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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B1)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-05-08
(45)【発行日】2025-05-16
(54)【発明の名称】抗ＩｇＥ抗体誘導用ワクチン組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 39/00 20060101AFI20250509BHJP
A61P 11/02 20060101ALI20250509BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20250509BHJP
A61P 17/04 20060101ALI20250509BHJP
A61P 27/14 20060101ALI20250509BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20250509BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20250509BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20250509BHJP
C07K 14/00 20060101ALI20250509BHJP
【ＦＩ】
A61K39/00 H ZNA
A61P11/02
A61P11/06
A61P17/04
A61P27/14
A61P37/04
A61P37/08
C07K19/00
C07K14/00
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2024575628
(86)(22)【出願日】2024-11-08
(86)【国際出願番号】 JP2024039742
【審査請求日】2024-12-23
(31)【優先権主張番号】P 2023191836
(32)【優先日】2023-11-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】514055277
【氏名又は名称】株式会社ファンペップ
(73)【特許権者】
【識別番号】504176911
【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100152308
【弁理士】
【氏名又は名称】中 正道
(74)【代理人】
【識別番号】100201558
【弁理士】
【氏名又は名称】亀井 恵二郎
(72)【発明者】
【氏名】川畑 壮大朗
(72)【発明者】
【氏名】坂口 誠
(72)【発明者】
【氏名】中神 啓徳
(72)【発明者】
【氏名】林 宏樹
(72)【発明者】
【氏名】森下 竜一
【審査官】渡邉 潤也
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／１６４４０９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２００２－５３７４０３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００４－５１４６５５（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第００／０７４７１６（ＷＯ，Ａ２）
【文献】国際公開第２００１／０４５７４５（ＷＯ，Ａ２）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ
Ｃ０７
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｔ細胞受容体抗原ペプチドとＢ細胞受容体抗原ペプチドとの複合体を含む、ＩｇＥに対する抗体の産生を誘導し得るワクチン組成物であって、該Ｂ細胞受容体抗原ペプチドが、配列番号２０～２２のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる、ワクチン組成物であって、ここで、Ｔ細胞受容体抗原ペプチドが配列番号１で表されるアミノ酸配列である、ワクチン組成物。
【請求項2】
複合体が、Ｔ細胞受容体抗原ペプチドのＣ末端とＢ細胞受容体抗原ペプチドのＮ末端との間で結合している、請求項１記載のワクチン組成物。
【請求項3】
Ｔ細胞受容体抗原ペプチドとＢ細胞受容体抗原ペプチドとがリンカーを介して結合されている、請求項１または２記載のワクチン組成物。
【請求項4】
ＩｇＥの過剰分泌を伴う疾患の治療または予防のための、請求項１または２記載のワクチン組成物。
【請求項5】
ＩｇＥの過剰分泌を伴う疾患が、喘息、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、結膜炎、湿疹、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、およびアナフィラキシー性過敏症、からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項４記載のワクチン組成物。
【請求項6】
以下のアミノ酸配列を有するペプチド：Ａｃ－ＥＬＫＬＩＦＬＨＲＬＫＲＬＲＫＲＬＫＲＫ－Ａｈｘ－ＧＫＰＶＮＨＳＴＲＫＥＥＫＱＲＮＧＴ－ＮＨ２
（式中、Ａｃは、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基がアセチル化されていることを示し、Ａｈｘは、ε－アミノカプロン酸を示し、ＮＨ２は、Ｃ末端のアミノ酸残基のカルボキシル基がアミド化されていることを示す。）
【請求項7】
以下のアミノ酸配列を有するペプチド：Ａｃ－ＥＬＫＬＩＦＬＨＲＬＫＲＬＲＫＲＬＫＲＫ－Ａｈｘ－ＳＧＫＰＶＮＨＳＴＲＫＥＥＫＱＲＮＧＴ－ＮＨ２
（式中、Ａｃは、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基がアセチル化されていることを示し、Ａｈｘは、ε－アミノカプロン酸を示し、ＮＨ２は、Ｃ末端のアミノ酸残基のカルボキシル基がアミド化されていることを示す。）
【請求項8】
以下のアミノ酸配列を有するペプチド：Ａｃ－ＥＬＫＬＩＦＬＨＲＬＫＲＬＲＫＲＬＫＲＫ－Ａｈｘ－ＡＳＧＫＰＶＮＨＳＴＲＫＥＥＫＱＲＮＧＴ－ＮＨ２
（式中、Ａｃは、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基がアセチル化されていることを示し、Ａｈｘは、ε－アミノカプロン酸を示し、ＮＨ２は、Ｃ末端のアミノ酸残基のカルボキシル基がアミド化されていることを示す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ワクチン組成物に関し、詳細には、生体内においてＩｇＥに対する抗体を誘導することができるワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
ＩｇＥは、Ｉ型アレルギー疾患（例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、蕁麻疹等）におけるアレルギー応答を媒介する免疫グロブリンファミリーの一種である。ＩｇＥがＩ型アレルギー疾患を引き起こすメカニズムは簡潔には次の通りである：ＩｇＥがマスト細胞や好塩基球の細胞表面上に存在する高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲ１）に結合し、さらに、アレルゲンが当該ＩｇＥに結合して架橋を形成すると、マスト細胞や好塩基球がヒスタミンを始めとする化学伝達物質を放出する。放出された化学伝達物質によって、血管の拡張や血管の透過性が亢進する。その結果として種々のアレルギー症状が生じる。
【0003】
Ｉ型アレルギー疾患の治療薬の一つとして、抗ＩｇＥモノクローナル抗体であるオマリズマブ（商品名Ｘｏｌａｉｒ（登録商標））が市販されている。オマリズマブは、血中のフリーのＩｇＥに特異的に結合し、これを除去することによってマスト細胞の表面にあるＦｃεＲ１とＩｇＥとの結合頻度を低減させることにより、マスト細胞の活性化を抑制する。
【0004】
オマリズマブは重度の喘息に対して一定の効果を有し、アレルギー疾患に対しての有効な治療薬の一つであるが、依然としていくつかの改善点を有している。例えば、オマリズマブはヒト化マウスモノクローナル抗体であり、ヒト患者において使用する際の免疫学的反応を完全には回避することができない。また、抗体医薬は高価であり、オマリズマブを用いた治療に伴う費用は患者一人当たり年間１５，０００～４４，０００米ドルであると言われている。さらに、抗体医薬は投与方法が限定されるなどのデメリットも存在する。かかる背景から、より安全で低コストであるアレルギー疾患治療方法の開発が強く求められている。
【0005】
かかるデメリットを克服するために、生体に投与することで抗ＩｇＥ抗体を誘導し得る抗原ペプチドなどの代替手段の開発が鋭意進められている。例えば、特許文献１には抗ＩｇＥ抗体を誘導し得るＩｇＥ免疫原構築物が開示されている。しかしながら、効率よく抗ＩｇＥ抗体を誘導し得るＩｇＥ免疫原の開発は常に求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【文献】ＷＯ２０１００６７２８６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
上述した背景から、本発明は、極めて効率よく抗ＩｇＥ抗体を誘導できる新規のＩｇＥ免疫原を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、上記課題に対して鋭意検討した結果、特定のアミノ酸配列を有するＴ細胞受容体抗原ペプチドと、ＩｇＥのＦｃ領域中のＣε３領域における特定のアミノ酸配列を有するＢ細胞受容体抗原ペプチドとの複合体が、生体内において極めて効率よく抗ＩｇＥ中和抗体を誘導し得ることを見出した。本発明者らの見出した複合体は、優れたＩｇＥ免疫原性を有し、ＩｇＥ中和活性の高い抗体を効率よく誘導できた。
本発明者らは、かかる知見に基づいてさらに研究を進めることによって本発明を完成するに至った。
本発明者らは、かかる知見に基づいてさらに研究を進めることによって本発明を完成するに至った。
【0009】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］
Ｔ細胞受容体抗原ペプチドとＢ細胞受容体抗原ペプチドとの複合体を含む、ＩｇＥに対する抗体の産生を誘導し得るワクチン組成物であって、該Ｂ細胞受容体抗原ペプチドが、配列番号２０～２２のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、ワクチン組成物。
［２］
Ｔ細胞受容体抗原ペプチドが配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、［１］記載のワクチン組成物。
［３］
複合体が、Ｔ細胞受容体抗原ペプチドのＣ末端とＢ細胞受容体抗原ペプチドのＮ末端との間で結合している、［１］または［２］記載のワクチン組成物。
［４］
Ｔ細胞受容体抗原ペプチドとＢ細胞受容体抗原ペプチドとがリンカーを介して結合されている、［１］～［３］のいずれか記載のワクチン組成物。
［５］
ＩｇＥの過剰分泌を伴う疾患の治療または予防のための、［１］～［４］のいずれか記載のワクチン組成物。
［６］
ＩｇＥの過剰分泌を伴う疾患が、喘息、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、結膜炎、湿疹、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、およびアナフィラキシー性過敏症、からなる群から選択される少なくとも１つである、［５］記載のワクチン組成物。
［Ａ－１］
Ｔ細胞受容体抗原ペプチドとＢ細胞受容体抗原ペプチドとの複合体を含む、ＩｇＥに対する抗体の産生を誘導し得るワクチン組成物を対象に投与することを含む、対象におけるＩｇＥの過剰分泌を伴う疾患の治療または予防のための方法であって、該Ｂ細胞受容体抗原ペプチドが、配列番号２０～２２のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、方法。
［Ａ－２］
Ｔ細胞受容体抗原ペプチドが配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、［Ａ－１］記載の方法。
［Ａ－３］
複合体が、Ｔ細胞受容体抗原ペプチドのＣ末端とＢ細胞受容体抗原ペプチドのＮ末端との間で結合している、［Ａ－１］または［Ａ－２］記載の方法。
［Ａ－４］
Ｔ細胞受容体抗原ペプチドとＢ細胞受容体抗原ペプチドとがリンカーを介して結合されている、［Ａ－１］～［Ａ－３］のいずれか記載の方法。
［Ａ－５］
ＩｇＥの過剰分泌を伴う疾患が、喘息、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、結膜炎、湿疹、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、およびアナフィラキシー性過敏症、からなる群から選択される少なくとも１つである、［Ａ－１］～［Ａ－４］のいずれか記載の方法。
［Ｂ－１］
ＩｇＥの過剰分泌を伴う疾患の治療または予防における使用のための、Ｔ細胞受容体抗原ペプチドとＢ細胞受容体抗原ペプチドとの複合体を含む、ＩｇＥに対する抗体の産生を誘導し得るワクチン組成物であって、該Ｂ細胞受容体抗原ペプチドが、配列番号２０～２２のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、ワクチン組成物。
［Ｂ－２］
Ｔ細胞受容体抗原ペプチドが配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、［Ｂ－１］記載の使用のためのワクチン組成物。
［Ｂ－３］
複合体が、Ｔ細胞受容体抗原ペプチドのＣ末端とＢ細胞受容体抗原ペプチドのＮ末端との間で結合している、［Ｂ－１］または［Ｂ－２］記載の使用のためのワクチン組成物。
［Ｂ－４］
Ｔ細胞受容体抗原ペプチドとＢ細胞受容体抗原ペプチドとがリンカーを介して結合されている、［Ｂ－１］～［Ｂ－３］のいずれか記載の使用のためのワクチン組成物。
［Ｂ－５］
ＩｇＥの過剰分泌を伴う疾患が、喘息、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、結膜炎、湿疹、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、およびアナフィラキシー性過敏症、からなる群から選択される少なくとも１つである、［Ｂ－１］～［Ｂ－４］のいずれか記載の使用のためのワクチン組成物。
［Ｃ－１］
ＩｇＥの過剰分泌を伴う疾患を治療または予防するための医薬の製造における、Ｔ細胞受容体抗原ペプチドとＢ細胞受容体抗原ペプチドとの複合体を含む、ＩｇＥに対する抗体の産生を誘導し得るワクチン組成物の使用であって、該Ｂ細胞受容体抗原ペプチドが、配列番号２０～２２のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、使用。
［Ｃ－２］
Ｔ細胞受容体抗原ペプチドが配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、［Ｃ－１］記載の使用。
［Ｃ－３］
複合体が、Ｔ細胞受容体抗原ペプチドのＣ末端とＢ細胞受容体抗原ペプチドのＮ末端との間で結合している、［Ｃ－１］または［Ｃ－２］記載の使用。
［Ｃ－４］
Ｔ細胞受容体抗原ペプチドとＢ細胞受容体抗原ペプチドとがリンカーを介して結合されている、［Ｃ－１］～［Ｃ－３］のいずれか記載の使用。
［Ｃ－５］
ＩｇＥの過剰分泌を伴う疾患が、喘息、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、結膜炎、湿疹、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、およびアナフィラキシー性過敏症、からなる群から選択される少なくとも１つである、［Ｃ－１］～［Ｃ－４］のいずれか記載の使用。
［１］
Ｔ細胞受容体抗原ペプチドとＢ細胞受容体抗原ペプチドとの複合体を含む、ＩｇＥに対する抗体の産生を誘導し得るワクチン組成物であって、該Ｂ細胞受容体抗原ペプチドが、配列番号２０～２２のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、ワクチン組成物。
［２］
Ｔ細胞受容体抗原ペプチドが配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、［１］記載のワクチン組成物。
［３］
複合体が、Ｔ細胞受容体抗原ペプチドのＣ末端とＢ細胞受容体抗原ペプチドのＮ末端との間で結合している、［１］または［２］記載のワクチン組成物。
［４］
Ｔ細胞受容体抗原ペプチドとＢ細胞受容体抗原ペプチドとがリンカーを介して結合されている、［１］～［３］のいずれか記載のワクチン組成物。
［５］
ＩｇＥの過剰分泌を伴う疾患の治療または予防のための、［１］～［４］のいずれか記載のワクチン組成物。
［６］
ＩｇＥの過剰分泌を伴う疾患が、喘息、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、結膜炎、湿疹、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、およびアナフィラキシー性過敏症、からなる群から選択される少なくとも１つである、［５］記載のワクチン組成物。
［Ａ－１］
Ｔ細胞受容体抗原ペプチドとＢ細胞受容体抗原ペプチドとの複合体を含む、ＩｇＥに対する抗体の産生を誘導し得るワクチン組成物を対象に投与することを含む、対象におけるＩｇＥの過剰分泌を伴う疾患の治療または予防のための方法であって、該Ｂ細胞受容体抗原ペプチドが、配列番号２０～２２のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、方法。
［Ａ－２］
Ｔ細胞受容体抗原ペプチドが配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、［Ａ－１］記載の方法。
［Ａ－３］
複合体が、Ｔ細胞受容体抗原ペプチドのＣ末端とＢ細胞受容体抗原ペプチドのＮ末端との間で結合している、［Ａ－１］または［Ａ－２］記載の方法。
［Ａ－４］
Ｔ細胞受容体抗原ペプチドとＢ細胞受容体抗原ペプチドとがリンカーを介して結合されている、［Ａ－１］～［Ａ－３］のいずれか記載の方法。
［Ａ－５］
ＩｇＥの過剰分泌を伴う疾患が、喘息、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、結膜炎、湿疹、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、およびアナフィラキシー性過敏症、からなる群から選択される少なくとも１つである、［Ａ－１］～［Ａ－４］のいずれか記載の方法。
［Ｂ－１］
ＩｇＥの過剰分泌を伴う疾患の治療または予防における使用のための、Ｔ細胞受容体抗原ペプチドとＢ細胞受容体抗原ペプチドとの複合体を含む、ＩｇＥに対する抗体の産生を誘導し得るワクチン組成物であって、該Ｂ細胞受容体抗原ペプチドが、配列番号２０～２２のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、ワクチン組成物。
［Ｂ－２］
Ｔ細胞受容体抗原ペプチドが配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、［Ｂ－１］記載の使用のためのワクチン組成物。
［Ｂ－３］
複合体が、Ｔ細胞受容体抗原ペプチドのＣ末端とＢ細胞受容体抗原ペプチドのＮ末端との間で結合している、［Ｂ－１］または［Ｂ－２］記載の使用のためのワクチン組成物。
［Ｂ－４］
Ｔ細胞受容体抗原ペプチドとＢ細胞受容体抗原ペプチドとがリンカーを介して結合されている、［Ｂ－１］～［Ｂ－３］のいずれか記載の使用のためのワクチン組成物。
［Ｂ－５］
ＩｇＥの過剰分泌を伴う疾患が、喘息、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、結膜炎、湿疹、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、およびアナフィラキシー性過敏症、からなる群から選択される少なくとも１つである、［Ｂ－１］～［Ｂ－４］のいずれか記載の使用のためのワクチン組成物。
［Ｃ－１］
ＩｇＥの過剰分泌を伴う疾患を治療または予防するための医薬の製造における、Ｔ細胞受容体抗原ペプチドとＢ細胞受容体抗原ペプチドとの複合体を含む、ＩｇＥに対する抗体の産生を誘導し得るワクチン組成物の使用であって、該Ｂ細胞受容体抗原ペプチドが、配列番号２０～２２のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、使用。
［Ｃ－２］
Ｔ細胞受容体抗原ペプチドが配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、［Ｃ－１］記載の使用。
［Ｃ－３］
複合体が、Ｔ細胞受容体抗原ペプチドのＣ末端とＢ細胞受容体抗原ペプチドのＮ末端との間で結合している、［Ｃ－１］または［Ｃ－２］記載の使用。
［Ｃ－４］
Ｔ細胞受容体抗原ペプチドとＢ細胞受容体抗原ペプチドとがリンカーを介して結合されている、［Ｃ－１］～［Ｃ－３］のいずれか記載の使用。
［Ｃ－５］
ＩｇＥの過剰分泌を伴う疾患が、喘息、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、結膜炎、湿疹、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、およびアナフィラキシー性過敏症、からなる群から選択される少なくとも１つである、［Ｃ－１］～［Ｃ－４］のいずれか記載の使用。
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、生体内において非常に効率よく抗ＩｇＥ抗体の産生を誘導できる。従って、Ｉ型アレルギー性疾患等のＩｇＥの過剰分泌を伴う疾患の安価かつ安全な治療および／または予防が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】図１は、配列番号２～３４のいずれかのＢ細胞エピトープ配列を有するＡＪＰ００１コンジュゲートペプチドを投与したマウス由来の抗血清におけるＩｇＥ合成ペプチドに対する抗体価をＥＬＩＳＡ法で測定した結果、および、配列番号１６～２８のいずれかのＢ細胞エピトープ配列を有するＡＪＰ００１コンジュゲートペプチドを投与したマウス由来の抗血清におけるヒトＩｇＥに対する抗体価をＥＬＩＳＡ法で測定した結果を示す図である。（ＧＭＴ±９５％ＣＩ（Ｎ＝４））
【図2】図２は、配列番号１６および２０～２４のいずれかのＢ細胞エピトープ配列を有するＡＪＰ００１コンジュゲートペプチドを投与したラット抗血清の中和活性評価（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの発現阻害、Ｍｅａｎ±ＳＤ（Ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ））の結果を示す図である。
【図3】図３は、Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ＩｇＥ／ＦｃεＲ１ Ｔｇマウスへ配列番号２０または２１のＢ細胞エピトープ配列を有するＡＪＰ００１コンジュゲートペプチドを投与したときの、マウス血清の各ＡＪＰ００１コンジュゲートペプチドまたはヒトＩｇＥに対する抗体価（ＧＭＴ±９５％ＣＩ、（Ｎ＝８））を示す図である。
【図4】図４は、Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ＩｇＥ／ＦｃεＲ１ Ｔｇマウスへ配列番号２０または２１のＢ細胞エピトープ配列を有するＡＪＰ００１コンジュゲートペプチドを投与したときの、当該マウスの血清中の複合体濃度（Ｍｅａｎ±ＳＥ（Ｎ＝７ｏｒ８））を示す図である。
【図5】図５は、Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ＩｇＥ／ＦｃεＲ１ Ｔｇマウスへ配列番号２０または２１のＢ細胞エピトープ配列を有するＡＪＰ００１コンジュゲートペプチドを投与したときの、当該マウスにおける鼻掻き行動回数（Ｍｅａｎ±ＳＥ（Ｎ＝８）、＊＊： ｐ＜ ０．０１ ｖｓ ＯＶＡ ｇｒｏｕｐ （ｔ ｔｅｓｔ）、♯♯： ｐ＜ ０．０１ ｖｓ ＯＶＡ＋Ａｄｊｕｖａｎｔ ｇｒｏｕｐ （ｔ ｔｅｓｔ））、および、当該回数と複合体濃度との相関図（Ｓｐｅａｒｍａｎ’ｓ ｒａｎｋ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0012】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0013】
１．ワクチン組成物
本発明は、Ｔ細胞受容体抗原ペプチドとＢ細胞受容体抗原ペプチドとの複合体を含む、ＩｇＥに対する抗体の産生を誘導し得るワクチン組成物であって、該Ｂ細胞受容体抗原ペプチドが、配列番号２０～２２のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、ワクチン組成物（以下、「本発明のワクチン組成物」と称することがある）を提供する。
本発明は、Ｔ細胞受容体抗原ペプチドとＢ細胞受容体抗原ペプチドとの複合体を含む、ＩｇＥに対する抗体の産生を誘導し得るワクチン組成物であって、該Ｂ細胞受容体抗原ペプチドが、配列番号２０～２２のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、ワクチン組成物（以下、「本発明のワクチン組成物」と称することがある）を提供する。
【0014】
本明細書に記載されるペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。本発明のワクチン組成物において有効成分として含まれるペプチド複合体は、Ｃ末端がカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）、カルボキシレート(－ＣＯＯ－）、アミド（－ＣＯＮＨ２）またはエステル（－ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
【0015】
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチルなどのＣ１－６アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３－８シクロアルキル基；例えば、フェニル、α－ナフチルなどのＣ６－１２アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル－Ｃ１－２アルキル基；α－ナフチルメチルなどのα－ナフチル－Ｃ１－２アルキル基などのＣ７－１４アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
【0016】
該ペプチド複合体がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明におけるペプチド複合体に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
【0017】
さらに、該ペプチド複合体には、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１－６アルカノイルなどのＣ１－６アシル基など）で保護されているもの、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基がアセチル化されているもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば－ＯＨ、－ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１－６アルカノイル基などのＣ１－６アシル基など）で保護されているものなども含まれる。一実施態様においては、該ペプチド複合体は、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基がアセチル化され、および／または、Ｃ末端のカルボキシル基がアミド化されている。
【0018】
本発明のワクチン組成物において有効成分として含まれるペプチド複合体は、その一部にＢ細胞受容体抗原ペプチドを含む。ここで、Ｂ細胞受容体とは、Ｂ細胞表面に発現する受容体である。抗原ペプチドによって刺激を受けたＢ細胞は増殖し、当該Ｂ細胞受容体を抗原ペプチドに対する抗体として分泌する。
【0019】
本発明のワクチン組成物におけるＢ細胞受容体抗原ペプチドは、配列番号２０～２２のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む。配列番号２０～２２で表されるアミノ酸配列は、具体的には、次の通りである：
【0020】
ＧＫＰＶＮＨＳＴＲＫＥＥＫＱＲＮＧＴ（配列番号２０）
ＳＧＫＰＶＮＨＳＴＲＫＥＥＫＱＲＮＧＴ（配列番号２１）
ＡＳＧＫＰＶＮＨＳＴＲＫＥＥＫＱＲＮＧＴ（配列番号２２）
ＳＧＫＰＶＮＨＳＴＲＫＥＥＫＱＲＮＧＴ（配列番号２１）
ＡＳＧＫＰＶＮＨＳＴＲＫＥＥＫＱＲＮＧＴ（配列番号２２）
【0021】
本発明の一態様において、Ｂ細胞受容体抗原ペプチドは、配列番号２０～２２のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり得る。
【0022】
本発明のワクチン組成物に含まれる複合体の一部はＴ細胞受容体抗原ペプチドである。Ｔ細胞受容体抗原ペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩと複合体を形成し、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体とＣＤ４によって認識され、ＣＤ３陽性細胞内へシグナルを伝達する抗原ペプチドであれば特に制限されない。ＭＨＣクラスＩＩは、例えば、ヒトの場合ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱおよびＨＬＡ－ＤＰ、マウスの場合、Ｈ－２ＡまたはＨ－２Ｂが挙げられ、それぞれα鎖とβ鎖（例えばＨＬＡ－ＤＲは、α鎖であるＨＬＡ－ＤＲＡとβ鎖であるＨＬＡ－ＤＲＢ１）からなる二量体であり、好ましくは、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱまたはＨＬＡ－ＤＰである。
【0023】
本発明のワクチン組成物において、Ｔ細胞受容体抗原ペプチドとしては、抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子上に提示されてヘルパーＴ細胞を活性化し得るエピトープ配列を含むものであれば特に制限はないが、例えば、本発明者らが開発したＡＪＰ００１ペプチド（ＥＬＫＬＩＦＬＨＲＬＫＲＬＲＫＲＬＫＲＫ（配列番号１）、詳細はＷＯ２０１６／０４７７６３を参照）のほか、ＵＢＩＴｈペプチド（ＵＢＩＴｈ（登録商標）１：ＩＳＩＴＥＩＫＧＶＩＶＨＲＩＥＴＩＬＦ（配列番号３５）、ＵＢＩＴｈ（登録商標）２：ＫＫＫＩＩＴＩＴＲＩＩＴＩＩＴＴＩＤ（配列番号３６）、ＵＢＩＴｈ（登録商標）３：ＩＳＩＳＥＩＫＧＶＩＶＨＫＩＥＴＩＬＦ（配列番号３７）、ＩＳＩＴＥＩＲＴＶＩＶＴＲＩＥＴＩＬＦ（配列番号３８）、詳細はＵＳ ｐａｔｅｎｔ ｎｏ．９，１０２，７５２を参照）、Ｔｅｔａｎｏｕｓ ｔｏｘｉｓｏｉｄペプチド（ＴＴａａ８３０－８４３ ｐｅｐｔｉｄｅ：ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥ（配列番号３９））等を使用することができる。ＡＪＰ００１は、ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化を介してＩＬ－β１やＩＬ－１８の分泌を誘導し、ＮＦ－κＢ経路を通じてＴＮＦ－αやＩＬ－６の産生を誘導することにより自然免疫系をも活性化することができるので、本発明におけるＴ細胞受容体抗原ペプチドとして特に好ましい。
【0024】
本発明のワクチン組成物において、Ｔ細胞受容体抗原ペプチドとＢ細胞受容体抗原ペプチドとは結合して複合体を形成するが、当該結合は一方のペプチド鎖の末端と他方のペプチド鎖の末端との連結であっても、一方のペプチドのアミノ酸側鎖と他方のペプチド鎖の末端との結合や両方のアミノ酸側鎖同士の結合であってもよいが、好ましくは一方のペプチド鎖の末端と他方のペプチド鎖の末端との連結であり、より好ましくは一方のペプチド鎖のＣ末端と他方のペプチド鎖のＮ末端との連結であり、さらに好ましくはＴ細胞受容体抗原ペプチドのＣ末端とＢ細胞受容体抗原ペプチドのＮ末端との連結である。一方のペプチド鎖の末端と他方のペプチド鎖の末端とが連結される場合、両者は末端アミノ酸同士がペプチド結合により直接連結されていてもよく、あるいはリンカー（本明細書において「スペーサー」ともいう）を介して連結されていてもよい。リンカーは、Ｔ細胞受容体抗原ペプチドとＢ細胞受容体抗原ペプチドを連結でき、抗原提示細胞内に取り込まれてＴ細胞受容体抗原ペプチド中のヘルパーＴ細胞エピトープを遊離・ＭＨＣクラスＩＩ分子上に提示できるものであれば特に限定されない。例えば、ε－アミノカプロン酸、β－アミノアラニン、γ－アミノ酪酸、７－アミノヘプタン酸、１２－アミノラウリン酸、ｐ－アミノ安息香酸等のα－アミノ酸以外のアミノ酸を用いることができる。また、天然のタンパク質に存在するＬ－アミノ酸（例、グルタミン酸、システイン、リジン）やそれらのＤ－アミノ酸も用いることができる。好ましい一態様において、アミノ酸リンカーは、ε－アミノカプロン酸である。あるいは任意の２～１５アミノ酸からなるペプチドリンカーを用いることもできる。例えば、グリシン（Ｇｌｙ）又はメチル化グリシン（ＭｅＧ）からなるペプチドリンカーであるＧリンカー、Ｇｌｙ又はＭｅＧとＳｅｒからなるペプチドリンカーであるＧＳリンカー等を挙げることができるが、それらに限定されない。別の実施態様においては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリエチレングリコールの誘導体を含むＰＥＧリンカーを用いることもできる。ＰＥＧリンカーにグリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アルギニン（Ａｒｇ）及びリジン（Ｌｙｓ）から選ばれる１つ以上をさらに含ませたものも用いることができる。
【0025】
一態様において、Ｂ細胞受容体抗原ペプチドとＴ細胞受容体抗原ペプチドが連結された複合体は付加的なアミノ酸をさらに含んでいてもよい。このようなアミノ酸の付加は、本発明のワクチン組成物の所望の効果が得られる限り許容される。付加されるアミノ酸配列は、特に限定されないが、例えば複合体の検出や精製等を容易にならしめるためのタグを挙げることができる。タグとしては、Ｆｌａｇタグ、ヒスチジンタグ、ｃ－Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＡＵ１タグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、蛍光タンパク質タグ（例えばＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ等）、イムノグロブリンＦｃタグ等が挙げられる。アミノ酸配列が付加される位置は、特に限定されないが、好ましくは複合体のＮ末端および／またはＣ末端である。
また、別の一態様において、本発明のワクチン組成物における複合体は、上述したタグ以外の他の機能性分子と結合されていてもよい。かかる機能性分子は、本発明のワクチン組成物が所望の効果を奏する限り、特に限定されない。かかる機能性分子としては、本発明のワクチン組成物が生体内に投与されたときに複合体の分解を抑制する機能を有する分子などが挙げられるがこれらに限定されない。
また、別の一態様において、本発明のワクチン組成物における複合体は、上述したタグ以外の他の機能性分子と結合されていてもよい。かかる機能性分子は、本発明のワクチン組成物が所望の効果を奏する限り、特に限定されない。かかる機能性分子としては、本発明のワクチン組成物が生体内に投与されたときに複合体の分解を抑制する機能を有する分子などが挙げられるがこれらに限定されない。
【0026】
本発明のワクチン組成物における複合体は、公知の一般的なペプチド合成のプロトコールに従って、固相合成法（Ｆｍｏｃ法およびＢｏｃ法）または液相合成法により製造することができる。Ｂ細胞受容体抗原ペプチドとＴ細胞受容体抗原ペプチドが直接またはアミノ酸もしくはペプチドリンカーを介して連結された複合体である場合は、当該複合体全体を一度に合成することができる。また、Ｂ細胞受容体抗原ペプチドとＴ細胞受容体抗原ペプチドを別々に合成し、その後に２つのペプチドを直接またはリンカーを介して連結させてもよい。
【0027】
一態様において、本発明のワクチン組成物におけるペプチド複合体はその免疫原性を高めるためにキャリアたんぱく質とコンジュゲートさせたものでもよい。キャリアたんぱく質は、一般には、分子量が小さいために免疫原性を有さない分子（ハプテン）に結合して免疫原性を付与する物質であり、当技術分野で公知であるものがある。キャリアたんぱく質の例としては、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリン（ＴＧ）、ジフテリア毒素のアミノ酸の一部を置き換えて無毒化したジフテリア毒素（ＣＲＭ１９７）、免疫グロブリン等などが挙げられる。キャリアたんぱく質は本発明のワクチン組成物における複合体のＮ末端またはＣ末端にコンジュゲートすることができる。コンジュゲートする方法としては、本発明の抗原ペプチドにシステイン残基を導入し、当該システインの側鎖であるＳＨ基を介してキャリアたんぱく質のアミノ基と結合させることによってコンジュゲートすることができる（ＭＢＳ法）。また、たんぱく質のリジン残基のεアミノ基や、αアミノ基などのアミノ基同士を結合させることによってもコンジュゲートすることができる（グルタルアルデヒド法）。
【0028】
一態様において、本発明のワクチン組成物は、製薬上許容可能で且つ活性成分と相溶性であるアジュバントをさらに含有してもよい。アジュバントは、一般には、宿主の免疫応答を非特異的に増強する物質であり、多数のアジュバントが当技術分野で公知である。本発明のワクチン組成物に使用されるアジュバントは、免疫応答を非特異的に増強することができる限り特に限定されないが、例えば、アルミニウム塩（Ａｌｕｍ）、ミョウバン、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、ｄｓＲＮＡ、モンタナイド（セピック社商標名）、スクワラン、サポニン等が挙げられる。
【0029】
本発明のワクチン組成物は、Ｔ細胞受容体抗原ペプチドとＢ細胞受容体抗原ペプチドの複合体に加えて医薬上許容される担体を含む医薬組成物として提供され得る。
【0030】
医薬上許容される担体は、剤形によって適宜選択されてよく、例えば、ショ糖、デンプン等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム等の滑剤、クエン酸、メントール等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤、クエン酸ナトリウム等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、ベースワックス等が挙げられるが、それらに限定されない。
【0031】
本発明のワクチン組成物は、経口または非経口的に哺乳動物に対して投与することができる。Ｔ細胞受容体抗原ペプチドとＢ細胞受容体抗原ペプチドの複合体は胃の中で分解され得るので非経口的に投与することが好ましい。経口投与に好適な製剤としては、液剤、カプセル剤、サシェ剤、錠剤、懸濁液剤、乳剤等を挙げることができる。非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
【0032】
ワクチン組成物中の有効成分（即ち、ペプチド複合体）の含有量は、通常、組成物全体の０．００１～１００重量％、好ましくは０．０５～９９重量％、さらに好ましくは０.１～９０重量％程度であるが、これらに限定されない。
【0033】
本発明のワクチン組成物の投与対象は、ＩｇＥの過剰分泌に伴い病態が悪化し得る疾患（以下、「ＩｇＥの過剰分泌を伴う疾患」と称することがある）に罹患し得る哺乳動物であれば特に制限されない。かかる哺乳動物としては、例えば、マウス等のげっ歯類、イヌやネコ等のペット、ブタ、ウマ、ウシ等の家畜、ヒト、サル、オランウータン、チンパンジー等の霊長類等が挙げられ、特にヒトが好ましい。
【0034】
本発明のワクチン組成物の投与量は、投与する対象、投与方法、投与形態等によって異なるが、通常成人１人当たり、有効成分であるＴ細胞受容体抗原ペプチドとＢ細胞受容体抗原ペプチドの複合体を、一回当たり１μｇ～３００，０００μｇの範囲、好ましくは２０μｇ～３０，０００μｇの範囲で、通常４週間から１２週間に亘って、２回から３回投与し、抗体価が低下した場合にはその都度１回追加投与することができる。
【0035】
本発明のワクチン組成物により治療または予防され得る疾患は、上述したＩｇＥの過剰分泌を伴う疾患である。かかる疾患としては、例えば、喘息、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、結膜炎、湿疹、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、およびアナフィラキシー性過敏症が挙げられるが、これらに限定されない。
【0036】
一態様において、本発明のワクチン組成物は、既存のＩｇＥの過剰分泌を伴う疾患の治療剤と併用して使用してもよい。例えば、アレルギー性疾患の治療において、疾患の活動期には即効性の高い抗体医薬（例、オマリズマブ等）で治療を開始し、寛解期に本発明のワクチン組成物の投与を開始することで、患者のＱＯＬと治療コストの両立を図ることができる。また、本発明のワクチン組成物と既存の治療薬を同時に用いることもできる。
【0037】
なお、本明細書における疾患の「治療」には、疾患の治癒のみならず、疾患の寛解および疾患の程度の改善も含まれ得る。
【0038】
また、本明細書における疾患の「予防」には、疾患の発症を防ぐことに加えて、疾患の発症を遅らせることが含まれる。加えて、本明細書における疾患の「予防」には、治療後の該疾患の再発を防ぐこと、または治療後の該疾患の再発を遅らせることも含まれ得る。
【0039】
また、本明細書における「ワクチン組成物」との用語は、「医薬組成物」または「薬剤」とも言い換えることができる。
【0040】
２．ＩｇＥの過剰分泌を伴う疾患を治療または予防するための方法
本発明はまた、ＩｇＥの過剰分泌を伴う疾患に罹患する又は罹患する可能性のある対象に本発明のワクチン組成物を投与することを含む、ＩｇＥの過剰分泌を伴う疾患を治療または予防するための方法（以下、「本発明の方法」と称することがある）を提供する。
本発明はまた、ＩｇＥの過剰分泌を伴う疾患に罹患する又は罹患する可能性のある対象に本発明のワクチン組成物を投与することを含む、ＩｇＥの過剰分泌を伴う疾患を治療または予防するための方法（以下、「本発明の方法」と称することがある）を提供する。
【0041】
本発明の方法における、治療または予防対象、本発明のワクチン組成物の投与条件等は「１．本発明のワクチン組成物」において説明したものと同様である。
【0042】
尚、一態様において、本発明は、本発明のワクチン組成物を対象に投与することを含む、該対象においてＩｇＥに対する抗体の産生を誘導するための方法を提供する。かかる方法における、対象、本発明のワクチン組成物の投与条件等は「１．本発明のワクチン組成物」において説明したものと同様である。
【0043】
以下の実施例において本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。
【実施例】
【0044】
ペプチドの合成（Ｆｍｏｃ法）
第５版実験化学講座１６有機化合物の合成ＩＶ等に記載の方法に従い、全自動固相合成機を用いて、保護ペプチド樹脂をＦｍｏｃ法で合成した。得られた保護ペプチド樹脂にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）とスカベンジャー（チオアニソール、２，２’－（エチレンジオキシ）ジエタンチオール、ｍ－クレゾール、トリイソプロピルシラン、および、水等の混合物）を加えて、樹脂から切り出すとともに脱保護して、粗ペプチドを得た。この粗ペプチドを、逆相ＨＰＬＣカラムを用いて、０．１％ＴＦＡ－Ｈ２０／ＣＨ３ＣＮの系でグラジエント溶出し、精製を行った。目的物を含む画分を集め凍結乾燥して、目的のペプチドを得た。
第５版実験化学講座１６有機化合物の合成ＩＶ等に記載の方法に従い、全自動固相合成機を用いて、保護ペプチド樹脂をＦｍｏｃ法で合成した。得られた保護ペプチド樹脂にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）とスカベンジャー（チオアニソール、２，２’－（エチレンジオキシ）ジエタンチオール、ｍ－クレゾール、トリイソプロピルシラン、および、水等の混合物）を加えて、樹脂から切り出すとともに脱保護して、粗ペプチドを得た。この粗ペプチドを、逆相ＨＰＬＣカラムを用いて、０．１％ＴＦＡ－Ｈ２０／ＣＨ３ＣＮの系でグラジエント溶出し、精製を行った。目的物を含む画分を集め凍結乾燥して、目的のペプチドを得た。
【0045】
ペプチドのＨＰＬＣ分析方法
合成したペプチドの純度をＨＰＬＣ装置により以下の分析条件で測定した。
ＨＰＬＣ機種：島津製作所 ＬＣＬＣ－２０ＡＤＸＲ
測定波長：２２０ ｎｍ
流量：毎分０．３１ ｍＬ
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ－３，２．１ｍ×２５０ｍｍ，５ｍｉｃｒｏｎ
カラム温度：室温
移動相Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸水溶液
移動相Ｂ：アセトニトリル
グラジエント条件：３０分間で移動相Ｂの濃度を直線的勾配で５％から８０％にする。（５→８０％ ｂｕｆｆｅｒ Ｂ ｉｎ ３０ｍｉｎ）
合成したペプチドの純度をＨＰＬＣ装置により以下の分析条件で測定した。
ＨＰＬＣ機種：島津製作所 ＬＣＬＣ－２０ＡＤＸＲ
測定波長：２２０ ｎｍ
流量：毎分０．３１ ｍＬ
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ－３，２．１ｍ×２５０ｍｍ，５ｍｉｃｒｏｎ
カラム温度：室温
移動相Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸水溶液
移動相Ｂ：アセトニトリル
グラジエント条件：３０分間で移動相Ｂの濃度を直線的勾配で５％から８０％にする。（５→８０％ ｂｕｆｆｅｒ Ｂ ｉｎ ３０ｍｉｎ）
【0046】
ペプチドの質量分析
合成したペプチドの質量をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳにより以下の分析条件で測定した。
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ機種：Ｂｒｕｋｅｒ ａｕｔｏｆｌｅｘ ｓｐｅｅｄマトリックス：２，５－Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ
溶解溶液：０．１％トリフルオロ酢酸水溶液とアセトニトリルの混合溶液
合成したペプチドの質量をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳにより以下の分析条件で測定した。
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ機種：Ｂｒｕｋｅｒ ａｕｔｏｆｌｅｘ ｓｐｅｅｄマトリックス：２，５－Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ
溶解溶液：０．１％トリフルオロ酢酸水溶液とアセトニトリルの混合溶液
【0047】
［実施例１］ＡＪＰ００１コンジュゲートペプチド（ヒトＩｇＥ）を用いたラット免疫原性評価試験
表２に示すヒトＩｇＥのエピトープペプチド（配列番号２～３４）をＢ細胞抗原として選択し、Ｔ細胞抗原ＡＪＰ００１（表１、配列番号１）とε－アミノカプロン酸（「Ａｈｘ」と称することがある）をスペーサーとし、コンジュゲートした複合体（ＡＪＰ００１コンジュゲートペプチド）を作製した（製造は株式会社東レリサーチセンターもしくは株式会社ペプチド研究所に委託した）。なお、本明細書では、Ｂ細胞エピトープが配列番号「Ｘ」で表されるアミノ酸配列を有するＡＪＰ００１コンジュゲートペプチドを、「ＡＪＰ００１コンジュゲートペプチド（配列番号Ｘ）」等と称することとする。
表２に示すヒトＩｇＥのエピトープペプチド（配列番号２～３４）をＢ細胞抗原として選択し、Ｔ細胞抗原ＡＪＰ００１（表１、配列番号１）とε－アミノカプロン酸（「Ａｈｘ」と称することがある）をスペーサーとし、コンジュゲートした複合体（ＡＪＰ００１コンジュゲートペプチド）を作製した（製造は株式会社東レリサーチセンターもしくは株式会社ペプチド研究所に委託した）。なお、本明細書では、Ｂ細胞エピトープが配列番号「Ｘ」で表されるアミノ酸配列を有するＡＪＰ００１コンジュゲートペプチドを、「ＡＪＰ００１コンジュゲートペプチド（配列番号Ｘ）」等と称することとする。
【0048】
【表1】
【0049】
【表2】
【0050】
配列番号２～３４のいずれかのＢ細胞エピトープ配列を有するＡＪＰ００１コンジュゲートペプチドを生理食塩水に溶解し、２％ Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、０．３ ｍｇ／ｂｏｄｙ）およびＫ３ Ｅｔ－Ｆｒｅｅ（ジーンデザイン、０．１ ｍｇ／ｂｏｄｙ）と混合し、０．５ ｍｇ／ｂｏｄｙ、２週間隔で３回、ＪＣＬ：Ｗｉｓｔａｒラット（雌、７週齢、Ｎ＝４）に皮下投与した。投与前および初回投与後６週の時点で採血し、各エピトープ配列およびヒトＩｇＥに対する抗体価をＥＬＩＳＡ法で測定した。具体的には、炭酸バッファーで１０ μｇ／ｍＬに溶解したエピトープペプチドを固相化した９６ウェルプレートを５％スキムミルク／ＰＢＳにてブロッキング後、５％スキムミルク／ＰＢＳを用いて段階希釈した血清を添加し、４℃で一晩静置した。ＰＢＳ－Ｔでウェルを洗浄後、５％スキムミルク／ＰＢＳにて希釈したＨＲＰ標識抗ラットＩｇＧ抗体（ＢＥＴＨＹＬ）を添加し、室温で３時間振とうした。ＰＢＳ－Ｔでウェルを洗浄後、ＴＭＢ溶液（ＳＩＧＭＡ）を添加して遮光で３０分間静置し、０．１Ｍ Ｈ２ＳＯ４（関東化学）を加えて反応を停止し、プレートリーダーで４５０ ｎｍの吸光度を測定した。吸光度の最大値の１／２（ＯＤ＝１．７５）となる血清希釈倍率を抗体価と定義し、個体値から幾何平均抗体価（Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ ｍｅａｎ ｔｉｔｅｒ：ＧＭＴ）を算出した。図は幾何平均抗体価（ＧＭＴ）±９５％信頼区間（９５％Ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｒｖａｌ、９５％ＣＩ）で示す。ヒトＩｇＥに対する抗体価は、固相化抗原としてヒトＩｇＥ ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ（ａｂｃａｍ）を使用し、上記と同様にＥＬＩＳＡ法で測定した。
【0051】
各ＡＪＰ００１コンジュゲートペプチドおよびヒトＩｇＥに対する抗体価を図１に示した。その結果、配列番号１７～２７のＢ細胞エピトープ配列を有するＡＪＰ００１コンジュゲートペプチドを投与したラット抗血清において、ヒトＩｇＥ抗体価の顕著な増加が確認された。
【0052】
［実施例２］ＡＪＰ００１コンジュゲートペプチド（ヒトＩｇＥ）のラット抗血清を用いた中和活性評価
実施例１の初回投与後６週時点の血清を用いて、ＡＪＰ００１コンジュゲートペプチドで産生された抗ヒトＩｇＥ抗体の中和活性を評価した。ＲＢＬ－２Ｈ３にヒトＦｃεＲＩαおよびＮＦＡＴ－ＲＥ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子を導入して樹立した安定発現細胞株（ＲＢＬ－２Ｈ３/ＦＣＥＲ１Ａ＋ＮＦＡＴ ＮＬｕｃ細胞）を使用した。本細胞は、ヒトＩｇＥを添加するとＦｃεＲＩαに結合し、次いで抗ヒトＩｇＥ抗体で刺激することによりＮＦＡＴが活性化し、レポーター遺伝子（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）が発現する。ヒトＩｇＥ刺激におけるＬｕｃｉｆｅｒａｓｅの発現阻害を指標に評価した。具体的には、配列番号１６および２０～２４について、プール血清（４００ μＬ／個体、Ｎ＝４）を調製し、非働化処理（５６℃、３０分間反応）後、等量の硫酸アンモニウム（富士フイルム和光純薬）を添加し、転倒混和させながら室温で３０分間反応させた。その後、４℃、３０００×ｇ、２０分間遠心し、沈殿物をＰＢＳで溶解し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰ ｓｐｉｎ ｔｒａｐ（Ｃｙｔｉｖａ）、Ａｂ ｂｕｆｆｅｒ ｋｉｔ（Ｃｙｔｉｖａ）、Ａｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ－０．５ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒ ｄｅｖｉｃｅｓ（１００Ｋ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で血清中ＩｇＧ抗体（抗ＩｇＥ抗体を含む）を精製した。次に、この精製ＩｇＧ（終濃度 １．２～５００ μｇ／ｍＬ）とヒトＩｇＥ（終濃度 ０．６ μｇ／ｍＬ）を培養用培地（１％ Ｐ/Ｓ、４００ μｇ/ｍＬ Ｇ４１８、５００ μｇ/ｍＬ ハイグロマイシンＢ、１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ）に添加し、３７℃で２時間反応させた後、９６－Ｗｅｌｌ ｗｈｉｔｅ ｐｌａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に播種した細胞（１．０ × １０＾５ ｃｅｌｌｓ／５０ μＬ／ｗｅｌｌ）に５０ μＬ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃で２４時間反応させた。なお、無処置のｗｅｌｌおよびヒトＩｇＥのみを添加した対照ｗｅｌｌを設定した。２４時間後、維持培地で洗浄し、抗ヒトＩｇＥ抗体（終濃度 １ μｇ／ｍＬ、ＡＱＩ）を添加し、３７℃で４時間反応させた。その後、ＮａｎｏＧｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ ｓｕｂｓｔｒａｔｅを添加し、３分間反応させ、発光値をルミネッセンスプレートリーダーで測定した。無処置ｗｅｌｌ（Ａ）、対照ｗｅｌｌ（Ｂ）および各ＡＪＰ００１コンジュゲートペプチドを投与したラット抗血清由来の精製ＩｇＧのｗｅｌｌ（Ｃ）の各発光値から以下の式で対照ｗｅｌｌに対する発光値の割合（％）を算出した。
実施例１の初回投与後６週時点の血清を用いて、ＡＪＰ００１コンジュゲートペプチドで産生された抗ヒトＩｇＥ抗体の中和活性を評価した。ＲＢＬ－２Ｈ３にヒトＦｃεＲＩαおよびＮＦＡＴ－ＲＥ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子を導入して樹立した安定発現細胞株（ＲＢＬ－２Ｈ３/ＦＣＥＲ１Ａ＋ＮＦＡＴ ＮＬｕｃ細胞）を使用した。本細胞は、ヒトＩｇＥを添加するとＦｃεＲＩαに結合し、次いで抗ヒトＩｇＥ抗体で刺激することによりＮＦＡＴが活性化し、レポーター遺伝子（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）が発現する。ヒトＩｇＥ刺激におけるＬｕｃｉｆｅｒａｓｅの発現阻害を指標に評価した。具体的には、配列番号１６および２０～２４について、プール血清（４００ μＬ／個体、Ｎ＝４）を調製し、非働化処理（５６℃、３０分間反応）後、等量の硫酸アンモニウム（富士フイルム和光純薬）を添加し、転倒混和させながら室温で３０分間反応させた。その後、４℃、３０００×ｇ、２０分間遠心し、沈殿物をＰＢＳで溶解し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰ ｓｐｉｎ ｔｒａｐ（Ｃｙｔｉｖａ）、Ａｂ ｂｕｆｆｅｒ ｋｉｔ（Ｃｙｔｉｖａ）、Ａｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ－０．５ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒ ｄｅｖｉｃｅｓ（１００Ｋ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で血清中ＩｇＧ抗体（抗ＩｇＥ抗体を含む）を精製した。次に、この精製ＩｇＧ（終濃度 １．２～５００ μｇ／ｍＬ）とヒトＩｇＥ（終濃度 ０．６ μｇ／ｍＬ）を培養用培地（１％ Ｐ/Ｓ、４００ μｇ/ｍＬ Ｇ４１８、５００ μｇ/ｍＬ ハイグロマイシンＢ、１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ）に添加し、３７℃で２時間反応させた後、９６－Ｗｅｌｌ ｗｈｉｔｅ ｐｌａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に播種した細胞（１．０ × １０＾５ ｃｅｌｌｓ／５０ μＬ／ｗｅｌｌ）に５０ μＬ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃で２４時間反応させた。なお、無処置のｗｅｌｌおよびヒトＩｇＥのみを添加した対照ｗｅｌｌを設定した。２４時間後、維持培地で洗浄し、抗ヒトＩｇＥ抗体（終濃度 １ μｇ／ｍＬ、ＡＱＩ）を添加し、３７℃で４時間反応させた。その後、ＮａｎｏＧｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ ｓｕｂｓｔｒａｔｅを添加し、３分間反応させ、発光値をルミネッセンスプレートリーダーで測定した。無処置ｗｅｌｌ（Ａ）、対照ｗｅｌｌ（Ｂ）および各ＡＪＰ００１コンジュゲートペプチドを投与したラット抗血清由来の精製ＩｇＧのｗｅｌｌ（Ｃ）の各発光値から以下の式で対照ｗｅｌｌに対する発光値の割合（％）を算出した。
【0053】
精製ＩｇＧの添加濃度を元に、４－ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｍｏｄｅｌにて回帰式を算出し、回帰式から５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を算出した。ＩＣ５０の濃度（μｇ／ｍＬ）から中和活性を段階的に表記した（＋：１０＾４桁、＋＋：１０＾３桁、＋＋＋：１０＾２桁、計算不能の場合、ＮＣと表記）。
【0054】
対照ｗｅｌｌに対する発光値の割合（％）＝１００×［（Ｃ－Ａ）/（Ｂ－Ａ）］
【0055】
ヒトＩｇＥに対する中和活性を図２に示す。その結果、配列番号２０、２１、２２のＢ細胞エピトープ配列を有するＡＪＰ００１コンジュゲートペプチドを投与したラット抗血清において、中和活性（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの発現阻害）が確認された。
【0056】
［実施例３］ＡＪＰ００１コンジュゲートペプチド（ヒトＩｇＥ）のＨｕｍａｎｉｚｅｄ ＩｇＥ/ＦｃεＲ１ Ｔｇマウスを用いたＯＶＡ誘発アレルギー性鼻炎モデルに対する薬効評価試験
配列番号２０もしくは２１のＢ細胞エピトープ配列を有するＡＪＰ００１コンジュゲートペプチドを生理食塩水に溶解し、２％ Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、０．３ ｍｇ／ｂｏｄｙ）およびＫ３ Ｅｔ－Ｆｒｅｅ（ジーンデザイン、０．１ ｍｇ／ｂｏｄｙ）と混合し、０．５ ｍｇ／ｂｏｄｙ、２週間隔３回（Ｄａｙ ０、１４、２８）でＨｕｍａｎｉｚｅｄ ＩｇＥ/ＦｃεＲ１ Ｔｇマウス（雌、１０週齢、Ｎ＝８/群）に皮下投与した。陽性対照物質の抗ヒスタミン薬（ビラスチン、大鵬薬品工業）はＤａｙ５６～６６に５０ｍｇ／ｋｇでＯＶＡ投与の１時間前に経口投与した。また、配列番号２０もしくは２１投与群の対照群としてＯＶＡ＋ａｄｊｕｖａｎｔ群、ビラスチン投与群の対照群としてＯＶＡ群を設定した。病態モデルは、ＯＶＡ（Ａｌｕｍ含有）をＤａｙ３５に１００ μｇ／ｂｏｄｙ（腹腔内）、Ｄａｙ４９に５０ μｇ／ｂｏｄｙ（皮下）で投与後、Ｄａｙ５６～６６にＯＶＡ ５０ μｇを経鼻投与して作製した。本試験条件において、血清（Ｄａｙ０、１４、２８、３５、４９および６７）を採取し、各ＡＪＰ００１コンジュゲートペプチドおよびヒトＩｇＥに対する抗体価、血清中ヒトＩｇＥ／抗ヒトＩｇＥ抗体の複合体濃度および血清中ＯＶＡ特異的ヒトＩｇＥ濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。また、Ｄａｙ５５、６０および６６の経鼻投与後１時間にビデオ撮影を行い、鼻掻き行動回数を評価した。Ｄａｙ６７に安楽死後、鼻腔洗浄液（ＮＡＬＦ）を回収し、ＮＡＬＦ中Ｅｏｔａｘｉｎ濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。更に、鼻腔組織を回収後、Ｌｕｎａ染色標本を作製し、好酸球浸潤数を測定した。抗体価の測定は実施例１と同様の手順で実施し、血清中ＯＶＡ特異的ヒトＩｇＥ濃度はＨｕｍａｎ Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＥ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｆｉｎｅｔｅｓｔ）、ＮＡＬＦ中Ｅｏｔａｘｉｎ濃度はＭｏｕｓｅ ＣＣＬ１１/Ｅｏｔａｘｉｎ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ）を使用して測定した。
配列番号２０もしくは２１のＢ細胞エピトープ配列を有するＡＪＰ００１コンジュゲートペプチドを生理食塩水に溶解し、２％ Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、０．３ ｍｇ／ｂｏｄｙ）およびＫ３ Ｅｔ－Ｆｒｅｅ（ジーンデザイン、０．１ ｍｇ／ｂｏｄｙ）と混合し、０．５ ｍｇ／ｂｏｄｙ、２週間隔３回（Ｄａｙ ０、１４、２８）でＨｕｍａｎｉｚｅｄ ＩｇＥ/ＦｃεＲ１ Ｔｇマウス（雌、１０週齢、Ｎ＝８/群）に皮下投与した。陽性対照物質の抗ヒスタミン薬（ビラスチン、大鵬薬品工業）はＤａｙ５６～６６に５０ｍｇ／ｋｇでＯＶＡ投与の１時間前に経口投与した。また、配列番号２０もしくは２１投与群の対照群としてＯＶＡ＋ａｄｊｕｖａｎｔ群、ビラスチン投与群の対照群としてＯＶＡ群を設定した。病態モデルは、ＯＶＡ（Ａｌｕｍ含有）をＤａｙ３５に１００ μｇ／ｂｏｄｙ（腹腔内）、Ｄａｙ４９に５０ μｇ／ｂｏｄｙ（皮下）で投与後、Ｄａｙ５６～６６にＯＶＡ ５０ μｇを経鼻投与して作製した。本試験条件において、血清（Ｄａｙ０、１４、２８、３５、４９および６７）を採取し、各ＡＪＰ００１コンジュゲートペプチドおよびヒトＩｇＥに対する抗体価、血清中ヒトＩｇＥ／抗ヒトＩｇＥ抗体の複合体濃度および血清中ＯＶＡ特異的ヒトＩｇＥ濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。また、Ｄａｙ５５、６０および６６の経鼻投与後１時間にビデオ撮影を行い、鼻掻き行動回数を評価した。Ｄａｙ６７に安楽死後、鼻腔洗浄液（ＮＡＬＦ）を回収し、ＮＡＬＦ中Ｅｏｔａｘｉｎ濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。更に、鼻腔組織を回収後、Ｌｕｎａ染色標本を作製し、好酸球浸潤数を測定した。抗体価の測定は実施例１と同様の手順で実施し、血清中ＯＶＡ特異的ヒトＩｇＥ濃度はＨｕｍａｎ Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＥ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｆｉｎｅｔｅｓｔ）、ＮＡＬＦ中Ｅｏｔａｘｉｎ濃度はＭｏｕｓｅ ＣＣＬ１１/Ｅｏｔａｘｉｎ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ）を使用して測定した。
【0057】
各ＡＪＰ００１コンジュゲートペプチドおよびヒトＩｇＥに対する抗体価を図３に、血清中複合体濃度を図４に、鼻掻き行動回数および複合体濃度との相関図を図５に、血清中ＯＶＡ－ｈＩｇＥ濃度およびＮＡＬＦ中Ｅｏｔａｘｉｎ濃度を図６に、病理組織学的検査および好酸球浸潤の程度を図７にそれぞれ示す。
【0058】
その結果、配列番号２０または２１を投与した群では、抗体価が経時的に増加し、鼻掻き回数および鼻腔組織中の好酸球浸潤を有意に抑制した。また、ＮＡＬＦ中Ｅｏｔａｘｉｎ濃度および血清中ＯＶＡ特異的ヒトＩｇＥ濃度においても低値傾向を示した。これらの結果から、配列番号２０または２１を投与した群において誘導された抗体は、ヒトＩｇＥに結合し、ＩｇＥ/ＦｃεＲ１結合を阻害することで鼻炎症状を抑制できることが示唆された。一方で、抗ヒスタミン薬（ビラスチン）は鼻掻き回数において配列番号２０または２１投与群と同等の有効性を示したが、他のパラメータは変化しなかった。このことから、本ＩｇＥ抗体誘導ペプチドと抗ヒスタミン薬は異なる作用機序で鼻炎症状を抑制することが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【0059】
本発明によれば、Ｉ型アレルギー性疾患等のＩｇＥの過剰分泌を伴う疾患の治療および／または予防のためのペプチドワクチンを低コストで製造できるため、医薬品の製造分野において極めて有用である。
【0060】
本出願は、日本で出願された特願２０２３－１９１８３６（出願日：２０２３年１１月９日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【要約】
本発明は、Ｔ細胞受容体抗原ペプチドとＢ細胞受容体抗原ペプチドとの複合体を含む、IｇＥに対する抗体の産生を誘導し得るワクチン組成物であって、該Ｂ細胞受容体抗原ペプチドが、配列番号２０～２２のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、ワクチン組成物を提供する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】