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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-04-30
(45)【発行日】2025-05-12
(54)【発明の名称】核酸抗凝固剤に関連する組成物および方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/115 20100101AFI20250501BHJP
A61K 31/712 20060101ALI20250501BHJP
A61P 7/02 20060101ALI20250501BHJP
【ＦＩ】
C12N15/115 Z ZNA
A61K31/712
A61P7/02
【請求項の数】
18
(21)【出願番号】P 2021522450
(86)(22)【出願日】2019-10-25
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-07
(86)【国際出願番号】 US2019058133
(87)【国際公開番号】W WO2020086996
(87)【国際公開日】2020-04-30
【審査請求日】2022-10-20
(31)【優先権主張番号】62/750,900
(32)【優先日】2018-10-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】517366013
【氏名又は名称】ノース カロライナ ステート ユニバーシティ
【氏名又は名称原語表記】ＮＯＲＴＨ ＣＡＲＯＬＩＮＡ ＳＴＡＴＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】ラビーン，トム
(72)【発明者】
【氏名】クリッサナプラシット，アビーチャート
【審査官】小倉 梢
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１５－５２６０７５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１２－１００６３６（ＪＰ，Ａ）
【文献】Current Pharmaceutical Design，2016年，Vol. 22，p. 5163-5176
【文献】Nature Communications，2018年，Vol. 9:18，p. 1-10，DOI: 10.1038/s41467-017-02435-x
【文献】Nature Nanotechnology，Vol. 3，p. 418-422
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００ － １５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下を含む一本鎖核酸分子：少なくとも１つのＡ型二重らせん構造、および少なくとも１つのクロスオーバー領域；
少なくとも１つのキッシングループ領域；
および抗凝固活性を有する少なくとも１つの核酸アプタマー；
ここで、前記一本鎖核酸分子は、２’－フルオロ修飾を含む、修飾されたＲＮＡ分子である。
【請求項2】
少なくとも１つのテトラループ領域をさらに含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項3】
上記少なくとも１つのテトラループ領域が４－ヌクレオチドモチーフを含む、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項4】
上記少なくとも１つのキッシングループ領域が１８０°キッシングループ領域である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項5】
上記核酸分子が、抗凝固活性を有する１～４個のアプタマーを含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項6】
上記１～４個のアプタマーの各々がテトラループ領域を置換する、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項7】
上記核酸分子が、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＲＮＡ分子である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項8】
少なくとも１つの核酸アプタマーの抗凝固活性がトロンビン阻害を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項9】
少なくとも１つの核酸アプタマーの抗凝固活性が、第ＸＩＩａ因子、第ＸＩＩＩａ因子、第ＸＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、およびフォン・ヴィレブランド因子のうちの１つまたは複数の阻害を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項10】
上記少なくとも１つの核酸アプタマーが、抗トロンビンＲＮＡＲ９Ｄ－１４Ｔアプタマーまたはその誘導体を含む、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項11】
上記少なくとも１つの核酸アプタマーが、抗トロンビントグル－２５ｔＲＮＡアプタマーまたはその誘導体を含む、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項12】
上記核酸分子が、１００～６００のヌクレオチドを含むＲＮＡ分子である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項13】
上記核酸分子が、以下を含むＲＮＡ分子である、請求項１に記載の核酸分子：上記ＲＮＡ分子のテトラループ領域１を置換する、トロンビンのエキソサイト１に結合し得る核酸アプタマー；
および上記ＲＮＡ分子のテトラループ領域２を置換する、トロンビンのエキソサイト２に結合可能な核酸アプタマー。
【請求項14】
上記ＲＮＡ分子が、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１３に記載の核酸分子。
【請求項15】
上記核酸分子が、以下を含むＲＮＡ分子である、請求項１に記載の核酸分子：上記ＲＮＡ分子のテトラループ領域１を置換する、トロンビンのエキソサイト１に結合可能な核酸アプタマー；
および上記ＲＮＡ分子のテトラループ領域３を置換する、トロンビンのエキソサイト２に結合可能な核酸アプタマー。
【請求項16】
上記ＲＮＡ分子が、配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１５に記載の核酸分子。
【請求項17】
以下を含む抗凝固剤組成物：少なくとも１つのＡ型二重らせん構造、少なくとも１つのクロスオーバー領域、少なくとも１つのキッシングループ領域、および抗凝固活性を有する少なくとも１つの核酸アプタマーを含む、一本鎖核酸分子；
ならびに薬学的に許容される賦形剤、溶媒、担体、または希釈剤；
ここで、前記一本鎖核酸分子は、２’－フルオロ修飾を含む、修飾されたＲＮＡ分子である。
【請求項18】
前記核酸分子が、少なくとも１つのテトラループ領域をさらに含む、請求項１７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
〔関連出願の相互参照〕
本出願は２０１８年１０月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／７５０，９００号の優先権および利益を主張し、この仮特許出願は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は２０１８年１０月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／７５０，９００号の優先権および利益を主張し、この仮特許出願は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
〔政府資金〕
本発明は、米国科学財団（ＮＳＦ）によって授与された助成金ナンバー１５５９０７７、１６０３１７９、および１７０９０１０の下で政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明においてある種の権利を有する。
本発明は、米国科学財団（ＮＳＦ）によって授与された助成金ナンバー１５５９０７７、１６０３１７９、および１７０９０１０の下で政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明においてある種の権利を有する。
【0003】
〔電子的に提出された資料の参照による組み込み〕
参照によりその全体が本明細書に組み込まれるのは、本明細書と同時に提出され、以下のように同定されるコンピュータ読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸配列表である： Ｏｎｅ １０，１５６ Ｂｙｔｅ ＡＳＣＩＩ（Ｔｅｘｔ）ファイル、名称「３７０６０－６０１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」（２０１９年１０月２５日作成）。
参照によりその全体が本明細書に組み込まれるのは、本明細書と同時に提出され、以下のように同定されるコンピュータ読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸配列表である： Ｏｎｅ １０，１５６ Ｂｙｔｅ ＡＳＣＩＩ（Ｔｅｘｔ）ファイル、名称「３７０６０－６０１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」（２０１９年１０月２５日作成）。
【0004】
〔技術分野〕
本開示は、治療用アプタマーを有する核酸分子に関する組成物および方法を提供する。特に、本開示は、疾患および外科的介入に関する血液凝固の調節のための抗凝固活性を有する１つまたは複数のアプタマーを含む核酸分子、ならびに対応する核酸解毒剤を提供する。
本開示は、治療用アプタマーを有する核酸分子に関する組成物および方法を提供する。特に、本開示は、疾患および外科的介入に関する血液凝固の調節のための抗凝固活性を有する１つまたは複数のアプタマーを含む核酸分子、ならびに対応する核酸解毒剤を提供する。
【0005】
〔背景技術〕
凝固カスケードは、破裂した血管および細胞表面上に最終的にフィブリン凝塊を生成する一連の酵素反応を含む。抗凝固剤は、カスケード中の重要なプレーヤーをブロックすることによって凝固のプロセスを破壊する。抗凝固薬によるフィブリン凝塊形成の調節は、結果として、心臓、肺、および脳などの重要な器官における血栓症、つまり血栓の形成を回避し得る。血栓症の生命を脅かす影響には、脳卒中または一過性脳虚血発作、心臓発作、深部静脈血栓症、および肺塞栓症などがある。
凝固カスケードは、破裂した血管および細胞表面上に最終的にフィブリン凝塊を生成する一連の酵素反応を含む。抗凝固剤は、カスケード中の重要なプレーヤーをブロックすることによって凝固のプロセスを破壊する。抗凝固薬によるフィブリン凝塊形成の調節は、結果として、心臓、肺、および脳などの重要な器官における血栓症、つまり血栓の形成を回避し得る。血栓症の生命を脅かす影響には、脳卒中または一過性脳虚血発作、心臓発作、深部静脈血栓症、および肺塞栓症などがある。
【0006】
最も一般的に処方される抗凝固剤はワルファリンであり、これは殺げっ歯類剤としてしばしば使用される小分子である。ワルファリンはビタミンＫ拮抗薬であり、血液凝固第ＩＩ、第ＶＩＩ、第ＩＸ、および第Ｘ因子の合成を阻害するほか、内因性抗凝固タンパク質ＣおよびＳの合成を阻害する。ビタミンＫの変動に対する身体の感受性には、その濃度を厳重かつ適時にモニタリングし、それに応じて投与量を調節する必要がある。その他の抗凝固薬には、ヘパリン、第Ｘａ因子阻害剤、直接トロンビン阻害剤、および線維素溶解薬などがある。例えば手術中に抗凝固剤の投与量が高すぎる場合、過剰な抗凝固を引き起こすことなく凝固を効果的に治療する投与のための狭い治療ウィンドウが、現在の抗凝固方法の全てにわたって一致している。残念ながら、投与をさらに媒介し、細胞毒性作用と闘い得る化学ベースの抗凝固剤の解毒剤はない。
【0007】
〔発明の概要〕
本開示の実施形態は、少なくとも１つのＡ型二重らせん構造および少なくとも１つのクロスオーバー領域、少なくとも１つのキッシングループ領域、ならびに抗凝固活性を有する少なくとも１つの核酸アプタマーを含む一本鎖核酸分子を提供する。
本開示の実施形態は、少なくとも１つのＡ型二重らせん構造および少なくとも１つのクロスオーバー領域、少なくとも１つのキッシングループ領域、ならびに抗凝固活性を有する少なくとも１つの核酸アプタマーを含む一本鎖核酸分子を提供する。
【0008】
いくつかの実施形態では、核酸分子が少なくとも１つのテトラループ領域を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子がＲＮＡ分子、または２’修飾を有する少なくとも１つのヌクレオシドを含むＲＮＡ分子である。
【0009】
いくつかの実施形態では、一本鎖核酸分子が４－ヌクレオチドモチーフを含む少なくとも１つのテトラループ領域を含む。いくつかの実施形態では、一本鎖核酸分子が、各々が４－ヌクレオチドモチーフを含む１～６個のテトラループ領域を含む。いくつかの実施形態では、一本鎖核酸分子が１８０°キッシングループ領域である少なくとも１つのキッシングループ領域を含む。いくつかの実施形態では、一本鎖核酸分子が１つの１８０°キッシングループ領域を含む。
【0010】
いくつかの実施形態では、一本鎖核酸分子が、抗凝固活性を有する１～４つのアプタマーを含む。これらの実施形態によれば、１～４個のアプタマーの各々は、テトラループ領域を置換する。
【0011】
いくつかの実施形態では、核酸分子が、配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＲＮＡ分子である。
【0012】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸アプタマーの抗凝固活性が、トロンビン阻害を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸アプタマーの抗凝固活性が第ＸＩＩａ因子、第ＸＩＩＩａ因子、第ＸＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、およびフォン・ヴィレブランド因子のうちの１つまたは複数の阻害を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸アプタマーが、抗トロンビンＲＮＡＲ９Ｄ－１４Ｔアプタマーまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸アプタマーが抗トロンビントグル－２５ｔＲＮＡアプタマーまたはその誘導体を含む。
【0013】
いくつかの実施形態では、核酸分子が、約１００～約６００個のヌクレオチドを含むＲＮＡ分子である。
【0014】
いくつかの実施形態では、一本鎖核酸分子が、ＲＮＡ分子のテトラループ領域１を置換する、トロンビンのエキソサイト１に結合可能な核酸アプタマー、およびＲＮＡ分子のテトラループ領域２を置換する、トロンビンのエキソサイト２に結合可能な核酸アプタマーを含むＲＮＡ分子（２ＨＯ－ＲＮＡ－１２ＮＮまたは２ＨＦ－ＲＮＡ－１２ＮＮ）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
【0015】
いくつかの実施形態では、一本鎖核酸分子が、ＲＮＡ分子のテトラループ領域１を置換する、トロンビンのエキソサイト１に結合可能な核酸アプタマー、およびＲＮＡ分子のテトラループ領域３を置換する、トロンビンのエキソサイト２に結合可能な核酸アプタマーを含むＲＮＡ分子（２ＨＯ－ＲＮＡ－１Ｎ２Ｎまたは２ＨＦ－ＲＮＡ－１Ｎ２Ｎ）である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ分子は、配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
【0016】
いくつかの実施形態では、一本鎖核酸分子が、ＲＮＡ分子のテトラループ領域１を置換する、トロンビンのエキソサイト２に結合可能な核酸アプタマー、およびＲＮＡ分子のテトラループ領域４を置換する、トロンビンのエキソサイト１に結合可能な核酸アプタマーを含むＲＮＡ分子（２ＨＯ－ＲＮＡ－２ＮＮ１または２ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１）である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ分子は、配列番号４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
【0017】
いくつかの実施形態では、一本鎖核酸分子が、一本鎖ＲＮＡリンカーの一端に連結された、トロンビンのエキソサイト２に結合可能な核酸アプタマー、および一本鎖ＲＮＡリンカーの他端に連結された、トロンビンのエキソサイト１に結合可能な核酸アプタマーを含むＲＮＡ分子（Ｆｓｓ１２）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号５と少なくとも８０％の配列同一性を有する。
【0018】
いくつかの実施形態では、一本鎖核酸分子が、それぞれＲＮＡ分子のテトラループ領域１および２を置換する、トロンビンのエキソサイト２に結合可能な２つの核酸アプタマー、およびそれぞれＲＮＡ分子のテトラループ領域３および４を置換する、トロンビンのエキソサイト１に結合可能な２つの核酸アプタマーを含むＲＮＡ分子（２Ｈ－２２１１）である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ分子は、配列番号６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
【0019】
いくつかの実施形態では、一本鎖核酸分子が、ＲＮＡ分子のテトラループ領域１を置換する、トロンビンのエキソサイト２に結合可能な核酸アプタマー、ＲＮＡ分子のテトラループ領域４を置換する、トロンビンのエキソサイト１に結合可能な核酸アプタマー、およびトロンビンのエキソサイト１に結合可能な核酸アプタマーからトロンビンのエキソサイト２に結合可能な核酸アプタマーを分離するＡ型二重らせん構造を含むＲＮＡ分子（３Ｈ－２ＮＮ１）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
【0020】
いくつかの実施形態では、一本鎖核酸分子が、ＲＮＡ分子のテトラループ領域１を置換する、トロンビンのエキソサイト２に結合可能な核酸アプタマー、ＲＮＡ分子のテトラループ領域４を置換する、トロンビンのエキソサイト１に結合可能な核酸アプタマー、およびトロンビンのエキソサイト１に結合可能な核酸アプタマーからトロンビンのエキソサイト２に結合可能な核酸アプタマーを分離する２つのＡ型二重らせん構造を含むＲＮＡ分子（４Ｈ－２ＮＮ１）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号８に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
【0021】
いくつかの実施形態では、トロンビンのエキソサイト１に結合可能な核酸アプタマーがＲＮＡＲ９Ｄ－１４Ｔアプタマーまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、トロンビンのエキソサイト２に結合可能な核酸アプタマーがトグル－２５ｔＲＮＡアプタマーまたはその誘導体である。
【0022】
本開示の実施形態はまた、本明細書に記載の一本鎖核酸分子のいずれかをコードするＤＮＡ分子を含む。
【0023】
本開示の実施形態はまた、抗凝固剤組成物を含む。これらの実施形態によれば、組成物は、少なくとも１つのＡ型二重らせん構造、少なくとも１つのクロスオーバー領域、少なくとも１つのテトラループ領域、少なくとも１つのキッシングループ領域、および抗凝固活性を有する少なくとも１つの核酸アプタマーを含む一本鎖核酸分子、ならびに薬学的に許容される賦形剤、溶媒、担体、または希釈剤を含む。
【0024】
本開示の実施形態はまた、凝固を調節するためのシステムを含む。これらの実施形態によれば、システムは、本明細書に記載される一本鎖核酸分子のいずれかと、本明細書に記載される一本鎖核酸分子のいずれかの少なくとも一部に結合可能であり、これらの一本鎖核酸分子の抗凝固活性を妨げる少なくとも１つの一本鎖核酸解毒剤とを含む。
【0025】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸解毒剤が、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、Ｏ－メチルＲＮＡ分子、フルオロ修飾ＲＮＡ分子、ＰＮＡ分子、ＬＮＡ分子、またはそれらの組み合わせ、もしくはそれらの誘導体である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸解毒剤が逆相補的様式で、本明細書中に記載される一本鎖核酸分子のいずれかの少なくとも一部に結合する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸解毒剤が本明細書に記載される一本鎖核酸分子のいずれかの少なくとも１つの核酸アプタマーに結合し、抗凝固活性を妨げる。
【0026】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、凝固カスケードおよび抗凝固薬によって標的化される対応する酵素の概略図を含む。トロンビンはフィブリノーゲン、上流の凝固因子、および血小板受容体の切断を触媒することにより、凝固において重要な役割を果たす。トロンビンの触媒活性部位およびエキソサイトと呼ばれる２つの拡張表面は高分子リガンド結合に関与し、凝固を防ぐために化学および生物学ベースの分子を使用してブロックされ得る。凝固カスケードにおけるトロンビン活性の制御は、治療的、外科的、および臨床的利益をもたらす。
図１は、凝固カスケードおよび抗凝固薬によって標的化される対応する酵素の概略図を含む。トロンビンはフィブリノーゲン、上流の凝固因子、および血小板受容体の切断を触媒することにより、凝固において重要な役割を果たす。トロンビンの触媒活性部位およびエキソサイトと呼ばれる２つの拡張表面は高分子リガンド結合に関与し、凝固を防ぐために化学および生物学ベースの分子を使用してブロックされ得る。凝固カスケードにおけるトロンビン活性の制御は、治療的、外科的、および臨床的利益をもたらす。
【0027】
図２Ａ～２Ｅは、抗凝固活性を有する核酸塩基アプタマーの代表的な描写を含む。図２Ａは、エキソサイト１およびエキソサイト２の位置を含むトロンビンの三次構造を含む。図２Ｂ～２Ｅは、トロンビン活性の特異的阻害のために抗凝固剤として使用されるＤＮＡおよびＲＮＡアプタマーの例を含む。ＲＮＡＲ９Ｄ－１４Ｔ（図２Ｂ）およびトグル－２５ｔ（図２Ｃ）ＲＮＡアプタマーは、それぞれトロンビンのエキソサイト１およびエキソサイト２に結合する。ＤＮＡアプタマーＮＵ１７２（図２Ｄ）およびＨＤ２２（図２Ｅ）は、それぞれトロンビンのエキソサイト１およびエキソサイト２に結合する。
【0028】
図３は、トロンビンのエキソサイト２に結合したトグル－２５ｔＲＮＡアプタマーの結晶構造を示す。
【0029】
図４は、トロンビンに結合したＲＮＡオリガミの例示的な画像である（縮尺通りではない）。ＲＮＡオリガミ構造は、二重らせん構造を含む。
【0030】
【0031】
【0032】
【0033】
図８Ａ～８Ｂはクロスオーバーを形成するように整列された後の二重らせんの代表的な画像を含む（図８Ａ；上側のらせんはらせん１であり、下側のらせんはらせん２である）。クロスオーバーが位置するリン酸原子および骨格および側（糖／塩基）は、それぞれ赤色および黄色で特定される。図８Ｂは、らせんに整列した全てのモチーフを有するＲＮＡ構造の代表的な側面図を含む。左上のモチーフはＲＮＡトロンビンアプタマーである。
【0034】
図９は、ＲＮＡアプタマーを含む二重らせんＲＮＡオリガミ分子のライゲーション構造の３Ｄ描写である。
【0035】
図１０は、２Ｄモデルからテキストファイル（下側）に転写されるＲＮＡオリガミ分子（上側）の代表的な図である。
【0036】
図１１Ａ～１１Ｂは、ＲＮＡオリガミ配列の代表的な描写を含む。図１１Ａはトレーススクリプトを通過した後のテキストファイルの代表的な描写を含み、赤いボックスはＮＵＰＡＣＫに提示され得る出力されたコードを強調し、次いで、ＮＵＰＡＣＫはＲＮＡ配列を提供する。図１１ＢはＮＵＰＡＣＫによって出力されるＲＮＡ配列の代表的な描写を含む；ＮＥＤもまた提供される（一般に、最も低いＮＥＤを有する配列が分析のために選択される）。
【0037】
図１２Ａ～１２Ｂは、ＲＮＡアプタマーを含まない二重らせんＲＮＡオリガミ（２ＨＯ－ＲＮＡ－ＮＮＮＮ）の３Ｄ図（図１２Ａ）および２Ｄリボンモデル（図１２Ｂ）の代表的な描写を含む。数字は、ＲＮＡオリガミ分子上のＲＮＡアプタマーを含み得る４つの位置を表す。テトラループは黄色のボックスで表され、キッシングループは緑色のボックスで示される。
【0038】
図１３Ａ～１３Ｄは、２つのアプタマーを含むＲＮＡオリガミの４つの設計の代表的な２Ｄモデルを含む。図１３Ａは２ＨＯ－ＲＮＡ－ＮＮＮＮ（配列番号１）を示し、図１３Ｂは２ＨＯ－ＲＮＡ－１２ＮＮ（配列番号２）を示し、図１３Ｃは２ＨＯ－ＲＮＡ－１Ｎ２Ｎ（配列番号３）を示し、および図１３Ｄは２ＨＯ－ＲＮＡ－２ＮＮ１（配列番号４）を示す。
【0039】
図１４Ａ～１４Ｃは、２ＨＯ－ＲＮＡ－ＮＮＮＮの代表的な２Ｄモデル（Ａ）、およびｍｆｏｌｄ（Ｂ）およびＮＵＰＡＣＫ（Ｃ）によって分析されたＲＮＡ折りたたみの計算シミュレーションを含む。テトラループおよびキッシングループは、それぞれ黄色および緑色のボックスで示されている。
【0040】
図１５Ａ～１５Ｃは、２ＨＯ－ＲＮＡ－１２ＮＮの代表的な２Ｄモデル（Ａ）、およびｍｆｏｌｄ（Ｂ）およびＮＵＰＡＣＫ（Ｃ）によって分析されたＲＮＡ折りたたみの計算シミュレーションを含む。テトラループおよびキッシングループは、それぞれ黄色および緑色のボックスで示されている。エキソサイト１および２結合ＲＮＡアプタマーは、それぞれ紫色および青色の長方形で表される。
【0041】
図１６Ａ～１６Ｃは、２ＨＯ－ＲＮＡ－１Ｎ２Ｎの代表的な２Ｄモデル（Ａ）、およびｍｆｏｌｄ（Ｂ）およびＮＵＰＡＣＫ（Ｃ）によって分析されたＲＮＡ折りたたみの計算シミュレーションを含む。テトラループおよびキッシングループは、それぞれ黄色および緑色のボックスで示されている。エキソサイト１および２結合ＲＮＡアプタマーは、それぞれ紫および青色の長方形で表される。
【0042】
図１７Ａ～１７Ｃは、２ＨＯ－ＲＮＡ－２ＮＮ１の代表的な２Ｄモデル（Ａ）、およびｍｆｏｌｄ（Ｂ）およびＮＵＰＡＣＫ（Ｃ）によって分析されたＲＮＡ折りたたみの計算シミュレーションを含む。テトラループおよびキッシングループは、それぞれ黄色および緑色のボックスで示されている。エキソサイト１および２結合ＲＮＡアプタマーは、それぞれ紫および青色の長方形で表される。
【0043】
図１８は、１５０Ｖで３０分間泳動した１％アガロースゲルを使用してＤＮＡ鋳型増幅を特徴付ける代表的な画像を含む。１ｋｂラダー（レーン１および５）、２Ｈ－ＤＮＡ－ＮＮＮＮ（レーン２）、２Ｈ－ＤＮＡ－１２ＮＮ（レーン３）、２Ｈ－ＤＮＡ－１Ｎ２Ｎ（レーン４）、および２Ｈ－ＤＮＡ－２ＮＮ１（レーン６）。
【0044】
図１９は、新しいＤＴＴを伴う転写と伴わない転写との間の差異の代表的な画像を含む。Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂからの未変性Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを、非修飾ＲＮＡ構造の転写に使用した。
【0045】
図２０は、２０Ｗで１時間、６％変性アクリルアミドゲル上で泳動したＲＮＡオリガミの代表的な画像を含む。１ｋｂラダー（レーン１）、２ＨＯ－ＲＮＡ－ＮＮＮＮ（レーン２）、２ＨＦ－ＲＮＡ－ＮＮＮ（レーン３）、２ＨＯ－ＲＮＡ－２ＮＮ１（レーン４）、２ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１（レーン５）、２ＨＯ－ＲＮＡ－１Ｎ２Ｎ（レーン６）、および２ＨＦ－ＲＮＡ－１Ｎ２Ｎ（レーン７）。
【0046】
図２１は、２０Ｗで１時間、６％変性アクリルアミドゲル上で泳動したＲＮＡオリガミの代表的な画像を含む。１ｋｂラダー（レーン１）、２ＨＯ－ＲＮＡ－１Ｎ２Ｎ、２７９ｎｔ（レーン２）、２ＨＯ－ＲＮＡ－ＮＮＮＮ、２１０ｎｔ（レーン３）、１ｋｂラダー（レーン４）、２ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１、２８５ｎｔ（レーン５）、２ＨＦ－ＲＮＡ－１Ｎ２Ｎ、２７９ｎｔ（レーン６）、２ＨＦ－ＲＮＡ－１２ＮＮ、２７９ｎｔ（レーン７）、および２ＨＦ－ＲＮＡ－ＮＮＮＮ、２１０ｎｔ（レーン８）。
【0047】
図２２は、１５０Ｖで３時間、６％未変性アクリルアミドゲル上で泳動したＲＮＡオリガミの代表的な画像を含む。ＤＮＡマーカー、ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｒａｎｇｅ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（左レーン）および２ＨＯ－ＲＮＡ－２ＮＮ１（右レーン）。
【0048】
図２３は、ａＰＴＴアッセイを用いて、２’－フルオロ－修飾遊離アプタマー、非修飾ＲＮＡオリガミ（２ＨＯ‐ＲＮＡ）、２’－フルオロ－修飾ＲＮＡオリガミ（２ＨＦ‐ＲＮＡ）、およびＤＮＡウィーブタイル（２ＨＴ‐ＤＮＡ）の平均凝固時間を比較する抗凝固試験の代表的な結果を含む。エラーバーは標準偏差である（Ｎ＝３）。
【0049】
図２４は、ＲＮＡオリガミ－トロンビン複合体のアクリルアミドゲル電気泳動の結果の代表的な画像を含む。核酸染色ゲル（左）およびタンパク質染色ゲル（右）。
【0050】
図２５は、ゲル電気泳動移動度シフトアッセイによる、４つの異なるタンパク質を有するＲＮＡオリガミに含まれるトロンビンアプタマーの特異性試験の、アクリルアミドゲル電気泳動の結果の代表的な画像を含む。レーン１：ＤＮＡマーカー、レーン２：２ＨＦ－ＲＮＡ－ＮＮＮＮ、レーン３－６：トロンビン、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、およびＢＳＡと共にそれぞれインキュベートした２ＨＦ－ＲＮＡ－ＮＮＮＮ。左のゲルは核酸染色ゲルであり、右のゲルはタンパク質染色ゲルである。
【0051】
図２６は、４つの異なるタンパク質を有するＲＮＡオリガミに含まれるトロンビンアプタマーの特異性試験のアクリルアミドゲル電気泳動の結果の代表的な画像を含む。レーン１：ＤＮＡマーカー、レーン２：２ＨＦ－ＲＮＡ－１２ＮＮ、レーン３－６：トロンビン、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、およびＢＳＡと共にそれぞれインキュベートした２ＨＦ－ＲＮＡ－１２ＮＮ。左のゲルは核酸染色ゲルであり、右のゲルはタンパク質染色ゲルである。
【0052】
図２７は、４つの異なるタンパク質を有するＲＮＡオリガミに含まれるトロンビンアプタマーの特異性試験のアクリルアミドゲル電気泳動の結果の代表的な画像を含む。レーン１：ＤＮＡマーカー、レーン２：２ＨＦ－ＲＮＡ－１Ｎ２Ｎ、レーン３－６：トロンビン、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、およびＢＳＡと共にそれぞれインキュベートした２ＨＦ－ＲＮＡ－１Ｎ２Ｎ。左のゲルは核酸染色ゲルであり、右のゲルはタンパク質染色ゲルである。
【0053】
図２８は、４つの異なるタンパク質を有するＲＮＡオリガミに含まれるトロンビンアプタマーの特異性試験のアクリルアミドゲル電気泳動の結果の代表的な画像を含む。レーン１：ＤＮＡマーカー、レーン２：２ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１、レーン３－６：トロンビン、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、およびＢＳＡと共にそれぞれインキュベートした２ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１。左のゲルは核酸染色ゲルであり、右のゲルはタンパク質染色ゲルである。
【0054】
図２９は、ＤＮＡウィーブタイルに含まれるトロンビンＤＮＡアプタマーとトロンビンとの結合アッセイの代表的な結果を含む。左のゲルは核酸染色ゲルであり、右のゲルはタンパク質染色ゲルである。
【0055】
図３０Ａ～３０Ｂは、１０ｕｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａで処理した修飾（Ａ）および非修飾（Ｂ）ＲＮＡオリガミの安定性試験の代表的な結果を含む。サンプルを変性ゲル電気泳動によって特徴付けた。
【0056】
図３１Ａ～３１Ｂは、高濃度のＲＮａｓｅ Ａ（５００ｕｇ／ｍｌ）で処理した修飾（Ａ）および非修飾（Ｂ）ＲＮＡオリガミの安定性試験の代表的な結果を含む。サンプルを変性ゲル電気泳動によって特徴付けた。
【0057】
図３２Ａ～３２Ｂは、ヒト血漿中に１０分～２４時間保存した修飾ＲＮＡオリガミ（２ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１）の安定性試験の代表的な結果を含む。修飾ＲＮＡオリガミ（Ａ）をヒト血漿と共に３７℃で４時間保存した。２ＨＦ‐ＲＮＡ‐２ＮＮ１オリガミ（Ｂ）を１０分から２４時間、ヒト血漿中に保存した。コントロールは１ｘバッファー中３７℃で２４時間保存した２ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１である。
【0058】
図３３は、ヒト血漿中に３７℃で１０分～２４時間保存した非修飾ＲＮＡオリガミ（２ＨＯ－ＲＮＡ－２ＮＮ１）の安定性試験の代表的な結果を含む。
【0059】
図３４は、ヒト血漿中に３７℃で１０分から２４時間保存したＤＮＡウィーブタイル（２ＨＴ－ＤＮＡ－ＰＮＮＢ）の安定性試験の代表的な結果を含む。
【0060】
図３５Ａ～３５Ｃは、３１ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡリンカー上の２つのアプタマー（Ｆｓｓ１２；Ａ）を含むＲＮＡオリガミの４つの設計の代表的な２Ｄモデルを含む。ｍｆｏｌｄ ＲＮＡおよびＮＵＰＡＣＫソフトウェアによって分析されたＲＮＡオリガミ折りたたみの計算分析（Ｂ～Ｃ）。紫および青色の長方形は、それぞれエキソサイト１およびエキソサイト２結合アプタマーを表す。
【0061】
図３６Ａ～３６Ｃは、４つのアプタマーを含むＲＮＡオリガミ（２Ｈ－ＲＮＡ－２２１１；Ａ）の４つの設計の代表的な２Ｄモデルを含む。ｍｆｏｌｄ ＲＮＡおよびＮＵＰＡＣＫソフトウェアによって分析されるＲＮＡオリガミ折りたたみの計算分析（Ｂ～Ｃ）。紫および青色の長方形はそれぞれエキソサイト１およびエキソサイト２結合アプタマーを表し、緑色の長方形はキッシングループモチーフを示す。
【0062】
図３７Ａ～３７Ｃは、２つのアプタマーおよび３つのＡ型二重らせん構造を含むＲＮＡオリガミ（３Ｈ－ＲＮＡ－２ＮＮ１；Ａ）の４つの設計の代表的な２Ｄモデルを含む。ｍｆｏｌｄ ＲＮＡおよびＮＵＰＡＣＫソフトウェアによって分析されたＲＮＡオリガミ折りたたみの計算分析（Ｂ～Ｃ）。紫および青の長方形はそれぞれエキソサイト１およびエキソサイト２結合アプタマーを表し、黄色および緑色の長方形は、それぞれテトラループおよびキッシングループモチーフを示す。
【0063】
図３８Ａ～３８Ｃは、２つのアプタマーおよび４つのＡ型二重らせん構造を含むＲＮＡオリガミ（４Ｈ－ＲＮＡ－２ＮＮ１；Ａ）の４つの設計の代表的な２Ｄモデルを含む。ｍｆｏｌｄ ＲＮＡおよびＮＵＰＡＣＫソフトウェアによって分析されたＲＮＡオリガミ折りたたみの計算分析（Ｂ～Ｃ）。紫および青の長方形はそれぞれエキソサイト１およびエキソサイト２結合アプタマーを表し、黄色および緑色の長方形は、それぞれテトラループおよびキッシングループを示す。
【0064】
図３９は、ＤＮＡ鋳型増幅を特徴付ける代表的な画像を含む。レーン１および８：ＤＮＡマーカー、レーン２：Ｆｓｓ１２、レーン３：２Ｈ－ＤＮＡ－ＮＮＮＮ、レーン４：２Ｈ－ＤＮＡ－２ＮＮ１、レーン５：２Ｈ－ＤＮＡ－２２１１、レーン６：３Ｈ－ＤＮＡ－２ＮＮ１およびレーン７：４Ｈ－ＤＮＡ－２ＮＮ１。
【0065】
図４０は、変性アクリルアミドゲル電気泳動によるＲＮＡオリガミを特徴付ける代表的な画像を含む。レーン１および８：ｓｓＲＮＡマーカー、レーン２：３１ｎｔ連結アプタマー（Ｆｓｓ１２）、レーン３：２ＨＦ－ＲＮＡ－ＮＮＮＮ、レーン４：２ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１、レーン５：２ＨＦ－ＲＮＡ－２２１１、レーン６：３ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１、レーン７：４ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１。
【0066】
図４１Ａ～４１Ｄは、６％未変性アクリルアミドゲル電気泳動によってトロンビンと結合するアプタマーを有するＲＮＡオリガミを特徴付ける代表的な画像を含む。ＲＮＡオリガミを、特徴付けの前に、３７℃で１時間、トロンビンと共にインキュベートした（Ａ）。（Ａ）および（Ｂ）中のゲルは同じゲルであり、１５０Ｖで３時間泳動した。ゲル（Ｃ）および（Ｄ）は同じゲルであり、１５０Ｖで６時間泳動した。核酸染色ゲル、臭化エチジウム（ＡおよびＣ）。タンパク質染色ゲル、クマシーブルー（ＢおよびＤ）。負の符号と正の符号はそれぞれトロンビンの無しおよび有りを示した。
【0067】
図４２Ａ～４２Ｂは、未変性アクリルアミドゲル電気泳動による、４つの異なるタンパク質を有する３１ｎｔが連結した２つのアプタマー（Ｆｓｓ１２）の特異的結合試験の代表的な画像を含む。レーン１：Ｆｓｓ１２。レーン２：トロンビンと共にインキュベートしたＦｓｓ１２。レーン３：第ＩＸａ因子と共にインキュベートしたＦｓｓ１２。レーン４：第Ｘａ因子と共にインキュベートしたＦｓｓ１２、およびレーン５：ＢＳＡと共にインキュベートしたＦｓｓ１２。６％未変性ＰＡＧＥゲルを１５０で３時間泳動した。核酸染色ゲル、臭化エチジウム（Ａ）。タンパク質染色ゲル、クマシーブルー（Ｂ）。（Ａ）および（Ｂ）は同じゲルである。
【0068】
図４３Ａ～４３Ｂは、未変性アクリルアミドゲル電気泳動による、４つの異なるタンパク質との２ＨＦ－ＲＮＡ－２２１１の特異的結合試験の代表的な画像を含む。レーン１：２ＨＦ－ＲＮＡ－２２１１。レーン２：トロンビンと共にインキュベートした２ＨＦ－ＲＮＡ－２２１１。レーン３：第ＩＸａ因子と共にインキュベートした２ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１。レーン４：第Ｘａ因子と共にインキュベートした２ＨＦ－ＲＮＡ－２２１１、およびレーン５：ＢＳＡと共にインキュベートした２ＨＦ－ＲＮＡ－２２１１。６％未変性ＰＡＧＥゲルを１５０で３時間泳動した。核酸染色ゲル、臭化エチジウム（Ａ）。タンパク質染色ゲル、クマシーブルー（Ｂ）。（ＡおよびＢ）。（Ａ）および（Ｂ）は同じゲルである。
【0069】
図４４Ａ～４４Ｂは、未変性アクリルアミドゲル電気泳動による４つの異なるタンパク質との３ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１の特異的結合試験の代表的な画像を含む。レーン１：３ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１。レーン２：トロンビンと共にインキュベートした３ＨＦ－２ＮＮ１。レーン３：第ＩＸａ因子と共にインキュベートした３ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１。レーン４：第Ｘａ因子と共にインキュベートした３ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１、およびレーン５：ＢＳＡと共にインキュベートした３ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１。６％未変性ＰＡＧＥゲルを１５０で６時間泳動した。核酸染色ゲル、臭化エチジウム（Ａ）。タンパク質染色ゲル、クマシーブルー（Ｂ）。（Ａ）と（Ｂ）は同じゲルである。
【0070】
図４５Ａ～４５Ｂは、未変性アクリルアミドゲル電気泳動による４つの異なるタンパク質との４ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１の特異的結合試験の代表的な画像を含む。レーン１：２ＨＦ－ＲＮＡ－４ＮＮ１。レーン２：トロンビンと共にインキュベートした４ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１。レーン３：第ＩＸａ因子と共にインキュベートした４ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１。レーン４：第Ｘａ因子と共にインキュベートした２ＨＦ－ＲＮＡ－４ＮＮ１、およびレーン５：ＢＳＡと共にインキュベートした４ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１。６％未変性ＰＡＧＥゲルを１５０で６時間泳動した。核酸染色ゲル、臭化エチジウム（Ａ）。タンパク質染色ゲル、クマシーブルー（Ｂ）。（Ａ）と（Ｂ）は同じゲルである。
【0071】
図４６は、ＲＮＡオリガミの長期保存を試験する代表的な結果を含む。新たに調製した２ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１サンプルの平均抗凝固活性を、４℃で９０日まで保存したサンプルと比較する。結果は、ＲＮＡオリガミ抗凝固剤が４℃で保存した後、少なくとも３ヶ月間安定であり、活性であることを実証する。
【0072】
図４７は、ａＰＴＴアッセイによって試験された、遊離アプタマー、ｓｓＲＮＡ連結アプタマー、およびアプタマーを含むＲＮＡオリガミの抗凝固活性の代表的な結果を含む。抗凝固剤の全ての設計は、２ＨＦ－ＲＮＡ－２２１１を除いて、５００ｎＭの最終濃度である。２ＨＦ－ＲＮＡ－２２１１の最終濃度は４００ｎＭである。結果は、ｓｓＲＮＡと連結した２つのアプタマー（Ｆｓｓ１２）の抗凝固活性が遊離アプタマーおよび遊離アプタマーの混合物よりも高いことを実証する。さらに、ＲＮＡオリガミ（２ＨＦ‐ＲＮＡ‐２ＮＮ１）に含まれる２つのアプタマーの抗凝固活性はｓｓＲＮＡ連結アプタマー（Ｆｓｓ１２）よりも大きい。さらに、４つのアプタマーを含むＲＮＡオリガミ（２ＨＦ‐ＲＮＡ‐２２１１）は、最も高い抗凝固活性（２ＨＦ‐ＲＮＡ‐２ＮＮ１活性の２倍を超える）を示す。
【0073】
図４８は、２つ（２ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１）および４つ（２ＨＦ－ＲＮＡ－２２１１）のＲＮＡアプタマーを含むＲＮＡオリガミの濃度依存性凝固時間を試験する代表的な結果を含む。４００ｎＭの濃度の２ＨＦ－ＲＮＡ－２２１１について、凝固時間は、最大限界（凝固計を用いて測定した９９９秒）に達した。驚くべきことに、２ＨＦ－ＲＮＡ－２２１１（４アプタマー）の抗凝固活性は、２ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１（２アプタマー）の抗凝固活性の２倍を超える。
【0074】
図４９は、２つのＲＮＡアプタマー（２ＮＮ１）および２つ（２ＨＦ）、３つ（３ＨＦ）、または４つ（４ＨＦ）のらせん構造を含むＲＮＡオリガミの抗凝固活性を試験する代表的な結果を含む。結果は、２つのＲＮＡアプタマーを含む２ＨＦ、３ＨＦ、および４ＨＦ ＲＮＡオリガミがすべて抗凝固活性を示すことを示す。
【0075】
図５０Ａ～５０Ｂは、トロンビン阻害の逆転の代表的な結果を含む。凝固時間（Ａ）、抗凝固活性（Ｂ）を示す。
【0076】
図５１は、ＤＮＡまたはＰＮＡ解毒剤の添加によるトロンビン活性の逆転を試験する代表的な結果を含む。２ＨＦ－２ＮＮ１オリガミ抗凝固剤の抗凝固活性をコントロールサンプルとして使用した。ＤＮＡまたはＰＮＡ解毒剤（９等量）をＲＮＡオリガミと共にインキュベートした。ＰＮＡ解毒剤の阻害活性はＤＮＡ解毒剤より高かった。
【0077】
〔詳細な説明〕
本開示の実施形態は、ＲＮＡアプタマーを、２’－フルオロ－修飾転写物として産生されるＲＮＡオリガミ構造と組み合わせる核酸ベースの抗凝固剤を提供する。本明細書中に開示される新しい抗凝固剤は、遊離アプタマーよりも何倍も高い活性を実証した。単一分子構築物は外科的抗凝固剤としての使用に有利であり、迅速な腎クリアランスを大幅に減少させるのに十分に高い分子量のものである。本明細書中に開示される核酸抗凝固剤は、現在使用されている小分子血液シンナーと比較して、重篤な副作用がより少ないであろう。さらに、本開示の実施形態は、抗凝固活性を妨げる相補的ＤＮＡから作製される核酸解毒剤を含む。
本開示の実施形態は、ＲＮＡアプタマーを、２’－フルオロ－修飾転写物として産生されるＲＮＡオリガミ構造と組み合わせる核酸ベースの抗凝固剤を提供する。本明細書中に開示される新しい抗凝固剤は、遊離アプタマーよりも何倍も高い活性を実証した。単一分子構築物は外科的抗凝固剤としての使用に有利であり、迅速な腎クリアランスを大幅に減少させるのに十分に高い分子量のものである。本明細書中に開示される核酸抗凝固剤は、現在使用されている小分子血液シンナーと比較して、重篤な副作用がより少ないであろう。さらに、本開示の実施形態は、抗凝固活性を妨げる相補的ＤＮＡから作製される核酸解毒剤を含む。
【0078】
核酸治療剤は、現在の薬学的抗凝固剤に代わる解決策を表す（図２Ａ～２Ｅおよび図３）。ＤＮＡおよびＲＮＡアプタマーは特定の標的分子に結合する構造をとることができ、トロンビンに結合し、凝固カスケードを破壊するように開発されている。それらの利点には、副作用を最小限にするためのより優れた生体適合性、より優れた治療ウィンドウ、および解毒剤の利用可能性が含まれる。解毒剤は、アプタマーを展開することができるアプタマーに相補的な天然核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）または非天然核酸（ＰＮＡなど）を含む。これは、迅速かつ頑強な抗凝固療法を必要とする臨床応用に利点をもたらす。しかしながら、これらのアプタマーはその小さいサイズ（３０ＫＤａ未満）のため、薬物動態が不十分であり、それらは循環後に腎臓によって迅速に除去され、したがって、有効であるために、より濃縮された投薬量を必要とした。
【0079】
本開示の実施形態はトロンビンに結合し、凝固を防止することができる新しい機能性ＲＮＡオリガミを含む（図４）。一実施形態では、ＲＮＡアプタマーの局所濃度を増加させることによって結合親和性を増加させ、必要な投与量を低下させるために、２つのアプタマーをＲＮＡオリガミ上に装飾した。ＲＮＡの生体適合性および解毒剤の利用可能性は同様に、負の副作用を最小限に抑えながら、正確な治療を可能にし得る。ヒト身体におけるＲＮＡオリガミの循環はより高い分子量（例えば、８０ｋＤａを超える）のために、遊離アプタマーよりも長い。本開示のＲＮＡオリガミ抗凝固剤組成物およびシステムは、より副作用が少ない、より制御可能な解決策を提供することによって、現在の臨床抗凝固剤に対する実行可能な代替物を提供する。
【0080】
このセクションおよび本明細書の開示全体で使用されるセクション見出しは、単に構成上の目的のためのものであり、限定することを意図するものではない。
【0081】
１．定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先する。好ましい方法および材料を以下に記載するが、本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料を、本開示の実施または試験において使用することができる。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。本明細書に開示される材料、方法、および実施例は、例示にすぎず、限定することを意図するものではない。
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先する。好ましい方法および材料を以下に記載するが、本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料を、本開示の実施または試験において使用することができる。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。本明細書に開示される材料、方法、および実施例は、例示にすぎず、限定することを意図するものではない。
【0082】
用語「含む(comprise(s))」、「含む(include(s))」、「有する(having)」、「有する(has)」、「し得る(can)」、「含有する(contain(s))」、およびその変形は、本明細書で使用されるように、追加の行為または構造の可能性を排除しない、オープンエンドの移行句、用語、または単語であることが意図されている。単数形「ａ」、「ａｎｄ」および「ｔｈｅ」は文脈が明確に指定しない限り、複数形の言及を含む。本開示はまた、明確に記載されているか否かにかかわらず、本明細書で提示される実施形態または要素を「含む」、「からなる」、および「本質的にからなる」他の実施形態を是認する。
【0083】
本明細書における数値範囲の記載に関して、同程度の正確さを有するそれらの間の各介在数が明確に是認される。例えば、６～９の範囲については６および９に加えて数字７および８が是認され、６．０～７．０の範囲については数字６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０が明示的に是認される。
【0084】
本明細書における数値範囲の記載に関して、同程度の正確さを有するそれらの間の各介在数が明確に是認される。例えば、６～９の範囲については６および９に加えて数字７および８が是認され、６．０～７．０の範囲については数字６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０が明示的に是認される。
【0085】
本明細書で使用される「と相関する」とは、比較されることを指す。
【0086】
用語「アプタマー」は一般に、単一の定義された配列のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドの混合物のいずれかを指し、ここで、混合物は標的分子に特異的に結合する特性を保持する。したがって、本明細書で使用される場合、「アプタマー」はオリゴヌクレオチドの単一および複数の配列の両方を指す。用語「アプタマー」は一般に、タンパク質または他の分子に結合可能であり、それによって、タンパク質または他の分子の機能を妨害する、一本鎖または二本鎖核酸を指す。
【0087】
用語「一本鎖」オリゴヌクレオチドは一般に、単一の共有結合した一連のヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチドを指す。
【0088】
用語「オリゴマー」または「オリゴヌクレオチド」は一本鎖または二本鎖形態のいずれかの２つ以上のヌクレオチドのＲＮＡまたはＤＮＡ配列を含み、特異的には、一本鎖または二本鎖形態のいずれかの、特異的に結合するオリゴヌクレオチドの生成で中間生成物になり得る二量体および三量体のような短い配列を含む。候補プールにおいて使用される「修飾された」形態は、少なくとも一つの未変性ではない残基を含む。「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、ＤＮＡなどのポリデオキシリボヌクレオチド（２’－デオキシ－Ｄ－リボースまたはその修飾された形態を含有する）、ＲＮＡなどのポリリボヌクレオチド（Ｄ－リボースまたはその修飾された形態を含有する）、およびプリンもしくはピリミジン塩基、または修飾されたプリンもしくはピリミジン塩基のＮ－グリコシドまたはＣ－グリコシドである任意の他の種類のポリヌクレオチド、もしくは脱塩基ヌクレオチドに一般的である。「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」はまた、ペプチド核酸（ＰＮＡ）のオリゴを含むがこれらに限定されない、ＲＮＡおよびＤＮＡに類似する人工的に合成されたポリマーを表すために使用することができる。
【0089】
「ＲＮＡアプタマー」はリボヌクレオシドユニットを含むアプタマーであり、「ＲＮＡアプタマー」はまた、本明細書中に開示されるようなＲＮＡアナログを包含することを意味する。
【0090】
用語「凝固因子」は一般に、内因性凝固カスケードおよび外因性凝固カスケードのいずれかまたは両方において作用する因子をいう。
【0091】
用語「ＲＮＡアナログ」または「ＲＮＡ誘導体」、または「修飾されたＲＮＡ」は一般に、リボヌクレオシドをその単位として含むことに加えて、下記のうち少なくとも一つを含むポリマー分子を指す：２’－デオキシ、２’－ハロ（２’－フルオロを含む）、２’－アミノ（好ましくは置換されていない、もしくはモノ置換またはジ置換）、２’－モノ－、ジ－またはトリ－ハロメチル、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－ハロ置換アルキル、２’－アルキル、アジド、ホスホロチオアート、スルホヒドリル、メチルホスホナート、フルオレセイン、ローダミン、ピレン、ビオチン、キサンチン、ヒポキサンチン、２，６－ジアミノプリン、２－ヒドロキシ－６－メルカプトプリン、および６位が硫黄で置換されたピリミジン塩基、もしくは５位がハロまたはＣ１－５アルキル基で置換されたピリミジン塩基、塩基性リンカー、３’－デオキシ－アデノシン、ならびに他の「連鎖停止剤」または「伸長不能である」アナログ（ＲＮＡの３’－末端）、あるいは３２Ｐ、３３Ｐなどの標識および同様のもの。上記の全ては、本明細書中に開示される標準的な合成技術を使用してＲＮＡに組み込まれ得る。
【0092】
用語「結合活性」および「結合親和性」は一般に、リガンド分子が標的に結合するかまたは結合しない傾向を指す。これらの相互作用のエネルギー論は、相互作用するパートナーの濃度、これらのパートナーが会合することができる速度、および溶液中の結合分子および遊離分子の相対濃度の定義を含むことができるため、「結合活性」および「結合親和性」において重要である。
【0093】
「配列同一性」とは、２つのポリマー配列（例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸など）が同一の連続的なモノマーサブユニットの組成を有する程度をいう。用語「配列類似性」は２つのポリマー配列（例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸など）が類似のポリマー配列を有する程度をいう。例えば、類似のアミノ酸は同一の生物物理学的特性を共有し、例えば酸性（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）および非荷電極性（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）のファミリーに分類することができる。「配列同一性パーセント」（または「配列類似性パーセント」）は下記によって計算される：（１）２つの最適に整列された配列を比較ウィンドウ（例えば、より長い配列の長さ、より短い配列の長さ、特定のウィンドウ）で比較すること、（２）一致する位置の数を得るために、同一の（または類似の）モノマー（例えば、同じアミノ酸が両方の配列において生じる、類似のアミノ酸が両方の配列において生じる）を含む位置の数を決定すること、（３）一致する位置の数を比較ウィンドウ（例えば、より長い配列の長さ、より短い配列の長さ、特定のウィンドウ）における位置の総数で割ること、および（４）配列同一性パーセントまたは配列類似性パーセントを得るために、結果に１００を掛けること。例えば、ペプチドＡおよびＢが両方とも長さ２０アミノ酸であり、１位を除く全てにおいて同一のアミノ酸を有する場合、ペプチドＡおよびペプチドＢは９５％の配列同一性を有する。同一でない位置のアミノ酸が同じ生物物理学的特性を共有する場合（例えば、両方とも酸性であった）、ペプチドＡおよびペプチドＢは１００％の配列類似性を有する。別の例として、ペプチドＣが長さ２０アミノ酸であり、ペプチドＤが長さ１５アミノ酸であり、ペプチドＤの１５アミノ酸のうちの１４アミノ酸がペプチドＣのそれらの一部と同一である場合、ペプチドＣおよびＤは７０％の配列同一性を有するが、ペプチドＤはペプチドＣの最適な比較ウィンドウに対して９３．３％の配列同一性を有する。本明細書中の「配列同一性パーセント」（または「配列類似性パーセント」）を計算する目的のために、整列した配列中の任意のギャップはその位置でのミスマッチとして扱われる。
【0094】
本開示の実施形態は、Ａ型二重らせん構造および少なくとも１つのクロスオーバー領域、少なくとも１つのキッシングループ領域、ならびに抗凝固活性を有する少なくとも１つの核酸アプタマーを有する一本鎖核酸分子を提供する。これらの実施形態によれば、一本鎖核酸分子は、ＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子、またはそれらの任意の誘導体もしくは組み合わせであり得る。
【0095】
いくつかの実施形態では、一本鎖核酸分子が、２’－修飾を有する少なくとも１つのヌクレオシドを含むＲＮＡ分子であり得る。いくつかの実施形態では、本開示の一本鎖ＲＮＡオリガミ分子が少なくとも１つの２’－フルオロ－ｄＣＴＰもしくは２’－フルオロ－ｄＵＴＰ、または２’－アミノもしくは２’－Ｏ－メチルなどの２’－修飾、またはホスホロチオアートなどの骨格リン酸基の化学修飾を有する１つの他のヌクレオシドを含み得る。
【0096】
いくつかの実施形態では、一本鎖核酸分子が、４－ヌクレオチドモチーフを含む少なくとも１つのテトラループ領域を含む。いくつかの実施形態では、一本鎖核酸分子が、各々が４－ヌクレオチドモチーフを含む、１～３個のテトラループ領域を含む。いくつかの実施形態では、一本鎖核酸分子が抗凝固活性を有する１～４つのアプタマーを含む。これらの実施形態によれば、１～４つのアプタマーの各々は、少なくとも１つのテトラループ領域の１つを置換する。いくつかの実施形態では、一本鎖核酸分子がテトラループ領域を含まない。
【0097】
いくつかの実施形態では、一本鎖核酸分子が、１８０°キッシングループ領域である少なくとも１つのキッシングループ領域を含む。いくつかの実施形態では、一本鎖核酸分子が１つの１８０°キッシングループ領域を含む。いくつかの実施形態では、一本鎖核酸分子はキッシングループ領域を含まない。
【0098】
いくつかの実施形態では、一本鎖核酸分子が一本鎖ＲＮＡリンカー領域を含む。いくつかの実施形態では、核酸アプタマーが一本鎖ＲＮＡリンカー領域の一端または両端に連結され得る。いくつかの実施形態では、一本鎖核酸分子はキッシングループ領域およびテトラループ領域を含まない。
【0099】
いくつかの実施形態では、一本鎖核酸分子が少なくとも１つのらせん構造（例えば、Ａ型二重らせん構造）を含む。いくつかの実施形態では、一本鎖核酸分子が少なくとも２つのらせん構造を含む。いくつかの実施形態では、一本鎖核酸分子が少なくとも３つのらせん構造を含む。いくつかの実施形態では、一本鎖核酸分子が少なくとも４つのらせん構造を含む。いくつかの実施形態では、一本鎖核酸分子が５つまたはそれ以上のらせん構造を含む。いくつかの実施形態では、一本鎖核酸分子が２つまたはそれ以上の核酸アプタマーを分離する少なくとも１つのらせん構造を含む。いくつかの実施形態では、２つまたはそれ以上の核酸アプタマーを分離する少なくとも１つのらせん構造が、少なくとも１つの核酸アプタマーを含む。いくつかの実施形態では、２つまたはそれ以上の核酸アプタマーを分離する少なくとも１つのらせん構造は、核酸アプタマーを含まない。
【0100】
いくつかの実施形態では、核酸分子が、配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、核酸分子が、配列番号１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、核酸分子が、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、核酸分子が、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、核酸分子が、配列番号１に対して少なくとも９６％の配列同一性を有するＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、核酸分子が、配列番号１に対して少なくとも９７％の配列同一性を有するＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、核酸分子が、配列番号１に対して少なくとも９８％の配列同一性を有するＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、核酸分子が、配列番号１に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するＲＮＡ分子である。
【0101】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸アプタマーの抗凝固活性が第ＸＩＩａ因子、第ＸＩＩＩａ因子、第ＸＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、およびフォン・ヴィレブランド因子のうちの１つまたは複数の阻害を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＲＮＡオリガミ分子に含まれ得る核酸アプタマーが、血液凝固を調節することに関与する任意のアプタマーを含み、これにはＡＲＣ１８３／ＨＤ１（標的ＦＩＩａ）；ＨＤ２２（標的ＦＩＩａ）；ＨＤ１－２２（標的ＦＩＩａ）；Ｔｏｇ２５（標的ＦＩＩ）；Ｒ９ｄ１４ｔ（標的ＦＩＩ／ＦＩＩａ）；１１Ｆ７ｔ（標的ＦＸａ）；１６．３（標的ＦＶＩＩａ）；７Ｓ－１／７Ｓ－２（標的ＦＶＩＩ）；９．３ｔ（標的ＦＩＸａ）；Ｒ４ｃＸＩＩ－１（標的ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ）；ＮＵ１７２（標的トロンビン）；ＲＥＧ１（標的ＦＩＸ／ＦＩＸａ）；ＲＥＧ２（標的ＦＩＸ／ＦＩＸａ）；ＡＲＣ１７７９（標的フォン・ヴィレブランド因子）；およびＡＲＣ１９４９９（標的ＴＦＰＩ）が含まれるが、これらに限定されない。
【0102】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸アプタマーの抗凝固活性がトロンビン阻害を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸アプタマーが抗トロンビンＲＮＡＲ９Ｄ－１４Ｔアプタマーまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸アプタマーが抗トロンビントグル－２５ｔ ＲＮＡアプタマーまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態では、トロンビンのエキソサイト１に結合可能な核酸アプタマーがＲＮＡＲ９Ｄ－１４Ｔアプタマーまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、トロンビンのエキソサイト２に結合可能な核酸アプタマーがトグル－２５ｔＲＮＡアプタマーまたはその誘導体である。
【0103】
いくつかの実施形態では、核酸分子が、約１００～約１０００ヌクレオチドを含むＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、核酸分子が、約１００～約９００ヌクレオチドを含むＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、核酸分子が、約１００～約８００ヌクレオチドを含むＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、核酸分子が、約１００～約７００ヌクレオチドを含むＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、核酸分子が、約１００～約６００ヌクレオチドを含むＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、核酸分子が、約１００～約５００ヌクレオチドを含むＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、核酸分子が、約１００～約４００ヌクレオチドを含むＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、核酸分子が、約１００～約３００ヌクレオチドを含むＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、核酸分子が、約１５０～約６００ヌクレオチドを含むＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、核酸分子が、約１５０～約５００ヌクレオチドを含むＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、核酸分子が、約１５０～約４００ヌクレオチドを含むＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、核酸分子が、約１５０～約３００ヌクレオチドを含むＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、核酸分子が、約２００～約６００ヌクレオチドを含むＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、核酸分子が、約２２５～約６００ヌクレオチドを含むＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、核酸分子が、約２５０～約６００ヌクレオチドを含むＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、核酸分子が、約２００～約５００ヌクレオチドを含むＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、核酸分子が、約２００～約４５０ヌクレオチドを含むＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、核酸分子が、約２００～約４００ヌクレオチドを含むＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、核酸分子が、約２００～約３５０ヌクレオチドを含むＲＮＡ分子である。
【0104】
いくつかの実施形態では、一本鎖核酸分子が、トロンビンのエキソサイト１に結合可能なＲＮＡ分子のテトラループ領域１を置換する核酸アプタマー、およびトロンビンのエキソサイト２に結合可能なＲＮＡ分子のテトラループ領域２を置換する核酸アプタマーを含むＲＮＡ分子（２ＨＯ－ＲＮＡ－１２ＮＮまたは２ＨＦ－ＲＮＡ－１２ＮＮ）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号２に対して８０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号２に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号２に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号２に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号２に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号２に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【0105】
いくつかの実施形態では、一本鎖核酸分子が、トロンビンのエキソサイト１に結合可能なＲＮＡ分子のテトラループ領域１を置換する核酸アプタマー、およびトロンビンのエキソサイト２に結合可能なＲＮＡ分子のテトラループ領域３を置換する核酸アプタマーを含むＲＮＡ分子（２ＨＯ－ＲＮＡ－１Ｎ２Ｎまたは２ＨＦ－ＲＮＡ－１Ｎ２Ｎ）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号３に対して８０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号３に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号３に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号３に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号３に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【0106】
いくつかの実施形態では、一本鎖核酸分子が、トロンビンのエキソサイト２に結合可能なＲＮＡ分子のテトラループ領域１を置換する核酸アプタマー、およびトロンビンのエキソサイト１に結合可能なＲＮＡ分子のテトラループ領域４を置換する核酸アプタマーを含むＲＮＡ分子（２ＨＯ－ＲＮＡ－２ＮＮ１または２ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号４に対して８０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号４に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号４に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号４に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号４に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号４に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【0107】
いくつかの実施形態では、一本鎖核酸分子が、一本鎖ＲＮＡリンカーの一端に連結されたトロンビンのエキソサイト２に結合可能な核酸アプタマー、および一本鎖ＲＮＡリンカーの他端に連結されたトロンビンのエキソサイト１に結合可能な核酸アプタマーを含むＲＮＡ分子（Ｆｓｓ１２）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号５に対して８０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号５に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号５に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号５に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号５に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号５に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【0108】
いくつかの実施形態では、一本鎖核酸分子が、それぞれＲＮＡ分子のテトラループ領域１および２を置換する、トロンビンのエキソサイト２に結合可能な２つの核酸アプタマー、およびそれぞれＲＮＡ分子のテトラループ領域３および４を置換する、トロンビンのエキソサイト１に結合可能な２つの核酸アプタマーを含むＲＮＡ分子（２Ｈ－２２１１）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号６に対して８０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号６に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号６に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号６に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号６に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号６に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号６に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【0109】
いくつかの実施形態では、一本鎖核酸分子が、ＲＮＡ分子のテトラループ領域１を置換するトロンビンのエキソサイト２に結合可能な核酸アプタマー、ＲＮＡ分子のテトラループ領域４を置換するトロンビンのエキソサイト１に結合可能な核酸アプタマー、およびトロンビンのエキソサイト１に結合可能な核酸アプタマーからトロンビンのエキソサイト２に結合可能な核酸アプタマーを分離するＡ型二重らせん構造を含むＲＮＡ分子（３Ｈ－２ＮＮ１）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号７に対して８０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号７に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号７に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号７に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号７に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号７に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【0110】
いくつかの実施形態では、一本鎖核酸分子が、ＲＮＡ分子のテトラループ領域１を置換するトロンビンのエキソサイト２に結合可能な核酸アプタマー、ＲＮＡ分子のテトラループ領域４を置換するトロンビンのエキソサイト１に結合可能な核酸アプタマー、およびトロンビンのエキソサイト１に結合可能な核酸アプタマーからトロンビンのエキソサイト２に結合可能な核酸アプタマーを分離する２つのＡ型二重らせん構造を含むＲＮＡ分子である（４Ｈ－２ＮＮ１）。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号８に対して８０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号８に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号８に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号８に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号８に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が配列番号８に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【0111】
本開示の実施形態はまた、本明細書に記載の一本鎖核酸分子のいずれかをコードするＤＮＡ分子を含む。本開示に基づいて当業者によって認識されるように、本明細書中に記載される一本鎖核酸分子のいずれかをコードするＤＮＡ分子は、一本鎖または二本鎖であり得、そして本明細書中に記載される一本鎖核酸分子のいずれかを生成するための鋳型として作用し得る。ＤＮＡ鋳型は、インビボおよび／またはインビトロ生化学反応のための発現プラスミドまたは他の構築物の一部であり得る。
【0112】
本開示の実施形態はまた、抗凝固剤組成物を含む。これらの実施形態によれば、組成物は、Ａ型二重らせん構造および少なくとも１つのクロスオーバー領域、少なくとも１つのキッシングループ領域、および抗凝固活性を有する少なくとも１つの核酸アプタマーを含む一本鎖核酸分子、ならびに薬学的に許容される賦形剤、溶媒、担体、または希釈剤を含む。いくつかの実施形態では、一本鎖核酸分子が少なくとも１つのテトラループ領域をさらに含む。本開示に基づいて当業者によって認識されるように、組成物は外科的処置の状況において血液凝固を調節するために、および／または疾患状態を処置するために、治療計画に従って被験体または患者に投与され得る。
【0113】
本開示の実施形態はまた、凝固を調節するためのシステムを含む。これらの実施形態に従って、システムは、本明細書に記載される一本鎖核酸分子のいずれかと、本明細書に記載される一本鎖核酸分子のいずれかの少なくとも一部に結合可能であり、これらの一本鎖核酸分子の抗凝固活性を妨げる少なくとも１つの一本鎖核酸解毒剤とを含む。本開示に基づいて当業者によって認識されるように、このシステムは、外科的処置の状況において血液凝固を調節するため、および／または疾患状態を処置するための治療計画に従って、被験体または患者を処置するために使用され得る。
【0114】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸解毒剤がＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、Ｏ－メチルＲＮＡ分子、フルオロ修飾ＲＮＡ分子、ＰＮＡ分子、ＬＮＡ分子、またはそれらの組み合わせもしくは誘導体である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸解毒剤は逆相補的様式で、本明細書中に記載される一本鎖核酸分子のいずれかの少なくとも一部に結合する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸解毒剤は、本明細書中に記載される一本鎖核酸分子のいずれかの少なくとも１つの核酸アプタマーに結合して抗凝固活性を妨げる。
【0115】
本明細書で別段の定義がない限り、本開示に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。例えば、本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学およびタンパク質ならびに核酸化学およびハイブリダイゼーションに関連して使用される任意の用語法は技術分野で周知であり、そして一般的に使用されるものである。用語の意味および範囲は明確であるべきである；しかしながら、潜在的な曖昧さの場合には、本明細書に提供される定義が任意の辞書または外部定義よりも先行する。さらに、文脈によって特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。
【0116】
２．設計および方法
本開示の実施形態は、様々な治療機能（例えば、抗凝固活性が挙げられるが、これに限定されない）を有する核酸アプタマーを含む一本鎖核酸分子を設計および生成するための方法を含む。いくつかの実施形態では、本開示の一本鎖核酸分子が、抗凝固活性を有する核酸アプタマーを含むＲＮＡ分子（ＲＮＡオリガミ）を含む。これらの実施形態によれば、本開示は、（ｉ）３Ｄモデルを作成すること、（ｉｉ）２Ｄモデルへの変換、（ｉｉｉ）２Ｄモデルからテキストファイル設計を作成すること、および（ｉｖ）ＲＮＡ配列の分析を含む、ＲＮＡオリガミを設計するための一般的な工程を提供する。
本開示の実施形態は、様々な治療機能（例えば、抗凝固活性が挙げられるが、これに限定されない）を有する核酸アプタマーを含む一本鎖核酸分子を設計および生成するための方法を含む。いくつかの実施形態では、本開示の一本鎖核酸分子が、抗凝固活性を有する核酸アプタマーを含むＲＮＡ分子（ＲＮＡオリガミ）を含む。これらの実施形態によれば、本開示は、（ｉ）３Ｄモデルを作成すること、（ｉｉ）２Ｄモデルへの変換、（ｉｉｉ）２Ｄモデルからテキストファイル設計を作成すること、および（ｉｖ）ＲＮＡ配列の分析を含む、ＲＮＡオリガミを設計するための一般的な工程を提供する。
【0117】
ＲＮＡオリガミ設計のいくつかの実施形態では、ＲＮＡ二重らせんＡ型が使用される（図５Ａ～５Ｂ）。らせんの幾何学的形状は、二重クロスオーバーをどこに配置するかを決定するのに寄与する。この設計では、複数のモチーフを使用することができる。例えば、キッシングループモチーフの使用は、多重らせん構造が一本鎖によって経路指定されることを可能にする。いくつかの実施形態では、１８０°キッシングループを使用し得る。さらに、テトラループモチーフを使用し得る；テトラループは、構造の末端をキャップする小さな４ヌクレオチドモチーフである。テトラループの存在は、ＲＮＡ分子の全体構造を安定化するように機能し得る。
【0118】
本明細書に記載の方法によれば、ＲＮＡオリガミ分子の３Ｄモデルを作製し得る。例えば、２－らせんＲＮＡオリガミ構造を作製し、トロンビンＲＮＡアプタマーを含めた。バイオインフォマティクスソフトウェアは、ＲＮＡ二重らせん、テトラループ、１８０°キッシングループ、およびＲＮＡトロンビンアプタマーを含むが、これらに限定されない、モチーフの各々についてのファイルを生成するために使用され得る。一般に、Ａ型ＲＮＡ二重らせんに対応するファイルは、それが全ての他のモチーフのためのベースとして働くので、最初に生成される。次に、１８０°キッシングループ（図５Ｂ）に対応するファイルが追加され、続いてテトラループに対応するファイルが追加され、場合によっては、より大きなファイルから抽出することができる（図６Ａ～６Ｂ）。最後に、エキソサイト１およびエキソサイト２ＲＮＡアプタマーに対応するファイルが追加される；再度、いくつかの場合では、これらのファイルは、より大きな供給源から抽出され得る（図７Ａ～７Ｂ）。
【0119】
一旦全てのモチーフファイルが得られると、それらは、キメラ（ｃｇｌ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／キメラ）のようなプログラムを用いて組み立てられ、整列され得る。例えば、２つのＡ型ＲＮＡヘリックスは、図８Ａに示すように整列させることができる。次に、クロスオーバーが配置されるヌクレオチドは、クロスオーバーが配置されるべき場所の視覚化を容易にする、代替的な着色などを用いて特定され得る。ＲＮＡらせんを整列させた後、テトラループ、キッシングループおよびＲＮＡアプタマーを含む全てのモチーフを整列パネルに挿入することができる（図８Ｂ）。次の工程はこの構造を一本鎖構造に変換することを含み、これは、図９に示されるように、種々のバイオインフォマティクスソフトウェア（例えば、ａｎｄｅｒｓｅｎ－ｌａｂ．ｄｋ）を使用して行われ得る。
【0120】
本開示の方法はまた、図１０に示されるように、上記のファイルおよび適切なソフトウェアプログラム（例えば、Ａｓｓｅｍｂｌｅ２ソフトウェア）を使用して、ＲＮＡオリガミ分子の３Ｄモデルを２Ｄモデルに変換する工程を含む。次いで、２Ｄモデルは、テキストファイルまたは同様のフォーマットに転記される。一本鎖ＲＮＡオリガミ分子のヌクレオチド配列を生成するために、適切なソフトウェア（例えば、ＮＵＰＡＣＫ．ｏｒｇ）を使用し、次いで、２Ｄ試験ファイルをトレーススクリプト（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ－ｌａｂ．ｄｋ）に通す。トレーススクリプトからの出力コードを図１１Ａに示し、生成されたアウトＲＮＡ配列を図１１Ｂに示す。
【0121】
本開示の方法はまた、ソフトウェア（例えば、ＮＵＰＡＣＫ）によって生成されたＲＮＡ配列を分析することを含む。ＲＮＡオリガミ分子の適切な折りたたみについて試験するために、ＮＵＰＡＣＫおよびｍｆｏｌｄを使用した。配列は、適切な配列折りたたみを保証する最適な配列を選択するために分析することができる。例えば、適切な折りたたみを有する配列は一般的に、低いΔＧ、６５％未満のＧＣ％、および低い正規化されたアンサンブル欠陥(normalized ensemble defect)（ＮＥＤ）を有する配列である。配列が有する二次構造が少ないほど、適切に折りたたまれる可能性が高い。配列を最適化するために、好ましくない構造を除去するためＧ－Ｃ塩基対合の位置を変化させることを含むが、これに限定されない、配列の手動編集を行うことができる。
【0122】
本開示の実施形態はまた、一本鎖核酸オリガミ分子に核酸アプタマーを含めるための設計および方法を含む。本開示の一本鎖ＲＮＡオリガミ分子に含まれ得る核酸アプタマーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、またはそれらの任意の誘導体から作製され得る。例えば、本明細書中にさらに記載されるように、ＲＮＡオリガミ分子は血液凝固に関与するタンパク質に特異的に結合し、そしてそれを調節するＲＮＡアプタマーのような、１つまたは複数の核酸アプタマーを含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーがトロンビン、第ＸＩＩａ因子、第ＸＩＩＩａ因子、第ＸＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、およびフォン・ヴィレブランド因子のうちの１つまたは複数を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の凝固タンパク質を阻害することによって、抗凝固活性を示す。いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーが血液凝固を防止し、血栓症などの状態から保護する抗トロンビン活性を示す。いくつかの実施形態では、本開示の一本鎖ＲＮＡオリガミ分子に含まれる抗トロンビンＲＮＡアプタマーが、エキソサイト１でプロトロンビンおよびトロンビンに結合するＲＮＡＲ９Ｄ－１４Ｔアプタマー（下記（Ａ））、およびトロンビンのエキソサイト２に結合するトグル－２５アプタマー（下記（Ｂ））である。
【0123】
【化1】
【0124】
本明細書中に開示されるＲＮＡオリガミ分子に含まれ得る他の核酸アプタマーとしては、血液凝固を調節することに関与する任意のアプタマーが挙げられ、これにはＡＲＣ１８３／ＨＤ１（標的ＦＩＩａ）；ＨＤ２２（標的ＦＩＩａ）；ＨＤ１－２２（標的ＦＩＩａ）；Ｔｏｇ２５（標的ＦＩＩ）；Ｒ９ｄ１４ｔ（標的ＦＩＩ／ＦＩＩａ）；１１Ｆ７ｔ（標的ＦＸａ）；１６．３（標的ＦＶＩＩａ）；７Ｓ－１／７Ｓ－２（標的ＦＶＩＩ）；９．３ｔ（標的ＦＩＸａ）；Ｒ４ｃＸＩＩ－１（標的ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ）；ＮＵ１７２（標的トロンビン）；ＲＥＧ１（標的ＦＩＸ／ＦＩＸａ）；ＲＥＧ２（標的ＦＩＸ／ＦＩＸａ）；ＡＲＣ１７７９（標的フォン・ヴィレブランド因子）；およびＡＲＣ１９４９９（標的ＴＦＰＩ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0125】
抗凝固活性を改善し、最適化するために、４つの異なる位置のＲＮＡオリガミ分子に１～４つのアプタマーを含めた。例えば、２－らせんＲＮＡオリガミ（２ＨＯ－ＲＮＡ－ＸＸＸＸ）は図１２Ａ～１２Ｂに示されるように、ＲＮＡアプタマーについて４つの可能な位置、各テトラループに１つのアプタマーを提供する。
【0126】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡオリガミ分子に含まれる二重ＲＮＡアプタマーの結合活性は、２つのアプタマー間の距離およびＲＮＡオリガミ上の異なる位置における各アプタマーの柔軟性に少なくとも部分的に依存することが決定された。これらの実施形態に従って、ＲＮＡアプタマーの４つの配置を、図１３Ａ～１３Ｄに示されるように、ＲＮＡオリガミにそれらを含めることによって設計した。用語法の目的のために、使用した特定のＲＮＡオリガミの後に４桁を加え、例えば２ＨＯ－ＲＮＡ－ＸＸＸＸ（アプタマーなし；配列番号１）とした。アプタマーおよび配置位置に応じて、Ｘは特定のアプタマーに対応する数字または文字で置き換えることができる。例えば、エキソサイト１およびエキソサイト２結合ＲＮＡアプタマーは、それぞれ「１」および「２」と呼ばれる。（アプタマー無しは「Ｎ」と定義される。）したがって、２ＨＯ－ＲＮＡ－１Ｎ２Ｎは、２－らせんＲＮＡオリガミ上の位置１に配置されたエキソサイト１結合アプタマーおよび位置３に繋がれたエキソサイト２結合アプタマー２を指す。４つの設計はすべて、図１３Ａ～１３Ｄに描写される。２ＨＯ－ＲＮＡ－ＮＮＮＮ分子を、後続の実験においてネガティブコントロールとして使用した。
【0127】
これらのＲＮＡオリガミ構造の折りたたみを、図１４～１７に示すように、オンラインソフトウェア（ｍｆｏｌｄ；ｕｎａｆｏｌｄ．ｒｎａ．ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕを参照のこと）およびＮＵＰＡＣＫ（ｎｕｐａｃｋ．ｏｒｇを参照のこと）を使用して計算的に分析した。キッシングループの構造はシミュレーションには示されていない。
【0128】
これらの実施形態によれば、アプタマーを含まない一本鎖ＲＮＡオリガミ構造は長さが約２００ヌクレオチドであり、２つのアプタマーがＲＮＡオリガミに含まれる場合は長さが約５００ヌクレオチドである。本開示に基づいて当業者によって認識されるように、アプタマーを伴うまたは伴わない一本鎖ＲＮＡ分子は化学的に、酵素的に、または細胞ベースの技術を使用して合成され得る。例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、インビトロ転写およびインビボ転写を介するＲＮＡ産生のために使用され得る。いくつかの実施形態では、二本鎖ＤＮＡを鋳型として使用し得る。例えば、ＤＮＡ鋳型は、ＲＮＡオリガミについてのブループリントおよび配列の５’末端に位置するＴ７プロモーターを含むように操作され得る。
【0129】
いくつかの実施形態では、修飾および非修飾ＲＮＡオリガミ構造の両方を生成し得る。例えば、本開示の一本鎖ＲＮＡオリガミ分子は、２’－修飾を有する少なくとも１つのヌクレオシドを含み得る。いくつかの実施形態では、本開示の一本鎖ＲＮＡオリガミ分子が少なくとも１つの２’－フルオロ－ｄＣＴＰもしくは２’－フルオロ－ｄＵＴＰ、または２’－アミノもしくは２’－Ｏ－メチルなどの２’－修飾を有する１つの他のヌクレオシド、またはホスホロチオアートなどの骨格リン酸基の化学修飾を含み得る。
【0130】
上記の設計および方法は、実施例および図面において具体化されるものを含む、本明細書に記載されるすべての核酸分子の構築に適用可能である。当業者が本開示に基づいて認識するように、上述の設計および方法はまた、例えば所望の機能性（例えば、抗トロンビン活性）に関して、本明細書に記載される核酸分子のバリエーションを生成するために使用され得る。
【0131】
３．実施例
本明細書に記載される本開示の方法の他の適切な修正および適応は容易に適用可能であり、認識可能であり、本開示の範囲または本明細書で開示される態様および実施形態から逸脱することなく、適切な均等物を使用して行われ得ることが、当業者には容易に明らかになるであろう。本開示を詳細に記載してきたが、以下の実施例を参照することによって、本開示がより明確に理解されるであろうが、それらは単に本開示のいくつかの態様および実施形態を例示することのみを意図しており、本開示の範囲を限定するものと見なされるべきではない。本明細書で参照される全ての雑誌参考文献、米国特許、および刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載される本開示の方法の他の適切な修正および適応は容易に適用可能であり、認識可能であり、本開示の範囲または本明細書で開示される態様および実施形態から逸脱することなく、適切な均等物を使用して行われ得ることが、当業者には容易に明らかになるであろう。本開示を詳細に記載してきたが、以下の実施例を参照することによって、本開示がより明確に理解されるであろうが、それらは単に本開示のいくつかの態様および実施形態を例示することのみを意図しており、本開示の範囲を限定するものと見なされるべきではない。本明細書で参照される全ての雑誌参考文献、米国特許、および刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0132】
本開示は、以下の非限定的な実施例によって例示される、複数の態様を有する。
【0133】
実施例１
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＧブロックから鋳型化されたＤＮＡの増幅。ＤＮＡ配列を増幅し、転写に使用した。各配列は二本鎖ＤＮＡであり、図１２～１７および図３５～３９に示すように、それぞれ異なるアプタマー配置を有していた。アプタマーを含まない配列をネガティブコントロールとして使用した。ＤＮＡ鋳型を、インビトロ産生のためにＰＣＲによってＧブロックから増幅した。すべてのＤＮＡ配列は、良好な転写収率で首尾よく増幅された。図１８および図３９は、全ての増幅されたＤＮＡ配列について正確なサイズの明確なバンドを有する１％アガロースゲルを示す。各増幅は、典型的には精製を行った後、約３０～６０ｎｇ／ｕｌのＤＮＡを産生した。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＧブロックから鋳型化されたＤＮＡの増幅。ＤＮＡ配列を増幅し、転写に使用した。各配列は二本鎖ＤＮＡであり、図１２～１７および図３５～３９に示すように、それぞれ異なるアプタマー配置を有していた。アプタマーを含まない配列をネガティブコントロールとして使用した。ＤＮＡ鋳型を、インビトロ産生のためにＰＣＲによってＧブロックから増幅した。すべてのＤＮＡ配列は、良好な転写収率で首尾よく増幅された。図１８および図３９は、全ての増幅されたＤＮＡ配列について正確なサイズの明確なバンドを有する１％アガロースゲルを示す。各増幅は、典型的には精製を行った後、約３０～６０ｎｇ／ｕｌのＤＮＡを産生した。
【0134】
増幅ＤＮＡからのＲＮＡオリガミの産生。次いで、ＲＮＡオリガミを転写によって産生した。２つのタイプのＲＮＡオリガミが産生された：（ｉ）非修飾ＲＮＡオリガミおよび（ｉｉ）修飾ＲＮＡオリガミ。修飾ＲＮＡオリガミを産生するために、通常のＣＴＰおよびＵＴＰの代わりに２’－フルオロ－ｄＣＴＰおよび－ｄＵＴＰを用い、未変性Ｔ７ポリメラーゼの代わりに突然変異Ｔ７ＲＮＡポリマーゼ（Ｙ６３９Ｆ）を用いた。ＤＴＴを用いて転写されたＲＮＡと用いずに転写されたＲＮＡとの差は、図１９に見ることができる。その後、ＤＴＴを各転写反応に添加した。
【0135】
サイズに基づくＲＮＡオリガミ構造の分析。非修飾ＲＮＡおよび修飾ＲＮＡを産生した。２Ｈ‐１２ＮＮを除き、すべてのＤＮＡ配列は修飾ＲＮＡと非修飾ＲＮＡに転写された。ＲＮＡは、種々のアプタマー配置を有する非修飾２らせんＲＮＡについては「２ＨＯ－ＲＮＡ－ＸＸＸＸ」と、種々のアプタマー配置を有する２らせん修飾ＲＮＡについては「２ＨＦ－ＲＮＡ－ＸＸＸＸ」と標識された。エキソサイト１および２に結合するＲＮＡアプタマーはそれぞれ「１」および「２」と標識された。図２０は、２０Ｗで１時間、６％変性アクリルアミドゲルに通したＮＮＮＮ、２ＮＮ１、および１Ｎ２Ｎ配列についての修飾および非修飾ＲＮＡバンドを示す。図２１は、ＮＮＮＮおよび１Ｎ２Ｎについての非修飾転写および４つの配列すべてについての修飾転写を示す。より鮮明な単一バンドを達成するために、図２０と比較して、より少量のＲＮＡを図２１のゲルに添加した。熱アニールに続いて、未変性ゲルを泳動して、折りたたまれた構造を特徴づけた。図２２は、２ＨＯ－ＲＮＡ－２ＮＮ１熱アニールされたサンプルおよび１ｋｂ ＤＮＡラダーを用いて、１５０Ｖで３時間泳動した６％未変性アクリルアミドゲルの実施例を示す。
【0136】
実験はまた、図３５～３８に具体化された核酸構築物を特徴付けるために行われた。図３５Ａ～３５Ｃは、３１ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡリンカーに含まれる２つのアプタマー（Ｆｓｓ１２；図３５Ａ）の代表的な２Ｄモデルを含む。図３６Ａ～３６Ｃは、４つのアプタマーを含むＲＮＡオリガミ（２Ｈ－ＲＮＡ－２２１１；図３６Ａ）の代表的な２Ｄモデルを含む。図３７Ａ～３７Ｃは、２つのアプタマーおよび３つのＡ型二重らせん構造を含むＲＮＡオリガミ（３Ｈ－ＲＮＡ－２ＮＮ１；図３７Ａ）の代表的な２Ｄモデルを含む。また、図３８Ａ～３８Ｃは、２つのアプタマーおよび４つのＡ型二重らせん構造を含むＲＮＡオリガミ（４Ｈ－ＲＮＡ－２ＮＮ１；図３８Ａ）の代表的な２Ｄモデルを含む。ｍｆｏｌｄ ＲＮＡおよびＮＵＰＡＣＫソフトウェアを使用して、上記の実施形態についてのＲＮＡオリガミ折りたたみの計算分析を分析した。紫および青の長方形はそれぞれエキソサイト－１およびエキソサイト－２結合アプタマーを表し、黄色および緑色の長方形は、それぞれテトラループおよびキッシングループモチーフを示す。
【0137】
総合すると、これらの結果は、有効な核酸ベースの抗凝固治療薬を構築するための広い程度の変動および柔軟性を提供する。特に、これらの結果はまた、トロンビンのエキソサイト１および２と結合する修飾および非修飾ＲＮＡオリガミ構造の両方を産生する能力を実証する。これは、ＤＮＡ配列の増幅、それに続く転写および熱アニーリングによって行われ、ＲＮＡオリガミ構造を生成した。図１２～１７および図３５～３８に示すように、それぞれが異なるアプタマー配置を有する（またはコントロールとしてアプタマーを有さない；図１３Ａ～１３Ｄを参照のこと）８つのタイプのオリガミ構造を作製し、それぞれをゲル電気泳動によって特徴付けた。フルオロ修飾ＮＴＰおよび突然変異Ｔ７ポリメラーゼを用いて、血漿中で安定な修飾ＲＮＡを作製した。インビトロ産生は構造の大量産生を可能にし、血漿中で凝固を引き起こすのに十分なものを作り出す。
【0138】
実施例２
抗凝固活性。ヒト血液における凝固は、血液凝固カスケード（ＢＣＣ）と呼ばれる血液中のさまざまなタンパク質間の複雑な一連の反応の結果である。本明細書で使用されるアプタマーは、ＢＣＣ中のタンパク質の１つであるトロンビンに結合する。トロンビンに結合することによって、ＲＮＡオリガミに含まれるアプタマーはＢＣＣを阻害し、凝固を遅延させる。オリガミは、２つの異なるアプタマーを使用して、ＢＣＣを妨げるトロンビンタンパク質上のエキソサイト１および２に結合する。ＢＣＣの相対的阻害は、凝固計でａＰＴＴアッセイを用いて試験することができる。凝固計は、ＣａＣｌ２を使用して人工的に凝固が誘導された後、凝固にかかる時間を測定する。この方法を用いて、本明細書に記載の一本鎖核酸分子の凝固調節効能を決定することができる。
抗凝固活性。ヒト血液における凝固は、血液凝固カスケード（ＢＣＣ）と呼ばれる血液中のさまざまなタンパク質間の複雑な一連の反応の結果である。本明細書で使用されるアプタマーは、ＢＣＣ中のタンパク質の１つであるトロンビンに結合する。トロンビンに結合することによって、ＲＮＡオリガミに含まれるアプタマーはＢＣＣを阻害し、凝固を遅延させる。オリガミは、２つの異なるアプタマーを使用して、ＢＣＣを妨げるトロンビンタンパク質上のエキソサイト１および２に結合する。ＢＣＣの相対的阻害は、凝固計でａＰＴＴアッセイを用いて試験することができる。凝固計は、ＣａＣｌ２を使用して人工的に凝固が誘導された後、凝固にかかる時間を測定する。この方法を用いて、本明細書に記載の一本鎖核酸分子の凝固調節効能を決定することができる。
【0139】
抗凝固試験のために、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方のための４つのアプタマー配置を、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ ＳｔａｇｏからのＭｏｄｅｌ ＳＴ４凝固計で試験した。得られた収集データは、２ＨＮ ＲＮＡオリガミが標準バッファーと同じ凝固時間を示したので、非修飾ＲＮＡオリガミの抗凝固活性が、全てのアプタマー配置設計において見出されなかったことを確認した。これらの結果はまた、未修飾ＲＮＡオリガミがヒト血漿中で不安定であることを確認した。しかし、修飾ＲＮＡオリガミは、１５０～２６０秒の凝固時間を有する未修飾ＲＮＡタイルと比較して顕著な活性を示した。さらに、試験されたＤＮＡタイル上に存在するＤＮＡアプタマーは以前に報告されたのと同じ抗凝固活性の傾向を示し、同様の大きさの活性を有する。試験した全てのタイルの活性を図２３に示す。
【0140】
その結果、修飾ＲＮＡはＤＮＡタイルと同等かそれ以上の有効性を有し、データは標準偏差内に収まることが実証された。１２ＮＮ、１Ｎ２Ｎ、２ＮＮ１（図２３および４８）、および２２１１（図４７および４８）のＲＮＡ構造は、程度は異なるが、すべて有意な抗凝固活性を示した。ＲＮＡアプタマーを有するＲＮＡオリガミタイルは、それらのＤＮＡ対応物より優れているとは言わないまでも同じくらい良好に予備形成された。観察された結合はまた、修飾ＲＮＡがヒト血漿中で安定であることのさらなる確認でもある。
【0141】
実施例３
特異性試験。凝固カスケードとヒト血漿の複雑な環境では、多くのタンパク質と小分子が関与し、血液中に存在する。したがって、捕捉分子のその標的への特異的結合が重要である。トロンビンは、エキソサイト１および２として知られる凝固経路の活性化のための２つの活性部位を含む。トロンビンの活性を阻害するために、本明細書にさらに記載されるように、トロンビンＲＮＡアプタマーを使用した。凝固プロセスを阻害するためにトロンビンに結合する２つのアプタマーを含有する機能性ＲＮＡオリガミ分子を設計した。トロンビン結合ＲＮＡオリガミの特異性を試験するために、凝固カスケードに全て関与するトロンビン、第ＩＸａ因子、および第Ｘａ因子を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と共に使用した。ＲＮＡオリガミ－タンパク質複合体の結合を、ゲル電気泳動移動度シフトアッセイによって特徴付けた。
特異性試験。凝固カスケードとヒト血漿の複雑な環境では、多くのタンパク質と小分子が関与し、血液中に存在する。したがって、捕捉分子のその標的への特異的結合が重要である。トロンビンは、エキソサイト１および２として知られる凝固経路の活性化のための２つの活性部位を含む。トロンビンの活性を阻害するために、本明細書にさらに記載されるように、トロンビンＲＮＡアプタマーを使用した。凝固プロセスを阻害するためにトロンビンに結合する２つのアプタマーを含有する機能性ＲＮＡオリガミ分子を設計した。トロンビン結合ＲＮＡオリガミの特異性を試験するために、凝固カスケードに全て関与するトロンビン、第ＩＸａ因子、および第Ｘａ因子を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と共に使用した。ＲＮＡオリガミ－タンパク質複合体の結合を、ゲル電気泳動移動度シフトアッセイによって特徴付けた。
【0142】
ＲＮＡオリガミ（Ｔｈ－ＲＮＡオリガミ）に含まれるＲＮＡトロンビンアプタマーとトロンビンとの結合複合体を、ゲル電気泳動移動度シフトアッセイを用いて試験した。ＲＮＡオリガミの８つの設計（トロンビンアンプタマー無しのものと、トロンビンアプタマーを含む７つの設計）について検討した。トロンビンアプタマー無しのＲＮＡオリガミ（２ＨＦ－ＲＮＡ－ＮＮＮＮ）はトロンビンと結合できなかった。トロンビンと共にインキュベートした、トロンビンを含むＲＮＡオリガミの７つの設計（２ＨＦ－ＲＮＡ－１２ＮＮ、１Ｎ２Ｎ、２ＮＮ１、Ｆｓｓ１２、２ＨＦ－２２１１、３ＨＦ－２ＮＮ１、および４ＨＦ－２ＮＮ１）はすべて、トロンビンの非存在下でのＲＮＡオリガミよりもゆっくりと移動する（図２４および４１）。さらに、タンパク質染色ゲルは、トロンビンタンパク質のスメアパターンバンドが核酸染色ゲル中のＲＮＡ－トロンビン複合体の同じ位置に現れることを示す。これらの結果は、ＲＮＡトロンビンアプタマーを有するＲＮＡオリガミがトロンビンと結合することを示す。
【0143】
凝固カスケードに関与する２種類のタンパク質（第ＩＸａ因子と第Ｘａ因子）と１種類の共通タンパク質（ウシ血清アルブミン、ＢＳＡ）を有するＴｈ‐ＲＮＡオリガミの特異性試験を行った。特異性を試験するために、ＲＮＡオリガミをタンパク質と共に３７℃で１時間インキュベートし、未変性アクリルアミドゲル電気泳動によって特徴付けた。ＲＮＡオリガミ（２ＨＦ－ＲＮＡ－ＮＮＮ）上に存在する非アプタマーは、４つのタンパク質すべてに結合することができなかった（図２５）。ＲＮＡトロンビンアプタマーを用いたＲＮＡオリガミの７つの設計（２ＨＦ－ＲＮＡ－１２ＮＮ、１Ｎ２Ｎ、２ＮＮ１、Ｆｓｓ１２、２ＨＦ－２２１１、３ＨＦ－２ＮＮ１、および４ＨＦ－２ＮＮ１）はすべて、図２６～２８および図４２～４５に示される結果のように、トロンビンと結合する特異性を示す。
【0144】
さらに、ＤＮＡウィーブタイル上に装飾されたトロンビンＤＮＡアプタマーの、トロンビンタンパク質との特異的結合も試験した。２－らせん－ＤＮＡウィーブタイル（２ＨＴ）を使用した。ＤＮＡタイルについては「Ａｐｔ－Ｐ」および「Ａｐｔ－Ｂ」と呼ばれる２つのアプタマーがトロンビンのエキソサイト１および２と結合する各設計上で伸長された。「ＮＮＮＮ」と呼ばれるＤＮＡタイルはいかなるアプタマーも含まない。２ＨＴ－ＤＮＡ－ＢＰＮＮ構築物については、アプタマーＢおよびＰをＤＮＡウィーブタイル上の１位および２位から伸長させた（図２９）。これらの結果は、２ＨＴ‐ＤＮＡ‐ＮＮＮＮとのトロンビン結合が観察されなかったことを実証する。
【0145】
２つのアプタマーおよび４つのアプタマーを含む２ＨＦ－ＲＮＡおよび２ＨＴ－ＤＮＡのトロンビンとの結合を、ゲル電気泳動移動度シフトアッセイを用いて評価した。これらの結果は、アプタマーを有するＲＮＡオリガミおよびＤＮＡウィーブタイルの両方がトロンビンと特異的に結合することを実証した。さらに、ＲＮＡオリガミと非特異的標的（第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子およびＢＳＡ因子）との非特異的結合は見出されなかった（図２６～２８および４２～４５）。
【0146】
本明細書中にさらに記載されるように、図３５～３８に具体化される核酸構築物は、有効な抗凝固活性が、テトラループおよびキッシングループの１つまたは複数を有する二本鎖ＲＮＡオリガミプラットフォームの使用と比較して、テトラループおよびキッシングループのモチーフ無しでアプタマーに連結された一本鎖ＲＮＡ（図３５Ａ～３５Ｃ）を使用して達成されたことを実証する。有効な抗凝固活性はまた、４つのアプタマーを有するが、テトラループを有さないＲＮＡオリガミプラットフォーム（図３６Ａ～３６Ｃ）を使用して達成された。さらに、有効な抗凝固活性はまた、２つのアプタマーおよびアプタマーを分離する２、３、または４つのらせん構造を有するＲＮＡオリガミプラットフォームを使用して達成される。
【0147】
実施例４
安定性試験。ＲＮＡは、遺伝子調節のような細胞生物学において極めて重要な役割を果たす機能的生体分子である。ＲＮＡは細胞生理学的状態において安定であるが、一般に、ヒト血漿において短い半減期を有する（以下の図を参照のこと）。治療目的のために機能性ＲＮＡを使用するために、ＲＮＡの安定性は、主要な課題の１つである。リボース糖の２’修飾は、ヒト血漿のようなヌクレアーゼ状態におけるＲＮＡの安定性の改善のために広く使用されている。リボザイムに組み込まれた２’－フルオロ－および２’－アミノ修飾ヌクレオチドは、リボヌクレアーゼ劣化に抵抗的であることが以前に報告されている。重要なことに、２’‐フルオロ‐ｄＣＴＰおよび２’‐フルオロ‐ｄＵＴＰはリボザイムの触媒活性に影響しなかった。したがって、２’‐フルオロ‐ＣＴＰおよび‐ＵＴＰをＲＮＡオリガミのインビトロ産生のための構成要素として選択した。
安定性試験。ＲＮＡは、遺伝子調節のような細胞生物学において極めて重要な役割を果たす機能的生体分子である。ＲＮＡは細胞生理学的状態において安定であるが、一般に、ヒト血漿において短い半減期を有する（以下の図を参照のこと）。治療目的のために機能性ＲＮＡを使用するために、ＲＮＡの安定性は、主要な課題の１つである。リボース糖の２’修飾は、ヒト血漿のようなヌクレアーゼ状態におけるＲＮＡの安定性の改善のために広く使用されている。リボザイムに組み込まれた２’－フルオロ－および２’－アミノ修飾ヌクレオチドは、リボヌクレアーゼ劣化に抵抗的であることが以前に報告されている。重要なことに、２’‐フルオロ‐ｄＣＴＰおよび２’‐フルオロ‐ｄＵＴＰはリボザイムの触媒活性に影響しなかった。したがって、２’‐フルオロ‐ＣＴＰおよび‐ＵＴＰをＲＮＡオリガミのインビトロ産生のための構成要素として選択した。
【0148】
【化2】
【0149】
上記に示すように、（Ａ）未変性ヌクレオチド、シチジン－５’－三リン酸（ＣＴＰ）および（Ｂ－Ｄ）修飾ヌクレオチド、（Ｂ）２’－フルオロ－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸（２’Ｆ－ｄＣＴＰ）、（Ｃ）２’－アミノ－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸（２’－アミノ－ｄＣＴＰ）、および（Ｄ）２’－Ｏ－メチルシチジン－５’－三リン酸（２’－Ｏ－メチル－ＣＴＰ）。シトシン、リボース糖、三リン酸、および２’修飾を、それぞれ緑、青、橙、および黄色の長方形で示す。
【0150】
ＲＮａｓｅ Ａ中のＲＮＡオリガミの安定性を試験するために、非修飾および修飾ＲＮＡオリガミをＲＮａｓｅ Ａ（１０および５００μｇ／ｍｌ）と共に３７℃で１０分間～２４時間インキュベートした。ＲＮＡオリガミの完全性を、変性ゲル電気泳動を使用することによって特徴付けた（図３０～３１）。結果が示すように、非修飾ＲＮＡオリガミは、ＲＮａｓｅ Ａ含有溶液中で１０分以内に分解された（図３０Ｂ）。２’－フルオロ－ＣＴＰおよび２’－フルオロ－ＵＴＰ修飾ＲＮＡオリガミは、１０μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ Ａ中で少なくとも６時間安定である（図３０Ａ）。高濃度のＲＮａｓｅ Ａ（５００μｇ／ｍｌ）では、修飾ＲＮＡオリガミが図３１Ａに示すように３０分間安定であった。
【0151】
治療への適用では、ヒト血漿中の抗凝固剤の安定性が重要である。ヒト血漿は、ＤＮＡおよびＲＮＡ構造を分解するＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅなどの複数の成分を含有する。ここでは、プールされたヒト血漿中のＲＮＡオリガミとＤＮＡタイルの抵抗を試験した。変性ゲル電気泳動を使用して、核酸ナノ構造の完全性を特徴付けた。ＲＮＡオリガミおよびＤＮＡタイルを、１０分から２４時間までの種々の時点でヒト血漿とインキュベートした。２’フルオロ修飾ＲＮＡオリガミは図３２Ａ～３２Ｂに示すように、２４時間にわたってヒト血漿中で安定であった。図３２Ａの頂部バンドに現れたＲＮＡの強度は、ヒト血漿中のトロンビンと依然として結合する、いくらかの量のＲＮＡオリガミを示す。非修飾ＲＮＡオリガミは１０分未満で分解された（図３３）。ＤＮＡウィーブタイルは、ヒト血漿中で６時間安定である（図３４）。これらの結果は、２’‐フルオロ修飾ＲＮＡオリガミがヒト血漿中のＤＮＡタイルよりも安定であることを実証する。
【0152】
未変性ＲＮＡオリガミは、１０分未満でリボヌクレアーゼによって分解される。治療への適用で機能性ＲＮＡオリガミを使用するためには、ＲＮＡオリガミの安定性が重要である。これらの結果は、２’－フルオロ修飾ＲＮＡオリガミがＲＮａｓｅ Ａ中で少なくとも６時間安定であることを実証する。さらに、修飾されたＲＮＡオリガミは、ＤＮＡタイルよりも安定である２４時間にわたってヒト血漿中で安定である。２４時間にわたるヒト血漿中の２’－フルオロ修飾ＲＮＡオリガミの安定性は、ＲＮＡオリガミが治療への応用に使用するための有望な生体分子であることを実証する。
【0153】
図４６に示すように、本開示の核酸アプタマー構築物の貯蔵安定性も試験した。一実施形態では、使用した保存バッファーが２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および２ｍＭ ＣａＣｌ２を含んでいた。本開示に基づいて当業者によって認識されるように、この保存バッファーの成分は、アプタマー構築物が貯蔵される状況に依存して、±２５％まで変化し得る。例えば、図４６に示すように、新たに調製した２ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１サンプルの平均的な抗凝固活性を、４℃で９０日まで保存したサンプルと比較した。結果は、ＲＮＡオリガミ抗凝固剤が４℃で保存した後、少なくとも３ヶ月間安定であり、活性であることを実証する。
【0154】
これらの実施形態に従って、本開示の核酸アプタマー構築物は抗凝固活性の有意な損失無しに、室温～－２０℃までの範囲の温度で保存することができる。いくつかの実施形態において、本開示の核酸アプタマー構築物は長期保存の前に、保存バッファーに直接溶解され得、かつ／または水（例えば、超純水）中で凍結乾燥され得る。いくつかの実施形態では、本開示の核酸アプタマー構築物が保存バッファーに溶解された後、水に溶解され、次いで凍結乾燥され、保存される。使用前に、核酸アプタマー構築物は再構成され得、そして特定の期間（例えば、３０分間）、適切に折りたたむことが可能であり得る。他の実施形態において、本開示の核酸アプタマー構築物は、凍結乾燥前に保存バッファー中で適切に折りたたむことが可能であり得る。使用前に、水またはバッファーを添加して、凍結乾燥構築物を溶解し得、これは、一般的に機能的であり、そして使用のための準備が整うだろう。
【0155】
実施例５
トロンビン阻害の逆転。凝固カスケードの制御は、外科的および疾患への適用に有益である。化学ベースの抗凝固薬が開発され、頻繁に使用されているが、治療ウィンドウが小さい（治療用量と毒性用量の濃度差が狭い）ため、大出血や出血などの危険な副作用を防ぐために、患者を常に監視する必要がある。代替的な解決策は、大出血を決して誘発せず、利用可能な解毒剤によって止めることができる核酸ベースの抗凝固剤である。
トロンビン阻害の逆転。凝固カスケードの制御は、外科的および疾患への適用に有益である。化学ベースの抗凝固薬が開発され、頻繁に使用されているが、治療ウィンドウが小さい（治療用量と毒性用量の濃度差が狭い）ため、大出血や出血などの危険な副作用を防ぐために、患者を常に監視する必要がある。代替的な解決策は、大出血を決して誘発せず、利用可能な解毒剤によって止めることができる核酸ベースの抗凝固剤である。
【0156】
アプタマーベースの抗凝固剤のための解毒剤は、アプタマー配列に相補的なヌクレオチド配列を有する一本鎖核酸（ＤＮＡおよびＰＮＡ）の短鎖であり得る。以前の研究はｓｓＤＮＡ解毒剤の添加によるトロンビン活性の逆転阻害と再活性化を示した。これはまた、ＤＮＡタイル上のＤＮＡアプタマーでも実証された。ＲＮＡアプタマーを有するＲＮＡオリガミは、（本明細書中で実証されるように）遊離アプタマーと比較して高い抗凝固活性を提供する。トロンビン阻害の逆転は、強固なトロンビン結合およびアプタマーの安定な折りたたみを中断する必要性のために、困難であり得る。ここで、凝固活性のリカバリーを、エキソサイト－１およびエキソサイト－２結合アプタマーの相補的対応物である解毒剤を添加することによって試験した。凝固カスケードを調節するためのこの解毒機構は、医学的処置および疾患治療中に大きな利益を提供する可能性がある。
【0157】
図５０Ａ～５０Ｂに示されるように、２ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１の解毒剤は、両方のアプタマーのためのＤＮＡから作製されて設計された。ＲＮＡオリガミを血漿およびａＰＴＴアッセイのための他の試薬と共にインキュベートした後、解毒剤を添加し、サンプル全体をさらに５分間インキュベートした。
【0158】
解毒剤試験は８０％のリカバリーである約８５秒の平均凝固時間を明らかにした（トロンビンはなお２０％阻害された）ので、データは解毒剤の添加で活性の逆転が可能であることを示した。不完全な逆転は、解毒剤が２つのアプタマーの一方への鎖侵入にあまり有効でないこと、またはトロンビン結合を妨げるために必要な解毒剤の濃度の差によるものであり得る。さらに、図５１に示すように、２ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１に対するペプチド核酸（ＰＮＡ）解毒剤も有効であり、ＤＮＡベースの対応物よりも有意に有効であった。
【0159】
２ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１オリガミは０．５μＭ程度の低い濃度で、凝固を阻害し、遅延させるのに有効であることが示されている。しかし、ＲＮＡオリガミおよびＲＮＡアプタマー設計の別の利点はアプタマーへの解毒剤の容易な実施であり、例えば、外科医が抗凝固を止めることを可能にする。トロンビンの活性は、実証されるように、ｓｓＤＮＡ解毒剤を使用して約８０％リカバリーすることができ、またはＰＮＡ解毒剤を使用して少なくとも８０％リカバリーすることができる。
【0160】
４．材料および方法
Ｇブロック配列の増幅を行った。反応バッファー、フォワードおよびリバースプライマー、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼおよびヌクレアーゼフリー水を、表１に示す濃度でＰＣＲチューブに添加した。ＤＮＡポリメラーゼを最後に添加し、サンプルをピペットで混合した。
Ｇブロック配列の増幅を行った。反応バッファー、フォワードおよびリバースプライマー、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼおよびヌクレアーゼフリー水を、表１に示す濃度でＰＣＲチューブに添加した。ＤＮＡポリメラーゼを最後に添加し、サンプルをピペットで混合した。
【0161】
【表1】
【0162】
サンプルをサーモサイクラーに入れ、以下のプロトコルをＰＣＲに使用した：
【0163】
【化3】
【0164】
ＰＣＲ後、少量の増幅ＤＮＡサンプル（約２～５μｌ）を１％アガロースゲル中で試験に使用した。ＤＮＡを１ｋｂラダー（Ｐｒｏｍｅｇａ）のそばに１５０Ｖで３０分間泳動した。次いで、ゲルをＵＶ光（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）下で観察した。適切なバンドサイズが観察された場合、次いで、残りのＤＮＡサンプルを、ＧＦＸ ＤＮＡ精製キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する溶液内精製のために使用した。約１μｌの精製溶液を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ３０００ｃ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用する分析のために使用した。濃度をさらなる使用のために記録し、ＤＮＡを保持し、後の転写のために標識した（２Ｈ－ＸＸＸＸ）。
【0165】
次に、非修飾転写を行った。ＲＮＡ Ｔ７ポリメラーゼを除く以下の表２に見られる全ての内容物を、ＰＣＲチューブ中で混合した。使用したＤＴＴは、新鮮さを確保するために実験室で混合したことに注意すべきである。最後に、ＲＮＡ Ｔ７ポリメラーゼを添加し、サンプルをピペットで混合した。サンプルを氷上で合成して、ＲＮＡの産生に負の影響を及ぼすＲＮａｓｅなどの酵素を試み、減速させた。一度、全ての成分を添加し、混合したら、サンプルをサーモサイクラーに入れ、３７℃で４～１６時間インキュベートし、次いで４℃に保持した。
【0166】
【表2】
【0167】
フルオロ修飾転写については上記と同じプロトコルに従ったが、以下の表３に見出される内容物を使用した：
【0168】
【表3】
【0169】
転写後、少量のサンプル（約５μｌ）を６％アクリルアミド変性ゲルで観察するために使用した。サンプルを核酸メーカーのそばで２０Ｗで１時間泳動した。次いで、ゲルをＵＶ光下で観察して、正しい長さについてチェックした。配列長が正しく、良好なバンドが存在する場合、次いで、Ｍｏｎａｒｃｈ ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐキットを使用してサンプルを精製した。約３１μｌの溶出バッファーを精製に使用し、１μｌのサンプルをＮａｎｏｄｒｏｐ ３０００ｃでの分析に使用した。光学密度（Ａ２６０）を記録し、ベールの法則を用いてサンプルのモル濃度を計算した。
【0170】
次に、サンプルを９５℃で５分間加熱し、続いて－２０℃で３分間冷却することによって熱アニールした。次いで、５Ｘ ＤＮＡタイルバッファーを添加し、サンプルを３７℃に３０分間加熱した。１Ｘ ＤＮＡタイルバッファーを使用して、さらなる使用のためにサンプルを所望の容量に希釈した。
【0171】
ＡＰＰＴ凝固試験は、抗凝固アプタマーを使用してＤＮＡ／ＲＮＡタイルを用いてプールされたヒト血漿の凝固時間を評価した。プールされたヒト血漿５０μＬ、ａＰＴＴ試薬５０μＬ、およびＣａＣｌ２溶液５０μＬ中で、ＲＮＡタイルおよびＤＮＡタイルの両方の５μＭサンプル約１６．６７μＬを試験した。
【0172】
特異性試験のために、熱アニールしたＲＮＡオリガミまたはＤＮＡウィーブタイル（５ｐｍｏｌ）を１Ｘアニールバッファーに溶解し、タンパク質（２５ｐｍｏｌ）と共に３７℃で１時間インキュベートした。サンプルを、泳動バッファーとして１Ｘ ＴＢＥ中の６％未変性アクリルアミドゲル電気泳動により、１５０Ｖで３時間試験した。ゲルを、核酸染色のために臭化エチジウムで染色し、ＵＶランプ下で可視化した。次いで、ゲルをタンパク質染色のためにクマシーブルーでさらに染色し、ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ機器で画像化した。
【0173】
ＲＮＡオリガミを折りたたむために、非修飾および修飾ＲＮＡオリガミをヌクレアーゼフリー水に溶解し、９５℃で５分間加熱し、－２０℃で３分間急速に冷却した。次に、サンプルを５Ｘアニーリングバッファーと混合して１Ｘバッファーで濃度を得、３７℃で３０分間アニールした。最後に、１Ｘバッファーを折り畳まれたＲＮＡオリガミに添加して、所望の濃度を得た。折りたたまれたＲＮＡオリガミ（１μｌ、５μＭ）をＲＮａｓｅ Ａ（１０および５００μｇ／ｍｌの１μｌ）またはヒト血漿（３μｌ）と混合し、３７℃で１０分から２４時間の様々なタイムコースでインキュベートした。ＲＮＡオリガミの完全性は、変性ゲル電気泳動によって特徴付けられた。変性ゲル電気泳動のために、ゲルを２０ Ｗで１５分間予備泳動し、サンプルを２０ Ｗで１時間泳動した。最後に、核酸染色のために、ゲルを臭化エチジウムで染色した。核酸バンドを、ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ機器のＵＶランプ下で可視化した。
【0174】
解毒剤試験のために、凝固試験を、モデルＳＴ４凝固計（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ）を用いて、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）アッセイで行った。約５０μＬのプールされたヒト血漿（Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏ－Ｍｅｄｉｃａｌ）を各キュベットに添加し、５０μＬのａＰＴＴ試薬（ＴｒｉｎｉＣｌｏｔ）と混合し、３７℃で５分間インキュベートした。次に、１３．６７μＬの６．０９μＭ ＲＮＡオリガミサンプルまたはバッファーを添加し、３７℃でさらに５分間インキュベートした。５分後、３．００μＬのＤＮＡまたはＰＮＡ解毒剤を添加し、３７℃でさらに５分間インキュベートした。凝固を活性化するために、５０μＬのＣａＣｌ２溶液を添加した。ＲＮＡサンプルの最終濃度は０．５μＭであった。次いで、凝固までの時間を機械によって測定し、記録した。
【0175】
５．配列
以下の核酸は本明細書中で参照されるように、本開示によって提供される。
以下の核酸は本明細書中で参照されるように、本開示によって提供される。
【0176】
ＲＮＡ－ＮＮＮＮ（配列番号１）
ＧＧＧＡＧＡＵＣＧＡＧＣＧＡＣＵＵＣＣＧＡＣＵＵＣＧＧＵＣＧＧＧＡＧＵＣＧＧＧＣＵＡＧＵＣＡＵＣＵＵＣＧＧＡＵＧＡＵＵＡＧＣＣＧＣＵＧＧＵＧＡＡＧＣＣＵＣＣＡＣＧＣＣＡＧＣＣＵＣＧＧＵＣＵＣＣＣＧＣＡＧＵＡＧＧＡＵＣＧＧＡＣＵＧＡＡＧＧＡＧＧＣＡＣＧＧＵＣＣＣＡＧＣＣＧＡＡＧＵＧＵＣＵＵＧＣＵＵＣＧＧＣＡＡＧＧＣＡＣＵＵＵＧＧＣＵＧＣＵＡＧＡＣＵＧＧＣＵＧＧＣＵＵＣＧＧＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵＵＡＧＧＡＵＵＣＵＡＵＵＧＣ
ＲＮＡ－１２ＮＮ（配列番号２）
ＧＧＧＡＧＡＵＣＧＡＧＣＧＡＣＵＵＣＣＧＡＣＵＵＣＧＧＵＣＧＧＧＡＧＵＣＧＧＧＣＵＡＧＵＣＡＵＣＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＵＧＡＡＧＵＡＣＵＵＡＣＣＣＧＡＵＧＡＵＵＡＧＣＣＧＣＵＧＧＵＧＡＡＧＣＣＵＣＣＡＣＧＣＣＡＧＣＣＵＣＧＧＵＣＵＣＣＣＧＣＡＧＵＡＧＧＡＵＣＧＧＡＣＵＧＡＡＧＧＡＧＧＣＡＣＧＧＵＣＣＣＡＧＣＣＧＡＡＧＵＧＵＣＵＧＧＣＧＧＵＣＧＡＵＣＡＣＡＣＡＧＵＵＣＡＡＡＣＧＵＡＡＵＡＡＧＣＣＡＡＵＧＵＡＣＧＡＧＧＣＡＧＡＣＧＡＣＵＣＧＣＣＡＧＧＣＡＣＵＵＵＧＧＣＵＧＣＵＡＧＡＣＵＧＧＣＵＧＧＣＵＵＣＧＧＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵＵＡＧＧＡＵＵＣＵＡＵＵＧＣ
ＲＮＡ－１Ｎ２Ｎ（配列番号３）
ＧＧＧＡＧＡＵＣＧＡＧＣＧＡＣＵＵＣＣＧＡＣＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＵＧＡＡＧＵＡＣＵＵＡＣＣＣＧＵＣＧＧＧＡＧＵＣＧＧＧＣＵＡＧＵＣＡＵＣＵＵＣＧＧＡＵＧＡＵＵＡＧＣＣＧＣＵＧＧＵＧＡＡＧＣＣＵＣＣＡＣＧＣＣＡＧＣＣＵＣＧＧＵＣＵＣＣＣＧＣＡＧＵＡＧＧＡＵＣＧＧＡＣＵＧＡＡＧＧＡＧＧＣＡＣＧＧＵＣＣＣＡＧＣＣＧＡＡＧＵＧＵＣＵＧＧＣＧＧＵＣＧＡＵＣＡＣＡＣＡＧＵＵＣＡＡＡＣＧＵＡＡＵＡＡＧＣＣＡＡＵＧＵＡＣＧＡＧＧＣＡＧＡＣＧＡＣＵＣＧＣＣＡＧＧＣＡＣＵＵＵＧＧＣＵＧＣＵＡＧＡＣＵＧＧＣＵＧＧＣＵＵＣＧＧＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵＵＡＧＧＡＵＵＣＵＡＵＵＧＣ
ＲＮＡ－２ＮＮ１（配列番号４）
ＧＧＧＡＧＡＵＣＧＡＧＣＧＡＣＵＵＣＣＧＡＣＵＵＣＧＧＵＣＧＧＧＡＧＵＣＧＧＧＣＵＡＧＵＣＡＵＣＵＵＣＧＧＡＵＧＡＵＵＡＧＣＣＧＣＵＧＧＵＧＡＡＧＣＣＵＣＣＡＣＧＣＣＡＧＣＣＵＣＧＧＵＣＵＣＣＣＧＣＡＧＵＡＧＧＡＵＣＧＧＡＣＵＧＡＡＧＧＡＧＧＣＡＣＧＧＵＣＣＣＡＧＣＣＧＡＡＧＵＧＵＣＵＵＧＣＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＵＧＡＡＧＵＡＣＵＵＡＣＣＣＧＣＡＡＧＧＣＡＣＵＵＵＧＧＣＵＧＣＵＡＧＡＣＵＧＧＣＵＧＧＣＧＧＣＧＧＵＣＧＡＵＣＡＣＡＣＡＧＵＵＣＡＡＡＣＧＵＡＡＵＡＡＧＣＣＡＡＵＧＵＡＣＧＡＧＧＣＡＧＡＣＧＡＣＵＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵＵＡＧＧＡＵＵＣＵＡＵＵＧＣ
Ｆｓｓ１２（配列番号５）
ＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＵＧＡＡＧＵＡＣＵＵＡＣＣＣＡＣＣＵＵＡＣＣＡＣＵＣＣＡＣＣＵＣＡＣＵＣＡＣＣＵＡＵＵＡＣＧＧＣＧＧＵＣＧＡＵＣＡＣＡＣＡＧＵＵＣＡＡＡＣＧＵＡＡＵＡＡＧＣＣＡＡＵＧＵＡＣＧＡＧＧＣＡＧＡＣＧＡＣＵＣＧＣＣ
２Ｈ－２２１１（配列番号６）
ＧＧＧＡＧＡＵＣＧＡＧＣＧＡＣＵＵＣＣＧＡＣＵＣＵＧＧＣＧＧＵＣＧＡＵＣＡＣＡＣＡＧＵＵＣＡＡＡＣＧＵＡＡＵＡＡＧＣＣＡＡＵＧＵＡＣＧＡＧＧＣＡＧＡＣＧＡＣＵＣＧＣＣＡＧＡＧＵＣＧＧＧＡＧＵＣＧＧＧＣＵＡＧＵＣＡＵＣＡＧＧＣＡＣＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＵＧＡＡＧＵＡＣＵＵＡＣＣＣＧＵＧＣＣＵＧＡＵＧＡＵＵＡＧＣＣＧＣＵＧＧＵＧＡＡＧＣＣＵＣＣＡＣＧＣＣＡＧＣＣＵＣＧＧＵＣＵＣＣＣＧＣＡＧＵＡＧＧＡＵＣＧＧＡＣＵＧＡＡＧＧＡＧＧＣＡＣＧＧＵＣＣＣＡＧＣＣＧＡＡＧＵＧＵＣＵＵＧＣＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＵＧＡＡＧＵＡＣＵＵＡＣＣＣＧＣＡＡＧＧＣＡＣＵＵＵＧＧＣＵＧＣＵＡＧＡＣＵＧＧＣＵＧＧＣＧＧＣＧＧＵＣＧＡＵＣＡＣＡＣＡＧＵＵＣＡＡＡＣＧＵＡＡＵＡＡＧＣＣＡＡＵＧＵＡＣＧＡＧＧＣＡＧＡＣＧＡＣＵＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵＵＡＧＧＡＵＵＣＵＡＵＵＧＣ
３Ｈ－２ＮＮ１（配列番号７）
ＧＧＡＡＡＵＧＡＵＧＣＣＧＡＧＵＵＧＡＣＧＣＵＵＣＧＧＣＧＵＣＡＧＣＵＣＧＣＣＣＵＧＵＧＧＣＣＵＡＧＵＵＣＧＣＵＡＧＧＵＣＡＣＡＧＡＣＡＵＣＵＵＧＧＣＧＵＵＣＧＣＧＣＣＡＧＧＡＵＧＵＣＵＣＧＣＣＣＡＡＵＵＣＣＧＵＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＵＡＧＣＣＡＡＡＵＣＣＡＧＡＧＧＣＵＡＧＣＡＵＵＡＵＵＵＣＣＧＡＵＣＵＡＧＧＡＵＣＧＣＧＵＵＧＡＧＡＡＣＵＧＧＡＵＡＣＵＣＡＡＣＡＧＣＧＧＵＡＡＡＣＧＧＡＡＡＡＣＣＧＣＵＣＡＧＣＣＧＡＡＧＵＧＵＣＵＵＧＣＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＵＧＡＡＧＵＡＣＵＵＡＣＣＣＧＣＡＡＧＧＣＡＣＵＵＵＧＧＣＵＧＧＣＣＡＣＧＣＧＵＣＧＵＡＵＵＣＧＵＡＣＧＧＣＧＣＧＵＧＣＵＡＧＡＣＵＧＧＣＵＧＧＣＧＧＣＧＧＵＣＧＡＵＣＡＣＡＣＡＧＵＵＣＡＡＡＣＧＵＡＡＵＡＡＧＣＣＡＡＵＧＵＡＣＧＡＧＧＣＡＧＡＣＧＡＣＵＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵＵＡＧＧＡＵＵＣＵＡＧＡＵＣ
４Ｈ－２ＮＮ１（配列番号８）
ＧＧＡＡＡＵＧＡＵＧＣＣＧＡＧＵＵＧＡＣＧＣＵＵＣＧＧＣＧＵＣＡＧＣＵＣＧＣＣＣＵＧＵＧＧＣＣＵＡＧＵＵＣＧＣＵＡＧＧＵＣＡＣＡＧＣＣＧＡＣＣＡＵＵＧＣＧＵＵＵＣＧＡＣＧＣＡＧＵＧＧＵＣＡＣＡＵＣＵＵＧＧＣＧＵＵＣＧＣＧＣＣＡＧＧＡＵＧＵＣＵＣＧＣＣＣＡＡＵＵＣＣＧＵＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＧＡＣＣＣＡＡＡＵＣＣＣＵＡＧＧＧＵＣＧＧＵＡＧＣＣＡＡＡＵＣＣＡＧＡＧＧＣＵＡＧＣＡＵＵＡＵＵＵＣＣＧＡＵＣＵＡＧＧＡＵＣＧＣＧＵＵＧＡＧＡＡＣＵＧＧＡＵＡＣＵＣＡＡＣＣＧＵＧＧＣＡＵＡＡＡＧＧＧＡＵＡＡＵＧＣＣＡＡＧＣＧＧＵＡＡＡＣＧＧＡＡＡＡＣＣＧＣＵＣＡＧＣＣＧＡＡＧＵＧＵＣＵＵＧＣＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＵＧＡＡＧＵＡＣＵＵＡＣＣＣＧＣＡＡＧＧＣＡＣＵＵＵＧＧＣＵＧＣＧＵＧＧＣＧＵＵＡＣＡＧＵＵＣＧＣＵＧＵＧＡＣＧＣＣＡＧＣＣＡＣＧＣＧＵＣＧＵＡＵＵＣＧＵＡＣＧＧＣＧＣＧＵＧＣＵＡＧＡＣＵＧＧＣＵＧＧＣＧＧＣＧＧＵＣＧＡＵＣＡＣＡＣＡＧＵＵＣＡＡＡＣＧＵＡＡＵＡＡＧＣＣＡＡＵＧＵＡＣＧＡＧＧＣＡＧＡＣＧＡＣＵＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵＵＡＧＧＡＵＵＣＵＡＧＡＵＣ
Ｇブロック配列を以下に提供する（Ｔ７プロモーターは太字である）。
ＧＧＧＡＧＡＵＣＧＡＧＣＧＡＣＵＵＣＣＧＡＣＵＵＣＧＧＵＣＧＧＧＡＧＵＣＧＧＧＣＵＡＧＵＣＡＵＣＵＵＣＧＧＡＵＧＡＵＵＡＧＣＣＧＣＵＧＧＵＧＡＡＧＣＣＵＣＣＡＣＧＣＣＡＧＣＣＵＣＧＧＵＣＵＣＣＣＧＣＡＧＵＡＧＧＡＵＣＧＧＡＣＵＧＡＡＧＧＡＧＧＣＡＣＧＧＵＣＣＣＡＧＣＣＧＡＡＧＵＧＵＣＵＵＧＣＵＵＣＧＧＣＡＡＧＧＣＡＣＵＵＵＧＧＣＵＧＣＵＡＧＡＣＵＧＧＣＵＧＧＣＵＵＣＧＧＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵＵＡＧＧＡＵＵＣＵＡＵＵＧＣ
ＲＮＡ－１２ＮＮ（配列番号２）
ＧＧＧＡＧＡＵＣＧＡＧＣＧＡＣＵＵＣＣＧＡＣＵＵＣＧＧＵＣＧＧＧＡＧＵＣＧＧＧＣＵＡＧＵＣＡＵＣＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＵＧＡＡＧＵＡＣＵＵＡＣＣＣＧＡＵＧＡＵＵＡＧＣＣＧＣＵＧＧＵＧＡＡＧＣＣＵＣＣＡＣＧＣＣＡＧＣＣＵＣＧＧＵＣＵＣＣＣＧＣＡＧＵＡＧＧＡＵＣＧＧＡＣＵＧＡＡＧＧＡＧＧＣＡＣＧＧＵＣＣＣＡＧＣＣＧＡＡＧＵＧＵＣＵＧＧＣＧＧＵＣＧＡＵＣＡＣＡＣＡＧＵＵＣＡＡＡＣＧＵＡＡＵＡＡＧＣＣＡＡＵＧＵＡＣＧＡＧＧＣＡＧＡＣＧＡＣＵＣＧＣＣＡＧＧＣＡＣＵＵＵＧＧＣＵＧＣＵＡＧＡＣＵＧＧＣＵＧＧＣＵＵＣＧＧＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵＵＡＧＧＡＵＵＣＵＡＵＵＧＣ
ＲＮＡ－１Ｎ２Ｎ（配列番号３）
ＧＧＧＡＧＡＵＣＧＡＧＣＧＡＣＵＵＣＣＧＡＣＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＵＧＡＡＧＵＡＣＵＵＡＣＣＣＧＵＣＧＧＧＡＧＵＣＧＧＧＣＵＡＧＵＣＡＵＣＵＵＣＧＧＡＵＧＡＵＵＡＧＣＣＧＣＵＧＧＵＧＡＡＧＣＣＵＣＣＡＣＧＣＣＡＧＣＣＵＣＧＧＵＣＵＣＣＣＧＣＡＧＵＡＧＧＡＵＣＧＧＡＣＵＧＡＡＧＧＡＧＧＣＡＣＧＧＵＣＣＣＡＧＣＣＧＡＡＧＵＧＵＣＵＧＧＣＧＧＵＣＧＡＵＣＡＣＡＣＡＧＵＵＣＡＡＡＣＧＵＡＡＵＡＡＧＣＣＡＡＵＧＵＡＣＧＡＧＧＣＡＧＡＣＧＡＣＵＣＧＣＣＡＧＧＣＡＣＵＵＵＧＧＣＵＧＣＵＡＧＡＣＵＧＧＣＵＧＧＣＵＵＣＧＧＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵＵＡＧＧＡＵＵＣＵＡＵＵＧＣ
ＲＮＡ－２ＮＮ１（配列番号４）
ＧＧＧＡＧＡＵＣＧＡＧＣＧＡＣＵＵＣＣＧＡＣＵＵＣＧＧＵＣＧＧＧＡＧＵＣＧＧＧＣＵＡＧＵＣＡＵＣＵＵＣＧＧＡＵＧＡＵＵＡＧＣＣＧＣＵＧＧＵＧＡＡＧＣＣＵＣＣＡＣＧＣＣＡＧＣＣＵＣＧＧＵＣＵＣＣＣＧＣＡＧＵＡＧＧＡＵＣＧＧＡＣＵＧＡＡＧＧＡＧＧＣＡＣＧＧＵＣＣＣＡＧＣＣＧＡＡＧＵＧＵＣＵＵＧＣＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＵＧＡＡＧＵＡＣＵＵＡＣＣＣＧＣＡＡＧＧＣＡＣＵＵＵＧＧＣＵＧＣＵＡＧＡＣＵＧＧＣＵＧＧＣＧＧＣＧＧＵＣＧＡＵＣＡＣＡＣＡＧＵＵＣＡＡＡＣＧＵＡＡＵＡＡＧＣＣＡＡＵＧＵＡＣＧＡＧＧＣＡＧＡＣＧＡＣＵＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵＵＡＧＧＡＵＵＣＵＡＵＵＧＣ
Ｆｓｓ１２（配列番号５）
ＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＵＧＡＡＧＵＡＣＵＵＡＣＣＣＡＣＣＵＵＡＣＣＡＣＵＣＣＡＣＣＵＣＡＣＵＣＡＣＣＵＡＵＵＡＣＧＧＣＧＧＵＣＧＡＵＣＡＣＡＣＡＧＵＵＣＡＡＡＣＧＵＡＡＵＡＡＧＣＣＡＡＵＧＵＡＣＧＡＧＧＣＡＧＡＣＧＡＣＵＣＧＣＣ
２Ｈ－２２１１（配列番号６）
ＧＧＧＡＧＡＵＣＧＡＧＣＧＡＣＵＵＣＣＧＡＣＵＣＵＧＧＣＧＧＵＣＧＡＵＣＡＣＡＣＡＧＵＵＣＡＡＡＣＧＵＡＡＵＡＡＧＣＣＡＡＵＧＵＡＣＧＡＧＧＣＡＧＡＣＧＡＣＵＣＧＣＣＡＧＡＧＵＣＧＧＧＡＧＵＣＧＧＧＣＵＡＧＵＣＡＵＣＡＧＧＣＡＣＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＵＧＡＡＧＵＡＣＵＵＡＣＣＣＧＵＧＣＣＵＧＡＵＧＡＵＵＡＧＣＣＧＣＵＧＧＵＧＡＡＧＣＣＵＣＣＡＣＧＣＣＡＧＣＣＵＣＧＧＵＣＵＣＣＣＧＣＡＧＵＡＧＧＡＵＣＧＧＡＣＵＧＡＡＧＧＡＧＧＣＡＣＧＧＵＣＣＣＡＧＣＣＧＡＡＧＵＧＵＣＵＵＧＣＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＵＧＡＡＧＵＡＣＵＵＡＣＣＣＧＣＡＡＧＧＣＡＣＵＵＵＧＧＣＵＧＣＵＡＧＡＣＵＧＧＣＵＧＧＣＧＧＣＧＧＵＣＧＡＵＣＡＣＡＣＡＧＵＵＣＡＡＡＣＧＵＡＡＵＡＡＧＣＣＡＡＵＧＵＡＣＧＡＧＧＣＡＧＡＣＧＡＣＵＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵＵＡＧＧＡＵＵＣＵＡＵＵＧＣ
３Ｈ－２ＮＮ１（配列番号７）
ＧＧＡＡＡＵＧＡＵＧＣＣＧＡＧＵＵＧＡＣＧＣＵＵＣＧＧＣＧＵＣＡＧＣＵＣＧＣＣＣＵＧＵＧＧＣＣＵＡＧＵＵＣＧＣＵＡＧＧＵＣＡＣＡＧＡＣＡＵＣＵＵＧＧＣＧＵＵＣＧＣＧＣＣＡＧＧＡＵＧＵＣＵＣＧＣＣＣＡＡＵＵＣＣＧＵＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＵＡＧＣＣＡＡＡＵＣＣＡＧＡＧＧＣＵＡＧＣＡＵＵＡＵＵＵＣＣＧＡＵＣＵＡＧＧＡＵＣＧＣＧＵＵＧＡＧＡＡＣＵＧＧＡＵＡＣＵＣＡＡＣＡＧＣＧＧＵＡＡＡＣＧＧＡＡＡＡＣＣＧＣＵＣＡＧＣＣＧＡＡＧＵＧＵＣＵＵＧＣＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＵＧＡＡＧＵＡＣＵＵＡＣＣＣＧＣＡＡＧＧＣＡＣＵＵＵＧＧＣＵＧＧＣＣＡＣＧＣＧＵＣＧＵＡＵＵＣＧＵＡＣＧＧＣＧＣＧＵＧＣＵＡＧＡＣＵＧＧＣＵＧＧＣＧＧＣＧＧＵＣＧＡＵＣＡＣＡＣＡＧＵＵＣＡＡＡＣＧＵＡＡＵＡＡＧＣＣＡＡＵＧＵＡＣＧＡＧＧＣＡＧＡＣＧＡＣＵＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵＵＡＧＧＡＵＵＣＵＡＧＡＵＣ
４Ｈ－２ＮＮ１（配列番号８）
ＧＧＡＡＡＵＧＡＵＧＣＣＧＡＧＵＵＧＡＣＧＣＵＵＣＧＧＣＧＵＣＡＧＣＵＣＧＣＣＣＵＧＵＧＧＣＣＵＡＧＵＵＣＧＣＵＡＧＧＵＣＡＣＡＧＣＣＧＡＣＣＡＵＵＧＣＧＵＵＵＣＧＡＣＧＣＡＧＵＧＧＵＣＡＣＡＵＣＵＵＧＧＣＧＵＵＣＧＣＧＣＣＡＧＧＡＵＧＵＣＵＣＧＣＣＣＡＡＵＵＣＣＧＵＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＧＡＣＣＣＡＡＡＵＣＣＣＵＡＧＧＧＵＣＧＧＵＡＧＣＣＡＡＡＵＣＣＡＧＡＧＧＣＵＡＧＣＡＵＵＡＵＵＵＣＣＧＡＵＣＵＡＧＧＡＵＣＧＣＧＵＵＧＡＧＡＡＣＵＧＧＡＵＡＣＵＣＡＡＣＣＧＵＧＧＣＡＵＡＡＡＧＧＧＡＵＡＡＵＧＣＣＡＡＧＣＧＧＵＡＡＡＣＧＧＡＡＡＡＣＣＧＣＵＣＡＧＣＣＧＡＡＧＵＧＵＣＵＵＧＣＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＵＧＡＡＧＵＡＣＵＵＡＣＣＣＧＣＡＡＧＧＣＡＣＵＵＵＧＧＣＵＧＣＧＵＧＧＣＧＵＵＡＣＡＧＵＵＣＧＣＵＧＵＧＡＣＧＣＣＡＧＣＣＡＣＧＣＧＵＣＧＵＡＵＵＣＧＵＡＣＧＧＣＧＣＧＵＧＣＵＡＧＡＣＵＧＧＣＵＧＧＣＧＧＣＧＧＵＣＧＡＵＣＡＣＡＣＡＧＵＵＣＡＡＡＣＧＵＡＡＵＡＡＧＣＣＡＡＵＧＵＡＣＧＡＧＧＣＡＧＡＣＧＡＣＵＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵＵＡＧＧＡＵＵＣＵＡＧＡＵＣ
Ｇブロック配列を以下に提供する（Ｔ７プロモーターは太字である）。
【0177】
２Ｈ－ＤＮＡＧｂｌｏｃｋ－ＮＮＮＮ（配列番号９）
【0178】
【化4】
【0179】
２Ｈ－ＤＮＡＧｂｌｏｃｋ－１２ＮＮ（配列番号１０）
【0180】
【化5】
【0181】
２Ｈ－ＤＮＡＧｂｌｏｃｋ－１Ｎ２Ｎ（配列番号１１）
【0182】
【化6】
【0183】
２Ｈ－ＤＮＡＧｂｌｏｃｋ－２ＮＮ１（配列番号１２）
【0184】
【化7】
【0185】
ＤＮＡＧｂｌｏｃｋ－Ｆｓｓ１２（配列番号１３）
【0186】
【化8】
【0187】
２Ｈ－ＤＮＡＧｂｌｏｃｋ－２２１１（配列番号１４）
【0188】
【化9】
【0189】
３Ｈ－ＤＮＡＧｂｌｏｃｋ－２ＮＮ１（配列番号１５）
【0190】
【化10】
【0191】
４Ｈ－ＤＮＡＧｂｌｏｃｋ－２ＮＮ１（配列番号１６）
【0192】
【化11】
【0193】
ＤＮＡおよびＰＮＡ解毒剤配列を以下に示す
Ａｎｔｉ＿Ｅｘ１＿Ａ０６（配列番号１７）
ＧＴＣＴＧＣＣＴＣＧＴＡＣＡＴＴＧＧＣＴ
Ａｎｔｉ＿Ｅｘ２＿Ｆｕｌｌ（配列番号１８）
ＧＧＧＴＡＡＧＴＡＣＴＴＣＡＧＣＴＴＴＧＴＴＣＣＣ
Ａｎｔｉ＿Ｅｘ１＿ＰＮＡ＿Ａ０６（配列番号１９）
ＧＴＣＴＧＣＣＴＣＧＴＡＣＡＴＴＧＧＣＴ
Ａｎｔｉ＿Ｅｘ２＿ＰＮＡ＿１９ｎｔ（配列番号２０）
ＧＴＡＣＴＴＣＡＧＣＴＴＴＧＴＴＣＣＣ
他の適切な変更が当業者に容易に明らかである。
Ａｎｔｉ＿Ｅｘ１＿Ａ０６（配列番号１７）
ＧＴＣＴＧＣＣＴＣＧＴＡＣＡＴＴＧＧＣＴ
Ａｎｔｉ＿Ｅｘ２＿Ｆｕｌｌ（配列番号１８）
ＧＧＧＴＡＡＧＴＡＣＴＴＣＡＧＣＴＴＴＧＴＴＣＣＣ
Ａｎｔｉ＿Ｅｘ１＿ＰＮＡ＿Ａ０６（配列番号１９）
ＧＴＣＴＧＣＣＴＣＧＴＡＣＡＴＴＧＧＣＴ
Ａｎｔｉ＿Ｅｘ２＿ＰＮＡ＿１９ｎｔ（配列番号２０）
ＧＴＡＣＴＴＣＡＧＣＴＴＴＧＴＴＣＣＣ
他の適切な変更が当業者に容易に明らかである。
【0194】
前述の詳細な説明および添付の実施例は単に例示的なものであり、添付の特許請求の範囲、およびそれらの同等するものによってのみ定義される本開示の範囲に対する限定として解釈されるべきではないことが理解される。
【0195】
開示された実施形態に対する様々な変更および修正は、当業者には明らかであろう。そのような変更および修正は、本開示の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成物、製剤、または使用方法に関するものを含むがこれらに限定されず、その意図および範囲から逸脱することなくなされ得る。
【図面の簡単な説明】
【0196】
【図1】図１は、凝固カスケードおよび抗凝固薬によって標的化される対応する酵素の概略図を含む。トロンビンはフィブリノーゲン、上流の凝固因子、および血小板受容体の切断を触媒することにより、凝固において重要な役割を果たす。トロンビンの触媒活性部位およびエキソサイトと呼ばれる２つの拡張表面は高分子リガンド結合に関与し、凝固を防ぐために化学および生物学ベースの分子を使用してブロックされ得る。凝固カスケードにおけるトロンビン活性の制御は、治療的、外科的、および臨床的利益をもたらす。
【図2B-E】図２Ａ～２Ｅは、抗凝固活性を有する核酸塩基アプタマーの代表的な描写を含む。図２Ｂ～２Ｅは、トロンビン活性の特異的阻害のために抗凝固剤として使用されるＤＮＡおよびＲＮＡアプタマーの例を含む。ＲＮＡＲ９Ｄ－１４Ｔ（図２Ｂ）およびトグル－２５ｔ（図２Ｃ）ＲＮＡアプタマーは、それぞれトロンビンのエキソサイト１およびエキソサイト２に結合する。ＤＮＡアプタマーＮＵ１７２（図２Ｄ）およびＨＤ２２（図２Ｅ）は、それぞれトロンビンのエキソサイト１およびエキソサイト２に結合する。
【図7A-B】図７Ａ～７Ｂは、より大きな構造から抽出する前（図７Ａ）および抽出した後（図７Ｂ）のエキソサイト２トロンビンアプタマーの代表的な画像を含む。赤い円は、より大きな構造内のテトラループを示す。
【図8A-B】図８Ａ～８Ｂはクロスオーバーを形成するように整列された後の二重らせんの代表的な画像を含む（図８Ａ；上側のらせんはらせん１であり、下側のらせんはらせん２である）。クロスオーバーが位置するリン酸原子および骨格および側（糖／塩基）は、それぞれ赤色および黄色で特定される。図８Ｂは、らせんに整列した全てのモチーフを有するＲＮＡ構造の代表的な側面図を含む。左上のモチーフはＲＮＡトロンビンアプタマーである。
【図11A】図１１Ａ～１１Ｂは、ＲＮＡオリガミ配列の代表的な描写を含む。図１１Ａはトレーススクリプトを通過した後のテキストファイルの代表的な描写を含み、赤いボックスはＮＵＰＡＣＫに提示され得る出力されたコードを強調し、次いで、ＮＵＰＡＣＫはＲＮＡ配列を提供する。
【図11B】図１１Ａ～１１Ｂは、ＲＮＡオリガミ配列の代表的な描写を含む。図１１ＢはＮＵＰＡＣＫによって出力されるＲＮＡ配列の代表的な描写を含む；ＮＥＤもまた提供される（一般に、最も低いＮＥＤを有する配列が分析のために選択される）。
【図12A】図１２Ａ～１２Ｂは、ＲＮＡアプタマーを含まない二重らせんＲＮＡオリガミ（２ＨＯ－ＲＮＡ－ＮＮＮＮ）の３Ｄ図（図１２Ａ）の代表的な描写を含む。数字は、ＲＮＡオリガミ分子上のＲＮＡアプタマーを含み得る４つの位置を表す。テトラループは黄色のボックスで表され、キッシングループは緑色のボックスで示される。
【図12B】図１２Ａ～１２Ｂは、ＲＮＡアプタマーを含まない二重らせんＲＮＡオリガミ（２ＨＯ－ＲＮＡ－ＮＮＮＮ）の２Ｄリボンモデル（図１２Ｂ）の代表的な描写を含む。数字は、ＲＮＡオリガミ分子上のＲＮＡアプタマーを含み得る４つの位置を表す。テトラループは黄色のボックスで表され、キッシングループは緑色のボックスで示される。
【図13A-D】図１３Ａ～１３Ｄは、２つのアプタマーを含むＲＮＡオリガミの４つの設計の代表的な２Ｄモデルを含む。図１３Ａは２ＨＯ－ＲＮＡ－ＮＮＮＮ（配列番号１）を示し、図１３Ｂは２ＨＯ－ＲＮＡ－１２ＮＮ（配列番号２）を示し、図１３Ｃは２ＨＯ－ＲＮＡ－１Ｎ２Ｎ（配列番号３）を示し、および図１３Ｄは２ＨＯ－ＲＮＡ－２ＮＮ１（配列番号４）を示す。
【図14A-C】図１４Ａ～１４Ｃは、２ＨＯ－ＲＮＡ－ＮＮＮＮの代表的な２Ｄモデル（Ａ）、およびｍｆｏｌｄ（Ｂ）およびＮＵＰＡＣＫ（Ｃ）によって分析されたＲＮＡ折りたたみの計算シミュレーションを含む。テトラループおよびキッシングループは、それぞれ黄色および緑色のボックスで示されている。
【図15A-C】図１５Ａ～１５Ｃは、２ＨＯ－ＲＮＡ－１２ＮＮの代表的な２Ｄモデル（Ａ）、およびｍｆｏｌｄ（Ｂ）およびＮＵＰＡＣＫ（Ｃ）によって分析されたＲＮＡ折りたたみの計算シミュレーションを含む。テトラループおよびキッシングループは、それぞれ黄色および緑色のボックスで示されている。エキソサイト１および２結合ＲＮＡアプタマーは、それぞれ紫色および青色の長方形で表される。
【図16A-C】図１６Ａ～１６Ｃは、２ＨＯ－ＲＮＡ－１Ｎ２Ｎの代表的な２Ｄモデル（Ａ）、およびｍｆｏｌｄ（Ｂ）およびＮＵＰＡＣＫ（Ｃ）によって分析されたＲＮＡ折りたたみの計算シミュレーションを含む。テトラループおよびキッシングループは、それぞれ黄色および緑色のボックスで示されている。エキソサイト１および２結合ＲＮＡアプタマーは、それぞれ紫および青色の長方形で表される。
【図17A-C】図１７Ａ～１７Ｃは、２ＨＯ－ＲＮＡ－２ＮＮ１の代表的な２Ｄモデル（Ａ）、およびｍｆｏｌｄ（Ｂ）およびＮＵＰＡＣＫ（Ｃ）によって分析されたＲＮＡ折りたたみの計算シミュレーションを含む。テトラループおよびキッシングループは、それぞれ黄色および緑色のボックスで示されている。エキソサイト１および２結合ＲＮＡアプタマーは、それぞれ紫および青色の長方形で表される。
【図18】図１８は、１５０Ｖで３０分間泳動した１％アガロースゲルを使用してＤＮＡ鋳型増幅を特徴付ける代表的な画像を含む。１ｋｂラダー（レーン１および５）、２Ｈ－ＤＮＡ－ＮＮＮＮ（レーン２）、２Ｈ－ＤＮＡ－１２ＮＮ（レーン３）、２Ｈ－ＤＮＡ－１Ｎ２Ｎ（レーン４）、および２Ｈ－ＤＮＡ－２ＮＮ１（レーン６）。
【図20】図２０は、２０Ｗで１時間、６％変性アクリルアミドゲル上で泳動したＲＮＡオリガミの代表的な画像を含む。１ｋｂラダー（レーン１）、２ＨＯ－ＲＮＡ－ＮＮＮＮ（レーン２）、２ＨＦ－ＲＮＡ－ＮＮＮ（レーン３）、２ＨＯ－ＲＮＡ－２ＮＮ１（レーン４）、２ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１（レーン５）、２ＨＯ－ＲＮＡ－１Ｎ２Ｎ（レーン６）、および２ＨＦ－ＲＮＡ－１Ｎ２Ｎ（レーン７）。
【図21】図２１は、２０Ｗで１時間、６％変性アクリルアミドゲル上で泳動したＲＮＡオリガミの代表的な画像を含む。１ｋｂラダー（レーン１）、２ＨＯ－ＲＮＡ－１Ｎ２Ｎ、２７９ｎｔ（レーン２）、２ＨＯ－ＲＮＡ－ＮＮＮＮ、２１０ｎｔ（レーン３）、１ｋｂラダー（レーン４）、２ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１、２８５ｎｔ（レーン５）、２ＨＦ－ＲＮＡ－１Ｎ２Ｎ、２７９ｎｔ（レーン６）、２ＨＦ－ＲＮＡ－１２ＮＮ、２７９ｎｔ（レーン７）、および２ＨＦ－ＲＮＡ－ＮＮＮＮ、２１０ｎｔ（レーン８）。
【図22】図２２は、１５０Ｖで３時間、６％未変性アクリルアミドゲル上で泳動したＲＮＡオリガミの代表的な画像を含む。ＤＮＡマーカー、ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｒａｎｇｅ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（左レーン）および２ＨＯ－ＲＮＡ－２ＮＮ１（右レーン）。
【図23】図２３は、ａＰＴＴアッセイを用いて、２’－フルオロ－修飾遊離アプタマー、非修飾ＲＮＡオリガミ（２ＨＯ‐ＲＮＡ）、２’－フルオロ－修飾ＲＮＡオリガミ（２ＨＦ‐ＲＮＡ）、およびＤＮＡウィーブタイル（２ＨＴ‐ＤＮＡ）の平均凝固時間を比較する抗凝固試験の代表的な結果を含む。エラーバーは標準偏差である（Ｎ＝３）。
【図25】図２５は、ゲル電気泳動移動度シフトアッセイによる、４つの異なるタンパク質を有するＲＮＡオリガミに含まれるトロンビンアプタマーの特異性試験の、アクリルアミドゲル電気泳動の結果の代表的な画像を含む。レーン１：ＤＮＡマーカー、レーン２：２ＨＦ－ＲＮＡ－ＮＮＮＮ、レーン３－６：トロンビン、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、およびＢＳＡと共にそれぞれインキュベートした２ＨＦ－ＲＮＡ－ＮＮＮＮ。左のゲルは核酸染色ゲルであり、右のゲルはタンパク質染色ゲルである。
【図26】図２６は、４つの異なるタンパク質を有するＲＮＡオリガミに含まれるトロンビンアプタマーの特異性試験のアクリルアミドゲル電気泳動の結果の代表的な画像を含む。レーン１：ＤＮＡマーカー、レーン２：２ＨＦ－ＲＮＡ－１２ＮＮ、レーン３－６：トロンビン、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、およびＢＳＡと共にそれぞれインキュベートした２ＨＦ－ＲＮＡ－１２ＮＮ。左のゲルは核酸染色ゲルであり、右のゲルはタンパク質染色ゲルである。
【図27】図２７は、４つの異なるタンパク質を有するＲＮＡオリガミに含まれるトロンビンアプタマーの特異性試験のアクリルアミドゲル電気泳動の結果の代表的な画像を含む。レーン１：ＤＮＡマーカー、レーン２：２ＨＦ－ＲＮＡ－１Ｎ２Ｎ、レーン３－６：トロンビン、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、およびＢＳＡと共にそれぞれインキュベートした２ＨＦ－ＲＮＡ－１Ｎ２Ｎ。左のゲルは核酸染色ゲルであり、右のゲルはタンパク質染色ゲルである。
【図28】図２８は、４つの異なるタンパク質を有するＲＮＡオリガミに含まれるトロンビンアプタマーの特異性試験のアクリルアミドゲル電気泳動の結果の代表的な画像を含む。レーン１：ＤＮＡマーカー、レーン２：２ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１、レーン３－６：トロンビン、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、およびＢＳＡと共にそれぞれインキュベートした２ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１。左のゲルは核酸染色ゲルであり、右のゲルはタンパク質染色ゲルである。
【図31A-B】図３１Ａ～３１Ｂは、高濃度のＲＮａｓｅ Ａ（５００ｕｇ／ｍｌ）で処理した修飾（Ａ）および非修飾（Ｂ）ＲＮＡオリガミの安定性試験の代表的な結果を含む。サンプルを変性ゲル電気泳動によって特徴付けた。
【図32A-B】図３２Ａ～３２Ｂは、ヒト血漿中に１０分～２４時間保存した修飾ＲＮＡオリガミ（２ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１）の安定性試験の代表的な結果を含む。修飾ＲＮＡオリガミ（Ａ）をヒト血漿と共に３７℃で４時間保存した。２ＨＦ‐ＲＮＡ‐２ＮＮ１オリガミ（Ｂ）を１０分から２４時間、ヒト血漿中に保存した。コントロールは１ｘバッファー中３７℃で２４時間保存した２ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１である。
【図35A-C】図３５Ａ～３５Ｃは、３１ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡリンカー上の２つのアプタマー（Ｆｓｓ１２；Ａ）を含むＲＮＡオリガミの４つの設計の代表的な２Ｄモデルを含む。ｍｆｏｌｄ ＲＮＡおよびＮＵＰＡＣＫソフトウェアによって分析されたＲＮＡオリガミ折りたたみの計算分析（Ｂ～Ｃ）。紫および青色の長方形は、それぞれエキソサイト１およびエキソサイト２結合アプタマーを表す。
【図36A-C】図３６Ａ～３６Ｃは、４つのアプタマーを含むＲＮＡオリガミ（２Ｈ－ＲＮＡ－２２１１；Ａ）の４つの設計の代表的な２Ｄモデルを含む。ｍｆｏｌｄ ＲＮＡおよびＮＵＰＡＣＫソフトウェアによって分析されるＲＮＡオリガミ折りたたみの計算分析（Ｂ～Ｃ）。紫および青色の長方形はそれぞれエキソサイト１およびエキソサイト２結合アプタマーを表し、緑色の長方形はキッシングループモチーフを示す。
【図37A-C】図３７Ａ～３７Ｃは、２つのアプタマーおよび３つのＡ型二重らせん構造を含むＲＮＡオリガミ（３Ｈ－ＲＮＡ－２ＮＮ１；Ａ）の４つの設計の代表的な２Ｄモデルを含む。ｍｆｏｌｄ ＲＮＡおよびＮＵＰＡＣＫソフトウェアによって分析されたＲＮＡオリガミ折りたたみの計算分析（Ｂ～Ｃ）。紫および青の長方形はそれぞれエキソサイト１およびエキソサイト２結合アプタマーを表し、黄色および緑色の長方形は、それぞれテトラループおよびキッシングループモチーフを示す。
【図38A-C】図３８Ａ～３８Ｃは、２つのアプタマーおよび４つのＡ型二重らせん構造を含むＲＮＡオリガミ（４Ｈ－ＲＮＡ－２ＮＮ１；Ａ）の４つの設計の代表的な２Ｄモデルを含む。ｍｆｏｌｄ ＲＮＡおよびＮＵＰＡＣＫソフトウェアによって分析されたＲＮＡオリガミ折りたたみの計算分析（Ｂ～Ｃ）。紫および青の長方形はそれぞれエキソサイト１およびエキソサイト２結合アプタマーを表し、黄色および緑色の長方形は、それぞれテトラループおよびキッシングループを示す。
【図39】図３９は、ＤＮＡ鋳型増幅を特徴付ける代表的な画像を含む。レーン１および８：ＤＮＡマーカー、レーン２：Ｆｓｓ１２、レーン３：２Ｈ－ＤＮＡ－ＮＮＮＮ、レーン４：２Ｈ－ＤＮＡ－２ＮＮ１、レーン５：２Ｈ－ＤＮＡ－２２１１、レーン６：３Ｈ－ＤＮＡ－２ＮＮ１およびレーン７：４Ｈ－ＤＮＡ－２ＮＮ１。
【図40】図４０は、変性アクリルアミドゲル電気泳動によるＲＮＡオリガミを特徴付ける代表的な画像を含む。レーン１および８：ｓｓＲＮＡマーカー、レーン２：３１ｎｔ連結アプタマー（Ｆｓｓ１２）、レーン３：２ＨＦ－ＲＮＡ－ＮＮＮＮ、レーン４：２ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１、レーン５：２ＨＦ－ＲＮＡ－２２１１、レーン６：３ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１、レーン７：４ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１。
【図41A-D】図４１Ａ～４１Ｄは、６％未変性アクリルアミドゲル電気泳動によってトロンビンと結合するアプタマーを有するＲＮＡオリガミを特徴付ける代表的な画像を含む。ＲＮＡオリガミを、特徴付けの前に、３７℃で１時間、トロンビンと共にインキュベートした（Ａ）。（Ａ）および（Ｂ）中のゲルは同じゲルであり、１５０Ｖで３時間泳動した。ゲル（Ｃ）および（Ｄ）は同じゲルであり、１５０Ｖで６時間泳動した。核酸染色ゲル、臭化エチジウム（ＡおよびＣ）。タンパク質染色ゲル、クマシーブルー（ＢおよびＤ）。負の符号と正の符号はそれぞれトロンビンの無しおよび有りを示した。
【図42A-B】図４２Ａ～４２Ｂは、未変性アクリルアミドゲル電気泳動による、４つの異なるタンパク質を有する３１ｎｔが連結した２つのアプタマー（Ｆｓｓ１２）の特異的結合試験の代表的な画像を含む。レーン１：Ｆｓｓ１２。レーン２：トロンビンと共にインキュベートしたＦｓｓ１２。レーン３：第ＩＸａ因子と共にインキュベートしたＦｓｓ１２。レーン４：第Ｘａ因子と共にインキュベートしたＦｓｓ１２、およびレーン５：ＢＳＡと共にインキュベートしたＦｓｓ１２。６％未変性ＰＡＧＥゲルを１５０で３時間泳動した。核酸染色ゲル、臭化エチジウム（Ａ）。タンパク質染色ゲル、クマシーブルー（Ｂ）。（Ａ）および（Ｂ）は同じゲルである。
【図43A-B】図４３Ａ～４３Ｂは、未変性アクリルアミドゲル電気泳動による、４つの異なるタンパク質との２ＨＦ－ＲＮＡ－２２１１の特異的結合試験の代表的な画像を含む。レーン１：２ＨＦ－ＲＮＡ－２２１１。レーン２：トロンビンと共にインキュベートした２ＨＦ－ＲＮＡ－２２１１。レーン３：第ＩＸａ因子と共にインキュベートした２ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１。レーン４：第Ｘａ因子と共にインキュベートした２ＨＦ－ＲＮＡ－２２１１、およびレーン５：ＢＳＡと共にインキュベートした２ＨＦ－ＲＮＡ－２２１１。６％未変性ＰＡＧＥゲルを１５０で３時間泳動した。核酸染色ゲル、臭化エチジウム（Ａ）。タンパク質染色ゲル、クマシーブルー（Ｂ）。（ＡおよびＢ）。（Ａ）および（Ｂ）は同じゲルである。
【図44A-B】図４４Ａ～４４Ｂは、未変性アクリルアミドゲル電気泳動による４つの異なるタンパク質との３ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１の特異的結合試験の代表的な画像を含む。レーン１：３ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１。レーン２：トロンビンと共にインキュベートした３ＨＦ－２ＮＮ１。レーン３：第ＩＸａ因子と共にインキュベートした３ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１。レーン４：第Ｘａ因子と共にインキュベートした３ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１、およびレーン５：ＢＳＡと共にインキュベートした３ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１。６％未変性ＰＡＧＥゲルを１５０で６時間泳動した。核酸染色ゲル、臭化エチジウム（Ａ）。タンパク質染色ゲル、クマシーブルー（Ｂ）。（Ａ）と（Ｂ）は同じゲルである。
【図45A-B】図４５Ａ～４５Ｂは、未変性アクリルアミドゲル電気泳動による４つの異なるタンパク質との４ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１の特異的結合試験の代表的な画像を含む。レーン１：２ＨＦ－ＲＮＡ－４ＮＮ１。レーン２：トロンビンと共にインキュベートした４ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１。レーン３：第ＩＸａ因子と共にインキュベートした４ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１。レーン４：第Ｘａ因子と共にインキュベートした２ＨＦ－ＲＮＡ－４ＮＮ１、およびレーン５：ＢＳＡと共にインキュベートした４ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１。６％未変性ＰＡＧＥゲルを１５０で６時間泳動した。核酸染色ゲル、臭化エチジウム（Ａ）。タンパク質染色ゲル、クマシーブルー（Ｂ）。（Ａ）と（Ｂ）は同じゲルである。
【図46】図４６は、ＲＮＡオリガミの長期保存を試験する代表的な結果を含む。新たに調製した２ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１サンプルの平均抗凝固活性を、４℃で９０日まで保存したサンプルと比較する。結果は、ＲＮＡオリガミ抗凝固剤が４℃で保存した後、少なくとも３ヶ月間安定であり、活性であることを実証する。
【図47】図４７は、ａＰＴＴアッセイによって試験された、遊離アプタマー、ｓｓＲＮＡ連結アプタマー、およびアプタマーを含むＲＮＡオリガミの抗凝固活性の代表的な結果を含む。抗凝固剤の全ての設計は、２ＨＦ－ＲＮＡ－２２１１を除いて、５００ｎＭの最終濃度である。２ＨＦ－ＲＮＡ－２２１１の最終濃度は４００ｎＭである。結果は、ｓｓＲＮＡと連結した２つのアプタマー（Ｆｓｓ１２）の抗凝固活性が遊離アプタマーおよび遊離アプタマーの混合物よりも高いことを実証する。さらに、ＲＮＡオリガミ（２ＨＦ‐ＲＮＡ‐２ＮＮ１）に含まれる２つのアプタマーの抗凝固活性はｓｓＲＮＡ連結アプタマー（Ｆｓｓ１２）よりも大きい。さらに、４つのアプタマーを含むＲＮＡオリガミ（２ＨＦ‐ＲＮＡ‐２２１１）は、最も高い抗凝固活性（２ＨＦ‐ＲＮＡ‐２ＮＮ１活性の２倍を超える）を示す。
【図48】図４８は、２つ（２ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１）および４つ（２ＨＦ－ＲＮＡ－２２１１）のＲＮＡアプタマーを含むＲＮＡオリガミの濃度依存性凝固時間を試験する代表的な結果を含む。４００ｎＭの濃度の２ＨＦ－ＲＮＡ－２２１１について、凝固時間は、最大限界（凝固計を用いて測定した９９９秒）に達した。驚くべきことに、２ＨＦ－ＲＮＡ－２２１１（４アプタマー）の抗凝固活性は、２ＨＦ－ＲＮＡ－２ＮＮ１（２アプタマー）の抗凝固活性の２倍を超える。
【図1】
【図2A】
【図2B-2E】
【図3】
【図4】
【図5A-5B】
【図6A-6B】
【図7A-7B】
【図8A-8B】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【図13A-13D】
【図14A-14C】
【図15A-15C】
【図16A-16C】
【図17A-17C】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30A-B】
【図31A-B】
【図32A-B】
【図33】
【図34】
【図35A-35C】
【図36A-36C】
【図37A-37C】
【図38A-38C】
【図39】
【図40】
【図41A-D】
【図42A-B】
【図43A-B】
【図44A-B】
【図45A-B】
【図46】
【図47】
【図48】
【図49】
【図50A-B】
【図51】
【配列表】