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特許7677690ＦＡＭ１６７Ａを含むＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性チロシンキナーゼ阻害剤耐性を診断するためのバイオマーカーおよびＦＡＭ１６７Ａをターゲットとする慢性骨髄性白血病の予防または治療用組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-05-07
(45)【発行日】2025-05-15
(54)【発明の名称】ＦＡＭ１６７Ａを含むＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性チロシンキナーゼ阻害剤耐性を診断するためのバイオマーカーおよびＦＡＭ１６７Ａをターゲットとする慢性骨髄性白血病の予防または治療用組成物
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20250508BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20250508BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68
A61K39/395 D
A61K39/395 N
【請求項の数】
19
(21)【出願番号】P 2024552483
(86)(22)【出願日】2023-03-03
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2025-04-11
(86)【国際出願番号】 KR2023002947
(87)【国際公開番号】W WO2023167544
(87)【国際公開日】2023-09-07
【審査請求日】2025-01-09
(31)【優先権主張番号】10-2022-0027709
(32)【優先日】2022-03-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】521081975
【氏名又は名称】ソウル ナショナル ユニヴァーシティ アール アンド ディービー ファウンデーション
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】パク，ソンギュ
(72)【発明者】
【氏名】ヤン，テウ
【審査官】大瀧 真理
(56)【参考文献】
【文献】韓国公開特許第１０－２０１８－０１０９８１１（ＫＲ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１１２４８１３７６（ＣＮ，Ａ）
【文献】韓国公開特許第１０－２０１９－０１４２７４６（ＫＲ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００６／０１４７９１１（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特開２０１８－１３０１１３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１５－５２６５２０（ＪＰ，Ａ）
【文献】YANG, T. et al.，FAM167A is a key molecule to induce BCR-ABL-independent TKI resistance in CML via noncanonical NF-κB signaling activation，Journal of Experimental ＆ Clincal Cancer Research，2022年，Vol.41, No.82，DOI: 10.1186/s13046-022-02298-1
【文献】ITO, Ikue et al.，Association of the FAM167A-BLK Region With Systemic Sclerosis，ARTHRITIS & RHEUMATISM，2010年，Vol.62, No.3，pp. 890-895，DOI: 10.1002/art.27303
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／６８
Ａ６１Ｋ ３９／３９５
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＦＡＭ１６７Ａタンパク質またはこれをコード化する遺伝子を含む、慢性骨髄性白血病患者においてＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）またはニロチニブ（ｎｉｌｏｔｉｎｉｂ）耐性を診断するためのバイオマーカー組成物。
【請求項2】
ＦＡＭ１６７Ａタンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを測定する製剤を含む、慢性骨髄性白血病患者においてＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）またはニロチニブ（ｎｉｌｏｔｉｎｉｂ）耐性を診断するための組成物。
【請求項3】
前記ＦＡＭ１６７Ａタンパク質またはその断片の発現レベルを測定する製剤は、前記ＦＡＭ１６７Ａタンパク質またはその断片に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片、またはアプタマーを含む、請求項２に記載の慢性骨髄性白血病患者においてＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性イマチニブまたはニロチニブ耐性を診断するための組成物。
【請求項4】
前記ＦＡＭ１６７Ａタンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定する製剤は、前記遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合するセンスおよびアンチセンスプライマーまたはプローブを含む、請求項２に記載の慢性骨髄性白血病患者においてＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性イマチニブまたはニロチニブ耐性を診断するための組成物。
【請求項5】
請求項２に記載の組成物を含む、慢性骨髄性白血病患者のＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）またはニロチニブ（ｎｉｌｏｔｉｎｉｂ）耐性診断用キット。
【請求項6】
前記キットは、ＲＴ－ＰＣＲキット、競合的ＲＴ－ＰＣＲキット、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲキット、ＤＮＡチップキット、マイクロアレイキット、ＳＡＧＥ（Ｓｅｒｉａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）キット、遺伝子チップキット、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）キット、タンパク質チップキット、ラピッド（ｒａｐｉｄ）キットまたはＭＲＭ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）キットである、請求項５に記載の慢性骨髄性白血病患者のＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性イマチニブまたはニロチニブ耐性診断用キット。
【請求項7】
（ａ）慢性骨髄性白血病患者から分離した生物学的試料でＦＡＭ１６７Ａタンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを測定する段階；および（ｂ）前記（ａ）段階で測定された発現レベルを、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）またはニロチニブ（ｎｉｌｏｔｉｎｉｂ）耐性がない慢性骨髄性白血病患者から分離した生物学的試料で測定された同じタンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルと比較する段階；
を含む、慢性骨髄性白血病患者のＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性イマチニブまたはニロチニブ耐性を診断するための情報提供方法。
【請求項8】
（ｃ）前記（ａ）段階の慢性骨髄性白血病患者から分離した生物学的試料で測定されたＦＡＭ１６７Ａタンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルが、前記（ｂ）段階のＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性イマチニブまたはニロチニブ耐性がない慢性骨髄性白血病患者から分離した生物学的試料で測定された同じタンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルより高い場合、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性イマチニブまたはニロチニブ耐性を示すと判断する段階をさらに含む、請求項７に記載の慢性骨髄性白血病患者のＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性イマチニブまたはニロチニブ耐性を診断するための情報提供方法。
【請求項9】
前記生物学的試料は、血液、血漿、血清、尿、粘液、唾液、涙、喀痰、脊髄液、胸水、乳頭吸引液、リンパ液、気道液、腸液、泌尿生殖器液、母乳、リンパ系体液、精液、脳脊髄液、気管系内体液、腹水、嚢胞性腫瘍体液、羊水液またはこれらの組み合わせを含む、請求項７に記載の慢性骨髄性白血病患者のＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性イマチニブまたはニロチニブ耐性を診断するための情報提供方法。
【請求項10】
ＦＡＭ１６７Ａタンパク質に特異的に結合する中和抗体を有効成分として含む、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）またはニロチニブ（ｎｉｌｏｔｉｎｉｂ）耐性を示す慢性骨髄性白血病の予防または治療用医薬組成物。
【請求項11】
前記ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性イマチニブまたはニロチニブ耐性を示す慢性骨髄性白血病は、イマチニブまたはニロチニブ感受性を示す白血病に比べてＮＦ－κＢ活性が増加したものである、請求項１０に記載のＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性イマチニブまたはニロチニブ耐性を示す慢性骨髄性白血病の予防または治療用医薬組成物。
【請求項12】
チロシンキナーゼ阻害剤（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＴＫＩ）と併用投与されるものである、請求項１０に記載のＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性イマチニブまたはニロチニブ耐性を示す慢性骨髄性白血病の予防または治療用医薬組成物。
【請求項13】
前記ＴＫＩは、クリゾチニブ（ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ）、セリチニブ（ｃｅｒｉｔｉｎｉｂ）、アレクチニブ（ａｌｅｃｔｉｎｉｂ）、ブリグチニブ（ｂｒｉｇａｔｉｎｉｂ）、ボスチニブ（ｂｏｓｕｔｉｎｉｂ）、ダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）、イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）、ニロチニブ（ｎｉｌｏｔｉｎｉｂ）、ポナチニブ（ｐｏｎａｔｉｎｉｂ）、イブルチニブ（ｉｂｒｕｔｉｎｉｂ）、カボザンチニブ（ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ）、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、ラパチニブ（ｌａｐａｔｉｎｉｂ）、バンデタニブ（ｖａｎｄｅｔａｎｉｂ）、アファチニブ（ａｆａｔｉｎｉｂ）、オシメルチニブ（ｏｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂ）、ルキソリチニブ（ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂ）、トファシチニブ（ｔｏｆａｃｉｔｉｎｉｂ）、アキシチニブ（ａｘｉｔｉｎｉｂ）、レンバチニブ（ｌｅｎｖａｔｉｎｉｂ）、ニンテダニブ（ｎｉｎｔｅｄａｎｉｂ）、パゾパニブ（ｐａｚｏｐａｎｉｂ）、レゴラフェニブ（ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ）、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）またはスニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）を含む、請求項１２に記載のＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性イマチニブまたはニロチニブ耐性を示す慢性骨髄性白血病の予防または治療用医薬組成物。
【請求項14】
ＦＡＭ１６７Ａタンパク質に特異的に結合する中和抗体を有効成分として含む、慢性骨髄性白血病患者のＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）またはニロチニブ（ｎｉｌｏｔｉｎｉｂ）耐性阻害用医薬組成物。
【請求項15】
前記ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性イマチニブまたはニロチニブ耐性を示す慢性骨髄性白血病は、イマチニブまたはニロチニブ感受性を示す白血病に比べてＮＦ－κＢ活性が増加したものである、請求項１４に記載の慢性骨髄性白血病患者のＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性イマチニブまたはニロチニブ耐性阻害用医薬組成物。
【請求項16】
チロシンキナーゼ阻害剤（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＴＫＩ）と併用投与されるものである、請求項１４に記載の慢性骨髄性白血病患者のＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性イマチニブまたはニロチニブ耐性阻害用医薬組成物。
【請求項17】
前記ＴＫＩは、クリゾチニブ（ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ）、セリチニブ（ｃｅｒｉｔｉｎｉｂ）、アレクチニブ（ａｌｅｃｔｉｎｉｂ）、ブリグチニブ（ｂｒｉｇａｔｉｎｉｂ）、ボスチニブ（ｂｏｓｕｔｉｎｉｂ）、ダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）、イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）、ニロチニブ（ｎｉｌｏｔｉｎｉｂ）、ポナチニブ（ｐｏｎａｔｉｎｉｂ）、イブルチニブ（ｉｂｒｕｔｉｎｉｂ）、カボザンチニブ（ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ）、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、ラパチニブ（ｌａｐａｔｉｎｉｂ）、バンデタニブ（ｖａｎｄｅｔａｎｉｂ）、アファチニブ（ａｆａｔｉｎｉｂ）、オシメルチニブ（ｏｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂ）、ルキソリチニブ（ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂ）、トファシチニブ（ｔｏｆａｃｉｔｉｎｉｂ）、アキシチニブ（ａｘｉｔｉｎｉｂ）、レンバチニブ（ｌｅｎｖａｔｉｎｉｂ）、ニンテダニブ（ｎｉｎｔｅｄａｎｉｂ）、パゾパニブ（ｐａｚｏｐａｎｉｂ）、レゴラフェニブ（ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ）、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）またはスニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）を含む、請求項１６に記載の慢性骨髄性白血病患者のＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性イマチニブまたはニロチニブ耐性阻害用医薬組成物。
【請求項18】
（ａ）ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）またはニロチニブ（ｎｉｌｏｔｉｎｉｂ）耐性を示す細胞株またはヒトを除いた動物モデルに候補物質を処理する段階；および（ｂ）前記候補物質が処理された細胞株またはヒトを除いた動物モデルにおいてＦＡＭ１６７Ａタンパク質の阻害の有無または前記タンパク質をコード化する遺伝子発現の阻害の有無を確認する段階；
を含む、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性イマチニブまたはニロチニブ耐性を示す慢性骨髄性白血病の治療剤またはＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性イマチニブまたはニロチニブ耐性阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項19】
（ｃ）前記候補物質がＦＡＭ１６７Ａタンパク質を阻害するか、前記タンパク質をコード化する遺伝子発現を阻害する場合、前記候補物質をＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性イマチニブまたはニロチニブ耐性を示す慢性骨髄性白血病の治療剤またはＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性イマチニブまたはニロチニブ耐性阻害剤と判断する段階をさらに含む、請求項１８に記載のＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性イマチニブまたはニロチニブ耐性を示す慢性骨髄性白血病の治療剤またはＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性イマチニブまたはニロチニブ耐性阻害剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＦＡＭ１６７Ａを含むＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性チロシンキナーゼ阻害剤（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＴＫＩ）耐性を診断するためのバイオマーカー組成物およびＦＡＭ１６７Ａをターゲットとする慢性骨髄性白血病の予防または治療用組成物に関し、より詳細には、ＦＡＭ１６７Ａタンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを確認することによって、慢性骨髄性白血病患者のＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を診断する組成物、キット、方法とＦＡＭ１６７ＡをターゲットとしてＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示す慢性骨髄性白血病の予防または治療用医薬組成物および慢性骨髄性白血病患者のＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性阻害用医薬組成物を提供する。
【背景技術】
【0002】
慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ，ＣＭＬ）は、ＢＣＲ－ＡＢＬフィラデルフィア染色体の特徴的なｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）相互転座（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）により発生する。ＢＣＲ－ＡＢＬ融合遺伝子は、転座中にＡＢＬ１の上方制御ドメインの損失によって構成的に活性のＢＣＲ－ＡＢＬ腫瘍タンパク質をコード化する。イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）のようなＢＣＲ－ＡＢＬターゲットチロシンキナーゼ阻害剤（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＴＫＩ）の開発は、ＣＭＬ患者の治療に革命を起こした。しかしながら、ＴＫＩに対する耐性は、成功したＣＭＬ治療の主要な障害物として残っている。
【0003】
ＴＫＩ耐性は、ＢＣＲ－ＡＢＬ依存性とＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性の２つの方式で発生する。ＢＣＲ－ＡＢＬ依存性耐性は、主にＢＣＲ－ＡＢＬキナーゼドメインの突然変異によって発生するが、このドメインに突然変異がない多くのＣＭＬ患者もＴＫＩ耐性を示す。ニロチニブ（ｎｉｌｏｔｉｎｉｂ）およびダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）のような第２世代ＴＫＩは、ＢＣＲ－ＡＢＬ依存性耐性疾患に効果的な治療法である。対照的に、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性は、第２世代ＴＫＩで解決できない。信号経路活性の変化、後成遺伝学的調節因子の突然変異、微小環境の要因および白血病幹細胞の活性を含む様々な要因がＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性に潜在的な寄与因子であるが、このような種類の耐性の根本的な理由は、完全には理解されていなかった。したがって、基本メカニズムを識別し、効果的な治療法を開発することが主要な目標である。
【0004】
核因子－κＢ（ＮＦ－κＢ）ファミリーメンバーは、免疫反応、炎症およびがんに関連した様々な遺伝子を調節する誘導転写因子である。標準および非標準の２つの主要なＮＦ－κＢ活性化信号経路がある。標準ＮＦ－κＢ経路は、主にκＢタンパク質阻害剤（ＩκＢ）の分解とｐ５０含有二量体の核転座を通じて活性化する。対照的に、非標準ＮＦ－κＢ経路の中心信号タンパク質は、ＮＦ－κＢ誘導キナーゼ（ＮＦ－κＢ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ，ＮＩＫ）である。非標準ＮＦ－κＢ活性化は、ユビキチン化依存性ＮＩＫ分解の遮断を通したＮＩＫ蓄積に依存する。蓄積したＮＩＫは、ｐ１００からｐ５２への処理を誘導し、後にｐ５２含有二量体の核転座が続く。ＮＦ－κＢ経路は、ＴＫＩ耐性に寄与し、このような経路の阻害は、ＴＫＩに対するＣＭＬの感受性を回復させる。しかしながら、ＴＫＩ耐性ＣＭＬにおいてＮＦ－κＢ経路の直接的な活性化と関連した要因は、まだ知られていない。
【0005】
このような背景下に、本発明者らは、ＮＦ－κＢがイン・シリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）活性化した転写因子の分析を通じてテストされたもののうち、最も高度で活性化した転写因子であり、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性ＣＭＬ細胞において差次的遺伝子発現を担当することを明らかにした。また、本発明者らは、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性があるＣＭＬの非標準ＮＦ－κＢ経路で以前に特性化されなかったタンパク質であるＦＡＭ１６７Ａの重要な機能を明らかにした。具体的には、ＦＡＭ１６７Ａの発現がＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を有する患者のＣＤ３４＋ ＣＭＬ細胞において高度で上方制御され（ＣＭＬ細胞株における結果と類似）、ＦＡＭ１６７ＡがＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を担当することを示す。ＦＡＭ１６７Ａの中和は、培養細胞およびマウス腫瘍モデルにおいてＴＫＩ耐性を逆転させた。
【0006】
このような知見は、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性のメカニズムと関連して非標準ＮＦ－κＢ経路でＦＡＭ１６７Ａに対する新規かつ重要な役割を説明し、ＴＫＩ耐性ＣＭＬを克服するための有望なターゲットとして提示される。
【0007】
ＦＡＭ１６７Ａと関連して、非特許文献１は、ＣＧＡによって確認された全身性硬化症（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）感受性遺伝子としてＦＡＭ１６７Ａ－ＢＬＫを確認したことがあるが、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性の診断およびＴＫＩ耐性ＣＭＬを治療するためのターゲットとしてＦＡＭ１６７Ａの役割については知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【文献】Ｏｔａ Ｙ，Ｋｕｗａｎａ Ｍ．Ｕｐｄａｔｅｓ ｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｉｎ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｉｎｆｌａｍｍ Ｒｅｇｅｎ．２０２１ Ｊｕｎ １５；４１（１）：１７。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、前述した課題を解決するために案出されたものであって、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性の診断およびＴＫＩ耐性ＣＭＬを治療するための新規ターゲットを発掘し、前記ターゲットをバイオマーカーとして、ＣＭＬ患者のＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性診断、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性ＣＭＬの治療およびＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を阻害する技術を提供することに目的がある。
【課題を解決するための手段】
【0010】
前述した課題を解決するために、本発明は、ＦＡＭ１６７Ａタンパク質またはこれをコード化する遺伝子を含む、慢性骨髄性白血病患者においてＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性チロシンキナーゼ阻害剤（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＴＫＩ）耐性を診断するためのバイオマーカー組成物を提供する。
【0011】
本発明は、また、ＦＡＭ１６７Ａタンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを測定する製剤を含む、慢性骨髄性白血病患者においてＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を診断するための組成物およびキットを提供する。
【0012】
本発明において、前記ＦＡＭ１６７Ａタンパク質またはその断片の発現レベルを測定する製剤は、前記ＦＡＭ１６７Ａタンパク質またはその断片に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片、またはアプタマーを含んでもよい。
【0013】
本発明において、前記ＦＡＭ１６７Ａタンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定する製剤は、前記遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合するセンスおよびアンチセンスプライマーまたはプローブを含んでもよい。
【0014】
本発明において、前記キットは、ＲＴ－ＰＣＲキット、競合的ＲＴ－ＰＣＲキット、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲキット、ＤＮＡチップキット、マイクロアレイキット、ＳＡＧＥ（Ｓｅｒｉａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）キット、遺伝子チップキット、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）キット、タンパク質チップキット、ラピッド（ｒａｐｉｄ）キットまたはＭＲＭ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）キットを含んでもよい。
【0015】
本発明は、また、以下の段階を含む慢性骨髄性白血病患者のＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を診断するための情報提供方法を提供する：
（ａ）慢性骨髄性白血病患者から分離した生物学的試料でＦＡＭ１６７Ａタンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを測定する段階；および
（ｂ）前記（ａ）段階で測定された発現レベルを、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性チロシンキナーゼ阻害剤耐性がない慢性骨髄性白血病患者から分離した生物学的試料で測定された同じタンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルと比較する段階。
（ａ）慢性骨髄性白血病患者から分離した生物学的試料でＦＡＭ１６７Ａタンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを測定する段階；および
（ｂ）前記（ａ）段階で測定された発現レベルを、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性チロシンキナーゼ阻害剤耐性がない慢性骨髄性白血病患者から分離した生物学的試料で測定された同じタンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルと比較する段階。
【0016】
本発明において、前記情報提供方法は、（ｃ）前記（ａ）段階の慢性骨髄性白血病患者から分離した生物学的試料で測定されたＦＡＭ１６７Ａタンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルが、前記（ｂ）段階のＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性チロシンキナーゼ阻害剤耐性がない慢性骨髄性白血病患者から分離した生物学的試料で測定された同じタンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルより高い場合、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩに耐性を示すと判断する段階をさらに含んでもよい。
【0017】
本発明において、前記生物学的試料は、血液、血漿、血清、尿、粘液、唾液、涙、喀痰、脊髄液、胸水、乳頭吸引液、リンパ液、気道液、腸液、泌尿生殖器液、母乳、リンパ系体液、精液、脳脊髄液、気管系内体液、腹水、嚢胞性腫瘍体液、羊水液またはこれらの組み合わせを含んでもよい。
【0018】
さらに、本発明は、ＦＡＭ１６７Ａタンパク質阻害剤；ＦＡＭ１６７Ａタンパク質をコード化する遺伝子の発現阻害剤；またはこれらの混合物を有効成分として含むＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示す慢性骨髄性白血病の予防または治療用医薬組成物および慢性骨髄性白血病患者のＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性阻害用医薬組成物を提供する。
【0019】
本発明において、前記ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示す慢性骨髄性白血病は、ＴＫＩ感受性を示す慢性骨髄性白血病に比べてＮＦ－κＢ活性が増加することができる。
【0020】
本発明において、前記医薬組成物は、ＴＫＩと併用投与され得る。
【0021】
本発明において、前記ＴＫＩは、クリゾチニブ（ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ）、セリチニブ（ｃｅｒｉｔｉｎｉｂ）、アレクチニブ（ａｌｅｃｔｉｎｉｂ）、ブリグチニブ（ｂｒｉｇａｔｉｎｉｂ）、ボスチニブ（ｂｏｓｕｔｉｎｉｂ）、ダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）、イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）、ニロチニブ（ｎｉｌｏｔｉｎｉｂ）、ポナチニブ（ｐｏｎａｔｉｎｉｂ）、イブルチニブ（ｉｂｒｕｔｉｎｉｂ）、カボザンチニブ（ｃ
ａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ）、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、ラパチニブ（ｌａｐａｔｉｎｉｂ）、バンデタニブ（ｖａｎｄｅｔａｎｉｂ）、アファチニブ（ａｆａｔｉｎｉｂ）、オシメルチニブ（ｏｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂ）、ルキソリチニブ（ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂ）、トファシチニブ（ｔｏｆａｃｉｔｉｎｉｂ）、アキシチニブ（ａｘｉｔｉｎｉｂ）、レンバチニブ（ｌｅｎｖａｔｉｎｉｂ）、ニンテダニブ（ｎｉｎｔｅｄａｎｉｂ）、パゾパニブ（ｐａｚｏｐａｎｉｂ）、レゴラフェニブ（ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ）、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）またはスニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）を含んでもよい。
ａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ）、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、ラパチニブ（ｌａｐａｔｉｎｉｂ）、バンデタニブ（ｖａｎｄｅｔａｎｉｂ）、アファチニブ（ａｆａｔｉｎｉｂ）、オシメルチニブ（ｏｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂ）、ルキソリチニブ（ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂ）、トファシチニブ（ｔｏｆａｃｉｔｉｎｉｂ）、アキシチニブ（ａｘｉｔｉｎｉｂ）、レンバチニブ（ｌｅｎｖａｔｉｎｉｂ）、ニンテダニブ（ｎｉｎｔｅｄａｎｉｂ）、パゾパニブ（ｐａｚｏｐａｎｉｂ）、レゴラフェニブ（ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ）、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）またはスニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）を含んでもよい。
【0022】
本発明は、また、以下の段階を含むＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示すＣＭＬの治療剤またはＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性阻害剤のスクリーニング方法を提供する：
（ａ）ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示す細胞株または動物モデルに候補物質を処理する段階；および
（ｂ）前記候補物質が処理された細胞株または動物モデルにおいてＦＡＭ１６７Ａタンパク質の阻害の有無または前記タンパク質をコード化する遺伝子発現の阻害の有無を確認する段階。
（ａ）ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示す細胞株または動物モデルに候補物質を処理する段階；および
（ｂ）前記候補物質が処理された細胞株または動物モデルにおいてＦＡＭ１６７Ａタンパク質の阻害の有無または前記タンパク質をコード化する遺伝子発現の阻害の有無を確認する段階。
【0023】
本発明において、前記スクリーニング方法は、（ｃ）前記候補物質がＦＡＭ１６７Ａタンパク質を阻害するか、または前記タンパク質をコード化する遺伝子発現を阻害する場合、前記候補物質をＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示すＣＭＬの治療剤またはＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性阻害剤と判断する段階をさらに含んでもよい。
【0024】
しかも、本発明は、ＦＡＭ１６７Ａタンパク質阻害剤、ＦＡＭ１６７Ａタンパク質をコード化する遺伝子の発現阻害剤またはこれらの混合物の治療学的有効量をＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示す慢性骨髄性白血病患者に投与することを含む、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示す慢性骨髄性白血病の治療方法を提供する。
【0025】
また、本発明は、ＦＡＭ１６７Ａタンパク質阻害剤、ＦＡＭ１６７Ａタンパク質をコード化する遺伝子の発現阻害剤またはこれらの混合物の治療学的有効量をＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示す慢性骨髄性白血病患者に投与することを含む、慢性骨髄性白血病患者においてＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を阻害する方法を提供する。
【0026】
また、本発明は、以下の段階を含む、慢性骨髄性白血病患者のＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性の診断およびＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示す慢性骨髄性白血病の治療方法を提供する：
（ａ）慢性骨髄性白血病患者から分離した生物学的試料でＦＡＭ１６７Ａタンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを測定する段階；
（ｂ）前記（ａ）段階で測定された発現レベルが、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性がない慢性骨髄性白血病患者から分離した生物学的試料で測定された同じタンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルより増加する場合、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示すものと診断する段階；および
（ｃ）前記（ｂ）段階でＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示すものと診断された患者にＦＡＭ１６７Ａタンパク質阻害剤、ＦＡＭ１６７Ａタンパク質をコード化する遺伝子の発現阻害剤またはこれらの混合物の治療学的有効量を投与する段階。
（ａ）慢性骨髄性白血病患者から分離した生物学的試料でＦＡＭ１６７Ａタンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを測定する段階；
（ｂ）前記（ａ）段階で測定された発現レベルが、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性がない慢性骨髄性白血病患者から分離した生物学的試料で測定された同じタンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルより増加する場合、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示すものと診断する段階；および
（ｃ）前記（ｂ）段階でＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示すものと診断された患者にＦＡＭ１６７Ａタンパク質阻害剤、ＦＡＭ１６７Ａタンパク質をコード化する遺伝子の発現阻害剤またはこれらの混合物の治療学的有効量を投与する段階。
【0027】
また、本発明は、以下の段階を含む、慢性骨髄性白血病患者のＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性の診断およびＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性阻害方法を提供する：
（ａ）慢性骨髄性白血病患者から分離した生物学的試料でＦＡＭ１６７Ａタンパク質、
その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを測定する段階；
（ｂ）前記（ａ）段階で測定された発現レベルが、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性がない慢性骨髄性白血病患者から分離した生物学的試料で測定された同じタンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルより増加する場合、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示すものと診断する段階；および
（ｃ）前記（ｂ）段階でＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示すものと診断された患者にＦＡＭ１６７Ａタンパク質阻害剤、ＦＡＭ１６７Ａタンパク質をコード化する遺伝子の発現阻害剤またはこれらの混合物の治療学的有効量を投与する段階。
（ａ）慢性骨髄性白血病患者から分離した生物学的試料でＦＡＭ１６７Ａタンパク質、
その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを測定する段階；
（ｂ）前記（ａ）段階で測定された発現レベルが、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性がない慢性骨髄性白血病患者から分離した生物学的試料で測定された同じタンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルより増加する場合、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示すものと診断する段階；および
（ｃ）前記（ｂ）段階でＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示すものと診断された患者にＦＡＭ１６７Ａタンパク質阻害剤、ＦＡＭ１６７Ａタンパク質をコード化する遺伝子の発現阻害剤またはこれらの混合物の治療学的有効量を投与する段階。
【発明の効果】
【0028】
本発明では、ＢＣＲ－ＡＢＬキナーゼドメインに突然変異がないＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示すＣＭＬにおいてＴＫＩ耐性の指標として活用できる新規バイオマーカーとしてＦＡＭ１６７Ａを発掘し、これを阻害する場合、ＴＫＩ耐性が逆転することを確認したところ、これを用いて既存の第２世代ＴＫＩで治療されていないＣＭＬ患者のＴＫＩ耐性を診断し、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示すＣＭＬ患者のＴＫＩ耐性を逆転させることによって、ＴＫＩ耐性患者を効果的に治療できる利点を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【図1b】図１ｂと図１ｃは、それぞれ表示された濃度のイマチニブ（図１ｂ）とニロチニブ（図１ｃ）で３日間処理した後、Ｋ５６２ＳおよびＫ５６２Ｒ細胞の生存能を分析した結果を示す図であり、図１ｄと図１ｅは、それぞれ表示された濃度のイマチニブ（図１ｄ）とニロチニブ（図１ｅ）で３日間処理した後、Ｋ５６２ＳおよびＫ５６２Ｒ細胞においてアポトーシスを評価するためのアネキシンＶ染色細胞のフローサイトメトリー結果を示す図である。データは、３回（図１ｂ～図１ｅ）の独立実験（エラーバー、三重（図１ｂおよび図１ｃ）サンプルのｓ．ｄ．）を示す。独立標本両側ｔ検定；＊＊＊Ｐ＜０．００１。Ｋ５６２Ｓ：ＴＫＩに敏感なＫ５６２細胞株、Ｋ５６２Ｒ：ＢＣＲ－ＡＢＬキナーゼドメイン突然変異がないＴＫＩ耐性Ｋ５６２細胞株。
【図1c】図１ｂと図１ｃは、それぞれ表示された濃度のイマチニブ（図１ｂ）とニロチニブ（図１ｃ）で３日間処理した後、Ｋ５６２ＳおよびＫ５６２Ｒ細胞の生存能を分析した結果を示す図であり、図１ｄと図１ｅは、それぞれ表示された濃度のイマチニブ（図１ｄ）とニロチニブ（図１ｅ）で３日間処理した後、Ｋ５６２ＳおよびＫ５６２Ｒ細胞においてアポトーシスを評価するためのアネキシンＶ染色細胞のフローサイトメトリー結果を示す図である。データは、３回（図１ｂ～図１ｅ）の独立実験（エラーバー、三重（図１ｂおよび図１ｃ）サンプルのｓ．ｄ．）を示す。独立標本両側ｔ検定；＊＊＊Ｐ＜０．００１。Ｋ５６２Ｓ：ＴＫＩに敏感なＫ５６２細胞株、Ｋ５６２Ｒ：ＢＣＲ－ＡＢＬキナーゼドメイン突然変異がないＴＫＩ耐性Ｋ５６２細胞株。
【図1d】図１ｂと図１ｃは、それぞれ表示された濃度のイマチニブ（図１ｂ）とニロチニブ（図１ｃ）で３日間処理した後、Ｋ５６２ＳおよびＫ５６２Ｒ細胞の生存能を分析した結果を示す図であり、図１ｄと図１ｅは、それぞれ表示された濃度のイマチニブ（図１ｄ）とニロチニブ（図１ｅ）で３日間処理した後、Ｋ５６２ＳおよびＫ５６２Ｒ細胞においてアポトーシスを評価するためのアネキシンＶ染色細胞のフローサイトメトリー結果を示す図である。データは、３回（図１ｂ～図１ｅ）の独立実験（エラーバー、三重（図１ｂおよび図１ｃ）サンプルのｓ．ｄ．）を示す。独立標本両側ｔ検定；＊＊＊Ｐ＜０．００１。Ｋ５６２Ｓ：ＴＫＩに敏感なＫ５６２細胞株、Ｋ５６２Ｒ：ＢＣＲ－ＡＢＬキナーゼドメイン突然変異がないＴＫＩ耐性Ｋ５６２細胞株。
【図1e】図１ｂと図１ｃは、それぞれ表示された濃度のイマチニブ（図１ｂ）とニロチニブ（図１ｃ）で３日間処理した後、Ｋ５６２ＳおよびＫ５６２Ｒ細胞の生存能を分析した結果を示す図であり、図１ｄと図１ｅは、それぞれ表示された濃度のイマチニブ（図１ｄ）とニロチニブ（図１ｅ）で３日間処理した後、Ｋ５６２ＳおよびＫ５６２Ｒ細胞においてアポトーシスを評価するためのアネキシンＶ染色細胞のフローサイトメトリー結果を示す図である。データは、３回（図１ｂ～図１ｅ）の独立実験（エラーバー、三重（図１ｂおよび図１ｃ）サンプルのｓ．ｄ．）を示す。独立標本両側ｔ検定；＊＊＊Ｐ＜０．００１。Ｋ５６２Ｓ：ＴＫＩに敏感なＫ５６２細胞株、Ｋ５６２Ｒ：ＢＣＲ－ＡＢＬキナーゼドメイン突然変異がないＴＫＩ耐性Ｋ５６２細胞株。
【図1h】図１ｈおよび図１ｉ～図１ｋは、マイクロアレイおよびＲＮＡ－ｓｅｑ分析の両方で差次的発現する遺伝子調節に関与する転写因子（図１ｈ）および３個の対照群遺伝子（各グループは、５００個の無作為に選択された遺伝子を含む）（図１ｉ～図１ｋ）のイン・シリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）分析結果を示す図である。サイズと色は、転写因子と関連した遺伝子の数を示す。
【図1i】図１ｈおよび図１ｉ～図１ｋは、マイクロアレイおよびＲＮＡ－ｓｅｑ分析の両方で差次的発現する遺伝子調節に関与する転写因子（図１ｈ）および３個の対照群遺伝子（各グループは、５００個の無作為に選択された遺伝子を含む）（図１ｉ～図１ｋ）のイン・シリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）分析結果を示す図である。サイズと色は、転写因子と関連した遺伝子の数を示す。
【図1j】図１ｈおよび図１ｉ～図１ｋは、マイクロアレイおよびＲＮＡ－ｓｅｑ分析の両方で差次的発現する遺伝子調節に関与する転写因子（図１ｈ）および３個の対照群遺伝子（各グループは、５００個の無作為に選択された遺伝子を含む）（図１ｉ～図１ｋ）のイン・シリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）分析結果を示す図である。サイズと色は、転写因子と関連した遺伝子の数を示す。
【図1k】図１ｈおよび図１ｉ～図１ｋは、マイクロアレイおよびＲＮＡ－ｓｅｑ分析の両方で差次的発現する遺伝子調節に関与する転写因子（図１ｈ）および３個の対照群遺伝子（各グループは、５００個の無作為に選択された遺伝子を含む）（図１ｉ～図１ｋ）のイン・シリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）分析結果を示す図である。サイズと色は、転写因子と関連した遺伝子の数を示す。
【図1m】図１ｍのＡは、Ｋ５６２ＳとＫ５６２Ｒの間で差次的発現する遺伝子のうち表示された転写因子によってターゲッティングされた遺伝子の割合を示す図であり、Ｂは、無作為に選択された５００個の遺伝子のうちで表示された転写因子によってターゲッティングされた遺伝子の割合を示す図である。
【図1o】図１ｏは、Ｋ５６２ＳおよびＫ５６２Ｒ細胞と１μＭイマチニブで２４時間処理されたＫ５６２Ｒ細胞において７個の遺伝子のｍＲＮＡレベルに対する定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）分析結果を示す図である。ＩＭＡ：イマチニブ。データは、３回（図１ｎおよび図１ｏ）の独立実験（エラーバー、二重（図１ｏ）または三重（図１ｌおよび図１ｎ）サンプルのｓ．ｄ．）を示す。独立標本両側Ｔ検定；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。ＮＳ：有意性なし；Ｋ５６２Ｓ：ＴＫＩ敏感Ｋ５６２細胞株；Ｋ５６２Ｒ：ＢＣＲ－ＡＢＬキナーゼドメイン突然変異がないＴＫＩ耐性Ｋ５６２細胞株。
【図2a】図２ａは、表示された遺伝子をコード化するプラスミドの形質感染２４時間後、Ｋ５６２Ｓ細胞および２４時間１μＭイマチニブで処理されたＫ５６２Ｒ細胞とＫ５６２Ｒ細胞におけるＮＦ－κＢルシフェラーゼレポータ活性を示す図である。
【図2b】図２ｂは、２日間イマチニブ（ＩＭＡ、１μＭ）で処理するかまたは処理しなかった後、表示された遺伝子をコード化するプラスミドで形質感染されたＫ５６２Ｓ細胞の生存率を示す図である。データは、２回の独立実験（エラーバー、三重サンプルのｓ．ｄ．）を示す。独立標本両側ｔ検定；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図2c】図２ｃのＡは、ＳｅｃｒｅｔｏｍｅＰツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｅｃｒｅｔｏｍｅＰ／）によるヒト、マウス、ラットおよびゼブラフィッシュＦＡＭ１６７ＡおよびＨＡタグヒトＦＡＭ１６７Ａ分泌のイン・シリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）予測を示す図であり、ＮＮスコアが０．５以上のタンパク質は分泌されると予測される。図２ｃのＢは、Ｋ５６２Ｒ細胞の細胞溶解物および培養上清液においてＦＡＭ１６７Ａの免疫ブロット分析結果を示す図である。培地は、対照群上清液に使用された。上清液タンパク質は、アセトン沈殿によって濃縮された。細胞質タンパク質であるＥｒｂｉｎも、対照群として分析し、培養上清液に細胞質タンパク質がないことを確認した。データは、３回（図２ｃのＢ）の独立実験を示す。
【図2d】図２ｄは、組換えＦＡＭ１６７Ａで処理後、Ｋ５６２Ｓ細胞において２４時間のＮＦ－κＢルシフェラーゼレポータ活性を示す図であり、図２ｅは、抗ＦＡＭ１６７Ａ中和抗体で２４時間処理した後、Ｋ５６２Ｒ細胞においてＮＦ－κＢルシフェラーゼレポータ活性を示す図であり、図２ｆは、５０μｇ／ｍｌのＳＮ５０、１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳまたはこれら両方で２４時間処理した後、Ｋ５６２Ｒ細胞においてＮＦ－κＢルシフェラーゼレポータ活性を示す図であり、図２ｇは、優性陰性ＮＩＫ（ＮＩＫ－ＤＮ）をコード化するプラスミドの形質感染２４時間後、Ｋ５６２Ｒ細胞においてＮＦ－κＢルシフェラーゼレポータ活性を示す図であり、図２ｈと図２ｉは、Ｋ５６２ＳおよびＫ５６２Ｒ細胞においてＮＩＫ（図２ｈ）およびｐ１００／ｐ５２（図２ｉ）に対する免疫ブロット分析結果を示す図である。
【図2e】図２ｄは、組換えＦＡＭ１６７Ａで処理後、Ｋ５６２Ｓ細胞において２４時間のＮＦ－κＢルシフェラーゼレポータ活性を示す図であり、図２ｅは、抗ＦＡＭ１６７Ａ中和抗体で２４時間処理した後、Ｋ５６２Ｒ細胞においてＮＦ－κＢルシフェラーゼレポータ活性を示す図であり、図２ｆは、５０μｇ／ｍｌのＳＮ５０、１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳまたはこれら両方で２４時間処理した後、Ｋ５６２Ｒ細胞においてＮＦ－κＢルシフェラーゼレポータ活性を示す図であり、図２ｇは、優性陰性ＮＩＫ（ＮＩＫ－ＤＮ）をコード化するプラスミドの形質感染２４時間後、Ｋ５６２Ｒ細胞においてＮＦ－κＢルシフェラーゼレポータ活性を示す図であり、図２ｈと図２ｉは、Ｋ５６２ＳおよびＫ５６２Ｒ細胞においてＮＩＫ（図２ｈ）およびｐ１００／ｐ５２（図２ｉ）に対する免疫ブロット分析結果を示す図である。
【図2f】図２ｄは、組換えＦＡＭ１６７Ａで処理後、Ｋ５６２Ｓ細胞において２４時間のＮＦ－κＢルシフェラーゼレポータ活性を示す図であり、図２ｅは、抗ＦＡＭ１６７Ａ中和抗体で２４時間処理した後、Ｋ５６２Ｒ細胞においてＮＦ－κＢルシフェラーゼレポータ活性を示す図であり、図２ｆは、５０μｇ／ｍｌのＳＮ５０、１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳまたはこれら両方で２４時間処理した後、Ｋ５６２Ｒ細胞においてＮＦ－κＢルシフェラーゼレポータ活性を示す図であり、図２ｇは、優性陰性ＮＩＫ（ＮＩＫ－ＤＮ）をコード化するプラスミドの形質感染２４時間後、Ｋ５６２Ｒ細胞においてＮＦ－κＢルシフェラーゼレポータ活性を示す図であり、図２ｈと図２ｉは、Ｋ５６２ＳおよびＫ５６２Ｒ細胞においてＮＩＫ（図２ｈ）およびｐ１００／ｐ５２（図２ｉ）に対する免疫ブロット分析結果を示す図である。
【図2g】図２ｄは、組換えＦＡＭ１６７Ａで処理後、Ｋ５６２Ｓ細胞において２４時間のＮＦ－κＢルシフェラーゼレポータ活性を示す図であり、図２ｅは、抗ＦＡＭ１６７Ａ中和抗体で２４時間処理した後、Ｋ５６２Ｒ細胞においてＮＦ－κＢルシフェラーゼレポータ活性を示す図であり、図２ｆは、５０μｇ／ｍｌのＳＮ５０、１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳまたはこれら両方で２４時間処理した後、Ｋ５６２Ｒ細胞においてＮＦ－κＢルシフェラーゼレポータ活性を示す図であり、図２ｇは、優性陰性ＮＩＫ（ＮＩＫ－ＤＮ）をコード化するプラスミドの形質感染２４時間後、Ｋ５６２Ｒ細胞においてＮＦ－κＢルシフェラーゼレポータ活性を示す図であり、図２ｈと図２ｉは、Ｋ５６２ＳおよびＫ５６２Ｒ細胞においてＮＩＫ（図２ｈ）およびｐ１００／ｐ５２（図２ｉ）に対する免疫ブロット分析結果を示す図である。
【図2h】図２ｄは、組換えＦＡＭ１６７Ａで処理後、Ｋ５６２Ｓ細胞において２４時間のＮＦ－κＢルシフェラーゼレポータ活性を示す図であり、図２ｅは、抗ＦＡＭ１６７Ａ中和抗体で２４時間処理した後、Ｋ５６２Ｒ細胞においてＮＦ－κＢルシフェラーゼレポータ活性を示す図であり、図２ｆは、５０μｇ／ｍｌのＳＮ５０、１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳまたはこれら両方で２４時間処理した後、Ｋ５６２Ｒ細胞においてＮＦ－κＢルシフェラーゼレポータ活性を示す図であり、図２ｇは、優性陰性ＮＩＫ（ＮＩＫ－ＤＮ）をコード化するプラスミドの形質感染２４時間後、Ｋ５６２Ｒ細胞においてＮＦ－κＢルシフェラーゼレポータ活性を示す図であり、図２ｈと図２ｉは、Ｋ５６２ＳおよびＫ５６２Ｒ細胞においてＮＩＫ（図２ｈ）およびｐ１００／ｐ５２（図２ｉ）に対する免疫ブロット分析結果を示す図である。
【図2i】図２ｄは、組換えＦＡＭ１６７Ａで処理後、Ｋ５６２Ｓ細胞において２４時間のＮＦ－κＢルシフェラーゼレポータ活性を示す図であり、図２ｅは、抗ＦＡＭ１６７Ａ中和抗体で２４時間処理した後、Ｋ５６２Ｒ細胞においてＮＦ－κＢルシフェラーゼレポータ活性を示す図であり、図２ｆは、５０μｇ／ｍｌのＳＮ５０、１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳまたはこれら両方で２４時間処理した後、Ｋ５６２Ｒ細胞においてＮＦ－κＢルシフェラーゼレポータ活性を示す図であり、図２ｇは、優性陰性ＮＩＫ（ＮＩＫ－ＤＮ）をコード化するプラスミドの形質感染２４時間後、Ｋ５６２Ｒ細胞においてＮＦ－κＢルシフェラーゼレポータ活性を示す図であり、図２ｈと図２ｉは、Ｋ５６２ＳおよびＫ５６２Ｒ細胞においてＮＩＫ（図２ｈ）およびｐ１００／ｐ５２（図２ｉ）に対する免疫ブロット分析結果を示す図である。
【図2j】図２ｊは、ＮＦ－κＢプローブおよび抗ｐ５２抗体でスーパーシフト（ｓｕｐｅｒｓｈｉｆｔ）を示すＫ５６２ＳおよびＫ５６２Ｒ細胞から分離した核抽出物の電気泳動移動度分析（ＥＭＳＡ）結果を示す図である。
【図2k】図２ｋは、１００ｎｇ／ｍｌ組換えＦＡＭ１６７Ａで処理し、ＮＩＫ－ＤＮをコード化するプラスミドの形質感染後２４時間目にＫ５６２Ｓ細胞においてＮＦ－κＢルシフェラーゼレポータ活性を示す図である。
【図2m】図２ｍは、表示された濃度の組換えＦＡＭ１６７Ａで１２時間処理した後、Ｋ５６２ＳおよびＫ５６２Ｒ細胞においてｐ１００／ｐ５２の免疫ブロット分析結果を示す図である。ＧＡＰＤＨは、内部標準（図２ｈ、図２ｉ図２ｌおよび図２ｍ）に使用された。データは、３回（図２ａ、図２ｄ～図２ｇおよび図２ｉ～図２ｍ）または５回（図２ｈ）の独立実験を示す（エラーバー、三重（図２ａ、図２ｄ～２ｇおよび図２ｉ～図２ｍ）または５個（図２ｈ）サンプルのｓ．ｄ．）。独立標本両側ｔ検定；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図3a】図３ａは、ＭｙｃタグＦＡＭ１６７ＡおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８接合抗Ｍｙｃ抗体を使用したＫ５６２ＳおよびＫ５６２Ｒ細胞の表面ＦＡＭ１６７Ａ受容体（ＦＡＭ１６７ＡＲ）染色結果を示す図である。
【図3c】図３ｃは、ＭｙｃタグＦＡＭ１６７ＡおよびＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ(登録商標)ビーズに結合した抗Ｍｙｃ抗体を使用してＫ５６２Ｒ細胞から準備した免疫沈降サンプルの銀染色結果を示す図である。
【図3m】図３ｍは、Ｋ５６２ＳおよびＫ５６２Ｒ細胞においてＤＳＧ１発現の免疫蛍光顕微鏡分析写真を示す図である。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２を使用して核を視覚化した。スケールバー：１０μｍ。ＧＡＰＤＨは、内部標準（図３ｇ）に使用された。ＩＰ：免疫沈降。ＭＦＩ：平均蛍光強度。データは、３回（図３ａ、図３ｃおよび図３ｅ～３ｉ）の独立実験（エラーバー、二重（図３ｆ）または三重（図３ａおよび図３ｈ）サンプルのｓ．ｄ．）を示す。独立標本両側ｔ検定；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＮＳ：有意ではない。
【図3o】図３ｏは、ＦＡＭ１６７Ａをコード化するプラスミドの形質感染および表示された濃度の抗ＦＡＭ１６７Ａ中和抗体で処理した後２４時間目にＫ５６２Ｓ細胞においてＮＦ－κＢルシフェラーゼレポータ活性結果を示す図である。データは、２回（図３ｎおよび図３ｏ）の独立実験（エラーバー、三重（図３ｎ）サンプルのｓ．ｄ．）を示す。独立標本両側ｔ検定；＊Ｐ＜０．０５。
【図4a】図４ａは、抗ＤＳＧ１抗体と共に２個の異なるＤＳＧ１特異的ｓｈＲＮＡをコード化する組換えレンチウイルスを使用してＤＳＧ１ノックダウンさせた後、Ｋ５６２Ｒ細胞の表面ＤＳＧ１染色結果を示す図である。
【図4b】図４ｂは、２個の異なるＤＳＧ１特異的ｓｈＲＮＡをコード化する組換えレンチウイルスを使用してＤＳＧ１ノックダウンさせた後、Ｋ５６２Ｒ細胞においてＮＦ－κＢルシフェラーゼレポータ活性を示す図である。
【図4d】図４ｄは、２μｇ／ｍｌ抗ＦＡＭ１６７Ａ中和抗体で処理するかまたは処理しなかった状態でＤＳＧ１またはＤＳＧ１とＥｒｂｉｎをコード化するプラスミドの形質感染２４時間後、Ｋ５６２Ｒ細胞においてＮＦ－κＢルシフェラーゼレポータ活性を示す図である。
【図4f】図４ｆは、Ｋ５６２ＳおよびＫ５６２Ｒ細胞においてＥｒｂｉｎに対する免疫ブロット分析結果を示す図である。データは、３回（図４ａ、図４ｅおよび図４ｆ）の独立実験（エラーバー、三重（図４ｅ）サンプルのｓ．ｄ．）を示す。独立標本両側ｔ検定；ＮＳ：有意ではない。
【図4i】図４ｉは、２μｇ／ｍｌの抗ＦＡＭ１６７Ａ中和抗体またはアイソタイプ対照群と１０μＭ ＭＧ１３２を３時間処理したＫ５６２Ｒ細胞からのＮＩＫ免疫沈降後、抗ユビキチン抗体を使用したＮＩＫユビキチン化の免疫ブロット分析結果を示す図である。
【図4j】図４ｊのＡは、Ｋ５６２ＳおよびＫ５６２Ｒ細胞においてＤＳＧ１、Ｅｒｂｉｎ、ＮＩＫ、ＴＲＡＦ３、ＣＨＩＰおよびｃ－ｃｂｌの免疫共沈降分析結果を示す図であり、Ｂは、抗ＤＳＧ１および抗ＴＲＡＦ３抗体を使用してＫ５６２Ｓ細胞においてＤＳＧ１、ＮＩＫおよびＴＲＡＦ３の免疫共沈降分析結果を示す図であり、Ｃは、抗ＤＳＧ１および抗ＣＨＩＰ抗体を使用してＫ５６２Ｓ細胞においてＤＳＧ１、ＮＩＫおよびＣＨＩＰの免疫共沈降分析結果を示す図であり、Ｄは、抗ＤＳＧ１および抗ｃ－ｃｂｌ抗体を使用してＫ５６２Ｓ細胞においてＤＳＧ１、ＮＩＫおよびｃ－ｃｂｌの免疫共沈降分析結果を示す図である。ＧＡＰＤＨは、内部標準（図４ｊのＡ）に使用された。データは、３回（図４ｊのＡ～Ｄ）の独立実験を示す。
【図4k】図４ｋは、ＦＡＭ１６７Ａ誘導非標準ＮＦ－κＢ経路の概略図モデルを示す図である。ＧＡＰＤＨは、内部標準（図４ｃおよび図４ｇ～図４ｉ）に使用された。Ｕｂ：ユビキチン化。データは、２回（図４ｃ）または３回（図４ｂ、図４ｄ、図４ｇ～図４ｉ）の独立実験（エラーバー、二重（図４ｃ）または三重（図４ｂ、図４ｄ、図４ｇおよび図４ｈ）サンプルのｓ．ｄ．）を示す。独立標本両側ｔ検定；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図5d】図５ｄは、イマチニブまたはニロチニブの存在下に３日間２μｇ／ｍｌの抗ＦＡＭ１６７Ａ中和抗体またはアイソタイプ対照群で処理した後、Ｋ５６２Ｒ細胞の細胞死滅集団を示す図である。データは、３回（図５ｂ～図５ｄ）の独立実験（エラーバー、三重（図５ｂ～図５ｄ）サンプルのｓ．ｄ．）を示す。独立標本両側ｔ検定；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図6b】図６ｂと図６ｃは、それぞれ抗ＦＡＭ１６７Ａ中和抗体またはアイソタイプ対照群（２ｍｇ／ｋｇ／３日）があるかまたはない状態でビヒクルまたは１０ｍｇ／ｋｇ／日のイマチニブで処理されたマウスで確立されたＫ５６２Ｒ腫瘍の体積とマウスの体重を示す図である。
【図6c】図６ｂと図６ｃは、それぞれ抗ＦＡＭ１６７Ａ中和抗体またはアイソタイプ対照群（２ｍｇ／ｋｇ／３日）があるかまたはない状態でビヒクルまたは１０ｍｇ／ｋｇ／日のイマチニブで処理されたマウスで確立されたＫ５６２Ｒ腫瘍の体積とマウスの体重を示す図である。
【図6f】図６ｆは、ヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）染色、抗Ｋｉ－６７および抗ＮＩＫ抗体を使用した腫瘍切片の免疫組織化学的染色およびＴＵＮＥＬ染色結果を示す図である。スケールバー：１００μｍ。データは、３回（図６ｂ～６ｆ）の独立実験（エラーバー、５匹（図６ｂ、図６ｃ、図６ｅおよび図６ｆ）マウスまたはサンプルのｓ．ｄ．）を示す。独立標本両側ｔ検定；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＮＳ：有意ではない。
【図7】図７は、２４時間１μＭイマチニブで処理されたＫＣＬ２２Ｓ、ＫＣＬ２２ＲおよびＫＣＬ２２Ｒ細胞においてＦＡＭ１６７Ａ ｍＲＮＡのｑＲＴ－ＰＣＲ分析結果を示す図である。データは、３回の独立実験（エラーバー、三重サンプルのｓ．ｄ．）を示す。独立標本両側ｔ検定；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図8a】図８ａは、診断時点（ｎ＝１２）および追跡観察時（ｎ＝１１）にＢＣＲ－ＡＢＬ突然変異がないイマチニブ耐性ＣＭＬ患者（Ｒ）、そして診断時点（ｎ＝１０）および追跡観察時（ｎ＝１２）にＢＣＲ－ＡＢＬ突然変異があるイマチニブ耐性ＣＭＬ患者において、診断時点（ｎ＝２６）および追跡観察時（ｎ＝２６）にイマチニブ反応性ＣＭＬ患者（Ｓ）のＣＤ３４＋幹／前駆細胞においてＦＡＭ１６７Ａ ｍＲＮＡ発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析結果を示す図である。イマチニブ耐性とＢＣＲ－ＡＢＬ突然変異状態は、追跡観察で決定された。ＦＡＭ１６７Ａのレベルは、ＧＡＰＤＨのレベルで正規化された。
【発明を実施するための形態】
【0030】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【0031】
本発明において使用されるすべての技術用語は、別段の定義がない限り、本発明の関連分野における通常の当業者が一般的に理解するような意味で使用される。また、本明細書には、好ましい方法や試料が記載されているが、これと同様または同等のものも本発明の範疇に含まれる。
【0032】
前述したように、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性は、第２世代ＴＫＩでも治療が不可能で、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性ＣＭＬの診断および治療に活用できる新規のバイオマーカーの発掘が必要となる。
【0033】
これより、本発明では、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示すＣＭＬの非標準ＮＦ－κＢ経路で以前に特性化されていないタンパク質であるＦＡＭ１６７Ａの重要な機能を明らかにし、ＦＡＭ１６７Ａの中和が培養細胞およびマウス腫瘍モデルにおいてＴＫＩ耐性を逆転させる効果を示すことを糾明し、ＦＡＭ１６７ＡがＴＫＩ耐性ＣＭＬを克服するための有望なターゲットになり得ることを確認することによって、前述した問題の解決方案を模索した。
【0034】
したがって、本発明の第１態様は、ＦＡＭ１６７Ａタンパク質またはこれをコード化する遺伝子を含む、慢性骨髄性白血病患者においてＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性チロシンキナーゼ阻害剤（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＴＫＩ）耐性を診断するためのバイオマーカー組成物に関する。
【0035】
前記ＦＡＭ１６７Ａは、Ｃ８ｏｒｆ１３とも知られており、ＦＡＭ１６７（ＳＥＣ）ファミリーに属する２１４個のアミノ酸タンパク質である。ＦＡＭ１６７Ａをコード化する遺伝子は、約１億４６００万の塩基対で構成されたヒト染色体８にマッピングされる。ヒトにおいて前記ＦＡＭ１６７Ａタンパク質またはその断片は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿４４４５０９．２のアミノ酸を含んでもよいが、実質的に前記タンパク質と同一または相当する効能を示すアミノ酸配列であれば、制限なしに含んでもよい。前記ＦＡＭ１６７Ａタンパク質は、イソ型タンパク質（ｉｓｏｆｏｒｍ）またはその前駆体も含んでもよい。本発明では、代表的なＦＡＭ１６７Ａタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１に示した。
【0036】
ＭＳＶＰＱＩＨＶＥＥ ＶＧＡＥＥＧＡＧＡＡ ＡＰＰＤＤＨＬＲＳＬ ＫＡＬＴＥＫＬＲＬＥ ＴＲＲＰＳＹＬＥＷＱ ＡＲＬＥＥＨＴＷＰＦ ＰＲＰＡＡＥＰＱＡＳ ＬＥＥＧＥＲＧＧＱＥ ＰＬＬＰＬＲＥＡＧＱ ＨＰＰＳＡＲＳＡＳＱ ＧＡＲＰＬＳＴＧＫＬ ＥＧＦＱＳＩＤＥＡＩ ＡＷＬＲＫＥＬＴＥＭ ＲＬＱＤＱＱＬＡＲＱ ＬＭＲＬＲＧＤＩＮＫ ＬＫＩＥＨＴＣＲＬＨ ＲＲＭＬＮＤＡＴＹＥ ＬＥＥＲＤＥＬＡＤＬ ＦＣＤＳＰＬＡＳＳＦ ＳＬＳＴＰＬＫＬＩＧ ＶＴＫＭＮＩＮＳＲＲ ＦＳＬＣ（配列番号１）
【0037】
前記ＦＡＭ１６７Ａタンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿０５３２７９．３のヌクレオチド配列を含んでもよいが、実質的に前記遺伝子と同一または相当する効能を示すヌクレオチド配列であれば、制限なしに含んでもよい。本発明では、代表的なＦＡＭ１６７Ａタンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡ配列を配列番号２に示した。
【0038】
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【0039】
前記バイオマーカータンパク質およびこれをコード化する遺伝子の具体的なアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、公知のデータベースであるＮＣＢＩなどから確認することができる。
【0040】
本発明の用語「バイオマーカー」は、生物学的現象の存在と定量的または定性的に関連する分子を意味し、本発明のバイオマーカーは、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性の有無を判断する基準となるタンパク質またはこれをコード化する遺伝子を指す。バイオマーカーは、ゲノムヌクレオチド配列、または発現したヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡ、ｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）、またはコード化したポリペプチドに由来することができる。この用語は、バイオマーカー配列に相補的またはそれにフランキングされた核酸配列、例えば、前記バイオマーカー配列を増幅させることができるプローブまたはプラ
イマー対に使用された核酸を含む。
イマー対に使用された核酸を含む。
【0041】
本発明において前記「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」は、タンパク質または核酸が生成されることを意味する。「タンパク質」は、「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」または「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」と互換して使用され、例えば、自然状態のタンパク質において一般的に発見されるようにアミノ酸残基の重合体をいう。「ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」または「核酸」は、一本鎖または二本鎖の形態からなるデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはリボヌクレオチド（ＲＮＡ）を指す。他の制限がない限り、天然に生成されるヌクレオチドと同様の方法で核酸にハイブリダイズする天然ヌクレオチドの既知のアナログも含まれる。「ｍＲＮＡ」は、タンパク質合成過程で特定の遺伝子からアミノ酸配列を特定するリボソームに遺伝情報（遺伝子特異的塩基配列）を伝達するＲＮＡを意味する。
【0042】
前記第１態様と関連して、本発明は、ＦＡＭ１６７Ａタンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化するｍＲＮＡの発現レベルを測定する製剤を含む、慢性骨髄性白血病患者においてＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を診断するための組成物およびこれを含むキットを提供する。
【0043】
本発明において、用語「診断」は、特定の病気または疾患に対する個体（ｓｕｂｊｅｃｔ）の感受性（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）を判定すること、個体が特定の病気または疾患を現在有しているかどうかを判定すること、特定の病気または疾患にかかった個体の予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）を判定すること、またはテラメトリックス（ｔｈｅｒａｍｅｔｒｉｃｓ）（例えば、治療効能に関する情報を提供するために個体の状態をモニタリングすること）を含む。
【0044】
本発明において、用語「耐性」は、「抵抗性」とも言い、当該薬物に対して敏感に反応せず、薬物の効能が作用しないことを意味する。
【0045】
本発明において、「ＦＡＭ１６７Ａタンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを測定する製剤」とは、本発明のバイオマーカータンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを確認するために使用され得る分子を意味し、好ましくは、前記タンパク質またはその断片に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片、またはアプタマーであり得、または前記遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合するセンスおよびアンチセンスプライマーまたはプローブであり得るが、これに制限されない。
【0046】
本発明において、前記ＦＡＭ１６７Ａタンパク質の断片は、免疫原性断片であり得、好ましくは、前記タンパク質に対する抗体によって認識され得る１つ以上のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）を有している断片であり得る。
【0047】
本発明において、用語「抗体」とは、当該分野において公知の用語であり、抗原性部位に対して指示される特異的なタンパク質分子を意味する。本発明の目的上、抗体は、前述したバイオマーカーに対して特異的に結合する抗体を意味し、このような抗体は、各遺伝子を通常の方法によって発現ベクターにクローニングして、前記バイオマーカー遺伝子によってコード化するタンパク質を得、得られたタンパク質から通常の方法によって製造することができる。ここには、前記タンパク質で作成され得る部分ペプチドも含まれ、本発明の部分ペプチドとしては、少なくとも７個のアミノ酸、好ましくは、９個のアミノ酸、より好ましくは、１２個以上のアミノ酸を含む。本発明の抗体の形態は、特に制限されず、ポリクロナール抗体、モノクロナール抗体または抗原結合性を有するものであれば、その一部も本発明の抗体に含まれ、すべての免疫グロブリン抗体が含まれる。しかも、本発
明の抗体には、ヒト化抗体などの特殊抗体も含まれる。このような本発明のバイオマーカー遺伝子がコード化するタンパク質に対する抗体は、当業界における公知の方法で製造することができるすべての抗体が挙げられる。例えば、前述したバイオマーカーの検出に使用される抗体は、２個の全長の軽鎖および２個の全長の重鎖を有する完全な形態だけでなく、抗体分子の機能的な断片を含んでもよい。前記抗体分子の機能的な断片とは、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖなどが挙げられるが、特にこれに制限されない。
明の抗体には、ヒト化抗体などの特殊抗体も含まれる。このような本発明のバイオマーカー遺伝子がコード化するタンパク質に対する抗体は、当業界における公知の方法で製造することができるすべての抗体が挙げられる。例えば、前述したバイオマーカーの検出に使用される抗体は、２個の全長の軽鎖および２個の全長の重鎖を有する完全な形態だけでなく、抗体分子の機能的な断片を含んでもよい。前記抗体分子の機能的な断片とは、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖなどが挙げられるが、特にこれに制限されない。
【0048】
本発明において、用語「アプタマー」とは、一本鎖オリゴヌクレオチドを意味し、抗体と類似した機能を有し、化学的抗体（ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）とも呼ばれ、所定の標的分子に対する結合活性を有する核酸分子を指す。前記アプタマーは、その塩基配列によって様々な三次元構造を有することができ、抗原抗体反応のように特定の物質に対して高い親和力を有することができる。アプタマーは、所定の標的分子に結合することによって、所定の標的分子の活性を阻害することができる。
【0049】
本発明のアプタマーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）核酸またはこれらの混合物であり得、その形態が直鎖状または環状（ｒｉｎｇ）であり得るが、これらに限定されない。前記３種のバイオマーカータンパク質それぞれに結合活性を有するアプタマーは、各塩基配列を参照して当該技術分野における通常の知識を有する者が公知の方法によって容易に製作することができる。
【0050】
本発明において、用語「プライマー」は、短い自由３′末端水酸化基（ｆｒｅｅ ３′
ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）を有する核酸配列で相補的な鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）と塩基対（ｂａｓｅ ｐａｉｒ）を形成することができ、鋳型のコピーのための開始地点として機能する短い核酸配列を意味する。本発明では、前述したバイオマーカーポリヌクレオチドのセンスおよびアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲ増幅を実施し、所望の生成物の生成の有無を通じてＣＭＬ患者のＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を診断することができる。ＰＣＲ条件、センスおよびアンチセンスプライマーの長さは、当業界に公知のものを基礎として変形することができる。
ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）を有する核酸配列で相補的な鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）と塩基対（ｂａｓｅ ｐａｉｒ）を形成することができ、鋳型のコピーのための開始地点として機能する短い核酸配列を意味する。本発明では、前述したバイオマーカーポリヌクレオチドのセンスおよびアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲ増幅を実施し、所望の生成物の生成の有無を通じてＣＭＬ患者のＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を診断することができる。ＰＣＲ条件、センスおよびアンチセンスプライマーの長さは、当業界に公知のものを基礎として変形することができる。
【0051】
本発明において、用語「プローブ（ｐｒｏｂｅ）」とは、ｍＲＮＡと特異的結合を形成することができる短くは数塩基～長くては数百塩基に該当するＲＮＡまたはＤＮＡなどの核酸断片を意味し、標識（ｌａｂｅｌｉｎｇ）されていて、特定のｍＲＮＡの存在の有無を確認することができる。プローブは、オリゴヌクレオチドプローブ、単鎖ＤＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ）プローブ、二本鎖ＤＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ）プローブ、ＲＮＡプローブなどの形態で製作することができる。本発明では、前述したバイオマーカーポリヌクレオチドと相補的なプローブを用いてハイブリダイゼーションを実施し、ハイブリダイゼーションの有無を通じて慢性骨髄性白血病患者のＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を診断することができる。適当なプローブの選択およびハイブリダイゼーション条件は、当業界に公知のものを基礎として変形することができる。
【0052】
本発明のプライマーまたはプローブは、ホスホロアミダイト固体支持体方法またはその他広く公知の方法を使用して化学的に合成することができる。このような核酸配列は、また、当該分野に公知の多くの手段を用いて修飾させることができる。このような修飾の非制限的例としては、メチル化、キャップ化、天然ヌクレオチド１つ以上の同族体への置換、およびヌクレオチド間の修飾、例えば、非荷電性連結体（例：メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロジアミデート、カルバマートなど）または荷電性連結体（例：ホスホロチオエート、ホスホロジチオアートなど）への修飾がある。
【0053】
本発明において用いられるバイオマーカー遺伝子の発現レベルを測定する製剤の塩基配列は、生物学的に均等活性を有する変異を考慮すると、バイオマーカー遺伝子に特異的に結合する配列と実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す配列も含むと解釈される。前記用語「実質的な同一性」は、特定の配列と任意の他の配列を最大限対応するように整列し（ａｌｉｇｎ）、当業界において通常用いられるアルゴリズムを用いて整列した配列を分析した場合に、最小６０％の同一性、より具体的には、７０％の同一性、さらに具体的には、８０％の同一性、最も具体的には、９０％の同一性を示す配列を意味する。
【0054】
本発明のキットは、ＲＴ－ＰＣＲキット、競合的ＲＴ－ＰＣＲキット、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲキット、ＤＮＡチップキット、マイクロアレイキット、ＳＡＧＥ（Ｓｅｒｉａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）キット、遺伝子チップキット、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）キット、タンパク質チップキット、ラピッド（ｒａｐｉｄ）キットまたはＭＲＭ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）キットであり得るが、これに制限されるものではない。具体的な例として、前記キットは、ＲＴ－ＰＣＲを行うために必要な必須要素を含むキットであり得る。例えば、ＲＴ－ＰＣＲキットは、バイオマーカー遺伝子に対する特異的なそれぞれのプライマーの他にも、テストチューブまたは他の適切なコンテナ、反応緩衝液（ｐＨおよびマグネシウム濃度は多様である）、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）、ジデオキシヌクレオチドｄｄＮＴＰｓ）、Ｔａｑ－ポリメラーゼおよび逆転写酵素のような酵素、ＤＮａｓｅ、ＲＮＡｓｅ阻害剤、ＤＥＰＣ水（ＤＥＰＣ－ｗａｔｅｒ）、滅菌水などを含んでもよい。また、定量対照群に使用されるＤＮＡまたはＲＮＡに特異的なプライマー対を含んでもよい。
【0055】
本発明のキットには、核酸（例えば、トータルＲＮＡ）を抽出するためのキット、標識用蛍光物質、核酸増幅用酵素および培地、使用説明書などを含ませることができる。
【0056】
本発明のキットは、前記核酸が、例えば、固相に結合または付着した膵臓がんに対するバイオマーカー測定のためのデバイスである。固相の材質の例は、プラスチック、紙、ガラス、シリコンなどであり、加工の容易さから好ましい固相の材質は、プラスチックである。固相の形状は、任意であり、例えば、四角形、円形、矩形、フィルム型などである。
【0057】
前記キットは、データ分析または統計処理を行うことができるプログラムをさらに含んでもよい。前記プログラムは、遺伝子またはタンパク質の発現レベルを分析するものであり得る。前記データ分析または統計処理プログラムは、Ｓｋｙｌｉｎｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＰｒｏｔｅｏＷｉｚａｒｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＳＣＩＥＸ ＯＳ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＳＰＳＳ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＭｅｄＣａｌｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＭｕｌｔｉＱｕａｎｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＭａｓｔｅｒＶｉｅｗ ＳｏｆｔｗａｒｅまたはＣｌｉｑｕｉｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅの中から選択された１つ以上であり得るが、これに限定されない。
【0058】
前記第１態様と関連して、本発明は、また、ＣＭＬ患者においてＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を診断するためのキットの製造時に、ＦＡＭ１６７Ａタンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを測定する製剤の用途に関する。
【0059】
本発明の第１態様による前述したすべての説明は、前記用途にも同一に適用されるところ、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
【0060】
本発明では、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示す細胞において上方制御される、
以前に特性化されていないタンパク質であるＦＡＭ１６７Ａを確認し、臨床サンプル分析結果でも、ＦＡＭ１６７ＡがＴＫＩ治療後だけでなく、ＣＭＬ診断時点にも、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性患者の細胞において上方制御されることを確認したところ、前記バイオマーカータンパク質を用いてＣＭＬ患者のＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を診断することができる。
以前に特性化されていないタンパク質であるＦＡＭ１６７Ａを確認し、臨床サンプル分析結果でも、ＦＡＭ１６７ＡがＴＫＩ治療後だけでなく、ＣＭＬ診断時点にも、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性患者の細胞において上方制御されることを確認したところ、前記バイオマーカータンパク質を用いてＣＭＬ患者のＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を診断することができる。
【0061】
したがって、本発明の第２態様は、ＦＡＭ１６７Ａバイオマーカーを用いた、慢性骨髄性白血病患者のＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を診断するための情報提供方法に関する。
【0062】
本明細書に使用された用語「情報提供方法（ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」とは、ＣＭＬ患者のＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性の有無に関する情報を提供する方法であり、本発明によるバイオマーカータンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルがＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性がないＣＭＬ、あるいは、ＴＫＩ感受性ＣＭＬに比べて増加したとき、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性に関する情報を獲得する方法を意味する。
【0063】
具体的には、本発明による慢性骨髄性白血病患者のＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を診断するための情報提供方法は、以下の段階を含んでもよい：
（ａ）慢性骨髄性白血病患者から分離した生物学的試料でＦＡＭ１６７Ａタンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを測定する段階；および
（ｂ）前記（ａ）段階で測定された発現レベルを、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性がない慢性骨髄性白血病患者から分離した生物学的試料で測定された同じタンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルと比較する段階。
（ａ）慢性骨髄性白血病患者から分離した生物学的試料でＦＡＭ１６７Ａタンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを測定する段階；および
（ｂ）前記（ａ）段階で測定された発現レベルを、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性がない慢性骨髄性白血病患者から分離した生物学的試料で測定された同じタンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルと比較する段階。
【0064】
本発明の情報提供方法は、（ｃ）前記（ａ）段階の慢性骨髄性白血病患者から分離した生物学的試料で測定されたＦＡＭ１６７Ａタンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルが、前記（ｂ）段階のＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性チロシンキナーゼ阻害剤耐性がない慢性骨髄性白血病患者から分離した生物学的試料で測定された同じタンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルより高い場合、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩに耐性を示すと判断する段階をさらに含んでもよい。
【0065】
本発明の情報提供方法において、前記慢性骨髄性白血病患者は、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩに耐性を診断しようとする対象であり、患者の対象は、ヒト、チンパンジーを含む霊長類、イヌ、ネコなどの愛玩動物、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギなどの家畜動物、マウス、ラットなどのげっ歯類などの哺乳動物を含む意味と解釈される。
【0066】
本発明の情報提供方法において、分析のために使用される「生物学的試料」は、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性がないＣＭＬ患者、あるいは、ＴＫＩ感受性ＣＭＬ患者と区別され得る、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性診断に特異的なバイオマーカータンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡレベルを確認できる生体試料を含む。例えば、前記生体試料は、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性の有無を判別しようとするＣＭＬ患者から分離したＣＤ３４＋幹細胞／前駆細胞を含む生体試料を意味し得、例えば、血液、血漿、血清、尿、粘液、唾液、涙、喀痰、脊髄液、胸水、乳頭吸引液、リンパ液、気道液、腸液、泌尿生殖器液、母乳、リンパ系体液、精液、脳脊髄液、気管系内体液、腹水、嚢胞性腫瘍体液、羊水液またはこれらの組み合わせを含むが、これに制限されない。
【0067】
本発明の情報提供方法において、前記バイオマーカーの発現レベルは、ＦＡＭ１６７Ａタンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルで測定することができ、生物学的試料からタンパク質またはｍＲＮＡの分離は、公知の工程を用いて行うことができる。
【0068】
本発明において、用語「タンパク質レベル測定」とは、試料において前記バイオマーカータンパク質またはその断片の存在の有無と発現程度を確認する過程であり、前記タンパク質またはその断片に対して特異的に結合する抗体などを用いてタンパク質の量を確認することができる。このために分析方法としては、ウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）、放射免疫測定（ＲＩＡ：ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射免疫拡散法（ｒａｄｉａｌ ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、オクタロニー免疫拡散法（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、ロケット免疫電気泳動（ｒｏｃｋｅｔ ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、免疫組織化学的染色法（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ）、免疫沈降アッセイ（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、補体結合アッセイ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、免疫蛍光法（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）、免疫クロマトグラフィー法（ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、質量分析法（ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、ＦＡＣＳ分析（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ）またはタンパク質チップ技術（ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｉｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）などがあるが、これに制限されるものではない。
【0069】
本発明において、用語、「ｍＲＮＡレベル測定」とは、試料において本発明のバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡ存在の有無と発現程度を確認する過程であり、ｍＲＮＡの量を測定することによって知ることが出来る。これのために分析方法としては、ＲＴ－ＰＣＲ、競合的ＲＴ－ＰＣＲ（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護法（ＲＮａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）、ノーザンブロット法（ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、サザンブロット法（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）インシチュ（Ｉｎ ｓｉｔｕ）交雑法またはＤＮＡチップ技術（ＤＮＡ ｃｈｉｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）などがあるが、これに制限されるものではない。
【0070】
例えば、前記バイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルは、ハイブリダイゼーション法または遺伝子増幅方法で測定することができる。前記ハイブリダイゼーション法は、プローブを用いて遺伝子の存在を確認するものであり得る。
【0071】
本発明の情報提供方法がハイブリダイゼーション方式のうちマイクロアレイ方式で実施される場合、上記したプローブは、ハイブリダイゼーションアレイ要素（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｂｌｅ ａｒｒａｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）として用いられ、基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）上に固定化される。好ましい基質は、堅固性または半堅固性支持体であり、例えば、膜、フィルター、チップ、スライド、ウェハー、ファイバー、磁性ビーズまたは非磁性ビーズ、ゲル、チュービング、プレート、高分子、微小粒子および毛細管を含む。前記ハイブリダイゼーションアレイ要素は、前記基質上に配列され、固定化される。このような固定化は、化学的結合方法またはＵＶのような共有結合方法によって実施される。例えば、前記ハイブリダイゼーションアレイ要素は、エポキシ化合物またはアルデヒド基を含むように修飾されたガラス表面に結合してもよく、また、ポリリジンコーティング表面でＵＶによって結合してもよい。また、前記ハイブリダイゼーションアレイ要素は、リンカー（イェ：エチレングリコールオリゴマーおよびジアミン）を介して基質に結合してもよい。
【0072】
なお、本発明のマイクロアレイに適用される試料ＤＮＡは、標識（ｌａｂｅｌｉｎｇ）されてもよく、マイクロアレイ上のアレイ要素とハイブリダイゼーションされる。ハイブリダイゼーション条件は、多様に変更することができる。また、ハイブリダイゼーション程度の検出および分析は、標識物質によって多様に実施することができる。
【0073】
プローブの標識は、ハイブリダイゼーションの有無を検出するシグナルを提供することができ、これは、オリゴヌクレオチドに連結され得る。適切な標識は、蛍光団（例えば、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ローダミン、リサミン（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）、そしてＣｙ３とＣｙ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））、ＴｄＴ（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、発色団、化学発光団、磁気粒子、放射能同位元素（Ｐ３２またはＳ３５）、質量標識、電子密集粒子、酵素（アルカリンホスファターゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼ）、補助因子、酵素に対する基質、重金属（例えば、金）、そして抗体、ストレプトアビジン、ビオチン、ジゴキシゲニンとキレート基のような特定の結合パートナーを有するヘプテンを含むが、これに限定されるものではない。標識は、当業界において通常実施される様々な方法、例えば、ニックトランスレーション法(ｎ
ｉｃｋ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）、ランダムプライミング法（Ｍｕｌｔｉｐｒｉｍｅ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍｓ ｂｏｏｋｌｅｔ，“Ａｍｅｒｓｈａｍ”（１９８９））およびカイネーション法（Ｍａｘａｍ ＆ Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５：４９９（１９８６））を通じて実施することができる。標識は、蛍光、放射能、発色測定、重量測定、Ｘ線回折または吸収、磁気、酵素活性、質量分析、結合親和性、ハイブリダイゼーション高周波、ナノクリスタルによって検出可能なシグナルを提供する。
ｉｃｋ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）、ランダムプライミング法（Ｍｕｌｔｉｐｒｉｍｅ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍｓ ｂｏｏｋｌｅｔ，“Ａｍｅｒｓｈａｍ”（１９８９））およびカイネーション法（Ｍａｘａｍ ＆ Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５：４９９（１９８６））を通じて実施することができる。標識は、蛍光、放射能、発色測定、重量測定、Ｘ線回折または吸収、磁気、酵素活性、質量分析、結合親和性、ハイブリダイゼーション高周波、ナノクリスタルによって検出可能なシグナルを提供する。
【0074】
プローブを用いる場合、プローブをｃＤＮＡ分子とハイブリダイゼーションさせる。本発明において、適切なハイブリダイゼーション条件は、最適化手続きによって一連の過程で決定することができる。このような手続きは、研究室で使用のためのプロトコルを樹立するために、当業者によって一連の過程で実施する。例えば、温度、成分の濃度、ハイブリダイゼーションおよび洗浄時間、緩衝液成分およびこれらのｐＨおよびイオン強度などの条件は、プローブの長さおよびＧＣ量およびターゲットヌクレオチド配列などの様々な因子に依存する。
【0075】
ハイブリダイゼーション反応後に、ハイブリダイゼーション反応を通じて出るハイブリダイゼーションシグナルを検出する。ハイブリダイゼーションシグナルは、例えば、プローブに結合した標識の種類によって様々な方法で実施することができる。例えば、プローブが酵素によって標識された場合、この酵素の基質をハイブリダイゼーション反応結果物と反応させてハイブリダイゼーションの有無を確認することができる。用いられ得る酵素／基質の組み合わせは、ペルオキシダーゼ（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ）とクルロロナフトール、アミノエチルカルバゾール、ジアミノベンジジン、Ｄ－ルシフェリン、ルシゲニン（ビス－Ｎ－メチルアクリジニウムニトラート）、レゾルフィンベンジルエーテル、ルミノール、アンプレックスレッド試薬（１０－アセチル－３，７－ジヒドロキシフェノキサジン）、ＨＹＲ（ｐ－ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ－ＨＣｌ
ａｎｄ ｐｙｒｏｃａｔｅｃｈｏｌ）、ＴＭＢ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＡＢＴＳ（２，２’－Ａｚｉｎｅ－ｄｉ［３－ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ］）、ｏ－フェニレンジアミン（ＯＰＤ）およびナフトール／ピロニン；アルカリンホスファターゼとブロモクロロインドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ナフトール－ＡＳ－Ｂ１－ホスフェート（ｎａｐｈｔｈｏｌ－ＡＳ－Ｂ１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）およびＥＣＦ基質；グルコースオキシダーゼとｔ－ＮＢＴ（ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）および
ｍ－ＰＭＳ（ｐｈｅｎｚａｉｎｅ ｍｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ）などである。プローブが金粒子で標識された場合には、硝酸銀を用いて銀染色方法で検出することができる。
ａｎｄ ｐｙｒｏｃａｔｅｃｈｏｌ）、ＴＭＢ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＡＢＴＳ（２，２’－Ａｚｉｎｅ－ｄｉ［３－ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ］）、ｏ－フェニレンジアミン（ＯＰＤ）およびナフトール／ピロニン；アルカリンホスファターゼとブロモクロロインドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ナフトール－ＡＳ－Ｂ１－ホスフェート（ｎａｐｈｔｈｏｌ－ＡＳ－Ｂ１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）およびＥＣＦ基質；グルコースオキシダーゼとｔ－ＮＢＴ（ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）および
ｍ－ＰＭＳ（ｐｈｅｎｚａｉｎｅ ｍｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ）などである。プローブが金粒子で標識された場合には、硝酸銀を用いて銀染色方法で検出することができる。
【0076】
本発明では、ＦＡＭ１６７Ａを中和すると、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性がある細胞においてＴＫＩ感受性が回復し、マウス腫瘍モデルにおいてＴＫＩ耐性が逆転することを確認したところ、ＦＡＭ１６７Ａタンパク質バイオマーカーをターゲットとするＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示すＣＭＬに対する治療剤およびＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性阻害剤を提供することができる。
【0077】
したがって、本発明の第３態様は、ＦＡＭ１６７Ａタンパク質阻害剤；ＦＡＭ１６７Ａタンパク質をコード化する遺伝子の発現阻害剤；またはこれらの混合物を有効成分として含む、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示すＣＭＬ予防または治療用医薬組成物およびＣＭＬ患者のＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性阻害用医薬組成物に関する。
【0078】
本発明において、前記ＦＡＭ１６７Ａタンパク質阻害剤は、ＦＡＭ１６７Ａタンパク質の発現を減少させるか、機能または活性を減少させる製剤を含んでもよい。
【0079】
本発明において、前記ＦＡＭ１６７Ａタンパク質をコード化する遺伝子の発現阻害剤は、ＦＡＭ１６７Ａ遺伝子のｍＲＮＡ発現を減少させる製剤を含んでもよい。
【0080】
前記ＦＡＭ１６７Ａタンパク質阻害剤は、ＦＡＭ１６７タンパク質と結合し、非標準ＮＦ－κＢ活性を減少させるペプチドまたは化合物などであり得る。このような阻害剤は、タンパク質構造分析などの下記例示されたスクリーニング方法を通じて選定することができ、当業界に公知の方法を用いて設計することができる。
【0081】
具体的には、前記ＦＡＭ１６７Ａタンパク質阻害剤は、ＦＡＭ１６７Ａタンパク質に特異的に結合する低分子化合物、ペプチド、ペプチドミメティックス（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）、アプタマー、抗体および天然物から成る群から選択されるいずれか１つ以上を含んでもよいが、これに制限されない。
【0082】
前記ＦＡＭ１６７Ａタンパク質をコード化する遺伝子の発現阻害剤は、遺伝子自体に結合し、転写を妨害するか、遺伝子から転写したｍＲＮＡに結合し、ｍＲＮＡの翻訳を妨害する阻害剤であり得る。例えば、前記遺伝子の発現阻害剤は、ＦＡＭ１６７Ａ遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合するアンチセンスヌクレオチド、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡから成る群から選択されるいずれか１つ以上を含んでもよいが、これに制限されない。
【0083】
本発明において、用語「ｓｉＲＮＡ」は、標的遺伝子のｍＲＮＡの切断を通じてＲＮＡ干渉現象を誘導する二本鎖ＲＮＡを意味し、標的遺伝子のｍＲＮＡのような配列を有するセンス配列のＲＮＡ鎖とこれと相補的な配列を有するアンチセンス配列のＲＮＡ鎖で構成される。
【0084】
前記ｓｉＲＮＡは、試験管内で合成したｓｉＲＮＡ自体またはｓｉＲＮＡをコードする塩基配列を発現ベクターに挿入して発現する形態を含んでもよい。
【0085】
本発明において、前記「ベクター」は、ポリペプチドをコード化するゲノム内に挿入された外部ＤＮＡを含む遺伝子コンストラクトを指す。
【0086】
本発明に関連したベクターは、前記遺伝子を阻害する核酸配列がゲノム内に挿入されたベクターであり、これらのベクターは、ＤＮＡベクター、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター、酵母ベクター、またはウイルスベクターを例示
することができる。
することができる。
【0087】
また、前記アンチセンスは、ＦＡＭ１６７Ａ遺伝子またはその断片から転写するｍＲＮＡ配列全体または一部と相補的な配列を有し、前記ｍＲＮＡと結合して前記ＦＡＭ１６７Ａ遺伝子または断片の発現を阻害することができる。
【0088】
また、前記ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）は、ヒトまたはマウスのｓｈＲＮＡ共通塩基配列部位をターゲットとして通常の方法によって製作されたものを使用することができる。
【0089】
本発明において、前記ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示す慢性骨髄性白血病は、ＴＫＩ感受性を示すＣＭＬに比べてＮＦ－κＢ活性が増加することができる。
【0090】
本発明において、前記医薬組成物は、ＴＫＩと併用投与され得る。
【0091】
本発明において、用語「併用投与」は、異なる成分が対象に一緒に投与されることを意味する。異なる成分が一緒に投与されるというのは、所望の治療効果を得るために、各成分を同じ時間に、または任意の順序で、または異なる時間に順次に投与することができることを意味する。
【0092】
したがって、本発明の医薬組成物は、ＴＫＩと同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）、別々に（ｓｅｐａｒａｔｅ）または順次に（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ）投与され得る。
【0093】
本発明において、前記ＴＫＩは、クリゾチニブ（ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ）、セリチニブ（ｃｅｒｉｔｉｎｉｂ）、アレクチニブ（ａｌｅｃｔｉｎｉｂ）、ブリグチニブ（ｂｒｉｇａｔｉｎｉｂ）、ボスチニブ（ｂｏｓｕｔｉｎｉｂ）、ダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）、イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）、ニロチニブ（ｎｉｌｏｔｉｎｉｂ）、ポナチニブ（ｐｏｎａｔｉｎｉｂ）、イブルチニブ（ｉｂｒｕｔｉｎｉｂ）、カボザンチニブ（ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ）、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、ラパチニブ（ｌａｐａｔｉｎｉｂ）、バンデタニブ（ｖａｎｄｅｔａｎｉｂ）、アファチニブ（ａｆａｔｉｎｉｂ）、オシメルチニブ（ｏｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂ）、ルキソリチニブ（ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂ）、トファシチニブ（ｔｏｆａｃｉｔｉｎｉｂ）、アキシチニブ（ａｘｉｔｉｎｉｂ）、レンバチニブ（ｌｅｎｖａｔｉｎｉｂ）、ニンテダニブ（ｎｉｎｔｅｄａｎｉｂ）、パゾパニブ（ｐａｚｏｐａｎｉｂ）、レゴラフェニブ（ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ）、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）またはスニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）を含んでもよいが、これに制限されない。
【0094】
本発明において、用語「予防」および／または「治療」は、病気または病症の発症を抑制または遅延させるすべての行為、病気または病症状態を好転または有益に変更するすべての行為、および病気または病症の進行を遅延、中断または逆転させるすべての行為を意味する。
【0095】
本発明の医薬組成物は、医薬組成物の製造に通常使用する適切な担体、賦形剤、崩解剤、甘味剤、被覆剤、膨張剤、潤滑剤、滑沢剤、香味剤、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤から成る群から選択される１つ以上の添加剤をさらに含んでもよい。
【0096】
具体的には、担体、賦形剤および希釈剤は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリ
ケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾアート、プロピルヒドロキシベンゾアート、タルク、マグネシウムステアレートおよび鉱物油を使用することができる。
ケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾアート、プロピルヒドロキシベンゾアート、タルク、マグネシウムステアレートおよび鉱物油を使用することができる。
【0097】
経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、前記組成物に少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、カルシウムカーボネート、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調製することができる。また、単純な賦形剤以外に、マグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も使用することができる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などがあり、頻繁に使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に、様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。
【0098】
他の態様において、本発明の医薬組成物に含まれる担体は、イオン交換樹脂、アルミナ、アルミニウムステアレート、レシチン、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）、緩衝物質（例えば、各種リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、カリウムソルベート、飽和植物性脂肪酸の部分的なグリセリド混合物）、水、塩または電解質（例えば、プロタミンサルフェート、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウムおよび亜鉛塩）、架橋性シリカ、マグネシウムトリシリケート、ポリビニルピロリドン、セルロース系基質、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアリレート、ワックス、ポリエチレングリコールまたは羊毛紙などを含むが、これに制限されない。
【0099】
非経口投与のための製剤には、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤などが含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、エチルオレートのような注射用エステルなどが使用され得る。坐剤の基材としては、ウィテプソール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用され得る。
【0100】
本発明による医薬組成物は、非経口投与のための水溶性溶液で製造することができ、好ましくは、ハンクス溶液（Ｈａｎｋ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、リンゲル溶液（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）または物理的に緩衝された塩水のような緩衝溶液を使用することができる。水溶性注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランのように懸濁液の粘度を増加させることができる基質を添加することができる。
【0101】
また、本発明の医薬組成物は、前記成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、または保存剤などをさらに含んでもよい。
【0102】
本発明の医薬組成物は、全身または局所的に投与され得、このような投与のために、公知の技術で適切な剤形で製剤化することができる。例えば、経口投与時には、不活性希釈剤または食用担体と混合するか、硬質または軟質ゼラチンカプセルにシールするか、または錠剤に圧型して投与することができる。経口投与用の場合、活性化合物は、賦形剤と混合して、摂取型錠剤、頬側錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、サスペンション、シロップ、ウェハーなどの形態で使用され得る。
【0103】
本発明の医薬組成物の有効成分の有効量は、疾患の予防、抑制または軽減効果を達成するのに要求される量を意味する。したがって、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含有された有効成分および他の成分の種類および含有量、剤形の種類および患者の年齢、体重
、一般健康状態、性別および食事、投与時間、投与経路および組成物の分泌率、治療期間、同時使用される薬物を含む様々な因子によって調節することができる。
、一般健康状態、性別および食事、投与時間、投与経路および組成物の分泌率、治療期間、同時使用される薬物を含む様々な因子によって調節することができる。
【0104】
前記第３態様と関連して、本発明は、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示すＣＭＬ患者にＦＡＭ１６７Ａタンパク質阻害剤、ＦＡＭ１６７Ａタンパク質をコード化する遺伝子の発現阻害剤またはこれらの混合物を治療学的有効量で投与する段階を含むＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示すＣＭＬの治療方法およびＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性の阻害方法を提供する。
【0105】
本発明において、前記方法に使用されるＦＡＭ１６７Ａタンパク質阻害剤またはＦＡＭ１６７Ａタンパク質をコード化する遺伝子の発現阻害剤およびこれの投与方法は、前述の通りであるので、本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
【0106】
なお、前記ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示すＣＭＬ患者の対象は、前記情報提供方法で説明された患者の対象と同一なので、本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
【0107】
前記第３態様と関連して、本発明は、また、以下の段階を含む、慢性骨髄性白血病患者のＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性の診断およびＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示す慢性骨髄性白血病の治療方法を提供する：
【0108】
（ａ）慢性骨髄性白血病患者から分離した生物学的試料でＦＡＭ１６７Ａタンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを測定する段階；
（ｂ）前記（ａ）段階で測定された発現レベルが、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性がない慢性骨髄性白血病患者から分離した生物学的試料で測定された同じタンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルより増加する場合、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示すものと診断する段階；および
（ｃ）前記（ｂ）段階でＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示すものと診断された患者にＦＡＭ１６７Ａタンパク質阻害剤、ＦＡＭ１６７Ａタンパク質をコード化する遺伝子の発現阻害剤またはこれらの混合物の治療学的有効量を投与する段階。
（ｂ）前記（ａ）段階で測定された発現レベルが、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性がない慢性骨髄性白血病患者から分離した生物学的試料で測定された同じタンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルより増加する場合、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示すものと診断する段階；および
（ｃ）前記（ｂ）段階でＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示すものと診断された患者にＦＡＭ１６７Ａタンパク質阻害剤、ＦＡＭ１６７Ａタンパク質をコード化する遺伝子の発現阻害剤またはこれらの混合物の治療学的有効量を投与する段階。
【0109】
前記第３態様と関連して、本発明は、また、以下の段階を含む、慢性骨髄性白血病患者のＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性の診断およびＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性阻害方法を提供する：
（ａ）慢性骨髄性白血病患者から分離した生物学的試料でＦＡＭ１６７Ａタンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを測定する段階；
（ｂ）前記（ａ）段階で測定された発現レベルが、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性がない慢性骨髄性白血病患者から分離した生物学的試料で測定された同じタンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルより増加する場合、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示すものと診断する段階；および
（ｃ）前記（ｂ）段階でＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示すものと診断された患者にＦＡＭ１６７Ａタンパク質阻害剤、ＦＡＭ１６７Ａタンパク質をコード化する遺伝子の発現阻害剤またはこれらの混合物の治療学的有効量を投与する段階。
（ａ）慢性骨髄性白血病患者から分離した生物学的試料でＦＡＭ１６７Ａタンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを測定する段階；
（ｂ）前記（ａ）段階で測定された発現レベルが、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性がない慢性骨髄性白血病患者から分離した生物学的試料で測定された同じタンパク質、その断片または前記タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルより増加する場合、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示すものと診断する段階；および
（ｃ）前記（ｂ）段階でＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示すものと診断された患者にＦＡＭ１６７Ａタンパク質阻害剤、ＦＡＭ１６７Ａタンパク質をコード化する遺伝子の発現阻害剤またはこれらの混合物の治療学的有効量を投与する段階。
【0110】
同様に、前記方法に使用されるＦＡＭ１６７Ａタンパク質阻害剤またはＦＡＭ１６７Ａタンパク質をコード化する遺伝子の発現阻害剤およびその投与方法は、前述の通りであるので、本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
【0111】
また、前記ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示すＣＭＬ患者の対象は、前記情報提供方法で説明された患者の対象と同一なので、本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
【0112】
本発明において、前記ＦＡＭ１６７Ａタンパク質阻害剤、ＦＡＭ１６７Ａタンパク質をコード化する遺伝子の発現阻害剤またはこれらの混合物は、ＴＫＩと併用投与され得、併用投与およびＴＫＩ種類などは、前記医薬組成物で説明されたものと同一なので、本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
【0113】
前記第３態様と関連して、本発明は、また、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示すＣＭＬを予防または治療するための薬剤の製造時に、またはＣＭＬ患者においてＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を阻害するための薬剤の製造時に、ＦＡＭ１６７Ａタンパク質阻害剤；ＦＡＭ１６７Ａタンパク質をコード化する遺伝子の発現阻害剤；またはこれらの混合物の用途を提供する。
【0114】
前記第３態様と関連して、本発明は、また、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示す慢性骨髄性白血病を予防または治療するための薬剤の製造時に、ＦＡＭ１６７Ａタンパク質阻害剤；ＦＡＭ１６７Ａタンパク質をコード化する遺伝子の発現阻害剤；またはこれらの混合物の用途に関する。
【0115】
前記第３態様と関連して、本発明は、また、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示す慢性骨髄性白血病患者のＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を阻害するための薬剤の製造時に、ＦＡＭ１６７Ａタンパク質阻害剤；ＦＡＭ１６７Ａタンパク質をコード化する遺伝子の発現阻害剤；またはこれらの混合物の用途に関する。
【0116】
本発明の第３態様による前述したすべての説明は、前記用途にも同一に適用されるところ、本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
【0117】
本発明では、ＦＡＭ１６７Ａを中和すると、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性がある細胞においてＴＫＩ感受性が回復し、マウス腫瘍モデルにおいてＴＫＩ耐性が逆転することを確認したところ、ＦＡＭ１６７Ａタンパク質バイオマーカーの阻害の有無によってＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示すＣＭＬの治療剤およびＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性阻害剤と判断できる基準を提供する。
【0118】
したがって、本発明の第４態様は、ＦＡＭ１６７Ａバイオマーカーを用いた、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示すＣＭＬの治療剤またはＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性阻害剤のスクリーニング方法に関する。
【0119】
具体的には、本発明のスクリーニング方法は、以下の段階を含んでもよい：
（ａ）ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示す細胞株または動物モデルに候補物質を処理する段階；および
（ｂ）前記候補物質が処理された細胞株または動物モデルにおいてＦＡＭ１６７Ａタンパク質の阻害の有無および／または前記タンパク質をコード化する遺伝子発現の阻害の有無を確認する段階。
（ａ）ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示す細胞株または動物モデルに候補物質を処理する段階；および
（ｂ）前記候補物質が処理された細胞株または動物モデルにおいてＦＡＭ１６７Ａタンパク質の阻害の有無および／または前記タンパク質をコード化する遺伝子発現の阻害の有無を確認する段階。
【0120】
本発明において、前記候補物質は、通常の選定方式によってＦＡＭ１６７Ａ遺伝子塩基配列においてｍＲＮＡ、タンパク質への転写、翻訳を阻害する物質またはＦＡＭ１６７Ａタンパク質の機能または活性を阻害する医薬としての可能性を有するものと推定されるか、または無作為的に選定された個別的な核酸、タンパク質、ペプチド、その他抽出物、天然物、化合物などになり得る。
【0121】
その後、候補物質が処理された細胞株または動物モデルから分離した生物学的試料で前記遺伝子の発現量、タンパク質のレベルまたは活性を測定することができ、測定結果、前記遺伝子の発現量、タンパク質のレベルまたは活性が減少することが測定されると、前記候補物質は、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示すＣＭＬの治療剤およびＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性阻害剤と判断することができる。
【0122】
したがって、本発明のスクリーニング方法は、（ｃ）前記候補物質がＦＡＭ１６７Ａタンパク質を阻害するか、前記タンパク質をコード化する遺伝子発現を阻害する場合、前記候補物質をＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示すＣＭＬの治療剤またはＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性阻害剤と判断する段階をさらに含んでもよい。
【0123】
本発明において、上記において遺伝子の発現量、タンパク質のレベルまたは活性を測定する方法は、当業界に公知の様々な方法を通じて実行することができ、前記情報提供方法で説明したものと同一なので、本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
【0124】
本発明において、前記候補物質は、後のＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示すＣＭＬの治療剤およびＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性阻害剤の開発過程でリード化合物（ｌｅａｄｉｎｇ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）として作用し、リード化合物がＦＡＭ１６７Ａ遺伝子またはこれから発現するタンパク質の機能を抑制させる効果を示すことができるようにその構造を修飾させ、最適化することによって、新しいＣＭＬの治療剤およびＴＫＩ耐性阻害剤を開発することができる。
【0125】
以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。ただし、本発明は、様々な変更を加えることができ、様々な形態を有することができるところ、以下で記述する特定の実施例および説明は、本発明の理解を助けるためのものに過ぎず、本発明を特定の開示形態に対して限定しようとするものではない。本発明の範囲は、本発明の思想および技術範囲に含まれるすべての変更、均等物ないし代替物を含むものと理解すべきである。
【実施例】
【0126】
［実施例１］
ＴＫＩ－耐性ＣＭＬ細胞において差次的発現する遺伝子およびこれを調節する転写因子の確認
１－１．細胞培養
ヒトＣＭＬ細胞株Ｋ５６２Ｓは、韓国細胞株バンクから入手した。ＫＣＬ２２Ｓは、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手した。Ｋ５６２Ｒ細胞株は、Ｋ５６２ＳからＴＫＩの濃度を徐々に増加させて細胞に処理することによって生成された。すべての細胞株は、加湿された細胞培養インキュベーターで３７℃および５％ＣＯ２に維持され、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンが補充されたＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）１６４０培地（ＨｙＣｌｏｎｅ）で培養された。ＴＫＩ耐性を維持するために、Ｋ５６２ＲおよびＫＣＬ２２Ｒ細胞を１μＭイマチニブが補充された培地で培養した。
ＴＫＩ－耐性ＣＭＬ細胞において差次的発現する遺伝子およびこれを調節する転写因子の確認
１－１．細胞培養
ヒトＣＭＬ細胞株Ｋ５６２Ｓは、韓国細胞株バンクから入手した。ＫＣＬ２２Ｓは、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手した。Ｋ５６２Ｒ細胞株は、Ｋ５６２ＳからＴＫＩの濃度を徐々に増加させて細胞に処理することによって生成された。すべての細胞株は、加湿された細胞培養インキュベーターで３７℃および５％ＣＯ２に維持され、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンが補充されたＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）１６４０培地（ＨｙＣｌｏｎｅ）で培養された。ＴＫＩ耐性を維持するために、Ｋ５６２ＲおよびＫＣＬ２２Ｒ細胞を１μＭイマチニブが補充された培地で培養した。
【0127】
１－２．マイクロアレイおよびＲＮＡ－ｓｅｑ分析
ＢＣＲ－ＡＢＬキナーゼドメインの突然変異を伴わないＴＫＩ耐性（すなわち、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性）はよく知られていない。これによって、本発明者らは、ＴＫＩ耐性ＣＭＬ細胞において差次的発現する遺伝子を確認し、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性で潜在的な役割をする遺伝子を探そうとした（図１ａ）。したがって、ＢＣＲ－
ＡＢＬキナーゼドメインに突然変異がないＴＫＩ耐性ＣＭＬ細胞株であるＫ５６２Ｒ（図１ｂ～図１ｅ）を前記実施例１－１のように生成した後、ＴＫＩ感受性Ｋ５６２Ｓ細胞、Ｋ５６２Ｒ細胞およびイマチニブで処理されたＫ５６２Ｒ細胞において遺伝子発現を分析し、分析方法による偽陽性を除去するために、マイクロアレイおよびＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）分析を全部行った。
ＢＣＲ－ＡＢＬキナーゼドメインの突然変異を伴わないＴＫＩ耐性（すなわち、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性）はよく知られていない。これによって、本発明者らは、ＴＫＩ耐性ＣＭＬ細胞において差次的発現する遺伝子を確認し、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性で潜在的な役割をする遺伝子を探そうとした（図１ａ）。したがって、ＢＣＲ－
ＡＢＬキナーゼドメインに突然変異がないＴＫＩ耐性ＣＭＬ細胞株であるＫ５６２Ｒ（図１ｂ～図１ｅ）を前記実施例１－１のように生成した後、ＴＫＩ感受性Ｋ５６２Ｓ細胞、Ｋ５６２Ｒ細胞およびイマチニブで処理されたＫ５６２Ｒ細胞において遺伝子発現を分析し、分析方法による偽陽性を除去するために、マイクロアレイおよびＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）分析を全部行った。
【0128】
マイクロアレイおよびＲＮＡ－ｓｅｑ分析方法は、以下の通りである。トータルＲＮＡは、ＴＲＩ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）で抽出した。マイクロアレイの場合、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｏｔａｌＰｒｅｐ ＲＮＡ増幅キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用してｃＤＮＡおよびビオチニル化したｃＲＮＡの合成を行った。標識されたｃＲＮＡをＨｕｍａｎ ＨＴ－１２ ｖ４ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＢｅａｄＣｈｉｐ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）にハイブリダイズし、アレイをＢｅａｄ Ａｒｒａｙ Ｒｅａｄｅｒ共焦点スキャナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でスキャンした。ＲＮＡ－ｓｅｑの場合、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑプロトコルに従ってＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ ＬＴ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してライブラリーを準備した。ＮｏｖａＳｅｑ ６０００システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してペアエンドシーケンシング（ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行った。倍数変化≧２を示す遺伝子は、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｖｉｅｗｅｒで生成されたヒートマップに差次的に表現され、表示されるものと定義される。
【0129】
【0130】
１－３．イン・シリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）分析
差次的発現した遺伝子を識別することに加えて、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性耐性ＣＭＬ細胞において特異的に差次的発現した遺伝子を調節できる転写因子を確認しようとした。活性化した転写因子のイン・シリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）分析のために、ＧｅｎｅＣａｒｄｓデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃ ａｒｄｓ．ｏｒｇ／）から差次的に発現するか、無作為に選択された遺伝子プロモーターでそれぞれの結合部位と関連した転写因子に関する情報を得、プロットは、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅを使用して生成した。転写因子のエンリッチメントスコアは、以下の等式を使用して計算した：
エンリッチメントスコア＝（差次的に発現した遺伝子と関連した転写因子の割合）／（無作為に選択された遺伝子と関連した転写因子の割合）×（転写因子と関連した差次的に発現した遺伝子の数）。
差次的発現した遺伝子を識別することに加えて、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性耐性ＣＭＬ細胞において特異的に差次的発現した遺伝子を調節できる転写因子を確認しようとした。活性化した転写因子のイン・シリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）分析のために、ＧｅｎｅＣａｒｄｓデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃ ａｒｄｓ．ｏｒｇ／）から差次的に発現するか、無作為に選択された遺伝子プロモーターでそれぞれの結合部位と関連した転写因子に関する情報を得、プロットは、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅを使用して生成した。転写因子のエンリッチメントスコアは、以下の等式を使用して計算した：
エンリッチメントスコア＝（差次的に発現した遺伝子と関連した転写因子の割合）／（無作為に選択された遺伝子と関連した転写因子の割合）×（転写因子と関連した差次的に発現した遺伝子の数）。
【0131】
ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性ＣＭＬ細胞の差次的遺伝子発現に関与する転写因子のイン・シリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）分析を通じてＡＰ－１およびＮＦ－κＢが無作為に選択された遺伝子と比較して差次的発現した遺伝子の調節因子のうちで最も豊富な転写因子であることを明らかにした（図１ｈ～図１ｍ）。ＡＰ－１とＮＦ－κＢは、他の転写因子に比べて顕著に高いエンリッチメントスコアを示し、これらの２つの転写因子に対するスコアのみが平均から３標準偏差を外れた。
【0132】
１－４．ルシフェラーゼレポータ分析
ＴＫＩ耐性細胞株においてＡＰ－１とＮＦ－κＢ活性の差異を確認するために、Ｋ５６２Ｒ細胞、Ｋ５６２Ｓ細胞およびイマチニブが処理されたＫ５６２Ｒ細胞においてＡＰ－１およびＮＦ－κＢレポータアッセイを行い、ＴＫＩ治療の効果を調査した。
ＴＫＩ耐性細胞株においてＡＰ－１とＮＦ－κＢ活性の差異を確認するために、Ｋ５６２Ｒ細胞、Ｋ５６２Ｓ細胞およびイマチニブが処理されたＫ５６２Ｒ細胞においてＡＰ－１およびＮＦ－κＢレポータアッセイを行い、ＴＫＩ治療の効果を調査した。
【0133】
このために、Ｋ５６２ＳおよびＫ５６２Ｒ細胞は、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して文献［Ｐａｒｋ ＳＧ，Ｓｃｈｕｌｚｅ－Ｌｕｅｈｒｍａｎ
Ｊ，Ｈａｙｄｅｎ ＭＳ，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ Ｎ、Ｏｇａｗａ Ｗ，Ｋａｓｕｇａ
Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｋｉｎａｓｅ ＰＤＫ１ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｓ Ｔ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ＣＤ２８ ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ＮＦ－ｋａｐｐａＢ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｅ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９；１０（２）：１５８－６６．］に記載のレニラルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）ベクターとＮＦ－κＢ依存性レポータコンストラクト（ｐＢＩＩｘ－ｌｕｃ）または文献［Ｚｈａｎｇ Ｄ，Ｚｈａｎｇ Ｇ，Ｈａｙｄｅｎ ＭＳ，Ｇｒｅｅｎｂｌａｔｔ ＭＢ，Ｂｕｓｓｅｙ Ｃ，Ｆｌａｖｅｌｌ ＲＡ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｈａｔ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００４；３０３（５６６３）：１５２２－６．］に記載のＡＰ－１依存性レポータコンストラクト（ＡＰ－１－ｌｕｃ）とその他プラスミドで同時形質感染させた後、各文献に示されているように処理した。形質感染２４時間後、Ｄｕａｌ－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してルシフェラーゼ活性を測定し、レニラルシフェラーゼ活性に正規化した。
Ｊ，Ｈａｙｄｅｎ ＭＳ，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ Ｎ、Ｏｇａｗａ Ｗ，Ｋａｓｕｇａ
Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｋｉｎａｓｅ ＰＤＫ１ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｓ Ｔ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ＣＤ２８ ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ＮＦ－ｋａｐｐａＢ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｅ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９；１０（２）：１５８－６６．］に記載のレニラルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）ベクターとＮＦ－κＢ依存性レポータコンストラクト（ｐＢＩＩｘ－ｌｕｃ）または文献［Ｚｈａｎｇ Ｄ，Ｚｈａｎｇ Ｇ，Ｈａｙｄｅｎ ＭＳ，Ｇｒｅｅｎｂｌａｔｔ ＭＢ，Ｂｕｓｓｅｙ Ｃ，Ｆｌａｖｅｌｌ ＲＡ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｈａｔ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００４；３０３（５６６３）：１５２２－６．］に記載のＡＰ－１依存性レポータコンストラクト（ＡＰ－１－ｌｕｃ）とその他プラスミドで同時形質感染させた後、各文献に示されているように処理した。形質感染２４時間後、Ｄｕａｌ－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してルシフェラーゼ活性を測定し、レニラルシフェラーゼ活性に正規化した。
【0134】
結果は、ＡＰ－１でなく、ＮＦ－κＢ活性がＫ５６２Ｓ細胞よりもＫ５６２Ｒ細胞において有意にさらに高いことを示した。また、この活性は、イマチニブで処理されたＫ５６２Ｒ細胞において格別に高かったが、ＡＰ－１活性には、有意差がなかった（図１ｎ）。これは、ＮＦ－κＢが遺伝子発現を調節することによって、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性に寄与することを示唆する。また、Ｋ５６２Ｒ細胞において増加したＮＦ－κＢ活性に関連した遺伝子を確認するために、Ｋ５６２Ｓ、Ｋ５６２Ｒおよびイマチニブで処理されたＫ５６２Ｒ細胞の遺伝子発現プロファイルデータを使用してパターンＮＦ－κＢ活性と類似した発現様相を示した７個の差次的発現遺伝子（ＦＡＭ１６７Ａ、ＡＩＦ１Ｌ、ＡＣＳＳ１、Ｓ１００Ａ４、ＬＹ６Ｇ６Ｄ、ＣＹＰ１１Ａ１およびＮＲ５Ａ１）を選択した。
【0135】
１－５．定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）
選択された遺伝子の発現レベルを確認するために、ｑＲＴ－ＰＣＲを行った。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してトータル細胞ＲＮＡを分離し、ＴＯＰｓｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｄｒｙｍｉｘ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ）としてｃＤＮＡを準備した。ｑＲＴ－ＰＣＲは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｍｘ３０００Ｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ２ｘ Ｐｒｅｍｉｘ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ）を使用して行われた。結果は、ＧＡＰＤＨレベルに正規化された。ｑＲＴ－ＰＣＲに使用されたプライマー配列は、表１に示し、ｑＲＴ－ＰＣＲ結果は、図１ｏに示した。
選択された遺伝子の発現レベルを確認するために、ｑＲＴ－ＰＣＲを行った。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してトータル細胞ＲＮＡを分離し、ＴＯＰｓｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｄｒｙｍｉｘ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ）としてｃＤＮＡを準備した。ｑＲＴ－ＰＣＲは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｍｘ３０００Ｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ２ｘ Ｐｒｅｍｉｘ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ）を使用して行われた。結果は、ＧＡＰＤＨレベルに正規化された。ｑＲＴ－ＰＣＲに使用されたプライマー配列は、表１に示し、ｑＲＴ－ＰＣＲ結果は、図１ｏに示した。
【0136】
【表1】
【0137】
［実施例２］
非標準ＮＦ－κＢ経路におけるＦＡＭ１６７Ａ役割
２－１．選択された遺伝子のルシフェラーゼレポータ分析
選択された遺伝子をスクリーニングするために、表示された遺伝子をコード化するプラスミドで形質感染されたＫ５６２Ｓ細胞においてＮＦ－κＢ活性をルシフェラーゼレポータ分析で確認した。前記プラスミドは、ＨＡタグＳ１００Ａ４、ＣＹＰ１１Ａ１、ＡＣＳＳ１、ＬＹ６Ｇ６Ｄ、ＮＲ５Ａ１、ＡＩＦ１ＬおよびＦＡＭ１６７ＡをＭｉｇＲ１ベクターにクローニングして製造した。
非標準ＮＦ－κＢ経路におけるＦＡＭ１６７Ａ役割
２－１．選択された遺伝子のルシフェラーゼレポータ分析
選択された遺伝子をスクリーニングするために、表示された遺伝子をコード化するプラスミドで形質感染されたＫ５６２Ｓ細胞においてＮＦ－κＢ活性をルシフェラーゼレポータ分析で確認した。前記プラスミドは、ＨＡタグＳ１００Ａ４、ＣＹＰ１１Ａ１、ＡＣＳＳ１、ＬＹ６Ｇ６Ｄ、ＮＲ５Ａ１、ＡＩＦ１ＬおよびＦＡＭ１６７ＡをＭｉｇＲ１ベクターにクローニングして製造した。
【0138】
７個の選択された遺伝子のうちで、ＦＡＭ１６７Ａのみが異所的に（ｅｃｔｏｐｉｃａｌｌｙ）発現するとき、ＮＦ－κＢ活性を有意に増加させた（図２ａ）。また、他の遺伝子と比較して、ＦＡＭ１６７Ａの異所性発現は、イマチニブの存在下でＫ５６２Ｓ細胞の生存力を増加させた（図２ｂ）。ＦＡＭ１６７Ａは、分泌に対する信号配列がないにもかかわらず、非古典的タンパク質の分泌を予測するＳｅｃｒｅｔｏｍｅＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｅｃｒｅｔｏｍｅＰ／）を用いた生物情報学的分析でＦＡＭ１６７Ａが高いスコア（ＮＮ－スコア＝０．９０５）（図２ｃのＡ）を有することを示した。
【0139】
２－２．細胞分画の準備および免疫ブロット分析
Ｋ５６２Ｒ細胞溶解物および培養上清液の免疫ブロット分析によりＦＡＭ１６７Ａの分泌を分析した。
Ｋ５６２Ｒ細胞溶解物および培養上清液の免疫ブロット分析によりＦＡＭ１６７Ａの分泌を分析した。
【0140】
細胞溶解物は、細胞をＳＤＳサンプル緩衝液で沸かすことによって抽出された。培養上清液内タンパク質は、アセトンを用いた沈殿を通じて濃縮された後、ＳＤＳサンプル緩衝液で沸かすことによって抽出された。
【0141】
次に、免疫ブロット分析のために、タンパク質を８－１５％ゲルでＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）－ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後、ポリビニリデンジフルオライド（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜に移した。メンブレンは、指示されたように、抗ＦＡＭ１６７Ａ抗体（ｓｃ－３９３９９９，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）またはＥｒｂｉｎ抗体（ＮＢＰ２－１３９６８，Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）でプローブされた。分析結果、ＦＡＭ１６７Ａがこれらの細胞によって分泌されることを確認した（図２ｃのＢ）。
【0142】
２－３．ＦＡＭ１６７ＡのＮＦ－κＢ活性化機能の確認
ＮＦ－κＢ活性化機能を直接テストするために、組換えＦＡＭ１６７Ａタンパク質（ＭＢＳ１３６３５２２，ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）とＦＡＭ１６７Ａに特異的な中和抗体（ｓｃ－３９３９９９，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して細胞培養中にＦＡＭ１６７Ａレベルをそれぞれ増加および減少させた後、ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポータ分析を行った。
ＮＦ－κＢ活性化機能を直接テストするために、組換えＦＡＭ１６７Ａタンパク質（ＭＢＳ１３６３５２２，ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）とＦＡＭ１６７Ａに特異的な中和抗体（ｓｃ－３９３９９９，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して細胞培養中にＦＡＭ１６７Ａレベルをそれぞれ増加および減少させた後、ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポータ分析を行った。
【0143】
生物情報学的分析結果と一致して、可溶性組換えＦＡＭ１６７ＡでＫ５６２Ｓ細胞を処理すると、ＮＦ－κＢ活性が増加したのに対し（図２ｄ）、Ｋ５６２Ｒ細胞培養でＦＡＭ１６７Ａを中和すると、ＮＦ－κＢ活性が減少した（図２ｅ）。これは、分泌されたＦＡＭ１６７Ａタンパク質がＮＦ－κＢ経路の誘導剤として機能することを示唆する。
【0144】
２－４．ＮＦ－κＢ活性化経路の確認
Ｋ５６２Ｒ細胞においてどんなＮＦ－κＢ経路が活性化するかを決定するために、標準ＮＦ－κＢ経路を阻害するＳＮ５０（４８１４８０，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を処理するか、非標準ＮＦ－κＢ経路を抑制するＮＩＫ－ＤＮを一過性発現させた後、ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポータ分析を行った。ＮＩＫ－ＤＮの一過性発現のために、文献［Ｐａｒｋ ＳＧ，Ｒｙｕ ＨＭ，Ｌｉｍ ＳＯ，Ｋｉｍ ＹＩ，Ｈｗａｎｇ ＳＢ，Ｊｕｎｇ Ｇ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ
Ｂ ｖｉｒｕｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＮＦ－ｋａｐｐａＢ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＦ－ｋａｐｐａＢ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２００５；１２８（７）：２０４２－５３．］に記載のｐＦＬＡＧ－ＮＩＫ－ＤＮを使用した。
Ｋ５６２Ｒ細胞においてどんなＮＦ－κＢ経路が活性化するかを決定するために、標準ＮＦ－κＢ経路を阻害するＳＮ５０（４８１４８０，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を処理するか、非標準ＮＦ－κＢ経路を抑制するＮＩＫ－ＤＮを一過性発現させた後、ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポータ分析を行った。ＮＩＫ－ＤＮの一過性発現のために、文献［Ｐａｒｋ ＳＧ，Ｒｙｕ ＨＭ，Ｌｉｍ ＳＯ，Ｋｉｍ ＹＩ，Ｈｗａｎｇ ＳＢ，Ｊｕｎｇ Ｇ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ
Ｂ ｖｉｒｕｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＮＦ－ｋａｐｐａＢ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＦ－ｋａｐｐａＢ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２００５；１２８（７）：２０４２－５３．］に記載のｐＦＬＡＧ－ＮＩＫ－ＤＮを使用した。
【0145】
標準ＮＦ－κＢ経路を阻害するＳＮ５０処理は、Ｋ５６２Ｒ細胞においてＮＦ－κＢ活性を有意に減少させなかったが、ＳＮ５０処理は、ＮＦ－κＢ活性の追加ＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）刺激増加を遮断した（図２ｆ）。対照的に、非標準ＮＦ－κＢ経路を抑制する優性陰性ＮＩＫ（ＮＩＫ－ＤＮ）の一過性発現は、Ｋ５６２Ｒ細胞においてＮＦ－κＢ活性を有意に減少させ、刺激されなかったＫ５６２Ｓ細胞において観察されたものと類似したレベルに減少させた（図２ｇ）。
【0146】
２－５．ＮＩＫおよびｐ１００／ｐ５２に対する免疫ブロット分析
非標準ＮＦ－κＢ活性化は、ユビキチン化依存型ＮＩＫ分解の遮断を通したＮＩＫ蓄積に依存し、蓄積されたＮＩＫは、ｐ１００からｐ５２への処理を誘導し、後にｐ５２含有
二量体の核転座が続く。したがって、Ｋ５６２Ｓ細胞とＫ５６２Ｒ細胞においてＮＩＫおよびｐ１００／ｐ５２に対する免疫ブロット分析を通じてＫ５６２Ｒ細胞において非標準ＮＦ－κＢ経路が活性化するかを確認した。
非標準ＮＦ－κＢ活性化は、ユビキチン化依存型ＮＩＫ分解の遮断を通したＮＩＫ蓄積に依存し、蓄積されたＮＩＫは、ｐ１００からｐ５２への処理を誘導し、後にｐ５２含有
二量体の核転座が続く。したがって、Ｋ５６２Ｓ細胞とＫ５６２Ｒ細胞においてＮＩＫおよびｐ１００／ｐ５２に対する免疫ブロット分析を通じてＫ５６２Ｒ細胞において非標準ＮＦ－κＢ経路が活性化するかを確認した。
【0147】
メンブレンは、指示されたように、抗ＮＩＫ（４９９４，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ｐ１００／ｐ５２（（ｓｃ－７３８６ Ｘ，Ｓａｎｔａ
Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびＧＡＰＤＨ（ｓｃ－１６６５７４，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）抗体でプローブされた。ＧＡＰＤＨを内部標準として使用するＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して密度測定を行った。
Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびＧＡＰＤＨ（ｓｃ－１６６５７４，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）抗体でプローブされた。ＧＡＰＤＨを内部標準として使用するＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して密度測定を行った。
【0148】
【0149】
２－６．電気泳動移動度分析（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙ，ＥＭＳＡ）
核分画は、以下のように抽出された。まず、細胞を低張性緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．９；１０ｍＭ ＫＣｌ；１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；０．５ｍＭ ＤＴＴ；０．５ｍＭ ＰＭＳＦ）に懸濁させ、氷の上で１５分間培養した。その後、０．０５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０を添加し、溶解物を２５ゲージ針に５回通過させた。核を沈殿させるために、遠心分離（１０００×ｇ、５分、４℃）した後、上清液を収集し、高速遠心分離（１６，０００×ｇ、５分、４℃）で分離した。生成された上清液は、細胞質分画として－８０℃で保管された。細胞核を含むペレットを低張性緩衝液で洗浄し、高張性緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．９；４２０ｍＭ ＮａＣｌ；１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；２５％グリセロール；０．２ｍＭ ＥＤＴＡ；０．５ｍＭ ＤＴＴ；０．５ｍＭ ＰＭＳＦ；１μｇ／ｍＬロイペプチン、１μｇ／ｍＬアプロチニン、１μｇ／ｍＬペプスタチンＡ）に懸濁した後、１０分ごとにボルテックス（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）しながら、氷で３０分間培養した。核溶解物を遠心分離（１６，０００Хｇ、５分、４℃）した後、生成された上清液を核分画として－８０℃で保管した。
核分画は、以下のように抽出された。まず、細胞を低張性緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．９；１０ｍＭ ＫＣｌ；１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；０．５ｍＭ ＤＴＴ；０．５ｍＭ ＰＭＳＦ）に懸濁させ、氷の上で１５分間培養した。その後、０．０５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０を添加し、溶解物を２５ゲージ針に５回通過させた。核を沈殿させるために、遠心分離（１０００×ｇ、５分、４℃）した後、上清液を収集し、高速遠心分離（１６，０００×ｇ、５分、４℃）で分離した。生成された上清液は、細胞質分画として－８０℃で保管された。細胞核を含むペレットを低張性緩衝液で洗浄し、高張性緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．９；４２０ｍＭ ＮａＣｌ；１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；２５％グリセロール；０．２ｍＭ ＥＤＴＡ；０．５ｍＭ ＤＴＴ；０．５ｍＭ ＰＭＳＦ；１μｇ／ｍＬロイペプチン、１μｇ／ｍＬアプロチニン、１μｇ／ｍＬペプスタチンＡ）に懸濁した後、１０分ごとにボルテックス（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）しながら、氷で３０分間培養した。核溶解物を遠心分離（１６，０００Хｇ、５分、４℃）した後、生成された上清液を核分画として－８０℃で保管した。
【0150】
スーパーシフト分析のためには、核分画を結合緩衝液（５ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５；２５ｍＭ ＫＣｌ；０．５ｍＭ ＥＤＴＡ；２．５％グリセロール；０．５ｍＭ ＤＴＴ；０．１μｇ／μｌポリ（ｄＩ／ｄＣ）、０．５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）で抗ｐ５２抗体（４８８２，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）またはアイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）対照群（Ｈ９６５８，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に室温で２０分間培養した後、室温で２０分間ビオチニル化した二本鎖ＮＦ－κＢプローブ（配列番号２３：５’－ＡＧＴＴＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧ－３’）と一緒に追加培養した。反応サンプルを６％非変性ポリアクリルアミドゲルを通じて分離し、ナイロンメンブレンに移した。メンブレン上のプローブは、ＬｉｇｈｔＳｈｉｆｔ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ＥＭＳＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して視覚化し、ＩｍａｇｅＪで定量化した。
【0151】
ＥＭＳＡで行われたスーパーシフト分析でも、Ｋ５６２Ｒ細胞においてさらに高いＮＦ－κＢ活性およびｐ５２スーパーシフトレベルが現れた（図２ｊ）。
【0152】
２－７．ＦＡＭ１６７Ａの非標準ＮＦ－κＢ経路活性化効果の確認
前記結果に基づいて、ＦＡＭ１６７Ａが非標準ＮＦ－κＢ経路の活性化を担当するか否かを確認した。
前記結果に基づいて、ＦＡＭ１６７Ａが非標準ＮＦ－κＢ経路の活性化を担当するか否かを確認した。
【0153】
第一に、１００ｎｇ／ｍｌ組換えＦＡＭ１６７Ａで処理し、ＮＩＫ－ＤＮをコード化するプラスミドの形質感染後２４時間目にＫ５６２Ｓ細胞においてＮＦ－κＢルシフェラー
ゼレポータ活性を確認した結果、興味深く、組換えＦＡＭ１６７Ａによって刺激されたＮＦ－κＢ活性は、ＮＩＫ－ＤＮの一過性発現がある細胞において減少した（図２ｋ）。
ゼレポータ活性を確認した結果、興味深く、組換えＦＡＭ１６７Ａによって刺激されたＮＦ－κＢ活性は、ＮＩＫ－ＤＮの一過性発現がある細胞において減少した（図２ｋ）。
【0154】
第二に、２μｇ／ｍｌの抗ＦＡＭ１６７Ａ中和抗体またはアイソタイプ対照群で１２時間処理した後、Ｋ５６２Ｒ細胞においてＮＩＫの免疫ブロット分析を行った。前記結果と一致して、ＦＡＭ１６７Ａの中和は、Ｋ５６２Ｒ細胞のＮＩＫレベルを非常に減少させた（図２ｌ）。
【0155】
最後に、表示された濃度の組換えＦＡＭ１６７Ａで１２時間処理した後、Ｋ５６２ＳおよびＫ５６２Ｒ細胞においてｐ１００／ｐ５２の免疫ブロット分析を行った。組換えＦＡＭ１６７ＡでＫ５６２ＳおよびＫ５６２Ｒ細胞を処理すると、ｐ１００からｐ５２への処理が増加した（図２ｍ）。
【0156】
したがって、前記データは、ＦＡＭ１６７ＡがＫ５６２Ｓ細胞よりもＫ５６２Ｒ細胞においてさらに大きい程度で非標準ＮＦ－κＢ経路を活性化することを示す。
【0157】
［実施例３］
ＦＡＭ１６７Ａ結合受容体の確認
３－１．フローサイトメトリー
分泌されたＦＡＭ１６７Ａの処理および中和が非標準ＮＦ－κＢ経路を効果的に調節することにより、ＦＡＭ１６７Ａに対する受容体が細胞表面で発現することができるという仮設をたてた。ＦＡＭ１６７Ａに対する潜在的受容体の発現を評価するために、まず、Ｋ５６２ＳおよびＫ５６２Ｒ細胞をＭｙｃタグ組換えＦＡＭ１６７Ａで標識した後、蛍光染料結合抗Ｍｙｃ抗体染色およびフローサイトメトリーを行った。
ＦＡＭ１６７Ａ結合受容体の確認
３－１．フローサイトメトリー
分泌されたＦＡＭ１６７Ａの処理および中和が非標準ＮＦ－κＢ経路を効果的に調節することにより、ＦＡＭ１６７Ａに対する受容体が細胞表面で発現することができるという仮設をたてた。ＦＡＭ１６７Ａに対する潜在的受容体の発現を評価するために、まず、Ｋ５６２ＳおよびＫ５６２Ｒ細胞をＭｙｃタグ組換えＦＡＭ１６７Ａで標識した後、蛍光染料結合抗Ｍｙｃ抗体染色およびフローサイトメトリーを行った。
【0158】
具体的には、表面受容体の染色のために、細胞をＭｙｃタグＦＡＭ１６７Ａ（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）と一緒に培養した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８接合抗Ｍｙｃ抗体（９Ｂ１１，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で染色した。
【0159】
フローサイトメトリーおよび細胞分類は、Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅ ＨＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して行われ、データは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）で分析された。
【0160】
分析結果は、ＦＡＭ１６７Ａに対する受容体が細胞表面で発現し、Ｋ５６２Ｒ細胞のレベルがＫ５６２Ｓ細胞のレベルより高いことを示唆した（図３ａ）。
【0161】
細胞表面で受容体の存在を確認した後、識別のために受容体を分離するために、タンパク質Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズに結合したＭｙｃ－タグ組換えＦＡＭ１６７Ａおよび抗Ｍｙｃ抗体を使用してＫ５６２Ｒ細胞において受容体を免疫沈降した（図３ｂ）。
【0162】
ＭｙｃタグＦＡＭ１６７Ａで免疫沈降されたタンパク質の銀染色は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（２４６１２，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行った。銀染色結果、ＦＡＭ１６７Ａなしに免疫沈降された対照群サンプルでも検出されたバックグラウンドと比較して２個の別個のバンドを示した（図３ｃ）。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析は、組換えＦＡＭ１６７Ａで１つのバンド（約３０ｋＤａ）を確認し、他のバンド（約１２０ｋＤａ）を公知の細胞接着分子であるＤＳＧ１で確認した（図３ｄ～図３ｈ）。
【0163】
３－２．Ｋ５６２Ｒ細胞溶解物を使用した免疫共沈降
細胞を溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．０；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００；１０％グリセロール；２ｍＭ ＥＤＴＡ；１μｇ／ｍｌロイペプチン；１μｇ／ｍｌ；アプロチニン；１μｇ／ｍｌペプスタチンＡ；０．１ｍＭ ＰＭＳＦ）で氷の上で３０分間溶解させた。その後、溶解物を１５分間１５，０００ｘｇおよび４℃で遠心分離し、上清液を抗ＦＡＭ１６７Ａ（ｓｃ－３９３９９９，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と一緒に回転しながら、４℃で培養した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を添加し、４℃で回転しながら培養した。溶解緩衝液で４回洗浄した後、免疫沈降物をＳＤＳサンプル緩衝液に沸かして溶出させた後、免疫ブロット分析を行った。バンド強度は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアで分析した。
細胞を溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．０；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００；１０％グリセロール；２ｍＭ ＥＤＴＡ；１μｇ／ｍｌロイペプチン；１μｇ／ｍｌ；アプロチニン；１μｇ／ｍｌペプスタチンＡ；０．１ｍＭ ＰＭＳＦ）で氷の上で３０分間溶解させた。その後、溶解物を１５分間１５，０００ｘｇおよび４℃で遠心分離し、上清液を抗ＦＡＭ１６７Ａ（ｓｃ－３９３９９９，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と一緒に回転しながら、４℃で培養した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を添加し、４℃で回転しながら培養した。溶解緩衝液で４回洗浄した後、免疫沈降物をＳＤＳサンプル緩衝液に沸かして溶出させた後、免疫ブロット分析を行った。バンド強度は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアで分析した。
【0164】
これを通じて、ＦＡＭ１６７ＡがＤＳＧ１に結合することを確認した（図３ｉ）。
【0165】
３－３．ＤＳＧ１に対するｑＲＴ－ＰＣＲおよび免疫ブロット分析
ＤＳＧ１の上方制御された表面発現がトータルＤＳＧ１タンパク質レベルの増加によって媒介されることを確認するために、ＤＳＧ１ ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現をそれぞれｑＲＴ－ＰＣＲおよび免疫ブロット分析で測定した。ｑＲＴ－ＰＣＲに使用されたプライマーの配列は、表２に示した。
ＤＳＧ１の上方制御された表面発現がトータルＤＳＧ１タンパク質レベルの増加によって媒介されることを確認するために、ＤＳＧ１ ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現をそれぞれｑＲＴ－ＰＣＲおよび免疫ブロット分析で測定した。ｑＲＴ－ＰＣＲに使用されたプライマーの配列は、表２に示した。
【0166】
【表2】
【0167】
興味深く、Ｋ５６２ＳとＫ５６２Ｒ細胞の間にｍＲＮＡやタンパク質の発現には、差異がなかった（図３ｊおよび図３ｋ）。対照的に、ＤＳＧ１の細胞表面発現は、Ｋ５６２Ｒ細胞においてさらに高かった（図３ａおよび図３ｌ）。
【0168】
３－４．免疫蛍光染色およびＮＦ－ｋＢルシフェラーゼレポータ分析
免疫蛍光染色のために、固定および透過性細胞を抗ＤＳＧ１抗体（１２９２０４，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で染色した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８接合抗マウスＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。核は、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）染色で視覚化された。ＦＶ１０００共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）および一緒に提供されるＦＶ１０－ＡＳＷソフトウェアを使用して共焦点イメージを獲得した。
免疫蛍光染色のために、固定および透過性細胞を抗ＤＳＧ１抗体（１２９２０４，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で染色した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８接合抗マウスＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。核は、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）染色で視覚化された。ＦＶ１０００共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）および一緒に提供されるＦＶ１０－ＡＳＷソフトウェアを使用して共焦点イメージを獲得した。
【0169】
また、ＦＡＭ１６７Ａをコード化するプラスミドの形質感染および表示された濃度の抗ＦＡＭ１６７Ａ中和抗体で処理した後２４時間目にＫ５６２Ｓ細胞においてＮＦ－κＢルシフェラーゼレポータ活性を分析した。
【0170】
免疫蛍光染色結果およびＮＦ－κＢルシフェラーゼレポータ活性分析結果を通じて、ＤＳＧ１がＫ５６２Ｓ細胞でなく、Ｋ５６２Ｒ細胞の表面に主に限定されていることを確認
した（図３ｍ）。また、ＦＡＭ１６７Ａは、主にＫ５６２Ｒ細胞の表面でＤＳＧ１と一緒に共局在化された（図３ｎ）。ＦＡＭ１６７ＡがＫ５６２Ｓ細胞において異所的に発現したが、ＦＡＭ１６７Ａ誘導ＮＦ－κＢ活性化は、抗ＦＡＭ１６７Ａ中和抗体で処理し、非常に抑制され（図３ｏ）、これは、分泌されたＦＡＭ１６７Ａが非標準ＮＦ－κＢ経路を活性化することを示す。総合すれば、このような結果は、ＤＳＧ１がＦＡＭ１６７Ａの受容体であり、その表面発現は、Ｋ５６２Ｓ細胞よりもＫ５６２Ｒ細胞においてさらに高いことを示す。
した（図３ｍ）。また、ＦＡＭ１６７Ａは、主にＫ５６２Ｒ細胞の表面でＤＳＧ１と一緒に共局在化された（図３ｎ）。ＦＡＭ１６７ＡがＫ５６２Ｓ細胞において異所的に発現したが、ＦＡＭ１６７Ａ誘導ＮＦ－κＢ活性化は、抗ＦＡＭ１６７Ａ中和抗体で処理し、非常に抑制され（図３ｏ）、これは、分泌されたＦＡＭ１６７Ａが非標準ＮＦ－κＢ経路を活性化することを示す。総合すれば、このような結果は、ＤＳＧ１がＦＡＭ１６７Ａの受容体であり、その表面発現は、Ｋ５６２Ｓ細胞よりもＫ５６２Ｒ細胞においてさらに高いことを示す。
【0171】
［実施例４］
ＦＡＭ１６７ＡのＤＳＧ１を通したＮＩＫユビキチン化調節の確認
４－１．ＤＳＧ１がノックダウンされたＫ５６２Ｒ細胞におけるＮＦ－κＢ活性の確認
ＤＳＧ１の表面発現は、Ｋ５６２Ｓ細胞よりもＫ５６２Ｒ細胞においてさらに高かったために（図３ａおよび３ｌ）、Ｋ５６２Ｒ細胞においてＤＳＧ１ノックダウンが非標準ＮＦ－κＢ活性を減少させることができるという仮設をたてた。これをテストするために、Ｋ５６２Ｒ細胞にＤＳＧ１特異的ｓｈＲＮＡ短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）コンストラクトをレンチウイルスで形質導入し、ＤＳＧ１の発現をノックダウンさせた後（図４ａ）、ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポータ分析およびｐ１００／ｐ５２に対する免疫ブロット分析を行った。ＤＳＧ１特異的ｓｈＲＮＡレンチウイルス粒子（ｓｃ－３５２２４－Ｖ）と対照群ｓｈＲＮＡレンチウイルス粒子（ｓｃ－１０８０８０）は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手して使用した。
ＦＡＭ１６７ＡのＤＳＧ１を通したＮＩＫユビキチン化調節の確認
４－１．ＤＳＧ１がノックダウンされたＫ５６２Ｒ細胞におけるＮＦ－κＢ活性の確認
ＤＳＧ１の表面発現は、Ｋ５６２Ｓ細胞よりもＫ５６２Ｒ細胞においてさらに高かったために（図３ａおよび３ｌ）、Ｋ５６２Ｒ細胞においてＤＳＧ１ノックダウンが非標準ＮＦ－κＢ活性を減少させることができるという仮設をたてた。これをテストするために、Ｋ５６２Ｒ細胞にＤＳＧ１特異的ｓｈＲＮＡ短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）コンストラクトをレンチウイルスで形質導入し、ＤＳＧ１の発現をノックダウンさせた後（図４ａ）、ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポータ分析およびｐ１００／ｐ５２に対する免疫ブロット分析を行った。ＤＳＧ１特異的ｓｈＲＮＡレンチウイルス粒子（ｓｃ－３５２２４－Ｖ）と対照群ｓｈＲＮＡレンチウイルス粒子（ｓｃ－１０８０８０）は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手して使用した。
【0172】
【0173】
４－２．ＤＳＧ１またはＤＳＧ１およびＥｒｂｉｎが一過性発現した細胞におけるＮＦ－κＢ活性の確認
抗ＦＡＭ１６７Ａ中和抗体を処理するかまたは処理しないＫ５６２Ｒ細胞においてＤＳＧ１とその相互作用タンパク質Ｅｒｂｉｎの一過性発現後、ＮＦ－κＢ活性を測定した。ＤＳＧ１の一過性発現は、ＤＳＧをＭｉｇＲ１ベクターにクローニングしたプラスミドを使用して行い、Ｅｒｂｉｎの一過性発現は、ｐＣｌｎｅｏ－Ｍｙｃ－Ｅｒｂｉｎ（Ａｄｄｇｅｎｅ）を使用して行った。
抗ＦＡＭ１６７Ａ中和抗体を処理するかまたは処理しないＫ５６２Ｒ細胞においてＤＳＧ１とその相互作用タンパク質Ｅｒｂｉｎの一過性発現後、ＮＦ－κＢ活性を測定した。ＤＳＧ１の一過性発現は、ＤＳＧをＭｉｇＲ１ベクターにクローニングしたプラスミドを使用して行い、Ｅｒｂｉｎの一過性発現は、ｐＣｌｎｅｏ－Ｍｙｃ－Ｅｒｂｉｎ（Ａｄｄｇｅｎｅ）を使用して行った。
【0174】
ＮＦ－κＢ活性は、ＤＳＧ１の一過性発現によって減少し、ＤＳＧ１とＥｒｂｉｎの両方の一過性発現によってさらに減少した（図４ｄ）。しかも、ＦＡＭ１６７Ａ－中和抗体の存在下にＤＳＧ１およびＥｒｂｉｎの一過性発現は、ＮＦ－κＢ活性のさらなる減少をほとんど起こさなかった（有意ではない、ｐ＞０．０５）（図４ｄ）。このようなデータは、ＤＳＧ１とＥｒｂｉｎが抑制するのに対し、ＦＡＭ１６７Ａは、同じ経路を介して非標準ＮＦ－κＢを活性化することを示す。
【0175】
４－３．Ｅｒｂｉｎの発現レベルの確認
この経路の基本分子メカニズムをさらに調査するために、まず、Ｋ５６２ＳおよびＫ５６２Ｒ細胞においてＥｒｂｉｎのｍＲＮＡおよびタンパク質発現レベルをそれぞれｑＲＴ－ＰＣＲと免疫ブロット分析で確認した。ｑＲＴ－ＰＣＲに使用されたプライマー配列は、表３に示し、免疫ブロット分析には、抗Ｅｒｂｉｎ抗体（ＮＢＰ２－１３９６８，Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を使用した。
この経路の基本分子メカニズムをさらに調査するために、まず、Ｋ５６２ＳおよびＫ５６２Ｒ細胞においてＥｒｂｉｎのｍＲＮＡおよびタンパク質発現レベルをそれぞれｑＲＴ－ＰＣＲと免疫ブロット分析で確認した。ｑＲＴ－ＰＣＲに使用されたプライマー配列は、表３に示し、免疫ブロット分析には、抗Ｅｒｂｉｎ抗体（ＮＢＰ２－１３９６８，Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を使用した。
【0176】
【表3】
【0177】
【0178】
４－４．免疫共沈降分析を通したＥｒｂｉｎおよびＮＩＫ間の相互作用の確認
ＮＩＫが非標準ＮＦ－κＢ経路の核心構成要素であるから、ＤＳＧ１、ＥｒｂｉｎおよびＮＩＫ間の相互作用を調査するために免疫共沈降分析を行った。
ＮＩＫが非標準ＮＦ－κＢ経路の核心構成要素であるから、ＤＳＧ１、ＥｒｂｉｎおよびＮＩＫ間の相互作用を調査するために免疫共沈降分析を行った。
【0179】
まず、細胞を溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００；１０％グリセロール；２ｍＭ ＥＤＴＡ；１μｇ／ｍｌロイペプチン；１μｇ／ｍｌ；アプロチニン；１μｇ／ｍｌペプスタチンＡ；０．１ｍＭ ＰＭＳＦ）で氷の上で３０分間溶解させた。その後、溶解物を１５分間１５，０００ｘｇおよび４℃で遠心分離し、上清液を抗ＤＳＧ１抗体（３２－６０００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に回転しながら４℃で培養した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を添加し、４℃で回転しながら培養した。溶解緩衝液で４回洗浄した後、免疫沈降物をＳＤＳサンプル緩衝液に沸かして溶出させた後、免疫ブロット分析を行った。バンド強度は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアで分析した。
【0180】
ＤＳＧ１に対するＥｒｂｉｎの結合がＫ５６２ＳおよびＫ５６２Ｒ細胞間に有意差がないが、ＤＳＧ１に対するＮＩＫの結合は、Ｋ５６２Ｒ細胞において減少したことを示した（図４ｇ）。ＦＡＭ１６７ＡがＤＳＧ１に対するＮＩＫ結合の変化を起こすか否かをさらに決定するために、Ｋ５６２Ｒ細胞においてＦＡＭ１６７Ａタンパク質を中和し、ＤＳＧ１に対するＮＩＫの結合を評価した。ＦＡＭ１６７Ａが中和したとき、増加した結合を観察することができた（図４ｈ）。
【0181】
４－５．免疫ブロット分析を通したＮＩＫユビキチン化の確認
ＮＩＫは、ユビキチン化媒介分解を通じて調節されるので、Ｋ５６２Ｒ細胞においてＦＡＭ１６７Ａ中和後、免疫ブロット分析を通じてＮＩＫユビキチン化を調査しようとした。
ＮＩＫは、ユビキチン化媒介分解を通じて調節されるので、Ｋ５６２Ｒ細胞においてＦＡＭ１６７Ａ中和後、免疫ブロット分析を通じてＮＩＫユビキチン化を調査しようとした。
【0182】
具体的には、２μｇ／ｍｌの抗ＦＡＭ１６７Ａ中和抗体またはアイソタイプ対照群と１０μＭ ＭＧ１３２（４７４７９０，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を３時間処理したＫ５６２Ｒ細胞からのＮＩＫ免疫沈降後、抗ユビキチン抗体（ｓｃ－８０１７，Ｓａｎｔａ
Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用したＮＩＫユビキチン化を確認した。
Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用したＮＩＫユビキチン化を確認した。
【0183】
免疫ブロット分析は、ＦＡＭ１６７Ａが中和したとき、ＮＩＫのユビキチン化が増加したことを示した（図４ｉ）。ＮＩＫのユビキチン化は、ＤＳＧ１およびＥｒｂｉｎとの相
互作用の変化によって調節されると認められるが（図４ｇ～図４ｉ）、このようなタンパク質は、報告されたユビキチンリガーゼ機能がない。ＮＩＫユビキチン化に関与するリガーゼを確認するために、ＴＲＡＦ３、ＣＨＩＰおよびｃ－ｃｂｌを含む候補ユビキチンリガーゼ構成要素に対する免疫共沈降分析を行った。この際、使用された抗ＴＲＡＦ３抗体（４７２９）、抗ＣＨＩＰ抗体（２０８０）および抗ｃ－ｃｂｌ抗体（２７４７）Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。免疫共沈降の分析結果、これらに対する相互作用を発見しなかった（図４ｊ）。
互作用の変化によって調節されると認められるが（図４ｇ～図４ｉ）、このようなタンパク質は、報告されたユビキチンリガーゼ機能がない。ＮＩＫユビキチン化に関与するリガーゼを確認するために、ＴＲＡＦ３、ＣＨＩＰおよびｃ－ｃｂｌを含む候補ユビキチンリガーゼ構成要素に対する免疫共沈降分析を行った。この際、使用された抗ＴＲＡＦ３抗体（４７２９）、抗ＣＨＩＰ抗体（２０８０）および抗ｃ－ｃｂｌ抗体（２７４７）Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。免疫共沈降の分析結果、これらに対する相互作用を発見しなかった（図４ｊ）。
【0184】
全般的に、このような結果は、ＦＡＭ１６７ＡがＤＳＧ１およびＥｒｂｉｎに対するＮＩＫの結合を調節することによって、非標準ＮＦ－κＢ経路を活性化するだけでなく、後続のユビキチン化を活性化することを示唆し、これは、非標準ＮＦ－κＢ活性とＤＳＧ１の細胞表面発現間の関係を説明することができる（図４ｋ）。
【0185】
［実施例５］
ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性におけるＦＡＭ１６７Ａ役割の確認
５－１．ＴＫＩ処理後の非標準ＮＦ－κＢ経路の抑制による細胞生存率の確認
ＦＡＭ１６７ＡがＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を担当するか否かを調査するために、まず、非標準ＮＦ－κＢ経路の役割を調査した。このために、３日間イマチニブ（ｓｃ－２０２１８０，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）またはニロチニブ（１７０５０，ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）で処理した後、ＮＩＫ－ＤＮをコード化するプラスミドで形質感染されたＫ５６２Ｒ細胞の生存率を確認した。
ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性におけるＦＡＭ１６７Ａ役割の確認
５－１．ＴＫＩ処理後の非標準ＮＦ－κＢ経路の抑制による細胞生存率の確認
ＦＡＭ１６７ＡがＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を担当するか否かを調査するために、まず、非標準ＮＦ－κＢ経路の役割を調査した。このために、３日間イマチニブ（ｓｃ－２０２１８０，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）またはニロチニブ（１７０５０，ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）で処理した後、ＮＩＫ－ＤＮをコード化するプラスミドで形質感染されたＫ５６２Ｒ細胞の生存率を確認した。
【0186】
細胞生存能アッセイのために、Ｋ５６２ＳまたはＫ５６２Ｒ細胞を９６ウェルプレートに播種し、発現コンストラクトで一過性形質感染前に指示されたように処理した。７２時間後、ＷＳＴ試薬（ＤｏＧｅｎＢｉｏ）を使用して細胞生存率を測定した。
【0187】
【0188】
５－２．ＴＫＩ処理後の抗ＦＡＭ１６７Ａ中和抗体処理による細胞生存率の確認
さらに、抗ＦＡＭ１６７Ａ中和抗体２μｇ／ｍｌまたはアイソタイプ対照群で３日間イマチニブまたはニロチニブの存在下に処理した後、Ｋ５６２Ｒ細胞の生存率を確認するために、細胞生存能アッセイおよびアポトーシス分析を行った。
さらに、抗ＦＡＭ１６７Ａ中和抗体２μｇ／ｍｌまたはアイソタイプ対照群で３日間イマチニブまたはニロチニブの存在下に処理した後、Ｋ５６２Ｒ細胞の生存率を確認するために、細胞生存能アッセイおよびアポトーシス分析を行った。
【0189】
アポトーシス分析のために、Ｋ５６２ＳまたはＫ５６２Ｒ細胞を６ウェルプレートに播種し、指示されたように処理した。７２時間後、細胞をＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＡＰＣアポトーシス検出キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＡＰＣおよびプロピジウムヨージドで染色し、Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅ ＨＴ細胞測定装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で分析した。
【0190】
細胞生存率（ＷＳＴアッセイで）およびアポトーシス（フローサイトメトリーで測定）の分析は、ＦＡＭ１６７Ａの中和がＫ５６２Ｒ細胞の生存能力を有意に減少させ（図５ａおよび図５ｃ）、ＴＫＩの存在下でアポトーシスを増加させたことを示した（図５ｄ）。したがって、非標準ＮＦ－κＢ経路のＦＡＭ１６７Ａ媒介活性化は、ＴＫＩ耐性に重要である。
【0191】
［実施例６］
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性におけるＦＡＭ１６７Ａ役割の確認
Ｋ５６２Ｒ細胞をヌードマウスに皮下注射して確立されたマウス異種移植モデルを使用
して生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）ＴＫＩ耐性に対するＦＡＭ１６７Ａの効果を調査した。
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性におけるＦＡＭ１６７Ａ役割の確認
Ｋ５６２Ｒ細胞をヌードマウスに皮下注射して確立されたマウス異種移植モデルを使用
して生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）ＴＫＩ耐性に対するＦＡＭ１６７Ａの効果を調査した。
【0192】
６－１．マウス異種移植モデルの確立
Ｋ５６２Ｒ細胞（１Х１０７）を５０％（ｖ／ｖ）無血清マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に懸濁し、６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ（ｎｕ／ｎｕ）マウスの右脇腹に皮下移植した。腫瘍のサイズは、キャリパーで測定し、腫瘍体積は、標準公式（幅２×の長さ／２）を使用して計算した。腫瘍体積が１００－２００ｍｍ３に到達すると、マウスを無作為にグループに分け、１０日間イマチニブ（１０ｍｇ／ｋｇ／日、腹腔内）、抗ＦＡＭ１６７Ａ抗体またはアイソタイプ対照群（２ｍｇ／ｋｇ／３日、腹腔内）、またはビヒクル（食塩水、ＰＢＳ）で処理した。すべての動物実験は、ソウル大学校動物実験委員会（ＳＮＵ－２１０３１５－６）と光州科学技術院（ＧＩＳＴ－２０１９－００８）で承認したプロトコルに従って行われた。
Ｋ５６２Ｒ細胞（１Х１０７）を５０％（ｖ／ｖ）無血清マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に懸濁し、６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ（ｎｕ／ｎｕ）マウスの右脇腹に皮下移植した。腫瘍のサイズは、キャリパーで測定し、腫瘍体積は、標準公式（幅２×の長さ／２）を使用して計算した。腫瘍体積が１００－２００ｍｍ３に到達すると、マウスを無作為にグループに分け、１０日間イマチニブ（１０ｍｇ／ｋｇ／日、腹腔内）、抗ＦＡＭ１６７Ａ抗体またはアイソタイプ対照群（２ｍｇ／ｋｇ／３日、腹腔内）、またはビヒクル（食塩水、ＰＢＳ）で処理した。すべての動物実験は、ソウル大学校動物実験委員会（ＳＮＵ－２１０３１５－６）と光州科学技術院（ＧＩＳＴ－２０１９－００８）で承認したプロトコルに従って行われた。
【0193】
６－２．抗ＦＡＭ１６７Ａ中和抗体の処理によるＣＭＬ治療効果の確認
抗ＦＡＭ１６７Ａ中和抗体またはアイソタイプ対照群（２ｍｇ／ｋｇ／３日）があるかまたはない状態でビヒクルまたは１０ｍｇ／ｋｇ／日のイマチニブで処理されたマウスで確立されたＫ５６２Ｒ腫瘍の体積（図６ｂ）およびマウスの体重（図６ｃ）、治療１０日目に各グループのマウスから収集した腫瘍のサイズ（図６ｄ）および重量（図６ｅ）を測定した。イマチニブ単独またはアイソタイプ対照群抗体とイマチニブの組み合わせと比較して、イマチニブとＦＡＭ１６７Ａ中和（抗ＦＡＭ１６７Ａ中和抗体の腹腔内注射によって誘導される）で治療すると、体重損失なしに腫瘍成長が顕著に抑制された（図６ｂ～図６ｅ）。
抗ＦＡＭ１６７Ａ中和抗体またはアイソタイプ対照群（２ｍｇ／ｋｇ／３日）があるかまたはない状態でビヒクルまたは１０ｍｇ／ｋｇ／日のイマチニブで処理されたマウスで確立されたＫ５６２Ｒ腫瘍の体積（図６ｂ）およびマウスの体重（図６ｃ）、治療１０日目に各グループのマウスから収集した腫瘍のサイズ（図６ｄ）および重量（図６ｅ）を測定した。イマチニブ単独またはアイソタイプ対照群抗体とイマチニブの組み合わせと比較して、イマチニブとＦＡＭ１６７Ａ中和（抗ＦＡＭ１６７Ａ中和抗体の腹腔内注射によって誘導される）で治療すると、体重損失なしに腫瘍成長が顕著に抑制された（図６ｂ～図６ｅ）。
【0194】
細胞レベルで腫瘍成長の差異に対する根拠を調査するために、免疫組織化学的染色を行った。固定およびパラフィン包埋腫瘍切片を標準手続を使用してヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）、抗Ｋｉ－６７抗体（ＳＰ６，Ａｂｃａｍ）および抗ＮＩＫ抗体（Ａｂｃａｍ）で染色した。ＴＵＮＥＬ染色は、ＤｅａｄＥｎｄ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ＴＵＮＥＬ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で行われた。イメージは、Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）と共に提供されるＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアでキャプチャーした。定量化は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して行われた。各フィールドでＫｉ－６７＋またはＴＵＮＥＬ＋細胞の数を計数した。腫瘍細胞においてＮＩＫ発現を点数化し（強度：０＝陰性、１＝弱い、２＝普通、３＝強い）、Ｈスコアを次の等式を使用して計算した。
【0195】
Ｈスコア＝１×（強度１の細胞の％）＋２×（強度２の細胞の％）＋３×（強度３の細胞の％）。
【0196】
ＨＥ染色を通じて腫瘍組織切片を分析した結果、ＦＡＭ１６７Ａ中和腫瘍において細胞密度がさらに低かった。さらなる免疫組織化学染色は、ＮＩＫおよび増殖マーカーＫｉ－６７の減少した発現と共に、アポトーシスマーカーＴＵＮＥＬの増加したレベルを示した（図６ｆ）。総合すれば、このようなデータは、ＦＡＭ１６７Ａを中和すると、ＢＣＲ－ＡＢＬ独立型ＴＫＩ耐性がある細胞においてＴＫＩ感受性を回復することを示唆する。
【0197】
［実施例７］
ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性ＫＣＬ２２Ｒ細胞におけるＦＡＭ１６７Ａ発現の確認
７－１．細胞培養
Ｋ５６２Ｒ細胞の他にも、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性ＫＣＬ２２Ｒ細胞を調査した。ＫＣＬ２２ＳおよびＫＣＬ２２Ｒは、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手した。すべての細胞株は、加湿された細
胞培養インキュベーターで３７℃および５％ＣＯ２に維持され、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンが補充されたＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）１６４０培地（ＨｙＣｌｏｎｅ）で培養された。ＴＫＩ耐性を維持するために、ＫＣＬ２２Ｒ細胞を１μＭイマチニブが補充された培地で培養した。
ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性ＫＣＬ２２Ｒ細胞におけるＦＡＭ１６７Ａ発現の確認
７－１．細胞培養
Ｋ５６２Ｒ細胞の他にも、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性ＫＣＬ２２Ｒ細胞を調査した。ＫＣＬ２２ＳおよびＫＣＬ２２Ｒは、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手した。すべての細胞株は、加湿された細
胞培養インキュベーターで３７℃および５％ＣＯ２に維持され、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンが補充されたＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）１６４０培地（ＨｙＣｌｏｎｅ）で培養された。ＴＫＩ耐性を維持するために、ＫＣＬ２２Ｒ細胞を１μＭイマチニブが補充された培地で培養した。
【0198】
７－２．ＫＣＬ２２Ｒ細胞におけるＦＡＭ１６７Ａレベルの確認
配列分析を通じてＡＢＬ領域に突然変異がないことを確認した。また、ＦＡＭ１６７ＡのｍＲＮＡ発現レベルをｑＲＴ－ＰＣＲで確認した結果、ＫＣＬ２２Ｒ細胞は、ＫＣＬ２２Ｓ細胞よりさらに高いＦＡＭ１６７Ａレベルを示し、ＫＣＬ２２Ｒ細胞のイマチニブ処理は、増加したＦＡＭ１６７Ａ発現を示した（図７）。
配列分析を通じてＡＢＬ領域に突然変異がないことを確認した。また、ＦＡＭ１６７ＡのｍＲＮＡ発現レベルをｑＲＴ－ＰＣＲで確認した結果、ＫＣＬ２２Ｒ細胞は、ＫＣＬ２２Ｓ細胞よりさらに高いＦＡＭ１６７Ａレベルを示し、ＫＣＬ２２Ｒ細胞のイマチニブ処理は、増加したＦＡＭ１６７Ａ発現を示した（図７）。
【0199】
［実施例８］
ＣＭＬ患者におけるＦＡＭ１６７Ａ発現の確認
本研究結果の臨床的重要性を確認するために、ｑＲＴ－ＰＣＲを通じてＣＭＬ患者から分離したＣＤ３４＋幹細胞／前駆細胞のＦＡＭ１６７Ａレベルを分析した。
ＣＭＬ患者におけるＦＡＭ１６７Ａ発現の確認
本研究結果の臨床的重要性を確認するために、ｑＲＴ－ＰＣＲを通じてＣＭＬ患者から分離したＣＤ３４＋幹細胞／前駆細胞のＦＡＭ１６７Ａレベルを分析した。
【0200】
８－１．一次ヒトサンプル
韓国の和順に位置する全南大学校病院でＣＭＬ患者５８人（表４に羅列された臨床病理学的特徴）から末梢血液または骨髄サンプルを採取した。サンプルは、診断当時とＴＫＩで治療する前（診断）、ＴＫＩで治療した後の後続措置時（後続措置）に再び採取した。患者から分離した単核細胞は、追加使用前まで液体窒素に冷凍保管された。ヘルシンキ宣言により事前同意を得、すべての手続は、ソウル大学校臨床審査委員会（Ｅ２１０３／００３－００７）と光州科学技術院（２０１８０６２９－ＢＲ－３６－０１－０２）の承認を受けた。ＴＫＩ反応者とＴＫＩ耐性患者は、ヨーロッパ白血病ネットワーク（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｎｅｔ）の指針に従って臨床的に分類された。ＣＭＬサンプルにおいてＢＣＲ－ＡＢＬの突然変異状態は、シーケンシング分析によって確認された。
韓国の和順に位置する全南大学校病院でＣＭＬ患者５８人（表４に羅列された臨床病理学的特徴）から末梢血液または骨髄サンプルを採取した。サンプルは、診断当時とＴＫＩで治療する前（診断）、ＴＫＩで治療した後の後続措置時（後続措置）に再び採取した。患者から分離した単核細胞は、追加使用前まで液体窒素に冷凍保管された。ヘルシンキ宣言により事前同意を得、すべての手続は、ソウル大学校臨床審査委員会（Ｅ２１０３／００３－００７）と光州科学技術院（２０１８０６２９－ＢＲ－３６－０１－０２）の承認を受けた。ＴＫＩ反応者とＴＫＩ耐性患者は、ヨーロッパ白血病ネットワーク（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｎｅｔ）の指針に従って臨床的に分類された。ＣＭＬサンプルにおいてＢＣＲ－ＡＢＬの突然変異状態は、シーケンシング分析によって確認された。
【0201】
【表4-1】
【表4-2】
【0202】
１イマチニブ耐性は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｎｅｔのガイドラインに従って臨床的に分類される。２塩基配列分析でＢＣＲ－ＡＢＬの突然変異状態を確認する。ＣＰ：慢性期；ＡＰ：加速期；ＢＰ：芽球期。
【0203】
データは、ＦＡＭ１６７Ａの発現がイマチニブ反応性患者またはＢＣＲ－ＡＢＬ依存性イマチニブ耐性患者（それぞれＳおよびＲ突然変異）の細胞よりもＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性イマチニブ耐性患者（Ｒ、突然変異なし）の細胞においてさらに高かったことを示した
（図８ａ）。また、ＦＡＭ１６７Ａレベルは、治療を受ける前（すなわち、診断時）にＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性イマチニブ耐性患者の細胞においてさらに高く、これは、ＦＡＭ１６７Ａの発現がＣＭＬ患者においてＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を予測することができることを示唆する。
（図８ａ）。また、ＦＡＭ１６７Ａレベルは、治療を受ける前（すなわち、診断時）にＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性イマチニブ耐性患者の細胞においてさらに高く、これは、ＦＡＭ１６７Ａの発現がＣＭＬ患者においてＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を予測することができることを示唆する。
【0204】
フローサイトメトリーは、また、ＤＳＧ１の表面発現が治療前（診断）よりもイマチニブ治療後（追跡観察）に、ＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性イマチニブ耐性患者の細胞においてさらに高いことを示した（図８ｂ）。総合的に、このような結果は、ＦＡＭ１６７ＡおよびＤＳＧ１が非標準ＮＦ－κＢ経路の活性化を通じてＣＭＬ患者においてＢＣＲ－ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性と関連があることを示唆する（図８ｃ）。
【0205】
統計分析
各実験の反復回数は、図面に表示された。データは、平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）で表示される。両側独立標本スチューデントＴ検定（Ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ－ｔｅｓｔ）は、統計的有意性を決定するのに使用された。Ｐ値＜０．０５は、有意なものと見なされた（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
各実験の反復回数は、図面に表示された。データは、平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）で表示される。両側独立標本スチューデントＴ検定（Ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ－ｔｅｓｔ）は、統計的有意性を決定するのに使用された。Ｐ値＜０．０５は、有意なものと見なされた（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【0206】
この発明を支援した国家研究開発事業は、以下の通りである。
（１）［課題固有番号］１７１１１３０６２７
［課題番号］２０２１Ｒ１Ａ２Ｃ３０１１２１１
［部署名］科学技術情報通信部
［課題管理（専門）機関名］韓国研究財団
［研究事業名］個人基礎研究（科学技術情報通信部）（Ｒ＆Ｄ）
［研究課題名］ガンマヘルペスウイルス感染の神経炎症性疾患における役割糾明研究
［寄与率］１／２
［課題遂行機関名］ソウル大学校
［研究期間］２０２１．０３．０１～２０２２．０２．２８
（２）［課題固有番号］１７１１１７０８８０
［課題番号］２０２２Ｍ３Ａ９Ｉ２０１７５８７
［部署名］科学技術情報通信部
［課題管理（専門）機関名］韓国研究財団
［研究事業名］源泉技術開発事業／バイオ・医療技術開発
［研究課題名］マルチオミックス基盤未来新種・変種インフルエンザ変異株対応プラットフォーム開発
［寄与率］１／２
［課題遂行機関名］ソウル大学校
［研究期間］２０２３．０１．０１～２０２３．１２．３１
（１）［課題固有番号］１７１１１３０６２７
［課題番号］２０２１Ｒ１Ａ２Ｃ３０１１２１１
［部署名］科学技術情報通信部
［課題管理（専門）機関名］韓国研究財団
［研究事業名］個人基礎研究（科学技術情報通信部）（Ｒ＆Ｄ）
［研究課題名］ガンマヘルペスウイルス感染の神経炎症性疾患における役割糾明研究
［寄与率］１／２
［課題遂行機関名］ソウル大学校
［研究期間］２０２１．０３．０１～２０２２．０２．２８
（２）［課題固有番号］１７１１１７０８８０
［課題番号］２０２２Ｍ３Ａ９Ｉ２０１７５８７
［部署名］科学技術情報通信部
［課題管理（専門）機関名］韓国研究財団
［研究事業名］源泉技術開発事業／バイオ・医療技術開発
［研究課題名］マルチオミックス基盤未来新種・変種インフルエンザ変異株対応プラットフォーム開発
［寄与率］１／２
［課題遂行機関名］ソウル大学校
［研究期間］２０２３．０１．０１～２０２３．１２．３１
【図1a】
【図1b】
【図1c】
【図1d】
【図1e】
【図1f】
【図1g】
【図1h】
【図1i】
【図1j】
【図1k】
【図1l】
【図1m】
【図1n】
【図1o】
【図2a】
【図2b】
【図2c】
【図2d】
【図2e】
【図2f】
【図2g】
【図2h】
【図2i】
【図2j】
【図2k】
【図2l】
【図2m】
【図3a】
【図3b】
【図3c】
【図3d】
【図3e】
【図3f】
【図3g】
【図3h】
【図3i】
【図3j】
【図3k】
【図3l】
【図3m】
【図3n】
【図3o】
【図4a】
【図4b】
【図4c】
【図4d】
【図4e】
【図4f】
【図4g】
【図4h】
【図4i】
【図4j】
【図4k】
【図5a】
【図5b】
【図5c】
【図5d】
【図6a】
【図6b】
【図6c】
【図6d】
【図6e】
【図6f】
【図7】
【図8a】
【図8b】
【図8c】
【配列表】