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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-06-13
(45)【発行日】2025-06-23
(54)【発明の名称】新規化合物又はその塩及びこれらを有効成分とする抗腫瘍活性剤
(51)【国際特許分類】
C07H 19/056 20060101AFI20250616BHJP
A61K 31/7056 20060101ALI20250616BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250616BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20250616BHJP
【ＦＩ】
C07H19/056 CSP
A61K31/7056
A61P35/00
A61P35/02
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2023505293
(86)(22)【出願日】2022-02-25
(86)【国際出願番号】 JP2022008078
(87)【国際公開番号】W WO2022190915
(87)【国際公開日】2022-09-15
【審査請求日】2025-01-15
(31)【優先権主張番号】P 2021038597
(32)【優先日】2021-03-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】504409543
【氏名又は名称】国立大学法人秋田大学
(73)【特許権者】
【識別番号】504157024
【氏名又は名称】国立大学法人東北大学
(74)【代理人】
【識別番号】100129838
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 典輝
(72)【発明者】
【氏名】柴田 浩行
(72)【発明者】
【氏名】岩渕 好治
【審査官】藤田 雅也
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２００７／０００９９８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１０－５０６８３６（ＪＰ，Ａ）
【文献】MURAKAMI, Megumi et al.，Synthetic Analogs of Curcumin Modulate the Function of Multidrug Resistance-Linked ATP-Binding Casse，DRUG METABOLISM AND DISPOSITION，2017年11月，Vol. 45，pp. 1166-11177
【文献】CAGNONI, Alejandro J. et al.，Synthesis of Multivalent Glycoclusters from 1-Thio-β-D-galactose and Their Inhibitory Activity agai，The Journal of Organic Chemistry，2011年03月29日，Vol. 76，pp. 3064-3077
【文献】KOHYAMA, Aki et al.，Reversibility of the thia-Michael reaction of cytotoxic C5-curcuminoid and structure-activity relati，Organic & Biomolecular Chemistry，2016年10月24日，Vol. 14，pp. 10683-10687
【文献】European Journal of Medicinal Cheistry，2023年03月21日，Vol.252, No.115297，p.1-15
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｈ １９／０５６
Ａ６１Ｋ ３１／７０５６
Ａ６１Ｐ ３５／００－３５／０４
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
次の一般式で表される化合物又はその塩。【化1】
【請求項2】
請求項１に記載の化合物又はその塩を有効成分とする抗腫瘍活性剤。【請求項3】
請求項１に記載の化合物又はその塩を有効成分とする胃癌、大腸癌、膵癌、悪性中皮腫、及び皮膚Ｔ細胞性リンパ腫用抗腫瘍活性剤。【請求項4】
請求項１に記載の化合物又はその塩を有効成分とする膵癌、悪性中皮腫、及び皮膚Ｔ細胞性リンパ腫用抗腫瘍活性剤。【請求項5】
請求項１に記載の化合物又はその塩を有効成分とする膵癌用抗腫瘍活性剤。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願は、新規化合物又はその塩及びそれらを有効成分とする抗腫瘍活性剤に関する。
【背景技術】
【0002】
スパイスなどに含まれるクルクミンは、抗腫瘍活性を含む様々な薬理作用が知られている。例えば、クルクミンの薬理作用としては抗腫瘍活性、抗炎症活性、抗心不全活性、抗菌活性、放射線防護作用などが知られている。また、クルクミンは食用されるスパイスであって、低毒性であることも知られている。
【0003】
本発明者らは、以前、低毒性を維持しつつ抗腫瘍活性を増強させたクルクミン誘導体を特許文献１において開示している。具体的には、特許文献１は、新規化合物である所定のビス（アリールメチリデン）アセトン化合物又はその塩、及びこれらを有効成分とするＫｉ－Ｒａｓ、ＥｒｂＢ２、ｃ－Ｍｙｃ若しくはＣｙｃｌｉｎＤ１の発現抑制剤、β－カテニン分解剤、ｐ５３の発現増強剤、抗癌剤又は発癌予防剤を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】特許第５０５０２０６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
特許文献１の通り、本発明者らはクルクミンの抗腫瘍活性を増強させたクルクミン誘導体の開発に成功している。しかしながら、特許文献１のクルクミン誘導体は水溶性が低く、生体内有効性を改善できずにいたため、薬剤用途が限られていた。
【0006】
そこで、本開示の目的は、上記実情を鑑み、クルクミン誘導体の生体内有効性及び抗腫瘍活性を向上した新規化合物又はその塩及びこれらを有効成分とする抗腫瘍活性剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本開示は、上記課題を解決するための一つの態様として、次の一般式で表される化合物又はその塩を提供する。
【0008】
【化1】
【0009】
ここで、Ｒ１～Ｒ４は水素原子、Ｃ１－４低級アルキル基、ヒドロキシＣ１－４低級アルキル基、Ｃ１－４低級アルコキシＣ１－４低級アルキル基、及びＣ１－４低級アルコキシＣ１－４低級アルコキシＣ１－４低級アルキル基から選ばれる置換基である。Ｒ１～Ｒ４は同一であってもよく、異なっていてもよい。ｎは１～６である。Ｓｕｇａｒは単糖類又は二糖類である。
【0010】
また、本開示は上記化合物又はその塩を有効成分とする抗腫瘍活性剤を提供する。抗腫瘍活性剤は胃癌、大腸癌、膵癌、悪性中皮腫、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫用抗腫瘍活性剤でもよく、膵癌、悪性中皮腫、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫用抗腫瘍活性剤でもよく、膵癌抗腫瘍活性剤でもよい。
【発明の効果】
【0011】
本開示の化合物又はその塩は特許文献１のクルクミン誘導体に比べて水溶性が改善されているため、生体内有効性が向上している。従って、幅広い薬剤用途に用いることができる。また、本開示の化合物又はその塩は、特許文献１のクルクミン誘導体に比べて抗腫瘍活性も向上している。さらに、本開示の化合物又はその塩は、マウスを用いた実験において、安全性も確認されている。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】ＧＯ－Ｙ１９０～１９２の化学構造を示す図である。
【図2】ＧＯ－Ｙ１９３～１９６の化学構造を示す図である。
【図3】ＧＯ－Ｙ１９７～２００の化学構造を示す図である。
【図4】ＧＯ－Ｙ０２２、ＧＯ－Ｙ１３６、ＧＯ－Ｙ０３０、ｍｆ７９７の化学構造を示す図である。
【図5】ＧＯ－Ｙ２０６の化学構造を示す図である。
【図6】ＨＣＴ１１６に対するＧＯ－Ｙ１９０、ＧＯ－Ｙ１９３、ＧＯ－Ｙ１９６、ＧＯ－Ｙ１９７の細胞増殖抑制活性の実験結果を示す図である。
【図7】各種癌細胞株に対するＧＯ－Ｙ１９９の細胞増殖抑制活性の実験結果を示す図である。
【図8】大腸癌細胞株ＤＬＤ－１、ＨＣＴ１１６、胃癌細胞株ＫＡＴＯ ＩＩＩ、Ｈ－１１１－ＴＣに対する各種化合物の細胞増殖抑制活性の実験結果を示す図である。
【図9】膵癌細胞株ＡＳＰＣ－１、Ｐａｎｃ－１に対する各種化合物の細胞増殖抑制活性の実験結果を示す図である。
【図10】悪性胸膜中皮腫細胞株ＮＣＩ－Ｈ２２６、ＭＳＴＯ２１１Ｈに対する各種化合物の細胞増殖抑制活性（ＩＣ５０）の実験結果を示す図である。
【図11】悪性黒色腫細胞株Ｇ３６１に対する各種化合物の細胞増殖抑制活性の実験結果を示す図である。
【図12】皮膚Ｔ細胞性リンパ腫細胞株ＨＨ、ＨＵＴ７８に対する各種化合物の細胞増殖抑制活性（ＩＣ５０）の実験結果を示す図である。
【図13】ＨＣＴ１１６及びＫａｔｏ ＩＩＩに対するＧＯ－Ｙ１９９の殺細胞効果の実験結果を示す図である。
【図14】ＧＯ－Ｙ１９９のＮＦ－ｋＢに対する影響に関する実験結果を示す図である。
【図15】コントロール群に対するＧＯ－Ｙ１９９添加群のＮＦ－ｋＢ阻害作用の比較結果を示す図である。
【図16】ＧＯ－Ｙ１９９のｐＳＴＡＴ３に対する影響に関する実験結果を示す図である。
【図17】ＧＯ－Ｙ１９９のβ－カテニンに対する影響に関する実験結果を示す図である。
【図18】コントロール群に対するＧＯ－Ｙ１９９添加群のβ－カテニン阻害作用の比較結果を示す図である。
【図19】コントロール群に対するＧＯ－Ｙ１９９添加群の脂肪酸シンセターゼ阻害作用の比較結果を示す図である。
【図20】ＧＯ－Ｙ１９９のカスパーゼ３に対する影響に関する実験結果を示す図である。
【図21】コントロール群に対するＧＯ－Ｙ１９９添加群のアポトーシスに対する影響の比較結果を示す図である。
【図22】血管内皮細胞ＨＵＶＥＣ－Ｒに対する各種化合物の血管新生阻害活性の実験結果を示す図である。
【図23】ＧＯ－Ｙ１９９の制御性Ｔ細胞抑制活性に関する実験結果を示す図である。
【図24】ＧＯ－Ｙ１９９の生体内抗腫瘍効果に関する実験結果を示す図である。
【図25】動物モデルを用いた悪性中皮腫細胞に対するＧＯ－Ｙ１９９の抗腫瘍効果に関する実験結果を示す図である。
【図26】悪性中皮腫細胞の病理学的解析の結果を示す図である。
【図27】静注後における血液のＨＰＬＣ分析の結果を示す図である。
【図28】静注後におけるＧＯ－Ｙ１９９の血中濃度の経時変化を示す図である。
【図29】静注後のマウスの体重変化を示す図である。
【図30】静注後のマウスの尾部の写真である。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明者らは、特許文献１のクルクミン誘導体（ディアリルペンタノイド誘導体：ＤＰＡ）の生体内有効性（水溶性）を向上させるために、鋭意検討した結果、ＤＰＡにリンカーを介して糖類（Ｓｕｇａｒ）を付加させたＳｕＤＰＡを新たに合成した。そして、合成したＳｕＤＰＡについて種々の実験を行った結果、ＳｕＤＰＡはＤＰＡに比べて顕著に水溶性が改善し、また抗腫瘍活性も向上した。さらに、ＳｕＤＰＡはＤＰＡの持つがん分子標的性も維持されていた。さらに、低毒性であることも認められた。以上の知見に基づいて、本開示の化合物又はその塩は発明されたものである。以下、本開示の化合物又はその塩について説明する。
【0014】
本開示は、次の一般式で表される化合物又はその塩を提供するものである。
【0015】
【化2】
【0016】
ここで、Ｒ１～Ｒ４は水素原子、Ｃ１－４低級アルキル基、ヒドロキシＣ１－４低級アルキル基、Ｃ１－４低級アルコキシＣ１－４低級アルキル基、及びＣ１－４低級アルコキシＣ１－４低級アルコキシＣ１－４低級アルキル基から選ばれる置換基である。Ｒ１～Ｒ４は同一であってもよく、異なっていてもよい。Ｒ１～Ｒ４は、Ｃ１－４低級アルコキシＣ１－４低級アルキル基であってもよく、メトキシメチル基であってもよい。
【0017】
ここで、上述した置換基におけるＣ１－４炭素鎖は直鎖であってもよく、分岐鎖であってもよい。また、炭素鎖にハロゲン原子等が置換されていてもよい。
【0018】
ＤＰＡ部位と糖類部位とを接続するリンカー部位（ビニルアルコール部位）の長さを示すｎは１～６である。水溶性向上の観点から、ｎが２～５であってもよく、３～４であってもよく、４であってもよい。
【0019】
Ｓｕｇａｒは単糖類又は二糖類であり、これらのデオキシ糖も含まれる。単糖類としては、例えばグルコース、ガラクトース、マンノース、及びデオキシグルコース等が挙げられる。二糖類としては、ラクトース、マルトース等が挙げられる。これらの糖類は光学異性体も含む概念である。例えば、ＳｕｇａｒはＤ、Ｌ－グルコース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－マンノース、Ｄ－ラクトース、Ｄ－マルトース、及びデオキシグルコースであってもよい。水溶性向上の観点から、ＳｕｇａｒはＤ－ガラクトース、Ｌ－グルコース、Ｄ－マンノース、Ｄ－ラクトース、Ｄ－マルトースであってもよい。抗腫瘍活性向上の観点から、ＳｕｇａｒはＤ－マンノース、Ｄ－ラクトース、及びＤ－マルトースであってもよい。合成収率の観点から、ＳｕｇａｒはＤ－ラクトースであってもよい。ここで、隣接するトリアゾール基と結合するＳｕｇａｒの位置は特に限定されないが、合成の容易性の観点から、１位の炭素であってもよい。
【0020】
本開示の化合物の塩は特に限定されないが、例えば本開示の化合物のナトリウム塩やカリウム塩、カルシウム塩、又はマグネシウム塩等が挙げられる。
【0021】
本開示の化合物又はその塩は、ＤＰＡ部位にリンカーを介して糖類を付加させた構造により、特許文献１のクルクミン誘導体と比較して、水溶性及び抗腫瘍活性が向上している。本開示の化合物又はその塩は、ＮＦ－ｋＢ、ｐＳＴＡＴ３、β－カテニン、及び／又は脂肪酸シンセターゼの阻害作用を有し、これにより、抗腫瘍活性を発揮する。また、本開示の化合物又はその塩は、さらに血管新生阻害作用及び／又は制御性Ｔ細胞抑制作用を有し、これにより抗腫瘍活性を発揮する。本開示の化合物又はその塩はアポトーシス誘導能を有する。本開示の化合物又はその塩は静注可能であり、マウスモデルにおいて抗腫瘍活性を発揮する。また、本開示の化合物又はその塩は、マウスモデルにおいて安全性が確認されている。
【0022】
以上のように、本開示の化合物又はその塩は、特許文献１のクルクミン誘導体に比べて水溶性及び抗腫瘍活性が改善され、さらに安全性も確認されている。よって、本開示の化合物又はその塩は、これらを有効成分とする抗腫瘍活性剤に広く用いることができる。本開示の化合物又はその塩を有効成分とする抗腫瘍活性剤は、胃癌用抗腫瘍活性剤としてもよく、大腸癌用抗腫瘍活性剤としてもよく、膵癌用抗腫瘍活性剤としてもよく、悪性中皮腫用抗腫瘍活性剤としてもよく、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫用抗腫瘍活性剤としてもよい。また、抗腫瘍活性剤は胃癌、大腸癌、膵癌、悪性中皮腫、及び皮膚Ｔ細胞性リンパ腫用抗腫瘍活性剤としてもよく、膵癌、悪性中皮腫、及び皮膚Ｔ細胞性リンパ腫用抗腫瘍活性剤としてもよい。中でも、抗腫瘍活性剤は膵癌用抗腫瘍活性剤としてよい。また、本開示の化合物又はその塩は、抗炎症剤や免疫療法剤、心不全保護剤などの有効成分として、多様な用途に用いることができる。
【0023】
なお、有効成分の含有量は患者の状態（一般的状態、病状、合併症の有無）や年齢、体重等を考慮して最適量を決定すべきである。薬剤の態様は特に限定されるものではなく、経口剤や注射剤、吸入剤等の公知の態様を用いることができる。
【0024】
次に、本開示の化合物又はその塩の製造方法について説明する。本開示の化合物又はその塩の製造方法は特に限定されないが、次の製造方法（本開示の製造方法）が挙げられる。本開示の製造方法では次の化合物（１）～（３）を用いる。化合物（１）、化合物（３）は公知であり、試薬会社で購入することができる。化合物（２）は特許文献１に記載の方法により得ることができる。
【0025】
【化3】
【0026】
【化4】
【0027】
【化5】
【0028】
本開示の化合物又はその塩の製造方法は、化合物（１）のヒドロキシル基をアセチルチオ化する工程Ｓ１と、アセチルチオ化された化合物（１）と化合物（２）とを反応させ、中間体Ａを得る工程Ｓ２と、中間体Ａと化合物３とを反応させ、本開示の化合物を得る工程Ｓ３と、を備える。下記に、各工程の反応図を示した。
【0029】
【化6】
【0030】
工程Ｓ１は化合物（１）のヒドロキシル基をアセチルチオ化することができれば特に限定されない。例えば、化合物（１）のヒドロキシル基を塩基性条件下でトシル化した後、トシル化された化合物（１）をアセチルチオ化することにより、アセチルチオ化された化合物（１）を得ることができる。
【0031】
トシル化は、塩基性条件下で化合物（１）とｐ－トルエンスルホン酸のハロゲン化物とを反応させることにより実施される。トシル化に用いられる溶媒は、トシル化を進行させることができれば特に限定されないが、例えばエーテルが挙げられる。塩基性条件を得る方法は特に限定されないが、例えば、水酸化カリウムを溶媒に溶解することにより得ることができる。具体的なトシル化の方法は、後述の実施例において説明されている。
【0032】
アセチルチオ化は、トシル化された化合物（１）とチオ酢酸又はその塩とを反応させることにより実施される。アセチルチオ化に用いられる溶媒は特に限定されないが、例えばＤＭＦが挙げられる。具体的なアセチルチオ化の方法は、後述の実施例において説明されている。
【0033】
工程Ｓ２はアセチルチオ化された化合物（１）と化合物（２）とを反応させ、中間体Ａを得ることができれば特に限定されない。例えば、アセチルチオ化された化合物（１）をチオール化した後、チオール化された化合物（１）と化合物（２）とを反応させることにより、中間体Ａを得ることができる。
【0034】
チオール化は、アセチルチオ化された化合物（１）のアルコール溶液にアルコキシドを添加することにより進行する。具体的なチオール化の方法は、後述の実施例において説明されている。
【0035】
チオール化された化合物（１）と化合物（２）との反応は、塩基性化合物の存在下で進行する。塩基化合物は特に限定されないが、例えばトリエチルアミンが挙げられる。溶媒は特に限定されないが、ＤＭＦが挙げられる。チオール化された化合物（１）と化合物（２）との反応の具体的な方法は、後述の実施例において説明されている。
【0036】
工程Ｓ３は中間体Ａと化合物（３）とを反応させ、本開示の化合物を得ることができれば特に限定されない。例えば、中間体Ａの三重結合部位と化合物（３）のアジド部位とを環化反応により結合し、トリアゾール骨格を形成することにより得ることができる。
【0037】
環化反応は、銅触媒存在下で進行する。銅触媒は特に限定されないが、２－チオフェンカルボン酸銅が挙げられる。溶媒は特に限定されないが、含水エーテル溶媒が挙げられる。具体的な環化反応の方法は、後述の実施例において説明されている。
【0038】
本開示の製造方法は、工程Ｓ３により得られた化合物を中和反応により塩に変換する工程を備えていてもよい。本開示の化合物を中和反応により塩に変換する方法は特に限定されず、公知の方法を採用し得る。例えば、本開示の化合物を所定の金属イオンを含む塩基性溶液に溶解することにより、目的の塩を得ることができる。
【実施例】
【0039】
【0040】
［化合物の合成］
下記の合成経路によりＧＯ－Ｙ１９３、１９７～２００、２０６を合成した。また、同様の合成経路によりＧＯ－Ｙ１９６を合成した。
下記の合成経路によりＧＯ－Ｙ１９３、１９７～２００、２０６を合成した。また、同様の合成経路によりＧＯ－Ｙ１９６を合成した。
【0041】
【化7】
【0042】
＜化合物２の合成＞
３，６，９，１２－テトラオキサペンタデカ－１４－イン－１－オール（化合物１、３．８７ｇ、１６．７ｍｍｏｌ）のジエチルエーテル溶液（２５ｍＬ）に水酸化カリウム（２．８５ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。０℃で１０分間撹拌後、塩化パラトルエンスルホニル（３．８２ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）を加えてから室温下で５０分間撹拌を続けた。半飽和の塩化アンモニウム水溶液（５０ｍＬ）を加えて反応を停止した後、混合物を酢酸エチル（１６０ｍＬ＋８０ｍＬ）で抽出した。有機層をまとめて飽和食塩水（８０ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。綿栓ろ過した溶液を減圧下で濃縮し、次工程に使用可能な粗生成物（６．６７ｇ）を得た。
３，６，９，１２－テトラオキサペンタデカ－１４－イン－１－オール（化合物１、３．８７ｇ、１６．７ｍｍｏｌ）のジエチルエーテル溶液（２５ｍＬ）に水酸化カリウム（２．８５ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。０℃で１０分間撹拌後、塩化パラトルエンスルホニル（３．８２ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）を加えてから室温下で５０分間撹拌を続けた。半飽和の塩化アンモニウム水溶液（５０ｍＬ）を加えて反応を停止した後、混合物を酢酸エチル（１６０ｍＬ＋８０ｍＬ）で抽出した。有機層をまとめて飽和食塩水（８０ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。綿栓ろ過した溶液を減圧下で濃縮し、次工程に使用可能な粗生成物（６．６７ｇ）を得た。
【0043】
粗生成物（粗トシル酸エステル）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液（２０ｍＬ）に酢酸Ｓ－カリウム（２．３０ｇ,２０．０ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。室温下で２．５時間撹拌後、飽和の炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）を加えて反応を停止した。生じた混合物を綿栓ろ過し、濾過液をジエチルエーテル（４×１００ｍＬ）で抽出した。有機層をまとめて飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。綿栓ろ過した溶液を減圧下で濃縮して得られた粗生成物（１０．７ｇ）をフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲル５０g、ノルマルヘキサン／酢酸エチル ３：１→酢酸エチル)で精製し、チオ酢酸Ｓ－３，６，９，１２－テトラオキサペンタデカ－１４－イン－１－イル（化合物２、３．５４ｇ，二工程収率７３％）を橙色油状化合物として得た。
【0044】
（化合物２の化合物データ）
Rf 0.63 (AcOEt); IR (neat) 3259, 2869, 2113, 1692, 1456, 1353, 1292, 1249, 1105, 1034, 954 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.34 (s, 3H), 2.43 (t, J = 2.3 Hz, 1H), 3.09 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.60 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.63-3.72 (m, 12H), 4.21 (d, J = 2.3 Hz, 2H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 28.8, 30.5, 58.4, 69.1, 69.7, 70.3, 70.4, 70.5, 70.6, 74.4, 74.5, 79.6, 195.5; HRMS (FAB) m/z [M + H]+ calcd for C13H23O5S 291.1261; found 291.1238.
Rf 0.63 (AcOEt); IR (neat) 3259, 2869, 2113, 1692, 1456, 1353, 1292, 1249, 1105, 1034, 954 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.34 (s, 3H), 2.43 (t, J = 2.3 Hz, 1H), 3.09 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.60 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.63-3.72 (m, 12H), 4.21 (d, J = 2.3 Hz, 2H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 28.8, 30.5, 58.4, 69.1, 69.7, 70.3, 70.4, 70.5, 70.6, 74.4, 74.5, 79.6, 195.5; HRMS (FAB) m/z [M + H]+ calcd for C13H23O5S 291.1261; found 291.1238.
【0045】
＜化合物３の合成＞
化合物２（６２０ｍｇ，２．１３ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（１０ｍＬ）にナトリウムメトキシド（３４７ｍｇ，６．４２ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。室温下で１．５時間撹拌後、陽イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ ５０Ｗｘ８）を加えて反応液を中和した。セライトろ過した後、濾液を減圧下で濃縮し、次工程に使用可能な粗生成物（７３４ｍｇ）を得た。
化合物２（６２０ｍｇ，２．１３ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（１０ｍＬ）にナトリウムメトキシド（３４７ｍｇ，６．４２ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。室温下で１．５時間撹拌後、陽イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ ５０Ｗｘ８）を加えて反応液を中和した。セライトろ過した後、濾液を減圧下で濃縮し、次工程に使用可能な粗生成物（７３４ｍｇ）を得た。
【0046】
ＧＯ－Ｙ０３０（１．０２ｇ，２．１４ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（０．３５ｍＬ，２．５２ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（６．０ｍＬ）に溶解させた。粗チオールのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液（１２ｍＬ＋洗浄用２ｍＬ）を２３℃でゆっくりと加えた。同温度（２３℃）下で２時間撹拌後、水（５０ｍＬ）を加えた。生じた混合物をジエチルエーテル（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機層をまとめて飽和食塩水（１５０ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。綿栓ろ過した溶液を減圧下で濃縮して得られた粗生成物（１．８９ｇ）をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル５０ｇ、ノルマルヘキサン／酢酸エチル １：１）で精製し、ＧＯ－Ｙ０３０－ＳＰＥＧ４－ａｌｋｙｎｅ（化合物３、７７６ｍｇ、収率５０％）を淡黄色油状化合物として得た。
【0047】
ここで上記の反応に用いたＧＯ－ＹＯ３０は（１Ｅ，４Ｅ）－１，５－ビス－［３，５－ビス（メトキシメトキシ）フェニル］ペンタジエン－３－オンである。ＧＯ－ＹＯ３０の合成方法は特許文献１に記載されている。
【0048】
（化合物３の化合物データ）
Rf 0.15 (n-Hexane/AcOEt 1:1); IR (neat) 3279, 2901, 2827, 2114, 1688, 1663, 1592, 1454, 1401, 1332, 1281, 1248, 1215, 1146, 1185, 1033, 965 cm-1; 1H NMR (400 MHz, acetone-d6) δ 2.56 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.92 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 3.22 (dd, J = 7.3, 16.4 Hz, 1H), 3.30 (dd, J = 7.3, 16.4 Hz, 1H), 3.41 (s, 6H), 3.43 (s, 6H), 3.50-3.61 (m, 14H), 4.54 (d, J = 2.5 Hz, 2H), 4.53 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 5.16 (s, 4H), 5.22 (s, 4H), 6.59 (t, J = 2.2 Hz, 1H), 6.76 (t, J = 2.3 Hz, 1H), 6.78 (d, J = 2.3 Hz, 2H), 6.82 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 7.00 (d, J = 2.3 Hz, 2H), 7.57 (d, J = 15.9 Hz, 1H); 13C NMR (150 MHz, acetone-d6) δ 31.3, 45.6, 47.5, 56.1, 56.2, 58.5, 69.8, 70.9, 71.0, 71.2, 71.6, 75.7, 81.0, 95.1, 95.2, 104.1, 107.7, 110.20, 110.23, 127.8, 137.7, 143.1, 145.7, 159.3, 159.6, 197.0; HRMS (FAB) m/z [M + H]+ calcd for C36H51O13S 723.3045; found 723.3062.
Rf 0.15 (n-Hexane/AcOEt 1:1); IR (neat) 3279, 2901, 2827, 2114, 1688, 1663, 1592, 1454, 1401, 1332, 1281, 1248, 1215, 1146, 1185, 1033, 965 cm-1; 1H NMR (400 MHz, acetone-d6) δ 2.56 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.92 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 3.22 (dd, J = 7.3, 16.4 Hz, 1H), 3.30 (dd, J = 7.3, 16.4 Hz, 1H), 3.41 (s, 6H), 3.43 (s, 6H), 3.50-3.61 (m, 14H), 4.54 (d, J = 2.5 Hz, 2H), 4.53 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 5.16 (s, 4H), 5.22 (s, 4H), 6.59 (t, J = 2.2 Hz, 1H), 6.76 (t, J = 2.3 Hz, 1H), 6.78 (d, J = 2.3 Hz, 2H), 6.82 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 7.00 (d, J = 2.3 Hz, 2H), 7.57 (d, J = 15.9 Hz, 1H); 13C NMR (150 MHz, acetone-d6) δ 31.3, 45.6, 47.5, 56.1, 56.2, 58.5, 69.8, 70.9, 71.0, 71.2, 71.6, 75.7, 81.0, 95.1, 95.2, 104.1, 107.7, 110.20, 110.23, 127.8, 137.7, 143.1, 145.7, 159.3, 159.6, 197.0; HRMS (FAB) m/z [M + H]+ calcd for C36H51O13S 723.3045; found 723.3062.
【0049】
＜ＧＯ－Ｙ１９３の合成＞
化合物３（２１４ ｍｇ,２９６μｍｏｌ）とアジド（３５８ｍｇ，１．７５ｍｍｏｌ）を含水テトラヒドロフラン（８．１ｍＬ，テトラヒドロフラン：水＝１００：１）に溶解させた。２－チオフェンカルボン酸銅（４．１ｍｇ，２１．５μｍｏｌ）を加えた後、室温下で２時間撹拌した。反応溶液を減圧下で濃縮して得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル２．４ｇ，クロロホルム／メタノール１９：１→９：１）で精製し、ＧＯ－Ｙ１９３（６２．０ｍｇ，収率２３％）を無色アモルファスとして得た。
化合物３（２１４ ｍｇ,２９６μｍｏｌ）とアジド（３５８ｍｇ，１．７５ｍｍｏｌ）を含水テトラヒドロフラン（８．１ｍＬ，テトラヒドロフラン：水＝１００：１）に溶解させた。２－チオフェンカルボン酸銅（４．１ｍｇ，２１．５μｍｏｌ）を加えた後、室温下で２時間撹拌した。反応溶液を減圧下で濃縮して得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル２．４ｇ，クロロホルム／メタノール１９：１→９：１）で精製し、ＧＯ－Ｙ１９３（６２．０ｍｇ，収率２３％）を無色アモルファスとして得た。
【0050】
（ＧＯ－Ｙ１９３の化合物データ）
Rf 0.67 (CHCl3/MeOH 4:1); IR (neat) 3398, 1688, 1660, 1593, 1455, 1401, 1281, 1215, 1146, 1085, 1033, 924 cm-1; 1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 2.55 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.18 (dd, J = 7.0, 16.1 Hz, 1H), 3.24 (dd, J = 7.9, 16.1 Hz, 1H), 3.41 (s, 6H), 3.44 (s, 6H), 3.50-3.64 (m, 17H), 3.72 (dd, J = 5.5, 12.2 Hz, 1H), 3.88 (dd, J = 2.0, 12.2 Hz, 1H), 3.90 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 4.47 (dd, J = 7.0, 7.9 Hz, 1H), 4.62 (s, 2H), 5.12 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 5.13 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 5.18 (s, 4H), 5.60 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 6.59 (t, J = 2.2 Hz, 1H), 6.75 (d, J = 16.1 Hz, 1H), 6.76 (t, J = 2.2 Hz, 1H), 6.76 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 6.92 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 7.48 (d, J = 16.1 Hz, 1H), 8.15 (s, 1H); 13C NMR (150 MHz, CD3OD) δ 31.6 (CH2), 46.4 (CH), 48.0 (CH2), 56.3 (CH3), 56.4 (CH3), 62.4 (CH2), 64.9 (CH2), 70.8 (CH2), 70.9 (CH), 71.3 (CH2), 71.51 (CH2), 71.53 (CH2), 71.55 (CH2), 72.0 (CH2), 74.0 (CH), 78.5 (CH), 81.1 (CH), 89.5 (CH), 95.5 (CH2), 95.6 (CH2), 104.7 (CH), 108.2 (CH), 110.6 (CH), 110.7 (CH), 124.3 (CH), 127.8 (CH), 137.9 (C), 144.6 (CH), 145.8 (C), 146.1 (C), 159.7 (C), 160.0 (C), 199.5 (C); HRMS (FAB) m/z [M + H]+ calcd for C42H62N3O18S 928.37442; found 928.3762.
Rf 0.67 (CHCl3/MeOH 4:1); IR (neat) 3398, 1688, 1660, 1593, 1455, 1401, 1281, 1215, 1146, 1085, 1033, 924 cm-1; 1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 2.55 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.18 (dd, J = 7.0, 16.1 Hz, 1H), 3.24 (dd, J = 7.9, 16.1 Hz, 1H), 3.41 (s, 6H), 3.44 (s, 6H), 3.50-3.64 (m, 17H), 3.72 (dd, J = 5.5, 12.2 Hz, 1H), 3.88 (dd, J = 2.0, 12.2 Hz, 1H), 3.90 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 4.47 (dd, J = 7.0, 7.9 Hz, 1H), 4.62 (s, 2H), 5.12 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 5.13 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 5.18 (s, 4H), 5.60 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 6.59 (t, J = 2.2 Hz, 1H), 6.75 (d, J = 16.1 Hz, 1H), 6.76 (t, J = 2.2 Hz, 1H), 6.76 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 6.92 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 7.48 (d, J = 16.1 Hz, 1H), 8.15 (s, 1H); 13C NMR (150 MHz, CD3OD) δ 31.6 (CH2), 46.4 (CH), 48.0 (CH2), 56.3 (CH3), 56.4 (CH3), 62.4 (CH2), 64.9 (CH2), 70.8 (CH2), 70.9 (CH), 71.3 (CH2), 71.51 (CH2), 71.53 (CH2), 71.55 (CH2), 72.0 (CH2), 74.0 (CH), 78.5 (CH), 81.1 (CH), 89.5 (CH), 95.5 (CH2), 95.6 (CH2), 104.7 (CH), 108.2 (CH), 110.6 (CH), 110.7 (CH), 124.3 (CH), 127.8 (CH), 137.9 (C), 144.6 (CH), 145.8 (C), 146.1 (C), 159.7 (C), 160.0 (C), 199.5 (C); HRMS (FAB) m/z [M + H]+ calcd for C42H62N3O18S 928.37442; found 928.3762.
【0051】
＜ＧＯ－Ｙ１９７の合成＞
化合物３（３７２ｍｇ，５１５μｍｏｌ）、アジド（１６４ｍｇ，７９９μｍｏｌ）、含水テトラヒドロフラン（１０ｍＬ，テトラヒドロフラン：水＝１００：１）、２－チオフェンカルボン酸銅（５．２ｍｇ，２７．３μｍｏｌ）を使用した。反応溶液を減圧下で濃縮して得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ，酢酸エチル→酢酸エチル／メタノール９：１）で精製し、ＧＯ－Ｙ１９７（３０７ｍｇ，収率６４％）を無色アモルファスとして得た。
化合物３（３７２ｍｇ，５１５μｍｏｌ）、アジド（１６４ｍｇ，７９９μｍｏｌ）、含水テトラヒドロフラン（１０ｍＬ，テトラヒドロフラン：水＝１００：１）、２－チオフェンカルボン酸銅（５．２ｍｇ，２７．３μｍｏｌ）を使用した。反応溶液を減圧下で濃縮して得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ，酢酸エチル→酢酸エチル／メタノール９：１）で精製し、ＧＯ－Ｙ１９７（３０７ｍｇ，収率６４％）を無色アモルファスとして得た。
【0052】
（ＧＯ－Ｙ１９７の化合物データ）
Rf 0.10 (AcOEt/MeOH 9:1); IR (neat) 3399, 2903, 1662, 1593, 1455, 1401, 1281, 1215, 1146, 1085, 1033, 924 cm-1; 1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 2.53 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.18 (dd, J = 6.9, 16.0 Hz, 1H), 3.23 (dd, J = 7.9, 16.0 Hz, 1H), 3.39 (s, 6H), 3.42 (s, 6H), 3.50-3.62 (m, 17H), 3.71 (dd, J = 5.1, 12.2 Hz, 1H), 3.87 (d, J = 12.2 Hz, 1H), 3.91 (t, J = 9.1 Hz, 1H), 4.46 (dd, J = 6.9, 7.9 Hz, 1H), 4.61 (s, 2H), 5.11 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 5.15 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 5.16 (s, 4H), 5.61 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 6.58 (t, J = 2.0 Hz, 1H), 6.73 (d, J = 16.1 Hz, 1H), 6.75 (t, J = 2.1 Hz, 1H), 6.75 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.91 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 7.46 (d, J = 16.1 Hz, 1H), 8.19 (s, 1H); 13C NMR (150 MHz, CD3OD) δ 31.6 (CH2), 46.3 (CH), 48.0 (CH2), 56.38 (CH3), 56.43 (CH3), 62.4 (CH2), 65.0 (CH2), 70.78 (CH2), 70.82 (CH), 71.2 (CH2), 71.43 (CH2), 71.46 (CH2), 71.49 (CH2), 71.9 (CH2), 74.0 (CH), 78.4 (CH), 81.1 (CH), 89.6 (CH), 95.5 (CH2), 95.6 (CH2), 104.7 (CH), 108.2 (CH), 110.6 (CH), 110.7 (CH), 124.8 (CH), 127.8 (CH), 137.9 (C), 144.5 (CH), 145.8 (C), 159.7 (C), 159.9 (C), 199.4 (C); HRMS (FAB) m/z [M + H]+ calcd for C42H62N3O18S 928.3744; found 928.3742.
Rf 0.10 (AcOEt/MeOH 9:1); IR (neat) 3399, 2903, 1662, 1593, 1455, 1401, 1281, 1215, 1146, 1085, 1033, 924 cm-1; 1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 2.53 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.18 (dd, J = 6.9, 16.0 Hz, 1H), 3.23 (dd, J = 7.9, 16.0 Hz, 1H), 3.39 (s, 6H), 3.42 (s, 6H), 3.50-3.62 (m, 17H), 3.71 (dd, J = 5.1, 12.2 Hz, 1H), 3.87 (d, J = 12.2 Hz, 1H), 3.91 (t, J = 9.1 Hz, 1H), 4.46 (dd, J = 6.9, 7.9 Hz, 1H), 4.61 (s, 2H), 5.11 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 5.15 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 5.16 (s, 4H), 5.61 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 6.58 (t, J = 2.0 Hz, 1H), 6.73 (d, J = 16.1 Hz, 1H), 6.75 (t, J = 2.1 Hz, 1H), 6.75 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.91 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 7.46 (d, J = 16.1 Hz, 1H), 8.19 (s, 1H); 13C NMR (150 MHz, CD3OD) δ 31.6 (CH2), 46.3 (CH), 48.0 (CH2), 56.38 (CH3), 56.43 (CH3), 62.4 (CH2), 65.0 (CH2), 70.78 (CH2), 70.82 (CH), 71.2 (CH2), 71.43 (CH2), 71.46 (CH2), 71.49 (CH2), 71.9 (CH2), 74.0 (CH), 78.4 (CH), 81.1 (CH), 89.6 (CH), 95.5 (CH2), 95.6 (CH2), 104.7 (CH), 108.2 (CH), 110.6 (CH), 110.7 (CH), 124.8 (CH), 127.8 (CH), 137.9 (C), 144.5 (CH), 145.8 (C), 159.7 (C), 159.9 (C), 199.4 (C); HRMS (FAB) m/z [M + H]+ calcd for C42H62N3O18S 928.3744; found 928.3742.
【0053】
＜ＧＯ－Ｙ１９８の合成＞
化合物３（２４７ｍｇ，３４２μｍｏｌ）、アジド（１２７ｍｇ，３４０μｍｏｌ）、含水テトラヒドロフラン（７．０ｍＬ，テトラヒドロフラン：水＝１００：１）、２－チオフェンカルボン酸銅（５．２ｍｇ，２７．３μｍｏｌ）を使用した。反応溶液を減圧下で濃縮して得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル２．３ｇ,クロロホルム／メタノール１９：１→９：１）で精製し、ＧＯ－Ｙ１９８（１０２ｍｇ，収率３２％）を無色アモルファスとして得た。
化合物３（２４７ｍｇ，３４２μｍｏｌ）、アジド（１２７ｍｇ，３４０μｍｏｌ）、含水テトラヒドロフラン（７．０ｍＬ，テトラヒドロフラン：水＝１００：１）、２－チオフェンカルボン酸銅（５．２ｍｇ，２７．３μｍｏｌ）を使用した。反応溶液を減圧下で濃縮して得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル２．３ｇ,クロロホルム／メタノール１９：１→９：１）で精製し、ＧＯ－Ｙ１９８（１０２ｍｇ，収率３２％）を無色アモルファスとして得た。
【0054】
（ＧＯ－Ｙ１９８の化合物データ）
Rf 0.13 (AcOEt/MeOH 9:1); IR (neat) 3399, 2903, 1685, 1654, 1593, 1456, 1400, 1332, 1281, 1215, 1146, 1084, 1033, 924 cm-1; 1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 2.53 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.16 (dd, J = 7.0, 15.8 Hz, 1H), 3.20 (dd, J = 7.9, 15.8 Hz, 1H), 3.39 (s, 6H), 3.43 (s, 6H), 3.49-3.52 (m, 4H), 3.55-3.63 (m, 11H), 3.72-3.82 (m, 3H), 4.07 (dd, J = 3.3, 8.7 Hz, 1H), 4.45 (dd, J = 6.9, 7.9 Hz, 1H), 4.68 (t, J = 3.3 Hz, 1H), 4.80 (s, 2H), 5.11 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 5.14 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 5.16 (s, 4H), 6.02 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 6.57 (t, J = 2.1 Hz, 1H), 6.72 (d, J = 16.1 Hz, 1H), 6.74 (t, J = 2.1 Hz, 1H), 6.74 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.90 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 7.46 (d, J = 16.1 Hz, 1H), 8.12 (s, 1H); 13C NMR (150 MHz, CD3OD) δ 31.6 (CH2), 46.3 (CH), 48.0 (CH2), 56.37 (CH3), 56.42 (CH3), 62.5 (CH2), 64.9 (CH2), 68.5 (CH), 70.1 (CH), 70.8 (CH2), 71.2 (CH2), 71.45 (CH2), 71.48 (CH2), 71.51 (CH2), 71.9 (CH2), 72.5 (CH), 78.5 (CH), 88.3 (CH), 95.5 (CH2), 95.6 (CH2), 104.7 (CH), 108.2 (CH), 110.6 (CH), 110.7 (CH), 125.0 (CH), 127.8 (CH), 137.9 (C), 144.5 (CH), 145.8 (C), 146.3 (C), 159.7 (C), 159.9 (C), 199.3 (C); HRMS (FAB) m/z [M + H]+ calcd for C42H62N3O18S 928.3744; found 928.3752.
Rf 0.13 (AcOEt/MeOH 9:1); IR (neat) 3399, 2903, 1685, 1654, 1593, 1456, 1400, 1332, 1281, 1215, 1146, 1084, 1033, 924 cm-1; 1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 2.53 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.16 (dd, J = 7.0, 15.8 Hz, 1H), 3.20 (dd, J = 7.9, 15.8 Hz, 1H), 3.39 (s, 6H), 3.43 (s, 6H), 3.49-3.52 (m, 4H), 3.55-3.63 (m, 11H), 3.72-3.82 (m, 3H), 4.07 (dd, J = 3.3, 8.7 Hz, 1H), 4.45 (dd, J = 6.9, 7.9 Hz, 1H), 4.68 (t, J = 3.3 Hz, 1H), 4.80 (s, 2H), 5.11 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 5.14 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 5.16 (s, 4H), 6.02 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 6.57 (t, J = 2.1 Hz, 1H), 6.72 (d, J = 16.1 Hz, 1H), 6.74 (t, J = 2.1 Hz, 1H), 6.74 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.90 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 7.46 (d, J = 16.1 Hz, 1H), 8.12 (s, 1H); 13C NMR (150 MHz, CD3OD) δ 31.6 (CH2), 46.3 (CH), 48.0 (CH2), 56.37 (CH3), 56.42 (CH3), 62.5 (CH2), 64.9 (CH2), 68.5 (CH), 70.1 (CH), 70.8 (CH2), 71.2 (CH2), 71.45 (CH2), 71.48 (CH2), 71.51 (CH2), 71.9 (CH2), 72.5 (CH), 78.5 (CH), 88.3 (CH), 95.5 (CH2), 95.6 (CH2), 104.7 (CH), 108.2 (CH), 110.6 (CH), 110.7 (CH), 125.0 (CH), 127.8 (CH), 137.9 (C), 144.5 (CH), 145.8 (C), 146.3 (C), 159.7 (C), 159.9 (C), 199.3 (C); HRMS (FAB) m/z [M + H]+ calcd for C42H62N3O18S 928.3744; found 928.3752.
【0055】
＜ＧＯ－Ｙ１９９の合成＞
化合物３（２１４ｍｇ，２９６μｍｏｌ）、アジド（１０９ｍｇ，２９６μｍｏｌ）、含水テトラヒドロフラン（６．０ｍＬ，テトラヒドロフラン：水＝１００：１）、２－チオフェンカルボン酸銅（６．２ｍｇ，３２．５μｍｏｌ）を使用した。反応溶液を減圧下で濃縮して得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（二度：シリカゲル３ｇ,クロロホルム／メタノール９：１→４：１，シリカゲル２．３ｇ，クロロホルム／メタノール９：１→１７：３）で精製し、ＧＯ－Ｙ１９９（１９９ｍｇ，収率６２％）を無色アモルファスとして得た。
化合物３（２１４ｍｇ，２９６μｍｏｌ）、アジド（１０９ｍｇ，２９６μｍｏｌ）、含水テトラヒドロフラン（６．０ｍＬ，テトラヒドロフラン：水＝１００：１）、２－チオフェンカルボン酸銅（６．２ｍｇ，３２．５μｍｏｌ）を使用した。反応溶液を減圧下で濃縮して得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（二度：シリカゲル３ｇ,クロロホルム／メタノール９：１→４：１，シリカゲル２．３ｇ，クロロホルム／メタノール９：１→１７：３）で精製し、ＧＯ－Ｙ１９９（１９９ｍｇ，収率６２％）を無色アモルファスとして得た。
【0056】
（ＧＯ－Ｙ１９９の化合物データ）
Rf 0.20 (CHCl3/MeOH 4:1); IR (neat) 3389, 1660, 1593, 1455, 1440, 1401, 1333, 1281, 1241, 1215, 1146, 1084, 1034, 924 cm-1; 1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 2.55 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 3.18 (dd, J = 7.1, 15.9 Hz, 1H), 3.23 (dd, J = 7.9, 15.9 Hz, 1H), 3.41 (s, 6H), 3.45 (s, 6H), 3.47-3.64 (m, 17H), 3.74-3.83 (m, 6H), 3.89 (m, 2H), 3.97 (t, J = 9.1 Hz, 1H), 4.41 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.47 (dd J = 6.6, 7.9 Hz, 1H), 4.62 (s, 2H), 5.12 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 5.14 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 5.18 (s, 4H), 5.63 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 6.58 (t, J = 2.2 Hz, 1H), 6.74 (d, J = 16.2 Hz, 1H), 6.76 (t, J = 2.1 Hz, 1H), 6.76 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 6.92 (d, J = 2.1 Hz, 2H), 7.48 (d, J = 16.2 Hz, 1H), 8.16 (s, 1H); 13C NMR (150 MHz, CD3OD) δ 31.6 (CH2), 46.4 (CH), 48.1 (CH2), 56.3 (CH3), 56.4 (CH3), 61.6 (CH2), 62.5 (CH2), 65.0 (CH2), 70.3 (CH), 70.8 (CH2), 71.3 (CH2), 71.51 (CH2), 71.56 (CH2), 71.57 (CH2), 71.59 (CH2), 72.0 (CH2), 72.5 (CH), 73.7 (CH), 74.9 (CH), 76.9 (CH), 77.1 (CH), 79.6 (CH), 79.8 (CH), 89.3 (CH), 95.56 (CH2), 95.62 (CH2), 104.8 (CH), 105.1 (CH), 108.2 (CH), 110.65 (CH), 110.72 (CH), 124.3 (CH), 127.8 (CH), 137.9 (C), 144.6 (CH), 145.8 (C), 146.1 (C), 159.8 (C), 160.0 (C), 199.6 (C); HRMS (FAB) m/z [M + H]+ calcd for C48H72N3O23S 1090.4272; found 1090.4265.
Rf 0.20 (CHCl3/MeOH 4:1); IR (neat) 3389, 1660, 1593, 1455, 1440, 1401, 1333, 1281, 1241, 1215, 1146, 1084, 1034, 924 cm-1; 1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 2.55 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 3.18 (dd, J = 7.1, 15.9 Hz, 1H), 3.23 (dd, J = 7.9, 15.9 Hz, 1H), 3.41 (s, 6H), 3.45 (s, 6H), 3.47-3.64 (m, 17H), 3.74-3.83 (m, 6H), 3.89 (m, 2H), 3.97 (t, J = 9.1 Hz, 1H), 4.41 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.47 (dd J = 6.6, 7.9 Hz, 1H), 4.62 (s, 2H), 5.12 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 5.14 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 5.18 (s, 4H), 5.63 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 6.58 (t, J = 2.2 Hz, 1H), 6.74 (d, J = 16.2 Hz, 1H), 6.76 (t, J = 2.1 Hz, 1H), 6.76 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 6.92 (d, J = 2.1 Hz, 2H), 7.48 (d, J = 16.2 Hz, 1H), 8.16 (s, 1H); 13C NMR (150 MHz, CD3OD) δ 31.6 (CH2), 46.4 (CH), 48.1 (CH2), 56.3 (CH3), 56.4 (CH3), 61.6 (CH2), 62.5 (CH2), 65.0 (CH2), 70.3 (CH), 70.8 (CH2), 71.3 (CH2), 71.51 (CH2), 71.56 (CH2), 71.57 (CH2), 71.59 (CH2), 72.0 (CH2), 72.5 (CH), 73.7 (CH), 74.9 (CH), 76.9 (CH), 77.1 (CH), 79.6 (CH), 79.8 (CH), 89.3 (CH), 95.56 (CH2), 95.62 (CH2), 104.8 (CH), 105.1 (CH), 108.2 (CH), 110.65 (CH), 110.72 (CH), 124.3 (CH), 127.8 (CH), 137.9 (C), 144.6 (CH), 145.8 (C), 146.1 (C), 159.8 (C), 160.0 (C), 199.6 (C); HRMS (FAB) m/z [M + H]+ calcd for C48H72N3O23S 1090.4272; found 1090.4265.
【0057】
＜ＧＯ－Ｙ２００の合成＞
化合物３（２２６ｍｇ，３１３μｍｏｌ）、アジド（１６０ｍｇ，４３６μｍｏｌ）、含水テトラヒドロフラン（１０ｍＬ，テトラヒドロフラン：水＝１００：１）、２－チオフェンカルボン酸銅（３．３ｍｇ，１７．３μｍｏｌ）を使用した。反応溶液を減圧下で濃縮して得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル５．５ｇ，クロロホルム／メタノール９：１→１７：３）で精製し、ＧＯ－Ｙ２００（１３３ｍｇ，収率３５％）を無色アモルファスとして得た。
化合物３（２２６ｍｇ，３１３μｍｏｌ）、アジド（１６０ｍｇ，４３６μｍｏｌ）、含水テトラヒドロフラン（１０ｍＬ，テトラヒドロフラン：水＝１００：１）、２－チオフェンカルボン酸銅（３．３ｍｇ，１７．３μｍｏｌ）を使用した。反応溶液を減圧下で濃縮して得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル５．５ｇ，クロロホルム／メタノール９：１→１７：３）で精製し、ＧＯ－Ｙ２００（１３３ｍｇ，収率３５％）を無色アモルファスとして得た。
【0058】
（ＧＯ－Ｙ２００の化合物データ）
Rf 0.08 (CHCl3/MeOH 8:1); IR (neat) 3386, 2904, 1684, 1661, 1594, 1541, 1506, 1456, 1400, 1334, 1281, 1216, 1146, 1084, 1033, 968 cm-1; 1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 2.56 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.18 (dd, J = 6.9, 16.0 Hz, 1H), 3.24 (dd, J = 7.9, 16.0 Hz, 1H), 3.42 (s, 6H), 3.46 (s, 6H), 3.48 (m, 1H), 3.53-3.56 (m, 4H), 3.59-3.70 (m, 12H), 3.76 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 3.82-3.90 (m, 4H), 3.96 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 4.48 (dd J = 6.9, 7.9 Hz, 1H), 4.63 (s, 2H), 5.13 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 5.15 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 5.19 (s, 4H), 5.24 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 5.63 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.59 (t, J = 2.2 Hz, 1H), 6.75 (d, J = 16.3 Hz, 1H), 6.77 (t, J = 2.2 Hz, 1H), 6.77 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 6.94 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 7.49 (d, J = 16.3 Hz, 1H), 8.17 (s, 1H); 13C NMR (150 MHz, CD3OD) δ 31.6 (CH2), 46.4 (CH), 48.1 (CH2), 56.3 (CH3), 56.4 (CH3), 61.9 (CH2), 62.8 (CH2), 65.0 (CH2), 70.8 (CH-), 71.3 (CH2), 71.53 (CH), 71.57 (CH2), 71.58 (CH2), 71.60 (CH2), 72.1 (CH2), 73.6 (CH), 74.2 (CH), 74.9 (CH), 75.1 (CH), 78.2 (CH), 79.7 (CH), 80.4 (CH), 89.4 (CH), 95.57 (CH2), 95.63 (CH2), 103.0 (CH), 104.8 (CH), 108.2 (CH), 110.66 (CH), 110.72 (CH), 124.3 (CH), 127.8 (CH), 138.0 (C), 144.6 (CH), 145.8 (C), 146.1 (C), 159.8 (C), 160.0 (C), 199.6 (C); HRMS (FAB) m/z [M + H]+ calcd for C48H72N3O23S 1090.4272; found 1090.4303.
Rf 0.08 (CHCl3/MeOH 8:1); IR (neat) 3386, 2904, 1684, 1661, 1594, 1541, 1506, 1456, 1400, 1334, 1281, 1216, 1146, 1084, 1033, 968 cm-1; 1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 2.56 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.18 (dd, J = 6.9, 16.0 Hz, 1H), 3.24 (dd, J = 7.9, 16.0 Hz, 1H), 3.42 (s, 6H), 3.46 (s, 6H), 3.48 (m, 1H), 3.53-3.56 (m, 4H), 3.59-3.70 (m, 12H), 3.76 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 3.82-3.90 (m, 4H), 3.96 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 4.48 (dd J = 6.9, 7.9 Hz, 1H), 4.63 (s, 2H), 5.13 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 5.15 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 5.19 (s, 4H), 5.24 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 5.63 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.59 (t, J = 2.2 Hz, 1H), 6.75 (d, J = 16.3 Hz, 1H), 6.77 (t, J = 2.2 Hz, 1H), 6.77 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 6.94 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 7.49 (d, J = 16.3 Hz, 1H), 8.17 (s, 1H); 13C NMR (150 MHz, CD3OD) δ 31.6 (CH2), 46.4 (CH), 48.1 (CH2), 56.3 (CH3), 56.4 (CH3), 61.9 (CH2), 62.8 (CH2), 65.0 (CH2), 70.8 (CH-), 71.3 (CH2), 71.53 (CH), 71.57 (CH2), 71.58 (CH2), 71.60 (CH2), 72.1 (CH2), 73.6 (CH), 74.2 (CH), 74.9 (CH), 75.1 (CH), 78.2 (CH), 79.7 (CH), 80.4 (CH), 89.4 (CH), 95.57 (CH2), 95.63 (CH2), 103.0 (CH), 104.8 (CH), 108.2 (CH), 110.66 (CH), 110.72 (CH), 124.3 (CH), 127.8 (CH), 138.0 (C), 144.6 (CH), 145.8 (C), 146.1 (C), 159.8 (C), 160.0 (C), 199.6 (C); HRMS (FAB) m/z [M + H]+ calcd for C48H72N3O23S 1090.4272; found 1090.4303.
【0059】
＜ＧＯ－Ｙ２０６の合成＞
化合物３（１４８ｍｇ，２０５μｍｏｌ）、アジド（α：β＝１：０．７，１１６ｍｇ，６１３μｍｏｌ）、含水テトラヒドロフラン（４．０ｍＬ，テトラヒドロフラン：水＝１００：１）、２－チオフェンカルボン酸銅（８．８ｍｇ，４６．２μｍｏｌ）を使用した。反応溶液を減圧下で濃縮して得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル５．０ｇ,クロロホルム／メタノール１：０→１００：３→１０：１）で精製し、ＧＯ－Ｙ２０６（１１３ｍｇ，収率６１％）を無色油状物質として得た。なお、図５ではβ－デオキシグルコースが結合している化合物のみを示しているが、ＧＯ－Ｙ２０６はα－デオキシグルコースが結合している化合物も含む。
化合物３（１４８ｍｇ，２０５μｍｏｌ）、アジド（α：β＝１：０．７，１１６ｍｇ，６１３μｍｏｌ）、含水テトラヒドロフラン（４．０ｍＬ，テトラヒドロフラン：水＝１００：１）、２－チオフェンカルボン酸銅（８．８ｍｇ，４６．２μｍｏｌ）を使用した。反応溶液を減圧下で濃縮して得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル５．０ｇ,クロロホルム／メタノール１：０→１００：３→１０：１）で精製し、ＧＯ－Ｙ２０６（１１３ｍｇ，収率６１％）を無色油状物質として得た。なお、図５ではβ－デオキシグルコースが結合している化合物のみを示しているが、ＧＯ－Ｙ２０６はα－デオキシグルコースが結合している化合物も含む。
【0060】
（ＧＯ－Ｙ２０６の化合物データ）
Rf 0.13 (AcOEt/MeOH 9:1); IR (neat) 3416, 2902, 1687, 1661, 1593, 1454, 1400, 1332, 1281, 1215, 1146, 1084, 1033, 924 cm-1; 1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 2.19 (q, J = 11.8 Hz, 1H), 2.43 (ddd, J = 2.0, 4.8, 11.8 Hz, 1H), 2.52 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.18 (dd, J = 7.0, 16.0 Hz, 1H), 3.23 (dd, J = 7.4, 16.0 Hz, 1H), 3.39 (t, J = 9.3 Hz, 1H), 3.40 (s, 6H), 3.43 (s, 6H), 3.49-3.63 (m, 15H), 3.72 (dd, J = 5.4, 12.0 Hz, 1H), 3.79 (m, 1H), 3.89 (dd, J = 2.3, 12.0 Hz, 1H), 4.46 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 4.60 (s, 2H), 5.11 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 5.13 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 5.17 (s, 4H), 5.90 (dd, J = 2.0, 11.8 Hz, 1H), 6.58 (t, J = 2.2 Hz, 1H), 6.74 (d, J = 16.1 Hz, 1H), 6.75 (m, 3H), 6.91 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 7.48 (d, J = 16.1 Hz, 1H), 8.15 (s, 1H); 13C NMR (150 MHz, CD3OD) δ 31.6 (CH2), 39.4 (CH2), 46.3 (CH), 48.0 (CH2), 56.8 (CH3), 56.43 (CH3), 62.5 (CH2), 64.9 (CH2), 70.8 (CH2), 71.2 (CH2), 71.45 (CH2), 71.49 (CH2), 71.51 (CH2), 71.53 (CH2), 71.9 (CH2), 72.3 (CH), 72.4 (CH), 81.0 (CH), 85.6 (CH), 95.5 (CH2), 95.6 (CH2), 104.7 (CH), 108.2 (CH), 110.6 (CH), 110.7 (CH), 123.8 (CH), 127.8 (CH), 137.9 (C), 144.5 (CH), 145.8 (C), 146.1 (C), 159.7 (C), 159.9 (C), 199.3 (C); HRMS (FAB) m/z [M + H]+ calcd for C42H62N3O17S 912.3794; found 912.3803.
Rf 0.13 (AcOEt/MeOH 9:1); IR (neat) 3416, 2902, 1687, 1661, 1593, 1454, 1400, 1332, 1281, 1215, 1146, 1084, 1033, 924 cm-1; 1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 2.19 (q, J = 11.8 Hz, 1H), 2.43 (ddd, J = 2.0, 4.8, 11.8 Hz, 1H), 2.52 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.18 (dd, J = 7.0, 16.0 Hz, 1H), 3.23 (dd, J = 7.4, 16.0 Hz, 1H), 3.39 (t, J = 9.3 Hz, 1H), 3.40 (s, 6H), 3.43 (s, 6H), 3.49-3.63 (m, 15H), 3.72 (dd, J = 5.4, 12.0 Hz, 1H), 3.79 (m, 1H), 3.89 (dd, J = 2.3, 12.0 Hz, 1H), 4.46 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 4.60 (s, 2H), 5.11 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 5.13 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 5.17 (s, 4H), 5.90 (dd, J = 2.0, 11.8 Hz, 1H), 6.58 (t, J = 2.2 Hz, 1H), 6.74 (d, J = 16.1 Hz, 1H), 6.75 (m, 3H), 6.91 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 7.48 (d, J = 16.1 Hz, 1H), 8.15 (s, 1H); 13C NMR (150 MHz, CD3OD) δ 31.6 (CH2), 39.4 (CH2), 46.3 (CH), 48.0 (CH2), 56.8 (CH3), 56.43 (CH3), 62.5 (CH2), 64.9 (CH2), 70.8 (CH2), 71.2 (CH2), 71.45 (CH2), 71.49 (CH2), 71.51 (CH2), 71.53 (CH2), 71.9 (CH2), 72.3 (CH), 72.4 (CH), 81.0 (CH), 85.6 (CH), 95.5 (CH2), 95.6 (CH2), 104.7 (CH), 108.2 (CH), 110.6 (CH), 110.7 (CH), 123.8 (CH), 127.8 (CH), 137.9 (C), 144.5 (CH), 145.8 (C), 146.1 (C), 159.7 (C), 159.9 (C), 199.3 (C); HRMS (FAB) m/z [M + H]+ calcd for C42H62N3O17S 912.3794; found 912.3803.
【0061】
［濁度測定］
各種化合物の濁度を測定した。方法は次のようである。化合物をＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に一旦、溶解してから蒸留水、または１０％牛胎児血清入りのＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）に最終濃度５０μＭになるように溶解した。クルクミンには濁りがあり、ＧＯ－Ｙ１９９は透明であった。この溶解度を濁度計（ＲＥＸ社、ＷＺＢ－１７０ Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｅｒ）で測定した。化合物の濁度を濃度で補正した。結果を表１に示した。
各種化合物の濁度を測定した。方法は次のようである。化合物をＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に一旦、溶解してから蒸留水、または１０％牛胎児血清入りのＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）に最終濃度５０μＭになるように溶解した。クルクミンには濁りがあり、ＧＯ－Ｙ１９９は透明であった。この溶解度を濁度計（ＲＥＸ社、ＷＺＢ－１７０ Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｅｒ）で測定した。化合物の濁度を濃度で補正した。結果を表１に示した。
【0062】
【表1】
【0063】
表１より、ＧＯ－Ｙ１９６～２００の濁度は０であるか又は非常に小さく、ＧＯ－Ｙ０３０やクルクミンに比べて、水溶性が改善されていることが確認できた。
【0064】
続いて、ＧＯ－Ｙ２０６とクルクミンを最終濃度１．２５μＭと５．００μＭに調整し、それぞれの濁度を測定した。結果を表２に示した。
【0065】
【表2】
【0066】
最終濃度が１．２５μＭであるＧＯ－Ｙ２０６の濁度は０．１８ＮＴＵ、最終濃度が５．００μＭであるＧＯ－Ｙ２０６の濁度は１．８２ＮＴＵであった。一方、最終濃度が１．２５μＭであるクルクミンの濁度は４．９６ＮＴＵ、最終濃度が５．００μＭであるクルクミンの濁度は２９．０ＮＴＵであった。ＮＴＵを濃度で割って、得られた値の平均を求めるとＧＯ－Ｙ２０６は０．２５４ＮＴＵ／μＭであるのに対し、クルクミンは４．８８４ＮＴＵ／μＭであった。従って、ＧＯ－Ｙ２０６の濁度はクルクミンの５％まで改善していた。
【0067】
［細胞増殖抑制活性と濁度］
大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６に対する細胞増殖抑制活性を測定した。細胞増殖抑制活性の指標として、コントロールと比較して細胞増殖を５０％抑制する濃度（ＩＣ５０）を用いた。方法は次のようである。ＨＣＴ１１６を６ウェルプレートに５ｘ１０４巻き込み、２４時間後に各種濃度の化合物を添加し、さらに７２時間の培養後に細胞数をカウントした。コントロールは最も高い濃度の化合物の添加濃度に合わせて加えた量と同量のＤＭＳＯを使用した。コントロールに対する各濃度の細胞数を百分率で示した。結果を表２に示した。また、表３では、化合物の濁度についても記載した。さらに、図６に代表してＧＯ－Ｙ１９０、ＧＯ－Ｙ１９３、ＧＯ－Ｙ１９６、ＧＯ－Ｙ１９７の細胞増殖抑制活性の測定結果を示した。
大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６に対する細胞増殖抑制活性を測定した。細胞増殖抑制活性の指標として、コントロールと比較して細胞増殖を５０％抑制する濃度（ＩＣ５０）を用いた。方法は次のようである。ＨＣＴ１１６を６ウェルプレートに５ｘ１０４巻き込み、２４時間後に各種濃度の化合物を添加し、さらに７２時間の培養後に細胞数をカウントした。コントロールは最も高い濃度の化合物の添加濃度に合わせて加えた量と同量のＤＭＳＯを使用した。コントロールに対する各濃度の細胞数を百分率で示した。結果を表２に示した。また、表３では、化合物の濁度についても記載した。さらに、図６に代表してＧＯ－Ｙ１９０、ＧＯ－Ｙ１９３、ＧＯ－Ｙ１９６、ＧＯ－Ｙ１９７の細胞増殖抑制活性の測定結果を示した。
【0068】
【表3】
【0069】
表３より、ＧＯ－Ｙ１９０～１９４、１９６～２００はＧＯ－Ｙ０３０やクルクミンに比べて細胞増殖抑制活性が高いものであった。また、その中でＧＯ－Ｙ１９０、１９１、１９８～２００は特に細胞増殖抑制活性が高かった。さらに、その中で、ＧＯ－Ｙ１９８～２００は水溶性に優れていた。これらの中でＧＯ－Ｙ１９９が最も収率良く合成可能なものであるため、ＧＯ－Ｙ１９９に着目して以降の実験を行った。
【0070】
［各種癌細胞株に対する細胞増殖抑制活性］
各種癌細胞株（胃癌細胞株：ＧＣＩＹ、Ｋａｔｏ ＩＩＩ、ＳＨ－１０－ＴＣ、大腸癌細胞株：ＤＬＤ－１、ＨＴ２９、ＨＣＴ－１１６、乳癌細胞株：ＨＣＣ３８、ＨＣＣ７０、ＨＣＣ１３９５）に対するクルクミン、ＧＯ－Ｙ０３０、ＧＯ－Ｙ１９３、ＧＯ－Ｙ１９９の細胞増殖抑制活性の（ＩＣ５０）を測定した。方法は前述したとおりである。結果を表４に示した。また、表５において、ＧＯ－Ｙ１９９と、クルクミン・ＧＯ－Ｙ０３０とのＩＣ５０をそれぞれ比較した。さらに、図７に各種癌細胞株に対するＧＯ－Ｙ１９９の細胞増殖抑制活性の結果を示した。
各種癌細胞株（胃癌細胞株：ＧＣＩＹ、Ｋａｔｏ ＩＩＩ、ＳＨ－１０－ＴＣ、大腸癌細胞株：ＤＬＤ－１、ＨＴ２９、ＨＣＴ－１１６、乳癌細胞株：ＨＣＣ３８、ＨＣＣ７０、ＨＣＣ１３９５）に対するクルクミン、ＧＯ－Ｙ０３０、ＧＯ－Ｙ１９３、ＧＯ－Ｙ１９９の細胞増殖抑制活性の（ＩＣ５０）を測定した。方法は前述したとおりである。結果を表４に示した。また、表５において、ＧＯ－Ｙ１９９と、クルクミン・ＧＯ－Ｙ０３０とのＩＣ５０をそれぞれ比較した。さらに、図７に各種癌細胞株に対するＧＯ－Ｙ１９９の細胞増殖抑制活性の結果を示した。
【0071】
【表4】
【0072】
【表5】
【0073】
表４より、ＧＯ－Ｙ１９３及びＧＯ－Ｙ１９９は何れの癌細胞株に対しても、高い細胞増殖抑制活性を有していた。また、表５より、ＧＯ－Ｙ１９９はクルクミンに対して３３．３～７１．４倍の抗腫瘍活性を有しており、ＧＯ－Ｙ０３０に対して０．８～４．２の抗腫瘍活性を有していた。この結果から、ＧＯ－Ｙ１９９はクルクミン及びＧＯ－Ｙ０３０よりも高い抗腫瘍活性を有しているといえる。
【0074】
大腸癌細胞株ＤＬＤ－１、ＨＣＴ１１６、胃癌細胞株ＫＡＴＯ ＩＩＩ、Ｈ－１１１－ＴＣに対するクルクミン、ＧＯ－Ｙ１９９、ＧＯ－Ｙ２０６の細胞増殖抑制活性（ＩＣ５０）を測定した。方法は前述したとおりである。結果を表６に示した。また、図８に各種癌細胞株に対するこれら化合物の細胞増殖抑制活性の結果を示した。
【0075】
【表6】
【0076】
表６より、ＧＯ－Ｙ１９９及びＧＯ－Ｙ２０６はクルクミンに比べて何れの大腸癌細胞株に対しても、高い細胞増殖抑制活性を有していた。また、ＧＯ－Ｙ２０６の効果はＧＯ－Ｙ１９９と同等であった。
【0077】
膵癌細胞株ＡＳＰＣ－１、Ｐａｎｃ－１に対するクルクミン、ＧＯ－Ｙ０２２、ＧＯ－Ｙ０３０、ＧＯ－Ｙ１９９、ＧＯ－Ｙ２００の細胞増殖抑制活性（ＩＣ５０）を測定した。方法は前述したとおりである。結果を表７に示した。また、図９に各種癌細胞株に対するこれら化合物の細胞増殖抑制活性の結果を示した。
【0078】
【表7】
【0079】
表７より、ＧＯ－Ｙ１９９及びＧＯ-Ｙ２００はクルクミンに比べて、何れの膵癌細胞株に対しても、高い細胞増殖抑制活性を有していた。また、ＧＯ－Ｙ１９９及びＧＯ-Ｙ２００はＧＯ－Ｙ０２２と比べても高い効果を有していた。
【0080】
悪性胸膜中皮腫細胞株ＮＣＩ－Ｈ２２６、ＭＳＴＯ２１１Ｈに対するクルクミン、ＧＯ－Ｙ１９３、ＧＯ－Ｙ１９７、ＧＯ－Ｙ１９８、ＧＯ－Ｙ１９９、ＧＯ－Ｙ２００の細胞増殖抑制活性（ＩＣ５０）を測定した。方法は前述したとおりである。結果を表８、図１０に示した。比較のために殺細胞性抗がん剤シスプラチン（ＣＤＤＰ）のＩＣ５０も併記した。
【0081】
【表8】
【0082】
表８より、ＧＯ－Ｙ１９３、ＧＯ－Ｙ１９７、ＧＯ－Ｙ１９８、ＧＯ－Ｙ１９９、ＧＯ－Ｙ２００はクルクミンに比べて、何れの悪性胸膜中皮腫細胞株に対しても高い細胞増殖抑制活性を有していた。
【0083】
悪性黒色腫細胞株Ｇ３６１に対するクルクミン、ＧＯ－Ｙ０２２、ＧＯ－Ｙ０３０、ＧＯ－Ｙ１９３、ＧＯ－Ｙ１９７、ＧＯ－Ｙ１９９の細胞増殖抑制活性（ＩＣ５０）を測定した。方法は前述したとおりである。結果を表９に示した。また、図１１に代表してＧＯ－Ｙ１９３、ＧＯ－Ｙ１９７、ＧＯ－Ｙ１９９の悪性黒色腫細胞株に対する細胞増殖抑制活性の結果を示した。
【0084】
【表9】
【0085】
表９より、ＧＯ－Ｙ１９３、ＧＯ－Ｙ１９７、ＧＯ－Ｙ１９９はクルクミンに比べて、悪性黒色腫細胞株に対して高い細胞増殖抑制活性を有していた。また、ＧＯ－Ｙ１９３、ＧＯ－Ｙ１９７、ＧＯ－Ｙ１９９はＧＯ－Ｙ０２２、ＧＯ－Ｙ０３０よりも高い効果を有していた。
【0086】
皮膚Ｔ細胞性リンパ腫細胞株ＨＨ、ＨＵＴ７８に対するクルクミン、ＧＯ－Ｙ０２２、ＧＯ－Ｙ０３０、ＧＯ－Ｙ１９３、ＧＯ－Ｙ１９７、ＧＯ－Ｙ１９８、ＧＯ－Ｙ１９９、ＧＯ－Ｙ２００の細胞増殖抑制活性（ＩＣ５０）を測定した。方法は前述したとおりである。結果を表１０に示した。また、図１２に各種癌細胞株に対するこれら化合物の細胞増殖抑制活性の結果を示した。
【0087】
【表10】
【0088】
表１０より、ＧＯ－Ｙ１９３、ＧＯ－Ｙ１９７、ＧＯ－Ｙ１９８、ＧＯ－Ｙ１９９、ＧＯ－Ｙ２００はクルクミンに比べて、何れの皮膚Ｔ細胞性リンパ腫細胞株に対しても高い細胞増殖抑制活性を有していた。また、ＧＯ－Ｙ１９３、ＧＯ－Ｙ１９７、ＧＯ－Ｙ１９８、ＧＯ－Ｙ１９９、ＧＯ－Ｙ２００はＧＯ－Ｙ０２２よりも高い効果を有していた。
【0089】
［殺細胞効果］
ＧＯ－Ｙ１９９の殺細胞効果について調べた。方法は次のとおりである。各細胞株を６ウェルプレートに５ｘ１０４巻き込み、２４時間後に２μＭ、５μＭのＧＯ－Ｙ１９９を添加し、４８時間後、７２時間後に細胞数をカウントした。結果を図１３に示した。
ＧＯ－Ｙ１９９の殺細胞効果について調べた。方法は次のとおりである。各細胞株を６ウェルプレートに５ｘ１０４巻き込み、２４時間後に２μＭ、５μＭのＧＯ－Ｙ１９９を添加し、４８時間後、７２時間後に細胞数をカウントした。結果を図１３に示した。
【0090】
図１３に示した通り、ＧＯ－Ｙ１９９はＨＣＴ１１６及びＫａｔｏ ＩＩＩのいずれの癌細胞株に対しても殺細胞効果が認められた。
【0091】
［ＮＦ－ｋＢに対する影響］
ＧＯ－Ｙ１９９のＮＦ－ｋＢ（ｐ６５）に対する影響を調べた。方法は次のとおりである。ＨＣＴ１１６細胞株を１０センチプレートに３ｘ１０６個を巻き込み、２４時間後に２μＭのＧＯ－Ｙ１９９を添加し、２４時間後に細胞を回収し、ｉＰＧｅｌｌ（ＧｅｎｏＳｔａｆｆ）に包埋し、ホルマリン固定後にパラフィンブロックを作製し、抗ＮＦ－ｋＢ（ｐ６５）抗体で免疫組織化学を行った。また、２μＭと５μＭのＧＯ－Ｙ１９９を添加し、２４時間後にライゼートを回収し、ＥＬＩＳＡプレート（ＮＦ－ｋＢｐ６５（ｐＳ５３６） ＳｉｍｐｌｅＳｔｅｐ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ， Ａｂｃａｍ）を用いてＮＦ－ｋＢ（ｐ６５）の発現量を解析した。タンパク質量をＡ２８０ｎｍの吸光度で補正した。結果を図１４、図１５に示した。図１４上部は、２４時間経過後のコントロール群とＧＯ－Ｙ１９９（２μＭ）添加群との写真である。図１４下部は、２４時間経過後におけるこれらの群のｔ検定の結果である。図１５はコントロール群に対する、ＧＯ－Ｙ１９９（２μＭ、５μＭ）添加群のＮＦ－ｋＢ阻害作用の比較結果である。
ＧＯ－Ｙ１９９のＮＦ－ｋＢ（ｐ６５）に対する影響を調べた。方法は次のとおりである。ＨＣＴ１１６細胞株を１０センチプレートに３ｘ１０６個を巻き込み、２４時間後に２μＭのＧＯ－Ｙ１９９を添加し、２４時間後に細胞を回収し、ｉＰＧｅｌｌ（ＧｅｎｏＳｔａｆｆ）に包埋し、ホルマリン固定後にパラフィンブロックを作製し、抗ＮＦ－ｋＢ（ｐ６５）抗体で免疫組織化学を行った。また、２μＭと５μＭのＧＯ－Ｙ１９９を添加し、２４時間後にライゼートを回収し、ＥＬＩＳＡプレート（ＮＦ－ｋＢｐ６５（ｐＳ５３６） ＳｉｍｐｌｅＳｔｅｐ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ， Ａｂｃａｍ）を用いてＮＦ－ｋＢ（ｐ６５）の発現量を解析した。タンパク質量をＡ２８０ｎｍの吸光度で補正した。結果を図１４、図１５に示した。図１４上部は、２４時間経過後のコントロール群とＧＯ－Ｙ１９９（２μＭ）添加群との写真である。図１４下部は、２４時間経過後におけるこれらの群のｔ検定の結果である。図１５はコントロール群に対する、ＧＯ－Ｙ１９９（２μＭ、５μＭ）添加群のＮＦ－ｋＢ阻害作用の比較結果である。
【0092】
図１４に示したように、コントロール群のＮＦ－ｋＢ（ｐ６５）発現細胞の割合は９６．８±１．１％であるが、ＧＯ－Ｙ１９９添加群は６９．４±１２．４％であった。また、図１５に示したように、コントロール群のＮＦ－ｋＢ（ｐ６５）の相対的発現量は５．２７±０．９５であるのに対し、ＧＯ－Ｙ１９９添加群（２μＭ、５μＭ）はそれぞれ０、０であった。このことから、ＧＯ－Ｙ１９９はＮＦ－ｋＢ阻害作用を有することが確認された。
【0093】
［ｐＳＴＡＴ３に対する影響］
ＧＯ－Ｙ１９９のｐＳＴＡＴ３に対する影響を調べた。方法は前述のとおりである。抗ｐＳＴＡＴ３抗体で免疫組織化学を行った。結果を図１６に示した。図１６上部は、２４時間経過後のコントロール群とＧＯ－Ｙ１９９（２μＭ）添加群との写真である。図１６下部は、２４時間経過後におけるこれらの群のｔ検定の結果である。
ＧＯ－Ｙ１９９のｐＳＴＡＴ３に対する影響を調べた。方法は前述のとおりである。抗ｐＳＴＡＴ３抗体で免疫組織化学を行った。結果を図１６に示した。図１６上部は、２４時間経過後のコントロール群とＧＯ－Ｙ１９９（２μＭ）添加群との写真である。図１６下部は、２４時間経過後におけるこれらの群のｔ検定の結果である。
【0094】
図１６の通り、コントロール群のｐＳＴＡＴ３の相対的発現量は１０．２±１．６％であるのに対し、ＧＯ－Ｙ１９９（２μＭ）添加群のｐＳＴＡＴ３の相対的発現量は０．３±０．５％であった。このように、ＧＯ－Ｙ１９９添加によりｐＳＴＡＴ３の発現量は有意に減少していたため、ＧＯ－Ｙ１９９はｐＳＴＡＴ３の発現を阻害していることが確認された。
【0095】
［β－カテニンに対する影響］
ＧＯ－Ｙ１９９のβ－カテニンに対する影響を調べた。方法は前述のとおりである。抗β－カテニン抗体で免疫組織化学を行った。タンパク質の定量はＥＬＩＳＡプレート（ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ）を用いて行った。結果を図１７、図１８に示した。図１７は２４時間経過後のコントロール群とＧＯ－Ｙ１９９（２μＭ）添加群との写真である。図１７における数値は、β－カテニン不活性化セルのｔ検定の結果である。図１８はコントロール群に対する、ＧＯ－Ｙ１９９（２μＭ、５μＭ）添加群のβ－カテニン阻害作用の比較結果である。
ＧＯ－Ｙ１９９のβ－カテニンに対する影響を調べた。方法は前述のとおりである。抗β－カテニン抗体で免疫組織化学を行った。タンパク質の定量はＥＬＩＳＡプレート（ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ）を用いて行った。結果を図１７、図１８に示した。図１７は２４時間経過後のコントロール群とＧＯ－Ｙ１９９（２μＭ）添加群との写真である。図１７における数値は、β－カテニン不活性化セルのｔ検定の結果である。図１８はコントロール群に対する、ＧＯ－Ｙ１９９（２μＭ、５μＭ）添加群のβ－カテニン阻害作用の比較結果である。
【0096】
図１８に示したように、β－カテニンの相対的発現量はコントロール群が１１．５±２．３であるのに対し、ＧＯ－Ｙ１９９（２μＭ）添加群は２．８±０．８、ＧＯ－Ｙ１９９（５μＭ）添加群は３．９±１．１であり、ＧＯ－Ｙ１９９の添加によりβ－カテニンの発現量が有意に減少していた。従って、ＧＯ－Ｙ１９９はβ－カテニン阻害作用を有していることが確認された。
【0097】
［脂肪酸シンセターゼに対する影響］
ＧＯ－Ｙ１９９の脂肪酸シンセターゼに対する影響を調べた。方法は前述のとおりである。タンパク質の定量はＨｕｍａｎ Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）を用いて行った。結果を図１９に示した。図１９はコントロール群に対する、ＧＯ－Ｙ１９９（４μＭ）添加群の脂肪酸シンセターゼ阻害作用の比較結果である。
ＧＯ－Ｙ１９９の脂肪酸シンセターゼに対する影響を調べた。方法は前述のとおりである。タンパク質の定量はＨｕｍａｎ Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）を用いて行った。結果を図１９に示した。図１９はコントロール群に対する、ＧＯ－Ｙ１９９（４μＭ）添加群の脂肪酸シンセターゼ阻害作用の比較結果である。
【0098】
図１９の通り、ＧＯ－Ｙ１９９は有意な脂肪酸シンセターゼ阻害作用を有していることが確認された。
【0099】
［カスパーゼ３に対する影響］
ＧＯ－Ｙ１９９のＣａｓｐａｓｅ ３に対する影響を調べた。方法は前述のとおりである。抗Ｃａｓｐａｓｅ ３抗体で免疫組織化学を行った。アポトーシス関連タンパク質の定量はＭ３０ Ａｐｏｔｏｓｅｎｓｅ ＥＬＩＳＡ（ＰＥＶＩＶＡ）を用いて行った。結果を図２０、図２１に示した。図２０上部は、２４時間経過後のコントロール群とＧＯ－Ｙ１９９（２μＭ）添加群との写真である。図２０下部は、２４時間経過後におけるＣａｓｐａｓｅ ３発現細胞の割合である。図２１はコントロール群に対する、ＧＯ－Ｙ１９９（２μＭ、５μＭ）添加群のアポトーシス関連タンパク質の誘導を示す。
ＧＯ－Ｙ１９９のＣａｓｐａｓｅ ３に対する影響を調べた。方法は前述のとおりである。抗Ｃａｓｐａｓｅ ３抗体で免疫組織化学を行った。アポトーシス関連タンパク質の定量はＭ３０ Ａｐｏｔｏｓｅｎｓｅ ＥＬＩＳＡ（ＰＥＶＩＶＡ）を用いて行った。結果を図２０、図２１に示した。図２０上部は、２４時間経過後のコントロール群とＧＯ－Ｙ１９９（２μＭ）添加群との写真である。図２０下部は、２４時間経過後におけるＣａｓｐａｓｅ ３発現細胞の割合である。図２１はコントロール群に対する、ＧＯ－Ｙ１９９（２μＭ、５μＭ）添加群のアポトーシス関連タンパク質の誘導を示す。
【0100】
図２０の通り、コントロール群のＣａｓｐａｓｅ ３発現細胞の割合は１．０±０．１％であるのに対し、ＧＯ－Ｙ１９９（２μＭ）添加群では５７．４±２．６％と有意に増加していた。また、図２１のとおり、コントロール群が３６０Ｕ／Ｌであるのに対し、ＧＯ－Ｙ１９９（２μＭ）添加群は１，８３０Ｕ／Ｌであり、ＧＯ－Ｙ１９９（５μＭ）添加群は２，０５０Ｕ／Ｌであり、ＧＯ－Ｙ１９９添加によりアポトーシス関連タンパク質の誘導が示された。従って、ＧＯ－Ｙ１９９はカスパーゼ３を活性化し、アポトーシスを誘導することが確認された。
【0101】
［血管新生阻害活性］
血管新生阻害剤Ｋｉ８７５１に耐性化した血管内皮細胞ＨＵＶＥＣ－Ｒに対するクルクミン、ＧＯ－Ｙ０２２、ＧＯ－Ｙ０３０、ＧＯ－Ｙ１９３、ＧＯ－Ｙ１９７、ＧＯ－Ｙ１９８、ＧＯ－Ｙ１９９、ＧＯ－Ｙ２００の血管新生阻害活性を調べた。ＨＵＶＥＣ－ＲをＥＧＭＴＭ―２ Ｂｕｌｌｅｔ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．， Ｏｔｓｕ， Ｊａｐａｎ）で各化合物の存在下で培養し、７２時間後に細胞数を測定した。また、その結果からＩＣ５０を求めた。ＧＯ－Ｙ０３０には血管新生阻害活性が知られており、それと比較検討した。結果を表１１、図２２に示した。
血管新生阻害剤Ｋｉ８７５１に耐性化した血管内皮細胞ＨＵＶＥＣ－Ｒに対するクルクミン、ＧＯ－Ｙ０２２、ＧＯ－Ｙ０３０、ＧＯ－Ｙ１９３、ＧＯ－Ｙ１９７、ＧＯ－Ｙ１９８、ＧＯ－Ｙ１９９、ＧＯ－Ｙ２００の血管新生阻害活性を調べた。ＨＵＶＥＣ－ＲをＥＧＭＴＭ―２ Ｂｕｌｌｅｔ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．， Ｏｔｓｕ， Ｊａｐａｎ）で各化合物の存在下で培養し、７２時間後に細胞数を測定した。また、その結果からＩＣ５０を求めた。ＧＯ－Ｙ０３０には血管新生阻害活性が知られており、それと比較検討した。結果を表１１、図２２に示した。
【0102】
【表11】
【0103】
表１１より、ＧＯ－Ｙ１９３、ＧＯ－Ｙ１９７、ＧＯ－Ｙ１９８、ＧＯ－Ｙ１９９、ＧＯ－Ｙ２００はクルクミンに比べて、高い血管新生阻害活性を有していた。また、ＧＧＯ－Ｙ１９３、ＧＯ－Ｙ１９７、ＧＯ－Ｙ１９８、ＧＯ－Ｙ１９９、ＧＯ－Ｙ２００はＧＯ－Ｙ０２２よりも高い効果を有していた。
【0104】
［制御性Ｔ細胞抑制活性］
ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌｈｉ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、マウスの脾臓からＮａｉｖｅ ＣＤ４＋ Ｔ細胞を集めた。ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（５，０００ユニット／ｍＬ）、１０％牛胎仔血清、５０μＭの２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを添加したＲＰＭＩ １６４０培地に、採取したＴ細胞０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬを添加した。続いて、培地に１μｇ／ｍＬのａｎｔｉ－ＣＤ３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を添加し、さらに１μｇ／ｍｌのａｎｔｉ－ＣＤ２８抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を添加した。その後、培地を３７℃で３日間培養した。次に、培地にＴＧＦ－β１（２ｎｇ／ｍＬ）を添加して２４時間培養した。その後、ＦＯＸＰ３ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｋｉｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて細胞を固定し、細胞膜を処理し、核内のＦＯＸＰ３を染色した。ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａＴＭ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）フローサイトメーターを用いて、染色された細胞を測定し、得られたデータをＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ－Ｓｔａｒ ｖｅｒｓｉｏｎ）で解析した。結果を図２３に示した。
ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌｈｉ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、マウスの脾臓からＮａｉｖｅ ＣＤ４＋ Ｔ細胞を集めた。ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（５，０００ユニット／ｍＬ）、１０％牛胎仔血清、５０μＭの２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを添加したＲＰＭＩ １６４０培地に、採取したＴ細胞０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬを添加した。続いて、培地に１μｇ／ｍＬのａｎｔｉ－ＣＤ３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を添加し、さらに１μｇ／ｍｌのａｎｔｉ－ＣＤ２８抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を添加した。その後、培地を３７℃で３日間培養した。次に、培地にＴＧＦ－β１（２ｎｇ／ｍＬ）を添加して２４時間培養した。その後、ＦＯＸＰ３ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｋｉｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて細胞を固定し、細胞膜を処理し、核内のＦＯＸＰ３を染色した。ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａＴＭ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）フローサイトメーターを用いて、染色された細胞を測定し、得られたデータをＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ－Ｓｔａｒ ｖｅｒｓｉｏｎ）で解析した。結果を図２３に示した。
【0105】
対照群であるＦＯＸＰ３陽性の制御性Ｔ細胞の誘導割合は１２．８％であったが、０．３μＭのＧＯ－Ｙ１９９が添加された制御性Ｔ細胞の誘導割合は２．２２％にまで抑制された。
【0106】
［生体内抗腫瘍効果］
ＧＯ－Ｙ１９９の生体内抗腫瘍効果について調べた。方法は次のとおりである。ＨＣＴ１１６をヌードマウスの皮下に移植した。腫瘍形成後、１００ｍＭ ＧＯ－Ｙ１９９のＤＭＳＯ溶液をＰＢＳ １００μＬに溶解し、マウスの尾静脈より単回注入した（ＧＯ－Ｙ１９９ １ｍｇ相当）。コントロール群として、同等濃度のＤＭＳＯ－ＰＢＳ溶液を単回尾静注した。投与後４日後に腫瘍の最大径を測定した。結果を図２４に示した。
ＧＯ－Ｙ１９９の生体内抗腫瘍効果について調べた。方法は次のとおりである。ＨＣＴ１１６をヌードマウスの皮下に移植した。腫瘍形成後、１００ｍＭ ＧＯ－Ｙ１９９のＤＭＳＯ溶液をＰＢＳ １００μＬに溶解し、マウスの尾静脈より単回注入した（ＧＯ－Ｙ１９９ １ｍｇ相当）。コントロール群として、同等濃度のＤＭＳＯ－ＰＢＳ溶液を単回尾静注した。投与後４日後に腫瘍の最大径を測定した。結果を図２４に示した。
【0107】
図２４はコントロール群（左）とＧＯ－Ｙ１９９静注群（右）の相対的腫瘍増大の程度を示す。コントロール群の腫瘍増大が投与前の１１３．７±１２．４％であるのに対し、ＧＯ－Ｙ１９９静注群では投与前の９５．２±２０．０％であり、ＧＯ－Ｙ１９９添加により有意に腫瘍増大を抑制していた。従って、ＧＯ－Ｙ１９９は生体内においても抗腫瘍活性を示すことが確認された。
【0108】
動物モデルを用いて、悪性中皮腫細胞に対するＧＯ－Ｙ１９９の抗腫瘍効果について調べた。方法は次のとおりである。ＭＳＴＯ－２１１Ｈ細胞を各々、２．８×１０６個ずつを５匹のヌードマウスの腹腔内に移植した。Ｄａｙ５から１００ｍＭのＧＯ－Ｙ１９９のＤＭＳＯ溶液４３μＬをＰＢＳで５００μＬに希釈し、マウスに腹腔内投与した（ＧＯ－Ｙ１９９、５ｍｇ相当）。コントロール群として、同様にＭＳＴＯ－２１１Ｈ細胞を腹腔内に移植した４匹のヌードマウスに同等濃度のＤＭＳＯ－ＰＢＳ溶液を腹腔内投与した。投与は５日間隔で計５回施行した。３０日後にと殺、剖検して解析した。結果を図２５に示した。
【0109】
ＧＯ－Ｙ１９９投与群の１匹で、ＭＳＴＯ－２１１Ｈ細胞を腹腔内投与した穿刺部位に腫瘍形成を認めた。対照群には認めなかった。微小な腹膜播種病変はＧＯ－Ｙ１９９投与群の４匹（８０％）、対照群では３匹（７５％）に認められた。一方で、最大径が５ｍｍを超える播種結節はＧＯ－Ｙ１９９投与群の１匹（２０％）に１個認められたが、対照群では４匹（１００％）に合計６個が認められた。また、そのサイズ（最大径）はＧＯ－Ｙ１９９投与群が５ｍｍに対して、対照群では６－１３ｍｍ（平均：１０．２ｍｍ）と巨大であった。また、図２６に示した通り、病理学的解析で、ＧＯ－Ｙ１９９投与群の播種結節の内部は壊死に陥っていたが、対照群は腫瘍細胞で充満していた。
【0110】
［静注後の血中濃度］
ＧＯ－Ｙ１９９の静注後の血中濃度について調べた。方法は次のとおりである。ＢＡＬＢ／ｃＳｌｃ－ｎｕ／＋マウスに、前述のようにＧＯ－Ｙ１９９ １ｍｇ相当を尾静注し、経時的に眼窩静脈より採血し、血清をＨＰＬＣにかけて、ＧＯ－Ｙ１９９の血中濃度を測定した。結果を図２７、図２８に示した。図２７は静注後における血液のＨＰＬＣ分析の結果である。図２８は静注後におけるＧＯ－Ｙ１９９の血中濃度の経時変化の結果である。
ＧＯ－Ｙ１９９の静注後の血中濃度について調べた。方法は次のとおりである。ＢＡＬＢ／ｃＳｌｃ－ｎｕ／＋マウスに、前述のようにＧＯ－Ｙ１９９ １ｍｇ相当を尾静注し、経時的に眼窩静脈より採血し、血清をＨＰＬＣにかけて、ＧＯ－Ｙ１９９の血中濃度を測定した。結果を図２７、図２８に示した。図２７は静注後における血液のＨＰＬＣ分析の結果である。図２８は静注後におけるＧＯ－Ｙ１９９の血中濃度の経時変化の結果である。
【0111】
図２７はＨＰＬＣ分析の生データである。図２８の通り、ＧＯ－Ｙ１９９の血中濃度は静注６０分後まで急激に低下し、その後緩やかに低下し、静注１８０分後にはＧＯ－Ｙ１９９は血中より消失した。このことから、ＧＯ－Ｙ１９９は静脈投与が可能であり、投与後、３時間は血中濃度が維持され、その後、速やかに代謝・排出されることが確認された。
【0112】
［安全性・毒性試験］
ＧＯ－Ｙ１９９の生体内における安全性・毒性について調べた。方法は次のとおりである。前述のようにＧＯ－Ｙ１９９ １ｍｇ相当を尾静注し、７日後に眼窩静脈より採血し、Ｃｅｌｌ ｔａｃ ＭＥＫ－５２５８（日本光電社製）でヘモグロビン値（Ｈｂ）、白血球数（ＷＢＣ）、血小板数（Ｐｌｔ）を測定した。血清クレアチニン値（Ｃｒｅ）、総ビリルビン値（Ｔ－Ｂｉｌ）、ＡＳＴ値は外注（株式会社スカイライト・バイオテックにて測定）した。結果を表１２、表１３に示した。図２９に静注後のマウスの体重変化について示した。図３０に静注後のマウスの尾部の写真を示した。
ＧＯ－Ｙ１９９の生体内における安全性・毒性について調べた。方法は次のとおりである。前述のようにＧＯ－Ｙ１９９ １ｍｇ相当を尾静注し、７日後に眼窩静脈より採血し、Ｃｅｌｌ ｔａｃ ＭＥＫ－５２５８（日本光電社製）でヘモグロビン値（Ｈｂ）、白血球数（ＷＢＣ）、血小板数（Ｐｌｔ）を測定した。血清クレアチニン値（Ｃｒｅ）、総ビリルビン値（Ｔ－Ｂｉｌ）、ＡＳＴ値は外注（株式会社スカイライト・バイオテックにて測定）した。結果を表１２、表１３に示した。図２９に静注後のマウスの体重変化について示した。図３０に静注後のマウスの尾部の写真を示した。
【0113】
【表12】
【0114】
【表13】
【0115】
表１２、表１３に示す通り、コントロール群とＧＯ－Ｙ１９９静注群の間で著しい違いは確認できなかった。また図２９に示す通り、体重変化も両群で違いは確認できなかった。図３０に示す通り、静注したマウスの尾部は全例において、局所の異常所見は観察されなかった。以上の結果から、マウスモデルに対するＧＯ－Ｙ１９９の安全性が確認された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】