特許 7687600 遺伝子の発現上昇剤及び光合成活性化剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-05-26

(45)【発行日】2025-06-03

(54)【発明の名称】遺伝子の発現上昇剤及び光合成活性化剤

(51)【国際特許分類】

   A01N 61/00 20060101AFI20250527BHJP

   A01P 21/00 20060101ALI20250527BHJP

   A01H 3/00 20060101ALI20250527BHJP

【ＦＩ】

A01N61/00 C ZNA

A01P21/00

A01H3/00

【請求項の数】 3

(21)【出願番号】P 2023510676

(86)(22)【出願日】2022-02-25

(86)【国際出願番号】 JP2022007914

(87)【国際公開番号】W WO2022209485

(87)【国際公開日】2022-10-06

【審査請求日】2023-08-29

(31)【優先権主張番号】P 2021055089

(32)【優先日】2021-03-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000003296

【氏名又は名称】デンカ株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】504157024

【氏名又は名称】国立大学法人東北大学

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100128381

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 義憲

(74)【代理人】

【識別番号】100185591

【弁理士】

【氏名又は名称】中塚 岳

(74)【代理人】

【識別番号】100126653

【弁理士】

【氏名又は名称】木元 克輔

(72)【発明者】

【氏名】大川 峻

(72)【発明者】

【氏名】本田 一馬

(72)【発明者】

【氏名】飯野 藤樹

(72)【発明者】

【氏名】加藤 一幾

【審査官】高橋 直子

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１４－００１１６０（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１５／０３５１３９２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特開２０１６－０５０１５１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００３－１７１２１５（ＪＰ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１１２２４４０４１（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０７１５６１２５（ＣＮ，Ａ）

【文献】特開２０１８－０９５５５５（ＪＰ，Ａ）

【文献】CHA, Joon-Yung et al.，Transcriptome changes reveal the molecular mechanisms of humic acid-induced salt stress tolerance in，Molecules，2021年，26,782，1-17

【文献】RADY, M. M.，A novel organo-mineral fertilizer can mitigate salinity stress effects for tomato production on recl，South African Journal of Botany，2012年，81，8-14

【文献】農業と科学，2018年，第703号，p.1-6

【文献】SOUZA, Aline Costa et al.，Acclimation with humic acids enhances maize and tomato tolerance to salinity，Chemical and Biological Technologies in Agriculture，2021年，8:40，1-13

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ０１Ｎ ６１／００

Ａ０１Ｐ ２１／００

Ａ０１Ｈ ３／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＪＳＴＣｈｉｎａ（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

腐植酸を含む植物の硝酸還元酵素をコードする遺伝子の発現上昇剤。

【請求項2】

腐植酸が亜炭由来である、請求項１に記載の発現上昇剤。

【請求項3】

メラニックインデックスが２．０以上である、請求項１又は２に記載の発現上昇剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ストレス応答遺伝子の発現上昇剤及び植物にストレス耐性を付与する方法に関する。本発明は、また、窒素代謝に関与する遺伝子の発現上昇剤に関する。本発明は、さらに、光合成活性化剤及び植物の光合成を活性化する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

植物は、乾燥、塩、病気、有害生物及び温度等の様々なストレスに対して感受性を有する。植物のストレス応答を改善する手段が検討されており、例えば、特許文献１には、部分的に腐食された天然有機物を特徴とする溶存有機物の農業上許容可能な複合混合物を含む組成物を植物に接触させる方法が開示されている。また、特許文献１では、かかる組成物は、フルボ酸及びフミン酸とは化学的及び生物学的に異なる独特なものであると特徴付けている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【文献】特開２０１６－１５４５３３号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明の課題の一つは、植物のストレス応答を改善する手段を提供することにあり、より具体的には、ストレス応答遺伝子の発現上昇剤を提供することが本発明の課題の一つである。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、腐植酸が植物のストレス応答遺伝子の発現を上昇させることを見出した。また、本発明者らがさらに検討を重ねたところ、腐植酸が植物の窒素代謝に関与する遺伝子の発現も上昇させること、及び腐植酸が光合成速度を向上させることも見出し、本発明を完成するに至った。

【0006】

すなわち、本発明は、以下の［１］～［２０］に関する。
［１］腐植酸を含む植物のストレス応答遺伝子の発現上昇剤。
［２］腐植酸が亜炭由来である、上記［１］に記載の発現上昇剤。
［３］メラニックインデックスが２．０以上である、上記［１］又は［２］に記載の発現上昇剤。
［４］ストレス応答遺伝子が塩ストレスに対する応答遺伝子である、上記［１］～［３］のいずれかに記載の発現上昇剤。
［５］ストレス応答遺伝子が分子シャペロンをコードする遺伝子である、上記［１］～［３］のいずれかに記載の発現上昇剤。
［６］ストレス応答遺伝子がＤｎａＪ及びＷＲＫＹからなる群から選択される１以上のタンパク質をコードする遺伝子である、上記［１］～［３］のいずれかに記載の発現上昇剤。
［７］植物に腐植酸を施用することを含む、植物にストレス耐性を付与する方法。
［８］腐植酸が亜炭由来である、上記［７］に記載の方法。
［９］メラニックインデックスが２．０以上である、上記［７］又は［８］に記載の方法。
［１０］ストレス耐性が塩ストレス耐性である、上記［７］～［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］腐植酸を含む植物の窒素代謝に関与する遺伝子の発現上昇剤。
［１２］腐植酸が亜炭由来である、上記［１１］に記載の発現上昇剤。
［１３］メラニックインデックスが２．０以上である、上記［１１］又は［１２］に記載の発現上昇剤。
［１４］窒素代謝に関与する遺伝子が硝酸還元酵素をコードする遺伝子である、上記［１１］～［１３］のいずれかに記載の発現上昇剤。
［１５］腐植酸を含む光合成活性化剤。
［１６］腐植酸が亜炭由来である、上記［１５］に記載の光合成活性化剤。
［１７］メラニックインデックスが２．０以上である、上記［１５］又は［１６］に記載の光合成活性化剤。
［１８］植物に腐植酸を施用することを含む、植物の光合成を活性化する方法。
［１９］腐植酸が亜炭由来である、上記［１８］に記載の方法。
［２０］メラニックインデックスが２．０以上である、上記［１８］又は［１９］に記載の方法。

【発明の効果】

【0007】

腐植酸を植物に施用すると、植物においてストレス応答遺伝子の発現が上昇し、植物にストレス耐性が付与される。腐植酸を植物に施用すると、植物において窒素代謝に関与する遺伝子の発現が上昇し、植物の生育が促進される。腐植酸を植物に施用すると、植物において光合成速度が上昇し、植物の光合成が活性化される。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】腐植酸未施用時のトマトの葉における遺伝子発現に対する、腐植酸を施用時のトマトの葉における遺伝子発現を表した図である。

【図2】腐植酸未施用時及び施用時のトマトの葉における、ＤｎａＪをコードする遺伝子の発現（ＤｎａＪ／ＡｃｔＩＩ）を表した図である。

【図3】腐植酸未施用時及び施用時のトマトの葉における、ＮＲをコードする遺伝子の発現（ＮＲ／ＡｃｔＩＩ）を表した図である。

【発明を実施するための形態】

【0009】

本発明の一実施形態に係る植物のストレス応答遺伝子の発現上昇剤は腐植酸を含む。腐植酸は、腐植酸及び腐植酸塩からなる群の１種以上を含む。腐植酸としては、泥炭及び風化炭等の天然に産出される天然腐植酸、亜炭の硝酸酸化等により人工的に製造される人工腐植酸、及び、天然腐植酸又は人工腐植酸をナトリウム、カリウム、アンモニア、カルシウム及びマグネシウム等のアルカリ物質で中和した腐植酸塩等が挙げられる。腐植酸としては、フミン酸、ニトロフミン酸、フミン酸アンモニウム、フミン酸カルシウム、フミン酸マグネシウム、ニトロフミン酸アンモニウム、ニトロフミン酸カルシウム及びニトロフミン酸マグネシウム等が挙げられる。

【0010】

腐植酸は、腐植酸抽出液であってもよい。腐植酸抽出液とは、亜炭及び褐炭等の若年炭の硝酸酸化物をｐＨ５～８の範囲で抽出した抽出液、好ましくはｐＨ５～７の範囲で抽出した抽出液をいう。腐植酸抽出液は、例えば、若年炭を硝酸で酸化分解させて得られた若年炭の硝酸酸化物（以下、腐植酸粗製物という）と、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウム及び水酸化カルシウムから選ばれた１価又は２価のアルカリの少なくとも一つを含む無機化合物と、水との混合物を、４０～９０℃で、０．５～１時間攪拌した後、固液分離工程を行うことにより、液状物として得られる。無機化合物は、ｐＨ５～８の範囲になるように、水に添加する。腐植酸抽出液の製法は、特許第６２３１０５９号公報に記載されている。ストレス応答遺伝子の発現上昇の効果の観点から、亜炭由来の腐植酸抽出液であることが好ましい。

【0011】

上記腐植酸は、メラニックインデックス（ＭＩ）が２．０以上であることが好ましい。ＭＩとは、腐植酸の分類に用いられている指標であり、水酸化ナトリウム抽出液の吸収スペクトルの波長４５０ｎｍと５２０ｎｍにおける吸光度の比（Ａ４５０／Ａ５２０）である。（熊田恭一著、土壌有機物の化学第２版 学会出版センター（１９８１）、山本定博ら、「メラニックインデックスによる腐植酸型の簡易推定」、日本土壌肥料学雑誌 第７１号 第１号 ｐ．８２～８５（２０００））。

【0012】

より具体的には、ＭＩとは、次の方法によって算出されるものである。試料を乳鉢と２５０μｍ篩を用い２５０μｍ篩下品に粉砕する。その約１０ｇを、質量が既知の秤量ビンに取り精秤する。この秤量ビンを温度１０５℃に保持した乾燥機で約１２時間放置し、その後、デシケーター中で室温に戻してから再度精秤する。その質量減少分を水分とみなして試料の含水率を求める。次に、５０ｍｌ遠沈管に、上記２５０μｍ篩下品を乾燥質量相当量で０．１０ｇと、０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液４５ｍｌとを入れ、室温２０℃で約１時間、２５０ｒｐｍの速度で振とうした後、３，０００×ｇ、約１０分間の遠心分離を実施し、その上澄み液をアドバンテック社製Ｎｏ．５Ｃの濾紙で濾過する。濾液の４５０ｎｍの吸光度と５２０ｎｍの吸光度を、蒸留水をブランクとして測定する。この場合、４５０ｎｍの吸光度が１．０以上を示したならば、０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を添加し吸光度が０．８以上１．０未満に調整してから、５２０ｎｍの吸光度を測定する。（４５０ｎｍでの吸光度／５２０ｎｍでの吸光度）の比を算出し、ＭＩとする。

【0013】

ＭＩの上限値は特に限定されないが、５．０以下とすることができる。また、ＭＩの数値範囲は好ましくは２．０～４．５であり、より好ましくは２．０～４．０である。

【0014】

腐植酸抽出液の全有機炭素（ＴＯＣ）濃度は５，０００ｍｇ／Ｌ以上が好ましい。腐植酸抽出液のＴＯＣ濃度は６０，０００ｍｇ／Ｌ以下が好ましい。腐植酸抽出液のＴＯＣ濃度は、１０，０００～５０，０００ｍｇ／Ｌがより好ましい。

【0015】

抽出液のＴＯＣ濃度の測定方法は、次のように定義される。腐植酸粗製物の抽出液を、３，０００×ｇで遠心分離した上澄み液を、全有機体炭素計（島津製作所製ＴＯＣ－Ｌ）を用いて燃焼触媒酸化方式で測定した値である。肥料成分である尿素等の非腐植物質を含む場合は、国際腐植物質学会法（藤嶽、ＨｕｍｉｃＳｕｂｓｔａｎｃｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｏｌ３、Ｐ１－９）に準じて分別したもの（腐植酸及びフルボ酸画分）を上記の手法にて定量し、抽出液のＴＯＣ濃度を測定する。

【0016】

本実施形態に係る植物のストレス応答遺伝子の発現上昇剤の対象となる植物は、種子植物、シダ植物又はコケ植物でもよく、種子植物としては裸子植物又は被子植物でもよく、被子植物としては単子葉植物でも双子葉植物でもよい。また、種子植物には種子を形成せず繁殖する植物、例えば、球根や塊茎によって繁殖する栄養繁殖性の植物も含む。商業的観点から、野菜及び花卉を対象とすることが好ましい。

【0017】

このような植物として、具体的には、アブラナ科、ナス科、キク科、ウリ科、セリ科、イネ科、バラ科、ユリ科、ラン科、ヒガンバナ科、サクラソウ科、マメ科、ネギ科、タデ科、ヒルガオ科、アカザ科、ブドウ科、ミカン科、カキノキ科、ツバキ科、モクセイ科、アオイ科、バショウ科、ショウガ科、アカネ科、パイナップル科等の植物が挙げられる。アブラナ科の植物として、コマツナ、チンゲンサイ、カブ、カリフラワー、キャベツ、ダイコン、ハクサイ、ブロッコリー等が挙げられる。ナス科の植物として、トマト、タバコ、シシトウガラシ、ジャガイモ、トウガラシ、ナス、パプリカ、ピーマン等が挙げられる。キク科の植物とし、レタス、アーティチョーク、ゴボウ、シュンギク、キク、ヒマワリ等が挙げられる。ウリ科の植物として、カボチャ、キュウリ、スイカ、メロン等が挙げられる。セリ科の植物として、セリ、セロリ、ニンジン、パセリ等が挙げられる。イネ科の植物として、イネ、オオムギ、コムギ、サトウキビ、トウモロコシ等が挙げられる。バラ科の植物として、イチゴ、バラ、リンゴ、ナシ、モモ、ビワ、アーモンド等が挙げられる。ユリ科の植物として、アスパラガス、チューリップ、ユリ等が挙げられる。ラン科の植物として、ラン、シンビジウム等が挙げられる。ヒガンバナ科の植物として、スイセン等が挙げられる。サクラソウ科の植物として、シクラメン等が挙げられる。マメ科の植物として、ダイズ、インゲンマメ、アズキ等が挙げられる。ネギ科の植物として、ネギ、ニラ、ラッキョウ、ニンニク等が挙げられる。タデ科の植物としてソバ等が挙げられる。ヒルガオ科の植物としてサツマイモ等が挙げられる。アカザ科の植物として、ホウレンソウ、テンサイ等が挙げられる。ブドウ科の植物としてブドウ等が挙げられる。ミカン科の植物として、ミカン、レモン、オレンジ等が挙げられる。カキノキ科の植物としてカキ等が挙げられる。ツバキ科の植物として、チャ等が挙げられる。モクセイ科の植物として、オリーブ、ジャスミン等が挙げられる。アオイ科の植物として、ワタ、カカオ、オクラ等が挙げられる。バショウ科の植物として、バナナ等が挙げられる。ショウガ科の植物として、ショウガ等が挙げられる。アカネ科の植物として、コーヒーノキ等が挙げられる。パイナップル科植物として、パイナップル、アナナス等が挙げられる。

【0018】

ストレス応答遺伝子とは、植物にストレスが掛けられたときに発現が誘導される遺伝子である。ストレス応答遺伝子として、ＤｎａＪ、ＨＳＰ、シャペロニン等の分子シャペロン、ＷＲＫＹ、ユニバーサルストレスプロテイン、アクアポリン、パソジェネシスリレイティッドプロテイン、プラントディフェンシン等をコードする遺伝子が挙げられる。本実施形態は、ＤｎａＪ及びＷＲＫＹからなる群から選択される１以上のタンパク質をコードするストレス応答遺伝子に対して有用である。
分子シャペロン（シャペロンということもある）とは、例えば、立体構造が正しくとれていないタンパク質等を修復する機能があるタンパク質をいい、タンパク質の品質管理に重要な役割を果たしている。本実施形態において有用な分子シャペロンとしては、ＤｎａＪが挙げられる。
ＷＲＫＹとは、例えば、生物及び非生物ストレスに対する反応、免疫、植物防御、老化、種子の休眠や発芽等を含む、植物における多くの過程を調節する、植物転写因子のファミリーをいう。

【0019】

ストレス環境下にある植物は、ストレス応答遺伝子の発現（転写及び／又は翻訳）が誘導される。本実施形態に係る植物のストレス応答遺伝子の発現上昇剤をかかる植物に施用すると、施用しない場合と比較してストレス応答遺伝子の発現が上昇し、その発現量は、ストレス応答遺伝子の発現上昇剤を施用しない場合の発現量（転写量及び／又は翻訳量）の１．１倍以上、好ましくは１．５倍以上である。

【0020】

本発明の一実施形態に係る植物にストレス耐性を付与する方法は、腐植酸を植物に施用することを含む。ストレス耐性は、乾燥耐性、塩耐性、病気耐性、有害生物耐性、低温耐性、高温耐性等が挙げられるが、塩耐性であることが好ましい。腐植酸を施用する部位は特に限られず、根圏とすることができる。腐植酸の施用量及び施用期間は特に限られず、土壌施用の場合は全有機炭素濃度として０．１～５０００ｍｇ／Ｌを月に１～１２回、水耕栽培の場合は全有機炭素濃度として０．１～５０００ｍｇ／Ｌを月に１～１２回、葉面施用の場合は全有機炭素濃度として０．１～５０００ｍｇ／Ｌで月に１～１２回とすることができる。

【0021】

本発明の一実施形態に係る植物の窒素代謝に関与する遺伝子の発現上昇剤は腐植酸を含む。腐植酸及び対象となる植物等は、上述のとおりである。

【0022】

窒素代謝に関与する遺伝子とは、窒素又は窒素化合物を別の窒素化合物へと変換する反応に関与するタンパク質をコードする遺伝子であり、硝酸還元酵素（ＮＲ）、硝酸イオントランスポーター（Ｎｒｔ）等をコードする遺伝子が挙げられる。

【0023】

本発明の一実施形態に係る植物の窒素代謝に関与する遺伝子の発現上昇剤を植物に施用すると、施用しない場合と比較して窒素代謝に関与する遺伝子の発現が上昇し、その発現量は、窒素代謝に関与する遺伝子の発現上昇剤を施用しない場合の発現量（転写量及び／又は翻訳量）の１．１倍以上、好ましくは１．５倍以上である。

【0024】

本発明の一実施形態に係る光合成活性化剤は腐植酸を含む。腐植酸及び対象となる植物等は、上述のとおりである。

【0025】

本実施形態に係る光合成活性化剤を植物に施用すると、施用しない場合と比較して光合成が活性化され、その光合成速度は、施用しない場合の光合成速度の１．１倍以上、好ましくは１．３倍以上である。

【0026】

本発明の一実施形態に係る植物の光合成を活性化する方法は、腐植酸を植物に施用することを含む。腐植酸を施用する部位、施用量及び施用期間は上述のとおりである。植物に腐植酸を施用すると、植物の光合成が活性化され、窒素代謝に関与する遺伝子の発現が上昇することと相まって、植物の生育が促進される。

【実施例】

【0027】

試験例１：塩ストレス下でのトマトの栽培
１．トマト（Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ）種子を冷蔵庫から取り出し、室温（約２５℃）で一晩静置した。
２．プラスチックシャーレに湿らせたペーパータオルを敷き、その上にトマト種子を約１ｃｍ間隔で播種した。その後、インキュベーター内に静置した。
３．播種から４日後、発芽したトマトをロックウール（ｇｒｏｄａｎ社）に移植し、トレーに並べた後に、ＯＡＴ Ａ処方（ＯＡＴアグリオ株式会社；窒素全量 ２６０ｐｐｍ、Ｐ_２Ｏ_５ １２０ｐｐｍ、Ｋ_２Ｏ ４０５ｐｐｍ）を施用した。
４．移植から１週間後、腐植酸を施用する区にはＴＯＣ濃度８ｐｐｍでＯＡＴ Ａ処方を施用し腐植酸に馴化させた。腐植酸を施用しないものに関してはＯＡＴ Ａ処方のみを施用した。
５．腐植酸馴化から１週間後、試験区ごとにプラスチック容器に株を移し、塩ストレス試験を行った。試験条件は、後述の「試験区」に記載のとおりである。
６．塩ストレス試験開始から１週間おきに培地の交換を行った。
７．生育調査は最大葉長（ｃｍ）、着花数（個）、ＳＰＡＤ、主茎長（ｃｍ）を計測した。ＳＰＡＤ（葉中に含まれる葉緑素含有量）はコニカミノルタ社製ＳＰＡＤ－５０２Ｐｌｕｓを使用して計測した。

【0028】

栽培はすべてインキュベーター（東京理化器械株式会社；ＦＬＩ－２０１０Ｈ－ＬＥＤ）内で行った。インキュベーション条件は以下の通りである。
日長：１６時間
温度：２５℃、１６時間／２０℃、８時間

【0029】

試験区
塩ストレス試験に関してはＮａＣｌ濃度を０、５０ｍＭ又は１００ｍＭに調整し、腐植酸未施用又は腐植酸（ＴＯＣ濃度１５又は６０ｐｐｍ）施用として試験を実施した。遺伝子発現解析及び光合成速度測定試験に関しては腐植酸未施用又は腐植酸（ＴＯＣ濃度６０ｐｐｍ）施用で実施した。

【0030】

腐植酸
使用した腐植酸は、亜炭由来の腐植酸抽出液であり、特許第６２３１０５９号公報記載の方法に従い、腐植酸抽出液の製造時に添加する硝酸量を調整することでＴＯＣ及びＭＩを調整した。使用した腐植酸は、製品１（亜炭由来の腐植酸抽出液、ＴＯＣ ３５０００ｐｐｍ、ＭＩ２．０以上）、製品２（亜炭由来の腐植酸抽出液、ＴＯＣ ２００００ｐｐｍ、ＭＩ４．０）である。

【0031】

腐植酸を施用することで、最大葉長、着花数、ＳＰＡＤ、主茎長を大きくでき、トマトの生育促進及び塩ストレス耐性向上が確認された。一例として、ＮａＣｌ濃度１００ｍＭでの塩ストレス条件下、製品１をＴＯＣ濃度１５ｐｐｍとなるように施用して、５週間栽培したときの結果を以下の表に示す。

【0032】

【表1】

【0033】

試験例２：マイクロアレイ解析

【0034】

遺伝子発現解析
転写産物の抽出は以下のとおり行った。
１．腐植酸を施用して２４時間後に葉をピンセットでちぎり、液体窒素で速やかに冷凍した。
２．冷凍したトマトの葉をビーズ破砕して、転写産物を抽出した。破砕は、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｅｒｔｉｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＭＮ Ｂｅａｄ Ｔｕｂｅｓ Ｔｙｐｅ Ｇ（タカラバイオ株式会社）を使用した。
３．シカジーニアス（登録商標）ＲＮＡプレップキット（植物用）（関東化学株式会社）を用いて転写産物の精製を行った。その際、Ａｂｓ２６０／Ａｂｓ２８０の測定等により転写産物のＤＮＡのコンタミを確認した。
４．得られた転写産物を逆転写反応（ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（登録商標） ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ；東洋紡株式会社）でｃＤＮＡを合成して遺伝子発現解析を実施した。

【0035】

マイクロアレイ解析は以下のとおり行った。
１．Ｔｏｍａｔｏ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（アジレント・テクノロジー株式会社）を用いた解析をタカラバイオ株式会社にて実施した。
２．株式会社ＳｕｂｉｏのＰｌａｔｆｏｒｍを用いてデータを解析した。腐植酸未施用と比較して２倍以上の発現変動があった遺伝子を、腐植酸が発現に影響を与えた遺伝子と判断した。

【0036】

図１は、腐植酸未施用時のトマトの葉における遺伝子発現に対する腐植酸を施用時のトマトの葉における遺伝子発現を表した図である。ストレス応答遺伝子であるＤｎａＪ及びＷＲＫＹをコードする遺伝子の発現上昇が確認された。

【0037】

試験例３：定量的ＰＣＲ解析
定量的ＰＣＲ解析は以下のとおり行った。
１．ハウスキーピング遺伝子としてＡＣＴ２遺伝子を用いると、分子シャペロンをコードする遺伝子であるＤｎａＪをコードする遺伝子の発現がマイクロアレイで増加し、また、生育が旺盛になったことから、窒素代謝が活発になったと考えた。そこで、硝酸還元に関わるＮＲをコードする遺伝子の発現を調査した。ＡＣＴ２遺伝子とは、アクチン遺伝子の１種をいう。使用した機器は、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）であり、用いた試薬は、ＫＯＤ ＳＹＢＲ（登録商標） ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（東洋紡株式会社）である。また、使用したプライマーの配列を以下に示す。

【0038】

ＡＣＴ２
cattgtgctcagtggtggttc（配列番号１）
tctgctggaaggtgctaagtg（配列番号２）
ＤｎａＪ
ctacgatccaggagatcaag（配列番号３）
gacgtgtccttctgatcaat（配列番号４）
ＮＲ
cgtaggccgtactttcaagc（配列番号５）
catcgtcatcctcgtcttca（配列番号６）

【0039】

図２は、腐植酸未施用時及び施用時のトマトの葉におけるＤｎａＪをコードする遺伝子の発現（ＤｎａＪ／ＡｃｔＩＩ）を表した図である。腐植酸を施用することで、ＤｎａＪをコードする遺伝子の発現が２．０倍に上昇した。図３は、腐植酸未施用時及び施用時のトマトの葉におけるＮＲをコードする遺伝子の発現（ＮＲ／ＡｃｔＩＩ）を表した図である。腐植酸を施用することで、ＮＲをコードする遺伝子の発現が２．５倍に上昇した。

【0040】

試験例４：光合成速度解析
腐植酸施用により生育が旺盛になる結果が得られたことから、光合成が活発になっていると推定して、光合成速度を栽培３週目と４週目に測定した。腐植酸を施用することで、光合成速度の上昇が確認された。一例として、製品２を施用したときの結果を以下の表に示す。
光合成蒸散測定とクロロフィル蛍光測定を行った。
光合成蒸散測定には、植物光合成総合解析システム（ＬｉＣｏｒ社製、ＬＩ－６８００）を用いて、蒸散速度、光合成速度、気孔コンダクタンスを測定した。蒸散速度は、光合成反応により生じた水分が葉から蒸散される速度である。蒸散速度は、光合成反応が良好に進行する程、値が大きくなる。気孔コンダクタンスは、葉内に二酸化炭素を取り込むための気孔の開度の指標となる値である。気孔コンダクタンスが大きい程、葉内に二酸化炭素を取り込みやすくなり、光合成反応が良好に進行しやすい。
た。
クロロフィル蛍光測定には、植物光合成総合解析システム（ＬｉＣｏｒ社製、ＬＩ－６８００）を用いて、実効量子収率、電子伝達速度、非光化学消光を測定した。非光化学消光（ＮＰＱ）は光防御機構の１つであり、過剰に吸収した照射を熱として散逸する機構を示す指標である。非光化学消光の値が小さいということは、熱放散を高く発現しなくても光を十分に利用でき、植物の光合成効率と植物成長が大きいことを示す。
腐植酸を施用することで、蒸散速度、光合成速度、気孔コンダクタンス、実効量子収率、電子伝達速度が大きくなり、非光化学消光の値が小さくなり、光合成効率と植物成長が大きいことを確認した。

【0041】

【表2】

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

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