特許 7676148 グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）融合ペプチド共役環状ペプチドチロシンチロシンコンジュゲート及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-05-02

(45)【発行日】2025-05-14

(54)【発明の名称】グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）融合ペプチド共役環状ペプチドチロシンチロシンコンジュゲート及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20250507BHJP

   C07K 14/605 20060101ALI20250507BHJP

   C07K 14/575 20060101ALI20250507BHJP

   A61K 47/65 20170101ALI20250507BHJP

   A61K 38/22 20060101ALI20250507BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20250507BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20250507BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20250507BHJP

   A61P 5/50 20060101ALI20250507BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00

C07K14/605 ZNA

C07K14/575

A61K47/65

A61K38/22

A61P3/04

A61P3/10

A61P3/06

A61P5/50

【請求項の数】 18

(21)【出願番号】P 2020559562

(86)(22)【出願日】2019-04-24

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-08-30

(86)【国際出願番号】 IB2019053384

(87)【国際公開番号】W WO2019207505

(87)【国際公開日】2019-10-31

【審査請求日】2022-04-22

(31)【優先権主張番号】62/662,313

(32)【優先日】2018-04-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】PCT/US2018/029284

(32)【優先日】2018-04-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】510020022

【氏名又は名称】ヤンセン・サイエンシズ・アイルランド・アンリミテッド・カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100093676

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 純子

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100149010

【弁理士】

【氏名又は名称】星川 亮

(72)【発明者】

【氏名】カマチョ，ラウル

(72)【発明者】

【氏名】ケース，マーティン エー．

(72)【発明者】

【氏名】チ，エレン

(72)【発明者】

【氏名】エダヴェタル，スザンヌ

(72)【発明者】

【氏名】エドワーズ，ウィルソン

(72)【発明者】

【氏名】ノーキー，リサ

(72)【発明者】

【氏名】ウォール，マーク ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】チャン，ルイ

(72)【発明者】

【氏名】チェン，ソンマオ

(72)【発明者】

【氏名】チャン，ユエ－メイ

【審査官】上村 直子

(56)【参考文献】

【文献】特表２００７－５３１７１３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００９－５０４６８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００７－５２５４９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１２－５０２８８８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００８－５２１８６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１３－５０６６２８（ＪＰ，Ａ）

【文献】Peptides，2013年，Vol.39，pp.6-10

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １４／００－１９／００

Ａ６１Ｋ

Ａ６１Ｐ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

環状ＰＹＹペプチドに結合したグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）融合ペプチドを含むコンジュゲートであって、前記ＧＬＰ－１融合ペプチドが、配列番号５６～５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＧＬＰ－１ペプチド、配列番号６０～８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む任意選択の第１のリンカーペプチド、配列番号８４～９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するヒンジ－Ｆｃ領域ペプチド、及び環状ＰＹＹペプチドに結合したシステイン残基及び配列番号９３～１１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２のリンカーペプチドを含み、
前記環状ＰＹＹペプチドが、式Ｉによって表されるか、又はその薬学的に許容される塩であり、

【化1】

式中、
ｐは、０又は１であり、
ｍは、０、１、２、３、４、又は５であり、
ｎは、１、２、３、又は４であり、
ｑは、０又は１であり（但し、ｑは、Ｚ_３０が存在しない場合にのみ１である）、
ＢＲＩＤＧＥは、－Ｐｈ－ＣＨ_２－Ｓ－、－トリアゾリル－、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ_２Ｓ－、－ＳＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、
－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ_２Ｓ、－ＮＨＣ（Ｏ）－、又は－ＣＨ_２Ｓ－であり、
Ｚ_４は、Ｋ、Ａ、Ｅ、Ｓ、又はＲであり、
Ｚ_７は、Ａ又はＫであり、前記Ｋのアミノ側鎖は、任意選択で、

【化2】

（式中、ｉは、０～２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである）、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｉ、又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｃｌでアシル化され、
Ｚ_９は、Ｇ又はＫであり、前記Ｋのアミノ側鎖は、任意選択で、

【化3】

（式中、ｉは、０～２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである）、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｉ、又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｃｌでアシル化され、
Ｚ_１１は、Ｄ又はＫであり、前記Ｋのアミノ側鎖は、任意選択で、

【化4】

（式中、ｉは、０～２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである）、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｉ、又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｃｌでアシル化され、
Ｚ_２２は、Ａ又はＫであり、前記Ｋのアミノ側鎖は、任意選択で、

【化5】

（式中、ｉは、０～２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである）、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｉ、又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｃｌでアシル化され、
Ｚ_２３は、Ｓ又はＫであり、前記Ｋのアミノ側鎖は、任意選択で、

【化6】

（式中、ｉは、０～２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである）、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｉ、又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｃｌでアシル化され、
Ｚ_２６は、Ａ又はＨであり、
Ｚ_３０は、Ｌ、Ｗであるか、又は存在せず、
（但し、Ｚ_３０は、ｑが１である場合にのみ存在しない）、
Ｚ_３４は、

【化7】

であり、
Ｚ_３５は、

【化8】

であり、
式Ｉが、Ｚ_７、Ｚ_９、Ｚ_１１、Ｚ_２２、又はＺ_２３のうちの少なくとも１つにアシル化リシン（Ｋ）残基を含み、前記アシル化リシン残基が、前記第２のリンカーペプチドの前記システイン残基に共有結合で反応的にコンジュゲートされている、コンジュゲート。

【請求項2】

前記環状ＰＹＹペプチドが、式Ｉによって表されるか、又はその薬学的に許容される塩であり、
式中、
ｐは、０又は１であり、
ｍは、０、１、２、３、又は５であり、
ｎは、１、２、又は４であり、
ｑは、０又は１であり（但し、ｑは、Ｚ_３０が不在の場合にのみ１であり得る）、
ＢＲＩＤＧＥは、－Ｐｈ－ＣＨ_２－Ｓ－、－トリアゾリル－、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ_２Ｓ－、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ_２Ｓ、－ＮＨＣ（Ｏ）－、又は－ＣＨ_２Ｓ－であり、
Ｚ_４は、Ｋ、Ａ、Ｅ、Ｓ、又はＲであり、
Ｚ_７は、Ａ又はＫであり、前記Ｋのアミノ側鎖は、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒで任意選択でアシル化されており、
Ｚ_９は、Ｇ又はＫであり、前記Ｋのアミノ側鎖は、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒで任意選択でアシル化されており、
Ｚ_１１は、Ｄ又はＫであり、前記Ｋのアミノ側鎖は、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒで任意選択でアシル化されており、
Ｚ_２２は、Ａ又はＫであり、前記Ｋのアミノ側鎖は、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒで任意選択でアシル化されており、
Ｚ_２３は、Ｓ又はＫであり、前記Ｋのアミノ側鎖は、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒで任意選択でアシル化されており、
Ｚ_２６は、Ａ又はＨであり、
Ｚ_３０は、Ｌであり、
Ｚ_３４は、

【化9】

であり、
Ｚ_３５は、

【化10】

である、請求項１に記載のコンジュゲート。

【請求項3】

前記環状ＰＹＹペプチドが、配列番号１～５４からなる群から選択されるか、又はその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載のコンジュゲート。

【請求項4】

前記環状ＰＹＹペプチドが、配列番号２４、２５、２７、２８、２９、３０、３３、若しくは３４から選択されるか、又はその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載のコンジュゲート。

【請求項5】

式Ｉ中のＺ_１１がリシンである、請求項１に記載のコンジュゲート。

【請求項6】

前記第２のリンカーペプチドが、配列番号９３、９４、９５、１０６又は１１１のアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項7】

環状ＰＹＹペプチドに結合しているグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）融合ペプチドを含むコンジュゲートであって、前記ＧＬＰ－１融合ペプチドが、配列番号１１３～２２４及び２６７～２７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記環状ＰＹＹペプチドが、配列番号２４、２５、２７、２８、２９、３０、３３、若しくは３４から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はその薬学的に許容される塩であり、前記ＧＬＰ－１融合ペプチドのアミノ酸残基２８７～２８９の間のシステイン残基が、化学リンカーを介して、前記環状ＰＹＹペプチドのアミノ酸残基１１におけるリシン残基（Ｋ１１）と共有結合で連結している、コンジュゲート。

【請求項8】

環状ＰＹＹペプチドに結合しているグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）融合ペプチド（ＧＦ）を含むコンジュゲートであって、配列番号２２５～２６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はその薬学的に許容される塩を含み、前記ＧＬＰ－１融合ペプチドが、配列番号５６～５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＧＬＰ－１ペプチド、配列番号６０～８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む任意選択の第１のリンカーペプチド、配列番号８４～９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するヒンジ－Ｆｃ領域ペプチド、及び環状ＰＹＹペプチドに結合したシステイン残基及び配列番号９３～１１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２のリンカーペプチドを含む、コンジュゲート。

【請求項9】

前記環状ＰＹＹペプチドのリシン残基の側鎖に導入された求電子剤を、前記ＧＬＰ－１融合ペプチドの前記第２のリンカーペプチドのシステイン残基のスルフヒドリル基と反応させ、それにより、前記環状ＰＹＹペプチドと前記ＧＬＰ－１融合ペプチドとの間に共有結合性連結を生じさせることを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のコンジュゲートを生成する方法。

【請求項10】

前記ＧＬＰ－１融合ペプチドの前記第２のリンカーペプチドの前記システイン残基が、前記ＧＬＰ－１融合ペプチドを過剰なアザホスフィン還元剤と接触させることによって還元され、前記還元されたシステイン残基が前記求電子剤と反応する、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記アザホスフィン還元剤が、１，３，５－トリアザ－７－ホスファトリシクロ［３．３．１．１］デカン（ＰＴＡ）又はその誘導体である、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

請求項１～８のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。

【請求項13】

請求項１２に記載の医薬組成物であって、
前記医薬組成物が、それを必要としている対象における疾患又は障害を治療又は予防する方法で用いるためのものであり、
前記疾患又は障害が、肥満、Ｉ型又はＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、耐糖能異常、高血糖症、高インスリン血症、高トリグリセリド血症、先天性高インスリン症（ＣＨＩ）による低血糖、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性腎症、並びに管理されていないコレステロール及び／若しくは脂質レベルに関連する高血圧及び心血管危険因子などの他の心血管危険因子、骨粗鬆症、炎症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、腎疾患、並びに／又は湿疹であり、
前記方法が、前記それを必要としている対象に有効量の前記医薬組成物を投与することを含む、医薬組成物。

【請求項14】

請求項１２に記載の医薬組成物であって、
前記医薬組成物が、それを必要としている対象における食物摂取又は体重のうちの少なくとも１つを減少させる方法で用いるためのものであり、
前記方法が、前記それを必要としている対象に有効量の前記医薬組成物を投与することを含む、医薬組成物。

【請求項15】

請求項１２に記載の医薬組成物であって、
前記医薬組成物が、それを必要としている対象におけるＹ２受容体活性及び／又はＧＬＰ－１受容体活性を調節する方法で用いるためのものであり、
前記方法が、それを必要としている対象に有効量の前記医薬組成物を投与することを含む医薬組成物。

【請求項16】

前記医薬組成物が、注射により投与される、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項17】

請求項１～８のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含むキットであって、注射用デバイスを更に含む、キット。

【請求項18】

請求項１～８のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む医薬組成物を生成する方法であって、前記コンジュゲートを薬学的に許容される担体と組み合わせて前記医薬組成物を得ることを含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１８年４月２５日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２９２８４号及び２０１８年４月２５日に出願された米国特許仮出願第６２／６６２，３１３号に対する優先権を主張するものである。各開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

（発明の分野）
本発明は、概して、神経ペプチドＹ２受容体及びＧＬＰ－１受容体の調節因子である、新規グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）融合ペプチド共役環状ペプチドチロシンチロシン（ＰＹＹ）コンジュゲートを目的とする。本発明はまた、医薬組成物及びその使用方法に関する。新規ＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹコンジュゲートは、とりわけ、肥満、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、及び脂質異常症などの疾患及び障害を予防する、治療する、又は寛解させるのに有用である。

【0003】

（電子的に提出された配列表の参照）
本出願は、ファイル名「ＰＲＤ３４６５ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ」のＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出された、２０１９年４月２日の作成日で、４０９ｋｂのサイズを有する配列表を含む。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される情報と、ファイル名「ＰＲＤ３４６５ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ」でＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出された配列表との間で、配列番号２２５～２６２の構造に関して何らかの不一致がある場合は、本明細書の情報が優先される。

【背景技術】

【0004】

神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）受容体は、各受容体サブタイプに対して異なる親和性を有する「ＮＰＹファミリー」と呼ばれる、密接に関連するペプチドアゴニスト群によって活性化される。ＮＰＹ、ペプチドチロシン－チロシン（ＰＹＹ）、及び膵臓ポリペプチド（ＰＰ）の、長さ３６個全てのアミノ酸は、ＮＰＹ受容体ファミリーのアゴニストである。ＮＰＹは、神経伝達物質であり、合成され、共貯蔵（co-stored）され、ノルエピネフリン及びエピネフリンと共に放出される。ＮＰＹは、ヒト及びげっ歯類の中枢神経系（ＣＮＳ）中の最も豊富かつ広範に分布したペプチドのうちの１つであり、摂食及びストレスに関連する脳の領域で発現される。末梢神経系では、ＮＰＹ含有ニューロンは主に交感神経性である。ＰＹＹは、腸内分泌細胞によって主に合成され、放出される。内皮セリン－プロテアーゼ、ジ－ペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ－ＩＶ）によるＮＰＹ及びＰＹＹの切断によって、ＮＰＹ受容体ファミリーのＹ２及びＹ５サブタイプの選択的リガンドであるＮＰＹ_３－３６及びＰＹＹ_３－３６が生成される。ＰＰは、主に、インスリン、グルカゴン、又はソマトスタチンを貯蔵するものとは異なる膵島細胞に見られる。

【0005】

５つの異なるＮＰＹ受容体がこれまでに特定されており、そのうちの４つは、ヒトの生理機能に関連するものとして理解される。受容体Ｙ１、Ｙ２、及びＹ５は、ＮＰＹ及びＰＹＹに優先的に結合し、他方、Ｙ４受容体はＰＰに優先的に結合する。Ｙ２及びＹ５受容体はまた、ＮＰＹ_３－３６及びＰＹＹ_３－３６によって強力に活性化される。概して、ＮＰＹファミリーのリガンドは、ＮＰＹ受容体イソ型のそれぞれに対して可変選択性を有し、ＰＹＹ_３－３６は、Ｙ２イソ型に対して中程度から強固な選択性を有することが以前に報告されている。これらの受容体のそれぞれは、百日咳毒素感受性Ｇαｉを介してアデニル酸シクラーゼの阻害に結合される。

【0006】

ＰＹＹは、食物に応じて内分泌腺Ｌ－細胞から分泌され、特に脂肪摂取後に分泌される。ＰＹＹ_１－３６は、空腹状態で優勢であり、ＰＹＹ_３－３６は、ヒトにおいて食後に見られる主な形態であり、血漿濃度は、消費されるカロリー数と負の相関関係にある。ＰＹＹ_３－３６は、ヒト、サル、ラット、ウサギ、及びマウスにおいて食物摂取を減少させることが実証されている（Ｂａｔｔｅｒｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１８（６８９８）：６５０－４（２００２）；Ｂａｔｔｅｒｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４９（１０）：９４１－８（２００３）；Ｃｈａｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３１１（４）：９１５－９（２００３））。ＰＹＹ_３－３６の食欲減退効果は、この受容体における優先的結合及びＹ２欠損マウスにおける摂食の効能の喪失に基づいて、Ｙ２が媒介していると考えられる（Ｂａｔｔｅｒｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１８（６８９８）：６５０－４（２００２））。ＰＹＹ_３－３６を弓内注射すると、ラット及びマウスにおいて食物摂取が減少し（Ｂａｔｔｅｒｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１８（６８９８）：６５０－４（２００２））、これは、視床下部Ｙ２受容体の会合がこれらの効果を媒介している可能性があることを示唆している。摂食に対する急性効果は、ｏｂ／ｏｂマウス、ＤＩＯマウス、及びＺｕｃｋｅｒ ｆａ／ｆａマウスの体重に対する用量依存的効果に変換されることも示されている（Ｐｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｏｂｅｓ Ｒｅｌａｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｏｒｄ ２８（８）：９６３－７１（２００４））。加えて、ＰＹＹ_３－３６は、ＤＩＯげっ歯類においてインスリン媒介グルコース処理及びインスリン感受性を改善することも示されている（Ｖｒａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ Ｉｎｔｅｇｒ Ｃｏｍｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９１（２）：Ｒ３６７－７５（２００６））。肥満手術の結果、循環ＰＹＹ免疫反応性が増大し（ｌｅ Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｓｕｒｇ ２４３（１）：１０８－１４（２００６））、これは、術後の体重減少において役割を果たすように思われる。

【0007】

食欲及び食物摂取の制御におけるその役割、並びに哺乳動物の胃腸管におけるその抗分泌及び吸収促進効果を考慮すると、ＰＹＹ_３－３６は、肥満及び関連病態、並びに多くかの胃腸障害の治療に有効であり得る。しかしながら、ＰＹＹ_３－３６自体の治療剤としての治療的有用性は、その迅速な代謝及び結果として生じる短い循環半減期によって制限される（Ｔｏｒａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｇｕｌ．Ｉｎｔｅｇｒ．Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３１０：Ｒ８６６－Ｒ８７４（２０１６））。

【0008】

インクレチンホルモンＧＬＰ－１及びその受容体（ＧＬＰ１Ｒ）の活性化は、グルコース依存性インスリン分泌の刺激（Ｋｒｅｙｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ２：１３００－１３０４（１９８７））、並びにグルカゴン分泌（Ｇｕｔｎｉａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３２６：１３１６－１３２２（１９９２））、胃排出（Ｗｅｔｔｅｒｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ３８：６６５－６７３（１９９３））及び食物摂取（Ｆｌｉｎｔ ｅｔ ａｌ．，ＪＣＩ １０１：５１５－５２０（１９９８））の阻害を含む、ヒトにおけるグルコース代謝及びエネルギーバランスにおいて多くの有益な効果を有する。ＧＬＰ１Ｒアゴニストはまた、２型糖尿病患者における心血管及び微小血管予後（Ｍａｒｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７５（４）：３１１－３２２（２０１６））並びに腎臓病（Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７７（９）：８３９－８４８（２０１７）のリスクを有意に減少させることが示されている。ＧＬＰ－１は、短い半減期を特徴とし、これが、ＧＬＰ－１を潜在的な治療薬として使用することを非実用的なものにしている。循環半減期は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（Ｚｈｕ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ ２７８：２２４１８－２２４２３（２００３））及び中性エンドペプチダーゼ（Ｈｕｐｅ－Ｓｏｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｇｕｌ Ｐｅｐｔ ５８（３）：１４９－１５６（１９９５））によるタンパク質分解のされやすさ、並びに腎臓濾過（Ｒｕｉｚ－Ｇｒａｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ６８（１２）：１５６８－１５７３（１９９０））の両方によって制限される。

【0009】

したがって、それぞれＰＹＹ_３－３６及び／又はＧＬＰ－１に比べて改善された代謝安定性及び薬物動態プロファイルを有するＰＹＹアナログ若しくはその誘導体及び／又はＧＬＰ－１アナログ若しくはその誘導体を得ることが望ましい。インビボでの半減期が長いこのような誘導体は、より長い作用持続時間でのＹ２及び／又はＧＬＰ－１受容体の調節を提供し、これによって、当該誘導体はこのような調節を必要とする対象の治療薬として好適なものになる。

【0010】

前述の議論は、単に、当該技術分野が直面する問題の性質のより良い理解を提供するために提示されているものであり、いかなる意味でも先行技術の容認として解釈されるべきではなく、本明細書における任意の参考文献の引用は、そのような参照が本出願の「先行技術」を構成することを容認するものとして解釈されるべきではない。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0011】

全般的な一態様では、本発明は、神経ペプチドＹ２受容体及びＧＬＰ－１受容体の調節因子である新規グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）融合共役環状ペプチドチロシンチロシン（ＰＹＹ）コンジュゲートに関する。

【0012】

環状ＰＹＹペプチドに結合したグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）融合ペプチドを含むコンジュゲートであって、当該ＧＬＰ－１融合ペプチドが、ＧＬＰ－１又はＧＬＰ－１変異体ペプチド、第１のリンカーペプチド、ヒンジ－Ｆｃ領域ペプチド、及び第２のリンカーペプチドを含み、当該第１のリンカーが、任意選択で、存在しない、コンジュゲートが、本明細書に提供される。

【0013】

特定の実施形態では、環状ＰＹＹペプチドは、式Ｉによって表されるか、又はその誘導体若しくは薬学的に許容される塩であり：

【0014】

【化1】

式中、
ｐは、０又は１であり、
ｍは、０、１、２、３、４、又は５であり、
ｎは、１、２、３、又は４であり、
ｑは、０又は１であり（但し、ｑは、Ｚ_３０が存在しない場合にのみ１である。）、
ＢＲＩＤＧＥは、－Ｐｈ－ＣＨ_２－Ｓ－、－トリアゾリル－、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ_２Ｓ－、－ＳＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、
－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ_２Ｓ、－ＮＨＣ（Ｏ）－、又は－ＣＨ_２Ｓ－であり、
Ｚ_４は、Ｋ、Ａ、Ｅ、Ｓ、又はＲであり、
Ｚ_７は、Ａ又はＫであり、
Ｚ_９は、Ｇ又はＫであり、
Ｚ_１１は、Ｄ又はＫであり、
Ｚ_２２は、Ａ又はＫであり、
Ｚ_２３は、Ｓ又はＫであり、
Ｚ_２６は、Ａ又はＨであり、
Ｚ_３０は、Ｌ、Ｗであるか、又は存在せず、
（但し、Ｚ_３０は、ｑが１である場合にのみ存在しない。）、
Ｚ_３４は、

【0015】

【化2】

であり、
Ｚ_３５は、

【0016】

【化3】

であり、
当該誘導体は、アミド化、アシル化、及びＰＥＧ化からなる群から選択される１つ又は２つ以上のプロセスによって修飾された式Ｉの化合物である。

【0017】

特定の実施形態では、環状ＰＹＹペプチドは、式Ｉによって表されるか、又はその誘導体若しくは薬学的に許容される塩であり、式中、
ｐは、０又は１であり、
ｍは、０、１、２、３、４、又は５であり、
ｎは、１、２、３、又は４であり、
ｑは、０又は１であり（但し、ｑは、Ｚ_３０が存在しない場合にのみ１である。）、
ＢＲＩＤＧＥは、－Ｐｈ－ＣＨ_２－Ｓ－、－トリアゾリル－、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ_２Ｓ－、－ＳＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２－、
－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ_２Ｓ、－ＮＨＣ（Ｏ）－、又は－ＣＨ_２Ｓ－であり、
Ｚ_４は、Ｋ、Ａ、Ｅ、Ｓ、又はＲであり、
Ｚ_７は、Ａ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、任意選択で、

【0018】

【化4】

（式中、ｉは、０～２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである。）、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｉ、又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｃｌで置換され、
Ｚ_９は、Ｇ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、任意選択で、

【0019】

【化5】

（式中、ｉは、０～２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである。）、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｉ、又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｃｌで置換され、
Ｚ_１１は、Ｄ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、任意選択で、

【0020】

【化6】

（式中、ｉは、０～２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである。）、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｉ、又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｃｌで置換され、
Ｚ_２２は、Ａ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、任意選択で、

【0021】

【化7】

（式中、ｉは、０～２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである。）、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｉ、又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｃｌで置換され、
Ｚ_２３は、Ｓ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、任意選択で、

【0022】

【化8】

（式中、ｉは、０～２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである。）、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｉ、又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｃｌで置換され、
Ｚ_２６は、Ａ又はＨであり、
Ｚ_３０は、Ｌであり、
Ｚ_３４は、

【0023】

【化9】

であり、
Ｚ_３５は、

【0024】

【化10】

である。

【0025】

特定の実施形態では、環状ＰＹＹペプチドは、式Ｉによって表されるか、又はその誘導体若しくは薬学的に許容される塩であり、式中、
ｐは、０又は１であり、
ｍは、０、１、２、３、又は５であり、
ｎは、１、２、又は４であり、
ｑは、０又は１であり（但し、ｑは、Ｚ_３０が不在の場合にのみ１であり得る。）、
ＢＲＩＤＧＥは、－Ｐｈ－ＣＨ_２－Ｓ－、－トリアゾリル－、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ_２Ｓ－、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ_２Ｓ、－ＮＨＣ（Ｏ）－、又は－ＣＨ_２Ｓ－であり、
Ｚ_４は、Ｋ、Ａ、Ｅ、Ｓ、又はＲであり、
Ｚ_７は、Ａ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒで置換されており、
Ｚ_９は、Ｇ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒで置換されており、
Ｚ_１１は、Ｄ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒで置換されており、
Ｚ_２２は、Ａ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒで置換されており、
Ｚ_２３は、Ｓ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒで置換されており、
Ｚ_２６は、Ａ又はＨであり、
Ｚ_３０は、Ｌであり、
Ｚ_３４は、

【0026】

【化11】

であり、
Ｚ_３５は、

【0027】

【化12】

である。

【0028】

特定の実施形態では、環状ＰＹＹペプチドは、配列番号１～５４からなる群から選択されるか、又はその薬学的に許容される塩である。特定の実施形態では、環状ＰＹＹペプチドは、配列番号２４、２５、２７、２８、２９、３０、３３、又は３４から選択される。

【0029】

特定の実施形態では、ＧＬＰ－１融合ペプチドは、環状ＰＹＹペプチドのリシン残基において、環状ＰＹＹペプチドに共有結合で連結している。特定の実施形態では、式Ｉ中のＺ_７、Ｚ_９、Ｚ_１１、Ｚ_２２、及びＺ_２３のうちの１つだけがリシンであり、当該リシンは、ＧＬＰ－１融合ペプチドの第２のリンカーペプチドにおけるシステイン残基に共有結合で連結している。

【0030】

特定の実施形態では、ＧＬＰ－１融合ペプチドのＧＬＰ－１ペプチドは、配列番号５６～５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＧＬＰ－１融合ペプチドの第１のリンカーペプチドは、配列番号６０～８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＧＬＰ－１融合ペプチドのヒンジ－Ｆｃ領域ペプチドは、配列番号８４～９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＧＬＰ－１融合ペプチドの第２のリンカーペプチドは、配列番号９１～１１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第２のリンカーペプチドは、配列番号９３、９４、９５、１０６、又は１１１のアミノ酸配列を含む。

【0031】

また、環状ＰＹＹペプチドに共役しているグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）融合ペプチドを含むコンジュゲートであって、当該ＧＬＰ－１融合ペプチドが、配列番号１１３～２２４及び２６７～２７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該環状ＰＹＹペプチドが、配列番号２４、２５、２７、２８、２９、３０、３３、又は３４から選択されるアミノ酸配列を含む、コンジュゲートも提供される。特定の実施形態では、ＧＬＰ－１融合ペプチドは、配列番号１１３又は配列番号１３６のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、配列番号１１３又は配列番号１３６のアミノ酸残基２８７～２８９の間のシステイン残基、好ましくは配列番号１１３又は配列番号１３６のシステイン残基２８８は、環状ＰＹＹペプチドの残基７、９、１１、２２、又は２３におけるリシン残基、好ましくは環状ＰＹＹペプチドのリシン残基１１に直接又は化学リンカーを介して共有結合で連結している。

【0032】

また、環状ＰＹＹペプチドに共役しているグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）融合ペプチドを含むコンジュゲートであって、配列番号２２５～２６２からなる群から選択される配列又はその薬学的に許容される塩を含むコンジュゲートも提供される。

【0033】

また、本発明のコンジュゲートの生成方法も提供される。当該方法は、環状ＰＹＹペプチドの側鎖、好ましくは環状ＰＹＹペプチドのリシン残基の側鎖に導入された求電子剤、好ましくはブロモアセトアミド又はマレイミドを、ＧＬＰ－１融合ペプチドの第２のリンカーペプチド（例えば、カルボキシ末端リンカーペプチド）のシステイン残基のスルフヒドリル基と反応させ、それにより、当該環状ＰＹＹペプチドと当該ＧＬＰ－１融合ペプチドとの間に共有結合性連結を生じさせることを含む。

【0034】

また、本発明のコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物も提供される。

【0035】

また、それを必要としている対象における疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、当該疾患又は障害が、肥満、Ｉ型又はＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、耐糖能異常、高血糖症、高インスリン血症、高トリグリセリド血症、先天性高インスリン症（ＣＨＩ）による低血糖、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性腎症、並びに管理されていないコレステロール及び／若しくは脂質レベルに関連する高血圧及び心血管危険因子などの他の心血管危険因子、骨粗鬆症、炎症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、腎疾患、並びに／又は湿疹である、方法も提供される。当該方法は、それを必要としている対象に、有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む。

【0036】

また、それを必要としている対象における食物摂取又は体重のうちの少なくとも１つを減少させる方法も提供される。当該方法は、それを必要としている対象に、有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む。

【0037】

また、それを必要としている対象における、Ｙ２受容体活性又はＧＬＰ－１受容体活性を調節する方法も提供される。当該方法は、それを必要としている対象に、有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む。

【0038】

特定の実施形態では、医薬組成物は、注射により投与される。

【0039】

また本発明の化合物を含むキットであって、好ましくは、リラグルチド及び注射用デバイスを更に含む、キットも提供される。

【0040】

また、本発明の医薬組成物の生成方法も提供される。当該方法は、コンジュゲートを薬学的に許容される担体と組み合わせて医薬組成物を得ることを含む。

【0041】

本発明の更なる態様、特徴、及び利点は、「発明の詳細な説明」及び「特許請求の範囲」を読むことにより、より良く理解されるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0042】

上記の概要、及び本出願の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことでより良く理解されるであろう。しかしながら、本出願は、図面に示される実施形態そのものに限定されないことを理解するべきである。

【図1A】ＧＬＰ－１融合ペプチド部分のエクスビボにおけるヒト血漿安定性を示す。図１Ａは、３７℃で７日間、ヒト血漿中でインキュベートした、ＧＬＰ－１融合ペプチドＧＦ３２（配列番号１４４）（▲）、ＧＦ３６（１４８）（△）、ＧＦ３３（１４５）（▼）、ＧＦ３９（１５１）（▽）、ＧＦ３４（１４６）

【数1】

、ＧＦ３５（１４７）（●）、ＧＦ３７（１４９）（○）、ＧＦ４０（１５２）（◇）、及びデュラグルチド対照（◆）のエクスビボにおけるヒト血漿安定性を示すグラフを示す。

【図1B】ＧＬＰ－１融合ペプチド部分のエクスビボにおけるヒト血漿安定性を示す。図１Ｂは、デュラグルチド対照（◇）と共に、３７℃で７日間、エクスビボでヒト血漿中においてインキュベートした、ＧＦ４０（配列番号１５２）（▲）及びＧＦ３４（配列番号１４６）（●）、並びにこれらの対応するＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹペプチドコンジュゲート配列番号２４８（△）及び配列番号２６２（○）、並びに別のＧＬＰ－１融合ペプチドＧＦ４１（配列番号１５３）（▼）のエクスビボにおけるヒト血漿安定性を示すグラフを示す。

【図2A】ＤＩＯマウスにおける食物摂取及び体重の減少を示す。図２Ａは、デュラグルチド、化合物１（ＧＦ１（配列番号１１３））（０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ）、及び化合物２（配列番号２２５）（０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ）で処理したＤＩＯマウスにおける食物摂取（図２Ａ）のグラフを示す。ビヒクル（白丸）、デュラグルチド（白四角）、化合物１（黒四角）、又は化合物２（黒丸）を皮下注射することによってマウスに投与し、体重及び食物摂取を３日間記録した。

【図2B】ＤＩＯマウスにおける食物摂取及び体重の減少を示す。図２Ｂは、デュラグルチド、化合物１（ＧＦ１（配列番号１１３））（０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ）、及び化合物２（配列番号２２５）（０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ）で処理したＤＩＯマウスにおける体重減少率（図２Ｂ）のグラフを示す。ビヒクル（白丸）、デュラグルチド（白四角）、化合物１（黒四角）、又は化合物２（黒丸）を皮下注射することによってマウスに投与し、体重及び食物摂取を３日間記録した。

【図3A】ＤＩＯマウスにおける食物摂取及び体重の減少を示す。図３Ａは、デュラグルチド、化合物３（ＧＦ２４（配列番号１３６））（０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ）、及び化合物４（配列番号２２９）（０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ）で処理したＤＩＯマウスにおける食物摂取（図３Ａ）のグラフを示す。ビヒクル（白丸）、デュラグルチド（白四角）、化合物３（黒四角）、又は化合物４（黒丸）を皮下注射することによってマウスに投与し、体重及び食物摂取を３日間記録した。

【図3B】ＤＩＯマウスにおける食物摂取及び体重の減少を示す。図３Ｂは、デュラグルチド、化合物３（ＧＦ２４（配列番号１３６））（０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ）、及び化合物４（配列番号２２９）（０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ）で処理したＤＩＯマウスにおける体重減少率（図３Ｂ）のグラフを示す。ビヒクル（白丸）、デュラグルチド（白四角）、化合物３（黒四角）、又は化合物４（黒丸）を皮下注射することによってマウスに投与し、体重及び食物摂取を３日間記録した。

【図4A】ＤＩＯマウスにおけるＩＰＧＴＴを示す。図４Ａは、０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ及び１．０ｎｍｏｌ／ｋｇのデュラグルチド、化合物４（配列番号２２９）、及び化合物２（配列番号２２５）で処理したＤＩＯマウスにおける経時的なグルコースレベルのグラフを示す。ビヒクル（黒丸）、デュラグルチド（白／黒四角）、化合物４（白／黒三角）、又は化合物２（白／黒円、点線）を皮下注射することによってマウスに投与した。全ての化合物を０．３又は１．０ｎｍｏｌ／ｋｇで投与した。１８時間の絶食後、腹腔内耐糖能試験（ＩＧＰＴＴ）のために１ｇ／ｋｇデキストロースをマウスに投与した。

【図4B】ＤＩＯマウスにおけるＩＰＧＴＴを示す。図４Ｂは、０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ及び１．０ｎｍｏｌ／ｋｇのデュラグルチド、化合物４（配列番号２２９）、及び化合物２（配列番号２２５）で処理したＤＩＯマウスにおけるベースラインに対する正味のＡＵＣのグラフを示す。ビヒクル（黒丸）、デュラグルチド（白／黒四角）、化合物４（白／黒三角）、又は化合物２（白／黒円、点線）を皮下注射することによってマウスに投与した。全ての化合物を０．３又は１．０ｎｍｏｌ／ｋｇで投与した。１８時間の絶食後、腹腔内耐糖能試験（ＩＧＰＴＴ）のために１ｇ／ｋｇデキストロースをマウスに投与した。

【図5A】ＤＩＯマウスにおける食物摂取及び体重の減少を示す。図５Ａは、デュラグルチド、ＧＦ４１（配列番号１５３）（０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ）、及びＧＦ４０（配列番号１５２）（０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ）で処理したＤＩＯマウスにおける食物摂取（図５Ａ）のグラフを示す。ビヒクル（白丸）、デュラグルチド（白四角）、配列番号１５３（黒四角）、又は配列番号１５２（黒丸）を皮下注射することによってマウスに投与し、体重及び食物摂取を３日間記録した。

【図5B】ＤＩＯマウスにおける食物摂取及び体重の減少を示す。図５Ｂは、デュラグルチド、ＧＦ４１（配列番号１５３）（０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ）、及びＧＦ４０（配列番号１５２）（０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ）で処理したＤＩＯマウスにおける体重減少率（図５Ｂ）のグラフを示す。ビヒクル（白丸）、デュラグルチド（白四角）、配列番号１５３（黒四角）、又は配列番号１５２（黒丸）を皮下注射することによってマウスに投与し、体重及び食物摂取を３日間記録した。

【図6A】ＤＩＯマウスにおける食物摂取及び体重の減少を示す。図６Ａは、デュラグルチド及びＧＦ１９（配列番号１３１）（０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ）で処理したＤＩＯマウスにおける食物摂取（図６Ａ）のグラフを示す。ビヒクル（白丸）、デュラグルチド（白四角）、又は配列番号１３１（黒四角）を皮下注射することによってマウスに投与し、体重及び食物摂取を３日間記録した。

【図6B】ＤＩＯマウスにおける食物摂取及び体重の減少を示す。図６Ｂは、デュラグルチド及びＧＦ１９（配列番号１３１）（０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ）で処理したＤＩＯマウスにおける体重減少率（図６Ｂ）のグラフを示す。ビヒクル（白丸）、デュラグルチド（白四角）、又は配列番号１３１（黒四角）を皮下注射することによってマウスに投与し、体重及び食物摂取を３日間記録した。

【図7A】ＤＩＯマウスにおけるＩＰＧＴＴを示す。図７Ａは、０．３ｎｍｏｌ／ｋｇのデュラグルチド、化合物４（配列番号２２９）、及び化合物３（ＧＦ２４（配列番号１３６））で処理したＤＩＯマウスにおける経時的なグルコースレベルのグラフを示す。ビヒクル（黒丸）、デュラグルチド（白四角）、化合物４（白丸）、又は化合物３（黒四角、点線）を皮下注射することによってマウスに投与した。全ての化合物を０．３ｎｍｏｌ／ｋｇで投与した。１８時間の絶食後、腹腔内耐糖能試験（ＩＧＰＴＴ）のために１ｇ／ｋｇデキストロースをマウスに投与した。

【図7B】ＤＩＯマウスにおけるＩＰＧＴＴを示す。図７Ｂは、０．３ｎｍｏｌ／ｋｇのデュラグルチド、化合物４（配列番号２２９）、及び化合物３（ＧＦ２４（配列番号１３６））で処理したＤＩＯマウスにおけるベースラインに対する正味のＡＵＣのグラフを示す。ビヒクル（黒丸）、デュラグルチド（白四角）、化合物４（白丸）、又は化合物３（黒四角、点線）を皮下注射することによってマウスに投与した。全ての化合物を０．３ｎｍｏｌ／ｋｇで投与した。１８時間の絶食後、腹腔内耐糖能試験（ＩＧＰＴＴ）のために１ｇ／ｋｇデキストロースをマウスに投与した。

【図8A】ＤＩＯマウスにおける単回投与後の食物摂取及び体重変化に対する化合物４（配列番号２２９）又はデュラグルチドの曝露応答分析を示す。図８Ａは、体重変化率（図８Ｂ）のグラフを示す。白四角は、デュラグルチドについて観察された個々のデータを表す。黒四角は、化合物４について観察された個々のデータを表す。曲線は、デュラグルチド（灰色曲線）及び化合物４（黒色曲線）についての曝露応答非線形回帰に基づく最良当てはめ曲線を表す。灰色の縦線は、全ての分析試験において、０．３ｎｍｏｌ／ｋｇのデュラグルチド平均（±標準偏差）３日目ＨＧＥ濃度を表す：≒０．３２（±０．１５）ｎＭ。

【図8B】ＤＩＯマウスにおける単回投与後の食物摂取及び体重変化に対する化合物４（配列番号２２９）又はデュラグルチドの曝露応答分析を示す。図８Ｂは、体重変化率（図８Ｂ）のグラフを示す。白四角は、デュラグルチドについて観察された個々のデータを表す。黒四角は、化合物４について観察された個々のデータを表す。曲線は、デュラグルチド（灰色曲線）及び化合物４（黒色曲線）についての曝露応答非線形回帰に基づく最良当てはめ曲線を表す。灰色の縦線は、全ての分析試験において、０．３ｎｍｏｌ／ｋｇのデュラグルチド平均（±標準偏差）３日目ＨＧＥ濃度を表す：≒０．３２（±０．１５）ｎＭ。

【図9A】反復（４、Ｑ３Ｄ）皮下（ＳＣ）投与後９日目（投与前）及び１２日目（投与前）における、過体重のカニクイザルにおけるカロリー摂取に対する影響について化合物４（黒色記号）又はデュラグルチド（白四角）の曝露応答分析を示す。活性ＧＬＰ－１濃度を、リガンド結合アッセイ（ＬＢＡ）（図９Ａ）によって測定した。曲線は、デュラグルチド（灰色曲線）及び化合物４（黒色曲線）についての曝露応答非線形回帰に基づく最良当てはめ曲線を表す。０．００７４ｍｇ／ｋｇで投与された化合物４からのデータは、曝露応答分析には含めず、グラフにのみ含める。毎日のカロリー摂取変化率％をベースラインに対して計算し、これを－２～０日目の平均として定義した。

【図9B】反復（４、Ｑ３Ｄ）皮下（ＳＣ）投与後９日目（投与前）及び１２日目（投与前）における、過体重のカニクイザルにおけるカロリー摂取に対する影響について化合物４（黒色記号）又はデュラグルチド（白四角）の曝露応答分析を示す。活性ＧＬＰ－１濃度を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ ＨＥアッセイ（図９Ｂ）によって測定した。曲線は、デュラグルチド（灰色曲線）及び化合物４（黒色曲線）についての曝露応答非線形回帰に基づく最良当てはめ曲線を表す。０．００７４ｍｇ／ｋｇで投与された化合物４からのデータは、曝露応答分析には含めず、グラフにのみ含める。毎日のカロリー摂取変化率％をベースラインに対して計算し、これを－２～０日目の平均として定義した。

【図10A】ビヒクル、デュラグルチド（０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ）、又は配列番号１４０（０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ）で処理したＤＩＯマウスにおける食物摂取（ＦＩ）（グラム）（図１０Ａ）を示す。試験の１日前にＤＩＯマウスの体重を測定し、体重別にグループ分けした。ビヒクル（白丸）、デュラグルチド（白四角）、又は配列番号１４０（黒四角）を皮下注射（２ｍＬ／ｋｇ）することによってマウスに投与し、ＢＷ及びＦＩを次の３日間記録した。

【図10B】ビヒクル、デュラグルチド（０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ）、又は配列番号１４０（０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ）で処理したＤＩＯマウスにおける体重（ＢＷ）の変化％（図１０Ｂ）を示す。試験の１日前にＤＩＯマウスの体重を測定し、体重別にグループ分けした。ビヒクル（白丸）、デュラグルチド（白四角）、又は配列番号１４０（黒四角）を皮下注射（２ｍＬ／ｋｇ）することによってマウスに投与し、ＢＷ及びＦＩを次の３日間記録した。

【図11A】ビヒクル、デュラグルチド（０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ）、配列番号１３１（０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ）、又は配列番号２５１（０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ）で処理したＤＩＯマウスにおける食物摂取（ＦＩ）（グラム）（図１１Ａ）を示す。試験の１日前にＤＩＯマウスの体重を測定し、体重別にグループ分けした。ビヒクル（白丸）、デュラグルチド（白四角）、配列番号１３１（黒四角）、又は配列番号２５１（黒丸）を皮下注射（２ｍＬ／ｋｇ）することによってマウスに投与し、ＢＷ及びＦＩを次の３日間記録した。

【図11B】ビヒクル、デュラグルチド（０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ）、配列番号１３１（０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ）、又は配列番号２５１（０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ）で処理したＤＩＯマウスにおける体重（ＢＷ）の変化％（図１１Ｂ）を示す。試験の１日前にＤＩＯマウスの体重を測定し、体重別にグループ分けした。ビヒクル（白丸）、デュラグルチド（白四角）、配列番号１３１（黒四角）、又は配列番号２５１（黒丸）を皮下注射（２ｍＬ／ｋｇ）することによってマウスに投与し、ＢＷ及びＦＩを次の３日間記録した。

【図12】ＧＬＰ－１ペプチド（配列番号５８）を異なる長さの第１のリンカーペプチド（Ｎ末端リンカーペプチド）と比較したヒトＧＬＰ－１Ｒ一次スクリーニングアッセイの結果を示すグラフを示す。最も長い第１のリンカーペプチド（配列番号６７）（▼）を含有する配列番号１７１が最も強力であり、続いて、より短い第１のリンカーペプチドを有するＧＬＰ－１融合ペプチド、すなわち、第１のリンカーペプチド配列番号６４を有する配列番号１６９（▲）及び第１のリンカーペプチド配列番号７４を有する配列番号１６８（■）であった。ＧＬＰペプチドとヒンジ－Ｆｃペプチドとの間に介在する第１のリンカーペプチドを有さない配列番号１６７（●）が、最も微力であった。ＧＬＰ－１ペプチド（◆）をアッセイ対照として含めた。

【発明を実施するための形態】

【0043】

背景技術において、また、本明細書全体を通じて各種刊行物、論文及び特許を引用又は記載する。これら参照文献の各々はその全容が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明のコンテキストを与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいかなる発明に対しても先行技術の一部を構成することを容認するものではない。

【0044】

特に規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。そうでない場合、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有するものである。

【0045】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に文脈上明らかでない限り、複数の指示対象物を含むことに留意すべきである。

【0046】

特に明記しない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲などのあらゆる数値は、全ての場合において、「約」という用語によって修飾されているものとして理解されるべきである。したがって、数値は、典型的には、記載される値の±１０％を含む。例えば、１ｍｇ／ｍＬの濃度は０．９ｍｇ／ｍＬ～１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１％～１０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲は０．９％（ｗ／ｖ）～１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書で使用する場合、数値範囲の使用は、文脈上そうでない旨が明確に示されない限り、その範囲内の整数及び値の分数を含む、全ての可能な部分範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含む。

【0047】

別途記載のない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、直列の全ての要素を指すと理解されるべきである。当業者であれば、単なる通常の実験手順を使用するだけで、本明細書に記載した特定の実施形態に対して多くの同等物を認識するか、又は確認することができよう。このような等価物は、本発明によって包含されることが意図される。

【0048】

本明細書で使用されるとき、用語「備える（comprises）、「備える（comprising）」、「含む（includes）」、「含む（including）」、「有する（has）」、「有する（having）」、「含有する（contains）」、又は「含有する（containing）」あるいはこれらの任意の他の変形形態は、述べられている整数又は整数群を含むことが意図されるが、これら以外の他の整数又は整数群を除外するものではなく、非排他的又は非制限的であることが意図されることが理解されよう。例えば、一連の要素を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されるものではなく、明示的に列挙されない、又はそのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置に本来存在しない他の要素を含んでもよい。更に、明示的に反対に明記されない限り、「又は」は包括的な「又は」を指すものであり、排他的な「又は」を指すものではない。例えば、条件Ａ又はＢは、Ａが真であり（又は存在する）かつＢが偽である（又は存在しない）場合、Ａが偽であり（又は存在しない）かつＢが真である（又は存在する）場合、並びにＡ及びＢの両方が真である（又は存在する）場合、のいずれか１つによって充足される。

【0049】

好ましい発明の構成要素の寸法又は特徴を指すときに本明細書で使用される用語「約」、「およそ」、「概ね」、「実質的に」などの用語は、当業者には理解されるように、記載の寸法／特徴が厳密な境界又はパラメータではなく、また機能的に同じ又は類似する、それらからのわずかな相違を除外しないことを示すことも理解されたい。最小値では、数値パラメータを含むこのような参照は、当該技術分野において受け入れられている数学的及び工業的原理（例えば、四捨五入、測定、又は他の系統的誤差、製造公差など）を使用すると、最小有効数字は変化しない変形形態を含むであろう。

【0050】

２つ以上の核酸又はポリペプチド配列（例えば、ＧＬＰ－１ペプチド、リンカーペプチド、ヒンジ－Ｆｃ領域ペプチド、環状ＰＹＹ_３－３６ペプチド配列）に関連する、「同一の」又は「同一性」パーセントという用語は、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して又は本開示を考慮して当該技術分野において既知の方法を使用した目視検査によって測定したときに、比較し、一致が最大になるようにアラインメントした場合、同一であるか、又は指定の割合の同一であるアミノ酸残基若しくはヌクレオチドを有する２つ以上の配列又はサブ配列を指す。

【0051】

配列比較のために、典型的には、１つの配列は、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じて、サブシーケンス座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。

【0052】

比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視検査（一般的に、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照されたい）によって行うことができる。

【0053】

配列同一性パーセント及び配列類似性を求めるのに好適なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９９７）に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うソフトウェアは、国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）を通じて公的に入手可能である。

【0054】

２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であることの更なる指標は、以下に記載されるように、第１の核酸によりコードされるポリペプチドが、第２の核酸によりコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。したがって、ポリペプチドは、典型的には、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一である別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。

【0055】

本明細書で使用される場合、「対象」は、任意の動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。本明細書で使用するとき、用語「哺乳動物」とは、あらゆる哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、これらに限定されるものではないが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、ヒトなど、より好ましくはヒトが挙げられる。

【0056】

本発明の方法に関して用語「投与」は、本発明のコンジュゲート若しくは化合物、又はその形態、組成物、若しくは医薬を使用することにより、本明細書に記載の症候群、障害、又は疾患を治療的又は予防的に予防する、治療する、又は寛解させる方法を意味する。このような方法は、有効量の当該コンジュゲート、化合物、その形態、組成物、若しくは医薬を、組み合わせ形態で、治療過程における異なる時点で又は同時に投与することを含む。本発明の方法は、既知の治療的処置レジメンを全て包含するものとして理解されるものである。

【0057】

用語「有効量」は、研究者、獣医師、医師、又はその他の臨床医が探求している生物学的又は医学的反応を組織系、動物、又はヒトにおいて惹起する（治療される症候群、障害若しくは疾患、又は、治療される症候群、障害若しくは疾患の症状を予防する、治療する、又は寛解させることを含む）活性コンジュゲート、化合物、又は薬剤の量を意味する。

【0058】

本明細書で使用するとき、用語「組成物」は、特定の成分を特定の量で含む生成物、並びに、直接的又は間接的に特定の成分の特定の量の組み合わせから生じる任意の生成物を包含するものとする。

【0059】

本明細書で使用するとき、用語「共役／結合した」は、２つ以上の物体を一緒に接合又は接続することを指す。化学化合物又は生物学的化合物を指す場合、共役／結合したとは、２つ以上の化学化合物又は生物学的化合物間の共有結合による接続を指し得る。非限定的な例として、本発明のグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）融合ペプチドを目的の環状ＰＹＹペプチドと結合させて、ＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹペプチドコンジュゲートを形成することができる。特定の実施形態では、本発明のＧＬＰ－１融合ペプチドは、少なくとも１つのリンカーを通して本発明の環状ＰＹＹペプチドと共有結合で結合され得る。ＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹペプチドコンジュゲートは、ＧＬＰ－１融合ペプチドを環状ＰＹＹペプチドにコンジュゲートさせるように設計された特定の化学反応を通して形成され得る。例として、ＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹペプチドコンジュゲートは、コンジュゲーション反応を通して形成することができる。コンジュゲーション反応は、例えば、求電子基（例えば、ブロモアセトアミド又はマレイミド）を、目的のペプチド（例えば、ＧＬＰ－１融合ペプチド）におけるシステイン残基のスルフヒドリル基と反応させることを含み得る。求電子基は、例えば、環状ＰＹＹペプチドのアミノ酸残基の側鎖に導入することができる。求電子基とスルフヒドリル基との反応により、共有チオエーテル結合が形成される。

【0060】

本明細書で使用するとき、用語「ペプチドリンカー」又は「リンカーペプチド」は、ＧＬＰ－１ペプチドをヒンジ－Ｆｃ領域ペプチドに連結させるか、又はヒンジ－Ｆｃ領域ペプチドを環状ＰＹＹペプチドに連結させて、ＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹペプチドコンジュゲートを形成する、１つ又は２つ以上のアミノ酸を含有する化学モジュールを指す。ＧＬＰ－１融合ペプチドは、例えば、第１のリンカーペプチド及び第２のリンカーペプチドを含み得る。

【0061】

本明細書で使用するとき、用語「化学リンカー」は、環状ＰＹＹペプチドをＧＬＰ－１融合ペプチドに連結させるアミノ酸を全く含有しない化学モジュールを指す。特定の実施形態では、環状ＰＹＹペプチドは、化学リンカーを含む。環状ＰＹＹペプチドのための化学リンカーとしては、例えば、炭化水素リンカー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）リンカー、多糖類リンカー、ポリエステルリンカー、アシル基を含有するリンカー、ＰＥＧ及び埋め込まれた複素環からなるハイブリッドリンカー、並びに炭化水素鎖を挙げることができるが、これらに限定されない。化学リンカーは、例えば、まず環状ＰＹＹペプチドに共有結合で接続させ、次いで、ＧＬＰ－１融合ペプチド、好ましくはＧＬＰ－１融合ペプチドの第２のリンカーペプチドに共有結合で接続させてよい。

【0062】

本明細書で使用するとき、用語「コンジュゲート」は、別の薬学的活性部分（例えば、環状ＰＹＹペプチド）に共有結合で結合したペプチド（例えば、ＧＬＰ－１融合ペプチド）を指す。「コンジュゲートされる」という用語は、本発明のペプチドが、直接的に又はリンカーを介して間接的に、別の薬学的活性部分、好ましくは治療用ペプチドに共有結合で連結される又は共有結合で接続されることを指す。非限定的な例として、ペプチドは、本発明のＧＬＰ－１融合ペプチドであってよく、他の薬学的活性部分は、目的の環状ＰＹＹペプチドなどの治療用ペプチドであってよい。

【0063】

本明細書に記載のペプチド配列は、通常の慣習に従って記載され、ペプチドのＮ末端領域は左側にあり、Ｃ末端領域は右側にある。アミノ酸の異性体形態は既知であるが、別途明示的に示されない限り、示されるのはアミノ酸のＬ型である。

【0064】

グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）融合ペプチド
全般的な一態様では、本発明は、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）融合ペプチドに関する。ＧＬＰ－１融合ペプチドは、ＧＬＰ－１又はＧＬＰ－１変異体ペプチド、第１のリンカーペプチド（例えば、アミノ（Ｎ）－末端リンカー）、ヒンジ－Ｆｃ領域ペプチド、及び第２のリンカーペプチド（例えば、カルボキシ（Ｃ）－末端リンカー）を含む。

【0065】

グルカゴン様ペプチド－１又はＧＬＰ－１変異体ペプチド
グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）は、腸内で合成され、食物摂取に応答して放出されるインスリン分泌促進物質である。それは、主に、ＧＬＰ－１－（７－３７）及びＧＬＰ－１－（７－３６）ＮＨ_２の２つの形態で分泌され、これらはいずれも膵臓β細胞上の特異的ＧＬＰ－１受容体（ＧＬＰ－１Ｒ）に結合し、グルコース刺激インスリン分泌を増強する。

【0066】

多くのＧＬＰ－１アナログ及び誘導体が既知であり、本明細書では「ＧＬＰ－１変異体」と呼ぶ場合がある。これらのＧＬＰ－１変異体ペプチドは、アメリカドクトカゲの毒にみられるペプチドであるエキセンディンを含み得る。これらのエキセンディンは、天然のＧＬＰ－１との配列相同性を有しており、ＧＬＰ－１受容体に結合し、ＧＬＰ－１（７－３７）に起因する活性に対するシグナル伝達カスケード応答を開始させることができる。

【0067】

ＧＬＰ－１及びＧＬＰ－１変異体ペプチドは、様々な方法で作用することが示されており、これには、インスリン放出の刺激、グルカゴン分泌の低下、胃排出の阻害、及びグルコース利用の増強を挙げることができるが、これらに限定されない。

【0068】

ＧＬＰ－１Ｒは、７回膜貫通ヘテロ三量体Ｇタンパク質共役受容体のクラスＢファミリーに属し、膵島のα－、β－、及びδ－細胞、心臓、腎臓、胃、腸、迷走神経の神経節神経、並びに視床下部及び脳幹を含む中枢神経系（ＣＮＳ）のいくつかの領域を含むがこれらに限定されない広範囲の組織で発現する。ＧＬＰ－１Ｒは、細胞内カルシウム、アデニル酸シクラーゼ、及びホスホリパーゼＣを増加させ、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＰＩ－３Ｋ、Ｅｐａｃ２、及びＭＡＰＫシグナル伝達経路を活性化させるＧα_ｓ、Ｇα_ｑ、Ｇα_ｉ、及びＧα_ｏ（Ｍｏｎｔｒｏｓｅ－Ｒａｆｉｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４０：１１３２－４０（１９９９）；Ｈａｌｌｂｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １５４６：７９－８６（２００１））に結合し得る（Ｄｒｕｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ８４：３４３４－８（１９８７）；Ｗｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｒｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３３：５７－６２（１９９３）；及びＨｏｌｚ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ ２７０：１７７４９－５７（１９９５））。

【0069】

第１の構成要素を含むＧＬＰ－１融合ペプチドであって、当該第１の構成要素がＧＬＰ－１又はＧＬＰ－１変異体ペプチドである、融合ペプチドが本明細書に提供される。本明細書で使用するとき、用語「ＧＬＰ－１ペプチド」、「ＧＬＰ－１変異体ペプチド」、「ＧＬＰ－１ペプチド変異体」、及び「ＧＬＰ－１又はＧＬＰ－１変異体ペプチド」は互換的に使用される。ＧＬＰ－１又はＧＬＰ－１変異体ペプチドは、表１に提供される配列のうちの１つを含み得る。ＧＬＰ－１又はＧＬＰ－１変異体ペプチド配列は、以下の基準：（ｉ）発現収率、（ｉｉ）インビトロ安定性、（ｉｉｉ）インビトロ効力、（ｉｖ）環状ＰＹＹペプチドとの化学コンジュゲーション後のインビトロ効力の保持、（ｖ）セリンキシロシル化又はセリンキシロシル化の可能性の欠如、及び（ｖｉ）ＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹペプチドコンジュゲートの特性（例えば、インビボ安定性及びインビボ効力（すなわち、ＧＬＰ－１又はＧＬＰ－１変異体ペプチド及び環状ＰＹＹペプチドが、それぞれ、ＧＬＰ－１及びＹ２受容体に対するアゴニスト活性を有することができるかどうか））のうちの少なくとも１つに基づいて選択してよい。

【0070】

ＧＬＰ－１融合ペプチドの第１の構成要素を構成するＧＬＰ－１又はＧＬＰ－１変異体ペプチドは、天然のＧＬＰ－１に十分な相同性及び機能性を有するペプチドを包含することが意図される。ＧＬＰ－１又はＧＬＰ－１変異体ペプチドは、膵臓のβ－細胞においてＧＬＰ－１受容体に結合することができるように設計され、その結果、天然のＧＬＰ－１が膵臓のβ－細胞上のＧＬＰ－１受容体に結合したときと同じシグナル伝達経路が生じ、同じ又は類似のインスリン分泌活性を呈する。

【0071】

【表1】

【0072】

第１のリンカーペプチド：アミノ末端リンカー（Ｎ末端リンカー）
第２の構成要素を含むＧＬＰ－１融合ペプチドであって、当該第２の構成要素が第１のリンカーペプチド（すなわち、アミノ末端リンカーペプチド）である、融合ペプチドが、本明細書に提供される。第１のリンカーペプチドは、表２に提供される配列のうちの１つを含み得る。第１のリンカーペプチド配列は、以下の基準：（ｉ）発現収率、（ｉｉ）インビトロ効力、（ｉｉｉ）インビトロ安定性、（ｉｖ）セリンキシロシル化又はセリンキシロシル化の可能性の欠如、及び（ｖ）ＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹペプチドコンジュゲートの特性（例えば、インビボ安定性及びインビボ効力（すなわち、ＧＬＰ－１又はＧＬＰ－１変異体ペプチド及び環状ＰＹＹペプチドが、それぞれ、ＧＬＰ－１及びＹ２受容体に対するアゴニスト活性を有することができるかどうか））のうちの少なくとも１つに基づいて選択してよい。

【0073】

特定の実施形態では、ＧＬＰ－１融合ペプチドは、第１のリンカーペプチドである第２の構成要素を含まない。

【0074】

【表2】

【0075】

ヒンジ－Ｆｃ領域ペプチド
特定の実施形態では、ＧＬＰ－１融合ペプチドは、第３の構成要素を含み、当該第３の構成要素は、ヒンジ－Ｆｃ領域ペプチドである。ヒンジ－Ｆｃ領域ペプチドは、ＦｃＲｎ受容体の再生に加えて、分子量の増加及び糸球体濾過の減少によって治療用ペプチドの循環半減期をより長くすることができる。特定の実施形態では、ヒンジ－Ｆｃ領域ペプチドは、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域に由来していてよい。ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域は、他のＩｇＧサブタイプと比較して、ＦｃγＲ及び補体因子に結合する能力が低減されている。好ましくは、Ｆｃ領域は、エフェクター機能を排除する置換を有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含有する。したがって、ＧＬＰ－１融合ペプチドは、以下の置換のうちの１つ又は２つ以上を含有する修飾されたヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域を有するＦｃ領域を更に含む：残基２３３におけるグルタミン酸の代わりにプロリンを使用、残基２３４におけるフェニルアラニンの代わりにアラニン又はバリンを使用、及び残基２３５におけるロイシンの代わりにアラニン又はグルタミン酸を使用（ＥＵ番号付け、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１－３２４２（１９９１））。残基２９７（ＥＵ番号付け）においてＡｓｎの代わりにＡｌａを使用することによって、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域におけるＮ連結グリコシル化部位を除去することは、残留エフェクター活性が排除されることを確実にする別の方法である。

【0076】

特定の実施形態では、本発明のＧＬＰ－１融合ペプチドは、単量体又は二量体として存在する。好ましい実施形態では、ＧＬＰ－１融合ペプチドは、二量体として存在する。特定の実施形態では、ＧＬＰ－１融合ペプチドは二量体として存在し、当該二量体はホモ二量体である、すなわち、当該二量体は、同じ配列を有する２つのＧＬＰ－１融合ペプチドを含む。特定の実施形態では、ＧＬＰ－１融合ペプチドは二量体として存在し、当該二量体はヘテロ二量体である、すなわち、当該二量体は、異なる配列を有する２つのＧＬＰ－１融合ペプチドを含む。

【0077】

好ましくは、本発明のＧＬＰ－１融合ペプチドは、ジスルフィド結合及び様々な非共有結合相互作用によって互いに接合された二量体として存在する。したがって、本発明の抗体に有用なＦｃ部分は、重鎖二量体形成を安定させ、半ＩｇＧ４ Ｆｃ鎖の形成を防止する、２２８（ＥＵ番号付け）における位置でのプロリンに対するセリンなどの置換を含有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり得る。特定の実施形態では、ヒンジジスルフィドのＮ末端にアミノ酸の天然の配列が含まれ得る。ヒトＩｇＧ４のｘ線結晶構造は、これらのアミノ酸が、空間内において上流構造を逆の配向にする傾向のある構造を形成し得ることを示唆している。このような傾向は、ＧＬＰ－１融合ペプチドなどの上流エレメントの空間的分離を維持するのに有利である。他の実施形態では、ヒンジジスルフィドのＮ末端の天然のアミノ酸を省略してもよい。

【0078】

特定の実施形態では、ヒトＰＡＡ Ｆｃに融合しているハイブリッドヒトＩｇＧ２ａヒンジを使用して、ＧＬＰ－１融合ペプチドの効力及び安定性に対する影響を調べた。

【0079】

別の実施形態では、重鎖のＣ末端Ｌｙｓ残基は、組換えにより生成されたモノクローナル抗体に一般的に見られるように除去される。

【0080】

ヒンジ－Ｆｃ領域ペプチドは、表３に提供される配列のうちの１つを含み得る。ヒンジ－Ｆｃ領域ペプチド配列は、以下の基準：（ｉ）インビトロ安定性、（ｉｉ）インビトロ効力、（ｉｉｉ）ＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹペプチドコンジュゲートの特性（例えば、インビボ安定性及びインビボ効力（すなわち、ＧＬＰ－１又はＧＬＰ－１変異体ペプチド及び環状ＰＹＹペプチドが、それぞれ、ＧＬＰ－１及びＹ２受容体に対するアゴニスト活性を有することができるかどうか））のうちの少なくとも１つに基づいて選択してよい。

【0081】

【表3】

【0082】

ヒンジ－Ｆｃ領域プラットフォームペプチドであって、ヒンジ－Ｆｃ領域ペプチドと、当該ヒンジ－Ｆｃ領域ペプチドのアミノ末端に接続された第１のリンカーペプチド及び当該ヒンジ－Ｆｃ領域ペプチドのカルボキシ末端に接続された第２のリンカーペプチドのうちの少なくとも１つと、を含むヒンジ－Ｆｃ領域プラットフォームペプチドが、本明細書に提供される。ヒンジ－Ｆｃ領域ペプチドは、例えば、配列番号８４～９０からなる群から選択されるアミノ酸配列であってよく、第１のリンカーペプチドは、例えば、配列番号６０～８３からなる群から選択されるアミノ酸配列であってよく、第２のリンカーペプチドは、例えば、配列番号９１～１１２からなる群から選択されるアミノ酸配列であってよい。特定の実施形態では、ヒンジ－Ｆｃ領域ペプチドは、配列番号８４を含み、第１のリンカーペプチドは、配列番号６０を含む。特定の実施形態では、ヒンジ－Ｆｃ領域ペプチドは、配列番号８４を含み、第２のリンカーペプチドは、配列番号９３、９４、９５、１０６、又は１１１を含む。特定の実施形態では、ヒンジ－Ｆｃ領域ペプチドは、配列番号８４を含み、第１のリンカーペプチドは、配列番号６０を含み、第２のリンカーペプチドは、配列番号９３、９４、９５、１０６、又は１１１を含む。

【0083】

第２のリンカーペプチド：カルボキシ末端リンカー（Ｃ末端リンカー）
第４の構成要素を含むＧＬＰ－１融合ペプチドであって、当該第４の構成要素が第２のリンカーペプチド（すなわち、カルボキシ末端リンカーペプチド）である、融合ペプチドが、本明細書に提供される。第２のリンカーペプチドは、表４に提供される配列のうちの１つを含み得る。第２のリンカーペプチド配列は、以下の基準：（ｉ）発現収率、（ｉｉ）インビトロ効力、（ｉｉｉ）インビトロ安定性、（ｉｖ）セリンキシロシル化又はセリンキシロシル化の可能性の欠如、（ｖ）コンジュゲーション収率、及び（ｖｉ）ＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹペプチドコンジュゲートの特性（例えば、インビボ安定性及びインビボ効力（すなわち、ＧＬＰ－１又はＧＬＰ－１変異体ペプチド及び環状ＰＹＹペプチドが、それぞれ、ＧＬＰ－１及びＹ２受容体に対するアゴニスト活性を有することができるかどうか））のうちの少なくとも１つに基づいて選択してよい。

【0084】

加えて、第２のリンカーペプチド配列は、環状ＰＹＹペプチドに特異的で有効にコンジュゲートする能力に基づいて選択してよい。この文脈において、特異性とは、融合タンパク質の任意の他の部分におけるコンジュゲーションよりも、第２のリンカーのＣ末端領域における遺伝子操作を受けたシステイン残基において優先的にコンジュゲートすることを指す。特異性を最大化するストラテジーの例としては、（ｉ）スルフヒドリル側鎖の求核性を増大させ、その反応性を強化するために、遺伝子操作を受けたシステイン残基に隣接するアミノ酸を導入すること、（ｉｉ）チオール－求電子性コンジュゲーションにおける選択性の強化が既に実証されているアミノ酸配列に、遺伝子操作を受けたシステイン残基を含めること、及び（ｉｉｉ）コンジュゲーションのための反応性チオールを特異的に遊離させるために、カチオン性又はアニオン性ジスルフィド還元剤をそれぞれ静電的に誘引するアニオン性又はカチオン性側鎖を有するアミノ酸を組み込むことが挙げられる。コンジュゲーション効率を最大化するストラテジーの例としては、（ｉ）第２のリンカーペプチドの相互静電反発力を生じさせるために、第２のリンカーペプチドの任意の部分に、アニオン性又はカチオン性のいずれかの同電荷を導入し、それによって、遺伝子操作を受けたシステイン残基間のジスルフィド形成を低減すること、（ｉｉ）リンカーの剛性を強化するアミノ酸を組み込むこと、（ｉｉｉ）リンカーの柔軟性を増大させるアミノ酸を組み込むこと、及び（ｉｖ）静電的に環状ＰＹＹペプチドを効率的にコンジュゲートさせるアニオン性又はカチオン性側鎖を有するアミノ酸を組み込むことが挙げられる。

【0085】

【表4】

【0086】

ＧＬＰ－１融合ペプチド
上記のように第１、第２、第３、及び第４の構成要素を含むＧＬＰ－１融合ペプチドであって、当該第２の構成要素が任意選択で、存在していなくてもよい、ＧＬＰ－１融合ペプチドが本明細書に提供される。第１の構成要素は、ＧＬＰ－１又はＧＬＰ－１変異体ペプチドであり、第２の構成要素は、第１のリンカーペプチドであり、第３の構成要素は、ヒンジ－Ｆｃ領域ペプチドであり、第４の構成要素は、第２のリンカーペプチドである。ＧＬＰ－１融合ペプチドは、表５に提供される配列のうちの１つを含み得る。ＧＬＰ－１融合ペプチド配列は、以下の基準：（ｉ）発現収率、（ｉｉ）インビトロ効力、（ｉｉｉ）インビトロ安定性、（ｉｖ）セリンキシロシル化の欠如、（ｖ）コンジュゲーション収率、及び（ｖｉ）ＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹペプチドコンジュゲートの特性（例えば、インビボ安定性及びインビボ効力（すなわち、ＧＬＰ－１又はＧＬＰ－１変異体ペプチド及び環状ＰＹＹペプチドが、それぞれ、ＧＬＰ－１及びＹ２受容体に対するアゴニスト活性を有することができるかどうか））のうちの少なくとも１つに基づいて選択してよい。

【0087】

【表5-1】

【0088】

【表5-2】

【0089】

【表5-3】

【0090】

【表5-4】

【0091】

【表5-5】

【0092】

【表5-6】

【0093】

【表5-7】

【0094】

【表5-8】

【0095】

【表5-9】

【0096】

【表5-10】

【0097】

【表5-11】

【0098】

【表5-12】

【0099】

環状ＰＹＹペプチド
ＰＹＹ_３－３６は、食物摂取を阻害するためにＹ２受容体のアゴニストとして作用する、遠位腸内のＬ細胞によって分泌される内因性ホルモンである。食欲及び食物摂取の制御におけるその役割、並びに哺乳動物の胃腸管におけるその抗分泌及び吸収促進効果を考慮すると、ＰＹＹ_３－３６は、肥満及び関連病態、並びに多くの胃腸障害の治療に有効であり得る。しかしながら、ＰＹＹ_３－３６自体の治療剤としての治療的有用性は、その迅速な代謝及び短い循環半減期によって制限される。したがって、本発明は、概して、ＰＹＹ_３－３６ペプチドの半減期を延長し、インビボでのペプチドの代謝を低減する、修飾されたＰＹＹ_３－３６コンジュゲートを目的とする。

【0100】

本発明の特定の実施形態では、修飾されたＰＹＹ_３－３６ペプチドは、環状ＰＹＹペプチドである。「環状ＰＹＹペプチド」、「環状ＰＹＹ_３－３６アナログ」、及び「環状ＰＹＹ_３－３６ペプチドアナログ」という用語は、互換的に使用され得る。本発明のコンジュゲートにおいて使用することができる環状ＰＹＹペプチドの例は、２０１７年１０月２６日に出願された米国特許出願第１５／７９４，２３１号及び２０１７年１０月２６日に出願された米国特許出願第１５／７９４，１７１号に記載されており、両出願の内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0101】

本明細書で使用される場合、「ＮＴＳＣ－ＰＹＹ」という用語は、ＰＹＹのＮ末端～側鎖環状アナログを説明することを意図している。

【0102】

本明細書に記載のペプチド配列は、通常の慣習に従って記載され、ペプチドのＮ末端領域は左側にあり、Ｃ末端領域は右側にある。アミノ酸の異性体形態は既知であるが、別途明示的に示されない限り、示されるのはアミノ酸のＬ型である。本発明の分子を説明する際の便宜上、様々なアミノ酸の従来の及び非従来的な略語（単一及び３文字コードの両方）及び機能部分が使用される。これらの略語は当業者にはよく知られているが、明確にするために、以下に列記する：Ａ＝Ａｌａ＝アラニン；Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン；Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン；Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸；βＡ＝βＡｌａ＝ベータ－アラニン；Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン；ｈＣ＝ｈＣｙｓ＝ホモシステイン；Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸；Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン；Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン；Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン；Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン；Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン；Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン；Ｎｌｅ＝ノルロイシン；Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン；Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン；Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン；Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン；Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン；Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン、及びＶ＝Ｖａｌ＝バリン。

【0103】

便宜上、本発明のＮＴＳＣ－ＰＹＹペプチドを命名する際に使用されるアミノ酸残基の番号付け規則は、ｈＰＹＹ_３－３６のものに従う。ｈＰＹＹ_３－３６の対応する位置における天然の残基に対して、ＮＴＳＣ－ＰＹＹペプチドに導入された特定のアミノ酸置換は、適切なアミノ酸コードと、それに続く置換の位置とによって示される。したがって、ＮＴＳＣ－ＰＹＹペプチドにおける「Ｓ４」は、ｈＰＹＹ_３－３６の対応する天然のｌｙｓ４残基がセリンに置換されているペプチドを指す。同様に、ＮＴＳＣ－ＰＹＹペプチドにおける「ｈＣ３１」は、ｈＰＹＹ_３－３６の対応する天然のｖａｌ３１残基がホモシステインに置換されているペプチドを指す。ＮＴＳＣ－ＰＹＹペプチド内で生じる更なるアミノ酸置換は、この規則に従って記載され、当業者によってこのようなものとして認識されるであろう。

【0104】

また便宜上、本発明のＮＴＳＣ－ＰＹＹペプチドに使用される命名法は、環（cycle）に含まれるＮ末端残基から出発して、左から右方向に、それらの間の連結基と共に環に含まれるアミノ酸残基を組み込む。全ての場合において、環のＮ末端アミノ酸残基は、そのα－アミノ官能基を介して連結基に連結し、これは次に、ＮＴＳＣ－ＰＹＹペプチドの３１位のアミノ酸の側鎖残基に接続する。したがって、「シクロ－（Ｉ３－ｍ－ＣＯＰｈＣＨ_２－ｈＣ３１）」は、Ｉｌｅ３のα－アミノ官能基がメタ－トルイル酸残基でアシル化され、そのメチル基が、チオエーテル結合を介してｈＣｙｓ３１残基の側鎖に更に連結されている、ＮＴＳＣ－ＰＹＹペプチドの環を説明するために使用される。同様に、「シクロ－（Ｋ４－ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＮＨＣＯＣＨ_２－ｈＣ３１）」は、天然のＩｌｅ３残基が欠失しており、そのｌｙｓ４の（ここではＮ末端の）α－アミノ官能基が３－アセトアミドプロパノイル基によりアシル化され、そのアセトアミドメチレン炭素が、チオエーテル結合を介してｈＣｙｓ３１残基の側鎖に接続されている、ＮＴＳＣ－ＰＹＹペプチドの環を説明するために使用される。

【0105】

更なる誘導体化のために便利な機能性ハンドルを提供するために、ｈＰＹＹ_３－３６配列の様々な位置にリシン残基を組み込んでよい。間接的にＧＬＰ－１融合ペプチドに結合されるように、リシン残基を修飾してよい。ＧＬＰ－１融合ペプチドへの間接的共役において、環状ＰＹＹペプチドをＧＬＰ－１融合ペプチドに結合させる化学リンカーを含むように、リシン残基を修飾してよい。当業者であれば、関連するオルソロガスもそのように効果的に使用することができ、本明細書において企図されることを認識するであろう。

【0106】

「Ｋ（ＰＥＧ２４－ＡｃＢｒ）」という用語は、その側鎖ε－アミノ基が、その１－カルボン酸官能基を介して、Ｎ－ブロモアセチル－７５－アミノ－４，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８，３１，３４，３７，４０，４３，４６，４９，５２，５５，５８，６１，６４，６７，７０，７３－テトラコサオキサペンタヘプタコンタン酸によってアシル化されているリシニル残基を表す。

【0107】

「Ｋ（ＰＥＧ１２－ＡｃＢｒ）」という用語は、その側鎖ε－アミノ基が、その１－カルボン酸官能基を介して、Ｎ－ブロモアセチル－３９－アミノ－４，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８，３１，３４，３７－ドデカオキサノナトリアコンタン酸によってアシル化されているリシニル残基を表す。

【0108】

「Ｋ（ＰＥＧ６－ＡｃＢｒ）」という用語は、その側鎖ε－アミノ基が、その１－カルボン酸官能基を介して、Ｎ－ブロモアセチル－３－［（１７－アミノ－３，６，９，１２，１５－ペンタオキサヘプタデカ－１－イル）オキシ］－プロパン酸によってアシル化されているリシニル残基を表す。

【0109】

「Ｋ（ＰＥＧ８－トリアゾリル－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯ－ＰＥＧ４－ＡｃＢｒ）」という用語は、その側鎖ε－アミノ基が、その１－カルボン酸官能基を介して、２７－［４－［２－［３－［２－［２－［３－（Ｎ－ブロモアセチルアミノ）プロポキシ］エトキシ］エトキシ］プロピルアミノカルボニル］エチル］テトラゾール－１－イル］－４，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５－オクタオキサヘプタコサン酸によってアシル化されているリシニル残基を表す。

【0110】

本発明の化合物／コンジュゲートの多くは、配列のＣ末端残基と、Ｙ３６と、その隣接する残基Ｒ３５との間に還元アミド結合を組み込む。この還元アミド連結は、「ｐｓｉ－（Ｒ３５，Ｙ３６）」という用語により表される。

【0111】

本発明の特定の配列を含む様々なアミノ酸残基は、メチル化されているα－アミノ基を含む。したがって、「Ｎ－Ｍｅ－Ｑ３４」又は「Ｎ－Ｍｅ－Ｒ３５」という用語は、それぞれ、配列の３４位におけるα－Ｎ－メチル化グルタミン及び配列の３５位におけるα－Ｎ－メチル化アルギニンを表す。

【0112】

配列の説明において「Ｎ－Ｍｅ－Ｑ３４，ｐｓｉ－（Ｒ３５，Ｙ３６）」という用語は、３４位におけるα－メチルグルタミン残基、並びに残基Ｒ３５とＹ３６との間の還元アミド結合の両方を含む配列を指す。

【0113】

同様に、配列の説明において「Ｎ－Ｍｅ－Ｒ３５，ｐｓｉ－（Ｒ３５，Ｙ３６）」という用語は、３５位におけるα－メチルアルギニン残基、並びにこの残基とＹ３６との間の還元アミド結合の両方を含む配列を指す。

【0114】

環状ＰＹＹペプチドの例を表６に提供する。

【0115】

【表6-1】

【0116】

【表6-2】

【0117】

本明細書において、ヒトＰＹＹ_３－３６（ｈＰＹＹ_３－３６）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を示す、Ｎ末端～ＰＹＹの側鎖環状アナログも提供する。２つのアナログ間の配列同一性を求める方法の例として、２つのペプチド

【0118】

【化13】

（配列番号１）とｈＰＹＹ_３－３６

【0119】

【化14】

（配列番号５５）とをアラインメントする。ｈＰＹＹ（_３－３６）に対するアナログの配列同一性は、アラインメントされた残基の総数から異なる残基の数を減じて（すなわち、アラインメントされた同一残基の数）、ｈＰＹＹ_３－３６における残基の総数で除することによって求められる。この例では、異なる残基は、置換Ｋ１１と交換されたＤ１１であり、その後ｈＣ３１と交換されたＶ３１、そして最後に脱カルボニル化されたＲ３５が続く。したがって、この例では、配列同一性は、（３４－３）／３４×１００である。

【0120】

コンジュゲート
別の全般的な態様では、本発明は、ＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹペプチドが、ＧＬＰ－１又はＧＬＰ－１変異体ペプチド又は環状ＰＹＹペプチド単独と比較して延長された／増加した半減期を有するように、部位特異的に環状ＰＹＹペプチドに共有結合でコンジュゲートされた本発明のＧＬＰ－１融合ペプチドを含むコンジュゲートに関する。本発明はまた、医薬組成物及びその使用方法に関する。このコンジュゲートは、とりわけ、肥満、２型糖尿病、メタボリックシンドローム（すなわち、シンドロームＸ）、インスリン抵抗性、耐糖能異常（例えば、耐糖能障害）、高血糖症、高インスリン血症、高トリグリセリド血症、先天性高インスリン症（ＣＨＩ）による低血糖、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性腎症、並びに管理されていないコレステロール及び／若しくは脂質レベルに関連する高血圧及び心血管危険因子などの他の心血管危険因子、骨粗鬆症、炎症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、腎疾患、並びに湿疹などの疾患又は障害を予防する、治療する又は緩解させるのに有用である。

【0121】

特定の実施形態では、本発明のＧＬＰ－１融合ペプチドは、環状ＰＹＹペプチドにコンジュゲートすることができる少なくとも１つのシステイン残基を含む。特定の実施形態では、ＧＬＰ－１融合ペプチドは、配列番号１１３～２２４及び２６７～２７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＧＬＰ－１融合体は、配列番号１１３又は１３６から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、少なくとも１つのシステイン残基は、ＧＬＰ－１融合ペプチドの第２のリンカーペプチドに含まれる。特定の実施形態では、システイン残基は、配列番号１１３又は配列番号１３６のＧＬＰ－１融合ペプチドの残基２８７と２８９との間に位置し、好ましくは、システイン残基は、ＧＬＰ－１融合体の残基２８８に位置する。特定の実施形態では、ＧＬＰ－１融合ペプチドは、環状ＰＹＹペプチドの残基７、９、１１、２２、又は２３におけるリシン残基、好ましくはリシン残基１１に共有結合で連結している。特定の実施形態では、ＧＬＰ－１融合ペプチドは、環状ＰＹＹペプチドに直接、又は環状ＰＹＹペプチド上の化学リンカーを介して環状ＰＹＹペプチドに間接的に共有結合で連結している。

【0122】

特定の実施形態では、環状ＰＹＹペプチドは、化学リンカーを含み得る。化学リンカーは、ＧＬＰ－１融合ペプチドを環状ＰＹＹ化学リンカーにコンジュゲートさせるために、化学的に修飾されてもよい（例えば、求電子性基をリンカーに付加してもよい）。化学リンカーとしては、例えば、ペプチドリンカー、炭化水素リンカー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）リンカー、多糖類リンカー、ポリエステルリンカー、アシル基を含有するリンカー、ＰＥＧ及び埋め込まれた複素環からなるハイブリッドリンカー、又は炭化水素鎖を挙げることができるが、これらに限定されない。ＰＥＧリンカーは、例えば、２～２４のＰＥＧ単位を含み得る。

【0123】

本発明のＧＬＰ－１融合ペプチドを本発明の環状ＰＹＹペプチドとコンジュゲートさせる方法は、当該技術分野において既知である。簡潔に述べると、本発明のＧＬＰ－１融合ペプチドを還元剤（例えば、１，３，５－トリアザ－７－ホスファアダマンタン（ＰＴＡ））で還元し、（例えば、脱塩クロマトグラフィによって）精製し、（例えば、コンジュゲーションを可能にする条件下で還元ＧＬＰ－１融合ペプチドを提供することによって）環状ＰＹＹペプチドとコンジュゲートさせることができる。コンジュゲーション反応中、環状ＰＹＹペプチドの求電子性脱離基が置換され、ＧＬＰ－１融合ペプチドと環状ＰＹＹペプチドとの間に共有結合が形成されて、ＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹペプチドコンジュゲートが形成される。コンジュゲーション反応後、コンジュゲートは、イオン交換クロマトグラフィ又は疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）によって、タンパク質Ａ吸着の最終精製工程により精製することができる。特定の実施形態では、本発明のＧＬＰ－１融合ペプチドは、ＨＩＣ方法を利用して還元前に精製することができる。コンジュゲーション方法のより詳細な説明については、例えば、実施例２を参照されたい。

【0124】

環状ＰＹＹペプチドに結合したグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）－融合ペプチドを含むコンジュゲートであって、当該ＧＬＰ－１融合ペプチドが、ＧＬＰ－１ペプチド、第１のリンカーペプチド、ヒンジ－Ｆｃ領域ペプチド、及び第２のリンカーペプチドを含み、当該第１のリンカーが、任意選択で、存在しないコンジュゲートが本明細書に提供される。

【0125】

特定の実施形態では、環状ＰＹＹペプチドは、式Ｉによって表されるか、又はその誘導体若しくは薬学的に許容される塩であり：

【0126】

【化15】

式中、
ｐは、０又は１であり、
ｍは、０、１、２、３、４、又は５であり、
ｎは、１、２、３、又は４であり、
ｑは、０又は１であり（但し、ｑは、Ｚ_３０が存在しない場合にのみ１である。）、
ＢＲＩＤＧＥは、－Ｐｈ－ＣＨ_２－Ｓ－、－トリアゾリル－、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ_２Ｓ－、－ＳＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、
－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ_２Ｓ、－ＮＨＣ（Ｏ）－、又は－ＣＨ_２Ｓ－であり、
Ｚ_４は、Ｋ、Ａ、Ｅ、Ｓ、又はＲであり、
Ｚ_７は、Ａ又はＫであり、
Ｚ_９は、Ｇ又はＫであり、
Ｚ_１１は、Ｄ又はＫであり、
Ｚ_２２は、Ａ又はＫであり、
Ｚ_２３は、Ｓ又はＫであり、
Ｚ_２６は、Ａ又はＨであり、
Ｚ_３０は、Ｌ、Ｗ、存在せず、
（但し、Ｚ_３０は、ｑが１である場合にのみ存在しない。）、
Ｚ_３４は、

【0127】

【化16】

であり、
Ｚ_３５は、

【0128】

【化17】

であり、
当該誘導体は、アミド化、アシル化、及びＰＥＧ化からなる群から選択される１つ又は２つ以上のプロセスによって修飾された式Ｉの化合物である。

【0129】

特定の実施形態では、環状ＰＹＹペプチドは、式Ｉによって表されるか、又はその誘導体若しくは薬学的に許容される塩であり、
式中、
ｐは、０又は１であり、
ｍは、０、１、２、３、４、又は５であり、
ｎは、１、２、３、又は４であり、
ｑは、０又は１であり（但し、ｑは、Ｚ_３０が存在しない場合にのみ１である。）、
ＢＲＩＤＧＥは、－Ｐｈ－ＣＨ_２－Ｓ－、－トリアゾリル－、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ_２Ｓ－、－ＳＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、
－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ_２Ｓ、－ＮＨＣ（Ｏ）－、又は－ＣＨ_２Ｓ－であり、
Ｚ_４は、Ｋ、Ａ、Ｅ、Ｓ、又はＲであり、
Ｚ_７は、Ａ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、任意選択で、

【0130】

【化18】

（式中、ｉは、０～２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである。）、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｉ、又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｃｌで置換され、
Ｚ_９は、Ｇ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、任意選択で、

【0131】

【化19】

（式中、ｉは、０～２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである。）、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｉ、又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｃｌで置換され、
Ｚ_１１は、Ｄ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、任意選択で、

【0132】

【化20】

（式中、ｉは、０～２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである。）、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｉ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｃｌ、又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒで置換され、
Ｚ_２２は、Ａ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、任意選択で、

【0133】

【化21】

（式中、ｉは、０～２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである）、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｉ、又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｃｌで置換され、
Ｚ_２３は、Ｓ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、任意選択で、

【0134】

【化22】

（式中、ｉは、０～２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである）、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｉ、又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｃｌで置換され、
Ｚ_２６は、Ａ又はＨであり、
Ｚ_３０は、Ｌ、Ｗ、存在せず、
（但し、Ｚ_３０は、ｑが１である場合にのみ存在しない。）、
Ｚ_３４は、

【0135】

【化23】

であり、
Ｚ_３５は、

【0136】

【化24】

であり、
Ｘは、求電子基であり、Ｘ求電子基のＢｒ、Ｃｌ、又はＩは、コンジュゲーション反応において置換されて、ＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹペプチドコンジュゲートを形成する。

【0137】

特定の実施形態では、環状ＰＹＹペプチドは、式Ｉによって表されるか、又はその誘導体若しくは薬学的に許容される塩であり、
式中、
ｐは、０又は１であり、
ｍは、０、１、２、３、又は５であり、
ｎは、１、２、又は４であり、
ｑは、０又は１であり（但し、ｑは、Ｚ_３０が不在の場合にのみ１である。）、
ＢＲＩＤＧＥは、－Ｐｈ－ＣＨ_２－Ｓ－、－トリアゾリル－、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ_２Ｓ－、－ＳＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、
－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ_２Ｓ、－ＮＨＣ（Ｏ）－、又は－ＣＨ_２Ｓ－であり、
Ｚ_４は、Ｋ、Ａ、Ｅ、Ｓ、又はＲであり、
Ｚ_７は、Ａ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、

【0138】

【化25】

で置換され、
Ｚ_９は、Ｇ又はＫであり、
Ｚ_１１は、Ｄ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、任意選択で、

【0139】

【化26】

－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒ、で置換され、
又は
Ｚ_２２は、Ａ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、

【0140】

【化27】

で置換され、
Ｚ_２３は、Ｓ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、

【0141】

【化28】

で置換され、
Ｚ_２６は、Ａ又はＨであり、
Ｚ_３０は、Ｌであり、
Ｚ_３４は、

【0142】

【化29】

であり、
Ｚ_３５は、

【0143】

【化30】

であり、
Ｂｒは、コンジュゲーション反応において置換されて、ＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹペプチドコンジュゲートを形成する。

【0144】

特定の実施形態では、コンジュゲートは、環状ＰＹＹペプチドにコンジュゲートしているＧＬＰ－１融合ペプチドを含み、当該環状ＰＹＹペプチドは、配列番号１～５４からなる群から選択される。好ましい実施形態では、コンジュゲートは、環状ＰＹＹペプチドにコンジュゲートしているＧＬＰ－１融合ペプチドを含み、当該環状ＰＹＹペプチドは、配列番号２４、２５、２７、２８、２９、３０、３３、又は３４から選択される。

【0145】

特定の実施形態では、ＧＬＰ－１融合ペプチドは、リシン残基上の化学リンカーを介して環状ＰＹＹペプチドのリシン残基において当該環状ＰＹＹペプチドに共有結合で連結している。化学リンカーは、例えば、Ｃ（Ｏ）ＣＨ２、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８－トリアゾリル－ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ－ＰＥＧ４、２～２４個のＰＥＧ単位のＰＥＧ鎖、アシル基を含有するリンカー、又は２～１０個の炭素原子を含有するアルキル鎖から選択されるリンカーを含み得る。

【0146】

本発明の実施形態によるＧＬＰ－１融合ペプチドは、当該技術分野において既知の方法を使用して、環状ＰＹＹペプチドのアミノ酸残基４、７、９、１０、１１、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、３０、又は３１などの、環状ＰＹＹペプチドの１つ又は２つ以上のアミノ酸位置で環状ＰＹＹペプチドにコンジュゲートされ得る。アミノ酸残基の番号付けは、ｈＰＹＹ_３－３６のものに従う。特定の実施形態では、式Ｉ中のＺ_７、Ｚ_９、Ｚ_１１、Ｚ_２２、及びＺ_２３のうちの１つだけがリシンであり、当該リシンは、ＧＬＰ－１融合ペプチドの第２のリンカーペプチドにおけるシステイン残基に共有結合で連結している。好ましい実施形態では、本発明の実施形態によるＧＬＰ－１融合ペプチドは、環状ＰＹＹペプチドの残基１１において環状ＰＹＹペプチドにコンジュゲートされ、残基１１はリシンである。別の好ましい実施形態では、ブロモアセトアミド又はマレイミドなどの求電子剤は、環状ＰＹＹペプチドの残基１１におけるリシンのアミノ側鎖などの環状ＰＹＹペプチドの側鎖に導入され、当該求電子剤の反応部位が、ＧＬＰ－１融合ペプチドの第２のリンカーペプチドのシステイン残基のスルフヒドリル基と特異的に反応し、好ましくは、ＧＬＰ－１融合ペプチドの第２のリンカーペプチドは、配列番号９３、９４、９５、１０６、又は１１１であり、それにより、環状ＰＹＹペプチドとＧＬＰ－１融合ペプチドとの間に共有結合性連結が生じる。より好ましくは、環状ＰＹＹペプチドは、配列番号２４、２５、２７、２８、２９、３０、３３、又は３４から選択される。一実施形態では、求電子剤は、環状ＰＹＹの側鎖上に直接導入される。別の実施形態では、求電子剤は、化学リンカーを介して間接的に環状ＰＹＹの側鎖に導入される。

【0147】

特定の実施形態では、ＧＬＰ－１融合ペプチドの第２のリンカーペプチドのシステイン残基は、ＧＬＰ－１融合ペプチドを過剰なアザホスフィン還元剤と接触させることによって還元され、それにより、還元されたシステイン残基が求電子剤と反応する。アザホスフィン還元剤は、１，３，５－トリアザ－７－ホスファトリシクロ［３．３．１．１］デカン（ＰＴＡ）又はその誘導体である。

【0148】

また、本発明のコンジュゲートを含み、薬学的に許容される担体を更に含む、医薬組成物も提供される。

【0149】

ＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹペプチドコンジュゲートの非限定例を表７に提供する。

【0150】

【表7】

【0151】

半減期延長部分
ＧＬＰ－１融合ペプチドに加えて、本発明のコンジュゲートは、例えば共有結合性相互作用を介して、薬学的活性部分（例えば、環状ＰＹＹペプチド）の半減期を延長するための１つ又は２つ以上の他の部分を組み込んでもよい。例示的な他の半減期延長部分としては、アルブミン、アルブミン変異体、アルブミン結合タンパク質、及び／又はドメイン、トランスフェリン、並びにそれらの断片及びアナログが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のコンジュゲートに組み込むことができる更なる半減期延長部分としては、例えば、所望の特性のための、ＰＥＧ５０００又はＰＥＧ２０，０００などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、ポリリシン、オクタン、炭水化物（デキストラン、セルロース、オリゴ糖、又は多糖類）が挙げられる。これらの部分は、タンパク質足場コード配列との直接融合体であってもよく、標準的なクローニング及び発現技術によって生成されてもよい。あるいは、周知の化学結合方法を用いて、組換えにより及び化学的に生成された本発明のコンジュゲートにその部分を結合させることができる。

【0152】

周知の方法を用いて、システイン残基を分子のＣ－末端に組み込み、ＰＥＧ基をシステインに結合させることによって、ＰＥＧ部分を、例えば、本発明のペプチド分子に付加してもよい。

【0153】

更なる部分を組み込んだ本発明のペプチド分子を、いくつかの周知のアッセイによって、官能性について比較することができる。例えば、目的の治療用ペプチドの生物学的又は薬物動態的活性は、単独で又は本発明によるコンジュゲートにおいて、既知のインビトロ又はインビボアッセイを使用してアッセイし、比較することができる。

【0154】

医薬組成物
別の全般的な態様では、本発明は、本発明のコンジュゲート及び化合物、並びに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、薬学的に許容される担体と一緒に本発明のコンジュゲートを含む生成物を意味する。本発明のコンジュゲート及び化合物、並びにそれらを含む組成物は、本明細書で言及される治療用途のための薬剤の製造にも有用である。

【0155】

本明細書で使用するとき、用語「担体」は、あらゆる賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、バッファー、安定剤、可溶化剤、油、脂質、脂質含有小胞、ミクロスフェア、リポソーム封入体、又は医薬製剤で使用するための技術分野では公知の他の材料を指す。担体、賦形剤又は希釈剤の特性は、特定の用途の投与経路によって決まる点は理解されよう。本明細書で使用するころの「医薬上許容できる担体」という用語は、本発明による組成物の効果又は本発明による組成物の生物活性を妨げない無毒性材料を指す。特定の実施形態によれば、本開示を考慮して、コンジュゲートされたペプチド医薬組成物での使用に好適ないずれの薬学的に許容される担体を本発明で使用してもよい。

【0156】

本発明において使用するための薬学的に許容される酸性／アニオン性の塩としては、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、酒石酸水素塩、臭化物、エデト酸カルシウム、カンシル酸塩、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストル酸塩、エシル酸塩、フマル酸塩、グリセプト酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニル酸塩、ヘキシルレソルシン酸塩、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メチル臭化物、メチル硝酸塩、メチル硫酸塩、ムコ酸塩、ナプシル酸塩、硝酸塩、パモ酸塩、パントテン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシル酸塩、及びトリエチオジドが挙げられるが、これらに限定されない。また、有機酸又は無機酸としては、ヨウ化水素酸、過塩素酸、硫酸、リン酸、プロピオン酸、グリコール酸、メタンスルホン酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、シュウ酸、２－ナフタレンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、シクロヘキサンスルファミン酸、サッカリン酸又はトリフルオロ酢酸が挙げられるが、これらに限定されない。

【0157】

薬学的に許容され得る塩基性／カチオン性の塩としては、アルミニウム、２－アミノ－２－ヒドロキシメチル－プロパン－１，３－ジオール（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トロメタン、又は「ＴＲＩＳ」としても知られる）、アンモニア、ベンザチン、ｔ－ブチルアミン、カルシウム、クロロプロカイン、コリン、シクロへキシルアミン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、リチウム、Ｌ－リシン、マグネシウム、メグルミン、Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン、ピペリジン、カリウム、プロカイン、キニーネ、ナトリウム、トリエタノールアミン、又は亜鉛が挙げられるが、これらに限定されない。

【0158】

本発明のいくつかの実施形態では、約０．００１ｍｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬ、約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、又は約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２５ｍｇ／ｍＬの量で本発明のコンジュゲートを含む医薬製剤が提供される。医薬製剤は、約３．０～約１０、例えば、約３～約７、又は約５～約９のｐＨを有し得る。製剤は、緩衝系、防腐剤、等張化剤、キレート剤、安定化剤、及び界面活性剤から選択される少なくとも１つの成分を更に含み得る。

【0159】

薬学的に許容可能な担体を有する薬学的活性成分の製剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（例えば２１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ（２００５）及びそれ以降の任意の改訂版）にあるように、当該技術分野において既知である。追加成分の非限定的な例としては、緩衝剤、希釈剤、溶媒、張度調節剤、防腐剤、安定剤、及びキレート剤が挙げられる。１つ又は２つ以上の薬学的に許容される担体が、本発明の医薬組成物の製剤化において使用され得る。

【0160】

本発明の一実施形態では、医薬組成物は液体製剤である。液体製剤の好ましい例は、水性製剤、すなわち、水を含む製剤である。液体製剤は、溶液、懸濁液、エマルジョン、マイクロエマルジョン、ゲルなどを含んでいてよい。水性製剤は、典型的には、少なくとも５０％ｗ／ｗの水、又は少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％ｗ／ｗの水を含む。

【0161】

一実施形態では、医薬組成物は、例えば注射デバイス（例えば、注射器又は注入ポンプ）を介して注射することができる注射剤として製剤化され得る。注射によると、例えば、皮下、筋肉内、腹腔内、又は静脈内に送達され得る。

【0162】

別の実施形態では、医薬組成物は、固体製剤、例えば、そのまま使用することができるか、又は医師若しくは患者が使用前に溶媒及び／若しくは希釈剤を添加する、凍結乾燥又は噴霧乾燥組成物である。固体剤形としては、圧縮錠剤及び／又はコーティング錠剤などの錠剤、並びにカプセル剤（例えば、硬又は軟ゼラチンカプセル）を挙げることができる。医薬組成物はまた、例えば、サッシェ、糖衣錠、粉末、顆粒、トローチ、又は再構成用の粉末の形態であってもよい。

【0163】

剤形は即時放出であってもよく、その場合、当該剤形は、水溶性若しくは分散性担体を含んでいてよく、又は遅延放出、持続放出、若しくは調節放出であってもよく、その場合、当該剤形は、胃腸管における剤形の溶解速度を制御する非水溶性ポリマーを含んでいてよい。

【0164】

他の実施形態では、医薬組成物は、鼻腔内、頬内、又は舌下に送達され得る。

【0165】

水性製剤のｐＨは、ｐＨ３～ｐＨ１０であり得る。本発明の一実施形態では、製剤のｐＨは約７．０～約９．５である。本発明の別の実施形態では、製剤のｐＨは約３．０～約７．０である。

【0166】

本発明の別の実施形態では、医薬組成物は緩衝剤を含む。緩衝剤の非限定的な例としては、アルギニン、アスパラギン酸、ビシン、シトレート、リン酸一水素二ナトリウム、フマル酸、グリシン、グリシルグリシン、ヒスチジン、リシン、マレイン酸、リンゴ酸、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、コハク酸塩、酒石酸、トリシン、及びトリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン、及びこれらの混合物が挙げられる。緩衝液は、個々に又は凝集体中に、約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これらの具体的な緩衝剤の各１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。

【0167】

本発明の別の実施形態では、医薬組成物は防腐剤を含む。防腐剤の非限定的な例としては、塩化ベンゼトニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、ブロノポール、ブチル４－ヒドロキシベンゾエート、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロヘキシジン、クロルフェネシン、ｏ－クレゾール、ｍ－クレゾール、ｐ－クレゾール、エチル４－ヒドロキシベンゾエート、イミド尿素、メチル４－ヒドロキシベンゾエート、フェノール、２－フェノキシエタノール、２－フェニルエタノール、プロピル４－ヒドロキシベンゾエート、デヒドロ酢酸ナトリウム、チオメロサール、及びこれらの混合物が挙げられる。防腐剤は、個々に又は凝集体中に、約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これらの具体的な防腐剤の各１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。

【0168】

本発明の別の実施形態では、医薬組成物は、等張剤を含む。等張剤の非限定的な例としては、塩（塩化ナトリウムなど）、アミノ酸（グリシン、ヒスチジン、アルギニン、リシン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、及びスレオニンなど）、アルジトール（グリセロール、１，２－プロパンジオールプロピレングリコールなど）、１，３－プロパンジオール、及び１，３－ブタンジオールなど）、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ４００）、並びにこれらの混合物が挙げられる。等張剤の別の例としては、糖が挙げられる。糖の非限定的な例は、例えば、フルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、アルファ及びベータ－ＨＰＣＤ、可溶性澱粉、ヒドロキシエチル澱粉、及びカルボキシメチルセルロースナトリウムを含む、単糖類、二糖類、又は多糖類であり得る。等張剤の別の例は糖アルコールであり、「糖アルコール」という用語は、少なくとも１つの－ＯＨ基を有するＣ（４－８）炭化水素として定義される。糖アルコールの非限定的な例としては、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトール、及びアラビトールが挙げられる。等張剤は、個々に又は凝集体中に、約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これらの具体的な等張剤の各１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。

【0169】

本発明の別の実施形態では、医薬組成物はキレート剤を含む。キレート剤の非限定的な例としては、クエン酸、アスパラギン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の塩、及びこれらの混合物が挙げられる。キレート剤は、個々に又は凝集体中に、約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これらの具体的なキレート剤の各１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。

【0170】

本発明の別の実施形態では、医薬組成物は安定剤を含む。安定剤の非限定的な例としては、１つ又は２つ以上の凝集阻害剤、１つ又は２つ以上の酸化阻害剤、１つ又は２つ以上の界面活性剤、及び／又は、１つ又は２つ以上のプロテアーゼ阻害剤が挙げられる。

【0171】

本発明の別の実施形態では、医薬組成物は安定剤を含み、当該安定剤は、カルボキシ－／ヒドロキシセルロース及びそれらの誘導体（ＨＰＣ、ＨＰＣ－ＳＬ、ＨＰＣ－Ｌ、及びＨＰＭＣなど）、シクロデキストリン、２－メチルチオエタノール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ ３３５０など）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、塩（塩化ナトリウムなど）、硫黄含有物質、例えばモノチオグリセロール）、又はチオグリコール酸である。安定剤は、個々に又は凝集体中に、約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これらの具体的な安定剤の各１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。

【0172】

本発明の更なる実施形態では、医薬組成物は、１つ又は２つ以上の界面活性剤、好ましくは界面活性剤、少なくとも１つの界面活性剤、又は２つの異なる界面活性剤を含む。「界面活性剤」という用語は、水溶性（親水性）部分及び脂溶性（親油性）部分から構成される任意の分子又はイオンを指す。界面活性剤は、例えば、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、及び／又は双性イオン性界面活性剤から選択され得る。界面活性剤は、個々に又は凝集体中に、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これらの具体的な界面活性剤の各１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。

【0173】

本発明の更なる実施形態では、医薬組成物は、１つ又は２つ以上のプロテアーゼ阻害剤、例えば、ＥＤＴＡ、及び／又はベンズアミジン塩酸（ＨＣｌ）を含む。プロテアーゼ阻害剤は、個々に又は凝集体中に、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これらの具体的なプロテアーゼ阻害剤の各１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。

【0174】

本発明の医薬組成物は、組成物の保管中のポリペプチド凝集体の形成を減少させるのに十分な量のアミノ酸塩基を含み得る。「アミノ酸塩基」という用語は、１つ又は２つ以上のアミノ酸（メチオニン、ヒスチジン、イミダゾール、アルギニン、リシン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニンなど）、又はこれらのアナログを指す。任意のアミノ酸は、その遊離塩基形態又はその塩形態のいずれかで存在し得る。アミノ酸塩基の任意の立体異性体（すなわち、Ｌ、Ｄ、又はこれらの混合物）が存在し得る。アミノ酸塩基は、個々に又は他のアミノ酸塩基と組み合わせて、約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これらの具体的なアミノ酸塩基の各１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。

【0175】

本発明のコンジュゲートの薬学的に許容される塩としては、無機又は有機の酸又は塩基から形成される、従来の非毒性の塩又は第四級アンモニウム塩が挙げられる。かかる酸付加塩の例としては、酢酸塩、アジピン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、ドデシル硫酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩及び酒石酸塩が挙げられる。塩基性塩としては、アンモニウム塩、ナトリウム塩及びカリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ジシクロヘキシルアミノ塩などの有機塩基との塩、並びにアルギニンなどのアミノ酸との塩が挙げられる。更に、塩基性の窒素含有基は、例えばハロゲン化アルキルによって第四級化されていてもよい。

【0176】

本発明の医薬組成物は、その意図する目的を実現する任意の手段によって投与することができる。例としては、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮的、口内又は眼内投与が挙げられる。経口経路により投与してもよい。非経口投与に適する製剤としては、水溶性形態の活性コンジュゲートの水溶液、例えば、水溶性の塩、酸性溶液、アルカリ性溶液、デキストロース水溶液、等張炭水化物溶液、及びシクロデキストリン包接錯体が挙げられる。特定の実施形態では、本発明のコンジュゲートは末梢に投与される。

【0177】

本発明はまた、薬学的に許容される担体を本発明のコンジュゲートのいずれかと混合することを含む、医薬組成物の作製方法も包含する。加えて、本発明は、１つ又は２つ以上の薬学的に許容される担体を本発明のコンジュゲートのいずれかと混合することによって作製される医薬組成物を含む。

【0178】

更に、本発明のコンジュゲートは、１つ又は２つ以上の結晶多形又は非晶質結晶形を有していてもよく、これも本発明の範囲に含まれることが意図される。加えて、コンジュゲートは、例えば水（すなわち、水和物）又は一般的な有機溶媒と溶媒和物を形成してもよい。本明細書で使用されるとき、用語「溶媒和物」は、本発明のコンジュゲートと１つ又は２つ以上の溶媒分子との物理的会合を意味する。この物理的会合は、水素結合など、イオン結合及び共有結合の度合いの変化を伴う。特定の場合では、例えば１つ又は２つ以上の溶媒分子が結晶質固体の結晶格子に組み込まれているとき、この溶媒和物を単離することができるようになる。用語「溶媒和物」は、溶液相溶媒和物と、単離可能な溶媒和物の両方を包含するものとする。好適な溶媒和物の非限定的な例としては、エタノレート、メタノレートなどが挙げられる。

【0179】

本発明は、本発明のコンジュゲートの多形体及び溶媒和物をその範囲内に包含することを意図する。したがって、本発明の治療方法における「投与」という用語には、本発明のコンジュゲート、又は具体的に開示されていなくとも、明らかに本発明の範囲内に含まれる結晶多形又はその溶媒和物を用いて、本明細書に記載の症候群、障害、又は疾患を治療する、寛解させる、又は予防する手段が含まれる。

【0180】

別の実施形態では、本発明は、薬剤として使用するための本発明のコンジュゲートに関する。

【0181】

本発明の範囲内には、本発明のコンジュゲートのプロドラッグが含まれる。一般的には、そのようなプロドラッグは、インビボで必要なコンジュゲートに容易に変換可能な、コンジュゲートの機能的誘導体である。したがって、本発明の治療方法において、用語「投与」は、具体的に開示されるコンジュゲートを用いた、又は具体的に開示されなくてもよいが、患者への投与後にインビボで特定のコンジュゲートに転換するコンジュゲートを用いた、記載される様々な障害の治療を包含するものとする。好適なプロドラッグ誘導体の選択及び調製に関する従来の手順は、例えば、「Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ」（Ｅｄ．Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８５）に記載されている。

【0182】

更に、本発明の範囲内で、任意の元素が、特に本発明のコンジュゲートに関して言及される場合、天然に存在するか又は合成により生成されたかのいずれか、また自然存在比であるか又は同位体濃縮形態のいずれかで、当該元素の全ての同位体及び同位体の混合物を含むものとすることが意図される。例えば、水素への言及には、その範囲内に^１Ｈ、^２Ｈ（Ｄ）、及び^３Ｈ（Ｔ）が含まれる。同様に、炭素及び酸素への言及には、それらの範囲内に１２Ｃ、^１３Ｃ及び^１４Ｃ、並びに^１６Ｏ及び^１８Ｏがそれぞれ含まれる。同位体は、放射性同位体であってもよく、又は非放射性同位体であってもよい。本発明の放射性標識コンジュゲートは、^３Ｈ、^１１Ｃ、^１８Ｆ、^１２２Ｉ、^１２３Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒ、^７７Ｂｒ、及び^８２Ｂｒからなる群から選択される放射性同位体を含んでもよい。好ましくは、放射性同位体は、^３Ｈ、^１１Ｃ、及び^１８Ｆからなる群から選択される。

【0183】

本発明のいくつかのコンジュゲートは、アトロプ異性体として存在していてもよい。アトロプ異性体は、単結合の周りの回転が障害されることにより生じる立体異性体であり、回転に対する立体歪みによる障壁が、配座異性体の単離を可能にする程度に十分高いものである。かかる配座異性体及びその混合物は全て、本発明の範囲内に包含されると理解される。

【0184】

本発明によるコンジュゲートが少なくとも１つの立体中心を有する場合、それに応じて、当該コンジュゲートは、エナンチオマー又はジアステレオマーとして存在し得る。かかる異性体及びその混合物は全て、本発明の範囲内に包含されると理解される。

【0185】

本発明によるコンジュゲートの調製プロセスにより立体異性体の混合物が生じた場合、これらの異性体は、分取クロマトグラフィなどの従来の技術により分離することができる。コンジュゲートをラセミ体として調製してもよく、又は個々のエナンチオマーをエナンチオ特異的合成若しくは分割のいずれかにより調製してもよい。コンジュゲートは、例えば、（－）－ジ－ｐ－トルオイル－Ｄ－酒石酸及び／又は（＋）－ジ－ｐ－トルオイル－Ｌ－酒石酸などの光学活性の酸と共に塩を形成することによりジアステレオマー対を形成した後、分別結晶化及び遊離塩基の再生を行うなどの標準的な方法により、その構成要素であるエナンチオマーに分割することができる。コンジュゲートはまた、ジアステレオマーのエステル又はアミドを形成した後、クロマトグラフィ分離を行い、キラル補助基を除去することにより、分割することもできる。あるいは、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）又はＳＦＣを介して、キラルカラムを使用して、コンジュゲートを分割することもできる。場合によっては、１Ｈ ＮＭＲスペクトルにおいて複雑な多重項及びピーク積分をもたらす、１Ｈ ＮＭＲにより観察可能なコンジュゲートの回転異性体が存在し得る。

【0186】

本発明のコンジュゲートを調製するプロセスのいずれかの間、関連する分子のいずれかにおける感受性基又は反応性基を保護することが必要である及び／又は望ましい場合がある。これは、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｅｄ．Ｊ．Ｆ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９７３、及びＴ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ＆ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９１（それらのそれぞれは、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。）に記載されるものなど、従来の保護基の手段によって達成され得る。保護基は、好都合な後続段階において、当該技術分野で既知の方法を用いて除去することができる。

【0187】

使用方法
本発明は、それを必要としている対象における、Ｙ２受容体媒介症候群及び／又はＧＬＰ－１受容体媒介症候群、障害、又は疾患を予防する、治療する、又は寛解させる方法であって、当該それを必要としている対象に、有効量の本発明のコンジュゲート、化合物、又は医薬組成物を投与することを含む、方法を目的とする。

【0188】

本発明は、それを必要とする対象における、障害、疾患、若しくは病態、又は当該障害、疾患、若しくは病態の任意の１つ又は２つ以上の症状を予防する、治療する、その発症を遅延させる、又は寛解させる方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本発明のコンジュゲート、化合物、又は医薬組成物を投与することを含む、方法も提供する。

【0189】

特定の実施形態によれば、疾患障害、又は病態は、肥満、Ｉ型又はＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム（すなわち、シンドロームＸ）、インスリン抵抗性、耐糖能異常（例えば、耐糖能障害）、高血糖症、高インスリン血症、高トリグリセリド血症、先天性高インスリン症（ＣＨＩ）による低血糖、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性腎症、並びに管理されていないコレステロール及び／若しくは脂質レベルに関連する高血圧及び心血管危険因子などの他の心血管危険因子、骨粗鬆症、炎症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、腎疾患、並びに／又は湿疹から選択される。

【0190】

特定の実施形態によれば、治療有効量は、以下の効果のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上を実現するのに十分である治療量を指す：（ｉ）治療される疾患、障害、若しくは病態、又はそれに関連する症状の重症度を低減する、又は寛解させること、（ｉｉ）治療される疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状の期間を短縮すること、（ｉｉｉ）治療される疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状の進行を防止すること、（ｉｖ）治療される疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状の退縮を生じさせること、（ｖ）治療される疾患、障害又は病態、又はそれに関連する症状の進行又は発症を予防すること、（ｖｉ）治療される疾患、障害又は病態、又はそれに関連する症状の再発を防止すること、（ｖｉｉ）治療される疾患、障害、若しくは病態、又はそれに関連する症状を有する対象の入院を減少させること、（ｖｉｉｉ）治療される疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状を有する対象の入院期間を短縮させること、（ｉｘ）治療される疾患、障害又は病態、又はそれに関連する症状を有する対象の生存率を高めること、（ｘｉ）治療される対象の疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状を阻害又は軽減すること、及び／又は（ｘｉｉ）別の治療の予防又は治療効果を強化又は改善すること。

【0191】

治療有効量又は用量は、治療される疾患、障害又は病態、投与手段、標的部位、対象の生理学的状態（例えば、年齢、体重、健康状態を含む）、対象がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬剤、及び、治療が予防的なものであるか治療的なものであるか、などの様々な因子によって異なり得る。治療用量は、安全性及び効能を最適化するために最適に漸増される。

【0192】

本明細書で使用される場合、「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、及び「治療（treatment）」という用語は全て、疾患、障害、又は病態に関連する少なくとも１つの測定可能な物理的パラメータの改善又は逆転を指すものであり、これは対象において必ずしも認識されるとは限らないが、対象において認識可能な場合もある。「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、及び「治療（treatment）」という用語はまた、疾患、障害、又は病態の退縮を生じる、その進行を防止する、又は少なくともその進行を遅らせることを指す場合もある。特定の実施形態では、「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、及び「治療（treatment）」は、疾患、障害、若しくは病態に関連する１つ又は２つ以上の症状の緩和、進行若しくは発症の予防、又はその期間の短縮を指す。具体的な実施形態では、「治療する」、「治療する」、及び「治療」は、疾患、障害、又は病態の再発の防止を指す。具体的な実施形態では、「治療する」、「治療する」、及び「治療」は、疾患、障害、又は病態を有する対象の生存率の向上を指す。具体的な実施形態では、「治療する」、「治療する」、及び「治療」は、対象における疾患、障害、又は病態の消失を指す。

【0193】

一実施形態では、本発明は、それを必要とする対象における、肥満、又は肥満の任意の１つ又は２つ以上の症状を予防する、治療する、その発症を遅延させる、又は寛解させる方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本発明のコンジュゲート、化合物、又は医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。

【0194】

一実施形態では、本発明は、それを必要としている対象における体重を減少させる方法であって、当該それを必要としている対象に、有効量の本発明のコンジュゲート、化合物、又は医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。

【0195】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の本発明のコンジュゲート、化合物、医薬組成物、形態、若しくは医薬のいずれかの投与前の対象の体重に対して、又は本明細書に記載の本発明のコンジュゲート、化合物、組成物、形態、医薬、若しくは組み合わせのいずれも投与されていない対照対象と比較して、対象の体重は、例えば、約０．０１％～約０．１％、約０．１％～約０．５％、約０．５％～約１％、約１％～約５％、約２％～約３％、約５％～約１０％、約１０％～約１５％、約１５％～約２０％、約２０％～約２５％、約２５％～約３０％、約３０％～約３５％、約３５％～約４０％、約４０％～約４５％、又は約４５％～約５０％減少する。

【0196】

いくつかの実施形態では、体重の低減は、約１週間、約２週間、約３週間、約１ヶ月間、約２ヶ月間、約３ヶ月間、約４ヶ月間、約５ヶ月間、約６ヶ月間、約７ヶ月間、約８ヶ月間、約９ヶ月間、約１０ヶ月間、約１１ヶ月間、約１年間、約１．５年間、約２年間、約２．５年間、約３年間、約３．５年間、約４年間、約４．５年間、約５年間、約６年間、約７年間、約８年間、約９年間、約１０年間、約１５年間、又は約２０年間維持される。

【0197】

本発明は、それを必要としている対象における、症候群、障害、若しくは疾患、又は当該症候群、障害、若しくは疾患のいずれか１つ又は２つ以上の症状を予防する、治療する、その発症を遅延させる、又は寛解させる方法であって、当該症候群、障害、又は疾患が、肥満、Ｉ型若しくはＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム（すなわち、シンドロームＸ）、インスリン抵抗性、耐糖能異常（例えば、耐糖能障害）、高血糖症、高インスリン血症、高トリグリセリド血症、先天性高インスリン症（ＣＨＩ）による低血糖、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性腎症、並びに管理されていないコレステロール及び／又は脂質レベルに関連する高血圧及び心血管危険因子などの他の心血管危険因子、骨粗鬆症、炎症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、腎疾患、並びに湿疹から選択され、当該方法が、それを必要としている対象に、有効量の本発明のコンジュゲート、化合物、又は医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。

【0198】

本明細書で使用される場合、メタボリックシンドロームは、高血糖（例えば、高空腹時血糖）、高血圧、異常コレステロールレベル（例えば、低ＨＤＬレベル）、異常トリグリセリドレベル（例えば、高トリグリセリド）、太いウエストライン（すなわち、腹囲）、腹部領域の脂肪の増加、インスリン抵抗性、耐糖能障害、高いＣ反応性タンパク質レベル（すなわち、前炎症状態）、及び血漿プラスミノゲン活性化因子阻害剤－１及びフィブリノーゲンレベル（すなわち、血栓状態）の任意の１つ又は２つ以上を有する対象を指す。

【0199】

本発明は、それを必要とする対象における、食物摂取を低減する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本発明のコンジュゲート、化合物、又は医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象の食物摂取は、本明細書に記載の本発明のコンジュゲート、化合物、組成物、形態、薬剤、若しくは組み合わせのいずれかの投与前の対象の食物摂取に対して、又は本明細書に記載の本発明のコンジュゲート、化合物、組成物、形態、薬剤、若しくは組み合わせのいずれも受けていない対照対象と比較して、例えば、約０．０１％～約０．１％、約０．１％～約０．５％、約０．５％～約１％、約１％～約５％、約２％～約３％、約５％～約１０％、約１０％～約１５％、約１５％～約２０％、約２０％～約２５％、約２５％～約３０％、約３０％～約３５％、約３５％～約４０％、約４０％～約４５％、又は約４５％～約５０％低減される。

【0200】

いくつかの実施形態では、食物摂取の低減は、約１週間、約２週間、約３週間、約１ヶ月間、約２ヶ月間、約３ヶ月間、約４ヶ月間、約５ヶ月間、約６ヶ月間、約７ヶ月間、約８ヶ月間、約９ヶ月間、約１０ヶ月間、約１１ヶ月間、約１年間、約１．５年間、約２年間、約２．５年間、約３年間、約３．５年間、約４年間、約４．５年間、約５年間、約６年間、約７年間、約８年間、約９年間、約１０年間、約１５年間、又は約２０年間維持される。

【0201】

本発明は、それを必要とする対象における糖化ヘモグロビン（Ａ１Ｃ）を低減する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本発明のコンジュゲート、化合物、又は医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象のＡ１Ｃは、本明細書に記載の本発明のコンジュゲート、化合物、組成物、形態、薬剤、若しくは組み合わせのいずれかの投与前の対象のＡ１Ｃに対して、又は本明細書に記載の本発明のコンジュゲート、化合物、組成物、形態、薬剤、若しくは組み合わせのいずれも受けていない対照対象と比較して、例えば、約０．００１％～約０．０１％、約０．０１％～約０．１％、約０．１％～約０．２％、約０．２％～約０．３％、約０．３％～約０．４％、約０．４％～約０．５％、約０．５％～約１％、約１％～約１．５％、約１．５％～約２％、約２％～約２．５％、約２．５％～約３％、約３％～約４％、約４％～約５％、約５％～約６％、約６％～約７％、約７％～約８％、約８％～約９％、又は約９％～約１０％低減される。

【0202】

他の実施形態では、それを必要とする対象における空腹時血糖レベルを低減する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本発明のコンジュゲート、化合物、又は医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。空腹時血糖レベルは、本明細書に記載の本発明のコンジュゲート、化合物、組成物、形態、薬剤、若しくは組み合わせのいずれかの投与前の対象の空腹時血糖レベルに対して、又は本明細書に記載の本発明のコンジュゲート、化合物、組成物、形態、薬剤、若しくは組み合わせのいずれも受けていない対照対象と比較して、約１４０～約１５０ｍｇ／ｄＬ未満、約１４０～約１３０ｍｇ／ｄＬ未満、約１３０～約１２０ｍｇ／ｄＬ未満、約１２０～約１１０ｍｇ／ｄＬ未満、約１１０～約１００ｍｇ／ｄＬ未満、約１００～約９０ｍｇ／ｄＬ未満、又は約９０～約８０ｍｇ／ｄＬ未満まで低減され得る。

【0203】

本発明は、それを必要としている対象におけるＹ２受容体活性及びＧＬＰ－１受容体活性を調節する方法であって、それを必要としている対象に、有効量の本発明のコンジュゲート、化合物、又は医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。本明細書で使用される場合、「調節する」とは、受容体活性を増加又は減少させることを指す。

【0204】

いくつかの実施形態では、有効量の本発明のコンジュゲート若しくは化合物、又はその形態、組成物、若しくは薬剤は、それを必要とする対象に、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回、１日７回、又は１日８回投与される。他の実施形態では、有効量の本発明のコンジュゲート若しくは化合物、又はその形態、組成物、若しくは薬剤は、それを必要とする対象に、２日に１回、週に１回、週に２回、週に３回、週に４回、週に５回、週に６回、１ヶ月に２回、１ヶ月に３回、又は１ヶ月に４回投与される。

【0205】

本発明の別の実施形態は、それを必要とする対象における、疾患、障害、若しくは症候群、又は当該疾患、障害、若しくは症候群のいずれかの１つ又は２つ以上の症状を予防する、治療する、その発症を遅延させる、又は寛解させる方法であって、それを必要とする対象に、併用療法で、有効量の本発明のコンジュゲート、化合物、又は医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。特定の実施形態では、併用治療薬は、第２の治療薬である。特定の実施形態では、併用療法は、外科療法である。

【0206】

本明細書で使用するとき、用語「併用される」は、対象への２つ以上の治療薬の投与との関連において、複数の治療薬の使用を指す。

【0207】

本明細書で使用されるとき、併用療法は、それを必要とする対象に、有効量の本発明のコンジュゲート若しくは化合物、又はその形態、組成物、若しくは薬剤と同時に、１つ若しくは２つ以上の追加の治療薬、又は１つ若しくは２つ以上の外科療法を施すことを指す。いくつかの実施形態では、１つ若しくは２つ以上の追加の治療薬又は外科療法は、有効量の本発明のコンジュゲートと同日に施され得、他の実施形態では、１つ若しくは２つ以上の追加の治療薬又は外科療法は、有効量の本発明のコンジュゲート又は化合物と同じ週又は同じ月に施され得る。

【0208】

本発明はまた、それを必要とする対象における、本明細書に記載の疾患、障害、症候群、又は症状のいずれかを、併用療法を用いて予防する、治療する、その発症を遅延させる、又は寛解させることも企図し、当該併用療法は、それを必要とする対象に、有効量の本発明のコンジュゲート、化合物、又は医薬組成物を、以下の治療薬のうちの任意の１つ又は２つ以上と組み合わせて投与することを含む：ジペプチジルペプチダーゼ－４（ＤＰＰ－４）阻害剤（例えば、シタグリプチン、サクサグリプチン、リナグリプチン、アログリプチンなど）；ＧＬＰ－１受容体アゴニスト（例えば、エキセナチド及びリキシセナチドなどの、短時間作用型ＧＬＰ－１受容体アゴニスト；中間作用型ＧＬＰ－１受容体アゴニスト（例えば、リラグルチド）；長期放出型エクセナチド、アルビグルチド、デュラグルチドなどの長時間作用型ＧＬＰ－１受容体アゴニスト；ナトリウム－グルコース共輸送体－２（ＳＧＬＴ－２）阻害剤（例えば、カナグリフォジン、ダパグリフォジン、エンパグリフォジンなど）；胆汁酸封鎖剤（例えば、コレセベラムなど）；ドーパミン受容体アゴニスト（例えば、ブロモクリプチン急速放出）；ビグアニド（例えば、メトホルミンなど）；インスリン；オキシントモジュリン；スルホニル尿素（例えば、クロルプロパミド、グリメピリド、グリピジド、グリブリド、グリベンクラミド、グリボルヌリド、グリソキセピド、グリクロピラミド、トラザミド、トルブタミド、アセトヘキサミド、カブタミドなど）；及びチアゾリジンジオン（例えば、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、ロベグリタゾン、シグリタゾン、ダルグリタゾン、エングリタゾン、ネトグリタゾン、リボグリタゾン、トログリタゾンなど）。いくつかの実施形態では、追加の治療薬の用量は、本発明のコンジュゲート又は化合物と組み合わせて与えられる場合に低減される。いくつかの実施形態では、本発明のコンジュゲート又は化合物と組み合わせて使用される場合、追加の治療剤は、それぞれが単独で使用される場合よりも低い用量で使用され得る。

【0209】

本発明は、それを必要とする対象における、本明細書に記載の疾患、障害、症候群、又は症状のいずれかを、併用療法を用いて予防する、治療する、その発症を遅延させる、又は寛解させることを企図し、当該併用療法は、それを必要とする対象に、有効量の本発明のコンジュゲート、化合物、又は医薬組成物を、外科療法と組み合わせて施すことを含む。特定の実施形態では、外科療法は、肥満手術（例えば、Ｒｏｕｘ－ｅｎ－Ｙ胃バイパス手術などの胃バイパス手術；スリーブ胃切除術；調節可能な胃バンド手術；十二指腸スイッチを伴う胆すい消化回避術；胃内バルーン；胃縫縮術、及びこれらの組み合わせ）であり得る。

【0210】

１つ若しくは２つ以上の追加の治療薬又は外科療法が、有効量の本発明のコンジュゲート又は化合物と同日に投与される実施形態では、本発明のコンジュゲート又は化合物は、追加の治療薬又は外科療法の前、後、又は同時に投与され得る。「併用される」という用語の使用は、治療が対象に投与される順序を限定しない。例えば、第１の治療薬（例えば、本明細書に記載される組成物）を、対象への第２の治療薬の投与の前（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間前）、それと同時に、又はその後（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間後）に投与することができる。

【0211】

実施形態
本発明は以下の非限定的な実施形態も提供する。

【0212】

実施形態１は、環状ＰＹＹペプチドに結合したグルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ－１）融合ペプチドを含むコンジュゲートであって、当該ＧＬＰ－１融合ペプチドが、ＧＬＰ－１ペプチド、第１のリンカーペプチド、ヒンジ－Ｆｃ領域ペプチド、及び第２のリンカーペプチドを含み、当該第１のリンカーが、任意選択で、存在しない、コンジュゲートである。

【0213】

実施形態２は、当該環状ＰＹＹペプチドが、式Ｉによって表されるか、又はその誘導体若しくは薬学的に許容される塩であり、

【0214】

【化31】

式中、
ｐは、０又は１であり、
ｍは、０、１、２、３、４、又は５であり、
ｎは、１、２、３、又は４であり、
ｑは、０又は１であり（但し、ｑは、Ｚ_３０が存在しない場合にのみ１である。）、
ＢＲＩＤＧＥは、－Ｐｈ－ＣＨ_２－Ｓ－、－トリアゾリル－、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ_２Ｓ－、－ＳＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、
－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ_２Ｓ、－ＮＨＣ（Ｏ）－、又は－ＣＨ_２Ｓ－であり、
Ｚ_４は、Ｋ、Ａ、Ｅ、Ｓ、又はＲであり、
Ｚ_７は、Ａ又はＫであり、
Ｚ_９は、Ｇ又はＫであり、
Ｚ_１１は、Ｄ又はＫであり、
Ｚ_２２は、Ａ又はＫであり、
Ｚ_２３は、Ｓ又はＫであり、
Ｚ_２６は、Ａ又はＨであり、
Ｚ_３０は、Ｌ、Ｗであるか、又は存在せず、
（但し、Ｚ_３０は、ｑが１である場合にのみ存在しない。）、
Ｚ_３４は、

【0215】

【化32】

であり、
Ｚ_３５は、

【0216】

【化33】

であり、
当該誘導体が、アミド化、アシル化、及びＰＥＧ化からなる群から選択される１つ又は２つ以上のプロセスによって修飾された式Ｉの化合物である、実施形態１に記載のコンジュゲートである。

【0217】

実施形態３は、当該環状ＰＹＹペプチドが、式Ｉによって表されるか、又はその誘導体若しくは薬学的に許容される塩であり、
式中、
ｐは、０又は１であり、
ｍは、０、１、２、３、４、又は５であり、
ｎは、１、２、３、又は４であり、
ｑは、０又は１であり（但し、ｑは、Ｚ_３０が存在しない場合にのみ１である。）、
ＢＲＩＤＧＥは、－Ｐｈ－ＣＨ_２－Ｓ－、－トリアゾリル－、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ_２Ｓ－、－ＳＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２－、
－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ_２Ｓ、－ＮＨＣ（Ｏ）－、又は－ＣＨ_２Ｓ－であり、
Ｚ_４は、Ｋ、Ａ、Ｅ、Ｓ、又はＲであり、
Ｚ_７は、Ａ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、任意選択で、

【0218】

【化34】

（式中、ｉは、０～２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである。）、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｉ、又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｃｌで置換され、
Ｚ_９は、Ｇ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、任意選択で、

【0219】

【化35】

（式中、ｉは、０～２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである。）、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｉ、又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｃｌで置換され、
Ｚ_１１は、Ｄ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、任意選択で、

【0220】

【化36】

（式中、ｉは、０～２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである。）、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｉ、又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｃｌで置換され、
Ｚ_２２は、Ａ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、任意選択で、

【0221】

【化37】

（式中、ｉは、０～２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである。）、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｉ、又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｃｌで置換され、
Ｚ_２３は、Ｓ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、任意選択で、

【0222】

【化38】

（式中、ｉは、０～２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである。）、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｉ、又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｃｌで置換され、
Ｚ_２６は、Ａ又はＨであり、
Ｚ_３０は、Ｌであり、
Ｚ_３４は、

【0223】

【化39】

であり、
Ｚ_３５は、

【0224】

【化40】

であり、
Ｘは、求電子基であり、Ｘ求電子基のＢｒ、Ｃｌ、又はＩは、コンジュゲーション反応において置換されて、ＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹペプチドコンジュゲートを形成する、実施形態２に記載のコンジュゲートである。

【0225】

実施形態４は、当該環状ＰＹＹペプチドが、式Ｉによって表されるか、又はその誘導体若しくは薬学的に許容される塩であり、
式中、
ｐは、０又は１であり、
ｍは、０、１、２、３、又は５であり、
ｎは、１、２、又は４であり、
ｑは、０又は１であり（但し、ｑは、Ｚ_３０が不在の場合にのみ１であり得る。）、
ＢＲＩＤＧＥは、－Ｐｈ－ＣＨ_２－Ｓ－、－トリアゾリル－、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ_２Ｓ－、－ＳＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２－、
－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ_２Ｓ、－ＮＨＣ（Ｏ）－、又は－ＣＨ_２Ｓ－であり、
Ｚ_４は、Ｋ、Ａ、Ｅ、Ｓ、又はＲであり、
Ｚ_７は、Ａ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒで置換されており、
Ｚ_９は、Ｇ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒで置換されており、
Ｚ_１１は、Ｄ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒで置換されており、
Ｚ_２２は、Ａ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒで置換されており、
Ｚ_２３は、Ｓ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒで置換されており、
Ｚ_２６は、Ａ又はＨであり、
Ｚ_３０は、Ｌであり、
Ｚ_３４は、

【0226】

【化41】

であり、
Ｚ_３５は、

【0227】

【化42】

であり、
Ｂｒは、コンジュゲーション反応において置換されて、ＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹペプチドコンジュゲートを形成する、実施形態２に記載のコンジュゲートである。

【0228】

実施形態５は、当該環状ＰＹＹペプチドが、配列番号１～５４からなる群から選択されるか、又はその薬学的に許容される塩である、実施形態１又は２に記載のコンジュゲートである。

【0229】

実施形態６は、当該環状ＰＹＹペプチドが、配列番号２４、２５、２７、２８、２９、３０、３３、若しくは３４から選択されるか、又はその薬学的に許容される塩である、実施形態５に記載のコンジュゲートである。

【0230】

実施形態７は、当該ＧＬＰ－１融合ペプチドが、当該環状ＰＹＹペプチドのリシン残基において当該環状ＰＹＹペプチドに共有結合で連結している、実施形態１～６のいずれか１つに記載のコンジュゲートである。

【0231】

実施形態８は、当該環状ＰＹＹペプチドが、化学リンカーを含む、実施形態７に記載のコンジュゲートである。

【0232】

実施形態９は、当該化学リンカーが、Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）_８－トリアゾリル－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯ－ＰＥＧ_４、２～２４個のＰＥＧ単位のＰＥＧ鎖、アシル基を含有するリンカー、及び２～１０個の炭素原子を含有するアルキル鎖からなる群から選択される１つを含む、実施形態８に記載のコンジュゲートである。

【0233】

実施形態１０は、式Ｉ中のＺ_７、Ｚ_９、Ｚ_１１、Ｚ_２２、及びＺ_２３のうちの１つだけがリシンであり、当該リシンが、当該ＧＬＰ－１融合ペプチドの当該第２のリンカーペプチドのシステイン残基に共有結合で連結している、実施形態７～９のいずれか１つに記載のコンジュゲートである。

【0234】

実施形態１１は、式Ｉ中のＺ_１１がリシンである、実施形態１０に記載のコンジュゲートである。

【0235】

実施形態１２は、当該ＧＬＰ－１ペプチドが、配列番号５６～５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１～１１のいずれか１つに記載のコンジュゲートである。

【0236】

実施形態１３は、当該ＧＬＰ－１ペプチドが、配列番号５７のアミノ酸配列を含む、実施形態１２に記載のコンジュゲートである。

【0237】

実施形態１４は、当該第１のリンカーペプチドが、配列番号６０～８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１～１３のいずれか１つに記載のコンジュゲートである。

【0238】

実施形態１５は、当該第１のリンカーペプチドが、配列番号６０のアミノ酸配列を含む、実施形態１４に記載のコンジュゲートである。

【0239】

実施形態１６は、当該ヒンジ－Ｆｃ領域ペプチドが、配列番号８４～９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のコンジュゲートである。

【0240】

実施形態１７は、当該ヒンジ－Ｆｃ領域ペプチドが、配列番号８４又は配列番号８５のアミノ酸配列を含む、実施形態１６に記載のコンジュゲートである。

【0241】

実施形態１８は、当該第２のリンカーペプチドが、配列番号９３～１１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１～１７のいずれか１つに記載のコンジュゲートである。

【0242】

実施形態１９は、当該第２のリンカーペプチドが、配列番号９３、９４、９５、１０６、又は１１１のアミノ酸配列を含む、実施形態１８に記載のコンジュゲートである。

【0243】

実施形態２０は、環状ＰＹＹペプチドに共役しているグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）融合ペプチドを含むコンジュゲートであって、当該ＧＬＰ－１融合ペプチドが、配列番号１１３～２２４及び２６７～２７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該環状ＰＹＹペプチドが、配列番号２４、２５、２７、２８、２９、３０、３３、又は３４から選択されるアミノ酸配列を含む、コンジュゲートである。

【0244】

実施形態２１は、当該ＧＬＰ－１融合ペプチドが、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む、実施形態２０に記載のコンジュゲートである。

【0245】

実施形態２２は、当該ＧＬＰ－１融合ペプチドが、配列番号１３６のアミノ酸配列を含む、実施形態２０に記載のコンジュゲートである。

【0246】

実施形態２３は、当該ＧＬＰ－１融合ペプチドの残基２８７～２８９のシステイン残基が、当該環状ＰＹＹペプチドの残基７、９、１１、２２、又は２３におけるリシン残基に共有結合で連結している、実施形態２１又は２２に記載のコンジュゲートである。

【0247】

実施形態２４は、当該システイン残基が、当該ＧＬＰ－１融合ペプチドの残基２８８に存在する、実施形態２３に記載のコンジュゲートである。

【0248】

実施形態２５は、当該リシン残基が、当該環状ＰＹＹペプチドの残基１１に存在する、実施形態２０～２４のいずれか１つに記載のコンジュゲートである。

【0249】

実施形態２６は、当該ＧＬＰ－１融合ペプチドが、当該環状ＰＹＹペプチドにおける化学リンカーを介して当該環状ＰＹＹペプチドに共有結合で連結している、実施形態２０～２５のいずれか１つに記載のコンジュゲートである。

【0250】

実施形態２７は、当該化学リンカーが、Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８－トリアゾリル－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯ－ＰＥＧ４、２～２４個のＰＥＧ単位のＰＥＧ鎖、アシル基を含有するリンカー、又は２～１０個の炭素原子を含有するアルキル鎖からなる群から選択される、実施形態２６に記載のコンジュゲートである。

【0251】

実施形態２８は、環状ＰＹＹペプチドに共役しているグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）融合ペプチドを含むコンジュゲートであって、配列番号２２５～２６２からなる群から選択される配列又はその薬学的に許容される塩を含むコンジュゲートである。

【0252】

実施形態２９は、当該ＧＬＰ－１融合ペプチドが単量体である、実施形態１～２８のいずれか１つに記載のコンジュゲートである。

【0253】

実施形態３０は、当該ＧＬＰ－１融合ペプチドが二量体である、実施形態１～２８のいずれか１つに記載のコンジュゲートである。

【0254】

実施形態３１は、実施形態１～３０のいずれか１つに記載のコンジュゲートを生成する方法であって、当該環状ＰＹＹペプチドの側鎖、好ましくは当該環状ＰＹＹペプチドのリシン残基のアミノ側鎖に導入された求電子剤、好ましくはブロモアセトアミド又はマレイミドを、当該ＧＬＰ－１融合ペプチドの当該第２のリンカーペプチドのシステイン残基のスルフヒドリル基と反応させ、それにより、当該環状ＰＹＹペプチドと当該ＧＬＰ－１融合ペプチドとの間に共有結合性連結を生じさせることを含む、方法である。

【0255】

実施形態３２は、当該ＧＬＰ－１融合ペプチドの当該第２のリンカーペプチドのシステイン残基が、当該ＧＬＰ－１融合ペプチドを過剰なアザホスフィン還元剤と接触させることによって還元され、それにより、還元されたシステイン残基が当該求電子剤と反応する、実施形態３１に記載の方法である。

【0256】

実施形態３３は、当該アザホスフィン還元剤が、１，３，５－トリアザ－７－ホスファトリシクロ［３．３．１．１］デカン（ＰＴＡ）又はその誘導体である、実施形態３２に記載の方法である。

【0257】

実施形態３４は、実施形態１～３０のいずれか１つに記載のコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物である。

【0258】

実施形態３５は、それを必要としている対象における肥満を治療又は予防する方法であって、当該それを必要としている対象に有効量の実施形態３４に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法である。

【0259】

実施形態３６は、当該それを必要としている対象に有効量の医薬組成物を投与することによって、当該医薬組成物の投与前の当該対象の体重と比較して、約５％～約１０％、約１０％～約１５％、約１５％～約２０％、又は約２０％～約２５％体重が減少する、実施形態３５に記載の方法である。

【0260】

実施形態３７は、それを必要としている対象における疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、当該疾患又は障害が、肥満、Ｉ型又はＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、耐糖能異常、高血糖症、高インスリン血症、高トリグリセリド血症、先天性高インスリン症（ＣＨＩ）による低血糖、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性腎症、並びに管理されていないコレステロール及び／若しくは脂質レベルに関連する高血圧及び心血管危険因子などの他の心血管危険因子、骨粗鬆症、炎症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、腎疾患、並びに／又は湿疹であり、当該方法が、当該それを必要としている対象に有効量の実施形態３４に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法である。

【0261】

実施形態３８は、当該疾患又は障害が、肥満である、実施形態３７に記載の方法である。

【0262】

実施形態３９は、当該疾患又は障害が、Ｉ型糖尿病である、実施形態３７に記載の方法である。

【0263】

実施形態４０は、当該疾患又は障害が、ＩＩ型糖尿病である、実施形態３７に記載の方法である。

【0264】

実施形態４１は、当該疾患又は障害が、メタボリックシンドロームである、実施形態３７に記載の方法である。

【0265】

実施形態４２は、当該疾患又は障害が、腎疾患である、実施形態３７に記載の方法である。

【0266】

実施形態４３は、当該疾患又は障害が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、実施形態３７に記載の方法である。

【0267】

実施形態４４は、当該疾患又は障害が、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である、実施形態３７に記載の方法である。

【0268】

実施形態４５は、それを必要としている対象における食物摂取又は体重のうちの少なくとも１つを減少させる方法であって、当該それを必要としている対象に有効量の実施形態３４に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法である。

【0269】

実施形態４６は、当該それを必要としている対象に有効量の医薬組成物を投与することによって、当該医薬組成物の投与前の当該対象の食物摂取と比較して、約５％～約１０％、約１０％～約１５％、約１５％～約２０％、約２０％～約２５％、約２５％～約３０％、約３０％～約３５％、約３５％～約４０％、約４０％～約４５％、又は約４５％～約５０％食物摂取が減少する、実施形態４５に記載の方法である。

【0270】

実施形態４７は、それを必要としている対象におけるＹ２受容体活性及びＧＬＰ－１受容体活性を調節する方法であって、当該それを必要としている対象に、有効量の実施形態３４に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法である。

【0271】

実施形態４８は、当該医薬組成物が、注射により投与される、実施形態３５～４７のいずれか１つに記載の方法である。

【0272】

実施形態４９は、当該注射が、皮下、筋肉内、腹腔内、又は静脈内に送達される、実施形態４８に記載の方法である。

【0273】

実施形態５０は、当該医薬組成物が、第２の治療薬と組み合わせて投与される、実施形態３５～４９のいずれか１つに記載の方法である。

【0274】

実施形態５１は、当該医薬組成物が、それを必要としている対象に毎日、毎週、又は毎月投与される、実施形態３５～５０のいずれか１つに記載の方法である。

【0275】

実施形態５２は、当該医薬組成物が、１日に１回、２回、３回、４回、５回、又は６回投与される、実施形態５１に記載の方法である。

【0276】

実施形態５３は、当該医薬組成物が、１週間に１回、２回、３回、４回、５回、又は６回投与される、実施形態５１に記載の方法である。

【0277】

実施形態５４は、当該医薬組成物が、１ヶ月に１回、２回、３回、又は４回投与される、実施形態５１に記載の方法である。

【0278】

実施形態５５は、実施形態１～３０のいずれか１つに記載のコンジュゲート又は実施形態３４の医薬組成物を含むキットであって、好ましくは、注射デバイスを更に含む、キットである。

【0279】

実施形態５６は、実施形態１～３０のいずれか１つに記載のコンジュゲートを含む医薬組成物を生成する方法であって、当該コンジュゲートを薬学的に許容される担体と組み合わせて医薬組成物を得ることを含む、方法である。

【0280】

実施形態５７は、単離されたヒンジ－Ｆｃ領域プラットフォームペプチドであって、好ましくは配列番号８４～９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むヒンジ－Ｆｃ領域ペプチドと、好ましくは配列番号６０～８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第１のリンカーペプチドであって、任意選択で、欠損している、第１のリンカーペプチドと、配列番号９１～１１２から選択されるアミノ酸配列を含む第２のリンカーペプチドと、を含み、当該第１のリンカーペプチドが、当該ヒンジ－Ｆｃ領域ペプチドのアミノ末端に接続され、当該第２のリンカーペプチドが、当該ヒンジ－Ｆｃ領域ペプチドのカルボキシ末端に接続されている、ヒンジ－Ｆｃ領域プラットフォームペプチドである。

【0281】

実施形態５８は、当該ヒンジ－Ｆｃ領域ペプチドが、配列番号８４のアミノ酸配列を含む、実施形態５７に記載の単離されたヒンジ－Ｆｃ領域プラットフォームペプチドである。

【0282】

実施形態５９は、当該第１のリンカーペプチドが、配列番号６０のアミノ酸配列を含む、実施形態５７又は５８に記載の単離されたヒンジ－Ｆｃ領域プラットフォームペプチドである。

【0283】

実施形態６０は、当該第２のリンカーペプチドが、配列番号９３、９４、９５、１０６、又は１１１のアミノ酸配列を含む、実施形態５７～５９のいずれか１つに記載の単離されたヒンジ－Ｆｃ領域プラットフォームペプチドである。

【0284】

実施形態６１は、当該第２のリンカーペプチドにおいて標的ペプチドに共有結合で連結している当該ヒンジ－Ｆｃ領域プラットフォームペプチドを含むコンジュゲートである。

【0285】

実施形態６２は、当該標的ペプチドが、式Ｉによって表される環状ＰＹＹペプチド又はその誘導体若しくは薬学的に許容される塩であり：

【0286】

【化43】

式中、
ｐは、０又は１であり、
ｍは、０、１、２、３、４、又は５であり、
ｎは、１、２、３、又は４であり、
ｑは、０又は１であり（但し、ｑは、Ｚ_３０が存在しない場合にのみ１である。）、
ＢＲＩＤＧＥは、－Ｐｈ－ＣＨ_２－Ｓ－、－トリアゾリル－、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ_２Ｓ－、－ＳＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、
－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ_２Ｓ、－ＮＨＣ（Ｏ）－、又は－ＣＨ_２Ｓ－であり、
Ｚ_４は、Ｋ、Ａ、Ｅ、Ｓ、又はＲであり、
Ｚ_７は、Ａ又はＫであり、
Ｚ_９は、Ｇ又はＫであり、
Ｚ_１１は、Ｄ又はＫであり、
Ｚ_２２は、Ａ又はＫであり、
Ｚ_２３は、Ｓ又はＫであり、
Ｚ_２６は、Ａ又はＨであり、
Ｚ_３０は、Ｌ、Ｗであるか、又は存在せず、
（但し、Ｚ_３０は、ｑが１である場合にのみ存在しない。）、
Ｚ_３４は、

【0287】

【化44】

であり、
Ｚ_３５は、

【0288】

【化45】

であり、
当該誘導体が、アミド化、アシル化、及びＰＥＧ化からなる群から選択される１つ又は２つ以上のプロセスによって修飾された式Ｉの化合物である、実施形態６１に記載のコンジュゲートである。

【0289】

実施形態６３は、ヒンジ－Ｆｃ領域プラットフォームペプチドと標的ペプチドとのコンジュゲートを生成する方法であって、第２のリンカーペプチドと当該標的ペプチドとの間に共有結合性連結を生じさせることを含む、方法である。

【実施例】

【0290】

合成
本発明の化合物又はコンジュゲートは、当業者に既知の全般的な合成法に従って合成することができる。以下の合成の説明は、例示目的のためのものであり、決して本発明の限定を意図するものではない。

【0291】

本発明のＮＴＳＣ環状ＰＹＹ（ＮＴＳＣ－ＰＹＹ）アナログ又は誘導体は、自動化されたペプチド合成装置、従来のベンチ合成、又は両方のアプローチの組み合わせを使用して、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９－２１５４（１９６３））に概説されているとおり、アミノ酸間の連続するペプチド連結を形成するための様々な既知の従来の手順によって合成することができ、優先的に固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により行われる。ペプチド合成のための従来の手順は、１つのアミノ酸残基の遊離アミノ基（その他の反応性官能基は好適に保護されている）と別のアミノ酸の遊離カルボキシル基（その反応性官能基も好適に保護されている）との間の縮合を伴う。ペプチド結合形成に典型的に利用される縮合剤の例としては、１－ヒドロキシベンズトリアゾール（ＨＯＢＴ）又はエチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセテート（Ｏｘｙｍａ Ｐｕｒｅ）を有する又は有しないジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、２－（１Ｈ－７－アザベンズトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、２－（６－クロロ－１Ｈ－ベンズトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、１－シアノ－２－エトキシ－２－オキソエチリデンアミノオキシ－トリス－ピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＯｘｉｍ）、２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルアミニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）ブロモ－トリス－ピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｒｏＰ）などが挙げられる。

【0292】

自動化されたペプチド合成方法は、Ｙｕ（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５７：４７８１－４７８４（１９９２））に記載され、より最近では、Ｐａｌａｓｅｋ（Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．，１３：１４３－１４８（２００７））によって精緻化されたとおり、室温（ｒｔ）又は高温で、好ましくは、マイクロ波加熱の適用を通して実行してよい。

【0293】

本発明の化合物（Ｃ末端アミド）は、好適な保護されたＮ－α－ＦＭＯＣ保護されたアミノ酸のカルボキシ末端が、好適な結合剤を使用して従来の固相樹脂上に結合される、Ｎ－α－ＦＭＯＣ（９－フルオロエニルメチルオキシカルボニル）保護されたアミノ酸方法論を用いて、好便に調製することができる。好適な従来の市販の固相樹脂としては、ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂、ＲｉｎｋアミドＡＭ樹脂、Ｔｅｎｔａｇｅｌ Ｓ ＲＡＭ Ｒｅｓｉｎ、ＦＭＯＣ－ＰＡＬ－ＰＥＧ ＰＳ樹脂、ＳｐｈｅｒｉＴｉｄｅ Ｒｉｎｋアミド樹脂、ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ Ｒｉｎｋ樹脂、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂、ＴＧ Ｓｉｅｂｅｒ樹脂などが挙げられる。次いで、樹脂結合されたＦＭＯＣ－アミノ酸は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）又は１－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）のいずれか中の２０％ピペリジンへの曝露によって脱保護されてもよく、その処理は、ＦＭＯＣ保護基を選択的に除去する役割を果たす。次いで、追加のＦＭＯＣ保護されたアミノ酸は、続いて順次結合及び脱保護され、それによって所望の樹脂結合された、保護されたペプチドを生成する。特定の場合では、ＦＭＯＣ脱保護条件に耐えるペプチド配列中の別のアミンに対して直交反応性保護基を利用することが必要なことがある。４－メチルトリチル（Ｍｔｔ）又は４－メトキシトリチル（Ｍｍｔ）といった保護基は、いずれも１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／ジクロロメタン（ＤＣＭ）処理によって除去可能であるか、又は好ましくはアリルオキシカルボニル（ａｌｌｏｃ；Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４（テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０））／ＰｈＳｉＨ_３（フェニルシラン）処理により除去可能）、１－（４，４－ジメチル－２，６－ジオキソシクロへクス－１－イリデン）エチル（Ｄｄｅ；２～３％ヒドラジン／ＤＭＦで処理することによって除去可能）、及び１－（４，４－ジメチル－２，６－ジオキソシクロへクス－１－イリデン）－３－メチルブチル（ｉｖＤｄｅ；２～３％ヒドラジン／ＤＭＦで処理することによって除去可能）が、そのような場合に効果的に使用され得る。

【0294】

従来のペプチド合成方法論では、アルファアミノ酸の反応性側鎖は、概して、結合及び脱保護プロトコルに対してそれらを不活性にするために、好適な保護基で合成を通して保護される。アミノ酸側鎖のための複数の保護基が当該技術分野において既知であるが、本明細書では、以下の保護基が最も好ましい：セリン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、及びチロシンにはｔｅｒｔ－ブチル（ｔ－Ｂｕ）；アスパラギン、グルタミン、システイン、ホモシステイン、及びヒスチジンにはトリチル（Ｔｒｔ）；トリプトファン及びリシンのε－アミノ基にはｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）；並びにアルギニンには２，２，４，６，７－ペンタメチルジヒドロベンゾフラン－５－スルホニル（Ｐｂｆ）。これらの保護基は、高濃度のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）などの強酸処理の際に除去される。

【0295】

ＳＰＰＳが完了すると、樹脂結合され側鎖保護されたペプチドは、脱保護され、トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）、水、フェノール、及びアニソールなどの様々な組み合わせのカルボカチオンスカベンジャと共に、主に（ＴＦＡ）からなる切断カクテルを使用して、樹脂から同時に切断される。次いで、ペプチド／カクテル濾液を冷エーテルで沈殿させることにより、粗固体ペプチドを単離する。Ｓｉｅｂｅｒ樹脂に結合している保護されたペプチドの特別な場合では、保護されたペプチドの樹脂からの切断は、側鎖の脱保護を引き起こすことなく、ＤＣＭ中１～２％ ＴＦＡで繰り返し処理する際に有利に行われ得る。単離されたら、保護されたペプチドの更なる操作は、溶液相反応において行われてもよい。最後に、保護されたペプチドは、切断カクテルを用いた別個の処理を使用して、全体的に脱保護され、上記のように沈殿されてもよい。次いで、このようにして得られた粗ペプチドを、アセトニトリル又はエタノールなどの有機共溶媒を含有する主に水性溶媒系中に低濃度（約＜４ｍｇ／ｍＬ）で溶解する。溶液のｐＨを＞５に上昇させると、次にペプチドは分子内環化反応を経て、本発明の対応する粗ＮＴＳＣ ＰＹＹアナログを形成する。このように形成されたＮＴＳＣ ＰＹＹアナログは、当該技術分野において概ね既知の精製技術を使用して精製することができる。本明細書で使用されるペプチド精製の好ましい方法は、逆相高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）である。次いで、精製されたペプチドは、液体クロマトグラフィ／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）によって特定される。

【0296】

本発明の環状ＰＹＹペプチドを生成するための全般的なスキーム及び方法は、２０１７年１０月２６日に出願された米国特許出願第１５／７９４，２３１号及び２０１７年１０月２６日出願された米国特許出願第１５／７９４，１７１号に記載されている。両出願の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0297】

本明細書に記載の以下の実施例及び実施形態は例示の目的のみであって、それらを考慮した様々な修正又は変更が当業者に提示され、本出願の趣旨及び範囲、並びに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが理解される。本明細書で引用される全ての発行物、特許、及び特許出願は、全ての目的においてそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0298】

実施例１：一過的にトランスフェクトされた哺乳動物細胞由来のグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）融合ペプチドの発現及び精製
合成された遺伝子断片を、様々な設計のエンドヌクレアーゼ制限酵素を使用してｐＣＤＮＡ３．１由来の哺乳動物発現ベクターにクローニングすることにより、ＧＬＰ－１融合ペプチド用のＤＮＡコンストラクトを生成した。合成された遺伝子断片は、融合タンパク質の以下の構成要素（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＧＬＰ－１ペプチド又はＧＬＰ－１変異体ペプチド、第１のリンカーペプチド、ヒンジ－Ｆｃ領域ペプチド、及び環状ＰＹＹペプチドにコンジュゲートするためのＣｙｓを含有する第２のリンカーペプチドのうちの１つ又は全てをコードしているＤＮＡ配列を含むように設計した。

【0299】

製造者の推奨に従って、融合タンパク質発現コンストラクトの精製プラスミドＤＮＡでＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、カタログ番号Ａ２９１２７）を一過的にトランスフェクトすることにより、ＧＬＰ－１融合タンパク質を当該細胞中で発現させた。簡潔に述べると、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞を、３７℃、８％ ＣＯ_２及び１２５ＲＰＭに設定した振盪インキュベータ内で、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ２９１００）中懸濁状態で維持した。細胞を継代し、６．０×１０^６細胞／ｍＬに希釈し、細胞生存率を９８％以上で維持した。一過性トランスフェクションは、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯトランスフェクションキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号Ａ２９１３１）を使用して行った。トランスフェクトされる希釈細胞１ｍＬごとに１マイクログラムのプラスミドＤＮＡを使用し、ＯｐｔｉＰＲＯ（商標）ＳＦＭ複合体化培地に希釈した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ試薬を、１：３比（ｖ／ｖ、ＤＮＡ：試薬）で使用し、ＯｐｔｉＰＲＯ（商標）にも希釈した。希釈したＤＮＡ及びトランスフェクション試薬を１分間組み合わせ、ＤＮＡ／脂質複合体を形成させ、次いで細胞に添加した。一晩インキュベートした後、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）フィード及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯエンハンサを細胞に添加した。細胞を３７℃で５日間振盪しながら培養した後、培養上清を収集した。

【0300】

一過的にトランスフェクトされたＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞からの培養上清を、遠心分離（３０分、６０００ｒｐｍ）を通して清澄化した後、濾過（０．２μ ＰＥＳ膜、Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ））によって収集した。最初に、Ｐａｌｌ Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎシステムを使用して、大規模トランスフェクション（５～２０リットル）を１０倍濃縮した。１０×ＤＰＢＳ（ｐＨ７．２）を上清に添加して、１×最終濃度にした後、ＡＫＴＡ ＦＰＬＣクロマトグラフィシステムを使用して、樹脂１ｍＬ当たり約２０ｍｇのタンパク質の相対濃度で、平衡化した（ＤＰＢＳ、ｐＨ７．２）ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕｒｅプロテインＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）に充填した。充填した後、カラムを１０カラム体積のＤＰＢＳ（ｐＨ７．２）で逐次洗浄した。場合によっては、２０カラム体積の１００ｍＭトリス、２．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭカプリル酸ナトリウム（ｐＨ９）及び１０カラム体積のＤＰＢＳ（ｐＨ７．２）の追加の洗浄を含めた。タンパク質を、１０カラム体積の０．１Ｍ酢酸ナトリウム（Ｎａ）（ｐＨ３）で溶出した。タンパク質画分は、２０％の溶出画分体積の２．０Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７）を入れたチューブに溶出することによって直ちに中和した。ピーク画分をプールし、必要に応じて、追加のトリスを用いてｐＨを約７に調整した。精製したタンパク質を濾過し（０．２μ）、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）ＨＴＭ分光光度計で２８０ｎｍにおける吸光度によってその濃度を求めた。精製タンパク質の品質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び分析サイズ排除ＨＰＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ（商標）ＨＰＬＣシステム）により評価した。内毒素レベルを比濁ＬＡＬアッセイ（Ｐｙｒｏｔｅｌｌ（登録商標）－Ｔ、Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ；ＦＡＬＭＯＵＴＨ，ＭＡ）を用いて測定した。

【0301】

あるいは、製造者の推奨に従って、融合タンパク質発現コンストラクトの精製プラスミドＤＮＡでＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ１４５２７）を一過的にトランスフェクトすることにより、ＧＬＰ－１融合タンパク質を当該細胞中で発現させた。簡潔に述べると、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞を、３７℃、８％ ＣＯ_２及び１２５ＲＰＭに設定した振盪インキュベータ内で、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）発現培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ１４３５１０１）中懸濁状態で維持した。細胞を継代し、２．５×１０^６細胞／ｍＬに希釈し、細胞生存率を９５％以上で維持した。一過性トランスフェクションは、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号Ａ１４５２５）を使用して行った。トランスフェクトされる希釈細胞１ｍＬごとに１マイクログラムのプラスミドＤＮＡを使用し、ＯｐｔｉＭＥＭ（商標）ＳＦＭ複合体化培地に希釈した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬を、１：２．６比（ｖ／ｖ、ＤＮＡ：試薬）で使用し、ＯｐｔｉＭＥＭ（商標）に希釈し、室温で５分間インキュベートした。希釈したＤＮＡ及びトランスフェクション試薬を２０分間合わせ、ＤＮＡ／脂質複合体を形成させ、次いで、細胞に添加した。一晩インキュベートした後、Ｅｘｐｉ２９３（商標）フィード及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３エンハンサを細胞に添加した。細胞を３７℃で４日間、振盪しながら培養した後、培養上清を収集した。

【0302】

一過的にトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３（商標）細胞からの培養上清を、遠心分離（３０分、６０００ｒｐｍ）を通して清澄化した後、濾過（０．２μ ＰＥＳ膜、Ｃｏｒｎｉｎｇ）によって収集した。１０×ＤＰＢＳ（ｐＨ７．２）をこの上清に添加して、１×最終濃度にした後、ＡＫＴＡ ＦＰＬＣクロマトグラフィシステムを使用して、樹脂１ｍＬ当たり約２０ｍｇのタンパク質の相対濃度で、平衡化した（ＤＰＢＳ、ｐＨ７．２）ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕｒｅプロテインＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。充填後、カラムを１０カラム体積のＤＰＢＳ、ｐＨ７．２で洗浄した。タンパク質を、１０カラム体積の０．１Ｍ酢酸Ｎａ（ｐＨ３）で溶出した。タンパク質画分は、２０％の溶出画分体積の２．０Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７）を入れたチューブに溶出することによって直ちに中和した。ピーク画分をプールし、必要に応じて、追加のトリスを用いてｐＨを約５．５に調整した。精製したタンパク質を濾過し（０．２μ）、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）ＨＴＭ分光光度計で２８０ｎｍにおける吸光度によってその濃度を求めた。精製タンパク質の品質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び分析サイズ排除ＨＰＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ（商標）ＨＰＬＣシステム）により評価した。内毒素レベルを比濁ＬＡＬアッセイ（Ｐｙｒｏｔｅｌｌ（登録商標）－Ｔ、Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ）を用いて測定した。

【0303】

ポリグリシンリンカーである配列番号６１のアミノ酸配列を含む第１のリンカーペプチドを有するＧＬＰ－１融合タンパク質は、低レベルで発現し、精製収率が低かった。したがって、ＧＬＰ－１融合タンパク質を遺伝子操作する際に、第１のリンカーペプチドにポリグリシンを使用することは、この実験では好ましくなかった。

【0304】

配列番号１００のアミノ酸配列を含む第２のリンカーペプチドを有するＧＬＰ－１融合タンパク質は、切断され、質量分析により分析したときに予想分子量ではないと判定された。したがって、ＧＬＰ－１融合タンパク質を遺伝子操作する際に、配列番号１００の第２のリンカーペプチドを使用することは、この実験では好ましくなかった。

【0305】

更に、ＧＬＰ－１融合ペプチドコンストラクトを調製するとき、タンパク質分解の負担の可能性を回避するために、ヒンジ－Ｆｃ領域ペプチド（すなわち、ヒトＩｇＧ４）のカルボキシ末端リシンを最終コンストラクトから欠失させた。

【0306】

実施例２：ＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹペプチドコンジュゲートの生成
ＧＬＰ－１融合タンパク質の還元
方法Ａ
精製ＧＬＰ－１融合タンパク質は、組換えタンパク質と、各リンカーに少なくとも１つのシステイン残基を含有する遺伝子操作を受けた第２のリンカーペプチドとの混合物であり、そのシステイン残基は、他のシステインにジスルフィド結合しているか、又はサイトゾル若しくは増殖培地中の外因性システイン残基に分子内でジスルフィド結合しているかのいずれかである。このような異種ＧＬＰ－１融合タンパク質溶液（トリスＯＡｃ中５～１２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ５．４～６．４）に、過剰量のホスフィン還元試薬１，３，５－トリアザ－７－ホスファアダマンタン（ＰＴＡ、１５～４０当量）を添加し、続いて、１００ｍＭ ＥＤＴＡ（最終濃度１～２ｍＭ）を添加した。得られた反応混合物を、標的システイン残基の還元が完了するまで室温で穏やかに撹拌した（４～１６時間）。遊離システイン及び残りのＰＴＡを、脱塩クロマトグラフィによって除去した。

【0307】

方法Ｂ
異種ＧＬＰ－１融合タンパク質溶液（トリスＯＡｃ中５～１５ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ５．０～６．５）に、過剰量のホスフィン還元試薬トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ、４～２５当量）を添加し、続いて、１００ｍＭ ＥＤＴＡ（最終濃度１ｍＭ）を添加した。得られた反応混合物を室温で一晩穏やかに撹拌し、次いで、トリスＯＡｃ（ｐＨ７．０）で平衡化した脱塩カラムに適用した。完全に還元されたＧＬＰ－１融合タンパク質（ヒンジのジスルフィド結合が切断）を、デヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡＡ、１０当量）で２時間処理した後、還元されたＧＬＰ－１融合ペプチドを酸化して、完全に脱キャッピングされた第２のリンカーペプチドにおいて遺伝子操作されたシステインを有する完全ＧＬＰ－１融合ペプチドを得た。

【0308】

ＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹペプチドコンジュゲートの調製
トリスＯＡｃ中還元ＧＬＰ－１融合ペプチドの溶液（（３～１０ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ５．５）を、脱イオン水中環状ＰＹＹペプチド（２．６～３．０当量、１０～１５ｍｇ／ｍＬ）の溶液に添加した。反応性チオールを金属触媒酸化から保護するために、ＥＤＴＡの濃度が１ｍＭになるまで、１００ｍＭのＥＤＴＡ溶液を反応混合物に添加した。トリス緩衝液（１Ｍ、ｐＨ９．１）を滴下することによって、反応溶液のｐＨをｐＨ８．０～８．２まで上昇させた。反応を室温で３～７時間、次いで、５℃で１８時間進行させた。ＬＣＭＳは、コンジュゲーションが完了し、ＧＬＰ－１融合環状ＰＹＹペプチドコンジュゲートの形成が９５％超であったことを示した。この反応物をプロテインＡ精製に直接供して、過剰な環状ＰＹＹペプチドを除去するか、又は（残存する反応性環状ＰＹＹペプチドをキャッピングするために）５当量のシステインを添加することによりクエンチした。得られた粗コンジュゲートを、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）によって精製した直後、プロテインＡで吸着させた。コンジュゲートを溶出（酢酸ナトリウム、ｐＨ３．５）し、続いて、トリス緩衝液でｐＨ７～７．５まで中和して、最終生成物を得た。あるいは、ＨＩＣで精製されたコンジュゲートは、ＨＩＣ精製の前に行われた場合、更なるプロテインＡポリッシングなしにＰＤ－１０カラムによって所望の緩衝液に交換することができる。

【0309】

コンジュゲーション反応はまた、低温（５℃）で実施してもよく、ＬＣＭＳによりモニタリングしてもよい（約４８時間）。

【0310】

場合によっては、ＧＬＰ－１融合タンパク質の第２のリンカーペプチドにおける反応性システインを、ブロモアセトアミドによってキャッピングして、安定したチオエーテル結合を形成させる。これらのアセトアミド修飾ＧＬＰ－１融合タンパク質を、以下のとおり調製した：ＧＬＰ－１融合タンパク質溶液（トリスＯＡｃ中５約１２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ５．４～６．４）に、過剰量のホスフィン還元試薬１，３，５－トリアザ－７－ホスファアダマンタン（ＰＴＡ、１５～２０当量）を添加し、続いて、１００ｍＭ ＥＤＴＡ（最終濃度１～２ｍＭ）を添加した。得られた反応混合物を、室温で１８時間穏やかに撹拌した。１５～２０当量のブロモアセトアミドをＧＬＰ－１融合ペプチド溶液に添加し、反応混合物のｐＨ値をトリス緩衝液（１Ｍ、ｐＨ９．１）によりｐＨ７．５～８．１に調整した。２時間後、反応混合物を疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）によって精製した直後、プロテインＡポリッシングを行った。

【0311】

表８は、ＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹペプチドコンジュゲートの単離収率を提供する。ＧＬＰ－１融合ペプチド６４（ＧＦ６４）と同様に第１のリンカーペプチドがＡＰリンカーであり、ＧＬＰ－１融合ペプチド８（ＧＦ８）と同様に第２のリンカーペプチドがＧ_４Ａリンカーであった場合、ＧＬＰ－１共役環状ＰＹＹペプチドコンジュゲートの単離収率が不十分であったことが観察された。

【0312】

【表8】

【0313】

実施例３：ＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹペプチドコンジュゲートの特性評価
（ｉ）疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）、（ｉｉ）ＬＣ－ＥＳＩＭＳによるインタクトな質量測定、（ｉｉｉ）サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を使用して、ＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹペプチドコンジュゲートの分析的特性評価を実施した。ＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹペプチドコンジュゲートの分析的特性評価の結果及びコンジュゲーション方法を表９に示す。

【0314】

【表9】

【0315】

実施例４：インビトロアッセイ
キットの指示書に従って、Ｌａｎｃｅ競合ｃＡＭＰイムノアッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ））を使用して細胞内ｃＡＭＰを測定する細胞ベースのアッセイにおいて、機能活性及びインビトロ効力についてコンジュゲートをスクリーニングした。マウス又はヒトＧＬＰ－１Ｒ又はＮＰＹ２受容体（Ｙ２Ｒ）を安定的に発現するクローンＨＥＫ２９３細胞をアッセイで使用した。ＧＬＰ１Ｒを発現している細胞を解凍し、ＨＢＳＳ、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１％ＢＳＡ、０．５ｍＭ ＩＢＭＸに懸濁させた。細胞をキットの抗ｃＡＭＰ抗体と混合し、３８４ウェル白色ｏｐｔｉ－ｐｌａｔｅ内においてＨＢＳＳ、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１％ＢＳＡで連続希釈したコンジュゲートに添加した。室温で１０分間インキュベートした後、イムノアッセイ検出混合物を添加した。アッセイプレートをＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（励起３２０ｎｍ、発光６１５ｎｍ及び６６５ｎｍ）においてＴＲ－ＦＲＥＴアッセイとして読み取り、データを使用して、Ｐｒｉｓｍ統計ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を使用して化合物のＥＣ_５０値を計算した。

【0316】

Ｙ２Ｒ受容体における化合物の活性を求めるために、Ｙ２Ｒを発現しているＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ胎児血清、１％Ｌ－グルタミン、１％ピルビン酸ナトリウム、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、及び６００ｕｇ／ｍＬ Ｇ４１８を補給したＤＭＥＭ高グルコース培地（Ｃｅｌｌｇｒｏ）中で培養し、Ｇ４１８を含まない培地中で３８４ウェルプレートにて一晩プレーティングした。アッセイの日に、細胞増殖培地を細胞から取り出し、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｕＭ ＩＢＭＸ、及びＨＢＳＳ中０．１％ＢＳＡ中の６μＬのコンジュゲート（２×）を添加した。次に、フォルスコリン（２×、５ｕＭ最終濃度）及びＬＡＮＣＥ ｃＡＭＰ抗体（１：１００）を含有する刺激緩衝液６μＬを細胞に添加した。室温で２５分間インキュベートした後、１２μμＬの検出混合物を添加し、ＬＡＮＣＥ ｃＡＭＰイムノアッセイにおいてｃＡＭＰ濃度を定量した。

【0317】

データ解析
Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーからのデータは、（６１５ｎｍ／６６５ｎｍ）ｘ１０，０００として計算された相対蛍光単位（ＲＦＵ）として表した。全ての試料は３つ組で測定された。各ウェル内の未知のｃＡＭＰ濃度は、各プレート内に含まれる既知のｃＡＭＰ濃度の参照標準から補間された。ＥＣ_５０、Ｌｏｇ（ＥＣ_５０）、ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ（ｎＨ）、最大値、最小値などのパラメータは、非線形加重最小二乗法アプリケーションを使用して４－Ｐモデルで当てはめた対数化合物濃度に対するｃＡＭＰ濃度値をプロットすることによって得られた。

【0318】

【表10】

【0319】

【表11】

【0320】

配列番号１３５、１３４、１４６、及び１７６のＧＬＰ－１Ｒの効力の、配列番号２３８、２４２、２６２、２５３、及び２４１との比較は、エキセンディン４（１－３９）（配列番号５８）を有するＧＬＰ－１融合ペプチドが、ＰＹＹペプチドとのコンジュゲーション後にＧＬＰ－１Ｒ効力を失ったことを示した。これらの結果に基づいて、エキセンディン４（１－３９）（配列番号５８）を有するＧＬＰ－１融合ペプチドを用いた試験は、この実験では好ましくなかった。

【0321】

ヒトＮＰＹ２Ｒ一次スクリーニングアッセイ：インビトロでＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹペプチドコンジュゲートのＮＰＹ２Ｒ効力をスクリーニングするために使用した方法は、ヒトＮＰＹ２Ｒ Ｇｉ－タンパク質共役受容体の調節を通してアデニル酸シクラーゼによって生成されたフォルスコリン誘導性ｃＡＭＰの阻害を測定するように設計された細胞ベースのアッセイであった。ヒトＮＰＹ２ＲでトランスフェクトされたＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）におけるフォルスコリン誘導性ｃＡＭＰ生成は、ＰＹＹアナログ及び対照によるＮＰＹ２Ｒの活性化によって用量依存的に減少し、ＦＲＥＴベースの競合ｃＡＭＰイムノアッセイにおいて測定された。

【0322】

細胞を冷凍保存から取り出し、３７℃の水浴中で解凍し、４０ｍＬの１×ＤＰＢＳ（ｐＨ７．２）（Ｇｉｂｃｏ）に添加し、セルストレイナーで濾過した。細胞を４５０×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞ペレットを、０．１２５×１０^６細胞／ｍＬの密度で、ＤＭＥＭ／高グルコース、１０％ ＨＩＦＢＳ、１％ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１ ％Ｌ－グルタミン、１％ピルビン酸Ｎａに再懸濁させた。最終５０００細胞／ウェルになるように、コラーゲンでコーティングされた白色３８４ウェルプレートに４０μＬ／ウェルで細胞を分注し、３７℃、５％ ＣＯ_２で１６～２４時間インキュベートした。アッセイプレート中の細胞を、８０μＬ／ウェルの１×ＤＰＢＳを添加することによって２回洗浄し、上清をデカントした。１×ＨＢＳＳ、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．００２ｍＭフォルスコリン、０．１％ＢＳＡ、０．５ｍＭ ３－イソブチル－１－メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）でサンプル及び対照の希釈物を調製し、２０μＬ／ウェルの各サンプルを指定ウェルに添加し、室温で３０分間、振盪しながらインキュベートした。次いで、２０μＬ／ウェルのｃＡＭＰ検出試薬混合物を各アッセイプレートに添加し、室温で２～２４時間、振盪しながらインキュベートした。プレートリーダーでプレートを読み取った。全てのサンプルを４連で測定した。Ｒ環境内で非線形加重最小二乗法アプリケーションを使用して４－Ｐモデルで当てはめたｌｏｇ化合物濃度にわたる生のＬＡＮＣＥ ｃＡＭＰ値をプロットすることによって、データを分析した。

【0323】

ヒトＧＬＰ－１Ｒ一次スクリーニングアッセイ：インビトロでＧＬＰ－１融合タンパク質及びＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹペプチドコンジュゲートのＧＬＰ－１Ｒ効力をスクリーニングするために使用した方法は、ヒトＧＬＰ－１Ｒ Ｇｓ－タンパク質共役受容体の調節を通してｃＡＭＰ生成を測定するように設計された細胞ベースのアッセイであった。ＧＬＰ－１融合ペプチド及びＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹペプチドコンジュゲートによるＧＬＰ－１Ｒの濃度依存性活性化に続いて、ヒトＧＬＰ－１ＲでトランスフェクトされたＨＥＫ細胞中のｃＡＭＰ蓄積をＴＲＦＲＥＴベースの競合ｃＡＭＰアッセイで測定した。

【0324】

ヒトＧＬＰ－１ＲでトランスフェクトされたＨＥＫ細胞をアッセイの日に解凍し、１×ＨＢＳＳ、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１％ＢＳＡ、及び１ｍＭ ＩＢＭＸに０．５×１０^６細胞／ｍＬで再懸濁させ、１０μＬを３８４ウェルプレートの各ウェルに添加した（５０００細胞／ウェル）。サンプルを１×ＨＢＳＳ、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１％ＢＳＡで希釈し、１０μＬ／ウェルでアッセイプレートに添加し、室温で３０分間インキュベートした。ｃＡＭＰ検出試薬を２０μＬ／ウェルで添加した。プレートを室温で２時間インキュベートした後、プレートリーダーで読み取った。全てのサンプルを４連で測定した。Ｒ環境内で非線形加重最小二乗法アプリケーションを使用して４－Ｐモデルで当てはめたｌｏｇ化合物濃度にわたる生のＬＡＮＣＥ ｃＡＭＰ値をプロットすることによって、データを分析した。

【0325】

実施例５：ＧＬＰ－１融合ペプチド及びＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹコンジュゲートにおけるキシロース分析
サンプル調製：ペプチドマッピング用のサンプルを調製するために、各タンパク質分子（１ｍｇ／ｍＬ）：ＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹコンジュゲート（配列番号２４４）、ＧＦ４０（配列番号１５２）、及びＧＦ３４（配列番号１４６）を、ｐＨ８．０で緩衝された８Ｍグアニジン／ＨＣｌで１：４希釈した。これらのサンプルに、最終濃度が２５ｍＭに達するまで１Ｍ ＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ ４３８１６－１０ＭＬ、ＢｉｏＵｌｔｒａ）のアリコートを添加し、次いで、サンプルを３７℃で１時間インキュベートした。ヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ、Ａ３２２１－１０ＶＬ）又はＮ－メチルマレイミド（ＮＥＭ）（Ｓｉｇｍａ、Ｅ３８７６）のいずれかを使用してアルキル化を実施した。新たに調製した１Ｍアルキル化剤を約５０ｍＭに達するまで添加し、サンプルを暗所において室温で６０分間インキュベートした。次いで、反応混合物（Ｓｉｇｍａ ４３８１６－１０ＭＬ、ＢｉｏＵｌｔｒａ）４００ｕＬごとに１Ｍ ＤＴＴ １５μＬを添加することによって、アルキル化反応をクエンチした。５０ｍＭトリス、１ｍＭ ＣａＣｌ_２（ｐＨ＝８．０）中で、製造元のプロトコルに従って、Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ＃８９８３３）を使用してサンプルを脱塩した。５０ｍＭ酢酸（凍結乾燥トリプシンと共に供給）中で再構成した１μｇ／μＬのトリプシン１μＬを添加した後、３７℃で４時間、トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａシークエンシンググレード、Ｖ５１１Ａ）でサンプルを消化した。消化されたタンパク質の６０μＬのアリコートに１００％ ＴＦＡ ０．６μＬを添加することにより、トリプシン消化をクエンチした。サンプルをマイクロバイアル瓶に再懸濁させ、ＬＣ／ＭＳ分析のために４℃に設定したオートサンプラーに入れた。

【0326】

液体クロマトグラフィ及び質量分析：０．１ｍＬ／分の流速でＡｇｉｌｅｎｔ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ １２９０ ＵＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、部品番号：Ｇ１３３０Ｂ、Ｇ４２２６Ａ、Ｇ４２２０Ａ、Ｇ４２１２Ａ）を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍａｐ Ｍｉｃｒｏ Ｂｏｒｅ Ｒａｐｉｄ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎ（１×１５０ｍｍ、２．７μｍ、部品番号８６３６００－９１１）に２μｇ（～１０μＬ）の消化されたタンパク質を注入した。カラム温度を６５℃で維持した。質量分析グレードＨＰＬＣ溶媒（０．１％ギ酸及びＢ：０．１％ギ酸中１００％ ＡＣＮ）をＶＷＲ（部品番号：ＬＣ４５２－１、ＬＣ４４１－１）から購入した。タンパク質分解ペプチドを、０．１％ ＦＡ中２％から４０％までＡＣＮの５０分間の勾配を用いてカラムから溶出した。３．５ｋＶの正の噴霧電圧、２０（任意単位）のシースガス、７（任意単位）の補助ガス、２９９℃のイオン移動管、及び１００℃の蒸発器を用いて、加熱した電子スプレーイオン化プローブ（ＨＥＳＩ）を介してカラム溶出液をＯｒｂｉｔｒａｐ Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計（Thermofisher Scientific）に導入した。フルＭＳスキャンで観察された上位５個の多量に存在するペプチドイオンを連続的に解離させることによって、データ依存的取得法を実施した。Ｏｒｂｉｔｒａｐ検出、７０，０００分解能、質量範囲１５０～２０００ｍ／ｚ、自動利得制御（ＡＧＣ）目標１．０ｅ６、最長注入時間５０ミリ秒に設定したプリカーサスキャンで質量分析を行った。１マイクロスキャンスペクトルをプロファイルモードで取得した。プリカーサの決定基準は、モノアイソトピックプリカーサ選択ペプチドであり、電荷状態：２～７、ダイナミックエクスクルージョン：６．０秒、及びプリカーサ強度閾値５ｅ４であった。コリジョンセルに送られた１．６ｍ／ｚの単離幅を有する四重極によってプリカーサペプチドを単離した。正規化された衝突エネルギー２８（任意単位）の結果を、ペプチドイオンの高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）に使用した。オービトラップ設定を用いた質量分析のためにオービトラップに移したプロダクトイオンは、１７，５００の分離電力、２００～２０００ｍ／ｚ範囲、ＡＧＣ標的５ｅ５、最長注入時間１００ミリ秒、重心モードで取得されたスペクトル１マイクロスキャンである。

【0327】

データ分析：ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの生データを、Ｂｙｏｎｉｃソフトウェア（バージョン２．１５．７）（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ）を使用してデータベース検索に付した。以下のパラメータをデータ検索のために使用した：プリカーサイオン質量公差、８ ｐｐｍ；プロダクトイオン質量公差、ＨＣＤスペクトルについては２０ｐｐｍ；可変修飾としては、システインカルバミドメチル化、又はＮ－メチルマレイミド（ＮＥＭ）、システインＤＴＴ付加体形成、存在する場合はシステインペプチドＹＹ（ＰＹＹ）コンジュゲートが含まれ、アスパラギン、セリンキシロースの脱アミノ化、並びにＢｙｏｎｉｃグリカンライブラリから得られた７８の哺乳動物Ｏ－結合グリカンのセリン及びスレオニンＯ－グリコシル化が挙げられる。全ての検索のために、最大２つの欠失した切断を有する完全トリプシン特異性検索を選択した。タンパク質偽発見率（ＦＤＲ）を１％に設定した。タンパク質データベースは、各タンパク質のアミノ酸配列を含有していた。全てのＢｙｏｎｉｃ検索結果を、Ｂｙｌｏｇｉｃソフトウェア（バージョン２．１５．２９６）（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ）で処理し、ペプチドを、最大プリカーサｍ／ｚ誤差８ｐｐｍ及びＸＩＣ面積ウインドウ２分で、最小Ｂｙｏｎｉｃスコア１５、最大アルトランスコア／プライマリランクスコア０．９９でフィルタリングした。リンカー領域を構成するアイソフォームの全てのペプチドＸＩＣピーク面積を考慮することによって、セリンキシロシル化レベルを報告した。次いで、各セリン残基におけるキシロシル化を、総ＸＩＣピーク面積の合計分率として計算した。また、ＭａｘＱｕａｎｔソフトウェアバージョン１．６．１（ＭａｘＰｌａｎｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のＡｎｄｒｏｍｅｄａ検索エンジンを使用してデータベース検索を実行して、ＰＴＭ部位局在化確率を得た。完全に環化されたＰＹＹ及びトリプシンにより切断されたＰＹＹ構造に対応する質量を、ＢＩＯＶＩＡ描画ソフトウェアを使用して得た。データを表１２に報告する。

【0328】

【表12】

リンカーのセリンにおけるキシロース修飾：部位の同定及び修飾レベル
ＮＤ＝ＭＳ／ＭＳにより検出されず、ＮＱ＝定量されず；ＮＡ＝リンカーのセリン位置は分子には適用できない、^＊＊番号：配列番号：括弧は、配列番号１５２の部位番号を示す。

【0329】

表１２は、目的のピーク／ピーク（推定修飾、すなわち、セリンキシロシル化）に基づくＸＩＣ％を、以下の等式に従って、部位特異的キシロシル化に寄与する全ての種の合計に対して正規化した、Ｂｙｌｏｇｉｃにおけるピーク積分を使用して同定及び定量された部位特異的キシロシル化をまとめる。

【0330】

修飾のＸＩＣ％＝（修飾ペプチドのＸＩＣ／ペプチド対応物のΣＸＩＣ）×１００
調べた３つの分子は全て、ＧＬＰ－１ペプチド及びヒンジ－Ｆｃ領域ペプチドを接続する同じ第１のリンカーペプチドＡＳ（Ｇ_４Ｓ）_２からなる。しかしながら、配列番号１５２（ＧＦ４０）にみられるＧＬＰ－１融合ペプチドと配列番号２４４及び１４６（ＧＦ３４）の両方にみられるＧＬＰ－１融合ペプチドとの差に起因して、表１２に示すように、配列番号１５２における３つのセリン残基の位置は、配列番号２４４及び１４６とは異なる。ペプチドの分析によって、配列番号２４４及び１４６のＳｅｒ－４１、Ｓｅｒ－４６、Ｓｅｒ－５１における３つの部位特異的セリン残基キシロシル化事象、及び配列番号１５２のＳｅｒ－３３におけるセリン残基キシロシル化事象が証明された。部位特異的キシロシル化の定量は、ほとんどのキシロシル化ペプチド種が逆相液体クロマトグラフィ中に同時溶出したので、限定的にしか実現できなかった。例えば、配列番号２４４では、Ｓｅｒ－４１は約９％であり、一方、Ｓｅｒ－４６及びＳｅｒ－５１は約７％であった。同様に、配列番号１４６の３つの部位は全て、約５％でキシロシル化された。配列番号１５２のキシロシル化は、約０．１％とより少ない程度で発生することが見出された。

【0331】

治療用タンパク質のＧ_４Ｓリンカー領域は、キシロシル化を受けやすく、キシロシル化レベルはリンカー長に基づいて変化することが示されている（Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．，「Ｔｈｅ ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ ｆｏｒ ｘｙｌｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ（Ｇ_４Ｓ）_ｎ ｌｉｎｋｅｒｓ ｏｃｃｕｒｓ ｗｈｅｎ ｎ＞２，」Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８５：４８０５－１２（２０１３）；Ｓｐｈａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２２：１７３９－５３（２０１３），Ｓｐｈａｒ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ６：９０４－１４（２０１４））。３つ全ての分子にみられる第１のリンカーペプチド、ＡＳ（Ｇ_４Ｓ）_２リンカーは、全て又はいくつかのセリン残基においてキシロシル化を示し、これらのデータに基づいて、ＧＬＰ－１融合ペプチドコンストラクトを調製する際に、セリンを含有する第１のリンカーペプチドを使用することは、この実験では好ましくなかった。

【0332】

実施例６：ＧＬＰ－１融合ペプチドのエクスビボにおけるヒト血漿安定性
ナトリウムヘパリン抗凝固剤を含む４人の健常ヒトドナー由来の新鮮な全血を、安定性サンプルを準備する日に受け取った。新鮮な全血を、３５００ＲＰＭで１５分間遠心分離することによって血漿のために処理し、次いで、血漿を単離した。４人全てのドナー由来の血漿を合わせ、０．２μフィルターを通して濾過し、３７℃に加温した。２０ｎＭのＧＬＰ－１融合ペプチド及びＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹコンジュゲート二重アゴニスト（ＤＡ）アナログでサンプルをスパイクし、ゼロ時間サンプルを直ちに収集し、分析するまで－８０℃で保存した。サンプルを３７℃でインキュベートし、指定の時点で収集し、分析するまで－８０℃で保存した。分析の日に、ゼロ時間及びその後の時点のサンプルを解凍し、機能性細胞ベースのバイオアッセイにおいて一緒に分析した。

【0333】

ヒト血漿サンプル中の生物活性ＧＬＰ－１融合ペプチド及びＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹコンジュゲートＤＡアナログのレベルを検出及び定量するために使用した方法は、ヒトＧＬＰ－１Ｒ Ｇタンパク質共役受容体の調節を通してｃＡＭＰ生成を測定するように設計された細胞ベースのバイオアッセイであった。ＧＬＰ－１融合タンパク質及びＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹペプチドコンジュゲートによるＧＬＰ－１Ｒの濃度依存性活性化に続いて、ヒトＧＬＰ－１ＲでトランスフェクトされたＨＥＫ細胞中のｃＡＭＰ蓄積をＴＲＦＲＥＴベースの競合ｃＡＭＰアッセイで測定した。ヒトＧＬＰ－１ＲでトランスフェクトされたＨＥＫ細胞をアッセイの日に解凍し、１×ＨＢＳＳ、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１％ＢＳＡ、及び１ｍＭ ＩＢＭＸに０．５×１０^６細胞／ｍＬで再懸濁させ、１０μＬを３８４ウェルプレートの各ウェルに添加した（５０００細胞／ウェル）。安定性サンプルを解凍し、１×ＨＢＳＳ、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１％ＢＳＡ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、プロテアーゼ阻害剤から構成されるアッセイ緩衝液中で２０％血漿に希釈し、その後の希釈は、２０％正常ヒト血漿を含むアッセイ緩衝液で行った。２０％正常ヒト血漿を含むアッセイ緩衝液中で、各化合物について既知の濃度の参照標準を調製した。標準及びサンプルを各アッセイプレートに１０μＬ／ウェルで添加し、室温で３０分間インキュベートした。ｃＡＭＰ検出試薬を２０μＬ／ウェルで添加した。プレートを室温で２時間インキュベートした後、プレートリーダーで読み取った。

【0334】

全てのサンプルを４連で測定した。対数変換された濃度、非線形当てはめ、Ｌｏｇ ｖ．応答（可変勾配）を用いて化合物の参照標準曲線を作成し、ＥＣ_１０及びＥＣ_９０値を、定量的アッセイの上限及び下限として求めた。各化合物についての安定性サンプルの濃度を、対応する参照標準曲線から外挿した。各安定性サンプルの生物活性残存率を、対応するゼロ時間サンプルに対して求め、１６８時間の時間経過にわたって、出発血漿濃度の％として報告した。％出発血漿濃度＝［安定性サンプルの平均］／［ゼロ時間の平均］×１００。

【0335】

結果：ＧＬＰ－１融合ペプチド配列番号１４４（ＧＦ３２）、１４８（ＧＦ３６）、１４５（ＧＦ３３）、１５１（ＧＦ３９）、１４６（ＧＦ３４）、１４７（ＧＦ３５）、１４９（ＧＦ３７）、１５２（ＧＦ４０）、及びデュラグルチド対照を、３７℃で７日間、エクスビボでヒト血漿中においてインキュベートし、インビトロＧＬＰ－１Ｒ ｃＡＭＰ機能アッセイで機能的安定性を測定した（図１Ａ）。ＧＬＰ－１ペプチド配列番号５８（エキセンディン４（１－３９））を有するＧＬＰ－１融合タンパク質が最も高い安定性を示し、続いて、配列番号５７（（Ａ８Ｇ、Ｇ２２Ｅ、Ｒ３６Ｇ）ＧＬＰ－１（７－３７））及びデュラグルチド対照であり、配列番号５６（（Ａ８Ｓ、Ａ３０Ｅ）ＧＬＰ－１（７－３６））の安定性が最も低かった。これらの結果に基づいて、ＧＬＰ－１ペプチド配列番号５６を有するＦｃ融合タンパク質を用いた試験は、この実験では好ましくなかった。

【0336】

ＧＬＰ－１融合ペプチド配列番号１５２（ＧＦ４０）及び１４６（ＧＦ３４）、並びにこれらの対応するＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹペプチドコンジュゲート配列番号２４８及び２６２、並びに別のＧＬＰ－１融合ペプチド配列番号１５３（ＧＦ４１）を、デュラグルチド対照と共に、３７℃で７日間、エクスビボでヒト血漿中においてインキュベートした。インビトロＧＬＰ－１Ｒ ｃＡＭＰ機能アッセイで機能安定性を測定した（図１Ｂ）。ＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹペプチドコンジュゲートの安定性は、対応するコンジュゲートしていない融合タンパク質と同等であり、これは、ＰＹＹペプチドのコンジュゲーションがＧＬＰ－１ペプチドの安定性に影響を与えなかったことを示す。ＧＬＰ－１融合ペプチド配列番号１４６（ＧＦ３４）及びＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹペプチドコンジュゲート配列番号２６２が、最高の安定性を有し、配列番号１５２（ＧＦ４０）、２４８、及び１５３（ＧＦ４１）は、デュラグルチド対照と同様の安定性を有した。

【0337】

実施例７:インビボにおけるマウス安定性アッセイ
方法
ＬＣＭＳ法：抗ヒトＦｃ抗体を使用して免疫親和性捕捉によって血漿サンプルを処理した後、トリプシンで消化し、トリプル四重極質量分析計で逆相ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析によって分析した。ＧＬＰ－１のＮ末端におけるペプチド、すなわち、ＧＬＰＤ３０についてはＨＧＥ（ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫ（配列番号２６３）、ＧＬＰＤ３１についてはＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫ（配列番号２６４）を、活性ＧＬＰ１を含有する分子の代用としてモニタリングした。Ｆｃに位置するペプチド、すなわち、ＶＶＳ（ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２６５））を、総Ｆｃレベルの代用としてモニタリングした。環状ＰＹＹペプチドに位置するペプチド、ＹＹＡ（ＹＹＡＳＬＲ（配列番号２６６））を、ＰＹＹレベルの代用としてモニタリングした。較正標準曲線及び品質管理サンプルを、血漿中の参照標準をスパイクすることによって調製し、試験サンプルと同時に同じ手順を使用して処理した。

【0338】

結果
マウスにおける投与７２時間後のインタクトなＧＬＰ－１融合ペプチド部分Ｎ末端の血漿曝露レベルをＬＣＭＳアッセイで測定し、Ｆｃレベルに対するＨＧＥ Ｎ末端ＧＬＰ－１融合ペプチド部分配列レベルのパーセントとして報告した（ＦｃのＨＧＥ％）。表１３の結果は、ＡＰ反復を含む配列番号６２及び６６の第１のリンカーペプチドが、Ｇ_４Ａ反復を含む配列番号６０の第１のリンカーペプチドよりも少なかったことを示す。これらの結果に基づいて、ＡＰ反復を含む第１のリンカーペプチドを有するＧＬＰ－１融合ペプチドを用いた試験は、この実験では好ましくなかった。

【0339】

【表13】

ＢＱＬ＝定量限界未満

【0340】

ＤＩＯマウスにおける急性及び亜慢性の薬力学試験
これらの試験で使用した全てのげっ歯類は、Ｊａｎｓｓｅｎ Ｒ＆Ｄ（Ｓｐｒｉｎｇ Ｈｏｕｓｅ，ＰＡ）において、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ＆ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたプロトコルに従って維持した。動物を、食物及び水に自由にアクセスできる標準的な温度及び湿度条件で、１２時間明／１２時間暗サイクルで飼育した（特に断りのない限り）。個々に飼育した２０週齢の雄ＤＩＯ（１５週間６０％ ｋｃａｌ％高脂肪食）Ｃ５７ＢＬ／６Ｔマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を使用した。動物を、体重に基づいて群に無作為化した。腹腔内（ＩＰ）耐糖能試験（ＩＰＧＴＴ）については、ビヒクル、デュラグルチド（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ；Ｍｙｏｄｅｒｍ（Ｎｏｒｒｉｓｔｏｗｎ，ＰＡ）から購入）、又は化合物１～４（それぞれ配列番号１１３、配列番号２２５、配列番号１３６、配列番号２２９）をマウスに投与した（ｎ＝８／群）。２４時間後（一晩絶食後）、マウスにデキストロース（１ｇ／ｋｇ）をＩＰ投与した。Ｏｎｅ Ｔｏｕｃｈ Ｕｌｔｒａ ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（ＬｉｆｅＳｃａｎ）を用いて指定の時点で血中グルコースを測定し、血漿インスリン（Meso Scale Discovery）を０及び１０分で測定した。急性食物摂取（ＦＩ）及び体重減少（ＷＬ）試験については、個々に飼育したＤＩＯマウスに、ビヒクル、デュラグルチド、又は化合物を投与し、食物及び体重を３日間にわたって測定した（ｎ＝８／群）。データを図２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、及び４Ａ～４Ｂに示す。図２Ａ～２Ｂ、図３Ａ～３Ｂ、及び図４Ａ～４Ｂのデータは、ＧＬＰ－１融合ペプチドが望ましいＧＬＰ－１Ｒの効能を有し、環状ＰＹＹペプチド配列番号２７とコンジュゲートしたときに効能が向上したことを示す。図５Ａ～５Ｂ及び図６Ａ～６Ｂのデータから、ＧＬＰ－１融合ペプチドの上方ヒンジがＧＬＰ－１Ｒの効力に寄与すると判定された。

【0341】

実施例８：カニクイザルを用いたインビボ試験
方法
効能試験
ランイン（run-in）及びビヒクル処理中に測定したベースライン（０日目前３日間の平均）食物摂取量（主要、加重８０％）及び体重（副次的、加重２０％）に基づいて、サルを選択し、化合物処理について群に無作為化した。試験は、順化／トレーニング２週間、３日ごと（Ｑ３Ｄ）のビヒクル処理３週間、及びベースラインの食物摂取測定、処理（５回、Ｑ３Ｄ）１２日間、及び休薬２週間の９週間にわたった。動物にビヒクルを７回投与し、試験物品のうちの１つ（投与体積０．５ｍＬ／ｋｇ）をおよそ午前８時にＱ３Ｄで５回投与した。各群の用量は以下のとおりであった：デュラグルチド（０．０１２５ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝１１）、化合物４（高用量；０．０１４８ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝１１）、化合物４（低用量；０．００７４ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝６）。カロリー摂取は毎日測定し、体重はＱ３Ｄで測定した。

【0342】

曝露応答分析
２つの分析方法を使用して、カニクイザルのインビボ血漿サンプルから化合物４及びデュラグルチドの濃度を測定した。

【0343】

カニクイザルにおける化合物４及びデュラグルチドのリガンド結合アッセイ（ＬＢＡ）曝露分析は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ Ｓ６００（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ ＵＳＡ））を使用して、目的にかなった電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）法によって実施した。化合物４及びデュラグルチドの両方について活性ＧＬＰ－１を測定するためのフォーマットは、以下のように記載される：アナライトを、ＧＬＰ－１ Ｎ末端（７－１７）特異的ｍＡｂ（ビオチン－抗ＧＬＰ１（７－３７、７－３６、アミド、遊離ＮＴ）ｍＡｂ）で捕捉し、抗ヒトＦｃ特異的ｍＡｂ（ＳｕｌｆｏＴａｇ－Ｒ１０）で検出した。１／Ｆ２標準曲線重み付けを用いた５パラメータロジスティックフィットを使用して、Ｗａｔｓｏｎ ＬＩＭＳ（商標）ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ ＵＳＡ））において、生データ回帰を実施した。

【0344】

分子の個々の部分の定量のために、ボトムアップトリプシンアッセイによって、カニクイザルにおける化合物４及びデュラグルチドのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析も行った。トリプシンアッセイでは、抗ヒトＦｃ抗体による免疫親和性捕捉を使用して血漿サンプルからアナライトを精製し、続いて、トリプシンで消化し、ＳＣＩＥＸ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ（商標）５５００ ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＩＥＸ（Ｃｏｎｃｏｒｄ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ））で逆相ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより分析した。安定な同位体［１３Ｃ６、１５Ｎ４－アルギニン］及び［１３Ｃ６、１５Ｎ２－リシン］標識ヒトＩｇＧ４（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＭＳＱＣ７）を内部標準として使用し、免疫親和性捕捉工程の開始時に添加した。その活性にはＨＧＥペプチドが必須であるため、ＧＬＰ－１のＮ末端のペプチド、すなわち、ＨＧＥ（ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫ）（配列番号２６３）を、活性ＧＬＰ－１を含有する分子の代用としてモニタリングした。

【0345】

結果
本出願の実施形態による二重アゴニストは、環状ＰＹＹペプチドに共有結合で連結しているＧＬＰ－１融合（ＧＦ）ペプチドを含有する。二重アゴニストは、第１のリンカーペプチド（Ｎ末端リンカーペプチド）を通してヒンジ－Ｆｃ領域に融合している組み換えグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）ペプチド又はＧＬＰ－１変異体ペプチドと、組換えＧＬＰ－１融合（ＧＦ）ペプチドの第２のリンカーペプチド（Ｃ末端リンカーペプチド）内に含有される標的システインに化学的にコンジュゲートしている環状ＰＹＹペプチドとから構成される。二重アゴニストの各構成要素は、各受容体における効力、安定性、翻訳後修飾、コンジュゲーション生成収率、及び生物物理的特性が挙げられるが、これらに限定されない、いくつかの重要なパラメータに基づいて経験的に選択した。

【0346】

ＧＬＰ－１ペプチド変異体配列番号５７をＧＬＰ－１ペプチド変異体として選択した。ＧＬＰ－１ペプチド－１変異体配列番号５６は、インビボにおいてそれほど強力ではなく、エクスビボにおけるヒト血漿安定性試験（図１Ａ）において安定性が低かったため、この実験では好ましくなかった。ＧＬＰ－１ペプチド変異体配列番号５８は、予想外なことに、環状ＰＹＹペプチドにコンジュゲートしたときにＧＬＰ－１Ｒの効力を失い（表１１）（例えば、配列番号１３５、１３４、１４６、及び１７６のＧＬＰ－１Ｒの効力を参照）、配列番号２３８、２４２、２６２、２５３、及び２４１は、エキセンディン４（１－３９）（配列番号５８）を有するＧＬＰ－１融合ペプチドが、一部のＰＹＹペプチドとのコンジュゲーション後にＧＬＰ－１Ｒの効力を失った又は有意に低下したことを示した。これらの結果に基づいて、エキセンディン４（１－３９）（配列番号５８）を有するＧＬＰ－１融合ペプチドを用いた試験は、この実験では好ましくなかった。ＧＬＰ－１ペプチド変異体配列番号５８は、更に、易ＮＧ脱アミド化モチーフを含有する。配列番号５９は、第１のリンカーペプチド中の第１のアミノ酸がグリシンであったとき、ＧＬＰ－１ペプチド／第１のリンカーペプチド界面で易ＮＧ脱アミド化モチーフを形成した。更に、ＧＬＰ－１ペプチド配列番号５９を含有するＧＦ２８（配列番号１４０）は、食物摂取（ＦＩ）及び体重（ＢＷ）の変化％の両方について、デュラグルチドよりも効力が低かった（それぞれ、図１０Ａ及び図１０Ｂ）。

【0347】

配列番号６０は、第１のリンカーペプチド（Ｎ末端リンカーペプチド）として選択された。第１のペプチドリンカー、配列番号６１を含有するＧＬＰ－１融合タンパク質は、低い発現及び精製収率を有しており、所望の量のＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹペプチドコンジュゲートを生成するためのこの実験では好ましくなかった。ＡＰ反復を含有する第１のリンカーペプチドは、第２の末端ペプチドがＧ_４Ａ反復であった場合には不十分な収率を有し（例えば、実施例２及び表８を参照）、配列番号６０と比較してインビボにおける安定性が低かった（例えば、表１３を参照）。これらの結果に基づいて、ＡＰ反復リンカーを用いた試験は、この実験では好ましくなかった。リンカーを短くした結果、効力が低下した（例えば、異なる長さの第１のリンカーペプチドを有する同じＧＬＰ－１ペプチド（配列番号５８）を含むＧＬＰ－１融合ペプチドの効力を比較する、図５の配列番号１５２、図１０Ａ～１０Ｂの配列番号１４０、及び図１２を参照）。したがって、これらの結果に基づいて、より短いリンカーを用いた試験は、この実験では好ましくなかった。キシロシル化されるセリン残基の性質に基づいて、セリン含有リンカーの使用は、この実験では好ましくなかった（例えば、表１２を参照）。

【0348】

ＧＬＰ－１変異体ペプチド、配列番号５７、第１のリンカーペプチド、配列番号６０、及びヒンジ－Ｆｃ領域ペプチド、配列番号８４を含有していたＧＬＰ－１融合ペプチド、ＧＦ１９（配列番号１３１）は、食物摂取（ＦＩ）及び体重（ＢＷ）の変化％の両方についてデュラグルチドと同等の効力を示した（例えば、それぞれ図６Ａ及び図６Ｂを参照）。

【0349】

ＧＬＰ－１融合ペプチドＧＦ１（配列番号１１３、化合物１）、ＧＦ１９（配列番号１３１）、及びＧＦ２４（配列番号１３６、化合物３）は全て、食物摂取及び体重変化％についてデュラグルチドと同等の効能を示した（例えば、それぞれ図２Ａ～２Ｂ、図６Ａ～６Ｂ、及び図３Ａ～３Ｂを参照）。ＧＦ１（配列番号１１３、化合物１）及びＧＦ２４（配列番号１３６、化合物３）も、耐糖能に対してデュラグルチドと同等の効能を示した（図４Ａ～４Ｂ及び図７Ａ～７Ｂ）。

【0350】

しかしながら、環状ＰＹＹペプチド（配列番号２７）をＧＦ１９（配列番号１３１）の第２のリンカーペプチド、配列番号９２にコンジュゲートさせることによって、ＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹペプチドコンジュゲート、配列番号２５１を作製した場合、デュラグルチドと比較して、食物摂取又は体重変化％について更なる薬理作用は存在しなかった（それぞれ図１１Ａ及び図１１Ｂ）。追加の第２のリンカーペプチドを試験したが、少なくとも以下の理由から、この実験では好ましくなかった：（ａ）配列番号９５は、第１のリンカーペプチドがＡＰ反復であったときに低い生成収率を有し、（ｂ）配列番号１００は、組み換え発現中に切断され、（ｃ）ヒンジＦｃ領域ペプチドのＣ末端にＰＹＹペプチドコンジュゲーションの標的システインを含む、第２のリンカーペプチドを有さないヒンジＦｃ領域ペプチドは、タンパク質発現中に切断され、これは、ＰＹＹペプチドコンジュゲーションしやすいインタクトなタンパク質を生成するために第２のリンカーペプチドが必要であったことを示し、（ｄ）第２のリンカーペプチドを含有するセリンは、キシロシル化される可能性を有し、（ｅ）より短い第２のリンカーペプチドは、より低い純度で、より低い効率にてコンジュゲートした。

【0351】

第２のリンカーペプチド、配列番号９４を有するＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹペプチドコンジュゲート、配列番号２２５（化合物２）は、ＦＩ及びＢＷ変化％の両方についてデュラグルチドよりも有意に高い効力を示した（例えば、それぞれ図２Ａ及び２Ｂを参照）が、それにより、驚くべきことに、高濃度液体製剤中において４℃で２週間保管している間に有意にタンパク質が失われた。第２のリンカーペプチド、配列番号９３を有する同等のＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹペプチドコンジュゲート、配列番号２２９は、４℃及び４０℃で２週間保管している間、高濃度液体製剤中で安定であり、タンパク質レベルを維持していた（表１４）。第２のリンカーペプチドが、これら２つの分子間の唯一の差異であり、したがって、配列番号９３をこの実験における第２のリンカーペプチドとして選択した。

【0352】

【表14】

【0353】

長い半減期を有する剤に必要なインビボ安定性を付与し、効力を保持しながらＧＬＰ－１融合タンパク質に連結できるようにするために、環状ＰＹＹペプチド機能活性にはいくつかの修飾が必要である。合成ペプチド化学を用いて、これらの修飾を組み込む環状ＰＹＹペプチドを作製し、当該環状ＰＹＹペプチドを、ＧＬＰ－１融合ペプチドに化学的にコンジュゲートさせて、ＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹペプチドコンジュゲートを生成した。

【0354】

環状ＰＹＹペプチドを選択してＧＬＰ－１融合ペプチドにコンジュゲートさせて、ＰＹＹペプチドの効力及び安定性の改変を調査及び比較した。ＰＹＹペプチドを環化させて、ペプチド骨格に沿ったタンパク質分解の複数の部位を安定化させた。

【0355】

環状ＰＹＹペプチドを選択して、ＧＬＰ－１融合ペプチドにコンジュゲートさせて、環状ＰＹＹペプチドのＮ末端結合からＣ末端結合までの間隔及びサイズ、並びに効力及び安定性に対する効果について調べた。これらの環状ＰＹＹペプチドは、環内の炭素数が様々であり、Ｎ末端をＣ末端に選択的に連結させるために使用したシステイン及びホモシステインの位置も異なっていた。例えば、次を参照：
ａ）ｈＣｙｓ３１に連結しているβＡ２ 配列番号２５、
ｂ）Ｃｙｓ３０に連結しているβＡ２ 配列番号２８及び２９、
ｃ）Ｃｙｓ３０に連結しているＧ２ 配列番号２７及び３０、
ｄ）ｈＣｙｓ３１に連結しているγＡｂａ２ 配列番号３４。

【0356】

３５位で置換されたＮ－Ｍｅアルギニン（Ｎ－ＭｅＲ３５）（配列番号２７、２８、３３、及び３４）及び３５位と３６位との間の還元アミド結合（ｐｓｉ３５，３６）（配列番号２４、２５、２９、及び３０）を、環状ＰＹＹペプチド中の３６位におけるアミド化されたＣ末端チロシンを安定化させ、効力を保持する能力について比較した（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１８／０１１７１７０号を参照）。特定の場合では、Ｎ－Ｍｅ３５修飾の結果、ｐｓｉ３５，３６修飾と比較して効力が低下した（例えば、米国特許公開第２０１８／０１１７１７０号）、表３を参照、これは、ｐｓｉ３５，３６修飾を有する配列番号１０２が、Ｎ－Ｍｅ３５修飾を有する配列番号１２２よりもヒトＹ２受容体に対して約１２倍強力であったことを示す）。

【0357】

予想外なことに、環状ＰＹＹペプチド、配列番号２７を含有する、ＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹペプチドコンジュゲート、配列番号２２９におけるＮ－ＭｅＲ３５修飾の効力は、環状ＰＹＹペプチド、配列番号３０を含有する配列番号２３２のｐｓｉ３５，３６修飾と比較して同等以上であった（表１１）。

【0358】

構成要素の組み合わせによって商品コストが下がり、試薬の調達が容易になったと判定されたことに加えて、効力及び安定性に基づいて、環状ＰＹＹペプチド、配列番号２７をこの実験におけるＰＹＹペプチドとして選択した。Ｃ末端付近の３０位でシステインに連結しているＮ末端における天然アミノ酸グリシンは、環状ＰＹＹペプチドをＧＬＰ－１融合ペプチドとコンジュゲートさせたときに試験した任意の環状ＰＹＹペプチドについて達成された最高レベルの効力及び安定性と同等の効力及び安定性を有していた。環状ＰＹＹペプチド配列番号２７が十分な効力及び安定性を有していたので、３１位のホモシステインよりも３０位のシステインを選択した。したがって、より高価でありあまり容易に入手することができない非天然アミノ酸は、この実験では必要なかった。３６位におけるＣ末端アミド化チロシンを安定化させるために使用したＮ－ＭｅＲ３５は、費用がかかるｐｓｉ３５，３６修飾よりも安価でありより容易に入手可能な試薬である。これは、特別な構成要素の必要性を排除し、同じ安定性及び効力を提供する。

【0359】

加えて、ＰＥＧスペーサーは効力に必要ではなく、また、予想外なことに、ＰＥＧスペーサーはインビボにおけるＰＹＹ安定性にも必要ではなかったと判定された。ＰＥＧスペーサーを有するｍＡｂ－環状ＰＹＹペプチドコンジュゲートは、インビボ安定性を増大させたと判定されていたので、これは予想外であった（例えば、米国特許出願公開第２０１８／０１１７１７０号、表４を参照、これは、投与４８時間後に採取したマウス由来の血液サンプル中の全ヒトｍＡｂレベルの量に対するインタクトな化合物の残存率を示す。１２×ＰＥＧスペーサを含有する化合物１は、４８時間で９０．８％残存しており、６×ＰＥＧスペーサを含有する化合物２は、４８時間で６５．６％残存しており、ＰＥＧスペーサーを有さない化合物３は、４８時間で５１％しか残存していなかった）。この結果、商品の製造コストを増加させるであろうＰＥＧ構成要素の必要性が排除された。

【0360】

２つの安定な環状ＰＹＹペプチド配列番号２７が付加されたＧＬＰ－１融合ペプチド配列番号１３６を含有していた配列番号２２９を、この実験におけるＧＬＰ－１融合ペプチド共役環状ＰＹＹペプチドコンジュゲートとして選択した。配列番号２２９は、ＦＩ及びＢＷの両方について、配列番号１３６（ＧＬＰ１Ｒのみ会合）に比べてＹ２Ｒ会合から更なる薬力学的効能を示し（図３Ａ～３Ｂ）、それと共に、耐糖能に対してはデュラグルチド及び配列番号１３６と同等のＧＬＰ１Ｒの効力を示した（図４Ａ～４Ｂ及び７Ａ～７Ｂ）。

【0361】

ＦＩ及びＢＷに対するデュラグルチド及び配列番号２２９（化合物４）の効果をＤＩＯマウスで比較した。利用可能な試験の積分曝露応答非線形回帰分析に基づいて（化合物４についての６つの試験及びデュラグルチドについての７つの試験；用量０．０３～１．０ｎｍｏｌ／ｋｇ）、３日目に臨床的に関連する活性ＧＬＰ－１（ＨＧＥ）曝露をもたらす用量（０．３ｎｍｏｌ／ｋｇを単回皮下投与）で、化合物４は、活性を同じにしたＧＧＬＰ１（ＨＧＥ）曝露でのＦＩ及びＢＷの低下において（図８Ａ～８Ｂ）、コンジュゲートの環状ＰＹＹペプチドによるＹ２Ｒ会合を介して、デュラグルチドに対して更なる薬理作用を示した。０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ（単回ＳＣ投与）のデュラグルチドの同じＨＧＥ濃度では、化合物４（配列番号２２９）による曝露応答非線形回帰に基づいて、計算されたＦＩ及びＢＷ変化％は、それぞれ、デュラグルチドよりも約２．１及び１．５倍大きかった。

【0362】

過体重カニクイザルにおいて、個々のＰＫ及びカロリー摂取ベースの曝露応答分析（図９Ａ～９Ｂ）は、臨床的に関連するデュラグルチド曝露（Ｔ２ＤＭ患者における１．５ｍｇのＱＷ ＳＣ投与後に定常状態のＣ_{ｔｒｏｕｇｈ}及びＣ_ｍａｘを包囲する１～２ｎＭ）［Ｇｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ ５５（５）：（２０１６）］）において、化合物４は、活性を同じにしたＧＬＰ－１曝露でデュラグルチドと比較して約１．７倍～２倍（９５％信頼区間：１．３～３．３、リガンド結合アッセイ［ＬＢＡ］に基づくＰＫ、図９Ａ）又は約１．５～１．６倍（９５％信頼区間：１．０～２．８、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ ＨＥに基づくＰＫ、図９Ｂ）大きくカロリー摂取率が低下することを示唆し、これは、化合物４の環状ＰＹＹペプチドからの更なる薬理作用を実証するものであった。

【0363】

当業者は、広い発明概念から逸脱することなく前述の実施形態に変更を行うことができることを理解するであろう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に制限されず、本説明によって定義されるように本発明の趣旨及び範囲内の修正を包含することを意図するものと理解される。

【0364】

引用した全ての文献は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0365】

本発明の例示的なＧＬＰ－１融合環状ＰＹＹペプチドコンジュゲートとしては、以下が挙げられる：

【0366】

配列番号２２５
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（Ｇ２－ＣＯＣＨ_２－Ｃ３０），Ｋ（Ａｃ）１１，Ｎ－Ｍｅ－Ｒ３５］－ＰＹＹ２－３６ホモ二量体コンジュゲート
構造：

【0367】

【化46】

【0368】

配列番号２２６
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（βＡ２－ＣＯＣＨ_２－Ｃ３０），Ｋ（Ａｃ）１１，Ｎ－Ｍｅ－Ｒ３５］－ＰＹＹ２－３６ホモ二量体コンジュゲート
構造：

【0369】

【化47】

【0370】

配列番号２２７
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（βＡ２－ＣＯＣＨ_２－Ｃ３０），Ｋ（Ａｃ）１１，ｐｓｉ－（Ｒ３５，Ｙ３６）］－ＰＹＹ２－３６ホモ二量体コンジュゲート
構造：

【0371】

【化48】

【0372】

配列番号２２８
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（Ｇ２－ＣＯＣＨ_２－Ｃ３０），Ｋ（Ａｃ）１１，ｐｓｉ－（Ｒ３５，Ｙ３６）］－ＰＹＹ２－３６ホモ二量体コンジュゲート
構造：

【0373】

【化49】

【0374】

配列番号２２９
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（Ｇ２－ＣＯＣＨ_２－Ｃ３０），Ｋ（Ａｃ）１１，Ｎ－Ｍｅ－Ｒ３５］－ＰＹＹ２－３６ホモ二量体コンジュゲート
構造：

【0375】

【化50】

【0376】

配列番号２３０
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（βＡ２－ＣＯＣＨ_２－Ｃ３０），Ｋ（Ａｃ）１１，Ｎ－Ｍｅ－Ｒ３５］－ＰＹＹ２－３６ホモ二量体コンジュゲート
構造：

【0377】

【化51】

【0378】

配列番号２３１
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（βＡ２－ＣＯＣＨ_２－Ｃ３０），Ｋ（Ａｃ）１１，ｐｓｉ－（Ｒ３５，Ｙ３６）］－ＰＹＹ２－３６ホモ二量体コンジュゲート
構造：

【0379】

【化52】

【0380】

配列番号２３２
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（Ｇ２－ＣＯＣＨ_２－Ｃ３０），Ｋ（Ａｃ）１１，ｐｓｉ－（Ｒ３５，Ｙ３６）］－ＰＹＹ２－３６ホモ二量体コンジュゲート
構造：

【0381】

【化53】

【0382】

配列番号２３３
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（Ｇ２－ＣＯＣＨ_２－Ｃ３０），Ｋ（Ａｃ）１１，Ｎ－Ｍｅ－Ｒ３５］－ＰＹＹ２－３６ホモ二量体コンジュゲート
構造：

【0383】

【化54】

【0384】

配列番号２３４
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（Ｇ２－ＣＯＣＨ_２－Ｃ３０），Ｋ（Ａｃ）１１，Ｎ－Ｍｅ－Ｒ３５］－ＰＹＹ２－３６ホモ二量体コンジュゲート
構造：

【0385】

【化55】

【0386】

配列番号２３５
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（Ｇ２－ＣＯＣＨ_２－Ｃ３０），Ｋ（Ａｃ）１１，Ｎ－Ｍｅ－Ｒ３５］－ＰＹＹ２－３６ホモ二量体コンジュゲート
構造：

【0387】

【化56】

【0388】

配列番号２３６
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（Ｇ２－ＣＯＣＨ_２－Ｃ３０），Ｋ（Ａｃ）１１，Ｎ－Ｍｅ－Ｒ３５］－ＰＹＹ２－３６ホモ二量体コンジュゲート
構造：

【0389】

【化57】

【0390】

配列番号２３７
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（Ｇ２－ＣＯＣＨ_２－Ｃ３０），Ｋ（Ａｃ）１１，Ｎ－Ｍｅ－Ｒ３５］－ＰＹＹ２－３６ホモ二量体コンジュゲート
構造：

【0391】

【化58】

【0392】

配列番号２３８
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（Ｇ２－ＣＯＣＨ_２－Ｃ３０），Ｋ（Ａｃ）１１，Ｎ－Ｍｅ－Ｒ３５］－ＰＹＹ２－３６ホモ二量体コンジュゲート
構造：

【0393】

【化59】

【0394】

配列番号２３９
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（Ｇ２－ＣＯＣＨ_２－Ｃ３０），Ｋ（Ａｃ）１１，Ｎ－Ｍｅ－Ｒ３５］－ＰＹＹ２－３６ホモ二量体コンジュゲート
構造：

【0395】

【化60】

【0396】

配列番号２４０
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（Ｇ２－ＣＯＣＨ_２－Ｃ３０），Ｋ（Ａｃ）１１，Ｎ－Ｍｅ－Ｒ３５］－ＰＹＹ２－３６ホモ二量体コンジュゲート
構造：

【0397】

【化61】

【0398】

配列番号２４１
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（Ｇ２－ＣＯＣＨ_２－Ｃ３０），Ｋ（Ａｃ）１１，Ｎ－Ｍｅ－Ｒ３５］－ＰＹＹ２－３６ホモ二量体コンジュゲート
構造：

【0399】

【化62】

【0400】

配列番号２４２
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（Ｇ２－ＣＯＣＨ_２－Ｃ３０），Ｋ（Ａｃ）１１，Ｎ－Ｍｅ－Ｒ３５］－ＰＹＹ２－３６ホモ二量体コンジュゲート
構造：

【0401】

【化63】

【0402】

配列番号２４３
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（Ｇ２－ＣＯＣＨ_２－Ｃ３０），Ｋ（Ａｃ）１１，Ｎ－Ｍｅ－Ｒ３５］－ＰＹＹ２－３６ホモ二量体コンジュゲート
構造：

【0403】

【化64】

【0404】

配列番号２４４
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（Ｇ２－ＣＯＣＨ_２－ｈＣ３１），Ｋ（ＰＥＧ２４Ａｃ）１１，Ｎ－Ｍｅ－Ｒ３５］－ＰＹＹ２－３６ホモ二量体コンジュゲート
構造：

【0405】

【化65】

【0406】

配列番号２４５
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（Ｇ２－ＣＯＣＨ_２－Ｃ３０），Ｋ（Ａｃ）１１，Ｎ－Ｍｅ－Ｒ３５］－ＰＹＹ２－３６ホモ二量体コンジュゲート
構造：

【0407】

【化66】

【0408】

配列番号２４６
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（Ｇ２－ＣＯＣＨ_２－Ｃ３０），Ｋ（Ａｃ）１１，Ｎ－Ｍｅ－Ｒ３５］－ＰＹＹ２－３６ホモ二量体コンジュゲート
構造：

【0409】

【化67】

【0410】

配列番号２４７
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（Ｇ２－ＣＯＣＨ_２－Ｃ３０），Ｋ（Ａｃ）１１，Ｎ－Ｍｅ－Ｒ３５］－ＰＹＹ２－３６ホモ二量体コンジュゲート
構造：

【0411】

【化68】

【0412】

配列番号２４８
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（Ｇ２－ＣＯＣＨ_２－Ｃ３０），Ｋ（Ａｃ）１１，Ｎ－Ｍｅ－Ｒ３５］－ＰＹＹ２－３６ホモ二量体コンジュゲート
構造：

【0413】

【化69】

【0414】

配列番号２４９
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（Ｇ２－Ｅ３０），Ｓ４，Ｋ（Ａｃ）１１，Ｎ－Ｍｅ－Ｒ３５］－ＰＹＹ２－３６ホモ二量体コンジュゲート
構造：

【0415】

【化70】

【0416】

配列番号２５０
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（Ｇ２－Ｅ３０），Ｓ４，Ｋ（Ａｃ）１１，ｐｓｉ－（Ｒ３５，Ｙ３６）］－ＰＹＹ２－３６ホモ二量体コンジュゲート
構造：

【0417】

【化71】

【0418】

配列番号２５１
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（Ｇ２－ＣＯＣＨ_２－Ｃ３０），Ｋ（Ａｃ）１１，Ｎ－Ｍｅ－Ｒ３５］－ＰＹＹ２－３６ホモ二量体コンジュゲート
構造：

【0419】

【化72】

【0420】

配列番号２５２
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（Ｇ２－ＣＯＣＨ_２－Ｃ３０），Ｋ（Ａｃ）１１，Ｎ－Ｍｅ－Ｒ３５］－ＰＹＹ２－３６ホモ二量体コンジュゲート
構造：

【0421】

【化73】

【0422】

配列番号２５３
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（ｇＡｂａ２－ＣＯＣＨ_２－ｈＣ３０），Ｋ（Ａｃ）１１，Ｎ－Ｍｅ－Ｒ３５］－ＰＹＹ２－３６ホモ二量体コンジュゲート
構造：

【0423】

【化74】

【0424】

配列番号２５４
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（Ｇ２－ＣＯＣＨ_２－Ｃ３０），Ｋ（Ａｃ）１１，Ｎ－Ｍｅ－Ｒ３５］－ＰＹＹ２－３６ホモ二量体コンジュゲート
構造：

【0425】

【化75】

【0426】

配列番号２５５
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（Ｇ２－ＣＯＣＨ_２－Ｃ３０），Ｋ（Ａｃ）１１，Ｎ－Ｍｅ－Ｒ３５］－ＰＹＹ２－３６ホモ二量体コンジュゲート
構造：

【0427】

【化76】

【0428】

配列番号２５６
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（Ｇ２－ＣＯＣＨ_２－Ｃ３０），Ｋ（Ａｃ）１１，Ｎ－Ｍｅ－Ｒ３５］－ＰＹＹ２－３６ホモ二量体コンジュゲート
構造：

【0429】

【化77】

【0430】

配列番号２５７
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（Ｇ２－ＣＯＣＨ_２－Ｃ３０），Ｋ（Ａｃ）１１，Ｎ－Ｍｅ－Ｒ３５］－ＰＹＹ２－３６ホモ二量体コンジュゲート
構造：

【0431】

【化78】

【0432】

配列番号２５８
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（βＡ２－ＣＯＣＨ_２－Ｃ３０），Ｋ（Ａｃ）１１，Ｎ－Ｍｅ－Ｒ３５］－ＰＹＹ２－３６ホモ二量体コンジュゲート
構造：

【0433】

【化79】

【0434】

配列番号２５９
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（βＡ２－ＣＯＣＨ_２－Ｃ３０），Ｋ（Ａｃ）１１，ｐｓｉ－（Ｒ３５，Ｙ３６）］－ＰＹＹ２－３６ホモ二量体コンジュゲート
構造：

【0435】

【化80】

【0436】

配列番号２６０
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（βＡ２－ＣＯＣＨ_２－Ｃ３０），Ｋ（Ａｃ）１１，Ｎ－Ｍｅ－Ｒ３５］－ＰＹＹ２－３６ホモ二量体コンジュゲート
構造：

【0437】

【化81】

【0438】

配列番号２６１
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（Ｇ２－ＣＯＣＨ_２－Ｃ３０），Ｋ（Ａｃ）１１，Ｎ－Ｍｅ－Ｒ３５］－ＰＹＹ２－３６単量体コンジュゲート
構造：

【0439】

【化82】

【0440】

配列番号２６２
名称：ＧＬＰ－１融合体－［シクロ－（Ｇ２－ＣＯＣＨ_２－Ｃ３０），Ｋ（Ａｃ）１１，Ｎ－Ｍｅ－Ｒ３５］－ＰＹＹ２－３６ホモ二量体コンジュゲート
構造：

【0441】

【化83】

以下の態様を包含し得る。
［１］ 環状ＰＹＹペプチドに結合したグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）融合ペプチドを含むコンジュゲートであって、前記ＧＬＰ－１融合ペプチドが、ＧＬＰ－１ペプチド、第１のリンカーペプチド、ヒンジ－Ｆｃ領域ペプチド、及び第２のリンカーペプチドを含み、前記第１のリンカーが、任意選択で欠損している、コンジュゲート。
［２］ 前記環状ＰＹＹペプチドが、式Ｉによって表されるか、又はその誘導体若しくは薬学的に許容される塩であり、

【化84-1】

式中、
ｐは、０又は１であり、
ｍは、０、１、２、３、４、又は５であり、
ｎは、１、２、３、又は４であり、
ｑは、０又は１であり（但し、ｑは、Ｚ _３０ が存在しない場合にのみ１である）、
ＢＲＩＤＧＥは、－Ｐｈ－ＣＨ _２ －Ｓ－、－トリアゾリル－、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ _２ Ｓ－、－ＳＣＨ _２ Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、
－（ＯＣＨ _２ ＣＨ _２ ） _２ ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ _２ Ｓ、－ＮＨＣ（Ｏ）－、又は－ＣＨ _２ Ｓ－であり、
Ｚ _４ は、Ｋ、Ａ、Ｅ、Ｓ、又はＲであり、
Ｚ _７ は、Ａ又はＫであり、
Ｚ _９ は、Ｇ又はＫであり、
Ｚ _１１ は、Ｄ又はＫであり、
Ｚ _２２ は、Ａ又はＫであり、
Ｚ _２３ は、Ｓ又はＫであり、
Ｚ _２６ は、Ａ又はＨであり、
Ｚ _３０ は、Ｌ、Ｗであるか、又は存在せず、
（但し、Ｚ _３０ は、ｑが１である場合にのみ存在しない）、
Ｚ _３４ は、

【化84-2】

であり、
Ｚ _３５ は、

【化84-3】

であり、
前記誘導体が、アミド化、アシル化、及びＰＥＧ化からなる群から選択される１つ又は２つ以上のプロセスによって修飾された式Ｉの化合物である、上記［１］に記載のコンジュゲート。
［３］ 前記環状ＰＹＹペプチドが、式Ｉによって表されるか、又はその誘導体若しくは薬学的に許容される塩であり、
式中、
ｐは、０又は１であり、
ｍは、０、１、２、３、４、又は５であり、
ｎは、１、２、３、又は４であり、
ｑは、０又は１であり（但し、ｑは、Ｚ _３０ が存在しない場合にのみ１である）、
ＢＲＩＤＧＥは、－Ｐｈ－ＣＨ _２ －Ｓ－、－トリアゾリル－、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ _２ Ｓ－、－ＳＣＨ _２ Ｃ（Ｏ）ＮＨ _２ －、－（ＯＣＨ _２ ＣＨ _２ ） _２ ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ _２ Ｓ、－ＮＨＣ（Ｏ）－、又は－ＣＨ _２ Ｓ－であり、
Ｚ _４ は、Ｋ、Ａ、Ｅ、Ｓ、又はＲであり、
Ｚ _７ は、Ａ又はＫであり、前記Ｋのアミノ側鎖は、任意選択で、

【化84-4】

（式中、ｉは、０～２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである）、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ _２ Ｂｒ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ _２ Ｉ、又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ _２ Ｃｌで置換され、
Ｚ _９ は、Ｇ又はＫであり、前記Ｋのアミノ側鎖は、任意選択で、

【化84-5】

（式中、ｉは、０～２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである）、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ _２ Ｂｒ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ _２ Ｉ、又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ _２ Ｃｌで置換され、
Ｚ _１１ は、Ｄ又はＫであり、前記Ｋのアミノ側鎖は、任意選択で、

【化84-6】

（式中、ｉは、０～２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである）、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ _２ Ｂｒ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ _２ Ｉ、又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ _２ Ｃｌで置換され、
Ｚ _２２ は、Ａ又はＫであり、前記Ｋのアミノ側鎖は、任意選択で、

【化84-7】

（式中、ｉは、０～２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである）、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ _２ Ｂｒ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ _２ Ｉ、又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ _２ Ｃｌで置換され、
Ｚ _２３ は、Ｓ又はＫであり、前記Ｋのアミノ側鎖は、任意選択で、

【化84-8】

（式中、ｉは、０～２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである）、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ _２ Ｂｒ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ _２ Ｉ、又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ _２ Ｃｌで置換され、
Ｚ _２６ は、Ａ又はＨであり、
Ｚ _３０ は、Ｌであり、
Ｚ _３４ は、

【化84-9】

であり、
Ｚ _３５ は、

【化84-10】

である、上記［２］に記載のコンジュゲート。
［４］ 前記環状ＰＹＹペプチドが、式Ｉによって表されるか、又はその誘導体若しくは薬学的に許容される塩であり、
式中、
ｐは、０又は１であり、
ｍは、０、１、２、３、又は５であり、
ｎは、１、２、又は４であり、
ｑは、０又は１であり（但し、ｑは、Ｚ _３０ が不在の場合にのみ１であり得る）、
ＢＲＩＤＧＥは、－Ｐｈ－ＣＨ _２ －Ｓ－、－トリアゾリル－、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ _２ Ｓ－、－（ＯＣＨ _２ ＣＨ _２ ） _２ ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ _２ Ｓ、－ＮＨＣ（Ｏ）－、又は－ＣＨ _２ Ｓ－であり、
Ｚ _４ は、Ｋ、Ａ、Ｅ、Ｓ、又はＲであり、
Ｚ _７ は、Ａ又はＫであり、前記Ｋのアミノ側鎖は、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ _２ Ｂｒで置換されており、
Ｚ _９ は、Ｇ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ _２ Ｂｒで置換されており、
Ｚ _１１ は、Ｄ又はＫであり、前記Ｋのアミノ側鎖は、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ _２ Ｂｒで置換されており、
Ｚ _２２ は、Ａ又はＫであり、前記Ｋのアミノ側鎖は、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ _２ Ｂｒで置換されており、
Ｚ _２３ は、Ｓ又はＫであり、前記Ｋのアミノ側鎖は、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ _２ Ｂｒで置換されており、
Ｚ _２６ は、Ａ又はＨであり、
Ｚ _３０ は、Ｌであり、
Ｚ _３４ は、

【化84-11】

であり、
Ｚ _３５ は、

【化84-12】

である、上記［２］に記載のコンジュゲート。
［５］ 前記環状ＰＹＹペプチドが、配列番号１～５４からなる群から選択されるか、又はその薬学的に許容される塩である、上記［２］に記載のコンジュゲート。
［６］ 前記環状ＰＹＹペプチドが、配列番号２４、２５、２７、２８、２９、３０、３３、若しくは３４から選択されるか、又はその薬学的に許容される塩である、上記［５］に記載のコンジュゲート。
［７］ 前記ＧＬＰ－１融合ペプチドが、前記環状ＰＹＹペプチドのリシン残基において前記環状ＰＹＹペプチドに共有結合で連結している、上記［１］～［６］のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
［８］ 式Ｉ中のＺ _７ 、Ｚ _９ 、Ｚ _１１ 、Ｚ _２２ 、及びＺ _２３ のうちの１つだけがリシンであり、前記リシンが、前記ＧＬＰ－１融合ペプチドの前記第２のリンカーペプチドにおけるシステイン残基に共有結合で連結している、上記［７］に記載のコンジュゲート。
［９］ 式Ｉ中のＺ _１１ がリシンである、上記［８］に記載のコンジュゲート。
［１０］ 前記ＧＬＰ－１ペプチドが、配列番号５６～５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記［１］～［９］のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
［１１］ 前記第１のリンカーペプチドが、存在し、かつ配列番号６０～８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記［１］～［１０］のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
［１２］ 前記ヒンジ－Ｆｃ領域ペプチドが、配列番号８４～９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記［１］～［１１］のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
［１３］ 前記第２のリンカーペプチドが、配列番号９３～１１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記［１］～［１２］のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
［１４］ 前記第２のリンカーペプチドが、配列番号９３、９４、９５、１０６又は１１１のアミノ酸配列を含む、上記［１］～［１２］のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
［１５］ 環状ＰＹＹペプチドに共役しているグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）融合ペプチドを含むコンジュゲートであって、前記ＧＬＰ－１融合ペプチドが、配列番号１１３～２２４及び２６７～２７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記環状ＰＹＹペプチドが、配列番号２４、２５、２７、２８、２９、３０、３３、若しくは３４から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はその薬学的に許容される塩である、コンジュゲート。
［１６］ 前記ＧＬＰ－１融合ペプチドのアミノ酸残基２８７～２８９の間のシステイン残基、好ましくはシステイン残基２８８が、化学リンカーを介して、前記環状ＰＹＹペプチドの残基７、９、１１、２２、又は２３におけるリシン残基、好ましくは前記環状ＰＹＹペプチドのリシン残基１１と共有結合で連結している、上記［１５］に記載のコンジュゲート。
［１７］ 環状ＰＹＹペプチドに共役しているグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）融合ペプチドを含むコンジュゲートであって、配列番号２２５～２６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はその薬学的に許容される塩である、コンジュゲート。
［１８］ 前記環状ＰＹＹペプチドの側鎖、好ましくは前記環状ＰＹＹペプチドのリシン残基の側鎖に導入された求電子剤、好ましくはブロモアセトアミド又はマレイミドを、前記ＧＬＰ－１融合ペプチドの前記第２のリンカーペプチドのシステイン残基のスルフヒドリル基と反応させ、それにより、前記環状ＰＹＹペプチドと前記ＧＬＰ－１融合ペプチドとの間に共有結合性連結を生じさせることを含む、上記［１］～［１７］のいずれか一項に記載のコンジュゲートを生成する方法。
［１９］ 前記ＧＬＰ－１融合ペプチドの前記第２のリンカーペプチドの前記システイン残基が、前記ＧＬＰ－１融合ペプチドを過剰なアザホスフィン還元剤と接触させることによって還元され、前記還元されたシステイン残基が前記求電子剤と反応する、上記［１８］に記載の方法。
［２０］ 前記アザホスフィン還元剤が、１，３，５－トリアザ－７－ホスファトリシクロ［３．３．１．１］デカン（ＰＴＡ）又はその誘導体である、上記［１９］に記載の方法。
［２１］ 上記［１］～［１７］のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
［２２］ それを必要としている対象における疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、前記疾患又は障害が、肥満、Ｉ型又はＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、耐糖能異常、高血糖症、高インスリン血症、高トリグリセリド血症、先天性高インスリン症（ＣＨＩ）による低血糖、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性腎症、並びに管理されていないコレステロール及び／若しくは脂質レベルに関連する高血圧及び心血管危険因子などの他の心血管危険因子、骨粗鬆症、炎症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、腎疾患、並びに／又は湿疹であり、前記方法が、前記それを必要としている対象に有効量の上記［２１］に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
［２３］ それを必要としている対象における食物摂取又は体重のうちの少なくとも１つを減少させる方法であって、前記それを必要としている対象に有効量の上記［２１］に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
［２４］ それを必要としている対象におけるＹ２受容体活性及び／又はＧＬＰ－１受容体活性を調節する方法であって、前記それを必要としている対象に有効量の上記［２１］に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
［２５］ 前記医薬組成物が、注射により投与される、上記［２２］～［２４］のいずれか一項に記載の方法。
［２６］ 上記［１］～［１７］のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含むキットであって、好ましくは、注射用デバイスを更に含む、キット。
［２７］ 上記［１］～［１７］のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む医薬組成物を生成する方法であって、前記コンジュゲートを薬学的に許容される担体と組み合わせて前記医薬組成物を得ることを含む、方法。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図12】

【配列表】

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