特許 7697712 培養システム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-06-16

(45)【発行日】2025-06-24

(54)【発明の名称】培養システム

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20250617BHJP

   C12M 3/00 20060101ALI20250617BHJP

   C12N 5/077 20100101ALI20250617BHJP

   C12N 5/0775 20100101ALI20250617BHJP

【ＦＩ】

C12M1/00 A

C12M3/00 Z

C12N5/077

C12N5/0775

【請求項の数】 15

(21)【出願番号】P 2023536798

(86)(22)【出願日】2022-07-19

(86)【国際出願番号】 JP2022028554

(87)【国際公開番号】W WO2023003046

(87)【国際公開日】2023-01-26

【審査請求日】2023-12-22

(31)【優先権主張番号】P 2021119592

(32)【優先日】2021-07-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和２年度、沖縄県、先端医療産業開発拠点実用化事業（内閣府沖縄振興一括交付金）、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】504209655

【氏名又は名称】国立大学法人佐賀大学

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(72)【発明者】

【氏名】中山 功一

(72)【発明者】

【氏名】中村 アンナマリア

【審査官】村松 宏紀

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１６－１４４４３０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００３－２８９８５１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１４－０７６０２６（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２００８／１２３６１４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０２０／１８９７９４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】伊藤 学 ほか，スキャフォールドフリー小口径細胞製人工血管，腎と透析，2019年，Vol. 86(3)，pp. 291-295

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｍ、Ｃ１２Ｎ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞塊を培養する培養システムであって、
複数の基板に針状体を剣山状に配列させた細胞塊積層用の複数の支持体に細胞塊が積層された培養ユニットを収容するための培養槽と、
培養液容器と、
前記培養液容器から前記培養ユニットに培養液を供給する複数の培養液供給管とを備え、
前記支持体の最も外側の針状体は、その針状体から前記基板の外縁までの距離が、隣り合う針状体の間隔よりも短くなるように配列されており、
前記複数の培養液供給管のそれぞれは、前記針状体の間に配置される、
前記培養システム。

【請求項2】

前記支持体は、その最も外側の針状体から前記外縁までの距離が、隣り合う針状体の間隔の２分の１である、請求項１に記載の培養システム。

【請求項3】

前記基板は、矩形状の平面を備える、請求項１に記載の培養システム。

【請求項4】

前記矩形状の平面は、１辺が１０ｍｍの長さを備える、請求項３に記載の培養システム。

【請求項5】

前記培養ユニットは、前記支持体が互いに隣り合うように配置されたものである、請求項１に記載の培養システム。

【請求項6】

前記複数の培養液供給管のそれぞれは、前記基板の上面に沿って配置される、請求項１に記載の培養システム。

【請求項7】

前記複数の培養液供給管のそれぞれは、前記細胞塊の下方に配置される、請求項１に記載の培養システム。

【請求項8】

前記複数の培養液供給管のそれぞれは、前記培養液を流出する開口を備える、請求項１に記載の培養システム。

【請求項9】

前記開口は、前記培養液を前記細胞塊に向けて流出するように形成される、請求項８に記載の培養システム。

【請求項10】

前記複数の培養液供給管のそれぞれは、前記基板の少なくとも１つの辺と平行に前記基板上を延びる、請求項１に記載の培養システム。

【請求項11】

前記複数の培養液供給管のそれぞれは、互いに並行に配置される、請求項１に記載の培養システム。

【請求項12】

前記培養槽は、前記培養ユニットを収容する枠体又は凹部を備える、請求項１に記載の培養システム。

【請求項13】

複数の基板に針状体を剣山状に配列させた細胞塊積層用の複数の支持体であって前記支持体の最も外側の針状体は、その針状体から前記基板の外縁までの距離が、隣り合う針状体の間隔よりも短くなるように配列された支持体に細胞塊が積層された培養ユニットを、請求項１～１２のいずれか１項に記載の培養システムに配置して培養することを特徴とする、任意の１方向の長さが少なくとも１０ｍｍである大型の細胞立体構造体の製造方法。

【請求項14】

前記細胞塊の積層は、製造の目的となる組織の形状データを複数のパーツに分割して設計し、当該分割設計されたデータに基づきそれぞれの支持体に積層する、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記培養ユニットは、積層された細胞塊が製造目的となる細胞立体構造体の元の形状となるように配置させたものである、請求項１３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、基板に針状体を剣山状に配列させた細胞凝集塊積層用支持体を用いる培養システム、及び大型の細胞立体構造体の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

細胞塊を任意の空間に配置するための支持体を使用して細胞塊を任意の３次元空間に配置し、細胞塊同士を融合させることにより、細胞のみからなる細胞構築物を作製するための方法が知られており（特許第４５１７１２５号）、その方法のための自動化装置も開発されている（非特許文献１：Ｄ．Ｍｕｒａｔａ，Ｋ．Ａｒａｉ，ａｎｄ Ｋ．Ｎａｋａｙａｍａ，“Ｓｃａｆｆｏｌｄ－Ｆｒｅｅ Ｂｉｏ－３Ｄ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ Ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ ａｓ‘Ｂｉｏ－Ｉｎｋｓ’ｆｏｒ Ｔｉｓｓｕｅ（Ｒｅ－）Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｔｅｓｔｓ，”Ａｄｖ．Ｈｅａｌｔｈｃ．Ｍａｔｅｒ．，ｖｏｌ．９，ｎｏ．１５，ｐ．１９０１８３１，Ａｕｇ．２０２０．；非特許文献２：Ｋ．Ｎａｋａｙａｍａ，Ｋｅｎｚａｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｓｃａｆｆｏｌｄ－Ｆｒｅｅ Ｂｉｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ．Ｃｈａｍ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０２１．）

【0003】

上記装置は、バイオ３Ｄプリンタとして、様々な形状の細胞構造体を構築することが可能であり、上記装置では、針状体が１ｃｍ四方内に配列された支持体が使用されている（図１）。このため、積層（プリント）が可能なサイズ（平面の面積）は最大で１ｃｍ^２となる。
従って、さらに大型の細胞構造体をプリントするためには、針状体を配列させる面積を大きくし、本数も増やす必要がある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【文献】特許第４５１７１２５号

【非特許文献】

【0005】

【文献】Ｄ．Ｍｕｒａｔａ，Ｋ．Ａｒａｉ，ａｎｄ Ｋ．Ｎａｋａｙａｍａ，“Ｓｃａｆｆｏｌｄ－Ｆｒｅｅ Ｂｉｏ－３Ｄ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ Ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ ａｓ‘Ｂｉｏ－Ｉｎｋｓ’ｆｏｒ Ｔｉｓｓｕｅ（Ｒｅ－）Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｔｅｓｔｓ，”Ａｄｖ．Ｈｅａｌｔｈｃ．Ｍａｔｅｒ．，ｖｏｌ．９，ｎｏ．１５，ｐ．１９０１８３１，Ａｕｇ．２０２０．

【文献】Ｋ．Ｎａｋａｙａｍａ，Ｋｅｎｚａｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｓｃａｆｆｏｌｄ－Ｆｒｅｅ Ｂｉｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ．Ｃｈａｍ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０２１

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

大型の細胞構造体をプリントするには支持体を大型化するなどの操作が必要であるが、それにはバイオプリンタ自体の改修が必要であり、手間やコストを要する。
このため、簡易に細胞構造体を大型化させるための手段が求められていた。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、剣山状支持体をモジュール化（部品化）し、目的とする細胞構造体の３Ｄデータを分割して分割データごとにモジュール化された支持体に細胞凝集塊を積層し、これらの支持体を培養することにより、大型の細胞構造体を構築することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）基板に針状体を剣山状に配列させた細胞塊積層用支持体であって、当該基板上の最も外側の針状体は、その針状体から前記基板の外縁までの距離が、隣り合う針状体の間隔よりも短くなるように配列されている、前記支持体。
（２）前記最も外側の針状体から前記外縁までの距離が、隣り合う針状体の間隔の２分の１である、（１）に記載の支持体。
（３）前記基板は、矩形状の平面を備える、（１）又は（２）に記載の支持体。
（４）前記矩形状の平面は、１辺が１０ｍｍの長さを備える、（３）に記載の支持体。
（５）細胞塊を培養する培養システムであって、
（１）～（４）のいずれか１項に記載の複数の支持体に細胞塊が積層された培養ユニットを収容するための培養槽と、
培養液容器と、
前記培養液容器から前記培養ユニットに培養液を供給する複数の培養液供給管とを備え、
前記複数の培養液供給管のそれぞれは、前記針状体の間に配置される、前記培養システム。
（６）前記培養ユニットは、前記支持体が互いに隣り合うように配置されたものである、（５）に記載の培養システム。
（７）前記複数の培養液供給管のそれぞれは、前記基板の上面に沿って配置される、（５）又は（６）に記載の培養システム。
（８）前記複数の培養液供給管のそれぞれは、前記細胞塊の下方に配置される、（５）～（７）のいずれか１項に記載の培養システム。
（９）前記複数の培養液供給管のそれぞれは、前記培養液を流出する開口を備える、（５）～（８）のいずれか１項に記載の培養システム。
（１０）前記開口は、前記培養液を前記細胞塊に向けて流出するように形成される、（９）に記載の培養システム。
（１１）前記複数の培養液供給管のそれぞれは、前記基板の少なくとも１つの辺と平行に前記基板上を延びる、（５）～（１０）のいずれか１項に記載の培養システム。
（１２）前記複数の培養液供給管のそれぞれは、互いに並行に配置される、（５）～（１１）のいずれか１項に記載の培養システム。
（１３）前記培養槽は、前記培養ユニットを収容する枠体又は凹部を備える、請求項５～１２のいずれか１項に記載の培養システム。
（１４）（１）～（４）のいずれか１項に記載の複数の支持体に細胞塊が積層された培養ユニットを、（５）～（１３）のいずれか１項に記載の培養システムに配置して培養することを特徴とする、任意の１方向の長さが少なくとも１０ｍｍである大型の細胞立体構造体の製造方法。
（１５）前記細胞塊の積層は、製造の目的となる組織の形状データを複数のパーツに分割して設計し、当該分割設計されたデータに基づきそれぞれの支持体に積層する、（１４）に記載の方法。
（１６）前記培養ユニットは、積層された細胞塊が製造目的となる細胞立体構造体の元の形状となるように配置させたものである、（１４）又は（１５）に記載の方法。
（１７）（１４）～（１６）のいずれか１項に記載の方法により製造され、任意の１方向の長さが少なくとも１０ｍｍである大型の細胞立体構造体。

【発明の効果】

【0008】

本発明により、任意の方向の長さが１０ｍｍ以上の大きさを有する立体構造体の製造が可能となった。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】従来使用されているバイオ３Ｄプリンタ用支持体を示す図である。

【図2】細胞塊積層用支持体の側断面図である。

【図3】本発明の実施形態に係る培養システムの上面図である。。

【図4】図３の培養液供給管の拡大図である。

【図5】細胞塊積層用支持体に細胞塊を配置した状態を示す側面図である。

【図6】培養ユニットを用いて組織を培養した状態を示す上面図である。

【図7】培養ユニットから立体構造体を取り出すことを示す図である。

【図8】培養ユニットから立体構造体を取り出すことを示す図である。

【図9】本発明の培養システムの写真である。

【図10】耳の形状データを６つのパーツに分割して設計したことを示す図である。

【図11】図１０の設計に基づいて、耳の形状の立体構造体を形成するように細胞塊を積層した結果を示す写真である。

【図12】軟骨の形状データを２つのパーツに分割して設計したことを示す図である。

【図13】図１２の設計に基づいて、軟骨の立体構造体を形成するように細胞塊を積層した結果を示す写真である。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本発明は、基板に針状体を剣山状に配列させた細胞凝集塊（細胞塊、又はスフェロイドともいう）の積層用支持体であって、当該基板上の最も外側の針状体は、その針状体から前記基板の外縁までの距離が、隣り合う針状体の間隔よりも短くなるように配列されている、前記支持体に関する。
従来は、針状体が１ｃｍ四方内に配列された支持体が使用されているが、支持体を配置させる基板に余白があったため（図１）、余白部分に針状体を隣接して配置させることができなかった。
本発明は、上記余白部分を削除して余分な縁を失くし（エッジレス化）、互いに隣り合わせて配置できるようにモジュール化された支持体を提供する。
また本発明は、上記支持体を用いて細胞塊を培養する培養システムに関する。

【0011】

１．細胞塊積層用支持体
本発明の細胞凝集体（細胞塊）積層用支持体の側面断面図を図２に示す。
図２に示すように、細胞塊積層用支持体２２（単に「支持体」又は「支持体２２」ともいう）は、複数の貫通孔２４ａを有する板状の基板２４と、複数の貫通孔２４ａを介して基板２４に取付けられる複数の針状体２６とから構成される。針状体２６は、鋭い先端部と、貫通孔２４ａの直径より若干大きな直径を有する下端部とを有する。図２に示すように、基板２４の下方から針状体２６の先端部を貫通孔２４ａに差し込み上方に移動すると、針状体２６の下端部が貫通孔２４ａに嵌る。これにより、基板２４に対して針状体２６が固定される。基板２４の平面は、好ましくは矩形とすることでき、より好ましくは正方形又は長方形とすることができる。なお、矩形（正方形又は長方形）の一辺の長さは、好ましくは０．５ｃｍ～３．０ｃｍ、より好ましくは０．８ｃｍ～１．２ｃｍ、さらに好ましくは約１ｃｍ（１０ｍｍ）とすることができる。

【0012】

また、支持体２２において、基板２４に取り付けられた針状体２６のうち、最も外側の針状体２６から基板２４の外縁までの距離ｄは、隣り合う針状体の間隔Ｄよりも短くなるように設計されている（Ｄ＞ｄ）。好ましくは、距離ｄは、隣り合う針状体の間隔Ｄの２分の１である。このようにして、基板の余白部分を削除することにより（エッジレス化）、例えば２つの支持体を隣り合わせに配置したときに、一の支持体の最も外側の針状体と、隣接面における他の支持体の最も外側の針状体との距離が間隔Ｄとほぼ同じとなる（図６ｂ）。距離ｄが針状体の間隔Ｄの２分の１のときは、一の支持体の最も外側の針状体から隣接面における他の支持体の最も外側の針状体との距離が２ｄ＝Ｄとなる。これにより、支持体間における隣り同士の細胞凝集塊が接着しやすくなる。

【0013】

針状体２６の素材として、ステンレス製、ポリプロピレン製、ナイロン製等のものを使用できるが、これらに限定されるものではない。
また、基板２４及びシート２８（シート２８の詳細は後述する（図７、８））は、フッ素等により細胞非接着コーティングされたもの（例えばポリジメチルシロキサン製）であることが好ましい。但し、フッ素加工されたもののほか、ポリヒドロキシエチルメタクリレートポリマー加工されたものを使用することもでき、さらには、アクリル樹脂、ＡＢＳ樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリアセタール、ポリエーテルエーテルケトン、ナイロン製のもの等を用いることもできる。

【0014】

２．培養システム
本実施形態に係る培養システム１００を図３に示す。培養システム１００は、複数の支持体２２を収容する培養槽２０と、培養液を貯留する少なくとも１つの培養液容器３０と、培養液容器３０から培養槽２０に培養液を供給する培養液供給管３２とから構成される。

【0015】

培養槽２０の底面には、複数の支持体２２を互いに隣り合うように配置するために、複数の支持体２２を収容する枠体又は凹部２８が設けられている。枠体又は凹部２８は、支持体２２のそれぞれに対応して設けてもよい。また凹部２８は支持体２２の平面に合わせて矩形とするが、支持体２２の底面に突起（図示せず）を設けてその突起が嵌まり込むような凹部とすることができる。
隣り合う支持体２２の基板２４の側面は、好ましくは互いに当接するように配置することもできる。

【0016】

図３には、５つの支持体２２が、隣り合うように配置されている。破線で示す領域２２’には、支持体２２が配置されていないが、支持体２２を追加配置して、合計６つとすることもできる。配置させる支持体２２の数は、目的とする立体構造体の大きさに応じて適宜選択する。

【0017】

図４に示すように、培養液供給管３２は、一定間隔で配置された開口３２ａを有する。培養液容器３０から圧送された培養液が開口３２ａから流出する。開口３２ａの形状は、好ましくは円形又は楕円形とすることができる。但し、開口３２ａは１個でも複数でもよく、限定されるものではない、また、培養液供給管３２として注射針を用いて、針の先端部が開口３２ａを形成するようにしてもよい。

【0018】

図３に示すように、複数の培養液供給管３２のそれぞれは、基板２４の矩形状の平面の少なくとも１つの辺と平行に基板２４上を延びている。複数の培養液供給管３２のそれぞれは、互いに並行に配置されている。

【0019】

図５は、複数の細胞塊Ｃが支持体２２のそれぞれの針状体２６を貫通して配置された状態を示している。この状態で、最も下に配置された細胞塊Ｃと、基板２４の上面との間に培養液供給管３２が配置されており、培養液供給管３２の開口３２ａから上方に向けて培養液、その他栄養液が供給される。栄養液は、血清、成長因子（血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）等）が挙げられ、培養液中に含有させることもできる。本明細書において、「培養液」は、上記栄養液を含む培養液を包含する。複数の培養液供給管３２のそれぞれは、基板２４の上面に沿って（好ましくは並行に）配置される。複数の培養液供給管３２のそれぞれは、細胞塊Ｃの下方に配置される。

【0020】

本発明において使用される細胞の種類は特に限定されるものではなく、細胞塊を形成する任意の細胞を使用することができる。細胞塊を形成する細胞としては、幹細胞（ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、臍帯血由来細胞、未分化間葉系幹細胞、成体間葉系幹細胞等）などの未分化細胞又はその分化型細胞が挙げられる。これらの細胞が由来する組織は、例えば、関節軟骨、骨、脂肪組織、靱帯、腱、歯、耳介、鼻、肝臓、すい臓、血管、神経、心臓などが挙げられ、中でも軟骨などが好ましい。また、細胞塊は、必ずしも単一の種類の細胞の凝集体として形成される必要はなく、細胞塊が形成される限り、複数種類の細胞種から形成されてもよい。

【0021】

また、細胞塊を形成するまでの培養期間は、一般的培養条件（例えば３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下）で概ね３日～２１日である。

【0022】

３．立体構造体の製造
図６は、製造の目的となる立体構造体（組織Ｔ）の形状データを複数のパーツに分割して設計し、当該分割設計されたデータに基づきそれぞれの支持体に細胞塊を積層したことを示す図であり、組織Ｔの形状をヒトの耳の形状に設計したものである。
図６において、耳の形状を６つのパーツに分解することにより、それぞれのパーツごとに細胞塊を積層することができる。細胞塊が積層された支持体を「培養ユニット」とすると、図６ａは、６つの培養ユニットを、もとの耳の形状となるように隣接して並べた状態を示している。図６の状態で培養することにより、各培養ユニット間において互いに隣接する細胞塊は一体化し、全体として一つの組織の形状を形成する。図６ｂは、図６ａの側面断面図である。左側の支持体に積層された細胞塊と、右側の支持体に積層された細胞塊とが融合して、全体として１つの組織Ｔが形成されている。

【0023】

図６の状態で、複数の培養液供給管３２は、細胞塊からなる組織Ｔの下方に位置する破線部分３２’から、培養液を組織Ｔ（複数の細胞塊）に供給することができる。組織Ｔの大きさが大きくなればなるほど、組織Ｔの内部に培養液、その他栄養分が届きにくくなる。これを回避するために、本実施形態の培養システムは、組織Ｔの形状に合わせて培養ユニット２２の配置を変更しつつ、培養ユニット２２が互いに隣接する領域にも、培養液供給管３２から十分な培養液を供給することができる。

【0024】

培養が終了した後は、形成された組織Ｔは、培養ユニットから抜き出して単離する。
図７において、基板２４の上に予めシート２８を敷いておくことにより（図７ａ）、培養終了後、シートを持ち上げて組織Ｔを針状体２６から引き抜く（図７ｂ、ｃ）。

【0025】

あるいは、図８ａに示すように、基板２４の底部にシート２８を敷き（シート２８上の基板２４を配置し）、針状体２６を貫通させて支持体２２を形成しておけば、培養終了後、基板２４からシート２８を引き抜くことにより、針状体２６も一緒に引き抜かれて組織Ｔが培養ユニットから分離される（図８ｂ、ｃ）。
このようにして分離された組織Ｔは、任意の１方向の長さが少なくとも１０ｍｍである大型の細胞構造体となっている。

【0026】

実施例
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
［実施例１］

【0027】

図９は、図３に示す培養システムの実施形態を示す写真である。システムの中央に２つの支持体を配列させ、両側から培養液供給管を通した。
［実施例２］

【0028】

１辺が１０ｍｍの正方形の基板に直径０．１ｍｍの針を ０．４ｍｍ間隔で２６本ｘ２６本＝合計６７６本配置した。これを１個の支持体単位（モジュール）とした。最も外側の針から基板の縁部までの距離は０．２ｍｍであった。
耳の３Ｄのデータをダウンロードした後、耳の形状データを６分割してそれぞれのパーツに細胞塊を積層するためのデータ処理を行った。図１０左は、基板が１ｃｍ四方の矩形の支持体を６個配列し（全体で２ｃｍ×３ｃｍの培養ユニット）、その６個の支持体上に耳のデータを表示させたものである。図１０右は、６個の耳のパーツのデータを表示した図である。

【0029】

線維芽細胞を凝集させて細胞塊を形成し、上記データに基づいて、それぞれの支持体に細胞塊を積層した。積層前の支持体を６個配列させた図を図１１ａに示す。積層済みの支持体を、それぞれのパーツがもとの配置となるように配列させた図を図１１ｂに示す。図１１ｂに示すように、細胞塊のみから形成される立体構造体が、耳の形状を維持したまま、横２ｃｍ、縦３ｃｍの領域に形成された。
［実施例３］

【0030】

ブタの軟骨を３Ｄスキャンして、実施例２と同様にして３次元データを作成した（図１２上）。これを２つのパーツに分割し、細胞塊を積層させるデータを作成した（図１２下）。
このデータに基づいて、それぞれの支持体に細胞塊を積層した。

【0031】

細胞塊は、ヒトｉＰＳ細胞から神経堤を介して誘導した間葉系幹細胞ＭＳＣ（ｉＮＣＭＳＣ）細胞を、軟骨細胞誘導培地の中、ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）９６ウェルプレートで培養をすることにより作製した。細胞塊を積層した培養ユニットを本発明のシステムに配置させ、軟骨細胞誘導培地を用いて、３７℃で培養した。
軟骨細胞誘導培地組成は以下の通りである。
基礎培地（Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＰＴ－３９２，ＬＯＮＺＡ））
血清（Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ（ＰＴ－４１２１，ＬＯＮＺＡ））
成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－ＢＢ（ＰＤＧＦ－ＢＢ），Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－β３（ＴＧＦ－β３），Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ ４（ＢＭＰ－４）

【0032】

図１３左は、積層初日（Ｄａｙ０）の細胞塊を示し、図１３中央は、培養８日目（Ｄａｙ８）の細胞塊を示す。Ｄａｙ８には、細胞塊同士が融合して、縦の長さが約２ｃｍの軟骨組織が形成されていることがわかる。図１３右は、培養１４日目（Ｄａｙ１４）の図であり、全体として軟骨組織を形成していた。
［符号の説明］
１００ 培養システム
２０ 培養槽
２２ 支持体
２４ 基板
２４ａ 貫通孔
２６ 針状体
２８ 枠体又は凹部
３０ 培養液容器
３２ 培養液供給管
３２ａ 開口
Ｃ 細胞塊
Ｔ 組織

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】