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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B1)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-04-30
(45)【発行日】2025-05-12
(54)【発明の名称】ウラシル誘導体を含有する医薬組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 31/513 20060101AFI20250501BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20250501BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20250501BHJP
C07D 401/14 20060101ALI20250501BHJP
【ＦＩ】
A61K31/513
A61P31/14
A61P43/00
C07D401/14
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2025509007
(86)(22)【出願日】2024-10-04
(86)【国際出願番号】 JP2024035560
【審査請求日】2025-02-17
(31)【優先権主張番号】P 2023173420
(32)【優先日】2023-10-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(31)【優先権主張番号】P 2024096866
(32)【優先日】2024-06-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和５年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、「新興・再興感染症に対する革新的医薬品等開発推進研究事業」「次世代ＣＯＶＩＤ－１９低分子経口治療薬の開発」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】000001926
【氏名又は名称】塩野義製薬株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100156144
【弁理士】
【氏名又は名称】落合 康
(74)【代理人】
【識別番号】100221578
【弁理士】
【氏名又は名称】林 康次郎
(72)【発明者】
【氏名】佐藤 淳
(72)【発明者】
【氏名】芝山 啓允
(72)【発明者】
【氏名】上原 彰太
(72)【発明者】
【氏名】宇納 佑斗
(72)【発明者】
【氏名】平井 啓一朗
【審査官】愛清 哲
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０２２／１３８９８７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０２２／１３８９８８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０２３－５１９０３５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０２２－５３４１８６（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０２３／１９５５２９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０２３／１９５５３０（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３１／００－３１／８０
Ａ６１Ｐ ３１／００－３１／２２
Ａ６１Ｐ ４３／００
Ｃ０７Ｄ ４０１／１４
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（Ｉ－１）：【化1】
で示される化合物またはその製薬上許容される塩、を含有する医薬組成物。
【請求項2】
３ＣＬプロテアーゼ阻害剤である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項3】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス増殖を阻害するために用いられる、請求項１または２記載の医薬組成物。
【請求項4】
新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療剤および／または予防剤である、請求項１または２記載の医薬組成物。
【請求項5】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の重症化抑制のために用いられる、請求項１または２記載の医薬組成物。
【請求項6】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の症状が発現してから、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性判定から、７２時間以内に投与を開始するように用いられる、請求項１または２記載の医薬組成物。
【請求項7】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の症状が発現してから、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性判定から、２４時間以内に投与を開始するように用いられる、請求項１または２記載の医薬組成物。
【請求項8】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス伝播を抑制するために用いられる、請求項１または２記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、コロナウイルス３ＣＬプロテアーゼ阻害活性を示す化合物を含有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
ニドウイルス目コロナウイルス科オルトコロナウイルス亜科に属するコロナウイルスは、約３０キロベースのゲノムサイズを有し、既知のＲＮＡウイルスでは最大級の一本鎖＋鎖ＲＮＡウイルスである。コロナウイルスはアルファコロナウイルス属、ベータコロナウイルス属、ガンマコロナウイルス属およびデルタコロナウイルス属の４つに分類され、ヒトに感染するコロナウイルスとして、アルファコロナウイルス属の２種類（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３）およびベータコロナウイルス属の５種類（ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の計７種類が知られている。この内、４種類（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３）は風邪の病原体であるが、残りの３種類は重症肺炎を引き起こす重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）および新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）である。
【0003】
２０１９年１２月に発生した新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）は急速に国際社会に蔓延し、２０２０年３月１１日にＷＨＯよりパンデミックが表明された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の主な感染経路として飛沫感染、接触感染およびエアロゾル感染が報告されており、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は３時間程度エアロゾルと共に空気中を漂い続け、感染力を維持することが確認されている（非特許文献１）。潜伏期間は２～１４日程度であり、発熱（８７．９％）、空咳（６７．７％）、倦怠感（３８．１％）、痰（３３．４％）等の風邪様症状が典型的である（非特許文献２）。重症例では、急性呼吸窮迫症候群や急性肺障害、間質性肺炎等による呼吸器不全が起こる。また、腎不全や肝不全などの多臓器不全も報告されている。
【0004】
本邦においては、既存薬のドラッグリポジショニングから、抗ウイルス薬であるレムデシビル、抗炎症薬であるデキサメタゾン、リウマチ薬であるバリシチニブがＣＯＶＩＤ－１９に対する治療薬として承認され、２０２２年１月に抗ＩＬ－６受容体抗体であるトシリズマブが追加承認されている。また、２０２１年７月に、抗体カクテル療法であるロナプリーブ（カシリビマブ／イムデビマブ）が特例承認され、２０２１年９月にソトロビマブが特例承認され、２０２１年１２月にモルヌピラビルが特例承認された。これらの薬剤についての有効性や安全性については、十分なエビデンスが得られていない。したがって、ＣＯＶＩＤ－１９に対する治療薬の創製は急務である。
【0005】
コロナウイルスは、細胞に感染すると、２つのポリタンパク質を合成する。この２つのポリタンパク質中には、ウイルスゲノムを作る複製複合体、２つのプロテアーゼが含まれている。プロテアーゼは、ウイルスから合成されたポリタンパク質を切断し、それぞれのタンパク質を機能させるために不可欠な働きをする。２つのプロテアーゼのうち、ポリタンパク質の切断のほとんどを担うのが、３ＣＬプロテアーゼ（メインプロテアーゼ）である（非特許文献３）。
３ＣＬプロテアーゼを標的とした、ＣＯＶＩＤ－１９治療薬としては、２０２１年６月、Ｐｆｉｚｅｒ社によるＰＦ－００８３５２３１のプロドラッグであるＬｕｆｏｔｒｅｌｖｉｒ（ＰＦ－０７３０４８１４）のＰｈａｓｅ１ｂ試験の完了がＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖに掲載された（ＮＣＴ０４５３５１６７）。また、２０２１年３月、Ｐｆｉｚｅｒ社は新型コロナウイルス感染症に対する治療薬ＰＦ－０７３２１３３２のＰｈａｓｅ１試験を開始すると発表した。ＰＦ－００８３５２３１、ＬｕｆｏｔｒｅｌｖｉｒおよびＰＦ－０７３２１３３２の構造式は以下に示す通りで、本発明に使用する化合物とは化学構造が異なる（非特許文献４、８および９、ならびに特許文献１および２）。
ＰＦ－００８３５２３１：
Ｌｕｆｏｔｒｅｌｖｉｒ（ＰＦ－０７３０４８１４）：
ＰＦ－０７３２１３３２：
２０２１年１２月、ＰＡＸＬＯＶＩＤ（ＴＭ）は米国で緊急使用許可が承認され、２０２２年２月１０日にパキロビッド（登録商標）パックが日本で特例承認された。
３ＣＬプロテアーゼを標的とした、ＣＯＶＩＤ－１９治療薬としては、２０２１年６月、Ｐｆｉｚｅｒ社によるＰＦ－００８３５２３１のプロドラッグであるＬｕｆｏｔｒｅｌｖｉｒ（ＰＦ－０７３０４８１４）のＰｈａｓｅ１ｂ試験の完了がＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖに掲載された（ＮＣＴ０４５３５１６７）。また、２０２１年３月、Ｐｆｉｚｅｒ社は新型コロナウイルス感染症に対する治療薬ＰＦ－０７３２１３３２のＰｈａｓｅ１試験を開始すると発表した。ＰＦ－００８３５２３１、ＬｕｆｏｔｒｅｌｖｉｒおよびＰＦ－０７３２１３３２の構造式は以下に示す通りで、本発明に使用する化合物とは化学構造が異なる（非特許文献４、８および９、ならびに特許文献１および２）。
ＰＦ－００８３５２３１：
【化1】
Ｌｕｆｏｔｒｅｌｖｉｒ（ＰＦ－０７３０４８１４）：
【化2】
ＰＦ－０７３２１３３２：
【化3】
２０２１年１２月、ＰＡＸＬＯＶＩＤ（ＴＭ）は米国で緊急使用許可が承認され、２０２２年２月１０日にパキロビッド（登録商標）パックが日本で特例承認された。
【0006】
また、３ＣＬプロテアーゼを標的とした、ＣＯＶＩＤ－１９治療薬としては、２０２１年８月、Ｐａｒｄｅｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社によるＰＢＩ－０４５１のＰｈａｓｅ１試験の開始がＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖに掲載された（ＮＣＴ０５０１１８１２）。ＰＢＩ－０４５１の構造式は以下に示す通りで、本発明に使用する化合物とは化学構造が異なる（非特許文献１２）。
【化4】
【0007】
さらに、３ＣＬプロテアーゼを標的とした、ＣＯＶＩＤ－１９治療薬として、２０２２年１１月２２日にゾコーバ（登録商標）が日本で緊急承認され、２０２４年３月５日に通常承認された（非特許文献１７および１８）。
ゾコーバの有効成分はエンシトレルビル フマル酸であり、構造式は以下に示す通り、本発明に使用する化合物とは化学構造が異なる（特許文献１０～１３）。
ゾコーバの有効成分はエンシトレルビル フマル酸であり、構造式は以下に示す通り、本発明に使用する化合物とは化学構造が異なる（特許文献１０～１３）。
【化5】
【0008】
一方、３ＣＬプロテアーゼを標的としたＣＯＶＩＤ－１９治療薬に対する耐性変異については、十分なエビデンスが得られていない。
【0009】
３ＣＬプロテアーゼ阻害活性を有する化合物が非特許文献４～７および１３～１６に開示されているが、いずれの文献においても本発明に使用する化合物は記載も示唆もされていない。また、３ＣＬプロテアーゼ阻害活性を有する化合物が特許文献１４および１５に開示されているが、いずれの文献においても本発明に係る化合物を含む医薬組成物は記載も示唆もされていない。
Ρ２Ｘ３および／またはΡ２Ｘ２／３受容体阻害作用を有する化合物が特許文献３～９に開示されているが、いずれの文献においても、３ＣＬプロテアーゼ阻害活性および抗ウイルス効果については記載も示唆もされていない。
ＨＩＶ－１逆転写酵素阻害作用を有する化合物が非特許文献１１に記載されているが、３ＣＬプロテアーゼ阻害活性および抗コロナウイルス効果については記載も示唆もされていない。
Ρ２Ｘ３および／またはΡ２Ｘ２／３受容体阻害作用を有する化合物が特許文献３～９に開示されているが、いずれの文献においても、３ＣＬプロテアーゼ阻害活性および抗ウイルス効果については記載も示唆もされていない。
ＨＩＶ－１逆転写酵素阻害作用を有する化合物が非特許文献１１に記載されているが、３ＣＬプロテアーゼ阻害活性および抗コロナウイルス効果については記載も示唆もされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0010】
【文献】国際公開第２０２１／２０５２９８号
【文献】国際公開第２０２１／２５０６４８号
【文献】国際公開第２０１２／０２０７４２号
【文献】国際公開第２０１３／１１８８５５号
【文献】中国特許出願公開第１１３６２０８８８号明細書
【文献】中国特許出願公開第１１３６６６９１４号明細書
【文献】中国特許出願公開第１１３７３５８３８号明細書
【文献】中国特許出願公開第１１３７７３３００号明細書
【文献】中国特許出願公開第１１３８０１０９７号明細書
【文献】国際公開第２０２２／１３８９８７号
【文献】国際公開第２０２２／１３８９８８号
【文献】国際公開第２０２３／０５４２９２号
【文献】国際公開第２０２３／０５４７３２号
【文献】国際公開第２０２３／１９５５２９号
【文献】国際公開第２０２３／１９５５３０号
【非特許文献】
【0011】
【文献】The NEW ENGLAND JOURNAL of MEDICINE（２０２０年）、３８２巻、１５６４～１５６７頁
【文献】“Report of the WHO-China Joint Mission on Coronavirus Disease 2019 (COVID-19)”、［online］、２０２０年２月２８日、ＷＨＯ、［２０２３年３月１６日検索］、インターネット<URL：https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/who-china-joint-mission-on-covid-19-final-report.pdf>
【文献】Science（２００３年）、３００巻、１７６３～１７６７頁
【文献】“A comparative analysis of SARS-CoV-2 antivirals characterizes 3CLpro inhibitor PF-00835231 as a potential new treatment for COVID-19”、Journal of Virology、２０２１ Ｍａｒ １０；９５（７）、ｅ０１８１９－２０
【文献】Cell Research（２０２０年）、３０巻、６７８～６９２頁
【文献】Science（２０２０年）、３６８巻、４０９～４１２頁
【文献】ACS Central Science（２０２１年）、７巻、３号、４６７～４７５頁
【文献】261st Am Chem Soc (ACS) Natl Meet ・ 2021-04-05 / 2021-04-16 ・ Virtual, N/A ・ Abst 243
【文献】Science（２０２１年）、３７４巻、１５８６～１５９３頁
【文献】"Pfizer’s Novel COVID-19 Oral Antiviral Treatment Candidate Reduced Risk Of Hospitalization Or Death By 89% In Interim Analysis Of Phase 2/3 EPIC-HR Study"、［online］、２０２１年１１月５日、 Pfizer Press Release、［２０２３年３月１６日検索］、インターネット＜URL：https://www.pfizer.com/news/press-release/press-release-detail/pfizers-novel-covid-19-oral-antiviral-treatment-candidate＞
【文献】Synthetic Communications（２００６年）、３６巻、１９号、２９１３～２９２０頁
【文献】"Discovery and Development of PBI-0451"、［online］、２０２２年３月２４日、35th International Conference on Antiviral Research (ICAR)、［２０２３年３月１６日検索］、インターネット＜URL：https://ir.pardesbio.com/static-files/fc7c4f8c-e0bd-4b97-8c9c-eff09bafd4db＞
【文献】Molecules（２０２０年）、２５巻、３１９３頁
【文献】Molecules（２０２０年）、２５巻、３９２０頁
【文献】European Journal of Medicinal Chemistry（２０２０年）、２０６巻、１１２７１１頁
【文献】Journal of the American Chemical Society（２０２２年）、１４４巻、２９０５～２９２０頁
【文献】塩野義製薬株式会社プレスリリース（２０２２年１１月２２日）
【文献】塩野義製薬株式会社プレスリリース（２０２４年３月５日）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
本発明の目的は、コロナウイルス３ＣＬプロテアーゼ阻害活性を有する化合物を含有する医薬組成物を提供することにある。好ましくは、本発明は、抗ウイルス作用、特にコロナウイルスの増殖阻害作用を有する化合物を含有する医薬を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明は、以下に関する。
（１）式（Ｉ－１）：
で示される化合物またはその製薬上許容される塩、を含有する医薬組成物。
（２）３ＣＬプロテアーゼ阻害剤である、上記項目（１）記載の医薬組成物。
（３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス増殖を阻害するために用いられる、上記項目（１）または（２）記載の医薬組成物。
（４）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療剤および／または予防剤である、上記項目（１）～（３）のいずれかに記載の医薬組成物。
（５）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の重症化抑制のために用いられる、上記項目（１）～（４）のいずれかに記載の医薬組成物。
（６）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の症状が発現してから、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性判定から、７２時間以内に投与を開始するように用いられる、上記項目（１）～（４）のいずれかに記載の医薬組成物。
（７）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の症状が発現してから、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性判定から、２４時間以内に投与を開始するように用いられる、上記項目（１）～（４）のいずれかに記載の医薬組成物。
（８）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の症状が発現してから、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性判定から、１２０時間以内に投与を開始するように用いられる、上記項目（１）～（４）のいずれかに記載の医薬組成物。
（９）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の症状が発現してから、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性判定から、４８時間以内に投与を開始するように用いられる、上記項目（１）～（４）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１０）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス伝播を抑制するために用いられる、上記項目（１）～（４）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の症状が、軽症または中等症Ｉの症状である、上記項目（１）～（４）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１）式（Ｉ－１）：
【化6】
で示される化合物またはその製薬上許容される塩、を含有する医薬組成物。
（２）３ＣＬプロテアーゼ阻害剤である、上記項目（１）記載の医薬組成物。
（３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス増殖を阻害するために用いられる、上記項目（１）または（２）記載の医薬組成物。
（４）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療剤および／または予防剤である、上記項目（１）～（３）のいずれかに記載の医薬組成物。
（５）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の重症化抑制のために用いられる、上記項目（１）～（４）のいずれかに記載の医薬組成物。
（６）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の症状が発現してから、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性判定から、７２時間以内に投与を開始するように用いられる、上記項目（１）～（４）のいずれかに記載の医薬組成物。
（７）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の症状が発現してから、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性判定から、２４時間以内に投与を開始するように用いられる、上記項目（１）～（４）のいずれかに記載の医薬組成物。
（８）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の症状が発現してから、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性判定から、１２０時間以内に投与を開始するように用いられる、上記項目（１）～（４）のいずれかに記載の医薬組成物。
（９）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の症状が発現してから、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性判定から、４８時間以内に投与を開始するように用いられる、上記項目（１）～（４）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１０）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス伝播を抑制するために用いられる、上記項目（１）～（４）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の症状が、軽症または中等症Ｉの症状である、上記項目（１）～（４）のいずれかに記載の医薬組成物。
【0014】
（１２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス増殖阻害方法であって、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療および／または予防を必要とする個体に、式（Ｉ－１）：
で示される化合物またはその製薬上許容される塩、を投与することを含む、
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス増殖阻害方法。
（１３）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療および／または予防方法であって、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療および／または予防を必要とする個体に、式（Ｉ－１）：
で示される化合物またはその製薬上許容される塩、を投与することを含む、
新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療および／または予防方法。
（１４）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の重症化抑制方法であって、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療および／または予防を必要とする個体に、式（Ｉ－１）：
で示される化合物またはその製薬上許容される塩、を投与することを含む、
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の重症化抑制方法。
（１５）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療方法であって、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療を必要とする個体に、式（Ｉ－１）：
で示される化合物またはその製薬上許容される塩、をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の症状が発現してから、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性判定から、７２時間以内に投与することを含む、
新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療方法。
（１６）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療方法であって、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療を必要とする個体に、式（Ｉ－１）：
で示される化合物またはその製薬上許容される塩、をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の症状が発現してから、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性判定から、２４時間以内に投与することを含む、
新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療方法。
（１７）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療方法であって、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療を必要とする個体に、式（Ｉ－１）：
で示される化合物またはその製薬上許容される塩、をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の症状が発現してから、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性判定から、１２０時間以内に投与することを含む、
新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療方法。
（１８）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療方法であって、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療を必要とする個体に、式（Ｉ－１）：
で示される化合物またはその製薬上許容される塩、をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の症状が発現してから、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性判定から、４８時間以内に投与することを含む、
新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療方法。
（１９）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス伝播を抑制する方法であって、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療を必要とする個体に、式（Ｉ－１）：
で示される化合物またはその製薬上許容される塩、を投与することを含む、
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス伝播を抑制する方法。
（２０）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療方法であって、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療を必要とする個体の症状が軽症または中等症Ｉの症状である、式（Ｉ－１）：
で示される化合物またはその製薬上許容される塩、を投与することを特徴とする、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療方法。
【化7】
で示される化合物またはその製薬上許容される塩、を投与することを含む、
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス増殖阻害方法。
（１３）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療および／または予防方法であって、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療および／または予防を必要とする個体に、式（Ｉ－１）：
【化8】
で示される化合物またはその製薬上許容される塩、を投与することを含む、
新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療および／または予防方法。
（１４）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の重症化抑制方法であって、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療および／または予防を必要とする個体に、式（Ｉ－１）：
【化9】
で示される化合物またはその製薬上許容される塩、を投与することを含む、
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の重症化抑制方法。
（１５）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療方法であって、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療を必要とする個体に、式（Ｉ－１）：
【化10】
で示される化合物またはその製薬上許容される塩、をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の症状が発現してから、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性判定から、７２時間以内に投与することを含む、
新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療方法。
（１６）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療方法であって、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療を必要とする個体に、式（Ｉ－１）：
【化11】
で示される化合物またはその製薬上許容される塩、をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の症状が発現してから、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性判定から、２４時間以内に投与することを含む、
新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療方法。
（１７）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療方法であって、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療を必要とする個体に、式（Ｉ－１）：
【化12】
で示される化合物またはその製薬上許容される塩、をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の症状が発現してから、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性判定から、１２０時間以内に投与することを含む、
新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療方法。
（１８）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療方法であって、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療を必要とする個体に、式（Ｉ－１）：
【化13】
で示される化合物またはその製薬上許容される塩、をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の症状が発現してから、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性判定から、４８時間以内に投与することを含む、
新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療方法。
（１９）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス伝播を抑制する方法であって、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療を必要とする個体に、式（Ｉ－１）：
【化14】
で示される化合物またはその製薬上許容される塩、を投与することを含む、
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス伝播を抑制する方法。
（２０）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療方法であって、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療を必要とする個体の症状が軽症または中等症Ｉの症状である、式（Ｉ－１）：
【化15】
で示される化合物またはその製薬上許容される塩、を投与することを特徴とする、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療方法。
【0015】
（２１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス増殖阻害のための、式（Ｉ－１）：
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用。
（２２）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療および／または予防用医薬を製造するための、式（Ｉ－１）：
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用。
（２３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の重症化抑制のための、式（Ｉ－１）：
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用。
（２３’）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の重症化抑制用医薬を製造するための、式（Ｉ－１）：
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用。
（２４）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の症状が発現してから、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性判定から、７２時間以内に投与するための、式（Ｉ－１）：
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用。
（２４’）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療用医薬を製造するための、式（Ｉ－１）：
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用であって、該医薬が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の症状が発現してから、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性判定から、７２時間以内に投与される、使用。
（２５）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の症状が発現してから、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性判定から、２４時間以内に投与するための、式（Ｉ－１）：
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用。
（２５’）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療用医薬を製造するための、式（Ｉ－１）：
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用であって、該医薬が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の症状が発現してから、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性判定から、２４時間以内に投与される、使用。
（２６）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の症状が発現してから、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性判定から、１２０時間以内に投与するための、式（Ｉ－１）：
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用。
（２６’）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療用医薬を製造するための、式（Ｉ－１）：
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用であって、該医薬が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の症状が発現してから、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性判定から、１２０時間以内に投与される、使用。
（２７）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の症状が発現してから、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性判定から、４８時間以内に投与するための、式（Ｉ－１）：
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用。
（２７’）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療用医薬を製造するための、式（Ｉ－１）：
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用であって、該医薬が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の症状が発現してから、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性判定から、４８時間以内に投与される、使用。
（２８）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス伝播を抑制するための、式（Ｉ－１）：
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用。
（２８’）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の伝播抑制用医薬を製造するための、式（Ｉ－１）：
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用。
（２９）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療用医薬を製造するための、式（Ｉ－１）：
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用であって、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療を必要とする個体の症状が軽症または中等症Ｉの症状である使用。
（２９’）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療用医薬を製造するための、式（Ｉ－１）：
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用であって、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療を必要とする個体の症状が軽症または中等症Ｉの症状である使用。
【化16】
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用。
（２２）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療および／または予防用医薬を製造するための、式（Ｉ－１）：
【化17】
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用。
（２３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の重症化抑制のための、式（Ｉ－１）：
【化18】
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用。
（２３’）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の重症化抑制用医薬を製造するための、式（Ｉ－１）：
【化19】
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用。
（２４）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の症状が発現してから、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性判定から、７２時間以内に投与するための、式（Ｉ－１）：
【化20】
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用。
（２４’）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療用医薬を製造するための、式（Ｉ－１）：
【化21】
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用であって、該医薬が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の症状が発現してから、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性判定から、７２時間以内に投与される、使用。
（２５）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の症状が発現してから、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性判定から、２４時間以内に投与するための、式（Ｉ－１）：
【化22】
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用。
（２５’）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療用医薬を製造するための、式（Ｉ－１）：
【化23】
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用であって、該医薬が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の症状が発現してから、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性判定から、２４時間以内に投与される、使用。
（２６）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の症状が発現してから、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性判定から、１２０時間以内に投与するための、式（Ｉ－１）：
【化24】
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用。
（２６’）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療用医薬を製造するための、式（Ｉ－１）：
【化25】
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用であって、該医薬が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の症状が発現してから、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性判定から、１２０時間以内に投与される、使用。
（２７）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の症状が発現してから、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性判定から、４８時間以内に投与するための、式（Ｉ－１）：
【化26】
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用。
（２７’）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療用医薬を製造するための、式（Ｉ－１）：
【化27】
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用であって、該医薬が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の症状が発現してから、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性判定から、４８時間以内に投与される、使用。
（２８）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス伝播を抑制するための、式（Ｉ－１）：
【化28】
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用。
（２８’）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の伝播抑制用医薬を製造するための、式（Ｉ－１）：
【化29】
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用。
（２９）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療用医薬を製造するための、式（Ｉ－１）：
【化30】
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用であって、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療を必要とする個体の症状が軽症または中等症Ｉの症状である使用。
（２９’）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療用医薬を製造するための、式（Ｉ－１）：
【化31】
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用であって、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療を必要とする個体の症状が軽症または中等症Ｉの症状である使用。
【0016】
また、本発明は、以下に関する。
（１０１）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の予防用医薬であって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の暴露後の発症抑制のために用いられる、以下の式（Ｉ－１）：
で示される化合物またはその製薬上許容される塩、を含有する医薬組成物。
（１０２）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の予防方法であって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の暴露後の発症抑制を必要とする個体に、式（Ｉ－１）：
で示される化合物またはその製薬上許容される塩、を投与することを含む、
新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の予防方法。
（１０３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の暴露後の発症抑制のための、式（Ｉ－１）：
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用。
（１０４）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の暴露後の発症抑制用医薬を製造するための、式（Ｉ－１）：
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用。
（１０１）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の予防用医薬であって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の暴露後の発症抑制のために用いられる、以下の式（Ｉ－１）：
【化32】
で示される化合物またはその製薬上許容される塩、を含有する医薬組成物。
（１０２）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の予防方法であって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の暴露後の発症抑制を必要とする個体に、式（Ｉ－１）：
【化33】
で示される化合物またはその製薬上許容される塩、を投与することを含む、
新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の予防方法。
（１０３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の暴露後の発症抑制のための、式（Ｉ－１）：
【化34】
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用。
（１０４）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の暴露後の発症抑制用医薬を製造するための、式（Ｉ－１）：
【化35】
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用。
【0017】
さらに、本発明は、以下に関する。
（２０１）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の予防用医薬であって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の暴露前予防のために用いられる、以下の式（Ｉ－１）：
で示される化合物またはその製薬上許容される塩、を含有する医薬組成物。
（２０２）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の予防方法であって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の暴露前予防を必要とする個体に、式（Ｉ－１）：
で示される化合物またはその製薬上許容される塩、を投与することを含む、
新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の予防方法。
（２０３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の暴露前予防のための、式（Ｉ－１）：
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用。
（２０４）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の暴露前予防用医薬を製造するための、式（Ｉ－１）：
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用。
（２０１）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の予防用医薬であって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の暴露前予防のために用いられる、以下の式（Ｉ－１）：
【化36】
で示される化合物またはその製薬上許容される塩、を含有する医薬組成物。
（２０２）新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の予防方法であって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の暴露前予防を必要とする個体に、式（Ｉ－１）：
【化37】
で示される化合物またはその製薬上許容される塩、を投与することを含む、
新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の予防方法。
（２０３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の暴露前予防のための、式（Ｉ－１）：
【化38】
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用。
（２０４）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の暴露前予防用医薬を製造するための、式（Ｉ－１）：
【化39】
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の使用。
【0018】
また、一つの実施態様として、本発明は以下を含む。
（３０１）
式（ＩＩ）：
（式中、
Ｘは、単結合または－ＣＨ２－であり；
Ｒ２は、置換もしくは非置換の芳香族炭素環式基であり；
Ｒ３ｃは、置換もしくは非置換の芳香族炭素環式基、置換もしくは非置換の非芳香族炭素環式基、置換もしくは非置換の芳香族複素環式基、置換もしくは非置換の非芳香族複素環式基、ハロゲン、置換もしくは非置換のアルキルまたは置換もしくは非置換のアミノであり；
Ｒ１は、置換もしくは非置換の芳香族複素環式基または置換もしくは非置換の非芳香族複素環式基であり；
ｍは、０または１であり；
Ｒ５ａはそれぞれ独立して、水素原子または置換もしくは非置換のアルキルであり；
Ｒ５ｂはそれぞれ独立して、水素原子または置換もしくは非置換のアルキルである）で示される化合物（ただし、以下の化合物：
を除く）、またはその製薬上許容される塩。
（３０２）Ｘが単結合であり；
Ｒ２がハロゲンで置換されたフェニルであり；
Ｒ３ｃが置換基群ａから選択される１～３の置換基で置換された非芳香族複素環式基もしくは非置換非芳香族複素環式基（置換基群ａ：ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１－Ｃ３アルキル、Ｃ１－３アルキルオキシ、ハロＣ１－３アルキル、ハロＣ１－３アルキルオキシ、非置換５－６員芳香族複素環式基およびハロゲンで置換された５－６員芳香族複素環式基）または置換基群ｂから選択される１～３の置換基で置換されたアルキルもしくは非置換アルキル（置換基群ｂ：ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１－３アルキルオキシおよびハロＣ１－３アルキルオキシ）であり；
Ｒ１がハロゲンで置換されたピリジルであり；
ｍが０である、上記項目（３０１）記載の化合物、またはその製薬上許容される塩。
（３０１）
式（ＩＩ）：
【化40】
（式中、
Ｘは、単結合または－ＣＨ２－であり；
Ｒ２は、置換もしくは非置換の芳香族炭素環式基であり；
Ｒ３ｃは、置換もしくは非置換の芳香族炭素環式基、置換もしくは非置換の非芳香族炭素環式基、置換もしくは非置換の芳香族複素環式基、置換もしくは非置換の非芳香族複素環式基、ハロゲン、置換もしくは非置換のアルキルまたは置換もしくは非置換のアミノであり；
Ｒ１は、置換もしくは非置換の芳香族複素環式基または置換もしくは非置換の非芳香族複素環式基であり；
ｍは、０または１であり；
Ｒ５ａはそれぞれ独立して、水素原子または置換もしくは非置換のアルキルであり；
Ｒ５ｂはそれぞれ独立して、水素原子または置換もしくは非置換のアルキルである）で示される化合物（ただし、以下の化合物：
【化41】
を除く）、またはその製薬上許容される塩。
（３０２）Ｘが単結合であり；
Ｒ２がハロゲンで置換されたフェニルであり；
Ｒ３ｃが置換基群ａから選択される１～３の置換基で置換された非芳香族複素環式基もしくは非置換非芳香族複素環式基（置換基群ａ：ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１－Ｃ３アルキル、Ｃ１－３アルキルオキシ、ハロＣ１－３アルキル、ハロＣ１－３アルキルオキシ、非置換５－６員芳香族複素環式基およびハロゲンで置換された５－６員芳香族複素環式基）または置換基群ｂから選択される１～３の置換基で置換されたアルキルもしくは非置換アルキル（置換基群ｂ：ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１－３アルキルオキシおよびハロＣ１－３アルキルオキシ）であり；
Ｒ１がハロゲンで置換されたピリジルであり；
ｍが０である、上記項目（３０１）記載の化合物、またはその製薬上許容される塩。
【発明の効果】
【0019】
本発明に係る化合物は、コロナウイルス３ＣＬプロテアーゼに対する阻害活性を有し、本発明に係る化合物を含有する医薬組成物は、コロナウイルス感染症の治療剤および／または予防剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ７－５０１／２０２１感染マウス（１．００×１０４ ＴＣＩＤ５０／マウスを経鼻接種）について、媒体および式（Ｉ－１）で示される化合物を一日二回で感染１日後から２日間経口投与した際の、感染３日後の肺ホモジネート液中ウイルス力価を示す。縦軸は肺ホモジネート液中ウイルス力価、横軸は各投与群を示す。
【図2-1】ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７０２／２０２２感染ハムスター（１．００×１０４ＴＣＩＤ５０／ハムスターを経鼻接種）について、媒体および式（Ｉ－１）で示される化合物を一日二回で感染１日後から２－３日間経口投与した際の、感染３－４日後の肺ホモジネート液中ウイルス力価を示す。縦軸は肺ホモジネート液中ウイルス力価、横軸は各投与群および感染後からの日数を示す。
【図2-2】ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７０２／２０２２感染ハムスター（１．００×１０４ＴＣＩＤ５０／ハムスターを経鼻接種）について、媒体および式（Ｉ－１）で示される化合物を一日二回で感染１日後から２－３日間経口投与した際の、感染３－４日後の鼻甲介ホモジネート液中ウイルス力価を示す。縦軸は鼻甲介ホモジネート液中ウイルス力価、横軸は各投与群および感染後からの日数を示す。
【図3】ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７０２／２０２２感染ハムスター（１．００×１０４ＴＣＩＤ５０／ハムスターを経鼻接種）について、媒体および式（Ｉ－１）で示される化合物を一日二回で感染１日後から５日間経口投与した際の、感染７日後の肺重量／体重を示す。縦軸は肺重量／体重、横軸は各投与群を示す。
【図4】ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７０２／２０２２感染ハムスター（１．００×１０４ＴＣＩＤ５０／ハムスターを経鼻接種）について、媒体および式（Ｉ－１）で示される化合物を一日二回で感染１日後から５日間経口投与した際の、感染１０日後までの体重変動を示す。縦軸は感染当日の体重を１００％とした場合の体重変動（％）、横軸は感染後からの日数を示す。
【図5】ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７０２／２０２２感染ハムスター（１．００×１０４ＴＣＩＤ５０／ハムスターを経鼻接種）について、媒体および式（Ｉ－１）で示される化合物を感染３日前あるいは１日前に単回皮下投与した際の、感染７日後までの体重変動を示す。縦軸は感染当日の体重を１００％とした場合の体重変動（％）、横軸は感染後からの日数を示す。
【図6-1】ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７０２／２０２２感染ハムスター（１．００×１０４ＴＣＩＤ５０／ハムスターを経鼻接種）について、媒体および式（Ｉ－１）で示される化合物を感染１日前に単回皮下投与した際の、感染１－２日後の肺ホモジネート液中ウイルス力価を示す。縦軸は肺ホモジネート液中ウイルス力価、横軸は各投与群および感染後からの日数を示す。
【図6-2】ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７０２／２０２２感染ハムスター（１．００×１０４ＴＣＩＤ５０／ハムスターを経鼻接種）について、媒体および式（Ｉ－１）で示される化合物を感染１日前に単回皮下投与した際の、感染１－２日後の鼻甲介ホモジネート液中ウイルス力価を示す。縦軸は鼻甲介ホモジネート液中ウイルス力価、横軸は各投与群および感染後からの日数を示す。
【図7】式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶の粉末Ｘ線回折パターンを示す。横軸は２θ（°）、縦軸はＩｎｔｅｎｓｉｔｙ（強度）を表す。
【図9】式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶の結晶構造（非対称単位中の構造）を示す。
【図10】式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）結果を示す。横軸は温度（℃）を、縦軸は熱量（Ｗ／ｇ）を表す。
【図11】式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶の示差熱－熱重量同時測定（ＴＧ／ＤＴＡ）結果を示す。縦軸は熱量（μＶ）又は重量変化（％）を示し、横軸は温度（℃）を示す。図中のＣｅｌは、セルシウス度（℃）を意味する。
【図12】式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶のラマンスペクトルを示す。横軸はラマンシフト（ｃｍ－１）を表し、縦軸はピーク強度を表す。
【図13】上部に式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶のＨＰＬＣ測定結果を示す。下部にＨＰＬＣのピークテーブルを示す。
【図14】ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７０２／２０２２感染ハムスター（１．００×１０４ＴＣＩＤ５０／ハムスターを経鼻接種）について、媒体および式（Ｉ－１）で示される化合物を一日二回で感染２日後から１－５日間経口投与した際の、感染３－７日後の鼻腔洗浄液（ＮＡＬＦ）中ウイルス力価を示す。縦軸はＮＡＬＦ中ウイルス力価、横軸は感染後からの日数を示す。
【図15】ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７０２／２０２２感染ハムスター（１．００×１０４ＴＣＩＤ５０／ハムスターを経鼻接種）について、媒体および式（Ｉ－１）で示される化合物を一日二回で感染３日後から１－５日間経口投与した際の、感染４－８日後の鼻腔洗浄液（ＮＡＬＦ）中ウイルス力価を示す。縦軸はＮＡＬＦ中ウイルス力価、横軸は感染後からの日数を示す。
【図16】ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ１１－９２７／２０２１感染ハムスター（１．００×１０３ＴＣＩＤ５０／ハムスターを経鼻接種、Ｉｎｄｅｘ）に化合物を投与し、非感染ハムスター（Ｃｏｎｔａｃｔ）を感染１日後から２日後の夜間１２時間にかけて同居させたときの同居開始４日後の非感染ハムスター（Ｃｏｎｔａｃｔ）の肺ホモジネート液および鼻腔洗浄液（ＮＡＬＦ）中ウイルス力価を示す。感染ハムスター（Ｉｎｄｅｘ）は媒体および式（Ｉ－１）で示される化合物を一日二回で感染８時間後から経口投与した。縦軸は肺ホモジネート液およびＮＡＬＦ中ウイルス力価、横軸は各投与群を示す。
【図17】ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ１１－９２７／２０２１感染ハムスター（１．００×１０３ＴＣＩＤ５０／ハムスターを経鼻接種、Ｉｎｄｅｘ）と、化合物を投与した非感染ハムスター（Ｃｏｎｔａｃｔ）を感染１日後から２日後の夜間１２時間にかけて同居させたときの同居開始４日後の非感染ハムスター（Ｃｏｎｔａｃｔ）の肺ホモジネート液および鼻腔洗浄液（ＮＡＬＦ）中ウイルス力価を示す。非感染ハムスター（Ｃｏｎｔａｃｔ）は媒体および式（Ｉ－１）で示される化合物を同居開始１２時間前に皮下投与した。縦軸は肺ホモジネート液およびＮＡＬＦ中ウイルス力価、横軸は各投与群を示す。
【図18】ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ１１－９２７／２０２１感染加齢ハムスター（１．００×１０４ＴＣＩＤ５０／ハムスターを経鼻接種、１１カ月齢ハムスター）について、媒体および式（Ｉ－１）で示される化合物を感染１日後から一日二回５日間経口投与した際の、感染１０日後までの生存率を示す。縦軸は生存率（％）、横軸は感染後からの日数を示す。
【図19】ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ１１－９２７／２０２１感染加齢ハムスター（１．００×１０４ＴＣＩＤ５０／ハムスターを経鼻接種、１１カ月齢ハムスター）について、媒体および式（Ｉ－１）で示される化合物を感染１日後から一日二回５日間経口投与した際の、感染１０日後までの体重変動を示す。縦軸は感染当日の体重を１００％とした場合の体重変動（％）、横軸は感染後からの日数を示す。
【発明を実施するための形態】
【0021】
以下に本明細書において用いられる各用語の意味を説明する。各用語は特に断りのない限り、単独で用いられる場合も、または他の用語と組み合わせて用いられる場合も、同一の意味で用いられる。
「からなる」という用語は、構成要件のみを有することを意味する。
「含む」および「包含する」という用語は、構成要件に限定されず、記載されていない要素を排除しないことを意味する。
以下、本発明について実施形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。
また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当上記分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
「からなる」という用語は、構成要件のみを有することを意味する。
「含む」および「包含する」という用語は、構成要件に限定されず、記載されていない要素を排除しないことを意味する。
以下、本発明について実施形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。
また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当上記分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【0022】
本明細書の式（ＩＩ）で示される化合物において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３ｃ、Ｒ５ａおよびＲ５ｂで使用される各用語の定義は、国際公開第２０２３／１９５５２９号を援用することができ、その開示を参照により本明細書に組み込む。また、各用語において使用される置換基の定義についても同様に、国際公開第２０２３／１９５５２９号を援用することができ、その開示を参照により本明細書に組み込む。
【0023】
式（Ｉ－１）または式（ＩＩ）で示される化合物は、特定の異性体に限定するものではなく、全ての可能な異性体（例えば、ケト－エノール異性体、イミン－エナミン異性体、ジアステレオ異性体、光学異性体、回転異性体等）、ラセミ体またはそれらの混合物を含む。
【0024】
式（Ｉ－１）または式（ＩＩ）で示される化合物の一つ以上の水素、炭素および／または他の原子は、それぞれ水素、炭素および／または他の原子の同位体で置換され得る。そのような同位体の例としては、それぞれ２Ｈ、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、１２３Ｉおよび３６Ｃｌのように、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素、ヨウ素および塩素が包含される。式（Ｉ－１）または式（ＩＩ）で示される化合物は、そのような同位体で置換された化合物（例えば、重水素変換体等）も包含する。該同位体で置換された化合物は、医薬品としても有用である。式（Ｉ－１）または式（ＩＩ）で示される化合物は、該同位体に含まれる放射性同位体で置換されたすべての放射性標識体を包含する。また該「放射性標識体」を製造するための「放射性標識化方法」も本発明に包含され、該「放射性標識体」は、代謝薬物動態研究、結合アッセイにおける研究および／または診断のツールとして有用である。
【0025】
式（Ｉ－１）で示される化合物の重水素変換体としては、以下の構造が挙げられる。
【化42】
【化43】
【化44】
【化45】
【0026】
式（Ｉ－１）または式（ＩＩ）で示される化合物の放射性標識体は、当該技術分野で周知の方法で調製できる。例えば、式（Ｉ－１）または式（ＩＩ）で示されるトリチウム標識化合物は、トリチウムを用いた触媒的脱ハロゲン化反応によって、式（Ｉ－１）または式（ＩＩ）で示される特定の化合物にトリチウムを導入することで調製できる。この方法は、適切な触媒、例えばＰｄ／Ｃの存在下、塩基の存在下または非存在下で、式（Ｉ－１）または式（ＩＩ）で示される化合物が適切にハロゲン置換された前駆体とトリチウムガスとを反応させることを包含する。トリチウム標識化合物を調製するための他の適切な方法は、“Ｉｓｏｔｏｐｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．１，Ｌａｂｅｌｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ （Ｐａｒｔ Ａ），Ｃｈａｐｔｅｒ ６ （１９８７年）”を参照することができる。１４Ｃ－標識化合物は、１４Ｃ炭素を有する原料を用いることによって調製できる。
【0027】
本発明の式（Ｉ－１）または式（ＩＩ）で示される化合物は、プロドラッグを形成する場合があり、本発明はそのような各種のプロドラッグも包含する。プロドラッグは、化学的又は代謝的に分解できる基を有する本発明化合物の誘導体であり、加溶媒分解により又は生理学的条件下でインビボにおいて薬学的に活性な本発明化合物となる化合物である。プロドラッグは、生体内における生理条件下で酵素的に酸化、還元、加水分解等を受けて式（Ｉ－１）または式（ＩＩ）で示される化合物に変換される化合物、胃酸等により加水分解されて式（Ｉ－１）または式（ＩＩ）で示される化合物に変換される化合物等を包含する。適当なプロドラッグ誘導体を選択する方法及び製造する方法は、例えば“Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， １９８５”に記載されている。プロドラッグは、それ自身が活性を有する場合がある。
【0028】
本明細書中で用いる「式（Ｉ－１）または式（ＩＩ）で示される化合物」は、塩、共結晶、又はそれらの溶媒和物を形成する場合がある。
本明細書中で用いる「式（Ｉ－１）または式（ＩＩ）で示される化合物、その製薬上許容される塩、又はそれらの溶媒和物」には、そのような各種の塩、共結晶、及びそれらの溶媒和物も包含する。
本明細書中で用いる「式（Ｉ－１）または式（ＩＩ）で示される化合物、その製薬上許容される塩、又はそれらの溶媒和物」には、そのような各種の塩、共結晶、及びそれらの溶媒和物も包含する。
【0029】
本明細書中で用いる「塩」とは、例えば「式（Ｉ－１）または式（ＩＩ）で示される化合物」とカウンター分子が同一結晶格子内に規則正しく配列することを意味し、任意の数のカウンター分子を含んでいても良い。結晶格子中で化合物とカウンター分子との間でプロトン移動することにより、イオン結合を介するものをいう。
【0030】
本明細書中で用いる「共結晶」とは、カウンター分子（ｃｏ－ｆｏｒｍｅｒ分子）が同一結晶格子内に規則的に配列することを意味し、任意の数のカウンター分子（ｃｏ－ｆｏｒｍｅｒ分子）を含んでいても良い。また、共結晶とは、化合物とカウンター分子（ｃｏ－ｆｏｒｍｅｒ分子）との分子間相互作用が、水素結合、ファンデルワールス力などの、非共有結合性かつ非イオン性の化学的相互作用を介するものをいう。
【0031】
一般的に、塩は化合物とカウンター分子との間でプロトン移動が生じるとされているが、場合によっては、プロトン移動が完全ではない場合があることも知られている。該状態は、真の塩（ｔｒｕｅ ｓａｌｔ）ではないため、共結晶と呼ばれることもある。プロトン移動は、温度によって連続的に変わる場合があることも知られている。
従って、本明細書中で用いる「式（Ｉ－１）または式（ＩＩ）で示される化合物の製薬上許容される塩」は、共結晶を包含し、式（Ｉ－１）または式（ＩＩ）で示される化合物の製薬上許容される塩又は共結晶を指す。
従って、本明細書中で用いる「式（Ｉ－１）または式（ＩＩ）で示される化合物の製薬上許容される塩」は、共結晶を包含し、式（Ｉ－１）または式（ＩＩ）で示される化合物の製薬上許容される塩又は共結晶を指す。
【0032】
本明細書における一態様は、式（Ｉ－１）または式（ＩＩ）で示される化合物と、フッ化水素酸、塩酸、臭化水素酸、オルトリン酸、ヨウ化水素酸、硝酸、リン酸、ホウ酸、硫酸メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トリフルオロメチルベンゼンスルホン酸、クロロベンゼンスルホン酸、メトキシベンゼンスルホン酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、クエン酸、フマル酸、マロン酸、リンゴ酸、コハク酸、サリチル酸、マレイン酸、グリセロリン酸、酒石酸、安息香酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、2-ナフタレンスルホン酸、ヘキサン酸、アセチルサリチル酸等との製薬上許容される塩又は共結晶である。
【0033】
塩形成及び共結晶形成の研究は、その化学構造を変更することなく、薬剤の物理化学的特徴及び得られる生物学的特徴を変更する手段を提供する。塩形成及び共結晶形成は、薬剤の特性に劇的な影響を及ぼし得る。適切な、塩又は共結晶の選択においては、吸湿性、安定性、溶解性及び加工特性も重要な観点である。塩又は共結晶の溶解性は、薬剤として使用するためのその適性に影響を及ぼし得る。水性溶解性が低い場合、ｉｎ ｖｉｖｏ投与における溶解速度は吸収過程に律速され、低いバイオアベイラビリティーをもたらし得る。また、水溶性が低いことにより、注射による投与が困難となり得るため、適切な投与経路の選択に制限が生じ得る。
【0034】
「式（Ｉ－１）または式（ＩＩ）で示される化合物」は、水との溶媒和物（すなわち、水和物）又は一般的な有機溶媒との溶媒和物を形成することができる。「式（Ｉ－１）または式（ＩＩ）で示される化合物の製薬上許容される塩」は、水との溶媒和物（すなわち、水和物）又は一般的な有機溶媒との溶媒和物を形成することができる。
【0035】
本明細書中で用いる「溶媒和物」とは、例えば「式（Ｉ－１）または式（ＩＩ）で示される化合物」に対し、任意の数の溶媒分子と規則正しく配列しているものをいう。
溶媒分子としては、例えば、酢酸エチル、水、エタノール、アセトン、１，１－ジエトキシプロパン、１，１－ジメトキシメタン、２，２－ジメトキシプロパン、イソオクタン、イソプロピルエーテル、メチルイソプロピルケトン、メチルテトラヒドロフラン、石油エーテル、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、酢酸、アニソール、１－ブタノール、２－ブタノール、酢酸ｎ－ブチル、ｔ－ブチルメチルエーテル、クメン、ジメチルスルホキシド、ジエチルエーテル、ギ酸エチル、ギ酸、ヘプタン、酢酸イソブチル、酢酸イソプロピル、酢酸メチル、３－メチル－１－ブタノール、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、２－メチル－１－プロパノール、ペンタン、１－ペンタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、酢酸プロピル、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、クロロベンゼン、クロロホルム、シクロヘキサン、１，２－ジクロロエテン、ジクロロメタン、１，２－ジメトキシエタン、Ｎ,Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ,Ｎ－ジメチルホルムアミド、１，４－ジオキサン、２－エトキシエタノール、エチレングリコール、ホルムアミド、ヘキサン、メタノール、２－メトキシエタノール、メチルブチルケトン、メチルシクロヘキサン、Ｎ－メチルピロリドン、ニトロメタン、ピリジン、スルホラン、テトラリン、トルエン、１，１，２－トリクロロエテン、キシレン及びｔ－ブタノールが挙げられる。
好ましくは、酢酸エチル、水、エタノール、アセトン、１，１－ジエトキシプロパン、１，１－ジメトキシメタン、２，２－ジメトキシプロパン、イソオクタン、イソプロピルエーテル、メチルイソプロピルケトン、メチルテトラヒドロフラン、石油エーテル、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、酢酸、アニソール、１－ブタノール、２－ブタノール、酢酸ｎ－ブチル、ｔ－ブチルメチルエーテル、クメン、ジメチルスルホキシド、ジエチルエーテル、ギ酸エチル、ギ酸、ヘプタン、酢酸イソブチル、酢酸イソプロピル、酢酸メチル、３－メチル－１－ブタノール、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、２－メチル－１－プロパノール、ペンタン、１－ペンタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、酢酸プロピル及びテトラヒドロフランが挙げられる。
より好ましくは、酢酸エチル、水、エタノール、アセトン、１，１－ジエトキシプロパン、１，１－ジメトキシメタン、２，２－ジメトキシプロパン、イソオクタン、イソプロピルエーテル、メチルイソプロピルケトン、メチルテトラヒドロフラン、石油エーテル、トリクロロ酢酸及びトリフルオロ酢酸などが挙げられる。
また、「式（Ｉ－１）または式（ＩＩ）で示される化合物」を、大気中に放置することにより、水分を吸収し、吸着水が付着する場合や、水和物を形成する場合がある。
溶媒分子としては、例えば、酢酸エチル、水、エタノール、アセトン、１，１－ジエトキシプロパン、１，１－ジメトキシメタン、２，２－ジメトキシプロパン、イソオクタン、イソプロピルエーテル、メチルイソプロピルケトン、メチルテトラヒドロフラン、石油エーテル、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、酢酸、アニソール、１－ブタノール、２－ブタノール、酢酸ｎ－ブチル、ｔ－ブチルメチルエーテル、クメン、ジメチルスルホキシド、ジエチルエーテル、ギ酸エチル、ギ酸、ヘプタン、酢酸イソブチル、酢酸イソプロピル、酢酸メチル、３－メチル－１－ブタノール、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、２－メチル－１－プロパノール、ペンタン、１－ペンタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、酢酸プロピル、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、クロロベンゼン、クロロホルム、シクロヘキサン、１，２－ジクロロエテン、ジクロロメタン、１，２－ジメトキシエタン、Ｎ,Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ,Ｎ－ジメチルホルムアミド、１，４－ジオキサン、２－エトキシエタノール、エチレングリコール、ホルムアミド、ヘキサン、メタノール、２－メトキシエタノール、メチルブチルケトン、メチルシクロヘキサン、Ｎ－メチルピロリドン、ニトロメタン、ピリジン、スルホラン、テトラリン、トルエン、１，１，２－トリクロロエテン、キシレン及びｔ－ブタノールが挙げられる。
好ましくは、酢酸エチル、水、エタノール、アセトン、１，１－ジエトキシプロパン、１，１－ジメトキシメタン、２，２－ジメトキシプロパン、イソオクタン、イソプロピルエーテル、メチルイソプロピルケトン、メチルテトラヒドロフラン、石油エーテル、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、酢酸、アニソール、１－ブタノール、２－ブタノール、酢酸ｎ－ブチル、ｔ－ブチルメチルエーテル、クメン、ジメチルスルホキシド、ジエチルエーテル、ギ酸エチル、ギ酸、ヘプタン、酢酸イソブチル、酢酸イソプロピル、酢酸メチル、３－メチル－１－ブタノール、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、２－メチル－１－プロパノール、ペンタン、１－ペンタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、酢酸プロピル及びテトラヒドロフランが挙げられる。
より好ましくは、酢酸エチル、水、エタノール、アセトン、１，１－ジエトキシプロパン、１，１－ジメトキシメタン、２，２－ジメトキシプロパン、イソオクタン、イソプロピルエーテル、メチルイソプロピルケトン、メチルテトラヒドロフラン、石油エーテル、トリクロロ酢酸及びトリフルオロ酢酸などが挙げられる。
また、「式（Ｉ－１）または式（ＩＩ）で示される化合物」を、大気中に放置することにより、水分を吸収し、吸着水が付着する場合や、水和物を形成する場合がある。
【0036】
なお、本明細書中で用いる「結晶」とは、構成する原子、イオン、分子などが三次元的に規則正しく配列した固体を意味し、そのような規則正しい内部構造を持たない非晶質固体とは区別される。本明細書中で用いる結晶は、単結晶、双晶、多結晶などであってもよい。
さらに、「結晶」には、組成が同一でありながら結晶中の配列が異なる「結晶多形」が存在することがあり、それらを含めて「結晶形態」という。
「式（Ｉ－１）または式（ＩＩ）で示される化合物、その製薬上許容される塩、又はそれらの溶媒和物」は、それらの結晶多形を包含する。
本発明に係る化合物の結晶は重水素変換体であってもよい。本明細書中で用いる結晶は同位元素（例、２Ｈ、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉ等）で標識されていてもよい。
結晶形態及び／又は結晶化度は、例えば、Ｘ線回折、ラマン分光、赤外吸収スペクトル、固体ＮＭＲなどの分光法によって確認することができる。また、結晶の物理的特性は、示差走査熱量測定、水分吸脱着測定、溶解特性などの多くの技術によって確認することができる。
さらに、「結晶」には、組成が同一でありながら結晶中の配列が異なる「結晶多形」が存在することがあり、それらを含めて「結晶形態」という。
「式（Ｉ－１）または式（ＩＩ）で示される化合物、その製薬上許容される塩、又はそれらの溶媒和物」は、それらの結晶多形を包含する。
本発明に係る化合物の結晶は重水素変換体であってもよい。本明細書中で用いる結晶は同位元素（例、２Ｈ、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉ等）で標識されていてもよい。
結晶形態及び／又は結晶化度は、例えば、Ｘ線回折、ラマン分光、赤外吸収スペクトル、固体ＮＭＲなどの分光法によって確認することができる。また、結晶の物理的特性は、示差走査熱量測定、水分吸脱着測定、溶解特性などの多くの技術によって確認することができる。
【0037】
本明細書における一態様は、式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶である。
本明細書中で用いる「無水物」は、「無溶媒和物」、「非溶媒和物」、「無水和物」及び「非水和物」と同義である。
式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶は、結晶水の理論含量は０重量％ある。ただし、水分量及び／又は溶媒量の分析においては、結晶表面に付着した付着水及び／又は付着溶媒の影響を受けて、結晶水の理論含量よりも高い値をとることがある。
本明細書中で用いる「無水物」は、「無溶媒和物」、「非溶媒和物」、「無水和物」及び「非水和物」と同義である。
式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶は、結晶水の理論含量は０重量％ある。ただし、水分量及び／又は溶媒量の分析においては、結晶表面に付着した付着水及び／又は付着溶媒の影響を受けて、結晶水の理論含量よりも高い値をとることがある。
【0038】
本明細書における一態様は、粉末Ｘ線回折パターン（ＣｕＫα線、λ＝１.５４１８Å）において、回折角度（２θ）：６．５°±０．２°、１５．６°±０．２°、１７．４°±０．２°、１９．９°±０．２°及び２０．３°±０．２°に特徴的なピークを有する、式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶である。
【0039】
本明細書における一態様は、ＣｕＫα線（λ＝１.５４１８Å）、２９８Ｋ（２５℃）で単結晶回折実験を実施した場合、
以下の結晶学的データ：
空間群： Ｐｂｃａ
ａ＝１４.６７ű０．０５Å
ｂ＝１１.８３ű０．０５Å
ｃ＝２７.１０ű０．０５Å
α＝９０°
β＝９０°
γ＝９０°
により特徴付けられる、式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶である。
以下の結晶学的データ：
空間群： Ｐｂｃａ
ａ＝１４.６７ű０．０５Å
ｂ＝１１.８３ű０．０５Å
ｃ＝２７.１０ű０．０５Å
α＝９０°
β＝９０°
γ＝９０°
により特徴付けられる、式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶である。
【0040】
本明細書における一態様は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）において、融点が２６１．３℃±２℃である、式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶である。
本明細書における一態様は、示差熱－熱重量同時測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、融点が２６５．６℃±２℃である、式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶である。
本明細書における一態様は、示差熱－熱重量同時測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、融点が２６５．６℃±２℃である、式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶である。
【0041】
本明細書における一態様は、ラマンスペクトルにおいて、４１５．２ｃｍ－１±２ｃｍ－１、５０２．７ｃｍ－１±２ｃｍ－１、１４３１．４ｃｍ－１±２ｃｍ－１、１７１４．８ｃｍ－１±２ｃｍ－１及び３０６５．４ｃｍ－１±２ｃｍ－１に特徴的なピークを有する、式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶である。
【0042】
（粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ））
粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）は、固体の結晶形態および結晶性を測定するための最も感度の良い分析法の１つである。Ｘ線が結晶に照射されると、結晶格子面で反射し、互いに干渉しあい、構造の周期に対応した秩序だった回折線を示す。一方、非晶質固体については、通常、その構造の中に秩序だった繰返し周期をもたないため、回折現象は起こらず、特徴のないブロードなＸＲＰＤパターン（ハローパターンとも呼ばれる）を示す。
粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）は、固体の結晶形態および結晶性を測定するための最も感度の良い分析法の１つである。Ｘ線が結晶に照射されると、結晶格子面で反射し、互いに干渉しあい、構造の周期に対応した秩序だった回折線を示す。一方、非晶質固体については、通常、その構造の中に秩序だった繰返し周期をもたないため、回折現象は起こらず、特徴のないブロードなＸＲＰＤパターン（ハローパターンとも呼ばれる）を示す。
【0043】
式（Ｉ－１）または式（ＩＩ）で示される化合物の結晶形態は、粉末Ｘ線回折パターンおよび特徴的な回折ピークにより識別可能である。式（Ｉ－１）または式（ＩＩ）で示される化合物の結晶形態は、特徴的な回折ピークの存在によって他の結晶形態と区別することができる。
本明細書中で用いる特徴的な回折ピークは、観測された回折パターンから選択されるピークである。特徴的な回折ピークは、好ましくは回折パターンにおける約１０本、より好ましくは約５本、さらに好ましくは約３本から選択される。
複数の結晶を区別する上では、ピークの強度よりも、当該結晶で確認され、他の結晶では確認されないピークが、その結晶を特定する上で好ましい特徴的なピークとなる。そういった特徴的なピークであれば、一つまたは二つのピークでも、当該結晶を特徴付けることができる。測定して得られたチャートを比較し、これらの特徴的なピークが一致すれば、粉末Ｘ線回折パターンが実質的に一致するといえる。
本明細書中で用いる特徴的な回折ピークは、観測された回折パターンから選択されるピークである。特徴的な回折ピークは、好ましくは回折パターンにおける約１０本、より好ましくは約５本、さらに好ましくは約３本から選択される。
複数の結晶を区別する上では、ピークの強度よりも、当該結晶で確認され、他の結晶では確認されないピークが、その結晶を特定する上で好ましい特徴的なピークとなる。そういった特徴的なピークであれば、一つまたは二つのピークでも、当該結晶を特徴付けることができる。測定して得られたチャートを比較し、これらの特徴的なピークが一致すれば、粉末Ｘ線回折パターンが実質的に一致するといえる。
【0044】
一般に、粉末Ｘ線回折における回折角度（２θ）は±０．２°の範囲内で誤差が生じ得るため、粉末Ｘ線回折の回折角度の値は±０．２°程度の範囲内の数値も含むものとして理解される必要がある。したがって、粉末Ｘ線回折におけるピークの回折角度が完全に一致する結晶だけでなく、ピークの回折角度が±０．２°程度の誤差で一致する結晶も本発明に含まれる。
【0045】
以下の表および図において表示されるピークの強度は、一般に、多くの因子、例えばＸ線ビームに対する結晶の選択配向の効果、粗大粒子の影響、分析される物質の純度またはサンプルの結晶化度によって変動し得ることが知られている。また、ピーク位置についても、サンプル高の変動に基づいてシフトし得る。さらに、異なる波長を使用して測定するとブラッグ式（ｎλ＝２ｄｓｉｎθ）に従って異なるシフトが得られるが、このような別の波長の使用により得られる別のＸＲＰＤパターンも、本発明の範囲に含まれる。
【0046】
（単結晶構造解析）
結晶を特定する方法の一つで、当該結晶における結晶学的パラメーター、さらに、原子座標（各原子の空間的な位置関係を示す値）および３次元構造モデルを得ることができる。桜井敏雄著「Ｘ線構造解析の手引き」裳華房発行（１９８３年）、Stout & Jensen著 X-Ray Structure Determination： A Practical Guide, Macmillan Co., New York (1968)などを参照。本発明のような複合体、塩、光学異性体、互変異性体、幾何異性体の結晶の構造を同定する際には、単結晶構造解析が有用である。
結晶を特定する方法の一つで、当該結晶における結晶学的パラメーター、さらに、原子座標（各原子の空間的な位置関係を示す値）および３次元構造モデルを得ることができる。桜井敏雄著「Ｘ線構造解析の手引き」裳華房発行（１９８３年）、Stout & Jensen著 X-Ray Structure Determination： A Practical Guide, Macmillan Co., New York (1968)などを参照。本発明のような複合体、塩、光学異性体、互変異性体、幾何異性体の結晶の構造を同定する際には、単結晶構造解析が有用である。
【0047】
（ラマン分光法）
ラマンスペクトルは分子または複合体系の振動の特徴を示す。その起源は分子と光線を含む光の粒子である光子との間の非弾性的な衝突にある。分子と光子の衝突はエネルギーの交換をもたらし、その結果エネルギーが変化し、これにより光子の波長が変化する。即ち、ラマンスペクトルは、対象分子に光子が入射されたときに発せられる、極めて波長の狭いスペクトル線であるため、光源としてはレーザー等が用いられる。各ラマン線の波長は入射光からの波数シフトにより表示され、これはラマン線と入射光の波長の逆数の間の差である。ラマンスペクトルは分子の振動状態を測定するものであり、これはその分子構造により決定される。
一般に、ラマンスペクトルピーク（ｃｍ－１）は±２ｃｍ－１の範囲内で誤差が生じ得るから、上記のラマンスペクトルピークの値は±２ｃｍ－１程度の範囲内の数値も含むものとして理解される必要がある。したがって、ラマンスペクトルにおけるラマンスペクトルピークが完全に一致する結晶だけでなく、ラマンスペクトルピークが±２ｃｍ－１程度の誤差で一致する結晶も本発明に含まれる。
ラマンスペクトルは分子または複合体系の振動の特徴を示す。その起源は分子と光線を含む光の粒子である光子との間の非弾性的な衝突にある。分子と光子の衝突はエネルギーの交換をもたらし、その結果エネルギーが変化し、これにより光子の波長が変化する。即ち、ラマンスペクトルは、対象分子に光子が入射されたときに発せられる、極めて波長の狭いスペクトル線であるため、光源としてはレーザー等が用いられる。各ラマン線の波長は入射光からの波数シフトにより表示され、これはラマン線と入射光の波長の逆数の間の差である。ラマンスペクトルは分子の振動状態を測定するものであり、これはその分子構造により決定される。
一般に、ラマンスペクトルピーク（ｃｍ－１）は±２ｃｍ－１の範囲内で誤差が生じ得るから、上記のラマンスペクトルピークの値は±２ｃｍ－１程度の範囲内の数値も含むものとして理解される必要がある。したがって、ラマンスペクトルにおけるラマンスペクトルピークが完全に一致する結晶だけでなく、ラマンスペクトルピークが±２ｃｍ－１程度の誤差で一致する結晶も本発明に含まれる。
【0048】
（示差走査熱量測定法（ＤＳＣ））
ＤＳＣは、熱分析の主要な測定方法の一つで、原子・分子の集合体としての物質の熱的性質を測定する方法である。
ＤＳＣにより、医薬活性成分の温度または時間に係る熱量の変化を測定し、得られたデータを温度または時間に対してプロットすることにより示差走査熱量曲線が得られる。示差走査熱量曲線より、医薬活性成分が融解する際のオンセット温度、融解に伴う吸熱ピーク曲線の最大値およびエンタルピーに関する情報を得ることができる。
ＤＳＣについて、観察される温度は、温度変化速度ならびに用いる試料調製技法および特定の装置に依存し得ることが知られている。したがって、ＤＳＣにおける「融点」とは試料の調製技法の影響を受けにくいオンセット温度のことを指す。示差走査熱量曲線から得られるオンセット温度における誤差範囲はおよそ±２℃である。結晶の同一性の認定においては、融点のみならず全体的なパターンが重要であり、測定条件や測定機器によって多少は変化し得る。
ＤＳＣは、熱分析の主要な測定方法の一つで、原子・分子の集合体としての物質の熱的性質を測定する方法である。
ＤＳＣにより、医薬活性成分の温度または時間に係る熱量の変化を測定し、得られたデータを温度または時間に対してプロットすることにより示差走査熱量曲線が得られる。示差走査熱量曲線より、医薬活性成分が融解する際のオンセット温度、融解に伴う吸熱ピーク曲線の最大値およびエンタルピーに関する情報を得ることができる。
ＤＳＣについて、観察される温度は、温度変化速度ならびに用いる試料調製技法および特定の装置に依存し得ることが知られている。したがって、ＤＳＣにおける「融点」とは試料の調製技法の影響を受けにくいオンセット温度のことを指す。示差走査熱量曲線から得られるオンセット温度における誤差範囲はおよそ±２℃である。結晶の同一性の認定においては、融点のみならず全体的なパターンが重要であり、測定条件や測定機器によって多少は変化し得る。
【0049】
（示差熱－熱重量同時測定法（ＴＧ／ＤＴＡ））
ＴＧ／ＤＴＡは、熱分析の主要な測定方法の一つで、原子・分子の集合体としての物質の重量および熱的性質を測定する方法である。
ＴＧ／ＤＴＡは、医薬活性成分の温度または時間に係る重量および熱量の変化を測定する方法であり、得られたデータを温度または時間に対してプロットすることにより、ＴＧ（熱重量）およびＤＴＡ（示差熱）曲線が得られる。ＴＧ／ＤＴＡ曲線より、医薬活性成分の分解、脱水、酸化、還元、昇華、蒸発に関する重量および熱量変化の情報を得ることができる。
ＴＧ／ＤＴＡについて、観察される温度、重量変化は、温度変化速度ならびに用いる試料調製技法および特定の装置に依存し得ることが知られている。したがって、ＴＧ／ＤＴＡにおける「融点」とは試料の調製技法の影響を受けにくいオンセット温度のことを指す。結晶の同一性の認定においては、融点のみならず全体的なパターンが重要であり、測定条件や測定機器によって多少は変化し得る。
ＴＧ／ＤＴＡは、熱分析の主要な測定方法の一つで、原子・分子の集合体としての物質の重量および熱的性質を測定する方法である。
ＴＧ／ＤＴＡは、医薬活性成分の温度または時間に係る重量および熱量の変化を測定する方法であり、得られたデータを温度または時間に対してプロットすることにより、ＴＧ（熱重量）およびＤＴＡ（示差熱）曲線が得られる。ＴＧ／ＤＴＡ曲線より、医薬活性成分の分解、脱水、酸化、還元、昇華、蒸発に関する重量および熱量変化の情報を得ることができる。
ＴＧ／ＤＴＡについて、観察される温度、重量変化は、温度変化速度ならびに用いる試料調製技法および特定の装置に依存し得ることが知られている。したがって、ＴＧ／ＤＴＡにおける「融点」とは試料の調製技法の影響を受けにくいオンセット温度のことを指す。結晶の同一性の認定においては、融点のみならず全体的なパターンが重要であり、測定条件や測定機器によって多少は変化し得る。
【0050】
本発明に係る化合物は、コロナウイルス３ＣＬプロテアーゼ阻害活性を有するため、コロナウイルス３ＣＬプロテアーゼが関与する疾患の治療剤および／または予防剤として有用である。
本発明において「治療剤および／または予防剤」という場合、症状改善剤を包含する。
本発明において、「予防」という場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の暴露後の発症を抑制することを包含する。
本発明において「予防」という場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の暴露後であって、発症抑制を必要とする個体に本発明医薬組成物を投与することにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる症状の発症を抑制することを包含する。
本発明において、「予防」という場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の暴露前予防を包含する。
本発明において「予防」という場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の暴露前であって、発症抑制を必要とする個体に本発明医薬組成物を投与することにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる症状の発症を抑制することを包含する。
本発明について「予防」という場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の暴露後の発症および重症化を抑制することを包含する。
本発明において「治療剤および／または予防剤」という場合、症状改善剤を包含する。
本発明において、「予防」という場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の暴露後の発症を抑制することを包含する。
本発明において「予防」という場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の暴露後であって、発症抑制を必要とする個体に本発明医薬組成物を投与することにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる症状の発症を抑制することを包含する。
本発明において、「予防」という場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の暴露前予防を包含する。
本発明において「予防」という場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の暴露前であって、発症抑制を必要とする個体に本発明医薬組成物を投与することにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる症状の発症を抑制することを包含する。
本発明について「予防」という場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の暴露後の発症および重症化を抑制することを包含する。
【0051】
コロナウイルス３ＣＬプロテアーゼが関与する疾患としては、ウイルス感染症が挙げられ、好ましくはコロナウイルス感染症が挙げられる。
一つの態様として、コロナウイルスとしては、ヒトに感染するコロナウイルスが挙げられる。ヒトに感染するコロナウイルスとしては、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が挙げられる。
一つの態様として、コロナウイルスとしては、アルファコロナウイルスおよび／またはベータコロナウイルス、より好ましくはベータコロナウイルス、さらに好ましくはサルベコウイルスが挙げられる。
一つの態様として、アルファコロナウイルスとしては、ＨＣｏＶ－２２９ＥおよびＨＣｏＶ－ＮＬ６３が挙げられる。特に好ましくは、ＨＣｏＶ－２２９Ｅが挙げられる。
一つの態様として、ベータコロナウイルスとしては、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が挙げられる。好ましくはＨＣｏＶ－ＯＣ４３またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、特に好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が挙げられる。
一つの態様として、ベータコロナウイルスとしては、ベータコロナウイルスＡ系統（β－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｌｉｎｅａｇｅ Ａ）、ベータコロナウイルスＢ系統（β－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｌｉｎｅａｇｅ Ｂ）、およびベータコロナウイルスＣ系統（β－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｌｉｎｅａｇｅ Ｃ）が挙げられる。より好ましくは、ベータコロナウイルスＡ系統（β－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｌｉｎｅａｇｅ Ａ）、およびベータコロナウイルスＢ系統（β－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｌｉｎｅａｇｅ Ｂ）、特に好ましくはベータコロナウイルスＢ系統（β－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｌｉｎｅａｇｅ Ｂ）が挙げられる。
ベータコロナウイルスＡ系統（β－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｌｉｎｅａｇｅ Ａ）としては、例えばＨＣｏＶ－ＨＫＵ１およびＨＣｏＶ－ＯＣ４３、好ましくは、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３が挙げられる。ベータコロナウイルスＢ系統（β－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｌｉｎｅａｇｅ Ｂ）としては、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が挙げられる。ベータコロナウイルスＣ系統（β－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｌｉｎｅａｇｅ Ｃ）としては、好ましくはＭＥＲＳ－ＣｏＶが挙げられる。
一つの態様として、コロナウイルスとしては、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、特に好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が挙げられる。
なお、ウイルスは増殖や感染を繰り返す中で変異することが一般的に知られている。上記コロナウイルスには、本発明に係る化合物が、コロナウイルス３ＣＬプロテアーゼ阻害活性を発揮することができる株である限り、当該分野で公知の変異株のみならず、今後出現する変異株も含まれる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の公知の変異株としては、例えば、本明細書の実施例で使用した変異株が挙げられる。
コロナウイルス感染症としては、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症が挙げられる。好ましくは、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症、特に好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症が挙げられる。
コロナウイルス感染症としては、特に好ましくは、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）が挙げられる。
一つの態様として、コロナウイルスとしては、ヒトに感染するコロナウイルスが挙げられる。ヒトに感染するコロナウイルスとしては、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が挙げられる。
一つの態様として、コロナウイルスとしては、アルファコロナウイルスおよび／またはベータコロナウイルス、より好ましくはベータコロナウイルス、さらに好ましくはサルベコウイルスが挙げられる。
一つの態様として、アルファコロナウイルスとしては、ＨＣｏＶ－２２９ＥおよびＨＣｏＶ－ＮＬ６３が挙げられる。特に好ましくは、ＨＣｏＶ－２２９Ｅが挙げられる。
一つの態様として、ベータコロナウイルスとしては、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が挙げられる。好ましくはＨＣｏＶ－ＯＣ４３またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、特に好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が挙げられる。
一つの態様として、ベータコロナウイルスとしては、ベータコロナウイルスＡ系統（β－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｌｉｎｅａｇｅ Ａ）、ベータコロナウイルスＢ系統（β－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｌｉｎｅａｇｅ Ｂ）、およびベータコロナウイルスＣ系統（β－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｌｉｎｅａｇｅ Ｃ）が挙げられる。より好ましくは、ベータコロナウイルスＡ系統（β－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｌｉｎｅａｇｅ Ａ）、およびベータコロナウイルスＢ系統（β－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｌｉｎｅａｇｅ Ｂ）、特に好ましくはベータコロナウイルスＢ系統（β－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｌｉｎｅａｇｅ Ｂ）が挙げられる。
ベータコロナウイルスＡ系統（β－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｌｉｎｅａｇｅ Ａ）としては、例えばＨＣｏＶ－ＨＫＵ１およびＨＣｏＶ－ＯＣ４３、好ましくは、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３が挙げられる。ベータコロナウイルスＢ系統（β－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｌｉｎｅａｇｅ Ｂ）としては、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が挙げられる。ベータコロナウイルスＣ系統（β－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｌｉｎｅａｇｅ Ｃ）としては、好ましくはＭＥＲＳ－ＣｏＶが挙げられる。
一つの態様として、コロナウイルスとしては、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、特に好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が挙げられる。
なお、ウイルスは増殖や感染を繰り返す中で変異することが一般的に知られている。上記コロナウイルスには、本発明に係る化合物が、コロナウイルス３ＣＬプロテアーゼ阻害活性を発揮することができる株である限り、当該分野で公知の変異株のみならず、今後出現する変異株も含まれる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の公知の変異株としては、例えば、本明細書の実施例で使用した変異株が挙げられる。
コロナウイルス感染症としては、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症が挙げられる。好ましくは、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症、特に好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症が挙げられる。
コロナウイルス感染症としては、特に好ましくは、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）が挙げられる。
【0052】
新型コロナウイルス感染者の重症度分類は、例えば以下に例示される。（参考：新型コロナウイルス感染症ＣＯＶＩＤ－１９診療の手引き第１０．０版（厚生労働省））
（軽症）
酸素飽和度が９６％以上である。臨床状態は、呼吸器症状はない、または咳のみで呼吸困難はなく、いずれの場合であっても肺炎所見を認めない。
（中等症Ｉ）
酸素飽和度が９６％未満～９３％超である。呼吸困難があり、肺炎所見がある。
（中等症ＩＩ）
酸素飽和度が９３％未満である。呼吸不全があり、酸素投与が必要である。
（重症）
ＩＣＵに入室している、または、人工呼吸器が必要である。
上記の分類は日本における重症度分類の定義であり、例えば、中国や米国ＮＩＨの重症度分類を援用することが可能である。
また、無症候のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者とは、無症状病原体保有者を意味する。例えば、ＣＯＶＩＤ－１９症状の１４症状または１２症状が認められていない者が挙げられる。
（ＣＯＶＩＤ－１９の１４症状：けん怠感 (疲労感)、筋肉痛又は体の痛み、頭痛、悪寒／発汗、熱っぽさ又は発熱、味覚異常、嗅覚異常、鼻水又は鼻づまり、喉の痛み、咳、息切れ（呼吸困難）、吐き気、嘔吐、下痢）
（軽症）
酸素飽和度が９６％以上である。臨床状態は、呼吸器症状はない、または咳のみで呼吸困難はなく、いずれの場合であっても肺炎所見を認めない。
（中等症Ｉ）
酸素飽和度が９６％未満～９３％超である。呼吸困難があり、肺炎所見がある。
（中等症ＩＩ）
酸素飽和度が９３％未満である。呼吸不全があり、酸素投与が必要である。
（重症）
ＩＣＵに入室している、または、人工呼吸器が必要である。
上記の分類は日本における重症度分類の定義であり、例えば、中国や米国ＮＩＨの重症度分類を援用することが可能である。
また、無症候のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者とは、無症状病原体保有者を意味する。例えば、ＣＯＶＩＤ－１９症状の１４症状または１２症状が認められていない者が挙げられる。
（ＣＯＶＩＤ－１９の１４症状：けん怠感 (疲労感)、筋肉痛又は体の痛み、頭痛、悪寒／発汗、熱っぽさ又は発熱、味覚異常、嗅覚異常、鼻水又は鼻づまり、喉の痛み、咳、息切れ（呼吸困難）、吐き気、嘔吐、下痢）
【0053】
本明細書中、ＣＯＶＩＤ－１９の１２症状とは、(けん怠感 (疲労感)、筋肉痛又は体の痛み、頭痛、悪寒/発汗、熱っぽさ又は発熱、鼻水又は鼻づまり、喉の痛み、咳、息切れ (呼吸困難)、吐き気、嘔吐、下痢)が挙げられる。
【0054】
本明細書中、重症化抑制とは、無症候のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者が、軽症、中等症Ｉ、中等症ＩＩまたは重症に分類される重症度に引き上げられることを抑制することを含む。
本明細書中、重症化抑制とは、無症候のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者または軽症のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者が、中等症Ｉ、中等症ＩＩまたは重症に分類される重症度に引き上げられることを抑制することを含む。
本明細書中、重症化抑制とは、無症候のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者、軽症のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者または中等症ＩのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者が、中等症ＩＩまたは重症に分類される重症度に引き上げられることを抑制することを含む。
本明細書中、重症化抑制とは、無症候のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者、軽症のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者、中等症ＩのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者または中等症ＩＩのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者が、重症に分類される重症度に引き上げられることを含む。
本明細書中、重症化抑制とは、本剤のウイルス増殖抑制効果を介して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者の入院や死亡リスクが減少することを含む。
本明細書中、重症化抑制とは、本剤のウイルス増殖抑制効果を介して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者の肺での炎症を軽減することを含む。
本明細書中、重症化抑制とは、本剤のウイルス増殖抑制効果を介して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス感染によって引き起こされる肺炎を抑制することを含む。
本明細書中、重症化抑制とは、本剤のウイルス増殖抑制効果を介して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス感染によって引き起こされる宿主の過剰な免疫反応を抑制することを含む。
本明細書中、重症化抑制とは、無症候のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者または軽症のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者が、中等症Ｉ、中等症ＩＩまたは重症に分類される重症度に引き上げられることを抑制することを含む。
本明細書中、重症化抑制とは、無症候のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者、軽症のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者または中等症ＩのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者が、中等症ＩＩまたは重症に分類される重症度に引き上げられることを抑制することを含む。
本明細書中、重症化抑制とは、無症候のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者、軽症のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者、中等症ＩのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者または中等症ＩＩのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者が、重症に分類される重症度に引き上げられることを含む。
本明細書中、重症化抑制とは、本剤のウイルス増殖抑制効果を介して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者の入院や死亡リスクが減少することを含む。
本明細書中、重症化抑制とは、本剤のウイルス増殖抑制効果を介して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者の肺での炎症を軽減することを含む。
本明細書中、重症化抑制とは、本剤のウイルス増殖抑制効果を介して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス感染によって引き起こされる肺炎を抑制することを含む。
本明細書中、重症化抑制とは、本剤のウイルス増殖抑制効果を介して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス感染によって引き起こされる宿主の過剰な免疫反応を抑制することを含む。
【0055】
一つの実施態様として、本発明の医薬組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者のうち、重症化リスク因子を少なくとも一つ有する感染者に投与することが挙げられる。重症化に関連する基礎疾患などについては、米国ＣＤＣまとめを参照することができる(https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/clinical-care/underlyingconditions.html)。
【0056】
一つの実施態様として、本発明の医薬組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者のうち、次に示す重症化リスク因子を少なくとも一つ有する感染者に投与することが挙げられる。
重症化リスク因子：悪性腫瘍、代謝疾患、心血管疾患、呼吸器疾患、肝疾患、腎疾患、精神神経疾患、運動不足、妊娠、喫煙、小児、遺伝性疾患、免疫不全
重症化リスク因子：悪性腫瘍、代謝疾患、心血管疾患、呼吸器疾患、肝疾患、腎疾患、精神神経疾患、運動不足、妊娠、喫煙、小児、遺伝性疾患、免疫不全
【0057】
一つの実施態様として、本発明の医薬組成物は、重症化リスク因子を少なくとも一つ有する感染者に投与され、ＣＯＶＩＤ－１９症状の重症化を抑制するために用いられる。
【0058】
一つの実施態様として、本発明の医薬組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による肺炎を有する患者に用いられる。
【0059】
本明細書において、「予防」とは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の暴露後の発症抑制を含む。
例えば、新型コロナウイルス感染症を発症している患者の同居家族または共同生活者に対し、本発明の医薬組成物を投与することができる。
例えば、新型コロナウイルス感染症患者に接触後、すみやかに（例：７２時間以内）接触者に対し、本発明の医薬組成物を投与することができる。
例えば、無症候のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者に本発明の医薬組成物を投与し、発症を抑制することができる。
また、「予防」とは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の暴露前予防を含む。
例えば、ＣＯＶＩＤ－１９流行期等、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染リスクがある場合において、医療従事者、高齢者、重症化リスク因子を有する人に対し、本発明の医薬組成物を投与することができる。
例えば、新型コロナウイルス感染症を発症している患者の同居家族または共同生活者に対し、本発明の医薬組成物を投与することができる。
例えば、新型コロナウイルス感染症患者に接触後、すみやかに（例：７２時間以内）接触者に対し、本発明の医薬組成物を投与することができる。
例えば、無症候のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者に本発明の医薬組成物を投与し、発症を抑制することができる。
また、「予防」とは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の暴露前予防を含む。
例えば、ＣＯＶＩＤ－１９流行期等、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染リスクがある場合において、医療従事者、高齢者、重症化リスク因子を有する人に対し、本発明の医薬組成物を投与することができる。
【0060】
（式（Ｉ－１）で示される化合物の製造法）
式（Ｉ－１）で示される化合物は、例えば、下記に示す一般的合成法によって製造することができる。抽出、精製等は、通常の有機化学の実験で行う処理を行えばよい。当該分野において公知の手法を参考にしながら合成することができる。抽出、精製等は、通常の有機化学の実験で行う処理を行えばよい。
式（Ｉ－１）で示される化合物は、当該分野において公知の手法を参考にしながら製造することができる。例えば、ＷＯ２０１２／０２０７４２、ＷＯ２０１３／１１８８５５、ＷＯ２０２３／１９５５２９およびＷＯ２０２３／１９５５３０等を参考にして製造することができる。
（式（ＩＩ）で示される化合物の製造法）
式（ＩＩ）で示される化合物は、例えば、ＷＯ２０２３／１９５５２９を参考にして製造することができる。
式（Ｉ－１）で示される化合物は、例えば、下記に示す一般的合成法によって製造することができる。抽出、精製等は、通常の有機化学の実験で行う処理を行えばよい。当該分野において公知の手法を参考にしながら合成することができる。抽出、精製等は、通常の有機化学の実験で行う処理を行えばよい。
式（Ｉ－１）で示される化合物は、当該分野において公知の手法を参考にしながら製造することができる。例えば、ＷＯ２０１２／０２０７４２、ＷＯ２０１３／１１８８５５、ＷＯ２０２３／１９５５２９およびＷＯ２０２３／１９５５３０等を参考にして製造することができる。
（式（ＩＩ）で示される化合物の製造法）
式（ＩＩ）で示される化合物は、例えば、ＷＯ２０２３／１９５５２９を参考にして製造することができる。
【0061】
本発明に係る化合物（例：式（Ｉ－１）で示される化合物、式（Ｉ－２）で示される化合物および式（ＩＩ）で示される化合物）は、コロナウイルス３ＣＬプロテアーゼ阻害活性を有するため、ウイルス感染症の治療剤および／または予防剤として有用である。
さらに本発明に係る化合物は、医薬としての有用性を備えており、好ましくは、下記のいずれか、または複数の優れた特徴を有している。
ａ）ＣＹＰ酵素（例えば、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ４等）に対する阻害作用が弱い。
ｂ）高いバイオアベイラビリティー、適度なクリアランス等良好な薬物動態を示す。
ｃ）代謝安定性が高い。
ｄ）ＣＹＰ酵素（例えば、ＣＹＰ３Ａ４）に対し、本明細書に記載する測定条件の濃度範囲内で不可逆的阻害作用を示さない。
ｅ）変異原性を有さない。
ｆ）心血管系のリスクが低い。
ｇ）高い溶解性を示す。
ｈ）タンパク質非結合率（ｆｕ値）が高い。
ｉ）高いコロナウイルス３ＣＬプロテアーゼ選択性を有している。
ｊ）高いコロナウイルス増殖阻害活性を有している。例えば、ヒト血清（ＨＳ）またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）添加下において、高いコロナウイルス増殖阻害活性を有している。
ｋ）３ＣＬプロテアーゼ阻害剤耐性ウイルスに対しても、高い増殖阻害活性を有する。
コロナウイルス増殖阻害剤としては、例えば後述のＣＰＥ抑制効果確認試験（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）において、例えばＥＣ５０が１０μＭ以下、好ましくは１μＭ以下、より好ましくは１００ｎＭ以下である態様が挙げられる。
さらに本発明に係る化合物は、医薬としての有用性を備えており、好ましくは、下記のいずれか、または複数の優れた特徴を有している。
ａ）ＣＹＰ酵素（例えば、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ４等）に対する阻害作用が弱い。
ｂ）高いバイオアベイラビリティー、適度なクリアランス等良好な薬物動態を示す。
ｃ）代謝安定性が高い。
ｄ）ＣＹＰ酵素（例えば、ＣＹＰ３Ａ４）に対し、本明細書に記載する測定条件の濃度範囲内で不可逆的阻害作用を示さない。
ｅ）変異原性を有さない。
ｆ）心血管系のリスクが低い。
ｇ）高い溶解性を示す。
ｈ）タンパク質非結合率（ｆｕ値）が高い。
ｉ）高いコロナウイルス３ＣＬプロテアーゼ選択性を有している。
ｊ）高いコロナウイルス増殖阻害活性を有している。例えば、ヒト血清（ＨＳ）またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）添加下において、高いコロナウイルス増殖阻害活性を有している。
ｋ）３ＣＬプロテアーゼ阻害剤耐性ウイルスに対しても、高い増殖阻害活性を有する。
コロナウイルス増殖阻害剤としては、例えば後述のＣＰＥ抑制効果確認試験（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）において、例えばＥＣ５０が１０μＭ以下、好ましくは１μＭ以下、より好ましくは１００ｎＭ以下である態様が挙げられる。
【0062】
本発明の医薬組成物は、経口的、非経口的のいずれの方法でも投与することができる。非経口投与の方法としては、経皮、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、経粘膜、吸入、経鼻、点眼、点耳、膣内投与等が挙げられる。
【0063】
経口投与の場合は常法に従って、内用固形製剤（例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、フィルム剤等）、内用液剤（例えば、懸濁剤、乳剤、エリキシル剤、シロップ剤、リモナーデ剤、酒精剤、芳香水剤、エキス剤、煎剤、チンキ剤等）等の通常用いられるいずれの剤型に調製して投与すればよい。錠剤は、糖衣錠、フィルムコーティング錠、腸溶性コーティング錠、徐放錠、トローチ錠、舌下錠、バッカル錠、チュアブル錠または口腔内崩壊錠であってもよく、散剤および顆粒剤はドライシロップであってもよく、カプセル剤は、ソフトカプセル剤、マイクロカプセル剤または徐放性カプセル剤であってもよい。
【0064】
非経口投与の場合は、注射剤、点滴剤、外用剤（例えば、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、エアゾール剤、吸入剤、ローション剤、注入剤、塗布剤、含嗽剤、浣腸剤、軟膏剤、硬膏剤、ゼリー剤、クリーム剤、貼付剤、パップ剤、外用散剤、坐剤等）等の通常用いられるいずれの剤型でも好適に投与することができる。注射剤は、Ｏ／Ｗ、Ｗ／Ｏ、Ｏ／Ｗ／Ｏ、Ｗ／Ｏ／Ｗ型等のエマルジョンであってもよい。
【0065】
本発明に係る化合物の有効量にその剤型に適した賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等の各種医薬用添加剤を必要に応じて混合し、医薬組成物とすることができる。さらに、該医薬組成物は、本発明に係る化合物の有効量、剤型および／または各種医薬用添加剤を適宜変更することにより、小児用、高齢者用、重症患者用または手術用の医薬組成物とすることもできる。例えば、小児用医薬組成物は、新生児（出生後４週未満）、乳児（出生後４週～１歳未満）幼児（１歳以上７歳未満）、小児（７歳以上１５歳未満）もしくは１５歳～１８歳の患者に投与されうる。例えば、高齢者用医薬組成物は、６５歳以上の患者に投与されうる。
【0066】
本発明の医薬組成物の投与量は、患者の年齢、体重、疾病の種類や程度、投与経路等を考慮した上で設定することが望ましいが、経口投与する場合、本発明に係る化合物として、通常０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ／日であり、好ましくは０．０５～５０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内である。非経口投与の場合には投与経路により大きく異なるが、本発明に係る化合物として、通常０．００５～２００ｍｇ／ｋｇ／日であり、好ましくは０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内である。これを１日１回～数回に分けて投与すれば良い。
【0067】
本発明に係る化合物は、該化合物の作用の増強または該化合物の投与量の低減等を目的として、例えば、他の新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療薬（該治療薬としては、承認を受けた薬剤、および開発中または今後開発される薬剤を含む）（以下、併用薬剤と称する）と組み合わせて用いてもよい。この際、本発明に係る化合物と併用薬剤の投与時期は限定されず、これらを投与対象に対し、同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。さらに、本発明に係る化合物と併用薬剤とは、それぞれの活性成分を含む２種類以上の製剤として投与されてもよいし、それらの活性成分を含む単一の製剤として投与されてもよい。
【0068】
併用薬剤の投与量は、臨床上用いられている用量を基準として適宜選択することができる。また、本発明に係る化合物と併用薬剤の配合比は、投与対象、投与ルート、対象疾患、症状、組み合わせ等により適宜選択することができる。例えば、投与対象がヒトである場合、本発明に係る化合物１重量部に対し、併用薬剤を０．０１～１００重量部用いればよい。
【実施例】
【0069】
以下に実施例および参考例、ならびに試験例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【0070】
また、本明細書中で用いる略語は以下の意味を表す。
ＦＢＳ：ウシ胎児血清
ｍＭ：ｍｍｏｌ／Ｌ
ｎＭ：ｎｍｏｌ／Ｌ
μＭ：μｍｏｌ／Ｌ
ＦＢＳ：ウシ胎児血清
ｍＭ：ｍｍｏｌ／Ｌ
ｎＭ：ｎｍｏｌ／Ｌ
μＭ：μｍｏｌ／Ｌ
【0071】
（化合物の同定方法）
各実施例で得られたＮＭＲ分析は４００ＭＨｚで行い、ＤＭＳＯ－ｄ６、ＣＤＣｌ３を用いて測定した。また、ＮＭＲデータを示す場合は、測定した全てのピークを記載していない場合が存在する。
明細書中にＲＴとあるのは、ＬＣ／ＭＳ：液体クロマトグラフィー／質量分析でのリテンションタイムを表し、以下の条件で測定した。
（測定条件Ａ）
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ Ｃ１８ （１．７μｍ ｉ．ｄ．２．１ｘ５０ｍｍ） （Ｗａｔｅｒｓ）
流速：０．８ｍＬ／分
ＵＶ検出波長：２５４ｎｍ
移動相：［Ａ］は０．１％ギ酸含有水溶液、［Ｂ］は０．１％ギ酸含有アセトニトリル溶液
グラジエント：３．５分間で５％－１００％溶媒［Ｂ］のリニアグラジエントを行った後、０．５分間、１００％溶媒［Ｂ］を維持した。
各実施例で得られたＮＭＲ分析は４００ＭＨｚで行い、ＤＭＳＯ－ｄ６、ＣＤＣｌ３を用いて測定した。また、ＮＭＲデータを示す場合は、測定した全てのピークを記載していない場合が存在する。
明細書中にＲＴとあるのは、ＬＣ／ＭＳ：液体クロマトグラフィー／質量分析でのリテンションタイムを表し、以下の条件で測定した。
（測定条件Ａ）
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ Ｃ１８ （１．７μｍ ｉ．ｄ．２．１ｘ５０ｍｍ） （Ｗａｔｅｒｓ）
流速：０．８ｍＬ／分
ＵＶ検出波長：２５４ｎｍ
移動相：［Ａ］は０．１％ギ酸含有水溶液、［Ｂ］は０．１％ギ酸含有アセトニトリル溶液
グラジエント：３．５分間で５％－１００％溶媒［Ｂ］のリニアグラジエントを行った後、０．５分間、１００％溶媒［Ｂ］を維持した。
【0072】
粉末Ｘ線回折実験（ＸＲＰＤ）
日本薬局方の一般試験法に記載された粉末Ｘ線回折測定法に従い、実施例で得られた、固体形態（結晶）の粉末Ｘ線回折測定を行った。測定条件を以下に示す。
測定条件１：
粉末Ｘ線回折装置：リガク社製ＳｍａｒｔＬａｂ
測定法：反射法
使用波長：ＣｕＫα線（λ＝１.５４１８Å）
管電流：２００ｍＡ
管電圧：４５ｋＶ
試料プレート：アルミニウム
Ｘ線の入射角：２．５°
サンプリング幅：０．０２°
検出器：ＨｙＰｉｘ－３０００（２次元検出モード）
日本薬局方の一般試験法に記載された粉末Ｘ線回折測定法に従い、実施例で得られた、固体形態（結晶）の粉末Ｘ線回折測定を行った。測定条件を以下に示す。
測定条件１：
粉末Ｘ線回折装置：リガク社製ＳｍａｒｔＬａｂ
測定法：反射法
使用波長：ＣｕＫα線（λ＝１.５４１８Å）
管電流：２００ｍＡ
管電圧：４５ｋＶ
試料プレート：アルミニウム
Ｘ線の入射角：２．５°
サンプリング幅：０．０２°
検出器：ＨｙＰｉｘ－３０００（２次元検出モード）
【0073】
単結晶構造解析の測定と解析方法
実施例で得られた結晶の単結晶構造解析を行った。測定条件及び解析方法を以下に示す。
（装置）
リガク社製 ＸｔａＬＡＢ Ｐ２００ ＭＭ００７
（測定条件）
測定温度：２５℃
温度コントローラ：リガク社製 試料吹付低温装置
使用波長：ＣｕＫα線（λ＝１．５４１８Å）
ソフト：ＣｒｙｓＡｌｉｓＰｒｏ １．１７１．３９．４６ｅ （Ｒｉｇａｋｕ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ， ２０１８）
（データ処理）
ソフト：ＣｒｙｓＡｌｉｓＰｒｏ １．１７１．３９．４６ｅ （Ｒｉｇａｋｕ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ， ２０１８）
データはローレンツ及び偏光補正、吸収補正を行った。
（結晶構造解析）
直接法プログラムＳｈｅｌＸＴ（Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ, Ｇ.Ｍ.，２０１５）を用いて位相決定を行い、精密化はＳｈｅｌＸＬ（Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ, Ｇ.Ｍ.，２０１５）を用いて、ｆｕｌｌ－ｍａｔｒｉｘ最小二乗法を実施した。非水素原子の温度因子はすべて異方性で精密化を行った。水素原子は、特に記載のない限りＳｈｅｌＸＬのデフォルトパラメータを用いて計算により導入し、ｒｉｄｉｎｇ ａｔｏｍとして取り扱った。また、水素原子は、等方性パラメーターで精密化を行った。
以下の構造図の作図には、ＰＬＡＴＯＮ（Ｓｐｅｋ，１９９１）／ＯＲＴＥＰ（Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９７６）を使用した（３０％ ＰＲＯＢＡＢＩＬＩＴＹ ｌｅｖｅｌ）。
実施例で得られた結晶の単結晶構造解析を行った。測定条件及び解析方法を以下に示す。
（装置）
リガク社製 ＸｔａＬＡＢ Ｐ２００ ＭＭ００７
（測定条件）
測定温度：２５℃
温度コントローラ：リガク社製 試料吹付低温装置
使用波長：ＣｕＫα線（λ＝１．５４１８Å）
ソフト：ＣｒｙｓＡｌｉｓＰｒｏ １．１７１．３９．４６ｅ （Ｒｉｇａｋｕ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ， ２０１８）
（データ処理）
ソフト：ＣｒｙｓＡｌｉｓＰｒｏ １．１７１．３９．４６ｅ （Ｒｉｇａｋｕ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ， ２０１８）
データはローレンツ及び偏光補正、吸収補正を行った。
（結晶構造解析）
直接法プログラムＳｈｅｌＸＴ（Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ, Ｇ.Ｍ.，２０１５）を用いて位相決定を行い、精密化はＳｈｅｌＸＬ（Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ, Ｇ.Ｍ.，２０１５）を用いて、ｆｕｌｌ－ｍａｔｒｉｘ最小二乗法を実施した。非水素原子の温度因子はすべて異方性で精密化を行った。水素原子は、特に記載のない限りＳｈｅｌＸＬのデフォルトパラメータを用いて計算により導入し、ｒｉｄｉｎｇ ａｔｏｍとして取り扱った。また、水素原子は、等方性パラメーターで精密化を行った。
以下の構造図の作図には、ＰＬＡＴＯＮ（Ｓｐｅｋ，１９９１）／ＯＲＴＥＰ（Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９７６）を使用した（３０％ ＰＲＯＢＡＢＩＬＩＴＹ ｌｅｖｅｌ）。
【0074】
ラマンスペクトルの測定
実施例で得られた結晶のラマンスペクトルの測定とベースライン補正を行った測定条件を以下に示す。
測定条件１
測定方法：顕微レーザーラマン分光法
レーザー波長：６７１ｎｍ
積算回数：１回
露光時間：１秒
実施例で得られた結晶のラマンスペクトルの測定とベースライン補正を行った測定条件を以下に示す。
測定条件１
測定方法：顕微レーザーラマン分光法
レーザー波長：６７１ｎｍ
積算回数：１回
露光時間：１秒
【0075】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
実施例で得られた結晶のＤＳＣの測定を行った。アルミニウムパンに試料を量り、簡易密封して測定した。測定条件を以下に示す。なお、示差走査熱量（ＤＳＣ）による測定は±２℃の範囲内で誤差が生じうる。
装置：Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＤＳＣ／ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ
測定温度範囲：－１０℃－２７０℃
昇温速度：１０℃／分
雰囲気：Ｎ２ ５０ｍＬ／分
実施例で得られた結晶のＤＳＣの測定を行った。アルミニウムパンに試料を量り、簡易密封して測定した。測定条件を以下に示す。なお、示差走査熱量（ＤＳＣ）による測定は±２℃の範囲内で誤差が生じうる。
装置：Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＤＳＣ／ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ
測定温度範囲：－１０℃－２７０℃
昇温速度：１０℃／分
雰囲気：Ｎ２ ５０ｍＬ／分
【0076】
示差熱－熱重量同時測定（ＴＧ／ＤＴＡ）
実施例で得られた、固体形態（結晶）の示差熱－熱重量同時測定（ＴＧ／ＤＴＡ）を行った。実施例で得られた試料を量り、アルミニウムパンにつめ、開放系にて測定した。測定条件は以下のとおりである。
装置：日立ハイテクノロジーズ ＴＧ/ＤＴＡ ＳＴＡ７２００ＲＶ
測定温度範囲：室温－３５０℃
昇温速度：１０℃／分
実施例で得られた、固体形態（結晶）の示差熱－熱重量同時測定（ＴＧ／ＤＴＡ）を行った。実施例で得られた試料を量り、アルミニウムパンにつめ、開放系にて測定した。測定条件は以下のとおりである。
装置：日立ハイテクノロジーズ ＴＧ/ＤＴＡ ＳＴＡ７２００ＲＶ
測定温度範囲：室温－３５０℃
昇温速度：１０℃／分
【0077】
ＨＰＬＣ測定
機器：Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＶＬ
カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８、 １．７μｍ、２．１×１００ｍｍ
カラム温度：４０℃付近の一定温度
ＵＶ検出波長：３００ｎｍ
移動相：［Ａ］は０．１％ギ酸含有水溶液、［Ｂ］は０．１％ギ酸含有アセトニトリル溶液
グラジエント：１分間、２０％溶媒［Ｂ］を維持し、３２分間で２０％－８０％溶媒［Ｂ］のリニアグラジエントを行った後、７分間、２０％溶媒［Ｂ］を維持した。
流量：０．４ｍＬ／分
注入量：３μＬ
機器：Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＶＬ
カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８、 １．７μｍ、２．１×１００ｍｍ
カラム温度：４０℃付近の一定温度
ＵＶ検出波長：３００ｎｍ
移動相：［Ａ］は０．１％ギ酸含有水溶液、［Ｂ］は０．１％ギ酸含有アセトニトリル溶液
グラジエント：１分間、２０％溶媒［Ｂ］を維持し、３２分間で２０％－８０％溶媒［Ｂ］のリニアグラジエントを行った後、７分間、２０％溶媒［Ｂ］を維持した。
流量：０．４ｍＬ／分
注入量：３μＬ
【実施例1】
【0078】
化合物（Ｉ－１）の合成
工程１ 化合物３の合成
２．６４ｍｏｌ／Ｌ ｎ－ブチルリチウムのヘキサン溶液（３１ｍＬ、８２．４ｍｍｏｌ）とテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）の混合溶液に、化合物１（１２ｇ、６８．７ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（７０ｍＬ）溶液を－７８℃で１５分かけて滴下した。－７８℃で１時間攪拌した。１．９ｍｏｌ／Ｌ 塩化亜鉛の２－メチルテトラヒドロフラン溶液（４３ｍＬ、８２．４ｍｍｏｌ）を５分かけて滴下した。室温で２時間撹拌した。化合物２（９．１ｍＬ、７５．６ｍｍｏｌ）およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（４．０ｇ、３．４４ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で１．５時間撹拌した。反応液を常温に冷却し、水（８０ｍＬ）と２ｍｏｌ／Ｌ塩酸（４０ｍＬ）を加えて酢酸エチルで抽出した。有機層を減圧濃縮し、得られた残渣にイソプロパノール（４０ｍＬ）を加えた。沈殿物を濾取してイソプロパノールで洗浄した。風乾して化合物３（１４．８ｇ、４９ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．９５（ｓ，３Ｈ）、４．０５（ｓ，３Ｈ）、７．１８－７．２３（ｍ，２Ｈ）、７．３５（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ）
ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝３０３、ＲＴ＝２．７０ｍｉｎ、ＬＣ／ＭＳ測定条件Ａ
【化46】
工程１ 化合物３の合成
２．６４ｍｏｌ／Ｌ ｎ－ブチルリチウムのヘキサン溶液（３１ｍＬ、８２．４ｍｍｏｌ）とテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）の混合溶液に、化合物１（１２ｇ、６８．７ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（７０ｍＬ）溶液を－７８℃で１５分かけて滴下した。－７８℃で１時間攪拌した。１．９ｍｏｌ／Ｌ 塩化亜鉛の２－メチルテトラヒドロフラン溶液（４３ｍＬ、８２．４ｍｍｏｌ）を５分かけて滴下した。室温で２時間撹拌した。化合物２（９．１ｍＬ、７５．６ｍｍｏｌ）およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（４．０ｇ、３．４４ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で１．５時間撹拌した。反応液を常温に冷却し、水（８０ｍＬ）と２ｍｏｌ／Ｌ塩酸（４０ｍＬ）を加えて酢酸エチルで抽出した。有機層を減圧濃縮し、得られた残渣にイソプロパノール（４０ｍＬ）を加えた。沈殿物を濾取してイソプロパノールで洗浄した。風乾して化合物３（１４．８ｇ、４９ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．９５（ｓ，３Ｈ）、４．０５（ｓ，３Ｈ）、７．１８－７．２３（ｍ，２Ｈ）、７．３５（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ）
ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝３０３、ＲＴ＝２．７０ｍｉｎ、ＬＣ／ＭＳ測定条件Ａ
【0079】
工程２ 化合物４の合成
化合物３（１４．８ｇ、４８．８ｍｍｏｌ）に酢酸（４０ｍＬ）と濃塩酸（４１ｍＬ）を加え、１１０℃で５時間撹拌した。反応液を室温まで冷却した後に水（８０ｍｌ）を加えた。沈殿物を濾取して水で洗浄した。風乾して化合物４（１１．６ｇ、４２．２ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：７．３１（ｄｄｄ，Ｊ＝８．８，４．９，２．１Ｈｚ，１Ｈ）、７．４５（ｔ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．５３（ｄｄ，Ｊ＝７．３，２．１Ｈｚ，１Ｈ）、１１．５７（ｓ，１Ｈ）、１２．２４（ｂｒｓ，１Ｈ）
ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝２７５、ＲＴ＝１．８１ｍｉｎ、ＬＣ／ＭＳ測定条件Ａ
化合物３（１４．８ｇ、４８．８ｍｍｏｌ）に酢酸（４０ｍＬ）と濃塩酸（４１ｍＬ）を加え、１１０℃で５時間撹拌した。反応液を室温まで冷却した後に水（８０ｍｌ）を加えた。沈殿物を濾取して水で洗浄した。風乾して化合物４（１１．６ｇ、４２．２ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：７．３１（ｄｄｄ，Ｊ＝８．８，４．９，２．１Ｈｚ，１Ｈ）、７．４５（ｔ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．５３（ｄｄ，Ｊ＝７．３，２．１Ｈｚ，１Ｈ）、１１．５７（ｓ，１Ｈ）、１２．２４（ｂｒｓ，１Ｈ）
ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝２７５、ＲＴ＝１．８１ｍｉｎ、ＬＣ／ＭＳ測定条件Ａ
【0080】
工程３ 化合物５の合成
化合物４（１．００ｇ、３．６４ｍｍｏｌ）、５－クロロピリジン－３－ボロン酸（１．１４ｇ、７．２７ｍｍｏｌ）、酢酸銅（ＩＩ）（０．９９ｇ、５．４５ｍｍｏｌ）、アセトニトリル（１０ｍＬ）、トリエチルアミン（５．０４ｍＬ、３６．４ｍｍｏｌ）およびピリジン（７．３４ｍＬ、９１．０ｍｍｏｌ）を混合し、溶液を常温で終夜撹拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５ｍＬ）を加えて、酢酸エチルで抽出した。有機層を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１００：０～９０：１０）で精製し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を減圧乾燥し、化合物５（１．１５ｇ、２．９７ｍｍｏｌ、収率８２％）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：７．３５－７．３７（１Ｈ，ｍ），７．４９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．５４－７．５６（１Ｈ，ｍ），８．０７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝２．１Ｈｚ），８．５４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），８．７０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ）．
ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝３８６、ＲＴ＝１．９８ｍｉｎ、ＬＣ／ＭＳ測定条件Ａ
化合物４（１．００ｇ、３．６４ｍｍｏｌ）、５－クロロピリジン－３－ボロン酸（１．１４ｇ、７．２７ｍｍｏｌ）、酢酸銅（ＩＩ）（０．９９ｇ、５．４５ｍｍｏｌ）、アセトニトリル（１０ｍＬ）、トリエチルアミン（５．０４ｍＬ、３６．４ｍｍｏｌ）およびピリジン（７．３４ｍＬ、９１．０ｍｍｏｌ）を混合し、溶液を常温で終夜撹拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５ｍＬ）を加えて、酢酸エチルで抽出した。有機層を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１００：０～９０：１０）で精製し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を減圧乾燥し、化合物５（１．１５ｇ、２．９７ｍｍｏｌ、収率８２％）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：７．３５－７．３７（１Ｈ，ｍ），７．４９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．５４－７．５６（１Ｈ，ｍ），８．０７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝２．１Ｈｚ），８．５４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），８．７０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ）．
ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝３８６、ＲＴ＝１．９８ｍｉｎ、ＬＣ／ＭＳ測定条件Ａ
【0081】
工程４ 化合物６の合成
化合物５（５２０ｍｇ、１．３４５ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．７０５ｍＬ、４．０４ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（５．２ｍＬ）を混合した溶液に、２－ブロモアセトニトリル（２６９μＬ、４．０４ｍｍｏｌ）を加え、常温で終夜撹拌した。氷冷下で反応液に２ｍｏｌ／Ｌ塩酸（２ｍＬ）を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１００：０～９９：１）で精製し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を減圧乾燥し、化合物６（２９１ｍｇ、０．６８４ｍｍｏｌ、収率５１％）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：５．１３（２Ｈ，ｓ），７．２３－７．２４（２Ｈ，ｍ），７．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．６７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝２．１Ｈｚ），８．４５（１Ｈ，ｄ, Ｊ＝２．３Ｈｚ），８．６７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ）．
ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝４２５、ＲＴ＝２．１７ｍｉｎ、ＬＣ／ＭＳ測定条件Ａ
化合物５（５２０ｍｇ、１．３４５ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．７０５ｍＬ、４．０４ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（５．２ｍＬ）を混合した溶液に、２－ブロモアセトニトリル（２６９μＬ、４．０４ｍｍｏｌ）を加え、常温で終夜撹拌した。氷冷下で反応液に２ｍｏｌ／Ｌ塩酸（２ｍＬ）を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１００：０～９９：１）で精製し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を減圧乾燥し、化合物６（２９１ｍｇ、０．６８４ｍｍｏｌ、収率５１％）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：５．１３（２Ｈ，ｓ），７．２３－７．２４（２Ｈ，ｍ），７．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．６７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝２．１Ｈｚ），８．４５（１Ｈ，ｄ, Ｊ＝２．３Ｈｚ），８．６７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ）．
ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝４２５、ＲＴ＝２．１７ｍｉｎ、ＬＣ／ＭＳ測定条件Ａ
【0082】
工程５ 化合物（Ｉ－１）の合成
化合物６（２５．０ｍｇ、０．０５９ｍｍｏｌ）、６，６－ジフルオロ－２－アザスピロ［３．３］ヘプタン トリフルオロ酢酸塩（１７．４ｍｇ、０．０７０ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２０．５μＬ、０．１１７ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）を混合し、溶液を６０℃で２時間撹拌した。反応液に水（２ｍＬ）を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を濃縮し、酢酸エチル（０．０５ｍＬ）、ヘキサン（０．１２５ｍＬ）およびジイソプロピルエーテル（０．１２５ｍＬ）を加えた。得られた沈殿物をろ取し、ジイソプロピルエーテルで洗浄した。得られた固体を減圧乾燥し、化合物（Ｉ－１）の無水物結晶（２２．０ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ、収率７２％）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：２．７５（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ），４．０２（４Ｈ，ｓ），４．７４（２Ｈ，ｓ），７．１６－７．１８（２Ｈ，ｍ），７．３２－７．３５（１Ｈ，ｍ），７．６５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝２．１Ｈｚ），８．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ），８．６１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ）．
ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝５２２、ＲＴ＝２．２７ｍｉｎ、ＬＣ／ＭＳ測定条件Ａ
化合物６（２５．０ｍｇ、０．０５９ｍｍｏｌ）、６，６－ジフルオロ－２－アザスピロ［３．３］ヘプタン トリフルオロ酢酸塩（１７．４ｍｇ、０．０７０ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２０．５μＬ、０．１１７ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）を混合し、溶液を６０℃で２時間撹拌した。反応液に水（２ｍＬ）を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を濃縮し、酢酸エチル（０．０５ｍＬ）、ヘキサン（０．１２５ｍＬ）およびジイソプロピルエーテル（０．１２５ｍＬ）を加えた。得られた沈殿物をろ取し、ジイソプロピルエーテルで洗浄した。得られた固体を減圧乾燥し、化合物（Ｉ－１）の無水物結晶（２２．０ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ、収率７２％）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：２．７５（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ），４．０２（４Ｈ，ｓ），４．７４（２Ｈ，ｓ），７．１６－７．１８（２Ｈ，ｍ），７．３２－７．３５（１Ｈ，ｍ），７．６５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝２．１Ｈｚ），８．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ），８．６１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ）．
ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝５２２、ＲＴ＝２．２７ｍｉｎ、ＬＣ／ＭＳ測定条件Ａ
【0083】
（式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶の粉砕）
実施例１で得られた、式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶について、１０００μＭメッシュで篩過した後、以下条件で粉砕を行った。
装置：Ａ－Ｏジェットミル（株式会社セイシン企業）
供給方法：フィーダー
供給速度：２０ｇ／時間
粉砕圧：０．３０ＭＰａ
供給圧：０．４０ＭＰａ
実施例１で得られた、式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶について、１０００μＭメッシュで篩過した後、以下条件で粉砕を行った。
装置：Ａ－Ｏジェットミル（株式会社セイシン企業）
供給方法：フィーダー
供給速度：２０ｇ／時間
粉砕圧：０．３０ＭＰａ
供給圧：０．４０ＭＰａ
【0084】
（式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶の粉末Ｘ線回折実験）
粉砕後の式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶について、上記記載の測定条件で粉末Ｘ線回折実験を行った。当該粉末Ｘ線回折パターンを図７に、粉末Ｘ線回折パターンのピークリストを図８に示す。以下、粉末Ｘ線回折パターンのピークリストの表中、Ｐｏｓｉｔｉｏｎは２θ（°）、Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙは強度を示す。
粉末Ｘ線回折パターンにおいて、回折角度（２θ）：６．５°±０．２°、１０．１°±０．２°、１３．０°±０．２°、１４．１°±０．２°、１５．３°±０．２°、１５．６°±０．２°、１６．２°±０．２°、１７．４°±０．２°、１８．９°±０．２°、１９．９°±０．２°、２０．３°±０．２°、２１．７°±０．２°、２３．０°±０．２°、２３．８°±０．２°、２５．８°±０．２°、２８．８°±０．２°及び３０．６°±０．２°にピークが認められた。
式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶は、粉末Ｘ線回折パターンにおいて、回折角度（２θ）： ６．５°±０．２°、１５．６°±０．２°、１７．４°±０．２°、１９．９°±０．２°及び２０．３°±０．２°に特徴的なピークを示した。
粉砕後の式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶について、上記記載の測定条件で粉末Ｘ線回折実験を行った。当該粉末Ｘ線回折パターンを図７に、粉末Ｘ線回折パターンのピークリストを図８に示す。以下、粉末Ｘ線回折パターンのピークリストの表中、Ｐｏｓｉｔｉｏｎは２θ（°）、Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙは強度を示す。
粉末Ｘ線回折パターンにおいて、回折角度（２θ）：６．５°±０．２°、１０．１°±０．２°、１３．０°±０．２°、１４．１°±０．２°、１５．３°±０．２°、１５．６°±０．２°、１６．２°±０．２°、１７．４°±０．２°、１８．９°±０．２°、１９．９°±０．２°、２０．３°±０．２°、２１．７°±０．２°、２３．０°±０．２°、２３．８°±０．２°、２５．８°±０．２°、２８．８°±０．２°及び３０．６°±０．２°にピークが認められた。
式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶は、粉末Ｘ線回折パターンにおいて、回折角度（２θ）： ６．５°±０．２°、１５．６°±０．２°、１７．４°±０．２°、１９．９°±０．２°及び２０．３°±０．２°に特徴的なピークを示した。
【0085】
（式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶の単結晶構造解析）
＜単結晶の調製方法＞
式（Ｉ－１）で示される化合物の結晶１ｍｇに、４００μＬのメタノールを添加し、５０℃に加熱して溶解させた。当該溶液を、１．５ ｍＬのＨＰＬＣバイアルに分注して、ＨＰＬＣバイアルの蓋をし、蓋にシリンジ針を刺して、室温にて静置した。溶媒蒸発法により単結晶を調製した。
＜単結晶構造解析＞
上記記載の方法で、単結晶回折実験及び解析を行った。なお、Ｃｌ１とＣｌ７Ｃ、Ｈ５ＣＡとＨ６ＣＡはディスオーダーの関係にあるため、Ｃｌ１：Ｃｌ７Ｃ＝０．７５：０．２５、Ｈ５ＣＡ：Ｈ６ＣＡ＝０．２５：０．７５の占有率で解析した。
＜単結晶の調製方法＞
式（Ｉ－１）で示される化合物の結晶１ｍｇに、４００μＬのメタノールを添加し、５０℃に加熱して溶解させた。当該溶液を、１．５ ｍＬのＨＰＬＣバイアルに分注して、ＨＰＬＣバイアルの蓋をし、蓋にシリンジ針を刺して、室温にて静置した。溶媒蒸発法により単結晶を調製した。
＜単結晶構造解析＞
上記記載の方法で、単結晶回折実験及び解析を行った。なお、Ｃｌ１とＣｌ７Ｃ、Ｈ５ＣＡとＨ６ＣＡはディスオーダーの関係にあるため、Ｃｌ１：Ｃｌ７Ｃ＝０．７５：０．２５、Ｈ５ＣＡ：Ｈ６ＣＡ＝０．２５：０．７５の占有率で解析した。
【0086】
当該単結晶構造解析の結果を以下に示す。Ｒ１（Ｉ＞２．００ｓ（Ｉ））は０．０５５５であり、最終の差フーリエから電子密度の欠如も誤置もないことを確認した。
【0087】
結晶学的データを表１に示す。
ここで、Ｖは単位格子体積、Ｚは単位格子中の分子数を意味する。
【表1】
ここで、Ｖは単位格子体積、Ｚは単位格子中の分子数を意味する。
【0088】
非水素原子の原子分率座標ｘ、ｙ、ｚ（Å×１０４）及び等価等方性温度因子Ｕ（ｅｑ）（Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ Ｉｓｏｔｒｏｐｉｃ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ、Å２×１０３）を表２に示す。ここで、Ｕ（ｅｑ）は、直行化Ｕｉｊテンソルの軌跡の３分の１として定義する。
なお、表２における非水素原子の番号は、それぞれ図９に記載された番号に対応している。
なお、表２における非水素原子の番号は、それぞれ図９に記載された番号に対応している。
【表2】
【0089】
次に、水素原子の原子座標ｘ、ｙ、ｚ（Å×１０４）及び等方性温度因子Ｕ（ｅｑ）（Ｉｓｏｔｒｏｐｉｃ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ、Å２×１０３）を表３に示す。
【表3】
【0090】
【0091】
当該結晶構造は、非対称単位中に、式（Ｉ－１）で示される化合物１分子のみが存在していたため、式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶であると同定した。
【0092】
当該結晶構造から、Ｍｅｒｃｕｒｙ（Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ Ｄａｔａ Ｃｅｎｔｒe, Ｖｅｒ．４．０．０）を用いて計算を行った粉末Ｘ線回折パターン（λ＝１.５４１８Å）は、上記の粉末Ｘ線回折パターン（図７）と概ね一致していることを確認した。
【0093】
（式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶の示差走査熱量測定）
粉砕後の式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶を、アルミニウムパンに約２ｍｇ量り、上記記載の方法で測定を行った。その結果を図１０に示す。オンセット温度が約２６１．３℃の吸熱ピークを示した。
粉砕後の式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶を、アルミニウムパンに約２ｍｇ量り、上記記載の方法で測定を行った。その結果を図１０に示す。オンセット温度が約２６１．３℃の吸熱ピークを示した。
【0094】
（式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶の示差熱－熱重量同時測定）
粉砕後の式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶について、上記記載の方法で測定を行った。その結果を図１１に示す。オンセット温度が約２６５．６℃の吸熱ピークを示した。また、重量減少は確認されなかった。
粉砕後の式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶について、上記記載の方法で測定を行った。その結果を図１１に示す。オンセット温度が約２６５．６℃の吸熱ピークを示した。また、重量減少は確認されなかった。
【0095】
（式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶のラマンスペクトル測定）
粉砕後の式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶について、上記記載の測定条件１でラマンスペクトル測定を行った。その結果を図１２に示す。また、主なラマンピークを以下に示す。
式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶は、ラマンスペクトルにおいて、４１５．２ｃｍ－１±２ｃｍ－１、５０２．７ｃｍ－１±２ｃｍ－１、１４３１．４ｃｍ－１±２ｃｍ－１、１７１４．８ｃｍ－１±２ｃｍ－１、及び３０６５．４ｃｍ－１±２ｃｍ－１に特徴的なピークを示した。
粉砕後の式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶について、上記記載の測定条件１でラマンスペクトル測定を行った。その結果を図１２に示す。また、主なラマンピークを以下に示す。
【表4】
【0096】
（式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶のＨＰＬＣ測定）
粉砕後の式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶について、上記記載の方法で測定を行った。その結果を図１３に示す（約９６．５ｐａ％）。
粉砕後の式（Ｉ－１）で示される化合物の無水物結晶について、上記記載の方法で測定を行った。その結果を図１３に示す（約９６．５ｐａ％）。
【実施例2】
【0097】
化合物（Ｉ－２）の合成
【化47】
【0098】
工程１ 化合物８の合成
化合物７（２．６ g、１４.２ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１３ｍＬ）およびメチルアルコール－Ｏ１８（１．１８ｍＬ、２９．１ｍｍｏｌ）を混合し、氷冷下で水素化ナトリウム（１．４２ｇ、３５．４ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。反応溶液を常温に昇温し、２時間撹拌した。反応溶液を氷浴中で冷却し、水（２６ｍＬ）および酢酸エチル（２６ｍＬ）を加えクエンチし、酢酸エチルで抽出した。有機層を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１０：０～９：１）で精製し、溶媒を減圧留去し、化合物８（１．５７ｇ、８．７９ｍｍｏｌ、収率６２％）を得た。
ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝１７９、ＲＴ＝１．５７ｍｉｎ、ＬＣ／ＭＳ測定条件Ａ
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．９７（ｓ，３Ｈ）、４．００（ｓ，３Ｈ）、６．４１（ｓ，１Ｈ）
化合物７（２．６ g、１４.２ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１３ｍＬ）およびメチルアルコール－Ｏ１８（１．１８ｍＬ、２９．１ｍｍｏｌ）を混合し、氷冷下で水素化ナトリウム（１．４２ｇ、３５．４ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。反応溶液を常温に昇温し、２時間撹拌した。反応溶液を氷浴中で冷却し、水（２６ｍＬ）および酢酸エチル（２６ｍＬ）を加えクエンチし、酢酸エチルで抽出した。有機層を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１０：０～９：１）で精製し、溶媒を減圧留去し、化合物８（１．５７ｇ、８．７９ｍｍｏｌ、収率６２％）を得た。
ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝１７９、ＲＴ＝１．５７ｍｉｎ、ＬＣ／ＭＳ測定条件Ａ
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．９７（ｓ，３Ｈ）、４．００（ｓ，３Ｈ）、６．４１（ｓ，１Ｈ）
【0099】
工程２ 化合物１０の合成
化合物９（０．５ｇ、３．４３ｍｍｏｌ）、重水（１７．１ｍＬ、９４５ｍｍｏｌ）および５ｍｏｌ／Ｌ ＤＣｌ（０．６９ｍＬ、３．４３ｍｏｌ）を混合し１８０℃でマイクロウェーブを用いて３０分加熱した。同様の操作を１０回繰り返し、全ての反応溶液を混合し、酢酸エチル５０ｍＬ、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液（５１．５ｍＬ）を加え、酢酸エチルで抽出したのち、水、飽和食塩水で洗浄した。有機層を減圧濃縮し、化合物１０（５．０２ｇ、３４ｍｍｏｌ、収率９９％）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．５９（ｂｒｓ，２Ｈ）、６．８７～６．９５（ｍ，１Ｈ）
化合物９（０．５ｇ、３．４３ｍｍｏｌ）、重水（１７．１ｍＬ、９４５ｍｍｏｌ）および５ｍｏｌ／Ｌ ＤＣｌ（０．６９ｍＬ、３．４３ｍｏｌ）を混合し１８０℃でマイクロウェーブを用いて３０分加熱した。同様の操作を１０回繰り返し、全ての反応溶液を混合し、酢酸エチル５０ｍＬ、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液（５１．５ｍＬ）を加え、酢酸エチルで抽出したのち、水、飽和食塩水で洗浄した。有機層を減圧濃縮し、化合物１０（５．０２ｇ、３４ｍｍｏｌ、収率９９％）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．５９（ｂｒｓ，２Ｈ）、６．８７～６．９５（ｍ，１Ｈ）
【0100】
工程３ 化合物１１の合成
化合物１０（５ｇ、３３．９ｍｍｏｌ）および水（１１．５ｍＬ）を混合し、氷冷下で臭化水素（１１．５ｍＬ、１０２ｍｍｏｌ）を加えた。その後ＮａＮＯ２（２．３８４ｇ、３４．６ｍｍｏｌ）を水（７．５ｍＬ）に溶かしゆっくりと加えた。反応溶液を３０℃に加熱し、ＣｕＢｒ（６．３２ｇ、４４．０ｍｍｏｌ）を臭化水素（１３．４２ｍＬ、１１９ｍｍｏｌ）に溶かして加え、内温３０～４０℃で加えた。３０分撹拌したのち反応溶液にヘキサン２００ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（６７．８ｍＬ、３３９ｍｍｏｌ）を加えた。反応溶液をセライトでろ過し、ろ液をヘキサンで抽出した。有機層を水及び飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。有機層を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１０：０～９：１）で精製し、溶媒を減圧留去し、化合物１１（４．３５ｇ、１５．１ｍｍｏｌ、７３．５ｗｔ％）を得た。化合物１１は沸点が低いため、溶媒を完全に留去せずに次の反応に用いた。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：７．００－７．０７（ｍ，２Ｈ）
化合物１０（５ｇ、３３．９ｍｍｏｌ）および水（１１．５ｍＬ）を混合し、氷冷下で臭化水素（１１．５ｍＬ、１０２ｍｍｏｌ）を加えた。その後ＮａＮＯ２（２．３８４ｇ、３４．６ｍｍｏｌ）を水（７．５ｍＬ）に溶かしゆっくりと加えた。反応溶液を３０℃に加熱し、ＣｕＢｒ（６．３２ｇ、４４．０ｍｍｏｌ）を臭化水素（１３．４２ｍＬ、１１９ｍｍｏｌ）に溶かして加え、内温３０～４０℃で加えた。３０分撹拌したのち反応溶液にヘキサン２００ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（６７．８ｍＬ、３３９ｍｍｏｌ）を加えた。反応溶液をセライトでろ過し、ろ液をヘキサンで抽出した。有機層を水及び飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。有機層を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１０：０～９：１）で精製し、溶媒を減圧留去し、化合物１１（４．３５ｇ、１５．１ｍｍｏｌ、７３．５ｗｔ％）を得た。化合物１１は沸点が低いため、溶媒を完全に留去せずに次の反応に用いた。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：７．００－７．０７（ｍ，２Ｈ）
【0101】
工程４ 化合物１２の合成
２．７６ｍｏｌ／Ｌ ｎ－ブチルリチウムのヘキサン溶液（１．８ｍＬ、５．０４ｍｍｏｌ）とテトラヒドロフラン（２.６ｍＬ）の混合溶液に、化合物８（０．７５ｇ、４．２ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（７０ｍＬ）溶液を－７８℃で５分かけてゆっくり滴下した。反応溶液を－７８℃で１時間攪拌した。反応溶液に、１．９ｍｏｌ／Ｌ 塩化亜鉛の２－メチルテトラヒドロフラン溶液（２．６ｍＬ、８２．４ｍｍｏｌ）を滴下した。室温で反応溶液を２時間撹拌した。反応溶液に、化合物１１（１．２ｇ、４．２ｍｍｏｌ）およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（２４３ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）を加え、９０℃で１．５時間撹拌した。反応溶液を常温に冷却し、水（７．５ｍＬ）を加えて酢酸エチルで抽出した。有機層を水及び飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。有機層を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１０：０～９：１）で精製し、溶媒を減圧留去し、化合物１２（３７４ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ、収率２９％）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．９５（ｓ，３Ｈ）、４．０５（ｓ，３Ｈ）、７．２０（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ）
ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝３０９、ＲＴ＝２．５１ｍｉｎ、ＬＣ／ＭＳ測定条件A
２．７６ｍｏｌ／Ｌ ｎ－ブチルリチウムのヘキサン溶液（１．８ｍＬ、５．０４ｍｍｏｌ）とテトラヒドロフラン（２.６ｍＬ）の混合溶液に、化合物８（０．７５ｇ、４．２ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（７０ｍＬ）溶液を－７８℃で５分かけてゆっくり滴下した。反応溶液を－７８℃で１時間攪拌した。反応溶液に、１．９ｍｏｌ／Ｌ 塩化亜鉛の２－メチルテトラヒドロフラン溶液（２．６ｍＬ、８２．４ｍｍｏｌ）を滴下した。室温で反応溶液を２時間撹拌した。反応溶液に、化合物１１（１．２ｇ、４．２ｍｍｏｌ）およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（２４３ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）を加え、９０℃で１．５時間撹拌した。反応溶液を常温に冷却し、水（７．５ｍＬ）を加えて酢酸エチルで抽出した。有機層を水及び飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。有機層を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１０：０～９：１）で精製し、溶媒を減圧留去し、化合物１２（３７４ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ、収率２９％）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．９５（ｓ，３Ｈ）、４．０５（ｓ，３Ｈ）、７．２０（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ）
ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝３０９、ＲＴ＝２．５１ｍｉｎ、ＬＣ／ＭＳ測定条件A
【0102】
工程５ 化合物１３の合成
化合物１２（３７４ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）、アセトニトリル（７．５ｍＬ）、ＮａＩ（１８１ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）およびＴＭＳＣｌ（４６４μＬ）を混合し、反応溶液を４０℃で加熱した。原料がほぼ消失するまで約３０分ごとにＮａＩ（１８１ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）およびＴＭＳＣｌ（４６４μＬ）を加えた。反応終了後に水（１５ｍＬ）を反応溶液に加えると固体が析出した。反応溶液を一部濃縮した後、固体をろ取した。冷やしたアセトニトリルで固体を洗浄し、化合物１３（２４６ｍｇ、０．８８ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：７．４３（ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，２Ｈ）、７．５３（ｄｄ，Ｊ＝７．３，２．１Ｈｚ，１Ｈ）、１１．５３（ｓ，１Ｈ）、１２．２３（ｂｒ ｓ，１Ｈ）
ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝２８１、ＲＴ＝１．４４ｍｉｎ、ＬＣ／ＭＳ測定条件A
化合物１２（３７４ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）、アセトニトリル（７．５ｍＬ）、ＮａＩ（１８１ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）およびＴＭＳＣｌ（４６４μＬ）を混合し、反応溶液を４０℃で加熱した。原料がほぼ消失するまで約３０分ごとにＮａＩ（１８１ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）およびＴＭＳＣｌ（４６４μＬ）を加えた。反応終了後に水（１５ｍＬ）を反応溶液に加えると固体が析出した。反応溶液を一部濃縮した後、固体をろ取した。冷やしたアセトニトリルで固体を洗浄し、化合物１３（２４６ｍｇ、０．８８ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：７．４３（ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，２Ｈ）、７．５３（ｄｄ，Ｊ＝７．３，２．１Ｈｚ，１Ｈ）、１１．５３（ｓ，１Ｈ）、１２．２３（ｂｒ ｓ，１Ｈ）
ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝２８１、ＲＴ＝１．４４ｍｉｎ、ＬＣ／ＭＳ測定条件A
【0103】
工程６ 化合物１４の合成
化合物１３（２５０ｍｇ、０．８９ｍｍｏｌ）、５－クロロピリジン－３－ボロン酸（２８０ｍｇ、１．７８ｍｍｏｌ）、酢酸銅（ＩＩ）（２４２ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）、アセトニトリル（７．５ｍＬ）、トリエチルアミン（１．２３ｍＬ、８．８９ｍｍｏｌ）およびピリジン（１．８ｍＬ、２２．２ｍｍｏｌ）を混合し、溶液を常温で終夜撹拌した。反応溶液に２ｍｏｌ／Ｌ塩酸（４４．５ｍＬ）を加えて、酢酸エチルで抽出した。有機層を水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を濃縮し、得られた残渣を精製せずに次の工程へと進んだ。
化合物１３（２５０ｍｇ、０．８９ｍｍｏｌ）、５－クロロピリジン－３－ボロン酸（２８０ｍｇ、１．７８ｍｍｏｌ）、酢酸銅（ＩＩ）（２４２ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）、アセトニトリル（７．５ｍＬ）、トリエチルアミン（１．２３ｍＬ、８．８９ｍｍｏｌ）およびピリジン（１．８ｍＬ、２２．２ｍｍｏｌ）を混合し、溶液を常温で終夜撹拌した。反応溶液に２ｍｏｌ／Ｌ塩酸（４４．５ｍＬ）を加えて、酢酸エチルで抽出した。有機層を水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を濃縮し、得られた残渣を精製せずに次の工程へと進んだ。
【0104】
工程７ 化合物１５の合成
化合物１４（３３０ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（４４０μＬ、２．５２ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（３．３ｍＬ）を混合した溶液に、２－ブロモアセトニトリル（１６８μＬ、２．５２ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を常温で終夜撹拌した。反応溶液に水（１４ｍＬ）を加えて酢酸エチルで抽出した。有機層を水及び飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１０：０～２：３）で精製し、溶媒を減圧留去し、化合物１５（３０７ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ、収率８５％）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：５．１３（ｓ，２Ｈ），７．２１－７．２５（ｍ，１Ｈ）、７．６７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝２．３Ｈｚ），８．４５（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），８．６６（ｄ、Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ）．
ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝４３１、ＲＴ＝２．１３ｍｉｎ、ＬＣ／ＭＳ測定条件A
化合物１４（３３０ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（４４０μＬ、２．５２ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（３．３ｍＬ）を混合した溶液に、２－ブロモアセトニトリル（１６８μＬ、２．５２ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を常温で終夜撹拌した。反応溶液に水（１４ｍＬ）を加えて酢酸エチルで抽出した。有機層を水及び飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１０：０～２：３）で精製し、溶媒を減圧留去し、化合物１５（３０７ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ、収率８５％）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：５．１３（ｓ，２Ｈ），７．２１－７．２５（ｍ，１Ｈ）、７．６７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝２．３Ｈｚ），８．４５（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），８．６６（ｄ、Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ）．
ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝４３１、ＲＴ＝２．１３ｍｉｎ、ＬＣ／ＭＳ測定条件A
【0105】
工程８ 化合物（Ｉ－２）の合成
化合物１５（４８．８ｍｇ、０．１１３ｍｍｏｌ）、６，６－ジフルオロ－２－アザスピロ［３．３］ヘプタン トリフルオロ塩酸塩（３３．５ｍｇ、０．１３６ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（５９．２μＬ、０．３３９ｍｍｏｌ）を混合し、６０℃で２時間撹拌した。反応溶液に水（２ｍＬ）を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１０：０～３：７）で精製し、溶媒を減圧留去し、ジイソプロピルエーテルを加えた。得られた沈殿物をろ取し、ジイソプロピルエーテルで洗浄した。得られた固体を減圧乾燥し、化合物（Ｉ－２）（３４．３ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ、収率５７％）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：２．８３（ｔ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，４Ｈ），４．０７（ｓ，４Ｈ）、４．８６（ｓ，２Ｈ），７．４４（ｄ，Ｊ＝９.４Ｈｚ，１Ｈ）、８．０１（ｔ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ）、８．５０（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ）、８．７３（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ）．
ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝５２８、ＲＴ＝２．１９ｍｉｎ、ＬＣ／ＭＳ測定条件A
化合物１５（４８．８ｍｇ、０．１１３ｍｍｏｌ）、６，６－ジフルオロ－２－アザスピロ［３．３］ヘプタン トリフルオロ塩酸塩（３３．５ｍｇ、０．１３６ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（５９．２μＬ、０．３３９ｍｍｏｌ）を混合し、６０℃で２時間撹拌した。反応溶液に水（２ｍＬ）を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１０：０～３：７）で精製し、溶媒を減圧留去し、ジイソプロピルエーテルを加えた。得られた沈殿物をろ取し、ジイソプロピルエーテルで洗浄した。得られた固体を減圧乾燥し、化合物（Ｉ－２）（３４．３ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ、収率５７％）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：２．８３（ｔ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，４Ｈ），４．０７（ｓ，４Ｈ）、４．８６（ｓ，２Ｈ），７．４４（ｄ，Ｊ＝９.４Ｈｚ，１Ｈ）、８．０１（ｔ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ）、８．５０（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ）、８．７３（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ）．
ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝５２８、ＲＴ＝２．１９ｍｉｎ、ＬＣ／ＭＳ測定条件A
【0106】
（参考例１）
化合物（ＩＩ－１）の合成
工程１ 化合物（ＩＩ－１）の合成
化合物１６（１５０ｍｇ、０．３７６ｍｍｏｌ、合成法は国際公開第２０２３／１９５５２９号参照）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．１９７ｍＬ、１．１３ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１．２ｍＬ）を混合した溶液に、臭化プロパルギル（９０μＬ、１．１３ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で４時間攪拌した。６，６－ジフルオロ－２－アザスピロ［３．３］ヘプタン トリフルオロ塩酸塩（１８６ｍｇ、０．７５３ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．１９７ｍＬ、１．１３ｍｍｏｌ）を加え、溶液を８０℃で３時間撹拌した。反応液に０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸水溶液（１０ｍＬ）を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝９：１～３：７）で精製し、溶媒を減圧留去し、化合物（ＩＩ－１）（５７ｍｇ、０．１０９ｍｍｏｌ、収率２９％）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：２．７３－２．７９（４Ｈ，ｍ），３．４５（１Ｈ，ｓ），４．０６（４Ｈ，ｓ），４．５７（２Ｈ，ｓ），７．１８－７．２１（２Ｈ，ｍ），７．３６－７．４３（２Ｈ，ｍ），７．９７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），８．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），８．６６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ）．
ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝５２１、ＲＴ＝２．３７ｍｉｎ、ＬＣ／ＭＳ測定条件Ａ
化合物（ＩＩ－１）の合成
【化48】
工程１ 化合物（ＩＩ－１）の合成
化合物１６（１５０ｍｇ、０．３７６ｍｍｏｌ、合成法は国際公開第２０２３／１９５５２９号参照）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．１９７ｍＬ、１．１３ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１．２ｍＬ）を混合した溶液に、臭化プロパルギル（９０μＬ、１．１３ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で４時間攪拌した。６，６－ジフルオロ－２－アザスピロ［３．３］ヘプタン トリフルオロ塩酸塩（１８６ｍｇ、０．７５３ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．１９７ｍＬ、１．１３ｍｍｏｌ）を加え、溶液を８０℃で３時間撹拌した。反応液に０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸水溶液（１０ｍＬ）を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝９：１～３：７）で精製し、溶媒を減圧留去し、化合物（ＩＩ－１）（５７ｍｇ、０．１０９ｍｍｏｌ、収率２９％）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：２．７３－２．７９（４Ｈ，ｍ），３．４５（１Ｈ，ｓ），４．０６（４Ｈ，ｓ），４．５７（２Ｈ，ｓ），７．１８－７．２１（２Ｈ，ｍ），７．３６－７．４３（２Ｈ，ｍ），７．９７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），８．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），８．６６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ）．
ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝５２１、ＲＴ＝２．３７ｍｉｎ、ＬＣ／ＭＳ測定条件Ａ
【0107】
（参考例２）
参考例１および国際公開第２０２３／１９５５２９号と同様にして、以下の化合物を合成することができる。
参考例１および国際公開第２０２３／１９５５２９号と同様にして、以下の化合物を合成することができる。
【化49】
【化50】
【0108】
以下に、本発明に係る化合物の生物試験例を記載する。
本発明に係る化合物は、コロナウイルス３ＣＬプロテアーゼ阻害作用を有し、コロナウイルス３ＣＬプロテアーゼを阻害する。
具体的には、以下に記載する評価方法において、ＩＣ５０は５０μＭ以下が好ましく、より好ましくは、１μＭ以下、さらにより好ましくは１００ｎＭ以下である。ＥＣ５０は１０μＭ以下が好ましく、より好ましくは、１μＭ以下、さらにより好ましくは１００ｎＭ以下である。
本発明に係る化合物は、コロナウイルス３ＣＬプロテアーゼ阻害作用を有し、コロナウイルス３ＣＬプロテアーゼを阻害する。
具体的には、以下に記載する評価方法において、ＩＣ５０は５０μＭ以下が好ましく、より好ましくは、１μＭ以下、さらにより好ましくは１００ｎＭ以下である。ＥＣ５０は１０μＭ以下が好ましく、より好ましくは、１μＭ以下、さらにより好ましくは１００ｎＭ以下である。
【0109】
試験例１：ｈｕｍａｎ ＴＭＰＲＳＳ２、ＡＣＥ２発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ／ＡＣＥ２－ＴＭＰＲＳＳ２細胞）を用いたＣｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ（ＣＰＥ）抑制効果確認試験
＜操作手順＞
・被験試料の希釈、分注
予め被験試料をＤＭＳＯで適度な濃度に希釈し、２～５倍段階希釈系列を作製後、３８４ウェルプレートに分注する。
・細胞およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の希釈、分注
ＨＥＫ２９３Ｔ／ＡＣＥ２－ＴＭＰＲＳＳ２細胞（ＧＣＰ－ＳＬ２２２、５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２００－６００ＴＣＩＤ５０／ｗｅｌｌ）を培地（ＭＥＭ、２％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）で混合し、被験試料が入ったウェルに分注した後、ＣＯ２インキュベーターで３日間培養する。
・ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０の分注および発光シグナルの測定
３日間培養したプレートを室温に戻した後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０を各ウェルに分注し、プレートミキサーで混和する。一定時間置いた後、プレートリーダーで発光シグナル（Ｌｕｍ）を測定する。
＜各測定項目値の算出＞
・５０％ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞死阻害濃度（ＥＣ５０）算出
ｘを化合物濃度の対数値、ｙを％Ｅｆｆｉｃａｃｙとしたとき、以下のＬｏｇｉｓｔｉｃ回帰式で阻害曲線を近似し、ｙ＝５０（％）を代入したときのｘの値をＥＣ５０として算出する。
y = min + (max - min)/{1 + (X50/x) ^Hill}
%Efficacy = {(Sample - virus control) / (cell control - virus control)} * 100%
cell control： the average of Lum of cell control wells
virus control： the average of Lum of virus control wells
min：y軸下限値、max：y軸上限値、X50：変曲点のx座標、Hill：minとmaxの中間点でのカーブの傾き
＜操作手順＞
・被験試料の希釈、分注
予め被験試料をＤＭＳＯで適度な濃度に希釈し、２～５倍段階希釈系列を作製後、３８４ウェルプレートに分注する。
・細胞およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の希釈、分注
ＨＥＫ２９３Ｔ／ＡＣＥ２－ＴＭＰＲＳＳ２細胞（ＧＣＰ－ＳＬ２２２、５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２００－６００ＴＣＩＤ５０／ｗｅｌｌ）を培地（ＭＥＭ、２％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）で混合し、被験試料が入ったウェルに分注した後、ＣＯ２インキュベーターで３日間培養する。
・ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０の分注および発光シグナルの測定
３日間培養したプレートを室温に戻した後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０を各ウェルに分注し、プレートミキサーで混和する。一定時間置いた後、プレートリーダーで発光シグナル（Ｌｕｍ）を測定する。
＜各測定項目値の算出＞
・５０％ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞死阻害濃度（ＥＣ５０）算出
ｘを化合物濃度の対数値、ｙを％Ｅｆｆｉｃａｃｙとしたとき、以下のＬｏｇｉｓｔｉｃ回帰式で阻害曲線を近似し、ｙ＝５０（％）を代入したときのｘの値をＥＣ５０として算出する。
y = min + (max - min)/{1 + (X50/x) ^Hill}
%Efficacy = {(Sample - virus control) / (cell control - virus control)} * 100%
cell control： the average of Lum of cell control wells
virus control： the average of Lum of virus control wells
min：y軸下限値、max：y軸上限値、X50：変曲点のx座標、Hill：minとmaxの中間点でのカーブの傾き
【0110】
本発明に係る化合物を本質的に上記のとおり試験した。ＥＣ５０値を以下に示す。
（結果）
化合物Ｉ－１：１．６６ｎＭ
化合物Ｉ－２：２．３６ｎＭ
（結果）
化合物Ｉ－１：１．６６ｎＭ
化合物Ｉ－２：２．３６ｎＭ
【0111】
試験例２－１：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ３ＣＬプロテアーゼに対する阻害活性試験
＜材料＞
・市販のＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ３ＣＬ Ｐｒｏｔｅａｓｅ
・市販の基質ペプチド
Ｄａｂｃｙｌ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ（Ｅｄａｎｓ）－ＮＨ２（配列番号：１）
・Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄペプチド
Ｄａｂｃｙｌ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ（１３Ｃ６，１５Ｎ）－Ｇｌｎ（配列番号：２）
Ｄａｂｃｙｌ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ（１３Ｃ６，１５Ｎ）－Ｇｌｎは、文献（Atherton, E.; Sheppard, R. C.、“In Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach”、IRL Press at Oxford University Pres、1989.およびBioorg. Med. Chem.、５巻、９号、１９９７年、１８８３－１８９１頁、等）を参考に合成できる。以下に一例を示す。
Ｒｉｎｋアミド樹脂を用いて、Ｆｍｏｃ固相合成によって、Ｈ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ（１３Ｃ６，１５Ｎ）－Ｇｌｕ（ｒｅｓｉｎ）－ＯαＯｔＢｕ（Ｌｙｓ側鎖はＢｏｃ保護、Ｔｈｒ側鎖はｔｅｒｔ－ブチル基で保護、Ｓｅｒ側鎖はｔｅｒｔ－ブチル基で保護、ＧｌｕのＣ末端ＯＨはｔｅｒｔ－ブチル基で保護されており、Ｇｌｕ側鎖のカルボン酸を樹脂に縮合）を合成する。Ｎ末端Ｄａｂｃｙｌ基の修飾は４－ジメチルアミノアゾベンゼン－４’－カルボン酸（Ｄａｂｃｙｌ－ＯＨ）をＥＤＣ／ＨＯＢＴを用いて樹脂上で縮合する。最終脱保護、および樹脂からの切り出しはＴＦＡ／ＥＤＴ＝９５：５で処理することで行う。その後、逆相ＨＰＬＣによって精製する。
・ＲａｐｉｄＦｉｒｅ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ Ｃ４ ｔｙｐｅＡ
＜操作手順＞
・アッセイバッファーの調製
本試験では、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．０１％ ＢＳＡからなるアッセイバッファーを使用する。
・被験試料の希釈、分注
予め被験試料をＤＭＳＯで適度な濃度に希釈し、２～５倍段階希釈系列を作製後、３８４ウェルプレートに分注する。
・酵素と基質の添加、酵素反応
準備した化合物プレートに、８μＭの基質、及び６ｎＭまたは０．６ｎＭの酵素溶液を添加し、室温で３～５時間インキュベーションを行う。その後、反応停止液（０．０６７μＭ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ、０．１％ ギ酸、１０または２５％ アセトニトリル）を加え酵素反応を停止させる。
・反応産物の測定
反応完了したプレートはＲａｐｉｄＦｉｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ ３６０及び質量分析器（Ａｇｉｌｅｎｔ、６５５０ ｉＦｕｎｎｅｌ Ｑ－ＴＯＦ）、またはＲａｐｉｄ Ｆｉｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ ３６５及び質量分析器（Ａｇｉｌｅｎｔ、 ６４９５Ｃ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ）を用いて測定する。測定時の移動相としてＡ溶液（７５％ イソプロパノール、１５％ アセトニトリル、５ｍＭ ギ酸アンモニウム）とＢ溶液（０．０１％ トリフルオロ酢酸、０．０９％ ギ酸）を用いる。
質量分析器によって検出された反応産物は、ＲａｐｉｄＦｉｒｅ Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒまたは同等の解析が可能なプログラムを用いて算出しＰｒｏｄｕｃｔ ａｒｅａ値とする。また、同時に検出されたＩｎｔｅｒｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄも算出しＩｎｔｅｒｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ ａｒｅａ値とする。
＜各測定項目値の算出＞
・Ｐ／ＩＳの算出
前項目で得られたａｒｅａ値を下記の式によって計算し、Ｐ／ＩＳを算出する。
Ｐ／ＩＳ＝ Ｐｒｏｄｕｃｔ ａｒｅａ値／ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ ａｒｅａ値
・５０％ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ３ＣＬプロテアーゼ阻害濃度（ＩＣ５０）算出
ｘを化合物濃度の対数値、ｙを％Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎとしたとき、以下のＬｏｇｉｓｔｉｃ回帰式で阻害曲線を近似し、ｙ＝５０（％）を代入したときのｘの値をＩＣ５０として算出する。
y = min + (max - min)/{1 + (X50/x) ^Hill}
%Inhibition = {1-(Sample - Control(-)) / Control(+)-Control(-))} * 100
Control(-)：the average of P/IS of enzyme inhibited condition wells
Control(+)：the average of P/IS of DMSO control wells
min：y軸下限値、max：y軸上限値、X50：変曲点のx座標、Hill：minとmaxの中間点でのカーブの傾き
＜材料＞
・市販のＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ３ＣＬ Ｐｒｏｔｅａｓｅ
・市販の基質ペプチド
Ｄａｂｃｙｌ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ（Ｅｄａｎｓ）－ＮＨ２（配列番号：１）
・Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄペプチド
Ｄａｂｃｙｌ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ（１３Ｃ６，１５Ｎ）－Ｇｌｎ（配列番号：２）
Ｄａｂｃｙｌ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ（１３Ｃ６，１５Ｎ）－Ｇｌｎは、文献（Atherton, E.; Sheppard, R. C.、“In Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach”、IRL Press at Oxford University Pres、1989.およびBioorg. Med. Chem.、５巻、９号、１９９７年、１８８３－１８９１頁、等）を参考に合成できる。以下に一例を示す。
Ｒｉｎｋアミド樹脂を用いて、Ｆｍｏｃ固相合成によって、Ｈ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ（１３Ｃ６，１５Ｎ）－Ｇｌｕ（ｒｅｓｉｎ）－ＯαＯｔＢｕ（Ｌｙｓ側鎖はＢｏｃ保護、Ｔｈｒ側鎖はｔｅｒｔ－ブチル基で保護、Ｓｅｒ側鎖はｔｅｒｔ－ブチル基で保護、ＧｌｕのＣ末端ＯＨはｔｅｒｔ－ブチル基で保護されており、Ｇｌｕ側鎖のカルボン酸を樹脂に縮合）を合成する。Ｎ末端Ｄａｂｃｙｌ基の修飾は４－ジメチルアミノアゾベンゼン－４’－カルボン酸（Ｄａｂｃｙｌ－ＯＨ）をＥＤＣ／ＨＯＢＴを用いて樹脂上で縮合する。最終脱保護、および樹脂からの切り出しはＴＦＡ／ＥＤＴ＝９５：５で処理することで行う。その後、逆相ＨＰＬＣによって精製する。
・ＲａｐｉｄＦｉｒｅ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ Ｃ４ ｔｙｐｅＡ
＜操作手順＞
・アッセイバッファーの調製
本試験では、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．０１％ ＢＳＡからなるアッセイバッファーを使用する。
・被験試料の希釈、分注
予め被験試料をＤＭＳＯで適度な濃度に希釈し、２～５倍段階希釈系列を作製後、３８４ウェルプレートに分注する。
・酵素と基質の添加、酵素反応
準備した化合物プレートに、８μＭの基質、及び６ｎＭまたは０．６ｎＭの酵素溶液を添加し、室温で３～５時間インキュベーションを行う。その後、反応停止液（０．０６７μＭ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ、０．１％ ギ酸、１０または２５％ アセトニトリル）を加え酵素反応を停止させる。
・反応産物の測定
反応完了したプレートはＲａｐｉｄＦｉｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ ３６０及び質量分析器（Ａｇｉｌｅｎｔ、６５５０ ｉＦｕｎｎｅｌ Ｑ－ＴＯＦ）、またはＲａｐｉｄ Ｆｉｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ ３６５及び質量分析器（Ａｇｉｌｅｎｔ、 ６４９５Ｃ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ）を用いて測定する。測定時の移動相としてＡ溶液（７５％ イソプロパノール、１５％ アセトニトリル、５ｍＭ ギ酸アンモニウム）とＢ溶液（０．０１％ トリフルオロ酢酸、０．０９％ ギ酸）を用いる。
質量分析器によって検出された反応産物は、ＲａｐｉｄＦｉｒｅ Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒまたは同等の解析が可能なプログラムを用いて算出しＰｒｏｄｕｃｔ ａｒｅａ値とする。また、同時に検出されたＩｎｔｅｒｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄも算出しＩｎｔｅｒｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ ａｒｅａ値とする。
＜各測定項目値の算出＞
・Ｐ／ＩＳの算出
前項目で得られたａｒｅａ値を下記の式によって計算し、Ｐ／ＩＳを算出する。
Ｐ／ＩＳ＝ Ｐｒｏｄｕｃｔ ａｒｅａ値／ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ ａｒｅａ値
・５０％ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ３ＣＬプロテアーゼ阻害濃度（ＩＣ５０）算出
ｘを化合物濃度の対数値、ｙを％Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎとしたとき、以下のＬｏｇｉｓｔｉｃ回帰式で阻害曲線を近似し、ｙ＝５０（％）を代入したときのｘの値をＩＣ５０として算出する。
y = min + (max - min)/{1 + (X50/x) ^Hill}
%Inhibition = {1-(Sample - Control(-)) / Control(+)-Control(-))} * 100
Control(-)：the average of P/IS of enzyme inhibited condition wells
Control(+)：the average of P/IS of DMSO control wells
min：y軸下限値、max：y軸上限値、X50：変曲点のx座標、Hill：minとmaxの中間点でのカーブの傾き
【0112】
本発明化合物を本質的に上記のとおり試験した。ＩＣ５０値を以下に示す。
（結果）
化合物Ｉ－１：０．０００３６μＭ
化合物Ｉ－２：０．０００３３μＭ
化合物ＩＩ－１：０．０００６８μＭ
（結果）
化合物Ｉ－１：０．０００３６μＭ
化合物Ｉ－２：０．０００３３μＭ
化合物ＩＩ－１：０．０００６８μＭ
【0113】
試験例２－２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ３ＣＬプロテアーゼに対する阻害活性試験
＜材料＞
・市販のＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ３ＣＬ Ｐｒｏｔｅａｓｅ
・ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ３ＣＬ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｐ１３２Ｈ
・市販の基質ペプチド
Ｄａｂｃｙｌ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ（Ｅｄａｎｓ）－ＮＨ２（配列番号：１）
・Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄペプチド
Ｄａｂｃｙｌ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ（１３Ｃ６，１５Ｎ）－Ｇｌｎ（配列番号：２）
Ｄａｂｃｙｌ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ（１３Ｃ６，１５Ｎ）－Ｇｌｎは、文献（Ａｔｈｅｒｔｏｎ， Ｅ．； Ｓｈｅｐｐａｒｄ， Ｒ． Ｃ．、“Ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓ、１９８９．およびＢｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．、５巻、９号、１９９７年、１８８３－１８９１頁、等）を参考に合成できる。以下に一例を示す。
Ｒｉｎｋアミド樹脂を用いて、Ｆｍｏｃ固相合成によって、Ｈ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ（１３Ｃ６，１５Ｎ）－Ｇｌｕ（ｒｅｓｉｎ）－ＯαＯｔＢｕ（Ｌｙｓ側鎖はＢｏｃ保護、Ｔｈｒ側鎖はｔｅｒｔ－ブチル基で保護、Ｓｅｒ側鎖はｔｅｒｔ－ブチル基で保護、ＧｌｕのＣ末端ＯＨはｔｅｒｔ－ブチル基で保護されており、Ｇｌｕ側鎖のカルボン酸を樹脂に縮合）を合成する。Ｎ末端Ｄａｂｃｙｌ基の修飾は４－ジメチルアミノアゾベンゼン－４’－カルボン酸（Ｄａｂｃｙｌ－ＯＨ）をＥＤＣ／ＨＯＢＴを用いて樹脂上で縮合する。最終脱保護、および樹脂からの切り出しはＴＦＡ／ＥＤＴ＝９５：５で処理することで行う。その後、逆相ＨＰＬＣによって精製する。
・ＲａｐｉｄＦｉｒｅ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ Ｃ４ ｔｙｐｅＡ
＜操作手順＞
・アッセイバッファーの調製
本試験では、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．０１％ ＢＳＡからなるアッセイバッファーを使用する。
・被験試料の希釈、分注
予め被験試料をＤＭＳＯで適度な濃度に希釈し、３倍段階希釈系列を作製後、３８４ウェルプレートに分注する。
・酵素と基質の添加、酵素反応
準備した化合物プレートに、最終濃度４μMの基質、０．３ｎＭの酵素を添加し、室温で４時間インキュベーションを行う。その後、反応停止液（７．２ｎＭ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ、０．１％ ギ酸、１０％ アセトニトリル）を加え酵素反応を停止させる。
・反応産物の測定
反応完了したプレートはＲａｐｉｄ Ｆｉｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ ３６５及び質量分析器（Ａｇｉｌｅｎｔ、 ６４９５Ｃ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ）を用いて測定する。測定時の移動相としてＡ溶液（７５％ イソプロパノール、１５％ アセトニトリル、５ｍＭ ギ酸アンモニウム）とＢ溶液（０．０１％ トリフルオロ酢酸、０．０９％ ギ酸）を用いる。
質量分析器によって検出された反応産物は、ＲａｐｉｄＦｉｒｅ Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒを用いて算出しＰｒｏｄｕｃｔ ａｒｅａ値とする。また、同時に検出されたＩｎｔｅｒｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄも算出しＩｎｔｅｒｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ ａｒｅａ値とする。
＜各測定項目値の算出＞
・Ｐ／ＩＳの算出
前項目で得られたａｒｅａ値を下記の式によって計算し、Ｐ／ＩＳを算出する。
Ｐ／ＩＳ＝ Ｐｒｏｄｕｃｔ ａｒｅａ値／ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ ａｒｅａ値
・５０％ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ３ＣＬプロテアーゼ阻害濃度（ＩＣ５０）算出
ｘを化合物濃度の対数値、ｙを％Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎとしたとき、以下のＬｏｇｉｓｔｉｃ回帰式で阻害曲線を近似し、ｙ＝５０（％）を代入したときのｘの値をＩＣ５０として算出する。
ｙ ＝ ｍｉｎ ＋ （ｍａｘ － ｍｉｎ）／｛１ ＋ （Ｘ５０／ｘ） ＾Ｈｉｌｌ｝
％Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ＝ ｛１－（Ｓａｍｐｌｅ － Ｃｏｎｔｒｏｌ（－）） ／ Ｃｏｎｔｒｏｌ（＋）－Ｃｏｎｔｒｏｌ（－））｝ ＊ １００
Ｃｏｎｔｒｏｌ（－）：ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｏｆ Ｐ／ＩＳ ｒａｔｉｏ ｉｎ ｔｈｅ ｗｅｌｌｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ３ＣＬ ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｎｄ ｔｅｓｔ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ
Ｃｏｎｔｒｏｌ（＋）：ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｏｆ Ｐ／ＩＳ ｒａｔｉｏ ｉｎ ｔｈｅ ｗｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ３ＣＬ ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｎｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｔｅｓｔ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ
ｍｉｎ：ｙ軸下限値、ｍａｘ：ｙ軸上限値、Ｘ５０：変曲点のｘ座標、Ｈｉｌｌ：ｍｉｎとｍａｘの中間点でのカーブの傾き
＜材料＞
・市販のＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ３ＣＬ Ｐｒｏｔｅａｓｅ
・ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ３ＣＬ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｐ１３２Ｈ
・市販の基質ペプチド
Ｄａｂｃｙｌ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ（Ｅｄａｎｓ）－ＮＨ２（配列番号：１）
・Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄペプチド
Ｄａｂｃｙｌ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ（１３Ｃ６，１５Ｎ）－Ｇｌｎ（配列番号：２）
Ｄａｂｃｙｌ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ（１３Ｃ６，１５Ｎ）－Ｇｌｎは、文献（Ａｔｈｅｒｔｏｎ， Ｅ．； Ｓｈｅｐｐａｒｄ， Ｒ． Ｃ．、“Ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓ、１９８９．およびＢｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．、５巻、９号、１９９７年、１８８３－１８９１頁、等）を参考に合成できる。以下に一例を示す。
Ｒｉｎｋアミド樹脂を用いて、Ｆｍｏｃ固相合成によって、Ｈ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ（１３Ｃ６，１５Ｎ）－Ｇｌｕ（ｒｅｓｉｎ）－ＯαＯｔＢｕ（Ｌｙｓ側鎖はＢｏｃ保護、Ｔｈｒ側鎖はｔｅｒｔ－ブチル基で保護、Ｓｅｒ側鎖はｔｅｒｔ－ブチル基で保護、ＧｌｕのＣ末端ＯＨはｔｅｒｔ－ブチル基で保護されており、Ｇｌｕ側鎖のカルボン酸を樹脂に縮合）を合成する。Ｎ末端Ｄａｂｃｙｌ基の修飾は４－ジメチルアミノアゾベンゼン－４’－カルボン酸（Ｄａｂｃｙｌ－ＯＨ）をＥＤＣ／ＨＯＢＴを用いて樹脂上で縮合する。最終脱保護、および樹脂からの切り出しはＴＦＡ／ＥＤＴ＝９５：５で処理することで行う。その後、逆相ＨＰＬＣによって精製する。
・ＲａｐｉｄＦｉｒｅ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ Ｃ４ ｔｙｐｅＡ
＜操作手順＞
・アッセイバッファーの調製
本試験では、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．０１％ ＢＳＡからなるアッセイバッファーを使用する。
・被験試料の希釈、分注
予め被験試料をＤＭＳＯで適度な濃度に希釈し、３倍段階希釈系列を作製後、３８４ウェルプレートに分注する。
・酵素と基質の添加、酵素反応
準備した化合物プレートに、最終濃度４μMの基質、０．３ｎＭの酵素を添加し、室温で４時間インキュベーションを行う。その後、反応停止液（７．２ｎＭ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ、０．１％ ギ酸、１０％ アセトニトリル）を加え酵素反応を停止させる。
・反応産物の測定
反応完了したプレートはＲａｐｉｄ Ｆｉｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ ３６５及び質量分析器（Ａｇｉｌｅｎｔ、 ６４９５Ｃ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ）を用いて測定する。測定時の移動相としてＡ溶液（７５％ イソプロパノール、１５％ アセトニトリル、５ｍＭ ギ酸アンモニウム）とＢ溶液（０．０１％ トリフルオロ酢酸、０．０９％ ギ酸）を用いる。
質量分析器によって検出された反応産物は、ＲａｐｉｄＦｉｒｅ Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒを用いて算出しＰｒｏｄｕｃｔ ａｒｅａ値とする。また、同時に検出されたＩｎｔｅｒｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄも算出しＩｎｔｅｒｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ ａｒｅａ値とする。
＜各測定項目値の算出＞
・Ｐ／ＩＳの算出
前項目で得られたａｒｅａ値を下記の式によって計算し、Ｐ／ＩＳを算出する。
Ｐ／ＩＳ＝ Ｐｒｏｄｕｃｔ ａｒｅａ値／ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ ａｒｅａ値
・５０％ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ３ＣＬプロテアーゼ阻害濃度（ＩＣ５０）算出
ｘを化合物濃度の対数値、ｙを％Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎとしたとき、以下のＬｏｇｉｓｔｉｃ回帰式で阻害曲線を近似し、ｙ＝５０（％）を代入したときのｘの値をＩＣ５０として算出する。
ｙ ＝ ｍｉｎ ＋ （ｍａｘ － ｍｉｎ）／｛１ ＋ （Ｘ５０／ｘ） ＾Ｈｉｌｌ｝
％Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ＝ ｛１－（Ｓａｍｐｌｅ － Ｃｏｎｔｒｏｌ（－）） ／ Ｃｏｎｔｒｏｌ（＋）－Ｃｏｎｔｒｏｌ（－））｝ ＊ １００
Ｃｏｎｔｒｏｌ（－）：ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｏｆ Ｐ／ＩＳ ｒａｔｉｏ ｉｎ ｔｈｅ ｗｅｌｌｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ３ＣＬ ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｎｄ ｔｅｓｔ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ
Ｃｏｎｔｒｏｌ（＋）：ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｏｆ Ｐ／ＩＳ ｒａｔｉｏ ｉｎ ｔｈｅ ｗｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ３ＣＬ ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｎｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｔｅｓｔ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ
ｍｉｎ：ｙ軸下限値、ｍａｘ：ｙ軸上限値、Ｘ５０：変曲点のｘ座標、Ｈｉｌｌ：ｍｉｎとｍａｘの中間点でのカーブの傾き
【0114】
本発明に係る化合物を本質的に上記のとおり試験した。結果を以下に示す。
【表5】
【0115】
試験例３：ｈｕｍａｎ ＴＭＰＲＳＳ２発現Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞（Ｖｅｒｏ Ｅ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞）を用いたＣｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ（ＣＰＥ）抑制効果確認試験
＜操作手順＞
・被験試料の希釈、分注
予め被験試料をＤＭＳＯで適度な濃度に希釈し、３倍段階希釈系列を作製後、９６ウェルプレートに分注する。
・細胞およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の希釈、分注
ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞（ＪＣＲＢ１８１９、１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ／ＷＫ－５２１／２０２０（Ａｎｃｅｓｔｒａｌ）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＱＨＮ００１／２０２０（Ａｌｐｈａ）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ８－６１２／２０２１（Ｂｅｔａ）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ７－５０１／２０２１（Ｇａｍｍａ）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ１１－９２７／２０２１（Ｄｅｌｔａ）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ３８－８７１／２０２１（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＢＡ．１．１）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４０－３８５／２０２２（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＢＡ．２）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７２１／２０２２（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＢＡ．２．１２．１）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７１６／２０２２（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＢＡ．２．７５）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７０３／２０２２（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＢＡ．４．１）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７６３／２０２２（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＢＡ．４．６）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７０２／２０２２（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＢＥ．１／ＢＡ．５－ｌｉｋｅ）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７０４／２０２２（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＢＡ．５．２．１）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－８２０／２０２２（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＢＦ．７）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－８２８／２０２２（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＢＦ．７．４．１）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７９６／２０２２（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＢＱ．１．１）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－８３２／２０２２（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＣＨ．１．１．１１）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７９５／２０２２（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＸＢＢ．１）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／２３－０１８／２０２２（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＸＢＢ．１．５）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ－４１９５１／２０２３（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＸＢＢ．１．９．１）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－９８４／２０２３（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＸＢＢ．１．１６）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－８３１／２０２２（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＸＢＦ）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－６８６／２０２２（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＸＥ）（３０－３０００ＴＣＩＤ５０／ｗｅｌｌ）を培地（ＭＥＭ、２％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）で混合し、被験試料が入ったウェルに分注した後、ＣＯ２インキュベーターで３日間あるいは４日間培養する。
・ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０の分注および発光シグナルの測定
３日間培養したプレートを室温に戻した後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０を各ウェルに分注し、プレートミキサーで混和する。一定時間置いた後、プレートリーダーで発光シグナル（Ｌｕｍ）を測定する。
＜操作手順＞
・被験試料の希釈、分注
予め被験試料をＤＭＳＯで適度な濃度に希釈し、３倍段階希釈系列を作製後、９６ウェルプレートに分注する。
・細胞およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の希釈、分注
ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞（ＪＣＲＢ１８１９、１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ／ＷＫ－５２１／２０２０（Ａｎｃｅｓｔｒａｌ）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＱＨＮ００１／２０２０（Ａｌｐｈａ）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ８－６１２／２０２１（Ｂｅｔａ）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ７－５０１／２０２１（Ｇａｍｍａ）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ１１－９２７／２０２１（Ｄｅｌｔａ）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ３８－８７１／２０２１（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＢＡ．１．１）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４０－３８５／２０２２（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＢＡ．２）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７２１／２０２２（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＢＡ．２．１２．１）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７１６／２０２２（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＢＡ．２．７５）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７０３／２０２２（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＢＡ．４．１）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７６３／２０２２（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＢＡ．４．６）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７０２／２０２２（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＢＥ．１／ＢＡ．５－ｌｉｋｅ）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７０４／２０２２（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＢＡ．５．２．１）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－８２０／２０２２（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＢＦ．７）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－８２８／２０２２（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＢＦ．７．４．１）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７９６／２０２２（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＢＱ．１．１）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－８３２／２０２２（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＣＨ．１．１．１１）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７９５／２０２２（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＸＢＢ．１）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／２３－０１８／２０２２（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＸＢＢ．１．５）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ－４１９５１／２０２３（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＸＢＢ．１．９．１）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－９８４／２０２３（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＸＢＢ．１．１６）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－８３１／２０２２（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＸＢＦ）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－６８６／２０２２（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＸＥ）（３０－３０００ＴＣＩＤ５０／ｗｅｌｌ）を培地（ＭＥＭ、２％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）で混合し、被験試料が入ったウェルに分注した後、ＣＯ２インキュベーターで３日間あるいは４日間培養する。
・ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０の分注および発光シグナルの測定
３日間培養したプレートを室温に戻した後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０を各ウェルに分注し、プレートミキサーで混和する。一定時間置いた後、プレートリーダーで発光シグナル（Ｌｕｍ）を測定する。
【0116】
＜各測定項目値の算出＞
・５０％ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞死阻害濃度（ＥＣ５０）算出
ｘを化合物濃度の対数値、ｙを％Ｅｆｆｉｃａｃｙとしたとき、以下のＬｏｇｉｓｔｉｃ回帰式で阻害曲線を近似し、ｙ＝５０（％）を代入したときのｘの値をＥＣ５０として算出する。
y = min + (max - min)/{1 + (X50/x) ^Hill}
%Efficacy = {(Sample - virus control) / (cell control - virus control)} * 100%
cell control： the average of Lum of cell control wells
virus control： the average of Lum of virus control wells
min：y軸下限値、max：y軸上限値、X50：変曲点のx座標、Hill：minとmaxの中間点でのカーブの傾き
・５０％ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞死阻害濃度（ＥＣ５０）算出
ｘを化合物濃度の対数値、ｙを％Ｅｆｆｉｃａｃｙとしたとき、以下のＬｏｇｉｓｔｉｃ回帰式で阻害曲線を近似し、ｙ＝５０（％）を代入したときのｘの値をＥＣ５０として算出する。
y = min + (max - min)/{1 + (X50/x) ^Hill}
%Efficacy = {(Sample - virus control) / (cell control - virus control)} * 100%
cell control： the average of Lum of cell control wells
virus control： the average of Lum of virus control wells
min：y軸下限値、max：y軸上限値、X50：変曲点のx座標、Hill：minとmaxの中間点でのカーブの傾き
【0117】
本発明に係る化合物を本質的に上記のとおり試験した。結果を以下に示す。
【表6】
【0118】
試験例５：ＨＣｏＶ－ＯＣ４３に対する抗ウイルス効果
＜操作手順＞
・被験試料の希釈、分注
予め被験試料をＤＭＳＯで適度な濃度に希釈し、３倍段階希釈系列を作製後、９６ウェルプレートに分注し維持培地（ＭＥＭ、２％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）で希釈する。
・細胞およびＨＣｏＶ－ＯＣ４３の希釈、分注
継代培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）に懸濁させたＭＲＣ－５細胞（２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を感染前日に９６ｗｅｌｌプレートに播種し、翌日、維持培地（ＭＥＭ、２％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）に懸濁させたＨＣｏＶ－ＯＣ４３（３００ＴＣＩＤ５０／ｗｅｌｌ）を１時間で感染させる。その後、ウイルス液を除去し、被験試薬が入った維持培地を添加し、ＣＯ２インキュベーターで７２時間培養する。また被験試薬の細胞毒性を調べるために、ウイルス非存在下にて同様の操作を実施する。
・ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０の分注および発光シグナルの測定
７２時間培養したプレートを室温に戻した後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０を各ウェルに分注し、プレートミキサーで混和する。一定時間置いた後、プレートリーダーで発光シグナル（Ｌｕｍ）を測定する。
＜操作手順＞
・被験試料の希釈、分注
予め被験試料をＤＭＳＯで適度な濃度に希釈し、３倍段階希釈系列を作製後、９６ウェルプレートに分注し維持培地（ＭＥＭ、２％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）で希釈する。
・細胞およびＨＣｏＶ－ＯＣ４３の希釈、分注
継代培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）に懸濁させたＭＲＣ－５細胞（２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を感染前日に９６ｗｅｌｌプレートに播種し、翌日、維持培地（ＭＥＭ、２％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）に懸濁させたＨＣｏＶ－ＯＣ４３（３００ＴＣＩＤ５０／ｗｅｌｌ）を１時間で感染させる。その後、ウイルス液を除去し、被験試薬が入った維持培地を添加し、ＣＯ２インキュベーターで７２時間培養する。また被験試薬の細胞毒性を調べるために、ウイルス非存在下にて同様の操作を実施する。
・ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０の分注および発光シグナルの測定
７２時間培養したプレートを室温に戻した後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０を各ウェルに分注し、プレートミキサーで混和する。一定時間置いた後、プレートリーダーで発光シグナル（Ｌｕｍ）を測定する。
【0119】
＜各測定項目値の算出＞
・５０％ ＨＣｏＶ－ＯＣ４３感染細胞死阻害濃度（ＥＣ５０）算出
ｘを化合物濃度の対数値、ｙを％Ｅｆｆｉｃａｃｙとしたとき、以下のＬｏｇｉｓｔｉｃ回帰式で阻害曲線を近似し、ｙ＝５０（％）を代入したときのｘの値をＥＣ５０として算出する。
y = min + (max - min)/{1 + (X50/x) ^Hill}
%Efficacy = {(Sample - virus control) / (cell control - virus control)} * 100%
cell control： the average of Lum of cell control wells
virus control： the average of Lum of virus control wells
min：y軸下限値、max：y軸上限値、X50：変曲点のx座標、Hill：minとmaxの中間点でのカーブの傾き
・５０％細胞毒性濃度の算出
ｘを化合物濃度の対数値、ｙを％Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙとしたとき、以下のＬｏｇｉｓｔｉｃ回帰式で阻害曲線を近似し、ｙ＝５０（％）を代入したときのｘの値をＣＣ５０として算出する。
y = min + (max - min)/{1 + (X50/x) ^Hill}
%Cytotoxicity = {(Sample - medium control) / (cell control - medium control)} * 100%
cell control： the average of Lum of cell control wells
medium control： the average of Lum of medium control wells
min：y軸下限値、max：y軸上限値、X50：変曲点のx座標、Hill：minとmaxの中間点でのカーブの傾き
・５０％ ＨＣｏＶ－ＯＣ４３感染細胞死阻害濃度（ＥＣ５０）算出
ｘを化合物濃度の対数値、ｙを％Ｅｆｆｉｃａｃｙとしたとき、以下のＬｏｇｉｓｔｉｃ回帰式で阻害曲線を近似し、ｙ＝５０（％）を代入したときのｘの値をＥＣ５０として算出する。
y = min + (max - min)/{1 + (X50/x) ^Hill}
%Efficacy = {(Sample - virus control) / (cell control - virus control)} * 100%
cell control： the average of Lum of cell control wells
virus control： the average of Lum of virus control wells
min：y軸下限値、max：y軸上限値、X50：変曲点のx座標、Hill：minとmaxの中間点でのカーブの傾き
・５０％細胞毒性濃度の算出
ｘを化合物濃度の対数値、ｙを％Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙとしたとき、以下のＬｏｇｉｓｔｉｃ回帰式で阻害曲線を近似し、ｙ＝５０（％）を代入したときのｘの値をＣＣ５０として算出する。
y = min + (max - min)/{1 + (X50/x) ^Hill}
%Cytotoxicity = {(Sample - medium control) / (cell control - medium control)} * 100%
cell control： the average of Lum of cell control wells
medium control： the average of Lum of medium control wells
min：y軸下限値、max：y軸上限値、X50：変曲点のx座標、Hill：minとmaxの中間点でのカーブの傾き
【0120】
本発明に係る化合物を本質的に上記のとおり試験した。結果を以下に示す。
化合物Ｉ－１：ＥＣ５０ ９２．０±２１．０ｎＭ、ＣＣ５０＞１００μＭ
化合物Ｉ－１：ＥＣ５０ ９２．０±２１．０ｎＭ、ＣＣ５０＞１００μＭ
【0121】
試験例６：ＨＣｏＶ－２２９Ｅに対する抗ウイルス効果
＜操作手順＞
・被験試料の希釈、分注
予め被験試料をＤＭＳＯで適度な濃度に希釈し、３倍段階希釈系列を作製後、９６ウェルプレートに分注し維持培地（ＭＥＭ、２％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）で希釈する。
・細胞およびＨＣｏＶ－２２９Ｅの希釈、分注
継代培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）に懸濁させたＭＲＣ－５細胞（２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を感染前日に９６ｗｅｌｌプレートに播種し、翌日、維持培地（ＭＥＭ、２％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）に懸濁させたＨＣｏＶ－２２９Ｅ（１０００ＴＣＩＤ５０／ｗｅｌｌ）を1時間で感染させる。その後、ウイルス液を除去し、被験試薬が入った維持培地を添加し、ＣＯ２インキュベーターで７２時間培養する。
・ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０の分注および発光シグナルの測定
７２時間培養したプレートを室温に戻した後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０を各ウェルに分注し、プレートミキサーで混和する。一定時間置いた後、プレートリーダーで発光シグナル（Ｌｕｍ）を測定する。
＜操作手順＞
・被験試料の希釈、分注
予め被験試料をＤＭＳＯで適度な濃度に希釈し、３倍段階希釈系列を作製後、９６ウェルプレートに分注し維持培地（ＭＥＭ、２％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）で希釈する。
・細胞およびＨＣｏＶ－２２９Ｅの希釈、分注
継代培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）に懸濁させたＭＲＣ－５細胞（２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を感染前日に９６ｗｅｌｌプレートに播種し、翌日、維持培地（ＭＥＭ、２％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）に懸濁させたＨＣｏＶ－２２９Ｅ（１０００ＴＣＩＤ５０／ｗｅｌｌ）を1時間で感染させる。その後、ウイルス液を除去し、被験試薬が入った維持培地を添加し、ＣＯ２インキュベーターで７２時間培養する。
・ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０の分注および発光シグナルの測定
７２時間培養したプレートを室温に戻した後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０を各ウェルに分注し、プレートミキサーで混和する。一定時間置いた後、プレートリーダーで発光シグナル（Ｌｕｍ）を測定する。
【0122】
＜各測定項目値の算出＞
・５０％ ＨＣｏＶ－２２９Ｅ感染細胞死阻害濃度（ＥＣ５０）算出
ｘを化合物濃度の対数値、ｙを％Ｅｆｆｉｃａｃｙとしたとき、以下のＬｏｇｉｓｔｉｃ回帰式で阻害曲線を近似し、ｙ＝５０（％）を代入したときのｘの値をＥＣ５０として算出する。
y = min + (max - min)/{1 + (X50/x) ^Hill}
%Efficacy = {(Sample - virus control) / (cell control - virus control)} * 100%
cell control： the average of Lum of cell control wells
virus control： the average of Lum of virus control wells
min：y軸下限値、max：y軸上限値、X50：変曲点のx座標、Hill：minとmaxの中間点でのカーブの傾き
・５０％ ＨＣｏＶ－２２９Ｅ感染細胞死阻害濃度（ＥＣ５０）算出
ｘを化合物濃度の対数値、ｙを％Ｅｆｆｉｃａｃｙとしたとき、以下のＬｏｇｉｓｔｉｃ回帰式で阻害曲線を近似し、ｙ＝５０（％）を代入したときのｘの値をＥＣ５０として算出する。
y = min + (max - min)/{1 + (X50/x) ^Hill}
%Efficacy = {(Sample - virus control) / (cell control - virus control)} * 100%
cell control： the average of Lum of cell control wells
virus control： the average of Lum of virus control wells
min：y軸下限値、max：y軸上限値、X50：変曲点のx座標、Hill：minとmaxの中間点でのカーブの傾き
【0123】
本発明に係る化合物を本質的に上記のとおり試験した。結果を以下に示す。
化合物Ｉ－１：ＥＣ５０ ３５７０±５１０ｎＭ
化合物Ｉ－１：ＥＣ５０ ３５７０±５１０ｎＭ
【0124】
試験例７：抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性に対するヒト血清、マウス血清及びハムスター血清の影響
＜操作手順＞
・被験試料の希釈、分注
予め被験試料をＤＭＳＯで適度な濃度に希釈し、３倍段階希釈系列を作製後、９６ウェルプレートに分注する。
・血清添加培地の添加
最終濃度０、１２．５、２５、５０％ヒト血清もしくはマウス血清もしくはハムスター血清となるよう培地（ＭＥＭ、２％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）で調製し、被験試料が入ったウェルに分注し、室温で１時間インキュベートする。
・細胞およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の希釈、分注
ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞（ＪＣＲＢ１８１９、１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を感染前日に９６ｗｅｌｌプレートに播種し、翌日、維持培地（ＭＥＭ、２％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）に懸濁させたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ７－５０１／２０２１（１０００ＴＣＩＤ５０／ｗｅｌｌ）を１時間で感染させる。その後、ウイルス液を除去し、被験試薬およびヒト血清、マウス血清あるいはハムスター血清添加培地を添加し、ＣＯ２インキュベーターで１日培養する。
・ウイルス量の定量
１日培養したプレートの上清を除去し、Ｔｒｉｚｏｌ ＬＳと維持培地を３：１で混和した細胞溶解液を添加し、Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ－９６ ＲＮＡ Ｋｉｔ（ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ）を用いてＲＮＡを抽出する。抽出後のＲＮＡ溶液をリアルタイムＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ５）にて定量する。プローブ、プライマーは以下のものを使用する。
＜操作手順＞
・被験試料の希釈、分注
予め被験試料をＤＭＳＯで適度な濃度に希釈し、３倍段階希釈系列を作製後、９６ウェルプレートに分注する。
・血清添加培地の添加
最終濃度０、１２．５、２５、５０％ヒト血清もしくはマウス血清もしくはハムスター血清となるよう培地（ＭＥＭ、２％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）で調製し、被験試料が入ったウェルに分注し、室温で１時間インキュベートする。
・細胞およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の希釈、分注
ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞（ＪＣＲＢ１８１９、１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を感染前日に９６ｗｅｌｌプレートに播種し、翌日、維持培地（ＭＥＭ、２％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）に懸濁させたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ７－５０１／２０２１（１０００ＴＣＩＤ５０／ｗｅｌｌ）を１時間で感染させる。その後、ウイルス液を除去し、被験試薬およびヒト血清、マウス血清あるいはハムスター血清添加培地を添加し、ＣＯ２インキュベーターで１日培養する。
・ウイルス量の定量
１日培養したプレートの上清を除去し、Ｔｒｉｚｏｌ ＬＳと維持培地を３：１で混和した細胞溶解液を添加し、Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ－９６ ＲＮＡ Ｋｉｔ（ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ）を用いてＲＮＡを抽出する。抽出後のＲＮＡ溶液をリアルタイムＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ５）にて定量する。プローブ、プライマーは以下のものを使用する。
【表7】
【0125】
＜各測定項目値の算出＞
・９０％ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス複製阻害濃度（ＥＣ９０）算出
ｘを化合物濃度の対数値、ｙをウイルスのコピー数（Ｌｏｇ１０ ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ）とした濃度依存性曲線においてウイルスコントロールからの１ ｌｏｇ１０ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎに相当する値をその前後の２濃度のコピー数から二点法で算出する。すなわち、
X = the lowest concentration at the mean reduction of viral RNA copy number from that of virus control is less than z
x = the highest concentration at the mean reduction of viral RNA copy number from that of virus control is z or more.
Y = the mean of logarithmic reduction of viral RNA copy number from that of virus control at X
y = the mean of logarithmic reduction of viral RNA copy number from that of virus control at x
EC90 values were calculated by the following formula.
EC90 = 10[log(x) + (log(X) - log(x)) × (y - z)/(y - Y)]
z = log10(10/100)
・Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ａｄｊｕｓｔｅｄ ＥＣ９０（ＰＡ－ＥＣ９０）の算出
各血清濃度でのＥＣ９０を算出後、線形回帰によって血清１００％条件でのＰＡ－ＥＣ９０値を計算した。
・９０％ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス複製阻害濃度（ＥＣ９０）算出
ｘを化合物濃度の対数値、ｙをウイルスのコピー数（Ｌｏｇ１０ ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ）とした濃度依存性曲線においてウイルスコントロールからの１ ｌｏｇ１０ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎに相当する値をその前後の２濃度のコピー数から二点法で算出する。すなわち、
X = the lowest concentration at the mean reduction of viral RNA copy number from that of virus control is less than z
x = the highest concentration at the mean reduction of viral RNA copy number from that of virus control is z or more.
Y = the mean of logarithmic reduction of viral RNA copy number from that of virus control at X
y = the mean of logarithmic reduction of viral RNA copy number from that of virus control at x
EC90 values were calculated by the following formula.
EC90 = 10[log(x) + (log(X) - log(x)) × (y - z)/(y - Y)]
z = log10(10/100)
・Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ａｄｊｕｓｔｅｄ ＥＣ９０（ＰＡ－ＥＣ９０）の算出
各血清濃度でのＥＣ９０を算出後、線形回帰によって血清１００％条件でのＰＡ－ＥＣ９０値を計算した。
【0126】
本発明に係る化合物を本質的に上記のとおり試験した。結果を以下に示す。
化合物Ｉ－１：
ヒト血清ＰＡ－ＥＣ９０ ７．９０ｎＭ
マウス血清ＰＡ－ＥＣ９０ １９．８ｎＭ
ハムスター血清ＰＡ－ＥＣ９０ ８．１７ｎＭ
化合物Ｉ－１：
ヒト血清ＰＡ－ＥＣ９０ ７．９０ｎＭ
マウス血清ＰＡ－ＥＣ９０ １９．８ｎＭ
ハムスター血清ＰＡ－ＥＣ９０ ８．１７ｎＭ
【0127】
試験例８：ｈｕｍａｎ ａｉｒｗａｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ細胞を用いたウイルス増殖抑制効果確認試験
＜操作手順＞
・被験試料の希釈、分注
予め被験試料をＤＭＳＯで適度な濃度に希釈し、３倍段階希釈系列を作製後、ＭｕｃｉｌＡｉｒＴＭ培養液で２００倍希釈し、２４ウェルプレートに分注した。
・ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌに播種してあるＭｕｃｉｌＡｉｒＴＭ（Ｎａｓａｌ ｃａｖｉｔｙ、約５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７０２／２０２２（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＢＥ．１／ＢＡ．５－ｌｉｋｅ）（５０００ＴＣＩＤ５０／ｗｅｌｌ）を感染させ、ＣＯ２インキュベーターで２時間培養した。その後ＭｕｃｉｌＡｉｒＴＭ培養液で洗浄し、ｔｒａｎｓｗｅｌｌを被験試料が入ったウェルに乗せ、ＣＯ２インキュベーターで培養した。感染２日後に、ｔｒａｎｓｗｅｌｌにＭｕｃｉｌＡｉｒＴＭ培養液を添加し、その上清を回収した。
・上清中ウイルス力価の測定
回収した上清を培地（ＭＥＭ、２％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）にて１０倍希釈系列を作製後、ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞（ＪＣＲＢ１８１９、１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）と混合し、９６ウェルプレートに播種した。ＣＯ２インキュベーターで４日間培養後、Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ（ＣＰＥ）を観察し、上清中に含まれるウイルス力価を算出した。
＜操作手順＞
・被験試料の希釈、分注
予め被験試料をＤＭＳＯで適度な濃度に希釈し、３倍段階希釈系列を作製後、ＭｕｃｉｌＡｉｒＴＭ培養液で２００倍希釈し、２４ウェルプレートに分注した。
・ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌに播種してあるＭｕｃｉｌＡｉｒＴＭ（Ｎａｓａｌ ｃａｖｉｔｙ、約５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７０２／２０２２（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＢＥ．１／ＢＡ．５－ｌｉｋｅ）（５０００ＴＣＩＤ５０／ｗｅｌｌ）を感染させ、ＣＯ２インキュベーターで２時間培養した。その後ＭｕｃｉｌＡｉｒＴＭ培養液で洗浄し、ｔｒａｎｓｗｅｌｌを被験試料が入ったウェルに乗せ、ＣＯ２インキュベーターで培養した。感染２日後に、ｔｒａｎｓｗｅｌｌにＭｕｃｉｌＡｉｒＴＭ培養液を添加し、その上清を回収した。
・上清中ウイルス力価の測定
回収した上清を培地（ＭＥＭ、２％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）にて１０倍希釈系列を作製後、ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞（ＪＣＲＢ１８１９、１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）と混合し、９６ウェルプレートに播種した。ＣＯ２インキュベーターで４日間培養後、Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ（ＣＰＥ）を観察し、上清中に含まれるウイルス力価を算出した。
【0128】
＜各測定項目値の算出＞
・９０％ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス産生阻害濃度（ＥＣ９０）算出
ｘを化合物濃度の対数値、ｙをウイルス力価（Ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）とした濃度依存性曲線においてウイルスコントロールからの１ ｌｏｇ１０ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎに相当する値をその前後の２濃度のウイルス力価から二点法で算出する。
・９０％ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス産生阻害濃度（ＥＣ９０）算出
ｘを化合物濃度の対数値、ｙをウイルス力価（Ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）とした濃度依存性曲線においてウイルスコントロールからの１ ｌｏｇ１０ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎに相当する値をその前後の２濃度のウイルス力価から二点法で算出する。
【数1】
【0129】
本発明に係る化合物を本質的に上記のとおり試験した。結果を以下に示す。
【表8】
【0130】
試験例９：化合物Ｉ－１の遅延投与によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染マウスの肺ホモジネート液中ウイルス力価増殖抑制試験
＜材料と方法＞
・化合物
本発明に係る化合物Ｉ－１を、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）および０．５ｗ／ｖ％ ポリ（１－ビニルピロリドン－ｃｏ－酢酸ビニル）（ＰＶＰＶＡ）含有ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）（ＤＭＡ：０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ含有ＰＥＧ４００＝１：９）を用いて、被験試料とした。投与容量は、５ｍＬ／ｋｇとした。
・ウイルス
国立感染症研究所にて分離されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ７－５０１／２０２１株を用いた。
・マウス肺感染、投薬、肺回収
特定病原体不在の５週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＣＬＥＡ Ｊａｐａｎ，Ｉｎｃ．）を本研究において使用した。ウイルス接種の際、Ｓａｌｉｎｅ中に０．０３ｍｇ／ｍＬの塩酸メデトミジン、０．４ｍｇ／ｍＬのミダゾラム、０．５ｍｇ／ｍＬの酒石酸ブトルファノールを含む１００μＬの麻酔液の筋内投与によってマウスを麻酔した。マウスに、麻酔下で、５０μＬのｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ７－５０１／２０２１（１．００×１０４ＴＣＩＤ５０）を経鼻接種した。ウイルス感染１日後を開始点として、マウス（ｎ＝５／群）に、化合物Ｉ－１を０．１、０．３、１、３、１０ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回経口投与した。対照マウスには、ＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００を１日２回経口投与した。化合物投与は投与開始から２日間とした。感染３日後にマウス肺を回収し、２ｍＬのＰＢＳを添加、ホモジナイズし、遠心後の上清を回収した。
・肺ホモジネート液中ウイルス力価の測定
肺ホモジネート液を培地（ＭＥＭ、２％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）にて１０倍希釈系列を作製後、ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞（ＪＣＲＢ１８１９、１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）と混合し、９６ウェルプレートに播種した。ＣＯ２インキュベーターで４日間培養後、Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ（ＣＰＥ）を観察し、肺ホモジネート液中に含まれるウイルス力価を算出した。
＜材料と方法＞
・化合物
本発明に係る化合物Ｉ－１を、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）および０．５ｗ／ｖ％ ポリ（１－ビニルピロリドン－ｃｏ－酢酸ビニル）（ＰＶＰＶＡ）含有ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）（ＤＭＡ：０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ含有ＰＥＧ４００＝１：９）を用いて、被験試料とした。投与容量は、５ｍＬ／ｋｇとした。
・ウイルス
国立感染症研究所にて分離されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ７－５０１／２０２１株を用いた。
・マウス肺感染、投薬、肺回収
特定病原体不在の５週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＣＬＥＡ Ｊａｐａｎ，Ｉｎｃ．）を本研究において使用した。ウイルス接種の際、Ｓａｌｉｎｅ中に０．０３ｍｇ／ｍＬの塩酸メデトミジン、０．４ｍｇ／ｍＬのミダゾラム、０．５ｍｇ／ｍＬの酒石酸ブトルファノールを含む１００μＬの麻酔液の筋内投与によってマウスを麻酔した。マウスに、麻酔下で、５０μＬのｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ７－５０１／２０２１（１．００×１０４ＴＣＩＤ５０）を経鼻接種した。ウイルス感染１日後を開始点として、マウス（ｎ＝５／群）に、化合物Ｉ－１を０．１、０．３、１、３、１０ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回経口投与した。対照マウスには、ＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００を１日２回経口投与した。化合物投与は投与開始から２日間とした。感染３日後にマウス肺を回収し、２ｍＬのＰＢＳを添加、ホモジナイズし、遠心後の上清を回収した。
・肺ホモジネート液中ウイルス力価の測定
肺ホモジネート液を培地（ＭＥＭ、２％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）にて１０倍希釈系列を作製後、ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞（ＪＣＲＢ１８１９、１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）と混合し、９６ウェルプレートに播種した。ＣＯ２インキュベーターで４日間培養後、Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ（ＣＰＥ）を観察し、肺ホモジネート液中に含まれるウイルス力価を算出した。
【0131】
本発明に係る化合物を本質的に上記のとおり試験した。結果を以下に示す。
感染３日後の肺ホモジネート液中ウイルス力価はＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００投与群では６．４５－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬを示し、化合物Ｉ－１ ０．１、０．３、１、３、１０ｍｇ／ｋｇ投与群ではそれぞれ６．２７、５．３９、３．９７、２．５１、２．４７－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬを示した。化合物Ｉ－１投与群では肺ホモジネート液中ウイルス力価がＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００投与群に比べて低値を示したことから、感染から投与までの期間が空いても肺ホモジネート液中ウイルス力価を低減する効果があることが示唆された（図１）。
感染３日後の肺ホモジネート液中ウイルス力価はＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００投与群では６．４５－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬを示し、化合物Ｉ－１ ０．１、０．３、１、３、１０ｍｇ／ｋｇ投与群ではそれぞれ６．２７、５．３９、３．９７、２．５１、２．４７－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬを示した。化合物Ｉ－１投与群では肺ホモジネート液中ウイルス力価がＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００投与群に比べて低値を示したことから、感染から投与までの期間が空いても肺ホモジネート液中ウイルス力価を低減する効果があることが示唆された（図１）。
【0132】
試験例１０：化合物Ｉ－１の遅延投与によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ハムスターの肺及び鼻甲介ホモジネート液中ウイルス力価増殖抑制試験及び肺重量増加抑制試験
＜材料と方法＞
・化合物
本発明に係る化合物Ｉ－１を、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）および０．５ｗ／ｖ％ ポリ（１－ビニルピロリドン－ｃｏ－酢酸ビニル）（ＰＶＰＶＡ）含有ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）（ＤＭＡ：０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ含有ＰＥＧ４００＝１：９）を用いて、被験試料とした。投与容量は、２．５ｍＬ／ｋｇとした。
・ウイルス
国立感染症研究所にて分離されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７０２／２０２２株（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＢＥ．１／ＢＡ．５－ｌｉｋｅ）を用いた。
・ハムスター肺感染、投薬、肺、鼻甲介回収
特定病原体不在の６週齢の雄性シリアンハムスター（Ｊａｐａｎ ＳＬＣ，Ｉｎｃ．）を本研究において使用した。ウイルス接種の際、０．０７ｍｇ／ｍＬの塩酸メデトミジン、６．９８ｍｇ／ｍＬのアルファキサロン、１．１６ｍｇ／ｍＬの酒石酸ブトルファノールを含む麻酔液を３ｍＬ／ｋｇで皮下投与によってハムスターを麻酔し、１００μＬのｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７０２／２０２２（１．００×１０４ＴＣＩＤ５０）を経鼻接種した。感染ハムスターには、ウイルス接種１日後を開始点として、化合物Ｉ－１を０．１、１、１０ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回経口投与した。対照の感染ハムスター及び非感染ハムスターには、ＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００を１日２回経口投与した。化合物投与は投与開始から５日間とした。感染３、４日後に感染ハムスター肺及び鼻甲介を回収し、それぞれ５ｍＬ若しくは１ｍLのＰＢＳを添加、ホモジナイズし、遠心後の上清を回収した。また、感染７日後の感染及び非感染ハムスターの肺を回収し、肺重量を測定した。
・肺及び鼻甲介ホモジネート液中ウイルス力価の測定
肺及び鼻甲介ホモジネート液を培地（ＭＥＭ、２％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）にて１０倍希釈系列を作製後、予め９６ウェルプレートに培養したＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞（ＪＣＲＢ１８１９、１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）に播種した。ＣＯ２インキュベーターで４日間培養後、Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ（ＣＰＥ）を観察し、肺若しくは鼻甲介ホモジネート液中に含まれるウイルス力価を算出した。
＜材料と方法＞
・化合物
本発明に係る化合物Ｉ－１を、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）および０．５ｗ／ｖ％ ポリ（１－ビニルピロリドン－ｃｏ－酢酸ビニル）（ＰＶＰＶＡ）含有ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）（ＤＭＡ：０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ含有ＰＥＧ４００＝１：９）を用いて、被験試料とした。投与容量は、２．５ｍＬ／ｋｇとした。
・ウイルス
国立感染症研究所にて分離されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７０２／２０２２株（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＢＥ．１／ＢＡ．５－ｌｉｋｅ）を用いた。
・ハムスター肺感染、投薬、肺、鼻甲介回収
特定病原体不在の６週齢の雄性シリアンハムスター（Ｊａｐａｎ ＳＬＣ，Ｉｎｃ．）を本研究において使用した。ウイルス接種の際、０．０７ｍｇ／ｍＬの塩酸メデトミジン、６．９８ｍｇ／ｍＬのアルファキサロン、１．１６ｍｇ／ｍＬの酒石酸ブトルファノールを含む麻酔液を３ｍＬ／ｋｇで皮下投与によってハムスターを麻酔し、１００μＬのｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７０２／２０２２（１．００×１０４ＴＣＩＤ５０）を経鼻接種した。感染ハムスターには、ウイルス接種１日後を開始点として、化合物Ｉ－１を０．１、１、１０ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回経口投与した。対照の感染ハムスター及び非感染ハムスターには、ＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００を１日２回経口投与した。化合物投与は投与開始から５日間とした。感染３、４日後に感染ハムスター肺及び鼻甲介を回収し、それぞれ５ｍＬ若しくは１ｍLのＰＢＳを添加、ホモジナイズし、遠心後の上清を回収した。また、感染７日後の感染及び非感染ハムスターの肺を回収し、肺重量を測定した。
・肺及び鼻甲介ホモジネート液中ウイルス力価の測定
肺及び鼻甲介ホモジネート液を培地（ＭＥＭ、２％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）にて１０倍希釈系列を作製後、予め９６ウェルプレートに培養したＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞（ＪＣＲＢ１８１９、１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）に播種した。ＣＯ２インキュベーターで４日間培養後、Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ（ＣＰＥ）を観察し、肺若しくは鼻甲介ホモジネート液中に含まれるウイルス力価を算出した。
【0133】
本発明に係る化合物を本質的に上記のとおり試験した。結果を以下に示す。
肺ホモジネート液中ウイルス力価は、感染３日後のＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００投与群では５．４－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬを示し、化合物Ｉ－１を０．１、１、１０ｍｇ／ｋｇ投与群ではそれぞれ５．５、３．５、２．５－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬを示した。感染４日後はＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００投与群では５．６－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬを示し、化合物Ｉ－１を０．１、１、１０ｍｇ／ｋｇ投与群ではそれぞれ４．６、２．４、１．９－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬを示した。
鼻甲介ホモジネート液中ウイルス力価は、感染３日後はＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００投与群では５．０－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬを示し、化合物Ｉ－１を０．１、１、１０ｍｇ／ｋｇ投与群ではそれぞれ４．８、３．２、２．７－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬを示した。感染４日後はＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００投与群では３．８－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬを示し、化合物Ｉ－１を０．１、１、１０ｍｇ／ｋｇ投与群ではそれぞれ４．０、２．２、１．８－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬを示した。
化合物Ｉ－１投与群では肺及び鼻甲介ホモジネート液中ウイルス力価がＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００投与群に比べて投与量依存的に低値を示したことから、感染から投与までの期間が空いても肺及び鼻甲介ホモジネート液中ウイルス力価を低減する効果があることが示唆された（図２－１、図２－２）。
また、感染７日後の肺重量／体重は、非感染ハムスターでは５．２６ｍｇ／g、感染ハムスターのＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００投与群では８．９６ｍｇ／ｇ、化合物Ｉ－１を０．１、１、１０ｍｇ／ｋｇ投与群ではそれぞれ８．２４、５．７５、５．５７ｍｇ／ｇを示した。
化合物Ｉ－１投与群では肺重量／体重がＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００投与群に比べて投与量依存的に低値を示したことから、化合物Ｉ－１の投与により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染によって引き起こされる肺重量増加抑制効果があることが示唆された（図３）。
肺ホモジネート液中ウイルス力価は、感染３日後のＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００投与群では５．４－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬを示し、化合物Ｉ－１を０．１、１、１０ｍｇ／ｋｇ投与群ではそれぞれ５．５、３．５、２．５－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬを示した。感染４日後はＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００投与群では５．６－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬを示し、化合物Ｉ－１を０．１、１、１０ｍｇ／ｋｇ投与群ではそれぞれ４．６、２．４、１．９－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬを示した。
鼻甲介ホモジネート液中ウイルス力価は、感染３日後はＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００投与群では５．０－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬを示し、化合物Ｉ－１を０．１、１、１０ｍｇ／ｋｇ投与群ではそれぞれ４．８、３．２、２．７－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬを示した。感染４日後はＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００投与群では３．８－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬを示し、化合物Ｉ－１を０．１、１、１０ｍｇ／ｋｇ投与群ではそれぞれ４．０、２．２、１．８－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬを示した。
化合物Ｉ－１投与群では肺及び鼻甲介ホモジネート液中ウイルス力価がＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００投与群に比べて投与量依存的に低値を示したことから、感染から投与までの期間が空いても肺及び鼻甲介ホモジネート液中ウイルス力価を低減する効果があることが示唆された（図２－１、図２－２）。
また、感染７日後の肺重量／体重は、非感染ハムスターでは５．２６ｍｇ／g、感染ハムスターのＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００投与群では８．９６ｍｇ／ｇ、化合物Ｉ－１を０．１、１、１０ｍｇ／ｋｇ投与群ではそれぞれ８．２４、５．７５、５．５７ｍｇ／ｇを示した。
化合物Ｉ－１投与群では肺重量／体重がＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００投与群に比べて投与量依存的に低値を示したことから、化合物Ｉ－１の投与により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染によって引き起こされる肺重量増加抑制効果があることが示唆された（図３）。
【0134】
試験例１１：化合物Ｉ－１の投与によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ハムスターの体重減少抑制試験
＜材料と方法＞
・化合物
本発明に係る化合物Ｉ－１を、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）および０．５ｗ／ｖ％ ポリ（１－ビニルピロリドン－ｃｏ－酢酸ビニル）（ＰＶＰＶＡ）含有ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）（ＤＭＡ：０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ含有ＰＥＧ４００＝１：９）を用いて、被験試料とした。投与容量は、２．５ｍＬ／ｋｇとした。
・ウイルス
国立感染症研究所にて分離されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７０２／２０２２株（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＢＥ．１／ＢＡ．５－ｌｉｋｅ）を用いた。
・ハムスター肺感染、投薬、体重測定
特定病原体不在の６週齢の雄性シリアンハムスター（Ｊａｐａｎ ＳＬＣ，Ｉｎｃ．）を本研究において使用した。ウイルス接種の際、０．０７ｍｇ／ｍＬの塩酸メデトミジン、６．９８ｍｇ／ｍＬのアルファキサロン、１．１６ｍｇ／ｍＬの酒石酸ブトルファノールを含む麻酔液を３ｍＬ／ｋｇで皮下投与によってハムスターを麻酔し、１００μＬのｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７０２／２０２２（１．００×１０４ＴＣＩＤ５０）を経鼻接種した。感染ハムスターには、ウイルス接種１日後を開始点として、化合物Ｉ－１を０．１、１、１０ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回経口投与した。対照の感染ハムスター及び非感染ハムスターには、ＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００を１日２回経口投与した。化合物投与は投与開始から５日間とした。体重を１日１回モニタリングした。
＜材料と方法＞
・化合物
本発明に係る化合物Ｉ－１を、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）および０．５ｗ／ｖ％ ポリ（１－ビニルピロリドン－ｃｏ－酢酸ビニル）（ＰＶＰＶＡ）含有ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）（ＤＭＡ：０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ含有ＰＥＧ４００＝１：９）を用いて、被験試料とした。投与容量は、２．５ｍＬ／ｋｇとした。
・ウイルス
国立感染症研究所にて分離されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７０２／２０２２株（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＢＥ．１／ＢＡ．５－ｌｉｋｅ）を用いた。
・ハムスター肺感染、投薬、体重測定
特定病原体不在の６週齢の雄性シリアンハムスター（Ｊａｐａｎ ＳＬＣ，Ｉｎｃ．）を本研究において使用した。ウイルス接種の際、０．０７ｍｇ／ｍＬの塩酸メデトミジン、６．９８ｍｇ／ｍＬのアルファキサロン、１．１６ｍｇ／ｍＬの酒石酸ブトルファノールを含む麻酔液を３ｍＬ／ｋｇで皮下投与によってハムスターを麻酔し、１００μＬのｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７０２／２０２２（１．００×１０４ＴＣＩＤ５０）を経鼻接種した。感染ハムスターには、ウイルス接種１日後を開始点として、化合物Ｉ－１を０．１、１、１０ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回経口投与した。対照の感染ハムスター及び非感染ハムスターには、ＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００を１日２回経口投与した。化合物投与は投与開始から５日間とした。体重を１日１回モニタリングした。
【0135】
本発明に係る化合物を本質的に上記のとおり試験した。結果を以下に示す。
非感染ハムスターは体重増加が認められたが、感染ハムスターでは感染３日後から体重が減少し、感染６日後に体重が最も低値となった。このとき化合物Ｉ－１ １、１０ｍｇ／ｋｇ投与群では観察した感染１０日後まで全例が生存し、体重減少が抑制された（図４）。
以上の結果から、化合物Ｉ－１投与により体重減少抑制効果があることが示唆された。
非感染ハムスターは体重増加が認められたが、感染ハムスターでは感染３日後から体重が減少し、感染６日後に体重が最も低値となった。このとき化合物Ｉ－１ １、１０ｍｇ／ｋｇ投与群では観察した感染１０日後まで全例が生存し、体重減少が抑制された（図４）。
以上の結果から、化合物Ｉ－１投与により体重減少抑制効果があることが示唆された。
【0136】
試験例１２：化合物Ｉ－１の予防投与によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ハムスターの体重減少抑制、肺及び鼻甲介ホモジネート液中ウイルス増殖抑制試験
＜材料と方法＞
・化合物
化合物Ｉ－１を、０．５％メチルセルロース（０．５％ＭＣ）溶液を用いて被験試料とした。投与容量は、１０ｍＬ／ｋｇとした。
・ウイルス
国立感染症研究所にて分離されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７０２／２０２２株（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＢＥ．１／ＢＡ．５－ｌｉｋｅ）を用いた。
・ハムスター肺感染、投薬、体重測定
特定病原体不在の６週齢の雄性シリアンハムスター（Ｊａｐａｎ ＳＬＣ，Ｉｎｃ．）を本研究において使用した。ウイルス接種の際、０．０７ｍｇ／ｍＬの塩酸メデトミジン、６．９８ｍｇ／ｍＬのアルファキサロン、１．１６ｍｇ／ｍＬの酒石酸ブトルファノールを含む麻酔液を３ｍＬ／ｋｇで皮下投与によってハムスターを麻酔し、１００μＬのｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７０２／２０２２（１．００×１０４ＴＣＩＤ５０）を経鼻接種した。体重減少抑制試験ではウイルス感染１日前あるいは３日前に化合物Ｉ－１を３、１０ｍｇ／ｋｇで１回皮下投与した。肺及び鼻甲介ホモジネート液中ウイルス増殖抑制試験ではウイルス感染１日前に化合物Ｉ－１を１０、３０ｍｇ／ｋｇで１回皮下投与した。対象ハムスターには０．５％ＭＣをウイルス感染１日前に１回皮下投与した。体重は１日１回モニタリングした。感染１、２日後に感染ハムスター肺及び鼻甲介を回収し、それぞれ５ｍＬ若しくは１ｍLのＰＢＳを添加、ホモジナイズし、遠心後の上清を回収した。
・肺及び鼻甲介ホモジネート液中ウイルス力価の測定
肺及び鼻甲介ホモジネート液を培地（ＭＥＭ、２％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）にて１０倍希釈系列を作製後、予め９６ウェルプレートに培養したＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞（ＪＣＲＢ１８１９、１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）に播種した。ＣＯ２インキュベーターで４日間培養後、Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ（ＣＰＥ）を観察し、肺若しくは鼻甲介ホモジネート液中に含まれるウイルス力価を算出した。
＜材料と方法＞
・化合物
化合物Ｉ－１を、０．５％メチルセルロース（０．５％ＭＣ）溶液を用いて被験試料とした。投与容量は、１０ｍＬ／ｋｇとした。
・ウイルス
国立感染症研究所にて分離されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７０２／２０２２株（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＢＥ．１／ＢＡ．５－ｌｉｋｅ）を用いた。
・ハムスター肺感染、投薬、体重測定
特定病原体不在の６週齢の雄性シリアンハムスター（Ｊａｐａｎ ＳＬＣ，Ｉｎｃ．）を本研究において使用した。ウイルス接種の際、０．０７ｍｇ／ｍＬの塩酸メデトミジン、６．９８ｍｇ／ｍＬのアルファキサロン、１．１６ｍｇ／ｍＬの酒石酸ブトルファノールを含む麻酔液を３ｍＬ／ｋｇで皮下投与によってハムスターを麻酔し、１００μＬのｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７０２／２０２２（１．００×１０４ＴＣＩＤ５０）を経鼻接種した。体重減少抑制試験ではウイルス感染１日前あるいは３日前に化合物Ｉ－１を３、１０ｍｇ／ｋｇで１回皮下投与した。肺及び鼻甲介ホモジネート液中ウイルス増殖抑制試験ではウイルス感染１日前に化合物Ｉ－１を１０、３０ｍｇ／ｋｇで１回皮下投与した。対象ハムスターには０．５％ＭＣをウイルス感染１日前に１回皮下投与した。体重は１日１回モニタリングした。感染１、２日後に感染ハムスター肺及び鼻甲介を回収し、それぞれ５ｍＬ若しくは１ｍLのＰＢＳを添加、ホモジナイズし、遠心後の上清を回収した。
・肺及び鼻甲介ホモジネート液中ウイルス力価の測定
肺及び鼻甲介ホモジネート液を培地（ＭＥＭ、２％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）にて１０倍希釈系列を作製後、予め９６ウェルプレートに培養したＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞（ＪＣＲＢ１８１９、１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）に播種した。ＣＯ２インキュベーターで４日間培養後、Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ（ＣＰＥ）を観察し、肺若しくは鼻甲介ホモジネート液中に含まれるウイルス力価を算出した。
【0137】
本発明に係る化合物を本質的に上記のとおり試験した。結果を以下に示す。
感染ハムスターでは感染３日後から体重が減少し、感染６日後に体重が最も低値となった。このとき化合物Ｉ－１を感染１日前での３、１０ｍｇ／ｋｇ投与群、感染３日前での１０ｍｇ／ｋｇ投与群では観察した感染７日後まで全例が生存し、体重減少が抑制された（図５）。
肺ホモジネート液中ウイルス力価は、感染１日後において、０．５％ＭＣ投与群では５．５９－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬを示し、化合物Ｉ－１ １０、３０ｍｇ／ｋｇ投与群ではそれぞれ３．３４、１．８４－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬを示した。感染２日後において、０．５％ＭＣ投与群では６．１８－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬを示し、化合物Ｉ－１ １０、３０ｍｇ／ｋｇ投与群ではそれぞれ５．２９、３．５５－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬを示した（図６－１）。
鼻甲介ホモジネート液中ウイルス力価は、感染１日後において、０．５％ＭＣ投与群では５．７１－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬを示し、化合物Ｉ－１ １０、３０ｍｇ／ｋｇ投与群ではそれぞれ４．８０、３．３６－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬを示した。感染２日後において、０．５％ＭＣ投与群では５．８０－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬを示し、化合物Ｉ－１ １０、３０ｍｇ／ｋｇ投与群ではそれぞれ５．３８、５．０１－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬを示した（図６－２）。
なお、感染直前の血漿中濃度を測定したところ、感染１日前での３、１０ｍｇ／ｋｇ投与群、感染３日前での３、１０ｍｇ／ｋｇ投与群で、それぞれ６．１、１２．５、５．９、３．０ｎｇ／ｍＬであった。
以上の結果から、化合物Ｉ－１の予防的投与によりウイルス感染時の血漿中濃度がおよそ６ｎｇ／ｍＬ以上で体重減少抑制効果が示され、およそ１２ｎｇ／ｍＬ以上で肺および鼻甲介ホモジナイズ中ウイルス増殖抑制効果あることが示された。
感染ハムスターでは感染３日後から体重が減少し、感染６日後に体重が最も低値となった。このとき化合物Ｉ－１を感染１日前での３、１０ｍｇ／ｋｇ投与群、感染３日前での１０ｍｇ／ｋｇ投与群では観察した感染７日後まで全例が生存し、体重減少が抑制された（図５）。
肺ホモジネート液中ウイルス力価は、感染１日後において、０．５％ＭＣ投与群では５．５９－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬを示し、化合物Ｉ－１ １０、３０ｍｇ／ｋｇ投与群ではそれぞれ３．３４、１．８４－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬを示した。感染２日後において、０．５％ＭＣ投与群では６．１８－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬを示し、化合物Ｉ－１ １０、３０ｍｇ／ｋｇ投与群ではそれぞれ５．２９、３．５５－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬを示した（図６－１）。
鼻甲介ホモジネート液中ウイルス力価は、感染１日後において、０．５％ＭＣ投与群では５．７１－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬを示し、化合物Ｉ－１ １０、３０ｍｇ／ｋｇ投与群ではそれぞれ４．８０、３．３６－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬを示した。感染２日後において、０．５％ＭＣ投与群では５．８０－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬを示し、化合物Ｉ－１ １０、３０ｍｇ／ｋｇ投与群ではそれぞれ５．３８、５．０１－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬを示した（図６－２）。
なお、感染直前の血漿中濃度を測定したところ、感染１日前での３、１０ｍｇ／ｋｇ投与群、感染３日前での３、１０ｍｇ／ｋｇ投与群で、それぞれ６．１、１２．５、５．９、３．０ｎｇ／ｍＬであった。
以上の結果から、化合物Ｉ－１の予防的投与によりウイルス感染時の血漿中濃度がおよそ６ｎｇ／ｍＬ以上で体重減少抑制効果が示され、およそ１２ｎｇ／ｍＬ以上で肺および鼻甲介ホモジナイズ中ウイルス増殖抑制効果あることが示された。
【0138】
上記試験結果は、化合物Ｉ－１の予防的な皮下投与においてウイルス感染による病態進行およびウイルス増殖が抑制されたことを示しており、化合物Ｉ－１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の予防薬としての有用性を支持する。
【0139】
試験例１３：化合物Ｉ－１の遅延投与によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ハムスターの鼻腔洗浄液中ウイルス力価クリアランス試験
＜材料と方法＞
・化合物
本発明に係る化合物Ｉ－１を、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）および０．５ｗ／ｖ％ ポリ（１－ビニルピロリドン－ｃｏ－酢酸ビニル）含有ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）（ＰＶＰＶＡ）（ＤＭＡ：０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ含有ＰＥＧ４００＝１：９）を用いて、被験試料とした。投与容量は、２．５ｍＬ／ｋｇとした。
・ウイルス
国立感染症研究所にて分離されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７０２／２０２２株（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＢＥ．１／ＢＡ．５－ｌｉｋｅ）を用いた。
・ハムスター経鼻感染、投薬、鼻腔洗浄液回収
特定病原体不在の６週齢の雄性シリアンハムスター（Ｊａｐａｎ ＳＬＣ，Ｉｎｃ．）を本研究において使用した。ウイルス接種の際、０．０７ｍｇ／ｍＬの塩酸メデトミジン、６．９８ｍｇ／ｍＬのアルファキサロン、１．１６ｍｇ／ｍＬの酒石酸ブトルファノールを含む麻酔液を３ｍＬ／ｋｇで皮下投与によってハムスターを麻酔し、１００μＬのｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７０２／２０２２（１．００×１０４ＴＣＩＤ５０）を経鼻接種した。感染ハムスターには、ウイルス接種２日あるいは３日後を開始点として、化合物Ｉ－１を１、１０ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回経口投与した。対照の感染ハムスターには、ＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００を１日２回経口投与した。化合物投与は投与開始から５日間とした。感染２－６日後に感染ハムスターをイソフルラン麻酔下においてＤＰＢＳ４００μLにて鼻腔洗浄液を回収し、遠心後の上清を回収した。各群ｎ＝４で実施した。
・鼻腔洗浄液中ウイルス力価の測定
鼻腔洗浄液の上清を培地（ＭＥＭ、２％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）にて１０倍希釈系列を作製後、予め９６ウェルプレートに培養したＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞（ＪＣＲＢ１８１９、１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）に播種した。ＣＯ２インキュベーターで４日間培養後、Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ（ＣＰＥ）を観察し、鼻腔洗浄液中に含まれるウイルス力価を算出した。
＜材料と方法＞
・化合物
本発明に係る化合物Ｉ－１を、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）および０．５ｗ／ｖ％ ポリ（１－ビニルピロリドン－ｃｏ－酢酸ビニル）含有ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）（ＰＶＰＶＡ）（ＤＭＡ：０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ含有ＰＥＧ４００＝１：９）を用いて、被験試料とした。投与容量は、２．５ｍＬ／ｋｇとした。
・ウイルス
国立感染症研究所にて分離されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７０２／２０２２株（Ｏｍｉｃｒｏｎ ＢＥ．１／ＢＡ．５－ｌｉｋｅ）を用いた。
・ハムスター経鼻感染、投薬、鼻腔洗浄液回収
特定病原体不在の６週齢の雄性シリアンハムスター（Ｊａｐａｎ ＳＬＣ，Ｉｎｃ．）を本研究において使用した。ウイルス接種の際、０．０７ｍｇ／ｍＬの塩酸メデトミジン、６．９８ｍｇ／ｍＬのアルファキサロン、１．１６ｍｇ／ｍＬの酒石酸ブトルファノールを含む麻酔液を３ｍＬ／ｋｇで皮下投与によってハムスターを麻酔し、１００μＬのｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ４１－７０２／２０２２（１．００×１０４ＴＣＩＤ５０）を経鼻接種した。感染ハムスターには、ウイルス接種２日あるいは３日後を開始点として、化合物Ｉ－１を１、１０ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回経口投与した。対照の感染ハムスターには、ＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００を１日２回経口投与した。化合物投与は投与開始から５日間とした。感染２－６日後に感染ハムスターをイソフルラン麻酔下においてＤＰＢＳ４００μLにて鼻腔洗浄液を回収し、遠心後の上清を回収した。各群ｎ＝４で実施した。
・鼻腔洗浄液中ウイルス力価の測定
鼻腔洗浄液の上清を培地（ＭＥＭ、２％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）にて１０倍希釈系列を作製後、予め９６ウェルプレートに培養したＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞（ＪＣＲＢ１８１９、１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）に播種した。ＣＯ２インキュベーターで４日間培養後、Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ（ＣＰＥ）を観察し、鼻腔洗浄液中に含まれるウイルス力価を算出した。
【0140】
本発明化合物を本質的に上記のとおり試験した。結果を以下に示す。
鼻腔洗浄液中ウイルス力価は、ウイルス接種２日後から化合物を投薬した群において、ＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００投与群、化合物Ｉ－１ １、１０ｍｇ／ｋｇ投与群の投与開始時点（感染２日後、投与開始１日目）では、それぞれ４．８０、４．９０、４．８８－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、感染３日後（投与開始２日目）では、それぞれ３．７５、３．６３、３．６８－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍL、感染５日後（投与開始４日目）では、それぞれ２．９６、＜１．８０、＜１．８０－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍLを示した（図１４）。ウイルス接種３日後から化合物を投薬した群において、ＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００投与群、化合物Ｉ－１ １、１０ｍｇ／ｋｇ投与群の投与開始時点（感染３日後、投与開始１日目）では、それぞれ３．４０、２．９３、３．１３－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、感染４日後（投与開始１日後）では、それぞれ２．９７、１．８４、２．１３－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍL、感染６日後（投与開始４日後）では、それぞれ２．４３、＜１．８０、＜１．８０－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍLを示した（図１５）。
化合物Ｉ－１ １、１０ｍｇ／ｋｇ投与群では投与開始が感染２日後あるいは３日後のいずれにおいても、鼻腔洗浄液中ウイルス力価がＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００投与群に比べて低値を示したことから、感染から投与までの期間が空いても生体内においてウイルスを低減する効果があることが示された。
鼻腔洗浄液中ウイルス力価は、ウイルス接種２日後から化合物を投薬した群において、ＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００投与群、化合物Ｉ－１ １、１０ｍｇ／ｋｇ投与群の投与開始時点（感染２日後、投与開始１日目）では、それぞれ４．８０、４．９０、４．８８－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、感染３日後（投与開始２日目）では、それぞれ３．７５、３．６３、３．６８－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍL、感染５日後（投与開始４日目）では、それぞれ２．９６、＜１．８０、＜１．８０－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍLを示した（図１４）。ウイルス接種３日後から化合物を投薬した群において、ＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００投与群、化合物Ｉ－１ １、１０ｍｇ／ｋｇ投与群の投与開始時点（感染３日後、投与開始１日目）では、それぞれ３．４０、２．９３、３．１３－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、感染４日後（投与開始１日後）では、それぞれ２．９７、１．８４、２．１３－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍL、感染６日後（投与開始４日後）では、それぞれ２．４３、＜１．８０、＜１．８０－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍLを示した（図１５）。
化合物Ｉ－１ １、１０ｍｇ／ｋｇ投与群では投与開始が感染２日後あるいは３日後のいずれにおいても、鼻腔洗浄液中ウイルス力価がＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００投与群に比べて低値を示したことから、感染から投与までの期間が空いても生体内においてウイルスを低減する効果があることが示された。
【0141】
試験例１４：化合物Ｉ－１の遅延投与によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染動物から非感染動物へのウイルス伝播抑制試験
＜材料と方法＞
・化合物
本発明に係る化合物Ｉ－１を、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）および０．５ｗ／ｖ％ ポリ（１－ビニルピロリドン－ｃｏ－酢酸ビニル）（ＰＶＰＶＡ）含有ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）（ＤＭＡ：０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ含有ＰＥＧ４００＝１：９）を用いて、被験試料とした。投与容量は、２．５ｍＬ／ｋｇとした。
・ウイルス
国立感染症研究所にて分離されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ１１－９２７／２０２１を用いた。
・ハムスター経鼻感染、投薬、同居、鼻腔洗浄液及び肺回収
特定病原体不在の６週齢の雄性シリアンハムスター（Ｊａｐａｎ ＳＬＣ，Ｉｎｃ．）を本研究において使用した。ウイルス接種の際、０．０７ｍｇ／ｍＬの塩酸メデトミジン、６．９８ｍｇ／ｍＬのアルファキサロン、１．１６ｍｇ／ｍＬの酒石酸ブトルファノールを含む麻酔液を３ｍＬ／ｋｇで皮下投与によってハムスターを麻酔し、１００μＬのｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ１１－９２７／２０２１（１．００×１０３ＴＣＩＤ５０）を経鼻接種した。感染ハムスター（Ｉｎｄｅｘ）にウイルス接種８時間後を開始点として、化合物Ｉ－１を０．１、１、１０ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回経口投与した。対照の感染ハムスター（Ｉｎｄｅｘ）には、ＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００を１日２回経口投与した。化合物投与は投与開始から合計３回とした。感染１日後から２日後の夜間１２時間にかけて、感染ハムスター（Ｉｎｄｅｘ）１匹とウイルスを接種しない非感染ハムスター１匹（Ｃｏｎｔａｃｔ）を、同一ケージ内において、直接接触できないように別のステンレスケージに入れて２ｃｍ離した状態で同居させた。同居終了後は個別飼育した。同居開始４日後（同居解除３日後）の非感染ハムスター（Ｃｏｔａｃｔ）から鼻腔洗浄液及び肺を回収した。鼻腔洗浄液は、イソフルラン麻酔下においてＤＰＢＳ４００μLにて回収し、遠心後の上清を回収した。肺は５ｍＬのＤＰＢＳを添加、ホモジナイズし、遠心後の上清を回収した。各群ｎ＝６で実施した。
・鼻腔洗浄液及び肺ホモジナイズ上清中ウイルス力価の測定
鼻腔洗浄液若しくは肺ホモジネート上清を培地（ＭＥＭ、２％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）にて１０倍希釈系列を作製後、予め９６ウェルプレートに培養したＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞（ＪＣＲＢ１８１９、１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）へ接種した。ＣＯ２インキュベーターで４日間培養後、Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ（ＣＰＥ）を観察し、鼻腔洗浄液若しくは肺ホモジネート上清中に含まれるウイルス力価を算出した。
＜材料と方法＞
・化合物
本発明に係る化合物Ｉ－１を、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）および０．５ｗ／ｖ％ ポリ（１－ビニルピロリドン－ｃｏ－酢酸ビニル）（ＰＶＰＶＡ）含有ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）（ＤＭＡ：０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ含有ＰＥＧ４００＝１：９）を用いて、被験試料とした。投与容量は、２．５ｍＬ／ｋｇとした。
・ウイルス
国立感染症研究所にて分離されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ１１－９２７／２０２１を用いた。
・ハムスター経鼻感染、投薬、同居、鼻腔洗浄液及び肺回収
特定病原体不在の６週齢の雄性シリアンハムスター（Ｊａｐａｎ ＳＬＣ，Ｉｎｃ．）を本研究において使用した。ウイルス接種の際、０．０７ｍｇ／ｍＬの塩酸メデトミジン、６．９８ｍｇ／ｍＬのアルファキサロン、１．１６ｍｇ／ｍＬの酒石酸ブトルファノールを含む麻酔液を３ｍＬ／ｋｇで皮下投与によってハムスターを麻酔し、１００μＬのｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ１１－９２７／２０２１（１．００×１０３ＴＣＩＤ５０）を経鼻接種した。感染ハムスター（Ｉｎｄｅｘ）にウイルス接種８時間後を開始点として、化合物Ｉ－１を０．１、１、１０ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回経口投与した。対照の感染ハムスター（Ｉｎｄｅｘ）には、ＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００を１日２回経口投与した。化合物投与は投与開始から合計３回とした。感染１日後から２日後の夜間１２時間にかけて、感染ハムスター（Ｉｎｄｅｘ）１匹とウイルスを接種しない非感染ハムスター１匹（Ｃｏｎｔａｃｔ）を、同一ケージ内において、直接接触できないように別のステンレスケージに入れて２ｃｍ離した状態で同居させた。同居終了後は個別飼育した。同居開始４日後（同居解除３日後）の非感染ハムスター（Ｃｏｔａｃｔ）から鼻腔洗浄液及び肺を回収した。鼻腔洗浄液は、イソフルラン麻酔下においてＤＰＢＳ４００μLにて回収し、遠心後の上清を回収した。肺は５ｍＬのＤＰＢＳを添加、ホモジナイズし、遠心後の上清を回収した。各群ｎ＝６で実施した。
・鼻腔洗浄液及び肺ホモジナイズ上清中ウイルス力価の測定
鼻腔洗浄液若しくは肺ホモジネート上清を培地（ＭＥＭ、２％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）にて１０倍希釈系列を作製後、予め９６ウェルプレートに培養したＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞（ＪＣＲＢ１８１９、１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）へ接種した。ＣＯ２インキュベーターで４日間培養後、Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ（ＣＰＥ）を観察し、鼻腔洗浄液若しくは肺ホモジネート上清中に含まれるウイルス力価を算出した。
【0142】
本発明化合物を本質的に上記のとおり試験した。結果を以下に示す。
感染ハムスター（Ｉｎｄｅｘ）との同居開始４日後（同居解除３日後）の非感染ハムスター（Ｃｏｎｔａｃｔ）の鼻腔洗浄液あるいは肺ホモジナイズ上清中ウイルス力価が検出限界（１．８－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）以上となった個体は、ＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００投与群では６／６例、化合物Ｉ－１ ０．１ｍｇ／ｋｇ投与群では６／６例、化合物Ｉ－１ １ｍｇ／ｋｇ投与群では０／６例、化合物Ｉ－１ １０ｍｇ／ｋｇ投与群では０／６例、となり、用量依存的な伝播抑制効果を示した（図１６）。これらの結果から、化合物Ｉ－１を感染ハムスター（Ｉｎｄｅｘ）に感染後に投与することにより、非感染ハムスター（Ｃｏｎｔａｃｔ）へのウイルス伝播を抑制する効果があることが示された。
感染ハムスター（Ｉｎｄｅｘ）との同居開始４日後（同居解除３日後）の非感染ハムスター（Ｃｏｎｔａｃｔ）の鼻腔洗浄液あるいは肺ホモジナイズ上清中ウイルス力価が検出限界（１．８－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）以上となった個体は、ＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００投与群では６／６例、化合物Ｉ－１ ０．１ｍｇ／ｋｇ投与群では６／６例、化合物Ｉ－１ １ｍｇ／ｋｇ投与群では０／６例、化合物Ｉ－１ １０ｍｇ／ｋｇ投与群では０／６例、となり、用量依存的な伝播抑制効果を示した（図１６）。これらの結果から、化合物Ｉ－１を感染ハムスター（Ｉｎｄｅｘ）に感染後に投与することにより、非感染ハムスター（Ｃｏｎｔａｃｔ）へのウイルス伝播を抑制する効果があることが示された。
【0143】
試験例１５：化合物Ｉ－１の非感染動物への予防的投与によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染動物からのウイルス伝播予防試験
＜材料と方法＞
・化合物
化合物Ｉ－１を、０．５％メチルセルロース（０．５％ＭＣ）溶液を用いて被験試料とした。投与容量は、５ｍＬ／ｋｇとした。
・ウイルス
国立感染症研究所にて分離されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ１１－９２７／２０２１（Ｄｅｌｔａ）を用いた。
・ハムスター経鼻感染、投薬、同居、鼻腔洗浄液及び肺回収
特定病原体不在の６週齢の雄性シリアンハムスター（Ｊａｐａｎ ＳＬＣ，Ｉｎｃ．）を本研究において使用した。ウイルス接種の際、０．０７ｍｇ／ｍＬの塩酸メデトミジン、６．９８ｍｇ／ｍＬのアルファキサロン、１．１６ｍｇ／ｍＬの酒石酸ブトルファノールを含む麻酔液を３ｍＬ／ｋｇで皮下投与によってハムスターを麻酔し、１００μＬのｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ１１－９２７／２０２１（１．００×１０３ＴＣＩＤ５０）を経鼻接種した。非感染ハムスター（Ｃｏｎｔａｃｔ）に化合物Ｉ－１を３、１０、３０、９０ｍｇ／ｋｇの用量で同居１２時間前に単回皮下投与した。対照の非感染ハムスター（Ｃｏｎｔａｃｔ）には、０．５％ＭＣを単回皮下投与した。感染ハムスター（Ｉｎｄｅｘ）への感染１日後から２日後の夜間１２時間にかけて、感染ハムスター（Ｉｎｄｅｘ）１匹と化合物を投与した非感染ハムスター１匹（Ｃｏｎｔａｃｔ）を、同一ケージ内において、直接接触できないように別のステンレスケージに入れて２ｃｍ離した状態で同居させた。同居終了後は個別飼育した。同居開始４日後（同居解除３日後）の非感染ハムスター（ｃｏｎｔａｃｔ）から鼻腔洗浄液及び肺を回収した。鼻腔洗浄液は、イソフルラン麻酔下においてＤＰＢＳ４００μLにて回収し、遠心後の上清を回収した。肺は３ｍＬのＤＰＢＳを添加、ホモジナイズし、遠心後の上清を回収し、ＤＰＢＳで２倍希釈した。各群ｎ＝６で実施した。
・鼻腔洗浄液及び肺ホモジナイズ上清中ウイルス力価の測定
鼻腔洗浄液若しくは肺ホモジネート上清を培地（ＭＥＭ、２％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）にて１０倍希釈系列を作製後、予め９６ウェルプレートに培養したＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞（ＪＣＲＢ１８１９、１．５０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）へ接種した。ＣＯ２インキュベーターで４日間培養後、Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ（ＣＰＥ）を観察し、鼻腔洗浄液若しくは肺ホモジネート上清中に含まれるウイルス力価を算出した。
＜材料と方法＞
・化合物
化合物Ｉ－１を、０．５％メチルセルロース（０．５％ＭＣ）溶液を用いて被験試料とした。投与容量は、５ｍＬ／ｋｇとした。
・ウイルス
国立感染症研究所にて分離されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ１１－９２７／２０２１（Ｄｅｌｔａ）を用いた。
・ハムスター経鼻感染、投薬、同居、鼻腔洗浄液及び肺回収
特定病原体不在の６週齢の雄性シリアンハムスター（Ｊａｐａｎ ＳＬＣ，Ｉｎｃ．）を本研究において使用した。ウイルス接種の際、０．０７ｍｇ／ｍＬの塩酸メデトミジン、６．９８ｍｇ／ｍＬのアルファキサロン、１．１６ｍｇ／ｍＬの酒石酸ブトルファノールを含む麻酔液を３ｍＬ／ｋｇで皮下投与によってハムスターを麻酔し、１００μＬのｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ１１－９２７／２０２１（１．００×１０３ＴＣＩＤ５０）を経鼻接種した。非感染ハムスター（Ｃｏｎｔａｃｔ）に化合物Ｉ－１を３、１０、３０、９０ｍｇ／ｋｇの用量で同居１２時間前に単回皮下投与した。対照の非感染ハムスター（Ｃｏｎｔａｃｔ）には、０．５％ＭＣを単回皮下投与した。感染ハムスター（Ｉｎｄｅｘ）への感染１日後から２日後の夜間１２時間にかけて、感染ハムスター（Ｉｎｄｅｘ）１匹と化合物を投与した非感染ハムスター１匹（Ｃｏｎｔａｃｔ）を、同一ケージ内において、直接接触できないように別のステンレスケージに入れて２ｃｍ離した状態で同居させた。同居終了後は個別飼育した。同居開始４日後（同居解除３日後）の非感染ハムスター（ｃｏｎｔａｃｔ）から鼻腔洗浄液及び肺を回収した。鼻腔洗浄液は、イソフルラン麻酔下においてＤＰＢＳ４００μLにて回収し、遠心後の上清を回収した。肺は３ｍＬのＤＰＢＳを添加、ホモジナイズし、遠心後の上清を回収し、ＤＰＢＳで２倍希釈した。各群ｎ＝６で実施した。
・鼻腔洗浄液及び肺ホモジナイズ上清中ウイルス力価の測定
鼻腔洗浄液若しくは肺ホモジネート上清を培地（ＭＥＭ、２％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）にて１０倍希釈系列を作製後、予め９６ウェルプレートに培養したＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞（ＪＣＲＢ１８１９、１．５０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）へ接種した。ＣＯ２インキュベーターで４日間培養後、Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ（ＣＰＥ）を観察し、鼻腔洗浄液若しくは肺ホモジネート上清中に含まれるウイルス力価を算出した。
【0144】
本発明化合物を本質的に上記のとおり試験した。結果を以下に示す。
感染ハムスター（Ｉｎｄｅｘ）との同居開始４日後（同居解除３日後）の化合物を投与した非感染ハムスター（Ｃｏｎｔａｃｔ）の鼻腔洗浄液あるいは肺ホモジナイズ上清中ウイルス力価が検出限界（１．８－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）以上となった個体は、０．５％ＭＣ投与群では６例／６例、化合物Ｉ－１ ３ｍｇ／ｋｇ投与群では５／６例、化合物Ｉ－１ １０ｍｇ／ｋｇ投与群では６／６例、化合物Ｉ－１ ３０ｍｇ／ｋｇ投与群では３／６例、化合物Ｉ－１ ９０ｍｇ／ｋｇ投与群では０／６例となり、用量依存的な感染予防効果を示した（図１７）。これらの結果から、化合物Ｉ－１を予防的に投与することにより、感染ハムスター（Ｉｎｄｅｘ）からのウイルス伝播を予防する効果があることが示唆された。
感染ハムスター（Ｉｎｄｅｘ）との同居開始４日後（同居解除３日後）の化合物を投与した非感染ハムスター（Ｃｏｎｔａｃｔ）の鼻腔洗浄液あるいは肺ホモジナイズ上清中ウイルス力価が検出限界（１．８－ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）以上となった個体は、０．５％ＭＣ投与群では６例／６例、化合物Ｉ－１ ３ｍｇ／ｋｇ投与群では５／６例、化合物Ｉ－１ １０ｍｇ／ｋｇ投与群では６／６例、化合物Ｉ－１ ３０ｍｇ／ｋｇ投与群では３／６例、化合物Ｉ－１ ９０ｍｇ／ｋｇ投与群では０／６例となり、用量依存的な感染予防効果を示した（図１７）。これらの結果から、化合物Ｉ－１を予防的に投与することにより、感染ハムスター（Ｉｎｄｅｘ）からのウイルス伝播を予防する効果があることが示唆された。
【0145】
試験例１６：化合物Ｉ－１の遅延投与によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染加齢ハムスターの致死、体重減少抑制試験
＜材料と方法＞
・化合物
本発明に係る化合物Ｉ－１を、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）および０．５ｗ／ｖ％ ポリ（１－ビニルピロリドン－ｃｏ－酢酸ビニル）（ＰＶＰＶＡ）含有ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）（ＤＭＡ：０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ含有ＰＥＧ４００＝１：９）を用いて、被験試料とした。投与容量は、１．２５ｍＬ／ｋｇとした。
・ウイルス
国立感染症研究所にて分離されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ１１－９２７／２０２１を用いた。
・ハムスター経鼻感染、投薬、同居、鼻腔洗浄液及び肺回収
特定病原体不在の１１カ月齢（加齢）の雄性シリアンハムスター（Ｊａｐａｎ ＳＬＣ，Ｉｎｃ．）を本研究において使用した。ウイルス接種の際、０．０７ｍｇ／ｍＬの塩酸メデトミジン、６．９８ｍｇ／ｍＬのアルファキサロン、１．１６ｍｇ／ｍＬの酒石酸ブトルファノールを含む麻酔液を３ｍＬ／ｋｇで皮下投与によってハムスターを麻酔し、１００μＬのｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ１１－９２７／２０２１（１．００×１０４ＴＣＩＤ５０）を経鼻接種した。ウイルス接種１日後を開始点として、化合物Ｉ－１を０．１、１、１０ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回経口投与した。対照の感染ハムスターには、ＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００を１日２回経口投与した。化合物投与は投与開始から５日間とした。体重を１日１回モニタリングし、生存率の評価においては、感染直前の体重を基準として８０％未満となった場合には死亡と見做した。各群ｎ＝６で実施した。
＜材料と方法＞
・化合物
本発明に係る化合物Ｉ－１を、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）および０．５ｗ／ｖ％ ポリ（１－ビニルピロリドン－ｃｏ－酢酸ビニル）（ＰＶＰＶＡ）含有ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）（ＤＭＡ：０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ含有ＰＥＧ４００＝１：９）を用いて、被験試料とした。投与容量は、１．２５ｍＬ／ｋｇとした。
・ウイルス
国立感染症研究所にて分離されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ１１－９２７／２０２１を用いた。
・ハムスター経鼻感染、投薬、同居、鼻腔洗浄液及び肺回収
特定病原体不在の１１カ月齢（加齢）の雄性シリアンハムスター（Ｊａｐａｎ ＳＬＣ，Ｉｎｃ．）を本研究において使用した。ウイルス接種の際、０．０７ｍｇ／ｍＬの塩酸メデトミジン、６．９８ｍｇ／ｍＬのアルファキサロン、１．１６ｍｇ／ｍＬの酒石酸ブトルファノールを含む麻酔液を３ｍＬ／ｋｇで皮下投与によってハムスターを麻酔し、１００μＬのｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ１１－９２７／２０２１（１．００×１０４ＴＣＩＤ５０）を経鼻接種した。ウイルス接種１日後を開始点として、化合物Ｉ－１を０．１、１、１０ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回経口投与した。対照の感染ハムスターには、ＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００を１日２回経口投与した。化合物投与は投与開始から５日間とした。体重を１日１回モニタリングし、生存率の評価においては、感染直前の体重を基準として８０％未満となった場合には死亡と見做した。各群ｎ＝６で実施した。
【0146】
本発明化合物を本質的に上記のとおり試験した。結果を以下に示す。
感染ハムスターのＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００投与群では感染８日後に２匹が致死となり、生存率は６６．７％を示した。このとき化合物Ｉ－１ １、１０ｍｇ／ｋｇ投与群では観察した感染１０日後まで全例が生存し、体重減少が抑制された（図１８および図１９）。
以上の結果から、加齢ハムスターにおいても、化合物Ｉ－１投与により致死および体重減少抑制効果があることが示唆された。
感染ハムスターのＤＭＡ／０．５ｗ／ｖ％ＰＶＰＶＡ ｉｎ ＰＥＧ４００投与群では感染８日後に２匹が致死となり、生存率は６６．７％を示した。このとき化合物Ｉ－１ １、１０ｍｇ／ｋｇ投与群では観察した感染１０日後まで全例が生存し、体重減少が抑制された（図１８および図１９）。
以上の結果から、加齢ハムスターにおいても、化合物Ｉ－１投与により致死および体重減少抑制効果があることが示唆された。
【0147】
げっ歯類においても加齢することにより、ヒトと同様、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体として知られているＡＣＥ２受容体の発現量が増加することが知られており（参考文献：Scientific Reports (2020)10:22401およびMolecular Therapy Methods & Clinical Development, Vol. 18, P1-6, 2020）、また感染源から身体を防御し、それらを排除する正常な免疫応答が低下するため、ウイルス感染により重症化しやすいことが想定される。上記に示す通り、加齢ハムスターを用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染モデルにおいて、化合物Ｉ－１の投与により、体重減少抑制効果および致死抑制効果が認められた。加齢ハムスターを用いた非臨床試験は、基礎疾患を有するハイリスク患者が重症化に至る過程を模した非臨床評価系の一つとして位置づけられるため、重症化リスクの高い患者に対する治療オプションとして、化合物Ｉ－１の有用性を支持する。
また、上記試験結果は、化合物Ｉ－１投与群においてウイルス感染による重症化が抑制されたことを示唆しており、化合物Ｉ－１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗ウイルス効果のみならず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の重症化抑制用医薬としての有用性を支持する。
また、上記試験結果は、化合物Ｉ－１投与群においてウイルス感染による重症化が抑制されたことを示唆しており、化合物Ｉ－１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗ウイルス効果のみならず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の重症化抑制用医薬としての有用性を支持する。
【0148】
試験例１７：ｉｎ ｖｉｔｒｏ併用効果確認試験
＜操作手順＞
・被験試料
化合物Ｉ－１と併用する被験試料としてエンシトレルビル フマル酸、ニルマトレルビル、レムデシビル、ＥＩＤＤ－１９３１、ソトロビマブ、チキサゲビマブ／シルガビマブを用いた。
・被験試料の希釈、分注
各被験試料をＤＭＳＯあるいはＤＰＢＳおよび培地（ＭＥＭ、２％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）で適度な濃度に希釈し、段階希釈系列を９６ウェルプレートに作製した。
・細胞およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の希釈、分注
Ａ５４９／ＡＣＥ２－ＴＭＰＲＳＳ２細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、ａ５４９－ｈａｃｅ２ｔｐｓａ、１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ１１－９２７／２０２１（１００ＴＣＩＤ５０／ｗｅｌｌ）を培地（ＭＥＭ、２％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）で混合し、被験試料が入ったウェルに分注した後、ＣＯ２インキュベーターで２日間培養した。
・ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０の分注および発光シグナルの測定
３日間培養したプレートを室温に戻した後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０を各ウェルに分注し、プレートミキサーで混和した。一定時間置いた後、プレートリーダーで発光シグナル（Ｌｕｍ）を測定した。
＜操作手順＞
・被験試料
化合物Ｉ－１と併用する被験試料としてエンシトレルビル フマル酸、ニルマトレルビル、レムデシビル、ＥＩＤＤ－１９３１、ソトロビマブ、チキサゲビマブ／シルガビマブを用いた。
・被験試料の希釈、分注
各被験試料をＤＭＳＯあるいはＤＰＢＳおよび培地（ＭＥＭ、２％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）で適度な濃度に希釈し、段階希釈系列を９６ウェルプレートに作製した。
・細胞およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の希釈、分注
Ａ５４９／ＡＣＥ２－ＴＭＰＲＳＳ２細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、ａ５４９－ｈａｃｅ２ｔｐｓａ、１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ１１－９２７／２０２１（１００ＴＣＩＤ５０／ｗｅｌｌ）を培地（ＭＥＭ、２％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン）で混合し、被験試料が入ったウェルに分注した後、ＣＯ２インキュベーターで２日間培養した。
・ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０の分注および発光シグナルの測定
３日間培養したプレートを室温に戻した後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０を各ウェルに分注し、プレートミキサーで混和した。一定時間置いた後、プレートリーダーで発光シグナル（Ｌｕｍ）を測定した。
【0149】
＜併用効果の解析＞
ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙＩＩによりＳｙｎｅｇｙ ｖｏｌｕｍｅ及びＡｎｔａｇｏｎｉｓｍ ｖｏｌｕｍｅを算出した。これらの数値は既報の論文（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９０，Ｖｏｌｕｍｅ １４，ｐ．１８１－２０６）等を参考に算出できる。
・併用効果の判定
併用効果は、ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙＩＩの９９％信頼度でのＳｙｎｅｇｙ ｖｏｌｕｍｅ及びＡｎｔａｇｏｎｉｓｍ ｖｏｌｕｍｅについて以下に示す基準で判定した。
ｓｙｎｅｒｇｙ ｖｏｌｕｍｅ ≦ ２５： ａｄｄｉｔｉｖｅ
２５ ＜ ｓｙｎｅｒｇｙ ｖｏｌｕｍｅ ≦ ５０： ｍｉｎｏｒ ｓｙｎｅｒｇｙ
５０ ＜ ｓｙｎｅｒｇｙ ｖｏｌｕｍｅ ≦ １００： ｍｏｄｅｒａｔｅ ｓｙｎｅｒｇｙ
１００ ＜ ｓｙｎｅｒｇｙ ｖｏｌｕｍｅ： ｓｔｒｏｎｇ ｓｙｎｅｒｇｙ
－２５ ≦ ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ ｖｏｌｕｍｅ： ａｄｄｉｔｉｖｅ
－５０ ≦ ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ ｖｏｌｕｍｅ ＜ －２５： ｍｉｎｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ
－１００ ≦ ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ ｖｏｌｕｍｅ ＜ －５０： ｍｏｄｅｒａｔｅ ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ
ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ ｖｏｌｕｍｅ ＜ －１００： ｓｔｒｏｎｇ ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ
ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙＩＩによりＳｙｎｅｇｙ ｖｏｌｕｍｅ及びＡｎｔａｇｏｎｉｓｍ ｖｏｌｕｍｅを算出した。これらの数値は既報の論文（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９０，Ｖｏｌｕｍｅ １４，ｐ．１８１－２０６）等を参考に算出できる。
・併用効果の判定
併用効果は、ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙＩＩの９９％信頼度でのＳｙｎｅｇｙ ｖｏｌｕｍｅ及びＡｎｔａｇｏｎｉｓｍ ｖｏｌｕｍｅについて以下に示す基準で判定した。
ｓｙｎｅｒｇｙ ｖｏｌｕｍｅ ≦ ２５： ａｄｄｉｔｉｖｅ
２５ ＜ ｓｙｎｅｒｇｙ ｖｏｌｕｍｅ ≦ ５０： ｍｉｎｏｒ ｓｙｎｅｒｇｙ
５０ ＜ ｓｙｎｅｒｇｙ ｖｏｌｕｍｅ ≦ １００： ｍｏｄｅｒａｔｅ ｓｙｎｅｒｇｙ
１００ ＜ ｓｙｎｅｒｇｙ ｖｏｌｕｍｅ： ｓｔｒｏｎｇ ｓｙｎｅｒｇｙ
－２５ ≦ ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ ｖｏｌｕｍｅ： ａｄｄｉｔｉｖｅ
－５０ ≦ ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ ｖｏｌｕｍｅ ＜ －２５： ｍｉｎｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ
－１００ ≦ ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ ｖｏｌｕｍｅ ＜ －５０： ｍｏｄｅｒａｔｅ ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ
ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ ｖｏｌｕｍｅ ＜ －１００： ｓｔｒｏｎｇ ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ
【0150】
本質的に上記のとおり試験した。結果を以下の表に示す。
【0151】
【表9】
【0152】
以上の結果から、化合物Ｉ－１とＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤（ＥＩＤＤ－１９３１、およびレムデシビル）、３ＣＬプロテアーゼ阻害剤（エンシトレルビル、ニルマトレルビル）、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２モノクローナル抗体（ソトロビマブ、チキサゲビマブ／シルガビマブ）の組み合わせにより、拮抗的な効果を示すことなく、相加から相乗的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２増殖抑制効果を示した。
【0153】
以下に示す製剤例は例示にすぎないものであり、発明の範囲を何ら限定することを意図するものではない。
本発明に係る化合物は、任意の従来の経路により、特に、経腸、例えば、経口で、例えば、錠剤またはカプセル剤の形態で、または非経口で、例えば注射液剤または懸濁剤の形態で、局所で、例えば、ローション剤、ゲル剤、軟膏剤またはクリーム剤の形態で、または経鼻形態または座剤形態で医薬組成物として投与することができる。少なくとも１種の薬学的に許容される担体または希釈剤と一緒にして、遊離形態または薬学的に許容される塩の形態の本発明の化合物を含む医薬組成物は、従来の方法で、混合、造粒またはコーティング法によって製造することができる。例えば、経口用組成物としては、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤等および有効成分等を含有する錠剤、顆粒剤、カプセル剤とすることができる。また、注射用組成物としては、溶液剤または懸濁剤とすることができ、滅菌されていてもよく、また、保存剤、安定化剤、緩衝化剤等を含有してもよい。
本発明に係る化合物は、任意の従来の経路により、特に、経腸、例えば、経口で、例えば、錠剤またはカプセル剤の形態で、または非経口で、例えば注射液剤または懸濁剤の形態で、局所で、例えば、ローション剤、ゲル剤、軟膏剤またはクリーム剤の形態で、または経鼻形態または座剤形態で医薬組成物として投与することができる。少なくとも１種の薬学的に許容される担体または希釈剤と一緒にして、遊離形態または薬学的に許容される塩の形態の本発明の化合物を含む医薬組成物は、従来の方法で、混合、造粒またはコーティング法によって製造することができる。例えば、経口用組成物としては、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤等および有効成分等を含有する錠剤、顆粒剤、カプセル剤とすることができる。また、注射用組成物としては、溶液剤または懸濁剤とすることができ、滅菌されていてもよく、また、保存剤、安定化剤、緩衝化剤等を含有してもよい。
【産業上の利用可能性】
【0154】
本発明に係る化合物は、コロナウイルス３ＣＬプロテアーゼに対する阻害活性を有し、本発明に係る化合物を含有する医薬組成物は、コロナウイルス感染症の治療剤および／または予防剤として有用である。
【要約】
本発明は、コロナウイルス増殖阻害活性を示す化合物を含有する医薬組成物を提供する。
式（Ｉ－１）：
で示される化合物またはその製薬上許容される塩、を含有する医薬組成物。
式（Ｉ－１）：
で示される化合物またはその製薬上許容される塩、を含有する医薬組成物。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【配列表】