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特許7674332核酸、例えばＲＮＡ、および適宜粒子を含む試料組成物の少なくとも１つのパラメーターを決定する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-04-28
(45)【発行日】2025-05-09
(54)【発明の名称】核酸、例えばＲＮＡ、および適宜粒子を含む試料組成物の少なくとも１つのパラメーターを決定する方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/68 20180101AFI20250430BHJP
G01N 15/02 20240101ALI20250430BHJP
B03B 5/00 20060101ALI20250430BHJP
B03B 5/62 20060101ALI20250430BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20250430BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/68
G01N15/02 D
B03B5/00 Z
B03B5/62
C12N15/09 Z
【請求項の数】
69
(21)【出願番号】P 2022503433
(86)(22)【出願日】2020-07-17
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-16
(86)【国際出願番号】 EP2020070344
(87)【国際公開番号】W WO2021009368
(87)【国際公開日】2021-01-21
【審査請求日】2023-07-14
(31)【優先権主張番号】PCT/EP2019/069342
(32)【優先日】2019-07-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】522021206
【氏名又は名称】ビオンテック・ソシエタス・エウロパエア
【氏名又は名称原語表記】ＢｉｏＮＴｅｃｈ ＳＥ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(74)【代理人】
【識別番号】100221545
【弁理士】
【氏名又は名称】白江 雄介
(72)【発明者】
【氏名】ハース，ハインリヒ
(72)【発明者】
【氏名】バチッチ，ティヤナ
(72)【発明者】
【氏名】シューマッハー，イェンス
【審査官】山本 匡子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１９／０６７９９２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１７／０２８４９７５（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１５－５１４０７６（ＪＰ，Ａ）
【文献】Matolanovic et al.，Hsp70 silencing with siRNA in nanocarriers enhances cancer cell death induced by the inhibitor of Hsp90，European Journal of Pharmaceutical Sciences，Elsevier，2013年04月10日，Vol.50，p149-158
【文献】Zhang et al.，Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by assymmetric-flow field-flow fractionation，Nature Cell Biology，Nature Publishing Group，2018年02月19日，Vol.20, No.3，p332-343
【文献】Zhang et al.，Polydispersity characterization of lipid nanoparticles for siRNA delivery using multiple detection size-exclusion chromatography，Analytical Chemistry，American Chemical Society，2012年06月07日，Vol.84，p6088-6096
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－９０
Ｃ１２Ｑ
Ｃ１２Ｍ
ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料組成物の１つまたは複数のパラメーターを決定する方法であって、前記試料組成物は、ＲＮＡおよびＲＮＡが結合している粒子を含み、前記方法は、（ａ）前記試料組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーションに供することによって、前記試料組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の試料画分を生成する工程と；
（ｂ）工程（ａ）から得た前記１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナル、および適宜光散乱（ＬＳ）シグナルを測定する工程と；
（ｃ）前記ＵＶシグナルから、かつ適宜前記ＬＳシグナルから、１つまたは複数のパラメーターを算出する工程と
を含み、
前記１つまたは複数のパラメーターは、ＲＮＡ完全性、ＲＮＡの総量、遊離ＲＮＡの量、粒子に結合したＲＮＡの量、ＲＮＡ含有粒子のサイズ、ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布、およびＲＮＡ含有粒子の定量的サイズ分布を含み、
ここで、遊離ＲＮＡの量、粒子に結合したＲＮＡの量、ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布、およびＲＮＡ含有粒子の定量的サイズ分布からなる群より選択される少なくとも２つのパラメーターが決定され、
ここで、ＲＮＡの量が、（ｉ）ＲＮＡ減衰係数または（ｉｉ）ＲＮＡ較正曲線を用いることによって求められ、
ここで、前記粒子に結合したＲＮＡの量が、前記遊離ＲＮＡの量を、前記総ＲＮＡの量から減算することによって求められ、
ここで、前記遊離ＲＮＡの量が、放出剤の添加なしで、工程（ａ）～（ｃ）を実行すること、およびＲＮＡの量を求めることによって求められ、
ここで、前記総ＲＮＡの量が（ｉ）前記試料組成物の一部を放出剤により処理する工程と；（ｉｉ）工程（ａ）～工程（ｃ）を、工程（ｉ）から得た前記一部に実行する工程と；（ｉｉｉ）ＲＮＡの量を求める工程とによって求められる、方法。
【請求項2】
前記フィールド－フローフラクショネーションが、フローフィールド－フローフラクショネーション、非対称フローフィールド－フローフラクショネーション（ＡＦ４）またはホローファイバーフローフィールド－フローフラクショネーション（ＨＦ５）である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
工程（ａ）が、ＲＮＡが透過するのを防止するのに適した分子量（ＭＷ）カットオフを有する膜、または２ｋＤａから３０ｋＤａの範囲内のＭＷカットオフ、もしくは１０ｋＤａのＭＷカットオフを有する膜を用いて実行される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
工程（ａ）が、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）または再生セルロース膜を用いて実行される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
工程（ａ）が、最大８ｍＬ／分、最大４ｍＬ／分、または最大２ｍＬ／分のクロスフローレートを用いて実行される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
工程（ａ）が、以下のクロスフローレートプロファイル：１０分間の１．０～２．０ｍＬ／分、３０分以内の１．０～２．０ｍＬ／分から０．０１～０．０７ｍＬ／分への指数勾配；３０分間の０．０１～０．０７ｍＬ／分；および１０分間の０ｍＬ／分を用いて実行される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
工程（ａ）が、０．０５～０．３５ｍＬ／分の範囲内で、０．１０～０．３０ｍＬ／分の範囲内で、または０．１５～０．２５ｍＬ／分の範囲内のインジェクトフローを用いて実行される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
工程（ａ）が、０．３０～０．７０ｍＬ／分の範囲内で、０．４０～０．６０ｍＬ／分の範囲内で、または０．４５～０．５５ｍＬ／分の範囲内の検出器フローを用いて実行される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記試料組成物中に含有される前記ＲＮＡの完全性が、対照ＲＮＡの完全性を用いて算出される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記対照ＲＮＡの完全性が、以下の工程：（ａ’）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、前記対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ’）工程（ａ’）から得た前記１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ’１）工程（ｂ’）において得た前記ＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの最大高さから前記ＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（対照）を得る工程と；
（ｃ’２）工程（ｂ’）において得た前記ＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた前記１つのピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（対照）を得る工程と；
（ｃ’３）Ａ５０％（対照）とＡ１００％（対照）との比率を求めることによって、前記対照ＲＮＡの完全性［Ｉ（対照）］を得る工程と
によって求められる、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記試料組成物中に含有される前記ＲＮＡの完全性が、以下の工程：（ｃ１）工程（ｂ）から得た前記試料ＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた前記対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの最大高さから前記試料ＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（試料）を得る工程と；
（ｃ２）工程（ｂ）から得た前記試料ＵＶシグナルから、工程（ｃ１）において用いた前記試料ＵＶピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（試料）を得る工程と；
（ｃ３）Ａ５０％（試料）とＡ１００％（試料）との比率を求めることによって、Ｉ（試料）を得る工程と；
（ｃ４）Ｉ（試料）とＩ（対照）との比率を求めることによって、前記試料組成物中に含有される前記ＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出される、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記対照ＲＮＡの完全性を算出する工程が、以下の工程：（ａ”）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、前記対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ”）工程（ａ”）から得た前記１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ”）工程（ｂ”）において得た前記ＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの高さ［Ｈ（対照）］を求めることによって、前記対照ＲＮＡの完全性を得る工程と
によって決定される、請求項９に記載の方法。
【請求項13】
前記試料組成物中に含有される前記ＲＮＡの完全性が、以下の工程：（ｃ１’）工程（ｂ）において得た前記ＵＶシグナルから、工程（ｃ”）において用いた前記対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの高さ［Ｈ（試料）］を求める工程と；
（ｃ２’）Ｈ（試料）とＨ（対照）との比率を求めることによって、前記試料組成物中に含有される前記ＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出される、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記ＲＮＡが結合している粒子が、リポプレックス粒子および／または脂質ナノ粒子および／またはポリプレックス粒子および／またはリポポリプレックス粒子および／またはウイルス様粒子を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
工程（ａ）において、前記フィールド－フローフラクショネーションが、前記放出剤を含有する液相を用いて実行される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記放出剤が、（ｉ）界面活性剤もしくはそれらの混合物；（ｉｉ）アルコールもしくはアルコールの混合液；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組合せである、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
（ｉ）前記界面活性剤が陰イオン界面活性剤、双性イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、もしくはそれらの混合物である；または前記界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム、ｎ－テトラデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホナート（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３－１４）もしくはそれらの混合物である；および／または
（ｉｉ）前記アルコールが脂肪族アルコール、脂肪族アルコールの混合物、またはエタノールである、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
工程（ｂ）がさらに、工程（ａ）から得た前記１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つのＬＳシグナルを測定することを含む、請求項１４から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記ＬＳシグナルが、動的光散乱（ＤＬＳ）シグナル、静的光散乱（ＳＬＳ）、または多角度光散乱（ＭＡＬＳ）シグナルである、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
ＲＮＡ含有粒子のサイズが、工程（ｂ）から得た前記ＬＳシグナルから、回転半径（Ｒｇ）値および／または流体力学半径（Ｒｈ）値を算出することによって求められる、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項21】
実験的に求めた前記Ｒｇ値および／または前記Ｒｈ値が平滑化されるか、または実験的に求めた前記Ｒ
ｇ
値および／または前記Ｒ
ｈ
値が、実験的に求めた、もしくは算出した前記Ｒｇ値または前記Ｒｈ値を、多項式関数または線形関数に適合させて、多項式適合または線形適合に基づくＲｇ値またはＲｈ値を再算出することによって平滑化される、請求項１８また１９に記載の方法。
【請求項22】
ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布が、工程（ｂ）から得た前記ＵＶシグナルを、請求項２０に規定するように求めた前記Ｒｇ値または前記Ｒｈ値に対してプロットすることによって求められる、請求項１８から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
ＲＮＡ含有粒子の前記定量的サイズ分布が、前記Ｒｇ値または前記Ｒｈ値の関数として前記ＵＶシグナルを示すプロットから、前記ＵＶシグナルを累積重量分率に変換して、前記累積重量分率を前記求めたＲｇ値または前記Ｒｈ値に対してプロットすることによって算出される、請求項１８から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記定量的サイズ分布が、Ｄ１０値、Ｄ５０値、および／またはＤ９０値を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
工程（ｂ）が、工程（ａ）から得た前記１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの動的光散乱（ＤＬＳ）シグナルを測定することを含み、工程（ｃ）が、前記ＤＬＳシグナルからＲｈ値を算出することを含む、請求項２０から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記１つまたは複数のパラメーターが、遊離ＲＮＡの量、粒子に結合したＲＮＡの量、ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布、およびＲＮＡ含有粒子の定量的サイズ分布からなる群から選択される２つのパラメーターであるか、または、前記１つまたは複数のパラメーターが、遊離ＲＮＡの量、粒子に結合したＲＮＡの量、ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布、およびＲＮＡ含有粒子の定量的サイズ分布からなる群から選択される、少なくとも３つのパラメーターを含むか、もしくは３つのパラメーターである、請求項１４から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
ＲＮＡの前記量、特に遊離ＲＮＡの前記量が、２６０ｎｍでのＵＶシグナルを測定し、２６０ｎｍでのＲＮＡ減衰係数を用いることによって、または２８０ｎｍでのＵＶシグナルを測定し、２８０ｎｍでのＲＮＡ減衰係数を用いることによって求められる、請求項１４から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
ＲＮＡ含有粒子の前記サイズ分布および／またはＲＮＡ含有粒子の前記定量的サイズ分布が、１０～２０００ｎｍの範囲内、２０～１５００ｎｍ、３０～１２００ｎｍ、４０～１１００ｎｍ、５０～１０００、６０～９００ｎｍ、７０～８００ｎｍ、８０～７００ｎｍ、９０～６００ｎｍ、もしくは１００～５００ｎｍの範囲内、または１０～１０００ｎｍ、１５～５００ｎｍ、２０～４５０ｎｍ、２５～４００ｎｍ、３０～３５０ｎｍ、４０～３００ｎｍ、もしくは５０～２５０ｎｍの範囲内である、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記ＲＮＡが、１０～１５，０００ヌクレオチド、４０～１５，０００ヌクレオチド、１００～１２，０００ヌクレオチド、または２００～１０，０００ヌクレオチド長を有する、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記ＲＮＡが、インビトロ転写ＲＮＡ、またはインビトロ転写ｍＲＮＡである、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記ＵＶシグナル、適宜前記ＬＳシグナルを測定する工程がオンラインで実行され、かつ／または工程（ｃ）がオンラインで実行される、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
前記試料組成物の少なくとも一部をフィールド－フローフラクショネーションに供する前に、前記試料組成物の前記少なくとも一部が、溶媒または溶媒混合液により希釈され、前記溶媒または前記溶媒混合液が、粒子の凝集体の形成を防止することができる、請求項１４から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
前記溶媒混合液が、水および有機溶媒の混合液、または水およびホルムアミドの混合液である、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記ＵＶシグナルを測定する工程が、円二色性（ＣＤ）分光法を用いることによって実行される、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
ＲＮＡおよびＲＮＡが結合している粒子を含む組成物を用意する場合に、１つまたは複数の反応条件を変更する影響を分析する方法であって、（Ａ）ＲＮＡおよび粒子を含む第１の組成物を用意する工程と；
（Ｂ）ＲＮＡおよび粒子を含む第２の組成物を用意する工程であって、前記第１の組成物を用意する工程と、１つまたは複数の反応条件のみが異なる、工程と；
（Ｃ）前記第１の組成物の一部を、請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法に供することによって、前記第１の組成物の１つまたは複数のパラメーターを決定する工程と；
（Ｄ）前記第２の組成物の対応する一部を、工程（Ｃ）において用いた前記方法に供することによって、前記第２の組成物の１つまたは複数のパラメーターを決定する工程と；
（Ｅ）工程（Ｃ）において得た前記第１の組成物の前記１つまたは複数のパラメーターを、工程（Ｄ）において得た前記第２の組成物の前記対応する１つまたは複数のパラメーターと比較する工程と
を含む方法。
【請求項36】
前記１つまたは複数の反応条件が、塩濃度／イオン強度；温度；ｐＨまたはバッファ濃度；光／放射線；酸素；剪断力；圧力；凍結／解凍サイクル；乾燥／復元サイクル；賦形剤の添加；粒子形成化合物のタイプおよび／または源；電荷比；物理的状態；ならびにＲＮＡの、粒子形成化合物に対する比率のいずれかを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
（ｉ）前記塩濃度／イオン強度が２ｍＭ ＮａＣｌまたは１００ｍＭ ＮａＣｌである；
（ｉｉ）前記温度が低温または高温である；
（ｉｉｉ）前記温度が－２０℃または５０℃である；
（ｉｖ）前記賦形剤がスタビライザーおよび／もしくはキレート化剤である；
（ｖ）前記粒子形成化合物が脂質および／もしくはポリマーである；ならびに／または
（ｖｉ）前記粒子形成化合物が陽イオン脂質対双性イオン脂質、またはペグ化脂質対非ペグ化脂質である、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
ＲＮＡおよびＲＮＡが結合している粒子を含む試料組成物の１つまたは複数のパラメーターを決定するためのフィールド－フローフラクショネーションの使用であって、前記１つまたは複数のパラメーターは、ＲＮＡ完全性、ＲＮＡの総量、遊離ＲＮＡの量、粒子に結合したＲＮＡの量、ＲＮＡ含有粒子のサイズ（例えば、ＲＮＡ含有粒子の流体力学半径）、ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布、およびＲＮＡ含有粒子の定量的サイズ分布を含み、ここで、遊離ＲＮＡの量、粒子に結合したＲＮＡの量、ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布、およびＲＮＡ含有粒子の定量的サイズ分布からなる群より選択される少なくとも２つのパラメーターが決定される、使用。
【請求項39】
前記フィールド－フローフラクショネーションが、（ａ）前記試料組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーションに供することによって、前記試料組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の試料画分を生成する工程と；
（ｂ）工程（ａ）から得た前記１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナル、および適宜光散乱（ＬＳ）シグナルを測定する工程と；
（ｃ）前記ＵＶシグナルから、かつ適宜前記ＬＳシグナルから、１つまたは複数のパラメーターを算出する工程と
を含み、
ここで、ＲＮＡの量が、（ｉ）ＲＮＡ減衰係数または（ｉｉ）ＲＮＡ較正曲線を用いることによって求められ、
ここで、前記粒子に結合したＲＮＡの量が、前記遊離ＲＮＡの量を、前記総ＲＮＡの量から減算することによって求められ、
ここで、前記遊離ＲＮＡの量が、放出剤の添加なしで、工程（ａ）～（ｃ）を実行すること、およびＲＮＡの量を求めることによって求められ、
ここで、前記総ＲＮＡの量が（ｉ）前記試料組成物の一部を放出剤により処理する工程と；（ｉｉ）工程（ａ）～工程（ｃ）を、工程（ｉ）から得た前記一部に実行する工程と；（ｉｉｉ）ＲＮＡの量を求める工程とによって求められる、
、請求項３８に記載の使用。
【請求項40】
前記フィールド－フローフラクショネーションが、フローフィールド－フローフラクショネーション、非対称フローフィールド－フローフラクショネーション（ＡＦ４）またはホローファイバーフローフィールド－フローフラクショネーション（ＨＦ５）である、請求項３８または３９に記載の使用。
【請求項41】
前記フィールド－フローフラクショネーションが、ＲＮＡが透過するのを防止するのに適した分子量（ＭＷ）カットオフを有する膜、または２ｋＤａから３０ｋＤａの範囲内のＭＷカットオフ、もしくは１０ｋＤａのＭＷカットオフを有する膜を用いる、請求項３８から４０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項42】
前記フィールド－フローフラクショネーションが、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）または再生セルロース膜を用いる、請求項３８から４１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項43】
工程（ａ）が、（Ｉ）最大８ｍＬ／分、最大４ｍＬ／分、もしくは最大２ｍＬ／分のクロスフローレート、または以下：１０分間の１．０～２．０ｍＬ／分、３０分以内の１．０～２．０ｍＬ／分から０．０１～０．０７ｍＬ／分への指数勾配；３０分間の０．０１～０．０７ｍＬ／分；および１０分間の０ｍＬ／分のクロスフローレートプロファイル；ならびに／または
（ＩＩ）０．０５～０．３５ｍＬ／分の範囲内、０．１０～０．３０ｍＬ／分の範囲内、または０．１５～０．２５ｍＬ／分の範囲内のインジェクトフロー；ならびに／または
（ＩＩＩ）０．３０～０．７０ｍＬ／分の範囲内、０．４０～０．６０ｍＬ／分の範囲内、または０．４５～０．５５ｍＬ／分の範囲内の検出器フロー
を用いて実行される、請求項３９から４２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項44】
前記試料組成物中に含有される前記ＲＮＡの完全性が、対照ＲＮＡの完全性を用いて求められる、請求項３８から４３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項45】
前記対照ＲＮＡの完全性が、以下の工程：（ａ’）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、前記対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ’）工程（ａ’）から得た前記１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ’１）工程（ｂ’）において得た前記ＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの最大高さから前記ＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（対照）を得る工程と；
（ｃ’２）工程（ｂ’）において得た前記ＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた前記１つのピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（対照）を得る工程と；
（ｃ’３）Ａ５０％（対照）とＡ１００％（対照）との比率を求めることによって、前記対照ＲＮＡの完全性［Ｉ（対照）］を得る工程と
によって求められる、請求項４４に記載の使用。
【請求項46】
前記試料組成物中に含有される前記ＲＮＡの完全性が、以下の工程：（ｃ１）工程（ｂ）から得た前記試料ＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた前記対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの最大高さから前記試料ＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（試料）を得る工程と；
（ｃ２）工程（ｂ）から得た前記試料ＵＶシグナルから、工程（ｃ１）において用いた前記試料ＵＶピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（試料）を得る工程と；
（ｃ３）Ａ５０％（試料）とＡ１００％（試料）との比率を求めることによって、Ｉ（試料）を得る工程と；
（ｃ４）Ｉ（試料）とＩ（対照）との比率を求めることによって、前記試料組成物中に含有される前記ＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出される、請求項４５に記載の使用。
【請求項47】
前記対照ＲＮＡの完全性を算出する工程が、以下の工程：（ａ”）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、前記対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ”）工程（ａ”）から得た前記１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ”）工程（ｂ”）において得た前記ＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの高さ［Ｈ（対照）］を求めることによって、前記対照ＲＮＡの完全性を得る工程と
によって決定される、請求項４４に記載の使用。
【請求項48】
前記試料組成物中に含有される前記ＲＮＡの完全性が、以下の工程：（ｃ１’）工程（ｂ）において得た前記ＵＶシグナルから、工程（ｃ”）において用いた前記対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの高さ［Ｈ（試料）］を求める工程と；
（ｃ２’）Ｈ（試料）とＨ（対照）との比率を求めることによって、前記試料組成物中に含有される前記ＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出される、請求項４７に記載の使用。
【請求項49】
前記ＲＮＡが結合している粒子が、リポプレックス粒子および／または脂質ナノ粒子および／またはポリプレックス粒子および／またはリポポリプレックス粒子および／またはウイルス様粒子を含む、請求項３９から４８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項50】
工程（ａ）において、前記フィールド－フローフラクショネーションが、前記放出剤を含有する液相を用いて実行される、請求項３９から４９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項51】
前記放出剤が、（ｉ）界面活性剤もしくはそれらの混合物；（ｉｉ）アルコールもしくはアルコールの混合液；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組合せである、請求項３９から５０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項52】
（ｉ）前記界面活性剤が陰イオン界面活性剤、双性イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、もしくはそれらの混合物である；または前記界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム、ｎ－テトラデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホナート（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３－１４）もしくはそれらの混合物である；および／または
（ｉｉ）前記アルコールが脂肪族アルコール、脂肪族アルコールの混合物、またはエタノールである、請求項５１に記載の使用。
【請求項53】
工程（ｂ）がさらに、工程（ａ）から得た前記１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つのＬＳシグナルを測定することを含む、請求項４９から５２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項54】
前記ＬＳシグナルが、動的光散乱（ＤＬＳ）シグナル、静的光散乱（ＳＬＳ）、または多角度光散乱（ＭＡＬＳ）シグナルである、請求項５３に記載の使用。
【請求項55】
ＲＮＡ含有粒子のサイズが、工程（ｂ）から得た前記ＬＳシグナルから、回転半径（Ｒｇ）値および／または流体力学半径（Ｒｈ）値を算出することによって求められる、請求項５３または５４に記載の使用。
【請求項56】
実験的に求めた前記Ｒｇ値および／または前記Ｒｈ値が平滑化されるか、または実験的に求めた前記Ｒ
ｇ
値および／または前記Ｒ
ｈ
値が、実験的に求めた、もしくは算出した前記Ｒｇ値または前記Ｒｈ値を、多項式関数または線形関数に適合させて、多項式適合または線形適合に基づくＲｇ値またはＲｈ値を再算出することによって平滑化される、請求項５５に記載の使用。
【請求項57】
ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布が、工程（ｂ）から得た前記ＵＶシグナルを、請求項５５に規定するように求めた前記Ｒｇ値または前記Ｒｈ値に対してプロットすることによって求められる、請求項５３から５６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項58】
ＲＮＡ含有粒子の前記定量的サイズ分布が、前記Ｒｇ値または前記Ｒｈ値の関数として前記ＵＶシグナルを示すプロットから、前記ＵＶシグナルを累積重量分率に変換して、前記累積重量分率を前記Ｒｇ値または前記Ｒｈ値に対してプロットすることによって算出される、請求項５３から５７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項59】
前記定量的サイズ分布が、Ｄ１０値、Ｄ５０値、および／またはＤ９０値を含む、請求項５８に記載の使用。
【請求項60】
工程（ｂ）が、工程（ａ）から得た前記１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの動的光散乱（ＤＬＳ）シグナルを測定することを含み、工程（ｃ）が、前記ＤＬＳシグナルからＲｈ値を算出することを含む、請求項５５から５９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項61】
前記１つまたは複数のパラメーターが、遊離ＲＮＡの量、粒子に結合したＲＮＡの量、ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布、およびＲＮＡ含有粒子の定量的サイズ分布からなる群から選択される２つのパラメーターであるか、または、前記１つまたは複数のパラメーターが、遊離ＲＮＡの量、粒子に結合したＲＮＡの量、ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布、およびＲＮＡ含有粒子の定量的サイズ分布からなる群から選択される、少なくとも３つのパラメーターを含むか、もしくは３つのパラメーターである、請求項４９から６０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項62】
ＲＮＡの前記量、特に遊離ＲＮＡの前記量が、２６０ｎｍでのＵＶシグナルを測定し、２６０ｎｍでのＲＮＡ減衰係数を用いることによって、または２８０ｎｍでのＵＶシグナルを測定し、２８０ｎｍでのＲＮＡ減衰係数を用いることによって求められる、請求項４９から６１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項63】
ＲＮＡ含有粒子の前記サイズ分布および／またはＲＮＡ含有粒子の前記定量的サイズ分布が、１０～２０００ｎｍの範囲内、２０～１５００ｎｍ、３０～１２００ｎｍ、４０～１１００ｎｍ、５０～１０００、６０～９００ｎｍ、７０～８００ｎｍ、８０～７００ｎｍ、９０～６００ｎｍ、もしくは１００～５００ｎｍの範囲内、または１０～１０００ｎｍ、１５～５００ｎｍ、２０～４５０ｎｍ、２５～４００ｎｍ、３０～３５０ｎｍ、４０～３００ｎｍ、もしくは５０～２５０ｎｍの範囲内である、請求項３８から６２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項64】
前記ＲＮＡが、１０～１５，０００ヌクレオチド、例えば、４０～１５，０００ヌクレオチド、１００～１２，０００ヌクレオチド、または２００～１０，０００ヌクレオチド長を有する、請求項３８から６３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項65】
前記ＲＮＡが、インビトロ転写ＲＮＡ、またはインビトロ転写ｍＲＮＡである、請求項３８から６４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項66】
前記ＵＶシグナル、適宜前記ＬＳシグナルを測定する工程がオンラインで実行され、かつ／または工程（ｃ）がオンラインで実行される、請求項３９から６５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項67】
前記試料組成物の少なくとも一部をフィールド－フローフラクショネーションに供する前に、前記試料組成物の前記少なくとも一部が、溶媒または溶媒混合液により希釈され、前記溶媒または前記溶媒混合液が、粒子の凝集体の形成を防止することができる、請求項３９から６６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項68】
前記溶媒混合液が、水および有機溶媒の混合液、または水とホルムアミドの混合液である、請求項６７に記載の使用。
【請求項69】
前記ＵＶシグナルを測定する工程が、ＣＤ分光法を用いることによって実行される、請求項３９から６８のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、一般に、核酸、例えばＲＮＡを分析する分野、特に、核酸、特にＲＮＡ、および適宜粒子を含む試料組成物の少なくとも１つのパラメーターの決定に関する。
【背景技術】
【0002】
標的細胞への外来性遺伝情報のデリバリーための組換え核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の使用は周知である。ＲＮＡを用いることの利点としては、一過的発現および非形質転換特性が挙げられる。ＲＮＡは、発現のために核に入る必要がなく、さらに、宿主ゲノムに組み込まれる可能性はなく、それによって、発癌などの多様な危険性が排除される。
【0003】
組換え核酸は、それを必要とする対象にネイキッド形態で投与することができるが、通常、組換え核酸は医薬組成物を使用して投与される。例えば、ＲＮＡは、ＲＮＡおよびナノ粒子形成媒体、例えば、陽イオン脂質、陽イオン脂質とヘルパー脂質の混合物、または陽イオンポリマーを含有する、いわゆるナノ粒子製剤によって送達することができる。
【0004】
そのようなナノ粒子製剤の運命は、多様な重要な因子（例えば、ナノ粒子中の核酸の完全性および濃度；遊離核酸の量；ナノ粒子のサイズ、サイズ分布、定量的サイズ分布および形態など）によって制御される。これらの因子は、例えば、分析され、特定されるべき特定の属性として、２０１８年からＦＤＡ「Liposome Drug Products Guidance」で言及されている。現在のナノ粒子製剤の臨床適用に対する制限は、均一で、純粋で、かつ十分に特徴付けられたナノ粒子製剤がないことにある可能性がある。これはまた、これらの因子を決定するための現行の技法の全てがいくつかの欠点を有するという事実にもよる。
【0005】
例えば、ナノ粒子中の核酸の完全性および／または濃度の決定のための現在の技法（例えば、色素、ゲル電気泳動、マイクロチャネル電気泳動またはキャピラリー電気泳動（ＣＥ）に基づく方法）は、大きな労働力を要し、費用がかかり、アーチファクトを引き起こす試料調製工程を利用し、十分な情報を提供することができず、および／または多数の試料を分析することができない。色素（例えば、蛍光色素）を用いる現在の一技法では、色素それ自体が差異を引き起こす可能性があり、これは、測定結果の信頼性に影響を及ぼす可能性がある。加えて、ゲル電気泳動に基づく技法の多くは、複数の洗浄工程、手順の長さを増す特別なランニングバッファの使用、および有毒な試薬の使用による特別な注意を必要とする。例えば、アガロースゲル技法は、複数のパラメーター［例えば、アガロースの品質、ゲルのキャスト、色素／感度（より多くの量の試料が必要とされる）、露出時間、生データの処理、およびデンシトメトリーソフトウェアによる標準化された評価（２８Ｓ／１８Ｓ方法）］の影響を受け、これらは、この技法を信頼できないものにする。マイクロチャネル、チップベース電気泳動またはキャピラリー電気泳動に基づく技法は、アガロースゲル電気泳動と比較して、実施時間をより速くし、データ品質を向上させるが、このシステムへのゲル、マーカーおよび試料のプライミングおよびローディングのためにハンズオン（ｈａｎｄｓ－ｏｎ）処理を必要とする。ＣＥ装置は、十分なＲＮＡ品質／定量分析に必要とされる感度、ダイナミックレンジ、および分離の質を欠く。
【0006】
さらに、ナノ粒子製剤を特徴付けるための重要な一課題は、製剤中に含有される粒子のサイズ分布の定量的決定にある。これは、特に、約５００ｎｍ未満、すなわち、大抵の医薬製品に適した範囲の直径を有する粒子に当てはまる。さらなる未だ対処されていない必要性が、サイズ分布が広いかまたは複雑である（特に、非対称である）、ナノ粒子製剤のサイズ分布の決定にある。ナノ粒子製剤の特徴付けに利用可能な既存の技法全ては、ある特定の欠点を有し、例えば、これらはサイズについての直接的な定量的情報を提供しないか、または小さな、適宜代表的でない、試料のサブセットのみを測定し、または異なるサイズ（もしくは他のパラメーター、例えば、バルク相に関して屈折率勾配）を有する粒子に対する感度が非常に異なり、これは、得られるサイズ分布に強く影響を及ぼす。
【0007】
より低いサブミクロン範囲（約、１００ｎｍ）の粒子のサイズ測定に関して、動的光散乱（ＤＬＳ）、ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）、電子顕微鏡（ＥＭ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）－ＵＶなどのいくつかの技法が存在する。
【0008】
ＤＬＳは、ストークス－アインシュタインの式を用いて流体力学半径、Ｒｈが算出される、ナノ粒子の拡散定数についての情報を提供する。しかし、ＤＬＳは、ある特定のアルゴリズムを用いて粒径が数的に算出される平均データしか提供しない。定量的に信頼できる数を得るために、ナノ粒子製剤は単峰性かつ単分散でなければならず、これは、ナノ粒子医薬製剤を含めて、多くの生成物に当てはまらない。ＤＬＳにおいて最も広く用いられているアルゴリズムは、いわゆる累積分析［D.E. Koppel, J. Chem. Phys. 57 (1972) 4814-4820］であり、これは、前提として、単峰性のサイズ分布のみを想定し、多分散度がある特定の閾値未満である場合のみ、物理的に意味のある数を提供する。ＤＬＳのための他のアルゴリズム（例えば、Provencher, S.W., Comput. Phys. Commun. 1982, 27, 229-242を参照されたい）は、サイズ曲線を提供し、これは、適合パラメーターに大いに依存し、いくつかの非常に異なるプロファイルが同じデータセットに対応する可能性がある。そのような分析は、大きな粒子に対する光散乱強度がより小さな粒子に対するものよりもはるかに高いという事実によって妨げられ、これによって、はるかに大きな粒子の存在下で、より小さな粒子の画分を決定することが難しくなる。
【0009】
ＮＴＡは、試料の非常に小さな（希釈された）サブセットからの散乱光を経時的に顕微鏡的に観察することによって、その拡散定数から粒子のサイズを決定する方法である。ＮＴＡは、原理上は、定量的サイズ分布プロファイルを提供することができるが、非常に希釈された試料しか測定することができず、粒子は比較的小さなサイズ範囲で存在しなければならず、すなわち、非常に小さな粒子は、はるかに大きな粒子の背景では決定することができず、これは、そのはるかに高い散乱強度が理由である。したがって、ＮＴＡは、医薬製剤について定量的サイズ分布を決定するための正式に適用可能な方法として適切ではない。さらに、ＮＴＡの統計学的標準偏差は、他の技法（例えば、ＤＬＳ）と比較して高い。これは、ＮＴＡによって分析された粒子の１～３桁低い量の直接的な結果である。特に、生物学的影響を有する限界量の粒子（例えば、凝集体）は過小評価される可能性があるか、またはＮＴＡで検出することさえできない。ＮＴＡは、正確な測定のための適切な設定を特定するために、いくつかの時間のかかる最適化工程（例えば、ビデオキャプチャーの設定、異なる試料希釈など）を必要とする。典型的には、ＮＴＡ測定のための試料は、１０～１０００倍の倍率で希釈されなければならず、これは、特に濃度依存的な粒子の凝集またはディスアセンブリーに関する問題を引き起こす可能性がある。これら全ての不利な点が理由で、ＮＴＡを品質管理方法として確立することは難しい。
【0010】
ＥＭは、個々の粒子のサイズ、形状および形態についての定量的情報を提供するが、分析することができる粒子の数はＮＴＡよりもさらに少ない。したがって、ＥＭは、測定される粒子が試料全体の代表でない可能性があるという意味で、ＮＴＡのものと同様または同一の不利な点を有する。この技法のさらなる主な欠点は、費用が高いこと、試料調製が複雑であること、および試料を分析するための所要時間が長いことである。これは、なぜＥＭがＧＭＰ方法として一般に用いられないかの理由である。ＥＭの別の問題は、試料の固定がアーティファクト（例えば、収縮、凝集など）を引き起こす可能性があることである。試料が固定されない（例えば、Ｃｒｙｏ－ＥＭ）場合、試料はコントラストが低い場合があり、分析されない可能性がある。
【0011】
ＳＥＣ－ＵＶのような他の分離技法は、カラムマトリックスとの相互作用が問題（例えば、溶出の吸収または遅延）を引き起こす可能性があるので、適用可能でない。ナノ粒子は、ＳＥＣカラムの限られたサイズ範囲が理由で、十分に分散されない可能性があり、またはナノ粒子は、凝集体から分離されない可能性がある。さらに、ＳＥＣ－ＵＶは、質量または粒子数が粒子サイズと直接的に相関があるという意味で、定量的サイズ分布を提供しない。分析用超遠心法（ＡＵＣ）などの他の分散的方法は、例えば沈降係数に基づくような間接的なサイズ測定しか可能にせず、この場合、サイズプロファイルを算出するために、いくつかの仮定が行われなければならない。加えて、ＡＵＣは費用がかかり、時間がかかり、かつこれは、正式の品質管理において一般的な方法ではない。したがって、ＡＵＣもまた、正式の品質管理方法として、定量的サイズプロファイルの決定に適していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
上記を考慮すると、ナノ粒子製剤の再現性のある品質を保証するために、粒子の詳細な特徴付けのための進歩した分析方法が必要とされる。特に、核酸（特に、ＲＮＡ）を含有するナノ粒子製剤を分析する改良方法が必要であり、前記方法は、好ましくは、（ｉ）製剤の特徴についての情報を提供する（例えば、製剤中に含有される粒子の定量的サイズ分布（特に、５００ｎｍ未満の直径を有する粒子に関して）；（ｉｉ）粒子組成物の特徴についての情報を提供する［例えば、粒子中に含有される核酸（特に、ＲＮＡ）の量、特に、粒子サイズの関数、例えば、粒子中に含有される核酸（特に、ＲＮＡ）の量対粒子形成化合物の比率として（特に、脂質および／もしくはポリマー、例えば、陽イオン脂質対陽イオンポリマー）の量として、特に、粒子サイズの関数として］；（ｉｉｉ）ＧＭＰ適合性である、（ｉｖ）色素の使用に依存しない；（ｖ）半自動式である；ならびに／または（ｖｉ）核酸（例えば、ＲＮＡ）および適宜粒子を含む組成物を調製および／もしくは保存する場合に、１つもしくは複数の反応条件［例えば、塩濃度；温度；ｐＨもしくはバッファ濃度；光／放射線；酸素；剪断力；圧力；凍結／解凍サイクル；乾燥／復元サイクル；賦形剤（例えば、スタビライザーおよび／もしくはキレート化剤）の添加；粒子形成化合物（特に、脂質および／もしくはポリマー）のタイプおよび／もしくは源；電荷比；ならびに／もしくは核酸（例えば、ＲＮＡ）対粒子形成化合物（特に、脂質および／もしくはポリマー）の比率］を変更する影響を分析するために用いることができる。好ましくは、前記方法は、以下のパラメーターの１つまたは複数に関するデータを提供する：核酸（例えば、ＲＮＡ）完全性；核酸（例えば、ＲＮＡ）の総量；遊離核酸（例えば、ＲＮＡ）の量；粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）の量；核酸（例えば、ＲＮＡ）含有粒子のサイズ［例えば、核酸（例えば、ＲＮＡ）含有粒子の回転半径（Ｒｇ）および／もしくは核酸（例えば、ＲＮＡ）含有粒子の流体力学半径（Ｒｈ）に基づく］；核酸（例えば、ＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布（例えば、ＲｇもしくはＲｈ値に基づく）；核酸（例えば、ＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布（例えば、ＲｇもしくはＲｈ値に基づく）；核酸（例えば、ＲＮＡ）の分子量；ならびに／または核酸（例えば、ＲＮＡ）含有粒子の形状（例えば、形状および／もしくは形態因子）。適宜、追加的なパラメーターは、以下の１つまたは複数を含むことができる：表面核酸の量（例えば、表面ＲＮＡの量）、封入核酸の量（例えば、封入ＲＮＡの量）、アクセス可能な核酸の量（例えば、アクセス可能なＲＮＡの量）、核酸（特に、ＲＮＡ）のサイズ（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）、核酸（特に、ＲＮＡ）のサイズ分布（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）、核酸（特に、ＲＮＡ）の定量的サイズ分布（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）、核酸（特に、ＲＮＡ）封入効率、粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）の量対粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の総量の比率、粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の正に荷電した部分の量対粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）の量の比率、ならびに粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の正に荷電した部分の量対粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）の負に荷電した部分の量の電荷比（Ｎ／Ｐ比）。
【0013】
本発明者らは、驚いたことに、本明細書に記載の方法および使用が上述の要件を満たすことを見出した。
【課題を解決するための手段】
【0014】
第１の態様において、本開示は、試料組成物の１つまたは複数のパラメーターを決定する方法であって、試料組成物は、核酸（例えばＲＮＡ）および適宜粒子を含み、方法は、
（ａ）試料組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーションに供することによって、試料組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の試料画分を生成する工程と；
（ｂ）工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、および屈折率（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｉｎｄｅｘ）（ＲＩ）シグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定し、かつ適宜光散乱（ＬＳ）シグナルを測定する工程と；
（ｃ）ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、かつ適宜ＬＳシグナルから、１つまたは複数のパラメーターを算出する工程と
を含み、
１つまたは複数のパラメーターは、核酸（例えばＲＮＡ）完全性、核酸（例えばＲＮＡ）の総量、遊離核酸（例えばＲＮＡ）の量、粒子に結合した核酸（例えばＲＮＡ）の量、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のサイズ［特に、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子の回転半径（Ｒｇ）および／または核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の流体力学半径（Ｒｈ）に基づく］、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布［例えば、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のＲｇ値またはＲｈ値に基づく］、および核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布［例えば、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のＲｇ値またはＲｈ値に基づく］を含む、方法を提供する。通常、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布および／または定量的サイズ分布は、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子の数、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のモル量、または核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子の質量として（各々、粒子のサイズの関数として）与えられ得る。必要に応じた追加的なパラメーターとして、核酸（とりわけＲＮＡ）の分子量、表面核酸の量（例えば表面ＲＮＡの量）、封入核酸の量（例えば封入ＲＮＡの量）、アクセス可能な核酸の量（例えばアクセス可能なＲＮＡの量）、核酸（とりわけＲＮＡ）のサイズ［特に、核酸（とりわけＲＮＡ）のＲｇ値および／またはＲｈ値に基づく］、核酸（とりわけＲＮＡ）のサイズ分布［例えば、核酸（とりわけＲＮＡ）のＲｇ値またはＲｈ値に基づく］、核酸（とりわけＲＮＡ）の定量的サイズ分布［例えば、核酸（とりわけＲＮＡ）のＲｇ値またはＲｈ値に基づく］、シェイプファクター、フォームファクター、および核酸（とりわけＲＮＡ）封入効率が挙げられる。通常、核酸（とりわけＲＮＡ）のサイズ分布および／または定量的サイズ分布は、核酸（とりわけＲＮＡ）分子の数、核酸（とりわけＲＮＡ）のモル量、または核酸（とりわけＲＮＡ）の質量として（各々、粒子のサイズの関数として）与えられ得る。さらに、必要に応じた追加的なパラメーターとして、粒子に結合した核酸（例えばＲＮＡ）の量の、粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の総量に対する比率であって、粒子サイズの関数として与えられ得る比率；粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の正に帯電する部分の量の、粒子に結合した核酸（例えばＲＮＡ）の量に対する比率であって、粒子サイズの関数として与えられ得る比率；および粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の正に帯電する部分の量の、粒子に結合した核酸（例えばＲＮＡ）の負に帯電する部分の量に対する電荷比であって、通常Ｎ／Ｐ比として表され、かつ粒子サイズの関数として与えられ得る電荷比が挙げられる。
（ａ）試料組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーションに供することによって、試料組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の試料画分を生成する工程と；
（ｂ）工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、および屈折率（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｉｎｄｅｘ）（ＲＩ）シグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定し、かつ適宜光散乱（ＬＳ）シグナルを測定する工程と；
（ｃ）ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、かつ適宜ＬＳシグナルから、１つまたは複数のパラメーターを算出する工程と
を含み、
１つまたは複数のパラメーターは、核酸（例えばＲＮＡ）完全性、核酸（例えばＲＮＡ）の総量、遊離核酸（例えばＲＮＡ）の量、粒子に結合した核酸（例えばＲＮＡ）の量、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のサイズ［特に、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子の回転半径（Ｒｇ）および／または核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の流体力学半径（Ｒｈ）に基づく］、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布［例えば、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のＲｇ値またはＲｈ値に基づく］、および核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布［例えば、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のＲｇ値またはＲｈ値に基づく］を含む、方法を提供する。通常、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布および／または定量的サイズ分布は、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子の数、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のモル量、または核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子の質量として（各々、粒子のサイズの関数として）与えられ得る。必要に応じた追加的なパラメーターとして、核酸（とりわけＲＮＡ）の分子量、表面核酸の量（例えば表面ＲＮＡの量）、封入核酸の量（例えば封入ＲＮＡの量）、アクセス可能な核酸の量（例えばアクセス可能なＲＮＡの量）、核酸（とりわけＲＮＡ）のサイズ［特に、核酸（とりわけＲＮＡ）のＲｇ値および／またはＲｈ値に基づく］、核酸（とりわけＲＮＡ）のサイズ分布［例えば、核酸（とりわけＲＮＡ）のＲｇ値またはＲｈ値に基づく］、核酸（とりわけＲＮＡ）の定量的サイズ分布［例えば、核酸（とりわけＲＮＡ）のＲｇ値またはＲｈ値に基づく］、シェイプファクター、フォームファクター、および核酸（とりわけＲＮＡ）封入効率が挙げられる。通常、核酸（とりわけＲＮＡ）のサイズ分布および／または定量的サイズ分布は、核酸（とりわけＲＮＡ）分子の数、核酸（とりわけＲＮＡ）のモル量、または核酸（とりわけＲＮＡ）の質量として（各々、粒子のサイズの関数として）与えられ得る。さらに、必要に応じた追加的なパラメーターとして、粒子に結合した核酸（例えばＲＮＡ）の量の、粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の総量に対する比率であって、粒子サイズの関数として与えられ得る比率；粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の正に帯電する部分の量の、粒子に結合した核酸（例えばＲＮＡ）の量に対する比率であって、粒子サイズの関数として与えられ得る比率；および粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の正に帯電する部分の量の、粒子に結合した核酸（例えばＲＮＡ）の負に帯電する部分の量に対する電荷比であって、通常Ｎ／Ｐ比として表され、かつ粒子サイズの関数として与えられ得る電荷比が挙げられる。
【0015】
第１の態様の第１のサブグループにおいて、方法は、
（ａ）試料組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーションに供することによって、試料組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の試料画分を生成する工程と；
（ｂ）工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナル、および適宜光散乱（ＬＳ）シグナルを測定する工程と；
（ｃ）ＵＶシグナルから、かつ適宜ＬＳシグナルから、１つまたは複数のパラメーターを算出する工程と
を含む。
（ａ）試料組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーションに供することによって、試料組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の試料画分を生成する工程と；
（ｂ）工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナル、および適宜光散乱（ＬＳ）シグナルを測定する工程と；
（ｃ）ＵＶシグナルから、かつ適宜ＬＳシグナルから、１つまたは複数のパラメーターを算出する工程と
を含む。
【0016】
第１の態様の第２の、かつ好ましいサブグループにおいて、方法は、試料組成物の１つまたは複数のパラメーターを決定するためにあり、試料組成物は、ＲＮＡ、および適宜粒子を含み、方法は、
（ａ）試料組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーションに供することによって、試料組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の試料画分を生成する工程と；
（ｂ）工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、および屈折率（ＲＩ）シグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定し、かつ適宜光散乱（ＬＳ）シグナルを測定する工程と；
（ｃ）ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、かつ適宜ＬＳシグナルから、１つまたは複数のパラメーターを算出する工程と
を含む。
（ａ）試料組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーションに供することによって、試料組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の試料画分を生成する工程と；
（ｂ）工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、および屈折率（ＲＩ）シグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定し、かつ適宜光散乱（ＬＳ）シグナルを測定する工程と；
（ｃ）ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、かつ適宜ＬＳシグナルから、１つまたは複数のパラメーターを算出する工程と
を含む。
【0017】
第１の態様の第３の、かつより好ましいサブグループにおいて、方法は、試料組成物の１つまたは複数のパラメーターを決定するためにあり、試料組成物は、ＲＮＡ、および適宜粒子を含み、方法は、
（ａ）試料組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーションに供することによって、試料組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の試料画分を生成する工程と；
（ｂ）工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナル、および適宜光散乱（ＬＳ）シグナルを測定する工程と；
（ｃ）ＵＶシグナルから、かつ適宜ＬＳシグナルから、１つまたは複数のパラメーターを算出する工程と
を含む。
（ａ）試料組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーションに供することによって、試料組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の試料画分を生成する工程と；
（ｂ）工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナル、および適宜光散乱（ＬＳ）シグナルを測定する工程と；
（ｃ）ＵＶシグナルから、かつ適宜ＬＳシグナルから、１つまたは複数のパラメーターを算出する工程と
を含む。
【0018】
第１の態様の一実施形態において（特に、第１の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布は、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のＲｇ値に基づいて算出される。第１の態様の別の実施形態において（特に、第１の態様の第１、第２、または第３のサブグループの別の実施形態において）、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布は、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のＲｈ値に基づいて算出される。第１の態様の別の実施形態において（特に、第１の態様の第１、第２、または第３のサブグループの別の実施形態において）、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布は、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のＲｇ値に基づいて、かつ別途、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のＲｈ値に基づいて算出される［すなわち、この実施形態は、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布についての２つのデータセットをもたらし、一方はＲｇ値に基づき、かつ一方はＲｈ値に基づく］。
【0019】
１つまたは複数のパラメーターが、核酸（例えばＲＮＡ）のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布を含む第１の態様の一実施形態において（特に、第１の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、核酸（例えばＲＮＡ）のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布は、核酸（例えばＲＮＡ）のＲｇ値に基づいて算出される。１つまたは複数のパラメーターが、核酸（例えばＲＮＡ）のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布を含む第１の態様の別の実施形態において（特に、第１の態様の第１、第２、または第３のサブグループの別の実施形態において）、核酸（例えばＲＮＡ）のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布は、核酸（例えばＲＮＡ）のＲｈ値に基づいて算出される。１つまたは複数のパラメーターが、核酸（例えばＲＮＡ）のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布を含む第１の態様の別の実施形態において（特に、第１の態様の第１、第２、または第３のサブグループの別の実施形態において）、核酸（例えばＲＮＡ）のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布は、核酸（例えばＲＮＡ）のＲｇ値に基づいて、かつ別途、核酸（例えばＲＮＡ）のＲｈ値に基づいて算出される［すなわち、この実施形態は、核酸（例えばＲＮＡ）のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布についての２つのデータセットをもたらし、一方はＲｇ値に基づき、かつ一方はＲｈ値に基づく］。
【0020】
第１の態様の一実施形態において（特に、第１の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、フィールド－フローフラクショネーションは好ましくは、フローフィールド－フローフラクショネーション、例えば非対称フローフィールド－フローフラクショネーション（ＡＦ４）またはホローファイバーフローフィールド－フローフラクショネーション（ＨＦ５）である。
【0021】
第１の態様の一実施形態において（特に、第１の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、工程（ａ）は、核酸（とりわけＲＮＡ）が透過するのを防止するのに適した分子量（ＭＷ）カットオフを有する膜、好ましくは２ｋＤａから３０ｋＤａの範囲内のＭＷカットオフ、例えば１０ｋＤａのＭＷカットオフを有する膜を用いて実行される。
【0022】
第１の態様の一実施形態において（特に、第１の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、工程（ａ）は、ポリエーテルスルホン（ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｓｕｌｆｏｎ）（ＰＥＳ）または再生セルロース膜を用いて実行される。
【0023】
第１の態様の一実施形態において（特に、第１の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、工程（ａ）は、（Ｉ）最大８ｍＬ／分、好ましくは最大４ｍＬ／分、より好ましくは最大２ｍＬ／分のクロスフローレート、例えばクロスフローレートプロファイル；および／または（ＩＩ）０．０５～０．３５ｍＬ／分の範囲内、好ましくは０．１０～０．３０ｍＬ／分の範囲内、より好ましくは０．１５～０．２５ｍＬ／分の範囲内のインジェクトフロー；および／または（ＩＩＩ）０．３０～０．７０ｍＬ／分の範囲内、好ましくは０．４０～０．６０ｍＬ／分の範囲内、より好ましくは０．４５～０．５５ｍＬ／分の範囲内の検出器フローを用いて実行される。
【0024】
第１の態様の一実施形態において（特に、第１の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、クロスフローレートプロファイルは、好ましくは、対照組成物または試料組成物中に含有される構成要素が、そのサイズによって分画／分離して、１つまたは複数の試料画分を生成することができるようにする分画相を含む。クロスフローレートは、この分画相の間に変化する［例えば、ある値（例えば、約１～約４ｍＬ／分）から始まってから、より低い値（例えば約０～約０．１ｍＬ／分）に低下するか、またはある値（例えば約０～約０．１ｍＬ／分）から始まってから、より高い値（例えば約１～約４ｍＬ／分）まで増大する］ことが好ましく、変化は何であってもよく、例えば、連続的な（例えば、線形であるか、または指数関数的な）変化であっても、段階的な変化であってもよい。好ましくは、クロスフローレートプロファイルは、分画相を含有し、クロスフローレートは、連続的に（好ましくは指数関数的に）変化して、ある値（例えば約１～約４ｍＬ／分）から始まってから、より低い値（例えば約０～約０．１ｍＬ／分）に低下する。分画相は、試料組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画／分離するのに適したあらゆる長さを有してよく、例えば約５分～約６０分、例えば、約１０分～約５０分、約１５分～約４５分、約２０分～約４０分、もしくは約２５分～約３５分、または約３０分である。クロスフローレートプロファイルは、追加的な相（例えば、１、２、３、または４相）を含有してもよく、これは、分画相の前、および／または後であり得（例えば、分画相の前に１相、および後に１、２、または３相）、かつこれは、試料組成物（例えば、タンパク質、ポリペプチド、モノヌクレオチドその他）中に含有される非核酸（とりわけ非ＲＮＡ）構成要素を、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）から分離して、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）に焦点を合わせ、かつ／またはフィールド－フローフラクショネーションデバイスを再生させるように（例えば、デバイスの膜に結合した全ての構成要素を除去するように）機能し得る。好ましくは、これらの追加的な相のクロスフローレートは、追加的な相毎に一定であり、かつ追加的な相毎の長さは、追加的な相毎に独立して、約５分～約６０分の範囲内にある（約１０分～約５０分、約１５分～約４５分、約２０分～約４０分、もしくは約２５分～約３５分、または約３０分）。例えば、クロスフローレートプロファイルは、（ｉ）分画相の前にある第１の追加的な相であって、前記第１の追加的な相のクロスフローレートは一定であり、分画相が始まる同じクロスフローレート（ｃｒｏｓｓ ｌｏｗ ｒａｔｅ）である、第１の追加的な相（第１の追加的な相の長さは、約５分～約６０分の範囲内にあってよく、例えば、約１０分～約５０分、約１５分～約４５分、約２０分～約４０分、もしくは約２５分～約３５分、または約１０分、もしくは約２０分、もしくは約３０分である）；（ｉｉ）分画相の後にある第２の追加的な相であって、前記第２の追加的な相のクロスフローレートは一定であり、分画相が終わる同じクロスフローレートである、第２の追加的な相（第２の追加的な相の長さは、約５分～約６０分の範囲内にあってよく、例えば、約１０分～約５０分、約１５分～約４５分、約２０分～約４０分、もしくは約２５分～約３５分、または約１０分、もしくは約２０分、もしくは約３０分である）；および適宜（ｉｉｉ）第２の追加的な相の後にある第３の追加的な相であって、前記第３の追加的な相のクロスフローレートは一定であり、かつ第２の追加的な相のクロスフローレートとは異なる、第３の追加的な相（第３の追加的な相の長さは、約５分～約６０分の範囲内にあってよく、例えば、約１０分～約５０分、約１５分～約４５分、約２０分～約４０分、もしくは約２５分～約３５分、または約１０分、もしくは約２０分、もしくは約３０分である）を含有してもよい。クロスフローレートプロファイルが分画相を含有し、クロスフローレートが連続的に（好ましくは指数関数的に）変化して、ある値（例えば約１～約４ｍＬ／分）から始まってから、より低い値（例えば約０～約０．１ｍＬ／分）に低下する実施形態において、クロスフローレートプロファイルはさらに、（ｉ）分画相の前にある第１の追加的な相であって、前記第１の追加的な相のクロスフローレートは一定であり、分画相が始まる同じクロスフローレート（例えば約１～約４ｍＬ／分）である、第１の追加的な相（第１の追加的な相の長さは、約５分～約３０分の範囲内にあってよく、例えば、約６分～約２５分、約７分～約２０分、もしくは約８分～約１５分、もしくは約１０分～約１２分、または約５分、もしくは約１０分、もしくは約１２分である）；（ｉｉ）分画相の後にある第２の追加的な相であって、前記第２の追加的な相のクロスフローレートは一定であり、分画相が終わる同じクロスフローレート（例えば約０．０１～約０．１ｍＬ／分）である、第２の追加的な相（第２の追加的な相の長さは、約５分～約６０分の範囲内にあってよく、例えば、約１０分～約５０分、約１５分～約４５分、約２０分～約４０分、もしくは約２５分～約３５分、または約３０分である）；および適宜（ｉｉｉ）第２の追加的な相の後にある第３の追加的な相であって、前記第３の追加的な相のクロスフローレートは一定であり、かつ第２の追加的な相のクロスフローレートよりも低い、第３の追加的な相（例えば、前記第３の追加的な相のクロスフローレートは０である）（第３の追加的な相の長さは、約５分～約３０分の範囲内にあってよく、例えば、約６分～約２５分、約７分～約２０分、もしくは約８分～約１５分、もしくは約１０分～約１２分、または約５分、もしくは約１０分、もしくは約１２分である）を含有することが好ましい。そのようなクロスフローレートプロファイルの好ましい例は、以下の通りである：１０分間の１．０～２．０ｍＬ／分、３０分以内の１．０～２．０ｍＬ／分から０．０１～０．０７ｍＬ／分への指数勾配；３０分間の０．０１～０．０７ｍＬ／分；および１０分間の０ｍＬ／分。
【0025】
第１の態様の一実施形態において（特に、第１の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性は、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を用いて算出される。
【0026】
第１の態様のこの実施形態の第１の特定の例において、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性は、以下の工程：
（ａ’）対照核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ’）工程（ａ’）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、および屈折率（ＲＩ）シグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定する工程と；
（ｃ’１）工程（ｂ’）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、１つのＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの最大高さからＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（対照）を得る工程と；
（ｃ’２）工程（ｂ’）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた１つのピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（対照）を得る工程と；
（ｃ’３）Ａ５０％（対照）とＡ１００％（対照）との比率を求めることによって、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性［Ｉ（対照）］を得る工程と
によって求められる。
（ａ’）対照核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ’）工程（ａ’）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、および屈折率（ＲＩ）シグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定する工程と；
（ｃ’１）工程（ｂ’）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、１つのＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの最大高さからＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（対照）を得る工程と；
（ｃ’２）工程（ｂ’）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた１つのピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（対照）を得る工程と；
（ｃ’３）Ａ５０％（対照）とＡ１００％（対照）との比率を求めることによって、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性［Ｉ（対照）］を得る工程と
によって求められる。
【0027】
この第１の例において、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性は、以下の工程：
（ｃ１）工程（ｂ）から得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた対照ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークに対応する試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの最大高さから試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（試料）を得る工程と；
（ｃ２）工程（ｂ）から得た試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩシグナルから、工程（ｃ１）において用いた試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（試料）を得る工程と；
（ｃ３）Ａ５０％（試料）とＡ１００％（試料）との比率を求めることによって、Ｉ（試料）を得る工程と；
（ｃ４）Ｉ（試料）とＩ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を得る工程と
によって算出され得る。
（ｃ１）工程（ｂ）から得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた対照ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークに対応する試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの最大高さから試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（試料）を得る工程と；
（ｃ２）工程（ｂ）から得た試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩシグナルから、工程（ｃ１）において用いた試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（試料）を得る工程と；
（ｃ３）Ａ５０％（試料）とＡ１００％（試料）との比率を求めることによって、Ｉ（試料）を得る工程と；
（ｃ４）Ｉ（試料）とＩ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を得る工程と
によって算出され得る。
【0028】
第１の態様のこの実施形態の第２の特定の例において、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性は、以下の工程：
（ａ”）対照核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ”）工程（ａ”）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定する工程と；
（ｃ”）工程（ｂ”）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、１つのＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの高さ［Ｈ（対照）］を求めることによって、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を得る工程と
によって求められる。
（ａ”）対照核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ”）工程（ａ”）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定する工程と；
（ｃ”）工程（ｂ”）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、１つのＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの高さ［Ｈ（対照）］を求めることによって、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を得る工程と
によって求められる。
【0029】
この第２の例において、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性は、以下の工程：
（ｃ１’）工程（ｂ）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、工程（ｃ”）において用いた対照ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークに対応する試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの高さ［Ｈ（試料）］を求める工程と；
（ｃ２’）Ｈ（試料）とＨ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を得る工程と
によって算出され得る。
（ｃ１’）工程（ｂ）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、工程（ｃ”）において用いた対照ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークに対応する試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの高さ［Ｈ（試料）］を求める工程と；
（ｃ２’）Ｈ（試料）とＨ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を得る工程と
によって算出され得る。
【0030】
第１の態様のこの実施形態の第３の特定の例（第１の態様の第１のサブグループに関する）において、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性は、以下の工程：
（ａ’）対照核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ’）工程（ａ’）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ’１）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの最大高さからＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（対照）を得る工程と；
（ｃ’２）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた１つのピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（対照）を得る工程と；
（ｃ’３）Ａ５０％（対照）とＡ１００％（対照）との比率を求めることによって、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性［Ｉ（対照）］を得る工程と
によって求められる。
（ａ’）対照核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ’）工程（ａ’）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ’１）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの最大高さからＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（対照）を得る工程と；
（ｃ’２）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた１つのピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（対照）を得る工程と；
（ｃ’３）Ａ５０％（対照）とＡ１００％（対照）との比率を求めることによって、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性［Ｉ（対照）］を得る工程と
によって求められる。
【0031】
この第３の例において、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性は、以下の工程：
（ｃ１）工程（ｂ）から得たＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの最大高さから試料ＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（試料）を得る工程と；
（ｃ２）工程（ｂ）から得た試料ＵＶシグナルから、工程（ｃ１）において用いた試料ＵＶピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（試料）を得る工程と；
（ｃ３）Ａ５０％（試料）とＡ１００％（試料）との比率を求めることによって、Ｉ（試料）を得る工程と；
（ｃ４）Ｉ（試料）とＩ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を得る工程と
によって算出され得る。
（ｃ１）工程（ｂ）から得たＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの最大高さから試料ＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（試料）を得る工程と；
（ｃ２）工程（ｂ）から得た試料ＵＶシグナルから、工程（ｃ１）において用いた試料ＵＶピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（試料）を得る工程と；
（ｃ３）Ａ５０％（試料）とＡ１００％（試料）との比率を求めることによって、Ｉ（試料）を得る工程と；
（ｃ４）Ｉ（試料）とＩ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を得る工程と
によって算出され得る。
【0032】
第１の態様のこの実施形態の第４の特定の例（第１の態様の第１のサブグループに関する）において、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性は、以下の工程：
（ａ”）対照核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ”）工程（ａ”）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ”）工程（ｂ”）において得たＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの高さ［Ｈ（対照）］を求めることによって、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を得る工程と
によって求められる。
（ａ”）対照核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ”）工程（ａ”）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ”）工程（ｂ”）において得たＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの高さ［Ｈ（対照）］を求めることによって、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を得る工程と
によって求められる。
【0033】
この第４の例において、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性は、以下の工程：
（ｃ１’）工程（ｂ）において得たＵＶシグナルから、工程（ｃ”）において用いた対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの高さ［Ｈ（試料）］を求める工程と；
（ｃ２’）Ｈ（試料）とＨ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を得る工程と
によって算出され得る。
（ｃ１’）工程（ｂ）において得たＵＶシグナルから、工程（ｃ”）において用いた対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの高さ［Ｈ（試料）］を求める工程と；
（ｃ２’）Ｈ（試料）とＨ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を得る工程と
によって算出され得る。
【0034】
第１の態様のこの実施形態の第５の特定の例（第１の態様の第２のサブグループに関する）において、対照ＲＮＡの完全性は、以下の工程：
（ａ’）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ’）工程（ａ’）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定する工程と；
（ｃ’１）工程（ｂ’）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、１つのＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの最大高さからＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（対照）を得る工程と；
（ｃ’２）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた１つのピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（対照）を得る工程と；
（ｃ’３）Ａ５０％（対照）とＡ１００％（対照）との比率を求めることによって、対照ＲＮＡの完全性［Ｉ（対照）］を得る工程と
によって求められる。
（ａ’）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ’）工程（ａ’）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定する工程と；
（ｃ’１）工程（ｂ’）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、１つのＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの最大高さからＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（対照）を得る工程と；
（ｃ’２）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた１つのピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（対照）を得る工程と；
（ｃ’３）Ａ５０％（対照）とＡ１００％（対照）との比率を求めることによって、対照ＲＮＡの完全性［Ｉ（対照）］を得る工程と
によって求められる。
【0035】
この第５の例において、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性は、以下の工程：
（ｃ１）工程（ｂ）から得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた対照ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークに対応する試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの最大高さから試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（試料）を得る工程と；
（ｃ２）工程（ｂ）から得た試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩシグナルから、工程（ｃ１）において用いた試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（試料）を得る工程と；
（ｃ３）Ａ５０％（試料）とＡ１００％（試料）との比率を求めることによって、Ｉ（試料）を得る工程と；
（ｃ４）Ｉ（試料）とＩ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出され得る。
（ｃ１）工程（ｂ）から得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた対照ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークに対応する試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの最大高さから試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（試料）を得る工程と；
（ｃ２）工程（ｂ）から得た試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩシグナルから、工程（ｃ１）において用いた試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（試料）を得る工程と；
（ｃ３）Ａ５０％（試料）とＡ１００％（試料）との比率を求めることによって、Ｉ（試料）を得る工程と；
（ｃ４）Ｉ（試料）とＩ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出され得る。
【0036】
第１の態様のこの実施形態の第６の特定の例（第１の態様の第２のサブグループに関する）において、対照ＲＮＡの完全性は、以下の工程：
（ａ”）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ”）工程（ａ”）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定する工程と；
（ｃ”）工程（ｂ”）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、１つのＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの高さ［Ｈ（対照）］を求めることによって、対照ＲＮＡの完全性を得る工程と
によって求められる。
（ａ”）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ”）工程（ａ”）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定する工程と；
（ｃ”）工程（ｂ”）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、１つのＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの高さ［Ｈ（対照）］を求めることによって、対照ＲＮＡの完全性を得る工程と
によって求められる。
【0037】
この第６の例において、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性は、以下の工程：
（ｃ１’）工程（ｂ）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、工程（ｃ”）において用いた対照ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークに対応する試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの高さ［Ｈ（試料）］を求める工程と；
（ｃ２’）Ｈ（試料）とＨ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出され得る。
（ｃ１’）工程（ｂ）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、工程（ｃ”）において用いた対照ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークに対応する試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの高さ［Ｈ（試料）］を求める工程と；
（ｃ２’）Ｈ（試料）とＨ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出され得る。
【0038】
第１の態様のこの実施形態の第７の特定の例（第１の態様の第３のサブグループに関する）において、対照ＲＮＡの完全性は、以下の工程：
（ａ’）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ’）工程（ａ’）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ’１）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの最大高さからＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（対照）を得る工程と；
（ｃ’２）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた１つのピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（対照）を得る工程と；
（ｃ’３）Ａ５０％（対照）とＡ１００％（対照）との比率を求めることによって、対照ＲＮＡの完全性［Ｉ（対照）］を得る工程と
によって求められる。
（ａ’）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ’）工程（ａ’）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ’１）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの最大高さからＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（対照）を得る工程と；
（ｃ’２）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた１つのピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（対照）を得る工程と；
（ｃ’３）Ａ５０％（対照）とＡ１００％（対照）との比率を求めることによって、対照ＲＮＡの完全性［Ｉ（対照）］を得る工程と
によって求められる。
【0039】
この第７の例において、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性は、以下の工程：
（ｃ１）工程（ｂ）から得たＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの最大高さから試料ＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（試料）を得る工程と；
（ｃ２）工程（ｂ）から得た試料ＵＶシグナルから、工程（ｃ１）において用いた試料ＵＶピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（試料）を得る工程と；
（ｃ３）Ａ５０％（試料）とＡ１００％（試料）との比率を求めることによって、Ｉ（試料）を得る工程と；
（ｃ４）Ｉ（試料）とＩ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出され得る。
（ｃ１）工程（ｂ）から得たＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの最大高さから試料ＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（試料）を得る工程と；
（ｃ２）工程（ｂ）から得た試料ＵＶシグナルから、工程（ｃ１）において用いた試料ＵＶピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（試料）を得る工程と；
（ｃ３）Ａ５０％（試料）とＡ１００％（試料）との比率を求めることによって、Ｉ（試料）を得る工程と；
（ｃ４）Ｉ（試料）とＩ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出され得る。
【0040】
第１の態様のこの実施形態の第８の特定の例（第１の態様の第３のサブグループに関する）において、対照ＲＮＡの完全性は、以下の工程：
（ａ”）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ”）工程（ａ”）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ”）工程（ｂ”）において得たＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの高さ［Ｈ（対照）］を求めることによって、対照ＲＮＡの完全性を得る工程と
によって求められる。
（ａ”）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ”）工程（ａ”）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ”）工程（ｂ”）において得たＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの高さ［Ｈ（対照）］を求めることによって、対照ＲＮＡの完全性を得る工程と
によって求められる。
【0041】
この第８の例において、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性は、以下の工程：
（ｃ１’）工程（ｂ）において得たＵＶシグナルから、工程（ｃ”）において用いた対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの高さ［Ｈ（試料）］を求める工程と；
（ｃ２’）Ｈ（試料）とＨ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出され得る。
（ｃ１’）工程（ｂ）において得たＵＶシグナルから、工程（ｃ”）において用いた対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの高さ［Ｈ（試料）］を求める工程と；
（ｃ２’）Ｈ（試料）とＨ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出され得る。
【0042】
第１の態様の一実施形態において（特に、第１の態様の第２または第３のサブグループの一実施形態において）、核酸（とりわけＲＮＡ）の量は、（ｉ）核酸減衰係数（とりわけＲＮＡ減衰係数）または（ｉｉ）核酸較正曲線（とりわけＲＮＡ較正曲線）を用いることによって求められる。
【0043】
第１の態様の一実施形態において（特に、第１の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、試料組成物は、核酸（とりわけＲＮＡ）、ならびに核酸（とりわけＲＮＡ）が結合している粒子、例えば、リポプレックス粒子および／または脂質ナノ粒子および／またはポリプレックス粒子および／またはリポポリプレックス粒子および／またはウイルス様粒子を含む。
【0044】
第１の態様の一実施形態において（特に、第１の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、総核酸の量（とりわけ総ＲＮＡの量）は、（ｉ）試料組成物の少なくとも一部を放出剤により処理する工程と；（ｉｉ）工程（ａ）～工程（ｃ）を、工程（ｉ）から得た少なくとも一部に実行する工程と；（ｉｉｉ）本明細書中に規定される核酸（とりわけＲＮＡ）の量を求める工程とによって［例えば、（ｉ）核酸減衰係数（とりわけＲＮＡ減衰係数）または（ｉｉ）核酸較正曲線（とりわけＲＮＡ較正曲線）を用いることによって］求められる。この実施形態において、第１の態様の方法の工程（ａ）において、フィールド－フローフラクショネーションは、好ましくは、放出剤を含有する液相を用いて実行される。
【0045】
第１の態様の一実施形態において（特に、第１の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、放出剤は、（ｉ）界面活性剤、例えば、陰イオン界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム）、双性イオン界面活性剤［例えばｎ－テトラデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホナート（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３－１４）］、陽イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、もしくはそれらの混合物；（ｉｉ）アルコール、例えば脂肪族アルコール（例えばエタノール）、もしくはアルコールの混合液；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組合せである。
【0046】
第１の態様の一実施形態において（特に、第１の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量は、放出剤の添加なしで、特にいかなる放出剤もなく、工程（ａ）～（ｃ）を実行することによって；および本明細書中に規定される核酸（とりわけＲＮＡ）の量を求めることによって［例えば、（ｉ）核酸減衰係数（とりわけＲＮＡ減衰係数）または（ｉｉ）核酸較正曲線（とりわけＲＮＡ較正曲線）を用いることによって］求められる。
【0047】
第１の態様の一実施形態において（特に、第１の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、粒子に結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量は、本明細書中で求められる［例えば、放出剤の添加なしで、特にいかなる放出剤もなく、工程（ａ）～（ｃ）を実行することによって；および本明細書中に規定される核酸（とりわけＲＮＡ）の量を求めることによって［例えば、（ｉ）核酸減衰係数（とりわけＲＮＡ減衰係数）または（ｉｉ）核酸較正曲線（とりわけＲＮＡ較正曲線）を用いることによって］］遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量を、本明細書中で求められる［例えば、（ｉ）試料組成物の少なくとも一部を放出剤により処理する工程と；（ｉｉ）工程（ａ）～工程（ｃ）を、工程（ｉ）から得た少なくとも一部に実行する工程と；（ｉｉｉ）本明細書中に規定される核酸（とりわけＲＮＡ）の量を求める工程とによって［例えば、（ｉ）核酸減衰係数（とりわけＲＮＡ減衰係数）または（ｉｉ）核酸較正曲線（とりわけＲＮＡ較正曲線）を用いることによって］］総核酸（とりわけＲＮＡ）の量から減算することによって求められる。
【0048】
第１の態様の一実施形態において（特に、第１の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、工程（ｂ）はさらに、工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つのＬＳシグナル、例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）シグナルおよび／または静的光散乱（ＳＬＳ）、例えば多角度光散乱（ＭＡＬＳ）シグナルを測定することを含む。
【0049】
第１の態様の一実施形態において（特に、第１の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズは、工程（ｂ）から得たＬＳシグナルから、回転半径（Ｒｇ）値および／または流体力学半径（Ｒｈ）値を算出することによって求められる。第１の態様の一実施形態において（特に、第１の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、工程（ｂ）は、工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの動的光散乱（ＤＬＳ）シグナルを測定することを含み、工程（ｃ）は、ＤＬＳシグナルからＲｈ値を算出することを含む。第１の態様の一実施形態において（特に、第１の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、工程（ｂ）は、工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの静的光散乱（ＳＬＳ）、例えばＭＡＬＳシグナルを測定することを含み、工程（ｃ）は、ＳＬＳシグナルからＲｇ値を算出することを含む。第１の態様の一実施形態において（特に、第１の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、工程（ｂ）は、工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの動的光散乱（ＤＬＳ）シグナルおよび静的光散乱（ＳＬＳ）、例えばＭＡＬＳシグナルを測定することを含み、工程（ｃ）は、Ｒｇ値およびＲｈ値を算出することを含む。この後者の実施形態は、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のサイズについての２つのデータセット、すなわち、Ｒｇ値に基づくもの、およびＲｈ値に基づくものをもたらす。
【0050】
第１の態様の一実施形態において（特に、第１の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布は、工程（ｂ）から得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを、本明細書中に規定されるように求めたＲｇ値またはＲｈ値に対してプロットすることによって［例えば、工程（ｂ）から得たＳＬＳシグナルからＲｇ値を算出することによって、または工程（ｂ）から得たＤＬＳシグナルからＲｈ値を算出することによって］求められる。この実施形態の第１の例（第１の態様の第１のサブグループに関する）において、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布は、工程（ｂ）から得たＵＶシグナルを、本明細書中に規定されるように求めたＲｇ値またはＲｈ値に対してプロットすることによって［例えば、工程（ｂ）から得たＳＬＳシグナルからＲｇ値を算出することによって、または工程（ｂ）から得たＤＬＳシグナルからＲｈ値を算出することによって］求められる。この実施形態の第２の例（第１の態様の第２のサブグループに関する）において、ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布は、工程（ｂ）から得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを、本明細書中に規定されるように求めたＲｇ値またはＲｈ値に対してプロットすることによって［例えば、工程（ｂ）から得たＳＬＳシグナルからＲｇ値を算出することによって、または工程（ｂ）から得たＤＬＳシグナルからＲｈ値を算出することによって］求められる。この実施形態の第３の例（第１の態様の第３のサブグループに関する）において、ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布は、工程（ｂ）から得たＵＶシグナルを、本明細書中に規定されるように求めたＲｇ値またはＲｈ値に対してプロットすることによって［例えば、工程（ｂ）から得たＳＬＳシグナルからＲｇ値を算出することによって、または工程（ｂ）から得たＤＬＳシグナルからＲｈ値を算出することによって］求められる。先の第１、第２、および第３の例の各々において、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布は、Ｒｇ値、Ｒｈ値、または双方に基づいて求められ得る。核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布は、Ｒｇ値およびＲｈ値に基づいて求められるならば、２つのデータセット、すなわち、Ｒｇ値に基づくサイズ分布およびＲｈ値に基づくサイズ分布をもたらす。
【0051】
第１の態様の一実施形態において（特に、第１の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布は、Ｒｇ値またはＲｈ値の関数としてＵＶ、蛍光、またはＲＩシグナルを示すプロットから、ＵＶ、蛍光、またはＲＩシグナルを累積重量分率に変換して、累積重量分率をＲｇ値またはＲｈ値に対してプロットすることによって算出される。この実施形態の第１の例（第１の態様の第１のサブグループに関する）において、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布は、Ｒｇ値またはＲｈ値の関数としてＵＶシグナルを示すプロットから、ＵＶシグナルを累積重量分率に変換して、累積重量分率をＲｇ値またはＲｈ値に対してプロットすることによって算出される。この実施形態の第２の例（第１の態様の第２のサブグループに関する）において、ＲＮＡ含有粒子の定量的サイズ分布は、Ｒｇ値またはＲｈ値の関数としてＵＶ、蛍光、またはＲＩシグナルを示すプロットから、ＵＶ、蛍光、またはＲＩシグナルを累積重量分率に変換して、累積重量分率をＲｇ値またはＲｈ値に対してプロットすることによって算出される。この実施形態の第３の例（第１の態様の第３のサブグループに関する）において、ＲＮＡ含有粒子の定量的サイズ分布は、Ｒｇ値またはＲｈ値の関数としてＵＶシグナルを示すプロットから、ＵＶシグナルを累積重量分率に変換して、累積重量分率をＲｇ値またはＲｈ値に対してプロットすることによって算出される。先の第１、第２、および第３の例の各々において、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布は、Ｒｇ値、Ｒｈ値、または双方に基づいて求められ得る。核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布は、Ｒｇ値およびＲｈ値に基づいて求められるならば、２つのデータセット、すなわち、Ｒｇ値に基づく定量的サイズ分布およびＲｈ値に基づく定量的サイズ分布をもたらす。
【0052】
第１の態様の一実施形態において（特に、第１の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、定量的サイズ分布は、Ｄ１０値、Ｄ５０値、および／またはＤ９０値（例えば、Ｒｇ値またはＲｈ値に基づく）を含む。核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布は、Ｒｇ値およびＲｈ値に基づいて求められるならば、２つのデータセット、すなわち、Ｒｇ値に基づくＤ１０値、Ｄ５０値、および／またはＤ９０値の１セット、ならびにＲｈ値に基づくＤ１０値、Ｄ５０値、および／またはＤ９０値の１セットをもたらす。
【0053】
第１の態様の一実施形態において（特に、第１の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、１つまたは複数のパラメーターは、本明細書中に規定される少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つのパラメーター（必要に応じた追加的なパラメーターを含む）、特に、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量、粒子に結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布［特に、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の回転半径（Ｒｇ）および／または核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の流体力学半径（Ｒｈ）に基づく］、および核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布（例えば、Ｒｇ値またはＲｈ値に基づく）からなる群から選択される少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つのパラメーターを含む（またはである）。核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布は、Ｒｇ値およびＲｈ値に基づいて求められるならば、２つのデータセット、すなわち、Ｒｇ値に基づくもの、およびＲｈ値に基づくものをもたらす。しかしながら、本発明に従えば、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布についてのこれらの２つのデータセットは、１つのパラメーターとして（２つのパラメーターとしてではない）しか考えない。また、フィールド－フローフラクショネーションによって得たフラクトグラムが複数の粒子ピークを示す場合、粒子ピーク毎に求められるサイズ分布は、１つのパラメーターとして（粒子ピーク毎の１つのパラメーターとしてではない）しか考えない。核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布がＲｇ値およびＲｈ値に基づいて求められる状況も同様である。
【0054】
第１の態様の一実施形態において（特に、第１の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において、特に、第１の態様の第３のサブグループの好ましい実施形態において）、１つまたは複数のパラメーターは、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布［例えば、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の回転半径（Ｒｇ）および／または核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の流体力学半径（Ｒｈ）に基づく］、および適宜、本明細書中で規定される残りのパラメーター（必要に応じた追加的なパラメーターを含む）の、少なくとも１つのパラメーター、例えば少なくとも２つのパラメーターを含む；好ましくは、残りのパラメーターは、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量、粒子に結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量、および核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布（例えば、Ｒｇ値またはＲｈ値に基づく）からなる群から選択される。第１の態様の一実施形態において（特に、第１の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において、特に、第１の態様の第３のサブグループの好ましい実施形態において）、１つまたは複数のパラメーターは、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布（例えば、Ｒｇ値またはＲｈ値に基づく）、ならびに、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量、粒子に結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量、および核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布（例えば、Ｒｇ値またはＲｈ値に基づく）からなる群から選択される少なくとも１つのパラメーター、例えば少なくとも２つのパラメーターを含む。第１の態様の一実施形態において（特に、第１の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において、特に、第１の態様の第３のサブグループの好ましい実施形態において）、１つまたは複数のパラメーターは、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布（例えば、Ｒｇ値またはＲｈ値に基づく）、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量、および粒子に結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量を含む。核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布は、Ｒｇ値およびＲｈ値に基づいて求められるならば、２つのデータセット、すなわち、Ｒｇ値に基づくもの、およびＲｈ値に基づくものをもたらす。しかしながら、本発明に従えば、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布についてのこれらの２つのデータセットは、１つのパラメーターとして（２つのパラメーターとしてではない）しか考えない。また、フィールド－フローフラクショネーションによって得たフラクトグラムが複数の粒子ピークを示す場合において、粒子ピーク毎に求められる定量的サイズ分布は、１つのパラメーターとして（粒子ピーク毎の１つのパラメーターとしてではない）しか考えない。核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布がＲｇ値およびＲｈ値に基づいて求められる状況も同様である。
【0055】
第１の態様の一実施形態において（特に、第１の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、核酸（とりわけＲＮＡ）、特に遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量は、ＵＶシグナルを、例えば２６０ｎｍ～２８０ｎｍの範囲内の波長にて、例えば２６０ｎｍまたは２８０ｎｍの波長にて測定し、かつ対応する波長（例えば、２６０ｎｍまたは２８０ｎｍ）での核酸（とりわけＲＮＡ）減衰係数を用いることによって求められる。
【0056】
第１の態様の一実施形態において（特に、第１の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において、特に、第１の態様の第３のサブグループの好ましい実施形態において）、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布（例えば、Ｒｇ値またはＲｈ値に基づく）および／または核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布（例えば、Ｒｇ値またはＲｈ値に基づく）は、１０～２０００ｎｍの範囲内、好ましくは２０～１５００ｎｍ、例えば、３０～１２００ｎｍ、４０～１１００ｎｍ、５０～１０００、６０～９００ｎｍ、７０～８００ｎｍ、８０～７００ｎｍ、９０～６００ｎｍ、もしくは１００～５００ｎｍの範囲内、または例えば、１０～１０００ｎｍ、１５～５００ｎｍ、２０～４５０ｎｍ、２５～４００ｎｍ、３０～３５０ｎｍ、４０～３００ｎｍ、もしくは５０～２５０ｎｍの範囲内である。第１の態様の第３のサブグループの好ましい実施形態において、ＲＮＡ含有粒子の（定量的）サイズ分布（例えば、Ｒｇ値またはＲｈ値に基づく）は、１０～１０００ｎｍの範囲内、例えば、１５～５００ｎｍ、２０～４５０ｎｍ、２５～４００ｎｍ、３０～３５０ｎｍ、４０～３００ｎｍ、または５０～２５０ｎｍの範囲内にある。
【0057】
第１の態様の一実施形態において（特に、第１の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、核酸（とりわけＲＮＡ）は、１０～１５，０００ヌクレオチド、例えば、４０～１５，０００ヌクレオチド、１００～１２，０００ヌクレオチド、または２００～１０，０００ヌクレオチド長を有する。
【0058】
第１の態様の一実施形態において（特に、第１の態様の第１のサブグループの一実施形態において）、核酸はＲＮＡである。この実施形態において、かつ第１の態様の第２または第３のサブグループの実施形態において、ＲＮＡは好ましくは、ｍＲＮＡまたはインビトロ転写ＲＮＡ、特にインビトロ転写ｍＲＮＡである。
【0059】
第１の態様の一実施形態において（特に、第１の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナル、適宜、ＬＳシグナル、例えばＳＬＳ、例えばＭＡＬＳシグナル、および／またはＤＬＳシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定することは、オンラインで実行され、かつ／または工程（ｃ）は、オンラインで実行される。
【0060】
第１の態様の一実施形態において（特に、第１の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、１つまたは複数のパラメーターは、工程（ａ）～（ｃ）の１サイクルにより決定される。
【0061】
第１の態様の一実施形態において（特に、第１の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、試料組成物の少なくとも一部をフィールド－フローフラクショネーションに供する前に、試料組成物の少なくとも一部は、溶媒または溶媒混合液により希釈され、前記溶媒または前記溶媒混合液は、粒子の凝集体の形成を防止することができる。一実施形態において、溶媒混合液は、水および有機溶媒、例えばホルムアミドの混合液である。
【0062】
第１の態様の一実施形態において（特に、第１の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、ＵＶシグナルを測定することは、円二色性（ＣＤ）分光法を用いることによって実行される。
【0063】
第２の態様において、本開示は、核酸（例えばＲＮＡ）および適宜粒子を含む組成物を用意する場合に、１つまたは複数の反応条件を変更する影響を分析する方法であって、
（Ａ）核酸（例えばＲＮＡ）および適宜粒子を含む第１の組成物を用意する工程と；
（Ｂ）核酸（例えばＲＮＡ）および適宜粒子を含む第２の組成物を用意する工程であって、第１の組成物を用意する工程と、１つまたは複数の反応条件のみが異なる、工程と；
（Ｃ）第１の組成物の一部を、第１の態様の方法に供することによって、第１の組成物の１つまたは複数のパラメーターを決定する工程と；
（Ｄ）第２の組成物の対応する一部を、工程（Ｃ）において用いた方法に供することによって、第２の組成物の１つまたは複数のパラメーターを決定する工程と；
（Ｅ）工程（Ｃ）において得た第１の組成物の１つまたは複数のパラメーターを、工程（Ｄ）において得た第２の組成物の対応する１つまたは複数のパラメーターと比較する工程と
を含む方法を提供する。
（Ａ）核酸（例えばＲＮＡ）および適宜粒子を含む第１の組成物を用意する工程と；
（Ｂ）核酸（例えばＲＮＡ）および適宜粒子を含む第２の組成物を用意する工程であって、第１の組成物を用意する工程と、１つまたは複数の反応条件のみが異なる、工程と；
（Ｃ）第１の組成物の一部を、第１の態様の方法に供することによって、第１の組成物の１つまたは複数のパラメーターを決定する工程と；
（Ｄ）第２の組成物の対応する一部を、工程（Ｃ）において用いた方法に供することによって、第２の組成物の１つまたは複数のパラメーターを決定する工程と；
（Ｅ）工程（Ｃ）において得た第１の組成物の１つまたは複数のパラメーターを、工程（Ｄ）において得た第２の組成物の対応する１つまたは複数のパラメーターと比較する工程と
を含む方法を提供する。
【0064】
第２の態様の一実施形態において、１つまたは複数のパラメーターは、核酸（例えばＲＮＡ）完全性、核酸（例えばＲＮＡ）の総量、遊離核酸（例えばＲＮＡ）の量、粒子に結合した核酸（例えばＲＮＡ）の量、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のサイズ［特に、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子の回転半径（Ｒｇ）および／または核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子の流体力学半径（Ｒｈ）に基づく］、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布［例えば、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のＲｇ値またはＲｈ値に基づく］、および核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布［例えば、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のＲｇ値またはＲｈ値に基づく］を含む。通常、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布および／または定量的サイズ分布は、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子の数、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のモル量、または核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子の質量として（各々、粒子のサイズの関数として）与えられ得る。必要に応じた追加的なパラメーターとして、核酸（とりわけＲＮＡ）の分子量、表面核酸の量（例えば表面ＲＮＡの量）、封入核酸の量（例えば封入ＲＮＡの量）、アクセス可能な核酸の量（例えばアクセス可能なＲＮＡの量）、核酸（とりわけＲＮＡ）のサイズ［特に、核酸（例えばＲＮＡ）のＲｇ値および／またはＲｈ値に基づく］、核酸（とりわけＲＮＡ）のサイズ分布［例えば、核酸（例えばＲＮＡ）のＲｇ値またはＲｈ値に基づく］、核酸（とりわけＲＮＡ）の定量的サイズ分布［例えば、核酸（例えばＲＮＡ）のＲｇ値またはＲｈ値に基づく］、シェイプファクター、フォームファクター、および核酸（とりわけＲＮＡ）封入効率が挙げられる。通常、核酸（とりわけＲＮＡ）のサイズ分布および／または定量的サイズ分布は、核酸（とりわけＲＮＡ）分子の数、核酸（とりわけＲＮＡ）のモル量、または核酸（とりわけＲＮＡ）の質量として（各々、粒子のサイズの関数として）与えられ得る。さらに、必要に応じた追加的なパラメーターとして、粒子に結合した核酸（例えばＲＮＡ）の量の、粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の総量に対する比率であって、粒子サイズの関数として与えられ得る比率；粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の正に帯電する部分の量の、粒子に結合した核酸（例えばＲＮＡ）の量に対する比率であって、粒子サイズの関数として与えられ得る比率；および粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の正に帯電する部分の量の、粒子に結合した核酸（例えばＲＮＡ）の負に帯電する部分の量に対する電荷比であって、通常Ｎ／Ｐ比として表され、かつ粒子サイズの関数として与えられ得る電荷比が挙げられる。
【0065】
第２の態様の一実施形態において、１つまたは複数のパラメーターは、本明細書中に規定される少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つのパラメーター（必要に応じた追加的なパラメーターを含む）、特に、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量、粒子に結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布［例えば、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のＲｇ値またはＲｈ値に基づく］、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布［例えば、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のＲｇ値またはＲｈ値に基づく］、および核酸（とりわけＲＮＡ）の分子量からなる群から選択される少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つのパラメーターを含む（またはである）。第２の態様の一実施形態において、１つまたは複数のパラメーターは、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量、粒子に結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布［例えば、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のＲｇ値またはＲｈ値に基づく］、および核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布［例えば、核酸（とりわけＲＮＡ）のＲｇ値またはＲｈ値に基づく］からなる群から選択される少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つのパラメーターを含む（またはである）。
【0066】
第２の態様の一実施形態において、工程（Ｃ）および（Ｄ）において用いられる第１の態様の方法は、
（ａ）組成物［例えば、工程（Ｃ）について第１の組成物または工程（Ｄ）について第２の組成物］の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーションに供することによって、組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の組成物画分を生成する工程と；
（ｂ）工程（ａ）から得た１つまたは複数の組成物画分の少なくとも１つの、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、および屈折率（ＲＩ）シグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定し、かつ適宜光散乱（ＬＳ）シグナルを測定する工程と；
（ｃ）ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、かつ適宜ＬＳシグナルから、１つまたは複数のパラメーターを算出する工程と
を含む方法である。
（ａ）組成物［例えば、工程（Ｃ）について第１の組成物または工程（Ｄ）について第２の組成物］の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーションに供することによって、組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の組成物画分を生成する工程と；
（ｂ）工程（ａ）から得た１つまたは複数の組成物画分の少なくとも１つの、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、および屈折率（ＲＩ）シグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定し、かつ適宜光散乱（ＬＳ）シグナルを測定する工程と；
（ｃ）ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、かつ適宜ＬＳシグナルから、１つまたは複数のパラメーターを算出する工程と
を含む方法である。
【0067】
第２の態様の第１のサブグループにおいて、工程（Ｃ）および（Ｄ）において用いられる第１の態様の方法は、
（ａ）組成物［例えば、工程（Ｃ）について第１の組成物または工程（Ｄ）について第２の組成物］の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーションに供することによって、組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の画分を生成する工程と；
（ｂ）工程（ａ）から得た１つまたは複数の画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナル、および適宜光散乱（ＬＳ）シグナルを測定する工程と；
（ｃ）ＵＶシグナルから、かつ適宜ＬＳシグナルから、１つまたは複数のパラメーターを算出する工程と
を含む方法である。
（ａ）組成物［例えば、工程（Ｃ）について第１の組成物または工程（Ｄ）について第２の組成物］の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーションに供することによって、組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の画分を生成する工程と；
（ｂ）工程（ａ）から得た１つまたは複数の画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナル、および適宜光散乱（ＬＳ）シグナルを測定する工程と；
（ｃ）ＵＶシグナルから、かつ適宜ＬＳシグナルから、１つまたは複数のパラメーターを算出する工程と
を含む方法である。
【0068】
第２の態様の第２の、かつ好ましいサブグループにおいて、工程（Ｃ）および（Ｄ）において用いられる第１の態様の方法は、試料組成物［例えば、工程（Ｃ）について第１の組成物または工程（Ｄ）について第２の組成物］の１つまたは複数のパラメーターを決定するための方法であり、試料組成物は、ＲＮＡ、および適宜粒子を含み、方法は、
（ａ）試料組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーションに供することによって、試料組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の試料画分を生成する工程と；
（ｂ）工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、および屈折率（ＲＩ）シグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定し、かつ適宜光散乱（ＬＳ）シグナルを測定する工程と；
（ｃ）ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、かつ適宜ＬＳシグナルから、１つまたは複数のパラメーターを算出する工程と
を含む。
（ａ）試料組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーションに供することによって、試料組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の試料画分を生成する工程と；
（ｂ）工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、および屈折率（ＲＩ）シグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定し、かつ適宜光散乱（ＬＳ）シグナルを測定する工程と；
（ｃ）ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、かつ適宜ＬＳシグナルから、１つまたは複数のパラメーターを算出する工程と
を含む。
【0069】
第２の態様の第３の、かつより好ましいサブグループにおいて、工程（Ｃ）および（Ｄ）において用いられる第１の態様の方法は、試料組成物［例えば、工程（Ｃ）について第１の組成物または工程（Ｄ）について第２の組成物］の１つまたは複数のパラメーターを決定するための方法であり、試料組成物は、ＲＮＡ、および適宜粒子を含み、方法は、
（ａ）試料組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーションに供することによって、試料組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の試料画分を生成する工程と；
（ｂ）工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナル、および適宜光散乱（ＬＳ）シグナルを測定する工程と；
（ｃ）ＵＶシグナルから、かつ適宜ＬＳシグナルから、１つまたは複数のパラメーターを算出する工程と
を含む。
（ａ）試料組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーションに供することによって、試料組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の試料画分を生成する工程と；
（ｂ）工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナル、および適宜光散乱（ＬＳ）シグナルを測定する工程と；
（ｃ）ＵＶシグナルから、かつ適宜ＬＳシグナルから、１つまたは複数のパラメーターを算出する工程と
を含む。
【0070】
第２の態様の一実施形態において（特に、第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布は、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のＲｇ値に基づいて算出される。第２の態様の別の実施形態において（特に、第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの別の実施形態において）、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布は、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のＲｈ値に基づいて算出される。第２の態様の別の実施形態において（特に、第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの別の実施形態において）、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布は、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のＲｇ値に基づいて、かつ別途、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のＲｈ値に基づいて算出される［すなわち、この実施形態は、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布についての２つのデータセットをもたらし、一方はＲｇ値に基づき、かつ一方はＲｈ値に基づく］。
【0071】
１つまたは複数のパラメーターが、核酸（例えばＲＮＡ）のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布を含む第２の態様の一実施形態において（特に、第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、核酸（例えばＲＮＡ）のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布は、核酸（例えばＲＮＡ）のＲｇ値に基づいて算出される。１つまたは複数のパラメーターが、核酸（例えばＲＮＡ）のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布を含む第２の態様の別の実施形態において（特に、第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの別の実施形態において）、核酸（例えばＲＮＡ）のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布は、核酸（例えばＲＮＡ）のＲｈ値に基づいて算出される。１つまたは複数のパラメーターが、核酸（例えばＲＮＡ）のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布を含む第２の態様の別の実施形態において（特に、第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの別の実施形態において）、核酸（例えばＲＮＡ）のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布は、核酸（例えばＲＮＡ）のＲｇ値に基づいて、かつ別途、核酸（例えばＲＮＡ）のＲｈ値に基づいて算出される［すなわち、この実施形態は、核酸（例えばＲＮＡ）のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布についての２つのデータセットをもたらし、一方はＲｇ値に基づき、かつ一方はＲｈ値に基づく］。
【0072】
第２の態様の一実施形態において（特に、第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、１つまたは複数のパラメーターは、核酸（とりわけＲＮＡ）完全性、核酸（とりわけＲＮＡ）の総量、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量、粒子に結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ［特に、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の回転半径（Ｒｇ）および／または核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の流体力学半径（Ｒｈ）に基づく］、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布（例えば、Ｒｇ値またはＲｈ値に基づく）、および核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布（例えば、Ｒｇ値またはＲｈ値に基づく）、ならびに適宜核酸（とりわけＲＮＡ）の分子量を含む。
【0073】
第２の態様の一実施形態において（特に、第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、１つまたは複数のパラメーターは、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量、粒子に結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布［例えば、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のＲｇ値またはＲｈ値に基づく］、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布［例えば、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のＲｇ値またはＲｈ値に基づく］、および核酸（とりわけＲＮＡ）の分子量からなる群から選択される少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つのパラメーターを含む（またはである）。第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において、１つまたは複数のパラメーターは、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量、粒子に結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布［例えば、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のＲｇ値またはＲｈ値に基づく］、および核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布［例えば、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のＲｇ値またはＲｈ値に基づく］からなる群から選択される少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つのパラメーターを含む（またはである）。核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布は、Ｒｇ値およびＲｈ値に基づいて求められるならば、２つのデータセット、すなわち、Ｒｇ値に基づくもの、およびＲｈ値に基づくものをもたらす。しかしながら、本発明に従えば、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布についてのこれらの２つのデータセットは、１つのパラメーターとして（２つのパラメーターとしてではない）しか考えない。また、フィールド－フローフラクショネーションによって得たフラクトグラムが複数の粒子ピークを示す場合、粒子ピーク毎に求められるサイズ分布は、１つのパラメーターとして（粒子ピーク毎の１つのパラメーターとしてではない）しか考えない。核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布がＲｇ値およびＲｈ値に基づいて求められる状況も同様である。
【0074】
第２の態様の一実施形態において（特に、第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において、特に、第２の態様の第３のサブグループの好ましい実施形態において）、１つまたは複数のパラメーターは、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布［例えば、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の回転半径（Ｒｇ）および／または核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の流体力学半径（Ｒｈ）に基づく］、および適宜、本明細書中で規定される残りのパラメーター（必要に応じた追加的なパラメーターを含む）の、少なくとも１つのパラメーター、例えば少なくとも２つのパラメーターを含む；好ましくは、残りのパラメーターは、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量、粒子に結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量、および核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布（例えば、Ｒｇ値またはＲｈ値に基づく）からなる群から選択される。第２の態様の一実施形態において（特に、第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において、特に、第２の態様の第３のサブグループの好ましい実施形態において）、１つまたは複数のパラメーターは、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布（例えば、Ｒｇ値またはＲｈ値に基づく）、ならびに、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量、粒子に結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量、および核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布（例えば、Ｒｇ値またはＲｈ値に基づく）からなる群から選択される少なくとも１つのパラメーター、例えば少なくとも２つのパラメーターを含む。第２の態様の一実施形態において（特に、第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において、特に、第２の態様の第３のサブグループの好ましい実施形態において）、１つまたは複数のパラメーターは、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布（例えば、Ｒｇ値またはＲｈ値に基づく）、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量、および粒子に結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量を含む。核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布は、Ｒｇ値およびＲｈ値に基づいて求められるならば、２つのデータセット、すなわち、Ｒｇ値に基づくもの、およびＲｈ値に基づくものをもたらす。しかしながら、本発明に従えば、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布についてのこれらの２つのデータセットは、１つのパラメーターとして（２つのパラメーターとしてではない）しか考えない。また、フィールド－フローフラクショネーションによって得たフラクトグラムが複数の粒子ピークを示す場合において、粒子ピーク毎に求められる定量的サイズ分布は、１つのパラメーターとして（粒子ピーク毎の１つのパラメーターとしてではない）しか考えない。核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布がＲｇ値およびＲｈ値に基づいて求められる状況も同様である。
【0075】
第２の態様の一実施形態において（特に、第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、１つまたは複数のパラメーターは、工程（ａ）～（ｃ）の１サイクルにより決定される。
【0076】
第２の態様の一実施形態において（特に、第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、１つまたは複数の反応条件は、塩濃度／イオン強度；温度；ｐＨまたはバッファ濃度；光／放射線；酸素；剪断力；圧力；凍結／解凍サイクル；乾燥／復元サイクル；賦形剤（例えば、スタビライザーおよび／またはキレート化剤）の添加；粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）のタイプおよび／または源；電荷比；物理的状態；ならびに核酸（とりわけＲＮＡ）の、粒子形成化合物（特に、粒子を構成する脂質および／またはポリマー）に対する比率のいずれかを含む。例示的な塩濃度として、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｍＭの塩、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｍＭ ＮａＣｌが挙げられる。例示的な温度条件として、低温（例えば－２０℃）、周囲温度もしくは室温、中温（例えば３０℃）、または高温（例えば５０℃）が挙げられる。粒子形成化合物のタイプおよび／または源に関する例示的な条件として、陽イオン脂質対陽イオンポリマー、陽イオン脂質対双性イオン脂質、またはペグ化脂質対非ペグ化脂質がある。核酸（とりわけＲＮＡ）粒子における陽電荷の、陰電荷に対する例示的な電荷比は、約６：１～約１：２、例えば、約５：１～約１．２：２、約４：１～約１．４：２、約３：１～約１．６：２、約２：１～約１．８：２、または約１．６：１～約１：１である。核酸（とりわけＲＮＡ）の、粒子形成化合物（特に、粒子を構成する脂質および／またはポリマー）に対する例示的な比率として、約１：１００～約１０：１（ｗ／ｗ）の範囲内の、核酸（とりわけＲＮＡ）の、総脂質に対する比率が挙げられる。
【0077】
第２の態様の一実施形態において（特に、第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、フィールド－フローフラクショネーションは、好ましくは、フローフィールド－フローフラクショネーション、例えば、非対称フローフィールド－フローフラクショネーション（ＡＦ４）またはホローファイバーフローフィールド－フローフラクショネーション（ＨＦ５）である。
【0078】
第２の態様の一実施形態において（特に、第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、工程（ａ）は、核酸（とりわけＲＮＡ）が透過するのを防止するのに適した分子量（ＭＷ）カットオフを有する膜、好ましくは２ｋＤａから３０ｋＤａの範囲内のＭＷカットオフ、例えば１０ｋＤａのＭＷカットオフを有する膜を用いて実行される。
【0079】
第２の態様の一実施形態において（特に、第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、工程（ａ）は、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）または再生セルロース膜を用いて実行される。
【0080】
第２の態様の一実施形態において（特に、第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、工程（ａ）は、（Ｉ）最大８ｍＬ／分、好ましくは最大４ｍＬ／分、より好ましくは最大２ｍＬ／分のクロスフローレート、例えばクロスフローレートプロファイル；および／または（ＩＩ）０．０５～０．３５ｍＬ／分の範囲内、好ましくは０．１０～０．３０ｍＬ／分の範囲内、より好ましくは０．１５～０．２５ｍＬ／分の範囲内のインジェクトフロー；および／または（ＩＩＩ）０．３０～０．７０ｍＬ／分の範囲内、好ましくは０．４０～０．６０ｍＬ／分の範囲内、より好ましくは０．４５～０．５５ｍＬ／分の範囲内の検出器フローを用いて実行される。
【0081】
第２の態様の一実施形態において（特に、第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、クロスフローレートプロファイルは、好ましくは、組成物（例えば、対照組成物または試料組成物、特に工程（Ｃ）について第１の組成物または工程（Ｄ）について第２の組成物）中に含有される構成要素が、そのサイズによって分画／分離して、１つまたは複数の組成物画分を生成することができるようにする分画相を含有する。クロスフローレートは、この分画相の間に変化する［例えば、ある値（例えば、約１～約４ｍＬ／分）から始まってから、より低い値（例えば約０～約０．１ｍＬ／分）に低下するか、またはある値（例えば約０～約０．１ｍＬ／分）から始まってから、より高い値（例えば約１～約４ｍＬ／分）まで増大する］ことが好ましく、変化は何であってもよく、例えば、連続的な（例えば、線形であるか、または指数関数的な）変化であっても、段階的な変化であってもよい。好ましくは、クロスフローレートプロファイルは、分画相を含有し、クロスフローレートは、連続的に（好ましくは指数関数的に）変化して、ある値（例えば約１～約４ｍＬ／分）から始まってから、より低い値（例えば約０～約０．１ｍＬ／分）に低下する。分画相は、組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画／分離するのに適したあらゆる長さを有してよく、例えば約５分～約６０分、例えば、約１０分～約５０分、約１５分～約４５分、約２０分～約４０分、もしくは約２５分～約３５分、または約３０分である。クロスフローレートプロファイルは、追加的な相（例えば、１、２、３、または４相）を含有してもよく、これは、分画相の前、および／または後であり得（例えば、分画相の前に１相、および後に１、２、または３相）、かつこれは、組成物（例えば、タンパク質、ポリペプチド、モノヌクレオチドその他）中に含有される非核酸（とりわけ非ＲＮＡ）構成要素を、組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）から分離して、組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）に焦点を合わせ、かつ／またはフィールド－フローフラクショネーション装置を再生させるように（例えば、装置の膜に結合した全ての構成要素を除去するように）機能し得る。好ましくは、これらの追加的な相のクロスフローレートは、追加的な相毎に一定であり、かつ追加的な相毎の長さは、追加的な相毎に独立して、約５分～約６０分の範囲内にある（約１０分～約５０分、約１５分～約４５分、約２０分～約４０分、もしくは約２５分～約３５分、または約３０分）。例えば、クロスフローレートプロファイルは、（ｉ）分画相の前にある第１の追加的な相であって、前記第１の追加的な相のクロスフローレートは一定であり、かつ分画相が始まるクロスフローレートである、第１の追加的な相（第１の追加的な相の長さは、約５分～約６０分の範囲内にあってよく、例えば、約１０分～約５０分、約１５分～約４５分、約２０分～約４０分、もしくは約２５分～約３５分、または約１０分、もしくは約２０分、もしくは約３０分である）；（ｉｉ）分画相の後にある第２の追加的な相であって、前記第２の追加的な相のクロスフローレートは一定であり、かつ分画相が終わるクロスフローレートである、第２の追加的な相（第２の追加的な相の長さは、約５分～約６０分の範囲内にあってよく、例えば、約１０分～約５０分、約１５分～約４５分、約２０分～約４０分、もしくは約２５分～約３５分、または約１０分、もしくは約２０分、もしくは約３０分である）；および適宜（ｉｉｉ）第２の追加的な相の後にある第３の追加的な相であって、前記第３の追加的な相のクロスフローレートは一定であり、かつ第２の追加的な相のクロスフローレートとは異なる、第３の追加的な相（第３の追加的な相の長さは、約５分～約６０分の範囲内にあってよく、例えば、約１０分～約５０分、約１５分～約４５分、約２０分～約４０分、もしくは約２５分～約３５分、または約１０分、もしくは約２０分、もしくは約３０分である）を含有してもよい。クロスフローレートプロファイルが分画相を含有し、クロスフローレートが連続的に（好ましくは指数関数的に）変化して、ある値（例えば約１～約４ｍＬ／分）から始まってから、より低い値（例えば約０～約０．１ｍＬ／分）に低下する実施形態において、クロスフローレートプロファイルはさらに、（ｉ）分画相の前にある第１の追加的な相であって、前記第１の追加的な相のクロスフローレートは一定であり、かつ分画相が始まるクロスフローレート（例えば約１～約４ｍＬ／分）である、第１の追加的な相（第１の追加的な相の長さは、約５分～約３０分の範囲内にあってよく、例えば、約６分～約２５分、約７分～約２０分、もしくは約８分～約１５分、もしくは約１０分～約１２分、または約５分、もしくは約１０分、もしくは約１２分である）；（ｉｉ）分画相の後にある第２の追加的な相であって、前記第２の追加的な相のクロスフローレートは一定であり、かつ分画相が終わるクロスフローレート（例えば約０．０１～約０．１ｍＬ／分）である、第２の追加的な相（第２の追加的な相の長さは、約５分～約６０分の範囲内にあってよく、例えば、約１０分～約５０分、約１５分～約４５分、約２０分～約４０分、もしくは約２５分～約３５分、または約３０分である）；および適宜（ｉｉｉ）第２の追加的な相の後にある第３の追加的な相であって、前記第３の追加的な相のクロスフローレートは一定であり、かつ第２の追加的な相のクロスフローレートよりも低い、第３の追加的な相（例えば、前記第３の追加的な相のクロスフローレートは０である）（第３の追加的な相の長さは、約５分～約３０分の範囲内にあってよく、例えば、約６分～約２５分、約７分～約２０分、もしくは約８分～約１５分、もしくは約１０分～約１２分、または約５分、もしくは約１０分、もしくは約１２分である）を含有することが好ましい。そのようなクロスフローレートプロファイルの好ましい例は、以下の通りである：１０分間の１．０～２．０ｍＬ／分、３０分以内の１．０～２．０ｍＬ／分から０．０１～０．０７ｍＬ／分への指数勾配；３０分間の０．０１～０．０７ｍＬ／分；および１０分間の０ｍＬ／分。
【0082】
第２の態様の一実施形態において（特に、第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、試料組成物［例えば、工程（Ｃ）について第１の組成物または工程（Ｄ）について第２の組成物］中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性は、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を用いて算出される。
【0083】
第２の態様のこの実施形態の第１の特定の例において、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性は、以下の工程：
（ａ’）対照核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ’）工程（ａ’）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、および屈折率（ＲＩ）シグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定する工程と；
（ｃ’１）工程（ｂ’）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、１つのＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの最大高さからＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（対照）を得る工程と；
（ｃ’２）工程（ｂ’）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた１つのピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（対照）を得る工程と；
（ｃ’３）Ａ５０％（対照）とＡ１００％（対照）との比率を求めることによって、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性［Ｉ（対照）］を得る工程と
によって求められる。
（ａ’）対照核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ’）工程（ａ’）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、および屈折率（ＲＩ）シグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定する工程と；
（ｃ’１）工程（ｂ’）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、１つのＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの最大高さからＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（対照）を得る工程と；
（ｃ’２）工程（ｂ’）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた１つのピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（対照）を得る工程と；
（ｃ’３）Ａ５０％（対照）とＡ１００％（対照）との比率を求めることによって、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性［Ｉ（対照）］を得る工程と
によって求められる。
【0084】
この第１の例において、試料組成物［例えば、工程（Ｃ）について第１の組成物または工程（Ｄ）について第２の組成物］中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性は、以下の工程：
（ｃ１）工程（ｂ）から得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた対照ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークに対応する試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの最大高さから試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（試料）を得る工程と；
（ｃ２）工程（ｂ）から得た試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩシグナルから、工程（ｃ１）において用いた試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（試料）を得る工程と；
（ｃ３）Ａ５０％（試料）とＡ１００％（試料）との比率を求めることによって、Ｉ（試料）を得る工程と；
（ｃ４）Ｉ（試料）とＩ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を得る工程と
によって算出され得る。
（ｃ１）工程（ｂ）から得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた対照ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークに対応する試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの最大高さから試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（試料）を得る工程と；
（ｃ２）工程（ｂ）から得た試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩシグナルから、工程（ｃ１）において用いた試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（試料）を得る工程と；
（ｃ３）Ａ５０％（試料）とＡ１００％（試料）との比率を求めることによって、Ｉ（試料）を得る工程と；
（ｃ４）Ｉ（試料）とＩ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を得る工程と
によって算出され得る。
【0085】
第２の態様のこの実施形態の第２の特定の例において、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性は、以下の工程：
（ａ”）対照核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ”）工程（ａ”）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定する工程と；
（ｃ”）工程（ｂ”）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、１つのＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの高さ［Ｈ（対照）］を求めることによって、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を得る工程と
によって求められる。
（ａ”）対照核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ”）工程（ａ”）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定する工程と；
（ｃ”）工程（ｂ”）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、１つのＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの高さ［Ｈ（対照）］を求めることによって、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を得る工程と
によって求められる。
【0086】
この第２の例において、試料組成物［例えば、工程（Ｃ）について第１の組成物または工程（Ｄ）について第２の組成物］中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性は、以下の工程：
（ｃ１’）工程（ｂ）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、工程（ｃ”）において用いた対照ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークに対応する試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの高さ［Ｈ（試料）］を求める工程と；
（ｃ２’）Ｈ（試料）とＨ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を得る工程と
によって算出され得る。
（ｃ１’）工程（ｂ）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、工程（ｃ”）において用いた対照ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークに対応する試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの高さ［Ｈ（試料）］を求める工程と；
（ｃ２’）Ｈ（試料）とＨ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を得る工程と
によって算出され得る。
【0087】
第２の態様のこの実施形態の第３の特定の例（第２の態様の第１のサブグループに関する）において、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性は、以下の工程：
（ａ’）対照核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ’）工程（ａ’）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ’１）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの最大高さからＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（対照）を得る工程と；
（ｃ’２）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた１つのピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（対照）を得る工程と；
（ｃ’３）Ａ５０％（対照）とＡ１００％（対照）との比率を求めることによって、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性［Ｉ（対照）］を得る工程と
によって求められる。
（ａ’）対照核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ’）工程（ａ’）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ’１）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの最大高さからＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（対照）を得る工程と；
（ｃ’２）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた１つのピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（対照）を得る工程と；
（ｃ’３）Ａ５０％（対照）とＡ１００％（対照）との比率を求めることによって、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性［Ｉ（対照）］を得る工程と
によって求められる。
【0088】
この第３の例において、試料組成物［例えば、工程（Ｃ）について第１の組成物または工程（Ｄ）について第２の組成物］中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性は、以下の工程：
（ｃ１）工程（ｂ）から得たＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの最大高さから試料ＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（試料）を得る工程と；
（ｃ２）工程（ｂ）から得た試料ＵＶシグナルから、工程（ｃ１）において用いた試料ＵＶピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（試料）を得る工程と；
（ｃ３）Ａ５０％（試料）とＡ１００％（試料）との比率を求めることによって、Ｉ（試料）を得る工程と；
（ｃ４）Ｉ（試料）とＩ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を得る工程と
によって算出され得る。
（ｃ１）工程（ｂ）から得たＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの最大高さから試料ＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（試料）を得る工程と；
（ｃ２）工程（ｂ）から得た試料ＵＶシグナルから、工程（ｃ１）において用いた試料ＵＶピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（試料）を得る工程と；
（ｃ３）Ａ５０％（試料）とＡ１００％（試料）との比率を求めることによって、Ｉ（試料）を得る工程と；
（ｃ４）Ｉ（試料）とＩ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を得る工程と
によって算出され得る。
【0089】
第２の態様のこの実施形態の第４の特定の例（第２の態様の第１のサブグループに関する）において、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性は、以下の工程：
（ａ”）対照核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ”）工程（ａ”）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ”）工程（ｂ”）において得たＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの高さ［Ｈ（対照）］を求めることによって、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を得る工程と
によって求められる。
（ａ”）対照核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ”）工程（ａ”）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ”）工程（ｂ”）において得たＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの高さ［Ｈ（対照）］を求めることによって、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を得る工程と
によって求められる。
【0090】
この第４の例において、試料組成物［例えば、工程（Ｃ）について第１の組成物または工程（Ｄ）について第２の組成物］中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性は、以下の工程：
（ｃ１’）工程（ｂ）において得たＵＶシグナルから、工程（ｃ”）において用いた対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの高さ［Ｈ（試料）］を求める工程と；
（ｃ２’）Ｈ（試料）とＨ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を得る工程と
によって算出され得る。
（ｃ１’）工程（ｂ）において得たＵＶシグナルから、工程（ｃ”）において用いた対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの高さ［Ｈ（試料）］を求める工程と；
（ｃ２’）Ｈ（試料）とＨ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を得る工程と
によって算出され得る。
【0091】
第２の態様のこの実施形態の第５の特定の例（第２の態様の第２のサブグループに関する）において、対照ＲＮＡの完全性は、以下の工程：
（ａ’）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ’）工程（ａ’）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定する工程と；
（ｃ’１）工程（ｂ’）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、１つのＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの最大高さからＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（対照）を得る工程と；
（ｃ’２）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた１つのピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（対照）を得る工程と；
（ｃ’３）Ａ５０％（対照）とＡ１００％（対照）との比率を求めることによって、対照ＲＮＡの完全性［Ｉ（対照）］を得る工程と
によって求められる。
（ａ’）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ’）工程（ａ’）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定する工程と；
（ｃ’１）工程（ｂ’）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、１つのＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの最大高さからＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（対照）を得る工程と；
（ｃ’２）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた１つのピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（対照）を得る工程と；
（ｃ’３）Ａ５０％（対照）とＡ１００％（対照）との比率を求めることによって、対照ＲＮＡの完全性［Ｉ（対照）］を得る工程と
によって求められる。
【0092】
この第５の例において、試料組成物［例えば、工程（Ｃ）について第１の組成物または工程（Ｄ）について第２の組成物］中に含有されるＲＮＡの完全性は、以下の工程：
（ｃ１）工程（ｂ）から得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた対照ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークに対応する試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの最大高さから試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（試料）を得る工程と；
（ｃ２）工程（ｂ）から得た試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩシグナルから、工程（ｃ１）において用いた試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（試料）を得る工程と；
（ｃ３）Ａ５０％（試料）とＡ１００％（試料）との比率を求めることによって、Ｉ（試料）を得る工程と；
（ｃ４）Ｉ（試料）とＩ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出され得る。
（ｃ１）工程（ｂ）から得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた対照ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークに対応する試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの最大高さから試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（試料）を得る工程と；
（ｃ２）工程（ｂ）から得た試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩシグナルから、工程（ｃ１）において用いた試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（試料）を得る工程と；
（ｃ３）Ａ５０％（試料）とＡ１００％（試料）との比率を求めることによって、Ｉ（試料）を得る工程と；
（ｃ４）Ｉ（試料）とＩ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出され得る。
【0093】
第２の態様のこの実施形態の第６の特定の例（第２の態様の第２のサブグループに関する）において、対照ＲＮＡの完全性は、以下の工程：
（ａ”）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ”）工程（ａ”）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定する工程と；
（ｃ”）工程（ｂ”）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、１つのＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの高さ［Ｈ（対照）］を求めることによって、対照ＲＮＡの完全性を得る工程と
によって求められる。
（ａ”）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ”）工程（ａ”）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定する工程と；
（ｃ”）工程（ｂ”）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、１つのＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの高さ［Ｈ（対照）］を求めることによって、対照ＲＮＡの完全性を得る工程と
によって求められる。
【0094】
この第６の例において、試料組成物［例えば、工程（Ｃ）について第１の組成物または工程（Ｄ）について第２の組成物］中に含有されるＲＮＡの完全性は、以下の工程：
（ｃ１’）工程（ｂ）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、工程（ｃ”）において用いた対照ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークに対応する試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの高さ［Ｈ（試料）］を求める工程と；
（ｃ２’）Ｈ（試料）とＨ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出され得る。
（ｃ１’）工程（ｂ）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、工程（ｃ”）において用いた対照ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークに対応する試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの高さ［Ｈ（試料）］を求める工程と；
（ｃ２’）Ｈ（試料）とＨ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出され得る。
【0095】
第２の態様のこの実施形態の第７の特定の例（第２の態様の第３のサブグループに関する）において、対照ＲＮＡの完全性は、以下の工程：
（ａ’）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ’）工程（ａ’）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ’１）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの最大高さからＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（対照）を得る工程と；
（ｃ’２）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた１つのピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（対照）を得る工程と；
（ｃ’３）Ａ５０％（対照）とＡ１００％（対照）との比率を求めることによって、対照ＲＮＡの完全性［Ｉ（対照）］を得る工程と
によって求められる。
（ａ’）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ’）工程（ａ’）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ’１）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの最大高さからＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（対照）を得る工程と；
（ｃ’２）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた１つのピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（対照）を得る工程と；
（ｃ’３）Ａ５０％（対照）とＡ１００％（対照）との比率を求めることによって、対照ＲＮＡの完全性［Ｉ（対照）］を得る工程と
によって求められる。
【0096】
この第７の例において、試料組成物［例えば、工程（Ｃ）について第１の組成物または工程（Ｄ）について第２の組成物］中に含有されるＲＮＡの完全性は、以下の工程：
（ｃ１）工程（ｂ）から得たＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの最大高さから試料ＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（試料）を得る工程と；
（ｃ２）工程（ｂ）から得た試料ＵＶシグナルから、工程（ｃ１）において用いた試料ＵＶピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（試料）を得る工程と；
（ｃ３）Ａ５０％（試料）とＡ１００％（試料）との比率を求めることによって、Ｉ（試料）を得る工程と；
（ｃ４）Ｉ（試料）とＩ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出され得る。
（ｃ１）工程（ｂ）から得たＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの最大高さから試料ＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（試料）を得る工程と；
（ｃ２）工程（ｂ）から得た試料ＵＶシグナルから、工程（ｃ１）において用いた試料ＵＶピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（試料）を得る工程と；
（ｃ３）Ａ５０％（試料）とＡ１００％（試料）との比率を求めることによって、Ｉ（試料）を得る工程と；
（ｃ４）Ｉ（試料）とＩ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出され得る。
【0097】
第２の態様のこの実施形態の第８の特定の例（第２の態様の第３のサブグループに関する）において、対照ＲＮＡの完全性は、以下の工程：
（ａ”）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ”）工程（ａ”）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ”）工程（ｂ”）において得たＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの高さ［Ｈ（対照）］を求めることによって、対照ＲＮＡの完全性を得る工程と
によって求められる。
（ａ”）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ”）工程（ａ”）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ”）工程（ｂ”）において得たＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの高さ［Ｈ（対照）］を求めることによって、対照ＲＮＡの完全性を得る工程と
によって求められる。
【0098】
この第８の例において、試料組成物［例えば、工程（Ｃ）について第１の組成物または工程（Ｄ）について第２の組成物］中に含有されるＲＮＡの完全性は、以下の工程：
（ｃ１’）工程（ｂ）において得たＵＶシグナルから、工程（ｃ”）において用いた対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの高さ［Ｈ（試料）］を求める工程と；
（ｃ２’）Ｈ（試料）とＨ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出され得る。
（ｃ１’）工程（ｂ）において得たＵＶシグナルから、工程（ｃ”）において用いた対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの高さ［Ｈ（試料）］を求める工程と；
（ｃ２’）Ｈ（試料）とＨ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出され得る。
【0099】
第２の態様の一実施形態において（特に、第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、核酸（とりわけＲＮＡ）の量は、（ｉ）核酸減衰係数（とりわけＲＮＡ減衰係数）または（ｉｉ）核酸較正曲線（とりわけＲＮＡ較正曲線）を用いることによって求められる。
【0100】
第２の態様の一実施形態において（特に、第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、試料組成物［例えば、工程（Ｃ）について第１の組成物または工程（Ｄ）について第２の組成物］は、核酸（とりわけＲＮＡ）、ならびに核酸（とりわけＲＮＡ）が結合している粒子、例えば、リポプレックス粒子および／または脂質ナノ粒子および／またはポリプレックス粒子および／またはリポポリプレックス粒子および／またはウイルス様粒子を含む。
【0101】
第２の態様の一実施形態において（特に、第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、総核酸の量（とりわけ総ＲＮＡの量）は、（ｉ）試料組成物［例えば、工程（Ｃ）について第１の組成物または工程（Ｄ）について第２の組成物］の少なくとも一部を放出剤により処理する工程と；（ｉｉ）工程（ａ）～工程（ｃ）を、工程（ｉ）から得た少なくとも一部に実行する工程と；（ｉｉｉ）本明細書中に規定される核酸（とりわけＲＮＡ）の量を求める工程とによって［例えば、（ｉ）核酸減衰係数（とりわけＲＮＡ減衰係数）または（ｉｉ）核酸較正曲線（とりわけＲＮＡ較正曲線）を用いて］求められる。この実施形態において、第２の態様の方法の工程（ａ）において、フィールド－フローフラクショネーションは、好ましくは、放出剤を含有する液相を用いて実行される。
【0102】
第２の態様の一実施形態において（特に、第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、放出剤は、（ｉ）界面活性剤、例えば、陰イオン界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム）、双性イオン界面活性剤［例えばｎ－テトラデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホナート（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３－１４）］、陽イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、もしくはそれらの混合物；（ｉｉ）アルコール、例えば脂肪族アルコール（例えばエタノール）、もしくはアルコールの混合液；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組合せである。
【0103】
第２の態様の一実施形態において（特に、第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量は、放出剤の添加なしで、特にいかなる放出剤もなく、工程（ａ）～（ｃ）を実行すること；および本明細書中に規定される核酸（とりわけＲＮＡ）の量を求めることによって［例えば、（ｉ）核酸減衰係数（とりわけＲＮＡ減衰係数）または（ｉｉ）核酸較正曲線（とりわけＲＮＡ較正曲線）を用いて］求められる。
【0104】
第２の態様の一実施形態において（特に、第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、粒子に結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量は、本明細書中で求められる［例えば、放出剤の添加なしで、特にいかなる放出剤もなく、工程（ａ）～（ｃ）を実行すること；および本明細書中に規定される核酸（とりわけＲＮＡ）の量を求めることによって［例えば、（ｉ）核酸減衰係数（とりわけＲＮＡ減衰係数）または（ｉｉ）核酸較正曲線（とりわけＲＮＡ較正曲線）を用いて］］遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量を、本明細書中で求められる［例えば、（ｉ）試料組成物［例えば、工程（Ｃ）について第１の組成物または工程（Ｄ）について第２の組成物］の少なくとも一部を放出剤により処理する工程と；（ｉｉ）工程（ａ）～工程（ｃ）を、工程（ｉ）から得た少なくとも一部に実行する工程と；（ｉｉｉ）本明細書中に規定される核酸（とりわけＲＮＡ）の量を求める工程とによって［例えば、（ｉ）核酸減衰係数（とりわけＲＮＡ減衰係数）または（ｉｉ）核酸較正曲線（とりわけＲＮＡ較正曲線）を用いて］］総核酸（とりわけＲＮＡ）の量から減算することによって求められる。
【0105】
第２の態様の一実施形態において（特に、第２の態様の第２または第３のサブグループの一実施形態において）、工程（ｂ）はさらに、工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つのＬＳシグナル、例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）および／または静的光散乱（ＳＬＳ）、例えば多角度光散乱（ＭＡＬＳ）シグナルを測定することを含む。
【0106】
第２の態様の一実施形態において（特に、第２の態様の第２または第３のサブグループの一実施形態において）、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズは、工程（ｂ）から得たＬＳシグナルから、回転半径（Ｒｇ）値および／または流体力学半径（Ｒｈ）値を算出することによって求められる。第２の態様の一実施形態において（特に、第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、工程（ｂ）は、工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの動的光散乱（ＤＬＳ）シグナルを測定することを含み、工程（ｃ）は、ＤＬＳシグナルからＲｈ値を算出することを含む。第２の態様の一実施形態において（特に、第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、工程（ｂ）は、工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの静的光散乱（ＳＬＳ）、例えばＭＡＬＳシグナルを測定することを含み、工程（ｃ）は、ＳＬＳシグナルからＲｇ値を算出することを含む。第２の態様の一実施形態において（特に、第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、工程（ｂ）は、工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの動的光散乱（ＤＬＳ）シグナルおよび静的光散乱（ＳＬＳ）、例えばＭＡＬＳシグナルを測定することを含み、工程（ｃ）は、Ｒｇ値およびＲｈ値を算出することを含む。この後者の実施形態は、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のサイズについての２つのデータセット、すなわち、Ｒｇ値に基づくもの、およびＲｈ値に基づくものをもたらす。
【0107】
第２の態様の一実施形態において（特に、第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布は、工程（ｂ）から得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを、本明細書中に規定されるように求めたＲｇ値またはＲｈ値に対してプロットすることによって［例えば、工程（ｂ）から得たＳＬＳシグナルからＲｇ値を算出することによって、または工程（ｂ）から得たＤＬＳシグナルからＲｈ値を算出することによって］求められる。この実施形態の第１の例（第２の態様の第１のサブグループに関する）において、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布は、工程（ｂ）から得たＵＶシグナルを、本明細書中に規定されるように求めたＲｇ値またはＲｈ値に対してプロットすることによって［例えば、工程（ｂ）から得たＳＬＳシグナルからＲｇ値を算出することによって、または工程（ｂ）から得たＤＬＳシグナルからＲｈ値を算出することによって］求められる。この実施形態の第２の例（第２の態様の第２のサブグループに関する）において、ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布は、工程（ｂ）から得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを、本明細書中に規定されるように求めたＲｇ値またはＲｈ値に対してプロットすることによって［例えば、工程（ｂ）から得たＳＬＳシグナルからＲｇ値を算出することによって、または工程（ｂ）から得たＤＬＳシグナルからＲｈ値を算出することによって］求められる。この実施形態の第３の例（第２の態様の第３のサブグループに関する）において、ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布は、工程（ｂ）から得たＵＶシグナルを、本明細書中に規定されるように求めたＲｇ値またはＲｈ値に対してプロットすることによって［例えば、工程（ｂ）から得たＳＬＳシグナルからＲｇ値を算出することによって、または工程（ｂ）から得たＤＬＳシグナルからＲｈ値を算出することによって］求められる。先の第１、第２、および第３の例の各々において、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布は、Ｒｇ値、Ｒｈ値、または双方に基づいて求められ得る。核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布は、Ｒｇ値およびＲｈ値に基づいて求められるならば、２つのデータセット、すなわち、Ｒｇ値に基づくサイズ分布およびＲｈ値に基づくサイズ分布をもたらす。
【0108】
第２の態様の一実施形態において（特に、第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布は、Ｒｇ値またはＲｈ値の関数としてＵＶ、蛍光、またはＲＩシグナルを示すプロットから、ＵＶ、蛍光、またはＲＩシグナルを累積重量分率に変換して、累積重量分率をＲｇ値またはＲｈ値に対してプロットすることによって算出される。この実施形態の第１の例（第２の態様の第１のサブグループに関する）において、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布は、Ｒｇ値またはＲｈ値の関数としてＵＶシグナルを示すプロットから、ＵＶシグナルを累積重量分率に変換して、累積重量分率をＲｇ値またはＲｈ値に対してプロットすることによって算出される。この実施形態の第２の例（第２の態様の第２のサブグループに関する）において、ＲＮＡ含有粒子の定量的サイズ分布は、Ｒｇ値またはＲｈ値の関数としてＵＶ、蛍光、またはＲＩシグナルを示すプロットから、ＵＶ、蛍光、またはＲＩシグナルを累積重量分率に変換して、累積重量分率をＲｇ値またはＲｈ値に対してプロットすることによって算出される。この実施形態の第３の例（第２の態様の第３のサブグループに関する）において、ＲＮＡ含有粒子の定量的サイズ分布は、Ｒｇ値またはＲｈ値の関数としてＵＶシグナルを示すプロットから、ＵＶシグナルを累積重量分率に変換して、累積重量分率をＲｇ値またはＲｈ値に対してプロットすることによって算出される。先の第１、第２、および第３の例の各々において、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布は、Ｒｇ値、Ｒｈ値、または双方に基づいて求められ得る。核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布は、Ｒｇ値およびＲｈ値に基づいて求められるならば、２つのデータセット、すなわち、Ｒｇ値に基づく定量的サイズ分布およびＲｈ値に基づく定量的サイズ分布をもたらす。
【0109】
第２の態様の一実施形態において（特に、第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、定量的サイズ分布は、Ｄ１０値、Ｄ５０値、および／またはＤ９０値を含む。核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布は、Ｒｇ値およびＲｈ値に基づいて求められるならば、２つのデータセット、すなわち、Ｒｇ値に基づくＤ１０値、Ｄ５０値、および／またはＤ９０値の１セット、ならびにＲｈ値に基づくＤ１０値、Ｄ５０値、および／またはＤ９０値の１セットをもたらす。
【0110】
第２の態様の一実施形態において（特に、第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、核酸（とりわけＲＮＡ）、特に遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量は、ＵＶシグナルを、例えば２６０ｎｍ～２８０ｎｍの範囲内の波長にて、例えば２６０ｎｍまたは２８０ｎｍの波長にて測定し、かつ対応する波長（例えば、２６０ｎｍまたは２８０ｎｍ）での核酸（とりわけＲＮＡ）減衰係数を用いることによって求められる。
【0111】
第２の態様の一実施形態において（特に、第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において、特に、第２の態様の第３のサブグループの好ましい実施形態において）、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布（例えば、Ｒｇ値またはＲｈ値に基づく）および／または核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布（例えば、Ｒｇ値またはＲｈ値に基づく）は、１０～２０００ｎｍの範囲内、好ましくは２０～１５００ｎｍ、例えば、３０～１２００ｎｍ、４０～１１００ｎｍ、５０～１０００、６０～９００ｎｍ、７０～８００ｎｍ、８０～７００ｎｍ、９０～６００ｎｍ、もしくは１００～５００ｎｍの範囲内、または例えば、１０～１０００ｎｍ、１５～５００ｎｍ、２０～４５０ｎｍ、２５～４００ｎｍ、３０～３５０ｎｍ、４０～３００ｎｍ、もしくは５０～２５０ｎｍの範囲内である。第２の態様の第３のサブグループの好ましい実施形態において、ＲＮＡ含有粒子の（定量的）サイズ分布（例えば、Ｒｇ値またはＲｈ値に基づく）は、１０～１０００ｎｍの範囲内、例えば、１５～５００ｎｍ、２０～４５０ｎｍ、２５～４００ｎｍ、３０～３５０ｎｍ、４０～３００ｎｍ、または５０～２５０ｎｍの範囲内にある。
【0112】
第２の態様の一実施形態において（特に、第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、核酸（とりわけＲＮＡ）は、１０～１５，０００ヌクレオチド、例えば、４０～１５，０００ヌクレオチド、１００～１２，０００ヌクレオチド、または２００～１０，０００ヌクレオチド長を有する。
【0113】
第２の態様の一実施形態において（特に、第２の態様の第１のサブグループの一実施形態において）、核酸はＲＮＡである。この実施形態において、かつ第２の態様の第２または第３のサブグループの実施形態において、ＲＮＡは好ましくは、ｍＲＮＡまたはインビトロ転写ＲＮＡ、特にインビトロ転写ｍＲＮＡである。
【0114】
第２の態様の一実施形態において（特に、第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナル、適宜、ＬＳシグナル、例えばＳＬＳ、例えばＭＡＬＳシグナル、および／またはＤＬＳシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定することは、オンラインで実行され、かつ／または工程（ｃ）は、オンラインで実行される。
【0115】
第２の態様の一実施形態において（特に、第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、試料組成物［例えば、工程（Ｃ）について第１の組成物または工程（Ｄ）について第２の組成物］の少なくとも一部をフィールド－フローフラクショネーションに供する前に、試料組成物の少なくとも一部は、溶媒または溶媒混合液により希釈され、前記溶媒または前記溶媒混合液は、粒子の凝集体の形成を防止することができる。一実施形態において、溶媒混合液は、水および有機溶媒、例えばホルムアミドの混合液である。
【0116】
第２の態様の一実施形態において（特に、第２の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、ＵＶシグナルを測定することは、円二色性（ＣＤ）分光法を用いることによって実行される。
【0117】
第１の態様の文脈において本明細書中に記載されるあらゆる実施形態は、第２の態様のあらゆる実施形態に用いられてもよいことが理解される。
【0118】
第３の態様において、本開示は、核酸（例えばＲＮＡ）および適宜粒子を含む試料組成物の１つまたは複数のパラメーターを決定するための、フィールド－フローフラクショネーションの使用を提供し、１つまたは複数のパラメーターは、核酸（例えばＲＮＡ）完全性、核酸（例えばＲＮＡ）の総量、遊離核酸（例えばＲＮＡ）の量、粒子に結合した核酸（例えばＲＮＡ）の量、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のサイズ［特に、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子の回転半径（Ｒｇ）および／または核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子の流体力学半径（Ｒｈ）に基づく］、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布［例えば、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のＲｇ値またはＲｈ値に基づく］、および核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布［例えば、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のＲｇ値またはＲｈ値に基づく］を含む。通常、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布および／または定量的サイズ分布は、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子の数、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のモル量、または核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子の質量として（各々、粒子のサイズの関数として）与えられ得る。必要に応じた追加的なパラメーターとして、核酸（例えばＲＮＡ）の分子量、表面核酸の量（例えば表面ＲＮＡの量）、封入核酸の量（例えば封入ＲＮＡの量）、アクセス可能な核酸の量（例えばアクセス可能なＲＮＡの量）、核酸（とりわけＲＮＡ）のサイズ［特に、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のＲｇ値および／またはＲｈ値に基づく］、核酸（とりわけＲＮＡ）のサイズ分布［例えば、核酸（例えばＲＮＡ）のＲｇ値またはＲｈ値に基づく］、核酸（とりわけＲＮＡ）の定量的サイズ分布［例えば、核酸（例えばＲＮＡ）のＲｇ値またはＲｈ値に基づく］、シェイプファクター、フォームファクター、および核酸（とりわけＲＮＡ）封入効率が挙げられる。通常、核酸（とりわけＲＮＡ）のサイズ分布および／または定量的サイズ分布は、核酸（とりわけＲＮＡ）分子の数、核酸（とりわけＲＮＡ）のモル量、または核酸（とりわけＲＮＡ）の質量として（各々、粒子のサイズの関数として）与えられ得る。さらに、必要に応じた追加的なパラメーターとして、粒子に結合した核酸（例えばＲＮＡ）の量の、粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の総量に対する比率であって、粒子サイズの関数として与えられ得る比率；粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の正に帯電する部分の量の、粒子に結合した核酸（例えばＲＮＡ）の量に対する比率であって、粒子サイズの関数として与えられ得る比率；および粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の正に帯電する部分の量の、粒子に結合した核酸（例えばＲＮＡ）の負に帯電する部分の量に対する電荷比であって、通常Ｎ／Ｐ比として表され、かつ粒子サイズの関数として与えられ得る電荷比が挙げられる。
【0119】
第３の態様の一実施形態において、フィールド－フローフラクショネーションは、
（ａ）試料組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーションに供することによって、試料組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の試料画分を生成する工程と；
（ｂ）工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、および屈折率（ＲＩ）シグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナル、および適宜光散乱（ＬＳ）シグナルを測定する工程と；
（ｃ）ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、かつ適宜ＬＳシグナルから、１つまたは複数のパラメーターを算出する工程と
を含む。
（ａ）試料組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーションに供することによって、試料組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の試料画分を生成する工程と；
（ｂ）工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、および屈折率（ＲＩ）シグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナル、および適宜光散乱（ＬＳ）シグナルを測定する工程と；
（ｃ）ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、かつ適宜ＬＳシグナルから、１つまたは複数のパラメーターを算出する工程と
を含む。
【0120】
第３の態様の第１のサブグループにおいて、フィールド－フローフラクショネーションは、
（ａ）試料組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーションに供することによって、試料組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の試料画分を生成する工程と；
（ｂ）工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナル、および適宜光散乱（ＬＳ）シグナルを測定する工程と；
（ｃ）ＵＶシグナルから、かつ適宜ＬＳシグナルから、１つまたは複数のパラメーターを算出する工程と
を含む。
（ａ）試料組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーションに供することによって、試料組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の試料画分を生成する工程と；
（ｂ）工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナル、および適宜光散乱（ＬＳ）シグナルを測定する工程と；
（ｃ）ＵＶシグナルから、かつ適宜ＬＳシグナルから、１つまたは複数のパラメーターを算出する工程と
を含む。
【0121】
第３の態様の第２の、かつ好ましいサブグループにおいて、使用は、試料組成物の１つまたは複数のパラメーターを決定するためにあり、試料組成物は、ＲＮＡ、および適宜粒子を含み、フィールド－フローフラクショネーションは、
（ａ）試料組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーションに供することによって、試料組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の試料画分を生成する工程と；
（ｂ）工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、および屈折率（ＲＩ）シグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定し、かつ適宜光散乱（ＬＳ）シグナルを測定する工程と；
（ｃ）ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、かつ適宜ＬＳシグナルから、１つまたは複数のパラメーターを算出する工程と
を含む。
（ａ）試料組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーションに供することによって、試料組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の試料画分を生成する工程と；
（ｂ）工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、および屈折率（ＲＩ）シグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定し、かつ適宜光散乱（ＬＳ）シグナルを測定する工程と；
（ｃ）ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、かつ適宜ＬＳシグナルから、１つまたは複数のパラメーターを算出する工程と
を含む。
【0122】
第３の態様の第３の、かつより好ましいサブグループにおいて、使用は、試料組成物の１つまたは複数のパラメーターを決定するためにあり、試料組成物は、ＲＮＡ、および適宜粒子を含み、フィールド－フローフラクショネーションは、
（ａ）試料組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーションに供することによって、試料組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の試料画分を生成する工程と；
（ｂ）工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナル、および適宜光散乱（ＬＳ）シグナルを測定する工程と；
（ｃ）ＵＶシグナルから、かつ適宜ＬＳシグナルから、１つまたは複数のパラメーターを算出する工程と
を含む。
（ａ）試料組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーションに供することによって、試料組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の試料画分を生成する工程と；
（ｂ）工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナル、および適宜光散乱（ＬＳ）シグナルを測定する工程と；
（ｃ）ＵＶシグナルから、かつ適宜ＬＳシグナルから、１つまたは複数のパラメーターを算出する工程と
を含む。
【0123】
第３の態様の一実施形態において（特に、第３の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布は、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のＲｇ値に基づいて算出される。第３の態様の別の実施形態において（特に、第３の態様の第１、第２、または第３のサブグループの別の実施形態において）、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布は、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のＲｈ値に基づいて算出される。第３の態様の別の実施形態において（特に、第３の態様の第１、第２、または第３のサブグループの別の実施形態において）、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布は、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のＲｇ値に基づいて、かつ別途、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のＲｈ値に基づいて算出される［すなわち、この実施形態は、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布についての２つのデータセットをもたらし、一方はＲｇ値に基づき、かつ一方はＲｈ値に基づく］。
【0124】
１つまたは複数のパラメーターが、核酸（例えばＲＮＡ）のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布を含む第３の態様の一実施形態において（特に、第３の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、核酸（例えばＲＮＡ）のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布は、核酸（例えばＲＮＡ）のＲｇ値に基づいて算出される。１つまたは複数のパラメーターが、核酸（例えばＲＮＡ）のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布を含む第３の態様の別の実施形態において（特に、第３の態様の第１、第２、または第３のサブグループの別の実施形態において）、核酸（例えばＲＮＡ）のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布は、核酸（例えばＲＮＡ）のＲｈ値に基づいて算出される。１つまたは複数のパラメーターが、核酸（例えばＲＮＡ）のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布を含む第３の態様の別の実施形態において（特に、第３の態様の第１、第２、または第３のサブグループの別の実施形態において）、核酸（例えばＲＮＡ）のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布は、核酸（例えばＲＮＡ）のＲｇ値に基づいて、かつ別途、核酸（例えばＲＮＡ）のＲｈ値に基づいて算出される［すなわち、この実施形態は、核酸（例えばＲＮＡ）のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布についての２つのデータセットをもたらし、一方はＲｇ値に基づき、かつ一方はＲｈ値に基づく］。
【0125】
第３の態様の一実施形態において（特に、第３の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、フィールド－フローフラクショネーションは、フローフィールド－フローフラクショネーション、例えば、非対称フローフィールド－フローフラクショネーション（ＡＦ４）またはホローファイバーフローフィールド－フローフラクショネーション（ＨＦ５）である。
【0126】
第３の態様の一実施形態において（特に、第３の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、フィールド－フローフラクショネーションは、核酸（とりわけＲＮＡ）が透過するのを防止するのに適した分子量（ＭＷ）カットオフを有する膜、好ましくは２ｋＤａから３０ｋＤａの範囲内のＭＷカットオフ、例えば１０ｋＤａのＭＷカットオフを有する膜を用いる。
【0127】
第３の態様の一実施形態において（特に、第３の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、フィールド－フローフラクショネーションは、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）または再生セルロース膜を用いる。
【0128】
第３の態様の一実施形態において（特に、第３の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、工程（ａ）は、（Ｉ）最大８ｍＬ／分、好ましくは最大４ｍＬ／分、より好ましくは最大２ｍＬ／分のクロスフローレート、例えばクロスフローレートプロファイル；および／または（ＩＩ）０．０５～０．３５ｍＬ／分の範囲内、好ましくは０．１０～０．３０ｍＬ／分の範囲内、より好ましくは０．１５～０．２５ｍＬ／分の範囲内のインジェクトフロー；および／または（ＩＩＩ）０．３０～０．７０ｍＬ／分の範囲内、好ましくは０．４０～０．６０ｍＬ／分の範囲内、より好ましくは０．４５～０．５５ｍＬ／分の範囲内の検出器フローを用いて実行される。
【0129】
第３の態様の一実施形態において（特に、第３の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、クロスフローレートプロファイルは、好ましくは、対照組成物または試料組成物中に含有される構成要素が、そのサイズによって分画／分離して、１つまたは複数の試料画分を生成することができるようにする分画相を含む。クロスフローレートは、この分画相の間に変化する［例えば、ある値（例えば、約１～約４ｍＬ／分）から始まってから、より低い値（例えば約０～約０．１ｍＬ／分）に低下するか、またはある値（例えば約０～約０．１ｍＬ／分）から始まってから、より高い値（例えば約１～約４ｍＬ／分）まで増大する］ことが好ましく、変化は何であってもよく、例えば、連続的な（例えば、線形であるか、または指数関数的な）変化であっても、段階的な変化であってもよい。好ましくは、クロスフローレートプロファイルは、分画相を含有し、クロスフローレートは、連続的に（好ましくは指数関数的に）変化して、ある値（例えば約１～約４ｍＬ／分）から始まってから、より低い値（例えば約０～約０．１ｍＬ／分）に低下する。分画相は、試料組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画／分離するのに適したあらゆる長さを有してよく、例えば約５分～約６０分、例えば、約１０分～約５０分、約１５分～約４５分、約２０分～約４０分、もしくは約２５分～約３５分、または約３０分である。クロスフローレートプロファイルは、追加的な相（例えば、１、２、３、または４相）を含有してもよく、これは、分画相の前、および／または後であり得（例えば、分画相の前に１相、および後に１、２、または３相）、かつこれは、試料組成物（例えば、タンパク質、ポリペプチド、モノヌクレオチドその他）中に含有される非核酸（とりわけ非ＲＮＡ）構成要素を、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）から分離して、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）に焦点を合わせ、かつ／またはフィールド－フローフラクショネーション装置を再生させるように（例えば、装置の膜に結合した全ての構成要素を除去するように）機能し得る。好ましくは、これらの追加的な相のクロスフローレートは、追加的な相毎に一定であり、かつ追加的な相毎の長さは、追加的な相毎に独立して、約５分～約６０分の範囲内にある（約１０分～約５０分、約１５分～約４５分、約２０分～約４０分、もしくは約２５分～約３５分、または約３０分）。例えば、クロスフローレートプロファイルは、（ｉ）分画相の前にある第１の追加的な相であって、前記第１の追加的な相のクロスフローレートは一定であり、かつ分画相が始まるクロスフローレートである、第１の追加的な相（第１の追加的な相の長さは、約５分～約６０分の範囲内にあってよく、例えば、約１０分～約５０分、約１５分～約４５分、約２０分～約４０分、もしくは約２５分～約３５分、または約１０分、もしくは約２０分、もしくは約３０分である）；（ｉｉ）分画相の後にある第２の追加的な相であって、前記第２の追加的な相のクロスフローレートは一定であり、かつ分画相が終わるクロスフローレートである、第２の追加的な相（第２の追加的な相の長さは、約５分～約６０分の範囲内にあってよく、例えば、約１０分～約５０分、約１５分～約４５分、約２０分～約４０分、もしくは約２５分～約３５分、または約１０分、もしくは約２０分、もしくは約３０分である）；および適宜（ｉｉｉ）第２の追加的な相の後にある第３の追加的な相であって、前記第３の追加的な相のクロスフローレートは一定であり、かつ第２の追加的な相のクロスフローレートとは異なる、第３の追加的な相（第３の追加的な相の長さは、約５分～約６０分の範囲内にあってよく、例えば、約１０分～約５０分、約１５分～約４５分、約２０分～約４０分、もしくは約２５分～約３５分、または約１０分、もしくは約２０分、もしくは約３０分である）を含有してもよい。クロスフローレートプロファイルが分画相を含有し、クロスフローレートが連続的に（好ましくは指数関数的に）変化して、ある値（例えば約１～約４ｍＬ／分）から始まってから、より低い値（例えば約０～約０．１ｍＬ／分）に低下する実施形態において、クロスフローレートプロファイルはさらに、（ｉ）分画相の前にある第１の追加的な相であって、前記第１の追加的な相のクロスフローレートは一定であり、かつ分画相が始まるクロスフローレート（例えば約１～約４ｍＬ／分）である、第１の追加的な相（第１の追加的な相の長さは、約５分～約３０分の範囲内にあってよく、例えば、約６分～約２５分、約７分～約２０分、もしくは約８分～約１５分、もしくは約１０分～約１２分、または約５分、もしくは約１０分、もしくは約１２分である）；（ｉｉ）分画相の後にある第２の追加的な相であって、前記第２の追加的な相のクロスフローレートは一定であり、かつ分画相が終わるクロスフローレート（例えば約０．０１～約０．１ｍＬ／分）である、第２の追加的な相（第２の追加的な相の長さは、約５分～約６０分の範囲内にあってよく、例えば、約１０分～約５０分、約１５分～約４５分、約２０分～約４０分、もしくは約２５分～約３５分、または約３０分である）；および適宜（ｉｉｉ）第２の追加的な相の後にある第３の追加的な相であって、前記第３の追加的な相のクロスフローレートは一定であり、かつ第２の追加的な相のクロスフローレートよりも低い、第３の追加的な相（例えば、前記第３の追加的な相のクロスフローレートは０である）（第３の追加的な相の長さは、約５分～約３０分の範囲内にあってよく、例えば、約６分～約２５分、約７分～約２０分、もしくは約８分～約１５分、もしくは約１０分～約１２分、または約５分、もしくは約１０分、もしくは約１２分である）を含有することが好ましい。そのようなクロスフローレートプロファイルの好ましい例は、以下の通りである：１０分間の１．０～２．０ｍＬ／分、３０分以内の１．０～２．０ｍＬ／分から０．０１～０．０７ｍＬ／分への指数勾配；３０分間の０．０１～０．０７ｍＬ／分；および１０分間の０ｍＬ／分。
【0130】
第３の態様の一実施形態において（特に、第３の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性は、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を用いて求められる。
【0131】
第３の態様のこの実施形態の第１の特定の例において、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性は、以下の工程：
（ａ’）対照核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ’）工程（ａ’）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、および屈折率（ＲＩ）シグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定する工程と；
（ｃ’１）工程（ｂ’）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、１つのＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの最大高さからＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（対照）を得る工程と；
（ｃ’２）工程（ｂ’）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた１つのピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（対照）を得る工程と；
（ｃ’３）Ａ５０％（対照）とＡ１００％（対照）との比率を求めることによって、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性［Ｉ（対照）］を得る工程と
によって求められる。
（ａ’）対照核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ’）工程（ａ’）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、および屈折率（ＲＩ）シグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定する工程と；
（ｃ’１）工程（ｂ’）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、１つのＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの最大高さからＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（対照）を得る工程と；
（ｃ’２）工程（ｂ’）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた１つのピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（対照）を得る工程と；
（ｃ’３）Ａ５０％（対照）とＡ１００％（対照）との比率を求めることによって、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性［Ｉ（対照）］を得る工程と
によって求められる。
【0132】
この第１の例において、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性は、以下の工程：
（ｃ１）工程（ｂ）から得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた対照ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークに対応する試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの最大高さから試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（試料）を得る工程と；
（ｃ２）工程（ｂ）から得た試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩシグナルから、工程（ｃ１）において用いた試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（試料）を得る工程と；
（ｃ３）Ａ５０％（試料）とＡ１００％（試料）との比率を求めることによって、Ｉ（試料）を得る工程と；
（ｃ４）Ｉ（試料）とＩ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を得る工程と
によって算出され得る。
（ｃ１）工程（ｂ）から得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた対照ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークに対応する試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの最大高さから試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（試料）を得る工程と；
（ｃ２）工程（ｂ）から得た試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩシグナルから、工程（ｃ１）において用いた試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（試料）を得る工程と；
（ｃ３）Ａ５０％（試料）とＡ１００％（試料）との比率を求めることによって、Ｉ（試料）を得る工程と；
（ｃ４）Ｉ（試料）とＩ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を得る工程と
によって算出され得る。
【0133】
第３の態様のこの実施形態の第２の特定の例において、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性は、以下の工程：
（ａ”）対照核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ”）工程（ａ”）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定する工程と；
（ｃ”）工程（ｂ”）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、１つのＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの高さ［Ｈ（対照）］を求めることによって、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を得る工程と
によって求められる。
（ａ”）対照核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ”）工程（ａ”）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定する工程と；
（ｃ”）工程（ｂ”）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、１つのＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの高さ［Ｈ（対照）］を求めることによって、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を得る工程と
によって求められる。
【0134】
この第２の例において、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性は、以下の工程：
（ｃ１’）工程（ｂ）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、工程（ｃ”）において用いた対照ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークに対応する試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの高さ［Ｈ（試料）］を求める工程と；
（ｃ２’）Ｈ（試料）とＨ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を得る工程と
によって算出され得る。
（ｃ１’）工程（ｂ）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、工程（ｃ”）において用いた対照ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークに対応する試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの高さ［Ｈ（試料）］を求める工程と；
（ｃ２’）Ｈ（試料）とＨ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を得る工程と
によって算出され得る。
【0135】
第３の態様のこの実施形態の第３の特定の例（第３の態様の第１のサブグループに関する）において、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性は、以下の工程：
（ａ’）対照核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ’）工程（ａ’）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ’１）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの最大高さからＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（対照）を得る工程と；
（ｃ’２）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた１つのピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（対照）を得る工程と；
（ｃ’３）Ａ５０％（対照）とＡ１００％（対照）との比率を求めることによって、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性［Ｉ（対照）］を得る工程と
によって求められる。
（ａ’）対照核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ’）工程（ａ’）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ’１）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの最大高さからＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（対照）を得る工程と；
（ｃ’２）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた１つのピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（対照）を得る工程と；
（ｃ’３）Ａ５０％（対照）とＡ１００％（対照）との比率を求めることによって、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性［Ｉ（対照）］を得る工程と
によって求められる。
【0136】
この第３の例において、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性は、以下の工程：
（ｃ１）工程（ｂ）から得たＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの最大高さから試料ＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（試料）を得る工程と；
（ｃ２）工程（ｂ）から得た試料ＵＶシグナルから、工程（ｃ１）において用いた試料ＵＶピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（試料）を得る工程と；
（ｃ３）Ａ５０％（試料）とＡ１００％（試料）との比率を求めることによって、Ｉ（試料）を得る工程と；
（ｃ４）Ｉ（試料）とＩ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を得る工程と
によって算出され得る。
（ｃ１）工程（ｂ）から得たＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの最大高さから試料ＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（試料）を得る工程と；
（ｃ２）工程（ｂ）から得た試料ＵＶシグナルから、工程（ｃ１）において用いた試料ＵＶピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（試料）を得る工程と；
（ｃ３）Ａ５０％（試料）とＡ１００％（試料）との比率を求めることによって、Ｉ（試料）を得る工程と；
（ｃ４）Ｉ（試料）とＩ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を得る工程と
によって算出され得る。
【0137】
第３の態様のこの実施形態の第４の特定の例（第３の態様の第１のサブグループに関する）において、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性は、以下の工程：
（ａ”）対照核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ”）工程（ａ”）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ”）工程（ｂ”）において得たＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの高さ［Ｈ（対照）］を求めることによって、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を得る工程と
によって求められる。
（ａ”）対照核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ”）工程（ａ”）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ”）工程（ｂ”）において得たＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの高さ［Ｈ（対照）］を求めることによって、対照核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を得る工程と
によって求められる。
【0138】
この第４の例において、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性は、以下の工程：
（ｃ１’）工程（ｂ）において得たＵＶシグナルから、工程（ｃ”）において用いた対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの高さ［Ｈ（試料）］を求める工程と；
（ｃ２’）Ｈ（試料）とＨ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を得る工程と
によって算出され得る。
（ｃ１’）工程（ｂ）において得たＵＶシグナルから、工程（ｃ”）において用いた対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの高さ［Ｈ（試料）］を求める工程と；
（ｃ２’）Ｈ（試料）とＨ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性を得る工程と
によって算出され得る。
【0139】
第３の態様のこの実施形態の第５の特定の例（第３の態様の第２のサブグループに関する）において、対照ＲＮＡの完全性は、以下の工程：
（ａ’）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ’）工程（ａ’）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定する工程と；
（ｃ’１）工程（ｂ’）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、１つのＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの最大高さからＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（対照）を得る工程と；
（ｃ’２）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた１つのピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（対照）を得る工程と；
（ｃ’３）Ａ５０％（対照）とＡ１００％（対照）との比率を求めることによって、対照ＲＮＡの完全性［Ｉ（対照）］を得る工程と
によって求められる。
（ａ’）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ’）工程（ａ’）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定する工程と；
（ｃ’１）工程（ｂ’）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、１つのＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの最大高さからＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（対照）を得る工程と；
（ｃ’２）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた１つのピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（対照）を得る工程と；
（ｃ’３）Ａ５０％（対照）とＡ１００％（対照）との比率を求めることによって、対照ＲＮＡの完全性［Ｉ（対照）］を得る工程と
によって求められる。
【0140】
この第５の例において、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性は、以下の工程：
（ｃ１）工程（ｂ）から得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた対照ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークに対応する試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの最大高さから試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（試料）を得る工程と；
（ｃ２）工程（ｂ）から得た試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩシグナルから、工程（ｃ１）において用いた試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（試料）を得る工程と；
（ｃ３）Ａ５０％（試料）とＡ１００％（試料）との比率を求めることによって、Ｉ（試料）を得る工程と；
（ｃ４）Ｉ（試料）とＩ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出され得る。
（ｃ１）工程（ｂ）から得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた対照ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークに対応する試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの最大高さから試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（試料）を得る工程と；
（ｃ２）工程（ｂ）から得た試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩシグナルから、工程（ｃ１）において用いた試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（試料）を得る工程と；
（ｃ３）Ａ５０％（試料）とＡ１００％（試料）との比率を求めることによって、Ｉ（試料）を得る工程と；
（ｃ４）Ｉ（試料）とＩ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出され得る。
【0141】
第３の態様のこの実施形態の第６の特定の例（第３の態様の第２のサブグループに関する）において、対照ＲＮＡの完全性は、以下の工程：
（ａ”）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ”）工程（ａ”）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定する工程と；
（ｃ”）工程（ｂ”）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、１つのＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの高さ［Ｈ（対照）］を求めることによって、対照ＲＮＡの完全性を得る工程と
によって求められる。
（ａ”）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ”）工程（ａ”）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定する工程と；
（ｃ”）工程（ｂ”）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、１つのＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの高さ［Ｈ（対照）］を求めることによって、対照ＲＮＡの完全性を得る工程と
によって求められる。
【0142】
この第６の例において、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性は、以下の工程：
（ｃ１’）工程（ｂ）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、工程（ｃ”）において用いた対照ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークに対応する試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの高さ［Ｈ（試料）］を求める工程と；
（ｃ２’）Ｈ（試料）とＨ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出され得る。
（ｃ１’）工程（ｂ）において得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルから、工程（ｃ”）において用いた対照ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークに対応する試料ＵＶ、蛍光、またはＲＩピークの高さ［Ｈ（試料）］を求める工程と；
（ｃ２’）Ｈ（試料）とＨ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出され得る。
【0143】
第３の態様のこの実施形態の第７の特定の例（第３の態様の第３のサブグループに関する）において、対照ＲＮＡの完全性は、以下の工程：
（ａ’）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ’）工程（ａ’）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ’１）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの最大高さからＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（対照）を得る工程と；
（ｃ’２）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた１つのピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（対照）を得る工程と；
（ｃ’３）Ａ５０％（対照）とＡ１００％（対照）との比率を求めることによって、対照ＲＮＡの完全性［Ｉ（対照）］を得る工程と
によって求められる。
（ａ’）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ’）工程（ａ’）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ’１）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの最大高さからＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（対照）を得る工程と；
（ｃ’２）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた１つのピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（対照）を得る工程と；
（ｃ’３）Ａ５０％（対照）とＡ１００％（対照）との比率を求めることによって、対照ＲＮＡの完全性［Ｉ（対照）］を得る工程と
によって求められる。
【0144】
この第７の例において、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性は、以下の工程：
（ｃ１）工程（ｂ）から得たＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの最大高さから試料ＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（試料）を得る工程と；
（ｃ２）工程（ｂ）から得た試料ＵＶシグナルから、工程（ｃ１）において用いた試料ＵＶピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（試料）を得る工程と；
（ｃ３）Ａ５０％（試料）とＡ１００％（試料）との比率を求めることによって、Ｉ（試料）を得る工程と；
（ｃ４）Ｉ（試料）とＩ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出され得る。
（ｃ１）工程（ｂ）から得たＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの最大高さから試料ＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（試料）を得る工程と；
（ｃ２）工程（ｂ）から得た試料ＵＶシグナルから、工程（ｃ１）において用いた試料ＵＶピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（試料）を得る工程と；
（ｃ３）Ａ５０％（試料）とＡ１００％（試料）との比率を求めることによって、Ｉ（試料）を得る工程と；
（ｃ４）Ｉ（試料）とＩ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出され得る。
【0145】
第３の態様のこの実施形態の第８の特定の例（第３の態様の第３のサブグループに関する）において、対照ＲＮＡの完全性は、以下の工程：
（ａ”）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ”）工程（ａ”）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ”）工程（ｂ”）において得たＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの高さ［Ｈ（対照）］を求めることによって、対照ＲＮＡの完全性を得る工程と
によって求められる。
（ａ”）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ”）工程（ａ”）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ”）工程（ｂ”）において得たＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの高さ［Ｈ（対照）］を求めることによって、対照ＲＮＡの完全性を得る工程と
によって求められる。
【0146】
この第８の例において、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性は、以下の工程：
（ｃ１’）工程（ｂ）において得たＵＶシグナルから、工程（ｃ”）において用いた対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの高さ［Ｈ（試料）］を求める工程と；
（ｃ２’）Ｈ（試料）とＨ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出され得る。
（ｃ１’）工程（ｂ）において得たＵＶシグナルから、工程（ｃ”）において用いた対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの高さ［Ｈ（試料）］を求める工程と；
（ｃ２’）Ｈ（試料）とＨ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出され得る。
【0147】
第３の態様の一実施形態において（特に、第３の態様の第１、第２または第３のサブグループの一実施形態において）、核酸（とりわけＲＮＡ）の量は、（ｉ）核酸減衰係数（とりわけＲＮＡ減衰係数）または（ｉｉ）核酸較正曲線（とりわけＲＮＡ較正曲線）を用いることによって求められる。
【0148】
第３の態様の一実施形態において（特に、第３の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、試料組成物は、核酸（とりわけＲＮＡ）、ならびに核酸（とりわけＲＮＡ）が結合している粒子、例えば、リポプレックス粒子および／または脂質ナノ粒子および／またはポリプレックス粒子および／またはリポポリプレックス粒子および／またはウイルス様粒子を含む。
【0149】
第３の態様の一実施形態において（特に、第３の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、総核酸の量（とりわけＲＮＡ）は、（ｉ）試料組成物の少なくとも一部を放出剤により処理する工程と；（ｉｉ）工程（ａ）～工程（ｃ）を、工程（ｉ）から得た少なくとも一部に実行する工程と；（ｉｉｉ）本明細書中に規定される核酸（とりわけＲＮＡ）の量を求める工程とによって［例えば、（ｉ）核酸減衰係数（とりわけＲＮＡ減衰係数）または（ｉｉ）核酸較正曲線（とりわけＲＮＡ較正曲線）を用いることによって］求められる。この実施形態において、第１の態様の方法の工程（ａ）において、フィールド－フローフラクショネーションは、好ましくは、放出剤を含有する液相を用いて実行される。
【0150】
第３の態様の一実施形態において（特に、第３の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、放出剤は、（ｉ）界面活性剤、例えば、陰イオン界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム）、双性イオン界面活性剤［例えばｎ－テトラデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホナート（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３－１４）］、陽イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、もしくはそれらの混合物；（ｉｉ）アルコール、例えば脂肪族アルコール（例えばエタノール）、もしくはアルコールの混合液；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組合せである。
【0151】
第３の態様の一実施形態において（特に、第３の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量は、放出剤の添加なしで、特にいかなる放出剤もなく、工程（ａ）～（ｃ）を実行することによって；および本明細書中に規定される核酸（とりわけＲＮＡ）の量を求めることによって［例えば、（ｉ）核酸減衰係数（とりわけＲＮＡ減衰係数）または（ｉｉ）核酸較正曲線（とりわけＲＮＡ較正曲線）を用いることによって］求められる。
【0152】
第３の態様の一実施形態において（特に、第３の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、粒子に結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量は、本明細書中で求められる［例えば、放出剤の添加なしで、特にいかなる放出剤もなく、工程（ａ）～（ｃ）を実行することによって；および本明細書中に規定される核酸（とりわけＲＮＡ）の量を求めることによって［例えば、（ｉ）核酸減衰係数（とりわけＲＮＡ減衰係数）または（ｉｉ）核酸較正曲線（とりわけＲＮＡ較正曲線）を用いることによって］］遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量を、本明細書中で求められる［例えば、（ｉ）試料組成物の少なくとも一部を放出剤により処理する工程と；（ｉｉ）工程（ａ）～工程（ｃ）を、工程（ｉ）から得た少なくとも一部に実行する工程と；（ｉｉｉ）本明細書中に規定される核酸（とりわけＲＮＡ）の量を求める工程とによって［例えば、（ｉ）核酸減衰係数（とりわけＲＮＡ減衰係数）または（ｉｉ）核酸較正曲線（とりわけＲＮＡ較正曲線）を用いることによって］］総核酸（とりわけＲＮＡ）の量から減算することによって求められる。
【0153】
第３の態様の一実施形態において（特に、第３の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、工程（ｂ）はさらに、工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つのＬＳシグナル、例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）シグナルおよび／または静的光散乱（ＳＬＳ）、例えば多角度光散乱（ＭＡＬＳ）シグナルを測定することを含む。
【0154】
第３の態様の一実施形態において（特に、第３の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズは、工程（ｂ）から得たＬＳシグナルから、回転半径（Ｒｇ）値および／または流体力学半径（Ｒｈ）値を算出することによって求められる。第３の態様の一実施形態において（特に、第３の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、工程（ｂ）は、工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの動的光散乱（ＤＬＳ）シグナルを測定することを含み、工程（ｃ）は、ＤＬＳシグナルからＲｈ値を算出することを含む。第３の態様の一実施形態において（特に、第３の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、工程（ｂ）は、工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの静的光散乱（ＳＬＳ）、例えばＭＡＬＳシグナルを測定することを含み、工程（ｃ）は、ＳＬＳシグナルからＲｇ値を算出することを含む。第３の態様の一実施形態において（特に、第３の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、工程（ｂ）は、工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの動的光散乱（ＤＬＳ）シグナルおよび静的光散乱（ＳＬＳ）、例えばＭＡＬＳシグナルを測定することを含み、工程（ｃ）は、Ｒｇ値およびＲｈ値を算出することを含む。この後者の実施形態は、核酸（例えばＲＮＡ）含有粒子のサイズについての２つのデータセット、すなわち、Ｒｇ値に基づくもの、およびＲｈ値に基づくものをもたらす。
【0155】
第３の態様の一実施形態において（特に、第３の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布は、工程（ｂ）から得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを、本明細書中に規定されるように求めたＲｇ値またはＲｈ値に対してプロットすることによって［例えば、工程（ｂ）から得たＳＬＳシグナルからＲｇ値を算出することによって、または工程（ｂ）から得たＤＬＳシグナルからＲｈ値を算出することによって］求められる。この実施形態の第１の例（第３の態様の第１のサブグループに関する）において、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布は、工程（ｂ）から得たＵＶシグナルを、本明細書中に規定されるように求めたＲｇ値またはＲｈ値に対してプロットすることによって［例えば、工程（ｂ）から得たＳＬＳシグナルからＲｇ値を算出することによって、または工程（ｂ）から得たＤＬＳシグナルからＲｈ値を算出することによって］求められる。この実施形態の第２の例（第３の態様の第２のサブグループに関する）において、ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布は、工程（ｂ）から得た、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを、本明細書中に規定されるように求めたＲｇ値またはＲｈ値に対してプロットすることによって［例えば、工程（ｂ）から得たＳＬＳシグナルからＲｇ値を算出することによって、または工程（ｂ）から得たＤＬＳシグナルからＲｈ値を算出することによって］求められる。この実施形態の第３の例（第３の態様の第３のサブグループに関する）において、ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布は、工程（ｂ）から得たＵＶシグナルを、本明細書中に規定されるように求めたＲｇ値またはＲｈ値に対してプロットすることによって［例えば、工程（ｂ）から得たＳＬＳシグナルからＲｇ値を算出することによって、または工程（ｂ）から得たＤＬＳシグナルからＲｈ値を算出することによって］求められる。先の第１、第２、および第３の例の各々において、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布は、Ｒｇ値、Ｒｈ値、または双方に基づいて求められ得る。核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布は、Ｒｇ値およびＲｈ値に基づいて求められるならば、２つのデータセット、すなわち、Ｒｇ値に基づくサイズ分布およびＲｈ値に基づくサイズ分布をもたらす。
【0156】
第３の態様の一実施形態において（特に、第３の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布は、Ｒｇ値またはＲｈ値の関数としてＵＶ、蛍光、またはＲＩシグナルを示すプロットから、ＵＶ、蛍光、またはＲＩシグナルを累積重量分率に変換して、累積重量分率をＲｇ値またはＲｈ値に対してプロットすることによって算出される。この実施形態の第１の例（第３の態様の第１のサブグループに関する）において、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布は、Ｒｇ値またはＲｈ値の関数としてＵＶシグナルを示すプロットから、ＵＶシグナルを累積重量分率に変換して、累積重量分率をＲｇ値またはＲｈ値に対してプロットすることによって算出される。この実施形態の第２の例（第３の態様の第２のサブグループに関する）において、ＲＮＡ含有粒子の定量的サイズ分布は、Ｒｇ値またはＲｈ値の関数としてＵＶ、蛍光、またはＲＩシグナルを示すプロットから、ＵＶ、蛍光、またはＲＩシグナルを累積重量分率に変換して、累積重量分率をＲｇ値またはＲｈ値に対してプロットすることによって算出される。この実施形態の第３の例（第３の態様の第３のサブグループに関する）において、ＲＮＡ含有粒子の定量的サイズ分布は、Ｒｇ値またはＲｈ値の関数としてＵＶシグナルを示すプロットから、ＵＶシグナルを累積重量分率に変換して、累積重量分率をＲｇ値またはＲｈ値に対してプロットすることによって算出される。先の第１、第２、および第３の例の各々において、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布は、Ｒｇ値、Ｒｈ値、または双方に基づいて求められ得る。核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布は、Ｒｇ値およびＲｈ値に基づいて求められるならば、２つのデータセット、すなわち、Ｒｇ値に基づく定量的サイズ分布およびＲｈ値に基づく定量的サイズ分布をもたらす。
【0157】
第３の態様の一実施形態において（特に、第３の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、定量的サイズ分布は、Ｄ１０値、Ｄ５０値、および／またはＤ９０値を含む。核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布は、Ｒｇ値およびＲｈ値に基づいて求められるならば、２つのデータセット、すなわち、Ｒｇ値に基づくＤ１０値、Ｄ５０値、および／またはＤ９０値の１セット、ならびにＲｈ値に基づくＤ１０値、Ｄ５０値、および／またはＤ９０値の１セットをもたらす。
【0158】
第３の態様の一実施形態において（特に、第３の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、１つまたは複数のパラメーターは、本明細書中に規定される少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つのパラメーター（必要に応じた追加的なパラメーターを含む）、特に：遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量、粒子に結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布［特に、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の回転半径（Ｒｇ）および／または核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の流体力学半径（Ｒｈ）に基づく］、および核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布（例えば、Ｒｇ値またはＲｈ値に基づく）からなる群から選択される少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つのパラメーターを含む（またはである）。核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布は、Ｒｇ値およびＲｈ値に基づいて求められるならば、２つのデータセット、すなわち、Ｒｇ値に基づくもの、およびＲｈ値に基づくものをもたらす。しかしながら、本発明に従えば、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布についてのこれらの２つのデータセットは、１つのパラメーターとして（２つのパラメーターとしてではない）しか考えない。また、フィールド－フローフラクショネーションによって得たフラクトグラムが複数の粒子ピークを示す場合、粒子ピーク毎に求められるサイズ分布は、１つのパラメーターとして（粒子ピーク毎の１つのパラメーターとしてではない）しか考えない。核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布がＲｇ値およびＲｈ値に基づいて求められる状況も同様である。
【0159】
第３の態様の一実施形態において（特に、第３の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において、特に、第３の態様の第３のサブグループの好ましい実施形態において）、１つまたは複数のパラメーターは、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布［例えば、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の回転半径（Ｒｇ）および／または核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の流体力学半径（Ｒｈ）に基づく］、および適宜、本明細書中で規定される残りのパラメーター（必要に応じた追加的なパラメーターを含む）の、少なくとも１つのパラメーター、例えば少なくとも２つのパラメーターを含む；好ましくは、残りのパラメーターは：遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量、粒子に結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量、および核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布（例えば、Ｒｇ値またはＲｈ値に基づく）からなる群から選択される。第３の態様の一実施形態において（特に、第３の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において、特に、第３の態様の第３のサブグループの好ましい実施形態において）、１つまたは複数のパラメーターは、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布（例えば、Ｒｇ値またはＲｈ値に基づく）、ならびに：遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量、粒子に結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量、および核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布（例えば、Ｒｇ値またはＲｈ値に基づく）からなる群から選択される少なくとも１つのパラメーター、例えば少なくとも２つのパラメーターを含む。第３の態様の一実施形態において（特に、第３の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において、特に、第３の態様の第３のサブグループの好ましい実施形態において）、１つまたは複数のパラメーターは、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布（例えば、Ｒｇ値またはＲｈ値に基づく）、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量、および粒子に結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量を含む。核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布は、Ｒｇ値およびＲｈ値に基づいて求められるならば、２つのデータセット、すなわち、Ｒｇ値に基づくもの、およびＲｈ値に基づくものをもたらす。しかしながら、本発明に従えば、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布についてのこれらの２つのデータセットは、１つのパラメーターとして（２つのパラメーターとしてではない）しか考えない。また、フィールド－フローフラクショネーションによって得たフラクトグラムが複数の粒子ピークを示す場合において、粒子ピーク毎に求められる定量的サイズ分布は、１つのパラメーターとして（粒子ピーク毎の１つのパラメーターとしてではない）しか考えない。核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布がＲｇ値およびＲｈ値に基づいて求められる状況も同様である。
【0160】
第３の態様の一実施形態において（特に、第３の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、１つまたは複数のパラメーターは、工程（ａ）～（ｃ）の１サイクルにより決定される。
【0161】
第３の態様の一実施形態において（特に、第３の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、核酸（とりわけＲＮＡ）、特に遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量は、ＵＶシグナルを、例えば２６０ｎｍ～２８０ｎｍの範囲内の波長にて、例えば２６０ｎｍまたは２８０ｎｍの波長にて測定し、かつ対応する波長（例えば、２６０ｎｍまたは２８０ｎｍ）での核酸（とりわけＲＮＡ）減衰係数を用いることによって求められる。
【0162】
第３の態様の一実施形態において（特に、第３の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において、特に、第３の態様の第３のサブグループの好ましい実施形態において）、核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布（例えば、Ｒｇ値またはＲｈ値に基づく）および／または核酸（とりわけＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布（例えば、Ｒｇ値またはＲｈ値に基づく）は、１０～２０００ｎｍの範囲内、好ましくは２０～１５００ｎｍ、例えば、３０～１２００ｎｍ、４０～１１００ｎｍ、５０～１０００、６０～９００ｎｍ、７０～８００ｎｍ、８０～７００ｎｍ、９０～６００ｎｍ、もしくは１００～５００ｎｍの範囲内、または例えば、１０～１０００ｎｍ、１５～５００ｎｍ、２０～４５０ｎｍ、２５～４００ｎｍ、３０～３５０ｎｍ、４０～３００ｎｍ、もしくは５０～２５０ｎｍの範囲内である。第３の態様の第３のサブグループの好ましい実施形態において、ＲＮＡ含有粒子の（定量的）サイズ分布（例えば、Ｒｇ値またはＲｈ値に基づく）は、１０～１０００ｎｍの範囲内、例えば、１５～５００ｎｍ、２０～４５０ｎｍ、２５～４００ｎｍ、３０～３５０ｎｍ、４０～３００ｎｍ、または５０～２５０ｎｍの範囲内にある。
【0163】
第３の態様の一実施形態において（特に、第３の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、核酸（とりわけＲＮＡ）は、１０～１５，０００ヌクレオチド、例えば、４０～１５，０００ヌクレオチド、１００～１２，０００ヌクレオチド、または２００～１０，０００ヌクレオチド長を有する。
【0164】
第３の態様の一実施形態において（特に、第３の態様の第１のサブグループの一実施形態において）、核酸はＲＮＡである。この実施形態において、かつ第３の態様の第２または第３のサブグループの実施形態において、ＲＮＡは好ましくは、ｍＲＮＡまたはインビトロ転写ＲＮＡ、特にインビトロ転写ｍＲＮＡである。
【0165】
第３の態様の一実施形態において（特に、第３の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナル、適宜、ＬＳシグナル、例えばＳＬＳ、例えばＭＡＬＳシグナル、および／またはＤＬＳシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定することは、オンラインで実行され、かつ／または工程（ｃ）は、オンラインで実行される。
【0166】
第３の態様の一実施形態において（特に、第３の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、試料組成物の少なくとも一部をフィールド－フローフラクショネーションに供する前に、試料組成物の少なくとも一部は、溶媒または溶媒混合液により希釈され、前記溶媒または前記溶媒混合液は、粒子の凝集体の形成を防止することができる。一実施形態において、溶媒混合液は、水および有機溶媒、例えばホルムアミドの混合液である。
【0167】
第３の態様の一実施形態において（特に、第３の態様の第１、第２、または第３のサブグループの一実施形態において）、ＵＶシグナルを測定することは、円二色性（ＣＤ）分光法を用いることによって実行される。
【0168】
第１または第２の態様の文脈において本明細書中に記載されるあらゆる実施形態は、第３の態様のあらゆる実施形態に用いられてもよいことが理解される。
【0169】
さらなる実施形態は、以下の通りである：
１．試料組成物の１つまたは複数のパラメーターを決定する方法であって、試料組成物は、ＲＮＡ、および適宜粒子を含み、方法は、
（ａ）試料組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーションに供することによって、試料組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の試料画分を生成する工程と；
（ｂ）工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナル、および適宜光散乱（ＬＳ）シグナルを測定する工程と；
（ｃ）ＵＶシグナルから、かつ適宜ＬＳシグナルから、１つまたは複数のパラメーターを算出する工程と
を含み、
１つまたは複数のパラメーターは、ＲＮＡ完全性、ＲＮＡの総量、遊離ＲＮＡの量、粒子に結合したＲＮＡの量、ＲＮＡ含有粒子のサイズ、ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布、およびＲＮＡ含有粒子の定量的サイズ分布を含む、方法。
１．試料組成物の１つまたは複数のパラメーターを決定する方法であって、試料組成物は、ＲＮＡ、および適宜粒子を含み、方法は、
（ａ）試料組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーションに供することによって、試料組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の試料画分を生成する工程と；
（ｂ）工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナル、および適宜光散乱（ＬＳ）シグナルを測定する工程と；
（ｃ）ＵＶシグナルから、かつ適宜ＬＳシグナルから、１つまたは複数のパラメーターを算出する工程と
を含み、
１つまたは複数のパラメーターは、ＲＮＡ完全性、ＲＮＡの総量、遊離ＲＮＡの量、粒子に結合したＲＮＡの量、ＲＮＡ含有粒子のサイズ、ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布、およびＲＮＡ含有粒子の定量的サイズ分布を含む、方法。
【0170】
２．フィールド－フローフラクショネーションが、フローフィールド－フローフラクショネーション、例えば、非対称フローフィールド－フローフラクショネーション（ＡＦ４）またはホローファイバーフローフィールド－フローフラクショネーション（ＨＦ５）である、項目１の方法。
【0171】
３．工程（ａ）が、ＲＮＡが透過するのを防止するのに適した分子量（ＭＷ）カットオフを有する膜、好ましくは２ｋＤａから３０ｋＤａの範囲内のＭＷカットオフ、例えば１０ｋＤａのＭＷカットオフを有する膜を用いて実行される、項目１または２の方法。
【0172】
４．工程（ａ）が、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）または再生セルロース膜を用いて実行される、項目１から３のいずれか一項の方法。
【0173】
５．工程（ａ）が、最大８ｍＬ／分、好ましくは最大４ｍＬ／分、より好ましくは最大２ｍＬ／分のクロスフローレートを用いて実行される、項目１から４のいずれか一項の方法。
【0174】
６．工程（ａ）が、以下のクロスフローレートプロファイル：１０分間の１．０～２．０ｍＬ／分、３０分以内の１．０～２．０ｍＬ／分から０．０１～０．０７ｍＬ／分への指数勾配；３０分間の０．０１～０．０７ｍＬ／分；および１０分間の０ｍＬ／分を用いて実行される、項目１から５のいずれか一項の方法。
【0175】
７．工程（ａ）が、インジェクトフローを、０．０５～０．３５ｍＬ／分の範囲内で、好ましくは０．１０～０．３０ｍＬ／分の範囲内で、より好ましくは０．１５～０．２５ｍＬ／分の範囲内で用いて実行される、項目１から６のいずれか一項の方法。
【0176】
８．工程（ａ）が、検出器フローを、０．３０～０．７０ｍＬ／分の範囲内で、好ましくは０．４０～０．６０ｍＬ／分の範囲内で、より好ましくは０．４５～０．５５ｍＬ／分の範囲内で用いて実行される、項目１から７のいずれか一項の方法。
【0177】
９．試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性が、対照ＲＮＡの完全性を用いて算出される、項目１から８のいずれか一項の方法。
【0178】
１０．対照ＲＮＡの完全性が、以下の工程：
（ａ’）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ’）工程（ａ’）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ’１）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの最大高さからＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（対照）を得る工程と；
（ｃ’２）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた１つのピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（対照）を得る工程と；
（ｃ’３）Ａ５０％（対照）とＡ１００％（対照）との比率を求めることによって、対照ＲＮＡの完全性［Ｉ（対照）］を得る工程と
によって求められる、項目９の方法。
（ａ’）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ’）工程（ａ’）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ’１）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの最大高さからＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（対照）を得る工程と；
（ｃ’２）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた１つのピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（対照）を得る工程と；
（ｃ’３）Ａ５０％（対照）とＡ１００％（対照）との比率を求めることによって、対照ＲＮＡの完全性［Ｉ（対照）］を得る工程と
によって求められる、項目９の方法。
【0179】
１１．試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性が、以下の工程：
（ｃ１）工程（ｂ）から得た試料ＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの最大高さから試料ＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（試料）を得る工程と；
（ｃ２）工程（ｂ）から得た試料ＵＶシグナルから、工程（ｃ１）において用いた試料ＵＶピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（試料）を得る工程と；
（ｃ３）Ａ５０％（試料）とＡ１００％（試料）との比率を求めることによって、Ｉ（試料）を得る工程と；
（ｃ４）Ｉ（試料）とＩ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出される、項目１０の方法。
（ｃ１）工程（ｂ）から得た試料ＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの最大高さから試料ＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（試料）を得る工程と；
（ｃ２）工程（ｂ）から得た試料ＵＶシグナルから、工程（ｃ１）において用いた試料ＵＶピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（試料）を得る工程と；
（ｃ３）Ａ５０％（試料）とＡ１００％（試料）との比率を求めることによって、Ｉ（試料）を得る工程と；
（ｃ４）Ｉ（試料）とＩ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出される、項目１０の方法。
【0180】
１２．対照ＲＮＡの完全性を算出する工程が、以下の工程：
（ａ”）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ”）工程（ａ”）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ”）工程（ｂ”）において得たＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの高さ［Ｈ（対照）］を求めることによって、対照ＲＮＡの完全性を得る工程と
によって決定される、項目９の方法。
（ａ”）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ”）工程（ａ”）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ”）工程（ｂ”）において得たＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの高さ［Ｈ（対照）］を求めることによって、対照ＲＮＡの完全性を得る工程と
によって決定される、項目９の方法。
【0181】
１３．試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性が、以下の工程：
（ｃ１’）工程（ｂ）において得たＵＶシグナルから、工程（ｃ”）において用いた対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの高さ［Ｈ（試料）］を求める工程と；
（ｃ２’）Ｈ（試料）とＨ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出される、項目１２の方法。
（ｃ１’）工程（ｂ）において得たＵＶシグナルから、工程（ｃ”）において用いた対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの高さ［Ｈ（試料）］を求める工程と；
（ｃ２’）Ｈ（試料）とＨ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出される、項目１２の方法。
【0182】
１４．ＲＮＡの量が、（ｉ）ＲＮＡ減衰係数または（ｉｉ）ＲＮＡ較正曲線を用いることによって求められる、項目１から１３のいずれか一項の方法。
【0183】
１５．試料組成物が、ＲＮＡ、ならびにＲＮＡが結合している粒子、例えば、リポプレックス粒子および／または脂質ナノ粒子および／またはポリプレックス粒子および／またはリポポリプレックス粒子および／またはウイルス様粒子を含む、項目１から１４のいずれか一項の方法。
【0184】
１６．総ＲＮＡの量が、（ｉ）試料組成物の少なくとも一部を放出剤により処理する工程と；（ｉｉ）工程（ａ）～工程（ｃ）を、工程（ｉ）から得た少なくとも一部に実行する工程と；（ｉｉｉ）項目１４に規定されるＲＮＡの量を求める工程とによって求められる、項目１５の方法。
【0185】
１７．工程（ａ）において、フィールド－フローフラクショネーションが、放出剤を含有する液相を用いて実行される、項目１６の方法。
【0186】
１８．放出剤が、（ｉ）界面活性剤、例えば、陰イオン界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム）、双性イオン界面活性剤［例えばｎ－テトラデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホナート（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３－１４）］、陽イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、もしくはそれらの混合物；（ｉｉ）アルコール、例えば脂肪族アルコール（例えばエタノール）、もしくはアルコールの混合液；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組合せである、項目１６または１７の方法。
【0187】
１９．遊離ＲＮＡの量が、放出剤の添加なしで、特にいかなる放出剤もなく、工程（ａ）～（ｃ）を実行すること；および項目１４に規定されるＲＮＡの量を求めることによって求められる、項目１５から１８のいずれか一項の方法。
【0188】
２０．粒子に結合したＲＮＡの量が、項目１９によって求めた遊離ＲＮＡの量を、項目１６から１８のいずれか一項によって求めた総ＲＮＡの量から減算することによって求められる、項目１５から１９のいずれか一項の方法。
【0189】
２１．工程（ｂ）がさらに、工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つのＬＳシグナル、例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）シグナルおよび／または静的光散乱（ＳＬＳ）、例えば多角度光散乱（ＭＡＬＳ）シグナルを測定することを含む、項目１５から２０のいずれか一項の方法。
【0190】
２２．ＲＮＡ含有粒子のサイズが、工程（ｂ）から得たＬＳシグナルから、回転半径（Ｒｇ）値および／または流体力学半径（Ｒｈ）値を算出することによって求められる、項目２１の方法。
【0191】
２３．実験的に求めたＲｇ値および／またはＲｈ値が、好ましくは、実験的に求めたか、または算出したＲｇ値またはＲｈ値を、多項式関数または線形関数に適合させて、多項式適合または線形適合に基づくＲｇ値またはＲｈ値を再算出することによって平滑化される、項目２１の方法。
【0192】
２４．ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布が、工程（ｂ）から得たＵＶシグナルを、項目２２に規定するように求めたＲｇ値またはＲｈ値に対してプロットすることによって求められる、項目２１から２３のいずれか一項の方法。
【0193】
２５．ＲＮＡ含有粒子の定量的サイズ分布が、Ｒｇ値またはＲｈ値の関数としてＵＶシグナルを示すプロットから、ＵＶシグナルを累積重量分率に変換して、累積重量分率をＲｇ値またはＲｈ値に対してプロットすることによって算出される、項目２１から２４のいずれか一項の方法。
【0194】
２６．定量的サイズ分布が、Ｄ１０値、Ｄ５０値、および／またはＤ９０値を含む、項目２５の方法。
【0195】
２７．工程（ｂ）が、工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの動的光散乱（ＤＬＳ）シグナルを測定することを含み、工程（ｃ）が、ＤＬＳシグナルからＲｈ値を算出することを含む、項目２２から２６のいずれか一項の方法。
【0196】
２８．１つまたは複数のパラメーターが、遊離ＲＮＡの量、粒子に結合したＲＮＡの量、ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布、およびＲＮＡ含有粒子の定量的サイズ分布からなる群から選択される、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つのパラメーターを含む（またはである）、項目１５から２７のいずれか一項の方法。
【0197】
２９．ＲＮＡの量、特に遊離ＲＮＡの量が、２６０ｎｍでのＵＶシグナルを測定し、２６０ｎｍでのＲＮＡ減衰係数を用いることによって、または２８０ｎｍでのＵＶシグナルを測定し、２８０ｎｍでのＲＮＡ減衰係数を用いることによって求められる、項目１５から２８のいずれか一項の方法。
【0198】
３０．ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布および／またはＲＮＡ含有粒子の定量的サイズ分布が、２０～１５００ｎｍ、例えば、３０～１２００ｎｍ、４０～１１００ｎｍ、５０～１０００、６０～９００ｎｍ、７０～８００ｎｍ、８０～７００ｎｍ、９０～６００ｎｍ、または１００～５００ｎｍの範囲内、例えば、１０～１０００ｎｍ、１５～５００ｎｍ、２０～４５０ｎｍ、２５～４００ｎｍ、３０～３５０ｎｍ、４０～３００ｎｍ、または５０～２５０ｎｍの範囲内である、項目１から２９のいずれか一項の方法。
【0199】
３１．ＲＮＡが、１０～１５，０００ヌクレオチド、例えば、４０～１５，０００ヌクレオチド、１００から１２，０００ヌクレオチド、または２００～１０，０００ヌクレオチド長を有する、項目１～３０のいずれか一項の方法。
【0200】
３２．ＲＮＡが、インビトロ転写ＲＮＡ、特にインビトロ転写ｍＲＮＡである、項目１から３１のいずれか一項の方法。
【0201】
３３．ＵＶシグナル、適宜ＬＳシグナル、例えばＳＬＳ、例えばＭＡＬＳシグナルおよび／もしくはＤＬＳシグナルを測定する工程がオンラインで実行され、かつ／または工程（ｃ）がオンラインで実行される、項目１から３２のいずれか一項の方法。
【0202】
３４．試料組成物の少なくとも一部をフィールド－フローフラクショネーションに供する前に、試料組成物の少なくとも一部が、溶媒または溶媒混合液により希釈され、溶媒または溶媒混合液が、粒子の凝集体の形成を防止することができる、項目１５から３３のいずれか一項の方法。
【0203】
３５．溶媒混合液が、水および有機溶媒、例えばホルムアミドの混合液である、項目３４の方法。
【0204】
３５ａ．ＵＶシグナルを測定する工程が、円二色性（ＣＤ）分光法を用いることによって実行される、項目１から３５のいずれか一項の方法。
【0205】
３６．ＲＮＡおよび適宜粒子を含む組成物を用意する場合に、１つまたは複数の反応条件を変更する影響を分析する方法であって、
（Ａ）ＲＮＡおよび適宜粒子を含む第１の組成物を用意する工程と；
（Ｂ）ＲＮＡおよび適宜粒子を含む第２の組成物を用意する工程であって、第１の組成物を用意する工程と、１つまたは複数の反応条件のみが異なる、工程と；
（Ｃ）第１の組成物の一部を、項目１から３５および３５ａのいずれか一項の方法に供することによって、第１の組成物の１つまたは複数のパラメーターを決定する工程と；
（Ｄ）第２の組成物の対応する一部を、工程（Ｃ）において用いた方法に供することによって、第２の組成物の１つまたは複数のパラメーターを決定する工程と；
（Ｅ）工程（Ｃ）において得た第１の組成物の１つまたは複数のパラメーターを、工程（Ｄ）において得た第２の組成物の対応する１つまたは複数のパラメーターと比較する工程と
を含む方法。
（Ａ）ＲＮＡおよび適宜粒子を含む第１の組成物を用意する工程と；
（Ｂ）ＲＮＡおよび適宜粒子を含む第２の組成物を用意する工程であって、第１の組成物を用意する工程と、１つまたは複数の反応条件のみが異なる、工程と；
（Ｃ）第１の組成物の一部を、項目１から３５および３５ａのいずれか一項の方法に供することによって、第１の組成物の１つまたは複数のパラメーターを決定する工程と；
（Ｄ）第２の組成物の対応する一部を、工程（Ｃ）において用いた方法に供することによって、第２の組成物の１つまたは複数のパラメーターを決定する工程と；
（Ｅ）工程（Ｃ）において得た第１の組成物の１つまたは複数のパラメーターを、工程（Ｄ）において得た第２の組成物の対応する１つまたは複数のパラメーターと比較する工程と
を含む方法。
【0206】
３７．１つまたは複数の反応条件が、以下：塩濃度／イオン強度（例えば、２ｍＭ ＮａＣｌまたは１００ｍＭ ＮａＣｌ）；温度［例えば、低温（例えば－２０℃）または高温（例えば５０℃）］；ｐＨまたはバッファ濃度；光／放射線；酸素；剪断力；圧力；凍結／解凍サイクル；乾燥／復元サイクル；賦形剤（例えば、スタビライザーおよび／またはキレート化剤）の添加；粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー、例えば、陽イオン脂質対陽イオンポリマー、陽イオン脂質対双性イオン脂質、またはペグ化脂質対非ペグ化脂質）のタイプおよび／または源；電荷比；物理的状態；ならびにＲＮＡの、粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）に対する比率のいずれかを含む、項目３６の方法。
【0207】
３８．ＲＮＡおよび適宜粒子を含む試料組成物の１つまたは複数のパラメーターを決定するためのフィールド－フローフラクショネーションの使用であって、１つまたは複数のパラメーターは、ＲＮＡ完全性、ＲＮＡの総量、遊離ＲＮＡの量、粒子に結合したＲＮＡの量、ＲＮＡ含有粒子のサイズ（例えば、ＲＮＡ含有粒子の流体力学半径）、ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布、およびＲＮＡ含有粒子の定量的サイズ分布を含む、使用。
【0208】
３９．フィールド－フローフラクショネーションが：
（ａ）試料組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーションに供することによって、試料組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の試料画分を生成する工程と；
（ｂ）工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナル、および適宜光散乱（ＬＳ）シグナルを測定する工程と；
（ｃ）ＵＶシグナルから、かつ適宜ＬＳシグナルから、１つまたは複数のパラメーターを算出する工程と
を含む、項目３８の使用。
（ａ）試料組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーションに供することによって、試料組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の試料画分を生成する工程と；
（ｂ）工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナル、および適宜光散乱（ＬＳ）シグナルを測定する工程と；
（ｃ）ＵＶシグナルから、かつ適宜ＬＳシグナルから、１つまたは複数のパラメーターを算出する工程と
を含む、項目３８の使用。
【0209】
４０．フィールド－フローフラクショネーションが、フローフィールド－フローフラクショネーション、例えば、非対称フローフィールド－フローフラクショネーション（ＡＦ４）またはホローファイバーフローフィールド－フローフラクショネーション（ＨＦ５）である、項目３８または３９の使用。
【0210】
４１．フィールド－フローフラクショネーションが、ＲＮＡが透過するのを防止するのに適した分子量（ＭＷ）カットオフを有する膜、好ましくは２ｋＤａから３０ｋＤａの範囲内のＭＷカットオフ、例えば１０ｋＤａのＭＷカットオフを有する膜を用いる、項目３８から４０のいずれか一項の使用。
【0211】
４２．フィールド－フローフラクショネーションが、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）または再生セルロース膜を用いる、項目３８から４１のいずれか一項の使用。
【0212】
４３．工程（ａ）が、
（Ｉ）最大８ｍＬ／分、好ましくは最大４ｍＬ／分、より好ましくは最大２ｍＬ／分、例えば、以下のクロスフローレートプロファイル：１０分間の１．０～２．０ｍＬ／分、３０分以内の１．０～２．０ｍＬ／分から０．０１～０．０７ｍＬ／分への指数勾配；３０分間の０．０１～０．０７ｍＬ／分；および１０分間の０ｍＬ／分のクロスフローレート；ならびに／または
（ＩＩ）０．０５～０．３５ｍＬ／分の範囲内の、好ましくは０．１０～０．３０ｍＬ／分の範囲内、より好ましくは０．１５～０．２５ｍＬ／分の範囲内のインジェクトフロー；ならびに／または
（ＩＩＩ）０．３０～０．７０ｍＬ／分の範囲内、好ましくは０．４０～０．６０ｍＬ／分の範囲内、より好ましくは０．４５～０．５５ｍＬ／分の範囲内の検出器フロー
を用いて実行される、項目３９から４２のいずれか一項の使用。
（Ｉ）最大８ｍＬ／分、好ましくは最大４ｍＬ／分、より好ましくは最大２ｍＬ／分、例えば、以下のクロスフローレートプロファイル：１０分間の１．０～２．０ｍＬ／分、３０分以内の１．０～２．０ｍＬ／分から０．０１～０．０７ｍＬ／分への指数勾配；３０分間の０．０１～０．０７ｍＬ／分；および１０分間の０ｍＬ／分のクロスフローレート；ならびに／または
（ＩＩ）０．０５～０．３５ｍＬ／分の範囲内の、好ましくは０．１０～０．３０ｍＬ／分の範囲内、より好ましくは０．１５～０．２５ｍＬ／分の範囲内のインジェクトフロー；ならびに／または
（ＩＩＩ）０．３０～０．７０ｍＬ／分の範囲内、好ましくは０．４０～０．６０ｍＬ／分の範囲内、より好ましくは０．４５～０．５５ｍＬ／分の範囲内の検出器フロー
を用いて実行される、項目３９から４２のいずれか一項の使用。
【0213】
４４．試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性が、対照ＲＮＡの完全性を用いて求められる、項目３８から４３のいずれか一項の使用。
【0214】
４５．対照ＲＮＡの完全性が、以下の工程：
（ａ’）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ’）工程（ａ’）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ’１）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの最大高さからＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（対照）を得る工程と；
（ｃ’２）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた１つのピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（対照）を得る工程と；
（ｃ’３）Ａ５０％（対照）とＡ１００％（対照）との比率を求めることによって、対照ＲＮＡの完全性［Ｉ（対照）］を得る工程と
によって求められる、項目４４の使用。
（ａ’）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ’）工程（ａ’）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ’１）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの最大高さからＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（対照）を得る工程と；
（ｃ’２）工程（ｂ’）において得たＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた１つのピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（対照）を得る工程と；
（ｃ’３）Ａ５０％（対照）とＡ１００％（対照）との比率を求めることによって、対照ＲＮＡの完全性［Ｉ（対照）］を得る工程と
によって求められる、項目４４の使用。
【0215】
４６．試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性が、以下の工程：
（ｃ１）工程（ｂ）から得た試料ＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの最大高さから試料ＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（試料）を得る工程と；
（ｃ２）工程（ｂ）から得た試料ＵＶシグナルから、工程（ｃ１）において用いた試料ＵＶピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（試料）を得る工程と；
（ｃ３）Ａ５０％（試料）とＡ１００％（試料）との比率を求めることによって、Ｉ（試料）を得る工程と；
（ｃ４）Ｉ（試料）とＩ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出される、項目４５の使用。
（ｃ１）工程（ｂ）から得た試料ＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの最大高さから試料ＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ５０％（試料）を得る工程と；
（ｃ２）工程（ｂ）から得た試料ＵＶシグナルから、工程（ｃ１）において用いた試料ＵＶピークの総面積を算出することによって、Ａ１００％（試料）を得る工程と；
（ｃ３）Ａ５０％（試料）とＡ１００％（試料）との比率を求めることによって、Ｉ（試料）を得る工程と；
（ｃ４）Ｉ（試料）とＩ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出される、項目４５の使用。
【0216】
４７．対照ＲＮＡの完全性を算出する工程が、以下の工程：
（ａ”）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ”）工程（ａ”）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ”）工程（ｂ”）において得たＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの高さ［Ｈ（対照）］を求めることによって、対照ＲＮＡの完全性を得る工程と
によって決定される、項目４４の使用。
（ａ”）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ”）工程（ａ”）から得た１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ”）工程（ｂ”）において得たＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの高さ［Ｈ（対照）］を求めることによって、対照ＲＮＡの完全性を得る工程と
によって決定される、項目４４の使用。
【0217】
４８．試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性が、以下の工程：
（ｃ１’）工程（ｂ）において得たＵＶシグナルから、工程（ｃ”）において用いた対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの高さ［Ｈ（試料）］を求める工程と；
（ｃ２’）Ｈ（試料）とＨ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出される、項目４７の使用。
（ｃ１’）工程（ｂ）において得たＵＶシグナルから、工程（ｃ”）において用いた対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの高さ［Ｈ（試料）］を求める工程と；
（ｃ２’）Ｈ（試料）とＨ（対照）との比率を求めることによって、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出される、項目４７の使用。
【0218】
４９．ＲＮＡの量が、（ｉ）ＲＮＡ減衰係数または（ｉｉ）ＲＮＡ較正曲線を用いることによって求められる、項目３８から４８のいずれか一項の使用。
【0219】
５０．試料組成物が、ＲＮＡ、ならびにＲＮＡが結合し、かつ／またはＲＮＡが含有される粒子、例えば、リポプレックス粒子および／または脂質ナノ粒子および／またはポリプレックス粒子および／またはリポポリプレックス粒子および／またはウイルス様粒子を含む、項目３９から４９のいずれか１つの使用。
【0220】
５１．総ＲＮＡの量が、（ｉ）試料組成物の少なくとも一部を放出剤により処理する工程と；（ｉｉ）工程（ａ）～工程（ｃ）を、工程（ｉ）から得た少なくとも一部に実行する工程と；（ｉｉｉ）項目４９に規定されるＲＮＡの量を求める工程とによって求められる、項目５０の使用。
【0221】
５２．工程（ａ）において、フィールド－フローフラクショネーションが、放出剤を含有する液相を用いて実行される、項目５１の使用。
【0222】
５３．放出剤が、（ｉ）界面活性剤、例えば、陰イオン界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム）、双性イオン界面活性剤［例えばｎ－テトラデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホナート（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３－１４）］、陽イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、もしくはそれらの混合物；（ｉｉ）アルコール、例えば脂肪族アルコール（例えばエタノール）、もしくはアルコールの混合液；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組合せである、項目５１または５２の使用。
【0223】
５４．遊離ＲＮＡの量が、放出剤の添加なしで、特にいかなる放出剤もなく、工程（ａ）～（ｃ）を実行すること；および項目４９に規定されるＲＮＡの量を求めることによって求められる、項目５０から５３のいずれか一項の使用。
【0224】
５５．粒子に結合したＲＮＡの量が、項目５３によって求めた遊離ＲＮＡの量を、項目５１から５３のいずれか一項によって求めた総ＲＮＡの量から減算することによって求められる、項目５０から５４のいずれか一項の使用。
【0225】
５６．工程（ｂ）がさらに、工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つのＬＳシグナル、例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）シグナルおよび／または静的光散乱（ＳＬＳ）、例えば多角度光散乱（ＭＡＬＳ）シグナルを測定することを含む、項目５０から５５のいずれか一項の使用。
【0226】
５７．ＲＮＡ含有粒子のサイズが、工程（ｂ）から得たＬＳシグナルから、回転半径（Ｒｇ）値および／または流体力学半径（Ｒｈ）値を算出することによって求められる、項目５６の使用。
【0227】
５８．実験的に求めたＲｇ値および／またはＲｈ値が、好ましくは、実験的に求めたか、または算出したＲｇ値またはＲｈ値を、多項式関数または線形関数に適合させて、多項式適合または線形適合に基づくＲｇ値またはＲｈ値を再算出することによって平滑化される、項目５７の使用。
【0228】
５９．ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布が、工程（ｂ）から得たＵＶシグナルを、項目５７に規定するように求めたＲｇ値またはＲｈ値に対してプロットすることによって求められる、項目５６から５８のいずれか一項の使用。
【0229】
６０．ＲＮＡ含有粒子の定量的サイズ分布が、Ｒｇ値またはＲｈ値の関数としてＵＶシグナルを示すプロットから、ＵＶシグナルを累積重量分率に変換して、累積重量分率をＲｇ値またはＲｈ値に対してプロットすることによって算出される、項目５６から５９のいずれか一項の使用。
【0230】
６１．定量的サイズ分布が、Ｄ１０値、Ｄ５０値、および／またはＤ９０値を含む、項目６０の使用。
【0231】
６２．工程（ｂ）が、工程（ａ）から得た１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの動的光散乱（ＤＬＳ）シグナルを測定することをさらに含み、工程（ｃ）が、ＤＬＳシグナルからＲｈ値を算出することを含む、項目５７から６１のいずれか一項の使用。
【0232】
６３．１つまたは複数のパラメーターが、遊離ＲＮＡの量、粒子に結合したＲＮＡの量、ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布、およびＲＮＡ含有粒子の定量的サイズ分布からなる群から選択される、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つのパラメーターを含む（またはである）、項目５０から６２のいずれか一項の使用。
【0233】
６４．ＲＮＡの量、特に遊離ＲＮＡの量が、２６０ｎｍでのＵＶシグナルを測定し、２６０ｎｍでのＲＮＡ減衰係数を用いることによって、または２８０ｎｍでのＵＶシグナルを測定し、２８０ｎｍでのＲＮＡ減衰係数を用いることによって求められる、項目５０から６３のいずれか一項の使用。
【0234】
６５．ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布および／またはＲＮＡ含有粒子の定量的サイズ分布が、２０～１５００ｎｍ、例えば、３０～１２００ｎｍ、４０～１１００ｎｍ、５０～１０００、６０～９００ｎｍ、７０～８００ｎｍ、８０～７００ｎｍ、９０～６００ｎｍ、または１００～５００ｎｍの範囲内、例えば、１０～１０００ｎｍ、１５～５００ｎｍ、２０～４５０ｎｍ、２５～４００ｎｍ、３０～３５０ｎｍ、４０～３００ｎｍ、または５０～２５０ｎｍの範囲内である、項目３８から６４のいずれか一項の使用。
【0235】
６６．ＲＮＡが、１０～１５，０００ヌクレオチド、例えば、４０～１５，０００ヌクレオチド、１００～１２，０００ヌクレオチド、または２００～１０，０００ヌクレオチド長を有する、項目３８から６４のいずれか一項の使用。
【0236】
６７．ＲＮＡが、インビトロ転写ＲＮＡ、特にインビトロ転写ｍＲＮＡである、項目３８から６５のいずれか一項の使用。
【0237】
６８．ＵＶシグナル、適宜ＬＳシグナル、例えばＳＬＳ、例えばＭＡＬＳシグナルおよび／もしくはＤＬＳシグナルを測定する工程がオンラインで実行され、かつ／または工程（ｃ）がオンラインで実行される、項目３９から６７のいずれか一項の使用。
【0238】
６９．試料組成物の少なくとも一部をフィールド－フローフラクショネーションに供する前に、試料組成物の少なくとも一部が、溶媒または溶媒混合液により希釈され、前記溶媒または溶媒混合液が、粒子の凝集体の形成を防止することができる、項目３９から６８のいずれか一項の使用。
【0239】
７０．溶媒混合液が、水および有機溶媒、例えばホルムアミドの混合液である、項目６９の使用。
【0240】
７０ａ．ＵＶシグナルを測定する工程が、円二色性（ＣＤ）分光法を用いることによって実行される、項目３９から７０のいずれか一項の使用。
【0241】
第４の態様において、本開示は、本開示の方法のいずれかを実行する手段を含むデータプロセシング装置／系、特に第１の態様の方法（例えば、項目１～３５および３５ａのいずれか１つに規定される方法）および／または第２の態様の方法（例えば、項目３６または３７に規定される方法）を提供する。
【0242】
第５の態様において、本開示は、本開示の方法、特に第１の態様の方法（例えば、項目１～３５および３５ａのいずれか１つに規定される方法）および／または第２の態様の方法（例えば、項目３６または３７に規定される方法）のいずれかを実行するように適合されたコンピュータプログラムを提供する。
【0243】
第６の態様において、本開示は、本開示の第５の態様のプログラムを含むコンピュータ可読記憶媒体またはデータ担体を提供する。
【0244】
本開示のさらなる態様が、本明細書中に開示される。
本開示は、以下の態様を提供し得る。
［項１］
試料組成物の１つまたは複数のパラメーターを決定する方法であって、前記試料組成物は、ＲＮＡを、および適宜粒子を含み、前記方法は、
（ａ）前記試料組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーションに供することによって、前記試料組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の試料画分を生成する工程と；
（ｂ）工程（ａ）から得た前記１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナル、および適宜光散乱（ＬＳ）シグナルを測定する工程と；
（ｃ）前記ＵＶシグナルから、かつ適宜前記ＬＳシグナルから、１つまたは複数のパラメーターを算出する工程と
を含み、
前記１つまたは複数のパラメーターは、ＲＮＡ完全性、ＲＮＡの総量、遊離ＲＮＡの量、粒子に結合したＲＮＡの量、ＲＮＡ含有粒子のサイズ、ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布、およびＲＮＡ含有粒子の定量的サイズ分布を含む、方法。
［項２］
前記フィールド－フローフラクショネーションが、フローフィールド－フローフラクショネーション、例えば、非対称フローフィールド－フローフラクショネーション（ＡＦ４）またはホローファイバーフローフィールド－フローフラクショネーション（ＨＦ５）である、項１に記載の方法。
［項３］
工程（ａ）が、ＲＮＡが透過するのを防止するのに適した分子量（ＭＷ）カットオフを有する膜、好ましくは２ｋＤａから３０ｋＤａの範囲内のＭＷカットオフ、例えば１０ｋＤａのＭＷカットオフを有する膜を用いて実行される、項１または２に記載の方法。
［項４］
工程（ａ）が、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）または再生セルロース膜を用いて実行される、項１から３のいずれか一項に記載の方法。
［項５］
工程（ａ）が、最大８ｍＬ／分、好ましくは最大４ｍＬ／分、より好ましくは最大２ｍＬ／分のクロスフローレートを用いて実行される、項１から４のいずれか一項に記載の方法。
［項６］
工程（ａ）が、以下のクロスフローレートプロファイル：１０分間の１．０～２．０ｍＬ／分、３０分以内の１．０～２．０ｍＬ／分から０．０１～０．０７ｍＬ／分への指数勾配；３０分間の０．０１～０．０７ｍＬ／分；および１０分間の０ｍＬ／分を用いて実行される、項１から５のいずれか一項に記載の方法。
［項７］
工程（ａ）が、インジェクトフローを、０．０５～０．３５ｍＬ／分の範囲内で、好ましくは０．１０～０．３０ｍＬ／分の範囲内で、より好ましくは０．１５～０．２５ｍＬ／分の範囲内で用いて実行される、項１から６のいずれか一項に記載の方法。
［項８］
工程（ａ）が、検出器フローを、０．３０～０．７０ｍＬ／分の範囲内で、好ましくは０．４０～０．６０ｍＬ／分の範囲内で、より好ましくは０．４５～０．５５ｍＬ／分の範囲内で用いて実行される、項１から７のいずれか一項に記載の方法。
［項９］
前記試料組成物中に含有される前記ＲＮＡの完全性が、対照ＲＮＡの完全性を用いて算出される、項１から８のいずれか一項に記載の方法。
［項１０］
前記対照ＲＮＡの完全性が、以下の工程：
（ａ’）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、前記対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ’）工程（ａ’）から得た前記１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ’１）工程（ｂ’）において得た前記ＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの最大高さから前記ＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ ５０％ （対照）を得る工程と；
（ｃ’２）工程（ｂ’）において得た前記ＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた前記１つのピークの総面積を算出することによって、Ａ １００％ （対照）を得る工程と；
（ｃ’３）Ａ ５０％ （対照）とＡ １００％ （対照）との比率を求めることによって、前記対照ＲＮＡの完全性［Ｉ（対照）］を得る工程と
によって求められる、項９に記載の方法。
［項１１］
前記試料組成物中に含有される前記ＲＮＡの完全性が、以下の工程：
（ｃ１）工程（ｂ）から得た前記試料ＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた前記対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの最大高さから前記試料ＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ ５０％ （試料）を得る工程と；
（ｃ２）工程（ｂ）から得た前記試料ＵＶシグナルから、工程（ｃ１）において用いた前記試料ＵＶピークの総面積を算出することによって、Ａ １００％ （試料）を得る工程と；
（ｃ３）Ａ ５０％ （試料）とＡ １００％ （試料）との比率を求めることによって、Ｉ（試料）を得る工程と；
（ｃ４）Ｉ（試料）とＩ（対照）との比率を求めることによって、前記試料組成物中に含有される前記ＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出される、項１０に記載の方法。
［項１２］
前記対照ＲＮＡの完全性を算出する工程が、以下の工程：
（ａ”）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、前記対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ”）工程（ａ”）から得た前記１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ”）工程（ｂ”）において得た前記ＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの高さ［Ｈ（対照）］を求めることによって、前記対照ＲＮＡの完全性を得る工程と
によって決定される、項９に記載の方法。
［項１３］
前記試料組成物中に含有される前記ＲＮＡの完全性が、以下の工程：
（ｃ１’）工程（ｂ）において得た前記ＵＶシグナルから、工程（ｃ”）において用いた前記対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの高さ［Ｈ（試料）］を求める工程と；
（ｃ２’）Ｈ（試料）とＨ（対照）との比率を求めることによって、前記試料組成物中に含有される前記ＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出される、項１２に記載の方法。
［項１４］
ＲＮＡの量が、（ｉ）ＲＮＡ減衰係数または（ｉｉ）ＲＮＡ較正曲線を用いることによって求められる、項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
［項１５］
前記試料組成物が、ＲＮＡ、ならびにＲＮＡが結合している粒子、例えば、リポプレックス粒子および／または脂質ナノ粒子および／またはポリプレックス粒子および／またはリポポリプレックス粒子および／またはウイルス様粒子を含む、項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
［項１６］
総ＲＮＡの量が、（ｉ）前記試料組成物の少なくとも一部を放出剤により処理する工程と；（ｉｉ）工程（ａ）～工程（ｃ）を、工程（ｉ）から得た少なくとも前記一部に実行する工程と；（ｉｉｉ）項１４に規定されるＲＮＡの量を求める工程とによって求められる、項１５に記載の方法。
［項１７］
工程（ａ）において、前記フィールド－フローフラクショネーションが、前記放出剤を含有する液相を用いて実行される、項１６に記載の方法。
［項１８］
前記放出剤が、（ｉ）界面活性剤、例えば、陰イオン界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム）、双性イオン界面活性剤［例えばｎ－テトラデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホナート（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３－１４）］、陽イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、もしくはそれらの混合物；（ｉｉ）アルコール、例えば脂肪族アルコール（例えばエタノール）、もしくはアルコールの混合液；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組合せである、項１６または１７に記載の方法。
［項１９］
遊離ＲＮＡの量が、放出剤の添加なしで、特にいかなる放出剤もなく、工程（ａ）～（ｃ）を実行すること；および項１４に規定されるＲＮＡの量を求めることによって求められる、項１５から１８のいずれか一項に記載の方法。
［項２０］
粒子に結合したＲＮＡの量が、項１９によって求めた遊離ＲＮＡの前記量を、項１６から１８のいずれか一項によって求めた総ＲＮＡの前記量から減算することによって求められる、項１５から１９のいずれか一項に記載の方法。
［項２１］
工程（ｂ）がさらに、工程（ａ）から得た前記１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つのＬＳシグナル、例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）シグナルおよび／または静的光散乱（ＳＬＳ）、例えば多角度光散乱（ＭＡＬＳ）シグナルを測定することを含む、項１５から２０のいずれか一項に記載の方法。
［項２２］
ＲＮＡ含有粒子のサイズが、工程（ｂ）から得た前記ＬＳシグナルから、回転半径（Ｒ ｇ ）値および／または流体力学半径（Ｒ ｈ ）値を算出することによって求められる、項２１に記載の方法。
［項２３］
実験的に求めた前記Ｒ ｇ 値および／または前記Ｒ ｈ 値が、好ましくは、実験的に求めたか、または算出した前記Ｒ ｇ 値または前記Ｒ ｈ 値を、多項式関数または線形関数に適合させて、多項式適合または線形適合に基づくＲ ｇ 値またはＲ ｈ 値を再算出することによって平滑化される、項２１に記載の方法。
［項２４］
ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布が、工程（ｂ）から得た前記ＵＶシグナルを、項２２に規定するように求めた前記Ｒ ｇ 値または前記Ｒ ｈ 値に対してプロットすることによって求められる、項２１から２３のいずれか一項に記載の方法。
［項２５］
ＲＮＡ含有粒子の前記定量的サイズ分布が、前記Ｒ ｇ 値または前記Ｒ ｈ 値の関数として前記ＵＶシグナルを示すプロットから、前記ＵＶシグナルを累積重量分率に変換して、前記累積重量分率を前記Ｒ ｇ 値または前記Ｒ ｈ 値に対してプロットすることによって算出される、項２１から２４のいずれか一項に記載の方法。
［項２６］
前記定量的サイズ分布が、Ｄ１０値、Ｄ５０値、および／またはＤ９０値を含む、項２５に記載の方法。
［項２７］
工程（ｂ）が、工程（ａ）から得た前記１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの動的光散乱（ＤＬＳ）シグナルを測定することを含み、工程（ｃ）が、前記ＤＬＳシグナルからＲ ｈ 値を算出することを含む、項２２から２６のいずれか一項に記載の方法。
［項２８］
前記１つまたは複数のパラメーターが、遊離ＲＮＡの量、粒子に結合したＲＮＡの量、ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布、およびＲＮＡ含有粒子の定量的サイズ分布からなる群から選択される、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つのパラメーターを含む（またはである）、項１５から２７のいずれか一項に記載の方法。
［項２９］
ＲＮＡの前記量、特に遊離ＲＮＡの前記量が、２６０ｎｍでのＵＶシグナルを測定し、２６０ｎｍでのＲＮＡ減衰係数を用いることによって、または２８０ｎｍでのＵＶシグナルを測定し、２８０ｎｍでのＲＮＡ減衰係数を用いることによって求められる、項１５から２８のいずれか一項に記載の方法。
［項３０］
ＲＮＡ含有粒子の前記サイズ分布および／またはＲＮＡ含有粒子の前記定量的サイズ分布が、１０～２０００ｎｍの範囲内、好ましくは２０～１５００ｎｍ、例えば、３０～１２００ｎｍ、４０～１１００ｎｍ、５０～１０００、６０～９００ｎｍ、７０～８００ｎｍ、８０～７００ｎｍ、９０～６００ｎｍ、または１００～５００ｎｍの範囲内、例えば、１０～１０００ｎｍ、１５～５００ｎｍ、２０～４５０ｎｍ、２５～４００ｎｍ、３０～３５０ｎｍ、４０～３００ｎｍ、または５０～２５０ｎｍの範囲内である、項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
［項３１］
前記ＲＮＡが、１０～１５，０００ヌクレオチド、例えば、４０～１５，０００ヌクレオチド、１００～１２，０００ヌクレオチド、または２００～１０，０００ヌクレオチド長を有する、項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
［項３２］
前記ＲＮＡが、インビトロ転写ＲＮＡ、特にインビトロ転写ｍＲＮＡである、項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
［項３３］
前記ＵＶシグナル、適宜前記ＬＳシグナル、例えば前記ＳＬＳ、例えばＭＡＬＳシグナルおよび／もしくは前記ＤＬＳシグナルを測定する工程がオンラインで実行され、かつ／または工程（ｃ）がオンラインで実行される、項１から３２のいずれか一項に記載の方法。
［項３４］
前記試料組成物の少なくとも一部をフィールド－フローフラクショネーションに供する前に、前記試料組成物の前記少なくとも一部が、溶媒または溶媒混合液により希釈され、前記溶媒または前記溶媒混合液が、粒子の凝集体の形成を防止することができる、項１５から３３のいずれか一項に記載の方法。
［項３５］
前記溶媒混合液が、水および有機溶媒、例えばホルムアミドの混合液である、項３６に記載の方法。
［項３６］
前記ＵＶシグナルを測定する工程が、円二色性（ＣＤ）分光法を用いることによって実行される、項１から３５のいずれか一項に記載の方法。
［項３７］
ＲＮＡおよび適宜粒子を含む組成物を用意する場合に、１つまたは複数の反応条件を変更する影響を分析する方法であって、
（Ａ）ＲＮＡおよび適宜粒子を含む第１の組成物を用意する工程と；
（Ｂ）ＲＮＡおよび適宜粒子を含む第２の組成物を用意する工程であって、前記第１の組成物を用意する工程と、前記１つまたは複数の反応条件のみが異なる、工程と；
（Ｃ）前記第１の組成物の一部を、項１から３６のいずれか一項に記載の方法に供することによって、前記第１の組成物の１つまたは複数のパラメーターを決定する工程と；
（Ｄ）前記第２の組成物の対応する一部を、工程（Ｃ）において用いた前記方法に供することによって、前記第２の組成物の１つまたは複数のパラメーターを決定する工程と；
（Ｅ）工程（Ｃ）において得た前記第１の組成物の前記１つまたは複数のパラメーターを、工程（Ｄ）において得た前記第２の組成物の前記対応する１つまたは複数のパラメーターと比較する工程と
を含む方法。
［項３８］
前記１つまたは複数の反応条件が、塩濃度／イオン強度（例えば、２ｍＭ ＮａＣｌまたは１００ｍＭ ＮａＣｌ）；温度［例えば、低温（例えば－２０℃）または高温（例えば５０℃）］；ｐＨまたはバッファ濃度；光／放射線；酸素；剪断力；圧力；凍結／解凍サイクル；乾燥／復元サイクル；賦形剤（例えば、スタビライザーおよび／またはキレート化剤）の添加；粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー、例えば、陽イオン脂質対双性イオン脂質、またはペグ化脂質対非ペグ化脂質）のタイプおよび／または源；電荷比；物理的状態；ならびにＲＮＡの、粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）に対する比率のいずれかを含む、項３７に記載の方法。
［項３９］
ＲＮＡおよび適宜粒子を含む試料組成物の１つまたは複数のパラメーターを決定するためのフィールド－フローフラクショネーションの使用であって、前記１つまたは複数のパラメーターは、ＲＮＡ完全性、ＲＮＡの総量、遊離ＲＮＡの量、粒子に結合したＲＮＡの量、ＲＮＡ含有粒子のサイズ（例えば、ＲＮＡ含有粒子の流体力学半径）、ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布、およびＲＮＡ含有粒子の定量的サイズ分布を含む、使用。
［項４０］
前記フィールド－フローフラクショネーションが、
（ａ）前記試料組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーションに供することによって、前記試料組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の試料画分を生成する工程と；
（ｂ）工程（ａ）から得た前記１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナル、および適宜光散乱（ＬＳ）シグナルを測定する工程と；
（ｃ）前記ＵＶシグナルから、かつ適宜前記ＬＳシグナルから、１つまたは複数のパラメーターを算出する工程と
を含む、項３９に記載の使用。
［項４１］
前記フィールド－フローフラクショネーションが、フローフィールド－フローフラクショネーション、例えば、非対称フローフィールド－フローフラクショネーション（ＡＦ４）またはホローファイバーフローフィールド－フローフラクショネーション（ＨＦ５）である、項３９または４０に記載の使用。
［項４２］
前記フィールド－フローフラクショネーションが、ＲＮＡが透過するのを防止するのに適した分子量（ＭＷ）カットオフを有する膜、好ましくは２ｋＤａから３０ｋＤａの範囲内のＭＷカットオフ、例えば１０ｋＤａのＭＷカットオフを有する膜を用いる、項３９から４１のいずれか一項に記載の使用。
［項４３］
前記フィールド－フローフラクショネーションが、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）または再生セルロース膜を用いる、項３９から４２のいずれか一項に記載の使用。
［項４４］
工程（ａ）が、
（Ｉ）最大８ｍＬ／分、好ましくは最大４ｍＬ／分、より好ましくは最大２ｍＬ／分、例えば、以下のクロスフローレートプロファイル：１０分間の１．０～２．０ｍＬ／分、３０分以内の１．０～２．０ｍＬ／分から０．０１～０．０７ｍＬ／分への指数勾配；３０分間の０．０１～０．０７ｍＬ／分；および１０分間の０ｍＬ／分のクロスフローレート；ならびに／または
（ＩＩ）０．０５～０．３５ｍＬ／分の範囲内の、好ましくは０．１０～０．３０ｍＬ／分の範囲内、より好ましくは０．１５～０．２５ｍＬ／分の範囲内のインジェクトフロー；ならびに／または
（ＩＩＩ）０．３０～０．７０ｍＬ／分の範囲内、好ましくは０．４０～０．６０ｍＬ／分の範囲内、より好ましくは０．４５～０．５５ｍＬ／分の範囲内の検出器フロー
を用いて実行される、項４０から４３のいずれか一項に記載の使用。
［項４５］
前記試料組成物中に含有される前記ＲＮＡの完全性が、対照ＲＮＡの完全性を用いて求められる、項３９から４４のいずれか一項に記載の使用。
［項４６］
前記対照ＲＮＡの完全性が、以下の工程：
（ａ’）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、前記対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ’）工程（ａ’）から得た前記１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ’１）工程（ｂ’）において得た前記ＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの最大高さから前記ＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ ５０％ （対照）を得る工程と；
（ｃ’２）工程（ｂ’）において得た前記ＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた前記１つのピークの総面積を算出することによって、Ａ １００％ （対照）を得る工程と；
（ｃ’３）Ａ ５０％ （対照）とＡ １００％ （対照）との比率を求めることによって、前記対照ＲＮＡの完全性［Ｉ（対照）］を得る工程と
によって求められる、項４５に記載の使用。
［項４７］
前記試料組成物中に含有される前記ＲＮＡの完全性が、以下の工程：
（ｃ１）工程（ｂ）から得た前記試料ＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた前記対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの最大高さから前記試料ＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ ５０％ （試料）を得る工程と；
（ｃ２）工程（ｂ）から得た前記試料ＵＶシグナルから、工程（ｃ１）において用いた前記試料ＵＶピークの総面積を算出することによって、Ａ １００％ （試料）を得る工程と；
（ｃ３）Ａ ５０％ （試料）とＡ １００％ （試料）との比率を求めることによって、Ｉ（試料）を得る工程と；
（ｃ４）Ｉ（試料）とＩ（対照）との比率を求めることによって、前記試料組成物中に含有される前記ＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出される、項４６に記載の使用。
［項４８］
前記対照ＲＮＡの完全性を算出する工程が、以下の工程：
（ａ”）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、前記対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ”）工程（ａ”）から得た前記１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ”）工程（ｂ”）において得た前記ＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの高さ［Ｈ（対照）］を求めることによって、前記対照ＲＮＡの完全性を得る工程と
によって決定される、項４５に記載の使用。
［項４９］
前記試料組成物中に含有される前記ＲＮＡの完全性が、以下の工程：
（ｃ１’）工程（ｂ）において得た前記ＵＶシグナルから、工程（ｃ”）において用いた前記対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの高さ［Ｈ（試料）］を求める工程と；
（ｃ２’）Ｈ（試料）とＨ（対照）との比率を求めることによって、前記試料組成物中に含有される前記ＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出される、項４８に記載の使用。
［項５０］
ＲＮＡの量が、（ｉ）ＲＮＡ減衰係数または（ｉｉ）ＲＮＡ較正曲線を用いることによって求められる、項３９から４９のいずれか一項に記載の使用。
［項５１］
前記試料組成物が、ＲＮＡ、ならびにＲＮＡが結合している粒子、例えば、リポプレックス粒子および／または脂質ナノ粒子および／またはポリプレックス粒子および／またはリポポリプレックス粒子および／またはウイルス様粒子を含む、項４０から５０のいずれか一項に記載の使用。
［項５２］
総ＲＮＡの量が、（ｉ）前記試料組成物の少なくとも一部を放出剤により処理する工程と；（ｉｉ）工程（ａ）～工程（ｃ）を、工程（ｉ）から得た少なくとも前記一部に実行する工程と；（ｉｉｉ）項５０に規定されるＲＮＡの量を求める工程とによって求められる、項５１に記載の使用。
［項５３］
工程（ａ）において、前記フィールド－フローフラクショネーションが、前記放出剤を含有する液相を用いて実行される、項５２に記載の使用。
［項５４］
前記放出剤が、（ｉ）界面活性剤、例えば、陰イオン界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム）、双性イオン界面活性剤［例えばｎ－テトラデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホナート（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３－１４）］、陽イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、もしくはそれらの混合物；（ｉｉ）アルコール、例えば脂肪族アルコール（例えばエタノール）、もしくはアルコールの混合液；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組合せである、項５２または５３に記載の使用。
［項５５］
遊離ＲＮＡの量が、放出剤の添加なしで、特にいかなる放出剤もなく、工程（ａ）～（ｃ）を実行すること；および項５０に規定されるＲＮＡの量を求めることによって求められる、項５１から５４のいずれか一項に記載の使用。
［項５６］
粒子に結合したＲＮＡの量が、項５５によって求めた遊離ＲＮＡの前記量を、項５２から５４のいずれか一項によって求めた総ＲＮＡの前記量から減算することによって求められる、項５１から５５のいずれか一項に記載の使用。
［項５７］
工程（ｂ）がさらに、工程（ａ）から得た前記１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つのＬＳシグナル、例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）シグナルおよび／または静的光散乱（ＳＬＳ）、例えば多角度光散乱（ＭＡＬＳ）シグナルを測定することを含む、項５１から５６のいずれか一項に記載の使用。
［項５８］
ＲＮＡ含有粒子のサイズが、工程（ｂ）から得た前記ＬＳシグナルから、回転半径（Ｒ ｇ ）値および／または流体力学半径（Ｒ ｈ ）値を算出することによって求められる、項５７に記載の使用。
［項５９］
実験的に求めた前記Ｒ ｇ 値および／または前記Ｒ ｈ 値が、好ましくは、実験的に求めたか、または算出した前記Ｒ ｇ 値または前記Ｒ ｈ 値を、多項式関数または線形関数に適合させて、多項式適合または線形適合に基づくＲ ｇ 値またはＲ ｈ 値を再算出することによって平滑化される、項５８に記載の使用。
［項６０］
ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布が、工程（ｂ）から得た前記ＵＶシグナルを、項５８に規定するように求めた前記Ｒ ｇ 値または前記Ｒ ｈ 値に対してプロットすることによって求められる、項５７から５９のいずれか一項に記載の使用。
［項６１］
ＲＮＡ含有粒子の前記定量的サイズ分布が、前記Ｒ ｇ 値または前記Ｒ ｈ 値の関数として前記ＵＶシグナルを示すプロットから、前記ＵＶシグナルを累積重量分率に変換して、前記累積重量分率を前記Ｒ ｇ 値または前記Ｒ ｈ 値に対してプロットすることによって算出される、項５７から６０のいずれか一項に記載の使用。
［項６２］
前記定量的サイズ分布が、Ｄ１０値、Ｄ５０値、および／またはＤ９０値を含む、項６１に記載の使用。
［項６３］
工程（ｂ）が、工程（ａ）から得た前記１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの動的光散乱（ＤＬＳ）シグナルを測定することを含み、工程（ｃ）が、前記ＤＬＳシグナルからＲ ｈ 値を算出することを含む、項５８から６２のいずれか一項に記載の使用。
［項６４］
前記１つまたは複数のパラメーターが、遊離ＲＮＡの量、粒子に結合したＲＮＡの量、ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布、およびＲＮＡ含有粒子の定量的サイズ分布からなる群から選択される、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つのパラメーターを含む（またはである）、項５１から６３のいずれか一項に記載の使用。
［項６５］
ＲＮＡの前記量、特に遊離ＲＮＡの前記量が、２６０ｎｍでのＵＶシグナルを測定し、２６０ｎｍでのＲＮＡ減衰係数を用いることによって、または２８０ｎｍでのＵＶシグナルを測定し、２８０ｎｍでのＲＮＡ減衰係数を用いることによって求められる、項５１から６４のいずれか一項に記載の使用。
［項６６］
ＲＮＡ含有粒子の前記サイズ分布および／またはＲＮＡ含有粒子の前記定量的サイズ分布が、１０～２０００ｎｍの範囲内、好ましくは２０～１５００ｎｍ、例えば、３０～１２００ｎｍ、４０～１１００ｎｍ、５０～１０００、６０～９００ｎｍ、７０～８００ｎｍ、８０～７００ｎｍ、９０～６００ｎｍ、または１００～５００ｎｍの範囲内、例えば、１０～１０００ｎｍ、１５～５００ｎｍ、２０～４５０ｎｍ、２５～４００ｎｍ、３０～３５０ｎｍ、４０～３００ｎｍ、または５０～２５０ｎｍの範囲内である、項３９から６５のいずれか一項に記載の使用。
［項６７］
前記ＲＮＡが、１０～１５，０００ヌクレオチド、例えば、４０～１５，０００ヌクレオチド、１００～１２，０００ヌクレオチド、または２００～１０，０００ヌクレオチド長を有する、項３９から６６のいずれか一項に記載の使用。
［項６８］
前記ＲＮＡが、インビトロ転写ＲＮＡ、特にインビトロ転写ｍＲＮＡである、項３９から６７のいずれか一項に記載の使用。
［項６９］
前記ＵＶシグナル、適宜前記ＬＳシグナル、例えばＳＬＳ、例えばＭＡＬＳシグナルおよび／もしくは前記ＤＬＳシグナルを測定する工程がオンラインで実行され、かつ／または工程（ｃ）がオンラインで実行される、項４０から６８のいずれか一項に記載の使用。
［項７０］
前記試料組成物の少なくとも一部をフィールド－フローフラクショネーションに供する前に、前記試料組成物の前記少なくとも一部が、溶媒または溶媒混合液により希釈され、前記溶媒または前記溶媒混合液が、粒子の凝集体の形成を防止することができる、項４０から６９のいずれか一項に記載の使用。
［項７１］
前記溶媒混合液が、水および有機溶媒、例えばホルムアミドの混合液である、項７０に記載の使用。
［項７２］
前記ＵＶシグナルを測定する工程が、ＣＤ分光法を用いることによって実行される、項４０から７１のいずれか一項に記載の使用。
本開示は、以下の態様を提供し得る。
［項１］
試料組成物の１つまたは複数のパラメーターを決定する方法であって、前記試料組成物は、ＲＮＡを、および適宜粒子を含み、前記方法は、
（ａ）前記試料組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーションに供することによって、前記試料組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の試料画分を生成する工程と；
（ｂ）工程（ａ）から得た前記１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナル、および適宜光散乱（ＬＳ）シグナルを測定する工程と；
（ｃ）前記ＵＶシグナルから、かつ適宜前記ＬＳシグナルから、１つまたは複数のパラメーターを算出する工程と
を含み、
前記１つまたは複数のパラメーターは、ＲＮＡ完全性、ＲＮＡの総量、遊離ＲＮＡの量、粒子に結合したＲＮＡの量、ＲＮＡ含有粒子のサイズ、ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布、およびＲＮＡ含有粒子の定量的サイズ分布を含む、方法。
［項２］
前記フィールド－フローフラクショネーションが、フローフィールド－フローフラクショネーション、例えば、非対称フローフィールド－フローフラクショネーション（ＡＦ４）またはホローファイバーフローフィールド－フローフラクショネーション（ＨＦ５）である、項１に記載の方法。
［項３］
工程（ａ）が、ＲＮＡが透過するのを防止するのに適した分子量（ＭＷ）カットオフを有する膜、好ましくは２ｋＤａから３０ｋＤａの範囲内のＭＷカットオフ、例えば１０ｋＤａのＭＷカットオフを有する膜を用いて実行される、項１または２に記載の方法。
［項４］
工程（ａ）が、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）または再生セルロース膜を用いて実行される、項１から３のいずれか一項に記載の方法。
［項５］
工程（ａ）が、最大８ｍＬ／分、好ましくは最大４ｍＬ／分、より好ましくは最大２ｍＬ／分のクロスフローレートを用いて実行される、項１から４のいずれか一項に記載の方法。
［項６］
工程（ａ）が、以下のクロスフローレートプロファイル：１０分間の１．０～２．０ｍＬ／分、３０分以内の１．０～２．０ｍＬ／分から０．０１～０．０７ｍＬ／分への指数勾配；３０分間の０．０１～０．０７ｍＬ／分；および１０分間の０ｍＬ／分を用いて実行される、項１から５のいずれか一項に記載の方法。
［項７］
工程（ａ）が、インジェクトフローを、０．０５～０．３５ｍＬ／分の範囲内で、好ましくは０．１０～０．３０ｍＬ／分の範囲内で、より好ましくは０．１５～０．２５ｍＬ／分の範囲内で用いて実行される、項１から６のいずれか一項に記載の方法。
［項８］
工程（ａ）が、検出器フローを、０．３０～０．７０ｍＬ／分の範囲内で、好ましくは０．４０～０．６０ｍＬ／分の範囲内で、より好ましくは０．４５～０．５５ｍＬ／分の範囲内で用いて実行される、項１から７のいずれか一項に記載の方法。
［項９］
前記試料組成物中に含有される前記ＲＮＡの完全性が、対照ＲＮＡの完全性を用いて算出される、項１から８のいずれか一項に記載の方法。
［項１０］
前記対照ＲＮＡの完全性が、以下の工程：
（ａ’）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、前記対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ’）工程（ａ’）から得た前記１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ’１）工程（ｂ’）において得た前記ＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの最大高さから前記ＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ ５０％ （対照）を得る工程と；
（ｃ’２）工程（ｂ’）において得た前記ＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた前記１つのピークの総面積を算出することによって、Ａ １００％ （対照）を得る工程と；
（ｃ’３）Ａ ５０％ （対照）とＡ １００％ （対照）との比率を求めることによって、前記対照ＲＮＡの完全性［Ｉ（対照）］を得る工程と
によって求められる、項９に記載の方法。
［項１１］
前記試料組成物中に含有される前記ＲＮＡの完全性が、以下の工程：
（ｃ１）工程（ｂ）から得た前記試料ＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた前記対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの最大高さから前記試料ＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ ５０％ （試料）を得る工程と；
（ｃ２）工程（ｂ）から得た前記試料ＵＶシグナルから、工程（ｃ１）において用いた前記試料ＵＶピークの総面積を算出することによって、Ａ １００％ （試料）を得る工程と；
（ｃ３）Ａ ５０％ （試料）とＡ １００％ （試料）との比率を求めることによって、Ｉ（試料）を得る工程と；
（ｃ４）Ｉ（試料）とＩ（対照）との比率を求めることによって、前記試料組成物中に含有される前記ＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出される、項１０に記載の方法。
［項１２］
前記対照ＲＮＡの完全性を算出する工程が、以下の工程：
（ａ”）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、前記対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ”）工程（ａ”）から得た前記１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ”）工程（ｂ”）において得た前記ＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの高さ［Ｈ（対照）］を求めることによって、前記対照ＲＮＡの完全性を得る工程と
によって決定される、項９に記載の方法。
［項１３］
前記試料組成物中に含有される前記ＲＮＡの完全性が、以下の工程：
（ｃ１’）工程（ｂ）において得た前記ＵＶシグナルから、工程（ｃ”）において用いた前記対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの高さ［Ｈ（試料）］を求める工程と；
（ｃ２’）Ｈ（試料）とＨ（対照）との比率を求めることによって、前記試料組成物中に含有される前記ＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出される、項１２に記載の方法。
［項１４］
ＲＮＡの量が、（ｉ）ＲＮＡ減衰係数または（ｉｉ）ＲＮＡ較正曲線を用いることによって求められる、項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
［項１５］
前記試料組成物が、ＲＮＡ、ならびにＲＮＡが結合している粒子、例えば、リポプレックス粒子および／または脂質ナノ粒子および／またはポリプレックス粒子および／またはリポポリプレックス粒子および／またはウイルス様粒子を含む、項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
［項１６］
総ＲＮＡの量が、（ｉ）前記試料組成物の少なくとも一部を放出剤により処理する工程と；（ｉｉ）工程（ａ）～工程（ｃ）を、工程（ｉ）から得た少なくとも前記一部に実行する工程と；（ｉｉｉ）項１４に規定されるＲＮＡの量を求める工程とによって求められる、項１５に記載の方法。
［項１７］
工程（ａ）において、前記フィールド－フローフラクショネーションが、前記放出剤を含有する液相を用いて実行される、項１６に記載の方法。
［項１８］
前記放出剤が、（ｉ）界面活性剤、例えば、陰イオン界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム）、双性イオン界面活性剤［例えばｎ－テトラデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホナート（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３－１４）］、陽イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、もしくはそれらの混合物；（ｉｉ）アルコール、例えば脂肪族アルコール（例えばエタノール）、もしくはアルコールの混合液；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組合せである、項１６または１７に記載の方法。
［項１９］
遊離ＲＮＡの量が、放出剤の添加なしで、特にいかなる放出剤もなく、工程（ａ）～（ｃ）を実行すること；および項１４に規定されるＲＮＡの量を求めることによって求められる、項１５から１８のいずれか一項に記載の方法。
［項２０］
粒子に結合したＲＮＡの量が、項１９によって求めた遊離ＲＮＡの前記量を、項１６から１８のいずれか一項によって求めた総ＲＮＡの前記量から減算することによって求められる、項１５から１９のいずれか一項に記載の方法。
［項２１］
工程（ｂ）がさらに、工程（ａ）から得た前記１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つのＬＳシグナル、例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）シグナルおよび／または静的光散乱（ＳＬＳ）、例えば多角度光散乱（ＭＡＬＳ）シグナルを測定することを含む、項１５から２０のいずれか一項に記載の方法。
［項２２］
ＲＮＡ含有粒子のサイズが、工程（ｂ）から得た前記ＬＳシグナルから、回転半径（Ｒ ｇ ）値および／または流体力学半径（Ｒ ｈ ）値を算出することによって求められる、項２１に記載の方法。
［項２３］
実験的に求めた前記Ｒ ｇ 値および／または前記Ｒ ｈ 値が、好ましくは、実験的に求めたか、または算出した前記Ｒ ｇ 値または前記Ｒ ｈ 値を、多項式関数または線形関数に適合させて、多項式適合または線形適合に基づくＲ ｇ 値またはＲ ｈ 値を再算出することによって平滑化される、項２１に記載の方法。
［項２４］
ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布が、工程（ｂ）から得た前記ＵＶシグナルを、項２２に規定するように求めた前記Ｒ ｇ 値または前記Ｒ ｈ 値に対してプロットすることによって求められる、項２１から２３のいずれか一項に記載の方法。
［項２５］
ＲＮＡ含有粒子の前記定量的サイズ分布が、前記Ｒ ｇ 値または前記Ｒ ｈ 値の関数として前記ＵＶシグナルを示すプロットから、前記ＵＶシグナルを累積重量分率に変換して、前記累積重量分率を前記Ｒ ｇ 値または前記Ｒ ｈ 値に対してプロットすることによって算出される、項２１から２４のいずれか一項に記載の方法。
［項２６］
前記定量的サイズ分布が、Ｄ１０値、Ｄ５０値、および／またはＤ９０値を含む、項２５に記載の方法。
［項２７］
工程（ｂ）が、工程（ａ）から得た前記１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの動的光散乱（ＤＬＳ）シグナルを測定することを含み、工程（ｃ）が、前記ＤＬＳシグナルからＲ ｈ 値を算出することを含む、項２２から２６のいずれか一項に記載の方法。
［項２８］
前記１つまたは複数のパラメーターが、遊離ＲＮＡの量、粒子に結合したＲＮＡの量、ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布、およびＲＮＡ含有粒子の定量的サイズ分布からなる群から選択される、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つのパラメーターを含む（またはである）、項１５から２７のいずれか一項に記載の方法。
［項２９］
ＲＮＡの前記量、特に遊離ＲＮＡの前記量が、２６０ｎｍでのＵＶシグナルを測定し、２６０ｎｍでのＲＮＡ減衰係数を用いることによって、または２８０ｎｍでのＵＶシグナルを測定し、２８０ｎｍでのＲＮＡ減衰係数を用いることによって求められる、項１５から２８のいずれか一項に記載の方法。
［項３０］
ＲＮＡ含有粒子の前記サイズ分布および／またはＲＮＡ含有粒子の前記定量的サイズ分布が、１０～２０００ｎｍの範囲内、好ましくは２０～１５００ｎｍ、例えば、３０～１２００ｎｍ、４０～１１００ｎｍ、５０～１０００、６０～９００ｎｍ、７０～８００ｎｍ、８０～７００ｎｍ、９０～６００ｎｍ、または１００～５００ｎｍの範囲内、例えば、１０～１０００ｎｍ、１５～５００ｎｍ、２０～４５０ｎｍ、２５～４００ｎｍ、３０～３５０ｎｍ、４０～３００ｎｍ、または５０～２５０ｎｍの範囲内である、項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
［項３１］
前記ＲＮＡが、１０～１５，０００ヌクレオチド、例えば、４０～１５，０００ヌクレオチド、１００～１２，０００ヌクレオチド、または２００～１０，０００ヌクレオチド長を有する、項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
［項３２］
前記ＲＮＡが、インビトロ転写ＲＮＡ、特にインビトロ転写ｍＲＮＡである、項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
［項３３］
前記ＵＶシグナル、適宜前記ＬＳシグナル、例えば前記ＳＬＳ、例えばＭＡＬＳシグナルおよび／もしくは前記ＤＬＳシグナルを測定する工程がオンラインで実行され、かつ／または工程（ｃ）がオンラインで実行される、項１から３２のいずれか一項に記載の方法。
［項３４］
前記試料組成物の少なくとも一部をフィールド－フローフラクショネーションに供する前に、前記試料組成物の前記少なくとも一部が、溶媒または溶媒混合液により希釈され、前記溶媒または前記溶媒混合液が、粒子の凝集体の形成を防止することができる、項１５から３３のいずれか一項に記載の方法。
［項３５］
前記溶媒混合液が、水および有機溶媒、例えばホルムアミドの混合液である、項３６に記載の方法。
［項３６］
前記ＵＶシグナルを測定する工程が、円二色性（ＣＤ）分光法を用いることによって実行される、項１から３５のいずれか一項に記載の方法。
［項３７］
ＲＮＡおよび適宜粒子を含む組成物を用意する場合に、１つまたは複数の反応条件を変更する影響を分析する方法であって、
（Ａ）ＲＮＡおよび適宜粒子を含む第１の組成物を用意する工程と；
（Ｂ）ＲＮＡおよび適宜粒子を含む第２の組成物を用意する工程であって、前記第１の組成物を用意する工程と、前記１つまたは複数の反応条件のみが異なる、工程と；
（Ｃ）前記第１の組成物の一部を、項１から３６のいずれか一項に記載の方法に供することによって、前記第１の組成物の１つまたは複数のパラメーターを決定する工程と；
（Ｄ）前記第２の組成物の対応する一部を、工程（Ｃ）において用いた前記方法に供することによって、前記第２の組成物の１つまたは複数のパラメーターを決定する工程と；
（Ｅ）工程（Ｃ）において得た前記第１の組成物の前記１つまたは複数のパラメーターを、工程（Ｄ）において得た前記第２の組成物の前記対応する１つまたは複数のパラメーターと比較する工程と
を含む方法。
［項３８］
前記１つまたは複数の反応条件が、塩濃度／イオン強度（例えば、２ｍＭ ＮａＣｌまたは１００ｍＭ ＮａＣｌ）；温度［例えば、低温（例えば－２０℃）または高温（例えば５０℃）］；ｐＨまたはバッファ濃度；光／放射線；酸素；剪断力；圧力；凍結／解凍サイクル；乾燥／復元サイクル；賦形剤（例えば、スタビライザーおよび／またはキレート化剤）の添加；粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー、例えば、陽イオン脂質対双性イオン脂質、またはペグ化脂質対非ペグ化脂質）のタイプおよび／または源；電荷比；物理的状態；ならびにＲＮＡの、粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）に対する比率のいずれかを含む、項３７に記載の方法。
［項３９］
ＲＮＡおよび適宜粒子を含む試料組成物の１つまたは複数のパラメーターを決定するためのフィールド－フローフラクショネーションの使用であって、前記１つまたは複数のパラメーターは、ＲＮＡ完全性、ＲＮＡの総量、遊離ＲＮＡの量、粒子に結合したＲＮＡの量、ＲＮＡ含有粒子のサイズ（例えば、ＲＮＡ含有粒子の流体力学半径）、ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布、およびＲＮＡ含有粒子の定量的サイズ分布を含む、使用。
［項４０］
前記フィールド－フローフラクショネーションが、
（ａ）前記試料組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーションに供することによって、前記試料組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の試料画分を生成する工程と；
（ｂ）工程（ａ）から得た前記１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナル、および適宜光散乱（ＬＳ）シグナルを測定する工程と；
（ｃ）前記ＵＶシグナルから、かつ適宜前記ＬＳシグナルから、１つまたは複数のパラメーターを算出する工程と
を含む、項３９に記載の使用。
［項４１］
前記フィールド－フローフラクショネーションが、フローフィールド－フローフラクショネーション、例えば、非対称フローフィールド－フローフラクショネーション（ＡＦ４）またはホローファイバーフローフィールド－フローフラクショネーション（ＨＦ５）である、項３９または４０に記載の使用。
［項４２］
前記フィールド－フローフラクショネーションが、ＲＮＡが透過するのを防止するのに適した分子量（ＭＷ）カットオフを有する膜、好ましくは２ｋＤａから３０ｋＤａの範囲内のＭＷカットオフ、例えば１０ｋＤａのＭＷカットオフを有する膜を用いる、項３９から４１のいずれか一項に記載の使用。
［項４３］
前記フィールド－フローフラクショネーションが、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）または再生セルロース膜を用いる、項３９から４２のいずれか一項に記載の使用。
［項４４］
工程（ａ）が、
（Ｉ）最大８ｍＬ／分、好ましくは最大４ｍＬ／分、より好ましくは最大２ｍＬ／分、例えば、以下のクロスフローレートプロファイル：１０分間の１．０～２．０ｍＬ／分、３０分以内の１．０～２．０ｍＬ／分から０．０１～０．０７ｍＬ／分への指数勾配；３０分間の０．０１～０．０７ｍＬ／分；および１０分間の０ｍＬ／分のクロスフローレート；ならびに／または
（ＩＩ）０．０５～０．３５ｍＬ／分の範囲内の、好ましくは０．１０～０．３０ｍＬ／分の範囲内、より好ましくは０．１５～０．２５ｍＬ／分の範囲内のインジェクトフロー；ならびに／または
（ＩＩＩ）０．３０～０．７０ｍＬ／分の範囲内、好ましくは０．４０～０．６０ｍＬ／分の範囲内、より好ましくは０．４５～０．５５ｍＬ／分の範囲内の検出器フロー
を用いて実行される、項４０から４３のいずれか一項に記載の使用。
［項４５］
前記試料組成物中に含有される前記ＲＮＡの完全性が、対照ＲＮＡの完全性を用いて求められる、項３９から４４のいずれか一項に記載の使用。
［項４６］
前記対照ＲＮＡの完全性が、以下の工程：
（ａ’）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、前記対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ’）工程（ａ’）から得た前記１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ’１）工程（ｂ’）において得た前記ＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの最大高さから前記ＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ ５０％ （対照）を得る工程と；
（ｃ’２）工程（ｂ’）において得た前記ＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた前記１つのピークの総面積を算出することによって、Ａ １００％ （対照）を得る工程と；
（ｃ’３）Ａ ５０％ （対照）とＡ １００％ （対照）との比率を求めることによって、前記対照ＲＮＡの完全性［Ｉ（対照）］を得る工程と
によって求められる、項４５に記載の使用。
［項４７］
前記試料組成物中に含有される前記ＲＮＡの完全性が、以下の工程：
（ｃ１）工程（ｂ）から得た前記試料ＵＶシグナルから、工程（ｃ’１）において用いた前記対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの最大高さから前記試料ＵＶピークの終わりまでの面積を算出することによって、Ａ ５０％ （試料）を得る工程と；
（ｃ２）工程（ｂ）から得た前記試料ＵＶシグナルから、工程（ｃ１）において用いた前記試料ＵＶピークの総面積を算出することによって、Ａ １００％ （試料）を得る工程と；
（ｃ３）Ａ ５０％ （試料）とＡ １００％ （試料）との比率を求めることによって、Ｉ（試料）を得る工程と；
（ｃ４）Ｉ（試料）とＩ（対照）との比率を求めることによって、前記試料組成物中に含有される前記ＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出される、項４６に記載の使用。
［項４８］
前記対照ＲＮＡの完全性を算出する工程が、以下の工程：
（ａ”）対照ＲＮＡを含有する対照組成物の少なくとも一部を、フィールド－フローフラクショネーション、特にＡＦ４またはＨＦ５に供することによって、前記対照組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画して、１つまたは複数の対照画分を生成する工程と；
（ｂ”）工程（ａ”）から得た前記１つまたは複数の対照画分の少なくとも１つの少なくともＵＶシグナルを測定する工程と；
（ｃ”）工程（ｂ”）において得た前記ＵＶシグナルから、１つのＵＶピークの高さ［Ｈ（対照）］を求めることによって、前記対照ＲＮＡの完全性を得る工程と
によって決定される、項４５に記載の使用。
［項４９］
前記試料組成物中に含有される前記ＲＮＡの完全性が、以下の工程：
（ｃ１’）工程（ｂ）において得た前記ＵＶシグナルから、工程（ｃ”）において用いた前記対照ＵＶピークに対応する試料ＵＶピークの高さ［Ｈ（試料）］を求める工程と；
（ｃ２’）Ｈ（試料）とＨ（対照）との比率を求めることによって、前記試料組成物中に含有される前記ＲＮＡの完全性を得る工程と
によって算出される、項４８に記載の使用。
［項５０］
ＲＮＡの量が、（ｉ）ＲＮＡ減衰係数または（ｉｉ）ＲＮＡ較正曲線を用いることによって求められる、項３９から４９のいずれか一項に記載の使用。
［項５１］
前記試料組成物が、ＲＮＡ、ならびにＲＮＡが結合している粒子、例えば、リポプレックス粒子および／または脂質ナノ粒子および／またはポリプレックス粒子および／またはリポポリプレックス粒子および／またはウイルス様粒子を含む、項４０から５０のいずれか一項に記載の使用。
［項５２］
総ＲＮＡの量が、（ｉ）前記試料組成物の少なくとも一部を放出剤により処理する工程と；（ｉｉ）工程（ａ）～工程（ｃ）を、工程（ｉ）から得た少なくとも前記一部に実行する工程と；（ｉｉｉ）項５０に規定されるＲＮＡの量を求める工程とによって求められる、項５１に記載の使用。
［項５３］
工程（ａ）において、前記フィールド－フローフラクショネーションが、前記放出剤を含有する液相を用いて実行される、項５２に記載の使用。
［項５４］
前記放出剤が、（ｉ）界面活性剤、例えば、陰イオン界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム）、双性イオン界面活性剤［例えばｎ－テトラデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホナート（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３－１４）］、陽イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、もしくはそれらの混合物；（ｉｉ）アルコール、例えば脂肪族アルコール（例えばエタノール）、もしくはアルコールの混合液；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組合せである、項５２または５３に記載の使用。
［項５５］
遊離ＲＮＡの量が、放出剤の添加なしで、特にいかなる放出剤もなく、工程（ａ）～（ｃ）を実行すること；および項５０に規定されるＲＮＡの量を求めることによって求められる、項５１から５４のいずれか一項に記載の使用。
［項５６］
粒子に結合したＲＮＡの量が、項５５によって求めた遊離ＲＮＡの前記量を、項５２から５４のいずれか一項によって求めた総ＲＮＡの前記量から減算することによって求められる、項５１から５５のいずれか一項に記載の使用。
［項５７］
工程（ｂ）がさらに、工程（ａ）から得た前記１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つのＬＳシグナル、例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）シグナルおよび／または静的光散乱（ＳＬＳ）、例えば多角度光散乱（ＭＡＬＳ）シグナルを測定することを含む、項５１から５６のいずれか一項に記載の使用。
［項５８］
ＲＮＡ含有粒子のサイズが、工程（ｂ）から得た前記ＬＳシグナルから、回転半径（Ｒ ｇ ）値および／または流体力学半径（Ｒ ｈ ）値を算出することによって求められる、項５７に記載の使用。
［項５９］
実験的に求めた前記Ｒ ｇ 値および／または前記Ｒ ｈ 値が、好ましくは、実験的に求めたか、または算出した前記Ｒ ｇ 値または前記Ｒ ｈ 値を、多項式関数または線形関数に適合させて、多項式適合または線形適合に基づくＲ ｇ 値またはＲ ｈ 値を再算出することによって平滑化される、項５８に記載の使用。
［項６０］
ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布が、工程（ｂ）から得た前記ＵＶシグナルを、項５８に規定するように求めた前記Ｒ ｇ 値または前記Ｒ ｈ 値に対してプロットすることによって求められる、項５７から５９のいずれか一項に記載の使用。
［項６１］
ＲＮＡ含有粒子の前記定量的サイズ分布が、前記Ｒ ｇ 値または前記Ｒ ｈ 値の関数として前記ＵＶシグナルを示すプロットから、前記ＵＶシグナルを累積重量分率に変換して、前記累積重量分率を前記Ｒ ｇ 値または前記Ｒ ｈ 値に対してプロットすることによって算出される、項５７から６０のいずれか一項に記載の使用。
［項６２］
前記定量的サイズ分布が、Ｄ１０値、Ｄ５０値、および／またはＤ９０値を含む、項６１に記載の使用。
［項６３］
工程（ｂ）が、工程（ａ）から得た前記１つまたは複数の試料画分の少なくとも１つの動的光散乱（ＤＬＳ）シグナルを測定することを含み、工程（ｃ）が、前記ＤＬＳシグナルからＲ ｈ 値を算出することを含む、項５８から６２のいずれか一項に記載の使用。
［項６４］
前記１つまたは複数のパラメーターが、遊離ＲＮＡの量、粒子に結合したＲＮＡの量、ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布、およびＲＮＡ含有粒子の定量的サイズ分布からなる群から選択される、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つのパラメーターを含む（またはである）、項５１から６３のいずれか一項に記載の使用。
［項６５］
ＲＮＡの前記量、特に遊離ＲＮＡの前記量が、２６０ｎｍでのＵＶシグナルを測定し、２６０ｎｍでのＲＮＡ減衰係数を用いることによって、または２８０ｎｍでのＵＶシグナルを測定し、２８０ｎｍでのＲＮＡ減衰係数を用いることによって求められる、項５１から６４のいずれか一項に記載の使用。
［項６６］
ＲＮＡ含有粒子の前記サイズ分布および／またはＲＮＡ含有粒子の前記定量的サイズ分布が、１０～２０００ｎｍの範囲内、好ましくは２０～１５００ｎｍ、例えば、３０～１２００ｎｍ、４０～１１００ｎｍ、５０～１０００、６０～９００ｎｍ、７０～８００ｎｍ、８０～７００ｎｍ、９０～６００ｎｍ、または１００～５００ｎｍの範囲内、例えば、１０～１０００ｎｍ、１５～５００ｎｍ、２０～４５０ｎｍ、２５～４００ｎｍ、３０～３５０ｎｍ、４０～３００ｎｍ、または５０～２５０ｎｍの範囲内である、項３９から６５のいずれか一項に記載の使用。
［項６７］
前記ＲＮＡが、１０～１５，０００ヌクレオチド、例えば、４０～１５，０００ヌクレオチド、１００～１２，０００ヌクレオチド、または２００～１０，０００ヌクレオチド長を有する、項３９から６６のいずれか一項に記載の使用。
［項６８］
前記ＲＮＡが、インビトロ転写ＲＮＡ、特にインビトロ転写ｍＲＮＡである、項３９から６７のいずれか一項に記載の使用。
［項６９］
前記ＵＶシグナル、適宜前記ＬＳシグナル、例えばＳＬＳ、例えばＭＡＬＳシグナルおよび／もしくは前記ＤＬＳシグナルを測定する工程がオンラインで実行され、かつ／または工程（ｃ）がオンラインで実行される、項４０から６８のいずれか一項に記載の使用。
［項７０］
前記試料組成物の少なくとも一部をフィールド－フローフラクショネーションに供する前に、前記試料組成物の前記少なくとも一部が、溶媒または溶媒混合液により希釈され、前記溶媒または前記溶媒混合液が、粒子の凝集体の形成を防止することができる、項４０から６９のいずれか一項に記載の使用。
［項７１］
前記溶媒混合液が、水および有機溶媒、例えばホルムアミドの混合液である、項７０に記載の使用。
［項７２］
前記ＵＶシグナルを測定する工程が、ＣＤ分光法を用いることによって実行される、項４０から７１のいずれか一項に記載の使用。
【図面の簡単な説明】
【0245】
【図1】図１は、非対称流フィールドフローフラクショネーション（ＡＦ４）分離のタイム－フロープロファイルを示しており、ここで、検出器フロー（Ｖｄ）は０．５ｍＬ／分であり、クロスフロー（Ｖｘ）の開始点は１．５ｍＬ／分であり、０．０４ｍＬ／分まで指数関数的に減少した。
【図2】図２は、相対的ＲＮＡ完全性の評価のための好ましい算出手順の概要を示す。ＡＦ４フラクトグラムの例は、ＲＮＡを分離した後の２６０ｎｍでのＵＶシグナルによって示される。Ａ）対照ＲＮＡの算出における限界。Ｂ）総ＲＮＡピーク面積の算出における限界。Ｃ）わずかに分解したＲＮＡの算出における限界。Ｄ）わずかに分解した総ＲＮＡピーク面積の算出における限界。
【図3】図３は、標準を使用しないＲＮＡの定量化を示す：Ａ）ＲＮＡ原液の異なる注入量をＡＦ４－ＵＶ－ＲＩによって分析した。曲線下ピーク面積（ＵＶは実線；ＲＩは破線）を注入量に対してプロットし、線形回帰を適合した。Ｂ）ＲＮＡの段階希釈を同一の注入量においてＡＦ４－ＵＶ－ＲＩによって測定し、Ａ）と同様に分析した。
【図4】図４は、ＡＦ４－ＵＶ－ＲＩを使用しおよび標準を使用しない分解したＲＮＡの定量化を示す：Ａ）異なる熱分解ＲＮＡおよび未処理ＲＮＡの代表的ＡＦ４フラクトグラムが表される（曲線は２６０ｎｍでのＵＶシグナルを表す）。Ｂ）異なる分解したＲＮＡのＵＶシグナルは濃度に直接相関し、ランベルト・ベールの法則を適用する。
【図5】図５は、本明細書において開示されるＡＦ４法によって分離された試料粒子組成物（１．３／２のモル比において脂質およびＲＮＡを含有する）から得られる代表的フラクトグラムを示す。実線は、９０°の角度における光散乱（ＬＳ）シグナルを表し、それは、粒子ピーク（ｔ＝約３５分）を示しており、その一方で、破線は、ＵＶシグナル（２６０ｎｍにおいて記録）を表し、それは、結合ＲＮＡ（ｔ＝約３８分）および非結合ＲＮＡ（ｔ＝約２０分）を反映している。
【図6-1】図６は、非製剤化ＲＮＡの定量的ＲＮＡ完全性測定を示す：Ａ）異なる熱分解ＲＮＡの代表的ＡＦ４フラクトグラム（ｎ＝３；曲線は２６０ｎｍにおけるＵＶシグナルを表す）。Ｂ）長さにおいて異なる（ＲＮＡ＃１～４；サイズ：９８６～１６８８ｎｔ）４つの熱分解ＲＮＡの算出された平均相対完全性の総括。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を表す。Ｃ）異なる比率を使用してＲＮＡ＃２から得られる代表的ＡＦ４フラクトグラム（未処理のもの、完全に熱分解したもの、ならびに未処理のものと完全に熱分解したものによる５０：５０混合物）。Ｄ）検証実験：異なるＲＮＡ（ＲＮＡ＃１～３、９８６～１６８８ｎｔ）を熱分解させ、規定された方式において混合し（混合物４のＡＦ４フラクトグラムについては、図６Ｃを参照）、ＡＦ４－ＵＶ測定によって分析した。棒グラフは、理論的計算値（黒色のバー）と比較した、本明細書において開示されるＡＦ４法によって求めた相対的ＲＮＡ完全性（暗い灰色のバー、中程度の灰色のバー、および明るい灰色のバー）を表す。
【図6-2】同上。
【図7】図７は、蛍光色素を使用したＲＮＡの定量化との比較において、定量化ＲＮＡに対するＵＶシグナルの適性を実証する（概念の実証）。Ａ）ＵＶピークならびに試料組成物（ＲＮＡおよび蛍光標識された粒子を含む）の蛍光（ＦＳ）積分は、試料組成物中の対応する総ＲＮＡ量に相関した。Ｂ）試料組成物のＵＶピーク面積とＦＳピーク面積との比率の計算値は、広い質量範囲（試料組成物中における１～１５μｇの総ＲＮＡ）にわたって一定であることが見出された。
【図8】図８は、ＲＮＡ試料組成物に対するパラメーターとしてのＵＶ比を示す。Ａ）遊離ＲＮＡならびに粒子に結合したＲＮＡのＵＶピーク積分は、試料組成物中に含有される対応する名目上の総ＲＮＡ量に相関する。Ｂ）遊離ＲＮＡ（ピーク）と結合ＲＮＡ（ピーク）とのＵＶ比の算出。
【図9-1】図９は、ＡＦ４－ＵＶ－ＭＡＬＳによる粒径分布の定量化に対する概念の実証を示す。Ａ）試料組成物（ＲＮＡおよびＡｔｔｏ５９４標識粒子）の代表的ＡＦ４フラクトグラム：破線は、２６０ｎｍにおいて記録したＵＶトレースを表し、実線は、６２４ｎｍにおいて放出された蛍光シグナル（ＦＳ）を表す。Ｂ）ＵＶ／ＦＳ比（破線）を算出し、回転半径（Ｒｇ）に対してプロットし、ならびに粒子ピーク画分（溶出時間：２２～６０分）からの記録されたＵＶシグナル（強調表示された灰色のピーク）もプロットした。ＵＶ／ＦＳ比の５０％未満の変動を有するＲｇエリアが、強調表示されている（四角）。５０ｎｍから３００ｎｍの間のＲｇ範囲において、ＵＶ／ＦＳ比の変動は小さく、ならびに信頼できるサイズ値を与える。より小さいＲｇ値は、ＲＮＡシグナルの影響を受ける。より大きいＲｇ値は、散乱の影響を受ける。合計で、これらの影響を受けるＲｇ値は、総シグナル量の１０％未満である。Ｃ）６２４ｎｍでの蛍光放出および２６０ｎｍでのＵＶシグナルを使用した累積重量分率分析に基づく定量的品質パラメーター（Ｄ１０、Ｄ５０、Ｄ９０）の算出。
【図9-2】同上。
【図10】図１０は、９０°でのＬＳシグナルおよび２６０ｎｍでのＵＶ検出による試料組成物（ＲＮＡおよび粒子）の代表的ＡＦ４フラクトグラムを示す。回転半径（Ｒｇ）の計算値（灰色の正方形）は、Ｂｅｒｒｙプロットを使用した多角度光散乱（ＭＡＬＳ）から得られ、ならびに流体力学半径（Ｒｈ）値は、オンライン動的光散乱から得られる（ＤＬＳ：灰色の円）。
【図11-1】図１１は、ＡＦ４－ＵＶ－ＭＡＬＳを使用することによる、複合試料組成物における粒径分布の定量化を示す。Ａ）試料組成物（ＲＮＡおよび粒子）のＡＦ４－ＵＶ－ＭＡＬＳ溶出プロファイル、ＲＮＡ検出に対する２６０ｎｍでのＵＶシグナル（破線）、および９０°での光散乱シグナル（実線）が表される。ＭＡＬＳシグナルからの対応する回転半径（Ｒｇ）値が黒点として示されている。Ｂ）粒子ピーク（溶出時間：２６～５５分）の実験的に求めたＲＭＳ値を、多項式方程式に適合させる（薄灰色の線）。Ｃ）ＵＶシグナル（実線）を、多項式適合させたＲｇ値の関数としてプロットし（図１１Ｂを参照されたい）、ならびに対応する累積重量分率を、ＵＶシグナルの関数としてプロットする（破線）。
【図11-2】同上。
【図12-1】図１２は、本明細書において開示されるＡＦ４法を使用した、異なる試料組成物（１００ｍＭ ＮａＣｌを用いて異なる脂質／ＲＮＡ比（０．１～０．９）において脂質とＲＮＡとを混合することによって調製した）の分離および定性分析を示す。Ａ）異なる試料組成物のそれぞれに対して、Ｂｅｒｒｙプロットを使用して算出した、ＵＶシグナル（２６０ｎｍにおいて）、光散乱シグナル（９０°において）、および対応する回転半径（Ｒｇ）値が重ね合わせて示されている。Ｂ）ＭＡＬＳシグナルから算出したＲｇ値を、適切な累積重量分率分析に対してプロットし、その後、対応するＤ９０値の算出を行う。Ｃ）累積重量分率分析から得られたＲｇ（Ｄ９０）値を、１００ｍＭ ＮａＣｌを用いた（黒点）またはＮａＣｌを用いない（白点）脂質／ＲＮＡ比の関数としてプロットする。
【図12-2】同上。
【図14-1】図１４は、本明細書において開示されるＡＦ４法による、様々な粒子組成物（ＬＰＸ、ＬＮＰ、ポリプレックス粒子（ＰＬＸ）、リポソーム、ＶＬＰ＋ＬＰＸ）の分離およびキャラクタリゼーションを示す。ＡＦ４－ＵＶ－ＭＡＬＳ－ＤＬＳ分離／検出が示されている。９０°の角度でのＬＳが、実線として表されており、それは、粒子ピークを示している。破線は、２６０ｎｍにおいて記録されたＵＶシグナル（ＲＮＡ検出のため）を表す。回転半径（Ｒｇ）値（暗色の点）は、Ｚｉｍｍプロットを使用した多角度光散乱（ＭＡＬＳ）によって得られる。動的光散乱（ＤＬＳ；灰色の点）は、流体力学半径（Ｒｈ）を提供する。個別の粒子ピーク分画は、灰色のバーによって強調表示される。Ａ）ＡＦ４－ＵＶ－ＭＡＬＳ－ＤＬＳ分離／検出の後の、１．３／２のモル比において脂質およびＲＮＡを含有するＬＰＸ試料の代表的フラクトグラム。Ｂ）２つのタイプの粒子を含む組成物（低分子ＲＮＡ－ＬＰＸ：ＶＬＰ、１：１混合物）の代表的フラクトグラム。Ｃ）リポソーム試料（２／１のモル比におけるＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥで構成される、正に帯電したリポソーム）の代表的フラクトグラム。Ｄ）ＬＰＸ試料（４／１のモル比においてＤＯＴＭＡおよびコレステロールとＲＮＡとを含有する、正に帯電したＬＰＸ）の代表的フラクトグラム。Ｅ）３／１のモル比におけるＤＯＤＭＡ、コレステロール、ＤＯＰＥ、ＰＥＧ（１．２／１．４４／０．３／０．０６のモル比）とＲＮＡとで構成される脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）試料の代表的フラクトグラム。Ｆ）粒子とＲＮＡの１２／１の比において、ＪｅｔＰＥＩポリマーとＩＶＴ－ＲＮＡまたはｓａＲＮＡとを含有する粒子の代表的フラクトグラム。
【図14-2】同上。
【図14-3】同上。
【図15】図１５は、イオン（塩化ナトリウム）の存在下でのＲＮＡ挙動の解析を示す。異なる塩化ナトリウム濃度（０～５０ｍＭ）における非製剤化ＲＮＡからの例示的ＡＦ４フラクトグラム（９０°での光散乱シグナルが示される）が、表される。回転半径（Ｒｇ）値は、Ｚｉｍｍプロットを使用した多角度光散乱（ＭＡＬＳ）から得られる。
【図16】図１６は、塩化ナトリウムによる処理後のＲＮＡのキャラクタリゼーションを示す。Ａ）異なる塩化ナトリウム濃度（０～５０ｍＭ）に対して、累積重量分率分析から得られるＲｇ（Ｄ５０）値が示される。Ｂ）ＲＮＡ Ｒｇ（Ｄ５０）値（図１６Ａから）を、塩化ナトリウム濃度に対してプロットし、ならびに比率（塩化ナトリウム（ｍＭ）対Ｒｇ（ｎｍ））を算出した。０～１０ｍＭ ＮａＣｌ値の比率の線形適合が太い線で表されており、その一方で、点線は、１０～５０ｍＭ ＮａＣｌの適合を表す。灰色と黒色の線は、２つの異なるＲＮＡ濃度による測定の例を表している。
【図17】図１７は、複合試料組成物中の遊離／非結合ＲＮＡの定量化を示す。Ａ）本明細書において開示されるＡＦ４法を使用して、異なる量の遊離ＲＮＡ（１～１５μｇ）を、粒子を用いない組成物における２６０ｎｍでのＵＶ吸収によって検出した。直線較正曲線を生成するために、ＲＮＡ量をそれぞれの曲線下ＵＶピーク面積（ＡＵＣ＊分）に対してプロットした。Ｂ）様々な量の粒子組成物（１～１５μｇの総ＲＮＡを含有する）を、ＡＦ４法によって分析した。重ねたＡＦ４フラクトグラムは、２６０ｎｍでのＵＶシグナルを示している。第１のピーク（溶出時間：約２０分）は、遊離ＲＮＡに対応し、その一方で、第２のピーク（溶出時間：約３８分）は、粒子（結合ＲＮＡ）に対応する。粒子組成物中の非結合の遊離ＲＮＡの量は、基準ＲＮＡ（＝１００％）との関係において算出することができる（図１７Ａを参照）。Ｃ）方法の線形性を示すために、遊離ＲＮＡ（図１７Ｂを参照）ならびに裸の基準ＲＮＡ（図１７Ａを参照）のＵＶピーク積分を、異なるＲＮＡ量（１～１５μｇ）の関数としてプロットする。Ｄ）遊離ＲＮＡの定量化のための第２の好ましい手順（直接法）として、非結合ＲＮＡのピークが定義され、ならびにＲＮＡ量は、ＲＮＡの比減衰係数を使用して直接算出することができる。
【図18】図１８は、異なる物理化学的挙動を有する試料組成物中の遊離ＲＮＡ量の分析を示す。Ａ）ＮａＣｌを用いない粒子組成物（様々な電荷比（０．１～０．９）において混合した（ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ２／１）／ＲＮＡ複合体）のＡＦ４－ＵＶフラクトグラム、またはＢ）１００ｍＭ ＮａＣｌを用いた粒子組成物が表される。Ｃ）２６０ｎｍでのＡＦ４－ＵＶ－検出を使用した、１００ｍＭ ＮａＣｌを用いた（黒丸）およびＮａＣｌを用いない（白丸）、算出された非結合ＲＮＡのパーセンテージ（ｍｏｌ／ｍｏｌ）のプロット。全ての混合物はデュブリケートにおいて調製し、ならびに少なくともデュブリケートにおいて測定した。エラーバーは、標準偏差を表している。Ｄ）２６０ｎｍでのＲＮＡの減衰係数を使用して算出した、１００ｍＭ ＮａＣｌを用いた（黒丸）およびＮａＣｌを用いない（白丸）、非結合ＲＮＡの濃度（μｇ／ｍＬ）のプロット。
【図19】図１９は、粒子組成物中の総ＲＮＡの定量化を示す。Ａ）本明細書において開示されるＡＦ４法によって分離された、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ処理した裸のＲＮＡのＡＦ４フラクトグラム。２６０ｎｍでのＵＶシグナルは、黒色の線で表されており、９０°でのＬＳシグナルは、破線によって表されている。Ｂ）遊離ＲＮＡ（灰色で強調表示される）および結合ＲＮＡ（第２のピーク）によるＵＶ検出（実線）、および９０°の角度でのＬＳシグナル（破線）による粒子組成物の代表的フラクトグラム。Ｃ）粒子が放出剤を使用して溶解されている（液相は０．１％のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔを含有した）ＲＮＡ組成物の、ＵＶ検出（実線）および９０°での光散乱（破線）によるＡＦ４フラクトグラム。Ｄ）放出剤（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）による処理後の裸のＲＮＡおよび総ＲＮＡの直接的定量化。
【図20-1】図２０は、ＲＮＡおよび粒子を含有する試料組成物中の遊離ＲＮＡおよび総ＲＮＡの完全性を示す。Ａ）本明細書において開示されるＡＦ４法を使用した、ＲＮＡ完全性において異なるＲＮＡによる分離された粒子のＵＶトレース（未処理のＲＮＡ：黒色の実線；部分的に熱分解したＲＮＡ：点線；混合物（５０％の未処理のものと５０％の完全に分解したものとを規定された方式において混合した）：破線；粒子中の完全に分解したＲＮＡ：灰色の実線）。Ｂ）粒子中の、無傷の遊離ＲＮＡ（暗灰色）、ならびに総（黒色）遊離ＲＮＡおよび完全に分解した（薄灰色）遊離ＲＮＡの定量化。Ｃ）ＡＦ４分離（液相において放出剤を使用する）後の溶解した粒子のＵＶトレース。Ｄ）粒子中の遊離ＲＮＡおよび総ＲＮＡのＡＦ４－ＵＶ測定によって分析した、求められた完全性。棒グラフは、粒子中の総ＲＮＡ値の求められた完全性（黒色のバー）と比較した、遊離ＲＮＡ（灰色のバー）の相対的ＲＮＡ完全性を表す。
【図20-2】同上。
【図21】図２１は、ＲＮＡ（総ＲＮＡ、結合ＲＮＡ、封入ＲＮＡ、アクセス可能なＲＮＡ、表面ＲＮＡ、および非結合ＲＮＡ）の異なる画分をどのように、本明細書において開示されるＡＦ４法によって求めることができるかのスキームを示す。例えば、ＡＦ４法は、インターカレーティング色素（例えば、ＧｅｌＲＥＤ）の蛍光放出シグナルを使用した、アクセス可能なＲＮＡおよび／または表面ＲＮＡの定量化のために使用することができる。遊離（非結合）ＲＮＡ、総ＲＮＡ、およびアクセス可能なＲＮＡの定量化の組合せを使用することにより、封入ＲＮＡ、結合ＲＮＡ、および表面ＲＮＡを算出することができる。６００ｎｍでのＧｅｌＲＥＤの蛍光放出は、ＲＮＡへのインターカレーションによって増強される。
【図22-1】図２２は、（Ａ）本明細書において開示されるＡＦ４法を使用した蛍光検出の線形性；（Ｂ）アクセス可能なＲＮＡ（黒色のバー）および封入ＲＮＡ（灰色のバー）の相対量を示す棒グラフ；および（Ｃ）粒子組成物中の遊離ＲＮＡの相対量の比較、を示しており、この場合、量は、異なるＲＮＡ検出を使用して求めた：２６０ｎｍでのＵＶ吸収（黒色のバー）および６００ｎｍでの蛍光放出シグナル（ＦＳ）（灰色のバー）。
【図22-2】同上。
【図23】図２３は、基準ＲＮＡを使用しない、本明細書において開示されるＡＦ４法によるＲＮＡ完全性の分析を示す。Ａ）９０°でのＬＳシグナル（点線）および２６０ｎｍでのＵＶシグナル（実線）による、長鎖ｓａＲＮＡの例示的ＡＦ４フラクトグラムが示される。太く暗い線は、ＭＡＬＳシグナルから得られた分子量曲線を表す。Ｂ）より良い概説のために、（Ａ）からの分子量曲線のみが、図２３Ｂの上側パネルに実線として示されている。総ＲＮＡのピーク（ピーク１）に対する限界は、総ＵＶピークシグナルに基づいて設定される（すなわち、ｔ＝１０分～ｔ＝４０分）。ここで、「無傷の」ＲＮＡのピーク（ピーク２）に対する限界は、以下のように、分子量曲線（ＭＡＬＳから得られる）からの一次導関数によって設定される。分子量曲線からの一次導関数が算出される（図２３Ｂの下側パネルにおける点線）。分子量曲線のより水平な部分は、保持時間を反映しており、その場合、未分解のＲＮＡの分画が存在する。これに基づいて、積分限界を選択することができ、ならびに試料中の未分解ＲＮＡの量を算出することができる。
【図24-1】図２４は、粒径分布、特に累積ＲＮＡ重量分率、ＲＮＡリポプレックス（ＬＰＸ）分画におけるＲＮＡ質量、およびＬＰＸ画分あたりのＲＮＡコピー、の決定のためにＵＶを使用した遊離ＲＮＡおよび結合ＲＮＡの定量分析を示す。Ａ）９０°でのＬＳシグナル（実線）および２６０ｎｍでのＵＶシグナル（破線）による、ＲＮＡ ＬＰＸ試料組成物に対する代表的ＡＦ４フラクトグラムが示される。ＵＶシグナルは２つのピークを示しており、この場合、第１のピークは、非結合の遊離ＲＮＡの量を表しており、ならびに第２のピークは、ＲＮＡを含むＬＰＸナノ粒子から生じている。ＵＶシグナルは、溶出時間の関数として、異なる分画中のＲＮＡ量を直接的に代表する。回転半径（Ｒｇ；太い線）は、ＭＡＬＳシグナルから得られる。Ｂ）図２４Ａからの、２６０ｎｍにおけるＵＶシグナル（破線）と、実線として、ＵＶシグナル下面積に基づく累積重量分率とが、示されている。Ｃ）ある特定のサイズの粒子を含む異なるＲｇ画分（Δｔ＝１分）における２６０ｎｍでの吸収を使用することによる、ＲＮＡ ＬＰＸ試料組成物中の結合ＲＮＡ量が示される。異なるＲｇ画分のＲＮＡ量の算出のために、ＬＰＸピーク（すなわち、ｔ＝約２４分に始まり、ｔ＝約６０分に終わる図２４Ａおよび２４Ｂの第２のピーク）のみを使用した。Ｄ）図２４Ｃに提示された結果からから算出されるＲｇ画分あたりの算出されたＲＮＡコピーの数（バー、左側ｙ軸）が示される。Ｒｇ画分あたりの算出された粒子数は、対応する点線曲線（第２の右側ｙ軸）によって表される。
【図24-2】同上。
【図25-1】図２５は、本明細書において開示されるＡＦ４法における円二色性（ＣＤ）分光法の使用の実現可能性を示す。Ａ）９０°の角度でのＬＳシグナル（実線）および２６０ｎｍで記録されたＣＤシグナル（点線）によるＲＮＡリポプレックス（ＬＰＸ）製剤の代表的ＡＦ４フラクトグラムが示されており、この場合、後者は、非結合ＲＮＡ（第１のピーク；ｔ＝１８分）および結合ＲＮＡ（第２のピーク；ｔ＝３５分）を表す。Ｂ）裸のＲＮＡの較正曲線が、２６０ｎｍでのＵＶ検出ならびに２６０ｎｍでのＣＤ検出を同時に使用して生成される。注入されたＲＮＡ量に対して、曲線下ピーク面積（ＣＤ：黒四角および実線；ＵＶ：黒三角および点線）をプロットする。ＣＤシグナルとＵＶシグナルとのピーク面積の比は、点として示される（第２の右側ｙ軸）。Ｃ）異なる量のＲＮＡ ＬＰＸ試料（２～１５μｇ）を、ＡＦ４法を使用して分析した。適切な裸のＲＮＡからのＣＤシグナルの曲線下面積（ＡＵＣ）は、適切な総ＡＵＣ ＣＤシグナルに相関し、この場合、それぞれのＣＤピークＡＵＣ値が、ＲＮＡの量に対してプロットされ、結果として、線形適合（Ｒ２＝０．９９８）をもたらした。ＲＮＡ ＬＰＸ試料組成物中の非結合ＲＮＡ（白四角）および結合ＲＮＡ（白丸）の相対量（％）を、総ＲＮＡ量に対して非結合ＲＮＡおよび結合ＲＮＡの量を相関付けることによって求めた。
【図25-2】同上。
【発明を実施するための形態】
【0246】
本開示はさらに、以下でより詳細に記載されるが、本開示は、本明細書中に記載される特定の方法論、プロトコール、および試薬に限定されないことが理解されるべきである。というのも、これらは変動し得るからである。また、本明細書中で用いられる専門用語は、特定の実施形態を説明するためだけにあり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本開示の範囲を限定することは意図されないことが理解されるべきである。別段の定めがない限り、本明細書中で用いられる全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【0247】
以下において、本開示の要素をより詳細に説明する。要素は、特定の実施形態と共に記載されている。しかしながら、要素は、あらゆる様式で、かつあらゆる数で組み合わされて、追加的な実施形態を生じさせることができると理解されるべきである。様々に説明される例および好ましい実施形態は、本開示を、明示的に説明される実施形態にのみ限定するものと解釈されるべきでない。本明細書は、明示的に記載される実施形態を、開示される、および／または好ましいあらゆる数の要素と組み合わせる実施形態を補助かつ包含することが理解されるべきである。さらに、文脈がそうでないと示さない限り、本出願中の記載される全ての要素のあらゆる順列および組合せは、本出願の記載によって開示されていると考えられるべきである。例えば、本開示の方法の好ましい実施形態において、ＡＦ４がフィールド－フローフラクショネーションとして用いられるならば、そして本開示の方法の別の好ましい実施形態において、核酸（例えばＲＮＡ）がインビトロ転写ＲＮＡであるならば、本開示の方法のさらに好ましい実施形態において、ＡＦ４はフィールド－フローフラクショネーションとして用いられ、そして核酸（例えばＲＮＡ）はインビトロ転写ＲＮＡである。
【0248】
好ましくは、本明細書中で用いられる用語は、"A multilingual glossary of biotechnological terms:(IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Koelbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland (1995)に記載されるように定義される。
【0249】
本開示の実施は、特に明記されない限り、従来の化学、生化学、細胞生物学、免疫学、および当該分野の文献に説明されている組換えＤＮＡ技術を使用することとなる［例えば、Organikum, Deutscher Verlag der Wissenschaften, Berlin 1990；Streitwieser/Heathcook, "Organische Chemie", VCH, 1990；Beyer/Walter, "Lehrbuch der Organischen Chemie", S. Hirzel Verlag Stuttgart, 1988；Carey/Sundberg, "Organische Chemie", VCH, 1995；March, "Advanced Organic Chemistry", John Wiley & Sons, 1985；Roempp Chemie Lexikon, Falbe/Regitz (Hrsg.), Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York, 1989；Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989参照］。
【0250】
本明細書および続く特許請求の範囲の全体を通して、文脈上別段の解釈を要する場合を除き、文言「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変形は、明示される部材、整数、もしくは工程、または部材、整数、もしくは工程の群の包含を意味し、他のいかなる部材、整数、もしくは工程、または部材、整数、もしくは工程の群の排除も意味しないと理解されよう。用語「から本質的になる」は、あらゆる必須の有意性の他の部材、整数、または工程を除外することを意味する。用語「含む」は、用語「から本質的になる」を包含し、これは今度は、用語「からなる」を包含する。ゆえに、本出願における各存在にて、用語「含む」は、用語「から本質的になる」または「からなる」と置き換えられてよい。同様に、本出願における各存在にて、用語「から本質的になる」は、用語「からなる」と置き換えられてよい。
【0251】
用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」、ならびに本開示を記載する文脈において（とりわけ特許請求の範囲の文脈において）用いられる類似の指示（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）は、本明細書中で特に明記されない限り、または文脈が明らかに矛盾しない限り、単数および複数の双方を包含すると解釈されるべきである。本明細書中での値の範囲の列挙は単に、当該範囲に入る別個の各値に個々に言及する速記方法として機能することが意図されるだけである。本明細書中で特に明記されない限り、個々の値は、本明細書中に、あたかも本明細書中で個々に列挙されているかの如く組み込まれる。本明細書中に記載される方法は全て、本明細書中で特に明記されない限り、または文脈が明らかに矛盾しない限り、適切なあらゆる順序で実行することができる。本明細書中で提供されるあらゆる全ての例の使用、または例示的な文言（例えば、「例えば」）は単に、本開示を十分に説明することしか意図されず、別途特許請求される本開示の範囲に対する限定をもたらさない。明細書中の文言は、本開示の実施に必須の、特許請求されていないあらゆる要素を示すものとして解釈されるべきでない。
【0252】
本明細書中で用いられる場合、「および／または」は、指定された２つの構成または構成要素の各々の、他方と共にある、または他方がない具体的な開示として理解されるべきである。例えば、「Ｘおよび／またはＹ」は、（ｉ）Ｘ、（ｉｉ）Ｙ、ならびに（ｉｉｉ）ＸおよびＹの各々の具体的な開示として、各々があたかも個々に本明細書中で述べられているかの如く理解されるべきである。
【0253】
本開示の文脈において、用語「約」は、当業者が、問題となっている構成の技術的効果を依然として確実にすることを理解するであろう精度の間隔を表す。用語は典型的に、示される数値からの±５％、±４％、±３％、±２％、±１％、±０．９％、±０．８％、±０．７％、±０．６％、±０．５％、±０．４％、±０．３％、±０．２％、±０．１％、±０．０５％、および例えば±０．０１％のずれを示す。当業者によって認識されるように、所与の技術的効果についての数値のそのような特定のずれは、技術的効果の性質によって決まることとなる。例えば、天然の、または生物学的な技術的効果は、通常、そのようなずれが、人工の、または操作された技術的効果のずれよりも大きくなる場合がある。
【0254】
本明細書中での値の範囲の列挙は単に、当該範囲に入る別個の各値に個々に言及する速記方法として機能することが意図されるだけである。本明細書中で特に明記されない限り、個々の値は、本明細書中に、あたかも本明細書中で個々に列挙されているかの如く組み込まれる。
【0255】
本明細書中で提供されるあらゆる全ての例の使用、または例示的な文言（例えば、「例えば」）は単に、本発明を十分に説明することしか意図されず、別途特許請求される本開示の範囲に対する限定をもたらさない。明細書中の文言は、本発明の実施に必須の、特許請求されていないあらゆる要素を示すものとして解釈されるべきでない。
【0256】
いくつかの文献が、本明細書の本文の全体を通して引用されている。本明細書中で引用される文献（全ての特許、特許出願、科学出版物、メーカーの仕様書、説明書その他が挙げられる）の各々が、前掲であるにせよ後掲であるにせよ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書中ではいずれも、本発明が、以前の発明による開示に先立って権利が与えられないという承認として解釈されるべきでない。
【0257】
定義
以下において、本開示の全ての態様に当てはまる定義を提供する。以下の用語は、特に明記されない限り、以下の意味を有する。定義を与えられていない用語はいずれも、その技術によって認識される意味を有する。
以下において、本開示の全ての態様に当てはまる定義を提供する。以下の用語は、特に明記されない限り、以下の意味を有する。定義を与えられていない用語はいずれも、その技術によって認識される意味を有する。
【0258】
本明細書中で用いられる用語「引き下げる」または「阻害する」等は、レベルの全体としての、例えば、約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約２５％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、または約７５％以上の低下を引き起こす能力を意味する。用語「阻害する」または類似のフレーズは、完全な、または本質的に完全な阻害、すなわちゼロへの、または本質的にゼロへの引下げを含む。
【0259】
一実施形態における用語「増大させる」または「増強させる」等は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約１００％の増大または増強に関する。
【0260】
本明細書中で用いられる「生理学的ｐＨ」は、約７．５のｐＨを指す。
【0261】
本開示において用いられる「％ ｗ／ｖ」は、重量／容量パーセントを指し、これは、溶液の総容量ミリリットル（ｍＬ）のパーセントとして表される溶質の量グラム（ｇ）を測定する濃度の単位である。
【0262】
用語「イオン強度」は、特定の溶液中の異なる種類のイオン種の数と、それらの各電荷との数学的な関係を指す。ゆえに、イオン強度ＩＳは、式
【0263】
【数1】
【0264】
本開示に従えば、一実施形態における用語「イオン強度」は、一価のイオンの存在に関する。二価イオン、特に二価陽イオンの存在に関して、それらの濃度または有効濃度（遊離イオンの存在）は、キレート化剤の存在に起因して、一実施形態において、ＲＮＡの分解を防止するほど十分に低い。一実施形態において、二価イオンの濃度または有効濃度は、ＲＮＡヌクレオチド間のホスホジエステル結合の加水分解についての触媒レベル未満である。一実施形態において、遊離二価イオンの濃度は、２０μＭ以下である。一実施形態において、遊離二価イオンは存在しないか、または本質的に存在しない。
【0265】
「オスモル濃度」は、溶媒のキログラム当たりの溶質のオスモルの数として表される特定の溶質の濃度を指す。
【0266】
用語「凍結」は、通常熱の除去による、液体の凝固に関する。
【0267】
用語「凍結乾燥させる（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｉｎｇ）」または「凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）」は、物質を凍結させてから、周囲の圧力を引き下げて、物質中の凍結媒体を固相から気相に直接的に昇華させることによる物質の凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｎｇ）を指す。
【0268】
用語「スプレー乾燥」は、（加熱された）気体を、容器（噴霧乾燥器）内で霧状にされた（スプレーされた）流体と混合することによって物質をスプレー乾燥させることを指し、形成された滴由来の溶媒は蒸発して、乾燥粉末がもたらされる。
【0269】
用語「復元する」は、乾燥した生成物に溶媒、例えば水を加えて、液体状態、例えばその元々の液体状態に戻すことに関する。
【0270】
本開示の文脈における用語「組換え」は、「遺伝子工学によりなされる」ものを意味する。一実施形態において、本開示の文脈における「組換え対象」は、天然に存在しない。
【0271】
本明細書中で用いられる用語「天然に存在する」は、対象が自然界において見出され得るという事実を指す。例えば、生物（ウイルスを含む）中に存在し、かつ自然界において源から単離され得、かつラボにおいて人によって故意に修飾されていないペプチドまたは核酸が、天然に存在する。用語「自然界において見出される」は、「自然界において存在する」を意味し、知られている対象、ならびに自然からまだ発見および／または単離されていないが、天然の源から将来発見および／または単離される可能性がある対象を含む。
【0272】
本明細書中で用いられる用語「室温」および「周囲温度」は、本明細書中で互換的に用いられており、少なくとも約１５℃から、好ましくは約１５℃から約３５℃、約１５℃から約３０℃、約１５℃から約２５℃、または約１７℃から約２２℃の温度を指す。そのような温度として、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、および２２℃が挙げられる。
【0273】
用語「エタノール注入技術」は、脂質を含むエタノール溶液が針を通って水溶液中に迅速に注入されるプロセスを指す。この動作は、脂質を溶液の至る所に分散させて、脂質構造形成、例えば脂質ベシクル形成、例えばリポソーム形成を促進する。通常、本明細書中に記載される核酸（とりわけＲＮＡ）リポプレックス粒子は、核酸（とりわけＲＮＡ）をコロイドリポソーム分散系に加えることによって獲得できる。エタノール注射技術を用いて、そのようなコロイドリポソーム分散系は、一実施形態において、以下のように形成される：脂質、例えば、ＤＯＴＭＡのような陽イオン脂質および追加的な脂質を含むエタノール溶液が、撹拌下の水溶液中に注入される。一実施形態において、本明細書中に記載される核酸（とりわけＲＮＡ）リポプレックス粒子は、押出工程なしで獲得できる。
【0274】
用語ＥＤＴＡは、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩を指す。全ての濃度は、ＥＤＴＡ二ナトリウム塩に関して与えられる。
【0275】
用語「アルキル」は、飽和直鎖状または分枝状炭化水素のモノラジカルを指す。好ましくは、アルキル基は、１～１２個（例えば１～１０個）の炭素原子、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の炭素原子（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の炭素原子）、より好ましくは１～８個の炭素原子、例えば１～６個または１～４個の炭素原子を含む。例示的なアルキル基として、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル（２－プロピルまたは１－メチルエチルとも称される）、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ｓｅｃ－ペンチル、ネオペンチル、１，２－ジメチルプロピル、イソアミル、ｎ－ヘキシル、イソヘキシル、ｓｅｃ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、イソヘプチル、ｎ－オクチル、２－エチルヘキシル、ｎ－ノニル、ｎ－デシル、ｎ－ウンデシル、およびｎ－ドデシル等が挙げられる。
【0276】
本開示に従えば、用語「ペプチド」は、オリゴペプチドおよびポリペプチドを含み、約２以上、約３以上、約４以上、約６以上、約８以上、約１０以上、約１３以上、約１６以上、約２０以上、および最大約５０、約１００、または約１５０個の、ペプチド結合を介して互いに結合した連続アミノ酸を含む物質を指す。用語「タンパク質」は、大きなペプチド、特に、少なくとも約１５１個のアミノ酸を有するペプチドを指すが、用語「ペプチド」および「タンパク質」は、通常同義語として本明細書中で用いられている。
【0277】
本開示に従えば、細胞によって導入されたか、または細胞中に導入された、すなわち形質移入されたか、または形質導入されたペプチドまたはタンパク質をコードする核酸、例えばＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）（細胞はインビトロで存在しても対象内に存在してもよい）は、前記ペプチドまたは前記タンパク質の発現をもたらすことが好ましい。細胞は、コードされたペプチドまたはタンパク質を細胞内で（例えば、細胞質内で、および／または核内で）発現し得、コードされたペプチドまたはタンパク質を分泌し得、または表面上で発現し得る。
【0278】
本開示に従えば、「核酸発現」および「核酸コーディング」等の用語または類似の用語は、本明細書中で互換的に用いられており、かつ特定のペプチドまたはポリペプチドに関して、核酸は、適切な環境中に、好ましくは細胞内に存在するならば、発現されて前記ペプチドまたは前記ポリペプチドを産生することができることを意味する。
【0279】
本開示に従えば、ペプチドまたはタンパク質の一部または断片が、好ましくは、それが由来したペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つの機能特性を有する。そのような機能特性は、薬理活性、他のペプチドまたはタンパク質との相互作用、酵素活性、抗体との相互作用、および核酸の選択的結合を含む。例えば、ペプチドまたはタンパク質の薬理活性断片は、断片が由来したペプチドまたはタンパク質の薬理活性の少なくとも１つを有する。ペプチドまたはタンパク質の一部または断片は、好ましくは、少なくとも６、特に、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、または少なくとも５０個の、ペプチドまたはタンパク質の連続アミノ酸の配列を含む。ペプチドまたはタンパク質の一部または断片は、好ましくは、最大８個、特に、最大１０、最大１２、最大１５、最大２０、最大３０、または最大５５個の、ペプチドまたはタンパク質の連続アミノ酸の配列を含む。
【0280】
本開示に従えば、ペプチドまたはタンパク質の類似体は、それが由来した前記ペプチドまたは前記タンパク質の修飾形態であり、前記ペプチドまたは前記タンパク質の少なくとも１つの機能特性を有する。例えば、ペプチドまたはタンパク質の薬理活性類似体は、類似体が由来したペプチドまたはタンパク質の薬理活性の少なくとも１つを有する。そのような修飾は、あらゆる化学修飾を含み、タンパク質またはペプチドと関連するあらゆる分子、例えば、炭水化物、脂質、および／またはタンパク質もしくはペプチドの単一または複数の置換、欠失、および／または付加を含む。一実施形態において、タンパク質またはペプチドの「類似体」として、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、パルミトイル化、ミリストイル化、イソプレニル化、脂質化、アルキル化、誘導体化、保護基／ブロッキング基の導入、抗体への、または別の細胞リガンドへのタンパク質分解性切断または結合に由来する修飾形態が挙げられる。また、用語「類似体」は、前記タンパク質および前記ペプチドの全ての機能化学均等物に及ぶ。
【0281】
本開示に従う「抗原」は、免疫応答を誘発することとなるあらゆる物質、および／または免疫応答もしくは免疫機構、例えば細胞性応答が向けられるあらゆる物質を包含する。また、これは、特にＭＨＣ分子の文脈において提示されるならば、抗原が抗原ペプチドにプロセシングされて、免疫応答または免疫機構が、１つまたは複数の抗原ペプチドに向けられる状況を含む。特に、「抗原」は、抗体またはＴリンパ球（Ｔ細胞）と特異的に反応するあらゆる物質、好ましくはペプチドまたはタンパク質に関する。本発明に従えば、用語「抗原」は、少なくとも１つのエピトープ、例えばＴ細胞エピトープを含むあらゆる分子を含む。好ましくは、本開示の文脈における抗原は、適宜プロセシングの後に、好ましくは抗原（抗原を発現する細胞を含む）に特異的である免疫反応を誘導する分子である。一実施形態において、抗原は、疾患関連抗原、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、もしくは細菌抗原、またはそのような抗原に由来するエピトープである。
【0282】
本開示に従えば、免疫応答の候補である適切なあらゆる抗原が用いられてよく、免疫応答は液性免疫応答および細胞性免疫応答の双方であってよい。本開示の一部の実施形態の文脈において、抗原は好ましくは、ＭＨＣ分子の文脈において、細胞によって、好ましくは抗原提示細胞によって提示されて、抗原に対する免疫応答がもたらされる。抗原は、好ましくは、天然に存在する抗原に相当するか、または由来する生成物である。そのような天然に存在する抗原は、アレルゲン、ウイルス、細菌、菌類、寄生虫、ならびに他の感染性エージェント（ａｇｅｎｔ）および病原体を含んでもよいし、これらに由来してもよいし、抗原は、腫瘍抗原であってもよい。本発明に従えば、抗原は、天然に存在する生成物、例えば、ウイルスタンパク質またはその一部に相当し得る。
【0283】
好ましい実施形態において、抗原は、腫瘍抗原、すなわち、腫瘍細胞の一部、特に、主に細胞内に、または腫瘍細胞の表面抗原として出現するものである。別の実施形態において、抗原は、病原体関連抗原、すなわち、病原体に、例えば、ウイルス、細菌、単細胞生物、または寄生虫、例えばウイルス抗原、例えばウイルスリボ核タンパク質またはコートタンパク質に由来する抗原である。特に、抗原は、ＭＨＣ分子によって提示されるべきであり、これは、特にＴ細胞受容体の活性のモジュレーションを介して、免疫系の細胞、好ましくはＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球のモジュレーション、特に活性化をもたらす。
【0284】
用語「疾患関連抗原」は、最も広義に用いられて、疾患と関連するあらゆる抗原を指す。疾患関連抗原は、疾患に対して細胞抗原特異的免疫応答および／または液性抗体応答を起こすように宿主の免疫系を刺激することとなるエピトープを含有する分子である。疾患関連抗原として、病原体関連抗原、すなわち、微生物による感染と関連する抗原、典型的には微生物抗原（例えば細菌抗原もしくはウイルス抗原）、またはがん、典型的には腫瘍と関連する抗原、例えば腫瘍抗原が挙げられる。
【0285】
用語「腫瘍抗原」は、がん細胞の、細胞質、細胞表面、または細胞核に由来し得る構成成分を指す。特に、細胞内に、または腫瘍細胞上の表面抗原として産生される抗原を指す。例えば、腫瘍抗原として、癌胎児性（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎａｌ）抗原、α１－フェトプロテイン、イソフェリチンおよび胎児性スルホ糖タンパク質、α２－Ｈ－鉄タンパク質およびγ－フェトプロテイン、ならびに種々のウイルス腫瘍抗原が挙げられる。本開示に従えば、腫瘍抗原は、好ましくは、タイプおよび／または発現レベルに関して、腫瘍またはがんに、かつ腫瘍細胞またはがん細胞に特有であるあらゆる抗原を含む。
【0286】
用語「ウイルス抗原」は、抗原特性を有する、すなわち個体において免疫応答を誘発することができるあらゆるウイルス構成要素を指す。ウイルス抗原は、ウイルスリボ核タンパク質またはエンベロープタンパク質であってもよい。
【0287】
用語「細菌抗原」は、抗原特性を有する、すなわち個体において免疫応答を誘発することができるあらゆる細菌構成要素を指す。細菌抗原は、細菌の細胞壁または細胞質膜に由来し得る。
【0288】
用語「エピトープ」は、分子、例えば抗原における抗原性決定因子を、すなわち、免疫系によって認識される、例えば、特にＭＨＣ分子の文脈において提示される場合、抗体Ｔ細胞またはＢ細胞によって認識される分子の一部またはその断片を指す。タンパク質のエピトープは、好ましくは、前記タンパク質の連続的な、または非連続的な部分を含み、好ましくは約５～約１００、好ましくは約５～約５０、より好ましくは約８～約０、最も好ましくは約１０～約２５個のアミノ酸長であり、例えば、エピトープは好ましくは、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個のアミノ酸長であってよい。本発明の文脈におけるエピトープは、Ｔ細胞エピトープであることが特に好ましい。
【0289】
用語「エピトープ」、「抗原の断片」、「免疫原性ペプチド」、および「抗原ペプチド」等は、本明細書中で互換的に用いられており、好ましくは、抗原、または抗原を発現し、もしくは含み、かつ好ましくは提示する細胞に対する免疫応答を好ましくは誘発することができる抗原の不完全な表現に関する。好ましくは、当該用語は、抗原の免疫原性部分に関する。好ましくは、特にＭＨＣ分子の文脈において提示されるならば、Ｔ細胞受容体によって認識される（すなわち、特異的に結合される）抗原の部分である。特定の好ましい免疫原性部分は、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子に結合する。
【0290】
用語「Ｔ細胞エピトープ」は、ＭＨＣ分子の文脈において提示される場合、Ｔ細胞によって認識されるタンパク質の一部または断片を指す。用語「主要組織適合性複合体」および略語「ＭＨＣ」は、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子を含み、全脊椎動物中に存在する遺伝子の複合体に関する。ＭＨＣタンパク質またはＭＨＣ分子は、免疫反応において、リンパ球と抗原提示細胞または疾患細胞との間のシグナル伝達にとって重要であり、ＭＨＣタンパク質またはＭＨＣ分子は、ペプチドエピトープに結合して、これを、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体による認識のために提示する。ＭＨＣによってコードされるタンパク質は、細胞の表面上に発現されて、自己抗原（細胞それ自体由来のペプチド断片）および非自己抗原（例えば、侵入微生物の断片）の双方をＴ細胞に提示する。クラスＩ ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的に、約８～約１０個のアミノ酸長であるが、より長いか、またはより短いペプチドが有効である場合がある。クラスＩＩ ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的に、約１０～約２５個のアミノ酸長であり、特に約１３～約１８個のアミノ酸長であるが、より長いペプチド、およびより短いペプチドが有効である場合がある。
【0291】
用語「標的」は、エージェント、例えば、免疫応答、例えば細胞性免疫応答についての標的である細胞または組織を意味するものとする。標的として、抗原または抗原エピトープ、すなわち抗原に由来するペプチド断片を提示する細胞が挙げられる。一実施形態において、標的細胞は、抗原を発現し、かつ好ましくは前記抗原をクラスＩ ＭＨＣに提示する細胞である。
【0292】
用語「部分」は、画分を指す。特定の構造、例えば、アミノ酸配列またはタンパク質に関して、用語、その「部分」は、前記構造の連続的な、または非連続的な画分を示し得る。
【0293】
用語「一部」および「断片」は、本明細書中で互換的に用いられており、連続的な要素を指す。例えば、構造、例えばアミノ酸配列またはタンパク質の一部は、前記構造の連続的な要素を指す。組成物の文脈において用いられる場合、用語「一部」は、組成物の部分を意味する。例えば、組成物の一部は、前記組成物の０．１％～９９．９％のあらゆる部分（例えば、０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、５０％、９０％、または９９％）であってよい。
【0294】
「抗原プロセシング」は、抗原の、前記抗原の断片であるプロセシング生成物への分解（例えば、タンパク質の、ペプチドへの分解）、および細胞、好ましくは抗原提示細胞による、特定のＴ細胞への提示のための、断片の１つまたは複数の、ＭＨＣ分子との会合（例えば、結合を介した）を指す。
【0295】
「抗原応答性ＣＴＬ」は、抗原提示細胞の表面上のクラスＩ ＭＨＣにより提示される抗原、または前記抗原に由来するペプチドに応答性であるＣＤ８＋Ｔ細胞を意味する。
【0296】
本発明に従えば、ＣＴＬ応答性として、持続カルシウムフラックス（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｆｌｕｘ）、細胞分裂、サイトカイン、例えばＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αの産生、活性化マーカー、例えばＣＤ４４およびＣＤ６９の上方制御、および腫瘍抗原発現標的細胞の特異的な細胞溶解性の死滅が挙げられ得る。また、ＣＴＬ応答性は、ＣＴＬ応答性を正確に示す人工リポーターを用いて決定されてもよい。
【0297】
用語「免疫応答」および「免疫反応」は、本明細書中で従来の意味で互換的に用いられており、抗原に対する統合した身体応答を指し、好ましくは細胞性免疫応答、液性免疫応答、または双方を指す。本発明に従えば、用語、エージェント、例えば、抗原、細胞、または組織に関する「への免疫応答」または「に対する免疫応答」は、免疫応答、例えばエージェントに対して向けられる細胞性応答に関する。免疫応答は、１つまたは複数の抗原に対する抗体の発達、および抗原特異的Ｔリンパ球、好ましくはＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球、より好ましくはＣＤ８＋Ｔリンパ球の増殖からからなる群から選択される１つまたは複数の反応を含んでよく、これは、種々の増殖試験またはサイトカイン産生試験によりインビトロ検出され得る。
【0298】
本発明の文脈における用語「免疫応答を誘導すること」および「免疫応答を誘発すること」、ならびに類似の用語は、免疫応答の誘導、好ましくは細胞性免疫応答、液性免疫応答、または双方の誘導を指す。免疫応答は、保護的／予防的（ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ）／予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）、および／または治療的であってよい。免疫応答は、あらゆる免疫原または抗原または抗原ペプチドに対して、好ましくは腫瘍関連抗原、または病原体関連抗原［例えば、ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス（Ａ、Ｂ、またはＣ）、ＣＭＶ、またはＲＳＶ）の抗原］に対して向けられてよい。この文脈における「誘導すること」は、誘導の前に特定の抗原または病原体に対する免疫応答がなかったことを意味し得るが、また、免疫応答が増強される誘導の前に、かつ誘導の後に、特定の抗原または病原体に対する特定のレベルの免疫応答があったことを意味し得る。ゆえに、この文脈において、「免疫応答を誘導すること」は、「免疫応答を増強すること」も含む。好ましくは、免疫応答を個体において誘導した後に、前記個体は、疾患、例えば感染性の疾患もしくはがん性の疾患を発病することから保護され、または疾患の症状は、免疫応答を誘導することによって寛解する。
【0299】
用語「細胞性免疫応答」、「細胞性応答」、「細胞媒介性免疫」、または類似の用語は、抗原の発現および／またはクラスＩもしくはクラスＩＩ ＭＨＣによる抗原の提示によって特徴付けられる細胞に向けられる細胞性応答を含むことを意味する。細胞性応答は、「ヘルパー」または「キラー」の機能を果たす、Ｔ細胞またはＴリンパ球と呼ばれる細胞に関する。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞とも称される）は、免疫応答を調節することによって中心的な役割を果たし、キラー細胞（細胞障害性Ｔ細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはＣＴＬとも称される）は、細胞、例えば疾患細胞を死滅させる。
【0300】
用語「液性免疫応答」は、生きている生物におけるプロセスを指し、そこでは抗体が、エージェントおよび生物に応答して産生され、最終的に中和かつ／または排除される。抗体応答の特異性は、Ｔおよび／またはＢ細胞によって、単一の特異性の抗原に結合する膜関連受容体を介して媒介される。適切な抗原の結合、および種々の他の活性化シグナルの受取りの後に、Ｂリンパ球が分裂して、記憶Ｂ細胞および抗体分泌プラズマ細胞クローンが生じ、各々が、その抗原受容体によって認識されるのと同一の抗原性エピトープを認識する抗体を産生する。記憶Ｂリンパ球は、後にその特異的抗原によって活性化されるまで、休止状態のままである。これらのリンパ球は、特異的抗原に再曝露されると、抗体応答において、細胞ベースの記憶および結果として生じる漸増を実現する。
【0301】
本明細書中で用いられる用語「抗体」は、免疫グロブリン分子を指し、これは、抗原上のエピトープに特異的に結合することができる。特に、用語「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互連結した少なくとも２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質を指す。用語「抗体」は、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、および前述のあらゆるものの組合せを含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成される。また、可変領域および定常領域は、本明細書中で、それぞれ可変ドメインおよび定常ドメインと称される。ＶＨ領域およびＶＬ領域はさらに、超可変性の領域［相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される］に再分割され得、より保存された領域［フレームワーク領域（ＦＲ）と称される］が散在する。各ＶＨおよび各ＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置される。ＶＨのＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３と称され、ＶＬのＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３と称される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、重鎖定常領域（ＣＨ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）を含み、ＣＨはさらに、定常ドメインＣＨ１、ヒンジ領域、ならびに定常ドメインＣＨ２およびＣＨ３（アミノ末端からカルボキシ末端まで、以下の順序：ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３で配置される）に再分割され得る。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、宿主組織または宿主因子［免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の構成要素（Ｃ１ｑ）が挙げられる］への結合を媒介し得る。抗体は、天然の源に、または組換え源に由来するインタクト免疫グロブリンであり得、かつインタクト免疫グロブリンの免疫活性部分であり得る。抗体は、典型的に、免疫グロブリン分子のテトラマーである。抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ、およびＦ（ａｂ）２、ならびに単鎖抗体およびヒト化抗体が挙げられる種々の形態で存在し得る。
【0302】
用語「免疫グロブリン」は、免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質に、好ましくは抗原受容体、例えば抗体またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）に関する。免疫グロブリンは、特有の免疫グロブリン（Ｉｇ）フォールドを有する構造ドメイン、すなわち免疫グロブリンドメインによって特徴付けられる。当該用語は、膜結合免疫グロブリンおよび可溶性免疫グロブリンを包含する。また、膜結合免疫グロブリンは、表面免疫グロブリンまたは膜免疫グロブリンと称され、これは通常、ＢＣＲの一部である。可溶性免疫グロブリンは、通常、抗体と称される。免疫グロブリンは、通常、いくつかの鎖、典型的には２本の同一の重鎖および２本の同一の軽鎖を含み、これらはジスルフィド結合を介して結合されている。これらの鎖は、主に、免疫グロブリンドメイン、例えば、ＶＬ（可変軽鎖）ドメイン、ＣＬ（定常軽鎖）ドメイン、ＶＨ（可変重鎖）ドメイン、ならびにＣＨ（定常重鎖）ドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４で構成される。哺乳動物の免疫グロブリン重鎖の５つのタイプ、すなわち、α、δ、ε、γ、およびμが存在し、これらは、様々なクラスの抗体、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭを構成する。可溶性免疫グロブリンの重鎖とは対照的に、膜免疫グロブリンまたは表面免疫グロブリンの重鎖は、そのカルボキシ末端に膜貫通ドメインおよび短い細胞質ドメインを含む。哺乳動物において、２つのタイプの軽鎖、すなわち、ラムダおよびカッパが存在する。免疫グロブリン鎖は、可変領域および定常領域を含む。定常領域は、本質的に、免疫グロブリンの様々なアイソタイプ内に保存されており、可変部は非常に多種多様であり、抗原認識の原因である。
【0303】
用語「ワクチン接種」および「免疫化」は、個体を治療的理由または予防的理由のために処置するプロセスを説明し、１つまたは複数の免疫原もしくは抗原またはその誘導体を、特に、これをコードする、本明細書中に記載されるＲＮＡの形態で、個体に投与して、前記１つもしくは複数の免疫原もしくは抗原、または前記１つもしくは複数の免疫原もしくは抗原の提示によって特徴付けられる細胞に対する免疫応答を誘発する手順に関する。
【0304】
「抗原の提示によって特徴付けられる細胞」もしくは「抗原を提示する細胞」もしくは「抗原提示細胞の表面上に抗原を提示するＭＨＣ分子」または類似の表現は、ＭＨＣ分子、好ましくはＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ分子、最も好ましくはＭＨＣクラスＩ分子の文脈において、疾患細胞、特に腫瘍細胞、または直接的に、もしくはプロセシングに従って、抗原もしくは抗原ペプチドを提示する抗原提示細胞等の細胞を意味する。
【0305】
本開示の文脈において、用語「転写」は、ＤＮＡ配列中の遺伝コードがＲＮＡに転写されるプロセスに関する。その後、ＲＮＡはペプチドまたはタンパク質に翻訳されてもよい。
【0306】
ＲＮＡに関して、用語「発現」または「翻訳」は、ｍＲＮＡの鎖が、アミノ酸の配列のアセンブリーにペプチドまたはタンパク質を形成するように指示する、細胞のリボソーム内でのプロセスに関する。
【0307】
本明細書中で用いられる用語「必要に応じた」または「適宜」は、後に記載される事象、状況、または状態が、起こっても起こらなくてもよいこと、そして記載が、前記事象、状況、または状態が起こる例、および起こらない例を含むことを意味する。
【0308】
回転軸周りの粒子の「回転半径」（本明細書中でＲｇと略される）は、粒子の全質量が一点に集められるとされるならば、所与の軸周りの慣性モーメントが、質量の実際の分布と同じとなる、回転軸からの点の半径方向距離である。数学的に、Ｒｇは、粒子の構成要素の、質量中心または所与の軸からの二乗平均平方根距離である。例えば、質量中心から固定距離ｓｉにて位置決めされた、質量ｍｉの、ｎ質量要素で構成される巨大分子について（ｉ＝１、２、３、…、ｎ）、Ｒｇは、全ての質量要素についてのｓｉ２の質量平均の平方根であり、以下のように算出され得る：
【0309】
【数2】
【0310】
回転半径は、実験的に、例えば光散乱を用いることによって、求めることができ、または算出することができる。特に、小さな散乱ベクトル（
【0311】
【数3】
【0312】
【数4】
【0313】
「Ｄ１０値」は、特に粒子の定量的サイズ分布に関して、粒子の１０％の直径が、ある値未満の直径である。Ｄ１０値は、粒子の集団内で（例えば、フィールド－フローフラクショネーションから得た粒子ピーク内で）最も小さな粒子の割合を説明する手段である。
【0314】
「Ｄ５０値」は、特に粒子の定量的サイズ分布に関して、粒子の５０％の直径が、ある値未満の直径である。Ｄ５０値は、粒子の集団の（例えば、フィールド－フローフラクショネーションから得た粒子ピーク内の）平均粒子サイズを説明する手段である。
【0315】
「Ｄ９０値」は、特に粒子の定量的サイズ分布に関して、粒子の９０％の直径が、ある値未満の直径である。「Ｄ９５」、「Ｄ９９」および「Ｄ１００」値は、対応する意味を有する。Ｄ９０、Ｄ９５、Ｄ９９、およびＤ１００値は、粒子の集団内で（例えば、フィールド－フローフラクショネーションから得た粒子ピーク内で）より大きな粒子の割合を説明する手段である。
【0316】
粒子の「流体力学半径」（時折、「ストークス半径」または「ストークス－アインシュタイン半径」と呼ばれる）は、前記粒子と同じ速度にて拡散する仮定的剛体球の半径である。流体力学半径は、サイズだけではなく溶媒効果も考慮した、粒子の運動能に関する。例えば、水和がより強い、より小さな帯電粒子ほど、水和がより弱い、より大きな帯電粒子よりも流体力学半径が大きくなり得る。これは、溶液を通して移動するにつれ、粒子が小さいほど水分子の数をより多くドラッグするからである。溶媒中の粒子の実際の寸法は直接的に測定可能でないので、流体力学半径は、ストークス－アインシュタイン式によって定義されてよい：
【0317】
【数5】
【0318】
本明細書中で用いられる用語「シェイプファクター」は、Ｒｇ値（例えば再計算されたＲｇ値）の、流体力学半径（Ｒｈ）値に対する比率を意味する。これは、Ｒｇ値（例えば再計算されたＲｇ値）を流体力学半径（Ｒｈ）値に対してプロットして、データポイントを関数（例えば線形関数）に適合させることによって求めることができ、または算出することができる。
【0319】
本明細書中で用いられる用語「フォームファクター」は、流体力学半径（Ｒｈ）値の、Ｒｇ値（例えば再計算されたＲｇ値）に対する比率を意味する。これは、流体力学半径（Ｒｈ）値をＲｇ値（例えば再計算されたＲｇ値）に対してプロットして、データポイントを関数（例えば線形関数）に適合させることによって求めることができ、または算出することができる。
【0320】
本明細書中で用いられる表現「核酸封入効率」は、核酸および粒子を含む試料または対照組成物中に含有される封入核酸の量の、試料または対照組成物中に含有される核酸の総量に対する比率を意味する。例えば、核酸がＲＮＡである場合には、本明細書中で用いられる表現「ＲＮＡ封入効率」は、ＲＮＡおよび粒子を含む試料または対照組成物中に含有される封入ＲＮＡの量の、試料または対照組成物中に含有されるＲＮＡの総量に対する比率を意味する。
【0321】
本明細書中で用いられる用語「膜」は、分子を、「カットオフ」［例えば分子量（ＭＷ）カットオフ］と呼ばれる特定のサイズ下で通過させるが、前記特定のサイズを超える分子を止める（すなわち、カットオフ、例えばＭＷカットオフ）サイズ選択的バリアを指す。好ましくは、膜は合成のものである。本開示の方法および／または使用に適した膜の例として、限外濾過膜、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜、再生セルロース膜、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜、および他の限外濾過膜が挙げられる。
【0322】
本明細書中で用いられる用語「凝集体」は、粒子が互いに同一であるか、または非常に類似しており、かつ非共有結合的に（例えば、イオン相互作用、Ｈ架橋相互作用、双極子相互作用、および／またはファンデルワールス相互作用を介して）付着している粒子のクラスターに関する。
【0323】
本明細書中で用いられる表現「光散乱」は、光が、光が通過する媒体中での局在化された不均一性に起因して、１つまたは複数の経路による直線的軌跡から逸脱するように強いられる物理的プロセスを指す。
【0324】
用語「ＵＶ」は、紫外線を意味し、波長が１０ｎｍから４００ｎｍ、すなわち、可視光よりも短いがＸ線よりも長い電磁スペクトルの帯域を示す。
【0325】
本明細書中で用いられる用語「円二色性分光法」または「ＣＤ分光法」は、円偏光を用いた分光法を指す。好ましくは、ＣＤ分光法は、左回りの光および右回りの光の差分吸収を包含する。
【0326】
用語「ＵＶ ＣＤ光」または「ＵＶ ＣＤシグナル」は、波長が１０ｎｍから４００ｎｍ、すなわち、可視光よりも短いがＸ線よりも長い円偏光を意味する。
【0327】
本明細書中で用いられる表現「多角度光散乱」またはＭＡＬＳは、試料によって複数の角度に散乱する光を測定するための技術に関する。「多角度」は、この点で、例えば、選択された特定の角度を含む範囲にわたって移動する単一の検出器、または特定の角位置にて固定された検出器のアレイによって測定される様々な離散角度にて、散乱光が検出され得ることを意味する。好ましい一実施形態において、ＭＡＬＳに用いられる光源は、レーザー源（ＭＡＬＬＳ：多角度レーザー光散乱）である。粒子を含む組成物のＭＡＬＳシグナルに基づいて、そして適切なフォーマリズム（例えば、Ｚｉｍｍプロット、Ｂｅｒｒｙプロット、またはＤｅｂｙｅプロット）を用いることによって、回転半径（Ｒｇ）を、ゆえに前記粒子のサイズを求めることが可能である。好ましくは、Ｚｉｍｍプロットは、以下の式を用いたグラフ表示である：
【0328】
【数6】
【0329】
【数7】
【0330】
【数8】
【0331】
本明細書中で用いられる表現「動的光散乱」または「ＤＬＳ」は、特に粒子の流体力学半径に関する、粒子のサイズおよびサイズ分布プロファイルを求めるための技術を指す。単色光源、通常レーザーは、偏光子によって試料中に放射される。続いて、散乱光が第２の偏光子から入って検出されて、結果として生じる画像がスクリーン上に投影される。溶液中の粒子は、光が衝突して、光を全方向に回析する。粒子からの回析光は、建設的に干渉することも（明領域）、破壊的に干渉することも（暗領域）できる。このプロセスは、短い時間間隔にて繰り返されて、スペックルパターンの結果として生じるセットが、経時的に各スポットでの光の強度を比較するオートコリレータによって分析される。
【0332】
本明細書中で用いられる表現「静的光散乱」または「ＳＬＳ」は、特に粒子の回転半径、および／または粒子のモル質量に関する、粒子のサイズおよびサイズ分布プロファイルを求める技術を指す。高強度単色光、通常レーザーが、粒子を含有する溶液中に発射される。１つまたは多くの検出器が、１つまたは多くの角度での散乱強度を測定するのに用いられる。角度依存性が、全ての巨大分子の半径について、モル質量およびサイズの双方の正確な測定値を得るのに必要とされる。それゆえに、入射光の方向に対するいくつかの角度での同時測定［多角度光散乱（ＭＡＬＳ）または多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）として知られている］が、通常、静的光散乱の標準的な実施とみなされる。
【0333】
表現「溶出時間」および「保持時間」は、本明細書中で互換的に用いられており、特定の分析物が、設定された条件の下で、系（例えば、フィールド－フローフラクショネーションデバイスの注入点から、検出器まで）を通過するのにかかる期間に関する。
【0334】
表現「連続的変化」は、ある値から異なる値への変化が絶え間なく、すなわちいかなるジャンプもなく実行されることを意味する。連続的変化の例として、線形変化または指数関数的変化（例えば、線形勾配または指数勾配）がある。
【0335】
表現「段階的変化」は、ある値から異なる値への変化が連続的でなく、第１の特定の値から第２の特定の値までジャンプすることによって、第１の値と第２の値との間の少なくとも１つを省くことを意味する。段階的変化の一例が、第１の値（例えば１０ｍＬ／分）から始まり、かつ第２の値（例えば０ｍＬ／分）にて終了するフローレートプロファイルであり、このプロファイルの間、フローレートは整数（例えば、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、または０ｍＬ／分）のみであることによって、これらの整数の間の値を省くことができる。
【0336】
本明細書中で用いられる表現「核酸（例えばＲＮＡ）および適宜粒子を含む組成物を用意すること」は、そのような組成物が、あらゆる手段によって用意されることを意味し、例えば、調製されてもよく、プロセシングされてもよく（例えば、精製かつ／または乾燥される）、かつ／または貯蔵されてもよい。
【0337】
核酸
本開示に従えば、用語「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、それらの組合せ、およびそれらの修飾型を含む。当該用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換えにより生成された分子、および化学的に合成された分子を含む。本開示に従えば、核酸は、一本鎖として存在しても、二本鎖として存在してもよく、直鎖状分子であっても、共有結合的に環状に閉じた分子であってもよい。核酸は、本開示に従えば、単離することができる。用語「単離した核酸」は、本開示に従えば、核酸が、（ｉ）インビトロで、例えばＤＮＡについてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、もしくはＲＮＡについてインビトロ転写（例えばＲＮＡポリメラーゼを用いる）を介して増幅され、（ｉｉ）クローニングによって組換えにより生成され、（ｉｉｉ）例えば、ゲル電気泳動による切断および分離により精製され、または（ｉｖ）例えば化学合成によって合成されたことを意味する。
本開示に従えば、用語「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、それらの組合せ、およびそれらの修飾型を含む。当該用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換えにより生成された分子、および化学的に合成された分子を含む。本開示に従えば、核酸は、一本鎖として存在しても、二本鎖として存在してもよく、直鎖状分子であっても、共有結合的に環状に閉じた分子であってもよい。核酸は、本開示に従えば、単離することができる。用語「単離した核酸」は、本開示に従えば、核酸が、（ｉ）インビトロで、例えばＤＮＡについてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、もしくはＲＮＡについてインビトロ転写（例えばＲＮＡポリメラーゼを用いる）を介して増幅され、（ｉｉ）クローニングによって組換えにより生成され、（ｉｉｉ）例えば、ゲル電気泳動による切断および分離により精製され、または（ｉｖ）例えば化学合成によって合成されたことを意味する。
【0338】
用語「ヌクレオシド」（本明細書中で「Ｎ」と略される）は、リン酸基のないヌクレオチドと考えることができる化合物に関する。ヌクレオシドは、糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）に結合された核酸塩基である一方、ヌクレオチドは、ヌクレオシドおよび１つまたは複数のリン酸基で構成される。ヌクレオシドの例として、シチジン、ウリジン、シュードウリジン、アデノシン、およびグアノシンが挙げられる。
【0339】
通常、天然に存在する核酸を構成する５つの標準的なヌクレオシドは、ウリジン、アデノシン、チミジン、シチジン、およびグアノシンである。５つのヌクレオシドは一般的にそれぞれ、それらの一文字コードＵ、Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧと略される。しかしながら、チミジンは、より一般的に、ウリジンにおいて見出されるリボフラノース環ではなく２’－デオキシリボフラノース部分を含有するので、「ｄＴ」（ｄはデオキシを表す）として記される。これは、チミジンがデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）において見出され、リボ核酸（ＲＮＡ）では見出されないからである。逆に言えば、ウリジンは、ＲＮＡにおいて見出され、ＤＮＡでは見出されない。残りの３つのヌクレオシドは、ＲＮＡおよびＤＮＡの双方において見出され得る。ＲＮＡにおいて、これらはＡ、Ｃ、およびＧと表されるが、ＤＮＡにおいて、ｄＡ、ｄＣ、およびｄＧと表される。
【0340】
修飾プリン（ＡまたはＧ）またはピリミジン（Ｃ、Ｔ、またはＵ）塩基部分は、好ましくは１つまたは複数のアルキル基、より好ましくは１つまたは複数のＣ１～４アルキル基、さらにより好ましくは１つまたは複数のメチル基によって修飾されている。修飾プリンまたはピリミジン塩基部分の特定の例として、Ｎ７－アルキル－グアニン、Ｎ６－アルキル－アデニン、５－アルキル－シトシン、５－アルキル－ウラシル、およびＮ（１）－アルキル－ウラシル、例えば、Ｎ７－Ｃ１～４アルキル－グアニン、Ｎ６－Ｃ１～４アルキル－アデニン、５－Ｃ１～４アルキル－シトシン、５－Ｃ１～４アルキル－ウラシル、ならびにＮ（１）－Ｃ１～４アルキル－ウラシル、好ましくはＮ７－メチル－グアニン、Ｎ６－メチル－アデニン、５－メチル－シトシン、５－メチル－ウラシル、およびＮ（１）－メチル－ウラシルが挙げられる。
【0341】
本開示において、用語「ＤＮＡ」は、デオキシリボヌクレオチド残基を含む核酸分子に関する。好ましい実施形態において、ＤＮＡは、全てまたは大多数のデオキシリボヌクレオチド残基を含有する。本明細書中で用いられる「デオキシリボヌクレオチド」は、β－Ｄ－リボフラノシル基の２’位にてヒドロキシル基を欠いているヌクレオチドを指す。ＤＮＡは、限定されないが、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、単離したＤＮＡ、例えば、部分的に精製されたＤＮＡ、本質的に純粋なＤＮＡ、合成ＤＮＡ、組換えにより生成されたＤＮＡ、ならびに１つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換、および／または変更によって、天然に存在するＤＮＡと異なる修飾ＤＮＡを包含する。そのような変更は、内部ＤＮＡヌクレオチドへの、またはＤＮＡの末端への、非ヌクレオチド材料の付加を指し得る。また、本明細書中で、ＤＮＡ中のヌクレオチドが、非標準ヌクレオチド、例えば化学的に合成されたヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであってもよいことが意図される。本開示について、変更されたＤＮＡは、天然に存在するＤＮＡの類似体と考える。分子は、分子中のデオキシリボヌクレオチド残基の含量が、分子中のヌクレオチド残基の総数に基づいて５０％を超える（例えば、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）ならば、「大多数のデオキシリボヌクレオチド残基」を含有する。分子中のヌクレオチド残基の総数は、全てのヌクレオチド残基［ヌクレオチド残基が標準（すなわち、天然に存在する）ヌクレオチド残基またはその類似体であるかに拘わらない］の合計である。
【0342】
一実施形態において、ＤＮＡは、組換えＤＮＡであり、特定のｃＤＮＡにおける核酸のクローニングによって得てもよい。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写によって得ることができる。
【0343】
本開示において、用語「ＲＮＡ」は、リボヌクレオチド残基を含む核酸分子に関する。好ましい実施形態において、ＲＮＡは、全てまたは大多数のリボヌクレオチド残基を含有する。本明細書中で用いられる「リボヌクレオチド」は、β－Ｄ－リボフラノシル基の２’位にてヒドロキシル基を有するヌクレオチドを指す。ＲＮＡは、限定されないが、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離したＲＮＡ、例えば、部分的に精製されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換えにより生成されたＲＮＡ、ならびに１つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換、および／または変更によって、天然に存在するＲＮＡと異なる修飾ＲＮＡを包含する。そのような変更は、内部ＲＮＡヌクレオチドへの、またはＲＮＡの末端への、非ヌクレオチド材料の付加を指し得る。また、本明細書中で、ＲＮＡ中のヌクレオチドが、非標準ヌクレオチド、例えば化学的に合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドであってもよいことが意図される。本開示について、変更／修飾されたヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチドの類似体と称され得、そのような変更／修飾されたヌクレオチド（すなわち、変更／修飾されたＲＮＡ）を含有する対応するＲＮＡは、天然に存在するＲＮＡの類似体と称され得る。分子は、分子中のリボヌクレオチド残基の含量が、分子中のヌクレオチド残基の総数に基づいて５０％を超える（例えば、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）ならば、「大多数のリボヌクレオチド残基」を含有する。分子中のヌクレオチド残基の総数は、全てのヌクレオチド残基［ヌクレオチド残基が標準（すなわち、天然に存在する）ヌクレオチド残基またはその類似体であるかに拘わらない］の合計である。
【0344】
本開示に従えば、「ＲＮＡ」として、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、自己増幅ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、ｄｓＲＮＡ、阻害ＲＮＡ［例えば、アンチセンスｓｓＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）］、活性化ＲＮＡ（例えば低分子活性化ＲＮＡ）、および免疫刺激性ＲＮＡ（ｉｓＲＮＡ）が挙げられる。
【0345】
本明細書中で用いられる用語「インビトロ転写」または「ＩＶＴ」は、転写（すなわち、ＲＮＡの生成）が無細胞の様式で行われることを意味する。すなわち、ＩＶＴは、生細胞／培養細胞ではなく、細胞から抽出される転写機構［例えば、細胞溶解液またはその単離した構成要素（ＲＮＡポリメラーゼ（好ましくは、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６ポリメラーゼ）が挙げられる）］を用いる。
【0346】
本開示に従えば、用語「ｍＲＮＡ」は、「メッセンジャーＲＮＡ」を意味し、ＤＮＡ鋳型を用いることによって生成され得、かつペプチドまたはタンパク質をコードし得る「転写産物」に関する。典型的には、ｍＲＮＡは、５’－ＵＴＲ、ペプチド／タンパク質コーディング領域、および３’－ＵＴＲを含む。本開示の文脈において、ｍＲＮＡは、好ましくは、ＤＮＡ鋳型からインビトロ転写（ＩＶＴ）によって生成される。先に示されるように、インビトロ転写方法論は、当業者に知られており、種々のインビトロ転写キットが商業的に入手可能である。
【0347】
ｍＲＮＡは一本鎖であるが、自己相補的配列を含有してもよく、これにより、ｍＲＮＡの一部が折り重なって、それ自体と対形成して二重螺旋を形成することができる。
【0348】
本開示に従えば、「ｄｓＲＮＡ」は、二本鎖ＲＮＡを意味し、２本の部分的に、または完全に相補的な鎖を有するＲＮＡである。
【0349】
ＲＮＡの長さは、１０ヌクレオチドから１５，０００、例えば４０～１５，０００、１００～１２，０００、または２００～１０，０００ヌクレオチドまで変動し得る。一実施形態において、ＲＮＡは阻害ＲＮＡであり、１０～１００ヌクレオチド（例えば、多くとも９０ヌクレオチド、多くとも８０ヌクレオチド、多くとも７０ヌクレオチド、多くとも６０ヌクレオチド、多くとも５０ヌクレオチド、多くとも４５ヌクレオチド、多くとも４０ヌクレオチド、多くとも３５ヌクレオチド、多くとも３０ヌクレオチド、多くとも２５ヌクレオチド、または多くとも２０ヌクレオチド）の長さを有する。一実施形態において、ＲＮＡはペプチドまたはタンパク質をコードしており、少なくとも４５ヌクレオチド（例えば、少なくとも６０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１，０００、少なくとも１，５００、少なくとも２，０００、少なくとも２，５００、少なくとも３，０００、少なくとも３，５００、少なくとも４，０００、少なくとも４，５００、少なくとも５，０００、少なくとも６，０００、少なくとも７，０００、少なくとも８，０００、少なくとも９，０００ヌクレオチド）、好ましくは最大１５，０００、例えば、最大１４，０００、最大１３，０００、最大１２，０００ヌクレオチド、最大１１，０００ヌクレオチド、または最大１０，０００ヌクレオチドの長さを有する。
【0350】
本開示の特定の実施形態において、ＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ転写産物に関するｍＲＮＡである。当該技術において確立されているように、ｍＲＮＡは一般に、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）、ペプチドコーディング領域、および３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）を含有する。一部の実施形態において、ＲＮＡは、インビトロ転写または化学合成によって生成される。一実施形態において、ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型を用いるインビトロ転写によって生成される。インビトロ転写方法論は、当業者に知られている；例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989参照。さらに、種々のインビトロ転写キットが、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ［例えば、ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔＡｉｄ（商標）Ｔ７キット、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｔ７キット、ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔ（登録商標）］、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．［例えば、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７キット、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ ＡＲＣＡ ｍＲＮＡキット］、Ｐｒｏｍｅｇａ［例えば、ｉｂｏＭＡＸ（商標）、ＨｅＬａＳｃｒｉｂｅ（登録商標）、Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ（登録商標）システム］、Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（例えば、ＳＰ６またはＴ７転写キット）、およびＥｐｉｃｅｎｔｒｅ［例えばＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ（商標）］から商業的に入手可能である。修飾ＲＮＡを用意するために、それに応じて、修飾ヌクレオチド、例えば、天然に存在する修飾ヌクレオチド、天然に存在しないヌクレオチド、および／または天然に存在しない修飾ヌクレオチドが、合成（好ましくはインビトロ転写）中に組み込まれてもよいし、修飾が、転写後のＲＮＡ中にもたらされ、かつ／または転写後のＲＮＡに加えられてもよい。
【0351】
一実施形態において、ＲＮＡは、インビトロ転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）であり、適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって得ることができる。転写を制御するためのプロモータは、あらゆるＲＮＡポリメラーゼのためのあらゆるプロモータであってよい。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にｃＤＮＡをクローニングして、これをインビトロ転写に適したベクター中に導入することによって得ることができる。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写によって得ることができる。
【0352】
本開示の文脈において、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、例えば、その安定性を増大させ、かつ／または翻訳効率を増大させ、かつ／または免疫原性を低下させ、かつ／または細胞毒性を低下させるような、１つまたは複数の修飾を含有する。例えば、ＲＮＡ（とりわけｍＲＮＡ）の発現を増大させるために、コーディング領域内、すなわち、発現されるペプチドまたはタンパク質をコードする配列内で、好ましくは、発現されるペプチドまたはタンパク質の配列を変更することなく修飾されてもよい。そのような修飾は、例えば、国際公開第２００７／０３６３６６号パンフレットおよび国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１９／０５６５０２号明細書に記載されており、以下が挙げられる：５’－キャップ構造；天然に存在するポリ（Ａ）尾部の拡張または切断；５’－および／または３’－非翻訳領域（ＵＴＲ）の変更、例えば前記ＲＮＡのコーディング領域に関連していないＵＴＲの導入；合成ヌクレオチドによる、１つまたは複数の天然に存在するヌクレオチドの置換；ならびにコドン最適化（例えば、ＲＮＡのＧＣ含量を変更する、好ましくは増大させる）。本開示に従う修飾ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）の文脈における用語「修飾」は、好ましくは、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）の、前記ＲＮＡにおいて天然に存在しないあらゆる修飾に関する。
【0353】
一部の実施形態において、本開示に従うＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）は、５’－キャップ構造を含む。一実施形態において、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）は、キャップなし５’－三リン酸を有していない。一実施形態において、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）は、従来の５’－キャップおよび／または５’－キャップ類似体を含んでよい。用語「従来の５’－キャップ」は、ｍＲＮＡ分子の５’－末端上に見出されるキャップ構造を指し、一般に、グアノシン５’－三リン酸（Ｇｐｐｐ）からなり、これは、その三リン酸部分を介して、ｍＲＮＡの隣のヌクレオチドの５’－末端に連結されている（すなわち、グアノシンは、５’－５’三リン酸結合を介して、ｍＲＮＡの残りに連結されている）。グアノシンは、Ｎ７位にてメチル化されていてよい（キャップ構造ｍ７Ｇｐｐｐが生じる）。用語「５’－キャップ類似体」は、従来の５’－キャップに基づくが、ｍ７グアノシン構造の２’位または３’位にて、５’－キャップ類似体の逆方向の統合を回避するように修飾されている５’－キャップを指す［そのような５’－キャップ類似体は、アンチリバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）とも呼ばれている］。特に好ましい５’－キャップ類似体は、架橋位置での（ａｔ ｔｈｅ ｂｒｉｄｇｉｎｇ）１つまたは複数の置換、およびホスファート架橋内の非架橋酸素を有するもの、例えば、β－ホスファートでのホスホロチオアート修飾５’－キャップ類似体（例えば、ｍ２
７，２’ＯＧ（５’）ｐｐＳｐ（５’）Ｇ（ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡまたはβ－Ｓ－ＡＲＣＡと称される）であり、国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１９／０５６５０２号明細書に記載されている（その全体の開示が参照によって本明細書に組み込まれる）。本明細書中に記載される、５’－キャップ構造を有するＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）を用意することは、対応する５’－キャップ化合物の存在下での、ＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって達成されてよく、前記５’－キャップ構造は、生成されるＲＮＡ鎖中に共転写して組み込まれ、またはＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）は、例えばインビトロ転写によって生成されてよく、５’－キャップ構造は、ＲＮＡに、キャッピング酵素、例えばワクシニアウイルスのキャッピング酵素を用いて、転写後に付着されてよい。
【0354】
一部の実施形態において、本開示に従うＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）は、ｍ２
７，２’ＯＧ（５’）ｐｐＳｐ（５’）Ｇ（特にそのＤ１ジアステレオマー）、ｍ２
７，３’ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、およびｍ２
７，３－ＯＧｐｐｐ（ｍ１
２’－Ｏ）ＡｐＧからなる群から選択される５’－キャップ構造を含む。
【0355】
一部の実施形態において、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）は、ｃａｐ０、ｃａｐ１、またはｃａｐ２（好ましくはｃａｐ１またはｃａｐ２）を含む。本開示に従えば、用語「ｃａｐ０」は、構造「ｍ７ＧｐｐｐＮ」を意味し、Ｎは、２’位にてＯＨ部分を有するあらゆるヌクレオシドである。本開示に従えば、用語「ｃａｐ１」は、構造「ｍ７ＧｐｐｐＮｍ」を意味し、Ｎｍは、２’位にてＯＣＨ３部分を有するあらゆるヌクレオシドである。本開示に従えば、用語「ｃａｐ２」は、構造「ｍ７ＧｐｐｐＮｍＮｍ」を意味し、各Ｎｍは、独立して、２’位にてＯＣＨ３部分を有するあらゆるヌクレオシドである。
【0356】
ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（β－Ｓ－ＡＲＣＡ）のＤ１ジアステレオマーは、以下の構造を有する：
【0357】
【化1】
【0358】
「ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマー」または「ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）」は、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡのジアステレオマーであり、これは、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ２））のＤ２ジアステレオマーと比較して、ＨＰＬＣカラムにより最初に溶出するので、より短い保持時間を示す。ＨＰＬＣは好ましくは、分析ＨＰＬＣである。一実施形態において、好ましくはフォーマット：５μｍ、４．６×２５０ｍｍの、Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ－１８－Ｔ ＲＰカラムを分離に用いることによって、１．３ｍｌ／分のフローレートを用いることができる。一実施形態において、酢酸アンモニウム中のメタノールの勾配、例えば、０．０５Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ＝５．９中のメタノールの１５分以内の０～２５％直線勾配が用いられる。ＵＶ検出（ＶＷＤ）が、２６０ｎｍにて実行されてよく、蛍光検出（ＦＬＤ）が、２８０ｎｍでの励起および３３７ｎｍでの検出により実行されてよい。
【0359】
ｃａｐ１の構築ブロックである５’－キャップ類似体ｍ２
７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１
２’－Ｏ）ＡｐＧ（ｍ２
７，３’ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ｍ２’－ＯＡｐＧとも称される）は、以下の構造を有する：
【0360】
【化2】
【0361】
β－Ｓ－ＡＲＣＡおよびＲＮＡを含む例示的なｃａｐ０ ＲＮＡは、以下の構造を有する：
【0362】
【化3】
【0363】
ｍ２
７，３’ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＧおよびＲＮＡを含む例示的なｃａｐ０ ＲＮＡは、以下の構造を有する：
【0364】
【化4】
【0365】
ｍ２
７，３－ＯＧｐｐｐ（ｍ１
２’－Ｏ）ＡｐＧおよびＲＮＡを含む例示的なｃａｐ１ ＲＮＡは、以下の構造を有する：
【0366】
【化5】
【0367】
本明細書中で用いられる用語「ポリＡ尾部」または「ポリＡ配列」は、ＲＮＡ分子の３’－末端にて典型的に位置決めされるアデニラート残基の不断配列または中断配列を指す。ポリＡ尾部またはポリＡ配列は、当業者に知られており、本明細書中に記載されるＲＮＡにおいて、３’－ＵＴＲの後に続いてよい。不断ポリＡ尾部が、連続アデニラート残基によって特徴付けられる。自然界では、不断ポリＡ尾部が典型的である。本明細書中で開示されるＲＮＡは、転写後に鋳型非依存性ＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡの自由３’－末端に付着したポリＡ尾部、またはＤＮＡによってコードされ、かつ鋳型依存性ＲＮＡポリメラーゼによって転写されたポリＡ尾部を有してよい。
【0368】
約１２０個のＡヌクレオチドのポリＡ尾部が、形質移入された真核生物細胞内でのＲＮＡのレベル、およびポリＡ尾部の上流（５’）に存在するオープンリーディングフレームから翻訳されるタンパク質のレベルに有益な影響を及ぼすことが実証されている（Holtkamp et al., 2006, Blood, vol. 108, pp. 4009-4017）。
【0369】
ポリＡ尾部は、あらゆる長さであってよい。一部の実施形態において、ポリＡ尾部は、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも８０、または少なくとも１００、および最大５００、最大４００、最大３００、最大２００、または最大１５０個のＡヌクレオチド、特に約１２０個のＡヌクレオチドを含むか、から本質的になるか、またはからなる。この文脈において、「から本質的になる」は、ポリＡ尾部内のほとんどのヌクレオチド、典型的にはポリＡ尾部内のヌクレオチド数の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％がＡヌクレオチドであることを意味するが、残りのヌクレオチドは、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチド、例えば、Ｕヌクレオチド（ウリジラート）、Ｇヌクレオチド（グアニラート）、またはＣヌクレオチド（シチジラート）であることを容認する。この文脈において、「からなる」は、ポリＡ尾部内の全てのヌクレオチド、すなわちポリＡ尾部内のヌクレオチド数の１００％が、Ａヌクレオチドであることを意味する。用語「Ａヌクレオチド」または「Ａ」は、アデニラートを指す。
【0370】
一部の実施形態において、ポリＡ尾部は、コーディング鎖と相補的な鎖内の反復ｄＴヌクレオチド（デオキシチミジラート）を含むＤＮＡ鋳型に基づいて、ＲＮＡ転写中に、例えばインビトロ転写ＲＮＡの調製中に付着される。ポリＡ尾部をコードするＤＮＡ配列（コーディング鎖）は、ポリ（Ａ）カセットと称される。
【0371】
一部の実施形態において、ＤＮＡのコーディング鎖内に存在するポリ（Ａ）カセットは、ｄＡヌクレオチドから本質的になるが、４つのヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、およびｄＴ）のランダム配列によって中断されている。そのようなランダム配列は、５～５０、１０～３０、または１０～２０ヌクレオチド長であってよい。そのようなカセットは、参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６／００５３２４ Ａ１号パンフレットにおいて開示されている。国際公開第２０１６／００５３２４ Ａ１号パンフレットにおいて開示されるあらゆるポリ（Ａ）カセットが、本発明に用いられてよい。ｄＡヌクレオチドから本質的になるが、４つのヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ）の等しい分布を有し、かつ、例えば５～５０ヌクレオチド長を有するランダム配列によって中断されているポリ（Ａ）カセットが、ＤＮＡレベルで、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のプラスミドＤＮＡの一定の増殖を示し、かつなお、ＲＮＡレベルで、ＲＮＡ安定性の補助に関する有益な特性が付随し、かつ翻訳効率が包含される。結果的に、一部の実施形態において、本明細書中に記載されるＲＮＡ分子中に含有されるポリＡ尾部は、Ａヌクレオチドから本質的になるが、４つのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）のランダム配列によって中断されている。そのようなランダム配列は、５～５０、１０～３０、または１０～２０ヌクレオチド長であってよい。
【0372】
一部の実施形態において、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドは、ポリＡ尾部の側面に、その３’－末端にて位置しない、すなわち、ポリＡ尾部は、その３’－末端にて、Ａ以外のヌクレオチドによってマスクされない、または続けられない。
【0373】
一部の実施形態において、本開示に従うＲＮＡは、５’－ＵＴＲおよび／または３’－ＵＴＲを含む。用語「非翻訳領域」または「ＵＴＲ」は、転写されるが、アミノ酸配列に翻訳されないＤＮＡ分子内の領域に、またはＲＮＡ分子、例えばｍＲＮＡ分子内の対応する領域に関する。非翻訳領域（ＵＴＲ）は、オープンリーディングフレームの５’（上流）（５’－ＵＴＲ）および／またはオープンリーディングフレームの３’（下流）（３’－ＵＴＲ）に存在し得る。５’－ＵＴＲは、存在するならば、５’－末端にて、タンパク質コーディング領域の開始コドンの上流に位置決めされる。５’－ＵＴＲは、５’－キャップの下流にあり（存在するならば）、例えば５’－キャップに直接的に隣接している。３’－ＵＴＲは、存在するならば、３’－末端にて、タンパク質コーディング領域の終止コドンの下流に位置決めされるが、用語「３’－ＵＴＲ」は好ましくは、ポリＡ配列を含まない。ゆえに、３’－ＵＴＲは、ポリＡ配列の上流にあり（存在するならば）、例えばポリＡ配列に直接的に隣接している。３’－ＵＴＲの、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）分子の３’－非翻訳領域中への組込みが、翻訳効率の増強をもたらし得る。そのような３’－ＵＴＲの２つ以上［これらは好ましくは頭部－尾部方向に配置されている；例えば、Holtkamp et al., Blood 108, 4009-4017 (2006)参照］を組み込むことによって、相乗効果が達成され得る。３’－ＵＴＲは、導入されるＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）にとって、自己由来であっても異種起源であってもよい。特定の一実施形態において、３’－ＵＴＲは、グロビン遺伝子またはｍＲＮＡ、例えば、アルファ２－グロビン、アルファ１－グロビン、またはベータ－グロビン、好ましくはベータ－グロビン、より好ましくはヒトベータグロビンの遺伝子またはｍＲＮＡに由来する。例えば、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）は、既存の３’－ＵＴＲの、１つまたは複数の、好ましくは２つのコピーの、グロビン遺伝子、例えば、アルファ２－グロビン、アルファ１－グロビン、ベータ－グロビン、好ましくはベータ－グロビン、より好ましくはヒトベータ－グロビンに由来する３’－ＵＴＲによる置換、またはその挿入によって修飾されていてよい。
【0374】
ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）は、その安定性を増大させ、および／または免疫原性を低下させ、および／または細胞毒性を低下させるような修飾リボヌクレオチドを有してよい。例えば、一実施形態において、本明細書中に記載されるＲＮＡ中のウリジンは、修飾ヌクレオシドによって置き換えられている（部分的に、または完全に、好ましくは完全に）。一部の実施形態において、修飾ヌクレオシドは、修飾ウリジンである。
【0375】
一部の実施形態において、ウリジンを置き換える修飾ウリジンは、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）、５－メチル－ウリジン（ｍ５Ｕ）、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【0376】
一部の実施形態において、ＲＮＡ中のウリジンを置き換える（部分的に、または完全に、好ましくは完全に）修飾ヌクレオシドは、３－メチル－ウリジン（ｍ３Ｕ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－アザ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ウリジン（ｓ２Ｕ）、４－チオ－ウリジン（ｓ４Ｕ）、４－チオ－シュードウリジン、２－チオ－シュードウリジン、５－ヒドロキシ－ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５－アミノアリル－ウリジン、５－ハロ－ウリジン（例えば、５－ヨード－ウリジンまたは５－ブロモ－ウリジン）、ウリジン５－オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５－カルボキシメチル－ウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５－アミノメチル－２－チオウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、１－エチル－シュードウリジン、５－メチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－２－セレノ－ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５－カルバモイルメチル－ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－ウリジン（τｍ５Ｕ）、１－タウリノメチル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１－タウリノメチル－４－チオ－シュードウリジン）、５－メチル－２－チオ－ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１－メチル－４－チオ－シュードウリジン（ｍ１ｓ４ψ）、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、３－メチル－シュードウリジン（ｍ３ψ）、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロシュードウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、５－メチル－ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロ－シュードウリジン、２－メトキシ－ウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュードウリジン（ａｃｐ３ψ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２－チオ－ウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α－チオ－ウリジン、２’－Ｏ－メチル－ウリジン（Ｕｍ）、５，２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’－Ｏ－メチル－シュードウリジン（ψｍ）、２－チオ－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１－チオ－ウリジン、デオキシチミジン、２’－Ｆ－アラ－ウリジン、２’－Ｆ－ウリジン、２’－ＯＨ－アラ－ウリジン、５－（２－カルボメトキシビニル）ウリジン、５－［３－（１－Ｅ－プロペニルアミノ）ウリジン、または当該技術において知られている他のあらゆる修飾ウリジンのいずれか１つまたは複数であってよい。
【0377】
シュードウリジンによって修飾されている（部分的に、または完全に、好ましくは完全に、ウリジンを置き換えている）ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）は、本明細書中で「Ψ－修飾」と称されるが、用語「ｍ１Ψ－修飾」は、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）が、Ｎ（１）－メチルシュードウリジンを含有する（部分的に、または完全に、好ましくは完全に、ウリジンを置き換えている）ことを意味する。さらに、用語「ｍ５Ｕ－修飾」は、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）が５－メチルウリジンを含有する（部分的に、または完全に、好ましくは完全に、ウリジンを置き換えている）ことを意味する。そのようなΨ－またはｍ１Ψ－またはｍ５Ｕ－修飾ＲＮＡは、通常、それらの非修飾形態と比較して、免疫原性の低下を示すので、免疫応答の誘導が回避または最小限にされるべき用途において好ましい。
【0378】
本開示のＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）のコドンはさらに、例えば、ＲＮＡのＧＣ含量を増大させ、かつ／または細胞（または対象）内で稀であるコドンを置き換えて、目的のペプチドまたはタンパク質が、前記細胞（または対象）内の頻繁な同義コドンであるコドンによって発現されることとなるように最適化されてもよい。
【0379】
先に記載される修飾の組合せ、すなわち、５’－キャップ構造の組込み、ポリＡ配列の組込み、ポリＡ配列のアンマスキング、５’－および／または３’－ＵＴＲの変更（例えば、１つまたは複数の３’－ＵＴＲの組込み）、１つまたは複数の天然に存在するヌクレオチドの、合成ヌクレオチドによる置換［例えば、シチジンについて５－メチルシチジン、かつ／またはウリジンについてシュードウリジン（Ψ）もしくはＮ（１）－メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）もしくは５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）］、ならびにコドン最適化は、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）の安定性、および翻訳効率の増大に及ぼす相乗効果的な影響を有する。ゆえに、好ましい実施形態において、本開示に従うＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）は、上記の修飾、すなわち、（ｉ）５’－キャップ構造の組込み、（ｉｉ）ポリＡ配列の組込み、ポリＡ配列のアンマスキング；（ｉｉｉ）５’－および／または３’－ＵＴＲの変更（例えば、１つまたは複数の３’－ＵＴＲの組込み）；（ｉｖ）１つまたは複数の天然に存在するヌクレオチドの、合成ヌクレオチドによる置換［例えば、シチジンについて５－メチルシチジン、かつ／またはウリジンについてシュードウリジン（Ψ）もしくはＮ（１）－メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）もしくは５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）］、ならびに（ｖ）コドン最適化の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または５つ全ての組合せを含有する。
【0380】
一実施形態において、本開示に従うＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質、好ましくは医薬的に活性なペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列を含む。
【0381】
好ましい実施形態において、本開示に従うＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質、好ましくは医薬的に活性なペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列を含み、特に細胞または対象中に移されれば、前記ペプチドまたはタンパク質を発現することができる。ゆえに、好ましくは本発明に従うＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質をコードする、好ましくは医薬的に活性なペプチドまたはタンパク質をコードするコーディング領域［オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）］を含有する。この点で、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、開始コドンで始まって終止コドンで終わるコドンの連続的な広がりである。
【0382】
本開示に従えば、用語「医薬的に活性なペプチドまたはタンパク質」は、個体の処置に用いることができるペプチドまたはタンパク質を意味し、ペプチドまたはタンパク質の発現は、例えば疾患または障害の病徴を寛解させるのに、有益である。好ましくは、医薬的に活性なペプチドまたはタンパク質は、治療特性または緩和特性を有しており、疾患もしくは障害の発症を寛解させるか、軽減するか、緩和するか、食い止めるか、遅延させるか、または疾患もしくは障害の１つもしくは複数の病徴の重症度を小さくするのに投与されてよい。好ましくは、医薬的に活性なペプチドまたはタンパク質は、治療的に有効な量が個体に投与されると、個体の症状または疾患状態に及ぼすポジティブまたは有益な効果がある。医薬的に活性なペプチドまたはタンパク質は、予防的特性を有し得、かつ、疾患もしくは障害の発症を遅延させるのに、またはそのような疾患もしくは障害の重症度を小さくするのに用いられてよい。用語「医薬的に活性なペプチドまたはタンパク質」は、タンパク質またはポリペプチド全体を含み、かつ、その医薬的に活性な断片を指し得る。また、ペプチドまたはタンパク質の医薬的に活性な類似体が挙げられ得る。
【0383】
医薬的に活性なペプチドおよびタンパク質の具体的な例として、サイトカイン、ホルモン、接着分子、免疫グロブリン、免疫学的に活性な化合物、増殖因子、プロテアーゼ阻害剤、酵素、受容体、アポトーシス調節因子、転写因子、腫瘍抑制タンパク質、構造タンパク質、再プログラミング因子、ゲノム工学タンパク質、および血液タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【0384】
用語「サイトカイン」は、約５～２０ｋＤａの分子量を有し、かつ細胞シグナル伝達（例えば、パラクリンシグナル伝達、内分泌シグナル伝達、および／または自己分泌シグナル伝達）に関与するタンパク質に関する。特に、放出されると、サイトカインは、放出場所の周りで、細胞の挙動に及ぼす作用を発揮する。サイトカインの例として、リンホカイン、インターロイキン、ケモカイン、インターフェロン、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が挙げられる。本開示に従えば、サイトカインは、ホルモンまたは増殖因子を含まない。サイトカインは、ホルモンと、（ｉ）通常、ホルモンよりもかなり可変的な濃度にて作動し、かつ（ｉｉ）一般に、広い範囲の細胞（ほぼ全ての有核細胞は、サイトカインを産生することができる）によって製造される点で異なる。インターフェロンは、通常、抗ウイルス活性、抗増殖活性、および免疫調節活性によって特徴付けられる。インターフェロンは、調節された細胞の表面上のインターフェロン受容体に結合することによって細胞内での遺伝子の転写を改変かつ調節することによって、細胞内でのウイルス複製を妨げるタンパク質である。インターフェロンは、２つのタイプにグループ化することができる。ＩＦＮ－ガンマは、唯一のＩＩ型インターフェロンである；他は全て、Ｉ型インターフェロンである。サイトカインの特定の例として、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）、インターフェロンベータ（ＩＦＮβ）、インターフェロンガンマ（ＩＮＦγ）、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン４（ＩＬ－４）、インターロイキン１０（ＩＬ－１０）、およびインターロイキン１１（ＩＬ－１１）が挙げられる。
【0385】
用語「ホルモン」は、腺によって産生されるシグナル伝達分子のクラスに関し、シグナル伝達は通常、以下の工程：（ｉ）特定の組織内のホルモンの合成；（ｉｉ）記憶および分泌；（ｉｉｉ）ホルモンの、その標的への輸送；（ｉｖ）受容体によるホルモンの結合；（ｖ）シグナルのリレーおよび増幅；ならびに（ｖｉ）ホルモンの分解を含む。ホルモンは、サイトカインと、（１）ホルモンが通常、より可変的でない濃度で作動し、かつ（２）一般に、特定の種類の細胞によって製造される点で異なる。一実施形態において、「ホルモン」は、ペプチドまたはタンパク質ホルモン、例えば、インスリン、バソプレシン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、甲状腺ホルモン、成長ホルモン（例えば、ヒト成長ホルモンまたはウシ成長ホルモン）、オキシトシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、グルカゴン、ソマトスタチン、コレシストキニン、ガストリン、およびレプチンである。
【0386】
用語「接着分子」は、細胞の表面上に位置決めされ、かつ細胞の、他の細胞との、または細胞外マトリックス（ＥＣＭ）との結合に関与するタンパク質に関する。接着分子は典型的に、膜貫通受容体であり、カルシウム非依存性（例えば、インテグリン、免疫グロブリンスーパーファミリー、リンパ球ホーミング受容体）として、ならびにカルシウム依存性（カドヘリンおよびセレクチン）として分類され得る。接着分子の特定の例として、インテグリン、リンパ球ホーミング受容体、セレクチン（例えば、Ｐ－セレクチン）、およびアドレシンがある。
【0387】
また、インテグリンが、シグナル伝達に関与する。特に、リガンド結合の直後に、インテグリンは、細胞シグナル伝達経路、例えば、膜貫通プロテインキナーゼ、例えば受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の経路をモジュレートする。そのような調節は、細胞の増殖、分裂、生存、もしくは分化の、またはアポトーシスの原因となり得る。インテグリンの特定の例として：α１β１、α２β１、α３β１、α４β１、α５β１、α６β１、α７β１、αＬβ２、αＭβ２、αＩＩｂβ３、αＶβ１、αＶβ３、αＶβ５、αＶβ６、αＶβ８、およびα６β４が挙げられる。
【0388】
用語「免疫グロブリン」または「免疫グロブリンスーパーファミリー」は、細胞の認識、結合、および／または接着プロセスに関与する分子を指す。このスーパーファミリーに属する分子は、免疫グロブリンドメインまたはフォールドとして知られている領域を含有するという構成を共有する。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーとして、抗体（例えばＩｇＧ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子、共受容体（例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９）、抗原受容体アクセサリ分子（例えば、ＣＤ－３γ、ＣＤ－３δ、ＣＤ－３ε、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ）、共刺激分子または阻害分子（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６）、およびその他が挙げられる。
【0389】
用語「免疫学的に活性な化合物」は、好ましくは、免疫細胞の成熟を誘導および／または抑制し、サイトカイン生合成を誘導および／または抑制し、および／またはＢ細胞による抗体産生を誘発することによって液性免疫を変更することによって、免疫応答を変更するあらゆる化合物に関する。免疫学的に活性な化合物は、強い免疫刺激活性を有し、以下に限定されないが、抗ウイルス活性および抗腫瘍活性が挙げられる。また、免疫応答の他の態様を下方制御することもでき、例えば、免疫応答をＴＨ２免疫応答から遠ざかる方向にシフトし、これは、広範なＴＨ２媒介疾患を処置するのに有用である。免疫学的に活性な化合物は、ワクチンアジュバントとして有用であり得る。免疫学的に活性な化合物の特定の例として、インターロイキン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、エリトロポイエチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロン、インテグリン、アドレシン、セレクチン、ホーミング受容体、および抗原、特に、腫瘍関連抗原、病原体関連抗原（例えば、細菌抗原、寄生虫抗原、またはウイルス抗原）、アレルゲン、および自己抗原が挙げられる。
【0390】
用語「自己抗原（ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ）」または「自己抗原（ｓｅｌｆ－ａｎｔｉｇｅｎ）」は、対象の体内を起源とし（すなわち、自己抗原は「自己由来の抗原」とも称され得る）、かつ身体の正常な部分に対して異常に激しい免疫応答をもたらす抗原を指す。自己抗原に対するそのような激しい免疫反応は、「自己免疫疾患」の原因であり得る。
【0391】
用語「アレルゲン」は、対象の体外を起源とし（すなわち、アレルゲンは「異種抗原」とも称され得る）、かつ、対象の免疫系が、普通であれば対象に無害である、認められた脅威と戦って、異常に激しい免疫応答をもたらす種類の抗原を指す。「アレルギー」は、アレルゲンに対するそのような激しい免疫反応によって引き起こされる疾患である。アレルゲンは、通常、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）応答を介して、アトピーの個体においてＩ型過敏性反応を刺激することができる抗原である。アレルゲンの特定の例として、ピーナッツタンパク質（例えば、Ａｒａ ｈ ２．０２）、オバルブミン、イネ科植物花粉タンパク質（例えば、Ｐｈｌ ｐ ５）、およびイエダニのタンパク質（例えば、Ｄｅｒ ｐ ２）に由来するアレルゲンが挙げられる。
【0392】
用語「増殖因子」は、細胞の成長、増殖、治癒、および／または細胞分化を刺激することができる分子を指す。典型的には、増殖因子は、細胞間のシグナル伝達分子としての機能を果たす。用語「増殖因子」は、その標的細胞の表面上の特定の受容体に結合する特定のサイトカインおよびホルモンを含む。増殖因子の例として、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、例えばＶＥＧＦＡ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インシュリン様増殖因子、エフリン、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ニューレグリン、ニューロトロフィン［例えば、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）］、胎盤増殖因子（ＰＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、レナラーゼ（ＲＮＬＳ）（抗アポトーシス生存因子）、Ｔ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、トランスフォーミング増殖因子［トランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦ－α）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β）］、および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）が挙げられる。一実施形態において、「増殖因子」は、ペプチド増殖因子またはタンパク質増殖因子である。
【0393】
用語「プロテアーゼ阻害剤」は、プロテアーゼの機能を阻害する分子、特にペプチドまたはタンパク質を指す。プロテアーゼ阻害剤は、阻害されるプロテアーゼによって（例えば、アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤）、またはその作用機序によって（例えば自殺阻害剤、例えばセルピン）分類され得る。プロテアーゼ阻害剤の特定の例として、セルピン、例えば、アルファ１－アンチトリプシン、アプロチニン、およびベスタチンが挙げられる。
【0394】
用語「酵素」は、化学反応を促進する高分子生体触媒を指す。あらゆる触媒のように、酵素は、これが触媒する反応において消費されず、かつ前記反応の平衡を変更しない。他の多くの触媒とは異なり、酵素はかなり特異的である。一実施形態において、酵素は、対象のホメオスタシスにとって不可欠であり、例えば、酵素の何らかの機能不全（特に、突然変異、欠失、または産生の低下のいずれかによって引き起こされ得る活性の低下）が、疾患をもたらす。酵素の例として、単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１－ＴＫ）、ヘキソサミニダーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、偽コリンエステラーゼ、およびラクターゼが挙げられる。
【0395】
用語「受容体」は、細胞の外側からシグナル（特に、リガンドと呼ばれる化学シグナル）を受け取るタンパク質分子を指す。シグナル（例えば、リガンド）の、受容体への結合は、細胞の一部の種類の応答、例えば、キナーゼの細胞内活性化を引き起こす。受容体として、膜貫通受容体［例えば、イオンチャネル結合型（イオンチャネル型）受容体、Ｇタンパク質結合型（代謝調節型）受容体、および酵素結合型受容体］、および細胞内受容体（例えば、細胞質受容体および核内受容体）が挙げられる。受容体の特定の例として、ステロイドホルモン受容体、増殖因子受容体、およびペプチド受容体（すなわち、リガンドがペプチドである受容体）、例えばＰ－セレクチン糖タンパク質リガンド－１（ＰＳＧＬ－１）が挙げられる。用語「増殖因子受容体」は、増殖因子に結合する受容体を指す。
【0396】
用語「アポトーシス調節因子」は、アポトーシスをモジュレートする、すなわち、アポトーシスを活性化または阻害する分子、特にペプチドまたはタンパク質を指す。アポトーシス調節因子は、２つの広いクラス：ミトコンドリア機能をモジュレートするクラス、およびカスパーゼを調節するクラスにグループ化することができる。第１のクラスは、ミトコンドリア膜電位の損失、および／またはアポトーシス促進性タンパク質、例えばシトクロムＣの、サイトゾル中への放出を妨げることによってミトコンドリア完全性を保存するように作動するタンパク質（例えば、Ｂｃｌ－２、ＢＣＬ－ｘＬ）を含む。また、この第１のクラスに、シトクロムＣの放出を促進するアポトーシス促進性タンパク質（例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫ、ＢＩＭ）が属する。第２のクラスは、タンパク質、例えば、アポトーシスタンパク質の阻害剤（例えばＸＩＡＰ）、またはカスパーゼの活性化をブロックするＦＬＩＰを含む。
【0397】
用語「転写制御因子」は、特に特定のＤＮＡ配列に結合することによって、ＤＮＡからメッセンジャーＲＮＡへの遺伝情報の転写の速度を調節するタンパク質に関する。転写因子は、細胞分裂、細胞増殖、および細胞死を、寿命の全体を通して、細胞移動および組織化を、胚発生中に、かつ／または細胞の外側からのシグナル、例えばホルモンに応答して、調節し得る。転写因子は、特定のＤＮＡ配列（通常、転写因子によって調節される遺伝子に隣接）に結合する少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインを含有する。転写因子の特定の例として、ＭＥＣＰ２、ＦＯＸＰ２、ＦＯＸＰ３、ＳＴＡＴタンパク質ファミリー、およびＨＯＸタンパク質ファミリーが挙げられる。
【0398】
用語「腫瘍抑制タンパク質」は、がんへの経路上の一工程から細胞を保護する分子、特にペプチドまたはタンパク質に関する。腫瘍抑制タンパク質（通常、対応する腫瘍抑制遺伝子によってコードされている）は、細胞周期の調節に及ぼす弱化効果もしくは抑制効果を示し、かつ／またはアポトーシスを促進する。それらの機能は、以下：細胞周期の継続に不可欠な遺伝子の抑制；細胞周期の、ＤＮＡ損傷へのカップリング（損傷を受けたＤＮＡが細胞内に存在する限り、細胞分裂は起こるべきでない）；損傷を受けたＤＮＡが修復され得ないならば、アポトーシスの開始；転移抑制（例えば、腫瘍細胞が分散するのを妨げ、接触阻害のロスをブロックし、かつ転移を阻害する）；およびＤＮＡ修復の１つまたは複数であり得る。腫瘍抑制タンパク質の特定の例として、ｐ５３、ホスファターゼおよびテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、ＳＷＩ／ＳＮＦ（ＳＷＩｔｃｈ／スクロース非発酵性）、フォンヒッペル－リンドウ腫瘍抑制因子（ｐＶＨＬ）、腺腫様多発結腸ポリープ（ＡＰＣ）、ＣＤ９５、腫瘍形成抑制５（ＳＴ５）、腫瘍形成抑制５（ＳＴ５）、腫瘍形成抑制１４（ＳＴ１４）、およびＹｉｐｐｅｅ－ｌｉｋｅ ３（ＹＰＥＬ３）が挙げられる。
【0399】
用語「構造タンパク質」は、普通であれば流体の生体構成要素に剛性および硬直化を付与するタンパク質を指す。構造タンパク質はほとんどの場合、繊維性である（例えば、コラーゲンおよびエラスチン）が、球状であってもよい（例えば、アクチンおよびチューブリン）。通常、球状タンパク質は、モノマーとして可溶性であるが、長い、例えば、細胞骨格を構成し得る繊維を形成するように重合する。他の構造タンパク質は、機械力およびサーファクタントタンパク質を生成することができる運動タンパク質（例えば、ミオシン、キネシン、およびダイニン）である。構造タンパク質の特定の例として、コラーゲン、サーファクタントタンパク質Ａ、サーファクタントタンパク質Ｂ、サーファクタントタンパク質Ｃ、サーファクタントタンパク質Ｄ、エラスチン、チューブリン、アクチン、およびミオシンが挙げられる。
【0400】
用語「再プログラミング因子」または「再プログラミング転写因子」は、適宜さらなるエージェント、例えばさらなる再プログラミング因子と共に、体細胞内で発現されると、前記体細胞の、幹細胞の特性、特に多能性を有する細胞への再プログラミングまたは脱分化の原因となる分子、特にペプチドまたはタンパク質に関する。再プログラミング因子の特定の例として、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、およびＮＡＮＯＧが挙げられる。
【0401】
用語「ゲノム工学タンパク質」は、対象のゲノムにおいてＤＮＡを挿入するか、欠失させるか、置換することができるタンパク質に関する。ゲノム工学タンパク質の特定の例として、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクティベータ様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート－ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）が挙げられる。
【0402】
用語「血液タンパク質」は、対象の血漿、特に健康な対象の血漿中に存在するペプチドまたはタンパク質に関する。血液タンパク質は、多様な機能、例えば輸送（例えば、アルブミン、トランスフェリン）、酵素活性（例えば、トロンビンまたはセルロプラスミン）、血液凝固（例えばフィブリノゲン）、病原体に対する防御（例えば、補完成分および免疫グロブリン）、プロテアーゼ阻害剤（例えばアルファ１－アンチトリプシン）、その他を有する。血液タンパク質の特定の例として、トロンビン、血清アルブミン、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、インスリン、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、組織プラスミノゲンアクティベータ、プロテインＣ、フォンウィルブランド因子、アンチトロンビンＩＩＩ、グルコセレブロシダーゼ、エリトロポイエチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、修飾第ＶＩＩＩ因子、および抗凝固剤が挙げられる。
【0403】
ゆえに、一実施形態において、医薬的に活性なペプチドまたはタンパク質は、（ｉ）好ましくは、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、インターロイキン４（ＩＬ－２）、およびインターロイキン１０（ＩＬ－１１）からなる群から選択されるサイトカイン、より好ましくはＥＰＯ；（ｉｉ）接着分子、特にインテグリン；（ｉｉｉ）免疫グロブリン、特に抗体；（ｉｖ）免疫学的に活性な化合物、特に抗原；（ｖ）ホルモン、特に、バソプレシン、インスリン、または成長ホルモン；（ｖｉ）増殖因子、特にＶＥＧＦＡ；（ｖｉｉ）プロテアーゼ阻害剤、特にアルファ１－アンチトリプシン；（ｖｉｉｉ）好ましくは、単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１－ＴＫ）、ヘキソサミニダーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、偽コリンエステラーゼ、膵臓酵素、およびラクターゼからなる群から選択される酵素；（ｉｘ）受容体、特に増殖因子受容体；（ｘ）アポトーシス調節因子、特にＢＡＸ；（ｘｉ）転写因子、特にＦＯＸＰ３；（ｘｉｉ）腫瘍抑制タンパク質、特にｐ５３；（ｘｉｉｉ）構造タンパク質、特にサーファクタントタンパク質Ｂ；（ｘｉｖ）例えば、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、およびＮＡＮＯＧからなる群から選択される、再プログラミング因子；（ｘｖ）ゲノム工学タンパク質、特に、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート－ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）；ならびに（ｘｖｉ）血液タンパク質、特にフィブリノゲンである。
【0404】
一実施形態において、医薬的に活性なペプチドまたはタンパク質は、１つもしくは複数の抗原または１つもしくは複数のエピトープを含む、すなわち、対象へのペプチドまたはタンパク質の投与は、対象において１つもしくは複数の抗原または１つもしくは複数のエピトープに対して免疫応答を誘発し、これは、治療的であり得る、または部分的に、もしくは完全に保護的であり得る。
【0405】
特定の実施形態において、ＲＮＡは、少なくとも１つのエピトープをコードする。特定の実施形態において、エピトープは、腫瘍抗原に由来する。腫瘍抗原は、「標準的な」抗原であってよく、これは通常、種々のがんにおいて発現されることが知られている。また、腫瘍抗原は、「新抗原」であってよく、これは、個体の腫瘍に特異的であり、以前に免疫系によって認識されていない。新抗原またはネオエピトープは、アミノ酸変化をもたらす、がん細胞のゲノム内の１つまたは複数のがん特異的突然変異に由来し得る。腫瘍抗原の例として、ｐ５３、ＡＲＴ－４、ＢＡＧＥ、ベータ－カテニン／ｍ、Ｂｃｒ－ａｂＬ ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ－１、ＣＡＳＰ－８、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＥＡ、クラウディンファミリーの細胞表面タンパク質、例えば、ＣＬＡＵＤ ΓΝ－６、ＣＬＡＵＤＩＮ－１８．２およびＣＬＡＵＤＩＮ－１２、ｃ－ＭＹＣ、ＣＴ、Ｃｙｐ－Ｂ、ＤＡＭ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ－Ｖ、Ｇａｐ １００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＨＰＶ－Ｅ７、ＨＰＶ－Ｅ６、ＨＡＳＴ－２、ｈＴＥＲＴ（またはｈＴＲＴ）、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ－Ａ、好ましくは、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ５、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ７、ＭＡＧＥ－Ａ８、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１１、またはＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ｂ、ＭＡＧＥ－Ｃ、ＭＡＲＴ－１／メラン－Ａ、ＭＣ１Ｒ、ミオシン／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ－１、ＭＵＭ－２、ＭＵＭ－３、ＮＡ８８－Ａ、ＮＦ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＮＹ－ＢＲ－１、ｐｌ９０マイナーＢＣＲ－ａｂＬ、Ｐｍｌ／ＲＡＲａ、ＰＲＡＭＥ、プロテイナーゼ３、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１またはＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ－１またはＳＡＲＴ－３、ＳＣＧＢ３Ａ２、ＳＣＰ１、ＳＣＰ２、ＳＣＰ３、ＳＳＸ、ＳＵＲＶＩＶＩＮ、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２、ＴＰＴＥ、ＷＴ、およびＷＴ－１が挙げられるが、これらに限定されない。
【0406】
がん突然変異は、各個体によって変動する。ゆえに、新規のエピトープ（ネオエピトープ）をコードするがん突然変異は、ワクチン組成物および免疫治療の開発における魅力的な標的を表す。腫瘍免疫治療の有効性は、宿主内で強力な免疫応答を誘導することができるがん特異的抗原およびエピトープの選択に依存する。ＲＮＡは、患者特異的腫瘍エピトープを患者に送達するのに用いることができる。脾臓中に存在する樹状細胞（ＤＣ）は、免疫原性エピトープまたは抗原、例えば腫瘍エピトープのＲＮＡ発現について、特に目的とする抗原提示細胞を表す。多重エピトープの使用は、腫瘍ワクチン組成物における治療有効性を促進することが示されている。腫瘍ミュータノームの迅速な配列決定により、例えば単一のポリペプチドとして、本明細書中に記載されるＲＮＡによってコードされ得る個々に区別されたワクチン用の多重エピトープが提供され得、エピトープは、適宜、リンカーによって分離されている。本開示の特定の実施形態において、ＲＮＡは、少なくとも１つのエピトープ、少なくとも２つのエピトープ、少なくとも３つのエピトープ、少なくとも４つのエピトープ、少なくとも５つのエピトープ、少なくとも６つのエピトープ、少なくとも７つのエピトープ、少なくとも８つのエピトープ、少なくとも９つのエピトープ、または少なくとも１０個のエピトープをコードする。例示的な実施形態は、少なくとも５つのエピトープ（「ペンタトープ」と称される）をコードするＲＮＡおよび少なくとも１０個のエピトープ（「デカトープ」と称される）をコードするＲＮＡを含む。
【0407】
粒子
本開示の文脈において、用語「粒子」は、分子または分子複合体、特に粒子形成化合物によって形成される構造化された実体に関する。好ましくは、粒子は、両親媒性物質（例えば、両親媒性脂質、両親媒性ポリマー、および／または両親媒性タンパク質／ポリペプチド）の１つまたは複数のタイプから製造されるエンベロープ（例えば、１つまたは複数の層またはラメラ）を含有する。この文脈において、表現「両親媒性物質」は、物質が親水性および親油性の双方の特性を有することを意味する。また、エンベロープは、両親媒性である必要がない追加的な物質（例えば、追加的な脂質および／または追加的なポリマー）を含んでもよい。ゆえに、一実施形態において、粒子は、モノラメラ構造またはマルチラメラ構造であり、１つまたは複数の層またはラメラを構成する物質は、１つまたは複数のタイプの両親媒性物質（特に、両親媒性脂質、両親媒性ポリマー、および／または両親媒性タンパク質／ポリペプチドからなる群から選択される）を、適宜、両親媒性である必要がない追加的な物質（例えば、追加的な脂質および／または追加的なポリマー）と組み合わせて含む。一実施形態において、用語「粒子」は、マイクロ－またはナノサイズの構造、例えば、マイクロ－またはナノサイズのコンパクト構造に関する。この点で、用語「マイクロサイズの」は、粒子の３つの外部寸法が全てマイクロスケール、すなわち、１～５μｍであることを意味する。本開示に従えば、用語「粒子」は、リポプレックス粒子（ＬＰＸ）、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、ポリプレックス粒子、リポポリプレックス粒子、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、およびそれらの混合物（例えば、２つ以上の粒子タイプの混合物、例えばＬＰＸおよびＶＬＰの混合物またはＬＮＰおよびＶＬＰの混合物）を含む。
本開示の文脈において、用語「粒子」は、分子または分子複合体、特に粒子形成化合物によって形成される構造化された実体に関する。好ましくは、粒子は、両親媒性物質（例えば、両親媒性脂質、両親媒性ポリマー、および／または両親媒性タンパク質／ポリペプチド）の１つまたは複数のタイプから製造されるエンベロープ（例えば、１つまたは複数の層またはラメラ）を含有する。この文脈において、表現「両親媒性物質」は、物質が親水性および親油性の双方の特性を有することを意味する。また、エンベロープは、両親媒性である必要がない追加的な物質（例えば、追加的な脂質および／または追加的なポリマー）を含んでもよい。ゆえに、一実施形態において、粒子は、モノラメラ構造またはマルチラメラ構造であり、１つまたは複数の層またはラメラを構成する物質は、１つまたは複数のタイプの両親媒性物質（特に、両親媒性脂質、両親媒性ポリマー、および／または両親媒性タンパク質／ポリペプチドからなる群から選択される）を、適宜、両親媒性である必要がない追加的な物質（例えば、追加的な脂質および／または追加的なポリマー）と組み合わせて含む。一実施形態において、用語「粒子」は、マイクロ－またはナノサイズの構造、例えば、マイクロ－またはナノサイズのコンパクト構造に関する。この点で、用語「マイクロサイズの」は、粒子の３つの外部寸法が全てマイクロスケール、すなわち、１～５μｍであることを意味する。本開示に従えば、用語「粒子」は、リポプレックス粒子（ＬＰＸ）、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、ポリプレックス粒子、リポポリプレックス粒子、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、およびそれらの混合物（例えば、２つ以上の粒子タイプの混合物、例えばＬＰＸおよびＶＬＰの混合物またはＬＮＰおよびＶＬＰの混合物）を含む。
【0408】
本開示において用いられる「ナノ粒子」は、本明細書中に記載される核酸（とりわけＲＮＡ）および少なくとも１つの陽イオン脂質を含む粒子を指し、粒子の３つの外部寸法は全て、ナノスケール、すなわち、少なくとも約１ｎｍかつ約１０００ｎｍ未満（好ましくは、１０～９９０ｎｍ、例えば１５～９００ｎｍ、２０～８００ｎｍ、３０～７００ｎｍ、４０～６００ｎｍ、または５０～５００ｎｍ）である。好ましくは、最も長い軸および最も短い軸は、大きく異ならない。好ましくは、粒子のサイズは、その直径である。
【0409】
本開示の文脈において、用語「リポプレックス粒子」は、両親媒性脂質、特に陽イオン両親媒性脂質、および本明細書中に記載される核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子に関する。正に帯電するリポソーム（１つまたは複数の両親媒性脂質、特に陽イオン両親媒性脂質から製造される）と負に帯電する核酸（とりわけＲＮＡ）との間の静電的相互作用は、核酸リポプレックス粒子の錯体化および自発的形成をもたらす。正に帯電するリポソームは、通常、陽イオン両親媒性脂質、例えばＤＯＴＭＡ、および追加的な脂質、例えばＤＯＰＥを用いて合成されてもよい。一実施形態において、核酸（とりわけＲＮＡ）リポプレックス粒子は、ナノ粒子である。
【0410】
用語「脂質ナノ粒子」は、ナノサイズのリポプレックス粒子に関する。
【0411】
本開示の文脈において、用語「ポリプレックス粒子」は、両親媒性ポリマー、特に、陽イオン両親媒性ポリマー、および本明細書中に記載される核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子に関する。正に帯電する陽イオン両親媒性ポリマーと負に帯電する核酸（とりわけＲＮＡ）との間の静電的相互作用は、核酸ポリプレックス粒子の錯体化および自発的形成をもたらす。ポリプレックス粒子の調製に適した正に帯電する両親媒性ポリマーとして、プロタミン、ポリエチレンイミン、ポリ－Ｌ－リシン、ポリ－Ｌ－アルギニン、およびヒストンが挙げられる。一実施形態において、核酸（とりわけＲＮＡ）ポリプレックス粒子は、ナノ粒子である。
【0412】
用語「リポポリプレックス粒子」は、本明細書中に記載される両親媒性脂質（特に陽イオン両親媒性脂質）、本明細書中に記載される両親媒性ポリマー（特に陽イオン両親媒性ポリマー）、および本明細書中に記載される核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子に関する。一実施形態において、核酸（とりわけＲＮＡ）リポポリプレックス粒子は、ナノ粒子である。
【0413】
用語「ウイルス様粒子」（本明細書中でＶＬＰと略される）は、ウイルスに酷似しているが、前記ウイルスのいかなる遺伝的材料も含有しないことで、非感染性である分子を指す。好ましくは、ＶＬＰは、本明細書中に記載される核酸（好ましくはＲＮＡ）を含有し、前記核酸（好ましくはＲＮＡ）は、ＶＬＰが由来するウイルスにとって異種起源である。ＶＬＰは、ウイルス構造タンパク質の個々の発現を介して合成することができ、これが続いて、ウイルス様構造に自己アセンブルすることができる。一実施形態において、異なるウイルス由来の構造カプシドタンパク質の組合せを用いて、組換えＶＬＰを生じさせることができる。ＶＬＰは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）［小型ＨＢＶ由来表面抗原（ＨＢｓＡｇ）］、パルボウイルス科（例えばアデノ随伴ウイルス）、パピローマウイルス科（例えばＨＰＶ）、レトロウイルス科（例えばＨＩＶ）、フラビウイルス科（例えばＣ型肝炎ウイルス）、およびバクテリオファージ（例えばＱβ、ＡＰ２０５）が挙げられる多種多様なウイルスファミリーの構成要素から生成することができる。
【0414】
用語「核酸含有粒子」は、本明細書中に記載される、核酸（とりわけＲＮＡ）が結合される粒子に関する。この点で、核酸（とりわけＲＮＡ）は、粒子の外表面に付着されてもよく［表面核酸（とりわけ表面ＲＮＡ）］、および／または粒子中に含有されてもよい［封入核酸（とりわけ封入ＲＮＡ）］。
【0415】
一実施形態において、本開示の方法および使用に利用される粒子は、サイズ（好ましくは直径、すなわち、半径の二倍、例えば、回転半径（Ｒｇ）値の二倍または流体力学半径の二倍）が、約１０～約２０００ｎｍの範囲内、例えば、少なくとも約１５ｎｍ（好ましくは、少なくとも約２０ｎｍ、少なくとも約２５ｎｍ、少なくとも約３０ｎｍ、少なくとも約３５ｎｍ、少なくとも約４０ｎｍ、少なくとも約４５ｎｍ、少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約５５ｎｍ、少なくとも約６０ｎｍ、少なくとも約６５ｎｍ、少なくとも約７０ｎｍ、少なくとも約７５ｎｍ、少なくとも約８０ｎｍ、少なくとも約８５ｎｍ、少なくとも約９０ｎｍ、少なくとも約９５ｎｍ、または少なくとも約１００ｎｍ）、かつ／または多くとも１９００ｎｍ（好ましくは、多くとも約１９００ｎｍ、多くとも約１８００ｎｍ、多くとも約１７００ｎｍ、多くとも約１６００ｎｍ、多くとも約１５００ｎｍ、多くとも約１４００ｎｍ、多くとも約１３００ｎｍ、多くとも約１２００ｎｍ、多くとも約１１００ｎｍ、多くとも約１０００ｎｍ、多くとも約９５０ｎｍ、多くとも約９００ｎｍ、多くとも約８５０ｎｍ、多くとも約８００ｎｍ、多くとも約７５０ｎｍ、多くとも約７００ｎｍ、多くとも約６５０ｎｍ、多くとも約６００ｎｍ、多くとも約５５０ｎｍ、または多くとも約５００ｎｍ）、好ましくは約２０～約１５００ｎｍ、例えば、約３０～約１２００ｎｍ、約４０～約１１００ｎｍ、約５０～約１０００、約６０～約９００ｎｍ、約７０～８００ｎｍ、約８０～７００ｎｍ、約９０～６００ｎｍ、または約１００～５００ｎｍの範囲内、例えば、１０～１０００ｎｍ、１５～５００ｎｍ、２０～４５０ｎｍ、２５～４００ｎｍ、３０～３５０ｎｍ、４０～３００ｎｍ、または５０～２５０ｎｍの範囲内である。
【0416】
一実施形態において、遊離形態である［すなわち、核酸（とりわけＲＮＡ）および粒子を含む試料または対照組成物中に含有される粒子に結合も付着もされていない］場合の、または製剤化されてない形態である［すなわち、組成物中で、本明細書中に明示される粒子を欠く、例えば、粒子形成化合物（例えば、リポソーム（特に陽イオン脂質）および／またはウイルス様粒子を構成する構成要素）を欠く］場合の核酸（とりわけＲＮＡ）は、サイズ（好ましくは直径、すなわち、半径の二倍、例えば、回転半径（Ｒｇ）値の二倍または流体力学半径の二倍）が、約１０～約２００ｎｍ、例えば、約１５～約１９０ｎｍ、約２０～約１８０ｎｍ、約２５～約１７０ｎｍ、または約３０～約１６０ｎｍの範囲内である。
【0417】
本開示によれば、試料組成物は、本明細書で開示される核酸（特に、ＲＮＡ）、および適宜、本明細書で開示される粒子を含む。一実施形態では、試料組成物は、本明細書で開示されるＲＮＡを含む。一実施形態では、試料組成物は、本明細書で開示されるＲＮＡおよび本明細書で開示される粒子を含む。一実施形態では、試料組成物は、ＲＮＡおよび本明細書で開示される粒子の混合物、例えば、２つ以上のタイプの粒子の混合物、例えば、ＬＰＸとＶＬＰの混合物またはＬＮＰとＶＬＰの混合物またはＬＰＸとＶＬＰとＶＬＰの混合物を含む。
【0418】
試料組成物は、当業者に既知の手順を用いて用意する（例えば、調製する）ことができる。例えば、本明細書で開示されるＲＮＡを含む試料組成物は、当業者に既知であるかまたは本明細書に開示されるように、インビトロ転写または化学合成によって、用意する（例えば、調製する）ことができる。次いで、ＲＮＡを含むそのような組成物を用いて、ＲＮＡおよび粒子を含む試料組成物を生成することができる。例えば、そのような試料組成物は、１種または複数の適切な脂質を含有するリポソーム組成物を用意し、ＲＮＡを含む組成物をリポソーム組成物と混合することによって、調製することができる。リポソーム組成物は、好ましくは、エタノール注入技法を用いることによって調製される。代替の実施形態では、リポソーム組成物は、好ましくは、マイクロ流体流体力学的集束（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ）（ＭＨＦ）［その開示全体が参照により本明細書に組み込まれるZizzari et al., Materials, 10 (2017), 1411を参照されたい］または同様の手順を用いて調製される。
【0419】
試料組成物（例えば、第２の態様の方法の工程（Ａ）および（Ｃ）で言及される第１の組成物、または第２の態様の方法の工程（Ｂ）および（Ｄ）で言及される第２の組成物）が用意される［例えば、調製される、処理される（例えば、精製される、および／もしくは乾燥される）、ならびに／または保存される］いくつかの反応条件は、前記試料組成物の１つまたは複数のパラメーターに影響を与える可能性があり、１つまたは複数のパラメーターは、核酸完全性（特に、ＲＮＡ完全性）、核酸（特に、ＲＮＡ）の総量、遊離核酸（特に、ＲＮＡ）の量、粒子に結合した核酸（特に、ＲＮＡ）の量、核酸（特に、ＲＮＡ）含有粒子のサイズ［特に、核酸（例えば、ＲＮＡ）含有粒子の回転半径（Ｒｇ）および／または核酸（特に、ＲＮＡ）含有粒子の流体力学半径（Ｒｈ）に基づく］、核酸（特に、ＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布［例えば、核酸（特に、ＲＮＡ）含有粒子のＲｇまたはＲｈ値に基づく］、ならびに核酸（特に、ＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布［例えば、核酸（特に、ＲＮＡ）含有粒子のＲｇまたはＲｈ値に基づく］を含む［追加的な適宜のパラメーターは、核酸（特に、ＲＮＡ）の分子量、表面核酸の量（例えば、表面ＲＮＡの量）、封入核酸の量（例えば、封入ＲＮＡの量）、アクセス可能な核酸の量（例えば、アクセス可能なＲＮＡの量）、核酸（特に、ＲＮＡ）のサイズ（特に、核酸（特に、ＲＮＡ）のＲｇおよび／またはＲｈ値に基づく）、核酸（特に、ＲＮＡ）のサイズ分布（例えば、核酸（特に、ＲＮＡ）のＲｇまたはＲｈ値に基づく）、核酸（特に、ＲＮＡ）の定量的サイズ分布［例えば、核酸（特に、ＲＮＡ）のＲｇまたはＲｈ値に基づく）］、形状因子、形態因子、および核酸（特に、ＲＮＡ）封入効率を含み；さらなる追加的な適宜のパラメーターは、粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）の量対粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の総量の比率（前記比率は粒子サイズの関数として与えられ得る）；粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の正に荷電した部分の量対粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）の量の比率（前記比率は粒子サイズの関数として与えられ得る）；ならびに粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の正に荷電した部分の量対粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）の負に荷電した部分の量の電荷比（前記電荷比は通常Ｎ／Ｐ比として示され、粒子サイズの関数として与えられ得る）を含む］。これらの反応条件は、限定されないが、塩濃度／イオン強度；温度（例えば、乾燥および／または保存に関する）；ｐＨまたはバッファ濃度；光／放射線；酸素；剪断力；圧力；凍結／解凍サイクル；乾燥／復元サイクル；賦形剤（例えば、スタビライザーおよび／またはキレート化剤）の添加；粒子形成化合物［特に、脂質（例えば、陽イオン両親媒性脂質）および／またはポリマー（例えば、陽イオン両親媒性ポリマー）］のタイプおよび／または源；核酸（特に、ＲＮＡ）対粒子形成化合物［特に、脂質（例えば、陽イオン両親媒性脂質）および／またはポリマー（例えば、陽イオン両親媒性ポリマー）］の比率；電荷比；ならびに物理的状態を含む。
【0420】
Ａ）塩およびイオン強度
本開示によれば、本明細書に記載の試料組成物は、塩化ナトリウムなどの塩を含むことができる。理論に拘束されることを望むものではないが、塩化ナトリウムは、少なくとも１つの陽イオン脂質と混合するより前に核酸（特に、ＲＮＡ）を事前調整するためのイオン性浸透圧剤として機能する。ある特定の実施形態は、本開示において塩化ナトリウムの代替の有機または無機塩を企図する。代替の塩としては、限定されないが、塩化カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一カリウム、酢酸カリウム、炭酸水素カリウム、硫酸カリウム、酢酸カリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化リチウム、塩化マグネシウム、リン酸マグネシウム、塩化カルシウム、およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のナトリウム塩が挙げられる。
本開示によれば、本明細書に記載の試料組成物は、塩化ナトリウムなどの塩を含むことができる。理論に拘束されることを望むものではないが、塩化ナトリウムは、少なくとも１つの陽イオン脂質と混合するより前に核酸（特に、ＲＮＡ）を事前調整するためのイオン性浸透圧剤として機能する。ある特定の実施形態は、本開示において塩化ナトリウムの代替の有機または無機塩を企図する。代替の塩としては、限定されないが、塩化カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一カリウム、酢酸カリウム、炭酸水素カリウム、硫酸カリウム、酢酸カリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化リチウム、塩化マグネシウム、リン酸マグネシウム、塩化カルシウム、およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のナトリウム塩が挙げられる。
【0421】
一般に、本明細書に記載の核酸（特に、ＲＮＡ）粒子を含む試料組成物は、好ましくは、０ｍＭ～約５００ｍＭ、約２ｍＭ～約４００ｍＭ、約４ｍＭ～約３００ｍＭ、約６ｍＭ～約２００ｍＭ、または約１０ｍＭ～約１００ｍＭの範囲にわたる濃度の塩化ナトリウムを含むことができる。例示的塩濃度としては、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００ｍＭの塩、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００ｍＭ ＮａＣｌが挙げられる。一実施形態では、核酸（特に、ＲＮＡ）粒子を含む組成物は、そのような塩化ナトリウム濃度に対応するイオン強度を含む。
【0422】
一般に、本明細書に記載のものなどの核酸（特に、ＲＮＡ）およびリポソームから核酸（特に、ＲＮＡ）粒子を形成するための試料組成物、およびその形成から生じる試料組成物は、高塩化ナトリウム濃度を含むことができるか、または高イオン強度を含むことができる。一実施形態では、塩化ナトリウムは少なくとも４５ｍＭ、例えば、約４５ｍＭ～約３００ｍＭ、または約５０ｍＭ～約１５０ｍＭの濃度である。一実施形態では、試料組成物はそのような塩化ナトリウム濃度に対応するイオン強度を含む。
【0423】
一般に、例えば本明細書に記載のものなどの核酸（特に、ＲＮＡ）粒子を凍結するために、核酸（特に、ＲＮＡ）粒子を保存するための組成物は、低塩化ナトリウム濃度を含むことができるか、または低イオン強度を含むことができる。一実施形態では、塩化ナトリウムは０ｍＭ～約５０ｍＭ、２ｍＭ～約４０ｍＭ、または約１０ｍＭ～約５０ｍＭの濃度である。一実施形態では、組成物はそのような塩化ナトリウム濃度に対応するイオン強度を含む。
【0424】
一般に、凍結した核酸（特に、ＲＮＡ）粒子組成物を解凍し、水性液体を添加することによって浸透圧およびイオン強度を適宜調整することによって生じる試料組成物は、高塩化ナトリウム濃度を含むことができるか、または高イオン強度を含むことができる。一実施形態では、塩化ナトリウムは約５０ｍＭ～約３００ｍＭ、または約８０ｍＭ～約１５０ｍＭの濃度である。一実施形態では、組成物はそのような塩化ナトリウム濃度に対応するイオン強度を含む。
【0425】
Ｂ）温度
一般に、本明細書に記載の試料組成物は、核酸（特に、ＲＮＡ）の安定性に、および存在するならば核酸（特に、ＲＮＡ）粒子の安定性に適した温度で調製される。しかし、例えば、合成の間、低温（例えば０℃未満、例えば－２０℃）または高温（例えば、約５０℃以上、例えば、約６０℃もしくは約８０℃）を適用する必要があり得る。さらに、処理（例えば、乾燥）および／または保存の間に、試料組成物を室温以外の温度に供することができる。したがって、室温以外のこれらの温度（例えば、ストレス温度）がどのように試料組成物の１つまたは複数のパラメーターをもたらし得るかを分析する必要があり得る。例示的温度条件としては、低温（例えば、約０℃未満（例えば、約－５℃未満、例えば、約－２０℃、または５℃から１５℃の間）、周囲温度もしくは室温、中温（例えば、３５℃から４５℃の間）、または高温（例えば、４５℃超、例えば、約５０℃以上、約６０℃、約８０℃もしくは約９８℃）が挙げられる。
一般に、本明細書に記載の試料組成物は、核酸（特に、ＲＮＡ）の安定性に、および存在するならば核酸（特に、ＲＮＡ）粒子の安定性に適した温度で調製される。しかし、例えば、合成の間、低温（例えば０℃未満、例えば－２０℃）または高温（例えば、約５０℃以上、例えば、約６０℃もしくは約８０℃）を適用する必要があり得る。さらに、処理（例えば、乾燥）および／または保存の間に、試料組成物を室温以外の温度に供することができる。したがって、室温以外のこれらの温度（例えば、ストレス温度）がどのように試料組成物の１つまたは複数のパラメーターをもたらし得るかを分析する必要があり得る。例示的温度条件としては、低温（例えば、約０℃未満（例えば、約－５℃未満、例えば、約－２０℃、または５℃から１５℃の間）、周囲温度もしくは室温、中温（例えば、３５℃から４５℃の間）、または高温（例えば、４５℃超、例えば、約５０℃以上、約６０℃、約８０℃もしくは約９８℃）が挙げられる。
【0426】
Ｃ）ｐＨおよびバッファ
本開示によれば、本明細書に記載の試料組成物は、核酸（特に、ＲＮＡ）の安定性に、および存在するならば核酸（特に、ＲＮＡ）粒子の安定性に適したｐＨを有することができる。しかし、例えば、対象への投与のために、ｐＨ（例えば、生理的ｐＨへ）、ならびに／またはｐＨ値に対して試料組成物中で用いられるバッファのタイプおよび／もしくは量、ならびに／または核酸（特に、ＲＮＡ）の安定性、および存在するならば核酸（特に、ＲＮＡ）粒子の安定性に最適でないバッファのタイプおよび／もしくは量を調整する必要があり得る。したがって、これらのストレス条件（すなわち、変化したｐＨおよび／またはバッファ条件）がどのように試料組成物の１つまたは複数のパラメーターをもたらし得るかを分析する必要があり得る。
本開示によれば、本明細書に記載の試料組成物は、核酸（特に、ＲＮＡ）の安定性に、および存在するならば核酸（特に、ＲＮＡ）粒子の安定性に適したｐＨを有することができる。しかし、例えば、対象への投与のために、ｐＨ（例えば、生理的ｐＨへ）、ならびに／またはｐＨ値に対して試料組成物中で用いられるバッファのタイプおよび／もしくは量、ならびに／または核酸（特に、ＲＮＡ）の安定性、および存在するならば核酸（特に、ＲＮＡ）粒子の安定性に最適でないバッファのタイプおよび／もしくは量を調整する必要があり得る。したがって、これらのストレス条件（すなわち、変化したｐＨおよび／またはバッファ条件）がどのように試料組成物の１つまたは複数のパラメーターをもたらし得るかを分析する必要があり得る。
【0427】
一実施形態では、本明細書に記載の試料組成物は約５．７～約６．７のｐＨを有する。特定の実施形態では、組成物は、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６または約６．７のｐＨを有する。
【0428】
本開示によれば、バッファを含む試料組成物が提供される。理論に拘束されることを望むものではないが、バッファの使用は、試料組成物の製造、保存および使用の間、試料組成物のｐＨを維持する。本開示のある特定の実施形態では、バッファは、炭酸水素ナトリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、［ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、２－（Ｂｉｓ（２－ヒドロキシエチル）アミノ）酢酸（ビシン）、２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－ジオール（トリス）、Ｎ－（２－ヒドロキシ－１，１－ｂｉｓ（ヒドロキシメチル）エチル）グリシン（トリシン）、３－［［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ］－２－ヒドロキシプロパン－１－スルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－ｌ－イル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２－［［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ］エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、１，４－ピペラジンジエタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）、ジメチルアルシン酸、２－モルホリン－４－イルエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３－モルホリノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）であり得る。他の適切なバッファは、塩状態の酢酸、塩状態のクエン酸、塩状態のホウ酸および塩状態のリン酸であり得る。
【0429】
一部の実施形態では、バッファは約５．７～約６．７のｐＨを有する。特定の実施形態では、バッファは、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６または約６．７のｐＨを有する。一実施形態では、バッファはＨＥＰＥＳである。好ましい実施形態では、ＨＥＰＥＳは約５．７～約６．７のｐＨを有する。特定の実施形態では、ＨＥＰＥＳは、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６または約６．７のｐＨを有する。例示的実施形態では、ＨＥＰＥＳは約６．２のｐＨを有する。
【0430】
さらに別の実施形態では、バッファは約２．５ｍＭ～約１０ｍＭの濃度を有する。ＨＥＰＥＳがバッファである特定の実施形態では、ＨＥＰＥＳの濃度は、約２．５ｍＭ、約２．７５ｍＭ、３．０ｍＭ、約３．２５ｍＭ、約３．５ｍＭ、約３．７５ｍＭ、約４．０ｍＭ、約４．２５ｍＭ、約４．５ｍＭ、約４．７５ｍＭ、約５．０ｍＭ、約５．２５ｍＭ、約５．５ｍＭ、約５．７５ｍＭ、約６．０ｍＭ、約６．２５ｍＭ、約６．５ｍＭ、約６．７５ｍＭ、約７．０ｍＭ、約７．２５ｍＭ、約７．５ｍＭ、約７．７５ｍＭ、約８．０ｍＭ、約８．２５ｍＭ、約８．５ｍＭ、約８．７５ｍＭ、約９．０ｍＭ、約９．２５ｍＭ、約９．５ｍＭ、約９．７５ｍＭ、または約１０．０ｍＭである。好ましい実施形態では、ＨＥＰＥＳは約７．５ｍＭの濃度である。
【0431】
Ｄ）光、放射線、酸素、剪断力および／または圧力
【0432】
一般に、本明細書に記載の試料組成物は、核酸（特に、ＲＮＡ）の安定性に、および存在するならば核酸（特に、ＲＮＡ）粒子の安定性に適した、光、放射線、酸素、剪断力および／または圧力から選択される条件で調製することができる。しかし、例えば、試料組成物の合成、処理および／または保存の間に、核酸（特に、ＲＮＡ）の安定性、および存在するならば核酸（特に、ＲＮＡ）粒子の安定性に最適でない、光、放射線、酸素、剪断力および／または圧力を適用する必要があり得る。したがって、これらのストレス条件（すなわち、核酸（特に、ＲＮＡ）の安定性、および存在するならば核酸（特に、ＲＮＡ）粒子の安定性に最適でない、光、放射線、酸素、剪断力および／または圧力）がどのように試料組成物の１つまたは複数のパラメーターをもたらし得るかを分析する必要があり得る。
【0433】
一部の実施形態では、本明細書に記載の試料組成物は光の非存在下で、すなわち暗所で調製される。
【0434】
一部の実施形態では、本明細書に記載の試料組成物は放射線の非存在下で調製される。代替の実施形態では、本明細書に記載の試料組成物は放射線、例えば、マイクロ波放射線を用いて調製される。
【0435】
一部の実施形態では、本明細書に記載の試料組成物は周囲空気（すなわち、酸素を含有する空気）で調製される。代替の実施形態では、本明細書に記載の試料組成物は不活性ガス（例えば、窒素または貴ガス）下で、すなわち、酸素の非存在下で調製される。この方法で、酸素の存在が、例えば試料組成物の保存の間に、核酸（特に、ＲＮＡ）の安定性に、および存在するならば核酸（特に、ＲＮＡ）粒子の安定性に（特に、粒子の構成要素としての脂質の安定性に）影響があるかどうかを分析することができ、経時的安定性プロファイルを確立することができる。
【0436】
一部の実施形態では、本明細書に記載の試料組成物は高剪断力下で調製される［例えば、エタノール注入技法またはマイクロ流体流体力学的集束（ＭＨＦ）を用いる［Zizzari et al., Materials, 10 (2017), 1411を参照されたい］。代替の実施形態では、本明細書に記載の試料組成物は低剪断力下で調製される（例えば、本明細書に記載のＲＮＡを含む組成物を本明細書に記載のリポソーム組成物とピペットを用いて混合することによる）。この方法で、異なる剪断力の適用が、核酸（特に、ＲＮＡ）の安定性に、および存在するならば核酸（特に、ＲＮＡ）粒子の安定性に影響があるかどうかを分析することができる。
【0437】
一部の実施形態では、本明細書に記載の試料組成物は周囲圧力下で調製される。代替の実施形態では、本明細書に記載の試料組成物は周囲圧力より低いかまたは周囲圧力より高い圧力下で調製される。この方法で、異なる圧力の適用が、核酸（特に、ＲＮＡ）の安定性に、および存在するならば核酸（特に、ＲＮＡ）粒子の安定性に影響があるかどうかを分析することができる。
【0438】
Ｅ）凍結／解凍サイクル
一実施形態では、試料組成物を、－１０℃未満の温度（例えば、約－１５℃～約－４０℃）で保存することができ、次いで、約４℃～約２５℃の温度（周囲温度）に解凍することができる。別の実施形態では、試料組成物を複数の凍結融解サイクル［例えば、１０℃未満の温度（例えば、約－１５℃～約－４０℃）で凍結し、約４℃～約２５℃の温度（周囲温度）に解凍する］に供することができる。この方法で、１つまたは複数の凍結融解サイクルの適用が、核酸（特に、ＲＮＡ）の安定性に、および存在するならば核酸（特に、ＲＮＡ）粒子の安定性に影響があるかどうかを分析することができる。
一実施形態では、試料組成物を、－１０℃未満の温度（例えば、約－１５℃～約－４０℃）で保存することができ、次いで、約４℃～約２５℃の温度（周囲温度）に解凍することができる。別の実施形態では、試料組成物を複数の凍結融解サイクル［例えば、１０℃未満の温度（例えば、約－１５℃～約－４０℃）で凍結し、約４℃～約２５℃の温度（周囲温度）に解凍する］に供することができる。この方法で、１つまたは複数の凍結融解サイクルの適用が、核酸（特に、ＲＮＡ）の安定性に、および存在するならば核酸（特に、ＲＮＡ）粒子の安定性に影響があるかどうかを分析することができる。
【0439】
一実施形態では、試料組成物を－１０℃未満の温度（例えば、約－１５℃～約－４０℃）で保存することができる。代替の実施形態では、試料組成物を凍結なしで保存することができる。この方法で、凍結が、核酸（特に、ＲＮＡ）の安定性に、および存在するならば核酸（特に、ＲＮＡ）粒子の安定性に影響があるかどうかを分析することができる。
【0440】
Ｆ）乾燥／復元サイクル
一実施形態では、試料組成物を乾燥形態で保存することができ、次いで、適切な溶媒または溶媒混合液（例えば、水性溶媒）を用いて復元することができる。乾燥形態は、試料調製物を噴霧乾燥、凍結乾燥、または凍結することによって実現することができる。代替の実施形態では、この乾燥／復元サイクルは、１回または複数回繰り返すことができる。この方法で、複数の乾燥／復元サイクルの適用が、核酸（特に、ＲＮＡ）の安定性に、および存在するならば核酸（特に、ＲＮＡ）粒子の安定性に影響があるかどうかを分析することができる。
一実施形態では、試料組成物を乾燥形態で保存することができ、次いで、適切な溶媒または溶媒混合液（例えば、水性溶媒）を用いて復元することができる。乾燥形態は、試料調製物を噴霧乾燥、凍結乾燥、または凍結することによって実現することができる。代替の実施形態では、この乾燥／復元サイクルは、１回または複数回繰り返すことができる。この方法で、複数の乾燥／復元サイクルの適用が、核酸（特に、ＲＮＡ）の安定性に、および存在するならば核酸（特に、ＲＮＡ）粒子の安定性に影響があるかどうかを分析することができる。
【0441】
Ｇ）賦形剤
本明細書に記載の試料組成物は、１種または複数の賦形剤を含むことができる。そのような賦形剤としては、限定されないが、スタビライザー、キレート化剤、担体、結合剤、希釈剤、潤滑剤、増ちょう剤、表面活性剤、防腐剤、乳化剤、バッファ、着香剤、または着色剤が挙げられる。代替の実施形態では、本明細書に記載の試料組成物は賦形剤を含まない。この方法で、特定の賦形剤（例えば、スタビライザーまたはキレート化剤）の存在が、核酸（特に、ＲＮＡ）の安定性に、および存在するならば核酸（特に、ＲＮＡ）粒子の安定性に影響があるかどうかを分析することができる。
本明細書に記載の試料組成物は、１種または複数の賦形剤を含むことができる。そのような賦形剤としては、限定されないが、スタビライザー、キレート化剤、担体、結合剤、希釈剤、潤滑剤、増ちょう剤、表面活性剤、防腐剤、乳化剤、バッファ、着香剤、または着色剤が挙げられる。代替の実施形態では、本明細書に記載の試料組成物は賦形剤を含まない。この方法で、特定の賦形剤（例えば、スタビライザーまたはキレート化剤）の存在が、核酸（特に、ＲＮＡ）の安定性に、および存在するならば核酸（特に、ＲＮＡ）粒子の安定性に影響があるかどうかを分析することができる。
【0442】
例えば、本明細書に記載の試料組成物は、製品の品質の実質的な喪失、特に、凍結、凍結乾燥または噴霧乾燥、および凍結、凍結乾燥または噴霧乾燥した組成物の保存の間の核酸（特に、ＲＮＡ）活性の実質的な喪失を回避するために、スタビライザーを含むことができる。典型的には、スタビライザーは、凍結、凍結乾燥または噴霧乾燥プロセスより前に存在し、得られた凍結、凍結乾燥または凍結乾燥した調製物中に存続する。これは、凍結、凍結乾燥または噴霧乾燥、および凍結、凍結乾燥または凍結乾燥した調製物の保存の間に、核酸（特に、ＲＮＡ）粒子を保護するために、例えば、凝集、粒子の崩壊、核酸（特に、ＲＮＡ）の分解および／または他のタイプの損傷を低減させるかまたは防止するために、用いることができる。
【0443】
一実施形態では、スタビライザーは炭水化物である。本明細書で用いられる場合、用語「炭水化物」は、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖および多糖を指し、包含する。
【0444】
一実施形態では、スタビライザーは単糖である。本明細書で用いられる場合、用語「単糖」は、より単純な炭水化物単位に加水分解することができない単一炭水化物単位［例えば、単純糖（ｓｉｍｐｌｅ ｓｕｇａｒ）］を指す。例示的単糖スタビライザーとしては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース、リボースなどが挙げられる。
【0445】
一実施形態では、スタビライザーは二糖である。本明細書で用いられる場合、用語「二糖」は、グリコシド結合を介して、例えば、１－４結合または１－６結合を介して互いに結合している２つの単糖単位によって形成される化合物または化学部分を指す。二糖は、２つの単糖に加水分解され得る。例示的二糖スタビライザーとしては、ショ糖、トレハロース、ラクトース、マルトースなどが挙げられる。
【0446】
用語「三糖」は、互いに連結して１つの分子を形成する３つの糖を意味する。三糖の例としては、ラフィノースおよびメレチトースが挙げられる。
【0447】
一実施形態では、スタビライザーはオリゴ糖である。本明細書で用いられる場合、用語「オリゴ糖」は、グリコシド結合を介して、例えば、１－４結合または１－６結合を介して互いに結合して直鎖状、分枝状または環状構造体を形成する３～約１５個、好ましくは３～約１０個の単糖単位によって形成される化合物または化学部分を指す。例示的オリゴ糖スタビライザーとしては、シクロデキストリン、ラフィノース、メレチトース、マルトトリオース、スタキオース、アカルボースなどが挙げられる。オリゴ糖は酸化または還元され得る。
【0448】
一実施形態では、スタビライザーは環状オリゴ糖である。本明細書で用いられる場合、用語「環状オリゴ糖」は、グリコシド結合を介して、例えば、１－４結合または１－６結合を介して互いに結合して環状構造体を形成する３～約１５個、好ましくは６、７、８、９または１０個の単糖単位によって形成される化合物または化学部分を指す。例示的環状オリゴ糖スタビライザーとしては、別々の化合物である環状オリゴ糖、例えば、αシクロデキストリン、βシクロデキストリンまたはγシクロデキストリンが挙げられる。
【0449】
他の例示的環状オリゴ糖スタビライザーとしては、より大きな分子構造中にシクロデキストリン部分を含む化合物、例えば環状オリゴ糖部分を含有するポリマーが挙げられる。環状オリゴ糖は酸化または還元されてもよく、例えば、ジカルボニル形態に酸化されてもよい。本明細書で用いられる場合、用語「シクロデキストリン部分」は、ポリマーなどのより大きな分子構造体に組み込まれたかまたは該分子構造体の一部であるシクロデキストリン（例えば、α、βまたはγシクロデキストリン）基を指す。シクロデキストリン部分は、直接的に、または適宜のリンカーを介して１つまたは複数の他の部分と結合することができる。シクロデキストリン部分は酸化または還元されてもよく、例えば、ジカルボニル形態に酸化されてもよい。
【0450】
炭水化物スタビライザー、例えば、環状オリゴ糖スタビライザーは、誘導体化された炭水化物であり得る。例えば、一実施形態では、スタビライザーは誘導体化された環状オリゴ糖、例えば、誘導体化されたシクロデキストリン、例えば、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン、例えば、部分的にエーテル化されたシクロデキストリン（例えば、部分的にエーテル化されたβシクロデキストリン）である。
【0451】
例示的スタビライザーは多糖である。本明細書で用いられる場合、用語「多糖」は、グリコシド結合を介して、例えば、１－４結合または１－６結合を介して互いに結合して、直鎖状、分枝状または環状構造体を形成する少なくとも１６個の単糖単位によって形成される化合物または化学部分を指し、その骨格構造の一部として多糖を含むポリマーを含む。骨格において、多糖は直鎖状または環状であり得る。例示的多糖スタビライザーとしては、グリコーゲン、アミラーゼ、セルロース、デキストラン、マルトデキストリンなどが挙げられる。
【0452】
一実施形態では、スタビライザーは糖アルコールである。本明細書で用いられる場合、用語「糖アルコール」は「糖」の還元生成物を指し、単純糖アルコール分子中の全ての酸素原子がヒドロキシル基の形態で存在することを示す。糖アルコールは「ポリオール」である。この用語は、３つ以上のヒドロキシル基を含有する化学化合物を指し、別の慣例的用語、多価アルコールと同義である。糖アルコールの例としては、限定されないが、ソルビトール、マンニトール、マルチトール、ラクチトール、エリスリトール、グリセリン、キシリトールまたはイノシトールが挙げられる。
【0453】
一実施形態では、試料組成物はスタビライザーとしてショ糖を含むことができる。理論に拘束されることを望むものではないが、ショ糖は、試料組成物の凍結保護を促進し、それによって、核酸（特に、ＲＮＡ）粒子の凝集を防止し、組成物の化学的および物理的安定性を維持するように機能する。ある特定の実施形態は、本開示においてショ糖の代替のスタビライザーを企図する。代替のスタビライザーとしては、限定されないが、トレハロース、グルコース、フルクトース、アルギニン、グリセリン、マンニトール、プロリン、ソルビトール、グリシンベタインおよびデキストランが挙げられる。特定の実施形態では、ショ糖の代替のスタビライザーはトレハロースである。
【0454】
一実施形態では、スタビライザーは、約５％（ｗ／ｖ）～約３５％（ｗ／ｖ）、例えば、約１０％（ｗ／ｖ）～約２５％（ｗ／ｖ）、約１５％（ｗ／ｖ）～約２５％（ｗ／ｖ）または約２０％（ｗ／ｖ）～約２５％（ｗ／ｖ）の濃度である。
【0455】
一実施形態では、本明細書に記載の試料組成物はキレート化剤を含む。キレート化剤は、金属イオンと少なくとも２つの配位共有結合を形成し、それによって、安定な水溶性錯体を生成することができる化学化合物を指す。理論に拘束されることを望むものではないが、キレート化剤は、遊離二価イオンの濃度を低減させ、そうでなければ、遊離二価イオンは試料組成物中の核酸（特に、ＲＮＡ）の分解の加速を誘導し得る。適切なキレート化剤の例としては、限定されないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ＥＤＴＡの塩、デスフェリオキサミンＢ、デフェロキサミン、ジチオカルブナトリウム、ペニシラミン、ペンテト酸カルシウム、ペンテト酸のナトリウム塩、サクシマー、トリエンチン、ニトリロ三酢酸、ｔｒａｎｓ－ジアミノシクロヘキサンテトラ酢酸（ＤＣＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ｂｉｓ（アミノエチル）グリコールエーテル－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラ酢酸、イミノ二酢酸、クエン酸、酒石酸、フマル酸またはこれらの塩が挙げられる。ある特定の実施形態では、キレート化剤はＥＤＴＡまたはＥＤＴＡの塩である。例示的実施形態では、キレート化剤はＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物である。
【0456】
一部の実施形態では、ＥＤＴＡは、約０．２５ｍＭ～約５ｍＭ、例えば、約０．３ｍＭ～約４．５ｍＭ、約０．５ｍＭ～約４．０ｍＭ、約１．０ｍＭ～約３．５ｍＭ、または約１．５ｍＭ～約２．５ｍＭの濃度で試料組成物中に含有される。好ましい実施形態では、ＥＤＴＡは約２．５ｍＭの濃度で試料組成物中に含有される。
【0457】
Ｈ）粒子形成化合物
粒子形成化合物、すなわち、試料組成物の核酸（特に、ＲＮＡ）含有粒子を主に構成する化合物［特に、脂質（例えば、陽イオン両親媒性脂質）および／またはポリマー（例えば、陽イオン両親媒性ポリマー）］の量および／またはタイプおよび／または源（例えば、天然、半合成または合成起源）は、前記試料組成物の１つまたは複数のパラメーターに影響がある可能性がある。影響は、本開示の方法および／または使用を異なる試料組成物に適用し、それによって、前記異なる試料組成物の１種または複数の１つまたは複数のパラメーターを決定し、異なる試料組成物のうちの１つについて決定した１種または複数の１つまたは複数のパラメーターを異なる試料組成物の別のものについて決定した１種または複数の１つまたは複数のパラメーターと比較することによって、分析することができる。これらの異なる試料組成物は、限定されないが、核酸（特に、ＲＮＡ）の異なる濃度、脂質および／またはポリマーの異なる源（例えば、天然、半合成または合成起源）、陽イオン両親媒性脂質以外の脂質の有無、陽イオン両親媒性脂質以外のポリマーの有無、総脂質の異なる濃度、総ポリマーの異なる濃度、脂質およびポリマーの総量の異なる濃度、ならびに核酸（特に、ＲＮＡ）の、粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）に対する異なる比率を含めた様々な条件を用いて用意され得る。核酸および粒子形成化合物は両方とも核酸（特に、ＲＮＡ）含有粒子の構成要素であるが、本開示で用いられる場合、表現「粒子形成化合物」は、いかなる核酸も包含しない。
粒子形成化合物、すなわち、試料組成物の核酸（特に、ＲＮＡ）含有粒子を主に構成する化合物［特に、脂質（例えば、陽イオン両親媒性脂質）および／またはポリマー（例えば、陽イオン両親媒性ポリマー）］の量および／またはタイプおよび／または源（例えば、天然、半合成または合成起源）は、前記試料組成物の１つまたは複数のパラメーターに影響がある可能性がある。影響は、本開示の方法および／または使用を異なる試料組成物に適用し、それによって、前記異なる試料組成物の１種または複数の１つまたは複数のパラメーターを決定し、異なる試料組成物のうちの１つについて決定した１種または複数の１つまたは複数のパラメーターを異なる試料組成物の別のものについて決定した１種または複数の１つまたは複数のパラメーターと比較することによって、分析することができる。これらの異なる試料組成物は、限定されないが、核酸（特に、ＲＮＡ）の異なる濃度、脂質および／またはポリマーの異なる源（例えば、天然、半合成または合成起源）、陽イオン両親媒性脂質以外の脂質の有無、陽イオン両親媒性脂質以外のポリマーの有無、総脂質の異なる濃度、総ポリマーの異なる濃度、脂質およびポリマーの総量の異なる濃度、ならびに核酸（特に、ＲＮＡ）の、粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）に対する異なる比率を含めた様々な条件を用いて用意され得る。核酸および粒子形成化合物は両方とも核酸（特に、ＲＮＡ）含有粒子の構成要素であるが、本開示で用いられる場合、表現「粒子形成化合物」は、いかなる核酸も包含しない。
【0458】
一般に、本明細書に記載の試料組成物中の核酸の濃度は、約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、例えば、約０．０５ｍｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬまたは約０．１ｍｇ／ｍＬ～約０．５ｍｇ／ｍＬであり得る。したがって、本開示のある特定の実施形態では、本明細書に記載の試料組成物中のＲＮＡの濃度は、約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、例えば、約０．０５ｍｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬまたは約０．１ｍｇ／ｍＬ～約０．５ｍｇ／ｍＬである。
【0459】
一実施形態では、本明細書に記載の脂質溶液、リポソームおよび核酸（特に、ＲＮＡ）粒子は、陽イオン両親媒性脂質を含む。本明細書で用いられる場合、「陽イオン両親媒性脂質」は、正味の正電荷を有する両親媒性脂質を指す。陽イオン両親媒性脂質は、脂質マトリックスへの静電気的相互作用によって、負に荷電した核酸（特に、ＲＮＡ）に結合する。一般に、陽イオン両親媒性脂質は、親油性部分、例えば、ステロール、アシルまたはジアシル鎖を有し、脂質の頭部基は、典型的には正電荷を帯びている。陽イオン両親媒性脂質の例としては、限定されないが、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）；１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）；１，２－ジアシルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン；１，２－ジアルキルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン；ジオクタデシルジメチル塩化アンモニウム（ＤＯＤＡＣ）、２，３－ジ（テトラデコキシ）プロピル－（２－ヒドロキシエチル）－ジメチルアザニウム（ＤＭＲＩＥ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＭＥＰＣ）、１，２－ジミリストイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、１，２－ジオレイルオキシプロピル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、および２，３－ジオレオイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－プロパナミウム（ｐｒｏｐａｎａｍｉｕｍ）トリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）が挙げられる。ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＤＡＣおよびＤＯＳＰＡが好ましい。特定の実施形態では、少なくとも１つの陽イオン両親媒性脂質はＤＯＴＭＡおよび／またはＤＯＴＡＰである。一実施形態では、少なくとも１つの陽イオン両親媒性脂質はＤＯＴＭＡ、特に（Ｒ）－ＤＯＴＭＡである。
【0460】
核酸（特に、ＲＮＡ）粒子の全体的な正電荷対負電荷の比率および物理的安定性を調整するために、追加的な脂質を組み込むことができる。ある特定の実施形態では、追加的な脂質は中性脂質である。本明細書で用いられる場合、「中性脂質」は、ゼロの正味電荷を有する脂質を指す。中性脂質の例としては、限定されないが、１，２－ジ－（９Ｚ－オクタデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、ペグ化セラミド［例えば、Ｎ－オクタノイル－スフィンゴシン－１－｛スクシニル［メトキシ（ＰＥＧ）］｝およびＮ－パルミトイル－スフィンゴシン－１－｛スクシニル［メトキシ（ＰＥＧ）］｝［ＰＥＧは（ポリエチレングリコール）７５０、（ポリエチレングリコール）２０００または（ポリエチレングリコール）５０００である］、スフィンゴミエリン（ｓｐｈｉｎｇｏｅｍｙｅｌｉｎ）、セファリン、コレステロール、ペグ化コレステロール［例えば、コレステロール－（ポリエチレングリコール）６００］、ペグ化ジアシルグリセリド（例えば、ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロール－ＰＥＧ２０００、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００、１，３－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００、または１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００と１，３－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００の混合物］ならびにセレブロシドが挙げられる。特定の実施形態では、第２の脂質はＤＯＰＥ、コレステロールおよび／またはＤＯＰＣである。
【0461】
ある特定の実施形態では、核酸（特に、ＲＮＡ）粒子は陽イオン両親媒性脂質と追加的な脂質の両方を含む。例示的実施形態では、陽イオン両親媒性脂質はＤＯＴＭＡであり、追加的な脂質はＤＯＰＥである。理論に拘束されることを望むものではないが、少なくとも１つの追加的な脂質の量と比較した少なくとも１つの陽イオン両親媒性脂質の量は、核酸（特に、ＲＮＡ）粒子の重要な特徴、例えば、電荷、粒子サイズ、安定性、組織選択性および核酸（特に、ＲＮＡ）の生物活性に影響を及ぼす可能性がある。したがって、一部の実施形態では、少なくとも１つの陽イオン両親媒性脂質対少なくとも１つの追加的な脂質のモル比は、約１０：０～約１：９、約４：１～約１：２または約３：１～約１：１である。特定の実施形態では、モル比は、約３：１、約２．７５：１、約２．５：１、約２．２５：１、約２：１、約１．７５：１、約１．５：１、約１．２５：１または約１：１であり得る。例示的実施形態では、少なくとも１つの陽イオン両親媒性脂質対少なくとも１つの追加的な脂質のモル比は約２：１である。
【0462】
一般に、本明細書に記載の試料組成物中の総脂質の濃度は、約０．１～約１００ｍｇ／ｍＬ、例えば、約０．５～約９０ｍｇ／ｍｌ、約１～約８０ｍｇ／ｍｌ、約２～約７０ｍｇ／ｍｌ、約４～約６０ｍｇ／ｍｌ、約６～約５０ｍｇ／ｍｌ、約８～約４０ｍｇ／ｍｌまたは約１０～約２０ｍｇ／ｍｌであり得る。
【0463】
また、核酸（特に、ＲＮＡ）対粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の比率も、前記試料組成物の１つまたは複数のパラメーターに影響を与える可能性があり、１つまたは複数のパラメーターは、核酸完全性（特に、ＲＮＡ完全性）、核酸（特に、ＲＮＡ）の総量、遊離核酸（特に、ＲＮＡ）の量、粒子に結合した核酸（特に、ＲＮＡ）の量、核酸（特に、ＲＮＡ）含有粒子のサイズ［特に、核酸（例えば、ＲＮＡ）含有粒子の回転半径（Ｒｇ）および／または核酸（特に、ＲＮＡ）含有粒子の流体力学半径（Ｒｈ）に基づく］、核酸（特に、ＲＮＡ）含有粒子のサイズ分布［例えば、核酸（特に、ＲＮＡ）含有粒子のＲｇまたはＲｈ値に基づく］、ならびに核酸（特に、ＲＮＡ）含有粒子の定量的サイズ分布［例えば、核酸（特に、ＲＮＡ）含有粒子のＲｇまたはＲｈ値に基づく］を含む［追加的な適宜のパラメーターは、核酸（特に、ＲＮＡ）の分子量、表面核酸の量（例えば、表面ＲＮＡの量）、封入核酸の量（例えば、封入ＲＮＡの量）、アクセス可能な核酸の量（例えば、アクセス可能なＲＮＡの量）、核酸（特に、ＲＮＡ）のサイズ［特に、核酸（特に、ＲＮＡ）のＲｇおよび／またはＲｈ値に基づく］、核酸（特に、ＲＮＡ）のサイズ分布［例えば、核酸（特に、ＲＮＡ）のＲｇまたはＲｈ値に基づく］、核酸（特に、ＲＮＡ）の定量的サイズ分布［例えば、核酸（特に、ＲＮＡ）のＲｇまたはＲｈ値に基づく）］、形状因子、形態因子、および核酸（特に、ＲＮＡ）封入効率）、ならびに粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）の量対粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の総量の比率（前記比率は粒子サイズの関数として与えられ得る）；粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の正に荷電した部分の量対粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）の量の比率（前記比率は粒子サイズの関数として与えられ得る）；ならびに粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の正に荷電した部分の量対粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）の負に荷電した部分の量の電荷比（前記電荷比は通常Ｎ／Ｐ比として示される）を含む］。例えば、電荷比（以下を参照されたい）は、これらのパラメーターの１つまたは複数に影響を与える可能性がある。さらに、中性脂質対陽イオン両親媒性脂質の比率も、これらのパラメーターの１つまたは複数に影響を与える可能性がある。
【0464】
一般に、核酸（特に、ＲＮＡ）対粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の比率は、約１：１００～約１０：１（ｗ／ｗ）、例えば、約１：９０～約５：１（ｗ／ｗ）、約１：８０～約１：２（ｗ／ｗ）、約１：７０～約１：１（ｗ／ｗ）、約１：６０～約１：２（ｗ／ｗ）、約１：５５～約１：５、約１：５０～約１：１０、約１：４５～約１：１５、約１：４０～約１：２０または約１：３５～約１：２５（ｗ／ｗ）であり得る。
【0465】
Ｉ）電荷比
本開示の核酸（特に、ＲＮＡ）粒子の電荷は、少なくとも１つの陽イオン脂質中に存在する電荷と核酸（特に、ＲＮＡ）中に存在する電荷の合計である。電荷比は、少なくとも１つの陽イオン両親媒性脂質（または陽イオン両親媒性ポリマー）中に存在する正電荷対核酸（特に、ＲＮＡ）中に存在する負電荷の比率である。少なくとも１つの陽イオン両親媒性脂質（または陽イオン両親媒性ポリマー）中に存在する正電荷対核酸（特に、ＲＮＡ）中に存在する負電荷の電荷比は、以下の式によって算出される：電荷比＝［（陽イオン両親媒性脂質またはポリマーの濃度（ｍｏｌ））＊（陽イオン両親媒性脂質またはポリマー中の正電荷の総数）］／［（核酸（特に、ＲＮＡ）濃度（ｍｏｌ））＊［核酸（特に、ＲＮＡ））中の負電荷の総数］。核酸の濃度（特に、ＲＮＡ）および少なくとも１つの陽イオン両親媒性脂質またはポリマーの量は、常法を用いて当業者が求めることができる。
本開示の核酸（特に、ＲＮＡ）粒子の電荷は、少なくとも１つの陽イオン脂質中に存在する電荷と核酸（特に、ＲＮＡ）中に存在する電荷の合計である。電荷比は、少なくとも１つの陽イオン両親媒性脂質（または陽イオン両親媒性ポリマー）中に存在する正電荷対核酸（特に、ＲＮＡ）中に存在する負電荷の比率である。少なくとも１つの陽イオン両親媒性脂質（または陽イオン両親媒性ポリマー）中に存在する正電荷対核酸（特に、ＲＮＡ）中に存在する負電荷の電荷比は、以下の式によって算出される：電荷比＝［（陽イオン両親媒性脂質またはポリマーの濃度（ｍｏｌ））＊（陽イオン両親媒性脂質またはポリマー中の正電荷の総数）］／［（核酸（特に、ＲＮＡ）濃度（ｍｏｌ））＊［核酸（特に、ＲＮＡ））中の負電荷の総数］。核酸の濃度（特に、ＲＮＡ）および少なくとも１つの陽イオン両親媒性脂質またはポリマーの量は、常法を用いて当業者が求めることができる。
【0466】
電荷比は、本明細書に記載の試料組成物の１つまたは複数のパラメーターに影響がある可能性がある。影響は、異なる電荷比で用意された少なくとも２つの試料組成物に本開示の方法および／または使用を適用し、それによって、前記異なる試料組成物の１種または複数の１つまたは複数のパラメーターを決定し、少なくとも２つの異なる試料組成物のうちの１つについて決定した１種または複数の１つまたは複数のパラメーターを少なくとも２つの異なる試料組成物の別のものについて決定した１種または複数の１つまたは複数のパラメーターと比較することによって、分析することができる。
【0467】
一般に、生理的ｐＨで、核酸（特に、ＲＮＡ）粒子中の正電荷対負電荷の電荷比は、約６：１～約１：２、例えば、約５：１～約１．２：２、約４：１～約１．４：２、約３：１～約１．６：２、約２：１～約１．８：２または約１．６：１～約１：１である。
【0468】
第１の実施形態では、生理的ｐＨで、核酸（特に、ＲＮＡ）粒子中の正電荷対負電荷の電荷比は約１．９：２～約１：２である。特定の実施形態では、生理的ｐＨにおける核酸（特に、ＲＮＡ）粒子中の正電荷対負電荷の電荷比は、約１．９：２．０、約１．８：２．０、約１．７：２．０、約１．６：２．０、約１．５：２．０、約１．４：２．０、約１．３：２．０、約１．２：２．０、約１．１：２．０または約１：２．０である。一実施形態では、生理的ｐＨにおける核酸（特に、ＲＮＡ）粒子中の正電荷対負電荷の電荷比は１．３：２．０である。別の実施形態では、本明細書に記載の核酸（特に、ＲＮＡ）粒子は生理的ｐＨで同数の正電荷および負電荷を有し、正味の中性の電荷比を有する核酸（特に、ＲＮＡ）粒子をもたらすことができる。第１の実施形態による電荷比を有する核酸（特に、ＲＮＡ）粒子は、脾臓組織または脾臓細胞、例えば、抗原提示細胞、特に樹状細胞を優先的に標的にする。
【0469】
第２の実施形態では、生理的ｐＨで、核酸（特に、ＲＮＡ）粒子中の正電荷対負電荷の電荷比は約６：１～約１．５：１である。特定の実施形態では、生理的ｐＨにおける核酸（特に、ＲＮＡ）粒子中の正電荷対負電荷の電荷比は、約６．０：１．０、約５．８：１．０、約５．６：１．０、約５．４：１．０、約５．２：１．０、約５．０：１．０、約４．８：１．０、約４．６：１．０、約４．４：１．０、約４．２：１．０、約４．０：１．０、約３．８：１．０、約３．６：１．０、約３．４：１．０、約３．２：１．０、約３．０：１．０、約２．８：１．０、約２．６：１．０、約２．４：１．０、約２．２：１．０、約２．０：１．０、約１．８：１．０、約１．６：１．０または約１．５：１．０である。第２の実施形態による電荷比を有する核酸（特に、ＲＮＡ）粒子は、肺組織または肺細胞を優先的に標的にする。
【0470】
Ｊ）物理的状態
本明細書に記載の試料組成物の物理的状態（すなわち、液体または個体）は、前記試料組成物の１つまたは複数のパラメーターに影響がある可能性がある。固体の非限定例としては、凍結形態または凍結乾燥形態が挙げられる。液体形態の非限定例としては、溶液または懸濁液が挙げられる。固体形態は、試料調製を噴霧乾燥、凍結乾燥または凍結することによって実現することができる。一実施形態では、試料組成物は固体形態であり得る。代替の実施形態では、試料組成物は液体形態（例えば、溶液または懸濁液）であり得る。
本明細書に記載の試料組成物の物理的状態（すなわち、液体または個体）は、前記試料組成物の１つまたは複数のパラメーターに影響がある可能性がある。固体の非限定例としては、凍結形態または凍結乾燥形態が挙げられる。液体形態の非限定例としては、溶液または懸濁液が挙げられる。固体形態は、試料調製を噴霧乾燥、凍結乾燥または凍結することによって実現することができる。一実施形態では、試料組成物は固体形態であり得る。代替の実施形態では、試料組成物は液体形態（例えば、溶液または懸濁液）であり得る。
【0471】
試料組成物の物理的状態の影響は、異なる物理的状態で用意された少なくとも２つの試料組成物に本開示の方法および／または使用を適用し、それによって、前記異なる試料組成物の１種または複数の１つまたは複数のパラメーターを決定し、異なる試料組成物のうちの１つについて決定した１種または複数の１つまたは複数のパラメーターを異なる試料組成物の別のものについて決定した１種または複数の１つまたは複数のパラメーターと比較することによって、分析することができる。
【0472】
本開示の試料組成物のパラメーター
試料組成物または対照組成物が、核酸（とりわけＲＮＡ）および粒子を含む場合、核酸（とりわけＲＮＡ）は、遊離形態（すなわち、粒子に結合／付着していない状態）において、および／または結合形態（すなわち、粒子に結合／付着した状態）において、試料組成物または対照組成物に含まれ得る。核酸（とりわけＲＮＡ）の総量は、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）（すなわち、非結合核酸（例えば、非結合ＲＮＡ））と結合核酸（とりわけＲＮＡ）との合計である。結合核酸（とりわけＲＮＡ）は、粒子の外部表面に結合／付着した核酸（とりわけＲＮＡ）（本明細書において、「表面核酸」（例えば、「表面ＲＮＡ」）とも称される）および粒子内に含有／封入された核酸（とりわけＲＮＡ）（本明細書において、「封入核酸」（例えば、「封入ＲＮＡ」）とも称される）から構成される。表面核酸（例えば、「表面ＲＮＡ」）および遊離核酸（例えば、「遊離ＲＮＡ」）の合計は、本明細書において、「アクセス可能な核酸」（例えば、「アクセス可能なＲＮＡ」）とも呼ばれる。したがって、核酸の総量（例えば、ＲＮＡの総量）および遊離核酸の量（例えば、遊離ＲＮＡの量）以外に、核酸（とりわけＲＮＡ）および粒子を含む試料組成物または対照組成物の追加のパラメーターは、表面核酸の量（例えば、表面ＲＮＡの量）、封入核酸の量（例えば、封入ＲＮＡの量）、およびアクセス可能な核酸の量（例えば、アクセス可能なＲＮＡの量）である。図２１は、核酸と粒子とを含む試料組成物または対照組成物中に含有される核酸における上記において言及された形態を例示しており、この場合、核酸はＤＮＡである。
試料組成物または対照組成物が、核酸（とりわけＲＮＡ）および粒子を含む場合、核酸（とりわけＲＮＡ）は、遊離形態（すなわち、粒子に結合／付着していない状態）において、および／または結合形態（すなわち、粒子に結合／付着した状態）において、試料組成物または対照組成物に含まれ得る。核酸（とりわけＲＮＡ）の総量は、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）（すなわち、非結合核酸（例えば、非結合ＲＮＡ））と結合核酸（とりわけＲＮＡ）との合計である。結合核酸（とりわけＲＮＡ）は、粒子の外部表面に結合／付着した核酸（とりわけＲＮＡ）（本明細書において、「表面核酸」（例えば、「表面ＲＮＡ」）とも称される）および粒子内に含有／封入された核酸（とりわけＲＮＡ）（本明細書において、「封入核酸」（例えば、「封入ＲＮＡ」）とも称される）から構成される。表面核酸（例えば、「表面ＲＮＡ」）および遊離核酸（例えば、「遊離ＲＮＡ」）の合計は、本明細書において、「アクセス可能な核酸」（例えば、「アクセス可能なＲＮＡ」）とも呼ばれる。したがって、核酸の総量（例えば、ＲＮＡの総量）および遊離核酸の量（例えば、遊離ＲＮＡの量）以外に、核酸（とりわけＲＮＡ）および粒子を含む試料組成物または対照組成物の追加のパラメーターは、表面核酸の量（例えば、表面ＲＮＡの量）、封入核酸の量（例えば、封入ＲＮＡの量）、およびアクセス可能な核酸の量（例えば、アクセス可能なＲＮＡの量）である。図２１は、核酸と粒子とを含む試料組成物または対照組成物中に含有される核酸における上記において言及された形態を例示しており、この場合、核酸はＤＮＡである。
【0473】
その上、核酸（とりわけＲＮＡ）が、遊離形態（すなわち、核酸（とりわけＲＮＡ）と粒子とを含む試料組成物または対照組成物中に含有される粒子に結合または付着していない）または非製剤化形態（すなわち、本明細書において指定されるような粒子を含まない組成物、例えば、リポソームを構成する構成要素（特に、カチオン性両親媒性脂質および／またはカチオン性両親媒性ポリマー）および／またはウイルス様粒子を含まない組成物）である場合、核酸（とりわけＲＮＡ）のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布（例えば、核酸（例えば、ＲＮＡ）の回転半径（Ｒｇ）および／または核酸（例えば、ＲＮＡ）の流体力学半径（Ｒｈ）に基づく）も、求めるかまたは分析することができる。したがって、遊離形態または非製剤化形態における、核酸（とりわけＲＮＡ）を含む試料組成物または対照組成物の追加のパラメーターは、核酸（とりわけＲＮＡ）のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布（それぞれ、例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）である。
【0474】
さらなるパラメーターとしては、例えば、上記のパラメーターのうちの１つまたは複数から得られるもの、例えば、形状因子、形態因子、核酸（とりわけＲＮＡ）封入効率、粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）の量と粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の総量との比率、粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の正に帯電した部分の量と粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）の量との比率、ならびに粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の正に帯電した部分の量と粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）の負に帯電した部分の量との電荷比（Ｎ／Ｐ比）が挙げられる。
【0475】
したがって、一部の実施形態では、本開示の方法および／または使用によって求められるかまたは分析される１つまたは複数のパラメーターは、以下：核酸完全性（とりわけＲＮＡ完全性）、核酸（とりわけＲＮＡ）の総量、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量、粒子に結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子のサイズ（例えば、核酸（例えば、ＲＮＡ）を含有する粒子の回転半径（Ｒｇ）、および／または核酸（例えば、ＲＮＡ）を含有する粒子の流体力学半径（Ｒｈ）に基づく）、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子のサイズ分布（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子の定量的サイズ分布（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）、核酸（とりわけＲＮＡ）の分子量、表面核酸の量（例えば、表面ＲＮＡの量）、封入核酸の量（例えば、封入ＲＮＡの量）、アクセス可能な核酸の量（例えば、アクセス可能なＲＮＡの量）、核酸（とりわけＲＮＡ）のサイズ（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）、核酸（とりわけＲＮＡ）のサイズ分布（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）、核酸（とりわけＲＮＡ）の定量的サイズ分布（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）、形状因子、形態因子、核酸（とりわけＲＮＡ）封入効率、粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）の量と粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の総量との比率、粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の正に帯電した部分の量と粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）の量との比率、ならびに粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の正に帯電した部分の量と粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）の負に帯電した部分の量との電荷比（Ｎ／Ｐ比）、のうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ（例えば、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つ、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または全て）を含む。一部の実施形態では、本開示の方法および／または使用によって求められるまたは分析される１つまたは複数のパラメーターは、以下：核酸完全性（とりわけＲＮＡ完全性）、核酸（とりわけＲＮＡ）の総量、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量、粒子に結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子のサイズ（核酸（例えば、ＲＮＡ）を含有する粒子の回転半径（Ｒｇ）、および／または核酸（例えば、ＲＮＡ）を含有する粒子の流体力学半径（Ｒｈ）に基づく）、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子のサイズ分布（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子の定量的サイズ分布（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）、表面核酸の量（例えば、表面ＲＮＡの量）、封入核酸の量（例えば、封入ＲＮＡの量）、アクセス可能な核酸の量（例えば、アクセス可能なＲＮＡの量）、核酸（とりわけＲＮＡ）のサイズ（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）、核酸（とりわけＲＮＡ）のサイズ分布（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）、核酸（とりわけＲＮＡ）の定量的サイズ分布（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）、形状因子、形態因子、核酸（とりわけＲＮＡ）封入効率、粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）の量と粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の総量との比率、粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の正に帯電した部分の量と粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）の量との比率、ならびに粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の正に帯電した部分の量と粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）の負に帯電した部分の量との電荷比（Ｎ／Ｐ比）、のうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ（例えば、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つ、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または全て）を含む。一部の実施形態では、本開示の方法および／または使用によって求められるまたは分析される１つまたは複数のパラメーターは、以下：核酸完全性（とりわけＲＮＡ完全性）、核酸（とりわけＲＮＡ）の総量、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量、粒子に結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子のサイズ（例えば、核酸（例えば、ＲＮＡ）を含有する粒子の回転半径（Ｒｇ）、および／または核酸（例えば、ＲＮＡ）を含有する粒子の流体力学半径（Ｒｈ）に基づく）、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子のサイズ分布（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子の定量的サイズ分布（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）、表面核酸の量（例えば、表面ＲＮＡの量）、封入核酸の量（例えば、封入ＲＮＡの量）、アクセス可能な核酸の量（例えば、アクセス可能なＲＮＡの量）、核酸（とりわけＲＮＡ）のサイズ（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）、核酸（とりわけＲＮＡ）のサイズ分布（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）、核酸（とりわけＲＮＡ）の定量的サイズ分布（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）、形状因子、形態因子、ならびに核酸（とりわけＲＮＡ）封入効率、のうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ（例えば、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つ、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または全て）を含む。一部の実施形態では、本開示の方法および／または使用によって求められるかまたは分析される１つまたは複数のパラメーターは、以下：核酸完全性（とりわけＲＮＡ完全性）、核酸（とりわけＲＮＡ）の総量、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量、粒子に結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子のサイズ（例えば、核酸（例えば、ＲＮＡ）を含有する粒子の回転半径（Ｒｇ）、および／または核酸（例えば、ＲＮＡ）を含有する粒子の流体力学半径（Ｒｈ）に基づく）、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子のサイズ分布（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子の定量的サイズ分布（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）、表面核酸の量（例えば、表面ＲＮＡの量）、封入核酸の量（例えば、封入ＲＮＡの量）、アクセス可能な核酸の量（例えば、アクセス可能なＲＮＡの量）、核酸（とりわけＲＮＡ）のサイズ（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）、核酸（とりわけＲＮＡ）のサイズ分布（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）、核酸（とりわけＲＮＡ）の定量的サイズ分布（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）、ならびに核酸（とりわけＲＮＡ）封入効率、のうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ（例えば、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つ、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または全て）を含む。一部の実施形態では、本開示の方法および／または使用によって求められるかまたは分析される１つまたは複数のパラメーターは、以下：核酸完全性（とりわけＲＮＡ完全性）、核酸（とりわけＲＮＡ）の総量、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量、粒子に結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子のサイズ分布（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子の定量的サイズ分布（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）、表面核酸の量（例えば、表面ＲＮＡの量）、封入核酸の量（例えば、封入ＲＮＡの量）、アクセス可能な核酸の量（例えば、アクセス可能なＲＮＡの量）、核酸（とりわけＲＮＡ）のサイズ（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）、核酸（とりわけＲＮＡ）のサイズ分布（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）、核酸（とりわけＲＮＡ）の定量的サイズ分布（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）、ならびに核酸（とりわけＲＮＡ）封入効率、のうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ（例えば、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つ、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または全て）を含む。一部の実施形態では、本開示の方法および／または使用によって求められるかまたは分析される１つまたは複数のパラメーターは、以下：核酸完全性（とりわけＲＮＡ完全性）、核酸（とりわけＲＮＡ）の総量、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量、粒子に結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子のサイズ分布（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）、ならびに核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子の定量的サイズ分布（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）、のうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ（例えば、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つ、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ）を含む。一部の実施形態では、本開示の方法および／または使用によって求められるかまたは分析される１つまたは複数のパラメーターは、以下：核酸（とりわけＲＮＡ）の総量、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量、粒子に結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子のサイズ分布（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）、ならびに核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子の定量的サイズ分布（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）、のうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ（例えば、少なくとも３つ、または少なくとも４つ、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ）を含む。一部の実施形態では、本開示の方法および／または使用によって求められるかまたは分析される１つまたは複数のパラメーターは、以下：遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量、粒子に結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子のサイズ分布（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）、ならびに核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子の定量的サイズ分布（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）、のうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ（例えば、少なくとも３つ、例えば、１つ、２つ、３つ、または４つ）を含む。
【0476】
本開示の方法および／または使用の一部の実施形態（特に、組成物（例えば、試料組成物または対照組成物）がＲＮＡおよび粒子を含むような実施形態）では、１つまたは複数のパラメーターは、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子の定量的サイズ分布（例えば、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子の回転半径（Ｒｇ）および／または核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子の流体力学半径（Ｒｈ）に基づく）、ならびに適宜、本明細書において指定される残りのパラメーター（追加の適宜のパラメーターを含む）のうちの少なくとも１つのパラメーター、例えば、少なくとも２つのパラメーター、を含み；好ましくは、これらの残りのパラメーターは、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量、粒子に結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量、および核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子のサイズ分布（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）、からなる群から選択される。本開示の方法および／または使用の一部の実施形態（特に、組成物（例えば、試料組成物または対照組成物）がＲＮＡおよび粒子を含むような実施形態）では、１つまたは複数のパラメーターは、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子の定量的サイズ分布（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）ならびに：遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量、粒子に結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量、および核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子のサイズ分布（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）、からなる群から選択される少なくとも１つのパラメーター、例えば、少なくとも２つのパラメーター、を含む。本開示の方法および／または使用の一部の実施形態（特に、組成物（例えば、試料組成物または対照組成物）がＲＮＡおよび粒子を含むような実施形態）では、１つまたは複数のパラメーターは、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子の定量的サイズ分布（例えば、ＲｇまたはＲｈ値に基づく）、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量、および粒子に結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量を含む。核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子の定量的サイズ分布が、Ｒｇ値およびＲｈ値に基づいて求められる場合、これは、結果として、２つのデータセット、すなわち、Ｒｇ値に基づくものとＲｈ値に基づくもの、を生じる。しかしながら、本発明により、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子の定量的サイズ分布に対するこれら２つのデータセットは、１つのみのパラメーターと見なされる（２つのパラメーターとは見なされない）。加えて、フィールドフローフラクショネーションによって得られたフラクトグラムが２つ以上の粒子ピークを示す場合、粒子ピークの各々に対する定量的サイズ分布の決定は、１つのみのパラメーターと見なされる（粒子ピークの各々に対して１つのパラメーターとは見なされない）。同じことが、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子のサイズ分布がＲｇ値およびＲｈ値に基づいて求められる状況にも適用される。
【0477】
一部の実施形態では、本開示の方法および／または使用によって求められるかまたは分析される１つまたは複数のパラメーターは、工程（ａ）～（ｃ）の少なくとも１回（例えば、１～１０回）のサイクルにおいて求められるかまたは分析される。好ましい一実施形態では、本開示の方法および／または使用によって求められるかまたは分析される１つまたは複数のパラメーターは、工程（ａ）～（ｃ）の１回のサイクルにおいて求められるかまたは分析される。
【0478】
概して、試料組成物のパラメーター（例えば、核酸（とりわけＲＮＡ）の量）は、本開示の方法および／または使用によって求められるかまたは分析されるべきである。したがって、一部の実施形態では、試料組成物の１つまたは複数のパラメーター（例えば、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量）は、本開示の方法が実施される前または本開示の使用が適用される前には知られていない。しかしながら、一部の実施形態では、試料組成物の１つまたは複数のパラメーター（例えば、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量）は、時間における第１の時点において既知であり、ならびに本開示の方法および／または使用は、少なくとも時間におけるより後の第２の時点において（例えば、ある特定の期間（例えば、１時間以上、１日以上、１週間以上、１か月以上、または１年以上）にわたって、１時間毎に（例えば、毎日、毎週、毎月、または毎年）少なくとも１回（例えば、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも８回、少なくとも１０回）１つまたは複数のパラメーター（例えば、試料組成物の遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量）を決定または分析するために利用される。したがって、一実施形態では、本開示の方法および／または使用は、経時における１つまたは複数のパラメーターのプロファイルを求めるために、ある特定の期間にわたって（例えば、１時間以上、１日以上、１週間以上、１か月以上、または１年以上）、例えば、試料組成物の貯蔵の間、試料組成物の１つまたは複数のパラメーターをモニターするために利用され得る。
【0479】
代替の実施形態では、本開示の方法および／または使用は、少なくとも２つの試料組成物の同じ１つまたは複数のパラメーター（例えば、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量）を比較するために利用され得、その場合、少なくとも２つの試料組成物は、少なくとも２つの試料組成物が提供された１つまたは複数の反応条件においてのみ異なる。この実施形態では、試料組成物の１つまたは複数のパラメーターに対する異なる反応条件の効果を分析することは可能である。これらの反応条件としては、これらに限定されないが、合成条件、処理条件（例えば、精製条件および／または乾燥条件）、および貯蔵条件が挙げられる。
【0480】
Ａ．核酸完全性（とりわけＲＮＡ完全性）
本開示により、核酸完全性（とりわけＲＮＡ完全性）は、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の分解の度合いを表すパラメーターである。例えば、分解されていない核酸（とりわけＲＮＡ）の場合、前記核酸の全ての分子は、同じ長さを有する。したがって、フィールドフローフラクショネーションを使用してそれらのサイズまたは流体力学的移動性（例えば、拡散係数）に従って分離した場合、分解されていない核酸（とりわけＲＮＡ）は、鋭いピークを与えるはずである。対照的に、核酸（とりわけＲＮＡ）の分解は、結果として、長さの異なる分子の混合物をもたらす。その結果、フィールドフローフラクショネーションを使用してそれらのサイズまたは流体力学的移動性に従って分離した場合、分解した核酸（とりわけＲＮＡ）は、未分解の核酸（とりわけＲＮＡ）と比較して、異なる保持時間、特により早い保持時間、において検出され、未分解の核酸（とりわけＲＮＡ）に対するピークは、未分解の核酸（とりわけＲＮＡ）のみが存在する状況と比較して、より広くかつより小さい。分解の程度が高いほど、分解した核酸（とりわけＲＮＡ）に対するピークは、より広くかつより高くなり、ならびに未分解の核酸（とりわけＲＮＡ）に対するピークは、より広くかつより小さい。当業者であれば、日常的実験技術および機器を使用して核酸（とりわけＲＮＡ）を検出することができるであろう。例えば、フィールドフローフラクショネーションによる分離の後、核酸（とりわけＲＮＡ）は、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、および屈折率（ＲＩ）シグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定することによって検出され得る。核酸（とりわけＲＮＡ）は、ＵＶ範囲において（例えば、２６０ｎｍまたは２８０ｎｍにおいて）、特徴的減衰係数を有するため、前記核酸（とりわけＲＮＡ）の検出は、ＵＶシグナル（好ましくは、２６０ｎｍ～２８０ｎｍの範囲の波長、例えば、２６０ｎｍまたは２８０ｎｍの波長において）を測定することによって為すことが好ましい。
本開示により、核酸完全性（とりわけＲＮＡ完全性）は、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の分解の度合いを表すパラメーターである。例えば、分解されていない核酸（とりわけＲＮＡ）の場合、前記核酸の全ての分子は、同じ長さを有する。したがって、フィールドフローフラクショネーションを使用してそれらのサイズまたは流体力学的移動性（例えば、拡散係数）に従って分離した場合、分解されていない核酸（とりわけＲＮＡ）は、鋭いピークを与えるはずである。対照的に、核酸（とりわけＲＮＡ）の分解は、結果として、長さの異なる分子の混合物をもたらす。その結果、フィールドフローフラクショネーションを使用してそれらのサイズまたは流体力学的移動性に従って分離した場合、分解した核酸（とりわけＲＮＡ）は、未分解の核酸（とりわけＲＮＡ）と比較して、異なる保持時間、特により早い保持時間、において検出され、未分解の核酸（とりわけＲＮＡ）に対するピークは、未分解の核酸（とりわけＲＮＡ）のみが存在する状況と比較して、より広くかつより小さい。分解の程度が高いほど、分解した核酸（とりわけＲＮＡ）に対するピークは、より広くかつより高くなり、ならびに未分解の核酸（とりわけＲＮＡ）に対するピークは、より広くかつより小さい。当業者であれば、日常的実験技術および機器を使用して核酸（とりわけＲＮＡ）を検出することができるであろう。例えば、フィールドフローフラクショネーションによる分離の後、核酸（とりわけＲＮＡ）は、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、および屈折率（ＲＩ）シグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルを測定することによって検出され得る。核酸（とりわけＲＮＡ）は、ＵＶ範囲において（例えば、２６０ｎｍまたは２８０ｎｍにおいて）、特徴的減衰係数を有するため、前記核酸（とりわけＲＮＡ）の検出は、ＵＶシグナル（好ましくは、２６０ｎｍ～２８０ｎｍの範囲の波長、例えば、２６０ｎｍまたは２８０ｎｍの波長において）を測定することによって為すことが好ましい。
【0481】
例えば、図６Ｃは、未処理のＲＮＡ、完全に分解したＲＮＡ、または未処理のＲＮＡと分解したＲＮＡとの混合物のいずれかを含む３つの試料組成物に対するＵＶシグナルを示している。図６Ｃから分かるように、未処理の（すなわち、未分解の）ＲＮＡは、約１７分の保持時間において単一のピークを与え、完全に分解したＲＮＡは、約４分の保持時間においてピークを与え、ならびに未分解のＲＮＡと分解したＲＮＡとの混合物は、全く分解していないＲＮＡに対して得られるピークまたは完全に分解したＲＮＡに対して得られるピークよりも小さい２つのピーク（それぞれ、約４分の保持時間および約１７分の保持時間）を与える。
【0482】
本明細書において開示される試料組成物の核酸完全性（とりわけＲＮＡ完全性）は、対照核酸（とりわけ対照ＲＮＡ）の完全性を使用して求められるかまたは算出されることが好ましい。この対照核酸（とりわけ対照ＲＮＡ）は、通常、対照組成物に含まれており、この場合、対照組成物および試料組成物は、（ｉ）試料の１つまたは複数のパラメーターに対するその効果が求められるかまたは分析される、試料組成物に適用される条件、および／または（ｉｉ）試料の１つまたは複数のパラメーターに対するその効果が求められるかまたは分析される、試料組成物中の構成要素の有無、を除いて、同一である。例えば、試料組成物に適用される条件が、例えば、約９８℃の高温（ある特定の期間（例えば、２分間、４分間、または１０分間）において適用される）である場合、それぞれの対照組成物は、試料組成物と同一であるが（すなわち、試料組成物と同じ量において同じ構成要素（特に、同じ核酸（とりわけＲＮＡ）など）を有する）高温に晒されてはいない。その上、例えば、試料組成物が、さらに、賦形剤（例えば、安定化剤またはキレート化剤）を含む場合、それぞれの対照組成物は、賦形剤を含有しないことを除いて、試料組成物と同一であり、ならびに試料組成物と同じ条件に供されている。加えて、試料組成物の１つまたは複数のパラメーターがある期間においてモニターされる場合（例えば、貯蔵に関する安定性プロファイルを得るために）、対照組成物は、初期試料組成物、すなわち、モニタリングの開始時の試料組成物、であってもよい。
【0483】
概して、本明細書において開示される試料組成物の核酸完全性（とりわけＲＮＡ完全性）が対照核酸（とりわけ対照ＲＮＡ）の完全性を使用して求められるかまたは算出される場合、試料組成物に対して求められるかまたは算出される完全性値が、対照組成物に対して求められるかまたは算出された完全性値と相関することが好ましい。したがって、通常、試料組成物に対して求められるかまたは算出される完全性値（ＩＶ）は、対照組成物に対して求められるかまたは算出された完全性値に対して正規化され、例えば、試料組成物に対して求められるかまたは算出された完全性値（ＩＶＳ）が、対照組成物に対して求められるかまたは算出された完全性値（ＩＶＣ）によって除算され、結果として、以下の方程式により、試料組成物における正規化された完全性（ＩＳｎｏｒｍ．）がもたらされ：
【0484】
【数9】
【0485】
これに関して、完全性値は、例えば、対照組成物または試料組成物のフィールドフローフラクショネーションから得られるフラクトグラムにおける、未分解核酸（とりわけ未分解ＲＮＡ）を表すピークの面積および／または高さを使用して、当業者に既知なように求められるかまたは算出され得る。
【0486】
好ましい一実施形態では、完全性値は、未分解核酸（とりわけ未分解ＲＮＡ）を表すピーク（ＵＶピーク、蛍光ピーク、またはＲＩピーク）の面積に基づいて求められるかまたは算出される。特に、完全性値は、（ｉ）前記ピークの最大高さから前記ピークの終わりまでの面積（Ａ５０％）と、（ｉｉ）前記ピークの総面積（Ａ１００％）との比率として求められるかまたは算出される。例えば、図２は、Ａ５０％値およびＡ１００％値の決定または算出を例示している。特に、図２Ａは、対照ＲＮＡ組成物に対するＡ５０％値の決定または算出を示しており（Ａ５０％値の決定または算出に対する限界は、数字の「１」で示される）、その一方で、図２Ｂは、対照ＲＮＡ組成物に対するＡ１００％値の決定または算出を示している（Ａ１００％値の決定または算出に対する限界は、数字の「２」で示される）。図２Ｃおよび２Ｄは、熱処理に供された試料ＲＮＡ組成物に対するＡ５０％値（図２Ｃ）およびＡ１００％値（図２Ｄ）の決定または算出を示している（したがって、図２Ｃおよび２Ｄにおけるピークは、分解したＲＮＡの存在に起因して、より広い）。
【0487】
代替の好ましい実施形態では、完全性値は、基準試料を用いずに求められるかまたは算出される。この実施形態では、試料組成物に対する完全性値は、好ましくは、（ｉ）２・Ａ５０％、すなわち、前記ピークの最大高さから前記ピークの終わりまでのピーク面積の２倍値と、（ｉｉ）Ａ１００％、すなわち、前記ピークの総面積との比率である。したがって、試料組成物中の核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性は、以下の方程式に従って求められるかまたは算出されるであろう。
【0488】
【数10】
【0489】
さらなる代替の実施形態では、完全性値は、未分解核酸（とりわけ未分解ＲＮＡ）を表すピーク（ＵＶピーク、蛍光ピーク、またはＲＩピーク）の高さに基づいて求められるかまたは算出される。この実施形態では、試料組成物に対する完全性値は、試料組成物に対して得られるフラクトグラムにおける前記ピークの高さ（ＨＳ）であり、ならびに対照組成物に対する完全性値は、対照組成物に対して得られるフラクトグラムにおける前記ピークの高さ（ＨＣ）である。したがって、試料組成物中の核酸（とりわけＲＮＡ）の正規化された完全性は、以下の方程式に従って求められるかまたは算出されるであろう。
【0490】
【数11】
【0491】
さらなる代替の実施形態では、特に、核酸（とりわけＲＮＡ）が、１０，０００超のヌクレオチド（例えば、最大で１５，０００までのヌクレオチド、または最大で１２，０００までのヌクレオチド）の長さを有する場合、試料組成物に対する完全性値は、（ａ）ＵＶシグナル、蛍光シグナル、および屈折率（ＲＩ）シグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナル、および（ｂ）ＬＳシグナル（例えば、ＭＡＬＳシグナル）、の両方に基づいて求められ得るかまたは算出され得る。このさらなる代替の実施形態は、基準核酸（とりわけＲＮＡ）を頼ることなく使用することができる。上記において示されるように、未分解の核酸（とりわけＲＮＡ）は、鋭いピークを与えるはずであり、その一方で、核酸（とりわけＲＮＡ）の分解は、結果として、長さの異なる分子の混合物を生じる。その結果、未分解の核酸（とりわけＲＮＡ）を表すＬＳシグナル（例えば、ＭＡＬＳシグナル）から算出された分子量曲線は、（ほぼ）水平な線、すなわち、約０の傾きを有する連続曲線部分、であるはずである。対照的に、部分的に分解した核酸（とりわけＲＮＡ）の混合物（すなわち、異なる（好ましくは減少する）分子量を有する核酸（とりわけＲＮＡ）の混合物）を表すＬＳシグナル（例えば、ＭＡＬＳシグナル）から算出される分子量曲線は、異なる傾きを有した異なる部分を有し、この場合、ほぼ０の傾きを有する（好ましくは連続する）当該部分は、理想的には、無傷の／未分解の核酸（とりわけＲＮＡ）の部分を表している。したがって、分子量曲線の（ほとんど）水平な部分がそれぞれ始まり、そして終わる（すなわち、ｔｂおよびｔｅ）それらの保持時間は、「無傷の」／未分解の核酸（とりわけＲＮＡ）を表すピーク（ＵＶピーク、蛍光ピーク、またはＲＩピーク）に対する制限と見なすことができる。分子量曲線の（ほとんど）水平な部分がそれぞれ始まり、そして終わる、これらの保持時間を求めるために、分子量曲線の一次導関数が算出され得る。次いで、一次導関数が約０である、（好ましくは連続する）部分の開始点および終了点は、所望の保持時間を表している。その結果、このさらなる代替の実施形態では、試料組成物に対する完全性値は、好ましくは、（ｉ）これらの保持時間の間のピーク（ＵＶピーク、蛍光ピーク、またはＲＩピーク）の面積と、（ｉｉ）前記ピークの総面積との比率として求められるかまたは算出される。したがって、このさらなる代替の実施形態では、試料組成物中の核酸（とりわけＲＮＡ）の完全性（Ｉ）は、以下の方程式を使用して算出することができ：
【0492】
【数12】
【0493】
本明細書において開示されるように、本開示の方法および／または使用の工程（ｂ）では、１つまたは複数の試料画分のうちの少なくとも１つのＵＶシグナル、蛍光シグナル、および屈折率（ＲＩ）シグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルが測定され、それらから、（試料）組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の量を求めることができる。核酸（とりわけＲＮＡ）は、ＵＶ範囲において（例えば、２６０ｎｍまたは２８０ｎｍにおいて）、特徴的減衰係数を有するため、前記核酸（とりわけＲＮＡ）の量は、ＵＶシグナルを測定することによって求めることができる。核酸（とりわけＲＮＡ）が、蛍光である場合（例えば、核酸が、共有結合または非共有結合によって蛍光色素で標識されているため）、または、蛍光性になる場合（例えば、核酸に（特に、特異的に）付着する蛍光色素、例えば、インターカレーティング蛍光色素、を加えることによって）、核酸（とりわけＲＮＡ）の量も、蛍光（ＦＳ）シグナルを測定することによって求めることができる。あるいは、粒子に結合している核酸（とりわけＲＮＡ）の量は、蛍光色素で標識された粒子を使用することによって求めることができる。上記のアプローチにおいて、任意の蛍光色素を使用することができる。蛍光色素を核酸（とりわけＲＮＡ）または別の物質（例えば、本明細書において記載される粒子を構成する物質、例えば、脂質および／またはポリマー）に共有結合または非共有結合によって取り付けるための蛍光色素および手順は、当業者に既知であり；例えば、"The Molecular Probes Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies", 11th edt. (2010), I. Johnson and M.T.Z. Spence (editors)を参照、なお、当該文献は、参照により本明細書に組み入れられる。その上、核酸（とりわけＲＮＡ）の量は、屈折率（ＲＩ）シグナルを測定することによっても決定することができる。
【0494】
Ｂ．核酸（とりわけＲＮＡ）の総量
概して、核酸（とりわけＲＮＡ）の量は、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、および屈折率（ＲＩ）シグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルに基づいて求められ得るかまたは算出され得る。一実施形態では、この目的のために、較正曲線が使用され、この場合、前記較正曲線は、異なる既知の量の対照核酸（とりわけＲＮＡ）を含有するいくつかの対照組成物と、前記対照核酸（とりわけＲＮＡ）から得られる、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルとに基づいて確立される。
概して、核酸（とりわけＲＮＡ）の量は、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、および屈折率（ＲＩ）シグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルに基づいて求められ得るかまたは算出され得る。一実施形態では、この目的のために、較正曲線が使用され、この場合、前記較正曲線は、異なる既知の量の対照核酸（とりわけＲＮＡ）を含有するいくつかの対照組成物と、前記対照核酸（とりわけＲＮＡ）から得られる、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルとに基づいて確立される。
【0495】
核酸（とりわけＲＮＡ）は、ＵＶ範囲において（例えば、２６０ｎｍまたは２８０ｎｍにおいて）、特徴的減衰係数を有する。したがって、代替の好ましい実施形態では、核酸（とりわけＲＮＡ）の量は、ＵＶシグナルを測定すること（好ましくは、２６０ｎｍ～２８０ｎｍの範囲の波長、例えば、２６０ｎｍまたは２８０ｎｍの波長において）、およびランベルト・ベールの法則を使用することによって求められるかまたは算出される。例えば、試料組成物または対照組成物の核酸（とりわけＲＮＡ）濃度は、以下の方程式を使用して算出することができ：
【0496】
【数13】
【0497】
ＵＶ範囲における（例えば、２６０ｎｍまたは２８０ｎｍにおける）減衰係数を使用した核酸（とりわけＲＮＡ）の決定または算出は、較正曲線の確立を必要としないため、有利である。
【0498】
上記において示されるように、試料組成物または対照組成物が、核酸（とりわけＲＮＡ）および粒子を含む場合、核酸（とりわけＲＮＡ）は、遊離形態（すなわち、粒子に結合／付着していない状態）において、および／または結合形態（すなわち、粒子に結合／付着した状態）において、組成物に含有され得る。核酸（とりわけＲＮＡ）の総量は、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）（すなわち、非結合核酸（例えば、非結合ＲＮＡ））および結合核酸（とりわけＲＮＡ）の合計である。
【0499】
したがって、核酸（とりわけＲＮＡ）と粒子とを含む本開示の試料組成物または対照組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の総量を求めるかまたは算出するために、（ａ）前記試料組成物または対照組成物における遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量および結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量の両方を求めるかまたは算出しなければならないか、または（ｂ）一方の形態の核酸（とりわけＲＮＡ）（例えば、結合した核酸（とりわけ結合ＲＮＡ）を他の形態（例えば、遊離核酸（とりわけ遊離ＲＮＡ）に移行させ、後者の形態の量を求めるかまたは算出しなければならないか、のどちらかである。この移行は、例えば、放出剤を試料組成物または対照組成物あるいはそれらの一部に加えることによって、達成することができる。放出剤は、粒子に結合した核酸（とりわけＲＮＡ）を粒子から放出させることができる（それにより、結合した核酸（とりわけ結合ＲＮＡ）の量をゼロまで減少させ、遊離核酸（とりわけ遊離ＲＮＡ）の量をその最大まで増加させる）。放出剤の例としては、これらに限定されるわけではないが、（ｉ）界面活性剤、例えば、陰イオン性界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）、双性イオン性界面活性剤（例えば、ｎ－テトラデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホネート（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３－１４））、陽イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、またはそれらの混合物；（ｉｉ）アルコール、例えば、脂肪族アルコール（例えば、エタノール）、またはアルコールの混合物；あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組合せ物、が挙げられる。好ましい放出剤は、陰イオン性界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）、双性イオン性界面活性剤（例えば、ｎ－テトラデシル－Ｎ、Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホネート（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３－１４））、またはそれらの組合せ物である。核酸（とりわけＲＮＡ）がフィールドフローフラクショネーションの間に粒子内に再取り込みされないことを確実にするために、一実施形態では、含有する核酸（とりわけＲＮＡ）の総量が求められるかまたは算出される、試料組成物または対照組成物あるいは前記試料組成物または対照組成物の一部が、放出剤を含有する液相を使用するフィールドフローフラクショネーションに供される。しかしながら、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３－１４が放出剤として使用される場合、放出剤を含有する液相を使用することは必ずしも必要ではない。
【0500】
Ｃ．遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量
遊離核酸（とりわけＲＮＡ）は、本明細書において開示される粒子と比べて、サイズにおいてはるかに小さいか、または少なくとも、本明細書において開示される粒子と比べて、フィールドフローフラクショネーションにおいてはるかに高い流体力学的移動性を有する。したがって、フィールドフローフラクショネーションを使用することによって、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）を、核酸（とりわけＲＮＡ）から２つの（好ましくはベースラインとは別の）ピークへと分離することが可能であり、この場合、一方のピークは、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）を表し、もう一方のピークは、粒子に結合した核酸（とりわけＲＮＡ）を表す。例えば、フィールドフローフラクショネーションが、ある値（例えば、約１～約４ｍＬ／分）から開始されて、より低い値（例えば、約０～約０．１ｍＬ／分）まで減少するようなクロスフローレートプロファイルを使用して実施される場合、より早い保持時間のピークは、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）を表し、より遅い保持時間のピークは、粒子に結合した核酸（とりわけＲＮＡ）を表す。例えば、図５は、ＲＮＡと粒子とを含む試料組成物をフィールドフローフラクショネーションに供することによって得られる代表的なフラクトグラムを表しており、この場合、ＵＶシグナル（２６０ｎｍにおいて記録される；破線）および光散乱（ＬＳ）シグナル（実線）が、時間経過において記録される。薄灰色の四角は、遊離ＲＮＡに対するピークを示しており、その一方で、暗灰色の四角は、粒子に結合したＲＮＡ（破線）および粒子（実線）を示している。
遊離核酸（とりわけＲＮＡ）は、本明細書において開示される粒子と比べて、サイズにおいてはるかに小さいか、または少なくとも、本明細書において開示される粒子と比べて、フィールドフローフラクショネーションにおいてはるかに高い流体力学的移動性を有する。したがって、フィールドフローフラクショネーションを使用することによって、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）を、核酸（とりわけＲＮＡ）から２つの（好ましくはベースラインとは別の）ピークへと分離することが可能であり、この場合、一方のピークは、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）を表し、もう一方のピークは、粒子に結合した核酸（とりわけＲＮＡ）を表す。例えば、フィールドフローフラクショネーションが、ある値（例えば、約１～約４ｍＬ／分）から開始されて、より低い値（例えば、約０～約０．１ｍＬ／分）まで減少するようなクロスフローレートプロファイルを使用して実施される場合、より早い保持時間のピークは、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）を表し、より遅い保持時間のピークは、粒子に結合した核酸（とりわけＲＮＡ）を表す。例えば、図５は、ＲＮＡと粒子とを含む試料組成物をフィールドフローフラクショネーションに供することによって得られる代表的なフラクトグラムを表しており、この場合、ＵＶシグナル（２６０ｎｍにおいて記録される；破線）および光散乱（ＬＳ）シグナル（実線）が、時間経過において記録される。薄灰色の四角は、遊離ＲＮＡに対するピークを示しており、その一方で、暗灰色の四角は、粒子に結合したＲＮＡ（破線）および粒子（実線）を示している。
【0501】
したがって、核酸（とりわけＲＮＡ）と粒子とを含む本開示の試料組成物または対照組成物中に含有される遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量は、核酸（とりわけＲＮＡ）と粒子とを含む本開示の試料組成物または対照組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の総量の決定または算出に対して上記において指定されたのと同じ方法において求められ得るかまたは算出され得る。したがって、一実施形態では、核酸（とりわけＲＮＡ）と粒子とを含む本開示の試料組成物または対照組成物中に含有される遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量は、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、および屈折率（ＲＩ）シグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルに基づいて求められるかまたは算出され、その場合、較正曲線が使用される。好ましい実施形態では、遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量は、ＵＶ範囲における（例えば、２６０ｎｍまたは２８０ｎｍにおける）核酸（とりわけＲＮＡ）の減衰係数を使用することによって求められるかまたは算出される。
【0502】
Ｄ．粒子に結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量
上記において示されるように、試料組成物または対照組成物が、核酸（とりわけＲＮＡ）および粒子を含む場合、核酸（とりわけＲＮＡ）は、遊離形態（すなわち、粒子に結合／付着していない状態）において、および／または結合形態（すなわち、粒子に結合／付着した状態）において、組成物中に含有され得る。
上記において示されるように、試料組成物または対照組成物が、核酸（とりわけＲＮＡ）および粒子を含む場合、核酸（とりわけＲＮＡ）は、遊離形態（すなわち、粒子に結合／付着していない状態）において、および／または結合形態（すなわち、粒子に結合／付着した状態）において、組成物中に含有され得る。
【0503】
したがって、一実施形態では、核酸（とりわけＲＮＡ）と粒子とを含む本開示の試料組成物または対照組成物中に含有される結合核酸（とりわけＲＮＡ）の量は、特に、核酸（とりわけＲＮＡ）の総量から遊離核酸（とりわけ遊離ＲＮＡ）の量を減算することによって、組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の総量および組成物中に含有される遊離核酸（とりわけ遊離ＲＮＡ）の量から求めることができるかまたは算出することができる。組成物中に含有される結合核酸（とりわけＲＮＡ）の量および遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量の両方は、例えば、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、および屈折率（ＲＩ）シグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルに基づく較正曲線を使用することによって、またはＵＶ範囲における（例えば、２６０ｎｍまたは２８０ｎｍにおける）核酸（とりわけＲＮＡ）の減衰係数を使用することによって、上記において指定されたように求めることができるかまたは算出することができる。
【0504】
Ｅ．表面核酸の量（例えば、表面ＲＮＡの量）
上記において示されるように、試料組成物または対照組成物が、核酸（とりわけＲＮＡ）および粒子を含む場合、核酸（とりわけＲＮＡ）は、粒子の外部表面に結合／付着され得る（「表面核酸」（例えば、「表面ＲＮＡ」））。この表面核酸（例えば、表面ＲＮＡ）は、色素、特に蛍光色素、を試料組成物または対照組成物に添加することによって検出することができ、この場合、色素は、核酸（とりわけＲＮＡ）、特に、粒子の外部表面に結合／付着した核酸、に（とりわけ特異的に）結合する（すなわち、色素は、好ましくは、粒子に封入された核酸に結合することができない）。この目的に好適な色素、特に蛍光色素は、当業者に既知であり；例えば、"The Molecular Probes Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies", 11th edt.. (2010)を参照。核酸（とりわけＲＮＡ）、特に、粒子の外部表面に結合／付着した核酸、に（特に特異的に）結合するそのような色素の特定の例としては、インターカレーティング色素、例えば、ＧｅｌＲＥＤ（５，５’－（６，２２－ジオキソ－１１，１４，１７－トリオキサ－７，２１－ジアザヘプタコサン－１，２７－ジイル）ビス（３，８－ジアミノ－６－フェニルフェナントリジン－５－イウム）ヨージド）、ＧｅｌＧｒｅｅｎ（１０，１０’－（６，２２－ジオキソ－１１，１４，１７－トリオキサ－７，２１－ジアザヘプタコサン－１，２７－ジイル）ビス（３，６－ビス（ジメチルアミノ）アクリジン－１０－イウム）ヨージド）、ベルベリン、エチジウム（例えば、臭化エチジウム）、メチレンブルー、またはプロフラビンが挙げられ、好ましくは、ＧｅｌＲＥＤである。
上記において示されるように、試料組成物または対照組成物が、核酸（とりわけＲＮＡ）および粒子を含む場合、核酸（とりわけＲＮＡ）は、粒子の外部表面に結合／付着され得る（「表面核酸」（例えば、「表面ＲＮＡ」））。この表面核酸（例えば、表面ＲＮＡ）は、色素、特に蛍光色素、を試料組成物または対照組成物に添加することによって検出することができ、この場合、色素は、核酸（とりわけＲＮＡ）、特に、粒子の外部表面に結合／付着した核酸、に（とりわけ特異的に）結合する（すなわち、色素は、好ましくは、粒子に封入された核酸に結合することができない）。この目的に好適な色素、特に蛍光色素は、当業者に既知であり；例えば、"The Molecular Probes Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies", 11th edt.. (2010)を参照。核酸（とりわけＲＮＡ）、特に、粒子の外部表面に結合／付着した核酸、に（特に特異的に）結合するそのような色素の特定の例としては、インターカレーティング色素、例えば、ＧｅｌＲＥＤ（５，５’－（６，２２－ジオキソ－１１，１４，１７－トリオキサ－７，２１－ジアザヘプタコサン－１，２７－ジイル）ビス（３，８－ジアミノ－６－フェニルフェナントリジン－５－イウム）ヨージド）、ＧｅｌＧｒｅｅｎ（１０，１０’－（６，２２－ジオキソ－１１，１４，１７－トリオキサ－７，２１－ジアザヘプタコサン－１，２７－ジイル）ビス（３，６－ビス（ジメチルアミノ）アクリジン－１０－イウム）ヨージド）、ベルベリン、エチジウム（例えば、臭化エチジウム）、メチレンブルー、またはプロフラビンが挙げられ、好ましくは、ＧｅｌＲＥＤである。
【0505】
したがって、一実施形態では、核酸（とりわけＲＮＡ）と粒子とを含む本開示の試料組成物または対照組成物中に含有される表面核酸（とりわけ表面ＲＮＡ）の量は、試料組成物または対照組成物に加えられた色素のシグナル、特に、蛍光色素、例えば、インターカレーティング色素（例えば、ＧｅｌＲＥＤ（５，５’－（６，２２－ジオキソ－１１，１４，１７－トリオキサ－７，２１－ジアザヘプタコサン－１，２７－ジイル）ビス（３，８－ジアミノ－６－フェニルフェナントリジン－５－イウム）ヨージド）、ＧｅｌＧｒｅｅｎ（１０，１０’－（６，２２－ジオキソ－１１，１４，１７－トリオキサ－７，２１－ジアザヘプタコサン－１，２７－ジイル）ビス（３，６－ビス（ジメチルアミノ）アクリジン－１０－イウム）ヨージド）、ベルベリン、エチジウム（例えば、臭化エチジウムど）、メチレンブルー、またはプロフラビン、好ましくは、ＧｅｌＲＥＤ）の蛍光シグナルから求めることができるかまたは算出することができ、この場合、色素は、核酸（とりわけＲＮＡ）、特に、粒子の外部表面に結合／付着した核酸（とりわけＲＮＡ）、に（とりわけ特異的に）結合する。好ましくは、色素の光放出（例えば、蛍光放出）は、表面核酸（とりわけ表面ＲＮＡ）に結合すること（例えば、インターカレーション）によって増強される。
【0506】
一実施形態では、この目的のために、較正曲線が使用され、その場合、前記較正曲線は、色素（例えば、蛍光色素、例えば、インターカレーティング色素、例えば、ＧｅｌＲＥＤ、ＧｅｌＧｒｅｅｎ、ベルベリン、エチジウム（例えば、臭化エチジウム）、メチレンブルー、またはプロフラビン、好ましくはＧｅｌＲＥＤ）を含有するいくつかの対照組成物、ならびに対照核酸（とりわけＲＮＡ）の異なる既知の量および色素からの光放出シグナル（例えば、蛍光色素からの蛍光シグナル）に基づいて確立される。
【0507】
Ｆ．封入核酸の量（例えば、封入ＲＮＡの量）
上記において示されるように、試料組成物または対照組成物が、核酸（とりわけＲＮＡ）および粒子を含む場合、核酸（とりわけＲＮＡ）は、結合形態（すなわち、粒子に結合／付着した状態）において、組成物に含まれ得、その場合、結合した核酸（とりわけＲＮＡ）は、粒子の外部表面に結合／付着した核酸（とりわけＲＮＡ）（すなわち、表面核酸（例えば、表面ＲＮＡ））および粒子内に含有／封入された核酸（とりわけＲＮＡ）（すなわち、封入核酸（例えば、封入ＲＮＡ））で構成される。
上記において示されるように、試料組成物または対照組成物が、核酸（とりわけＲＮＡ）および粒子を含む場合、核酸（とりわけＲＮＡ）は、結合形態（すなわち、粒子に結合／付着した状態）において、組成物に含まれ得、その場合、結合した核酸（とりわけＲＮＡ）は、粒子の外部表面に結合／付着した核酸（とりわけＲＮＡ）（すなわち、表面核酸（例えば、表面ＲＮＡ））および粒子内に含有／封入された核酸（とりわけＲＮＡ）（すなわち、封入核酸（例えば、封入ＲＮＡ））で構成される。
【0508】
したがって、一実施形態では、核酸（とりわけＲＮＡ）と粒子とを含む本開示の試料組成物または対照組成物中に含有される封入核酸（とりわけ封入ＲＮＡ）の量は、特に、結合した核酸（とりわけ結合ＲＮＡ）の量から表面核酸（とりわけ表面ＲＮＡ）の量を減算することによって、組成物中に含有される結合した核酸（とりわけ結合ＲＮＡ）の量および組成物中に含有される表面核酸（とりわけ表面ＲＮＡ）の量から求めることができるかまたは算出することができる。組成物中に含有される結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量および表面核酸（とりわけＲＮＡ）の量の両方は、上記において指定されたように求めることができるかまたは算出することができる。例えば、組成物中に含有される結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量は、上記において指定されたように、組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の総量および組成物中に含有される遊離核酸（とりわけ遊離ＲＮＡ）の量から求めることができるかまたは算出することができる（特に、核酸（とりわけＲＮＡ）の総量から遊離核酸（とりわけ遊離ＲＮＡ）の量を減算することによって、この場合、組成物中に含有される結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量および遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量の両方は、例えば、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、および屈折率（ＲＩ）シグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルに基づく較正曲線を使用することによって、またはＵＶ範囲における（例えば、２６０ｎｍまたは２８０ｎｍにおける）核酸（とりわけＲＮＡ）の減衰係数を使用することによって、上記において指定されたように求めることができるかまたは算出することができる）。その上、組成物中に含有される表面核酸（とりわけＲＮＡ）の量は、例えば、組成物に加えられた色素の光放出シグナル（例えば、蛍光色素、例えば、インターカレーティング色素（例えば、ＧｅｌＲＥＤ（５，５’－（６，２２－ジオキソ－１１，１４，１７－トリオキサ－７，２１－ジアザヘプタコサン－１，２７－ジイル）ビス（３，８－ジアミノ－６－フェニルフェナントリジン－５－イウム）ヨージド）、ＧｅｌＧｒｅｅｎ（１０，１０’－（６，２２－ジオキソ－１１，１４，１７－トリオキサ－７，２１－ジアザヘプタコサン－１，２７－ジイル）ビス（３，６－ビス（ジメチルアミノ）アクリジン－１０－イウム）ヨージド）、ベルベリン、エチジウム（例えば、臭化エチジウム）、メチレンブルー、またはプロフラビン、好ましくはＧｅｌＲＥＤ）、の蛍光シグナルから、上記において説明したように求めることができるかまたは算出することができ、この場合、色素は、粒子の外部表面に結合／付着している核酸（とりわけＲＮＡ）に（とりわけ特異的に）結合する。
【0509】
Ｇ．アクセス可能な核酸の量（例えば、アクセス可能なＲＮＡの量）
上記において示されるように（例えば、図２１を参照）、試料組成物または対照組成物が、核酸（とりわけＲＮＡ）および粒子を含む場合、アクセス可能な核酸（とりわけＲＮＡ）は、表面核酸（とりわけ表面ＲＮＡ）と遊離核酸（とりわけ遊離ＲＮＡ）との合計である。あるいは、アクセス可能な核酸（とりわけＲＮＡ）は、核酸の総量（とりわけＲＮＡの総量）から封入核酸（とりわけ封入ＲＮＡ）の量を減算することによって、核酸の総量（とりわけＲＮＡの総量）および封入核酸（とりわけ封入ＲＮＡ）から求められ得るかまたは算出され得る。
上記において示されるように（例えば、図２１を参照）、試料組成物または対照組成物が、核酸（とりわけＲＮＡ）および粒子を含む場合、アクセス可能な核酸（とりわけＲＮＡ）は、表面核酸（とりわけ表面ＲＮＡ）と遊離核酸（とりわけ遊離ＲＮＡ）との合計である。あるいは、アクセス可能な核酸（とりわけＲＮＡ）は、核酸の総量（とりわけＲＮＡの総量）から封入核酸（とりわけ封入ＲＮＡ）の量を減算することによって、核酸の総量（とりわけＲＮＡの総量）および封入核酸（とりわけ封入ＲＮＡ）から求められ得るかまたは算出され得る。
【0510】
したがって、一実施形態では、核酸（とりわけＲＮＡ）と粒子とを含む本開示の試料組成物または対照組成物中に含有されるアクセス可能な核酸の量（とりわけアクセス可能なＲＮＡの量）は、特に、表面核酸（とりわけ表面ＲＮＡ）の量および表面核酸（とりわけ表面ＲＮＡ）の量を合計することによって、組成物中に含有される表面核酸（とりわけ表面ＲＮＡ）の量および組成物中に含有される遊離核酸（とりわけ遊離ＲＮＡ）の量から求めることができるかまたは算出することができる。代替の実施形態では、核酸（とりわけＲＮＡ）と粒子とを含む本開示の試料組成物または対照組成物中に含有されるアクセス可能な核酸の量（とりわけアクセス可能なＲＮＡの量）は、特に、核酸の総量（とりわけＲＮＡの総量）から封入核酸（とりわけ封入ＲＮＡ）の量を減算することによって、組成物中に含有される核酸の総量（とりわけＲＮＡの総量）および組成物中に含有される封入核酸（とりわけ封入ＲＮＡ）から求めることができるかまたは算出することができる。組成物中に含有される核酸の総量（とりわけＲＮＡの総量）、組成物中に含有される遊離核酸（とりわけ遊離ＲＮＡ）の量、組成物中に含有される表面核酸（とりわけ表面ＲＮＡ）の量、および組成物中に含有される封入核酸（とりわけ封入ＲＮＡ）は、それぞれＢ．、Ｃ．、Ｅ．、およびＦ．の下において、上記において指定されたように求めることができるかまたは算出することができる。
【0511】
Ｈ．核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子のサイズ、サイズ分布、および定量的サイズ分布
試料組成物または対照組成物が、核酸（とりわけＲＮＡ）および粒子を含む場合、粒子のサイズおよび前記粒子の分布は、試料組成物または対照組成物または少なくともその一部をフィールドフローフラクショネーションに供することによって得られる１つまたは複数の試料画分または対照画分の光散乱（ＬＳ）シグナルから求めることができるかまたは算出することができる。一実施形態では、多角度において測定された散乱光の強度が使用され、この場合、各切片は、溶出する粒子によって散乱された光の角度依存性を説明する曲線に対応する。曲線を適切なフォーマリズム（例えば、ベリープロット、ジムプロット、またはデバイプロット）によって適合させ、ゼロ角度に外挿することによって、回転半径（Ｒｇ）値および／または流体力学半径（Ｒｈ）値を得ることができ、それらから、溶出した粒子のサイズを求めることができるかまたは算出することができる。別の実施形態では、溶出した粒子のサイズを求めるためかまたは算出するために、異なる粒子サイズ標準の保持時間に基づく外部較正および回帰分析を利用することができる。第３の実施形態では、溶出した粒子のサイズは、溶出した種の保持時間からの直接算出によって（すなわち、較正なしに）求められる。分取チャネルの寸法が既知であり、ならびに一定のクロスフローが存在する場合、保持比は、測定されたボイド時間と保持時間との比率から実験的に求めることができる。ＵＶシグナル、蛍光シグナル、および屈折率（ＲＩ）シグナルからなる群から選択されるシグナル（それらから、核酸（とりわけＲＮＡ）の量を、本明細書において説明されるように求めることができ、ならびに核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子の量も求めることができる）は、粒径分布および／または定量的粒径分布の決定または算出のために使用することができ、それにより、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択されるシグナルを、特定のサイズを有する粒子の量へと直接的に変換することができる。粒径分布および／または定量的粒径分布は、それぞれそれらのサイズの関数としての、粒子の数、粒子のモル量、または粒子の質量として与えることができる。
試料組成物または対照組成物が、核酸（とりわけＲＮＡ）および粒子を含む場合、粒子のサイズおよび前記粒子の分布は、試料組成物または対照組成物または少なくともその一部をフィールドフローフラクショネーションに供することによって得られる１つまたは複数の試料画分または対照画分の光散乱（ＬＳ）シグナルから求めることができるかまたは算出することができる。一実施形態では、多角度において測定された散乱光の強度が使用され、この場合、各切片は、溶出する粒子によって散乱された光の角度依存性を説明する曲線に対応する。曲線を適切なフォーマリズム（例えば、ベリープロット、ジムプロット、またはデバイプロット）によって適合させ、ゼロ角度に外挿することによって、回転半径（Ｒｇ）値および／または流体力学半径（Ｒｈ）値を得ることができ、それらから、溶出した粒子のサイズを求めることができるかまたは算出することができる。別の実施形態では、溶出した粒子のサイズを求めるためかまたは算出するために、異なる粒子サイズ標準の保持時間に基づく外部較正および回帰分析を利用することができる。第３の実施形態では、溶出した粒子のサイズは、溶出した種の保持時間からの直接算出によって（すなわち、較正なしに）求められる。分取チャネルの寸法が既知であり、ならびに一定のクロスフローが存在する場合、保持比は、測定されたボイド時間と保持時間との比率から実験的に求めることができる。ＵＶシグナル、蛍光シグナル、および屈折率（ＲＩ）シグナルからなる群から選択されるシグナル（それらから、核酸（とりわけＲＮＡ）の量を、本明細書において説明されるように求めることができ、ならびに核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子の量も求めることができる）は、粒径分布および／または定量的粒径分布の決定または算出のために使用することができ、それにより、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択されるシグナルを、特定のサイズを有する粒子の量へと直接的に変換することができる。粒径分布および／または定量的粒径分布は、それぞれそれらのサイズの関数としての、粒子の数、粒子のモル量、または粒子の質量として与えることができる。
【0512】
図１１は、試料組成物をＡＦ４－ＵＶ－ＭＡＬＳに供することから得られたフラクトグラム（図１１Ａ）に含まれるデータのサイズ分布（図１１Ｃ、実線）への変換およびＲＮＡ含有粒子の定量的サイズ分布（図１１Ｃ、破線）を示している。回転半径（Ｒｇ）値（図１１Ａおよび１１Ｂに黒点として示される）は、Ｂｅｒｒｙプロットを使用して粒子ピークのＭＡＬＳシグナル（溶出時間：２６～５５分、図１１Ａを参照）から求めた。実験的に求めたＲｇ値は、Ｒｇ値を多項式関数に適合させ（図１１Ｂを参照、薄灰色の線）、多項式適合に基づいてＲｇ値を再算出し、ならびに再算出されたＲｇ値を保持時間の関数としてプロットすることによって平滑化した。ＵＶシグナルを再算出されたＲｇ値の関数としてプロットし、それにより、サイズ分布曲線を作製した（図１１Ｃ、実線）。ＵＶシグナルを累積重量分率へと変換し、再算出されたＲｇ値に対して累積重量分率をプロットすることにより、結果として、定量的サイズ分布曲線を得た（図１１Ｃ、破線）。定量的サイズ分布曲線から、特性値（特に、Ｄ１０、Ｄ５０、およびＤ９０）を求めた。
【0513】
したがって、一実施形態では、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子のサイズは、ＬＳシグナルに基づいて、それらから回転半径（Ｒｇ）値を求めるかまたは算出することによって、求められるかまたは算出される。好ましくは、Ｒｇ値は、少なくとも１つの粒子ピークに対して求められるかまたは算出される。フィールドフローフラクショネーションにより、結果として、２つ以上の粒子ピークが生じる場合、Ｒｇ値は、各粒子ピークに対して別々に求められるかまたは算出されることが好ましい。
【0514】
一実施形態では、実験的に求められるかまたは算出されたＲｇ値は、例えば、実験的に求められるかまたは算出されたＲｇ値を多項式関数（例えば、ｆ（ｔ）＝ａ＋ｂ１ｘ＋ｂ２ｘ２＋ｂ３ｘ３＋ｂ４ｘ４）または線形関数（例えば、ｆ（ｔ）＝ａ＋ａ１ｘ）に適合させ、多項式適合または線形適合に基づいてＲｇ値を再算出し、ならびに適宜、再算出されたＲｇ値を保持時間の関数としてプロットすることによって平滑化される。フィールドフローフラクショネーションにより、結果として、２つ以上の粒子ピークが生じる場合、実験的に求められるかまたは算出されたＲｇ値は、各粒子ピークに対して別々に平滑化される（例えば、上記において指定されたように再算出される）ことが好ましい。
【0515】
ＬＳシグナルは、任意の好適な検出器によって得られ得、好ましくは、動的光散乱（ＤＬＳ）シグナルおよび／または静的光散乱（ＳＬＳ）シグナルであり、例えば、多角度光散乱（ＭＡＬＳ）シグナルである。好ましいＭＡＬＳシグナルは、多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）シグナルである。
【0516】
一実施形態では、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子のサイズ分布は、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択されるシグナル（好ましくはＵＶシグナル）を（適宜再算出された）Ｒｇ値に対してプロットすることによって求められるかまたは算出される。したがって、好ましい実施形態では、ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布は、再算出されたＲｇ値に対してＵＶシグナルをプロットすることによって求められるかまたは算出される。核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子のサイズ分布は、それぞれそれらのサイズの関数としての、粒子の数、粒子のモル量、または粒子の質量として与えられ得る。フィールドフローフラクショネーションにより、結果として、２つ以上の粒子ピークが生じる場合、サイズ分布は、各粒子ピークに対して別々に求められるかまたは算出される。
【0517】
一実施形態では、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子の定量的サイズ分布は、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択されるシグナル（好ましくはＵＶシグナル）を累積重量分率へと変換し、（適宜再算出された）Ｒｇ値に対して累積重量分率をプロットすることによって、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子のサイズ分布から求められるかまたは算出される。したがって、好ましい実施形態では、ＲＮＡ含有粒子の定量的サイズ分布は、ＵＶシグナルを累積重量分率へと変換し、再算出されたＲｇ値に対して累積重量分率をプロットすることによって、ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布から求められるかまたは算出される。核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子の定量的サイズ分布は、それぞれそれらのサイズの関数としての、粒子の数、粒子のモル量、または粒子の質量として与えられ得る。フィールドフローフラクショネーションにより、結果として、２つ以上の粒子ピークが生じる場合、定量的サイズ分布が、各粒子ピークに対して別々に求められるかまたは算出されることは好ましい。
【0518】
一実施形態では、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子の定量的サイズ分布は、Ｄ１０値、Ｄ５０値、Ｄ９０値、Ｄ９５値、Ｄ９９値、および／またはＤ１００値（特に、Ｒｇ値に基づいて）を含む。一実施形態では、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子の定量的サイズ分布は、Ｄ１０値、Ｄ５０値、および／またはＤ９０値（特に、Ｒｇ値に基づいて）を含む。フィールドフローフラクショネーションにより、結果として、２つ以上の粒子ピークが生じる場合、Ｄ１０値、Ｄ５０値、Ｄ９０値、Ｄ９５値、Ｄ９９値、および／またはＤ１００値（好ましくはＤ１０値、Ｄ５０値、および／またはＤ９０値）（特に、Ｒｇ値に基づいて）が、各粒子ピークに対して別々に求められるかまたは算出されることは好ましい。
【0519】
図２４は、試料組成物をＡＦ４－ＵＶ－ＭＡＬＳに供することから得られたフラクトグラムに含まれるデータ（図２３Ａ）の、ＲＮＡに含有する粒子の定量的サイズ分布の様々なタイプ：（ａ）累積重量分率（図２４Ｂ、実線）；（ｂ）粒子画分あたりのＲＮＡ質量（Δｔ＝１分）（図２４Ｃ）；または（ｃ）粒子画分あたりのＲＮＡコピー数または粒子数（Δｔ＝１分）（図２４Ｄ）、への変換を示している。回転半径（Ｒｇ）値（図２４Ａに太い線で示される）は、Ｂｅｒｒｙプロットを使用して粒子ピークのＭＡＬＳシグナル（溶出時間：２４～５５分、図２４Ａを参照）から求めた。実験的に求めたＲｇ値は、Ｒｇ値を多項式関数へと適合させ、多項式適合に基づいてＲｇ値を再算出し、ならびに再算出されたＲｇ値を保持時間の関数としてプロットすることによって平滑化した。ＵＶシグナルを累積重量分率へと変換し、ならびに再算出されたＲｇ値に対して累積重量分率をプロットすることにより、結果として、図２４Ｂに実線として示される、定量的サイズ分布曲線を得た。再算出されたＲｇ値に基づいて粒子ピークを細分化し（Δｔ＝１分）（その結果、３１のＲｇ画分を作製する）、各Ｒｇ画分に対してＵＶシグナルからＲＮＡ質量を算出し、Ｒｇ画分に対してＲＮＡ質量値をプロットすることにより、結果として、Ｒｇ画分あたりのＲＮＡ質量を示す特定の定量的サイズ分布を得た；図２４Ｃを参照。その上、ＲＮＡ質量値をＲＮＡコピー数に変換し、Ｒｇ画分に対して後者をプロットすることにより、結果として、Ｒｇ画分あたりのＲＮＡコピー数を示す特定の定量的サイズ分布を得た；図２４Ｄのバーを参照。加えて、ＵＶシグナルおよびＭＡＬＳシグナルを粒子の数に変換し、Ｒｇ画分に対して後者をプロットすることにより、結果として、Ｒｇ画分あたりの粒子数を示す特定の定量的サイズ分布を得た；図２４Ｄの点線の曲線を参照。上記の算出および変換のために、以下の方程式および情報を使用することができる：
・粒子の体積：
・粒子の体積：
【0520】
【数14】
【0521】
【数15】
－ 使用されるＲＮＡの長さ：２０００ヌクレオチド
－ 総合密度：１ｇ／ｍＬ＝１ｇ／ｃｍ３＝１０－２１ｇ／ｎｍ３
－ ヌクレオチド（３３０Ｄａ）あたりのモル質量：３３０ｇ／ｍｏｌ
－ モル質量ＲＮＡリポプレックス／ヌクレオチド（ヌクレオチド＋ＤＯＴＭＡ＋１／２ＤＯＰＥ）：１３７０Ｄａ
－ モル質量ＲＮＡリポプレックス／コピー：１３７０×２０００＝２．７４×１０６Ｄａ ｇ／ｍｏｌ
－ 体積ＲＮＡリポプレックス／コピー：２．７４×１０６×１０２１／６×１０２３＝４．６×１０３ｎｍ３
【0522】
したがって、一実施形態では、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子のサイズは、それらから回転半径（Ｒｇ）値を求めるかまたは算出することによって、ＬＳシグナルに基づいて求められるかまたは算出され、ならびにＲｇ値は、少なくとも２つ（例えば、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０）のＲｇ画分および／または最高で１００まで（例えば、最高で９０まで、最高で８０まで、最高で７０まで、最高で６０まで、最高で５０まで、最高で４０まで、最高で３０まで、または最高で２０まで）のＲｇ画分に細分化され、この場合、各Ｒｇ画分は、あるＲｇ範囲（好ましくは、任意の他のＲｇ画分のＲｇ範囲と重ならない）を有する。好ましくは、Ｒｇ値およびＲｇ画分は、少なくとも１つの粒子ピークに対して求められるかまたは算出される。フィールドフローフラクショネーションにより、結果として、２つ以上の粒子ピークが生じる場合、Ｒｇ値およびＲｇ画分は、各粒子ピークに対して別々に求められるかまたは算出される。
【0523】
一実施形態では、実験的に求められるかまたは算出されたＲｇ値は、Ｒｇ画分へと細分化される前に、例えば、実験的に求められるかまたは算出されたＲｇ値を多項式関数（例えば、ｆ（ｔ）＝ａ＋ｂ１ｘ＋ｂ２ｘ２＋ｂ３ｘ３＋ｂ４ｘ４）または線形関数（例えば、ｆ（ｔ）＝ａ＋ａ１ｘ）に適合させ、多項式適合または線形適合に基づいてＲｇ値を再算出し、ならびに適宜、再算出されたＲｇ値を保持時間の関数としてプロットするによって平滑化される。フィールドフローフラクショネーションにより、結果として、２つ以上の粒子ピークが生じる場合、実験的に求められるかまたは算出されたＲｇ値は、各粒子ピークに対して別々に平滑化される（例えば、上記において指定されたように再算出される）ことは好ましい。
【0524】
ＬＳシグナルは、任意の好適な検出器によって得られ得、ならびに好ましくは、動的光散乱（ＤＬＳ）シグナルおよび／または静的光散乱（ＳＬＳ）シグナル、例えば、多角度光散乱（ＭＡＬＳ）シグナルである。好ましいＭＡＬＳシグナルは、多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）シグナルである。
【0525】
一実施形態では、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子のサイズ分布は、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択されるシグナル（好ましくはＵＶシグナル）を、Ｒｇ画分（（適宜、再算出された）Ｒｇ値を細分化することによって得られる）に対してプロットすることによって求められるかまたは算出される。したがって、好ましい実施形態では、ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布は、ＵＶシグナルを、再算出されたＲｇ値を細分化することによって得られるＲｇ画分に対してプロットすることによって求められるかまたは算出される。核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子のサイズ分布は、それぞれＲｇ画分の関数として、核酸質量（とりわけＲＮＡ質量）、核酸コピー数（とりわけＲＮＡコピー数）、または粒子数として与えられ得る。フィールドフローフラクショネーションにより、結果として、２つ以上の粒子ピークが生じる場合、サイズ分布が、各粒子ピークに対して別々に求められるかまたは算出されることは好ましい。
【0526】
一実施形態では、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子の定量的サイズ分布は、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択されるシグナル（好ましくはＵＶシグナル）を累積重量分率へと変換し、累積重量分率をＲｇ画分（（適宜、再算出された）Ｒｇ値を細分化することによって得られる）に対してプロットすることによって、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子のサイズ分布から求められるかまたは算出される。したがって、好ましい実施形態では、ＲＮＡ含有粒子の定量的サイズ分布は、ＵＶシグナルを累積重量分率へと変換し、累積重量分率を、Ｒｇ画分（再算出されたＲｇ値を細分化することによって得られる）に対してプロットすることによって、ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布から求められるかまたは算出される。核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子の定量的サイズ分布は、Ｒｇ画分あたりの核酸質量（とりわけＲＮＡ質量）、核酸コピー数（とりわけＲＮＡコピー数）、またはＲｇ画分あたりの粒子数として与えられ得る。フィールドフローフラクショネーションにより、結果として、２つ以上の粒子ピークが生じる場合、定量的サイズ分布が、各粒子ピークに対して別々に求められるかまたは算出されることは好ましい。
【0527】
上記の変換アプローチ（例えば、図１１および図２４を参照）は、Ｒｇ値を使用することによって例示されている。しかしながら、Ｒｈ値を使用する場合（図１１または図２４には示されていない）も、同じアプローチを利用することができる。例えば、実験的に求められたＲｈ値は、Ｒｈ値を多項式関数に適合させ、多項式適合に基づいてＲｈ値を再算出し、ならびに再算出されたＲｈ値を保持時間の関数としてプロットすることによって平滑化される。適宜、Ｒｈ値は、少なくとも２つ（例えば、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０）のＲｈ画分および／または最高で１００まで（例えば、最高で９０まで、最高で８０まで、最高で７０まで、最高で６０まで、最高で５０まで、最高で４０まで、最高で３０まで、または最高で２０まで）のＲｈ画分に細分化され、その場合、各Ｒｈ画分は、あるＲｈ範囲（好ましくは、任意の他のＲｈ画分のＲｈ範囲と重ならない）を有する。ＵＶシグナルを再算出されたＲｈ値（または、再計算されたＲｈ値を細分化することによって得られるＲｈ画分）の関数としてプロットし、それにより、サイズ分布曲線を作製する（Ｒｈ値またはＲｈ画分に基づいて）。ＵＶシグナルを累積重量分率へと変換し、再算出されたＲｈ値に対して累積重量分率をプロットすることにより、結果として、定量的サイズ分布曲線を得る。定量的サイズ分布曲線から、Ｒｈ値に基づいて、特性値（特に、Ｄ１０、Ｄ５０、およびＤ９０）を求めることができる。あるいは、ＵＶシグナルを累積重量分率へと変換し、Ｒｈ画分に対して累積重量分率をプロットすることにより、結果として、代替の定量的サイズ分布曲線を得る。代替の定量的サイズ分布曲線から、特性パラメーター、特に、Ｒｈ画分あたりの核酸質量（とりわけＲＮＡ質量）、核酸コピー数（とりわけＲＮＡコピー数）、またはＲｈ画分あたりの粒子数を求めることができる。
【0528】
したがって、一部の実施形態では、特に、本開示の方法および／または使用によって求められるかまたは分析される１つまたは複数のパラメーターが、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布を含むような実施形態では、方法および／または使用は、フィールドフローフラクショネーションから得られる１つまたは複数の試料画分のうちの少なくとも１つの動的光散乱（ＤＬＳ）シグナルを測定することを含み得る。流体力学半径は、任意の従来の方法、例えば、ストークス－アインシュタイン方程式を使用することによって、ＤＬＳシグナルから求められ得るかまたは算出され得る。好ましくは、Ｒｈ値は、少なくとも１つの粒子ピークに対して求められるかまたは算出される。フィールドフローフラクショネーションにより、結果として、２つ以上の粒子ピークが生じる場合、Ｒｈ値が、各粒子ピークに対して別々に求められるかまたは算出されることは好ましい。
【0529】
適宜、Ｒｈ値は、少なくとも２つ（例えば、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０）のＲｈ画分および／または最高で１００まで（例えば、最高で９０まで、最高で８０まで、最高で７０まで、最高で６０まで、最高で５０まで、最高で４０まで、最高で３０まで、または最高で２０まで）のＲｈ画分に細分化され、その場合、各Ｒｈ画分は、あるＲｈ範囲（好ましくは、任意の他のＲｈ画分のＲｈ範囲と重ならない）を有する。
【0530】
一実施形態では、実験的に求められるかまたは算出されたＲｈ値は、例えば、実験的に求められるかまたは算出されたＲｈ値を多項式関数（例えば、ｆ（ｔ）＝ａ＋ｂ１ｘ＋ｂ２ｘ２＋ｂ３ｘ３＋ｂ４ｘ４）または線形関数（例えば、ｆ（ｔ）＝ａ＋ａ１ｘ）に適合させ、多項式適合または線形適合に基づいてＲｈ値を再算出し、ならびに適宜、再算出されたＲｈ値を保持時間の関数としてプロットすることによって、平滑化される（好ましくは、それらがＲｇ画分へと細分化される前に）。フィールドフローフラクショネーションにより、結果として、２つ以上の粒子ピークが生じる場合、実験的に求められるかまたは算出されたＲｈ値が、各粒子ピークに対して別々に平滑化される（例えば、上記において指定されたように再算出される）ことは好ましい。
【0531】
一実施形態では、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子のサイズ分布は、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択されるシグナル（好ましくはＵＶシグナル）を、（適宜再算出された）Ｒｈｇ値（または、（適宜再算出された）Ｒｈ値を細分化することによって得られるＲｈ画分）に対してプロットすることによって求められるかまたは算出される。したがって、好ましい実施形態では、ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布は、再算出されたＲｈ値（または、再算出されたＲｈ値を細分化することによって得られるＲｈ画分）に対してＵＶシグナルをプロットすることによって求められるかまたは算出される。核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子のサイズ分布は、それぞれそれらのサイズの関数として（例えば、Ｒｈ値または再算出されたＲｈ値を細分化することによって得られるＲｈ画分の関数として）の、粒子の数、粒子のモル量、または粒子の質量として与えられ得る。フィールドフローフラクショネーションにより、結果として、２つ以上の粒子ピークが生じる場合、サイズ分布が、各粒子ピークに対して別々に求められるかまたは算出されることは好ましい。
【0532】
一実施形態では、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子の定量的サイズ分布は、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択されるシグナル（好ましくはＵＶシグナル）を累積重量分率へと変換し、累積重量分率を、（適宜再算出された）Ｒｈ値（または、（適宜再算出された）Ｒｈ値を細分化することによって得られるＲｈ画分）に対してプロットすることによって、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子のサイズ分布から求められるかまたは算出される。したがって、好ましい実施形態では、ＲＮＡ含有粒子の定量的サイズ分布は、ＵＶシグナルを累積重量分率へと変換し、累積重量分率を、再算出されたＲｈ値（または、再算出されたＲｈ値を細分化することによって得られるＲｈ画分）に対してプロットするによって、ＲＮＡ含有粒子のサイズ分布から求められるかまたは算出される。核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子の定量的サイズ分布は、それぞれそれらのサイズの関数としての、粒子の数、粒子のモル量、または粒子の質量として与えられ得る。あるいは、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子の定量的サイズ分布は、Ｒｈ画分あたりの核酸質量（とりわけＲＮＡ質量）、核酸コピー数（とりわけＲＮＡコピー数）、またはＲｈ画分あたりの粒子数として与えられ得る。フィールドフローフラクショネーションにより、結果として、２つ以上の粒子ピークが生じる場合、定量的サイズ分布が、各粒子ピークに対して別々に求められるかまたは算出されることは好ましい。
【0533】
一実施形態では、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子の定量的サイズ分布は、Ｄ１０値、Ｄ５０値、Ｄ９０値、Ｄ９５値、Ｄ９９値、および／またはＤ１００値（Ｒｈ値に基づいて）を含む。一実施形態では、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子の定量的サイズ分布は、Ｄ１０値、Ｄ５０値、および／またはＤ９０値（Ｒｈ値に基づいて）を含む。フィールドフローフラクショネーションにより、結果として、２つ以上の粒子ピークが生じる場合、Ｄ１０値、Ｄ５０値、Ｄ９０値、Ｄ９５値、Ｄ９９値、および／またはＤ１００値（好ましくはＤ１０値、Ｄ５０値、および／またはＤ９０値）（Ｒｈ値に基づいて）が、各粒子ピークに対して別々に求められるかまたは算出されることは好ましい。
【0534】
一部の実施形態、特に、本開示の方法および／または使用によって求められるかまたは分析される１つまたは複数のパラメーターが、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布を含むような実施形態では、核酸（例えば、ＲＮＡ）を含有する粒子のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布は、上記において説明されるような核酸（例えば、ＲＮＡ）を含有する粒子のＲｇ値に基づいて算出され、ならびに上記において説明されるような核酸（例えば、ＲＮＡ）を含有する粒子のＲｈ値に基づいて別々に算出される（すなわち、これらの実施形態は、結果として、核酸（例えば、ＲＮＡ）を含有する粒子のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布に対して、２つのデータセットを生じ、一方は、Ｒｇ値に基づき、もう一方は、Ｒｈ値に基づく）。
【0535】
一部の実施形態、特に、本開示の方法および／または使用によって求められるかまたは分析される１つまたは複数のパラメーターが、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布を含むような実施形態では、Ｒｇ値は、上記において説明されるような少なくとも２つのＲｇ画分に細分化され、ならびにＲｈ値は、上記において説明されるような少なくとも２つのＲｈ画分に細分化され、核酸（例えば、ＲＮＡ）を含有する粒子のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布は、上記において説明されるような核酸（例えば、ＲＮＡ）を含む粒子のＲｇ画分に基づいて算出され、ならびに上記において説明されるような核酸（例えば、ＲＮＡ）を含有する粒子のＲｈ画分に基づいて別々に算出される（すなわち、これらの実施形態は、結果として、核酸（例えば、ＲＮＡ）を含有する粒子のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布に対して、２つのデータセットを生じ、一方は、Ｒｇ画分に基づき、もう一方は、Ｒｈ画分に基づく）。
【0536】
Ｉ．核酸（とりわけＲＮＡ）のサイズ、サイズ分布、および定量的サイズ分布
核酸（とりわけＲＮＡ）が、遊離形態（すなわち、核酸（とりわけＲＮＡ）および粒子を含む試料組成物または対照組成物中に含有される粒子に結合または付着していない）または非製剤化形態（すなわち、本明細書において指定されるような粒子を含まない組成物、例えば、リポソームを構成する構成要素（特に、陽イオン性両親媒性脂質および／または陽イオン性両親媒性ポリマー類）および／またはウイルス様粒子を含まない組成物）の場合、核酸（とりわけＲＮＡ）のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布（特に、核酸（とりわけＲＮＡ）の回転半径（Ｒｇ）および／または核酸（とりわけＲＮＡ）の流体力学半径（Ｒｈ）に基づいて）も、求めるかまたは分析することができる。
核酸（とりわけＲＮＡ）が、遊離形態（すなわち、核酸（とりわけＲＮＡ）および粒子を含む試料組成物または対照組成物中に含有される粒子に結合または付着していない）または非製剤化形態（すなわち、本明細書において指定されるような粒子を含まない組成物、例えば、リポソームを構成する構成要素（特に、陽イオン性両親媒性脂質および／または陽イオン性両親媒性ポリマー類）および／またはウイルス様粒子を含まない組成物）の場合、核酸（とりわけＲＮＡ）のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布（特に、核酸（とりわけＲＮＡ）の回転半径（Ｒｇ）および／または核酸（とりわけＲＮＡ）の流体力学半径（Ｒｈ）に基づいて）も、求めるかまたは分析することができる。
【0537】
したがって、一実施形態では、特に、試料組成物または対照組成物が、遊離形態または非製剤化形態において核酸（とりわけＲＮＡ）を含む場合、本開示の方法および／または使用によって分析されるかまたは求められる追加のパラメーターは、核酸（とりわけＲＮＡ）のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布（特に、核酸（とりわけＲＮＡ）のＲｇ値および／またはＲｈ値を核酸（とりわけＲＮＡ）のＲｇ画分および／またはＲｈ画分に細分化した後の、核酸（とりわけＲＮＡ）のＲｇ値および／またはＲｈ値あるいは核酸（とりわけＲＮＡ）のＲｇ画分および／またはＲｈ画分に基づく）を含む。概して、核酸（とりわけＲＮＡ）のサイズ分布および／または定量的サイズ分布は、それぞれそれらのサイズの関数としての、核酸（とりわけＲＮＡ）分子の数、核酸（とりわけＲＮＡ）のモル量、または核酸（とりわけＲＮＡ）の質量として与えることができる。あるいは、核酸（とりわけＲＮＡ）のサイズ分布および／または定量的サイズ分布は、Ｒｇ画分および／またはＲｈ画分あたりの核酸質量（とりわけＲＮＡ質量）あるいはＲｇ画分および／またはＲｈ画分あたりの核酸コピー数（とりわけＲＮＡコピー数）として与えることができる。
【0538】
これらのパラメーターは、核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子に対して、上記において指定されたように求めることができるかまたは算出することができる。
【0539】
例えば、一実施形態では、核酸（とりわけＲＮＡ）のサイズは、ＬＳシグナルに基づいて、それらから回転半径（Ｒｇ）値および／または流体力学半径（Ｒｈ）値を求めるかまたは算出することによって、求められるかまたは算出される。好ましくは、Ｒｇ（またはＲｈ）値は、少なくとも１つの核酸（とりわけＲＮＡ）ピークに対して求められるかまたは算出される。フィールドフローフラクショネーションにより、結果として、２つ以上の核酸（とりわけＲＮＡ）ピークが生じる場合、Ｒｇ（またはＲｈ）値が、別々に各核酸（とりわけＲＮＡ）ピークに対して求められるかまたは算出されることは好ましい。
【0540】
適宜、Ｒｇ（またはＲｈ）値は、少なくとも２つ（例えば、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０）のＲｇ（またはＲｈ）画分および／または最高で１００まで（例えば、最高で９０まで、最高で８０まで、最高で７０まで、最高で６０まで、最高で５０まで、最高で４０まで、最高で３０まで、または最高で２０まで）のＲｇ（またはＲｈ）画分に細分化され、その場合、各Ｒｇ（またはＲｈ）画分は、あるＲｇ（またはＲｈ）範囲（好ましくは、任意の他のＲｇ（またはＲｈ）画分のＲｇ（またはＲｈ）範囲と重ならない）を有する。
【0541】
一実施形態では、実験的に求められるかまたは算出されたＲｇ（またはＲｈ）値は、例えば、実験的に求められるかまたは算出されたＲｇ（またはＲｈ）値を多項式関数（例えば、ｆ（ｔ）＝ａ＋ｂ１ｘ＋ｂ２ｘ２＋ｂ３ｘ３＋ｂ４ｘ４）または線形関数（例えば、ｆ（ｔ）＝ａ＋ａ１ｘ）に適合させ、多項式適合または線形適合に基づいてＲｇ（またはＲｈ）値を再算出し、ならびに適宜、再算出されたＲｇ（またはＲｈ）値を保持時間の関数としてプロットすることによって、平滑化される（好ましくは、それらがＲｇ（またはＲｈ）画分へと細分化される前に）。フィールドフローフラクショネーションにより、結果として、２つ以上の核酸（とりわけＲＮＡ）ピークが生じる場合、実験的に求められるかまたは算出されたＲｇ（またはＲｈ）値が、別々に各核酸（とりわけＲＮＡ）ピークに対して平滑化される（例えば、上記において指定されたように再算出される）ことは好ましい。
【0542】
ＬＳシグナルは、任意の好適な検出器によって得られ得、ならびに好ましくは、動的光散乱（ＤＬＳ）シグナルおよび／または静的光散乱（ＳＬＳ）シグナル例えば、多角度光散乱（ＭＡＬＳ）シグナルである。好ましいＭＡＬＳシグナルは、多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）シグナルである。
【0543】
一実施形態では、核酸（とりわけＲＮＡ）のサイズ分布は、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択されるシグナル（好ましくはＵＶシグナル）を、（適宜再算出された）Ｒｇ（またはＲｈ）値（または、（適宜再算出された）Ｒｇ（またはＲｈ）値を細分化することによって得られるＲｇ（またはＲｈ）画分）に対してプロットすることによって求められるかまたは算出される。したがって、好ましい実施形態では、ＲＮＡのサイズ分布は、ＵＶシグナルを再算出されたＲｇ（またはＲｈ）値（または、再算出されたＲｇ（またはＲｈ）値を細分化することによって得られるＲｇ（またはＲｈ）画分）に対してプロットすることによって求められるかまたは算出される。核酸（とりわけＲＮＡ）のサイズ分布は、それぞれそれらのサイズの関数としての、核酸（とりわけＲＮＡ）分子の数、核酸（とりわけＲＮＡ）のモル量、または粒子の核酸（とりわけＲＮＡ）として与えられ得る。あるいは、核酸（とりわけＲＮＡ）のサイズ分布は、Ｒｇ画分および／またはＲｈ画分あたりの核酸質量（とりわけＲＮＡ質量）あるいはＲｇ画分および／またはＲｈ画分あたりの核酸コピー数（とりわけＲＮＡコピー数）として与えることができる。フィールドフローフラクショネーションにより、結果として、２つ以上の核酸（とりわけＲＮＡ）ピークが生じる場合、サイズ分布が、別々に各核酸（とりわけＲＮＡ）ピークに対して求められるかまたは算出されることは好ましい。
【0544】
一実施形態では、核酸（とりわけＲＮＡ）の定量的サイズ分布は、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、およびＲＩシグナルからなる群から選択されるシグナル（好ましくはＵＶシグナル）を累積重量分率へと変換し、累積重量分率を、（適宜再算出された）Ｒｇ（またはＲｈ）値（または、（適宜再算出された）Ｒｇ（またはＲｈ）値を細分化することによって得られるＲｇ（またはＲｈ）画分）に対してプロットすることによって、核酸（とりわけＲＮＡ）のサイズ分布から求められるかまたは算出される。したがって、好ましい実施形態では、ＲＮＡの定量的サイズ分布は、ＵＶシグナルを累積重量分率へと変換し、累積重量分率を、再算出されたＲｇ（またはＲｈ）値（または、再算出されたＲｇ（またはＲｈ）値を細分化することによって得られるＲｇ（またはＲｈ）画分）に対してプロットすることによって、ＲＮＡのサイズ分布から求められるかまたは算出される。核酸（とりわけＲＮＡ）の定量的サイズ分布は、それぞれそれらのサイズの関数としての、核酸（とりわけＲＮＡ）分子の数、核酸（とりわけＲＮＡ）のモル量、または粒子の核酸（とりわけＲＮＡ）として与えられ得る。あるいは、核酸（とりわけＲＮＡ）の定量的サイズ分布は、Ｒｇ画分および／またはＲｈ画分あたりの核酸質量（とりわけＲＮＡ質量）あるいはＲｇ画分および／またはＲｈ画分あたりの核酸コピー数（とりわけＲＮＡコピー数）として与えることができる。フィールドフローフラクショネーションにより、結果として、２つ以上の核酸（とりわけＲＮＡ）ピークが生じる場合、定量的サイズ分布が、別々に各核酸（とりわけＲＮＡ）ピークに対して求められるかまたは算出されることは好ましい。
【0545】
一実施形態では、核酸（とりわけＲＮＡ）の定量的サイズ分布は、Ｄ１０値、Ｄ５０値、Ｄ９０値、Ｄ９５値、Ｄ９９値、および／またはＤ１００値（ＲｇまたはＲｈ値に基づく）を含む。一実施形態では、核酸（とりわけＲＮＡ）の定量的サイズ分布は、Ｄ１０値、Ｄ５０値、および／またはＤ９０値（ＲｇまたはＲｈ値に基づく）を含む。フィールドフローフラクショネーションにより、結果として、２つ以上の核酸（とりわけＲＮＡ）ピークが生じる場合、Ｄ１０値、Ｄ５０値、Ｄ９０値、Ｄ９５値、Ｄ９９値、および／またはＤ１００値（好ましくはＤ１０値、Ｄ５０値、および／またはＤ９０値）（ＲｇまたはＲｈ値に基づく）が、別々に各核酸（とりわけＲＮＡ）ピークに対して求められるかまたは算出されることは好ましい。
【0546】
一部の実施形態、特に、本開示の方法および／または使用によって求められるかまたは分析される１つまたは複数のパラメーターが核酸（とりわけＲＮＡ）のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布を含むような実施形態では、核酸（例えば、ＲＮＡ）のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布は、上記において説明されるような核酸（例えば、ＲＮＡ）のＲｇ値に基づいて、ならびに上記において説明されるような核酸（例えば、ＲＮＡ）のＲｈ値に基づいて別々に、算出される（すなわち、これらの実施形態は、結果として、核酸（例えば、ＲＮＡ）のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布に対して、２つのデータセットを生じ、一方は、Ｒｇ値に基づき、ならびにもう一方は、Ｒｈ値に基づく）。
【0547】
一部の実施形態、特に、本開示の方法および／または使用によって求められるかまたは分析される１つまたは複数のパラメーターが核酸（とりわけＲＮＡ）のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布を含むような実施形態では、Ｒｇ値は、上記において説明されるような少なくとも２つのＲｇ画分に細分化され、ならびにＲｈ値は、上記において説明されるような少なくとも２つのＲｈ画分に細分化され、核酸（例えば、ＲＮＡ）のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布は、上記において説明されるような核酸（例えば、ＲＮＡ）のＲｇ画分に基づいて、ならびに上記において説明されるような核酸（例えば、ＲＮＡ）のＲｈ画分に基づいて別々に、算出される（すなわち、これらの実施形態は、結果として、核酸（例えば、ＲＮＡ）のサイズ、サイズ分布、および／または定量的サイズ分布に対して、２つのデータセットを生じ、一方は、Ｒｇ画分に基づき、ならびにもう一方は、Ｒｈ画分に基づく）。
【0548】
Ｊ．形状因子／形態因子
核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子の一部の用途、例えば、治療用途または予防用途、に対して、粒子は、ある特定の形状（例えば、球形）であるべきである。粒子の形状に関する情報を提供するパラメーターは、形状因子および形態因子である（例えば、図１３を参照）。
核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子の一部の用途、例えば、治療用途または予防用途、に対して、粒子は、ある特定の形状（例えば、球形）であるべきである。粒子の形状に関する情報を提供するパラメーターは、形状因子および形態因子である（例えば、図１３を参照）。
【0549】
したがって、一部の実施形態では、本開示の方法および／または使用によって求められるかまたは分析される１つまたは複数のパラメーターは、形状因子および／または形態因子を含む。形状因子および形態因子は、好ましくは上記のセクションＨ～Ｊのいずれか１つにおいて求められるかまたは算出されるような、Ｒｇ値（例えば、再算出されたＲｇ値）および流体力学半径（Ｒｈ）値に基づいて求められ得るかまたは算出され得る。例えば、形状因子は、上記において求められるかまたは算出されるようなＲｇ値（例えば、再算出されたＲｇ値）を、上記において求められるかまたは算出されるような流体力学半径（Ｒｈ）値に対してプロットし、このプロットのデータ点をある関数（例えば、線形関数）に適合させることによって求められ得るかまたは算出され得る。例えば、線形回帰に対する約０．７７４（例えば、０．７４）の傾きは、分析した粒子の球状形態を示している。線形回帰に対する約０．８１６の傾きは、分析した粒子のコイル状形態を示しているであろうし、線形回帰に対する約１．７３２の傾きは、分析した粒子のロッド状形態を示しているであろう。例えば、W. Burchard (1990) "Laser Light Scattering in Biochemistry"を参照。同様に形態因子は、上記において求められるかまたは算出されるような流体力学半径（Ｒｈ）値を、上記において求められるかまたは算出されるようなＲｇ値（例えば、再算出されたＲｇ値）に対してプロットし、このプロットのデータ点をある関数（例えば、線形関数）に適合させることによって求められ得るかまたは算出され得る。
【0550】
Ｋ．核酸（とりわけＲＮＡ）の封入効率
核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子の一部の用途、例えば、治療用途または予防用途、に対して、どの程度効率的に核酸（とりわけＲＮＡ）が粒子内に封入されるかについて知ることは必要である。
核酸（とりわけＲＮＡ）を含有する粒子の一部の用途、例えば、治療用途または予防用途、に対して、どの程度効率的に核酸（とりわけＲＮＡ）が粒子内に封入されるかについて知ることは必要である。
【0551】
したがって、一部の実施形態では、本開示の方法および／または使用によって求められるかまたは分析される１つまたは複数のパラメーターは、核酸（とりわけＲＮＡ）の封入効率を含む。核酸（とりわけＲＮＡ）の封入効率は、（ｉ）核酸と粒子とを含む試料組成物または対照組成物中に含有される封入核酸（とりわけＲＮＡ）の量、ならびに（ｉｉ）試料組成物または対照組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の総量に基づいて求められ得るかまたは算出され得、この場合、核酸（とりわけＲＮＡ）の総量および封入核酸（とりわけＲＮＡ）の量は、好ましくは、セクションＢ．およびＦ．において指定されるように求められるかまたは算出される。一実施形態では、核酸（とりわけＲＮＡ）の封入効率は、封入核酸（とりわけＲＮＡ）の量を核酸（とりわけＲＮＡ）の総量によって除算することによって求められるかまたは算出される。
【0552】
Ｌ．核酸（とりわけＲＮＡ）の分子量
核酸（とりわけＲＮＡ）の分子量は、ＬＳデータから求めるかまたは算出することができ、ならびにその理論的に算出された分子量と比較することができる。核酸（とりわけＲＮＡ）の理論上の分子量は、核酸（とりわけＲＮＡ）配列および核酸に共有結合または非共有結合によって結合している適宜の追加物質（例えば、１つまたは複数の色素、キャップ構造体など）に基づいて求めることができるかまたは算出することができる。
核酸（とりわけＲＮＡ）の分子量は、ＬＳデータから求めるかまたは算出することができ、ならびにその理論的に算出された分子量と比較することができる。核酸（とりわけＲＮＡ）の理論上の分子量は、核酸（とりわけＲＮＡ）配列および核酸に共有結合または非共有結合によって結合している適宜の追加物質（例えば、１つまたは複数の色素、キャップ構造体など）に基づいて求めることができるかまたは算出することができる。
【0553】
したがって、一部の実施形態では、本開示の方法および／または使用によって求められるかまたは分析される１つまたは複数のパラメーターは、核酸（とりわけＲＮＡ）の分子量を含む。これらの実施形態では、本開示の方法および／または使用は、得られた１つまたは複数の試料画分のうちの少なくとも１つのＬＳシグナルを測定する工程を含み、この場合、核酸（とりわけＲＮＡ）の分子量は、ＬＳシグナルに基づいて求められ得るかまたは算出され得る。適宜、ＬＳシグナルに基づいて求められるかまたは算出された核酸（とりわけＲＮＡ）の分子量は、核酸（とりわけＲＮＡ）の理論上の分子量と比較され、この場合、核酸（とりわけＲＮＡ）の理論上の分子量は、本明細書において説明されるかまたは当業者に既知のように求められるかまたは算出される（例えば、核酸（とりわけＲＮＡ）配列に基づいて、ならびに核酸（とりわけＲＮＡ）に共有結合または非共有結合によって結合している適宜の追加物質（例えば、１つまたは複数の色素、キャップ構造体など）に基づいて算出されるかまたは求められる）。
【0554】
Ｍ．粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）の量と粒子形成化合物の総量との比率
一部の実施形態では、本開示の方法および／または使用によって求められるかまたは分析される１つまたは複数のパラメーターは、粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）の量と粒子における粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の総量との比率を含み、その場合、前記比率は、粒子サイズの関数として与えられ得る。
一部の実施形態では、本開示の方法および／または使用によって求められるかまたは分析される１つまたは複数のパラメーターは、粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）の量と粒子における粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の総量との比率を含み、その場合、前記比率は、粒子サイズの関数として与えられ得る。
【0555】
核酸（とりわけＲＮＡ）と粒子とを含む本開示の試料組成物または対照組成物中に含有される結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量は、特に、核酸（とりわけＲＮＡ）の総量から遊離核酸（とりわけ遊離ＲＮＡ）の量を減算することによって、例えば、組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の総量および組成物中に含有される遊離核酸（とりわけ遊離ＲＮＡ）の量から、上記において説明したように求めることができるかまたは算出することができる。組成物中に含有される結合した核酸の量および遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量の両方は、例えば、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、および屈折率（ＲＩ）シグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルに基づく較正曲線を使用することによって、またはＵＶ範囲における（例えば、２６０ｎｍまたは２８０ｎｍにおける）核酸（とりわけＲＮＡ）の減衰係数を使用することによって、上記において指定されたように求めることができるかまたは算出することができる。粒子における粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の総量は、粒子を作製するために使用される粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の量から求めることができるかまたは算出することができる。あるいは、粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の量は、当業者に既知の方法および／または技術、例えば、ＨＰＬＣに基づくものによって求めることができる［例えば、Roces et al., Pharmaceutics. 8, 29 (2016)を参照］。粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）の量と粒子における粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の総量との比率は、求められるかまたは算出された粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）の量を求められるかまたは算出された粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の総量で除算することによって求めることができるかまたは算出することができる。
【0556】
上記の実施形態のうちの、粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）の量と粒子における粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の総量との比率が、粒子サイズの関数として与えられるような実施形態では、本開示の方法および／または使用は、好ましくは、試料組成物または対照組成物または少なくともその一部をフィールドフローフラクショネーションに供することによって得られる１つまたは複数の試料画分のうちの少なくとも１つのＬＳシグナルを測定する工程を含む。ＬＳシグナルに基づいて、Ｒｇ値および／またはＲｈ値を得ることができ（好ましくは上記において説明されるように）、それらから、溶出した粒子のサイズを求めることができるかまたは算出することができる（上記において説明されるように）。
【0557】
Ｎ．粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）における正に帯電した部分の量と粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）の量との比率
一部の実施形態では、本開示の方法および／または使用によって求められるかまたは分析される１つまたは複数のパラメーターは、粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）における正に帯電した部分の量と粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）の量との比率を含み、この場合、前記比率は、粒子サイズの関数として与えられ得る。
一部の実施形態では、本開示の方法および／または使用によって求められるかまたは分析される１つまたは複数のパラメーターは、粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）における正に帯電した部分の量と粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）の量との比率を含み、この場合、前記比率は、粒子サイズの関数として与えられ得る。
【0558】
粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）における正に帯電した部分の量は、粒子を作製するために使用される粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の量から、ならびに、前記粒子形成化合物の化学組成物から（例えば、粒子形成化合物に含有される正に帯電した部分の数から）求めることができるかまたは算出することができる。あるいは、粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の量は、当業者に既知の方法および／または技術、例えば、ＨＰＬＣに基づくもの、によって求めることができる［例えば、Roces et al., Pharmaceutics. 8,29(2016)を参照］。核酸（とりわけＲＮＡ）と粒子とを含む本開示の試料組成物または対照組成物中に含有される結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量は、特に、核酸（とりわけＲＮＡ）の総量から遊離核酸（とりわけ遊離ＲＮＡ）の量を減算することによって、例えば、組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）の総量および組成物中に含有される遊離核酸（とりわけ遊離ＲＮＡ）の量から、上記において説明したように求めることができるかまたは算出することができる。組成物中に含有される結合した核酸（とりわけＲＮＡ）の量および遊離核酸（とりわけＲＮＡ）の量の両方は、例えば、ＵＶシグナル、蛍光シグナル、および屈折率（ＲＩ）シグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルに基づく較正曲線を使用することによって、またはＵＶ範囲における（例えば、２６０ｎｍまたは２８０ｎｍにおける）核酸（とりわけＲＮＡ）の減衰係数を使用することによって、上記において指定されたように求めることができるかまたは算出することができる。粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）における正に帯電した部分の量と粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）の量との比率は、求められるかまたは算出された、粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）における正に帯電した部分の量を求められるかまたは算出された粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）の量で除算することによって求めることができるかまたは算出することができる。
【0559】
上記の実施形態のうちの、粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）における正に帯電した部分の量と粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）の量との比率が粒子サイズの関数として与えられるような実施形態では、本開示の方法および／または使用は、好ましくは、試料組成物または対照組成物または少なくともその一部をフィールドフローフラクショネーションに供することによって得られる１つまたは複数の試料画分のうちの少なくとも１つのＬＳシグナルを測定する工程を含む。ＬＳシグナルに基づいて、Ｒｇ値および／またはＲｈ値を得ることができ（好ましくは上記において説明されるように）、それらから、溶出した粒子のサイズを求めることができるかまたは算出することができる（上記において説明されるように）。
【0560】
Ｏ．粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）における正に帯電した部分の量と粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）における負に帯電した部分の量との電荷比
一部の実施形態では、本開示の方法および／または使用によって求められるかまたは分析される１つまたは複数のパラメーターは、粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）における正に帯電した部分の量と粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）における負に帯電した部分の量との電荷比を含む。前記電荷比は、通常、Ｎ／Ｐ比と呼ばれ、粒子サイズの関数として与えられ得る。
一部の実施形態では、本開示の方法および／または使用によって求められるかまたは分析される１つまたは複数のパラメーターは、粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）における正に帯電した部分の量と粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）における負に帯電した部分の量との電荷比を含む。前記電荷比は、通常、Ｎ／Ｐ比と呼ばれ、粒子サイズの関数として与えられ得る。
【0561】
粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の正に荷電した部分の量は、粒子を作製するために用いられる粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の量から、ならびに前記粒子形成化合物の化学組成から（例えば、粒子形成化合物中に含有される正に荷電した部分の数から）求めるかまたは算出することができる。あるいは、粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の量は、当業者に既知の方法および／または技法、例えば、ＨＰＬＣに基づくものによって求めることができる［例えば、Roces et al., Pharmaceutics. 8, 29 (2016)を参照されたい］。粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）の負に荷電した部分の量は、粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）の量から、および前記核酸（例えば、ＲＮＡ）の化学組成、例えば、核酸中に含有される負に荷電した部分（例えば、リン酸基）の数から求めるかまたは算出することができる。核酸（特に、ＲＮＡ）および粒子を含む本開示の試料または対照組成物中に含有される結合した核酸（特に、ＲＮＡ）の量は、例えば、組成物中に含有される核酸（特に、ＲＮＡ）の総量および組成物中に含有される遊離核酸（特に、遊離ＲＮＡ）の量から、特に、核酸（特に、ＲＮＡ）の総量から遊離核酸（特に、遊離ＲＮＡ）の量を減算することによって、上記のように求めるかまたは算出することができる。組成物中に含有される結合したおよび遊離した核酸（特に、ＲＮＡ）の量の両方は、例えば、ＵＶシグナル、蛍光シグナルおよび屈折率（ＲＩ）シグナルからなる群から選択される少なくとも１つのシグナルに基づく較正曲線を用いることによって、またはＵＶ域における（例えば、２６０ｎｍもしくは２８０ｎｍでの）核酸（特に、ＲＮＡ）の減衰係数を用いることによって、上記で規定されるように求めるかまたは算出することができる。粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の正に荷電した部分の量対粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）の負に荷電した部分の量の電荷比は、粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の正に荷電した部分の求められたかまたは算出された量を粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）の負に荷電した部分の求められたかまたは算出された量で割ることによって、求めるかまたは算出することができる。
【0562】
粒子中の粒子形成化合物（特に、脂質および／またはポリマー）の正に荷電した部分の量対粒子に結合した核酸（例えば、ＲＮＡ）の負に荷電した部分の量の電荷比が粒子サイズの関数として与えられる、上記実施形態のものでは、本開示の方法および／または使用は、好ましくは、試料または対照組成物またはそれらの少なくとも一部をフィールド－フローフラクショネーションに供することによって得られた１種または複数の試料画分の少なくとも１つのＬＳシグナルを測定する工程を含む。ＬＳシグナルに基づいて、Ｒｇ値および／またはＲｈ値を得ることができ（好ましくは上記の通り）、それらから、溶出された粒子のサイズを求めるかまたは算出することができる（上記の通り）。
【0563】
フィールド－フローフラクショネーション
フィールド－フローフラクショネーションは、垂直力場が加えられる非常に薄いフローを用い、高分解能分離を実現するクロマトグラフィー技法である。フィールド－フローフラクショネーションの例としては、非対称フローフィールド－フローフラクショネーション（ＡＦ４）およびホローファイバーフローフィールド－フローフラクショネーション（ＨＦ５）、例えば、Ｗｙａｔｔによって市販されており、例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１８／１６５６２７に記載されているＥｃｌｉｐｓｅ（商標）システム（Ｄｕａｌｔｅｃ（商標）またはＡＦ４（商標））が挙げられる。したがって、一実施形態では、本開示の方法および／または使用において利用されるフィールド－フローフラクショネーションは、フローフィールド－フローフラクショネーション、例えば、非対称フローフィールド－フローフラクショネーション（ＡＦ４）またはホローファイバーフローフィールド－フローフラクショネーション（ＨＦ５）である。
フィールド－フローフラクショネーションは、垂直力場が加えられる非常に薄いフローを用い、高分解能分離を実現するクロマトグラフィー技法である。フィールド－フローフラクショネーションの例としては、非対称フローフィールド－フローフラクショネーション（ＡＦ４）およびホローファイバーフローフィールド－フローフラクショネーション（ＨＦ５）、例えば、Ｗｙａｔｔによって市販されており、例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１８／１６５６２７に記載されているＥｃｌｉｐｓｅ（商標）システム（Ｄｕａｌｔｅｃ（商標）またはＡＦ４（商標））が挙げられる。したがって、一実施形態では、本開示の方法および／または使用において利用されるフィールド－フローフラクショネーションは、フローフィールド－フローフラクショネーション、例えば、非対称フローフィールド－フローフラクショネーション（ＡＦ４）またはホローファイバーフローフィールド－フローフラクショネーション（ＨＦ５）である。
【0564】
典型的には、非対称フローフィールド－フローフラクショネーションシステム（ＡＦ４システムなど）はチャネルを含み、これは、スペーサーホイル（これは、典型的には１００～５００μｍの厚さを有する）によって分離される２つのプレートから構成され、その中でフローおよび分離が生じる。上部プレートは不透過性であるが、下部プレートは透過性である（例えば、多孔性フリット材料でできている）。さらに、下部プレートは、核酸（特に、ＲＮＡ）およびより大きな分析物（例えば、本明細書で開示される粒子）が膜を透過するのを防止するのに適した分子量（ＭＷ）カットオフを有する膜で覆われている。一実施形態では、膜は、２ｋＤａ～３０ｋＤａの範囲のＭＷカットオフ、例えば、３ｋＤａ～２５ｋＤａ（４ｋＤａ～２０ｋＤａ、５ｋＤａ～１５ｋＤａまたは５ｋＤａ～１２ｋＤａなど）の範囲のＭＷカットオフ、例えば、１０ｋＤａのＭＷカットオフを有する。上記の目的に適した任意の膜を利用することができる。一実施形態では、膜は、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜、再生セルロース膜またはフッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（上記で規定されたＭＷカットオフを有する既知の限外濾過膜のいずれかなど）である。
【0565】
典型的には、非対称フローフィールド－フローフラクショネーションシステム（ＡＦ４システムなど）は、チャネルの一方の末端にある入口ポート、チャネルのもう一方の末端にある出口ポート、および入口ポートと出口ポートの間に位置し、好ましくは入口ポートにより近い注入ポートを含む。
【0566】
フローチャンネル内で、液相の層状フローが理由で放物線状フロープロファイルが作り出され、液相は、チャネルフローの中心で移動するよりも、境界エッジに近いほどゆっくりと移動する。層状フローに垂直力場が加えられる場合に、液相の構成要素［分離される分析物、特に、核酸（特に、ＲＮＡ）、および存在するならば粒子を含める］は、好ましくは膜側面上の、チャネルの境界層に運ばれる。ブラウン運動と関連する拡散によって反作用運動が引き起こされる。したがって、拡散速度がより高いより小さな分析物は、縦方向のフローがより速い、チャネル中のより高い平衡位置に達する傾向がある。したがって、チャネル内の速度勾配フローは、異なるサイズの分析物を分離することができる。大きな粒子よりも小さな分析物ほどチャネルに沿って急速に輸送されるので、より小さな分析物は、より大きな分析物の前に溶出され、これは、より大きな分析物が最初に溶出されるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）などに対してオルソゴナル（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）である。
【0567】
非対称フローフィールド－フローフラクショネーションシステム（ＡＦ４システムなど）に関する上記の原理は、ＨＦ５システムが上部プレートを含有せず、むしろ低部プレートおよび膜がチューブに巻かれていることを除いては、ＨＦ５システムにも適用される。この構成は非常に小さなチャネル容量を用いることができ、高感度および非常に速い実施時間をもたらす。
【0568】
フィールド－フローフラクショネーションは、分離される分析物と固定相の相互作用に依拠せず、かつ前記固定相で充填された対応するカラムを必要としないので、チャネルを通して液相を移動させるために高い圧力を必要せず、それによって、特に、高い剪断力を回避する。実際に、フィールド－フローフラクショネーションは、穏やかで、急速で、かつ非破壊性である。
【0569】
一般に、フィールド－フローフラクショネーションは、２つの工程：注入および溶出／分画を含む。適宜、注入工程の後、および溶出／分画工程の前に、フィールド－フローフラクショネーションは集束工程を含むことができる。好ましくは、フィールド－フローフラクショネーションが集束工程を含む場合は、最初の２つの工程の間に、液相が分割され、両端（入口ポートおよび出口ポート）からチャネルに入り、好ましくは、注入ポートの下で出会うようにバランスがとられている［例えば、入口および出口ポートを通るフロー（すなわち、注入ポートを通して注入された分析物が入口ポートまたは出口ポートに向かってさまよわない（好ましくは、溶出されない）が、集束されるような方法で互いに適合されている］。これらの最初の２つの工程の間に、液相は膜を通って透過するのみである。試料または対照組成物またはそれらの少なくとも一部が注入される（好ましくは、注入ポートを介する）場合、前記試料または対照組成物またはそれらの少なくとも一部に含有される分析物は、バンド（好ましくは、できるだけ薄い）に適宜集束され、好ましくは、膜に向かって濃縮される。試料の注入が完了した後、注入フローが停止される。適宜、集束が、ある特定の期間にわたって（例えば、約０．５～約２分、例えば約１分にわたって）続けられる。次いで、フローは溶出／分画モードに切り替えられ、ここでは、液相は、入口ポートから入り、出口ポートから出るのみであり、出口ポートは、１種または複数の検出器［例えば、ＵＶ検出器（例えば、ＵＶおよびＣＤシグナルを好ましくは同時にモニターすることができるＵＶ検出器）、蛍光検出器、屈折率検出器、１種もしくは複数のＬＳ検出器（例えば、ＭＡＬＳ検出器および／もしくはＤＬＳ検出器）、ならびに／または粘度計）に接続している。分析物はサイズ（または流体力学的移動度）に従って分離されて溶出され、１種または複数の検出器（例えば、一連の異なる検出器）によって検出および／またはモニターされる。この検出および／またはモニタリングは、好ましくはオンラインで、すなわち、直ちに行われ、これにより、フィールド－フローフラクショネーションから得られた画分を保存する必要性が回避される。しかし、一実施形態では、少なくとも１画分のオフライン分析を可能にするために、オンラインの検出および／またはモニタリングが完了した後に少なくとも１画分が収集される。一実施形態では、１つまたは複数のパラメーターの算出または決定はオンラインで実行される。
【0570】
したがって、一部の実施形態では、本明細書で用いられる場合、表現「試料組成物の少なくとも一部をフィールド－フローフラクショネーションに供する」は、好ましくは、フィールド－フローフラクショネーションデバイスに試料組成物の少なくとも一部を注入する工程；適宜、試料組成物の少なくとも一部に含有される構成要素［特に、核酸（特に、ＲＮＡ）、および存在するならば粒子］をフィールド－フローフラクショネーションデバイス中で集束させる工程；ならびに構成要素［特に、核酸（特に、ＲＮＡ）、および存在するならば粒子］をそれらのサイズまたは流体力学的移動度に従って分画する工程を含む。同様に、一部の実施形態では、本明細書で用いられる場合、表現「対照組成物の少なくとも一部をフィールド－フローフラクショネーションに供する」は、好ましくは、対照組成物の少なくとも一部をフィールド－フローフラクショネーションデバイスに注入する工程；適宜、試料組成物の少なくとも一部に含有される構成要素［特に、核酸（特に、ＲＮＡ）、および存在するならば粒子］をフィールド－フローフラクショネーションデバイス中で集束させる工程；ならびに構成要素［特に、核酸（特に、ＲＮＡ）、および存在するならば粒子］をそれらのサイズまたは流体力学的移動度に従って分画する工程を含む。フィールド－フローフラクショネーションに供される組成物（すなわち、試料組成物、対照組成物、これら２つのうちのいずれかの少なくとも一部など）のタイプに関係なく、分画工程は少なくとも１画分を生成するが、少なくとも２（例えば、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９または少なくとも１０）画分および／または１００まで（例えば、９０まで、８０まで、７０まで、６０まで、５０まで、４０まで、３０まで、または２０まで）の画分も生成し得る。画分のそれぞれは、（１）ある特定のサイズの核酸（特に、ＲＮＡ）［例えば、約１０～約４００ｎｍもしくは２０～３００ｎｍの範囲の直径を有する核酸（特に、ＲＮＡ）］、もしくはある特定のタイプの核酸（特に、ＲＮＡ）（例えば、遊離核酸（特に、遊離ＲＮＡ）もしくは結合した核酸（特に結合ＲＮＡ）、または（２）ある特定のサイズの核酸（特に、ＲＮＡ）含有粒子［例えば、約２００～１２００ｎｍの範囲の直径を有する核酸（特に、ＲＮＡ）含有粒子］、もしくはある特定のタイプの核酸（特に、ＲＮＡ）含有粒子［例えば、核酸（特に、ＲＮＡ）含有リポプレックス粒子もしくは核酸（特に、ＲＮＡ）含有ウイルス様粒子］に相当し得る。
【0571】
一般に、フィールド－フローフラクショネーション［例えば、非対称フローフィールド－フローフラクショネーションシステム（ＡＦ４システムなど）またはホローファイバーシステム（ＨＦ５システムなど）をともなう、で用いられるクロスフローレートは、約１０ｍＬ／分までであり得る。一実施形態では、本開示の方法および／または使用において利用されるフィールド－フローフラクショネーションは、８ｍＬ／分まで、好ましくは４ｍＬ／分まで、より好ましくは２ｍＬ／分までのクロスフローレートを用いて実行される。好ましい実施形態では、本開示の方法および／または使用において利用されるフィールド－フローフラクショネーションは、クロスフロープロファイルを用いて実行され、すなわち、クロスフローレートはフィールド－フローフラクショネーションの全ての相（注入、適宜、集束および溶出／分画）の間一定ではないが、相ごとに異なる。例えば、注入相および存在するならば集束相の間、クロスフローは一定であり、好ましくは、核酸（特に、ＲＮＡ）および存在するならば本明細書で開示される粒子が溶出されない速度であることが好ましい。この目的に適したクロスフローレートは、本開示の教示に基づいて決定することができる。
【0572】
一実施形態において、クロスフローレートプロファイルは、好ましくは、対照組成物または試料組成物中に含有される構成要素が、そのサイズによって分画／分離して、１つまたは複数の試料画分を生成することができるようにする分画相を含む。クロスフローレートは、この分画相の間に変化する［例えば、ある値（例えば、約１～約４ｍＬ／分）から始まってから、より低い値（例えば約０～約０．１ｍＬ／分）に低下するか、またはある値（例えば約０～約０．１ｍＬ／分）から始まってから、より高い値（例えば約１～約４ｍＬ／分）まで増大する］ことが好ましく、変化は何であってもよく、例えば、連続的な（例えば、線形であるか、または指数関数的な）変化であっても、段階的な変化であってもよい。好ましくは、クロスフローレートプロファイルは、分画相を含有し、クロスフローレートは、連続的に（好ましくは指数関数的に）変化して、ある値（例えば約１～約４ｍＬ／分）から始まってから、より低い値（例えば約０～約０．１ｍＬ／分）に低下する。分画相は、試料組成物中に含有される構成要素をサイズによって分画／分離するのに適したあらゆる長さを有してよく、例えば約５分～約６０分、例えば、約１０分～約５０分、約１５分～約４５分、約２０分～約４０分、もしくは約２５分～約３５分、または約３０分である。クロスフローレートプロファイルは、追加的な相（例えば、１、２、３、または４相）を含有してもよく、これは、分画相の前、および／または後であり得（例えば、分画相の前に１相、および後に１、２、または３相）、かつこれは、試料組成物（例えば、タンパク質、ポリペプチド、モノヌクレオチドその他）中に含有される非核酸（とりわけ非ＲＮＡ）構成要素を、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）から分離して、試料組成物中に含有される核酸（とりわけＲＮＡ）に焦点を合わせ、かつ／またはフィールド－フローフラクショネーション装置を再生させるように（例えば、装置の膜に結合した全ての構成要素を除去するように）機能し得る。好ましくは、これらの追加的な相のクロスフローレートは、追加的な相毎に一定であり、かつ追加的な相毎の長さは、追加的な相毎に独立して、約５分～約６０分の範囲内にある（約１０分～約５０分、約１５分～約４５分、約２０分～約４０分、もしくは約２５分～約３５分、または約３０分）。例えば、クロスフローレートプロファイルは、（ｉ）分画相の前にある第１の追加的な相であって、前記第１の追加的な相のクロスフローレートは一定であり、かつ分画相が始まるクロスフローレートである、第１の追加的な相（第１の追加的な相の長さは、約５分～約６０分の範囲内にあってよく、例えば、約１０分～約５０分、約１５分～約４５分、約２０分～約４０分、もしくは約２５分～約３５分、または約１０分、もしくは約２０分、もしくは約３０分である）；（ｉｉ）分画相の後にある第２の追加的な相であって、前記第２の追加的な相のクロスフローレートは一定であり、かつ分画相が終わるクロスフローレートである、第２の追加的な相（第２の追加的な相の長さは、約５分～約６０分の範囲内にあってよく、例えば、約１０分～約５０分、約１５分～約４５分、約２０分～約４０分、もしくは約２５分～約３５分、または約１０分、もしくは約２０分、もしくは約３０分である）；および適宜（ｉｉｉ）第２の追加的な相の後にある第３の追加的な相であって、前記第３の追加的な相のクロスフローレートは一定であり、かつ第２の追加的な相のクロスフローレートとは異なる、第３の追加的な相（第３の追加的な相の長さは、約５分～約６０分の範囲内にあってよく、例えば、約１０分～約５０分、約１５分～約４５分、約２０分～約４０分、もしくは約２５分～約３５分、または約１０分、もしくは約２０分、もしくは約３０分である）を含有してもよい。クロスフローレートプロファイルが分画相を含有し、クロスフローレートが連続的に（好ましくは指数関数的に）変化して、ある値（例えば約１～約４ｍＬ／分）から始まってから、より低い値（例えば約０～約０．１ｍＬ／分）に低下する実施形態において、クロスフローレートプロファイルはさらに、（ｉ）分画相の前にある第１の追加的な相であって、前記第１の追加的な相のクロスフローレートは一定であり、かつ分画相が始まるクロスフローレート（例えば約１～約４ｍＬ／分）である、第１の追加的な相（第１の追加的な相の長さは、約５分～約３０分の範囲内にあってよく、例えば、約６分～約２５分、約７分～約２０分、もしくは約８分～約１５分、もしくは約１０分～約１２分、または約５分、もしくは約１０分、もしくは約１２分である）；（ｉｉ）分画相の後にある第２の追加的な相であって、前記第２の追加的な相のクロスフローレートは一定であり、かつ分画相が終わるクロスフローレート（例えば約０．０１～約０．１ｍＬ／分）である、第２の追加的な相（第２の追加的な相の長さは、約５分～約６０分の範囲内にあってよく、例えば、約１０分～約５０分、約１５分～約４５分、約２０分～約４０分、もしくは約２５分～約３５分、または約３０分である）；および適宜（ｉｉｉ）第２の追加的な相の後にある第３の追加的な相であって、前記第３の追加的な相のクロスフローレートは一定であり、かつ第２の追加的な相のクロスフローレートよりも低い、第３の追加的な相（例えば、前記第３の追加的な相のクロスフローレートは０である）（第３の追加的な相の長さは、約５分～約３０分の範囲内にあってよく、例えば、約６分～約２５分、約７分～約２０分、もしくは約８分～約１５分、もしくは約１０分～約１２分、または約５分、もしくは約１０分、もしくは約１２分である）を含有することが好ましい。そのようなクロスフローレートプロファイルの好ましい例は、以下の通りである：１０分間の１．０～２．０ｍＬ／分、３０分以内の１．０～２．０ｍＬ／分から０．０１～０．０７ｍＬ／分への指数勾配；３０分間の０．０１～０．０７ｍＬ／分；および１０分間の０ｍＬ／分。
【0573】
したがって、一実施形態では、注入相、および存在するならば集束相の間のクロスフローレートは、ある期間（例えば、５～１５分）にわたって、一定であり、かつ少なくとも約１．０（例えば、約１．３～約３．０ｍＬ／分、約１．５～約２．５ｍＬ／分または約１．８～約２．０ｍＬ／分）の範囲である。さらに、一実施形態では、溶出／分画相の間のクロスフローは、ある期間（例えば、２０～４０分）にわたって、非常に低い速度（例えば、０．０１～０．０７ｍＬ／分）に次第に低下する。適宜、クロスフローが非常に低い速度に達した後、この速度がある期間（例えば、２０～４０分、例えば、クロスフローレートを非常に低い速度に低下させために用いられるのと同じ期間）にわたって維持され、および／またはクロスフローは、ある期間（例えば、５～２０分）にわたって０ｍＬ／分に設定される。注入、集束および溶出／分画相の完全なサイクルのための例示的クロスフロープロファイルは、以下通りである：１０分間の１．０～２．０ｍＬ／分、３０分以内の１．０～２．０ｍＬ／分～０．０１～０．０７ｍＬ／分の指数勾配；３０分間の０．０１～０．０７ｍＬ／分；および１０分間の０ｍＬ／分。本開示で用いられるクロスフロープロファイルの特定例を図１に示す。
【0574】
一実施形態では、本開示の方法および／または使用において利用されるフィールド－フローフラクショネーションは、０．０５～０．３５ｍＬ／分の範囲の、好ましくは０．１０～０．３０ｍＬ／分の範囲の、より好ましくは０．１５～０．２５ｍＬ／分の範囲のインジェクトフローレートを用いて実行される。
【0575】
一実施形態では、本開示の方法および／または使用において利用されるフィールド－フローフラクショネーションは、０．３０～０．７０ｍＬ／分の範囲の、好ましくは０．４０～０．６０ｍＬ／分の範囲の、より好ましくは０．４５～０．５５ｍＬ／分の範囲の検出器フローレートを用いて実行される。一実施形態では、検出器フローレートは、フィールド－フローフラクショネーションの全ての相（注入、集束および溶出／分画）の間一定である。
【0576】
インジェクトフローのためにフィールド－フローフラクショネーションで用いられる液相は、フィールド－フローフラクショネーションシステムに適合し、かつ核酸（特に、ＲＮＡ）を溶解するのに適した、いかなる液体でもよい。好ましい液体は水性液体、例えば、主に水から構成される［すなわち、液体の含水量が５０％（ｖ／ｖ）または（ｗ／ｗ）を超える（例えば、６０％を超える、７０％を超える、８０％を超える、９０％を超える、または９５％（ｖ／ｖ）もしくは（ｗ／ｗ）を超える）］液体である。液相は、バッファ、塩および／または追加的な賦形剤（例えば、キレート化剤）を含有することができる。
【0577】
一実施形態では、本開示の方法および／または使用において利用されるフィールド－フローフラクショネーションは、ＵＶおよびＣＤシグナルを好ましくは同時にモニターすることができるＵＶ検出器を用いて実行される。
【0578】
本開示の方法および／または使用によって分析されるパラメーターのうちの１つが核酸（特に、ＲＮＡ）の総量である場合、フィールド－フローフラクショネーションで用いられる液相が、粒子に結合した核酸（特に、ＲＮＡ）を粒子から放出し［それによって、結合した核酸（特に結合ＲＮＡ）の量をゼロに減少させ、遊離核酸（特に、遊離ＲＮＡ）の量をその最大限まで増加させることができる放出剤を含有することが好ましい。これに対して、本開示の方法および／または使用によって分析されるパラメーターのうちの１つが遊離核酸（特に、遊離ＲＮＡ）の量である場合、フィールド－フローフラクショネーションで用いられる液相が放出剤を含有しないことが好ましい。
【0579】
一実施形態では、試料または対照組成物の少なくとも一部をフィールド－フローフラクショネーションに供する前に、試料または対照組成物の少なくとも一部は、例えば、液相で、または溶媒もしくは溶媒混合液で希釈され、前記溶媒または溶媒混合液は、粒子の凝集体の形成を防止することができる。一実施形態では、溶媒混合液は水と有機溶媒、例えばホルムアミドとの混合液である。
【実施例】
【0580】
略語
以下の略語が、説明全体を通して使用される：
ｉｖｔＲＮＡ インビトロ転写されたＲＮＡ
ｓａＲＮＡ 自己増幅ＲＮＡ
ＮＰ ナノ粒子（ＬＰＸ、ＬＮＰ、ＰＬＸ、ＶＬＰ）
ＬＮＰ 脂質ナノ粒子
ＬＰＸ リポプレックス粒子
ＰＬＸ ポリプレックス粒子
ＶＬＰ ウイルス様粒子
Ｒｇ 回転半径
Ｒｈ 流体力学半径
ＭＷ 分子量
以下の略語が、説明全体を通して使用される：
ｉｖｔＲＮＡ インビトロ転写されたＲＮＡ
ｓａＲＮＡ 自己増幅ＲＮＡ
ＮＰ ナノ粒子（ＬＰＸ、ＬＮＰ、ＰＬＸ、ＶＬＰ）
ＬＮＰ 脂質ナノ粒子
ＬＰＸ リポプレックス粒子
ＰＬＸ ポリプレックス粒子
ＶＬＰ ウイルス様粒子
Ｒｇ 回転半径
Ｒｈ 流体力学半径
ＭＷ 分子量
【0581】
機器
フィールドフローフラクショネーションは、対応するソフトウェアと一緒に、水溶液に対してＥｃｌｉｐｓｅ（登録商標）ＡＦ４（Ｗｙａｔｔ）を使用して行った。フラクショネーションにおいて使用した膜は、１０ｋＤａをカットオフするＰＥＳ膜（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｅｕｒｏｐｅ、デルンバッハ、ドイツ）であった。インライン真空脱ガス装置を備えるＡｇｉｌｅｎｔ １２６０シリーズクォータナリポンプが、キャリアフローを送達し、ならびにＡｇｉｌｅｎｔ １２６０シリーズ自動サンプラーが、試料組成物または対照組成物（注入された４μｇのＲＮＡに相当する）をフリット－インレットチャンネルに提供した。分析物（すなわち、ＲＮＡおよび粒子）は、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（２６０～２８０ｎｍ ＭＷＤ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ヴァルトブロン、ドイツ）ならびに波長６６０ｎｍおよび６０％の出力を有するレーザーを備えた多角度光散乱（ＭＡＬＳ）検出器（ＤＡＷＮ ＨＥＬＥＯＳ ＩＩ、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ． サンタバルバラ、カリフォルニア、米国）を使用することによって検出した。ＭＡＬＳ検出器番号１６は、グラスファイバーを介してＱＥＬＳ（ＤｙｎａＰｒｏ ＮａｎｏＳｔａｒ、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒ．、サンタバルバラ、カリフォルニア、米国）に接続される。
フィールドフローフラクショネーションは、対応するソフトウェアと一緒に、水溶液に対してＥｃｌｉｐｓｅ（登録商標）ＡＦ４（Ｗｙａｔｔ）を使用して行った。フラクショネーションにおいて使用した膜は、１０ｋＤａをカットオフするＰＥＳ膜（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｅｕｒｏｐｅ、デルンバッハ、ドイツ）であった。インライン真空脱ガス装置を備えるＡｇｉｌｅｎｔ １２６０シリーズクォータナリポンプが、キャリアフローを送達し、ならびにＡｇｉｌｅｎｔ １２６０シリーズ自動サンプラーが、試料組成物または対照組成物（注入された４μｇのＲＮＡに相当する）をフリット－インレットチャンネルに提供した。分析物（すなわち、ＲＮＡおよび粒子）は、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（２６０～２８０ｎｍ ＭＷＤ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ヴァルトブロン、ドイツ）ならびに波長６６０ｎｍおよび６０％の出力を有するレーザーを備えた多角度光散乱（ＭＡＬＳ）検出器（ＤＡＷＮ ＨＥＬＥＯＳ ＩＩ、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ． サンタバルバラ、カリフォルニア、米国）を使用することによって検出した。ＭＡＬＳ検出器番号１６は、グラスファイバーを介してＱＥＬＳ（ＤｙｎａＰｒｏ ＮａｎｏＳｔａｒ、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒ．、サンタバルバラ、カリフォルニア、米国）に接続される。
【0582】
材料
方法
ＡＦ４フラクショネーション法
インジェクトフロー、検出器フロー、およびクロスフローのための液相は、水中における５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である。分離は、１０分間の、０．２ｍＬ／分の注入流速Ｖｉ、０．５ｍＬ／分の検出器流速Ｖｄ、および１．５ｍＬ／分のクロスフローレートＶｘによる溶出注入プログラムと、それに続く、傾き３．５を使用して３０分以内１．５ｍＬ／分～０．０４ｍＬ／分指数関数的に減少するＶｘ勾配において実施される。その後、Ｖｘは、３０分間にわたって、０．０４ｍＬ／分において一定に保たれ、それに続いて、ゼロクロスフローにおいて１０分間保たれる（図１を参照）。
方法
ＡＦ４フラクショネーション法
インジェクトフロー、検出器フロー、およびクロスフローのための液相は、水中における５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である。分離は、１０分間の、０．２ｍＬ／分の注入流速Ｖｉ、０．５ｍＬ／分の検出器流速Ｖｄ、および１．５ｍＬ／分のクロスフローレートＶｘによる溶出注入プログラムと、それに続く、傾き３．５を使用して３０分以内１．５ｍＬ／分～０．０４ｍＬ／分指数関数的に減少するＶｘ勾配において実施される。その後、Ｖｘは、３０分間にわたって、０．０４ｍＬ／分において一定に保たれ、それに続いて、ゼロクロスフローにおいて１０分間保たれる（図１を参照）。
【0583】
溶出した分析物は、多波長（２６０～２８０ｎｍ）において、波長６６０ｎｍおよび６０％のレーザー出力を有するレーザーを備えた多角度光散乱（ＭＡＬＳ）検出器（ＤＡＷＮ ＨＥＬＥＯＳ ＩＩ、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．、サンタバルバラ、カリフォルニア、米国）を使用することによって検出した。ＭＡＬＳ検出器番号１６は、グラスファイバーを介してＱＥＬＳ（ＤｙｎａＰｒｏ ＮａｎｏＳｔａｒ、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒ．サンタバルバラ、カリフォルニア、米国）に接続される。ＣＤ実験には、検出器ＣＤ－４０９５（Ｊａｓｃｏ）を用いた。
【0584】
サイズ分布は、散乱検出器において得られたデータに対する一次適合を実施することにより、Ｂｅｒｒｙプロットを使用したＡＳＴＲＡソフトウェアバージョン７．１．３．２５（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｅｕｒｏｐｅ、デルンバッハ、ドイツ）によって算出される。ＡＦ４ ＭＡＬＳのサイズ結果は、回転半径（Ｒｇ）値として与えられ、ならびに粒子ピーク面積に対して求めた。カップリングされたＤＬＳは、同時に流体力学半径（Ｒｈ）を提供した。ＵＶシグナルは、試料組成物または対照組成物中の非結合（すなわち、遊離）ＲＮＡの直接定量分析のために使用され、ならびに試料組成物または対照組成物中のＲＮＡの総量は、放出剤（界面活性剤）を使用して粒子を溶解させた後に求められる。ＵＶシグナル（例えば、２６０ｎｍまたは２８０ｎｍの）をＭＡＬＳシグナルから得られたＲｇ値に対してプロットすることによって得られるグラフは、試料組成物または対照組成物中に含有される粒子のサイズ分布に関する情報を提供し、ならびに対応する累積重量分率分析（ＵＶシグナルを累積重量分率へと変換することによって得られる）は、試料組成物または対照組成物中に含有される粒子の定量的サイズ分布に関する情報を提供する。
【0585】
ＲＮＡ完全性の決定
多くの異なる熱処理された（分解した）ＲＮＡ試験体（９８６ｎｔ～１００００ｎｔの範囲）によって、ＲＮＡ完全性の決定を実施した。ＲＮＡ（実施１回あたり４μｇの注入量）を、ＡＦ４フラクショネーション法（上記を参照）によって分離し、ＲＮＡを、２６０ｎｍにおいてオンラインで検出した。同一の緩衝液中における未処理（未分解）ＲＮＡを含む対照組成物を分離し、処理されたＲＮＡ試料組成物との比較において分析した。ＲＮＡ試料組成物をホルムアミド（６０％（ｖ／ｖ））で希釈し、測定の直前に６０℃で５分間インキュベートした。より高次の分子構造を形成する傾向が低いＲＮＡは、ホルムアミドを用いずに分析することができる。ＲＮＡ完全性の算出のために、ＲＮＡ対照組成物を最初に分析した。最大ピーク高さの溶出時間を求め、最大ピーク高さから実施の終わり（ベースライン）までのピーク面積を算出し、それにより、Ａ５０％（対照）を得た（図２Ａを参照）。第二に、総ピーク面積を算出し、それにより、Ａ１００％（対照）を得た（図２Ｂを参照）。第三に、比率（半ピーク面積／総ピーク面積＝Ａ５０％（対照）／Ａ１００％（対照））を求めて、１００％に設定し、それにより、対照ＲＮＡの完全性を得た（Ｉ（対照））。第四に、処理されたＲＮＡ試料組成物のうちの１つを、以前に求めた溶出時点（対照ＲＮＡ）から実施の終わりまでのピーク面積を算出することによって分析し、それにより、Ａ５０％（試料）を得た（図２Ｃを参照）。第五に、総ピーク面積を算出し、それにより、Ａ１００％（試料）を得た（図２Ｄを参照）。第六に、Ａ５０％（試料）とＡ１００％（試料）との間の比率を算出し、それにより、Ｉ（試料）を得て、ならびに処理したＲＮＡ試料のパーセンテージ完全性を、Ｉ（試料）をＩ（対照）に対して正規化することによって求め、それにより、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性を得た。
多くの異なる熱処理された（分解した）ＲＮＡ試験体（９８６ｎｔ～１００００ｎｔの範囲）によって、ＲＮＡ完全性の決定を実施した。ＲＮＡ（実施１回あたり４μｇの注入量）を、ＡＦ４フラクショネーション法（上記を参照）によって分離し、ＲＮＡを、２６０ｎｍにおいてオンラインで検出した。同一の緩衝液中における未処理（未分解）ＲＮＡを含む対照組成物を分離し、処理されたＲＮＡ試料組成物との比較において分析した。ＲＮＡ試料組成物をホルムアミド（６０％（ｖ／ｖ））で希釈し、測定の直前に６０℃で５分間インキュベートした。より高次の分子構造を形成する傾向が低いＲＮＡは、ホルムアミドを用いずに分析することができる。ＲＮＡ完全性の算出のために、ＲＮＡ対照組成物を最初に分析した。最大ピーク高さの溶出時間を求め、最大ピーク高さから実施の終わり（ベースライン）までのピーク面積を算出し、それにより、Ａ５０％（対照）を得た（図２Ａを参照）。第二に、総ピーク面積を算出し、それにより、Ａ１００％（対照）を得た（図２Ｂを参照）。第三に、比率（半ピーク面積／総ピーク面積＝Ａ５０％（対照）／Ａ１００％（対照））を求めて、１００％に設定し、それにより、対照ＲＮＡの完全性を得た（Ｉ（対照））。第四に、処理されたＲＮＡ試料組成物のうちの１つを、以前に求めた溶出時点（対照ＲＮＡ）から実施の終わりまでのピーク面積を算出することによって分析し、それにより、Ａ５０％（試料）を得た（図２Ｃを参照）。第五に、総ピーク面積を算出し、それにより、Ａ１００％（試料）を得た（図２Ｄを参照）。第六に、Ａ５０％（試料）とＡ１００％（試料）との間の比率を算出し、それにより、Ｉ（試料）を得て、ならびに処理したＲＮＡ試料のパーセンテージ完全性を、Ｉ（試料）をＩ（対照）に対して正規化することによって求め、それにより、試料組成物中に含有されるＲＮＡの完全性を得た。
【0586】
ＲＮＡ量の決定
ＡＦ４フラクトグラムからのＲＮＡ量の決定のため、規定された量（４μｇ）のＲＮＡを含む対照組成物（０．５ｍｇ／ｍＬ）をＡＦ４フラクショネーション法（上記を参照）に供し、ならびに２６０ｎｍまたは２８０ｎｍにおけるＵＶシグナルを検出した。ＵＶピーク面積を求め、それを使用して、以下の方程式に従ってランベルト・ベールの法則を用いてピーク面積から直接的にＲＮＡ濃度を算出した：
ＡＦ４フラクトグラムからのＲＮＡ量の決定のため、規定された量（４μｇ）のＲＮＡを含む対照組成物（０．５ｍｇ／ｍＬ）をＡＦ４フラクショネーション法（上記を参照）に供し、ならびに２６０ｎｍまたは２８０ｎｍにおけるＵＶシグナルを検出した。ＵＶピーク面積を求め、それを使用して、以下の方程式に従ってランベルト・ベールの法則を用いてピーク面積から直接的にＲＮＡ濃度を算出した：
【0587】
【数16】
【0588】
ＲＮＡに対する塩処理の効果の分析
異なるＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡおよびｓａＲＮＡ）に対する異なる塩化ナトリウム濃度の影響を、ＡＦ４フラクショネーション法（上記を参照）を使用して、ならびにＲＮＡのいくつかの特徴（Ｒｇ、Ｒｈ、ＭＷ）を求めることによって、系統的に調査した。異なるＲＮＡを、異なる塩化ナトリウム濃度（例えば、０～５０ｍＭ）によってプレインキュベートして、それをＡＦ４フラクショネーション法に供したが、この場合、実施１回あたりの注入されたＲＮＡの量は、３０～１００μｇであり、ＡＦ４フラクショネーション法は、様々なＮａＣｌ濃度（０～５０ｍＭ ＮａＣｌ）を有する対応する液相を使用した。Ｚｉｍｍプロットを使用してＭＡＬＳシグナルに基づいて異なるＮａＣｌ濃度で処理した各ＲＮＡに対してＲｇ値を求め、それをＮａＣｌ濃度の関数としてプロットした。異なるＮａＣｌ濃度で処理した各ＲＮＡ組成物に対するＲｇ（Ｄ５０）値およびＲｇ（Ｄ９０）値を、下記において説明されるように２６０ｎｍまたは２８０ｎｍでのＵＶシグナルを使用して累積重量分率分析によって算出した。
異なるＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡおよびｓａＲＮＡ）に対する異なる塩化ナトリウム濃度の影響を、ＡＦ４フラクショネーション法（上記を参照）を使用して、ならびにＲＮＡのいくつかの特徴（Ｒｇ、Ｒｈ、ＭＷ）を求めることによって、系統的に調査した。異なるＲＮＡを、異なる塩化ナトリウム濃度（例えば、０～５０ｍＭ）によってプレインキュベートして、それをＡＦ４フラクショネーション法に供したが、この場合、実施１回あたりの注入されたＲＮＡの量は、３０～１００μｇであり、ＡＦ４フラクショネーション法は、様々なＮａＣｌ濃度（０～５０ｍＭ ＮａＣｌ）を有する対応する液相を使用した。Ｚｉｍｍプロットを使用してＭＡＬＳシグナルに基づいて異なるＮａＣｌ濃度で処理した各ＲＮＡに対してＲｇ値を求め、それをＮａＣｌ濃度の関数としてプロットした。異なるＮａＣｌ濃度で処理した各ＲＮＡ組成物に対するＲｇ（Ｄ５０）値およびＲｇ（Ｄ９０）値を、下記において説明されるように２６０ｎｍまたは２８０ｎｍでのＵＶシグナルを使用して累積重量分率分析によって算出した。
【0589】
異なる粒子（ＬＰＸ、ＬＮＰ、またはＶＬＰ）を含むＲＮＡ組成物の分析
様々なＮＰ（ＬＰＸ、ＬＮＰ、ＶＬＰ）の広いセットのキャラクタリゼーション（例えば、サイズ分布の決定）のために、ＡＦ４フラクショネーション法（上記を参照）を適用した。各ＮＰの注入量は、総ＲＮＡ量に対して調節した（ＬＰＸおよびＬＮＰは４μｇ；ＶＬＰ：２０μｇ）。（ｉ）ＡＦ４システムをＵＶ検出器（ＭＷＤ Ａｇｉｌｅｎｔ）およびＭＡＬＳ検出器（ＨＥＬＥＯＳ ＩＩ、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｒｇ値の検出のため）に直接接続し、（ｉｉ）Ｒｈ値の同時決定のためにグラスファイバーによってＭＡＬＳ検出器（番号１６）においてある角度にＤＬＳを外部接続することによって、粒子のオンライン検出を実現した。一部の試料に対しては、ＲＩシグナルを同時に検出するために、ＲＩ検出器（Ｏｐｔｉｌａｂ Ｔ－ｒＥＸ、Ｗｙａｔｔ）も使用した。
様々なＮＰ（ＬＰＸ、ＬＮＰ、ＶＬＰ）の広いセットのキャラクタリゼーション（例えば、サイズ分布の決定）のために、ＡＦ４フラクショネーション法（上記を参照）を適用した。各ＮＰの注入量は、総ＲＮＡ量に対して調節した（ＬＰＸおよびＬＮＰは４μｇ；ＶＬＰ：２０μｇ）。（ｉ）ＡＦ４システムをＵＶ検出器（ＭＷＤ Ａｇｉｌｅｎｔ）およびＭＡＬＳ検出器（ＨＥＬＥＯＳ ＩＩ、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｒｇ値の検出のため）に直接接続し、（ｉｉ）Ｒｈ値の同時決定のためにグラスファイバーによってＭＡＬＳ検出器（番号１６）においてある角度にＤＬＳを外部接続することによって、粒子のオンライン検出を実現した。一部の試料に対しては、ＲＩシグナルを同時に検出するために、ＲＩ検出器（Ｏｐｔｉｌａｂ Ｔ－ｒＥＸ、Ｗｙａｔｔ）も使用した。
【0590】
２つの異なる粒子（ＶＬＰおよびＬＰＸ）を含むＲＮＡ組成物の分析
１．３／２の脂質／ＲＮＡ比によるＲＮＡのアクセスにおいて、低分子ＲＮＡ（４０ｂｐ；タンパク質ベースのワクチンの免疫反応を増強するための補助剤として使用される）と、Ｆ１２リポプレックス（ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ ２／１）とを含むリポプレックス粒子を調製した。結果として得られる低分子ＲＮＡリポプレックス粒子を、第２の工程において１／１のＬＰＸ／ＶＬＰ比におけるＶＬＰ試料組成物と混合し、ならびに前記低分子ＲＮＡ－ＬＰＸ ＶＬＰ試料組成物中に含有される粒子のサイズ分布を求めるために、４μｇの総ＲＮＡをＡＦ４フラクショネーション法（上記を参照）に供した。
１．３／２の脂質／ＲＮＡ比によるＲＮＡのアクセスにおいて、低分子ＲＮＡ（４０ｂｐ；タンパク質ベースのワクチンの免疫反応を増強するための補助剤として使用される）と、Ｆ１２リポプレックス（ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ ２／１）とを含むリポプレックス粒子を調製した。結果として得られる低分子ＲＮＡリポプレックス粒子を、第２の工程において１／１のＬＰＸ／ＶＬＰ比におけるＶＬＰ試料組成物と混合し、ならびに前記低分子ＲＮＡ－ＬＰＸ ＶＬＰ試料組成物中に含有される粒子のサイズ分布を求めるために、４μｇの総ＲＮＡをＡＦ４フラクショネーション法（上記を参照）に供した。
【0591】
様々なＲＮＡ－ＮＰの定量的サイズ分布（例えば、Ｄ９０）
ＲＮＡ－脂質ベースの粒子（ＬＰＸまたはＬＮＰ）を分析するために、４μｇの総ＲＮＡをＡＦ４フラクショネーション法（上記を参照）に供し、その一方で、ＲＮＡ－ポリマーベースのナノ粒子を分析するために、１０μｇの総ＲＮＡをＡＦ４フラクショネーション法に供した。ＡＦ４システムをＵＶ検出器（ＭＷＤ Ａｇｉｌｅｎｔ）およびＭＡＬＳ検出器（ＨＥＬＥＯＳ ＩＩ、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｒｇ値の検出のため）に直接接続する粒子のオンライン検出を実現した。Ｒｈ値の同時決定のために、ＤＬＳをグラスファイバーによって外部的にＭＡＬＳに接続した。ＲＮＡ（遊離および非結合）に関する追加情報を提供するために、２６０ｎｍまたは２８０ｎｍでのオンラインＵＶ検出もＡＦ４－ＭＡＬＳ－ＤＬＳに適用した。定量的サイズ分布に対しては、実験的に得られたＲｇ値を、粒子ピーク画分のＵＶシグナルに対して直接的にプロットした。例えば、より大きい粒子に対するＲｇ値は、保持時間の関数としてプロットすることができ、データ点は、多項式方程式（例えば、ｆ（ｔ）＝ａ＋ｂ１ｘ＋ｂ２ｘ２＋ｂ３ｘ３＋ｂ４ｘ４）または線形方程式（例えば、ｆ（ｔ）＝ａ＋ａ１ｘ）に適合させることができ、ならびにＲｇ値を、多項式適合または線形適合に基づいて再算出することができる。次の工程において、粒子画分のＵＶシグナルが、再算出されたＲｇ値の関数としてプロットされる。ＵＶシグナルは、対応する粒子画分に結合したＲＮＡ量に正比例し、ならびに重量分率に等しい。最終工程において、記録されたＵＶシグナルならびに（Ｄ１０値、Ｄ５０値、およびＤ９０値）を含む対応する累積重量分率分析の値を、Ｒｇ値の関数としてプロットした。粒子サイズ（Ｒｇ値）に対するＵＶシグナルトレースのプロットは、粒子量に関する定量的情報を直接的に提供する。
ＲＮＡ－脂質ベースの粒子（ＬＰＸまたはＬＮＰ）を分析するために、４μｇの総ＲＮＡをＡＦ４フラクショネーション法（上記を参照）に供し、その一方で、ＲＮＡ－ポリマーベースのナノ粒子を分析するために、１０μｇの総ＲＮＡをＡＦ４フラクショネーション法に供した。ＡＦ４システムをＵＶ検出器（ＭＷＤ Ａｇｉｌｅｎｔ）およびＭＡＬＳ検出器（ＨＥＬＥＯＳ ＩＩ、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｒｇ値の検出のため）に直接接続する粒子のオンライン検出を実現した。Ｒｈ値の同時決定のために、ＤＬＳをグラスファイバーによって外部的にＭＡＬＳに接続した。ＲＮＡ（遊離および非結合）に関する追加情報を提供するために、２６０ｎｍまたは２８０ｎｍでのオンラインＵＶ検出もＡＦ４－ＭＡＬＳ－ＤＬＳに適用した。定量的サイズ分布に対しては、実験的に得られたＲｇ値を、粒子ピーク画分のＵＶシグナルに対して直接的にプロットした。例えば、より大きい粒子に対するＲｇ値は、保持時間の関数としてプロットすることができ、データ点は、多項式方程式（例えば、ｆ（ｔ）＝ａ＋ｂ１ｘ＋ｂ２ｘ２＋ｂ３ｘ３＋ｂ４ｘ４）または線形方程式（例えば、ｆ（ｔ）＝ａ＋ａ１ｘ）に適合させることができ、ならびにＲｇ値を、多項式適合または線形適合に基づいて再算出することができる。次の工程において、粒子画分のＵＶシグナルが、再算出されたＲｇ値の関数としてプロットされる。ＵＶシグナルは、対応する粒子画分に結合したＲＮＡ量に正比例し、ならびに重量分率に等しい。最終工程において、記録されたＵＶシグナルならびに（Ｄ１０値、Ｄ５０値、およびＤ９０値）を含む対応する累積重量分率分析の値を、Ｒｇ値の関数としてプロットした。粒子サイズ（Ｒｇ値）に対するＵＶシグナルトレースのプロットは、粒子量に関する定量的情報を直接的に提供する。
【0592】
非結合ＲＮＡ（遊離ＲＮＡ）の量の決定
ＲＮＡ－ＬＰＸにおける非結合ＲＮＡ（遊離ＲＮＡ）の決定のために、ＬＰＸ粒子中における４μｇの総ＲＮＡを上記において説明されるようなＡＦ４フラクショネーション法に供した（例えば、図１を参照）。非結合／遊離ＲＮＡの量は、好ましくは、２６０ｎｍまたは２８０ｎｍでのＵＶ吸収を使用した粒子（例えば、ＬＰＸ）からの非結合／遊離ＲＮＡのベースライン分離を必要とする。非結合／遊離ＲＮＡの決定のために、２つのアプローチを適用することができる：
１）較正曲線を使用するアプローチ：ＲＮＡ－ＬＰＸ粒子中の非結合／遊離ＲＮＡの相対量（％）を、非結合／遊離ＲＮＡのＵＶピーク面積を対照ＲＮＡのＵＶピーク面積に関連付けることによって求める（較正曲線）。
２）直接アプローチ：ランベルト・ベールの法則およびＲＮＡ減衰係数（上記において説明されるような）を使用して、ＵＶ吸収を濃度に直接変換することができる。
ＲＮＡ－ＬＰＸにおける非結合ＲＮＡ（遊離ＲＮＡ）の決定のために、ＬＰＸ粒子中における４μｇの総ＲＮＡを上記において説明されるようなＡＦ４フラクショネーション法に供した（例えば、図１を参照）。非結合／遊離ＲＮＡの量は、好ましくは、２６０ｎｍまたは２８０ｎｍでのＵＶ吸収を使用した粒子（例えば、ＬＰＸ）からの非結合／遊離ＲＮＡのベースライン分離を必要とする。非結合／遊離ＲＮＡの決定のために、２つのアプローチを適用することができる：
１）較正曲線を使用するアプローチ：ＲＮＡ－ＬＰＸ粒子中の非結合／遊離ＲＮＡの相対量（％）を、非結合／遊離ＲＮＡのＵＶピーク面積を対照ＲＮＡのＵＶピーク面積に関連付けることによって求める（較正曲線）。
２）直接アプローチ：ランベルト・ベールの法則およびＲＮＡ減衰係数（上記において説明されるような）を使用して、ＵＶ吸収を濃度に直接変換することができる。
【0593】
脂質およびＲＮＡの異なる比率（「ＮＰ比」）での非結合／遊離ＲＮＡの定量化も、ＡＦ４フラクショネーション法を使用して求めることができるかまたは算出することができる。ＮａＣｌ（１００ｍＭ）を用いずにまたは用いて、異なる電荷比において（０．１～０．９）脂質（ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ ２／１）の混合物をＲＮＡと混合することによって、試料組成物を調製したが、この場合、ＲＮＡ濃度は一定に維持し、脂質の量を変化させた。これらの試料組成物中の非結合／遊離ＲＮＡの決定のために、４０μＬの形成されたナノ粒子（４μｇの総ＲＮＡ）を、ＡＦ４フラクショネーション法に供した。分析は、上記において説明したアプローチに従って実施した。
【0594】
ＲＮＡ－ＬＰＸ試料組成物中のＲＮＡ含有量の総量の決定
ＡＦ４フラクショネーション法を使用したＲＮＡの総量の定量的決定の前に、粒子からＲＮＡを放出させるために、放出剤（例えば、０．５％のＳＤＳまたは０．１％のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（ＺＷ））の添加によってナノ粒子を崩壊させなければならない。４０μＬの試料組成物（４μｇの総ＲＮＡ）を分離の際にナノ粒子の再形成を防ぐために液相が放出剤（例えば、０．０５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ）を含む変更例の、上記において説明されるようなＡＦ４フラクショネーション法に供した。測定した曲線下ＵＶピーク面積は、ランベルト・ベールの法則およびＲＮＡ減衰係数を使用して、ＲＮＡ濃度に直接変換することができる（ならびに、それらを試料組成物中に含有されるＲＮＡの総量に変換することができる）。加えて、ＮＰ崩壊の完全さは、ＭＡＬＳシグナルによってモニターすることができる。
［実施例１］
ＡＦ４フラクショネーション法を使用したＲＮＡの総量の定量的決定の前に、粒子からＲＮＡを放出させるために、放出剤（例えば、０．５％のＳＤＳまたは０．１％のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（ＺＷ））の添加によってナノ粒子を崩壊させなければならない。４０μＬの試料組成物（４μｇの総ＲＮＡ）を分離の際にナノ粒子の再形成を防ぐために液相が放出剤（例えば、０．０５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ）を含む変更例の、上記において説明されるようなＡＦ４フラクショネーション法に供した。測定した曲線下ＵＶピーク面積は、ランベルト・ベールの法則およびＲＮＡ減衰係数を使用して、ＲＮＡ濃度に直接変換することができる（ならびに、それらを試料組成物中に含有されるＲＮＡの総量に変換することができる）。加えて、ＮＰ崩壊の完全さは、ＭＡＬＳシグナルによってモニターすることができる。
［実施例１］
【0595】
ＡＦ４フラクショネーション法を使用したＲＮＡの決定
異なる注入量のＲＮＡ原液を、ＵＶ検出器およびＲＩ検出器を使用してＡＦ４フラクショネーション法によって分析した（ＡＦ４－ＵＶ－ＲＩ）。曲線下ピーク面積（ＵＶは実線；ＲＩは破線）を、注入された量に対してプロットし、線形回帰を適合させた（図３Ａを参照）。ＲＮＡの段階希釈をＡＦ４－ＵＶ－ＲＩによる同一注入量において測定し、前述のように分析した（図３Ｂを参照）。
異なる注入量のＲＮＡ原液を、ＵＶ検出器およびＲＩ検出器を使用してＡＦ４フラクショネーション法によって分析した（ＡＦ４－ＵＶ－ＲＩ）。曲線下ピーク面積（ＵＶは実線；ＲＩは破線）を、注入された量に対してプロットし、線形回帰を適合させた（図３Ａを参照）。ＲＮＡの段階希釈をＡＦ４－ＵＶ－ＲＩによる同一注入量において測定し、前述のように分析した（図３Ｂを参照）。
【0596】
図３ＡおよびＢに示されるデータは、シグナル（ＲＩおよびＵＶ）とＲＮＡ量との間の直接的直線相関を実証している。したがって、これらのデータは、ＲＮＡの直接決定（すなわち、較正曲線を使用しないで）が実行可能であることを証明している。その上、試料希釈は必要ない（キュベットにおいてＲＮＡ溶液のＵＶシグナルを測定することによるＲＮＡ量の決定と比較して）。したがって、幅広い濃度範囲の試料ＲＮＡ組成物を使用することができる（注入量は適合させることができる）。ＡＦ４フラクショネーション法のさらなる利点は、以下である：
－ 低い標準偏差（＜２％）；
－ 低い塩効果（試料が、ＡＦ４フラクショネーション手順の際に「洗浄される」ため）；
－ ＲＮＡの減衰係数の変化を分析し求めることができる。
［実施例２］
－ 低い標準偏差（＜２％）；
－ 低い塩効果（試料が、ＡＦ４フラクショネーション手順の際に「洗浄される」ため）；
－ ＲＮＡの減衰係数の変化を分析し求めることができる。
［実施例２］
【0597】
ＲＮＡ完全性の決定
ＲＮＡを様々な程度に分解させるため、ＲＮＡを熱処理した（９８℃で２分間、４分間、または１０分間）。未処理のＲＮＡ、処理したＲＮＡ（９８℃で２分間、４分間、または１０分間）、または熱分解ＲＮＡと未処理のＲＮＡとによる規定された混合物のいずれかを含む試料組成物を、標準を使用せずにＡＦ４フラクショネーション法（ＡＦ４－ＵＶ－ＲＩ）によって分析した。異なる試料組成物の代表的ＡＦ４フラクトグラム（ｎ＝３）が、図４Ａに表されている。これらのフラクトグラムから、平均曲線下面積を、ランベルト・ベールの法則を適用してＲＮＡ濃度に直接変換し、結果として得られる濃度を、ＲＮＡの分解時間の関数としてプロットした（図４Ｂを参照）。
ＲＮＡを様々な程度に分解させるため、ＲＮＡを熱処理した（９８℃で２分間、４分間、または１０分間）。未処理のＲＮＡ、処理したＲＮＡ（９８℃で２分間、４分間、または１０分間）、または熱分解ＲＮＡと未処理のＲＮＡとによる規定された混合物のいずれかを含む試料組成物を、標準を使用せずにＡＦ４フラクショネーション法（ＡＦ４－ＵＶ－ＲＩ）によって分析した。異なる試料組成物の代表的ＡＦ４フラクトグラム（ｎ＝３）が、図４Ａに表されている。これらのフラクトグラムから、平均曲線下面積を、ランベルト・ベールの法則を適用してＲＮＡ濃度に直接変換し、結果として得られる濃度を、ＲＮＡの分解時間の関数としてプロットした（図４Ｂを参照）。
【0598】
図４Ｂから分かるように、ＲＮＡ分解における異なる程度は（０～５０％分解の範囲において）、ＡＦ４フラクショネーション法を使用するＲＮＡの定量化に対して小さい影響（＜２％）を有する。対照的に、他の定量化法（アガロースゲル、フラグメントアナライザー）は、シグナル強度対分解における強い依存性を示す。
［実施例３］
［実施例３］
【0599】
複合混合物の分離
試料粒子組成物（１．３／２のモル比において脂質およびＲＮＡを含む）を調製し、本明細書において開示されるＡＦ４法に供し、この場合、ＵＶシグナルおよび光散乱（ＬＳ）シグナルを検出した。ＡＦ４法から得られる代表的なフラクトグラムが、図５に示されており、ここで、実線は、９０°の角度でのＬＳシグナルを表し、ならびに粒子ピーク（ｔ＝約３５分）を示しており、その一方で、破線は、ＵＶシグナル（２６０ｎｍにおいて記録）を表し、ならびに結合ＲＮＡ（ｔ＝約３８分）および非結合ＲＮＡ（ｔ＝約２０分）を反映している。
試料粒子組成物（１．３／２のモル比において脂質およびＲＮＡを含む）を調製し、本明細書において開示されるＡＦ４法に供し、この場合、ＵＶシグナルおよび光散乱（ＬＳ）シグナルを検出した。ＡＦ４法から得られる代表的なフラクトグラムが、図５に示されており、ここで、実線は、９０°の角度でのＬＳシグナルを表し、ならびに粒子ピーク（ｔ＝約３５分）を示しており、その一方で、破線は、ＵＶシグナル（２６０ｎｍにおいて記録）を表し、ならびに結合ＲＮＡ（ｔ＝約３８分）および非結合ＲＮＡ（ｔ＝約２０分）を反映している。
【0600】
図５は、ＡＦ４法が、構成要素（遊離ＲＮＡおよびＬＰＸ粒子）の複合混合物を分離することができ、それにより、構成要素が、それらの流体力学半径（Ｒｈ）の関数として溶出されることを示している。ＵＶトレース（破線）は、１８～２５分の保持時間および２５～６０分の間の保持時間における２つの異なるピークを示している。第１のピーク（薄灰色の四角）は、製剤中のＲＮＡのモルアクセスに起因する、溶液中の非結合の遊離ＲＮＡを表しており、第２のピークは、ＬＰＸ粒子を表している（暗灰色の四角）。
【0601】
したがって、図５に提示されるデータにより、ＡＦ４法は、広いサイズ範囲（ｎｍからμｍ）にわたって試料組成物に対して適用可能であり、ならびにＲＮＡおよびナノ粒子の複合混合物の異なる構成要素（ＲＮＡおよびＮＰ）を効率的に分離する。加えて、方法は、より大きなサイズの範囲における多分散ナノ粒子画分（ＬＮＰ、ＬＰＸ、ＶＬＰ、ＲＮＡ）を分離することができ、それは、ＳＥＣのような一般的技術では達成することができない。したがって、ＡＦ４方法は、粒子の複合混合物を含む組成物のサイズ分離のための要件を満たす。
［実施例４］
［実施例４］
【0602】
ＲＮＡ完全性の決定
長さの異なる、異なる熱分解ＲＮＡ（ＲＮＡ＃１～４；サイズ：９８６～１６８８ｎｔ）を含む試料組成物および未処理のＲＮＡを含む対照組成物を調製し、それを、ＡＦ４フラクショネーション法に供した（図６Ａを参照）。同様に、異なる比率を使用するＲＮＡ＃２を含む試料組成物（未処理の（対照）ＲＮＡ、完全に熱分解したＲＮＡ、および未処理のＲＮＡと完全に熱分解したＲＮＡとの５０：５０混合物）を調製し、それを、ＡＦ４フラクショネーション法に供した（図６Ｃを参照）。各試料組成物に対するＲＮＡ完全性を、上記において指定されたＵＶシグナルに基づいて求め（試料組成物および対照組成物の両方に対して、半ピーク面積／総ピーク面積の比率を使用して；少なくともトリプリケートにおいて測定した）、それを、理論的計算値と比較した。試料組成物（暗灰色のバー、中間灰色のバー、および薄灰色のバー）および理論的計算値のＲＮＡ完全性のパーセンテージが、図６Ｂおよび６Ｄに示されている。
長さの異なる、異なる熱分解ＲＮＡ（ＲＮＡ＃１～４；サイズ：９８６～１６８８ｎｔ）を含む試料組成物および未処理のＲＮＡを含む対照組成物を調製し、それを、ＡＦ４フラクショネーション法に供した（図６Ａを参照）。同様に、異なる比率を使用するＲＮＡ＃２を含む試料組成物（未処理の（対照）ＲＮＡ、完全に熱分解したＲＮＡ、および未処理のＲＮＡと完全に熱分解したＲＮＡとの５０：５０混合物）を調製し、それを、ＡＦ４フラクショネーション法に供した（図６Ｃを参照）。各試料組成物に対するＲＮＡ完全性を、上記において指定されたＵＶシグナルに基づいて求め（試料組成物および対照組成物の両方に対して、半ピーク面積／総ピーク面積の比率を使用して；少なくともトリプリケートにおいて測定した）、それを、理論的計算値と比較した。試料組成物（暗灰色のバー、中間灰色のバー、および薄灰色のバー）および理論的計算値のＲＮＡ完全性のパーセンテージが、図６Ｂおよび６Ｄに示されている。
【0603】
図６Ａおよび６Ｃから分かるように、異なる熱分解ＲＮＡは、ＡＦ４法によって分離および検出することができる。算出されたＲＮＡ完全性は、２分間の熱処理では約９５％の完全性、４分間では約９０％の完全性、１０分間では約７０％の完全性による加熱時間依存性分解速度（図６Ｂ）を示した。アプローチを検証するために、分解ＲＮＡおよび未分解ＲＮＡの規定された混合物を、制御された方法において組合せ、分析した（図６Ｄ）。測定したＲＮＡ完全性値は、理論上の計算値と素晴らしく一致する（図６Ｄ）。
【0604】
ＲＮＡにとって１つの主要な重要品質パラメーターは、完全性である。本明細書において説明されるＡＦ４法は、小さい４０ｎｔのＲＮＡから非常に大きい１００００ｎｔのＲＮＡまで及ぶ異なる非製剤化ＲＮＡ試験体からのＲＮＡ完全性の決定にとって好適である。当該方法は、ＲＮＡ完全性における非常に小さな変動も検出することができ、インターカレーティング色素による定量化問題とは無関係である。
［実施例５］
［実施例５］
【0605】
ＡＦ４法および蛍光に基づく方法を使用したＲＮＡ定量化の比較
ＲＮＡと蛍光標識された粒子とを含む試料組成物を調製し、それを、本明細書において説明されるＡＦ４法に供し、この場合、増加した量を注入し、ＵＶシグナルおよび蛍光シグナル（ＦＳ）を検出した。それぞれの試料組成物におけるＵＶピーク面積およびＦＳ粒子ピーク面積を求め、それを注入されたＲＮＡ量に対してプロットした（図７Ａを参照）。その上、試料組成物のＵＶピーク面積とＦＳ粒子ピーク面積との比率を算出し、それを、注入されたＲＮＡ量に対してプロットした（図７Ｂを参照）。
ＲＮＡと蛍光標識された粒子とを含む試料組成物を調製し、それを、本明細書において説明されるＡＦ４法に供し、この場合、増加した量を注入し、ＵＶシグナルおよび蛍光シグナル（ＦＳ）を検出した。それぞれの試料組成物におけるＵＶピーク面積およびＦＳ粒子ピーク面積を求め、それを注入されたＲＮＡ量に対してプロットした（図７Ａを参照）。その上、試料組成物のＵＶピーク面積とＦＳ粒子ピーク面積との比率を算出し、それを、注入されたＲＮＡ量に対してプロットした（図７Ｂを参照）。
【0606】
図７は、両方の検出システムのＡＵＣは、注入されたＲＮＡの漸増濃度による直線性を増加させ、結果として得られるプロットは、広い濃度範囲において匹敵する結果を提供したことを実証している。両方のシグナルの直線挙動は、リポソームに結合した高いＲＮＡ濃度の支配的ＵＶ吸収に起因して、ＵＶシグナルは散乱によって影響を受けないこと、すなわち、いかなる散乱の影響も存在しないことを示している。したがって、図７は、粒子に結合したＲＮＡを定量化するためのＵＶシグナルの適性を実証している。
［実施例６］
［実施例６］
【0607】
遊離ＲＮＡのＵＶシグナルと粒子に結合したＲＮＡのＵＶシグナルとの比率の決定
様々な量のＲＮＡとリポプレックス粒子とを含む試料組成物を調製し、それを、本明細書において説明されるＡＦ４法に供し、この場合、ＵＶシグナルを検出した。ＵＶシグナルから、遊離ＲＮＡおよび粒子に結合したＲＮＡの両方のピーク面積を求め、それをそれぞれの試料組成物中のＲＮＡの総量に対してプロットした；図８Ａを参照。その上、粒子に結合したＲＮＡのピーク面積と遊離ＲＮＡのピーク面積との比率を、各試料組成物において求め、それを、それぞれの試料組成物中のＲＮＡの総量に対してプロットした；図８Ｂを参照。
様々な量のＲＮＡとリポプレックス粒子とを含む試料組成物を調製し、それを、本明細書において説明されるＡＦ４法に供し、この場合、ＵＶシグナルを検出した。ＵＶシグナルから、遊離ＲＮＡおよび粒子に結合したＲＮＡの両方のピーク面積を求め、それをそれぞれの試料組成物中のＲＮＡの総量に対してプロットした；図８Ａを参照。その上、粒子に結合したＲＮＡのピーク面積と遊離ＲＮＡのピーク面積との比率を、各試料組成物において求め、それを、それぞれの試料組成物中のＲＮＡの総量に対してプロットした；図８Ｂを参照。
【0608】
図８Ａから分かるように、遊離ＲＮＡのピークとＬＰＸのピークとの間には、広いＲＮＡの総量にわたって直線関係が存在する。その上、粒子に結合したＲＮＡのピーク面積と遊離ＲＮＡのピーク面積とにおける求められた比率と減衰係数は、広いＬＰＸ濃度範囲にわたって一定であることが見出された（図８Ｂを参照）。そのような比率は、粒子製剤のための追加の品質パラメーターであり得る。
［実施例７］
［実施例７］
【0609】
粒子のサイズ分布の決定 － ＵＶシグナルまたは蛍光シグナルによって得られる結果の比較
ＲＮＡとＡｔｔｏ５９４標識された粒子とを含む試料組成物を調製し、それを、本明細書において説明されるＡＦ４法に供し、この場合、ＵＶシグナル（２６０ｎｍ）、ＭＡＬＳシグナル、および蛍光シグナル（ＦＳ）（６２４ｎｍにおいて放出）を検出した。代表的フラクトグラムが、図９Ａに示されている。ＵＶ／ＦＳ比を算出し、粒子ピーク画分（溶出時間：２２～６０分）からのＵＶシグナルとＵＶ／ＦＳ比を、Ｒｇ値（ＭＡＬＳシグナルに基づいて求めた）に対してプロットした；図９Ｂを参照。ＵＶ／ＦＳ比の５０％未満の変動を有するＲｇ面積が、図９Ｂにおいて強調表示されている（四角）。５０ｎｍから３００ｎｍの間のＲｇ範囲において、ＵＶ／ＦＳ比の変動は小さく、信頼できるサイズ値を与える。より小さいＲｇ値は、ＲＮＡシグナルよって影響を受ける。より大きいＲｇ値は、散乱よって影響を受ける。合計で、これらの影響を受けるＲｇ値は、総シグナル量の１０％未満である。６２４ｎｍでの蛍光放出（黒色のバー）および２６０ｎｍでのＵＶシグナル（灰色のバー）を使用した累積重量分率分析に基づいてＤ１０値、Ｄ５０値、およびＤ９０値を算出した；図９Ｃを参照。蛍光検出器によって得られたフラクトグラム（図９Ａを参照）は、１つのピークのみを示し、それは、蛍光標識されたヘルパー脂質の使用に起因して、リポプレックス粒子（ＬＰＸ）によるものであり、それは、ナノ粒子のみの検出を可能にする。ＵＶおよびＦＳのトレースは、より長い保持時間において変動が少なく、溶出範囲全体において非常に似ており、それは、サイズ増加による散乱の影響が小さいことを示している。粒径分布に関する定量的情報を得るためにＵＶを使用することの実現可能性をさらに証明するために、ＬＰＸ（本明細書において説明されるＡＦ４法によって分画化された）のＵＶ吸収値全体とＦＳシグナル（６２０ｎｍにおいて同時に記録した）との比率を算出し、それを、対応するＲｇ値に対してプロットした（図９Ｂを参照）。結果として得られるＵＶ／ＦＳ比は、広いサイズ範囲にわたって一定であり、より大きなサイズにおいて変動が増加することが見出された。累積重量分率を、定量的Ｄ１０値、Ｄ５０値、およびＤ９０値を提供する両方のシグナルを使用して分析した；図９Ｃを参照。ＵＶシグナルに基づいて求めたこれらのＤ１０値、Ｄ５０値、およびＤ９０値を、ＦＳシグナルに基づいて求めたものと比較する場合、粒子サイズＤ１０およびＤ５０に対しては有意な差は観察されず、より大きいサイズ（Ｄ９０）において小さな差のみが検出される。したがって、これらのデータは、ナノ粒子のみが、無視できる量の光減衰に貢献すること、ならびにＵＶシグナルは、散乱によってあまり強くは影響を受けないことを示している。
ＲＮＡとＡｔｔｏ５９４標識された粒子とを含む試料組成物を調製し、それを、本明細書において説明されるＡＦ４法に供し、この場合、ＵＶシグナル（２６０ｎｍ）、ＭＡＬＳシグナル、および蛍光シグナル（ＦＳ）（６２４ｎｍにおいて放出）を検出した。代表的フラクトグラムが、図９Ａに示されている。ＵＶ／ＦＳ比を算出し、粒子ピーク画分（溶出時間：２２～６０分）からのＵＶシグナルとＵＶ／ＦＳ比を、Ｒｇ値（ＭＡＬＳシグナルに基づいて求めた）に対してプロットした；図９Ｂを参照。ＵＶ／ＦＳ比の５０％未満の変動を有するＲｇ面積が、図９Ｂにおいて強調表示されている（四角）。５０ｎｍから３００ｎｍの間のＲｇ範囲において、ＵＶ／ＦＳ比の変動は小さく、信頼できるサイズ値を与える。より小さいＲｇ値は、ＲＮＡシグナルよって影響を受ける。より大きいＲｇ値は、散乱よって影響を受ける。合計で、これらの影響を受けるＲｇ値は、総シグナル量の１０％未満である。６２４ｎｍでの蛍光放出（黒色のバー）および２６０ｎｍでのＵＶシグナル（灰色のバー）を使用した累積重量分率分析に基づいてＤ１０値、Ｄ５０値、およびＤ９０値を算出した；図９Ｃを参照。蛍光検出器によって得られたフラクトグラム（図９Ａを参照）は、１つのピークのみを示し、それは、蛍光標識されたヘルパー脂質の使用に起因して、リポプレックス粒子（ＬＰＸ）によるものであり、それは、ナノ粒子のみの検出を可能にする。ＵＶおよびＦＳのトレースは、より長い保持時間において変動が少なく、溶出範囲全体において非常に似ており、それは、サイズ増加による散乱の影響が小さいことを示している。粒径分布に関する定量的情報を得るためにＵＶを使用することの実現可能性をさらに証明するために、ＬＰＸ（本明細書において説明されるＡＦ４法によって分画化された）のＵＶ吸収値全体とＦＳシグナル（６２０ｎｍにおいて同時に記録した）との比率を算出し、それを、対応するＲｇ値に対してプロットした（図９Ｂを参照）。結果として得られるＵＶ／ＦＳ比は、広いサイズ範囲にわたって一定であり、より大きなサイズにおいて変動が増加することが見出された。累積重量分率を、定量的Ｄ１０値、Ｄ５０値、およびＤ９０値を提供する両方のシグナルを使用して分析した；図９Ｃを参照。ＵＶシグナルに基づいて求めたこれらのＤ１０値、Ｄ５０値、およびＤ９０値を、ＦＳシグナルに基づいて求めたものと比較する場合、粒子サイズＤ１０およびＤ５０に対しては有意な差は観察されず、より大きいサイズ（Ｄ９０）において小さな差のみが検出される。したがって、これらのデータは、ナノ粒子のみが、無視できる量の光減衰に貢献すること、ならびにＵＶシグナルは、散乱によってあまり強くは影響を受けないことを示している。
【0610】
したがって、これらの結果は、散乱に対する補正要素を必要としない、定量的サイズ測定のためにオンラインＵＶ検出を使用することの実現可能性の証拠を提供する。本明細書において説明されるＡＦ４法は、１回の実施において、拡散係数の関数として粒子を分離する機会（例えば、ＲＮＡを含有するＬＰＸから非結合／遊離ＲＮＡ）、ならびに、遊離ＲＮＡの量およびＲＮＡを含有するＬＰＸのサイズ分布を定量的に求める機会を提供し、それは、ＤＬＳのような従来の方法では不可能である。ＮＴＡ（ナノ粒子追跡解析）のような他の方法も、粒径分布に関する情報を提供し得るが、それらは、他の欠点を有する（例えば、上記のセクション「背景技術」を参照）。例えば、ＮＴＡの場合、試料を１０～１０００倍に希釈しなければならず、それは、とりわけ、粒子の濃度依存性凝集もしくは解体により問題を生じ得、結果として、粒径分布に関する正しくない情報をもたらし得る。
［実施例８］
［実施例８］
【0611】
粒子のいくつかのパラメーターの決定
ＲＮＡと粒子とを含む試料組成物を調製し、それを、本明細書において説明されるＡＦ４法に供し、この場合、ＵＶシグナル（２６０ｎｍにおいて）、ＭＡＬＳシグナル（９０°において）、およびＤＬＳシグナルを検出した。代表的フラクトグラムが、図１０に示されている（ＤＬＳシグナルは、図１０に示されていない）。
ＲＮＡと粒子とを含む試料組成物を調製し、それを、本明細書において説明されるＡＦ４法に供し、この場合、ＵＶシグナル（２６０ｎｍにおいて）、ＭＡＬＳシグナル（９０°において）、およびＤＬＳシグナルを検出した。代表的フラクトグラムが、図１０に示されている（ＤＬＳシグナルは、図１０に示されていない）。
【0612】
図１０に示される分離プロファイルは、ＵＶシグナル（破線）ならびに９０°でのＭＡＬＳシグナル（実線）を含む。Ｂｅｒｒｙプロットを使用して、ＬＰＸピーク（２５～６０分の保持時間）に対するＭＡＬＳシグナルに基づいて、Ｒｇ値（灰色の四角）を求めたところ、８０ｎｍ～４００ｎｍの範囲であった。流体力学半径（Ｒｈ）値（灰色の円）を、ＤＬＳシグナルに基づいて求めたところ、１３０ｎｍ～３００ｎｍの範囲であった。
【0613】
サイズおよびサイズ分布は、薬物送達媒体の重要なパラメーターのうちの２つである（例えば、FDA's "Liposome Drug Products Guidance" 2018）。この実施例によって実証されるように、ＡＦ４法は、複合ナノ粒子の構成要素を効率的に分離することができるだけでなく（ナノ粒子からＲＮＡを）、広いサイズ範囲（ｎｍ～μｍ）にわたる、ナノ粒子のサイズおよびサイズ分布のオンライン決定も可能にする。
［実施例９］
［実施例９］
【0614】
粒子の定量的サイズ分布の決定
実施例８において調製および分析した試料組成物によって得られる実験データを、粒子の定量的サイズ分布を求めるためにさらに分析した。図１０に示されたフラクトグラムが、再び、図１１Ａに示される。定量的サイズ分布の決定のための第１の工程において、図１１Ａに示されたフラクトグラムに含まれる粒子ピーク（溶出時間：２６～５５分）の実験的に求めたＲｇ値を抽出し、それを、多項式方程式に適合させた（薄灰色の線）；図１１Ｂを参照。次いで、Ｒｇ値を、多項式適合に基づいて再算出した。次の工程において、粒子画分のＵＶシグナルを、再算出されたＲｇ値の関数としてプロットした（図１１Ｃの実線を参照）。ＵＶシグナルは、粒子量に正比例し、重量分率に等しい。最終工程において、記録したＵＶシグナルを、対応する累積重量分率値（Ｄ１０値、Ｄ５０値、およびＤ９０値を含む）へと変換し、それを、再算出されたＲｇ値の関数としてプロットした（図１１Ｃの破線を参照）。粒子サイズ（Ｒｇ値）に対するＵＶシグナルのプロットは、粒子量に関する定量的情報を直接的に提供する。
実施例８において調製および分析した試料組成物によって得られる実験データを、粒子の定量的サイズ分布を求めるためにさらに分析した。図１０に示されたフラクトグラムが、再び、図１１Ａに示される。定量的サイズ分布の決定のための第１の工程において、図１１Ａに示されたフラクトグラムに含まれる粒子ピーク（溶出時間：２６～５５分）の実験的に求めたＲｇ値を抽出し、それを、多項式方程式に適合させた（薄灰色の線）；図１１Ｂを参照。次いで、Ｒｇ値を、多項式適合に基づいて再算出した。次の工程において、粒子画分のＵＶシグナルを、再算出されたＲｇ値の関数としてプロットした（図１１Ｃの実線を参照）。ＵＶシグナルは、粒子量に正比例し、重量分率に等しい。最終工程において、記録したＵＶシグナルを、対応する累積重量分率値（Ｄ１０値、Ｄ５０値、およびＤ９０値を含む）へと変換し、それを、再算出されたＲｇ値の関数としてプロットした（図１１Ｃの破線を参照）。粒子サイズ（Ｒｇ値）に対するＵＶシグナルのプロットは、粒子量に関する定量的情報を直接的に提供する。
【0615】
この実施例および他の実施例（例えば、実施例５および７を参照）において実証されるように、ＵＶシグナルおよび対応する累積重量分率分布は、定量的粒径分布プロファイルの決定および分析を可能にする。本明細書において説明されるＡＦ４法は、ロバストで、再現可能であり、ならびに分離された試料の徹底的なキャラクタリゼーションを提供し、結果として、試料組成物内の変化の検出を可能にする。結果は、ＡＦ４法が、量に関する同時情報ならびにサイズおよびサイズ分布に関する定量的情報、すなわち、ＮＰなどの粒子のキャラクタリゼーションのための情報、を提供することを例示している。
［実施例１０］
［実施例１０］
【0616】
粒子のパラメーターに対する異なる脂質／ＲＮＡ比の効果の分析
１００ｍＭ ＮａＣｌを用いてまたは用いずに、異なる脂質／ＲＮＡ比（０．１～０．９）において脂質およびＲＮＡを混合することによって、異なる試料組成物を調製し、それを、本明細書において説明されるＡＦ４法に供した。異なる試料組成物のそれぞれに対して、ＵＶシグナル（２６０ｎｍにおいて）、光散乱シグナル（９０°において）、および対応するＲｇ値（Ｂｅｒｒｙプロットを使用して算出した）を求めた。図１２Ａは、対応するＲｇデータ点と一緒の場合のフラクトグラムの重なりを示している。累積重量分率値を求め、Ｒｇ値を累積重量分率値に対してプロットし、ならびに、９つの試料組成物のそれぞれに対するＤ９０値を求めた（図１２Ｂを参照）。これらのＲｇ（Ｄ９０）値を、１００ｍＭ ＮａＣｌを用いる（黒点）またはＮａＣｌを用いない（白点）の液体／ＲＮＡ比の関数としてプロットした。
１００ｍＭ ＮａＣｌを用いてまたは用いずに、異なる脂質／ＲＮＡ比（０．１～０．９）において脂質およびＲＮＡを混合することによって、異なる試料組成物を調製し、それを、本明細書において説明されるＡＦ４法に供した。異なる試料組成物のそれぞれに対して、ＵＶシグナル（２６０ｎｍにおいて）、光散乱シグナル（９０°において）、および対応するＲｇ値（Ｂｅｒｒｙプロットを使用して算出した）を求めた。図１２Ａは、対応するＲｇデータ点と一緒の場合のフラクトグラムの重なりを示している。累積重量分率値を求め、Ｒｇ値を累積重量分率値に対してプロットし、ならびに、９つの試料組成物のそれぞれに対するＤ９０値を求めた（図１２Ｂを参照）。これらのＲｇ（Ｄ９０）値を、１００ｍＭ ＮａＣｌを用いる（黒点）またはＮａＣｌを用いない（白点）の液体／ＲＮＡ比の関数としてプロットした。
【0617】
図１２Ａは、ＡＦ４法を使用することによって、遊離ＲＮＡを、物理化学的に不均一なナノ粒子（ＬＰＸ）から効率的に分離することができ、ならびに定量化することができることを示している。加えて、図１２Ａは、試料組成物の構成要素（すなわち、遊離ＲＮＡおよび粒子）の物理化学的特性／パラメーター（例えば、Ｒｇ）に対する、試料組成物の合成の際の異なる脂質／ＲＮＡ比の効果を例示している。図１２Ｂおよび１２Ｃにより、粒子のサイズは、粒子によってあまり変化しなかった（０．１から０．４の間の脂質／ＲＮＡ比）。より大きい粒子は、より高い比率（＞０．４）において形成された。サイズは、ＬＰＸ試料に対してリポソームの量の増加と共に直線的に増加するが、イオン強度によって影響を受けるようには見えない。データは、リポソームのアクセスの増加は、結果として、得られる粒子のサイズの増加をもたらすことを示している。塩の不在は、示された電荷比でのサイズの減少につながる。
【0618】
この実施例は、ＡＦ４法が、遊離ＲＮＡおよび粒子の分離および定量化、ならびに様々な電荷比での粒子の定量的サイズ分布の決定およびキャラクタリゼーションを可能にすることを示している。したがって、当該方法は、ＲＮＡ－ＬＰＸ相互作用を分析するための有用な分析ツールであり、ならびに、１回の実施において、異なるナノ粒子に関する定量的および定性的情報を与えることができることが実証された。
［実施例１１］
［実施例１１］
【0619】
粒子の形態の評価
算出されたＲｇ値（例えば、実施例８から）をＲｈ値（ＤＬＳシグナルに基づいて求めた）に対してプロットして、データを線形方程式に適合させることによって、粒子形状に関するさらなる情報を受け取ることができる。線形回帰の傾きは、粒子形状に関する情報を提供する。例えば、０．７４の傾きは、分析したナノ粒子に対して球状の形状を示している。Ｒｇ値とＲｈ値との比率は、形状因子とも呼ばれる。
［実施例１２］
算出されたＲｇ値（例えば、実施例８から）をＲｈ値（ＤＬＳシグナルに基づいて求めた）に対してプロットして、データを線形方程式に適合させることによって、粒子形状に関するさらなる情報を受け取ることができる。線形回帰の傾きは、粒子形状に関する情報を提供する。例えば、０．７４の傾きは、分析したナノ粒子に対して球状の形状を示している。Ｒｇ値とＲｈ値との比率は、形状因子とも呼ばれる。
［実施例１２］
【0620】
異なるタイプの粒子の分離およびキャラクタリゼーション
異なるタイプの粒子（ＬＰＸ、ＬＮＰ、ＰＬＸ、リポソーム、ＶＬＰｓ＋ＬＰＸ）を含む試料組成物を調製し、それを、本明細書において説明されるＡＦ４法を使用して分析した。図１４は、ＡＦ４－ＵＶ－ＭＡＬＳ－ＤＬＳ分離／検出を示している。９０°の角度でのＬＳが実線として表されており、それは、粒子ピークを示す。破線は、２６０ｎｍにおいて記録されたＵＶシグナル（ＲＮＡ検出のため）を表す。回転半径（Ｒｇ）値（暗い点）は、Ｚｉｍｍプロット（ＲＮＡおよびＶＬＰ）およびＢｅｒｒｙプロット（ＬＮＰ）を使用した多角度光散乱（ＭＡＬＳ）シグナルから得られる。動的光散乱（ＤＬＳ；灰色の点）は、流体力学半径（Ｒｈ ）を提供する。個別の粒子ピーク画分は、灰色のバーによって強調表示される。図１４Ａは、ＡＦ４－ＵＶ－ＭＡＬＳ－ＤＬＳ分離／検出の後の、１．３／２のモル比において脂質およびＲＮＡを含有するＬＰＸ試料の代表的フラクトグラムを示している。図１４Ｂは、２つのタイプの粒子を含む組成物（低分子ＲＮＡ－ＬＰＸ：ＶＬＰ、１：１混合物）の代表的フラクトグラムを表している。図１４Ｃは、リポソーム試料（２／１のモル比のＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥで構成された、正に帯電したリポソーム）の代表的フラクトグラムを示している。図１４Ｄは、ＬＰＸ試料（４／１のモル比においてＤＯＴＭＡおよびコレステロールならびにＲＮＡを含有する、正に帯電したＬＰＸ）の代表的フラクトグラムを表している。図１４Ｅは、３／１のモル比においてＤＯＤＭＡ、コレステロール、ＤＯＰＥ、ＰＥＧ（１．２／１．４４／０．３／０．０６のモル比）およびＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）試料の代表的フラクトグラムを示している。図１４Ｆは、１２／１の粒子とＲＮＡの比においてＪｅｔＰＥＩポリマーおよびＩＶＴ－ＲＮＡもしくはｓａＲＮＡを含有する、粒子の代表的フラクトグラムを表している。
異なるタイプの粒子（ＬＰＸ、ＬＮＰ、ＰＬＸ、リポソーム、ＶＬＰｓ＋ＬＰＸ）を含む試料組成物を調製し、それを、本明細書において説明されるＡＦ４法を使用して分析した。図１４は、ＡＦ４－ＵＶ－ＭＡＬＳ－ＤＬＳ分離／検出を示している。９０°の角度でのＬＳが実線として表されており、それは、粒子ピークを示す。破線は、２６０ｎｍにおいて記録されたＵＶシグナル（ＲＮＡ検出のため）を表す。回転半径（Ｒｇ）値（暗い点）は、Ｚｉｍｍプロット（ＲＮＡおよびＶＬＰ）およびＢｅｒｒｙプロット（ＬＮＰ）を使用した多角度光散乱（ＭＡＬＳ）シグナルから得られる。動的光散乱（ＤＬＳ；灰色の点）は、流体力学半径（Ｒｈ ）を提供する。個別の粒子ピーク画分は、灰色のバーによって強調表示される。図１４Ａは、ＡＦ４－ＵＶ－ＭＡＬＳ－ＤＬＳ分離／検出の後の、１．３／２のモル比において脂質およびＲＮＡを含有するＬＰＸ試料の代表的フラクトグラムを示している。図１４Ｂは、２つのタイプの粒子を含む組成物（低分子ＲＮＡ－ＬＰＸ：ＶＬＰ、１：１混合物）の代表的フラクトグラムを表している。図１４Ｃは、リポソーム試料（２／１のモル比のＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥで構成された、正に帯電したリポソーム）の代表的フラクトグラムを示している。図１４Ｄは、ＬＰＸ試料（４／１のモル比においてＤＯＴＭＡおよびコレステロールならびにＲＮＡを含有する、正に帯電したＬＰＸ）の代表的フラクトグラムを表している。図１４Ｅは、３／１のモル比においてＤＯＤＭＡ、コレステロール、ＤＯＰＥ、ＰＥＧ（１．２／１．４４／０．３／０．０６のモル比）およびＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）試料の代表的フラクトグラムを示している。図１４Ｆは、１２／１の粒子とＲＮＡの比においてＪｅｔＰＥＩポリマーおよびＩＶＴ－ＲＮＡもしくはｓａＲＮＡを含有する、粒子の代表的フラクトグラムを表している。
【0621】
図１４は、ＡＦ４法が粒子の幅広い試験体に対して適用することができることを実証している。溶出プロファイルは、例えば、粒子のサイズ分布の決定を可能にする。その上、試料中の凝集物を検出することができ（例えば、図１４Ｂ）、ならびに異なるタイプの粒子を、非結合の遊離ＲＮＡ（図１４Ａ／Ｂ／ＦにおけるマークされていないＵＶピーク）から効率的に分離することができる。
［実施例１３］
［実施例１３］
【0622】
塩による処理後の非製剤化ＲＮＡのキャラクタリゼーション
ＡＦ４法を使用して、イオン（塩化ナトリウム）の存在下でのＲＮＡ挙動を分析した。異なる塩化ナトリウム濃度（０～５０ｍＭ）において様々なＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）をプレインキュベートすることによって、試料組成物を調製した。異なる塩化ナトリウム濃度（０～５０ｍＭ）における非製剤化ＲＮＡからの例示的ＡＦ４フラクトグラム（９０°での光散乱が示される）を図１５に表す。Ｒｇ値は、Ｚｉｍｍプロットを使用してＭＡＬＳシグナルから得た。
ＡＦ４法を使用して、イオン（塩化ナトリウム）の存在下でのＲＮＡ挙動を分析した。異なる塩化ナトリウム濃度（０～５０ｍＭ）において様々なＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）をプレインキュベートすることによって、試料組成物を調製した。異なる塩化ナトリウム濃度（０～５０ｍＭ）における非製剤化ＲＮＡからの例示的ＡＦ４フラクトグラム（９０°での光散乱が示される）を図１５に表す。Ｒｇ値は、Ｚｉｍｍプロットを使用してＭＡＬＳシグナルから得た。
【0623】
図１５から分かるように、別々に処理されたＲＮＡは、ＡＦ４法によって分離および検出することができる。非常に少量のみの、より高い分子量オーダーの凝集体を検出することができた。興味深いことに、ＲＮＡのＲｇ値は、塩化ナトリウム濃度の増加の関数として減少し、したがって、イオン濃度と逆相関する（ＮａＣｌを用いない約８０ｎｍから、５０ｍＭ ＮａＣｌを用いる２０ｎｍまで）。その上、保持時間は、塩濃度の増加と共により長い時点へとシフトした（ＮａＣｌを用いない約１５分から、５０ｍＭ ＮａＣｌを用いる１８分へ）。このシフトは、ＲＮＡのＲｈにおける変化を示している（より小さいＲｈ値から、より大きいＲｈ値へ）。形状因子（Ｒｈ／Ｒｇ）を算出することができ、それは、塩の存在下でのＲＮＡのコンパクト化を示している。
【0624】
異なる塩化ナトリウム濃度（０～５０ｍＭ）で処理した各々の試料組成物に対して定量的サイズ分布ならびにＲｇ（Ｄ５０）値を求めるために、上記のデータを累積重量分率分析に供した；図１６Ａを参照。ＲＮＡのＲｇ（Ｄ５０）値（図１６Ａから）を塩化ナトリウム濃度に対してプロットして、比率（ｍＭ塩化ナトリウム対ｎｍ Ｒｇ）を算出した。０～１０ｍＭ ＮａＣｌ値の比率の線形適合が太い線で表されており、その一方で、点線は、１０～５０ｍＭ ＮａＣｌの適合を表す。灰色と黒色の線は、２つの異なるＲＮＡ濃度による測定の例を表している。
【0625】
図１６から分かるように、塩が低濃度において存在する場合（０～５ｍＭ ＮａＣｌ）、Ｒｇ値の大幅な減少（約３０％）が存在する。より高い塩濃度において（１０ｍＭ ＮａＣｌ）、Ｒｇ値の減少の進行は低下する。図１６Ｂにより、より低いＮａＣｌ濃度（０～１０ｍＭ）には線形相関が存在するが、その一方で、高いＮａＣｌ濃度（５０ｍＭ）では、非線形相関が見られる。このことは、低濃度のイオンの存在下でのＲＮＡの強力なコンパクト化によって説明することができるが（５ｍＭ ＮａＣｌによって３０％のＲｇ減少）、その一方で、依然として、ＲＮＡのさらなるコンパクト化（約３０％）が、ある程度まで生じ得、ただし、それは、はるかに高いイオン濃度（５０ｍＭ ＮａＣｌ）を必要とする。
【0626】
イオンは、ＲＮＡの折り畳み／コンパクト化を駆動する１つの重要な因子であり、それは、ナノ粒子のＲＮＡ負荷能力に影響を及ぼす。本明細書において説明されるＡＦ４プロトコルは、塩化ナトリウム処理されたＲＮＡ（例えば、ＩＶＴ－ＲＮＡおよびｓａＲＮＡ）のＲｇ値における変化の分析にとって好適である。
［実施例１４］
［実施例１４］
【0627】
複合試料組成物中の遊離ＲＮＡの分離および定量化
この実施例は、複合試料組成物中の遊離／非結合ＲＮＡの定量化を例示している。ＲＮＡと粒子とを含む試料組成物中の遊離ＲＮＡの決定に対するＡＦ４法の適性を示すために、２６０ｎｍでのＵＶ検出を使用して裸のＲＮＡの較正曲線を実施した。
この実施例は、複合試料組成物中の遊離／非結合ＲＮＡの定量化を例示している。ＲＮＡと粒子とを含む試料組成物中の遊離ＲＮＡの決定に対するＡＦ４法の適性を示すために、２６０ｎｍでのＵＶ検出を使用して裸のＲＮＡの較正曲線を実施した。
【0628】
本明細書において開示されるＡＦ４法を使用して、粒子を用いない組成物における２６０ｎｍでのＵＶ吸収によって、異なる量の遊離ＲＮＡ（１～１５μｇ）を検出した。線形較正曲線を作製するために、ＲＮＡ量をそれぞれの曲線下ＵＶピーク面積（ＡＵＣ＊分）に対してプロットした（図１７Ａを参照）。様々な量の試料組成物（１～１５μｇの総ＲＮＡを含有する）を、ＡＦ４法によって分析した。重ねられたＡＦ４フラクトグラムは、２６０ｎｍでのＵＶシグナルを示している（図１７Ｂを参照）。第１のピーク（溶出時間：約２０分）は、遊離ＲＮＡに対応し、その一方で、第２のピーク（溶出時間：約３８分）は、粒子（結合ＲＮＡ）に対応する。粒子組成物中の結合していない遊離ＲＮＡの量は、基準ＲＮＡ（＝１００％）との関係において算出することができる（図１７Ａを参照）。方法の線形性を示すために、遊離ＲＮＡ（図１７Ｂを参照）ならびに裸の基準ＲＮＡ（図１７Ａを参照）のＵＶピーク積分を、異なるＲＮＡ量（１～１５μｇ）の関数としてプロットした（図１７Ｃを参照）。遊離ＲＮＡの定量化のための第２の好ましい手順（直接法）として、非結合ＲＮＡピークを定義し、ＲＮＡ量は、ＲＮＡの比減衰係数を使用して直接算出することができる（ランベルト・ベールの法則）（図１７Ｄを参照）。
【0629】
図１７から分かるように、ＵＶシグナル面積は、再現可能な方法において、示された範囲において試料濃度に比例することが見出された。図１７Ａは、ＵＶシグナルを使用したＲＮＡの定量化に対して直線挙動を示すＲＮＡの異なる量の関数としてのＵＶシグナルのＡＵＣを示している。その上、図１７Ｂにより、非結合ＲＮＡの溶出挙動において変化は観察されなかった。図１７Ｃにおいて、裸のＲＮＡならびにナノ粒子の遊離ＲＮＡのＵＶシグナル積分が、ＲＮＡの異なる量の関数として示されている。両方のプロットを線形適合させたところ、それらは、直接相関を示す。これは、裸のＲＮＡによる較正曲線を実施することなく、ＮＰ試料中の遊離ＲＮＡを定量化するためにＵＶシグナル（ＡＵＣ＊分）を直接利用することができることの実行可能性を示している。したがって、示された直線範囲において、同じ量の適切な裸のＲＮＡに関して遊離ＲＮＡを直接定量化することができる。結果は、コロイド状製剤中の遊離ＲＮＡのパーセンテージ（％）を与える。
【0630】
したがって、この実施例は、ＡＦ４法が、基準試料または正規化を必要とせずに、粒子を含む試料組成物中の遊離ＲＮＡの直接定量化ためのスタンダードレス法として使用することができることを示している。その上、粒子を含む試料組成物のさらなる品質指標として、遊離ＲＮＡとＮＰとの比率を求めることができる。
［実施例１５］
［実施例１５］
【0631】
異なる試料組成物中の遊離ＲＮＡの分離および定量化
この実施例は、異なる物理学的挙動を有する試料組成物中の遊離ＲＮＡ量の分析を示している。試料粒子組成物（様々な電荷比（０．１～０．９）において混合した（ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ ２／１）／ＲＮＡ複合体）を、ＮａＣｌを用いずに（図１８Ａを参照）または１００ｍＭ ＮａＣｌを用いて（図１８Ｂを参照）調製し、それを、本明細書において説明されるＡＦ４法を使用して分析した。全ての混合物をデュブリケートにおいて調製し、ならびに少なくともデュブリケートにおいて測定した。１００ｍＭ ＮａＣｌを用いた（黒色の円）およびＮａＣｌを用いない（白色の円）、算出された非結合ＲＮＡのパーセンテージを、電荷比に対してプロットした。
この実施例は、異なる物理学的挙動を有する試料組成物中の遊離ＲＮＡ量の分析を示している。試料粒子組成物（様々な電荷比（０．１～０．９）において混合した（ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ ２／１）／ＲＮＡ複合体）を、ＮａＣｌを用いずに（図１８Ａを参照）または１００ｍＭ ＮａＣｌを用いて（図１８Ｂを参照）調製し、それを、本明細書において説明されるＡＦ４法を使用して分析した。全ての混合物をデュブリケートにおいて調製し、ならびに少なくともデュブリケートにおいて測定した。１００ｍＭ ＮａＣｌを用いた（黒色の円）およびＮａＣｌを用いない（白色の円）、算出された非結合ＲＮＡのパーセンテージを、電荷比に対してプロットした。
【0632】
図１８Ａおよび１８Ｂは、ＡＦ４法が、物理化学的に不均一なＮＰ（ＬＰＸ）試料（脂質／ＲＮＡ電荷比）から遊離ＲＮＡを効率的に分離および定量化することができ、ならびにさらに、異なるＬＰＸを分離することができる。遊離ＲＮＡの相対量を、脂質／ＲＮＡ電荷比の関数として算出し、この場合、ＲＮＡ濃度は一定（０．１ｍｇ／ｍＬ）に維持して、リポソーム量を変更した。混合物のイオン強度（０対１００ｍＭ ＮａＣｌ）も変更した。脂質／ＲＮＡ比およびイオン強度（０～１００ｍＭ ＮａＣｌ）に応じて、遊離ＲＮＡの量における明確な変化が見られた。全ての試料組成物における遊離ＲＮＡの保持時間は、全ての試料において同じであった（図１８Ａ／Ｂ）。遊離ＲＮＡの量は、ＮａＣｌの有無にかかわらずＬＰＸ試料のリポソームの量の増加と共に直線的に減少した。塩の存在は、検出可能な遊離ＲＮＡの量における減少を引き起こした（最大で１５％まで）。これらのデータから、塩の添加は、ＬＰＸ結合ＲＮＡの量を約１５％増加させることができると結論付けることができる。１００ｍＭ ＮａＣｌを用いた（黒色の円）およびＮａＣｌを用いない（白色の円）非結合ＲＮＡの濃度（μｇ／ｍＬ）を表す図１８Ｄも、同じ結果を示している。
【0633】
この実施例は、ＡＦ４法が、非結合ＲＮＡの分離ならびに不均一なＬＰＸ試料中の遊離薬物（ＲＮＡ）のオンライン定量化を可能にすることを実証している。方法は、ＲＮＡ－ＬＰＸ相互作用を決定するための有用な分析ツールであり、ならびに、一回の実施において、粒子に関する定量的情報を与えることができる。
［実施例１６］
［実施例１６］
【0634】
試料組成物中の総ＲＮＡの定量化
この実施例は、本明細書において説明されるＡＦ４法を使用した粒子組成物中の総ＲＮＡの定量化を例示している。
この実施例は、本明細書において説明されるＡＦ４法を使用した粒子組成物中の総ＲＮＡの定量化を例示している。
【0635】
図１９Ａは、ＡＦ４法によって分離された、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ処理した裸のＲＮＡのフラクトグラムを示している。２６０ｎｍでのＵＶシグナルは、黒色の線で表されており、ならびに、９０°でのＬＳシグナルは、破線によって表されている。図１９Ｂは、遊離ＲＮＡ（灰色で強調表示される）および結合ＲＮＡ（第２のピーク）によるＵＶ検出（実線）と、９０°の角度でのＬＳシグナル（破線）とによる粒子組成物の代表的フラクトグラムを表している。図１９Ｃは、粒子が放出剤を使用して溶解されている（液相は０．１％のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔを含有した）ＲＮＡ組成物の、ＵＶ検出（実線）および９０°での光散乱（破線）による対応するフラクトグラムを示している。図１９Ｄは、放出剤（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）による処理後の裸のＲＮＡおよび総ＲＮＡの直接的定量化を表している。
【0636】
ＦＤＡガイダンスにおける重要な品質パラメーターであると見なされるパラメーターは、試料組成物中の遊離ＲＮＡ濃度、結合ＲＮＡ濃度、および総ＲＮＡ濃度である。脂質ベースの製剤中の総ＲＮＡを定量化するためにＵＶ検出を使用することの課題は、遊離ＲＮＡと結合ＲＮＡの減衰係数の違いにある。ＬＰＸ中の総ＲＮＡ濃度の定量化のために２６０ｎｍでのＵＶ検出を使用するためには、これらの違いを排除しなければならない。これらのタスクに対処するために、２つの異なるアプローチを適用することができる。第１のアプローチは、複合化ＲＮＡの減衰係数の決定に基づいており、それは、決定のために多量のＲＮＡを必要とするため、より複雑である。第２のアプローチは、結合ＲＮＡを製剤から放出させることに基づいている。総ＲＮＡの定量的決定の前に、粒子からＲＮＡを放出させるために、放出剤（例えば、界面活性剤、例えば、０．５％のＳＤＳまたは０．１％のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（ＺＷ））、の添加によってナノ粒子を崩壊させなければならない。分離の際のナノ粒子の再形成を防ぐために、溶解したＬＰＸの分離を、例えば、０．０５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳまたは０．０５％（ｗ／ｖ）のＺＷを含有する液相によって実施した。溶解したＬＰＸの分離は、結果として、フラクトグラムにおけるＵＶシグナルの増加を伴うＬＳピークの減少を生じた（図１９Ｃ）。裸の対照ＲＮＡのＵＶシグナルは（図１９Ａ）、粒子から放出されたＲＮＡの記録されたＵＶシグナルに匹敵した（図１９Ｃ）。
【0637】
したがって、溶解されたＬＰＸの得られたＵＶピーク面積は、粒子製剤中の総ＲＮＡ濃度（ｍｇ／ｍＬ）に直接変換することができる。両方のＲＮＡに対して同じ減衰係数を使用してｍｇ／ｍＬにおいて計算された濃度は、裸の対照ならびにＬＰＸから放出されたＲＮＡに対して、匹敵する結果を示す（図１９Ｄ）。
【0638】
結果は、ＡＦ４法は、遊離ＲＮＡの量の決定ならびにＲＮＡと粒子とを含む組成物中のＲＮＡの総量の定量化を可能にすることを示している。
［実施例１７］
［実施例１７］
【0639】
試料組成物中の遊離ＲＮＡおよび総ＲＮＡの完全性の決定
この実施例は、本明細書において開示されるＡＦ４法を使用した、ＲＮＡおよび粒子を含有する試料組成物中の遊離ＲＮＡおよび総ＲＮＡの完全性の決定を例示している。
この実施例は、本明細書において開示されるＡＦ４法を使用した、ＲＮＡおよび粒子を含有する試料組成物中の遊離ＲＮＡおよび総ＲＮＡの完全性の決定を例示している。
【0640】
図２０Ａは、ＡＦ４法を使用した、ＲＮＡ完全性の異なるＲＮＡを伴う分離された粒子のＵＶトレースを示している（未処理のＲＮＡ：黒色の実線；部分的に熱分解したＲＮＡ：点線；混合物（５０％の未処理のものと５０％の完全に分解したものとを規定された方式において混合した）：破線；粒子中の完全に分解したＲＮＡ：灰色の実線）。図２０Ｂは、無傷の遊離ＲＮＡ（暗い灰色）ならびに粒子中の総ＲＮＡ（黒色）および完全に分解した（薄灰色）遊離ＲＮＡの定量化を表している。図２０Ｃは、ＡＦ４分離（液相において放出剤を使用する）後の溶解した粒子のＵＶトレースを示している。図２０Ｄは、粒子中の遊離ＲＮＡおよび総ＲＮＡのＡＦ４－ＵＶ測定によって分析した、求められた完全性を表している。棒グラフは、粒子中の総ＲＮＡ値の求められた完全性（黒色のバー）と比較した、遊離ＲＮＡ（灰色のバー）の相対的ＲＮＡ完全性を表す。
【0641】
ＲＮＡ完全性は、上記において言及したような重要な品質パラメーターである。この実施例は、ＡＦ４法は、他の方法（例えば、毛細管電気泳動法）によって実現することができない、裸のＲＮＡおよび総ＲＮＡの完全性の決定を可能にすることを実証している。
【0642】
図２０Ａは、異なる分解ＲＮＡ（未分解ＲＮＡから熱分解ＲＮＡまで）を用いて調製されたＬＰＸの、重ねられたＵＶフラクトグラムを示している。無傷の未処理ＲＮＡは、１３～２５分（遊離ＲＮＡ）および２５～６０分（ナノ粒子）において溶出する２つの異なるピークを与えた。完全に分解したＲＮＡ（９８℃、１６時間）は、０～１０分（分解した遊離ＲＮＡ）および２２～５０分に２つの異なるピークを有する灰色の実線として示されている。未処理のＲＮＡと完全に分解したＲＮＡとの混合物（５０％の未処理のＲＮＡと５０％の完全に分解したＲＮＡと混合することによって調製した）が、０～１０分（分解した遊離ＲＮＡ）、１３～２５分（無傷の遊離ＲＮＡ）、および２５～５５分（ナノ粒子）に３つの異なるピークを有する点線として示されている。さらなる試料組成物は、部分的に分解したＲＮＡ（９８℃で１５分間熱処理したＲＮＡ）およびＬＰＸを含んだ。これらの試料組成物を、ＡＦ４法によって分離し、それを、ＵＶ検出を使用して分析した。分離されたＬＰＸのＵＶシグナルが、黒色の点線として示されており、２つの異なるピークが、５～２５分（遊離ＲＮＡ、部分的に分解したＲＮＡ）および２５～５５分（ＬＰＸ）に現れている。無傷の遊離ＲＮＡの量における違いが、図２０Ｂに示されており、それは、ＲＮＡの分解の程度に対応する。完全に分解したＲＮＡを含むＬＰＸ組成物の場合、無傷の遊離ＲＮＡは検出可能ではなく、その一方で、混合物を含む試料組成物は、２２％の無傷の遊離ＲＮＡを含有し、ならびに未処理のＲＮＡを含む試料組成物は、５２％の無傷の遊離ＲＮＡを含有した。遊離ＲＮＡの総量を見たところ、ほぼ匹敵する結果が観察された。遊離ＲＮＡのわずかな増加（５５～６０％）が、ＲＮＡ分解の増加に伴って観察された。しかしながら、混合物を含む試料組成物中の遊離ＲＮＡの完全性は、予想（５０％）より低く（３７％）、それは、完全に分解したＲＮＡと比べて、カチオン性脂質に対する無傷のＲＮＡの好ましい相互作用を示している。完全に分解したＲＮＡの完全性は、製剤中のより多量の分解した遊離ＲＮＡに起因して（１２％、図２０）、遊離ＲＮＡの完全性に影響を及ぼす。これらの研究結果（無傷のＲＮＡと分解したＲＮＡとの混合物における、より高い総ＲＮＡの完全性値、より低い遊離ＲＮＡの完全性値）は、カチオン性脂質への無傷のＲＮＡの好ましい結合を示しており、その一方で、混合物を含む試料組成物中の遊離ＲＮＡの完全性ならびに含有量は、匹敵するように見える。
【0643】
図２０Ｃは、放出剤を含む対応するＬＰＸ試料組成物の、重ねられたＵＶフラクトグラムを示している。全てのＬＰＸ粒子に対するより長い溶出時間におけるＵＶピークは消失し、ならびに結合ＲＮＡの溶出時間は、遊離ＲＮＡの溶出時間へとシフトした。
【0644】
したがって、この実施例は、本明細書において説明されるＡＦ４法が、ＬＰＸ中のＲＮＡ（遊離ＲＮＡ、結合ＲＮＡ、総ＲＮＡ）の異なる画分を分離することができ、ならびに、分画化されたＲＮＡの完全性を決定することができることを実証している。加えて、ＡＦ４法は、一回の実施において、粒子のＲＮＡ完全性とＲＮＡ量（ＵＶ検出に基づく）を同時に算出することを可能にする。これらのパラメーターの同時解析は、他の従来の技術では実現することができない。
［実施例１８］
［実施例１８］
【0645】
試料組成物中の遊離ＲＮＡ、アクセス可能なＲＮＡ、および封入ＲＮＡの決定
この実施例は、本明細書において開示されるＡＦ４法を使用した、試料組成物中の遊離ＲＮＡ、アクセス可能なＲＮＡ、および封入ＲＮＡの決定を例示している。
この実施例は、本明細書において開示されるＡＦ４法を使用した、試料組成物中の遊離ＲＮＡ、アクセス可能なＲＮＡ、および封入ＲＮＡの決定を例示している。
【0646】
ＡＦ４法の蛍光位検出の直線性が、図２２Ａに示されており：この場合、異なる量のＲＮＡ（０ｍＭ対１００ｍＭ ＮａＣｌ）が注入され、本明細書において説明されるＡＦ４法によって分離された。注入の前に、蛍光検出（６００ｎｍ）のためにＲＮＡにインターカレーティング色素（ＧｅｌＲＥＤ）を加えた。図２２Ｂは、ＮａＣｌを用いないおよび用いた（１００ｍＭ）ＬＰＸ組成物中のアクセス可能なＲＮＡ（黒色のバー）および封入ＲＮＡ（灰色のバー）の相対量を示す棒グラフを表している。蛍光放出シグナルの検出のために、ＬＰＸ形成の前または後に、インターカレーティング色素（ＧｅｌＲＥＤ；６００ｎｍ）を加えた。図２２Ｃは、本明細書において開示されるＡＦ４法を使用した、粒子組成物（ＬＰＸ）中の遊離ＲＮＡの相対量の比較を示しており、ならびに、スキームが、図２１に表されており、この場合、量は、異なるＲＮＡ検出：２６０ｎｍでのＵＶ吸収（黒色のバー）および６００ｎｍでの蛍光放出シグナル（ＦＳ）（灰色のバー）、を使用して求めた。
［実施例１９］
［実施例１９］
【0647】
基準ＲＮＡを使用しないＲＮＡ完全性の分析
この実施例は、本明細書において開示されるＡＦ４法を使用し、かつ基準ＲＮＡを使用しない、ＲＮＡ、特に長鎖ｓａＲＮＡの（相対）完全性を評価するための手順の概要を提供する。
この実施例は、本明細書において開示されるＡＦ４法を使用し、かつ基準ＲＮＡを使用しない、ＲＮＡ、特に長鎖ｓａＲＮＡの（相対）完全性を評価するための手順の概要を提供する。
【0648】
１１，９１７ｎｔの長さを有するｓａＲＮＡを、本明細書において開示されるＡＦ４法に供した。図２３Ａは、９０°でのＬＳシグナル（点線）および２６０ｎｍでのＵＶシグナル（実線）による、ｓａＲＮＡの例示的ＡＦ４フラクトグラムを示している。太く暗い線は、ＭＡＬＳシグナルから得られた分子量曲線を表す。図２３Ｂにおいて、より良い概要のために、図２３Ａから分子量曲線のみが、図２３Ｂの上側パネルに実線として示されている。総ＲＮＡのピーク（ピーク１）に対する限界は、総ＵＶピークシグナルに基づいて設定した（すなわち、ｔ＝１０分～ｔ＝４０分）。ここで、「無傷の」ＲＮＡのピーク（ピーク２）に対する限界は、以下のように、分子量曲線（ＭＡＬＳから得られる）からの一次導関数によって設定した。分子量曲線からの一次導関数を算出した（図２３Ｂの下側パネルにおける点線）。分子量曲線のほぼ水平な部分は、未分解ＲＮＡの分画が存在する保持時間を反映している。これに基づいて、積分限界を選択し、ならびに、試料中の未分解ＲＮＡの量を算出した。
［実施例２０］
［実施例２０］
【0649】
粒径分布の決定のためのＵＶ、累積ＲＮＡ重量分率、ＬＰＸ画分におけるＲＮＡ質量、およびＬＰＸ画分あたりのＲＮＡコピー、を使用した遊離ＲＮＡおよび結合ＲＮＡの定量分析
ＲＮＡリポプレックス（ＬＰＸ）試料組成物を、本明細書において開示されるＡＦ４法に供した。図２４Ａは、９０°でのＬＳシグナル（実線）および２６０ｎｍでのＵＶシグナル（破線）による、前記ＲＮＡ ＬＰＸ試料組成物に対する代表的ＡＦ４フラクトグラムを示している。ＵＶシグナルは２つのピークを示しており、この場合、第１のピークは、非結合の遊離ＲＮＡの量を表しており、ならびに、第２のピークは、ＲＮＡを含むＬＰＸナノ粒子から生じている。ＵＶシグナルは、溶出時間の関数として、異なる分画中のＲＮＡ量を直接的に代表とする。回転半径（Ｒｇ；太い線）を、ＭＡＬＳシグナルから得た。
ＲＮＡリポプレックス（ＬＰＸ）試料組成物を、本明細書において開示されるＡＦ４法に供した。図２４Ａは、９０°でのＬＳシグナル（実線）および２６０ｎｍでのＵＶシグナル（破線）による、前記ＲＮＡ ＬＰＸ試料組成物に対する代表的ＡＦ４フラクトグラムを示している。ＵＶシグナルは２つのピークを示しており、この場合、第１のピークは、非結合の遊離ＲＮＡの量を表しており、ならびに、第２のピークは、ＲＮＡを含むＬＰＸナノ粒子から生じている。ＵＶシグナルは、溶出時間の関数として、異なる分画中のＲＮＡ量を直接的に代表とする。回転半径（Ｒｇ；太い線）を、ＭＡＬＳシグナルから得た。
【0650】
図２４Ｂは、図２４Ａからの２６０ｎｍにおけるＵＶシグナル（破線）と、実線として、ＵＶシグナル下面積に基づく累積重量分率とを示している。非結合ＲＮＡの絶対定量化のために、曲線下第１のピーク面積を比ＲＮＡ減衰係数と一緒に使用して、非結合ＲＮＡ画分の量を算出した。したがって、第１のピークを非結合ＲＮＡの絶対量へと定量的に変換することができる（ここで、１．４μｇ；３６μｇ／ｍＬ）。非結合ＲＮＡ画分の相対量（３６％）は、総ＲＮＡ（実線）との関連においてＲＮＡ ＬＰＸ試料組成物中の非結合ＲＮＡの絶対量（μｇ）を関係付けることによって得ることができる。この値のもっともらしさを、２つの追加の直交法（アガロースゲル電気泳動アッセイおよび遠心分離アッセイ）によって確認した。３６％の未結合ＲＮＡ値を確認することによって、ＲＮＡの残りの量（３．６６μｇ；６４μｇ／ｍＬ）が、ＬＰＸ画分において結合していると結論付けられる。これは、ＡＦ４フラクトグラムからの直接的なＵＶデータも、ほぼ１００％の回収率において粒子中のＲＮＡに定量的に対応することを示している。粒子からのより強い散乱が、ある役割を果たす場合、定量的に求められた遊離ＲＮＡは、他の測定からの遊離ＲＮＡの画分からのデータと一緒に、粒子に対するＵＶピークのスケーリングのために取得することができる。
【0651】
図２４Ｃは、異なるサイズ画分（Δｔ＝１分）における２６０ｎｍでの吸収を使用することによる、ＲＮＡ ＬＰＸ試料組成物において結合ＲＮＡの量を示している。ナノ粒子をそれらの拡散係数に従って分離し、ならびに、回転半径（Ｒｇ）をＢａｒｒｙプロットを使用してＭＡＬＳシグナルから得た。異なるＲｇ画分のＲＮＡ量の算出のために、ＬＰＸピーク（すなわち、ｔ＝約２４分に始まり、ｔ＝約６０分に終わる図２４Ａおよび２４Ｂの第２のピーク）のみを使用した。図２４Ｄは、図２４Ｃにおいて提示された結果から算出されるＲｇ画分あたりの算出されたＲＮＡコピーの数（バー、左側ｙ軸）を示している。Ｒｇ画分あたりの算出された粒子数は、対応する点線曲線によって表される。
【0652】
この実施例は、本明細書において説明されるＡＦ４法が、一回の実施において、ＲＮＡ ＬＰＸ試料組成物の累積ＲＮＡ重量分率（図２４Ｂを参照）、ＬＰＸ画分におけるＲＮＡ質量（図２３Ｃを参照）、ＬＰＸ画分あたりのＲＮＡコピー（図２３Ｄ、バーを参照）、ならびにＬＰＸ画分あたりの粒子数（図２３Ｄ、点線曲線を参照）を同時に求めることができることを実証している。これらのパラメーターの同時決定は、他の従来の技術では実現することができない。
［実施例２１］
［実施例２１］
【0653】
ＡＦ４法での円二色性（ＣＤ）分光法の使用
この実施例は、ＣＤ分光法も、ＵＶシグナルを測定するために、本明細書において開示されるＡＦ４法において使用することができることを実証している。
この実施例は、ＣＤ分光法も、ＵＶシグナルを測定するために、本明細書において開示されるＡＦ４法において使用することができることを実証している。
【0654】
ＲＮＡリポプレックス（ＬＰＸ）試料組成物を、ＵＶシグナルを測定するための手段としてＣＤ分光法を使用する本明細書において開示されるＡＦ４法に供した。図２５Ａは、９０°の角度でのＬＳシグナル（実線）および２６０ｎｍで記録されたＣＤシグナル（点線）によるＲＮＡ ＬＰＸ試料組成物に対する代表的ＡＦ４フラクトグラムを示しており、この場合、後者は、非結合ＲＮＡ（第１のピーク；ｔ＝１８分）および結合ＲＮＡ（第２のピーク；ｔ＝３５分）を表す。
【0655】
図２５Ｂは、ナノ粒子製剤中の遊離ＲＮＡおよび結合ＲＮＡの定量化に対する、本明細書において開示されるＡＦ４法におけるＣＤ検出の適性を示している。裸のＲＮＡの較正曲線を、並行しての２６０ｎｍにおけるＵＶおよびＣＤ検出を使用して作製した。曲線下ピーク面積（ＣＤ：黒四角および実線；ＵＶ：黒三角および破線）を、注入されたＲＮＡ量に対してプロットした。ＣＤシグナルとＵＶシグナルとのピーク面積の比が、点として示される（第２の右側ｙ軸）。ＣＤシグナル面積の値は、良好な直線性（Ｒ２＝０．９９９）において適合し、ＲＮＡの量（およびＵＶシグナル）に正比例することが見出される。ＣＤシグナルとＵＶシグナルとのピーク面積の比は、広い較正範囲（４～２０μｇ）にわたって一定の挙動を示す。したがって、この実施例は、ＣＤも、ナノ粒子中のＲＮＡ（遊離ＲＮＡおよび結合ＲＮＡ）の量を定量化するために使用することができることを実証している。
【0656】
図２５Ｃは、本明細書において開示されるＡＦ４法においてＣＤ検出を使用する、遊離ＲＮＡおよび結合ＲＮＡの定量化を示している。適切な裸のＲＮＡからのＣＤシグナルの曲線下面積（ＡＵＣ）は、適切な総ＡＵＣ ＣＤシグナルに相関した。異なる量のＲＮＡ ＬＰＸ試料組成物（２～１５μｇ）を、ＡＦ４法に供し、それを、それぞれのＣＤピークＡＵＣに対してプロットしたところ、値は、線形適合した（Ｒ２＝０．９９８）。ＣＤシグナル面積は、遊離ＲＮＡおよび結合ＲＮＡの量に正比例することが見出された。ＲＮＡ ＬＰＸ試料組成物中の非結合ＲＮＡ（白四角）および結合ＲＮＡ（白丸）の相対量（％）を、総ＲＮＡ量に対して非結合ＲＮＡおよび結合ＲＮＡの量を相関付けることによって求めた。結合ＲＮＡ画分と未結合ＲＮＡ画分との相対比率は、示された較正範囲にわたって一定である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図7】
【図8】
【図9-1】
【図9-2】
【図10】
【図11-1】
【図11-2】
【図12-1】
【図12-2】
【図13】
【図14-1】
【図14-2】
【図14-3】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20-1】
【図20-2】
【図21】
【図22-1】
【図22-2】
【図23】
【図24-1】
【図24-2】
【図25-1】
【図25-2】
