特許 7674703 複数試料分析方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-04-30

(45)【発行日】2025-05-12

(54)【発明の名称】複数試料分析方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 30/86 20060101AFI20250501BHJP

   G01N 30/46 20060101ALI20250501BHJP

【ＦＩ】

G01N30/86 B

G01N30/86 G

G01N30/46 Z

【請求項の数】 6

(21)【出願番号】P 2021165425

(22)【出願日】2021-10-07

(65)【公開番号】P2023056214

(43)【公開日】2023-04-19

【審査請求日】2024-07-08

(73)【特許権者】

【識別番号】000001993

【氏名又は名称】株式会社島津製作所

(74)【代理人】

【識別番号】110003993

【氏名又は名称】弁理士法人野口新生特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100205981

【弁理士】

【氏名又は名称】野口 大輔

(72)【発明者】

【氏名】西尾 顕

(72)【発明者】

【氏名】藤田 雄一郎

【審査官】黒田 浩一

(56)【参考文献】

【文献】特開昭６０－１０４２３８（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１７／１１９０８６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２０２０－０５６５９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１５／００５３６１（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３０／００－３０／９６

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも１つの試料について、前記少なくとも１つの試料に含まれる複数の成分を互いに分離することが可能な条件でフォトダイオードアレイを用いた第１のクロマトグラフィ分析を実行することにより前記少なくとも１つの試料の３次元クロマトグラムを取得し、前記少なくとも１つの試料の３次元クロマトグラムから前記少なくとも１つの試料に含まれる前記複数の成分のそれぞれのスペクトルデータを抽出する第１分析ステップと、
前記少なくとも１つの試料と主成分が同一である他の試料について、前記第１のクロマトグラフィ分析よりも短時間に３次元クロマトグラムが得られる条件でフォトダイオードアレイを用いた第２のクロマトグラフィ分析を実行することによって前記他の試料の３次元クロマトグラムを取得する第２分析ステップと、
前記第２分析ステップで取得した前記他の試料の３次元クロマトグラムに対して、前記第１分析ステップで抽出した前記スペクトルデータに基づいたピーク分離処理を適用することにより、前記他の試料に含まれる複数の成分のピークが互いに分離された前記他の試料についてのピーク分離データを取得するピーク分離ステップと、を備えている複数試料分析方法。

【請求項2】

前記第１のクロマトグラフィ分析において使用する第１の分析カラムと前記第２のクロマトグラフィ分析において使用する第２の分析カラムは、内径、全長、及び／又は充填剤が互いに異なる、請求項１に記載の複数試料分析方法。

【請求項3】

前記第２のクロマトグラフィ分析における移動相流量は前記第１のクロマトグラフィ分析における移動相流量よりも大きい、請求項１又は２に記載の複数試料分析方法。

【請求項4】

主成分が互いに共通する２以上の試料が存在する場合において、
前記２以上の試料のうちの１つの試料について前記第１分析ステップを実行して前記１つの試料に含まれる複数の成分のそれぞれのスペクトルデータを抽出し、
前記２以上の試料のうちの残りの試料に対して前記第２分析ステップを実行して前記残りの試料のそれぞれについての３次元クロマトグラムを取得し、取得した前記残りの試料のそれぞれについての３次元クロマトグラムに対して前記ピーク分離ステップを実行して前記残りの試料のそれぞれについてのピーク分離データを取得する、請求項１から３のいずれか一項に記載の複数試料分析方法。

【請求項5】

前記第１のクロマトグラフィ分析及び前記第２のクロマトグラフィ分析は液体クロマトグラフィ分析である、請求項１から４のいずれか一項に記載の複数試料分析方法。

【請求項6】

前記ピーク分離処理では、モデル関数の当てはめにより各成分のピークを推定するアルゴリズム、又は、前記モデル関数を用いないで行列分解によって数学的に各成分のピークを推定するアルゴリズムを使用する、請求項１から５のいずれか一項に記載の複数試料分析方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、主成分が互いに共通な複数の試料について含有成分のピークが互いに分離した状態のクロマトグラムデータを取得する複数試料分析方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

製薬業界などでは、主成分が共通の多数の試料のそれぞれに含まれる不純物の濃度を定量しなければならない場合がある。試料に含まれる複数の成分をそれぞれ定量するための方法として液体クロマトグラフィ分析が一般的である（特許文献１参照）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【文献】特許第６２６０７０９号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

液体クロマトグラフィ分析を用いて試料に含まれる複数の成分のそれぞれを定量するためには、複数の成分のピークを互いに分離する必要がある。互いの性質が類似した複数の成分が試料に混在している場合、それらの成分ピークを完全に分離するためには、分析カラム内に充填される充填剤を調整したり、分析カラムの全長を長くしたり、分析カラムの内径を細くして移動相の流量を極端に小さくしたりするなど、分析条件の調整が必要である。そして、そのような分析条件で分析を行なう結果、試料中の全成分が分析カラムから溶出するまでに要する時間が長くなり、１つの試料の分析が完了するまでに長時間を要することになる。しかし、分析すべき試料の数が膨大であると、それらの試料のすべてについてそのような長時間の分析を実施することは、費用的、時間的、人的コストが膨大になり現実的でない。

【0005】

本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、主成分が共通する複数の試料の分析を効率的に実行することができる複数試料分析方法を提供することを目的とするものである。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明に係る複数試料分析方法は、少なくとも１つの試料について、前記少なくとも１つの試料に含まれる複数の成分を互いに分離することが可能な条件でフォトダイオードアレイを用いた第１のクロマトグラフィ分析を実行することにより前記少なくとも１つの試料の３次元クロマトグラムを取得し、前記少なくとも１つの試料の３次元クロマトグラムから前記少なくとも１つの試料に含まれる前記複数の成分のそれぞれのスペクトルデータを抽出する第１分析ステップと、前記少なくとも１つの試料と主成分が同一である他の試料について、前記第１のクロマトグラフィ分析よりも短時間に３次元クロマトグラムが得られる条件でフォトダイオードアレイを用いた第２のクロマトグラフィ分析を実行することによって前記他の試料の３次元クロマトグラムを取得する第２分析ステップと、前記第２分析ステップで取得した前記他の試料の３次元クロマトグラムに対して、前記第１分析ステップで抽出した前記スペクトルデータに基づいたピーク分離処理を適用することにより、前記他の試料に含まれる複数の成分のピークが互いに分離された前記他の試料についてのピーク分離データを取得するピーク分離ステップと、を備えている。

【0007】

すなわち、本発明では、互いの主成分が共通する複数の試料のうちの一部の試料については、高い分離度が得られる長時間の第１のクロマトグラフィ分析を実施して複数の成分についてのスペクトルデータを取得し、他の残りの試料については、第１のクロマトグラフィ分析よりも分離度は低いものの高速で３次元クロマトグラムが得られる第２のクロマトグラフィ分析を実施し、第２のクロマトグラフィ分析で得られた比較的分離度の低い３次元クロマトグラムに対して、第１のクロマトグラフィ分析を実施して得られたスペクトルデータに基づくピーク分離処理を適用することにより、他の残りの試料についてのピーク分離データを取得する。

【発明の効果】

【0008】

上述のとおり、本発明に係る複数試料分析方法によれば、互いの主成分が共通する複数の試料のうち、一部の試料についてのみ、高い分離度が得られる長時間の第１のクロマトグラフィ分析を実施し、他の試料については、第１のクロマトグラフィ分析よりも分離度は低いものの高速で３次元クロマトグラムが得られる第２のクロマトグラフィ分析を実施する。これにより、主成分が共通する複数の試料のすべてについて長時間を要する第１のクロマトグラフィ分析を実施しなくても、すべての試料についての高精度なピーク分離データを取得することができる。したがって、主成分が共通する複数の試料の分析を効率的に実行することができる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】液体クロマトグラフィ分析装置の構成例を示す概略構成図である。

【図2】複数試料分析方法の一実施例を概略的に示す概念図である。

【図3】同実施例の手順の一例を示すフローチャートである。

【発明を実施するための形態】

【0010】

以下、本発明に係る複数試料分析方法の一実施例について図面を参照しながら説明する。

【0011】

まず、複数試料分析方法の実施に用いる液体クロマトグラフィ分析装置の構成例について、図１を用いて説明する。

【0012】

液体クロマトグラフィ分析装置は、送液ポンプ２、インジェクタ４、分析カラム６、ＰＤＡ検出器８、オーブン１０及び演算処理装置１２を備えている。送液ポンプ２は、移動相を送液する。送液ポンプ２の下流には、上流から順に、インジェクタ４、分析カラム６及びＰＤＡ検出器８が接続されている。インジェクタ４は、送液ポンプ２によって送液される移動相中に試料を注入するためのものである。分析カラム６は、インジェクタ４によって移動相中に注入された試料中の成分を互いに分離するためのものである。分析カラム６はオーブン１０の内部に収容されており、分析条件に応じた温度に制御される。ＰＤＡ検出器８は、分析カラム６からの溶出液の吸光度の時間変化を波長帯域ごとに測定するものである。すなわち、ＰＤＡ検出器８では、各測定波長帯域での吸光度の時間変化を表すクロマトグラム情報、及び分析中の各時間でのスペクトルを表すスペクトル情報を含む分析データが取得される。

【0013】

演算処理装置１２は、ＣＰＵ（中央演算装置）及びデータ記憶装置等を備えたコンピュータ装置によって実現される。演算処理装置１２にはＰＤＡ検出器８から出力される分析データが入力される。演算処理装置１２は、ＰＤＡ検出器８から出力された分析データを用いて種々の解析処理を実行する機能を有する。演算処理装置１２による解析処理機能としては、試料についてのクロマトグラム情報及びスペクトル情報を併せ持つ３次元クロマトグラムを作成する機能、作成した３次元クロマトグラムに基づいて分析カラム６で互いに分離された成分のそれぞれのスペクトルデータを抽出する機能、さらには、抽出したスペクトルデータを用いて３次元クロマトグラムに対するピーク分離処理を実行する機能、がある。すなわち、演算処理装置１２は、一度解析処理を実施して３次元クロマトグラムから抽出したスペクトルデータをデータベースに蓄積し、データベースに蓄積されたスペクトルデータを、別の３次元クロマトグラムについてのピーク分離処理に利用する機能を有する。

【0014】

次に、複数試料分析方法の概念について図２を用いて説明する。

【0015】

分析すべき複数の試料１～ｎがあるとする。これらの試料１～ｎは主成分が互いに共通しているものである。分析は、試料１～ｎに含まれる複数成分のそれぞれの濃度を定量することを目的とし、図１に示した構成をもつ液体クロマトグラフィ装置により実施する。

【0016】

試料１については、主成分ピークとその近傍成分のピークとの高いピーク分離度が得られるような高分離度条件を探索し、その高分離度条件で分析を実施する（第１のクロマトグラフィ分析）。分析条件には、分析カラム６の内径、長さ、分析カラム６の充填剤の種類、オーブン１０の設定温度、送液ポンプ２によって送液する移動相の組成、送液ポンプ２による送液流量、インジェクタ４による注入条件などの要素が含まれる。それらの要素を、少なくとも試料１の主成分のピークと主成分の近くに現れる他の成分のピークがそれぞれ単離するように、好ましくは、試料１に含まれるすべての成分が単離するように、決定する。

【0017】

上記第１のクロマトグラフィ分析により、試料１に含まれる複数の成分のピークが互いに分離された３次元クロマトグラムが得られるとともに、その３次元クロマトグラムから第１のクロマトグラフィ分析において単離された成分のそれぞれのスペクトルデータが得られる。

【0018】

ここで、一般論として、第１のクロマトグラフィ分析のように試料中の複数成分のピークを完全分離するように最適化された条件での分析は、すべての成分を分析カラム６から溶出させるまでに比較的長い時間を要する。そのため、複数の試料１～ｎのすべてについてこのような高分離度分析を実施すると、すべての試料１～ｎについての分析結果を得るまでには莫大な時間を要することになる。

【0019】

そこで、試料１以外の試料２～ｎのそれぞれについては、第１のクロマトグラフィ分析よりも短時間ですべての成分が分析カラム６から溶出するような条件で分析を実施する（第２のクロマトグラフィ分析）。第２のクロマトグラフィ分析においては、第１のクロマトグラフィ分析とは異なる分析カラムを使用することができる。すなわち、第１のクロマトグラフィ分析で使用する第１の分析カラムと第２のクロマトグラフィ分析で使用する第２の分析カラムとは、内径、長さ及び／又は充填剤の種類が互いに異なっていてよい。

【0020】

第２のクロマトグラフィ分析で得られる３次元クロマトグラムでは、第１のクロマトグラフィ分析に比べて各ピークの間の間隔が短くなって分離度が低くなり、複数の成分のピーク同士が重なることもあり得る。その場合、第２のクロマトグラフィ分析によって得られた各分析データは、そのままでは試料２～ｎに含まれる成分の定量に使用することができない不完全なものである。

【0021】

第２のクロマトグラフィ分析で得られた分析データの不完全性を解消するため、各分析データに対してピーク分離処理を適用する。ピーク分離処理とは、クロマトグラム上で互いに重なっている複数成分のピークのそれぞれの形状及び大きさを推定する処理である。ピーク分離処理では、ＥＭＧ（Exponential Modified Gaussian）関数等のモデル関数（ピークモデル）を実際のクロマトグラムの波形に当てはめることによって各成分のそれぞれのクロマトグラムを推定するアルゴリズム（例えば、国際公開第２０１６／０３５１６７号参照）のほかに、モデル関数を用いずに元の３次元クロマトグラムデータにＮＭＦ（Non-negative Matrix factorization）などの行列分解を適用して各成分のクロマトグラムを数学的に推定するアルゴリズム、ＰＣＡ（principal component analysis）などの主成分分析アルゴリズムを用いることができる。

【0022】

上述のピーク分離処理では、試料に含まれる含まれる成分に関する情報がまったくない状態であっても、３次元クロマトグラムデータ上で互いに重なっているピークの数、形状及び大きさを推定することが可能である。ただし、互いのピークが重なっている成分のうち少なくとも１つの成分のスペクトルデータが存在していれば、そのスペクトルデータをピーク分離処理の基礎情報として使用することによって互いに重なっているピークの数、形状及び大きさの推定精度を向上させることができる。

【0023】

この実施例では、第２のクロマトグラフィ分析で取得された各分析データに適用するピーク分離処理において、第１のクロマトグラフィ分析の分析データから抽出されたスペクトルデータの少なくとも一部を使用する。試料１～ｎは互いに主成分が共通しているため、第１のクロマトグラフィ分析の分析データから抽出された主成分についてのスペクトルデータをピーク分離処理に使用することができ、それによって、試料２～ｎの分析データに対するピーク分離処理で得られる推定結果の精度が向上する。なお、試料１～ｎのそれぞれの含有成分が互いにすべて同一である場合には、第１のクロマトグラフィ分析で単離されたすべての成分のスペクトルデータをピーク分離処理に用いることで、試料２～ｎについての高精度なピーク分離データを取得することができる。

【0024】

この実施例の複数試料分析方法の手順の一例について、図３のフローチャートを用いて説明する。

【0025】

分析すべき多数の試料のうち、一部の試料（１以上の試料であればよい）について、少なくとも主成分ピークと他の成分ピークとが完全に分離されるような高分離度分析（第１のクロマトグラフィ分析）を実施する（ステップ１０１）。演算処理装置１２を用いて第１のクロマトグラフィ分析で得られた分析データを解析することにより、高分離度分析で単離した各成分についてのスペクトルデータを抽出する（ステップ１０２）。一部の試料については、第１のクロマトグラフィ分析により、各成分の定量のために必要なピーク分離データが得られる。

【0026】

次に、第１のクロマトグラフィ分析が行われた一部の試料を除く残りの試料について、第１のクロマトグラフィ分析よりも各ピーク間の分離度が低くなるものの第１のクロマトグラフィ分析よりも短時間で分析データを取得することができるような低分離度分析（第２のクロマトグラフィ分析）を実施する（ステップ１０３）。これにより、残りの試料についての３次元クロマトグラムが得られる（ステップ１０４）。

【0027】

第２のクロマトグラフィ分析で得られた３次元クロマトグラムに対して、ステップ１０２で抽出したスペクトルデータに基づくピーク分離処理を適用する（ステップ１０５）。このピーク分離処理により、当初は不完全な状態であった分析データにおいて互いに重なっている複数のピークが高い推定精度で分離され、試料中に含まれる各成分の定量に使用可能なピーク分離データとなる。すなわち、ステップ１０５のピーク分離処理を実施することで、すべての試料について長時間に及ぶ高分離度分析を実施した場合と同等の分析結果を取得することができる。

【0028】

上記のとおり、この実施例では、膨大な数の分析すべき試料が存在する場合でも、それらの試料のうち少なくとも１試料についてのみ、主成分と他の成分を単離させるように設定された分析条件で、長時間（及び場合によっては高コスト）をかけて第１のクロマトグラフィ分析を実施するものの、残りの試料については短時間（及び場合によっては低コスト）で第２のクロマトグラフィ分析を実施するだけで、すべての試料について長時間に及ぶ高分離度分析を実施した場合と同等の分析結果を取得することができるので、すべての試料についてのピーク分離データを取得するまでに要する時間が大幅に削減される。

【0029】

以上において説明した実施例は、本発明に係る複数試料分析方法の実施形態を例示したに過ぎない。本発明に係る複数試料分析方法の実施形態は以下に示すとおりである。

【0030】

本発明に係る複数試料分析方法の一実施形態では、少なくとも１つの試料について、前記少なくとも１つの試料に含まれる複数の成分を互いに分離することが可能な条件でフォトダイオードアレイを用いた第１のクロマトグラフィ分析を実行することにより前記少なくとも１つの試料の３次元クロマトグラムを取得し、前記少なくとも１つの試料の３次元クロマトグラムから前記少なくとも１つの試料に含まれる前記複数の成分のそれぞれのスペクトルデータを抽出する第１分析ステップと、前記少なくとも１つの試料と主成分が同一である他の試料について、前記第１のクロマトグラフィ分析よりも短時間に３次元クロマトグラムが得られる条件でフォトダイオードアレイを用いた第２のクロマトグラフィ分析を実行することによって前記他の試料の３次元クロマトグラムを取得する第２分析ステップと、前記第２分析ステップで取得した前記他の試料の３次元クロマトグラムに対して、前記第１分析ステップで抽出した前記スペクトルデータに基づいたピーク分離処理を適用することにより、前記他の試料に含まれる複数の成分のピークが互いに分離された前記他の試料についてのピーク分離データを取得するピーク分離ステップと、を備えている。

【0031】

上記一実施形態の第１態様では、前記第１のクロマトグラフィ分析において使用する第１の分析カラムと前記第２のクロマトグラフィ分析において使用する第２の分析カラムは、内径、全長、及び／又は充填剤が互いに異なる。例えば、第１のクロマトグラフィ分析では、高いピーク分離度を得るために比較的高価な分析カラムを第１の分析カラムとして使用し、第２のクロマトグラフィ分析では、第１の分析カラムよりも安価な分析カラムを使用することができる。これにより、複数試料のすべてについて分析するために必要なコストを低減することができる。

【0032】

上記一実施形態の第２態様では、前記第２のクロマトグラフィ分析における移動相流量は前記第１のクロマトグラフィ分析における移動相流量よりも大きい。この第２態様は上記第１態様と組み合わせることができる。

【0033】

上記一実施形態の第３態様では、主成分が互いに共通する２以上の試料が存在する場合において、前記２以上の試料のうちの１つの試料について前記第１分析ステップを実行して前記１つの試料に含まれる複数の成分のそれぞれのスペクトルデータを抽出し、前記２以上の試料のうちの残りの試料に対して前記第２分析ステップを実行して前記残りの試料のそれぞれについての３次元クロマトグラムを取得し、取得した前記残りの試料のそれぞれについての３次元クロマトグラムに対して前記ピーク分離ステップを実行して前記残りの試料のそれぞれについてのピーク分離データを取得する。このような態様により、分析に長時間を要する第１のクロマトグラフィ分析が１つの試料についてのみ実施し、他の残りの試料については、比較的短時間で完了する第２のクロマトグラフィ分析を実施するので、すべての試料の分析が完了するまでに要する時間を大幅に短縮することができる。この第３態様は、上記第１態様及び／又は第２態様と組み合わせることができる。

【0034】

上記一実施形態の第４態様では、前記第１のクロマトグラフィ分析及び前記第２のクロマトグラフィ分析は液体クロマトグラフィ分析である。なお、本発明における「クロマトグラフィ分析」には、液体クロマトグラフィ分析だけでなくガスクロマトグラフィ分析も含めることができる。この第４態様は、上記第１態様、第２態様及び／又は第３態様と組み合わせることができる。

【0035】

上記一実施形態の第５態様では、前記ピーク分離処理において、モデル関数の当てはめにより各成分のピークを推定するアルゴリズム、又は、前記モデル関数を用いないで行列分解によって数学的に各成分のピークを推定するアルゴリズムを使用する。この第５態様は、上記第１態様、第２態様、第３態様、及び／又は第４態様と組み合わせることができる。

【符号の説明】

【0036】

２ 送液ポンプ
４ インジェクタ
６ 分離カラム
８ ＰＤＡ検出器
１０ オーブン
１２ 演算処理装置

【図1】

【図2】

【図3】