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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-06-03
(45)【発行日】2025-06-11
(54)【発明の名称】発酵漬物の製造方法
(51)【国際特許分類】
A23B 7/10 20060101AFI20250604BHJP
A23B 7/155 20060101ALI20250604BHJP
【ＦＩ】
A23B7/10 A
A23B7/10 B
A23B7/155
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2021025599
(22)【出願日】2021-02-19
(65)【公開番号】P2022127441
(43)【公開日】2022-08-31
【審査請求日】2023-11-21
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】501203344
【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
(74)【代理人】
【識別番号】110002147
【氏名又は名称】弁理士法人酒井国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】冨田 理
【審査官】田辺 義拓
(56)【参考文献】
【文献】特開２００９－０５０２０８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開昭５９－１０２３５０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０２０－００５５０１（ＪＰ，Ａ）
【文献】無塩の伝統的発酵漬物「すんき」の乳酸菌叢と成分組成の包括的解析，農研機構，2019年，https://www.naro.go.jp/project/results/4th_laboratory/nfri/2019/nfri19_s06.html
【文献】Satoru Tomita et.al，NMR- and GC/MS-based metabolomic characterization of sunki, an unsalted fermented pickle of turnip leaves，Food Chemistry，2018年，258，p25-34
【文献】Satoru Tomita et.al，Characterisation of the bacterial community structures of sunki, a traditional unsalted pickle of fermented turnip leaves，Journal of Bioscience and Bioengineering，2020年，Vol.129, No.5，p541-551
【文献】板橋雅子 et.al，各種有機酸を添加したすんき漬，日本食品工業学会誌，1987年，第34巻, 第7号，p439-442
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ２３Ｂ ７／１０
Ａ２３Ｂ ７／１５５
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
野菜原料に乳酸菌を添加して、発酵温度３０～４５℃、塩化ナトリウム添加量２％（２／ｖ）未満の条件で到達ｐＨが４．５以下となるまで発酵させ、コハク酸含有量及びイソチオシアネート含有量の少なくともいずれかが野菜原料よりも多い発酵漬物を得る、発酵漬物の製造方法であって、野菜原料がキャベツであり、
乳酸菌が、
ラクトバチルス・ディオリボランス、ラクトバチルス・パラファラギニス、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ブフネリ、ラクトバチルス・パラケフィリ、ラクトバチルス・クリスパタス、ラクトバチルス・オタキエンシス、及びラクトバチルス・キソネンシスから選ばれる少なくとも１つであるか、又は、
ラクトバチルス・デルブリュッキーと、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ディオリボランス、ラクトバチルス・パラファラギニス、ラクトバチルス・ブフネリ、及びラクトバチルス・パラケフィリとの組み合わせからなる群より選ばれる少なくとも１つの組み合わせである、
方法。
【請求項2】
野菜原料に乳酸菌を添加して、発酵温度３０～４５℃、塩化ナトリウム添加量２％（２／ｖ）未満の条件で到達ｐＨが４．５以下となるまで発酵させ、コハク酸含有量及びイソチオシアネート含有量の少なくともいずれかが野菜原料よりも多い発酵漬物を得る、発酵漬物の製造方法であって、野菜原料が白菜であり、
乳酸菌が、
ラクトバチルス・デルブリュッキー、ラクトバチルス・ディオリボランス、ラクトバチルス・パラファラギニス、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ブフネリ、ラクトバチルス・パラケフィリ、ラクトバチルス・オタキエンシス、及びラクトバチルス・キソネンシスから選ばれる少なくとも１つであるか、又は、
ラクトバチルス・デルブリュッキーと、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ディオリボランス、ラクトバチルス・パラファラギニス、ラクトバチルス・ブフネリ、ラクトバチルス・パラケフィリ、ラクトバチルス・クリスパタス、及びラクトバチルス・ガセリとの組み合わせから選ばれる少なくとも１つの組み合わせである、
方法。
【請求項3】
野菜原料に乳酸菌を添加して、発酵温度３０～４５℃、塩化ナトリウム添加量２％（２／ｖ）未満の条件で到達ｐＨが４．５以下となるまで発酵させ、コハク酸含有量及びイソチオシアネート含有量の少なくともいずれかが野菜原料よりも多い発酵漬物を得る、発酵漬物の製造方法であって、野菜原料がキュウリであり、
乳酸菌が、
ラクトバチルス・デルブリュッキー、ラクトバチルス・ディオリボランス、ラクトバチルス・パラファラギニス、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ブフネリ、ラクトバチルス・パラケフィリ、及びラクトバチルス・オタキエンシスから選ばれる少なくとも１つであるか、又は、
ラクトバチルス・デルブリュッキーと、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ディオリボランス、ラクトバチルス・パラファラギニス、ラクトバチルス・ブフネリ、ラクトバチルス・パラケフィリ、ラクトバチルス・クリスパタス、及びラクトバチルス・ガセリとの組み合わせから選ばれる少なくとも１つの組み合わせである、
方法。
【請求項4】
野菜原料に第１の乳酸菌を添加して発酵させた後、第２の乳酸菌を添加して、発酵温度３０～４５℃、塩化ナトリウム添加量２％（ｗ／ｖ）未満の条件で到達ｐＨが４．３以下となるまで発酵させ、コハク酸含有量及びイソチオシアネート含有量の少なくともいずれかが野菜原料よりも多い発酵漬物を得る、発酵漬物の製造方法であって、野菜原料がカブ、キャベツ、白菜又はキュウリであり、
第１の乳酸菌が、ラクトバチルス・デルブリュッキーであり、
第２の乳酸菌が、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ディオリボランス、ラクトバチルス・パラファラギニス、ラクトバチルス・ブフネリ、及びラクトバチルス・パラケフィリから選ばれる少なくとも１つである、
方法。
【請求項5】
第１の乳酸菌が、ラクトバチルス・デルブリュッキーであり、第２の乳酸菌が、ラクトバチルス・ファーメンタム及び／又はラクトバチルス・プランタラムである、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、発酵漬物の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
発酵食品は伝統食品としての価値や健康増進への期待が高まっており、野菜類の発酵食品として漬物が広く認知されている。漬物製品の大部分を占めているのは、無発酵の浅漬である。しかし、各地域の発酵漬物は、伝統食品として現在も高い知名度を保っている。さらに、２０１９年には全日本漬物協同組合連合会によって「発酵漬物認定制度」が開始されている。このような業界の動向から、浅漬けから発酵漬物へと回帰する機運が高まり、今後の需要が伸びると期待される。ただし、漬物は塩分摂取過多の原因となるというネガティブイメージが根深く、将来的な漬物需要のためにもこれを払拭する必要がある。これらのことから、発酵漬物の中でも無塩（極低塩）の漬物に潜在的需要があるのではないかと考えた。
【0003】
国内で商業的に生産されている無塩発酵漬物は、赤カブの葉を用いて作られる木曽地域伝統の「すんき」が唯一のものである。すんきには、様々な乳酸菌が生息する。特許文献１には、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・デルブリュッキー、及びラクトバチルス・パラブフネリを含むスターター乳酸菌が、良好な品質を有するすんきを安定して製造することが可能であることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】特許第５２７６２９０号公報
【非特許文献】
【0005】
【文献】日本の地域伝統的発酵食品 木曽の伝統発酵野菜「すんき」とおいしさの秘密 Ｆｏｏｄｓ & Ｆｏｏｄ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｊａｐａｎ Ｖｏｌ．２２３ Ｎｏ．２ Ｐａｇｅ．１０２－１１０（２０１８．０５．０１）
【文献】すんき発酵乳酸菌の特性解明への取り組み 日本乳酸菌学会誌 Ｖｏｌ．２８ Ｎｏ．２ Ｐａｇｅ １２８（２０１７．０６．２７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
しかしながら、無塩及び極低塩の発酵漬物に生息する乳酸菌、成分組成、風味等品質との関係についてはこれまで知られていない。
【0007】
本発明の目的は、発酵漬物の発酵条件、成分組成、風味等品質との関係を明らかにし、良風味で安定生産可能な発酵漬物の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明は、以下を提供する。
〔１〕野菜原料に乳酸菌を添加して、到達ｐＨが４．５以下となるまで発酵させ、コハク酸含有量及びイソチオシアネート含有量の少なくともいずれかが野菜原料よりも多い発酵漬物を得る、発酵漬物の製造方法。
〔２〕乳酸菌が、ラクトバチルス属乳酸菌である、〔１〕に記載の方法。
〔３〕乳酸菌が、ラクトバチルス・デルブリュッキー、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ディオリボランス、ラクトバチルス・パラファラギニス、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ブフネリ、ラクトバチルス・パラケフィリ、ラクトバチルス・クリスパタス、ラクトバチルス・ガセリ及びラクトバチルス・ロイテリから選ばれる少なくとも１つである、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕乳酸菌が、ラクトバチルス・デルブリュッキーと、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ディオリボランス、ラクトバチルス・パラファラギニス、ラクトバチルス・ブフネリ、ラクトバチルス・パラケフィリ、ラクトバチルス・クリスパタス、及びラクトバチルス・ガセリから選ばれる少なくとも１つとの組み合わせである、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔５〕野菜原料に第１の乳酸菌を添加して発酵させた後、第２の乳酸菌を添加して、到達ｐＨが４．３以下となるまで発酵させる、〔１〕～〔４〕のいずれか１項に記載の方法。
〔６〕第１の乳酸菌が、ラクトバチルス・デルブリュッキーであり、第２の乳酸菌が、ラクトバチルス・ファーメンタム及びラクトバチルス・プランタラムである、〔５〕に記載の方法。
〔７〕発酵を、３０～４５℃の温度条件で行う、〔１〕～〔６〕のいずれか１項に記載の方法。
〔８〕発酵の際、塩化ナトリウムを発酵培地に対し２％（ｗ／ｖ）未満添加する、〔１〕～〔７〕のいずれか１項に記載の方法。
〔９〕発酵の際、リンゴ酸又はその塩を添加する、〔１〕～〔８〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１０〕野菜原料が、カブ、キャベツ、白菜、及びキュウリから選ばれる少なくとも１種である、〔１〕～〔９〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１〕野菜原料に乳酸菌を添加して、到達ｐＨが４．５以下となるまで発酵させ、コハク酸含有量及びイソチオシアネート含有量の少なくともいずれかが野菜原料よりも多い発酵漬物を得る、発酵漬物の製造方法。
〔２〕乳酸菌が、ラクトバチルス属乳酸菌である、〔１〕に記載の方法。
〔３〕乳酸菌が、ラクトバチルス・デルブリュッキー、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ディオリボランス、ラクトバチルス・パラファラギニス、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ブフネリ、ラクトバチルス・パラケフィリ、ラクトバチルス・クリスパタス、ラクトバチルス・ガセリ及びラクトバチルス・ロイテリから選ばれる少なくとも１つである、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕乳酸菌が、ラクトバチルス・デルブリュッキーと、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ディオリボランス、ラクトバチルス・パラファラギニス、ラクトバチルス・ブフネリ、ラクトバチルス・パラケフィリ、ラクトバチルス・クリスパタス、及びラクトバチルス・ガセリから選ばれる少なくとも１つとの組み合わせである、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔５〕野菜原料に第１の乳酸菌を添加して発酵させた後、第２の乳酸菌を添加して、到達ｐＨが４．３以下となるまで発酵させる、〔１〕～〔４〕のいずれか１項に記載の方法。
〔６〕第１の乳酸菌が、ラクトバチルス・デルブリュッキーであり、第２の乳酸菌が、ラクトバチルス・ファーメンタム及びラクトバチルス・プランタラムである、〔５〕に記載の方法。
〔７〕発酵を、３０～４５℃の温度条件で行う、〔１〕～〔６〕のいずれか１項に記載の方法。
〔８〕発酵の際、塩化ナトリウムを発酵培地に対し２％（ｗ／ｖ）未満添加する、〔１〕～〔７〕のいずれか１項に記載の方法。
〔９〕発酵の際、リンゴ酸又はその塩を添加する、〔１〕～〔８〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１０〕野菜原料が、カブ、キャベツ、白菜、及びキュウリから選ばれる少なくとも１種である、〔１〕～〔９〕のいずれか１項に記載の方法。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、良風味で安定生産可能な発酵漬物の製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【発明を実施するための形態】
【0011】
［発酵漬物の製造方法］
本発明においては、野菜原料に乳酸菌を添加して発酵させて発酵漬物を製造する。
本発明においては、野菜原料に乳酸菌を添加して発酵させて発酵漬物を製造する。
【0012】
－野菜原料－
本明細書において野菜原料とは、野菜を少なくとも１種含む原料である。野菜としては、カブ（例えば、白カブ、赤カブ（例えば、王滝カブ、開田カブ）、キャベツ、白菜、キュウリが挙げられる。野菜原料は、必要に応じて（例えば、過発酵の防止、調味等の目的のため）、調味料、保存料等の他の添加物を含んでもよい。
本明細書において野菜原料とは、野菜を少なくとも１種含む原料である。野菜としては、カブ（例えば、白カブ、赤カブ（例えば、王滝カブ、開田カブ）、キャベツ、白菜、キュウリが挙げられる。野菜原料は、必要に応じて（例えば、過発酵の防止、調味等の目的のため）、調味料、保存料等の他の添加物を含んでもよい。
【0013】
－乳酸菌－
本発明においては、野菜原料に乳酸菌をスターターとして添加（接種）することにより、野菜原料を発酵させる。乳酸菌としては、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ（ラクトバチルス）属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ（ラクトコッカス）属、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ（ロイコノストック）属、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ（ペディオコッカス）属の乳酸菌が挙げられ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属乳酸菌が好ましい。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属乳酸菌としては、例えば、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌ．ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ、Ｌ．ｐａｒａｆａｒｒａｇｉｎｉｓ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｌ．ｖｉｌｉｄｅｓｃｅｎｓ、Ｌ．ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ、Ｌ．ｓａｋｅｉ、Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ、Ｌ．ｃａｓｅｉ、Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｌ．ｐａｒａｋｅｆｉｒｉ、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｌ．ｒｏｓｓｉａｅ、Ｌ．ｏｔａｋｉｅｎｓｉｓ、Ｌ．ｋｉｓｏｎｅｎｓｉｓ、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓが挙げられ、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌ．ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ、Ｌ．ｐａｒａｆａｒｒａｇｉｎｉｓ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｌ．ｐａｒａｋｅｆｉｒｉ、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉが好ましい。Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属乳酸菌としては、例えば、Ｐ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉが挙げられる。
本発明においては、野菜原料に乳酸菌をスターターとして添加（接種）することにより、野菜原料を発酵させる。乳酸菌としては、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ（ラクトバチルス）属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ（ラクトコッカス）属、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ（ロイコノストック）属、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ（ペディオコッカス）属の乳酸菌が挙げられ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属乳酸菌が好ましい。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属乳酸菌としては、例えば、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌ．ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ、Ｌ．ｐａｒａｆａｒｒａｇｉｎｉｓ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｌ．ｖｉｌｉｄｅｓｃｅｎｓ、Ｌ．ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ、Ｌ．ｓａｋｅｉ、Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ、Ｌ．ｃａｓｅｉ、Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｌ．ｐａｒａｋｅｆｉｒｉ、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｌ．ｒｏｓｓｉａｅ、Ｌ．ｏｔａｋｉｅｎｓｉｓ、Ｌ．ｋｉｓｏｎｅｎｓｉｓ、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓが挙げられ、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌ．ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ、Ｌ．ｐａｒａｆａｒｒａｇｉｎｉｓ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｌ．ｐａｒａｋｅｆｉｒｉ、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉが好ましい。Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属乳酸菌としては、例えば、Ｐ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉが挙げられる。
【0014】
乳酸菌は１種単独で用いても、２種以上の組み合わせを用いてもよい。１種単独の場合、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌ．ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ、及びＬ．ｐａｒａｆａｒｒａｇｉｎｉｓ、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉが好ましく、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌ．ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓがより好ましい。２種以上の場合、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉを少なくとも含む組み合わせが好ましく、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉと、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌ．ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ、Ｌ．ｐａｒａｆａｒｒａｇｉｎｉｓ、Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｌ．ｐａｒａｋｅｆｉｒｉ、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉから選ばれる少なくとも１つとの組み合わせがより好ましく、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉと、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ及びＬ．ｐａｒａｆａｒｒａｇｉｎｉｓから選ばれる少なくとも１つとの組み合わせがさらに好ましい。
【0015】
－到達ｐＨ－
発酵終了時のｐＨ（到達ｐＨ）は、初発ｐＨ（通常、弱酸性、すなわち５．０～６．０）よりも低いｐＨであればよく、好ましくは４．５以下、より好ましくは４．４以下、更に好ましくは４．３以下である。到達ｐＨの調整は、用いる乳酸菌の種類、量、温度、塩濃度等の発酵条件により行えばよい。到達ｐＨの下限は、通常３．３以上、好ましくは３．４以上であるが、特に限定されない。
発酵終了時のｐＨ（到達ｐＨ）は、初発ｐＨ（通常、弱酸性、すなわち５．０～６．０）よりも低いｐＨであればよく、好ましくは４．５以下、より好ましくは４．４以下、更に好ましくは４．３以下である。到達ｐＨの調整は、用いる乳酸菌の種類、量、温度、塩濃度等の発酵条件により行えばよい。到達ｐＨの下限は、通常３．３以上、好ましくは３．４以上であるが、特に限定されない。
【0016】
－発酵温度－
発酵温度は、３０～４５℃が好ましく、３０～４０℃がより好ましい。これにより、到達ｐＨを好ましい数値へ低下させることができる。
発酵温度は、３０～４５℃が好ましく、３０～４０℃がより好ましい。これにより、到達ｐＨを好ましい数値へ低下させることができる。
【0017】
－多段発酵－
２種以上の乳酸菌を用いる場合、各乳酸菌を同時に添加して発酵を行ってもよいし、あるいは、順次添加して発酵を行う、いわゆる多段発酵を行ってもよい。例えば、野菜原料に第１の乳酸菌を添加して発酵させた後、他の乳酸菌を添加して発酵を行う操作を繰り返し、最後の乳酸菌を添加して発酵を行って到達ｐＨが４．３以下となるまで発酵させることができる。多段発酵は、２段発酵が好ましく、第１の乳酸菌としてのＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉを用いる第１の発酵の後、第２の乳酸菌としてＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ及びＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍを用いる第２の発酵を行うことがより好ましい。多段発酵における各乳酸菌を用いる発酵の条件は、それぞれ独立して定めることができる。
２種以上の乳酸菌を用いる場合、各乳酸菌を同時に添加して発酵を行ってもよいし、あるいは、順次添加して発酵を行う、いわゆる多段発酵を行ってもよい。例えば、野菜原料に第１の乳酸菌を添加して発酵させた後、他の乳酸菌を添加して発酵を行う操作を繰り返し、最後の乳酸菌を添加して発酵を行って到達ｐＨが４．３以下となるまで発酵させることができる。多段発酵は、２段発酵が好ましく、第１の乳酸菌としてのＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉを用いる第１の発酵の後、第２の乳酸菌としてＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ及びＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍを用いる第２の発酵を行うことがより好ましい。多段発酵における各乳酸菌を用いる発酵の条件は、それぞれ独立して定めることができる。
【0018】
－塩分濃度－
発酵にあたっては、塩化ナトリウムを添加してもよく、その添加量は培地に対し２％（ｗ／ｖ）未満が好ましく、好ましくは１．５％（ｗ／ｖ）以下がより好ましい。これにより、塩分摂取過多の原因となるというネガティブイメージを払拭でき、健康に配慮しながら風味を向上させた、極低塩発酵漬物を得ることができる。塩化ナトリウムの添加時期は、発酵の途中であればよいが、発酵開始時（多段発酵の場合、第１の発酵の開始時）が好ましい。
発酵にあたっては、塩化ナトリウムを添加してもよく、その添加量は培地に対し２％（ｗ／ｖ）未満が好ましく、好ましくは１．５％（ｗ／ｖ）以下がより好ましい。これにより、塩分摂取過多の原因となるというネガティブイメージを払拭でき、健康に配慮しながら風味を向上させた、極低塩発酵漬物を得ることができる。塩化ナトリウムの添加時期は、発酵の途中であればよいが、発酵開始時（多段発酵の場合、第１の発酵の開始時）が好ましい。
【0019】
－リンゴ酸－
発酵にあたっては、リンゴ酸又はその塩を添加してもよい。これにより、コハク酸をより多量に含む発酵漬物を得ることができる。リンゴ酸の添加量は、培地に対し通常は５０ｍＭ以上、好ましくは７０ｍＭ以上、より好ましくは９０ｍＭ以上である。リンゴ酸又はその塩の添加時期は、発酵の途中であればよいが、発酵開始時（多段発酵の場合、第１の発酵の開始時）が好ましい。
発酵にあたっては、リンゴ酸又はその塩を添加してもよい。これにより、コハク酸をより多量に含む発酵漬物を得ることができる。リンゴ酸の添加量は、培地に対し通常は５０ｍＭ以上、好ましくは７０ｍＭ以上、より好ましくは９０ｍＭ以上である。リンゴ酸又はその塩の添加時期は、発酵の途中であればよいが、発酵開始時（多段発酵の場合、第１の発酵の開始時）が好ましい。
【0020】
－他の発酵条件－
上記以外の他の発酵条件は、特に限定されないが、一例を挙げると以下のとおりである。乳酸菌の接種量は、通常は、１．０×１０5～１．０×１０10ｃｆｕ／ｍＬ、好ましくは５．０×１０5～５．０×１０9ｃｆｕ／ｍＬ、より好ましくは１．０×１０6～１．０×１０9ｃｆｕ／ｍＬである。接種量は、前培養等、常法に従って調整できる。発酵時間は、通常は、１２時間以上、好ましくは２０時間以上、より好ましくは２４時間以上である。上限は、特に限定されないが、５日程度であれば十分であり、通常は３日以内であり、衛生面からは短期間がよい。また、乳酸菌としてＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ等の酸素感受性の乳酸菌を用いる場合には、発酵を嫌気条件で行うことが好ましい。発酵の際には、培地を静置して行ってもよいし、必要に応じて撹拌してもよい。
上記以外の他の発酵条件は、特に限定されないが、一例を挙げると以下のとおりである。乳酸菌の接種量は、通常は、１．０×１０5～１．０×１０10ｃｆｕ／ｍＬ、好ましくは５．０×１０5～５．０×１０9ｃｆｕ／ｍＬ、より好ましくは１．０×１０6～１．０×１０9ｃｆｕ／ｍＬである。接種量は、前培養等、常法に従って調整できる。発酵時間は、通常は、１２時間以上、好ましくは２０時間以上、より好ましくは２４時間以上である。上限は、特に限定されないが、５日程度であれば十分であり、通常は３日以内であり、衛生面からは短期間がよい。また、乳酸菌としてＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ等の酸素感受性の乳酸菌を用いる場合には、発酵を嫌気条件で行うことが好ましい。発酵の際には、培地を静置して行ってもよいし、必要に応じて撹拌してもよい。
【0021】
［発酵漬物］
上記製造方法により発酵漬物を得ることができる。本明細書において「発酵漬物」とは、食材（例えば、野菜原料）を発酵（例えば、乳酸発酵）させる工程を含む方法により製造される漬物を意味する。例えば、すんき、すぐき、発酵キムチ、発酵しば漬、野沢菜漬、ザワークラウト、ピクルス等が挙げられる。
上記製造方法により発酵漬物を得ることができる。本明細書において「発酵漬物」とは、食材（例えば、野菜原料）を発酵（例えば、乳酸発酵）させる工程を含む方法により製造される漬物を意味する。例えば、すんき、すぐき、発酵キムチ、発酵しば漬、野沢菜漬、ザワークラウト、ピクルス等が挙げられる。
【0022】
発酵漬物は、そのコハク酸含有量及びイソチオシアネート含有量の少なくともいずれかが野菜原料のよりも多いことが好ましく、通常は４倍以上、好ましくは５倍以上である。発酵漬物のコハク酸含有量及びイソチオシアネート含有量は、野菜原料により異なるため一律に特定することは難しいが、通常０．５ｍＭ以上、好ましくは５ｍＭ以上、より好ましくは６ｍＭ以上である。イソチオシアネートは、アブラナ科植物の野菜に特有の成分であるグルコシノレートの分解産物であり、アブラナ科植物の野菜（例えば、白カブ、赤カブ、キャベツ、白菜）に含まれる。本明細書においてイソチオシアネート含有量は、イソチオシアネート類（例えば、４－ペンテニルＩＴＣ、３－ブテニルＩＴＣ、２－フェネチルＩＴＣ、アリルＩＴＣ）の総量を意味し、未発酵の野菜に対する相対量として通常８以上、好ましくは１０以上である。コハク酸含有量及びイソチオシアネート含有量の調整は、野菜原料の種類、乳酸菌の種類、量、発酵条件により行うことができる。
【0023】
発酵漬物は、コハク酸以外の酸含有量も野菜原料よりも多いことが好ましい。コハク酸以外の酸としては、例えば、酢酸、乳酸が挙げられる。発酵漬物のこれらの酸含有量も、野菜原料により異なるため一律に特定することは難しい。たとえば、酢酸含有量は、通常５ｍＭ以上、好ましくは６ｍＭ以上である。乳酸含有量は、通常１０ｍＭ以上、好ましくは１２ｍＭ以上である。
【実施例】
【0024】
以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は以下の例に限定されるものではない。
【0025】
参考例１
国内で唯一製造される無塩発酵漬物「すんき」の品評会に出展された４９試料の成分組成等を比較し、最優秀品の特徴を明らかにした（表１）。
・ｐＨは４．１であり平均値（４．０）と比較しても良好に乳酸発酵している
・コハク酸の含有量が４９試料中で際立って大きい（旨味の寄与成分）
・乳酸、酢酸、グルタミン酸、イソチオシアネート（ＩＴＣ）の含有量が大きい（風味・漬菜香への寄与成分）
・エタノール、酢酸エチル、アセトイン、ジアセチルの含有量が小さい（発酵臭・つわり臭の原因成分）
国内で唯一製造される無塩発酵漬物「すんき」の品評会に出展された４９試料の成分組成等を比較し、最優秀品の特徴を明らかにした（表１）。
・ｐＨは４．１であり平均値（４．０）と比較しても良好に乳酸発酵している
・コハク酸の含有量が４９試料中で際立って大きい（旨味の寄与成分）
・乳酸、酢酸、グルタミン酸、イソチオシアネート（ＩＴＣ）の含有量が大きい（風味・漬菜香への寄与成分）
・エタノール、酢酸エチル、アセトイン、ジアセチルの含有量が小さい（発酵臭・つわり臭の原因成分）
【0026】
【表1】
【0027】
本参考例の結果から、高品質な無塩発酵漬物にはコハク酸やイソチオシアネートの含有量が重要であることが明らかとなった。また、他の特徴成分についてもいずれも味や香りを有する成分であることから、良好な風味に対して複合的に貢献していると考えられる。
【0028】
実施例１ 高品質なすんきの成分組成に関わる乳酸菌株の探索
すんきに生息する乳酸菌のうち高いコハク酸の生産に関わるものを探索した。市販や自作したすんきから１８の異なる乳酸菌種に属する２５０個の乳酸菌コロニーを収集した。凍結乾燥した赤カブ（開田カブ）の葉から熱水抽出して調製したエキスに、ラクトバチルスＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で３０℃・２４時間培養した乳酸菌を接種し、３０℃で３日間発酵させた。発酵後に生産された水溶性成分と揮発性成分の濃度を核磁気共鳴（ＮＭＲ）法および固相マイクロ抽出－ガスクロマトグラフィー／質量分析（ＳＰＭＥ－ＧＣ／ＭＳ）法により分析した。
すんきに生息する乳酸菌のうち高いコハク酸の生産に関わるものを探索した。市販や自作したすんきから１８の異なる乳酸菌種に属する２５０個の乳酸菌コロニーを収集した。凍結乾燥した赤カブ（開田カブ）の葉から熱水抽出して調製したエキスに、ラクトバチルスＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で３０℃・２４時間培養した乳酸菌を接種し、３０℃で３日間発酵させた。発酵後に生産された水溶性成分と揮発性成分の濃度を核磁気共鳴（ＮＭＲ）法および固相マイクロ抽出－ガスクロマトグラフィー／質量分析（ＳＰＭＥ－ＧＣ／ＭＳ）法により分析した。
【0029】
【表2】
【0030】
分析の結果、最もコハク酸を生産するのはＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉであることが明らかとなった（表２、図１）。さらに、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉにより発酵したカブ菜の汁は、参考例１で示された最優秀品の特徴に最も近くなった。すなわち、良好なｐＨの低下を示し、乳酸・酢酸の含有量に優れ、エタノール・アセトイン・酢酸エチルの生産量が小さく、イソチオシアネート類の信号強度が大きいといった特徴を示した。
中程度のコハク酸の生産量を示した乳酸菌として、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌ．ｐａｒａｆａｒｒａｇｉｎｉｓ、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌ．ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓも選抜された。これらの乳酸菌は酢酸の生産量にも優れる。ただし、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉに比べて発酵物の最終ｐＨが高くなったため、単独の使用では適切な品質を保つｐＨに到達しない恐れがある。また、これらの菌株の発酵では、成分組成の特徴が最優秀品のすんきとは異なるものになった。
中程度のコハク酸の生産量を示した乳酸菌として、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌ．ｐａｒａｆａｒｒａｇｉｎｉｓ、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌ．ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓも選抜された。これらの乳酸菌は酢酸の生産量にも優れる。ただし、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉに比べて発酵物の最終ｐＨが高くなったため、単独の使用では適切な品質を保つｐＨに到達しない恐れがある。また、これらの菌株の発酵では、成分組成の特徴が最優秀品のすんきとは異なるものになった。
【0031】
実施例２ 様々な漬物用野菜に対する適用性の解析
白カブ、木曽の赤カブ（開田カブ、王滝カブ）、キャベツ、白菜、キュウリを用いて、各植物の葉から実施例１と同様にして抽出したエキスに、ラクトバチルスＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で３０℃・２４時間培養した表３～表５に示す乳酸菌を接種し、３０℃で３日間発酵させた。得られる発酵物の水溶性代謝産物の組成をＮＭＲ法により、到達ｐＨをｐＨメーターにより分析し、原料への適性を３段階（◎：特に良好、〇：概ね良好、△：使用可能）で判定した（表３～５）。
白カブ、木曽の赤カブ（開田カブ、王滝カブ）、キャベツ、白菜、キュウリを用いて、各植物の葉から実施例１と同様にして抽出したエキスに、ラクトバチルスＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で３０℃・２４時間培養した表３～表５に示す乳酸菌を接種し、３０℃で３日間発酵させた。得られる発酵物の水溶性代謝産物の組成をＮＭＲ法により、到達ｐＨをｐＨメーターにより分析し、原料への適性を３段階（◎：特に良好、〇：概ね良好、△：使用可能）で判定した（表３～５）。
【0032】
【表3】
【0033】
【表4】
【0034】
【表5】
【0035】
その結果、乳酸菌は各野菜においてコハク酸生産能を示し、中でも、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉはいずれの野菜でもすんき乳酸菌の中で最も優れたコハク酸生産能を示した。発酵物のｐＨについては、白カブ、赤カブ（開田カブ）、白菜、キュウリは特に良好に、赤カブ（王滝カブ）は概ね良好に、キャベツは限定的ではあるがｐＨ低下がみられた。このことから、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉを広く漬物に利用される他の野菜に用いても、コハク酸を特徴とする良風味の無塩発酵漬物を製造できることが明らかとなった。
【0036】
ただし、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉはキャベツの発酵に対する適性が他菌種に劣り、コハク酸の生産量は最大レベルであるものの、到達ｐＨが４．５付近に留まる結果となった。これに対し、他の野菜で中程度のコハク酸生産量を示したＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍが、キャベツの発酵においてはＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉに匹敵するコハク酸生産量を示した。また、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌ．ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ、Ｌ．ｐａｒａｆａｒｒａｇｉｎｉｓなどについても、開田カブと同様の代謝物生産傾向が確認された。
【0037】
実施例３ 複数の乳酸菌を併用した共発酵試験
白カブ、木曽の赤カブ（開田カブ、王滝カブ）、キャベツ、白菜、キュウリを用いて、各植物の葉から実施例１と同様にして抽出したエキスに、ラクトバチルスＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で３０℃・２４時間培養した表６及び表７に示す乳酸菌（単独又は２種の組み合わせ）を接種し、３０℃で３日間発酵させた。得られる発酵物の水溶性代謝産物の組成、到達ｐＨを実施例２と同様の方法で分析し、原料への適性を実施例１、２と同様に判定した（表６、７）。
白カブ、木曽の赤カブ（開田カブ、王滝カブ）、キャベツ、白菜、キュウリを用いて、各植物の葉から実施例１と同様にして抽出したエキスに、ラクトバチルスＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で３０℃・２４時間培養した表６及び表７に示す乳酸菌（単独又は２種の組み合わせ）を接種し、３０℃で３日間発酵させた。得られる発酵物の水溶性代謝産物の組成、到達ｐＨを実施例２と同様の方法で分析し、原料への適性を実施例１、２と同様に判定した（表６、７）。
【0038】
【表6】
【0039】
【表7】
【0040】
試験の結果、キャベツを用いて、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ及びＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍを共発酵した場合、コハク酸の蓄積量が増加した（表６、７）。さらに、乳酸と酢酸の生産もそれぞれ大幅に向上し、ｐＨ低下が大幅に改善した。両乳酸菌をそれぞれ単独で使用したときよりも向上していることから、これらの乳酸菌の併用により相乗的な発酵促進効果を得ることできた。この相乗効果が科学的に検証された事例はなく、そのメカニズムは明らかではないが、ヨーグルト発酵においてＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓとＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓとがお互いに不足する栄養素を補い合うような、何らかの共生関係が成立しているのではないかと考えられる。
【0041】
また、キャベツ以外の野菜においても共発酵の効果が見られ、たとえば白カブや赤カブの発酵において、コハク酸と乳酸生産にはほとんど影響させずに酢酸の増加効果が得られた。この効果はＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍに限らず他の乳酸菌でも同様である。コハク酸生産能が比較的低いＬ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｌ．ｐａｒａｋｅｆｉｒｉ、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉを共発酵に用いても同様に乳酸と酢酸の増加効果が得られる。
【0042】
実施例４ ２段階の共発酵による追加発酵の効果
白カブ、木曽の赤カブ（開田カブ、王滝カブ）、キャベツ、白菜、キュウリを用いて、各植物の葉から実施例１と同様にして抽出したエキスに、ラクトバチルスＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で３０℃・２４時間培養したＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉを接種し、３０℃で３日間発酵させた。続いて、表８及び表９に示す乳酸菌をさらに接種し、追加で３０℃で３日間発酵させた。得られる発酵物の水溶性代謝産物の組成、到達ｐＨを分析し、原料への適性を実施例１、２と同様に判定した（表８、９）。
白カブ、木曽の赤カブ（開田カブ、王滝カブ）、キャベツ、白菜、キュウリを用いて、各植物の葉から実施例１と同様にして抽出したエキスに、ラクトバチルスＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で３０℃・２４時間培養したＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉを接種し、３０℃で３日間発酵させた。続いて、表８及び表９に示す乳酸菌をさらに接種し、追加で３０℃で３日間発酵させた。得られる発酵物の水溶性代謝産物の組成、到達ｐＨを分析し、原料への適性を実施例１、２と同様に判定した（表８、９）。
【0043】
【表8】
【0044】
【表9】
【0045】
共発酵の効果は、実施例３のように２菌株を同時に接種した場合だけでなく、発酵を２段階に分けた場合にも得られた（表８、９）。
【0046】
キャベツのように、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ単独ではコハク酸を蓄積できるがｐＨ低下に乏しい原料の場合、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍなどキャベツ発酵に適する乳酸菌による２段階目の追加発酵を行うことによって、コハク酸を低下させることなく酢酸と乳酸を大幅に増加させ、ｐＨを４．０以下に低下させることができる。これは、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉが適性の低い原料においてもコハク酸を優先して生産する性質を利用しており、残っている大部分の炭素源を他の乳酸菌によって追加発酵させたことによるものである。
【0047】
王滝カブのように、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ単独では到達ｐＨがやや高くなる原料では、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍなどによる追加発酵を行うと、高いコハク酸濃度を維持したまま酢酸と乳酸の蓄積量を高め、ｐＨ低下を補助することができる。これは、一般的には他の炭素源に比べて乳酸菌に優先的に消費されるグルコースが、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉによる野菜汁の発酵においてはむしろ残存しやすいという、本研究での発見に基づいて実現したものである。Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍは、その残存したグルコースに加えて、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉが資化しないクエン酸をも乳酸や酢酸へと変換することができる。
【0048】
実施例５ 発酵温度の影響
木曽の赤カブ（開田カブ、王滝カブ）を用いて、各植物の葉から実施例１と同様にして抽出したエキスに、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉを接種し、温度条件を表１０及び表１１に示す条件として１日から１４日間まで発酵させた。培養開始後、発酵物の水溶性代謝産物の組成、到達ｐＨを実施例２と同様の方法により分析した（表１０及び１１）。
木曽の赤カブ（開田カブ、王滝カブ）を用いて、各植物の葉から実施例１と同様にして抽出したエキスに、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉを接種し、温度条件を表１０及び表１１に示す条件として１日から１４日間まで発酵させた。培養開始後、発酵物の水溶性代謝産物の組成、到達ｐＨを実施例２と同様の方法により分析した（表１０及び１１）。
【0049】
【表10】
【0050】
【表11】
【0051】
漬物の発酵における温度の影響を確認したところ、最も早くｐＨが低下し、到達ｐＨも最低となった発酵温度は４０℃だった（表１０及び１１）。３０℃ではわずかに、４５℃ではやや発酵が遅れた。５０℃あるいは２０℃以下ではｐＨ低下の悪化が顕著だった。コハク酸の生産量は４０℃または３０℃で最大となり、ｐＨ低下の進行と同様の差がみられた。したがって、適切な発酵の進行は、好ましくは３０℃から４５℃の範囲、より好ましくは３０℃から４０℃の範囲で得られると考えられる。
【0052】
実施例６ Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉの塩濃度耐性
木曽の赤カブ（開田カブ）を用いて、各植物の葉から実施例１と同様にして抽出したエキスに、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉを接種し、食塩水を表１２に示す濃度となるように４分の１倍量を添加し、３０℃で３日間発酵させた。培養開始後、発酵物の水溶性代謝産物の組成、到達ｐＨを実施例２と同様の方法により分析した（表１２）。
木曽の赤カブ（開田カブ）を用いて、各植物の葉から実施例１と同様にして抽出したエキスに、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉを接種し、食塩水を表１２に示す濃度となるように４分の１倍量を添加し、３０℃で３日間発酵させた。培養開始後、発酵物の水溶性代謝産物の組成、到達ｐＨを実施例２と同様の方法により分析した（表１２）。
【0053】
【表12】
【0054】
ＮａＣｌ濃度が２％（ｗ／ｖ）以上のＮａＣｌ濃度では発酵が大きく抑制されたのに対し、２％（ｗ／ｖ）未満では、代謝産物の組成に大きな影響はみられなかった（表１２）。このことから、食塩を２％（ｗ／ｖ）未満の濃度で添加してもよいことが分かった。
【0055】
実施例７ リンゴ酸の添加によるコハク酸生産の増強
キャベツを用いて、各植物の葉から実施例１と同様にして抽出したエキスに、リンゴ酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬社製）を１００ｍＭとなるよう添加し、ラクトバチルスＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で３０℃・２４時間培養した表１３に示す乳酸菌を接種し、３０℃で３日間発酵させた。培養開始後、発酵物の水溶性代謝産物の組成、到達ｐＨを実施例２と同様の方法により分析した（表１３）。
キャベツを用いて、各植物の葉から実施例１と同様にして抽出したエキスに、リンゴ酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬社製）を１００ｍＭとなるよう添加し、ラクトバチルスＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で３０℃・２４時間培養した表１３に示す乳酸菌を接種し、３０℃で３日間発酵させた。培養開始後、発酵物の水溶性代謝産物の組成、到達ｐＨを実施例２と同様の方法により分析した（表１３）。
【0056】
【表13】
【0057】
１００ｍＭリンゴ酸ナトリウムを添加してからＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉとＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍの共発酵を行ったところ、リンゴ酸ナトリウムの添加により共発酵におけるコハク酸の増強効果がさらに高まった（表１３）。この結果から、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉとＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍとの共培養をベースとして、リンゴ酸の添加を併用することで、コハク酸による発酵漬物の特徴付けをさらに強化できることが分かった。
【0058】
野菜の発酵における乳酸菌によるコハク酸の生産は、リンゴ酸を基質としてコハク酸に変換することによるものが大部分と考えられる。本実施例の結果から、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ等の乳酸菌単独でもコハク酸を高生産できる野菜の場合は、単純にリンゴ酸を添加することで乳酸菌によるコハク酸の生産を増強できることが分かる。
【0059】
実施例８ 酸素が発酵の進行に与える影響
木曽の赤カブ（開田カブ、王滝カブ）を用いて、各植物の葉から実施例１と同様にして抽出したエキスをツーポジションキャップ付き培養チューブ（コーニング社製）にとり、表１４に示す乳酸菌を接種し、３０℃で３日間発酵させた。嫌気条件のグループは、密閉した嫌気ジャーの中でアネロパック（三菱ガス化学社製）を使用して嫌気状態で発酵を行い、通気ありのグループは、半開放した嫌気ジャーの中でツーポジションキャップを通気状態にして静置し、さらに２４時間ごとに培地を混和して通気を行った。得られる発酵物の水溶性代謝産物及び到達ｐＨを実施例２と同様の方法により分析した（表１４）。
木曽の赤カブ（開田カブ、王滝カブ）を用いて、各植物の葉から実施例１と同様にして抽出したエキスをツーポジションキャップ付き培養チューブ（コーニング社製）にとり、表１４に示す乳酸菌を接種し、３０℃で３日間発酵させた。嫌気条件のグループは、密閉した嫌気ジャーの中でアネロパック（三菱ガス化学社製）を使用して嫌気状態で発酵を行い、通気ありのグループは、半開放した嫌気ジャーの中でツーポジションキャップを通気状態にして静置し、さらに２４時間ごとに培地を混和して通気を行った。得られる発酵物の水溶性代謝産物及び到達ｐＨを実施例２と同様の方法により分析した（表１４）。
【0060】
【表14】
【0061】
Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉが明らかな酸素への感受性を示した（表１４）。また、到達ｐＨが上昇しただけでなく、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉによるコハク酸生産量も約１／３と大幅に低下した。Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍも若干であるが酸素への感受性を示した。したがって、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ等の酸素感受性の乳酸菌を用いる場合、培養は嫌気条件で行うことが好ましいことが分かった。
【0062】
実施例９ 無塩発酵漬物の小仕込み試験
発酵漬物の製造実績を有する漬物工場において、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉを用いた無塩発酵漬物を試作し、発酵物の評価を行った。発酵スターターには、食塩無添加トマトジュース（商品名：カゴメトマトジュース食塩無添加、カゴメ社製）の遠心分離上清と食品添加物で調製した食品グレード培地（０．５％ハイニュートＡＭ（不二製油社製）、３．０％食用酵母エキス（マーマイト：ユニリーバ社製）、０．５％酢酸ナトリウム、０．０２％硫酸マグネシウム、水酸化ナトリウムでｐＨ６．５に調整し１１５℃・１０分間オートクレーブ滅菌）を用いて、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉを３７℃で２４時間培養したものを用いた。赤カブ、白菜、キュウリ及びキャベツを用いて、刻んだ原料それぞれ９ｋｇを７０℃の熱水で湯通ししてから漬物用コンテナに設置したポリ袋に入れ、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉを初発１．０×１０7ｃｆｕ／ｍＬとなるように接種した。原料が液面に浸るようにポリ袋の空気を追い出してから口を閉じ、コンテナをマットレスに包み保温して室温に静置し３日間発酵させた。比較対照として、０．５％の乳酸を添加して３日間漬け込んだ無発酵の無塩漬物を調製した。得られる漬物の汁に含まれる代謝産物、到達ｐＨ、乳酸菌数、大腸菌群数及びカビ・酵母数を分析した（表１５）。また、漬け上がった無塩発酵漬物の嗜好性を４名のパネルで評価し、それぞれが３段階（３点：特に良好、２点：概ね良好、１点：不良）で判定し、点数の平均値（平均評価）を算出した（表１６）。
発酵漬物の製造実績を有する漬物工場において、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉを用いた無塩発酵漬物を試作し、発酵物の評価を行った。発酵スターターには、食塩無添加トマトジュース（商品名：カゴメトマトジュース食塩無添加、カゴメ社製）の遠心分離上清と食品添加物で調製した食品グレード培地（０．５％ハイニュートＡＭ（不二製油社製）、３．０％食用酵母エキス（マーマイト：ユニリーバ社製）、０．５％酢酸ナトリウム、０．０２％硫酸マグネシウム、水酸化ナトリウムでｐＨ６．５に調整し１１５℃・１０分間オートクレーブ滅菌）を用いて、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉを３７℃で２４時間培養したものを用いた。赤カブ、白菜、キュウリ及びキャベツを用いて、刻んだ原料それぞれ９ｋｇを７０℃の熱水で湯通ししてから漬物用コンテナに設置したポリ袋に入れ、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉを初発１．０×１０7ｃｆｕ／ｍＬとなるように接種した。原料が液面に浸るようにポリ袋の空気を追い出してから口を閉じ、コンテナをマットレスに包み保温して室温に静置し３日間発酵させた。比較対照として、０．５％の乳酸を添加して３日間漬け込んだ無発酵の無塩漬物を調製した。得られる漬物の汁に含まれる代謝産物、到達ｐＨ、乳酸菌数、大腸菌群数及びカビ・酵母数を分析した（表１５）。また、漬け上がった無塩発酵漬物の嗜好性を４名のパネルで評価し、それぞれが３段階（３点：特に良好、２点：概ね良好、１点：不良）で判定し、点数の平均値（平均評価）を算出した（表１６）。
【0063】
【表15】
【0064】
【表16】
【0065】
各発酵漬物においては、コハク酸等の発酵代謝物が生成し、良好な嗜好性が発揮されたことから、発酵が良好に進み、生成したコハク酸やＩＴＣ等が旨味、香り等の風味向上に貢献していることが分かった（表１５、１６）。
【0066】
実施例１０ ＩＴＣ量への様々な乳酸菌による発酵および共発酵の効果
ＩＴＣ生成の基質となるグルコシノレート類を特徴的に含むアブラナ科の漬物野菜（白カブ、木曽の赤カブ（開田カブ、王滝カブ）、キャベツ、白菜）を用いて、各植物の葉から実施例１と同様にして抽出したエキスに、ラクトバチルスＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で３０℃・２４時間培養した表１７に示す乳酸菌を接種し、３０℃で３日間発酵させた。また、複合スターターによる発酵試験も実施した。複合発酵試験では、実施例３及び実施例４と同様にして、共発酵及び２段階発酵を行った。共発酵試験では、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ及び表１８に示すその他の乳酸菌を接種し、３０℃・３日間発酵させた。２段階発酵試験では、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉによる３０℃・３日間の発酵ののち、さらに表１８に示すその他の乳酸菌を用いて３０℃・３日間発酵させた。発酵はスクリューキャップ付き不活性ガラスバイアルを用いて行った。得られる発酵物の揮発性代謝産物の組成をＳＰＭＥ－ＧＣ／ＭＳを用いて分析し、各ＩＴＣが示したピーク面積値を信号強度として比較した（表１７及び表１８）。
ＩＴＣ生成の基質となるグルコシノレート類を特徴的に含むアブラナ科の漬物野菜（白カブ、木曽の赤カブ（開田カブ、王滝カブ）、キャベツ、白菜）を用いて、各植物の葉から実施例１と同様にして抽出したエキスに、ラクトバチルスＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で３０℃・２４時間培養した表１７に示す乳酸菌を接種し、３０℃で３日間発酵させた。また、複合スターターによる発酵試験も実施した。複合発酵試験では、実施例３及び実施例４と同様にして、共発酵及び２段階発酵を行った。共発酵試験では、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ及び表１８に示すその他の乳酸菌を接種し、３０℃・３日間発酵させた。２段階発酵試験では、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉによる３０℃・３日間の発酵ののち、さらに表１８に示すその他の乳酸菌を用いて３０℃・３日間発酵させた。発酵はスクリューキャップ付き不活性ガラスバイアルを用いて行った。得られる発酵物の揮発性代謝産物の組成をＳＰＭＥ－ＧＣ／ＭＳを用いて分析し、各ＩＴＣが示したピーク面積値を信号強度として比較した（表１７及び表１８）。
【0067】
【表17】
【0068】
【表18】
【0069】
分析の結果、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉによりアブラナ科漬物野菜を発酵させると、他の乳酸菌よりも多くのＩＴＣが生成されることが明らかとなった（表１７）。白カブ、赤カブ（開田カブ・王滝カブ）、白菜を用いた場合では、４－ペンテニルＩＴＣと３－ブテニルＩＴＣが、乳酸菌未接種に対して約１．５から約２．５倍に増加した。キャベツではほとんどアリルＩＴＣのみが検出されたが、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉで発酵させた場合に、乳酸菌未接種よりも信号強度がやや増加した。Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍによって発酵させた試料では、一部の野菜で極めて強いＩＴＣの信号が検出された。この特徴は漬物に強烈な辛みをもたらし、品質の異常につながることが懸念される。以上のことから、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉでアブラナ科野菜の発酵に用いることで、ＩＴＣの香りと辛みによる特徴を適度に強調する効果が得られると期待される。
【0070】
Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉと他の乳酸菌との共発酵では、Ｌ．ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ、Ｌ．ｐａｒａｆａｒｒａｇｉｎｉｓ、Ｌ．ｐａｒａｋｅｆｉｒｉなどの、多くの組み合わせで乳酸菌未接種よりも各ＩＴＣが増加する効果が得られた（表１８）。したがって、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉによるコハク酸及びＩＴＣの高生産と、実施例３で示した共発酵による乳酸及び酢酸の生成促進は、同時に効果を得ることができることが分かる。
【図1】