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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B1)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-05-23
(45)【発行日】2025-06-02
(54)【発明の名称】細胞傷害誘導治療剤
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20250526BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20250526BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20250526BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20250526BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250526BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20250526BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C07K16/46
C07K16/28
C07K16/30
A61P35/00
A61K39/395 T
【請求項の数】
30
(21)【出願番号】P 2025058131
(22)【出願日】2025-03-31
(62)【分割の表示】P 2025018089の分割
【原出願日】2011-11-30
【審査請求日】2025-03-31
(31)【優先権主張番号】P 2010266760
(32)【優先日】2010-11-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(31)【優先権主張番号】P 2011121771
(32)【優先日】2011-05-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(31)【優先権主張番号】P 2011238818
(32)【優先日】2011-10-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】000003311
【氏名又は名称】中外製薬株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】230104019
【弁護士】
【氏名又は名称】大野 聖二
(74)【代理人】
【識別番号】100149076
【弁理士】
【氏名又は名称】梅田 慎介
(74)【代理人】
【識別番号】100162503
【弁理士】
【氏名又は名称】今野 智介
(74)【代理人】
【識別番号】100144794
【弁理士】
【氏名又は名称】大木 信人
(74)【代理人】
【識別番号】100155125
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 直俊
(72)【発明者】
【氏名】根津 淳一
(72)【発明者】
【氏名】石黒 敬弘
(72)【発明者】
【氏名】成田 敦
(72)【発明者】
【氏名】坂本 昭久
(72)【発明者】
【氏名】川合 由美子
(72)【発明者】
【氏名】井川 智之
(72)【発明者】
【氏名】倉持 太一
【審査官】鳥居 敬司
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２００６／１０６９０５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２００８－５２２６００（ＪＰ，Ａ）
【文献】Cancer Immunol. Immunother.，2009年，VoL.58, No.1，p.95-109
【文献】Blood，2007年，Vol.109, No.3，p.1185-1192
【文献】Nat. Biotechnol.，1998年，Vol.16, No.7，p.677-681
【文献】日生研たより，2010年07月01日，Vol.56, No.4，p.45-51
【文献】Cancer Immunol. Immunother.，2007年，Vol.56, No.10，p.1637-1644
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記のドメイン；（１）癌抗原結合ドメイン、
（２）ヒトIgG1抗体のFc領域を構成するアミノ酸が変異しているFc領域であって、ヒトIgG1抗体のFc領域を有する対照二重特異性抗体と比較して、Fcγ受容体に対する結合活性が低下しているFc領域を含むドメイン、及び、
（３）CD3結合ドメイン、
を含む二重特異性抗体であって、
癌抗原結合ドメイン及びCD3結合ドメインは、各々一価のFabであり、
Fc領域を構成する二つのポリペプチドの配列が互いに異なる配列を有し、
癌抗原結合ドメインを構成するFabの重鎖Fv断片がCH1領域を介してFc領域を構成する一方のポリペプチドに連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がCL領域と連結され、CD3結合ドメインを構成するFabの重鎖Fv断片がCH1領域を介してFc領域を構成する他方のポリペプチドに連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がCL領域と連結されており、
ヒトIgG1抗体のFc領域を構成するアミノ酸のうち、EUナンバリングに従って特定される２３４位のロイシンがバリン、フェニルアラニン又はアラニンに置換されており、２３５位のロイシンがグルタミン酸又はアラニンに置換されており、及び２６５位のアスパラギン酸がアラニンに置換されている、二重特異性抗体。
【請求項2】
４４７位のリジンが欠失している、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項3】
CH3領域にそれぞれ異なるアミノ酸置換が存在することによってFc領域を構成する二つのポリペプチドの配列が互いに異なっており、CH3領域におけるそれぞれ異なるアミノ酸置換によって配列の異なる二つのポリペプチドを含むFc領域を含む二重特異性抗体が形成されるように促進される、請求項１又は２に記載の二重特異性抗体。
【請求項4】
Fc領域がFcγI、FcγIIA、FcγIIB、FcγIIIA及び／又はFcγIIIBのいずれかのFcγ受容体に対する結合活性が低下しているFc領域である、請求項１～３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項5】
二重特異性抗体であり、T細胞エンゲージャーである、請求項１～４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を有効成分として含む癌治療剤。
【請求項7】
癌抗原非依存的なサイトカインストームを誘導しないか、又は、誘導を低下するための、請求項６に記載の癌治療剤。
【請求項8】
下記のドメイン；（１）癌抗原結合ドメイン、
（２）ヒトIgG1抗体のFc領域を構成するアミノ酸のうち、EUナンバリングに従って特定される２３４位のロイシンがバリン、フェニルアラニン又はアラニンに置換されており、２３５位のロイシンがグルタミン酸又はアラニンに置換されており、及び２６５位のアスパラギン酸がアラニンに置換されているFc領域であって、ヒトIgG1抗体のFc領域を有する対照二重特異性抗体と比較して、Fcγ受容体に対する結合活性が低下しているFc領域を含むドメイン、及び、
（３）CD3結合ドメイン、
を含む二重特異性抗体であって、
癌抗原結合ドメイン及びCD3結合ドメインは、各々一価のFabであり、
Fc領域を構成する二つのポリペプチドの配列が互いに異なる配列を有し、
癌抗原結合ドメインを構成するFabの重鎖Fv断片がCH1領域を介してFc領域を構成する一方のポリペプチドに連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がCL領域と連結され、CD3結合ドメインを構成するFabの重鎖Fv断片がCH1領域を介してFc領域を構成する他方のポリペプチドに連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がCL領域と連結されている、二重特異性抗体。
【請求項9】
４４７位のリジンが欠失している、請求項８に記載の二重特異性抗体。
【請求項10】
CH3領域にそれぞれ異なるアミノ酸置換が存在することによってFc領域を構成する二つのポリペプチドの配列が互いに異なっており、CH3領域におけるそれぞれ異なるアミノ酸置換によって配列の異なる二つのポリペプチドを含むFc領域を含む二重特異性抗体が形成されるように促進される、請求項８又は９に記載の二重特異性抗体。
【請求項11】
Fc領域がFcγI、FcγIIA、FcγIIB、FcγIIIA及び／又はFcγIIIBのいずれかのFcγ受容体に対する結合活性が低下しているFc領域である、請求項８～１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項12】
二重特異性抗体であり、T細胞エンゲージャーである、請求項８～１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項13】
請求項８～１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を有効成分として含む癌治療剤。
【請求項14】
癌抗原非依存的なサイトカインストームを誘導しないか、又は、誘導を低下するための、請求項１３に記載の癌治療剤。
【請求項15】
下記のドメイン；（１）癌抗原結合ドメイン、
（２）ヒトIgG1抗体のFc領域を構成するアミノ酸が変異しているFc領域であって、ヒトIgG1抗体のFc領域を有する対照二重特異性抗体と比較して、Fcγ受容体に対する結合活性が低下しているFc領域を含むドメイン、及び、
（３）CD3結合ドメイン、
を含む二重特異性抗体であって、
癌抗原結合ドメイン及びCD3結合ドメインは、各々一価のFabであり、
Fc領域を構成する二つのポリペプチドの配列が互いに異なる配列を有し、
癌抗原結合ドメインを構成するFabの重鎖Fv断片がCH1領域を介してFc領域を構成する一方のポリペプチドに連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がCL領域と連結され、CD3結合ドメインを構成するFabの重鎖Fv断片がCH1領域を介してFc領域を構成する他方のポリペプチドに連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がCL領域と連結されており、
ヒトIgG1抗体のFc領域を構成するアミノ酸のうち、EUナンバリングに従って特定される２３４位のロイシンがバリン、フェニルアラニン又はアラニンに置換されており、２３５位のロイシンがグルタミン酸又はアラニンに置換されている、二重特異性抗体。
【請求項16】
２６５位のアスパラギン酸がアラニンに置換されている、請求項１５に記載の二重特異性抗体。
【請求項17】
４４７位のリジンが欠失している、請求項１５又は１６に記載の二重特異性抗体。
【請求項18】
CH3領域にそれぞれ異なるアミノ酸置換が存在することによってFc領域を構成する二つのポリペプチドの配列が互いに異なっており、CH3領域におけるそれぞれ異なるアミノ酸置換によって配列の異なる二つのポリペプチドを含むFc領域を含む二重特異性抗体が形成されるように促進される、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項19】
Fc領域がFcγI、FcγIIA、FcγIIB、FcγIIIA及び／又はFcγIIIBのいずれかのFcγ受容体に対する結合活性が低下しているFc領域である、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項20】
二重特異性抗体であり、T細胞エンゲージャーである、請求項１５～１９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項21】
請求項１５～２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を有効成分として含む癌治療剤。
【請求項22】
癌抗原非依存的なサイトカインストームを誘導しないか、又は、誘導を低下するための、請求項２１に記載の癌治療剤。
【請求項23】
下記のドメイン；（１）癌抗原結合ドメイン、
（２）ヒトIgG1抗体のFc領域を構成するアミノ酸のうち、EUナンバリングに従って特定される２３４位のロイシンがバリン、フェニルアラニン又はアラニンに置換されており、２３５位のロイシンがグルタミン酸又はアラニンに置換されているFc領域であって、ヒトIgG1抗体のFc領域を有する対照二重特異性抗体と比較して、Fcγ受容体に対する結合活性が低下しているFc領域を含むドメイン、及び、
（３）CD3結合ドメイン、
を含む二重特異性抗体であって、
癌抗原結合ドメイン及びCD3結合ドメインは、各々一価のFabであり、
Fc領域を構成する二つのポリペプチドの配列が互いに異なる配列を有し、
癌抗原結合ドメインを構成するFabの重鎖Fv断片がCH1領域を介してFc領域を構成する一方のポリペプチドに連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がCL領域と連結され、CD3結合ドメインを構成するFabの重鎖Fv断片がCH1領域を介してFc領域を構成する他方のポリペプチドに連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がCL領域と連結されている、二重特異性抗体。
【請求項24】
２６５位のアスパラギン酸がアラニンに置換されている、請求項２３に記載の二重特異性抗体。
【請求項25】
４４７位のリジンが欠失している、請求項２３又は２４に記載の二重特異性抗体。
【請求項26】
CH3領域にそれぞれ異なるアミノ酸置換が存在することによってFc領域を構成する二つのポリペプチドの配列が互いに異なっており、CH3領域におけるそれぞれ異なるアミノ酸置換によって配列の異なる二つのポリペプチドを含むFc領域を含む二重特異性抗体が形成されるように促進される、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項27】
Fc領域がFcγI、FcγIIA、FcγIIB、FcγIIIA及び／又はFcγIIIBのいずれかのFcγ受容体に対する結合活性が低下しているFc領域である、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項28】
二重特異性抗体であり、T細胞エンゲージャーである、請求項２３～２７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項29】
請求項２３～２８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を有効成分として含む癌治療剤。
【請求項30】
癌抗原非依存的なサイトカインストームを誘導しないか、又は、誘導を低下するための、請求項２９に記載の癌治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、T細胞を標的癌細胞に近接せしめT細胞による標的癌細胞に対する細胞傷害活
性を通じて癌を治療することを可能とするポリペプチド会合体、当該ポリペプチド会合体
の製造方法、および当該ポリペプチド会合体を有効成分として含む細胞傷害誘導治療剤に
関する。また当該細胞傷害誘導治療剤を有効成分として含む、様々な癌を治療または予防
するための医薬組成物または当該医薬組成物を用いる治療方法に関する。
性を通じて癌を治療することを可能とするポリペプチド会合体、当該ポリペプチド会合体
の製造方法、および当該ポリペプチド会合体を有効成分として含む細胞傷害誘導治療剤に
関する。また当該細胞傷害誘導治療剤を有効成分として含む、様々な癌を治療または予防
するための医薬組成物または当該医薬組成物を用いる治療方法に関する。
【背景技術】
【0002】
これまでに優れた抗腫瘍効果を示す複数の治療用抗体が、癌治療を目的とする医薬品と
して開発されている（非特許文献１）。これらの治療用抗体は、癌細胞の増殖に必要なシ
グナルの阻害、細胞死シグナルの誘発、あるいはADCC（Antibody Dependent Cell-mediat
ed Cytotoxicity；抗体依存性細胞傷害）、CDC（Complement Dependent Cytotoxicity；
補体依存性細胞傷害）によって、癌細胞に対する抗腫瘍効果を発揮することが知られてい
る（非特許文献２）。抗体のFc領域がNK細胞やマクロファージなどのエフェクター細胞上
に存在するFcレセプターに結合することにより、抗体が結合した標的の癌細胞に対してこ
れらのエフェクター細胞が発揮する細胞傷害がADCCである。抗体の構造中に存在する補体
結合部位には補体複合体が結合する。抗体が結合した細胞の細胞膜上に当該複合体中に存
在する補体成分が孔を形成することにより、水やイオンの細胞内への流入が促進され細胞
が破壊されて起こる細胞傷害がCDCである。既存の治療用抗体には優れた作用が認められ
るものの、こうした抗体の投与によって得られる治療成績はまだ満足できるものではない
。そこで、さらに強力な殺細胞活性を発揮する癌に対する治療抗体の開発が望まれている
。
して開発されている（非特許文献１）。これらの治療用抗体は、癌細胞の増殖に必要なシ
グナルの阻害、細胞死シグナルの誘発、あるいはADCC（Antibody Dependent Cell-mediat
ed Cytotoxicity；抗体依存性細胞傷害）、CDC（Complement Dependent Cytotoxicity；
補体依存性細胞傷害）によって、癌細胞に対する抗腫瘍効果を発揮することが知られてい
る（非特許文献２）。抗体のFc領域がNK細胞やマクロファージなどのエフェクター細胞上
に存在するFcレセプターに結合することにより、抗体が結合した標的の癌細胞に対してこ
れらのエフェクター細胞が発揮する細胞傷害がADCCである。抗体の構造中に存在する補体
結合部位には補体複合体が結合する。抗体が結合した細胞の細胞膜上に当該複合体中に存
在する補体成分が孔を形成することにより、水やイオンの細胞内への流入が促進され細胞
が破壊されて起こる細胞傷害がCDCである。既存の治療用抗体には優れた作用が認められ
るものの、こうした抗体の投与によって得られる治療成績はまだ満足できるものではない
。そこで、さらに強力な殺細胞活性を発揮する癌に対する治療抗体の開発が望まれている
。
【0003】
上記のNK細胞やマクロファージをエフェクター細胞として動員するADCCをその抗腫瘍効
果のメカニズムとする抗体とは別に、T細胞をエフェクター細胞として動員する細胞傷害
をその抗腫瘍効果のメカニズムとする抗体であるT細胞リクルート抗体（T cell recruiti
ng抗体、TR抗体）も1980年代から知られている（非特許文献３－５）。TR抗体は、T細胞
上のT細胞レセプター（TCR）複合体の構成サブユニットのいずれかに対する抗体、特にCD
3 epsilon鎖に結合する抗体と、標的である癌細胞上の抗原に結合する抗体を含むbi-spec
ific（二重特異性）抗体である。TR抗体がCD3 epsilon鎖と癌抗原に同時に結合すること
により、T細胞が癌細胞に接近する。その結果、T細胞の持つ細胞傷害作用により癌細胞に
対する抗腫瘍効果が発揮されると考えられている。
果のメカニズムとする抗体とは別に、T細胞をエフェクター細胞として動員する細胞傷害
をその抗腫瘍効果のメカニズムとする抗体であるT細胞リクルート抗体（T cell recruiti
ng抗体、TR抗体）も1980年代から知られている（非特許文献３－５）。TR抗体は、T細胞
上のT細胞レセプター（TCR）複合体の構成サブユニットのいずれかに対する抗体、特にCD
3 epsilon鎖に結合する抗体と、標的である癌細胞上の抗原に結合する抗体を含むbi-spec
ific（二重特異性）抗体である。TR抗体がCD3 epsilon鎖と癌抗原に同時に結合すること
により、T細胞が癌細胞に接近する。その結果、T細胞の持つ細胞傷害作用により癌細胞に
対する抗腫瘍効果が発揮されると考えられている。
【0004】
TR抗体の一つとしてtrifunctional抗体と称される抗体も知られている（非特許文献６
、７）。これは、癌抗原に結合するFabとCD3 epsilon鎖に結合するFabがそれぞれ片腕に
含まれるwhole IgG型のbi-specific抗体である。EpCAMに対するtrifunctional抗体である
catumaxomabをEpCAM発現陽性の癌細胞を持つ悪性腹水患者の腹腔内に対して投与すること
により悪性腹水症に対する治療の効果が示されている。EUにおいて上記の治療を目的とす
るcatumaxomabの使用が承認されている。
、７）。これは、癌抗原に結合するFabとCD3 epsilon鎖に結合するFabがそれぞれ片腕に
含まれるwhole IgG型のbi-specific抗体である。EpCAMに対するtrifunctional抗体である
catumaxomabをEpCAM発現陽性の癌細胞を持つ悪性腹水患者の腹腔内に対して投与すること
により悪性腹水症に対する治療の効果が示されている。EUにおいて上記の治療を目的とす
るcatumaxomabの使用が承認されている。
【0005】
さらに最近になり、BiTE（bispecific T-cell engager）と称されるTR抗体が強い抗腫
瘍作用を示すことが知られるようになった（非特許文献８、９）。BiTEは癌抗原に対する
抗体のscFvとCD3 epsilon鎖に対する抗体のscFvが短いポリペプチドリンカーを介して連
結された分子型を有するTR抗体である。BiTEはそれまでに知られていた様々なTR抗体に比
べて優れた抗腫瘍作用を持つことが報告されている（非特許文献９、１０）。すなわちBi
TEは、他のTR抗体に比較し、著しく低い濃度、および低いエフェクター細胞：癌細胞比率
（ETレシオ）の下で抗腫瘍効果を発揮する。またこの効果の発現に、予めエフェクター細
胞をIL-2やCD28アゴニスト抗体などにより活性化させる必要がないことも示されている。
臨床的に優れた効果があることが知られているリツキサンよりもはるかに強いin vitroで
の癌細胞に対する傷害作用をCD19に対するBiTEであるblinatumomab（MT103）が示した。
さらに最近行なわれた第一相臨床試験、第二相臨床試験において極めて優れた抗腫瘍効果
を示したことが報告されている（非特許文献１１）。
瘍作用を示すことが知られるようになった（非特許文献８、９）。BiTEは癌抗原に対する
抗体のscFvとCD3 epsilon鎖に対する抗体のscFvが短いポリペプチドリンカーを介して連
結された分子型を有するTR抗体である。BiTEはそれまでに知られていた様々なTR抗体に比
べて優れた抗腫瘍作用を持つことが報告されている（非特許文献９、１０）。すなわちBi
TEは、他のTR抗体に比較し、著しく低い濃度、および低いエフェクター細胞：癌細胞比率
（ETレシオ）の下で抗腫瘍効果を発揮する。またこの効果の発現に、予めエフェクター細
胞をIL-2やCD28アゴニスト抗体などにより活性化させる必要がないことも示されている。
臨床的に優れた効果があることが知られているリツキサンよりもはるかに強いin vitroで
の癌細胞に対する傷害作用をCD19に対するBiTEであるblinatumomab（MT103）が示した。
さらに最近行なわれた第一相臨床試験、第二相臨床試験において極めて優れた抗腫瘍効果
を示したことが報告されている（非特許文献１１）。
【0006】
catumaxomabが臨床で薬効を示し治療薬として承認されていること、およびblinatumoma
bを始めとする複数のBiTEが強い抗腫瘍効果を発揮することから、T細胞をエフェクター細
胞として動員するTR抗体には、通常のADCCをその作用機序とする抗体に比べて極めて高い
抗腫瘍薬としてのポテンシャルがあることが示唆された。
bを始めとする複数のBiTEが強い抗腫瘍効果を発揮することから、T細胞をエフェクター細
胞として動員するTR抗体には、通常のADCCをその作用機序とする抗体に比べて極めて高い
抗腫瘍薬としてのポテンシャルがあることが示唆された。
【0007】
しかしながら、trifunctional抗体が癌抗原非依存的にT細胞とNK細胞やマクロファージ
などの細胞と同時に結合する結果、これらの細胞に発現する受容体が架橋されることによ
り、癌抗原非依存的な各種サイトカインの発現を誘導することが知られている。こうした
サイトカインの発現の誘導は、trifunctional抗体の全身投与によるサイトカインストー
ム様の副作用の発生につながるものと考えられる。実際、非小細胞肺癌患者に対するcatu
maxomabの全身投与による第一相臨床試験においては、5μg/bodyという極めて低い用量が
最大許容投与量であり、それ以上の用量の投与により様々な重篤な副作用が起こることが
報告されている（非特許文献１２）。こうした低い用量のcatumaxomabの投与によっては
、その有効血中濃度には到底達し得ない。すなわち、こうした低い用量のcatumaxomabの
投与によっては期待される抗腫瘍作用が得られない。
などの細胞と同時に結合する結果、これらの細胞に発現する受容体が架橋されることによ
り、癌抗原非依存的な各種サイトカインの発現を誘導することが知られている。こうした
サイトカインの発現の誘導は、trifunctional抗体の全身投与によるサイトカインストー
ム様の副作用の発生につながるものと考えられる。実際、非小細胞肺癌患者に対するcatu
maxomabの全身投与による第一相臨床試験においては、5μg/bodyという極めて低い用量が
最大許容投与量であり、それ以上の用量の投与により様々な重篤な副作用が起こることが
報告されている（非特許文献１２）。こうした低い用量のcatumaxomabの投与によっては
、その有効血中濃度には到底達し得ない。すなわち、こうした低い用量のcatumaxomabの
投与によっては期待される抗腫瘍作用が得られない。
【0008】
一方、BiTEはcatumaxomabとは異なりFcγ受容体に対する結合部位を持たないため、癌
抗原非依存的にT細胞とNK細胞やマクロファージなどに発現する受容体が架橋されること
はない。そのため、catumaxomabが投与された場合に観察された癌抗原非依存的なサイト
カインの誘導は起こらないことが示されている。しかしながら、BiTEはFc領域を欠く低分
子量型の改変抗体分子であるために、治療用抗体として通常用いられるIgG型の抗体に比
較して、患者に投与されたBiTEの血中半減期は著しく短いという問題点が存在する。実際
、生体に投与されたBiTEの血中半減期は数時間程度であることが示されており（非特許文
献１３、１４）、blinatumomabの臨床試験においてはミニポンプを用いた持続静脈内投与
によりblinatumomabの投与が行なわれている。こうした投与は患者にとって著しく利便性
の悪い投与法であるばかりでなく、機器の故障などによる医療事故のリスクも潜在し、望
ましい治療法であるとはいえない。
抗原非依存的にT細胞とNK細胞やマクロファージなどに発現する受容体が架橋されること
はない。そのため、catumaxomabが投与された場合に観察された癌抗原非依存的なサイト
カインの誘導は起こらないことが示されている。しかしながら、BiTEはFc領域を欠く低分
子量型の改変抗体分子であるために、治療用抗体として通常用いられるIgG型の抗体に比
較して、患者に投与されたBiTEの血中半減期は著しく短いという問題点が存在する。実際
、生体に投与されたBiTEの血中半減期は数時間程度であることが示されており（非特許文
献１３、１４）、blinatumomabの臨床試験においてはミニポンプを用いた持続静脈内投与
によりblinatumomabの投与が行なわれている。こうした投与は患者にとって著しく利便性
の悪い投与法であるばかりでなく、機器の故障などによる医療事故のリスクも潜在し、望
ましい治療法であるとはいえない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0009】
【文献】Clin Cancer Res. (2010) 16 (1), 11-20
【文献】Drug Des Devel Ther (2009) 3, 7-16
【文献】Nature (1985) 314 (6012), 628-31
【文献】Int J Cancer (1988) 41 (4), 609-15.
【文献】Proc Natl Acad Sci USA (1986) 83 (5), 1453-7
【文献】Cancer Treat Rev. (2010) 36 (6), 458-67
【文献】Expert Opin Biol Ther (2010) 10 (8), 1259-69
【文献】Proc Natl Acad Sci USA. (1995) 92 (15), 7021-5
【文献】Drug Discov Today (2005), 10 (18), 1237-44
【文献】Trends Biotechnol (2004) 22 (5), 238-44
【文献】Science (2008), 321 (5891), 974-7
【文献】Cancer Immunol Immunother (2007) 56 (10), 1637-44
【文献】Cancer Immunol Immunother. (2006) 55(5), 503-14
【文献】Cancer Immunol Immunother. (2009) 58(1), 95-109
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明は上記の情況に鑑みてなされたものであり、T細胞を標的癌細胞に近接せしめT細
胞による標的癌細胞に対する細胞傷害活性を通じて癌を治療することを可能とするポリペ
プチド会合体、当該ポリペプチド会合体の製造方法、および当該ポリペプチド会合体を有
効成分として含む細胞傷害誘導治療剤を提供することを目的とする。また当該細胞傷害誘
導治療剤を有効成分として含む、様々な癌を治療または予防するための医薬組成物または
当該医薬組成物を用いる治療方法を提供することを目的とする。
胞による標的癌細胞に対する細胞傷害活性を通じて癌を治療することを可能とするポリペ
プチド会合体、当該ポリペプチド会合体の製造方法、および当該ポリペプチド会合体を有
効成分として含む細胞傷害誘導治療剤を提供することを目的とする。また当該細胞傷害誘
導治療剤を有効成分として含む、様々な癌を治療または予防するための医薬組成物または
当該医薬組成物を用いる治療方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者らは、BiTEが持つ強い抗腫瘍活性と、癌抗原非依存的にサイトカインストーム
などを誘導しないという安全性上の優れた性質が維持され、かつ長い血中半減期を持つ新
たなポリペプチド会合体を見出した。さらに、ポリペプチド会合体における抗原結合ドメ
インを置換することにより、当該ポリペプチド会合体が様々な細胞を標的として細胞傷害
をもたらすことを見出した。本発明者らは、かかる発見に基づいて、本発明に係るポリペ
プチド会合体が癌細胞を傷害することを明らかにした。また、ポリペプチド会合体に、CH
1/CL界面会合制御導入およびKnob into Hole (KiH)改変を導入することで、さらに効率よ
く細胞傷害をもたらすことを見出した。また、本発明者らは、本発明に係るポリペプチド
会合体を有効成分とする細胞傷害誘導治療剤が、様々な癌を治療又は予防することを見出
した。
などを誘導しないという安全性上の優れた性質が維持され、かつ長い血中半減期を持つ新
たなポリペプチド会合体を見出した。さらに、ポリペプチド会合体における抗原結合ドメ
インを置換することにより、当該ポリペプチド会合体が様々な細胞を標的として細胞傷害
をもたらすことを見出した。本発明者らは、かかる発見に基づいて、本発明に係るポリペ
プチド会合体が癌細胞を傷害することを明らかにした。また、ポリペプチド会合体に、CH
1/CL界面会合制御導入およびKnob into Hole (KiH)改変を導入することで、さらに効率よ
く細胞傷害をもたらすことを見出した。また、本発明者らは、本発明に係るポリペプチド
会合体を有効成分とする細胞傷害誘導治療剤が、様々な癌を治療又は予防することを見出
した。
【0012】
すなわち、本発明は以下を提供するものである。
〔１〕 下記のドメイン；
（１）抗原結合ドメイン、
（２）Fcγ受容体に対する結合活性が低下しているFc領域を含むドメイン、及び、
（３）T細胞受容体複合体結合ドメイン、
を含むポリペプチド会合体。
〔２〕 T細胞受容体複合体結合ドメインがT細胞受容体結合ドメインである、〔１〕に記
載のポリペプチド会合体。
〔３〕 T細胞受容体複合体結合ドメインがCD3結合ドメインである、〔１〕に記載のポリ
ペプチド会合体。
〔４〕 抗原結合ドメインが二価の抗原結合ドメインである、〔１〕から〔３〕のいずれ
かに記載のポリペプチド会合体。
〔５〕 二価の抗原結合ドメインがF(ab’)2の構造を有するドメインである、〔４〕に記
載のポリペプチド会合体。
〔６〕 F(ab’)2の構造を有するドメインの重鎖定常領域を構成する二つのポリペプチド
がFc領域を構成する二つのポリペプチドの各々に連結された、〔５〕に記載のポリペプチ
ド会合体。
〔７〕 CD3結合ドメインがFc領域を構成する一つ又は二つのCH3に連結された、〔６〕に
記載のポリペプチド会合体。
〔８〕 CD3結合ドメインを構成する重鎖Fv断片がFc領域を構成する一方のCH3に連結され
、CD3結合ドメインを構成する軽鎖Fv断片がFc領域を構成するもう一方のCH3に連結された
、〔７〕に記載のポリペプチド会合体。
〔９〕 CD3結合ドメインを構成する重鎖Fv断片に抗体のCH1ドメイン、及び、軽鎖Fv断片
に抗体のCLドメインが連結された、〔８〕に記載のポリペプチド会合体。
〔１０〕 CD3結合ドメインがF(ab’)2を構成する一つ又は二つのCLに連結された、〔６
〕に記載のポリペプチド会合体。
〔１１〕 CD3結合ドメインがF(ab’)2を構成する一つ又は二つのVHに連結された、〔６
〕に記載のポリペプチド会合体。
〔１２〕 CD3結合ドメインがF(ab’)2を構成する一つ又は二つのVLに連結された、〔６
〕に記載のポリペプチド会合体。
〔１３〕 CD3結合ドメインがFvである、〔１〕から〔１２〕のいずれかに記載のポリペ
プチド会合体。
〔１４〕 CD3結合ドメインがFabである、〔１〕から〔７〕及び〔１０〕から〔１２〕の
いずれかに記載のポリペプチド会合体。
〔１５〕 CD3結合ドメインがscFvである、〔１〕から〔７〕及び〔１０〕から〔１２〕
のいずれかに記載のポリペプチド会合体。
〔１６〕 CD3結合ドメインが一価である、〔１〕から〔１５〕のいずれかに記載のポリ
ペプチド会合体。
〔１７〕 抗原結合ドメインが一価のscFv及び一価のFabである、〔１〕から〔３〕のい
ずれかに記載のポリペプチド会合体。
〔１８〕 一価のscFvがCD3結合ドメインを構成するscFvを介してFc領域を構成する一つ
のポリペプチドに、一価のFabの重鎖Fv断片がCH1領域を介してFc領域を構成する一つのポ
リペプチドに各々連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がCL領域と連結された、〔１７〕に記
載のポリペプチド会合体。
〔１９〕 抗原結合ドメインが二価のscFvである、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の
ポリペプチド会合体。
〔２０〕 一価のscFvがCD3結合ドメインを構成する重鎖Fv断片を介してFc領域を構成す
る一つのポリペプチドに、他方の一価のscFvがCD3結合ドメインを構成する軽鎖Fv断片を
介してFc領域を構成する他方の一つのポリペプチドに連結された、〔１９〕に記載のポリ
ペプチド会合体。
〔２１〕 一価のscFvがCD3結合ドメインを構成するscFvを介してFc領域を構成する一つ
のポリペプチドに、他方の一価のscFvがFc領域を構成する他方の一つのポリペプチドに連
結された、〔１９〕に記載のポリペプチド会合体。
〔２２〕 抗原結合ドメイン、及び、T細胞受容体複合体結合ドメインが各々一価のFabで
ある、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載のポリペプチド会合体。
〔２３〕 抗原結合ドメインを構成する一価のFabの重鎖Fv断片がCH1領域を介してFc領域
を構成する一方のポリペプチドに連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がCL領域と連結され、T
細胞受容体結合ドメインを構成するFabの重鎖Fv断片がCH1領域を介してFc領域を構成する
他方のポリペプチドに連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がCL領域と連結された、〔２２〕
に記載のポリペプチド会合体。
〔２４〕 抗原結合ドメインを構成する一価のFabの重鎖Fv断片がCH1領域を介してFc領域
を構成する一方のポリペプチドに連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がCL領域と連結され、T
細胞受容体結合ドメインを構成するFabの軽鎖Fv断片がCH1領域を介してFc領域を構成する
他方のポリペプチドに連結され、当該Fabの重鎖Fv断片がCL領域と連結された、〔２２〕
に記載のポリペプチド会合体。
〔２５〕 抗原結合ドメインを構成する一価のFabの重鎖Fv断片がCH1領域を介してFc領域
を構成する一方のポリペプチドに連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がCL領域と連結され、T
細胞受容体結合ドメインを構成するFabの重鎖Fv断片がCL領域を介してFc領域を構成する
他方のポリペプチドに連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がCH1領域と連結された、〔２２〕
に記載のポリペプチド会合体。
〔２６〕 T細胞受容体結合ドメインを構成する一価のFabの重鎖Fv断片がCH1領域を介し
てFc領域を構成する一方のポリペプチドに連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がCL領域と連
結され、抗原結合ドメインを構成するFabの軽鎖Fv断片がCH1領域を介してFc領域を構成す
る他方のポリペプチドに連結され、当該Fabの重鎖Fv断片がCL領域と連結された、〔２２
〕に記載のポリペプチド会合体。
〔２７〕 T細胞受容体結合ドメインを構成する一価のFabの重鎖Fv断片がCH1領域を介し
てFc領域を構成する一方のポリペプチドに連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がCL領域と連
結され、抗原結合ドメインを構成するFabの重鎖Fv断片がCL領域を介してFc領域を構成す
る他方のポリペプチドに連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がCH1領域と連結された、〔２２
〕に記載のポリペプチド会合体。
〔２８〕 （１）抗原に結合する一価のFab構造の重鎖Fv断片がCH1領域を介して前記Fc領
域を構成する一方のポリペプチドに連結され、当該Fab構造の軽鎖Fv断片がCL領域と連結
された抗原結合ドメイン、及び、
（２）T細胞受容体複合体に結合する一価のFab構造の重鎖Fv断片がCH1領域を介してFc
領域を構成する他方のポリペプチドに連結され、当該Fab構造の軽鎖Fv断片がCL領域と連
結されたT細胞受容体複合体結合ドメイン、
を含むポリペプチド会合体であって、抗原結合ドメイン中の重鎖Fv断片と抗原結合ドメイ
ン中の軽鎖Fv断片またはT細胞受容体結合ドメイン中の重鎖Fv断片とT細胞受容体結合ドメ
イン中の軽鎖Fv断片が会合するようにCH1領域とCL領域の電荷が制御されている、〔２２
〕に記載のポリペプチド会合体。
〔２９〕 T細胞受容体複合体結合ドメイン中の重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ
酸残基および抗原結合ドメイン中の軽鎖Fv断片に連結されたCL領域のアミノ酸残基が互い
に同種の電荷を有する、〔２８〕に記載のポリペプチド会合体。
〔３０〕 抗原結合ドメイン中の重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ酸残基およびT
細胞受容体複合体結合ドメイン中の軽鎖Fv断片に連結されたCL領域のアミノ酸残基が互い
に同種の電荷を有する、〔２８〕に記載のポリペプチド会合体。
〔３１〕 T細胞受容体複合体結合ドメイン中の重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ
酸残基および抗原結合ドメイン中の軽鎖Fv断片に連結されたCL領域のアミノ酸残基が互い
に同種の電荷を有し、抗原結合ドメイン中の重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ酸
残基およびT細胞受容体複合体結合ドメイン中の軽鎖Fv断片に連結されたCL領域のアミノ
酸残基が互いに同種の電荷を有する、〔２８〕に記載のポリペプチド会合体。
〔３２〕 T細胞受容体複合体結合ドメイン中の重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ
酸残基およびT細胞受容体結合ドメイン中の軽鎖Fv断片に連結されたCL領域のアミノ酸残
基が互いに異種の電荷を有する、〔２９〕又は〔３１〕に記載のポリペプチド会合体。
〔３３〕 抗原結合ドメイン中の重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ酸残基および
抗原結合ドメイン中の軽鎖Fv断片に連結されたCL領域のアミノ酸残基がともに異種の電荷
を有する、〔３０〕または〔３１〕に記載のポリペプチド会合体。
〔３４〕 T細胞受容体複合体結合ドメインがT細胞受容体結合ドメインである、〔２２〕
から〔３３〕のいずれかに記載のポリペプチド会合体。
〔３５〕 T細胞受容体結合ドメインがCD3結合ドメインである、〔３４〕に記載のポリペ
プチド会合体。
〔３６〕 CH1領域のアミノ酸残基およびCL領域のアミノ酸残基が、以下の（ａ）～（ｆ
）に示される1組又は2組以上のアミノ酸残基の組からなる群；
（ａ）CH1領域のアミノ酸残基であってEUナンバリング147位のアミノ酸残基、及びCL領域
のアミノ酸残基であってEUナンバリング180位のアミノ酸残基、
（ｂ）CH1領域のアミノ酸残基であってEUナンバリング147位のアミノ酸残基、及びCL領域
のアミノ酸残基であってEUナンバリング131位のアミノ酸残基
（ｃ）CH1領域のアミノ酸残基であってEUナンバリング147位のアミノ酸残基、及びCL領域
のアミノ酸残基であってEUナンバリング164位のアミノ酸残基
（ｄ）CH1領域のアミノ酸残基であってEUナンバリング147位のアミノ酸残基、及びCL領域
のアミノ酸残基であってEUナンバリング138位のアミノ酸残基
（ｅ）CH1領域のアミノ酸残基であってEUナンバリング147位のアミノ酸残基、及びCL領域
のアミノ酸残基であってEUナンバリング123位のアミノ酸残基
（ｆ）CH1領域のアミノ酸残基であってEUナンバリング175位のアミノ酸残基、及びCL領域
のアミノ酸残基であってEUナンバリング160位のアミノ酸残基
より選択され、CH1領域のアミノ酸残基とCL領域のアミノ酸残基とが互いに異種の電荷を
有するアミノ酸残基である、〔３２〕又は〔３３〕のいずれかに記載のポリペプチド会合
体。
〔３７〕 さらに、以下の（ｇ）に示されるアミノ酸残基の組を含む群より選択される、
〔３６〕に記載のポリペプチド会合体。
（ｇ）CH1領域のアミノ酸残基であってEUナンバリング213位のアミノ酸残基、及びCL領域
のアミノ酸残基であってEUナンバリング123位のアミノ酸残基
〔３８〕 前記異種の電荷を有するアミノ酸残基が、以下の（X）または（Y）のいずれか
の群；
（X）グルタミン酸（E）、アスパラギン酸（D）；
（Y）リジン（K）、アルギニン（R）、ヒスチジン（H）；
に含まれるアミノ酸残基から選択される、〔３６〕又は〔３７〕に記載のポリペプチド会
合体。
〔３９〕 前記異種の電荷を有するアミノ酸残基が、CH1領域のアミノ酸残基であってEU
ナンバリング175位のアミノ酸残基がＬｙｓ、CL領域のアミノ酸残基であってEUナンバリ
ング180位、131位及び160位のアミノ酸残基がいずれもＧｌｕである、〔３６〕から〔３
８〕のいずれかに記載のポリペプチド会合体。
〔４０〕 前記異種の電荷を有するアミノ酸残基が、CH1領域のアミノ酸残基であってEU
ナンバリング147位及び175位のアミノ酸残基がＧｌｕ、CL領域のアミノ酸残基であってEU
ナンバリング180位、131位及び160位のアミノ酸残基がいずれもＬｙｓである、〔３６〕
から〔３８〕のいずれかに記載のポリペプチド会合体。
〔４１〕 さらに、CH1領域のアミノ酸残基であってEUナンバリング213位のアミノ酸残基
がＧｌｕであり、CL領域のアミノ酸残基であってEUナンバリング123位のアミノ酸残基が
Ｌｙｓである、〔４０〕に記載のポリペプチド会合体。
〔４２〕 Fc領域がFcγI、FcγIIA、FcγIIB、FcγIIIA及び／又はFcγIIIBのいずれか
のFcγ受容体に対する結合活性が低下しているFc領域である、〔１〕から〔４１〕のいず
れかに記載のポリペプチド会合体。
〔４３〕 Fc領域が、配列番号：２３に記載のFc領域、配列番号：２４に記載のFc領域、
配列番号：２５に記載のFc領域、又は配列番号：２６に記載のFc領域を構成するアミノ酸
が変異しているFc領域であることを特徴とする、〔１〕から〔４２〕のいずれかに記載の
ポリペプチド会合体。
〔４４〕 Fc領域を構成するアミノ酸のうちEUナンバリングに従って特定される下記のい
ずれかのアミノ酸；
118位から260位のアミノ酸配列が配列番号：２４に記載の配列、261位から447位のアミノ
酸配列が配列番号：２６に記載の配列であるFc領域である、〔４３〕に記載のポリペプチ
ド会合体。
〔４５〕 Fc領域を構成するアミノ酸のうちEUナンバリングに従って特定される下記のい
ずれかのアミノ酸；
220位、226位、229位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239
位、240位、264位、265位、266位、267位、269位、270位、295位、296位、297位、298位
、299位、300位、325位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、
が変異しているFc領域である、〔４３〕に記載のポリペプチド会合体。
〔４６〕 Fc領域が配列番号：２３に記載のFc領域を構成するアミノ酸が変異しているFc
領域であることを特徴とする、〔４５〕に記載のポリペプチド会合体。
〔４７〕 Fc領域を構成するアミノ酸のうちEUナンバリングに従って特定される下記のい
ずれかのアミノ酸；
233位、234位、235位、236位、237位、327位、330位、331位、
が対応するIgG2またはIgG4においてそのEUナンバリングが対応するアミノ酸に置換された
Fc領域である、〔４６〕に記載のポリペプチド会合体。
〔４８〕 Fc領域を構成するアミノ酸のうちEUナンバリングに従って特定される下記のい
ずれかのアミノ酸；
234位、235位、297位、
が変異しているFc領域であることを特徴とする、〔４６〕に記載のポリペプチド会合体。
〔４９〕 234位のアミノ酸がアラニン、235位のアミノ酸がアラニン、及び／又は、297
位のアミノ酸がアラニンに変異していることを特徴とする、〔４８〕に記載のポリペプチ
ド会合体。
〔５０〕 Fc領域を構成する二つのポリペプチドの配列が互いに異なる配列を有すること
を特徴とする、〔４３〕から〔４９〕のいずれかに記載のポリペプチド会合体。
〔５１〕 Fc領域を構成する二つのポリペプチドの一方のポリペプチドのアミノ酸残基の
うちEUナンバリングに従って特定される349位のアミノ酸がシステイン、366位のアミノ酸
がトリプトファンに、他方のポリペプチドのアミノ酸残基のうちEUナンバリングに従って
特定される356位のアミノ酸がシステイン、366位のアミノ酸がセリンに、368位のアミノ
酸がアラニンに、407位のアミノ酸がバリンに変異していることを特徴とする、〔１〕か
ら〔５０〕のいずれかに記載のポリペプチド会合体。
〔５２〕 Fc領域を構成する二つのポリペプチドの一方のポリペプチドのアミノ酸残基の
うちEUナンバリングに従って特定される356位のアミノ酸がリジンに、他方のポリペプチ
ドのアミノ酸残基のうちEUナンバリングに従って特定される439位のアミノ酸がグルタミ
ン酸に変異し、いずれか一方のポリペプチドのアミノ酸残基のうちEUナンバリングに従っ
て特定される435位のアミノ酸がアルギニンに変異していることを特徴とする、〔１〕か
ら〔５０〕のいずれかに記載のポリペプチド会合体。
〔５３〕 Fc領域を構成する二つのポリペプチドのカルボキシ末端に存在する配列GKが欠
失していることを特徴とする、〔５１〕又は〔５２〕に記載のポリペプチド会合体。
〔５４〕 抗原結合ドメインが同一のエピトープに結合する、〔１〕から〔５３〕のいず
れかに記載のポリペプチド会合体。
〔５５〕 同一のエピトープが配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質中
に存在する、〔５４〕に記載のポリペプチド会合体。
〔５６〕 同一のエピトープが配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質中
に存在する、〔５４〕に記載のポリペプチド会合体。
〔５７〕 抗原結合ドメインが互いに異なるエピトープに結合する、〔１〕から〔５３〕
のいずれかに記載のポリペプチド会合体。
〔５８〕 異なるエピトープが配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質中
に存在する、〔５７〕に記載のポリペプチド会合体。
〔５９〕 異なるエピトープが配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質中
に存在する、〔５７〕に記載のポリペプチド会合体。
〔６０〕 〔１〕から〔５９〕のいずれかに記載のポリペプチド会合体をコードするポリ
ヌクレオチド。
〔６１〕 〔６０〕に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
〔６２〕 〔６１〕に記載のベクターを保持する細胞。
〔６３〕 〔６２〕に記載の細胞を培養し培養上清からポリペプチド会合体を回収するこ
とを含むポリペプチド会合体の製造方法。
〔６４〕 〔１〕から〔５９〕のいずれかに記載のポリペプチド会合体を有効成分として
含む細胞傷害誘導治療剤。
〔６５〕 細胞傷害誘導治療剤が癌治療剤である、〔６４〕に記載の治療剤。
〔６６〕 癌が肝癌又は肺癌である、〔６５〕に記載の治療剤。
〔６７〕 〔１〕から〔５９〕のいずれかに記載のポリペプチド会合体を治療が必要な患
者に投与することを特徴とする、癌の治療又は予防方法。
〔６８〕 癌が肝癌又は肺癌である、〔６７〕に記載の治療又は予防方法。
〔１〕 下記のドメイン；
（１）抗原結合ドメイン、
（２）Fcγ受容体に対する結合活性が低下しているFc領域を含むドメイン、及び、
（３）T細胞受容体複合体結合ドメイン、
を含むポリペプチド会合体。
〔２〕 T細胞受容体複合体結合ドメインがT細胞受容体結合ドメインである、〔１〕に記
載のポリペプチド会合体。
〔３〕 T細胞受容体複合体結合ドメインがCD3結合ドメインである、〔１〕に記載のポリ
ペプチド会合体。
〔４〕 抗原結合ドメインが二価の抗原結合ドメインである、〔１〕から〔３〕のいずれ
かに記載のポリペプチド会合体。
〔５〕 二価の抗原結合ドメインがF(ab’)2の構造を有するドメインである、〔４〕に記
載のポリペプチド会合体。
〔６〕 F(ab’)2の構造を有するドメインの重鎖定常領域を構成する二つのポリペプチド
がFc領域を構成する二つのポリペプチドの各々に連結された、〔５〕に記載のポリペプチ
ド会合体。
〔７〕 CD3結合ドメインがFc領域を構成する一つ又は二つのCH3に連結された、〔６〕に
記載のポリペプチド会合体。
〔８〕 CD3結合ドメインを構成する重鎖Fv断片がFc領域を構成する一方のCH3に連結され
、CD3結合ドメインを構成する軽鎖Fv断片がFc領域を構成するもう一方のCH3に連結された
、〔７〕に記載のポリペプチド会合体。
〔９〕 CD3結合ドメインを構成する重鎖Fv断片に抗体のCH1ドメイン、及び、軽鎖Fv断片
に抗体のCLドメインが連結された、〔８〕に記載のポリペプチド会合体。
〔１０〕 CD3結合ドメインがF(ab’)2を構成する一つ又は二つのCLに連結された、〔６
〕に記載のポリペプチド会合体。
〔１１〕 CD3結合ドメインがF(ab’)2を構成する一つ又は二つのVHに連結された、〔６
〕に記載のポリペプチド会合体。
〔１２〕 CD3結合ドメインがF(ab’)2を構成する一つ又は二つのVLに連結された、〔６
〕に記載のポリペプチド会合体。
〔１３〕 CD3結合ドメインがFvである、〔１〕から〔１２〕のいずれかに記載のポリペ
プチド会合体。
〔１４〕 CD3結合ドメインがFabである、〔１〕から〔７〕及び〔１０〕から〔１２〕の
いずれかに記載のポリペプチド会合体。
〔１５〕 CD3結合ドメインがscFvである、〔１〕から〔７〕及び〔１０〕から〔１２〕
のいずれかに記載のポリペプチド会合体。
〔１６〕 CD3結合ドメインが一価である、〔１〕から〔１５〕のいずれかに記載のポリ
ペプチド会合体。
〔１７〕 抗原結合ドメインが一価のscFv及び一価のFabである、〔１〕から〔３〕のい
ずれかに記載のポリペプチド会合体。
〔１８〕 一価のscFvがCD3結合ドメインを構成するscFvを介してFc領域を構成する一つ
のポリペプチドに、一価のFabの重鎖Fv断片がCH1領域を介してFc領域を構成する一つのポ
リペプチドに各々連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がCL領域と連結された、〔１７〕に記
載のポリペプチド会合体。
〔１９〕 抗原結合ドメインが二価のscFvである、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の
ポリペプチド会合体。
〔２０〕 一価のscFvがCD3結合ドメインを構成する重鎖Fv断片を介してFc領域を構成す
る一つのポリペプチドに、他方の一価のscFvがCD3結合ドメインを構成する軽鎖Fv断片を
介してFc領域を構成する他方の一つのポリペプチドに連結された、〔１９〕に記載のポリ
ペプチド会合体。
〔２１〕 一価のscFvがCD3結合ドメインを構成するscFvを介してFc領域を構成する一つ
のポリペプチドに、他方の一価のscFvがFc領域を構成する他方の一つのポリペプチドに連
結された、〔１９〕に記載のポリペプチド会合体。
〔２２〕 抗原結合ドメイン、及び、T細胞受容体複合体結合ドメインが各々一価のFabで
ある、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載のポリペプチド会合体。
〔２３〕 抗原結合ドメインを構成する一価のFabの重鎖Fv断片がCH1領域を介してFc領域
を構成する一方のポリペプチドに連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がCL領域と連結され、T
細胞受容体結合ドメインを構成するFabの重鎖Fv断片がCH1領域を介してFc領域を構成する
他方のポリペプチドに連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がCL領域と連結された、〔２２〕
に記載のポリペプチド会合体。
〔２４〕 抗原結合ドメインを構成する一価のFabの重鎖Fv断片がCH1領域を介してFc領域
を構成する一方のポリペプチドに連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がCL領域と連結され、T
細胞受容体結合ドメインを構成するFabの軽鎖Fv断片がCH1領域を介してFc領域を構成する
他方のポリペプチドに連結され、当該Fabの重鎖Fv断片がCL領域と連結された、〔２２〕
に記載のポリペプチド会合体。
〔２５〕 抗原結合ドメインを構成する一価のFabの重鎖Fv断片がCH1領域を介してFc領域
を構成する一方のポリペプチドに連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がCL領域と連結され、T
細胞受容体結合ドメインを構成するFabの重鎖Fv断片がCL領域を介してFc領域を構成する
他方のポリペプチドに連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がCH1領域と連結された、〔２２〕
に記載のポリペプチド会合体。
〔２６〕 T細胞受容体結合ドメインを構成する一価のFabの重鎖Fv断片がCH1領域を介し
てFc領域を構成する一方のポリペプチドに連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がCL領域と連
結され、抗原結合ドメインを構成するFabの軽鎖Fv断片がCH1領域を介してFc領域を構成す
る他方のポリペプチドに連結され、当該Fabの重鎖Fv断片がCL領域と連結された、〔２２
〕に記載のポリペプチド会合体。
〔２７〕 T細胞受容体結合ドメインを構成する一価のFabの重鎖Fv断片がCH1領域を介し
てFc領域を構成する一方のポリペプチドに連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がCL領域と連
結され、抗原結合ドメインを構成するFabの重鎖Fv断片がCL領域を介してFc領域を構成す
る他方のポリペプチドに連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がCH1領域と連結された、〔２２
〕に記載のポリペプチド会合体。
〔２８〕 （１）抗原に結合する一価のFab構造の重鎖Fv断片がCH1領域を介して前記Fc領
域を構成する一方のポリペプチドに連結され、当該Fab構造の軽鎖Fv断片がCL領域と連結
された抗原結合ドメイン、及び、
（２）T細胞受容体複合体に結合する一価のFab構造の重鎖Fv断片がCH1領域を介してFc
領域を構成する他方のポリペプチドに連結され、当該Fab構造の軽鎖Fv断片がCL領域と連
結されたT細胞受容体複合体結合ドメイン、
を含むポリペプチド会合体であって、抗原結合ドメイン中の重鎖Fv断片と抗原結合ドメイ
ン中の軽鎖Fv断片またはT細胞受容体結合ドメイン中の重鎖Fv断片とT細胞受容体結合ドメ
イン中の軽鎖Fv断片が会合するようにCH1領域とCL領域の電荷が制御されている、〔２２
〕に記載のポリペプチド会合体。
〔２９〕 T細胞受容体複合体結合ドメイン中の重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ
酸残基および抗原結合ドメイン中の軽鎖Fv断片に連結されたCL領域のアミノ酸残基が互い
に同種の電荷を有する、〔２８〕に記載のポリペプチド会合体。
〔３０〕 抗原結合ドメイン中の重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ酸残基およびT
細胞受容体複合体結合ドメイン中の軽鎖Fv断片に連結されたCL領域のアミノ酸残基が互い
に同種の電荷を有する、〔２８〕に記載のポリペプチド会合体。
〔３１〕 T細胞受容体複合体結合ドメイン中の重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ
酸残基および抗原結合ドメイン中の軽鎖Fv断片に連結されたCL領域のアミノ酸残基が互い
に同種の電荷を有し、抗原結合ドメイン中の重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ酸
残基およびT細胞受容体複合体結合ドメイン中の軽鎖Fv断片に連結されたCL領域のアミノ
酸残基が互いに同種の電荷を有する、〔２８〕に記載のポリペプチド会合体。
〔３２〕 T細胞受容体複合体結合ドメイン中の重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ
酸残基およびT細胞受容体結合ドメイン中の軽鎖Fv断片に連結されたCL領域のアミノ酸残
基が互いに異種の電荷を有する、〔２９〕又は〔３１〕に記載のポリペプチド会合体。
〔３３〕 抗原結合ドメイン中の重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ酸残基および
抗原結合ドメイン中の軽鎖Fv断片に連結されたCL領域のアミノ酸残基がともに異種の電荷
を有する、〔３０〕または〔３１〕に記載のポリペプチド会合体。
〔３４〕 T細胞受容体複合体結合ドメインがT細胞受容体結合ドメインである、〔２２〕
から〔３３〕のいずれかに記載のポリペプチド会合体。
〔３５〕 T細胞受容体結合ドメインがCD3結合ドメインである、〔３４〕に記載のポリペ
プチド会合体。
〔３６〕 CH1領域のアミノ酸残基およびCL領域のアミノ酸残基が、以下の（ａ）～（ｆ
）に示される1組又は2組以上のアミノ酸残基の組からなる群；
（ａ）CH1領域のアミノ酸残基であってEUナンバリング147位のアミノ酸残基、及びCL領域
のアミノ酸残基であってEUナンバリング180位のアミノ酸残基、
（ｂ）CH1領域のアミノ酸残基であってEUナンバリング147位のアミノ酸残基、及びCL領域
のアミノ酸残基であってEUナンバリング131位のアミノ酸残基
（ｃ）CH1領域のアミノ酸残基であってEUナンバリング147位のアミノ酸残基、及びCL領域
のアミノ酸残基であってEUナンバリング164位のアミノ酸残基
（ｄ）CH1領域のアミノ酸残基であってEUナンバリング147位のアミノ酸残基、及びCL領域
のアミノ酸残基であってEUナンバリング138位のアミノ酸残基
（ｅ）CH1領域のアミノ酸残基であってEUナンバリング147位のアミノ酸残基、及びCL領域
のアミノ酸残基であってEUナンバリング123位のアミノ酸残基
（ｆ）CH1領域のアミノ酸残基であってEUナンバリング175位のアミノ酸残基、及びCL領域
のアミノ酸残基であってEUナンバリング160位のアミノ酸残基
より選択され、CH1領域のアミノ酸残基とCL領域のアミノ酸残基とが互いに異種の電荷を
有するアミノ酸残基である、〔３２〕又は〔３３〕のいずれかに記載のポリペプチド会合
体。
〔３７〕 さらに、以下の（ｇ）に示されるアミノ酸残基の組を含む群より選択される、
〔３６〕に記載のポリペプチド会合体。
（ｇ）CH1領域のアミノ酸残基であってEUナンバリング213位のアミノ酸残基、及びCL領域
のアミノ酸残基であってEUナンバリング123位のアミノ酸残基
〔３８〕 前記異種の電荷を有するアミノ酸残基が、以下の（X）または（Y）のいずれか
の群；
（X）グルタミン酸（E）、アスパラギン酸（D）；
（Y）リジン（K）、アルギニン（R）、ヒスチジン（H）；
に含まれるアミノ酸残基から選択される、〔３６〕又は〔３７〕に記載のポリペプチド会
合体。
〔３９〕 前記異種の電荷を有するアミノ酸残基が、CH1領域のアミノ酸残基であってEU
ナンバリング175位のアミノ酸残基がＬｙｓ、CL領域のアミノ酸残基であってEUナンバリ
ング180位、131位及び160位のアミノ酸残基がいずれもＧｌｕである、〔３６〕から〔３
８〕のいずれかに記載のポリペプチド会合体。
〔４０〕 前記異種の電荷を有するアミノ酸残基が、CH1領域のアミノ酸残基であってEU
ナンバリング147位及び175位のアミノ酸残基がＧｌｕ、CL領域のアミノ酸残基であってEU
ナンバリング180位、131位及び160位のアミノ酸残基がいずれもＬｙｓである、〔３６〕
から〔３８〕のいずれかに記載のポリペプチド会合体。
〔４１〕 さらに、CH1領域のアミノ酸残基であってEUナンバリング213位のアミノ酸残基
がＧｌｕであり、CL領域のアミノ酸残基であってEUナンバリング123位のアミノ酸残基が
Ｌｙｓである、〔４０〕に記載のポリペプチド会合体。
〔４２〕 Fc領域がFcγI、FcγIIA、FcγIIB、FcγIIIA及び／又はFcγIIIBのいずれか
のFcγ受容体に対する結合活性が低下しているFc領域である、〔１〕から〔４１〕のいず
れかに記載のポリペプチド会合体。
〔４３〕 Fc領域が、配列番号：２３に記載のFc領域、配列番号：２４に記載のFc領域、
配列番号：２５に記載のFc領域、又は配列番号：２６に記載のFc領域を構成するアミノ酸
が変異しているFc領域であることを特徴とする、〔１〕から〔４２〕のいずれかに記載の
ポリペプチド会合体。
〔４４〕 Fc領域を構成するアミノ酸のうちEUナンバリングに従って特定される下記のい
ずれかのアミノ酸；
118位から260位のアミノ酸配列が配列番号：２４に記載の配列、261位から447位のアミノ
酸配列が配列番号：２６に記載の配列であるFc領域である、〔４３〕に記載のポリペプチ
ド会合体。
〔４５〕 Fc領域を構成するアミノ酸のうちEUナンバリングに従って特定される下記のい
ずれかのアミノ酸；
220位、226位、229位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239
位、240位、264位、265位、266位、267位、269位、270位、295位、296位、297位、298位
、299位、300位、325位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、
が変異しているFc領域である、〔４３〕に記載のポリペプチド会合体。
〔４６〕 Fc領域が配列番号：２３に記載のFc領域を構成するアミノ酸が変異しているFc
領域であることを特徴とする、〔４５〕に記載のポリペプチド会合体。
〔４７〕 Fc領域を構成するアミノ酸のうちEUナンバリングに従って特定される下記のい
ずれかのアミノ酸；
233位、234位、235位、236位、237位、327位、330位、331位、
が対応するIgG2またはIgG4においてそのEUナンバリングが対応するアミノ酸に置換された
Fc領域である、〔４６〕に記載のポリペプチド会合体。
〔４８〕 Fc領域を構成するアミノ酸のうちEUナンバリングに従って特定される下記のい
ずれかのアミノ酸；
234位、235位、297位、
が変異しているFc領域であることを特徴とする、〔４６〕に記載のポリペプチド会合体。
〔４９〕 234位のアミノ酸がアラニン、235位のアミノ酸がアラニン、及び／又は、297
位のアミノ酸がアラニンに変異していることを特徴とする、〔４８〕に記載のポリペプチ
ド会合体。
〔５０〕 Fc領域を構成する二つのポリペプチドの配列が互いに異なる配列を有すること
を特徴とする、〔４３〕から〔４９〕のいずれかに記載のポリペプチド会合体。
〔５１〕 Fc領域を構成する二つのポリペプチドの一方のポリペプチドのアミノ酸残基の
うちEUナンバリングに従って特定される349位のアミノ酸がシステイン、366位のアミノ酸
がトリプトファンに、他方のポリペプチドのアミノ酸残基のうちEUナンバリングに従って
特定される356位のアミノ酸がシステイン、366位のアミノ酸がセリンに、368位のアミノ
酸がアラニンに、407位のアミノ酸がバリンに変異していることを特徴とする、〔１〕か
ら〔５０〕のいずれかに記載のポリペプチド会合体。
〔５２〕 Fc領域を構成する二つのポリペプチドの一方のポリペプチドのアミノ酸残基の
うちEUナンバリングに従って特定される356位のアミノ酸がリジンに、他方のポリペプチ
ドのアミノ酸残基のうちEUナンバリングに従って特定される439位のアミノ酸がグルタミ
ン酸に変異し、いずれか一方のポリペプチドのアミノ酸残基のうちEUナンバリングに従っ
て特定される435位のアミノ酸がアルギニンに変異していることを特徴とする、〔１〕か
ら〔５０〕のいずれかに記載のポリペプチド会合体。
〔５３〕 Fc領域を構成する二つのポリペプチドのカルボキシ末端に存在する配列GKが欠
失していることを特徴とする、〔５１〕又は〔５２〕に記載のポリペプチド会合体。
〔５４〕 抗原結合ドメインが同一のエピトープに結合する、〔１〕から〔５３〕のいず
れかに記載のポリペプチド会合体。
〔５５〕 同一のエピトープが配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質中
に存在する、〔５４〕に記載のポリペプチド会合体。
〔５６〕 同一のエピトープが配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質中
に存在する、〔５４〕に記載のポリペプチド会合体。
〔５７〕 抗原結合ドメインが互いに異なるエピトープに結合する、〔１〕から〔５３〕
のいずれかに記載のポリペプチド会合体。
〔５８〕 異なるエピトープが配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質中
に存在する、〔５７〕に記載のポリペプチド会合体。
〔５９〕 異なるエピトープが配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質中
に存在する、〔５７〕に記載のポリペプチド会合体。
〔６０〕 〔１〕から〔５９〕のいずれかに記載のポリペプチド会合体をコードするポリ
ヌクレオチド。
〔６１〕 〔６０〕に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
〔６２〕 〔６１〕に記載のベクターを保持する細胞。
〔６３〕 〔６２〕に記載の細胞を培養し培養上清からポリペプチド会合体を回収するこ
とを含むポリペプチド会合体の製造方法。
〔６４〕 〔１〕から〔５９〕のいずれかに記載のポリペプチド会合体を有効成分として
含む細胞傷害誘導治療剤。
〔６５〕 細胞傷害誘導治療剤が癌治療剤である、〔６４〕に記載の治療剤。
〔６６〕 癌が肝癌又は肺癌である、〔６５〕に記載の治療剤。
〔６７〕 〔１〕から〔５９〕のいずれかに記載のポリペプチド会合体を治療が必要な患
者に投与することを特徴とする、癌の治療又は予防方法。
〔６８〕 癌が肝癌又は肺癌である、〔６７〕に記載の治療又は予防方法。
【0013】
また本発明は、本発明のポリペプチド会合体または本発明の製造方法により製造された
ポリペプチド会合体を含む、本発明の方法に用いるためのキットに関する。また本発明は
、本発明のポリペプチド会合体もしくは本発明の製造方法により製造されたポリペプチド
会合体の、細胞傷害誘導治療剤の製造における使用に関する。また本発明は、本発明の方
法に使用するための、本発明のポリペプチド会合体または本発明の製造方法により製造さ
れたポリペプチド会合体に関する。
ポリペプチド会合体を含む、本発明の方法に用いるためのキットに関する。また本発明は
、本発明のポリペプチド会合体もしくは本発明の製造方法により製造されたポリペプチド
会合体の、細胞傷害誘導治療剤の製造における使用に関する。また本発明は、本発明の方
法に使用するための、本発明のポリペプチド会合体または本発明の製造方法により製造さ
れたポリペプチド会合体に関する。
【発明の効果】
【0014】
本発明によって、BiTEが持つ強い抗腫瘍活性と、癌抗原非依存的にサイトカインストー
ムなどを誘導しないという安全性上の優れた性質が維持され、かつ長い血中半減期を持つ
新たなポリペプチド会合体が提供された。本発明のポリペプチド会合体における抗原結合
ドメインを置換することにより、当該ポリペプチド会合体を有効成分として含む細胞傷害
誘導治療剤が癌細胞を含む様々な細胞を標的として細胞傷害をもたらし、様々な癌を治療
又は予防することができる。患者にとっても、安全性が高いばかりでなく、身体的負担が
少なく利便性も高いという、望ましい治療ができるようになる。
ムなどを誘導しないという安全性上の優れた性質が維持され、かつ長い血中半減期を持つ
新たなポリペプチド会合体が提供された。本発明のポリペプチド会合体における抗原結合
ドメインを置換することにより、当該ポリペプチド会合体を有効成分として含む細胞傷害
誘導治療剤が癌細胞を含む様々な細胞を標的として細胞傷害をもたらし、様々な癌を治療
又は予防することができる。患者にとっても、安全性が高いばかりでなく、身体的負担が
少なく利便性も高いという、望ましい治療ができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】GPC3 ERY1（GPC3 BiTE）、GPC3 ERY2、IgG型GPC3抗体の細胞傷害活性の比較を表すグラフである。黒四角（■）はGPC3 ERY1（GPC3 BiTE）、黒三角（▲）はGPC3 ERY2、白四角（□）はIgG型GPC3抗体の細胞傷害活性をそれぞれ表す。
【図2】GPC3 BiTE、GPC3 ERY5の細胞傷害活性の比較を表すグラフである。黒四角（■）はGPC3 BiTE、白丸（○）はGPC3 ERY5の細胞傷害活性をそれぞれ表す。
【図3】GPC3 BiTE、GPC3 ERY6の細胞傷害活性の比較を表すグラフである。黒四角（■）はGPC3 BiTE、黒三角（▲）はGPC3 ERY6の細胞傷害活性をそれぞれ表す。
【図4】GPC3 BiTE、GPC3 ERY7の細胞傷害活性の比較を表すグラフである。黒四角（■）はGPC3 BiTE、黒菱（◆）はGPC3 ERY7の細胞傷害活性をそれぞれ表す。
【図5】GPC3 BiTE、GPC3 ERY8-2、GPC3 ERY9-1、GPC3 ERY10-1の細胞傷害活性の比較を表すグラフである。黒四角（■）はGPC3 BiTE、黒三角（▲）はGPC3 ERY8-2、白丸（○）はGPC3 ERY9-1、白四角（□）はGPC3 ERY10-1の細胞傷害活性をそれぞれ表す。
【図6】PC-10 pre-mixモデルにおけるGPC3 ERY8-2のin vivo抗腫瘍効果を表すグラフである。白四角（□）はGPC3 ERY7投与群の腫瘍体積の変化を表す。黒菱（◆）は対照群（PBS投与）の腫瘍体積の変化を表す。
【図7】PC-10 pre-mixモデルにおけるGPC3 ERY10-1のin vivo抗腫瘍効果を表すグラフである。白四角（□）はGPC3 ERY10-1投与群の腫瘍体積の変化を表す。黒菱（◆）は対照群（PBS投与）の腫瘍体積の変化を表す。
【図8】PC-10 T細胞移入モデルにおけるGPC3 ERY10-1のin vivo抗腫瘍効果を表すグラフである。白四角（□）はGPC3 ERY10-1投与群の腫瘍体積の変化を表す。黒菱（◆）は対照群（PBS投与）の腫瘍体積の変化を表す。
【図9】GPC3発現Ba/F3細胞を用いて測定したGPC3 ERY9-1及びGPC3 ERY10-1の血漿中濃度の推移を表すグラフである。黒菱（◆）はGPC3 ERY9-1、白四角（□）はGPC3 ERY10-1の血漿中濃度の推移を表す。
【図10】CD3発現Ba/F3細胞を用いて測定したGPC3 ERY9-1及びGPC3 ERY10-1の血漿中濃度の推移を表すグラフである。黒菱（◆）はGPC3 ERY9-1、白四角（□）はGPC3 ERY10-1の血漿中濃度の推移を表す。
【図11】GPC3 BiTE、GPC3 ERY9-1、GPC3 ERY10-1、GPC3 ERY15-1、及びcatumaxomabによる癌抗原非依存的なサイトカイン誘導能の評価を示すグラフである。
【図12】GPC3 ERY18 L1、GPC3 ERY18L2、GPC3 ERY18L3、GPC3 ERY18L4、GPC3 ERY18S1のin vitro細胞傷害活性を示すグラフである。黒三角（▲）はGPC3 ERY18 L1、黒丸（●）はGPC3 ERY18 L2、黒四角（■）はGPC3 ERY18 L3、白四角（□）はGPC3 ERY18 L4、白菱（◇）はGPC3 ERY18 S1の細胞傷害活性を表す。
【図13】GPC3 ERY18 L3とGPC3 ERY10-1のin vitro細胞傷害活性の比較を表すグラフである。黒四角（■）はGPC3 ERY18 L3、白四角（□）はGPC3 ERY10-1の細胞傷害活性を表す。
【図14】GPC3 ERY19-3とGPC3 BiTEのin vitro細胞傷害活性の比較を表すグラフである。白四角（□）はGPC3 ERY19-3、黒四角（■）はGPC3 BiTEの細胞傷害活性を表す。
【図15】Ａ．NTA1L/NTA1R/GC33-k0を発現させたCMのサイズ排除クロマトグラフィー分析の結果を表すクロマトグラムである。Ｂ．NTA2L/NTA2R/GC33-k0を発現させたCMのサイズ排除クロマトグラフィー分析の結果を表すクロマトグラムである。
【図16】本願明細書の実施例に記載されるポリペプチド会合体であるGPC3 BiTE、GPC3 ERY2、GPC3 ERY5、GPC3 ERY6、GPC3 ERY7、GPC3 ERY8-2、GPC3 ERY9-1、GPC3 ERY 10-1、GPC3 ERY15、GPC3 ERY18、およびGPC3 ERY19-3を構成する各ドメインの表示である；交差線で表されるドメインは抗癌抗原（GPC3、EpCAM、EGFR）抗体H鎖可変領域、斜線で表されるドメインは抗癌抗原（GPC3、EpCAM、EGFR）抗体L鎖可変領域、点線で表されるドメインは抗CD3抗体H鎖可変領域、黒塗りで表されるドメインは抗CD3抗体L鎖可変領域、白塗りで表されるドメインは抗体定常領域、クロス字はサイレントFc変異、星印はヘテロFcを会合化させる変異、をそれぞれ表す。
【図17】A：GPC3 BiTEの模式図、B：GPC3 ERY 10の模式図、C：GPC3 ERY2の模式図、D：GPC3 ERY5の模式図、E：GPC3 ERY6の模式図、F：GPC3 ERY7の模式図、G：GPC3 ERY8-2の模式図、H：GPC3 ERY9-1の模式図、I：GPC3 ERY10-1の模式図、J：GPC3 ERY15の模式図、K：GPC3 ERY18の模式図、L：GPC3 ERY19-3の模式図、を示す。
【図18】IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4のFc領域を構成するアミノ酸残基と、kabatのEUナンバリング（本明細書においてEU INDEXとも呼ばれる）との関係を表す。
【図19】本願明細書の実施例に記載されるポリペプチド会合体であるGPC3 ERY17-2、GPC3 ERY17-3、EpCAM ERY17-2、およびEpCAM ERY17-3を構成する各ドメインの表示である；交差線で表されるドメインは抗癌抗原（GPC3、EpCAM、EGFR）抗体H鎖可変領域、斜線で表されるドメインは抗癌抗原（GPC3、EpCAM、EGFR）抗体L鎖可変領域、点線で表されるドメインは抗CD3抗体H鎖可変領域、黒塗りで表されるドメインは抗CD3抗体L鎖可変領域、白塗りで表されるドメインは抗体定常領域、クロス字はサイレントFc変異、星印はヘテロFcを会合化させる変異、をそれぞれ表す。
【図20】GPC3 BiTE、GPC3 ERY17-2、GPC3 ERY17-3、GPC3 ERY10-1の細胞傷害活性の比較を表すグラフである。黒四角（■）はGPC3 BiTE、黒三角（▲）はGPC3 ERY17-2、白丸（○）はGPC3 ERY17-3、白四角（□）はGPC3 ERY10-1の細胞傷害活性をそれぞれ表す。
【図21】PC-10 T細胞移入モデルにおけるGPC3 ERY17-2のin vivo抗腫瘍効果を表すグラフである。白四角（□）はGPC3 ERY17-2投与群の腫瘍体積の変化を表す。黒菱（◆）は対照群（PBS投与）の腫瘍体積の変化を表す。
【図22】GPC3 ERY17-2、GPC3 ERY17-2-M20の細胞傷害活性の比較を表すグラフである。黒三角（▲）はGPC3 ERY17-2、白丸（○）はGPC3 ERY17-2-M20の細胞傷害活性をそれぞれ表す。
【図23】EpCAM ERY17-2、EpCAM ERY17-3の細胞傷害活性の比較を表すグラフである。黒三角（▲）はEpCAM ERY17-2、白四角（□）はEpCAM ERY17-3の細胞傷害活性をそれぞれ表す。
【図24】本願明細書の実施例に記載されるポリペプチド会合体であるGM1又はGM2、およびGM0を構成する各ドメインの表示である。CH1/CL界面会合制御が導入され、さらにKnob into Hole (KiH)の改変が導入されたポリペプチド会合体をA、CH1/CL界面会合制御もKiHも導入されていないポリペプチド会合体をBとして示した；交差線で表されるドメインは抗癌抗原（GPC3, EpCAM）抗体H鎖可変領域、斜線で表されるドメインは抗癌抗原（GPC3, EpCAM）抗体L鎖可変領域、点線で表されるドメインは抗CD3抗体H鎖可変領域、黒塗りで表されるドメインは抗CD3抗体L鎖可変領域、白塗りで表されるドメインは抗体定常領域、クロス字はサイレントFc変異、星印はヘテロFcを会合化させる変異、中空円はCH1/CL界面会合制御が導入された変異、をそれぞれ表す。
【図25】GM1、GM2、GM0の細胞傷害活性の比較を表すグラフである。黒三角（▲）はGM1、白四角（□）はGM2、白丸（○）はGM0の細胞傷害活性をそれぞれ表す。
【図26】EGFR ERY17-2の細胞傷害活性を表すグラフである。黒三角（▲）はEGFR ERY17-2の細胞傷害活性を表す。
【発明を実施するための形態】
【0016】
以下の定義は、本明細書において説明する本発明の理解を容易にするために提供される
。
。
【0017】
抗体
本明細書において、抗体とは、天然のものであるかまたは部分的もしくは完全合成によ
り製造された免疫グロブリンをいう。抗体はそれが天然に存在する血漿や血清等の天然資
源や抗体を産生するハイブリドーマ細胞の培養上清から単離され得るし、または遺伝子組
換え等の手法を用いることによって部分的にもしくは完全に合成され得る。抗体の例とし
ては免疫グロブリンのアイソタイプおよびそれらのアイソタイプのサブクラスが好適に挙
げられる。ヒトの免疫グロブリンとして、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、I
gE、IgMの9種類のクラス（アイソタイプ）が知られている。本発明の抗体には、これらの
アイソタイプのうちIgG1、IgG2、IgG3、IgG4が含まれ得る。
本明細書において、抗体とは、天然のものであるかまたは部分的もしくは完全合成によ
り製造された免疫グロブリンをいう。抗体はそれが天然に存在する血漿や血清等の天然資
源や抗体を産生するハイブリドーマ細胞の培養上清から単離され得るし、または遺伝子組
換え等の手法を用いることによって部分的にもしくは完全に合成され得る。抗体の例とし
ては免疫グロブリンのアイソタイプおよびそれらのアイソタイプのサブクラスが好適に挙
げられる。ヒトの免疫グロブリンとして、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、I
gE、IgMの9種類のクラス（アイソタイプ）が知られている。本発明の抗体には、これらの
アイソタイプのうちIgG1、IgG2、IgG3、IgG4が含まれ得る。
【0018】
所望の結合活性を有する抗体を作製する方法は当業者において公知である。以下に、GP
Iアンカー型受容体ファミリーに属する、GPC3（Int J Cancer. (2003) 103 (4), 455-65
）に結合する抗体（抗GPC3抗体）を作製する方法が例示される。GPC3以外の抗原に結合す
る抗体も下記の例示に準じて適宜作製され得る。
Iアンカー型受容体ファミリーに属する、GPC3（Int J Cancer. (2003) 103 (4), 455-65
）に結合する抗体（抗GPC3抗体）を作製する方法が例示される。GPC3以外の抗原に結合す
る抗体も下記の例示に準じて適宜作製され得る。
【0019】
抗GPC3抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として取
得され得る。抗GPC3抗体としては、哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好適に作製され
得る。哺乳動物由来のモノクローナル抗体には、ハイブリドーマにより産生されるもの、
および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞に
よって産生されるもの等が含まれる。
得され得る。抗GPC3抗体としては、哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好適に作製され
得る。哺乳動物由来のモノクローナル抗体には、ハイブリドーマにより産生されるもの、
および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞に
よって産生されるもの等が含まれる。
【0020】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、公知技術を使用することによって、例えば
以下のように作製され得る。すなわち、GPC3タンパク質を感作抗原として使用して、通常
の免疫方法にしたがって哺乳動物が免疫される。得られる免疫細胞が通常の細胞融合法に
よって公知の親細胞と融合される。次に、通常のスクリーニング法によって、モノクロー
ナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって抗GPC3抗体を産生するハイブリド
ーマが選択され得る。
以下のように作製され得る。すなわち、GPC3タンパク質を感作抗原として使用して、通常
の免疫方法にしたがって哺乳動物が免疫される。得られる免疫細胞が通常の細胞融合法に
よって公知の親細胞と融合される。次に、通常のスクリーニング法によって、モノクロー
ナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって抗GPC3抗体を産生するハイブリド
ーマが選択され得る。
【0021】
具体的には、モノクローナル抗体の作製は例えば以下に示すように行われる。まず、Re
fSeq登録番号NM_001164617.1（配列番号：１）にそのヌクレオチド配列が開示されたGPC3
遺伝子を発現することによって、抗体取得の感作抗原として使用されるRefSeq登録番号NP
_001158089.1（配列番号：２）で表されるGPC3タンパク質が取得され得る。すなわち、GP
C3をコードする遺伝子配列を公知の発現ベクターに挿入することによって適当な宿主細胞
が形質転換される。当該宿主細胞中または培養上清中から所望のヒトGPC3タンパク質が公
知の方法で精製される。培養上清中から可溶型のGPC3を取得するためには、例えば、配列
番号：２で表されるGPC3ポリペプチド配列のうち、GPC3が細胞膜上に係留されるために用
いられるGPIアンカー配列に相当する疎水性領域を構成する564-580アミノ酸を欠失したタ
ンパク質が配列番号：２で表されるGPC3タンパク質の代わりに発現される。また、精製し
た天然のGPC3タンパク質もまた同様に感作抗原として使用され得る。
fSeq登録番号NM_001164617.1（配列番号：１）にそのヌクレオチド配列が開示されたGPC3
遺伝子を発現することによって、抗体取得の感作抗原として使用されるRefSeq登録番号NP
_001158089.1（配列番号：２）で表されるGPC3タンパク質が取得され得る。すなわち、GP
C3をコードする遺伝子配列を公知の発現ベクターに挿入することによって適当な宿主細胞
が形質転換される。当該宿主細胞中または培養上清中から所望のヒトGPC3タンパク質が公
知の方法で精製される。培養上清中から可溶型のGPC3を取得するためには、例えば、配列
番号：２で表されるGPC3ポリペプチド配列のうち、GPC3が細胞膜上に係留されるために用
いられるGPIアンカー配列に相当する疎水性領域を構成する564-580アミノ酸を欠失したタ
ンパク質が配列番号：２で表されるGPC3タンパク質の代わりに発現される。また、精製し
た天然のGPC3タンパク質もまた同様に感作抗原として使用され得る。
【0022】
哺乳動物に対する免疫に使用する感作抗原として当該精製GPC3タンパク質が使用できる
。GPC3の部分ペプチドもまた感作抗原として使用できる。この際、該部分ペプチドはヒト
GPC3のアミノ酸配列より化学合成によっても取得され得る。また、GPC3遺伝子の一部を発
現ベクターに組込んで発現させることによっても取得され得る。さらにはタンパク質分解
酵素を用いてGPC3タンパク質を分解することによっても取得され得るが、部分ペプチドと
して用いるGPC3ペプチドの領域および大きさは特に特別の態様に限定されない。好ましい
領域は配列番号：２のアミノ酸配列において564-580アミノ酸に相当するアミノ酸配列か
ら任意の配列が選択され得る。感作抗原とするペプチドを構成するアミノ酸の数は少なく
とも5以上、例えば6以上、或いは7以上であることが好ましい。より具体的には8～50、好
ましくは10～30残基のペプチドが感作抗原として使用され得る。
。GPC3の部分ペプチドもまた感作抗原として使用できる。この際、該部分ペプチドはヒト
GPC3のアミノ酸配列より化学合成によっても取得され得る。また、GPC3遺伝子の一部を発
現ベクターに組込んで発現させることによっても取得され得る。さらにはタンパク質分解
酵素を用いてGPC3タンパク質を分解することによっても取得され得るが、部分ペプチドと
して用いるGPC3ペプチドの領域および大きさは特に特別の態様に限定されない。好ましい
領域は配列番号：２のアミノ酸配列において564-580アミノ酸に相当するアミノ酸配列か
ら任意の配列が選択され得る。感作抗原とするペプチドを構成するアミノ酸の数は少なく
とも5以上、例えば6以上、或いは7以上であることが好ましい。より具体的には8～50、好
ましくは10～30残基のペプチドが感作抗原として使用され得る。
【0023】
また、GPC3タンパク質の所望の部分ポリペプチドやペプチドを異なるポリペプチドと融
合した融合タンパク質が感作抗原として利用され得る。感作抗原として使用される融合タ
ンパク質を製造するために、例えば、抗体のFc断片やペプチドタグなどが好適に利用され
得る。融合タンパク質を発現するベクターは、所望の二種類又はそれ以上のポリペプチド
断片をコードする遺伝子がインフレームで融合され、当該融合遺伝子が前記のように発現
ベクターに挿入されることにより作製され得る。融合タンパク質の作製方法はMolecular
Cloning 2nd ed. （Sambrook,J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58（1989
）Cold Spring Harbor Lab. press）に記載されている。感作抗原として用いられるGPC3
の取得方法及びそれを用いた免疫方法は、WO2003/000883、WO2004/022754、WO2006/00669
3等にも具体的に記載されている。
合した融合タンパク質が感作抗原として利用され得る。感作抗原として使用される融合タ
ンパク質を製造するために、例えば、抗体のFc断片やペプチドタグなどが好適に利用され
得る。融合タンパク質を発現するベクターは、所望の二種類又はそれ以上のポリペプチド
断片をコードする遺伝子がインフレームで融合され、当該融合遺伝子が前記のように発現
ベクターに挿入されることにより作製され得る。融合タンパク質の作製方法はMolecular
Cloning 2nd ed. （Sambrook,J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58（1989
）Cold Spring Harbor Lab. press）に記載されている。感作抗原として用いられるGPC3
の取得方法及びそれを用いた免疫方法は、WO2003/000883、WO2004/022754、WO2006/00669
3等にも具体的に記載されている。
【0024】
該感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特定の動物に限定されるものではないが、
細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましい。一般的にはげっ
歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギ、サル等が好適に使
用される。
細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましい。一般的にはげっ
歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギ、サル等が好適に使
用される。
【0025】
公知の方法にしたがって上記の動物が感作抗原により免疫される。例えば、一般的な方
法として、感作抗原が哺乳動物の腹腔内または皮下に注射によって投与されることにより
免疫が実施される。具体的には、PBS（Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で適
当な希釈倍率で希釈された感作抗原が、所望により通常のアジュバント、例えばフロイン
ト完全アジュバントと混合され、乳化された後に、該感作抗原が哺乳動物に4から21日毎
に数回投与される。また、感作抗原の免疫時には適当な担体が使用され得る。特に分子量
の小さい部分ペプチドが感作抗原として用いられる場合には、アルブミン、キーホールリ
ンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合した該感作抗原ペプチドを免疫すること
が望ましい場合もある。
法として、感作抗原が哺乳動物の腹腔内または皮下に注射によって投与されることにより
免疫が実施される。具体的には、PBS（Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で適
当な希釈倍率で希釈された感作抗原が、所望により通常のアジュバント、例えばフロイン
ト完全アジュバントと混合され、乳化された後に、該感作抗原が哺乳動物に4から21日毎
に数回投与される。また、感作抗原の免疫時には適当な担体が使用され得る。特に分子量
の小さい部分ペプチドが感作抗原として用いられる場合には、アルブミン、キーホールリ
ンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合した該感作抗原ペプチドを免疫すること
が望ましい場合もある。
【0026】
また、所望の抗体を産生するハイブリドーマは、DNA免疫を使用し、以下のようにして
も作製され得る。DNA免疫とは、免疫動物中で抗原タンパク質をコードする遺伝子が発現
され得るような態様で構築されたベクターDNAが投与された当該免疫動物中で、感作抗原
が当該免疫動物の生体内で発現されることによって、免疫刺激が与えられる免疫方法であ
る。蛋白質抗原が免疫動物に投与される一般的な免疫方法と比べて、DNA免疫には、次の
ような優位性が期待される。
－GPC3のような膜蛋白質の構造を維持して免疫刺激が与えられ得る
－免疫抗原を精製する必要が無い
も作製され得る。DNA免疫とは、免疫動物中で抗原タンパク質をコードする遺伝子が発現
され得るような態様で構築されたベクターDNAが投与された当該免疫動物中で、感作抗原
が当該免疫動物の生体内で発現されることによって、免疫刺激が与えられる免疫方法であ
る。蛋白質抗原が免疫動物に投与される一般的な免疫方法と比べて、DNA免疫には、次の
ような優位性が期待される。
－GPC3のような膜蛋白質の構造を維持して免疫刺激が与えられ得る
－免疫抗原を精製する必要が無い
【0027】
DNA免疫によって本発明のモノクローナル抗体を得るために、まず、GPC3タンパク質を
発現するDNAが免疫動物に投与される。GPC3をコードするDNAは、PCRなどの公知の方法に
よって合成され得る。得られたDNAが適当な発現ベクターに挿入され、免疫動物に投与さ
れる。発現ベクターとしては、たとえばpcDNA3.1などの市販の発現ベクターが好適に利用
され得る。ベクターを生体に投与する方法として、一般的に用いられている方法が利用さ
れ得る。たとえば、発現ベクターが吸着した金粒子が、gene gunで免疫動物個体の細胞内
に導入されることによってDNA免疫が行われる。さらに、GPC3を認識する抗体の作製は国
際公開WO2003/104453に記載された方法を用いても作製され得る。
発現するDNAが免疫動物に投与される。GPC3をコードするDNAは、PCRなどの公知の方法に
よって合成され得る。得られたDNAが適当な発現ベクターに挿入され、免疫動物に投与さ
れる。発現ベクターとしては、たとえばpcDNA3.1などの市販の発現ベクターが好適に利用
され得る。ベクターを生体に投与する方法として、一般的に用いられている方法が利用さ
れ得る。たとえば、発現ベクターが吸着した金粒子が、gene gunで免疫動物個体の細胞内
に導入されることによってDNA免疫が行われる。さらに、GPC3を認識する抗体の作製は国
際公開WO2003/104453に記載された方法を用いても作製され得る。
【0028】
このように哺乳動物が免疫され、血清中におけるGPC3に結合する抗体力価の上昇が確認
された後に、哺乳動物から免疫細胞が採取され、細胞融合に供される。好ましい免疫細胞
としては、特に脾細胞が使用され得る。
された後に、哺乳動物から免疫細胞が採取され、細胞融合に供される。好ましい免疫細胞
としては、特に脾細胞が使用され得る。
【0029】
前記免疫細胞と融合される細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞が用いられる。ミエ
ローマ細胞は、スクリーニングのための適当な選択マーカーを備えていることが好ましい
。選択マーカーとは、特定の培養条件の下で生存できる（あるいはできない）形質を指す
。選択マーカーには、ヒポキサンチン－グアニン－ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠
損（以下HGPRT欠損と省略する）、あるいはチミジンキナーゼ欠損（以下TK欠損と省略す
る）などが公知である。HGPRTやTKの欠損を有する細胞は、ヒポキサンチン－アミノプテ
リン－チミジン感受性（以下HAT感受性と省略する）を有する。HAT感受性の細胞はHAT選
択培地中でDNA合成を行うことができず死滅するが、正常な細胞と融合すると正常細胞の
サルベージ回路を利用してDNAの合成を継続することができるためHAT選択培地中でも増殖
するようになる。
ローマ細胞は、スクリーニングのための適当な選択マーカーを備えていることが好ましい
。選択マーカーとは、特定の培養条件の下で生存できる（あるいはできない）形質を指す
。選択マーカーには、ヒポキサンチン－グアニン－ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠
損（以下HGPRT欠損と省略する）、あるいはチミジンキナーゼ欠損（以下TK欠損と省略す
る）などが公知である。HGPRTやTKの欠損を有する細胞は、ヒポキサンチン－アミノプテ
リン－チミジン感受性（以下HAT感受性と省略する）を有する。HAT感受性の細胞はHAT選
択培地中でDNA合成を行うことができず死滅するが、正常な細胞と融合すると正常細胞の
サルベージ回路を利用してDNAの合成を継続することができるためHAT選択培地中でも増殖
するようになる。
【0030】
HGPRT欠損やTK欠損の細胞は、それぞれ6チオグアニン、8アザグアニン（以下8AGと省略
する）、あるいは5'ブロモデオキシウリジンを含む培地で選択され得る。これらのピリミ
ジンアナログをDNA中に取り込む正常な細胞は死滅する。他方、これらのピリミジンアナ
ログを取り込めないこれらの酵素を欠損した細胞は、選択培地の中で生存することができ
る。この他G418耐性と呼ばれる選択マーカーは、ネオマイシン耐性遺伝子によって2-デオ
キシストレプタミン系抗生物質（ゲンタマイシン類似体）に対する耐性を与える。細胞融
合に好適な種々のミエローマ細胞が公知である。
する）、あるいは5'ブロモデオキシウリジンを含む培地で選択され得る。これらのピリミ
ジンアナログをDNA中に取り込む正常な細胞は死滅する。他方、これらのピリミジンアナ
ログを取り込めないこれらの酵素を欠損した細胞は、選択培地の中で生存することができ
る。この他G418耐性と呼ばれる選択マーカーは、ネオマイシン耐性遺伝子によって2-デオ
キシストレプタミン系抗生物質（ゲンタマイシン類似体）に対する耐性を与える。細胞融
合に好適な種々のミエローマ細胞が公知である。
【0031】
このようなミエローマ細胞として、例えば、P3（P3x63Ag8.653）（J. Immunol.（1979
）123 (4), 1548-1550）、P3x63Ag8U.1（Current Topics in Microbiology and Immunolo
gy（1978）81, 1-7）、NS-1（C. Eur. J. Immunol.（1976）6 (7), 511-519）、MPC-11（
Cell（1976）8 (3), 405-415）、SP2/0（Nature（1978）276 (5685), 269-270）、FO（J.
Immunol. Methods（1980）35 (1-2), 1-21）、S194/5.XX0.BU.1（J. Exp. Med.（1978）
148 (1), 313-323）、R210（Nature（1979）277 (5692), 131-133）等が好適に使用され
得る。
）123 (4), 1548-1550）、P3x63Ag8U.1（Current Topics in Microbiology and Immunolo
gy（1978）81, 1-7）、NS-1（C. Eur. J. Immunol.（1976）6 (7), 511-519）、MPC-11（
Cell（1976）8 (3), 405-415）、SP2/0（Nature（1978）276 (5685), 269-270）、FO（J.
Immunol. Methods（1980）35 (1-2), 1-21）、S194/5.XX0.BU.1（J. Exp. Med.（1978）
148 (1), 313-323）、R210（Nature（1979）277 (5692), 131-133）等が好適に使用され
得る。
【0032】
基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Methods Enzymo
l.（1981）73, 3-46）等に準じて、前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合が行われ
る。
より具体的には、例えば細胞融合促進剤の存在下で通常の栄養培養液中で、前記細胞融
合が実施され得る。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（PEG）、セン
ダイウイルス（HVJ）等が使用され、更に融合効率を高めるために所望によりジメチルス
ルホキシド等の補助剤が添加されて使用される。
l.（1981）73, 3-46）等に準じて、前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合が行われ
る。
より具体的には、例えば細胞融合促進剤の存在下で通常の栄養培養液中で、前記細胞融
合が実施され得る。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（PEG）、セン
ダイウイルス（HVJ）等が使用され、更に融合効率を高めるために所望によりジメチルス
ルホキシド等の補助剤が添加されて使用される。
【0033】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定され得る。例えば、ミエローマ細
胞に対して免疫細胞を1から10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液とし
ては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その
他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用され、さらに、牛胎児血清（FCS
）等の血清補液が好適に添加され得る。
胞に対して免疫細胞を1から10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液とし
ては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その
他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用され、さらに、牛胎児血清（FCS
）等の血清補液が好適に添加され得る。
【0034】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、
予め37℃程度に加温されたPEG溶液（例えば平均分子量1000から6000程度）が通常30から6
0％（w/v）の濃度で添加される。混合液が緩やかに混合されることによって所望の融合細
胞（ハイブリドーマ）が形成される。次いで、上記に挙げた適当な培養液が逐次添加され
、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくな
い細胞融合剤等が除去され得る。
予め37℃程度に加温されたPEG溶液（例えば平均分子量1000から6000程度）が通常30から6
0％（w/v）の濃度で添加される。混合液が緩やかに混合されることによって所望の融合細
胞（ハイブリドーマ）が形成される。次いで、上記に挙げた適当な培養液が逐次添加され
、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくな
い細胞融合剤等が除去され得る。
【0035】
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばHAT培養液（ヒ
ポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択
され得る。所望のハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（
通常、係る十分な時間は数日から数週間である）上記HAT培養液を用いた培養が継続され
得る。次いで、通常の限界希釈法によって、所望の抗体を産生するハイブリドーマのスク
リーニングおよび単一クローニングが実施される。
ポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択
され得る。所望のハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（
通常、係る十分な時間は数日から数週間である）上記HAT培養液を用いた培養が継続され
得る。次いで、通常の限界希釈法によって、所望の抗体を産生するハイブリドーマのスク
リーニングおよび単一クローニングが実施される。
【0036】
このようにして得られたハイブリドーマは、細胞融合に用いられたミエローマが有する
選択マーカーに応じた選択培養液を利用することによって選択され得る。例えばHGPRTやT
Kの欠損を有する細胞は、HAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを
含む培養液）で培養することにより選択され得る。すなわち、HAT感受性のミエローマ細
胞を細胞融合に用いた場合、HAT培養液中で、正常細胞との細胞融合に成功した細胞が選
択的に増殖し得る。所望のハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分
な時間、上記HAT培養液を用いた培養が継続される。具体的には、一般に、数日から数週
間の培養によって、所望のハイブリドーマが選択され得る。次いで、通常の限界希釈法に
よって、所望の抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニング
が実施され得る。
選択マーカーに応じた選択培養液を利用することによって選択され得る。例えばHGPRTやT
Kの欠損を有する細胞は、HAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを
含む培養液）で培養することにより選択され得る。すなわち、HAT感受性のミエローマ細
胞を細胞融合に用いた場合、HAT培養液中で、正常細胞との細胞融合に成功した細胞が選
択的に増殖し得る。所望のハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分
な時間、上記HAT培養液を用いた培養が継続される。具体的には、一般に、数日から数週
間の培養によって、所望のハイブリドーマが選択され得る。次いで、通常の限界希釈法に
よって、所望の抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニング
が実施され得る。
【0037】
所望の抗体のスクリーニングおよび単一クローニングが、公知の抗原抗体反応に基づく
スクリーニング方法によって好適に実施され得る。例えば、GPC3に結合するモノクローナ
ル抗体は、細胞表面に発現したGPC3に結合することができる。このようなモノクローナル
抗体は、たとえば、FACS（fluorescence activated cell sorting）によってスクリーニ
ングされ得る。FACSは、蛍光抗体と接触させた細胞をレーザー光で解析し、個々の細胞が
発する蛍光を測定することによって細胞表面への抗体の結合を測定することを可能にする
システムである。
スクリーニング方法によって好適に実施され得る。例えば、GPC3に結合するモノクローナ
ル抗体は、細胞表面に発現したGPC3に結合することができる。このようなモノクローナル
抗体は、たとえば、FACS（fluorescence activated cell sorting）によってスクリーニ
ングされ得る。FACSは、蛍光抗体と接触させた細胞をレーザー光で解析し、個々の細胞が
発する蛍光を測定することによって細胞表面への抗体の結合を測定することを可能にする
システムである。
【0038】
FACSによって本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニング
するためには、まずGPC3を発現する細胞を調製する。スクリーニングのための好ましい細
胞は、GPC3を強制発現させた哺乳動物細胞である。宿主細胞として使用した形質転換され
ていない哺乳動物細胞を対照として用いることによって、細胞表面のGPC3に対する抗体の
結合活性が選択的に検出され得る。すなわち、宿主細胞に結合せず、GPC3強制発現細胞に
結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択することによって、GPC3モノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマが取得され得る。
するためには、まずGPC3を発現する細胞を調製する。スクリーニングのための好ましい細
胞は、GPC3を強制発現させた哺乳動物細胞である。宿主細胞として使用した形質転換され
ていない哺乳動物細胞を対照として用いることによって、細胞表面のGPC3に対する抗体の
結合活性が選択的に検出され得る。すなわち、宿主細胞に結合せず、GPC3強制発現細胞に
結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択することによって、GPC3モノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマが取得され得る。
【0039】
あるいは固定化したGPC3発現細胞に対する抗体の結合活性がELISAの原理に基づいて評
価され得る。たとえば、ELISAプレートのウェルにGPC3発現細胞が固定化される。ハイブ
リドーマの培養上清をウェル内の固定化細胞に接触させ、固定化細胞に結合する抗体が検
出される。モノクローナル抗体がマウス由来の場合、細胞に結合した抗体は、抗マウスイ
ムノグロブリン抗体によって検出され得る。これらのスクリーニングによって選択された
、抗原に対する結合能を有する所望の抗体を産生するハイブリドーマは、限界希釈法等に
よりクローニングされ得る。
価され得る。たとえば、ELISAプレートのウェルにGPC3発現細胞が固定化される。ハイブ
リドーマの培養上清をウェル内の固定化細胞に接触させ、固定化細胞に結合する抗体が検
出される。モノクローナル抗体がマウス由来の場合、細胞に結合した抗体は、抗マウスイ
ムノグロブリン抗体によって検出され得る。これらのスクリーニングによって選択された
、抗原に対する結合能を有する所望の抗体を産生するハイブリドーマは、限界希釈法等に
よりクローニングされ得る。
【0040】
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは通常の培養
液中で継代培養され得る。また、該ハイブリドーマは液体窒素中で長期にわたって保存さ
れ得る。
液中で継代培養され得る。また、該ハイブリドーマは液体窒素中で長期にわたって保存さ
れ得る。
【0041】
当該ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清から所望のモノクローナ
ル抗体が取得され得る。あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与し
て増殖せしめ、その腹水からモノクローナル抗体が取得され得る。前者の方法は、高純度
の抗体を得るのに好適なものである。
ル抗体が取得され得る。あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与し
て増殖せしめ、その腹水からモノクローナル抗体が取得され得る。前者の方法は、高純度
の抗体を得るのに好適なものである。
【0042】
当該ハイブリドーマ等の抗体産生細胞からクローニングされる抗体遺伝子によってコー
ドされる抗体も好適に利用され得る。クローニングした抗体遺伝子を適当なベクターに組
み込んで宿主に導入することによって、当該遺伝子によってコードされる抗体が発現する
。抗体遺伝子の単離と、ベクターへの導入、そして宿主細胞の形質転換のための方法は例
えば、Vandammeらによって既に確立されている（Eur.J. Biochem.（1990）192 (3), 767-
775）。下記に述べるように組換え抗体の製造方法もまた公知である。
ドされる抗体も好適に利用され得る。クローニングした抗体遺伝子を適当なベクターに組
み込んで宿主に導入することによって、当該遺伝子によってコードされる抗体が発現する
。抗体遺伝子の単離と、ベクターへの導入、そして宿主細胞の形質転換のための方法は例
えば、Vandammeらによって既に確立されている（Eur.J. Biochem.（1990）192 (3), 767-
775）。下記に述べるように組換え抗体の製造方法もまた公知である。
【0043】
たとえば、抗GPC3抗体を産生するハイブリドーマ細胞から、抗GPC3抗体の可変領域（V
領域）をコードするcDNAが取得される。そのために、通常、まずハイブリドーマから全RN
Aが抽出される。細胞からmRNAを抽出するための方法として、たとえば次のような方法を
利用することができる。
－グアニジン超遠心法（Biochemistry (1979) 18 (24), 5294-5299）
－AGPC法（Anal. Biochem. (1987) 162 (1), 156-159）
領域）をコードするcDNAが取得される。そのために、通常、まずハイブリドーマから全RN
Aが抽出される。細胞からmRNAを抽出するための方法として、たとえば次のような方法を
利用することができる。
－グアニジン超遠心法（Biochemistry (1979) 18 (24), 5294-5299）
－AGPC法（Anal. Biochem. (1987) 162 (1), 156-159）
【0044】
抽出されたmRNAは、mRNA Purification Kit （GEヘルスケアバイオサイエンス製）等を
使用して精製され得る。あるいは、QuickPrep mRNA Purification Kit （GEヘルスケアバ
イオサイエンス製）などのように、細胞から直接全mRNAを抽出するためのキットも市販さ
れている。このようなキットを用いて、ハイブリドーマからmRNAが取得され得る。得られ
たmRNAから逆転写酵素を用いて抗体V領域をコードするcDNAが合成され得る。cDNAは、AMV
Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit（生化学工業社製）等によっ
て合成され得る。また、cDNAの合成および増幅のために、SMART RACE cDNA 増幅キット（
Clontech製）およびPCRを用いた5’-RACE法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85 (2
3), 8998-9002、Nucleic Acids Res. (1989) 17 (8), 2919-2932）が適宜利用され得る。
更にこうしたcDNAの合成の過程においてcDNAの両末端に後述する適切な制限酵素サイトが
導入され得る。
使用して精製され得る。あるいは、QuickPrep mRNA Purification Kit （GEヘルスケアバ
イオサイエンス製）などのように、細胞から直接全mRNAを抽出するためのキットも市販さ
れている。このようなキットを用いて、ハイブリドーマからmRNAが取得され得る。得られ
たmRNAから逆転写酵素を用いて抗体V領域をコードするcDNAが合成され得る。cDNAは、AMV
Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit（生化学工業社製）等によっ
て合成され得る。また、cDNAの合成および増幅のために、SMART RACE cDNA 増幅キット（
Clontech製）およびPCRを用いた5’-RACE法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85 (2
3), 8998-9002、Nucleic Acids Res. (1989) 17 (8), 2919-2932）が適宜利用され得る。
更にこうしたcDNAの合成の過程においてcDNAの両末端に後述する適切な制限酵素サイトが
導入され得る。
【0045】
得られたPCR産物から目的とするcDNA断片が精製され、次いでベクターDNAと連結される
。このように組換えベクターが作製され、大腸菌等に導入されコロニーが選択された後に
、該コロニーを形成した大腸菌から所望の組換えベクターが調製され得る。そして、該組
換えベクターが目的とするcDNAの塩基配列を有しているか否かについて、公知の方法、例
えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認される。
。このように組換えベクターが作製され、大腸菌等に導入されコロニーが選択された後に
、該コロニーを形成した大腸菌から所望の組換えベクターが調製され得る。そして、該組
換えベクターが目的とするcDNAの塩基配列を有しているか否かについて、公知の方法、例
えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認される。
【0046】
可変領域をコードする遺伝子を取得するためには、可変領域遺伝子増幅用のプライマー
を使った5’-RACE法を利用するのが簡便である。まずハイブリドーマ細胞より抽出された
RNAを鋳型としてcDNAが合成され、5’-RACE cDNAライブラリーが得られる。5’-RACE cDN
Aライブラリーの合成にはSMART RACE cDNA 増幅キットなど市販のキットが適宜用いられ
る。
を使った5’-RACE法を利用するのが簡便である。まずハイブリドーマ細胞より抽出された
RNAを鋳型としてcDNAが合成され、5’-RACE cDNAライブラリーが得られる。5’-RACE cDN
Aライブラリーの合成にはSMART RACE cDNA 増幅キットなど市販のキットが適宜用いられ
る。
【0047】
得られた5’-RACE cDNAライブラリーを鋳型として、PCR法によって抗体遺伝子が増幅さ
れる。公知の抗体遺伝子配列をもとにマウス抗体遺伝子増幅用のプライマーがデザインさ
れ得る。これらのプライマーは、イムノグロブリンのサブクラスごとに異なる塩基配列で
ある。したがって、サブクラスは予めIso Stripマウスモノクローナル抗体アイソタイピ
ングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス）などの市販キットを用いて決定しておく
ことが望ましい。
れる。公知の抗体遺伝子配列をもとにマウス抗体遺伝子増幅用のプライマーがデザインさ
れ得る。これらのプライマーは、イムノグロブリンのサブクラスごとに異なる塩基配列で
ある。したがって、サブクラスは予めIso Stripマウスモノクローナル抗体アイソタイピ
ングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス）などの市販キットを用いて決定しておく
ことが望ましい。
【0048】
具体的には、たとえばマウスIgGをコードする遺伝子の取得を目的とするときには、重
鎖としてγ1、γ2a、γ2b、γ3、軽鎖としてκ鎖とλ鎖をコードする遺伝子の増幅が可能
なプライマーが利用され得る。IgGの可変領域遺伝子を増幅するためには、一般に3'側の
プライマーには可変領域に近い定常領域に相当する部分にアニールするプライマーが利用
される。一方5'側のプライマーには、5’ RACE cDNAライブラリー作製キットに付属する
プライマーが利用される。
鎖としてγ1、γ2a、γ2b、γ3、軽鎖としてκ鎖とλ鎖をコードする遺伝子の増幅が可能
なプライマーが利用され得る。IgGの可変領域遺伝子を増幅するためには、一般に3'側の
プライマーには可変領域に近い定常領域に相当する部分にアニールするプライマーが利用
される。一方5'側のプライマーには、5’ RACE cDNAライブラリー作製キットに付属する
プライマーが利用される。
【0049】
こうして増幅されたPCR産物を利用して、重鎖と軽鎖の組み合せからなるイムノグロブ
リンが再構成され得る。再構成されたイムノグロブリンの、GPC3に対する結合活性を指標
として、所望の抗体がスクリーニングされ得る。たとえばGPC3に対する抗体の取得を目的
とするとき、抗体のGPC3への結合は、特異的であることがさらに好ましい。GPC3に結合す
る抗体は、たとえば次のようにしてスクリーニングされ得る；
（１）ハイブリドーマから得られたcDNAによってコードされるV領域を含む抗体をGPC3発
現細胞に接触させる工程、
（２）GPC3発現細胞と抗体との結合を検出する工程、および
（３）GPC3発現細胞に結合する抗体を選択する工程。
リンが再構成され得る。再構成されたイムノグロブリンの、GPC3に対する結合活性を指標
として、所望の抗体がスクリーニングされ得る。たとえばGPC3に対する抗体の取得を目的
とするとき、抗体のGPC3への結合は、特異的であることがさらに好ましい。GPC3に結合す
る抗体は、たとえば次のようにしてスクリーニングされ得る；
（１）ハイブリドーマから得られたcDNAによってコードされるV領域を含む抗体をGPC3発
現細胞に接触させる工程、
（２）GPC3発現細胞と抗体との結合を検出する工程、および
（３）GPC3発現細胞に結合する抗体を選択する工程。
【0050】
抗体とGPC3発現細胞との結合を検出する方法は公知である。具体的には、先に述べたFA
CSなどの手法によって、抗体とGPC3発現細胞との結合が検出され得る。抗体の結合活性を
評価するためにGPC3発現細胞の固定標本が適宜利用され得る。
CSなどの手法によって、抗体とGPC3発現細胞との結合が検出され得る。抗体の結合活性を
評価するためにGPC3発現細胞の固定標本が適宜利用され得る。
【0051】
結合活性を指標とする抗体のスクリーニング方法として、ファージベクターを利用した
パニング法も好適に用いられる。ポリクローナルな抗体発現細胞群より抗体遺伝子を重鎖
と軽鎖のサブクラスのライブラリーとして取得した場合には、ファージベクターを利用し
たスクリーニング方法が有利である。重鎖と軽鎖の可変領域をコードする遺伝子は、適当
なリンカー配列で連結することによってシングルチェインFv（scFv）を形成することがで
きる。scFvをコードする遺伝子をファージベクターに挿入することにより、scFvを表面に
発現するファージが取得され得る。このファージと所望の抗原との接触の後に、抗原に結
合したファージを回収することによって、目的の結合活性を有するscFvをコードするDNA
が回収され得る。この操作を必要に応じて繰り返すことにより、所望の結合活性を有する
scFvが濃縮され得る。
パニング法も好適に用いられる。ポリクローナルな抗体発現細胞群より抗体遺伝子を重鎖
と軽鎖のサブクラスのライブラリーとして取得した場合には、ファージベクターを利用し
たスクリーニング方法が有利である。重鎖と軽鎖の可変領域をコードする遺伝子は、適当
なリンカー配列で連結することによってシングルチェインFv（scFv）を形成することがで
きる。scFvをコードする遺伝子をファージベクターに挿入することにより、scFvを表面に
発現するファージが取得され得る。このファージと所望の抗原との接触の後に、抗原に結
合したファージを回収することによって、目的の結合活性を有するscFvをコードするDNA
が回収され得る。この操作を必要に応じて繰り返すことにより、所望の結合活性を有する
scFvが濃縮され得る。
【0052】
目的とする抗GPC3抗体のV領域をコードするcDNAが得られた後に、当該cDNAの両末端に
挿入した制限酵素サイトを認識する制限酵素によって該cDNAが消化される。好ましい制限
酵素は、抗体遺伝子を構成する塩基配列に出現する頻度が低い塩基配列を認識して消化す
る。更に１コピーの消化断片をベクターに正しい方向で挿入するためには、付着末端を与
える制限酵素の挿入が好ましい。上記のように消化された抗GPC3抗体のV領域をコードす
るcDNAを適当な発現ベクターに挿入することによって、抗体発現ベクターが取得され得る
。このとき、抗体定常領域（C領域）をコードする遺伝子と、前記V領域をコードする遺伝
子とがインフレームで融合されれば、キメラ抗体が取得される。ここで、キメラ抗体とは
、定常領域と可変領域の由来が異なることをいう。したがって、マウス－ヒトなどの異種
キメラ抗体に加え、ヒト－ヒト同種キメラ抗体も、本発明におけるキメラ抗体に含まれる
。予め定常領域を有する発現ベクターに、前記V領域遺伝子を挿入することによって、キ
メラ抗体発現ベクターが構築され得る。具体的には、たとえば、所望の抗体定常領域（C
領域）をコードするDNAを保持した発現ベクターの5’側に、前記V領域遺伝子を消化する
制限酵素の制限酵素認識配列が適宜配置され得る。同じ組み合わせの制限酵素で消化され
た両者がインフレームで融合されることによって、キメラ抗体発現ベクターが構築される
。
挿入した制限酵素サイトを認識する制限酵素によって該cDNAが消化される。好ましい制限
酵素は、抗体遺伝子を構成する塩基配列に出現する頻度が低い塩基配列を認識して消化す
る。更に１コピーの消化断片をベクターに正しい方向で挿入するためには、付着末端を与
える制限酵素の挿入が好ましい。上記のように消化された抗GPC3抗体のV領域をコードす
るcDNAを適当な発現ベクターに挿入することによって、抗体発現ベクターが取得され得る
。このとき、抗体定常領域（C領域）をコードする遺伝子と、前記V領域をコードする遺伝
子とがインフレームで融合されれば、キメラ抗体が取得される。ここで、キメラ抗体とは
、定常領域と可変領域の由来が異なることをいう。したがって、マウス－ヒトなどの異種
キメラ抗体に加え、ヒト－ヒト同種キメラ抗体も、本発明におけるキメラ抗体に含まれる
。予め定常領域を有する発現ベクターに、前記V領域遺伝子を挿入することによって、キ
メラ抗体発現ベクターが構築され得る。具体的には、たとえば、所望の抗体定常領域（C
領域）をコードするDNAを保持した発現ベクターの5’側に、前記V領域遺伝子を消化する
制限酵素の制限酵素認識配列が適宜配置され得る。同じ組み合わせの制限酵素で消化され
た両者がインフレームで融合されることによって、キメラ抗体発現ベクターが構築される
。
【0053】
抗GPC3モノクローナル抗体を製造するために、抗体遺伝子が発現制御領域による制御の
下で発現するように発現ベクターに組み込まれる。抗体を発現するための発現制御領域と
は、例えば、エンハンサーやプロモーターを含む。また、発現した抗体が細胞外に分泌さ
れるように、適切なシグナル配列がアミノ末端に付加され得る。後に記載される実施例で
はシグナル配列として、アミノ酸配列MGWSCIILFLVATATGVHS（配列番号：７２）を有する
ペプチドが使用されているが、これ以外にも適したシグナル配列が付加される。発現され
たポリペプチドは上記配列のカルボキシル末端部分で切断され、切断されたポリペプチド
が成熟ポリペプチドとして細胞外に分泌され得る。次いで、この発現ベクターによって適
当な宿主細胞が形質転換されることによって、抗GPC3抗体をコードするDNAを発現する組
換え細胞が取得され得る。
下で発現するように発現ベクターに組み込まれる。抗体を発現するための発現制御領域と
は、例えば、エンハンサーやプロモーターを含む。また、発現した抗体が細胞外に分泌さ
れるように、適切なシグナル配列がアミノ末端に付加され得る。後に記載される実施例で
はシグナル配列として、アミノ酸配列MGWSCIILFLVATATGVHS（配列番号：７２）を有する
ペプチドが使用されているが、これ以外にも適したシグナル配列が付加される。発現され
たポリペプチドは上記配列のカルボキシル末端部分で切断され、切断されたポリペプチド
が成熟ポリペプチドとして細胞外に分泌され得る。次いで、この発現ベクターによって適
当な宿主細胞が形質転換されることによって、抗GPC3抗体をコードするDNAを発現する組
換え細胞が取得され得る。
【0054】
抗体遺伝子の発現のために、抗体重鎖（H鎖）および軽鎖（L鎖）をコードするDNAは、
それぞれ別の発現ベクターに組み込まれる。H鎖とL鎖が組み込まれたベクターによって、
同じ宿主細胞に同時に形質転換（co-transfect）されることによって、H鎖とL鎖を備えた
抗体分子が発現され得る。あるいはH鎖およびL鎖をコードするDNAが単一の発現ベクター
に組み込まれることによって宿主細胞が形質転換され得る（国際公開WO 94/11523を参照
のこと）。
それぞれ別の発現ベクターに組み込まれる。H鎖とL鎖が組み込まれたベクターによって、
同じ宿主細胞に同時に形質転換（co-transfect）されることによって、H鎖とL鎖を備えた
抗体分子が発現され得る。あるいはH鎖およびL鎖をコードするDNAが単一の発現ベクター
に組み込まれることによって宿主細胞が形質転換され得る（国際公開WO 94/11523を参照
のこと）。
【0055】
単離された抗体遺伝子を適当な宿主に導入することによって抗体を作製するための宿主
細胞と発現ベクターの多くの組み合わせが公知である。これらの発現系は、いずれも本発
明の抗原結合ドメインやCD3結合ドメインを単離するのに応用され得る。真核細胞が宿主
細胞として使用される場合、動物細胞、植物細胞、あるいは真菌細胞が適宜使用され得る
。具体的には、動物細胞としては、次のような細胞が例示され得る。
（１）哺乳類細胞、：CHO、COS、ミエローマ、BHK（baby hamster kidney）、Hela、Vero
など
（２）両生類細胞：アフリカツメガエル卵母細胞など
（３）昆虫細胞：sf9、sf21、Tn5など
細胞と発現ベクターの多くの組み合わせが公知である。これらの発現系は、いずれも本発
明の抗原結合ドメインやCD3結合ドメインを単離するのに応用され得る。真核細胞が宿主
細胞として使用される場合、動物細胞、植物細胞、あるいは真菌細胞が適宜使用され得る
。具体的には、動物細胞としては、次のような細胞が例示され得る。
（１）哺乳類細胞、：CHO、COS、ミエローマ、BHK（baby hamster kidney）、Hela、Vero
など
（２）両生類細胞：アフリカツメガエル卵母細胞など
（３）昆虫細胞：sf9、sf21、Tn5など
【0056】
あるいは植物細胞としては、ニコティアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）などのニ
コティアナ（Nicotiana）属由来の細胞による抗体遺伝子の発現系が公知である。植物細
胞の形質転換には、カルス培養した細胞が適宜利用され得る。
コティアナ（Nicotiana）属由来の細胞による抗体遺伝子の発現系が公知である。植物細
胞の形質転換には、カルス培養した細胞が適宜利用され得る。
【0057】
更に真菌細胞としては、次のような細胞を利用することができる。
－酵母：サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces serevisiae）などのサッカロミセ
ス（Saccharomyces）属、メタノール資化酵母（Pichia pastoris）などのPichia属
－糸状菌：アスペスギルス・ニガー（Aspergillus niger）などのアスペルギルス（Asper
gillus）属
－酵母：サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces serevisiae）などのサッカロミセ
ス（Saccharomyces）属、メタノール資化酵母（Pichia pastoris）などのPichia属
－糸状菌：アスペスギルス・ニガー（Aspergillus niger）などのアスペルギルス（Asper
gillus）属
【0058】
また、原核細胞を利用した抗体遺伝子の発現系も公知である。たとえば、細菌細胞を用
いる場合、大腸菌（E. coli）、枯草菌などの細菌細胞が適宜利用され得る。これらの細
胞中に、目的とする抗体遺伝子を含む発現ベクターが形質転換によって導入される。形質
転換された細胞をin vitroで培養することにより、当該形質転換細胞の培養物から所望の
抗体が取得され得る。
いる場合、大腸菌（E. coli）、枯草菌などの細菌細胞が適宜利用され得る。これらの細
胞中に、目的とする抗体遺伝子を含む発現ベクターが形質転換によって導入される。形質
転換された細胞をin vitroで培養することにより、当該形質転換細胞の培養物から所望の
抗体が取得され得る。
【0059】
組換え抗体の産生には、上記宿主細胞に加えて、トランスジェニック動物も利用され得
る。すなわち所望の抗体をコードする遺伝子が導入された動物から、当該抗体を得ること
ができる。例えば、抗体遺伝子は、乳汁中に固有に産生されるタンパク質をコードする遺
伝子の内部にインフレームで挿入することによって融合遺伝子として構築され得る。乳汁
中に分泌されるタンパク質として、たとえば、ヤギβカゼインなどを利用され得る。抗体
遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むDNA断片はヤギの胚へ注入され、当該注入された胚
が雌のヤギへ導入される。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ（また
はその子孫）が産生する乳汁からは、所望の抗体が乳汁タンパク質との融合タンパク質と
して取得され得る。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁
量を増加させるために、ホルモンがトランスジェニックヤギに対して投与され得る（Bio/
Technology (1994), 12 (7), 699-702）。
る。すなわち所望の抗体をコードする遺伝子が導入された動物から、当該抗体を得ること
ができる。例えば、抗体遺伝子は、乳汁中に固有に産生されるタンパク質をコードする遺
伝子の内部にインフレームで挿入することによって融合遺伝子として構築され得る。乳汁
中に分泌されるタンパク質として、たとえば、ヤギβカゼインなどを利用され得る。抗体
遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むDNA断片はヤギの胚へ注入され、当該注入された胚
が雌のヤギへ導入される。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ（また
はその子孫）が産生する乳汁からは、所望の抗体が乳汁タンパク質との融合タンパク質と
して取得され得る。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁
量を増加させるために、ホルモンがトランスジェニックヤギに対して投与され得る（Bio/
Technology (1994), 12 (7), 699-702）。
【0060】
本明細書において記載されるポリペプチド会合体がヒトに投与される場合、当該会合体
における抗原結合ドメインとして、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的と
して人為的に改変した遺伝子組換え型抗体由来の抗原結合ドメインが適宜採用され得る。
遺伝子組換え型抗体には、例えば、ヒト化（Humanized）抗体等が含まれる。これらの改
変抗体は、公知の方法を用いて適宜製造される。
における抗原結合ドメインとして、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的と
して人為的に改変した遺伝子組換え型抗体由来の抗原結合ドメインが適宜採用され得る。
遺伝子組換え型抗体には、例えば、ヒト化（Humanized）抗体等が含まれる。これらの改
変抗体は、公知の方法を用いて適宜製造される。
【0061】
本明細書において記載されるポリペプチド会合体における抗原結合ドメインを作製する
ために用いられる抗体の可変領域は、通常、４つのフレームワーク領域（FR）にはさまれ
た３つの相補性決定領域（complementarity-determining region ; CDR）で構成されてい
る。CDRは、実質的に、抗体の結合特異性を決定している領域である。CDRのアミノ酸配列
は多様性に富む。一方FRを構成するアミノ酸配列は、異なる結合特異性を有する抗体の間
でも、高い同一性を示すことが多い。そのため、一般に、CDRの移植によって、ある抗体
の結合特異性を、他の抗体に移植することができるとされている。
ために用いられる抗体の可変領域は、通常、４つのフレームワーク領域（FR）にはさまれ
た３つの相補性決定領域（complementarity-determining region ; CDR）で構成されてい
る。CDRは、実質的に、抗体の結合特異性を決定している領域である。CDRのアミノ酸配列
は多様性に富む。一方FRを構成するアミノ酸配列は、異なる結合特異性を有する抗体の間
でも、高い同一性を示すことが多い。そのため、一般に、CDRの移植によって、ある抗体
の結合特異性を、他の抗体に移植することができるとされている。
【0062】
ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称される。具体的には、ヒト以外の動
物、たとえばマウス抗体のCDRをヒト抗体に移植したヒト化抗体などが公知である。ヒト
化抗体を得るための一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウスの抗
体のCDRをヒトのFRに移植するための方法として、たとえばOverlap Extension PCRが公知
である。Overlap Extension PCRにおいては、ヒト抗体のFRを合成するためのプライマー
に、移植すべきマウス抗体のCDRをコードする塩基配列が付加される。プライマーは４つ
のFRのそれぞれについて用意される。一般に、マウスCDRのヒトFRへの移植においては、
マウスのFRと同一性の高いヒトFRを選択するのが、CDRの機能の維持において有利である
とされている。すなわち、一般に、移植すべきマウスCDRに隣接しているFRのアミノ酸配
列と同一性の高いアミノ酸配列からなるヒトFRを利用するのが好ましい。
物、たとえばマウス抗体のCDRをヒト抗体に移植したヒト化抗体などが公知である。ヒト
化抗体を得るための一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウスの抗
体のCDRをヒトのFRに移植するための方法として、たとえばOverlap Extension PCRが公知
である。Overlap Extension PCRにおいては、ヒト抗体のFRを合成するためのプライマー
に、移植すべきマウス抗体のCDRをコードする塩基配列が付加される。プライマーは４つ
のFRのそれぞれについて用意される。一般に、マウスCDRのヒトFRへの移植においては、
マウスのFRと同一性の高いヒトFRを選択するのが、CDRの機能の維持において有利である
とされている。すなわち、一般に、移植すべきマウスCDRに隣接しているFRのアミノ酸配
列と同一性の高いアミノ酸配列からなるヒトFRを利用するのが好ましい。
【0063】
また連結される塩基配列は、互いにインフレームで接続されるようにデザインされる。
それぞれのプライマーによってヒトFRが個別に合成される。その結果、各FRにマウスCDR
をコードするDNAが付加された産物が得られる。各産物のマウスCDRをコードする塩基配列
は、互いにオーバーラップするようにデザインされている。続いて、ヒト抗体遺伝子を鋳
型として合成された産物のオーバーラップしたCDR部分を互いにアニールさせて相補鎖合
成反応が行われる。この反応によって、ヒトFRがマウスCDRの配列を介して連結される。
それぞれのプライマーによってヒトFRが個別に合成される。その結果、各FRにマウスCDR
をコードするDNAが付加された産物が得られる。各産物のマウスCDRをコードする塩基配列
は、互いにオーバーラップするようにデザインされている。続いて、ヒト抗体遺伝子を鋳
型として合成された産物のオーバーラップしたCDR部分を互いにアニールさせて相補鎖合
成反応が行われる。この反応によって、ヒトFRがマウスCDRの配列を介して連結される。
【0064】
最終的に３つのCDRと４つのFRが連結されたV領域遺伝子は、その5'末端と3'末端にアニ
ールし適当な制限酵素認識配列を付加されたプライマーによってその全長が増幅される。
上記のように得られたDNAとヒト抗体C領域をコードするDNAとをインフレームで融合する
ように発現ベクター中に挿入することによって、ヒト型抗体発現用ベクターが作成できる
。該組込みベクターを宿主に導入して組換え細胞を樹立した後に、該組換え細胞を培養し
、該ヒト化抗体をコードするDNAを発現させることによって、該ヒト化抗体が該培養細胞
の培養物中に産生される（欧州特許公開EP 239400、国際公開WO1996/002576参照）。
ールし適当な制限酵素認識配列を付加されたプライマーによってその全長が増幅される。
上記のように得られたDNAとヒト抗体C領域をコードするDNAとをインフレームで融合する
ように発現ベクター中に挿入することによって、ヒト型抗体発現用ベクターが作成できる
。該組込みベクターを宿主に導入して組換え細胞を樹立した後に、該組換え細胞を培養し
、該ヒト化抗体をコードするDNAを発現させることによって、該ヒト化抗体が該培養細胞
の培養物中に産生される（欧州特許公開EP 239400、国際公開WO1996/002576参照）。
【0065】
上記のように作製されたヒト化抗体の抗原への結合活性を定性的又は定量的に測定し、
評価することによって、CDRを介して連結されたときに該CDRが良好な抗原結合部位を形成
するようなヒト抗体のFRが好適に選択できる。必要に応じ、再構成ヒト抗体のCDRが適切
な抗原結合部位を形成するようにFRのアミノ酸残基を置換することもできる。たとえば、
マウスCDRのヒトFRへの移植に用いたPCR法を応用して、FRにアミノ酸配列の変異を導入す
ることができる。具体的には、FRにアニーリングするプライマーに部分的な塩基配列の変
異を導入することができる。このようなプライマーによって合成されたFRには、塩基配列
の変異が導入される。アミノ酸を置換した変異型抗体の抗原への結合活性を上記の方法で
測定し評価することによって所望の性質を有する変異FR配列が選択され得る（Sato, K.et
al., Cancer Res, 1993, 53, 851-856）。
評価することによって、CDRを介して連結されたときに該CDRが良好な抗原結合部位を形成
するようなヒト抗体のFRが好適に選択できる。必要に応じ、再構成ヒト抗体のCDRが適切
な抗原結合部位を形成するようにFRのアミノ酸残基を置換することもできる。たとえば、
マウスCDRのヒトFRへの移植に用いたPCR法を応用して、FRにアミノ酸配列の変異を導入す
ることができる。具体的には、FRにアニーリングするプライマーに部分的な塩基配列の変
異を導入することができる。このようなプライマーによって合成されたFRには、塩基配列
の変異が導入される。アミノ酸を置換した変異型抗体の抗原への結合活性を上記の方法で
測定し評価することによって所望の性質を有する変異FR配列が選択され得る（Sato, K.et
al., Cancer Res, 1993, 53, 851-856）。
【0066】
また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物（国際公
開WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1
996/033735参照）を免疫動物とし、DNA免疫により所望のヒト抗体が取得され得る。
開WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1
996/033735参照）を免疫動物とし、DNA免疫により所望のヒト抗体が取得され得る。
【0067】
さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も
知られている。例えば、ヒト抗体のV領域が一本鎖抗体（scFv）としてファージディスプ
レイ法によりファージの表面に発現される。抗原に結合するscFvを発現するファージが選
択され得る。選択されたファージの遺伝子を解析することにより、抗原に結合するヒト抗
体のV領域をコードするDNA配列が決定できる。抗原に結合するscFvのDNA配列を決定した
後、当該V領域配列を所望のヒト抗体C領域の配列とインフレームで融合させた後に適当な
発現ベクターに挿入することによって発現ベクターが作製され得る。当該発現ベクターを
上記に挙げたような好適な発現細胞中に導入し、該ヒト抗体をコードする遺伝子を発現さ
せることにより当該ヒト抗体が取得される。これらの方法は既に公知である（国際公開WO
1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/
001438、WO1995/015388参照）。
知られている。例えば、ヒト抗体のV領域が一本鎖抗体（scFv）としてファージディスプ
レイ法によりファージの表面に発現される。抗原に結合するscFvを発現するファージが選
択され得る。選択されたファージの遺伝子を解析することにより、抗原に結合するヒト抗
体のV領域をコードするDNA配列が決定できる。抗原に結合するscFvのDNA配列を決定した
後、当該V領域配列を所望のヒト抗体C領域の配列とインフレームで融合させた後に適当な
発現ベクターに挿入することによって発現ベクターが作製され得る。当該発現ベクターを
上記に挙げたような好適な発現細胞中に導入し、該ヒト抗体をコードする遺伝子を発現さ
せることにより当該ヒト抗体が取得される。これらの方法は既に公知である（国際公開WO
1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/
001438、WO1995/015388参照）。
【0068】
抗原結合ドメイン
本明細書において「抗原結合ドメイン」とは、抗原の一部または全部に特異的に結合し
且つ相補的である領域を含んで成る抗体の部分をいう。抗原の分子量が大きい場合、抗体
は抗原の特定部分にのみ結合することができる。当該特定部分はエピトープと呼ばれる。
抗原結合ドメインは一または複数の抗体の可変ドメインより提供され得る。好ましくは、
抗原結合ドメインは抗体軽鎖可変領域（VL）と抗体重鎖可変領域（VH）とを含む。こうし
た抗原結合ドメインの例としては、「scFv（single chain Fv）」、「単鎖抗体（single
chain antibody）」、「Fv」、「scFv2（single chain Fv 2）」、「Fab」または「F(ab'
)2」等が好適に挙げられる。
本明細書において「抗原結合ドメイン」とは、抗原の一部または全部に特異的に結合し
且つ相補的である領域を含んで成る抗体の部分をいう。抗原の分子量が大きい場合、抗体
は抗原の特定部分にのみ結合することができる。当該特定部分はエピトープと呼ばれる。
抗原結合ドメインは一または複数の抗体の可変ドメインより提供され得る。好ましくは、
抗原結合ドメインは抗体軽鎖可変領域（VL）と抗体重鎖可変領域（VH）とを含む。こうし
た抗原結合ドメインの例としては、「scFv（single chain Fv）」、「単鎖抗体（single
chain antibody）」、「Fv」、「scFv2（single chain Fv 2）」、「Fab」または「F(ab'
)2」等が好適に挙げられる。
【0069】
本発明のポリペプチド会合体における抗原結合ドメインは、同一のエピトープに結合す
ることができる。ここで同一のエピトープは、配列番号：２あるいは配列番号：４に記載
のアミノ酸配列からなるタンパク質中に存在することができる。あるいは本発明のポリペ
プチド会合体における抗原結合ドメインは、互いに異なるエピトープに結合することがで
きる。ここで異なるエピトープは、配列番号：２あるいは配列番号：４に記載のアミノ酸
配列からなるタンパク質中に存在することができる。
ることができる。ここで同一のエピトープは、配列番号：２あるいは配列番号：４に記載
のアミノ酸配列からなるタンパク質中に存在することができる。あるいは本発明のポリペ
プチド会合体における抗原結合ドメインは、互いに異なるエピトープに結合することがで
きる。ここで異なるエピトープは、配列番号：２あるいは配列番号：４に記載のアミノ酸
配列からなるタンパク質中に存在することができる。
【0070】
特異的
特異的とは、特異的に結合する分子の一方の分子がその一または複数の結合する相手方
の分子以外の分子に対しては何ら有意な結合を示さない状態をいう。また、抗原結合ドメ
インが、ある抗原中に含まれる複数のエピトープのうち特定のエピトープに対して特異的
である場合にも用いられる。また、抗原結合ドメインが結合するエピトープが複数の異な
る抗原に含まれる場合には、当該抗原結合ドメインを有するポリペプチド会合体は当該エ
ピトープを含む様々な抗原と結合することができる。
特異的とは、特異的に結合する分子の一方の分子がその一または複数の結合する相手方
の分子以外の分子に対しては何ら有意な結合を示さない状態をいう。また、抗原結合ドメ
インが、ある抗原中に含まれる複数のエピトープのうち特定のエピトープに対して特異的
である場合にも用いられる。また、抗原結合ドメインが結合するエピトープが複数の異な
る抗原に含まれる場合には、当該抗原結合ドメインを有するポリペプチド会合体は当該エ
ピトープを含む様々な抗原と結合することができる。
【0071】
抗原
本明細書において抗原は特に限定されず、CD3を除きどのような抗原でもよい。抗原の
例としては、例えば、受容体、癌抗原、MHC抗原、分化抗原等が好適に挙げられる。受容
体の例としては、例えば、造血因子受容体ファミリー、サイトカイン受容体ファミリー、
チロシンキナーゼ型受容体ファミリー、セリン／スレオニンキナーゼ型受容体ファミリー
、TNF受容体ファミリー、Gタンパク質共役型受容体ファミリー、GPIアンカー型受容体フ
ァミリー、チロシンホスファターゼ型受容体ファミリー、接着因子ファミリー、ホルモン
受容体ファミリー、等の受容体ファミリーに属する受容体などを挙げることができる。こ
れら受容体ファミリーに属する受容体、及びその特徴に関しては、多数の文献、例えば、
Cooke BA., King RJB., van der Molen HJ. ed. New Comprehesive Biochemistry Vol.18
B "Hormones and their Actions Part II"pp.1-46 (1988) Elsevier Science Publishers
BV.、又は、宮坂昌之監修, 細胞工学別冊ハンドブックシリーズ「接着因子ハンドブック
」(1994) （秀潤社, 東京, 日本）等のレビューの他、Patthy（Cell (1990) 61 (1), 13-
14）、Ullrichら（Cell (1990) 61 (2), 203-212）、Massague（eにはアキュート・アク
セント記号が付く）（Cell (1992) 69 (6), 1067-1070）、Miyajimaら（Annu. Rev. Immu
nol. (1992) 10, 295-331）、Tagaら（FASEB J. (1992) 6, 3387-3396）、Fantlら（Annu
. Rev. Biochem. (1993), 62, 453-481）、Smithら（Cell (1994) 76 (6) 959-962）、Fl
ower DR. Biochim. Biophys. Acta, Flower（Biochim. Biophys. Acta (1999) 1422 (3)
207-234等に記載されている。
本明細書において抗原は特に限定されず、CD3を除きどのような抗原でもよい。抗原の
例としては、例えば、受容体、癌抗原、MHC抗原、分化抗原等が好適に挙げられる。受容
体の例としては、例えば、造血因子受容体ファミリー、サイトカイン受容体ファミリー、
チロシンキナーゼ型受容体ファミリー、セリン／スレオニンキナーゼ型受容体ファミリー
、TNF受容体ファミリー、Gタンパク質共役型受容体ファミリー、GPIアンカー型受容体フ
ァミリー、チロシンホスファターゼ型受容体ファミリー、接着因子ファミリー、ホルモン
受容体ファミリー、等の受容体ファミリーに属する受容体などを挙げることができる。こ
れら受容体ファミリーに属する受容体、及びその特徴に関しては、多数の文献、例えば、
Cooke BA., King RJB., van der Molen HJ. ed. New Comprehesive Biochemistry Vol.18
B "Hormones and their Actions Part II"pp.1-46 (1988) Elsevier Science Publishers
BV.、又は、宮坂昌之監修, 細胞工学別冊ハンドブックシリーズ「接着因子ハンドブック
」(1994) （秀潤社, 東京, 日本）等のレビューの他、Patthy（Cell (1990) 61 (1), 13-
14）、Ullrichら（Cell (1990) 61 (2), 203-212）、Massague（eにはアキュート・アク
セント記号が付く）（Cell (1992) 69 (6), 1067-1070）、Miyajimaら（Annu. Rev. Immu
nol. (1992) 10, 295-331）、Tagaら（FASEB J. (1992) 6, 3387-3396）、Fantlら（Annu
. Rev. Biochem. (1993), 62, 453-481）、Smithら（Cell (1994) 76 (6) 959-962）、Fl
ower DR. Biochim. Biophys. Acta, Flower（Biochim. Biophys. Acta (1999) 1422 (3)
207-234等に記載されている。
【0072】
上記受容体ファミリーに属する具体的な受容体としては、例えば、ヒト又はマウスエリ
スロポエチン（EPO）受容体（Blood (1990) 76 (1), 31-35、Cell (1989) 57 (2), 277-2
85）、ヒト又はマウス顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）受容体（Proc. Natl. Acad. Sci
. USA. (1990) 87 (22), 8702-8706、mG-CSFR、Cell (1990) 61 (2), 341-350）、ヒト又
はマウストロンボポイエチン（TPO）受容体（Proc Natl Acad Sci U S A. (1992) 89 (12
), 5640-5644、EMBO J. (1993) 12(7), 2645-53）、ヒト又はマウスインスリン受容体（N
ature (1985) 313 (6005), 756-761）、ヒト又はマウスFlt-3リガンド受容体（Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA. (1994) 91 (2), 459-463）、ヒト又はマウス血小板由来増殖因子（P
DGF）受容体（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1988) 85 (10) 3435-3439）、ヒト又はマ
ウスインターフェロン（IFN）-α、β受容体（Cell (1990) 60 (2), 225-234.及びCell (
1994) 77 (3), 391-400）、ヒト又はマウスレプチン受容体、ヒト又はマウス成長ホルモ
ン（GH）受容体、ヒト又はマウスインターロイキン（IL）-10受容体、ヒト又はマウスイ
ンスリン様増殖因子（IGF）-I受容体、ヒト又はマウス白血病抑制因子（LIF）受容体、ヒ
ト又はマウス毛様体神経栄養因子（CNTF）受容体等が好適に例示される。
スロポエチン（EPO）受容体（Blood (1990) 76 (1), 31-35、Cell (1989) 57 (2), 277-2
85）、ヒト又はマウス顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）受容体（Proc. Natl. Acad. Sci
. USA. (1990) 87 (22), 8702-8706、mG-CSFR、Cell (1990) 61 (2), 341-350）、ヒト又
はマウストロンボポイエチン（TPO）受容体（Proc Natl Acad Sci U S A. (1992) 89 (12
), 5640-5644、EMBO J. (1993) 12(7), 2645-53）、ヒト又はマウスインスリン受容体（N
ature (1985) 313 (6005), 756-761）、ヒト又はマウスFlt-3リガンド受容体（Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA. (1994) 91 (2), 459-463）、ヒト又はマウス血小板由来増殖因子（P
DGF）受容体（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1988) 85 (10) 3435-3439）、ヒト又はマ
ウスインターフェロン（IFN）-α、β受容体（Cell (1990) 60 (2), 225-234.及びCell (
1994) 77 (3), 391-400）、ヒト又はマウスレプチン受容体、ヒト又はマウス成長ホルモ
ン（GH）受容体、ヒト又はマウスインターロイキン（IL）-10受容体、ヒト又はマウスイ
ンスリン様増殖因子（IGF）-I受容体、ヒト又はマウス白血病抑制因子（LIF）受容体、ヒ
ト又はマウス毛様体神経栄養因子（CNTF）受容体等が好適に例示される。
【0073】
癌抗原は細胞の悪性化に伴って発現する抗原であり、腫瘍特異性抗原とも呼ばれる。又
、細胞が癌化した際に細胞表面やタンパク質分子上に現れる異常な糖鎖も癌抗原であり、
癌糖鎖抗原とも呼ばれる。癌抗原の例としては、例えば、上記の受容体としてGPIアンカ
ー型受容体ファミリーに属するが肝癌を初めとする幾つかの癌において発現しているGPC3
（Int J Cancer. (2003) 103 (4), 455-65）、肺癌を初めとする複数の癌で発現するEpCA
M（Proc Natl Acad Sci U S A. (1989) 86 (1), 27-31）（そのポリヌクレオチド配列はR
efSeq登録番号NM_002354.2（配列番号：３）に、ポリペプチド配列はRefSeq登録番号NP_0
02345.2（配列番号：４）にそれぞれ記載されている。）、EGFR、CA19-9、CA15-3、シリ
アルSSEA-1（SLX）等が好適に挙げられる。
、細胞が癌化した際に細胞表面やタンパク質分子上に現れる異常な糖鎖も癌抗原であり、
癌糖鎖抗原とも呼ばれる。癌抗原の例としては、例えば、上記の受容体としてGPIアンカ
ー型受容体ファミリーに属するが肝癌を初めとする幾つかの癌において発現しているGPC3
（Int J Cancer. (2003) 103 (4), 455-65）、肺癌を初めとする複数の癌で発現するEpCA
M（Proc Natl Acad Sci U S A. (1989) 86 (1), 27-31）（そのポリヌクレオチド配列はR
efSeq登録番号NM_002354.2（配列番号：３）に、ポリペプチド配列はRefSeq登録番号NP_0
02345.2（配列番号：４）にそれぞれ記載されている。）、EGFR、CA19-9、CA15-3、シリ
アルSSEA-1（SLX）等が好適に挙げられる。
【0074】
MHC抗原は、主にMHC class I抗原とMHC class II抗原に分類され、MHC class I抗原に
は、HLA-A、-B、-C、-E、-F、-G、-Hが含まれ、MHC class II抗原には、HLA-DR、-DQ、-D
Pが含まれる。
は、HLA-A、-B、-C、-E、-F、-G、-Hが含まれ、MHC class II抗原には、HLA-DR、-DQ、-D
Pが含まれる。
【0075】
分化抗原には、CD1、CD2、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD
13、CD14、CD15s、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD23、CD25、CD28、CD29、CD30、CD3
2、CD33、CD34、CD35、CD38、CD40、CD41a、CD41b、CD42a、CD42b、CD43、CD44、CD45、C
D45RO、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD51、CD54、CD55、CD56、C
D57、CD58、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD64、CD69、CD71、CD73、CD95、CD102、CD106
、CD122、CD126、CDw130が含まれ得る。
13、CD14、CD15s、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD23、CD25、CD28、CD29、CD30、CD3
2、CD33、CD34、CD35、CD38、CD40、CD41a、CD41b、CD42a、CD42b、CD43、CD44、CD45、C
D45RO、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD51、CD54、CD55、CD56、C
D57、CD58、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD64、CD69、CD71、CD73、CD95、CD102、CD106
、CD122、CD126、CDw130が含まれ得る。
【0076】
エピトープ
抗原中に存在する抗原決定基を意味するエピトープは、本明細書において開示されるポ
リペプチド会合体中の抗原結合ドメインが結合する抗原上の部位を意味する。よって、例
えば、エピトープは、その構造によって定義され得る。また、当該エピトープを認識する
ポリペプチド会合体中の抗原に対する結合活性によっても当該エピトープが定義され得る
。抗原がペプチド又はポリペプチドである場合には、エピトープを構成するアミノ酸残基
によってエピトープを特定することも可能である。また、エピトープが糖鎖である場合に
は、特定の糖鎖構造によってエピトープを特定することも可能である。
抗原中に存在する抗原決定基を意味するエピトープは、本明細書において開示されるポ
リペプチド会合体中の抗原結合ドメインが結合する抗原上の部位を意味する。よって、例
えば、エピトープは、その構造によって定義され得る。また、当該エピトープを認識する
ポリペプチド会合体中の抗原に対する結合活性によっても当該エピトープが定義され得る
。抗原がペプチド又はポリペプチドである場合には、エピトープを構成するアミノ酸残基
によってエピトープを特定することも可能である。また、エピトープが糖鎖である場合に
は、特定の糖鎖構造によってエピトープを特定することも可能である。
【0077】
直線状エピトープは、アミノ酸一次配列が認識されたエピトープを含むエピトープであ
る。直線状エピトープは、典型的には、少なくとも３つ、および最も普通には少なくとも
５つ、例えば約８～約１０個、６～２０個のアミノ酸が固有の配列において含まれる。
る。直線状エピトープは、典型的には、少なくとも３つ、および最も普通には少なくとも
５つ、例えば約８～約１０個、６～２０個のアミノ酸が固有の配列において含まれる。
【0078】
立体構造エピトープは、直線状エピトープとは対照的に、エピトープを含むアミノ酸の
一次配列が、認識されたエピトープの単一の規定成分ではないエピトープ（例えば、アミ
ノ酸の一次配列が、必ずしもエピトープを規定する抗体により認識されないエピトープ）
である。立体構造エピトープは、直線状エピトープに対して増大した数のアミノ酸を包含
するかもしれない。立体構造エピトープの認識に関して、抗体は、ペプチドまたはタンパ
ク質の三次元構造を認識する。例えば、タンパク質分子が折り畳まれて三次元構造を形成
する場合には、立体構造エピトープを形成するあるアミノ酸および／またはポリペプチド
主鎖は、並列となり、抗体がエピトープを認識するのを可能にする。エピトープの立体構
造を決定する方法には、例えばX線結晶学、二次元核磁気共鳴分光学並びに部位特異的な
スピン標識および電磁常磁性共鳴分光学が含まれるが、これらには限定されない。例えば
、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996)、第66巻、Morr
is（編）を参照。
一次配列が、認識されたエピトープの単一の規定成分ではないエピトープ（例えば、アミ
ノ酸の一次配列が、必ずしもエピトープを規定する抗体により認識されないエピトープ）
である。立体構造エピトープは、直線状エピトープに対して増大した数のアミノ酸を包含
するかもしれない。立体構造エピトープの認識に関して、抗体は、ペプチドまたはタンパ
ク質の三次元構造を認識する。例えば、タンパク質分子が折り畳まれて三次元構造を形成
する場合には、立体構造エピトープを形成するあるアミノ酸および／またはポリペプチド
主鎖は、並列となり、抗体がエピトープを認識するのを可能にする。エピトープの立体構
造を決定する方法には、例えばX線結晶学、二次元核磁気共鳴分光学並びに部位特異的な
スピン標識および電磁常磁性共鳴分光学が含まれるが、これらには限定されない。例えば
、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996)、第66巻、Morr
is（編）を参照。
【0079】
下記にGPC3に対する抗原結合ドメインを含む被験ポリペプチド会合体によるエピトープ
への結合の確認方法が例示されるが、GPC3以外の抗原に対する抗原結合ドメインを含む被
験ポリペプチド会合体によるエピトープへの結合の確認方法も下記の例示に準じて適宜実
施され得る。
への結合の確認方法が例示されるが、GPC3以外の抗原に対する抗原結合ドメインを含む被
験ポリペプチド会合体によるエピトープへの結合の確認方法も下記の例示に準じて適宜実
施され得る。
【0080】
例えば、GPC3に対する抗原結合ドメインを含む被験ポリペプチド会合体が、GPC3分子中
に存在する線状エピトープを認識することは、たとえば次のようにして確認することがで
きる。上記の目的のためにGPC3の細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列からなる線状の
ペプチドが合成される。当該ペプチドは、化学的に合成され得る。あるいは、GPC3のcDNA
中の、細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列をコードする領域を利用して、遺伝子工学
的手法により得られる。次に、細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列からなる線状ペプ
チドと、GPC3に対する抗原結合ドメインを含む被験ポリペプチド会合体との結合活性が評
価される。たとえば、固定化された線状ペプチドを抗原とするELISAによって、当該ペプ
チドに対する当該ポリペプチド会合体の結合活性が評価され得る。あるいは、GPC3発現細
胞に対する当該ポリペプチド会合体の結合における、線状ペプチドによる阻害のレベルに
基づいて、線状ペプチドに対する結合活性が明らかにされ得る。これらの試験によって、
線状ペプチドに対する当該ポリペプチド会合体の結合活性が明らかにされ得る。
に存在する線状エピトープを認識することは、たとえば次のようにして確認することがで
きる。上記の目的のためにGPC3の細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列からなる線状の
ペプチドが合成される。当該ペプチドは、化学的に合成され得る。あるいは、GPC3のcDNA
中の、細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列をコードする領域を利用して、遺伝子工学
的手法により得られる。次に、細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列からなる線状ペプ
チドと、GPC3に対する抗原結合ドメインを含む被験ポリペプチド会合体との結合活性が評
価される。たとえば、固定化された線状ペプチドを抗原とするELISAによって、当該ペプ
チドに対する当該ポリペプチド会合体の結合活性が評価され得る。あるいは、GPC3発現細
胞に対する当該ポリペプチド会合体の結合における、線状ペプチドによる阻害のレベルに
基づいて、線状ペプチドに対する結合活性が明らかにされ得る。これらの試験によって、
線状ペプチドに対する当該ポリペプチド会合体の結合活性が明らかにされ得る。
【0081】
また、GPC3に対する抗原結合ドメインを含む被験ポリペプチド会合体が立体構造エピト
ープを認識することは、次のようにして確認され得る。上記の目的のために、GPC3を発現
する細胞が調製される。GPC3に対する抗原結合ドメインを含む被験ポリペプチド会合体が
GPC3発現細胞に接触した際に当該細胞に強く結合する一方で、当該ポリペプチド会合体が
固定化されたGPC3の細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列からなる線状ペプチドに対し
て実質的に結合しないとき等が挙げられる。ここで、実質的に結合しないとは、ヒトGPC3
発現細胞に対する結合活性の80％以下、通常50％以下、好ましくは30％以下、特に好まし
くは15％以下の結合活性をいう。
ープを認識することは、次のようにして確認され得る。上記の目的のために、GPC3を発現
する細胞が調製される。GPC3に対する抗原結合ドメインを含む被験ポリペプチド会合体が
GPC3発現細胞に接触した際に当該細胞に強く結合する一方で、当該ポリペプチド会合体が
固定化されたGPC3の細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列からなる線状ペプチドに対し
て実質的に結合しないとき等が挙げられる。ここで、実質的に結合しないとは、ヒトGPC3
発現細胞に対する結合活性の80％以下、通常50％以下、好ましくは30％以下、特に好まし
くは15％以下の結合活性をいう。
【0082】
GPC3に対する抗原結合ドメインを含む被験ポリペプチド会合体のGPC3発現細胞に対する
結合活性を測定する方法としては、例えば、Antibodies A Laboratory Manual記載の方法
（Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359-420）が挙げら
れる。即ち、GPC3発現細胞を抗原とするELISAやFACS（fluorescence activated cell sor
ting）の原理によって評価され得る。
結合活性を測定する方法としては、例えば、Antibodies A Laboratory Manual記載の方法
（Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359-420）が挙げら
れる。即ち、GPC3発現細胞を抗原とするELISAやFACS（fluorescence activated cell sor
ting）の原理によって評価され得る。
【0083】
ELISAフォーマットにおいて、GPC3に対する抗原結合ドメインを含む被験ポリペプチド
会合体のGPC3発現細胞に対する結合活性は、酵素反応によって生成するシグナルレベルを
比較することによって定量的に評価される。すなわち、GPC3発現細胞を固定化したELISA
プレートに被験ポリペプチド会合体を加え、細胞に結合した被験ポリペプチド会合体が、
被験ポリペプチド会合体を認識する酵素標識抗体を利用して検出される。あるいはFACSに
おいては、被験ポリペプチド会合体の希釈系列を作成し、GPC3発現細胞に対する抗体結合
力価（titer）を決定することにより、GPC3発現細胞に対する被験ポリペプチド会合体の
結合活性が比較され得る。
会合体のGPC3発現細胞に対する結合活性は、酵素反応によって生成するシグナルレベルを
比較することによって定量的に評価される。すなわち、GPC3発現細胞を固定化したELISA
プレートに被験ポリペプチド会合体を加え、細胞に結合した被験ポリペプチド会合体が、
被験ポリペプチド会合体を認識する酵素標識抗体を利用して検出される。あるいはFACSに
おいては、被験ポリペプチド会合体の希釈系列を作成し、GPC3発現細胞に対する抗体結合
力価（titer）を決定することにより、GPC3発現細胞に対する被験ポリペプチド会合体の
結合活性が比較され得る。
【0084】
緩衝液等に懸濁した細胞表面上に発現している抗原に対する被験ポリペプチド会合体の
結合は、フローサイトメーターによって検出することができる。フローサイトメーターと
しては、例えば、次のような装置が知られている。
FACSCantoTM II
FACSAriaTM
FACSArrayTM
FACSVantageTM SE
FACSCaliburTM （いずれもBD Biosciences社の商品名）
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta / Cell Lab Quanta SC（いずれもBeckman Coulter社の商品名）
結合は、フローサイトメーターによって検出することができる。フローサイトメーターと
しては、例えば、次のような装置が知られている。
FACSCantoTM II
FACSAriaTM
FACSArrayTM
FACSVantageTM SE
FACSCaliburTM （いずれもBD Biosciences社の商品名）
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta / Cell Lab Quanta SC（いずれもBeckman Coulter社の商品名）
【0085】
例えば、GPC3に対する抗原結合ドメインを含む被験ポリペプチド会合体の抗原に対する
結合活性の好適な測定方法の一例として、次の方法が挙げられる。まず、GPC3を発現する
細胞と反応させた被験ポリペプチド会合体を認識するFITC標識した二次抗体で染色する。
被験ポリペプチド会合体を適宜好適な緩衝液によって希釈することによって、当該会合体
が所望の濃度に調製して用いられる。例えば、10μg/mlから10 ng/mlまでの間のいずれか
の濃度で使用され得る。次に、FACSCalibur（BD社）により蛍光強度と細胞数が測定され
る。当該細胞に対する抗体の結合量は、CELL QUEST Software（BD社）を用いて解析する
ことにより得られた蛍光強度、すなわちGeometric Meanの値に反映される。すなわち、当
該Geometric Meanの値を得ることにより、被験ポリペプチド会合体の結合量によって表さ
れる被験ポリペプチド会合体の結合活性が測定され得る。
結合活性の好適な測定方法の一例として、次の方法が挙げられる。まず、GPC3を発現する
細胞と反応させた被験ポリペプチド会合体を認識するFITC標識した二次抗体で染色する。
被験ポリペプチド会合体を適宜好適な緩衝液によって希釈することによって、当該会合体
が所望の濃度に調製して用いられる。例えば、10μg/mlから10 ng/mlまでの間のいずれか
の濃度で使用され得る。次に、FACSCalibur（BD社）により蛍光強度と細胞数が測定され
る。当該細胞に対する抗体の結合量は、CELL QUEST Software（BD社）を用いて解析する
ことにより得られた蛍光強度、すなわちGeometric Meanの値に反映される。すなわち、当
該Geometric Meanの値を得ることにより、被験ポリペプチド会合体の結合量によって表さ
れる被験ポリペプチド会合体の結合活性が測定され得る。
【0086】
GPC3に対する抗原結合ドメインを含む被験ポリペプチド会合体が、あるポリペプチド会
合体とエピトープを共有することは、両者の同じエピトープに対する競合によって確認さ
れ得る。ポリペプチド会合体間の競合は、交叉ブロッキングアッセイなどによって検出さ
れる。例えば競合ELISAアッセイは、好ましい交叉ブロッキングアッセイである。
合体とエピトープを共有することは、両者の同じエピトープに対する競合によって確認さ
れ得る。ポリペプチド会合体間の競合は、交叉ブロッキングアッセイなどによって検出さ
れる。例えば競合ELISAアッセイは、好ましい交叉ブロッキングアッセイである。
【0087】
具体的には、交叉ブロッキングアッセイにおいては、マイクロタイタープレートのウェ
ル上にコートしたGPC3タンパク質が、候補となる競合ポリペプチド会合体の存在下、また
は非存在下でプレインキュベートされた後に、被験ポリペプチド会合体が添加される。ウ
ェル中のGPC3タンパク質に結合した被験ポリペプチド会合体の量は、同じエピトープへの
結合に対して競合する候補となる競合ポリペプチド会合体の結合能に間接的に相関してい
る。すなわち同一エピトープに対する競合ポリペプチド会合体の親和性が大きくなればな
る程、被験ポリペプチド会合体のGPC3タンパク質をコートしたウェルへの結合活性は低下
する。
ル上にコートしたGPC3タンパク質が、候補となる競合ポリペプチド会合体の存在下、また
は非存在下でプレインキュベートされた後に、被験ポリペプチド会合体が添加される。ウ
ェル中のGPC3タンパク質に結合した被験ポリペプチド会合体の量は、同じエピトープへの
結合に対して競合する候補となる競合ポリペプチド会合体の結合能に間接的に相関してい
る。すなわち同一エピトープに対する競合ポリペプチド会合体の親和性が大きくなればな
る程、被験ポリペプチド会合体のGPC3タンパク質をコートしたウェルへの結合活性は低下
する。
【0088】
GPC3タンパク質を介してウェルに結合した被験ポリペプチド会合体の量は、予めポリペ
プチド会合体を標識しておくことによって、容易に測定され得る。たとえば、ビオチン標
識されたポリペプチド会合体は、アビジンペルオキシダーゼコンジュゲートと適切な基質
を使用することにより測定される。ペルオキシダーゼなどの酵素標識を利用した交叉ブロ
ッキングアッセイは、特に競合ELISAアッセイといわれる。ポリペプチド会合体は、検出
あるいは測定が可能な他の標識物質で標識され得る。具体的には、放射標識あるいは蛍光
標識などが公知である。
プチド会合体を標識しておくことによって、容易に測定され得る。たとえば、ビオチン標
識されたポリペプチド会合体は、アビジンペルオキシダーゼコンジュゲートと適切な基質
を使用することにより測定される。ペルオキシダーゼなどの酵素標識を利用した交叉ブロ
ッキングアッセイは、特に競合ELISAアッセイといわれる。ポリペプチド会合体は、検出
あるいは測定が可能な他の標識物質で標識され得る。具体的には、放射標識あるいは蛍光
標識などが公知である。
【0089】
候補の競合ポリペプチド会合体の非存在下で実施されるコントロール試験において得ら
れる結合活性と比較して、競合ポリペプチド会合体が、GPC3に対する抗原結合ドメインを
含む被験ポリペプチド会合体の結合を少なくとも20％、好ましくは少なくとも20－50％、
さらに好ましくは少なくとも50％ブロックできるならば、当該被験ポリペプチド会合体は
競合ポリペプチド会合体と実質的に同じエピトープに結合するか、又は同じエピトープへ
の結合に対して競合するポリペプチド会合体である。
れる結合活性と比較して、競合ポリペプチド会合体が、GPC3に対する抗原結合ドメインを
含む被験ポリペプチド会合体の結合を少なくとも20％、好ましくは少なくとも20－50％、
さらに好ましくは少なくとも50％ブロックできるならば、当該被験ポリペプチド会合体は
競合ポリペプチド会合体と実質的に同じエピトープに結合するか、又は同じエピトープへ
の結合に対して競合するポリペプチド会合体である。
【0090】
GPC3に対する抗原結合ドメインを含む被験ポリペプチド会合体が結合するエピトープの
構造が同定されている場合には、被験ポリペプチド会合体と対照ポリペプチド会合体とが
エピトープを共有することは、当該エピトープを構成するペプチドにアミノ酸変異を導入
したペプチドに対する両者のポリペプチド会合体の結合活性を比較することによって評価
され得る。
構造が同定されている場合には、被験ポリペプチド会合体と対照ポリペプチド会合体とが
エピトープを共有することは、当該エピトープを構成するペプチドにアミノ酸変異を導入
したペプチドに対する両者のポリペプチド会合体の結合活性を比較することによって評価
され得る。
【0091】
こうした結合活性を測定する方法としては、例えば、前記のELISAフォーマットにおい
て変異を導入した線状のペプチドに対する被験ポリペプチド会合体及び対照ポリペプチド
会合体の結合活性を比較することによって測定され得る。ELISA以外の方法としては、カ
ラムに結合した当該変異ペプチドに対する結合活性を、当該カラムに被検ポリペプチド会
合体と対照ポリペプチド会合体を流下させた後に溶出液中に溶出されるポリペプチド会合
体を定量することによっても測定され得る。変異ペプチドを例えばGSTとの融合ペプチド
としてカラムに吸着させる方法は公知である。
て変異を導入した線状のペプチドに対する被験ポリペプチド会合体及び対照ポリペプチド
会合体の結合活性を比較することによって測定され得る。ELISA以外の方法としては、カ
ラムに結合した当該変異ペプチドに対する結合活性を、当該カラムに被検ポリペプチド会
合体と対照ポリペプチド会合体を流下させた後に溶出液中に溶出されるポリペプチド会合
体を定量することによっても測定され得る。変異ペプチドを例えばGSTとの融合ペプチド
としてカラムに吸着させる方法は公知である。
【0092】
また、同定されたエピトープが立体エピトープの場合には、被験ポリペプチド会合体と
対照ポリペプチド会合体とがエピトープを共有することは、次の方法で評価され得る。ま
ず、GPC3を発現する細胞とエピトープに変異が導入されたGPC3を発現する細胞が調製され
る。これらの細胞がPBS等の適切な緩衝液に懸濁された細胞懸濁液に対して被験ポリペプ
チド会合体と対照ポリペプチド会合体が添加される。次いで、適宜緩衝液で洗浄された細
胞懸濁液に対して、被験ポリペプチド会合体と対照ポリペプチド会合体を認識することが
できるFITC標識された抗体が添加される。標識抗体によって染色された細胞の蛍光強度と
細胞数がFACSCalibur（BD社）によって測定される。被験ポリペプチド会合体と対照ポリ
ペプチド会合体の濃度は好適な緩衝液によって適宜希釈することによって所望の濃度に調
製して用いられる。例えば、10μg/mlから10 ng/mlまでの間のいずれかの濃度で使用され
る。当該細胞に対する標識抗体の結合量は、CELL QUEST Software（BD社）を用いて解析
することにより得られた蛍光強度、すなわちGeometric Meanの値に反映される。すなわち
、当該Geometric Meanの値を得ることにより、標識抗体の結合量によって表される被験ポ
リペプチド会合体と対照ポリペプチド会合体の結合活性を測定することができる。
対照ポリペプチド会合体とがエピトープを共有することは、次の方法で評価され得る。ま
ず、GPC3を発現する細胞とエピトープに変異が導入されたGPC3を発現する細胞が調製され
る。これらの細胞がPBS等の適切な緩衝液に懸濁された細胞懸濁液に対して被験ポリペプ
チド会合体と対照ポリペプチド会合体が添加される。次いで、適宜緩衝液で洗浄された細
胞懸濁液に対して、被験ポリペプチド会合体と対照ポリペプチド会合体を認識することが
できるFITC標識された抗体が添加される。標識抗体によって染色された細胞の蛍光強度と
細胞数がFACSCalibur（BD社）によって測定される。被験ポリペプチド会合体と対照ポリ
ペプチド会合体の濃度は好適な緩衝液によって適宜希釈することによって所望の濃度に調
製して用いられる。例えば、10μg/mlから10 ng/mlまでの間のいずれかの濃度で使用され
る。当該細胞に対する標識抗体の結合量は、CELL QUEST Software（BD社）を用いて解析
することにより得られた蛍光強度、すなわちGeometric Meanの値に反映される。すなわち
、当該Geometric Meanの値を得ることにより、標識抗体の結合量によって表される被験ポ
リペプチド会合体と対照ポリペプチド会合体の結合活性を測定することができる。
【0093】
本方法において、例えば「変異GPC3発現細胞に実質的に結合しない」ことは、以下の方
法によって判断することができる。まず、変異GPC3を発現する細胞に対して結合した被験
ポリペプチド会合体と対照ポリペプチド会合体を、標識抗体で染色する。次いで細胞の蛍
光強度を検出する。蛍光検出にフローサイトメトリーとしてFACSCaliburを用いた場合、
得られた蛍光強度はCELL QUEST Softwareを用いて解析され得る。ポリペプチド会合体存
在下および非存在下でのGeometric Meanの値から、この比較値（ΔGeo-Mean）を下記の計
算式に基づいて算出することにより、ポリペプチド会合体の結合による蛍光強度の増加割
合を求めることができる。
法によって判断することができる。まず、変異GPC3を発現する細胞に対して結合した被験
ポリペプチド会合体と対照ポリペプチド会合体を、標識抗体で染色する。次いで細胞の蛍
光強度を検出する。蛍光検出にフローサイトメトリーとしてFACSCaliburを用いた場合、
得られた蛍光強度はCELL QUEST Softwareを用いて解析され得る。ポリペプチド会合体存
在下および非存在下でのGeometric Meanの値から、この比較値（ΔGeo-Mean）を下記の計
算式に基づいて算出することにより、ポリペプチド会合体の結合による蛍光強度の増加割
合を求めることができる。
【0094】
ΔGeo-Mean＝Geo-Mean（ポリペプチド会合体存在下）／Geo-Mean（ポリペプチド会合体
非存在下）
非存在下）
【0095】
解析によって得られる被験ポリペプチド会合体の変異GPC3発現細胞に対する結合量が反
映されたGeometric Mean比較値（変異GPC3分子ΔGeo-Mean値）を、被験ポリペプチド会合
体のGPC3発現細胞に対する結合量が反映されたΔGeo-Mean比較値と比較する。この場合に
おいて、変異GPC3発現細胞及びGPC3発現細胞に対するΔGeo-Mean比較値を求める際に使用
する被験ポリペプチド会合体の濃度は互いに同一又は実質的に同一の濃度で調整されるこ
とが特に好ましい。予めGPC3中のエピトープを認識していることが確認されたポリペプチ
ド会合体が、対照ポリペプチド会合体として利用される。
映されたGeometric Mean比較値（変異GPC3分子ΔGeo-Mean値）を、被験ポリペプチド会合
体のGPC3発現細胞に対する結合量が反映されたΔGeo-Mean比較値と比較する。この場合に
おいて、変異GPC3発現細胞及びGPC3発現細胞に対するΔGeo-Mean比較値を求める際に使用
する被験ポリペプチド会合体の濃度は互いに同一又は実質的に同一の濃度で調整されるこ
とが特に好ましい。予めGPC3中のエピトープを認識していることが確認されたポリペプチ
ド会合体が、対照ポリペプチド会合体として利用される。
【0096】
被験ポリペプチド会合体の変異GPC3発現細胞に対するΔGeo-Mean比較値が、被験ポリペ
プチド会合体のGPC3発現細胞に対するΔGeo-Mean比較値の、少なくとも80％、好ましくは
50％、更に好ましくは30％、特に好ましくは15％より小さければ、「変異GPC3発現細胞に
実質的に結合しない」ものとする。Geo-Mean値（Geometric Mean）を求める計算式は、CE
LL QUEST Software User’s Guide（BD biosciences社）に記載されている。比較値を比
較することによってそれが実質的に同視し得る程度であれば、被験ポリペプチド会合体と
対照ポリペプチド会合体のエピトープは同一であると評価され得る。
プチド会合体のGPC3発現細胞に対するΔGeo-Mean比較値の、少なくとも80％、好ましくは
50％、更に好ましくは30％、特に好ましくは15％より小さければ、「変異GPC3発現細胞に
実質的に結合しない」ものとする。Geo-Mean値（Geometric Mean）を求める計算式は、CE
LL QUEST Software User’s Guide（BD biosciences社）に記載されている。比較値を比
較することによってそれが実質的に同視し得る程度であれば、被験ポリペプチド会合体と
対照ポリペプチド会合体のエピトープは同一であると評価され得る。
【0097】
Fv（variable fragment）
本明細書において、「Fv（variable fragment）」という用語は、抗体の軽鎖可変領域
（VL（light chain variable region））と抗体の重鎖可変領域（VH（heavy chain varia
ble region））とのペアからなる抗体由来の抗原結合ドメインの最小単位を意味する。19
88年にSkerraとPluckthunは、バクテリアのシグナル配列の下流に抗体の遺伝子を挿入し
大腸菌中で当該遺伝子の発現を誘導することによって、均一でかつ活性を保持した状態で
大腸菌のペリプラズム画分から調製されることを見出した（Science (1988) 240 (4855),
1038-1041）。ペリプラズム画分から調製されたFvは、抗原に対する結合を有する態様で
VHとVLが会合していた。
本明細書において、「Fv（variable fragment）」という用語は、抗体の軽鎖可変領域
（VL（light chain variable region））と抗体の重鎖可変領域（VH（heavy chain varia
ble region））とのペアからなる抗体由来の抗原結合ドメインの最小単位を意味する。19
88年にSkerraとPluckthunは、バクテリアのシグナル配列の下流に抗体の遺伝子を挿入し
大腸菌中で当該遺伝子の発現を誘導することによって、均一でかつ活性を保持した状態で
大腸菌のペリプラズム画分から調製されることを見出した（Science (1988) 240 (4855),
1038-1041）。ペリプラズム画分から調製されたFvは、抗原に対する結合を有する態様で
VHとVLが会合していた。
【0098】
本明細書において、Fvとしては、例えば以下のポリペプチド会合体；
二価のscFvのうち一価のscFvがCD3結合ドメインを構成する重鎖Fv断片を介してFc領域を
構成する一つのポリペプチドに、他方の一価のscFvがCD3結合ドメインを構成する軽鎖Fv
断片を介してFc領域を構成する他方の一つのポリペプチドに連結された二価の抗原結合ド
メインが二価のscFvである（１）二価の抗原結合ドメイン、（２）IgG1、IgG2a、IgG3又
はIgG4のFc領域を構成するアミノ酸のうちFcγ受容体に対する結合活性を有しないFc領域
を含むドメイン、及び、（３）少なくとも一価のCD3結合ドメイン、
を含むポリペプチド会合体等において軽鎖Fv断片及び重鎖Fv断片が、抗原であるCD3に対
する結合を有する態様で会合しCD3結合ドメインを構成する一組のFvも好適に含まれる。
二価のscFvのうち一価のscFvがCD3結合ドメインを構成する重鎖Fv断片を介してFc領域を
構成する一つのポリペプチドに、他方の一価のscFvがCD3結合ドメインを構成する軽鎖Fv
断片を介してFc領域を構成する他方の一つのポリペプチドに連結された二価の抗原結合ド
メインが二価のscFvである（１）二価の抗原結合ドメイン、（２）IgG1、IgG2a、IgG3又
はIgG4のFc領域を構成するアミノ酸のうちFcγ受容体に対する結合活性を有しないFc領域
を含むドメイン、及び、（３）少なくとも一価のCD3結合ドメイン、
を含むポリペプチド会合体等において軽鎖Fv断片及び重鎖Fv断片が、抗原であるCD3に対
する結合を有する態様で会合しCD3結合ドメインを構成する一組のFvも好適に含まれる。
【0099】
scFv、単鎖抗体、またはsc(Fv)2
本明細書において、「scFv」、「単鎖抗体」、または「sc(Fv)2」という用語は、単一
のポリペプチド鎖内に、重鎖および軽鎖の両方に由来する可変領域を含むが、定常領域を
欠いている抗体断片を意味する。一般に、単鎖抗体は、抗原結合を可能にすると思われる
所望の構造を形成するのを可能にする、VHドメインとVLドメインの間のポリペプチドリン
カーをさらに含む。単鎖抗体は、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113巻,
Rosenburg、及び、Moore編, Springer-Verlag, New York, 269～315（1994）においてPlu
ckthunによって詳細に考察されている。同様に、国際特許出願公開WO1988/001649および
米国特許第4,946,778号および同第5,260,203号を参照。特定の態様において、単鎖抗体は
また、二重特異性であるか、かつ／またはヒト化され得る。
本明細書において、「scFv」、「単鎖抗体」、または「sc(Fv)2」という用語は、単一
のポリペプチド鎖内に、重鎖および軽鎖の両方に由来する可変領域を含むが、定常領域を
欠いている抗体断片を意味する。一般に、単鎖抗体は、抗原結合を可能にすると思われる
所望の構造を形成するのを可能にする、VHドメインとVLドメインの間のポリペプチドリン
カーをさらに含む。単鎖抗体は、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113巻,
Rosenburg、及び、Moore編, Springer-Verlag, New York, 269～315（1994）においてPlu
ckthunによって詳細に考察されている。同様に、国際特許出願公開WO1988/001649および
米国特許第4,946,778号および同第5,260,203号を参照。特定の態様において、単鎖抗体は
また、二重特異性であるか、かつ／またはヒト化され得る。
【0100】
scFvはFvを構成するVHとVLとがペプチドリンカーによって連結された抗原結合ドメイン
である（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85 (16), 5879-5883）。当該ペプチド
リンカーによってVHとVLとが近接した状態に保持され得る。
である（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85 (16), 5879-5883）。当該ペプチド
リンカーによってVHとVLとが近接した状態に保持され得る。
【0101】
sc(Fv)2は二つのVLと二つのVHの4つの可変領域がペプチドリンカー等のリンカーによっ
て連結され一本鎖を構成する単鎖抗体である（J Immunol. Methods (1999) 231 (1-2), 1
77-189）。この二つのVHとVLは異なるモノクローナル抗体から由来することもあり得る。
例えば、Journal of Immunology (1994) 152 (11), 5368-5374に開示されるような同一抗
原中に存在する二種類のエピトープを認識する二重特異性（bispecific sc(Fv)2）も好適
に挙げられる。sc(Fv)2は、当業者に公知の方法によって作製され得る。例えば、scFvを
ペプチドリンカー等のリンカーで結ぶことによって作製され得る。
て連結され一本鎖を構成する単鎖抗体である（J Immunol. Methods (1999) 231 (1-2), 1
77-189）。この二つのVHとVLは異なるモノクローナル抗体から由来することもあり得る。
例えば、Journal of Immunology (1994) 152 (11), 5368-5374に開示されるような同一抗
原中に存在する二種類のエピトープを認識する二重特異性（bispecific sc(Fv)2）も好適
に挙げられる。sc(Fv)2は、当業者に公知の方法によって作製され得る。例えば、scFvを
ペプチドリンカー等のリンカーで結ぶことによって作製され得る。
【0102】
本明細書におけるsc(Fv)2を構成する抗原結合ドメインの構成としては、二つのVH及び
二つのVLが、一本鎖ポリペプチドのN末端側を基点としてVH、VL、VH、VL（［VH］リンカ
ー［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］）の順に並んでいることを特徴とする抗体が挙げ
られるが、二つのVHと2つのVLの順序は特に上記の構成に限定されず、どのような順序で
並べられていてもよい。例えば以下のような、順序の構成も挙げることができる。
［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］
［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］
［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］
［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］
［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］
二つのVLが、一本鎖ポリペプチドのN末端側を基点としてVH、VL、VH、VL（［VH］リンカ
ー［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］）の順に並んでいることを特徴とする抗体が挙げ
られるが、二つのVHと2つのVLの順序は特に上記の構成に限定されず、どのような順序で
並べられていてもよい。例えば以下のような、順序の構成も挙げることができる。
［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］
［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］
［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］
［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］
［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］
【0103】
sc(Fv)2の分子形態についてはWO2006/132352においても詳細に記載されており、当業者
であればこれらの記載に基づいて、本明細書で開示されるポリペプチド会合体の作製のた
めに適宜所望のsc(Fv)2を作製することが可能である。
であればこれらの記載に基づいて、本明細書で開示されるポリペプチド会合体の作製のた
めに適宜所望のsc(Fv)2を作製することが可能である。
【0104】
また本発明のポリペプチド会合体は、PEG等のキャリアー高分子や抗がん剤等の有機化
合物をコンジュゲートしてもよい。また糖鎖付加配列を挿入し、糖鎖が所望の効果を得る
ことを目的として好適に付加され得る。
合物をコンジュゲートしてもよい。また糖鎖付加配列を挿入し、糖鎖が所望の効果を得る
ことを目的として好適に付加され得る。
【0105】
抗体の可変領域を結合するリンカーとしては、遺伝子工学により導入し得る任意のペプ
チドリンカー、又は合成化合物リンカー（例えば、Protein Engineering, 9 (3), 299-30
5, 1996参照）に開示されるリンカー等を用いることができるが、本発明においてはペプ
チドリンカーが好ましい。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業
者が適宜選択することが可能であるが、好ましい長さは5アミノ酸以上（上限は特に限定
されないが、通常、30アミノ酸以下、好ましくは20アミノ酸以下）であり、特に好ましく
は15アミノ酸である。sc(Fv)2に3つのペプチドリンカーが含まれる場合には、全て同じ長
さのペプチドリンカーを用いてもよいし、異なる長さのペプチドリンカーを用いてもよい
。
チドリンカー、又は合成化合物リンカー（例えば、Protein Engineering, 9 (3), 299-30
5, 1996参照）に開示されるリンカー等を用いることができるが、本発明においてはペプ
チドリンカーが好ましい。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業
者が適宜選択することが可能であるが、好ましい長さは5アミノ酸以上（上限は特に限定
されないが、通常、30アミノ酸以下、好ましくは20アミノ酸以下）であり、特に好ましく
は15アミノ酸である。sc(Fv)2に3つのペプチドリンカーが含まれる場合には、全て同じ長
さのペプチドリンカーを用いてもよいし、異なる長さのペプチドリンカーを用いてもよい
。
【0106】
例えば、ペプチドリンカーの場合：
Ser
Gly・Ser
Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：５）
Ser・Gly・Gly・Gly（配列番号：６）
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：７）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：８）
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：９）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：１０）
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：１１）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：１２）
(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：７）)n
(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：８）)n
［nは１以上の整数である］等を挙げることができる。但し、ペプチドリンカーの長さや
配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
Ser
Gly・Ser
Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：５）
Ser・Gly・Gly・Gly（配列番号：６）
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：７）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：８）
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：９）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：１０）
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：１１）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：１２）
(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：７）)n
(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：８）)n
［nは１以上の整数である］等を挙げることができる。但し、ペプチドリンカーの長さや
配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
【0107】
合成化学物リンカー（化学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられている架橋剤、
例えばN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、ジスクシンイミジルスベレート（DSS）、ビ
ス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）、ジチオビス（スクシンイミジルプロ
ピオネート）（DSP）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（DTSSP）
、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS）、エチレングリコ
ールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ－EGS）、ジスクシンイミジ
ル酒石酸塩（DST）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ－DST）、ビス［2-（ス
クシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（BSOCOES）、ビス［2-（スル
ホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ-BSOCOES）などで
あり、これらの架橋剤は市販されている。
例えばN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、ジスクシンイミジルスベレート（DSS）、ビ
ス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）、ジチオビス（スクシンイミジルプロ
ピオネート）（DSP）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（DTSSP）
、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS）、エチレングリコ
ールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ－EGS）、ジスクシンイミジ
ル酒石酸塩（DST）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ－DST）、ビス［2-（ス
クシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（BSOCOES）、ビス［2-（スル
ホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ-BSOCOES）などで
あり、これらの架橋剤は市販されている。
【0108】
4つの抗体可変領域を結合する場合には、通常、3つのリンカーが必要となるが、全て同
じリンカーを用いてもよいし、異なるリンカーを用いてもよい。
じリンカーを用いてもよいし、異なるリンカーを用いてもよい。
【0109】
Fab、F(ab’)2、またはFab’
「Fab」は、一本の軽鎖、ならびに一本の重鎖のCH1領域および可変領域から構成される
。Fab分子の重鎖は、別の重鎖分子とのジスルフィド結合を形成できない。
「Fab」は、一本の軽鎖、ならびに一本の重鎖のCH1領域および可変領域から構成される
。Fab分子の重鎖は、別の重鎖分子とのジスルフィド結合を形成できない。
【0110】
「F(ab’)2」及び「Fab’」とは、イムノグロブリン（モノクローナル抗体）をタンパ
ク質分解酵素であるペプシンあるいはパパイン等で処理することにより製造され、ヒンジ
領域中の2本のH鎖間に存在するジスルフィド結合の前後で消化されて生成される抗体フラ
グメントを意味する。例えば、IgGをパパインで処理することにより、ヒンジ領域中の2本
のH鎖間に存在するジスルフィド結合の上流で切断されてVL（L鎖可変領域）とCL（L鎖定
常領域）からなるL鎖、及びVH（H鎖可変領域）とCHγ1（H鎖定常領域中のγ1領域）とか
らなるH鎖フラグメントがC末端領域でジスルフィド結合により結合した相同な2つの抗体
フラグメントが製造され得る。これら2つの相同な抗体フラグメントはそれぞれFab'とい
われる。
ク質分解酵素であるペプシンあるいはパパイン等で処理することにより製造され、ヒンジ
領域中の2本のH鎖間に存在するジスルフィド結合の前後で消化されて生成される抗体フラ
グメントを意味する。例えば、IgGをパパインで処理することにより、ヒンジ領域中の2本
のH鎖間に存在するジスルフィド結合の上流で切断されてVL（L鎖可変領域）とCL（L鎖定
常領域）からなるL鎖、及びVH（H鎖可変領域）とCHγ1（H鎖定常領域中のγ1領域）とか
らなるH鎖フラグメントがC末端領域でジスルフィド結合により結合した相同な2つの抗体
フラグメントが製造され得る。これら2つの相同な抗体フラグメントはそれぞれFab'とい
われる。
【0111】
「F(ab’)2」は、二本の軽鎖、ならびに、鎖間のジスルフィド結合が2つの重鎖間で形
成されるようにCH1ドメインおよびCH2ドメインの一部分の定常領域を含む二本の重鎖を含
む。本明細書において開示されるポリペプチド会合体を構成するF(ab’)2は、所望の抗原
結合ドメインを有する全長モノクローナル抗体等をペプシン等の蛋白質分解酵素にて部分
消化した後に、Fc断片をプロテインAカラムに吸着させて除去することにより、好適に取
得され得る。かかる蛋白質分解酵素としてはpH等の酵素の反応条件を適切に設定すること
により制限的にF(ab’)2を生じるように全長抗体を消化し得るものであれば特段の限定は
されず、例えば、ペプシンやフィシン等が例示できる。
成されるようにCH1ドメインおよびCH2ドメインの一部分の定常領域を含む二本の重鎖を含
む。本明細書において開示されるポリペプチド会合体を構成するF(ab’)2は、所望の抗原
結合ドメインを有する全長モノクローナル抗体等をペプシン等の蛋白質分解酵素にて部分
消化した後に、Fc断片をプロテインAカラムに吸着させて除去することにより、好適に取
得され得る。かかる蛋白質分解酵素としてはpH等の酵素の反応条件を適切に設定すること
により制限的にF(ab’)2を生じるように全長抗体を消化し得るものであれば特段の限定は
されず、例えば、ペプシンやフィシン等が例示できる。
【0112】
Fc領域
本明細書において開示されるポリペプチド会合体を構成するFc領域はモノクローナル抗
体等の抗体をペプシン等の蛋白質分解酵素にて部分消化した後に、断片をプロテインAカ
ラム、あるいはプロテインGカラムに吸着させた後に、適切な溶出バッファー等により溶
出させることにより好適に取得され得る。かかる蛋白質分解酵素としてはpH等の酵素の反
応条件を適切に設定することによりモノクローナル抗体等の抗体を消化し得るものであれ
ば特段の限定はされず、例えば、ペプシンやフィシン等が例示できる。
本明細書において開示されるポリペプチド会合体を構成するFc領域はモノクローナル抗
体等の抗体をペプシン等の蛋白質分解酵素にて部分消化した後に、断片をプロテインAカ
ラム、あるいはプロテインGカラムに吸着させた後に、適切な溶出バッファー等により溶
出させることにより好適に取得され得る。かかる蛋白質分解酵素としてはpH等の酵素の反
応条件を適切に設定することによりモノクローナル抗体等の抗体を消化し得るものであれ
ば特段の限定はされず、例えば、ペプシンやフィシン等が例示できる。
【0113】
本明細書に記載されるポリペプチド会合体にはIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4のFc領域を構
成するアミノ酸のうちFcγ受容体に対する結合活性が低下しているFc領域が含まれる。
成するアミノ酸のうちFcγ受容体に対する結合活性が低下しているFc領域が含まれる。
【0114】
抗体のアイソタイプは、定常領域の構造によって決定される。IgG1、IgG2、IgG3、IgG4
の各アイソタイプの定常領域は、それぞれ、Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4と呼ばれている。ヒ
トCγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4のFc領域を構成するポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号
：２３、２４、２５、２６に例示される。各アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基と、ka
batのEUナンバリング（本明細書においてEU INDEXとも呼ばれる）との関係は図１８に示
されている。
の各アイソタイプの定常領域は、それぞれ、Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4と呼ばれている。ヒ
トCγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4のFc領域を構成するポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号
：２３、２４、２５、２６に例示される。各アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基と、ka
batのEUナンバリング（本明細書においてEU INDEXとも呼ばれる）との関係は図１８に示
されている。
【0115】
Fc領域は、二本の軽鎖、ならびに、鎖間のジスルフィド結合が2つの重鎖間で形成され
るようにCH1ドメインおよびCH2ドメイン間の定常領域の一部分を含む二本の重鎖を含むF(
ab’)2を除いた領域のことをいう。本明細書において開示されるポリペプチド会合体を構
成するFc領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4モノクローナル抗体等をペプシン等の蛋白質分
解酵素にて部分消化した後に、プロテインAカラムに吸着された画分を再溶出することに
よって好適に取得され得る。かかる蛋白質分解酵素としてはpH等の酵素の反応条件を適切
に設定することにより制限的にF(ab’)2を生じるように全長抗体を消化し得るものであれ
ば特段の限定はされず、例えば、ペプシンやフィシン等が例示できる。
るようにCH1ドメインおよびCH2ドメイン間の定常領域の一部分を含む二本の重鎖を含むF(
ab’)2を除いた領域のことをいう。本明細書において開示されるポリペプチド会合体を構
成するFc領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4モノクローナル抗体等をペプシン等の蛋白質分
解酵素にて部分消化した後に、プロテインAカラムに吸着された画分を再溶出することに
よって好適に取得され得る。かかる蛋白質分解酵素としてはpH等の酵素の反応条件を適切
に設定することにより制限的にF(ab’)2を生じるように全長抗体を消化し得るものであれ
ば特段の限定はされず、例えば、ペプシンやフィシン等が例示できる。
【0116】
Fcγ受容体
Fcγ受容体とは、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4モノクローナル抗体のFc領域に結合し得る受
容体をいい、実質的にFcγ受容体遺伝子にコードされるタンパク質のファミリーのいかな
るメンバーをも意味する。ヒトでは、このファミリーには、アイソフォームFcγRIa、Fc
γRIbおよびFcγRIcを含むFcγRI（CD64）；アイソフォームFcγRIIa（アロタイプH131お
よびR131を含む）、FcγRIIb（FcγRIIb-1およびFcγRIIb-2を含む）およびFcγRIIcを含
むFcγRII（CD32）；およびアイソフォームFcγRIIIa（アロタイプV158およびF158を含む
）およびFcγRIIIb（アロタイプFcγRIIIb-NA1およびFcγRIIIb-NA2を含む）を含むFcγR
III（CD16）、並びにいかなる未発見のヒトFcγR類またはFcγRアイソフォームまたはア
ロタイプも含まれるが、これらに限定されるものではない。FcγRは、ヒト、マウス、ラ
ット、ウサギおよびサルを含むが、これらに限定されるものではない、いかなる生物由来
でもよい。マウスFcγR類には、FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）、FcγRIII（CD16）お
よびFcγRIII-2（CD16-2）、並びにいかなる未発見のマウスFcγR類またはFcγRアイソフ
ォームまたはアロタイプも含まれるが、これらに限定されない。こうしたFcγ受容体の好
適な例としてはヒトFcγI（CD64）、FcγIIA（CD32）、FcγIIB（CD32）、FcγIIIA（CD1
6）及び／又はFcγIIIB（CD16）が挙げられる。FcγIのポリヌクレオチド配列及びアミノ
酸配列はそれぞれ配列番号：１３（NM_000566.3）及び１４（NP_000557.1）に、FcγIIA
のポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：１５（BC020823.1）及び
１６（AAH20823.1）に、FcγIIBのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列はそれぞれ配
列番号：１７（BC146678.1）及び１８（AAI46679.1）に、FcγIIIAのポリヌクレオチド配
列及びアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：１９（BC033678.1）及び２０（AAH33678.1）に
、及びFcγIIIBのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：２１（
BC128562.1）及び２２（AAI28563.1）に記載されている（カッコ内はRefSeq登録番号を示
す）。Fcγ受容体が、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4モノクローナル抗体のFc領域に結合活性を
有するか否かは、上記に記載されるFACSやELISAフォーマットのほか、ALPHAスクリーン（
Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay）や表面プラズモン共鳴（SPR）現
象を利用したBIACORE法等によって確認され得る（Proc.Natl.Acad.Sci.USA (2006) 103 (
11), 4005-4010）。
Fcγ受容体とは、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4モノクローナル抗体のFc領域に結合し得る受
容体をいい、実質的にFcγ受容体遺伝子にコードされるタンパク質のファミリーのいかな
るメンバーをも意味する。ヒトでは、このファミリーには、アイソフォームFcγRIa、Fc
γRIbおよびFcγRIcを含むFcγRI（CD64）；アイソフォームFcγRIIa（アロタイプH131お
よびR131を含む）、FcγRIIb（FcγRIIb-1およびFcγRIIb-2を含む）およびFcγRIIcを含
むFcγRII（CD32）；およびアイソフォームFcγRIIIa（アロタイプV158およびF158を含む
）およびFcγRIIIb（アロタイプFcγRIIIb-NA1およびFcγRIIIb-NA2を含む）を含むFcγR
III（CD16）、並びにいかなる未発見のヒトFcγR類またはFcγRアイソフォームまたはア
ロタイプも含まれるが、これらに限定されるものではない。FcγRは、ヒト、マウス、ラ
ット、ウサギおよびサルを含むが、これらに限定されるものではない、いかなる生物由来
でもよい。マウスFcγR類には、FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）、FcγRIII（CD16）お
よびFcγRIII-2（CD16-2）、並びにいかなる未発見のマウスFcγR類またはFcγRアイソフ
ォームまたはアロタイプも含まれるが、これらに限定されない。こうしたFcγ受容体の好
適な例としてはヒトFcγI（CD64）、FcγIIA（CD32）、FcγIIB（CD32）、FcγIIIA（CD1
6）及び／又はFcγIIIB（CD16）が挙げられる。FcγIのポリヌクレオチド配列及びアミノ
酸配列はそれぞれ配列番号：１３（NM_000566.3）及び１４（NP_000557.1）に、FcγIIA
のポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：１５（BC020823.1）及び
１６（AAH20823.1）に、FcγIIBのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列はそれぞれ配
列番号：１７（BC146678.1）及び１８（AAI46679.1）に、FcγIIIAのポリヌクレオチド配
列及びアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：１９（BC033678.1）及び２０（AAH33678.1）に
、及びFcγIIIBのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：２１（
BC128562.1）及び２２（AAI28563.1）に記載されている（カッコ内はRefSeq登録番号を示
す）。Fcγ受容体が、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4モノクローナル抗体のFc領域に結合活性を
有するか否かは、上記に記載されるFACSやELISAフォーマットのほか、ALPHAスクリーン（
Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay）や表面プラズモン共鳴（SPR）現
象を利用したBIACORE法等によって確認され得る（Proc.Natl.Acad.Sci.USA (2006) 103 (
11), 4005-4010）。
【0117】
また、「Fcリガンド」または「エフェクターリガンド」は、抗体のFc領域に結合してFc
／Fcリガンド複合体を形成する、任意の生物に由来する分子、好ましくはポリペプチドを
意味する。FcリガンドのFcへの結合は、好ましくは、１つまたはそれ以上のエフェクター
機能を誘起する。Fcリガンドには、Fc受容体、FcγR、FcαR、FcεR、FcRn、C1q、C3、マ
ンナン結合レクチン、マンノース受容体、スタフィロコッカスのプロテインＡ、スタフィ
ロコッカスのタンパク質ＧおよびウイルスのFcγRが含まれるが、これらに限定されない
。Fcリガンドには、FcγRに相同なFc受容体のファミリーであるFc受容体相同体（FcRH）
（Davis et al.,（2002）Immunological Reviews 190, 123-136）も含まれる。Fcリガン
ドには、Fcに結合する未発見の分子も含まれ得る。
／Fcリガンド複合体を形成する、任意の生物に由来する分子、好ましくはポリペプチドを
意味する。FcリガンドのFcへの結合は、好ましくは、１つまたはそれ以上のエフェクター
機能を誘起する。Fcリガンドには、Fc受容体、FcγR、FcαR、FcεR、FcRn、C1q、C3、マ
ンナン結合レクチン、マンノース受容体、スタフィロコッカスのプロテインＡ、スタフィ
ロコッカスのタンパク質ＧおよびウイルスのFcγRが含まれるが、これらに限定されない
。Fcリガンドには、FcγRに相同なFc受容体のファミリーであるFc受容体相同体（FcRH）
（Davis et al.,（2002）Immunological Reviews 190, 123-136）も含まれる。Fcリガン
ドには、Fcに結合する未発見の分子も含まれ得る。
【0118】
Fcγ受容体に対する結合活性
Fc領域がFcγI、FcγIIA、FcγIIB、FcγIIIA及び／又はFcγIIIBのいずれかのFcγ受
容体に対する結合活性が低下していることは、上記に記載されるFACSやELISAフォーマッ
トのほか、ALPHAスクリーン（Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay）や
表面プラズモン共鳴（SPR）現象を利用したBIACORE法等によって確認することができる（
Proc.Natl.Acad.Sci.USA (2006) 103 (11), 4005-4010）。
Fc領域がFcγI、FcγIIA、FcγIIB、FcγIIIA及び／又はFcγIIIBのいずれかのFcγ受
容体に対する結合活性が低下していることは、上記に記載されるFACSやELISAフォーマッ
トのほか、ALPHAスクリーン（Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay）や
表面プラズモン共鳴（SPR）現象を利用したBIACORE法等によって確認することができる（
Proc.Natl.Acad.Sci.USA (2006) 103 (11), 4005-4010）。
【0119】
ALPHAスクリーンは、ドナーとアクセプターの2つのビーズを使用するALPHAテクノロジ
ーによって下記の原理に基づいて実施される。ドナービーズに結合した分子が、アクセプ
タービーズに結合した分子と生物学的に相互作用し、2つのビーズが近接した状態の時に
のみ、発光シグナルを検出される。レーザーによって励起されたドナービーズ内のフォト
センシタイザーは、周辺の酸素を励起状態の一重項酸素に変換する。一重項酸素はドナー
ビーズ周辺に拡散し、近接しているアクセプタービーズに到達するとビーズ内の化学発光
反応を引き起こし、最終的に光が放出される。ドナービーズに結合した分子とアクセプタ
ービーズに結合した分子が相互作用しないときは、ドナービーズの産生する一重項酸素が
アクセプタービーズに到達しないため、化学発光反応は起きない。
ーによって下記の原理に基づいて実施される。ドナービーズに結合した分子が、アクセプ
タービーズに結合した分子と生物学的に相互作用し、2つのビーズが近接した状態の時に
のみ、発光シグナルを検出される。レーザーによって励起されたドナービーズ内のフォト
センシタイザーは、周辺の酸素を励起状態の一重項酸素に変換する。一重項酸素はドナー
ビーズ周辺に拡散し、近接しているアクセプタービーズに到達するとビーズ内の化学発光
反応を引き起こし、最終的に光が放出される。ドナービーズに結合した分子とアクセプタ
ービーズに結合した分子が相互作用しないときは、ドナービーズの産生する一重項酸素が
アクセプタービーズに到達しないため、化学発光反応は起きない。
【0120】
例えば、ドナービーズにビオチン標識されたポリペプチド会合体が結合され、アクセプ
タービーズにはグルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）でタグ化されたFcγ受容体が結
合される。競合する変異Fc領域を有するポリペプチド会合体の非存在下では、野生型Fc領
域を有するポリペプチド会合体とFcγ受容体とは相互作用し520-620 nmのシグナルを生ず
る。タグ化されていない変異Fc領域を有するポリペプチド会合体は、野生型Fc領域を有す
るポリペプチド会合体とFcγ受容体間の相互作用と競合する。競合の結果表れる蛍光の減
少を定量することによって相対的な結合親和性が決定され得る。抗体等のポリペプチド会
合体をSulfo-NHS-ビオチン等を用いてビオチン化することは公知である。Fcγ受容体をGS
Tでタグ化する方法としては、Fcγ受容体をコードするポリヌクレオチドとGSTをコードす
るポリヌクレオチドをインフレームで融合した融合遺伝子を発現可能なベクターに保持し
た細胞等において発現し、グルタチオンカラムを用いて精製する方法等が適宜採用され得
る。得られたシグナルは例えばGRAPHPAD PRISM（GraphPad社、San Diego）等のソフトウ
ェアを用いて非線形回帰解析を利用する一部位競合（one-site competition）モデルに適
合させることにより好適に解析される。
タービーズにはグルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）でタグ化されたFcγ受容体が結
合される。競合する変異Fc領域を有するポリペプチド会合体の非存在下では、野生型Fc領
域を有するポリペプチド会合体とFcγ受容体とは相互作用し520-620 nmのシグナルを生ず
る。タグ化されていない変異Fc領域を有するポリペプチド会合体は、野生型Fc領域を有す
るポリペプチド会合体とFcγ受容体間の相互作用と競合する。競合の結果表れる蛍光の減
少を定量することによって相対的な結合親和性が決定され得る。抗体等のポリペプチド会
合体をSulfo-NHS-ビオチン等を用いてビオチン化することは公知である。Fcγ受容体をGS
Tでタグ化する方法としては、Fcγ受容体をコードするポリヌクレオチドとGSTをコードす
るポリヌクレオチドをインフレームで融合した融合遺伝子を発現可能なベクターに保持し
た細胞等において発現し、グルタチオンカラムを用いて精製する方法等が適宜採用され得
る。得られたシグナルは例えばGRAPHPAD PRISM（GraphPad社、San Diego）等のソフトウ
ェアを用いて非線形回帰解析を利用する一部位競合（one-site competition）モデルに適
合させることにより好適に解析される。
【0121】
相互作用を観察する物質の一方（リガンド）をセンサーチップの金薄膜上に固定し、セ
ンサーチップの裏側から金薄膜とガラスの境界面で全反射するように光を当てると、反射
光の一部に反射強度が低下した部分（SPRシグナル）が形成される。相互作用を観察する
物質の他方（アナライト）をセンサーチップの表面に流しリガンドとアナライトが結合す
ると、固定化されているリガンド分子の質量が増加し、センサーチップ表面の溶媒の屈折
率が変化する。この屈折率の変化により、SPRシグナルの位置がシフトする（逆に結合が
解離するとシグナルの位置は戻る）。Biacoreシステムは上記のシフトする量、すなわち
センサーチップ表面での質量変化を縦軸にとり、質量の時間変化を測定データとして表示
する（センサーグラム）。センサーグラムのカーブからカイネティクス：結合速度定数（
ka）と解離速度定数(kd）が、当該定数の比からアフィニティー（KD）が求められる。BIA
CORE法では阻害測定法も好適に用いられる。阻害測定法の例はProc.Natl.Acad.Sci.USA (
2006) 103 (11), 4005-4010において記載されている。
ンサーチップの裏側から金薄膜とガラスの境界面で全反射するように光を当てると、反射
光の一部に反射強度が低下した部分（SPRシグナル）が形成される。相互作用を観察する
物質の他方（アナライト）をセンサーチップの表面に流しリガンドとアナライトが結合す
ると、固定化されているリガンド分子の質量が増加し、センサーチップ表面の溶媒の屈折
率が変化する。この屈折率の変化により、SPRシグナルの位置がシフトする（逆に結合が
解離するとシグナルの位置は戻る）。Biacoreシステムは上記のシフトする量、すなわち
センサーチップ表面での質量変化を縦軸にとり、質量の時間変化を測定データとして表示
する（センサーグラム）。センサーグラムのカーブからカイネティクス：結合速度定数（
ka）と解離速度定数(kd）が、当該定数の比からアフィニティー（KD）が求められる。BIA
CORE法では阻害測定法も好適に用いられる。阻害測定法の例はProc.Natl.Acad.Sci.USA (
2006) 103 (11), 4005-4010において記載されている。
【0122】
本明細書において、Fcγ受容体に対する結合活性が低下しているとは、例えば、上記の
解析方法に基づいて、対照とするポリペプチド会合体の競合活性に比較して被検ポリペプ
チド会合体の競合活性が、50％以下、好ましくは45％以下、40％以下、35％以下、30％以
下、20％以下、15％以下、特に好ましくは10％以下、9％以下、8％以下、7％以下、6％以
下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、1％以下の結合活性を示すことをいう。
解析方法に基づいて、対照とするポリペプチド会合体の競合活性に比較して被検ポリペプ
チド会合体の競合活性が、50％以下、好ましくは45％以下、40％以下、35％以下、30％以
下、20％以下、15％以下、特に好ましくは10％以下、9％以下、8％以下、7％以下、6％以
下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、1％以下の結合活性を示すことをいう。
【0123】
対照とするポリペプチド会合体としては、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4モノクローナル抗
体のFc領域を有するポリペプチド会合体が適宜使用され得る。当該Fc領域の構造は、配列
番号：２３（RefSeq登録番号AAC82527.1のN末にA付加）、２４（RefSeq登録番号AAB59393
.1のN末にA付加）、２５（RefSeq登録番号CAA27268.1のN末にA付加）、２６（RefSeq登録
番号AAB59394.1のN末にA付加）に記載されている。また、ある特定のアイソタイプの抗体
のFc領域の変異体を有するポリペプチド会合体を被検物質として使用する場合には、当該
特定のアイソタイプの抗体のFc領域を有するポリペプチド会合体を対照として用いること
によって、当該変異体が有する変異によるFcγ受容体への結合活性に対する効果が検証さ
れる。上記のようにして、Fcγ受容体に対する結合活性が低下していることが検証された
Fc領域の変異体を有するポリペプチド会合体が適宜作製される。
体のFc領域を有するポリペプチド会合体が適宜使用され得る。当該Fc領域の構造は、配列
番号：２３（RefSeq登録番号AAC82527.1のN末にA付加）、２４（RefSeq登録番号AAB59393
.1のN末にA付加）、２５（RefSeq登録番号CAA27268.1のN末にA付加）、２６（RefSeq登録
番号AAB59394.1のN末にA付加）に記載されている。また、ある特定のアイソタイプの抗体
のFc領域の変異体を有するポリペプチド会合体を被検物質として使用する場合には、当該
特定のアイソタイプの抗体のFc領域を有するポリペプチド会合体を対照として用いること
によって、当該変異体が有する変異によるFcγ受容体への結合活性に対する効果が検証さ
れる。上記のようにして、Fcγ受容体に対する結合活性が低下していることが検証された
Fc領域の変異体を有するポリペプチド会合体が適宜作製される。
【0124】
このような変異体の例としては、EUナンバリングに従って特定されるアミノ酸である23
1A-238Sの欠失（WO 2009/011941）、C226S, C229S, P238S, (C220S)（J.Rheumatol (2007
) 34, 11）、C226S, C229S（Hum.Antibod.Hybridomas (1990) 1(1), 47-54）、C226S, C2
29S, E233P, L234V, L235A（Blood (2007) 109, 1185-1192）等の変異体が公知である。
1A-238Sの欠失（WO 2009/011941）、C226S, C229S, P238S, (C220S)（J.Rheumatol (2007
) 34, 11）、C226S, C229S（Hum.Antibod.Hybridomas (1990) 1(1), 47-54）、C226S, C2
29S, E233P, L234V, L235A（Blood (2007) 109, 1185-1192）等の変異体が公知である。
【0125】
すなわち、特定のアイソタイプの抗体のFc領域を構成するアミノ酸のうち、EUナンバリ
ングに従って特定される下記のいずれかのアミノ酸；220位、226位、229位、231位、232
位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、264位、265位、266位
、267位、269位、270位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、325位、327位、3
28位、329位、330位、331位、332位が置換されているFc領域を有するポリペプチド会合体
が好適に挙げられる。Fc領域の起源である抗体のアイソタイプとしては特に限定されず、
IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4モノクローナル抗体を起源とするFc領域が適宜利用され得るが
、IgG1抗体を起源とするFc領域が好適に利用される。
ングに従って特定される下記のいずれかのアミノ酸；220位、226位、229位、231位、232
位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、264位、265位、266位
、267位、269位、270位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、325位、327位、3
28位、329位、330位、331位、332位が置換されているFc領域を有するポリペプチド会合体
が好適に挙げられる。Fc領域の起源である抗体のアイソタイプとしては特に限定されず、
IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4モノクローナル抗体を起源とするFc領域が適宜利用され得るが
、IgG1抗体を起源とするFc領域が好適に利用される。
【0126】
例えば、IgG1抗体のFc領域を構成するアミノ酸のうち、EUナンバリングに従って特定さ
れる下記のいずれかの置換（数字がEUナンバリングに従って特定されるアミノ酸残基の位
置、数字の前に位置する一文字のアミノ酸記号が置換前のアミノ酸残基、数字の後に位置
する一文字のアミノ酸記号が置換前のアミノ酸残基をそれぞれ表す）；
（a）L234F、L235E、P331S、
（b）C226S、C229S、P238S、
（c）C226S、C229S、
（d）C226S、C229S、E233P、L234V、L235A
が施されているFc領域、又は、231位から238位のアミノ酸配列が欠失したFc領域を有する
ポリペプチド会合体も適宜使用され得る。
れる下記のいずれかの置換（数字がEUナンバリングに従って特定されるアミノ酸残基の位
置、数字の前に位置する一文字のアミノ酸記号が置換前のアミノ酸残基、数字の後に位置
する一文字のアミノ酸記号が置換前のアミノ酸残基をそれぞれ表す）；
（a）L234F、L235E、P331S、
（b）C226S、C229S、P238S、
（c）C226S、C229S、
（d）C226S、C229S、E233P、L234V、L235A
が施されているFc領域、又は、231位から238位のアミノ酸配列が欠失したFc領域を有する
ポリペプチド会合体も適宜使用され得る。
【0127】
また、IgG2抗体のFc領域を構成するアミノ酸のうち、EUナンバリングに従って特定され
る下記のいずれかの置換（数字がEUナンバリングに従って特定されるアミノ酸残基の位置
、数字の前に位置する一文字のアミノ酸記号が置換前のアミノ酸残基、数字の後に位置す
る一文字のアミノ酸記号が置換前のアミノ酸残基をそれぞれ表す）；
（e）H268Q、V309L、A330S、P331S
（f）V234A
（g）G237A
（h）V234A、G237A
（i）A235E、G237A
（j）V234A、A235E、G237A
が施されているFc領域を有するポリペプチド会合体も適宜使用され得る。
る下記のいずれかの置換（数字がEUナンバリングに従って特定されるアミノ酸残基の位置
、数字の前に位置する一文字のアミノ酸記号が置換前のアミノ酸残基、数字の後に位置す
る一文字のアミノ酸記号が置換前のアミノ酸残基をそれぞれ表す）；
（e）H268Q、V309L、A330S、P331S
（f）V234A
（g）G237A
（h）V234A、G237A
（i）A235E、G237A
（j）V234A、A235E、G237A
が施されているFc領域を有するポリペプチド会合体も適宜使用され得る。
【0128】
また、IgG3抗体のFc領域を構成するアミノ酸のうち、EUナンバリングに従って特定され
る下記のいずれかの置換（数字がEUナンバリングに従って特定されるアミノ酸残基の位置
、数字の前に位置する一文字のアミノ酸記号が置換前のアミノ酸残基、数字の後に位置す
る一文字のアミノ酸記号が置換前のアミノ酸残基をそれぞれ表す）；
（k）F241A
（l）D265A
（m）V264A
が施されているFc領域を有するポリペプチド会合体も適宜使用され得る。
る下記のいずれかの置換（数字がEUナンバリングに従って特定されるアミノ酸残基の位置
、数字の前に位置する一文字のアミノ酸記号が置換前のアミノ酸残基、数字の後に位置す
る一文字のアミノ酸記号が置換前のアミノ酸残基をそれぞれ表す）；
（k）F241A
（l）D265A
（m）V264A
が施されているFc領域を有するポリペプチド会合体も適宜使用され得る。
【0129】
また、IgG4抗体のFc領域を構成するアミノ酸のうち、EUナンバリングに従って特定され
る下記のいずれかの置換（数字がEUナンバリングに従って特定されるアミノ酸残基の位置
、数字の前に位置する一文字のアミノ酸記号が置換前のアミノ酸残基、数字の後に位置す
る一文字のアミノ酸記号が置換前のアミノ酸残基をそれぞれ表す）；
（n）L235A、G237A、E318A
（o）L235E
（p）F234A、L235A
が施されているFc領域を有するポリペプチド会合体も適宜使用され得る。
る下記のいずれかの置換（数字がEUナンバリングに従って特定されるアミノ酸残基の位置
、数字の前に位置する一文字のアミノ酸記号が置換前のアミノ酸残基、数字の後に位置す
る一文字のアミノ酸記号が置換前のアミノ酸残基をそれぞれ表す）；
（n）L235A、G237A、E318A
（o）L235E
（p）F234A、L235A
が施されているFc領域を有するポリペプチド会合体も適宜使用され得る。
【0130】
その他の好ましい例として、IgG1抗体のFc領域を構成するアミノ酸のうち、EUナンバリ
ングに従って特定される下記のいずれかのアミノ酸；233位、234位、235位、236位、237
位、327位、330位、331位が、対応するIgG2またはIgG4においてそのEUナンバリングが対
応するアミノ酸に置換されているFc領域を有するポリペプチド会合体が挙げられる。
ングに従って特定される下記のいずれかのアミノ酸；233位、234位、235位、236位、237
位、327位、330位、331位が、対応するIgG2またはIgG4においてそのEUナンバリングが対
応するアミノ酸に置換されているFc領域を有するポリペプチド会合体が挙げられる。
【0131】
その他の好ましい例として、IgG1抗体のFc領域を構成するアミノ酸のうち、EUナンバリ
ングに従って特定される下記のいずれか一つ又はそれ以上のアミノ酸；234位、235位、29
7位が他のアミノ酸によって置換されているFc領域を有するポリペプチド会合体が好適に
挙げられる。置換後に存在するアミノ酸の種類は特に限定されないが、234位、235位、29
7位のいずれか一つ又はそれ以上のアミノ酸がアラニンに置換されているFc領域を有する
ポリペプチド会合体が特に好ましい。
ングに従って特定される下記のいずれか一つ又はそれ以上のアミノ酸；234位、235位、29
7位が他のアミノ酸によって置換されているFc領域を有するポリペプチド会合体が好適に
挙げられる。置換後に存在するアミノ酸の種類は特に限定されないが、234位、235位、29
7位のいずれか一つ又はそれ以上のアミノ酸がアラニンに置換されているFc領域を有する
ポリペプチド会合体が特に好ましい。
【0132】
その他の好ましい例として、IgG1抗体のFc領域を構成するアミノ酸のうち、EUナンバリ
ングに従って特定される下記のいずれかのアミノ酸；265位が他のアミノ酸によって置換
されているFc領域を有するポリペプチド会合体が好適に挙げられる。置換後に存在するア
ミノ酸の種類は特に限定されないが、265位のアミノ酸がアラニンに置換されているFc領
域を有するポリペプチド会合体が特に好ましい。
ングに従って特定される下記のいずれかのアミノ酸；265位が他のアミノ酸によって置換
されているFc領域を有するポリペプチド会合体が好適に挙げられる。置換後に存在するア
ミノ酸の種類は特に限定されないが、265位のアミノ酸がアラニンに置換されているFc領
域を有するポリペプチド会合体が特に好ましい。
【0133】
二重特異性抗体を起源とするFc領域
本明細書において、Fcγ受容体に対する結合活性が低下しているFc領域としては、二重
特異性抗体（bispecific抗体）を起源とするFc領域も適宜使用される。二重特異性抗体と
は、二つの異なる特異性を有する抗体である。IgG型の二重特異性抗体はIgG抗体を産生す
るハイブリドーマ二種を融合することによって生じるhybrid hybridoma（quadroma）によ
って分泌させることが出来る（Milstein C et al.Nature (1983) 305, 537-540）。
本明細書において、Fcγ受容体に対する結合活性が低下しているFc領域としては、二重
特異性抗体（bispecific抗体）を起源とするFc領域も適宜使用される。二重特異性抗体と
は、二つの異なる特異性を有する抗体である。IgG型の二重特異性抗体はIgG抗体を産生す
るハイブリドーマ二種を融合することによって生じるhybrid hybridoma（quadroma）によ
って分泌させることが出来る（Milstein C et al.Nature (1983) 305, 537-540）。
【0134】
また、IgG型の二重特異性抗体は目的の二種のIgGを構成するL鎖及びH鎖の遺伝子、合計
四種の遺伝子を細胞に導入しそれらを共発現させることによって分泌される。しかし、こ
れらの方法で産生されるIgGのH鎖とL鎖の組合せは理論上10通りにもなる。10種類のIgGか
ら目的の組み合わせのH鎖L鎖からなるIgGを精製することは困難である。さらに目的の組
み合わせのものの分泌量も理論上著しく低下するため、大きな培養規模が必要になり、製
造上のコストはさらに増大する。
四種の遺伝子を細胞に導入しそれらを共発現させることによって分泌される。しかし、こ
れらの方法で産生されるIgGのH鎖とL鎖の組合せは理論上10通りにもなる。10種類のIgGか
ら目的の組み合わせのH鎖L鎖からなるIgGを精製することは困難である。さらに目的の組
み合わせのものの分泌量も理論上著しく低下するため、大きな培養規模が必要になり、製
造上のコストはさらに増大する。
【0135】
この際H鎖のFc領域を構成するCH3領域に適当なアミノ酸置換を施すことによってH鎖に
ついてヘテロな組合せのIgGが優先的に分泌され得る。具体的には、一方のH鎖のCH3領域
に存在するアミノ酸側鎖をより大きい側鎖（knob（「突起」の意））に置換し、もう一方
のH鎖のCH3領域に存在するアミノ酸側鎖をより小さい側鎖（hole（「空隙」の意））に置
換することにより突起が空隙内に配置され得るようにして異種H鎖形成の促進および同種H
鎖形成の阻害を引き起こす方法である（WO1996/027011、Ridgway JB et al., Protein En
gineering (1996) 9, 617-621、Merchant AM et al. Nature Biotechnology (1998) 16,
677-681）。
ついてヘテロな組合せのIgGが優先的に分泌され得る。具体的には、一方のH鎖のCH3領域
に存在するアミノ酸側鎖をより大きい側鎖（knob（「突起」の意））に置換し、もう一方
のH鎖のCH3領域に存在するアミノ酸側鎖をより小さい側鎖（hole（「空隙」の意））に置
換することにより突起が空隙内に配置され得るようにして異種H鎖形成の促進および同種H
鎖形成の阻害を引き起こす方法である（WO1996/027011、Ridgway JB et al., Protein En
gineering (1996) 9, 617-621、Merchant AM et al. Nature Biotechnology (1998) 16,
677-681）。
【0136】
また、L鎖に関しては、H鎖可変領域に比べてL鎖可変領域の多様性が低いことから、両H
鎖に結合能を与え得る共通のL鎖が得られることが期待される。この共通L鎖と両H鎖遺伝
子を細胞に導入することによってIgGを発現させることで効率の良い二重特異性IgGの発現
が可能となる（Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681）。しかし任意に二種の抗体
を選んだ場合、同じL鎖を含む可能性は低く上記のアイデアを実行することは困難であり
、任意の異なるH鎖に対応し高い結合能を示す共通Ｌ鎖を選択する方法も提案されている
（WO2004/065611）。
鎖に結合能を与え得る共通のL鎖が得られることが期待される。この共通L鎖と両H鎖遺伝
子を細胞に導入することによってIgGを発現させることで効率の良い二重特異性IgGの発現
が可能となる（Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681）。しかし任意に二種の抗体
を選んだ場合、同じL鎖を含む可能性は低く上記のアイデアを実行することは困難であり
、任意の異なるH鎖に対応し高い結合能を示す共通Ｌ鎖を選択する方法も提案されている
（WO2004/065611）。
【0137】
また、ポリペプチドの会合、またはポリペプチドによって構成される異種多量体の会合
の制御方法を、Fc領域を構成する二つのポリペプチドの会合に利用することによって二重
特異性抗体を作製する技術も知られている。即ち、Fc領域を構成する二つのポリペプチド
内の界面を形成するアミノ酸残基を改変することによって、同一配列を有するFc領域を構
成するポリペプチドの会合が阻害され、配列の異なる二つのFc領域を構成するポリペプチ
ド会合体が形成されるように制御する方法が二重特異性抗体の作製に採用され得る（WO20
06/106905）。
の制御方法を、Fc領域を構成する二つのポリペプチドの会合に利用することによって二重
特異性抗体を作製する技術も知られている。即ち、Fc領域を構成する二つのポリペプチド
内の界面を形成するアミノ酸残基を改変することによって、同一配列を有するFc領域を構
成するポリペプチドの会合が阻害され、配列の異なる二つのFc領域を構成するポリペプチ
ド会合体が形成されるように制御する方法が二重特異性抗体の作製に採用され得る（WO20
06/106905）。
【0138】
本発明にかかるFc領域を含むドメインとしては、上記の二重特異性抗体を起源とするFc
領域を構成する二つのポリペプチドが適宜使用され得る。より具体的には、Fc領域を構成
する二つのポリペプチドであって、その一方のポリペプチドのアミノ酸配列のうちEUナン
バリングに従って特定される349位のアミノ酸がシステイン、366位のアミノ酸がトリプト
ファンであり、他方のポリペプチドのアミノ酸配列のうちEUナンバリングに従って特定さ
れる356位のアミノ酸がシステイン、366位のアミノ酸がセリンに、368位のアミノ酸がア
ラニンに、407位のアミノ酸がバリンであることを特徴とする、二つのポリペプチドが好
適に用いられる。
領域を構成する二つのポリペプチドが適宜使用され得る。より具体的には、Fc領域を構成
する二つのポリペプチドであって、その一方のポリペプチドのアミノ酸配列のうちEUナン
バリングに従って特定される349位のアミノ酸がシステイン、366位のアミノ酸がトリプト
ファンであり、他方のポリペプチドのアミノ酸配列のうちEUナンバリングに従って特定さ
れる356位のアミノ酸がシステイン、366位のアミノ酸がセリンに、368位のアミノ酸がア
ラニンに、407位のアミノ酸がバリンであることを特徴とする、二つのポリペプチドが好
適に用いられる。
【0139】
もう一つの態様において、本発明にかかるFc領域を含むドメインとしては、Fc領域を構
成する二つのポリペプチドであって、その一方のポリペプチドのアミノ酸配列のうちEUナ
ンバリングに従って特定される409位のアミノ酸がアスパラギン酸であり、他方のポリペ
プチドのアミノ酸配列のうちEUナンバリングに従って特定される399位のアミノ酸がリジ
ンであることを特徴とする、二つのポリペプチドが好適に用いられる。上記態様では、40
9位のアミノ酸はアスパラギン酸に代えてグルタミン酸、399位のアミノ酸はリジンに代え
てアルギニンであってもよい。また、399位のリジンに加えて360位のアスパラギン酸又は
392位のアスパラギン酸も好適に追加されうる。
成する二つのポリペプチドであって、その一方のポリペプチドのアミノ酸配列のうちEUナ
ンバリングに従って特定される409位のアミノ酸がアスパラギン酸であり、他方のポリペ
プチドのアミノ酸配列のうちEUナンバリングに従って特定される399位のアミノ酸がリジ
ンであることを特徴とする、二つのポリペプチドが好適に用いられる。上記態様では、40
9位のアミノ酸はアスパラギン酸に代えてグルタミン酸、399位のアミノ酸はリジンに代え
てアルギニンであってもよい。また、399位のリジンに加えて360位のアスパラギン酸又は
392位のアスパラギン酸も好適に追加されうる。
【0140】
別の態様において、本発明にかかるFc領域を含むドメインとしては、Fc領域を構成する
二つのポリペプチドであって、その一方のポリペプチドのアミノ酸配列のうちEUナンバリ
ングに従って特定される370位のアミノ酸がグルタミン酸であり、他方のポリペプチドの
アミノ酸配列のうちEUナンバリングに従って特定される357位のアミノ酸がリジンである
ことを特徴とする、二つのポリペプチドが好適に用いられる。
二つのポリペプチドであって、その一方のポリペプチドのアミノ酸配列のうちEUナンバリ
ングに従って特定される370位のアミノ酸がグルタミン酸であり、他方のポリペプチドの
アミノ酸配列のうちEUナンバリングに従って特定される357位のアミノ酸がリジンである
ことを特徴とする、二つのポリペプチドが好適に用いられる。
【0141】
更に別の態様において、本発明にかかるFc領域を含むドメインとしては、Fc領域を構成
する二つのポリペプチドであって、その一方のポリペプチドのアミノ酸配列のうちEUナン
バリングに従って特定される439位のアミノ酸がグルタミン酸であり、他方のポリペプチ
ドのアミノ酸配列のうちEUナンバリングに従って特定される356位のアミノ酸がリジンで
あることを特徴とする、二つのポリペプチドが好適に用いられる。
する二つのポリペプチドであって、その一方のポリペプチドのアミノ酸配列のうちEUナン
バリングに従って特定される439位のアミノ酸がグルタミン酸であり、他方のポリペプチ
ドのアミノ酸配列のうちEUナンバリングに従って特定される356位のアミノ酸がリジンで
あることを特徴とする、二つのポリペプチドが好適に用いられる。
【0142】
さらには本発明にかかるFc領域を含むドメインとしては、これらが組み合わされた態様
；
Fc領域を構成する二つのポリペプチドであって、その一方のポリペプチドのアミノ酸配列
のうちEUナンバリングに従って特定される409位のアミノ酸がアスパラギン酸、370位のア
ミノ酸がグルタミン酸であり、他方のポリペプチドのアミノ酸配列のうちEUナンバリング
に従って特定される399位のアミノ酸がリジン、357位のアミノ酸がリジンであることを特
徴とする、二つのポリペプチド（本態様では、370位のグルタミン酸に代えてアスパラギ
ン酸であってもよく、370位のグルタミン酸に代えて392位のアスパラギン酸であってもよ
い）、
Fc領域を構成する二つのポリペプチドであって、その一方のポリペプチドのアミノ酸配列
のうちEUナンバリングに従って特定される409位のアミノ酸がアスパラギン酸、439位のア
ミノ酸がグルタミン酸であり、他方のポリペプチドのアミノ酸配列のうちEUナンバリング
に従って特定される399位のアミノ酸がリジン、356位のアミノ酸がリジンであることを特
徴とする二つのポリペプチド（本態様では、439位のグルタミン酸に代えて360位のアスパ
ラギン酸、392位のアスパラギン酸又は439位のアスパラギン酸であってもよい）、
Fc領域を構成する二つのポリペプチドであって、その一方のポリペプチドのアミノ酸配列
のうちEUナンバリングに従って特定される370位のアミノ酸がグルタミン酸、439位のアミ
ノ酸がグルタミン酸であり、他方のポリペプチドのアミノ酸配列のうちEUナンバリングに
従って特定される357位のアミノ酸がリジン、356位のアミノ酸がリジンであることを特徴
とする二つのポリペプチド、または、
Fc領域を構成する二つのポリペプチドであって、その一方のポリペプチドのアミノ酸配列
のうちEUナンバリングに従って特定される409位のアミノ酸がアスパラギン酸、370位のア
ミノ酸がグルタミン酸、439位のアミノ酸がグルタミン酸であり、他方のポリペプチドの
アミノ酸配列のうちEUナンバリングに従って特定される399位のアミノ酸がリジン、357位
のアミノ酸がリジン、356位のアミノ酸がリジンであることを特徴とする二つのポリペプ
チド（本態様では、370位のアミノ酸をグルタミン酸に置換しなくてもよく、更に、370位
のアミノ酸をグルタミン酸に置換しない上で、439位のグルタミン酸に代えてアスパラギ
ン酸又は439位のグルタミン酸に代えて392位のアスパラギン酸であってもよい）、
が好適に用いられる。
；
Fc領域を構成する二つのポリペプチドであって、その一方のポリペプチドのアミノ酸配列
のうちEUナンバリングに従って特定される409位のアミノ酸がアスパラギン酸、370位のア
ミノ酸がグルタミン酸であり、他方のポリペプチドのアミノ酸配列のうちEUナンバリング
に従って特定される399位のアミノ酸がリジン、357位のアミノ酸がリジンであることを特
徴とする、二つのポリペプチド（本態様では、370位のグルタミン酸に代えてアスパラギ
ン酸であってもよく、370位のグルタミン酸に代えて392位のアスパラギン酸であってもよ
い）、
Fc領域を構成する二つのポリペプチドであって、その一方のポリペプチドのアミノ酸配列
のうちEUナンバリングに従って特定される409位のアミノ酸がアスパラギン酸、439位のア
ミノ酸がグルタミン酸であり、他方のポリペプチドのアミノ酸配列のうちEUナンバリング
に従って特定される399位のアミノ酸がリジン、356位のアミノ酸がリジンであることを特
徴とする二つのポリペプチド（本態様では、439位のグルタミン酸に代えて360位のアスパ
ラギン酸、392位のアスパラギン酸又は439位のアスパラギン酸であってもよい）、
Fc領域を構成する二つのポリペプチドであって、その一方のポリペプチドのアミノ酸配列
のうちEUナンバリングに従って特定される370位のアミノ酸がグルタミン酸、439位のアミ
ノ酸がグルタミン酸であり、他方のポリペプチドのアミノ酸配列のうちEUナンバリングに
従って特定される357位のアミノ酸がリジン、356位のアミノ酸がリジンであることを特徴
とする二つのポリペプチド、または、
Fc領域を構成する二つのポリペプチドであって、その一方のポリペプチドのアミノ酸配列
のうちEUナンバリングに従って特定される409位のアミノ酸がアスパラギン酸、370位のア
ミノ酸がグルタミン酸、439位のアミノ酸がグルタミン酸であり、他方のポリペプチドの
アミノ酸配列のうちEUナンバリングに従って特定される399位のアミノ酸がリジン、357位
のアミノ酸がリジン、356位のアミノ酸がリジンであることを特徴とする二つのポリペプ
チド（本態様では、370位のアミノ酸をグルタミン酸に置換しなくてもよく、更に、370位
のアミノ酸をグルタミン酸に置換しない上で、439位のグルタミン酸に代えてアスパラギ
ン酸又は439位のグルタミン酸に代えて392位のアスパラギン酸であってもよい）、
が好適に用いられる。
【0143】
さらに、別の態様において、本発明にかかるFc領域を含むドメインとしては、Fc領域を
構成する二つのポリペプチドであって、その一方のポリペプチドのアミノ酸配列のうちEU
ナンバリングに従って特定される356位のアミノ酸がリジンであり、他方のポリペプチド
のアミノ酸配列のうちEUナンバリングに従って特定される435位のアミノ酸がアルギニン
、439位のアミノ酸がグルタミン酸であることを特徴とする二つのポリペプチドも好適に
用いられる。
構成する二つのポリペプチドであって、その一方のポリペプチドのアミノ酸配列のうちEU
ナンバリングに従って特定される356位のアミノ酸がリジンであり、他方のポリペプチド
のアミノ酸配列のうちEUナンバリングに従って特定される435位のアミノ酸がアルギニン
、439位のアミノ酸がグルタミン酸であることを特徴とする二つのポリペプチドも好適に
用いられる。
【0144】
本発明に係るFc領域を含むドメインとして上記の二重特異性抗体を起源とするFc領域を
構成する二つのポリペプチドを使用することによって、本発明に係る抗原結合ドメイン及
び／又はCD3結合ドメインを所望の組合せで配置することが可能となる。
構成する二つのポリペプチドを使用することによって、本発明に係る抗原結合ドメイン及
び／又はCD3結合ドメインを所望の組合せで配置することが可能となる。
【0145】
C末端のヘテロジェニティーが改善されたFc領域
本明細書において、Fcγ受容体に対する結合活性が低下しているFc領域として、上記の
特徴に加えてFc領域のC末端のヘテロジェニティーが改善されたFc領域が適宜使用され得
る。より具体的には、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4を起源とするFc領域を構成する二つのポ
リペプチドのアミノ酸配列のうちEUナンバリングに従って特定される446位のグリシン、
及び447位のリジンが欠失したFc領域が提供される。
本明細書において、Fcγ受容体に対する結合活性が低下しているFc領域として、上記の
特徴に加えてFc領域のC末端のヘテロジェニティーが改善されたFc領域が適宜使用され得
る。より具体的には、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4を起源とするFc領域を構成する二つのポ
リペプチドのアミノ酸配列のうちEUナンバリングに従って特定される446位のグリシン、
及び447位のリジンが欠失したFc領域が提供される。
【0146】
T細胞受容体複合体結合ドメイン
本明細書において、「T細胞受容体複合体結合ドメイン」とは、T細胞受容体複合体の一
部または全部に特異的に結合し且つ相補的である領域を含んで成るT細胞受容体複合体抗
体の部分をいう。T細胞受容体複合体は、T細胞受容体自身でもよいし、T細胞受容体とと
もにT細胞受容体複合体を構成するアダプター分子でもよい。アダプターとして好適なも
のはCD3である。
本明細書において、「T細胞受容体複合体結合ドメイン」とは、T細胞受容体複合体の一
部または全部に特異的に結合し且つ相補的である領域を含んで成るT細胞受容体複合体抗
体の部分をいう。T細胞受容体複合体は、T細胞受容体自身でもよいし、T細胞受容体とと
もにT細胞受容体複合体を構成するアダプター分子でもよい。アダプターとして好適なも
のはCD3である。
【0147】
T細胞受容体結合ドメイン
本明細書において、「T細胞受容体結合ドメイン」とは、T細胞受容体の一部または全部
に特異的に結合し且つ相補的である領域を含んでなるT細胞受容体抗体の部分をいう。
本明細書において、「T細胞受容体結合ドメイン」とは、T細胞受容体の一部または全部
に特異的に結合し且つ相補的である領域を含んでなるT細胞受容体抗体の部分をいう。
【0148】
T細胞受容体としては、可変領域でもよいし、定常領域でもよいが、好ましいCD3結合ド
メインが結合するエピトープは定常領域に存在するエピトープである。定常領域の配列と
して、例えばRefSeq登録番号CAA26636.1のT細胞受容体α鎖（配列番号：６７）、RefSeq
登録番号C25777のT細胞受容体β鎖（配列番号：６８）、RefSeq登録番号A26659のT細胞受
容体γ1鎖（配列番号：６９）、RefSeq登録番号AAB63312.1のT細胞受容体γ2鎖（配列番
号：７０）、RefSeq登録番号AAA61033.1のT細胞受容体δ鎖（配列番号：７１）の配列を
挙げることができる。
メインが結合するエピトープは定常領域に存在するエピトープである。定常領域の配列と
して、例えばRefSeq登録番号CAA26636.1のT細胞受容体α鎖（配列番号：６７）、RefSeq
登録番号C25777のT細胞受容体β鎖（配列番号：６８）、RefSeq登録番号A26659のT細胞受
容体γ1鎖（配列番号：６９）、RefSeq登録番号AAB63312.1のT細胞受容体γ2鎖（配列番
号：７０）、RefSeq登録番号AAA61033.1のT細胞受容体δ鎖（配列番号：７１）の配列を
挙げることができる。
【0149】
CD3結合ドメイン
本明細書において「CD3結合ドメイン」とは、CD3の一部または全部に特異的に結合し且
つ相補的である領域を含んで成るCD3抗体の部分をいう。CD3結合ドメインは一または複数
の抗体の可変ドメインより提供され得る。好ましくは、CD3結合ドメインはCD3抗体の軽鎖
可変領域（VL）とCD3抗体の重鎖可変領域（VH）とを含む。こうしたCD3結合ドメインの例
としては、「scFv（single chain Fv）」、「単鎖抗体（single chain antibody）」、「
Fv」、「scFv2（single chain Fv 2）」、「Fab」または「F(ab')2」等が好適に挙げられ
る。
本明細書において「CD3結合ドメイン」とは、CD3の一部または全部に特異的に結合し且
つ相補的である領域を含んで成るCD3抗体の部分をいう。CD3結合ドメインは一または複数
の抗体の可変ドメインより提供され得る。好ましくは、CD3結合ドメインはCD3抗体の軽鎖
可変領域（VL）とCD3抗体の重鎖可変領域（VH）とを含む。こうしたCD3結合ドメインの例
としては、「scFv（single chain Fv）」、「単鎖抗体（single chain antibody）」、「
Fv」、「scFv2（single chain Fv 2）」、「Fab」または「F(ab')2」等が好適に挙げられ
る。
【0150】
本発明に係るCD3結合ドメインは、ヒトCD3を構成するγ鎖、δ鎖又はε鎖配列に存在す
るエピトープであればいずれのエピトープに結合するものであり得る。本発明において、
好ましくはヒトCD3複合体のε鎖の細胞外領域に存在するエピトープに結合するCD3抗体の
軽鎖可変領域（VL）とCD3抗体の重鎖可変領域（VH）とを含むCD3結合ドメインが好適に用
いられる。こうしたCD3結合ドメインとしては、OKT3抗体（Proc. Natl. Acad. Sci. USA
(1980) 77, 4914-4917）や種々の公知のCD3抗体の軽鎖可変領域（VL）とCD3抗体の重鎖可
変領域（VH）とを含むCD3結合ドメインが好適に用いられる。また、ヒトCD3を構成するγ
鎖、δ鎖又はε鎖を前記の方法によって所望の動物に免疫することによって取得された所
望の性質を有するCD3抗体を起源とするCD3結合ドメインが適宜使用され得る。CD3結合ド
メインの起源となるCD3抗体は前記のとおり適宜ヒト化された抗体やヒト抗体が適宜用い
られる。CD3を構成するγ鎖、δ鎖又はε鎖の構造は、そのポリヌクレオチド配列が、配
列番号：２７（NM_000073.2）、２９（NM_000732.4）及び３１（NM_000733.3）に、その
ポリペプチド配列が、配列番号：２８（NP_000064.1）、３０（NP_000723.1）及び３２（
NP_000724.1）に記載されている（カッコ内はRefSeq登録番号を示す）。
るエピトープであればいずれのエピトープに結合するものであり得る。本発明において、
好ましくはヒトCD3複合体のε鎖の細胞外領域に存在するエピトープに結合するCD3抗体の
軽鎖可変領域（VL）とCD3抗体の重鎖可変領域（VH）とを含むCD3結合ドメインが好適に用
いられる。こうしたCD3結合ドメインとしては、OKT3抗体（Proc. Natl. Acad. Sci. USA
(1980) 77, 4914-4917）や種々の公知のCD3抗体の軽鎖可変領域（VL）とCD3抗体の重鎖可
変領域（VH）とを含むCD3結合ドメインが好適に用いられる。また、ヒトCD3を構成するγ
鎖、δ鎖又はε鎖を前記の方法によって所望の動物に免疫することによって取得された所
望の性質を有するCD3抗体を起源とするCD3結合ドメインが適宜使用され得る。CD3結合ド
メインの起源となるCD3抗体は前記のとおり適宜ヒト化された抗体やヒト抗体が適宜用い
られる。CD3を構成するγ鎖、δ鎖又はε鎖の構造は、そのポリヌクレオチド配列が、配
列番号：２７（NM_000073.2）、２９（NM_000732.4）及び３１（NM_000733.3）に、その
ポリペプチド配列が、配列番号：２８（NP_000064.1）、３０（NP_000723.1）及び３２（
NP_000724.1）に記載されている（カッコ内はRefSeq登録番号を示す）。
【0151】
ポリペプチド会合体
本発明に係るポリペプチド会合体は前記の、
（１）抗原結合ドメイン、
（２）Fcγ受容体に対する結合活性が低下しているFc領域を含むドメイン、及び、
（３）T細胞受容体複合体結合ドメイン、
を含むものであればよく、その構造は限定されない。本発明においては、T細胞受容体複
合体結合ドメインは、好ましくはT細胞受容体結合ドメインあるいはCD3結合ドメインであ
る。上記の各ドメインはペプチド結合で直接連結することができる。例えば、（１）抗原
結合ドメインとしてF(ab')2を用い、（２）Fcγ受容体に対する結合活性が低下しているF
c領域を含むドメインとしてこれらのFc領域を用いた場合に（１）に記載された抗原結合
ドメインと（２）に記載されたFc領域を含むドメインとをペプチド結合で連結したときは
、連結されたポリペプチドは抗体の構造を形成する。そのような抗体を作製するためには
前述のハイブリドーマの培養液から精製する他、当該抗体を構成するポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドが安定に保持された所望の宿主細胞の培養液から当該抗体を精製
することもできる。
本発明に係るポリペプチド会合体は前記の、
（１）抗原結合ドメイン、
（２）Fcγ受容体に対する結合活性が低下しているFc領域を含むドメイン、及び、
（３）T細胞受容体複合体結合ドメイン、
を含むものであればよく、その構造は限定されない。本発明においては、T細胞受容体複
合体結合ドメインは、好ましくはT細胞受容体結合ドメインあるいはCD3結合ドメインであ
る。上記の各ドメインはペプチド結合で直接連結することができる。例えば、（１）抗原
結合ドメインとしてF(ab')2を用い、（２）Fcγ受容体に対する結合活性が低下しているF
c領域を含むドメインとしてこれらのFc領域を用いた場合に（１）に記載された抗原結合
ドメインと（２）に記載されたFc領域を含むドメインとをペプチド結合で連結したときは
、連結されたポリペプチドは抗体の構造を形成する。そのような抗体を作製するためには
前述のハイブリドーマの培養液から精製する他、当該抗体を構成するポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドが安定に保持された所望の宿主細胞の培養液から当該抗体を精製
することもできる。
【0152】
当該抗体構造に（３）CD3結合ドメインを結合する場合、当該CD3結合ドメインが当該抗
体構造の定常領域のC末端にペプチド結合を介して結合され得る。別の態様としては、当
該CD3結合ドメインは、当該抗体構造の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のN末端にペプチド
結合を介して結合され得る。その他の態様としては、当該CD3結合ドメインは、当該抗体
構造の軽鎖定常領域のC末端にペプチド結合を介して結合され得る。結合するCD3結合ドメ
インは所望の構造を有するCD3結合ドメインが採用され得るが、好ましくはFv、より好ま
しくはscFvが適宜使用される。当該抗体構造に結合するCD3結合ドメインの価数は限定さ
れない。当該抗体構造に二価のCD3結合ドメインを結合するためには、当該抗体構造の定
常領域を構成する二つのFc領域の各C末端にペプチド結合を介して各々一価のCD3結合ドメ
インが結合され得る。また、当該抗体構造に二価のCD3結合ドメインを結合するためには
、二つのFc領域のうち一つのFc領域のC末端にペプチド結合を介して二価のscFv即ちsc(Fv
)2が結合され得る。この場合において、前記の二重特異性抗体を起源とするFc領域を用い
ることによって、当該抗体構造の定常領域を構成する二つのFc領域のうち一つのFc領域の
C末端にのみ二価のscFv即ちsc(Fv)2が結合するポリペプチド会合体が効率的に取得される
。また、当該抗体構造に一価のCD3結合ドメインを結合するためには、二つのFc領域のう
ち一つのFc領域のC末端にペプチド結合を介して一価のscFvが結合され得る。この場合に
おいて、前記の二重特異性抗体を起源とするFc領域を用いることによって、当該抗体構造
の定常領域を構成する二つのFc領域のうち一つのFc領域のC末端にのみ一価のscFvが結合
する本発明に係るポリペプチド会合体が効率的に取得される。
体構造の定常領域のC末端にペプチド結合を介して結合され得る。別の態様としては、当
該CD3結合ドメインは、当該抗体構造の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のN末端にペプチド
結合を介して結合され得る。その他の態様としては、当該CD3結合ドメインは、当該抗体
構造の軽鎖定常領域のC末端にペプチド結合を介して結合され得る。結合するCD3結合ドメ
インは所望の構造を有するCD3結合ドメインが採用され得るが、好ましくはFv、より好ま
しくはscFvが適宜使用される。当該抗体構造に結合するCD3結合ドメインの価数は限定さ
れない。当該抗体構造に二価のCD3結合ドメインを結合するためには、当該抗体構造の定
常領域を構成する二つのFc領域の各C末端にペプチド結合を介して各々一価のCD3結合ドメ
インが結合され得る。また、当該抗体構造に二価のCD3結合ドメインを結合するためには
、二つのFc領域のうち一つのFc領域のC末端にペプチド結合を介して二価のscFv即ちsc(Fv
)2が結合され得る。この場合において、前記の二重特異性抗体を起源とするFc領域を用い
ることによって、当該抗体構造の定常領域を構成する二つのFc領域のうち一つのFc領域の
C末端にのみ二価のscFv即ちsc(Fv)2が結合するポリペプチド会合体が効率的に取得される
。また、当該抗体構造に一価のCD3結合ドメインを結合するためには、二つのFc領域のう
ち一つのFc領域のC末端にペプチド結合を介して一価のscFvが結合され得る。この場合に
おいて、前記の二重特異性抗体を起源とするFc領域を用いることによって、当該抗体構造
の定常領域を構成する二つのFc領域のうち一つのFc領域のC末端にのみ一価のscFvが結合
する本発明に係るポリペプチド会合体が効率的に取得される。
【0153】
また、（３）CD3結合ドメインが当該抗体構造の定常領域のC末端にペプチド結合を介し
て結合され得る場合に、CD3結合ドメインを構成する重鎖Fv断片がFc領域を構成する一方
の定常領域のC末端（CH3ドメイン）に連結され、CD3結合ドメインを構成する軽鎖Fv断片
がFc領域を構成するもう一方の定常領域のC末端（CH3ドメイン）に連結されたポリペプチ
ド会合体も適宜使用される。この場合において、重鎖Fv断片又は軽鎖Fv断片を定常領域の
C末端（CH3ドメイン）に連結する際にGly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：７）等のリ
ンカーが適挿入される。リンカーの繰返しの数は限定されず、１～１０、好ましくは２～
８、さらには２～６数から選択される、すなわち１，２，３，４，５，６，７，８，９又
は１０の繰返しからなるGly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：７）等のリンカーが適宜
挿入されうる。
て結合され得る場合に、CD3結合ドメインを構成する重鎖Fv断片がFc領域を構成する一方
の定常領域のC末端（CH3ドメイン）に連結され、CD3結合ドメインを構成する軽鎖Fv断片
がFc領域を構成するもう一方の定常領域のC末端（CH3ドメイン）に連結されたポリペプチ
ド会合体も適宜使用される。この場合において、重鎖Fv断片又は軽鎖Fv断片を定常領域の
C末端（CH3ドメイン）に連結する際にGly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：７）等のリ
ンカーが適挿入される。リンカーの繰返しの数は限定されず、１～１０、好ましくは２～
８、さらには２～６数から選択される、すなわち１，２，３，４，５，６，７，８，９又
は１０の繰返しからなるGly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：７）等のリンカーが適宜
挿入されうる。
【0154】
さらに、CD3結合ドメインを構成する重鎖Fv断片がFc領域を構成する一方の定常領域のC
末端（CH3ドメイン）に連結され、CD3結合ドメインを構成する軽鎖Fv断片がFc領域を構成
するもう一方の定常領域のC末端（CH3ドメイン）に連結されたポリペプチド会合体が作製
される場合には、当該重鎖Fv断片と軽鎖Fv断片との会合を強化するために当該重鎖Fv断片
と軽鎖Fv断片間にジスルフィド結合を形成させるようなアミノ酸残基の改変も適宜実施さ
れうる。
末端（CH3ドメイン）に連結され、CD3結合ドメインを構成する軽鎖Fv断片がFc領域を構成
するもう一方の定常領域のC末端（CH3ドメイン）に連結されたポリペプチド会合体が作製
される場合には、当該重鎖Fv断片と軽鎖Fv断片との会合を強化するために当該重鎖Fv断片
と軽鎖Fv断片間にジスルフィド結合を形成させるようなアミノ酸残基の改変も適宜実施さ
れうる。
【0155】
別の態様において、CD3結合ドメインを構成する重鎖Fv断片がFc領域を構成する一方の
定常領域のC末端（CH3ドメイン）に連結され、CD3結合ドメインを構成する軽鎖Fv断片がF
c領域を構成するもう一方の定常領域のC末端（CH3ドメイン）に連結されたポリペプチド
会合体が作製される場合には、当該重鎖Fv断片と軽鎖Fv断片との会合を強化するために当
該重鎖Fv断片と軽鎖Fv断片のそれぞれに抗体のCH1ドメイン及びCLドメインが連結され得
る。
定常領域のC末端（CH3ドメイン）に連結され、CD3結合ドメインを構成する軽鎖Fv断片がF
c領域を構成するもう一方の定常領域のC末端（CH3ドメイン）に連結されたポリペプチド
会合体が作製される場合には、当該重鎖Fv断片と軽鎖Fv断片との会合を強化するために当
該重鎖Fv断片と軽鎖Fv断片のそれぞれに抗体のCH1ドメイン及びCLドメインが連結され得
る。
【0156】
更に別の態様において、当該抗体構造に二価のCD3結合ドメインを結合するためには、
当該抗体構造の二つの軽鎖定常領域の各C末端又は軽鎖可変領域の各N末端にペプチド結合
を介して各々一価のCD3結合ドメインが結合され得る。また、当該抗体構造に二価のCD3結
合ドメインを結合するためには、二つの軽鎖定常領域の各C末端又は軽鎖可変領域の各N末
端にペプチド結合を介して二価のscFv即ちsc(Fv)2が結合され得る。この場合において、
前記の二重特異性抗体を起源とするFc領域を用いることによって、当該抗体構造の二つの
軽鎖可変領域のうち一つの軽鎖可変領域のC末端又はN末端に二価のscFv即ちsc(Fv)2が結
合するポリペプチド会合体が効率的に取得される。また、当該抗体構造に一価のCD3結合
ドメインを結合するためには、二つの軽鎖可変領域のうち一つの軽鎖可変領域のC末端又
はN末端にペプチド結合を介して一価のscFvが結合され得る。この場合において、前記の
二重特異性抗体を起源とするFc領域を用いることによって、当該抗体構造の二つの軽鎖可
変領域のうち一つの軽鎖可変領域のN末端又はC末端に一価のscFvが結合する本発明に係る
ポリペプチド会合体が効率的に取得される。
当該抗体構造の二つの軽鎖定常領域の各C末端又は軽鎖可変領域の各N末端にペプチド結合
を介して各々一価のCD3結合ドメインが結合され得る。また、当該抗体構造に二価のCD3結
合ドメインを結合するためには、二つの軽鎖定常領域の各C末端又は軽鎖可変領域の各N末
端にペプチド結合を介して二価のscFv即ちsc(Fv)2が結合され得る。この場合において、
前記の二重特異性抗体を起源とするFc領域を用いることによって、当該抗体構造の二つの
軽鎖可変領域のうち一つの軽鎖可変領域のC末端又はN末端に二価のscFv即ちsc(Fv)2が結
合するポリペプチド会合体が効率的に取得される。また、当該抗体構造に一価のCD3結合
ドメインを結合するためには、二つの軽鎖可変領域のうち一つの軽鎖可変領域のC末端又
はN末端にペプチド結合を介して一価のscFvが結合され得る。この場合において、前記の
二重特異性抗体を起源とするFc領域を用いることによって、当該抗体構造の二つの軽鎖可
変領域のうち一つの軽鎖可変領域のN末端又はC末端に一価のscFvが結合する本発明に係る
ポリペプチド会合体が効率的に取得される。
【0157】
別の態様において、当該抗体構造に二価のCD3結合ドメインを結合するためには、当該
抗体構造の二つの重鎖可変領域の各N末端にペプチド結合を介して各々一価のCD3結合ドメ
インが結合され得る。また、当該抗体構造に二価のCD3結合ドメインを結合するためには
、二つの重鎖可変領域のうち一つの重鎖可変領域のN末端にペプチド結合を介して二価のs
cFv即ちsc(Fv)2が結合され得る。この場合において、前記の二重特異性抗体を起源とする
Fc領域を用いることによって、当該抗体構造の二つの重鎖可変領域のうち一つの重鎖可変
領域のN末端にのみ二価のscFv即ちsc(Fv)2が結合するポリペプチド会合体が効率的に取得
される。また、当該抗体構造に一価のCD3結合ドメインを結合するためには、二つの重鎖
可変領域のうち一つの重鎖可変領域のN末端にペプチド結合を介して一価のscFvが結合さ
れ得る。この場合において、前記の二重特異性抗体を起源とするFc領域を用いることによ
って、当該抗体構造の二つの重鎖可変領域のうち一つの重鎖可変領域のN末端に一価のscF
vが結合する本発明に係るポリペプチド会合体が効率的に取得される。
抗体構造の二つの重鎖可変領域の各N末端にペプチド結合を介して各々一価のCD3結合ドメ
インが結合され得る。また、当該抗体構造に二価のCD3結合ドメインを結合するためには
、二つの重鎖可変領域のうち一つの重鎖可変領域のN末端にペプチド結合を介して二価のs
cFv即ちsc(Fv)2が結合され得る。この場合において、前記の二重特異性抗体を起源とする
Fc領域を用いることによって、当該抗体構造の二つの重鎖可変領域のうち一つの重鎖可変
領域のN末端にのみ二価のscFv即ちsc(Fv)2が結合するポリペプチド会合体が効率的に取得
される。また、当該抗体構造に一価のCD3結合ドメインを結合するためには、二つの重鎖
可変領域のうち一つの重鎖可変領域のN末端にペプチド結合を介して一価のscFvが結合さ
れ得る。この場合において、前記の二重特異性抗体を起源とするFc領域を用いることによ
って、当該抗体構造の二つの重鎖可変領域のうち一つの重鎖可変領域のN末端に一価のscF
vが結合する本発明に係るポリペプチド会合体が効率的に取得される。
【0158】
また、上記のポリペプチド会合体を作製するに際して、各ドメインは直接ペプチド結合
で結合される他、各ドメインはペプチドリンカーを介したペプチド結合で結合され得る。
この場合において、採用されるリンカーとしては上記記載で例示されるリンカーの他、例
えばHisタグ、HAタグ、mycタグ、FLAGタグ等のペプチドタグを有するリンカーも適宜使用
され得る。また、水素結合、ジスルフィド結合、共有結合、イオン性相互作用またはこれ
らの結合の組合せにより互いに結合する性質もまた好適に利用され得る。例えば、抗体の
CH1とCL間の親和性が利用されたり、ヘテロFc領域の会合に際して前述の二重特異性抗体
を起源とするFc領域が用いられたりする。さらに、実施例で記載されるように、ドメイン
間に形成されるジスルフィド結合もまた好適に利用され得る。
で結合される他、各ドメインはペプチドリンカーを介したペプチド結合で結合され得る。
この場合において、採用されるリンカーとしては上記記載で例示されるリンカーの他、例
えばHisタグ、HAタグ、mycタグ、FLAGタグ等のペプチドタグを有するリンカーも適宜使用
され得る。また、水素結合、ジスルフィド結合、共有結合、イオン性相互作用またはこれ
らの結合の組合せにより互いに結合する性質もまた好適に利用され得る。例えば、抗体の
CH1とCL間の親和性が利用されたり、ヘテロFc領域の会合に際して前述の二重特異性抗体
を起源とするFc領域が用いられたりする。さらに、実施例で記載されるように、ドメイン
間に形成されるジスルフィド結合もまた好適に利用され得る。
【0159】
本発明に係るポリペプチド会合体の別の構造としては、例えば、（１）抗原結合ドメイ
ンとして一価のFv及び一価のFabである構造もまた好適に使用される。この場合において
、本発明に係るポリペプチド会合体を構成する（２）Fcγ受容体に対する結合活性が低下
している二つのFc領域の内一つのFc領域にペプチド結合を介して連結された重鎖CH1領域
に一価のFvのうちの重鎖Fv断片（VH）又は軽鎖Fv断片（VL）がペプチド結合を介して連結
し、当該重鎖CH1領域にジスルフィド結合を介して結合した軽鎖CH領域に一価のFvのうち
のもう一方のVL又はVH断片がペプチド結合を介して連結することにより、重鎖CH1領域及
び軽鎖CL領域の末端に結合したVH及びVLが抗体結合ドメインを形成する構造が使用される
。二つのFc領域のうち上記の異なるもう一方のFc領域のN末端には（１）抗体結合ドメイ
ン、及び、（３）CD3結合ドメインを形成するsc(Fv)2がペプチド結合を介して連結され得
る。この場合において、前記の二重特異性抗体を起源とするFc領域を用いることによって
、当該ポリペプチド会合体を構成する二つのFc領域のうち一方ののFc領域に重鎖CH1領域
が、もう一方のFc領域にsc(Fv)2がそれぞれペプチド結合を介して連結した構造を有する
ポリペプチド会合体が作製され得る。上記のポリペプチド会合体を作製するに際して、各
ドメインは直接ペプチド結合で結合される他、各ドメインはペプチドリンカーを介したペ
プチド結合で結合され得る。この場合において、採用されるリンカーとしては上記記載で
例示されるリンカーの他、例えばHisタグ、HAタグ、mycタグ、FLAGタグ等のペプチドタグ
を有するリンカーも適宜使用され得る。
ンとして一価のFv及び一価のFabである構造もまた好適に使用される。この場合において
、本発明に係るポリペプチド会合体を構成する（２）Fcγ受容体に対する結合活性が低下
している二つのFc領域の内一つのFc領域にペプチド結合を介して連結された重鎖CH1領域
に一価のFvのうちの重鎖Fv断片（VH）又は軽鎖Fv断片（VL）がペプチド結合を介して連結
し、当該重鎖CH1領域にジスルフィド結合を介して結合した軽鎖CH領域に一価のFvのうち
のもう一方のVL又はVH断片がペプチド結合を介して連結することにより、重鎖CH1領域及
び軽鎖CL領域の末端に結合したVH及びVLが抗体結合ドメインを形成する構造が使用される
。二つのFc領域のうち上記の異なるもう一方のFc領域のN末端には（１）抗体結合ドメイ
ン、及び、（３）CD3結合ドメインを形成するsc(Fv)2がペプチド結合を介して連結され得
る。この場合において、前記の二重特異性抗体を起源とするFc領域を用いることによって
、当該ポリペプチド会合体を構成する二つのFc領域のうち一方ののFc領域に重鎖CH1領域
が、もう一方のFc領域にsc(Fv)2がそれぞれペプチド結合を介して連結した構造を有する
ポリペプチド会合体が作製され得る。上記のポリペプチド会合体を作製するに際して、各
ドメインは直接ペプチド結合で結合される他、各ドメインはペプチドリンカーを介したペ
プチド結合で結合され得る。この場合において、採用されるリンカーとしては上記記載で
例示されるリンカーの他、例えばHisタグ、HAタグ、mycタグ、FLAGタグ等のペプチドタグ
を有するリンカーも適宜使用され得る。
【0160】
本発明に係るポリペプチド会合体の別の構造としては、例えば、（１）抗原結合ドメイ
ンとして二価のscFvである構造もまた好適に使用される。こうした構造の態様として、二
価のscFvの内の一方が（３）CD3結合ドメインを構成するVHを介して（２）Fcγ受容体に
対する結合活性が低下している二つのFc領域の内一つのFc領域にペプチド結合により連結
され、二価のscFvの内のもう一方が（３）CD3結合ドメインを構成するVLを介して（２）F
cγ受容体に対する結合活性が低下している二つのFc領域の内のもう一方のFc領域にペプ
チド結合により連結された構造を有するポリペプチド会合体が作製され得る。この場合に
おいて、前記の二重特異性抗体を起源とするFc領域を用いることも可能である。上記のポ
リペプチド会合体を作製するに際して、各ドメインは直接ペプチド結合で結合される他、
各ドメインはペプチドリンカーを介したペプチド結合で結合され得る。この場合において
、採用されるリンカーとしては上記記載で例示されるリンカーの他、例えばHisタグ、HA
タグ、mycタグ、FLAGタグ等のペプチドタグを有するリンカーも適宜使用され得る。
ンとして二価のscFvである構造もまた好適に使用される。こうした構造の態様として、二
価のscFvの内の一方が（３）CD3結合ドメインを構成するVHを介して（２）Fcγ受容体に
対する結合活性が低下している二つのFc領域の内一つのFc領域にペプチド結合により連結
され、二価のscFvの内のもう一方が（３）CD3結合ドメインを構成するVLを介して（２）F
cγ受容体に対する結合活性が低下している二つのFc領域の内のもう一方のFc領域にペプ
チド結合により連結された構造を有するポリペプチド会合体が作製され得る。この場合に
おいて、前記の二重特異性抗体を起源とするFc領域を用いることも可能である。上記のポ
リペプチド会合体を作製するに際して、各ドメインは直接ペプチド結合で結合される他、
各ドメインはペプチドリンカーを介したペプチド結合で結合され得る。この場合において
、採用されるリンカーとしては上記記載で例示されるリンカーの他、例えばHisタグ、HA
タグ、mycタグ、FLAGタグ等のペプチドタグを有するリンカーも適宜使用され得る。
【0161】
（１）抗原結合ドメインとして二価のscFvが用いられる構造のもう一つの態様として、
二価のscFvの内一方が（３）CD3結合ドメインを構成するscFvを介して（２）Fcγ受容体
に対する結合活性が低下している二つのFc領域の内一つのFc領域にペプチド結合により連
結され、二価のscFvの内のもう一方が（２）Fcγ受容体に対する結合活性が低下している
二つのFc領域の内のもう一方のFc領域にペプチド結合により連結された構造を有するポリ
ペプチド会合体が作製され得る。この場合において、前記の二重特異性抗体を起源とする
Fc領域を用いることによって、当該ポリペプチド会合体を構成する二つのFc領域のうち一
方ののFc領域にCD3結合ドメインを構成するscFvを介して抗原結合ドメインを構成するscF
vが、もう一方のFc領域に抗原結合ドメインを構成するscFvがそれぞれペプチド結合を介
して連結した構造を有するポリペプチド会合体が作製され得る。上記のポリペプチド会合
体を作製するに際して、各ドメインは直接ペプチド結合で結合される他、各ドメインはペ
プチドリンカーを介したペプチド結合で結合され得る。この場合において、採用されるリ
ンカーとしては上記で例示されるリンカーの他、例えばHisタグ、HAタグ、mycタグ、FLAG
タグ等のペプチドタグを有するリンカーも適宜使用され得る。
二価のscFvの内一方が（３）CD3結合ドメインを構成するscFvを介して（２）Fcγ受容体
に対する結合活性が低下している二つのFc領域の内一つのFc領域にペプチド結合により連
結され、二価のscFvの内のもう一方が（２）Fcγ受容体に対する結合活性が低下している
二つのFc領域の内のもう一方のFc領域にペプチド結合により連結された構造を有するポリ
ペプチド会合体が作製され得る。この場合において、前記の二重特異性抗体を起源とする
Fc領域を用いることによって、当該ポリペプチド会合体を構成する二つのFc領域のうち一
方ののFc領域にCD3結合ドメインを構成するscFvを介して抗原結合ドメインを構成するscF
vが、もう一方のFc領域に抗原結合ドメインを構成するscFvがそれぞれペプチド結合を介
して連結した構造を有するポリペプチド会合体が作製され得る。上記のポリペプチド会合
体を作製するに際して、各ドメインは直接ペプチド結合で結合される他、各ドメインはペ
プチドリンカーを介したペプチド結合で結合され得る。この場合において、採用されるリ
ンカーとしては上記で例示されるリンカーの他、例えばHisタグ、HAタグ、mycタグ、FLAG
タグ等のペプチドタグを有するリンカーも適宜使用され得る。
【0162】
本発明に係るポリペプチド会合体の別の構造としては、例えば、抗原結合ドメインおよ
びT細胞受容体複合体結合ドメインが各々一価のFabである構造も、また好適に使用される
。こうした構造の態様として、抗原結合ドメインを構成する一価のFabの重鎖Fv断片がCH1
領域を介してFc領域を構成する一方のポリペプチドに連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がC
L領域と連結され、T細胞受容体結合ドメインを構成するFabの重鎖Fv断片がCH1領域を介し
てFc領域を構成する他方のポリペプチドに連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がCL領域と連
結された構造を有するポリペプチド会合体が作製され得る。
びT細胞受容体複合体結合ドメインが各々一価のFabである構造も、また好適に使用される
。こうした構造の態様として、抗原結合ドメインを構成する一価のFabの重鎖Fv断片がCH1
領域を介してFc領域を構成する一方のポリペプチドに連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がC
L領域と連結され、T細胞受容体結合ドメインを構成するFabの重鎖Fv断片がCH1領域を介し
てFc領域を構成する他方のポリペプチドに連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がCL領域と連
結された構造を有するポリペプチド会合体が作製され得る。
【0163】
こうした構造の別の態様として、抗原結合ドメインを構成する一価のFabの重鎖Fv断片
がCH1領域を介してFc領域を構成する一方のポリペプチドに連結され、当該Fabの軽鎖Fv断
片がCL領域と連結され、T細胞受容体結合ドメインを構成するFabの軽鎖Fv断片がCH1領域
を介してFc領域を構成する他方のポリペプチドに連結され、当該Fabの重鎖Fv断片がCL領
域と連結された構造を有するポリペプチド会合体が作製され得る。また、T細胞受容体結
合ドメインを構成する一価のFabの重鎖Fv断片がCH1領域を介してFc領域を構成する一方の
ポリペプチドに連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がCL領域と連結され、抗原結合ドメイン
を構成するFabの軽鎖Fv断片がCH1領域を介してFc領域を構成する他方のポリペプチドに連
結され、当該Fabの重鎖Fv断片がCL領域と連結された構造を有するポリペプチド会合体も
また作製され得る。
がCH1領域を介してFc領域を構成する一方のポリペプチドに連結され、当該Fabの軽鎖Fv断
片がCL領域と連結され、T細胞受容体結合ドメインを構成するFabの軽鎖Fv断片がCH1領域
を介してFc領域を構成する他方のポリペプチドに連結され、当該Fabの重鎖Fv断片がCL領
域と連結された構造を有するポリペプチド会合体が作製され得る。また、T細胞受容体結
合ドメインを構成する一価のFabの重鎖Fv断片がCH1領域を介してFc領域を構成する一方の
ポリペプチドに連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がCL領域と連結され、抗原結合ドメイン
を構成するFabの軽鎖Fv断片がCH1領域を介してFc領域を構成する他方のポリペプチドに連
結され、当該Fabの重鎖Fv断片がCL領域と連結された構造を有するポリペプチド会合体も
また作製され得る。
【0164】
さらにこうした構造の別の態様として、抗原結合ドメインを構成する一価のFabの重鎖F
v断片がCH1領域を介してFc領域を構成する一方のポリペプチドに連結され、当該Fabの軽
鎖Fv断片がCL領域と連結され、T細胞受容体結合ドメインを構成するFabの重鎖Fv断片がCL
領域を介してFc領域を構成する他方のポリペプチドに連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がC
H1領域と連結された構造を有するポリペプチド会合体が作製され得る。また、T細胞受容
体結合ドメインを構成する一価のFabの重鎖Fv断片がCH1領域を介してFc領域を構成する一
方のポリペプチドに連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がCL領域と連結され、抗原結合ドメ
インを構成するFabの重鎖Fv断片がCL領域を介してFc領域を構成する他方のポリペプチド
に連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がCH1領域と連結された構造を有するポリペプチド会合
体が作製され得る。
v断片がCH1領域を介してFc領域を構成する一方のポリペプチドに連結され、当該Fabの軽
鎖Fv断片がCL領域と連結され、T細胞受容体結合ドメインを構成するFabの重鎖Fv断片がCL
領域を介してFc領域を構成する他方のポリペプチドに連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がC
H1領域と連結された構造を有するポリペプチド会合体が作製され得る。また、T細胞受容
体結合ドメインを構成する一価のFabの重鎖Fv断片がCH1領域を介してFc領域を構成する一
方のポリペプチドに連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がCL領域と連結され、抗原結合ドメ
インを構成するFabの重鎖Fv断片がCL領域を介してFc領域を構成する他方のポリペプチド
に連結され、当該Fabの軽鎖Fv断片がCH1領域と連結された構造を有するポリペプチド会合
体が作製され得る。
【0165】
本発明に係るポリペプチド会合体の別の構造である、抗原結合ドメインおよびT細胞受
容体複合体結合ドメインが各々一価のFabである構造の一態様として、
（１）抗原に結合する一価のFab構造の重鎖Fv断片がCH1領域を介して前記Fc領域を構成す
る一方のポリペプチドに連結され、当該Fab構造の軽鎖Fv断片がCL領域と連結された抗原
結合ドメイン、及び、
（２）T細胞受容体複合体に結合する一価のFab構造の重鎖Fv断片がCH1領域を介してFc領
域を構成する他方のポリペプチドに連結され、当該Fab構造の軽鎖Fv断片がCL領域と連結
されたT細胞受容体複合体結合ドメイン、
を含み、抗原結合ドメイン中の重鎖Fv断片と抗原結合ドメイン中の軽鎖Fv断片またはT細
胞受容体結合ドメイン中の重鎖Fv断片とT細胞受容体結合ドメイン中の軽鎖Fv断片が会合
するようにCH1領域とCL領域の電荷が制御されているポリペプチドが好適に挙げられる。
本態様においては、抗原結合ドメイン中の重鎖Fv断片と抗原結合ドメイン中の軽鎖Fv断片
またはT細胞受容体結合ドメイン中の重鎖Fv断片とT細胞受容体結合ドメイン中の軽鎖Fv断
片が会合するようにCH1領域とCL領域の電荷が制御されていればよく、そのポリペプチド
会合体の構造（会合制御構造）は特定の一構造に限定されない。
容体複合体結合ドメインが各々一価のFabである構造の一態様として、
（１）抗原に結合する一価のFab構造の重鎖Fv断片がCH1領域を介して前記Fc領域を構成す
る一方のポリペプチドに連結され、当該Fab構造の軽鎖Fv断片がCL領域と連結された抗原
結合ドメイン、及び、
（２）T細胞受容体複合体に結合する一価のFab構造の重鎖Fv断片がCH1領域を介してFc領
域を構成する他方のポリペプチドに連結され、当該Fab構造の軽鎖Fv断片がCL領域と連結
されたT細胞受容体複合体結合ドメイン、
を含み、抗原結合ドメイン中の重鎖Fv断片と抗原結合ドメイン中の軽鎖Fv断片またはT細
胞受容体結合ドメイン中の重鎖Fv断片とT細胞受容体結合ドメイン中の軽鎖Fv断片が会合
するようにCH1領域とCL領域の電荷が制御されているポリペプチドが好適に挙げられる。
本態様においては、抗原結合ドメイン中の重鎖Fv断片と抗原結合ドメイン中の軽鎖Fv断片
またはT細胞受容体結合ドメイン中の重鎖Fv断片とT細胞受容体結合ドメイン中の軽鎖Fv断
片が会合するようにCH1領域とCL領域の電荷が制御されていればよく、そのポリペプチド
会合体の構造（会合制御構造）は特定の一構造に限定されない。
【0166】
当該会合制御構造の一態様として、当該T細胞受容体複合体結合ドメイン中の重鎖Fv断
片に連結されたCH1領域のアミノ酸残基および当該抗原結合ドメイン中の軽鎖Fv断片に連
結されたCL領域のアミノ酸残基が互いに同種の電荷を有するポリペプチド会合体が作成さ
れ得る。
片に連結されたCH1領域のアミノ酸残基および当該抗原結合ドメイン中の軽鎖Fv断片に連
結されたCL領域のアミノ酸残基が互いに同種の電荷を有するポリペプチド会合体が作成さ
れ得る。
【0167】
当該会合制御構造の別の一態様として、当該抗原結合ドメイン中の重鎖Fv断片に連結さ
れたCH1領域のアミノ酸残基およびT細胞受容体複合体結合ドメイン中の軽鎖Fv断片に連結
されたCL領域のアミノ酸残基が互いに同種の電荷を有するポリペプチド会合体が作成され
得る。
れたCH1領域のアミノ酸残基およびT細胞受容体複合体結合ドメイン中の軽鎖Fv断片に連結
されたCL領域のアミノ酸残基が互いに同種の電荷を有するポリペプチド会合体が作成され
得る。
【0168】
当該会合制御構造のさらなる一態様として、当該T細胞受容体複合体結合ドメイン中の
重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ酸残基および当該抗原結合ドメイン中の軽鎖Fv
断片に連結されたCL領域のアミノ酸残基が互いに同種の電荷を有し、抗原結合ドメイン中
の重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ酸残基およびT細胞受容体複合体結合ドメイン
中の軽鎖Fv断片に連結されたCL領域のアミノ酸残基が互いに同種の電荷を有するポリペプ
チド会合体が作成され得る。
重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ酸残基および当該抗原結合ドメイン中の軽鎖Fv
断片に連結されたCL領域のアミノ酸残基が互いに同種の電荷を有し、抗原結合ドメイン中
の重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ酸残基およびT細胞受容体複合体結合ドメイン
中の軽鎖Fv断片に連結されたCL領域のアミノ酸残基が互いに同種の電荷を有するポリペプ
チド会合体が作成され得る。
【0169】
また、当該会合制御構造の一態様として、当該T細胞受容体複合体結合ドメイン中の重
鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ酸残基および当該抗原結合ドメイン中の軽鎖Fv断
片に連結されたCL領域のアミノ酸残基が互いに同種の電荷を有し、当該T細胞受容体複合
体結合ドメイン中の重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ酸残基および当該T細胞受容
体結合ドメイン中の軽鎖Fv断片に連結されたCL領域のアミノ酸残基が互いに異種の電荷を
有するポリペプチド会合体が作成され得る。
鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ酸残基および当該抗原結合ドメイン中の軽鎖Fv断
片に連結されたCL領域のアミノ酸残基が互いに同種の電荷を有し、当該T細胞受容体複合
体結合ドメイン中の重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ酸残基および当該T細胞受容
体結合ドメイン中の軽鎖Fv断片に連結されたCL領域のアミノ酸残基が互いに異種の電荷を
有するポリペプチド会合体が作成され得る。
【0170】
また、当該会合制御構造の別の一態様として、当該T細胞受容体複合体結合ドメイン中
の重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ酸残基および当該抗原結合ドメイン中の軽鎖F
v断片に連結されたCL領域のアミノ酸残基が互いに同種の電荷を有し、当該抗原結合ドメ
イン中の重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ酸残基および当該T細胞受容体複合体結
合ドメイン中の軽鎖Fv断片に連結されたCL領域のアミノ酸残基が互いに同種の電荷を有し
、当該T細胞受容体複合体結合ドメイン中の重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ酸残
基および当該T細胞受容体結合ドメイン中の軽鎖Fv断片に連結されたCL領域のアミノ酸残
基が互いに異種の電荷を有するポリペプチド会合体が作製され得る。
の重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ酸残基および当該抗原結合ドメイン中の軽鎖F
v断片に連結されたCL領域のアミノ酸残基が互いに同種の電荷を有し、当該抗原結合ドメ
イン中の重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ酸残基および当該T細胞受容体複合体結
合ドメイン中の軽鎖Fv断片に連結されたCL領域のアミノ酸残基が互いに同種の電荷を有し
、当該T細胞受容体複合体結合ドメイン中の重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ酸残
基および当該T細胞受容体結合ドメイン中の軽鎖Fv断片に連結されたCL領域のアミノ酸残
基が互いに異種の電荷を有するポリペプチド会合体が作製され得る。
【0171】
さらに、当該会合制御構造の一態様として、当該抗原結合ドメイン中の重鎖Fv断片に連
結されたCH1領域のアミノ酸残基および当該T細胞受容体複合体結合ドメイン中の軽鎖Fv断
片に連結されたCL領域のアミノ酸残基が互いに同種の電荷を有し、当該抗原結合ドメイン
中の重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ酸残基および当該抗原結合ドメイン中の軽
鎖Fv断片に連結されたCL領域のアミノ酸残基がともに異種の電荷を有するポリペプチド会
合体が作製され得る。
結されたCH1領域のアミノ酸残基および当該T細胞受容体複合体結合ドメイン中の軽鎖Fv断
片に連結されたCL領域のアミノ酸残基が互いに同種の電荷を有し、当該抗原結合ドメイン
中の重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ酸残基および当該抗原結合ドメイン中の軽
鎖Fv断片に連結されたCL領域のアミノ酸残基がともに異種の電荷を有するポリペプチド会
合体が作製され得る。
【0172】
さらに、当該会合制御構造の別の一態様として、当該T細胞受容体複合体結合ドメイン
中の重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ酸残基および当該抗原結合ドメイン中の軽
鎖Fv断片に連結されたCL領域のアミノ酸残基が互いに同種の電荷を有し、当該抗原結合ド
メイン中の重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ酸残基および当該T細胞受容体複合体
結合ドメイン中の軽鎖Fv断片に連結されたCL領域のアミノ酸残基が互いに同種の電荷を有
し、当該抗原結合ドメイン中の重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ酸残基および当
該抗原結合ドメイン中の軽鎖Fv断片に連結されたCL領域のアミノ酸残基がともに異種の電
荷を有するポリペプチド会合体が作製され得る。
中の重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ酸残基および当該抗原結合ドメイン中の軽
鎖Fv断片に連結されたCL領域のアミノ酸残基が互いに同種の電荷を有し、当該抗原結合ド
メイン中の重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ酸残基および当該T細胞受容体複合体
結合ドメイン中の軽鎖Fv断片に連結されたCL領域のアミノ酸残基が互いに同種の電荷を有
し、当該抗原結合ドメイン中の重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ酸残基および当
該抗原結合ドメイン中の軽鎖Fv断片に連結されたCL領域のアミノ酸残基がともに異種の電
荷を有するポリペプチド会合体が作製され得る。
【0173】
加えて、当該会合制御構造の異なる一態様として、当該T細胞受容体複合体結合ドメイ
ン中の重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ酸残基および当該抗原結合ドメイン中の
軽鎖Fv断片に連結されたCL領域のアミノ酸残基が互いに同種の電荷を有し、当該抗原結合
ドメイン中の重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ酸残基および当該T細胞受容体複合
体結合ドメイン中の軽鎖Fv断片に連結されたCL領域のアミノ酸残基が互いに同種の電荷を
有し、当該T細胞受容体複合体結合ドメイン中の重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ
酸残基および当該T細胞受容体結合ドメイン中の軽鎖Fv断片に連結されたCL領域のアミノ
酸残基が互いに異種の電荷を有し、抗原結合ドメイン中の重鎖Fv断片に連結されたCH1領
域のアミノ酸残基および抗原結合ドメイン中の軽鎖Fv断片に連結されたCL領域のアミノ酸
残基が互いに異種の電荷を有するポリペプチド会合体が作製され得る。
ン中の重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ酸残基および当該抗原結合ドメイン中の
軽鎖Fv断片に連結されたCL領域のアミノ酸残基が互いに同種の電荷を有し、当該抗原結合
ドメイン中の重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ酸残基および当該T細胞受容体複合
体結合ドメイン中の軽鎖Fv断片に連結されたCL領域のアミノ酸残基が互いに同種の電荷を
有し、当該T細胞受容体複合体結合ドメイン中の重鎖Fv断片に連結されたCH1領域のアミノ
酸残基および当該T細胞受容体結合ドメイン中の軽鎖Fv断片に連結されたCL領域のアミノ
酸残基が互いに異種の電荷を有し、抗原結合ドメイン中の重鎖Fv断片に連結されたCH1領
域のアミノ酸残基および抗原結合ドメイン中の軽鎖Fv断片に連結されたCL領域のアミノ酸
残基が互いに異種の電荷を有するポリペプチド会合体が作製され得る。
【0174】
CH1領域とCL領域の電荷の制御
T細胞受容体結合ドメインの重鎖と軽鎖によりT細胞受容体結合ドメインのエピトープを
認識し、また、抗原結合ドメインの重鎖と軽鎖により抗原のエピトープを認識するような
二重特異性ポリペプチド会合体を取得したい場合、当該ポリペプチド会合体の生産に際し
て4種のそれぞれの鎖を発現させると理論上10種類のポリペプチド会合体分子が生産され
る可能性がある。
T細胞受容体結合ドメインの重鎖と軽鎖によりT細胞受容体結合ドメインのエピトープを
認識し、また、抗原結合ドメインの重鎖と軽鎖により抗原のエピトープを認識するような
二重特異性ポリペプチド会合体を取得したい場合、当該ポリペプチド会合体の生産に際し
て4種のそれぞれの鎖を発現させると理論上10種類のポリペプチド会合体分子が生産され
る可能性がある。
【0175】
この場合、例えば、T細胞受容体結合ドメインの重鎖と抗原結合ドメインの軽鎖および
／または抗原結合ドメインの重鎖とT細胞受容体結合ドメインの軽鎖の間の会合を阻害す
るように制御すれば、所望のポリペプチド会合体分子を優先的に取得することが可能であ
る。
／または抗原結合ドメインの重鎖とT細胞受容体結合ドメインの軽鎖の間の会合を阻害す
るように制御すれば、所望のポリペプチド会合体分子を優先的に取得することが可能であ
る。
【0176】
例えば、T細胞受容体結合ドメインの重鎖CH1と抗原結合ドメインの軽鎖CL間の界面を形
成するアミノ酸残基を正の電荷を有するアミノ酸残基に改変し、抗原結合ドメインの重鎖
CH1とT細胞受容体結合ドメインの軽鎖CL間の界面を形成するアミノ酸残基を負の電荷を有
するアミノ酸残基に改変する例を挙げることができる。この改変により、目的としないT
細胞受容体結合ドメインの重鎖CH1と抗原結合ドメインの軽鎖CLとの会合は界面を形成す
るアミノ酸残基がどちらも正電荷であるため阻害され、目的としない抗原結合ドメインの
重鎖CH1とT細胞受容体結合ドメインの軽鎖CLとの会合は界面を形成するアミノ酸残基がど
ちらも負電荷であるため阻害される。その結果、目的とするT細胞受容体結合ドメインの
重鎖CH1とT細胞受容体結合ドメインの軽鎖CLとの会合及び目的とする抗原結合ドメインの
重鎖CH1と抗原結合ドメインの軽鎖CLとの会合が生じた本発明のポリペプチド会合体が効
率的に取得され得る。また、好適には、目的とするT細胞受容体結合ドメインの重鎖とT細
胞受容体結合ドメインの軽鎖との会合は、界面を形成するアミノ酸残基が互いに異種の電
荷を有するために促進され、目的とする抗原結合ドメインの重鎖と抗原結合ドメインの軽
鎖との会合も界面を形成するアミノ酸残基が互いに異種の電荷を有するため促進される。
その結果、目的とする会合が生じた本発明のポリペプチド会合体が効率的に取得され得る
。
成するアミノ酸残基を正の電荷を有するアミノ酸残基に改変し、抗原結合ドメインの重鎖
CH1とT細胞受容体結合ドメインの軽鎖CL間の界面を形成するアミノ酸残基を負の電荷を有
するアミノ酸残基に改変する例を挙げることができる。この改変により、目的としないT
細胞受容体結合ドメインの重鎖CH1と抗原結合ドメインの軽鎖CLとの会合は界面を形成す
るアミノ酸残基がどちらも正電荷であるため阻害され、目的としない抗原結合ドメインの
重鎖CH1とT細胞受容体結合ドメインの軽鎖CLとの会合は界面を形成するアミノ酸残基がど
ちらも負電荷であるため阻害される。その結果、目的とするT細胞受容体結合ドメインの
重鎖CH1とT細胞受容体結合ドメインの軽鎖CLとの会合及び目的とする抗原結合ドメインの
重鎖CH1と抗原結合ドメインの軽鎖CLとの会合が生じた本発明のポリペプチド会合体が効
率的に取得され得る。また、好適には、目的とするT細胞受容体結合ドメインの重鎖とT細
胞受容体結合ドメインの軽鎖との会合は、界面を形成するアミノ酸残基が互いに異種の電
荷を有するために促進され、目的とする抗原結合ドメインの重鎖と抗原結合ドメインの軽
鎖との会合も界面を形成するアミノ酸残基が互いに異種の電荷を有するため促進される。
その結果、目的とする会合が生じた本発明のポリペプチド会合体が効率的に取得され得る
。
【0177】
また、本発明の会合制御を利用することにより、CH1同士(T細胞受容体結合ドメインの
重鎖と抗原結合ドメインの重鎖)、あるいは、CL同士(T細胞受容体結合ドメインの軽鎖と
抗原結合ドメインの軽鎖)の会合を抑制することも可能である。
重鎖と抗原結合ドメインの重鎖)、あるいは、CL同士(T細胞受容体結合ドメインの軽鎖と
抗原結合ドメインの軽鎖)の会合を抑制することも可能である。
【0178】
当業者であれば、本発明によって会合を制御したい所望のポリペプチド会合体について
、会合した際のCH1とCLの界面において接近するアミノ酸残基の種類を適宜知ることが可
能である。
、会合した際のCH1とCLの界面において接近するアミノ酸残基の種類を適宜知ることが可
能である。
【0179】
また、ヒト、サル、マウス及びウサギ等の生物において、抗体のCH1又はCLとして利用可
能な配列を、当業者は、公共のデータベース等を利用して適宜取得することができる。よ
り具体的には、後述の実施例に記載の手段にて、CH1又はCLのアミノ酸配列情報が取得さ
れ得る。
能な配列を、当業者は、公共のデータベース等を利用して適宜取得することができる。よ
り具体的には、後述の実施例に記載の手段にて、CH1又はCLのアミノ酸配列情報が取得さ
れ得る。
【0180】
例えば、後述の実施例で示されるように、T細胞受容体結合ドメインまたは抗原結合ド
メインを構成するVHおよびVLにそれぞれ連結するCH1とCLが会合する際のCH1とCLの界面に
おいて接近（相対または接触）するアミノ酸残基の具体例として、以下の組合せが挙げら
れる。
・CH1のEUナンバリング147位（例えば、配列番号：１に記載のアミノ酸配列における147
位）のリジン(K)と、相対（接触）するCLのEUナンバリング180位のスレオニン(T)
・CH1のEUナンバリング147位のリジン(K)と、相対（接触）するCLのEUナンバリング131位
のセリン(S)
・CH1のEUナンバリング147位のリジン(K)と、相対（接触）するCLのEUナンバリング164位
のスレオニン(T)
・CH1のEUナンバリング147位のリジン(K)と、相対（接触）するCLのEUナンバリング138位
のアスパラギン(N)
・CH1のEUナンバリング147位のリジン(K)と、相対（接触）するCLのEUナンバリング123位
のグルタミン酸(E)
・CH1のEUナンバリング175位のグルタミン（Q）と、相対（接触）するCLのEUナンバリン
グ160位のグルタミン（Q）
・CH1のEUナンバリング213位のリジン(K)と、相対（接触）するCLのEUナンバリング123位
のグルタミン酸(E)
なお、これら部位のナンバリングについては、Kabatらの文献(Kabat EA et al. 1991.
Sequence of Proteins of Immunological Interest. NIH)を参考にしている。
また、本発明におけるEUナンバリングとして記載された番号は、EU numbering(Sequences
of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242)にしたがって
記載した ものである。なお本発明において、「EUナンバリングX位のアミノ酸残基」、「
EUナンバリングX位のアミノ酸」（Xは任意の数）は、「EUナンバリングX位に相当するア
ミノ酸残基」、「EUナンバリングX位に相当するアミノ酸」と読みかえることも可能であ
る。
メインを構成するVHおよびVLにそれぞれ連結するCH1とCLが会合する際のCH1とCLの界面に
おいて接近（相対または接触）するアミノ酸残基の具体例として、以下の組合せが挙げら
れる。
・CH1のEUナンバリング147位（例えば、配列番号：１に記載のアミノ酸配列における147
位）のリジン(K)と、相対（接触）するCLのEUナンバリング180位のスレオニン(T)
・CH1のEUナンバリング147位のリジン(K)と、相対（接触）するCLのEUナンバリング131位
のセリン(S)
・CH1のEUナンバリング147位のリジン(K)と、相対（接触）するCLのEUナンバリング164位
のスレオニン(T)
・CH1のEUナンバリング147位のリジン(K)と、相対（接触）するCLのEUナンバリング138位
のアスパラギン(N)
・CH1のEUナンバリング147位のリジン(K)と、相対（接触）するCLのEUナンバリング123位
のグルタミン酸(E)
・CH1のEUナンバリング175位のグルタミン（Q）と、相対（接触）するCLのEUナンバリン
グ160位のグルタミン（Q）
・CH1のEUナンバリング213位のリジン(K)と、相対（接触）するCLのEUナンバリング123位
のグルタミン酸(E)
なお、これら部位のナンバリングについては、Kabatらの文献(Kabat EA et al. 1991.
Sequence of Proteins of Immunological Interest. NIH)を参考にしている。
また、本発明におけるEUナンバリングとして記載された番号は、EU numbering(Sequences
of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242)にしたがって
記載した ものである。なお本発明において、「EUナンバリングX位のアミノ酸残基」、「
EUナンバリングX位のアミノ酸」（Xは任意の数）は、「EUナンバリングX位に相当するア
ミノ酸残基」、「EUナンバリングX位に相当するアミノ酸」と読みかえることも可能であ
る。
【0181】
後述の実施例で示すように、これらアミノ酸残基を改変し、本発明の方法を実施するこ
とにより、所望のポリペプチド会合体が優先的に取得され得る。
とにより、所望のポリペプチド会合体が優先的に取得され得る。
【0182】
これらアミノ酸残基は、ヒトおよびマウスにおいて高度に保存されていることが知られ
ている(J. Mol. Recognit. (2003) 16, 113-120)ことから、実施例に示すポリペプチド会
合体以外のCH1とCLの会合についても、上記アミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を改変
することによって、本発明のポリペプチド会合体の定常領域の会合が制御され得る。
ている(J. Mol. Recognit. (2003) 16, 113-120)ことから、実施例に示すポリペプチド会
合体以外のCH1とCLの会合についても、上記アミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を改変
することによって、本発明のポリペプチド会合体の定常領域の会合が制御され得る。
【0183】
即ち、本発明は、重鎖と軽鎖の会合が制御されたポリペプチド会合体であって、以下の
（ａ）～（ｆ）に示すアミノ酸残基の組からなる群より選択される1組または２組以上の
アミノ酸残基が同種の電荷を有するポリペプチド会合体を提供する；
（ａ）CH1に含まれるアミノ酸残基であってEUナンバリング147位のアミノ酸残基、及びCL
に含まれるアミノ酸残基であってEUナンバリング180位のアミノ酸残基、
（ｂ）CH1に含まれるアミノ酸残基であってEUナンバリング147位のアミノ酸残基、及びCL
に含まれるアミノ酸残基であってEUナンバリング131位のアミノ酸残基、
（ｃ）CH1に含まれるアミノ酸残基であってEUナンバリング147位のアミノ酸残基、及びCL
に含まれるアミノ酸残基であってEUナンバリング164位のアミノ酸残基、
（ｄ）CH1に含まれるアミノ酸残基であってEUナンバリング147位のアミノ酸残基、及びCL
に含まれるアミノ酸残基であってEUナンバリング138位のアミノ酸残基、
（ｅ）CH1に含まれるアミノ酸残基であってEUナンバリング147位のアミノ酸残基、及びCL
に含まれるアミノ酸残基であってEUナンバリング123位のアミノ酸残基、
（ｆ）CH1に含まれるアミノ酸残基であってEUナンバリング175位のアミノ酸残基、及びCL
に含まれるアミノ酸残基であってEUナンバリング160位のアミノ酸残基。
（ａ）～（ｆ）に示すアミノ酸残基の組からなる群より選択される1組または２組以上の
アミノ酸残基が同種の電荷を有するポリペプチド会合体を提供する；
（ａ）CH1に含まれるアミノ酸残基であってEUナンバリング147位のアミノ酸残基、及びCL
に含まれるアミノ酸残基であってEUナンバリング180位のアミノ酸残基、
（ｂ）CH1に含まれるアミノ酸残基であってEUナンバリング147位のアミノ酸残基、及びCL
に含まれるアミノ酸残基であってEUナンバリング131位のアミノ酸残基、
（ｃ）CH1に含まれるアミノ酸残基であってEUナンバリング147位のアミノ酸残基、及びCL
に含まれるアミノ酸残基であってEUナンバリング164位のアミノ酸残基、
（ｄ）CH1に含まれるアミノ酸残基であってEUナンバリング147位のアミノ酸残基、及びCL
に含まれるアミノ酸残基であってEUナンバリング138位のアミノ酸残基、
（ｅ）CH1に含まれるアミノ酸残基であってEUナンバリング147位のアミノ酸残基、及びCL
に含まれるアミノ酸残基であってEUナンバリング123位のアミノ酸残基、
（ｆ）CH1に含まれるアミノ酸残基であってEUナンバリング175位のアミノ酸残基、及びCL
に含まれるアミノ酸残基であってEUナンバリング160位のアミノ酸残基。
【0184】
本発明の別の態様として、さらに、以下の（ｇ）に示すアミノ酸残基の組のアミノ酸残
基が同種の電荷である抗体を提供する；
（ｇ）CH1に含まれるアミノ酸残基であってEUナンバリング213位のアミノ酸残基、及びCL
に含まれるアミノ酸残基であってEUナンバリング123位のアミノ酸残基。
基が同種の電荷である抗体を提供する；
（ｇ）CH1に含まれるアミノ酸残基であってEUナンバリング213位のアミノ酸残基、及びCL
に含まれるアミノ酸残基であってEUナンバリング123位のアミノ酸残基。
【0185】
上記組合せに記載のそれぞれのアミノ酸残基は、後述の実施例に示すように、会合した
際に互いに接近している。当業者は、所望のCH1またはCLについて、市販のソフトウェア
を用いたホモロジーモデリング等により、上記（ａ）～（ｇ）に記載のアミノ酸残基に対
応する部位を見出すことができ、適宜、該部位のアミノ酸残基を改変に供することが可能
である。
際に互いに接近している。当業者は、所望のCH1またはCLについて、市販のソフトウェア
を用いたホモロジーモデリング等により、上記（ａ）～（ｇ）に記載のアミノ酸残基に対
応する部位を見出すことができ、適宜、該部位のアミノ酸残基を改変に供することが可能
である。
【0186】
上記抗体において、「電荷を有するアミノ酸残基」は、例えば、以下の（Ｘ）または（
Ｙ）のいずれかの群に含まれるアミノ酸残基から選択されることが好ましい；
（Ｘ）グルタミン酸（E）、アスパラギン酸（D）、
（Ｙ）リジン（K）、アルギニン（R）、ヒスチジン（H）。
Ｙ）のいずれかの群に含まれるアミノ酸残基から選択されることが好ましい；
（Ｘ）グルタミン酸（E）、アスパラギン酸（D）、
（Ｙ）リジン（K）、アルギニン（R）、ヒスチジン（H）。
【0187】
上記ポリペプチド会合体において、「同種の電荷を有する」とは、例えば、２つ以上の
アミノ酸残基のいずれもが、上記（Ｘ）または（Ｙ）のいずれか１の群に含まれるアミノ
酸残基を有することを意味する。「反対の電荷を有する」とは、例えば、２つ以上のアミ
ノ酸残基のなかの少なくとも１つのアミノ酸残基が、上記（Ｘ）または（Ｙ）のいずれか
１の群に含まれるアミノ酸残基を有する場合に、残りのアミノ酸残基が異なる群に含まれ
るアミノ酸残基を有することを意味する。
アミノ酸残基のいずれもが、上記（Ｘ）または（Ｙ）のいずれか１の群に含まれるアミノ
酸残基を有することを意味する。「反対の電荷を有する」とは、例えば、２つ以上のアミ
ノ酸残基のなかの少なくとも１つのアミノ酸残基が、上記（Ｘ）または（Ｙ）のいずれか
１の群に含まれるアミノ酸残基を有する場合に、残りのアミノ酸残基が異なる群に含まれ
るアミノ酸残基を有することを意味する。
【0188】
また、上述のポリペプチド会合体の製造方法、および、上記（a）～（ｇ）に示すアミ
ノ酸残基の組のアミノ酸残基が同種の電荷を有するアミノ酸残基となるように改変する本
発明の会合制御方法もまた、本発明の好ましい態様である。
ノ酸残基の組のアミノ酸残基が同種の電荷を有するアミノ酸残基となるように改変する本
発明の会合制御方法もまた、本発明の好ましい態様である。
【0189】
本発明において「改変」に供するアミノ酸残基としては、上述した定常領域のアミノ酸
残基に限られない。当業者であれば、ポリペプチド変異体または異種多量体について、市
販のソフトウェアを用いたホモロジーモデリング等により、界面を形成するアミノ酸残基
を見出すことができ、会合を制御するように、該部位のアミノ酸残基を改変に供すること
が可能である。
残基に限られない。当業者であれば、ポリペプチド変異体または異種多量体について、市
販のソフトウェアを用いたホモロジーモデリング等により、界面を形成するアミノ酸残基
を見出すことができ、会合を制御するように、該部位のアミノ酸残基を改変に供すること
が可能である。
【0190】
重鎖可変領域と軽鎖可変領域の界面に電荷的な反発を導入して目的としない重鎖と軽鎖
の会合を抑制させる技術において、重鎖可変領域（VH）と軽鎖可変領域（VL）の界面で接
触するアミノ酸残基としては、例えば、重鎖可変領域FR2の39位（例えば、WO2006/106905
において配列番号：６として記載されたアミノ酸配列における39番目）のグルタミン(Q)
と、相対（接触）する軽鎖可変領域FR2の38位（例えば、WO2006/106905において配列番号
：８として記載されたアミノ酸配列における44番目）のグルタミン(Q)が挙げられ得る。
さらに、重鎖可変領域FR2の45位（例えば、WO2006/106905において配列番号：６として記
載されたアミノ酸配列における45番目）のロイシン(L)と、相対する軽鎖可変領域FR2の44
位（例えば、WO2006/106905において配列番号：８に記載のアミノ酸配列における50番目
）のプロリン(P)が好適に例示され得る。なお、これら部位のナンバリングについては、K
abatらの文献(Kabat EA et al. 1991. Sequence of Proteins of Immunological Interes
t. NIH)を参考にしている。
の会合を抑制させる技術において、重鎖可変領域（VH）と軽鎖可変領域（VL）の界面で接
触するアミノ酸残基としては、例えば、重鎖可変領域FR2の39位（例えば、WO2006/106905
において配列番号：６として記載されたアミノ酸配列における39番目）のグルタミン(Q)
と、相対（接触）する軽鎖可変領域FR2の38位（例えば、WO2006/106905において配列番号
：８として記載されたアミノ酸配列における44番目）のグルタミン(Q)が挙げられ得る。
さらに、重鎖可変領域FR2の45位（例えば、WO2006/106905において配列番号：６として記
載されたアミノ酸配列における45番目）のロイシン(L)と、相対する軽鎖可変領域FR2の44
位（例えば、WO2006/106905において配列番号：８に記載のアミノ酸配列における50番目
）のプロリン(P)が好適に例示され得る。なお、これら部位のナンバリングについては、K
abatらの文献(Kabat EA et al. 1991. Sequence of Proteins of Immunological Interes
t. NIH)を参考にしている。
【0191】
これらアミノ酸残基は、ヒトおよびマウスにおいて高度に保存されていることが知られ
ている(J. Mol. Recognit. (2003) 16, 113-120)ことから、実施例に示すポリペプチド会
合体以外のVHとVLの会合についても、上記アミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を改変す
ることによって、抗体の可変領域の会合が制御され得る。
ている(J. Mol. Recognit. (2003) 16, 113-120)ことから、実施例に示すポリペプチド会
合体以外のVHとVLの会合についても、上記アミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を改変す
ることによって、抗体の可変領域の会合が制御され得る。
【0192】
より具体的には、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体においては、以下の（１
）と（２）、または、（３）と（４）のアミノ酸残基が同種の電荷を有するアミノ酸残基
である抗体とすることが挙げられ得る；
（１）重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、EUナンバリング39位に相当するア
ミノ酸残基、
（２）軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、EUナンバリング38位に相当するア
ミノ酸残基、
（３）重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、EUナンバリング45位に相当するア
ミノ酸残基、
（４）軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、EUナンバリング44位に相当するア
ミノ酸残基。
）と（２）、または、（３）と（４）のアミノ酸残基が同種の電荷を有するアミノ酸残基
である抗体とすることが挙げられ得る；
（１）重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、EUナンバリング39位に相当するア
ミノ酸残基、
（２）軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、EUナンバリング38位に相当するア
ミノ酸残基、
（３）重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、EUナンバリング45位に相当するア
ミノ酸残基、
（４）軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、EUナンバリング44位に相当するア
ミノ酸残基。
【0193】
上記（１）と（２）、（３）と（４）に記載のそれぞれのアミノ酸残基は、会合した際
に互いに接近している。当業者は、所望の重鎖可変領域または軽鎖可変領域について、市
販のソフトウェアを用いたホモロジーモデリング等により、上記（１）～（４）に記載の
アミノ酸残基に対応する部位を見出すことができ、適宜、該部位のアミノ酸残基を改変に
供することが可能である。
に互いに接近している。当業者は、所望の重鎖可変領域または軽鎖可変領域について、市
販のソフトウェアを用いたホモロジーモデリング等により、上記（１）～（４）に記載の
アミノ酸残基に対応する部位を見出すことができ、適宜、該部位のアミノ酸残基を改変に
供することが可能である。
【0194】
上記抗体において、「電荷を有するアミノ酸残基」は、例えば、以下の（X）または（Y
）のいずれかの群に含まれるアミノ酸残基から選択されることが好ましい；
（X）グルタミン酸（E）、アスパラギン酸（D）、
（Y）リジン（K）、アルギニン（R）、ヒスチジン（H）。
）のいずれかの群に含まれるアミノ酸残基から選択されることが好ましい；
（X）グルタミン酸（E）、アスパラギン酸（D）、
（Y）リジン（K）、アルギニン（R）、ヒスチジン（H）。
【0195】
上記（１）～（４）に記載のアミノ酸残基は、通常、ヒトおよびマウスにおいてはそれ
ぞれ
（１）グルタミン(Q)、
（２）グルタミン(Q)、
（３）ロイシン(L)、
（４）プロリン(P)
である。従って本発明の好ましい態様においては、これらアミノ酸残基が改変（例えば、
電荷アミノ酸への置換）に供される。なお、上記（１）～（４）のアミノ酸残基の種類は
、必ずしも上記のアミノ酸残基に限定されず、該アミノ酸に相当する他のアミノ酸であっ
てもよい。例えば、軽鎖可変領域上のEUナンバリング38位に相当するアミノ酸として、ヒ
トの場合、例えば、ヒスチジン(H)であってもよい。当業者は、公知文献等（例えば、J.
Mol. Recognit. (2003) 16, 113-120）を参照することにより、軽鎖の任意の位置につい
て、その位置に相当するアミノ酸残基の種類を知ることが可能であり、適宜、当該アミノ
酸残基について改変（例えば、電荷アミノ酸へ置換）することができる。
ぞれ
（１）グルタミン(Q)、
（２）グルタミン(Q)、
（３）ロイシン(L)、
（４）プロリン(P)
である。従って本発明の好ましい態様においては、これらアミノ酸残基が改変（例えば、
電荷アミノ酸への置換）に供される。なお、上記（１）～（４）のアミノ酸残基の種類は
、必ずしも上記のアミノ酸残基に限定されず、該アミノ酸に相当する他のアミノ酸であっ
てもよい。例えば、軽鎖可変領域上のEUナンバリング38位に相当するアミノ酸として、ヒ
トの場合、例えば、ヒスチジン(H)であってもよい。当業者は、公知文献等（例えば、J.
Mol. Recognit. (2003) 16, 113-120）を参照することにより、軽鎖の任意の位置につい
て、その位置に相当するアミノ酸残基の種類を知ることが可能であり、適宜、当該アミノ
酸残基について改変（例えば、電荷アミノ酸へ置換）することができる。
【0196】
重鎖可変領域と軽鎖可変領域の界面に存在する疎水性コアを形成するアミノ酸残基を電
荷を有する極性アミノ酸へ改変して、目的としない重鎖と軽鎖の会合を抑制する技術にお
いて、重鎖可変領域（VH）と軽鎖可変領域（VL）の界面で疎水性コアを形成し得るアミノ
酸残基としては、例えば、重鎖可変領域上の45位のロイシン(L)と、相対する軽鎖可変領
域上の44位のプロリン(P)を好適に例示することができる。
荷を有する極性アミノ酸へ改変して、目的としない重鎖と軽鎖の会合を抑制する技術にお
いて、重鎖可変領域（VH）と軽鎖可変領域（VL）の界面で疎水性コアを形成し得るアミノ
酸残基としては、例えば、重鎖可変領域上の45位のロイシン(L)と、相対する軽鎖可変領
域上の44位のプロリン(P)を好適に例示することができる。
【0197】
一般的に、「疎水性コア（hydrophobic core）」とは、会合したポリペプチドの内側に
疎水性アミノ酸の側鎖が集合して形成する部分を指す。疎水性アミノ酸には、例えばアラ
ニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトフ
ァン、バリンなどが含まれる。また、疎水コアの形成には、疎水性アミノ酸以外のアミノ
酸残基（例えばチロシン）が関わることもある。この疎水性コアは、親水性アミノ酸の側
鎖が外側に露出する親水性表面とともに、水溶性のポリペプチドの会合を進める駆動力と
なる。異なる２つのドメインの疎水性アミノ酸が分子表面に存在し、水分子に暴露される
とエントロピーが増大し自由エネルギーが増大してしまう。よって、２つのドメインは自
由エネルギーを減少させ、安定化するために、互いに会合し、界面の疎水性アミノ酸は分
子内部に埋もれ、疎水コアを形成することになる。
疎水性アミノ酸の側鎖が集合して形成する部分を指す。疎水性アミノ酸には、例えばアラ
ニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトフ
ァン、バリンなどが含まれる。また、疎水コアの形成には、疎水性アミノ酸以外のアミノ
酸残基（例えばチロシン）が関わることもある。この疎水性コアは、親水性アミノ酸の側
鎖が外側に露出する親水性表面とともに、水溶性のポリペプチドの会合を進める駆動力と
なる。異なる２つのドメインの疎水性アミノ酸が分子表面に存在し、水分子に暴露される
とエントロピーが増大し自由エネルギーが増大してしまう。よって、２つのドメインは自
由エネルギーを減少させ、安定化するために、互いに会合し、界面の疎水性アミノ酸は分
子内部に埋もれ、疎水コアを形成することになる。
【0198】
ポリペプチドの会合が起こる際に、疎水性コアを形成する疎水性アミノ酸からを電荷を
持つ極性アミノ酸へ改変することにより、疎水性コアの形成が阻害され、その結果、ポリ
ペプチドの会合が阻害されるものと考えられる。
持つ極性アミノ酸へ改変することにより、疎水性コアの形成が阻害され、その結果、ポリ
ペプチドの会合が阻害されるものと考えられる。
【0199】
本発明のポリペプチド会合体には、さらに他の公知技術を適用することができる。例え
ば、第一のVH（VH1）と第一のVL（VL1）、および／または第二のVH(VH2)と第二のVL（VL2
）の会合が促進されるように、本発明の「改変」に加えて、一方のH鎖の可変領域に存在
するアミノ酸側鎖をより大きい側鎖(knob; 突起)に置換し、もう一方のH鎖の相対する可
変領域に存在するアミノ酸側鎖をより小さい側鎖(hole; 空隙)に置換することによって、
突起が空隙に配置され得るようにしてVH1とVL1、および／またはVH2とVL2の会合を促進さ
せ、結果的にVH1とVL2、および／またはVH2とVL1のポリペプチド間の会合をさらに抑制す
ることが可能である（WO1996/027011、Ridgway JB et al., Protein Engineering (1996)
9, 617-621、Merchant AM et al. Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681）。
ば、第一のVH（VH1）と第一のVL（VL1）、および／または第二のVH(VH2)と第二のVL（VL2
）の会合が促進されるように、本発明の「改変」に加えて、一方のH鎖の可変領域に存在
するアミノ酸側鎖をより大きい側鎖(knob; 突起)に置換し、もう一方のH鎖の相対する可
変領域に存在するアミノ酸側鎖をより小さい側鎖(hole; 空隙)に置換することによって、
突起が空隙に配置され得るようにしてVH1とVL1、および／またはVH2とVL2の会合を促進さ
せ、結果的にVH1とVL2、および／またはVH2とVL1のポリペプチド間の会合をさらに抑制す
ることが可能である（WO1996/027011、Ridgway JB et al., Protein Engineering (1996)
9, 617-621、Merchant AM et al. Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681）。
【0200】
上記のポリペプチド会合体を作製するに際して、各ドメインは直接ペプチド結合で結合
される他、各ドメインはペプチドリンカーを介したペプチド結合で結合され得る。この場
合において、採用されるリンカーとしては上記で例示されるリンカーの他、例えばHisタ
グ、HAタグ、mycタグ、FLAGタグ等のペプチドタグを有するリンカーも適宜使用され得る
。また、水素結合、ジスルフィド結合、共有結合、イオン性相互作用またはこれらの結合
の組合せにより互いに結合する性質もまた好適に利用され得る。例えば、抗体のCH1とCL
間の親和性が利用されたり、ヘテロFc領域の会合に際して前述の二重特異性抗体を起源と
するFc領域が用いられたりする。さらに、実施例で記載されるように、ドメイン間に形成
されるジスルフィド結合もまた好適に利用され得る。
される他、各ドメインはペプチドリンカーを介したペプチド結合で結合され得る。この場
合において、採用されるリンカーとしては上記で例示されるリンカーの他、例えばHisタ
グ、HAタグ、mycタグ、FLAGタグ等のペプチドタグを有するリンカーも適宜使用され得る
。また、水素結合、ジスルフィド結合、共有結合、イオン性相互作用またはこれらの結合
の組合せにより互いに結合する性質もまた好適に利用され得る。例えば、抗体のCH1とCL
間の親和性が利用されたり、ヘテロFc領域の会合に際して前述の二重特異性抗体を起源と
するFc領域が用いられたりする。さらに、実施例で記載されるように、ドメイン間に形成
されるジスルフィド結合もまた好適に利用され得る。
【0201】
【0202】
本発明に係るポリペプチド会合体は前記組換え抗体の製造方法と同じ手法により作製さ
れる。
れる。
【0203】
また本発明は、本発明のポリペプチド会合体をコードするポリヌクレオチドに関する。
本発明のポリペプチド会合体は、任意の発現ベクターに組み込むことができる。発現ベク
ターで適当な宿主を形質転換し、ポリペプチド会合体の発現細胞とすることができる。ポ
リペプチド会合体の発現細胞を培養し、培養上清から発現産物を回収すれば、当該ポリヌ
クレオチドによってコードされるポリペプチド会合体を取得することができる。即ち本発
明は、本発明のポリペプチド会合体をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、当該
ベクターを保持する細胞、および当該細胞を培養し培養上清からポリペプチド会合体を回
収することを含むポリペプチド会合体の製造方法に関する。これらは例えば、前記組換え
抗体と同様の手法により得ることができる。
本発明のポリペプチド会合体は、任意の発現ベクターに組み込むことができる。発現ベク
ターで適当な宿主を形質転換し、ポリペプチド会合体の発現細胞とすることができる。ポ
リペプチド会合体の発現細胞を培養し、培養上清から発現産物を回収すれば、当該ポリヌ
クレオチドによってコードされるポリペプチド会合体を取得することができる。即ち本発
明は、本発明のポリペプチド会合体をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、当該
ベクターを保持する細胞、および当該細胞を培養し培養上清からポリペプチド会合体を回
収することを含むポリペプチド会合体の製造方法に関する。これらは例えば、前記組換え
抗体と同様の手法により得ることができる。
【0204】
医薬組成物
別の観点においては、本発明は、（１）抗原結合ドメイン（２）Fcγ受容体に対する結
合活性が低下しているFc領域を含むドメイン、及び（３）CD3結合ドメイン、を含むポリ
ペプチド会合体を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。又、本発明は当該会合
体を有効成分として含有する細胞傷害を誘導する治療剤（細胞傷害誘導治療剤）、細胞増
殖抑制剤および抗癌剤に関する。本発明の医薬組成物は、癌治療剤あるいは癌予防剤とし
て用いることもできる。本発明の細胞傷害誘導治療剤、細胞増殖抑制剤および抗癌剤は、
癌を罹患している対象または再発する可能性がある対象に投与されることが好ましい。
別の観点においては、本発明は、（１）抗原結合ドメイン（２）Fcγ受容体に対する結
合活性が低下しているFc領域を含むドメイン、及び（３）CD3結合ドメイン、を含むポリ
ペプチド会合体を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。又、本発明は当該会合
体を有効成分として含有する細胞傷害を誘導する治療剤（細胞傷害誘導治療剤）、細胞増
殖抑制剤および抗癌剤に関する。本発明の医薬組成物は、癌治療剤あるいは癌予防剤とし
て用いることもできる。本発明の細胞傷害誘導治療剤、細胞増殖抑制剤および抗癌剤は、
癌を罹患している対象または再発する可能性がある対象に投与されることが好ましい。
【0205】
また、本発明において、
（１）抗原結合ドメイン、
（２）Fcγ受容体に対する結合活性が低下しているFc領域を含むドメイン、及び
（３）CD3結合ドメイン、
を含むポリペプチド会合体を有効成分として含有する、細胞傷害誘導治療剤、細胞増殖抑
制剤および抗癌剤は、当該ポリペプチド会合体を対象に投与する工程を含む癌を予防また
は治療する方法、または、細胞傷害誘導治療剤、細胞増殖抑制剤および抗癌剤の製造にお
ける当該ポリペプチド会合体の使用と表現することもできる。
（１）抗原結合ドメイン、
（２）Fcγ受容体に対する結合活性が低下しているFc領域を含むドメイン、及び
（３）CD3結合ドメイン、
を含むポリペプチド会合体を有効成分として含有する、細胞傷害誘導治療剤、細胞増殖抑
制剤および抗癌剤は、当該ポリペプチド会合体を対象に投与する工程を含む癌を予防また
は治療する方法、または、細胞傷害誘導治療剤、細胞増殖抑制剤および抗癌剤の製造にお
ける当該ポリペプチド会合体の使用と表現することもできる。
【0206】
本発明において、「（１）抗原結合ドメイン、（２）Fcγ受容体に対する結合活性が低
下しているFc領域を含むドメイン、及び（３）CD3結合ドメイン、を含むポリペプチド会
合体を有効成分として含有する」とは、当該ポリペプチド会合体を主要な活性成分として
含むという意味であり、当該ポリペプチド会合体の含有率を制限するものではない。
下しているFc領域を含むドメイン、及び（３）CD3結合ドメイン、を含むポリペプチド会
合体を有効成分として含有する」とは、当該ポリペプチド会合体を主要な活性成分として
含むという意味であり、当該ポリペプチド会合体の含有率を制限するものではない。
【0207】
更に本発明における医薬組成物、あるいは細胞傷害誘導治療剤、細胞増殖抑制剤および
抗癌剤には、必要に応じて複数種類のポリペプチド会合体が配合され得る。たとえば、同
一の抗原に結合する複数の本発明のポリペプチド会合体のカクテルとすることによって、
当該抗原を発現する細胞に対する細胞傷害作用を強化できる可能性がある。あるいは、一
つの抗原に対する抗原結合ドメインを含む本発明のポリペプチド会合体に加えて、他の癌
抗原に結合する抗原結合ドメインを含む本発明のポリペプチド会合体を配合することによ
り、治療効果が高められる。
抗癌剤には、必要に応じて複数種類のポリペプチド会合体が配合され得る。たとえば、同
一の抗原に結合する複数の本発明のポリペプチド会合体のカクテルとすることによって、
当該抗原を発現する細胞に対する細胞傷害作用を強化できる可能性がある。あるいは、一
つの抗原に対する抗原結合ドメインを含む本発明のポリペプチド会合体に加えて、他の癌
抗原に結合する抗原結合ドメインを含む本発明のポリペプチド会合体を配合することによ
り、治療効果が高められる。
【0208】
また、必要に応じ本発明のポリペプチド会合体はマイクロカプセル（ヒドロキシメチル
セルロース、ゼラチン、ポリ［メチルメタクリル酸］等のマイクロカプセル）に封入され
、コロイドドラッグデリバリーシステム（リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイ
クロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等）とされ得る（"Remington’s Pharmace
utical Science 16th edition", Oslo Ed. (1980)等参照）。さらに、薬剤を徐放性の薬
剤とする方法も公知であり、当該方法は本発明のポリペプチド会合体に適用され得る（J.
Biomed.Mater.Res. (1981) 15, 267-277、Chemtech. (1982) 12, 98-105、米国特許第377
3719号、欧州特許公開公報EP58481号・EP133988号、Biopolymers (1983) 22, 547-556）
。
セルロース、ゼラチン、ポリ［メチルメタクリル酸］等のマイクロカプセル）に封入され
、コロイドドラッグデリバリーシステム（リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイ
クロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等）とされ得る（"Remington’s Pharmace
utical Science 16th edition", Oslo Ed. (1980)等参照）。さらに、薬剤を徐放性の薬
剤とする方法も公知であり、当該方法は本発明のポリペプチド会合体に適用され得る（J.
Biomed.Mater.Res. (1981) 15, 267-277、Chemtech. (1982) 12, 98-105、米国特許第377
3719号、欧州特許公開公報EP58481号・EP133988号、Biopolymers (1983) 22, 547-556）
。
【0209】
本発明の医薬組成物、あるいは細胞増殖抑制剤および抗癌剤は、経口、非経口投与のい
ずれかによって患者に投与することができる。好ましくは非経口投与である。係る投与方
法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注
射投与としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などが挙げら
れる。例えば注射投与によって本発明の医薬組成物、あるいは細胞傷害誘導治療剤、細胞
増殖抑制剤および抗癌剤が全身または局部的に投与できる。また、患者の年齢、症状によ
り適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、一回の投与につき体
重1 kgあたり0.0001 mgから1000 mgの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、患
者あたり0.001 mg/bodyから100000 mg/bodyの範囲で投与量が選択され得る。しかしなが
ら、本発明の医薬組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。
ずれかによって患者に投与することができる。好ましくは非経口投与である。係る投与方
法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注
射投与としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などが挙げら
れる。例えば注射投与によって本発明の医薬組成物、あるいは細胞傷害誘導治療剤、細胞
増殖抑制剤および抗癌剤が全身または局部的に投与できる。また、患者の年齢、症状によ
り適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、一回の投与につき体
重1 kgあたり0.0001 mgから1000 mgの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、患
者あたり0.001 mg/bodyから100000 mg/bodyの範囲で投与量が選択され得る。しかしなが
ら、本発明の医薬組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。
【0210】
本発明の医薬組成物は、常法に従って製剤化することができ（例えば、Remington's Ph
armaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A）、
医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。例えば界面活性剤、賦
形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、
滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられる。更にこれらに制限されず、その他常用の
担体が適宜使用できる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニト
ール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピ
ルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルア
ミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリ
オキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、
無機塩類等を担体として挙げることができる。
armaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A）、
医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。例えば界面活性剤、賦
形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、
滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられる。更にこれらに制限されず、その他常用の
担体が適宜使用できる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニト
ール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピ
ルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルア
ミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリ
オキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、
無機塩類等を担体として挙げることができる。
【0211】
また、本発明は、ある癌抗原を発現細胞と当該癌抗原に結合する本発明のポリペプチド
会合体とを接触させることにより当該癌抗原の発現細胞に傷害を引き起こす方法、又は細
胞の増殖を抑制する方法を提供する。当該癌抗原に結合するモノクローナル抗体は、本発
明の細胞傷害誘導治療剤、細胞増殖抑制剤および抗癌剤に含有される当該癌抗原に結合す
る本発明のポリペプチド会合体として上述したとおりである。当該癌抗原に結合する本発
明のポリペプチド会合体が結合する細胞は、当該癌抗原が発現している細胞であれば特に
限定されない。本発明における好ましい当該癌抗原の発現細胞は、具体的には、卵巣癌、
前立腺癌、乳癌、子宮癌、肝癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、及び大腸癌細胞等が好適
に挙げられる。癌抗原がGPC3である場合には、GPC3を発現している癌細胞であれば限定は
されないが、肝細胞癌、肺癌、卵巣癌、等が好適な癌細胞として挙げられる。
会合体とを接触させることにより当該癌抗原の発現細胞に傷害を引き起こす方法、又は細
胞の増殖を抑制する方法を提供する。当該癌抗原に結合するモノクローナル抗体は、本発
明の細胞傷害誘導治療剤、細胞増殖抑制剤および抗癌剤に含有される当該癌抗原に結合す
る本発明のポリペプチド会合体として上述したとおりである。当該癌抗原に結合する本発
明のポリペプチド会合体が結合する細胞は、当該癌抗原が発現している細胞であれば特に
限定されない。本発明における好ましい当該癌抗原の発現細胞は、具体的には、卵巣癌、
前立腺癌、乳癌、子宮癌、肝癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、及び大腸癌細胞等が好適
に挙げられる。癌抗原がGPC3である場合には、GPC3を発現している癌細胞であれば限定は
されないが、肝細胞癌、肺癌、卵巣癌、等が好適な癌細胞として挙げられる。
【0212】
本発明において「接触」は、例えば、試験管内で培養している癌抗原発現細胞の培養液
に、当該癌抗原に結合する本発明のポリペプチド会合体を添加することにより行われる。
この場合において、添加されるポリペプチド会合体の形状としては、溶液又は凍結乾燥等
により得られる固体等の形状が適宜使用され得る。水溶液として添加される場合にあって
は純粋に本発明のポリペプチド会合体のみを含有する水溶液であり得るし、例えば上記記
載の界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤
、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等を含む溶液でもあり得る。添加する
濃度は特に限定されないが、培養液中の最終濃度として、好ましくは1 pg/mlから1 g/ml
の範囲であり、より好ましくは1 ng/mlから1 mg/mlであり、更に好ましくは1μg/mlから1
mg/mlが好適に使用され得る。
に、当該癌抗原に結合する本発明のポリペプチド会合体を添加することにより行われる。
この場合において、添加されるポリペプチド会合体の形状としては、溶液又は凍結乾燥等
により得られる固体等の形状が適宜使用され得る。水溶液として添加される場合にあって
は純粋に本発明のポリペプチド会合体のみを含有する水溶液であり得るし、例えば上記記
載の界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤
、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等を含む溶液でもあり得る。添加する
濃度は特に限定されないが、培養液中の最終濃度として、好ましくは1 pg/mlから1 g/ml
の範囲であり、より好ましくは1 ng/mlから1 mg/mlであり、更に好ましくは1μg/mlから1
mg/mlが好適に使用され得る。
【0213】
また本発明において「接触」は更に、別の態様では、癌抗原の発現細胞を体内に移植し
た非ヒト動物や、内在的に当該癌抗原を発現する癌細胞を有する動物に投与することによ
っても行われる。投与方法は経口、非経口投与のいずれかによって実施できる。特に好ま
しくは非経口投与による投与方法であり、係る投与方法としては具体的には、注射投与、
経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与としては、例えば、静脈内注
射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などが挙げられる。例えば注射投与によって本発
明の医薬組成物、あるいは細胞傷害誘導治療剤、細胞増殖阻害剤および抗癌剤が全身また
は局部的に投与できる。また、被験動物の年齢、症状により適宜投与方法を選択すること
ができる。水溶液として投与される場合にあっては純粋に本発明のポリペプチド会合体の
みを含有する水溶液であってもよいし、例えば上記記載の界面活性剤、賦形剤、着色料、
着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性
促進剤、矯味剤等を含む溶液であってもよい。投与量としては、例えば、一回の投与につ
き体重1 kgあたり0.0001 mgから1000 mgの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば
、患者あたり0.001から100000 mg/bodyの範囲で投与量が選択できる。しかしながら、本
発明のポリペプチド会合体投与量はこれらの投与量に制限されるものではない。
た非ヒト動物や、内在的に当該癌抗原を発現する癌細胞を有する動物に投与することによ
っても行われる。投与方法は経口、非経口投与のいずれかによって実施できる。特に好ま
しくは非経口投与による投与方法であり、係る投与方法としては具体的には、注射投与、
経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与としては、例えば、静脈内注
射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などが挙げられる。例えば注射投与によって本発
明の医薬組成物、あるいは細胞傷害誘導治療剤、細胞増殖阻害剤および抗癌剤が全身また
は局部的に投与できる。また、被験動物の年齢、症状により適宜投与方法を選択すること
ができる。水溶液として投与される場合にあっては純粋に本発明のポリペプチド会合体の
みを含有する水溶液であってもよいし、例えば上記記載の界面活性剤、賦形剤、着色料、
着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性
促進剤、矯味剤等を含む溶液であってもよい。投与量としては、例えば、一回の投与につ
き体重1 kgあたり0.0001 mgから1000 mgの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば
、患者あたり0.001から100000 mg/bodyの範囲で投与量が選択できる。しかしながら、本
発明のポリペプチド会合体投与量はこれらの投与量に制限されるものではない。
【0214】
本発明のポリペプチド会合体の接触によって当該ポリペプチド会合体を構成する抗原結
合ドメインが結合する抗原を発現する細胞に引き起こされた細胞傷害を評価又は測定する
方法として、以下の方法が好適に使用される。試験管内において該細胞傷害活性を評価又
は測定する方法としては、細胞傷害性T細胞活性などの測定法を挙げることができる。本
発明のポリペプチド会合体がT細胞性傷害活性を有するか否か、公知の方法により測定す
ることができる（例えば、Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic
studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc.,(1993
)等）。活性の測定に際しては、本発明とはその抗原結合ドメインが結合する抗原が異な
る抗原であって試験に使用する細胞が発現していない抗原に結合するポリペプチド会合体
を、本発明のポリペプチド会合体と同様に対照として使用して、本発明のポリペプチド会
合体が対照として使用されたポリペプチド会合体よりも強い細胞傷害活性を示すことによ
り活性が判定され得る。
合ドメインが結合する抗原を発現する細胞に引き起こされた細胞傷害を評価又は測定する
方法として、以下の方法が好適に使用される。試験管内において該細胞傷害活性を評価又
は測定する方法としては、細胞傷害性T細胞活性などの測定法を挙げることができる。本
発明のポリペプチド会合体がT細胞性傷害活性を有するか否か、公知の方法により測定す
ることができる（例えば、Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic
studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc.,(1993
)等）。活性の測定に際しては、本発明とはその抗原結合ドメインが結合する抗原が異な
る抗原であって試験に使用する細胞が発現していない抗原に結合するポリペプチド会合体
を、本発明のポリペプチド会合体と同様に対照として使用して、本発明のポリペプチド会
合体が対照として使用されたポリペプチド会合体よりも強い細胞傷害活性を示すことによ
り活性が判定され得る。
【0215】
また、生体内で細胞傷害活性を評価又は測定するために、例えば本発明のポリペプチド
会合体を構成する抗原結合ドメインが結合する抗原を発現する細胞を、非ヒト被験動物の
皮内又は皮下に移植後、当日又は翌日から毎日又は数日間隔で被験ポリペプチド会合体を
静脈又は腹腔内に投与される。腫瘍の大きさを経日的に測定することにより当該腫瘍の大
きさの変化の差異が細胞傷害活性と規定され得る。試験管内での評価と同様に対照となる
ポリペプチド会合体が投与され、本発明のポリペプチド会合体の投与群における腫瘍の大
きさが対照ポリペプチド会合体の投与群における腫瘍の大きさよりも有意に小さいことが
細胞傷害活性を有すると判定され得る。
会合体を構成する抗原結合ドメインが結合する抗原を発現する細胞を、非ヒト被験動物の
皮内又は皮下に移植後、当日又は翌日から毎日又は数日間隔で被験ポリペプチド会合体を
静脈又は腹腔内に投与される。腫瘍の大きさを経日的に測定することにより当該腫瘍の大
きさの変化の差異が細胞傷害活性と規定され得る。試験管内での評価と同様に対照となる
ポリペプチド会合体が投与され、本発明のポリペプチド会合体の投与群における腫瘍の大
きさが対照ポリペプチド会合体の投与群における腫瘍の大きさよりも有意に小さいことが
細胞傷害活性を有すると判定され得る。
【0216】
本発明のポリペプチド会合体の接触による当該ポリペプチド会合体を構成する抗原結合
ドメインが結合する抗原を発現する細胞の増殖に対する抑制効果を評価又は測定する方法
としては、アイソトープラベルしたthymidineの細胞へ取込み測定やMTT法が好適に用いら
れる。また、生体内で細胞増殖抑制活性を評価又は測定する方法として、上記記載の生体
内において細胞傷害活性を評価又は測定する方法と同じ方法を好適に用いることができる
。
ドメインが結合する抗原を発現する細胞の増殖に対する抑制効果を評価又は測定する方法
としては、アイソトープラベルしたthymidineの細胞へ取込み測定やMTT法が好適に用いら
れる。また、生体内で細胞増殖抑制活性を評価又は測定する方法として、上記記載の生体
内において細胞傷害活性を評価又は測定する方法と同じ方法を好適に用いることができる
。
【0217】
また本発明は、本発明のポリペプチド会合体または本発明の製造方法により製造された
ポリペプチド会合体を含む、本発明の方法に用いるためのキットを提供する。該キットに
は、その他、薬学的に許容される担体、媒体、使用方法を記載した指示書等をパッケージ
しておくことができる。
また本発明は、本発明の方法に使用するための、本発明のポリペプチド会合体または本
発明の製造方法により製造されたポリペプチド会合体に関する。
ポリペプチド会合体を含む、本発明の方法に用いるためのキットを提供する。該キットに
は、その他、薬学的に許容される担体、媒体、使用方法を記載した指示書等をパッケージ
しておくことができる。
また本発明は、本発明の方法に使用するための、本発明のポリペプチド会合体または本
発明の製造方法により製造されたポリペプチド会合体に関する。
【0218】
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み
入れられる。
入れられる。
【実施例】
【0219】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を
制限するものではない。
制限するものではない。
【0220】
〔実施例１〕GPC3 ERY2の作製と検討
（１）概容
生体内に投与されたタンパク質の血中半減期を延ばす方法としては、目的タンパク質に
抗体のFcドメインを付加し、FcRnを介したリサイクリング機能を利用する方法が良く知ら
れている。しかしこの際、天然型のFcをBiTEに付加すると、一つの分子がBiTE部分の抗CD
3 scFvを介してT細胞と結合すると同時に、Fc部分を介してNK細胞、マクロファージなど
の細胞膜上のFcgR（Fcγ受容体）と結合することにより、癌抗原非依存的にこれらの細胞
を架橋することによって活性化させ、各種サイトカインの誘導につながる可能性があるも
のと考えられた。そこで、BiTEにポリペプチドリンカーを介してFcγ受容体に対する結合
活性が低下しているFc領域（サイレント型Fc）を連結させた分子、ERY2が作製され、この
活性をBiTEと比較する検証が行われた。肝臓癌細胞において高発現していることが知られ
ているGPIアンカータンパクであるGlypican 3（GPC3）に対する抗体のscFvとCD3 epsilon
に対する抗体のscFvを短いペプチドリンカーで連結することによって、GPC3に対するBiTE
（GPC3 BiTE）が作製された（図１７A）。ついで、これにサイレント型Fcを連結したGPC3
に対するERY2（GPC3 ERY2）が作製された（図１７C）。また、比較として通常のIgG型抗G
PC3抗体が作製された。この際、IgG型抗GPC3抗体は、ADCC活性がより増強することが知ら
れている、糖鎖部分においてフコース含量を低減させた抗体、すなわち低フコース型抗体
として調製された。
（１）概容
生体内に投与されたタンパク質の血中半減期を延ばす方法としては、目的タンパク質に
抗体のFcドメインを付加し、FcRnを介したリサイクリング機能を利用する方法が良く知ら
れている。しかしこの際、天然型のFcをBiTEに付加すると、一つの分子がBiTE部分の抗CD
3 scFvを介してT細胞と結合すると同時に、Fc部分を介してNK細胞、マクロファージなど
の細胞膜上のFcgR（Fcγ受容体）と結合することにより、癌抗原非依存的にこれらの細胞
を架橋することによって活性化させ、各種サイトカインの誘導につながる可能性があるも
のと考えられた。そこで、BiTEにポリペプチドリンカーを介してFcγ受容体に対する結合
活性が低下しているFc領域（サイレント型Fc）を連結させた分子、ERY2が作製され、この
活性をBiTEと比較する検証が行われた。肝臓癌細胞において高発現していることが知られ
ているGPIアンカータンパクであるGlypican 3（GPC3）に対する抗体のscFvとCD3 epsilon
に対する抗体のscFvを短いペプチドリンカーで連結することによって、GPC3に対するBiTE
（GPC3 BiTE）が作製された（図１７A）。ついで、これにサイレント型Fcを連結したGPC3
に対するERY2（GPC3 ERY2）が作製された（図１７C）。また、比較として通常のIgG型抗G
PC3抗体が作製された。この際、IgG型抗GPC3抗体は、ADCC活性がより増強することが知ら
れている、糖鎖部分においてフコース含量を低減させた抗体、すなわち低フコース型抗体
として調製された。
【0221】
（２）GPC3 BiTEの作製
抗GPC3抗体の発現ベクターを鋳型として用いることによって、PCR法により増幅されたH
鎖可変領域（anti-GPC3 VH）、L鎖可変領域（anti-GPC3 VL）をコードするcDNAがそれぞ
れ取得された。適切な配列を付加したプライマー及び当該cDNAを鋳型として用いたPCR法
により、anti-GPC3 VHとanti-GPC3 VLとがGly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：７）を3
回繰り返す配列からなるリンカーによって連結されたアミノ酸配列を有するanti-GPC3 sc
FvをコードするcDNA断片が作製された。
抗GPC3抗体の発現ベクターを鋳型として用いることによって、PCR法により増幅されたH
鎖可変領域（anti-GPC3 VH）、L鎖可変領域（anti-GPC3 VL）をコードするcDNAがそれぞ
れ取得された。適切な配列を付加したプライマー及び当該cDNAを鋳型として用いたPCR法
により、anti-GPC3 VHとanti-GPC3 VLとがGly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：７）を3
回繰り返す配列からなるリンカーによって連結されたアミノ酸配列を有するanti-GPC3 sc
FvをコードするcDNA断片が作製された。
【0222】
また、抗CD3抗体（M12）のH鎖可変領域（M12 VH）、及びL鎖可変領域（M12 VL）の部分
配列をコードする塩基配列を有し、その末端配列が相補的配列を有する一連のオリゴヌク
レオチドが作製された。ポリメラーゼ反応によってこれら一連のオリゴヌクレオチドがそ
の相補的配列部分を介して連結され当該H鎖可変領域（M12 VH）、及びL鎖可変領域（M12
VL）に相当するポリヌクレオチドが合成されるように設計された。当該オリゴヌクレオチ
ドが混合された後、PCR法によってこれらのオリゴヌクレオチドが連結され、各可変領域
のアミノ酸配列をコードする2つのcDNAが取得された。適切な配列を付加したプライマー
及びこれらのcDNAを鋳型として用いたPCR法により、M12 VLとM12 VHとがGly・Gly・Gly・
Gly・Ser（配列番号：７）を3回繰り返す配列からなるリンカーによって連結されたアミ
ノ酸配列を有するM12 scFvをコードするcDNA断片が作製された。
配列をコードする塩基配列を有し、その末端配列が相補的配列を有する一連のオリゴヌク
レオチドが作製された。ポリメラーゼ反応によってこれら一連のオリゴヌクレオチドがそ
の相補的配列部分を介して連結され当該H鎖可変領域（M12 VH）、及びL鎖可変領域（M12
VL）に相当するポリヌクレオチドが合成されるように設計された。当該オリゴヌクレオチ
ドが混合された後、PCR法によってこれらのオリゴヌクレオチドが連結され、各可変領域
のアミノ酸配列をコードする2つのcDNAが取得された。適切な配列を付加したプライマー
及びこれらのcDNAを鋳型として用いたPCR法により、M12 VLとM12 VHとがGly・Gly・Gly・
Gly・Ser（配列番号：７）を3回繰り返す配列からなるリンカーによって連結されたアミ
ノ酸配列を有するM12 scFvをコードするcDNA断片が作製された。
【0223】
次に、適切な配列を付加したプライマー及びanti-GPC3 scFvとM12 scFvをそれぞれコー
ドするcDNA断片を鋳型として用いたPCR法により、anti-GPC3 scFvとM12 scFvとがGly・Gl
y・Gly・Gly・Ser配列（配列番号：７）からなるリンカーによって連結され、かつそのC
末端にHisタグ（8個のHis）が付加された（配列番号：３３で記載されるアミノ末端の19
アミノ酸を除く）アミノ酸配列をコードするcDNA断片が作製された。
ドするcDNA断片を鋳型として用いたPCR法により、anti-GPC3 scFvとM12 scFvとがGly・Gl
y・Gly・Gly・Ser配列（配列番号：７）からなるリンカーによって連結され、かつそのC
末端にHisタグ（8個のHis）が付加された（配列番号：３３で記載されるアミノ末端の19
アミノ酸を除く）アミノ酸配列をコードするcDNA断片が作製された。
【0224】
適切な配列を付加したプライマー及び配列番号：３３で記載されるアミノ末端の19アミ
ノ酸を除くアミノ酸配列をコードするcDNA断片を鋳型として用いたPCR法により、当該cDN
A断片の5’側にEcoRI切断配列、kozac配列、及び分泌シグナル配列をコードする塩基配列
が付加され、またその3’側にNot I切断配列が付加されたcDNA断片が作製された。このcD
NA断片を、EcoRI、NotIで切断し、哺乳動物細胞用発現ベクターに組み込むことによって
、GPC3 BiTE（配列番号：３３、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列
には含まれない）の発現ベクターを取得した。
ノ酸を除くアミノ酸配列をコードするcDNA断片を鋳型として用いたPCR法により、当該cDN
A断片の5’側にEcoRI切断配列、kozac配列、及び分泌シグナル配列をコードする塩基配列
が付加され、またその3’側にNot I切断配列が付加されたcDNA断片が作製された。このcD
NA断片を、EcoRI、NotIで切断し、哺乳動物細胞用発現ベクターに組み込むことによって
、GPC3 BiTE（配列番号：３３、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列
には含まれない）の発現ベクターを取得した。
【0225】
当該ベクターがエレクトロポレーション法によってCHO細胞DG44株へ遺伝子導入された
。限界希釈後に1 mg/mL Geneticine存在下で遺伝子導入された細胞を培養することによっ
て薬剤耐性細胞株が単離された。Hisタグに対する抗体を用いて、得られた細胞株の培養
上清に対するウエスタンブロット解析を行なうことにより、GPC3 BiTEを発現する細胞株
が選択された。
。限界希釈後に1 mg/mL Geneticine存在下で遺伝子導入された細胞を培養することによっ
て薬剤耐性細胞株が単離された。Hisタグに対する抗体を用いて、得られた細胞株の培養
上清に対するウエスタンブロット解析を行なうことにより、GPC3 BiTEを発現する細胞株
が選択された。
【0226】
前記細胞株を大量に培養することによって得られた培養上清がSP Sepharose FFカラム
（GE Healthcare社）に添加された。当該カラムの洗浄後、GPC3 BiTEを含む画分がNaClの
濃度勾配によって溶出された。さらに当該画分がHisTrap HPカラム（GE Healthcare社）
に添加された。当該カラムの洗浄後、GPC3 BiTEを含む画分がイミダゾールの濃度勾配に
よって溶出された。当該画分が限外ろ過膜で濃縮された後に、濃縮液がSuperdex 200カラ
ム（GE Healthcare社）に添加された。単量体のGPC3 BiTE画分のみを回収することにより
精製GPC3 BiTEが得られた。
（GE Healthcare社）に添加された。当該カラムの洗浄後、GPC3 BiTEを含む画分がNaClの
濃度勾配によって溶出された。さらに当該画分がHisTrap HPカラム（GE Healthcare社）
に添加された。当該カラムの洗浄後、GPC3 BiTEを含む画分がイミダゾールの濃度勾配に
よって溶出された。当該画分が限外ろ過膜で濃縮された後に、濃縮液がSuperdex 200カラ
ム（GE Healthcare社）に添加された。単量体のGPC3 BiTE画分のみを回収することにより
精製GPC3 BiTEが得られた。
【0227】
（３）GPC3 ERY2の作製
上記した方法と同様の適切な配列が付加されたプライマーを用いたPCR法、およびQuikC
hange Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene社）を用いた方法等の当業者におい
て公知の方法によって、GPC3 ERY2_Hk（配列番号：３４、シグナル配列であるアミノ末端
１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、およびGPC3 ERY2_Hh（配列番号：３５、シグ
ナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）をそれぞれコードす
るポリヌクレオチドが挿入された発現ベクターが作製された。
上記した方法と同様の適切な配列が付加されたプライマーを用いたPCR法、およびQuikC
hange Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene社）を用いた方法等の当業者におい
て公知の方法によって、GPC3 ERY2_Hk（配列番号：３４、シグナル配列であるアミノ末端
１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、およびGPC3 ERY2_Hh（配列番号：３５、シグ
ナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）をそれぞれコードす
るポリヌクレオチドが挿入された発現ベクターが作製された。
【0228】
これらの発現ベクターがFreeStyle293-F細胞（Invitrogen社）に共に導入され、一過性
にGPC3 ERY2が発現させた。得られた培養上清がAnti FLAG M2カラム（Sigma社）に添加さ
れ、当該カラムの洗浄の後、0.1 mg/mL FLAGペプチド（Sigma社）による溶出が実施され
た。GPC3 ERY2を含む画分がHisTrap HPカラム（GE Healthcare社）に添加され、当該カラ
ムの洗浄の後、イミダゾールの濃度勾配による溶出が実施された。GPC3 ERY2を含む画分
が限外ろ過膜で濃縮された後、濃縮液がSuperdex 200カラム（GE Healthcare社）に添加
され、その溶出液の単量体のGPC3 ERY2画分のみを回収することにより精製GPC3 ERY2が得
られた。
にGPC3 ERY2が発現させた。得られた培養上清がAnti FLAG M2カラム（Sigma社）に添加さ
れ、当該カラムの洗浄の後、0.1 mg/mL FLAGペプチド（Sigma社）による溶出が実施され
た。GPC3 ERY2を含む画分がHisTrap HPカラム（GE Healthcare社）に添加され、当該カラ
ムの洗浄の後、イミダゾールの濃度勾配による溶出が実施された。GPC3 ERY2を含む画分
が限外ろ過膜で濃縮された後、濃縮液がSuperdex 200カラム（GE Healthcare社）に添加
され、その溶出液の単量体のGPC3 ERY2画分のみを回収することにより精製GPC3 ERY2が得
られた。
【0229】
（４）低フコース型抗GPC3抗体の作製
抗GPC3抗体（WO2006/006693においてヒト化GC33抗体として記載されている）の発現ベ
クターがエレクトロポレーション法によってGDPフコースノックアウトCHO細胞DXB11株（C
ancer Sci. (2010) 101(10), 2227-33）に遺伝子導入された。限界希釈後に0.5 mg/mL Ge
neticine存在下で培養することにより薬剤耐性株が選択され、低フコース型抗GPC3抗体発
現株が得られた。この細胞を培養して調製した培養上清より、Hitrap(R) ProteinA（Phar
macia社）を用いた通常のアフィニティー精製により抗体画分が調製された。次に当該抗
体画分がSuperdex 20026/60（Pharmacia社）を用いたゲルろ過精製に供され、溶出液のモ
ノマー画分を分取することによって低フコース型GPC3抗体が得られた。
抗GPC3抗体（WO2006/006693においてヒト化GC33抗体として記載されている）の発現ベ
クターがエレクトロポレーション法によってGDPフコースノックアウトCHO細胞DXB11株（C
ancer Sci. (2010) 101(10), 2227-33）に遺伝子導入された。限界希釈後に0.5 mg/mL Ge
neticine存在下で培養することにより薬剤耐性株が選択され、低フコース型抗GPC3抗体発
現株が得られた。この細胞を培養して調製した培養上清より、Hitrap(R) ProteinA（Phar
macia社）を用いた通常のアフィニティー精製により抗体画分が調製された。次に当該抗
体画分がSuperdex 20026/60（Pharmacia社）を用いたゲルろ過精製に供され、溶出液のモ
ノマー画分を分取することによって低フコース型GPC3抗体が得られた。
【0230】
（５）ヒト末梢血単核球を用いた細胞傷害活性の測定
（５－１）ヒト末梢血単核球（PBMC）溶液の調製
1,000単位/mLのヘパリン溶液（ノボ・ヘパリン注5千単位，ノボ・ノルディスク社）を
あらかじめ100μL注入した注射器を用い、健常人ボランティア（成人）より末梢血50 mL
が採取された。PBS（-）で2倍希釈した後に4等分された末梢血が、15 mLのFicoll-Paque
PLUSをあらかじめ注入して遠心操作が行なわれたLeucosepリンパ球分離管（Cat. No. 227
290、Greiner bio-one社）に加えられた。当該分離管の遠心分離（2,150 rpm、10分間、
室温）の後、単核球画分層が分取された。10%FBSを含むDulbecco’s Modified Eagle’s
Medium（SIGMA社、以下10%FBS/D-MEM）で1回単核球画分の細胞が洗浄された後、当該細胞
は10%FBS/D-MEMを用いてその細胞密度が4×106 /mLに調製された。このように調製された
細胞溶液がヒトPBMC溶液として以後の試験に用いられた。
（５－１）ヒト末梢血単核球（PBMC）溶液の調製
1,000単位/mLのヘパリン溶液（ノボ・ヘパリン注5千単位，ノボ・ノルディスク社）を
あらかじめ100μL注入した注射器を用い、健常人ボランティア（成人）より末梢血50 mL
が採取された。PBS（-）で2倍希釈した後に4等分された末梢血が、15 mLのFicoll-Paque
PLUSをあらかじめ注入して遠心操作が行なわれたLeucosepリンパ球分離管（Cat. No. 227
290、Greiner bio-one社）に加えられた。当該分離管の遠心分離（2,150 rpm、10分間、
室温）の後、単核球画分層が分取された。10%FBSを含むDulbecco’s Modified Eagle’s
Medium（SIGMA社、以下10%FBS/D-MEM）で1回単核球画分の細胞が洗浄された後、当該細胞
は10%FBS/D-MEMを用いてその細胞密度が4×106 /mLに調製された。このように調製された
細胞溶液がヒトPBMC溶液として以後の試験に用いられた。
【0231】
（５－２）細胞傷害活性の測定
細胞傷害活性はxCELLigenceリアルタイムセルアナライザー（ロシュ・ダイアグノステ
ィックス社）を用いた細胞増殖抑制率で評価された。標的細胞にはSK-HEP-1細胞株にヒト
GPC3を強制発現させて樹立したSK-pca13a細胞株が用いられた。SK-pca13aをディッシュか
ら剥離し、1×104 cells/wellとなるようにE-Plate 96（ロシュ・ダイアグノスティック
ス社）プレートに100μL/wellで播き、xCELLigenceリアルタイムセルアナライザーを用い
て生細胞の測定が開始された。翌日xCELLigenceリアルタイムセルアナライザーからプレ
ートを取り出し、当該プレートに各濃度（0.004、0.04、0.4、4 nM）に調製した各抗体50
μLが添加された。室温にて15分間反応させた後に（５－１）で調製されたヒトPBMC溶液5
0μL（2×105 cells/well）が加えられ、xCELLigenceリアルタイムセルアナライザーに当
該プレートを再セットすることによって、生細胞の測定が開始された。反応は5%炭酸ガス
、37℃条件下にて行われ、ヒトPBMC添加72時間後のCell Index値から、下式により細胞増
殖抑制率（％）が求められた。なお計算に用いたCell Index値は、抗体添加直前のCell I
ndex値が1となるようにノーマライズした後の数値が用いられた。
細胞傷害活性はxCELLigenceリアルタイムセルアナライザー（ロシュ・ダイアグノステ
ィックス社）を用いた細胞増殖抑制率で評価された。標的細胞にはSK-HEP-1細胞株にヒト
GPC3を強制発現させて樹立したSK-pca13a細胞株が用いられた。SK-pca13aをディッシュか
ら剥離し、1×104 cells/wellとなるようにE-Plate 96（ロシュ・ダイアグノスティック
ス社）プレートに100μL/wellで播き、xCELLigenceリアルタイムセルアナライザーを用い
て生細胞の測定が開始された。翌日xCELLigenceリアルタイムセルアナライザーからプレ
ートを取り出し、当該プレートに各濃度（0.004、0.04、0.4、4 nM）に調製した各抗体50
μLが添加された。室温にて15分間反応させた後に（５－１）で調製されたヒトPBMC溶液5
0μL（2×105 cells/well）が加えられ、xCELLigenceリアルタイムセルアナライザーに当
該プレートを再セットすることによって、生細胞の測定が開始された。反応は5%炭酸ガス
、37℃条件下にて行われ、ヒトPBMC添加72時間後のCell Index値から、下式により細胞増
殖抑制率（％）が求められた。なお計算に用いたCell Index値は、抗体添加直前のCell I
ndex値が1となるようにノーマライズした後の数値が用いられた。
【0232】
細胞増殖抑制率（％）＝(A-B)×100/(A-1)
【0233】
Aは抗体を添加していないウェルにおけるCell Index値の平均値（標的細胞とヒトPBMC
のみ）、Bは各ウェルにおけるCell Index値の平均値を示す。試験はtriplicateにて行な
われた。
のみ）、Bは各ウェルにおけるCell Index値の平均値を示す。試験はtriplicateにて行な
われた。
【0234】
ヒト血液より調製したPBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cell）をエフェクター細
胞としてGPC3 BiTE、GPC3 ERY2、およびIgG型GPC3抗体の細胞傷害活性を測定したところ
、GPC3 BiTEには極めて強い活性が認められた（図１）。この活性は低フコース型抗GPC3
抗体よりもはるかに強いものであり、GPC3 BiTEはIgG型抗体を凌駕する優れた癌治療薬と
なり得るものと考えられた。一方、GPC3 ERY2にはIgG型抗GPC3抗体を上回る活性が見られ
たものの、GPC3 BiTEの活性には及ばなかった。このことより、単にFcをBiTEに付加する
だけでは目的とする分子を創製することができないものと考えられた。
胞としてGPC3 BiTE、GPC3 ERY2、およびIgG型GPC3抗体の細胞傷害活性を測定したところ
、GPC3 BiTEには極めて強い活性が認められた（図１）。この活性は低フコース型抗GPC3
抗体よりもはるかに強いものであり、GPC3 BiTEはIgG型抗体を凌駕する優れた癌治療薬と
なり得るものと考えられた。一方、GPC3 ERY2にはIgG型抗GPC3抗体を上回る活性が見られ
たものの、GPC3 BiTEの活性には及ばなかった。このことより、単にFcをBiTEに付加する
だけでは目的とする分子を創製することができないものと考えられた。
【0235】
〔実施例２〕GPC3 ERY5、GPC3 ERY6、GPC3 ERY7の作製と検討
次に、癌抗原（GPC3）への結合ドメインを2価にすることにより、より癌細胞に対する
結合活性を高めることで比活性を向上させることを試みた。GPC3 ERY2にさらにGPC3に対
するscFvをもう一つ付加した形のGPC3 ERY5（図１７D）、付加するGPC3に対する結合ドメ
インをscFvではなくFabの形にしたGPC3 ERY7（図１７F）がそれぞれ作製された。また、G
PC3 ERY5のCD3 epsilonに対するscFvを両腕に分離した形のGPC3 ERY6（図１７E）も作製
された。
次に、癌抗原（GPC3）への結合ドメインを2価にすることにより、より癌細胞に対する
結合活性を高めることで比活性を向上させることを試みた。GPC3 ERY2にさらにGPC3に対
するscFvをもう一つ付加した形のGPC3 ERY5（図１７D）、付加するGPC3に対する結合ドメ
インをscFvではなくFabの形にしたGPC3 ERY7（図１７F）がそれぞれ作製された。また、G
PC3 ERY5のCD3 epsilonに対するscFvを両腕に分離した形のGPC3 ERY6（図１７E）も作製
された。
【0236】
すなわち、上記した方法と同様の適切な配列が付加されたプライマーを用いたPCR法等
の当業者において公知の方法により、GPC3 ERY5_Hh、GPC3 ERY6_Hk、GPC3 ERY6_Hh、GPC3
ERY7_Hh、GPC3 ERY7_Lをそれぞれコードするポリヌクレオチドが挿入された一連の発現
ベクターが作製された。
の当業者において公知の方法により、GPC3 ERY5_Hh、GPC3 ERY6_Hk、GPC3 ERY6_Hh、GPC3
ERY7_Hh、GPC3 ERY7_Lをそれぞれコードするポリヌクレオチドが挿入された一連の発現
ベクターが作製された。
【0237】
以下に示す組み合わせの発現ベクターがFreeStyle293-F細胞に導入され、各目的分子を
一過性に発現させた。
一過性に発現させた。
【0238】
Ａ．目的分子：GPC3 ERY5
発現ベクターに挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド：GPC3 E
RY5_Hh（配列番号：３６、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含
まれない）、GPC3 ERY2_Hk
発現ベクターに挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド：GPC3 E
RY5_Hh（配列番号：３６、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含
まれない）、GPC3 ERY2_Hk
【0239】
Ｂ．目的分子：GPC3 ERY6
発現ベクターに挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド：GPC3 E
RY6_Hk（配列番号：３７、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含
まれない）、GPC3 ERY6_Hh（配列番号：３８、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ
酸は成熟配列には含まれない）
発現ベクターに挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド：GPC3 E
RY6_Hk（配列番号：３７、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含
まれない）、GPC3 ERY6_Hh（配列番号：３８、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ
酸は成熟配列には含まれない）
【0240】
Ｃ．目的分子：GPC3 ERY7
発現ベクターに挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド：GPC3 E
RY7_Hh（配列番号：３９、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含
まれない）、GPC3 ERY7_L（配列番号：４０、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ
酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY2_Hk
発現ベクターに挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド：GPC3 E
RY7_Hh（配列番号：３９、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含
まれない）、GPC3 ERY7_L（配列番号：４０、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ
酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY2_Hk
【0241】
得られた培養上清がAnti FLAG M2カラム（Sigma社）に添加され、当該カラムの洗浄の
後、0.1 mg/mL FLAGペプチド（Sigma社）による溶出が行われた。目的分子を含む画分がH
isTrap HPカラム（GE Healthcare社）に添加され、当該カラムの洗浄の後、イミダゾール
の濃度勾配による溶出が実施された。目的分子を含む画分が限外ろ過膜で濃縮された後、
当該画分がSuperdex 200カラム（GE Healthcare社）に添加され、溶出液の単量体画分の
みを回収することにより精製された各目的分子が得られた。
後、0.1 mg/mL FLAGペプチド（Sigma社）による溶出が行われた。目的分子を含む画分がH
isTrap HPカラム（GE Healthcare社）に添加され、当該カラムの洗浄の後、イミダゾール
の濃度勾配による溶出が実施された。目的分子を含む画分が限外ろ過膜で濃縮された後、
当該画分がSuperdex 200カラム（GE Healthcare社）に添加され、溶出液の単量体画分の
みを回収することにより精製された各目的分子が得られた。
【0242】
これらのポリペプチド会合体とGPC3 BiTEとの細胞傷害活性の比較が行なわれた。その
結果、これらのポリペプチド会合体の細胞傷害活性はいずれもGPC3 BiTEの活性に及ばな
いことが明らかとなった（図２～４）。このことから、BiTEの構造、あるいはそれを模倣
した構造にFcを付加し、さらに癌抗原に対して2価で結合する構成のみでは目的とする分
子を創製することができないものと考えられた。
結果、これらのポリペプチド会合体の細胞傷害活性はいずれもGPC3 BiTEの活性に及ばな
いことが明らかとなった（図２～４）。このことから、BiTEの構造、あるいはそれを模倣
した構造にFcを付加し、さらに癌抗原に対して2価で結合する構成のみでは目的とする分
子を創製することができないものと考えられた。
【0243】
〔実施例３〕GPC3 ERY8-2、GPC3 ERY9-1、GPC3 ERY10-1の作製と検討
（１）GPC3 ERY8-2、GPC3 ERY9-1、GPC3 ERY10-1の作製
次に、BiTEの構造を持たずに目的の活性を持つ分子の創製が試みられた。癌抗原（GPC3
）に対するIgGを基本骨格とし、これにCD3 epsilonに対するscFvを付加した形の分子が作
製された。この際、基本骨格とするIgGのFcとしては、上述した場合と同様に、FcgR（Fc
γ受容体）への結合性が減弱されたサイレント型Fcが用いられた。CD3 epsilonに対するs
cFvが抗GPC3抗体IgGのH鎖のN末に付加されたGPC3 ERY8-2（図１７G）、H鎖のC末に付加さ
れたGPC3 ERY10-1（図１７I）、L鎖のC末に付加されたGPC3 ERY9-1（図１７H）がそれぞ
れ作製された。
（１）GPC3 ERY8-2、GPC3 ERY9-1、GPC3 ERY10-1の作製
次に、BiTEの構造を持たずに目的の活性を持つ分子の創製が試みられた。癌抗原（GPC3
）に対するIgGを基本骨格とし、これにCD3 epsilonに対するscFvを付加した形の分子が作
製された。この際、基本骨格とするIgGのFcとしては、上述した場合と同様に、FcgR（Fc
γ受容体）への結合性が減弱されたサイレント型Fcが用いられた。CD3 epsilonに対するs
cFvが抗GPC3抗体IgGのH鎖のN末に付加されたGPC3 ERY8-2（図１７G）、H鎖のC末に付加さ
れたGPC3 ERY10-1（図１７I）、L鎖のC末に付加されたGPC3 ERY9-1（図１７H）がそれぞ
れ作製された。
【0244】
すなわち、上記した方法と同様の適切な配列を付加したプライマーを用いたPCR法等の
当業者において公知の方法により、GPC3 ERY8-2_Hk（配列番号：４１、シグナル配列であ
るアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY8-2_Hh（配列番号：４
２、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY
9-1_H（配列番号：４３、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含
まれない）、GPC3 ERY9-1_ L-His（配列番号：４４、シグナル配列であるアミノ末端１９
アミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY9-1_ L-FLAG（配列番号：４５、シグナ
ル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY10-1_Hh（
配列番号：４６、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない
）をそれぞれコードするポリヌクレオチドが挿入された一連の発現ベクターが作製された
。
当業者において公知の方法により、GPC3 ERY8-2_Hk（配列番号：４１、シグナル配列であ
るアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY8-2_Hh（配列番号：４
２、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY
9-1_H（配列番号：４３、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含
まれない）、GPC3 ERY9-1_ L-His（配列番号：４４、シグナル配列であるアミノ末端１９
アミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY9-1_ L-FLAG（配列番号：４５、シグナ
ル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY10-1_Hh（
配列番号：４６、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない
）をそれぞれコードするポリヌクレオチドが挿入された一連の発現ベクターが作製された
。
【0245】
以下に示す組み合わせの発現ベクターがFreeStyle293-F細胞に導入され、各目的分子を
一過性に発現させた。
一過性に発現させた。
【0246】
Ｄ．目的分子：GPC3 ERY8-2
発現ベクターに挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド：GPC3 E
RY8-2_Hk（配列番号：４１、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には
含まれない）、GPC3 ERY8-2_Hh（配列番号：４２、シグナル配列であるアミノ末端１９ア
ミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY7_L
発現ベクターに挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド：GPC3 E
RY8-2_Hk（配列番号：４１、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には
含まれない）、GPC3 ERY8-2_Hh（配列番号：４２、シグナル配列であるアミノ末端１９ア
ミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY7_L
【0247】
Ｅ．目的分子：GPC3 ERY9-1
発現ベクターに挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド：GPC3 E
RY9-1_H（配列番号：４３、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には
含まれない）、GPC3 ERY9-1_L-His（配列番号：４４、シグナル配列であるアミノ末端１
９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY9-1_L-FLAG（配列番号：４５、シグナ
ル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）
発現ベクターに挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド：GPC3 E
RY9-1_H（配列番号：４３、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には
含まれない）、GPC3 ERY9-1_L-His（配列番号：４４、シグナル配列であるアミノ末端１
９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY9-1_L-FLAG（配列番号：４５、シグナ
ル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）
【0248】
Ｆ．目的分子：GPC3 ERY10-1
発現ベクターに挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド：GPC3 E
RY10-1_Hh（配列番号：４６、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列に
は含まれない）、GPC3 ERY8-2_Hk、GPC3 ERY7_L
発現ベクターに挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド：GPC3 E
RY10-1_Hh（配列番号：４６、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列に
は含まれない）、GPC3 ERY8-2_Hk、GPC3 ERY7_L
【0249】
得られた培養上清がAnti FLAG M2カラム（Sigma社）に添加され、当該カラムの洗浄の
後、0.1 mg/mL FLAGペプチド（Sigma社）による溶出が実施された。目的分子を含む画分
がHisTrap HPカラム（GE Healthcare社）に添加され、当該カラムの洗浄の後、イミダゾ
ールの濃度勾配による溶出が実施された。目的分子を含む画分が限外ろ過によって濃縮さ
れた後、当該画分がSuperdex 200カラム（GE Healthcare社）に添加され、溶出液の単量
体画分のみを回収することにより精製された各目的分子が得られた。
後、0.1 mg/mL FLAGペプチド（Sigma社）による溶出が実施された。目的分子を含む画分
がHisTrap HPカラム（GE Healthcare社）に添加され、当該カラムの洗浄の後、イミダゾ
ールの濃度勾配による溶出が実施された。目的分子を含む画分が限外ろ過によって濃縮さ
れた後、当該画分がSuperdex 200カラム（GE Healthcare社）に添加され、溶出液の単量
体画分のみを回収することにより精製された各目的分子が得られた。
【0250】
これらの分子についてin vitroの細胞傷害活性を調べたところ、いずれの分子もGPC3 B
iTEと同等以上の細胞傷害活性を示すことが明らかとなった（図５）。特に、GPC3 ERY9-1
、GPC3 ERY10-1は、明らかにGPC3 BiTEを上回る細胞傷害活性が認められた。本発明にお
いて、癌抗原に対するIgGにCD3 epsilonに対するscFvを付加する分子においてもBiTEと同
等以上の細胞傷害活性を持つことが初めて明らかとなった。特に、GPC3 ERY9-1、GPC3 ER
Y10-1のように癌抗原に対する結合ドメインとCD3 epsilonに対する結合ドメインの距離が
大きい分子において、BiTEよりも明らかに強い細胞傷害活性が見られたことは予想外の結
果であった。
iTEと同等以上の細胞傷害活性を示すことが明らかとなった（図５）。特に、GPC3 ERY9-1
、GPC3 ERY10-1は、明らかにGPC3 BiTEを上回る細胞傷害活性が認められた。本発明にお
いて、癌抗原に対するIgGにCD3 epsilonに対するscFvを付加する分子においてもBiTEと同
等以上の細胞傷害活性を持つことが初めて明らかとなった。特に、GPC3 ERY9-1、GPC3 ER
Y10-1のように癌抗原に対する結合ドメインとCD3 epsilonに対する結合ドメインの距離が
大きい分子において、BiTEよりも明らかに強い細胞傷害活性が見られたことは予想外の結
果であった。
【0251】
（２）GPC3 ERY8-2、及び、GPC3 ERY10-1の in vivo薬効の評価：
（１）で記載されたin vitroのアッセイでGPC3 BiTEと同等以上の細胞傷害活性が認め
られたGPC3 ERY8-2、及び、GPC3 ERY10-1のin vivoの薬効の評価が行なわれた。GPC3を発
現するヒト肺癌細胞株であるPC-10がヒトPBMCと混合されNOD scidマウスに移植された。
当該マウスに対してGPC3 ERY8-2、あるいはGPC3 ERY10-1の投与による治療が行なわれた
（pre-mixモデルと指称される）。
（１）で記載されたin vitroのアッセイでGPC3 BiTEと同等以上の細胞傷害活性が認め
られたGPC3 ERY8-2、及び、GPC3 ERY10-1のin vivoの薬効の評価が行なわれた。GPC3を発
現するヒト肺癌細胞株であるPC-10がヒトPBMCと混合されNOD scidマウスに移植された。
当該マウスに対してGPC3 ERY8-2、あるいはGPC3 ERY10-1の投与による治療が行なわれた
（pre-mixモデルと指称される）。
【0252】
すなわち、GPC3 ERY8-2のPC-10 pre-mixモデルによる薬効試験においては、下記のよう
な試験が実施された。健常人ボランティアより採取した血液から分離されたPBMCから、CD
56 MicroBeads, human (MCAS Miltenyi biotec社)を用いてNK細胞が除去された。ヒト肺
扁平上皮がん細胞株PC-10（免疫生物研究所）5×106細胞と、NK細胞が除去されたヒトPBM
C 4.5×106細胞、およびマトリゲル基底膜マトリックス（BD社）が混和され、NOD scidマ
ウス（日本クレア、雌、7W）のそけい部皮下に移植された。移植の日をday 0とした。マ
ウスには移植前日に抗アシアロGM1抗体（和光純薬）が0.2 mg/匹で腹腔内に投与された。
移植2時間後にGPC ERY8-2が30μg/匹で腹腔内投与された。GPC ERY8-2の投与がday 0～4
までの間、計5回行われた。
な試験が実施された。健常人ボランティアより採取した血液から分離されたPBMCから、CD
56 MicroBeads, human (MCAS Miltenyi biotec社)を用いてNK細胞が除去された。ヒト肺
扁平上皮がん細胞株PC-10（免疫生物研究所）5×106細胞と、NK細胞が除去されたヒトPBM
C 4.5×106細胞、およびマトリゲル基底膜マトリックス（BD社）が混和され、NOD scidマ
ウス（日本クレア、雌、7W）のそけい部皮下に移植された。移植の日をday 0とした。マ
ウスには移植前日に抗アシアロGM1抗体（和光純薬）が0.2 mg/匹で腹腔内に投与された。
移植2時間後にGPC ERY8-2が30μg/匹で腹腔内投与された。GPC ERY8-2の投与がday 0～4
までの間、計5回行われた。
【0253】
また、GPC3 ERY10-1のPC-10 pre-mixモデルによる薬効試験においては、下記のような
試験が実施された。健常人ボランティアより採取した血液から分離されたPBMCから、CD56
MicroBeads, human (MACS Miltenyi biotec社)を用いてNK細胞が除去された。ヒト肺扁
平上皮がん細胞株PC-10（免疫生物研究所） 5×106細胞と、NK細胞が除去されたヒトPBMC
4.5×106細胞、およびマトリゲル基底膜マトリックス（BD社）が混和され、NOD scidマ
ウス（日本クレア、雌、7W）のそけい部皮下に移植された。移植の日をday 0とした。マ
ウスには移植前日に抗アシアロGM1抗体（和光純薬）が0.2 mg/匹で腹腔内に投与された。
移植2時間後にGPC ERY10-1が30μg/匹で腹腔内投与された。GPC ERY10-1の投与がday 0～
4、day 7～11、day 14～16の間、計13回行われた。
試験が実施された。健常人ボランティアより採取した血液から分離されたPBMCから、CD56
MicroBeads, human (MACS Miltenyi biotec社)を用いてNK細胞が除去された。ヒト肺扁
平上皮がん細胞株PC-10（免疫生物研究所） 5×106細胞と、NK細胞が除去されたヒトPBMC
4.5×106細胞、およびマトリゲル基底膜マトリックス（BD社）が混和され、NOD scidマ
ウス（日本クレア、雌、7W）のそけい部皮下に移植された。移植の日をday 0とした。マ
ウスには移植前日に抗アシアロGM1抗体（和光純薬）が0.2 mg/匹で腹腔内に投与された。
移植2時間後にGPC ERY10-1が30μg/匹で腹腔内投与された。GPC ERY10-1の投与がday 0～
4、day 7～11、day 14～16の間、計13回行われた。
【0254】
その結果、GPC3 ERY8-2、あるいはGPC3 ERY10-1投与群においては、コントロールであ
る溶媒（PBS）投与群と比べて明らかに腫瘍の増殖が抑制されることが明らかとなった（
図６および７）。
る溶媒（PBS）投与群と比べて明らかに腫瘍の増殖が抑制されることが明らかとなった（
図６および７）。
【0255】
また、別のモデルにおいてもGPC3 ERY10-1によるin vivo薬効の評価が行なわれた。す
なわち、移植されたPC-10による腫瘍の形成が確認されたNOD scidマウスに、in vitroで
ヒトPBMCを培養することにより増殖させたT細胞が移入された。当該マウスに対してGPC3
ERY10-1を投与することによる治療が行なわれた（T細胞移入モデルと指称される）。
なわち、移植されたPC-10による腫瘍の形成が確認されたNOD scidマウスに、in vitroで
ヒトPBMCを培養することにより増殖させたT細胞が移入された。当該マウスに対してGPC3
ERY10-1を投与することによる治療が行なわれた（T細胞移入モデルと指称される）。
【0256】
すなわち、GPC3 ERY10-1のPC-10 T細胞移入モデルによる薬効試験においては、下記の
ような試験が行われた。健常人ボランティアより採取した血液から分離されたPBMC及びT
cell activation/ expansion kit/ human（MACS Miltenyi biotec社）を用いてT細胞の拡
大培養が行なわれた。ヒト肺扁平上皮がん細胞株PC-10（免疫生物研究所） 1×107細胞と
、マトリゲル基底膜マトリックス（BD社）が混和され、NOD scidマウス（日本クレア、雌
、7W）のそけい部皮下に移植された。移植の日をday 0とした。マウスには移植前日、お
よびday 6、8、12、16、20に抗アシアロGM1抗体（和光純薬）が0.2 mg/匹で腹腔内に投与
された。移植後6日目に腫瘍サイズと体重に応じて群分けが行なわれた後、前記拡大培養
によって得られたT細胞が1×107細胞/匹で腹腔内に移植された。その2時間後から、GPC E
RY10-1が30 μg/匹で腹腔内投与された。GPC ERY10-1の投与はday 7、8、12、16、17に、
計5回行われた。
ような試験が行われた。健常人ボランティアより採取した血液から分離されたPBMC及びT
cell activation/ expansion kit/ human（MACS Miltenyi biotec社）を用いてT細胞の拡
大培養が行なわれた。ヒト肺扁平上皮がん細胞株PC-10（免疫生物研究所） 1×107細胞と
、マトリゲル基底膜マトリックス（BD社）が混和され、NOD scidマウス（日本クレア、雌
、7W）のそけい部皮下に移植された。移植の日をday 0とした。マウスには移植前日、お
よびday 6、8、12、16、20に抗アシアロGM1抗体（和光純薬）が0.2 mg/匹で腹腔内に投与
された。移植後6日目に腫瘍サイズと体重に応じて群分けが行なわれた後、前記拡大培養
によって得られたT細胞が1×107細胞/匹で腹腔内に移植された。その2時間後から、GPC E
RY10-1が30 μg/匹で腹腔内投与された。GPC ERY10-1の投与はday 7、8、12、16、17に、
計5回行われた。
【0257】
その結果、このモデルにおいても、GPC3 ERY10-1投与群においては溶媒投与群に比較し
て明らかな抗腫瘍作用が認められた（図８）。
て明らかな抗腫瘍作用が認められた（図８）。
【0258】
以上のことから、サイレント型Fcを持つIgGを基本骨格とし、これにCD3 epsilonに対す
る抗体のscFvを一つ付加した形の一連の分子は明らかなin vivoにおける抗腫瘍効果を奏
することが示された。
る抗体のscFvを一つ付加した形の一連の分子は明らかなin vivoにおける抗腫瘍効果を奏
することが示された。
【0259】
（３）血漿中滞留性の評価
GPC3 ERY8-2、GPC3 ERY9-1、GPC3 ERY10-1等の一連の分子が、GPC3 BiTEに比較して顕
著に長い血漿中半減期を有するか否かを検証するために、癌細胞が移植されていないNOD
scidマウスに対して30μg/匹で投与された、GPC3 ERY9-1、GPC3 ERY10-1の血漿中濃度が
経時的に測定された。
GPC3 ERY8-2、GPC3 ERY9-1、GPC3 ERY10-1等の一連の分子が、GPC3 BiTEに比較して顕
著に長い血漿中半減期を有するか否かを検証するために、癌細胞が移植されていないNOD
scidマウスに対して30μg/匹で投与された、GPC3 ERY9-1、GPC3 ERY10-1の血漿中濃度が
経時的に測定された。
【0260】
すなわち、下記のようなPK解析試験が実施された。NOD scidマウス（日本クレア、雌、
8W）の腹腔内にGPC3 ERY9-1、GPC3 ERY10-1が30μg/匹で投与された。投与後、15min、2
時間、1日、2日、7日の各ポイントでマウスの頬静脈よりヘマトクリット毛細管（テルモ
）を用いて採血が行われ、その血漿が調製された。
8W）の腹腔内にGPC3 ERY9-1、GPC3 ERY10-1が30μg/匹で投与された。投与後、15min、2
時間、1日、2日、7日の各ポイントでマウスの頬静脈よりヘマトクリット毛細管（テルモ
）を用いて採血が行われ、その血漿が調製された。
【0261】
GPC3を発現させたBa/F3細胞（GPC3/BaF）およびヒトCD3 epsilonを発現させたBa/F3細
胞（CD3/BaF）に適宜希釈したGPC3 ERY9-1、GPC3 ERY10-1が加えられ、GPC3 ERY9-1、又
は、GPC3 ERY10-1とGPC3/BaF又はCD3/BaFと反応させた。これらの細胞の洗浄の後、FITC
標識された2次抗体が加えられ、当該二次抗体をさらに反応させた。当該細胞の洗浄の後
、Epics XLフローサイトメーター（Beckman coulter社）により当該細胞に標識された蛍
光強度が測定され、各抗体についての標準曲線が作成された。
胞（CD3/BaF）に適宜希釈したGPC3 ERY9-1、GPC3 ERY10-1が加えられ、GPC3 ERY9-1、又
は、GPC3 ERY10-1とGPC3/BaF又はCD3/BaFと反応させた。これらの細胞の洗浄の後、FITC
標識された2次抗体が加えられ、当該二次抗体をさらに反応させた。当該細胞の洗浄の後
、Epics XLフローサイトメーター（Beckman coulter社）により当該細胞に標識された蛍
光強度が測定され、各抗体についての標準曲線が作成された。
【0262】
GPC3 ERY9-1、GPC3 ERY10-1が投与されたマウスより継時的に採取された血液から調製
された血漿が適宜希釈された。上記の標準曲線の作成の場合と同様に当該血漿とGPC3/BaF
、CD3/BaFとを反応させ、血漿中に存在するGPC3 ERY9-1及びGPC3 ERY10-1の各細胞への結
合量が測定された。測定された値と前記の標準曲線を用いて、血漿中の各抗体濃度が算出
された。
された血漿が適宜希釈された。上記の標準曲線の作成の場合と同様に当該血漿とGPC3/BaF
、CD3/BaFとを反応させ、血漿中に存在するGPC3 ERY9-1及びGPC3 ERY10-1の各細胞への結
合量が測定された。測定された値と前記の標準曲線を用いて、血漿中の各抗体濃度が算出
された。
【0263】
その結果、GPC3 ERY9-1及びGPC3 ERY10-1はともに、投与後2日後において10 nM以上の
血中濃度を維持していることが明らかとなった（図９および１０）。この結果から、GPC3
ERY9-1及びGPC3 ERY10-1等の一連の分子の血漿中半減期はBiTEに比べて著しく改善され
ていることが示された。
血中濃度を維持していることが明らかとなった（図９および１０）。この結果から、GPC3
ERY9-1及びGPC3 ERY10-1等の一連の分子の血漿中半減期はBiTEに比べて著しく改善され
ていることが示された。
【0264】
（４）癌抗原非依存的サイトカイン誘導におけるサイレントFcの効果
（４－１）FcgR結合型Fcを持つGPC3 ERY15-1の作製
GPC3 ERY8-2、GPC3 ERY9-1、GPC3 ERY10-1等の一連の分子が癌抗原非依存的なサイトカ
インの誘導を起こすか否かを検証するために、FcgR結合型Fcを持つGPC3 ERY15-1（図１７
J）を作製した。
（４－１）FcgR結合型Fcを持つGPC3 ERY15-1の作製
GPC3 ERY8-2、GPC3 ERY9-1、GPC3 ERY10-1等の一連の分子が癌抗原非依存的なサイトカ
インの誘導を起こすか否かを検証するために、FcgR結合型Fcを持つGPC3 ERY15-1（図１７
J）を作製した。
【0265】
すなわち、上記の方法と同様に、適切な配列を付加したプライマーを用いたPCR法、お
よびQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene社）を用いた方法等の当業
者にとって公知の方法により、GPC3 ERY15-1_Hh（配列番号：４７、シグナル配列である
アミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY15-1_Hk（配列番号：４
８、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）をそれぞれ
コードするポリヌクレオチドが挿入された発現ベクターが作製された。
よびQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene社）を用いた方法等の当業
者にとって公知の方法により、GPC3 ERY15-1_Hh（配列番号：４７、シグナル配列である
アミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY15-1_Hk（配列番号：４
８、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）をそれぞれ
コードするポリヌクレオチドが挿入された発現ベクターが作製された。
【0266】
GPC3 ERY15-1_Hh（配列番号：４７、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成
熟配列には含まれない）、GPC3 ERY15-1_Hk（配列番号：４８、シグナル配列であるアミ
ノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、およびGPC3 ERY7_Lの発現ベクターが
共にFreeStyle293-F細胞に導入され、GPC3 ERY15-1を一過性に発現させた。得られた培養
上清がAnti FLAG M2カラム（Sigma社）に添加され、当該カラムの洗浄の後、0.1 mg/mL F
LAGペプチド（Sigma社）による溶出が実施された。GPC3 ERY15-1を含む画分がHisTrap HP
カラム（GE Healthcare社）に添加され、当該カラムの洗浄の後、イミダゾールの濃度勾
配による溶出が実施された。GPC3 ERY15-1を含む画分が限外ろ過によって濃縮された後、
当該画分がSuperdex 200カラム（GE Healthcare社）に添加され、溶出液の単量体のGPC3
ERY15-1画分のみを回収することにより精製GPC3 ERY15-1が得られた。
熟配列には含まれない）、GPC3 ERY15-1_Hk（配列番号：４８、シグナル配列であるアミ
ノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、およびGPC3 ERY7_Lの発現ベクターが
共にFreeStyle293-F細胞に導入され、GPC3 ERY15-1を一過性に発現させた。得られた培養
上清がAnti FLAG M2カラム（Sigma社）に添加され、当該カラムの洗浄の後、0.1 mg/mL F
LAGペプチド（Sigma社）による溶出が実施された。GPC3 ERY15-1を含む画分がHisTrap HP
カラム（GE Healthcare社）に添加され、当該カラムの洗浄の後、イミダゾールの濃度勾
配による溶出が実施された。GPC3 ERY15-1を含む画分が限外ろ過によって濃縮された後、
当該画分がSuperdex 200カラム（GE Healthcare社）に添加され、溶出液の単量体のGPC3
ERY15-1画分のみを回収することにより精製GPC3 ERY15-1が得られた。
【0267】
（４－２）癌抗原非依存的なサイトカイン誘導能の測定
GPC3 ERY15-1の癌抗原非依存的なサイトカイン誘導能が、GPC3 BiTE、GPC3 ERY9-1、GP
C3 ERY10-1、及びcatumaxomabのそれと比較された。健常人ボランティアから採取した血
液より上記の方法によりPBMCが調製された。ヒトPBMC溶液50 μL（2×105 細胞/ウェル）
に、40 nMに調製された各抗体50μLが添加され、更に100μLの10%FBS/D-MEMが加えられた
。反応液は5%炭酸ガス、37℃条件下にて培養された。72時間の培養の後に、培養上清が回
収され、Human Th1/Th2/Th17 Kit（BD社）を用いたCytometric Beads Array（CBA）法に
て培養上清中に分泌されたサイトカインが定量された。添付プロトコールに従った測定方
法による試験はtriplicateにて行われた。
GPC3 ERY15-1の癌抗原非依存的なサイトカイン誘導能が、GPC3 BiTE、GPC3 ERY9-1、GP
C3 ERY10-1、及びcatumaxomabのそれと比較された。健常人ボランティアから採取した血
液より上記の方法によりPBMCが調製された。ヒトPBMC溶液50 μL（2×105 細胞/ウェル）
に、40 nMに調製された各抗体50μLが添加され、更に100μLの10%FBS/D-MEMが加えられた
。反応液は5%炭酸ガス、37℃条件下にて培養された。72時間の培養の後に、培養上清が回
収され、Human Th1/Th2/Th17 Kit（BD社）を用いたCytometric Beads Array（CBA）法に
て培養上清中に分泌されたサイトカインが定量された。添付プロトコールに従った測定方
法による試験はtriplicateにて行われた。
【0268】
その結果、FcgR結合型Fcを持つGPC3 ERY15-1、catumaxomabには明らかなサイトカイン
誘導が認められたのに対して、Fcを持たないGPC3 BiTE、及びサイレント型Fcを持つGPC3
ERY9-1、GPC3 ERY10-1ではサイトカイン誘導が認められなかった（図１１）。よって、サ
イレント型Fcを持つGPC3 ERY8-2、GPC3 ERY9-1、GPC3 ERY10-1等の一連の分子は癌抗原非
依存的なサイトカイン誘導を起こさず、非常に高い安全性を持つ分子であるものと考えら
れた。
誘導が認められたのに対して、Fcを持たないGPC3 BiTE、及びサイレント型Fcを持つGPC3
ERY9-1、GPC3 ERY10-1ではサイトカイン誘導が認められなかった（図１１）。よって、サ
イレント型Fcを持つGPC3 ERY8-2、GPC3 ERY9-1、GPC3 ERY10-1等の一連の分子は癌抗原非
依存的なサイトカイン誘導を起こさず、非常に高い安全性を持つ分子であるものと考えら
れた。
【0269】
〔実施例４〕GPC3 ERY18 L1、L2、L3、L4、S1の作製と検討
scFv構造と異なるCD3結合ドメインを持つ分子の検討が行われた。癌抗原（GPC3）に対
するIgGの2本のH鎖のC末端にそれぞれCD3抗体のVH領域、VL領域を結合した分子型であるG
PC3 ERY18（図１７K）が作製された。この際、間のリンカー（Gly・Gly・Gly・Gly・Ser
）の個数を1個～4個に変えた一連の分子（GPC3 ERY18 L1～L4）が作製された。また、適
切な部位のアミノ酸をCysに置換してジスルフィド結合を導入することを可能とする分子
（GPC3 ERY18 S1）も同時に作製された。
scFv構造と異なるCD3結合ドメインを持つ分子の検討が行われた。癌抗原（GPC3）に対
するIgGの2本のH鎖のC末端にそれぞれCD3抗体のVH領域、VL領域を結合した分子型であるG
PC3 ERY18（図１７K）が作製された。この際、間のリンカー（Gly・Gly・Gly・Gly・Ser
）の個数を1個～4個に変えた一連の分子（GPC3 ERY18 L1～L4）が作製された。また、適
切な部位のアミノ酸をCysに置換してジスルフィド結合を導入することを可能とする分子
（GPC3 ERY18 S1）も同時に作製された。
【0270】
すなわち、上記の方法と同様に適切な配列を付加したプライマーを用いたPCR法等の当
業者にとって公知の方法により、GPC3 ERY18 L1_Hh（配列番号：４９、シグナル配列であ
るアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY18 L1_Hk（配列番号：
５０、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 E
RY18 L2_Hh（配列番号：５１、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列に
は含まれない）、GPC3 ERY18 L2_Hk（配列番号：５２、シグナル配列であるアミノ末端１
９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY18 L3_Hh（配列番号：５３、シグナル
配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY18 L3_Hk（配
列番号：５４、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）
、GPC3 ERY18 L4_Hh（配列番号：５５、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成
熟配列には含まれない）、GPC3 ERY18 L4_Hk（配列番号：５６、シグナル配列であるアミ
ノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY18 S1_Hh（配列番号：５７、
シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY18 S
1_Hk（配列番号：５８、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含ま
れない）をそれぞれコードするポリヌクレオチドが挿入された一連の発現ベクターが作製
された。
業者にとって公知の方法により、GPC3 ERY18 L1_Hh（配列番号：４９、シグナル配列であ
るアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY18 L1_Hk（配列番号：
５０、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 E
RY18 L2_Hh（配列番号：５１、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列に
は含まれない）、GPC3 ERY18 L2_Hk（配列番号：５２、シグナル配列であるアミノ末端１
９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY18 L3_Hh（配列番号：５３、シグナル
配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY18 L3_Hk（配
列番号：５４、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）
、GPC3 ERY18 L4_Hh（配列番号：５５、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成
熟配列には含まれない）、GPC3 ERY18 L4_Hk（配列番号：５６、シグナル配列であるアミ
ノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY18 S1_Hh（配列番号：５７、
シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY18 S
1_Hk（配列番号：５８、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含ま
れない）をそれぞれコードするポリヌクレオチドが挿入された一連の発現ベクターが作製
された。
【0271】
以下に示す組み合わせの発現ベクターがFreeStyle293-F細胞に導入され、各目的分子を
一過性に発現させた。
一過性に発現させた。
【0272】
Ｇ．目的分子：GPC3 ERY18 L1
発現ベクター：GPC3 ERY18 L1_Hh（配列番号：４９、シグナル配列であるアミノ末端１
９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY18 L1_Hk（配列番号：５０、シグナル
配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、及びGPC3 ERY7 L
発現ベクター：GPC3 ERY18 L1_Hh（配列番号：４９、シグナル配列であるアミノ末端１
９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY18 L1_Hk（配列番号：５０、シグナル
配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、及びGPC3 ERY7 L
【0273】
Ｈ．目的分子：GPC3 ERY18 L2
発現ベクター：GPC3 ERY18 L2_Hh（配列番号：５１、シグナル配列であるアミノ末端１
９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY18 L2_Hk（配列番号：５２、シグナル
配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、及びGPC3 ERY7 L
発現ベクター：GPC3 ERY18 L2_Hh（配列番号：５１、シグナル配列であるアミノ末端１
９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY18 L2_Hk（配列番号：５２、シグナル
配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、及びGPC3 ERY7 L
【0274】
Ｉ．目的分子：GPC3 ERY18 L3
発現ベクター：GPC3 ERY18 L3_Hh（配列番号：５３、シグナル配列であるアミノ末端１
９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY18 L3_Hk（配列番号：５４、シグナル
配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、及びGPC3 ERY7 L
発現ベクター：GPC3 ERY18 L3_Hh（配列番号：５３、シグナル配列であるアミノ末端１
９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY18 L3_Hk（配列番号：５４、シグナル
配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、及びGPC3 ERY7 L
【0275】
Ｊ．目的分子：GPC3 ERY18 L4
発現ベクター：GPC3 ERY18 L4_Hh（配列番号：５５、シグナル配列であるアミノ末端１
９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY18 L4_Hk（配列番号：５６、シグナル
配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、及びGPC3 ERY7 L
発現ベクター：GPC3 ERY18 L4_Hh（配列番号：５５、シグナル配列であるアミノ末端１
９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY18 L4_Hk（配列番号：５６、シグナル
配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、及びGPC3 ERY7 L
【0276】
Ｋ．目的分子：GPC3 ERY18 S1
発現ベクター：GPC3 ERY18 S1_Hh（配列番号：５７、シグナル配列であるアミノ末端１
９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY18 S1_Hk（配列番号：５８、シグナル
配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、及びGPC3 ERY7 L
発現ベクター：GPC3 ERY18 S1_Hh（配列番号：５７、シグナル配列であるアミノ末端１
９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY18 S1_Hk（配列番号：５８、シグナル
配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、及びGPC3 ERY7 L
【0277】
得られた培養上清がAnti FLAG M2カラム（Sigma社）に添加され、当該カラムの洗浄の
後、0.1 mg/mL FLAGペプチド（Sigma社）による溶出が実施された。目的分子を含む画分
がHisTrap HPカラム（GE Healthcare社）に添加され、当該カラムの洗浄の後、イミダゾ
ールの濃度勾配による溶出が実施された。目的分子を含む画分が限外ろ過によって濃縮さ
れた後、当該画分がSuperdex 200カラム（GE Healthcare社）に添加され、溶出液の単量
体画分のみを回収することにより精製された各目的分子が得られた。
後、0.1 mg/mL FLAGペプチド（Sigma社）による溶出が実施された。目的分子を含む画分
がHisTrap HPカラム（GE Healthcare社）に添加され、当該カラムの洗浄の後、イミダゾ
ールの濃度勾配による溶出が実施された。目的分子を含む画分が限外ろ過によって濃縮さ
れた後、当該画分がSuperdex 200カラム（GE Healthcare社）に添加され、溶出液の単量
体画分のみを回収することにより精製された各目的分子が得られた。
【0278】
GPC3 ERY18 L1、GPC3 ERY18L2、GPC3 ERY18L3、GPC3 ERY18L4、GPC3 ERY18S1の各分子
のin vitroの細胞傷害活性が評価された（図１２および１３）。その結果、GPC3 ERY18 L
1を除くいずれの分子もGPC3 ERY10-1と同等の活性を有することが見出された。scFvでは
ない構造を有する分子が同等の細胞傷害活性を有することが示された。癌抗原（GPC3）に
対するIgGの2本のH鎖のC末端にそれぞれCD3抗体のVH領域、VL領域を結合した構造による
、本願発明に係るポリペプチド会合体分子の安定化への貢献が期待される。
のin vitroの細胞傷害活性が評価された（図１２および１３）。その結果、GPC3 ERY18 L
1を除くいずれの分子もGPC3 ERY10-1と同等の活性を有することが見出された。scFvでは
ない構造を有する分子が同等の細胞傷害活性を有することが示された。癌抗原（GPC3）に
対するIgGの2本のH鎖のC末端にそれぞれCD3抗体のVH領域、VL領域を結合した構造による
、本願発明に係るポリペプチド会合体分子の安定化への貢献が期待される。
【0279】
〔実施例５〕GPC3 ERY19-3の作製と検討
次に、CD3結合ドメインがFab様構造である分子の検討が行われた。癌抗原（GPC3）に対
するIgG抗体の2本のH鎖のC末端にそれぞれCD3抗体のVH領域とCH1領域、およびVL領域とCL
領域が結合した分子型であるGPC3 ERY19-3が作製された（図１７L）。すなわち、上記の
方法と同様に適切な配列を付加したプライマーを用いたPCR法等の当業者にとって公知の
方法により、GPC3 ERY19-3_Hh（配列番号：５９、シグナル配列であるアミノ末端１９ア
ミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY19-3_Hk（配列番号：６０、シグナル配列
であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）をそれぞれコードするポリヌ
クレオチドが挿入された発現ベクターが作製された。
次に、CD3結合ドメインがFab様構造である分子の検討が行われた。癌抗原（GPC3）に対
するIgG抗体の2本のH鎖のC末端にそれぞれCD3抗体のVH領域とCH1領域、およびVL領域とCL
領域が結合した分子型であるGPC3 ERY19-3が作製された（図１７L）。すなわち、上記の
方法と同様に適切な配列を付加したプライマーを用いたPCR法等の当業者にとって公知の
方法により、GPC3 ERY19-3_Hh（配列番号：５９、シグナル配列であるアミノ末端１９ア
ミノ酸は成熟配列には含まれない）、GPC3 ERY19-3_Hk（配列番号：６０、シグナル配列
であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）をそれぞれコードするポリヌ
クレオチドが挿入された発現ベクターが作製された。
【0280】
GPC3 ERY19-3_Hh（配列番号：５９、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成
熟配列には含まれない）、GPC3 ERY19-3_Hk（配列番号：６０、シグナル配列であるアミ
ノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、およびGPC3 ERY7_Lの発現ベクターが
共にFreeStyle293-F細胞に導入され、一過性にGPC3 ERY19-3を発現させた。得られた培養
上清がHiTrap rProtein A FFカラム（GE Healthcare社）に添加され、当該カラムの洗浄
の後、酸による溶出が実施された。GPC3 ERY19-3を含む画分が限外ろ過によって濃縮され
た後、当該画分がSuperdex 200カラム（GE Healthcare社）に添加され、溶出液の単量体
のGPC3 ERY19-3画分のみを回収することにより精製GPC3 ERY19-3が得られた。
熟配列には含まれない）、GPC3 ERY19-3_Hk（配列番号：６０、シグナル配列であるアミ
ノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、およびGPC3 ERY7_Lの発現ベクターが
共にFreeStyle293-F細胞に導入され、一過性にGPC3 ERY19-3を発現させた。得られた培養
上清がHiTrap rProtein A FFカラム（GE Healthcare社）に添加され、当該カラムの洗浄
の後、酸による溶出が実施された。GPC3 ERY19-3を含む画分が限外ろ過によって濃縮され
た後、当該画分がSuperdex 200カラム（GE Healthcare社）に添加され、溶出液の単量体
のGPC3 ERY19-3画分のみを回収することにより精製GPC3 ERY19-3が得られた。
【0281】
GPC3 ERY19-3分子によるin vitroの細胞傷害活性が評価された。その結果、GPC3 BiTE
と同等の活性を有することが示された（図１４）。Fab様構造を有するCD3結合ドメインに
よる、本願発明に係るポリペプチド会合体分子の安定化への貢献が期待される。
と同等の活性を有することが示された（図１４）。Fab様構造を有するCD3結合ドメインに
よる、本願発明に係るポリペプチド会合体分子の安定化への貢献が期待される。
【0282】
〔実施例６〕GPC3 ERY 10-1のCH3ドメインへの変異導入によるプロテインA精製工程のみ
を用いたポリペプチド会合体の調製
（１）概要
実施例３で調製されたGPC3 ERY10-1では、CH3ドメインの構造としてknobs-into-holeが
用いられている。それぞれのH鎖のC末端にはHisタグとFLAGタグが付加されており、これ
らのタグを用いた2種類のアフィニティー精製を行うことにより、目的としている2種類の
H鎖がヘテロ会合化したGPC3 ERY10-1分子が精製された。GPC3 ERY10-1分子を医薬品とし
て製造する場合、GPC3 ERY10-1を発現する細胞の培養上精からプロテインAクロマトグラ
フィーを用いてFcドメインを有するポリペプチド会合体がまず精製される。さらに、His
タグアフィニティークロマトグラフィーとFLAGタグアフィニティークロマトグラフィーの
2種類のクロマトグラムを用いた精製工程が必要となり、精製工程のコストが高くなると
いう課題がある。そこで本実施例では、HisタグとFLAGタグを用いることなく、プロテイ
ンＡクロマトグラフィーのみを用いることによって目的とする2種類のH鎖がヘテロ会合化
したGPC3 ERY10-1分子を精製することを可能とする分子改変の検討が行われた。
を用いたポリペプチド会合体の調製
（１）概要
実施例３で調製されたGPC3 ERY10-1では、CH3ドメインの構造としてknobs-into-holeが
用いられている。それぞれのH鎖のC末端にはHisタグとFLAGタグが付加されており、これ
らのタグを用いた2種類のアフィニティー精製を行うことにより、目的としている2種類の
H鎖がヘテロ会合化したGPC3 ERY10-1分子が精製された。GPC3 ERY10-1分子を医薬品とし
て製造する場合、GPC3 ERY10-1を発現する細胞の培養上精からプロテインAクロマトグラ
フィーを用いてFcドメインを有するポリペプチド会合体がまず精製される。さらに、His
タグアフィニティークロマトグラフィーとFLAGタグアフィニティークロマトグラフィーの
2種類のクロマトグラムを用いた精製工程が必要となり、精製工程のコストが高くなると
いう課題がある。そこで本実施例では、HisタグとFLAGタグを用いることなく、プロテイ
ンＡクロマトグラフィーのみを用いることによって目的とする2種類のH鎖がヘテロ会合化
したGPC3 ERY10-1分子を精製することを可能とする分子改変の検討が行われた。
【0283】
具体的には、2種類のH鎖のうち、一方のH鎖のプロテインAへの結合を無くす改変の検討
が行なわれた。この改変により、プロテインAへの結合を無くしたH鎖がホモ会合化した分
子は、プロテインAに結合することができないためプロテインAクロマトグラフィーをパス
する。一方、プロテインAへの結合を無くしたH鎖とプロテインAへの結合を保持しているH
鎖がヘテロ会合化した分子と、プロテインAへの結合を保持しているH鎖がホモ会合化した
分子との、プロテインAへの結合性の相違を利用することによって、プロテインAクロマト
グラフィーによりこれらの分子の分離が可能であると考えられた。この際、抗体のFcドメ
インにおいて、プロテインAと抗体の血漿中滞留性に重要なFcRnが結合する箇所は重複し
ていることから、FcRnへの結合性を維持したまま、プロテインAへの結合性のみを選択的
に低減する必要がある。そのような改変として、EUナンバリング435番目のHisをArgに置
換する変異が見出された。この変異に加えて、2種類のH鎖のヘテロ会合化を促進する改変
として WO2006/106905に記載された変異（一方のH鎖のEUナンバリング356番目のAspをLys
に置換し、もう一方のH鎖のEUナンバリング439番目のLysをGluに置換する）を組み合わせ
ることにより、プロテインAクロマトグラフィーのみでGPC3 ERY10-1等のポリペプチド会
合体分子を精製することが可能かどうかが検証された。
が行なわれた。この改変により、プロテインAへの結合を無くしたH鎖がホモ会合化した分
子は、プロテインAに結合することができないためプロテインAクロマトグラフィーをパス
する。一方、プロテインAへの結合を無くしたH鎖とプロテインAへの結合を保持しているH
鎖がヘテロ会合化した分子と、プロテインAへの結合を保持しているH鎖がホモ会合化した
分子との、プロテインAへの結合性の相違を利用することによって、プロテインAクロマト
グラフィーによりこれらの分子の分離が可能であると考えられた。この際、抗体のFcドメ
インにおいて、プロテインAと抗体の血漿中滞留性に重要なFcRnが結合する箇所は重複し
ていることから、FcRnへの結合性を維持したまま、プロテインAへの結合性のみを選択的
に低減する必要がある。そのような改変として、EUナンバリング435番目のHisをArgに置
換する変異が見出された。この変異に加えて、2種類のH鎖のヘテロ会合化を促進する改変
として WO2006/106905に記載された変異（一方のH鎖のEUナンバリング356番目のAspをLys
に置換し、もう一方のH鎖のEUナンバリング439番目のLysをGluに置換する）を組み合わせ
ることにより、プロテインAクロマトグラフィーのみでGPC3 ERY10-1等のポリペプチド会
合体分子を精製することが可能かどうかが検証された。
【0284】
（２）抗体遺伝子発現ベクターの作製と各抗体の発現
抗体H鎖可変領域として、GC33(2)H（抗ヒトGlypican-3抗体 H鎖可変領域、配列番号：
６１、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）をコード
する遺伝子が当業者にとって公知の方法により作製された。同様に、抗体L鎖として、GC3
3-k0（抗ヒトGlypican-3抗体L鎖、配列番号：６２、シグナル配列であるアミノ末端１９
アミノ酸は成熟配列には含まれない）をコードする遺伝子が当業者にとって公知の方法に
より作製された。次に、抗体H鎖定常領域として、以下に示す遺伝子が当業者にとって公
知の方法により作製された。
抗体H鎖可変領域として、GC33(2)H（抗ヒトGlypican-3抗体 H鎖可変領域、配列番号：
６１、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）をコード
する遺伝子が当業者にとって公知の方法により作製された。同様に、抗体L鎖として、GC3
3-k0（抗ヒトGlypican-3抗体L鎖、配列番号：６２、シグナル配列であるアミノ末端１９
アミノ酸は成熟配列には含まれない）をコードする遺伝子が当業者にとって公知の方法に
より作製された。次に、抗体H鎖定常領域として、以下に示す遺伝子が当業者にとって公
知の方法により作製された。
【0285】
Ｌ．目的分子：LALA-G1d
IgG1の配列中のEUナンバリング234番目および235番目のLeuがAlaに置換され、297番目
のAsnがAlaに置換された変異が導入され、C末端のGly及びLysが除去されたLALA-G1d（配
列番号：６３、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）
IgG1の配列中のEUナンバリング234番目および235番目のLeuがAlaに置換され、297番目
のAsnがAlaに置換された変異が導入され、C末端のGly及びLysが除去されたLALA-G1d（配
列番号：６３、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）
【0286】
Ｍ．目的分子：LALA-G1d-CD3
LALA -G1d（配列番号：６３、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列
には含まれない）にCD3のscFv（抗ヒトCD3抗体H鎖可変領域及び抗ヒトCD3抗体L鎖可変領
域がポリペプチドリンカーを介して結合されたもの）がC末端に結合されたLALA-G1d-CD3
（配列番号：６４、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれな
い）
LALA -G1d（配列番号：６３、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列
には含まれない）にCD3のscFv（抗ヒトCD3抗体H鎖可変領域及び抗ヒトCD3抗体L鎖可変領
域がポリペプチドリンカーを介して結合されたもの）がC末端に結合されたLALA-G1d-CD3
（配列番号：６４、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれな
い）
【0287】
Ｎ．目的分子：LALA-G3S3E-G1d
LALA-G1d（配列番号：６３、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列に
は含まれない）の配列中のEUナンバリング435番目のHisをArgに置換する変異及びEUナン
バリング439番目のLysをGluに置換する変異が導入されたLALA-G3S3E-G1d（配列番号：６
５、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）
LALA-G1d（配列番号：６３、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列に
は含まれない）の配列中のEUナンバリング435番目のHisをArgに置換する変異及びEUナン
バリング439番目のLysをGluに置換する変異が導入されたLALA-G3S3E-G1d（配列番号：６
５、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）
【0288】
Ｏ．目的分子：LALA-S3K-G1d-CD3
LALA-G1d-CD3（配列番号：６４、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配
列には含まれない）の配列中のEUナンバリング356番目のAspをLysに置換する変異が導入
されたLALA-S3K-G1d-CD3（配列番号：６６、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸
は成熟配列には含まれない）。
LALA-G1d-CD3（配列番号：６４、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配
列には含まれない）の配列中のEUナンバリング356番目のAspをLysに置換する変異が導入
されたLALA-S3K-G1d-CD3（配列番号：６６、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸
は成熟配列には含まれない）。
【0289】
GC33(2) Hの下流にLALA-G1d-CD3あるいはLALA-G1dを連結することで、抗ヒトGPC3抗体H
鎖遺伝子NTA1LあるいはNTA1Rが作製された。GC33(2) Hの下流にLALA-S3K-G1d-CD3あるい
はLALA-G3S3E-G1dを連結することで、抗ヒトGPC3抗体H鎖遺伝子NTA2LあるいはNTA2Rが作
製された。
鎖遺伝子NTA1LあるいはNTA1Rが作製された。GC33(2) Hの下流にLALA-S3K-G1d-CD3あるい
はLALA-G3S3E-G1dを連結することで、抗ヒトGPC3抗体H鎖遺伝子NTA2LあるいはNTA2Rが作
製された。
【0290】
NTA1L, NTA1R, NTA2L, NTA2R（H鎖）及びGC33-k0（L鎖）の各遺伝子を、動物細胞発現
ベクターに組み込むことによって当該遺伝子の発現ベクターが作製された。以下に示す組
み合わせにより、これらのベクターが当業者公知の方法でFreeStyle293細胞（invitrogen
社）へ導入されることによって、下記に示す各ポリペプチド会合体を一過性に発現させた
。以下に示すように、導入した遺伝子の組み合わせを第一のH鎖／第二のH鎖／L鎖の順番
で示すことによってポリペプチド会合体の名前として表記されている。
NTA1L/NTA1R/GC33-k0
NTA2L/NTA2R/GC33-k0
ベクターに組み込むことによって当該遺伝子の発現ベクターが作製された。以下に示す組
み合わせにより、これらのベクターが当業者公知の方法でFreeStyle293細胞（invitrogen
社）へ導入されることによって、下記に示す各ポリペプチド会合体を一過性に発現させた
。以下に示すように、導入した遺伝子の組み合わせを第一のH鎖／第二のH鎖／L鎖の順番
で示すことによってポリペプチド会合体の名前として表記されている。
NTA1L/NTA1R/GC33-k0
NTA2L/NTA2R/GC33-k0
【0291】
（３）発現サンプルの精製とヘテロ会合体形成の評価
下記に示すポリペプチド会合体を含むFreeStyle293細胞の培養上清（以下CMと指称され
る）が試料として用いられた。
NTA1L/NTA1R/GC33-k0
NTA2L/NTA2R/GC33-k0
下記に示すポリペプチド会合体を含むFreeStyle293細胞の培養上清（以下CMと指称され
る）が試料として用いられた。
NTA1L/NTA1R/GC33-k0
NTA2L/NTA2R/GC33-k0
【0292】
D-PBSで平衡化したrProtein A Sepharose Fast Flowカラム（GE Healthcare）にφ0.22
μmフィルターで濾過したCMが負荷され、表１に示すバッファーにより洗浄1、2、および
溶出1の各ステップが実施された。負荷される抗体量が20 mg/mL resineになるようにCMの
負荷量が調節された。分取された溶出画分のサイズ排除クロマトグラフィー分析により、
溶出画分に含まれている成分が同定された。
μmフィルターで濾過したCMが負荷され、表１に示すバッファーにより洗浄1、2、および
溶出1の各ステップが実施された。負荷される抗体量が20 mg/mL resineになるようにCMの
負荷量が調節された。分取された溶出画分のサイズ排除クロマトグラフィー分析により、
溶出画分に含まれている成分が同定された。
【0293】
【表1】
【0294】
各溶出画分のサイズ排除クロマトグラフィー分析の結果を図１５及び表２に示した。値
は溶出ピークの面積がパーセントで表記されている。NTA1L/NTA1R/GC33-k0及びNTA2L/NTA
2R/GC33-k0を発現させたCM中には、共にCD3に対するホモ抗体（NTA1L/GC33-k0, NTA2L/GC
33-k0）がほとんど検出されなかった。GPC3に対するホモ抗体（NTA2R/GC33-k0）に関して
は、NTA1L/NTA1R/GC33-k0を発現させたCM中では76％程度検出されたのに対して、NTA2L/N
TA2R/GC33-k0をを発現させたCM中では2%程度しか検出されなかった。すなわち、EUナンバ
リング435番目のHisをArgに置換する変異に加えて、各H鎖のヘテロ分子を効率的に形成さ
せるために、一方のH鎖のポリペプチド配列中のEUナンバリング356番目のAspをLysに置換
する変異およびもう一方のH鎖のポリペプチド配列中のEUナンバリング439番目のLysをGlu
に置換する変異を導入することによって、プロテインＡを用いた精製工程のみにより、目
的のGPC3 ERY10-1と同様の分子形からなるヘテロで会合するポリペプチド会合体を98%以
上の純度で効率的に精製することが可能であることが明らかになった。
は溶出ピークの面積がパーセントで表記されている。NTA1L/NTA1R/GC33-k0及びNTA2L/NTA
2R/GC33-k0を発現させたCM中には、共にCD3に対するホモ抗体（NTA1L/GC33-k0, NTA2L/GC
33-k0）がほとんど検出されなかった。GPC3に対するホモ抗体（NTA2R/GC33-k0）に関して
は、NTA1L/NTA1R/GC33-k0を発現させたCM中では76％程度検出されたのに対して、NTA2L/N
TA2R/GC33-k0をを発現させたCM中では2%程度しか検出されなかった。すなわち、EUナンバ
リング435番目のHisをArgに置換する変異に加えて、各H鎖のヘテロ分子を効率的に形成さ
せるために、一方のH鎖のポリペプチド配列中のEUナンバリング356番目のAspをLysに置換
する変異およびもう一方のH鎖のポリペプチド配列中のEUナンバリング439番目のLysをGlu
に置換する変異を導入することによって、プロテインＡを用いた精製工程のみにより、目
的のGPC3 ERY10-1と同様の分子形からなるヘテロで会合するポリペプチド会合体を98%以
上の純度で効率的に精製することが可能であることが明らかになった。
【0295】
【表2】
【0296】
〔実施例７〕GPC3 ERY 17-2及びGPC3 ERY 17-3の作製と検討
（１）GPC3 ERY 17-2及びGPC3 ERY 17-3の作製
次に、癌抗原（GPC3）に対するIgGを基本骨格とし、片方のFabをCD3 epsilonに対する
結合ドメインに置き換えた形の分子が作製された。この際、基本骨格とするIgGのFcとし
ては、上述した場合と同様に、FcgR（Fcγ受容体）への結合性が減弱されたサイレント型
Fcが用いられた。CD3 epsilonに対する結合ドメインとして、CD3 epsilonに対するFabのV
HドメインとVLドメインを置き換えたGPC3 ERY17-2（図１９A）と、CH1ドメインとCLドメ
インを置き換えたGPC3 ERY17-3（図１９B）がそれぞれ作製された。
（１）GPC3 ERY 17-2及びGPC3 ERY 17-3の作製
次に、癌抗原（GPC3）に対するIgGを基本骨格とし、片方のFabをCD3 epsilonに対する
結合ドメインに置き換えた形の分子が作製された。この際、基本骨格とするIgGのFcとし
ては、上述した場合と同様に、FcgR（Fcγ受容体）への結合性が減弱されたサイレント型
Fcが用いられた。CD3 epsilonに対する結合ドメインとして、CD3 epsilonに対するFabのV
HドメインとVLドメインを置き換えたGPC3 ERY17-2（図１９A）と、CH1ドメインとCLドメ
インを置き換えたGPC3 ERY17-3（図１９B）がそれぞれ作製された。
【0297】
すなわち、上記した方法と同様の適切な配列を付加したプライマーを用いたPCR法等の
当業者において公知の方法により、ERY17-2_Hh（配列番号：７３、シグナル配列であるア
ミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、ERY17-2_L（配列番号：７４、シグ
ナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、ERY17-3_Hh（配列
番号：７５、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、
ERY17-3_L（配列番号：７６、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列に
は含まれない）をそれぞれコードするポリヌクレオチドが挿入された一連の発現ベクター
が作製された。
当業者において公知の方法により、ERY17-2_Hh（配列番号：７３、シグナル配列であるア
ミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、ERY17-2_L（配列番号：７４、シグ
ナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、ERY17-3_Hh（配列
番号：７５、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、
ERY17-3_L（配列番号：７６、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列に
は含まれない）をそれぞれコードするポリヌクレオチドが挿入された一連の発現ベクター
が作製された。
【0298】
以下に示す組み合わせの発現ベクターがFreeStyle293-F細胞に導入され、各目的分子を
一過性に発現させた。
一過性に発現させた。
【0299】
Ｐ．目的分子：GPC3 ERY17-2
発現ベクターに挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド：GPC3 E
RY8-2_Hk、GPC3 ERY7_L、ERY17-2_Hh（配列番号：７３、シグナル配列であるアミノ末端
１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、ERY17-2_L（配列番号：７４、シグナル配列
であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）
発現ベクターに挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド：GPC3 E
RY8-2_Hk、GPC3 ERY7_L、ERY17-2_Hh（配列番号：７３、シグナル配列であるアミノ末端
１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、ERY17-2_L（配列番号：７４、シグナル配列
であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）
【0300】
Ｑ．目的分子：GPC3 ERY17-3
発現ベクターに挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド：GPC3 E
RY8-2_Hk、GPC3 ERY7_L、ERY17-3_Hh（配列番号：７５、シグナル配列であるアミノ末端
１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、ERY17-3_L（配列番号：７６、シグナル配列
であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）
発現ベクターに挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド：GPC3 E
RY8-2_Hk、GPC3 ERY7_L、ERY17-3_Hh（配列番号：７５、シグナル配列であるアミノ末端
１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、ERY17-3_L（配列番号：７６、シグナル配列
であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）
【0301】
（２）GPC3 ERY 17-2及びGPC3 ERY 17-3の精製
得られた培養上清がAnti FLAG M2カラム（Sigma社）に添加され、当該カラムの洗浄の
後、0.1 mg/mL FLAGペプチド（Sigma社）による溶出が実施された。目的分子を含む画分
がHisTrap HPカラム（GE Healthcare社）に添加され、当該カラムの洗浄の後、イミダゾ
ールの濃度勾配による溶出が実施された。目的分子を含む画分が限外ろ過によって濃縮さ
れた後、当該画分がSuperdex 200カラム（GE Healthcare社）に添加され、溶出液の単量
体画分のみを回収することにより精製された各目的分子が得られた。
得られた培養上清がAnti FLAG M2カラム（Sigma社）に添加され、当該カラムの洗浄の
後、0.1 mg/mL FLAGペプチド（Sigma社）による溶出が実施された。目的分子を含む画分
がHisTrap HPカラム（GE Healthcare社）に添加され、当該カラムの洗浄の後、イミダゾ
ールの濃度勾配による溶出が実施された。目的分子を含む画分が限外ろ過によって濃縮さ
れた後、当該画分がSuperdex 200カラム（GE Healthcare社）に添加され、溶出液の単量
体画分のみを回収することにより精製された各目的分子が得られた。
【0302】
（３）GPC3 ERY 17-2及びGPC3 ERY 17-3の細胞傷害活性
GPC3 ERY 17-2及びGPC3 ERY 17-3についてin vitroの細胞傷害活性が調べられた（図２
０）。その結果、いずれの分子も明らかにGPC3 BiTEを上回る細胞傷害活性を奏すること
が認められた。本発明において、癌抗原に対するIgGを基本骨格とし、片側のFabをCD3 ep
silonに対する結合ドメインに置き換えた分子もBiTEと同等以上の細胞傷害活性を奏する
ことが初めて明らかとなった。
GPC3 ERY 17-2及びGPC3 ERY 17-3についてin vitroの細胞傷害活性が調べられた（図２
０）。その結果、いずれの分子も明らかにGPC3 BiTEを上回る細胞傷害活性を奏すること
が認められた。本発明において、癌抗原に対するIgGを基本骨格とし、片側のFabをCD3 ep
silonに対する結合ドメインに置き換えた分子もBiTEと同等以上の細胞傷害活性を奏する
ことが初めて明らかとなった。
【0303】
（４）PC-10 T細胞移入モデルを用いたGPC3 ERY17-2の薬効試験
in vitroのアッセイでGPC3 BiTEと同等以上の細胞傷害活性が認められたGPC3 ERY17-2
のin vivoの薬効の評価がPC-10 T細胞移入モデルを用いて行なわれた。すなわち、GPC3 E
RY17-2のPC-10 T細胞移入モデルによる薬効試験においては、下記のような試験が行われ
た。健常人ボランティアより採取した血液から分離されたPBMC及びT cell activation/ e
xpansion kit/ human（MACS Miltenyi biotec社）を用いてT細胞の拡大培養が行なわれた
。ヒト肺扁平上皮がん細胞株PC-10（免疫生物研究所） 1×107細胞と、マトリゲル基底膜
マトリックス（BD社）が混和され、NOD scidマウス（日本クレア、雌、7W）のそけい部皮
下に移植された。移植の日をday 0とした。マウスには移植前日、およびday 13、17、21
、25に抗アシアロGM1抗体（和光純薬）が0.2 mg/匹で腹腔内に投与された。移植後13日目
に腫瘍サイズと体重に応じて群分けが行なわれ、移植後14日目に前記拡大培養によって得
られたT細胞が3×107細胞/匹で腹腔内に移植された。その2時間後から、GPC ERY17-2が30
μg/匹で静脈内投与された。GPC ERY17-2の投与はday 14、15、16、17、18に、計5回行
われた。
in vitroのアッセイでGPC3 BiTEと同等以上の細胞傷害活性が認められたGPC3 ERY17-2
のin vivoの薬効の評価がPC-10 T細胞移入モデルを用いて行なわれた。すなわち、GPC3 E
RY17-2のPC-10 T細胞移入モデルによる薬効試験においては、下記のような試験が行われ
た。健常人ボランティアより採取した血液から分離されたPBMC及びT cell activation/ e
xpansion kit/ human（MACS Miltenyi biotec社）を用いてT細胞の拡大培養が行なわれた
。ヒト肺扁平上皮がん細胞株PC-10（免疫生物研究所） 1×107細胞と、マトリゲル基底膜
マトリックス（BD社）が混和され、NOD scidマウス（日本クレア、雌、7W）のそけい部皮
下に移植された。移植の日をday 0とした。マウスには移植前日、およびday 13、17、21
、25に抗アシアロGM1抗体（和光純薬）が0.2 mg/匹で腹腔内に投与された。移植後13日目
に腫瘍サイズと体重に応じて群分けが行なわれ、移植後14日目に前記拡大培養によって得
られたT細胞が3×107細胞/匹で腹腔内に移植された。その2時間後から、GPC ERY17-2が30
μg/匹で静脈内投与された。GPC ERY17-2の投与はday 14、15、16、17、18に、計5回行
われた。
【0304】
その結果、このモデルにおいても、GPC3 ERY17-2投与群においては溶媒投与群に比較し
て明らかな抗腫瘍作用が認められた（図２１）。
て明らかな抗腫瘍作用が認められた（図２１）。
【0305】
以上のことから、癌抗原に対するIgGを基本骨格とし、片側のFabをCD3 epsilonに対す
る結合ドメインに置き換えた分子は明らかなin vivoにおける抗腫瘍効果を奏することが
示された。
る結合ドメインに置き換えた分子は明らかなin vivoにおける抗腫瘍効果を奏することが
示された。
【0306】
〔実施例８〕GPC3 ERY17-2-M20の作製と検討
（１）GPC3 ERY17-2-M20の作製
次に、CD3 epsilonに対する結合ドメインの配列が変わっても目的の活性を持つ分子の
創製が試みられた。GPC3 ERY17-2のCD3 epsilonに対する結合ドメインの配列を変えたGPC
3 ERY17-2-M20（図１９Ａ）が作製された。すなわち、CD3抗体（M20）の発現ベクターが
鋳型として用いられ、上記した方法と同様の適切な配列を付加したプライマーを用いたPC
R法等の当業者において公知の方法により、ERY17-2-M20_Hh（配列番号：７７、シグナル
配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、ERY17-2-M20_L（配列
番号：７８、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）を
それぞれコードするポリヌクレオチドが挿入された一連の発現ベクターが作製された。
（１）GPC3 ERY17-2-M20の作製
次に、CD3 epsilonに対する結合ドメインの配列が変わっても目的の活性を持つ分子の
創製が試みられた。GPC3 ERY17-2のCD3 epsilonに対する結合ドメインの配列を変えたGPC
3 ERY17-2-M20（図１９Ａ）が作製された。すなわち、CD3抗体（M20）の発現ベクターが
鋳型として用いられ、上記した方法と同様の適切な配列を付加したプライマーを用いたPC
R法等の当業者において公知の方法により、ERY17-2-M20_Hh（配列番号：７７、シグナル
配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、ERY17-2-M20_L（配列
番号：７８、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）を
それぞれコードするポリヌクレオチドが挿入された一連の発現ベクターが作製された。
【0307】
（２）GPC3 ERY17-2-M20の精製
GPC3 ERY8-2_Hk、GPC3 ERY7_L、ERY17-2-M20_Hh（配列番号：７７）、およびERY17-2-M
20 _L（配列番号：７８）の発現ベクターが共にFreeStyle293-F細胞に導入され、一過性
にGPC3 ERY17-2-M20を発現させた。得られた培養上清が、φ0.22μmフィルターで濾過さ
れた後、平衡化したrProtein A Sepharose Fast Flowカラム（GE Healthcare）に負荷さ
れた。表３に示すバッファーにより洗浄1、2、および溶出1の各ステップが実施されるこ
とにより精製GPC3 ERY17-2-M20が得られた。
GPC3 ERY8-2_Hk、GPC3 ERY7_L、ERY17-2-M20_Hh（配列番号：７７）、およびERY17-2-M
20 _L（配列番号：７８）の発現ベクターが共にFreeStyle293-F細胞に導入され、一過性
にGPC3 ERY17-2-M20を発現させた。得られた培養上清が、φ0.22μmフィルターで濾過さ
れた後、平衡化したrProtein A Sepharose Fast Flowカラム（GE Healthcare）に負荷さ
れた。表３に示すバッファーにより洗浄1、2、および溶出1の各ステップが実施されるこ
とにより精製GPC3 ERY17-2-M20が得られた。
【0308】
【表3】
【0309】
（３）GPC3 ERY17-2-M20の細胞傷害活性
GPC3 ERY17-2-M20のin vitroの細胞傷害活性を調べたところ、GPC3 ERY17-2とほぼ同等
の細胞傷害活性が認められた（図２２）。このことからCD3 epsilonに対する結合ドメイ
ンの配列が変わった分子においても同等の細胞傷害活性を持つことが明らかとなった。
GPC3 ERY17-2-M20のin vitroの細胞傷害活性を調べたところ、GPC3 ERY17-2とほぼ同等
の細胞傷害活性が認められた（図２２）。このことからCD3 epsilonに対する結合ドメイ
ンの配列が変わった分子においても同等の細胞傷害活性を持つことが明らかとなった。
【0310】
〔実施例９〕EpCAM ERY17-2、EpCAM ERY17-3の作製と検討
（１）EpCAM ERY17-2、EpCAM ERY17-3の作製
次に、標的とする癌抗原が変わっても目的の活性を持つ分子の創製が試みられた。GPC3
ERY17-2のGPC3に対するFabをEpCAMに対するFabに変えたEpCAM ERY17-2（図１９Ａ）と、
GPC3 ERY17-3のGPC3に対するFabをEpCAMに対するFabに変えたEpCAM ERY17-3（図１９Ｂ）
がそれぞれ作製された。すなわち、EpCAM抗体の発現ベクターが鋳型として用いられ、上
記した方法と同様の適切な配列を付加したプライマーを用いたPCR法等の当業者において
公知の方法により、EpCAM ERY17_Hk（配列番号：７９、シグナル配列であるアミノ末端１
９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、EpCAM ERY17_L（配列番号：８０、シグナル配
列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）をそれぞれコードするポリ
ヌクレオチドが挿入された一連の発現ベクターが作製された。
（１）EpCAM ERY17-2、EpCAM ERY17-3の作製
次に、標的とする癌抗原が変わっても目的の活性を持つ分子の創製が試みられた。GPC3
ERY17-2のGPC3に対するFabをEpCAMに対するFabに変えたEpCAM ERY17-2（図１９Ａ）と、
GPC3 ERY17-3のGPC3に対するFabをEpCAMに対するFabに変えたEpCAM ERY17-3（図１９Ｂ）
がそれぞれ作製された。すなわち、EpCAM抗体の発現ベクターが鋳型として用いられ、上
記した方法と同様の適切な配列を付加したプライマーを用いたPCR法等の当業者において
公知の方法により、EpCAM ERY17_Hk（配列番号：７９、シグナル配列であるアミノ末端１
９アミノ酸は成熟配列には含まれない）、EpCAM ERY17_L（配列番号：８０、シグナル配
列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には含まれない）をそれぞれコードするポリ
ヌクレオチドが挿入された一連の発現ベクターが作製された。
【0311】
以下に示す組み合わせの発現ベクターがFreeStyle293-F細胞に導入され、各目的分子を
一過性に発現させた。
一過性に発現させた。
【0312】
Ｒ．目的分子：EpCAM ERY17-2
発現ベクターに挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド：EpCAM
ERY17_Hk（配列番号：７９、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には
含まれない）、EpCAM ERY17_L（配列番号：８０、シグナル配列であるアミノ末端１９ア
ミノ酸は成熟配列には含まれない）、ERY17-2_Hh、ERY17-2_L
発現ベクターに挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド：EpCAM
ERY17_Hk（配列番号：７９、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には
含まれない）、EpCAM ERY17_L（配列番号：８０、シグナル配列であるアミノ末端１９ア
ミノ酸は成熟配列には含まれない）、ERY17-2_Hh、ERY17-2_L
【0313】
Ｓ．目的分子：EpCAM ERY17-3
発現ベクターに挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド：EpCAM
ERY17_Hk、EpCAM ERY17_L、ERY17-3_Hh、ERY17-3_L
発現ベクターに挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド：EpCAM
ERY17_Hk、EpCAM ERY17_L、ERY17-3_Hh、ERY17-3_L
【0314】
（２）EpCAM ERY17-2、EpCAM ERY17-3の精製
得られた培養上清がAnti FLAG M2カラム（Sigma社）に添加され、当該カラムの洗浄の
後、0.1 mg/mL FLAGペプチド（Sigma社）による溶出が実施された。目的分子を含む画分
がHisTrap HPカラム（GE Healthcare社）に添加され、当該カラムの洗浄の後、イミダゾ
ールの濃度勾配による溶出が実施された。目的分子を含む画分が限外ろ過によって濃縮さ
れた後、当該画分がSuperdex 200カラム（GE Healthcare社）に添加され、溶出液の単量
体画分のみを回収することにより精製された各目的分子が得られた。
得られた培養上清がAnti FLAG M2カラム（Sigma社）に添加され、当該カラムの洗浄の
後、0.1 mg/mL FLAGペプチド（Sigma社）による溶出が実施された。目的分子を含む画分
がHisTrap HPカラム（GE Healthcare社）に添加され、当該カラムの洗浄の後、イミダゾ
ールの濃度勾配による溶出が実施された。目的分子を含む画分が限外ろ過によって濃縮さ
れた後、当該画分がSuperdex 200カラム（GE Healthcare社）に添加され、溶出液の単量
体画分のみを回収することにより精製された各目的分子が得られた。
【0315】
（３）EpCAM ERY17-2、EpCAM ERY17-3の細胞傷害活性
EpCAM ERY17-2、EpCAM ERY17-3のin vitroの細胞傷害活性を調べたところ、いずれの分
子においても強い細胞傷害活性が認められた（図２３）。本発明において、癌抗原に対す
るIgGを基本骨格とし、片側のFabをCD3 epsilonに対する結合ドメインに置き換えた分子
において、癌抗原の種類を変えても細胞傷害活性を持つことが明らかとなった。
EpCAM ERY17-2、EpCAM ERY17-3のin vitroの細胞傷害活性を調べたところ、いずれの分
子においても強い細胞傷害活性が認められた（図２３）。本発明において、癌抗原に対す
るIgGを基本骨格とし、片側のFabをCD3 epsilonに対する結合ドメインに置き換えた分子
において、癌抗原の種類を変えても細胞傷害活性を持つことが明らかとなった。
【0316】
〔実施例１０〕CH1/CL界面会合制御が導入された二重特異性抗体の作製と検討
（１）二重特異性抗体の設計
二重特異性抗体のそれぞれのCH1とCLドメインに変異を導入し、CH1/CLの界面の電荷的
な反発を利用し、CH1/CLの界面会合を制御することによって、GPC3に対するH鎖とL鎖のみ
が会合し、CD3に対するH鎖とL鎖のみがそれぞれ特異的に会合させることが可能であると
考えられた。電荷的な反発を利用してCH1/CL界面会合の制御を行うために、H鎖のCH1、ま
たはL鎖のCL中のアミノ酸残基が、正電荷であるLys、または負電荷であるGluに置換され
た。
（１）二重特異性抗体の設計
二重特異性抗体のそれぞれのCH1とCLドメインに変異を導入し、CH1/CLの界面の電荷的
な反発を利用し、CH1/CLの界面会合を制御することによって、GPC3に対するH鎖とL鎖のみ
が会合し、CD3に対するH鎖とL鎖のみがそれぞれ特異的に会合させることが可能であると
考えられた。電荷的な反発を利用してCH1/CL界面会合の制御を行うために、H鎖のCH1、ま
たはL鎖のCL中のアミノ酸残基が、正電荷であるLys、または負電荷であるGluに置換され
た。
【0317】
（２）抗体遺伝子発現ベクターの作製と各抗体の発現
Anti-CD3抗体であるM12 (H鎖、配列番号：８１およびL鎖、配列番号：８２)と、Anti-G
PC3抗体であるGC33(2)(H鎖、配列番号：８３およびL鎖、配列番号：８４)にCH1/CL界面会
合制御が導入され、さらにH鎖同士の会合を避けるため、Knob into Hole(KiH)（WO1996/0
27011、Ridgway JB ら（Protein Engineering (1996) 9, 617-621）、Merchant AM ら (N
at. Biotechnol. (1998) 16, 677-681)）の改変が導入された二重特異性抗体が作製され
た（図24A）。対照として、CH1/CL界面会合制御もKnob into Hole(KiH)改変も導入されて
いない二重特異性抗体も作製された（図24B）。具体的には、M12のH鎖(配列番号：８１)
のCH1の数アミノ酸がLysに置換されたM12_TH2h(配列番号：８５)、L鎖(配列番号：８２)
のCLの数アミノ酸がGluに置換されたM12_TL17(配列番号：８６)をそれぞれコードするポ
リヌクレオチドが挿入された発現ベクターが当業者にとって公知の方法により作製された
。同様に、GC33(2)のH鎖(配列番号：８３)のCH1の数アミノ酸がGluに置換されたGC33(2)_
TH13k(配列番号：８７)、GC33(2)_TH15k(配列番号：８８)、L鎖(配列番号：８４)のCLの
数アミノ酸がLysに置換されたGC33(2)_TL16(配列番号：８９)、GC33(2)_TL19(配列番号：
９０)をそれぞれコードするポリヌクレオチドが挿入された発現ベクターが当業者にとっ
て公知の方法により作製された。
Anti-CD3抗体であるM12 (H鎖、配列番号：８１およびL鎖、配列番号：８２)と、Anti-G
PC3抗体であるGC33(2)(H鎖、配列番号：８３およびL鎖、配列番号：８４)にCH1/CL界面会
合制御が導入され、さらにH鎖同士の会合を避けるため、Knob into Hole(KiH)（WO1996/0
27011、Ridgway JB ら（Protein Engineering (1996) 9, 617-621）、Merchant AM ら (N
at. Biotechnol. (1998) 16, 677-681)）の改変が導入された二重特異性抗体が作製され
た（図24A）。対照として、CH1/CL界面会合制御もKnob into Hole(KiH)改変も導入されて
いない二重特異性抗体も作製された（図24B）。具体的には、M12のH鎖(配列番号：８１)
のCH1の数アミノ酸がLysに置換されたM12_TH2h(配列番号：８５)、L鎖(配列番号：８２)
のCLの数アミノ酸がGluに置換されたM12_TL17(配列番号：８６)をそれぞれコードするポ
リヌクレオチドが挿入された発現ベクターが当業者にとって公知の方法により作製された
。同様に、GC33(2)のH鎖(配列番号：８３)のCH1の数アミノ酸がGluに置換されたGC33(2)_
TH13k(配列番号：８７)、GC33(2)_TH15k(配列番号：８８)、L鎖(配列番号：８４)のCLの
数アミノ酸がLysに置換されたGC33(2)_TL16(配列番号：８９)、GC33(2)_TL19(配列番号：
９０)をそれぞれコードするポリヌクレオチドが挿入された発現ベクターが当業者にとっ
て公知の方法により作製された。
【0318】
以下に示す配列をコードする発現ベクターの組み合わせがFreeStyle293-F細胞に導入さ
れ、各目的分子を一過性に発現させた。
れ、各目的分子を一過性に発現させた。
【0319】
Ｔ．目的分子：GM1
発現ベクター：M12_TH2h(配列番号：８５)、M12_TL17(配列番号：８６)、GC33(2)_TH13
k(配列番号：８７)、及びGC33(2)_TL16(配列番号：８９)
発現ベクター：M12_TH2h(配列番号：８５)、M12_TL17(配列番号：８６)、GC33(2)_TH13
k(配列番号：８７)、及びGC33(2)_TL16(配列番号：８９)
【0320】
Ｕ．目的分子：GM2
発現ベクター：M12_TH2h(配列番号：８５)、M12_TL17(配列番号：８６)、GC33(2)_TH15
k(配列番号：８８)、及びGC33(2)_TL19(配列番号：９０)
発現ベクター：M12_TH2h(配列番号：８５)、M12_TL17(配列番号：８６)、GC33(2)_TH15
k(配列番号：８８)、及びGC33(2)_TL19(配列番号：９０)
【0321】
Ｖ．目的分子：GM0
発現ベクター：M12のH鎖(配列番号：８１)、M12のL鎖(配列番号：８２)、GC33(2) のH
鎖(配列番号：８３)、及びGC33(2) のL鎖(配列番号：８４)
発現ベクター：M12のH鎖(配列番号：８１)、M12のL鎖(配列番号：８２)、GC33(2) のH
鎖(配列番号：８３)、及びGC33(2) のL鎖(配列番号：８４)
【0322】
得られた培養上清から、rProtein A SepharoseTM Fast Flow（GE Healthcare社）を用い
た当業者公知の方法で、抗体が精製された。
た当業者公知の方法で、抗体が精製された。
【0323】
（３）GM1、GM2、GM0細胞傷害活性
GM1、GM2、GM0の各ポリペプチド会合体のin vitroの細胞傷害活性を調べたところ、GM1
およびGM2は同等の細胞傷害活性を示すことが認められ、またその活性は明らかにGM0の活
性を上回る細胞傷害活性であった（図２５）。本発明において、CH1/CL界面制御の導入と
KiHの改変を組み合わせることによって効率よく二重特異性抗体が作製されることが明ら
かとなった。
GM1、GM2、GM0の各ポリペプチド会合体のin vitroの細胞傷害活性を調べたところ、GM1
およびGM2は同等の細胞傷害活性を示すことが認められ、またその活性は明らかにGM0の活
性を上回る細胞傷害活性であった（図２５）。本発明において、CH1/CL界面制御の導入と
KiHの改変を組み合わせることによって効率よく二重特異性抗体が作製されることが明ら
かとなった。
【0324】
〔実施例１１〕EGFR ERY17-2の作製と検討
（１）EGFR ERY17-2の作製
さらに他の癌抗原を標的とした目的の活性を持つ分子の創製が試みられた。GPC3 ERY17
-2のGPC3に対するFabをEGFRに対するFabに変えたEGFR ERY17-2（図１９Ａ）が作製された
。すなわち、EGFR抗体の発現ベクターが鋳型として用いられ、上記した方法と同様の適切
な配列を付加したプライマーを用いたPCR法等の当業者において公知の方法により、EGFR
ERY17_Hk（配列番号：９１、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には
含まれない）、EGFR ERY17_L（配列番号：９２、シグナル配列であるアミノ末端１９アミ
ノ酸は成熟配列には含まれない）をそれぞれコードするポリヌクレオチドが挿入された一
連の発現ベクターが作製された。
（１）EGFR ERY17-2の作製
さらに他の癌抗原を標的とした目的の活性を持つ分子の創製が試みられた。GPC3 ERY17
-2のGPC3に対するFabをEGFRに対するFabに変えたEGFR ERY17-2（図１９Ａ）が作製された
。すなわち、EGFR抗体の発現ベクターが鋳型として用いられ、上記した方法と同様の適切
な配列を付加したプライマーを用いたPCR法等の当業者において公知の方法により、EGFR
ERY17_Hk（配列番号：９１、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には
含まれない）、EGFR ERY17_L（配列番号：９２、シグナル配列であるアミノ末端１９アミ
ノ酸は成熟配列には含まれない）をそれぞれコードするポリヌクレオチドが挿入された一
連の発現ベクターが作製された。
【0325】
以下に示す組み合わせの発現ベクターがFreeStyle293-F細胞に導入され、各目的分子を
一過性に発現させた。
一過性に発現させた。
【0326】
Ｗ．目的分子：EGFR ERY17-2
発現ベクターに挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド：EGFR E
RY17_Hk（配列番号：９１、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には
含まれない）、EGFR ERY17_L（配列番号：９２、シグナル配列であるアミノ末端１９アミ
ノ酸は成熟配列には含まれない）、ERY17-2_Hh、ERY17-2_L
発現ベクターに挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド：EGFR E
RY17_Hk（配列番号：９１、シグナル配列であるアミノ末端１９アミノ酸は成熟配列には
含まれない）、EGFR ERY17_L（配列番号：９２、シグナル配列であるアミノ末端１９アミ
ノ酸は成熟配列には含まれない）、ERY17-2_Hh、ERY17-2_L
【0327】
（２）EGFR ERY17-2の精製
得られた培養上清がAnti FLAG M2カラム（Sigma社）に添加され、当該カラムの洗浄の
後、0.1 mg/mL FLAGペプチド（Sigma社）による溶出が実施された。目的分子を含む画分
がHisTrap HPカラム（GE Healthcare社）に添加され、当該カラムの洗浄の後、イミダゾ
ールの濃度勾配による溶出が実施された。目的分子を含む画分が限外ろ過によって濃縮さ
れた後、当該画分がSuperdex 200カラム（GE Healthcare社）に添加され、溶出液の単量
体画分のみを回収することにより精製された各目的分子が得られた。
得られた培養上清がAnti FLAG M2カラム（Sigma社）に添加され、当該カラムの洗浄の
後、0.1 mg/mL FLAGペプチド（Sigma社）による溶出が実施された。目的分子を含む画分
がHisTrap HPカラム（GE Healthcare社）に添加され、当該カラムの洗浄の後、イミダゾ
ールの濃度勾配による溶出が実施された。目的分子を含む画分が限外ろ過によって濃縮さ
れた後、当該画分がSuperdex 200カラム（GE Healthcare社）に添加され、溶出液の単量
体画分のみを回収することにより精製された各目的分子が得られた。
【0328】
（３）EGFR ERY17-2の細胞傷害活性
EGFR ERY17-2のin vitroの細胞傷害活性を調べたところ、強い細胞傷害活性が認められ
た（図２６）。本発明において、癌抗原に対するIgGを基本骨格とし、片側のFabをCD3 ep
silonに対する結合ドメインに置き換えた分子において、GPC3、EpCAMのみならず、癌抗原
の種類をさらに変えても細胞傷害活性を持つことが明らかとなった。
EGFR ERY17-2のin vitroの細胞傷害活性を調べたところ、強い細胞傷害活性が認められ
た（図２６）。本発明において、癌抗原に対するIgGを基本骨格とし、片側のFabをCD3 ep
silonに対する結合ドメインに置き換えた分子において、GPC3、EpCAMのみならず、癌抗原
の種類をさらに変えても細胞傷害活性を持つことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【0329】
本発明によって、BiTEが持つ強い抗腫瘍活性と、癌抗原非依存的にサイトカインストー
ムなどを誘導しないという安全性上の優れた性質が維持され、かつ長い血中半減期を持つ
新たなポリペプチド会合体が提供された。本発明のポリペプチド会合体における抗原結合
ドメインを置換することにより、当該ポリペプチド会合体を有効成分として含む細胞傷害
誘導治療剤が癌細胞を含む様々な細胞を標的として細胞傷害をもたらし、様々な癌を治療
又は予防することができる。患者にとっても、安全性が高いばかりでなく、身体的負担が
少なく利便性も高いという、望ましい治療ができるようになる。
ムなどを誘導しないという安全性上の優れた性質が維持され、かつ長い血中半減期を持つ
新たなポリペプチド会合体が提供された。本発明のポリペプチド会合体における抗原結合
ドメインを置換することにより、当該ポリペプチド会合体を有効成分として含む細胞傷害
誘導治療剤が癌細胞を含む様々な細胞を標的として細胞傷害をもたらし、様々な癌を治療
又は予防することができる。患者にとっても、安全性が高いばかりでなく、身体的負担が
少なく利便性も高いという、望ましい治療ができるようになる。
【要約】
【課題】T細胞による標的癌細胞に対する細胞傷害活性を示すポリペプチド会合体、当該
ポリペプチド会合体の製造方法、および当該ポリペプチド会合体を有効成分として含む細
胞傷害誘導治療剤の提供。当該細胞傷害誘導治療剤を有効成分として含む、様々な癌を治
療または予防するための医薬組成物または当該医薬組成物を用いる治療方法の提供。
【解決手段】（１）抗原結合ドメイン、（２）Fcγ受容体に対する結合活性が低下してい
るFc領域を含むドメイン、及び、（３）T細胞受容体複合体結合ドメイン、を含むポリペ
プチド会合体。ポリペプチド会合体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを保持
する細胞。前記細胞を培養し培養上清からポリペプチド会合体を回収することを含むポリ
ペプチド会合体の製造方法。ポリペプチド会合体を有効成分として含む細胞傷害誘導治療
剤、および治療が必要な患者に投与することを特徴とする、治療方法。
【選択図】なし
ポリペプチド会合体の製造方法、および当該ポリペプチド会合体を有効成分として含む細
胞傷害誘導治療剤の提供。当該細胞傷害誘導治療剤を有効成分として含む、様々な癌を治
療または予防するための医薬組成物または当該医薬組成物を用いる治療方法の提供。
【解決手段】（１）抗原結合ドメイン、（２）Fcγ受容体に対する結合活性が低下してい
るFc領域を含むドメイン、及び、（３）T細胞受容体複合体結合ドメイン、を含むポリペ
プチド会合体。ポリペプチド会合体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを保持
する細胞。前記細胞を培養し培養上清からポリペプチド会合体を回収することを含むポリ
ペプチド会合体の製造方法。ポリペプチド会合体を有効成分として含む細胞傷害誘導治療
剤、および治療が必要な患者に投与することを特徴とする、治療方法。
【選択図】なし
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【配列表】