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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-06-10
(45)【発行日】2025-06-18
(54)【発明の名称】タンパク質結晶の製造方法及び結晶構造解析方法
(51)【国際特許分類】
G01N 23/20 20180101AFI20250611BHJP
C07K 14/01 20060101ALN20250611BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20250611BHJP
C12N 1/21 20060101ALN20250611BHJP
C12N 15/35 20060101ALN20250611BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20250611BHJP
C12P 21/02 20060101ALN20250611BHJP
【ＦＩ】
G01N23/20 ZNA
C07K14/01
C07K19/00
C12N1/21
C12N15/35
C12N15/62 Z
C12P21/02 C
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2022501101
(86)(22)【出願日】2021-02-22
(86)【国際出願番号】 JP2021006607
(87)【国際公開番号】W WO2021167104
(87)【国際公開日】2021-08-26
【審査請求日】2023-12-19
(31)【優先権主張番号】P 2020027386
(32)【優先日】2020-02-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和２年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、研究成果展開事業、「研究成果最適展開支援プログラム 産学共同（育成型）」「精製なし無細胞タンパク質結晶化による迅速構造解析」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】304021417
【氏名又は名称】国立大学法人東京科学大学
(74)【代理人】
【識別番号】100165179
【弁理士】
【氏名又は名称】田▲崎▼ 聡
(74)【代理人】
【識別番号】100188558
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100175824
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100152272
【弁理士】
【氏名又は名称】川越 雄一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100181722
【弁理士】
【氏名又は名称】春田 洋孝
(72)【発明者】
【氏名】上野 隆史
(72)【発明者】
【氏名】安部 聡
(72)【発明者】
【氏名】小島 摩利子
【審査官】長谷川 強
(56)【参考文献】
【文献】SCHONHERR, R. et al.，Protein crystallization in living cells，Biol. Chem.，2018年，Vol.399, No.7，pp.751-772
【文献】DUSZENKO, M. et al.，In vivo protein crystallization in combination with highly brilliant radiation sources offers novel，Acta Crystallogr. F，2015年，Vol.71，pp.929-937
【文献】ECHEVERRY, F. et al.，Sequence analysis and expression of the polyhedrin gene of Choristoneura fumiferana cytoplasmic poly，Gene，1997年，Vol.198，pp.399-406
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ２３／２０
Ｃ０７Ｋ １４／０１
Ｃ０７Ｋ １９／００
Ｃ１２Ｎ １／２１
Ｃ１２Ｎ １５／３５
Ｃ１２Ｎ １５／６２
Ｃ１２Ｐ ２１／０２
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
結晶性タンパク質の発現コンストラクトが導入された大腸菌で前記結晶性タンパク質を発現誘導し、前記大腸菌の内部に前記結晶性タンパク質の結晶が形成されるまでの所定時間、前記大腸菌をインキュベートし、その結果、前記結晶が製造される工程と、前記結晶を、前記大腸菌ごとＸ線結晶構造解析し、分解能Åレベルで結晶構造を決定する工程と、
を含み、
前記結晶性タンパク質が、下記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかに記載のタンパク質である、結晶構造解析方法。
（ｉ）細胞質多角体タンパク質、核多角体タンパク質、Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（ＣｉｐＡ）、又は、Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ（ＣｉｐＢ）
（ｉｉ）前記（ｉ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１～５０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ結晶形成能を有するタンパク質
（ｉｉｉ）前記（ｉ）又は（ｉｉ）のタンパク質と５～５０アミノ酸の標的ペプチドとの融合タンパク質
【請求項2】
前記結晶性タンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列の第６６番目及び第６７番目のアミノ酸の間、又は、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ結晶形成能を有するタンパク質の、配列番号１に記載のアミノ酸配列の第６６番目に対応するアミノ酸及び第６７番目に対応するアミノ酸の間に、５～５０アミノ酸の標的ペプチドが挿入された、融合タンパク質である、請求項１に記載の結晶構造解析方法。
【請求項3】
前記所定時間が３～３０時間である、請求項１又は２に記載の結晶構造解析方法。
【請求項4】
前記インキュベートする工程を１８～４０℃で行う、請求項１～３のいずれか一項に記載の結晶構造解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、タンパク質結晶の製造方法及び結晶構造解析方法に関する。本願は、２０２０年２月２０日に、日本に出願された特願２０２０－０２７３８６号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【0002】
タンパク質の構造解析は、タンパク質の立体構造の決定、構造・機能相関の研究に重要である。タンパク質の構造解析を行うためには、良質なタンパク質結晶を作製することが必要である。タンパク質結晶の質が、タンパク質結晶構造解析の精度と信頼度に多大な影響を与える。このため、タンパク質の結晶化がタンパク質の構造解析の最大の律速段階となっている。
【0003】
タンパク質の結晶化には、タンパク質の濃度、純度、緩衝溶液の種類、ｐＨ、沈澱剤の種類と濃度、温度、有機溶媒、金属イオン、界面活性剤の種類と濃度等の多くの因子が関係する。このため、良質なタンパク質結晶を作製し、結晶構造解析を行うためには、多くの条件を検討する必要があり、多大な労力を必要とする（例えば、非特許文献１を参照。）。
【0004】
ところで、タンパク質分子の表面には、様々な機能性官能基をもつアミノ酸側鎖が存在し、特異な化学的特性を有している。そして、複数のタンパク質分子が規則正しく配列することにより、籠（ケージ）状の３次元構造（タンパク質ケージ）を形成する場合がある。
【0005】
例えば、多角体病ウイルスは、カイコ等の昆虫の細胞に感染するウイルスである。多角体病ウイルスは、感染後期に感染細胞内に多角体と呼ばれる封入体を全細胞タンパクの約半分に達するほど大量に作り、その中に多数のウイルス粒子を封入する。多角体タンパク質であるポリヘドリンは、上述したタンパク質ケージを形成するタンパク質の例である。
【0006】
タンパク質ケージを形成するタンパク質としては、ポリヘドリンタンパク質の他にも、ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｓｔａｒｖｅｄ ｃｅｌｌｓ（ＤＰＳ）、ＲＮＡを内包するウイルスのキャプシド等が知られている。これらのタンパク質から形成されたタンパク質ケージは、規則正しく配列して結晶を形成する場合がある。
【0007】
例えば、特許文献１には、少なくとも一部のアミノ酸配列を欠失した改変ポリヘドリンが多角体形成能を有することが記載されている。更に、この改変ポリヘドリンタンパク質から形成された多角体を用いて結晶構造解析を行うことができたことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【文献】特開２０１８－０３３４０４号公報
【非特許文献】
【0009】
【文献】芦田 玉一、Ｘ線構造解析を始めよう（９）タンパク質結晶構造解析入門、日本結晶学会誌、38, 378-388, 1996.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明は、タンパク質の結晶を簡便に作製する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明は以下の態様を含む。
［１］結晶性タンパク質の発現コンストラクトが導入された大腸菌で前記結晶性タンパク質を発現誘導し、前記大腸菌の内部に前記結晶性タンパク質の結晶が形成されるまでの所定時間、前記大腸菌をインキュベートする工程を含む、前記結晶の製造方法。
［２］前記大腸菌が非結晶性タンパク質の発現コンストラクトを更に導入されたものであり、前記インキュベートする工程において、前記結晶性タンパク質と共に前記非結晶性タンパク質を発現誘導し、前記大腸菌の内部に形成される前記結晶が、前記結晶性タンパク質及び前記非結晶性タンパク質の共結晶である、［１］に記載の製造方法。
［３］前記結晶性タンパク質が、下記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかに記載のタンパク質である、［１］又は［２］に記載の製造方法。
（ｉ）細胞質多角体タンパク質、核多角体タンパク質、カテプシンＢ、フェリチン、ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｓｔａｒｖｅｄ ｃｅｌｌｓ（ＤＰＳ）、ルシフェラーゼ、ｒｅｏｖｉｒｕｓ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（μＮＳ）、フソリンタンパク質（Ｆｕｓｏｌｉｎ）、Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（ＣｉｐＡ）、又は、Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ（ＣｉｐＢ）
（ｉｉ）前記（ｉ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ結晶形成能を有するタンパク質
（ｉｉｉ）前記（ｉ）又は（ｉｉ）のタンパク質と標的ペプチドとの融合タンパク質
［４］前記結晶性タンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列の第６６番目及び第６７番目のアミノ酸の間、又は、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ結晶形成能を有するタンパク質の、配列番号１に記載のアミノ酸配列の第６６番目に対応するアミノ酸及び第６７番目に対応するアミノ酸の間に、標的ペプチドが挿入された、融合タンパク質である、［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］前記所定時間が３～３０時間である、［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］前記インキュベートする工程を１８～４０℃で行う、［１］～［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］［１］～［６］のいずれかに記載の製造方法により製造された結晶を、前記大腸菌ごとＸ線結晶構造解析する工程を含む、結晶構造解析方法。
［１］結晶性タンパク質の発現コンストラクトが導入された大腸菌で前記結晶性タンパク質を発現誘導し、前記大腸菌の内部に前記結晶性タンパク質の結晶が形成されるまでの所定時間、前記大腸菌をインキュベートする工程を含む、前記結晶の製造方法。
［２］前記大腸菌が非結晶性タンパク質の発現コンストラクトを更に導入されたものであり、前記インキュベートする工程において、前記結晶性タンパク質と共に前記非結晶性タンパク質を発現誘導し、前記大腸菌の内部に形成される前記結晶が、前記結晶性タンパク質及び前記非結晶性タンパク質の共結晶である、［１］に記載の製造方法。
［３］前記結晶性タンパク質が、下記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかに記載のタンパク質である、［１］又は［２］に記載の製造方法。
（ｉ）細胞質多角体タンパク質、核多角体タンパク質、カテプシンＢ、フェリチン、ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｓｔａｒｖｅｄ ｃｅｌｌｓ（ＤＰＳ）、ルシフェラーゼ、ｒｅｏｖｉｒｕｓ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（μＮＳ）、フソリンタンパク質（Ｆｕｓｏｌｉｎ）、Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（ＣｉｐＡ）、又は、Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ（ＣｉｐＢ）
（ｉｉ）前記（ｉ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ結晶形成能を有するタンパク質
（ｉｉｉ）前記（ｉ）又は（ｉｉ）のタンパク質と標的ペプチドとの融合タンパク質
［４］前記結晶性タンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列の第６６番目及び第６７番目のアミノ酸の間、又は、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ結晶形成能を有するタンパク質の、配列番号１に記載のアミノ酸配列の第６６番目に対応するアミノ酸及び第６７番目に対応するアミノ酸の間に、標的ペプチドが挿入された、融合タンパク質である、［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］前記所定時間が３～３０時間である、［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］前記インキュベートする工程を１８～４０℃で行う、［１］～［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］［１］～［６］のいずれかに記載の製造方法により製造された結晶を、前記大腸菌ごとＸ線結晶構造解析する工程を含む、結晶構造解析方法。
【発明の効果】
【0012】
本発明によれば、タンパク質の結晶を簡便に作製する技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】（ａ）及び（ｂ）は、実験例１において、ＣＰＶ由来のポリヘドリンの結晶（多角体）を菌体内部で形成させた大腸菌の光学顕微鏡写真である。（ｃ）及び（ｄ）は、実験例１において、ＮＰＶ由来のポリヘドリンの結晶を菌体内部で形成させた大腸菌の光学顕微鏡写真である。
【図2】（ａ）は、実験例１において、ＣＰＶ由来のポリヘドリンの結晶を走査型電子顕微鏡で観察した結果を示す写真である。（ｂ）は、実験例１において、ＮＰＶ由来のポリヘドリンの結晶を走査型電子顕微鏡で観察した結果を示す写真である。
【図3】実験例１におけるＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）の結果を示す写真である。
【図4】（ａ）及び（ｂ）は、実験例１におけるＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ解析の結果を示すグラフである。
【図5】（ａ）～（ｃ）は、実験例２において、ポリヘドリン変異体の結晶を走査型電子顕微鏡で観察した結果を示す写真である。
【図6】（ａ）～（ｃ）は、実験例２におけるＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ解析の結果を示すグラフである。
【図7】（ａ）～（ｆ）は、実験例３において、ポリヘドリンの結晶を走査型電子顕微鏡で観察した結果を示す写真である。
【図8】実験例４において、ＣＰＶ由来のポリヘドリンの結晶を、大腸菌のまま構造解析した結果を示す図である。
【図9】（ａ）は、実験例４において、大腸菌で作製したポリヘドリンの結晶の立体構造と、昆虫細胞で作製したポリヘドリンの結晶の立体構造を重ねた図である。（ｂ）及び（ｃ）は、大腸菌で作製したポリヘドリンの結晶の立体構造解析の結果を示す画像である。
【図10】（ａ）及び（ｂ）は、実験例５において撮影した共焦点蛍光顕微鏡写真である。
【図11】（ａ）上は、実験例６において、ポリヘドリン変異体の結晶を走査型電子顕微鏡で観察した結果を示す写真であり、下は、ポリヘドリン変異体の結晶を構造解析した結果を示す図である。（ｂ）上は、実験例６において、ポリヘドリン変異体の結晶を走査型電子顕微鏡で観察した結果を示す写真であり、下は、ポリヘドリン変異体の結晶を構造解析した結果を示す図である。
【図12】（ａ）は、実験例７において、ＣｉｐＡの結晶を菌体内部で形成させた大腸菌の光学顕微鏡写真である。（ｂ）は、実験例７において、ＣｉｐＡの結晶を走査型電子顕微鏡で観察した結果を示す写真である。
【図13】（ａ）左及び（ｂ）左は、実験例７において、融合タンパク質の結晶を菌体内部で形成させた大腸菌の光学顕微鏡写真である。（ａ）右及び（ｂ）右は、実験例７において、融合タンパク質の結晶を走査型電子顕微鏡で観察した結果を示す写真である。（ｃ）は、実験例７において、回収した融合タンパク質の結晶をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ解析した結果を示すグラフである。
【図14】（ａ）は、実験例９において、大腸菌体内部で融合タンパク質の結晶を形成させ、回収した結晶の光学顕微鏡写真と、ＧＦＰの蛍光を観察した写真をマージした画像である。（ｂ）は、実験例９において、融合タンパク質の結晶を走査型電子顕微鏡で観察した結果を示す写真である。（ｃ）は、実験例９において、回収した融合タンパク質の結晶をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ解析した結果を示すグラフである。
【図15】（ａ）はＣＲＢＮタンパク質のサリドマイド結合ドメインの立体構造を示す図である。（ｂ）上及び（ｃ）上は、実験例１０において、大腸菌内で合成し、回収した融合タンパク質の結晶の光学顕微鏡写真である。（ｂ）下及び（ｃ）下は、実験例１０において、融合タンパク質の結晶を走査型電子顕微鏡で観察した結果を示す写真である。
【図16】（ａ）及び（ｃ）は、実験例１１において、細胞質多角体タンパク質の断片の結晶を走査型電子顕微鏡で観察した結果を示す写真である。（ｂ）及び（ｄ）は、実験例１１において、回収した細胞質多角体タンパク質の断片の結晶をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ解析した結果を示すグラフである。
【図17】（ａ）及び（ｃ）は、実験例１１において、細胞質多角体タンパク質の断片の結晶を走査型電子顕微鏡で観察した結果を示す写真である。（ｂ）及び（ｄ）は、実験例１１において、回収した細胞質多角体タンパク質の断片の結晶をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ解析した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0014】
［タンパク質結晶の製造方法］
１実施形態において、本発明は、結晶性タンパク質の発現コンストラクトが導入された大腸菌で前記結晶性タンパク質を発現誘導し、前記大腸菌の内部に前記結晶性タンパク質の結晶が形成されるまでの所定時間、前記大腸菌をインキュベートする工程を含む、前記結晶の製造方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、結晶性タンパク質の発現コンストラクトが導入された大腸菌で前記結晶性タンパク質を発現誘導し、前記大腸菌の内部に前記結晶性タンパク質の結晶が形成されるまでの所定時間、前記大腸菌をインキュベートする工程を含む、前記結晶の製造方法を提供する。
【0015】
結晶性タンパク質としては、大腸菌内で結晶を形成するタンパク質であれば特に限定されない。本来結晶を形成しない非結晶性タンパク質であっても、タンパク質の化学修飾や変異体作成、融合タンパク質などの手法により、大腸菌内で結晶を形成可能となった場合、当該タンパク質も本明細書における結晶性タンパク質に含まれる。
【0016】
より限定的な結晶性タンパク質としては、下記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかに記載のタンパク質が挙げられる。
（ｉ）細胞質多角体タンパク質、核多角体タンパク質、カテプシンＢ、フェリチン、ＤＰＳ、ルシフェラーゼ、μＮＳ、Ｆｕｓｏｌｉｎ、ＣｉｐＡ又はＣｉｐＢ、
（ｉｉ）前記（ｉ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ結晶形成能を有するタンパク質
（ｉｉｉ）前記（ｉ）又は（ｉｉ）のタンパク質と標的ペプチドとの融合タンパク質
（ｉ）細胞質多角体タンパク質、核多角体タンパク質、カテプシンＢ、フェリチン、ＤＰＳ、ルシフェラーゼ、μＮＳ、Ｆｕｓｏｌｉｎ、ＣｉｐＡ又はＣｉｐＢ、
（ｉｉ）前記（ｉ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ結晶形成能を有するタンパク質
（ｉｉｉ）前記（ｉ）又は（ｉｉ）のタンパク質と標的ペプチドとの融合タンパク質
【0017】
核多角体タンパク質とは、核多角体病の病原ウイルスである核多角体病ウイルス（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ、ＮＰＶ）由来のポリヘドリンタンパク質である。また、細胞質多角体タンパク質とは、細胞質多角体病の病原ウイルスである細胞質多角体病ウイルス（Ｃｙｐｏｖｉｒｕｓ、ＣＰＶ）由来のポリヘドリンタンパク質である。配列番号２に細胞質多角体タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【0018】
カテプシンＢは、エンドペプチダーゼ活性とエキソペプチダーゼ活性を有するプロテアーゼである。カテプシンＢは、昆虫培養細胞内で結晶を形成するタンパク質である。配列番号４にブルーストリパノソーマ由来カテプシンＢのアミノ酸配列を示す。
【0019】
フェリチンは、藻類、細菌、植物、ヒト、非ヒト動物を含むほぼ全ての生物が合成するタンパク質である。フェリチンは２４量体からなるケージを形成し、鉄イオンを内包することにより、生体内鉄貯蔵を担う。外径は約１２ｎｍである。
【0020】
フェリチンとしては特に限定されず、ウマ由来フェリチン、ヒト由来フェリチン等が挙げられる。配列番号５にウマ由来フェリチンＬ鎖のアミノ酸配列を示し、配列番号６にヒト由来フェリチンＬ鎖のアミノ酸配列を示す。
【0021】
ＤＰＳは、多くのバクテリアが合成する、フェリチンスーパーファミリーに属するタンパク質である。ＤＰＳは１２量体からなるケージを形成し、染色体ＤＮＡを内包することにより、染色体ＤＮＡを酸化ストレス等から守る。外径は約９ｎｍである。配列番号７に大腸菌由来ＤＰＳのアミノ酸配列を示す。
【0022】
ルシフェラーゼは発光バクテリアやホタルなどの生物発光において、発光物質が光を放つ化学反応を触媒する作用を持つ酵素の総称である。ルシフェラーゼは、昆虫細胞内で結晶を形成するタンパク質である。配列番号８にホタル由来ルシフェラーゼのアミノ酸配列を示し、配列番号９にウミシイタケ由来ルシフェラーゼのアミノ酸配列を示す。
【0023】
μＮＳは、結晶性を有するレオウイルスの非構造タンパク質である。配列番号１０にレオウイルス由来μＮＳのアミノ酸配列を示す。
【0024】
Ｆｕｓｏｌｉｎは、昆虫ポックスウイルスが宿主細胞内に形成する、結晶性タンパク質封入体の構成タンパク質である。配列番号１１に昆虫ポックスウイルス由来Ｆｕｓｏｌｉｎのアミノ酸配列を示す。
【0025】
ＣｉｐＡ及びＣｉｐＢは、昆虫病原性細菌のＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓが細胞質内に形成する結晶性タンパク質封入体の構成タンパク質である。配列番号１６にＣｉｐＡのアミノ酸配列を示し、配列番号１７にＣｉｐＢのアミノ酸配列を示す。
【0026】
結晶性タンパク質は、結晶形成能を有する限り、上述した、細胞質多角体タンパク質、核多角体タンパク質、カテプシンＢ、フェリチン、ＤＰＳ、ルシフェラーゼ、μＮＳ、Ｆｕｓｏｌｉｎ、ＣｉｐＡ、ＣｉｐＢ等に対して変異を有する変異体であってもよい。より具体的には、結晶性タンパク質は、例えば、上述した配列番号２～１１、１６、１７に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。
【0027】
ここで、１又は複数個とは、例えば１～５０個であってもよいし、例えば１～４０個であってもよいし、例えば１～３０個であってもよいし、例えば１～２０個であってもよいし、例えば１～１０個であってもよいし、例えば１～５個であってもよいし、例えば１～３個であってもよい。実施例において後述するように、発明者らは、ポリヘドリンタンパク質の３８アミノ酸を欠失させても結晶形成能を有することを確認している。
【0028】
また、結晶性タンパク質は、結晶形成能を有する限り、上述した、タンパク質と標的ペプチドとの融合タンパク質であってもよい。すなわち、結晶性タンパク質は、上述した、細胞質多角体タンパク質、核多角体タンパク質、カテプシンＢ、フェリチン、ＤＰＳ、ルシフェラーゼ、μＮＳ、Ｆｕｓｏｌｉｎ、ＣｉｐＡ、ＣｉｐＢ又はこれらの結晶性タンパク質の変異体と、標的ペプチドとの融合タンパク質であってもよい。
【0029】
ここで、標的ペプチドとは、例えば、立体構造を解析する対象であるペプチドであってもよい。後述するように、上述した結晶性タンパク質と標的ペプチドとの融合タンパク質である結晶性タンパク質を、大腸菌で発現させて結晶を形成し、前記結晶性タンパク質の結晶を前記大腸菌ごとＸ線結晶構造解析することにより、標的ペプチドの立体構造を簡便に解析することができる。
【0030】
この場合、標的ペプチドは、立体構造を解析する需要のある任意のペプチドであってよい。標的ペプチドのアミノ酸の長さは、結晶性タンパク質が、結晶形成能を維持することができる観点から、例えば５～５０アミノ酸程度であることが好ましい。
【0031】
結晶性タンパク質の変異体と、標的ペプチドとの融合タンパク質において、結晶性タンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列であり、配列番号１に記載のアミノ酸配列の第６６番目及び第６７番目のアミノ酸の間に、標的ペプチドが挿入された、融合タンパク質であってもよい。
【0032】
あるいは、結晶性タンパク質の変異体と、標的ペプチドとの融合タンパク質において、結晶性タンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列の変異タンパク質であってもよい。より具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列の変異タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ結晶形成能を有するタンパク質であってもよい。ここで、１又は複数個については上述したものと同様である。
【0033】
そして、融合タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の変異タンパク質において、配列番号１に記載のアミノ酸配列の第６６番目に対応するアミノ酸及び第６７番目に対応するアミノ酸の間に、標的ペプチドが挿入された、融合タンパク質であってもよい。
【0034】
配列番号１に記載のアミノ酸配列の第６６番目に対応するアミノ酸及び第６７番目に対応するアミノ酸は、例えば、ＣｌａｓｔａｌＷ等のソフトウエアを用いて配列番号１に記載のアミノ酸配列と変異タンパク質のアミノ酸配列をアラインメントすることにより特定することができる。
【0035】
本実施形態の製造方法において、前記大腸菌が非結晶性タンパク質の発現コンストラクトを更に導入されたものであり、前記インキュベートする工程において、前記結晶性タンパク質と共に前記非結晶性タンパク質を発現誘導し、前記大腸菌の内部に形成される前記結晶が、前記結晶性タンパク質及び前記非結晶性タンパク質の共結晶であってもよい。
【0036】
本明細書において、非結晶性タンパク質とは、通常、大腸菌内で結晶を形成しないタンパク質を意味する。非結晶性タンパク質としては、分子量が１，０００～１００，０００程度のタンパク質であれば特に制限なく用いることができる。
【0037】
例えば、非結晶性タンパク質として、膜タンパク質等の不安定なタンパク質を用いて共結晶を製造してもよい。これにより、膜タンパク質等の不安定なタンパク質を共結晶として容易に精製することができる。また、膜タンパク質等の不安定なタンパク質を共結晶の形態で安定的に保存することができる。
【0038】
非結晶性タンパク質は１種を単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。また、非結晶性タンパク質を２種以上用いる場合、それらの非結晶性タンパク質は複合体を形成してもよい。
【0039】
また、非結晶性タンパク質は、結晶性タンパク質の一部との融合タンパク質であってもよい。これにより、非結晶性タンパク質が、結晶性タンパク質の結晶に取り込まれやすくなり、共結晶が形成されやすくなる傾向にある。
【0040】
上述した結晶性タンパク質及び非結晶性タンパク質の大腸菌での発現方法は、特に限定されず、通常行われる方法で発現させればよい。例えば、結晶性タンパク質又は非結晶性タンパク質の発現コンストラクトが導入された大腸菌を培地中でインキュベートすることにより、結晶性タンパク質又は非結晶性タンパク質を発現誘導してもよい。
【0041】
大腸菌への発現コンストラクトの導入は、例えば、結晶性タンパク質又は非結晶性タンパク質の発現ベクターをプラスミド等の形態で大腸菌に導入することにより行ってもよいし、大腸菌のゲノム中に結晶性タンパク質又は非結晶性タンパク質の発現コンストラクトを挿入することにより行ってもよい。
【0042】
また、結晶性タンパク質又は非結晶性タンパク質の発現誘導は、結晶性タンパク質又は非結晶性タンパク質の発現コンストラクトの特性に応じた適宜の方法により行うことができる。例えば、ラクトースオペロンを利用した発現制御システムを利用し、培地中にイソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することで結晶性タンパク質又は非結晶性タンパク質の発現誘導を行ってもよい。
【0043】
あるいは、Ｔｅｔ－ｏｎ／Ｔｅｔ－ｏｆｆシステムによる発現制御システムを利用し、培地中にテトラサイクリン又はその誘導体を添加すること、あるいは培地からテトラサイクリン又はその誘導体を除去することにより結晶性タンパク質又は非結晶性タンパク質の発現誘導を行ってもよい。
【0044】
あるいは、発現誘導制御を行わず、大腸菌の培養開始と共に結晶性タンパク質又は非結晶性タンパク質の発現が開始される態様であってもよい。
【0045】
本実施形態の製造方法では、結晶性タンパク質又は非結晶性タンパク質の発現コンストラクトが導入された大腸菌で結晶性タンパク質又は非結晶性タンパク質を発現誘導する。発現誘導は、例えば、大腸菌のＯＤ６００が０．６～０．８に達した後に行うことが好ましい。
【0046】
大腸菌の培養は、約１０ｍＬ程度の少量の培地で行ってもよい。実施例において後述するように、発明者らは、このような少量の培地であっても、タンパク質の結晶を大量に作製することができ、大腸菌ごとＸ線結晶構造解析することにより、タンパク質の構造解析を行うことができることを明らかにした。
【0047】
続いて、結晶性タンパク質又は非結晶性タンパク質を発現誘導した後、大腸菌の内部に結晶性タンパク質の結晶、又は、結晶性タンパク質及び非結晶性タンパク質の共結晶が形成されるまでの所定時間、大腸菌をインキュベートする。ここで、所定時間は、３～３０時間であってもよく、例えば３～２４時間であってもよい。実施例において後述するように、発明者らは、わずか２０～２４時間インキュベートして結晶を形成させた後に、大腸菌ごとＸ線結晶構造解析することにより、タンパク質の構造解析を行うことができることを明らかにした。
【0048】
また、結晶性タンパク質の結晶、又は、結晶性タンパク質及び非結晶性タンパク質の共結晶が形成されるまでインキュベートするときの温度は１８～４０℃であってもよく、２５～３８℃であってもよく、約３０℃であってもよい。結晶性タンパク質、又は、結晶性タンパク質及び非結晶性タンパク質の共結晶の結晶が形成されるまでインキュベートするときの温度が上記範囲であると、形成されるタンパク質結晶の質が向上する傾向にある。
【0049】
［結晶構造解析方法］
１実施形態において、本発明は、上述した製造方法により製造された結晶を、大腸菌ごとＸ線結晶構造解析する工程を含む、結晶構造解析方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、上述した製造方法により製造された結晶を、大腸菌ごとＸ線結晶構造解析する工程を含む、結晶構造解析方法を提供する。
【0050】
実施例において後述するように、発明者らは、意外なことに、菌体内部でタンパク質結晶を形成させた大腸菌を、大腸菌ごとＸ線結晶構造解析することにより、タンパク質の構造解析を行うことができることを明らかにした。すなわち、タンパク質結晶の精製を行わなくても大腸菌ごとＸ線結晶構造解析することが可能である。本実施形態の方法によれば、従来技術と比較して、タンパク質の構造解析を格段に簡便に行うことができる。
【実施例】
【0051】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0052】
［実験例１］
（大腸菌内でのタンパク質の結晶化１）
ＣＰＶ由来のポリヘドリン（アミノ酸配列を配列番号２に示す。）をコードする遺伝子、及びＮＰＶ由来のポリヘドリンをコードする遺伝子を、それぞれｐＥＴ２９ｂベクター（メルクミリポア社）に挿入し、発現ベクターを作製した。続いて、各発現ベクターをそれぞれ大腸菌ＢＬ２１株に形質転換した。
（大腸菌内でのタンパク質の結晶化１）
ＣＰＶ由来のポリヘドリン（アミノ酸配列を配列番号２に示す。）をコードする遺伝子、及びＮＰＶ由来のポリヘドリンをコードする遺伝子を、それぞれｐＥＴ２９ｂベクター（メルクミリポア社）に挿入し、発現ベクターを作製した。続いて、各発現ベクターをそれぞれ大腸菌ＢＬ２１株に形質転換した。
【0053】
続いて、形質転換した大腸菌のそれぞれをＬＢ培地１０ｍＬに植菌し、３７℃でＯＤ６００が０．６～０．８になるまで培養した。続いて、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭとなるように添加し、ポリヘドリンを発現誘導した。続いて、３０℃で２０～２４時間培養し、ポリヘドリンの結晶を形成させた。
【0054】
図１（ａ）及び（ｂ）は、ＣＰＶ由来のポリヘドリンの結晶（多角体）を菌体内部で形成させた大腸菌の光学顕微鏡写真である。また、図１（ｃ）及び（ｄ）は、ＮＰＶ由来のポリヘドリンの結晶を菌体内部で形成させた大腸菌の光学顕微鏡写真である。図１（ａ）～（ｄ）中、スケールバーは１０μｍを示す。
【0055】
続いて、各大腸菌を遠心分離で回収した。続いて、大腸菌を超音波破砕し、遠心分離によりポリヘドリンの結晶を回収した。図２（ａ）は、ＣＰＶ由来のポリヘドリンの結晶を走査型電子顕微鏡で観察した結果を示す写真である。図２（ｂ）は、ＮＰＶ由来のポリヘドリンの結晶を走査型電子顕微鏡で観察した結果を示す写真である。図２（ａ）及び（ｂ）中、スケールバーは２μｍを示す。その結果、いずれの試料においても立方体状の結晶が観察され、大腸菌内で多角体結晶を形成できることが確認された。
【0056】
図３は、回収したＣＰＶ由来のポリヘドリンの結晶及びＮＰＶ由来のポリヘドリンの結晶をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）に供し、クマシーブリリアントブルー染色した結果を示す写真である。図３中、「Ｍ」は分子量マーカーを示し、「ＣＰＶ（ＷＴ）」は、対照としてＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した、昆虫細胞Ｓｆ２１株で発現させたＣＰＶ由来のポリヘドリンの結晶を示す。
【0057】
その結果、大腸菌で発現させた、ＣＰＶ由来のポリヘドリン及びＮＰＶ由来のポリヘドリンが、いずれも予想される分子量を有していることが確認された。
【0058】
図４（ａ）及び（ｂ）は、回収したＣＰＶ由来のポリヘドリンの結晶及びＮＰＶ由来のポリヘドリンの結晶をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ解析した結果を示すグラフである。図４（ａ）はＣＰＶ由来のポリヘドリンの結果を示し、図４（ｂ）はＮＰＶ由来のポリヘドリンの結果を示す。図４（ａ）及び（ｂ）中、「Ｏｂｓ」は測定された分子量を示し、「Ｃａｌ」は予測される全長タンパク質の分子量を示す。
【0059】
その結果、ＣＰＶ由来のポリヘドリン及びＮＰＶ由来のポリヘドリンが、予想される全長の分子量を有していることが確認された。
【0060】
［実験例２］
（大腸菌内でのタンパク質の結晶化２）
ＣＰＶ由来のポリヘドリン変異体を実験例１と同様にして大腸菌で発現させた。変異体としては、配列番号２に示すアミノ酸配列において、２９番目のアスパラギン（Ｎ２９）をセリンに置換した変異体（以下、「Ｎ２９Ｓ」といい、アミノ酸配列を配列番号１２に示す。）、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１９２番目のグリシン（Ｇ１９２）、１９３番目のセリン（Ｓ１９３）、１９４番目のアラニン（Ａ１９４）を欠失したアミノ酸配列からなる変異体（以下、「Δ３」といい、アミノ酸配列を配列番号１３に示す。）、配列番号２に示すアミノ酸配列において、６７番目のアラニン（Ａ６７）～１０４番目のアラニン（Ａ１０４）を欠失したアミノ酸配列からなる変異体（以下、「Δ３８」といい、アミノ酸配列を配列番号１に示す。）を使用した。ＣＰＶ由来のポリヘドリン変異体をコードする遺伝子を、それぞれｐＥＴ２９ｂベクター（メルクミリポア社）に挿入し、発現ベクターを作製した。続いて、各発現ベクターをそれぞれ大腸菌ＢＬ２１株に形質転換した。
（大腸菌内でのタンパク質の結晶化２）
ＣＰＶ由来のポリヘドリン変異体を実験例１と同様にして大腸菌で発現させた。変異体としては、配列番号２に示すアミノ酸配列において、２９番目のアスパラギン（Ｎ２９）をセリンに置換した変異体（以下、「Ｎ２９Ｓ」といい、アミノ酸配列を配列番号１２に示す。）、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１９２番目のグリシン（Ｇ１９２）、１９３番目のセリン（Ｓ１９３）、１９４番目のアラニン（Ａ１９４）を欠失したアミノ酸配列からなる変異体（以下、「Δ３」といい、アミノ酸配列を配列番号１３に示す。）、配列番号２に示すアミノ酸配列において、６７番目のアラニン（Ａ６７）～１０４番目のアラニン（Ａ１０４）を欠失したアミノ酸配列からなる変異体（以下、「Δ３８」といい、アミノ酸配列を配列番号１に示す。）を使用した。ＣＰＶ由来のポリヘドリン変異体をコードする遺伝子を、それぞれｐＥＴ２９ｂベクター（メルクミリポア社）に挿入し、発現ベクターを作製した。続いて、各発現ベクターをそれぞれ大腸菌ＢＬ２１株に形質転換した。
【0061】
続いて、形質転換した大腸菌のそれぞれをＬＢ培地１０ｍＬに植菌し、３７℃でＯＤ６００が０．６～０．８になるまで培養した。続いて、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭとなるように添加し、ポリヘドリン変異体を発現誘導した。続いて、３０℃で２０～２４時間培養し、ポリヘドリン変異体の結晶を形成させた。
【0062】
続いて、各大腸菌を遠心分離で回収した。続いて、大腸菌を超音波破砕し、遠心分離によりポリヘドリン変異体の結晶を回収した。図５（ａ）～（ｃ）は、ポリヘドリン変異体の結晶を走査型電子顕微鏡で観察した結果を示す写真である。図５（ａ）は、変異体（Ｎ２９Ｓ）の結晶を走査型電子顕微鏡で観察した結果を示す写真であり、図５（ｂ）は、変異体（Δ３）の結晶を走査型電子顕微鏡で観察した結果を示す写真であり、図５（ｃ）は、変異体（Δ３８）の結晶を走査型電子顕微鏡で観察した結果を示す写真である。図５（ａ）～（ｃ）中、スケールバーは２μｍを示す。その結果、いずれの試料においても結晶が観察され、大腸菌内でポリヘドリン変異体の結晶を形成できることが確認された。
【0063】
図６（ａ）～（ｃ）は、回収したポリヘドリン変異体の結晶をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ解析した結果を示すグラフである。図６（ａ）は変異体（Ｎ２９Ｓ）の結果を示し、図６（ｂ）は変異体（Δ３）の結果を示し、図６（ｃ）は変異体（Δ３８）の結果を示す。その結果、各ポリヘドリン変異体が、予想される全長の分子量を有していることが確認された。
【0064】
［実験例３］
（大腸菌内でのタンパク質の結晶化３）
ＣＰＶ由来のポリヘドリン（アミノ酸配列を配列番号２に示す。）を実験例１と同様にして大腸菌ＢＬ２１株で発現させ、結晶を形成した。ここで、結晶化の温度を３０℃又は３７℃に設定した。
（大腸菌内でのタンパク質の結晶化３）
ＣＰＶ由来のポリヘドリン（アミノ酸配列を配列番号２に示す。）を実験例１と同様にして大腸菌ＢＬ２１株で発現させ、結晶を形成した。ここで、結晶化の温度を３０℃又は３７℃に設定した。
【0065】
具体的には、まず、形質転換した大腸菌をＬＢ培地１０ｍＬに植菌し、３７℃でＯＤ６００が０．６～０．８になるまで培養した。続いて、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭとなるように添加し、ポリヘドリンを発現誘導した。続いて、３０℃又は３７℃で２０～２４時間培養し、ポリヘドリンの結晶を形成させた。
【0066】
続いて、各大腸菌を遠心分離で回収した。続いて、大腸菌を超音波破砕し、遠心分離によりポリヘドリンの結晶を回収した。図７（ａ）～（ｃ）は、３０℃で結晶化したポリヘドリンの結晶を走査型電子顕微鏡で観察した結果を示す写真である。また、図７（ｄ）～（ｆ）は、３７℃で結晶化したポリヘドリンの結晶を走査型電子顕微鏡で観察した結果を示す写真である。その結果、いずれの温度でもポリヘドリンを結晶化することができることが明らかとなった。また、より低温で結晶化することにより、ポリヘドリンの結晶の質が向上する傾向が認められた。
【0067】
［実験例４］
（ポリヘドリンの結晶の構造解析）
実験例１で作製した、ＣＰＶ由来のポリヘドリン（アミノ酸配列を配列番号２に示す。）の発現ベクターを有する大腸菌ＢＬ２１株をＬＢ培地１０ｍＬに植菌し、３７℃でＯＤ６００が０．６～０．８になるまで培養した。続いて、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭとなるように添加し、ポリヘドリンを発現誘導した。続いて、３０℃で２０～２４時間培養し、ポリヘドリンの結晶を形成させた。
（ポリヘドリンの結晶の構造解析）
実験例１で作製した、ＣＰＶ由来のポリヘドリン（アミノ酸配列を配列番号２に示す。）の発現ベクターを有する大腸菌ＢＬ２１株をＬＢ培地１０ｍＬに植菌し、３７℃でＯＤ６００が０．６～０．８になるまで培養した。続いて、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭとなるように添加し、ポリヘドリンを発現誘導した。続いて、３０℃で２０～２４時間培養し、ポリヘドリンの結晶を形成させた。
【0068】
続いて、この大腸菌を菌体ごとＸ線結晶構造解析に供した。Ｘ線結晶構造解析には、ＳＰｒｉｎｇ－８ ＢＬ３２ＸＵを使用した。その結果、分解能１．８Åでの構造解析に成功した。図８は、ＣＰＶ由来のポリヘドリンの結晶を、大腸菌のまま構造解析した結果を示す図である。
【0069】
続いて、実験例１と同様にして、大腸菌から精製したポリヘドリンの結晶を用いてＸ線結晶構造解析を行った。Ｘ線結晶構造解析には、ＳＰｒｉｎｇ－８ ＢＬ３２ＸＵを使用した。また、比較のために、昆虫細胞Ｓｆ２１株で作製し、精製したポリヘドリンの結晶についても同様にＸ線結晶構造解析を行った。その結果、精製した結晶は、分解能１．９Åでの構造解析に成功した。
【0070】
図９（ａ）は、大腸菌で作製したポリヘドリンの結晶の立体構造と、昆虫細胞で作製したポリヘドリンの結晶の立体構造を重ねた図である。その結果、両者が一致することが確認された。
【0071】
図９（ｂ）及び（ｃ）は、大腸菌で作製したポリヘドリンの結晶の立体構造解析の結果を示す画像である。図９（ｂ）及び（ｃ）中、「ＧＴＰ」はグアノシン三リン酸を示し、「ＡＴＰ」はアデノシン三リン酸を示し、「ＣＴＰ」はシトシン三リン酸を示す。その結果、図９（ｂ）及び（ｃ）に示すように、大腸菌で作製したポリヘドリンの結晶の立体構造には、核酸が結合していることが確認された。この結果は、大腸菌で作製したポリヘドリンの結晶が、昆虫細胞で作製したポリヘドリンの結晶と同等であることを更に支持するものである。
【0072】
［実験例５］
（大腸菌内でのタンパク質の結晶化４）
ＣＰＶ由来のポリヘドリン（アミノ酸配列を配列番号２に示す。）をコードする遺伝子を、ｐＥＴ２９ｂベクター（メルクミリポア社）に挿入し、発現ベクターを作製した。また、非結晶性タンパク質である緑色蛍光タンパク質（ｓｆＧＦＰ）をコードする遺伝子を、ｐＥＴ２１ｃベクター（メルクミリポア社）に挿入し、発現ベクターを作製した。
（大腸菌内でのタンパク質の結晶化４）
ＣＰＶ由来のポリヘドリン（アミノ酸配列を配列番号２に示す。）をコードする遺伝子を、ｐＥＴ２９ｂベクター（メルクミリポア社）に挿入し、発現ベクターを作製した。また、非結晶性タンパク質である緑色蛍光タンパク質（ｓｆＧＦＰ）をコードする遺伝子を、ｐＥＴ２１ｃベクター（メルクミリポア社）に挿入し、発現ベクターを作製した。
【0073】
ｓｆＧＦＰは、ＣＰＶ由来のポリヘドリンのＨ１領域（アミノ酸配列を配列番号１４に示す。）とｓｆＧＦＰとの融合タンパク質（アミノ酸配列を配列番号１５に示す。）の形態で用いた。続いて、各発現ベクターを混合して大腸菌ＢＬ２１株に形質転換した。
【0074】
続いて、形質転換した大腸菌をＬＢ培地１０ｍＬに植菌し、３７℃でＯＤ６００が０．６～０．８になるまで培養した。続いて、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭとなるように添加し、ポリヘドリン及びｓｆＧＦＰを発現誘導し、共発現させた。続いて、３０℃で２０～２４時間培養し、ポリヘドリン及びｓｆＧＦＰの共結晶を形成させた。
【0075】
続いて、各大腸菌を遠心分離で回収した。続いて、大腸菌を超音波破砕し、遠心分離によりポリヘドリンの結晶を回収した。図１０（ａ）及び（ｂ）は、３０℃で結晶化したポリヘドリン及びｓｆＧＦＰの共結晶を共焦点蛍光顕微鏡で観察した結果を示す代表的な写真である。図１０（ａ）及び（ｂ）では、明視野画像とｓｆＧＦＰの蛍光画像を重ね合わせて表示した。図１０（ａ）及び（ｂ）中、ｓｆＧＦＰの蛍光が検出された領域をドットで示す。
【0076】
その結果、形成された結晶がｓｆＧＦＰの蛍光を発することが確認された。この結果は、ポリヘドリン及びｓｆＧＦＰの共結晶が形成されたことを示す。
【0077】
［実験例６］
（ポリヘドリン変異体の結晶の構造解析）
実験例２で精製した、ＣＰＶ由来のポリヘドリン変異体（Δ３）の結晶、及び、ＣＰＶ由来のポリヘドリン変異体（Δ３８）の結晶のＸ線結晶構造解析を行った。Ｘ線結晶構造解析には、ＳＰｒｉｎｇ－８ ＢＬ３２ＸＵを使用した。
（ポリヘドリン変異体の結晶の構造解析）
実験例２で精製した、ＣＰＶ由来のポリヘドリン変異体（Δ３）の結晶、及び、ＣＰＶ由来のポリヘドリン変異体（Δ３８）の結晶のＸ線結晶構造解析を行った。Ｘ線結晶構造解析には、ＳＰｒｉｎｇ－８ ＢＬ３２ＸＵを使用した。
【0078】
図１１（ａ）上は、変異体（Δ３）の結晶を走査型電子顕微鏡で観察した結果を示す写真であり、図１１（ａ）下は、変異体（Δ３）の結晶を構造解析した結果を示す図である。その結果、精製した変異体（Δ３）の結晶は、分解能２．３Åでの構造解析に成功した。
【0079】
また、図１１（ｂ）上は、変異体（Δ３８）の結晶を走査型電子顕微鏡で観察した結果を示す写真であり、図１１（ｂ）下は、変異体（Δ３８）の結晶を構造解析した結果を示す図である。その結果、精製した変異体（Δ３８）の結晶は、分解能２．５Åでの構造解析に成功した。
【0080】
［実験例７］
（大腸菌内でのタンパク質の結晶化５）
Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（ＣｉｐＡ）をコードする遺伝子を、ｐＥＴ２９ｂベクター（メルクミリポア社）に挿入し、発現ベクターを作製した。続いて、発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１株に形質転換した。
（大腸菌内でのタンパク質の結晶化５）
Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（ＣｉｐＡ）をコードする遺伝子を、ｐＥＴ２９ｂベクター（メルクミリポア社）に挿入し、発現ベクターを作製した。続いて、発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１株に形質転換した。
【0081】
続いて、形質転換した大腸菌をＬＢ培地１０ｍＬに植菌し、３７℃でＯＤ６００が０．６～０．８になるまで培養した。続いて、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭとなるように添加し、ＣｉｐＡを発現誘導した。続いて、３０℃で２０～２４時間培養し、ＣｉｐＡの結晶を形成させた。図１２（ａ）は、ＣｉｐＡの結晶を菌体内部で形成させた大腸菌の光学顕微鏡写真である。スケールバーは１０μｍを示す。
【0082】
続いて、大腸菌を遠心分離で回収した。続いて、大腸菌を超音波破砕し、遠心分離によりＣｉｐＡの結晶を回収した。図１２（ｂ）は、ＣｉｐＡの結晶を走査型電子顕微鏡で観察した結果を示す写真である。スケールバーは２μｍを示す。
【0083】
続いて、精製したＣｉｐＡの結晶のＸ線結晶構造解析を行った。Ｘ線結晶構造解析には、ＳＰｒｉｎｇ－８ ＢＬ３２ＸＵを使用した。その結果、分解能２．８Åで回折データを取得することができた。
【0084】
以上の結果から、大腸菌内でＣｉｐＡの結晶を形成できることが明らかとなった。
【0085】
［実験例８］
（大腸菌内でのタンパク質の結晶化６）
ユビキチン（以下、「Ｕｂｑ」という場合がある。）と細胞質多角体タンパク質（以下、「ＰｈＭ」という場合がある。）の融合タンパク質をコードする遺伝子を、ｐＥＴ２９ｂベクター（メルクミリポア社）に挿入し、発現ベクターを作製した。
（大腸菌内でのタンパク質の結晶化６）
ユビキチン（以下、「Ｕｂｑ」という場合がある。）と細胞質多角体タンパク質（以下、「ＰｈＭ」という場合がある。）の融合タンパク質をコードする遺伝子を、ｐＥＴ２９ｂベクター（メルクミリポア社）に挿入し、発現ベクターを作製した。
【0086】
ＵｂｑがＮ末端側に位置する融合タンパク質（以下、「Ｕｂｑ－ＰｈＭ」という場合がある。）及びＰｈＭがＮ末端側に位置する融合タンパク質（以下、「ＰｈＭ－Ｕｂｑ」という場合がある。）の２種類の融合タンパク質について発現ベクターを作製した。Ｕｂｑ－ＰｈＭ及びＰｈＭ－Ｕｂｑのいずれにおいても、ＵｂｑとＰｈＭの間にリンカー「ＧＧＧＳ（配列番号１８）」を挿入した。Ｕｂｑ－ＰｈＭのアミノ酸配列を配列番号１９に示し、ＰｈＭ－Ｕｂｑのアミノ酸配列を配列番号２０に示す。
【0087】
続いて、各発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１株に形質転換した。続いて、形質転換した各大腸菌をＬＢ培地１０ｍＬにそれぞれ植菌し、３７℃でＯＤ６００が０．６～０．８になるまで培養した。続いて、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭとなるように添加し、Ｕｂｑ－ＰｈＭ及びＰｈＭ－Ｕｂｑをそれぞれ発現誘導した。続いて、３０℃で２０～２４時間培養し、Ｕｂｑ－ＰｈＭ及びＰｈＭ－Ｕｂｑの結晶をそれぞれ形成させた。
【0088】
図１３（ａ）左は、Ｕｂｑ－ＰｈＭの結晶を菌体内部で形成させた大腸菌の光学顕微鏡写真であり、図１３（ｂ）左は、ＰｈＭ－Ｕｂｑの結晶を菌体内部で形成させた大腸菌の光学顕微鏡写真である。スケールバーは１０μｍを示す。
【0089】
続いて、各大腸菌を遠心分離で回収した。続いて、各大腸菌を超音波破砕し、遠心分離によりＵｂｑ－ＰｈＭ及びＰｈＭ－Ｕｂｑの結晶をそれぞれ回収した。図１３（ａ）右は、Ｕｂｑ－ＰｈＭの結晶を走査型電子顕微鏡で観察した結果を示す写真であり、図１３（ｂ）右は、ＰｈＭ－Ｕｂｑの結晶を走査型電子顕微鏡で観察した結果を示す写真である。スケールバーは２μｍを示す。
【0090】
図１３（ｃ）は、回収したＵｂｑ－ＰｈＭ及びＰｈＭ－Ｕｂｑの結晶をそれぞれＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ解析した結果を示すグラフである。図１３（ｃ）上はＵｂｑ－ＰｈＭの結果を示し、図１３（ｃ）下はＰｈＭ－Ｕｂｑの結果を示す。図１３（ｃ）中、「Ｃａｌ」は予測される各融合タンパク質の分子量を示す。その結果、Ｕｂｑ－ＰｈＭ及びＰｈＭ－Ｕｂｑのそれぞれが、予想される分子量を有していることが確認された。
【0091】
以上の結果から、大腸菌内でＵｂｑ－ＰｈＭ及びＰｈＭ－Ｕｂｑの結晶を形成できることが明らかとなった。
【0092】
［実験例９］
（大腸菌内でのタンパク質の結晶化７）
緑色蛍光タンパク質（以下、「ＧＦＰ」という場合がある。）と細胞質多角体タンパク質（以下、「ＰｈＭ」という場合がある。）の融合タンパク質をコードする遺伝子を、ｐＥＴ２９ｂベクター（メルクミリポア社）に挿入し、発現ベクターを作製した。
（大腸菌内でのタンパク質の結晶化７）
緑色蛍光タンパク質（以下、「ＧＦＰ」という場合がある。）と細胞質多角体タンパク質（以下、「ＰｈＭ」という場合がある。）の融合タンパク質をコードする遺伝子を、ｐＥＴ２９ｂベクター（メルクミリポア社）に挿入し、発現ベクターを作製した。
【0093】
作製した融合タンパク質は、ＧＦＰがＮ末端側に位置していた（以下、「ＧＦＰ－ＰｈＭ」という場合がある。）ＧＦＰとＰｈＭの間にはリンカー「ＧＧＧＳ（配列番号１８）」を挿入した。ＧＦＰ－ＰｈＭのアミノ酸配列を配列番号２１に示す。
【0094】
続いて、発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１株に形質転換した。続いて、形質転換した大腸菌をＬＢ培地１０ｍＬにそれぞれ植菌し、３７℃でＯＤ６００が０．６～０．８になるまで培養した。続いて、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭとなるように添加し、ＧＦＰ－ＰｈＭを発現誘導した。続いて、３０℃で２０～２４時間培養し、ＧＦＰ－ＰｈＭの結晶をそれぞれ形成させた。
【0095】
続いて、大腸菌を遠心分離で回収した。続いて、大腸菌を超音波破砕し、遠心分離によりＧＦＰ－ＰｈＭの結晶を回収した。
【0096】
図１４（ａ）は、回収したＧＦＰ－ＰｈＭの結晶の光学顕微鏡写真と、ＧＦＰの蛍光を観察した写真をマージした画像である。スケールバーは１０μｍを示す。図１４（ｂ）は、ＧＦＰ－ＰｈＭの結晶を走査型電子顕微鏡で観察した結果を示す写真である。スケールバーは５μｍを示す。
【0097】
図１４（ｃ）は、回収したＧＦＰ－ＰｈＭの結晶をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ解析した結果を示すグラフである。図１４（ｃ）中、「ＳｆＧＦＰ－ＷＴＰｈＣ２＋」はＳｆＧＦＰ－ＷＴＰｈＣ（ＧＦＰ－ＰｈＭ）の２価イオンを示し、「ＳｆＧＦＰ－ＷＴＰｈＣ＋」はＳｆＧＦＰ－ＷＴＰｈＣ（ＧＦＰ－ＰｈＭ）の１価イオンを示す。また、「Ｃａｌ」は予測される融合タンパク質の分子量を示す。その結果、ＧＦＰ－ＰｈＭが、予想される分子量を有していることが確認された。
【0098】
以上の結果から、大腸菌内でＧＦＰ－ＰｈＭの結晶を形成できることが明らかとなった。
【0099】
［実験例１０］
（大腸菌内でのタンパク質の結晶化８）
セレブロン（ＣＲＢＮ）タンパク質のサリドマイド結合ドメイン（以下、「ＴＢＤ」という場合がある。）と細胞質多角体タンパク質（以下、「ＰｈＭ」という場合がある。）の融合タンパク質をコードする遺伝子を、ｐＥＴ２９ｂベクター（メルクミリポア社）に挿入し、発現ベクターを作製した。
（大腸菌内でのタンパク質の結晶化８）
セレブロン（ＣＲＢＮ）タンパク質のサリドマイド結合ドメイン（以下、「ＴＢＤ」という場合がある。）と細胞質多角体タンパク質（以下、「ＰｈＭ」という場合がある。）の融合タンパク質をコードする遺伝子を、ｐＥＴ２９ｂベクター（メルクミリポア社）に挿入し、発現ベクターを作製した。
【0100】
ＴＢＤがＮ末端側に位置する融合タンパク質（以下、「ＴＢＤ－ＰｈＭ」という場合がある。）及びＰｈＭがＮ末端側に位置する融合タンパク質（以下、「ＰｈＭ－ＴＢＤ」という場合がある。）の２種類の融合タンパク質について発現ベクターを作製した。ＴＢＤ－ＰｈＭ及びＰｈＭ－ＴＢＤのいずれにおいても、ＴＢＤとＰｈＭの間にリンカー「ＧＧＧＳ（配列番号１８）」を挿入した。ＴＢＤ－ＰｈＭのアミノ酸配列を配列番号２２に示し、ＰｈＭ－ＴＢＤのアミノ酸配列を配列番号２３に示す。
【0101】
続いて、各発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１株に形質転換した。続いて、形質転換した各大腸菌をＬＢ培地１０ｍＬにそれぞれ植菌し、３７℃でＯＤ６００が０．６～０．８になるまで培養した。続いて、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭとなるように添加し、ＴＢＤ－ＰｈＭ及びＰｈＭ－ＴＢＤをそれぞれ発現誘導した。続いて、３０℃で２０～２４時間培養し、ＴＢＤ－ＰｈＭ及びＰｈＭ－ＴＢＤの結晶をそれぞれ形成させた。
【0102】
続いて、各大腸菌を遠心分離で回収した。続いて、各大腸菌を超音波破砕し、遠心分離によりＴＢＤ－ＰｈＭ及びＰｈＭ－ＴＢＤの結晶をそれぞれ回収した。
【0103】
図１５（ａ）はＴＢＤ（ＣＲＢＮタンパク質のサリドマイド結合ドメイン）の立体構造を示す図である。図１５（ｂ）上は、回収したＴＢＤ－ＰｈＭの結晶の光学顕微鏡写真であり、図１５（ｃ）上は、回収したＰｈＭ－ＴＢＤの結晶の光学顕微鏡写真である。また、図１５（ｂ）下は、ＴＢＤ－ＰｈＭの結晶を走査型電子顕微鏡で観察した結果を示す写真であり、図１５（ｃ）下は、ＰｈＭ－ＴＢＤの結晶を走査型電子顕微鏡で観察した結果を示す写真である。スケールバーは２μｍを示す。
【0104】
以上の結果から、大腸菌内でＴＢＤ－ＰｈＭ及びＰｈＭ－ＴＢＤの結晶を形成できることが明らかとなった。
【0105】
［実験例１１］
（大腸菌内でのタンパク質の結晶化９）
細胞質多角体タンパク質の断片をコードする遺伝子を、ｐＥＴ２９ｂベクター（メルクミリポア社）に挿入し、発現ベクターを作製した。
（大腸菌内でのタンパク質の結晶化９）
細胞質多角体タンパク質の断片をコードする遺伝子を、ｐＥＴ２９ｂベクター（メルクミリポア社）に挿入し、発現ベクターを作製した。
【0106】
細胞質多角体タンパク質の断片として、配列番号２に示す細胞質多角体タンパク質のアミノ酸配列の第１～１１４番目のアミノ酸からなる断片（以下、「フラグメント１：Ｍ１～Ｓ１１４」という場合がある。）、配列番号２のアミノ酸配列の第１～１５５番目のアミノ酸からなる断片（以下、「フラグメント２：Ｍ１～Ｒ１５５」という場合がある。）、配列番号２のアミノ酸配列の第１１６～２４８番目のアミノ酸からなる断片（以下、「フラグメント３：Ｓ１１６～Ｑ２４８」という場合がある。）、及び、配列番号２のアミノ酸配列の第５８～２４８番目のアミノ酸からなる断片（以下、「フラグメント４：Ｋ５８～Ｑ２４８」という場合がある。）の４種類について発現ベクターを作製した。
【0107】
フラグメント１：Ｍ１～Ｓ１１４のアミノ酸配列を配列番号２４に示し、フラグメント２：Ｍ１～Ｒ１５５のアミノ酸配列を配列番号２５に示し、フラグメント３：Ｓ１１６～Ｑ２４８のアミノ酸配列を配列番号２６に示し、フラグメント４：Ｋ５８～Ｑ２４８のアミノ酸配列を配列番号２７に示す。
【0108】
続いて、各発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１株に形質転換した。続いて、形質転換した各大腸菌をＬＢ培地１０ｍＬにそれぞれ植菌し、３７℃でＯＤ６００が０．６～０．８になるまで培養した。続いて、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭとなるように添加し、フラグメント１～フラグメント４をそれぞれ発現誘導した。続いて、３０℃で２０～２４時間培養し、フラグメント１～フラグメント４の結晶をそれぞれ形成させた。
【0109】
続いて、各大腸菌を遠心分離で回収した。続いて、各大腸菌を超音波破砕し、遠心分離によりフラグメント１～フラグメント４の結晶をそれぞれ回収した。図１６（ａ）は、フラグメント１：Ｍ１～Ｓ１１４の結晶を走査型電子顕微鏡で観察した結果を示す写真であり、図１６（ｃ）は、フラグメント２：Ｍ１～Ｒ１５５の結晶を走査型電子顕微鏡で観察した結果を示す写真である。スケールバーは２μｍを示す。
【0110】
また、図１７（ａ）は、フラグメント３：Ｓ１１６～Ｑ２４８の結晶を走査型電子顕微鏡で観察した結果を示す写真であり、図１７（ｃ）は、フラグメント４：Ｋ５８～Ｑ２４８の結晶を走査型電子顕微鏡で観察した結果を示す写真である。スケールバーは５μｍを示す。また、図１６（ｂ）は、回収したフラグメント１：Ｍ１～Ｓ１１４の結晶をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ解析した結果を示すグラフであり、図１６（ｄ）は、回収したフラグメント２：Ｍ１～Ｒ１５５の結晶をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ解析した結果を示すグラフであり、図１７（ｂ）は、回収したフラグメント３：Ｓ１１６～Ｑ２４８の結晶をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ解析した結果を示すグラフであり、図１７（ｄ）は、回収したフラグメント４：Ｋ５８～Ｑ２４８の結晶をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ解析した結果を示すグラフである。図１６及び図１７中、「Ｃａｌ」は予測される各フラグメントの分子量を示す。その結果、フラグメント１～フラグメント４のそれぞれが、予想される分子量を有していることが確認された。
【0111】
以上の結果から、大腸菌内で細胞質多角体タンパク質の断片の結晶を形成できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【0112】
本発明によれば、タンパク質の結晶を簡便に作製する技術を提供することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【配列表】