特許 7677796 二重特異性抗ＰＳＭＡ×抗ＣＤ２８抗体およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-05-07

(45)【発行日】2025-05-15

(54)【発明の名称】二重特異性抗ＰＳＭＡ×抗ＣＤ２８抗体およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20250508BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20250508BHJP

   A61P 13/08 20060101ALI20250508BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20250508BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20250508BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20250508BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20250508BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20250508BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20250508BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20250508BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20250508BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46

A61K39/395 N

A61P13/08

A61P35/00

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/13 ZNA

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

【請求項の数】 35

(21)【出願番号】P 2020570940

(86)(22)【出願日】2019-06-21

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-10-14

(86)【国際出願番号】 US2019038460

(87)【国際公開番号】W WO2019246514

(87)【国際公開日】2019-12-26

【審査請求日】2022-06-15

(31)【優先権主張番号】62/815,878

(32)【優先日】2019-03-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/781,980

(32)【優先日】2018-12-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/688,227

(32)【優先日】2018-06-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/781,930

(32)【優先日】2018-12-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】597160510

【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(72)【発明者】

【氏名】アンドリュー・ジェイ・マーフィー

(72)【発明者】

【氏名】ディミトリス・スココス

(72)【発明者】

【氏名】ジャネール・ウェイト

(72)【発明者】

【氏名】エリカ・ウルマン

(72)【発明者】

【氏名】アイナー・ハーマン

(72)【発明者】

【氏名】エリック・スミス

(72)【発明者】

【氏名】ラウリック・ハーバー

(72)【発明者】

【氏名】ジョージ・ディー・ヤンコーポラス

【審査官】長谷川 強

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１８／０１４００１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１７／０２３７６１（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １６／４６

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｐ １３／０８

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ｃ１２Ｎ １／１５

Ｃ１２Ｎ １／１９

Ｃ１２Ｎ １／２１

Ｃ１２Ｎ ５／１０

Ｃ１２Ｎ １５／１３

Ｃ１２Ｎ １５／６２

Ｃ１２Ｎ １５／６３

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトＣＤ２８に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ヒトＰＳＭＡに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む、二重特異性抗原結合分子であって、
前記第１の抗原結合ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に含まれる３つの重鎖相補性決定領域（Ｄ１－ＨＣＤＲ１、Ｄ１－ＨＣＤＲ２、およびＤ１－ＨＣＤＲ３）と、配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に含まれる３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）とを含み、
前記第２の抗原結合ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ内に含まれる３つの重鎖相補性決定領域（Ｄ２－ＨＣＤＲ１、Ｄ２－ＨＣＤＲ２、およびＤ２－ＨＣＤＲ３）と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ内に含まれる３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）とを含む、
上記二重特異性抗原結合分子。

【請求項2】

Ｄ１－ＨＣＤＲ１は、配列番号１２のアミノ酸配列を含み；Ｄ１－ＨＣＤＲ２は、配列番号１４のアミノ酸配列を含み；Ｄ１－ＨＣＤＲ３は、配列番号１６のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は、配列番号２０のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は、配列番号２２のアミノ酸配列を含み；および、ＬＣＤＲ３は配列番号２４のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の二重特異性抗原結合分子。

【請求項3】

Ｄ２－ＨＣＤＲ１は、配列番号４のアミノ酸配列を含み；Ｄ２－ＨＣＤＲ２は、配列番号６のアミノ酸配列を含み；Ｄ２－ＨＣＤＲ３は、配列番号８のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は、配列番号２０のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は、配列番号２２のアミノ酸配列を含み；および、ＬＣＤＲ３は配列番号２４のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の二重特異性抗原結合分子。

【請求項4】

Ｄ１－ＨＣＤＲ１は、配列番号１２のアミノ酸配列を含み；Ｄ１－ＨＣＤＲ２は、配列番号１４のアミノ酸配列を含み；Ｄ１－ＨＣＤＲ３は、配列番号１６のアミノ酸配列を含み；
Ｄ２－ＨＣＤＲ１は、配列番号４のアミノ酸配列を含み；Ｄ２－ＨＣＤＲ２は、配列番号６のアミノ酸配列を含み；Ｄ２－ＨＣＤＲ３は、配列番号８のアミノ酸配列を含み；ならびに
ＬＣＤＲ１は、配列番号２０のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は、配列番号２２のアミノ酸配列を含み；および、ＬＣＤＲ３は配列番号２４のアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載の二重特異性抗原結合分子。

【請求項5】

第１の抗原結合ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と、配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）とを含み；および
第２の抗原結合ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲとを含む、
請求項１～４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。

【請求項6】

第１の重鎖およびジスルフィド結合によって相互連結された対になる軽鎖であって、前記第１の重鎖は、ＨＣＶＲと、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む重鎖定常領域とを含み、且つ、前記対になる軽鎖は、ＬＣＶＲと、軽鎖定常領域とを含み、ここで、前記第１の重鎖および対になる軽鎖は第１の抗原結合ドメインを含む、前記第１の重鎖および対になる軽鎖；ならびに
第２の重鎖およびジスルフィド結合によって相互連結された対になる軽鎖であって、前記第２の重鎖は、ＨＣＶＲと、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む重鎖定常領域とを含み、且つ、前記対になる軽鎖は、ＬＣＶＲと、軽鎖定常領域とを含み、ここで、前記第２の重鎖および対になる軽鎖は第２の抗原結合ドメインを含む、前記第２の重鎖および対になる軽鎖、
を含む、二重特異性抗体である、
請求項１～５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。

【請求項7】

第１の重鎖または第２の重鎖は、両方ではないが、Ｈ４３５Ｒ（ＥＵ番号付け）修飾およびＹ４３６Ｆ（ＥＵ番号付け）修飾を含むＣＨ３ドメインを含む、請求項６に記載の二重特異性抗原結合分子。

【請求項8】

第１の重鎖の重鎖定常領域および第２の重鎖の重鎖定常領域は、ＩｇＧ１アイソタイプである、請求項６または７に記載の二重特異性抗原結合分子。

【請求項9】

第１の重鎖の重鎖定常領域および第２の重鎖の重鎖定常領域は、ＩｇＧ４アイソタイプである、請求項６または７に記載の二重特異性抗原結合分子。

【請求項10】

第１の重鎖は、配列番号８１のアミノ酸配列を含み、その対になる軽鎖は、配列番号８３のアミノ酸配列を含み；および、第２の重鎖は、配列番号８２のアミノ酸配列を含み、対になる軽鎖は、配列番号８３のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の二重特異性抗原結合分子。

【請求項11】

ヒトＣＤ２８に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ヒトＰＳＭＡに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む、二重特異性抗原結合分子であって、
前記第１の抗原結合ドメインは、配列番号２６または配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に含まれる３つの重鎖相補性決定領域（Ｄ１－ＨＣＤＲ１、Ｄ１－ＨＣＤＲ２、およびＤ１－ＨＣＤＲ３）と、配列番号４２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に含まれる３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）とを含み、ならびに
前記第２の抗原結合ドメインは、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ内に含まれる３つの重鎖相補性決定領域（Ｄ２－ＨＣＤＲ１、Ｄ２－ＨＣＤＲ２、およびＤ２－Ｈ
ＣＤＲ３）と、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ内に含まれる３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）とを含む、
上記二重特異性抗原結合分子。

【請求項12】

Ｄ１－ＨＣＤＲ１は、配列番号２８または配列番号６０のアミノ酸配列を含み；Ｄ１－ＨＣＤＲ２は、配列番号３０または配列番号６２のアミノ酸配列を含み；Ｄ１－ＨＣＤＲ３は、配列番号３２または配列番号６４のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は、配列番号４４のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は、配列番号４６のアミノ酸配列を含み；および、ＬＣＤＲ３は配列番号４８のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の二重特異性抗原結合分子。

【請求項13】

Ｄ２－ＨＣＤＲ１は、配列番号３６のアミノ酸配列を含み；Ｄ２－ＨＣＤＲ２は、配列番号３８のアミノ酸配列を含み；Ｄ２－ＨＣＤＲ３は、配列番号４０のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は、配列番号４４のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は、配列番号４６のアミノ酸配列を含み；および、ＬＣＤＲ３は配列番号４８のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の二重特異性抗原結合分子。

【請求項14】

Ｄ１－ＨＣＤＲ１、Ｄ１－ＨＣＤＲ２、およびＤ１－ＨＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号２８、３０、および３２、または配列番号６０、６２、および６４のアミノ酸配列を含み；
Ｄ２－ＨＣＤＲ１、Ｄ２－ＨＣＤＲ２、およびＤ２－ＨＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号３６、３８、および４０のアミノ酸配列を含み；ならびに
ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４４、４６、および４８のアミノ酸配列を含む、
請求項１１に記載の二重特異性抗原結合分子。

【請求項15】

第１の抗原結合ドメインは、配列番号２６または配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と、配列番号４２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）とを含み；および
第２の抗原結合ドメインは、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲとを含む、
請求項１１～１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。

【請求項16】

第１の重鎖およびジスルフィド結合によって相互連結された対になる軽鎖であって、前記第１の重鎖は、ＨＣＶＲと、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む重鎖定常領域とを含み、且つ、前記対になる軽鎖は、ＬＣＶＲと、軽鎖定常領域とを含み、ここで、前記第１の重鎖および対になる軽鎖は第１の抗原結合ドメインを含む、前記第１の重鎖および対になる軽鎖；ならびに
第２の重鎖およびジスルフィド結合によって相互連結された対になる軽鎖であって、前記第２の重鎖は、ＨＣＶＲと、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む重鎖定常領域とを含み、且つ、前記対になる軽鎖は、ＬＣＶＲと、軽鎖定常領域とを含み、ここで、前記第２の重鎖および対になる軽鎖は第２の抗原結合ドメインを含む、前記第２の重鎖および対になる軽鎖、
を含む、二重特異性抗体である、
請求項１１～１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。

【請求項17】

第１の重鎖または第２の重鎖は、両方ではないが、Ｈ４３５Ｒ（ＥＵ番号付け）修飾およびＹ４３６Ｆ（ＥＵ番号付け）修飾を含むＣＨ３ドメインを含む、請求項１６に記載の二重特異性抗原結合分子。

【請求項18】

第１の重鎖の重鎖定常領域および第２の重鎖の重鎖定常領域は、ＩｇＧ１アイソタイプである、請求項１６または１７に記載の二重特異性抗原結合分子。

【請求項19】

第１の重鎖の重鎖定常領域および第２の重鎖の重鎖定常領域は、ＩｇＧ４アイソタイプである、請求項１６または１７に記載の二重特異性抗原結合分子。

【請求項20】

前記抗原結合分子が：
（ａ）１×１０^-12Ｍ～１×１０^-6ＭのＥＣ₅₀値で、ＣＤ２８を発現するヒトＴ細胞に結合する；
（ｂ）ヒトＣＤ２８を発現するヒト細胞、およびカニクイザルＣＤ２８を発現するカニクイザル細胞に結合する；
（ｃ）インビトロでヒトおよびカニクイザル末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖を誘発する；
（ｄ）ヒト全血におけるサイトカイン放出およびＣＤ２５上方調節を誘発する；または
（ｅ）ヒト前立腺細胞のＴ細胞媒介性細胞傷害を誘発する、
請求項１～１９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。

【請求項21】

請求項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、薬学的組成物。

【請求項22】

請求項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。

【請求項23】

請求項２２に記載の核酸分子を含む発現ベクター。

【請求項24】

（ａ）請求項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、（ｂ）請求項２２に記載の核酸分子、（ｃ）請求項２３に記載の発現ベクター、または（ｄ）請求項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子の、第１の抗原結合ドメインのＨＣＶＲをコードする核酸分子を含む発現ベクター、第２の抗原結合ドメインのＨＣＶＲをコードする核酸分子を含む発現ベクター、並びに第１および第２の抗原結合ドメインのＬＣＶＲをコードする核酸分子を含む発現ベクターを含む、宿主細胞。

【請求項25】

ＰＳＭＡを発現する癌を治療する方法において使用するための、請求項２１に記載の薬学的組成物。

【請求項26】

癌は、前立腺癌である、請求項２５に記載の薬学的組成物。

【請求項27】

方法は、第２の治療薬を対象に投与することをさらに含む、または、放射線療法をさらに含む、請求項２５または２６に記載の薬学的組成物。

【請求項28】

前記第２の治療薬は、抗腫瘍剤、抗体薬物複合体、抗腫瘍剤と複合化された二重特異性抗体、チェックポイント阻害剤、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２７に記載の薬学的組成物。

【請求項29】

前記第２の治療薬は、チェックポイント阻害剤である、請求項２８に記載の薬学的組成物。

【請求項30】

前記チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１またはＣＴＬＡ４を標的とする、請求項２９に記載の薬学的組成物。

【請求項31】

チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１を標的とし、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブ、およびセミプリマブからなる群から選択される、請求項３０に記載の薬学的組成物。

【請求項32】

チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ４を標的とし、イピリムマブである、請求項３０に記載の薬学的組成物。

【請求項33】

前記第２の治療薬が、ヒトＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインと、ヒトＰＳＭＡに結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体である、請求項２７に記載の薬学的組成物。

【請求項34】

二重特異性抗原結合分子の産生を可能にする条件下で請求項２４に記載の宿主細胞を培養すること、および産生された二重特異性抗原結合分子を回収することを含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子を産生する方法。

【請求項35】

請求項３４に記載の方法で産生した二重特異性抗原結合分子と、好適な担体を含む薬学的組成物を製剤化する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
この出願は、２０１８年６月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／６８８，２２７号、２０１８年１２月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／７８１，９３０号、２０１８年１２月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／７８１，９８０号、および２０１９年３月８日に出願された米国仮特許出願第６２／８１５，８７８号に関し、それらの優先権を主張する。前述の出願の内容全体は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１９年６月２０日に作成された上記のＡＳＣＩＩコピーは、１０３６７ＷＯ０１＿１１８００３－４５２２０＿ＳＬ．ＴＸＴという名前であり、サイズは４８，６９０バイトである。

【0003】

本発明はまた、ＣＤ２８およびＰＳＭＡなどの標的分子に結合する二重特異性抗原結合分子、ならびにそれらの使用方法に関する。

【背景技術】

【0004】

ＣＤ２８は、Ｔ細胞の表面上で発現されるＩ型膜貫通タンパク質であり、これはホモ二量体として組み立てられた単一の細胞外Ｉｇ－Ｖ様ドメインを有する。ＣＤ２８は、ＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＣＤ８６（Ｂ７．２）タンパク質の受容体であり、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で発現されるＣＤ８０またはＣＤ８６によって活性化される。ＣＤ２８のＣＤ８０またはＣＤ８６への結合は、Ｔ細胞の活性化および生存に重要な共刺激シグナルを提供する。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に加えてＣＤ２８を介したＴ細胞刺激は、様々なインターロイキンの産生に強力なシグナルを提供する。ＣＤ２８は、ＴＣＲ活性化後、ＮＦκＢ転写因子によって制御される経路などの細胞シグナルを増強する。ＣＤ２８共シグナルは、Ｔ細胞の分化、増殖、サイトカイン放出、および細胞死などの効果的なＴ細胞活性化に重要である。

【0005】

抗ＣＤ２８抗体は、Ｔ細胞の活性化を含む治療目的のために提案されている。１つの特定の抗ＣＤ２８抗体であるＴＧＮ１４１２（抗ＣＤ２８スーパーアゴニスト）が、臨床試験で使用された。ＴＧＮ１４１２は、サイトカインストームを誘発したが、これは毒性学またはエクスビボでのヒトＰＢＭＣ研究では予測されなかった。２００６年には、６人の健康なボランティアに、０．１ｍｇ／ｋｇの用量でＴＧＮ１４１２（抗ＣＤ２８スーパーアゴニスト）を静脈内投与した。２時間以内に、６人の患者全員が、重大な炎症反応（サイトカインストーム）を有した。１６時間以内に、全ての患者が多臓器不全に陥った。対象をコルチコステロイドで治療したところ、サイトカインレベルは、２～３日以内に正常レベルに戻った。第１相試験（ＣＲＳに関連）での０．１ｍｇ／ｋｇの開始用量は、カニクイザルにおける５０ｍｇ／ｋｇの無毒性量（ＮＯＡＥＬ）の５００倍量に基づいた（非特許文献１）。

【0006】

カニクイザルの毒性学研究では、ヒトにおいて観察されたサイトカイン応答を予測することができなかった。

【0007】

ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）／ＦＯＬＨ１は、「十分に特徴付けられた」腫瘍標的である。ＰＳＭＡは、前立腺癌において過剰発現されるＩＩ型膜貫通型糖タンパク質である。グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩ（ＧＰＣ）としても知られている。正常なヒトの前立腺では、ＰＳＭＡは、前立腺管を取り巻く上皮の細胞質および頂端側に関連している。前立腺組織の異形成および／または腫瘍性形質転換は、ＰＳＭＡの頂端膜から管の管腔表面への移動をもたらす。ＰＳＭＡは、構成的にエンドサイトーシスされ、脱落しない。ＰＳＭＡは、様々な臨床ＡＤＣ（抗体薬物結合体）試験およびイメージングアプローチの標的である。ＰＳＭＡは、ヒト前立腺腺癌で高度に発現され、転移（リンパ節）と一致する。前立腺腫瘍では、ＰＳＭＡの発現レベルは、病期およびグレードに応じて増加する。アンドロゲン非依存性前立腺癌への移行は、最終的に発現の増加につながる。興味深いことに、ＰＳＭＡの発現は、一部の固形腫瘍（結腸癌、肺癌、乳癌、腎癌、および膀胱癌のサブタイプを含む）の腫瘍新生血管系でも報告されている。

【0008】

ＰＳＭＡは、正常組織中でも発現される。最も強い発現は、前立腺上皮細胞、十二指腸、尿細管細胞、唾液腺、および星状細胞に見られる。ＰＳＭＡは、卵管、乳房で弱く発現され、子宮頸部の内皮ではめったに発現されない。

【0009】

ＣＤ２８および標的抗原（ＰＳＭＡなど）の両方に結合する二重特異性抗原結合分子は、標的抗原を発現する細胞の特異的標的化およびＴ細胞媒介性殺滅が望まれる治療環境において有用である。薬学的組成物での使用に安全な抗ＣＤ２８抗体に対する必要性も存在する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0010】

【文献】Ｓｕｎｔｈａｒａｌｉｎｇａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｓｔｏｒｍ ｉｎ ａ Ｐｈａｓｅ １ Ｔｒｉａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｔｉ－ＣＤ２８ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＴＧＮ１４１２，ＮＥＪＭ ３５５：１０１８－１０２８（２００６）

【発明の概要】

【0011】

第１の態様では、本発明は、ＣＤ２８および標的抗原に結合する二重特異性抗原結合分子を提供する。ある特定の例示的な実施形態によると、二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ２８およびＰＳＭＡに結合し、そのような二重特異性抗原結合分子は、本明細書では「抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性分子」とも称される。抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性分子の抗ＰＳＭＡ部分は、ＰＳＭＡを発現する腫瘍細胞（例えば、前立腺腫瘍細胞）を標的化するのに有用であり、二重特異性分子の抗ＣＤ２８部分は、Ｔ細胞を活性化するのに有用である。腫瘍細胞上のＰＳＭＡおよびＴ細胞上のＣＤ２８の同時結合は、活性化Ｔ細胞によって標的腫瘍細胞の指向性殺滅（細胞溶解）を誘導する。したがって、本発明の抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性分子は、とりわけ、ＰＳＭＡ発現腫瘍（例えば、前立腺癌）に関連するかまたはそれによって引き起こされる疾患および障害を治療するために有用である。

【0012】

本発明のこの態様に従う二重特異性抗原結合分子は、ヒトＣＤ２８に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＳＭＡに特異的に結合する第２の抗原結合分子とを含む。本発明は、各抗原結合ドメインが、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と対をなす重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む、抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性分子（例えば、二重特異性抗体）を含む。本発明のある特定の例示的な実施形態では、抗ＣＤ２８抗原結合ドメインおよび抗ＰＳＭＡ抗原結合ドメインが各々、共通のＬＣＶＲと対をなす異なる別個のＨＣＶＲを含む。

【0013】

本発明は、抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性分子を提供し、ＣＤ２８に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、表１に記載されるＨＣＶＲアミノ酸配列のうちのいずれかを含む。ＣＤ２８に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインはまた、表１に記載されるＬＣＶＲアミノ酸配列のうちのいずれかを含んでもよい。ある特定の実施形態によると、ＣＤ２８に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、表１に記載されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対のうちのいずれかを含む。本発明はまた、抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性分子を提供し、ＣＤ２８に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、表１に記載される重鎖ＣＤＲ１－ＣＤＲ２－ＣＤＲ３アミノ酸配列のうちのいずれか、および／または表１に記載される軽鎖ＣＤＲ１－ＣＤＲ２－ＣＤＲ３アミノ酸配列のうちのいずれかを含む。

【0014】

ある特定の実施形態によると、本発明は、抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性分子を提供し、ＣＤ２８に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号１０、２６、および５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。

【0015】

本発明はまた、抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性分子を提供し、ＣＤ２８に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号１８、４２、および６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。

【0016】

本発明はまた、抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性分子を提供し、ＣＤ２８に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号１０／１８、２６／４２、および５８／６６からなる群から選択されるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）アミノ酸配列対を含む。

【0017】

本発明はまた、抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性分子を提供し、ＣＤ２８に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号１６、３２、および６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列と、配列番号２４、４８、および７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列とを含む。

【0018】

ある特定の実施形態では、ＣＤ２８に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号１６／２４、３２／４８、および６４／７２からなる群から選択されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む。

【0019】

本発明はまた、抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子を提供し、ＣＤ２８に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号１２、２８、および６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列、配列番号１４、３０、および６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列、配列番号２０、４４、および６８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列、ならびに配列番号２２、４６、および７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。

【0020】

本発明のある特定の非限定的で例示的な抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子は、それぞれ配列番号１２－１４－１６－２０－２２－２４、２８－３０－３２－４４－４６－４８、および６０－６２－６４－６８－７０－７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３ドメインを含む、ＣＤ２８に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインを含む。

【0021】

本発明はまた、抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性分子を提供し、ＰＳＭＡに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号２、３４、および５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、または少なくとも９０％、少な
くとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。

【0022】

本発明はまた、抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性分子を提供し、ＰＳＭＡに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１８、４２、および６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。

【0023】

本発明はまた、抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性分子を提供し、ＰＳＭＡに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号２／１８、３４／４２、および５０／６６からなる群から選択されるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）アミノ酸配列対を含む。

【0024】

本発明はまた、抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性分子を提供し、ＰＳＭＡに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号８、４０、および５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列と、配列番号２４、４８、および７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列とを含む。

【0025】

ある特定の実施形態では、ＰＳＭＡに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号８／２４、４０／４８、および５６／７２からなる群から選択されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む。

【0026】

本発明はまた、抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子を提供し、ＰＳＭＡに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号４、３６、および５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列、配列番号６、３８、および５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列、配列番号２０、４４、および６８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列、ならびに配列番号２２、４６、および７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。

【0027】

ある特定の非限定的で例示的な抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子は、それぞれ配列番号４－６－８－２０－２２－２４、３６－３８－４０－４４－４６－４８、および５２－５４－５６－６８－７０－７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３ドメインを含む、ＰＳＭＡに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む。

【0028】

関連する実施形態では、本発明は、ＰＳＭＡに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインが、配列番号２／１８、３４／４２、および５０／６６からなる群から選択される重鎖および軽鎖可変領域（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）配列内に含有される重鎖および軽鎖ＣＤＲドメインを含む、抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子を含む。

【0029】

別の態様では、本発明は、本明細書に開示される抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、またはＣＤＲ配列のうちのいずれかをコードする核酸分子を提供し、本明細書の表１に記載されるポリヌクレオチド配列を含む核酸分子、および表１に記載されるポリヌクレオチド配列のうちの２つ以上をその任意の機能的組み合わせまたは配置で含む核酸分子を含む。本発明の核酸を保有する組み換え発現ベクター、およびそのようなベクターが導入された宿主細胞もまた、抗体の産生を可能にする条件下で宿主細胞を培養することによって、および産生された抗体を回収することによって、抗体を産生する方法と同様に本発明に含まれる。

【0030】

本発明は、ＣＤ２８に特異的に結合する前述の抗原結合ドメインのうちのいずれかが、ＰＳＭＡに特異的に結合する前述の抗原結合ドメインのいずれかと組み合わされ、連結され、または他の方法で関連付けられて、ＣＤ２８およびＰＳＭＡに結合する二重特異性抗原結合分子を形成する、抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子を含む。

【0031】

本発明は、修飾グリコシル化パターンを有する抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子を含む。いくつかの用途において、望ましくないグリコシル化部位を除去するための修飾、または例えば抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）機能を増大させるためのオリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を欠失している抗体は有用であり得る（Ｓｈｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＪＢＣ ２７７：２６７３３を参照）。他の用途において、ガラクトシル化の修飾は、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を修飾するために行うことができる。

【0032】

別の態様では、本発明は、本明細書に開示される抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。関連する態様では、本発明は、抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子と、第２の治療薬との組み合わせである組成物を特徴とする。一実施形態では、第２の治療薬は、抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子と有利に組み合わされる任意の薬剤である。抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子と有利に組み合わせることができる例示的な薬剤は、本明細書の他所に詳細に論じられている。

【0033】

さらに別の態様では、本発明は、本発明の抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子を使用してＰＳＭＡを発現する腫瘍細胞を標的化／殺滅するための治療方法を提供し、これらの治療方法は、本発明の抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子を含む治療有効量の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。

【0034】

本発明はまた、ＰＳＭＡ発現細胞に関連するかまたはそれによって引き起こされる疾患または障害の治療のための薬剤の製造における本発明の抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子の使用を含む。

【0035】

さらに別の態様では、本発明は、本発明の抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子を使用してＰＳＭＡを発現する腫瘍細胞を標的化／殺滅するための治療方法を提供し、抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ３に結合する他の抗腫瘍二重特異性抗原結合分子と組み合わされる（例えば、抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡは抗ＣＤ３／抗ＰＳＭＡ抗体と組み合わされる）。

【0036】

さらに別の態様では、本発明は、本発明の抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子を使用してＰＳＭＡを発現する腫瘍細胞を標的化／殺滅するための治療方法を提供し、抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子は、ＰＤ－１またはＣＴＬＡ－４を標的とするチェックポイント阻害剤と組み合わされる（例えば、抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡは抗ＰＤ－１抗体と組み合わされる）。

【0037】

さらに別の態様では、本発明は、本発明の抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子を使用してＰＳＭＡを発現する腫瘍細胞を標的化／殺滅するための治療方法を提供し、抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ３に結合する他の抗腫瘍二重特異性抗原結合分子（例えば、抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡは抗ＣＤ３／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗体と組み合わされる）およびＰＤ－１またはＣＴＬＡ－４を標的とするチェックポイント阻害剤と組み合わされる（例えば、抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡは抗ＰＤ－１抗体と組み合わされる）。

【0038】

他の実施形態は、後述の詳細な説明の精査から明らかとなるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0039】

【図1】例示的な抗ＣＤ２８／ＰＳＭＡ二重特異性抗体の構造を示す概略図である。

【図2】共刺激リガンド発現を導入した操作細胞株における腫瘍成長阻害を示すグラフである。３つの腫瘍細胞株、Ｂ１６Ｆ１０．９、ＥＬ４、およびＭＣ３８は、共刺激リガンドまたはＧＦＰを対照として発現するように操作された。図２は、生存率（％）を示すグラフである。腫瘍が２０００ｍｍ³超えて成長したとき、マウスを安楽死させた。

【図3】抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体を試験するための一次および操作されたバイオアッセイを示す概略図である。

【図4A】ＣＤ４＋Ｔ細胞および操作されたＪＲＴ３．Ｔ３／１Ｇ４／ｈＣＤ２８細胞の活性化が、一次刺激（ＲＥＧＮ２２８１）およびＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０細胞上で発現されるＰＳＭＡの存在下で抗ｈＰＳＭＡ×ｈＣＤ２８によって強化されたことを示す。

【図4B】ＣＤ４＋Ｔ細胞および操作されたＪＲＴ３．Ｔ３／１Ｇ４／ｈＣＤ２８細胞の活性化が、一次刺激（ＲＥＧＮ２２８１）およびＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０細胞上で発現されるＰＳＭＡの存在下で抗ｈＰＳＭＡ×ｈＣＤ２８によって強化されたことを示す。

【図5A】図５Ａ～５Ｈは、ＰＳＭＡを導入した操作細胞株において、ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体が、抗ＣＤ２０×ＣＤ３二重特異性抗体によるＴＣＲ刺激の存在下でＴ細胞活性化を増強することを示す。 図５Ａは、二重特異性抗体の作用様式を示す概略図である。

【図5B】図５Ｂは、免疫シナプスに出入りするＣＤ２８蛍光の比率の定量化を示すグラフである。ＰＳＭＡ操作標的細胞（ＨＥＫ２９３）およびヒトＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、蛍光標識された二重特異性抗体（抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８、抗ＣＤ２０×ＣＤ３）と３７℃で１時間共培養し、穏やかに固定して抗ＣＤ２８で染色した。グループごとに分析された細胞の数を棒グラフに示す。

【図5C】図５Ｃおよび５Ｄは、ＰＳＭＡで操作された標的細胞とともに培養されたヒトＴ細胞の増殖を示す。示されているデータは、平均±ＳＥＭである。データは、少なくとも２回の実験を表す。 図５Ｃは、０．５ｎＭのｈＩｇＧ４ｓアイソタイプ対照またはＰＳＭＡ×ＣＤ２８の存在下でのＣＤ２０×ＣＤ３の用量滴定を示すグラフを提供する。

【図5D】図５Ｄは、５ｐＭのｈＩｇＧ４ｓアイソタイプ対照またはＣＤ２０×ＣＤ３の存在下でのＰＳＭＡ×ＣＤ２８または示された対照の用量滴定を示すグラフを提供する。

【図5E】図５Ｅ～５Ｇは、５ｐＭのｈＩｇＧ４ｓアイソタイプ対照（各図の下パネル）またはＣＤ２０×ＣＤ３（各図の上パネル）の存在下での、パネルの上部に示されているようなＴＡＡ（ＰＳＭＡまたはＣＤ２０）操作された標的細胞とともに培養されたヒトＴ細胞の増殖およびサイトカイン放出を示すグラフである。データは、平均±ＳＥＭである。データは、少なくとも３回の実験を表す。 図５Ｅは、増殖を示すグラフである。

【図5F】図５Ｆは、ＩＬ－２放出を示すグラフである。

【図5G】図５Ｇは、ＩＦＮγ放出を示すグラフである。

【図5H】図５Ｈは、抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８および抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体が、ＰＳＭＡ発現細胞に同時に結合できることを示すグラフである。２２ＲＶ１細胞を、２０ｍｇ／ｍｌのＰＳＭＡ×ＣＤ３、またはＰＳＭＡｘＣＤ２８二重特異性抗体と同様の抗ＰＳＭＡアームを内包する２０ｍｇ／ｍｌの抗ＰＳＭＡ抗体を含むフローサイトメトリー緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＦＢＳ）中、４℃で３０分間プレインキュベートした。インキュベーション後、細胞をフローサイトメトリー緩衝液で洗浄し、Ａｌｅｘａ６４７で直接標識した５ｍｇ／ｍｌのＰＳＭＡ×ＣＤ２８とともに４℃で２０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、フローサイトメトリー緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。

【図6A】抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８が、前立腺癌およびヒトまたはカニクイザルＴ細胞の存在下で抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３の細胞傷害性効能を強化したことを示す。

【図6B】抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８が、前立腺癌およびヒトまたはカニクイザルＴ細胞の存在下で抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３の細胞傷害性効能を強化したことを示す。

【図7A】図７Ａ～７Ｈは、内在性ＰＳＭＡを有する癌細胞株において、ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体が、ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体によるＴＣＲ刺激の存在下でＴ細胞活性化を増強することを示すグラフを提供する。図７Ａ～７Ｄの場合、ヒトＴ細胞は、内在性ＰＳＭＡ発現を伴う癌標的細胞（前立腺癌株Ｃ４－２）および示された二重特異性抗体とともに９６時間培養された。 図７Ａは、腫瘍細胞の殺滅を示すグラフである。示されているデータは、生細胞のパーセンテージである。

【図7B】図７Ｂは、ＩＦＮγ放出を示すグラフである。

【図7C】図７Ｃは、ＣＤ４Ｔ細胞の数およびＣＤ２５⁺細胞の頻度をＣＤ４Ｔ細胞のパーセンテージとして示すグラフを提供する。

【図7D】図７Ｄは、ＣＤ８Ｔ細胞の数およびＣＤ２５⁺細胞の頻度をＣＤ８Ｔ細胞のパーセンテージとして示すグラフを提供する。

【図7E】図７Ｅ～７Ｇの場合、カニクイザルＴ細胞は、内在性ＰＳＭＡ発現を伴う癌細胞（前立腺癌株Ｃ４－２）および示された二重特異性抗体とともに９６時間培養された。 図７Ｅは、腫瘍細胞の殺滅を示すグラフである。示されているデータは、生細胞のパーセンテージである。

【図7F】図７Ｆは、ＣＤ４Ｔ細胞の数およびＣＤ２５⁺細胞の頻度をＣＤ４Ｔ細胞のパーセンテージとして示すグラフを提供する。

【図7G】図７Ｇは、ＣＤ８Ｔ細胞の数およびＣＤ２５⁺細胞の頻度をＣＤ８Ｔ細胞のパーセンテージとして示すグラフを提供する。

【図7H】図７Ｈは、フローサイトメトリーによって測定された細胞標的への抗体結合を示すグラフを提供する。

【図8】ＴＧＮスーパーアゴニストの特性と本発明の抗ＣＤ２８抗体の特性との比較を示す。

【図9A】ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体が、ＰＳＭＡ×ＣＤ３による抗腫瘍免疫、および誘発されたＴ細胞活性化を強化することを示すグラフおよびプロットを提供する。ＭＣ３８／ｈＰＳＭＡ腫瘍細胞を、ｈＣＤ３／ｈＣＤ２８／ｈＰＳＭＡヒト化マウスの皮下に移植した。０、３、および７日目に、マウスを５ｍｇ／ｋｇの示された二重特異性抗体で処置した。 図９Ａは、経時的な腫瘍体積を示す。値は、平均±ＳＥＭを表し、群あたり３～７匹のマウスを用いた３回の実験を表す。Ｐ値は、二元配置分散分析で計算された。（＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１、および＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１）。

【図9B】ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体が、ＰＳＭＡ×ＣＤ３による抗腫瘍免疫、および誘発されたＴ細胞活性化を強化することを示すグラフおよびプロットを提供する。ＭＣ３８／ｈＰＳＭＡ腫瘍細胞を、ｈＣＤ３／ｈＣＤ２８／ｈＰＳＭＡヒト化マウスの皮下に移植した。０、３、および７日目に、マウスを５ｍｇ／ｋｇの示された二重特異性抗体で処置した。 図９Ｂは、各処置群の各クラスター内の細胞のパーセンテージを示すグラフ（上パネル）、示されたクラスターのｖｉＳＮＥプロットへのオーバーレイ（下パネル）を提供する。

【図9C】ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体が、ＰＳＭＡ×ＣＤ３によって誘発されるサイトカイン放出を強化することを示す棒グラフを提供する。０日目の投与後４時間で、血清サイトカインのためにマウスから採血した。統計的有意性は、アイソタイプ＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．０００１と比較して一元配置分散分析で計算された。ｎ＝７匹のマウス／群。データは、代表的な３回の実験である。

【図9D】ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体が、ＰＳＭＡ×ＣＤ３によって誘発されるサイトカイン放出を強化することを示す棒グラフを提供する。０日目の投与後４時間で、血清サイトカインのためにマウスから採血した。統計的有意性は、アイソタイプ＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．０００１と比較して一元配置分散分析で計算された。ｎ＝７匹のマウス／群。データは、代表的な３回の実験である。

【図9E】ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体が、ＰＳＭＡ×ＣＤ３によって誘発されるＴ細胞活性化を強化することを示すグラフおよびプロットを提供する。

【図10】ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体または親ＣＤ２８二価抗体が、ＣＤ３／ＣＤ２８／ＰＳＭＡヒト化マウスにおいて血清サイトカイン産生を誘発しなかったことを示す。

【図11】ＣＤ２８スーパーアゴニスト治療が、ＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスにおいて４時間でサイトカイン応答を促進したが、抗ＣＤ２８抗体ｍＡｂ１４２２６Ｐ２は促進しなかったことを示す。

【図12】本発明の共刺激二重特異性抗原結合分子の潜在的により安全な毒性学的プロファイルを示す。抗ＣＤ２８×抗ＰＳＭＡは、サイトカイン応答を誘発しなかったが、抗ＣＤ３×抗ＰＳＭＡは誘発した。

【図13A】ＰＳＭＡ×ＣＤ３およびＣＤ２８スーパーアゴニストと比較して、ＰＳＭＡ×ＣＤ２８がサイトカイン産生またはＴ細胞辺縁趨向を示さなかったことを示す。ＬＬＯＱ：「定量下限」

【図13B】ＰＳＭＡ×ＣＤ３およびＣＤ２８スーパーアゴニストと比較して、ＰＳＭＡ×ＣＤ２８がサイトカイン産生またはＴ細胞辺縁趨向を示さなかったことを示す。ＬＬＯＱ：「定量下限」

【図14】図１４および１７は、ＴＳＡ×ＣＤ２８およびＰＤ－１遮断が、腫瘍部位のＴ細胞上のＴＣＲ／ＣＤ３およびＣＤ２８を活性化することを示す。図１５、１６、および１８は、ＴＳＡ×ＣＤ２８二重特異性およびＰＤ－１遮断が、インビトロでＴ細胞の活性化を相乗的に促進することを示す。図１４～１８において、非ブロッカーＰＤ－１ ｍＡｂ（ＮＢ ＰＤ－１ ｍＡｂ）またはブロッカー（ＰＤ－１ ｍＡｂ）、およびＣＤ２０×ＣＤ３二重特異性抗体の存在下でのＴ細胞（Ｊｕｒｋａｔ／ＰＤ－１）および標的細胞（Ｒａｊｉ ＷＴ）の結合体。 免疫シナプスにおけるＰＤ－１およびＣＤ２８の局在の定量化を示す棒グラフを提供する。統計的有意性は、対応のないｔ検定で計算された（有意でない、ｎｓ）。免疫シナプスでのＰＤ－１およびＣＤ２８の局在を定量化するために、非ブロッカーＰＤ－１ ｍＡｂ（ＮＢ ＰＤ－１ ｍＡｂ）またはブロッカー（ＰＤ－１ ｍＡｂ）および抗ＣＤ２０×ＣＤ３二重特異性抗体の存在下でのＴ細胞（Ｊｕｒｋａｔ／ＰＤ－１）および標的細胞（Ｒａｊｉ ＷＴ）の結合体の画像を撮影した。ＰＤ－１ ｍＡｂは、Ａｌｅｘａ６４７で直接標識され、抗ＣＤ２０×ＣＤ３二重特異性抗体は、Ａｌｅｘａ４８８で直接標識され、ＣＤ２８ ｍＡｂは、ＰＥで直接標識され、核はＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色された（画像は示さず）。

【図15】免疫シナプスにおけるＰＤ－１およびＣＤ２８の局在の定量化を示す棒グラフを提供する。統計的有意性は、対応のないｔ検定で計算された（ｐ＜０．０００１、＊＊＊＊）。免疫シナプスでのＰＤ－１およびＣＤ２８の局在を定量化するために、非ブロッカーＰＤ－１ ｍＡｂ（ＮＢ ＰＤ－１ ｍＡｂ）またはブロッカー（ＰＤ－１ ｍＡｂ）および抗ＣＤ２０×ＣＤ３二重特異性抗体の存在下でのＴ細胞（Ｊｕｒｋａｔ／ＰＤ－１）および標的細胞（Ｒａｊｉ／ＰＤ－Ｌ１）の結合体の画像を撮影した。ＰＤ－１ ｍＡｂは、Ａｌｅｘａ６４７で直接標識され（赤色で示される）、ＣＤ２０×ＣＤ３は、Ａｌｅｘａ４８８で直接標識され（緑色で示される）、ＣＤ２８ ｍＡｂは、ＰＥで直接標識され（青色で示される）、核は、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色された（灰色で示される）。点線は、明視野画像に基づいて描かれた細胞の輪郭である。

【図16】９６時間での２２ＲＶ１－ＰＤＬ１細胞の生存率（％）を示す。

【図17】９６時間での上清中のＩＦＮγレベルを示すグラフである。

【図18】９６時間でのＩＬ－２放出を示すグラフである。

【図19A】図１９Ａ～１９Ｄは、腫瘍細胞におけるＣＤ２８リガンド（ＣＤ８６）の発現が、抗ＰＤ１処置と相乗作用して、ＣＤ８依存性抗腫瘍免疫を誘発することを示す。ＭＣ３８腫瘍細胞は、ＣＤ２８、ＣＤ８６（ＭＣ３８／ＣＤ８６）、または空のベクター対照（ＭＣ３８／ＥＶ）のリガンドで形質導入された。ＷＴ Ｃ５７ＢＬ６マウスには、最初にマウスあたり１×１０⁶の腫瘍細胞を移植し、腫瘍移植後０、３、７、１０、および１４日目に、５ｍｇ／ｋｇのＰＤ－１ ｍＡｂまたはラットアイソタイプ対照で処置した。 図１９Ａは、経時的な平均腫瘍体積を示す。エラーバーは、＋／－ＳＥＭを表す。統計的有意性は、二元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定で決定された。

【図19B】図１９Ｂは、経時的な生存率（２０００ｍｍ³未満の腫瘍を有するマウスのパーセンテージ）を示す。移植後６０日目の統計的有意性は、ログ・ランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定で決定された。

【図19C】図１９Ｃでは、マウスをＣＤ８枯渇抗体（ＣＤ８が枯渇した）またはアイソタイプ対照（枯渇なし）で処置した。ＣＤ８枯渇（点線）および枯渇なし（実線）を伴う経時的な平均腫瘍体積は、＋／－ＳＥＭで示される。統計的有意性は、二元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定で決定された。

【図19D】図１９Ｄは、ＭＣ３８／ＣＤ８６を移植し、ＰＤ１ ｍＡｂで処置した無腫瘍マウスの二次腫瘍移植（再チャレンジ）を示す。 図１９Ａ～１９Ｄにおいて、示されているデータは、群あたり１０匹のマウスを用いた１回の実験からのものである。データは、少なくとも４回の別々の実験を表す。統計的有意性が示される（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。

【図20A】図２０、２１Ａ、２２、２４、および２５は、ＰＳＭＡ×ＣＤ２８が、ＰＤ１ ｍＡｂ治療と相乗作用して、抗腫瘍免疫を誘発することを示す。ＭＣ３８／ｈＰＳＭＡ腫瘍細胞を、ｈＣＤ３／ｈＣＤ２８／ｈＰＳＭＡマウスの皮下に移植した。ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体、ＰＤ－１ ｍＡｂまたはラットＩｇＧ２ａアイソタイプ対照は、単剤療法として、または各々５ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射によって組み合わせて投与された。図２１Ｂおよび２１Ｃは、ＰＳＭＡ×ＣＤ２８とＰＤ－１ ｍＡｂとの組み合わせが、腫瘍特異的Ｔ細胞の頻度を増加させることを示す。図２３Ａおよび２３Ｂは、ＰＳＭＡ×ＣＤ２８が、抗ＰＤ１処置と相乗作用して、脾臓または全身のサイトカインではなく腫瘍内サイトカインを誘発することを示す。 図２０Ａ～２０Ｅは、抗ＰＳＭＡ×抗ＣＤ２８抗体による即時処置が、腫瘍部位における免疫力を強化し、抗ＰＤ－１抗体と相乗作用して腫瘍拒絶反応を促進することを示す。 図２０Ａは、経時的な平均腫瘍体積を示す。エラーバーは、＋／－ＳＥＭを表す。統計的有意性は、二元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定で決定された（＊＊＊、ｐ＜０．００１および＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１）。

【図20B】図２０Ｂは、経時的な生存率を示す（２０００ｍｍ³を超える腫瘍を有するマウスは安楽死させる）。統計的有意性は、ログ・ランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定で決定された（＊＊、ｐ＜０．０１）。

【図20C】図２０Ｃは、移植後２１日目の平均腫瘍体積を示す。エラーバーは、＋／－ＳＥＭを表す。統計的有意性は、一元配置分散分析およびＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ多重比較検定で決定された（＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１）。

【図20D】図２０Ｄは、移植後２１日目の腫瘍体積（ｍｍ³）の表を示す。

【図20E】図２０Ｅは、６回の別々の実験からの群あたりの無腫瘍マウスの数の表を示す。

【図21A】ＰＳＭＡ×ＣＤ２８とＰＤ１ ｍＡｂとの組み合わせで以前に処置された無腫瘍マウスの二次腫瘍チャレンジを示す。エラーバーは、＋／－ＳＥＭを表す。データは、４回の実験を表す。

【図21B】ＣＤ３／ＣＤ２８／ＰＳＭＡヒト化マウスに移植され、移植後１０日目および１４日目に５ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照、ＰＳＭＡ×ＣＤ２８、ＰＤ１ ｍＡｂ、または組み合わせで処理されたＭＣ３８／ＰＳＭＡ腫瘍細胞を示す。１７日目に脾臓を採取した。脾細胞を、１０ｍｇ／ｍｌのペプチド（ｐ１５ＥまたはＯＶＡ）および２ｍｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８を含むＴ細胞培地で一晩培養した。一晩のインキュベーション後、標準手順に従って細胞内サイトカイン染色を行った。

【図21C】抗ＣＤ２８×ＰＳＭＡおよび抗ＣＤ３×ＰＳＭＡ処置ではなく、抗ＣＤ２８×ＰＳＭＡおよび抗ＰＤ１からの無腫瘍マウスは、２回目の腫瘍再チャレンジを拒絶したことを示す。

【図22A】図２２Ａ～２２Ｄ、２４および２５は、遅延／治療的処置レジメンを示す（投与は矢印で示される。図２２Ａおよび２２Ｂは９、１６、および２２日目、図２４および２５は７、１１、および１４日目）。 経時的な平均腫瘍体積を示す。エラーバーは、＋／－ＳＥＭを表す。統計的有意性は、二元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定で決定された。データは、３回の実験を表す。

【図22B】エクスビボの脾臓および腫瘍内サイトカインを示す。ポイントは、個々のマウスからのデータを表す。バーは、平均＋／－ＳＥＭである。

【図22C】２０日目の平均腫瘍サイズを示す。

【図22D】異なる処置を受けたマウスの生存率を示す。

【図23A】ＰＳＭＡ×ＣＤ２８が、抗ＰＤ１処置と相乗作用して、腫瘍内サイトカインを誘発するが、脾臓または全身性サイトカインを誘発しないことを示す。 図２３Ａでは、データは、図２２Ｂに対応する。エクスビボの脾臓および腫瘍内サイトカイン。ポイントは、個々のマウスからのデータを表す。バーは、平均＋／－ＳＥＭである。

【図23B】ＰＳＭＡ×ＣＤ２８が、抗ＰＤ１処置と相乗作用して、腫瘍内サイトカインを誘発するが、脾臓または全身性サイトカインを誘発しないことを示す。 図２３Ｂでは、ＣＤ３／ＣＤ２８／ＰＳＭＡトリプルヒト化マウスにＭＣ３８／ｈＰＳＭＡを移植し、０日目に５ｍｇ／ｋｇの示された抗体で処置した。マウスから採血し、投与後４時間で血清を収集した。図２３Ａおよび２３Ｂの両方において、統計的有意性は、一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定で計算された。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１

【図24】流入領域リンパ節（ｄＬＮ）、脾臓（Ｓｐ）、および腫瘍（Ｔｕ）からのＴ細胞サブセット上のＰＤ１発現を示す。ポイントは、個々のマウスからのデータを表す。バーは、平均＋／－ＳＥＭである。

【図25】示された処置群からのＣ１およびＣ２におけるＣＤ８Ｔ細胞の頻度を示す。 各々１回の実験からの図２２Ｂ、２４、および２５のデータ。図２２Ｂおよび２４、ｎ＝４～６匹のマウス／群。図２５、ｎ＝１０匹のマウス／群。

【図26A】図２６Ａ～２６Ｃは、図２７とともに、ＴＡＡ×ＣＤ２８単独、またはＰＤ１療法との組み合わせが、カニクイザルにおいて、ＣＤ２８スーパーアゴニストと比較して全身性Ｔ細胞活性化を誘発しないことを示す。カニクイザルは、示された用量（示されているように１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ）の単一用量の二重特異性抗体で処置された。投与後の時間（時間）が示される。 図２６Ａは、血清サイトカインを示す。

【図26B】図２６Ｂは、相対的な末梢血Ｔ細胞数を示す。

【図26C】図２６Ｃは、Ｋｉ６７⁺およびＩＣＯＳ⁺Ｔ細胞の頻度（ＣＤ３の％）を示す。 図２６Ａ～２６Ｃでは、値は、平均＋／－ＳＥＭを表す。Ｎ＝３匹の動物／群。

【図27】ＣＤ３／ＣＤ２８／ＰＳＭＡトリプルヒト化マウスが、単一用量の抗体（示されているように０．２５ｍｇ／ｋｇまたは２．５ｍｇ／ｋｇ）で処置されたことを示す。投与後４時間（０日目）にマウスから採血し、血清を収集した。統計的有意性は、一元配置分散分析およびＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋの多重比較検定を用いて計算された。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１

【図28】ＰＳＭＡ×ＣＤ２８＋／－ＰＤ１が、担腫瘍マウスの血清サイトカインを上昇させなかったことを示す。

【図29A】ＰＳＭＡ×ＣＤ２８単独、またはＰＤ１ ｍＡｂとの組み合わせが、非担腫瘍マウスにおいてインビボで安全なサイトカインプロファイルを示すことを示す。データは、図２７に対応する。ＣＤ３／ＣＤ２８／ＰＳＭＡトリプルヒト化マウスを、単一用量の抗体（示されているように０．２５ｍｇ／ｋｇまたは２．５ｍｇ／ｋｇ）で処置した。投与後４時間（０日目）および７２時間（３日目）にマウスから採血し、血清を収集した。統計的有意性は、一元配置分散分析およびＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋの多重比較検定を用いて計算された。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１

【図29B】ＰＳＭＡ×ＣＤ２８単独、またはＰＤ１ ｍＡｂとの組み合わせが、非担腫瘍マウスにおいてインビボで安全なサイトカインプロファイルを示すことを示す。データは、図２７に対応する。ＣＤ３／ＣＤ２８／ＰＳＭＡトリプルヒト化マウスを、単一用量の抗体（示されているように０．２５ｍｇ／ｋｇまたは２．５ｍｇ／ｋｇ）で処置した。投与後４時間（０日目）および７２時間（３日目）にマウスから採血し、血清を収集した。統計的有意性は、一元配置分散分析およびＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋの多重比較検定を用いて計算された。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１

【発明を実施するための形態】

【0040】

本発明を説明する前に、本発明は、特定の方法および説明される実験条件が変わり得るので、このような方法および条件に制限されないことは理解されることになっている。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、限定することを企図するものではないことも理解されるべきである。

【0041】

別段定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は全て、本発明の属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特定の列挙された数値に関して使用されるとき、その値が列挙された値から１％以下だけ変動し得ることを意味する。例えば、本発明で使用される場合、「約１００」という表現は、９９および１０１、ならびにその間の全ての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４等）を含む。

【0042】

本明細書に説明されるものと類似のまたは等価の任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料をこれから説明する。本明細書で言及される特許、出願、および非特許刊行物は全て、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0043】

定義
本明細書で使用される「ＣＤ２８」という表現は、共刺激受容体としてＴ細胞上に発現される抗原を指す。ヒトＣＤ２８は、配列番号７４に記載されているアミノ酸配列を含み、および／またはＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００６１３０．１に記載されているアミノ酸配列を有する。本明細書におけるタンパク質、ポリペプチド、およびタンパク質フラグメントについての全ての言及は、非ヒト種由来であることが明確に特定されない限り、それぞれのタンパク質、ポリペプチド、またはタンパク質フラグメントのヒト型を指すことを意図している。したがって、「ＣＤ２８」という表現は、非ヒト種、例えば「マウスＣＤ２８」、「サルＣＤ２８」等に由来するものとして特定されない限り、ヒトＣＤ２８を意味する。

【0044】

本明細書で使用される場合、「ＣＤ２８に結合する抗体」または「抗ＣＤ２８抗体」は、単量体ＣＤ２８を特異的に認識する抗体およびその抗原結合フラグメント、ならびに二量体ＣＤ２８を特異的に認識する抗体およびその抗原結合フラグメントを含む。本発明の抗体および抗原結合フラグメントは、可溶性ＣＤ２８および／または細胞表面発現ＣＤ２８に結合することができる。可溶性ＣＤ２８には、天然ＣＤ２８タンパク質、ならびに膜貫通ドメインを欠くかまたはそうでなければ細胞膜と会合していない、例えば単量体および二量体ＣＤ２８構築物などの組み換えＣＤ２８タンパク質変異体が含まれる。

【0045】

本明細書で使用される場合、「細胞表面発現ＣＤ２８」という表現は、インビトロまたはインビボで細胞表面上に発現される１つ以上のＣＤ２８タンパク質（複数可）を意味し、ＣＤ２８タンパク質の少なくとも一部分は、細胞膜の細胞外側に曝され、抗体の抗原結合部分に接近可能である。「細胞表面発現ＣＤ２８」としては、細胞膜内の機能的Ｔ細胞共刺激受容体の文脈に含まれるＣＤ２８タンパク質が挙げられる。「細胞表面発現ＣＤ２８」という表現は、細胞の表面上のホモ二量体の一部として発現されるＣＤ２８タンパク質を含む。「細胞表面発現ＣＤ２８」は、通常はＣＤ２８タンパク質を発現する細胞の表面上に発現されるＣＤ２８タンパク質を含み得るか、またはそれからなり得る。あるいは、「細胞表面発現ＣＤ２８」は、通常はその表面上にヒトＣＤ２８を発現しないが、その表面上にＣＤ２８を発現するように人工的に操作されている細胞の表面上に発現されるＣＤ２８タンパク質を含み得るか、またはそれからなり得る。

【0046】

本明細書で使用される場合、「抗ＣＤ２８抗体」という表現は、単一特異性を有する一価抗体、ならびにＣＤ２８に結合する第１のアームおよび第２の（標的）抗原に結合する第２のアームを含む二重特異性抗体の両方を含み、抗ＣＤ２８アームは、本明細書の表１に記載されているＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲ配列のうちのいずれかを含む。抗ＣＤ２８二重特異性抗体の例は、本明細書の他の場所に記載されている。用語「抗原結合分子」は、抗体および抗体の抗原結合フラグメントを含み、例えば二重特異性抗体を含む。

【0047】

本発明で使用される場合、「抗体」という用語は、特定の抗原（例えば、ＣＤ２８）に特異的に結合するかまたはそれと相互作用する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、任意の抗原結合分子または分子複合体を意味する。「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互連結された４本のポリペプチド鎖、２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子、ならびにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、Ｃ_H１、Ｃ_H２、およびＣ_H３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（Ｃ_L１）を含む。Ｖ_H領域およびＶ_L領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域が点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域へとさらに細分することができる。各Ｖ_HおよびＶ_Lは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる。本発明の異なる実施形態では、抗ＣＤ２８抗体（またはその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であってもよく、または天然にもしくは人工的に修飾されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義され得る。

【0048】

本明細書で使用される「抗体」という用語はまた、完全抗体分子の抗原結合フラグメントを含む。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合フラグメント」および同様の用語は、本明細書で使用される場合、天然の、酵素処理で入手可能な、合成の、または遺伝子操作された、抗原を特異的に結合して複合体を形成するポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗体結合フラグメントは、例えば、抗体可変ドメインおよび場合により定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現に関連するタンパク質消化技術または組み換え遺伝子操作技術などの任意の適切な標準的技術を用いて、完全抗体分子から誘導され得る。そのようなＤＮＡは既知であり、および／または例えば市販の供給源、ＤＮＡライブラリー（例えばファージ－抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であるか、または合成することができる。ＤＮＡは、例えば、１つ以上の可変ドメインおよび／もしくは定常ドメインを好適な配置へと配置するか、またはコドンを導入し、システイン残基を創造し、アミノ酸を修飾、付加、もしくは欠失などするために、化学的に、または分子生物学技術を使用することによって配列決定および操作され得る。

【0049】

抗体結合フラグメントの非限定例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント、（ｉｖ）Ｆｖフラグメント、（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント、および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））を模倣するアミノ酸残基、または拘束ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチドからなる最小認識単位が挙げられる。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小型モジュール型免疫医薬品（ＳＭＩＰ）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどの他の操作された分子も、本明細書で使用する「抗原結合フラグメント」という表現に包含される。

【0050】

抗体の抗原結合フラグメントは、典型的には、少なくとも１つの可変ドメインを含むであろう。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成物であり得、概して、１つ以上のフレームワーク配列に隣接しているかまたは１つ以上のフレームワーク配列とインフレームである少なくとも１つのＣＤＲを含む。Ｖ_Lドメインと結合したＶ_Hドメインを有する抗体結合フラグメントにおいて、Ｖ_HドメインおよびＶ_Lドメインは、任意の好適な配置で互いに対して配置され得る。例えば、可変領域は二量体であり、Ｖ_H－Ｖ_H、Ｖ_H－Ｖ_LまたはＶ_L－Ｖ_L二量体を含み得る。あるいは、抗体の抗原結合フラグメントは、単量体のＶ_HドメインまたはＶ_Lドメインを含み得る。

【0051】

ある特定の実施形態では、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合された少なくとも１つの可変ドメインを含み得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメント内に見出すことができる可変ドメインおよび定常ドメインの非限定的な例示的立体配置としては、（ｉ）Ｖ_H－Ｃ_H１、（ｉｉ）Ｖ_H－Ｃ_H２、（ｉｉｉ）Ｖ_H－Ｃ_H３、（ｉｖ）Ｖ_H－Ｃ_H１－Ｃ_H２、（ｖ）Ｖ_H－Ｃ_H１－Ｃ_H２－Ｃ_H３、（ｖｉ）Ｖ_H－Ｃ_H２－Ｃ_H３、（ｖｉｉ）Ｖ_H－Ｃ_L、（ｖｉｉｉ）Ｖ_L－Ｃ_H１、（ｉｘ）Ｖ_L－Ｃ_H２、（ｘ）Ｖ_L－Ｃ_H３、（ｘｉ）Ｖ_L－Ｃ_H１－Ｃ_H２、（ｘｉｉ）Ｖ_L－Ｃ_H１－Ｃ_H２－Ｃ_H３、（ｘｉｉｉ）Ｖ_L－Ｃ_H２－Ｃ_H３、および（ｘｉｖ）Ｖ_L－Ｃ_Lが挙げられる。先に列挙した例示的な立体配置のうちのいずれかを含む、可変ドメインおよび定常ドメインの任意の立体配置において、可変ドメインおよび定常ドメインは、互いに直接連結されていてもよく、または完全もしくは部分的ヒンジ領域もしくはリンカー領域によって連結されていてもよい。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子において隣接する可変ドメインおよび／または定常ドメイン間の可撓性または半可撓性の結合をもたらす少なくとも２つの（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０またはそれより多数の）アミノ酸からなり得る。そのうえ、抗原結合フラグメントは、互いとのおよび／または１つ以上の単量体Ｖ_HドメインもしくはＶ_Lドメインとの（例えば、ジスルフィド結合（複数可）による）非共有結合において、先に列挙した可変ドメイン立体配置および定常ドメイン立体配置のうちのいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含み得る。

【0052】

完全抗体分子と同様に、抗体結合フラグメントは、単一特異性または多重特異性（例えば、二重特異性）であり得る。抗体の多重特異性抗原結合フラグメントは、典型的には、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含むことになっており、各可変ドメインは、別個の抗原へまたは同じ抗原上の異なるエピトープへ特異的に結合することができる。本明細書に開示される例示的な二重特異性抗体フォーマットを含む任意の多重特異性抗体フォーマットは、当該技術分野で利用可能な通例の技術を使用して、本発明の抗体の抗原結合フラグメントとの関連で使用に適合し得る。

【0053】

本発明の抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して機能し得る。「補体依存性細胞傷害」（ＣＤＣ）は、補体の存在下における本発明の抗体による抗原発現細胞の溶解を指す。「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」（ＡＤＣＣ）は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が標的細胞上の結合抗体を認識し、それによって標的細胞の溶解をもたらす、細胞媒介性反応を指す。ＣＤＣおよびＡＤＣＣは、当該技術分野において周知であり利用可能なアッセイを用いて測定することができる。（例えば、米国特許第５，５００，３６２号および第５，８２１，３３７号、ならびにＣｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５：６５２－６５６を参照）。抗体の定常領域は、補体を固定して細胞依存性細胞傷害性を媒介する抗体の能力において重要である。したがって、抗体のアイソタイプは、その抗体が細胞傷害性を媒介することが望ましいかに基づいて選択され得る。

【0054】

本発明のある特定の実施形態では、本発明の抗ＣＤ２８抗体（単一特異性または二重特異性）は、ヒト抗体である。「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことが意図される。本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３における、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発によってまたはインビボでの体細胞突然変異によって導入された突然変異）によってコードされないアミノ酸残基を含み得る。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、別の哺乳類種（例えば、マウス）の生殖系列に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列へと移植された抗体を含むことを意図するものではない。

【0055】

本発明の抗体は、いくつかの実施形態では、組み換えヒト抗体であり得る。本明細書で使用される用語「組み換えヒト抗体」は、宿主細胞にトランスフェクトされた組み換え発現ベクターを使用して発現される抗体など、組み換え手段によって調製、発現、作成、または単離される全てのヒト抗体（後述）、組み換え型コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体（後述）、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ｒｅｓ．２０：６２８７－６２９５）、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、生成、または単離された全てのヒト抗体を含むことを意図する。そのような組み換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。しかしながら、ある特定の実施形態では、そのような組み換えヒト抗体は、インビトロ突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックな動物が用いられる場合は、インビボ体細胞突然変異誘発）を受け、したがって組み換え抗体のＶ_HおよびＶ_L領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列Ｖ_HおよびＶ_L配列に由来し関連してはいるが、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在し得ない配列である。

【0056】

ヒト抗体は、ヒンジの不均一性に関連する２つの形態で存在することができる。第１の形態において、免疫グロブリン分子は、二量体が鎖間重鎖ジスルフィド結合によって一緒に保持されているおよそ１５０～１６０ｋＤａの安定な四本鎖構築物を含む。第２の形態において、二量体は鎖間ジスルフィド結合を介して連結されておらず、共有結合した軽鎖および重鎖からなる約７５～８０ｋＤａの分子が形成される（半抗体）。これらの形態は、親和性精製後でさえも分離することが極めて困難とされている。

【0057】

様々な無傷のＩｇＧアイソタイプにおける第２の形態の出現頻度は、抗体のヒンジ領域アイソタイプに関連する構造上の相違によるが、それに限定されない。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における単一アミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１ヒンジを用いて典型的に観察されるレベルまで第２の形態の出現を有意に減少させることができる（Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３０：１０５）。本発明は、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３領域に１つ以上の突然変異を有する抗体を包含し、例えば産生において、所望の抗体形態の収率を改善するのに望ましい場合がある。

【0058】

本発明の抗体は単離された抗体であり得る。本明細書で使用される「単離された抗体」は、同定された抗体、およびその天然環境の少なくとも１つの成分から分離および／または回収された抗体を意味する。例えば、生物の少なくとも１つの成分から、または抗体が天然に存在するかもしくは天然に産生される組織または細胞から分離または除去された抗体は、本発明の目的のための「単離された抗体」である。単離された抗体はまた、組み換え細胞内の原位置の抗体を含む。単離された抗体は、少なくとも１つの精製または単離工程を受けている抗体である。ある特定の実施形態によると、単離された抗体は他の細胞性物質および／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。

【0059】

本発明はまた、ＣＤ２８に結合するワンアーム抗体も含む。本明細書中で使用される場合、「ワンアーム抗体」とは、単一の抗体重鎖および単一の抗体軽鎖を含む抗原結合分子を意味する。本発明のワンアーム抗体は、表２に記載されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれかを含み得る。

【0060】

本明細書の抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合ドメインは、抗原結合タンパク質または抗原結合ドメインが由来した対応する生殖系列配列と比較して、重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域に１つ以上のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含み得る。そのような突然変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば、公共の抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって容易に確認することができる。本発明は、本明細書に開示されるアミノ酸配列のうちのいずれかに由来する抗体、およびその抗原結合ドメインを含み、ここで、１つ以上のフレームワーク領域および／またはＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸は、抗体が由来した生殖系列配列の対応する残基（複数可）に、もしくは別のヒト生殖系列配列の対応する残基（複数可）に、または対応する生殖系列残基（複数可）の保存的アミノ酸置換に突然変異する（そのような配列変化は、本明細書では集合的に「生殖系列突然変異」と称される）。当業者は、本明細書に開示される重鎖および軽鎖可変領域配列から出発して、１つ以上の個々の生殖系列突然変異またはそれらの組み合わせを含む多くの抗体および抗体結合フラグメントを容易に産生することができる。ある特定の実施形態では、Ｖ_Hおよび／またはＶ_Lドメイン内のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基は全て、抗体が由来した元の生殖系列配列において見出される残基へと再び突然変異する。他の実施形態では、ある特定の残基のみが、元の生殖系列配列へと再び突然変異し、例えば、突然変異した残基のみが、ＦＲ１の最初の８個のアミノ酸内に、もしくはＦＲ４の最後の８個のアミノ酸内に認められるか、または突然変異した残基のみが、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３内に認められる。他の実施形態では、フレームワークおよび／またはＣＤＲ残基（複数可）のうちの１つ以上は、異なる生殖系列配列（すなわち、抗体が本来由来した生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基（複数可）へ突然変異する。さらに、本発明の抗体またはその抗原結合ドメインは、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内に２つ以上の生殖系列突然変異の任意の組み合わせを含有してもよく、例えば、ある特定の個々の残基は、特定の生殖系列配列の対応する残基へ突然変異するのに対し、元の生殖系列配列とは異なるある特定の他の残基は、維持されるか、または異なる生殖系列配列の対応する残基へ突然変異する。いったん得られれば、１つ以上の生殖系列突然変異を含有する抗原結合ドメインは、結合特異性の改善、結合親和性の増大、アンタゴニストまたはアゴニストの生物学的特性の改善または強化（場合によって）、免疫原性の低減等の１つ以上の所望の特性について容易に試験することができる。この一般的な方法で得られた抗体またはその抗原結合フラグメントは、本発明の範囲内に包含される。

【0061】

本発明はまた、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれかの変異体を含む、抗ＣＤ２８抗体および抗原結合分子を含む。本発明のこの態様に含まれる例示的な変異体には、１つ以上の保存的置換を有する、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれかの変異体が含まれる。例えば、本発明は、本明細書の表１に記載されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれかに対して、例えば１０個以下、８個以下、６個以下、または４個以下等の保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＣＤ２８抗体および抗原結合分子を含む。

【0062】

「エピトープ」という用語は、パラトープとして既知の抗体分子の可変領域における特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は２つ以上のエピトープを有してもよい。したがって、異なる抗体は、抗原上の異なる領域へ結合し得、異なる生物学的効果を有し得る。エピトープは、立体配座または直鎖状のいずれかであり得る。立体配座エピトープは、直鎖状ポリペプチド鎖の異なるセグメントから空間的に並置されたアミノ酸によって産生される。直鎖状エピトープは、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基によって産生されるものである。ある特定の状況において、エピトープは、抗原上の糖類、ホスホリル基、またはスルホニル基の部分を含み得る。

【0063】

「実質的な同一性」または「実質的に同一である」という用語は、核酸またはそのフラグメントを指す場合、別の核酸（またはその相補鎖）との適切なヌクレオチド挿入または欠失と最適に整列した場合、以下に考察するように、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐなど、配列同一性の任意の周知のアルゴリズムによって測定される場合に、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％のヌクレオチド配列同一性があることを示す。参照核酸分子と実質的な同一性を有する核酸分子は、ある特定の場合では、参照核酸分子によってコードされるポリペプチドと同じまたは実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。

【0064】

ポリペプチドへ適用される場合、「実質的な類似性」または「実質的に類似の」という用語は、２つのペプチド配列が、既定のギャップ重みを用いてプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列した場合、少なくとも９５％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％または９９％の配列同一性を共有する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換だけ異なる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を備えた側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されたものである。概して、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させないことになっている。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換だけ互いに異なる場合、配列同一性の割合または類似性の程度は、置換の保存的性質を補正するために上向きに調整してもよい。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３３１を参照されたい。類似の化学的特性を備えた側鎖を有するアミノ酸の基の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、（２）脂肪族－ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン、（３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン、（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン、（６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに（７）含硫側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタミン酸－アスパラギン酸、およびアスパラギン－グルタミンである。あるいは、保存的な置換とは、Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３－１４４５に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて正の値を有する任意の変化である。「適度に保存的な」置換とは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負以外の値を有する任意の変化である。

【0065】

ポリペプチドに対する配列類似性は、配列同一性とも呼ばれ、典型的には配列分析ソフトウェアを用いて測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む種々の置換、欠失および他の修飾へ割り当てられた類似の測定値を用いて類似の配列と一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、異なる種の生物由来の相同ポリペプチドのような密接に関連するポリペプチド間の、または野生型タンパク質とその変異タンパク質の間の配列相同性または配列同一性を決定するための既定パラメータとともに使用することができるＧａｐおよびＢｅｓｔｆｉｔなどのプログラムを含有する。例えば、ＧＣＧ第６．１版を参照されたい。ポリペプチド配列は、ＧＣＧ第６．１版におけるプログラムである、既定パラメータまたは推奨パラメータを備えたＦＡＳＴＡを使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、問い合わせ配列と検索配列の間の最良重複の領域の整列およびパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）上述）。本発明の配列を、異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、既定パラメータを使用するコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．ＢｉｏＩ．２１５：４０３－４１０ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－４０２を参照されたい。

【0066】

二重特異性抗原結合分子
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、または多重特異性であり得る。多重特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得るか、または２つ以上の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有し得る。例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａＩ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０－６９、Ｋｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８－２４４を参照されたい。本発明の抗ＣＤ２８抗体は、別の機能性分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質に連結するか、またはそれと同時発現させることができる。例えば、抗体またはそのフラグメントは、別の抗体または抗体フラグメントなどの１つ以上の他の分子実体に（例えば、化学結合、遺伝的融合、非共有結合、もしくは他の方法により）機能的に連結されて、第２の結合特異性を有する二重特異性抗体または多重特異性抗体を産生することができる。

【0067】

本明細書における「抗ＣＤ２８抗体」という表現の使用は、単一特異性抗ＣＤ２８抗体、ならびにＣＤ２８結合アームおよび標的抗原に結合する第２のアームを含む二重特異性抗体の両方を含むことを意図している。したがって、本発明は、免疫グロブリンの一方のアームがヒトＣＤ２８に結合し、免疫グロブリンの他方のアームが標的抗原に特異的である、二重特異性抗体を含む。ＣＤ２８二重特異性抗体のもう一方のアームが結合する標的抗原は、細胞、組織、器官、微生物、またはウイルス上またはその近傍で発現される、標的免疫応答が望まれる任意の抗原であり得る。ＣＤ２８結合アームは、本明細書の表１に記載されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれかを含み得る。ある特定の実施形態では、ＣＤ２８結合アームは、ヒトＣＤ２８に結合し、ヒトＴ細胞増殖を誘発する。

【0068】

抗体の一方のアームがＣＤ２８に結合し、もう一方のアームが標的抗原に結合する本発明の二重特異性抗体の文脈において、標的抗原は、ＰＳＭＡなどの腫瘍関連抗原であり得る。

【0069】

ある特定の例示的な実施形態によると、本発明は、ＣＤ２８およびＰＳＭＡに特異的に結合する二重特異性抗原結合分子を含む。そのような分子は、本明細書では、例えば、「抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ」もしくは「抗ＣＤ２８×ＰＳＭＡ」もしくは「ＣＤ２８×ＰＳＭＡ」もしくは「抗ＰＳＭＡ／抗ＣＤ２８」もしくは「抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８」もしくは「ＰＳＭＡ×ＣＤ２８」二重特異性分子と称され得るか、または他の同様の用語であり得る。

【0070】

「ＰＳＭＡ」という用語は、本明細書で使用される場合、非ヒト種（例えば、「マウスＰＳＭＡ」、「サルＰＳＭＡ」等）に由来するものとして指定されない限り、ヒトＰＳＭＡタンパク質を指す。ヒトＰＳＭＡタンパク質は、配列番号７３に示されるアミノ酸配列を有し、および／またはＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００４４６７．１に記載されるアミノ酸配列を有する。

【0071】

図１に示されるある特定の例示的な実施形態によると、二重特異性抗原結合分子（例えば、二重特異性抗体）は、エフェクターアームおよび標的化アームを有し得る。エフェクターアームは、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）上の抗原に結合する最初の抗原結合ドメイン（例えば、抗ＣＤ２８抗体）であり得る。標的化アームは、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）上の抗原に結合する第２の抗原結合ドメイン（例えば、抗ＰＳＭＡ抗体）であり得る。ある特定の例示的な実施形態によると、エフェクターアームは、ＣＤ２８に結合し、標的化アームは、ＰＳＭＡに結合する。二重特異性抗ＣＤ２８／ＰＳＭＡは、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）に共刺激シグナルを提供することができる。エフェクターアームは、クラスター化せずにＴ細胞を刺激する効果はない。クラスター化すると、エフェクターアームだけでは、Ｔ細胞を刺激する効果がほとんどない。標的化アームと組み合わせて、エフェクターアームは、Ｔ細胞を刺激する。腫瘍標的化アームは、腫瘍特異性が不完全である可能性がある。標的化アームの標的である抗原（例えば、ＰＳＭＡ）は、腫瘍細胞の一部に発現され得る。腫瘍標的化アームの特異性は、抗ＣＤ３二重特異性抗原結合分子（例えば、抗ＣＤ３／ＰＳＭＡ二重特異性抗体）との組み合わせと重複することによって増加し得る。

【0072】

本明細書で使用される場合、表現「抗原結合分子」は、単独で、または特定の抗原に特異的に結合する、１つ以上のさらなるＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域（ＦＲ）と組み合わせて少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むまたはそれからなるタンパク質、ポリペプチド、または分子複合体を意味する。ある特定の実施形態では、抗原結合分子は、それらの用語が本明細書の他所で定義されているように、抗体または抗体のフラグメントである。

【0073】

本明細書で使用される場合、表現「二重特異性抗原結合分子」は、少なくとも第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを含むタンパク質、ポリペプチドまたは分子複合体を意味する。二重特異性抗原結合分子内の各抗原結合ドメインは、単独で、または１つ以上の追加のＣＤＲおよび／またはＦＲと組み合わせて、特定の抗原に特異的に結合する少なくとも１つのＣＤＲを含む。本発明の文脈において、第１の抗原結合ドメインは、第１の抗原（例えば、ＣＤ２８）に特異的に結合し、第２の抗原結合ドメインは、第２の別個の抗原（例えば、ＰＳＭＡ）に特異的に結合する。

【0074】

本発明のある特定の例示的な実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、二重特異性抗体である。二重特異性抗体の各抗原結合ドメインは、重鎖可変ドメイン（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変ドメイン（ＬＣＶＲ）を含む。第１および第２の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子（例えば、二重特異性抗体）の文脈において、第１の抗原結合ドメインのＣＤＲは、接頭辞「Ｄ１」を付けて指定され、第２の抗原結合ドメインのＣＤＲは、接頭辞「Ｄ２」を付けて指定され得る。したがって、第１の抗原結合ドメインのＣＤＲは、本明細書においてＤ１－ＨＣＤＲ１、Ｄ１－ＨＣＤＲ２、およびＤ１－ＨＣＤＲ３と称されてもよく、第２の抗原結合ドメインのＣＤＲは、本明細書においてＤ２－ＨＣＤＲ１、Ｄ２－ＨＣＤＲ２、およびＤ２－ＨＣＤＲ３と称されてもよい。

【0075】

第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、互いに直接的または間接的に結合して、本発明の二重特異性抗原結合分子を形成し得る。あるいは、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは各々、別々の多量体化ドメインに連結されていてもよい。１つの多量体化ドメインと別の多量体化ドメインとの会合は、２つの抗原結合ドメイン間の会合を促進し、それによって二重特異性抗原結合分子を形成する。本明細書で使用される場合、「多量体化ドメイン」は、同一または類似の構造または構成の第２の多量体化ドメインと会合する能力を有する任意の高分子、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、またはアミノ酸である。例えば、多量体化ドメインは、免疫グロブリンＣ_H３ドメインを含むポリペプチドであってもよい。多量体化成分の非限定的な例は、免疫グロブリンのＦｃ部分（Ｃ_H２－Ｃ_H３ドメインを含む）、例えばアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４から選択されるＩｇＧのＦｃドメイン、ならびに各アイソタイプ群内の任意のアロタイプである。

【0076】

本発明の二重特異性抗原結合分子は、典型的には２つの多量体化ドメイン、例えば、それぞれ別々の抗体重鎖の一部である２つのＦｃドメインを含む。第１および第２の多量体化ドメインは、例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ１、ＩｇＧ２／ＩｇＧ２、ＩｇＧ４／ＩｇＧ４などの同じＩｇＧアイソタイプであり得る。あるいは、第１および第２の多量体化ドメインは、例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４等の異なるＩｇＧアイソタイプであり得る。

【0077】

ある特定の実施形態では、多量体化ドメインは、Ｆｃフラグメントまたは少なくとも１つのシステイン残基を含有する長さが１～約２００アミノ酸のアミノ酸配列である。他の実施形態では、多量体化ドメインは、システイン残基、または短いシステイン含有ペプチドである。他の多量体化ドメインには、ロイシンジッパー、ヘリックスループヘリックス、またはコイルドコイルモチーフを含むかまたはそれらからなるペプチドまたはポリペプチドが含まれる。

【0078】

任意の二重特異性抗体フォーマットまたは技術を使用して、本発明の二重特異性抗原結合分子を作製することができる。例えば、第１の抗原結合特異性を有する抗体またはそのフラグメントは、第２の抗原結合特異性を有する別の抗体または抗体フラグメントなどの１つ以上の他の分子実体に（例えば、化学結合、遺伝的融合、非共有結合などにより）機能的に連結されて、二重特異性抗原結合分子を産生することができる。本発明の文脈において使用できる特定の例示的な二重特異性フォーマットには、例えば、ｓｃＦｖ系フォーマットまたはダイアボディ二重特異性フォーマット、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合、二重可変ドメイン（ＯＶＯ）－Ｉｇ、Ｑｕａｄｒｏｍａ、ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）、共通の軽鎖（例えば、ノブ・イントゥ・ホールを備えた共通の軽鎖等）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＯ）体、ロイシンジッパー、Ｏｕｏｂｏｄｙ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用型Ｆａｂ（ＯＡＦ）－ＩｇＧ、およびＭａｂ²二重特異性フォーマットが含まれるが、これらに限定されない（上述のフォーマットの総説については、例えば、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１２，ｍＡｂｓ ４：６，１－１１、およびそこに引用されている参考文献を参照）。

【0079】

本発明の二重特異性抗原結合分子との関連で、多量体化ドメイン、例えば、Ｆｃドメインは、野生型の、天然に存在するＦｃドメインと比較して、１つ以上のアミノ酸変化（例えば、挿入、欠失または置換）を含んでもよい。例えば、本発明は、ＦｃとＦｃＲｎとの間の修飾された結合相互作用（例えば、強化または減少）を有する修飾Ｆｃドメインをもたらす、Ｆｃドメイン中の１つ以上の修飾を含む二重特異性抗原結合分子を含む。一実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、Ｃ_H２またはＣ_H３領域に修飾を含み、この修飾は、酸性環境（例えば、ｐＨ範囲約５．５～約６．０のエンドソーム内）において、ＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を高める。そのようなＦｃ修飾の非限定的な例には、例えば、２５０位（例えば、ＥもしくはＱ）、２５０位および４２８位（例えば、ＬもしくはＦ）、２５２位（例えば、ＬＮ／ＦＩＷもしくはＴ）、２５４位（例えば、ＳもしくはＴ）、および２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／ＥＩＤもしくはＴ）での修飾、あるいは４２８位および／または４３３位（例えばＵＲ／Ｓ／Ｐ／ＱもしくはＫ）および／または４３４位（例えばＨ／ＦもしくはＶ）での修飾、あるいは２５０位および／または４２８位の修飾、あるいは３０７位または３０８位（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）および４３４位での修飾が含まれる。一実施形態において、修飾は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の修飾；４２８Ｌ、２５９１（例えば、Ｖ２５９１）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の修飾；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４（例えば、４３４Ｙ）の修飾；２５２、２５４、および２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）の修飾、２５０Ｑおよび４２８Ｌの修飾（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）、ならびに３０７および／または３０８の修飾（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）を含む。

【0080】

本発明はまた、第１のＣ_H３ドメインおよび第２のＩｇＣ_H３ドメインを含む二重特異性抗原結合分子を含み、第１および第２のＩｇＣ_H３ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸ほど互いに異なっており、少なくとも１つのアミノ酸の相違は、アミノ酸の相違を欠失する二重特異性抗体と比較して、プロテインＡへの二重特異性抗体の結合を低減させる。一実施形態では、第１のＩｇＣ_H３ドメインは、プロテインＡに結合し、第２のＩｇＣ_H３ドメインは、Ｈ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる、ＥＵ番号付けではＨ４３５Ｒ）などのプロテインＡ結合を低減または消失させる突然変異を含有する。第２のＣ_H３は、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによるもの、ＥＵによるＹ４３６Ｆ）をさらに含み得る。第２のＣＨ３内に認められ得るさらなる修飾には、ＩｇＧ１抗体の場合、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２１（ＩＭＧＴによるもの；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２１）、ＩｇＧ２抗体の場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２１（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２１）、ならびにＩｇＧ４抗体の場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２１（ＩＭＧＴによるもの；ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２１）が含まれる。

【0081】

ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、２つ以上の免疫グロブリンアイソタイプに由来するＦｃ配列を組み合わせたキメラであり得る。例えば、キメラＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４のＣ_H２領域に由来するＣ_H２配列の一部または全部、およびヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４に由来するＣ_H３配列の一部または全部を含むことができる。キメラＦｃドメインはまた、キメラヒンジ領域を含み得る。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域、またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「下部ヒンジ」配列と組み合わせた、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域、またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「上部ヒンジ」配列を含むことができる。本明細書に記載される抗原結合分子のうちのいずれかに含まれ得るキメラＦｃドメインの特定の例は、Ｎ末端からＣ末端に、［ＩｇＧ４ Ｃ_H１］－［ＩｇＧ４上部ヒンジ］－［ＩｇＧ２下部ヒンジ］－［ＩｇＧ４ ＣＨ２］－［ＩｇＧ４ Ｃ_H３］を含む。本明細書に記載される抗原結合分子のうちのいずれかに含まれ得るキメラＦｃドメインの別の例は、Ｎ末端からＣ末端に、［ＩｇＧ１ Ｃ_H１］－［ＩｇＧ１上部ヒンジ］－［ＩｇＧ２下部ヒンジ］－［ＩｇＧ４ Ｃ_H２］－［ＩｇＧ１ Ｃ_H３］を含む。本発明の抗原結合分子のうちのいずれかに含めることができるキメラＦｃドメインのこれらおよび他の例は、ＷＯ２０１４／０２２５４０Ａ１に記載されており、これらの一般的な構造配列を有するキメラＦｃドメイン、およびそれらの変異体は、Ｆｃ受容体結合を改変することができ、これは順にＦｃエフェクター機能に影響を及ぼす。

【0082】

配列変異体
本明細書の抗体および二重特異性抗原結合分子は、個々の抗原結合ドメインが由来した対応する生殖系列配列と比較して、重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域に１つ以上のアミノ酸置換、挿入および／または欠失を含み得る。そのような突然変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば、公共の抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって容易に確認することができる。本発明の抗原結合分子は、本明細書に開示される例示的なアミノ酸配列のうちのいずれかに由来する抗原結合フラグメントを含んでもよく、ここで、１つ以上のフレームワーク領域および／またはＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸は、抗体が由来した生殖系列配列の対応する残基（複数可）に、または別のヒト生殖系列配列の対応する残基（複数可）に、または対応する生殖系列残基（複数可）の保存的アミノ酸置換に突然変異する（そのような配列変化は、本明細書では集合的に「生殖系列突然変異」と称される）。当業者は、本明細書に開示される重鎖および軽鎖可変領域配列から出発して、１つ以上の個々の生殖系列突然変異またはそれらの組み合わせを含む多くの抗体および抗体結合フラグメントを容易に産生することができる。ある特定の実施形態では、Ｖ_Hおよび／またはＶ_Lドメイン内のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基は全て、抗原結合ドメインが本来由来した元の生殖系列配列において見出される残基へと再び突然変異する。他の実施形態では、ある特定の残基のみが、元の生殖系列配列へと再び突然変異し、例えば、突然変異した残基のみが、ＦＲ１の最初の８個のアミノ酸内に、もしくはＦＲ４の最後の８個のアミノ酸内に認められるか、または突然変異した残基のみが、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３内に認められる。他の実施形態では、フレームワークおよび／またはＣＤＲ残基（複数可）のうちの１つ以上は、異なる生殖系列配列（すなわち、抗原結合ドメインが本来由来した生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基（複数可）へ突然変異する。さらに、抗原結合ドメインは、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内に２つ以上の生殖系列突然変異の任意の組み合わせを含有してもよく、例えば、ある特定の個々の残基は、特定の生殖系列配列の対応する残基へ突然変異するのに対し、元の生殖系列配列とは異なるある特定の他の残基は、維持されるか、または異なる生殖系列配列の対応する残基へ突然変異する。いったん得られれば、１つ以上の生殖系列突然変異を含有する抗原結合ドメインは、結合特異性の改善、結合親和性の増大、アンタゴニストまたはアゴニストの生物学的特性の改善または強化（場合によって）、免疫原性の低下などの１つ以上の所望の特性について容易に試験することができる。この一般的な方法で得られた１つ以上の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子は、本発明の範囲内に包含される。

【0083】

本発明はまた、一方または両方の抗原結合ドメインが、１つ以上の保存的置換を有する本明細書に開示するＨＣＶＲアミノ酸配列、ＬＣＶＲアミノ酸配列、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む、抗原結合分子を含む。例えば、本発明は、本明細書に開示するＨＣＶＲアミノ酸配列、ＬＣＶＲアミノ酸配列、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかに対して、例えば１０個以下、８個以下、６個以下、または４個以下などの保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲアミノ酸配列、ＬＣＶＲアミノ酸配列、および／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗原結合ドメインを含む抗原結合分子を含む。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を備えた側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されたものである。概して、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させないことになっている。類似の化学的特性を備えた側鎖を有するアミノ酸の基の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、（２）脂肪族－ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン、（３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン、（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン、（６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに（７）含硫側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタミン酸－アスパラギン酸、およびアスパラギン－グルタミンである。あるいは、保存的な置換とは、Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３－１４４５に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて正の値を有する任意の変化である。「適度に保存的な」置換とは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負以外の値を有する任意の変化である。

【0084】

本発明はまた、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれかと実質的に同一であるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗原結合ドメインを含む抗原結合分子を含む。アミノ酸配列について言及する場合、「実質的な同一性」または「実質的に同一の」という用語は、２つのアミノ酸配列が、既定のギャップ重みを用いてプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列した場合、少なくとも９５％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％、または９９％の配列同一性を共有する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換だけ異なる。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換だけ互いに異なる場合、配列同一性の割合または類似性の程度は、置換の保存的性質を補正するために上向きに調整してもよい。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３３１を参照されたい。

【0085】

ポリペプチドに対する配列類似性は、配列同一性とも呼ばれ、典型的には配列分析ソフトウェアを用いて測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む種々の置換、欠失および他の修飾へ割り当てられた類似の測定値を用いて類似の配列と一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、異なる種の生物由来の相同ポリペプチドのような密接に関連するポリペプチド間の、または野生型タンパク質とその変異タンパク質の間の配列相同性または配列同一性を決定するための既定パラメータとともに使用することができるＧａｐおよびＢｅｓｔｆｉｔなどのプログラムを含有する。例えば、ＧＣＧ第６．１版を参照されたい。ポリペプチド配列は、ＧＣＧ第６．１版におけるプログラムである、既定パラメータまたは推奨パラメータを備えたＦＡＳＴＡを使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、問い合わせ配列と検索配列の間の最良重複の領域の整列およびパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）上述）。本発明の配列を、異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、既定パラメータを使用するコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．ＢｉｏＩ．２１５：４０３－４１０ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－４０２を参照されたい。

【0086】

ｐＨ依存的結合
本発明は、ｐＨ依存性結合特性を有する、抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子を含む。例えば、本発明の抗抗ＣＤ２８抗体は、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＣＤ２８への結合の低減を呈し得る。あるいは、本発明の抗ＰＳＭＡ抗体は、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＰＳＭＡへの結合の強化を呈し得る。「酸性ｐＨ」という表現は、約６．２未満、例えば、約６．０、５．９５、５．９、５．８５、５．８、５．７５、５．７、５．６５、５．６、５．５５、５．５、５．４５、５．４、５．３５、５．３、５．２５、５．２、５．１５、５．１、５．０５、５．０、またはそれ以下のｐＨ値を含む。本明細書で使用される場合、「中性ｐＨ」との表現は、約７．０～約７．４のｐＨを意味する。「中性ｐＨ」という表現は、約７．０、７．０５、７．１、７．１５、７．２、７．２５、７．３、７．３５、および７．４のｐＨ値を含む。

【0087】

場合によっては、「中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨで．．．結合の低減」は、中性ｐＨでその抗原に結合する抗体のＫ_D値に対する酸性ｐＨでその抗原に結合する抗体のＫ_D値の比に関して、表される。（またはその逆）。例えば、抗体またはその抗原結合フラグメントが、約３．０以上の酸性／中性Ｋ_D比を呈する場合、本発明の目的のために、抗体またはその抗原結合フラグメントは、「中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＣＤ２８への結合の低減」を呈すると見なされ得る。ある特定の例示的な実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントの酸性／中性Ｋ_D比は、約３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、２０．０．２５．０、３０．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、１００．０、またはそれ以上であり得る。

【0088】

ｐＨ依存性結合特性を有する抗体は、例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで特定の抗原への結合の低減（または強化）について抗体の集団をスクリーニングすることによって得ることができる。さらに、アミノ酸レベルでの抗原結合ドメインの修飾は、ｐＨ依存的特徴を有する抗体を産生し得る。例えば、抗原結合ドメイン（例えばＣＤＲ内）の１つ以上のアミノ酸をヒスチジン残基で置換することにより、中性ｐＨに対して酸性ｐＨで抗原結合が低減した抗体を得ることができる。

【0089】

Ｆｃ変異体を含む抗体
本発明のある特定の実施形態によると、例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで、ＦｃＲｎ受容体への抗体結合を強化または減少させる１つ以上の突然変異を含むＦｃドメインを含む、抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子が提供される。例えば、本発明は、ＦｃドメインのＣ_H２またはＣ_H３領域に突然変異を含む抗体および抗原結合分子を含み、この突然変異（複数可）は、酸性環境（例えば、ｐＨ範囲約５．５～約６．０のエンドソーム内）において、ＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を高める。そのような突然変異は、動物に投与されたときに抗体の血清半減期の増加をもたらし得る。そのようなＦｃ修飾の非限定的な例には、例えば、２５０位（例えば、ＥまたはＱ）、２５０位および４２８位（例えば、ＬまたはＦ）、２５２位（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位（例えば、ＳまたはＴ）、および２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）での修飾、または４２８位および／または４３３位（例えばＨ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）および／または４３４位（例えばＨ／ＦまたはＹ）での修飾、あるいは２５０位および／または４２８位の修飾、あるいは３０７位もしくは３０８位（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、および４３４位での修飾が含まれる。一実施形態では、修飾は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の修飾；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の修飾；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４（例えば、４３４Ｙ）の修飾；２５２、２５４、および２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）の修飾；２５０Ｑおよび４２８Ｌの修飾（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７および／または３０８の修飾（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）を含む。

【0090】

例えば、本発明は、２５０Ｑおよび２４８Ｌ（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ２４８Ｌ）；２５２Ｙ、２５４Ｔおよび２５６Ｅ（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ）；４２８Ｌのおよび４３４Ｓ（例えば、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ）；ならびに４３３Ｋおよび４３４Ｆ（例えば、Ｈ４３３ＫおよびＮ４３４Ｆ）からなる群から選択される、１つ以上の突然変異の対または群を含むＦｃドメインを含む、抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子を含む。前述のＦｃドメイン突然変異、および本明細書に開示される抗体可変ドメイン内の他の突然変異の全ての可能な組み合わせが、本発明の範囲内で熟慮される。

【0091】

抗体および抗原結合分子の生物学的特性
本発明は、ヒトＣＤ２８および／またはＰＳＭＡに高親和性で結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを含む。本発明はまた、治療状況および所望される特定の標的化特性に応じて、中程度または低度の親和性でヒトＣＤ２８および／またはＰＳＭＡに結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを含む。例えば、一方のアームがＣＤ２８に結合し、別のアームが標的抗原（例えば、ＰＳＭＡ）に結合する二重特異性抗原結合分子の文脈では、標的抗原結合アームが標的抗原に高い親和性で結合することが望ましい場合があるが、抗ＣＤ２８アームは、中程度または低度の親和性でのみＣＤ２８に結合する。このようにして、標的抗原を発現する細胞への抗原結合分子の優先的標的化は、一般的／非標的ＣＤ２８結合およびそれと関連する結果として生じる有害な副作用を回避しながら達成され得る。

【0092】

ある特定の実施形態によると、本発明は、例えば、本明細書の実施例３に定義されるようなアッセイフォーマットを使用して、表面プラズモン共鳴により測定して、約２１０ｎＭ未満のＫ_DでヒトＣＤ２８に（例えば、２５℃で）結合する抗体および抗体の抗原結合フラグメントを含む。ある特定の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、例えば、本明細書の実施例３に定義されるようなアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して、表面プラズモン共鳴により測定して、約１５０ｎＭ未満、約１３０ｎＭ未満、約１２０ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約８０ｎＭ未満、約６０ｎＭ未満、約４０ｎＭ未満、または約３０ｎＭ未満のＫ_DでＣＤ２８に結合する。ある特定の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、約３０ｎＭ～約２０７ｎＭの間のＫ_DでＣＤ２８に結合する。

【0093】

本発明はまた、例えば、本明細書の実施例３に定義されるようなアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して、２５℃または３７℃での表面プラズモン共鳴により測定して、約３．５分超の解離半減期（ｔ１／２）でＣＤ２８に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを含む。ある特定の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、例えば、本明細書の実施例３に定義されるようなアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して、２５℃または３７℃での表面プラズモン共鳴により測定して、約５分超、約１０分超、約２０分超、約３０分超、約４０分超、約５０分超、約６０分超、約７０分超、約８０分超、約９０分超、約１００分超、約２００分超、約３００分超、約４００分超、約５００分超、約６００分超、約７００分超、約８００分超、約９００分超、約１０００分超、または約１２００分超のｔ１／２でＣＤ２８に結合する。

【0094】

本発明は、ヒトＣＤ２８およびヒトＰＳＭＡに同時に結合することができる二重特異性抗原結合分子（例えば、二重特異性抗体）を含む。ある特定の実施形態によると、本発明の二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ２８および／またはＰＳＭＡを発現する細胞と特異的に相互作用する。二重特異性抗原結合分子がＣＤ２８および／またはＰＳＭＡを発現する細胞に結合する程度は、本明細書の実施例４に例示されるように、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）によって評価することができる。例えば、本発明は、ＣＤ２８を発現するがＰＳＭＡを発現しないヒト細胞株（例えば、ＣＤ２８を発現するように操作されたＨＥＫ２９３）、およびＰＳＭＡを発現するがＣＤ２８を発現しないヒト前立腺癌細胞株（例えば、Ｃ４－２）に特異的に結合する二重特異性抗原結合分子を含む。本発明は、実施例４に記載されるようなＦＡＣＳアッセイまたは実質的に類似のアッセイを使用して決定して、約９．６×１０^-9～約３．５×１０^-10、またはそれ以下のＥＣ₅₀値で、前述の細胞および細胞株のうちのいずれかに結合する二重特異性抗原結合分子を含む。

【0095】

本発明はまた、腫瘍細胞のＴ細胞媒介性殺滅を誘発または増加させる抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子を提供する。例えば、本発明は、本明細書の実施例６に定義されるようなアッセイフォーマット（例えば、抗ＣＤ２８×ＰＳＭＡ抗体の存在下でのヒトＰＢＭＣによるＣ４－２腫瘍細胞殺滅の程度を評価する）または実質的に類似のアッセイを使用して、インビトロＴ細胞媒介性腫瘍細胞殺滅アッセイにおいて測定して、約７８ｐＭ未満のＥＣ₅₀で腫瘍細胞のＴ細胞媒介性殺滅を誘発または増加させる抗ＣＤ２８×ＰＳＭＡ抗体を含む。ある特定の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、本明細書の実施例６に定義されるようなアッセイフォーマットまたは実質的に類似のアッセイを使用して、インビトロＴ細胞媒介性腫瘍細胞殺滅アッセイにより測定して、約４０ｐＭ未満、約２０ｐＭ未満、約１６ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、約５．０ｐＭ未満、約４．０ｐＭ未満、約３．０ｐＭ未満、約２．５ｐＭ未満、約２．０ｐＭ未満、約１．５ｐＭ未満、または約１．４５ｐＭ未満のＥＣ₅₀値で、Ｔ細胞媒介性腫瘍細胞殺滅（例えば、Ｃ４－２細胞のＰＢＭＣ媒介性殺滅）を誘発する。

【0096】

本発明はまた、１．０ｐＭ～１０００ｎＭの間のＥＣ₅₀値でＣＤ２８発現ヒトＴ細胞に結合する抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子を含む。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子は、４８ｎＭ～１８０ｎＭの間のＥＣ₅₀値でＣＤ２８を発現するヒトＴ細胞に結合する。例えば、本発明は、約１ｐＭ、約１０ｐＭ、約１００ｐＭ、約５００ｐＭ、約１ｎＭ、約２ｎＭ、約５ｎＭ、約１０ｎＭ、約２０ｎＭ、約３０ｎＭ、約４０ｎＭ、約５０ｎＭ、約６０ｎＭ、約７０ｎＭ、約８０ｎＭ、約９０ｎＭ、約１００ｎＭ、約２００ｎＭ、約３００ｎＭ、約５００ｎＭ、約８００ｎＭ、約１０００ｎＭ、またはそれ以上のＥＣ₅₀値でＣＤ２８を発現するヒトＴ細胞に結合する、抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子を含む。

【0097】

本発明はまた、（ａ）インビトロでＴ細胞増殖を誘発する（例えば、本明細書の実施例８を参照）、（ｂ）Ｔ細胞を活性化し、ヒトＰＢＭＣにおけるＣＤ２５およびＰＤ－１の上方調節を誘発する（例えば、本明細書の実施例８を参照）、（ｃ）ＰＳＭＡ発現細胞株に対するヒトＴ細胞媒介性細胞傷害性の増加（例えば、本明細書の実施例８を参照）、（ｄ）ＰＳＭＡ発現細胞株に対してナイーブ霊長類Ｔ細胞媒介細胞傷害性を誘発する（例えば、本明細書の実施例８を参照）、（ｅ）マウスにおける腫瘍細胞を枯渇させる（例えば、本明細書の実施例１０）、（ｆ）マウスにおける腫瘍クリアランスを強化する（例えば、本明細書の実施例１０）、（ｇ）サイトカインストームを誘発しない（例えば、本明細書の実施例１０）、（ｈ）カニクイザルにおいて全身性Ｔ細胞作用を誘発しない（例えば、本明細書の実施例１１）、（ｉ）Ｔ細胞活性化によって誘発された腫瘍細胞殺滅に対するＰＤ－１遮断の効果を強化する（例えば、本明細書の実施例１３）、（ｊ）メモリーＴ細胞の増殖を強化する（例えば、本明細書の実施例１３）からなる群から選択される１つ以上の特性を呈する、抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子を含む。

【0098】

本発明は、対象の腫瘍細胞を枯渇させることができる抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子を含む（例えば、実施例８を参照）。例えば、ある特定の実施形態によると、抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子が提供され、対象への二重特異性抗原結合分子の単回投与（例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、またはそれ以下）は、対象における腫瘍細胞の数の低減を引き起こす。

【0099】

エピトープマッピングおよび関連技術
本発明の抗原結合分子が抗体が結合するＣＤ２８および／またはＰＳＭＡ上のエピトープは、ＣＤ２８タンパク質またはＰＳＭＡタンパク質の３つ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上）のアミノ酸の単一連続配列からなってもよい。あるいは、エピトープは、ＣＤ２８またはＰＳＭＡの複数の非連続アミノ酸（またはアミノ酸配列）からなっていてもよい。本発明の抗体は、ＣＤ２８単量体内に含まれるアミノ酸と相互作用し得るか、またはＣＤ２８二量体の２つ以上の異なるＣＤ２８鎖上のアミノ酸と相互作用し得る。本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、パラトープとして既知の抗体分子の可変領域における特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は２つ以上のエピトープを有してもよい。したがって、異なる抗体は、抗原上の異なる領域へ結合し得、異なる生物学的効果を有し得る。エピトープは、立体配座または直鎖状のいずれかであり得る。立体配座エピトープは、直鎖状ポリペプチド鎖の異なるセグメントから空間的に並置されたアミノ酸によって産生される。直鎖状エピトープは、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基によって産生されるものである。ある特定の状況において、エピトープは、抗原上の糖類、ホスホリル基、またはスルホニル基の部分を含み得る。

【0100】

当業者に既知の種々の技法を用いて、抗体の抗原結合ドメインがポリペプチドまたはタンパク質内にある「１つ以上のアミノ酸と相互作用する」かどうかを判定することができる。特定の抗体または抗原結合ドメインのエピトープまたは結合ドメインを決定するために使用できる例示的な技法には、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．，ＮＹ）に記載されるものなどのルーチン交差遮断アッセイ、点突然変異誘発（例えば、アラニン走査突然変異誘発、アルギニン走査突然変異誘発等）、ペプチドブロット分析（Ｒｅｉｎｅｋｅ，２００４，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８：４４３－４６３）、プロテアーゼ保護、およびペプチド切断分析が含まれる。加えて、エピトープ切除、エピトープ抽出、および抗原の化学修飾などの方法を採用することができる（Ｔｏｍｅｒ，２０００，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：４８７－４９６）。抗体が相互作用するポリペプチドの内部にあるアミノ酸を同定するために用いることができる別の方法は、質量分析によって検出される水素／重水素交換である。一般的にいえば、水素／重水素交換法は、関心対象のタンパク質を重水素標識した後、抗体を重水素標識タンパク質へ結合させることを包含する。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移して、抗体によって保護されている残基（重水素標識されたままである）を除く全ての残基で水素－重水素交換を生じさせる。抗体の解離後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断および質量分析へ供し、それにより、抗体が相互作用する特異的アミノ酸に対応する重水素標識残基を明らかにする。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７（２）：２５２－２５９、Ｅｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ－２６５Ａを参照されたい。Ｘ線結晶構造解析を使用して、抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定することもできる。

【0101】

本発明はさらに、本明細書に記載される特定の例示的な抗体のうちのいずれかと同じエピトープに結合する、抗ＣＤ２８および抗ＰＳＭＡ抗体（本明細書の表１に記載されるようなアミノ酸配列のうちのいずれかを含む抗体）を含む。同様に、本発明はまた、ＣＤ２８および／またはＰＳＭＡへの結合について、本明細書に記載される特定の例示的な抗体のうちのいずれかと競合する、抗ＣＤ２８および／または抗ＰＳＭＡ抗体（例えば、本明細書の表１に記載されるようなアミノ酸配列のうちのいずれかを含む抗体）を含む。

【0102】

本発明はまた、ヒトＣＤ２８に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ヒトＰＳＭＡに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗原結合分子を含み、第１の抗原結合ドメインは、本明細書に記載される特定の例示的なＣＤ２８特異的抗原結合ドメインのうちのいずれかと同じＣＤ２８上のエピトープに結合し、かつ／または第２の抗原結合ドメインは、本明細書に記載される特定の例示的なＰＳＭＡ特異的抗原結合ドメインのうちのいずれかと同じＰＳＭＡ上の同じエピトープに結合する。

【0103】

同様に、本発明はまた、ヒトＣＤ２８に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ヒトＰＳＭＡに特異的に結合する第２の抗原結合フラグメントとを含む二重特異性抗原結合分子を含み、第１の抗原結合ドメインは、ＣＤ２８への結合について、本明細書に記載される特定の例示的なＣＤ２８特異的抗原結合ドメインのうちのいずれかと競合し、かつ／または第２の抗原結合ドメインは、ＰＳＭＡへの結合について、本明細書に記載される特定の例示的なＰＳＭＡ特異的抗原結合ドメインのうちのいずれかと競合する。

【0104】

特定の抗原結合分子（例えば、抗体）またはその抗原結合ドメインが、本発明の参照抗原結合分子と同じエピトープに結合するか、または結合について本発明の参照抗原結合分子と競合するかどうかは、当該技術分野で既知の常法を用いて容易に判定できる。例えば、試験抗体が本発明の参照二重特異性抗原結合分子と同じＣＤ２８（またはＰＳＭＡ）上のエピトープに結合するかどうかを決定するために、参照二重特異性分子は、最初にＣＤ２８タンパク質（またはＰＳＭＡタンパク質）に結合させた。次に、ＣＤ２８（またはＰＳＭＡ）分子に結合する試験抗体の能力を評価する。試験抗体が参照二重特異性抗原結合分子との飽和結合後にＣＤ２８（またはＰＳＭＡ）に結合することができる場合、試験抗体は、参照二重特異性抗原結合分子とは異なるＣＤ２８（またはＰＳＭＡ）のエピトープに結合すると結論付けることができる。その一方で、試験抗体が、参照二重特異性抗原結合分子との飽和結合後にＣＤ２８（またはＰＳＭＡ）分子に結合することができない場合、試験抗体は、本発明の参照二重特異性抗原結合分子によって結合したエピトープと同じＣＤ２８（またはＰＳＭＡ）のエピトープに結合してもよい。次に、試験抗体の結合の観察された欠失が、実際に、参照二重特異性抗原結合分子と同じエピトープへの結合によるものであるか、それとも立体遮断（または別の現象）が、観察された結合の欠失の原因であるのかを確認するために、さらなる通例の実験（例えば、ペプチド変異および結合分析）を実施することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリー、または当該技術分野で利用可能な任意の他の定量的もしくは定性的な抗体結合アッセイを用いて行うことができる。本発明のある特定の実施形態によると、例えば、１倍、５倍、１０倍、２０倍、または１００倍過剰量の一方の抗原結合タンパク質が、競合結合アッセイにおいて測定して、もう一方の結合を少なくとも５０％、しかし好ましくは７５％、９０％、またはさらに９９％阻害する場合、２つの抗原結合タンパク質は、同じ（または重複する）エピトープに結合する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９０：５０：１４９５－１５０２を参照）。あるいは、一方の抗原結合タンパク質の結合を低減または排除する抗原における本質的に全てのアミノ酸変異が、もう一方の結合を低減または排除する場合、２つの抗原結合タンパク質は同じエピトープと結合すると見なされる。一方の抗原結合タンパク質の結合を減少または排除するアミノ酸変異のサブセットのみが他方の結合を減少または排除する場合、２つの抗原結合タンパク質は「重複エピトープ」を有するとみなされる。

【0105】

抗体またはその抗原結合ドメインが、結合について、参照抗原結合分子と競合するかどうかを決定するために、上述の結合方法を２つの方向性で実施する。第１の方向性おいて、参照抗原結合分子を飽和条件下でＣＤ２８タンパク質（またはＰＳＭＡタンパク質）に結合させた後、ＣＤ２８（またはＰＳＭＡ）分子への試験抗体の結合を評価する。第２の方向性において、試験抗体を飽和条件下でＣＤ２８（またはＰＳＭＡ）分子に結合させた後、参照抗原結合分子のＣＤ２８（またはＰＳＭＡ）分子への結合を評価する。両方の方向性において、第１の（飽和）抗原結合分子のみがＣＤ２８（またはＰＳＭＡ）分子に結合することができる場合、試験抗体および参照抗原結合分子は、ＣＤ２８（またはＰＳＭＡ）への結合について競合すると結論される。当業者によって認識されるように、参照抗原結合分子との結合について競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同一のエピトープへ結合するわけではないが、重複しているまたは隣接しているエピトープに結合することによって、参照抗体の結合を立体的に遮断し得る。

【0106】

抗原結合ドメインの調製と二重特異性分子の構築
特定の抗原に特異的な抗原結合ドメインは、当該技術分野で既知の任意の抗体産生技術によって調製することができる。一旦得られれば、２つの異なる抗原（例えば、ＣＤ２８およびＰＳＭＡ）に特異的な２つの異なる抗原結合ドメインを互いに適切に配置して、ルーチン方法を用いて本発明の二重特異性抗原結合分子を産生することができる。（本発明の二重特異性抗原結合分子を構築するために使用できる例示的な二重特異性抗体フォーマットの考察は、本明細書の他所に提供される）。ある特定の実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合分子の１つ以上の個々の構成要素（例えば、重鎖および軽鎖）は、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト型抗体に由来する。そのような抗体を作製するための方法は当該技術分野において周知である。例えば、本発明の二重特異性抗原結合分子の１つ以上の重鎖および／または軽鎖は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術を用いて調製することができる。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術（または任意の他のヒト抗体生成技術）を使用して、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する、特定の抗原（例えば、ＣＤ２８またはＰＳＭＡ）に対する高親和性キメラ抗体が、最初に単離される。抗体を、親和性、選択性、エピトープなどを含む望ましい特徴について特徴付けし選択する。マウス定常領域は、所望のヒト定常領域と置換されて、本発明の二重特異性抗原結合分子に組み込まれ得る完全ヒト型重鎖および／または軽鎖を産生する。

【0107】

遺伝子操作された動物は、ヒト二重特異性抗原結合分子を作製するために使用され得る。例えば、内在性マウス免疫グロブリン軽鎖可変配列を再編成および発現することができない、遺伝子改変マウスを使うことができ、マウスは、内在性マウスカッパ遺伝子座のマウスカッパ定常遺伝子に作動可能に連結されているヒト免疫グロブリン配列によってコードされる１つまたは２つのヒト軽鎖可変ドメインのみを発現する。そのような遺伝子改変マウスを使用して、２つの異なるヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントのうちの１つに由来する可変ドメインを含む同一の軽鎖と会合する２つの異なる重鎖を含む完全ヒト型二重特異性抗原結合分子を産生することができる。（そのような操作されたマウスおよび二重特異性抗原結合分子を産生するためのその使用の詳細な議論については、例えば、ＵＳ２０１１／０１９５４５４を参照）。

【0108】

生物学的等価物
本発明は、記載される抗体のものとは異なるが、ＣＤ２８および／またはＰＳＭＡに結合する能力を保持するアミノ酸配列を有する抗原結合分子を包含する。そのような変異体抗体は、親配列と比較して、アミノ酸の１つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、記載された抗原結合分子のものと本質的に同等である生物学的活性を呈する。同様に、本発明の抗体結合分子をコードするＤＮＡ配列は、開示された配列と比較して、ヌクレオチドの１つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、本発明の記載された抗原結合分子と本質的に生物学的同等性である配列を包含する。そのような変異体アミノ酸およびＤＮＡ配列の例は、上で議論されている。

【0109】

本発明は、本明細書に記載の例示的な抗原結合分子のいずれかと生物学的に等価な抗原結合分子を含む。２つの抗原結合タンパク質または抗体は、例えば、それらが類似の実験条件下で単回用量または複数回用量のいずれかで同じモル用量で投与された場合に、吸収速度および吸収の程度が有意差を示さない医薬的等価物または医薬的選択肢である場合、生物学的等価物とみなされる。いくつかの抗体は、これらの吸収の程度は等価であるが吸収速度は等価ではなく、吸収速度のこのような差が意図的であり、標識することに反映されているので生物学的に等価とみなされ得る場合、等価物または薬学的選択肢とみなされることになっており、例えば長期使用に及ぼす有効な身体薬剤濃度の達成に必須ではなく、研究した特定の薬剤製品にとって医学的に有意ではないとみなされる。

【0110】

一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、これらの安全性、純度、または有効性において臨床的に有意性のある差がない場合、生物学的に等価である。

【0111】

一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、免疫原性の臨床的に有意な変化または有効性の減退を含む有害作用のリスクの期待される上昇なしで参照生成物と生物学的生成物の間での切り替えなしで持続される療法と比較して、患者が１回以上切り替えられることができる場合、生物学的に等価である。

【0112】

一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、これらが両方とも、条件または使用条件についての共通の機序または作用機序によって、このような機序が既知である程度まで作用する場合、生物学的に等価である。

【0113】

生物学的等価性は、インビボおよびインビトロの方法によって実証され得る。生物学的等価性測定法には、例えば、（ａ）抗体またはその代謝産物の濃度が血液、血漿、血清または他の生物学的流体中で時間の関数として測定される、ヒトまたは他の哺乳類におけるインビボでの試験、（ｂ）ヒト生物学的利用能データと相関した、このデータを合理的に予測しているインビトロ試験、（ｃ）抗体（またはその標的）の適切な急性薬理学的効果が時間の関数として測定されるヒトまたは他の哺乳類におけるインビボ試験、および（ｄ）抗体の安全性、効能、または生物学的利用能もしくは生物学的等価性を確立する、十分に管理された臨床試験が含まれる。

【0114】

本明細書に示す例示的な二重特異性抗原結合分子の生物学的に等価な変異体は、例えば、残基もしくは配列の種々の置換を生じること、または生物活性に必要とされない末端もしくは内部の残基もしくは配列を欠失することによって構築され得る。例えば、生物学的活性にとって必須ではないシステイン残基は、再生の際の不必要または不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止するために、欠失または他のアミノ酸で置換することができる。他の文脈において、生物学的に等価な抗体は、抗体のグリコシル化特性を修飾するアミノ酸変化、例えば、グリコシル化を排除または除去する突然変異を含む、本明細書に記載される例示的な二重特異性抗原結合分子の変異体を含み得る。

【0115】

種の選択性および種の交差反応性
本発明は、ある特定の実施形態によると、ヒトＣＤ２８に結合するが、他の種からのＣＤ２８には結合しない抗原結合分子を提供する。本発明はまた、ヒトＰＳＭＡに結合するが、他の種からのＰＳＭＡには結合しない抗原結合分子を提供する。本発明はまた、ヒトＣＤ２８および１つ以上の非ヒト種由来のＣＤ２８に結合する抗原結合分子、ならびに／またはヒトＰＳＭＡおよび１つ以上の非ヒト種由来のＰＳＭＡに結合する抗原結合分子を含む。

【0116】

本発明のある特定の例示的な実施形態によると、ヒトＣＤ２８および／またはヒトＰＳＭＡに結合し、場合によってはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザルもしくはチンパンジーのＣＤ２８および／またはＰＳＭＡのうちの１つ以上に結合するか、または結合しない抗原結合分子が提供される。例えば、本発明の特定の例示的な実施形態では、ヒトＣＤ２８およびカニクイザルＣＤ２８に結合する第１の抗原結合ドメインと、ヒトＰＳＭＡに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。

【0117】

免疫結合体
本発明は、細胞毒素、化学療法薬、免疫抑制剤、または放射性同位元素などの治療部分（「免疫結合体」）にコンジュゲートされた抗原結合分子を包含する。細胞傷害性薬剤には、細胞に有害な任意の薬剤が含まれる。免疫結合体を形成するために好適な細胞傷害性薬剤および化学療法剤の例は、当該技術分野で知られている（例えば、ＷＯ０５／１０３０８１を参照）。

【0118】

治療用製剤および投与
本発明は、本発明の抗原結合分子を含む薬学的組成物を提供する。本発明の薬学的組成物は、好適な担体、賦形剤、および改善された移動、送達、耐性などを提供する他の薬剤とともに製剤化される。多くの適切な製剤は、製薬化学者全員に既知の処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡにおいて認めることができる。これらの製剤には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、ベシクル（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）など、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含有する脂質（カチオン性またはアニオン性）、ＤＮＡ結合体、無水吸収ペースト、水中油エマルジョンおよび油中水エマルジョン、エマルジョンカーボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、ならびにカーボワックスを含有する半固体混合物が含まれる。Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．”Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８－３１１も参照されたい。

【0119】

患者に投与される抗原結合分子の用量は、患者の年齢および大きさ、標的疾患、病態、投与経路などに応じて変わり得る。好ましい用量は、典型的には体重または体表面積に従って計算される。本発明の二重特異性抗原結合分子が成人患者の治療目的に使用される場合、本発明の二重特異性抗原結合分子を通常約０．０１～約２０ｍｇ／ｋｇ体重の単回投与で、より好ましくは約０．０２～約７、約０．０３～約５、または約０．０５～約３ｍｇ／ｋｇ体重の単回投与で静脈内投与することが有利であり得る。容態の重症度に応じて、治療の頻度および期間を調整することができる。二重特異性抗原結合分子を投与するための有効投与量およびスケジュールは経験的に決定され、例えば、患者の経過を定期的な評価によってモニターし、それに応じて用量を調整することができる。さらに、投与量の種間スケーリングは、当該技術分野において周知の方法を用いて実施することができる（例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．８：１３５１）。

【0120】

種々の送達系、例えば、リポソームにおける封入、微粒子、マイクロカプセル、突然変異体ウイルスを発現することができる組み換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシスが知られており、本発明の薬学的組成物を投与するために使用され得る（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９－４４３２を参照）。導入方法には、皮内経路、経皮経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路および経口経路が含まれるが、これらに限定されない。組成物は、例えば、注入もしくはボーラス注射、上皮または粘膜皮膚内層（ｌｉｎｉｎｇｓ）（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を介した吸収による任意の好都合な経路によって投与することができ、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与することができる。投与は全身または局所であり得る。

【0121】

本発明の薬学的組成物は、標準的な針および注射器を用いて皮下にまたは静脈内に送達することができる。加えて、皮下送達に関して、ペン送達デバイスは、本発明の薬学的組成物を送達する上での適用を容易に有する。このようなペン送達デバイスは、再利用可能または使い捨て可能であり得る。再利用可能なペン送達デバイスは、概して、薬学的組成物を含有する交換可能なカートリッジを利用する。一度、カートリッジ内の薬学的組成物が全て投与され、カートリッジが空になると、この空のカートリッジは容易に廃棄することができ、薬学的組成物を含有する新しいカートリッジと容易に交換することができる。次に、ペン送達デバイスは再利用することができる。使い捨てのペン送達デバイスにおいて、交換可能なカートリッジは存在しない。むしろ、使い捨てペン送達デバイスは、このデバイス内の貯蔵器の中に保持された薬学的組成物が事前に充填されている。一度、貯蔵器が薬学的組成物に関して空になると、デバイス全体が廃棄される。

【0122】

数多くの再利用可能なペン送達デバイスおよび自動注射送達デバイスは、本発明の薬学的組成物の皮下送達における用途を有する。例としては、ほんの数例を挙げると、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ，ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｅｒｇｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ ＭＩＸ ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、ならびにＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が含まれるが、これらに限定されない。本発明の薬学的組成物の皮下送達における用途を有する使い捨てペン送達デバイスの例としては、ほんの数例を挙げると、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、およびＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）自動注射器（Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ，Ｌ．Ｐ．）、およびＨＵＭＩＲＡ（商標）ペン（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ ＩＬ）が含まれるが、これらに限定されない。

【0123】

ある特定の状況において、薬学的組成物は、徐放系で送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用することができる（Ｌａｎｇｅｒ，上記；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１を参照）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる。Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），１９７４，ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａを参照されたい。さらに別の実施形態では、徐放系を組成物の標的の近傍に配置することができ、それによって全身用量の一部のみが必要となる（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，１９８４，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，上記，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５－１３８を参照）。他の徐放系は、Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７－１５３３による総説で論じられている。

【0124】

注射可能な調製物には、静脈内注射、皮下注射、皮内注射および筋肉内注射、点滴注入などのための剤形が含まれ得る。これらの注射可能な調製物は、公的に既知の方法によって調製され得る。例えば、注射可能な調製物は、例えば、注射用に従来通り使用される滅菌水性媒体または油性媒体中に上述の抗体またはその塩を溶解、懸濁または乳化させることによって調製され得る。注射用水性媒体としては、例えば、生理食塩水、グルコース含有等張液、および他の補助剤などがあり、これらは、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０（水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０モル）付加物）］などの適切な可溶化剤と組み合わせて使用してもよい。油性媒体として、例えば、ゴマ油、ダイズ油などが使用され、ベンジルベンゾエート、ベンジルアルコールなどの可溶化剤と組み合わせて使用してもよい。このように調製された注射は、好ましくは適切なアンプルに充填される。

【0125】

有益なことに、上記に記載される経口または非経口での使用のための薬学的組成物は、有効成分の用量に適合するために好適な単位用量の投薬形態へと調製される。このような単位用量の剤形には、例えば、錠剤、ピル、カプセル、注射（アンプル）、坐薬などが含まれる。前述の含有される抗体の量は概して、単位用量の剤形あたり約５～約５００ｍｇであり、特に注射の形態では、前述の抗体は、約５～約１００ｍｇで、他の剤形については約１０～約２５０ｍｇで含有されることが好ましい。

【0126】

抗原結合分子の治療的使用
本発明は、抗ＣＤ２８抗体またはＣＤ２８および標的抗原（例えば、ＰＳＭＡ）に特異的に結合する二重特異性抗原結合分子を含む治療用組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を含む。治療用組成物は、本明細書に開示される抗体または二重特異性抗原結合分子のいずれかと薬学的に許容される担体または希釈剤とを含み得る。本明細書で使用される場合、「それを必要とする対象」という表現は、癌の１つ以上の症状または徴候を呈するヒトまたは非ヒト動物（例えば、腫瘍を発現する対象または本明細書で後述される癌のうちのいずれかに罹患している対象）、あるいは、そうでなければＰＳＭＡ活性の阻害もしくは低減またはＰＳＭＡ＋細胞の枯渇から利益を得る者を意味する。

【0127】

本発明の抗体および二重特異性抗原結合分子（およびそれを含む治療用組成物）は、とりわけ、免疫応答の刺激、活性化および／または標的化が有益である任意の疾患または障害の治療に有用である。特に、本発明の抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子は、ＰＳＭＡ発現もしくは活性、またはＰＳＭＡ＋細胞の増殖に関連するかまたはそれによって媒介される任意の疾患または障害の治療、予防、および／または改善に使用され得る。本発明の治療方法が達成される作用機序は、エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の存在下での、ＰＳＭＡを発現する細胞の殺滅を含む。本発明の二重特異性抗原結合分子を使用して阻害または殺滅することができるＰＳＭＡを発現する細胞には、例えば、腫瘍原性前立腺細胞が含まれる。

【0128】

本発明の抗原結合分子は、例えば、結腸癌、肺癌、乳癌、腎癌、および膀胱癌のサブタイプで生じる原発性および／または転移性腫瘍を治療するために使用され得る。ある特定の例示的な実施形態によると、本発明の二重特異性抗原結合分子は、前立腺癌を治療するために使用される。

【0129】

本発明はまた、対象における残存癌を治療するための方法も含む。本明細書で使用される場合、用語「残存癌」は、抗癌療法による治療後の対象における１つ以上の癌性細胞の存在または持続を意味する。

【0130】

ある特定の態様によると、本発明は、対象が他の種類の抗癌療法に対して非応答性であることが示された後、本明細書の他所に記載される二重特異性抗原結合分子のうちの１つ以上を対象に投与することを含む、ＰＳＭＡ発現に関連する疾患または障害（例えば、前立腺癌）を治療するための方法を提供する。例えば、本発明は、対象が癌、例えば、前立腺癌に罹患している患者のための標準治療を受けてから１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、もしくは４週間、２ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、８ヶ月、１年、またはそれ以上後に、抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子を患者に投与することを含む、前立腺癌を治療するための方法を含む。他の態様では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子（抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子）は、最初に、１つ以上の時点で対象に投与され（例えば、前立腺癌細胞のロバストな初期枯渇を提供するため）、その後の時点で、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインなどの異なるＩｇＧドメインを含む等価の二重特異性抗原結合分子が投与される。本発明の抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ抗体は、抗ＰＳＭＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体などの他の二重特異性抗原結合分子と併せて使用され得ることが想定される。本発明の二重特異性抗体は、チェックポイント阻害剤、例えば、ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４を標的とするもの、および他の標的と併せて使用されることも想定されている。同じ腫瘍抗原（例えば、ＰＳＭＡ）を標的とする２つの二重特異性抗体を組み合わせることが有利であり得るが、二重特異性抗体のうちの一方は、Ｔ細胞上のＣＤ３を標的とし、もう一方の二重特異性抗体は、ＣＤ２８のような共刺激分子を標的とする。この組み合わせは、腫瘍細胞殺滅を強化するために単独で使用することができるか、またはチェックポイント阻害剤と組み合わせて使用することができる。

【0131】

併用療法および製剤
本発明は、本明細書に記載される例示的な抗体および二重特異性抗原結合分子のうちのいずれかを、１つ以上の追加の治療活性成分と組み合わせて含む組成物および治療用製剤、ならびにそのような組み合わせを、それを必要とする対象に投与することを含む治療方法を含む。

【0132】

本発明の抗原結合分子と組み合わせることができるか、またはそれと組み合わせて投与することができる例示的な追加の治療薬には、例えば、化学療法、放射線療法、ＰＤ－１を標的とするチェックポイント阻害剤（例えば、ペムブロリズマブまたはニボルマブなどの抗ＰＤ－１抗体、ＵＳ９，９８７，５００も参照）、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３など、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、４－１ＢＢなどの分子を標的とする共刺激アゴニスト二価抗体、ＣＤ３×二重特異性抗体（例えば、ＷＯ２０１７／０５３８５６Ａ１、ＷＯ２０１４／０４７２３１Ａ１、ＷＯ２０１８／０６７３３１Ａ１、およびＷＯ２０１８／０５８００１Ａ１を参照）、ＰＳＭＡ×ＣＤ３を標的とする他の抗体（例えば、ＷＯ２０１７／０２３７６１Ａ１を参照）および他の共刺激ＣＤ２８×二重特異性抗体が含まれる。

【0133】

本発明の抗体と組み合わせて有益に投与され得る他の薬剤には、例えば、タモキシフェン、アロマターゼ阻害剤、ならびに小分子サイトカイン阻害剤およびＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８などのサイトカイン、またはそれらそれぞれの受容体に結合する抗体を含むサイトカイン阻害剤が含まれる。本発明の薬学的組成物（例えば、本明細書に開示される抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子を含む薬学的組成物）はまた、「ＩＣＥ」：イホスファミド（例えば、Ｉｆｅｘ（登録商標））、カルボプラチン（例えば、Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））、エトポシド（例えば、Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ（登録商標）、Ｔｏｐｏｓａｒ（登録商標）、ＶｅＰｅｓｉｄ（登録商標）、ＶＰ－１６）、「ＤＨＡＰ」：デキサメタゾン（例えば、Ｄｅｃａｄｒｏｎ（登録商標））、シタラビン（例えば、Ｃｙｔｏｓａｒ－Ｕ（登録商標）、シトシンアラビノシド、ａｒａ－Ｃ）、シスプラチン（例えば、Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）－ＡＱ）、および「ＥＳＨＡＰ」：エトポシド（例えば、Ｅｔｏｐｏｆｏｓ（登録商標）、Ｔｏｐｏｓａｒ（登録商標）、ＶｅＰｅｓｉｄ（登録商標）、ＶＰ－１６）、メチルプレドニゾロン（例えば、Ｍｅｄｒｏｌ（登録商標））、高用量シタラビン、シスプラチン（例えば、Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）－ＡＱ）から選択される１つ以上の治療薬の組み合わせを含む治療レジメンの一部として投与され得る。

【0134】

本発明はまた、本明細書で言及される抗原結合分子のうちのいずれか、およびＶＥＧＦ、Ａｎｇ２、ＤＬＬ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｃＭｅｔ、ＩＧＦ１Ｒ、Ｂ－ｒａｆ、ＰＤＧＦＲ－ｏ、ＰＤＧＦＲ－Ｉ３、ＦＯＬＨ１、ＰＲＬＲ、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＭＳＬＮ、ＣＡ９、ウロプラキンのうちの１つ以上の阻害剤、または前述のサイトカインのうちのいずれかを含む治療薬の組み合せを含み、その阻害剤は、アプタマー、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ペプチボディ、ナノボディ、または抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント；Ｆ（ａｂ’）₂フラグメント；Ｆｄフラグメント；Ｆｖフラグメント；ｓｃＦｖ；ｄＡｂフラグメント；もしくはダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、および最小認識ユニットなどの他の操作された分子）である。本発明の抗原結合分子は、抗ウイルス薬、抗生物質、鎮痛薬、コルチコステロイドおよび／またはＮＳＡＩＤと組み合わせて投与および／または同時製剤することもできる。本発明の抗原結合分子はまた、放射線治療および／もしくは従来の化学療法、またはチェックポイント阻害剤もしくは他の二重特異性抗体を含む生物学的薬剤による治療も含む、治療計画の一部として投与してもよい。

【0135】

本発明は、１種以上の化学療法剤と組み合わせて、本明細書に記載される抗原結合分子のうちのいずれかを含む組成物および治療用製剤を含む。化学療法剤の例には、チオテパおよびシクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾドーパ、カルボクオン、メツレドーパ、およびウレドーパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスファオラミド、およびトリメチルオロメラミンを含むエチレンイミンおよびメチルアメラミン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソウレア；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、マイコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、プロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メトトレキサートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）などの代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストトラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎；フロリン酸などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エフロルニチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２´，２´´－トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン、例えばパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）およびドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（商標）；Ａｖｅｎｔｉｓ Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ－１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；および上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。この定義には、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）－イミダゾール、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む抗エストロゲンなどの腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤；フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲン；ならびに上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体も含まれる。

【0136】

追加の治療活性成分は（複数可）、本発明の抗原結合分子の投与の直前、同時に、または直後に投与してもよい。（本開示の目的のために、このような投与計画は、追加の治療活性成分と「組み合わせて」抗原結合分子を投与することと見なされる。

【0137】

本発明は、本発明の抗原結合分子が、本明細書の他所に記載される追加の治療活性成分（複数可）のうちの１つ以上と同時製剤された薬学的組成物を含む。

【0138】

投与レジメン
本発明のある特定の実施形態によると、複数回用量の抗原結合分子（例えば、ＰＳＭＡおよびＣＤ２８に特異的に結合する抗ＣＤ２８抗体または二重特異性抗原結合分子）を所定の期間にわたって対象に投与することができる。本発明のこの態様による方法は、本発明の抗原結合分子の複数回用量を対象へ連続的に投与することを含む。本明細書で使用される場合、「連続的に投与すること」は、抗原結合分子の各用量が、異なる時点、例えば、所定の間隔（例えば、数時間、数日間、数週間または数か月間）によって分けられた異なる日に対象へ投与されることを意味する。本発明には、抗原結合分子の単回の初回用量と、それに続く抗原結合分子の１回以上の二次用量、次いで場合により抗原結合分子の１回以上の三次用量を患者へ連続的に投与することを含む方法が含まれる。

【0139】

「一次用量」、「二次用量」、および「三次用量」という用語は、本発明の抗原結合分子の投与の時系列を指す。したがって、「一次用量」とは、治療様式の開始時に投与される用量（「ベースライン用量」とも呼ばれる）であり、「二次用量」とは、一次用量後に投与される用量であり、「三次用量」とは、二次用量後に投与される用量である。一次用量、二次用量、および三次用量は全て、同じ量の抗原結合分子を含有し得るが、概して、投与頻度に関して互いに異なり得る。しかしながら、ある特定の実施形態では、一次用量、二次用量、および／または三次用量に含有される抗原結合分子の量は、治療経過の間、互いに異なる（例えば、適宜上下に調整される）。ある特定の実施形態では、２回以上（例えば、２回、３回、４回、または５回）の用量が治療レジメンの開始時において「負荷用量（ｌｏａｄｉｎｇ ｄｏｓｅ）」として投与され、続いてより低い頻度に基づいて投与される後続用量（例えば、「維持用量」）が投与される。

【0140】

本発明のある例示的な実施形態では、各二次用量および／または三次用量は、直前の用量の１～２６（例えば、１、１と１／２、２、２と１／２、３、３と１／２、４、４と１／２、５、５と１／２、６、６と１／２、７、７と１／２、８、８と１／２、９、９と１／２、１０、１０と１／２、１１、１１と１／２、１２、１２と１／２、１３、１３と１／２、１４、１４と１／２、１５、１５と１／２、１６、１６と１／２、１７、１７と１／２、１８、１８と１／２、１９、１９と１／２、２０、２０と１／２、２１、２１と１／２、２２、２２と１／２、２３、２３と１／２、２４、２４と１／２、２５、２５と１／２、２６、２６と１／２、またはそれ以上）週間後に投与される。「直前の用量」という句は、本明細書で使用される場合、一連の複数回投与において、抗原結合分子の用量を意味し、これは、介入用量のない直後の用量の投与の前に患者へ投与される。

【0141】

本発明のこの態様による方法は、抗原結合分子（例えば、ＰＳＭＡおよびＣＤ２８に特異的に結合する抗ＣＤ２８抗体または二重特異性抗原結合分子）の二次用量および／または三次用量の任意の回数を患者に投与することを含んでよい。例えば、ある特定の実施形態では、単回の二次用量のみが患者に投与される。他の実施形態では、２回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回またはそれ以上）の二次用量が患者に投与される。同様に、ある特定の実施形態では、単回の三次用量のみが患者に投与される。他の実施形態では、２回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回またはそれ以上）の三次用量が患者に投与される。

【0142】

複数回の二次用量を伴う実施形態では、各二次用量は、他の二次用量と同じ頻度で投与され得る。例えば、各二次用量は、直前の用量の１～２週間後に患者に投与されてもよい。同様に、複数の三次用量を含む実施形態では、各三次用量は、他の三次用量と同じ頻度で投与されてもよい。例えば、各三次用量は、直前の用量の２～４週間後に患者に投与されてもよい。あるいは、二次用量および／または三次用量が患者へ投与される頻度は、治療計画の経過にわたって変動し得る。投与頻度はまた、臨床検査後の個々の患者の必要性に応じて、医師によって治療経過の間に調整され得る。

【0143】

抗体の診断的使用
本発明の二重特異性抗体はまた、例えば、診断目的のために、試料中のＣＤ２８もしくはＰＳＭＡまたはＣＤ２８発現細胞もしくはＰＳＭＡ発現細胞を検出および／または測定するために使用することができる。例えば、抗ＣＤ２８抗体×ＰＳＭＡ抗体、またはそのフラグメントを使用して、ＣＤ２８またはＰＳＭＡの異常な発現（例えば、過剰発現、過少発現、発現の欠如等）を特徴とする病態または疾患を診断してよい。ＣＤ２８またはＰＳＭＡについての例示的な診断アッセイは、例えば、患者から得られた試料を本発明の抗体と接触させることを含んでよく、抗体は、検出可能な標識またはレポーター分子で標識されている。あるいは、標識されていない抗体は、それ自体が検出可能に標識された二次抗体と組み合わせて診断用途において使用することができる。検出可能な標識またはレポーター分子は、³Ｈ、¹⁴Ｃ、³²Ｐ、³⁵Ｓ、もしくは¹²⁵Ｉなどの放射性同位体、フルオレセインイソチオシアナートもしくはローダミンなどの蛍光部分もしくは化学発光部分、またはアルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼなどの酵素であり得る。試料中のＣＤ２８またはＰＳＭＡを検出または測定するために使用することができる具体的な例示的アッセイには、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が含まれる。本発明によるＣＤ２８またはＰＳＭＡ診断アッセイにおいて使用することができる試料には、正常条件または病理学的条件下で、検出可能な量のＣＤ２８もしくはＰＳＭＡタンパク質またはそのフラグメントを含有する、患者から得ることのできる任意の組織または体液試料が含まれる。一般に、健常な患者（例えば、異常なＣＤ２８もしくはＰＳＭＡのレベルもしくは活性と関連した疾患もしくは病態に罹患していない患者）から得られた特定の試料中のＣＤ２８またはＰＳＭＡのレベルを測定して、ＣＤ２８またはＰＳＭＡのベースラインレベルまたは標準レベルを最初に確立する。次いで、このＣＤ２８またはＰＳＭＡのベースラインレベルを、ＣＤ２８またはＰＳＭＡに関連する疾患または病態を有することが疑われる個体から得られた試料において測定されたＣＤ２８またはＰＳＭＡのレベルと比較することができる。

【実施例】

【0144】

以下の実施例は、本発明の方法および組成物をどのように作製および使用するかに関する完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されており、本発明者らが本発明とみなすことの範囲を限定することを企図するものではない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力はしてきたが、いくつかの実験上の誤差および偏差が考慮されるべきである。別段示されない限り、部分は重量部分であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧またはそれに近い圧力である。

【0145】

要約
腫瘍特異性抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）－ＣＤ３二重特異性抗体（抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体など）の最近の臨床的成功は、癌免疫療法を変革している。ＴＡＡ－ＣＤ３抗体は、比較的安全ですぐに利用できる治療ソリューションを提供し、重要な新しいクラスの免疫療法であることが証明される可能性がある。しかしながら、ＣＤ２８細胞内ドメインによって媒介されることが多い２番目の共刺激シグナルに関与するＣＡＲ－Ｔ細胞アプローチで見られる有効性を達成できない場合がある。確かに、ＣＤ２８活性化抗体は、信じられないほど強力であるが、ヒトの研究では毒性でもある。ＴＳＡおよびＴＡＡという用語は、本明細書では交換可能に使用され得る。

【0146】

本明細書では、安全で、それら自体で十分に耐容されると思われ、ＴＡＡ－ＣＤ３と組み合わせると、大幅に増幅され、高度に標的化された抗腫瘍反応を生成する、ＴＡＡ－ＣＤ２８と称される新しいクラスの二重特異性抗体が説明される。前立腺腫瘍上で発現されるＰＳＭＡなどのＴＡＡを使用すると、ＴＡＡ×ＣＤ２８は、Ｔ細胞の活性化を強化し、腫瘍標的およびＴＣＲ／ＣＤ３刺激の存在下で腫瘍細胞の溶解を大幅に増強することがわかっている。

【0147】

本発明のＴＡＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体は、同系腫瘍モデルにおいて、ＴＡＡ×ＣＤ３誘発性Ｔ細胞活性化によって媒介される抗腫瘍免疫を有意に強化することが示されている。ＣＤ３は、正常組織の発現が制限された腫瘍抗原と対合したとき、非ヒト霊長類およびヒト化マウスモデルにおいて単独で、またはＴＡＡ×ＣＤ２８と組み合わせた場合に、末梢サイトカインの産生をほとんどまたは全く誘発しなかった。さらに、ＴＡＡ×ＣＤ２８単独では、ＣＤ２８スーパーアゴニスト抗体と比較して、カニクイザルの血清サイトカイン分泌およびＴ細胞活性化が最小であったか、または全くなかった。これらの結果は、この新規クラスの共刺激二重特異性抗体を、新しいクラスのＴＡＡ－ＣＤ３と組み合わせると、従来のＴＡＡ－ＣＤ３二重特異性抗体の有効性を著しく強化することができる、より安全な既製の生物製剤ソリューションを提供できる可能性があることを示唆する。

【0148】

前書き
モノクローナル抗体は、過去２０年間にわたって抗腫瘍治療薬として確立されてきたが、Ｔ細胞を動員し、腫瘍部位で細胞傷害活性を効率的に発揮する能力は限られている。Ｔ細胞標的免疫療法およびその後の腫瘍細胞殺滅に対する二重特異性抗体の能力は、以前に実証されている。実際、二重特異性抗体プラットフォームは、抗ＣＤ３と抗腫瘍標的結合ドメインとを組み合わせることによって免疫エフェクター細胞を動員することを目的としている。最近、カツマキソマブ（ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３）およびブリナツモマブ（ＣＤ１９×ＣＤ３）が、急性リンパ芽球性白血病の規制当局の承認を受け、他の多くの二重特異性抗体が調査中である。実際、Ｂ細胞マーカーＣＤ２０およびＴ細胞レパートリーのＣＤ３成分の両方を認識する二重特異性抗体が構築されており、現在、血液悪性腫瘍の臨床研究が行われている。実際、ＴＡＡ－ＣＤ３は、個々の患者向けに高度かつ骨の折れるカスタマイズを行う必要のない、比較的安全で既製の治療ソリューションを提供する。しかしながら、ＴＡＡ－ＣＤ３二重特異性抗体は、重要な新しいクラスの免疫療法であることが証明される可能性があるが、横断研究の比較では、ＣＡＲ－Ｔアプローチで見られる有効性を達成していない場合があることを示唆している。

【0149】

２つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞薬ＫｙｍｒｉｉａｈおよびＹｅｓｃａｒｔａは、最近、血液Ｂ細胞悪性腫瘍についてＦＤＡの承認を受けており、個別化された癌免疫療法の分野におけるこのアプローチの強力な可能性を実証している。どちらの製品も、ＣＤ１９抗原を腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）として利用し、これは、Ｂ細胞への発現が制限されているため、Ｔ細胞媒介性殺滅の理想的な標的であり、オフターゲット毒性を最小限に抑え、抗腫瘍効果を高める。しかしながら、ＣＡＲ－Ｔ細胞の高い効力は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）および神経毒性などの副作用と関連している。さらに、全ての患者がまだ治療の恩恵を受けているわけではなく、各患者の臨床転帰に影響を与える可能性のある変数の数は、自家アプローチおよび同種アプローチの両方で比較的高い。さらに、固形腫瘍中の腫瘍関連抗原を標的とする試みは、これまでのところ限られた成功しか達成しておらず、最小限の抗腫瘍活性または重篤な副作用のいずれかを示している。腫瘍微小環境の阻害、腫瘍組織全体へのＣＡＲ－Ｔ細胞のアクセス不良、および骨の折れる製造は、有望なＣＡＲ－Ｔ細胞療法に対する現在の課題のうちのいくつかを表す。

【0150】

現在の免疫療法的治療の限界の１つは、特定の腫瘍細胞の認識および細胞傷害性の誘発を介して、腫瘍細胞に対する患者自身の免疫応答を最適に誘発することである。ナイーブＴ細胞の効果的な活性化および経験豊富なメモリーＴ細胞集団の誘発には、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体（シグナル１）を介した抗原特異的刺激に加えて、共刺激シグナル（シグナル２）が必要である。共刺激経路ＣＤ２８および４－１ＢＢのアゴニスト作用は、異なる免疫療法に対する患者の耐性に役立つ可能性のある標的細胞溶解の有意な増強をもたらし得る。しかしながら、共刺激のより広い役割は、臨床腫瘍学において依然として評価されている。多くの腫瘍は、共刺激受容体を欠いており、それらの腫瘍がＣＤ３×ＴＡＡによって誘発されるＴ活性化をさらに強化することを妨げる。

【0151】

同系腫瘍のパネル上での共刺激リガンドの強制発現によって本明細書で実施される共刺激経路の盲検スクリーニングは、ＣＤ２８を４－１ＢＢとともに最も強力な共刺激受容体のうちの１つとして確立した。さらに、Ｔ細胞の表面上のＣＤ２８を架橋する共刺激ベースの二重特異性抗体が、抗腫瘍反応を増強するために前立腺組織からのＴＡＡを用いて、本明細書で構築された。本明細書に開示されるのは、ＴＡＡ－ＣＤ３およびＴＡＡ－ＣＤ２８二重特異性抗体との併用療法が、ＴＡＡおよびＴＣＲ刺激の両方の存在下でＴ細胞活性化および細胞傷害性を効率的に高め、抗腫瘍免疫の強化をもたらすことを実証するデータである。実際、本明細書に開示されるデータは、この新規クラスの二重特異性抗体（ＴＡＡ－ＣＤ２８）を新たなＴＡＡ－ＣＤ３クラスと組み合わせると、カスタマイズされたＣＡＲ－Ｔ細胞療法の有効性に近づき得るより安全な既製の生物製剤ソリューションを提供し得ることを示唆している。

【0152】

より具体的には、例示的なＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体が生成され、例示的な抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８が、インビトロでＰＳＭＡ×ＣＤ３またはＣＤ２０×ＣＤ３誘発性Ｔ細胞活性化を増強し、インビボで抗腫瘍効果を安全に強化することが実証された。インビトロでの活性は、Ｔ細胞および標的細胞結合体の免疫シナプスに局在する二重特異性抗体の画像、ＰＳＭＡ×ＣＤ３誘発性増殖の増強、サイトカイン放出、および細胞傷害性を示すことによって実証された。インビボ抗腫瘍効果は、マウス腫瘍モデル（同系）で評価された。腫瘍体積および血清サイトカインを経時的にモニターして、二重特異性抗体治療に対する応答を示した。非ヒト霊長類における本発明の例示的なＰＳＭＡ×ＣＤ２８の安全性および耐容性を決定するために、カニクイザルで研究が行われた。血清サイトカインおよびＴ細胞表現型を分析するために、臨床観察および血液試料収集によって、毒性について動物を調べた。

【0153】

以下に詳細に説明されるように、例示的な抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体は、ＴＣＲ／ＣＤ３依存性Ｔ細胞活性化を増強するために生成され、したがって、プロフェッショナルＡＰＣによって提供される共刺激（シグナル２）を模倣する。

【0154】

全ての手順は、アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）の実験動物の管理と使用に関する指針に従って実施された。プロトコルは、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓの動物実験委員会によって承認された。

【0155】

実施例１．抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８抗体の構築
抗ＣＤ２８抗体の生成
抗ＣＤ２８抗体は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（すなわち、ヒト免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む遺伝子操作マウス）を、マウスＩｇＧ２ａのＦｃ部分に融合されたヒトＣＤ２８で免疫するか、またはＣＤ２８を発現する細胞またはＣＤ２８をコードするＤＮＡで免疫することによって得た。抗体免疫応答を、ＣＤ２８特異的イムノアッセイによってモニターした。所望の免疫応答が達成されたとき、脾細胞を採取し、マウス骨髄腫細胞と融合させて、それらの生存率を維持し、ハイブリドーマ細胞株を形成した。ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングおよび選択して、ＣＤ２８特異的抗体を産生する細胞株を同定した。この技法を使用して、いくつかの抗ＣＤ２８キメラ抗体（すなわち、ヒト可変ドメインおよびマウス定常ドメインを有する抗体）を得た。さらに、ＵＳ２００７／０２８０９４５Ａ１に記載されるように、いくつかの完全ヒト抗ＣＤ２８抗体を、骨髄腫細胞に融合させることなく抗原陽性Ｂ細胞から直接単離した。

【0156】

本実施例の方法に従って生成された例示的な抗ＣＤ２８抗体のある特定の生物学的特性を、以下に記載される実施例において詳細に説明する。

【0157】

抗ＰＳＭＡ抗体の生成
抗ＰＳＭＡ抗体は、遺伝子修飾マウスをヒトＰＳＭＡ抗原で免疫することによって、またはヒト免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む遺伝子操作マウスをヒトＰＳＭＡ抗原で免疫することによって得た。あるいは、マウスを、ヒトＰＳＭＡ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ．Ｎｏ．Ｑ０４６０９）を発現するヒト前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ、ＡＴＴＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡ）で免疫した。抗体免疫応答を、ＰＳＭＡ特異的イムノアッセイによってモニターした。所望の免疫応答が達成された場合、各マウスから脾細胞を採取して、（１）マウス骨髄腫細胞と融合してそれらの生存率を維持し、ハイブリドーマ細胞を形成してＰＳＭＡ特異性についてスクリーニングするか、または（２）Ｎ末端６－Ｈｉｓタグを有するヒトＰＳＭＡ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号４２３４－ＺＮ）を、反応性抗体（抗原陽性Ｂ細胞）に結合して同定する選別試薬として使用して、Ｂ細胞を選別した（ＵＳ ２００７／０２８０９４５Ａ１に記載）。ヒト可変領域およびマウス定常領域を有するＰＳＭＡに対するキメラ抗体が、最初に単離された。抗体を、親和性、選択性等を含む望ましい特徴について特徴付けし選択する。必要ならば、マウス定常領域を所望のヒト定常領域、例えば、野生型または修飾ＩｇＧ１またはＩｇＧ４と置き換えて、完全ヒト抗ＰＳＭＡ抗体を生成した。

【0158】

ＣＤ２８およびＰＳＭＡに結合する二重特異性抗体の生成
抗ＰＳＭＡ特異的結合ドメインおよび抗ＣＤ２８特異的結合ドメインを含む二重特異性抗体を、標準的な方法を用いて構築し、抗ＰＳＭＡ抗原結合ドメインおよび抗ＣＤ２８抗原結合ドメインが各々、共通のＬＣＶＲと対をなす異なる別個のＨＣＶＲを含む。場合によっては、二重特異性抗体は、抗ＣＤ２８抗体からの重鎖、抗ＰＳＭＡ抗体からの重鎖、および共通の軽鎖を利用して構築された（表１を参照）。ある特定の実施形態では、例示的な二重特異性抗体（ｂｓ１６４２９Ｄ）の抗ＣＤ２８抗体からの重鎖アミノ酸配列は、配列番号８１に示されている。例示的な二重特異性抗体（ｂｓ１６４２９Ｄ）の抗ＰＳＭＡ抗体からの重鎖アミノ酸配列は、配列番号８２に示されている。ｂｓ１６４２９Ｄの共通軽鎖アミノ酸配列を配列番号８３に示す。

【0159】

本実施例に従って作成された二重特異性抗体は、２つの別個の抗原結合ドメイン（すなわち、結合アーム）を含む。第１の抗原結合ドメインは、抗ＣＤ２８抗体（「ＣＤ２８－ＶＨ」）に由来する重鎖可変領域を含み、第２の抗原結合ドメインは、抗ＰＳＭＡ抗体（「ＰＳＭＡ－ＶＨ」）に由来する重鎖可変領域を含む。抗ＰＳＭＡおよび抗ＣＤ２８の両方が、共通の軽鎖を共有する。ＣＤ２８－ＶＨ／ＰＳＭＡ－ＶＨ対合は、Ｔ細胞上のＣＤ２８および腫瘍細胞上のＰＳＭＡを特異的に認識する抗原結合ドメインを作成する。

【0160】

実施例２．重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列および核酸配列
表１は、実施例１に従って作製された様々な二重特異性抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域ならびにＣＤＲのアミノ酸配列識別子を示す。対応する核酸配列識別子を表２に示す。

【表1】

【表2】

【0161】

実施例３．ＣＤ２８および４－１ＢＢは、強力な共刺激受容体である
Ｔ細胞の活性化に重要な共刺激シグナルを提供するのにどの共刺激受容体が効果的であるかを決定するために、同系腫瘍のパネル上で共刺激リガンドの強制発現によって実施される共刺激経路のブラインドスクリーン（表３および図２）が、４－１ＢＢとともに最も強力な共刺激受容体の１つとしてＣＤ２８を再度確立した。表３は、ブラインドスクリーンでの無腫瘍マウスの数をまとめたものである。各群で５匹のマウスを試験した。アッセイは、７つの異なる共刺激リガンドを発現するように操作された３つの異なる腫瘍細胞株で実施された。簡単に説明すると、ＥＬ４、ＭＣ３８、およびＢ１６Ｆ１０．９腫瘍細胞は、レンチウイルス形質導入によって個々の共刺激リガンドを発現するように操作された。細胞を、ＷＴ Ｃ５７ＢＬ６マウスの皮下に移植した。腫瘍成長は、ＥＬ４、ＭＣ３８、およびＢ１６Ｆ１０．９腫瘍型の移植後１８、２４、および２５日目にそれぞれ測定した。これは、対照群の腫瘍体積が最大許容サイズ（＞２０００ｍｍ３）に達した時点である。腫瘍サイズを測定した。表３のデータと一致して、ＣＤ２８および４－１ＢＢも腫瘍のサイズを縮小するのに最も効果的である（データは示さず）。

【表3】

【0162】

実施例４．抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体の表面プラズモン共鳴由来の結合親和力および速度定数
抗ＰＳＭＡｘＣＤ２８二重特異性モノクローナル抗体の結合速度論を決定するために、抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体、ならびにＰＳＭＡおよび／またはＣＤ２８に対する関連親モノクローナル抗体の表面プラズモン共鳴由来の結合親和性および速度定数を決定した。

【0163】

抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性モノクローナル抗体のＰＳＭＡへの結合速度論
精製された抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性モノクローナル抗体または抗ＰＳＭＡ二価親モノクローナル抗体に結合する６ｈ．ｈＰＳＭＡ（組み換えヒトＰＳＭＡ／ＦＯＬＨ１タンパク質、Ｒ＆Ｄ、カタログ番号４２３４－ＺＮ）の平衡解離定数（Ｋ_D値）は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ－２００機器を使用したリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサーを使用して決定した。ＣＭ５ Ｂｉａｃｏｒｅセンサー表面は、モノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体とのアミンカップリングによって誘導体化され、精製された抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性、または抗ＰＳＭＡおよび抗ＣＤ２８親モノクローナル抗体を捕捉した。

【0164】

このＢｉａｃｏｒｅ結合研究は、０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、１．０ｍＭのＣａＣｌ₂、０．０５％ ｖ／ｖの界面活性剤Ｐ２０（ＨＢＳ－Ｐ＋＋泳動緩衝液）からなる緩衝液中で行った。Ｎ末端ポリヒスチジンタグ（６ｈ．ｈＰＳＭＡ、Ｒ＆Ｄ）を有する異なる濃度のｈＰＳＭＡを、抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体および抗ＰＳＭＡまたは抗ＣＤ２８親モノクローナル抗体について、３倍段階希釈で、１０ｎＭ～０．４ｎＭの範囲のＨＢＳ－Ｐ＋＋泳動緩衝液中で調製した。

【0165】

異なる濃度の６ｈ．ｈＰＳＭＡを、５０μＬ／分の流速でモノクローナル抗体で捕捉された表面に注入した。捕捉されたモノクローナル抗体への６ｈ．ｈＰＳＭＡの会合を３分間モニターし、ＨＢＳ－Ｐ＋＋泳動緩衝液中の６ｈ．ｈＰＳＭＡの解離を１０分間モニターした。Ｓｃｒｕｂｂｅｒ ２．０ｃ曲線適合ソフトウェア（ＢｉｏＬｏｇｉｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いてリアルタイムセンサーグラムを１：１結合モデルにあてはめることによって、動的結合（ｋ_a）速度定数および動的解離（ｋ_d）速度定数を測定した。結合解離平衡定数（Ｋ_D）および解離半減期（ｔ１／２）を、動的速度定数から以下のように計算した：
Ｋ_D（Ｍ）＝ｋ_d／ｋ_a、およびｔ１／２（分）＝０．６９３／ｋ_d／６０

【0166】

２５℃で精製モノクローナル抗体に結合する６ｈ．ｈＰＳＭＡの結合速度論的パラメータを以下の表４に示す。

【表4】

【0167】

３７℃で１つの精製された例示的なモノクローナル二重特異性抗体に結合する６ｈ．ｈＰＳＭＡの結合速度論的パラメータを以下の表５に示す。製造元によって定義されたように、１つのＲＵ（応答ユニット）は、１ｍｍ²あたり１ｐｇのタンパク質を表す。

【表5】

【0168】

抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性モノクローナル抗体のＣＤ２８への結合速度論
精製されたモノクローナル抗体に結合するｈＣＤ２８．ｍｍｈの平衡解離定数（Ｋ_D値）は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ－２００機器を使用したリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサーを使用して決定された。ＣＭ５ Ｂｉａｃｏｒｅセンサー表面は、モノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体とのアミンカップリングによって誘導体化され、精製された抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性モノクローナル抗体、および抗ＰＳＭＡまたは抗ＣＤ２８親モノクローナル抗体を捕捉した。

【0169】

異なる濃度のｈＣＤ２８．ｍｍｈを、５０μＬ／分の流速でモノクローナル抗体で捕捉された表面に注入した。捕捉されたモノクローナル抗体へのｈＣＤ２８．ｍｍｈの会合を５分間モニターし、ＨＢＳ－Ｐ＋＋泳動緩衝液中のｈＣＤ２８．ｍｍｈの解離を１０分間モニターした。Ｓｃｒｕｂｂｅｒ ２．０ｃ曲線適合ソフトウェアを用いてリアルタイムセンサーグラムを１：１結合モデルへあてはめることによって、動的結合（ｋ_a）速度定数および動的解離（ｋ_d）速度定数を測定した。結合解離平衡定数（Ｋ_D）および解離半減期（ｔ１／２）を、動的速度定数から以下のように計算した：
Ｋ_D（Ｍ）＝ｋ_d／ｋ_a、およびｔ１／２（分）＝０．６９３／ｋ_d／６０

【0170】

２５℃での精製された抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性モノクローナル抗体または抗ＣＤ２８二価親モノクローナル抗体へのｈＣＤ２８．ｍｍｈ結合の結合速度論的パラメータを以下の表６に示す。

【表6】

【0171】

３７℃での精製された抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性モノクローナル抗体へのｈＣＤ２８．ｍｍｈ結合の結合速度論的パラメータを以下の表７に示す。

【表7】

【0172】

表４～７に示されるように、本発明のいくつかの抗ＣＤ２８抗体は、高い親和性でＣＤ２８に結合する。本発明のいくつかの抗ＰＳＭＡ抗体は、高い親和性でＰＳＭＡに結合する。いくつかの抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体は、ＣＤ２８およびＰＳＭＡの両方に高い親和性で結合する。

【0173】

実施例５．ＰＳＭＡおよびＣＤ２８に対する抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性モノクローナル抗体の細胞結合の効力および特異性
これらの抗体（抗ＰＳＭＡ、抗ＣＤ２８、および抗ＰＳＭＡ×Ｄ２８モノクローナル抗体）が細胞表面タンパク質に特異的に結合する能力を評価するために、電気化学発光ベースの検出プラットフォーム（ＭＳＤ）でヒトＰＳＭＡまたはＣＤ２８を発現する細胞を使用して、インビトロ結合アッセイを開発した。２つの研究を行った。１つの研究では、細胞表面抗原に結合するモノクローナル抗体の効力および特異性を評価した。これらの抗体（抗ＰＳＭＡ、抗ＣＤ２８、および抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８抗体）は、ヒトＰＳＭＡまたはヒトＣＤ２８を発現する細胞株への特異的結合を示した。補足実験では、ＩｇＧ４ｓアイソタイプへのブリッジング研究が実施された。

【0174】

ＰＳＭＡおよびＣＤ２８への抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体の細胞結合の効力および特異性を決定するために使用される方法
ヒト上皮性前立腺癌細胞株であるＣ４－２（ＵｒｏＣｏｒ）は、ヒトＰＳＭＡを内在的に発現する。ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２８発現細胞株は、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ－１５７３）からのヒト胎児腎細胞にヒトＣＤ２８をコードするネオマイシン耐性レンチウイルス構築体（ｈＣＤ２８受託番号ＮＰ＿００６１３０．１）を形質導入することによって操作された。結合の特異性を評価するために、これら２つの細胞株を、親ＨＥＫ２９３ＨＺ細胞株（ＰＳＭＡおよびＣＤ２８に対して陰性）と並行して、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって評価した。抗Ｆｅｌｄ１ヒトＩｇＧ１抗体が、ＩｇＧ検出の陰性対照として含まれた。

【0175】

上記の細胞株を、Ｃａ^2+/Ｍｇ²⁺（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号９２４０）を含まない１×ＰＢＳ緩衝液で１回すすぎ、酵素フリー細胞解離溶液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号Ｓ－００４－Ｃ）とともに３７℃で１０分間インキュベートして、フラスコから細胞を分離した。Ｃａ^2+/Ｍｇ²⁺（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号９２３６）を含む１×ＰＢＳでの追加洗浄を行った。次いで、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（商標）Ａｕｔｏ Ｔ４セルカウンター（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、モデル＃Ａｕｔｏ Ｔ４）で細胞をカウントした。細胞洗浄緩衝液中のウェルあたりおよそ１０，０００個の細胞を、９６ウェルカーボン電極プレート（ＭＵＬＴＩ－ＡＲＲＡＹ高結合プレート、ＭＳＤ、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、カタログ番号Ｌ１５ＸＢ－３／ＬＸ１１ＸＢ－３）に個別に播種し、３７℃で１時間インキュベートして、細胞を接着させた。非特異的結合部位は、ＰＢＳ中２％のＢＳＡ（ｗ／ｖ）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ８５７７－１Ｌ）によって、室温で１時間遮断した。

【0176】

抗ＰＳＭＡ、抗ＣＤ２８、抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８、もしくは対照抗体を、１．７ｐＭ～１００ｎＭの範囲の段階希釈で含む溶液、または抗体を含まない溶液をプレート結合細胞に付加し、室温で１時間インキュベートした。示された場合を除き、分析は二重に行った。次いで、細胞洗浄ヘッドを備えるＡｑｕａＭａｘ２０００プレート洗浄機（ＭＤＳ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、モデル番号２０００）を使用してプレートを洗浄し、未結合抗体を除去した。プレート結合抗体は、重鎖および軽鎖に特異的なＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）コンジュゲートヤギポリクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ＃１０９－００５－０８８）を用いて室温で１時間検出した。洗浄後、製造元の推奨手順に従ってリードバッファー（ＭＳＤ、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、カタログ番号Ｒ９２ＴＤ－２）を用いてプレートを展開し、発光シグナルを、ＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ ６００（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、モデル＃６００）機器で記録した。

【0177】

直接結合シグナル（相対光単位、ＲＬＵ）を、抗体濃度の関数として分析した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアバージョン＃６）を使用して、データをシグモイド（４パラメータロジスティック）用量反応モデルに適合させた。最大結合シグナルの５０％が検出される抗体の濃度として定義されるＥＣ５０値は、ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２８およびＣ４－２細胞への結合について決定され、それぞれＣＤ２８またはＰＳＭＡに結合する各抗体の効力を示した。さらに、ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２８またはＣ４－２細胞上の１１．１ｎＭでの抗体の、ＨＥＫ２９３ＨＺ細胞に対する結合シグナルの比率を計算した。この代表的な濃度は、ＣＤ２８、ＰＳＭＡ陰性ＨＥＫ２９３ＨＺ細胞上の高い標的細胞結合、低いバックグラウンドシグナルのために選択された。結合比が３未満の抗体は、以下の表８でＮＢとしてマークされた。ＮＢは、「アッセイ条件下で特異的結合は観察されない」と定義される。

【0178】

補足研究では、上記と同じプロトコルを使用して別個の実験を実施したが、ＩｇＧ４アイソタイプ対照（ＵＳＳＮ１５／１４７，７９１を参照）および親ＣＤ２８モノクローナル抗体が含まれた。試験溶液は、３．４ｐＭ～２００ｎＭの抗ＰＳＭＡ、抗ＣＤ２８、抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性モノクローナル抗体または対照抗体を段階希釈で含んでいた。結合比は、７．４ｎｍで計算した。

【0179】

結果、要約、および結論
ＰＳＭＡまたはＣＤ２８のいずれかを発現する細胞に特異的に結合する抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体の能力を、免疫結合アッセイを使用して、ＰＳＭＡまたはＣＤ２８発現が陰性の細胞株と比較して評価した。比較のために、ＰＳＭＡまたはＣＤ２８に特異的な二価の親抗体を含めた。最大１００ｎＭの抗体濃度での、９６ウェル高結合プレート（ＭＳＤ、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、カタログ番号Ｌ１５ＸＢ－３／ＬＸ１１ＸＢ－３）上の細胞への抗体の用量依存的結合を、ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体を使用して検出し、電気化学発光の結合シグナルは、Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６００（ＭＳＤ）上で記録した。細胞に結合する抗体のＲＬＵ値を決定した。ＣＤ２８またはＰＳＭＡ発現細胞について、ＥＣ₅₀値を効力の尺度として計算した。高いバックグラウンドシグナルをもたらした試料の場合、ＥＣ５０値の計算から高濃度を除外し、値は表８に星印で示す。１１．１ｎＭでの抗体とＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２８、またはＣ４－２細胞と陰性ＨＥＫ２９３ＨＺ細胞との結合シグナルの比較を使用して、抗体の結合特異性を評価した。特異的結合は、その濃度のＨＥＫ２９３ＨＺ細胞と比較して、ＣＤ２８またはＰＳＭＡ発現細胞への結合の比率が３倍以上の抗体として定義される。

【0180】

結合結果を表８に要約する。１１．１ｎＭの濃度で、本発明の３つの例示的な抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体（ｂｓ１６４２９Ｄ、ｂｓ１６４３０Ｄ、およびｂｓ１６４３１Ｄ）は、ＨＥＫ２９３－ｈＣＤ２８およびＣ４－２細胞の両方に特異的に結合し、比率はそれぞれＨＥＫ２９３ＨＺ細胞の１３～３１倍および４～１０倍上であった。二重特異性抗体の効力は、ＨＥＫ２９３－ｈＣＤ２８細胞で５．３１～９．５８ｎＭおよびＣ４－２細胞で０．３５～５．２４ｎＭのＥＣ₅₀値の範囲であった。

【表8】

【0181】

親抗体は、抗体ＩＤ列の括弧内に示されているように、それらを生成するために使用された抗原に対応する細胞に特異的に結合した。親抗体について、ＨＥＫ２９３－ｈＣＤ２８およびＣ４－２細胞に結合するためのＥＣ₅₀値は、ＨＥＫ２９３－ｈＣＤ２８細胞上の１．０４～１０．２ｎＭ～Ｃ４－２細胞上の０．７３８～０．９４６ｎＭの範囲であった。抗体について、Ｃ４－２細胞上のより高い濃度のｍＡｂ１１８３８Ｐ２およびｍＡｂ１１８１０Ｐ２結合値は、陰性細胞上の高バックグラウンドを補償するために、ＥＣ₅₀値の計算から除外した。予想どおり、ＩｇＧ対照抗体は、ＣＤ２８またはＰＳＭＡ発現細胞株に特異的に結合しなかった。
補足実験は、上記のように実施されたが、ＩｇＧ４アイソタイプ対照および親ＣＤ２８モノクローナル抗体が含まれていた。このデータは、ｈＩｇＧ４ｓアイソタイプ対照を使用してわずかなバックグラウンドシグナルがあったことを実証するためのブリッジング研究として生成された。データを表９に要約する。表９に示されるように、抗ＣＤ２８抗体ｍＡｂ１４２２６Ｐ２は、ヒトＣＤ２８発現細胞であるＨＥＫ２９３－ｈＣＤ２８Ｐ－３に特異的に結合する。抗ＣＤ２８抗体ｍＡｂ１４２２６Ｐ２は、細胞がＰＳＭＡ（Ｃ４－２）を発現するかどうかに関係なく（ＨＥＫ２９３ＨＺ）、ヒトＣＤ２８を発現しない細胞には結合しない。

【表9】

【0182】

ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体のＴ細胞および標的細胞への結合
実験手順
フローサイトメトリー分析を利用して、抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体のＣ４－２、２２ＲＶ１、ＲＡＪＩ、ヒトおよびカニクイザルＴ細胞への結合を決定し、続いてフィコエリトリン（ＰＥ）標識抗ヒトＩｇＧ抗体で検出した。簡単に説明すると、１×１０⁵細胞／ウェルを、ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体またはヒトＩｇＧ４抗体（ＵＳＳＮ１５／１４７，７９１を参照）の段階希釈物とともに４℃で３０分間インキュベートし、これは、ヒトおよびカニクイザルＴ細胞については１３３ｎＭ～８．１４ｐＭの範囲、およびＰＳＭＡ発現細胞については１３３ｎＭ～６１ｐＭの範囲の、ヒトまたはカニクイザルＣＤ２８との交差反応性なしにヒト抗原に結合する。インキュベーション後、細胞を１％濾過ＦＢＳを含有する冷ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＥコンジュゲート抗ヒト二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号７０９－１１６－１４９）を細胞に添加して、さらに３０分間インキュベートした。Ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ色素を、ヒトおよびカニクイザルＴ細胞のインキュベーションに追加した。抗体を含有しないかまたは二次抗体のみを含有するウェルを対照として使用した。

【0183】

ＰＳＭＡ発現細胞とのインキュベーション後、細胞を洗浄し、１％の濾過したＦＢＳを含有する２００μＬの冷ＰＢＳに再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ上でフローサイトメトリーにより分析した。

【0184】

ヒトまたはカニクイザルＴ細胞とのインキュベーション後、細胞を洗浄し、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ染色バッファー（ＢＤ、カタログ番号５６６３４９）中の抗ＣＤ２（ＢＤ、カタログ番号５６２６３８）、抗ＣＤ１６（ＢＤ、カタログ番号５６２８７４）、抗ＣＤ４（ＢＤ、カタログ番号５６４３０５）、および抗ＣＤ８（ＢＤ、カタログ番号５６３７９５）抗体のカクテルで、さらに２０分のインキュベーションにわたって４℃で染色した。洗浄後、細胞を、１％の濾過したＦＢＳ（ＴＣＢ、カタログ番号１０１を含有する２００μＬの冷ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４１９０－１４４）中に再懸濁し、Ｌｉｖｅ／ＣＤ２＋／ＣＤ４＋／ＣＤ１６またはＬｉｖｅ／ＣＤ２＋／ＣＤ８＋／ＣＤ１６ゲートにゲートし、ＢＤ ＦＡＣＳ ＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ－Ｘ２０上でフローサイトメトリーにより分析した。

【0185】

結果、要約、および結論：
ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体の、ヒトＴ細胞の表面への結合をフローサイトメトリーによって試験した。

【0186】

ｂｓ１６４２９Ｄは、４．８０×１０^-8ＭのＥＣ５０値で全てのＴ細胞に結合した。それぞれ５．０９×１０^-8Ｍおよび５．８９×１０^-8ＭのＥＣ５０値で、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方に結合した。

【0187】

ｂｓ１６４３１Ｄは、１．８０×１０^-7のＥＣ５０値で全てのＴ細胞に弱く結合した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方に弱く結合し、ＥＣ５０値はそれぞれ１．６７Ｅ－０７Ｍおよび１．８０Ｅ－０７Ｍであった。

【0188】

ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体の、ＰＳＭＡを発現する細胞株の表面への結合をフローサイトメトリーによって試験した。

【0189】

Ｃ４－２は、ＬＮＣａＰ（リンパ節転移に由来するアンドロゲン感受性ヒト前立腺腺癌細胞、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５７：４０６－４１２（１９９４）を参照）細胞に由来するＣａＰ（前立腺癌）細胞株である。ｂｓ１６４２９Ｄおよびｂｓ１６４３１Ｄの両方は、それぞれ３．８７×１０^-9Ｍおよび１．５０×１０^-9ＭのＥＣ５０値でＣ４－２細胞（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｓｔａｔｅ，６０：９８－１０８を参照）に結合した。

【0190】

２２ＲＶ１は、上皮性前立腺癌細胞株である（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ａｎｉｍ．，１９９９，３５（７）：４０３－４０９を参照）。ｂｓ１６４２９Ｄおよびｂｓ１６４３１Ｄの両方は、それぞれ３．０５×１０^-9Ｍおよび６．３３×１０^-09ＭのＥＣ５０値で２２ＲＶ１細胞に結合した。

【0191】

これらの結果を表１０～１２に要約する。

【表10】

【表11】

【表12】

【0192】

実施例６：ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体の一次および操作されたバイオアッセイ
Ｔ細胞の活性化は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の主要組織適合性複合体クラスＩまたはＩＩ（ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ）タンパク質によって提示される特定のペプチドを認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を刺激することによって達成される（Ｇｏｌｄｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ａｎｄ ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ ａ ｄｉｖｅｒｓｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ，Ｎａｔｕｒｅ ４０２，２５５－２６２（１９９９））。活性化されたＴＣＲは、順にシグナル伝達事象のカスケードを開始し、これはアクチベータータンパク質１（ＡＰ－１）、活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）、または活性化Ｂ細胞の核因子κ軽鎖エンハンサー（ＮＦκＢ）などの様々な転写因子によって駆動される、レポーター遺伝子によってモニターすることができる。Ｔ細胞応答は次いで、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４）、ＰＤ－１（プログラム細胞死タンパク質１）、ＬＡＧ－３（リンパ球活性化遺伝子３）、または他の分子などのＴ細胞上に構成的または誘発的のいずれかで発現した共受容体の関与を介してさらに精製される（Ｓｈａｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｂ７－ＣＤ２８ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２（２）：１１６－２６（２００２））。共刺激分子であるＣＤ２８は、ＡＰＣ上で発現する内在性リガンドＣＤ８０またはＣＤ８６によって活性化される。ＣＤ２８は、ＴＣＲ活性化後、ＮＦκＢ転写因子によって制御される経路などの細胞シグナルを増強する。ＣＤ２８共シグナルは、Ｔ細胞の分化、増殖、サイトカイン放出、および細胞死などの効果的なＴ細胞活性化に重要である（Ｓｍｅｅｔｓ ｅｔ ａｌ．，ＮＦκＢ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ／ＣＤ２８ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ－Θ，ＰＮＡＳ，９７（７）：３３９４－３３９９（２０１２）。

【0193】

一次刺激およびＰＳＭＡ標的発現の両方の存在下でＴ細胞活性を強化する抗体を同定するために、抗ＣＤ２８抗体および抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体を、操作されたレポーターバイオアッセイおよびヒト初代Ｔ細胞を使用した細胞ベースのアッセイにおいて特徴付けた。アッセイは、一次刺激の存在下および非存在下、ならびに標的発現の存在下および非存在下での抗ＰＳＭＡ／ＣＤ２８二重特異性抗体の挙動を評価する。アッセイの概略図を図３に示す。一次刺激および標的発現の存在下でＴ細胞活性を強化する抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体を選択するためにアッセイを実施した。したがって、アッセイは、一次刺激および標的発現の存在下および非存在下での二重特異性抗体の挙動を評価した。

【0194】

１）ルシフェラーゼベースのレポーターアッセイ：
ａ）レポーターＴ細胞の操作：
Ｊｕｒｋａｔ由来のＴ細胞クローンであるＪＲＴ３．Ｔ３．５（ＡＴＣＣ、＃ＴＩＢ－１５３）に、ＮＦκＢルシフェラーゼレポーター構築体（ＮＦκＢ－Ｌｕｃ，ＳＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｑｉａｇｅｎ、カタログ＃ＣＬＳ－０１３Ｌ）を形質導入した。ピューロマイシン耐性クローン（ＪＲＴ３．Ｔ３．５／ＮＦκＢ－Ｌｕｃクローン１Ｃ２）の単離後、完全長ヒトＴＣＲα（１Ｇ４Ａ－アミノ酸Ｍ１～Ｓ２７４）およびＴＣＲβサブユニット（１Ｇ４Ｂ－アミノ酸Ｍ１～Ｇ３１１）を発現するように細胞をさらに操作した（Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｎｇｌｅ ａｎｄ Ｄｕａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ ｉｎ ＴＣＲ ＣＤＲｓ Ｃａｎ Ｅｎｈａｎｃｅ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８０（９）：６１１６－３１（２００８））。単一のクローン（Ｊ．ＲＴ３－Ｔ３．５／ＮＦκＢ－Ｌｕｃ／１Ｇ４ＡＢクローン１Ｄ２）を単離した後、完全長ヒトＣＤ８α（受託番号ＮＰ＿００１１３９３４５のｈＣＤ８ａ－アミノ酸Ｍ１～Ｖ２３５）およびヒトＣＤ８βサブユニット（受託番号Ｐ１０９６６のｈＣＤ８ｂ－アミノ酸Ｍ１～Ｋ２１０）を発現するように細胞をさらに操作した。単一のクローンが再び生成され（Ｊ．ＲＴ３－Ｔ３．５／ＮＦκＢ－Ｌｕｃ／１Ｇ４ＡＢ／ｈＣＤ８ａｂクローン１Ｄ５）、完全長ヒトＣＤ２８（受託番号＃Ｐ１０７４７のｈＣＤ２８－アミノ酸Ｍ１～Ｓ２２０）でさらに形質導入された。細胞をＣＤ２８の高発現のために選別し、ＲＰＭＩ＋２０％ ＦＢＳ＋ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン（Ｐ／Ｓ／Ｇ）＋ＮＥＡＡ＋ＮａＰｙｒ＋１μｇ／ｍＬのピューロマイシン＋５００μｇ／ｍＬのＧ４１８＋２５０μｇ／ｍＬのヒグロマイシン＋１０μｇ／ｍＬのブラスチシジン中で維持した。より速い成長のために、操作されたレポーターＴ細胞を、抗生物質を含まない細胞培養培地に保持し、操作されたレポーターＴ細胞として細胞ベースのルシフェラーゼ実験に使用した。試薬情報は次のとおりである：ＲＰＭＩ １６４０、Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号９１６０；ＦＢＳ、Ｓｅｒａｄｉｇｍ、カタログ＃１５００－５０；ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン１００×（Ｐ／Ｓ／Ｇ）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１０３７８－０１６；非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号９３０４；ピルビン酸ナトリウム（ＮａＰｙｒ）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＴＭＳ－００５－Ｃ；ピューロマイシン、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ８８３３；ジェネティシン（Ｇ４１８）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１８１１－０９８；ハイグロマイシン；ブラスチシジン。

【0195】

ｂ）ＡＰＣの操作：
ヒトＣＤ２０（受託番号ＮＰ＿０６８７６９．２のアミノ酸Ｍ１～Ｐ２９７）を発現する安定したＨＥＫ２９３細胞株（ＡＴＣＣ、＃ＣＲＬ－１５７３）にヒトＰＳＭＡ（受託番号Ｑ０４６０９のアミノ酸Ｍ１～Ａ７５０）を形質導入した。ヒトＰＳＭＡ陽性細胞を、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって分離し、得られた細胞株ＨＥＫ２９３／ＣＤ２０／ｈＰＳＭＡハイソートを、５００μｇ／ｍＬのＧ４１８を補充したＤＭＥＭ＋１０％＋Ｐ／Ｓ／Ｇ＋ＮＥＡＡ中で維持した。

【0196】

ｃ）Ｔ細胞／ＡＰＣ刺激：
この実験では、操作されたレポーターＴ細胞が、２つの二重特異性抗体を介して刺激される。最初の刺激は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗体である抗ＣＤ３×ＣＤ２０ ｈＩｇＧ４（ＷＯ１４／０４７２３１、ＵＳ９６５７１０２、およびＵＳＳＮ１４／６６１，３３４を参照）によって送達され、操作されたレポーターＴ細胞上のＣＤ３分子およびＨＥＫ２９３細胞上のＣＤ２０を標的とする。ここで、最初の刺激は、ＭＨＣ分子に表示される特定のペプチドである天然リガンドによるＴＣＲの活性化の必要性を回避する。２番目の刺激は、ＣＤ２８二重特異性抗体によって駆動される。この抗体は、ＡＰＣ上で発現されるリガンドであるＣＤ８０／ＣＤ８６によるＴ細胞でのＣＤ２８活性化を模倣する。ここで、抗体は、Ｔ細胞上のＣＤ２８および操作されたＨＥＫ２９３細胞上のＰＳＭＡと相互作用し、操作されたレポーターＴ細胞上のＣＤ２８の活性化を促進する。ＴＣＲおよびＣＤ２８の同時活性化により、ＮＦκＢの転写活性が強化され、順にレポーター遺伝子であるルシフェラーゼの産生が誘発される。

【0197】

ｄ）ルシフェラーゼアッセイの設定：
１０％ ＦＢＳおよびＰ／Ｓ／Ｇを補充したＲＰＭＩ１６４０をアッセイ培地として使用して、抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体のスクリーニング用の細胞懸濁液および抗体希釈液を調製した。

【0198】

スクリーニングの前日に、操作レポーターＴ細胞を、細胞培養培地中で１×１０⁶細胞／ｍＬまで培養した。３倍（１：３）段階的に希釈した抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体および対照を、一定の５０ｐＭ抗ＣＤ２０×ＣＤ３またはｈＩｇＧ４アイソタイプ対照の存在下で試験した。１０点希釈は、１５ｐＭ～１００ｎＭの範囲であり、最終希釈には抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８抗体が含まれていなかった。試薬は、次の順序で追加された。１）段階的に希釈した抗体を、９６ウェル白色平底プレートに対応するウェルに添加した。２）固定濃度の５０ｐＭ抗ＣＤ２０×ＣＤ３またはｈＩｇＧ４アイソタイプ対照を各ウェルに添加した。３）４×１０⁵細胞／ｍＬに再懸濁したＡＰＣを、最終濃度１×１０⁴細胞／ウェルでプレートに添加した。４）一晩培養したレポーターＴ細胞を、２×１０⁶／ｍＬで再懸濁し、最終濃度５×１０⁴細胞／ウェルでプレートに添加した。プレートを３７℃／５％ＣＯ₂で４～６時間インキュベートした後、１００μＬのＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ６０５１）試薬を添加して細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を検出した。放出された光は、マルチラベルプレートリーダーＥｎｖｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、モデル２１０４）上の相対光単位（ＲＬＵ）で捕捉された。全ての段階希釈物を二重に試験した。

【0199】

抗体のＥＣ₅₀値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアを使用して、１０点用量応答曲線上の４パラメータロジスティック方程式にデータを適合させることによって決定した。倍率誘発は、次の方程式を使用して計算した。

【数1】

【0200】

２）初代ヒトＣＤ４⁺Ｔ細胞を使用したＩＬ－２機能アッセイ：
初代ＣＤ４⁺Ｔ細胞／ＡＰＣ機能アッセイは、抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体との係合によるＩＬ－２産生に対するＣＤ２８活性化の影響を評価するために開発された。

【0201】

ａ）ヒト初代ＣＤ４＋Ｔ細胞の単離：
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健康なドナー白血球パックから単離した。ＰＢＭＣ単離は、５０ｍＬのＳｅｐＭａｔｅ（商標）チューブ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号８５４５０）を製造元の推奨プロトコルに従って使用し、密度勾配遠心分離によって達成された。簡単に説明すると、１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌＰａｑｕｅ ＰＬＵＳを５０ｍＬのＳｅｐＭａｔｅチューブに重層し、続いてＤ－ＰＢＳ（ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ＃９２４０）で１：２に希釈した３０ｍＬの白血球を添加した。その後の工程は、ＳｅｐＭａｔｅ製造元のプロトコルに従った。続いて、ＣＤ４⁺Ｔ細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ製のヒトＣＤ４マイクロビーズキット（カタログ番号１３０－０４５－１０１）を製造元の指示に従って使用して、ＰＢＭＣから単離した。単離されたＣＤ４⁺Ｔ細胞を、１０％ ＤＭＳＯ（Ｍａｃｒｏｎ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カタログ番号４９４８－０２）を、１バイアルあたり５×１０⁶細胞の濃度で含有するＦＢＳ中で冷凍した。

【0202】

ｂ）ＣＤ２８抗体で処理された初代ＣＤ４⁺Ｔ細胞からのＩＬ－２放出：
このアッセイでは、初代ＣＤ４⁺Ｔ細胞は、抗ＣＤ２０×ＣＤ３二重特異性抗体を、ヒトＣＤ２０を発現するように操作されたＨＥＫ２９３細胞と組み合わせて使用して、表面上のＣＤ３の架橋を介して活性化される。抗ＣＤ２０×ＣＤ３二重特異性抗体のＣＤ２０アームを、ＣＤ２０を発現するＨＥＫ２９３細胞に結合することにより、ＣＤ３受容体のクラスター化が促進され、Ｔ細胞刺激に重要な最初のシグナルが提供される。しかしながら、定量化可能なＩＬ－２放出を検出するには、ＣＤ２８分子を架橋することによって提供され得る共刺激が重要である。ここで、二重特異性抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８抗体は、ＣＤ４⁺Ｔ細胞上のＣＤ２８および操作されたＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０細胞上のＰＳＭＡと相互作用し、ＣＤ２８のクラスター化－活性化を促進する。組み合わされたＴＣＲとＣＤ２８との係合により、ＩＬ－２産生が強化され、これが細胞培養培地中に放出される。ＩＬ－２は、均質な洗浄なしのＡｌｐｈａＬｉｓａキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、カタログ番号ＡＬ２２１）を使用して、細胞上清から検出され、定量化される。

【0203】

ドナーから以前に単離および凍結したヒトＣＤ４⁺Ｔ細胞を、アッセイの日に、５０Ｕ／ｍＬベンゾナーゼヌクレアーゼ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号＃７１２０５－３）を含有する１０％ＦＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＮａＰｙｒ、ＮＥＡＡ、および０．０１ｍＭのＢＭＥ（β－メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｍ－７５２２）を補充した刺激培地（Ｘ－ＶＩＶＯ １５細胞培養培地（Ｌｏｎｚａ、カタログ＃０４－４１８Ｑ）中で解凍した。細胞を、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、刺激培地中に再懸濁し、１×１０⁵細胞／ウェルの濃度で９６ウェル丸底プレート中にプレートした。ヒトＣＤ２０を単独で、またはヒトＰＳＭＡと組み合わせて発現するように操作されたＨＥＫ２９３細胞を、１５μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ＃Ｍ４２８７）を用いて、一次刺激培地中１０×１０⁶細胞／ｍＬの濃度で処理した。３７℃で１時間インキュベートした後、５％ＣＯ₂、ＨＥＫ２９３細胞を、２％ＦＢＳを含有するＤ－ＰＢＳで３回洗浄し、１ウェルあたり１×１０⁴細胞の最終濃度でＣＤ４⁺Ｔ細胞を含有するウェルに添加した。

【0204】

続いて、１５ｐＭ～１００ｎＭの範囲の１：３段階的に希釈した抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性または対照抗体を、５０ｐＭの抗ＣＤ２０×ＣＤ３またはｈＩｇＧ４アイソタイプ対照の存在下でウェルに添加した。１０点希釈の最終点には、抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８または抗ＣＤ２８抗体は含まれていなかった。プレートを３７℃、５％ＣＯ₂で７２時間インキュベートした後、それらを遠心分離して細胞をペレット化し、４０μＬの培地上清を収集した。このことから、製造元のプロトコルに従い、ヒトＩＬ－２ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイにおいて、５μＬを試験した。測定値は、マルチラベルプレートリーダーＥｎｖｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、モデル２１０４）上で取得した。既知のＩＬ－２濃度の標準曲線を使用して、アッセイウェルで生成されたＩＬ－２の濃度を決定した。全ての段階希釈物を二重に試験した。

【0205】

抗体のＥＣ₅₀値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアを使用して、１０点用量応答曲線上の４パラメータロジスティック方程式にデータを適合させることによって決定した。倍率誘発は、次の方程式を使用して計算した。

【数2】

【0206】

結果、要約、および結論
図４Ａおよび４Ｂに示されるように、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＩＬ－２放出によって測定）および操作されたＪＲＴ３．Ｔ３／１Ｇ４／ｈＣＤ２８細胞（ルシフェラーゼ活性によって測定）の活性化は、一次刺激（ＲＥＧＮ２２８１抗ＣＤ２０×ＣＤ３）およびＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０細胞上で発現されたＰＳＭＡの存在下でｈＰＳＭＡ×ｈＣＤ２８によって強化された。ＣＤ２８二価抗体、ｍＡｂ１４１９３Ｐ２は、Ｔ細胞活性を一次刺激の存在下でわずかに強化し、一次刺激の非存在下で操作されたバイオアッセイにおいてわずかに強化する。ＣＤ２８スーパーアゴニストであるＴＧＮ１４１２は、標的ＰＳＭＡおよび一次刺激の存在下でＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体よりも程度は低いものの、ＣＤ２０×ＣＤ３刺激の存在下で一次および操作アッセイの両方でＴ細胞活性化を強化する。

【0207】

１）ルシフェラーゼベースのレポーターアッセイ：
ＥＣ₅₀および倍率誘発の値は、５０ｐＭの定常ｈＩｇＧ４アイソタイプ対照または抗ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異性抗体（Ｔ細胞刺激二重特異性抗体）に加えて、ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０またはＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ｈＰＳＭＡ細胞と共インキュベートされた操作されたレポーターＴ細胞について、表１３および１４に要約される。

【表13】

表１４は、ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０またはＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ｈＰＳＭＡ細胞および５０ｐＭの定常ｈＩｇＧ４アイソタイプ対照と共インキュベートされた操作されたＴ細胞におけるルシフェラーゼ活性について、ＥＣ₅₀値および倍率誘発の結果を要約する。

【表14】

表１４は、ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０またはＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ｈＰＳＭＡ細胞および５０ｐＭの定常抗ＣＤ３×ＣＤ２０と共インキュベートされた操作されたＴ細胞におけるルシフェラーゼ活性について、ＥＣ₅₀値および倍率誘発の結果を要約する。

【0208】

Ｔ細胞およびＡＰＣを５０ｐＭのｈＩｇＧ４アイソタイプ対照で処理した場合、ＣＤ２８二重特異性抗体のいずれも、アッセイで使用したＡＰＣ系列に関係なく、ＴＣＲ刺激の非存在下でルシフェラーゼ活性の増加を示さなかった。表１４に示されるＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０細胞（４．７６×）およびＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ｈＳＰＭＡ細胞（３．５９×）上で、親ＣＤ２８抗体のうちの１つ（ｍＡｂ１４２２６Ｐ２）でわずかなルシフェラーゼ活性化が観察された。

【0209】

対照的に、細胞を５０ｐＭの抗ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異性抗体で処理した場合、３つ全ての抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体ｂｓ１６４２９Ｄ、ｂｓ１６４３０Ｄ、およびｂｓ１６４３１Ｄは、表面上でｈＰＳＭＡを発現するＡＰＣと共インキュベートするとルシフェラーゼ活性を強く誘発した。ＡＰＣ系列に関係なく、ワンアーム対照（ワンアームのｍＡｂ１４２２６Ｐ２、ｍＡｂ１４１９３Ｐ２、およびｍＡｂ１４２１６Ｐ２）では、非常に低い活性化が観察されたか、または全く観察されなかった。表１４に示されるように、３つ全ての親ＣＤ２８抗体（ｍＡｂ１４２２６Ｐ２、ｍＡｂ１４１９３Ｐ２、およびｍＡｂ１４２１６Ｐ２）でわずかなルシフェラーゼ活性化が観察された。

【0210】

２）初代ヒトＣＤ４⁺Ｔ細胞を使用したＩＬ－２機能アッセイ：
ＰＳＭＡ標的発現の非存在下または存在下でＴ細胞上でＣＤ２８を介して共刺激を提供する抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体の能力を、ＩＬ－２サイトカイン産生を測定する機能的一次ＣＤ４⁺Ｔ細胞アッセイで評価した。

【0211】

ＥＣ₅₀および倍率誘発の値は、５０ｐＭの定常ｈＩｇＧ４アイソタイプ対照または抗ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異性抗体（Ｔ細胞刺激二重特異性抗体）に加えて、ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０またはＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ｈＰＳＭＡ細胞と共インキュベートされたＣＤ４⁺Ｔ細胞について、表１５に要約される。

【0212】

予想どおり、一次Ｔ細胞刺激がなかったため、一定量のｈＩｇＧ４アイソタイプ対照を含むウェルでは、測定可能なＩＬ－２放出は観察されなかった。

【0213】

対照的に、測定可能なＩＬ－２レベルは、抗ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異性抗体で処理された試料中で検出された。これらの条件下で、ヒトＣＤ４⁺Ｔ細胞を、ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０細胞と共インキュベートした場合、ｂｓ１６４３０Ｄおよびｂｓ１６４３１Ｄを除いて、抗ＣＤ２８抗体および抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体を含む、試験した全てのＣＤ２８モノクローナル抗体は、ＩＬ－２レベルの増加を示した（表１５）。親抗体は、ｍＡｂ１４２２６Ｐ２は、最高の倍率誘発および約６ｎＭのＥＣ₅₀を示した。ＣＤ４⁺Ｔ細胞を、ｈＰＳＭＡを発現するＡＰＣおよび抗ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異性抗体と共培養すると、３つ全ての抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体（ｂｓ１６４２９Ｄ、ｂｓ１６４３０Ｄ、およびｂｓ１６４３１Ｄ）でＩＬ－２放出が検出された。より低いＩＬ－２レベルは、表１５に示されるものと同じ設定で、ワンアーム対照抗体および親抗体を用いて測定される。

【表15】

表１５は、ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０またはＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ｈＰＳＭＡ細胞および５０ｐｍの定常抗ＣＤ３×ＣＤ２０抗体で共インキュベートされた初代ＣＤ４⁺Ｔ細胞からのＩＬ－２産生について、ＥＣ₅₀値および倍率誘発を要約する。

【0214】

実施例７：抗ＰＳＭＡｘＣＤ２８二重特異性抗体は、抗ＣＤ２０×ＣＤ３によるＰＳＭＡおよびＴＣＲ刺激の両方の存在下でＴ細胞活性化を増強する
例示的な抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体が生成され、ｂｉａｃｏｒｅで検証されている（例えば、実施例１および４を参照）。本発明の一対の二重特異性抗体（ＣＤ２０×ＣＤ３および例示的な抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体）を使用して、ＰＳＭＡ（ＣＤ２０および前立腺特異的膜腫瘍抗原－ＰＳＭＡ）に結合することにより、腫瘍細胞上のＴ細胞および共刺激受容体のクラスター化を誘発した（図５Ａ）。ＰＳＭＡ×ＣＤ２８が、標的細胞上で発現されたＰＳＭＡおよびＴＣＲ活性化の存在下でＣＤ２８に結合して活性化することを示すために、一連のインビトロ細胞ベースのアッセイを行った。

【0215】

ＣＤ２８の局在化
細胞株
安定したＨＥＫ２９３細胞株（ＡＴＣＣ、＃ＣＲＬ－１５７３）を、細胞株ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０、ＨＥＫ２９３／ｈＰＳＭＡ、およびＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ｈＰＳＭＡを作成する際に使用した。ＨＥＫ２９３／ｈＰＳＭＡ細胞株を生成するために、ユビキチンＣプロモーター駆動型ＰＳＭＡ（受託番号Ｑ０４６０９のアミノ酸Ｍ１～Ａ７５０）およびネオマイシン耐性遺伝子をコードする哺乳類ベクターを使用して、安定したトランスフェクションを行った。同様に、ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０細胞株は、ユビキチンプロモーター駆動型ｈＣＤ２０（受託番号ＮＰ＿０６８７６９．２のアミノ酸Ｍ１～Ｐ２９７）をコードする哺乳類ベクターを使用して生成された。トランスフェクトされた細胞を、５００μｇ／ｍｌのジェネティシンＡで培養し、安定して発現する細胞株を選択した。

【0216】

ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ｈＰＳＭＡ細胞の生成のために、ヒトＰＳＭＡ（受託番号Ｑ０４６０９のアミノ酸Ｍ１～Ａ７５０）およびネオマイシン耐性遺伝子をコードするレンチウイルスプラスミドを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトし、ウイルス粒子の産生を促進し、これを後に使用して、ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０細胞に感染させた。ヒトＰＳＭＡ陽性細胞は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって単離した。生成された全ての細胞株は、５００μｇ／ｍＬのＧ４１８を補充したＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋Ｐ／Ｓ／Ｇ＋ＮＥＡＡ中で維持した。ＪｕｒｋａｔクローンＥ６－１（ＡＴＣＣ、＃ＴＩＢ－１５２）を、ＡＴＣＣ推奨プロトコルに従って培養した。

【0217】

ＭＣ３８／ｈＰＳＭＡ細胞の生成のために、ヒトＰＳＭＡ（受託番号Ｑ０４６０９のアミノ酸Ｍ１～Ａ７５０）およびネオマイシン耐性遺伝子をコードするレンチウイルスプラスミドを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトし、ウイルス粒子の産生を促進し、これを後に使用して、ＭＣ３８／親細胞に感染させた。ヒトＰＳＭＡ陽性細胞は、ＦＡＣＳによって単離した。ＭＣ３８／ｈＰＭＡは、５００μｇ／ｍＬのＧ４１８を補充したＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋Ｐ／Ｓ／Ｇ＋ＮＥＡＡ中で維持した。

【0218】

Ａｍｎｉｓ Ｉｍａｇｅ ｓｔｒｅａｍ
Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞および標的細胞（ＨＥＫ２９３／ｈＰＳＭＡもしくはＨＥＫ２９３／ｈＰＳＭＡ／ｈＣＤ２０）を、ＣＤ２０×ＣＤ３－Ａｌｅｘａ４８８（ＲＥＧＮ２２８０、０．５μｇ／ｍｌ）単独で、またはＰＳＭＡ×ＣＤ２８－Ａｌｅｘａ６４７（ｂｓ１６４２９Ｄ、１μｇ／ｍｌ）と一緒に３７℃で１時間インキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（３％ＦＢＳ、ＰＢＳ中２ｍＭのＥＤＴＡ）で２回穏やかに洗浄し、抗ＣＤ２８－ビオチン（ＲＥＧＮ１４１２、２μｇ／ｍｌ）で１５分間、４℃で染色し、続いてストレプトアビジン－ＰＥ－ＣＦ５９４（ＢＤ５６２２８４、１μｇ／ｍｌ）およびＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｈ３５７０、１μＭ）で１５分間、４℃で染色した。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＢＤ安定化固定液（ＢＤ３３８０３６）中で保存した。細胞の画像を、Ａｍｎｉｓ（登録商標）イメージングフローサイトメーター上で収集し、ＩＤＥＡＳ（登録商標）ソフトウェアによって分析した。細胞を、ダブレット明視野、ダブレット核、核フォーカス、シングルスポットカウント、シングレットＣＤ２８でゲートした。シナプス領域は、核染色に基づくバレーマスクによって定義された。バレーマスクとＣＤ２８との間の重複領域をゲートすることによって、バレーマスクが間違っているセルを排除した。シナプス内外のＣＤ２８の比率は、次の式によって計算された。
シナプス内外のＣＤ２８＝シナプス内のＣＤ２８の強度／（ＣＤ２８総強度－シナプス内のＣＤ２８の強度）＊１００％。

【0219】

結果、要約、および結論
Ｔ細胞は、ＣＤ２０およびＰＳＭＡを過剰発現する操作された標的細胞（ＨＥＫ２９３／ｈＰＳＭＡまたはＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ｈＰＳＭＡ）、ならびに蛍光標識された二重特異性抗体（緑色のＣＤ２０×ＣＤ３、赤色のＰＳＭＡ×ＣＤ２８）と共培養された。ＣＤ２８の局在化を決定するために、３７℃で１時間インキュベートした後、細胞を固定し、抗ＣＤ２８で染色した。Ｔ細胞および標的細胞結合体の画像は、Ａｍｎｉｓ ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍイメージングフローサイトメトリーを使用して取得した。標的細胞上のＰＳＭＡ発現の非存在下で、ＣＤ２０×ＣＤ３二重特異性抗体のみでは、Ｔ細胞上のＣＤ２８のクラスター化はほとんどまたは全く誘発されなかった。ＰＳＭＡが標的細胞上で発現されると、ＣＤ２０×ＣＤ３は、Ｔ細胞および標的細胞結合体の界面に局在し、ＣＤ２８が局在化する免疫シナプス（ＩＳ）を形成した。ＰＳＭＡ×ＣＤ２８は、ＣＤ２０×ＣＤ３とともに、ＩＳでのＣＤ２８蓄積をさらに強化した。ＣＤ２８の分布は、ＩＳの内側と外側のＣＤ２８染色の比率を計算することによって定量化された（図５Ｂ）。

【0220】

ＰＳＭＡ×ＣＤ３およびＰＳＭＡ発現標的細胞の存在下でのＰＳＭＡ×ＣＤ２８は、Ｔ細胞活性化シグナル伝達が発生する場所であるＩＳでのロバストなＣＤ２８蓄積を促進すると結論付けられている。

【0221】

サイトカイン放出
Ｔ細胞活性化に対するＴＡＡ×ＣＤ２８の効果をさらに調査するために、初代ヒトＴ細胞および異なるＴＡＡを過剰発現する操作された標的細胞（ＨＥＫ２９３／ｈＰＳＭＡ、ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０、またはＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ｈＰＳＭＡ）との共培養物中の用量滴定のＣＤ２０×ＣＤ３またはＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体とのインキュベーション後に、Ｔ細胞増殖、ならびにＩＬ－２およびＩＦＮγサイトカイン放出を測定した（図５Ｃ～５Ｇ）本発明の例示的な抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８抗体および抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体は、ＰＳＭＡ発現細胞への結合について競合せず、したがって、異なるエピトープに結合することが確認された（図５Ｈ）。ＰＳＭＡ×ＣＤ２８は、標的細胞（ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ｈＰＳＭＡ＋５ｐＭのＣＤ２０×ＣＤ３）上でのＣＤ３刺激およびＰＳＭＡ発現の両方の存在下でＴ細胞の活性化を誘発することがさらに検証された。例示的な抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体によるＴ細胞の活性化は、標的細胞上のＰＳＭＡ発現の非存在下（ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０との共培養）またはＣＤ３刺激の非存在下（ＨＥＫ２９３／ＰＳＭＡ＋５ｐＭのＣＤ２０×ＣＤ３もしくはＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ｈＰＳＭＡ＋５ｐＭのアイソタイプ対照との共培養）では観察されなかった。（図５Ｅ～５Ｇ）。全体として、本発明の例示的な抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８抗体は、ＰＳＭＡ×ＣＤ３およびＰＳＭＡ発現標的細胞の存在下でＴ細胞活性化を促進し、増殖およびサイトカイン分泌の増加をもたらすことが実証された。

【0222】

実施例８：ＰＳＭＡ発現細胞の殺滅
２つのＦＡＣＳベースの細胞傷害性研究が実施された。第１の研究では、抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８刺激の存在下または非存在下、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の存在下で、Ｃ４－２細胞に対してＦＡＣＳベースの細胞傷害性を実施した。刺激は、固定濃度の抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体および連続希釈された抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体の存在下で実施した。第２の研究は、ヒトＰＢＭＣの代わりにカニクイザルＰＢＭＣを使用することを除いて、第１の研究と同じである。ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体は、ＰＳＭＡ×ＣＤ３によるＴＣＲ刺激の存在下で、前立腺腫瘍細胞に対するＴ細胞の活性化および細胞傷害性を増強すると結論付けられた。

【0223】

実験方法
ヒト初代ＣＤ４⁺Ｔ細胞の単離
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健康なドナー白血球パックから単離した。ＰＢＭＣの単離は、製造元のプロトコルに従って、５０ｍＬのＳｅｐＭａｔｅ（商標）チューブを使用した密度勾配遠心分離によって達成された。その後、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ４⁺Ｔ細胞単離キットを使用し、製造元の推奨する指示に従って、ＣＤ４⁺Ｔ細胞をＰＢＭＣから単離した。単離されたＣＤ４⁺Ｔ細胞を、１バイアルあたり５０×１０⁶細胞の濃度で１０％ ＤＭＳＯを含むＦＢＳ中で凍結させた。

【0224】

初代ヒトＴ細胞活性化アッセイ
以前に単離し、凍結したヒトＣＤ４⁺Ｔ細胞を、５０Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼヌクレアーゼを含む刺激培地（１０％ ＦＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＮａＰｙｒ、ＮＥＡＡ、および０．０１μＭ ＢＭＥで補充されたＸ－ＶＩＶＯ １５細胞培養培地）中でアッセイの日に解凍した。細胞を、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、刺激培地中に再懸濁し、１ウェルあたり１×１０⁵細胞の濃度で９６ウェル丸底プレート中にプレートした。ＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３／ｈＰＳＭＡ、ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０、またはＨＥＫ２９３／ｈＰＳＭＡ／ｈＣＤ２０）を、１０×１０⁶細胞／ｍＬの濃度で一次刺激培地中の１５μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣで処理した。３７℃で１時間インキュベートした後、５％ＣＯ₂、ＨＥＫ２９３細胞を、２％ＦＢＳを含有するＤ－ＰＢＳで３回洗浄し、１ウェルあたり２×１０⁴細胞の最終濃度でＣＤ４⁺Ｔ細胞を含有するウェルに添加した。

【0225】

Ｔ細胞を活性化するための最適以下のＣＤ２０×ＣＤ３二重特異性抗体濃度を決定するために、ＣＤ２０×ＣＤ３を、５００ｐＭのＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体またはｈＩｇＧ４ｓアイソタイプ対照の存在下で１．５ｐＭ～１０ｎＭの範囲で１：３に段階的に希釈した。一定の５ｐＭのＣＤ２０×ＣＤ３二重特異性抗体またはｈＩｇＧ４対照を選択し、次の抗体：１）ＰＳＭＡ×ＣＤ２８、２）非標的×ＣＤ２８対照、３）ＣＤ２８親、４）ＣＤ２８ＳＡ（スーパーアゴニスト）、５）ｈＩｇＧ４アイソタイプ対照、および６）ｈＩｇＧ４ｓアイソタイプ対照を、１：３希釈で１５ｐＭから１００ｎＭまで滴定した。１０点希釈の最終点には、滴定された抗体は含まれず、５ｐＭのＣＤ２０×ＣＤ３二重特異性抗体またはｈＩｇＧ４対照のみが含まれていた。

【0226】

プレートを３７℃、５％ＣＯ₂で４８時間インキュベートした後、それらを遠心分離して細胞をペレット化し、５０μＬの培地上清を収集した。このことから、製造元のプロトコルに従い、ヒトＩＬ－２およびヒトＩＦＮγ ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイにおいて、５μＬを試験した。測定値は、Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒのマルチラベルプレートリーダーＥｎｖｉｓｉｏｎで取得した。アッセイウェルで生成されたＩＬ－２またはＩＦＮγのｐｇ／ｍＬを推定するために、既知のＩＬ－２またはＩＦＮγ濃度の標準曲線を生成した。全ての段階希釈物を二重に試験した。ペレット化細胞を、［メチル－３Ｈ］－チミジン、０．２５ｕＣｉ／ウェルで１６時間３７℃、５％ＣＯ₂でインキュベートした。Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒのＵｎｉｆｉｌｔｅｒ ９６細胞採取器を使用して、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレート上に細胞を収集した。３０μｌのシンチレーション液を添加した後、プレートを密封し、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製のＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴを使用して、各ウェルの１分あたりのカウントを取得した。

【0227】

抗体のＥＣ₅₀値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアを使用して、１０点用量応答曲線上の４パラメータロジスティック方程式から決定した。

【0228】

ＦＡＣＳベースの細胞傷害性アッセイ
抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３抗体と抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８抗体との組み合わせの存在下でＰＳＭＡ＋細胞の殺滅をモニターするために、Ｃ４－２細胞を、１μＭの蛍光追跡色素バイオレット細胞トラッカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３４５５７）で標識化した。標識後、細胞を３７℃で一晩播種した。別に、ヒトＰＢＭＣ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ）またはカニクイザルＰＢＭＣ（Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｃｒａｎｆｏｒｄ ＮＪ）を、１×１０⁶細胞／ｍＬで補充ＲＰＭＩ培地に播種し、付着マクロファージ、樹状細胞、およびいくつかの単球を枯渇させることによってリンパ球を濃縮するために３７℃で一晩インキュベートした。翌日、標的細胞を、接着細胞が枯渇したナイーブＰＢＭＣ（エフェクター／標的細胞４：１比）、および抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体またはＩｇＧ４対照の段階希釈物（濃度範囲：０．４２ｎＭ～０．１ｐＭ）を単独で、または固定濃度のＰＳＭＡ×ＣＤ２８共刺激分子ｂｓ１６４２９Ｄまたはｂｓ１６４３１Ｄと組み合わせて２．５μｇ／ｍｌ（１６．７ｎＭ）で９６時間、３７℃で共インキュベートした。

【0229】

インキュベーション後、細胞を細胞培養プレートトリプシン－ＥＤＴＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＳＭ－２００４－Ｃ）解離バッファー）から除去し、ＦＡＣＳ ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ－Ｘ２０（ＢＤ）上でＦＡＣＳによって分析した。

【0230】

ＦＡＣＳ分析の場合、細胞を生存率の遠赤細胞トラッカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、抗体をＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ２５（ＢＤ）に直接コンジュゲートした。試料は、細胞カウント用のキャリブレーションビーズとともに泳動させた。殺滅の特異性を評価するために、標的細胞を、バイオレット細胞トラッカー陽性集団としてゲートした。生きた標的細胞のパーセントは、次のように計算した：生細胞のパーセンテージ（％）＝（Ｒ１／Ｒ２）＊１００（ここで、Ｒ１＝抗体の存在下での生きた標的細胞のパーセンテージ（％）、およびＲ２＝試験抗体の非存在下での生きた標的細胞のパーセンテージ（％））。Ｔ細胞の活性化は、ＣＤ２⁺／ＣＤ４⁺またはＣＤ２⁺／ＣＤ８⁺）Ｔ細胞のうちの活性化（ＣＤ２５⁺）Ｔ細胞のパーセントによって測定した。Ｔ細胞数は、キャリブレーションビーズあたりの生きたＣＤ４⁺またはＣＤ８⁺細胞の数を計算することによって測定した。

【0231】

培地に蓄積されたサイトカインのレベルは、ＢＤサイトメトリービーズアレイ（ＣＢＡ）ヒトＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７サイトカインキットを使用して、製造元のプロトコルに従って分析した。

【0232】

ＦＡＣＳ分析の場合、細胞をｄｅａｄ／ｌｉｖｅ近赤外反応性（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｌ３４９７６）色素で染色した。ＦＡＣＳ分析の直前に、５００，０００（５×１０⁵個）の計数ビーズを各ウェルに加えた。各試料につき１００，０００（１×１０⁵個）のビーズを収集した。殺滅の特異性を評価するために、細胞を生きたバイオレット標識集団にゲートした。生きた集団のパーセントを記録し、生存率の計算に使用した。

【0233】

Ｔ細胞の活性化およびＰＤ－１マーカーの上方調節は、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、およびＰＤ－１に対して直接コンジュゲートした抗体と細胞をインキュベートし、全Ｔ細胞（ＣＤ２＋）のうちの後期活性化（ＣＤ２５＋／ＣＤ８＋）Ｔ細胞およびＰＤ－１＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を報告することによって評価した。直接コンジュゲートした抗体の情報は、次のとおりである：ＣＤ２、ＰＥ：ＣＤ２（Ｃｌ：ＲＰＡ－２．１）、ＢＤ、カタログ番号５５５３２７；ＣＤ４、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５：ＣＤ４（Ｃｌ：ＯＫＴ－４）、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７４２８；ＣＤ８、ＡＰＣ：ＣＤ８（Ｃｌ：ＲＰＡ－Ｔ８）、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０１０４９；ＣＤ２５、ＢＶ５１０：ＣＤ２５（Ｃｌ：Ｍ－Ａ２５１）、ＢＤ、カタログ番号５６３３５２；およびＰＤ－１、ＰＥ－Ｃｙ７：ＰＤ１（Ｃｌ：ＥＨ１２．２Ｈ７）、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３２９９１８。

【0234】

ヒトＰＢＭＣアッセイからのアッセイウェルの上清を、ＢＤサイトメトリービーズアレイヒトキット（ＢＤ、カタログ番号５６０４８４）を使用し、製造元のプロトコルに従って、Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカイン放出について評価した。

【0235】

結果、要約、および結論：
図６Ａおよび６Ｂは、抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８が、ヒトまたはカニクイザルＴ細胞の存在下でｂｓ１３６４４Ｄ（抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３）の細胞傷害効力を強化したことを示す。抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体は、単剤としてまたは共刺激性抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体の存在下で、ナイーブヒトＴ細胞を誘発して、ヒトＰＳＭＡを発現する標的細胞を殺滅する能力について試験した。図６Ａおよび６Ｂに示される研究では、抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８抗体を、２．５μｇ／ｍｌで固定した。抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３は、１：４倍で段階的に希釈した。抗体を細胞とともに９６時間インキュベートした。表１６は、この研究で使用した抗体の成分を要約する。

【表16】

【0236】

例示的な抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体が、ＰＳＭＡを標的とすることによって、Ｔ細胞活性化および前立腺癌細胞に対する細胞傷害性を強化できるかどうかを試験した。ＦＡＣＳベースの細胞傷害性およびＴ細胞活性化アッセイを使用して、例示的な抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体を、ＰＳＭＡ×ＣＤ３と組み合わせて試験した（図６、７Ａ～７Ｄ）。Ｔ細胞を含むヒトＰＢＭＣを、内在的に高レベルのＰＳＭＡを発現するＣ４－２前立腺癌細胞と共培養した（データは示さず）。ＰＳＭＡ×ＣＤ２８は、ＰＳＭＡ×ＣＤ３単独によって誘発される細胞傷害性の効力を著しく増加させ、ＥＣ５０を（効力のログシフトにわたって）４．３×１０^-11から１．５×１０^-12にシフトした（図６および７Ａ）。Ｔ細胞の細胞傷害性の誘発と一致して、ＰＳＭＡ×ＣＤ２８は、ＰＳＭＡ×ＣＤ３によって誘発されるＩＦＮγ放出のレベルを４倍高めた（図７Ｂ）。同様に、ＰＳＭＡ×ＣＤ２８とＰＳＭＡ×ＣＤ３との組み合わせは、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞の数、ならびに活性化マーカーＣＤ２５の発現を増加させた（図７Ｃおよび７Ｄ）。例示的な抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体が、非標的化ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わされた場合、Ｔ細胞の細胞傷害性または活性化に対する効果は観察されなかった。さらに、例示的な抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体が、非ヒト霊長類からのＴ細胞のＰＳＭＡ×ＣＤ３細胞傷害性および活性化を増強できることを示すために、カニクイザルからのＰＢＭＣを使用して、同じアッセイを行って同様の結果を得た（図６、７Ｅ～７Ｇ）。これらの結果は、例示的な抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体が、増殖およびサイトカイン放出だけでなく細胞傷害性によっても、ＰＳＭＡ×ＣＤ３媒介性Ｔ細胞活性化を強力に強化できることを実証した。図７Ｈは、例示的な抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体が、フローサイトメトリーによって測定されるように、細胞標的に結合することを示している。

【0237】

抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体は、ヒトＴ細胞を活性化し、Ｃ４－２細胞（ヒト前立腺癌細胞株）を枯渇させるように誘導した。抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体の存在下で標的細胞の殺滅が観察され、Ｃ４－２細胞は、ピコモルＥＣ₅₀秒で用量依存的に殺滅された（表１７）。観察された標的細胞溶解は、これもピコモルＥＣ₅₀秒で、ＣＤ２＋Ｔ細胞上のＣＤ２５＋およびＰＤ－１＋細胞の上方調節と関連していた（表１７）。抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体は、ヒトサイトカインの放出を誘発した。単剤としての抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体で観察された細胞傷害活性は、固定濃度の抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８共刺激分子（二重特異性抗体）の存在下で強化された（表１７）。

【0238】

要約すると、抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体による共刺激は、抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体を単剤として用いて観察されたものと比較した場合、Ｔ細胞活性化、ＰＤ－１上方調節、およびサイトカイン放出を増加させた。表１６は、ヒトＰＢＭＣを使用した実験結果を要約する。

【表17】

【0239】

抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体は、単剤としてまたは共刺激性抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体の存在下で、ナイーブカニクイザルＴ細胞を誘発して、ヒトＰＳＭＡを発現する標的細胞を殺滅する能力についても試験した。選択した抗体滴定で、抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体は、ヒトＴ細胞を活性化したが、Ｔ細胞にＣ４－２細胞を枯渇させるようには誘導しなかった（表１８）。抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８抗体との共刺激により、Ｔ細胞の活性化が増加し、細胞傷害活性が強化され、Ｔ細胞上のＰＤ－１マーカーが上方調節された（表１８）。

【表18】

【0240】

実施例９：細胞からのサイトカイン放出
本明細書の他所で述べられているように、「可溶性」フォーマットでヒトＰＢＭＣＳを使用するエクスビボサイトカイン放出アッセイは、サイトカイン放出を予測することができなかった。そのため、「コーティングされた」アッセイフォーマットが開発された。

【0241】

本発明の抗ＰＳＭＡ／ＣＤ２８二重特異性抗体および抗ＣＤ２８抗体は、コーティングされたアッセイフォーマットを使用して、ヒトＰＢＭＣ増殖および細胞からのサイトカイン放出を誘発するそれらの能力について評価された。ＰＢＭＣ増殖アッセイでは、新たに単離したＰＢＭＣを１×１０⁵／ウェルで使用した。共培養のために、マイトマイシンＣで処理したＣ４－２細胞を、１×１０⁴／ウェルで添加した。抗体希釈物は、プレート上に一晩ウェットコーティングまたはドライコーティングされる。ＰＢＭＣを添加する前に、プレートを洗浄する。Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＭＳＤ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）によるサイトカイン分析のために、約５４時間で上清を収集した。³Ｈチミジンを１８時間添加し、増殖を測定した。

【0242】

結果は、可溶性抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体が、ＣＤ３刺激の存在下でヒトＰＢＭＣの増殖を誘発したことを示した。対照的に、抗ＣＤ２８スーパーアゴニストは、ＣＤ３刺激の非存在下でヒトＰＢＭＣの増殖を誘発した（データは示さず）。

【0243】

さらに、ウェットコーティングされたｂｓ１６４２９Ｄ（ＰＳＭＡ×ＣＤ２８「Ａ」）およびｍＡｂ１４２２６Ｐ２（ＣＤ２８親「Ａ」）は、ウェットコーティングされた抗ＣＤ２８スーパーアゴニストよりも少ないサイトカイン放出を誘発したが、ｂｓ１６４３１Ｄ（ＰＳＭＡ×ＣＤ２８「Ｂ」）およびｍＡｂ１４２１６Ｐ２（ＣＤ２８親「Ｂ」）は、対照と比較して著しく多くのサイトカイン放出を誘発しなかった（データは示さず）。

【0244】

本発明の抗ＣＤ２８抗体は、スーパーアゴニストＴＧＮ１４１２と比較していくつかの異なる特性を示す。従来のＣＤ２８アゴニストｍＡｂ（非スーパーアゴニスト）は、膜遠位エピトープに結合し、一価のＡｂ結合のみを可能にすると考えられている（Ｄｅｎｎｅｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｅｄｇｅ：ｍｏｎｏｖａｌｅｎｃｙ ｏｆ ＣＤ２８ ｍａｉｎｔａｉｎｓ ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７６（１０）：５７２５－２９（２００６））。ＣＤ２８抗体は、ＴＣＲによるペプチド－ＭＨＣの抗原特異的認識の存在下で最適なＴ細胞活性化を促進する。ＣＤ２８シグナル伝達は、ＴＣＲ活性化の閾値を調節し、効果的なＴ細胞活性化に必要なＴＣＲ係合の数を大幅に減少させる。対照的に、ＴＧＮ抗ＣＤ２８抗体は、いくつかのスーパーアゴニスト特性を有していた（Ｌｕｈｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ，ａｎｔｉ－ＣＤ２８ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｕｐｅｒａｇｏｎｉｓｔｓ，Ｊ．ｏｆ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７（８）：９５５－９６６（２００３））、Ｒｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，ｔｈｅ ＣＤ２８ ｆａｍｉｌｙ：ａ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｈｅｏｓｔａｔ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｔ－ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｂｌｏｏｄ，１０５（１）：１３－２１（２００５））。例えば、ＴＧＮ抗ＣＤ２８は、ＴＣＲシグナル伝達の非存在下でも、インビトロおよびインビボで強力なＴ細胞増殖およびＩＬ２産生を誘発し、従来の抗ＣＤ２８／ＣＤ３シグナル伝達よりも効果的にＮＦ－ｋＢ活性を増強し、ＡＰ－１／ＳＲＥ活性化を誘発し、細胞表面の近位にあるＣＤ２８エピトープに結合して、二価結合を可能にする。

【0245】

したがって、図８に示されるように、ＣＤ２８スーパーアゴニストＴＧＮ１４１２は、ＣＤ３一次刺激の非存在下でＡＰ－１レポーターを活性化した。対照的に、本発明の抗ＣＤ２８抗体（ＰＳＭＡ×ＣＤ２８の親）は、ＡＰ－１ルシフェラーゼバイオアッセイにおいてＡＰ－１を最小限に活性化した。

【0246】

実施例１０：抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８抗体のインビボ研究
同系腫瘍モデル
実施例８のインビトロ研究と一致して、腫瘍抗原を標的とする抗ＣＤ３×ＰＳＭＡと抗ＣＤ２８×ＰＳＭＡ二重特異性抗体とを組み合わせることにより、マウスモデルにおける腫瘍クリアランスが強化された。単剤療法として、または抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて、抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体の有効性をテストするために、Ｖｅｌｏｃｉｇｅｎｅ独自の技術を使用して生成された対応するマウス遺伝子の代わりに（ｈＣＤ３／ｈＣＤ２８／ｈＰＳＭＡマウス）、ヒトＣＤ２８、ヒトＣＤ３、およびヒトＰＳＭＡを発現するマウスで同系腫瘍実験を行った。抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体は、抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３誘発性Ｔ細胞活性化によってインビボで抗腫瘍免疫を強化すると結論付けられた。

【0247】

Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ３複合体がペプチド－ＭＨＣ複合体に結合すると開始される（「シグナル１」）。次に、活性化は、標的細胞上の同族のリガンド（複数可）に結合するＴ細胞上のＣＤ２８受容体などの第２の「共刺激」受容体の係合によって強化される（「シグナル２」）。最近記載されたＣＤ３ベースの「二重特異性抗体」は、従来のシグナル１を置き換え、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）を二重特異性抗体の一方のアームに結合してＴ細胞を腫瘍細胞に結合し、もう一方のアームでＴＣＲ／ＣＤ３にブリッジすることによって作用する。これらのＴＳＡ×ＣＤ３二重特異性抗体のうちのいくつかは、癌患者において有望な抗腫瘍効果を示したが、それらの活性は、まだ最適化されていない。本明細書の他所に記載されるように、本発明において導入されるのは、第２のＴＳＡをＴ細胞上の共刺激ＣＤ２８受容体に架橋することによってシグナル２を模倣する新規クラスの二重特異性抗体である。これらの二重特異性抗体は、ＴＳＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体または抗ＴＳＡ／ＣＤ２８二重特異性抗体と称される。本明細書に記載されるように、本発明の１つの例示的な抗体は、前立腺癌抗原（例えば、ＰＳＭＡ）に特異的である。Ｔ細胞を広く活性化し、ある特定の場合に初期の臨床試験で重篤な毒性をもたらしたＣＤ２８スーパーアゴニストとは異なり、これらのＴＳＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体は、遺伝的にヒト化された免疫担当マウスモデルまたは霊長類において単独で使用した場合、限られた活性を示し、毒性はない。しかしながら、ＴＳＡ×ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせると、本発明の例示的な抗体は、Ｔ細胞とその標的細胞との間の人工シナプスを強化し、Ｔ細胞活性化を増強し、同系腫瘍モデルにおけるＣＤ３二重特異性抗体の抗腫瘍活性を著しく改善した。この新規クラスのＣＤ２８共刺激二重特異性抗体を、新たなクラスのＴＳＡ×ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせると、耐容性の高い「既製の」抗体療法が提供され、抗腫瘍効果が高まる可能性がある。

【0248】

ウイルスに感染した細胞または腫瘍細胞などの細胞標的を認識して殺滅するＴ細胞の能力は、相互作用の調整されたセットに依存する。これらの中で最も重要なのは、ＴＣＲ複合体（関連するＣＤ３γ、δ、ε、ζ鎖を含む）による標的細胞の認識および結合である。この相互作用は、Ｔ細胞活性化の「シグナル１」と称されている。ＴＣＲは、標的細胞の表面上で発現されるＭＨＣタンパク質の溝に存在するウイルスまたは腫瘍ペプチドを認識することができる。この結合は通常、親和性が低くなり、したがって、シグナル１のトリガーを成功させるには、Ｔ細胞とその標的細胞との間のインターフェースに沿って多くのＴＣＲ複合体をクラスター化することが重要であり、このインターフェースは、免疫シナプスと称されている（Ｊ．Ｂ．Ｈｕｐｐａ，Ｍ．Ｍ．Ｄａｖｉｓ，Ｔ－ｃｅｌｌ－ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｙｎａｐｓｅ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３，９７３－９８３（２００３））。次いで、Ｔ細胞の活性化および増殖は、ＣＤ２８（「シグナル２」）などの共刺激受容体との追加の相互作用によってさらに促進される（Ｊ．Ｈ．Ｅｓｅｎｓｔｅｎ，Ｙ．Ａ．Ｈｅｌｏｕ，Ｇ．Ｃｈｏｐｒａ，Ａ．Ｗｅｉｓｓ，Ｊ．Ａ．Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ，ＣＤ２８ Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ：Ｆｒｏｍ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｔｏ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４４，９７３－９８８（２０１６））。Ｔ細胞がＴＣＲ複合体を介して標的細胞を認識し、プロフェッショナル抗原提示細胞または標的細胞上のその同族リガンド（複数可）（ＣＤ８０／Ｂ７．１および／もしくはＣＤ８６／Ｂ７．２）に結合するＣＤ２８を介してシグナル２と係合する場合、Ｔ細胞の活性化が強化される。シグナル１と同様に、ＣＤ２８を介したシグナル２は、免疫シナプスでの共クラスター化を介して発生すると考えられている。

【0249】

腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）を標的とする従来のモノクローナル抗体は、過去２０年間にわたって抗腫瘍治療薬として使用されてきた（Ｇ．Ｓａｌｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ ｉｎ Ｂ－Ｃｅｌｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ２０ Ｙｅａｒｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ．Ａｄｖ Ｔｈｅｒ ３４，２２３２－２２７３（２０１７）、Ｍ．Ｖ．Ｍａｔｅｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ ｐｌｕｓ Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ，Ｍｅｌｐｈａｌａｎ，ａｎｄ Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ ｆｏｒ Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ Ｍｙｅｌｏｍａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７８，５１８－５２８（２０１８）：Ｗ．Ｅｉｅｒｍａｎｎ，Ｇ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ Ｓｔｕｄｙ，Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ＨＥＲ２－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ：ｐｉｖｏｔａｌ ｔｒｉａｌ ｄａｔａ．Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ １２ Ｓｕｐｐｌ １，Ｓ５７－６２（２００１）、Ｊ．Ｍ．Ｃｏｎｎｏｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ Ｖｅｄｏｔｉｎ ｗｉｔｈ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｓｔａｇｅ ＩＩＩ ｏｒ ＩＶ Ｈｏｄｇｋｉｎ´ｓ Ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７８，３３１－３４４（２０１８）、Ｖ．Ｄｉｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｅｍｔａｎｓｉｎｅ ｖｅｒｓｕｓ ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ ｐｌｕｓ ｌａｐａｔｉｎｉｂ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ｔｒｅａｔｅｄ ＨＥＲ２－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｄｖａｎｃｅｄ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ（ＥＭＩＬＩＡ）：ａ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｆｉｎａｌ ｏｖｅｒａｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ａ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，ｏｐｅｎ－ｌａｂｅｌ，ｐｈａｓｅ ３ ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ １８，７３２－７４２（２０１７））。しかしながら、このクラスの抗体は、Ｔ細胞媒介性細胞傷害を誘発する能力が限られており、代わりに抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／もしくは補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を促進するか、または腫瘍細胞に毒素を送達することによって作用した。最近、Ｔ細胞を腫瘍細胞に結合し、代理機序を介して（通常はＣＤ３のｅ鎖を介して）ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を活性化し、したがってシグナル１を模倣することによって、腫瘍細胞のＴ細胞を介した殺滅を効率的に誘発できる新しいクラスの二重特異性抗体（ＴＳＡ×ＣＤ３）が出現した。そのような二重特異性抗体の初期バージョン（一方のアームは白血病細胞上のＣＤ１９に結合し、もう一方のアームはＣＤ３に結合する）は最近、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病に対して規制当局の承認を受けた（Ｒ．Ｂａｒｇｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｔｕｍｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｂｙ ｖｅｒｙ ｌｏｗ ｄｏｓｅｓ ｏｆ ａ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１，９７４－９７７（２００８）、Ｈ．Ｋａｎｔａｒｊｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ ｖｅｒｓｕｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｃｕｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ Ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７６，８３６－８４７（２０１７））。最近、より高度なバージョンの二重特異性抗体が、非ホジキンリンパ腫に対して良好な活性を有し、これらのリンパ腫上のＣＤ２０を標的とすることを示した（Ｅ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｏｖｅｌ，ｎａｔｉｖｅ－ｆｏｒｍａｔ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ Ｔ－ｃｅｌｌ ｋｉｌｌｉｎｇ ｏｆ Ｂｃｅｌｌｓ ｉｓ ｒｏｂｕｓｔｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅｌｓ ａｎｄ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ５，１７９４３（２０１５）、Ｌ．Ｌ．Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉ－ＣＤ２０／ＣＤ３ Ｔ ｃｅｌｌ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂ ｃｅｌｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ７，２８７ｒａ２７０（２０１５）、Ｍ．Ｂａｃａｃ ｅｔ ａｌ．，ＣＤ２０－ＴＣＢ ｗｉｔｈ Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｓ Ｎｅｘｔ－Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２４，４７８５－４７９７（２０１８）、Ｒ．Ｂａｎｎｅｒｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＲＥＧＮ１９７９，ａｎ Ａｎｔｉ－ＣＤ２０ｘＡｎｔｉ－ＣＤ３ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｒｅｌａｐｓｅｄ／Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ Ｌｙｍｐｈｏｍａ（ＦＬ），Ｄｉｆｆｕｓｅ Ｌａｒｇｅ Ｂ－Ｃｅｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｍａ（ＤＬＢＣＬ），ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｂ－Ｃｅｌｌ Ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ Ｌｙｍｐｈｏｍａ（Ｂ－ＮＨＬ）Ｓｕｂｔｙｐｅｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，（２０１８）、Ｌ．Ｂｕｄｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｓｕｎｅｔｕｚｕｍａｂ，ａ Ｆｕｌｌ－Ｌｅｎｇｔｈ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ２０／ＣＤ３ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｄｉｓｐｌａｙｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｒｅｌａｐｓｅｄ／Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｂ－Ｃｅｌｌ Ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ Ｌｙｍｐｈｏｍａ（ＮＨＬ）：Ｉｎｔｅｒｉｍ Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃａｃｙ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ａ Ｐｈａｓｅ １ Ｓｔｕｄｙ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，（２０１８））。しかしながら、ＴＳＡ×ＣＤ３二重特異性抗体は、血液悪性腫瘍における重要な新しいクラスの免疫療法として浮上しているが、横断研究の比較（Ｅ．Ａ．Ｚｈｕｋｏｖｓｋｙ，Ｒ．Ｊ．Ｍｏｒｓｅ，Ｍ．Ｖ．Ｍａｕｓ，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ＣＡＲｓ：ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４０，２４－３５（２０１６））は、場合によっては、個別化されたキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）療法で見られるレベルの有効性を達成できない可能性があることを示唆している。

【0250】

ＣＡＲ－Ｔ療法の強力な有効性の理由のうちの１つは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、腫瘍細胞上のその標的に結合する際に、シグナル１（ＣＤ３ｚ細胞ドメインの一部分を介して）およびシグナル２（例えば、ＣＤ２８細胞ドメインの一部分を介して）の両方を提供するように操作されていることである。２つのＣＡＲ－Ｔ細胞療法は最近、Ｂ細胞悪性腫瘍についてＦＤＡの承認を受け、どちらも抗原ＣＤ１９に結合して標的化することによって作用する（Ｓ．Ｓ．Ｎｅｅｌａｐｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｘｉｃａｂｔａｇｅｎｅ Ｃｉｌｏｌｅｕｃｅｌ ＣＡＲ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｌａｒｇｅ Ｂ Ｃｅｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７７，２５３１－２５４４（２０１７）、Ｓ．Ｊ．Ｓｃｈｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｂ－Ｃｅｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７７，２５４５－２５５４（２０１７））。ＣＡＲ－Ｔ細胞アプローチは、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）および神経毒性などの重篤な有害作用（Ｓ．Ｓ．Ｎｅｅｌａｐｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ－ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ－ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｏｘｉｃｉｔｉｅｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １５，４７－６２（２０１８）、Ｊ．Ｇｕｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ－Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｆｔｅｒ Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ Ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ ７，１４０４－１４１９（２０１７）、Ａ．Ｓｈｉｍａｂｕｋｕｒｏ－Ｖｏｒｎｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ６，５６（２０１８））、ならびに高度に個別化された製造プロセスおよび化学療法レジメンを事前調整するための要件に起因して関連付けることができ（Ｓ．Ｓ．Ｎｅｅｌａｐｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｘｉｃａｂｔａｇｅｎｅ Ｃｉｌｏｌｅｕｃｅｌ ＣＡＲ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｌａｒｇｅ Ｂ Ｃｅｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７７，２５３１－２５４４（２０１７）、Ｓ．Ｊ．Ｓｃｈｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｂ－Ｃｅｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７７，２５４５－２５５４（２０１７）、Ｐ．Ｓａｌｍｉｋａｎｇａｓ，Ｎ．Ｋｉｎｓｅｌｌａ，Ｐ．Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ－Ｃｅｌｌｓ（ＣＡＲＴ－Ｃｅｌｌｓ）ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ－Ｍｏｖｉｎｇ Ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ？Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ３５，１５２（２０１８））、多くの患者は適切な候補とは見なされない。

【0251】

ＴＳＡ×ＣＤ３二重特異性抗体の、より広い患者集団に対する比較的耐容性が高く「既製の」治療ソリューションとしての利点は、抗腫瘍活性をさらに最適化できれば、特に耐容性を犠牲にすることなく実行できれば、さらに向上するか、または恐らく正常細胞とは対照的に、腫瘍細胞に対する特異性がさらに高まる。この目的に向けて、ＴＳＡ×ＣＤ３二重特異性抗体を、シグナル２を独立して活性化する新規クラスの二重特異性抗体と対合すると、潜在的な有効性の向上と特異性の向上の機会がもたらされる可能性があるとの仮説が立てられた。したがって、第２のクラスの二重特異性抗体が設計された。これらの二重特異性抗体は、Ｔ細胞上で発現される共刺激受容体ＣＤ２８（ＴＳＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体）とともに、同じ腫瘍特異的抗原上の第２のエピトープまたは第２の別個の腫瘍抗原のいずれかに係合する可能性がある。ＴＳＡ１×ＣＤ３とＴＳＡ２×ＣＤ２８とを組み合わせると、シグナル１およびシグナル２の両方をトリガーすることによって、Ｔ細胞の誘導されおよび強化された代理活性化が可能になり、特異性は両方のエピトープまたは両方の抗原を発現する腫瘍細胞のみを標的とし、特異性を高める機会とともに、より大きな抗腫瘍活性を可能にするはずであると考えられた。

【0252】

本明細書に記載されているのは、前立腺癌を標的とするＴＳＡ×ＣＤ２８共刺激二重特異性抗体（ＰＳＭＡ×ＣＤ２８、前立腺特異的膜腫瘍抗原に結合する）の生成および試験である。遺伝的にヒト化された免疫担当マウスおよびカニクイザルにおける毒性学研究は、これらの二重特異性抗体が限られた活性を呈し、単剤として毒性を呈しないことを実証する。しかしながら、これらの新規共刺激二重特異性抗体は、ＴＳＡ×ＣＤ３二重特異性抗体の新しいクラスと効果的に組み合わせて、同系腫瘍モデルにおける抗腫瘍反応を増強することができる。まとめると、これらのデータは、この新規クラスのＣＤ２８ベースの二重特異性抗体（ＴＳＡ×ＣＤ２８）をＣＤ３ベースの二重特異性抗体（ＴＳＡ×ＣＤ３）と組み合わせると、著しく強化された相乗的な抗腫瘍活性を備えた、耐容性の高い「既製の」生物製剤ソリューションを提供できることを示唆している。

【0253】

材料および方法
実施例１０および１３では、以下の材料および方法が使用された。

【0254】

同系腫瘍研究
対応するマウス遺伝子の代わりにヒトＣＤ２８、ヒトＣＤ３、およびヒトＰＳＭＡを発現するマウスは、以前に記載されているように、Ｖｅｌｏｃｉｇｅｎｅ（登録商標）技術を使用して生成された（ｈＣＤ３／ｈＣＤ２８／ｈＰＳＭＡヒト化マウスと称される）（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ（２００３），Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｊｕｎ；２１（６）：６５２－９、Ｃｒａｗｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．２０１８，Ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ ｉｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）。各ヒト化マウスについて、Ｆ１Ｈ４（Ｃ５７ＢＬ／６×１２９ハイブリッド）胚性幹（ＥＳ）細胞クローンにおける正しい遺伝子標的化は、以前に記載されているように対立遺伝子喪失アッセイによって同定された（Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ（２００７），Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｊａｎ；２５（１）：９１－９）。標的ＥＳ細胞を、８細胞期のスイスウェブスター胚に注入して、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｒｅｎｓｓｅｌａｅｒ，ＮＹ）とホモ接合性で繁殖させるための完全にＦ０世代のヘテロ接合マウスを産生した。ｈＣＤ３／ｈＣＤ２８／ｈＰＳＭＡマウス（４～８匹／群、８～１６週齢）に、１×１０⁶ＭＣ３８／ｈＰＳＭＡ腫瘍細胞を皮下注射した。抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体、抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体、またはヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照を、単剤療法として、または０、３、および７日目に５ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射することにより組み合わせて投与した。

【0255】

ＸおよびＹ直径のキャリパー測定を使用して、腫瘍の成長を経時的にモニターした。腫瘍体積を計算した（Ｘ＊Ｙ＊（Ｘ／２））。腫瘍サイズが２０００ｍｍ³を超えたとき、マウスを安楽死させた。

【0256】

マウスにおける血清サイトカインレベルの測定
示された時点で、顎下腺穿刺によってマイクロテイナー血清チューブ（ＢＤ３６５９６７）に血液を収集した。サイトカインレベルは、Ｖ－ｐｌｅｘ Ｈｕｍａｎ ＰｒｏＩｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ－１０ Ｐｌｅｘキットを使用して、製造元の指示に従って分析した（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＡ）。

【0257】

結果、要約、および結論
Ｔ細胞およびＮＫ細胞でのヒトＣＤ２８の発現は、ＦＡＣＳによって検証された（データは示さず）。トリプルヒト化マウスは、インビトロＴ細胞増殖アッセイを使用して機能的に検証された（データは示さず）。ＰＳＭＡの発現は、ＱＰＣＲによって確認された（データは示さず）。ＭＣ３８／ｈＰＳＭＡ腫瘍成長は、トリプルヒト化ｈＣＤ３／ｈＣＤ２８／ｈＰＳＭＡマウス（上記）で経時的にモニターされた（図９Ａ）。アイソタイプ対照と比較して、ＰＳＭＡ×ＣＤ３およびＰＳＭＡ×ＣＤ２８の両方の単剤療法治療は、腫瘍成長を有意に阻害した（それぞれ、ｐ＜０．００１およびｐ＜０．０００１）。腫瘍成長は、併用療法によってさらに有意に阻害された（ｐ＜０．００００１）。アイソタイプ対照と比較して、ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体とＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体との組み合わせは、最大のサイトカイン産生を提供した（図９Ｃおよび９Ｄ）。腫瘍内ＣＤ８⁺Ｔ細胞の活性化状態に対する併用療法の役割をさらに理解するために、ｖｉＳＮＥ分析を行った（図９Ｂ）。ｖｉＳＮＥは、高次元構造を保持しながら、高次元サイトメトリーデータを２Ｄにマッピングするツールである。各治療は、脾臓および腫瘍における固有のＣＤ８＋Ｔ細胞クラスターを促進した。併用療法は、腫瘍のクラスター４に示されているように、活性化／メモリーＴ細胞表現型（ＴＣＦ１、ＣＤ１－２、ＣＤ１２７、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＫＬＲＧ１、およびＣＤ３８を発現する）の拡大を促進した。

【0258】

ｈＣＤ３^+/+／ｈＰＳＭＡ^+/+／ｈＣＤ２８^+/+マウスおよびｈＣＤ３^+/-／ｈＰＳＭＡ^+/-／ｈＣＤ２８^+/-マウスの両方における血清サイトカイン（ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦα、ＩＬ－４、およびＩＬ－５）のレベルを決定するために、研究を実施した。血液は、治療後０日目（４時間）、３、７、および１１日目に採取された。ｈＣＤ３^+/+／ｈＰＳＭＡ^+/+／ｈＣＤ２８^+/+マウスのＩＬ－１０を除いて、０日目に、抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３抗体を含む治療において、抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３と抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８との併用療法により、サイトカインレベルが有意に増加し、最大のサイトカイン放出を提供する。対照的に、ＩｇＧ対照および抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８単剤療法は、サイトカイン産生の増加を引き起こさなかった。ＩＬ－５およびＩＬ－１０を除いて、サイトカイン産生は、３日後に全ての治療群で同様のレベルに減少した。ＩＬ－５産生は、ｈＣＤ３^+/+／ｈＰＳＭＡ^+/+／ｈＣＤ２８^+/+では０日目よりも低いものの、３日目で有意に高い産生を示したが、併用療法を受けたｈＣＤ３^+/-／ｈＰＳＭＡ^+/-／ｈＣＤ２８^+/-マウスではそうではなかった。ｈＣＤ３^+/+／ｈＰＳＭＡ^+/+／ｈＣＤ２８^+/+マウスでは、ＩＬ－１０の産生は、０日目および３日目の全ての治療群で類似していたが、併用療法は、７日目および１１日目の併用療法において有意に高いレベルをもたらした。ｈＣＤ３^+/-／ｈＰＳＭＡ^+/-／ｈＣＤ２８^+/-マウスでは、併用療法により、０日目、３日目、および１１日目に有意に多くのＩＬ－１０を産生したが、７日目では産生しなかった。抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３単剤療法は、０日目および３日目に有意に多くのＩＬ－１０を産生したが、７日目および１１日目では産生しなかった。抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８単剤療法は、１１日目に有意に多くのＩＬ－１０を産生しただけであった（データは示さず）。

【0259】

図９Ａに示されるように、ＣＤ２８二重特異性抗体が非常に限られた単剤活性を有していた以前のインビトロ分析（上記の実施例８を参照）とは異なり、この同系ＭＣ３８／ｈＰＳＭＡモデルのＣＤ２８二重特異性抗体は、単剤としてより顕著な活性を有した。これは、このＭＣ３８モデルでは「シグナル１」が既にある程度活性化されていることを示唆した。これと一致して、ＭＣ３８腫瘍細胞は、ｐ１５Ｅなどの再活性化された内在性レトロウイルスタンパク質を高レベルで発現し、Ｃ５７ＢＬ６マウスは、このネオエピトープを認識して応答する内在性Ｔ細胞を生成できることが以前に示されている（Ｊ．Ｃ．Ｙａｎｇ，Ｄ．Ｐｅｒｒｙ－Ｌａｌｌｅｙ，Ｔｈｅ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｍｕｒｉｎｅ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｉｓ ａ ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｔ－ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｕｒｉｎｅ ｔｕｍｏｒｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２３，１７７－１８３（２０００）、Ｈ．Ｊ．Ｚｅｈ，３ｒｄ，Ｄ．Ｐｅｒｒｙ－Ｌａｌｌｅｙ，Ｍ．Ｅ．Ｄｕｄｌｅｙ，Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｃ．Ｙａｎｇ，Ｈｉｇｈ ａｖｉｄｉｔｙ ＣＴＬｓ ｆｏｒ ｔｗｏ ｓｅｌｆ－ａｎｔｉｇｅｎｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｉｃａｃｙ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６２，９８９－９９４（１９９９））。実際、ＭＣ３８モデルでは、このｐ１５Ｅネオ抗原に応答する腫瘍内Ｔ細胞を容易に検出できることが確認された。したがって、この同系腫瘍モデルのＣＤ２８二重特異性抗体は、内在性ＴＣＲ／ＣＤ３依存性Ｔ細胞応答を促進することができ、ＣＤ３二重特異性抗体を介して追加の「シグナル１」活性化を提供することでさらに強化することができる。

【0260】

併用療法の根底にある細胞機序を決定するために、腫瘍浸潤および脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞を、高次元フローサイトメトリーによってこれらの実験からプロファイリングし、無監督のクラスタリングアプローチを使用した。各治療は、脾臓および腫瘍において独特のＣＤ８＋Ｔ細胞クラスターを促進することが見出された。クラスターＣ３５に示されるように、単一の治療レジメンは、腫瘍内ＣＤ８＋Ｔ細胞を低減し、表現型の活性化は低かった（より低いＩＣＯＳ、ＫＬＲＧ１、Ｋｉ６７、ＰＤ１、ＣＤ３８、およびＬＡＧ３、図９Ｅ）。しかしながら、クラスターＣ４に示されるように、併用療法は、より活性化された／メモリーＴ細胞表現型（Ｔｃｆ１、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＰＤ１、ＩＣＯＳ、ＫＬＲＧ１、およびＣＤ３８を発現する、図９Ｂ）の拡大を大幅に促進した。

【0261】

抗ＣＤ２８×抗ＰＳＭＡは、腫瘍の非存在下および存在下でＣＤ２８／ＣＤ３／ＰＳＭＡヒト化マウスにおける血清サイトカインの上昇を誘発しない。
本明細書の他所で述べられているように、スーパーアゴニスト抗ＣＤ２８抗体であるＴＧＮ１４１２は、患者に有害な「サイトカインストーム」を誘発した。本発明の抗ＣＤ２８抗体および抗ＣＤ２８×ＰＳＭＡ二重特異性抗体は、サイトカインストームを引き起こさなかった。この研究では、いくつかの抗体（表１９に要約）を、ｈＣＤ３／ｈＣＤ２８／ｈＰＳＭＡヒト化マウスに２．５ｍｇ／ｋｇまたは０．２５ｍｇ／ｋｇの投与量で投与した。抗体投与の４時間後および３日後にマウスから採血した。図１０に示されるように、抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体または親ＣＤ２８二価抗体は、腫瘍の非存在下でＣＤ３／ＣＤ２８／ＰＳＭＡヒト化マウスにおいて血清サイトカイン産生を誘発しなかった。

【表19】

２．５ｍｇ／ｋｇにおいて、ＴＧＮ１４１２は、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、およびＴＮＦαの血中濃度を大幅に上昇させる可能性がある（データは示さず）。

【0262】

さらに、図２８に示されるように、抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８治療単独、または抗ＰＤ１との併用治療では、担腫瘍マウスの血清サイトカインは上昇しなかった。対照的に、抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３治療は、単独で、または抗ＰＤ１と組み合わせて、担腫瘍マウスのＴＮＦα、ＩＬ－５、ＩＬ－１０、ＩＬ－２、およびＩＬ－４などの血清サイトカインレベルを増加させた。抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３治療は、投与後４時間でサイトカイン発現を誘発した。サイトカインの上昇は、７日目以降は持続しなかった。この研究は、ＭＣ３８／ｈＰＳＭＡ腫瘍を担持するｈＣＤ３／ｈＣＤ２８／ｈＰＳＭＡヒト化マウスにおいて行った。５ｍｇ／ｋｇの示された抗体または二重特異性抗体を用いた０日目の投与後４時間、および７日目、その４日後に、ＭＣ３８／ｈＰＳＭＡ腫瘍を担持するｈＣＤ３／ｈＣＤ２８／ｈＰＳＭＡヒト化マウスから血清を収集した。血清サイトカインは、製造元のプロトコルに従って、１０プレックスマウスサイトカインＭＳＤキットを使用して測定した。

【0263】

さらに、図１１に示されるように、ＣＤ２８スーパーアゴニスト処置は、ＰＢＭＣを生着させたＮＳＧマウスにおいて４時間でサイトカイン応答を促進したが、本発明の抗ＣＤ２８抗体は促進しなかった。図１１に示される研究では、－１０日目に、免疫不全ＮＳＧマウスに、正常な健常ドナーからの５×１０⁶ＰＢＭＣを生着させた。－１日目に、Ｔ細胞の全身生着は、ヒトＴ細胞マーカーについて末梢血を染色することによって確認された。０日目に、マウスに、５０μｇのＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体、５μｇもしくは５０μｇの抗ＣＤ２８スーパーアゴニスト、または５μｇもしくは５０μｇの抗ＣＤ２８ ｍＡｂ１４２２６Ｐ２抗体のいずれかを腹腔内注射した。抗体注射の４時間後、動物から血液を採取し、血清を調製した。血清中のサイトカイン濃度は、マルチプレックスアッセイ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｖ－ＰＬＥＸキット）によって分析された。抗ＣＤ２８スーパーアゴニストは、アイソタイプ対照抗体で処置した動物と比較して、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）、ＩＬ－２、ＩＬ－６、およびＴＮＦαの血清レベルを増加させたが、抗ＣＤ２８ ｍＡｂ１４２２６Ｐ２で処置した動物の血清では、サイトカイン応答の増加は見られなかった。したがって、二重特異性抗ＣＤ２８×ＰＳＭＡは、共刺激性の二重特異性抗原結合分子の中で、潜在的により安全な毒性学プロファイルを有する。二重特異性抗ＣＤ２８×ＰＳＭＡは、サイトカイン応答を誘発しなかったが、抗ＣＤ３×ＰＳＭＡは誘発した。図１２に示されるように、抗ＣＤ３×ＰＳＭＡは、ヒト化マウスでＩＦＮγの上昇を引き起こしたが、抗ＣＤ２８×ＰＳＭＡは引き起こさなかった。この研究では、ＭＣ３８／ｈＰＳＭＡ腫瘍を担持するＣＤ３／ＣＤ２８／ＰＳＭＡまたはＣＤ３／ＣＤ２８ヒト化マウスから、５ｍｇ／ｋｇの示された二重特異性抗体を投与してから４時間後に血清を収集した。血清サイトカインは、製造元のプロトコルに従って、１０プレックスマウスサイトカインＭＳＤキットを使用して測定した。データポイントは、マウスごとの個々のサイトカインレベルを表す。グラフ上のバーは、治療群ごとの平均を表す。エラーバーは、＋／－ＳＥＭを表す。対照としてアイソタイプ処置マウスを使用した一元配置分散分析およびＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ多重比較検定で決定された統計的有意性（＊＊、ｐ＜０．０１）

【0264】

ヒト化マウスのデータと一致して、抗ＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗体は、非ヒト霊長類であるカニクイザルにおいてＣＲＰの上昇および全身性サイトカイン放出を引き起こした。サルの研究では、抗ＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗体が、０．０１、０．１、および０．５ｍｇ／ｋｇの投与量でカニクイザルに投与された。サルは、以下の症状を示した：嘔吐、むくみ、赤色／変色した皮膚；ＣＲＰの上昇（対照マウスでは約１０対１ｍｇ／ｄＬ）；血漿サイトカインの上昇（ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、およびＭＣＰ）；血液中の絶対Ｔ細胞数の低下などの１日目までの臨床兆候（データは示さず）。

【0265】

さらに、抗ＣＤ２８×ＰＳＭＡ処置を受けたマウスは、抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３または抗ＣＤ２８スーパーアゴニスト処置と比較して、サイトカイン産生またはＴ細胞辺縁趨向を示さなかった（図１３Ａおよび１３Ｂ）。

【0266】

概要
ＴＣＲ複合体を介したＴ細胞の活性化（「シグナル１」）は、Ｔ細胞上のＣＤ２８受容体が、標的細胞上のそのリガンド（ＣＤ８０／Ｂ７．１およびＣＤ８６／Ｂ７．２）に係合するときに媒介されるような共刺激シグナル（「シグナル２」）によって著しく強化され得ることが長い間認識されてきた（Ｊ．Ｈ．Ｅｓｅｎｓｔｅｎ，Ｙ．Ａ．Ｈｅｌｏｕ，Ｇ．Ｃｈｏｐｒａ，Ａ．Ｗｅｉｓｓ，Ｊ．Ａ．Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ，ＣＤ２８ Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ：Ｆｒｏｍ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｔｏ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４４，９７３－９８８（２０１６））。本明細書に開示されたデータと一致して、Ｔ細胞の抗腫瘍活性を強化するＣＤ２８共刺激の可能性は、Ｂ７リガンドが腫瘍細胞上で過剰発現された研究によって最初に実証され（Ｒ．Ｈ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ：ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ＣＤ２８，ＣＴＬＡ－４，ａｎｄ Ｂ７／ＢＢ１ ｉｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｅｌｌ ７１，１０６５－１０６８（１９９２）、Ｌ．Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｂｙ ｔｈｅ Ｂ７ ｃｏｕｎｔｅｒｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ＣＤ２８ ａｎｄ ＣＴＬＡ－４．Ｃｅｌｌ ７１，１０９３－１１０２（１９９２））、そのようなＢ７発現腫瘍のＴ細胞拒絶反応の改善を示した。これは、ヒト治験においてＣＤ２８活性化抗体を評価する取り組みに潜在的なインスピレーションを与えた。残念なことに、そのような抗体（ＴＧＮ１４１２）の２００６年の試験は、大量サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）に起因する多臓器不全により、６人のヒトボランティア全員に生命を脅かす合併症をもたらした（Ｇ．Ｓｕｎｔｈａｒａｌｉｎｇａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｔｏｒｍ ｉｎ ａ ｐｈａｓｅ １ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ＣＤ２８ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＴＧＮ１４１２．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５５，１０１８－１０２８（２００６））。この大惨事は、ヒトにおけるＣＤ２８活性化抗体のさらなる試験の中止につながった。

【0267】

本明細書に記載されているのは、共刺激「シグナル２」を提供することによって抗腫瘍活性を著しくかつ安全に促進することができる、新規クラスのＣＤ２８共刺激二重特異性抗体である。これらのＣＤ２８二重特異性抗体は、それら自体では限られた活性しかないが（「シグナル１」がない場合）、これらのＣＤ２８二重特異性抗体を新たなクラスのＣＤ３二重特異性抗体と対合することによって提供され得る場合（またはこれらのＣＤ２８二重特異性が、腫瘍特異的Ｔ細胞の内在性集団がすでに存在する状況で使用される場合）、「シグナル１」の設定において抗腫瘍活性を著しく強化し得る。本明細書に記載されているのは、前立腺癌（ＰＳＭＡ×ＣＤ２８）を標的とするＴＳＡ×ＣＤ２８共刺激二重特異性抗体の生成および試験である。「シグナル１」の非存在下で、これらのＣＤ２８二重特異性抗体は、インビトロまたはインビボで最小限の活性を有することが示された。しかしながら、これらのＣＤ２８二重特異性は、ＣＤ３二重特異性抗体と対合されて、腫瘍抗原ならびにＴＣＲおよびＣＤ２８の複合体を含む人工的な「免疫シナプス」を形成することができる。さらに、インビトロで適切なＣＤ３二重特異性抗体と対合されると、これらのＣＤ２８二重特異性抗体は、Ｔ細胞の活性化および腫瘍細胞の殺滅を、抗原依存的に効率的かつ特異的に促進することができる。さらに、これらのＣＤ２８二重特異性抗体はまた、同系腫瘍モデルにおいて、ＣＤ３二重特異性抗体の抗腫瘍活性を、腫瘍抗原特異的な方法で、インビボで効率的に強化する。そのようなモデルでは、腫瘍特異的Ｔ細胞がすでに存在しない限り、ＣＤ２８二重特異性抗体は、最小限の単剤活性を有し、そのような設定では、腫瘍抗原依存的にこの特異的活性を強化すると思われる。さらに、ＴＳＡ×ＣＤ２８とＴＳＡ×ＣＤ３との併用療法は、インビボで腫瘍内活性化／メモリーＴ細胞表現型の拡張を大幅に促進する。最後に、遺伝的にヒト化された免疫担当マウスおよびカニクイザルにおける毒性学研究は、これらの二重特異性抗体が、従来のＣＤ２８活性化抗体と直接比較して、単剤として限られた活性を呈し、毒性を呈しないことを実証する。

【0268】

多くの場合、免疫腫瘍学の分野におけるヒト特異的臨床候補の特徴付けは、生着されたヒト免疫細胞を用いた異種腫瘍モデルでの試験に限定されている。これらの異種モデルは非常に便利であるが、制限がある。そのような異種モデルで使用されるマウスは、それらの正常組織においてヒト腫瘍標的を発現せず、それにより、標的の正常組織発現の設定における試験薬剤の評価を妨げる。実際、標的が通常正常組織でも高レベルで発現される場合、これは試験薬を腫瘍からそらすことによって抗腫瘍効果を制限する可能性があり、これらの正常組織に毒性をもたらす可能性があり、これらのいずれも異種モデルにおいて評価することができなかった。追加の制限は、免疫不全マウスに移された生着したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の活性を伴う可能性があり、これは免疫担当系に見られる正常な宿主Ｔ細胞の活性とは異なる可能性がある。これらの制限を克服し、ヒト固有の臨床候補を試験するためのより良いモデルを提供するために、ダブルおよびトリプルの遺伝的にヒト化されたマウスがここで作成された。これらのモデルでは、腫瘍抗原は、適切な宿主組織での正常な発現を可能にするために遺伝的にヒト化され、ＣＤ３および／またはＣＤ２８成分は、免疫担当宿主細胞が、ヒト特異的臨床候補に応答できるように遺伝的にヒト化された。これらの遺伝的にヒト化された免疫担当同系動物モデルにおいて、ＰＳＭＡ腫瘍標的のＣＤ２８二重特異性抗体が、それらの適切なＣＤ３二重特異性抗体の抗腫瘍活性を強化することが見出された。複数の前臨床モデルにわたる異なるＴＳＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体による抗腫瘍効果の同様の強化は、この治療法がロバストであり、特定の腫瘍モデルに限定されず、免疫療法の新規組み合わせ標的クラスとしてより広い有用性を有し得ることを示唆する。全体として、調査結果は、ＴＳＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体が、ＴＳＡ×ＣＤ３二重特異性と相乗作用し得、十分に研究されたＴＳＡ×ＣＤ３二重特異性抗体の有効性を、合理的に安全で耐容性の高い方法で著しく強化し、ヒト治験での試験を正当化できる生物製剤ソリューションを提供する可能性があることを強調している。

【0269】

ＴＳＡ×ＣＤ３二重特異性抗体は、有望な新しいクラスの免疫療法を表すが、多くの場合、抗腫瘍活性のさらなる最適化が確かに重要になる。ＣＡＲ－Ｔアプローチが、「シグナル１」および「シグナル２」の両方を人工的に活性化して抗腫瘍活性を改善するキメラ受容体を採用したように（Ｅ．Ａ．Ｚｈｕｋｏｖｓｋｙ，Ｒ．Ｊ．Ｍｏｒｓｅ，Ｍ．Ｖ．Ｍａｕｓ，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ＣＡＲｓ：ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４０，２４－３５（２０１６）、Ｓ．Ｌ．Ｍａｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｉｓａｇｅｎｌｅｃｌｅｕｃｅｌ ｉｎ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ Ａｄｕｌｔｓ ｗｉｔｈ Ｂ－Ｃｅｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ Ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７８，４３９－４４８（２０１８））、ＣＤ３特異性抗体（「シグナル１」を提供する）とＣＤ２８二重特異性抗体（「シグナル２」を提供する）とを組み合わせて抗腫瘍活性を強化することの潜在的な利点をここに示す。そのようなアプローチが、ＣＡＲ－Ｔ療法に勝る実際的な利点に加えて、各患者に個別にカスタマイズする必要のある面倒な細胞療法の準備を必要とせず、患者が毒性化学療法を介して先制的に「リンパ球枯渇」する必要なく、それにより、しばしば副作用を伴うこの細胞療法を受け入れることができる（Ａ．Ｓｈｉｍａｂｕｋｕｒｏ－Ｖｏｒｎｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ６，５６（２０１８）、Ｃ．Ｈ．Ｊｕｎｅ，Ｒ．Ｓ．Ｏ´Ｃｏｎｎｏｒ，Ｏ．Ｕ．Ｋａｗａｌｅｋａｒ，Ｓ．Ｇｈａｓｓｅｍｉ，Ｍ．Ｃ．Ｍｉｌｏｎｅ，ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５９，１３６１－１３６５（２０１８））－本発明による二重特異性アプローチは、有効性の向上ならびに作用の安全性および特異性の向上の可能性を提供する。すなわち、１つの抗原のＣＤ３二重特異性抗体を第２の抗原に特異的なＣＤ２８二重特異性抗体と対合することによって、「コンビナトリアル標的化」を利用することが可能であり、有効性の向上は、両方の抗原を発現する腫瘍細胞でのみ発生しであり、したがって両方の抗原を発現する腫瘍細胞のみに対するＴ細胞殺滅に焦点を当てる一方で、抗原のうちの１つのみを発現する正常組織における「オフターゲット毒性」を制限する。まとめると、本明細書に開示されるデータは、ＣＤ２８ベースの二重特異性抗体をＣＤ３ベースの二重特異性抗体と組み合わせると、著しく強化され相乗的な抗腫瘍活性を有する耐容性の高い「既製の」生物製剤ソリューションを提供し得ることを示唆している。ヒト治験におけるこの可能性に関する最初の試験は、今年行われる。

【0270】

実施例１１：カニクイザル毒性学研究
これらの研究は、ＰＳＭＡ×ＣＤ２８単独または併用療法が、カニクイザルのＣＤ２８スーパーアゴニストと比較して全身性Ｔ細胞作用を誘発しないことを実証した。本発明の例示的な抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体は、カニクイザルからのＴ細胞のＴＡＡ×ＣＤ３活性化を増強した（実施例８、図７Ｅ～７Ｇ）。本発明の例示的な抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体の単独または抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３との組み合わせの安全性および耐容性を決定するために、カニクイザルにおいて単回投与毒性学研究を行った。表２０に示されるように、雌または雄のカニクイザルを治療群に割り当てた。

【表20】

【0271】

カニクイザルの研究は、ＩＡＣＵＣガイドラインに従って実施した。雄のカニクイザル（３匹／群）は、およそ３０分間の静脈内注入を介して各試験品の単回投与を受けた（併用処置は、合計１時間の個別注入として投与した）。毒性の評価は、臨床観察、定性的な食物消費、体重、神経学的検査、バイタルサイン（体温、心拍数、パルスオキシメトリ、および呼吸数）、ならびに臨床的および解剖学的病理学に基づいた。サイトカイン分析、ＦＡＣＳ免疫表現型分析、組織病理学、および毒物動態評価のために、血液および組織試料を収集した。ＣＲＰレベルは、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｄｕｌａｒ Ｐ８００システムで分析した。サイトカインは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＭＳＤ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）によって測定した。末梢血フローサイトメトリーでは、血液をカリウムＥＤＴＡチューブに収集し、溶解し、抗ＣＤ３、抗Ｋｉ６７、および抗ＩＣＯＳ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）などの指定の抗体で染色し、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩで分析した。１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇでのＰＳＭＡ×ＣＤ２８の単一用量の投与後に、有意なサイトカイン放出、Ｔ細胞辺縁化、またはＴ細胞活性化マーカー上方調節は観察されず、有意なサイトカイン放出、Ｔ細胞辺縁趨向、またはＴ細胞活性化マーカー上方調節を誘発しなかった（表２１）。

【表21】

【0272】

対照的に、ＣＤ２８スーパーアゴニストを投与したサルでは、有意なサイトカイン放出、リンパ球辺縁化、およびＴ細胞活性化が見られた。さらに、これらの発見は、ドライコーティングおよびウェットコーティングされたヒトＴ細胞増殖アッセイを使用して検証された（実施例９）。実際、例示的な抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体ならびに親二価ＣＤ２８抗体が、ＣＤ２８スーパーアゴニスト抗体と比較して、ヒトＴ細胞増殖を誘発することは観察されなかった。全体として、サルにおける探索的単回投与毒性学研究およびインビトロヒトＴ細胞ベースのアッセイは、本発明の例示的な抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体が安全であり、十分に耐容されることを示唆している。

【0273】

表２１に示されるように、ＣＤ２８スーパーアゴニストであるＴＧＮ１４１２は、Ｔ細胞の適度なサイトカイン放出と一過性の増加を引き起こした（Ｄ１５で測定）。この研究は、雄のカニクイザルを対象に、５～５０ｍｇ／ｋｇを４週間にわたって毎週投与して行った。白血球サブセット分析のＦＡＣＳは、ＴＧＮ１４１２の毎週（ｄ１、８、１５、２２）の漸増用量（５、１０、２５、５０ｍｇ／ｋｇ）のＩＶ注射後の雄のカニクイザルで行った。最初の２～２４時間（２～２０倍）にＩＬ－２、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γのわずかな増加が観察された。ＩＬ－４またはＴＮＦ－αに実質的な変化はなかった。抗ＣＤ２８×ＰＳＭＡを用いた探索的単回投与サル毒性学研究を実施して、抗ＣＤ２８×ＰＳＭＡ二重特異性抗体の安全性および薬物動態プロファイルを確立した。

【0274】

要約すると、抗ＣＤ２８×ＰＳＭＡ抗体が、腫瘍部位での免疫を強化することが示されている。抗ＣＤ２８×ＰＳＭＡは、腫瘍細胞を抗原提示細胞（ＡＰＣ）に変えた。抗ＣＤ２８×ＰＳＭＡ抗体は、抗ＣＤ２８スーパーアゴニストと比較して、Ｔ細胞増殖を誘発したり、またはサイトカイン放出を刺激したりしない。

【0275】

実施例１２：水素重水素交換によるＣＤ２８へのｍＡｂ１４２２６Ｐ２結合のエピトープマッピング
質量分析（ＨＤＸ－ＭＳ）によるＨ／Ｄ交換エピトープマッピングを行って、抗ｈＣＤ２８モノクローナル抗体と相互作用するＣＤ２８のアミノ酸残基（ｈＣＤ２８ ｅｃｔｏ（Ｎ１９－Ｐ１５２）．ｍｍｈとして示される組み換えヒトＣＤ２８、配列番号７５）を決定した。Ｈ／Ｄ交換法の一般的な説明は、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７（２）：２５２－２５９、およびＥｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ－２６５Ａに記載されている。

【0276】

ＨＤＸ－ＭＳ実験は、統合型ＨＤＸ／ＭＳプラットフォーム上で行われ、これは重水素標識およびクエンチングのためのＬｅａｐｔｅｃ ＨＤＸ ＰＡＬシステム、試料消化および充填のためのＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｍ－Ｃｌａｓｓ（補助溶媒マネジャー）、分析勾配のためのＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｍ－Ｃｌａｓｓ（μＢｉｎａｒｙ溶媒マネジャー）、およびペプチド質量測定のためのＴｈｅｒｍｏ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ質量分析計からなる。

【0277】

標識溶液は、ｐＤ７．０でＤ₂Ｏ中のＰＢＳ緩衝液として調製した（１０ｍＭのリン酸緩衝液、１４０ｍＭのＮａＣｌ、および３ｍＭのＫＣｌ、２５℃でｐＨ７．４と等価）。重水素標識のために、１：０．６モル比でＲＥＧＮ５７０５と予備混合した１１μＬのＣＤ２８．ｍｍＨ（ハウスタンパク質ＲＥＧＮ２０１１中のＲｅｇｅｎｅｒｏｎ、１２７μＭ）またはＣＤ２８．ｍｍＨ（Ａｇ－Ａｂ複合体）を、２０℃で４４μＬのＤ₂Ｏ標識溶液により、様々な時点について二重にインキュベートした（例えば、重水素化されていない対照＝０秒、重水素標識されたものは５分および１０分）。重水素化反応は、２０℃で５分のインキュベーションにわたって、５５μＬの事前に冷却されたクエンチバッファー（０．５Ｍ ＴＣＥＰ－ＨＣｌ、８Ｍ尿素、および１％ギ酸）を各試料に添加することによってクエンチした。次に、クエンチした試料をオンライン（ｏｎｌｉｎｅ）のペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ消化のためにＷａｔｅｒｓ ＨＤＸ Ｍａｎａｇｅｒに注入した。消化されたペプチドは、１０％から３２％Ｂ（移動相Ａ：水中０．５％ギ酸、移動相Ｂ：アセトニトリル中０．１％ギ酸）から１３分の勾配でＣ８カラム（１．０ｍｍ×５０ｍｍ、ＮｏｖａＢｉｏａｓｓａｙｓ）によって分離した。溶出したペプチドを、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ質量分析によってＬＣ－ＭＳ／ＭＳまたはＬＣ－ＭＳモードで分析した。

【0278】

重水素化されていないＣＤ２８試料のＬＣ－ＭＳ／ＭＳデータは、Ｂｙｏｎｉｃ検索エンジン（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ）を使用して、ＣＤ２８およびそのランダム化されたシーケンスを含むデータベースに対して検索された。検索パラメータ（ＥＬＮ）は、非特異的酵素消化およびヒトグリコシル化を一般的な可変修飾として使用してデフォルトとして設定された。次いで、同定されたペプチドのリストを、ＨＤＸ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈソフトウェア（バージョン３．３）にインポートして、全ての重水素化試料からＬＣ－ＭＳによって検出された各ペプチドの重水素取り込みを計算した。所与のペプチドについて、各時点での重心質量（強度加重平均質量）を使用して、重水素取り込み（Ｄ）および重水素取り込みのパーセンテージ（％Ｄ）を計算した。

【数3】

【0279】

ｈＣＤ２８．ｍｍＨ（配列番号７５）からの合計７３ペプチドが、ｈＣＤ２８．ｍｍＨ単独および抗ＣＤ２８抗体試料と複合した抗ＣＤ２８．ｍｍＨの両方から同定され、ｈＣＤ２８の８５．８％の配列包括度を表す。５％を超える異なるＤ－取り込み値のパーセントを示した任意のペプチドは、有意に保護されていると定義された。ｈＣＤ２８．ｍｍＨ（配列番号７５）の場合、アミノ酸５～２０（ＶＫＱＳＰＭＬＶＡＹＤＮＡＶＮＬ、配列番号７７）、２９～３８（ＦＳＲＥＦＲＡＳＬＨ、配列番号７８）、８０～８４（ＹＬＱＮＬ、配列番号７９）、および９１～１０８（ＩＹＦＣＫＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥ、配列番号８０）に対応する領域は、抗ＣＤ２８抗体によって有意に保護され、アミノ酸９１～１０８（ＩＹＦＣＫＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥ、配列番号８０）がＣＤ２８の一次エピトープとして定義された。抗ＣＤ２８抗体によるこれらの残基の保護は、ｈＣＤ２８．ｍＦｃ（配列番号７６）を使用して確認された。この研究の結果の要約については、以下の表２２も参照されたい。

【表22】

【0280】

実施例１３：ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体はＰＤ－１免疫療法の抗腫瘍効果を強力に強化する
要約
Ｔ細胞の活性化は、抗原特異的なＴＣＲ／ＣＤ３の活性化（「シグナル１」）に加えて、第２の共刺激受容体（「シグナル２」）に係合することによって強化される。癌免疫療法の目標は、Ｔ細胞を最適に活性化および動員して、腫瘍細胞を検出および殺滅することである。しかしながら、現在の治療法は、腫瘍部位でＴ細胞を効率的かつ選択的に活性化しない傾向があり、耐久性のある応答を達成できない、および／または望ましくない毒性をもたらすことが多い。ここでは、ＰＤ－１阻害と二重特異性抗体とを一緒に組み合わせた新規腫瘍標的免疫療法モダリティが導入された。二重特異性抗体は、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）（例えば、ＰＳＭＡ）を一方のアームに結合し、Ｔ細胞上の共刺激受容体ＣＤ２８をもう一方のアームに結合する。実際、ＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達阻害は、免疫シナプスに蓄積されたＣＤ２８の比率を大幅に増加させ、ＴＳＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体がその効果を発揮できるようにする。この併用免疫療法は、前立腺抗原に特異的な二重特異性抗体（例えば、ＰＳＭＡ）を使用して検証された。Ｔ細胞を広く活性化する非特異的ＣＤ２８スーパーアゴニストとは異なり、ＴＳＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体は、遺伝的にヒト化された免疫担当マウスモデルまたは霊長類において単独で、またはＰＤ－１ブロッカーと組み合わせて使用した場合に十分に耐容された。重要なことに、内在性ＴＣＲ／ＣＤ３トリガーの存在下で、ＴＳＡ×ＣＤ２８は、永続的な抗腫瘍反応に関連するＰＤ－１抗体の抗腫瘍活性を著しく改善した。併用療法は、腫瘍内Ｔ細胞の活性化を特異的に増強し、様々な同系およびヒト腫瘍異種移植モデルにおいて、全身性サイトカイン分泌なしにエフェクター記憶様Ｔ細胞表現型を促進する。このクラスのＣＤ２８共刺激二重特異性抗体を、臨床的に検証された抗ＰＤ－１治療と組み合わせると、耐容性の高い「既製」の抗体療法に、著しく強化された抗腫瘍効果を提供する可能性がある。

【0281】

前書き
Ｔ細胞の活性化を強化することを目的とした多数のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が、抗腫瘍治療薬として臨床開発中である（Ｍ．Ｋ．Ｃａｌｌａｈａｎ，Ｍ．Ａ．Ｐｏｓｔｏｗ，Ｊ．Ｄ．Ｗｏｌｃｈｏｋ，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｃｏ－ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４４，１０６９－１０７８（２０１６））。しかしながら、現在の治療法の大部分は、腫瘍微小環境の抑制性を克服することによって挑戦されており、したがって、効率的な腫瘍特異的Ｔ細胞活性化およびその後の腫瘍細胞殺滅を生成することができない（Ｋ．Ｇ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｉ．Ｍ．Ｓｔｒｏｍｎｅｓ，Ｐ．Ｄ．Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｏｂｓｔａｃｌｅｓ Ｐｏｓｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｔｕｍｏｒ Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｔｏ Ｔ ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ：Ａ Ｃａｓｅ ｆｏｒ Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３１，３１１－３２５（２０１７））。細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質（ＣＴＬＡ－４）およびプログラム細胞死１（ＰＤ－１）／プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）などのチェックポイント阻害剤に対して向けられたいくつかのブロッキングｍＡｂは、黒色腫、腎細胞癌、非小細胞肺癌、および進行した転移性皮膚扁平上皮癌に対して臨床的に承認されている（Ｊ．Ｓ．Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ ｖｅｒｓｕｓ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｅｌａｎｏｍａ ｗｈｏ ｐｒｏｇｒｅｓｓｅｄ ａｆｔｅｒ ａｎｔｉ－ＣＴＬＡ－４ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（ＣｈｅｃｋＭａｔｅ ０３７）：ａ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ｏｐｅｎ－ｌａｂｅｌ，ｐｈａｓｅ ３ ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ １６，３７５－３８４（２０１５）、Ｓ．Ｌ．Ｔｏｐａｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｒｖｉｖａｌ，ｄｕｒａｂｌｅ ｔｕｍｏｒ ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ，ａｎｄ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｓａｆｅｔｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｅｌａｎｏｍａ ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ ｎｉｖｏｌｕｍａｂ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３２，１０２０－１０３０（２０１４）、Ｍ．Ａ．Ｐｏｓｔｏｗ，Ｍ．Ｋ．Ｃａｌｌａｈａｎ，Ｊ．Ｄ．Ｗｏｌｃｈｏｋ，Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３３，１９７４－１９８２（２０１５）、Ｍ．Ｒ．Ｍｉｇｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＤ－１ Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｗｉｔｈ Ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｓｑｕａｍｏｕｓ－Ｃｅｌｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７９，３４１－３５１（２０１８））。ＰＤ－１をブロックすると、Ｔ細胞活性化の中断が解除されるが、単剤としての有効性では、腫瘍のクリアランスおよび持続的な抗腫瘍反応を得るのに十分でない場合が多い。抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１と抗ＣＴＬＡ－４とを組み合わせると、ある特定の腫瘍型で高い奏効率が得られるが、高悪性度の毒性がしばしば観察される（Ｊ．Ｌａｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ ａｎｄ Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ ｏｒ Ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ Ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７３，２３－３４（２０１５）、Ｄ．Ｂ．Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｌｍｉｎａｎｔ Ｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ ｗｉｔｈ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｂｌｏｃｋａｄｅ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７５，１７４９－１７５５（２０１６）、Ｍ．Ｈ．Ｐｏｌｌａｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｒｅｓｕｍｉｎｇ ａｎｔｉ－ＰＤ－１ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｉｍｍｕｎｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｖｅｎｔｓ（ｉｒＡＥｓ）ｄｕｒｉｎｇ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ａｎｔｉ－ＣＴＬＡ－４ ａｎｄ ａｎｔｉ－ＰＤ１ ｉｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ ２９，２５０－２５５（２０１８）、Ｊ．Ｄ．Ｗｏｌｃｈｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ ｐｌｕｓ ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６９，１２２－１３３（２０１３））。その結果、応答性を予測するバイオマーカーの同定を通じてチェックポイント阻害に反応する可能性が高い患者を特定するための相当の努力が進行中である（Ｒ．Ｃｒｉｓｔｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｎ－ｔｕｍｏｒ ｇｅｎｏｍｉｃ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ＰＤ－１ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｂｌｏｃｋａｄｅ－ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２，（２０１８））。さらに、共刺激受容体を誘発するアゴニスト抗体を組み合わせるか、または化学療法もしくは放射線療法などの他のモダリティと組み合わせることによって、ＰＤ－１遮断の有効性および抗腫瘍反応の持続性を改善することを目的とした併用療法が、前臨床および臨床評価を受けている（Ｓ．Ｈｕ－Ｌｉｅｓｋｏｖａｎ，Ａ．Ｒｉｂａｓ，Ｎｅｗ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ １／Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｌｉｇａｎｄ １ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｓ ａ Ｂａｃｋｂｏｎｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｊ ２３，１０－２２（２０１７）、Ｙ．Ｋ．Ｃｈａｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｌａｎｄｓｃａｐｅ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ ｄｕａｌ ａｎｔｉ－ＣＴＬＡ４ ａｎｄ ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ；ｌｅｓｓｏｎｓ ｌｅａｒｎｅｄ ｆｒｏｍ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ ｗｉｔｈ ｍｅｌａｎｏｍａ ａｎｄ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ（ＮＳＣＬＣ）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ６，３９（２０１８）、Ｐ．Ｓ．Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｋ．Ｃｈａｍｏｔｏ，Ｔ．Ｈｏｎｊｏ，Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ＰＤ－１ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ：ａ ｎｅｗ ｅｒａ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ ２８３，１１０－１２０（２０１８）、Ｂ．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＰＤ－１ ａｎｄ ＧＩＴＲ ｃａｎ ｒｅｓｃｕｅ ＣＤ８（＋）Ｔ ｃｅｌｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｉｎｔａｉｎ ｍｅｍｏｒｙ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．Ｓｃｉ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３，（２０１８）、Ｓ．Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ４－１ＢＢ ａｇｏｎｉｓｔ ａｎｄ ＰＤ－１ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔｏｒ／ｍｅｍｏｒｙ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ ｐｏｏｒｌｙ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ ３，１４９－１６０（２０１５））。Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｂｕｒｄｅｎ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｔｈａｔ ａｒｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｃｅｒｔａｉｎ ｃａｎｃｅｒｓ （Ｋ．Ｗ．Ｍｏｕｗ，Ｍ．Ｓ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｐ．Ａ．Ｋｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｐｏｕｌｏｓ，Ａ．Ｄ．Ｄ´Ａｎｄｒｅａ，ＤＮＡ Ｄａｍａｇｅ ａｎｄ Ｒｅｐａｉｒ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ ７，６７５－６９３（２０１７））。Ｔ細胞は、これらの突然変異ペプチドをネオ抗原として認識する（Ｍ．Ｅｆｒｅｍｏｖａ，Ｆ．Ｆｉｎｏｔｅｌｌｏ，Ｄ．Ｒｉｅｄｅｒ，Ｚ．Ｔｒａｊａｎｏｓｋｉ，Ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｏｌｅ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙＦｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８，１６７９（２０１７））。しかしながら、単離状態では、これらの抗原の提示は、抗腫瘍活性を生成するためのロバストなＴ細胞活性化を促進するのに十分ではない（Ｓ．Ｓｐｒａｎｇｅｒ，Ｒ．Ｂａｏ，Ｔ．Ｆ．Ｇａｊｅｗｓｋｉ，Ｍｅｌａｎｏｍａ－ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｕｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ ５２３，２３１－２３５（２０１５））。これは、腫瘍の免疫抑制性微小環境に起因する可能性がある。

【0282】

本明細書に記載されているのは、前立腺癌ＴＳＡ ＰＳＭＡ×ＣＤ２８を標的とするＴＳＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体を使用する新規免疫療法モダリティであり、ＰＤ－１ブロッキング抗体と組み合わせると、長寿命の抗腫瘍免疫を誘発し、ロバストな腫瘍内Ｔ細胞活性化およびＴ細胞メモリーを促進し、動物腫瘍モデルにおける全身性サイトカイン放出の兆候はなかった。遺伝的にヒト化された免疫担当マウスおよびカニクイザルにおける毒性学研究は、これらの二重特異性抗体がそれ自体で、または抗ＰＤ－１抗体との組み合わせで毒性を呈しないことを実証した。まとめると、これらのデータは、このクラスのＣＤ２８ベースの二重特異性抗体（ＴＳＡ×ＣＤ２８）をＰＤ－１阻害と組み合わせると、著しく強化された特異的かつ相乗的な抗腫瘍活性を備えた、耐容性の高い「既製の」生物製剤ソリューションを提供できることを示唆している。

【0283】

材料および方法
実施例１３では、以下の材料および方法を使用した。

【0284】

試験設計
本発明の１つの例示的な目的は、ＴＳＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体を開発し、ＴＳＡ×ＣＤ２８が、インビトロでＰＤ－１誘発性Ｔ細胞活性化を増強し、インビボで抗腫瘍効果を安全に強化することを実証することであった。インビトロでの活性は、Ｔ細胞および標的細胞結合体の免疫シナプスに局在する二重特異性抗体、ＰＤ－１、およびＣＤ２８の画像、ＰＤ－１ Ｔ細胞サイトカイン放出の強化を示すことによって実証された。インビボ抗腫瘍効果は、同系マウス腫瘍モデルで評価された。腫瘍体積および血清サイトカインを経時的にモニターして、二重特異性抗体治療に対する応答を示した。カニクイザル研究の目的の１つは、単剤療法としてのまたは非ヒト霊長類におけるＰＤ－１との併用療法でのＴＳＡ×ＣＤ２８の安全性および耐容性（薬理学的および毒性学的プロファイル）を決定することであった。血清サイトカインおよびＴ細胞表現型を分析するために、臨床観察および血液試料収集によって、毒性について動物を調べた。

【0285】

動物実験
全ての手順は、アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）の実験動物の管理と使用に関する指針に従って実施された。プロトコルは、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓの動物実験委員会によって承認された。

【0286】

細胞株
ＪｕｒｋａｔクローンＥ６－１（ＡＴＣＣ，＃ＴＩＢ－１５２）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ，＃ＣＣＬ－８６（商標）、ＨＥＫ２９３細胞株（ＡＴＣＣ、＃ＣＲＬ－１５７３）、およびＡ－４３１（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ－１５５５（商標））を、ＡＴＣＣにより推奨されるプロトコルに従って培養した。ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０細胞株は、ユビキチンプロモーター駆動型ｈＣＤ２０（受託番号ＮＰ＿０６８７６９．２のアミノ酸Ｍ１～Ｐ２９７）をコードする哺乳類ベクターを使用して生成された。トランスフェクトされた細胞を、５００μｇ／ｍｌのジェネティシンＡ（Ｇ４１８）で培養し、安定して発現する細胞株のために選択した。ｈＣＤ８０またはｈＰＤＬ１発現細胞を生成するために、ヒトＣＤ８０（２８８ａａ長、受託番号ＮＭ＿００５１９１．４）およびネオマイシン耐性遺伝子またはヒトＰＤＬ１（２９０ａａ長、受託番号ＮＭ＿１４１４３．４）およびピューロマイシン耐性遺伝子を使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトし、ウイルス粒子の産生を促進し、その後ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０またはＲａｊｉ細胞の感染に使用した。ヒトＣＤ８０またはＰＤＬ１陽性細胞は、ＦＡＣＳによって単離した。Ｑｉａｇｅｎ製のレンチウイルス（カタログ番号ＣＬＳ－０１３Ｌ）と、ヒトＰＤ－１およびピューロマイシン耐性遺伝子をコードするレンチウイルスプラスミドとを使用して、Ｊｕｒｋａｔ細胞にＮＦκＢ－Ｌｕｃを形質導入した。生成された全ての細胞株は、５００μｇ／ｍＬのＧ４１８および／または０．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを補充したＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋Ｐ／Ｓ／Ｇ＋ＮＥＡＡ中で維持した。

【0287】

ＤＵ１４５／ｈＰＳＭＡ細胞株は、ＤＵ１４５細胞（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ－８１）に、ヒトＰＳＭＡ（受託番号Ｑ０４６０９のアミノ酸Ｍ１～Ａ７５０）をコードするレンチウイルスプラスミドおよびネオマイシン耐性遺伝子をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞によって産生されたウイルス粒子を形質導入することによって生成された。感染後、細胞を５００μｇ／ｍｌのジェネティシンＡ（Ｇ４１８）中で培養して、ＰＳＭＡを安定して発現する細胞のために選択した。生成された細胞株ＤＵ１４５／ＰＳＭＡは、５００μｇ／ｍＬのＧ４１８を含むＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋Ｐ／Ｓ／Ｇ中で維持した。

【0288】

共刺激リガンドを発現するように操作された腫瘍細胞株を生成するために、マウスＣＤ８６または空のベクターをコードするＥＦ１ａプロモーターと、ピューロマイシン耐性遺伝子（それぞれｐＬＶＸ．ＥＦ１ａ．ＣＤ８６－ｐｕｒｏおよびｐＬＶＸ．ＥＦ１ａ．ＥＶ－ｐｕｒｏ）とを備えたｐＬＶＸレンチウイルスプラスミドを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトし、ウイルス粒子の産生を促進し、その後ＭＣ３８（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ）に感染させるために使用した。ＣＤ８６を発現する操作された細胞株は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって単離された。細胞は、０．５μｇ／ｍｌピューロマイシンの存在下、ＡＴＣＣによって推奨される条件下で維持した。得られた細胞株を、ＭＣ３８／ＣＤ８６およびＭＣ３８／ＥＶと名付けた。

【0289】

ＭＣ３８／ｈＰＳＭＡ細胞の生成のために、ヒトＰＳＭＡ（受託番号Ｑ０４６０９のアミノ酸Ｍ１～Ａ７５０）およびネオマイシン耐性遺伝子をコードするレンチウイルスプラスミドを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトし、ウイルス粒子の産生を促進し、これを後に使用して、ＭＣ３８／親細胞に感染させた。ヒトＰＳＭＡ陽性細胞は、ＦＡＣＳによって単離した。ＭＣ３８／ｈＰＭＡは、５００μｇ／ｍＬのＧ４１８を補充したＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋Ｐ／Ｓ／Ｇ＋ＮＥＡＡ中で維持した。

【0290】

Ａｍｎｉｓ Ｉｍａｇｅ Ｓｔｒｅａｍ
Ａｍｎｉｓ Ｉｍａｇｅ Ｓｔｒｅａｍは、実施例７に記載されるように行った。

【0291】

ヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞の単離
Ｔ細胞の単離は、実施例８に記載されるように行った。

【0292】

ＤＵ１４５／ＰＳＭＡ細胞とのＭＬＲ反応における初代ＣＤ３⁺Ｔ細胞からのＩＬ－２放出
以前に単離し、凍結したヒトＣＤ３⁺Ｔ細胞を、５０Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼヌクレアーゼを含む刺激培地（１０％ ＦＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＮａＰｙｒ、ＮＥＡＡ、および０．０１ｍＭ ＢＭＥで補充されたＸ－ＶＩＶＯ １５細胞培養培地）中でアッセイの日に解凍した。細胞を、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、刺激培地中に再懸濁し、１×１０⁵細胞／ウェルの濃度で９６ウェル丸底プレート中に播種した。ヒトＰＳＭＡを発現するように操作されたＤＵ１４５親細胞またはＤＵ１４５細胞を、１０×１０⁶細胞／ｍＬの濃度で一次刺激培地中２５μｇのマイトマイシンＣで処理した。３７℃で１時間インキュベートした後、５％ＣＯ₂、マイトマイシンＣで処理した細胞を、２％ＦＢＳを含有するＤ－ＰＢＳで３回洗浄し、１ウェルあたり５×１０⁴細胞の最終濃度でＣＤ３⁺Ｔ細胞を含有するウェルに添加した。Ｆｃ受容体へのＣＤ２８抗体のＦｃアンカーによるＣＤ２８アゴニスト活性の可能性を防ぐために、飽和量の非特異的ヒトＩｇＧ抗体（各々１００ｎＭのｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ４、およびｈＩｇＧ４ｓ）を各アッセイウェルに含めた。続いて、ＰＳＭＡ×ＣＤ２８、非標的×ＣＤ２８対照、またはｈＩｇＧ４ｓアイソタイプ対照、抗体を、１：３希釈で３０ｐＭから２００ｎＭまで滴定し、ウェルに添加した。１０点希釈の最終点には、滴定抗体は含まれていなかった。ＤＵ１４５細胞は、ＰＤ－Ｌ１を内在的に発現するため、ＰＤ－１アンタゴニストＲＥＧＮ２８１０を２０ｎＭ一定でウェルに添加することにより、Ｔ細胞活性のＰＤ－１抑制の影響を評価した。また、ＰＤ－１阻害がない状態も含まれ、その代わりに２０ｎＭの一致するｈＩｇＧ４アイソタイプ対照が使用された。プレートを３７℃、５％ ＣＯ₂で７２時間インキュベートし、続いて遠心分離して細胞をペレット化した。５０μＬの培地上清を収集し、これから、５μＬを製造元のプロトコルに従ってヒトＩＬ－２ ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイで試験した。測定値は、Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒのマルチラベルプレートリーダーＥｎｖｉｓｉｏｎで取得した。アッセイウェルで生成されたＩＬ－２のｐｇ／ｍＬを推定するために、既知のＩＬ－２濃度の標準曲線を生成した。全ての段階希釈物を二重に試験した。抗体のＥＣ₅₀値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアを使用して、１０点用量応答曲線上の４パラメータロジスティック方程式から決定した。

【0293】

ＦＡＣＳベースの細胞傷害性アッセイ
ＦＡＣＳベースの細胞傷害性アッセイは、以前に記載されたように行った（実施例８）。

【0294】

同系腫瘍研究
ＭＣ３８／ＥＶおよびＭＣ３８／ＣＤ８６は、ＡＴＣＣガイドラインに従った培養であった。１×１０⁶ＭＣ３８／ＥＶまたはＭＣ３８／ＣＤ８６を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの皮下に移植した。マウスを、腫瘍移植後０、３、７、１０、および１４日目に腹腔内注射により、５ｍｇ／ｋｇのＰＤ－１抗体（ＲＰＭ１－１４、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）またはラットＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（ＢｉｏＸｃｅｌｌ）で処置した。キャリパー（Ｒｏｂｏｚ ＲＳ－６４６６）を使用して、腫瘍サイズを週に２回測定した。腫瘍体積は、式Ｘ＊Ｙ＊（Ｘ／２）を使用して計算した。ここで、Ｙは、最長の寸法であり、Ｘは、垂直の寸法である。２０００ｍｍ³より大きい腫瘍を有するか、または潰瘍化腫瘍を有するマウスは、ＣＯ₂窒息により安楽死させた。

【0295】

実施例１０に記載されるように、ｈＣＤ３／ｈＣＤ２８／ｈＰＳＭＡヒト化マウスを生成した。示された抗体または二重特異性抗体を、０、７、および１４日目（予防的処置）または９、１３、および２２日目（遅延処置）に５ｍｇ／ｋｇで単剤療法として、または腹腔内注射と組み合わせて投与したことを除いて、抗体処置も同様であった。

【0296】

エクスビボ組織サイトカイン分析
移植後２９日目に、ＭＣ３８／ｈＰＳＭＡ腫瘍を担持するＣＤ３／ＣＤ２８／ＰＳＭＡマウスを、二酸化炭素窒息によって安楽死させた。脾臓および腫瘍を収集し、氷上の培地中で保存した。以下の全ての工程は、特に明記されていない限り、氷上または４℃で行った。腫瘍を小片に切断し、製造プロトコル（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ １３０－０９６－７３０）に従ってＭｉｌｔｅｎｙｉマウス腫瘍解離キットを使用してフラグメントを単一細胞懸濁液に処理した。脾臓は、穏やかなＭＡＣＳ機械的解離（脾臓４プログラム）を使用して単一細胞懸濁液に処理され、３ｍｌシリンジのゴム端を使用して７０ミクロンフィルターを通して潰した。１２００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって細胞をペレット化した。細胞ペレットを、１ｍｌのＡＣＫ溶解緩衝液に再懸濁し、氷上で５分間インキュベートすることによって赤血球を溶解した。ＡＣＫ溶解緩衝液を、ＦＡＣＳ緩衝液でクエンチした。１２００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって細胞をペレット化した。細胞懸濁液を、１ｍｌの培地に再懸濁し、０．２ｍｌを９６ウェルプレート（２０～４００Ｋ腫瘍細胞または５０～７０Ｋ脾臓細胞）に播種した。細胞を３７℃で一晩インキュベートし、培養上清を収集した。組織培養上清中のサイトカインレベルは、製造元のプロトコル（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｋ１５０４８Ｄ－４）に従い、Ｖ－Ｐｌｅｘ炎症誘発性ＭＳＤキットを使用して測定した。１ウェルあたりに播種された細胞の数は、ＦＡＣＳ分析によって決定した。サイトカインのレベルは、播種された細胞の数に対して正規化した。キャリブレーションビーズを細胞と一緒に泳動させて、次の計算を使用して細胞の数を正確に測定した。
細胞数＝（入力ビーズ数×ＦＡＣＳによってカウントされた細胞数）／ＦＡＣＳによってカウントされたビーズの数

【0297】

マウスにおける血清サイトカインレベルの測定
マウスにおける血清サイトカインレベルの測定は、以前に記載されたように行った（実施例１０）。

【0298】

フローサイトメトリー分析
インビボ実験のフローサイトメトリー分析のために、腫瘍を採取し、単一細胞懸濁液を調製し、ＡＣＫ溶解緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して赤血球を溶解した。生／死細胞の識別は、生／死固定可能な青色の死細胞染色キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行った。試料は、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上で取得し、Ｃｙｔｏｂａｎｋソフトウェア（Ｃｙｔｏｂａｎｋ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して分析した。分析は、試料ごとに同数の事象で行った。事象の範囲は、取得された事象が最も少ない試料によって決定された。特定のマーカーに基づいてＴ細胞を自動的にクラスター化するために、ＣｙｔｏｂａｎｋからのＣＩＴＲＵＳ分析を使用した。

【0299】

カニクイザルの毒性学研究
カニクイザルの研究は、以前に記載されたように実施した（実施例１１）。

【0300】

結果
ＰＤ－１チェックポイント阻害は、免疫シナプス内のＣＤ２８の相対比を増加させ、ＴＳＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体が、インビトロでＴ細胞活性化を促進する抗ＰＤ－１の能力を著しく強化することを可能にする
共刺激二重特異性アゴニストがチェックポイント阻害を補完できるかどうかを試験するために、本発明の例示的なＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体（ｂｓ１６４２９Ｄ）を、ＴＣＲ／ＣＤ３依存性Ｔ細胞活性化様式でＰＤ－１遮断の有効性を強化する能力に関して試験した。実際、効率的なＴ細胞の活性化は、「免疫シナプス」（ＩＳ）でのＴＣＲ／ＣＤ３およびＣＤ２８複合体の共クラスター化に依存する。しかしながら、ＴＣＲ／ＣＤ３およびＣＤ２８の両方からの活性化シグナルは、シナプスでのＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１クラスター化に続くＰＤ－１－Ｓｈｐ－２リン酸化によって直接阻害される（Ｅ．Ｈｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔ ｃｅｌｌ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＣＤ２８ ｉｓ ａ ｐｒｉｍａｒｙ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ＰＤ－１－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５５，１４２８－１４３３（２０１７）、Ｊ．Ｍ．Ｃｈｅｍｎｉｔｚ，Ｒ．Ｖ．Ｐａｒｒｙ，Ｋ．Ｅ．Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｃ．Ｈ．Ｊｕｎｅ，Ｊ．Ｌ．Ｒｉｌｅｙ，ＳＨＰ－１ ａｎｄ ＳＨＰ－２ ａｓｓｏｃｉａｔｅ ｗｉｔｈ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｓｗｉｔｃｈ ｍｏｔｉｆ ｏｆ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ １ ｕｐｏｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ，ｂｕｔ ｏｎｌｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｐｒｅｖｅｎｔｓ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７３，９４５－９５４（２００４））。ＩＳでのＣＤ２８およびＰＤ－１の相対的な局在化を決定するために、ＰＤ－１を過剰発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞およびＰＤ－Ｌ１を過剰発現するように操作されたＲａｊｉ腫瘍標的細胞を使用して、実施例７に記載されるようなインビトロアッセイであるＡｍｎｉｓ Ｉｍａｇｅ Ｓｔｒｅａｍを開発した。蛍光標識された二重特異性ＣＤ２０×ＣＤ３抗体（Ｅ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｏｖｅｌ，ｎａｔｉｖｅ－ｆｏｒｍａｔ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ Ｔ－ｃｅｌｌ ｋｉｌｌｉｎｇ ｏｆ Ｂ－ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｒｏｂｕｓｔｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅｌｓ ａｎｄ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ５，１７９４３（２０１５））を使用して、ペプチドＭＨＣ／ＴＣＲ結合を複製し、ＩＳを形成する標的細胞とのＴ細胞相互作用を視覚化した。２つの異なる蛍光標識モノクローナルＰＤ－１抗体（ＰＤ－１ ｍＡｂ）、ブロッカー（ＰＤ－１ ｍＡｂ、ＲＥＧＮ２８１０（Ｅ．Ｂｕｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｔｉ－ＰＤ－１ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＲＥＧＮ２８１０ ａｎｄ Ｉｔｓ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｈｕｍａｎ ＰＤ－１ Ｋｎｏｃｋ－Ｉｎ Ｍｉｃｅ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １６，８６１－８７０（２０１７））、および非ブロッカー（ＮＢ ＰＤ－１ ｍＡｂ）を使用して、ＰＤ－Ｌ１との相互作用を同時にブロックし、ＰＤ－１の局在を視覚化した。標的細胞上のＰＤ－Ｌ１発現の非存在下で、およびＰＤ－１ ｍＡｂの存在下で、ＩＳでのＰＤ－１またはＣＤ２８の相対量に変化はないことがわかった（図１４）。しかしながら、非ブロッキングＰＤ－１ ｍＡｂの存在下での標的細胞上のＰＤ－Ｌ１発現は、シナプスでのＣＤ２８を減少させ、ＩＳでの高いＰＤ－１蓄積を促進した。逆に、ブロッキングＰＤ－１ ｍＡｂの存在下では、ＰＤ－１の局在が大幅に低減し、相対的なＣＤ２８レベルがＩＳで維持された。ＰＤ－１およびＣＤ２８の分布は、ＩＳの内側と外側の抗体染色の比率を計算することによって定量化した（図１５）。このデータは、標的細胞上のＰＤ－Ｌ１の発現が、ＣＤ２８を減少させながら、ＩＳでのＰＤ－１の局在を強化することを示す。さらに、ＰＤ－１ブロッキングｍＡｂは、ＩＳでのＰＤ－１の相対量を低減し、ＣＤ２８のレベルをレスキューするため、ＣＤ２８とＰＤ－１との相対比を増加させる。

【0301】

次に、ＰＳＭＡ×ＣＤ２８がＴ細胞活性化によって誘発される腫瘍細胞殺滅に対するＰＤ－１遮断の効果を強化できるかどうかを試験した。この目的に向けて、前立腺癌株２２ＲＶ１を利用した。２２ＲＶ１細胞は、内在的にＰＳＭＡを発現し、ＰＤ－Ｌ１（２２ＲＶ１／ＰＤ－Ｌ１）を発現するように操作されている。同種Ｔ細胞応答によるＴＣＲ／ＣＤ３刺激がないため、ＰＳＭＡ×ＣＤ３（米国特許第１０，１７９，８１９号）を使用して一次刺激を提供した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ、ヒトＴ細胞を含む）と２２ＲＶ１／ＰＤ－Ｌ１細胞との共培養では、ＰＳＭＡ×ＣＤ３単独で約４０％の腫瘍細胞殺滅を誘発した（図１６、菱形、８Ｅ－１０のＥＣ₅₀）。ＰＳＭＡ×ＣＤ３にＰＤ－１ ｍＡｂを追加すると、腫瘍細胞の殺滅を約５５％まで強化した（図１６、黒三角形、４Ｅ－１０のＥＣ₅₀）。興味深いことに、ＰＳＭＡ×ＣＤ２８とＰＳＭＡ×ＣＤ３との組み合わせは、同様に腫瘍細胞の殺滅の深さを約５５％に高め、効力を高めた（図１６、黒丸、６Ｅ－１１のＥＣ₅₀）。これは、ＰＳＭＡ×ＣＤ２８がＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１を介した阻害を無効にできることを示唆している。興味深いことに、ＰＳＭＡ×ＣＤ２８、ＰＤ－１ ｍＡｂ、およびＰＳＭＡ×Ｃ３トリプルの組み合わせは、約７０％で最も強い腫瘍細胞殺滅を示し、この組み合わせの相乗効果を示している（図１６、黒四角、７Ｅ－１１のＥＣ₅₀）。予想通り、ＰＳＭＡ×ＣＤ２８単独、ＰＤ－１ ｍＡｂ、ＰＳＭＡ×ＣＤ２８とＰＤ－１ ｍＡｂとの組み合わせのいずれも、腫瘍細胞の殺滅を誘発しなかった（図１６、白抜きの記号）。一致して、トリプルの組み合わせ処置でＩＦＮγ放出の最大の増加が観察された（図１７）。

【0302】

次に、インビトロでの初代ヒトＴ細胞活性化に対するＰＳＭＡ×ＣＤ２８とＰＤ－１ ｍＡｂとの組み合わせの効果を決定した。生理学的ＰＤ－Ｌ１発現およびＴＣＲ／ＣＤ３刺激を再現するために、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を採用した。一方向性ＭＬＲでは、同種異系決定因子の非互換性がＴ細胞の活性化につながり、これはサイトカイン産生によって定量化され得る。ここでは、健康なドナーからのＴ細胞を、ＰＤ－Ｌ１を内在的に発現し、ＰＳＭＡを過剰発現する操作された前立腺癌細胞株であるＤＵ１４５／ＰＳＭＡ細胞、および示された抗体とともにインキュベートした（図１８）。ＤＵ１４５／ＰＳＭＡ細胞およびＴ細胞の存在下では、ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体は、ＩｇＧ４アイソタイプ対照の約３～４倍のＩＬ－２放出の用量依存的増加をもたらす（図１８、円）。同様に、ＭＬＲアッセイへの２０ｎＭのＰＤ－１ ｍＡｂの追加もまた、ＩＬ－２放出を、ＩｇＧ４アイソタイプ対照の約３～４倍増加させた（図１８、三角形）。組み合わせて、ＰＳＭＡ×ＣＤ２８および２０ｎＭのＰＤ－１ ｍＡｂは、ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体によって誘発される活性化を著しく増強し、最大ＩＬ－２レベルはアイソタイプ対照の約２０倍増加し（図１８、四角）、ＰＤ－１ブロッキングｍＡｂと組み合わせたＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体が、内在性レベルのＴＣＲ／ＣＤ３活性化およびＰＤ－Ｌ１阻害を伴う腫瘍細胞の存在下でＴ細胞を強力かつ相乗的に活性化することを示す。

【0303】

全体として、これらの結果は、ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体が、ＴＣＲ／ＣＤ３シグナル伝達（ＣＤ３二重特異性抗体または同種反応によって駆動される）の存在下でＴ細胞活性化を促進するＰＤ－１ ｍＡｂの能力を強力に強化することができ、サイトカイン放出の増加と、ＰＳＭＡおよびＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍細胞の殺滅をインビトロでもたらすことを示した。

【0304】

腫瘍細胞での天然ＣＤ２８リガンドの過剰発現は、ＰＤ－１ ｍＡｂ治療と相乗作用して、インビボでＣＤ８ Ｔ細胞依存性の耐久性のある抗腫瘍免疫を誘発する。
その天然リガンド（複数可）によるＣＤ２８の係合がインビボでＰＤ－１ ｍＡｂの抗腫瘍効果を増強できるかどうかを決定するために、ＭＣ３８腫瘍細胞を操作してＣＤ２８の共刺激リガンドのうちの１つであるＣＤ８６を過剰発現させた（データは示さず）。ＭＣ３８／ＣＤ８６細胞とＰＤ－１ ｍＡｂ治療との組み合わせは、腫瘍成長を著しく阻害し（図１９Ａ）、空のベクター対照でトランスフェクトされた陰性対照ＭＣ３８細胞（ＭＣ３８／ＥＶ）と比較した場合、ロバストな生存利益に関連する完全な腫瘍退縮をもたらした（図１９Ｂ）。処置中のＣＤ８⁺Ｔ細胞の枯渇は、ＰＤ－１ ｍＡｂ療法をＭＣ３８／ＣＤ８６細胞と組み合わせることによって誘発された抗腫瘍効果を完全に無効にし、ＣＤ８⁺Ｔ細胞への依存を示した（図１９Ｃ）。注目すべきことに、最初にＭＣ３８／ＣＤ８６細胞を移植し、ＰＤ－１ ｍＡｂで処置した無腫瘍マウスは、原発腫瘍の移植後６０日以上後に移植された２番目のＭＣ３８親腫瘍を拒絶し、Ｔ細胞メモリー応答の存在を示した（図１９Ｄ）。結果として、これらのデータは、構成的発現ＣＤ２８リガンドと抗ＰＤ－１療法の相乗効果がインビボでの耐久性のあるＣＤ８依存性抗腫瘍免疫をもたらす可能性があることを示す。

【0305】

ＰＳＭＡ×ＣＤ２８は、ＰＤ－１ ｍＡｂ治療と相乗作用して、同系腫瘍モデルにおいて抗腫瘍免疫を誘発する。
次に、上記の発見を拡張して、同系腫瘍モデルにおいてＴＳＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体を単独で、またはＰＤ－１ ｍＡｂと組み合わせて使用した治療の抗腫瘍効果を示した。本明細書に記載される確立されたＣ５７ＢＬ６同系ＭＣ３８腫瘍モデルを使用して、ｈＰＳＭＡ遺伝子（ｐＬＶＸ．ＥＦ１ａ．ｈＰＳＭＡ）をＭＣ３８細胞に遺伝的に導入し、本明細書に記載される腫瘍特異的抗原ＭＣ３８／ｈＰＳＭＡを作成した。導入されたヒト腫瘍抗原を発現するこれらの同系腫瘍をマウスが自発的に拒絶する可能性を回避するために、ＰＳＭＡをこれらのマウスで遺伝的にヒト化した。さらに、ＣＤ３γ－δ－εおよびＣＤ２８遺伝子も、前述のようにＶｅｌｏｃｉＧｅｎｅ技術を使用してヒト化し（Ｄ．Ｍ．Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２１，６５２－６５９（２００３）、Ｗ．Ｔ．Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｆ０ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍｉｃｅ ｆｕｌｌｙ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｇｅｎｅ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｌｌｏｗｉｎｇ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２５，９１－９９（２００７））、それにより二重特異性抗体が、（ｈＣＤ３またはｈＣＤ２８を介して）宿主Ｔ細胞、ならびに正常組織および腫瘍（すなわち、ｈＰＳＭＡ）の両方におけるヒト腫瘍抗原を認識し、実際の臨床状況を表す（Ｙ．Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｓｕｒｇ ３０，６２８－６３６（２００６））。このモデルでは、ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体とＰＤ－１ ｍＡｂとの組み合わせにより、最大の腫瘍成長の制御が提供され、これがロバストな生存利益につながった。

【0306】

抗ＣＤ２８×抗ＰＳＭＡと抗ＰＤ１との組み合わせによる即時処置は腫瘍成長を相乗的に阻害する
即時処置研究では、抗ＣＤ２８×抗ＰＳＭＡ、抗ＰＤ１、またはラットＩｇＧ２ａアイソタイプ対照を、単剤療法として、または０、７、１４日目に５ｍｇ／ｋｇでの腹腔内注射により組み合わせて投与した。ＸおよびＹ直径のキャリパー測定を使用して、腫瘍の成長を経時的にモニターした。腫瘍体積を計算した（Ｘ＊Ｙ＊（Ｘ／２））。腫瘍サイズが２０００ｍｍ³を超えたとき、マウスを安楽死させた。

【0307】

図２０Ａ～２０Ｅに示されるように、抗ＣＤ２８×抗ＰＳＭＡ抗体は、単独で使用した場合、マウスの腫瘍成長を抑制し、生存率を高めただけでなく、抗ＰＤ－１抗体と相乗作用して、ＰＤ－１抗体の非存在下で使用した場合よりも腫瘍拒絶反応を促進し、生存率をさらに高めた。

【0308】

ＣＤ２８×ＰＳＭＡとＰＤ１との組み合わせによる治療は、二次腫瘍チャレンジに対する長寿命の抗腫瘍免疫を誘発する。
さらに、ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体とＰＤ－１ ｍＡｂとの組み合わせで移植および処置された無腫瘍マウスは、原発腫瘍移植の６０日以上後に移植された第２のＭＣ３８親腫瘍株を拒絶し、本明細書に記載される観察と一致する免疫記憶の生成を示した（図２１Ａ）。これらの結果は、内在性抗原特異的ＴＣＲシグナル（シグナル１）がＭＣ３８／ＰＳＭＡ移植腫瘍細胞上のペプチドＭＨＣ複合体から生成されていることを示唆する。ＭＣ３８腫瘍細胞は、ｐ１５Ｅなどの再活性化された内在性レトロウイルスタンパク質を高レベルで発現し、Ｃ５７ＢＬ６マウスの腫瘍内Ｔ細胞は、このｐ１５Ｅ抗原に応答性であることが示されている（Ｊ．Ｃ．Ｙａｎｇ，Ｄ．Ｐｅｒｒｙ－Ｌａｌｌｅｙ，Ｔｈｅ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｍｕｒｉｎｅ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｉｓ ａ ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｔ－ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｕｒｉｎｅ ｔｕｍｏｒｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２３，１７７－１８３（２０００）、Ｈ．Ｊ．Ｚｅｈ，３ｒｄ，Ｄ．Ｐｅｒｒｙ－Ｌａｌｌｅｙ，Ｍ．Ｅ．Ｄｕｄｌｅｙ，Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｃ．Ｙａｎｇ，Ｈｉｇｈ ａｖｉｄｉｔｙ ＣＴＬｓ ｆｏｒ ｔｗｏ ｓｅｌｆ－ａｎｔｉｇｅｎｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｉｃａｃｙ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６２，９８９－９９４（１９９９））。この発見と一致して、ＰＳＭＡ×ＣＤ２８とＰＤ－１ ｍＡｂとの併用療法は、少なくとも１つの内在性抗原Ｐ１５Ｅに反応する末梢Ｔ細胞を誘発し、抗腫瘍免疫記憶の生成をサポートすることがわかった（図２１Ｂ）。特に、ＰＳＭＡ×ＣＤ３と組み合わせたＰＳＭＡ×ＣＤ２８による処置が、ＭＣ３８／ｈＰＳＭＡ腫瘍拒絶反応を誘発した同様の実験では、これらの無腫瘍マウスは、二次腫瘍の再チャレンジを拒絶できなかった（図２１Ｃ）。まとめると、このデータは、ＣＤ２８二重特異性抗体が、このＰＳＭＡ同系腫瘍モデルでＰＤ－１ ｍＡｂと相乗作用し、内在性ＴＣＲ／ＣＤ３依存性Ｔ細胞応答を促進できることを示す。

【0309】

抗ＣＤ２８×抗ＰＳＭＡと抗ＰＤ１との組み合わせによる治療的処置は、相乗的に腫瘍の成長を阻害する
同様に、遅延治療プロトコルでは、移植後１０日目のＰＳＭＡ×ＣＤ２８とＰＤ－１ ｍＡｂとの組み合わせにより、確立されたＭＣ３８／ｈＰＳＭＡ腫瘍の成長が阻害され（図２２Ａ）、また生存率の大幅な増加（図２２Ｃ）および腫瘍体積の低減（図２２Ｄ）をもたらした。興味深いことに、腫瘍を標的とした併用療法は、ＩＦＮγで示されているように腫瘍内サイトカインを選択的に増加させた（図２２Ｂ）。同じマウスでは、脾臓または全身のサイトカイン誘発は観察されなかった（図２３Ａおよび２３Ｂ）。さらに、Ｔ細胞活性化マーカーの発現プロファイリングは、この併用処置を支持して、腫瘍内ＰＤ－１発現が、ＰＳＭＡ×ＣＤ２８処置（図２４）で増加したことを示した。併用処置で応答するＴ細胞サブセットをさらに特徴づけるために、腫瘍浸潤ＣＤ８⁺Ｔ細胞を、高次元フローサイトメトリーによる腫瘍チャレンジの１７日後にプロファイリングした。ＣＩＴＲＵＳ（クラスターの同定、特性評価、および回帰）を使用して、統計的に有意な異なるＴ細胞クラスターを独立して層別化する。重要なことに、ＰＤ－１遮断は、高レベルの活性化／枯渇マーカー（ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、Ｋｉ６７）を発現するエフェクター（ＣＤ４４高ＣＤ６２Ｌ低）ＣＤ８⁺Ｔ細胞（クラスターＣ１）を拡張したことがわかった（図２５）。しかしながら、併用処置のみが、記憶様表現型（高Ｔｃｆ１、ＥＯＭＥＳ、ＣＤ６２Ｌ、中間ＣＤ１２２、およびＣＤ１２７）の拡張、ならびにより少ない消耗表現型（低ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＤ３８、ＫＬＲＧ１、より高いＣＤ５）を有する腫瘍内ＣＤ８⁺Ｔ細胞（クラスターＣ２）の拡張を促進することができた（図２５）（Ｍ．Ｐｈｉｌｉｐ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｓｔａｔｅｓ ｄｅｆｉｎｅ ｔｕｍｏｕｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ ５４５，４５２－４５６（２０１７））。これらのデータは、ＰＳＭＡ×ＣＤ２８の二重特異性抗体と抗ＰＤ－１との併用療法が、記憶様表現型を伴う腫瘍内Ｔ細胞の活性化に関連するロバストな抗腫瘍免疫、および延命効果を促進することを示す。

【0310】

ＴＳＡ×ＣＤ２８単独またはＰＤ－１ ｍＡｂとの併用療法は、カニクイザルのＣＤ２８スーパーアゴニストと比較して全身性Ｔ細胞活性化を誘発しない。
初期の臨床試験データは、「ＣＤ２８スーパーアゴニスト」（ＣＤ２８－ＳＡ）と呼ばれる二価のＣＤ２８活性化抗体が、Ｔ細胞を広く活性化し、健康なボランティアの群におけるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）に関連する深刻な毒性をもたらすことを示した（Ｇ．Ｓｕｎｔｈａｒａｌｉｎｇａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｔｏｒｍ ｉｎ ａ ｐｈａｓｅ １ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ＣＤ２８ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＴＧＮ１４１２．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５５，１０１８－１０２８（２００６））。ＴＳＡ×ＣＤ２８二重特異性単独の耐容性、またはＰＤ－１ ｍＡｂと組み合わせた相乗的薬理学の可能性を評価するために、遺伝子操作されたトリプルヒト化マウスおよびカニクイザルにおける探索的研究を実施した。治療群あたり３匹のサルは、ＰＳＭＡ×ＣＤ２８の単回投与（１０ｍｇ／ｋｇ）を単独で、またはＰＤ－１ ｍＡｂ（ＲＥＧＮ２８１０）（１０ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせて、静脈内注入により受けた（併用群は連続注入を受けた）（表２０、図２６Ａ～２６Ｃ、および２７）。

【0311】

さらに、群あたり３匹のサルは、本明細書に記載されるように、単回投与（０．１ｍｇ／ｋｇ）の抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体および単回投与（１０ｍｇ／ｋｇ）のＣＤ２８スーパーアゴニスト抗体を受けた（表２０、図２６Ａ～２６Ｃ、および２７）。毒性の評価は、臨床観察、定性的な食物消費、体重、バイタルサイン（体温、心拍数、パルスオキシメトリ、および呼吸数）、実験完了時の臨床的および解剖学的病理に基づいていた。サイトカインおよびＦＡＣＳ免疫表現型分析のために血液試料を収集した。ＰＳＭＡ×ＣＤ２８単独またはＰＤ－１との併用は、十分に耐容され、全ての動物が試験期間中生存した。臨床観察に関連する試験品は観察されなかった（データは示さず）。臓器重量の変化は見られず、最終剖検で肉眼的変化も認められなかった（データは示さず）。さらに、有意なサイトカイン放出、Ｔ細胞の辺縁趨向または活性化は観察されなかった（表２３、図２６Ａ～２６Ｃ）。対照的に、ＣＤ２８「スーパーアゴニスト」を単独で投与したサルでは、有意なサイトカイン放出、リンパ球辺縁趨向、およびＴ細胞活性化が見られた（図２９Ａおよび２９Ｂ）。ＣＤ２８スーパーアゴニストで処置した動物の腎臓、脳、および精嚢において、免疫細胞の大量浸潤が観察された。対照的に、ＰＳＭＡ×ＣＤ２８を単独で、またはＰＤ－１との組み合わせで投与した動物では、処置に関連した有意な組織学的変化は観察されなかった（データは示さず）。

【表23-1】

【表23-2】

【0312】

カニクイザルでの上記の研究と一致して、ＰＳＭＡ×ＣＤ２８を単独でまたはＰＤ－１と組み合わせて投与した担腫瘍または非担腫瘍のナイーブトリプルヒト化マウス（ｈＣＤ３／ｈＣＤ２８／ｈＰＳＭＡ）では、サイトカインの上昇は観察されなかった（図２７、ならびに図２９Ａおよび２９Ｂ）。対照的に、ＣＤ２８スーパーアゴニストの投与は、投与後４時間でＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－４、およびＩＬ－５の有意な増加を誘発した（図２７、ならびに図２９Ａおよび２９Ｂ）。上記の結果と一致して、ＴＳＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体（およびこれらの二重特異性抗体を作製するために使用される親二価非スーパーアゴニストＣＤ２８抗体）は、ＣＤ２８－ＳＡによって誘発される強い増殖と比較して、ＦＤＡが推奨するインビトロでのドライコーティングおよびウェットコーティングアッセイにおいて、ヒトＴ細胞増殖を誘発できなかったことが以前に示されている（Ｒ．Ｓｔｅｂｂｉｎｇｓ，Ｄ．Ｅａｓｔｗｏｏｄ，Ｓ．Ｐｏｏｌｅ，Ｒ．Ｔｈｏｒｐｅ，Ａｆｔｅｒ ＴＧＮ１４１２：ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ａｓｓａｙｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ １０，７５－８２（２０１３））（データは示さず）。全体として、これらのデータは、ＴＳＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体が、十分に耐容されることを示唆する。

【0313】

さらに、以前に記載されたように（実施例１０、図２８）、抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８処置単独または抗ＰＤ１との組み合わせは、担腫瘍マウスにおける血清サイトカインを上昇させなかったが、抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３処置は、単独でまたは抗ＰＤ１と組み合わせて、担腫瘍マウスにおける血清サイトカインレベルを上昇させた。

【0314】

考察
本明細書で紹介され、検証されたのは、ＴＳＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体をＰＤ－１ブロッキングｍＡｂと組み合わせて使用する新規の腫瘍標的免疫療法であり、長寿命の抗腫瘍免疫を誘発し、動物腫瘍モデルにおけるロバストな腫瘍内Ｔ細胞活性化を促進する。遺伝的にヒト化された免疫担当マウスおよびカニクイザルにおける毒性学研究は、これらの二重特異性抗体が単独で、またはＰＤ－１ ｍＡｂとの組み合わせで毒性を呈しないことを示し、この治療アプローチが、著しく強化された特異的かつ相乗的な抗腫瘍活性を有する、耐容性の高い「既製の」生物製剤ソリューションを提供する可能性があることを示唆している。

【0315】

ＰＤ－１ブロッキングｍＡｂによるチェックポイント阻害は、Ｔ細胞活性化の中断を解除することが知られているが、単剤としてのそれらの有効性は、多くの癌で腫瘍クリアランスおよび持続的な抗腫瘍反応を得るのに十分でない場合が多い。ＰＤ－１阻害に対する応答率を改善するためのいくつかのアプローチが、現在評価されている。実際、ＰＤ－１ ｍＡｂに対する応答性を予測するためのバイオマーカーの同定（Ｒ．Ｃｒｉｓｔｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｎ－ｔｕｍｏｒ ｇｅｎｏｍｉｃ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ＰＤ－１ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｂｌｏｃｋａｄｅ－ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２（２０１８））、共刺激受容体をトリガーしてＴ細胞活性化を改善するアゴニスト抗体と一緒に、または化学療法もしくは放射線療法とともにＰＤ－１阻害を使用する非腫瘍標的併用療法は全て、現在、前臨床および臨床試験を受けている（Ｓ．Ｈｕ－Ｌｉｅｓｋｏｖａｎ，Ａ．Ｒｉｂａｓ，Ｎｅｗ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ １／Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｌｉｇａｎｄ １ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｓ ａ Ｂａｃｋｂｏｎｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｊ ２３，１０－２２（２０１７）、Ｙ．Ｋ．Ｃｈａｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｌａｎｄｓｃａｐｅ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ ｄｕａｌ ａｎｔｉ－ＣＴＬＡ４ ａｎｄ ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ；ｌｅｓｓｏｎｓ ｌｅａｒｎｅｄ ｆｒｏｍ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ ｗｉｔｈ ｍｅｌａｎｏｍａ ａｎｄ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ（ＮＳＣＬＣ）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ６，３９（２０１８）、Ｐ．Ｓ．Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｋ．Ｃｈａｍｏｔｏ，Ｔ．Ｈｏｎｊｏ，Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ＰＤ－１ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ：ａ ｎｅｗ ｅｒａ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ ２８３，１１０－１２０（２０１８））。しかしながら、課題は、これらの組み合わせの多くが、真に仮説に基づくアプローチではなく、既存の薬剤の利用可能性および治療法を組み合わせるための事後の合理性に基づいていることが多く、場合によっては患者の転帰を悪化させることである（Ｍ．Ｊ．Ａｈｎ，Ｊ．Ｍ．Ｓｕｎ，Ｓ．Ｈ．Ｌｅｅ，Ｊ．Ｓ．Ａｈｎ，Ｋ．Ｐａｒｋ，ＥＧＦＲ ＴＫＩ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｓａｆ １６，４６５－４６９（２０１７））。免疫系のチェックポイント阻害および再活性化が、多くの患者において長期寛解の可能性を提供することは明らかであり（Ｊ．Ｓ．Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ ｖｅｒｓｕｓ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｅｌａｎｏｍａ ｗｈｏ ｐｒｏｇｒｅｓｓｅｄ ａｆｔｅｒ ａｎｔｉ－ＣＴＬＡ－４ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（ＣｈｅｃｋＭａｔｅ ０３７）：ａ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ｏｐｅｎ－ｌａｂｅｌ，ｐｈａｓｅ ３ ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ １６，３７５－３８４（２０１５）、Ｓ．Ｌ．Ｔｏｐａｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｒｖｉｖａｌ，ｄｕｒａｂｌｅ ｔｕｍｏｒ ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ，ａｎｄ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｓａｆｅｔｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｅｌａｎｏｍａ ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ ｎｉｖｏｌｕｍａｂ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３２，１０２０－１０３０（２０１４）、Ｍ．Ａ．Ｐｏｓｔｏｗ，Ｍ．Ｋ．Ｃａｌｌａｈａｎ，Ｊ．Ｄ．Ｗｏｌｃｈｏｋ，Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３３，１９７４－１９８２（２０１５）、Ｍ．Ｒ．Ｍｉｇｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＤ－１ Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｗｉｔｈ Ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｓｑｕａｍｏｕｓ－Ｃｅｌｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７９，３４１－３５１（２０１８））、したがって、Ｔ細胞活性をさらに改善または強化して、より耐久性のある応答を促進する方法が保証される。ここでは、ＰＤ－１ ｍＡｂの抗腫瘍効果を改善するために、ＴＳＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体を使用してＴ細胞のシグナル伝達および活性化を強化するという概念が導入された。実際、この新規併用免疫療法は、腫瘍標的（例えば、ＰＳＭＡ）を使用して検証され、ＣＤ２８共刺激二重特異性抗体が、ＰＤ－１ ｍＡｂと相乗作用して、ロバストなＴ細胞活性化を生成するだけでなく、全身毒性のない耐久性のある抗腫瘍反応を提供することを実証した。結果として、この腫瘍標的併用療法は、前述の非標的アプローチに比べてかなりの利点を提供する可能性がある。腫瘍細胞表面上にクラスター化されない限り、ＣＤ２８を直接活性化しないＣＤ２８二重特異性抗体を使用すると、腫瘍部位でのみ共刺激を促進する可能性がもたらされ、従来のＣＤ２８活性化抗体の全身毒性（Ｇ．Ｓｕｎｔｈａｒａｌｉｎｇａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｔｏｒｍ ｉｎ ａ ｐｈａｓｅ １ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ＣＤ２８ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＴＧＮ１４１２．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５５，１０１８－１０２８（２００６））、ＣＬＴＡ－４とＰＤ－１遮断との組み合わせでしばしば観察される毒性（Ｊ．Ｌａｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ ａｎｄ Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ ｏｒ Ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ Ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７３，２３－３４（２０１５）、Ｄ．Ｂ．Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｌｍｉｎａｎｔ Ｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ ｗｉｔｈ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｂｌｏｃｋａｄｅ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７５，１７４９－１７５５（２０１６）、Ｍ．Ｈ．Ｐｏｌｌａｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｒｅｓｕｍｉｎｇ ａｎｔｉ－ＰＤ－１ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｉｍｍｕｎｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｖｅｎｔｓ（ｉｒＡＥｓ）ｄｕｒｉｎｇ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ａｎｔｉ－ＣＴＬＡ－４ ａｎｄ ａｎｔｉ－ＰＤ１ ｉｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ ２９，２５０－２５５（２０１８））、または他の共刺激アゴニスト二価抗体（Ｎ．Ｈ．Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ａｎ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｓａｆｅｔｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｕｒｅｌｕｍａｂ，ａｎ Ａｇｏｎｉｓｔ Ａｎｔｉ－ＣＤ１３７ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２３，１９２９－１９３６（２０１７））を回避する。遺伝的にヒト化された免疫担当マウスおよびカニクイザルにおける毒性学研究は、これらの二重特異性抗体が、単剤としてまたはＰＤ－１ ｍＡｂとの組み合わせで毒性を呈しないことを示した。安全性プロファイルは、同系モデルにおけるＰＤ－１ ｍＡｂを用いた本発明の抗ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体による抗腫瘍効果の強化とともに、この治療法がロバストであり、免疫療法の新規併用クラスとしてより広い有用性を有する可能性があることを示唆する。

【0316】

Ｔ細胞を介した腫瘍細胞の殺滅を強化するために、腫瘍を標的としたアプローチが開発されている（Ｅ．Ｄａｈｌｅｎ，Ｎ．Ｖｅｉｔｏｎｍａｋｉ，Ｐ．Ｎｏｒｌｅｎ，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｔｈｅｒ Ａｄｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ６，３－１７（２０１８））。実際、ＣＤ３ベースの二重特異性抗体は、Ｔ細胞を腫瘍細胞に結合し、ＴＣＲ／ＣＤ３を活性化することにより（Ｅ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｏｖｅｌ，ｎａｔｉｖｅ－ｆｏｒｍａｔ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ Ｔ－ｃｅｌｌ ｋｉｌｌｉｎｇ ｏｆ Ｂ－ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｒｏｂｕｓｔｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅｌｓ ａｎｄ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ５，１７９４３（２０１５））、したがって通常の「信号１」を模倣することによって、Ｔ細胞の活性化を効率的にトリガーすることができる新しいクラスの抗体を表す。しかしながら、ＣＤ３二重特異性抗体は、それらの有望な臨床効果にもかかわらず、直接的なＴ細胞の活性化と腫瘍のみの特異性の欠如により、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）と関連する可能性がある（Ｓ．Ｌ．Ｍａｕｄｅ，Ｄ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｄ．Ｔ．Ｔｅａｃｈｅｙ，Ｓ．Ａ．Ｇｒｕｐｐ，Ｍａｎａｇｉｎｇ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｎｏｖｅｌ Ｔ ｃｅｌｌ－ｅｎｇａｇｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｊ ２０，１１９－１２２（２０１４））。ここでは、ＴＳＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体およびＰＤ－１ ｍＡｂの併用療法が、免疫担当マウス腫瘍モデルにおける長期記憶反応に関連する腫瘍特異的Ｔ細胞活性化を誘発することが初めて実証された。ＴＳＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体は、「シグナル１」がない場合、活性が制限されるか、全く活性がなく、ＰＤ－１遮断は、腫瘍ペプチドに対する内在性抗原特異的Ｔ細胞応答に依存する（Ｗ．Ｈｕｇｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ Ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ａｎｔｉ－ＰＤ－１ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｃｅｌｌ １６５，３５－４４（２０１６）、Ｎ．Ａ．Ｒｉｚｖｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ＰＤ－１ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｉｎ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４８，１２４－１２８（２０１５）、Ｊ．Ｍ．Ｍｅｈｎｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ ｉｎ ＰＯＬＥ－ｍｕｔａｎｔ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２６，２３３４－２３４０（２０１６）、Ｄ．Ｔ．Ｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ ｔｏ ＰＤ－１ ｂｌｏｃｋａｄｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５７，４０９－４１３（２０１７））。したがって、内在性腫瘍抗原によって提供される「シグナル１」は、ＰＳＭＡ×ＣＤ２８とＰＤ－１ ｍＡｂの併用療法にとって重要である。これは、ＴＣＲ特異性とは無関係にＴ細胞を活性化するＣＤ３二重特異性抗体とは対照的であり、したがって、長寿命の腫瘍特異的免疫を生成しない可能性がある。実際、ＰＳＭＡ×ＣＤ３とＰＳＭＡ×ＣＤ２８との併用処置は、強力な抗腫瘍効果を誘発するが、強力な記憶反応を引き起こさないことがわかった。さらに、ＭＣ３８腫瘍細胞は、ｐ１５Ｅなどの再活性化された内在性レトロウイルスペプチドを高レベルで発現し、Ｃ５７ＢＬ６マウスは、このネオエピトープを認識して応答する内在性Ｔ細胞を生成できることが示されている（Ｊ．Ｃ．Ｙａｎｇ，Ｄ．Ｐｅｒｒｙ－Ｌａｌｌｅｙ，Ｔｈｅ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｍｕｒｉｎｅ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｉｓ ａ ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｔ－ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｕｒｉｎｅ ｔｕｍｏｒｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２３，１７７－１８３（２０００）、Ｈ．Ｊ．Ｚｅｈ，３ｒｄ，Ｄ．Ｐｅｒｒｙ－Ｌａｌｌｅｙ，Ｍ．Ｅ．Ｄｕｄｌｅｙ，Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｃ．Ｙａｎｇ，Ｈｉｇｈ ａｖｉｄｉｔｙ ＣＴＬｓ ｆｏｒ ｔｗｏ ｓｅｌｆ－ａｎｔｉｇｅｎｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｉｃａｃｙ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６２，９８９－９９４（１９９９））。本明細書に記載されるＭＣ３８モデルでは、ＰＳＭＡ×ＣＤ２８とＰＤ－１ ｍＡｂとの併用療法により、このｐ１５Ｅネオ抗原に応答するＴ細胞の数が増加したことが実証された。さらに、ＰＳＭＡ×ＣＤ２８とＰＤ－１ ｍＡｂとの組み合わせが、機能不全の少ないＣＤ８ Ｔ細胞をもたらし、強力な腫瘍内メモリーＴ細胞表現型を促進することが、腫瘍浸潤Ｔ細胞の広範なプロファイリングを通じて本明細書で見出された。したがって、ＣＤ２８二重特異性抗体は、ＰＤ－１遮断と一緒に、内在性ＴＣＲ／ＣＤ３依存性Ｔ細胞応答を促進し、耐久性のある抗腫瘍反応を促進する。

【0317】

本明細書でのデータは、ＰＤ－Ｌ１が標的細胞によって発現されると、ＰＤ－１が免疫シナプスに蓄積され、その蓄積が、シナプスでのＣＤ２８の低減に関連していることを示し、これは、ＰＤ－１が、シナプスへのＣＤ２８局在を防止することによって、Ｔ細胞阻害を行使できることを示唆している。さらに、本明細書では、ＰＤ－１遮断が、ＰＤ－１シナプス局在化を防止する一方で、シナプスでのＣＤ２８蓄積が増加し、ＴＳＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体が、ＰＤ－１ ｍＡｂがＴ細胞活性化を促進する能力を著しく強化できることがわかった。これは、ＰＤ－１ブロッキング抗体が、Ｔ細胞の活性化を促進する機序のうちの１つであり得る。全体として、ＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１相互作用および／またはＰＤ－１阻害後の免疫シナプスにおけるＰＤ－１およびＣＤ２８の局在の視覚化により、Ｔ細胞活性化に対するＰＤ－１遮断の影響、ならびに免疫シナプスのレベルでのＴＳＡ×ＣＤ２８とＰＤ－１ ｍＡｂとの間の相乗効果をよりよく理解することができる。

【0318】

ＰＤ－１ ｍＡｂは、重要な新しいクラスの免疫療法であるが、多くの場合、抗腫瘍活性のさらなる最適化が確実に重要になる。ＣＡＲ－Ｔアプローチが、「シグナル１」および「シグナル２」の両方を人工的に活性化して抗腫瘍活性を改善するキメラ受容体を採用したように（Ｅ．Ａ．Ｚｈｕｋｏｖｓｋｙ，Ｒ．Ｊ．Ｍｏｒｓｅ，Ｍ．Ｖ．Ｍａｕｓ，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ＣＡＲｓ：ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４０，２４－３５（２０１６）、Ａ．Ｉ．Ｓａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ｋｉｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｔｈａｔ ａｆｆｅｃｔ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ １１，（２０１８））、ＰＤ－１阻害をＣＤ２８二重特異性抗体（「シグナル２」を提供する）と組み合わせて抗腫瘍活性を強化することの潜在的な利点が示されている。このアプローチには、各患者に個別にカスタマイズする必要のある面倒な細胞療法の準備が不要であるという点で、ＣＡＲ－Ｔ療法に比べていくつかの実用的な利点があり、また、多くの場合、患者が細胞療法を受け入れることができなくなるような有害作用に関連している毒性化学療法によって、患者を先制的に「リンパ球枯渇」させる必要もない（Ｃ．Ｈ．Ｊｕｎｅ，Ｒ．Ｓ．Ｏ´Ｃｏｎｎｏｒ，Ｏ．Ｕ．Ｋａｗａｌｅｋａｒ，Ｓ．Ｇｈａｓｓｅｍｉ，Ｍ．Ｃ．Ｍｉｌｏｎｅ，ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５９，１３６１－１３６５（２０１８））。この二重特異性アプローチは、その作用の特異性を通じて、有効性の向上と安全性の向上の可能性を提供する。まとめると、これらのデータは、ＣＤ２８ベースの二重特異性抗体と、セミプリマブなどの臨床的に検証されたＰＤ－１ ｍＡｂとを組み合わせると、著しく強化された相乗的な抗腫瘍活性を備えた、耐容性の高い「既製の」生物製剤ソリューションを提供できることを示唆する。

【0319】

本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されたものに加えて本発明の様々な修正は、前述の記載および添付の図から当業者には明らかであろう。そのような変更は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図5G】

【図5H】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図7F】

【図7G】

【図7H】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図9E】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19A】

【図19B】

【図19C】

【図19D】

【図20A】

【図20B】

【図20C】

【図20D】

【図20E】

【図21A】

【図21B】

【図21C】

【図22A】

【図22B】

【図22C】

【図22D】

【図23A】

【図23B】

【図24】

【図25】

【図26A】

【図26B】

【図26C】

【図27】

【図28】

【図29A】

【図29B】

【配列表】

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