特許 7692226 モノボディベースのキメラ抗原受容体及びそれを含む免疫細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-06-05

(45)【発行日】2025-06-13

(54)【発明の名称】モノボディベースのキメラ抗原受容体及びそれを含む免疫細胞

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20250606BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20250606BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20250606BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20250606BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20250606BHJP

   C07K 16/40 20060101ALI20250606BHJP

   A61K 35/15 20250101ALI20250606BHJP

   A61K 35/17 20250101ALI20250606BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20250606BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20250606BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20250606BHJP

   C07K 14/725 20060101ALN20250606BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20250606BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20250606BHJP

   C12N 15/60 20060101ALN20250606BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00

C12N15/63 Z ZNA

C12N5/10

C12N15/12

C12N15/62 Z

C07K16/40

A61K35/15

A61K35/17

A61P35/00

A61P35/02

A61P35/04

C07K14/725

C07K16/28

C12N15/13

C12N15/60

【請求項の数】 12

(21)【出願番号】P 2023572755

(86)(22)【出願日】2022-05-24

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-21

(86)【国際出願番号】 KR2022007379

(87)【国際公開番号】W WO2022250431

(87)【国際公開日】2022-12-01

【審査請求日】2023-11-22

(31)【優先権主張番号】10-2021-0067276

(32)【優先日】2021-05-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】523442828

【氏名又は名称】ヴァクセル－バイオ

【氏名又は名称原語表記】ＶＡＸＣＥＬＬ－ＢＩＯ

(74)【代理人】

【識別番号】100121728

【弁理士】

【氏名又は名称】井関 勝守

(74)【代理人】

【識別番号】100165803

【弁理士】

【氏名又は名称】金子 修平

(74)【代理人】

【識別番号】100179648

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 咲江

(74)【代理人】

【識別番号】100222885

【弁理士】

【氏名又は名称】早川 康

(74)【代理人】

【識別番号】100140338

【弁理士】

【氏名又は名称】竹内 直樹

(74)【代理人】

【識別番号】100227695

【弁理士】

【氏名又は名称】有川 智章

(74)【代理人】

【識別番号】100170896

【弁理士】

【氏名又は名称】寺薗 健一

(74)【代理人】

【識別番号】100219313

【弁理士】

【氏名又は名称】米口 麻子

(74)【代理人】

【識別番号】100161610

【弁理士】

【氏名又は名称】藤野 香子

(72)【発明者】

【氏名】イ ジュンヘン

【審査官】齋藤 光介

(56)【参考文献】

【文献】Han, X. et al.，Adnectin-Based Design of Chimeric Antigen Receptor for T Cell Engineering，Molecular Therapy，2017年，vol.25, no.11，p.2466-2476

【文献】Park, S-H. et al.，Isolation and Characterization of a Monobody with a Fibronectin Domain III Scaffold That Specifically Binds EphA2，PLos ONE，2015年，vol.10, no.7，e0132976

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

Ｃ０７Ｋ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

モノボディを含む細胞外リガンド結合ドメインを有する、モノボディベースのキメラ抗原受容体であって、
前記モノボディが、配列番号８のアミノ酸配列を含み、
前記モノボディベースのキメラ抗原受容体は、ＣＤ８アルファ鎖のヒンジ及び膜貫通ドメイン、並びにＣＤ３ゼータの細胞内シグナル伝達ドメインを含み、
前記モノボディベースのキメラ抗原受容体は、さらにＣＤ２８又は４－１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、モノボディベースのキメラ抗原受容体。

【請求項2】

前記ＣＤ８アルファ鎖のヒンジ及び膜貫通ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のモノボディベースのキメラ抗原受容体。

【請求項3】

前記ＣＤ３ゼータの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のモノボディベースのキメラ抗原受容体。

【請求項4】

前記ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号１０のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のモノボディベースのキメラ抗原受容体。

【請求項5】

前記４－１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号１１のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のモノボディベースのキメラ抗原受容体。

【請求項6】

請求項１～５のいずれか一項に記載のモノボディベースのキメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。

【請求項7】

請求項６に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。

【請求項8】

請求項１～５のいずれか一項に記載のモノボディベースのキメラ抗原受容体を細胞表面膜上に発現させた、免疫細胞。

【請求項9】

前記免疫細胞が、白血球、好中球、好酸球、好塩基球、単核球、リンパ球、Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、樹状細胞、またはそれらの組み合わせであることを特徴とする、請求項８に記載の免疫細胞。

【請求項10】

請求項８に記載の免疫細胞を含む、癌を予防または治療するための薬学的組成物。

【請求項11】

前記癌が、黒色腫、扁平上皮癌、乳癌、頭頸部癌、甲状腺癌、軟部組織肉腫、骨肉腫、精巣癌、前立腺癌、卵巣癌、膀胱癌、皮膚癌、脳癌、血管肉腫、肥満細胞腫、白血病、リンパ腫、肝臓癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、腎臓癌、大腸癌、造血器腫瘍及びそれらの転移癌からなる群から選択される少なくとも１つであることを特徴とする、請求項１０に記載の癌を予防または治療するための薬学的組成物。

【請求項12】

前記癌が、膵臓癌、前立腺癌、または卵巣癌であることを特徴とする、請求項１１に記載の癌を予防または治療するための薬学的組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、モノボディベースのキメラ抗原受容体に関する。前記モノボディベースのキメラ抗原受容体は、モノボディを含む細胞外リガンド結合ドメインを有する。また、本発明は、モノボディベースのキメラ抗原受容体を細胞表面膜上に発現させた免疫細胞に関する。

【背景技術】

【0002】

固形癌の治療において、外科的切除だけでは、癌幹細胞や残存している癌細胞、または転移性癌細胞を完全に除去することが難しいため、外科的切除術と共に放射線療法（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）、化学療法（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）、標的治療（ｔａｒｇｅｔｔｈｅｒａｐｙ）及び免疫治療法（ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）などを組み合わせた複合治療法が用いられている。特に、免疫治療法は、体内の免疫系を利用するため、放射線治療や化学療法で見られる副作用がほとんどない。

【0003】

Ｔ細胞は、適応性免疫反応（ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）を媒介する免疫細胞であり、全リンパ球の７５％を占める。Ｔ細胞は、血液中ではほとんどが不活性状態で存在するが、抗原刺激を受けると活性形態に変化し、特定の抗原を有する細胞を除去することができる。Ｔ細胞の作用は、抗原を認識することができる受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＴＣＲ）、共刺激因子（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）及びサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）などによって活性化される。

【0004】

しかしながら、Ｔ細胞のＴＣＲは、腫瘍関連抗原が結合したＭＨＣ（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）分子に結合するが、癌細胞は、そのようなＭＨＣの発現を抑制したり、Ｔ細胞の表面に発現したＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１などの免疫チェックポイント（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）の機能を変化させ、Ｔ細胞の機能を抑制する。故に、ＭＨＣ分子を認識するのではなく、腫瘍関連抗原を直接認識することができるキメラ抗原受容体を細胞内に発現させたＴ細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ；ＣＡＲ－Ｔ）、または癌細胞の免疫チェックポイント受容体に対する特異的な抗体配列を細胞内で発現させたＴ細胞が開発され始めた。

【0005】

現在開発されているキメラ抗原受容体の構造は、抗原を認識するｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）部分、膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）、及び細胞内にシグナルを伝達するシグナル伝達ドメイン（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）に分けられる。ノバルティス、ギリアド、セルジーン、アブクロンなどの製薬会社や臨床医は、血液癌の治療法として、血液癌細胞のＣＤ１９抗原に特異的に結合するｓｃＦｖを用いたＣＡＲ－Ｔを開発した（特許文献１０～１４）。

【0006】

固形癌に対しても、様々な遺伝子操作技術が融合したＣＡＲベースの免疫細胞治療が切望されているが、固形癌の場合、患者ごとに異なる抗原を発現する異形性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）、低酸素環境（ｈｙｐｏｘｉａ）などの腫瘍微小環境（ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）の複雑な特性、Ｔ細胞の移動及び活性の制約などにより進展がない状態である。

【0007】

エフリン受容体（Ｅｐｈｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、サイズ１０８ｋＤａの膜受容体型チロシンキナーゼ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ；ＲＴＫ）であり、３つの部分に分かれている。細胞膜の外側には、リガンド結合ドメイン（ｌｉｇａｎｄ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）、高システイン領域（ｃｙｓｔｅｉｎ－ｒｉｃｈ ｒｅｇｉｏｎ）及び２つのフィブロネクチンＩＩＩ反復構造があり、中央には膜貫通部分があり、そして細胞質側には、キナーゼ活性ドメインを有する（非特許文献４）。エフリン受容体は、リガンドであるエフリンと結合し、リン酸化過程を介して細胞外部の信号を細胞内に伝達するタンパク質であり、細胞増殖、細胞移動、分化及び神経細胞のシナプス伝達、組織再構築、骨細胞分化と血管新生に関与する（非特許文献５、６）。エフリン受容体の構造とリガンド－受容体の結合特異性（ｌｉｇａｎｄ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）によって、９種類のグループＡ（ＥｐｈＡ１－８及びＥｐｈＡ１０）と５種類のグループＢ（ＥｐｈＢ１－４及びＥｐｈＢ６）に分けられる（非特許文献７～１０）。これらのうち、エフリン受容体Ａ２（Ｅｐｈｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａ２；ＥｐｈＡ２）は、正常細胞ではごく少量しか発現しないが、肝臓癌、前立腺癌、膵臓癌、頭頸部癌、胃癌、大腸癌、肺癌、子宮頸癌、卵巣癌など、ほとんどの癌細胞では非特異的に過剰発現され、発癌（ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）、転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）、血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、癌の耐性（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｔｕｍｏｒｓ）などを促進する。ＥｐｈＡ２は、ＥｐｈＡ１と約６５％のタンパク質相同性を有し、ラットの肺においてほぼ同じ位置で発見される。それは、非細胞肺癌を始めとするいくつかの悪性腫瘍において、ＥｐｈＡ１及びリガンドであるＥｐｈｒｉｎ－Ａ１と共に過剰発現され、ＥｐｈＡ２／Ａ１－Ｅｐｈｒｉｎ－Ａ１との相互作用によって、発癌及び悪性化の進行に関与する（非特許文献１１、１２）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【文献】韓国公開特許第１０－２０２０－０１０５８４０号公報

【文献】韓国公開特許第１０－２０１８－０１２１９０４号公報

【文献】韓国公開特許第１０－２０１８－０１２７３４４号公報

【文献】韓国公開特許第１０－２００７－０１０７７２１号公報

【文献】韓国特許第１０－１５２８９３９号公報

【文献】韓国特許第１０－１５２１６６８号公報

【文献】韓国特許第１０－１６３６８８２号公報

【文献】韓国公開特許第１０－２０１８－０１３４３４７号公報

【文献】韓国特許第１０－２１５７１９７号公報

【文献】国際公開第２０１６／１６４７３号

【文献】国際公開第２０１５／１５７２５２号

【文献】国際公開第２０１８／０２３０２５号

【文献】国際公開第２０１７／２１１９００号

【文献】国際公開第２０１６／０２８８９６号

【非特許文献】

【0009】

【文献】Ｐａｒｋ ＳＨ，Ｐａｒｋ Ｓ，Ｋｉｍ ＤＹ，Ｐｙｏ Ａ，Ｋｉｍｕｒａ ＲＨ，Ｓａｔｈｉｒａｃｈｉｎｄａ Ａ，Ｃｈｏｙ ＨＥ，Ｍｉｎ ＪＪ，Ｇａｍｂｈｉｒ ＳＳ，Ｈｏｎｇ Ｙ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｍｏｎｏｂｏｄｙ ｗｉｔｈ ａ Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ Ｄｏｍａｉｎ ＩＩＩ Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｔｈａｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ Ｂｉｎｄｓ ＥｐｈＡ２．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５ Ｊｕｌ １５；１０（７）：ｅ０１３２９７６．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１３２９７６．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ２０１５．ＰＭＩＤ：２６１７７２０８

【文献】Ｋｉｍ ＭＡ，Ｙｏｏｎ ＨＳ，Ｐａｒｋ ＳＨ，Ｋｉｍ ＤＹ，Ｐｙｏ Ａ，Ｋｉｍ ＨＳ，Ｍｉｎ ＪＪ，Ｈｏｎｇ Ｙ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｍｏｎｏｂｏｄｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ＥｐｈＡ２－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｐｔｉｃａｌ ｉｍａｇｉｎｇ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１７ Ｊｕｌ ７；１２（７）：ｅ０１８０７８６．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１８０７８６．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ２０１７．ＰＭＩＤ：２８６８６６６１

【文献】Ｐｙｏ Ａ，Ｙｏｕ ＳＨ，Ｓｉｋ Ｋｉｍ Ｈ，Ｙｏｕｎｇ Ｋｉｍ Ｊ，Ｍｉｎ ＪＪ，Ｋｉｍ ＤＹ，Ｈｏｎｇ Ｙ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ（６４）Ｃｕ－ｌａｂｅｌｅｄ ｍｏｎｏｂｏｄｙ ｆｏｒ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＥｐｈＡ２－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｕｍｏｒｓ．Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．２０２０ Ｊｕｌ １５；３０（１４）：１２７２６２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｍｃｌ．２０２０．１２７２６２．Ｅｐｕｂ ２０２０ Ｍａｙ １５．ＰＭＩＤ：３２５２７５６０

【文献】Ｌａｂｒａｄｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｐａｓｑｕａｌｅ，１９９７

【文献】Ｐａｓｑｕａｌｅ ＥＢ．Ｃｅｌｌ．１３３：３８－５２，２００８

【文献】Ｂａｒｑｕｉｌｌａ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．５５：４６５－４８７，２０１５

【文献】Ｉｅｇｕｃｈｉ Ｋ．Ｅｎｄｏｃｒ Ｍｅｔａｂ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｏｒｄ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ．１５：１１９－１２８，２０１５

【文献】Ｅｐｈ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ．Ｃｅｌｌ．９０：４０３－４０４，１９９７

【文献】Ｌｉｎｄｂｅｒｇ ＲＡ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０（６）：６３２４，１９９０

【文献】Ｄａｖｉｓ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６６（５１８６）：８１６－８１９，１９９４

【文献】Ｎａｊ ＡＣ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．４３：４３６－４４１，２０１１

【文献】Ｆｉｎｎｅｙ ＡＣ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１３６：５６６－５８２，２０１７

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

従来の抗体の単鎖可変領域フラグメント（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｓｃＦｖ）を細胞外リガンド結合ドメインとして用いたＣＡＲ免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）では、以下の問題点があった。

【0011】

１）マウスのモノクローナル抗体から得られた動物由来タンパク質であるため、癌抗原との結合が強く、故にサイトカイン放出症候群（ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＣＲＳ）、移植片対宿主病、及び腫瘍溶解症候群などの重篤な副作用が発生し、免疫系の過剰な活性により急速な免疫系収縮が起こることから、長期的には腫瘍抑制効果が低下する。

【0012】

２）ＣＤ１９を単一抗原とする血液癌とは異なり、固形癌は、患者ごとに異なる様々な抗原（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）を有しており、これらの癌抗原に対する多様なライブラリーを構築するためには、動物由来の抗体情報を用いる必要があるため、高コスト、長時間、及び多大な努力が必要となる。

【0013】

３）抗体、二重抗体、ｓｃＦｖはサイズが大きく、固形癌の治療に用いると、組織への浸透力が低く、十分な治療効果を発揮しにくい。

【0014】

４）バイシストロニック（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）ｓｃＦｖ、すなわち２つの抗原認識部位をＴ細胞またはＮＫ細胞に発現させた場合、抗原に対するｓｃＦｖの親和性が低下し、治療効果が低下するか、あるいは非特異的結合による副作用が起こり得る。

【0015】

５）ｓｃＦｖベースのＣＡＲ免疫細胞治療剤を投与しても、ＣＡＲの標的となる癌細胞エピトープで突然変異が生じ、抗原回避の発生率が高い。

【0016】

これらのｓｃＦｖの問題を解決するために、モノボディが開発された。モノボディは、ｓｃＦｖと類似しており、抗原を認識することができ、ｓｃＦｖに比べてサイズが小さいので組織への浸透力が高いという利点を有するが、癌細胞の治療に用いるには次のような問題点がある。

【0017】

１）抗体及びｓｃＦｖと比較して、抗原への結合力が比較的に低い。

【0018】

２）モノボディそのものは癌細胞に対する毒性がないため、癌治療剤として用いるためには様々な操作（例えば、抗癌剤を結合させるか、あるいはＴ細胞またはＮＫ細胞を融合させる方式など）が必要となる。

【0019】

３）モノボディそのものは血清中で安定性が低く、例えば、モノボディを造影剤として用いるためには、比較的に大量を投与しなければならない（例えば、約６０μｇ超）。

【0020】

４）モノボディは体内半減期が短いので（＜２４ｈ）、頻繁に注入しなければならない。

【0021】

前記課題を解決するために、本発明者らは、癌細胞を選択的に認識して結合することができ、生体内浸透力に優れ、有効性が高く、大量を投与しても無害で、組織内に持続的に留まりながら免疫記憶を誘導することができる、新規なモノボディベースのＣＡＲ免疫細胞の完成に至った。

【0022】

本発明は、前述の従来技術の課題を解決するために、モノボディベースのキメラ抗原受容体及びそれを細胞表面膜上に発現させた免疫細胞を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0023】

本発明は、モノボディを含む細胞外リガンド結合ドメインを有するモノボディベースのキメラ抗原受容体に関する。

【0024】

前記モノボディは、ＣＲＬ１、エフリン受容体、ＥｐｈＡ２、β－ガラクトシダーゼ、ＲＡＳ、Ａｂｌキナーゼ、ＶＥＧＦＲ２、ＭＢＰ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、Ｂｃｒ－Ａｂｌキナーゼ、ＳＴＡＴ３、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ヒトＬｙｎチロシンキナーゼのＳＨ３ドメイン、ＭＬＫＬ、Ｆｌｕｃ同族体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ）、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）、ＥＲＫ２、ＭＡＰＫ１４、キナーゼＳＨ２ドメイン、ＳＵＭＯ、ＡｕｒＡ、ＷＤＲ５、Ｆｌｕｃファミリー、ＧＦＰ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体結合ドメイン、ＦＹＮのＳＨ３ドメイン、ＡＢＬのＳＨ２ドメイン、ＳＵＭＯ１、Ｂｃｒ－Ａｂｌ、ＧＰＲ５６ ＥＣＲ、ＰＤ－Ｌ１、グリピカン－３、ＰＣＳＫ９、Ｇｐ４１、ＣＤ４、及びＩＬ－２３からなる群から選択されるタンパク質に特異的に結合してもよい。

【0025】

前記モノボディは、エフリン受容体、ＥｐｈＡ２、またはヒトＥｐｈＡ２に特異的に結合してもよい。

【0026】

前記モノボディは、配列番号８のアミノ酸配列を含んでもよい。

【0027】

前記モノボディベースのキメラ抗原受容体は、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとをさらに含んでもよい。

【0028】

前記膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体アルファ鎖、Ｔ細胞受容体ベータ鎖、Ｔ細胞受容体ゼータ鎖、ＣＤ８アルファ鎖、ＣＤ８ベータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、それらの一部、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つであってもよい。

【0029】

前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＦｃＲイプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄからなる群から選択される少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含んでもよい。

【0030】

前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０ドメイン、ＣＤ２ドメイン、ＣＤ２７ドメイン、ＣＤ２８ドメイン、ＣＤＳドメイン、ＩＣＡＭ－１ドメイン、ＬＦＡ－１ドメイン及び４－１ＢＢドメインからなる群から選択される少なくとも１つを含んでもよい。

【0031】

本発明のモノボディベースのキメラ抗原受容体は、ヒンジをさらに含んでもよい。

【0032】

本発明のモノボディベースのキメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドに関してもよい。

【0033】

本発明は、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関してもよい。

【0034】

本発明は、前記モノボディベースのキメラ抗原受容体を細胞表面膜上に発現させる操作された免疫細胞に関してもよい。

【0035】

前記免疫細胞は、白血球、好中球、好酸球、好塩基球、単核球、リンパ球、Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、樹状細胞、またはそれらの組み合わせであってもよい。

【0036】

本発明は、前記免疫細胞を含む、癌を治療するための薬学的組成物に関してもよい。

【発明の効果】

【0037】

本発明に係るモノボディベースのキメラ抗原受容体、それを細胞表面膜上に発現させた免疫細胞、及びそれを用いて癌を予防または治療する組成物は、以下の効果を示す。

【0038】

１）急速な細胞増殖のみを抑制する従来方式の放射線治療法またはＤＮＡヌクレオチド類似体（シスプラチン系及び５－ＦＵ系）などの化学療法治療において、正常細胞の成長まで抑制することにより発生する副作用（例えば、脱毛や消化障害）を下げることができる。

【0039】

２）ヒトＦＮ３ベースの小さいサイズのモノボディを用いるため、動物由来の抗体ベースの抗癌治療法として用いられている標的抗体治療法と、マウスモノクローナル抗体のライブラリーから得られたｓｃＦｖを用いたキメラＴ細胞治療法とで発生する自己免疫疾患の副作用や抗癌剤耐性による癌細胞の転移などを最低限に抑えることができる。

【0040】

３）癌に対する殺傷能力がなく、不安定で、寿命が短いので診断のためのみに用いられていたモノボディの限界を超えて、癌抗原（例えば、ＥｐｈＡ２）を発現する固形癌を効果的に抑制または除去することができるので、癌の診断と治療が同時に可能である。

【0041】

４）モノボディベースのＣＡＲ免疫細胞は、従来のＴ細胞を単独で投与する固形癌治療と比較して、抗癌効果に優れており、例えば、ＥｐｈＡ２を抗原として発現する膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌などの固形癌を治療または予防するための免疫抗癌剤として用いることができる。

【0042】

５）ＦＮ３モノボディは、標的抗原に対して様々な種類のモノボディを作製できるという利点を有する。それにより、様々な抗原に対して特異的なモノボディベースのＣＡＲ免疫細胞を作製することができるので、癌の治療に非常に効果的である。

【0043】

６）モノボディベースのＣＡＲ免疫細胞は、他のＣＡＲ免疫細胞と比較してサイズが小さく（例えば、モノボディのサイズは、ｓｃＦｖサイズの約１／３）、ｓｃＦｖベースのＣＡＲよりも癌組織への浸透が容易であり、ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ＣＡＲをウイルスベクターに作製したい場合、ウイルスパッキング（ｖｉｒａｌ ｐａｃｋｉｎｇ）を考慮し、最大４個まで癌抗原を認識するモノボディ配列をベクターに組み込むことができ、固形癌の特性である癌抗原の多様性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）を克服できるメリットになる。また、癌抗原に対して十分な選択性及び特異性を有するため、癌の免疫細胞の回避などを遮断し、癌を効果的に予防または治療することができる。

【図面の簡単な説明】

【0044】

【図1】モノボディベースのキメラ抗原受容体を発現するベクターの構造を示す図である。

【図2A】モノボディベースのキメラ抗原受容体を発現するベクターの作製方法を示す図である。

【図2B】モノボディベースのキメラ抗原受容体を発現するベクターの作製方法を示す図である。

【図3】モノボディベースのキメラ抗原受容体が細胞膜表面上に発現された構造を示す図である。

【図4】Ｅ１モノボディキメラ抗原受容体を発現するベクターが組み込まれた免疫細胞におけるベクターの発現程度をＦＡＣＳで分析した結果図である。

【図5】ＶＥＣ－１及びＶＥＣ－２免疫細胞において、Ｔ細胞活性因子であるＣＤ２５及びＣＤ６９の活性度をＦＡＣＳで分析した結果図である。

【図6】固形癌細胞（胃癌、大腸癌、膵臓癌、卵巣癌及び前立腺癌）におけるＥｐｈＡ２タンパク質の発現の程度をＦＡＣＳで分析した結果図である。

【図7】ＲＴＣＡを用いて分析したＶＥＣ－１及びＶＥＣ－２免疫細胞の癌細胞殺害能を示す図である。

【図8】３Ｄ共培養法を用いたＥ１モノボディＣＡＲ－Ｔ（ＶＥＣ－１）免疫細胞の癌細胞殺害能を示した図である。

【図9】異種移植マウスモデルにおける腫瘍サイズの変化を示す図である。

【図10】異種移植マウスモデルにおけるマウスの体重変化を示す図である。

【図11】異種移植マウスモデルにおいて、カプラン・マイヤー法を用いたマウスの生存曲線グラフである。

【図12】異種移植マウスモデルにおいて、腫瘍移植後４４日目のマウスの腫瘍サイズを比較した写真である。

【図13】膵臓癌の異種移植マウスモデルにおける膵臓癌腫瘍の転移及び増殖の程度を比較したＩＶＩＳ撮影の結果図である。

【図14】膵臓癌の異種移植モデルにおいて、生物発光イメージングによって分析した膵臓癌の腫瘍増殖曲線を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0045】

本発明で特に定義しない限り、本発明で使用される全ての技術用語及び科学用語は、遺伝子治療法、生化学、遺伝学、及び分子生物学の分野における当業者であれば、一般に理解するものと同じ意味を有する。

【0046】

特に明記しない限り、本発明を実施する際に、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学の従来の技術を利用することができ、それは当該分野の技術に属するものである。

【0047】

モノボディベースのキメラ抗原受容体
本発明のモノボディベースのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。

【0048】

本発明のモノボディベースのキメラ抗原受容体は、細胞外リガンド結合ドメインを有してもよい。

【0049】

本発明に用いられる「細胞外リガンド結合ドメイン」なる用語は、リガンドに結合することができるオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。好ましくは、ドメインは、細胞表面分子と相互作用することができる。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、任意の疾患に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するために選択されてもよい。

【0050】

本発明に用いられる「モノボディ（ｍｏｎｏｂｏｄｙ）」なる用語は、標的細胞の表面に存在するリガンドまたは抗原に特異的に結合するものである。モノボディは、所望の標的に応じて様々に選択することができる。例えば、モノボディは、ＣＲＬ１、エフリン受容体、ＥｐｈＡ２、β－ガラクトシダーゼ（β－ｇａｌａｔｏｓｉｄａｓｅ）、ＲＡＳ、Ａｂｌキナーゼ、ＶＥＧＦＲ２、ＭＢＰ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、Ｂｃｒ－Ａｂｌキナーゼ、ＳＴＡＴ３、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ヒトＬｙｎチロシンキナーゼのＳＨ３ドメイン、ＭＬＫＬ、Ｆｌｕｃ同族体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ）、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）、ＥＲＫ２、ＭＡＰＫ１４、キナーゼＳＨ２ドメイン、ＳＵＭＯ、ＡｕｒＡ、ＷＤＲ５、Ｆｌｕｃファミリー、ＧＦＰ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体結合ドメイン、ＦＹＮのＳＨ３ドメイン、ＡＢＬのＳＨ２ドメイン、ＳＵＭＯ１、Ｂｃｒ－Ａｂｌ、ＧＰＲ５６ ＥＣＲ、ＰＤ－Ｌ１、グリピカン－３、ＰＣＳＫ９、Ｇｐ４１、ＣＤ４、及びＩＬ－２３からなる群から選択されるタンパク質に特異的に結合してもよいが、それらに限定されるものではない。

【0051】

さらに、モノボディは、公知のものであってもよい。

【0052】

モノボディは、エフリン受容体、ＥｐｈＡ２、またはヒトＥｐｈＡ２に特異的に結合してもよい。

【0053】

モノボディは、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有してもよい。

【0054】

モノボディベースのＣＡＲは、ヒンジ、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインからなる群から選択される少なくとも１つをさらに含んでもよい。

【0055】

さらに、モノボディベースのＣＡＲは、細胞表面膜上に発現される。よって、モノボディベースのＣＡＲは、膜貫通ドメインを含んでもよい。適切な膜貫通ドメインの際立った特徴は、細胞、好ましくは、本発明では免疫細胞（特にリンパ球細胞またはＮＫ細胞）の表面上に発現され、所定の標的細胞に対する免疫細胞の細胞応答を誘導するために相互作用する能力を備える。膜貫通ドメインは、天然供給源または合成供給源に由来してもよい。膜貫通ドメインは、任意の膜結合または膜貫通タンパク質に由来してもよい。

【0056】

前記膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体アルファ鎖、Ｔ細胞受容体ベータ鎖、Ｔ細胞受容体ゼータ鎖、ＣＤ８アルファ鎖、ＣＤ８ベータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、それらの一部、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つであってもよい。

【0057】

ヒンジ及び膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ８アルファ鎖またはその一部を含んでもよい。ヒンジ及び膜貫通ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列を含んでもよく、好ましくは、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。

【0058】

モノボディベースのＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫細胞及び免疫応答の活性化を引き起こす標的に細胞外リガンド結合ドメインを結合させた後に、細胞内シグナル伝達の原因となり得る。シグナル伝達ドメインは、モノボディベースのＣＡＲを発現する免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化の原因となり得る。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む細胞傷害活性またはヘルパー活性であってもよい。

【0059】

本発明に用いられる「シグナル伝達ドメイン」なる用語は、免疫細胞内のエフェクター機能シグナルを変換し、特別な機能を果たすために、細胞を誘導するタンパク質の一部を指す。

【0060】

細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＦｃＲイプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄからなる群から選択される少なくとも１つを含んでもよい。

【0061】

前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０ドメイン、ＣＤ２ドメイン、ＣＤ２７ドメイン、ＣＤ２８ドメイン、ＣＤＳドメイン、ＩＣＡＭ－１ドメイン、ＬＦＡ－１ドメイン及び４－１ＢＢドメインからなる群から選択される少なくとも１つを含んでもよい。

【0062】

細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８ドメイン、４－１ＢＢドメイン、及びＣＤ３ゼータドメインからなる群から少なくとも１つを含んでもよく、好ましくは、ＣＤ２８ドメイン及びＣＤ３ゼータドメイン、または４－１ＢＢドメイン及びＣＤ３ゼータドメインを含んでもよい。

【0063】

ＣＤ２８ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列、または少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。

【0064】

４－１ＢＢドメインは、配列番号１１のアミノ酸配列、または少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。

【0065】

ＣＤ３ゼータドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列、または少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。

【0066】

ポリヌクレオチド及びベクター
本発明は、モノボディベースのＣＡＲをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド、またはそのような核酸配列またはポリヌクレオチドを含むベクターに関する。ここで、ベクターは、発現ベクターを意味してもよい。

【0067】

ポリヌクレオチドは、配列番号２の核酸配列を含んでもよい。ポリヌクレオチドは、配列番号２の核酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有する核酸配列を含んでもよい。

【0068】

ポリヌクレオチドは、配列番号１～６のうち少なくとも１つの核酸配列を含んでもよく、あるいは配列番号１～６の核酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有する各核酸配列を少なくとも１つ含んでもよい。

【0069】

モノボディベースのＣＡＲをコードする核酸配列は、ヒト細胞における発現のために、コドン最適化されてもよい。

【0070】

本発明に用いられる「ベクター」は、少なくとも１つの目的の遺伝子または配列を宿主細胞内に送達することができる、好ましくはそれを発現することができる構築物を意味してもよい。例えば、ウイルスベクター、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性縮合剤と結合したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソームにカプセル化されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、及び特定の真核細胞、例えば、プロデューサー細胞を含むが、それらに限定されるものではない。

【0071】

ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス パルボウイルス（例えば、アデノ関連ウイルス）、コロナウイルス、ネガティブ鎖ＲＮＡウイルス、例えば、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病及び水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、はしか及びセンダイ）、ポジティブ鎖ＲＮＡウイルス、例えば、ピコルナウイルス及びアルファウイルス、並びにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型及び２型、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス）、及びポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘、及びカナリア痘）を含む二本鎖ＤＮＡウイルスを含んでもよい。ベクターとして使用され得る他のウイルスは、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、及び肝炎ウイルスであってもよい。レトロウイルスの例としては、トリ白血病肉腫（ａｖｉａｎ ｌｅｕｋｏｓｉｓ－ｓａｒｃｏｍａ）、哺乳動物Ｃ型、Ｂ型ウイルス Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ－ＢＬＶ群、レンチウイルス、スプーマウイルスが含まれる。

【0072】

免疫細胞を操作する方法
本発明は、免疫細胞にモノボディベースのＣＡＲを導入し、前記細胞を拡大することを含む、免疫療法のための免疫細胞を作製する方法に関する。

【0073】

本発明は、免疫細胞を提供するステップと、前記免疫細胞へポリヌクレオチドを導入するステップとを含む、免疫細胞を操作する方法に関する。

【0074】

本発明は、免疫細胞を提供し、前記細胞の表面上にモノボディベースのＣＡＲを発現させることを含む、免疫細胞を操作する方法に関する。

【0075】

本発明は、モノボディベースのＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドで免疫細胞を修飾し、前記ポリヌクレオチドを前記細胞に発現させることを含んでもよい。本発明の免疫細胞を作製または操作する方法は、インビトロまたは生体外の方法であってもよい。前記ポリヌクレオチドは、細胞における安定した発現のために、レンチウイルスベクターに含まれてもよい。

【0076】

操作された免疫細胞
本発明は、前記免疫細胞の作製方法または操作方法により得られる単離された細胞または細胞株に関する。ここで単離された細胞は、モノボディベースのＣＡＲを含んでもよい。

【0077】

本発明の単離された細胞は、異なる細胞外リガンド結合ドメインを有するＣＡＲの集団を含んでもよい。特に、前記単離された細胞は、ＣＡＲをコードする外因性ポリヌクレオチド配列を含んでもよい。

【0078】

本発明の免疫細胞は、先天性及び／または後天性免疫応答の開始及び／または実行において、機能的に含まれる造血起源の細胞を意味してもよい。本発明の免疫細胞は、幹細胞に由来してもよい。幹細胞は、成人幹細胞、非ヒト胚性幹細胞、非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、多能性幹細胞、または造血幹細胞であってもよい。

【0079】

本発明の免疫細胞は、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞であってもよい。一実施形態において、単離された細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、肥満細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞または炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球またはヘルパーＴリンパ球からなる群から選択されるＴ細胞であってもよい。一実施形態において、前記細胞は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球及びＣＤ８＋Ｔリンパ球からなる群に由来してもよい。

【0080】

細胞は、様々な非限定的な方法によって被験体から得られる。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染症部位からの組織、腹水、胸膜滲出液、脾臓組織、及び腫瘍を含む複数の非限定的な供給源から得ることができる。

【0081】

利用可能で当業者に知られている任意のＴ細胞株を用いてもよい。前記細胞は、健康なドナーに由来してもよく、癌診断を受けた患者に由来してもよく、あるいは感染症の診断を受けた患者に由来してもよい。前記細胞は、異なる表現型特徴を示す細胞の混合集団の一部であってもよい。前記の方法に従って操作されたＴ細胞から得られた細胞株を用いることができ、本発明に係る免疫細胞は、免疫抑制処理に対して耐性を有してもよい。

【0082】

前記免疫細胞は、白血球、好中球、好酸球、好塩基球、単核球、リンパ球、Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、樹状細胞、またはそれらの組み合わせであってもよいが、それらに限定されるものではない。

【0083】

モノボディベースのＣＡＲ免疫細胞を用いた治療
モノボディベースのＣＡＲ免疫細胞、操作された免疫細胞、またはそれらの細胞の集団は、癌を予防または治療するための薬学的組成物として用いてもよい。

【0084】

本発明は、モノボディベースのＣＡＲ免疫細胞または操作された免疫細胞を含む、癌を予防または治療するための薬学的組成物に関する。

【0085】

本発明は、モノボディベースのＣＡＲ免疫細胞をそれを必要とする対象に投与するステップを含む、それを必要とする対象における癌を予防または治療する方法に関する。

【0086】

本発明は、癌を予防または治療するための薬剤を製造するためのモノボディベースのＣＡＲ免疫細胞の用途に関する。

【0087】

本発明は、癌を予防または治療するために用いるためのモノボディベースのＣＡＲ免疫細胞であってもよい。

【0088】

本発明に用いられる「対象体」なる用語は、哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物には、家畜、ペット、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、及びラットなどが含まれるが、それらに限定されるものではない。

【0089】

本発明において、前記治療は、自己免疫療法の一部または同種異系免疫療法療法の一部であってもよい。自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）とは、対象体を治療するために使用される細胞、細胞株または細胞の集団が、前記対象体からまたはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と適合性のあるドナーから得られたことを意味してもよい。同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）とは、対象体を治療するために使用される細胞または細胞の集団が対象から得られたのではなく、ドナーから得られたものを意味してもよい。

【0090】

癌は、黒色腫、扁平上皮癌、乳癌、頭頸部癌、甲状腺癌、軟部組織肉腫、骨肉腫、精巣癌、前立腺癌、卵巣癌、膀胱癌、皮膚癌、脳癌、血管肉腫、肥満細胞腫、白血病、リンパ腫、肝臓癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、腎臓癌、大腸癌、造血器腫瘍またはそれらの転移癌であってもよく、それらに限定されるものではない。さらに、癌は、非固形腫瘍または固形癌であってもよい。

【0091】

非固形腫瘍または非固形癌は、骨髄腫、リンパ腫、または白血病であってもよいが、それらに限定されるものではない。

【0092】

固形癌は、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、子宮頸癌、皮膚癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳癌、及び肺癌からなる群から選択される少なくとも１つであってもよいが、それらに限定されるものではない。

【0093】

以下の実施例は、例示のみを目的として提供されており、本発明の範囲をいかなる形でも限定するものではない。実際、本発明に提示され記載されたものに加えて、本発明の様々な変形は、前記の記載から関連技術分野の当業者には明らかであり、それは添付の特許請求の範囲内に含まれる。

【0094】

従来の抗癌免疫治療は、マウスに基づく抗体分子、具体的には抗体断片（ｓｃＦｖ）によりヒト癌抗原を認識して結合した後、様々なサイトカイン分泌または周辺免疫細胞の攻撃によって癌細胞が除去される血液癌治療法として知られているが、動物由来の抗体による副作用、ｓｃＦｖのサイズによる組織への浸透力の低さ、及び固形癌の場合、患者ごとに異なる抗原を発現する特性（Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）によって少なくとも２つ以上の抗原を同時に認知する必要があるという問題点がある。

【0095】

本発明では、そのようなｓｃＦｖの欠点を補うために、ヒトフィブロネクチンＦＮ３をベースとするモノボディをキメラ抗原受容体の細胞外リガンド結合部位として用いると、優れた固形癌の予防及び治療効果を有することを確認した。

【実施例1】

【0096】

モノボディベースのキメラ抗原受容体を発現するベクターの調製
１．組換えレンチウイルスベクターの調製のための準備
モノボディベースのキメラ抗原受容体を発現する組換えプラスミドベクターの調製のために、以下の菌株及びベクターを準備した。

【0097】

（１）複製対象となるベクター
ヒトＥｐｈＡ２に特異的に結合するモノボディ（以下、Ｅ１モノボディ）を発現する核酸配列（配列番号２）を含むｐＥＴｈ－Ｅ１ＧＳＥ１ベクターを、全南大学産学協力団所属のホン・ヨンジン教授研究チームから分譲を受け、キメラ抗原受容体を発現するベクターを準備した。具体的には、発現ベクターは、インビトロジェン社のｐＬｅｎｔｉ７．３／Ｖ５－ＤＥＳＴ^ＴＭ Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標） Ｖｅｃｔｏｒを用い、前記ｐＬｅｎｔｉ７．３／Ｖ５－ＤＥＳＴベクターの５’ＵＴＲと３’ＵＴＲの間に、ＣＤ８αリーダー配列－ＭＳＬＮｓｃＦｖ－ＣＤ８ Ｈ＆ＴＭ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζまたはＣＤ８αリーダー配列－ＭＳＬＮ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ Ｈ＆ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζからなるキメラ抗原受容体を発現する核酸配列を含むようにした。そのように２つのレンチウイルスベクターを準備した（ｐＬｅｎｔｉ７．３：：ＣＤ８αリーダー配列－ＭＳＬＮｓｃＦｖ－ＣＤ８ Ｈ＆Ｔ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζベクター及びｐＬｅｎｔｉ７．３：：ＣＤ８αリーダー配列－ＭＳＬＮｓｃＦｖ－ＣＤ８ Ｈ＆Ｔ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζベクター）。

【0098】

組換えプラスミドベクター中のモノボディベースのキメラ抗原受容体を構成する核酸配列を以下の表１に示す。

【0099】

【表1】

【0100】

表１の核酸配列は、免疫細胞内で発現され、以下の表２のアミノ酸配列からなるモノボディベースのキメラ抗原受容体を細胞表面膜上に発現させることができる。

【0101】

【表2】

【0102】

（２）ベクター複製のための細胞の準備
ｐＥＴｈ－Ｅ１ＧＳＥ１ベクターのための宿主細胞：Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α（Ｆ－ｅｎｄＡ１ ｇｌｎＶ４４ ｔｈｉ－１ ｒｅｃＡ１ ｒｅｌＡ１ ｇｙｒＡ９６ ｄｅｏＲ ｎｕｐＧ ｐｕｒＢ２０ φ８０ｄ ｌａｃＺΔＭ１５ Δ（ｌａｃＺＹＡ－ａｒｇＦ）Ｕ１６９，ｈｓｄＲ１７（ｒＫ－ｍＫ＋），λ－）
ｐレンチウイルスベクターのための宿主細胞：Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓｔｂｌ３（Ｆ－ｍｃｒＢ ｍｒｒｈｓｄＳ２０（ｒＢ－，ｍＢ－）ｒｅｃＡ１３ ｓｕｐＥ４４ ａｒａ－１４ ｇａｌＫ２ ｌａｃＹ１ ｐｒｏＡ２ ｒｐｓＬ２０（Ｓｔｒ^Ｒ）ｘｙｌ－５ λｌｅｕｍｔｌ－１），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）

【0103】

前記宿主細胞をＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）固体培地（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社，ＵＳＡ）を用いて３７℃、２００ｒｐｍの条件下で培養し、全ての培地に１００μｇ／ｍＬのカナマイシンまたはアンピシリンを加えて、宿主細胞を準備した。その後、培養した各宿主細胞の単一コロニーをＬＢ液体培地（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社，ＵＳＡ）に接種して前培養し、それをＳＯＢ（Ｓｕｐｅｒ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｂｒｏｔｈ）培地に１％接種して、１８℃で２４時間培養してから、Ｉｎｏｕｅ ＴＢバッファーで洗浄して準備した。

【0104】

（３）ベクター大量生産のための形質転換細胞の調製
前記準備した各ベクターと宿主細胞を混合し、その後、氷に１０分間静置し、４２℃で９０秒間、氷で３分間処理して、各ベクターが組み込まれた形質転換細胞を作製した。前記作製した形質転換細胞を抗生物質を含むＬＢ固体培地に塗抹した後、３７℃で培養した。それにより、各ベクターを大量に準備した。

【0105】

２．Ｅ１モノボディ－キメラ抗原受容体を発現する組換えレンチウイルスベクターの調製
前記で準備した２つのレンチウイルスベクター（ｐＬｅｎｔｉ７．３：：ＣＤ８αリーダー配列－ＭＳＬＮｓｃＦｖ－ＣＤ８ Ｈ＆Ｔ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζベクター及びｐＬｅｎｔｉ７．３：：ＣＤ８αリーダー配列－ＭＳＬＮｓｃＦｖ－ＣＤ８ Ｈ＆Ｔ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζベクター）から、ｓｃＦｖ配列を除いたレンチウイルスベクターを調製した。まず、２種類のベクターを鋳型として、下記表３のＣＰＬ－Ｆプライマー、ＣＰＬ－Ｒプライマー、及びＣｌｏｎｅＡｍｐ ＨｉＦｉ ＰＣＲプレミックス（Ｔａｋａｒａ社）を用いてインバースＰＣＲを行った。そのように増幅されたベクターを分離精製し、２種類のＭＳＬＮｓｃＦｖ－ｆｒｅｅキメラ抗原受容体ベクターを準備した。

【0106】

Ｅ１モノボディ配列は、ｐＥＴｈ－Ｅ１ＧＳＥ１ベクターを下記表３のＥ１－Ｆプライマー及びＥ１－Ｒプライマーを用いてＰＣＲを行って増幅し、その後、分離及び精製して準備した。

【0107】

【表3】

【0108】

準備したベクター及びＥ１モノボディ配列を、Ｏｖｅｒｌａｐ ｃｌｏｎｅｒ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｅｌｐｉｓｂｉｏ社）を用いた相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）法によりｓｃＦｖ配列が存在した部位にＥ１モノボディ配列を挿入し、Ｅ１モノボディを含むキメラ抗原受容体を発現する組換えレンチウイルスベクター（ｐＬｅｎｔｉ７．３－ＥｐｈＡ２モノボディキメラ抗原受容体ベクター）を調製した。調製された組換えレンチウイルスベクターを、それぞれＥｐｈＡ２ ｍＣＡＲ－１及びＥｐｈＡ２ ｍＣＡＲ－２と命名した。その構造を図１に示す。前記ベクターの調製方法の模式図を図２Ａ及び２Ｂに示す。

【実施例2】

【0109】

Ｅ１モノボディ－キメラ抗原受容体を細胞膜表面上に発現させた免疫細胞の調製（ＶＥＣ－１及びＶＥＣ－２）及び評価
１．組換えレンチウイルスベクターを含むレンチウイルスの作製
実施例１で調製したＥｐｈＡ２ ｍＣＡＲ－１及びＥｐｈＡ２ ｍＣＡＲ－２を含むレンチウイルスを準備した。

【0110】

２．免疫細胞の準備及びウイルス感染による形質導入
（１）ＰＢＭＣからＣＤ３＋Ｔ細胞の分離
ヒトドナー血液から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をリンフォプレップ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ^ＴＭ，ＳＴＥＭＣＥＬＬ）に分離した。その後、ＣＤ３マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて陽性選択（Ｐｏｓｉｔｉｖｅｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）法により、分離したＰＢＭＣからヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を分離した。

【0111】

（２）ＣＤ３＋Ｔ細胞の活性化
抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズ（ａｎｔｉ－ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄ；Ｇｉｂｃｏ社）と、分離したヒトＣＤ３＋Ｔ細胞とを１：１で混合した。混合２４時間後、活性化磁気ビーズをＭＡＣＳｉＭＡＧセパレータ機構を用いて除去した。その後、ＲＰＭＩ－１６４０を用いて細胞を洗浄した。

【0112】

（３）レンチウイルスへの形質導入
ポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いたウイルス感染法により、レンチウイルスに感染したＴ細胞を調製した。具体的に活性化されたヒトＣＤ３＋Ｔ細胞に、ＥｐｈＡ２ ｍＣＡＲ－１及びＥｐｈＡ２ ｍＣＡＲ－２をそれぞれ含むレンチウイルスを感染させ、２４時間後にウイルス培地を交換した。感染の４８時間後から細胞の増殖が始まる。そのようにして調製された操作された免疫細胞をそれぞれＶＥＣ－１及びＶＥＣ－２と名付けた（それぞれＥｐｈＡ２ ｍＣＡＲ－１及びＥｐｈＡ２ ｍＣＡＲ－２を含む）。モノボディベースのキメラ抗原受容体が細胞膜表面上に発現された構造を図３に示す。

【0113】

３．操作された免疫細胞の評価
前記で調製したＶＥＣ－１及びＶＥＣ－２免疫細胞から導入したＥｐｈＡ２ ｍＣＡＲ－１及びＥｐｈＡ２ ｍＣＡＲ－２ベクターが正しく発現されるか否か、及びそのような免疫細胞の活性状態をＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌｓｏｒｔｉｎｇ）を利用して確認した。

【0114】

実験にはＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメトリー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いた。各免疫細胞について、抗ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ；緑色蛍光タンパク質）抗体を用いて、導入されたベクターの発現の有無を確認した。当該ベクターにはＧＦＰ発現部位が一緒に存在するため、そのようなベクターを大量に発現している免疫細胞では、抗ＧＦＰ抗体による分析結果が高く測定されるはずである。また、抗ＣＤ２５－ＰＥ抗体（ＰＥ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ２５，ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ^ＴＭ）と抗ＣＤ６９－ＡＰＣ抗体（ＡＰＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ６９，ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（登録商標））でＴ細胞への活性化の有無を確認した。

【0115】

導入されたベクター（すなわち、Ｅ１モノボディ－キメラ抗原受容体配列）の発現率をＦＡＣＳで比較分析したところ、ベクターを導入していない対照群に対して、ＶＥＣ－１免疫細胞は、約４０％の発現率を示し、ＶＥＣ－２免疫細胞は、約３０％の発現率を示した（図４を参照）。それらの結果から、免疫細胞に導入されたベクターが良好に発現されること、並びに操作された免疫細胞ＶＥＣ－１及びＶＥＣ－２内でＥ１モノボディ－キメラ抗原受容体が適切に発現されることが確認された。

【0116】

また、操作された免疫細胞ＶＥＣ－１及びＶＥＣ－２では、細胞増殖活性マーカーであるＣＤ２５が対照群と同様に発現されること、及び細胞傷害性Ｔ細胞の活性マーカーであるＣＤ６９が対照群に比べてより大量に発現されることが確認された（図５を参照）。よって、ＶＥＣ－１とＶＥＣ－２は、いずれも活性状態であることが確認された。

【実施例3】

【0117】

インビトロで癌細胞殺害能の評価
Ｅ１モノボディ－キメラ抗原受容体を発現する操作された免疫細胞ＶＥＣ－１及びＶＥＣ－２のＥｐｈＡ２特異的癌抗原に対する抗癌能力を評価するために、ＥｐｈＡ２を発現する癌細胞（卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ－３；膵臓癌細胞株ＣＡＰＡＮ－２及びＡｓＰＣ－１；前立腺癌細胞株ＰＣ－３、ＭＳＩ－Ｈ 胃癌細胞株ＳＮＵ６３８及びＭＳＩ－Ｈ 大腸癌細胞株ＤＬＤ１、Ｌｏｖｏ、ＨＣＴ８、ＨＣＴ１５、図６を参照）と、Ｅ１モノボディＣＡＲ－Ｔ細胞（すなわち、ＶＥＣ－１及びＶＥＣ－２細胞）とを共培養し、操作された免疫細胞の癌細胞殺害能を測定した（図７、図８を参照）。

【0118】

（１）韓国細胞株銀行（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ）から卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ－３；膵臓癌細胞株Ｃａｐａｎ－２及びＡｓＰＣ－１；及び前立腺癌細胞株ＰＣ－３；胃癌細胞株ＳＮＵ６３８、大腸癌細胞株ＤＬＤ１、ＬｏＶｏ、ＨＣＴ－８、ＨＣＴ－１５を購入して用いた。

【0119】

それらの細胞株において、ＥｐｈＡ２が発現されるかどうかを確認するために、抗ＥｐｈＡ２抗体を用いてＥｐｈＡ２抗原の発現の有無及び発現程度をＦＡＣＳにより分析した。その結果、それらの癌細胞株は、全てＥｐｈＡ２を高レベルで発現することが確認され（図６を参照）、それを用いてＥｐｈＡ２を標的とするＥ１モノボディＣＡＲ－Ｔ細胞の癌細胞殺害能を確認することができるはずである。

【0120】

（２）前記でＥｐｈＡ２抗原の発現が確認された癌細胞株を、各ウェルに１×１０^４個ずつ９６ウェルプレートに播種し、ＢＳＣに３０分間置いた後、癌細胞を３７℃、５％ＣＯ^２条件下、細胞培養器で２４時間培養した。その後、各ウェル当たり４×１０^４個のＥ１モノボディＣＡＲ－Ｔ細胞（すなわち、ＶＥＣ－１及びＶＥＣ－２細胞）を処理し、７２～９０時間共培養しながら、ＲＴＣＡで細胞の生存有無及び細胞運動活性を以下のように分析した。

【0121】

（３）ＲＴＣＡ（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ，ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）による運動学分析
マイクロタイタープレート（Ｅ－Ｐｌａｔｅ）ウェル（ｗｅｌｌ）の底面に付着した金微小電極（ｇｏｌｄ ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ）をバイオセンサーとして用いた。導電性溶液（例えば、緩衝液または標準的な組織培養培地）に浸漬し、そのような電極（バイオセンサの両端）に電位を印加すると、電子がカソード端子を出る。この電子はバルク溶液を通過し、アノード端子に堆積され、回路を完成する。電極－溶液の界面に付着細胞が存在すると電子の流れが妨げられるが、それはバルク溶液とバイオセンサーの間の相互作用に応じて信号が変化するからである。よって、細胞が成長している間に発生するインピーダンスという抵抗値を測定することで、様々な細胞反応（細胞数、増殖速度、細胞サイズ、細胞の形状、基質付着状態の変化）を運動学（ｋｉｎｅｔｉｃ）で自動測定できるようになる。細胞によって検知された抵抗値は、Ｃｅｌｌ Ｉｎｄｅｘ（ＣＩ）という指標で表され、ＣＩ値の変化は細胞の形状変化を示す。

【0122】

（４）形質導入されたＥ１モノボディＣＡＲ－Ｔ細胞（ＶＥＣ－１またはＶＥＣ－２）と、形質導入されていないヒトＴ細胞（対照群）との癌細胞に対する殺害能を比較して分析したところ、対照群に対して、ＶＥＣ－１とＶＥＣ－２の殺害能が著しく増加する（２０～１００％）ことをＲＴＣＡによる分析によって確認した（図７を参照）。それらの結果から、本発明による操作された免疫細胞が、優れた癌細胞殺害能を有することが分かる。

【0123】

（５）３Ｄ共培養法を用いたＥ１モノボディＣＡＲ－Ｔ（ＶＥＣ－１）免疫細胞の癌細胞殺害能を対照群と比較して評価した。

【0124】

１×１０^３細胞数で前立腺癌細胞（ＰＣ－３）を９６ウェルプレート（９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に播種し、その後、３日間培養後に形成された球状（ｓｐｈｅｒｅ）に２×１０^３細胞数のＶＥＣ－１を培地に入れて共培養してから、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社のＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標） Ｓ３ Ｌｉｖｅ－Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ－Ｔ細胞対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ－Ｔ）とＶＥＣ－１の癌細胞殺傷能力を比較して分析したところ、対照群よりも先だって、ＶＥＣ－１が共培養５８分後から前立腺癌細胞株（ＰＣ－３）球状構造物に侵入して球状構造を破壊し、細胞株に対する殺害が行われることが観察された。共培養１４時間５８分には、ＶＥＣ－１が前立腺癌細胞（ＰＣ－３）の球状（ｓｐｈｅｒｅ）構造を完全に消滅させることが観察されるのに対し、ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ－Ｔ細胞対照群は、球状構造の形態を破壊することなく球状を保持したまま、球状形態中央で観察された（図８を参照）。

【実施例4】

【0125】

異種移植マウスモデルにおける免疫細胞の抗腫瘍能の評価
全ての動物実験は、生命倫理委員会（ＩＡＣＵＣ，全南大学，大韓民国）の承認を受けて行われた。４週齢の雌ＮＳＧ（ＮＯＤ ＳＣＩＤ ｇａｍｍａ）マウスは、和順ワクチンセンターＳＰＦ動物実験室から供給された。

【0126】

膵臓癌細胞ＡｓＰＣ－１／ｌｕｃは、ＰＢＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ社）と高濃度マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）を１：１で混合した溶液に、４×１０^６細胞／２００ｕＬ～８ｘ１０^６細胞／２００ｕＬの濃度で浮遊させた。ＰＣ－３細胞は、ＰＢＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ社）と高濃度マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）を１：１に混ぜた溶液に、３×１０^６細胞／１００ｕＬ～１×１０^７細胞／１００ｕＬの濃度で浮遊させた。実験では、マウスの右脇腹にＡｓＰＣ－１／ｌｕｃ（２×１０^６細胞）、ＰＣ－３（３×１０^６細胞）を皮下注射した。

【0127】

腫瘍のサイズが１００～１５０ｍｍ^３に達したとき、用意されたＰＢＳ、対照群Ｔ細胞、ＶＥＣ－１、ＶＥＣ－２免疫細胞１×１０^７／２００ｕＬを静脈内に１回注射した。マウスはグループごとに５～１０匹を使用し、腫瘍のサイズとマウスの体重は週に２回測定した。

【0128】

１．細胞解凍（Ｃｅｌｌ ｔｈａｗｉｎｇ）及び細胞培養（Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ）
実験材料：ＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ社）、ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）、Ｐ／Ｓ（Ｇｉｂｃｏ社）、Ｌ－グルタミン２００ｍＭ（Ｇｉｂｃｏ社）、１００φ細胞培養フラスコ、バスケット、腫瘍細胞株（ＡｓＰＣ－１及びＰＣ－３）、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １８ ＡＯ・ＤＡＰＩ（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ社）、ＰＢＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ社）、ＴｒｙｐＬＥ^ＴＭ（Ｇｉｂｃｏ社）。ヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ－１及びヒト前立腺癌細胞株ＰＣ－３は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から供給されたものを用いた。ルシフェラーゼを発現するヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ－１／ｌｕｃは、ＪＣＲＢ（Ｃｅｌｌ ｂａｎｋ，Ａｕｓｔｒａｉｌｉａ）から供給されたものを用いた。

【0129】

細胞解凍：液体窒素タンクから腫瘍細胞株を３７℃の恒温水浴に入れて急速に解凍し、その後、薄氷が浮いたところでクリーンベンチに移し、１５ｍＬの円錐形チューブに入れた。細胞培養培地（ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓ＋２ｍＭ Ｌ－グルタミン）９ｍＬを１５ｍＬのチューブに入れ、３５０ｇ、３分条件で遠心分離した。上澄み液を除去し、１ｍＬの細胞培養液を加えて完全に再浮遊させた後、９ｍＬの細胞培養液を加えて１０ｍＬに合わせてから再浮遊させた。細胞数カウント溶液（ＰＢＳ：Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １８＝９０：５）を用いて細胞数を計算し、細胞密度を０．５×１０^６／１０ｍＬ及び１×１０^６／１０ｍＬ（それぞれＰＣ－３及びＡｓＰＣ－１に対して）に合わせて１００φフラスコに細胞を広げた。その後、３日間隔で（細胞密度が７０～８０％になる場合）継代培養した。

【0130】

継代培養：フラスコ中の上澄み液を除去し、その後、１０ｍＬのＰＢＳを入れて細胞残渣などの不純物を除去するために洗浄してから、上澄み液を捨てた。細胞をフラスコから剥離するために、ＴｒｙｐＬＥ^ＴＭ（２ｍＬまたは４ｍＬ）をそれぞれ１００φ及び１５０φフラスコに入れた。顕微鏡で観察し、細胞が丸い形をして浮遊したら、１０ｍＬまたは３０ｍＬの細胞培養培地（ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓ＋２ｍＭ Ｌ－グルタミン）を入れ、細胞を５０ｍＬの円錐形チューブに入れて５００ｇ、３～５分間遠心分離した。上澄み液を除去し、その後、１ｍＬの細胞培養液を入れて再浮遊させてから、９ｍＬの細胞培養液を入れた。細胞数カウント溶液（ＰＢＳ：Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １８＝９０：５）を用いて細胞数を測定した後、癌細胞（例えば、膵臓癌細胞ＡｓＰＣ－１：１×１０^６／１０ｍＬ）を培養容器に入れて培養した。

【0131】

２．マウスの準備
実験材料：ＰＩＣＯ ５０５３（オリエントバイオ）、ｇ－ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ １８％ｂｅｔａ－ｃｈｉｐ（オリエントバイオ）、滅菌水道水と水ボトル、高圧蒸気滅菌器、クリッパー（ジョンドＢ＆Ｐ）、ウェットティッシュ、Ｉｆｒａｎ液（ハナ製薬）、脱毛剤（ｖｅｅｔ）、呼吸麻酔機及びチャンバー
実験方法：週に２回、飼料（ＰＩＣＯ ５０５３）、敷きわら（ｒ－ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ １８％ベータチップ）、滅菌水道水、ケージを交換した。腫瘍を植える３日前には毛を除去し、実験中に腫瘍がよく見えないほど成長した場合は除去した。マウスは濃度２～３％のイソフルランで呼吸麻酔させ、マウスの右脇の毛をバリカンで除去し、脱毛剤を塗って１分程度置いてから、ウェットティッシュで脱毛剤を拭き取った。

【0132】

３．ヒト腫瘍異種移植マウスモデルの製造
実験材料：細胞、１ｍＬシリンジ（韓国ワクチン社）、２５１／２ Ｇ針（韓国ワクチン社）、高濃度マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）、アイスボックス、ＥＰチューブ、呼吸麻酔機及びチャンバー、Ｉｆｒａｎ液（ハナ製薬社）。マトリゲルの場合、異種移植の前日に冷蔵室でオーバーナイトした。マトリゲルは常温でゲル化するので、常に氷に刺して実験を行った。
実験方法：２～３％のイソフルランで呼吸麻酔したマウスの右側の脇腹にＡｓＰＣ－１／ｌｕｃ（２×１０^６細胞）及びＰＣ－３（３×１０^６細胞）とマトリゲルとを１：１で混合した溶液１００μＬを皮下注射した。また、マウス腹腔にそれぞれ腫瘍細胞株（４×１０^６細胞／１００μＬのＰＢＳ）とマトリゲルとを１：１で混合した溶液１００μＬを皮下注射した。

【0133】

４．キメラ抗原受容体Ｔ細胞の注入
実験材料：２７１／２ Ｇ針（チョンリム社）、１ｍＬシリンジ（韓国ワクチン社）、ＰＢＳ、正常Ｔ細胞（対照群）、Ｅ１モノボディＣＡＲ－Ｔ細胞（ＶＥＣ－１及びＶＥＣ－２）、マウス補正器（ジョンドＢ＆Ｐ社）、熱照射器（ジョンドＢ＆Ｐ社）、７０％アルコール綿、ノギス（ジョンドＢ＆Ｐ社）、体重計、カメラ。
実験方法：マウスの腫瘍サイズ及び体重を測定し、グループごとにマウスの腫瘍サイズ及び体重を同様に調整した。腫瘍サイズが１００～１５０ｍｍ^３に達したとき、２００ｕＬのＰＢＳ及び細胞（１×１０^７／２００μＬの対照群正常Ｔ細胞及びＥ１モノボディＣＡＲ－Ｔ細胞）をマウスの尾静脈に静脈内注射した。

【0134】

５．マウスモニタリング（腫瘍サイズ及び体重測定）
実験材料：呼吸麻酔機及びチャンバー、Ｉｆｒａｎ液（ハナ製薬社）、ノギス（ジョンドＢ＆Ｐ社）、体重計、カメラ。
実験方法：２～３％のイソフルランでマウスを呼吸麻酔した後、週に２回腫瘍サイズと体重を測定した。マウス腫瘍のサイズは、ノギスで長軸（Ｌ）、短軸（Ｗ）、高さ（Ｈ）を測定し、その後、０．５２を乗じて計算し、電子天秤を用いてマウスの体重を測定した。

【0135】

６．実験結果
（１）前立腺癌細胞株を用いた実験
前立腺癌細胞株（ＰＣ－３）１×１０^７細胞／１００μＬ及び１×ＰＢＳをマウス右背中部の皮下組織に異種移植したマウスモデルに、腫瘍生成１２日後、各群ごとにＰＢＳ、対照群Ｔ細胞（ウイルスで形質導入されていない活性化対照群正常Ｔ細胞；Ｃｏｎｔ－Ｔ）、ＶＥＣ－１細胞及びＶＥＣ－２細胞を静脈内注射し、その後、腫瘍サイズをスケールバーで測定した。その結果を図９に示す。

【0136】

図９に示すように、ＶＥＣ－１またはＶＥＣ－２を注入したマウスでは、腫瘍生成２２日以降からは、対照群正常Ｔ細胞またはＰＢＳのみを注入したマウスよりも腫瘍のサイズが有意に減少した。

【0137】

Ｅ１モノボディＣＡＲ－Ｔ細胞を静脈投与し、その後、マウスの体調回復の有無及び投与による副作用の有無を把握するために、マウスの体重を測定した。その結果を図１０に示す。

【0138】

図１０に示すように、ＶＥＣ－１またはＶＥＣ－２を投与したマウスは、対照群正常Ｔ細胞を投与したマウスよりも早く健康状態が回復し、その後正常Ｔ細胞が３０日後に回復傾向を示し始めた。ＰＢＳのみを与えたマウスは、腫瘍のサイズに比例して体重が減少しながら、健康状態が悪化した。

【0139】

実験の終了時点（５０日）における前立腺癌異種移植マウスモデルの生存率をカプラン・マイヤー法を用いて評価した。その結果を図１１に示す。図１１に示すように、ＶＥＣ－１とＶＥＣ－２を投与したマウス群は、いずれも高い生存率を示し、それは対照群正常Ｔ細胞に比べて著しく優れていた。

【0140】

マウスの右背中部に腫瘍を移植してから４４日後、Ｅ１モノボディＣＡＲ－Ｔ細胞（ＶＥＣ－１またはＶＥＣ－２）を静脈注射し、その後２８日目に腫瘍のサイズを測定した。その結果を図１２に示す。図１２に示すように、ＶＥＣ－１またはＶＥＣ－２を投与したマウス群では、正常Ｔ細胞を投与したマウス及びＰＢＳのみを投与したマウス群に対して、腫瘍が著しく小さいことが確認された。

【0141】

（２）膵臓癌細胞株を用いた実験
膵臓癌細胞（ＡｓＰＣ－１、２×１０^６個の細胞）をマウス腹腔内に移植し、１４日後にＰＢＳ、正常Ｔ細胞、ＶＥＣ－１及びＶＥＣ－２を腹腔内投与した。投与後４週目に生体内画像化システム（Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ；ＩＶＩＳ）を用いて膵臓癌細胞の転移度合いを撮影した。その結果を図１３に示す。図１３に示すように、正常Ｔ細胞とＰＢＳのみを投与したマウスに対して、ＶＥＣ－１及びＶＥＣ－２を投与したマウスでは、腫瘍がほとんど増殖または転移しないことが確認された。

【0142】

マウスの腹腔内に２×１０^６個の膵臓癌細胞を移植し、１４日後にＰＢＳ、正常Ｔ細胞（Ｃｏｎ Ｔ）、ＶＥＣ－１及びＶＥＣ－２を腹腔内投与し、生物発光イメージング（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ；ＢＩＯ）で腫瘍のサイズを測定した。その結果を図１４に示す。図１４に示すように、正常Ｔ細胞を投与したマウスとＰＢＳのみを投与したマウスに対して、ＶＥＣ－１またはＶＥＣ－２を投与したマウスでは、腫瘍がほとんど増殖せず、それは膵臓癌細胞の移植後４週間まで持続した。

【0143】

本発明に係るモノボディベースのキメラ抗原受容体及びそれを細胞膜表面上に発現させた免疫細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）は、前立腺癌及び膵臓癌細胞の増殖を顕著に抑制し、マウスの生存率を顕著に増加させる優れた抗癌効果を有することがわかる。よって、モノボディベースのキメラ抗原受容体を含む免疫細胞を用いて、固形癌を始めとする様々な癌を予防または治療することができる。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

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