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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-05-30
(45)【発行日】2025-06-09
(54)【発明の名称】ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20250602BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20250602BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20250602BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20250602BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20250602BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20250602BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20250602BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20250602BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20250602BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20250602BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28
C07K16/46
C12N15/13 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/21
C12N1/15
C12N1/19
C12N5/10
A61K39/395 H
A61P37/06
【請求項の数】
19
(21)【出願番号】P 2023567486
(86)(22)【出願日】2021-12-17
(86)【国際出願番号】 JP2021046786
(87)【国際公開番号】W WO2023112317
(87)【国際公開日】2023-06-22
【審査請求日】2024-09-26
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】504171134
【氏名又は名称】国立大学法人 筑波大学
(73)【特許権者】
【識別番号】518096021
【氏名又は名称】ＴＮＡＸ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110001070
【氏名又は名称】弁理士法人エスエス国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】渋谷 彰
(72)【発明者】
【氏名】渋谷 和子
(72)【発明者】
【氏名】金丸 由美
(72)【発明者】
【氏名】阿部 史枝
【審査官】白井 美香保
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／１８３６６５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１３／１４０７８７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】YAMASHITA-KANEMARU Y. et al.，MONOCLONAL ANTIBODIES IN IMMUNODIAGNOSIS AND IMMUNOTHERAPY，2021年04月，Vol.40, No.2，pp.52-59
【文献】Immunity，2020年，Vol.52，pp.96-108
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡＰＬＵＳ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記アミノ酸配列を含む重鎖可変領域；ＨＣＤＲ１として配列番号１のアミノ酸配列、ＨＣＤＲ２として配列番号２のアミノ酸配列、およびＨＣＤＲ３として配列番号３のアミノ酸配列、ならびに
下記アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
ＬＣＤＲ１として配列番号４のアミノ酸配列、ＬＣＤＲ２として配列番号５のアミノ酸配列、およびＬＣＤＲ３として配列番号６のアミノ酸配列、
を有する、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片であって、
前記重鎖可変領域が配列番号１０と９５％以上同一のアミノ酸配列を有し、かつ、
前記軽鎖可変領域が配列番号１１と９５％以上同一のアミノ酸配列を有し、
前記重鎖可変領域の配列番号１０の配列に対応するアミノ酸位置４９番目、７２番目のアミノ酸残基がそれぞれＭ、Ｒであり、前記軽鎖可変領域の配列番号１１の配列に対応するアミノ酸位置６７番目のアミノ酸残基がＹである、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片。
【請求項2】
前記重鎖可変領域が配列番号１０と９９％以上同一のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域が配列番号１１と９９％以上同一のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片。
【請求項3】
前記軽鎖可変領域が配列番号１１のアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載のヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片。
【請求項4】
前記重鎖可変領域が配列番号１０のアミノ酸配列を有し、かつ、前記軽鎖可変領域が配列番号１１のアミノ酸配列を有する、請求項３に記載のヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片。
【請求項5】
前記重鎖可変領域が配列番号９のアミノ酸配列を有し、かつ、前記軽鎖可変領域が配列番号１１のアミノ酸配列を有する、請求項３に記載のヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片。
【請求項6】
前記抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥからなる群から選ばれるクラスの重鎖定常領域を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片。
【請求項7】
前記重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１定常領域である、請求項６に記載のヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片。
【請求項8】
前記ヒトＩｇＧ１定常領域が、エフェクター機能を消失させる１以上の変異を有する、請求項７に記載のヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片。
【請求項9】
前記１以上の変異が、配列番号１４の配列に対応するアミノ酸位置２３８番目および２３９番目のそれぞれにアミノ酸Ａ又はＦを含む、請求項８に記載のヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片。
【請求項10】
前記１以上の変異が、配列番号１４の配列に対応するアミノ酸位置２３８番目および２３９番目のそれぞれにアミノ酸Ａを含む、請求項８に記載のヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片。
【請求項11】
配列番号１４と９５％以上同一のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１５と９５％以上同一のアミノ酸配列を有する軽鎖を有する、請求項１～１０のいずれか１項に記載のヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片。
【請求項12】
前記重鎖が配列番号１４のアミノ酸配列を有し、かつ、前記軽鎖が配列番号１５のアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載のヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体。
【請求項13】
請求項１～１２のいずれか一項に記載のヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸。
【請求項14】
請求項１３に記載の核酸を含有するベクター。
【請求項15】
請求項１４に記載のベクターをトランスフェクションされた宿主細胞。
【請求項16】
請求項１～１２のいずれか一項に記載のヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片を含む、自然リンパ球細胞の活性化を抑制する方法に使用するための組成物。
【請求項17】
請求項１～１２のいずれか一項に記載のヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片を含む、炎症性腸疾患、移植片対宿主病、臓器移植拒絶、自己免疫疾患、線維化疾患、炎症性腸炎、またはアレルギーの治療または予防に使用するための組成物。
【請求項18】
請求項１～１２のいずれか一項に記載のヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片を含む、炎症性腸疾患の治療に使用するための組成物。
【請求項19】
前記炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎である、請求項１８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体に関する。
【背景技術】
【0002】
ＤＮＡＭ－１は、ＣＤ２２６とも呼ばれる分子量６５ｋＤａの免疫グロブリンスーパーファミリーに属する接着分子であり、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、血小板などの造血系細胞に発現する活性化免疫受容体として同定された。
ＤＮＡＭ－１は、そのリガンドであるＣＤ１５５またはＣＤ１１２と結合すると、細胞傷害性のための活性化シグナルを媒介する。ＤＮＡＭ－１は、ヒトやマウスモデルにおいて、様々な炎症性疾患や癌の病態に関与していることが示されている。そして、抗マウスＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体は、マウスにおける実験的自己免疫脳炎および急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発症を抑制すること、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞集団を増加させ、その結果、マウスの皮膚移植片の生存期間を延長させること等が報告されている。これらの報告から、抗ＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体はこれらの疾患に有用であると考えられている。
本発明者らは、以前にマウス抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体を樹立した（特許文献１）。また、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体についても報告している（非特許文献１）。
ＤＮＡＭ－１は、そのリガンドであるＣＤ１５５またはＣＤ１１２と結合すると、細胞傷害性のための活性化シグナルを媒介する。ＤＮＡＭ－１は、ヒトやマウスモデルにおいて、様々な炎症性疾患や癌の病態に関与していることが示されている。そして、抗マウスＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体は、マウスにおける実験的自己免疫脳炎および急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発症を抑制すること、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞集団を増加させ、その結果、マウスの皮膚移植片の生存期間を延長させること等が報告されている。これらの報告から、抗ＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体はこれらの疾患に有用であると考えられている。
本発明者らは、以前にマウス抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体を樹立した（特許文献１）。また、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体についても報告している（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【文献】国際公開公報２０１７／１８３６６５号公報
【非特許文献】
【0004】
【文献】Yumi Yamashita-Kanemaru et.al., Suppression of Th1 and Th17 Proinflammatory Cytokines and Upregulation of FOXP3 Expression by a Humanized Anti-DNAM-1 Monoclonal Antibody, MONOCLONAL ANTIBODIES IN IMMUNODIAGNOSIS AND IMMUNOTHERAPY, Volume 40, Number 2, 2021
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
特許文献１に記載のマウス抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体は、制御性Ｔ細胞を活性化して免疫反応を抑制することから、移植片対宿主病、臓器移植拒絶、自己免疫疾患、線維化疾患、炎症性腸炎、アレルギー等の予防または治療に使用できるとされている。しかし、特許文献１で樹立されたのはマウス抗体に過ぎず、ヒトにおける治療的価値の点等で、改善の余地が残されていた。
また、ヒト化抗体は、一般的に、その親マウス抗体に比べて標的とする抗原への結合性が低下する、抗原への結合性を維持すると免疫原性が上がりやすい点等で改善の余地があった。
そこで、本発明者らは、新規なマウス抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体を取得し、ヒトにおける治療的価値の高いヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体を作製しようと考えた。
本発明は、ヒトＤＮＡＭ－１に特異的に結合するヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体を提供することを課題とする。
また、ヒト化抗体は、一般的に、その親マウス抗体に比べて標的とする抗原への結合性が低下する、抗原への結合性を維持すると免疫原性が上がりやすい点等で改善の余地があった。
そこで、本発明者らは、新規なマウス抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体を取得し、ヒトにおける治療的価値の高いヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体を作製しようと考えた。
本発明は、ヒトＤＮＡＭ－１に特異的に結合するヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した。その結果、以下の構成を有することにより上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、例えば以下の〔１〕～〔１０〕に関する。
〔１〕 下記アミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
ＨＣＤＲ１として配列番号１のアミノ酸配列、ＨＣＤＲ２として配列番号２のアミノ酸配列、およびＨＣＤＲ３として配列番号３のアミノ酸配列、ならびに
下記アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
ＬＣＤＲ１として配列番号４のアミノ酸配列、ＬＣＤＲ２として配列番号５のアミノ酸配列、およびＬＣＤＲ３として配列番号６のアミノ酸配列、
を有する、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片。
〔２〕 配列番号１０と９５％以上同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１１と９５％以上同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する、〔１〕に記載のヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片。
〔３〕 配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、または
配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、
を有する、〔１〕または〔２〕に記載のヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片。
〔４〕 重鎖の２３８番目および２３９番目のアミノ酸残基がＡである、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載のヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片。
〔５〕 配列番号１４と９５％以上同一のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１５と９５％以上同一のアミノ酸配列を有する軽鎖を有する、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載のヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片。
〔６〕 配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１５のアミノ酸配列を有する軽鎖、または
配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１５のアミノ酸配列を有する軽鎖
を有する、〔１〕～〔５〕のいずれかに記載のヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体。
〔７〕 〔１〕～〔６〕のいずれかに記載のヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸。
〔８〕 〔７〕に記載の核酸を含有するベクター。
〔９〕 〔８〕に記載のベクターを含有する形質転換体。
〔１０〕 〔１〕～〔６〕のいずれか１項に記載のヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片を含む、自然リンパ球（ＩＬＣ）の活性化抑制剤。
本発明は、例えば以下の〔１〕～〔１０〕に関する。
〔１〕 下記アミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
ＨＣＤＲ１として配列番号１のアミノ酸配列、ＨＣＤＲ２として配列番号２のアミノ酸配列、およびＨＣＤＲ３として配列番号３のアミノ酸配列、ならびに
下記アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
ＬＣＤＲ１として配列番号４のアミノ酸配列、ＬＣＤＲ２として配列番号５のアミノ酸配列、およびＬＣＤＲ３として配列番号６のアミノ酸配列、
を有する、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片。
〔２〕 配列番号１０と９５％以上同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１１と９５％以上同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する、〔１〕に記載のヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片。
〔３〕 配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、または
配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、
を有する、〔１〕または〔２〕に記載のヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片。
〔４〕 重鎖の２３８番目および２３９番目のアミノ酸残基がＡである、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載のヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片。
〔５〕 配列番号１４と９５％以上同一のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１５と９５％以上同一のアミノ酸配列を有する軽鎖を有する、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載のヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片。
〔６〕 配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１５のアミノ酸配列を有する軽鎖、または
配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１５のアミノ酸配列を有する軽鎖
を有する、〔１〕～〔５〕のいずれかに記載のヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体。
〔７〕 〔１〕～〔６〕のいずれかに記載のヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸。
〔８〕 〔７〕に記載の核酸を含有するベクター。
〔９〕 〔８〕に記載のベクターを含有する形質転換体。
〔１０〕 〔１〕～〔６〕のいずれか１項に記載のヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片を含む、自然リンパ球（ＩＬＣ）の活性化抑制剤。
【発明の効果】
【0007】
本発明によれば、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体を提供することができる。また、自然リンパ球（ＩＬＣ）の活性化抑制剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【発明を実施するための形態】
【0009】
次に本発明について具体的に説明する。
[ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体]
ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体とは、ヒトＤＮＡＭ－１を特異的に認識する、ヒト化抗体の意味で用いる。特異的に認識するとは、ヒトＤＮＡＭ－１タンパク質には結合するが、ヒトＤＮＡＭ－１タンパク質以外には結合しないことを意味する。前記結合活性は、公知の方法、例えば免疫沈降法、ウェスタンブロッティング、ＥＩＡ（ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、フローサイトメトリー、プルダウンアッセイ等の方法により測定することができる。
[ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体]
ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体とは、ヒトＤＮＡＭ－１を特異的に認識する、ヒト化抗体の意味で用いる。特異的に認識するとは、ヒトＤＮＡＭ－１タンパク質には結合するが、ヒトＤＮＡＭ－１タンパク質以外には結合しないことを意味する。前記結合活性は、公知の方法、例えば免疫沈降法、ウェスタンブロッティング、ＥＩＡ（ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、フローサイトメトリー、プルダウンアッセイ等の方法により測定することができる。
【0010】
ヒト化抗体とは、可変領域が原則、ヒト以外の抗体由来の相補決定領域（ＣＤＲ）とヒト抗体由来のフレームワーク領域（ＦＲ）とからなり、定常領域がヒト抗体由来の定常領域からなる抗体である。
【0011】
本発明の一態様であるヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体は、
下記アミノ酸配列を含む重鎖可変領域；ＨＣＤＲ１として配列番号１のアミノ酸配列、ＨＣＤＲ２として配列番号２のアミノ酸配列、およびＨＣＤＲ３として配列番号３のアミノ酸配列、ならびに
下記アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；ＬＣＤＲ１として配列番号４のアミノ酸配列、ＬＣＤＲ２として配列番号５のアミノ酸配列、およびＬＣＤＲ３として配列番号６のアミノ酸配列を有する。前記ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体をヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）と称する。
ＨＣＤＲとは重鎖のＣＤＲであり、ＬＣＤＲとは軽鎖のＣＤＲである。
下記アミノ酸配列を含む重鎖可変領域；ＨＣＤＲ１として配列番号１のアミノ酸配列、ＨＣＤＲ２として配列番号２のアミノ酸配列、およびＨＣＤＲ３として配列番号３のアミノ酸配列、ならびに
下記アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；ＬＣＤＲ１として配列番号４のアミノ酸配列、ＬＣＤＲ２として配列番号５のアミノ酸配列、およびＬＣＤＲ３として配列番号６のアミノ酸配列を有する。前記ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体をヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）と称する。
ＨＣＤＲとは重鎖のＣＤＲであり、ＬＣＤＲとは軽鎖のＣＤＲである。
【0012】
ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）は、ヒトＤＮＡＭ－１とそのリガンドとの結合を阻害する抗体でも、ヒトＤＮＡＭ－１とそのリガンドとの結合を阻害しない抗体であってもよいが、ヒトＤＮＡＭ－１とそのリガンドとの結合を阻害する抗体が好ましい。また、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）は、ヒトＤＮＡＭ－１のシグナル伝達を阻害または低減する抗体（中和抗体）でも、ヒトＤＮＡＭ－１のシグナル伝達を変化させない抗体でも、ヒトＤＮＡＭ－１のシグナル伝達を促進する抗体（アゴニスティック抗体）であってもよいが、ヒトＤＮＡＭ－１のシグナル伝達を阻害または低減する抗体（中和抗体）が好ましい。
【0013】
ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）のクラスおよびサブクラスは、本発明の効果が発揮される限り特に制限されず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥのいずれであってもよいが、好ましくはＩｇＧであり、より好ましくはＩｇＧ１である。ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）の重鎖は、γ、μ、α、δ、およびεのいずれであってもよいが、好ましくはγ、より好ましくはγ１である。ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）の軽鎖は、κおよびλのいずれであってもよいが、好ましくはκである。
【0014】
ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）は、形質転換体が産生した抗体または形質転換体の培養上清等をそのまま用いてもよいし、精製してから用いてもよい。精製は、例えば、飽和硫酸アンモニウム、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５２等）、抗イムノグロブリンカラムあるいはプロテインＡカラム、プロテインＧカラム等のアフィニティカラムクロマトグラフィーに供することにより行うことができる。
【0015】
ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）は、マルチスペシフィック抗体、リサイクリング抗体、スイーピング抗体、コンジュゲート抗体等であってもよい。また、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非ペプチド性ポリマー、放射性物質、毒素、低分子化合物、サイトカイン、成長因子、アルブミン、酵素、他の抗体などの機能分子を化学的または遺伝子工学的に結合していてもよい。これらは、公知の方法により製造することができる。
【0016】
ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）の製造方法は特に制限されず、公知の方法で製造することができる。例えば、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）は、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗（Ａ）体をコードする核酸を含有するベクターを宿主細胞にトランスフェクションして形質転換体を作製し、その形質転換体にヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）を産生させることにより得ることができる。
【0017】
ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）のアミノ酸配列は、ＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３以外の領域およびＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３以外の領域においては、ヒトＤＮＡＭ－１を特異的に認識する限り、特に制限されない。
【0018】
ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）は、好ましくは、重鎖可変領域のＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３以外の領域において、および／または、軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３以外の領域において、アミノ酸残基の復帰変異を有してもよい。
アミノ酸残基の復帰変異とは、マウス抗体のフレームワークに見られる対応するアミノ酸残基へのヒト抗体フレームワークに見られる単一アミノ酸残基の置換を指す。適切なアミノ酸残基の復帰変異により、低い免疫原性と抗原への高い結合性とを両立することができる。
アミノ酸残基の復帰変異とは、マウス抗体のフレームワークに見られる対応するアミノ酸残基へのヒト抗体フレームワークに見られる単一アミノ酸残基の置換を指す。適切なアミノ酸残基の復帰変異により、低い免疫原性と抗原への高い結合性とを両立することができる。
【0019】
重鎖可変領域におけるアミノ酸残基の復帰変異は、好ましくは１～６個、より好ましくは１～３個である。軽鎖可変領域におけるアミノ酸残基の復帰変異は、好ましくは、１～５個、より好ましくは１～２個である。
ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）は、好ましくは、重鎖可変領域のＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３以外の領域において、１～３個のアミノ酸残基の復帰変異を有し、軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３以外の領域において、アミノ酸残基の復帰変異を有さない。
ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）は、好ましくは、重鎖可変領域のＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３以外の領域において、１～３個のアミノ酸残基の復帰変異を有し、軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３以外の領域において、アミノ酸残基の復帰変異を有さない。
【0020】
復帰変異させるアミノ酸残基は、可変領域内において、非共有結合的に直接抗原と結合するアミノ酸残基、ＣＤＲ領域と隣接しているアミノ酸残基、ＣＤＲ領域と相互作用するアミノ酸残基、又はＶＬ－ＶＨインターフェースに関与しているアミノ酸残基から選ぶことができる。
重鎖可変領域におけるアミノ酸残基の復帰変異は、好ましくは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、またはＨＣＤＲ３の前後５アミノ酸、より好ましくは２アミノ酸の範囲内において行われる。
重鎖可変領域におけるアミノ酸残基の復帰変異は、好ましくは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、またはＨＣＤＲ３の前後５アミノ酸、より好ましくは２アミノ酸の範囲内において行われる。
【0021】
重鎖可変領域におけるアミノ酸残基の復帰変異は、好ましくは、重鎖可変領域の４９番目および７２番目から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基において行われる。軽鎖可変領域におけるアミノ酸残基の復帰変異は、好ましくは、軽鎖可変領域の６７番目のアミノ酸残基において行われる。
ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）は、より好ましくは、重鎖可変領域の４９番目および７２番目のアミノ酸残基、並びに軽鎖可変領域の６７番目のアミノ酸残基において復帰変異を有する。
なお、本明細書において、Ｘ番目のアミノ酸残基とは、シグナルペプチドを含めずに、タンパク質のＮ末端から数えてＸ番目を意味する。
ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）は、より好ましくは、重鎖可変領域の４９番目および７２番目のアミノ酸残基、並びに軽鎖可変領域の６７番目のアミノ酸残基において復帰変異を有する。
なお、本明細書において、Ｘ番目のアミノ酸残基とは、シグナルペプチドを含めずに、タンパク質のＮ末端から数えてＸ番目を意味する。
【0022】
重鎖可変領域におけるアミノ酸残基の復帰変異は、好ましくは、重鎖可変領域の４９番目のアミノ酸残基をＭ、７２番目のアミノ酸残基をＲとするものである。軽鎖可変領域におけるアミノ酸残基の復帰変異は、好ましくは、軽鎖可変領域の６７番目のアミノ酸残基をＹとするものである。
ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）は、より好ましくは、重鎖可変領域において、Ｉ４９Ｍ、およびＶ７２Ｒ、並びに軽鎖可変領域において、Ｓ６７Ｙの復帰変異を有する。
ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）は、より好ましくは、重鎖可変領域において、Ｉ４９Ｍ、およびＶ７２Ｒ、並びに軽鎖可変領域において、Ｓ６７Ｙの復帰変異を有する。
【0023】
ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）は、好ましくは、配列番号１０と９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号１１と９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する。
【0024】
配列同一性のパーセンテージは、Ｋａｂａｔ番号付け規則によって最大限に整列配置した抗体の配列によって決定される。アライメントの後、対象の抗体領域（例えば軽鎖可変領域）と、対照抗体の同じ領域とを比較する場合、対象の抗体領域と対照抗体領域との間における配列同一性のパーセントは、対象の抗体領域と対照抗体領域の両方において同じアミノ酸によって占められる位置の数を、２つの領域においてアライメントされた位置の総数（ギャップは数に入れない）で割り、１００を掛けることでパーセントを算出する。
【0025】
ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）は、配列番号１０のアミノ酸配列のうち、ＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３以外の領域において、１～６個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列であって、配列番号１０と少なくとも９５％以上同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号１１のアミノ酸配列のうち、ＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３以外の領域において、１～５個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列であって、配列番号１１と少なくとも９５％以上同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体であってもよい。アミノ酸残基の変異とは、単一アミノ酸残基の置換、挿入、または欠失を意味する。
【0026】
ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）は、配列番号１０のアミノ酸配列のうち、ＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３以外の領域において、１～３個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列であって、配列番号１０と少なくとも９７％以上同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号１１のアミノ酸配列のうち、ＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３以外の領域において、１～３個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列であって、配列番号１１と少なくとも９７％以上同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体であってもよい。
【0027】
アミノ酸残基の変異は、置換、挿入、欠失のうち、置換が好ましく、保存的置換がより好ましい。「保存的置換」とは、ペプチドの活性を実質的に改変しないように、アミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることである。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合等が挙げられる。このような置換を行うことができる、化学的に類似したアミノ酸の例として、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン等が挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システイン等が挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジン等が挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。
【0028】
ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）は、好ましくは、配列番号１０と９５％以上同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１１と９５％以上同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有し、前記重鎖可変領域の４９番目、７２番目のアミノ酸残基がそれぞれＭ、Ｒであり、前記軽鎖可変領域の６７番目のアミノ酸残基がＹである。
【0029】
ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）は、好ましくは、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、または配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、を有する。
【0030】
ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）は、好ましくは、ＩｇＧ抗体のエフェクター機能を消失させるためのアミノ酸残基の変異を有する。
ＩｇＧ抗体のエフェクター機能を消失させるためのアミノ酸残基の変異としては、例えば、重鎖の定常領域において、Ｖ（バリン）、Ｌ（ロイシン）、Ｉ（イソロイシン）等の分枝鎖アミノ酸；Ｐ（プロリン）、Ｍ（メチオニン）、Ｗ（トリプトファン）等の疎水性アミノ酸；またはＹ（チロシン）、Ｓ（セリン）、Ｔ（スレオニン）等のリン酸化されてシグナル伝達に関与するアミノ酸；をＡ（アラニン）またはＦ（フェニルアラニン）に置換する変異が挙げられるが、好ましくは、ＬをＡまたはＦに置換する変異であり、より好ましくは、２つ連続するＬをＡＡ、ＦＦ、ＡＦ、又はＦＡに置換する変異である。
ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）は、重鎖の２３８番目および２３９番目のアミノ酸残基が好ましくはＡまたはＦであり、より好ましくはどちらもＡである。このようなヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）は、ＩｇＧ抗体のエフェクター機能を消失させ、血小板を凝集させにくいため、ヒト疾患の治療に有用である。
ＩｇＧ抗体のエフェクター機能を消失させるためのアミノ酸残基の変異としては、例えば、重鎖の定常領域において、Ｖ（バリン）、Ｌ（ロイシン）、Ｉ（イソロイシン）等の分枝鎖アミノ酸；Ｐ（プロリン）、Ｍ（メチオニン）、Ｗ（トリプトファン）等の疎水性アミノ酸；またはＹ（チロシン）、Ｓ（セリン）、Ｔ（スレオニン）等のリン酸化されてシグナル伝達に関与するアミノ酸；をＡ（アラニン）またはＦ（フェニルアラニン）に置換する変異が挙げられるが、好ましくは、ＬをＡまたはＦに置換する変異であり、より好ましくは、２つ連続するＬをＡＡ、ＦＦ、ＡＦ、又はＦＡに置換する変異である。
ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）は、重鎖の２３８番目および２３９番目のアミノ酸残基が好ましくはＡまたはＦであり、より好ましくはどちらもＡである。このようなヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）は、ＩｇＧ抗体のエフェクター機能を消失させ、血小板を凝集させにくいため、ヒト疾患の治療に有用である。
【0031】
ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）は、好ましくは、配列番号１４と９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上同一のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１５と９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上同一のアミノ酸配列を有する軽鎖を有する。
【0032】
ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）は、好ましくは配列番号１４のアミノ酸配列のうち、ＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３以外の領域において、１～２２個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列であって、配列番号１４と少なくとも９５％以上同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号１５のアミノ酸配列のうち、ＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３以外の領域において、１～１０個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列であって、配列番号１５と少なくとも９５％以上同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体である。
【0033】
ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）は、好ましくは、配列番号１４のアミノ酸配列のうち、ＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３以外の領域において、１～１３個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列であって、配列番号１４と少なくとも９７％以上同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号１５のアミノ酸配列のうち、ＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３以外の領域において、１～６個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列であって、配列番号１５と少なくとも９７％以上同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体である。
【0034】
ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）は、好ましくは、配列番号１４と９５％以上同一のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１５と９５％以上同一のアミノ酸配列を有する軽鎖を有し、前記重鎖の可変領域の４９番目、７２番目のアミノ酸残基がそれぞれＭ、Ｒであり、前記軽鎖の可変領域の６７番目のアミノ酸残基がＹである。
【0035】
ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）は、好ましくは、配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１５のアミノ酸配列を有する軽鎖、または、配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１５のアミノ酸配列を有する軽鎖を有する。
【0036】
［ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体の抗原結合断片］
ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体の抗原結合断片とは、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）の一部分を含むタンパク質であり、抗原に結合できるものをいう。抗原結合断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ジスルフィド結合安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ｄｉａｂｏｄｙおよびこれらの重合体等が挙げられる。
ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体の抗原結合断片とは、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）の一部分を含むタンパク質であり、抗原に結合できるものをいう。抗原結合断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ジスルフィド結合安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ｄｉａｂｏｄｙおよびこれらの重合体等が挙げられる。
【0037】
Ｆａｂは、ＩｇＧをパパイン（タンパク質分解酵素）で処理して得られる断片のうち、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体のＦａｂは、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体をパパインで処理するか、前記抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、このベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入して発現させることで、作製することができる。
【0038】
Ｆ（ａｂ'）２は、ＩｇＧをペプシン（タンパク質分解酵素）で処理して得られる断片のうち、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体のＦ（ａｂ'）２は、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体をペプシンで処理するか、Ｆａｂ'（後述）をチオエーテル結合またはジスルフィド結合で結合させることで、作製することができる。
【0039】
Ｆａｂ'は、Ｆ（ａｂ'）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体のＦａｂ'は、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体のＦ（ａｂ'）２をジチオスレイトールで処理するか、前記抗体のＦａｂ'をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、このベクターを原核生物または真核生物へ導入して発現させることで、作製することができる。
【0040】
ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを適当なペプチドリンカーを用いて連結した抗原結合活性を有する抗体断片である。ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体のｓｃＦｖは、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入して発現させることで、作製することができる。
【0041】
ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体のｄｉａｂｏｄｙは、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｉａｂｏｄｙをコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入して発現させることで、作製することができる。
【0042】
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを、システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させた抗体断片である。ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体のｄｓＦｖは、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入して発現させることで、作製することができる。
【0043】
抗原結合断片は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非ペプチド性ポリマー、放射性物質、毒素、低分子化合物、サイトカイン、成長因子、アルブミン、酵素、他の抗体などの機能分子を化学的または遺伝子工学的に結合していてもよい。
抗原結合断片は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。また、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体とその抗原結合断片を組み合わせて用いてもよい。
抗原結合断片は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。また、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体とその抗原結合断片を組み合わせて用いてもよい。
【0044】
［ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸］
本発明の一態様は、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）またはその抗原結合断片をコードする核酸である。
このような核酸としては、例えば、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）の重鎖可変領域をコードする核酸、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）の軽鎖可変領域をコードする核酸、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）の重鎖可変領域および定常領域の一部をコードする核酸、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）の軽鎖可変領域および定常領域の一部をコードする核酸、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）の重鎖全長をコードする核酸、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）の軽鎖全長をコードする核酸、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを適切なリンカーで連結したｓｃＦｖをコードする核酸等が挙げられる。
前記核酸は、公知の遺伝子工学的手法を用いて製造することができる。
本発明の一態様は、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）またはその抗原結合断片をコードする核酸である。
このような核酸としては、例えば、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）の重鎖可変領域をコードする核酸、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）の軽鎖可変領域をコードする核酸、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）の重鎖可変領域および定常領域の一部をコードする核酸、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）の軽鎖可変領域および定常領域の一部をコードする核酸、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）の重鎖全長をコードする核酸、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）の軽鎖全長をコードする核酸、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを適切なリンカーで連結したｓｃＦｖをコードする核酸等が挙げられる。
前記核酸は、公知の遺伝子工学的手法を用いて製造することができる。
【0045】
ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）またはその抗原結合断片をコードする核酸には、シグナルペプチドをコードする核酸を付加することが好ましい。適切なアミノ酸配列のシグナルペプチドを付加することにより、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）またはその抗原結合断片の細胞における発現量または培養上清に分泌される抗体または抗原結合断片の量を増やすことができる。
【0046】
シグナルペプチドのアミノ酸配列は、特に制限されないが、重鎖においては、好ましくは配列番号２８、配列番号２９、配列番号３１に記載のアミノ酸配列であり、より好ましくは配列番号３１に記載のアミノ酸配列である。シグナルペプチドのアミノ酸配列は、軽鎖においては、好ましくは配列番号３０、配列番号３２に記載のアミノ酸配列であり、より好ましくは配列番号３２に記載のアミノ酸配列である。
【0047】
シグナルペプチドが付加された重鎖全長をコードする核酸は、好ましくは配列番号１６、配列番号１７、配列番号２４に記載のアミノ酸配列をコードする核酸、より好ましくは配列番号２４に記載のアミノ酸配列をコードする核酸、さらに好ましくは、配列番号１９または配列番号２０、配列番号２６に記載の塩基配列からなる核酸、特に好ましくは配列番号２６に記載の塩基配列からなる核酸である。
シグナルペプチドが付加された軽鎖全長をコードする核酸は、好ましくは配列番号１８、配列番号２５に記載のアミノ酸配列をコードする核酸、より好ましくは配列番号２５に記載のアミノ酸配列をコードする核酸、さらに好ましくは、配列番号２１または配列番号２７に記載の塩基配列からなる核酸であり、特に好ましくは配列番号２７に記載の塩基配列からなる核酸である。
シグナルペプチドが付加された軽鎖全長をコードする核酸は、好ましくは配列番号１８、配列番号２５に記載のアミノ酸配列をコードする核酸、より好ましくは配列番号２５に記載のアミノ酸配列をコードする核酸、さらに好ましくは、配列番号２１または配列番号２７に記載の塩基配列からなる核酸であり、特に好ましくは配列番号２７に記載の塩基配列からなる核酸である。
【0048】
[核酸を含有するベクター]
本発明の一態様は、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）またはその抗原結合断片をコードする核酸を含有するベクターである。換言すると、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）またはその抗原結合断片をコードする核酸を組み込んだ、組み換えベクターである。
ベクターは、特に制限されず、プラスミドベクター、ウイルスベクターを挙げることができる。ベクターは、哺乳動物、細菌、昆虫、酵母および真菌等において発現可能なベクターであってもよいが、真核細胞において発現可能なベクターが好ましく、哺乳動物由来の細胞において発現可能なベクターがより好ましい。哺乳動物由来の細胞において発現可能なベクターとしては、例えば、ｐＵＣシリーズ、ｐＣＡＧ、ｐＥＢＭｕｌｔｉ、ｐＥＧＦＰ－Ｃ１、ｐＥＧＦＰ－Ｃ１、ｐＥＦ－ＢＯＳ、ｐＴＲＥ－Ｍｙｃ、ｐＭＳＣＶｐｕｒｏ、ｐＣＥＰ４が挙げられるが、好ましくはｐＵＣ１９である。
本発明の一態様は、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）またはその抗原結合断片をコードする核酸を含有するベクターである。換言すると、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）またはその抗原結合断片をコードする核酸を組み込んだ、組み換えベクターである。
ベクターは、特に制限されず、プラスミドベクター、ウイルスベクターを挙げることができる。ベクターは、哺乳動物、細菌、昆虫、酵母および真菌等において発現可能なベクターであってもよいが、真核細胞において発現可能なベクターが好ましく、哺乳動物由来の細胞において発現可能なベクターがより好ましい。哺乳動物由来の細胞において発現可能なベクターとしては、例えば、ｐＵＣシリーズ、ｐＣＡＧ、ｐＥＢＭｕｌｔｉ、ｐＥＧＦＰ－Ｃ１、ｐＥＧＦＰ－Ｃ１、ｐＥＦ－ＢＯＳ、ｐＴＲＥ－Ｍｙｃ、ｐＭＳＣＶｐｕｒｏ、ｐＣＥＰ４が挙げられるが、好ましくはｐＵＣ１９である。
【0049】
ベクターの製造方法は特に制限されず、公知の遺伝子組み換え技術により製造することができる。
ベクターは、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）またはその抗原結合断片をコードする核酸に加えて、宿主における複製および発現、および／または宿主からの分泌を制御することが可能な調節制御配列を含んでもよい。調節制御配列としては、例えば、ＣＭＶプロモーター等のプロモーター配列が挙げられる。
ベクターは、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）またはその抗原結合断片をコードする核酸に加えて、宿主における複製および発現、および／または宿主からの分泌を制御することが可能な調節制御配列を含んでもよい。調節制御配列としては、例えば、ＣＭＶプロモーター等のプロモーター配列が挙げられる。
【0050】
[ベクターを含有する形質転換体]
本発明の一態様は、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）またはその抗原結合断片をコードする核酸を含有するベクターを含有する形質転換体である。形質転換体またはその培養上清等から、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）またはその抗原結合断片を得ることができる。
本発明の一態様は、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）またはその抗原結合断片をコードする核酸を含有するベクターを含有する形質転換体である。形質転換体またはその培養上清等から、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）またはその抗原結合断片を得ることができる。
【0051】
形質転換体は、上述した組み換えベクターを宿主に導入することにより得ることができる。宿主としては、例えば、大腸菌、酵母、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞等の培養細胞；カイコ等の昆虫生体；タバコ等の植物体等が挙げられるが、好ましくは動物細胞である。
動物細胞としては、ＮＳ０、Ｓｐ２／０、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ、線維芽細胞、および骨髄腫細胞等の哺乳動物細胞が挙げられるが、好ましくはＣＨＯである。
動物細胞としては、ＮＳ０、Ｓｐ２／０、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ、線維芽細胞、および骨髄腫細胞等の哺乳動物細胞が挙げられるが、好ましくはＣＨＯである。
【0052】
組換えベクターの宿主への導入（形質転換）は公知の方法を用いて行うことができる。このような方法としては、例えば、カルシウム処理された菌体を用いるコンピテント細胞法や、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、プラスミドベクター以外にも、ファージベクター、ウイルスベクター等を宿主に感染させて形質転換する方法を利用してもよい。
【0053】
[自然リンパ球（ＩＬＣ）の活性化抑制剤]
本発明の一態様は、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）またはその抗原結合断片を含む、自然リンパ球（ＩＬＣ）の活性化抑制剤である。
本発明の一態様は、自然リンパ球（ＩＬＣ）の活性化抑制における使用のための、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）またはその抗原結合断片である。
本発明の一態様は、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）またはその抗原結合断片の有効量を、対象に投与することを含む、自然リンパ球（ＩＬＣ）の活性化を抑制する方法である。
本発明の一態様は、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）またはその抗原結合断片を含む、自然リンパ球（ＩＬＣ）の活性化抑制剤である。
本発明の一態様は、自然リンパ球（ＩＬＣ）の活性化抑制における使用のための、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）またはその抗原結合断片である。
本発明の一態様は、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）またはその抗原結合断片の有効量を、対象に投与することを含む、自然リンパ球（ＩＬＣ）の活性化を抑制する方法である。
【0054】
自然リンパ球（ＩＬＣ；Ｉｎｎａｔｅ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｃｅｌｌ）とは、リンパ系前駆細胞（ＣＬＰ）に由来する自然免疫系の細胞である。ＩＬＣは、Ｔ細胞受容体もＢ細胞受容体も持たないことから、抗原特異的には活性化されないが、抗原非依存的な刺激によって迅速に活性化して，多量のサイトカインを産生することが知られている。
ＩＬＣは、Ｔ－ｂｅｔ依存的に分化し、ＩＦＮ－γを産生するＩＬＣ１；ＧＡＴＡ－３依存的に分化し、ＩＬ－５、ＩＬ－９およびＩＬ－１３を産生するＩＬＣ２；およびＲＯＲγｔを発現し、ＩＬ－２２あるいはＩＬ－１７を産生するＩＬＣ３の３つのサブセットに分類することができる。
ＩＬＣは、Ｔ－ｂｅｔ依存的に分化し、ＩＦＮ－γを産生するＩＬＣ１；ＧＡＴＡ－３依存的に分化し、ＩＬ－５、ＩＬ－９およびＩＬ－１３を産生するＩＬＣ２；およびＲＯＲγｔを発現し、ＩＬ－２２あるいはＩＬ－１７を産生するＩＬＣ３の３つのサブセットに分類することができる。
【0055】
ＩＬＣは、組織常在性の細胞であり、免疫細胞だけでなく、非免疫細胞とも相互作用して、組織恒常性の維持に寄与している。組織に局在し、抗原非特異的な刺激に応じて多量のサイトカインを産生するというＩＬＣの性質から、その不適切な活性化が病態形成につながると考えられている。しかし、ＩＬＣがどのような分子を介して活性化するか等の活性化のメカニズム等はわかっていないことが多い。
【0056】
ＩＬＣは、喘息、ＣＯＰＤ（ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）、肺線維症等の肺疾患；潰瘍性大腸炎、クローン病等の炎症性腸疾患；多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬等の自己免疫性疾患；ウイルス感染症、細菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症等の感染症；急性および慢性肝障害等と関係があると考えられている。
【0057】
ＩＬＣの活性化は、ＩＬＣの細胞数の増加、ＩＬＣが産生するＩＦＮ－γ、ＩＬ－５、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、ＩＬ－２２、ＩＬ－１７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－α等のサイトカインの増加等を指標とすることができる。
ＩＬＣの活性化抑制剤は、ＩＬＣの活性化に関する上記の指標のうち、いずれかを減少させればよい。ＩＬＣの活性化抑制剤は、好ましくはサイトカイン産生抑制剤であり、より好ましくはＩＦＮ－γ産生抑制剤、ＴＮＦ－α産生抑制剤である。
ＩＬＣの活性化抑制剤は、ＩＬＣの活性化に関する上記の指標のうち、いずれかを減少させればよい。ＩＬＣの活性化抑制剤は、好ましくはサイトカイン産生抑制剤であり、より好ましくはＩＦＮ－γ産生抑制剤、ＴＮＦ－α産生抑制剤である。
【0058】
実施例において後述するように、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）またはその抗原結合断片は、自然リンパ球の活性化、特にサイトカイン産生を抑制することができる。
したがって、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）またはその抗原結合断片は、自然リンパ球の活性化が関与する疾病、例えば、喘息、ＣＯＰＤ（ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）、肺線維症等の肺疾患；潰瘍性大腸炎、クローン病等の炎症性腸疾患；多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬等の自己免疫性疾患；ウイルス感染症、細菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症等の感染症、急性および慢性肝障害の予防および治療に効果を示すことが予測される。
したがって、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）またはその抗原結合断片は、自然リンパ球の活性化が関与する疾病、例えば、喘息、ＣＯＰＤ（ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）、肺線維症等の肺疾患；潰瘍性大腸炎、クローン病等の炎症性腸疾患；多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬等の自己免疫性疾患；ウイルス感染症、細菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症等の感染症、急性および慢性肝障害の予防および治療に効果を示すことが予測される。
【0059】
特許文献１には、抗ＤＮＡＭ－１抗体は、制御性Ｔ細胞を活性化して免疫反応を抑制するので、移植片対宿主病、臓器移植拒絶、自己免疫疾患、線維化疾患、炎症性腸炎、アレルギー等の予防または治療に使用できることが記載されている。本発明者らは、実施例で後述するように、肺、小腸、ＰＢＭＣのＩＬＣにＤＮＡＭ－１が発現していることを見出した。さらに、ＩＬＣの活性化、特にサイトカイン産生にＤＮＡＭ－１が関与していること、さらに、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体は、ＩＬＣの活性化を抑制できることを見出した。抗ＤＮＡＭ－１抗体を予防または治療に用いることができるとされてきた疾患のうち、特に、喘息、ＣＯＰＤ、肺線維症等の肺疾患；潰瘍性大腸炎、クローン病等の炎症性腸疾患；多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬等の自己免疫性疾患；ウイルス感染症、細菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症等の感染症；急性および慢性肝障害の患者においては、ＩＬＣが活性化している患者もいればしていない患者もいると考えられる。本明細書に記載した新たな知見により、ＩＬＣが活性化している患者に対して選択的にヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）を投与できるようになったので、治療成績が上がることが予測される。また、ＩＬＣの活性化を指標として、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（Ａ）の投与量、投与のタイミング、およびスケジュールを決定することができるようになった。
【実施例】
【0060】
次に本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
すべての実験は、筑波大学実験動物資源センターの動物倫理委員会のガイドラインに従って行った。
すべての実験は、筑波大学実験動物資源センターの動物倫理委員会のガイドラインに従って行った。
【0061】
［実験例１］抗ヒトＤＮＡＭ－１ヒト化抗体の作製
[抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体（ｍＡＫＢ１）の作製]
マウスリンパ球細胞であるＢＷ５１４７細胞株にヒトＤＭＡＭ－１遺伝子を導入し、ヒトＤＭＡＭ－１タンパク質を発現させた。この細胞を抗原としてマウスを免疫し、マウスから脾臓細胞を採取し、常法によりＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを得た。ヒトＤＮＡＭ－１タンパク質に対する反応性を指標としてハイブリドーマをスクリーニングし、選ばれたクローンをクローンｍＡＫＢ１とした。ｍＡＫＢ１が産生する抗体を抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体ｍＡＫＢ１（単にｍＡＫＢ１ともいう）と称す。クローンｍＡＫＢ１の培養上清をプロテインＡセファロースカラムで精製したｍＡＫＢ１を用いてヒトＤＮＡＭ－１との結合性を解析した。
[抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体（ｍＡＫＢ１）の作製]
マウスリンパ球細胞であるＢＷ５１４７細胞株にヒトＤＭＡＭ－１遺伝子を導入し、ヒトＤＭＡＭ－１タンパク質を発現させた。この細胞を抗原としてマウスを免疫し、マウスから脾臓細胞を採取し、常法によりＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを得た。ヒトＤＮＡＭ－１タンパク質に対する反応性を指標としてハイブリドーマをスクリーニングし、選ばれたクローンをクローンｍＡＫＢ１とした。ｍＡＫＢ１が産生する抗体を抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体ｍＡＫＢ１（単にｍＡＫＢ１ともいう）と称す。クローンｍＡＫＢ１の培養上清をプロテインＡセファロースカラムで精製したｍＡＫＢ１を用いてヒトＤＮＡＭ－１との結合性を解析した。
【0062】
[ヒトＤＮＡＭ－１との結合性の解析]
マウスリンパ芽細胞ＢＷ５１４７細胞株（以下、「ＢＷ」という場合がある。）、およびヒトｈＤＮＡＭ－１を安定的に発現するＢＷ５１４７（以下、「ｈＤＮＡＭ－１／ＢＷ」という場合がある。）を用いて、フローサイトメトリーによりヒトＤＮＡＭ－１への結合を調べた。０．５％ＢＳＡと０．０５％ＮａＮ3を含むＰＢＳ（ＦＡＣＳバッファー）中で、様々な濃度のテスト抗体を約１０5個のｈＤＮＡＭ－１／ＢＷ細胞と４℃で１時間インキュベートした。その後、氷冷したＦＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒで細胞を洗浄し、ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて４℃で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳバッファーで洗浄後、染色された細胞をＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて解析した。
マウスリンパ芽細胞ＢＷ５１４７細胞株（以下、「ＢＷ」という場合がある。）、およびヒトｈＤＮＡＭ－１を安定的に発現するＢＷ５１４７（以下、「ｈＤＮＡＭ－１／ＢＷ」という場合がある。）を用いて、フローサイトメトリーによりヒトＤＮＡＭ－１への結合を調べた。０．５％ＢＳＡと０．０５％ＮａＮ3を含むＰＢＳ（ＦＡＣＳバッファー）中で、様々な濃度のテスト抗体を約１０5個のｈＤＮＡＭ－１／ＢＷ細胞と４℃で１時間インキュベートした。その後、氷冷したＦＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒで細胞を洗浄し、ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて４℃で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳバッファーで洗浄後、染色された細胞をＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて解析した。
【0063】
ｍＡＫＢ１のヒトＤＮＡＭ－１との結合性を解析した結果を図１に示す。ｍＡＫＢ１は、ヒトＤＮＡＭ－１と特異的に結合し、ＥＣ50は６μｇ／ｍＬであった。
【0064】
[ｍＡＫＢ１の配列決定]
クローンｍＡＫＢ１から常法により、抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体ｍＡＫＢ１の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の遺伝子をクローニングし、ｍＡＫＢ１の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の塩基配列を同定した。その塩基配列からアミノ酸配列を推定し、さらにａｂＹｓｉｓを用いてＫａｂａｔの方法により、ＣＤＲを決定した。
クローンｍＡＫＢ１から常法により、抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体ｍＡＫＢ１の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の遺伝子をクローニングし、ｍＡＫＢ１の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の塩基配列を同定した。その塩基配列からアミノ酸配列を推定し、さらにａｂＹｓｉｓを用いてＫａｂａｔの方法により、ＣＤＲを決定した。
【0065】
［ヒト化抗体ｈＡＫＢ１のＶＨおよびＶＬ遺伝子の設計］
ｍＡＫＢ１を元にして、以下のようにして、ヒト化抗体のＶＨ（重鎖可変領域）およびＶＬ（軽鎖可変領域）のアミノ酸配列を設計した。まず、ｍＡＫＢ１可変領域の３次元分子モデルを構築した。この分子モデルを用いて、ＣＤＲの３次元構造の形成に重要なフレームワークアミノ酸残基を同定した。
ｍＡＫＢ１を元にして、以下のようにして、ヒト化抗体のＶＨ（重鎖可変領域）およびＶＬ（軽鎖可変領域）のアミノ酸配列を設計した。まず、ｍＡＫＢ１可変領域の３次元分子モデルを構築した。この分子モデルを用いて、ＣＤＲの３次元構造の形成に重要なフレームワークアミノ酸残基を同定した。
【0066】
ｍＡＫＢ１ ＶＨのフレームワークと相同性のあるヒトＶＨ配列をＧｅｎＢａｎｋデータベース内で検索し、ヒトＦＪ０３９７８３ ｃＤＮＡ（ＦＪ０３９７８３ ＶＨ）にコードされているＶＨ配列をヒト化のアクセプターとして選択した。
ｍＡＫＢ１のＨＣＤＲ配列を、ＦＪ０３９７８３ ＶＨの対応する位置にグラフトした。ＣＤＲ構造の形成に重要であると考えられたことから、重鎖可変領域の３０番目、４９番目、および７２番目のアミノ酸残基を、ＦＪ０３９７８３ ＶＨのアミノ酸残基からｍＡＫＢ１ ＶＨの対応する残基に置換した。得られたヒト化抗体のＶＨをｈＡＫＢ１－ＶＨ１とした。さらに、免疫原性を下げるために、３０番目のアミノ酸残基をマウスのアミノ酸残基に復帰変異させないｈＡＫＢ１－ＶＨ２を追加で設計した。ｍＡＫＢ１のＶＨ（配列番号７）、ｈＡＫＢ１－ＶＨ１（配列番号９）、ｈＡＫＢ１－ＶＨ２（配列番号１０）、およびＦＪ０３９７８３ ＶＨのアミノ酸配列を図２に示す。
ｍＡＫＢ１のＨＣＤＲ配列を、ＦＪ０３９７８３ ＶＨの対応する位置にグラフトした。ＣＤＲ構造の形成に重要であると考えられたことから、重鎖可変領域の３０番目、４９番目、および７２番目のアミノ酸残基を、ＦＪ０３９７８３ ＶＨのアミノ酸残基からｍＡＫＢ１ ＶＨの対応する残基に置換した。得られたヒト化抗体のＶＨをｈＡＫＢ１－ＶＨ１とした。さらに、免疫原性を下げるために、３０番目のアミノ酸残基をマウスのアミノ酸残基に復帰変異させないｈＡＫＢ１－ＶＨ２を追加で設計した。ｍＡＫＢ１のＶＨ（配列番号７）、ｈＡＫＢ１－ＶＨ１（配列番号９）、ｈＡＫＢ１－ＶＨ２（配列番号１０）、およびＦＪ０３９７８３ ＶＨのアミノ酸配列を図２に示す。
【0067】
ｍＡＫＢ１ ＶＬのフレームワークと相同性のあるヒトＶＬ配列をＧｅｎＢａｎｋデータベース内で検索し、ＫＵ７６０９７１ ｃＤＮＡ （ＫＵ７６０９７１ ＶＬ）にコードされているヒトＶκ領域をヒト化のアクセプターとして選択した。
ｍＡＫＢ１のＬＣＤＲ配列を、ＫＵ７６０９７１ ＶＬの対応する位置にグラフトした。ＣＤＲ構造の形成に重要であると考えられたことから、軽鎖可変領域の６７番目のアミノ酸残基を、ＫＵ７６０９７１ ＶＬのアミノ酸残基からｍＡＫＢ１ ＶＬの対応する残基に置換した。得られたヒト化抗体のＶＬをｈＡＫＢ１－ＶＬ１とした。さらに、免疫原性を下げるために、６７番目のアミノ酸残基をマウスのアミノ酸残基に復帰変異させないｈＡＫＢ１－ＶＬ２を追加で設計した。ｍＡＫＢ１のＶＬ（配列番号８）、ｈＡＫＢ１－ＶＬ１（配列番号１１）、ｈＡＫＢ１－ＶＬ２（配列番号１２）、およびＫＵ７６０９７１ ＶＬのアミノ酸配列を図３に示す。
ｍＡＫＢ１のＬＣＤＲ配列を、ＫＵ７６０９７１ ＶＬの対応する位置にグラフトした。ＣＤＲ構造の形成に重要であると考えられたことから、軽鎖可変領域の６７番目のアミノ酸残基を、ＫＵ７６０９７１ ＶＬのアミノ酸残基からｍＡＫＢ１ ＶＬの対応する残基に置換した。得られたヒト化抗体のＶＬをｈＡＫＢ１－ＶＬ１とした。さらに、免疫原性を下げるために、６７番目のアミノ酸残基をマウスのアミノ酸残基に復帰変異させないｈＡＫＢ１－ＶＬ２を追加で設計した。ｍＡＫＢ１のＶＬ（配列番号８）、ｈＡＫＢ１－ＶＬ１（配列番号１１）、ｈＡＫＢ１－ＶＬ２（配列番号１２）、およびＫＵ７６０９７１ ＶＬのアミノ酸配列を図３に示す。
【0068】
［ヒト化抗体のＶＨおよびＶＬ遺伝子の構築］
ｈＡＫＢ１－ＶＨ１、ｈＡＫＢ１－ＶＨ２、ｈＡＫＢ１－ＶＬ１、およびｈＡＫＢ１－ＶＬ２をコードする遺伝子を、シグナルペプチド、スプライスドナーシグナル、５’末および３’末の制限酵素サイトを含めて合成した。合成した遺伝子を以下の組み合わせでプラスミドに組み込み、発現ベクターを作製した。
ｈＡＫＢ１－ＶＨ１、ｈＡＫＢ１－ＶＨ２、ｈＡＫＢ１－ＶＬ１、およびｈＡＫＢ１－ＶＬ２をコードする遺伝子を、シグナルペプチド、スプライスドナーシグナル、５’末および３’末の制限酵素サイトを含めて合成した。合成した遺伝子を以下の組み合わせでプラスミドに組み込み、発現ベクターを作製した。
【0069】
【表1】
【0070】
ポリエチレンイミンを用いて、４つの発現ベクター（ｐｈＡＫＢ１－Ａ、ｐｈＡＫＢ１－Ｂ、ｐｈＡＫＢ１－Ｃ、ｐｈＡＫＢ１－Ｄ４）をそれぞれヒト胚性腎細胞株ＨＥＫ２９３にトランスフェクションした。ＨＥＫ２９３細胞は、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ社製）を含むＤＭＥＭ培地を用いて、７．５％ＣＯ2インキュベーター内で３７℃で培養した。
【0071】
一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の培養上清における抗体の発現をＥＬＩＳＡで確認した。ＥＬＩＳＡプレートに、ＰＢＳで１／２０００に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ特異的ポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を１００μｌ／ｗｅｌｌで４℃で一晩コーティングし、Ｗａｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で洗浄し、ＥＬＩＳＡ Ｂｕｆｆｅｒ（２％スキムミルクと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）３００μｌ／ｗｅｌｌでブロッキングした。Ｗａｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した後、ＥＬＩＳＡ Ｂｕｆｆｅｒで適切に希釈した１００μｌ／ｗｅｌｌの被験抗体をＥＬＩＳＡプレートに塗布した。標準品として、ヒト化ＩｇＧ１／ｋａｐｐａ抗体を用いた。ＥＬＩＳＡプレートを室温で１時間インキュベートし、Ｗａｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した後、結合した抗体を、１／２０００希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトκ鎖ポリクローナル抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）１００μｌ／ｗｅｌｌを用いて検出した。室温で０．５時間インキュベートし、Ｗａｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した後、１００μｌ／ｗｅｌｌのＡＢＴＳ基質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を添加して発色を開始し、１００μｌ／ｗｅｌｌの２％シュウ酸で停止させた。４０５ｎｍの吸光度を読み取った。
【0072】
［ヒト化抗体の抗原への結合性］
ｐｈＡＫＢ１－Ａ、ｐｈＡＫＢ１－Ｂ、ｐｈＡＫＢ１－Ｃ、またはｐｈＡＫＢ１－Ｄをトランスフェクトされた細胞が産生する抗体をそれぞれｈＡＫＢ１－Ａ、ｈＡＫＢ１－Ｂ、ｈＡＫＢ１－Ｃ、ｈＡＫＢ１－Ｄとした。これらの抗体のヒトＤＮＡＭ－１との結合性を、上述の「ヒトＤＮＡＭ－１との結合性の解析」の通りに解析した。結果を図４に示す。
ｈＡＫＢ１－ＡおよびｈＡＫＢ１－Ｂは、ｈＡＫＢ１－Ｃ、ｈＡＫＢ１－ＤよりもヒトＤＮＡＭ－１との結合性が高かった。ｈＡＫＢ１－ＶＬ１を含む抗体（ｈＡＫＢ１－Ａ、ｈＡＫＢ１－Ｂ）とｈＡＫＢ１－ＶＬ２を含む抗体（ｈＡＫＢ１－Ｃ、ｈＡＫＢ１－Ｄ）では、抗原への結合性に差が見られ、ｈＡＫＢ１－ＶＬ１の６７番目のアミノ酸残基がＴｙｒからＳｅｒに変更されたことで、結合性が低下した。ｈＡＫＢ１－ＡとｈＡＫＢ１－Ｂとでは、抗原への結合性に差は見られなかった。
ｐｈＡＫＢ１－Ａ、ｐｈＡＫＢ１－Ｂ、ｐｈＡＫＢ１－Ｃ、またはｐｈＡＫＢ１－Ｄをトランスフェクトされた細胞が産生する抗体をそれぞれｈＡＫＢ１－Ａ、ｈＡＫＢ１－Ｂ、ｈＡＫＢ１－Ｃ、ｈＡＫＢ１－Ｄとした。これらの抗体のヒトＤＮＡＭ－１との結合性を、上述の「ヒトＤＮＡＭ－１との結合性の解析」の通りに解析した。結果を図４に示す。
ｈＡＫＢ１－ＡおよびｈＡＫＢ１－Ｂは、ｈＡＫＢ１－Ｃ、ｈＡＫＢ１－ＤよりもヒトＤＮＡＭ－１との結合性が高かった。ｈＡＫＢ１－ＶＬ１を含む抗体（ｈＡＫＢ１－Ａ、ｈＡＫＢ１－Ｂ）とｈＡＫＢ１－ＶＬ２を含む抗体（ｈＡＫＢ１－Ｃ、ｈＡＫＢ１－Ｄ）では、抗原への結合性に差が見られ、ｈＡＫＢ１－ＶＬ１の６７番目のアミノ酸残基がＴｙｒからＳｅｒに変更されたことで、結合性が低下した。ｈＡＫＢ１－ＡとｈＡＫＢ１－Ｂとでは、抗原への結合性に差は見られなかった。
【0073】
［安定的に抗体を産生する細胞株の樹立］
ヒトＤＮＡＭ－１との結合性が高い、ｈＡＫＢ１－ＡまたはｈＡＫＢ１－Ｂを安定的に産生する細胞株を得るために、以下の方法により、発現ベクターｐｈＡＫＢ１－ＡおよびｐｈＡＫＢ１－Ｂをそれぞれチャイニーズハムスター卵巣細胞株ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣより入手）の染色体に導入した。
ＣＨＯ－Ｋ１細胞は、ＳＦＭ４ＣＨＯ培地（ＨｙＣｌｏｎｅ社製）を用いて、７．５％ＣＯ2インキュベーター内で３７℃で培養した。ＣＨＯ－Ｋ１へのトランスフェクションは、エレクトロポレーションによって行った。トランスフェクションの前に、各発現ベクターをＦｓｐＩを用いて直線化した。約２．５×１０6個の細胞に２０μｇの線状化したプラスミドをトランスフェクションし、ＳＦＭ４ＣＨＯ培地に懸濁し、細胞を適切に希釈した後、複数の９６ウェルプレートにプレーティングした。４８時間後、１０μｇ／ｍｌのピューロマイシンを加え、安定したトランスフェクタントを分離した。選択開始から約１０日後、９６ウェルプレートに入れたトランスフェクタントの培養上清について、上述の方法によりサンドイッチＥＬＩＳＡで抗体産生を測定した。ｈＡＫＢ１－ＡまたはｈＡＫＢ１－Ｂを高レベルで産生するＣＨＯ－Ｋ１ ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔを選択し、次の培養に供した。
ヒトＤＮＡＭ－１との結合性が高い、ｈＡＫＢ１－ＡまたはｈＡＫＢ１－Ｂを安定的に産生する細胞株を得るために、以下の方法により、発現ベクターｐｈＡＫＢ１－ＡおよびｐｈＡＫＢ１－Ｂをそれぞれチャイニーズハムスター卵巣細胞株ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣより入手）の染色体に導入した。
ＣＨＯ－Ｋ１細胞は、ＳＦＭ４ＣＨＯ培地（ＨｙＣｌｏｎｅ社製）を用いて、７．５％ＣＯ2インキュベーター内で３７℃で培養した。ＣＨＯ－Ｋ１へのトランスフェクションは、エレクトロポレーションによって行った。トランスフェクションの前に、各発現ベクターをＦｓｐＩを用いて直線化した。約２．５×１０6個の細胞に２０μｇの線状化したプラスミドをトランスフェクションし、ＳＦＭ４ＣＨＯ培地に懸濁し、細胞を適切に希釈した後、複数の９６ウェルプレートにプレーティングした。４８時間後、１０μｇ／ｍｌのピューロマイシンを加え、安定したトランスフェクタントを分離した。選択開始から約１０日後、９６ウェルプレートに入れたトランスフェクタントの培養上清について、上述の方法によりサンドイッチＥＬＩＳＡで抗体産生を測定した。ｈＡＫＢ１－ＡまたはｈＡＫＢ１－Ｂを高レベルで産生するＣＨＯ－Ｋ１ ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔを選択し、次の培養に供した。
【0074】
ＣＨＯ－Ｋ１ ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔを４５０ｍｌのＳＦＭ４ＣＨＯで約３×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度になるようにローラーボトルで培養し、３５ｍｇ／ｍｌのＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ４（ＨｙＣｌｏｎｅ社製）を５０ｍｌ添加し、細胞生存率が５０％以下になるまでさらに培養した。遠心分離とろ過を行った後、培養上清をプロテインＡセファロースカラム（ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にロードした。カラムをＰＢＳで洗浄した後、０．１Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍグリシン－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ３．０）で抗体を溶出した。１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和した後、溶出した抗体のバッファーを透析によってＰＢＳに交換した。
【0075】
精製したｈＡＫＢ１－ＡおよびｈＡＫＢ１－Ｂは、標準的な手順に従ってＳＤＳ－ＰＡＧＥで特性を調べた。還元条件で分析した結果、これらの抗体はそれぞれ、分子量約５０ｋＤａの重鎖と分子量約２５ｋＤａの軽鎖から構成されていることがわかった。また、各抗体の純度は９５％以上であることがわかった。
【0076】
精製したｈＡＫＢ１－ＡおよびｈＡＫＢ１－Ｂについて、ヒトＤＮＡＭ－１とのＥＣ5を上述の「ヒトＤＮＡＭ－１との結合性の解析」の方法により決定した。結果を図５に示す。
ｈＡＫＢ１－Ａ、ｈＡＫＢ１－ＢのＥＣ50はそれぞれ、５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬであり、ヒトＤＮＡＭ－１との結合性はヒト化の基礎としたｍＡＫＢ１と比較して、同等またはそれ以上であった。
ｈＡＫＢ１－Ａ、ｈＡＫＢ１－ＢのＥＣ50はそれぞれ、５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬであり、ヒトＤＮＡＭ－１との結合性はヒト化の基礎としたｍＡＫＢ１と比較して、同等またはそれ以上であった。
【0077】
ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＡＫＢ１－ＡおよびＣＨＯ－Ｋ１／ｈＡＫＢ１－ＢからＲＮＡを抽出して、ＰＣＲを行い、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＡＫＢ１－ＡおよびＣＨＯ－Ｋ１／ｈＡＫＢ１－Ｂが産生する、ｈＡＫＢ１－ＡおよびｈＡＫＢ１－Ｂの重鎖および軽鎖の塩基配列を確認した。
得られたｈＡＫＢ１－ＡおよびｈＡＫＢ１－Ｂの重鎖、および軽鎖のそれぞれのコーディング領域の塩基配列は、ｐｈＡＫＢ１－Ａ、ｐｈＡＫＢ１－Ｂベクターの対応する塩基配列と完全に一致していた。ｈＡＫＢ１－ＡおよびｈＡＫＢ１－Ｂの重鎖、および軽鎖のコーディング領域の塩基配列（配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１）を、それぞれ図６～図８に示す。また、塩基配列からアミノ酸配列を推定し、さらに可変領域を決定し、ａｂＹｓｉｓを用いてＫａｂａｔの方法により、ＣＤＲを決定した。結果を図９に示す。シグナルペプチドは白抜き文字、可変領域は太字、ＣＤＲは下線で示す。
得られたｈＡＫＢ１－ＡおよびｈＡＫＢ１－Ｂの重鎖、および軽鎖のそれぞれのコーディング領域の塩基配列は、ｐｈＡＫＢ１－Ａ、ｐｈＡＫＢ１－Ｂベクターの対応する塩基配列と完全に一致していた。ｈＡＫＢ１－ＡおよびｈＡＫＢ１－Ｂの重鎖、および軽鎖のコーディング領域の塩基配列（配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１）を、それぞれ図６～図８に示す。また、塩基配列からアミノ酸配列を推定し、さらに可変領域を決定し、ａｂＹｓｉｓを用いてＫａｂａｔの方法により、ＣＤＲを決定した。結果を図９に示す。シグナルペプチドは白抜き文字、可変領域は太字、ＣＤＲは下線で示す。
【0078】
配列番号１６のｈＡＫＢ１－Ａの重鎖のアミノ酸配列（シグナルペプチドあり）は、ｈＡＫＢ１－Ａの重鎖のシグナルペプチドのアミノ酸配列（配列番号２８）とｈＡＫＢ１－Ａの重鎖のアミノ酸配列（シグナルペプチドなし：配列番号１３）とから構成される。
配列番号１７のｈＡＫＢ１－Ｂの重鎖のアミノ酸配列（シグナルペプチドあり）は、ｈＡＫＢ１－Ｂ重鎖のシグナルペプチドのアミノ酸配列（配列番号２９）とｈＡＫＢ１－Ｂの重鎖のアミノ酸配列（シグナルペプチドなし：配列番号１４）とから構成される。
配列番号１８のｈＡＫＢ１－ＡおよびｈＡＫＢ１－Ｂの軽鎖のアミノ酸配列（シグナルペプチドあり）は、ｈＡＫＢ１－Ａ、およびｈＡＫＢ１－Ｂ軽鎖のシグナルペプチドのアミノ酸配列（配列番号３０）とｈＡＫＢ１－ＡおよびｈＡＫＢ１－Ｂの軽鎖のアミノ酸配列（シグナルペプチドなし：配列番号１５）とから構成される。
配列番号１７のｈＡＫＢ１－Ｂの重鎖のアミノ酸配列（シグナルペプチドあり）は、ｈＡＫＢ１－Ｂ重鎖のシグナルペプチドのアミノ酸配列（配列番号２９）とｈＡＫＢ１－Ｂの重鎖のアミノ酸配列（シグナルペプチドなし：配列番号１４）とから構成される。
配列番号１８のｈＡＫＢ１－ＡおよびｈＡＫＢ１－Ｂの軽鎖のアミノ酸配列（シグナルペプチドあり）は、ｈＡＫＢ１－Ａ、およびｈＡＫＢ１－Ｂ軽鎖のシグナルペプチドのアミノ酸配列（配列番号３０）とｈＡＫＢ１－ＡおよびｈＡＫＢ１－Ｂの軽鎖のアミノ酸配列（シグナルペプチドなし：配列番号１５）とから構成される。
【0079】
ｈＡＫＢ１－ＡおよびｈＡＫＢ１－ＢのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は共通であり、それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６とした。
【0080】
［ｈＴＫＢ１の樹立］
永続的に安定してｈＡＫＢ１－Ｂを効率良く産生し、細胞外に充分に分泌する細胞株を樹立するため、ｈＡＫＢ１－Ｂの重鎖および軽鎖のシグナルペプチド配列を改変した。
ｈＡＫＢ１－Ｂの重鎖、および軽鎖のコーディング領域の塩基配列の上流に、改変型シグナルペプチドをコードする塩基配列を結合させた配列からなる核酸断片を発現ベクターｐＷＸ０６８およびｐＷＸ０６９にそれぞれタンデムに組み込んだ。これをコンピテント大腸菌ＴＯＰ１０（ＴＩＡＮＧＥＮ社製、ＣＢ１０４－２）に導入し、抗体遺伝子を組み込んだ発現ベクターを増幅し回収した。これをＦｓｐＩ（ＮＥＢ社製、Ｒ０１３５Ｌ）で直線化したのち、ＣＨＯ－Ｋ１の染色体に導入した。「安定的に抗体を産生する細胞株の樹立」で前述した方法に準じて、ｈＡＫＢ１－Ｂを高レベルで産生し、高効率で分泌するｐＷＸ０６９の発現ベクターを導入したＣＨＯ－Ｋ１ ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔを選択した。得られた細胞株をＣＨＯ－Ｋ１／ｈＴＫＢ１、この細胞株により産生される抗体をｈＴＫＢ１とした。
永続的に安定してｈＡＫＢ１－Ｂを効率良く産生し、細胞外に充分に分泌する細胞株を樹立するため、ｈＡＫＢ１－Ｂの重鎖および軽鎖のシグナルペプチド配列を改変した。
ｈＡＫＢ１－Ｂの重鎖、および軽鎖のコーディング領域の塩基配列の上流に、改変型シグナルペプチドをコードする塩基配列を結合させた配列からなる核酸断片を発現ベクターｐＷＸ０６８およびｐＷＸ０６９にそれぞれタンデムに組み込んだ。これをコンピテント大腸菌ＴＯＰ１０（ＴＩＡＮＧＥＮ社製、ＣＢ１０４－２）に導入し、抗体遺伝子を組み込んだ発現ベクターを増幅し回収した。これをＦｓｐＩ（ＮＥＢ社製、Ｒ０１３５Ｌ）で直線化したのち、ＣＨＯ－Ｋ１の染色体に導入した。「安定的に抗体を産生する細胞株の樹立」で前述した方法に準じて、ｈＡＫＢ１－Ｂを高レベルで産生し、高効率で分泌するｐＷＸ０６９の発現ベクターを導入したＣＨＯ－Ｋ１ ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔを選択した。得られた細胞株をＣＨＯ－Ｋ１／ｈＴＫＢ１、この細胞株により産生される抗体をｈＴＫＢ１とした。
【0081】
ｈＴＫＢ１の重鎖、および軽鎖のコーディング領域の塩基配列（配列番号２６、配列番号２７）を、それぞれ図１０、図１１に示す。シグナルペプチドは白抜き文字、可変領域は太字で示す。
また、塩基配列からアミノ酸配列を推定し、さらに可変領域を決定し、ａｂＹｓｉｓを用いてＫａｂａｔの方法により、ＣＤＲを決定した。結果を図１２に示す。シグナルペプチドは白抜き文字、可変領域は太字、ＣＤＲは下線で示す。
また、塩基配列からアミノ酸配列を推定し、さらに可変領域を決定し、ａｂＹｓｉｓを用いてＫａｂａｔの方法により、ＣＤＲを決定した。結果を図１２に示す。シグナルペプチドは白抜き文字、可変領域は太字、ＣＤＲは下線で示す。
【0082】
ｈＴＫＢ１の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、シグナルペプチド以外では、ｈＡＫＢ１－Ｂの重鎖および軽鎖のアミノ酸配列とそれぞれ同じであった。すなわち、配列番号２２のアミノ酸配列と配列番号１４のアミノ酸配列、配列番号２３のアミノ酸配列と配列番号１５のアミノ酸配列は同じである。
ｈＴＫＢ１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ｈＡＫＢ１－ＡおよびｈＡＫＢ１－ＢのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３のアミノ酸配列とそれぞれ同じであった。
ｈＴＫＢ１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ｈＡＫＢ１－ＡおよびｈＡＫＢ１－ＢのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３のアミノ酸配列とそれぞれ同じであった。
【0083】
配列番号２４のｈＴＫＢ１の重鎖のアミノ酸配列（シグナルペプチドあり）は、ｈＴＫＢ１の重鎖のシグナルペプチドのアミノ酸配列（配列番号３１）とｈＴＫＢ１の重鎖のアミノ酸配列（シグナルペプチドなし：配列番号２２）とから構成される。
配列番号２５のｈＴＫＢ１の軽鎖のアミノ酸配列（シグナルペプチドあり）は、ｈＴＫＢ１の軽鎖のシグナルペプチドのアミノ酸配列（配列番号３２）とｈＴＫＢ１の軽鎖のアミノ酸配列（シグナルペプチドなし：配列番号２３）とから構成される。
配列番号２５のｈＴＫＢ１の軽鎖のアミノ酸配列（シグナルペプチドあり）は、ｈＴＫＢ１の軽鎖のシグナルペプチドのアミノ酸配列（配列番号３２）とｈＴＫＢ１の軽鎖のアミノ酸配列（シグナルペプチドなし：配列番号２３）とから構成される。
【0084】
［ＩＬＣにおけるＤＮＡＭ－１の発現解析］
（方法）
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、８－１０週齢、雌）の肺は、ＰＢＳで灌流した後、単離し、コラゲナーゼＩＶ（５ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ社製）で３７℃において１時間処理した後、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いてホモジナイズした。
マウスの大腸は、取り出した後、切開し、０．５％ＢＳＡ（Ｗａｋｏ社製）と２ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｊｕｎｓｅｉ社製）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、５％ＢＳＡ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中で３０分間インキュベートして上皮層を除去した。上皮層を除去された大腸組織は、０．５％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳと、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０で２回洗浄し、３～５ｍｍの大きさに切断した。切断された大腸片を、ｌａｍｉｎａ ｐｒｏｐｒｉａ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）とｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いて消化した。消化により得られた細胞標本は７０μｍのナイロンメッシュでろ過し、単細胞の懸濁液を得た。
（方法）
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、８－１０週齢、雌）の肺は、ＰＢＳで灌流した後、単離し、コラゲナーゼＩＶ（５ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ社製）で３７℃において１時間処理した後、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いてホモジナイズした。
マウスの大腸は、取り出した後、切開し、０．５％ＢＳＡ（Ｗａｋｏ社製）と２ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｊｕｎｓｅｉ社製）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、５％ＢＳＡ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中で３０分間インキュベートして上皮層を除去した。上皮層を除去された大腸組織は、０．５％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳと、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０で２回洗浄し、３～５ｍｍの大きさに切断した。切断された大腸片を、ｌａｍｉｎａ ｐｒｏｐｒｉａ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）とｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いて消化した。消化により得られた細胞標本は７０μｍのナイロンメッシュでろ過し、単細胞の懸濁液を得た。
【0085】
肺と腸から分離した細胞は、ＦｃγＲとの結合を避けるために抗ＣＤ１６／３２ｍＡｂ（２．４Ｇ２；トンボ・バイオサイエンス社製）で氷上で１０分間処理した後、ＣＤ４５．２、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３ε、ＮＫ１．１、ＤＸ５、Ｂ２２０、ＣＤ４４、ＣＤ９０．２、Ｓｃａ－１、ＲＯＲγｔに対するモノクローナル抗体と抗マウスＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体（クローンＴＸ４２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）の組み合わせで１０分間インキュベートし、フローサイトメトリーで分析した。抗マウスＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体の代わりに、ラットＩｇＧ２ａ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）を用いたものをＩｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌとした。
自然リンパ球（ＩＬＣ）サブセット１（ＩＬＣ１）は、ＣＤ４５．２+、ＣＤ１１ｂ-、ＣＤ３ε-、ＮＫ１．１+、ＤＸ５-である細胞として、自然リンパ球（ＩＬＣ）サブセット２（ＩＬＣ２）は、ＣＤ４５．２+、ＣＤ１１ｂ-、Ｂ２２０-、ＮＫ１．１-、ＣＤ３ε-、ＣＤ４４+、ＣＤ９０．２+、Ｓｃａ－１+である細胞として、自然リンパ球（ＩＬＣ）サブセット３（ＩＬＣ３）はＣＤ４５．２+、ＣＤ１１ｂ-、Ｂ２２０-、ＮＫ１．１-、ＣＤ３ε-、ＣＤ４４+、ＣＤ９０．２+、ＲＯＲγｔ+、Ｓｃａ－１-である細胞として同定した。
自然リンパ球（ＩＬＣ）サブセット１（ＩＬＣ１）は、ＣＤ４５．２+、ＣＤ１１ｂ-、ＣＤ３ε-、ＮＫ１．１+、ＤＸ５-である細胞として、自然リンパ球（ＩＬＣ）サブセット２（ＩＬＣ２）は、ＣＤ４５．２+、ＣＤ１１ｂ-、Ｂ２２０-、ＮＫ１．１-、ＣＤ３ε-、ＣＤ４４+、ＣＤ９０．２+、Ｓｃａ－１+である細胞として、自然リンパ球（ＩＬＣ）サブセット３（ＩＬＣ３）はＣＤ４５．２+、ＣＤ１１ｂ-、Ｂ２２０-、ＮＫ１．１-、ＣＤ３ε-、ＣＤ４４+、ＣＤ９０．２+、ＲＯＲγｔ+、Ｓｃａ－１-である細胞として同定した。
【0086】
抗体は以下のものを用いた。
抗ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）モノクローナル抗体：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社
抗ＴＣＲβモノクローナル抗体（Ｈ５７－５９７）、抗Ｔｈｙ１．２モノクローナル抗体（５３－２．１）：ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社
ＣＤ４５．２モノクローナル抗体（１０４）、抗ＣＤ４モノクローナル抗体（ＲＭ４－５）、抗ＣＤ８モノクローナル抗体（５３－６．７）、抗ＣＤ１２７モノクローナル抗体（Ａ７Ｒ３４）：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社
抗ＣＤ１１ｃモノクローナル抗体（Ｎ４１８）：Ｔｏｎｂｏ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社
抗ＣＤ３εモノクローナル抗体（１７Ａ２）：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社
抗ＮＫ１．１モノクローナル抗体（Ｓ１７０１６Ｄ）：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社
抗ＤＸ５モノクローナル抗体（ＤＸ５）：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社
抗Ｂ２２０モノクローナル抗体（ＲＡ３－６Ｂ２）：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社
抗ＣＤ４４モノクローナル抗体（３／２３）：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社
抗ＣＤ９０．２モノクローナル抗体（３０－Ｈ１２）：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社
抗Ｓｃａ－１モノクローナル抗体（Ｅ１３－１６１．７）：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社
抗ＲＯＲγｔモノクローナル抗体（ＲＯＲｇ２）：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社
抗ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）モノクローナル抗体：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社
抗ＴＣＲβモノクローナル抗体（Ｈ５７－５９７）、抗Ｔｈｙ１．２モノクローナル抗体（５３－２．１）：ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社
ＣＤ４５．２モノクローナル抗体（１０４）、抗ＣＤ４モノクローナル抗体（ＲＭ４－５）、抗ＣＤ８モノクローナル抗体（５３－６．７）、抗ＣＤ１２７モノクローナル抗体（Ａ７Ｒ３４）：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社
抗ＣＤ１１ｃモノクローナル抗体（Ｎ４１８）：Ｔｏｎｂｏ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社
抗ＣＤ３εモノクローナル抗体（１７Ａ２）：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社
抗ＮＫ１．１モノクローナル抗体（Ｓ１７０１６Ｄ）：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社
抗ＤＸ５モノクローナル抗体（ＤＸ５）：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社
抗Ｂ２２０モノクローナル抗体（ＲＡ３－６Ｂ２）：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社
抗ＣＤ４４モノクローナル抗体（３／２３）：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社
抗ＣＤ９０．２モノクローナル抗体（３０－Ｈ１２）：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社
抗Ｓｃａ－１モノクローナル抗体（Ｅ１３－１６１．７）：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社
抗ＲＯＲγｔモノクローナル抗体（ＲＯＲｇ２）：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社
【0087】
（結果）
結果を図１３Ａおよび図１３Ｂに示す。点線はＩｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ、実線は抗マウスＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体を用いた場合を示す。
図１３Ａおよび図１３Ｂより、ＤＮＡＭ－１は、肺（ｌｕｎｇ）および小腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）のＩＬＣ１、ＩＬＣ２、およびＩＬＣ３に発現していることが明らかになった。
結果を図１３Ａおよび図１３Ｂに示す。点線はＩｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ、実線は抗マウスＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体を用いた場合を示す。
図１３Ａおよび図１３Ｂより、ＤＮＡＭ－１は、肺（ｌｕｎｇ）および小腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）のＩＬＣ１、ＩＬＣ２、およびＩＬＣ３に発現していることが明らかになった。
【0088】
［ＩＬＣにおけるサイトカインの発現量の解析］
（方法）
野生型（ＷＴ）マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）およびＤＮＡＭ－１遺伝子欠損マウス（以下、「ＤＮＡＭ－１ＫＯ」ともいう。）に、生理食塩水に溶解した塩酸ブレオマイシン（ＢＬＭ、日本化薬社製）を６．５ｍｇ／ｋｇの用量で、気管内噴霧器（夏目製作所社製）を用いて１匹あたり５０μＬの容量で単回気管内投与することにより、肺線維症を発症させた。ＢＬＭ投与前後の肺に存在するＩＬＣ（ＣＤ４５．２+、ＣＤ１１ｂ-、ＣＤ１１ｃ-、ＴＣＲβ-、ＣＤ１２７+、Ｔｈｙ１．２+）をＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて選別し、Ｉｓｏｇｅｎ ｒｅａｇｅｎｔ（ニッポンジーン社製）中でホモジナイズした。その後、トータルＲＮＡを単離し、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてｆｉｒｓｔ－ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡを合成した。定量的ＲＴ－ＰＣＲは、ＡＢＩ ７５００ Ｆａｓｔ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムとＡＢＩ Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（いずれもＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて行った。遺伝子の転写産物の相対的な量とコピー数は、Ａｃｔｂの転写産物に対する値として正規化した。
（方法）
野生型（ＷＴ）マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）およびＤＮＡＭ－１遺伝子欠損マウス（以下、「ＤＮＡＭ－１ＫＯ」ともいう。）に、生理食塩水に溶解した塩酸ブレオマイシン（ＢＬＭ、日本化薬社製）を６．５ｍｇ／ｋｇの用量で、気管内噴霧器（夏目製作所社製）を用いて１匹あたり５０μＬの容量で単回気管内投与することにより、肺線維症を発症させた。ＢＬＭ投与前後の肺に存在するＩＬＣ（ＣＤ４５．２+、ＣＤ１１ｂ-、ＣＤ１１ｃ-、ＴＣＲβ-、ＣＤ１２７+、Ｔｈｙ１．２+）をＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて選別し、Ｉｓｏｇｅｎ ｒｅａｇｅｎｔ（ニッポンジーン社製）中でホモジナイズした。その後、トータルＲＮＡを単離し、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてｆｉｒｓｔ－ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡを合成した。定量的ＲＴ－ＰＣＲは、ＡＢＩ ７５００ Ｆａｓｔ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムとＡＢＩ Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（いずれもＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて行った。遺伝子の転写産物の相対的な量とコピー数は、Ａｃｔｂの転写産物に対する値として正規化した。
【0089】
（結果）
結果を図１４に示す。
図１４より、ＢＬＭ投与後３日、５日、および／または１４日後のＤＮＡＭ－１ＫＯのＩＬＣでは、ＩＬ１７ａ、ＩＬ１５、ＩＬ１３のｍＲＮＡの発現がＷＴマウスに比べて低下していた。
これらの結果から、ＩＬＣにおけるサイトカイン産生にはＤＮＡＭ－１が関与していることが明らかになった。
結果を図１４に示す。
図１４より、ＢＬＭ投与後３日、５日、および／または１４日後のＤＮＡＭ－１ＫＯのＩＬＣでは、ＩＬ１７ａ、ＩＬ１５、ＩＬ１３のｍＲＮＡの発現がＷＴマウスに比べて低下していた。
これらの結果から、ＩＬＣにおけるサイトカイン産生にはＤＮＡＭ－１が関与していることが明らかになった。
【0090】
［ヒト末梢血ＩＬＣにおけるＤＮＡＭ－１の発現］
（方法）
健康なボランティアから採血し、ＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐTM（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用い、製造元の指示に従って末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を採取した。ＰＢＭＣは、従来の系統マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ５６、ＦｃεＲＩに対する抗体）、抗ＣＤ１２７抗体、ＣＤ４５抗体、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（ｈＴＫＢ１）で染色した。ＤＮＡＭ－１の発現は、総ＩＬＣ（Ｌｉｎ-、ＣＤ４５+、ＣＤ１２７+）としてゲートされた細胞上でフローサイトメトリーにより分析した。ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（ｈＴＫＢ１）の代わりに、ヒトＩｇＧ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）を用いたものをＩｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌとした。
（方法）
健康なボランティアから採血し、ＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐTM（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用い、製造元の指示に従って末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を採取した。ＰＢＭＣは、従来の系統マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ５６、ＦｃεＲＩに対する抗体）、抗ＣＤ１２７抗体、ＣＤ４５抗体、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（ｈＴＫＢ１）で染色した。ＤＮＡＭ－１の発現は、総ＩＬＣ（Ｌｉｎ-、ＣＤ４５+、ＣＤ１２７+）としてゲートされた細胞上でフローサイトメトリーにより分析した。ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（ｈＴＫＢ１）の代わりに、ヒトＩｇＧ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）を用いたものをＩｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌとした。
【0091】
（結果）
結果を図１５に示す。点線はＩｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ、実線はヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（ｈＴＫＢ１）を用いた場合を示す。
図１５より、ＤＮＡＭ－１は、ヒトＰＢＭＣのＩＬＣに発現していることが明らかになった。また、ｈＴＫＢ１は、ＩＬＣ上のＤＮＡＭ－１を検出できることが確認された。
結果を図１５に示す。点線はＩｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ、実線はヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体（ｈＴＫＢ１）を用いた場合を示す。
図１５より、ＤＮＡＭ－１は、ヒトＰＢＭＣのＩＬＣに発現していることが明らかになった。また、ｈＴＫＢ１は、ＩＬＣ上のＤＮＡＭ－１を検出できることが確認された。
【0092】
［抗ＤＮＡＭ－１ヒト化抗体によるＩＬＣからのＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αの産生抑制］
（方法）
健康なボランティアから採血し、ＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐTM（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用い、製造元の指示に従って末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を採取した。ＭＡＣｓ ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製）を用いて、ＰＢＭＣから、ＣＤ４+Ｔ細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞、およびＣＤ５６+ＮＫ細胞を除去した。このＴ／ＮＫ細胞を除去したＰＢＭＣ２～３×１０6個を、ヒトＩＬ－２（５ｎｇ／ｍＬ）、ヒトＩＬ－１２（１０ｎｇ／ｍＬ）、およびヒトＩＬ－１５（５０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で、１０μｇ／ｍＬのマウスＩｇＧ１、ｈＡＫＢ１－Ａ、ｈＡＫＢ１－Ｂ、またはｈＴＫＢ１とともに３６時間培養した。その後、細胞を系統マーカー（Ｌｉｎ：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＦｃεＲＩ）に対する抗体、抗ＣＤ１２７抗体、および抗ＣＤ４５抗体で染色した。ＩＬＣ（Ｌｉｎ-、ＣＤ１２７+、ＣＤ４５+細胞）は、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて選別した。選別されたＩＬＣから、メーカーのプロトコール（ニッポンジーン社製）に従い、Ｉｓｏｇｅｎ試薬を用いてトータルＲＮＡを単離した。逆転写には，Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ－Ｔｒａｎｓｌｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。Ｉｆｎｇの定量的ＰＣＲ解析は、ＡＢＩ７５００ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、および下に示すプライマーを用いて行った。データを正規化するために、内部標準としてＧａｐｄｈの発現レベルを測定した。
（方法）
健康なボランティアから採血し、ＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐTM（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用い、製造元の指示に従って末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を採取した。ＭＡＣｓ ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製）を用いて、ＰＢＭＣから、ＣＤ４+Ｔ細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞、およびＣＤ５６+ＮＫ細胞を除去した。このＴ／ＮＫ細胞を除去したＰＢＭＣ２～３×１０6個を、ヒトＩＬ－２（５ｎｇ／ｍＬ）、ヒトＩＬ－１２（１０ｎｇ／ｍＬ）、およびヒトＩＬ－１５（５０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で、１０μｇ／ｍＬのマウスＩｇＧ１、ｈＡＫＢ１－Ａ、ｈＡＫＢ１－Ｂ、またはｈＴＫＢ１とともに３６時間培養した。その後、細胞を系統マーカー（Ｌｉｎ：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＦｃεＲＩ）に対する抗体、抗ＣＤ１２７抗体、および抗ＣＤ４５抗体で染色した。ＩＬＣ（Ｌｉｎ-、ＣＤ１２７+、ＣＤ４５+細胞）は、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて選別した。選別されたＩＬＣから、メーカーのプロトコール（ニッポンジーン社製）に従い、Ｉｓｏｇｅｎ試薬を用いてトータルＲＮＡを単離した。逆転写には，Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ－Ｔｒａｎｓｌｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。Ｉｆｎｇの定量的ＰＣＲ解析は、ＡＢＩ７５００ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、および下に示すプライマーを用いて行った。データを正規化するために、内部標準としてＧａｐｄｈの発現レベルを測定した。
【0093】
Gapdh forward;5'-CTT CAC CAC CAT GGA GAA GGC-3'（配列番号３３）
Gapdh reverse；5'-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG-3'（配列番号３４）
Ifng forward；5'-ACC AGA GCA TCC AAA AGA GTG T-3'（配列番号３５）
Ifng reverse；5'-TTA GCT GCT GGC GAC AGT TC-3'（配列番号３６）
Tnfa forward；5'-CAG CCT CTT CTC CTT CCT GAT-3'（配列番号３７）
Tnfa reverse；5'-GCC AGA GGG CTG ATT AGA GA-3'（配列番号３８）
Gapdh reverse；5'-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG-3'（配列番号３４）
Ifng forward；5'-ACC AGA GCA TCC AAA AGA GTG T-3'（配列番号３５）
Ifng reverse；5'-TTA GCT GCT GGC GAC AGT TC-3'（配列番号３６）
Tnfa forward；5'-CAG CCT CTT CTC CTT CCT GAT-3'（配列番号３７）
Tnfa reverse；5'-GCC AGA GGG CTG ATT AGA GA-3'（配列番号３８）
【0094】
（結果）
結果を図１６に示す。
マウスモノクローナル抗体であるｍＡＫＢ１はＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αのｍＲＮＡの発現に影響を与えなかったが、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体である、ｈＡＫＢ１－Ａ、ｈＡＫＢ１－Ｂ、およびｈＴＫＢ１は、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αのｍＲＮＡの発現を抑制した（図１６）。
結果を図１６に示す。
マウスモノクローナル抗体であるｍＡＫＢ１はＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αのｍＲＮＡの発現に影響を与えなかったが、ヒト化抗ＤＮＡＭ－１抗体である、ｈＡＫＢ１－Ａ、ｈＡＫＢ１－Ｂ、およびｈＴＫＢ１は、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αのｍＲＮＡの発現を抑制した（図１６）。
【0095】
配列番号１：ｈＴＫＢ１、ｈＡＫＢ１－ＡおよびｈＡＫＢ１－ＢのＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２：ｈＴＫＢ１、ｈＡＫＢ１－ＡおよびｈＡＫＢ１－ＢのＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号３：ｈＴＫＢ１、ｈＡＫＢ１－ＡおよびｈＡＫＢ１－ＢのＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号４：ｈＴＫＢ１、ｈＡＫＢ１－ＡおよびｈＡＫＢ１－ＢのＬＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号５：ｈＴＫＢ１、ｈＡＫＢ１－ＡおよびｈＡＫＢ１－ＢのＬＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号６：ｈＴＫＢ１、ｈＡＫＢ１－ＡおよびｈＡＫＢ１－ＢのＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号７：ｍＡＫＢ１の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号８：ｍＡＫＢ１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号９：ｈＡＫＢ１のＶＨ１の可変領域のアミノ酸配列
配列番号１０：ｈＡＫＢ１のＶＨ２の可変領域のアミノ酸配列
配列番号１１：ｈＡＫＢ１のＶＬ１の可変領域のアミノ酸配列
配列番号１２：ｈＡＫＢ１のＶＬ２の可変領域のアミノ酸配列
配列番号１３：ｈＡＫＢ１－Ａの重鎖のアミノ酸配列（シグナルペプチドなし）
配列番号１４：ｈＡＫＢ１－Ｂの重鎖のアミノ酸配列（シグナルペプチドなし）
配列番号１５：ｈＡＫＢ１－ＡおよびｈＡＫＢ１－Ｂの軽鎖のアミノ酸配列（シグナルペプチドなし）
配列番号１６：ｈＡＫＢ１－Ａの重鎖のアミノ酸配列（シグナルペプチドあり）
配列番号１７：ｈＡＫＢ１－Ｂの重鎖のアミノ酸配列（シグナルペプチドあり）
配列番号１８：ｈＡＫＢ１－ＡおよびｈＡＫＢ１－Ｂの軽鎖のアミノ酸配列（シグナルペプチドあり）
配列番号１９：ｈＡＫＢ１－Ａの重鎖コーディング領域の塩基配列
配列番号２０：ｈＡＫＢ１－Ｂの重鎖コーディング領域の塩基配列
配列番号２１：ｈＡＫＢ１－ＡおよびｈＡＫＢ１－Ｂの軽鎖コーディング領域の塩基配列
配列番号２２：ｈＴＫＢ１の重鎖のアミノ酸配列（シグナルペプチドなし）
配列番号２３：ｈＴＫＢ１の軽鎖のアミノ酸配列（シグナルペプチドなし）
配列番号２４：ｈＴＫＢ１の重鎖のアミノ酸配列（シグナルペプチドあり）
配列番号２５：ｈＴＫＢ１の軽鎖のアミノ酸配列（シグナルペプチドあり）
配列番号２６：ｈＴＫＢ１の重鎖コーディング領域の塩基配列
配列番号２７：ｈＴＫＢ１の軽鎖コーディング領域の塩基配列
配列番号２８：ｈＡＫＢ１－Ａ重鎖のシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号２９：ｈＡＫＢ１－Ｂ重鎖のシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号３０：ｈＡＫＢ１－Ａ、およびｈＡＫＢ１－Ｂ軽鎖のシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号３１：ｈＴＫＢ１の重鎖のシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号３２：ｈＴＫＢ１の軽鎖のシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号３３：Ｇａｐｄｈフォワードプライマーの塩基配列
配列番号３４：Ｇａｐｄｈリバースプライマーの塩基配列
配列番号３５：Ｉｆｎｇフォワードプライマーの塩基配列
配列番号３６：Ｉｆｎｇリバースプライマーの塩基配列
配列番号３７：Ｔｎｆａフォワードプライマーの塩基配列
配列番号３８：Ｔｎｆａリバースプライマーの塩基配列
配列番号２：ｈＴＫＢ１、ｈＡＫＢ１－ＡおよびｈＡＫＢ１－ＢのＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号３：ｈＴＫＢ１、ｈＡＫＢ１－ＡおよびｈＡＫＢ１－ＢのＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号４：ｈＴＫＢ１、ｈＡＫＢ１－ＡおよびｈＡＫＢ１－ＢのＬＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号５：ｈＴＫＢ１、ｈＡＫＢ１－ＡおよびｈＡＫＢ１－ＢのＬＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号６：ｈＴＫＢ１、ｈＡＫＢ１－ＡおよびｈＡＫＢ１－ＢのＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号７：ｍＡＫＢ１の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号８：ｍＡＫＢ１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号９：ｈＡＫＢ１のＶＨ１の可変領域のアミノ酸配列
配列番号１０：ｈＡＫＢ１のＶＨ２の可変領域のアミノ酸配列
配列番号１１：ｈＡＫＢ１のＶＬ１の可変領域のアミノ酸配列
配列番号１２：ｈＡＫＢ１のＶＬ２の可変領域のアミノ酸配列
配列番号１３：ｈＡＫＢ１－Ａの重鎖のアミノ酸配列（シグナルペプチドなし）
配列番号１４：ｈＡＫＢ１－Ｂの重鎖のアミノ酸配列（シグナルペプチドなし）
配列番号１５：ｈＡＫＢ１－ＡおよびｈＡＫＢ１－Ｂの軽鎖のアミノ酸配列（シグナルペプチドなし）
配列番号１６：ｈＡＫＢ１－Ａの重鎖のアミノ酸配列（シグナルペプチドあり）
配列番号１７：ｈＡＫＢ１－Ｂの重鎖のアミノ酸配列（シグナルペプチドあり）
配列番号１８：ｈＡＫＢ１－ＡおよびｈＡＫＢ１－Ｂの軽鎖のアミノ酸配列（シグナルペプチドあり）
配列番号１９：ｈＡＫＢ１－Ａの重鎖コーディング領域の塩基配列
配列番号２０：ｈＡＫＢ１－Ｂの重鎖コーディング領域の塩基配列
配列番号２１：ｈＡＫＢ１－ＡおよびｈＡＫＢ１－Ｂの軽鎖コーディング領域の塩基配列
配列番号２２：ｈＴＫＢ１の重鎖のアミノ酸配列（シグナルペプチドなし）
配列番号２３：ｈＴＫＢ１の軽鎖のアミノ酸配列（シグナルペプチドなし）
配列番号２４：ｈＴＫＢ１の重鎖のアミノ酸配列（シグナルペプチドあり）
配列番号２５：ｈＴＫＢ１の軽鎖のアミノ酸配列（シグナルペプチドあり）
配列番号２６：ｈＴＫＢ１の重鎖コーディング領域の塩基配列
配列番号２７：ｈＴＫＢ１の軽鎖コーディング領域の塩基配列
配列番号２８：ｈＡＫＢ１－Ａ重鎖のシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号２９：ｈＡＫＢ１－Ｂ重鎖のシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号３０：ｈＡＫＢ１－Ａ、およびｈＡＫＢ１－Ｂ軽鎖のシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号３１：ｈＴＫＢ１の重鎖のシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号３２：ｈＴＫＢ１の軽鎖のシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号３３：Ｇａｐｄｈフォワードプライマーの塩基配列
配列番号３４：Ｇａｐｄｈリバースプライマーの塩基配列
配列番号３５：Ｉｆｎｇフォワードプライマーの塩基配列
配列番号３６：Ｉｆｎｇリバースプライマーの塩基配列
配列番号３７：Ｔｎｆａフォワードプライマーの塩基配列
配列番号３８：Ｔｎｆａリバースプライマーの塩基配列
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図14】
【図15】
【図16】
【配列表】