知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-06-05
(45)【発行日】2025-06-13
(54)【発明の名称】組換えコラーゲン、調製方法及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 14/78 20060101AFI20250606BHJP
A61K 8/65 20060101ALI20250606BHJP
A61K 9/06 20060101ALI20250606BHJP
A61K 38/39 20060101ALI20250606BHJP
A61L 15/32 20060101ALI20250606BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20250606BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20250606BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20250606BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20250606BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20250606BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20250606BHJP
【ＦＩ】
C07K14/78 ZNA
A61K8/65
A61K9/06
A61K38/39
A61L15/32 300
A61P17/02
A61P43/00 105
C12N1/19
C12N15/12
C12N15/63 Z
C12P21/02 C
【請求項の数】
17
(21)【出願番号】P 2024533060
(86)(22)【出願日】2022-11-23
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-26
(86)【国際出願番号】 CN2022133595
(87)【国際公開番号】W WO2023098523
(87)【国際公開日】2023-06-08
【審査請求日】2024-11-11
(31)【優先権主張番号】202111470250.8
(32)【優先日】2021-12-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
【微生物の受託番号】CGMCC CGMCC 21891
【微生物の受託番号】CGMCC CGMCC 21892
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】522314304
【氏名又は名称】江蘇創健医療科技股▲ふん▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＪＩＡＮＧＳＵ ＴＲＡＵＴＥＣ ＭＥＤＩＣＡＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．，ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】２８ Ｓｈｕａｎｇｌｏｎｇ Ｒｏａｄ，ＪｉｎｔａｎＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｚｏｎｅ，Ｃｈａｎｇｚｈｏｕ，Ｊｉａｎｇｓｕ ２１３２５１，Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110000291
【氏名又は名称】弁理士法人コスモス国際特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】李 佳佳
(72)【発明者】
【氏名】王 麗萍
(72)【発明者】
【氏名】劉 慧敏
(72)【発明者】
【氏名】蒋 ▲ウェン▼▲ウェン▼
(72)【発明者】
【氏名】銭 晨明
(72)【発明者】
【氏名】程 鵬飛
(72)【発明者】
【氏名】銭 松
【審査官】上條 のぶよ
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１１０７４７１９８（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１１０００３３２４（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０９９８８２３４（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０６５５４４１０（ＣＮ，Ａ）
【文献】欧州特許出願公開第００６９９７５２（ＥＰ，Ａ２）
【文献】米国特許第０５７１０２５２（ＵＳ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１１００２９１１１（ＣＮ，Ａ）
【文献】特表２０２３－５２１５３１（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １４／００－１４／８２５
Ｃ１２Ｎ １５／００－９０
Ｃ１２Ｎ １／００－３８
Ｃ１２Ｐ ２１／００－０８
Ａ６１Ｋ ３８／００－５８
Ａ６１Ｋ ８／００－９９
Ａ６１Ｋ ９／００－７２
Ａ６１Ｌ １５／００－６４
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
α１（Ｉ）Ｍ１又はα１（ＩＩ）Ｍ６である組換えコラーゲンのα１鎖であって、前記のα１（Ｉ）Ｍ１は、ヒトＩ型のコラーゲンのα１鎖の天然の全長アミノ酸配列がアミノ酸変異することにより得られ、前記のα１（ＩＩ）Ｍ６は、ヒトＩＩ型のコラーゲンのα１鎖天然の全長アミノ酸配列がアミノ酸変異することにより得られ、前記のα１（Ｉ）Ｍ１の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示され、前記のα１（ＩＩ）Ｍ６の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されることを特徴とする、組換えコラーゲンのα１鎖。
【請求項2】
請求項１に記載の組換えコラーゲンのα１鎖をコードする、ヌクレオチド。
【請求項3】
前記のコードα１（Ｉ）Ｍ１のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示され、前記のコードα１（ＩＩ）Ｍ６のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されることを特徴とする、請求項２に記載のヌクレオチド。
【請求項4】
請求項２に記載のヌクレオチドを含む、組換え発現ベクター。
【請求項5】
請求項４に記載の組換え発現ベクターを含むピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）である、エンジニアリング菌。
【請求項6】
請求項１に記載の組換えコラーゲンのα１鎖を発現するピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）である、エンジニアリング菌。
【請求項7】
前記のエンジニアリング菌は、中国微生物菌種保蔵管理委員会の一般微生物学センターに寄託されており、寄託番号は、ＣＧＭＣＣ ＮＯ．２１８９１又はＣＧＭＣＣ ＮＯ．２１８９２であり、その中で、寄託番号がＣＧＭＣＣ ＮＯ．２１８９１であるエンジニアリング菌は、組換えα１（Ｉ）Ｍ１コラーゲンのα１鎖を発現し、寄託番号がＣＧＭＣＣ ＮＯ．２１８９２であるエンジニアリング菌は、組換えα１（ＩＩ）Ｍ６コラーゲンのα１鎖を発現することを特徴とする、請求項５に記載のエンジニアリング菌。
【請求項8】
前記のエンジニアリング菌は、中国微生物菌種保蔵管理委員会の一般微生物学センターに寄託されており、寄託番号は、ＣＧＭＣＣ ＮＯ．２１８９１又はＣＧＭＣＣ ＮＯ．２１８９２であり、その中で、寄託番号がＣＧＭＣＣ ＮＯ．２１８９１であるエンジニアリング菌は、組換えα１（Ｉ）Ｍ１コラーゲンのα１鎖を発現し、寄託番号がＣＧＭＣＣ ＮＯ．２１８９２であるエンジニアリング菌は、組換えα１（ＩＩ）Ｍ６コラーゲンのα１鎖を発現することを特徴とする、請求項６に記載のエンジニアリング菌。
【請求項9】
前記の組換えコラーゲンのα１鎖を調製するための、請求項４に記載の組換え発現ベクター又は請求項５～８のいずれか一項に記載のエンジニアリング菌の使用。
【請求項10】
請求項１に記載の組換えコラーゲンのα１鎖を含むことを特徴とする、組成物。
【請求項11】
医薬品、医療機器、生体材料、組織工学製品又は化粧品であって、請求項１に記載の組換えコラーゲンのα１鎖、又は請求項１０に記載の組成物を含むことを特徴とする、製品。
【請求項12】
細胞に接着、支持、成長・遊走の空間を提供する材料又は栄養物質や代謝産物を輸送するチャネルである材料であることを特徴とする、請求項１１に記載の製品。
【請求項13】
前記の製品は、コラーゲンヒドロゲルであることを特徴とする、請求項１２に記載の製品。
【請求項14】
請求項１に記載の組換えコラーゲンのα１鎖、請求項２～３のいずれか一項に記載のヌクレオチド、請求項４に記載の組換え発現ベクター、請求項５～８のいずれか一項に記載のエンジニアリング菌、又は請求項１０に記載の組成物の、医薬品、医療機器、生体材料、組織工学製品、又は化粧品を調製するための使用。
【請求項15】
請求項１に記載の組換えコラーゲンのα１鎖、請求項２～３のいずれか一項に記載のヌクレオチド、請求項４に記載の組換え発現ベクター、請求項５～８のいずれか一項に記載のエンジニアリング菌、又は請求項１０に記載の組成物の、創傷修復又は組織再生の促進用製品を調製するための使用。
【請求項16】
前記医薬品、医療機器、生体材料、組織工学製品、又は化粧品は、コラーゲンヒドロゲルであることを特徴とする、請求項１４に記載の使用。
【請求項17】
前記の製品は、コラーゲンヒドロゲルであることを特徴とする、請求項１５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、組換えコラーゲン、調製方法及びその使用に関し、特に組換え発現した全長コラーゲンのα１鎖、調製方法及びその使用に関し、コラーゲン発現の技術分野に属する。
【背景技術】
【0002】
Ｉ、ＩＩ型のコラーゲンは、ヒト体内の典型的な線維芽細胞コラーゲンであり、３本のαペプチド鎖で構成されており、各αペプチド鎖にはアミノ末端のペプチド領域、特徴的な（Ｇ-Ｘ-Ｙ）ｎトリプレット反復配列領域、及びカルボキシ末端のペプチド領域という３つの部分が含まれる。
【0003】
Ｉ型のコラーゲンは、２本のα１鎖と１本のα２鎖で構成されており、ヒト体内に最も豊富なタイプのコラーゲンで、筋肉、皮膚、動脈壁、線維軟骨に含まれている。ＩＩ型のコラーゲンは、３本のα１鎖で構成されており、主に軟骨組織、硝子体、角膜に分布し、成人の軟骨基質コラーゲンの総量の９０％以上を占め、軟骨と骨の形成、骨の成長、成熟した軟骨の維持などに不可欠な成分である。
【0004】
重要な天然生体タンパク質であるコラーゲンは、良好な生体適合性、生体活性、分解性などの独特の機能的特徴を有し、化学工業、医薬品、食品、化粧品などの多くの分野で広く使用され、特に様々な生体医療機器の調製に適しており、最も理想的な生体材料源であり、幅広い適用の可能性がある。
【0005】
市販されているコラーゲンは、主に動物組織を酸、アルカリ、酵素加水分解法で処理して得られるコラーゲンの抽出物であり、加工中に激しく分解され、生物活性が失われ、抽出されたコラーゲンペプチドは、長さが異なり、性質が不均一で、品質が不安定であり、狂牛病や口蹄疫などのウイルス感染の安全性リスクをもたらす。同時に、動物由来とヒト由来のコラーゲンのアミノ酸配列は、大きく異なり、免疫拒絶やアレルギー症状を引き起こす可能性がある異種タンパク質である。
【0006】
組換えコラーゲンを遺伝子工学技術により生成すれば、これらの欠陥を効果的に回避できる。既存の組換えコラーゲン発現法では、哺乳動物細胞の発現系、昆虫細胞（バキュロウイルス）の発現系、トランスジェニック動植物などの発現系は、コストが高く、収量が低く、サイクルが長いため、科学研究レベルで主に使用されている。大規模工業生産では、ヒトコラーゲンは、主に原核生物（大腸菌）発現系とピキアパストリス発現系によって発現される。大腸菌では、タンパク質の翻訳後修飾がなく、大規模発現は細胞内発現であり、細胞の溶解が必要で、大量に生成される不純物の宿主タンパク質と天然に存在する（細胞壁成分）エンドトキシン、ペプチドグリカンの除去は、複雑な精製が必要である。しかし、ピキアパストリスにとって、ヒトコラーゲンは結局のところ外因性タンパク質であり、発現するとより多くの細胞内リソース（依存するメタノール代謝経路は、最大３０％の細胞可溶性タンパク質を発現することができ）を占有し、細胞は外因性タンパク質に対応する調整を行うことになり、典型的な状況として、組換えタンパク質は激しい分解を受けるが、ヒトＩ型及びＩＩ型のコラーゲンのα１鎖は１０００個のアミノ酸を超える長いペプチド鎖であり、分解されやすくなっている。
【0007】
成熟ヒトＩ、ＩＩ型のコラーゲンのα１鎖配列は、アミノテロペプチド、三重らせん領域、及びカルボキシルテロペプチドという３つの部分が含まれ、ヒトＩ型のコラーゲンのα１鎖（以下、本明細書ではα１（Ｉ）という）の全長は１０５７個のアミノ酸（ＡＡ、ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）であり、ヒトＩＩ型のコラーゲンα１鎖（以下、本明細書ではα１（ＩＩ）という）の全長は１０６０ＡＡである。ピキアパストリスを用いたヒトα１（Ｉ）鎖の発現に関する研究や特許は数多くあるが、ヒトα１（ＩＩ）鎖の発現に関する研究や特許は少ない。全長α１（Ｉ）鎖及び全長α１（ＩＩ）鎖を発現するピキアパストリスに対する既存の研究結果のうち、ほとんどの研究は、成熟した全長α１（Ｉ）鎖ではなく、α１（Ｉ）鎖の配列の一部のみを発現していた。いくつかの開示された結果は、全長のα１（Ｉ）鎖を発現しているが、それらはすべて発現中に標的生成物と基本的に同じ割合を占める主な分解生成物を生成し、ラウリル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ－ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）では、全長α１鎖の標的バンド（標的生成物）と基本的に同じ割合を占める主な分解バンド（主な分解生成物）として表示される。このような分解は、発現によって生成される全長α１鎖の収量を減少させるだけでなく、その特性が全長α１鎖の関わる特性に近いため、高純度の単一全長α１鎖生成物を得るには、２段階の二重親和性の精製が必要であるが、精製プロセスの複雑さが増加するため、精製コストが増加する。したがって、全長ペプチド鎖を無傷に保ち、分解を減らし、コラーゲンの生体活性を変化させずに維持することは、ピキアパストリスを使用した組換えコラーゲンの生産にとって重要な課題である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明の目的は、従来技術に存在するいくつかの技術的問題を克服し、ピキアパストリス組換え発現した全長コラーゲンのα１鎖、調製方法及びその使用を提供する。本発明における組換えヒトＩ型のコラーゲンのα１鎖の変異体（α１（Ｉ）Ｍ１と表記する）と組換えヒトＩＩ型のコラーゲンのα１鎖の変異体（α１（ＩＩ）Ｍ６と表記する）は、天然の全長α１（Ｉ）鎖とα１（ＩＩ）鎖に比べて、ピキアパストリスで発現する場合、全長α１鎖の標的バンド（標的生成物）と基本的に同じ割合を占める主な分解バンド（主な分解生成物）が除去され、標的生成物の収率が向上し、ピキアパストリスで発現させた天然の全長α１（Ｉ）鎖のコラーゲン、α１（ＩＩ）鎖のコラーゲン、及び市販ヒトコラーゲンと類似の物理的・化学的特性や同じ生物学的活性があり、生体医学材料の分野に利用される価値がある。
【課題を解決するための手段】
【0009】
上記の本発明の目的を達成するために、本発明は以下の技術的解決手段を採用する。
本発明は、α１（Ｉ）Ｍ１又はα１（ＩＩ）Ｍ６である組換えコラーゲンのα１鎖であって、上記のα１（Ｉ）Ｍ１は、ヒトＩ型のコラーゲンのα１鎖の天然の全長アミノ酸配列がアミノ酸変異することにより得られ、上記のα１（ＩＩ）Ｍ６は、ヒトＩＩ型のコラーゲンのα１鎖天然の全長アミノ酸配列がアミノ酸変異することにより得られる、組換えコラーゲンのα１鎖を提供する。
本発明は、α１（Ｉ）Ｍ１又はα１（ＩＩ）Ｍ６である組換えコラーゲンのα１鎖であって、上記のα１（Ｉ）Ｍ１は、ヒトＩ型のコラーゲンのα１鎖の天然の全長アミノ酸配列がアミノ酸変異することにより得られ、上記のα１（ＩＩ）Ｍ６は、ヒトＩＩ型のコラーゲンのα１鎖天然の全長アミノ酸配列がアミノ酸変異することにより得られる、組換えコラーゲンのα１鎖を提供する。
【0010】
好ましくは、上記のα１（Ｉ）Ｍ１のアミノ酸の変異部位の数は４個であり、上記のα１（ＩＩ）Ｍ６のアミノ酸の変異部位の数は９個である。
好ましくは、上記のヒトＩ型のコラーゲンのα１鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示され、上記のアミノ酸の変異部位は、１０６番目のＭ、１０９番目のＲ、１９０番目のＭ、１９３番目のＲであり、具体的にいずれもＰに変更される。
好ましくは、上記のヒトＩ型のコラーゲンのα１鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示され、上記のアミノ酸の変異部位は、１０６番目のＭ、１０９番目のＲ、１９０番目のＭ、１９３番目のＲであり、具体的にいずれもＰに変更される。
【0011】
上記のヒトＩＩ型のコラーゲンのα１鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示され、上記のアミノ酸の変異部位は、６７番目のＶ、６８番目のＭ、７２番目のＭ、７５番目のＭ、７８番目のＲ、１０８番目のＭ、１１１番目のＲ、１６２番目のＭ、１６５番目のＲであり、具体的にいずれもＰに変更される。
【0012】
さらに、上記のα１（Ｉ）Ｍ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示され、上記のα１（ＩＩ）Ｍ６のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示される。
【0013】
本発明において、アミノ酸配列の変異部位において、対応するアミノ酸の変更の種類に何らかの変化があり、すなわち、変異部位が同じであるが、変更されるアミノ酸の種類が異なる場合にも本特許と同様の技術的効果を得ることができ、１つ又はいくつかの部位を変異処理することにより、本特許と同様の技術的効果も得ることができる。
【0014】
本発明は、上記のコード組換えコラーゲンのα１鎖のヌクレオチド配列がα１（Ｉ）Ｍ１又はα１（ＩＩ）Ｍ６をコードするヌクレオチド配列を含む、上記の組換えコラーゲンのα１鎖をコードするヌクレオチドをさらに提供する。
【0015】
さらに、上記のコードα１（Ｉ）Ｍ１をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示され、コードα１（ＩＩ）Ｍ６のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示される。
【0016】
本発明は、上記の組換えコラーゲンのα１鎖をコードするヌクレオチドを含む組換え発現ベクターをさらに提供する。
【0017】
本発明は、上記の組換え発現ベクターを含む又は上記の組換えコラーゲンのα１鎖を発現する、上記の組換え発現ベクターで構築したエンジニアリング菌をさらに提供する。
【0018】
上記のエンジニアリング菌の宿主菌は、ピキアパストリスが好ましく、上記のエンジニアリング菌は、中国典型培養物寄託センターにブタペスト条約に基づく国際寄託がなされ、寄託日期が２０２１年０３月１１日であり、寄託番号がＣＧＭＣＣ ＮＯ．２１８９１又はＣＧＭＣＣ ＮＯ．２１８９２であり、分類命名がピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）であり、寄託機関が中国微生物菌種保蔵管理委員会の一般微生物学センターであり、住所が北京市朝陽区北辰西路１号院３号である。ここで、寄託番号がＣＧＭＣＣ ＮＯ．２１８９１であるエンジニアリング菌は、組換えα１（Ｉ）Ｍ１コラーゲンのα１鎖を発現し、寄託番号がＣＧＭＣＣ ＮＯ．２１８９２であるエンジニアリング菌は、組換えα１（ＩＩ）Ｍ６コラーゲンのα１鎖を発現する。
【0019】
なお、本発明の宿主菌は、ピキアパストリスに限定されなく、本発明の方法に従ってピキアパストリスや他の種類の酵母菌において分泌・発現できる限り、理論的には本発明と同様の技術的効果が得られる。
【0020】
本発明は、上記の組換え発現ベクター又は上記のエンジニアリング菌の、上記の組換えコラーゲンのα１鎖を発現するための使用をさらに提供する。
【0021】
本発明は、上記の組換えコラーゲンのα１鎖の調製方法をさらに提供し、該当調製方法は、以下の工程が含まれる。
【0022】
（１）組換えコラーゲンのα１鎖をコードするヌクレオチド配列を合成すること、
天然コラーゲンのα１鎖配列のアミノ酸配列部位の対応するアミノ酸を変更することにより、Ｉ型コラーゲンのα１鎖を４個のアミノ酸変更してα１（Ｉ）Ｍ１取得し、ＩＩ型コラーゲンのα１鎖を９個のアミノ酸変更してα１（ＩＩ）Ｍ６を取得し、配列のアミノ基末端とカルボキシ末端に親和性精製タグを付加し、α１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６をコードするＤＮＡ配列が二重特異性親和性精製標識を含むように合成され、２つのタグ配列に基づいて免疫学的抗体の検出に寄与する。
α１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６は、全長α１（Ｉ）鎖、全長α１（ＩＩ）鎖がピキアパストリスで発現する場合に生成される全長α１鎖の標的バンド（標的生成物）と基本的に同じ割合を占める主な分解バンド（主な分解生成物）がそれぞれ除去されている。
α１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６は、元の天然配列に比べて、特徴的な（Ｇ－Ｘ－Ｙ）ｎの三重反復領域に位置するアミノ酸が変異するが、いずれもＸ、Ｙに位置するアミノ酸であり、コラーゲン（Ｇ－Ｘ－Ｙ）ｎの三重反復のアミノ酸配列の構造的特徴が変更しておらず、元のコラーゲンと類似の物理的・化学的特性や生物学的活性を依然として維持している。
天然コラーゲンのα１鎖配列のアミノ酸配列部位の対応するアミノ酸を変更することにより、Ｉ型コラーゲンのα１鎖を４個のアミノ酸変更してα１（Ｉ）Ｍ１取得し、ＩＩ型コラーゲンのα１鎖を９個のアミノ酸変更してα１（ＩＩ）Ｍ６を取得し、配列のアミノ基末端とカルボキシ末端に親和性精製タグを付加し、α１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６をコードするＤＮＡ配列が二重特異性親和性精製標識を含むように合成され、２つのタグ配列に基づいて免疫学的抗体の検出に寄与する。
α１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６は、全長α１（Ｉ）鎖、全長α１（ＩＩ）鎖がピキアパストリスで発現する場合に生成される全長α１鎖の標的バンド（標的生成物）と基本的に同じ割合を占める主な分解バンド（主な分解生成物）がそれぞれ除去されている。
α１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６は、元の天然配列に比べて、特徴的な（Ｇ－Ｘ－Ｙ）ｎの三重反復領域に位置するアミノ酸が変異するが、いずれもＸ、Ｙに位置するアミノ酸であり、コラーゲン（Ｇ－Ｘ－Ｙ）ｎの三重反復のアミノ酸配列の構造的特徴が変更しておらず、元のコラーゲンと類似の物理的・化学的特性や生物学的活性を依然として維持している。
【0023】
（２）組換え発現ベクターを構築すること
合成したＤＮＡを発現ベクターｐＰＩＣ９Ｋにライゲーションし、組換えα１（Ｉ）Ｍ１コラーゲンを発現するｐＰＩＣ９Ｋ－ＣＯＬ１Ａ１Ｍ１と組換えα１（ＩＩ）Ｍ６コラーゲンを発現するｐＰＩＣ９Ｋ－ＣＯＬ２Ａ１Ｍ６の２つの組換え発現ベクターをそれぞれ構築する。
合成したＤＮＡを発現ベクターｐＰＩＣ９Ｋにライゲーションし、組換えα１（Ｉ）Ｍ１コラーゲンを発現するｐＰＩＣ９Ｋ－ＣＯＬ１Ａ１Ｍ１と組換えα１（ＩＩ）Ｍ６コラーゲンを発現するｐＰＩＣ９Ｋ－ＣＯＬ２Ａ１Ｍ６の２つの組換え発現ベクターをそれぞれ構築する。
【0024】
（３）組換えエンジニアリング菌株を構築し、発現を誘導し、菌株をスクリーニングすること
組換え発現ベクターをＳａｃ Ｉで直線化し、ピキアパストリスのコンピテント細胞に電気的形質転換し、ＭＤプレートに移して予備スクリーニングし、異なる濃度のＧ４１８を含むＹＰＤプレートによりスクリーニングし、コロニーをつついてＢＭＧＹ培地に接種し、ＢＭＭＹ培地で発現を誘導し、高発現のエンジニアリング菌株をスクリーニングする。
上記のスクリーニングされた高発現のエンジニアリング菌は、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）であり、寄託番号は、それぞれＣＧＭＣＣ ＮＯ．２１８９１、ＣＧＭＣＣ ＮＯ．２１８９２である。
組換え発現ベクターをＳａｃ Ｉで直線化し、ピキアパストリスのコンピテント細胞に電気的形質転換し、ＭＤプレートに移して予備スクリーニングし、異なる濃度のＧ４１８を含むＹＰＤプレートによりスクリーニングし、コロニーをつついてＢＭＧＹ培地に接種し、ＢＭＭＹ培地で発現を誘導し、高発現のエンジニアリング菌株をスクリーニングする。
上記のスクリーニングされた高発現のエンジニアリング菌は、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）であり、寄託番号は、それぞれＣＧＭＣＣ ＮＯ．２１８９１、ＣＧＭＣＣ ＮＯ．２１８９２である。
【0025】
（４）高密度で発酵・培養すること
タンパク質発現により同定された高発現のエンジニアリング菌を、発酵槽を用いて高密度で発酵・培養する。
タンパク質発現により同定された高発現のエンジニアリング菌を、発酵槽を用いて高密度で発酵・培養する。
【0026】
（５）タンパク質を精製すること
発酵上澄みを一次陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥により高純度のα１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６コラーゲンを取得した。
発酵上澄みを一次陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥により高純度のα１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６コラーゲンを取得した。
【0027】
本発明によって得られたピキアパストリスで発現されたα１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６組換えコラーゲンをタンパク質の特性の特徴付け及びインビトロ実験によって分析し、本発明で得られたタンパク質は、組換えコラーゲンの構造的特徴に適合し、細胞接着活性を有し、市販のヒトコラーゲンと基本的に一致するが、より重要なことに、２つの変異体タンパク質及び変異前のコラーゲンの構造的特徴及び細胞接着活性が類似又は同一である。
【0028】
本発明は、上記の組換えコラーゲンのα１鎖又は上記の方法によって調製されたコラーゲンのα１鎖を含む組成物をさらに提供する。
【0029】
本発明は、上記の組換えコラーゲンのα１鎖又は上記の方法によって調製されたコラーゲンのα１鎖又は上記の組成物を含む製品をさらに提供する。上記の製品は、医薬品、医薬品組成物、医療器材、生体材料、組織工学製品、化粧品、又は保健品などが含まれるが、これらに限定されない。
【0030】
さらに、上記の製品は、細胞に接着、支持、成長・遊走の空間を提供する材料又は栄養物質や代謝産物を輸送するチャネルである材料が含まれる。
【0031】
さらに、上記の製品は、コラーゲンヒドロゲルである。
【0032】
本発明は、上記の組換えコラーゲンのα１鎖、ヌクレオチド、組換え発現ベクター、エンジニアリング菌、組成物などの完成品を調製するための使用をさらに提供し、医薬品、医療器材、生体材料、組織工学製品、化粧品又は保健品のための使用が含まれるが、これらに限定されない。
【0033】
本発明は、上記の組換えコラーゲンのα１鎖、ヌクレオチド、組換え発現ベクター、エンジニアリング菌又は組成物の、創傷修復又は組織再生の促進用製品を調製するための使用をさらに提供し、さらに、上記の製品は、コラーゲンヒドロゲルである。
【発明の効果】
【0034】
（１）本発明におけるコラーゲンのα１鎖変異体は、元の天然配列における変更されるアミノ酸部位の割合が極めて少なく（変異したアミノ酸の割合が１％未満であり、変異前後のアミノ酸配列の相同性が９９％以上である）、完全組換えα１鎖のコラーゲンを得ながら、元のタンパク質自体の性質（物理的・化学的特性、生物学的活性）を変えることなく、関連製品に調製した場合も天然配列の組換えタンパク質と同じ性質、生物学的活性などがある。
α１（Ｉ） Ｍ１は、α１（Ｉ）と比較して、α１（ＩＩ）Ｍ６は、α１（ＩＩ）と比較して、類似の物理的・化学的特性や生物学的活性があり、生体医学材料の分野に利用される価値がある。本発明は、α１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６、α１（Ｉ）、α１（ＩＩ）の細胞接着実験を行うことにより、α１（Ｉ）はα１（Ｉ）Ｍ１と比較して、α１（ＩＩ）Ｍ６はα１（ＩＩ）と比較して、細胞接着活性に有意差がなく、且つα１（Ｉ）Ｍ１及びα１（ＩＩ）Ｍ６は、細胞接着活性が市販のヒトコラーゲンと基本的に同じである。ピキアパストリスで発現されたα１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６、α１（Ｉ）、α１（ＩＩ）コラーゲンを用いてコラーゲンヒドロゲルを調製し、ヒドロゲルの液体機械特性を検出し、α１（Ｉ）はα１（Ｉ）Ｍ１と比較して、α１（ＩＩ）Ｍ６はα１（ＩＩ）と比較して、調製されたヒドロゲルが粘度、弾性率、膨潤度に有意差がない。走査型電子顕微鏡を用いて凍結乾燥のコラーゲンヒドロゲルをスキャンし、いずれも多孔質ネットワーク構造を有し、孔径の範囲が１００～２００μｍであり、生体医学材料の分野で使用される可能性があることが示されている。４つのコラーゲンヒドロゲルとＮＩＨ／３Ｔ３細胞とをインビトロで共培養し、カルセインＡＭを添加すると、ヒドロゲルに接着、成長する緑色蛍光を発する生細胞が検出され、ＭＴＴ検出に加え、いずれもヒドロゲル内で生細胞が接着、遊走、成長して形成される青紫色の結晶が観察され得る。
α１（Ｉ） Ｍ１は、α１（Ｉ）と比較して、α１（ＩＩ）Ｍ６は、α１（ＩＩ）と比較して、類似の物理的・化学的特性や生物学的活性があり、生体医学材料の分野に利用される価値がある。本発明は、α１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６、α１（Ｉ）、α１（ＩＩ）の細胞接着実験を行うことにより、α１（Ｉ）はα１（Ｉ）Ｍ１と比較して、α１（ＩＩ）Ｍ６はα１（ＩＩ）と比較して、細胞接着活性に有意差がなく、且つα１（Ｉ）Ｍ１及びα１（ＩＩ）Ｍ６は、細胞接着活性が市販のヒトコラーゲンと基本的に同じである。ピキアパストリスで発現されたα１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６、α１（Ｉ）、α１（ＩＩ）コラーゲンを用いてコラーゲンヒドロゲルを調製し、ヒドロゲルの液体機械特性を検出し、α１（Ｉ）はα１（Ｉ）Ｍ１と比較して、α１（ＩＩ）Ｍ６はα１（ＩＩ）と比較して、調製されたヒドロゲルが粘度、弾性率、膨潤度に有意差がない。走査型電子顕微鏡を用いて凍結乾燥のコラーゲンヒドロゲルをスキャンし、いずれも多孔質ネットワーク構造を有し、孔径の範囲が１００～２００μｍであり、生体医学材料の分野で使用される可能性があることが示されている。４つのコラーゲンヒドロゲルとＮＩＨ／３Ｔ３細胞とをインビトロで共培養し、カルセインＡＭを添加すると、ヒドロゲルに接着、成長する緑色蛍光を発する生細胞が検出され、ＭＴＴ検出に加え、いずれもヒドロゲル内で生細胞が接着、遊走、成長して形成される青紫色の結晶が観察され得る。
【0035】
（２）本発明では、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動、ウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）を使用して発現されたタンパク質を同定し、その結果、全長α１（Ｉ）鎖とα１（ＩＩ）鎖に対して、α１（Ｉ）Ｍ１とα１（ＩＩ）Ｍ６は、ピキアパストリスで発現する場合、全長α１鎖の標的バンド（標的生成物）と基本的に同じ割合を占める主な分解バンド（主な分解生成物）が除去され、標的生成物の収率が向上した。そして、発酵槽によって高密度で発酵実験を行い、発酵生成物をＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動で検出し、α１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６は、高密度の発酵条件下でも標的バンドの完全性を維持でき、主な分解バンドは依然として生成されなく、同じ高密度の発酵条件の下で発酵して生成された組換えヒトα１（Ｉ）、α１（ＩＩ）は、明らかな主な分解バンドが生成される。
【0036】
さらに、本発明の組換えコラーゲンは、陽イオン交換クロマトグラフィーを１段階で行うだけで発酵上澄みを精製し、凍結乾燥により高純度のα１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６コラーゲンの凍結乾燥スポンジを取得し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動検出では、主な分解バンドがなく、標的生成物である単一バンドのみが検出されるため、高純度の標的生成物が得られ、精製コストも削減できる。
【0037】
α１（Ｉ）、α１（ＩＩ）については、陽イオン交換クロマトグラフィーを１段階で行うと、標的バンド（標的生成物、全長α１鎖）と主な分解バンド（主な分解生成物）とが混合する精製タンパク質のみが得られる。そのため、高純度のα１（Ｉ）、α１（ＩＩ）コラーゲンを得るには、２段階目のアフィニティークロマトグラフィーが必要である。
【図面の簡単な説明】
【0038】
【図6】図６は、α１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６コラーゲンの誘導発現を２４時間行った上澄みのＷＢ図であり、図中の左側は抗６×Ｈｉｓ Ｔａｇ抗体のＷＢ図であり、右側は抗Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｇ ＩＩ抗体のＷＢ図である。
【図14】図１４は、凍結乾燥させたα１（Ｉ）、α１（Ｉ）Ｍ１コラーゲンヒドロゲルの表面の走査型電子顕微鏡図（上の２枚はα１（Ｉ）コラーゲンヒドロゲルであり、下の２枚はα１（Ｉ）Ｍ１コラーゲンヒドロゲルである）である。
【図15】図１５は、凍結乾燥させたα１（ＩＩ）、α１（ＩＩ）Ｍ６コラーゲンヒドロゲルの表面の走査型電子顕微鏡図（上の２枚はα１（ＩＩ）コラーゲンヒドロゲルであり、下の２枚はα１（ＩＩ）Ｍ６コラーゲンヒドロゲルである）。
【図16】図１６は、α１（Ｉ）、α１（Ｉ）Ｍ１コラーゲンヒドロゲルにおけるＮＩＨ／３Ｔ３の細胞接着成長の結果図である。図中、上の３枚の図は左から右にα１（Ｉ）コラーゲンヒドロゲルに接着、成長したＮＩＨ／３Ｔ３細胞（明視野顕微鏡で撮影）、α１（Ｉ）コラーゲンヒドロゲルに接着、成長したＮＩＨ／３Ｔ３細胞（カルセインＡＭ染色、明るい部分は緑色蛍光の細胞であり、蛍光顕微鏡で撮影）、α１（Ｉ）コラーゲンヒドロゲルに成長したＮＩＨ／３Ｔ３細胞に形成された青紫色の結晶（ＭＴＴ染色、黒い部分歯は結晶であり、明視野顕微鏡で撮影）である。下の３枚の図は左から右にα１（Ｉ）Ｍ１コラーゲンヒドロゲルに接着、成長したＮＩＨ／３Ｔ３細胞（明視野顕微鏡で撮影）、α１（Ｉ）Ｍ１コラーゲンヒドロゲルに接着、成長したＮＩＨ／３Ｔ３細胞（カルセインＡＭ染色、明るい部分は緑色蛍光の細胞であり、蛍光顕微鏡で撮影）、α１（Ｉ）Ｍ１コラーゲンヒドロゲルに成長したＮＩＨ／３Ｔ３細胞形成の青紫色の結晶（ＭＴＴ染色、黒い部分は結晶であり、明視野顕微鏡で撮影）。
【図17】図１７は、α１（ＩＩ）、α１（ＩＩ）Ｍ６コラーゲンヒドロゲルにおけるＮＩＨ／３Ｔ３の細胞接着成長の結果図である。図中、上の３枚の図は左から右にα１（ＩＩ）コラーゲンヒドロゲルに接着、成長したＮＩＨ／３Ｔ３細胞（明視野顕微鏡で撮影）、α１（ＩＩ）コラーゲンヒドロゲルに接着、成長したＮＩＨ／３Ｔ３細胞（カルセインＡＭ染色、明るい部分は緑色蛍光の細胞であり、蛍光顕微鏡で撮影）、α１（ＩＩ）コラーゲンヒドロゲルに成長したＮＩＨ／３Ｔ３細胞形成の青紫色の結晶（ＭＴＴ染色、黒い部分は結晶であり、明視野顕微鏡で撮影）である。下の３枚の図は左から右にα１（ＩＩ）Ｍ６コラーゲンヒドロゲルに接着、成長したＮＩＨ／３Ｔ３細胞（明視野顕微鏡で撮影）、α１（ＩＩ）Ｍ６コラーゲンヒドロゲルに接着、成長したＮＩＨ／３Ｔ３細胞（カルセインＡＭ染色、明るい部分は緑色蛍光の細胞であり、蛍光顕微鏡で撮影）、α１（ＩＩ）Ｍ６コラーゲンヒドロゲルに成長したＮＩＨ／３Ｔ３細胞形成の青紫色の結晶（ＭＴＴ染色、黒い部分は結晶であり、明視野顕微鏡で撮影）である。
【発明を実施するための形態】
【0039】
当業者が本発明の技術的解決手段をよりよく理解できるように、本発明の好ましい実施例を以下に詳細に説明するが、以下の実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
本発明の実施例では、従来の分子生物学の実験方法を特に説明することなく使用しており、実施例に含まれるＰＣＲ、酵素消化、ライゲーション、コドン最適化などのプロセスは、すべて製品の明細書又は当該分野の基礎知識に基づいて当業者であれば理解でき、容易に実施することができるため、詳しくは説明しない。
本発明の実施例では、従来の分子生物学の実験方法を特に説明することなく使用しており、実施例に含まれるＰＣＲ、酵素消化、ライゲーション、コドン最適化などのプロセスは、すべて製品の明細書又は当該分野の基礎知識に基づいて当業者であれば理解でき、容易に実施することができるため、詳しくは説明しない。
【0040】
実施例１．アミノ酸配列の設計と合成
ヒトＩ型のコラーゲンのα１鎖（α１（Ｉ）と表記する）のアミノ酸配列は、ＵｎｉｐｒｏｔデータベースＰ０２４５２－１（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ０２４５２）配列中の１６２～１２１８部分（ＰＲＯ＿００００００５７２０）を参照し、成熟ヒトＩ型のコラーゲンのα１鎖アミノ酸配列であり、シグナルペプチド、Ｃ末端プロペプチド、Ｎ末端プロペプチドなどのα１（Ｉ）前駆体タンパク質におけるプロセシングされて脱落する部分が含まれておらず、その配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される。
ヒトＩ型のコラーゲンのα１鎖（α１（Ｉ）と表記する）のアミノ酸配列は、ＵｎｉｐｒｏｔデータベースＰ０２４５２－１（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ０２４５２）配列中の１６２～１２１８部分（ＰＲＯ＿００００００５７２０）を参照し、成熟ヒトＩ型のコラーゲンのα１鎖アミノ酸配列であり、シグナルペプチド、Ｃ末端プロペプチド、Ｎ末端プロペプチドなどのα１（Ｉ）前駆体タンパク質におけるプロセシングされて脱落する部分が含まれておらず、その配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される。
【0041】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：
ＱＬＳＹＧＹＤＥＫＳＴＧＧＩＳＶＰＧＰＭＧＰＳＧＰＲＧＬＰＧＰＰＧＡＰＧＰＱＧＦＱＧＰＰＧＥＰＧＥＰＧＡＳＧＰＭＧＰＲＧＰＰＧＰＰＧＫＮＧＤＤＧＥＡＧＫＰＧＲＰＧＥＲＧＰＰＧＰＱＧＡＲＧＬＰＧＴＡＧＬＰＧＭＫＧＨＲＧＦＳＧＬＤＧＡＫＧＤＡＧＰＡＧＰＫＧＥＰＧＳＰＧＥＮＧＡＰＧＱＭＧＰＲＧＬＰＧＥＲＧＲＰＧＡＰＧＰＡＧＡＲＧＮＤＧＡＴＧＡＡＧＰＰＧＰＴＧＰＡＧＰＰＧＦＰＧＡＶＧＡＫＧＥＡＧＰＱＧＰＲＧＳＥＧＰＱＧＶＲＧＥＰＧＰＰＧＰＡＧＡＡＧＰＡＧＮＰＧＡＤＧＱＰＧＡＫＧＡＮＧＡＰＧＩＡＧＡＰＧＦＰＧＡＲＧＰＳＧＰＱＧＰＧＧＰＰＧＰＫＧＮＳＧＥＰＧＡＰＧＳＫＧＤＴＧＡＫＧＥＰＧＰＶＧＶＱＧＰＰＧＰＡＧＥＥＧＫＲＧＡＲＧＥＰＧＰＴＧＬＰＧＰＰＧＥＲＧＧＰＧＳＲＧＦＰＧＡＤＧＶＡＧＰＫＧＰＡＧＥＲＧＳＰＧＰＡＧＰＫＧＳＰＧＥＡＧＲＰＧＥＡＧＬＰＧＡＫＧＬＴＧＳＰＧＳＰＧＰＤＧＫＴＧＰＰＧＰＡＧＱＤＧＲＰＧＰＰＧＰＰＧＡＲＧＱＡＧＶＭＧＦＰＧＰＫＧＡＡＧＥＰＧＫＡＧＥＲＧＶＰＧＰＰＧＡＶＧＰＡＧＫＤＧＥＡＧＡＱＧＰＰＧＰＡＧＰＡＧＥＲＧＥＱＧＰＡＧＳＰＧＦＱＧＬＰＧＰＡＧＰＰＧＥＡＧＫＰＧＥＱＧＶＰＧＤＬＧＡＰＧＰＳＧＡＲＧＥＲＧＦＰＧＥＲＧＶＱＧＰＰＧＰＡＧＰＲＧＡＮＧＡＰＧＮＤＧＡＫＧＤＡＧＡＰＧＡＰＧＳＱＧＡＰＧＬＱＧＭＰＧＥＲＧＡＡＧＬＰＧＰＫＧＤＲＧＤＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＫＤＧＶＲＧＬＴＧＰＩＧＰＰＧＰＡＧＡＰＧＤＫＧＥＳＧＰＳＧＰＡＧＰＴＧＡＲＧＡＰＧＤＲＧＥＰＧＰＰＧＰＡＧＦＡＧＰＰＧＡＤＧＱＰＧＡＫＧＥＰＧＤＡＧＡＫＧＤＡＧＰＰＧＰＡＧＰＡＧＰＰＧＰＩＧＮＶＧＡＰＧＡＫＧＡＲＧＳＡＧＰＰＧＡＴＧＦＰＧＡＡＧＲＶＧＰＰＧＰＳＧＮＡＧＰＰＧＰＰＧＰＡＧＫＥＧＧＫＧＰＲＧＥＴＧＰＡＧＲＰＧＥＶＧＰＰＧＰＰＧＰＡＧＥＫＧＳＰＧＡＤＧＰＡＧＡＰＧＴＰＧＰＱＧＩＡＧＱＲＧＶＶＧＬＰＧＱＲＧＥＲＧＦＰＧＬＰＧＰＳＧＥＰＧＫＱＧＰＳＧＡＳＧＥＲＧＰＰＧＰＭＧＰＰＧＬＡＧＰＰＧＥＳＧＲＥＧＡＰＧＡＥＧＳＰＧＲＤＧＳＰＧＡＫＧＤＲＧＥＴＧＰＡＧＰＰＧＡＰＧＡＰＧＡＰＧＰＶＧＰＡＧＫＳＧＤＲＧＥＴＧＰＡＧＰＡＧＰＶＧＰＶＧＡＲＧＰＡＧＰＱＧＰＲＧＤＫＧＥＴＧＥＱＧＤＲＧＩＫＧＨＲＧＦＳＧＬＱＧＰＰＧＰＰＧＳＰＧＥＱＧＰＳＧＡＳＧＰＡＧＰＲＧＰＰＧＳＡＧＡＰＧＫＤＧＬＮＧＬＰＧＰＩＧＰＰＧＰＲＧＲＴＧＤＡＧＰＶＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＳＡＧＦＤＦＳＦＬＰＱＰＰＱＥＫＡＨＤＧＧＲＹＹＲＡ
ＱＬＳＹＧＹＤＥＫＳＴＧＧＩＳＶＰＧＰＭＧＰＳＧＰＲＧＬＰＧＰＰＧＡＰＧＰＱＧＦＱＧＰＰＧＥＰＧＥＰＧＡＳＧＰＭＧＰＲＧＰＰＧＰＰＧＫＮＧＤＤＧＥＡＧＫＰＧＲＰＧＥＲＧＰＰＧＰＱＧＡＲＧＬＰＧＴＡＧＬＰＧＭＫＧＨＲＧＦＳＧＬＤＧＡＫＧＤＡＧＰＡＧＰＫＧＥＰＧＳＰＧＥＮＧＡＰＧＱＭＧＰＲＧＬＰＧＥＲＧＲＰＧＡＰＧＰＡＧＡＲＧＮＤＧＡＴＧＡＡＧＰＰＧＰＴＧＰＡＧＰＰＧＦＰＧＡＶＧＡＫＧＥＡＧＰＱＧＰＲＧＳＥＧＰＱＧＶＲＧＥＰＧＰＰＧＰＡＧＡＡＧＰＡＧＮＰＧＡＤＧＱＰＧＡＫＧＡＮＧＡＰＧＩＡＧＡＰＧＦＰＧＡＲＧＰＳＧＰＱＧＰＧＧＰＰＧＰＫＧＮＳＧＥＰＧＡＰＧＳＫＧＤＴＧＡＫＧＥＰＧＰＶＧＶＱＧＰＰＧＰＡＧＥＥＧＫＲＧＡＲＧＥＰＧＰＴＧＬＰＧＰＰＧＥＲＧＧＰＧＳＲＧＦＰＧＡＤＧＶＡＧＰＫＧＰＡＧＥＲＧＳＰＧＰＡＧＰＫＧＳＰＧＥＡＧＲＰＧＥＡＧＬＰＧＡＫＧＬＴＧＳＰＧＳＰＧＰＤＧＫＴＧＰＰＧＰＡＧＱＤＧＲＰＧＰＰＧＰＰＧＡＲＧＱＡＧＶＭＧＦＰＧＰＫＧＡＡＧＥＰＧＫＡＧＥＲＧＶＰＧＰＰＧＡＶＧＰＡＧＫＤＧＥＡＧＡＱＧＰＰＧＰＡＧＰＡＧＥＲＧＥＱＧＰＡＧＳＰＧＦＱＧＬＰＧＰＡＧＰＰＧＥＡＧＫＰＧＥＱＧＶＰＧＤＬＧＡＰＧＰＳＧＡＲＧＥＲＧＦＰＧＥＲＧＶＱＧＰＰＧＰＡＧＰＲＧＡＮＧＡＰＧＮＤＧＡＫＧＤＡＧＡＰＧＡＰＧＳＱＧＡＰＧＬＱＧＭＰＧＥＲＧＡＡＧＬＰＧＰＫＧＤＲＧＤＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＫＤＧＶＲＧＬＴＧＰＩＧＰＰＧＰＡＧＡＰＧＤＫＧＥＳＧＰＳＧＰＡＧＰＴＧＡＲＧＡＰＧＤＲＧＥＰＧＰＰＧＰＡＧＦＡＧＰＰＧＡＤＧＱＰＧＡＫＧＥＰＧＤＡＧＡＫＧＤＡＧＰＰＧＰＡＧＰＡＧＰＰＧＰＩＧＮＶＧＡＰＧＡＫＧＡＲＧＳＡＧＰＰＧＡＴＧＦＰＧＡＡＧＲＶＧＰＰＧＰＳＧＮＡＧＰＰＧＰＰＧＰＡＧＫＥＧＧＫＧＰＲＧＥＴＧＰＡＧＲＰＧＥＶＧＰＰＧＰＰＧＰＡＧＥＫＧＳＰＧＡＤＧＰＡＧＡＰＧＴＰＧＰＱＧＩＡＧＱＲＧＶＶＧＬＰＧＱＲＧＥＲＧＦＰＧＬＰＧＰＳＧＥＰＧＫＱＧＰＳＧＡＳＧＥＲＧＰＰＧＰＭＧＰＰＧＬＡＧＰＰＧＥＳＧＲＥＧＡＰＧＡＥＧＳＰＧＲＤＧＳＰＧＡＫＧＤＲＧＥＴＧＰＡＧＰＰＧＡＰＧＡＰＧＡＰＧＰＶＧＰＡＧＫＳＧＤＲＧＥＴＧＰＡＧＰＡＧＰＶＧＰＶＧＡＲＧＰＡＧＰＱＧＰＲＧＤＫＧＥＴＧＥＱＧＤＲＧＩＫＧＨＲＧＦＳＧＬＱＧＰＰＧＰＰＧＳＰＧＥＱＧＰＳＧＡＳＧＰＡＧＰＲＧＰＰＧＳＡＧＡＰＧＫＤＧＬＮＧＬＰＧＰＩＧＰＰＧＰＲＧＲＴＧＤＡＧＰＶＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＳＡＧＦＤＦＳＦＬＰＱＰＰＱＥＫＡＨＤＧＧＲＹＹＲＡ
【0042】
長期にわたる実験研究の結果、α１（Ｉ）Ｍ１と表記する組換えヒトＩ型のコラーゲンのα１鎖の変異体が得られた。α１（Ｉ）に対して、α１（Ｉ）Ｍ１は、アミノ酸配列におけるアミノ酸を４個変更し、それらの４個のアミノ酸をプロリン（Ｐｒｏ、Ｐと略称する）に変異し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列の１０６番目のＭ、１０９番目のＲ、１９０番目のＭ、１９３番目のＲは、Ｐに変更され、残りのアミノ酸配列は変化しなかった。α１（Ｉ）Ｍ１とα１（Ｉ）との相同性は、９９．６％である。
【0043】
変更されたアミノ酸配列（α１（Ｉ）Ｍ１）の全長は１０５７ＡＡであり、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される。
【0044】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：
ＱＬＳＹＧＹＤＥＫＳＴＧＧＩＳＶＰＧＰＭＧＰＳＧＰＲＧＬＰＧＰＰＧＡＰＧＰＱＧＦＱＧＰＰＧＥＰＧＥＰＧＡＳＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＫＮＧＤＤＧＥＡＧＫＰＧＲＰＧＥＲＧＰＰＧＰＱＧＡＲＧＬＰＧＴＡＧＬＰＧＭＫＧＨＲＧＦＳＧＬＤＧＡＫＧＤＡＧＰＡＧＰＫＧＥＰＧＳＰＧＥＮＧＡＰＧＱＰＧＰＰＧＬＰＧＥＲＧＲＰＧＡＰＧＰＡＧＡＲＧＮＤＧＡＴＧＡＡＧＰＰＧＰＴＧＰＡＧＰＰＧＦＰＧＡＶＧＡＫＧＥＡＧＰＱＧＰＲＧＳＥＧＰＱＧＶＲＧＥＰＧＰＰＧＰＡＧＡＡＧＰＡＧＮＰＧＡＤＧＱＰＧＡＫＧＡＮＧＡＰＧＩＡＧＡＰＧＦＰＧＡＲＧＰＳＧＰＱＧＰＧＧＰＰＧＰＫＧＮＳＧＥＰＧＡＰＧＳＫＧＤＴＧＡＫＧＥＰＧＰＶＧＶＱＧＰＰＧＰＡＧＥＥＧＫＲＧＡＲＧＥＰＧＰＴＧＬＰＧＰＰＧＥＲＧＧＰＧＳＲＧＦＰＧＡＤＧＶＡＧＰＫＧＰＡＧＥＲＧＳＰＧＰＡＧＰＫＧＳＰＧＥＡＧＲＰＧＥＡＧＬＰＧＡＫＧＬＴＧＳＰＧＳＰＧＰＤＧＫＴＧＰＰＧＰＡＧＱＤＧＲＰＧＰＰＧＰＰＧＡＲＧＱＡＧＶＭＧＦＰＧＰＫＧＡＡＧＥＰＧＫＡＧＥＲＧＶＰＧＰＰＧＡＶＧＰＡＧＫＤＧＥＡＧＡＱＧＰＰＧＰＡＧＰＡＧＥＲＧＥＱＧＰＡＧＳＰＧＦＱＧＬＰＧＰＡＧＰＰＧＥＡＧＫＰＧＥＱＧＶＰＧＤＬＧＡＰＧＰＳＧＡＲＧＥＲＧＦＰＧＥＲＧＶＱＧＰＰＧＰＡＧＰＲＧＡＮＧＡＰＧＮＤＧＡＫＧＤＡＧＡＰＧＡＰＧＳＱＧＡＰＧＬＱＧＭＰＧＥＲＧＡＡＧＬＰＧＰＫＧＤＲＧＤＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＫＤＧＶＲＧＬＴＧＰＩＧＰＰＧＰＡＧＡＰＧＤＫＧＥＳＧＰＳＧＰＡＧＰＴＧＡＲＧＡＰＧＤＲＧＥＰＧＰＰＧＰＡＧＦＡＧＰＰＧＡＤＧＱＰＧＡＫＧＥＰＧＤＡＧＡＫＧＤＡＧＰＰＧＰＡＧＰＡＧＰＰＧＰＩＧＮＶＧＡＰＧＡＫＧＡＲＧＳＡＧＰＰＧＡＴＧＦＰＧＡＡＧＲＶＧＰＰＧＰＳＧＮＡＧＰＰＧＰＰＧＰＡＧＫＥＧＧＫＧＰＲＧＥＴＧＰＡＧＲＰＧＥＶＧＰＰＧＰＰＧＰＡＧＥＫＧＳＰＧＡＤＧＰＡＧＡＰＧＴＰＧＰＱＧＩＡＧＱＲＧＶＶＧＬＰＧＱＲＧＥＲＧＦＰＧＬＰＧＰＳＧＥＰＧＫＱＧＰＳＧＡＳＧＥＲＧＰＰＧＰＭＧＰＰＧＬＡＧＰＰＧＥＳＧＲＥＧＡＰＧＡＥＧＳＰＧＲＤＧＳＰＧＡＫＧＤＲＧＥＴＧＰＡＧＰＰＧＡＰＧＡＰＧＡＰＧＰＶＧＰＡＧＫＳＧＤＲＧＥＴＧＰＡＧＰＡＧＰＶＧＰＶＧＡＲＧＰＡＧＰＱＧＰＲＧＤＫＧＥＴＧＥＱＧＤＲＧＩＫＧＨＲＧＦＳＧＬＱＧＰＰＧＰＰＧＳＰＧＥＱＧＰＳＧＡＳＧＰＡＧＰＲＧＰＰＧＳＡＧＡＰＧＫＤＧＬＮＧＬＰＧＰＩＧＰＰＧＰＲＧＲＴＧＤＡＧＰＶＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＳＡＧＦＤＦＳＦＬＰＱＰＰＱＥＫＡＨＤＧＧＲＹＹＲＡ
ＱＬＳＹＧＹＤＥＫＳＴＧＧＩＳＶＰＧＰＭＧＰＳＧＰＲＧＬＰＧＰＰＧＡＰＧＰＱＧＦＱＧＰＰＧＥＰＧＥＰＧＡＳＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＫＮＧＤＤＧＥＡＧＫＰＧＲＰＧＥＲＧＰＰＧＰＱＧＡＲＧＬＰＧＴＡＧＬＰＧＭＫＧＨＲＧＦＳＧＬＤＧＡＫＧＤＡＧＰＡＧＰＫＧＥＰＧＳＰＧＥＮＧＡＰＧＱＰＧＰＰＧＬＰＧＥＲＧＲＰＧＡＰＧＰＡＧＡＲＧＮＤＧＡＴＧＡＡＧＰＰＧＰＴＧＰＡＧＰＰＧＦＰＧＡＶＧＡＫＧＥＡＧＰＱＧＰＲＧＳＥＧＰＱＧＶＲＧＥＰＧＰＰＧＰＡＧＡＡＧＰＡＧＮＰＧＡＤＧＱＰＧＡＫＧＡＮＧＡＰＧＩＡＧＡＰＧＦＰＧＡＲＧＰＳＧＰＱＧＰＧＧＰＰＧＰＫＧＮＳＧＥＰＧＡＰＧＳＫＧＤＴＧＡＫＧＥＰＧＰＶＧＶＱＧＰＰＧＰＡＧＥＥＧＫＲＧＡＲＧＥＰＧＰＴＧＬＰＧＰＰＧＥＲＧＧＰＧＳＲＧＦＰＧＡＤＧＶＡＧＰＫＧＰＡＧＥＲＧＳＰＧＰＡＧＰＫＧＳＰＧＥＡＧＲＰＧＥＡＧＬＰＧＡＫＧＬＴＧＳＰＧＳＰＧＰＤＧＫＴＧＰＰＧＰＡＧＱＤＧＲＰＧＰＰＧＰＰＧＡＲＧＱＡＧＶＭＧＦＰＧＰＫＧＡＡＧＥＰＧＫＡＧＥＲＧＶＰＧＰＰＧＡＶＧＰＡＧＫＤＧＥＡＧＡＱＧＰＰＧＰＡＧＰＡＧＥＲＧＥＱＧＰＡＧＳＰＧＦＱＧＬＰＧＰＡＧＰＰＧＥＡＧＫＰＧＥＱＧＶＰＧＤＬＧＡＰＧＰＳＧＡＲＧＥＲＧＦＰＧＥＲＧＶＱＧＰＰＧＰＡＧＰＲＧＡＮＧＡＰＧＮＤＧＡＫＧＤＡＧＡＰＧＡＰＧＳＱＧＡＰＧＬＱＧＭＰＧＥＲＧＡＡＧＬＰＧＰＫＧＤＲＧＤＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＫＤＧＶＲＧＬＴＧＰＩＧＰＰＧＰＡＧＡＰＧＤＫＧＥＳＧＰＳＧＰＡＧＰＴＧＡＲＧＡＰＧＤＲＧＥＰＧＰＰＧＰＡＧＦＡＧＰＰＧＡＤＧＱＰＧＡＫＧＥＰＧＤＡＧＡＫＧＤＡＧＰＰＧＰＡＧＰＡＧＰＰＧＰＩＧＮＶＧＡＰＧＡＫＧＡＲＧＳＡＧＰＰＧＡＴＧＦＰＧＡＡＧＲＶＧＰＰＧＰＳＧＮＡＧＰＰＧＰＰＧＰＡＧＫＥＧＧＫＧＰＲＧＥＴＧＰＡＧＲＰＧＥＶＧＰＰＧＰＰＧＰＡＧＥＫＧＳＰＧＡＤＧＰＡＧＡＰＧＴＰＧＰＱＧＩＡＧＱＲＧＶＶＧＬＰＧＱＲＧＥＲＧＦＰＧＬＰＧＰＳＧＥＰＧＫＱＧＰＳＧＡＳＧＥＲＧＰＰＧＰＭＧＰＰＧＬＡＧＰＰＧＥＳＧＲＥＧＡＰＧＡＥＧＳＰＧＲＤＧＳＰＧＡＫＧＤＲＧＥＴＧＰＡＧＰＰＧＡＰＧＡＰＧＡＰＧＰＶＧＰＡＧＫＳＧＤＲＧＥＴＧＰＡＧＰＡＧＰＶＧＰＶＧＡＲＧＰＡＧＰＱＧＰＲＧＤＫＧＥＴＧＥＱＧＤＲＧＩＫＧＨＲＧＦＳＧＬＱＧＰＰＧＰＰＧＳＰＧＥＱＧＰＳＧＡＳＧＰＡＧＰＲＧＰＰＧＳＡＧＡＰＧＫＤＧＬＮＧＬＰＧＰＩＧＰＰＧＰＲＧＲＴＧＤＡＧＰＶＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＳＡＧＦＤＦＳＦＬＰＱＰＰＱＥＫＡＨＤＧＧＲＹＹＲＡ
【0045】
α１（Ｉ）Ｍ１とα１（Ｉ）アミノ酸配列の違いは、図１における灰色のバックグラウンドと太字のアミノ酸に示される。
【0046】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるα１（１）Ｍ１をコードする遺伝子（ＣＯＬ１Ａ１Ｍ１と表記する）ＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される。
【0047】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３：
ＣＡＡＣＴＴＡＧＴＴＡＴＧＧＡＴＡＣＧＡＴＧＡＡＡＡＡＴＣＣＡＣＡＧＧＴＧＧＡＡＴＣＡＧＴＧＴＴＣＣＴＧＧＡＣＣＴＡＴＧＧＧＴＣＣＡＴＣＡＧＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＣＣＴＣＣＡＧＧＴＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＣＣＣＡＧＧＧＡＴＴＴＣＡＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＣＣＴＧＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＣＴＴＣＴＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＣＣＣＴＧＧＡＣＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＡＡＧＡＡＴＧＧＡＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＡＣＣＴＧＧＡＡＧＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＡＣＣＡＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＡＧＧＧＴＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＧＣＣＡＧＧＴＡＣＣＧＣＡＧＧＴＣＴＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＡＡＡＧＧＴＣＡＴＡＧＡＧＧＡＴＴＴＴＣＡＧＧＡＴＴＡＧＡＣＧＧＴＧＣＡＡＡＧＧＧＡＧＡＣＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＡＡＧＧＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＴＣＣＡＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＴＧＣＣＣＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＴＡＧＡＣＣＣＧＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＡＡＡＴＧＡＴＧＧＡＧＣＴＡＣＡＧＧＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＡＣＡＧＧＡＣＣＡＧＣＣＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＴＴＴＣＣＣＡＧＧＴＧＣＣＧＴＴＧＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＴＣＣＡＣＡＧＧＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＣＣＡＣＡＧＧＧＡＧＴＴＡＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＴＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＴＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＣＧＧＴＣＡＧＣＣＡＧＧＴＧＣＴＡＡＧＧＧＡＧＣＡＡＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＡＡＴＡＧＣＴＧＧＴＧＣＣＣＣＡＧＧＡＴＴＴＣＣＣＧＧＴＧＣＴＡＧＡＧＧＴＣＣＡＡＧＴＧＧＴＣＣＡＣＡＡＧＧＡＣＣＡＧＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＣＧＧＴＣＣＣＡＡＡＧＧＡＡＡＣＡＧＴＧＧＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＣＡＣＣＣＧＧＴＴＣＡＡＡＧＧＧＡＧＡＴＡＣＡＧＧＡＧＣＴＡＡＡＧＧＡＧＡＧＣＣＣＧＧＴＣＣＡＧＴＧＧＧＴＧＴＴＣＡＧＧＧＡＣＣＡＣＣＣＧＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＧＴＡＡＡＡＧＡＧＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＣＣＡＡＣＡＧＧＴＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＣＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＴＧＧＴＣＣＡＧＧＴＡＧＴＡＧＡＧＧＡＴＴＴＣＣＡＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＧＴＧＴＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＡＡＧＧＧＡＣＣＣＧＣＡＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＧＧＴＣＣＡＧＣＣＧＧＡＣＣＡＡＡＡＧＧＡＴＣＡＣＣＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＧＴＡＧＡＣＣＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＧＴＣＴＧＣＣＡＧＧＴＧＣＴＡＡＡＧＧＡＴＴＧＡＣＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＴＧＡＴＧＧＡＡＡＧＡＣＡＧＧＡＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣＣＣＧＣＴＧＧＴＣＡＧＧＡＣＧＧＴＡＧＡＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＴＣＡＧＧＣＡＧＧＴＧＴＡＡＴＧＧＧＴＴＴＣＣＣＣＧＧＡＣＣＴＡＡＡＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＡＡＣＣＴＧＧＴＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＧＣＣＴＧＧＡＣＣＣＣＣＴＧＧＡＧＣＴＧＴＴＧＧＴＣＣＡＧＣＡＧＧＡＡＡＧＧＡＴＧＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＣＣＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＣＡＡＧＧＴＣＣＣＧＣＡＧＧＴＴＣＴＣＣＡＧＧＴＴＴＴＣＡＧＧＧＴＴＴＧＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＣＧＧＴＣＣＴＣＣＴＧＧＡＧＡＧＧＣＡＧＧＡＡＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＡＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＡＧＡＣＣＴＧＧＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＣＣＴＣＴＧＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＴＴＣＣＴＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＴＧＴＧＣＡＧＧＧＡＣＣＡＣＣＡＧＧＴＣＣＣＧＣＣＧＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＡＡＴＧＧＡＧＣＣＣＣＴＧＧＡＡＡＴＧＡＣＧＧＡＧＣＴＡＡＧＧＧＴＧＡＣＧＣＴＧＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＴＴＣＴＣＡＡＧＧＴＧＣＴＣＣＣＧＧＡＴＴＧＣＡＧＧＧＴＡＴＧＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡＣＴＧＣＣＡＧＧＴＣＣＡＡＡＡＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＧＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＣＣＴＡＡＧＧＧＡＧＣＴＧＡＣＧＧＴＴＣＴＣＣＴＧＧＡＡＡＧＧＡＣＧＧＴＧＴＧＡＧＡＧＧＴＴＴＧＡＣＡＧＧＡＣＣＡＡＴＡＧＧＴＣＣＡＣＣＣＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＣＣＣＴＧＧＡＧＡＣＡＡＡＧＧＴＧＡＡＴＣＡＧＧＴＣＣＴＴＣＣＧＧＴＣＣＡＧＣＣＧＧＡＣＣＡＡＣＡＧＧＡＧＣＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＧＡＧＡＧＣＣＡＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＴＴＣＧＣＴＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＣＴＡＡＧＧＧＡＧＡＡＣＣＣＧＧＴＧＡＣＧＣＴＧＧＴＧＣＴＡＡＧＧＧＡＧＡＴＧＣＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＣＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＡＡＴＡＧＧＴＡＡＴＧＴＴＧＧＡＧＣＡＣＣＣＧＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＧＧＴＴＣＣＧＣＡＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＡＧＣＡＡＣＴＧＧＴＴＴＴＣＣＡＧＧＡＧＣＴＧＣＣＧＧＡＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＴＴＣＴＧＧＡＡＡＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＣＡＧＧＴＣＣＴＣＣＴＧＧＴＣＣＡＧＣＣＧＧＡＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＧＧＧＡＣＣＴＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＣＡＧＧＴＣＣＣＧＣＡＧＧＴＡＧＡＣＣＣＧＧＴＧＡＧＧＴＧＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＡＣＣＣＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＧＡＡＡＧＧＡＡＧＴＣＣＴＧＧＡＧＣＡＧＡＣＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＣＣＣＴＧＧＴＡＣＡＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＡＡＧＧＡＡＴＡＧＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＡＧＧＴＧＴＴＧＴＴＧＧＴＴＴＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＴＴＴＴＣＣＡＧＧＡＴＴＡＣＣＡＧＧＴＣＣＣＴＣＡＧＧＴＧＡＧＣＣＣＧＧＡＡＡＡＣＡＧＧＧＴＣＣＣＴＣＡＧＧＡＧＣＡＡＧＴＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＡＣＣＡＣＣＡＧＧＡＣＣＡＡＴＧＧＧＡＣＣＴＣＣＡＧＧＡＴＴＡＧＣＴＧＧＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＧＡＡＴＣＡＧＧＡＡＧＡＧＡＧＧＧＴＧＣＴＣＣＴＧＧＡＧＣＡＧＡＡＧＧＴＴＣＡＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＡＣＧＧＴＴＣＡＣＣＣＧＧＡＧＣＣＡＡＧＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＣＡＧＧＴＣＣＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＣＧＧＡＧＣＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＴＣＧＧＡＣＣＡＧＣＡＧＧＡＡＡＡＴＣＣＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＧＴＧＡＧＡＣＴＧＧＡＣＣＣＧＣＡＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＣＣＴＧＴＴＧＧＡＣＣＡＧＴＧＧＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＡＣＣＡＧＣＡＧＧＴＣＣＡＣＡＡＧＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡＡＡＧＧＴＧＡＧＡＣＡＧＧＴＧＡＧＣＡＧＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＧＡＡＴＴＡＡＡＧＧＴＣＡＣＡＧＡＧＧＡＴＴＴＴＣＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＧＧＡＣＣＡＣＣＣＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＴＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＣＡＡＧＧＴＣＣＡＴＣＣＧＧＴＧＣＡＴＣＣＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＡＣＣＣＡＧＡＧＧＡＣＣＡＣＣＴＧＧＴＴＣＴＧＣＴＧＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＧＡＡＣＧＧＴＴＴＧＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＴＡＧＧＡＣＣＴＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＡＣＴＧＧＴＧＡＣＧＣＣＧＧＴＣＣＣＧＴＣＧＧＡＣＣＡＣＣＣＧＧＴＣＣＡＣＣＡＧＧＴＣＣＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＣＣＣＧＧＡＣＣＡＣＣＡＴＣＣＧＣＡＧＧＡＴＴＴＧＡＴＴＴＣＴＣＡＴＴＣＣＴＴＣＣＴＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧＣＡＣＡＴＧＡＴＧＧＡＧＧＴＡＧＡＴＡＣＴＡＴＡＧＡＧＣＣ
ＣＡＡＣＴＴＡＧＴＴＡＴＧＧＡＴＡＣＧＡＴＧＡＡＡＡＡＴＣＣＡＣＡＧＧＴＧＧＡＡＴＣＡＧＴＧＴＴＣＣＴＧＧＡＣＣＴＡＴＧＧＧＴＣＣＡＴＣＡＧＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＣＣＴＣＣＡＧＧＴＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＣＣＣＡＧＧＧＡＴＴＴＣＡＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＣＣＴＧＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＣＴＴＣＴＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＣＣＣＴＧＧＡＣＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＡＡＧＡＡＴＧＧＡＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＡＣＣＴＧＧＡＡＧＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＡＣＣＡＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＡＧＧＧＴＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＧＣＣＡＧＧＴＡＣＣＧＣＡＧＧＴＣＴＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＡＡＡＧＧＴＣＡＴＡＧＡＧＧＡＴＴＴＴＣＡＧＧＡＴＴＡＧＡＣＧＧＴＧＣＡＡＡＧＧＧＡＧＡＣＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＡＡＧＧＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＴＣＣＡＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＴＧＣＣＣＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＴＡＧＡＣＣＣＧＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＡＡＡＴＧＡＴＧＧＡＧＣＴＡＣＡＧＧＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＡＣＡＧＧＡＣＣＡＧＣＣＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＴＴＴＣＣＣＡＧＧＴＧＣＣＧＴＴＧＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＴＣＣＡＣＡＧＧＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＣＣＡＣＡＧＧＧＡＧＴＴＡＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＴＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＴＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＣＧＧＴＣＡＧＣＣＡＧＧＴＧＣＴＡＡＧＧＧＡＧＣＡＡＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＡＡＴＡＧＣＴＧＧＴＧＣＣＣＣＡＧＧＡＴＴＴＣＣＣＧＧＴＧＣＴＡＧＡＧＧＴＣＣＡＡＧＴＧＧＴＣＣＡＣＡＡＧＧＡＣＣＡＧＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＣＧＧＴＣＣＣＡＡＡＧＧＡＡＡＣＡＧＴＧＧＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＣＡＣＣＣＧＧＴＴＣＡＡＡＧＧＧＡＧＡＴＡＣＡＧＧＡＧＣＴＡＡＡＧＧＡＧＡＧＣＣＣＧＧＴＣＣＡＧＴＧＧＧＴＧＴＴＣＡＧＧＧＡＣＣＡＣＣＣＧＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＧＴＡＡＡＡＧＡＧＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＣＣＡＡＣＡＧＧＴＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＣＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＴＧＧＴＣＣＡＧＧＴＡＧＴＡＧＡＧＧＡＴＴＴＣＣＡＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＧＴＧＴＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＡＡＧＧＧＡＣＣＣＧＣＡＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＧＧＴＣＣＡＧＣＣＧＧＡＣＣＡＡＡＡＧＧＡＴＣＡＣＣＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＧＴＡＧＡＣＣＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＧＴＣＴＧＣＣＡＧＧＴＧＣＴＡＡＡＧＧＡＴＴＧＡＣＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＴＧＡＴＧＧＡＡＡＧＡＣＡＧＧＡＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣＣＣＧＣＴＧＧＴＣＡＧＧＡＣＧＧＴＡＧＡＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＴＣＡＧＧＣＡＧＧＴＧＴＡＡＴＧＧＧＴＴＴＣＣＣＣＧＧＡＣＣＴＡＡＡＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＡＡＣＣＴＧＧＴＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＧＣＣＴＧＧＡＣＣＣＣＣＴＧＧＡＧＣＴＧＴＴＧＧＴＣＣＡＧＣＡＧＧＡＡＡＧＧＡＴＧＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＣＣＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＣＡＡＧＧＴＣＣＣＧＣＡＧＧＴＴＣＴＣＣＡＧＧＴＴＴＴＣＡＧＧＧＴＴＴＧＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＣＧＧＴＣＣＴＣＣＴＧＧＡＧＡＧＧＣＡＧＧＡＡＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＡＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＡＧＡＣＣＴＧＧＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＣＣＴＣＴＧＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＴＴＣＣＴＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＴＧＴＧＣＡＧＧＧＡＣＣＡＣＣＡＧＧＴＣＣＣＧＣＣＧＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＡＡＴＧＧＡＧＣＣＣＣＴＧＧＡＡＡＴＧＡＣＧＧＡＧＣＴＡＡＧＧＧＴＧＡＣＧＣＴＧＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＴＴＣＴＣＡＡＧＧＴＧＣＴＣＣＣＧＧＡＴＴＧＣＡＧＧＧＴＡＴＧＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡＣＴＧＣＣＡＧＧＴＣＣＡＡＡＡＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＧＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＣＣＴＡＡＧＧＧＡＧＣＴＧＡＣＧＧＴＴＣＴＣＣＴＧＧＡＡＡＧＧＡＣＧＧＴＧＴＧＡＧＡＧＧＴＴＴＧＡＣＡＧＧＡＣＣＡＡＴＡＧＧＴＣＣＡＣＣＣＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＣＣＣＴＧＧＡＧＡＣＡＡＡＧＧＴＧＡＡＴＣＡＧＧＴＣＣＴＴＣＣＧＧＴＣＣＡＧＣＣＧＧＡＣＣＡＡＣＡＧＧＡＧＣＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＧＡＧＡＧＣＣＡＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＴＴＣＧＣＴＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＣＴＡＡＧＧＧＡＧＡＡＣＣＣＧＧＴＧＡＣＧＣＴＧＧＴＧＣＴＡＡＧＧＧＡＧＡＴＧＣＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＣＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＡＡＴＡＧＧＴＡＡＴＧＴＴＧＧＡＧＣＡＣＣＣＧＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＧＧＴＴＣＣＧＣＡＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＡＧＣＡＡＣＴＧＧＴＴＴＴＣＣＡＧＧＡＧＣＴＧＣＣＧＧＡＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＴＴＣＴＧＧＡＡＡＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＣＡＧＧＴＣＣＴＣＣＴＧＧＴＣＣＡＧＣＣＧＧＡＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＧＧＧＡＣＣＴＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＣＡＧＧＴＣＣＣＧＣＡＧＧＴＡＧＡＣＣＣＧＧＴＧＡＧＧＴＧＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＡＣＣＣＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＧＡＡＡＧＧＡＡＧＴＣＣＴＧＧＡＧＣＡＧＡＣＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＣＣＣＴＧＧＴＡＣＡＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＡＡＧＧＡＡＴＡＧＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＡＧＧＴＧＴＴＧＴＴＧＧＴＴＴＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＴＴＴＴＣＣＡＧＧＡＴＴＡＣＣＡＧＧＴＣＣＣＴＣＡＧＧＴＧＡＧＣＣＣＧＧＡＡＡＡＣＡＧＧＧＴＣＣＣＴＣＡＧＧＡＧＣＡＡＧＴＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＡＣＣＡＣＣＡＧＧＡＣＣＡＡＴＧＧＧＡＣＣＴＣＣＡＧＧＡＴＴＡＧＣＴＧＧＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＧＡＡＴＣＡＧＧＡＡＧＡＧＡＧＧＧＴＧＣＴＣＣＴＧＧＡＧＣＡＧＡＡＧＧＴＴＣＡＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＡＣＧＧＴＴＣＡＣＣＣＧＧＡＧＣＣＡＡＧＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＣＡＧＧＴＣＣＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＣＧＧＡＧＣＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＴＣＧＧＡＣＣＡＧＣＡＧＧＡＡＡＡＴＣＣＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＧＴＧＡＧＡＣＴＧＧＡＣＣＣＧＣＡＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＣＣＴＧＴＴＧＧＡＣＣＡＧＴＧＧＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＡＣＣＡＧＣＡＧＧＴＣＣＡＣＡＡＧＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡＡＡＧＧＴＧＡＧＡＣＡＧＧＴＧＡＧＣＡＧＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＧＡＡＴＴＡＡＡＧＧＴＣＡＣＡＧＡＧＧＡＴＴＴＴＣＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＧＧＡＣＣＡＣＣＣＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＴＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＣＡＡＧＧＴＣＣＡＴＣＣＧＧＴＧＣＡＴＣＣＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＡＣＣＣＡＧＡＧＧＡＣＣＡＣＣＴＧＧＴＴＣＴＧＣＴＧＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＧＡＡＣＧＧＴＴＴＧＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＴＡＧＧＡＣＣＴＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＡＣＴＧＧＴＧＡＣＧＣＣＧＧＴＣＣＣＧＴＣＧＧＡＣＣＡＣＣＣＧＧＴＣＣＡＣＣＡＧＧＴＣＣＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＣＣＣＧＧＡＣＣＡＣＣＡＴＣＣＧＣＡＧＧＡＴＴＴＧＡＴＴＴＣＴＣＡＴＴＣＣＴＴＣＣＴＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧＣＡＣＡＴＧＡＴＧＧＡＧＧＴＡＧＡＴＡＣＴＡＴＡＧＡＧＣＣ
【0048】
ヒトＩＩ型のコラーゲンのα１鎖（α１（ＩＩ）と表記する）のアミノ酸配列は、ＵｎｉｐｒｏｔデータベースＰ０２４５８（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ０２４５８）配列中の１８２～１２４１部分（ＰＲＯ＿００００００５７３０）を参照し、成熟ヒトＩＩ型のコラーゲンのα１鎖アミノ酸配列であり、シグナルペプチド、Ｃ末端プロペプチド、Ｎ末端プロペプチドなどのα１（ＩＩ）前駆体タンパク質におけるプロセシングされて脱落する部分が含まれておらず、その配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される。
【0049】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：
ＱＭＡＧＧＦＤＥＫＡＧＧＡＱＬＧＶＭＱＧＰＭＧＰＭＧＰＲＧＰＰＧＰＡＧＡＰＧＰＱＧＦＱＧＮＰＧＥＰＧＥＰＧＶＳＧＰＭＧＰＲＧＰＰＧＰＰＧＫＰＧＤＤＧＥＡＧＫＰＧＫＡＧＥＲＧＰＰＧＰＱＧＡＲＧＦＰＧＴＰＧＬＰＧＶＫＧＨＲＧＹＰＧＬＤＧＡＫＧＥＡＧＡＰＧＶＫＧＥＳＧＳＰＧＥＮＧＳＰＧＰＭＧＰＲＧＬＰＧＥＲＧＲＴＧＰＡＧＡＡＧＡＲＧＮＤＧＱＰＧＰＡＧＰＰＧＰＶＧＰＡＧＧＰＧＦＰＧＡＰＧＡＫＧＥＡＧＰＴＧＡＲＧＰＥＧＡＱＧＰＲＧＥＰＧＴＰＧＳＰＧＰＡＧＡＳＧＮＰＧＴＤＧＩＰＧＡＫＧＳＡＧＡＰＧＩＡＧＡＰＧＦＰＧＰＲＧＰＰＧＰＱＧＡＴＧＰＬＧＰＫＧＱＴＧＥＰＧＩＡＧＦＫＧＥＱＧＰＫＧＥＰＧＰＡＧＰＱＧＡＰＧＰＡＧＥＥＧＫＲＧＡＲＧＥＰＧＧＶＧＰＩＧＰＰＧＥＲＧＡＰＧＮＲＧＦＰＧＱＤＧＬＡＧＰＫＧＡＰＧＥＲＧＰＳＧＬＡＧＰＫＧＡＮＧＤＰＧＲＰＧＥＰＧＬＰＧＡＲＧＬＴＧＲＰＧＤＡＧＰＱＧＫＶＧＰＳＧＡＰＧＥＤＧＲＰＧＰＰＧＰＱＧＡＲＧＱＰＧＶＭＧＦＰＧＰＫＧＡＮＧＥＰＧＫＡＧＥＫＧＬＰＧＡＰＧＬＲＧＬＰＧＫＤＧＥＴＧＡＡＧＰＰＧＰＡＧＰＡＧＥＲＧＥＱＧＡＰＧＰＳＧＦＱＧＬＰＧＰＰＧＰＰＧＥＧＧＫＰＧＤＱＧＶＰＧＥＡＧＡＰＧＬＶＧＰＲＧＥＲＧＦＰＧＥＲＧＳＰＧＡＱＧＬＱＧＰＲＧＬＰＧＴＰＧＴＤＧＰＫＧＡＳＧＰＡＧＰＰＧＡＱＧＰＰＧＬＱＧＭＰＧＥＲＧＡＡＧＩＡＧＰＫＧＤＲＧＤＶＧＥＫＧＰＥＧＡＰＧＫＤＧＧＲＧＬＴＧＰＩＧＰＰＧＰＡＧＡＮＧＥＫＧＥＶＧＰＰＧＰＡＧＳＡＧＡＲＧＡＰＧＥＲＧＥＴＧＰＰＧＰＡＧＦＡＧＰＰＧＡＤＧＱＰＧＡＫＧＥＱＧＥＡＧＱＫＧＤＡＧＡＰＧＰＱＧＰＳＧＡＰＧＰＱＧＰＴＧＶＴＧＰＫＧＡＲＧＡＱＧＰＰＧＡＴＧＦＰＧＡＡＧＲＶＧＰＰＧＳＮＧＮＰＧＰＰＧＰＰＧＰＳＧＫＤＧＰＫＧＡＲＧＤＳＧＰＰＧＲＡＧＥＰＧＬＱＧＰＡＧＰＰＧＥＫＧＥＰＧＤＤＧＰＳＧＡＥＧＰＰＧＰＱＧＬＡＧＱＲＧＩＶＧＬＰＧＱＲＧＥＲＧＦＰＧＬＰＧＰＳＧＥＰＧＫＱＧＡＰＧＡＳＧＤＲＧＰＰＧＰＶＧＰＰＧＬＴＧＰＡＧＥＰＧＲＥＧＳＰＧＡＤＧＰＰＧＲＤＧＡＡＧＶＫＧＤＲＧＥＴＧＡＶＧＡＰＧＡＰＧＰＰＧＳＰＧＰＡＧＰＴＧＫＱＧＤＲＧＥＡＧＡＱＧＰＭＧＰＳＧＰＡＧＡＲＧＩＱＧＰＱＧＰＲＧＤＫＧＥＡＧＥＰＧＥＲＧＬＫＧＨＲＧＦＴＧＬＱＧＬＰＧＰＰＧＰＳＧＤＱＧＡＳＧＰＡＧＰＳＧＰＲＧＰＰＧＰＶＧＰＳＧＫＤＧＡＮＧＩＰＧＰＩＧＰＰＧＰＲＧＲＳＧＥＴＧＰＡＧＰＰＧＮＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＧＩＤＭＳＡＦＡＧＬＧＰＲＥＫＧＰＤＰＬＱＹＭＲＡ
ＱＭＡＧＧＦＤＥＫＡＧＧＡＱＬＧＶＭＱＧＰＭＧＰＭＧＰＲＧＰＰＧＰＡＧＡＰＧＰＱＧＦＱＧＮＰＧＥＰＧＥＰＧＶＳＧＰＭＧＰＲＧＰＰＧＰＰＧＫＰＧＤＤＧＥＡＧＫＰＧＫＡＧＥＲＧＰＰＧＰＱＧＡＲＧＦＰＧＴＰＧＬＰＧＶＫＧＨＲＧＹＰＧＬＤＧＡＫＧＥＡＧＡＰＧＶＫＧＥＳＧＳＰＧＥＮＧＳＰＧＰＭＧＰＲＧＬＰＧＥＲＧＲＴＧＰＡＧＡＡＧＡＲＧＮＤＧＱＰＧＰＡＧＰＰＧＰＶＧＰＡＧＧＰＧＦＰＧＡＰＧＡＫＧＥＡＧＰＴＧＡＲＧＰＥＧＡＱＧＰＲＧＥＰＧＴＰＧＳＰＧＰＡＧＡＳＧＮＰＧＴＤＧＩＰＧＡＫＧＳＡＧＡＰＧＩＡＧＡＰＧＦＰＧＰＲＧＰＰＧＰＱＧＡＴＧＰＬＧＰＫＧＱＴＧＥＰＧＩＡＧＦＫＧＥＱＧＰＫＧＥＰＧＰＡＧＰＱＧＡＰＧＰＡＧＥＥＧＫＲＧＡＲＧＥＰＧＧＶＧＰＩＧＰＰＧＥＲＧＡＰＧＮＲＧＦＰＧＱＤＧＬＡＧＰＫＧＡＰＧＥＲＧＰＳＧＬＡＧＰＫＧＡＮＧＤＰＧＲＰＧＥＰＧＬＰＧＡＲＧＬＴＧＲＰＧＤＡＧＰＱＧＫＶＧＰＳＧＡＰＧＥＤＧＲＰＧＰＰＧＰＱＧＡＲＧＱＰＧＶＭＧＦＰＧＰＫＧＡＮＧＥＰＧＫＡＧＥＫＧＬＰＧＡＰＧＬＲＧＬＰＧＫＤＧＥＴＧＡＡＧＰＰＧＰＡＧＰＡＧＥＲＧＥＱＧＡＰＧＰＳＧＦＱＧＬＰＧＰＰＧＰＰＧＥＧＧＫＰＧＤＱＧＶＰＧＥＡＧＡＰＧＬＶＧＰＲＧＥＲＧＦＰＧＥＲＧＳＰＧＡＱＧＬＱＧＰＲＧＬＰＧＴＰＧＴＤＧＰＫＧＡＳＧＰＡＧＰＰＧＡＱＧＰＰＧＬＱＧＭＰＧＥＲＧＡＡＧＩＡＧＰＫＧＤＲＧＤＶＧＥＫＧＰＥＧＡＰＧＫＤＧＧＲＧＬＴＧＰＩＧＰＰＧＰＡＧＡＮＧＥＫＧＥＶＧＰＰＧＰＡＧＳＡＧＡＲＧＡＰＧＥＲＧＥＴＧＰＰＧＰＡＧＦＡＧＰＰＧＡＤＧＱＰＧＡＫＧＥＱＧＥＡＧＱＫＧＤＡＧＡＰＧＰＱＧＰＳＧＡＰＧＰＱＧＰＴＧＶＴＧＰＫＧＡＲＧＡＱＧＰＰＧＡＴＧＦＰＧＡＡＧＲＶＧＰＰＧＳＮＧＮＰＧＰＰＧＰＰＧＰＳＧＫＤＧＰＫＧＡＲＧＤＳＧＰＰＧＲＡＧＥＰＧＬＱＧＰＡＧＰＰＧＥＫＧＥＰＧＤＤＧＰＳＧＡＥＧＰＰＧＰＱＧＬＡＧＱＲＧＩＶＧＬＰＧＱＲＧＥＲＧＦＰＧＬＰＧＰＳＧＥＰＧＫＱＧＡＰＧＡＳＧＤＲＧＰＰＧＰＶＧＰＰＧＬＴＧＰＡＧＥＰＧＲＥＧＳＰＧＡＤＧＰＰＧＲＤＧＡＡＧＶＫＧＤＲＧＥＴＧＡＶＧＡＰＧＡＰＧＰＰＧＳＰＧＰＡＧＰＴＧＫＱＧＤＲＧＥＡＧＡＱＧＰＭＧＰＳＧＰＡＧＡＲＧＩＱＧＰＱＧＰＲＧＤＫＧＥＡＧＥＰＧＥＲＧＬＫＧＨＲＧＦＴＧＬＱＧＬＰＧＰＰＧＰＳＧＤＱＧＡＳＧＰＡＧＰＳＧＰＲＧＰＰＧＰＶＧＰＳＧＫＤＧＡＮＧＩＰＧＰＩＧＰＰＧＰＲＧＲＳＧＥＴＧＰＡＧＰＰＧＮＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＧＩＤＭＳＡＦＡＧＬＧＰＲＥＫＧＰＤＰＬＱＹＭＲＡ
【0050】
長期にわたる実験研究の結果、α１（ＩＩ）Ｍ６と表記する組換えヒトＩＩ型のコラーゲンのα１鎖の変異体が得られた。α１（ＩＩ）に対して、α１（ＩＩ）Ｍ６は、アミノ酸配列におけるアミノ酸を９個変更し、それらの９個のアミノ酸をプロリン（Ｐｒｏ、Ｐと略称する）に変異し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列の６７番目のＶ、６８番目のＭ、７２番目のＭ、７５番目のＭ、７８番目のＲ、１０８番目のＭ、１１１番目のＲ、１６２番目のＭ、１６５番目のＲは、Ｐに変更され、残りのアミノ酸配列は変化しなかった。α１（ＩＩ）Ｍ６とα１（ＩＩ）との相同性は、９９．２％である。
【0051】
変更された配列（α１（ＩＩ）Ｍ６）の全長は１０６０ＡＡであり、配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示される。
【0052】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５：
ＱＭＡＧＧＦＤＥＫＡＧＧＡＱＬＧＰＰＱＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＡＧＡＰＧＰＱＧＦＱＧＮＰＧＥＰＧＥＰＧＶＳＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＫＰＧＤＤＧＥＡＧＫＰＧＫＡＧＥＲＧＰＰＧＰＱＧＡＲＧＦＰＧＴＰＧＬＰＧＶＫＧＨＲＧＹＰＧＬＤＧＡＫＧＥＡＧＡＰＧＶＫＧＥＳＧＳＰＧＥＮＧＳＰＧＰＰＧＰＰＧＬＰＧＥＲＧＲＴＧＰＡＧＡＡＧＡＲＧＮＤＧＱＰＧＰＡＧＰＰＧＰＶＧＰＡＧＧＰＧＦＰＧＡＰＧＡＫＧＥＡＧＰＴＧＡＲＧＰＥＧＡＱＧＰＲＧＥＰＧＴＰＧＳＰＧＰＡＧＡＳＧＮＰＧＴＤＧＩＰＧＡＫＧＳＡＧＡＰＧＩＡＧＡＰＧＦＰＧＰＲＧＰＰＧＰＱＧＡＴＧＰＬＧＰＫＧＱＴＧＥＰＧＩＡＧＦＫＧＥＱＧＰＫＧＥＰＧＰＡＧＰＱＧＡＰＧＰＡＧＥＥＧＫＲＧＡＲＧＥＰＧＧＶＧＰＩＧＰＰＧＥＲＧＡＰＧＮＲＧＦＰＧＱＤＧＬＡＧＰＫＧＡＰＧＥＲＧＰＳＧＬＡＧＰＫＧＡＮＧＤＰＧＲＰＧＥＰＧＬＰＧＡＲＧＬＴＧＲＰＧＤＡＧＰＱＧＫＶＧＰＳＧＡＰＧＥＤＧＲＰＧＰＰＧＰＱＧＡＲＧＱＰＧＶＭＧＦＰＧＰＫＧＡＮＧＥＰＧＫＡＧＥＫＧＬＰＧＡＰＧＬＲＧＬＰＧＫＤＧＥＴＧＡＡＧＰＰＧＰＡＧＰＡＧＥＲＧＥＱＧＡＰＧＰＳＧＦＱＧＬＰＧＰＰＧＰＰＧＥＧＧＫＰＧＤＱＧＶＰＧＥＡＧＡＰＧＬＶＧＰＲＧＥＲＧＦＰＧＥＲＧＳＰＧＡＱＧＬＱＧＰＲＧＬＰＧＴＰＧＴＤＧＰＫＧＡＳＧＰＡＧＰＰＧＡＱＧＰＰＧＬＱＧＭＰＧＥＲＧＡＡＧＩＡＧＰＫＧＤＲＧＤＶＧＥＫＧＰＥＧＡＰＧＫＤＧＧＲＧＬＴＧＰＩＧＰＰＧＰＡＧＡＮＧＥＫＧＥＶＧＰＰＧＰＡＧＳＡＧＡＲＧＡＰＧＥＲＧＥＴＧＰＰＧＰＡＧＦＡＧＰＰＧＡＤＧＱＰＧＡＫＧＥＱＧＥＡＧＱＫＧＤＡＧＡＰＧＰＱＧＰＳＧＡＰＧＰＱＧＰＴＧＶＴＧＰＫＧＡＲＧＡＱＧＰＰＧＡＴＧＦＰＧＡＡＧＲＶＧＰＰＧＳＮＧＮＰＧＰＰＧＰＰＧＰＳＧＫＤＧＰＫＧＡＲＧＤＳＧＰＰＧＲＡＧＥＰＧＬＱＧＰＡＧＰＰＧＥＫＧＥＰＧＤＤＧＰＳＧＡＥＧＰＰＧＰＱＧＬＡＧＱＲＧＩＶＧＬＰＧＱＲＧＥＲＧＦＰＧＬＰＧＰＳＧＥＰＧＫＱＧＡＰＧＡＳＧＤＲＧＰＰＧＰＶＧＰＰＧＬＴＧＰＡＧＥＰＧＲＥＧＳＰＧＡＤＧＰＰＧＲＤＧＡＡＧＶＫＧＤＲＧＥＴＧＡＶＧＡＰＧＡＰＧＰＰＧＳＰＧＰＡＧＰＴＧＫＱＧＤＲＧＥＡＧＡＱＧＰＭＧＰＳＧＰＡＧＡＲＧＩＱＧＰＱＧＰＲＧＤＫＧＥＡＧＥＰＧＥＲＧＬＫＧＨＲＧＦＴＧＬＱＧＬＰＧＰＰＧＰＳＧＤＱＧＡＳＧＰＡＧＰＳＧＰＲＧＰＰＧＰＶＧＰＳＧＫＤＧＡＮＧＩＰＧＰＩＧＰＰＧＰＲＧＲＳＧＥＴＧＰＡＧＰＰＧＮＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＧＩＤＭＳＡＦＡＧＬＧＰＲＥＫＧＰＤＰＬＱＹＭＲＡ
ＱＭＡＧＧＦＤＥＫＡＧＧＡＱＬＧＰＰＱＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＡＧＡＰＧＰＱＧＦＱＧＮＰＧＥＰＧＥＰＧＶＳＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＫＰＧＤＤＧＥＡＧＫＰＧＫＡＧＥＲＧＰＰＧＰＱＧＡＲＧＦＰＧＴＰＧＬＰＧＶＫＧＨＲＧＹＰＧＬＤＧＡＫＧＥＡＧＡＰＧＶＫＧＥＳＧＳＰＧＥＮＧＳＰＧＰＰＧＰＰＧＬＰＧＥＲＧＲＴＧＰＡＧＡＡＧＡＲＧＮＤＧＱＰＧＰＡＧＰＰＧＰＶＧＰＡＧＧＰＧＦＰＧＡＰＧＡＫＧＥＡＧＰＴＧＡＲＧＰＥＧＡＱＧＰＲＧＥＰＧＴＰＧＳＰＧＰＡＧＡＳＧＮＰＧＴＤＧＩＰＧＡＫＧＳＡＧＡＰＧＩＡＧＡＰＧＦＰＧＰＲＧＰＰＧＰＱＧＡＴＧＰＬＧＰＫＧＱＴＧＥＰＧＩＡＧＦＫＧＥＱＧＰＫＧＥＰＧＰＡＧＰＱＧＡＰＧＰＡＧＥＥＧＫＲＧＡＲＧＥＰＧＧＶＧＰＩＧＰＰＧＥＲＧＡＰＧＮＲＧＦＰＧＱＤＧＬＡＧＰＫＧＡＰＧＥＲＧＰＳＧＬＡＧＰＫＧＡＮＧＤＰＧＲＰＧＥＰＧＬＰＧＡＲＧＬＴＧＲＰＧＤＡＧＰＱＧＫＶＧＰＳＧＡＰＧＥＤＧＲＰＧＰＰＧＰＱＧＡＲＧＱＰＧＶＭＧＦＰＧＰＫＧＡＮＧＥＰＧＫＡＧＥＫＧＬＰＧＡＰＧＬＲＧＬＰＧＫＤＧＥＴＧＡＡＧＰＰＧＰＡＧＰＡＧＥＲＧＥＱＧＡＰＧＰＳＧＦＱＧＬＰＧＰＰＧＰＰＧＥＧＧＫＰＧＤＱＧＶＰＧＥＡＧＡＰＧＬＶＧＰＲＧＥＲＧＦＰＧＥＲＧＳＰＧＡＱＧＬＱＧＰＲＧＬＰＧＴＰＧＴＤＧＰＫＧＡＳＧＰＡＧＰＰＧＡＱＧＰＰＧＬＱＧＭＰＧＥＲＧＡＡＧＩＡＧＰＫＧＤＲＧＤＶＧＥＫＧＰＥＧＡＰＧＫＤＧＧＲＧＬＴＧＰＩＧＰＰＧＰＡＧＡＮＧＥＫＧＥＶＧＰＰＧＰＡＧＳＡＧＡＲＧＡＰＧＥＲＧＥＴＧＰＰＧＰＡＧＦＡＧＰＰＧＡＤＧＱＰＧＡＫＧＥＱＧＥＡＧＱＫＧＤＡＧＡＰＧＰＱＧＰＳＧＡＰＧＰＱＧＰＴＧＶＴＧＰＫＧＡＲＧＡＱＧＰＰＧＡＴＧＦＰＧＡＡＧＲＶＧＰＰＧＳＮＧＮＰＧＰＰＧＰＰＧＰＳＧＫＤＧＰＫＧＡＲＧＤＳＧＰＰＧＲＡＧＥＰＧＬＱＧＰＡＧＰＰＧＥＫＧＥＰＧＤＤＧＰＳＧＡＥＧＰＰＧＰＱＧＬＡＧＱＲＧＩＶＧＬＰＧＱＲＧＥＲＧＦＰＧＬＰＧＰＳＧＥＰＧＫＱＧＡＰＧＡＳＧＤＲＧＰＰＧＰＶＧＰＰＧＬＴＧＰＡＧＥＰＧＲＥＧＳＰＧＡＤＧＰＰＧＲＤＧＡＡＧＶＫＧＤＲＧＥＴＧＡＶＧＡＰＧＡＰＧＰＰＧＳＰＧＰＡＧＰＴＧＫＱＧＤＲＧＥＡＧＡＱＧＰＭＧＰＳＧＰＡＧＡＲＧＩＱＧＰＱＧＰＲＧＤＫＧＥＡＧＥＰＧＥＲＧＬＫＧＨＲＧＦＴＧＬＱＧＬＰＧＰＰＧＰＳＧＤＱＧＡＳＧＰＡＧＰＳＧＰＲＧＰＰＧＰＶＧＰＳＧＫＤＧＡＮＧＩＰＧＰＩＧＰＰＧＰＲＧＲＳＧＥＴＧＰＡＧＰＰＧＮＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＧＩＤＭＳＡＦＡＧＬＧＰＲＥＫＧＰＤＰＬＱＹＭＲＡ
【0053】
α１（ＩＩ）Ｍ６とα１（ＩＩ）アミノ酸配列の違いは、図２における灰色のバックグラウンドと太字のアミノ酸に示される。
【0054】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるα１（ＩＩ）Ｍ６をコードする遺伝子（ＣＯＬ２Ａ１Ｍ６と表記する）ＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示される。
【0055】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６：
ＣＡＡＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＧＡＴＴＣＧＡＴＧＡＡＡＡＧＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＣＣＣＡＡＴＴＡＧＧＴＣＣＴＣＣＡＣＡＡＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣＣＣＧＣＣＧＧＴＧＣＴＣＣＴＧＧＡＣＣＡＣＡＧＧＧＴＴＴＣＣＡＡＧＧＡＡＡＣＣＣＣＧＧＴＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＧＣＣＴＧＧＴＧＴＴＴＣＡＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＣＡＣＣＡＧＧＡＡＡＧＣＣＴＧＧＴＧＡＣＧＡＣＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＧＴＡＡＡＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＣＴＣＡＧＧＧＴＧＣＣＡＧＡＧＧＴＴＴＣＣＣＡＧＧＴＡＣＣＣＣＴＧＧＴＣＴＴＣＣＴＧＧＴＧＴＣＡＡＧＧＧＴＣＡＴＡＧＡＧＧＴＴＡＣＣＣＣＧＧＴＴＴＧＧＡＴＧＧＴＧＣＣＡＡＧＧＧＴＧＡＡＧＣＣＧＧＴＧＣＣＣＣＴＧＧＴＧＴＴＡＡＧＧＧＴＧＡＡＴＣＡＧＧＡＡＧＴＣＣＣＧＧＴＧＡＡＡＡＴＧＧＡＡＧＴＣＣＣＧＧＴＣＣＡＣＣＣＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＴＧＣＣＡＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＧＣＴＡＧＡＧＧＡＡＡＴＧＡＣＧＧＡＣＡＧＣＣＣＧＧＡＣＣＡＧＣＣＧＧＡＣＣＴＣＣＣＧＧＴＣＣＴＧＴＴＧＧＧＣＣＣＧＣＡＧＧＴＧＧＴＣＣＴＧＧＴＴＴＣＣＣｔｇＧＴＧＣＴＣＣＴＧＧＡＧＣＣＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣＧＧＡＣＣＣＡＣＣＧＧＡＧＣＣＡＧＡＧＧＴＣＣＣＧＡＧＧＧＡＧＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＡＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＡＣＡＣＣＡＧＧＴＡＧＴＣＣＣＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＣＡＴＣＡＧＧＡＡＡＴＣＣＣＧＧＡＡＣＴＧＡＣＧＧＴＡＴＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＡＡＧＧＧＡＴＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＡＡＴＡＧＣＴＧＧＴＧＣＴＣＣＴＧＧＡＴＴＴＣＣＡＧＧＴＣＣＣＡＧＡＧＧＡＣＣＴＣＣＣＧＧＴＣＣＴＣＡＡＧＧＡＧＣＡＡＣＡＧＧＴＣＣＴＴＴＧＧＧＡＣＣＡＡＡＡＧＧＴＣＡＡＡＣＡＧＧＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＡＴＴＧＣＴＧＧＡＴＴＣＡＡＡＧＧＡＧＡＧＣＡＡＧＧＴＣＣＡＡＡＧＧＧＡＧＡＧＣＣＣＧＧＴＣＣＣＧＣＡＧＧＴＣＣＣＣＡＡＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＡＡＧＡＧＧＡＧＣＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＴＡＧＧＡＣＣＴＡＴＴＧＧＴＣＣＴＣＣＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＴＧＣＴＣＣＣＧＧＡＡＡＣＡＧＡＧＧＴＴＴＴＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＡＴＧＧＴＣＴＧＧＣＴＧＧＡＣＣＴＡＡＡＧＧＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＡＣＣＴＴＣＡＧＧＡＣＴＴＧＣＴＧＧＴＣＣＡＡＡＡＧＧＴＧＣＴＡＡＣＧＧＡＧＡＴＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＧＴＣＴＧＣＣＴＧＧＡＧＣＴＡＧＡＧＧＡＴＴＡＡＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＡＧＧＴＧＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＣＣＡＧＧＧＴＡＡＡＧＴＧＧＧＴＣＣＣＡＧＴＧＧＴＧＣＣＣＣＡＧＧＴＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＧＡＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＡＡＧＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣＣＴＧＧＡＣＣＣＡＡＧＧＧＴＧＣＴＡＡＣＧＧＡＧＡＡＣＣＴＧＧＡＡＡＡＧＣＴＧＧＴＧＡＧＡＡＡＧＧＡＣＴＧＣＣＣＧＧＴＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＴＴＡＧＡＧＧＴＴＴＧＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＡＴＧＧＡＧＡＡＡＣＡＧＧＡＧＣＣＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＣＣＧＧＴＣＣＡＧＣＣＧＧＡＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＴＧＡＡＣＡＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＧＴＧＧＴＴＴＴＣＡＧＧＧＴＣＴＴＣＣＡＧＧＴＣＣＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＧＴＡＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＧＡＧＡＡＧＣＡＧＧＴＧＣＡＣＣＣＧＧＴＣＴＴＧＴＧＧＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＡＴＴＣＣＣＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＴＣＣＴＡＧＡＧＧＴＣＴＧＣＣＡＧＧＴＡＣＣＣＣＴＧＧＴＡＣＡＧＡＣＧＧＡＣＣＡＡＡＧＧＧＡＧＣＡＴＣＡＧＧＡＣＣＣＧＣＴＧＧＡＣＣＴＣＣＣＧＧＡＧＣＣＣＡＡＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＴＴＴＡＣＡＡＧＧＴＡＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＡＴＡＧＣＴＧＧＡＣＣＡＡＡＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＧＴＧＡＣＧＴＴＧＧＴＧＡＧＡＡＧＧＧＴＣＣＣＧＡＡＧＧＡＧＣＣＣＣＴＧＧＡＡＡＡＧＡＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＡＡＣＡＧＧＴＣＣＴＡＴＡＧＧＡＣＣＡＣＣＣＧＧＴＣＣＡＧＣＣＧＧＴＧＣＴＡＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＴＡＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＡＧＧＡＴＣＴＧＣＡＧＧＴＧＣＴＡＧＡＧＧＴＧＣＣＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＣＡＧＧＡＣＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＴＴＣＧＣＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＧＡＣＡＧＣＣＣＧＧＴＧＣＡＡＡＡＧＧＴＧＡＡＣＡＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣＧＧＡＣＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＴＧＣＴＧＧＡＧＣＣＣＣＣＧＧＴＣＣＡＣＡＡＧＧＴＣＣＣＴＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＴＣＣＴＣＡＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＡＣＣＧＧＧＣＣＡＡＡＧＧＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＡＣＡＧＧＴＴＴＣＣＣＡＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＴＡＧＡＧＴＣＧＧＴＣＣＡＣＣＣＧＧＡＴＣＴＡＡＴＧＧＴＡＡＣＣＣＣＧＧＡＣＣＡＣＣＡＧＧＡＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＣＡＴＣＴＧＧＡＡＡＧＧＡＴＧＧＡＣＣＣＡＡＡＧＧＡＧＣＡＡＧＡＧＧＡＧＡＴＴＣＡＧＧＡＣＣＡＣＣＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＣＣＴＧＧＡＴＴＡＣＡＧＧＧＴＣＣＣＧＣＣＧＧＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＡＡＡＧＧＡＧＡＧＣＣＣＧＧＡＧＡＴＧＡＴＧＧＴＣＣＣＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＡＡＧＧＴＣＴＧＧＣＡＧＧＴＣＡＡＡＧＡＧＧＴＡＴＡＧＴＧＧＧＴＣＴＴＣＣＡＧＧＴＣＡＡＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＡＴＴＴＣＣＡＧＧＡＣＴＴＣＣＡＧＧＴＣＣＴＴＣＡＧＧＴＧＡＡＣＣＣＧＧＴＡＡＡＣＡＧＧＧＡＧＣＣＣＣＣＧＧＡＧＣＣＴＣＡＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＣＣＡＧＴＡＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＧＴＴＴＡＡＣＣＧＧＡＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＡＡＧＧＴＴＣＴＣＣＴＧＧＡＧＣＣＧＡＴＧＧＡＣＣＴＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＡＣＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＴＴＡＡＧＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＣＴＧＧＡＧＣＣＧＴＡＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＴＧＣＣＣＣＣＧＧＡＣＣＡＣＣＣＧＧＡＴＣＡＣＣＣＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＣＴＡＣＴＧＧＴＡＡＡＣＡＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣＧＧＴＧＣＣＣＡＧＧＧＴＣＣＴＡＴＧＧＧＴＣＣＴＴＣＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＡＡＧＡＧＧＴＡＴＡＣＡＡＧＧＴＣＣＡＣＡＧＧＧＴＣＣＣＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡＡＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＴＣＴＧＡＡＧＧＧＴＣＡＴＡＧＡＧＧＡＴＴＣＡＣＣＧＧＧＴＴＡＣＡＧＧＧＴＴＴＧＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＴＧＧＡＣＣＡＡＧＴＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＧＣＡＴＣＣＧＧＴＣＣＡＧＣＡＧＧＴＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＡＧＡＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＴＣＣＡＧＴＴＧＧＴＣＣＡＴＣＡＧＧＴＡＡＡＧＡＣＧＧＡＧＣＣＡＡＣＧＧＴＡＴＣＣＣＡＧＧＴＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣＣＴＡＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＴＧＧＡＧＡＧＡＣＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＣＣＴＣＣＴＧＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣＣＣＧＧＡＡＴＡＧＡＴＡＴＧＴＣＣＧＣＴＴＴＣＧＣＴＧＧＡＴＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＧＧＴＣＣＴＧＡＣＣＣＴＣＴＴＣＡＡＴＡＴＡＴＧＡＧＡＧＣＡ
ＣＡＡＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＧＡＴＴＣＧＡＴＧＡＡＡＡＧＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＣＣＣＡＡＴＴＡＧＧＴＣＣＴＣＣＡＣＡＡＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣＣＣＧＣＣＧＧＴＧＣＴＣＣＴＧＧＡＣＣＡＣＡＧＧＧＴＴＴＣＣＡＡＧＧＡＡＡＣＣＣＣＧＧＴＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＧＣＣＴＧＧＴＧＴＴＴＣＡＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＣＡＣＣＡＧＧＡＡＡＧＣＣＴＧＧＴＧＡＣＧＡＣＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＧＴＡＡＡＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＣＴＣＡＧＧＧＴＧＣＣＡＧＡＧＧＴＴＴＣＣＣＡＧＧＴＡＣＣＣＣＴＧＧＴＣＴＴＣＣＴＧＧＴＧＴＣＡＡＧＧＧＴＣＡＴＡＧＡＧＧＴＴＡＣＣＣＣＧＧＴＴＴＧＧＡＴＧＧＴＧＣＣＡＡＧＧＧＴＧＡＡＧＣＣＧＧＴＧＣＣＣＣＴＧＧＴＧＴＴＡＡＧＧＧＴＧＡＡＴＣＡＧＧＡＡＧＴＣＣＣＧＧＴＧＡＡＡＡＴＧＧＡＡＧＴＣＣＣＧＧＴＣＣＡＣＣＣＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＴＧＣＣＡＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＧＣＴＡＧＡＧＧＡＡＡＴＧＡＣＧＧＡＣＡＧＣＣＣＧＧＡＣＣＡＧＣＣＧＧＡＣＣＴＣＣＣＧＧＴＣＣＴＧＴＴＧＧＧＣＣＣＧＣＡＧＧＴＧＧＴＣＣＴＧＧＴＴＴＣＣＣｔｇＧＴＧＣＴＣＣＴＧＧＡＧＣＣＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣＧＧＡＣＣＣＡＣＣＧＧＡＧＣＣＡＧＡＧＧＴＣＣＣＧＡＧＧＧＡＧＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＡＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＡＣＡＣＣＡＧＧＴＡＧＴＣＣＣＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＣＡＴＣＡＧＧＡＡＡＴＣＣＣＧＧＡＡＣＴＧＡＣＧＧＴＡＴＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＡＡＧＧＧＡＴＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＡＡＴＡＧＣＴＧＧＴＧＣＴＣＣＴＧＧＡＴＴＴＣＣＡＧＧＴＣＣＣＡＧＡＧＧＡＣＣＴＣＣＣＧＧＴＣＣＴＣＡＡＧＧＡＧＣＡＡＣＡＧＧＴＣＣＴＴＴＧＧＧＡＣＣＡＡＡＡＧＧＴＣＡＡＡＣＡＧＧＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＡＴＴＧＣＴＧＧＡＴＴＣＡＡＡＧＧＡＧＡＧＣＡＡＧＧＴＣＣＡＡＡＧＧＧＡＧＡＧＣＣＣＧＧＴＣＣＣＧＣＡＧＧＴＣＣＣＣＡＡＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＡＡＧＡＧＧＡＧＣＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＴＡＧＧＡＣＣＴＡＴＴＧＧＴＣＣＴＣＣＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＴＧＣＴＣＣＣＧＧＡＡＡＣＡＧＡＧＧＴＴＴＴＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＡＴＧＧＴＣＴＧＧＣＴＧＧＡＣＣＴＡＡＡＧＧＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＡＣＣＴＴＣＡＧＧＡＣＴＴＧＣＴＧＧＴＣＣＡＡＡＡＧＧＴＧＣＴＡＡＣＧＧＡＧＡＴＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＧＴＣＴＧＣＣＴＧＧＡＧＣＴＡＧＡＧＧＡＴＴＡＡＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＡＧＧＴＧＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＣＣＡＧＧＧＴＡＡＡＧＴＧＧＧＴＣＣＣＡＧＴＧＧＴＧＣＣＣＣＡＧＧＴＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＧＡＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＡＡＧＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣＣＴＧＧＡＣＣＣＡＡＧＧＧＴＧＣＴＡＡＣＧＧＡＧＡＡＣＣＴＧＧＡＡＡＡＧＣＴＧＧＴＧＡＧＡＡＡＧＧＡＣＴＧＣＣＣＧＧＴＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＴＴＡＧＡＧＧＴＴＴＧＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＡＴＧＧＡＧＡＡＡＣＡＧＧＡＧＣＣＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＣＣＧＧＴＣＣＡＧＣＣＧＧＡＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＴＧＡＡＣＡＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＧＴＧＧＴＴＴＴＣＡＧＧＧＴＣＴＴＣＣＡＧＧＴＣＣＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＧＴＡＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＧＡＧＡＡＧＣＡＧＧＴＧＣＡＣＣＣＧＧＴＣＴＴＧＴＧＧＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＡＴＴＣＣＣＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＴＣＣＴＡＧＡＧＧＴＣＴＧＣＣＡＧＧＴＡＣＣＣＣＴＧＧＴＡＣＡＧＡＣＧＧＡＣＣＡＡＡＧＧＧＡＧＣＡＴＣＡＧＧＡＣＣＣＧＣＴＧＧＡＣＣＴＣＣＣＧＧＡＧＣＣＣＡＡＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＴＴＴＡＣＡＡＧＧＴＡＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＡＴＡＧＣＴＧＧＡＣＣＡＡＡＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＧＴＧＡＣＧＴＴＧＧＴＧＡＧＡＡＧＧＧＴＣＣＣＧＡＡＧＧＡＧＣＣＣＣＴＧＧＡＡＡＡＧＡＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＡＡＣＡＧＧＴＣＣＴＡＴＡＧＧＡＣＣＡＣＣＣＧＧＴＣＣＡＧＣＣＧＧＴＧＣＴＡＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＴＡＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＡＧＧＡＴＣＴＧＣＡＧＧＴＧＣＴＡＧＡＧＧＴＧＣＣＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＣＡＧＧＡＣＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＴＴＣＧＣＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＧＡＣＡＧＣＣＣＧＧＴＧＣＡＡＡＡＧＧＴＧＡＡＣＡＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣＧＧＡＣＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＴＧＣＴＧＧＡＧＣＣＣＣＣＧＧＴＣＣＡＣＡＡＧＧＴＣＣＣＴＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＴＣＣＴＣＡＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＡＣＣＧＧＧＣＣＡＡＡＧＧＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＡＣＡＧＧＴＴＴＣＣＣＡＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＴＡＧＡＧＴＣＧＧＴＣＣＡＣＣＣＧＧＡＴＣＴＡＡＴＧＧＴＡＡＣＣＣＣＧＧＡＣＣＡＣＣＡＧＧＡＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＣＡＴＣＴＧＧＡＡＡＧＧＡＴＧＧＡＣＣＣＡＡＡＧＧＡＧＣＡＡＧＡＧＧＡＧＡＴＴＣＡＧＧＡＣＣＡＣＣＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＣＣＴＧＧＡＴＴＡＣＡＧＧＧＴＣＣＣＧＣＣＧＧＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＡＡＡＧＧＡＧＡＧＣＣＣＧＧＡＧＡＴＧＡＴＧＧＴＣＣＣＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＡＡＧＧＴＣＴＧＧＣＡＧＧＴＣＡＡＡＧＡＧＧＴＡＴＡＧＴＧＧＧＴＣＴＴＣＣＡＧＧＴＣＡＡＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＡＴＴＴＣＣＡＧＧＡＣＴＴＣＣＡＧＧＴＣＣＴＴＣＡＧＧＴＧＡＡＣＣＣＧＧＴＡＡＡＣＡＧＧＧＡＧＣＣＣＣＣＧＧＡＧＣＣＴＣＡＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＣＣＡＧＴＡＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＧＴＴＴＡＡＣＣＧＧＡＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＡＡＧＧＴＴＣＴＣＣＴＧＧＡＧＣＣＧＡＴＧＧＡＣＣＴＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＡＣＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＴＴＡＡＧＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＣＴＧＧＡＧＣＣＧＴＡＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＴＧＣＣＣＣＣＧＧＡＣＣＡＣＣＣＧＧＡＴＣＡＣＣＣＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＣＴＡＣＴＧＧＴＡＡＡＣＡＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣＧＧＴＧＣＣＣＡＧＧＧＴＣＣＴＡＴＧＧＧＴＣＣＴＴＣＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＡＡＧＡＧＧＴＡＴＡＣＡＡＧＧＴＣＣＡＣＡＧＧＧＴＣＣＣＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡＡＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＴＣＴＧＡＡＧＧＧＴＣＡＴＡＧＡＧＧＡＴＴＣＡＣＣＧＧＧＴＴＡＣＡＧＧＧＴＴＴＧＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＴＧＧＡＣＣＡＡＧＴＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＧＣＡＴＣＣＧＧＴＣＣＡＧＣＡＧＧＴＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＡＧＡＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＴＣＣＡＧＴＴＧＧＴＣＣＡＴＣＡＧＧＴＡＡＡＧＡＣＧＧＡＧＣＣＡＡＣＧＧＴＡＴＣＣＣＡＧＧＴＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣＣＴＡＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＴＧＧＡＧＡＧＡＣＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＣＣＴＣＣＴＧＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣＣＣＧＧＡＡＴＡＧＡＴＡＴＧＴＣＣＧＣＴＴＴＣＧＣＴＧＧＡＴＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＧＧＴＣＣＴＧＡＣＣＣＴＣＴＴＣＡＡＴＡＴＡＴＧＡＧＡＧＣＡ
【0056】
α１（Ｉ）Ｍ１をコードするＤＮＡ配列の両末端には、アミノ基末端にＳｔｒｅｐ－Ｔａｇ ＩＩタグをコードするＤＮＡ配列を付加し、カルボキシ末端に６×Ｈｉｓ ＴａｇタグをコードするＤＮＡ配列を付加した後、α１（Ｉ）Ｍ１が最終的に発現して得たのは、タグ含有タンパク質であり、合計１０７１個のアミノ酸があり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示される。
【0057】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７：
ＷＳＨＰＱＦＥＫＱＬＳＹＧＹＤＥＫＳＴＧＧＩＳＶＰＧＰＭＧＰＳＧＰＲＧＬＰＧＰＰＧＡＰＧＰＱＧＦＱＧＰＰＧＥＰＧＥＰＧＡＳＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＫＮＧＤＤＧＥＡＧＫＰＧＲＰＧＥＲＧＰＰＧＰＱＧＡＲＧＬＰＧＴＡＧＬＰＧＭＫＧＨＲＧＦＳＧＬＤＧＡＫＧＤＡＧＰＡＧＰＫＧＥＰＧＳＰＧＥＮＧＡＰＧＱＰＧＰＰＧＬＰＧＥＲＧＲＰＧＡＰＧＰＡＧＡＲＧＮＤＧＡＴＧＡＡＧＰＰＧＰＴＧＰＡＧＰＰＧＦＰＧＡＶＧＡＫＧＥＡＧＰＱＧＰＲＧＳＥＧＰＱＧＶＲＧＥＰＧＰＰＧＰＡＧＡＡＧＰＡＧＮＰＧＡＤＧＱＰＧＡＫＧＡＮＧＡＰＧＩＡＧＡＰＧＦＰＧＡＲＧＰＳＧＰＱＧＰＧＧＰＰＧＰＫＧＮＳＧＥＰＧＡＰＧＳＫＧＤＴＧＡＫＧＥＰＧＰＶＧＶＱＧＰＰＧＰＡＧＥＥＧＫＲＧＡＲＧＥＰＧＰＴＧＬＰＧＰＰＧＥＲＧＧＰＧＳＲＧＦＰＧＡＤＧＶＡＧＰＫＧＰＡＧＥＲＧＳＰＧＰＡＧＰＫＧＳＰＧＥＡＧＲＰＧＥＡＧＬＰＧＡＫＧＬＴＧＳＰＧＳＰＧＰＤＧＫＴＧＰＰＧＰＡＧＱＤＧＲＰＧＰＰＧＰＰＧＡＲＧＱＡＧＶＭＧＦＰＧＰＫＧＡＡＧＥＰＧＫＡＧＥＲＧＶＰＧＰＰＧＡＶＧＰＡＧＫＤＧＥＡＧＡＱＧＰＰＧＰＡＧＰＡＧＥＲＧＥＱＧＰＡＧＳＰＧＦＱＧＬＰＧＰＡＧＰＰＧＥＡＧＫＰＧＥＱＧＶＰＧＤＬＧＡＰＧＰＳＧＡＲＧＥＲＧＦＰＧＥＲＧＶＱＧＰＰＧＰＡＧＰＲＧＡＮＧＡＰＧＮＤＧＡＫＧＤＡＧＡＰＧＡＰＧＳＱＧＡＰＧＬＱＧＭＰＧＥＲＧＡＡＧＬＰＧＰＫＧＤＲＧＤＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＫＤＧＶＲＧＬＴＧＰＩＧＰＰＧＰＡＧＡＰＧＤＫＧＥＳＧＰＳＧＰＡＧＰＴＧＡＲＧＡＰＧＤＲＧＥＰＧＰＰＧＰＡＧＦＡＧＰＰＧＡＤＧＱＰＧＡＫＧＥＰＧＤＡＧＡＫＧＤＡＧＰＰＧＰＡＧＰＡＧＰＰＧＰＩＧＮＶＧＡＰＧＡＫＧＡＲＧＳＡＧＰＰＧＡＴＧＦＰＧＡＡＧＲＶＧＰＰＧＰＳＧＮＡＧＰＰＧＰＰＧＰＡＧＫＥＧＧＫＧＰＲＧＥＴＧＰＡＧＲＰＧＥＶＧＰＰＧＰＰＧＰＡＧＥＫＧＳＰＧＡＤＧＰＡＧＡＰＧＴＰＧＰＱＧＩＡＧＱＲＧＶＶＧＬＰＧＱＲＧＥＲＧＦＰＧＬＰＧＰＳＧＥＰＧＫＱＧＰＳＧＡＳＧＥＲＧＰＰＧＰＭＧＰＰＧＬＡＧＰＰＧＥＳＧＲＥＧＡＰＧＡＥＧＳＰＧＲＤＧＳＰＧＡＫＧＤＲＧＥＴＧＰＡＧＰＰＧＡＰＧＡＰＧＡＰＧＰＶＧＰＡＧＫＳＧＤＲＧＥＴＧＰＡＧＰＡＧＰＶＧＰＶＧＡＲＧＰＡＧＰＱＧＰＲＧＤＫＧＥＴＧＥＱＧＤＲＧＩＫＧＨＲＧＦＳＧＬＱＧＰＰＧＰＰＧＳＰＧＥＱＧＰＳＧＡＳＧＰＡＧＰＲＧＰＰＧＳＡＧＡＰＧＫＤＧＬＮＧＬＰＧＰＩＧＰＰＧＰＲＧＲＴＧＤＡＧＰＶＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＳＡＧＦＤＦＳＦＬＰＱＰＰＱＥＫＡＨＤＧＧＲＹＹＲＡＨＨＨＨＨＨ
ＷＳＨＰＱＦＥＫＱＬＳＹＧＹＤＥＫＳＴＧＧＩＳＶＰＧＰＭＧＰＳＧＰＲＧＬＰＧＰＰＧＡＰＧＰＱＧＦＱＧＰＰＧＥＰＧＥＰＧＡＳＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＫＮＧＤＤＧＥＡＧＫＰＧＲＰＧＥＲＧＰＰＧＰＱＧＡＲＧＬＰＧＴＡＧＬＰＧＭＫＧＨＲＧＦＳＧＬＤＧＡＫＧＤＡＧＰＡＧＰＫＧＥＰＧＳＰＧＥＮＧＡＰＧＱＰＧＰＰＧＬＰＧＥＲＧＲＰＧＡＰＧＰＡＧＡＲＧＮＤＧＡＴＧＡＡＧＰＰＧＰＴＧＰＡＧＰＰＧＦＰＧＡＶＧＡＫＧＥＡＧＰＱＧＰＲＧＳＥＧＰＱＧＶＲＧＥＰＧＰＰＧＰＡＧＡＡＧＰＡＧＮＰＧＡＤＧＱＰＧＡＫＧＡＮＧＡＰＧＩＡＧＡＰＧＦＰＧＡＲＧＰＳＧＰＱＧＰＧＧＰＰＧＰＫＧＮＳＧＥＰＧＡＰＧＳＫＧＤＴＧＡＫＧＥＰＧＰＶＧＶＱＧＰＰＧＰＡＧＥＥＧＫＲＧＡＲＧＥＰＧＰＴＧＬＰＧＰＰＧＥＲＧＧＰＧＳＲＧＦＰＧＡＤＧＶＡＧＰＫＧＰＡＧＥＲＧＳＰＧＰＡＧＰＫＧＳＰＧＥＡＧＲＰＧＥＡＧＬＰＧＡＫＧＬＴＧＳＰＧＳＰＧＰＤＧＫＴＧＰＰＧＰＡＧＱＤＧＲＰＧＰＰＧＰＰＧＡＲＧＱＡＧＶＭＧＦＰＧＰＫＧＡＡＧＥＰＧＫＡＧＥＲＧＶＰＧＰＰＧＡＶＧＰＡＧＫＤＧＥＡＧＡＱＧＰＰＧＰＡＧＰＡＧＥＲＧＥＱＧＰＡＧＳＰＧＦＱＧＬＰＧＰＡＧＰＰＧＥＡＧＫＰＧＥＱＧＶＰＧＤＬＧＡＰＧＰＳＧＡＲＧＥＲＧＦＰＧＥＲＧＶＱＧＰＰＧＰＡＧＰＲＧＡＮＧＡＰＧＮＤＧＡＫＧＤＡＧＡＰＧＡＰＧＳＱＧＡＰＧＬＱＧＭＰＧＥＲＧＡＡＧＬＰＧＰＫＧＤＲＧＤＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＫＤＧＶＲＧＬＴＧＰＩＧＰＰＧＰＡＧＡＰＧＤＫＧＥＳＧＰＳＧＰＡＧＰＴＧＡＲＧＡＰＧＤＲＧＥＰＧＰＰＧＰＡＧＦＡＧＰＰＧＡＤＧＱＰＧＡＫＧＥＰＧＤＡＧＡＫＧＤＡＧＰＰＧＰＡＧＰＡＧＰＰＧＰＩＧＮＶＧＡＰＧＡＫＧＡＲＧＳＡＧＰＰＧＡＴＧＦＰＧＡＡＧＲＶＧＰＰＧＰＳＧＮＡＧＰＰＧＰＰＧＰＡＧＫＥＧＧＫＧＰＲＧＥＴＧＰＡＧＲＰＧＥＶＧＰＰＧＰＰＧＰＡＧＥＫＧＳＰＧＡＤＧＰＡＧＡＰＧＴＰＧＰＱＧＩＡＧＱＲＧＶＶＧＬＰＧＱＲＧＥＲＧＦＰＧＬＰＧＰＳＧＥＰＧＫＱＧＰＳＧＡＳＧＥＲＧＰＰＧＰＭＧＰＰＧＬＡＧＰＰＧＥＳＧＲＥＧＡＰＧＡＥＧＳＰＧＲＤＧＳＰＧＡＫＧＤＲＧＥＴＧＰＡＧＰＰＧＡＰＧＡＰＧＡＰＧＰＶＧＰＡＧＫＳＧＤＲＧＥＴＧＰＡＧＰＡＧＰＶＧＰＶＧＡＲＧＰＡＧＰＱＧＰＲＧＤＫＧＥＴＧＥＱＧＤＲＧＩＫＧＨＲＧＦＳＧＬＱＧＰＰＧＰＰＧＳＰＧＥＱＧＰＳＧＡＳＧＰＡＧＰＲＧＰＰＧＳＡＧＡＰＧＫＤＧＬＮＧＬＰＧＰＩＧＰＰＧＰＲＧＲＴＧＤＡＧＰＶＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＳＡＧＦＤＦＳＦＬＰＱＰＰＱＥＫＡＨＤＧＧＲＹＹＲＡＨＨＨＨＨＨ
【0058】
最適化された設計の後、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７アミノ酸配列（α１（Ｉ）Ｍ１）をコードする遺伝子（ＣＯＬ１Ａ１Ｍ１と表記する）のＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示される。
【0059】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８：
ＴＧＧＴＣＴＣＡＴＣＣＡＣＡＡＴＴＴＧＡＡＡＡＧＣＡＡＣＴＴＡＧＴＴＡＴＧＧＡＴＡＣＧＡＴＧＡＡＡＡＡＴＣＣＡＣＡＧＧＴＧＧＡＡＴＣＡＧＴＧＴＴＣＣＴＧＧＡＣＣＴＡＴＧＧＧＴＣＣＡＴＣＡＧＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＣＣＴＣＣＡＧＧＴＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＣＣＣＡＧＧＧＡＴＴＴＣＡＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＣＣＴＧＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＣＴＴＣＴＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＣＣＣＴＧＧＡＣＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＡＡＧＡＡＴＧＧＡＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＡＣＣＴＧＧＡＡＧＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＡＣＣＡＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＡＧＧＧＴＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＧＣＣＡＧＧＴＡＣＣＧＣＡＧＧＴＣＴＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＡＡＡＧＧＴＣＡＴＡＧＡＧＧＡＴＴＴＴＣＡＧＧＡＴＴＡＧＡＣＧＧＴＧＣＡＡＡＧＧＧＡＧＡＣＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＡＡＧＧＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＴＣＣＡＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＴＧＣＣＣＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＴＡＧＡＣＣＣＧＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＡＡＡＴＧＡＴＧＧＡＧＣＴＡＣＡＧＧＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＡＣＡＧＧＡＣＣＡＧＣＣＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＴＴＴＣＣＣＡＧＧＴＧＣＣＧＴＴＧＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＴＣＣＡＣＡＧＧＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＣＣＡＣＡＧＧＧＡＧＴＴＡＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＴＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＴＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＣＧＧＴＣＡＧＣＣＡＧＧＴＧＣＴＡＡＧＧＧＡＧＣＡＡＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＡＡＴＡＧＣＴＧＧＴＧＣＣＣＣＡＧＧＡＴＴＴＣＣＣＧＧＴＧＣＴＡＧＡＧＧＴＣＣＡＡＧＴＧＧＴＣＣＡＣＡＡＧＧＡＣＣＡＧＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＣＧＧＴＣＣＣＡＡＡＧＧＡＡＡＣＡＧＴＧＧＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＣＡＣＣＣＧＧＴＴＣＡＡＡＧＧＧＡＧＡＴＡＣＡＧＧＡＧＣＴＡＡＡＧＧＡＧＡＧＣＣＣＧＧＴＣＣＡＧＴＧＧＧＴＧＴＴＣＡＧＧＧＡＣＣＡＣＣＣＧＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＧＴＡＡＡＡＧＡＧＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＣＣＡＡＣＡＧＧＴＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＣＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＴＧＧＴＣＣＡＧＧＴＡＧＴＡＧＡＧＧＡＴＴＴＣＣＡＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＧＴＧＴＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＡＡＧＧＧＡＣＣＣＧＣＡＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＧＧＴＣＣＡＧＣＣＧＧＡＣＣＡＡＡＡＧＧＡＴＣＡＣＣＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＧＴＡＧＡＣＣＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＧＴＣＴＧＣＣＡＧＧＴＧＣＴＡＡＡＧＧＡＴＴＧＡＣＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＴＧＡＴＧＧＡＡＡＧＡＣＡＧＧＡＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣＣＣＧＣＴＧＧＴＣＡＧＧＡＣＧＧＴＡＧＡＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＴＣＡＧＧＣＡＧＧＴＧＴＡＡＴＧＧＧＴＴＴＣＣＣＣＧＧＡＣＣＴＡＡＡＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＡＡＣＣＴＧＧＴＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＧＣＣＴＧＧＡＣＣＣＣＣＴＧＧＡＧＣＴＧＴＴＧＧＴＣＣＡＧＣＡＧＧＡＡＡＧＧＡＴＧＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＣＣＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＣＡＡＧＧＴＣＣＣＧＣＡＧＧＴＴＣＴＣＣＡＧＧＴＴＴＴＣＡＧＧＧＴＴＴＧＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＣＧＧＴＣＣＴＣＣＴＧＧＡＧＡＧＧＣＡＧＧＡＡＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＡＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＡＧＡＣＣＴＧＧＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＣＣＴＣＴＧＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＴＴＣＣＴＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＴＧＴＧＣＡＧＧＧＡＣＣＡＣＣＡＧＧＴＣＣＣＧＣＣＧＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＡＡＴＧＧＡＧＣＣＣＣＴＧＧＡＡＡＴＧＡＣＧＧＡＧＣＴＡＡＧＧＧＴＧＡＣＧＣＴＧＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＴＴＣＴＣＡＡＧＧＴＧＣＴＣＣＣＧＧＡＴＴＧＣＡＧＧＧＴＡＴＧＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡＣＴＧＣＣＡＧＧＴＣＣＡＡＡＡＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＧＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＣＣＴＡＡＧＧＧＡＧＣＴＧＡＣＧＧＴＴＣＴＣＣＴＧＧＡＡＡＧＧＡＣＧＧＴＧＴＧＡＧＡＧＧＴＴＴＧＡＣＡＧＧＡＣＣＡＡＴＡＧＧＴＣＣＡＣＣＣＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＣＣＣＴＧＧＡＧＡＣＡＡＡＧＧＴＧＡＡＴＣＡＧＧＴＣＣＴＴＣＣＧＧＴＣＣＡＧＣＣＧＧＡＣＣＡＡＣＡＧＧＡＧＣＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＧＡＧＡＧＣＣＡＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＴＴＣＧＣＴＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＣＴＡＡＧＧＧＡＧＡＡＣＣＣＧＧＴＧＡＣＧＣＴＧＧＴＧＣＴＡＡＧＧＧＡＧＡＴＧＣＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＣＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＡＡＴＡＧＧＴＡＡＴＧＴＴＧＧＡＧＣＡＣＣＣＧＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＧＧＴＴＣＣＧＣＡＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＡＧＣＡＡＣＴＧＧＴＴＴＴＣＣＡＧＧＡＧＣＴＧＣＣＧＧＡＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＴＴＣＴＧＧＡＡＡＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＣＡＧＧＴＣＣＴＣＣＴＧＧＴＣＣＡＧＣＣＧＧＡＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＧＧＧＡＣＣＴＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＣＡＧＧＴＣＣＣＧＣＡＧＧＴＡＧＡＣＣＣＧＧＴＧＡＧＧＴＧＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＡＣＣＣＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＧＡＡＡＧＧＡＡＧＴＣＣＴＧＧＡＧＣＡＧＡＣＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＣＣＣＴＧＧＴＡＣＡＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＡＡＧＧＡＡＴＡＧＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＡＧＧＴＧＴＴＧＴＴＧＧＴＴＴＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＴＴＴＴＣＣＡＧＧＡＴＴＡＣＣＡＧＧＴＣＣＣＴＣＡＧＧＴＧＡＧＣＣＣＧＧＡＡＡＡＣＡＧＧＧＴＣＣＣＴＣＡＧＧＡＧＣＡＡＧＴＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＡＣＣＡＣＣＡＧＧＡＣＣＡＡＴＧＧＧＡＣＣＴＣＣＡＧＧＡＴＴＡＧＣＴＧＧＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＧＡＡＴＣＡＧＧＡＡＧＡＧＡＧＧＧＴＧＣＴＣＣＴＧＧＡＧＣＡＧＡＡＧＧＴＴＣＡＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＡＣＧＧＴＴＣＡＣＣＣＧＧＡＧＣＣＡＡＧＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＣＡＧＧＴＣＣＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＣＧＧＡＧＣＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＴＣＧＧＡＣＣＡＧＣＡＧＧＡＡＡＡＴＣＣＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＧＴＧＡＧＡＣＴＧＧＡＣＣＣＧＣＡＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＣＣＴＧＴＴＧＧＡＣＣＡＧＴＧＧＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＡＣＣＡＧＣＡＧＧＴＣＣＡＣＡＡＧＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡＡＡＧＧＴＧＡＧＡＣＡＧＧＴＧＡＧＣＡＧＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＧＡＡＴＴＡＡＡＧＧＴＣＡＣＡＧＡＧＧＡＴＴＴＴＣＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＧＧＡＣＣＡＣＣＣＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＴＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＣＡＡＧＧＴＣＣＡＴＣＣＧＧＴＧＣＡＴＣＣＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＡＣＣＣＡＧＡＧＧＡＣＣＡＣＣＴＧＧＴＴＣＴＧＣＴＧＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＧＡＡＣＧＧＴＴＴＧＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＴＡＧＧＡＣＣＴＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＡＣＴＧＧＴＧＡＣＧＣＣＧＧＴＣＣＣＧＴＣＧＧＡＣＣＡＣＣＣＧＧＴＣＣＡＣＣＡＧＧＴＣＣＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＣＣＣＧＧＡＣＣＡＣＣＡＴＣＣＧＣＡＧＧＡＴＴＴＧＡＴＴＴＣＴＣＡＴＴＣＣＴＴＣＣＴＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧＣＡＣＡＴＧＡＴＧＧＡＧＧＴＡＧＡＴＡＣＴＡＴＡＧＡＧＣＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＴＡＡ
ＴＧＧＴＣＴＣＡＴＣＣＡＣＡＡＴＴＴＧＡＡＡＡＧＣＡＡＣＴＴＡＧＴＴＡＴＧＧＡＴＡＣＧＡＴＧＡＡＡＡＡＴＣＣＡＣＡＧＧＴＧＧＡＡＴＣＡＧＴＧＴＴＣＣＴＧＧＡＣＣＴＡＴＧＧＧＴＣＣＡＴＣＡＧＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＣＣＴＣＣＡＧＧＴＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＣＣＣＡＧＧＧＡＴＴＴＣＡＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＣＣＴＧＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＣＴＴＣＴＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＣＣＣＴＧＧＡＣＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＡＡＧＡＡＴＧＧＡＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＡＣＣＴＧＧＡＡＧＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＡＣＣＡＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＡＧＧＧＴＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＧＣＣＡＧＧＴＡＣＣＧＣＡＧＧＴＣＴＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＡＡＡＧＧＴＣＡＴＡＧＡＧＧＡＴＴＴＴＣＡＧＧＡＴＴＡＧＡＣＧＧＴＧＣＡＡＡＧＧＧＡＧＡＣＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＡＡＧＧＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＴＣＣＡＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＴＧＣＣＣＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＴＡＧＡＣＣＣＧＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＡＡＡＴＧＡＴＧＧＡＧＣＴＡＣＡＧＧＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＡＣＡＧＧＡＣＣＡＧＣＣＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＴＴＴＣＣＣＡＧＧＴＧＣＣＧＴＴＧＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＴＣＣＡＣＡＧＧＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＣＣＡＣＡＧＧＧＡＧＴＴＡＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＴＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＴＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＣＧＧＴＣＡＧＣＣＡＧＧＴＧＣＴＡＡＧＧＧＡＧＣＡＡＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＡＡＴＡＧＣＴＧＧＴＧＣＣＣＣＡＧＧＡＴＴＴＣＣＣＧＧＴＧＣＴＡＧＡＧＧＴＣＣＡＡＧＴＧＧＴＣＣＡＣＡＡＧＧＡＣＣＡＧＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＣＧＧＴＣＣＣＡＡＡＧＧＡＡＡＣＡＧＴＧＧＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＣＡＣＣＣＧＧＴＴＣＡＡＡＧＧＧＡＧＡＴＡＣＡＧＧＡＧＣＴＡＡＡＧＧＡＧＡＧＣＣＣＧＧＴＣＣＡＧＴＧＧＧＴＧＴＴＣＡＧＧＧＡＣＣＡＣＣＣＧＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＧＴＡＡＡＡＧＡＧＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＣＣＡＡＣＡＧＧＴＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＣＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＴＧＧＴＣＣＡＧＧＴＡＧＴＡＧＡＧＧＡＴＴＴＣＣＡＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＧＴＧＴＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＡＡＧＧＧＡＣＣＣＧＣＡＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＧＧＴＣＣＡＧＣＣＧＧＡＣＣＡＡＡＡＧＧＡＴＣＡＣＣＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＧＴＡＧＡＣＣＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＧＴＣＴＧＣＣＡＧＧＴＧＣＴＡＡＡＧＧＡＴＴＧＡＣＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＴＧＡＴＧＧＡＡＡＧＡＣＡＧＧＡＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣＣＣＧＣＴＧＧＴＣＡＧＧＡＣＧＧＴＡＧＡＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＴＣＡＧＧＣＡＧＧＴＧＴＡＡＴＧＧＧＴＴＴＣＣＣＣＧＧＡＣＣＴＡＡＡＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＡＡＣＣＴＧＧＴＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＧＣＣＴＧＧＡＣＣＣＣＣＴＧＧＡＧＣＴＧＴＴＧＧＴＣＣＡＧＣＡＧＧＡＡＡＧＧＡＴＧＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＣＣＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＣＡＡＧＧＴＣＣＣＧＣＡＧＧＴＴＣＴＣＣＡＧＧＴＴＴＴＣＡＧＧＧＴＴＴＧＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＣＧＧＴＣＣＴＣＣＴＧＧＡＧＡＧＧＣＡＧＧＡＡＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＡＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＡＧＡＣＣＴＧＧＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＣＣＴＣＴＧＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＴＴＣＣＴＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＴＧＴＧＣＡＧＧＧＡＣＣＡＣＣＡＧＧＴＣＣＣＧＣＣＧＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＡＡＴＧＧＡＧＣＣＣＣＴＧＧＡＡＡＴＧＡＣＧＧＡＧＣＴＡＡＧＧＧＴＧＡＣＧＣＴＧＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＴＴＣＴＣＡＡＧＧＴＧＣＴＣＣＣＧＧＡＴＴＧＣＡＧＧＧＴＡＴＧＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡＣＴＧＣＣＡＧＧＴＣＣＡＡＡＡＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＧＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＣＣＴＡＡＧＧＧＡＧＣＴＧＡＣＧＧＴＴＣＴＣＣＴＧＧＡＡＡＧＧＡＣＧＧＴＧＴＧＡＧＡＧＧＴＴＴＧＡＣＡＧＧＡＣＣＡＡＴＡＧＧＴＣＣＡＣＣＣＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＣＣＣＴＧＧＡＧＡＣＡＡＡＧＧＴＧＡＡＴＣＡＧＧＴＣＣＴＴＣＣＧＧＴＣＣＡＧＣＣＧＧＡＣＣＡＡＣＡＧＧＡＧＣＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＧＡＧＡＧＣＣＡＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＴＴＣＧＣＴＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＣＴＡＡＧＧＧＡＧＡＡＣＣＣＧＧＴＧＡＣＧＣＴＧＧＴＧＣＴＡＡＧＧＧＡＧＡＴＧＣＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＣＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＡＡＴＡＧＧＴＡＡＴＧＴＴＧＧＡＧＣＡＣＣＣＧＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＧＧＴＴＣＣＧＣＡＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＡＧＣＡＡＣＴＧＧＴＴＴＴＣＣＡＧＧＡＧＣＴＧＣＣＧＧＡＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＴＴＣＴＧＧＡＡＡＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＣＡＧＧＴＣＣＴＣＣＴＧＧＴＣＣＡＧＣＣＧＧＡＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＧＧＧＡＣＣＴＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＣＡＧＧＴＣＣＣＧＣＡＧＧＴＡＧＡＣＣＣＧＧＴＧＡＧＧＴＧＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＡＣＣＣＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＧＡＡＡＧＧＡＡＧＴＣＣＴＧＧＡＧＣＡＧＡＣＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＣＣＣＴＧＧＴＡＣＡＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＡＡＧＧＡＡＴＡＧＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＡＧＧＴＧＴＴＧＴＴＧＧＴＴＴＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＴＴＴＴＣＣＡＧＧＡＴＴＡＣＣＡＧＧＴＣＣＣＴＣＡＧＧＴＧＡＧＣＣＣＧＧＡＡＡＡＣＡＧＧＧＴＣＣＣＴＣＡＧＧＡＧＣＡＡＧＴＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＡＣＣＡＣＣＡＧＧＡＣＣＡＡＴＧＧＧＡＣＣＴＣＣＡＧＧＡＴＴＡＧＣＴＧＧＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＧＡＡＴＣＡＧＧＡＡＧＡＧＡＧＧＧＴＧＣＴＣＣＴＧＧＡＧＣＡＧＡＡＧＧＴＴＣＡＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＡＣＧＧＴＴＣＡＣＣＣＧＧＡＧＣＣＡＡＧＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＣＡＧＧＴＣＣＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＣＧＧＡＧＣＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＴＣＧＧＡＣＣＡＧＣＡＧＧＡＡＡＡＴＣＣＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＧＴＧＡＧＡＣＴＧＧＡＣＣＣＧＣＡＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＣＣＴＧＴＴＧＧＡＣＣＡＧＴＧＧＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＡＣＣＡＧＣＡＧＧＴＣＣＡＣＡＡＧＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡＡＡＧＧＴＧＡＧＡＣＡＧＧＴＧＡＧＣＡＧＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＧＡＡＴＴＡＡＡＧＧＴＣＡＣＡＧＡＧＧＡＴＴＴＴＣＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＧＧＡＣＣＡＣＣＣＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＴＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＣＡＡＧＧＴＣＣＡＴＣＣＧＧＴＧＣＡＴＣＣＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＡＣＣＣＡＧＡＧＧＡＣＣＡＣＣＴＧＧＴＴＣＴＧＣＴＧＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＧＡＡＣＧＧＴＴＴＧＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＴＡＧＧＡＣＣＴＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＡＣＴＧＧＴＧＡＣＧＣＣＧＧＴＣＣＣＧＴＣＧＧＡＣＣＡＣＣＣＧＧＴＣＣＡＣＣＡＧＧＴＣＣＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＣＣＣＧＧＡＣＣＡＣＣＡＴＣＣＧＣＡＧＧＡＴＴＴＧＡＴＴＴＣＴＣＡＴＴＣＣＴＴＣＣＴＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧＣＡＣＡＴＧＡＴＧＧＡＧＧＴＡＧＡＴＡＣＴＡＴＡＧＡＧＣＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＴＡＡ
【0060】
α１（ＩＩ）Ｍ６をコードするＤＮＡ配列の両末端には、アミノ基末端にＳｔｒｅｐ－Ｔａｇ ＩＩタグをコードするＤＮＡ配列を付加し、カルボキシ末端に６×Ｈｉｓ ＴａｇタグをコードするＤＮＡ配列を付加した後、α１（ＩＩ）Ｍ６が最終的に発現して得たのは、タグ含有タンパク質であり、合計１０７６個のアミノ酸があり、配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示される。
【0061】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９：
ＥＦＷＳＨＰＱＦＥＫＱＭＡＧＧＦＤＥＫＡＧＧＡＱＬＧＰＰＱＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＡＧＡＰＧＰＱＧＦＱＧＮＰＧＥＰＧＥＰＧＶＳＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＫＰＧＤＤＧＥＡＧＫＰＧＫＡＧＥＲＧＰＰＧＰＱＧＡＲＧＦＰＧＴＰＧＬＰＧＶＫＧＨＲＧＹＰＧＬＤＧＡＫＧＥＡＧＡＰＧＶＫＧＥＳＧＳＰＧＥＮＧＳＰＧＰＰＧＰＰＧＬＰＧＥＲＧＲＴＧＰＡＧＡＡＧＡＲＧＮＤＧＱＰＧＰＡＧＰＰＧＰＶＧＰＡＧＧＰＧＦＰＧＡＰＧＡＫＧＥＡＧＰＴＧＡＲＧＰＥＧＡＱＧＰＲＧＥＰＧＴＰＧＳＰＧＰＡＧＡＳＧＮＰＧＴＤＧＩＰＧＡＫＧＳＡＧＡＰＧＩＡＧＡＰＧＦＰＧＰＲＧＰＰＧＰＱＧＡＴＧＰＬＧＰＫＧＱＴＧＥＰＧＩＡＧＦＫＧＥＱＧＰＫＧＥＰＧＰＡＧＰＱＧＡＰＧＰＡＧＥＥＧＫＲＧＡＲＧＥＰＧＧＶＧＰＩＧＰＰＧＥＲＧＡＰＧＮＲＧＦＰＧＱＤＧＬＡＧＰＫＧＡＰＧＥＲＧＰＳＧＬＡＧＰＫＧＡＮＧＤＰＧＲＰＧＥＰＧＬＰＧＡＲＧＬＴＧＲＰＧＤＡＧＰＱＧＫＶＧＰＳＧＡＰＧＥＤＧＲＰＧＰＰＧＰＱＧＡＲＧＱＰＧＶＭＧＦＰＧＰＫＧＡＮＧＥＰＧＫＡＧＥＫＧＬＰＧＡＰＧＬＲＧＬＰＧＫＤＧＥＴＧＡＡＧＰＰＧＰＡＧＰＡＧＥＲＧＥＱＧＡＰＧＰＳＧＦＱＧＬＰＧＰＰＧＰＰＧＥＧＧＫＰＧＤＱＧＶＰＧＥＡＧＡＰＧＬＶＧＰＲＧＥＲＧＦＰＧＥＲＧＳＰＧＡＱＧＬＱＧＰＲＧＬＰＧＴＰＧＴＤＧＰＫＧＡＳＧＰＡＧＰＰＧＡＱＧＰＰＧＬＱＧＭＰＧＥＲＧＡＡＧＩＡＧＰＫＧＤＲＧＤＶＧＥＫＧＰＥＧＡＰＧＫＤＧＧＲＧＬＴＧＰＩＧＰＰＧＰＡＧＡＮＧＥＫＧＥＶＧＰＰＧＰＡＧＳＡＧＡＲＧＡＰＧＥＲＧＥＴＧＰＰＧＰＡＧＦＡＧＰＰＧＡＤＧＱＰＧＡＫＧＥＱＧＥＡＧＱＫＧＤＡＧＡＰＧＰＱＧＰＳＧＡＰＧＰＱＧＰＴＧＶＴＧＰＫＧＡＲＧＡＱＧＰＰＧＡＴＧＦＰＧＡＡＧＲＶＧＰＰＧＳＮＧＮＰＧＰＰＧＰＰＧＰＳＧＫＤＧＰＫＧＡＲＧＤＳＧＰＰＧＲＡＧＥＰＧＬＱＧＰＡＧＰＰＧＥＫＧＥＰＧＤＤＧＰＳＧＡＥＧＰＰＧＰＱＧＬＡＧＱＲＧＩＶＧＬＰＧＱＲＧＥＲＧＦＰＧＬＰＧＰＳＧＥＰＧＫＱＧＡＰＧＡＳＧＤＲＧＰＰＧＰＶＧＰＰＧＬＴＧＰＡＧＥＰＧＲＥＧＳＰＧＡＤＧＰＰＧＲＤＧＡＡＧＶＫＧＤＲＧＥＴＧＡＶＧＡＰＧＡＰＧＰＰＧＳＰＧＰＡＧＰＴＧＫＱＧＤＲＧＥＡＧＡＱＧＰＭＧＰＳＧＰＡＧＡＲＧＩＱＧＰＱＧＰＲＧＤＫＧＥＡＧＥＰＧＥＲＧＬＫＧＨＲＧＦＴＧＬＱＧＬＰＧＰＰＧＰＳＧＤＱＧＡＳＧＰＡＧＰＳＧＰＲＧＰＰＧＰＶＧＰＳＧＫＤＧＡＮＧＩＰＧＰＩＧＰＰＧＰＲＧＲＳＧＥＴＧＰＡＧＰＰＧＮＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＧＩＤＭＳＡＦＡＧＬＧＰＲＥＫＧＰＤＰＬＱＹＭＲＡＨＨＨＨＨＨ
ＥＦＷＳＨＰＱＦＥＫＱＭＡＧＧＦＤＥＫＡＧＧＡＱＬＧＰＰＱＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＡＧＡＰＧＰＱＧＦＱＧＮＰＧＥＰＧＥＰＧＶＳＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＫＰＧＤＤＧＥＡＧＫＰＧＫＡＧＥＲＧＰＰＧＰＱＧＡＲＧＦＰＧＴＰＧＬＰＧＶＫＧＨＲＧＹＰＧＬＤＧＡＫＧＥＡＧＡＰＧＶＫＧＥＳＧＳＰＧＥＮＧＳＰＧＰＰＧＰＰＧＬＰＧＥＲＧＲＴＧＰＡＧＡＡＧＡＲＧＮＤＧＱＰＧＰＡＧＰＰＧＰＶＧＰＡＧＧＰＧＦＰＧＡＰＧＡＫＧＥＡＧＰＴＧＡＲＧＰＥＧＡＱＧＰＲＧＥＰＧＴＰＧＳＰＧＰＡＧＡＳＧＮＰＧＴＤＧＩＰＧＡＫＧＳＡＧＡＰＧＩＡＧＡＰＧＦＰＧＰＲＧＰＰＧＰＱＧＡＴＧＰＬＧＰＫＧＱＴＧＥＰＧＩＡＧＦＫＧＥＱＧＰＫＧＥＰＧＰＡＧＰＱＧＡＰＧＰＡＧＥＥＧＫＲＧＡＲＧＥＰＧＧＶＧＰＩＧＰＰＧＥＲＧＡＰＧＮＲＧＦＰＧＱＤＧＬＡＧＰＫＧＡＰＧＥＲＧＰＳＧＬＡＧＰＫＧＡＮＧＤＰＧＲＰＧＥＰＧＬＰＧＡＲＧＬＴＧＲＰＧＤＡＧＰＱＧＫＶＧＰＳＧＡＰＧＥＤＧＲＰＧＰＰＧＰＱＧＡＲＧＱＰＧＶＭＧＦＰＧＰＫＧＡＮＧＥＰＧＫＡＧＥＫＧＬＰＧＡＰＧＬＲＧＬＰＧＫＤＧＥＴＧＡＡＧＰＰＧＰＡＧＰＡＧＥＲＧＥＱＧＡＰＧＰＳＧＦＱＧＬＰＧＰＰＧＰＰＧＥＧＧＫＰＧＤＱＧＶＰＧＥＡＧＡＰＧＬＶＧＰＲＧＥＲＧＦＰＧＥＲＧＳＰＧＡＱＧＬＱＧＰＲＧＬＰＧＴＰＧＴＤＧＰＫＧＡＳＧＰＡＧＰＰＧＡＱＧＰＰＧＬＱＧＭＰＧＥＲＧＡＡＧＩＡＧＰＫＧＤＲＧＤＶＧＥＫＧＰＥＧＡＰＧＫＤＧＧＲＧＬＴＧＰＩＧＰＰＧＰＡＧＡＮＧＥＫＧＥＶＧＰＰＧＰＡＧＳＡＧＡＲＧＡＰＧＥＲＧＥＴＧＰＰＧＰＡＧＦＡＧＰＰＧＡＤＧＱＰＧＡＫＧＥＱＧＥＡＧＱＫＧＤＡＧＡＰＧＰＱＧＰＳＧＡＰＧＰＱＧＰＴＧＶＴＧＰＫＧＡＲＧＡＱＧＰＰＧＡＴＧＦＰＧＡＡＧＲＶＧＰＰＧＳＮＧＮＰＧＰＰＧＰＰＧＰＳＧＫＤＧＰＫＧＡＲＧＤＳＧＰＰＧＲＡＧＥＰＧＬＱＧＰＡＧＰＰＧＥＫＧＥＰＧＤＤＧＰＳＧＡＥＧＰＰＧＰＱＧＬＡＧＱＲＧＩＶＧＬＰＧＱＲＧＥＲＧＦＰＧＬＰＧＰＳＧＥＰＧＫＱＧＡＰＧＡＳＧＤＲＧＰＰＧＰＶＧＰＰＧＬＴＧＰＡＧＥＰＧＲＥＧＳＰＧＡＤＧＰＰＧＲＤＧＡＡＧＶＫＧＤＲＧＥＴＧＡＶＧＡＰＧＡＰＧＰＰＧＳＰＧＰＡＧＰＴＧＫＱＧＤＲＧＥＡＧＡＱＧＰＭＧＰＳＧＰＡＧＡＲＧＩＱＧＰＱＧＰＲＧＤＫＧＥＡＧＥＰＧＥＲＧＬＫＧＨＲＧＦＴＧＬＱＧＬＰＧＰＰＧＰＳＧＤＱＧＡＳＧＰＡＧＰＳＧＰＲＧＰＰＧＰＶＧＰＳＧＫＤＧＡＮＧＩＰＧＰＩＧＰＰＧＰＲＧＲＳＧＥＴＧＰＡＧＰＰＧＮＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＧＩＤＭＳＡＦＡＧＬＧＰＲＥＫＧＰＤＰＬＱＹＭＲＡＨＨＨＨＨＨ
【0062】
最適化された設計の後、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（α１（ＩＩ）Ｍ６）アミノ酸配列をコードする遺伝子（ＣＯＬ２Ａ１Ｍ６と表記する）のＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示される。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０：
ＧＡＡＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣＡＴＣＣＴＣＡＡＴＴＣＧＡＡＡＡＡＣＡＡＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＧＡＴＴＣＧＡＴＧＡＡＡＡＧＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＣＣＣＡＡＴＴＡＧＧＴＣＣＴＣＣＡＣＡＡＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣＣＣＧＣＣＧＧＴＧＣＴＣＣＴＧＧＡＣＣＡＣＡＧＧＧＴＴＴＣＣＡＡＧＧＡＡＡＣＣＣＣＧＧＴＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＧＣＣＴＧＧＴＧＴＴＴＣＡＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＣＡＣＣＡＧＧＡＡＡＧＣＣＴＧＧＴＧＡＣＧＡＣＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＧＴＡＡＡＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＣＴＣＡＧＧＧＴＧＣＣＡＧＡＧＧＴＴＴＣＣＣＡＧＧＴＡＣＣＣＣＴＧＧＴＣＴＴＣＣＴＧＧＴＧＴＣＡＡＧＧＧＴＣＡＴＡＧＡＧＧＴＴＡＣＣＣＣＧＧＴＴＴＧＧＡＴＧＧＴＧＣＣＡＡＧＧＧＴＧＡＡＧＣＣＧＧＴＧＣＣＣＣＴＧＧＴＧＴＴＡＡＧＧＧＴＧＡＡＴＣＡＧＧＡＡＧＴＣＣＣＧＧＴＧＡＡＡＡＴＧＧＡＡＧＴＣＣＣＧＧＴＣＣＡＣＣＣＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＴＧＣＣＡＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＧＣＴＡＧＡＧＧＡＡＡＴＧＡＣＧＧＡＣＡＧＣＣＣＧＧＡＣＣＡＧＣＣＧＧＡＣＣＴＣＣＣＧＧＴＣＣＴＧＴＴＧＧＧＣＣＣＧＣＡＧＧＴＧＧＴＣＣＴＧＧＴＴＴＣＣＣｔｇＧＴＧＣＴＣＣＴＧＧＡＧＣＣＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣＧＧＡＣＣＣＡＣＣＧＧＡＧＣＣＡＧＡＧＧＴＣＣＣＧＡＧＧＧＡＧＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＡＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＡＣＡＣＣＡＧＧＴＡＧＴＣＣＣＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＣＡＴＣＡＧＧＡＡＡＴＣＣＣＧＧＡＡＣＴＧＡＣＧＧＴＡＴＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＡＡＧＧＧＡＴＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＡＡＴＡＧＣＴＧＧＴＧＣＴＣＣＴＧＧＡＴＴＴＣＣＡＧＧＴＣＣＣＡＧＡＧＧＡＣＣＴＣＣＣＧＧＴＣＣＴＣＡＡＧＧＡＧＣＡＡＣＡＧＧＴＣＣＴＴＴＧＧＧＡＣＣＡＡＡＡＧＧＴＣＡＡＡＣＡＧＧＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＡＴＴＧＣＴＧＧＡＴＴＣＡＡＡＧＧＡＧＡＧＣＡＡＧＧＴＣＣＡＡＡＧＧＧＡＧＡＧＣＣＣＧＧＴＣＣＣＧＣＡＧＧＴＣＣＣＣＡＡＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＡＡＧＡＧＧＡＧＣＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＴＡＧＧＡＣＣＴＡＴＴＧＧＴＣＣＴＣＣＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＴＧＣＴＣＣＣＧＧＡＡＡＣＡＧＡＧＧＴＴＴＴＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＡＴＧＧＴＣＴＧＧＣＴＧＧＡＣＣＴＡＡＡＧＧＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＡＣＣＴＴＣＡＧＧＡＣＴＴＧＣＴＧＧＴＣＣＡＡＡＡＧＧＴＧＣＴＡＡＣＧＧＡＧＡＴＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＧＴＣＴＧＣＣＴＧＧＡＧＣＴＡＧＡＧＧＡＴＴＡＡＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＡＧＧＴＧＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＣＣＡＧＧＧＴＡＡＡＧＴＧＧＧＴＣＣＣＡＧＴＧＧＴＧＣＣＣＣＡＧＧＴＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＧＡＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＡＡＧＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣＣＴＧＧＡＣＣＣＡＡＧＧＧＴＧＣＴＡＡＣＧＧＡＧＡＡＣＣＴＧＧＡＡＡＡＧＣＴＧＧＴＧＡＧＡＡＡＧＧＡＣＴＧＣＣＣＧＧＴＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＴＴＡＧＡＧＧＴＴＴＧＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＡＴＧＧＡＧＡＡＡＣＡＧＧＡＧＣＣＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＣＣＧＧＴＣＣＡＧＣＣＧＧＡＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＴＧＡＡＣＡＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＧＴＧＧＴＴＴＴＣＡＧＧＧＴＣＴＴＣＣＡＧＧＴＣＣＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＧＴＡＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＧＡＧＡＡＧＣＡＧＧＴＧＣＡＣＣＣＧＧＴＣＴＴＧＴＧＧＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＡＴＴＣＣＣＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＴＣＣＴＡＧＡＧＧＴＣＴＧＣＣＡＧＧＴＡＣＣＣＣＴＧＧＴＡＣＡＧＡＣＧＧＡＣＣＡＡＡＧＧＧＡＧＣＡＴＣＡＧＧＡＣＣＣＧＣＴＧＧＡＣＣＴＣＣＣＧＧＡＧＣＣＣＡＡＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＴＴＴＡＣＡＡＧＧＴＡＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＡＴＡＧＣＴＧＧＡＣＣＡＡＡＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＧＴＧＡＣＧＴＴＧＧＴＧＡＧＡＡＧＧＧＴＣＣＣＧＡＡＧＧＡＧＣＣＣＣＴＧＧＡＡＡＡＧＡＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＡＡＣＡＧＧＴＣＣＴＡＴＡＧＧＡＣＣＡＣＣＣＧＧＴＣＣＡＧＣＣＧＧＴＧＣＴＡＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＴＡＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＡＧＧＡＴＣＴＧＣＡＧＧＴＧＣＴＡＧＡＧＧＴＧＣＣＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＣＡＧＧＡＣＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＴＴＣＧＣＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＧＡＣＡＧＣＣＣＧＧＴＧＣＡＡＡＡＧＧＴＧＡＡＣＡＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣＧＧＡＣＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＴＧＣＴＧＧＡＧＣＣＣＣＣＧＧＴＣＣＡＣＡＡＧＧＴＣＣＣＴＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＴＣＣＴＣＡＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＡＣＣＧＧＧＣＣＡＡＡＧＧＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＡＣＡＧＧＴＴＴＣＣＣＡＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＴＡＧＡＧＴＣＧＧＴＣＣＡＣＣＣＧＧＡＴＣＴＡＡＴＧＧＴＡＡＣＣＣＣＧＧＡＣＣＡＣＣＡＧＧＡＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＣＡＴＣＴＧＧＡＡＡＧＧＡＴＧＧＡＣＣＣＡＡＡＧＧＡＧＣＡＡＧＡＧＧＡＧＡＴＴＣＡＧＧＡＣＣＡＣＣＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＣＣＴＧＧＡＴＴＡＣＡＧＧＧＴＣＣＣＧＣＣＧＧＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＡＡＡＧＧＡＧＡＧＣＣＣＧＧＡＧＡＴＧＡＴＧＧＴＣＣＣＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＡＡＧＧＴＣＴＧＧＣＡＧＧＴＣＡＡＡＧＡＧＧＴＡＴＡＧＴＧＧＧＴＣＴＴＣＣＡＧＧＴＣＡＡＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＡＴＴＴＣＣＡＧＧＡＣＴＴＣＣＡＧＧＴＣＣＴＴＣＡＧＧＴＧＡＡＣＣＣＧＧＴＡＡＡＣＡＧＧＧＡＧＣＣＣＣＣＧＧＡＧＣＣＴＣＡＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＣＣＡＧＴＡＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＧＴＴＴＡＡＣＣＧＧＡＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＡＡＧＧＴＴＣＴＣＣＴＧＧＡＧＣＣＧＡＴＧＧＡＣＣＴＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＡＣＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＴＴＡＡＧＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＣＴＧＧＡＧＣＣＧＴＡＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＴＧＣＣＣＣＣＧＧＡＣＣＡＣＣＣＧＧＡＴＣＡＣＣＣＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＣＴＡＣＴＧＧＴＡＡＡＣＡＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣＧＧＴＧＣＣＣＡＧＧＧＴＣＣＴＡＴＧＧＧＴＣＣＴＴＣＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＡＡＧＡＧＧＴＡＴＡＣＡＡＧＧＴＣＣＡＣＡＧＧＧＴＣＣＣＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡＡＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＴＣＴＧＡＡＧＧＧＴＣＡＴＡＧＡＧＧＡＴＴＣＡＣＣＧＧＧＴＴＡＣＡＧＧＧＴＴＴＧＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＴＧＧＡＣＣＡＡＧＴＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＧＣＡＴＣＣＧＧＴＣＣＡＧＣＡＧＧＴＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＡＧＡＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＴＣＣＡＧＴＴＧＧＴＣＣＡＴＣＡＧＧＴＡＡＡＧＡＣＧＧＡＧＣＣＡＡＣＧＧＴＡＴＣＣＣＡＧＧＴＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣＣＴＡＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＴＧＧＡＧＡＧＡＣＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＣＣＴＣＣＴＧＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣＣＣＧＧＡＡＴＡＧＡＴＡＴＧＴＣＣＧＣＴＴＴＣＧＣＴＧＧＡＴＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＧＧＴＣＣＴＧＡＣＣＣＴＣＴＴＣＡＡＴＡＴＡＴＧＡＧＡＧＣＡＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＣＴＡＡ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０：
ＧＡＡＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣＡＴＣＣＴＣＡＡＴＴＣＧＡＡＡＡＡＣＡＡＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＧＡＴＴＣＧＡＴＧＡＡＡＡＧＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＣＣＣＡＡＴＴＡＧＧＴＣＣＴＣＣＡＣＡＡＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣＣＣＧＣＣＧＧＴＧＣＴＣＣＴＧＧＡＣＣＡＣＡＧＧＧＴＴＴＣＣＡＡＧＧＡＡＡＣＣＣＣＧＧＴＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＧＣＣＴＧＧＴＧＴＴＴＣＡＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＣＡＣＣＡＧＧＡＡＡＧＣＣＴＧＧＴＧＡＣＧＡＣＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＧＴＡＡＡＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＣＴＣＡＧＧＧＴＧＣＣＡＧＡＧＧＴＴＴＣＣＣＡＧＧＴＡＣＣＣＣＴＧＧＴＣＴＴＣＣＴＧＧＴＧＴＣＡＡＧＧＧＴＣＡＴＡＧＡＧＧＴＴＡＣＣＣＣＧＧＴＴＴＧＧＡＴＧＧＴＧＣＣＡＡＧＧＧＴＧＡＡＧＣＣＧＧＴＧＣＣＣＣＴＧＧＴＧＴＴＡＡＧＧＧＴＧＡＡＴＣＡＧＧＡＡＧＴＣＣＣＧＧＴＧＡＡＡＡＴＧＧＡＡＧＴＣＣＣＧＧＴＣＣＡＣＣＣＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＴＧＣＣＡＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＧＣＴＡＧＡＧＧＡＡＡＴＧＡＣＧＧＡＣＡＧＣＣＣＧＧＡＣＣＡＧＣＣＧＧＡＣＣＴＣＣＣＧＧＴＣＣＴＧＴＴＧＧＧＣＣＣＧＣＡＧＧＴＧＧＴＣＣＴＧＧＴＴＴＣＣＣｔｇＧＴＧＣＴＣＣＴＧＧＡＧＣＣＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣＧＧＡＣＣＣＡＣＣＧＧＡＧＣＣＡＧＡＧＧＴＣＣＣＧＡＧＧＧＡＧＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＡＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＡＣＡＣＣＡＧＧＴＡＧＴＣＣＣＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＣＡＴＣＡＧＧＡＡＡＴＣＣＣＧＧＡＡＣＴＧＡＣＧＧＴＡＴＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＡＡＧＧＧＡＴＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＡＡＴＡＧＣＴＧＧＴＧＣＴＣＣＴＧＧＡＴＴＴＣＣＡＧＧＴＣＣＣＡＧＡＧＧＡＣＣＴＣＣＣＧＧＴＣＣＴＣＡＡＧＧＡＧＣＡＡＣＡＧＧＴＣＣＴＴＴＧＧＧＡＣＣＡＡＡＡＧＧＴＣＡＡＡＣＡＧＧＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＡＴＴＧＣＴＧＧＡＴＴＣＡＡＡＧＧＡＧＡＧＣＡＡＧＧＴＣＣＡＡＡＧＧＧＡＧＡＧＣＣＣＧＧＴＣＣＣＧＣＡＧＧＴＣＣＣＣＡＡＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＡＡＧＡＧＧＡＧＣＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＴＡＧＧＡＣＣＴＡＴＴＧＧＴＣＣＴＣＣＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＴＧＣＴＣＣＣＧＧＡＡＡＣＡＧＡＧＧＴＴＴＴＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＡＴＧＧＴＣＴＧＧＣＴＧＧＡＣＣＴＡＡＡＧＧＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＡＣＣＴＴＣＡＧＧＡＣＴＴＧＣＴＧＧＴＣＣＡＡＡＡＧＧＴＧＣＴＡＡＣＧＧＡＧＡＴＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＧＴＣＴＧＣＣＴＧＧＡＧＣＴＡＧＡＧＧＡＴＴＡＡＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＡＧＧＴＧＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＣＣＡＧＧＧＴＡＡＡＧＴＧＧＧＴＣＣＣＡＧＴＧＧＴＧＣＣＣＣＡＧＧＴＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＧＡＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＡＡＧＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣＣＴＧＧＡＣＣＣＡＡＧＧＧＴＧＣＴＡＡＣＧＧＡＧＡＡＣＣＴＧＧＡＡＡＡＧＣＴＧＧＴＧＡＧＡＡＡＧＧＡＣＴＧＣＣＣＧＧＴＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＴＴＡＧＡＧＧＴＴＴＧＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＡＴＧＧＡＧＡＡＡＣＡＧＧＡＧＣＣＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＣＣＧＧＴＣＣＡＧＣＣＧＧＡＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＴＧＡＡＣＡＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＧＴＧＧＴＴＴＴＣＡＧＧＧＴＣＴＴＣＣＡＧＧＴＣＣＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＧＴＡＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＧＡＧＡＡＧＣＡＧＧＴＧＣＡＣＣＣＧＧＴＣＴＴＧＴＧＧＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＡＴＴＣＣＣＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＴＣＣＴＡＧＡＧＧＴＣＴＧＣＣＡＧＧＴＡＣＣＣＣＴＧＧＴＡＣＡＧＡＣＧＧＡＣＣＡＡＡＧＧＧＡＧＣＡＴＣＡＧＧＡＣＣＣＧＣＴＧＧＡＣＣＴＣＣＣＧＧＡＧＣＣＣＡＡＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＴＴＴＡＣＡＡＧＧＴＡＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＡＴＡＧＣＴＧＧＡＣＣＡＡＡＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＧＴＧＡＣＧＴＴＧＧＴＧＡＧＡＡＧＧＧＴＣＣＣＧＡＡＧＧＡＧＣＣＣＣＴＧＧＡＡＡＡＧＡＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＡＡＣＡＧＧＴＣＣＴＡＴＡＧＧＡＣＣＡＣＣＣＧＧＴＣＣＡＧＣＣＧＧＴＧＣＴＡＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＴＡＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＡＧＧＡＴＣＴＧＣＡＧＧＴＧＣＴＡＧＡＧＧＴＧＣＣＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＣＡＧＧＡＣＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＴＴＣＧＣＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＧＡＣＡＧＣＣＣＧＧＴＧＣＡＡＡＡＧＧＴＧＡＡＣＡＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣＧＧＡＣＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＴＧＣＴＧＧＡＧＣＣＣＣＣＧＧＴＣＣＡＣＡＡＧＧＴＣＣＣＴＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＴＣＣＴＣＡＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＡＣＣＧＧＧＣＣＡＡＡＧＧＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＡＣＡＧＧＴＴＴＣＣＣＡＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＴＡＧＡＧＴＣＧＧＴＣＣＡＣＣＣＧＧＡＴＣＴＡＡＴＧＧＴＡＡＣＣＣＣＧＧＡＣＣＡＣＣＡＧＧＡＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＣＡＴＣＴＧＧＡＡＡＧＧＡＴＧＧＡＣＣＣＡＡＡＧＧＡＧＣＡＡＧＡＧＧＡＧＡＴＴＣＡＧＧＡＣＣＡＣＣＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＣＣＴＧＧＡＴＴＡＣＡＧＧＧＴＣＣＣＧＣＣＧＧＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＡＡＡＧＧＡＧＡＧＣＣＣＧＧＡＧＡＴＧＡＴＧＧＴＣＣＣＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＡＡＧＧＴＣＴＧＧＣＡＧＧＴＣＡＡＡＧＡＧＧＴＡＴＡＧＴＧＧＧＴＣＴＴＣＣＡＧＧＴＣＡＡＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＡＴＴＴＣＣＡＧＧＡＣＴＴＣＣＡＧＧＴＣＣＴＴＣＡＧＧＴＧＡＡＣＣＣＧＧＴＡＡＡＣＡＧＧＧＡＧＣＣＣＣＣＧＧＡＧＣＣＴＣＡＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＣＣＡＧＴＡＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＧＴＴＴＡＡＣＣＧＧＡＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＡＡＧＧＴＴＣＴＣＣＴＧＧＡＧＣＣＧＡＴＧＧＡＣＣＴＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＡＣＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＴＴＡＡＧＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＣＴＧＧＡＧＣＣＧＴＡＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＴＧＣＣＣＣＣＧＧＡＣＣＡＣＣＣＧＧＡＴＣＡＣＣＣＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＣＴＡＣＴＧＧＴＡＡＡＣＡＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣＧＧＴＧＣＣＣＡＧＧＧＴＣＣＴＡＴＧＧＧＴＣＣＴＴＣＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＡＡＧＡＧＧＴＡＴＡＣＡＡＧＧＴＣＣＡＣＡＧＧＧＴＣＣＣＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡＡＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＴＣＴＧＡＡＧＧＧＴＣＡＴＡＧＡＧＧＡＴＴＣＡＣＣＧＧＧＴＴＡＣＡＧＧＧＴＴＴＧＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＴＧＧＡＣＣＡＡＧＴＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＧＣＡＴＣＣＧＧＴＣＣＡＧＣＡＧＧＴＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＡＧＡＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＴＣＣＡＧＴＴＧＧＴＣＣＡＴＣＡＧＧＴＡＡＡＧＡＣＧＧＡＧＣＣＡＡＣＧＧＴＡＴＣＣＣＡＧＧＴＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣＣＴＡＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＴＧＧＡＧＡＧＡＣＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＣＣＴＣＣＴＧＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣＣＣＧＧＡＡＴＡＧＡＴＡＴＧＴＣＣＧＣＴＴＴＣＧＣＴＧＧＡＴＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＧＧＴＣＣＴＧＡＣＣＣＴＣＴＴＣＡＡＴＡＴＡＴＧＡＧＡＧＣＡＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＣＴＡＡ
【0063】
ＤＮＡ配列の合成は、南京金斯瑞生物科技株式会社（Ｎａｎｊｉｎｇｊｉｎｓｉｒｕｉ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．）に依頼されて完成され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の２つの遺伝子のＤＮＡ断片を合成した。
【0064】
実施例２．組換え発現ベクターの構築、菌種選別
（１）組換え発現ベクターの構築
合成された遺伝子断片のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０をｐＰＩＣ９Ｋ空ベクター（サーモフィッシャーサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｉｎｃ．）から購入）に組換え、標的断片を分泌シグナルα－因子を含む分泌型ベクターの読み枠内に正確に挿入し、α１（ＩＩ）Ｍ６を発現するｐＰＩＣ９Ｋ－ＣＯＬ２Ａ１Ｍ６とα１（Ｉ）Ｍ１を発現するｐＰＩＣ９Ｋ－ＣＯＬ１Ａ１Ｍ１の２つの組換え発現ベクタープラスミドを取得した。
（１）組換え発現ベクターの構築
合成された遺伝子断片のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０をｐＰＩＣ９Ｋ空ベクター（サーモフィッシャーサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｉｎｃ．）から購入）に組換え、標的断片を分泌シグナルα－因子を含む分泌型ベクターの読み枠内に正確に挿入し、α１（ＩＩ）Ｍ６を発現するｐＰＩＣ９Ｋ－ＣＯＬ２Ａ１Ｍ６とα１（Ｉ）Ｍ１を発現するｐＰＩＣ９Ｋ－ＣＯＬ１Ａ１Ｍ１の２つの組換え発現ベクタープラスミドを取得した。
【0065】
ｐＰＩＣ９Ｋ－ＣＯＬ２Ａ１Ｍ６、ｐＰＩＣ９Ｋ－ＣＯＬ１Ａ１Ｍ１プラスミドをコンピテント大腸菌ＤＨ５α（生工生物工程（上海）株式会社（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）から購入）に形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ抗性プレートに陽性クローンをスクリーニングし、組換えプラスミドを抽出し、配列を同定により決定し（生工生物工程（上海）株式会社によって完成）、正確に検証した。ｐＰＩＣ９Ｋ－ＣＯＬ１Ａ１Ｍ１、ｐＰＩＣ９Ｋ－ＣＯＬ２Ａ１Ｍ６のプラスミドのパターンは、それぞれ図３と図４に示される。
【0066】
（２）菌種選別
上記の組換え発現ベクタープラスミド１０μｇをＳａｃＩ（中国大連ＴａＫａＲａ社から購入、具体的な操作は、キットの明細書に従って行った）で３７℃で一晩酵素消化し、直線化させ、ＰＣＲ生成物精製キット（生工生物工程（上海）株式会社から購入）により直線化プラスミドを回収し、容積を１０μＬ程度に調整した。
上記の組換え発現ベクタープラスミド１０μｇをＳａｃＩ（中国大連ＴａＫａＲａ社から購入、具体的な操作は、キットの明細書に従って行った）で３７℃で一晩酵素消化し、直線化させ、ＰＣＲ生成物精製キット（生工生物工程（上海）株式会社から購入）により直線化プラスミドを回収し、容積を１０μＬ程度に調整した。
【0067】
直線化プラスミドを宿主菌種のピキアパストリスＳＭＤ１１６８（サーモフィッシャーサイエンティフィックから購入）のコンピテント細胞に電気的形質転換化し、電気的形質転換した菌液を１００μＬ～２００μＬずつ１つのＭＤプレートにコートし、室温で１０分間放置し、単一コロニー（陽性形質転換体）が現れるまで３０℃で２～５日反転培養した。
【0068】
ＭＤプレートの表面に滅菌再蒸留水を２ｍＬ添加して、滅菌三角スプレッダーを使用してプレート表面のＨｉｓ＋形質転換体を軽くこすり落とし、５０ｍＬの遠心分離管に移した。菌懸濁液を滅菌再蒸留水で希釈し、１０５個の細胞を０．５ｍｇ／ｍＬＧ４１８を含むＹＰＤプレートにコートし、単一コロニーが現れるまで３０℃で３～４日反転培養した。ＹＰＤプレートからコロニーを滅菌９６ウェルプレート（２００μＬのＹＰＤ／ウェル）につつき、均一に混合し、３０℃で４８時間培養し、ウェル中の菌液をよく混合し、１つの新しい滅菌９６ウェルプレートに１０μＬずつ接種し、３０℃で２４時間培養してから、この操作を再び繰り返し、２４時間の後で、３枚目の９６ウェルプレートから１μＬを採取し、それぞれ１．０ｍｇ／ｍＬ及び４ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を含むＹＰＤプレートに接種し、３０℃で９６時間～１２０時間の培養を続けた。ピキアパストリスの形質転換体が高濃度（４ｍｇ／ｍＬ）Ｇ４１８を含むプレートで成長できる場合、該形質転換体は、複数のコピーの標的遺伝子を含んでおり、つまり、複数の組換え断片が酵母に入り、同じ組換えにより酵母の染色体に組み込まれたことを意味する。この段階のスクリーニングにより、高コピー、高発現性の組換え酵母エンジニアリング菌種が得られた。
【0069】
ｐＰＩＣ９Ｋ－ＣＯＬ１Ａ１Ｍ１、ｐＰＩＣ９Ｋ－ＣＯＬ２Ａ１Ｍ６を含む２つのエンジニアリング菌サンプルを構築し、中国微生物菌種保蔵管理委員会の一般微生物学センターに寄託した。
【0070】
組換え発現ベクターｐＰＩＣ９Ｋ－ＣＯＬ１Ａ１Ｍ１を含むエンジニアリング菌発現組換えα１（Ｉ）Ｍ１コラーゲンは、中国微生物菌種保蔵管理委員会の一般微生物学センターに寄託され、寄託番号はＣＧＭＣＣ ＮＯ．２１８９１であり、住所は北京市朝陽区北辰西路１号院３号であり、寄託日期は２０２１年０３月１１日であり、分類命名はピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。
【0071】
組換え発現ベクターｐＰＩＣ９Ｋ－ＣＯＬ２Ａ１Ｍ６を含むエンジニアリング菌発現組換えα１（ＩＩ）Ｍ６コラーゲンは、中国微生物菌種保蔵管理委員会の一般微生物学センターに寄託され、寄託番号はＣＧＭＣＣ ＮＯ．２１８９２である。住所は北京市朝陽区北辰西路１号院３号であり、寄託日期は２０２１年０３月１１日であり、分類命名はピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。
【0072】
実施例３．誘導発現と組換えコラーゲンの同定
実施例２で得られた発現α１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６の組換えエンジニアリング菌をそれぞれ取り、既存の特許における全長Ｉ型コラーゲンα１鎖タンパク質を発現するピキアパストリスのエンジニアリング菌株と全長ＩＩ型コラーゲンα１鎖タンパク質を発現するピキアパストリスのエンジニアリング菌株をコントロールとし、２つのコントロールのエンジニアリング菌株は、いずれも発明者チームの既存の研究結果であり、発現した全長コラーゲンα１鎖は同様にペプチド鎖のアミノ基末端にＳｔｒｅｐ－Ｔａｇ ＩＩタグを付加し、カルボキシ末端に６×Ｈｉｓ Ｔａｇタグを添加し、残りは出願番号２０１９１１１３５９５８．０（名称は、酵母組換えヒトＩ型コラーゲンα１鎖タンパク質、合成方法及びその使用であり、特許における全長α１（Ｉ）鎖を発現するピキアパストリスのエンジニアリング菌種は中国微生物菌種保蔵管理委員会の一般微生物学センターに寄託され、寄託番号はＣＧＭＣＣ ＮＯ．１７１５０である）、出願番号２０１９１１０８８０２５．０（名称は、ピキアパストリスによる組換えヒトＩＩ型コラーゲン単鎖の調製方法、特許における全長α１（ＩＩ）鎖を発現するピキアパストリスのエンジニアリング菌種は中国微生物菌種保蔵管理委員会の一般微生物学センターに寄託され、寄託番号はＣＧＭＣＣ ＮＯ．１７１４９である）の特許から由来した。４つのエンジニアリング菌を１０ｍＬのＢＭＧＹ培地を含む１００ｍＬ三角フラスコに入れ、２８～３０℃、２２０ｒｐｍでＯＤ６００が２～６になるまで培養し（１６～１８日）。室温、１５００～３０００ｇで５分間遠心分離し、菌体を集め、ＯＤ６００が２程度まで菌体をＢＭＭＹ培地に再懸濁し、２８～３０℃、２２０ｒｐｍのシェーカーに置き、引き続き３日成長させ、培地中のメタノールの最終濃度が１．０％になるまで２４時間毎に培地に１００％メタノールを添加した。メタノールを添加して１６時間以上誘導してから、菌液サンプルを１ｍＬのサンプリング量で採取し、１．５ｍＬのＥＰ管に置き、４℃、１２０００ｇで５分間遠心分離し、発現上澄みを集め、後で使用するために検出するサンプルを－８０℃で保管した。
実施例２で得られた発現α１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６の組換えエンジニアリング菌をそれぞれ取り、既存の特許における全長Ｉ型コラーゲンα１鎖タンパク質を発現するピキアパストリスのエンジニアリング菌株と全長ＩＩ型コラーゲンα１鎖タンパク質を発現するピキアパストリスのエンジニアリング菌株をコントロールとし、２つのコントロールのエンジニアリング菌株は、いずれも発明者チームの既存の研究結果であり、発現した全長コラーゲンα１鎖は同様にペプチド鎖のアミノ基末端にＳｔｒｅｐ－Ｔａｇ ＩＩタグを付加し、カルボキシ末端に６×Ｈｉｓ Ｔａｇタグを添加し、残りは出願番号２０１９１１１３５９５８．０（名称は、酵母組換えヒトＩ型コラーゲンα１鎖タンパク質、合成方法及びその使用であり、特許における全長α１（Ｉ）鎖を発現するピキアパストリスのエンジニアリング菌種は中国微生物菌種保蔵管理委員会の一般微生物学センターに寄託され、寄託番号はＣＧＭＣＣ ＮＯ．１７１５０である）、出願番号２０１９１１０８８０２５．０（名称は、ピキアパストリスによる組換えヒトＩＩ型コラーゲン単鎖の調製方法、特許における全長α１（ＩＩ）鎖を発現するピキアパストリスのエンジニアリング菌種は中国微生物菌種保蔵管理委員会の一般微生物学センターに寄託され、寄託番号はＣＧＭＣＣ ＮＯ．１７１４９である）の特許から由来した。４つのエンジニアリング菌を１０ｍＬのＢＭＧＹ培地を含む１００ｍＬ三角フラスコに入れ、２８～３０℃、２２０ｒｐｍでＯＤ６００が２～６になるまで培養し（１６～１８日）。室温、１５００～３０００ｇで５分間遠心分離し、菌体を集め、ＯＤ６００が２程度まで菌体をＢＭＭＹ培地に再懸濁し、２８～３０℃、２２０ｒｐｍのシェーカーに置き、引き続き３日成長させ、培地中のメタノールの最終濃度が１．０％になるまで２４時間毎に培地に１００％メタノールを添加した。メタノールを添加して１６時間以上誘導してから、菌液サンプルを１ｍＬのサンプリング量で採取し、１．５ｍＬのＥＰ管に置き、４℃、１２０００ｇで５分間遠心分離し、発現上澄みを集め、後で使用するために検出するサンプルを－８０℃で保管した。
【0073】
取得した発現上澄みに５×ローディングバッファー（２５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ値６．８、１０％ＳＤＳ、０．５％ブロモフェノールブルー、５０％グリセロール、５％β－メルカプトエタノール）を添加し、１００℃金属浴に入れて１０分間加熱し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出を行った。発現した標的タンパク質は、アミノ基末端にＳｒｔｅｐ－Ｔａｇ ＩＩタグがあり、カルボキシ末端に６×Ｈｉｓ Ｔａｇタグがあるため、抗Ｓｒｔｅｐ－Ｔａｇ ＩＩ、抗６×Ｈｉｓ Ｔａｇの抗体（南京金斯瑞生物科技株式会社から購入）を使用してウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）検出を行った（具体的な操作は、明細書を参照して行われる）。
【0074】
発現上澄みのＳＤＳ－ＰＡＧＥは、下の図５に示され、α１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６、α１（Ｉ）、α１（ＩＩ）は、いずれも２４時間誘導発現することで細胞外の発現上澄みに効率的に分泌発現でき、α１（Ｉ）、α１（ＩＩ）は、予想される標的バンド（＞１１６ｋＤａ）で明確の主な分解バンド（＜１１６ｋＤａ）を示しており、本発明のα１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６は、予想される標的バンド（＞１１６ｋＤａ）のみを有した。
【0075】
Ｉｍａｇｅ Ｌａｂソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｇｅｌ Ｄｏｃ ＸＲ＋イメージャー）を使用して計算した結果は、次の通りである。
（１）α１（Ｉ）Ｍ１標的バンドの見かけ分子量（１１６．３ｋＤａ）はα１（Ｉ）標的バンドの見かけ分子量（１１６．４ｋＤａ）と比較して、α１（ＩＩ）Ｍ６標的バンドの見かけ分子量（１１８．２ｋＤａ）はα１（ＩＩ）標的バンドの見かけ分子量（１１８．１ｋＤａ）と比較して基本的に一致し、α１（Ｉ）の主な分解バンドの見かけ分子量（１０４．５ｋＤａ）とα１（ＩＩ）の主な分解バンドの見かけ分子量（１０６．９ｋＤａ）よりも著しく多い。
（２）α１（Ｉ）電気泳動結果における標的バンドと主な分解バンドとの比は、５１．５％：４８．３％であり、α１（ＩＩ）電気泳動結果における標的バンドと主な分解バンドとの比は、５２．１％：４７．８％であり、主な分解生成物は、標的生成物の割合と基本的に同じである。
（１）α１（Ｉ）Ｍ１標的バンドの見かけ分子量（１１６．３ｋＤａ）はα１（Ｉ）標的バンドの見かけ分子量（１１６．４ｋＤａ）と比較して、α１（ＩＩ）Ｍ６標的バンドの見かけ分子量（１１８．２ｋＤａ）はα１（ＩＩ）標的バンドの見かけ分子量（１１８．１ｋＤａ）と比較して基本的に一致し、α１（Ｉ）の主な分解バンドの見かけ分子量（１０４．５ｋＤａ）とα１（ＩＩ）の主な分解バンドの見かけ分子量（１０６．９ｋＤａ）よりも著しく多い。
（２）α１（Ｉ）電気泳動結果における標的バンドと主な分解バンドとの比は、５１．５％：４８．３％であり、α１（ＩＩ）電気泳動結果における標的バンドと主な分解バンドとの比は、５２．１％：４７．８％であり、主な分解生成物は、標的生成物の割合と基本的に同じである。
【0076】
図６のＥＣＬ化学発光発色結果（全自動の化学発光画像解析システムＴａｎｏｎ ５２００がタンパク質の分子質量標準を画像に合成する）からわかるように、アミノ基末端にＳｒｔｅｐ－ＴａｇＩＩタグが、カルボキシ末端に６×Ｈｉｓ Ｔａｇタグが検出され得、標的バンドは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおける見かけ分子量の大きさと同じであり、α１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６の２つの組換えコラーゲンは全長配列を効率的に分泌発現できており、標的バンドの発現は予期通りであり、α１（Ｉ）、α１（ＩＩ）の２つのコラーゲンの標的バンド配列は全長であるが、主な分解バンドがアミノ基末端の配列を欠如し、カルボキシ末端６×Ｈｉｓ Ｔａｇタグのみ検出された。
【0077】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおけるα１（Ｉ）Ｍ１とα１（ＩＩ）Ｍ６の標的バンド、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおけるα１（Ｉ）とα１（ＩＩ）の標的バンドと主な分解バンドバンドを切り取り、トリプシンで酵素消化し、Ｎａｎｏ－ＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ質量分析により組換えコラーゲンのトリプシン分解ペプチド断片（蘇州普泰生物技術有限会社（Ｓｕｚｈｏｕ Ｐｕｔａｉ Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）に依頼して完成され）を検出し、検出したペプチド断片を配列比較し（Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース）、データの比較結果及び同定ペプチド断片と天然配列の比較重ね図（バックグラウンドの色が灰色である部分は、バンドにおいて質量分析で同定されたペプチド断片が天然配列と完全に同じ部分）は、図７と図８に示され、その結果は次の通りである。
（１）α１（Ｉ）Ｍ１、α１（Ｉ）の標的バンド及びα１（Ｉ）の主な分解バンドにおいて酵素消化した後で検出されたペプチド断片は、いずれもＩ型コラーゲンα１鎖の配列に属する。
（２）α１（ＩＩ）Ｍ６とα１（ＩＩ）の標的バンド及びα１（ＩＩ）の主な分解バンドにおいて酵素消化した後で検出されたペプチド断片は、いずれもヒトＩＩ型コラーゲンα１鎖の配列に属する。
（１）α１（Ｉ）Ｍ１、α１（Ｉ）の標的バンド及びα１（Ｉ）の主な分解バンドにおいて酵素消化した後で検出されたペプチド断片は、いずれもＩ型コラーゲンα１鎖の配列に属する。
（２）α１（ＩＩ）Ｍ６とα１（ＩＩ）の標的バンド及びα１（ＩＩ）の主な分解バンドにおいて酵素消化した後で検出されたペプチド断片は、いずれもヒトＩＩ型コラーゲンα１鎖の配列に属する。
【0078】
以上の結果より、α１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６は、α１（Ｉ）、α１（ＩＩ）と同様に発現することができ、それぞれヒトＩ型コラーゲンα１鎖、ヒトＩＩ型コラーゲンα１鎖の組換えコラーゲンに属するが、α１（Ｉ）、α１（ＩＩ）は、発現する場合に分解が発生し、主な分解バンドも対応する種類のコラーゲンに属することが分かった。
【0079】
実施例４．高密度で発酵、精製すること
（１）遺伝子のエンジニアリング菌を高密度で発酵すること
組換えα１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６コラーゲンを大規模に発現、生産し、組換えコラーゲンを含む発酵液を得た。
種培地ＹＰＧ（酵母粉末１０ｇ／Ｌ、酵母ペプトン２０ｇ／Ｌ、無水グリセロール１０ｇ／Ｌを含む）、発酵培地（ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４ １９０．４ ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １０．０６ ｇ／Ｌ、ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ １．１８ ｇ／Ｌ、Ｋ２ＳＯ４ １８．２ ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １４．９ ｇ／Ｌ、グリセロール４０ ｇ／Ｌを含む）、フィード培地（５０％Ｗ／Ｖグリセロールを含み、１リットルあたり１２ｍＬ ＰＴＭ１微量元素を加えて）、誘導培地（１００％メタノールを含み、１リットルあたり１２ｍＬ ＰＴＭ１微量元素を加えて）、ＰＴＭ１を０．２２μｍのフィルター膜でろ過・滅菌し、４℃で保管した。発酵培地を高温殺菌した後、室温まで下がった後にＰＴＭ１を加え、アンモニア水でｐＨ５．０に調整した。
（１）遺伝子のエンジニアリング菌を高密度で発酵すること
組換えα１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６コラーゲンを大規模に発現、生産し、組換えコラーゲンを含む発酵液を得た。
種培地ＹＰＧ（酵母粉末１０ｇ／Ｌ、酵母ペプトン２０ｇ／Ｌ、無水グリセロール１０ｇ／Ｌを含む）、発酵培地（ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４ １９０．４ ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １０．０６ ｇ／Ｌ、ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ １．１８ ｇ／Ｌ、Ｋ２ＳＯ４ １８．２ ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １４．９ ｇ／Ｌ、グリセロール４０ ｇ／Ｌを含む）、フィード培地（５０％Ｗ／Ｖグリセロールを含み、１リットルあたり１２ｍＬ ＰＴＭ１微量元素を加えて）、誘導培地（１００％メタノールを含み、１リットルあたり１２ｍＬ ＰＴＭ１微量元素を加えて）、ＰＴＭ１を０．２２μｍのフィルター膜でろ過・滅菌し、４℃で保管した。発酵培地を高温殺菌した後、室温まで下がった後にＰＴＭ１を加え、アンモニア水でｐＨ５．０に調整した。
【0080】
エンジニアリング菌株のバッチ培養条件及び誘導発現条件は、次の通りである。
流加培養法を採用し、培養温度が３０℃である。
エンジニアリング菌を種含有培地ＹＰＧの１Ｌ振盪ボトルに接種し、２２０ｒｐｍ、３０℃でＯＤ６００＝２～１０になるまで１８～２０時間培養した。５Ｌの発酵槽（保興生物社（Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｂａｏｘｉｎｇ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．））を使用して、発酵培地（２％グリセロールを含む）を２Ｌ投入して別途滅菌し、接種前に回転数３００ｒｐｍ、通気量４Ｌ／ｍｉｎ、温度３０℃に調整し、濃アンモニア水で調製されたアルカリ液によりｐＨを４．５に調整した。そして、０．９ｍＬのＰＴＭ１を接種して、調製された２００ｍＬの種液をタンク（フレイムリングによる接種）に接種し、溶存酸素電極の１００校正（ｈｕｎｄｒｅｄ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）をクリックし、１００校正後に発酵を開始した。成長溶存酸素が初めて３０％に下がったら、溶存酸素量・回転速度のカスケード機能（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｏｘｙｇｅｎ／ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ ｓｐｅｅｄ ｃａｓｃａｄｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）により成長溶存酸素を３０％に保ち、グリセロールが消費され、溶存酸素がリバウンドし、溶存酸素が７０％（ＯＤ６００値約２０）を超えると、溶存酸素のカスケード速度制御を解除し、攪拌を６５０ｒｐｍに調整し、グリセロールを３０％連結供給し、供給量は８０ｍＬである。グリセロールの補充を停止し、溶存酸素が７０％以上にリバウンドしてから、ｐＨ４、温度２９℃とし、メタノールとグリセロールとの混合炭素源（メタノール：５０％グリセロール＝７：３）を使用して誘導培養した。手動で上記の混合炭素源を５ｍＬ追加し、溶存酸素が７０％以上にリバウンドしてから、供給速度を８ｍＬ／ｈとし、１時間後に１０ｍＬ／ｈに上げ、１時間後に再び２０ｍＬ／ｈに上げた。溶存酸素の値が３０％未満の場合、供給を停止し、溶存酸素がリバウンドし、溶存酸素が３０％戻って連結供給した。４０～６０時間誘導し、ＵＶ測定によってタンパク質濃度が大幅に増加しない又は減少すると、タンクに入れる。ＵＶによるタンパク質の定量式は、Ｃ（ｍｇ／ｍＬ）＝０．１４４＊（Ａ２１５－Ａ２２５）であり、Ａ２１５＜１．５である。同時に、全長α１（Ｉ）鎖を発現するピキアパストリスのエンジニアリング菌種（中国微生物菌種保蔵管理委員会の一般微生物学センター菌種の寄託番号はＣＧＭＣＣ ＮＯ．１７１５０である）、全長α１（ＩＩ）鎖を発現するピキアパストリスのエンジニアリング菌種（中国微生物菌種保蔵管理委員会の一般微生物学センター菌種の寄託番号はＣＧＭＣＣ ＮＯ．１７１４９である）をそれぞれ取得して高密度で発酵した。
流加培養法を採用し、培養温度が３０℃である。
エンジニアリング菌を種含有培地ＹＰＧの１Ｌ振盪ボトルに接種し、２２０ｒｐｍ、３０℃でＯＤ６００＝２～１０になるまで１８～２０時間培養した。５Ｌの発酵槽（保興生物社（Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｂａｏｘｉｎｇ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．））を使用して、発酵培地（２％グリセロールを含む）を２Ｌ投入して別途滅菌し、接種前に回転数３００ｒｐｍ、通気量４Ｌ／ｍｉｎ、温度３０℃に調整し、濃アンモニア水で調製されたアルカリ液によりｐＨを４．５に調整した。そして、０．９ｍＬのＰＴＭ１を接種して、調製された２００ｍＬの種液をタンク（フレイムリングによる接種）に接種し、溶存酸素電極の１００校正（ｈｕｎｄｒｅｄ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）をクリックし、１００校正後に発酵を開始した。成長溶存酸素が初めて３０％に下がったら、溶存酸素量・回転速度のカスケード機能（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｏｘｙｇｅｎ／ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ ｓｐｅｅｄ ｃａｓｃａｄｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）により成長溶存酸素を３０％に保ち、グリセロールが消費され、溶存酸素がリバウンドし、溶存酸素が７０％（ＯＤ６００値約２０）を超えると、溶存酸素のカスケード速度制御を解除し、攪拌を６５０ｒｐｍに調整し、グリセロールを３０％連結供給し、供給量は８０ｍＬである。グリセロールの補充を停止し、溶存酸素が７０％以上にリバウンドしてから、ｐＨ４、温度２９℃とし、メタノールとグリセロールとの混合炭素源（メタノール：５０％グリセロール＝７：３）を使用して誘導培養した。手動で上記の混合炭素源を５ｍＬ追加し、溶存酸素が７０％以上にリバウンドしてから、供給速度を８ｍＬ／ｈとし、１時間後に１０ｍＬ／ｈに上げ、１時間後に再び２０ｍＬ／ｈに上げた。溶存酸素の値が３０％未満の場合、供給を停止し、溶存酸素がリバウンドし、溶存酸素が３０％戻って連結供給した。４０～６０時間誘導し、ＵＶ測定によってタンパク質濃度が大幅に増加しない又は減少すると、タンクに入れる。ＵＶによるタンパク質の定量式は、Ｃ（ｍｇ／ｍＬ）＝０．１４４＊（Ａ２１５－Ａ２２５）であり、Ａ２１５＜１．５である。同時に、全長α１（Ｉ）鎖を発現するピキアパストリスのエンジニアリング菌種（中国微生物菌種保蔵管理委員会の一般微生物学センター菌種の寄託番号はＣＧＭＣＣ ＮＯ．１７１５０である）、全長α１（ＩＩ）鎖を発現するピキアパストリスのエンジニアリング菌種（中国微生物菌種保蔵管理委員会の一般微生物学センター菌種の寄託番号はＣＧＭＣＣ ＮＯ．１７１４９である）をそれぞれ取得して高密度で発酵した。
【0081】
その結果は、表１に示され、４８時間誘導した後、α１（Ｉ）はα１（Ｉ）Ｍ１と比較して、α１（ＩＩ）Ｍ６はα１（ＩＩ）と比較して、菌濃度（ＯＤ６００）、菌湿重量、発酵液における発現タンパク質の濃度ＵＶ定量という３つの指標は、有意差がない。ただし、発酵上澄みを集めてＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動検出した結果は、図９に示され、高密度での発酵の条件下でα１（Ｉ）、α１（ＩＩ）の主な分解バンドは極めて明らかであり、振盪ボトルによる誘導発現と変わらなく、α１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６の最も主な生成物は依然としてその標的バンドであり、主な分解バンドが現れていないことから、α１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６の主な分解バンド（主な分解生成物）の除去効果は、高密度での発酵の条件下でも効果的に維持されることを意味する。
【0082】
【表1】
【0083】
（２）コラーゲンの精製
バッファーＡ：２０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨは４．０である。
バッファーＢ：２０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨは４．０である。
発酵液を集め、２０００ｇ、３０ｍｉｎ、４℃で菌体と発酵上澄みを遠心分離した。Ａ２１５吸光度値と電導率値が変化しないまで陽イオン交換媒体（クロマトグラフィー充填剤は、利穗科技（蘇州）有限会社（Ｌｉｓｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ （Ｓｕｚｈｏｕ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）製のＧＣＣ－５０－４００クロマトグラフィーカラムにロードされた蘇州納米微技術株式会社（ＳＵＺＨＯＵ ＮＡＮＯＭＩＣＲＯ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．， ＬＴＤ．）製のＵｎｉＧｅｌ－８０ｓｐであり、ＧＥ ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅタンパク質の分離、クロマトグラフィー、精製システムを使用）をバッファーＡでバランスさせた後、４０ｕｓ／ｃｍの流速に設定してローディングし、サンプル量を０．５Ｌ／回とし、紫外線Ａ２１５の吸光度値が上昇したことを検出したら、サンプルの採取を開始した。ローディングが完了した後、サンプルの採取を停止し、陽イオンクロマトグラフィー媒体をバッファーＡでバランスさせ、Ａ２１５の吸光度値が低下したら、紫外線と電導率が最小値に低下するまで変化しなくなる。溶出液を集め、成分を個別に検出、定量した後、透析（透析液は超純水であり）を行った後、濃縮、凍結乾燥し、凍結乾燥コラーゲンスポンジを集めた。精製した凍結乾燥スポンジを超純水に溶解し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動を行い、図１０に示す。α１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６を一段階のイオン交換で精製した後、不純物タンパク質、小さな分解バンドなどの大部分が除去され、高純度の単一標的タンパク質を取得した（Ｉｍａｇｅ Ｌａｂソフトウェアを使用して算出し、α１（Ｉ）Ｍ１の純度は９０．１％であり、α１（ＩＩ）Ｍ６の純度は８８．３％である）。α１（Ｉ）、α１（ＩＩ）に同じ精製工程を行った後、主な分解バンドは依然として現れ、除去できず、主な分解生成物は、サイズ、性質が標的生成物と類似しているため、一段階で精製することによりこれらを分離することが難しく、出願番号２０１９１１１３５９５８．０と出願番号２０１９１１０８８０２５．０の特許の内容によれば、単一標的全長α１（Ｉ）鎖、全長α１（ＩＩ）鎖の生成物を得るには、全長α１（Ｉ）鎖、全長α１（ＩＩ）鎖のアミノ基末端にＳｒｔｅｐ－ＴａｇＩＩタグがあり、カルボキシ末端に６×Ｈｉｓタグがある性質によって、Ｎｉ－ＮＴＡ、Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎアフィニティークロマトグラフィー媒体を使用して二重親和性の精製することによってのみ達成でき、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、主な分解バンドの主な分解生成物は廃棄され、菌体の生合成資源が無駄になれ、精製工程が増加し、標的生成物の収量が低下した。
バッファーＡ：２０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨは４．０である。
バッファーＢ：２０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨは４．０である。
発酵液を集め、２０００ｇ、３０ｍｉｎ、４℃で菌体と発酵上澄みを遠心分離した。Ａ２１５吸光度値と電導率値が変化しないまで陽イオン交換媒体（クロマトグラフィー充填剤は、利穗科技（蘇州）有限会社（Ｌｉｓｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ （Ｓｕｚｈｏｕ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）製のＧＣＣ－５０－４００クロマトグラフィーカラムにロードされた蘇州納米微技術株式会社（ＳＵＺＨＯＵ ＮＡＮＯＭＩＣＲＯ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．， ＬＴＤ．）製のＵｎｉＧｅｌ－８０ｓｐであり、ＧＥ ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅタンパク質の分離、クロマトグラフィー、精製システムを使用）をバッファーＡでバランスさせた後、４０ｕｓ／ｃｍの流速に設定してローディングし、サンプル量を０．５Ｌ／回とし、紫外線Ａ２１５の吸光度値が上昇したことを検出したら、サンプルの採取を開始した。ローディングが完了した後、サンプルの採取を停止し、陽イオンクロマトグラフィー媒体をバッファーＡでバランスさせ、Ａ２１５の吸光度値が低下したら、紫外線と電導率が最小値に低下するまで変化しなくなる。溶出液を集め、成分を個別に検出、定量した後、透析（透析液は超純水であり）を行った後、濃縮、凍結乾燥し、凍結乾燥コラーゲンスポンジを集めた。精製した凍結乾燥スポンジを超純水に溶解し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動を行い、図１０に示す。α１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６を一段階のイオン交換で精製した後、不純物タンパク質、小さな分解バンドなどの大部分が除去され、高純度の単一標的タンパク質を取得した（Ｉｍａｇｅ Ｌａｂソフトウェアを使用して算出し、α１（Ｉ）Ｍ１の純度は９０．１％であり、α１（ＩＩ）Ｍ６の純度は８８．３％である）。α１（Ｉ）、α１（ＩＩ）に同じ精製工程を行った後、主な分解バンドは依然として現れ、除去できず、主な分解生成物は、サイズ、性質が標的生成物と類似しているため、一段階で精製することによりこれらを分離することが難しく、出願番号２０１９１１１３５９５８．０と出願番号２０１９１１０８８０２５．０の特許の内容によれば、単一標的全長α１（Ｉ）鎖、全長α１（ＩＩ）鎖の生成物を得るには、全長α１（Ｉ）鎖、全長α１（ＩＩ）鎖のアミノ基末端にＳｒｔｅｐ－ＴａｇＩＩタグがあり、カルボキシ末端に６×Ｈｉｓタグがある性質によって、Ｎｉ－ＮＴＡ、Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎアフィニティークロマトグラフィー媒体を使用して二重親和性の精製することによってのみ達成でき、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、主な分解バンドの主な分解生成物は廃棄され、菌体の生合成資源が無駄になれ、精製工程が増加し、標的生成物の収量が低下した。
【0084】
実施例５．組換えコラーゲンの検出
（１）フーリエ変換赤外スペクトル（ＦＴ－ＩＲ）の分析
試験では、α１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６、α１（Ｉ）、α１（ＩＩ）のコラーゲンの精製後凍結乾燥サンプルを微量取り、それぞれ臭化カリウム（ＫＢｒ）と混合し、粉末に研磨して打錠し、室温で４０００～４００ｃｍ－１の範囲をスキャンし（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＮｉｃｏｌｅｔＴＭ ｉＳＴＭ １０ ＦＴ－ＩＲ分光計）、方法及び結果の分析は、（Ｊｅｏｎｇ、Ｈ．Ｊ． Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ ａｎｄ Ｓ． Ｋｉｍ、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｆｒｏｍ ｍａｒｉｎｅ ｆｉｓｈ （Ｔｈｕｎｎｕｓ ｏｂｅｓｕｓ）． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２０１３． １８（６）： ｐ． １１８５－１１９１．）を参照する。
（１）フーリエ変換赤外スペクトル（ＦＴ－ＩＲ）の分析
試験では、α１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６、α１（Ｉ）、α１（ＩＩ）のコラーゲンの精製後凍結乾燥サンプルを微量取り、それぞれ臭化カリウム（ＫＢｒ）と混合し、粉末に研磨して打錠し、室温で４０００～４００ｃｍ－１の範囲をスキャンし（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＮｉｃｏｌｅｔＴＭ ｉＳＴＭ １０ ＦＴ－ＩＲ分光計）、方法及び結果の分析は、（Ｊｅｏｎｇ、Ｈ．Ｊ． Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ ａｎｄ Ｓ． Ｋｉｍ、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｆｒｏｍ ｍａｒｉｎｅ ｆｉｓｈ （Ｔｈｕｎｎｕｓ ｏｂｅｓｕｓ）． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２０１３． １８（６）： ｐ． １１８５－１１９１．）を参照する。
【0085】
α１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６、α１（Ｉ）、α１（ＩＩ）のタンパク質精製サンプルをスキャンして得られた赤外スペクトルは、図１１と図１２に示され、特徴的な吸収平均波数は、アミドＡ（３２９９ｃｍ－１程度）、アミドＢ（３０８１ｃｍ－１程度）、アミドＩ（１６５０ｃｍ－１程度）、アミドＩＩ（１５３０～１５５０ｃｍ－１程度）、アミドＩＩＩ（１２４０ｃｍ－１程度）である組換えコラーゲンの構造的特徴と一致していることが分かり、α１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６におけるアミノ酸の変異がコラーゲン自体の性質に影響を及ぼさないことを示している（文献［１］．陳静涛ら、組換えコラーゲンとウシＩ型コラーゲン赤外スペクトルに対する検討．材料導報、２００８（０３）：１１９～１２１頁．［２］．Ｄｏｙｌｅ、Ｂ．Ｂ．、Ｅ．Ｇ． Ｂｅｎｄｉｔ ａｎｄ Ｅ．Ｒ． Ｂｌｏｕｔ、Ｉｎｆｒａｒｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｎｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ‐ｌｉｋｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ． Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、１９７５． １４（５）： ｐ． ９３７－９５７．［３］．周愛梅ら、組換えヒトコラーゲンの分離精製及びその構造的特性．食品と発酵工業、２０１５（０３）：第４６～５２頁．を参照）。
【0086】
（２）組換えコラーゲンの細胞接着活性の検出
組換えコラーゲンの細胞接着活性の検出方法は、文献Ｊｕｍｉｎｇ Ｙａｏ、Ｓａｔｏｓｈｉ Ｙａｎａｇｉｓａｗａ、Ｔｅｔｓｕｏ Ａｓａｋｕｒａ． Ｄｅｓｉｇｎ、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｌｌａｇｅｎ－Ｌｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｖｅ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｏｌｌａｇｅｎｓ 、Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ．１３６、６４３－６４９（２００４）を参照する。常州大学薬学部の機能性ナノ材料及び生体医学試験研究室に委託されて完成された。
組換えコラーゲンの細胞接着活性の検出方法は、文献Ｊｕｍｉｎｇ Ｙａｏ、Ｓａｔｏｓｈｉ Ｙａｎａｇｉｓａｗａ、Ｔｅｔｓｕｏ Ａｓａｋｕｒａ． Ｄｅｓｉｇｎ、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｌｌａｇｅｎ－Ｌｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｖｅ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｏｌｌａｇｅｎｓ 、Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ．１３６、６４３－６４９（２００４）を参照する。常州大学薬学部の機能性ナノ材料及び生体医学試験研究室に委託されて完成された。
【0087】
具体的な実施方法は、正常培養ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（中国科学院細胞バンクから購入、製品番号はＧＮＭ６であり、培養、継代の方法は、細胞の明細書に従って行われる）。組換えα１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６、α１（Ｉ）、α１（ＩＩ）のコラーゲンの凍結乾燥スポンジ、コントロールのヒトコラーゲン（Ｓｉｇｍａから購入、製品番号はＣ７７７４である）、及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、生工生物（上海）株式会社から購入）を取って溶解し（超純水又は１ＭのＨＣｌ溶液）、ＵＶタンパク質定量の実験式Ｃ（ｍｇ／ｍＬ）＝０．１４４×（Ａ２１５－Ａ２２５）に従ってタンパク質の濃度を測定し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で０．５ｍｇ／ｍＬに希釈した。９６ウェル細胞培養プレートに様々なタンパク質溶液とブランクＰＢＳ溶液のコントロールを１００μＬ添加し、室温で６０分間放置し、各ウェルに良好に培養されたＮＩＨ／３Ｔ３細胞を１０５個加え、３７℃、５％ＣＯ２で６０分間インキュベートした。ＰＢＳでウェル内の細胞を４回洗浄した。ＬＤＨ検出キット（Ｒｏｃｈｅ、０４７４４９２６００１）を使用してＯＤ４９２ｎｍの吸光度値を検出した（具体的な操作は、明細書に従って行われる）。
【0088】
ＯＤ４９２ｎｍの吸光度に対応する特性は、コラーゲンサンプルの細胞接着活性を表すことができ、ＯＤ４９２ｎｍの吸光度が高いほど、タンパク質がより多くの細胞に接着し、接着活性が高いほど、細胞が壁に接着したり、細胞外マトリックスに短時間で接着するのを助け、より良好な細胞外環境の構築に寄与する。その結果は、図１３に示され、組換えα１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６、α１（Ｉ）、α１（ＩＩ）のコラーゲンは、いずれも市販の天然ヒトコラーゲンと類似の細胞接着活性を有し、いずれもコントロール群よりも高く、α１（Ｉ）Ｍ１はα１（Ｉ）と比較して、α１（ＩＩ）Ｍ６はα１（ＩＩ）と比較して、細胞接着活性が基本的に一致しており、有意差がない。
【0089】
（３）組換えコラーゲンヒドロゲルの調製と検出
組換えα１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６、α１（Ｉ）、α１（ＩＩ）のコラーゲンを取り、１０％の濃度で注射用水に溶解し、ｐＨを４～６の範囲に調整し、０．２２μｍの無菌フィルターでろ過滅菌し、コラーゲン乾燥粉末１ｇあたり０．１ｇの１０％（ｗ／ｗ）滅菌Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）溶液を添加して均一に混合してから、コラーゲン乾燥粉末１ｇあたり０．１３ｇの５０％（ｗ／ｗ）滅菌１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）溶液を添加し、室温（２０～３０℃）で放置して２～６時間反応させてヒドロゲルを生成した。ヒドロゲルを滅菌ＰＢＳ溶液（ＮａＣｌ ８．５ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４ ０．５ ｇ／Ｌ、ＮａＨ２ＰＯ４ ０．１５ ｇ／Ｌ、ｐＨ ７．２）にて、ゲル：ＰＢＳ透析液＝１：６（ｍ／ｍ）で１２０時間連続透析し、２４時間毎に透析液を完全に交換し、ＮＨＳ、ＥＤＣの残留物が除去された。透析したヒドロゲルを滅菌容器に入れ、室温で放置した。
組換えα１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６、α１（Ｉ）、α１（ＩＩ）のコラーゲンを取り、１０％の濃度で注射用水に溶解し、ｐＨを４～６の範囲に調整し、０．２２μｍの無菌フィルターでろ過滅菌し、コラーゲン乾燥粉末１ｇあたり０．１ｇの１０％（ｗ／ｗ）滅菌Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）溶液を添加して均一に混合してから、コラーゲン乾燥粉末１ｇあたり０．１３ｇの５０％（ｗ／ｗ）滅菌１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）溶液を添加し、室温（２０～３０℃）で放置して２～６時間反応させてヒドロゲルを生成した。ヒドロゲルを滅菌ＰＢＳ溶液（ＮａＣｌ ８．５ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４ ０．５ ｇ／Ｌ、ＮａＨ２ＰＯ４ ０．１５ ｇ／Ｌ、ｐＨ ７．２）にて、ゲル：ＰＢＳ透析液＝１：６（ｍ／ｍ）で１２０時間連続透析し、２４時間毎に透析液を完全に交換し、ＮＨＳ、ＥＤＣの残留物が除去された。透析したヒドロゲルを滅菌容器に入れ、室温で放置した。
【0090】
ヒドロゲルを凍結乾燥させて水分を除去し、凍結乾燥したヒドロゲルを量り、再び滅菌ＰＢＳ溶液に２４時間放置し、完全に水を吸収して膨潤した後、ヒドロゲルを取り出し、吸収紙で表面の水分を吸い取って重量を量る。文献における方法に従って、膨潤率：Ｑ膨潤率＝（Ｗ吸水膨潤質量－Ｗ乾燥ゲル重量）／Ｗ乾燥ゲル重量を計算した。レオメーター（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＨＲ－２）を使用してヒドロゲルの弾性率（貯蔵弾性率、小振幅周波数スキャン、２５℃、応力０．５％、０．１～１００．０ｒａｄ／ｓ）、動粘度（フローピークに保ち、２５℃、せん断速度２．０ｓ－１）を検出した。凍結乾燥ヒドロゲルを液体窒素にて急速に凍結させて割り、走査型電子顕微鏡（日立のＴＭ３０３０ＰＬＵＳ）を使用して凍結乾燥ヒドロゲルの表面をスキャンした。弾性率、動粘度、膨潤率の結果は、表２に示され、α１（Ｉ）Ｍ１はα１（Ｉ）と比較して、α１（ＩＩ）Ｍ６はα１（ＩＩ）と比較して、同じ条件下で調製されたヒドロゲルの流体力学的特性が基本的に同じであり、大きくは変化していない。
【0091】
【表2】
【0092】
図１４、１５に示されるように、α１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６で調製されたヒドロゲルは、α１（Ｉ）、α１（ＩＩ）で調製されたヒドロゲルと同じように、いずれも多孔質ネットワーク構造であり、孔径範囲が１００～２００μｍに集まり、透過性がよく、大量の水を維持するための空間構造基盤を有しており、細胞に接着、支持、成長・遊走するための空間又は栄養物質や代謝産物を輸送するチャネルとして生体医学材料分野に利用される可能性がある。
【0093】
（４）組換えコラーゲンヒドロゲルの細胞の検出
無菌的に保存されたヒドロゲルを２４ウェル細胞培養プレートに置いた。正常培養ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（中国科学院細胞バンクから購入、製品番号ＧＮＭ６、培養、継代の方法は、細胞の明細書に従って行われ）を取り、ＰＢＳで洗浄し、トリプシンで消化し、培地を加え、均一にピペッティングしてカウントし、１０５個細胞／ウェルでヒドロゲルを含む細胞培養プレートに接種し、２４～７２時間共培養し、ヒドロゲル上の細胞の接着と増値の状況を観察した。
無菌的に保存されたヒドロゲルを２４ウェル細胞培養プレートに置いた。正常培養ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（中国科学院細胞バンクから購入、製品番号ＧＮＭ６、培養、継代の方法は、細胞の明細書に従って行われ）を取り、ＰＢＳで洗浄し、トリプシンで消化し、培地を加え、均一にピペッティングしてカウントし、１０５個細胞／ウェルでヒドロゲルを含む細胞培養プレートに接種し、２４～７２時間共培養し、ヒドロゲル上の細胞の接着と増値の状況を観察した。
【0094】
（１）２４ウェルプレートを取り、ＤＭＳＯで１ｍＭのカルセインＡＭ（碧云天生物技術研究所（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）から購入）を調製し、Ｄ－ＰＢＳで５０μＭのカルセイン作業液に希釈した。ウェル中の培地を吸引し、ＰＢＳで複数回洗浄し、１ｍＬの血清含有ＤＭＥＭ培地を添加し、１００μＬのカルセインＡＭ溶液（培地の１／１０）を添加し、３０分間インキュベートし、細胞を染色して成長培地を交換し、３０分間培養し、ヒドロゲルを軽く取り出し、新しい培養ウェルに置き、蛍光顕微鏡で写真を撮った（最大励起光波長は４９４ｎｍであり、最大発光波長は５１４ｎｍである）。
【0095】
（２）別の２４ウェルプレートを取り、２００μＬのＭＴＴ溶液（碧云天生物技術研究所から購入）を添加し、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を４時間培養した後、細胞に青紫色の結晶の形成状況を観察し、培地を捨て、ＰＢＳでヒドロゲルを洗浄し、ヒドロゲルを縦に切り、新しい培養ウェルに置き、顕微鏡で写真を撮った。
【0096】
この実施例における実験は、常州大学薬学部の機能ナノ材料と生体医学試験研究室に依頼されて完成された。
その結果は、図１６、１７に示され、α１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６で調製されたヒドロゲルは、α１（Ｉ）、α１（ＩＩ）で調製されたヒドロゲルと同じように、明視野顕微鏡で観察した場合、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の形態は、正常で、典型的な線維芽細胞の形態であり、ヒドロゲルに接着、成長したＮＩＨ／３Ｔ３細胞をカルセインＡＭで染色すると、緑色の蛍光を検出し（写真中の明るい部分）、ヒドロゲルに成長したＮＩＨ／３Ｔ３細胞は、ＭＴＴを添加すると、青紫色の結晶を形成し（写真中の黒い部分）、緑色の蛍光と青紫色の結晶は、生細胞によってのみ形成され、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞がヒドロゲル内で正常に接着、成長、遊走できることを示しており、α１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６で調製されたヒドロゲルは、天然配列のα１（Ｉ）、α１（ＩＩ）で調製されたヒドロゲルと類似の生物学的機能を有し、新規の生物医療機器として創傷修復、組織再生などの分野に適用され得る。
その結果は、図１６、１７に示され、α１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６で調製されたヒドロゲルは、α１（Ｉ）、α１（ＩＩ）で調製されたヒドロゲルと同じように、明視野顕微鏡で観察した場合、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の形態は、正常で、典型的な線維芽細胞の形態であり、ヒドロゲルに接着、成長したＮＩＨ／３Ｔ３細胞をカルセインＡＭで染色すると、緑色の蛍光を検出し（写真中の明るい部分）、ヒドロゲルに成長したＮＩＨ／３Ｔ３細胞は、ＭＴＴを添加すると、青紫色の結晶を形成し（写真中の黒い部分）、緑色の蛍光と青紫色の結晶は、生細胞によってのみ形成され、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞がヒドロゲル内で正常に接着、成長、遊走できることを示しており、α１（Ｉ）Ｍ１、α１（ＩＩ）Ｍ６で調製されたヒドロゲルは、天然配列のα１（Ｉ）、α１（ＩＩ）で調製されたヒドロゲルと類似の生物学的機能を有し、新規の生物医療機器として創傷修復、組織再生などの分野に適用され得る。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【配列表】