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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-05-14
(45)【発行日】2025-05-22
(54)【発明の名称】２剤硬化型接着剤、２剤硬化型接着剤用の硬化剤、及び、化合物
(51)【国際特許分類】
A61L 24/00 20060101AFI20250515BHJP
A61L 24/02 20060101ALI20250515BHJP
A61L 27/54 20060101ALI20250515BHJP
A61L 27/58 20060101ALI20250515BHJP
A61L 27/44 20060101ALI20250515BHJP
C08B 37/08 20060101ALI20250515BHJP
C08H 1/00 20060101ALI20250515BHJP
C08G 18/64 20060101ALI20250515BHJP
C08G 65/332 20060101ALI20250515BHJP
C08G 63/06 20060101ALI20250515BHJP
C08G 63/08 20060101ALI20250515BHJP
C08F 120/06 20060101ALI20250515BHJP
【ＦＩ】
A61L24/00 200
A61L24/00 310
A61L24/02
A61L27/54
A61L27/58
A61L27/44
C08B37/08 A
C08H1/00
C08G18/64 023
C08G65/332
C08G63/06
C08G63/08
C08F120/06
【請求項の数】
21
(21)【出願番号】P 2020204179
(22)【出願日】2020-12-09
(65)【公開番号】P2022091370
(43)【公開日】2022-06-21
【審査請求日】2023-11-28
(73)【特許権者】
【識別番号】301023238
【氏名又は名称】国立研究開発法人物質・材料研究機構
(72)【発明者】
【氏名】西口 昭広
【審査官】田澤 俊樹
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１８－７９１４５（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１３／０１２９７１０（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／０８８５４１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１４－５１９８４３（ＪＰ，Ａ）
【文献】Jae Suk Yoo et al.，"Study on Genipin: A New Alternative Natural Crosslinking Agent for Fixing Heterograft Tissue"，The Korean Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery，2011年，Vol.44，p.197-207，DOI: 10.5090/kjtcs.2011.44.3.197
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｌ １５／００－３３／１８
Ｃ０８Ｂ ３７／０８
Ｃ０８Ｈ １／００
Ｃ０８Ｇ １８／６４，６５／３３２，６３／０６，６３／０８
Ｃ０８Ｆ １２０／０６
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
第１級アミノ基と、＊を結合位置としたとき式１で表される基と、を分子内にそれぞれ１つ以上有する化合物Ａと、塩基性化合物とを含む第１剤と、酸性化合物を含む第２剤とを備える２剤硬化型接着剤。
【化1】
【請求項2】
前記第１剤、及び、前記第２剤からなる群より選択される少なくとも一方が溶媒を含み、前記第１剤と前記第２剤とを混合したとき、混合液のｐＨが８．０以下となる請求項１に記載の２剤硬化型接着剤。
【請求項3】
前記混合液のｐＨが７．０未満となる、請求項２に記載の２剤硬化型接着剤。
【請求項4】
前記混合液のｐＨが５．０以上となる、請求項２又は３に記載の２剤硬化型接着剤。
【請求項5】
前記第２剤が溶媒を含み、前記第２剤のｐＨが７．０未満である、請求項１～４のいずれか１項に記載の２剤硬化型接着剤。
【請求項6】
前記第２剤のｐＨが、２．０～５．０である、請求項５に記載の２剤硬化型接着剤。
【請求項7】
前記第１剤が溶媒を含み、前記第１剤のｐＨが７．０を超える、請求項１～６のいずれか１項に記載の２剤硬化型接着剤。
【請求項8】
前記化合物Ａが、骨格構造と、前記骨格構造に結合した前記第１級アミノ基と、前記式１で表される基とを有し、前記骨格構造が、多糖、ペプチド、タンパク質、ゼラチン、エチレンジアミン、ポリエチレンイミン、ポリアルキレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、及び、ポリアクリル酸からなる群より選択される少なくとも１種の化合物に由来する骨格構造である、請求項１～７のいずれか１項に記載の２剤硬化型接着剤。
【請求項9】
前記化合物Ａが、下記式２で表される化合物である、請求項１～８のいずれか１項に記載の２剤硬化型接着剤。【化2】
【請求項10】
前記Ｌ１、前記Ｌ２、及び、前記Ｌ３が、炭素数が１～１０個のアルキレンオキシ基を含む、請求項９に記載の２剤硬化型接着剤。
【請求項11】
前記化合物Ａが、下記式５で表される化合物である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の２剤硬化型接着剤。【化3】
【請求項12】
前記第２剤が、細胞外マトリックスを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の２剤硬化型接着剤。
【請求項13】
前記第１剤と前記第２剤とを混合したときｐＨが５．０～８．０となる請求項２～７のいずれか１項に記載の２剤硬化型接着剤。
【請求項14】
前記化合物Ａにおける、第１級アミノ基のモル基準の含有量に対する、前記式１で表される基のモル基準の含有量の含量比が０．０５～１．２である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の２剤硬化型接着剤。
【請求項15】
前記化合物Ａが２～６個の第１級アミノ基と、２～６個の式１で表される基とを有する請求項１～１４のいずれか１項に記載の２剤硬化型接着剤。
【請求項16】
第１級アミノ基と、＊を結合位置としたとき式１で表される基と、を分子内にそれぞれ１つ以上有する化合物Ａを含む２剤硬化型接着剤用の硬化剤。【化4】
【請求項17】
更に塩基性化合物を含む、請求項１６に記載の硬化剤。
【請求項18】
前記化合物Ａが、骨格構造と、前記骨格構造に結合した前記第１級アミノ基と、前記式１で表される基とを有し、前記骨格構造が、多糖、ペプチド、タンパク質、ゼラチン、エチレンジアミン、ポリエチレンイミン、ポリアルキレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、及び、ポリアクリル酸からなる群より選択される少なくとも１種の化合物に由来する骨格構造である、請求項１６又は１７に記載の硬化剤。
【請求項19】
化合物であって、骨格構造と、前記骨格構造に結合した第１級アミノ基と、下記式１で表される基とを有し、
前記骨格構造が、多糖、ゼラチン、エチレンジアミン、ポリエチレンイミン、ポリアルキレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、及び、ポリアクリル酸からなる群より選択される少なくとも１種の化合物に由来する骨格構造であり、
下記式２で表される化合物。
【化5】
【化6】
【請求項20】
前記Ｌ
１
、前記Ｌ
２
、及び、前記Ｌ
３
が、炭素数が１～１０個のアルキレンオキシ基を含む、請求項１９に記載の化合物。
【請求項21】
下記式５で表される、請求項１９項に記載の化合物。
【化7】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、２剤硬化型接着剤、２剤硬化型接着剤用の硬化剤、及び、化合物に関する。
【背景技術】
【0002】
ゲニピンは、グルタルアルデヒド等と比較して細胞毒性が低く、キセロゲルを含む医療用ゲルの硬化剤等として用いられている。特許文献１には、「ゲニピンと、ゼラチンと、を含む、止血材用スポンジ。」が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【文献】特開２０１８－６８７２３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
ゲニピンは、架橋反応の進行が遅く、２剤硬化型接着剤の硬化剤として用いることは難しかった。そこで本発明は、ゲニピン誘導体を含み、迅速に硬化可能な２剤硬化型接着剤を提供することを課題とする。
また、本発明は、２剤硬化型接着剤用の硬化剤、及び、化合物を提供することも課題とする。
また、本発明は、２剤硬化型接着剤用の硬化剤、及び、化合物を提供することも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意検討した結果、以下の構成により上記課題を達成することができることを見出した。
【0006】
［１］ 第１級アミノ基と、式１で表される基と、を分子内にそれぞれ１つ以上有する化合物Ａと、塩基性化合物とを含む第１剤と、酸性化合物を含む第２剤とを備える２剤硬化型接着剤。
［２］ 上記第１剤、及び、上記第２剤からなる群より選択される少なくとも一方が溶媒を含み、上記第１剤と上記第２剤とを混合したとき、混合液のｐＨが８．０以下となる［１］に記載の２剤硬化型接着剤。
［３］ 上記混合液のｐＨが７．０未満となる、［２］に記載の２剤硬化型接着剤。
［４］ 上記混合液のｐＨが５．０以上となる、［２］又は［３］に記載の２剤硬化型接着剤。
［５］ 上記第２剤が溶媒を含み、上記第２剤のｐＨが７．０未満である、［１］～［４］のいずれか１項に記載の２剤硬化型接着剤。
［６］ 上記第２剤のｐＨが、２．０～５．０である、［５］に記載の２剤硬化型接着剤。
［７］ 上記第１剤が溶媒を含み、上記第１剤のｐＨが７．０を超える、［１］～［６］のいずれか１項に記載の２剤硬化型接着剤。
［８］ 上記化合物Ａが、骨格構造と、上記骨格構造に結合した上記第１級アミノ基と、後述する式１で表される基とを有し、上記骨格構造が、多糖、ペプチド、タンパク質、ゼラチン、エチレンジアミン、ポリエチレンイミン、ポリアルキレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、及び、ポリアクリル酸からなる群より選択される少なくとも１種の化合物に由来する骨格構造である、［１］～［７］のいずれか１項に記載の２剤硬化型接着剤。
［９］ 上記化合物Ａが、後述する式２で表される化合物である、［１］～［８］のいずれか１項に記載の２剤硬化型接着剤。
［１０］ 上記Ｌ１、上記Ｌ２、及び、上記Ｌ３が、炭素数が１～１０個のアルキレンオキシ基を含む、［９］に記載の２剤硬化型接着剤。
［１１］ 上記化合物Ａが、下記式５で表される化合物である、［１］～［１０］のいずれか１項に記載の２剤硬化型接着剤。
［１２］ 上記第２剤が、細胞外マトリックスを含む、［１］～［１１］のいずれか１項に記載の２剤硬化型接着剤。
［１３］ 上記第１剤と上記第２剤とを混合したときｐＨが５．０～８．０となる［２］～［７］のいずれか１項に記載の２剤硬化型接着剤。
［１４］ 上記化合物における、第１級アミノ基のモル基準の含有量に対する、上記式１で表される基のモル基準の含有量の含量比が０．０５～１．２である、［１］～［１３］のいずれか１項に記載の２剤硬化型接着剤。
［１５］ 上記化合物Ａが２～６個の第１級アミノ基と、２～６個の式１で表される基とを有する［１］～［１４］のいずれか１項に記載の２剤硬化型接着剤。
［１６］ 第１級アミノ基と、式１で表される基と、を分子内にそれぞれ１つ以上有する化合物Ａを含む２剤硬化型接着剤用の硬化剤。
［１７］ 更に塩基性化合物を含む、［１６］に記載の硬化剤。
［１８］ 上記化合物Ａが、骨格構造と、上記骨格構造に結合した上記第１級アミノ基と、上記式１で表される基とを有し、上記骨格構造が、多糖、ペプチド、タンパク質、ゼラチン、エチレンジアミン、ポリエチレンイミン、ポリアルキレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、及び、ポリアクリル酸からなる群より選択される少なくとも１種の化合物に由来する骨格構造である、［１６］又は［１７］に記載の硬化剤。
［１９］ 後述する式２で表される化合物。
［２］ 上記第１剤、及び、上記第２剤からなる群より選択される少なくとも一方が溶媒を含み、上記第１剤と上記第２剤とを混合したとき、混合液のｐＨが８．０以下となる［１］に記載の２剤硬化型接着剤。
［３］ 上記混合液のｐＨが７．０未満となる、［２］に記載の２剤硬化型接着剤。
［４］ 上記混合液のｐＨが５．０以上となる、［２］又は［３］に記載の２剤硬化型接着剤。
［５］ 上記第２剤が溶媒を含み、上記第２剤のｐＨが７．０未満である、［１］～［４］のいずれか１項に記載の２剤硬化型接着剤。
［６］ 上記第２剤のｐＨが、２．０～５．０である、［５］に記載の２剤硬化型接着剤。
［７］ 上記第１剤が溶媒を含み、上記第１剤のｐＨが７．０を超える、［１］～［６］のいずれか１項に記載の２剤硬化型接着剤。
［８］ 上記化合物Ａが、骨格構造と、上記骨格構造に結合した上記第１級アミノ基と、後述する式１で表される基とを有し、上記骨格構造が、多糖、ペプチド、タンパク質、ゼラチン、エチレンジアミン、ポリエチレンイミン、ポリアルキレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、及び、ポリアクリル酸からなる群より選択される少なくとも１種の化合物に由来する骨格構造である、［１］～［７］のいずれか１項に記載の２剤硬化型接着剤。
［９］ 上記化合物Ａが、後述する式２で表される化合物である、［１］～［８］のいずれか１項に記載の２剤硬化型接着剤。
［１０］ 上記Ｌ１、上記Ｌ２、及び、上記Ｌ３が、炭素数が１～１０個のアルキレンオキシ基を含む、［９］に記載の２剤硬化型接着剤。
［１１］ 上記化合物Ａが、下記式５で表される化合物である、［１］～［１０］のいずれか１項に記載の２剤硬化型接着剤。
［１２］ 上記第２剤が、細胞外マトリックスを含む、［１］～［１１］のいずれか１項に記載の２剤硬化型接着剤。
［１３］ 上記第１剤と上記第２剤とを混合したときｐＨが５．０～８．０となる［２］～［７］のいずれか１項に記載の２剤硬化型接着剤。
［１４］ 上記化合物における、第１級アミノ基のモル基準の含有量に対する、上記式１で表される基のモル基準の含有量の含量比が０．０５～１．２である、［１］～［１３］のいずれか１項に記載の２剤硬化型接着剤。
［１５］ 上記化合物Ａが２～６個の第１級アミノ基と、２～６個の式１で表される基とを有する［１］～［１４］のいずれか１項に記載の２剤硬化型接着剤。
［１６］ 第１級アミノ基と、式１で表される基と、を分子内にそれぞれ１つ以上有する化合物Ａを含む２剤硬化型接着剤用の硬化剤。
［１７］ 更に塩基性化合物を含む、［１６］に記載の硬化剤。
［１８］ 上記化合物Ａが、骨格構造と、上記骨格構造に結合した上記第１級アミノ基と、上記式１で表される基とを有し、上記骨格構造が、多糖、ペプチド、タンパク質、ゼラチン、エチレンジアミン、ポリエチレンイミン、ポリアルキレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、及び、ポリアクリル酸からなる群より選択される少なくとも１種の化合物に由来する骨格構造である、［１６］又は［１７］に記載の硬化剤。
［１９］ 後述する式２で表される化合物。
【発明の効果】
【0007】
本発明によれば、ゲニピン誘導体を含み、迅速に硬化可能な２剤硬化型接着剤を提供できる。
また、本発明によれば、２剤硬化型接着剤用の硬化剤、及び、化合物も提供できる。
また、本発明によれば、２剤硬化型接着剤用の硬化剤、及び、化合物も提供できる。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】反応時間（横軸：分）に対する、ゲニピンの導入量（縦軸：個）を計算した結果を表す図である。
【図2】ポリアミン液のｐＨに対する、ポリアミン１分子へのゲニピン平均導入量を計算した結果を表す図である。
【図3】本接着剤の第１剤と第２剤との混合時を０分として、経時的に変化するせん断弾性率（Ｐａ）を表す図である。中実円が貯蔵弾性率、中空円が損失弾性率である。
【図4】第２剤のみの経時的に変化するせん断弾性率（Ｐａ）を表す図である。
【図5】第２剤とゲニピンとの混合時を０分として、経時的に変化するせん断弾性率（Ｐａ）を表す図である。
【図7】ポリアミンの第１級アミノ基の１００モル％に対してゲニピンを５０モル％となるよう仕込んで合成した化合物Ａを用いた本接着剤の第１剤と第２剤との混合時を０分としたときの、せん断弾性率（Ｐａ）の経時変化である。中実円は貯蔵弾性率、中空円は損失弾性率である。
【図8】ポリアミンの第１級アミノ基の１００モル％に対してゲニピンを６０モル％となるよう仕込んで合成した化合物Ａを用いた本接着剤の第１剤と第２剤との混合時を０分としたときの、せん断弾性率（Ｐａ）の経時変化である。中実円は貯蔵弾性率、中空円は損失弾性率である。
【図9】ポリアミンの第１級アミノ基の１００モル％に対してゲニピンを７０モル％となるよう仕込んで合成した化合物Ａを用いた本接着剤の第１剤と第２剤との混合時を０分としたときの、せん断弾性率（Ｐａ）の経時変化である。中実円は貯蔵弾性率、中空円は損失弾性率である。
【図10】ポリアミンの第１級アミノ基の１００モル％に対してゲニピンを８０モル％となるよう仕込んで合成した化合物Ａを用いた本接着剤の第１剤と第２剤との混合時を０分としたときの、せん断弾性率（Ｐａ）の経時変化である。中実円は貯蔵弾性率、中空円は損失弾性率である。
【図11】ゲニピンとポリアミンとの反応時間を３分とした場合に得られた化合物Ａを用いた本接着剤の第１剤と第２剤との混合時を０分としたときの、せん断弾性率（Ｐａ）の経時変化である。中実円は貯蔵弾性率、中空円は損失弾性率である。
【図12】ゲニピンとポリアミンとの反応時間を１０分とした場合に得られた化合物Ａを用いた本接着剤の第１剤と第２剤との混合時を０分としたときの、せん断弾性率（Ｐａ）の経時変化である。中実円は貯蔵弾性率、中空円は損失弾性率である。
【図13】ゲニピンとポリアミンとの反応時間を３０分とした場合に得られた化合物Ａを用いた本接着剤の第１剤と第２剤との混合時を０分としたときの、せん断弾性率（Ｐａ）の経時変化である。中実円は貯蔵弾性率、中空円は損失弾性率である。
【図14】ゲニピンとポリアミンとの反応時間を６０分とした場合に得られた化合物Ａを用いた本接着剤の第１剤と第２剤との混合時を０分としたときの、せん断弾性率（Ｐａ）の経時変化である。中実円は貯蔵弾性率、中空円は損失弾性率である。
【図15】ＵＢＭ（Ｕｒｉｎａｒｙ ｂｌａｄｄｅｒ ｍａｔｒｉｘ）溶液のｐＨを２．０とした場合の本接着剤の第１剤と第２剤との混合時を０分としたときの、せん断弾性率（Ｐａ）の経時変化である。中実円は貯蔵弾性率、中空円は損失弾性率である。
【図16】ＵＢＭ溶液のｐＨを２．５とした場合の本接着剤の第１剤と第２剤との混合時を０分としたときの、せん断弾性率（Ｐａ）の経時変化である。中実円は貯蔵弾性率、中空円は損失弾性率である。
【図17】ＵＢＭ溶液のｐＨを３．０とした場合の本接着剤の第１剤と第２剤との混合時を０分としたときの、せん断弾性率（Ｐａ）の経時変化である。中実円は貯蔵弾性率、中空円は損失弾性率である。
【図18】ＵＢＭ溶液のｐＨを５．０とした場合の本接着剤の第１剤と第２剤との混合時を０分としたときの、せん断弾性率（Ｐａ）の経時変化である。中実円は貯蔵弾性率、中空円は損失弾性率である。
【図19】ＵＢＭ溶液のｐＨを７．０とした場合の本接着剤の第１剤と第２剤との混合時を０分としたときの、せん断弾性率（Ｐａ）の経時変化である。中実円は貯蔵弾性率、中空円は損失弾性率である。
【図20】ハイドロケルの膨潤度測定の結果である。
【図21】ハイドロゲルの応力－ひずみの関係である。
【図22】細胞生存率（％）を表す図である。
【図23】コラーゲンケーシングに対する接着性を表す図である。
【図24】ブタ大動脈を用いた接着性評価結果である。
【図25】耐圧試験後のブタ大動脈の組織学的評価結果である。
【図26】ＵＢＭを含む第２剤を含む本接着剤の第１剤と第２剤との混合時を０分としたときの、せん断弾性率（貯蔵弾性率：Ｐａ）の経時変化である。
【図27】心臓由来のＥＣＭ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）を含む第２剤を含む本接着剤の第１剤と第２剤との混合時を０分としたときの、せん断弾性率（貯蔵弾性率：Ｐａ）の経時変化である。
【図28】肝臓由来のＥＣＭを含む第２剤を含む本接着剤の第１剤と第２剤との混合時を０分としたときの、せん断弾性率（貯蔵弾性率：Ｐａ）の経時変化である。
【図29】すい臓由来のＥＣＭを含む第２剤を含む本接着剤の第１剤と第２剤との混合時を０分としたときの、せん断弾性率（貯蔵弾性率：Ｐａ）の経時変化である。
【図30】小腸由来のＥＣＭを含む第２剤を含む本接着剤の第１剤と第２剤との混合時を０分としたときの、せん断弾性率（貯蔵弾性率：Ｐａ）の経時変化である。
【図31】ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）のみからなる第２剤を含む本接着剤の第１剤と第２剤との混合時を０分としたときの、せん断弾性率（貯蔵弾性率：Ｐａ）の経時変化である。
【図32】種々のＥＣＭを含有する第２剤を用いて作製したハイドロゲルのコラーゲンケーシングに対する接着性を表す図である。
【図33】ゲニピンの仕込み量（当量）に対する、ゲニピンの導入率（式１で表される基の導入率）を表す図である。
【図34】ゲニピンの導入率が９％である第１剤を含む本接着剤の第１剤と第２剤との混合時を０分としたときの、せん断弾性率（貯蔵弾性率：Ｐａ）の経時変化である。
【図35】ゲニピンの導入率が１８％である第１剤を含む本接着剤の第１剤と第２剤との混合時を０分としたときの、せん断弾性率（貯蔵弾性率：Ｐａ）の経時変化である。
【図36】ゲニピンの導入率が３１％である第１剤を含む本接着剤の第１剤と第２剤との混合時を０分としたときの、せん断弾性率（貯蔵弾性率：Ｐａ）の経時変化である。
【図37】ゲニピンの導入率が３３％である第１剤を含む本接着剤の第１剤と第２剤との混合時を０分としたときの、せん断弾性率（貯蔵弾性率：Ｐａ）の経時変化である。
【発明を実施するための形態】
【0009】
以下、本発明について詳細に説明する。
以下に記載する構成要件の説明は、本発明の代表的な実施形態に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に制限されるものではない。
なお、本明細書において、「～」を用いて表される数値範囲は、「～」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
以下に記載する構成要件の説明は、本発明の代表的な実施形態に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に制限されるものではない。
なお、本明細書において、「～」を用いて表される数値範囲は、「～」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
【0010】
本明細書における基（原子群）の表記において、置換及び無置換を記していない表記は、本発明の効果を損ねない範囲で、置換基を有さないものと共に置換基を有するものをも包含するものである。例えば、「アルキル基」とは、置換基を有さないアルキル基（無置換アルキル基）のみならず、置換基を有するアルキル基（置換アルキル基）をも包含するものである。このことは、各化合物についても同義である。
【0011】
［２剤硬化型接着剤］
本発明の実施形態に係る２剤硬化型接着剤（以下、単に「本接着剤」ともいう。）は、第１級アミノ基と、＊を結合位置としたとき式１で表される基と、を分子内にそれぞれ１つ以上有する化合物Ａと、塩基性化合物を含む第１剤と、酸性化合物を含む第２剤とを含む２剤硬化型接着剤である。
本発明の実施形態に係る２剤硬化型接着剤（以下、単に「本接着剤」ともいう。）は、第１級アミノ基と、＊を結合位置としたとき式１で表される基と、を分子内にそれぞれ１つ以上有する化合物Ａと、塩基性化合物を含む第１剤と、酸性化合物を含む第２剤とを含む２剤硬化型接着剤である。
【化1】
【0012】
上記２剤硬化型接着剤により本発明の課題が解決される機序は必ずしも明らかではないが、本発明者は以下のとおりと推測している。なお、以下の推測によって本発明の技術的範囲が限定されるものではなく、以下の機序に依らずに課題が解決される場合であっても、各請求項に記載された事項により特定される２剤硬化型接着剤等については、本発明の範囲に含まれるものとする。
【0013】
本発明者は、迅速に硬化する２剤硬化型接着剤の開発に際し、ゲニピンと第１級アミンとによる架橋（硬化）メカニズムについて鋭意検討してきた。
一般に、ゲニピンの架橋（硬化）反応機構としては、（１）第１級アミンによるゲニピンのＣ３炭素原子への求核攻撃から始まり、ジヒドロピラン環の開環に続いて、求核攻撃で生じた第２級アミンによる、上記開環で生じたアルデヒド基への攻撃でＮ含有複素環（ジヒドロピリジン環）が形成されることによるもの（下記式における「ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｃｈｅｍｅ（１）」）、（２）エステル基を第２級アミド結合で置換するＳＮ２求核置換反応によるもの（下記式における「ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｃｈｅｍｅ（２）」）、及び、（３）酸素ラジカルの存在下で起こる二量化反応（二量化反応形態は複数あると考えられている）があることが知られている。
一般に、ゲニピンの架橋（硬化）反応機構としては、（１）第１級アミンによるゲニピンのＣ３炭素原子への求核攻撃から始まり、ジヒドロピラン環の開環に続いて、求核攻撃で生じた第２級アミンによる、上記開環で生じたアルデヒド基への攻撃でＮ含有複素環（ジヒドロピリジン環）が形成されることによるもの（下記式における「ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｃｈｅｍｅ（１）」）、（２）エステル基を第２級アミド結合で置換するＳＮ２求核置換反応によるもの（下記式における「ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｃｈｅｍｅ（２）」）、及び、（３）酸素ラジカルの存在下で起こる二量化反応（二量化反応形態は複数あると考えられている）があることが知られている。
【0014】
これらの反応のうち、大気環境下でもその進行の制御がより容易で、硬化物における主たる架橋構造の形成に寄与すると推測されるｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｃｈｅｍｅ（１）及びｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｃｈｅｍｅ（２）の反応を段階的に起こさせれば、より迅速に硬化する２剤硬化型接着剤に応用できることを本発明者は着想した。
【0015】
ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｃｈｅｍｅ（１）及びｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｃｈｅｍｅ（２）の反応の速度は様々な要因の影響を受けて変化する可能性があることはすでに知られていた。しかし、本発明者は新たに、塩基性化合物を含む溶液、例えば、ｐＨ７．０を超える水溶液中（ｐＨ１１．０以下が好ましい）では、ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｃｈｅｍｅ（１）の反応が進みやすく、酸性化合物を含む溶液、具体的には、ｐＨ７．０未満の水溶液中（ｐＨ２．０以上が好ましい）では、ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｃｈｅｍｅ（２）の反応が進みやすいことを知見し、これに着目した。
【0016】
かくして、第１級アミノ基を有するゲニピン誘導体を合成して、塩基性化合物によりｐＨを調整して（好ましくはｐＨ＝７．０超にして）これを第１剤の成分とし、これと酸性化合物を含む第２剤とを混合して、ｐＨを下げて、（好ましくはｐＨを７．０未満として）、下記式におけるｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｃｈｅｍｅ（４）の反応を起こさせて硬化させる２剤硬化型接着剤を本発明者は完成させた。
【0017】
第１剤に含まれる化合物Ａは、上記の式１で表される基を有している。式１で表される基は、ゲニピンと第１級アミンとによるｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｃｈｅｍｅ（１）の反応によって生ずる基であるが、驚くべきことに、この基は、反応液のｐＨを低下させることで、ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｃｈｅｍｅ（４）の反応を非常に迅速に進行させることを本発明者は発見した。
【0018】
なお、以下の反応式は、模式的なものであり、それぞれの反応の前後、又は、途中でゲニピンの二量化機構に由来する反応が並行して起こる場合もあるが、省略している。なお、式中、ＲＡ、及び、ＲＢはそれぞれ１価の基を表す。
【0019】
【化2】
【0020】
なお、本発明者は、上記とは逆に、低ｐＨ領域でｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｃｈｅｍｅ（２）の反応を進めてから、ｐＨ調整剤と混合し、ｐＨを上げて、高ｐＨ領域でｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｃｈｅｍｅ（５）の反応により架橋を進行させる形態についても検討したが、所望の効果は得られなかった。
【0021】
すなわち、本接着剤は、反応液のｐＨとゲニピンの架橋反応速度との関係を利用し、かつ、ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｃｈｅｍｅ（４）の反応が迅速に進みやすい式１で表される基を有する化合物Ａを予め準備し、これを架橋剤として用いることで、はじめて所望の効果が得られたものと推測される。
【0022】
なお、上記反応式のｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｃｈｅｍｅ（４）では、第１級アミノ基を有する化合物「Ｈ２Ｎ－ＲＢ」と、化合物Ａとが結合して架橋構造が形成される形態が示されている。この「Ｈ２Ｎ－ＲＢ」は、化合物Ａ自体であってもよい。また、後述するように、「Ｈ２Ｎ－ＲＢ」は、第１剤又は第２剤（好ましくは第２剤）に含まれる他の化合物であってもよい。以下では、本発明の実施形態に係る２剤硬化型接着剤が含む成分について詳述する。
【0023】
〔第１剤〕
第１剤は、化合物Ａと塩基性化合物とを含み、更に溶媒を含んでもよい。
第１剤は、化合物Ａと塩基性化合物とを含み、更に溶媒を含んでもよい。
【0024】
＜化合物Ａ＞
化合物Ａは、第１級アミノ基と、式１で表される基とをそれぞれ分子内に１つ以上有する化合物である。（なお、式中＊は結合位置を表す。）
化合物Ａは、第１級アミノ基と、式１で表される基とをそれぞれ分子内に１つ以上有する化合物である。（なお、式中＊は結合位置を表す。）
【0025】
【化3】
【0026】
第１剤における化合物Ａの含有量としては特に制限されないが、より優れた本発明の効果を有する２剤硬化型接着剤が得られる点で、一般に第１剤中の固形分の全質量に対して、１～９９質量％が好ましい。なお、第１剤は、化合物Ａの１種を単独で含有してもよく、２種以上を含有していてもよい。第１剤が、２種以上の化合物Ａを含有する場合には、その合計含有量が上記数値範囲内であることが好ましい。
【0027】
化合物Ａが有する第１級アミノ基の個数としては特に制限されないが、２個以上が好ましく、３個以上がより好ましく、上限は特に制限されないが、５０個以下が好ましく、１０個以下が好ましく、８個以下がより好ましく、６個以下が更に好ましい。
【0028】
化合物Ａの１分子が有する式１で表される基の個数としては特に制限されないが、２個以上が好ましく、上限は特に制限されないが、５０個以下が好ましく、１０個以下が好ましく、８個以下がより好ましく、６個以下が更に好ましく、４個以下が特に好ましい。
【0029】
化合物Ａにおける第１級アミノ基のモル基準の含有量に対する、式１で表される基のモル基準の含有量の含有量比（式１で表される基／アミノ基）としては、特に制限されないが、一般に、０．０１～２．０が好ましい。より優れた本発明の効果を有する２剤硬化型接着剤が得られる観点では、０．０５～１．２が好ましい。なかでも、化合物Ａが後述する式１で表される化合物である場合、更に優れた本発明の効果を有する２剤硬化型接着剤が得られる観点で、０．４～１．０がより好ましく、０．５～０．９が更に好ましい。
一方、化合物Ａが、後述するポリアミンとしてゼラチンとゲニピンとを反応させて得られるものである場合、上記含有量比としては、０．０５～０．６が好ましい。
一方、化合物Ａが、後述するポリアミンとしてゼラチンとゲニピンとを反応させて得られるものである場合、上記含有量比としては、０．０５～０．６が好ましい。
【0030】
化合物Ａは、第１級アミノ基と式１で表される基とを分子内にそれぞれ１つ以上有する。すでに説明したとおり、式１で表される基は、典型的には、ゲニピンと第１級アミンとが結合して生じる基であり、化合物Ａは、ゲニピン誘導体である。
【0031】
実施例（図２２）にも示すとおり、従来、細胞毒性が低いと考えられていた遊離状態のゲニピン（図２２では、「ＵＢＭ＋Ｇｅｎｉｐｉｎｎ」と記載されている）は、十分に細胞毒性が低いとは言えないことが本発明者の検討によればわかっている。
一方、本実施形態の２剤硬化型接着剤は、架橋に寄与する成分（化合物Ａ）はゲニピン「誘導体」である。これは、言い換えれば、細胞毒性を有するゲニピンが後述する骨格構造に固定された状態となっており、架橋反応の進行に関わらず、ゲニピンそのもの（遊離のゲニピン）による毒性が発現しにくいという優れた特徴も有している。
一方、本実施形態の２剤硬化型接着剤は、架橋に寄与する成分（化合物Ａ）はゲニピン「誘導体」である。これは、言い換えれば、細胞毒性を有するゲニピンが後述する骨格構造に固定された状態となっており、架橋反応の進行に関わらず、ゲニピンそのもの（遊離のゲニピン）による毒性が発現しにくいという優れた特徴も有している。
【0032】
化合物Ａは、典型的には、骨格構造と、上記骨格構造に結合した第１級アミノ基と、式１で表される基とを有する化合物である。
この骨格構造は特に制限されず、種々の有機化合物に由来する構造が使用できる。
例えば、上記骨格構造としては、多糖、ペプチド、タンパク質、ゼラチン、エチレンジアミン、ポリエチレンイミン、ポリアルキレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、及び、ポリアクリル酸等に由来する構造が使用できる。
この骨格構造は特に制限されず、種々の有機化合物に由来する構造が使用できる。
例えば、上記骨格構造としては、多糖、ペプチド、タンパク質、ゼラチン、エチレンジアミン、ポリエチレンイミン、ポリアルキレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、及び、ポリアクリル酸等に由来する構造が使用できる。
【0033】
なかでも、より優れた本発明の効果を有する２剤硬化型接着剤が得られる観点では、骨格構造はエチレンジアミン、ポリエチレンイミン、ポリアルキレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、及び、ポリアクリル酸からなる群より選択される少なくとも１種に由来する構造が好ましく、ポリアルキレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、及び、ポリアクリル酸からなる群より選択される少なくとも１種に由来する構造がより好ましく、ポリアルキレングリコールに由来する構造が更に好ましい。
【0034】
化合物Ａとしては、より優れた本発明の効果を有する２剤硬化型接着剤が得られる観点から、式２で表される化合物が好ましい。
【0035】
【化4】
【0036】
式２中、ｓ１は１以上の整数であり、上限は特に制限されないが、８以下が好ましく、６以下がより好ましく、４以下が更に好ましく、２以下が特に好ましい。
式２中、ｔ１は１以上の整数であり、２以上が好ましく、上限は特に制限されないが１０以下が好ましく、８以下がより好ましく、６以下が更に好ましく、４以下が特に好ましい。
式２中、ｕ１は０以上の整数であり、２以下が好ましく、１以下がより好ましい。
式２中、ｔ１は１以上の整数であり、２以上が好ましく、上限は特に制限されないが１０以下が好ましく、８以下がより好ましく、６以下が更に好ましく、４以下が特に好ましい。
式２中、ｕ１は０以上の整数であり、２以下が好ましく、１以下がより好ましい。
【0037】
Ｍ１はｓ１＋ｔ１＋ｕ１価の基を表す。Ｍ１が２価の基である場合には、Ｍ１は、例えば、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲ２０－（Ｒ２０は水素原子又は１価の有機基を表す）、アルキレン基（炭素数１～１０個が好ましい）、シクロアルキレン基（炭素数３～１０個が好ましい）、アルケニレン基（炭素数２～１０個が好ましい）、及び、これらの組み合わせ等が挙げられる。
なかでも、より優れた本発明の効果を有する２剤硬化型接着剤が得られる観点では、－Ｃ（Ｏ）－、－ＮＨ－、－Ｏ－、炭素数１～５個のアルキレン基、及び、これらの組み合わせ等が好ましい。
なかでも、より優れた本発明の効果を有する２剤硬化型接着剤が得られる観点では、－Ｃ（Ｏ）－、－ＮＨ－、－Ｏ－、炭素数１～５個のアルキレン基、及び、これらの組み合わせ等が好ましい。
【0038】
また、Ｍ１が３価以上の基である場合には、特に制限されないが、例えば、（３ａ）～（３ｄ）で表される基が挙げられる。
【化5】
【0039】
式３ａ中、Ｑ３は３価の基を表す。Ｔ３は単結合又は２価の基を表し、３個のＴ３は互いに同一であってもよく異なっていてもよい。
Ｑ３としては、第３級アミノ基、３価の炭化水素基（炭素数１～１０個が好ましい。なお、炭化水素基は、芳香族炭化水素基でもよく脂肪族炭化水素基でもよい。）、又は、３価の複素環基（５員環～７員環の複素環基が好ましい）が挙げられ、炭化水素基にはヘテロ原子（例えば、－Ｏ－）が含まれていてもよい。Ｑ３の具体例としては、グリセリン残基、トリメチロールプロパン残基、フロログルシノール残基、及び、シクロヘキサントリオール残基等が挙げられる。
なお、Ｔ３の２価の基としては特に制限されないが、すでに説明したＭ１の２価の基と同様の基が挙げられ、なかでも、置換基を有していてもよい炭素数１～５のアルキレン基が好ましい。
Ｑ３としては、第３級アミノ基、３価の炭化水素基（炭素数１～１０個が好ましい。なお、炭化水素基は、芳香族炭化水素基でもよく脂肪族炭化水素基でもよい。）、又は、３価の複素環基（５員環～７員環の複素環基が好ましい）が挙げられ、炭化水素基にはヘテロ原子（例えば、－Ｏ－）が含まれていてもよい。Ｑ３の具体例としては、グリセリン残基、トリメチロールプロパン残基、フロログルシノール残基、及び、シクロヘキサントリオール残基等が挙げられる。
なお、Ｔ３の２価の基としては特に制限されないが、すでに説明したＭ１の２価の基と同様の基が挙げられ、なかでも、置換基を有していてもよい炭素数１～５のアルキレン基が好ましい。
【0040】
式３ｂ中、Ｑ４は４価の基を表す。Ｔ４は単結合又は２価の基を表し、４個のＴ４は互いに同一であってもよく異なっていてもよい。
なお、Ｑ４としては、４価の炭化水素基（炭素数１～１０個が好ましい。なお、炭化水素基は、芳香族炭化水素基でもよく脂肪族炭化水素基でもよい。）、４価の複素環基（５～７員環の複素環基が好ましい）が挙げられ、炭化水素基にはヘテロ原子（例えば、－Ｏ－）が含まれていてもよい。Ｑ４の具体例としては、ペンタエリスリトール残基、及び、ジトリメチロールプロパン残基等が挙げられる。
なお、Ｔ４の２価の基としては特に制限されないが、すでに説明したＭ１の２価の基と同様の基が挙げられ、なかでも、－Ｏ－、炭素数１～５のアルキレン基、又は、これらの組合せが好ましい。
なお、Ｑ４としては、４価の炭化水素基（炭素数１～１０個が好ましい。なお、炭化水素基は、芳香族炭化水素基でもよく脂肪族炭化水素基でもよい。）、４価の複素環基（５～７員環の複素環基が好ましい）が挙げられ、炭化水素基にはヘテロ原子（例えば、－Ｏ－）が含まれていてもよい。Ｑ４の具体例としては、ペンタエリスリトール残基、及び、ジトリメチロールプロパン残基等が挙げられる。
なお、Ｔ４の２価の基としては特に制限されないが、すでに説明したＭ１の２価の基と同様の基が挙げられ、なかでも、－Ｏ－、炭素数１～５のアルキレン基、又は、これらの組合せが好ましい。
【0041】
式３ｃ中、Ｑ５は５価の基を表す。Ｔ５は単結合又は２価の基を表し、５個のＴ５は互いに同一であってもよく異なっていてもよい。
なお、Ｑ５としては、５価の炭化水素基（炭素数２～１０が好ましい。なお、炭化水素基は、芳香族炭化水素基でもよく脂肪族炭化水素基でもよい。）、又は、５価の複素環基（５～７員環の複素環基が好ましい）が挙げられ、炭化水素基にはヘテロ原子（例えば、－Ｏ－）が含まれていてもよい。Ｑ５の具体例としては、アラビニトール残基、フロログルシドール残基、及び、シクロヘキサンペンタオール残基等が挙げられる。
なお、Ｔ５の２価の基としては特に制限されないが、すでに説明したＭ１の２価の基と同様の基が挙げられ、好適形態も同様である。
なお、Ｑ５としては、５価の炭化水素基（炭素数２～１０が好ましい。なお、炭化水素基は、芳香族炭化水素基でもよく脂肪族炭化水素基でもよい。）、又は、５価の複素環基（５～７員環の複素環基が好ましい）が挙げられ、炭化水素基にはヘテロ原子（例えば、－Ｏ－）が含まれていてもよい。Ｑ５の具体例としては、アラビニトール残基、フロログルシドール残基、及び、シクロヘキサンペンタオール残基等が挙げられる。
なお、Ｔ５の２価の基としては特に制限されないが、すでに説明したＭ１の２価の基と同様の基が挙げられ、好適形態も同様である。
【0042】
式３ｄ中、Ｑ６は６価の基を表す。Ｔ６は単結合又は２価の基を表し、６個のＴ６は互いに同一であってもよく異なっていてもよい。
なお、Ｑ６としては、６価の炭化水素基（炭素数２～１０が好ましい。なお、炭化水素基は、芳香族炭化水素基でもよく脂肪族炭化水素基でもよい。）、又は、６価の複素環基（６～７員環の複素環基が好ましい）が挙げられ、炭化水素基にはヘテロ原子（例えば、－Ｏ－）が含まれていてもよい。Ｑ６の具体例としては、マンニトール残基、ソルビトール残基、ジペンタエリスリトール残基、ヘキサヒドロキシベンゼン、及び、ヘキサヒドロキシシクロヘキサン残基等が挙げられる。
なお、Ｔ６の２価の基としては特に制限されないが、すでに説明したＭ１の２価の基と同様の基が挙げられ、好適形態も同様である。
なお、Ｑ６としては、６価の炭化水素基（炭素数２～１０が好ましい。なお、炭化水素基は、芳香族炭化水素基でもよく脂肪族炭化水素基でもよい。）、又は、６価の複素環基（６～７員環の複素環基が好ましい）が挙げられ、炭化水素基にはヘテロ原子（例えば、－Ｏ－）が含まれていてもよい。Ｑ６の具体例としては、マンニトール残基、ソルビトール残基、ジペンタエリスリトール残基、ヘキサヒドロキシベンゼン、及び、ヘキサヒドロキシシクロヘキサン残基等が挙げられる。
なお、Ｔ６の２価の基としては特に制限されないが、すでに説明したＭ１の２価の基と同様の基が挙げられ、好適形態も同様である。
【0043】
なお、Ｍ１が７価以上の基である場合には、式３ａ～式３ｄで表した基を組み合わせた基を用いることができる。
【0044】
式２中、Ｌ１、Ｌ２、及び、Ｌ３は、それぞれ独立に単結合、又は、２価の基であり、２価の基としては特に制限されないが、Ｍ１の２価の基としてすでに説明した基と同様の基が挙げられる。
また、Ｌ１、Ｌ２、及び、Ｌ３は、炭素数が１～１０個のアルキレンオキシ基（オキシアルキレン基）を含むことが好ましい。なお、アルキレンオキシ基を含む基には、ポリオキシアルキレン基も含まれる。
Ｌ１、Ｌ２、及び、Ｌ３は、炭素数が１～１０個のアルキレンオキシ基（オキシアルキレン基）を含む場合、本接着剤の硬化物がより優れた親水性を有し、結果として、より優れた組織接着性、及び／又は、生体適合性を有する。
また、Ｌ１、Ｌ２、及び、Ｌ３は、炭素数が１～１０個のアルキレンオキシ基（オキシアルキレン基）を含むことが好ましい。なお、アルキレンオキシ基を含む基には、ポリオキシアルキレン基も含まれる。
Ｌ１、Ｌ２、及び、Ｌ３は、炭素数が１～１０個のアルキレンオキシ基（オキシアルキレン基）を含む場合、本接着剤の硬化物がより優れた親水性を有し、結果として、より優れた組織接着性、及び／又は、生体適合性を有する。
【0045】
なかでも、より優れた本発明の効果を有する２剤硬化型接着剤が得られる観点から、Ｌ１、Ｌ２、及び、Ｌ３の２価の基としては以下の式（４）で表される基が好ましい。
【0046】
【化6】
【0047】
式４中、Ｒ１は、それぞれ独立に置換基を有していてもよい、炭素数が１～１０個（より好ましくは炭素数２～６個）のアルキレン基が好ましく、－ＣＨ２ＣＨ２－がより好ましい。また、Ｌ４は、単結合、又は、２価の基であり、Ｌ４の２価の基としては、Ｍ１の２価の基として説明したのと同様の基が挙げられる。
また、ｐ１は、２以上の数を表し、特に制限されないが、５０以上がより好ましく、１００以上が更に好ましく、１００００以下が好ましく、５０００以下がより好ましく、２０００以下が更に好ましく、１０００以下が特に好ましい。
また、＊は、Ｍ１との結合位置を表し、＊＊は他方の結合位置を表す。
なお、Ｌ１、Ｌ２、及び、Ｌ３はそれぞれ同一でも異なってもよいが、全て同一であることが好ましい。
また、ｐ１は、２以上の数を表し、特に制限されないが、５０以上がより好ましく、１００以上が更に好ましく、１００００以下が好ましく、５０００以下がより好ましく、２０００以下が更に好ましく、１０００以下が特に好ましい。
また、＊は、Ｍ１との結合位置を表し、＊＊は他方の結合位置を表す。
なお、Ｌ１、Ｌ２、及び、Ｌ３はそれぞれ同一でも異なってもよいが、全て同一であることが好ましい。
【0048】
また、式２においてＹ１は水素原子、又は、第１級アミノ基を有しない１価の基である。１価の基としては特に制限されないが、例えば、ヘテロ原子を有していてもよい炭化水素基、ハロゲン原子、カルボキシ基、ヒドロキシ基、及び、アルコキシ基等が挙げられる。また、Ｙ１は、以下の式で表される基でもよい。なお、式中、＊は結合位置を表す。
【0049】
【化7】
【0050】
また、式２においてＸ１は式１で表される基である。
【0051】
より優れた本発明の効果を有する２剤硬化型接着剤が得られる観点から、化合物Ａは以下の式５で表される化合物が好ましい。
【化8】
【0052】
式５中、Ｘ１、Ｌ１、及び、Ｌ２はそれぞれ式２中における各記号と同義であり、好適形態も同様である。Ｍ５は４価の基であり、具体例、及び、好適形態は式２中のＭ１の４価の基と同様である。また、ｓ５は１～３の整数である。
【0053】
化合物Ａの分子量としては特に制限されないが、典型的には、１００～３００，０００が好ましく、１０００～２００，０００がより好ましく、２０００～１００，０００が更に好ましい。
【0054】
（化合物Ａの合成方法）
化合物Ａは、典型的には、ゲニピンとポリアミン（本明細書においては、第１級アミノ基を２個以上含む化合物を意味する。）とを塩基性溶液中で反応させることにより得ることができる。
化合物Ａは、典型的には、ゲニピンとポリアミン（本明細書においては、第１級アミノ基を２個以上含む化合物を意味する。）とを塩基性溶液中で反応させることにより得ることができる。
【0055】
ポリアミンとしては、キトサン、アルブミン、ゼラチン、エチレンジアミン、及び、ポリエチレンイミン等のような、第１級アミノ基を複数有しているものであれば使用できる。また、ポリアルキレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、及び、ポリアクリル酸等に、第１級アミノ基を導入したものも使用できる。
【0056】
得られる化合物Ａを含む２剤硬化型接着剤がより優れた本発明の効果を有する点で、ポリアミンとしては、以下の式６で表される化合物が好ましい。
【0057】
【化9】
【0058】
式６中、ｓ６は２以上の整数を表し、上限は特に制限されないが９以下が好ましく、７以下がより好ましく、５以下が更に好ましく、３以下が特に好ましい。
式２中、u６は０以上の整数を表し、２以下が好ましく、１以下がより好ましい。
式２中、u６は０以上の整数を表し、２以下が好ましく、１以下がより好ましい。
【0059】
式６中、Ｍ１、Ｌ１、Ｌ３、及び、Ｙ１は、それぞれ式２における各記号と同義であり、好適形態も同様である。
なかでも、Ｙ１は、水素原子、ヒドロキシ基、又は、以下の基が好ましい。なお、以下の式において＊は結合位置を表す。
なかでも、Ｙ１は、水素原子、ヒドロキシ基、又は、以下の基が好ましい。なお、以下の式において＊は結合位置を表す。
【0060】
【化10】
【0061】
ポリアミンの具体例としては、キトサン等のアミノ糖を構成単位として有する多糖；エラスチン、アルブミン、及び、コラーゲン等のタンパク質等が挙げられある。また、ポリアミンとしては、リジン（ｌｙｓｉｎｅ）に由来する第１級アミノ基を有するゼラチン等も使用できる。
【0062】
また、ポリアミンの他の例として、エチレンジアミン、又は、ポリエチレンイミンも挙げられる。このとき、ポリエチレンイミンの分子量としては特に制限されないが、より優れた本発明の効果が得られる点で、３００～１００，０００が好ましい。
【0063】
また、ポリアミンの他の例として、ポリアルキレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、及び、ポリアクリル酸からなる群より選択される少なくとも１種のポリマーに複数の第１級アミノ基が導入された誘導体を用いることもできる。
上記ポリマーより優れた親水性を有し、より優れた生体適合性を有するため、上記ポリアミンを用いた場合、２剤硬化型接着剤の硬化物は優れた生体適合性を有する。
上記ポリマーより優れた親水性を有し、より優れた生体適合性を有するため、上記ポリアミンを用いた場合、２剤硬化型接着剤の硬化物は優れた生体適合性を有する。
【0064】
ポリアミンの分子量としては特に制限されないが、得られる硬化物がより優れた機械特性を有する点で、３００以上が好ましく、第１剤がより優れた流動性を有する点で、２００，０００以下が好ましい。
【0065】
＜塩基性化合物＞
第１剤は塩基性化合物を含む。本明細書において、塩基性化合物とは、２５℃の超純水１ｋｇに、炭酸ガスを含まない不活性ガス雰囲気中で、その化合物を０．０５ｍｏｌ溶解させたとき、水溶液のｐＨが７．０（小数第２位を切り上げ）を超える化合物を意味する。
第１剤は塩基性化合物を含む。本明細書において、塩基性化合物とは、２５℃の超純水１ｋｇに、炭酸ガスを含まない不活性ガス雰囲気中で、その化合物を０．０５ｍｏｌ溶解させたとき、水溶液のｐＨが７．０（小数第２位を切り上げ）を超える化合物を意味する。
【0066】
塩基性化合物としては、特に制限されないが、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、及び、ホウ酸ナトリウム等が挙げられる。
第１剤が塩基性化合物を含む形態は特に制限されず、例えば、化合物Ａの合成過程で使用されるｐＨ調整剤（水酸化ナトリウム等）や、緩衝剤（リン酸水素二ナトリウム等)が、最終的に第１剤に残留した形態であってもよい。
第１剤が塩基性化合物を含む形態は特に制限されず、例えば、化合物Ａの合成過程で使用されるｐＨ調整剤（水酸化ナトリウム等）や、緩衝剤（リン酸水素二ナトリウム等)が、最終的に第１剤に残留した形態であってもよい。
【0067】
より具体的には、化合物Ａは、典型的には、アルカリ性水溶液中で、ゲニピンとポリアミンとを反応させて得ることが好ましく、この際、溶液中にはｐＨ調整剤や緩衝剤として塩基性化合物が含まれている。第１剤は、化合物Ａの合成過程において使用された塩基性化合物が残留することにより、塩基性化合物を含む形態であってもよい。
【0068】
第１剤における塩基性化合物の含有量としては特に制限されないが、より優れた本発明の効果を有する２剤硬化型接着剤が得られる点で、一般に第１剤の固形分の全質量に対して、０．０００１～９９質量％が好ましい。なお、第１剤は、塩基性化合物の１種を単独で含有してもよく、２種以上を含有していてもよい。第１剤が、２種以上の塩基性化合物を含有する場合には、その合計含有量が上記数値範囲内であることが好ましい。
【0069】
＜溶媒＞
第１剤は溶媒を含んでいてもよい。溶媒としては特に制限されないが、水、アルコール等の水溶性有機溶媒、又は、その混合物が好ましく、水が好ましい。
第１剤中の溶媒の含有量としては特に制限されないが、取り扱い性、及び、硬化性の観点から、第１剤の固形分が、０．０１～９９質量％に調製されることが好ましく、０．１～４０質量％に調整されることがより好ましく、１～３０質量％に調製されることがより好ましい。
第１剤が溶媒を含むとき、第１剤のｐＨとしては特に制限されないが、ｐＨ７．０を超えることが好ましく、１１未満が好ましい。
第１剤は溶媒を含んでいてもよい。溶媒としては特に制限されないが、水、アルコール等の水溶性有機溶媒、又は、その混合物が好ましく、水が好ましい。
第１剤中の溶媒の含有量としては特に制限されないが、取り扱い性、及び、硬化性の観点から、第１剤の固形分が、０．０１～９９質量％に調製されることが好ましく、０．１～４０質量％に調整されることがより好ましく、１～３０質量％に調製されることがより好ましい。
第１剤が溶媒を含むとき、第１剤のｐＨとしては特に制限されないが、ｐＨ７．０を超えることが好ましく、１１未満が好ましい。
【0070】
第１剤は本発明の効果を奏する範囲内において、その他の成分を含んでいてもよい。その他の成分は、第２剤が含んでもよい「その他の成分」と同様であり、後述する。
【0071】
〔第２剤〕
第２剤は酸性化合物を含む。本明細書において、酸性化合物とは、２５℃の超純水１ｋｇに、炭酸ガスを含まない不活性ガス雰囲気中で、その化合物を０．０５ｍｏｌ溶解させたとき、水溶液のｐＨが７．０未満（小数第２位を切り上げ）となる化合物を意味する。
第２剤は酸性化合物を含む。本明細書において、酸性化合物とは、２５℃の超純水１ｋｇに、炭酸ガスを含まない不活性ガス雰囲気中で、その化合物を０．０５ｍｏｌ溶解させたとき、水溶液のｐＨが７．０未満（小数第２位を切り上げ）となる化合物を意味する。
【0072】
第２剤中における酸性化合物の含有量としては特に制限されないが、第１剤との関係で、使用の際に２剤（溶媒を含む）を混合したとき、混合液のｐＨが８．０以下となるよう調整されることが好ましい。
混合液のｐＨは、第１剤に含まれる塩基性化合物の種類、及び、量、並びに、第１剤が溶媒を含む場合には溶媒の種類、及び、量の影響を受ける。また、使用時の混合液の温度等の影響も受ける。
従って、酸性化合物の含有量は、上記条件に従って適宜選択されればよい。このようなｐＨの調整は当業者にとっては容易である。
混合液のｐＨは、第１剤に含まれる塩基性化合物の種類、及び、量、並びに、第１剤が溶媒を含む場合には溶媒の種類、及び、量の影響を受ける。また、使用時の混合液の温度等の影響も受ける。
従って、酸性化合物の含有量は、上記条件に従って適宜選択されればよい。このようなｐＨの調整は当業者にとっては容易である。
【0073】
２剤硬化型接着剤の硬化がより速くなりやすい点では、２剤の混合液のｐＨは７．０以下に調整されることがより好ましく、７．０未満となるよう調整されることが好ましい。
一方、混合液を調製した後から硬化までのより十分な時間（より十分なポットライフ）が確保される観点では、混合液のｐＨが２．０以上となるよう調整されることが好ましく、ｐＨが２．０超となるよう調整されることがより好ましく、５．０以上となるよう調整されることが更に好ましい。
一方、混合液を調製した後から硬化までのより十分な時間（より十分なポットライフ）が確保される観点では、混合液のｐＨが２．０以上となるよう調整されることが好ましく、ｐＨが２．０超となるよう調整されることがより好ましく、５．０以上となるよう調整されることが更に好ましい。
【0074】
第２剤のｐＨとしては、特に制限されないが、混合液のｐＨを調整し易い観点では、７．０未満であることが好ましく、５．０以下であることが好ましく、５．０未満であることがより好ましく、３．０以下であることが更に好ましく、２．０以上が好ましく、２．０を超えることが好ましく、２．５以上が更に好ましい。
【0075】
酸性化合物としては特に制限されないが、塩酸、酢酸、ホウ酸、クエン酸、クエン酸塩等が挙げられる。
第２剤における酸性化合物の含有量としては特に制限されないが、より優れた本発明の効果を有する２剤硬化型接着剤が得られる点で、一般に第２剤の固形分の全質量に対して、０．００１～９９質量％が好ましい。なお、第１剤は、酸性化合物の１種を単独で含有してもよく、２種以上を含有していてもよい。第１剤が、２種以上の酸性化合物を含有する場合には、その合計含有量が上記数値範囲内であることが好ましい。
第２剤における酸性化合物の含有量としては特に制限されないが、より優れた本発明の効果を有する２剤硬化型接着剤が得られる点で、一般に第２剤の固形分の全質量に対して、０．００１～９９質量％が好ましい。なお、第１剤は、酸性化合物の１種を単独で含有してもよく、２種以上を含有していてもよい。第１剤が、２種以上の酸性化合物を含有する場合には、その合計含有量が上記数値範囲内であることが好ましい。
【0076】
＜溶媒＞
第２剤は溶媒を含んでいてもよい。溶媒としては特に制限されないが、水、アルコール等の水溶性有機溶媒、又は、その混合物が好ましく、水が好ましい。
第２剤中の溶媒の含有量としては特に制限されないが、取り扱い性、及び、硬化性の観点から、第２剤の固形分が、０．０１～９９質量％に調製されることが好ましく、０．０１～１０質量％に調製されることがより好ましい。
第２剤は溶媒を含んでいてもよい。溶媒としては特に制限されないが、水、アルコール等の水溶性有機溶媒、又は、その混合物が好ましく、水が好ましい。
第２剤中の溶媒の含有量としては特に制限されないが、取り扱い性、及び、硬化性の観点から、第２剤の固形分が、０．０１～９９質量％に調製されることが好ましく、０．０１～１０質量％に調製されることがより好ましい。
【0077】
水溶性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、及び、イソプロピルアルコール等の炭素数が５個以下のアルコール、ジメチルスルホキシド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられる。
【0078】
＜その他の成分＞
第２剤は、上記以外の成分を含んでいてもよい。
上記成分としては例えば、化合物Ａの合成に使用できる化合物として説明したポリアミンが挙げられる。第２剤がポリアミンを含有すると、より速く硬化する、及び／又は、より優れた接着性を有する硬化物を形成可能な、２剤硬化型接着剤が得られる。
第２剤は、上記以外の成分を含んでいてもよい。
上記成分としては例えば、化合物Ａの合成に使用できる化合物として説明したポリアミンが挙げられる。第２剤がポリアミンを含有すると、より速く硬化する、及び／又は、より優れた接着性を有する硬化物を形成可能な、２剤硬化型接着剤が得られる。
【0079】
上記その他の成分としては、細胞外マトリックスが好ましい。
本明細書において「細胞外マトリックス」（ＥＣＭ：Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）は、「細胞外基質」と同義であり、上皮細胞、非上皮細胞を問わず体細胞（ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ）の間に存在する物質を意味する。
細胞外マトリックスは、一般には細胞が産生する生体物質の一つである。細胞外マトリックスは、組織の支持だけでなく、体細胞の生存に必要な内部環境の構成に関与する。細胞外マトリックスは、一般に、結合組織細胞から産生されるが、一部は上皮細胞や内皮細胞のような基底膜を保有する細胞自身からも分泌される。
本明細書において「細胞外マトリックス」（ＥＣＭ：Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）は、「細胞外基質」と同義であり、上皮細胞、非上皮細胞を問わず体細胞（ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ）の間に存在する物質を意味する。
細胞外マトリックスは、一般には細胞が産生する生体物質の一つである。細胞外マトリックスは、組織の支持だけでなく、体細胞の生存に必要な内部環境の構成に関与する。細胞外マトリックスは、一般に、結合組織細胞から産生されるが、一部は上皮細胞や内皮細胞のような基底膜を保有する細胞自身からも分泌される。
【0080】
細胞外マトリックスは線維成分とその間を満たす基質とに大別され、線維成分としては膠原線維、及び、弾性線維がある。基質の基本構成成分はグリコサミノグリカン（酸性ムコ多糖）であり、その大部分は非コラーゲン性タンパクと結合してプロテオグリカン（酸性ムコ多糖－タンパク複合体）の高分子を形成している。このほかに、基底膜のラミニン、弾性線維周囲のミクロフィブリル（ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌ）、線維、細胞表面のフィブロネクチンなどの糖タンパクも基質に含まれる。代表的な細胞外マトリックスとしては、例えば、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＶ、エラスチン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、トロンボスポンディン、及び、プロテオグリカン類（例えば、デコリン、バイグリカン、フィブロモジュリン、ルミカン、ヒアルロン酸、アグリカン等）等が挙げられる。
【0081】
第２剤が細胞外マトリックスを含む場合、２剤硬化型接着剤の硬化物はより優れた組織再生能を有し、より優れた組織接着力を有し、及び、より速く硬化する。
【0082】
細胞外マトリックスは購入してもよいし、公知の方法で調製してもよい。細胞外マトリックスを調製する方法としては特に限定されないが、例えば、生体由来の器官を洗浄し、その後に、必要に応じて核酸を除去する処理を行い、その後に、酸性溶液中でトリプシン、及び、ペプシン等の酸性プロテアーゼによる消化を行い、得られた消化液から凍結乾燥等の方法によって溶媒を除去する方法が使用できる。また、培養細胞に分泌させたものを使用することもできる。
第２剤が細胞外マトリックスを含む場合、その調製方法に由来して、第２剤に含まれる酸性化合物は、細胞外マトリックスの調製工程に起因して、結果として第２剤に含まれる（移行される）ものであってもよい。
第２剤が細胞外マトリックスを含む場合、その調製方法に由来して、第２剤に含まれる酸性化合物は、細胞外マトリックスの調製工程に起因して、結果として第２剤に含まれる（移行される）ものであってもよい。
【0083】
細胞外マトリックスの調製に使用される生体由来の器官の種類は特に限定されないが、例えば、哺乳類の膀胱、心臓、肝臓、すい臓、及び、小腸等が挙げられ、得られる２剤硬化型接着剤がより優れた接着性（耐圧強度：図３２）を有する観点では、膀胱、心臓、肝臓、及び、小腸からなる群より選択される少なくとも1種が好ましく、膀胱、及び、小腸からなる群より選択される少なくとも1種がより好ましい。また、培養細胞としては、ヒト胎児由来の線維芽細胞等が挙げられる。
【0084】
第２剤が細胞外マトリックスを含む場合、第２剤中における細胞外マトリックスの含有量としては特に制限されないが、一般に第２剤中の固形分の全質量を１００質量％としたとき、特に限定されないが、０．１～９９．９９質量％が好ましく、第２剤中に含まれる他の成分、特に酸性化合物の含有量に応じて適宜調整されればよい。
【0085】
第２剤は、上記以外にも各種薬剤等を含んでもよい。
第２剤がこれらの薬剤を含有すると、本接着剤の硬化物を、薬剤の局所デリバリー担体、又は、徐放性デリバリー担体として使用できる。
薬剤としては、特に限定されないが、抗がん剤、抗炎症薬、抗血栓薬、抗生物質、及び、生物学的製剤、並びに、線維芽細胞増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、及び、肝細胞増殖因子等の成長因子が挙げられる。
また、ワクチンとしてのウイルス、及び／又は、癌の抗原タンパク質を含む場合、本接着剤の硬化物をワクチンキャリアとして使用できる。
第２剤がこれらの薬剤を含有すると、本接着剤の硬化物を、薬剤の局所デリバリー担体、又は、徐放性デリバリー担体として使用できる。
薬剤としては、特に限定されないが、抗がん剤、抗炎症薬、抗血栓薬、抗生物質、及び、生物学的製剤、並びに、線維芽細胞増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、及び、肝細胞増殖因子等の成長因子が挙げられる。
また、ワクチンとしてのウイルス、及び／又は、癌の抗原タンパク質を含む場合、本接着剤の硬化物をワクチンキャリアとして使用できる。
【0086】
〔２剤硬化型接着剤の構成〕
本接着剤は第１剤と第２剤とを有し、これを混合することで硬化反応が進行し、迅速に硬化するという特徴を有する。しかも、第１剤中の塩基性化合物の含有量、及び、第２剤の酸性化合物の含有量の相対的な関係を調整する、すなわち、混合物のｐＨを下げる程度を調整することによりポットライフを自由に制御できる（詳細は実施例に示されている）。そのため、生体内の損傷部位の修復を目的とする場合、作業時間を予め勘案の上、混合物のｐＨを下げる程度を調製すれば、２剤を混合後にその損傷部にシリンジ等で本接着剤を直接注入し、損傷部位で迅速に硬化させるといった使用もできる。
本接着剤は第１剤と第２剤とを有し、これを混合することで硬化反応が進行し、迅速に硬化するという特徴を有する。しかも、第１剤中の塩基性化合物の含有量、及び、第２剤の酸性化合物の含有量の相対的な関係を調整する、すなわち、混合物のｐＨを下げる程度を調整することによりポットライフを自由に制御できる（詳細は実施例に示されている）。そのため、生体内の損傷部位の修復を目的とする場合、作業時間を予め勘案の上、混合物のｐＨを下げる程度を調製すれば、２剤を混合後にその損傷部にシリンジ等で本接着剤を直接注入し、損傷部位で迅速に硬化させるといった使用もできる。
【0087】
２剤硬化型接着剤の全固形分に対する、第１剤の含有量の含有質量比（百分率）としては、特に限定されないが、０．０１質量％以上が好ましく、７０質量％以上がより好ましく、８０質量％以上が更に好ましく、９０質量％以上が特に好ましく、９５質量％以上が最も好ましく、９９．９９質量％以下が好ましい。
【0088】
一方、２剤硬化型接着剤の全固形分に対する、第２剤の含有量としては特に限定されないが、一般に、０．０１質量％以上が好ましく、３０質量％以下が好ましく、２０質量％以下がより好ましく、１０質量％以下が更に好ましく、５質量％以下が特に好ましい。
【0089】
本接着剤は第１剤と第２剤とを有するため、予めこれらをシリンジに封入してプレフィルドシリンジとしてもよい。その場合、後段の実施例に示されるとおり、力学特性、架橋時間、及び、ポットライフ等を自由に制御できるため、筋損傷の治癒、膵液漏の予防、心筋梗塞後の菲薄化予防、癒着防止、脊髄損傷治療、褥瘡治療、及び、消化管粘膜における創傷治癒等に応用できる。
【0090】
本接着剤の硬化方法としては特に限定されないが、例えば、２０～４０℃の温度で、１０分～２時間程度静置することが好ましく、３０～６０分静置することがより好ましい。
【0091】
〔硬化物〕
本接着剤の硬化物は化合物Ａ、及び、必要により添加される細胞外マトリックス等により形成される架橋構造により、３次元網目構造を有している。生体適合性、及び、組織再生能の観点からは、硬化物は水を含むハイドロゲルであることが好ましい。水は第１剤、及び／又は、第２剤に由来するものであってもよいし、被着物周辺に存在するものであってもよい。
本接着剤の硬化物は化合物Ａ、及び、必要により添加される細胞外マトリックス等により形成される架橋構造により、３次元網目構造を有している。生体適合性、及び、組織再生能の観点からは、硬化物は水を含むハイドロゲルであることが好ましい。水は第１剤、及び／又は、第２剤に由来するものであってもよいし、被着物周辺に存在するものであってもよい。
【0092】
ハイドロゲルは、水を含む流動性の無いゲルである。ハイドロゲル中における水分含有量としては、特に限定されないが、ハイドロゲルの全質量を１００質量％としたとき、８０～９９重量％であることが好ましい。
【0093】
〔２剤硬化型接着剤の用途〕
本接着剤は、ゲニピン誘導体を用いつつ、迅速に硬化可能である。また、第２剤がＥＣＭを含む形態では、より高い生体適合性、より高い組織接着性、及び、より高い組織再生能を有する硬化物（ハイドロゲル）を形成可能であるため、医療用の組織接着剤として用いることができる。
本接着剤は、ゲニピン誘導体を用いつつ、迅速に硬化可能である。また、第２剤がＥＣＭを含む形態では、より高い生体適合性、より高い組織接着性、及び、より高い組織再生能を有する硬化物（ハイドロゲル）を形成可能であるため、医療用の組織接着剤として用いることができる。
【0094】
また、第１剤又は第２剤が薬剤を含む形態では、硬化物を病巣に定着させて、薬剤を放出させる用途にも用いることができる。また、特に第２剤がＥＣＭを含む形態では生体適合性がより高いため、再生医療分野における、細胞移植の際の細胞の足場材料として使用することもできる。
【実施例】
【0095】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0096】
＜化合物Ａを含む第１剤の調製＞
末端にアミノ基を有する４分岐型ポリエチレングリコール（ＮＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯ製、商品名「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＰＴＥ－２００ＰＡ」、分子量２万）をリン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）に分散させた。以下、この水分散液を「ポリアミン液」という。
末端にアミノ基を有する４分岐型ポリエチレングリコール（ＮＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯ製、商品名「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＰＴＥ－２００ＰＡ」、分子量２万）をリン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）に分散させた。以下、この水分散液を「ポリアミン液」という。
【0097】
なお、上記「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＰＴＥ－２００ＰＡ」は、式６で表されるポリアミンに該当し、式６において、Ｍ１がペンタエリスリトール残基、Ｌ１が式４で表される基であり、式４のＲ１が－ＣＨ２ＣＨ２－、Ｌ４が－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｕ６が０であり、ｓ６が４である化合物（分子量２０，０００）を主成分として含んでいる。
【0098】
ポリアミン液に、４分岐型ポリエチレングリコール中のアミノ基の量（ｎ）を１００モル％としたときに５０～１２５モル％のゲニピンを添加し、撹拌した。２０～３０℃で３～６０分間撹拌することによって、液中で化合物Ａが合成され、いずれの条件でも式５に該当する化合物が得られた。反応終了後、分散液を急速冷凍し、サンプルを保管した。これは本接着剤における第１剤（溶媒を含む形態）に該当する。なお、第１剤は、リン酸水素二ナトリウム（緩衝剤）、及び、水酸化ナトリウム（ｐＨ調整剤）を含んでいる。
【0099】
また、上記分散液を凍結乾燥することで、化合物Ａ（及び、塩基性化合物）を含む乾燥粉末が得られた。これは本接着剤における溶媒を含まない形態の第１剤に該当する。以下の各試験では、必要に応じてこれを超純水で再溶解して、液状の第１剤として使用した。
【0100】
＜紫外可視分光光度計による測定＞
上記方法に沿って化合物Ａを合成する際に、ポリアミンの１分子あたりに導入されるゲニピンの個数を測定するために、紫外可視分光光度計による測定を行った。ゲニピン（７０モル％）とポリアミン液（ポリアミンの含有量が２０質量％、ｐＨ＝１０.５）を混合してから、各時間（～６０分）にサンプルを分取し、吸収スペクトルからゲニピン導入量（式１で表される基の導入量）を計算した。なお、検量線としては、ゲニピンとエタノールアミンをとを反応させ、２９０ｎｍの吸収を測定したものを用いた。
上記方法に沿って化合物Ａを合成する際に、ポリアミンの１分子あたりに導入されるゲニピンの個数を測定するために、紫外可視分光光度計による測定を行った。ゲニピン（７０モル％）とポリアミン液（ポリアミンの含有量が２０質量％、ｐＨ＝１０.５）を混合してから、各時間（～６０分）にサンプルを分取し、吸収スペクトルからゲニピン導入量（式１で表される基の導入量）を計算した。なお、検量線としては、ゲニピンとエタノールアミンをとを反応させ、２９０ｎｍの吸収を測定したものを用いた。
【0101】
その結果、ポリアミン液とゲニピンとを混合して１分経過後から２９０ｎｍの吸収が大きく上昇し、反応時間の増加に伴って吸収が増加した。
図１は、横軸を反応時間（分）とし、縦軸をポリアミン１分子へのゲニピン（式１で表される基）の平均導入量（単位：個）を計算した結果を表す図である。
図１によれば、３０分間の反応時間においては、ポリアミン（４分岐型ポリエチレングリコール）１分子あたり、平均で１．７個のゲニピン（式１で表される基）が導入されていることが分かった。
図１は、横軸を反応時間（分）とし、縦軸をポリアミン１分子へのゲニピン（式１で表される基）の平均導入量（単位：個）を計算した結果を表す図である。
図１によれば、３０分間の反応時間においては、ポリアミン（４分岐型ポリエチレングリコール）１分子あたり、平均で１．７個のゲニピン（式１で表される基）が導入されていることが分かった。
【0102】
＜化合物Ａの合成時のｐＨがゲニピン導入率に与える影響＞
ポリアミン液（２０質量％）のｐＨを２～１０まで変化させ、そこにゲニピン（１００モル％）を溶解させ反応させた場合に導入されるゲニピンの個数を紫外可視分光光度計によって測定した。
検量線としては、ゲニピンとエタノールアミンを反応させ、２９０ｎｍの吸収を測定したものを用いた。
ポリアミン液（２０質量％）のｐＨを２～１０まで変化させ、そこにゲニピン（１００モル％）を溶解させ反応させた場合に導入されるゲニピンの個数を紫外可視分光光度計によって測定した。
検量線としては、ゲニピンとエタノールアミンを反応させ、２９０ｎｍの吸収を測定したものを用いた。
【0103】
図２は、ポリアミン液のｐＨに対する、ポリアミン１分子へのゲニピン平均導入量（式１で表される基）を計算した結果を表す図である。
図２によれば、低ｐＨ側では導入量が少ない、すなわち、反応速度が大きく低下しており、ｐＨが７．０を超えると、よりゲニピンが導入されやすく、ｐＨが９．０以上では更にゲニピンが導入されやすいことがわかった。
図２によれば、低ｐＨ側では導入量が少ない、すなわち、反応速度が大きく低下しており、ｐＨが７．０を超えると、よりゲニピンが導入されやすく、ｐＨが９．０以上では更にゲニピンが導入されやすいことがわかった。
【0104】
＜硬化化速度試験＞
第２剤を以下の手順により準備し、第１剤と反応させて硬化速度（ゲル化速度）を調べた。
まず、第２剤の成分として、ブタ膀胱由来の脱細胞化マトリックス（Ｕｒｉｎａｒｙ Ｂｌａｄｄｅｒ Ｍａｔｒｉｘ、ＵＢＭ）を作製した。
第２剤を以下の手順により準備し、第１剤と反応させて硬化速度（ゲル化速度）を調べた。
まず、第２剤の成分として、ブタ膀胱由来の脱細胞化マトリックス（Ｕｒｉｎａｒｙ Ｂｌａｄｄｅｒ Ｍａｔｒｉｘ、ＵＢＭ）を作製した。
【0105】
ＵＢＭは、以下の手順で作製した。まず、ブタ膀胱の上皮組織をメスによって切除し、生理食塩水で洗浄した。その後、処理溶液（０．１重量％過酢酸、４％エタノール）で２時間洗浄し、生理食塩水と超純水で洗浄した。その後、ＤＮａｓｅ溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）で２４時間処理し、ＤＮＡを除去した。更に、生理食塩水と超純水で洗浄し、得られた粉末１０ｍｇに対して、ペプシン１ｍｇと、１ｍＬの０．０１Ｍ塩酸を添加して４８時間処理し、ＰＢＳを加えてｐＨを７に調整してペプシンを不活化し、凍結乾燥によってＵＢＭ粉末を得た。
【0106】
上記ＵＢＭ粉末に超純水を加えて再溶解し、１Ｍ塩酸を加えてｐＨを調製し、ＵＢＭ溶液を得た。このＵＢＭ溶液（ＵＢＭ粉末の１質量％、ｐＨ＝２．５、塩酸を含み、第２剤に相当）と化合物Ａ溶液（上記で得られた化合物Ａの２０質量％、ｐＨ＝１０．５、第１剤に相当）を等量混合し、３７℃で撹拌し、硬化するまでの時間を測定した。なお、硬化（ハイドロゲル化）時間は、撹拌子が回転しなくなった時間として定義した。その結果、溶液を混合してから、３０秒後に硬化することが明らかとなった。
これは、従来のゲニピン含有接着剤が、硬化に数時間～１日要していたのと比較すると、顕著に迅速であった。
これは、従来のゲニピン含有接着剤が、硬化に数時間～１日要していたのと比較すると、顕著に迅速であった。
【0107】
＜粘度測定＞
粘弾性測定装置（レオメーター「Ｒｈｅｏｐｌｕｓ」、アントンパール社）を用いて、硬化物（ハイドロゲル）の粘弾性を測定した。
１００μＬのプレゲル溶液（第１剤と第２剤とを混合した液）をレオメーターのステージにのせ、直径１０ｍｍの治具で挟み込んだ。測定中、ステージの温度は３７度とした。
粘弾性測定装置（レオメーター「Ｒｈｅｏｐｌｕｓ」、アントンパール社）を用いて、硬化物（ハイドロゲル）の粘弾性を測定した。
１００μＬのプレゲル溶液（第１剤と第２剤とを混合した液）をレオメーターのステージにのせ、直径１０ｍｍの治具で挟み込んだ。測定中、ステージの温度は３７度とした。
【0108】
図３～６はその結果である。図３は、本接着剤の第１剤と第２剤との混合時を０分として、経時的に変化するせん断弾性率（Ｐａ）を表しており、中実円（黒丸、ｆｉｌｌｅｄ ｃｉｒｃｌｅ）が貯蔵弾性率、中空円（白丸、ｏｐｅｎ ｃｉｒｃｌｅ）が損失弾性率を表している。
なお、上記と同様に、図４～図６はそれぞれ、図４が第２剤（ＵＢＭ溶液）のみ、図５が第２剤とゲニピンの混合物、及び、図６が第２剤、ゲニピン、及び、ポリアミンの混合物の結果である。
なお、上記と同様に、図４～図６はそれぞれ、図４が第２剤（ＵＢＭ溶液）のみ、図５が第２剤とゲニピンの混合物、及び、図６が第２剤、ゲニピン、及び、ポリアミンの混合物の結果である。
【0109】
ＵＢＭ（図４）は、単独でもコラーゲンの自己集合によりゲル化するものの、貯蔵弾性率（Ｇ′）が小さい。一方、ＵＢＭ溶液（１質量％、ｐＨ＝２.５）と化合物Ａ溶液（２０質量％、ｐＨ＝１０．５）とからなるプレゲル溶液（図３）においては、第１剤と第２剤との混合後、即座にＧ′が上昇し、強度の高い硬化物（ハイドロゲル）が形成された。
【0110】
一方で、ＵＢＭ／ゲニピン（図５）、ＵＢＭ／ゲニピン／ポリアミン（図６）の組み合わせでは、ゲル化はするが、反応時間が遅かった。
これらの結果より、本接着剤は、２剤混合後、速やかに硬化し、脱細胞化マトリックスハイドロゲルを容易に形成できることがわかった。
これらの結果より、本接着剤は、２剤混合後、速やかに硬化し、脱細胞化マトリックスハイドロゲルを容易に形成できることがわかった。
【0111】
次に、ポリアミンと反応させるゲニピンの仕込み量を変化させ、化合物Ａを複数合成して、それぞれから化合物Ａ溶液を調製し（２０質量％、ｐＨ１０．５）、これをＵＢＭ溶液（１質量％、ｐＨ２．５）と混合してプレゲル溶液を調製した。このプレゲル溶液について、上記と同様に粘弾性測定を行った。
【0112】
図７～１０はその結果である。図７はポリアミンの第１級アミノ基の１００モル％に対してゲニピンを５０モル％となるよう仕込んで合成した化合物Ａを用いた本接着剤の第１剤と第２剤との混合時を０分としたときの、せん断弾性率（Ｐａ）の経時変化である。中実円は貯蔵弾性率、中空円は損失弾性率である。
なお、上記と同様に、図８～１０はそれぞれ、ゲニピンを６０モル％、７０モル％、及び、８０モル％とした場合の結果である。
なお、上記と同様に、図８～１０はそれぞれ、ゲニピンを６０モル％、７０モル％、及び、８０モル％とした場合の結果である。
【0113】
図７～１０から、ゲニピンの仕込み量が６０モル％以上となると、硬化（ゲル化）がより速くなった。一方で、７０モル％以下では、２剤混合後から、硬化までの時間（以下「ポットライフ」という。）がより長くなった。
いずれの当量比でも硬化時間としては十分に速かった。
いずれの当量比でも硬化時間としては十分に速かった。
【0114】
次に、ポリアミンとゲニピンとの反応時間を変化させ、化合物Ａを複数合成して、化合物Ａ溶液を調製し（２０質量％、ｐＨ１０．５）、これをＵＢＭ溶液（１質量％、ｐＨ２．５）と混合してプレゲル溶液を調整した。このプレゲル溶液について、上記と同様に粘弾性測定を行った。
【0115】
図１１～１４はその結果である。図１１は、ゲニピンとポリアミンとの反応時間を３分とした場合に得られた化合物Ａを用いた本接着剤の第１剤と第２剤との混合時を０分としたときの、せん断弾性率（Ｐａ）の経時変化である。中実円は貯蔵弾性率、中空円は損失弾性率である。
なお、上記と同様に、図１２～１４はそれぞれ、反応時間を１０分、３０分、６０分とした場合の結果である。
なお、上記と同様に、図１２～１４はそれぞれ、反応時間を１０分、３０分、６０分とした場合の結果である。
【0116】
図１１～１４から、ゲニピンとポリアミンの反応時間としては、１０分以上反応させると硬化が速くなることが分かった。
【0117】
次に、ＵＢＭ溶液（第２剤）に含まれる酸性化合物の含有量を調整し、ｐＨを変化させ、化合物Ａ溶液（２０質量％、ｐＨ１０．５）と混合してプレゲル溶液を調整した。このプレゲル溶液について、上記と同様に粘弾性測定を行った。
【0118】
図１５～１９はその結果である。図１５は、ＵＢＭ溶液のｐＨを２．０とした場合の本接着剤の第１剤と第２剤との混合時を０分としたときの、せん断弾性率（Ｐａ）の経時変化である。中実円は貯蔵弾性率、中空円は損失弾性率である。
なお、上記と同様に、図１６～１９はそれぞれ、ＵＢＭ溶液のｐＨを２．５、３．０、５．０、及び、７．０とした場合の結果である。
なお、上記と同様に、図１６～１９はそれぞれ、ＵＢＭ溶液のｐＨを２．５、３．０、５．０、及び、７．０とした場合の結果である。
【0119】
図１５～１９から、ＵＢＭ溶液のｐＨが７．０未満であると硬化がより速くなること、５．０以下で更に大きく、５．０未満で特に大きくなること、３．０以下で最も大きくなることがわかった。また、ＵＢＭ溶液のｐＨが２．０を超えると、より十分なポットライフが得られること、２．５以上だと更に十分なポットライフが得られることがわかった。
【0120】
＜膨潤度測定＞
ＵＢＭ溶液（１質量％、ｐＨ＝２.５）と化合物Ａ溶液（２０質量％、ｐＨ＝１０．５）とを等量混合し、３７℃で６０分間ゲル化させた。得られたゲルを直径５ｍｍのディスク状にカットし、ＰＢＳに浸漬し、３７℃で静置することで膨潤させた。所定時間おきにゲルを回収し、膨潤した重量（Ｗｓ）を測定し、さらに凍結乾燥することで乾燥重量（Ｗｄ）を求めた。式：（Ｗｓ-Ｗｄ）/Ｗｄより膨潤度を算出した。
その結果、このハイドロゲルの膨潤度は約１７で、１時間で平衡膨潤に達することが分かった（図２０はその結果を示す図である）。
ＵＢＭ溶液（１質量％、ｐＨ＝２.５）と化合物Ａ溶液（２０質量％、ｐＨ＝１０．５）とを等量混合し、３７℃で６０分間ゲル化させた。得られたゲルを直径５ｍｍのディスク状にカットし、ＰＢＳに浸漬し、３７℃で静置することで膨潤させた。所定時間おきにゲルを回収し、膨潤した重量（Ｗｓ）を測定し、さらに凍結乾燥することで乾燥重量（Ｗｄ）を求めた。式：（Ｗｓ-Ｗｄ）/Ｗｄより膨潤度を算出した。
その結果、このハイドロゲルの膨潤度は約１７で、１時間で平衡膨潤に達することが分かった（図２０はその結果を示す図である）。
【0121】
＜引張試験による力学強度測定＞
ＵＢＭ溶液（１質量％、ｐＨ＝２.５）と化合物Ａ溶液（５、１０、及び、２０質量％、ｐＨ＝１０．５）を等量混合し、ＩＳＯ ３７－２のサイズのシリコンモールドに注ぎ、３７℃で６０分間硬化（ゲル化）させた。
次に、テクスチャーアナライザーを用いて作製した硬化物（ゲル）の引張試験を行った。
ＵＢＭ溶液（１質量％、ｐＨ＝２.５）と化合物Ａ溶液（５、１０、及び、２０質量％、ｐＨ＝１０．５）を等量混合し、ＩＳＯ ３７－２のサイズのシリコンモールドに注ぎ、３７℃で６０分間硬化（ゲル化）させた。
次に、テクスチャーアナライザーを用いて作製した硬化物（ゲル）の引張試験を行った。
【0122】
図２１は、硬化物の応力－ひずみの関係である。図中の１０％、５％、２．５％は、それぞれ、プレゲル溶液の調製に用いた第１剤中の化合物Ａの含有量を表している。
図２１から、硬化物（ハイドロゲル）の力学強度は化合物Ａの含有量により制御可能であることがわかった。上記の結果から、硬化物の破断強度がより大きくなる観点では、混合液中における化合物Ａの含有量としては、７５質量％以上が好ましく、８５質量％以上がより好ましいことがわかった。また、硬化物の最大伸びがより大きくなる観点では、化合物Ａの含有量が９０質量％以下が好ましく、８０質量％以下がより好ましいことがわかった。
図２１から、硬化物（ハイドロゲル）の力学強度は化合物Ａの含有量により制御可能であることがわかった。上記の結果から、硬化物の破断強度がより大きくなる観点では、混合液中における化合物Ａの含有量としては、７５質量％以上が好ましく、８５質量％以上がより好ましいことがわかった。また、硬化物の最大伸びがより大きくなる観点では、化合物Ａの含有量が９０質量％以下が好ましく、８０質量％以下がより好ましいことがわかった。
【0123】
＜硬化物（ハイドロゲル）の細胞毒性試験＞
細胞毒性評価として、硬化物（ハイドロゲル）を培地に浸漬し、その上清を評価対象の細胞に添加することで細胞毒性を評価した。
ＵＢＭ溶液（１質量％、ｐＨ＝２.５）と化合物Ａ溶液（５、１０、２０質量％、ｐＨ＝１０．５）を等量混合し、３７℃で６０分間硬化（ゲル化）させた。
細胞毒性評価として、硬化物（ハイドロゲル）を培地に浸漬し、その上清を評価対象の細胞に添加することで細胞毒性を評価した。
ＵＢＭ溶液（１質量％、ｐＨ＝２.５）と化合物Ａ溶液（５、１０、２０質量％、ｐＨ＝１０．５）を等量混合し、３７℃で６０分間硬化（ゲル化）させた。
【0124】
硬化物（ハイドロゲル）１ｇに対して１０ｍＬのＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｍｅｄｉｕｍ）１６４０培地（１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリンストレプトマイシン）を添加し、３７℃で２４時間静置し、上清を回収した。
評価細胞として、マウス線維芽細胞（Ｌ９２９細胞）を用いて、硬化物（ハイドロゲル）の毒性を評価した。
評価細胞として、マウス線維芽細胞（Ｌ９２９細胞）を用いて、硬化物（ハイドロゲル）の毒性を評価した。
【0125】
Ｌ９２９細胞はＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリンストレプトマイシン）を用いて３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで培養した。１×１０４個のＬ９２９細胞を９６ウェルプレートに播種し、２４時間予備培養した。回収した上清、又は、コントロールとして未処理の培地のみを各ウェルに添加し、さらに２４時間培養した。培養完了後、細胞数カウンティングキット（ＷＳＴ－８、ＤＯＪＩＮＤＯ）を用いて細胞数を定量した。
【0126】
図２２は、細胞生存率（％）を表す図である。図２２の結果から、ＵＢＭ－化合物Ａの硬化物であるハイドロゲル（図２２中、「ＵＢＭ＋ＧｅｎｉＰＥＧ」と記載されている。）は高い細胞生存率を示した。
また、ＵＢＭを含まないハイドロゲル（図２２中、「ＧｅｎｉＰＥＧ」と記載されたもので、第２剤がＵＢＭを含有しないことを除いては、「ＵＢＭ＋ＧｅｎｉＰＥＧ」と同様である）も高い細胞生存率を示した。
また、ＵＢＭを含まないハイドロゲル（図２２中、「ＧｅｎｉＰＥＧ」と記載されたもので、第２剤がＵＢＭを含有しないことを除いては、「ＵＢＭ＋ＧｅｎｉＰＥＧ」と同様である）も高い細胞生存率を示した。
【0127】
一方、誘導体化していないゲニピンとＵＢＭとを含むサンプル（「ＵＢＭ＋Ｇｅｎｉｐｉｎ」と記載されている）においては、細胞生存率が著しく低かった。
ゲニピンを含まない「ＵＢＭ」のサンプルが高い細胞生存率を示したことからも、これは、ゲニピンの影響によるものと考えられた。
ゲニピンを含まない「ＵＢＭ」のサンプルが高い細胞生存率を示したことからも、これは、ゲニピンの影響によるものと考えられた。
【0128】
従来、ゲニピンは細胞毒性の低い架橋剤と考えられてきたが、上記の様に、本発明者の検討によれば、細胞生存率は十分低いとは言えなかった。しかし、本発明の２剤硬化型接着剤の第１剤に含まれる架橋剤である化合物Ａにおいては、ゲニピンは誘導体化されていて、硬化物等にゲニピンが溶出しにくい。そのため、ゲニピンの架橋機能を維持しつつ、細胞毒性を大幅に軽減することに成功したものと推測される。
すなわち、本接着剤の硬化物であるハイドロゲルは高い細胞適合性を示すことが明らかとなった。
すなわち、本接着剤の硬化物であるハイドロゲルは高い細胞適合性を示すことが明らかとなった。
【0129】
＜コラーゲンケーシングに対する接着性＞
ＡＳＴＭ－Ｆ２３９２－０４Ｒに準拠して、組織接着性を評価するためのモデル組織として、コラーゲンケーシングを用いた接着性評価を行った。
直径３５ｍｍのコラーゲンケーシングに直径３ｍｍのピンホールを作製し、２００μＬのプレゲル溶液を添加した。
なお、プレゲル溶液は、ＵＢＭ溶液（１質量％、ｐＨ＝２．５）の１００μＬと化合物Ａ溶液（２０質量％、ｐＨ＝１０．５）の１００μＬとを混合したものである。
ＡＳＴＭ－Ｆ２３９２－０４Ｒに準拠して、組織接着性を評価するためのモデル組織として、コラーゲンケーシングを用いた接着性評価を行った。
直径３５ｍｍのコラーゲンケーシングに直径３ｍｍのピンホールを作製し、２００μＬのプレゲル溶液を添加した。
なお、プレゲル溶液は、ＵＢＭ溶液（１質量％、ｐＨ＝２．５）の１００μＬと化合物Ａ溶液（２０質量％、ｐＨ＝１０．５）の１００μＬとを混合したものである。
【0130】
これを３７℃で６０分間静置し、耐圧強度を測定した。図２３は、その結果である。図２３の記載のとおり、本接着剤の硬化物（図２３中、「ＵＢＭ＋ＧｅｎｉＰＥＧ」と記載されたもの）は、５０ｍｍＨｇの高い耐圧強度を示した。一方で、ＵＢＭ単独では検出限界以下（０．７５ｍｍＨｇ以下）であり、「ＵＢＭ＋Ｇｅｎｉｐｉｎ」では、５．５ｍｍＨｇと低い値であった。この結果より、本接着剤の硬化物は、高い組織接着性を有していることが明らかとなった。
【0131】
＜ブタ大動脈に対する接着性＞
ＡＳＴＭ－Ｆ２３９２－０４Ｒに準拠して、ブタ大動脈を用いた接着性評価を行った。
直径３０ｍｍにカットしたブタ大動脈に直径３ｍｍのピンホールを作製し、２００μＬのプレゲル溶液を大動脈の外側に添加した。これを３７℃で６０分間静置し、耐圧強度を測定した。図２４はその結果である。
なお、プレゲル溶液はＵＢＭ溶液（１質量％、ｐＨ＝２.５）の１００μＬと化合物Ａ溶液（２０質量％、ｐＨ＝１０．５）の１００μＬとを混合したものである。
ＡＳＴＭ－Ｆ２３９２－０４Ｒに準拠して、ブタ大動脈を用いた接着性評価を行った。
直径３０ｍｍにカットしたブタ大動脈に直径３ｍｍのピンホールを作製し、２００μＬのプレゲル溶液を大動脈の外側に添加した。これを３７℃で６０分間静置し、耐圧強度を測定した。図２４はその結果である。
なお、プレゲル溶液はＵＢＭ溶液（１質量％、ｐＨ＝２.５）の１００μＬと化合物Ａ溶液（２０質量％、ｐＨ＝１０．５）の１００μＬとを混合したものである。
【0132】
図２４の記載のとおり、本接着剤の硬化物（図２４中、「ＵＢＭ＋ＧｅｎｉＰＥＧ」と記載）は、１００ｍｍＨｇの高い耐圧強度を示した。一方で、ＵＢＭ単独では検出限界以下（０．７５ｍｍＨｇ以下）であり、「ＵＢＭ＋Ｇｅｎｉｐｉｎ」では、３．３ｍｍＨｇと低い値であった。この結果より、本接着剤の硬化物は、大動脈に対しても高い組織接着性を有していることが明らかとなった。
【0133】
また、図２５は、耐圧試験後のブタ大動脈の組織学的評価結果である。図２５から、「ＵＢＭ＋Ｇｅｎｉｐｉｎ」は組織表面に残存していなかったのに対して、「ＵＢＭ＋ＧｅｎｉＰＥＧ」は組織表面に強く接着し、残存していることが明らかとなった。
【0134】
＜種々のＥＣＭを含有する第２剤を用いて作製したハイドロゲルの粘弾性測定＞
ＵＢＭ以外の脱細胞化マトリックス（ＥＣＭ）を含む第２剤を作製し、その硬化物（ハイドロゲル）の粘弾性を測定した。
ＵＢＭ以外の脱細胞化マトリックス（ＥＣＭ）を含む第２剤を作製し、その硬化物（ハイドロゲル）の粘弾性を測定した。
【0135】
まず、ブタ心臓、肝臓、すい臓、及び、小腸の一部をメスによってそれぞれ切除し、生理食塩水で洗浄した。その後、処理溶液（０．１重量％過酢酸、４％エタノール）で２時間洗浄し、生理食塩水と超純水で洗浄した。その後、１％Ｔｒｉｔｏｎ/０．１％ ＳＤＳ溶液で２４ｈ洗浄を行い、超純水で洗浄した。その後、ＤＮａｓｅ溶液（０．５ｍｇ/ｍＬ）で２４時間処理し、ＤＮＡを除去した。更に、生理食塩水と超純水で洗浄し、ペプシン（１ｍｇ/ｍＬ）で４８時間処理し、凍結乾燥によって各種マトリックス粉末を得た。
【0136】
上記粉末を用いて、１００μＬのプレゲル溶液を作製した。なお、プレゲル溶液は、ＵＢＭ、心臓、肝臓、膵臓、及び、小腸のぞれぞれから作製したＥＣＭ粉末溶液（ＥＣＭは１質量％、ｐＨ＝２.５、第２剤）の１００μＬと化合物Ａ溶液（２０質量％、ｐＨ＝１０．５、第１剤）の１００μＬとを混合したものである。
【0137】
１００μＬのプレゲル溶液を粘弾性測定装置のステージにのせ、直径１０ｍｍの治具で挟み込んだ。測定中、ステージの温度は３７度とした。
図２６～３１ははその結果である。図２６は、膀胱由来のＥＣＭ（ＵＢＭ）を含む第２剤を含む本接着剤の第１剤と第２剤との混合時を０分としたときの、せん断弾性率（貯蔵弾性率：Ｐａ）の経時変化である。なお、上記と同様に、図２７～３０はそれぞれ、心臓、肝臓、すい（膵）臓、及び、小腸由来のＥＣＭを含む第２剤を含む本接着剤の結果である。また、図３１は、ＥＣＭを含まず、ＰＢＳのみからなる（ｐＨ＝２．５）第２剤を含む本接着剤の結果である。
図２６～３１ははその結果である。図２６は、膀胱由来のＥＣＭ（ＵＢＭ）を含む第２剤を含む本接着剤の第１剤と第２剤との混合時を０分としたときの、せん断弾性率（貯蔵弾性率：Ｐａ）の経時変化である。なお、上記と同様に、図２７～３０はそれぞれ、心臓、肝臓、すい（膵）臓、及び、小腸由来のＥＣＭを含む第２剤を含む本接着剤の結果である。また、図３１は、ＥＣＭを含まず、ＰＢＳのみからなる（ｐＨ＝２．５）第２剤を含む本接着剤の結果である。
【0138】
図２６～３１から、すべてのプレゲル溶液が３０分以内で硬化（ゲル化）することがわかった。なかでも、ＵＢＭ、又は、小腸由来のＥＣＭを含む第２剤を含む本接着剤はより速く硬化することが確認された。
図２６～３０と図３１の比較から、第２剤がＥＣＭを含む場合、硬化がよりは速くなることが確認された。
図２６～３０と図３１の比較から、第２剤がＥＣＭを含む場合、硬化がよりは速くなることが確認された。
【0139】
＜種々のＥＣＭを含有する第２剤を用いて作製したハイドロゲルのコラーゲンケーシングに対する接着性＞
ＡＳＴＭ－Ｆ２３９２－０４Ｒに準拠して、組織接着性を評価するためのモデル組織として、コラーゲンケーシングを用いた接着性評価を行った。
直径３５ｍｍのコラーゲンケーシングに直径３ｍｍのピンホールを作製し、２００μＬのプレゲル溶液を添加した。これを３７℃で６０分間静置し、耐圧強度を測定した。図３２はその結果である。
なお、プレゲル溶液は、ＵＢＭ、心臓、肝臓、膵臓、及び、小腸からそれぞれ作製したＥＣＭ粉末溶液（ＥＣＭは１質量％、ｐＨ＝２．５、第２剤）の１００μＬと、化合物Ａ溶液（２０質量％、ｐＨ＝１０．５）の１００μＬとを混合したものである。
ＡＳＴＭ－Ｆ２３９２－０４Ｒに準拠して、組織接着性を評価するためのモデル組織として、コラーゲンケーシングを用いた接着性評価を行った。
直径３５ｍｍのコラーゲンケーシングに直径３ｍｍのピンホールを作製し、２００μＬのプレゲル溶液を添加した。これを３７℃で６０分間静置し、耐圧強度を測定した。図３２はその結果である。
なお、プレゲル溶液は、ＵＢＭ、心臓、肝臓、膵臓、及び、小腸からそれぞれ作製したＥＣＭ粉末溶液（ＥＣＭは１質量％、ｐＨ＝２．５、第２剤）の１００μＬと、化合物Ａ溶液（２０質量％、ｐＨ＝１０．５）の１００μＬとを混合したものである。
【0140】
図３２から、各硬化物（ハイドロゲル）は、４０ｍｍＨｇ以上の高い耐圧強度を有することが確認された。なかでも、ＵＢＭと小腸（Ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）由来のＥＣＭを含む第２剤を含む２剤
硬化型接着剤の硬化物は、より高い組織接着強度を有していた。
なお、図３２中、「Ｈｅａｒｔ」は心臓、「Ｌｉｖｅｒ」は肝臓、「Ｐａｎｃｒｅａｓ」はすい臓由来のＥＣＭであることを示している。
硬化型接着剤の硬化物は、より高い組織接着強度を有していた。
なお、図３２中、「Ｈｅａｒｔ」は心臓、「Ｌｉｖｅｒ」は肝臓、「Ｐａｎｃｒｅａｓ」はすい臓由来のＥＣＭであることを示している。
【0141】
＜紫外可視分光光度計による測定＞
４分岐型ポリエチレングリコールに代えてゼラチンを含むポリアミン液を用いたこと以外は上記と同様にして、化合物Ａを合成した。
その際に、ポリアミン（ゼラチン）の１分子あたりに導入されるゲニピン（式１で表される基）の個数を測定するために、紫外可視分光光度計による測定を行った。
ゼラチン液（含有量が２０質量％、ｐＨ＝１０.５、ＰＢＳ）に対して、ゼラチンの第１級アミノ基に対して、１０～４０モル％となるよう、ゲニピンを仕込んで、５０℃で混合してから、２分後にサンプルを分取し、吸収スペクトルからゲニピン導入量（式１で表される基の導入量）を計算した。なお、検量線としては、ゲニピンとエタノールアミンとを反応させ、２９０ｎｍの吸収を測定したものを用いた。
４分岐型ポリエチレングリコールに代えてゼラチンを含むポリアミン液を用いたこと以外は上記と同様にして、化合物Ａを合成した。
その際に、ポリアミン（ゼラチン）の１分子あたりに導入されるゲニピン（式１で表される基）の個数を測定するために、紫外可視分光光度計による測定を行った。
ゼラチン液（含有量が２０質量％、ｐＨ＝１０.５、ＰＢＳ）に対して、ゼラチンの第１級アミノ基に対して、１０～４０モル％となるよう、ゲニピンを仕込んで、５０℃で混合してから、２分後にサンプルを分取し、吸収スペクトルからゲニピン導入量（式１で表される基の導入量）を計算した。なお、検量線としては、ゲニピンとエタノールアミンとを反応させ、２９０ｎｍの吸収を測定したものを用いた。
【0142】
その結果、ゼラチン液とゲニピンとを混合すると２９０ｎｍの吸収が大きく上昇し、ゲニピンの仕込み量の増加に伴って吸収が増加した。図３３は、横軸を反応時間（分）とし、縦軸をゼラチン中のアミノ基に対するゲニピン（式１で表される基）の導入量（単位：％）を計算した結果を表す図である。ゲニピンの仕込み量（アミノ基に対する当量）が増加するのに従って増加し、導入率は、９％～３３％であることが分かった。
【0143】
＜レオロジー＞
ゼラチンと反応させるゲニピンの仕込み量を変化させ、化合物Ａを複数合成して、それぞれから化合物Ａ溶液を調製し（２０質量％、ｐＨ１０．５、第１剤）、これをＵＢＭ溶液（１質量％、ｐＨ２．５、第２剤）と混合してプレゲル溶液を調製した。このプレゲル溶液について、上記と同様に粘弾性測定を行った。
ゼラチンと反応させるゲニピンの仕込み量を変化させ、化合物Ａを複数合成して、それぞれから化合物Ａ溶液を調製し（２０質量％、ｐＨ１０．５、第１剤）、これをＵＢＭ溶液（１質量％、ｐＨ２．５、第２剤）と混合してプレゲル溶液を調製した。このプレゲル溶液について、上記と同様に粘弾性測定を行った。
【0144】
図３４～３７はゼラチンの第１級アミノ基の１００モル％に対してゲニピンが９～３３％導入された化合物Ａを含む第１剤を含む本接着剤の第１剤と第２剤との混合時を０分としたときの、せん断貯蔵弾性率（Ｐａ）の経時変化である。
【0145】
図３４～３７から、ゲニピンの導入率が１８モル％以上だと、硬化（ゲル化）がより速くなった。一方で、１８モル％未満だと、２剤混合後から、ポットライフがより長くなった。
いずれの当量比でも硬化時間としては十分に速かった
いずれの当量比でも硬化時間としては十分に速かった
【産業上の利用可能性】
【0146】
本発明の２剤硬化型接着剤の硬化物であるハイドロゲルは、高い生体適合性と組織接着性、組織再生能を有するハイドロゲルであり、組織接着剤として医療用途に大変有用である。
また、抗がん剤をハイドロゲルに内包することで、がん治療への応用も期待される。さらに、再生医療分野においては、細胞移植の際の細胞の足場材料として使用することができる。
また、抗がん剤をハイドロゲルに内包することで、がん治療への応用も期待される。さらに、再生医療分野においては、細胞移植の際の細胞の足場材料として使用することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
