している。

【図9】Ｈｓ５７８ｔ細胞のＤＮＡ含量のフローサイトメトリー分析を示す図である。図９Ａは、０．５％ＤＭＳＯ（対照）で処理したＨｓ５７８ｔ細胞又はＩＣ_５０濃度の薬剤で１２時間及び２４時間処理したＨｓ５７８ｔ細胞の細胞周期プロファイルを示す代表的なヒストグラムである。図９Ｂは、細胞周期の異なる段階にある細胞の定量化を示している。

【図10】Ｈｓ５７８ｔ（Ａ、Ｂ）及びＭＣＦ－７（Ｃ、Ｄ）細胞の微小管ネットワークに対する化合物ＭＣ４０８及びＭＣ４２１の効果を示す図である。

【図11】Ｃ．エレガンスにおける毒性効果の決定に用いた戦略を示す図である。蠕虫は、熱不活性化細菌（大腸菌ＯＰ５０）を食料源として利用し、いくつかの濃度の化合物ＭＣ４２１、ＭＣ４０６、ＭＣ３６９及びＭＣ４０８、ＭＣ４０９、ＭＣ４０７の存在下で、液体培地中で７日間培養した。３日目から５日目までの食物消費速度は、蠕虫の発育、健康状態、さらには３日目以降は蠕虫の子孫が食物量の急速な減少に寄与するため、繁殖力の指標として用いた。架空の化合物Ｘについての例を示す。ＤＭＳＯ１％及び５％を毒性の陰性及び陽性対照として使用した。

【図12】Ｃ．エレガンスにおける化合物のｉｎ ｖｉｖｏ毒性の欠如を示す図である。

【図13】Ｃ５７ＢＩ／６マウスに対する化合物ＭＣ４０８の効果を示す図である。

【図14】化合物ＭＣ４０８で処理されたＣ５７ＢＩ／６マウスで行った一連の福祉試験の結果を示す図である。

【図15】Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの酵素肝機能に対するＭＣ４０８処理の効果を示す図である。

【図16】Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに対するＭＣ４０８処理の効果－第２回目の実験を示す図である。図１６Ａは、実験のタイムラインの概略図である。図１６Ｂは、マウスの体重を示している。

【図17】乳がんＨｓ５７８ｔ細胞株に対するＭＣ４０８及びＭＣ４２１のｉｎ ｖｉｖｏ治療効果を示す図である。図１７ＡはＣＡＭアッセイの代表的な写真を示し、図１７Ｂは腫瘍成長率を示している。

【図18】アネキシンＶ／ＰＩアッセイで評価した７８６－Ｏ細胞の生存率のフローサイトメトリー分析を示す図である。図１８Ａは、０．５％ＤＭＳＯ（対照）で処理した７８６－Ｏ細胞又はＩＣ_５０濃度の薬剤で２４時間及び４８時間処理した７８６－Ｏ細胞の代表的なドットプロットである。図１８Ｂは、ドットプロットの各象限にある細胞の割合の定量化を示している。

【図19】７８６－Ｏ細胞を、化合物ＭＣ４０８及びＭＣ４２１で（Ａ）２４時間及び（Ｂ）４８時間、対応するＩＣ_５０濃度を用いて処理した後のＫＤＭ４Ｃ、完全長ＰＡＲＰ、Ｈｓｐ９０、完全長ＪＮＫ、完全長ｐ５３、Ｂｉｄ及びｐ２１についてのウェスタンブロット分析を示す図である。１２％ポリアクリルアミドゲルを用いた、溶解液におけるウェスタンブロッティングによるタンパク質レベルの検出。

【図20】７８６－Ｏ細胞を、２時間の飢餓期間と、セディラニブ、化合物ＭＣ３５０、ＭＣ４１５、ＭＣ４１２、ＭＣ４０８及びＭＣ４２１で６時間、２μＭの固有濃度を用いて処理した後のｍＴＯＲ、ＥＲＫ、ＶＥＧＦＲ２、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ、ＰＴＥＮ及びＡＭＰＫの完全型並びにリン酸化型、ＰＤＫ１、ＮＦ－κＢ及びｐ１８のリン酸化型並びにｃ－Ｍｙｃ、Ｈｓｐ９０及びＰＲＡＳ４０タンパク質についてのウェスタンブロット分析を示す図である。１０％ポリアクリルアミドゲルを用いた、溶解液におけるウェスタンブロッティングによるタンパク質レベルの検出。

【図21】腎がん７８６－Ｏ細胞株に対するＭＣ４０８及びＭＣ４２１のｉｎ ｖｉｖｏ治療効果を示す図である。図２１ＡはＣＡＭアッセイの代表的な写真を示し、図２１Ｂは腫瘍成長率を示している。

【図22】７８６－Ｏ細胞のＤＮＡ含量のフローサイトメトリー分析を示す図である。図２２Ａは、０．５％ＤＭＳＯ（対照）で処理した７８６－Ｏ細胞又はＩＣ_５０濃度の薬剤で２４時間及び４８時間処理した７８６－Ｏ細胞の細胞周期プロファイルを示す代表的なヒストグラムである。図２２Ｂは、細胞周期の異なる段階にある細胞の定量化を示している。

【図23】Ａ４９８耐性細胞株及び親細胞株を、選択した化合物の１／２ＩＣ_５０又はＩＣ_５０で２４時間及び４８時間処理した後の、細胞増殖に対するクロメン系化合物の効果を示す図である。

【図24】Ｃａｋｉ－２耐性細胞株及び親細胞株を、選択した化合物の１／２ＩＣ_５０又はＩＣ_５０で２４時間及び４８時間処理した後の、細胞増殖に対するクロメン系化合物の効果を示す図である。

【図25】Ａ４９８の親（Ｐ）及び耐性（Ｒ）細胞に対する、ＩＣ_５０のラパマイシン及びセディラニブ、化合物ＭＣ３５０、ＭＣ４１３、ＭＣ４０８及びＭＣ４２１での４８時間の処理期間を経た後の、ＥＲＫ及びＧＡＰＤＨ、ＨＫ２、ＬＤＨＡ、Ｈｉｆ２α、ＭＣＴ１、ＰＫＭ、ＰＦＫＬ、Ｈｓｐ９０及びｃ－Ｍｙｃタンパク質の完全型並びにリン酸化型についてについてのウェスタンブロット分析を示す図である。１０％ポリアクリルアミドゲルを用いた、溶解液におけるウェスタンブロッティングによるタンパク質レベルの検出。

【図26】血管新生に対する化合物ＭＣ４０８及びＭＣ４２１のｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図である。１３日目及び１７日目のｉｎ ｏｖｏ及びｅｘ ｏｖｏにおけるＣＡＭアッセイの代表的な画像（倍率２０倍）。

【図27】同所性乳がんＮＳＧマウス異種移植モデルの腫瘍体積及び重量を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0050】

本開示は、新規クラスのクロメン系抗がん化合物に関するものである。本開示は、新規クラスのクロメン系抗がん化合物の抗がん特性について記載する。本開示はさらに、新規クラスのクロメン系抗がん化合物を合成し、及び単離する方法を記載する。

【0051】

具体的には、本開示では、少なくとも２つの異なる分子を組み合わせることにより、興味深い関連する生物学的プロファイルを持つ化合物を生み出す新規クロメン系化合物の合成方法を記載している。

【0052】

一実施形態では、１９種類のクロメンイミダゾール系化合物を単離した。表１は、クロメン系骨格の構造と、合成及び単離した１９種類のクロメンイミダゾール系化合物とを示している。

【表1-1】

【表1-2】

【0053】

一実施形態では、単離した薬剤の抗増殖活性の評価の一環として、合成し、及び単離したクロメン系化合物の細胞増殖阻害率及びＩＣ_５０値を測定した。合成したすべての化合物について、構造活性相関に関する完全な研究を行った。ＭＣＦ－７乳がん細胞株に対する抗増殖活性を分析した。表２は、乳がん細胞株ＭＣＦ－７及び非新生物細胞株ＭＣＦ－１０Ａに対する化合物のＩＣ_５０値（μＭ）及び選択性指数（ＳＩ）を示している。また、非新生物細胞株ＭＣＦ－１０Ａを用いて、腫瘍細胞に対する化合物の選択性を調べた。ＩＣ_５０値（細胞の生存率を５０％低下させるのに必要な濃度）が２０μＭよりも高い化合物については、ＩＣ_５０ 値を決定しなかった。試験化合物の細胞毒性を評価するために、選択性指数（ＳＩ）を算出した。

【表2-1】

【表2-2】

【0054】

二量体化合物は、ＭＣＦ－７細胞株に対して優れたＩＣ_５０値を示し、それぞれの単量体よりも低い値を示した。イミダゾール部位に結合している芳香族環にハロゲン原子を有する、又は置換基のないモノマー化合物は、最も低いＩＣ_５０値（＜１μＭ）を示した。ＯＨ又はＯＣＨ_３／ＯＣＨ_２ＣＨ_３を有するイミダゾクロメンは、同じ芳香族部位にハロゲン原子が存在する場合でも、ＩＣ_５０値が著しく高くなった。

【0055】

非新生物細胞株ＭＣＦ－１０Ａに対しても、いくつかのクロメンで有望なＩＣ_５０値が得られ、高いＳＩ値が算出された。非新生物細胞に対する毒性は、二量体化合物の方がはるかに低く、優れたＳＩ値（６０より高い）が得られた。ＳＩ値は全般的に非常に有望であった。

【0056】

一実施形態では、比較研究のために、単量体及びそれぞれの二量体を選択し、さらにＨｓ５７８ｔ及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８乳がん細胞株で評価した。表３は、乳がん細胞株Ｈｓ５７８ｔ及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８に対する、選択したクロメン系化合物のＩＣ_５０値（μＭ）及び選択性指数（ＳＩ）を示している。これらの細胞株は、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）及びヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）分子マーカーが陰性であることから、既知のトリプルネガティブサブタイプに含まれる乳がんの基底細胞様サブタイプに相当する。これらの乳がんのサブタイプの臨床的挙動は非常に侵攻性が高く、いまだに特定の分子療法はない。

【表3-1】

【表3-2】

【0057】

クロメン系化合物は、Ｈｓ５７８ｔに対して０．０３５～０．２７μＭと非常に低いＩＣ_５０値を示した。臭素置換されたクロメン系化合物ＭＣ４０８及び二量体化合物ＭＣ４２１は、Ｈｓ５７８ｔ細胞株及びＭＤＡ－ＭＢ４６８細胞株に対して非常に低いＩＣ_５０値を示した。化合物ＭＣ４０８は特に活性が高い（ＩＣ_５０＝０．０２７μＭ）。一般に、化合物は、これらの侵攻性の乳がんのサブタイプに対して、さらに興味深い抗増殖能を示し、ＳＩ値も優れていた。

【0058】

一実施形態では、化合物ＭＣ４０８、ＭＣ４０９、ＭＣ４２１及びＭＣ４０６の抗増殖活性を、神経膠腫細胞株（Ｕ８７、ＧＡＭＧ及びＧＬ１８）並びに急性白血病細胞株（ＨＬ－６０、ＫＧ－１及びＪｕｒｋａｔ）に対してさらに測定した。これは、本化合物が他のがん細胞モデルにおいても同様に興味深い抗がんプロファイルを示すかどうかを評価するために行った。細胞の生存率は、細胞をそれぞれの化合物に適切な濃度範囲で７２時間曝露した後、ＭＴＳアッセイを用いて測定し、それぞれのＩＣ_５０値を求めた。表４は、化合物ＭＣ４０８、ＭＣ４０９、ＭＣ４２１及びＭＣ４０６の神経膠腫及び白血病のがん細胞モデルに対するＩＣ_５０値（μＭ）を示している。

【表4】

【0059】

これらの化合物は、すべての細胞株に対するＩＣ_５０値がナノモル又は低マイクロモルの範囲であったことから、優れた抗増殖能を示した。化合物ＭＣ４２１は、神経膠腫細胞株、特にＵ８７及びＧＡＭＧに対して非常に高い細胞増殖抑制を示した。化合物ＭＣ４０８は、他の化合物と比較して抗増殖能が低いが、ＩＣ_５０値は依然として低μＭの範囲にあった。白血病モデルでは、すべての化合物がＪｕｒｋａｔ細胞株に対してより選択的であると思われるが、他の白血病細胞株をすべての化合物で処理しても、優れた増殖抑制が達成された。これらの結果から、これらの化合物はいくつかのがん細胞モデルにおいて有望であり、がん治療の候補として見なされ得ることが示された。

【0060】

一実施形態では、化合物の抗増殖活性を、腎がん細胞株及び非新生物性腎細胞株に対してさらに測定した。表５は、腎がん細胞株（７８６－Ｏ、Ｃａｋｉ－２、Ａ４９８）及び非新生物細胞株（ＨＫ２）に対するＩＣ_５０値（μＭ）及び選択性指数（ＳＩ）を示す。化合物Ｍ９５５、Ｍ１２２０、Ｍ１１４３及びＭ１２２１は、最初のスクリーニングで生物学的活性を示さず、ＩＣ_５０の決定は追求されなかった。いくつかの化合物は、腎細胞がん（ＲＣＣ）細胞株に対して高い活性と優れた選択性指数を示した。

【表5】

【0061】

一実施形態では、化合物ＭＣ４２１、ＭＣ４０９、ＭＣ４０８、ＭＣ３５０、ＭＣ４１６、ＭＣ４１０、ＭＣ４１１、ＭＣ４１５及びＭＣ４１３の抗増殖活性を、薬剤耐性腎がん細胞株に対してさらに測定した。表６は、ラパマイシン耐性Ａ４９８細胞株及びセディラニブ耐性Ｃａｋｉ－２細胞株及び非新生物細胞株（ＨＫ２）に対するＩＣ_５０値（μＭ）及び選択性指数（ＳＩ）を示している。

【表6】

【0062】

一実施形態では、選択した４つの化合物（ＭＣ４０８、ＭＣ４０９、ＭＣ４０６及びＭＣ４２１）の効果を、細胞遊走に対してさらに評価した（図１）。ＭＣＦ－７細胞をそれぞれのＩＣ値_５０及び当該ＩＣ_５０値の半分で７２時間処理し、創傷治癒アッセイを行った。各化合物のＩＣ_５０濃度の半分を使用し、濃度依存性効果を評価した。図１は、ＭＣＦ－７細胞遊走に対するクロメン系化合物の効果を、創傷治癒アッセイによって評価したものである（各化合物について、それぞれ１／２ＩＣ_５０及びＩＣ_５０値で１２、２４、４８、７２時間処理した）。結果は、少なくとも３回の独立した実験の平均値±ＳＤとして示し、対照（ＤＭＳＯ、０．５％）と比較して、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１とした。

【0063】

すべての化合物について、わずか１２時間のインキュベーションで、顕微鏡で広範囲の細胞死が観察された。７２時間後には、大量の浮遊する死細胞が細胞遊走の正確な測定を妨げたため、写真を撮る前に各ウェルから培地を除去した。化合物ＭＣ４０９は、細胞遊走に対して早い段階で効果を示し、１２時間後、この化合物は、細胞遊走の割合（０．５％ＤＭＳＯの対照との比較）を、ＩＣ_５０及び１／２ＩＣ_５０値で約４０％減少させることができた。しかし、細胞遊走の緩やかな回復が観察されるように、細胞は化合物の影響から回復するように思われる。７２時間の処理後、ＩＣ_５０濃度を用いることにより、細胞遊走は対照よりも約１２％まで抑制された。他の３つの化合物についても、２４時間又は４８時間の処理後に低い効果が観察された。ＩＣ_５０濃度及び１／２_５０ＩＣ濃度を用いた化合物ＭＣ４０８及びＭＣ４０６処理については、細胞遊走に対して同様の効果が得られ、７２時間後には細胞遊走が対照と比べて２０％減少した。化合物ＭＣ４２１は、濃度依存的に効果を示した。ＩＣ_５０及び１／２ＩＣ_５０濃度のいずれにおいても、時間の経過とともに細胞遊走にわずかな効果が見られた。細胞遊走の減少は、７２時間の処理後にのみ観察された（対照より１３％減少）。

【0064】

一実施形態では、化合物ＭＣ４０８、ＭＣ４２１、ＭＣ４１２及びＭＣ４１５の効果は、腎細胞がん細胞株Ｃａｋｉ－２における細胞遊走（図２）についても、４つの異なる時点で評価した。参照薬物としてセディラニブを用い、すべての化合物をそれぞれのＩＣ_５０濃度値を用いて試験した。図２は、Ｃａｋｉ－２細胞株の遊走に対するクロメン系化合物の効果（各化合物のそれぞれのＩＣ_５０値で１２、２４、３６、４８時間処理）を、創傷治癒アッセイによって評価したものである。結果を対照（破線）に対して正規化し、平均値±ＳＥＭで示した。対照（０．５％ＤＭＳＯ）と比較して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００２、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１とした。異なるグループ間の差の有意性は、スチューデントのｔ検定で判定した。

【0065】

一実施形態では、細胞増殖に対する好ましいクロメン系化合物の効果を評価した。７８６－Ｏ細胞を、ＩＣ値_５０及び１／２_５０ＩＣ値で４８時間処理した。ＤＮＡ合成中のＢｒｄＵ取り込み能力を測定し、結果を図３に示した。図３は、４８時間処理した７８６－Ｏ細胞の増殖に対するクロメン系化合物の効果を示す。結果は、少なくとも３回の独立した実験の平均値±ＳＤで表した。対照（０．５％ＤＭＳＯ）と比較して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１とした。異なるグループ間の差の有意性は、スチューデントのｔ検定で判定した。一般に、クロメンは、７８６－Ｏ細胞に対して、濃度依存的に細胞増殖の有意な減少を誘導した。化合物ＭＣ４０９、ＭＣ４１０及びＭＣ３６８では例外が観察された。

【0066】

一実施形態では、化合物、特に化合物ＭＣ４０６、ＭＣ４０９及びＭＣ４０８は、細胞増殖及び細胞死に対する明確な効果を示した。これは、形態学的変化（顕微鏡で観察される細胞）によって見ることができ、丸い浮遊細胞の存在によっても見ることができる。

【0067】

一実施形態では、細胞死に至るメカニズムを理解するために、細胞をフローサイトメトリーによるアポトーシス誘導について調べた。ＭＣＦ－７細胞及びＨｓ５７８ｔ細胞を１２時間及び２４時間、７８６－Ｏ細胞を２４時間及び４８時間、それぞれのＩＣ_５０濃度の化合物とインキュベートした後、アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で二重染色し、ホスファチジルセリンの外在化を検出した。ホスファチジルセリンの外在化は、アポトーシスの初期に起こる。アネキシンＶがホスファチジルセリンに結合する一方で、ＰＩは膜の完全性を失った細胞のみを染色するため、生細胞、初期アポトーシス細胞、後期アポトーシス／壊死細胞又は壊死細胞を識別することができる実験手順である。化合物ＭＣ４０８及びＭＣ４２１は、図９及び図１０に示すように、２４時間後に３つの細胞株でアポトーシスによる細胞死（初期アポトーシス）を誘導し、関連する抗がん作用を示した。化合物ＭＣ４０６及びＭＣ４０９は、Ｈｓ５７８ｔ細胞株においてもアポトーシスによる細胞死を誘導した。

【0068】

図４は、アネキシンＶ／ＰＩアッセイで評価したＭＣＦ－７細胞の生存率のフローサイトメトリー分析を示している。図４Ａは、０．５％ＤＭＳＯ（対照）で処理したＭＣＦ－７細胞又はＩＣ_５０濃度の化合物ＭＣ４０８、ＭＣ４０９、ＭＣ４０６及びＭＣ４２１で１２時間及び２４時間処理したＭＣＦ－７細胞の代表的なドットプロットである。図４Ｂは、ドットプロットの各象限にある細胞の割合の定量化を示している。この結果は、ＤＭＳＯで処理した細胞を対照（１００％）として、３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを用いて得られたものである。アネキシンＶ／ＰＩのデータは、二元配置分散分析及びボンフェローニ事後検定により分析した。対照（０．５％ＤＭＳＯ）と比較して、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１とした。図５は、アネキシンＶ／ＰＩアッセイで評価したＨｓ５７８ｔ細胞の生存率のフローサイトメトリー分析を示している。図５Ａは、０．５％ＤＭＳＯ（対照）で処理したＨｓ５７８ｔ細胞又はＩＣ_５０濃度の化合物ＭＣ４０８、ＭＣ４０９、ＭＣ４０６及びＭＣ４２１で１２時間及び２４時間処理したＨｓ５７８ｔ細胞の代表的なドットプロットである。図５Ｂは、ドットプロットの各象限にある細胞の割合の定量化を示している。この結果は、ＤＭＳＯで処理した細胞を対照（１００％）として、３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを用いて得られたものである。アネキシンＶ／ＰＩのデータは、二元配置分散分析及びボンフェローニ事後検定により分析した。対照（０．５％ＤＭＳＯ）と比較して、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１とした。図１８は、アネキシンＶ／ＰＩアッセイで評価した７８６－Ｏ細胞の生存率のフローサイトメトリー分析を示している。図１８Ａは、０．５％ＤＭＳＯ（対照）で処理した７８６－Ｏ細胞又はＩＣ_５０濃度の化合物ＭＣ４０８及びＭＣ４２１で２４時間及び４８時間処理した７８６－Ｏ細胞の代表的なドットプロットである。図１８Ｂは、ドットプロットの各象限にある細胞の割合の定量化を示している。この結果は、０．５％ＤＭＳＯで処理した細胞を対照（１００％）として、３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを用いて得られたものである。アネキシンＶ／ＰＩのデータは、二元配置分散分析及びボンフェローニ事後検定により分析した。対照（０．５％ＤＭＳＯ）と比較して、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１とした。

【0069】

一実施形態では、主要なアポトーシスマーカーのウェスタンブロット分析によるアポトーシス経路の検討を通じて、細胞死の誘導をさらに検討した。細胞をＩＣ_５０を用いて化合物で２４時間及び４８時間処理した後、ポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ１（Ｐａｒｐ）、カスパーゼ３及び９を、誘導されたアポトーシスのマーカーとして評価した（図６）。

【0070】

化合物で細胞を処理すると、カスパーゼ活性化の最終段階であり、アポトーシスの特徴と考えられているＰＡＲＰの切断が起こった（図６及び７）。また、２つの時点で、切断されたカスパーゼ３も観察された。これらのマーカーの存在によって観察されるように、アポトーシスはすべての化合物によって誘導される。

【0071】

Ｂｉｍタンパク質も使用したところ、試験化合物でレベルの上昇が認められたが、Ｈｓ５７８ｔ細胞株についてのみであった。Ｂｉｍのような ＢＨ３ドメインタンパク質はチューブリンと相互作用し、初期段階では、微小管がダイニン軽鎖と結合してＢｉｍを隔離し、このようにしてアポトーシスシグナル伝達経路の開始を阻止すると言われている。Ｂｉｍは、微小管から放出された後、ミトコンドリアに移動し、いくつかのタンパク質（例えば、Ｂａｘ、Ｂｃｌ－２及びＢｃｌ－ｘＬ）と相互作用し、最終的にアポトーシスを促進する。このことから、試験化合物で処理された細胞からは早期にアポトーシスシグナルが放出され、その結果、ミトコンドリア誘導アポトーシスに関与するアポトーシス促進性及び抗アポトーシス性タンパク質のレベルに影響を与えていることが示唆される。

【0072】

一実施形態では、細胞周期分析を行い、化合物ＭＣ４０８、ＭＣ４０９、ＭＣ４０６及びＭＣ４２１の細胞増殖を阻害する能力を決定した。ＭＣＦ－７及びＨｓ５７８ｔ細胞を、それぞれのＩＣ_５０濃度の化合物で１２時間及び２４時間処理した。７８６－Ｏ細胞を、それぞれのＩＣ_５０の化合物ＭＣ４０８及びＭＣ４２１で２４時間及び４８時間処理した。細胞周期分析は、フローサイトメトリーを用いてＤＮＡ含量で評価した（図８、９及び２２）。図８は、ＭＣＦ－７細胞のＤＮＡ含量のフローサイトメトリー分析を示している。図８Ａは、０．５％ＤＭＳＯ（対照）で処理したＭＣＦ－７細胞又はＩＣ_５０濃度のＭＣ４０８、ＭＣ４０９、ＭＣ４０６及びＭＣ４２１で１２時間及び２４時間処理したＭＣＦ－７細胞の細胞周期プロファイルを示す代表的なヒストグラムである。図８Ｂは、化合物ＭＣ４０９を除く、細胞周期の異なる段階にある細胞の定量化を示している。結果は３回の独立した実験の平均値±ＳＤで示した。データは、二元配置分散分析及びボンフェローニ事後検定により分析した。対照（０．５％ＤＭＳＯ）と比較して、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１とした。

【0073】

図９は、Ｈｓ５７８ｔ細胞のＤＮＡ含量のフローサイトメトリー分析を示している。図９Ａは、０．５％ＤＭＳＯ（対照）で処理したＨｓ５７８ｔ細胞又はＩＣ_５０濃度のＭＣ４０８、ＭＣ４０９、ＭＣ４０６及びＭＣ４２１で１２時間及び２４時間処理したＨｓ５７８ｔ細胞の細胞周期プロファイルを示す代表的なヒストグラムである。図９Ｂは、化合物ＭＣ４０９を除く、細胞周期の異なる段階にある細胞の定量化を示している。結果は３回の独立した実験の平均値±ＳＤで示した。データは、二元配置分散分析及びボンフェローニ事後検定により分析した。対照（０．５％ＤＭＳＯ）と比較して、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１とした。

【0074】

図２２は、７８６－Ｏ細胞のＤＮＡ含量のフローサイトメトリー分析を示している。図２２Ａは、０．５％ＤＭＳＯ（対照）で処理した７８６－Ｏ細胞又はＩＣ_５０濃度のＭＣ４０８及びＭＣ４２１で２４時間及び４８時間処理した７８６－Ｏ細胞の細胞周期プロファイルを示す代表的なヒストグラムである。図２２Ｂは、細胞周期の異なる段階にある細胞の定量化を示している。結果は、３回の独立した実験の平均値±ＳＤで示した。データは、二元配置分散分析及びボンフェローニ事後検定により分析した。対照（０．５％ＤＭＳＯ）と比較して、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１とした。

【0075】

一実施形態では、微小管動力学に対するクロメン系化合物の効果を分析した。図１０は、Ｈｓ５７８ｔ（Ａ、Ｂ）及びＭＣＦ－７（Ｃ、Ｄ）細胞の微小管ネットワークに対する化合物ＭＣ４０８及びＭＣ４２１の効果を示している。未処理（対照）、パクリタキセル（Ｈｓ５７８ｔに１２時間：０．２５μＭ、２４時間：０．０１μＭ；ＭＣＦ－７に１２／２４時間：１μＭ）並びに化合物ＭＣ４０８及びＭＣ４２１をＩＣ_５０で１２時間（Ａ、Ｃ）又は２４時間（Ｂ、Ｄ）処理した細胞を、β－チューブリンで染色し、４，６－ジアミノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で対比染色した。微小管及び未集合のチューブリンは緑色で示されている。ＤＡＰＩで染色したＤＮＡは青で示されている。

【0076】

一実施形態では、セノラブディティス・エレガンス（Ｃ．エレガンス）をモデルとして、ｉｎ ｖｉｖｏでの化合物の毒性評価を行った。食物クリアランスに基づくアッセイを実施した。このアッセイでは、経時的な細菌消費量が蠕虫の発育、健康及び繁殖力の代用となる（図１１）。図１１は、Ｃ．エレガンスにおける毒性効果の決定に用いた戦略を示している。蠕虫は、熱不活性化細菌（大腸菌ＯＰ５０）を食料源として利用し、いくつかの濃度の化合物ＭＣ４２１、ＭＣ４０６、ＭＣ３６９及びＭＣ４０８、ＭＣ４０９、ＭＣ４０７の存在下で、液体培地中で７日間培養した。３日目から５日目までの食物消費速度は、蠕虫の発育、健康状態、さらには３日目以降は蠕虫の子孫が食物量の急速な減少に寄与するため、繁殖力の指標として用いた。架空の化合物Ｘについての例を示す。ＤＭＳＯ１％及び５％を毒性の陰性及び陽性対照としてそれぞれ使用した。この実験では、化合物をＤＭＳＯ１％（ビヒクル）に溶解させた。

【0077】

化合物は、いくつかの濃度で、可能な限り最も高い可溶性濃度である１５０μＭ（ＭＣ３６９、７５μＭ）まで試験した（図１２）。図１２は、Ｃ．エレガンスにおけるＭＣ４２１、ＭＣ４０６、ＭＣ３６９及びＭＣ４０８、ＭＣ４０９、ＭＣ４０７のｉｎ ｖｉｖｏ毒性の分析結果を示している。３～５日目の食物消費速度を、蠕虫の発育、健康及び繁殖力の指標として用い、１％ＤＭＳＯ（ビヒクル、毒性なし）と比較した。ＭＣ４２１、ＭＣ４０６、ＭＣ３６９及びＭＣ４０８、ＭＣ４０９、ＭＣ４０７では、統計的差異は見られなかった（分散分析、続いてゲームス－ハウエルの事後検定）。３～５日目の食料消費速度については、いずれの化合物／化合物の濃度においても統計的差異は認められなかった。化合物がｉｎ ｖｉｔｒｏ試験で使用される濃度よりも大幅に高い濃度でも十分に忍容されると思われることから、哺乳類モデルにおける毒性についての良い予測因子である可能性がある。

【0078】

一実施形態では、化合物の安全性プロファイルをげっ歯類で評価した。図１３は、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに対するＭＣ４０８処理の効果－第１回目の試験を示している。図１３Ａは、実験のタイムラインの概略図である。５ヶ月齢の雌雄の動物を使用し（ｎ＝３／グループ／性別）、３ｍｇ／ＫｇのＭＣ４０８又はビヒクル（生理食塩水、Ｔｗｅｅｎ８０及びメチルセルロース）のいずれかを７日間毎日注射した（腹腔内投与）。一連の福祉試験を毎日行った。図１３Ｂは、最初の注射の直後の様子を示している。この分析では、動物を１０分間ビデオ撮影し、不動時間及び垂直運動（ＲＥＡＲＳ）を実験者が数えた。ビヒクルマウスとＭＣ４０８マウスの間に違いは見られなかった。図１３Ｂは、実験全体を通してモニターしたマウスの体重を示しており、処理グループ間で差は見られなかった。図１３Ｄは、マウスの垂直探索行動を示したものである。この行動は、観察瓶の中で測定され、５分間の垂直運動の数を数えた。図１３Ｅは、マウスの水平方向の行動を示している。この活動は、升目のラベルが貼られたオープンアリーナで記録し、動物が自由に探索している間の升目の数を１分間数えた。探索行動に差は見られなかった。図１３Ｆは、マウスの不安を間接的に測定したものである。不安を間接的に測定するために、行動設定中に動物が生成したボーラスフェカリスの数を数えたが、グループ間で差は見られなかった。図１３Ｇ及びＨでは、水及び餌の摂取量をそれぞれ分析した。毎日、各ケージに０．３００ｇの餌と２００ｍＬの水を入れた。試験終了時（７日目）に餌を計量し、水を測定したところ、両パラメータに差は見られなかった。データを平均値±ＳＥで示した。

【0079】

図１４は、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに対するＭＣ４０８処理の効果を示したものである。一連の福祉試験を実施し、ビヒクル動物と比較した場合のＭＣ４０８による処理の毒性の兆候を評価した。評価したすべてのパラメータは、正常か異常か、存在するかしないかでスコア化し、すべての動物が同じスコア（ＭＣ４０８及びビヒクル）であったことから、本化合物がマウスの福祉に影響を与えていないことが示唆された。

【0080】

一実施形態では、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの肝機能に対する処理の効果を分析した。図１５は、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの酵素肝機能に対するＭＣ４０８処理の効果を示したものである。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ／ＴＧＯ）とアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ／ＴＧＰ）を、（図１５Ａ）雌と（図１５Ｂ）雄の血清中で標準的な手法を用いて測定した。血液は実験終了時（７日目）に採取した。化合物で処理した動物とビヒクルで処理した動物の間には、各性別において統計的差異は見られなかった。注目すべきは、ＭＣ４０８処理グループの１匹の雄が、同じグループの他の２匹の動物と比較して、ＡＳＴとＡＬＴの両方で高いレベルを示したことである。データを平均値±ＳＥで示した。

【0081】

一実施形態では、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに対する化合物処理の効果－第２回目の試験を分析した。図１６は、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに対するＭＣ４０８処理の効果－第２回目の試験を示す。図１６Ａは、実験のタイムラインの概略図である。３ヶ月齢の雌雄の動物を使用し（ｎ＝６／グループ／性別）、３ｍｇ／ＫｇのＭＣ４０８又はビヒクル（生理食塩水、Ｔｗｅｅｎ８０及びメチルセルロース）のいずれかを７日間毎日注射した（腹腔内投与）。この試験では、グループあたりの動物数を増やし、処理の前後に血液を採取する実験を考えた。図１６Ｂは、マウスの体重を示したものである。実験全体を通して体重をモニターし、各性別内のグループ間で差は見られなかった。データを平均値±ＳＥで示した。

【0082】

一実施形態では、化合物のｉｎ ｖｉｖｏ治療効率試験をＣＡＭモデルを用いて分析した。図１７は、乳がんＨｓ５７８ｔ細胞株に対するＭＣ４０８及びＭＣ４２１のｉｎ ｖｉｖｏ治療効果を示す。図１７Ａは、ｉｎ ｏｖｏ及びｅｘ ｏｖｏ（１３日目及び１７日目）でのＣＡＭアッセイの代表的な写真（倍率１０倍）を示している。図１４Ｂは、腫瘍成長率を示している。結果は、発生の１３日目から１７日目までの腫瘍成長率の平均値±ＳＤで表した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。データは一元配置分散分析検定により分析した。卵は、対照（ＤＭＳＯ ０．５％）、ＭＣ４０８（２ｘＩＣ_５０＝０．０９４μＭ）又はＭＣ４２１（２ｘＩＣ_５０＝０．０７０μＭ）で処理した。

【0083】

一実施形態では、主要なアポトーシスマーカーのウェスタンブロット分析によるアポトーシス経路の検討を通じて、細胞死の誘導をさらに調査した。ポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ１（Ｐａｒｐ）、熱ショックタンパク質９０（Ｈｓｐ９０）、ｃ－Ｊｕｎ Ｎ－末端キナーゼ（ＪＮＫ）、ｐ５３、ＢＨ３相互作用ドメインデスアゴニスト（Ｂｉｄ）及びｐ２１を誘導されたアポトーシスマーカーとして、７８６－Ｏ細胞を化合物でＩＣ_５０を用いて２４時間及び４８時間処理した後に評価した（図１９）。

【0084】

一実施形態では、ＲＴＫ受容体及びｍＴＯＲ／ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路との相互作用を、哺乳類ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、内皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、プロテインキナーゼＢ（ＡＫＴ）、ホスファターゼ及びテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、５’アデノシン一リン酸活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ１（ＰＤＫ１）、核内κＢ因子（ＮＦ－κＢ）、ｐ１８、ｃ－Ｍｙｃ、Ｈｓｐ９０及び４０ｋＤａのプロリンリッチＡｋｔ基質（ＰＲＡＳ４０）タンパク質の評価を通じてさらに検討した。これらのマーカーは、セディラニブ（腎細胞がんの治療に用いられる血管内皮増殖因子の強力な阻害剤）並びに化合物ＭＣ３５０、ＭＣ４１２、ＭＣ４１５、ＭＣ４０８及びＭＣ４２１で独自の用量である２μＭを用いて６時間処理した後に評価した（図２０）。

【0085】

７８６－Ｏ細胞をいくつかの化合物で処理したところ、リン酸化ｍＴＯＲ及びＡＫＴタンパク質レベルが低下した。さらに、ＥＧＦＲ及びＶＥＧＦＲ２の両方で、対照及びセディラニブと比較してレベルが低下するケースが見られた。試験したいくつかの化合物は、ｍＴＯＲ／ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路に影響を与え、様々なタンパク質マーカーを阻害する。

【0086】

ＶＥＧＦＲ及びＥＧＦＲは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及び内皮（ＥＧＦ）増殖因子ファミリーに特異的なチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の受容体であり、腫瘍の成長及び転移に重要な役割を果たす。それらの自己リン酸化は、リン酸化されたチロシンに結合した多くの他のタンパク質による下流の活性化とシグナル伝達を刺激する。これらの下流のシグナル伝達タンパク質は、Ａｋｔ経路を含むいくつかのシグナル伝達カスケードを開始し、遺伝子発現、細胞の増殖及び移動、脈管形成並びに血管形成を引き起こす。さらに、ｍＴＯＲは細胞の成長、増殖及び代謝を調節する。その活性は、ラパマイシンに感受性の高いｍＴＯＲＣ１と、耐性があると考えられているか、高用量を長期間投与した場合にのみ阻害されると考えられているｍＴＯＲＣ２の２つの多タンパク質複合体によって制御される。第二世代のデュアルｍＴＯＲ阻害剤が開発されており、それらの新薬の最も重要な利点は、ｍＴＯＲＣ２遮断時のＡＫＴリン酸化の大幅な減少と、ｍＴＯＲＣ１のより良好な阻害である。これらの結果を考慮すると、ＲＴＫ、ｍＴＯＲ及びＡＫＴの発現が減少すると、上述したすべての機能の主要な調節因子が減少することが示唆される。

【0087】

一実施形態では、ＣＡＭモデルを用いて、化合物のｉｎ ｖｉｖｏ治療有効性を分析した。図２１は、腎がん７８６－Ｏ細胞株に対するＭＣ４０８及びＭＣ４２１のｉｎ ｖｉｖｏ治療効果を示す。図２１Ａは、ｉｎ ｏｖｏ及びｅｘ ｏｖｏ（１３日目及び１７日目）のＣＡＭアッセイの代表的な写真（倍率１０倍）を示している。図２１Ｂは、腫瘍成長率を示している。結果は、発生の１３日目から１７日目までの腫瘍成長率の平均値±ＳＤで表し、対照と比較してｐ＜０．０００１とした（統計分析は、一元配置分散分析検定を用いて行った）。卵は、対照（ＤＭＳＯ ０．５％）、ＭＣ４０８（２ｘＩＣ_５０＝０．１２８μＭ）又はＭＣ４２１（２ｘＩＣ_５０＝０．１５４μＭ）で処理した。

【0088】

一実施形態では、セディラニブ、ラパマイシン及びクロメン系化合物の細胞増殖に対する効果を評価した。Ａ４９８（親及びラパマイシン耐性）細胞並びにＣａｋｉ－２（親及びセディラニブ耐性）細胞を、ＩＣ_５０値及び１／２ＩＣ_５０値で、２４時間及び４８時間処理した。ＤＮＡ合成中のＢｒｄＵの取り込み能力を測定し、結果を図２３及び２４に示した。図２３は、２４時間及び４８時間処理したＡ４９８（親及びラパマイシン耐性）細胞の増殖に対するクロメン系化合物の効果を示している。図２４は、２４時間及び４８時間の処理後のＣａｋｉ－２（親及びセディラニブ耐性）細胞の増殖に対するクロメン系化合物の効果を示している。結果は、少なくとも３回の独立した実験の平均値±ＳＤとして示す。

【0089】

概して、クロメンは、特に化合物ＭＣ４０８、ＭＣ４２１及びＭＣ４１３で、親又は耐性Ａ４９８細胞のいずれかに対して、濃度及び時間依存的に細胞増殖の有意な減少を誘導した（図２３）。

【0090】

親及び薬剤耐性Ｃａｋｉ－２細胞（図２４）では、クロメンＭＣ４２１、ＭＣ３５０及びＭＣ４１３は、濃度及び時間依存的に細胞増殖を減少させることができた。

【0091】

一実施形態では、代謝機能との相互作用を、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ２（ＨＫ２）、乳酸デヒドロゲナーゼＡ（ＬＤＨＡ）、低酸素誘導因子２α（Ｈｉｆ２α）、モノカルボン酸トランスポーター１（ＭＣＴ１）、ピルビン酸キナーゼアイソザイム（ＰＫＭ）、６－ホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫＬ）、熱ショックタンパク質９０（Ｈｓｐ９０）及びｃ－Ｍｙｃタンパク質の完全型並びにリン酸化型を評価することでさらに調査した。これらのマーカーは、ＩＣ_５０のラパマイシン及びセディラニブ、化合物ＭＣ３５０、ＭＣ４１３、ＭＣ４０８及びＭＣ４２１でＡ４９８親細胞（Ｐ）及び耐性細胞（Ｒ）を４８時間処理した後に評価した。１０％ポリアクリルアミドゲルを用いた溶解液のウェスタンブロッティングによるタンパク質レベルの検出（図２５）。

【0092】

Ａ４９８細胞を様々な化合物で処理すると、いくつかのタンパク質のレベルが低下した。実際、ラパマイシン耐性細胞では、ＧＡＰＤＨ、Ｈｉｆ２α、ｃ－Ｍｙｃ及びＨｓｐ９０のタンパク質発現レベルが対照細胞及び親細胞に比べて有意に減少した。得られた結果を考慮して、クロメンは、現在利用可能なＲＣＣ療法に耐性がある場合でも、がん細胞の代謝反応を変化させる。

【0093】

一実施形態では、ＣＡＭモデルを用いて、血管新生を阻害する化合物のｉｎ ｖｉｖｏ能力を分析した。血管新生への影響を評価するために、滅菌した直径５ｍｍのフィルターディスクを、一定濃度（ＩＣ_５０値の２倍）のクロメンＭＣ４０８及びＭＣ４２１又は０．５％ＤＭＳＯ（対照グループ）の培養液に含浸させ、ＣＡＭの血管領域に配置した。図２６は、ｉｎ ｏｖｏ及びｅｘ ｏｖｏ（１３日目及び１７日目）でのＣＡＭアッセイの代表的な写真（倍率１０倍）を示している。

【0094】

新規クロメンでの処理の４日後、クロメンＭＣ４０８及びＭＣ４２１では、新規血管形成が減少した。さらに、既存の血管の破壊（図２６の黒矢印）が観察され、化合物がＣＡＭモデルの血管新生を阻害していることが示唆された。

【0095】

一実施形態では、マウスモデルを用いて化合物ＭＣ４０８のｉｎ ｖｉｖｏ治療有効性を分析した。図２７は、ＴＮＢＣ細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１を用いた同所性乳がんマウス異種移植モデルにおけるＭＣ４０８のｉｎ ｖｉｖｏ治療効果を示している。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞をＮＳＧマウスの乳腺脂肪体に注射した（１グループあたりｎ＝６又は７）。処理は、移植後３日目から１週間行った。ＮＴ＝ビヒクル；用量１＝３ｍｇ／ｋｇ；用量２＝１０ｍｇ／ｋｇ；用量３＝５０ｍｇ／ｋｇ。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１（ＮＴグループとの比較；二元配置分散分析テューキーの事後検定又はウェルチ補正を伴う対応のないｔ検定）。

【0096】

クロメンＭＣ４０８は、同所性乳がん異種移植マウスモデルにおいて、用量依存的に腫瘍体積（図２７Ａ）及び重量（図２７Ｂ）を有意に減少させた。５０ｍｇ／ｋｇの用量で、腫瘍体積及び重量ともに、ビヒクルグループと比較して４０％を超える減少を示した。重要なことに、動物は、実験全体を通して、体重減少その他の副作用を示さなかった。

【0097】

一実施形態では、３つのヒト乳がん細胞株Ｈｓ５７８Ｔ、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８及びＭＣＦ－７並びに正常乳房細胞株ＭＣＦ－１０Ａを、ＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション）から入手した。がん細胞株は、１０％加熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）及び１％抗生物質溶液（ペニシリン－ストレプトマイシン、Ｇｉｂｃｏ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地、４．５ｇ／ｌグルコース（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）で培養した。正常細胞株は、５％加熱不活化ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１％抗生物質溶液（ペニシリン－ストレプトマイシン、Ｇｉｂｃｏ）、１％ステロイドホルモン（ヒドロコルチゾン、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．１％ペプチドホルモン（インスリン、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び０．０１％タンパク質複合体（コレラ毒素、Ｇｉｂｃｏ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地：栄養混合物Ｆ－１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｇｉｂｃｏ）で培養した。２つの異なるヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞株、ＨＬ－６０（ＦＡＢ Ｍ２）及びＫＧ－１（赤白血病－ＦＡＢ Ｍ６）及び１つのヒトリンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）細胞株、Ｊｕｒｋａｔ（Ｔ細胞型）も使用した。これら３つの細胞株は、ドイツ微生物細胞培養コレクション（ＤＭＳＺ（登録商標）、ドイツ語でＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）から入手した。細胞は、１０％加熱不活化ＦＢＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ（登録商標）－ Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と１％抗生物質／抗有糸分裂混合物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ（登録商標）－ Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で培養した。３種類のヒト神経膠芽腫（ＧＢＭ）細胞株モデル、２つの確立された市販の細胞株（Ｕ８７ＭＧ及びＧＡＭＧ、Ｒｕｉ Ｍ． Ｒｅｉｓからの贈物）及び１つの初代ＧＢＭ培養液（ＧＬ１８）も使用した。ＧＢＭ細胞は、すべて１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ－Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で培養した。腎細胞がんの細胞株Ａ４９８、７８６－Ｏ、Ｃａｋｉ－２及びＨＫ２はＡＴＣＣから入手した。がん細胞株Ａ４９８はＭＥＭ培地（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ（登録商標）－Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で培養し、７８６－ＯはＲＰＭＩ１６４０培地（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ（登録商標）－ Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で培養し、Ｃａｋｉ－２はＭｃ Ｃｏｙｓ培地（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ（登録商標）－Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で培養し、ＨＫ２はＲＰＭＩ１６４０培地（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ（登録商標）－Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で培養した。すべての培地には、１０％の熱不活化ＦＢＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ（登録商標）－Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と１％の抗生物質／抗有糸分裂混合物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））を添加した。すべての細胞は、３７℃、５％ＣＯ_２の加湿インキュベーターで培養した。すべてのアッセイにおいて、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）対照を使用した。

【0098】

一実施形態では、細胞生存率アッセイを行った。ＭＣＦ－７、Ｈｓ５７８Ｔ及びＭＣＦ－１０Ａ細胞を、９６マルチウェル培養プレートに、３０００細胞／ｍＬで、又はＭＤＡ－ＭＢ－４６８の場合は５０００細胞／ｍＬで、３連でプレーティングした（１００μＬ／ウェル）。その後、完全培地で１８～２０時間かけて細胞を付着させた。続いて、新鮮培地で７種類の濃度（０．１～４０μＭ若しくは５～６０μＭ）の化合物又は対照で細胞を処理した。ＨＬ－６０、ＫＧ－１及びＪｕｒｋａｔ細胞株は、９６マルチウェル培養プレートに５０．０００細胞／１００μＬ／ウェルでプレーティングし、様々な濃度（０．００１～２μＭ）の化合物（又は対照）で処理した。細胞を、ＧＡＭＧでは２０００細胞／ウェル、ＧＬ１８では４０００細胞／ウェル及びＵ８７ＭＧでは６０００細胞／ウェルの初期密度で、９６ウェルプレートに３連でプレーティングし、１８～２０時間付着させた。その後、細胞を様々な濃度の化合物（０．００５～１００μＭ）又は対照で処理した。Ａ４９８細胞及び７８６－Ｏ細胞を２０００細胞／ｍＬ、Ｃａｋｉ－２細胞を３０００細胞／ｍＬ、ＨＫ２細胞を２０００細胞／ｍＬで９６マルチウェル培養プレート（１００μＬ／ウェル）に３連でプレーティングし、完全培地で１８～２０時間かけて付着させた。その後、細胞を新鮮培地で７種類の濃度（０．１～４０μＭ又は５～６０μＭ）の化合物又は対照で処理した。７２時間培養した後、製造元の指示に従ってＭＴＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ）還元アッセイを行い、代謝細胞の生存率を介して生細胞の割合を間接的に評価した。３７℃、５％ＣＯ_２の加湿雰囲気においてＭＴＳとともに１～２時間インキュベートした後、４９０ｎｍで吸光度を測定した。ＲＣＣ細胞株については、製造元の指示に従い、スルホローダミンＢアッセイを使用した。データを対数変換し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアを用いて、対照に対する生細胞数を５０％に減少させる各化合物の濃度（ＩＣ_５０）を算出した。

【0099】

一実施形態では、ＭＣＦ－７細胞株及びＭＣＦ１０Ａ細胞株に対するすべての化合物のＩＣ_５０値を用い、以下の数式を用いて選択性指数（ＳＩ）値を算出した。
（数式）
ＳＩ＝（ＩＣ_５０正常細胞株－ＩＣ_５０がん細胞株）／ＩＣ_５０がん細胞株

【0100】

ＳＩ値＞１では、がん細胞株に対する細胞毒性は、非新生物細胞株に対する場合よりも高くなる。

【0101】

一実施形態では、細胞遊走を、ｉｎ ｖｉｖｏでの創傷治癒中の細胞遊走プロセスを模倣した創傷治癒アッセイによって評価した。この方法は、創傷を作り、細胞単層で創傷をシミュレートし、細胞遊走プロセスの初期及び一定の間隔において画像を撮影して創傷を閉じ、画像を比較して細胞遊走率を定量化することに基づいている。ＭＣＦ－７及びＣａｋｉ－２細胞を、６ウェルプレートにそれぞれ２ｍＬあたり９．０ｘ１０^５及び３．０ｘ１０^５の密度でプレーティングし、５％ＣＯ_２の加湿雰囲気において３７℃で一晩増殖させた。２００μＬのピペットチップを用いて、コンフルエントな細胞の層に２本の創傷をつけた。細胞を５００μＬのＰＢＳで１回穏やかに洗浄した。ＭＣＦ－７細胞を、それぞれのＩＣ_５０、１／２ＩＣ_５０の化合物又は０．５％ＤＭＳＯ（対照）で７２時間処理した。０、１２、２４、４８及び７２時間後に、特定の創傷部位（各創傷につき４箇所）を写真撮影した。Ｃａｋｉ－２細胞については、セディラニブを含む各化合物についてそれぞれのＩＣ_５０又は０．５％ＤＭＳＯ（対照）を用いて４８時間処理を行い、０、１２、２４、３６及び４８時間後に写真を撮影した。画像は、オリンパスＤＰ２０デジタルカメラシステムを搭載したオリンパスＩＸ５１倒立顕微鏡を用いて、１００倍の倍率で撮影した。ＢｅＷｏｕｎｄ １．７．１を用いて５つの移動距離の評価を行い、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアを用いて、対照に対して正規化した細胞遊走の割合をプロットした。各化合物について３回の独立した実験を行った。異なるグループ間の差の有意性は、スチューデントのｔ検定で判定した。

【0102】

一実施形態では、増殖アッセイを行った。７８６－Ｏ細胞を、９６ウェルプレートに７０００細胞／１０μｌの密度でプレーティングし、５％ＣＯ_２加湿雰囲気において３７℃で一晩インキュベートした。その後、接着細胞を、ＩＣ_５０又は１／２ＩＣ_５０濃度の化合物ＭＣ３５０、ＭＣ４０８、ＭＣ４１２、ＭＣ４１５、ＭＣ４０９、ＭＣ４１０、ＭＣ４１３及びＭＣ３６９又は０．５％ＤＭＳＯ（対照）で４８時間処理した。インキュベーション後、１０μｌ／ウェルのＢｒｄＵ標識溶液（最終濃度：４０μＭ ＢｒｄＵ）を加えて細胞を標識した。その後、細胞を１６時間再インキュベートして、ＢｒｄＵがチミジンに代わって増殖細胞のＤＮＡに取り込まれた。標識後、培地を除去して細胞を固定し、２００μｌのＦｉｘＤｅｎａｔ溶液とともに室温でインキュベートしてＤＮＡを変性させた。ＤＮＡの変性は、取り込まれたＢｒｄＵに抗体コンジュゲートが結合するために不可欠である。ＦｉｘＤｅｎａｔを除去した後、１００μｌの抗ＢｒｄＵ－ＰＯＤ抗体を室温で９０分間インキュベートした。抗ＢｒｄＵ－ＰＯＤ抗体は、新たに合成された細胞ＤＮＡに取り込まれたＢｒｄＵと結合する。抗体コンジュゲートを除去した後、洗浄液でウェルを３回洗浄した。基質溶液（１００μｌ／ウェル）を添加して免疫複合体を検出し、測光検出に必要な発色が得られるまでプレートを室温でインキュベートした（５～１０分）。２５μｌの１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を各ウェルに加え、穏やかに混合することで、基質反応を停止させた。マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００）で４５０ｎｍ（参照波長：６９０ｎｍ）の吸光度を測定し、反応生成物を定量した。ブランク試験は、各実験時点において、細胞を使用せず、上記のすべての工程を実行した。少なくとも３回の独立した実験（４連）の結果を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェアを用いて評価した。

【0103】

一実施形態では、タンパク質抽出及びウェスタンブロット分析を行った。ＭＣＦ－７細胞及びＨｓ５７８ｔ細胞をＴ２５フラスコで、７８６－Ｏ細胞を６ウェルプレートで増殖させ、細胞が７０～８０％コンフルエントに達したときに、細胞をそれぞれのＩＣ_５０値の化合物で、又は０．５％ＤＭＳＯで処理した（対照）。細胞を２４時間及び４８時間処理した。特にＲＴＫｓ及びｍＴＯＲ経路分析の場合、７８６－Ｏ細胞を２時間飢餓状態にした後、独自の用量である２μＭのセディラニブ若しくは化合物で処理し、又は０．５％ＤＭＳＯ（対照）で処理した。処理後、接着細胞及び浮遊細胞を掻き集め、２０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。ペレットをＰＢＳに再懸濁し、再び遠心分離した（１２００ｒｐｍ；５分、４℃）。上清を捨て、ペレットを溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．６－８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、１０ｍＭ ＮａＦ、１％ＮＰ－４０、１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００及び１／７プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））に懸濁し、氷上で２０分間インキュベートした。溶解液を４℃で１４０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し、上清を回収してＤＣタンパク質アッセイキット（ＢｉｏＲａｄ）を用いてタンパク質濃度を測定した。

【0104】

簡単に説明すると、各サンプルの総タンパク質３０μｇを１０％、１２％又は１５％のポリアクリルアミドゲル（１００Ｖ）で分離した後、ニトロセルロース膜に移した（１００Ｖ、３０分間）。この膜を１ＸＴＢＳ中の５％乳で６０分間ブロックした後、特異的一次抗体（ウサギ抗ＰＡＲＰ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃９５４２）、１：１０００ ５％乳；マウス抗カスパーゼ９抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃９５０８）、１：５００ ５％乳；ウサギ抗カスパーゼ３抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃９６６５）、１：５００ ５％乳；マウス抗Ｂａｘ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－７４８０）、１：５００ ５％乳；マウス抗Ｂａｘ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－８３９２）、１：５００ ５％乳；ウサギ抗Ｂｉｍ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃２９３３）、１：１０００ ５％ＢＳＡ；ウサギ抗Ｂｉｄ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃２００２）、１：１０００ ５％ＢＳＡ；ウサギ抗ＫＤＭ４Ｃ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ２７５３２）、１：２０００ ５％ＢＳＡ；ラット抗Ｈｓｐ９０抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ＃３８６０４１）、１：５００ ５％ＢＳＡ；ウサギ抗ｃ－Ｍｙｃ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃５６０５）、１：１０００ ５％ＢＳＡ；ウサギ抗ｐ５３抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃２５２７）、１：１０００ ５％ＢＳＡ；ウサギ抗ホスホ－ｐ５３抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃２５２１）、１：５００ ５％ＢＳＡ；ウサギ抗ｐ２１抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃２９４７）、１：１０００ ５％ＢＳＡ；ウサギ抗ＪＮＫ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃９２５２５）、１：５００ ５％ＢＳＡ；ウサギ抗ホスホ－ＪＮＫ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃４６６８５）、１：５００ ５％ＢＳＡ；ウサギ抗ｍＴＯＲ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃２９８３）、１：１０００ ５％ＢＳＡ；ウサギ抗ホスホ－ｍＴＯＲ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃５５３６）、１：５００ ５％ＢＳＡ；ウサギ抗ＰＲＡＳ４０抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃２６９１）、１：１０００ ５％ＢＳＡ；ウサギ抗ＶＥＧＦＲ２抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃２４７９）、１：５００ ５％ＢＳＡ；ウサギ抗ホスホ－ＶＥＧＦＲ２（Ｔｙｒ１１７５）抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃２４７８）、１：５００ ５％ＢＳＡ；ウサギ抗ＥＧＦＲ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃４２６７）、１：１５００ ５％ＢＳＡ；ウサギ抗ホスホ－ＥＧＦＲ（Ｔｙｒ１０６８）抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃２２３４）、１：１５００ ５％ＢＳＡ；マウス抗ホスホ－ＮＦ－κＢ ｐ６５（Ｓｅｒ５３６）抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃３０３６）、１：１０００ ５％ＢＳＡ；ウサギ抗ＡＭＰＫα抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃２５３２）、１：１０００ ５％ＢＳＡ；ウサギ抗ホスホ－ＡＭＰＫα抗体（Ｔｈｒ１７２）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃２５３５）、１：１０００ ５％ＢＳＡ；ウサギ抗ＡＫＴ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃４６９１）、１：１０００ ５％ＢＳＡ；ウサギ抗ホスホ－ＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃１３０３８）、１：１０００ ５％ＢＳＡ；ウサギ抗ＰＴＥＮ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃９５５９）、１：１０００ ５％ＢＳＡ；ウサギ抗ホスホ－ＰＴＥＮ（Ｓｅｒ３８０）抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃９５５１）、１：１０００ ５％ＢＳＡ；ウサギ抗ホスホ－ＰＤＫ１（Ｓｅｒ２４１）抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃３４３８）、１：１０００ ５％ＢＳＡ；ウサギ抗ホスホ－ｐ３８（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃４５１１）、１：１０００ ５％ＢＳＡ；ウサギ抗ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃４６９５）、１：１０００ ５％ＢＳＡ；ウサギ抗ホスホ－ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（ホスホ－Ｅｒｋ１／２）抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃４３７０）、１：１０００ ５％ＢＳＡ；ウサギ抗β－チューブリン抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ６０４６）、１：１００００ ５％ＢＳＡ；マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－３２２３３）、１：１０００ ５％ＢＳＡ；マウス抗ＨＫ２（Ａｂｃａｍ、ａｂ１０４８３６）、１：１０００ ５％ＢＳＡ；マウス抗ＬＤＨＡ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－１３７２４３）、１：１０００ ５％ＢＳＡ；ウサギ抗Ｈｉｆ２α抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃３６１６９）、１：１０００ ５％ＢＳＡ；ウサギ抗ＭＣＴ１抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－３６５５０１）、１：１０００ ５％ＢＳＡ；ウサギ抗ＰＫＭ（Ａｂｃａｍ、ａｂ３８２３７）、１：１０００ ５％ＢＳＡ；ウサギ抗ＰＦＫＬ（Ａｂｃａｍ、ａｂ３７５８３）、１：１０００ ５％ＢＳＡ及びマウス抗β－アクチン抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃Ｅ１３１４）、１：５００ ５％乳）とともに４℃で一晩インキュベートした。０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０で５分間（２回）、さらに１５分間（１回）洗浄した後、ブロットをそれぞれの二次抗体とともに室温で１時間インキュベートした（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ抗体サンプラーキット－Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（＃９９１５）：ヤギ抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰ（７０７４）及びウマ－抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（７０７６）二次抗体、１：２０００ ５％乳、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；及びウサギ抗ラットＩｇＧ－ＨＲＰ二次抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ６７３４）、１：３００００、５％ＢＳＡ）。ＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０で５分間（２回）、さらに１５分間（１回）洗浄した後、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋システム（ＢｉｏＲａｄ）で化学発光ＷｅｓｔｅｒｎＢｒｉｇｈｔ（商標）シリウスキット（Ａｄｖａｎｓｔａ）を用いて免疫反応バンドを検出した。免疫ブロットの定量は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ ４．６．９で行った。

【0105】

一実施形態では、フローサイトメトリーによる細胞周期分布を行った。ＭＣＦ－７細胞、Ｈｓ５７８ｔ細胞及び７８６－Ｏ細胞を６ウェル培養プレートに播種した。完全ＤＭＥＭ（ＭＣＦ－７及びＨｓ５７８ｔ細胞用）並びに完全ＲＰＭＩ（７８６－Ｏ細胞用）培地中で１８～２０時間かけて細胞を付着させ、ＩＣ_５０濃度の試験化合物又は０．５％ＤＭＳＯ（対照）で１２時間及び２４時間処理した。各実験は３連で行った。浮遊細胞と接着細胞を遠心分離で集めて合わせ、冷エタノール（７０％）で固定した。細胞をＰＢＳに再懸濁した。遠心分離して上清を除去した後、ＰＢＳ、ＰＩ（５０μｇ／ｍＬ、Ｐ１３０４ＭＰ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、リボヌクレアーゼＡ（２０ｍｇ／ｍＬ、１２０９１－０２１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＴｒｉｔｏｎＸ１００を含む溶液に再懸濁した。最終的に５０℃の暗所で１時間インキュベートした後、４８８ｎｍの励起レーザーによるＦＡＣＳ ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標））を用いてＰＩシグナルを測定し、捕捉し、取得ソフトウェアとしてＦＡＣＳ Ｄｉｖａを使用した。各段階の細胞の割合は、ＦｌｏｗＪｏ ７．６（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ（登録商標））ソフトウェアを用いて分析した。３回の独立した生物学的複製を行った。

【0106】

一実施形態では、ＭＣＦ－７、Ｈｓ５７８ｔ及び７８６－Ｏ細胞を６ウェル培養プレートに播種し、完全ＤＭＥＭ（ＭＣＦ－７及びＨｓ５７８ｔ細胞用）並びに完全ＲＰＭＩ（７８６－Ｏ細胞用）培地中で１８～２０時間かけて付着させ、フローサイトメトリー分析によってアポトーシスを検出した。細胞を、ＩＣ_５０濃度の試験化合物又は０．５％ＤＭＳＯ（対照）で１２時間及び２４時間処理した。各実験は３連で行った。浮遊細胞と接着細胞を遠心分離で集めて合わせた。上清を除去した後、１ｍＬの結合緩衝液を加えた。８μＬのＦＩＴＣアネキシンＶ（５５６４１９、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及び３０μＬのＰＩ（５０μｇ／ｍＬ、Ｐ１３０４ＭＰ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を細胞ペレットに加えた。サンプルを暗所で１５分間、室温でインキュベートした。さらに２００μＬの結合緩衝液を各サンプルに加えた。ＰＩシグナルは、４８８ｎｍの励起レーザーによるＦＡＣＳ ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標））を用いて測定した。アネキシンＶシグナルは、４８８ｎｍブロッキングフィルター、５２５ｎｍバンドパスを有する５５０ｎｍロングパスダイクロイックを通して収集した。シグナルを捕捉し、取得ソフトウェアとしてＦＡＣＳ Ｄｉｖａを使用した。各段階の細胞の割合は、ＦｌｏｗＪｏ ７．６（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ（登録商標））ソフトウェアを用いて分析した。３回の独立した生物学的複製を行った。

【0107】

一実施形態では、ブリストル株Ｎ２（アメリカ国立衛生研究所研究基盤プログラムが資金提供（Ｐ４０ ＯＤ０１０４４０）をしたＣＧＣによる提供）を用いて、Ｃ．エレガンスを用いた食物クリアランスアッセイに基づく各化合物の毒性を試験した。このアッセイは、９６ウェルプレートで液体培養中で実施した（Ｖｏｉｓｉｎｅら２００７年；Ｔｅｉｘｅｉｒａ－Ｃａｓｔｒｏら２０１５年）。最終容量６０μＬの各ウェルには、卵期の蠕虫約２０匹、最終ＯＤを０．６～０．８（５９５ｎｍ）としたＯＰ５０菌及び適切な濃度の各化合物を入れた。蠕虫は１８０ｒｐｍ／２０℃（Ｓｈｅｌ ｌａｂ Ｓｉシリーズインキュベーター）で連続振とうしながら７日間生育し、マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００）で吸光度（ＯＤ５９５）を毎日測定した。Ｃ．エレガンスの生理機能に対する化合物の影響は、大腸菌の食物懸濁液が消費される速度によってモニターした（図１４）。同齢期の蠕虫の卵を、以下のように「卵調整」によって得た：成虫を次亜塩素酸アルカリ溶液（２０％漂白剤、２５％１Ｍ ＮａＯＨ）で６分間処理した後、遠心分離し、Ｍ９緩衝液で２回洗浄した。その後、卵ペレットをＳ培地に再懸濁し、適切な卵濃度を得た後、９６ウェルプレートに移した。ＯＰ５０菌は、一晩培養したもの（３７℃、１８０ｒｐｍ、ルリアブロス培地）を４回の凍結融解サイクルで不活化して調製した。使用前に、ＯＰ５０を補充したＳ培地（コレステロール、ストレプトマイシン、ペニシリン及びナイスタチン）に再懸濁した。化合物は１００％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）で調製し、溶媒毒性を防ぐために１％ＤＭＳＯの試験濃度まで希釈した。各化合物について、溶解性の問題からＭＣ３６９（７５－１０μＭ）を除いて、いくつかの濃度（１５０－１０μＭ）で試験を行った。

【0108】

各化合物について、いくつかの濃度を使用し、３～５日目の対応するＯＤ５９５消費速度（勾配）を算出した。化合物は、９６ウェルプレート（ＰｌａｔｅＬａｙｏｕｔ．ｘｌｓ、補足情報）で生育した蠕虫において、２回の独立した実験で検証した。統計分析には、両実験のデータを一緒にプールし、ＩＢＭ ＳＰＳＳを用いて分散分析（ブラウン・フォーサイスの平均の同等性ロバスト検定）、続いてゲームス－ハウエルの事後検定を適用し、各化合物及び５％ＤＭＳＯ（ｗｔ／ｖ）に使用した様々な濃度を対照（１％ＤＭＳＯ（ｗｔ／ｖ））と比較した。

【0109】

一実施形態では、Ｃ５７／Ｂｌ６雌雄マウス（ｎ＝３／グループ／性別）にＭＣ４０８（３ｍｇ／Ｋｇ）又はビヒクル（生理食塩水、Ｔｗｅｅｎ８０及びメチルセルロース）を毎日７日間腹腔内投与し、マウスモデルにおける化合物の毒性を調べた。マウスの福祉を評価するための一連の試験を毎日実施した。最初の薬物投与の直後に、動物をビデオ撮影し、ＭＣ４０８の即時効果を記録した。垂直運動の回数及び不動時間を記録した。実験の７日間で、１日目に動物のホームケージに一定量の餌と水を加え、７日目に残りの量を測定することにより、水と餌の摂取量を評価した。動的マウススケールを用いて、体重を毎日測定した。水平及び垂直運動を分析し、動物の固有の探索行動を評価した。これらはそれぞれ、升目のラベルが貼られたオープンアリーナで１分間、観察瓶で５分間測定した。さらに、不安の指標として、動物が毎日の行動評価プロトコルを実行している間に、ボーラスフェカリスの数も数えた。実験者は、動物福祉に関連した一連の試験を適用し、（ｉ）体位及び体の彎曲、（ｉｉ）自発行動、（ｉｉｉ）呼吸速度、（ｉｖ）眼瞼開裂及び反射、（ｖ）脱水を分析するためのスキンピッキング、（ｖｉ）グルーミング、（ｖｉｉ）毛の起立、（ｖｉｉｉ）振戦、（ｉｘ）手足の把持及び（ｘ）移動時の反応を測定した。７日目に、動物を安楽死させた。すべての動物を深部麻酔し（塩酸ケタミン（１５０ｍｇ／ｋｇ）及びメデトミジン（０．３ｍｇ／ｋｇ））、生理食塩水（ＮａＣｌ ０．９％（ｗｔ／ｖ））で経心的に灌流した。血液を大静脈から採取し、１３．０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、血漿を新規チューブに移し、標準的な手法で酵素肝機能測定用のさらなる処理を行うまで－８０℃で保存した。臓器（腎臓、腸、胃、脳、肝臓、卵巣／精巣）を採取し、４％パラホルムアルデヒドを含むチューブに入れ、パラフィン包埋及び病理分析のためにさらに処理した。

【0110】

一実施形態では、ＣＡＭアッセイを行った。受精鶏卵を３７℃でインキュベートし、発育３日目に、気室を穿孔した後、卵殻に穴を開けた。この穴をＢＴＫテープで封じ、インキュベーターに戻した。発育９日目に、マトリゲル（１０μＬ）を含むＨｓ５７８ｔ細胞（２×１０^６細胞）又は７８６－Ｏ細胞（３．５×１０^６細胞）をＣＡＭに載せ、腫瘍を形成させて、卵を軽く叩いてインキュベーターに戻した。発育１４日目に、腫瘍の写真を撮った。処理グループには、完全ＤＭＥＭ（Ｈｓ５７８ｔ細胞の場合）又は完全ＲＰＭＩ（７８６－Ｏ細胞の場合）培地中の２×ＩＣ_５０濃度のＭＣ４０８又はＭＣ４２１を２０μＬ与え、対照には完全ＤＭＥＭ又はＲＰＭＩ中の０．５％ＤＭＳＯを２０μＬ与え、これらを形成された腫瘍に添加した。処置の７２時間後（発育１７日目）、腫瘍を再びｉｎ ｏｖｏで撮影した。ニワトリ胚の屠殺は、－８０℃で１０分間行い、ＣＡＭのみを４％のパラホルムアルデヒドで固定した後、再びｅｘ ｏｖｏで撮影した。

【0111】

一実施形態では、ＮＳＧ（ＮＯＤ Ｓｃｉｄ Ｇａｍｍａ）雌マウス（３～６ヶ月）に、０．６ｘ１０個^６のＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳がん細胞とマトリゲルの混合物（比率１：１）を乳腺脂肪体に注入した。マウスの処理グループへの無作為的割り当てを（少なくともマウス６匹／グループ）、化合物ＭＣ４０８の３つの独立した用量（用量１＝３ｍｇ／ｋｇ、用量２＝１０ｍｇ／ｋｇ及び用量３＝５０ｍｇ／ｋｇ）又はビヒクル（ＰＢＳ１ｘ及びマトリゲル、比率１：１）を使用して移植後３日目から開始し、７日間毎日投与した。マウスは標準的な実験室条件で飼育した。動物の腫瘍サイズ（２つの最大辺を測定し、Ｌ１を最大辺、Ｌ２を他方の辺とし、式ｖ＝３．１４ｘＬ１ｘＬ２／６を適用して算出）を定期的に測定し、記録した。移植後４７日目に動物を屠殺し、腫瘍を摘出した。すべての動物実験は、実験動物の飼育及び使用に関するガイドライン（欧州指令２０１０／６３／ＥＵ）に準拠して行った。

【0112】

一実施形態では、すべての化学化合物の反応を、０．２ｍｍのシリカゲル６０プレート（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）及び蛍光指示薬を用いた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）でモニターした。それらの暴露には、２５４ｎｍのランプを備えたＵＶチャンバー（ＣＮ－６ Ｖｉｌｂｅｒ Ｌｏｕｒｍａｔ）を使用した。ドライフラッシュクロマトグラフィーは、ＭＮ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０（２３０ ＡＳＴＭ）のシリカゲル（粒子径＜０．０６３ｍｍ）を用いて行った。温度を使用する反応には、ホットプレートスターラーＩＫＡＭＡＧ ＲＣＴを用い、適切な磁気撹拌を行い、特定の手順に従って様々な温度で行った。溶媒は、Ｂｕｃｈｉ ＲＥ １１ロータリーエバポレーターを用いて、真空状態及び可変浴温で蒸発させた。ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ（^１Ｈ ＮＭＲでは４００ＭＨｚ、^１３Ｃ ＮＭＲでは１００ＭＨｚ）で、重水素化ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ－ｄ_６）を溶媒として用いて２５℃で測定した。化学シフトは、内部標準として残留溶媒ピークを用い、百万分率（ｐｐｍ）で記録した。ＩＲスペクトルは、ＦＴ－ＩＲ Ｂｏｍｅｍ ＭＢ １０４で、ヌジョールマル及びＮａＣｌセルを用いて記録した。融点はＳｔｕａｒｔ ＳＭＰ３装置で測定し、補正しなかった。元素分析はＬＥＣＯ ＣＨＮＳ－９３２機器で行った。

【化6】

【0113】

２－イミノ－８－メトキシ－２Ｈ－クロメン－３－アミン（４）並びにクロメン誘導体Ｍ１１５９、Ｍ９５５、Ｍ１２２０、Ｍ１２２１及びＭ１１４３は、上述の方法で合成することができる。

【0114】

一実施形態では、３－アミノ－８－メトキシ－２Ｈ－クロメン－２－イミニウムクロリド（５）の合成を行った。濃ＨＣｌ（１．１当量）を、１ｍＬのＣＨ_３ＣＮ中の２－イミノ－８－メトキシ－２Ｈ－クロメン－３－アミン（４）（０．１５０ｍｇ；０．７９ｍｍｏｌ）のオレンジ色溶液に加えた。すぐに沈殿が観察され、反応混合液を室温で１０～１５分間撹拌した。オレンジ色固体を単純な濾過で分離し、３－アミノ－８－メトキシ－２Ｈ－クロメン－２－イミニウムクロリド（５）と同定した。オレンジ色固体；収率９１％；ｍｐ＞３００℃；^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ ３．９３ （ｓ， ３Ｈ）， ７．１２－７．１５ （ｍ， ２Ｈ）， ７．１８ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．０， １．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３２ （ｔ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， １１．４８ （ｓ， １Ｈ）； ^１３Ｃ ＮＭＲ （７５ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ ５６．０２， １１０．１３， １１３．５２， １１７．４２， １２２．２１， １２６．３９， １３０．５７， １３５．３３， １４６．５５， １６１．１５； ＩＲ （ヌジョールマル） ν ３３２２， ３１９２， １６７８， １６５４， １６００， １５７６， １５５２， １４６０ ｃｍ^－１； Ｃ_１０Ｈ_１１Ｎ_２Ｏ_２Ｃｌ．０．２Ｈ_２Ｏの分析計算値： Ｃ， ５２．１６； Ｈ， ４．９６； Ｎ， １２．１７． 実測値： Ｃ， ５２．０６； Ｈ， ４．７７； Ｎ， １２．４０．

【0115】

一実施形態では、クロメノ［２，３－ｄ］イミダゾールを合成した。アルデヒド（１）（１．１～１．７当量）をＣＨ_３ＣＮ（１～２ｍＬ）中の３－アミノ－８－メトキシ－２Ｈ－クロメン－２－イミニウムクロリド（５）（０．２５～０．３５ｍｍｏｌ）の懸濁液に加え、懸濁液を６０℃で２４～４８時間撹拌した。固体を濾過し、ＣＨ_３ＣＮで洗浄し、純粋生成物と同定した。^１Ｈ ＮＭＲスペクトルでＨＣｌの混入が観察された場合、固体をＮａＨＣＯ_３（０．０５Ｍ）水溶液で洗浄し、濾過し、水で洗浄すると、純粋生成物が得られた。

【0116】

一実施形態では、２－（４－フルオロフェニル）－５－メトキシ－３，９－ジヒドロクロメノ［２，３－ｄ］イミダゾール（ＭＣ４０９）を合成した。ＣＨ_３ＣＮ（１．６ｍＬ）中の３－アミノ－８－メトキシ－２Ｈ－クロメン－２－イミニウムクロリド（５）（０．０４７ｍｇ；０．２１ｍｍｏｌ）の懸濁液に４－フルオロベンズアルデヒド（０．０３７５ｍｇ；０．３０ｍｍｏｌ）を加え、６０℃で３２時間撹拌した。この固体を濾過し、ＣＨ_３ＣＮで洗浄し、純粋生成物と同定した。ベージュ色固体；収率９８％；ｍｐ１９１－１９２℃；^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ ３．８２ （ｓ， ３Ｈ）， ４．１２ （ｓ， ２Ｈ）， ６．９４ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．４， １．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．８６ （ｄｄ， Ｊ ＝ ７．４， １．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．００ （ｔ， Ｊ ＝ ７．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．２５－７．３２ （ｍ， ２Ｈ）， ７．８６－７．９２ （ｍ， ２Ｈ）， １２．４４ （ｓ， １Ｈ）； ^１３Ｃ ＮＭＲ （７５ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ ２３．６４， ５５．７５， １０３．６４， １１０．４８， １１５．７７ （Ｊ ＝ ２１．７ Ｈｚ）， １１９．３１， １２１．８２， １２２．５９， １２６．２９ （Ｊ ＝ ８．３ Ｈｚ）， １２７．１９ （Ｊ ＝ ３．２ Ｈｚ）， １３８．８８， １４１．２５， １４８．１９， １４８．３８， １６１．７８ （Ｊ ＝ ２４３．４ Ｈｚ）； ＩＲ （ヌジョールマル） ν ３３４８， １７００， １６５０， １６０８， １５７８， １５３８， １５００， １４６１ ｃｍ^－１； Ｃ_１７Ｈ_１３Ｎ_２Ｏ_２Ｆの分析計算値： Ｃ， ６８．９１； Ｈ， ４．４２； Ｎ， ９．４５． 実測値： Ｃ， ６８．８９； Ｈ， ４．６５； Ｎ， ９．５６．

【0117】

一実施形態では、２－（４－ブロモフェニル）－５－メトキシ－３，９－ジヒドロクロメノ［２，３－ｄ］イミダゾール（ＭＣ４０８）を合成した。ＣＨ_３ＣＮ（２ｍＬ）中の３－アミノ－８－メトキシ－２Ｈ－クロメン－２－イミニウムクロリド（５）（０．０７５８ｍｇ；０．３４ｍｍｏｌ）の懸濁液に４－ブロモベンズアルデヒド（０．０７３７ｍｇ；０．４０ｍｍｏｌ）を加え、６０℃で２４時間撹拌した。この固体を濾過し、ＣＨ_３ＣＮで洗浄し、純粋生成物と同定した。^１Ｈ ＮＭＲスペクトルにＨＣｌの混入が観察された場合、固体をＮａＨＣＯ_３（０．０５Ｍ；２ｍＬ）水溶液で洗浄し、濾過し、水で洗浄すると、純粋生成物が得られた。黄色固体；収率９９％；ｍｐ２１５－２１７℃；^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ ３．８２ （ｓ， ３Ｈ）， ４．１１ （ｓ， ２Ｈ）， ６．８６ （ｄｄ， Ｊ ＝ ７．６， １．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．９４ （ｄｄ， Ｊ ＝ ７．８， １．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．０１ （ｔ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．６３ （ｄｄ， Ｊ ＝ ６．８， ２．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．８０ （ｄｄ， Ｊ ＝ ６．８， ２．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， １２．６２ （ｓ， １Ｈ）； ^１３Ｃ ＮＭＲ （７５ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ ２３．６１， ５５．７７， １０４．４０， １１０．５４， １１９．２５， １２０．８７， １２１．８１， １２２．７０， １２６．１５ （２Ｃ）， １２９．５３， １３１．７６ （３Ｃ）， １３８．５１， １４１．１６， １４８．３６； ＩＲ （ヌジョールマル） ν ３４３５， １７１７， １６３９， １６０３， １５７６， １５３６， １４６３ ｃｍ^－１； Ｃ_１７Ｈ_１３Ｎ_２Ｏ_２Ｂｒ．１．９Ｈ_２Ｏの分析計算値： Ｃ， ５２．１２； Ｈ， ４．２９； Ｎ， ７．１５． 実測値： Ｃ， ５２．１２； Ｈ， ３．９３； Ｎ， ７．３７．

【0118】

一実施形態では、２－（２－フルオロフェニル）－５－メトキシ－３，９－ジヒドロクロメノ［２，３－ｄ］イミダゾール（ＭＣ４０７）を合成した。ＣＨ_３ＣＮ（２ｍＬ）中の３－アミノ－８－メトキシ－２Ｈ－クロメン－２－イミニウムクロリド（５）（０．０５７１ｍｇ；０．２５ｍｍｏｌ）の懸濁液に２－フルオロベンズアルデヒド（０．０３８９ｍｇ；０．３１ｍｍｏｌ）を加え、６０℃で２４時間撹拌した。この固体を濾過し、ＣＨ_３ＣＮで洗浄し、純粋生成物と同定した。ベージュ色固体；収率８２％；ｍｐ１０２－１０３℃；^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ ３．８２ （ｓ， ３Ｈ）， ４．１０ （ｓ， ２Ｈ）， ６．８６ （ｄｄ， Ｊ ＝ ７．６， ２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．９４ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．０， ２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．００ （ｔ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．２６－７．４０ （ｍ， ３Ｈ）， ７．９５ （ｔｄ， Ｊ ＝ ８．０， １．６ Ｈｚ， １Ｈ）， １２．０９ （ｓ， １Ｈ）； ^１３Ｃ ＮＭＲ （７５ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ ２３．９３， ５５．７９， １０４．６１， １１０．５４， １１６．２２ （Ｊ ＝ １６．１ Ｈｚ）， １１８．２２ （Ｊ ＝ ８．６ Ｈｚ）， １１９．４４， １２１．８５， １２２．６７， １２４．９４ （Ｊ ＝ ２．３ Ｈｚ）， １２８．２０ （Ｊ ＝ ２．２ Ｈｚ）， １２９．６１ （Ｊ ＝ ６．２ Ｈｚ）， １３４．５０， １４１．２４， １４８．１５， １４８．３８， １５８．５３ （Ｊ ＝ １８４．５ Ｈｚ）； ＩＲ （ヌジョールマル） ν ３４２６， １７１０， １６３１， １６０３， １５７６， １５３６， １４６３ ｃｍ^－１； Ｃ_１７Ｈ_１３Ｎ_２Ｏ_２Ｆ１．１Ｈ_２Ｏの分析計算値： Ｃ， ６４．６０； Ｈ， ４．４６； Ｎ， ８．８７． 実測値： Ｃ， ６４．３６； Ｈ， ４．４６； Ｎ， ８．９１．

【0119】

一実施形態では、２－（３－フルオロフェニル）－５－メトキシ－３，９－ジヒドロクロメノ［２，３－ｄ］イミダゾール（ＭＣ３４９）を合成した。３－フルオロベンズアルデヒド（０．０４８２ｍｇ；０．３９ｍｍｏｌ）をＣＨ_３ＣＮ（１ｍＬ）中の３－アミノ－８－メトキシ－２Ｈ－クロメン－２－イミニウムクロリド（５）（０．０７１２ｍｇ；０．３１ｍｍｏｌ）の懸濁液に加え、懸濁液を６０℃で３３時間撹拌した。この固体を濾過し、ＣＨ_３ＣＮで洗浄し、純粋生成物と同定した。ベージュ色固体；収率１００％；ｍｐ１９８－２００℃；^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ ３．８２ （ｓ， ３Ｈ）， ４．１２ （ｓ， ２Ｈ）， ６．８６ （ｄｄ， Ｊ ＝ ７．６， １．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．９４ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．０， １．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．００ （ｔ， Ｊ ＝ ８．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．１３ （ｔｄ， Ｊ ＝ ８．６， ２．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４４－７．５１ （ｍ， １Ｈ）， ７．７３ （ｄｔ， Ｊ ＝ １０．４， ２．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．７０ （ｄ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， １Ｈ）， １２．５８ （ｓ， １Ｈ）； ^１３Ｃ ＮＭＲ （７５ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ ２３．６０， ５５．７９， １０４．４６， １１０．５６， １１０．６８ （Ｊ ＝ １８．４ Ｈｚ）， １１４．４３ （Ｊ ＝ １５．８ Ｈｚ）， １１９．２４， １２０．２３ （Ｊ ＝ １．８ Ｈｚ）， １２１．８１， １２２．６８， １３０．９５ （Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ）， １３２．７８ （Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ）， １３８．３９ （Ｊ ＝ ２．３ Ｈｚ）， １４１．２１， １４８．３１， １４８．３８， １６２．５２ （Ｊ ＝ １８０．８ Ｈｚ）； ＩＲ （ヌジョールマル） ν ３３５６， １７０７， １６５２， １６２８， １５２２， １５０８， １４６１ ｃｍ^－１； Ｃ_１７Ｈ_１３Ｎ_２Ｏ_２Ｆの分析計算値： Ｃ， ６８．９１； Ｈ， ４．４２； Ｎ， ９．４５． 実測値： Ｃ， ６８．９８； Ｈ， ４．５８； Ｎ， ９．６６．

【0120】

一実施形態では、２－（４－クロロフェニル）－５－メトキシ－３，９－ジヒドロクロメノ［２，３－ｄ］イミダゾール（ＭＣ４１２）を合成した。ＣＨ_３ＣＮ（１ｍＬ）中の３－アミノ－８－メトキシ－２Ｈ－クロメン－２－イミニウムクロリド（５）（０．０４１７ｍｇ；０．１８ｍｍｏｌ）の懸濁液に４－クロロベンズアルデヒド（０．０２９１ｍｇ；０．２１ｍｍｏｌ）を加え、懸濁液を６０℃で２４時間撹拌した。この固体を濾過し、ＣＨ_３ＣＮで洗浄し、純粋な生成物と同定した。ベージュ色固体；収率１００％；ｍｐ２１２－２１４℃；^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ ３．８２ （ｓ， ３Ｈ）， ４．１２ （ｓ， ２Ｈ）， ６．８６ （ｄｄ， Ｊ ＝ ７．６， １．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．９４ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．２， １．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．００ （ｔ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．５０ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．８６ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， １２．５３ （ｓ， １Ｈ）； ^１３Ｃ ＮＭＲ （７５ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ ２３．６２， ５５．７６， １０４．１８， １１０．５２， １１９．２５， １２１．８０， １２２．６２， １２５．８４ （２Ｃ）， １２８．８４ （２Ｃ）， １２９．３６， １３２．１８， １３８．５５， １４１．２２， １４８．３１， １４８．３６； ＩＲ （ヌジョールマル） ν ３３５２， １７００， １６５６， １６０１， １５３２， １４８９， １４６２ ｃｍ^－１； Ｃ_１７Ｈ_１３Ｎ_２Ｏ_２Ｃｌの分析計算値： Ｃ， ６５．２９； Ｈ， ４．１９； Ｎ， ８．９６． 実測値： Ｃ， ６５．４７； Ｈ， ４．２３； Ｎ， ８．７４．

【0121】

一実施形態では、５－メトキシ－２－フェニル－３，９－ジヒドロクロメノ［２，３－ｄ］イミダゾール（ＭＣ３５０）を合成した。ベンズアルデヒド（０．０５２０ｍｇ；０．４９ｍｍｏｌ）をＣＨ_３ＣＮ（１ｍＬ）中の３－アミノ－８－メトキシ－２Ｈ－クロメン－２－イミニウムクロリド（５）（０．０６５３ｍｇ；０．２９ｍｍｏｌ）の懸濁液に加え、懸濁液を６０℃で３３時間撹拌した。固体を濾過し、ＣＨ_３ＣＮで洗浄し、純粋生成物と同定した。^１Ｈ ＮＭＲスペクトルにＨＣｌの混入が観察された場合、固体をＮａＨＣＯ_３（０．０５Ｍ）水溶液で洗浄し、濾過し、水で洗浄すると、純粋生成物が得られた。ベージュ色固体；収率９９％；ｍｐ１６２－１６２℃；^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ ３．８３ （ｓ， ３Ｈ）， ４．１２ （ｓ， ２Ｈ）， ６．８６ （ｄｄ， Ｊ ＝ ７．６， １．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．９４ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．０， １．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．００ （ｔ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３１ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４３ （ｔ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．８６ （ｄ， Ｊ ＝ ７．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， １２．４３ （ｓ， １Ｈ）； ^１３Ｃ ＮＭＲ （７５ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ ２３．６８， ５５．７７， １１０．５０， １１９．３３， １２１．８３， １２２．５６， １２４．２０ （２Ｃ）， １２７．７７， １２８．７５ （２Ｃ）， １３０．５０， １３９．６２， １４１．２９， １４８．２３， １４８．３８； ＩＲ （ヌジョールマル） ν ３３４６， １７０２， １６４８， １６０２， １５２６， １４９６， １４６１ｃｍ^－１； Ｃ_１７Ｈ_１４Ｎ_２Ｏ_２の分析計算値： Ｃ， ７３．３７； Ｈ， ５．０７； Ｎ， １０．０７． 実測値： Ｃ， ７３．５８； Ｈ， ５．１２； Ｎ， １０．３４．

【0122】

一実施形態では、３－（５－メトキシ－３，９－ジヒドロクロメノ［２，３－ｄ］イミダゾール－２－イル）フェノール（ＭＣ３５９）を合成した。３－ヒドロキシベンズアルデヒド（０．０４２７ｍｇ；０．３５ｍｍｏｌ）をＣＨ_３ＣＮ（１．２ｍＬ）中の３－アミノ－８－メトキシ－２Ｈ－クロメン－２－イミニウムクロリド（５）（０．０６７９ｍｇ；０．３０ｍｍｏｌ）の懸濁液に加え、この懸濁液を６０℃で２８時間撹拌した。固体を濾過し、ＣＨ_３ＣＮで洗浄し、純粋な生成物と同定した。^１Ｈ ＮＭＲスペクトルにＨＣｌの混入が観察された場合、固体をＮａＨＣＯ_３（０．０５Ｍ）水溶液で洗浄し、濾過し、水で洗浄すると、純粋生成物が得られた。薄緑色固体；収率９４％；ｍｐ１６２－１６４℃；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ３．８２ （ｓ， ３Ｈ）， ４．１０ （ｓ， ２Ｈ）， ６．７１ （ｄｑ， Ｊ ＝ ８．２， １．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．８５ （ｄｄ， Ｊ ＝ ７．８， １．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．９２ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．２， １．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．００ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．２１ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．２７－７．３０ （ｍ， ２Ｈ）， ９．５５ （ｓ， １Ｈ）， １２．３３ （ｓ， １Ｈ）； １３Ｃ ＮＭＲ （７５ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ２３．７０， ５５．７５， １１０．４７， １１１．２３， １１４．９９， １１５．０７， １１９．３６， １２１．８４， １２２．５４， １２９．７４， １３１．７７， １３９．７６， １４１．３０， １４８．１０， １４８．３７， １５７．６２； ＩＲ （ヌジョールマル） ν ３３５１， ３２１８， １７０２， １６５９， １６１１， １５２３， １５０７， １４６０ ｃｍ^－１； Ｃ１７Ｈ１４Ｎ２Ｏ３の分析計算値： Ｃ， ６９．３８； Ｈ， ４．７９； Ｎ， ９．５２． 実測値： Ｃ， ６９．４２； Ｈ， ４．８８； Ｎ， ９．５６．

【0123】

一実施形態では、４－（５－メトキシ－３，９－ジヒドロクロメノ［２，３－ｄ］イミダゾール－２－イル）フェノール（ＭＣ４１３）を合成した。ＣＨ_３ＣＮ（２ｍＬ）中の３－アミノ－８－メトキシ－２Ｈ－クロメン－２－イミニウムクロリド（５）（０．０５７９ｍｇ；０．２６ｍｍｏｌ）の懸濁液に４－ヒドロキシベンズアルデヒド（０．０３８８ｍｇ；０．３２ｍｍｏｌ）を加え、懸濁液を６０℃で４８時間撹拌した。固体を濾過し、ＣＨ_３ＣＮで洗浄し、純粋生成物と同定した。１Ｈ ＮＭＲスペクトルにＨＣｌの混入が観察された場合、固体をＮａＨＣＯ_３（０．０５Ｍ）水溶液で洗浄し、濾過し、水で洗浄すると、純粋生成物が得られた。黄色固体；収率６４％；ｍｐ２４５－２４６℃；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ３．８２ （ｓ， ３Ｈ）， ４．０９ （ｓ， ２Ｈ）， ６．８１ （ｄｄ， Ｊ ＝ ６．８， ２．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．８５ （ｄｄ， Ｊ ＝ ７．６， １．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．９２ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．０， １．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．９９ （ｔ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．６８ （ｄｄ， Ｊ ＝ ６．８， ２．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ９．６３ （ｓ， １Ｈ）， １２．１１ （ｓ， １Ｈ）； １３Ｃ ＮＭＲ （７５ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ２３．７６， ５５．７５， １０２．２６， １１０．４３， １１５．４８ （２Ｃ）， １１９．４５， １２１．８６ （２Ｃ）， １２２．４５， １２５．８８ （２Ｃ）， １４０．３４， １４１．３６， １４７．８６， １４８．３７， １５７．４４； ＩＲ （ヌジョールマル） ν ３３３８， ３２４６， １７０６， １６４５， １６１２， １５４８， １５０３， １４６３ ｃｍ^－１； Ｃ１７Ｈ１４Ｎ２Ｏ３の分析計算値： Ｃ， ６９．３８； Ｈ， ４．７９； Ｎ， ９．５２． 実測値： Ｃ， ６９．３９； Ｈ， ４．４２； Ｎ， ９．５４．

【0124】

一実施形態では、５－メトキシ－２－（２－メトキシフェニル）－３，９－ジヒドロクロメノ［２，３－ｄ］イミダゾール（ＭＣ４１１）を合成した。２－メトキシベンズアルデヒド（０．０６３２ｍｇ；０．４６ｍｍｏｌ）をＣＨ_３ＣＮ（１ｍＬ）中の３－アミノ－８－メトキシ－２Ｈ－クロメン－２－イミニウムクロリド（５）（０．０７８０ｍｇ；０．３４ｍｍｏｌ）の懸濁液に加え、懸濁液を６０℃で４７時間撹拌した。この固体を濾過し、ＣＨ_３ＣＮで洗浄し、純粋生成物と同定した。^１Ｈ ＮＭＲスペクトルにＨＣｌの混入が観察された場合、固体をＮａＨＣＯ_３（０．０５Ｍ）水溶液で洗浄し、濾過し、水で洗浄すると、純粋生成物が得られた。黄色固体；収率８５％；ｍｐ１８８－１９０℃；^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ ３．８２ （ｓ， ３Ｈ）， ３．９５ （ｓ， ３Ｈ）， ４．１０ （ｓ， ２Ｈ）， ６．８６ （ｄｄ， Ｊ ＝ ７．６， １．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．９３ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．０， １．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．９７－７．０４ （ｍ， ２Ｈ）， ７．１３ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．０， ０．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３０ （ｔｄ， Ｊ ＝ ７．７， ２．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．９９ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．０， ２．０ Ｈｚ， １Ｈ）， １１．６３ （ｓ， １Ｈ）； ^１３Ｃ ＮＭＲ （１００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ ２４．３０， ５５．５０， ５５．７８， １０３．０５， １１０．４７， １１１．７２， １１８．４４， １１９．６７， １２０．７８， １２１．９１， １２２．５１， １２７．３９， １２８．９５， １３７．１４， １４１．３４， １４７．７６， １４８．３８， １５５．５９； ＩＲ （ヌジョールマル） ν ３３４０， １７０６， １６５９， １５９４， １５３０， １５０６， １４６０ ｃｍ^－１； Ｃ_１８Ｈ_１６Ｎ_２Ｏ_３の分析計算値： Ｃ， ７０．１２； Ｈ， ５．２３； Ｎ， ９．０９． 実測値： Ｃ， ７０．４４； Ｈ， ５．２０； Ｎ， ９．１６．

【0125】

一実施形態では、２，４－ジフルオロ－６－（５－メトキシ－３，９－ジヒドロクロメノ［２，３－ｄ］イミダゾール－２－イル）フェノール（ＭＣ４１０）を合成した。２，４－ジフルオロ－６－ヒドロキシベンズアルデヒド（０．０４９３ｍｇ；０．３１ｍｍｏｌ）をＣＨ_３ＣＮ（２ｍＬ）中の３－アミノ－８－メトキシ－２Ｈ－クロメン－２－イミニウムクロリド（５）（０．０６１ｍｇ；０．２７ｍｍｏｌ）の懸濁液に加え、懸濁液を６０℃で３６時間撹拌した。この固体を濾過し、ＣＨ_３ＣＮで洗浄し、純粋生成物と同定した。^１Ｈ ＮＭＲスペクトルにＨＣｌの混入が観察された場合、固体をＮａＨＣＯ_３（０．０５Ｍ）水溶液で洗浄し、濾過し、水で洗浄すると、純粋生成物が得られた。黄色固体；収率４９％；ｍｐ２６０－２６２℃；^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ ３．８３ （ｓ， ３Ｈ）， ４．１５ （ｓ， ２Ｈ）， ６．８７ （ｄｄ， Ｊ ＝ ７．６， ２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．９６ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．２， ２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．０４ （ｔ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．２４ （ｔｄ， Ｊ ＝ １０．０， １．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．５１ （ｄｔ， Ｊ ＝ １０．０， １．６ Ｈｚ， １Ｈ）， １１．９１ （ｓ， １Ｈ）， １２．９０ （ｓ， １Ｈ）； ^１３Ｃ ＮＭＲ （７５ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ ２３．２８， ５５．７０， １０４．３１ （ｄｄ， Ｊ ＝ ２０．６， １６．５ Ｈｚ）， １０４．３９， １０５．３８ （ｄｄ， Ｊ ＝ １８．８， ４．５ Ｈｚ）， １１０．５９， １１５．３６ （ｄｄ， Ｊ ＝ ７．９， ４．５ Ｈｚ）， １１９．０３， １２１．７１， １２３．１４， １３７．７１－１３７．７９ （ｍ）， １４０．３０ （Ｊ ＝ １０．２， ４．５ Ｈｚ）， １４０．６８， １４５．６２， １４８．２９， １５０．８０ （ｄｄ， Ｊ ＝ １８１．９， １０．０）， １５３．９ （ｄｄ， Ｊ ＝ １７５．９， ８．８）； ＩＲ （ヌジョールマル） ν ３３４８， ３２２５， １６９８， １６５１， １６０１， １５４２， １４６１ ｃｍ^－１； Ｃ_１７Ｈ_１２Ｎ_２Ｏ_３Ｆ_２０．８Ｈ_２Ｏの分析計算値： Ｃ， ５９．２３； Ｈ， ３．７２； Ｎ， ８．１３． 実測値： Ｃ， ５９．１３； Ｈ， ３．５３； Ｎ， ８．４２．

【0126】

一実施形態では、２－（４－エトキシフェニル）－５－メトキシ－３，９－ジヒドロクロメノ［２，３－ｄ］イミダゾール（ＭＣ４１５）を合成した。ＣＨ_３ＣＮ（２ｍＬ）中の３－アミノ－８－メトキシ－２Ｈ－クロメン－２－イミニウムクロリド（５）（０．０６１４ｍｇ；０．２７ｍｍｏｌ）の懸濁液に４－エトキシベンズアルデヒド（０．０４０３ｍｇ；０．３０ｍｍｏｌ）を加え、懸濁液を６０℃で４７時間撹拌した。この固体を濾過し、ＣＨ_３ＣＮで洗浄し、純粋生成物と同定した。^１Ｈ ＮＭＲスペクトルにＨＣｌの混入が観察された場合、固体をＮａＨＣＯ_３（０．０５Ｍ）水溶液で洗浄し、濾過し、水で洗浄すると、純粋生成物が得られた。黄色固体；収率９６％；ｍｐ２１５－２１７℃；^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ １．２０ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ３Ｈ）， ２．６２ （ｑ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．８４ （ｓ， ３Ｈ）， ４．１２ （ｓ， ２Ｈ）， ６．８７ （ｄｄ， Ｊ ＝ ７．２， １．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．９４ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．２， １．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．０１ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．２８ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．７９ （ｄｄ， Ｊ ＝ ６．６， １．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， １２．３６ （ｓ， １Ｈ）； ^１３Ｃ ＮＭＲ （７５ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ １５．４３， ２３．７３， ２７．９４， ５５．８０， １０３．３０， １１０．５２， １１９．４１， １２１．８７， １２２．５９， １２４．３３ （２Ｃ）， １２８．０８， １２８．１６ （２Ｃ）， １３９．８７， １４１．３３， １４３．６０， １４８．４０； ＩＲ （ヌジョールマル） ν ３３４２， １７０３， １６５６， １６１０， １５３９， １５０２， １４６０ ｃｍ^－１； Ｃ_１９Ｈ_１８Ｎ_２Ｏ_３の分析計算値： Ｃ， ７０．８１； Ｈ， ５．５９； Ｎ， ８．７０． 実測値： Ｃ， ７０．７４； Ｈ， ５．６７； Ｎ， ８．７７．

【0127】

一実施形態では、２－ブロモ－６－メトキシ－３－（５－メトキシ－３，９－ジヒドロクロメノ［２，３－ｄ］イミダゾール－２－イル）フェノール（ＭＣ４１６）を合成した。２－ブロモ－３－ヒドロキシ－４－メトキシベンズアルデヒド（０．０７８０ｍｇ；０．３４ｍｍｏｌ）をＣＨ_３ＣＮ（１ｍＬ）中の３－アミノ－８－メトキシ－２Ｈ－クロメン－２－イミニウムクロリド（５）（０．０６０７ｍｇ；０．２７ｍｍｏｌ）の懸濁液に加え、懸濁液を６０℃で４６時間撹拌した。この固体を濾過し、ＣＨ_３ＣＮで洗浄し、純粋生成物と同定した。^１Ｈ ＮＭＲスペクトルにＨＣｌの混入が観察された場合、固体をＮａＨＣＯ_３（０．０５Ｍ）水溶液で洗浄し、濾過し、水で洗浄すると、純粋生成物が得られた。ベージュ色固体；収率７１％；ｍｐ１６０－１６１℃；^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ ３．８２ （ｓ， ３Ｈ）， ３．８６ （ｓ， ３Ｈ）， ４．０８ （ｓ， ２Ｈ）， ６．８５ （ｄｄ， Ｊ ＝ ７．６， １．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．９３ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．０， １．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．９９ （ｔ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．０３－７．０８ （ｍ， ２Ｈ）， ９．５５ （ｓ， １Ｈ）， １１．９７ （ｓ， １Ｈ）； ^１３Ｃ ＮＭＲ （７５ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ ２３．８２， ５５．７４， ５６．２３， １０２．７５， １０９．３０， １１０．４３， １１０．５４， １１９．４６， １２１．３８， １２１．８４， １２２．４６， １２５．２６， １３９．０４， １４１．３３， １４４．０５， １４７．５２， １４８．２９， １４８．３７； ＩＲ （ヌジョールマル） ν ３３３８， ３２１２， １７０３， １６４７， １５３５， １４９７， １４６１ ｃｍ^－１； Ｃ_１８Ｈ_１５Ｎ_２Ｏ_４Ｂｒ１．８Ｈ_２Ｏの分析計算値： Ｃ， ４９．６１； Ｈ， ３．８６； Ｎ， ６．４３． 実測値： Ｃ， ４９．６８； Ｈ， ３．９１； Ｎ， ６．４３．

【0128】

一実施形態では、５，５’－ジメトキシ－２，２’－ジフェニル－１，１’，９，９’－テトラヒドロ－９，９’－ビクロメノ［２，３－ｄ］イミダゾールを合成した。ＣＨ_３ＣＮ（１－２ｍＬ）中の２－イミノ－８－メトキシ－２Ｈ－クロメン－３－アミン（４）の溶液にアルデヒド（１）（１－１．２当量）を加え、溶液を８０℃で７－２４時間撹拌した。固体生成物が徐々に沈殿し始めたため、濾過し、ＣＨ_３ＣＮで洗浄し、純粋生成物８と同定した。

【0129】

一実施形態では、２，２’－ビス（４－フルオロフェニル）－５，５’－ジメトキシ－１，１’，９，９’－テトラヒドロ－９，９’－ビクロメノ［２，３－ｄ］イミダゾール（ＭＣ４０６）を合成した。ＣＨ_３ＣＮ（１ｍＬ）中の２－イミノ－８－メトキシ－２Ｈ－クロメン－３－アミン（４）（０．０９６２ｍｇ；０．５１ｍｍｏｌ）の溶液に４－フルオロベンズアルデヒド（０．０６２９ｍｇ；０．５１ｍｍｏｌ）を加え、溶液を８０℃で７時間撹拌した。固体生成物が徐々に沈殿し始めたため、濾過し、ＣＨ_３ＣＮで洗浄し、純粋生成物と同定した。ベージュ色固体；収率１８％；ｍｐ２７２－２７４℃；^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ ３．６８ （ｓ， ６Ｈ）， ４．８９ （ｓ， ２Ｈ）， ５．８０ （ｄｄ， Ｊ ＝ ７．８， ２．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．７１ （ｔ， Ｊ ＝ ７．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．８０ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．７， １．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３２－７．４９ （ｍ， ４Ｈ）， ７．９８－８．０３ （ｍ， ４Ｈ）， １２．５７ （ｓ， ２Ｈ）； ^１３Ｃ ＮＭＲ （７５ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ ４１．２１， ５５．６４， １０５．８１， １１１．００， １１５．８３ （２Ｃ， Ｊ ＝ ２１．２）， １１９．６２， １２０．４４， １２２．０１， １２６．８０ （２Ｃ， Ｊ ＝ ８．０）， １２７．１２， １３９．９８， １４１．９０， １４７．６２， １５０．１２， １６２．００ （Ｊ ＝ ２４３．８）； ＩＲ （ヌジョールマル） ν ３３４８， １７００， １６５０， １６０８， １５３８， １５００， １４６１ ｃｍ^－１； Ｃ_３４Ｈ_２４Ｎ_４Ｏ_４Ｆ_２１．２Ｈ_２Ｏの分析計算値： Ｃ， ６４．２３； Ｈ， ４．８５； Ｎ， ８．８２． 実測値： Ｃ， ６４．２１； Ｈ， ４．７９； Ｎ， ８．８０．

【0130】

一実施形態では、２，２’－ビス（４－ブロモフェニル）－５，５’－ジメトキシ－１，１’，９，９’－テトラヒドロ－９，９’－ビクロメノ［２，３－ｄ］イミダゾール（ＭＣ４２１）を合成した。ＣＨ_３ＣＮ（１．５ｍＬ）中の２－イミノ－８－メトキシ－２Ｈ－クロメン－３－アミン（４）（０．０７０５ｍｇ；０．３７ｍｍｏｌ）の溶液に４－ブロモベンズアルデヒド（０．０６９ｍｇ；０．３７ｍｍｏｌ）を加え、この溶液を８０℃で８時間撹拌した。固体生成物が徐々に沈殿し始めたため、濾過し、ＣＨ_３ＣＮで洗浄し、純粋生成物と同定した。ベージュ色固体；収率３２％；ｍｐ２６６－２６８℃；^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ ３．６８ （ｓ， ６Ｈ）， ４．８９ （ｓ， ２Ｈ）， ５．７８ （ｄｄ， Ｊ ＝ ７．８， １．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．７１ （ｔ， Ｊ ＝ ７．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．８０ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．２， ２．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．７１ （ｄｄ， Ｊ ＝ ６．６， １．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．９１ （ｄｄ， Ｊ ＝ ６．９， １．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， １２．６９ （ｓ， ２Ｈ）； ^１３Ｃ ＮＭＲ （７５ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ ４１．２４， ５５．６５， １０６．３３， １１１．０６， １１９．５２， １２０．４１， １２１．１４， １２２．０６， １２６．５８， １２９．６５， １３１．８０， １３９．７０， １４１．８６， １４７．６２， １５０．２５； ＩＲ （ヌジョールマル） ν ３３５２， １７０３， １６５４， １６１０， １５４３， １５０８， １４６１ｃｍ^－１； Ｃ_３４Ｈ_２４Ｎ_４Ｏ_４Ｂｒ_２の分析計算値： Ｃ， ５７．３２； Ｈ， ３．４０； Ｎ， ７．８６． 実測値： Ｃ， ５７．７８； Ｈ， ３．３７； Ｎ， ７．８８．

【0131】

一実施形態では、２，２’－ビス（２－フルオロフェニル）－５，５’－ジメトキシ－１，１’，９，９’－テトラヒドロ－９，９’－ビクロメノ［２，３－ｄ］イミダゾール（ＭＣ３６９）を合成した。２－フルオロベンズアルデヒド（０．０４４６ｍｇ；０．３６ｍｍｏｌ）をＣＨ_３ＣＮ（２ｍＬ）中の２－イミノ－８－メトキシ－２Ｈ－クロメン－３－アミン（４）（０．０５９０ｍｇ；０．３１ｍｍｏｌ）の溶液に加え、この溶液を８０℃で２４時間撹拌した。固体生成物が徐々に沈殿し始めたため、濾過し、ＣＨ_３ＣＮで洗浄し、純粋生成物と同定した。ベージュ色固体；収率１５％；ｍｐ２７６－２７８℃；^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ ３．６９ （ｓ， ６Ｈ）， ５．００ （ｓ， ２Ｈ）， ５．９１ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．０， １．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．７５ （ｔ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．８２ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．２， １．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３１－７．４８ （ｍ， ６Ｈ）， ７．９９ （ｔｄ， Ｊ ＝ ５．７， １．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， １１．８８ （ｓ， ２Ｈ）； ^１３Ｃ ＮＭＲ （７５ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ ４１．０８， ５５．６５， １０６．６３， １１０．９９， １１６．２８ （Ｊ ＝ ２１．３）， １１８．２４ （Ｊ ＝ １１．４）， １２０．０２， １２０．４５， １２２．０６， １２４．９８， １２８．６０ （Ｊ ＝ ２．８）， １２９．９８ （Ｊ ＝ ８．２）， １３５．５８， １４１．９０， １４７．６２， １４９．９３， １５８．７３ （Ｊ ＝ ２４６．６）； ＩＲ （ヌジョールマル） ν ３４３８， ３４４７， １６３７， １５７５， １６１４， １５７５， １５３０， １４６９ ｃｍ^－１； Ｃ_３４Ｈ_２４Ｎ_４Ｏ_４Ｆ_２．０．８Ｈ_２Ｏの分析計算値： Ｃ， ６７．５１； Ｈ， ４．２３； Ｎ， ９．２６． 実測値： Ｃ， ６７．５８； Ｈ， ４．３０； Ｎ， ９．１１．

【0132】

本書で使用される「含む」という用語は、記載された特徴、整数、工程、構成要素の存在を示すことを意図しているが、１つ若しくは複数の他の特徴、整数、工程、構成要素又はそれらのグループの存在若しくは追加を排除するものではない。

【0133】

当業者であれば、特に明記しない限り、記載された工程の特定の順序は例示的にすぎず、本開示から逸脱することなく変更することができることが理解されるであろう。このように、別段の記載がない限り、記載された工程は順序付けられていないため、可能な場合には、任意の便利な又は望ましい順序で実行することができることを意味する。

【0134】

要素又は特徴の単数形が特許請求の範囲の明細書で使用されている場合、特に除外されない限り、その複数形も含まれ、その逆も同様である。例えば、「化合物」又は「前記化合物」という用語には、複数形の「化合物」又は「前記化合物」も含まれ、その逆も同様である。特許請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」などの冠詞は、反対の指示がない限り、又は文脈から明らかでない限り、１つ若しくは複数を意味することがある。グループの１つ又は複数のメンバー間に「又は」を含む請求項又は記述は、反対の指示がない限り、又は文脈から明らかでない限り、グループメンバーの１つ、複数若しくはすべてが所定の製品又はプロセスに存在し、採用され、又はその他の点で関連性があれば満たされると考えられる。本発明は、グループの正確に１つのメンバーが、所定の製品又はプロセスに存在し、採用され、又はその他の点で関連する実施形態を含む。また、本発明は、グループのメンバーのうちの複数、又はすべてが、所定の製品又はプロセスに存在し、採用され、又はその他の点で関連する実施形態を含む。

【0135】

さらに、本発明は、１つ若しくは複数の請求項から、又は本明細書の関連部分から、１つ若しくは複数の限定、要素、条項、説明用語などを別の請求項に導入するすべての変形、組み合わせ及び順列を包含することを理解されたい。例えば、他の請求項に従属する任意の請求項は、同じ基本請求項に従属する任意の他の請求項に見られる１つ又は複数の制限を含むように変更することができる。

【0136】

さらに、特許請求の範囲に組成物が記載されている場合、別段の指示がない限り、又は矛盾若しくは不整合が生じることが当業者に明らかでない限り、本明細書に開示されている任意の目的に組成物を使用する方法が含まれ、本明細書に開示されている任意の製造方法又は当業者に知られている他の方法に従って組成物を製造する方法が含まれることを理解されたい。

【0137】

範囲が指定されている場合、端点も含まれる。さらに、別段の指示がない限り、又は文脈及び／若しくは当業者の理解から別段に明らかでない限り、範囲として表現されている値は、文脈が明確に指示しない限り、本発明の異なる実施形態において、範囲の下限の単位の１０分の１まで、記載の範囲内の任意の特定の値を想定することができることを理解されたい。また、別段の指示がない限り、又は文脈及び／若しくは当業者の理解から別段に明らかでない限り、範囲として表現される値は、所定の範囲内の任意のサブ範囲を想定することができ、サブ範囲の端点は、範囲の下限の単位の１０分の１と同程度の精度で表現されることを理解されたい。

【0138】

本開示は、記載された実施形態に何ら限定されるものではなく、当業者であれば、その変更に多くの可能性を予見するであろう。

【0139】

上述の実施形態は、組み合わせ可能である。

【0140】

（参照）
（１） ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｉｃｃ．ｏｒｇ／ｎｅｗ－ｇｌｏｂａｌ－ｃａｎｃｅｒ－ｄａｔａ－ｇｌｏｂｏｃａｎ－２０１８ （０２／０１／２０１９）
（２）ｈｔｔｐ：／／ｇｃｏ．ｉａｒｃ．ｆｒ （０２／０１／２０１９）
（３）Ｂａｏ， Ｂ； Ｍｉｔｒｅａ， Ｃ．； Ｗｉｊｅｓｉｎｇｈｅ， Ｐ．； Ｍａｒｃｈｅｔｔｉ， Ｌ．； Ｇｉｒｓｃｈ， Ｅ．； Ｆａｒｒ， Ｒ．； Ｂｏｅｒｎｅｒ， Ｊ．； Ｍｏｈａｍｍａｄ， Ｒ．； Ｄｙｓｏｎ， Ｇ．； Ｔｅｒｌｅｃｋｙ， Ｓ． ａｎｄ Ｂｏｌｌｉｇ－Ｆｉｓｃｈｅｒ， Ａ． Ｔｒｅａｔｉｎｇ ｔｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ ｐｌｕｓ ａ ｓｅｌｅｃｔ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｏｖｅｒｃｏｍｅｓ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ． Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１７， ７， ４４１２５．
（４） Ｃｏｓｔａ， Ｍ．； Ｄｉａｓ， Ｔ．； Ｂｒｉｔｏ， Ａ． Ａｎｄ Ｐｒｏｅｎｃａ， Ｆ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ ｃｈｒｏｍｅｎｅｓ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ， ２０１６， １２３， ４８７－５０７．
（５）Ｃｏｓｔａ， Ｍ．； Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ， Ａ． Ｉ．； Ｐｒｏｅｎｃａ， Ｆ． Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ３－ａｍｉｎｏｃｈｒｏｍｅｎｅｓ： ｔｈｅ Ｚｉｎｃｋｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ２０１４， ７０ （３３）， ４８６９．
（６）Ｃｏｓｔａ， Ｍ．； Ｐｒｏｅｎｃａ， Ｆ． ２－Ａｒｙｌ－１，９－ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｒｏｍｅｎｏ［３，２－ｄ］ｉｍｉｄａｚｏｌｅｓ： ａ ｆａｃｉｌｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｆｒｏｍ ｓａｌｉｃｙｌａｌｄｅｈｙｄｅｓ ａｎｄ ａｒｙｌｉｄｅｎｅａｍｉｎｏａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ２０１１， ６７ （１０）， １７９９．

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】