特許 7697929 核酸のサイズ選択的濃縮のための方法、組成物及びキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-06-16

(45)【発行日】2025-06-24

(54)【発明の名称】核酸のサイズ選択的濃縮のための方法、組成物及びキット

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/10 20060101AFI20250617BHJP

【ＦＩ】

C12N15/10 Z

C12N15/10 100Z

C12N15/10 110Z

【請求項の数】 22

(21)【出願番号】P 2022512441

(86)(22)【出願日】2020-08-26

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-12-07

(86)【国際出願番号】 CN2020111449

(87)【国際公開番号】W WO2021037075

(87)【国際公開日】2021-03-04

【審査請求日】2023-01-30

(31)【優先権主張番号】62/892,041

(32)【優先日】2019-08-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】520157602

【氏名又は名称】フェーズ サイエンティフィック インターナショナル リミテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｐｈａｓｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ．

【住所又は居所原語表記】３２ ＆ ３３／Ｆ， Ｇｒａｖｉｔｙ， ２９ Ｈｕｎｇ Ｙｉｐ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｋｗｕｎ Ｔｏｎｇ， Ｋｏｗｌｏｏｎ， Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ （ＣＮ）

(74)【代理人】

【識別番号】110001494

【氏名又は名称】前田・鈴木国際特許弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】チウ， イン トゥ

(72)【発明者】

【氏名】マルシャーク， ダニエル， ロバート

(72)【発明者】

【氏名】キットゥール， ハルシャ， マダン

(72)【発明者】

【氏名】コバヤシ， マサエ

【審査官】斉藤 貴子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１９／０５５９２６（ＷＯ，Ａ２）

【文献】MATOS, T. et al.，Isolation of PCR DNA fragments using aqueous two-phase systems，Separation and Purification Technology，2014年，Volume 122，Pages 144-148，https://doi.org/10.1016/j.seppur.2013.11.014

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

核酸及び夾雑物を含む液体混合物から標的サイズを下回る標的核酸断片を単離及び濃縮するための方法であって、
前記液体混合物と、第１相溶液に溶解されている、第１相を形成するポリマー及び第２相溶液に溶解されている塩から形成された第１水性二相系（ＡＴＰＳ）とを混合させることであって、それにより、前記標的サイズを下回る前記標的核酸断片は、前記第２相溶液に分配され、及び夾雑物は、前記第１相溶液に分配される、混合させることと；
前記第２相溶液を抽出し、且つ第３相溶液に溶解されている、第２相を形成するポリマー及び第４相溶液に溶解されている塩から形成された第２ＡＴＰＳと混合することであって、それにより、前記標的サイズを下回る前記標的核酸断片は、前記第３相溶液に分配され、且つその中で濃縮され、前記標的サイズを下回る濃縮標的核酸断片となる、抽出及び混合することと；
前記標的サイズを下回る前記濃縮標的核酸断片を前記第３相溶液から回収することと
を含む方法。

【請求項2】

前記第１相を形成するポリマーは、前記第２相を形成するポリマーよりも高い分子量を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記第１相溶液中の前記第１相を形成するポリマーのモル濃度は、前記第３相溶液中の前記第２相を形成するポリマーのモル濃度よりも高い、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記第１相溶液中の前記第１相を形成するポリマーの質量濃度は、前記第３相溶液中の前記第２相を形成するポリマーの質量濃度よりも高い、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記第２相溶液に溶解されている塩は、
リン酸二カリウムと、
リン酸一カリウムと、
コスモトロピック塩と、
カオトロピック塩と、
直鎖又は分岐トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、トリプロピルアンモニウム、トリブチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、テトラプロピルアンモニウム及びテトラブチルアンモニウムからなる群から選択されるカチオン並びに、リン酸、硫酸、硝酸、塩化物及び重炭酸塩からなる群から選択されるアニオンを含有する無機塩と、
ＮａＣｌと、
Ｎａ₃ＰＯ₄と、
Ｋ₃ＰＯ₄と、
Ｎａ₂ＳＯ₄と、
クエン酸カリウムと、
（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄と、
クエン酸ナトリウムと、
酢酸ナトリウムと、
酢酸アンモニウムと、
マグネシウム塩と、
リチウム塩と、
ナトリウム塩と、
カリウム塩と、
セシウム塩と、
亜鉛塩と、
アルミニウム塩と、
臭化物塩と、
ヨウ化物塩と、
フッ化物塩と、
炭酸塩と、
硫酸塩と、
クエン酸塩と、
カルボン酸塩と、
ホウ酸塩と、
リン酸塩と、
リン酸カリウムと、
それらの組み合わせと、
からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記第４相溶液に溶解されている塩は、
リン酸二カリウムと、
リン酸一カリウムと、
コスモトロピック塩と、
カオトロピック塩と、
直鎖又は分岐トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、トリプロピルアンモニウム、トリブチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、テトラプロピルアンモニウム及びテトラブチルアンモニウムからなる群から選択されるカチオン並びに、リン酸、硫酸、硝酸、塩化物及び重炭酸塩からなる群から選択されるアニオンを含有する無機塩と、
ＮａＣｌと、
Ｎａ₃ＰＯ₄と、
Ｋ₃ＰＯ₄と、
Ｎａ₂ＳＯ₄と、
クエン酸カリウムと、
（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄と、
クエン酸ナトリウムと、
酢酸ナトリウムと、
酢酸アンモニウムと、
マグネシウム塩と、
リチウム塩と、
ナトリウム塩と、
カリウム塩と、
セシウム塩と、
亜鉛塩と、
アルミニウム塩と、
臭化物塩と、
ヨウ化物塩と、
フッ化物塩と、
炭酸塩と、
硫酸塩と、
クエン酸塩と、
カルボン酸塩と、
ホウ酸塩と、
リン酸塩と、
リン酸カリウムと、
それらの組み合わせと、
からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記第１ＡＴＰＳの前記第２相溶液は、前記標的サイズを下回る前記標的核酸断片に対して、前記第２ＡＴＰＳの前記第４相溶液よりも弱い排除体積相互作用を及ぼす、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記第１ＡＴＰＳの前記第１相溶液は、前記標的サイズを下回る前記標的核酸断片に対して、前記第２ＡＴＰＳの前記第３相溶液よりも強い排除体積相互作用を及ぼす、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記第１ＡＴＰＳの前記第２相溶液は、前記標的サイズを下回る前記標的核酸断片の前記第２相への分配に対して、前記第２ＡＴＰＳの前記第４相溶液よりも有利な親水性／疎水性相互作用を及ぼす、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記第１ＡＴＰＳの前記第１相溶液は、前記標的サイズを下回る前記標的核酸断片の前記第１相溶液への分配に対して、前記第２ＡＴＰＳの前記第３相溶液よりも有利ではない親水性／疎水性相互作用を及ぼす、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記第１ＡＴＰＳの前記第２相溶液は、前記標的サイズを下回る前記標的核酸断片の前記第２相への分配に対して、前記第２ＡＴＰＳの前記第４相溶液よりも有利な静電相互作用を及ぼす、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記第１ＡＴＰＳの前記第１相溶液は、前記標的サイズを下回る前記標的核酸断片の前記第１相溶液への分配に対して、前記第２ＡＴＰＳの前記第４相溶液よりも有利ではない静電相互作用を及ぼす、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記標的サイズを下回る前記濃縮標的核酸断片を回収することは、
前記第３相溶液を前記第４相溶液から分離することと；
前記第３相溶液を、水溶液に溶解されている、ポリマー、界面活性剤、塩及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのサイズ分画成分と混合して、前記標的サイズを下回る前記濃縮標的核酸断片で構成される上清及び前記標的サイズを上回る核酸の沈殿ペレットを形成することと；
前記上清を、前記標的サイズを上回る核酸の前記沈殿ペレットから分離し、且つ前記標的サイズを下回る前記標的核酸断片を前記上清から沈殿させることと
を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

前記少なくとも１つのサイズ分画成分は、前記第１相を形成するポリマーよりも高い分子量を有するポリマーを含み、及び前記第１相を形成するポリマーは、前記第２相を形成するポリマーよりも高い分子量を有する、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記上清中の前記少なくとも１つのサイズ分画成分のモル濃度は、前記第１相溶液中の前記第１相を形成するポリマーのモル濃度未満であり、及び前記第１相溶液中の前記第１相を形成するポリマーは、前記第３相溶液中の前記第２相を形成するポリマーのモル濃度よりも高いモル濃度を有する、請求項１３に記載の方法。

【請求項16】

前記上清中の前記少なくとも１つのサイズ分画成分の質量濃度は、前記第１相溶液中の前記第１相を形成するポリマーの質量濃度未満であり、及び前記第１相溶液中の前記第１相を形成するポリマーは、前記第３相溶液中の前記第２相を形成するポリマーの質量濃度よりも高い質量濃度を有する、請求項１３に記載の方法。

【請求項17】

前記少なくとも１つのサイズ分画成分は、塩、ポリマー、界面活性剤及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。

【請求項18】

前記第１相を形成するポリマー及び前記第２相を形成するポリマーは、２００～１００００の分子量を有する、請求項１３に記載の方法。

【請求項19】

前記液体混合物は、血液、血漿、細胞、エキソソーム、タンパク質、無細胞ＤＮＡ、ＲＮＡ及び循環腫瘍ＤＮＡの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項20】

前記標的サイズは、１０，０００ｂｐ未満である、請求項１に記載の方法。

【請求項21】

前記標的サイズは、１０００ｂｐ未満である、請求項１に記載の方法。

【請求項22】

核酸及び夾雑物を含む液体混合物から標的サイズを下回る標的核酸断片を単離及び濃縮するためのキットであって、
第１相溶液に溶解されている、第１相を形成するポリマー及び第２相溶液に溶解されている塩を含む第１水性二相系（ＡＴＰＳ）を形成する組成物を有し、それにより、前記第１水性二相系（ＡＴＰＳ）を形成する前記組成物が前記液体混合物と混合されるとき、前記標的サイズを下回る前記標的核酸断片は、前記第２相溶液に分配され、及び夾雑物は、前記第１相溶液に分配される、形成することのための成分であって、
前記第１相を形成するポリマーは、ポリアルキレングリコール、ポリ（オキシアルキレン）ポリマー、ポリ（オキシアルキレン）コポリマー、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリビニルカプロラクタム、ポリビニルメチルエーテル、アルコキシ化界面活性剤、アルコキシ化デンプン、アルコキシ化セルロース、アルキルヒドロキシアルキルセルロース、シリコン修飾されたポリエーテル並びにポリＮ－イソプロピルアクリルアミド及びそのコポリマーであり、
前記第２相溶液に溶解されている塩は、
リン酸二カリウムと、
リン酸一カリウムと、
コスモトロピック塩と、
カオトロピック塩と、
直鎖又は分岐トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、トリプロピルアンモニウム、トリブチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、テトラプロピルアンモニウム及びテトラブチルアンモニウムからなる群から選択されるカチオン並びに、リン酸、硫酸、硝酸、塩化物及び重炭酸塩からなる群から選択されるアニオンを含有する無機塩と、
ＮａＣｌと、
Ｎａ₃ＰＯ₄と、
Ｋ₃ＰＯ₄と、
Ｎａ₂ＳＯ₄と、
クエン酸カリウムと、
（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄と、
クエン酸ナトリウムと、
酢酸ナトリウムと、
酢酸アンモニウムと、
マグネシウム塩と、
リチウム塩と、
ナトリウム塩と、
カリウム塩と、
セシウム塩と、
亜鉛塩と、
アルミニウム塩と、
臭化物塩と、
ヨウ化物塩と、
フッ化物塩と、
炭酸塩と、
硫酸塩と、
クエン酸塩と、
カルボン酸塩と、
ホウ酸塩と、
リン酸塩と、
リン酸カリウムと、
それらの組み合わせと、
からなる群から選択され；
第３相溶液に溶解されている、第２相を形成するポリマー及び第４相溶液に溶解されている塩を含む第２ＡＴＰＳを形成する組成物であって、それにより、前記第２ＡＴＰＳを形成する前記組成物が前記第２相溶液と混合されるとき、前記標的サイズを下回る前記標的核酸断片は、前記第３相溶液に分配され、且つその中で濃縮される、形成することのための成分であって；
前記第２相を形成するポリマーは、ポリアルキレングリコール、ポリ（オキシアルキレン）ポリマー、ポリ（オキシアルキレン）コポリマー、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリビニルカプロラクタム、ポリビニルメチルエーテル、アルコキシ化界面活性剤、アルコキシ化デンプン、アルコキシ化セルロース、アルキルヒドロキシアルキルセルロース、シリコン修飾されたポリエーテル並びにポリＮ－イソプロピルアクリルアミド及びそのコポリマーであり、
前記第４相溶液に溶解されている塩は、
リン酸二カリウムと、
リン酸一カリウムと、
コスモトロピック塩と、
カオトロピック塩と、
直鎖又は分岐トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、トリプロピルアンモニウム、トリブチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、テトラプロピルアンモニウム及びテトラブチルアンモニウムからなる群から選択されるカチオン並びに、リン酸、硫酸、硝酸、塩化物及び重炭酸塩からなる群から選択されるアニオンを含有する無機塩と、
ＮａＣｌと、
Ｎａ₃ＰＯ₄と、
Ｋ₃ＰＯ₄と、
Ｎａ₂ＳＯ₄と、
クエン酸カリウムと、
（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄と、
クエン酸ナトリウムと、
酢酸ナトリウムと、
酢酸アンモニウムと、
マグネシウム塩と、
リチウム塩と、
ナトリウム塩と、
カリウム塩と、
セシウム塩と、
亜鉛塩と、
アルミニウム塩と、
臭化物塩と、
ヨウ化物塩と、
フッ化物塩と、
炭酸塩と、
硫酸塩と、
クエン酸塩と、
カルボン酸塩と、
ホウ酸塩と、
リン酸塩と、
リン酸カリウムと、
それらの組み合わせと、
からなる群から選択され、
前記第３相溶液から前記標的核酸断片を濃縮するための材料を含むキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、連続的水相系における核酸断片の単離、濃度及び／又は精製に関する。特に、本発明は、生物学的材料からの核酸断片の単離、濃縮及び／又は精製のためのサンプル調製方法、組成物及びキット成分を提供する。

【背景技術】

【0002】

血液、組織、尿及び法医学サンプル並びに細菌及び哺乳動物細胞培地などの複雑なマトリックスからの核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡなど）の単離及び精製方法は、遺伝子研究、核酸プローブ診断、法医学ＤＮＡ検査及び核酸の増幅、プロセシング又は分析を必要とする他の領域において重要である。精製された核酸は、検出、配列決定、臨床診断などを含む様々な下流適用において使用可能であるように、高品質であり且つ十分な量に達しなければならない。精製された核酸を入手することは、尿、血液、血漿、血清、唾液及び他の生物学的液体を含む、核酸が同定される複合環境内に存在する大量の汚染性細胞物質（例えば、タンパク質及び炭水化物）の存在のため、複雑な作業である。生物学的サンプルからの核酸の抽出及び精製のための現在の方法は、通常、時間を費やし、面倒であり、コストがかかり、有害な有機溶媒の使用を含み、特定のサイズ、例えば１０００ｂｐを上回る核酸のみを捕捉ことに適することが多い。

【0003】

生物学的液体、例えば尿及び血液中に非常に低い濃度で存在する標的分析物の場合、その後の分子技術による検出のために十分な量の標的分析物を得るため、大量の生物学的液体を入手することが求められる。極めて低い濃度を有する分析物の存在を検出することは、大きい課題となっている。分析物は、患者の唾液、血液、尿及び他の体液などのサンプル中に存在する無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）又はタンパク質などの疾患のバイオマーカーであり得る。既存の診断又は検出方法の多くは、分析物濃度が低すぎる場合、分析物が存在しないと誤って報告することがある。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などの診断のゴールドスタンダードは、標的分析物がアッセイの検出範囲外の極めて低い量を有する場合、偽陰性結果を生成することがある。

【0004】

バイオマーカーが少量で存在する場合、正確な検出は、核酸をバックグラウンドから濃縮し得る単離方法に依存する。単離方法に応じて、この負荷は、核酸断片サイズの変動及び試験阻害剤による影響により複雑化され得る。核酸の精製のために種々の方法が用いられている。これらは、沈殿、限外濾過（Ｈｉｒａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｓｃｉ．，１０６：１２３－１２９（１９９５））に加えて、アニオン交換カラムを用いる吸着を含む。市販の方法を含む他の試験方法は、より低いＤＮＡ抽出収量を有し、２００ｂｐ長未満の小さいＤＮＡ断片を抽出できないことが報告されている（Ｆｏｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５５（３），５８７－５８９，２００９）。Ｒｉｂｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．Ｍａｙ ２０，２００２；７８（４）：３７６－８４）は、ポリマー成分としてＰＥＧ、また塩成分としてリン酸水素二カリウム（Ｋ₂ＨＰＯ₄）を用いる水性二相系（ＡＴＰＳ）について記載している。大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａからのプラスミドｐＣＦ１－ＣＦＴＲの単離が報告されている。この場合、細胞が最初にアルカリ溶解（ＮａＯＨ及びＳＤＳを含有する溶解緩衝液）を通して破壊され、次にライセートが３Ｍ酢酸ナトリウムで中和された。その後、細胞片、タンパク質及びゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）がバッチの遠心分離により除去された。上記の水性二相系において、清澄化されたライセートが利用された。しかし、このプロセスは、装置及び時間の観点で非常に高価であるという欠点を有する。上記の論文は、それら全体が参照により本明細書で援用される。市販のベンチトップ固相キット、例えばＱｉａｇｅｎ（登録商標）及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）により提供されたものは、核酸の比較的迅速な抽出及び精製を可能にするが、ベンチトップ実験機器を必要とし、それは、抽出及び精製が主に基本的な装置及び電源を有する実験室に限られることを意味する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

したがって、小さい標的断片サイズの核酸のより高い濃度及びより高い分子数を、下流適用にとっての正確なより高いシグナル対ノイズ、ポイントオブケア検査など、様々な産業、臨床及び研究用途に適合する安価な様式で達成するための簡素化された方法及び装置が非常に望ましいであろう。

【課題を解決するための手段】

【0006】

既存の技術の前述の制約を克服するために、複雑な設備の必要性を伴わずに連続的な水性二相系（ＡＴＰＳ）を利用する、安価であり、迅速であり、完全に液体のプロセスにおける分析物のサイズ選択的な濃縮、単離及び分析のための新規の方法、組成物及びキットが開示される。方法及び組成物は、細胞溶解、標的化されない生体分子の除去及び／又は標的化される分析物の濃縮を含む以下の複数の作業を達成することができる。いくつかの実施形態では、分析物は、選択されたサイズ未満の核酸断片、例えば１０００未満の塩基対（例えば、１０，０００ｂｐ、１０００ｂｐ、９００ｂｐ、８００ｂｐ、７００ｂｐ、６００ｂｐ、５００ｂｐ、４５０ｂｐ、４００ｂｐ、３５０ｂｐ、３００ｂｐ、２５０ｂｐ、２００ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ又は５０ｂｐ未満）を含む核酸である。いくつかの実施形態では、分析物は、一本鎖核酸であるが、他の実施形態では、分析物は、二本鎖核酸である。標的サイズのカットオフは、成分を形成及び分画するＡＴＰＳ相の適切な選択及び特定の順序並びに遠心分離、混合及びインキュベーション工程を介して選択され得る。いくつかの実施形態では、核酸断片は、分析に最も有利な範囲において、１０００ｂｐ未満の５０ｂｐ標的サイズカットオフ精度及びより好ましくは２５ｂｐの精度で単離及び濃縮され得る。

【0007】

本発明は、生物学的サンプルに由来する核酸を精製し、続いてそうでない場合に疾患検出、増幅及び遺伝子型判定などの下流適用に支障をきたすであろう、核酸に由来するＡＴＰＳの成分を除去するための改善された方法を提供する。例示的な生物学的サンプルは、血液、血漿、唾液、尿、細胞、エキソソーム、タンパク質、ｃｆＤＮＡ、ＲＮＡ及び循環腫瘍細胞を含み得る。本発明者らは、開示された安定で反復可能なプロセスが、核酸の損失をほとんど又は全く伴わずに核酸精製を達成すること（すなわち非常に高い回収率）及び固有のＡＴＰＳの一相を抽出し、それを、第１ＡＴＰＳの相形成成分と異なる化学特性を有する相形成成分と混合することにより、標的核酸が、第２ＡＴＰＳにおいて、第１ＡＴＰＳで分配された相と反対の相に分配される第２ＡＴＰＳが形成され得ることを予想外にも発見した。

【0008】

いくつかの実施形態において提供されるこれは、方法であり、核酸及び夾雑物を含む液体の生物学的混合物から所望の標的サイズの核酸を単離及び濃縮することについて開示される。生物学的混合物は、第１相溶液に溶解されている、第１相を形成するポリマー又は界面活性剤成分及び第２相溶液から形成された第１ＡＴＰＳと組み合わされ得、それにより、標的サイズを下回る標的核酸断片は、前記第２相溶液に分配されることによって単離される一方、夾雑物は、第１相溶液に分配される。次に、第２相溶液は、抽出され、且つ第３相溶液に溶解されている、第２相を形成するポリマー又は界面活性剤成分及び第４相溶液から形成された第２ＡＴＰＳと混合され得、それにより、標的核酸断片は、第３相溶液に分配されることによって濃縮される。次に、濃縮標的核酸断片は、任意の数の方法で第３相溶液から回収され得る。

【0009】

いくつかの実施形態では、第１相及び第２相を形成するポリマー又は界面活性剤成分は、１つ以上のポリマー、１つ以上の界面活性剤及びそれらの組み合わせを含み得る。利用され得る可能なポリマーとしては、疎水的に修飾されたポリアルキレングリコールなどのポリアルキレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（オキシアルキレン）ポリマー、疎水的に修飾されたポリ（オキシアルキレン）コポリマーなどのポリ（オキシアルキレン）コポリマー、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリビニルカプロラクタム、ポリビニルメチルエーテル、アルコキシ化界面活性剤、アルコキシ化デンプン、アルコキシ化セルロース、アルキルヒドロキシアルキルセルロース、シリコン修飾されたポリエーテル並びにポリＮ－イソプロピルアクリルアミド及びそのコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、第１相を形成するポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール又はデキストランを含む。利用され得る可能な界面活性剤としては、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ、Ｔｒｉｔｏｎ－１１４、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ－６３０及びＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０、カルボン酸塩、スルホン酸塩、石油スルホン酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩、オレフィンスルホン酸塩、アルキルスルホン酸塩、硫酸塩、硫酸化天然油及び脂肪などのアニオン性界面活性剤、硫酸化エステル、硫酸化アルカノールアミド、アルキルフェノール、エトキシ化脂肪族アルコールなどのエトキシ化及び硫酸化非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレン界面活性剤、カルボン酸エステル、ポリエチレングリコールエステル、無水ソルビトールエステル、脂肪酸のグリコールエステル、カルボン酸アミド、モノアルカノールアミン縮合物、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド、四級アンモニウム塩、アミド結合を有するアミン、ポリオキシエチレンアルキル及び脂環アミンなどのカチオン性界面活性剤、ｎ，ｎ，ｎ’，ｎ’テトラキス置換エチレンジアミン、２－アルキル１－ヒドロキシエチル２－イミダゾリン並びにｎ－ココ３－アミノプロピオン酸／ナトリウム塩、ｎ－タロー３－イミノジプロピオン酸塩、二ナトリウム塩、ｎ－カルボキシメチルｎジメチルｎ－９オクタデセニル水酸化アンモニウム、ｎ－ココアミドエチルｎヒドロキシエチルグリシン及びナトリウム塩などの両性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。

【0010】

いくつかの実施形態では、第１ポリマー又は界面活性剤成分は、第２ポリマー又は界面活性剤成分よりも高い分子量を有する。

【0011】

いくつかの実施形態では、ＮＡ単離ＡＴＰＳの第１相溶液中の第１ポリマー又は界面活性剤成分のモル濃度は、第３相溶液中の第２ポリマー又は界面活性剤成分、第４相溶液中の第２ポリマー又は界面活性剤成分及びＮＡ濃縮ＡＴＰＳ中の第２ポリマー又は界面活性剤成分の少なくとも１つのモル濃度よりも高い。

【0012】

いくつかの実施形態では、ＮＡ単離ＡＴＰＳの第１相溶液中の第１ポリマー又は界面活性剤成分の質量濃度は、第３相溶液中の第２ポリマー又は界面活性剤成分、第４相溶液中の第２ポリマー又は界面活性剤成分及びＮＡ濃縮ＡＴＰＳ中の第２ポリマー又は界面活性剤成分の少なくとも１つの質量濃度よりも高い。一実施形態では、第１相溶液中の第１ポリマー又は界面活性剤成分濃度は、水溶液の総重量の約０．０１重量％～約９０重量％（ｗ／ｗ）の範囲である。様々な実施形態では、第１相溶液は、約０．０１％ｗ／ｗ、約０．０５％ｗ／ｗ、約０．１％ｗ／ｗ、約０．１５％ｗ／ｗ、約０．２％ｗ／ｗ、約０．２５％ｗ／ｗ、約０．３％ｗ／ｗ、約０．３５％ｗ／ｗ、約０．４％ｗ／ｗ、約０．４５％ｗ／ｗ、約０．５％ｗ／ｗ、約０．５５％ｗ／ｗ、約０．６％ｗ／ｗ、約０．６５％ｗ／ｗ、約０．７％ｗ／ｗ、約０．７５％ｗ／ｗ、約０．８％ｗ／ｗ、約０．８５％ｗ／ｗ、約０．９％ｗ／ｗ、約０．９５％ｗ／ｗ又は約１％ｗ／ｗであるポリマー又は界面活性剤溶液から選択される。いくつかの実施形態では、第１相溶液は、約１％ｗ／ｗ、約２％ｗ／ｗ、約３％ｗ／ｗ、約４％ｗ／ｗ、約５％ｗ／ｗ、約６％ｗ／ｗ、約７％ｗ／ｗ、約８％ｗ／ｗ、約９％ｗ／ｗ、約１０％ｗ／ｗ、約１１％ｗ／ｗ、約１２％ｗ／ｗ、約１３％ｗ／ｗ、約１４％ｗ／ｗ、約１５％ｗ／ｗ、約１６％ｗ／ｗ、約１７％ｗ／ｗ、約１８％ｗ／ｗ、約１９％ｗ／ｗ、約２０％ｗ／ｗ、約２１％ｗ／ｗ、約２２％ｗ／ｗ、約２３％ｗ／ｗ、約２４％ｗ／ｗ、約２５％ｗ／ｗ、約２６％ｗ／ｗ、約２７％ｗ／ｗ、約２８％ｗ／ｗ、約２９％ｗ／ｗ、約３０％ｗ／ｗ、約３１％ｗ／ｗ、約３２％ｗ／ｗ、約３３％ｗ／ｗ、約３４％ｗ／ｗ、約３５％ｗ／ｗ、約３６％ｗ／ｗ、約３７％ｗ／ｗ、約３８％ｗ／ｗ、約３９％ｗ／ｗ、約４０％ｗ／ｗ、約４１％ｗ／ｗ、約４２％ｗ／ｗ、約４３％ｗ／ｗ、約４４％ｗ／ｗ、約４５％ｗ／ｗ、約４６％ｗ／ｗ、約４７％ｗ／ｗ、約４８％ｗ／ｗ、約４９％ｗ／ｗ及び約５０％ｗ／ｗであるポリマー又は界面活性剤溶液から選択される。

【0013】

いくつかの実施形態では、単離ＡＴＰＳ中の第２相溶液は、少なくとも１つの相を形成する上記の通りの溶解された界面活性剤又はポリマー成分並びに／又はリン酸二カリウム、リン酸一カリウム及びそれらの組み合わせなどの溶解された塩を含む。いくつかの実施形態では、塩としては、コスモトロピック塩、カオトロピック塩、直鎖又は分岐トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、トリプロピルアンモニウム、トリブチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、テトラプロピルアンモニウム及びテトラブチルアンモニウムなどのカチオン並びにリン酸、硫酸、硝酸、塩化物及び重炭酸塩などのアニオンを含有する無機塩が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、Ｎａ₃ＰＯ₄、Ｋ₃ＰＯ₄、Ｎａ₂ＳＯ₄、クエン酸カリウム、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム及びそれらの組み合わせを含み得る。他の塩、例えば酢酸アンモニウムも使用され得る。別の実施形態では、塩は、マグネシウム塩、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、セシウム塩、亜鉛塩及びアルミニウム塩から選択され得る。いくつかの実施形態では、塩は、臭化物塩、ヨウ化物塩、フッ化物塩、炭酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、カルボン酸塩、ホウ酸塩及びリン酸塩から選択され得る。いくつかの実施形態では、塩は、リン酸カリウムを含む。いくつかの実施形態では、塩は、硫酸アンモニウムを含む。一実施形態では、全体的な塩濃度は、約０．０１％～約９０％の範囲である。当業者は、ＡＴＰＳを形成するのに必要となる塩の量がポリマー又は界面活性剤の分子量、濃度及び物理的状態によって影響されることを理解するであろう。様々な実施形態では、塩溶液は、約０．００１％ｗ／ｗ～９０％ｗ／ｗである。様々な実施形態では、塩溶液は、約０．０１％ｗ／ｗ、約０．０５％ｗ／ｗ、約０．１％ｗ／ｗ、約０．１５％ｗ／ｗ、約０．２％ｗ／ｗ、約０．２５％ｗ／ｗ、約０．３％ｗ／ｗ、約０．３５％ｗ／ｗ、約０．４％ｗ／ｗ、約０．４５％ｗ／ｗ、約０．５％ｗ／ｗ、約０．５５％ｗ／ｗ、約０．６％ｗ／ｗ、約０．６５％ｗ／ｗ、約０．７％ｗ／ｗ、約０．７５％ｗ／ｗ、約０．８％ｗ／ｗ、約０．８５％ｗ／ｗ、約０．９％ｗ／ｗ、約０．９５％ｗ／ｗ又は約１％ｗ／ｗである。いくつかの実施形態では、塩溶液は、約１％ｗ／ｗ、約２％ｗ／ｗ、約３％ｗ／ｗ、約４％ｗ／ｗ、約５％ｗ／ｗ、約６％ｗ／ｗ、約７％ｗ／ｗ、約８％ｗ／ｗ、約９％ｗ／ｗ、約１０％ｗ／ｗ、約１１％ｗ／ｗ、約１２％ｗ／ｗ、約１３％ｗ／ｗ、約１４％ｗ／ｗ、約１５％ｗ／ｗ、約１６％ｗ／ｗ、約１７％ｗ／ｗ、約１８％ｗ／ｗ、約１９％ｗ／ｗ、約２０％ｗ／ｗ、約２１％ｗ／ｗ、約２２％ｗ／ｗ、約２３％ｗ／ｗ、約２４％ｗ／ｗ、約２５％ｗ／ｗ、約２６％ｗ／ｗ、約２７％ｗ／ｗ、約２８％ｗ／ｗ、約２９％ｗ／ｗ、約３０％ｗ／ｗ、約３１％ｗ／ｗ、約３２％ｗ／ｗ、約３３％ｗ／ｗ、約３４％ｗ／ｗ、約３５％ｗ／ｗ、約３６％ｗ／ｗ、約３７％ｗ／ｗ、約３８％ｗ／ｗ、約３９％ｗ／ｗ、約４０％ｗ／ｗ、約４１％ｗ／ｗ、約４２％ｗ／ｗ、約４３％ｗ／ｗ、約４４％ｗ／ｗ、約４５％ｗ／ｗ、約４６％ｗ／ｗ、約４７％ｗ／ｗ、約４８％ｗ／ｗ、約４９％ｗ／ｗ及び約５０％ｗ／ｗである。一実施形態では、塩の濃度は、約２％ｗ／ｗ～４０％ｗ／ｗである。一実施形態では、塩の濃度は、約３％ｗ／ｗ～３０％ｗ／ｗである。一実施形態では、塩の濃度は、約５％ｗ／ｗ～２０％ｗ／ｗである。

【0014】

いくつかの実施形態では、濃縮ＡＴＰＳ中の第４相溶液は、上記の通りの少なくとも１つの相形成溶解塩、界面活性剤又はポリマー成分及びそれらの組み合わせを含む。

【0015】

いくつかの実施形態では、単離ＡＴＰＳの第２相溶液は、標的核酸断片に対して、濃縮ＡＴＰＳの第４相溶液よりも弱い排除体積相互作用を及ぼす。いくつかの実施形態では、単離ＡＴＰＳの第１相溶液は、標的核酸断片に対して、濃縮ＡＴＰＳの第３相溶液よりも強い排除体積相互作用を及ぼす。

【0016】

いくつかの実施形態では、単離ＡＴＰＳの第２相溶液は、標的核酸断片の前記第２相への分配に対して、濃縮ＡＴＰＳの第４相溶液よりも有利な親水性及び疎水性相互作用を及ぼす。より具体的には、ＤＮＡの分子が第３相溶液から第４相溶液に移動するときよりも、標的ＤＮＡの分子が第１相溶液から第２相溶液に移動するときに自由エネルギーの有利な変化がある。いくつかの実施形態では、単離ＡＴＰＳの第１相溶液は、標的核酸断片の前記第１相溶液への分配に対して、濃縮ＡＴＰＳの第３相溶液よりも有利ではない親水性及び疎水性相互作用を及ぼす。

【0017】

いくつかの実施形態では、単離ＡＴＰＳの第２相溶液は、標的核酸断片の前記第２相への分配に対して、濃縮ＡＴＰＳの第４相溶液よりも有利な静電相互作用を及ぼす。より具体的には、ＤＮＡの分子が第３相溶液から第４相溶液に移動するときよりも、標的ＤＮＡの分子が第１相溶液から第２相溶液に移動するときに自由エネルギーの有利な変化がある。いくつかの実施形態では、単離ＡＴＰＳの第１相溶液は、標的核酸断片の前記第１相溶液への分配に対して、濃縮ＡＴＰＳの第４相溶液よりも有利ではない静電相互作用を及ぼす。

【0018】

１つの特定の実施形態では、第２ＡＴＰＳ中の濃縮標的核酸断片の回収は、第３相溶液を第４相溶液から分離することと、第３相溶液を、ポリマー、界面活性剤、塩及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのサイズ分画成分と混合して、濃縮標的核酸で構成される上清及び標的カットオフサイズを上回る核酸の沈殿ペレットを形成することとを含み得る。次に、上清は、標的カットオフサイズを上回る核酸の沈殿ペレットから分離され得、及び選択されたカットオフサイズ未満の標的核酸断片は、上清から沈殿され得る。

【0019】

いくつかの実施形態では、サイズ分画成分は、単離ＡＴＰＳの第１ポリマー又は界面活性剤成分よりも高い分子量を有するポリマー又は界面活性剤成分を含み得、第１ポリマー又は界面活性剤成分は、濃縮ＡＴＰＳの第２ポリマー又は界面活性剤成分よりも高い分子量を有する。

【0020】

いくつかの実施形態では、上清中の少なくとも１つのサイズ分画成分のモル濃度は、第１相溶液中の第１ポリマー又は界面活性剤成分のモル濃度未満であり得、及び第１相溶液中の第１ポリマー又は界面活性剤成分は、第３相溶液中の第２ポリマー又は界面活性剤成分のモル濃度よりも高いモル濃度を有する。

【0021】

いくつかの実施形態では、上清中の少なくとも１つのサイズ分画成分の質量濃度は、第１相溶液中の第１ポリマー又は界面活性剤成分の質量濃度未満であり、及び第１相溶液中の第１ポリマー又は界面活性剤成分は、第３相溶液中の第２ポリマー又は界面活性剤成分の質量濃度よりも高い質量濃度を有する。

【0022】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのサイズ分画成分は、上記のものなどの１つ以上の塩、ポリマー及び／若しくは界面活性剤又はそれらの組み合わせを含み得る。

【0023】

別の主要な実施形態では、核酸及び夾雑物を含む液体の（例えば、生物学的）混合物から、選択された小さい標的サイズの核酸を単離及び濃縮するための組成物が開示される。組成物は、第１相溶液に溶解されている、第１相を形成するポリマー又は界面活性剤成分及び第２相溶液からＮＡ単離ＡＴＰＳを形成することであって、それにより、液体混合物と混合されるとき、標的サイズを下回る標的核酸断片は、前記第２相溶液に分配され、及び夾雑物は、第１相溶液に分配される、形成することのための成分と、第３相溶液に溶解されている、第２相を形成するポリマー又は界面活性剤成分及び第４相溶液からＮＡ濃縮ＡＴＰＳを形成することであって、それにより、第２相溶液と混合されるとき、標的核酸断片は、第３相溶液に分配され、且つその中で濃縮される、形成することのための成分とを含み得る。組成物は、第３相溶液から標的核酸断片を濃縮するための材料も含み得る。

【0024】

さらに別の実施形態では、核酸及び夾雑物を含む液体混合物から標的サイズの核酸を単離及び濃縮するためのキットが開示される。キットは、組成物実施形態において記載される組成物成分を含み得るが、保管、充填及び／又は反応のためのシリンジ又はピペットを利用できる容器並びに任意選択により水溶液を操作するための備品をさらに含み得る。そのような容器及び備品は、カラム、試験管、毛細管チューブ、プラスチック試験管、ファルコンチューブ、培養チューブ、ウェルプレート、ピペット及び／又はキュベットを含み得る。

【0025】

これら及び他の特色及び特徴並びに操作の方法及び関連する成分の機能及び製造の経済性は、添付の図に照らして以下の詳細な説明及び添付の特許請求の範囲を考慮してより明確になり、これらのすべては、本明細書の一部を形成し、同様の参照番号は、様々な図における対応する部分を指定する。しかしながら、図面は、単に図示及び説明のためのものであり、特許請求の範囲の限定を定義するものではないことが明確に理解されるべきである。本明細書及び特許請求の範囲で使用する場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」は、文脈において他に明確な断りがない限り、複数の指示対象を含む。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】液体の（例えば、生物学的）混合物からの小さい断片サイズの核酸を単離及び濃縮するためのワークフローの実施形態を図示する。

【図2】本発明の一実施形態によって分配された核酸のゲル電気泳動画像を示す。

【図3A】本発明に従う単離及び濃縮ステップの実施形態において回収された核酸の百分率を示す。

【図3B】本発明に従う単離及び濃縮ステップの実施形態において回収された核酸の百分率を示す。

【図4】本発明のいくつかの実施形態に従う核酸サイズ分画によるペレット及び上清のゲル電気泳動画像を示す。

【図5】本発明のいくつかの実施形態に従う選択された断片サイズによる核酸分画によるペレット及び上清のゲル電気泳動画像を示す。

【図6A】本発明の実施形態とＱｉａｇｅｎキットとの間でのＤＮＡ回収率比較を示す。

【図6B】

【図7】本発明の実施形態例に従う上相及び下相のゲル電気泳動画像を示す。

【図8】本発明の実施形態例に従う３つのサンプルのＤＮＡ回収及びタンパク質回収率を示す。

【図9】本発明の実施形態例に従う、除去された液体、最終抽出物及びＴに富む相のゲル電気泳動画像を示す。

【図10】本発明のいくつかの実施形態に従うペレット及び上清のゲル電気泳動画像を示す。

【発明を実施するための形態】

【0027】

別段の指定がない限り、技術用語及び科学用語を含む、本明細書で使用される用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有し、本発明の趣旨を不明瞭にし得る、よく知られる機能及び構成の詳細な説明は、省略される。

【0028】

「水性」は、本明細書で使用する場合、溶媒和させる物質が主に親水性の性質を有する溶媒／溶質系の特徴的な特性を指す。水性の溶媒／溶質系の例は、水又は水を含有する組成物が主な溶媒であるものを含む。使用が実施形態において記載されるポリマー及び／又は界面活性剤成分は、水などの溶媒と組み合わされるとき、それらが水相を形成するという意味で「水性」である。さらに、当業者によって理解される通り、本明細書に関連して、液体「混合物」という用語は、単に本明細書で定義される成分の組み合わせを指す。

【0029】

本明細書で使用する場合、水性二相系（ＡＴＰＳ）は、分配することによって分析物の単離又は濃縮を達成することができる液体－液体分離系を意味し、２つの相、区画、領域又は成分などは、それらが暴露され且つ任意選択により溶解される少なくとも１つの分析物と別々に相互作用する。ＡＴＰＳは、特定の濃度を有する塩及びポリマー又は２つの非相溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ及びデキストラン）などの２つの不混和性の相形成成分が水溶液中で混合されるときに形成される。ＡＴＰＳ法は、それらが夾雑物から分析物（例えば、核酸）を分離する二相分配を利用するため、比較的安価であり且つスケーラブルである。

【0030】

用語「単離される」は、本明細書で使用する場合、その元の環境から除去された核酸を指し、したがってその元の環境から変えられている。単離された核酸は、一般に、元のサンプル中に存在する成分の量より少ない非核酸成分（例えば、タンパク質、脂質）とともに提供される。単離されたサンプル核酸を含む組成物は、実質的に単離され得る（例えば、非核酸成分を、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％を超えて不含である）。

【0031】

本明細書で使用する場合、「濃縮される」は、目的の分析物と、分析物が懸濁される溶液との質量比がその前濃縮溶液中の前記分析物の質量比よりも高いことを意味する。例えば、それは、わずかに高いか又はより好ましくは少なくとも２倍、１０倍若しくは１００倍高い場合がある。

【0032】

本明細書で使用する場合、「ポリマー」は、ホモポリマー、コポリマー、ターポリマー、ランダムコポリマー及びブロックコポリマーを含むが、これらに限定されない。ブロックコポリマーは、ブロック、グラフト、デンドリマー及びスターポリマーを含むが、これらに限定されない。本明細書で使用する場合、コポリマーは、２つのモノマー種に由来するポリマーを指し；同様に、ターポリマーは、３つのモノマー種に由来するポリマーを指す。ポリマーは、直鎖ポリマー、分岐ポリマー、ランダムポリマー、架橋ポリマー及びデンドリマー系を含むが、これらに限定されない様々な形態も含む。例として、ポリアクリルアミドポリマーは、ポリアクリルアミドを含む任意のポリマー、例えばポリアクリルアミドのホモポリマー、コポリマー、ターポリマー、ランダムコポリマー、ブロックコポリマー又はターポリマーを指す。ポリアクリルアミドは、ポリアクリルアミドの直鎖ポリマー、分岐ポリマー、ランダムポリマー、架橋ポリマー又はデンドリマーであり得る。

【0033】

サンプルの調製
図１に関して、例となる方法の実施形態は、好適な容器１４において生物学的サンプル及び溶解緩衝液を混合することによって液体混合物１２を調製し、生物学的サンプル中の細胞、エキソソーム、タンパク質及び／又は他の材料から核酸１６を放出する適切な温度（例えば、１５℃～４０℃の範囲）で十分な時間（例えば、好ましくは１分～６０分の範囲内）インキュベートする任意選択の第１工程１０を含み得る。好ましくは、溶解緩衝液は、４～１１、好ましくは７～１０及び最も好ましくは８～９の範囲のｐＨを有し得る。溶解緩衝液における物質の濃度は、溶解される生物学的材料の量及び前記生物学的材料の供給様式に依存する。原理上、当業者に知られるいずれかの分離方法は、生物学的サンプルから核酸を放出するのに好適であり得る。検討され得る溶解方法は、特に、熱の作用による溶解、機械力の作用による溶解、例えばプロテインキナーゼＫなどの酵素による溶解又は細胞を界面活性剤若しくはカオトロピック化合物を含有する溶解緩衝液に接触させることによる溶解又は低張性溶液による溶解である。適宜、前述の手段は、例えば、界面活性剤又はカオトロピック化合物を含有する溶解緩衝液中で細胞を機械的に破壊するか、又は例えばカオトロピック化合物とともにプロテインキナーゼＫを含有する溶解緩衝液を利用することによっても組み合わされ得る。

【0034】

分析物の単離
単離成分１７は、夾雑物２０から標的核酸断片２６を分離するために、単離工程１８において混合物１２に加えられ、遠心分離を伴って又は伴わずに水性二相系ＡＴＰＳ １９を形成し得る。単離成分１７は、第１相溶液２２に溶解されている、第１相を形成するポリマー又は界面活性剤成分及び第２相溶液２４を含み得、それにより、選択される標的カットオフサイズ未満の標的核酸断片２６が第２相溶液２４（例えば、塩に富む下相）に分配される一方、タンパク質及び他の夾雑物２０は、第１相溶液２２（例えば、ポリマーに富む上相）に分配される。

【0035】

ポリマー－塩系、ポリマー－ポリマー系、ポリマー－界面活性剤系及びミセル又は逆ミセル系を含むいくつかの種類のＡＴＰＳ １９が利用され得る。相分離分配は、単離成分１７の適切な選択及び特定の順序、ｐＨ、分子量、相対濃度並びに遠心分離、混合及びインキュベーション工程などの要因によって影響され得る。

【0036】

単離成分１７は、第１相溶液２２及び第２相溶液２４を形成することを促進するポリマー又は界面活性剤成分を含み得る。好適なポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、デキストラン、疎水的に修飾されたポリアルキレングリコールなどのポリアルキレングリコール、ポリ（オキシアルキレン）ポリマー、疎水的に修飾されたポリ（オキシアルキレン）コポリマーなどのポリ（オキシアルキレン）コポリマー、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリビニルカプロラクタム、ポリビニルメチルエーテル、アルコキシ化界面活性剤、アルコキシ化デンプン、アルコキシ化セルロース、アルキルヒドロキシアルキルセルロース、シリコン修飾されたポリエーテル並びにポリＮ－イソプロピルアクリルアミド及びそのコポリマーを含み得る。好適な界面活性剤としては、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ、Ｔｒｉｔｏｎ－１１４、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ－６３０及びＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０、カルボン酸塩、スルホン酸塩、石油スルホン酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩、オレフィンスルホン酸塩、アルキルスルホン酸塩、硫酸塩、硫酸化天然油及び脂肪などのアニオン性界面活性剤、硫酸化エステル、硫酸化アルカノールアミド、アルキルフェノール、エトキシ化脂肪族アルコールなどのエトキシ化及び硫酸化非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレン界面活性剤、カルボン酸エステル、ポリエチレングリコールエステル、無水ソルビトールエステル、脂肪酸のグリコールエステル、カルボン酸アミド、モノアルカノールアミン縮合物、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド、四級アンモニウム塩、アミド結合を有するアミン、ポリオキシエチレンアルキル及び脂環アミンなどのカチオン性界面活性剤、ｎ，ｎ，ｎ’，ｎ’テトラキス置換エチレンジアミン、２－アルキル１－ヒドロキシエチル２－イミダゾリン並びにｎ－ココ３－アミノプロピオン酸／ナトリウム塩、ｎ－タロー３－イミノジプロピオン酸塩、二ナトリウム塩、ｎ－カルボキシメチルｎジメチルｎ－９オクタデセニル水酸化アンモニウム、ｎ－ココアミドエチルｎヒドロキシエチルグリシン及びナトリウム塩などの両性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。

【0037】

ＡＴＰＳ １９のポリマー－塩の実施形態では、第２相溶液２４は、溶解された塩を含む単離成分を含み得る。好適な塩としては、コスモトロピック塩、カオトロピック塩、直鎖又は分岐トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、トリプロピルアンモニウム、トリブチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、テトラプロピルアンモニウム及びテトラブチルアンモニウムなどのカチオン、リン酸、硫酸、硝酸、塩化物及び重炭酸塩などのアニオンを含有する無機塩、ＮａＣｌ、Ｎａ３ＰＯ４、Ｋ３ＰＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、クエン酸カリウム、（ＮＨ４）２ＳＯ４、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、マグネシウム塩、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、セシウム塩、亜鉛塩、アルミニウム塩、臭化物塩、ヨウ化物塩、フッ化物塩、炭酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、カルボン酸塩、ホウ酸塩、リン酸塩、リン酸カリウム、硫酸アンモニウム並びにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

【0038】

いくつかの実施形態では、第１相溶液２４は、２００～１００００Ｄａ（例えば、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、５１００、５２００、５３００、５４００、５５００、５６００、５７００、５８００、５９００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、５００００又は１０００００Ｄａ）の平均分子量を有するポリマーを含む単離成分１７を含有して形成される。

【0039】

分析物の濃縮
核酸断片２６を含有する作業溶液のプロセス体積を減少させることが望ましい。ＡＴＰＳにおいて、これは、上相の体積を減少させることによって達成され得る。濃縮工程３０のいくつかの実施形態では、標的核酸断片２６を含有する第２相溶液２４は、第２ＡＴＰＳ ３４を形成するために、容器１４から抽出され、遠心分離を伴って又は伴わずに第２容器３２において濃縮成分３１と混合され得る。他の実施形態では、核酸が少ない第１相溶液２２が抽出され得、容器１４は、濃縮工程３０を実施する際に使用され得る。濃縮成分３１は、第３相溶液３６（例えば、上相）に溶解されている、第２相を形成するポリマー又は界面活性剤成分及び第４相溶液３８（例えば、下相）を含み得、それにより、標的核酸断片２６は、第３相溶液３６（例えば、ポリマーに富む上相）に分配され、且つその中で濃縮される一方、塩及び他の夾雑物は、第４相溶液３８（例えば、塩に富む下相）に分配される。

【0040】

いくつかの実施形態では、核酸断片２６は、容器１４から抽出される前濃縮水性下相体積と比較して１／１０の水溶液体積に濃縮され得る。いくつかの実施形態では、分析物核酸は、ＡＴＰＳ ３４の形成前のその濃度に対して少なくとも１０倍（例えば、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０又は１０００倍以上）濃縮される。いくつかの実施形態では、力（例えば、重力又は遠心分離）をＡＴＰＳ ３４にかけることによるものなど、二相を分離することを促進する工程が利用され得る。

【0041】

いくつかの実施形態では、第３相溶液３６及び第４相溶液３８は、異なる体積を有し、核酸断片２６は、より小さい体積を有する相に優先的に分配される。いくつかの実施形態では、第４相溶液３８は、ＡＴＰＳ ３４の第３相溶液３６の４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０又は１００倍以上の体積を有する。

【0042】

いくつかの実施形態では、第１相溶液２２中の第１ポリマー又は界面活性剤成分１７のモル濃度は、第３相溶液３６中の第２ポリマー又は界面活性剤成分、第４相溶液３８中の第２ポリマー又は界面活性剤成分及び第２ＡＴＰＳ ３４中の第２ポリマー又は界面活性剤成分３１の少なくとも１つのモル濃度よりも高い場合がある。

【0043】

いくつかの実施形態では、第１相溶液２２中の第１ポリマー又は界面活性剤成分１７の質量濃度は、第３相溶液３６、第４相溶液３８又は全体的な第２ＡＴＰＳ ３４中の第２ポリマー又は界面活性剤成分３１の少なくとも１つの質量濃度よりも高い。

【0044】

いくつかの実施形態では、第４相溶液３８を含む第２ポリマー又は界面活性剤成分３１は、上記のものなどの１つ以上の相形成溶解塩、界面活性剤又はポリマー成分及びそれらの組み合わせを含む。

【0045】

いくつかの実施形態では、第２相溶液２４は、標的核酸断片２６に対して、第４相溶液３８よりも弱い排除体積相互作用を及ぼし、且つより有利な静電相互作用を及ぼす。

【0046】

いくつかの実施形態では、第１相溶液２２は、標的核酸断片２６に対して、第３相溶液３６よりも強い排除体積相互作用を及ぼし、且つ第４相溶液３８よりも有利ではない静電相互作用を及ぼす。

【0047】

いくつかの実施形態では、第２相溶液２２は、標的核酸断片２６の前記第２相２２への分配に対して、第４相溶液３８によって及ぼされるものよりも有利な親水性／疎水性相互作用を及ぼす。いくつかの実施形態では、第１相溶液２２は、標的核酸断片２６の前記第１相溶液２２への分配に対して、第３相溶液３６によって及ぼされるものよりも有利ではない親水性／疎水性相互作用を及ぼす。混合の直後及び平衡に到達する直前の各相における標的核酸２６の化学ポテンシャルの関連性は、μ¹ _DNA／μ² _DNA＞μ³ _DNA／μ⁴ _DNAである。

【0048】

分析物の回収
回収工程４０において、濃縮標的核酸断片２６は、第３相溶液３６から回収され得る。図１は、断片２６を回収するための１つの任意選択の方法（工程４０ａ～４０ｃ）を図示し、第３相溶液３６は、望ましくない核酸（すなわち標的断片サイズより大きい）を沈殿させるために、工程４０ａにおいて遠心分離を伴って又は伴わずにサイズ分画成分４２と組み合わされ得る。標的断片２６を含む上清４４は、工程４０ｂにおいて、容器４８の底で形成されるペレット５０として溶液から標的核酸断片２６を単離及び脱塩するために、遠心分離を伴って又は伴わずに沈殿成分４６に移され且つ組み合わされ得る。工程４０ｃにおいて、上清４４は、除去され得、標的核酸断片２６で構成されるペレット５０は、再懸濁され得る。

【0049】

いくつかの実施形態では、サイズ分画成分４２は、１つ以上の塩、ポリマー及び／又は界面活性剤並びにそれらの組み合わせを含み得る。好適なポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、デキストラン、疎水的に修飾されたポリアルキレングリコールなどのポリアルキレングリコール、ポリ（オキシアルキレン）ポリマー、疎水的に修飾されたポリ（オキシアルキレン）コポリマーなどのポリ（オキシアルキレン）コポリマー、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリビニルカプロラクタム、ポリビニルメチルエーテル、アルコキシ化界面活性剤、アルコキシ化デンプン、アルコキシ化セルロース、アルキルヒドロキシアルキルセルロース、シリコン修飾されたポリエーテル並びにポリＮ－イソプロピルアクリルアミド及びそのコポリマーを含み得るが、これらに限定されない。

【0050】

好適な界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ、Ｔｒｉｔｏｎ－１１４、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ－６３０及びＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０、カルボン酸塩、スルホン酸塩、石油スルホン酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩、オレフィンスルホン酸塩、アルキルスルホン酸塩、硫酸塩、硫酸化天然油及び脂肪などのアニオン性界面活性剤、硫酸化エステル、硫酸化アルカノールアミド、アルキルフェノール、エトキシ化脂肪族アルコールなどのエトキシ化及び硫酸化非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレン界面活性剤、カルボン酸エステル、ポリエチレングリコールエステル、無水ソルビトールエステル、脂肪酸のグリコールエステル、カルボン酸アミド、モノアルカノールアミン縮合物、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド、四級アンモニウム塩、アミド結合を有するアミン、ポリオキシエチレンアルキル及び脂環アミンなどのカチオン性界面活性剤、ｎ，ｎ，ｎ’，ｎ’テトラキス置換エチレンジアミン、２－アルキル１－ヒドロキシエチル２－イミダゾリン並びにｎ－ココ３－アミノプロピオン酸／ナトリウム塩、ｎ－タロー３－イミノジプロピオン酸塩、二ナトリウム塩、ｎ－カルボキシメチルｎジメチルｎ－９オクタデセニル水酸化アンモニウム、ｎ－ココアミドエチルｎヒドロキシエチルグリシンなどの両性界面活性剤を含み得るが、これらに限定されない。

【0051】

好適な塩は、コスモトロピック塩、カオトロピック塩、直鎖又は分岐トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、トリプロピルアンモニウム、トリブチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、テトラプロピルアンモニウム及びテトラブチルアンモニウムなどのカチオン並びにリン酸、硫酸、硝酸、塩化物及び重炭酸塩などのアニオンを含有する無機塩、ＮａＣｌ、Ｎａ₃ＰＯ₄、Ｋ₃ＰＯ₄、Ｎａ₂ＳＯ₄、クエン酸カリウム、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、マグネシウム塩、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、セシウム塩、亜鉛塩、アルミニウム塩、臭化物塩、ヨウ化物塩、フッ化物塩、炭酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、カルボン酸塩、ホウ酸塩、リン酸塩、リン酸カリウム、硫酸アンモニウム並びにそれらの組み合わせを含み得るが、これらに限定されない。

【0052】

いくつかの実施形態では、上清中のサイズ分画成分４２のモル濃度は、第１相溶液２２中の第１ポリマー又は界面活性剤成分１７のモル濃度未満であり、さらに第３相溶液３６中の第２ポリマー又は界面活性剤成分３１のモル濃度よりも高いモル濃度を有する。

【0053】

いくつかの実施形態では、上清４４中の少なくとも１つのサイズ分画成分４２の質量濃度は、第１相溶液２２中の第１ポリマー又は界面活性剤成分１７の質量濃度未満であり、さらに第３相溶液３６中の第２ポリマー又は界面活性剤成分３１の質量濃度よりも高い質量濃度を有する。

【0054】

好適な沈殿成分４６は、イソプロパノール、ポリカチオン性ポリマー塩、圧縮剤及び／又はグリコールなど、当技術分野で知られるものを含み得る。

【実施例】

【0055】

本発明は、以下の実施例を参照して、より詳細に説明されることになる。当業者は、提示される実施例があくまで例示を目的とし、以下に続く特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定することが意図されないことを容易に理解するであろう。本願中の以下及び他の箇所に示されるすべての参考文献は、本明細書で参照により包含される。

【0056】

実施例１ － 核酸の単離
実験セットを実施し、上記のような単離するポリマー－塩ＡＴＰＳの上相と下相との間を分割することにより、夾雑物からの核酸精製に対する、様々な濃度の異なるサイズのポリマーの組み合わせを使用する効果を観察した。生物学的サンプルを溶解させるとき、タンパク質、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、細胞及び細胞片が放出される。溶解されたサンプルの遠心分離により、これらの夾雑物の一部が除去され得るが、多くは、維持され得る。単離ステップ実験の一部を意図して、１０％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ溶液１ｍＬ及びＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ又はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓから入手した異なるタイプのＤＮＡラダーの調製物を、室温（１５～３０℃）でｐＨが７～１１で変化する、相形成を単離する成分を有する遠心管内で混合し、様々な持続時間及び速度において遠心分離した。

【0057】

（３０ｗｔ％水溶液中で）４００～１２００の分子量を有する、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手したグリコールポリマーを、水中の４０ｕＬ～８０ｕＬの範囲内において、３０ｗｔ％水溶液中で調製した６７μＬの相形成塩と相対的比率で組み合わせ、単離ＡＴＰＳ（ｉｓｏｌａｔｉｎｇ ＡＴＰＳ）を形成した。

【0058】

ＡＴＰＳからの上相及び下相をアガロースゲル上で定性的に分析した（図２）。アガロースゲルは、ｍｉｎｉＰＣＲ製のｂｌｕｅＧｅｌ電気泳動システムユニットで実行した。１％（ｗ／ｖ）アガロース（Ｆｉｓｈｅｒ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ）ゲルを有する０．０１％（ｖ／ｖ）ＧｅｌＧｒｅｅｎ核酸染色（Ｂｉｏｔｉｕｍ）を４８Ｖで４０分間実行した。次に、ゲルを分析し、紫外光下で撮影した。アガロースゲル電気泳動から、大規模ＤＮＡ断片は、塩に富む下相まで高度に分配された状態になることを認めることができる。ゲル画像及び表は、異なるサイズのポリマーの単離成分の百分率を変更することが、ポリマーに富む上相に核酸を分配する一方、より大きい望ましくないＤＮＡ断片が塩に富む下相に分配されることに対して有する効果を図示する。

【0059】

ポリマー、４００～３５０００の範囲の分子量を有するポリプロピレングリコール、２００～３５０００の範囲の分子量を有するポリエチレングリコール、８０００～２４００００の範囲の分子量を有するナトリウムポリ（アクリレート）、６０００～６５０００の範囲の分子量を有するデキストラン、塩（相形成及び非相形成）、０．１Ｍ～５Ｍ塩化ナトリウム溶液、硫酸ナトリウム溶液、硫酸アンモニウム溶液、３０～６５ｗｔ％二塩基性リン酸カリウム、２０～５０ｗｔ％一塩基性リン酸カリウム及び界面活性剤、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４及び条件（例えば、ｐＨ、温度）といった多くの組み合わせで調製し、ボルテックス混合、それに続く様々な回転時間及び速度での遠心分離により、収量、安定性、分配性、その後の方法ステップ及び下流ＰＣＲとの互換性について最適化する場合における、熱力学的に安定な単離ＡＴＰＳに分離するそれらの能力についてスクリーニングした。好ましい実施形態では、核酸のより高度な回収は、ポリマー及び塩からなるＡＴＰＳにおいて達成可能であったが、他の相形成単離成分が好適である。ポリマーの分子量は、２００～２４００００の範囲であり、濃度は、０．１～４０であり、塩は、０．１～４０であった。一般に、７～８のｐＨ及び２０～３０℃の温度は、より安定なＡＴＰＳ及び比較的より高度な核酸回収率をもたらすことが認められた。さらに、相間の密度における工程は、共溶質の添加を通して調整した。

【0060】

実施例２ － 連続的ＡＴＰＳを使用した短い核酸断片の選択的単離及び濃縮
ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製、５００ｎｇのＧｅｎｅＲｕｌｅｒ Ｌｏｗ Ｒａｎｇｅ ＤＮＡラダーを８９ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液５００μＬに添加し、ＲＴ（２４℃）に平衡化した後、次に２２．５％（ｖ／ｖ）のグリコールポリマー（２００分子量）及び１８％（ｖ／ｖ）の相形成塩からなる単離成分溶液を約７～９のｐＨで有するチューブ内で混合した。徹底的にボルテックスしてから、チューブを７０００ｒｃｆで１２０秒間回転し、第１単離ＡＴＰＳを形成した。上相：下相が５：１の体積比で、夾雑物をポリマーに富む上相に分配した一方、特定のサイズ範囲の大部分の核酸を、塩に富む下相に分配した。試験配合物中において、下相中に回収された核酸の百分率を測定し、好ましい実施形態で９２％を超えることが見出された（実行２、図３Ａ）。

【0061】

核酸断片をより小さい体積に濃縮するため、核酸に富む下相を単離ＡＴＰＳ容器から抽出し、最終濃度が９．５％（ｖ／ｖ）のグリコールポリマー６００ＭＷ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）及び最終濃度が２５．８％（ｖ／ｖ）の相形成塩を含む、中身のｐＨが約７～９である、相形成濃縮成分の様々な組み合わせと混合した。徹底的にボルテックスしてから、チューブを７０００ｒｃｆで１２０秒間回転し、第２濃縮ＡＴＰＳを形成した。相形成塩の濃度増加により、より大きい下相がもたらされる一方、核酸がより小さい上相に分配され、それは、自由に調節可能であり、主にグリコールポリマー含量を変化させることにより核酸の濃縮又は分配が最大化される。

【0062】

第１ＡＴＰＳからの下相を、マイクロピペットにより、上記の第２ＡＴＰＳを有するマイクロ遠心チューブに移した。夾雑物を塩に富む下相に分配した一方、特定のサイズ範囲の核酸を、ポリマーに富む上相に分配し、濃縮し、それは、塩に富む下相の体積の１／３～１／２０の体積を有した。異なる実行において、上相中に回収された核酸の百分率を測定し、好ましい実施形態で９０％を超え、より好ましくはほぼ１００％であることが見出された（図３Ｂ）。

【0063】

実施例３ － 単離及び濃縮された核酸の回収率
極めて多数のスクリーニング実験を実施し、上記などの濃縮ＡＴＰＳの単離及び濃縮された上相などの溶液から所望の断片サイズの核酸を回収するのに適したパラメータを開発した。いくつかの実施形態では、サイズ分画及び塩析プロセスを利用し、ここでは、精製、濃縮された核酸溶液である、２５ｂｐ～２０ｋｂｐのＭＡサイズのＴｈｅｒｍｏ ＧＲ１ｋｂ＋及びＧＲＬを最初にボルテックスにより混合し、次に１～１２％の範囲の様々な濃度の分子量１５０００のグリコールポリマー及び０．１Ｍ～１．８Ｍの濃度範囲の非相形成塩を１０ｋｒｃｆ、ＲＴで１５分間遠心分離した。ポリマー／塩の縮合により、１００ｂｐを超えて自由に調節可能である、所望のカットオフサイズを上回る核酸を生じさせ、混合容器の底部でマイクロ遠心チューブの下端のペレットに沈殿させた一方、選択されたサイズより小さい核酸断片を含む上清が形成された。次に、製剤化に応じた最終体積を有する上清をマイクロピペットにより移し、ポリエチレンイミン、スペルミン、クアトロクアッド、ＮａＩ、スペルミンＨＣｌ、三価スペルミジン及び塩を含む沈殿成分と混合させ、ｐＨを約８～１０に中和した。次に、チューブを２０ｋｒｃｆで２分間回転し、標的核酸断片をペレットとして単離し、脱塩した。

【0064】

カットオフサイズは、１～１２％（ｖ／ｖ）の最終濃度、０．１Ｍ～１．８Ｍの非相形成塩濃度、０℃～３０℃のインキュベーション温度、５～２０分のインキュベーション時間、１０ｋｒｃｆで１５分から２０ｋｒｃｆで１分の組み合わせでの遠心分離時間及び速度において、２ｋ～２０ｋの異なる分子量を有するグリコールポリマーを含む極めて多数の要素により正確に調節可能であることが見出された。異なる共沈剤を試験し、大規模ＤＮＡバンドを除去するとともに、選択されたカットオフを安定化する場合、いくつかが有益であることが見出された。

【0065】

一例の実施形態では、いくつかの核酸回収実験により、サンプル１～９を調製し、分析し、ポリマー／塩のＤＮＡ沈殿系における異なるパラメータを変更する効果を評価した。血漿を添加して調製した核酸混合物のサンプル溶液（Ｔｈｅｒｍｏ ＧＲ１ｋｂ＋及びＧＲＬ、２５ｂｐ～２０ｋｂｐのＭＡサイズ）をチューブ内で第１ＡＴＰＳ成分と混合し、約３７℃で約１５分間インキュベートした。徹底的にボルテックスしてから、チューブを７０００ｒｃｆで約１分間遠心分離し、第１単離ＡＴＰＳを形成した。次に、第１ＡＴＰＳからの第１下相の各々を、第２ＡＴＰＳ成分を有する新しいチューブに移した。徹底的にボルテックスしてから、チューブを７０００ｒｃｆで約１分間遠心分離し、第２濃縮ＡＴＰＳを形成した。次に、第２ＡＴＰＳからの反応体積（ｕＬ）を有する第２上相の各々をそれぞれ新しいチューブに移した。グリコールポリマーＰ１０、塩Ｓ１７及び添加物ＥＤＴＡを含有する分画成分を第２ＡＴＰＳからの第２上相に添加し、分画混合物を形成した。徹底的にボルテックスしてから、チューブを室温で１０分間（又はサンプル９について３０分間）インキュベートし、約１６，０００ｒｃｆで１０分間回転した。各サンプルにおいて、ペレット「Ｐ」及び上清「Ｓ」を得た。上清「Ｓ」を新しいチューブに移し、上記のような沈殿成分及び塩と混合し、ｐＨを約８～１０に中和した。次に、チューブを２０ｋｒｃｆで２分間回転し、標的核酸断片をペレットとして単離し、脱塩し、さらに分析に適した緩衝液に再懸濁した。得られたペレット「Ｐ」を分析のための緩衝液に再懸濁した。表１～３は、この実施形態例における核酸回収実験において利用した第１ＡＴＰＳ成分及び第２ＡＴＰＳ成分及び実験条件の詳細を示す。

【0066】

【表1】

【0067】

【表2】

【0068】

【表3】

【0069】

図４は、いくつかの核酸回収実験におけるペレット及び上清のゲル画像結果を示す。「Ｌ」は、参照用ゲルに直接的に充填されたＤＮＡラダー（Ｔｈｅｒｍｏ ＧＲ１ｋｂ＋及びＧＲＬ、２５ｂｐ～２０ｋｂｐのＭＡサイズ）を表し、「Ｐ」は、ペレット中に回収されたＤＮＡを表し、「Ｓ」は、最終ステップで得られた上清中に回収されたＤＮＡを表す。これらは、いくつかの沈殿成分（ポリマー、塩、共沈剤）の変化がサイズカットオフにどのように影響するかを示す。結果によると、分画成分中のポリマー濃度における２６．０％から１４．３％への減少であれば、好ましくは５００ｂｐ以下（サンプル１）からカットオフなし、すなわちＤＮＡ断片のすべてのサイズが上清中に保持される（サンプル２）までサイズカットオフを変更することになる一方、分画成分中のポリマー濃度における２６．０％から４０．１％への増加であれば、好ましくは５００ｂｐ以下（サンプル１）から２００ｂｐ、すなわち専ら約２００ｂｐ以下のＤＮＡ断片が上清中に保持される（サンプル３）までサイズカットオフを変更することになることが示された。結果によると、分画成分中の塩濃度における０．５％から０．２６％への減少であれば、ペレット中のＤＮＡ沈殿に対する有害作用を引き起こすことになり、すべてのサイズのＤＮＡ断片が上清中に保持される（サンプル４）ことが示された。分画成分中の塩濃度における０．５％から０．９％への増加であっても、ペレット中のＤＮＡ沈殿に対する有害作用を引き起こすことになる（サンプル５）が、５００ｂｐより大きいＤＮＡ断片は、上清中に保持されない。（ＥＤＴＡ濃度が減少した）サンプル６及び（ＥＤＴＡ濃度が増加した）サンプル７における結果によると、ＥＤＴＡの濃度の変動がサイズカットオフにおける変化に寄与しないことが示される。さらに、結果によると、５００ｎｇ～１００ｎｇ添加された全ＤＮＡの量の減少（サンプル８）が最終収量を有意に減少させる（すなわちＤＮＡバンド強度がより軽い）が、サイズカットオフに影響しないことが示される。より長いインキュベーション時間（１０分から３０分への増加）は、最終収量を増加させない（サンプル９）。一般に、ゲル画像に示す通り、使用されるポリマーの濃度を変化させることで、サイズカットオフが５００ｂｐから２００ｂｐ又は５００ｂｐからカットオフなしまで変化する一方、使用される塩の濃度を変化させることで、沈殿能力、塩濃度の増加に応じた大規模ＤＮＡ断片の除去が影響を受けることになる。二重沈殿法を試みることで、一貫した結果を得ることが見出されたが、標的サイズの核酸断片の収量は減少した。さらに、より低い初期核酸濃度が、得られる核酸産物の収量及び純度を有意に減少させるが、サイズカットオフを減少させないことが発見された。こうした観察は、添加される各成分の濃度を調節することにより解決し得る（図５）。

【0070】

一例の実施形態では、サンプル１～５を調製し、分析し、回収システム実験の頑強性を評価した。表１～２は、第１ＡＴＰＳ成分及び第２ＡＴＰＳ成分の詳細を示し、表４は、この実施形態例における核酸回収実験において使用される実験条件を示す。

【0071】

【表4】

【0072】

図５は、回収システム実施形態の、１００ｂｐ～３００ｂｐの５０ｂｐの増加以内の核酸断片サイズカットオフのおける設計パラメータの調節を通して相対的に容易に微調整する頑強な能力を示すゲル画像を図示する。総量が１００ｎｇのＮＥＢの１ｋｂラダー及びＴｈｅｒｍｏ ＧＲＬを血漿サンプルに事前添加し、サンプルに対して本発明により実行した。

【0073】

実施形態例では、「ｃｆＤＮＡ」は、１５０～２００ｂｐ、例えば約１７０ｂｐの標的ＤＮＡサイズ例を表す。サンプル１～２における結果では、大部分のｃｆＤＮＡがペレットに沈殿する一方、サンプル３～５の場合、ｃｆＤＮＡが上清中に保持されることが示された。ポリマー／非相形成塩の沈殿ステップにおける成分の濃度のみを、１～１２％（ｖ／ｖ）のグリコールポリマー１５０００、０．１Ｍ～１．８Ｍの非相形成塩濃度であるように変化させることにより、上記の望ましいカットオフ範囲が達成され得る。この範囲は、あくまで例示目的として選択し、それは、ｃｆＤＮＡの分析で遭遇する小さいサイズと関連した。

【0074】

実施例４ － Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ｃｃｆＤＮＡ Ｍｉｎｉキットとの比較
この実施形態例では、同じＤＮＡサンプルを使用し、ＡＴＰＳ系を市販キットと比較した。ＭＡサイズが２５ｂｐ～２０ｋｂｐである、Ｔｈｅｒｍｏ ＧＲ１ｋｂ＋及びＧＲＬを血漿に添加し、試験のためにａ１ｋｂラダーサンプル混合物を形成した。同量の１ｋｂラダーサンプル混合物を試験のために使用した。Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ｃｃｆＤＮＡ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎキット）を使用するサンプルの場合、核酸を製造業者の使用説明書に従って調製した。ＡＴＰＳ系を使用するサンプルの場合、調製した核酸混合物溶液をチューブ内で第１ＡＴＰＳ成分と混合し、約３７℃で約１５分間インキュベートした。徹底的にボルテックスしてから、チューブを７０００ｒｃｆで約１分間遠心分離し、第１単離ＡＴＰＳを形成した。次に、第１ＡＴＰＳからの第１下相を、第２ＡＴＰＳ成分を有する新しいチューブに移した。徹底的にボルテックスしてから、チューブを７０００ｒｃｆで約１分間遠心分離し、第２濃縮ＡＴＰＳを形成した。次に、第２ＡＴＰＳからの反応体積（ｕＬ）を有する第２上相の各々をそれぞれ新しいチューブに移した。グリコールポリマーＰ１０、塩Ｓ１７及び添加物ＥＤＴＡを含有する分画成分を第２ＡＴＰＳからの第２上相に添加し、分画混合物を形成した。徹底的にボルテックスしてから、チューブを室温で１０分間（又はサンプル９について３０分間）インキュベートし、約１６，０００ｒｃｆで１０分間回転した。各サンプルにおいて、ペレット「Ｐ」及び上清「Ｓ」を得た。上清「Ｓ」を新しいチューブに移し、沈殿成分と混合した。次に、チューブを２０ｋｒｃｆで２分間遠心分離し、標的核酸断片をペレットとして単離し、脱塩し、さらに分析に適した緩衝液に再懸濁する。得られたペレット「Ｐ」を分析のための緩衝液に再懸濁した。表１～２は、第１ＡＴＰＳ成分及び第２ＡＴＰＳ成分の詳細を示し、表５は、この実施形態例における核酸回収実験において利用した実験条件を示す。ＡＴＰＳ系及び比較のための市販キットから回収されたＤＮＡサンプルをｑＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ）により分析した。

【0075】

【表5】

【0076】

図６に示す通り、本発明を用いるとき、核酸のほぼ１００％をｑＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ）により分析し、１３０ｂｐのスパイクインオリゴヌクレオチドを血漿サンプルから連続的ＡＴＰＳ法により抽出した一方、Ｑｉａｇｅｎキットによりかかる核酸の約５０％を抽出した。したがって、本発明は、ＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ｃｃｆＤＮＡ Ｍｉｎｉキットと比較して改善された性能を示した。

【0077】

実施例５ － グリコールポリマー／ナトリウムポリ（アクリレート）及びグリコールポリマー／Ｔｒｉｔｏｎ ＡＴＰＳ系を使用した標的核酸断片の選択的単離及び濃縮
この実施形態例では、いくつかの核酸回収実験により、サンプルを調製し、分析し、ＡＴＰＳ系の例を評価した。血漿を添加して調製した核酸混合物のサンプル溶液（Ｔｈｅｒｍｏ ＧＲ１ｋｂ＋及びＧＲＬ、２５ｂｐ～２０ｋｂｐのＭＡサイズ）をチューブ内で第１ＡＴＰＳ成分（グリコールポリマー／ナトリウムポリ（アクリレート）と混合し、約３７℃で約１５分間インキュベートした。徹底的にボルテックスしてから、チューブを７０００ｒｃｆで約１分間遠心分離し、第１単離ＡＴＰＳを形成した。次に、第１ＡＴＰＳからの下相の各々を、第２ＡＴＰＳ成分（０、１０、２０及び３０％の濃度のグリコールポリマー／塩／Ｔｒｉｔｏｎ）を有する新しいチューブに移した。徹底的にボルテックスしてから、チューブを７０００ｒｃｆで約１分間遠心分離し、第２濃縮ＡＴＰＳを形成した。上（Ｔ）相及び下（Ｂ）相を新しいチューブに移し、沈殿成分及び塩と混合した。次に、チューブを２０ｋｒｃｆで２分間遠心分離し、標的核酸断片をペレットとして単離し、脱塩し、さらに分析に適した緩衝液に再懸濁する。表６～７は、この実施形態例における第１ＡＴＰＳ成分及び第２ＡＴＰＳ成分の詳細を示す。

【0078】

【表6】

【0079】

【表7】

【0080】

図７は、核酸回収実験における上（Ｔ）相及び下（Ｂ）相のゲル画像結果を示す。これらは、いくつかの沈殿成分（ポリマー、塩、共沈剤）の変化がサイズカットオフにどのように影響するかを示す。結果によると、大部分のタンパク質及び夾雑物が第１ＡＴＰＳ系（グリコールポリマー／塩／ナトリウムポリ（アクリレート））における第１下相に分配され、核酸の大部分が第１上相中に保持されるであろうことが示された。図７は、第２ＡＴＰＳ系におけるグリコールポリマー／塩／Ｔｒｉｔｏｎの濃度が増加すると、核酸サイズカットオフ選択がカットオフなしから約３００ｂｐまで変化し、第２上（Ｔ）相中に保持され、より大きい望ましくないＤＮＡであれば、第２下（Ｂ）相に分配されることを示す。一般に、ゲル画像中で示す通り、使用されるグリコールポリマー／Ｔｒｉｔｏｎの濃度変化により、第２上相における所望の核酸サイズカットオフが変化することになる。

【0081】

実施例６ － 異なる塩濃度のＡＴＰＳ系を使用した標的核酸断片の選択的単離及び濃縮
この実施形態例では、いくつかのＤＮＡ及びタンパク質回収実験により、サンプルを調製し、分析し、様々な濃度の硫酸ナトリウムを評価した。８９．３ｍｇ／ｍｌのタンパク質を添加した核酸混合物のサンプル溶液（５００ｎｇ／ｕＬ）を調製し、チューブ内で異なる濃度の硫酸ナトリウムとともに第１ＡＴＰＳ成分と混合し、約３７℃で約１５分間インキュベートした。徹底的にボルテックスしてから、チューブを７０００ｒｃｆで約１分間遠心分離し、第１単離ＡＴＰＳを形成した。次に、第１ＡＴＰＳからの下相の各々を、第２ＡＴＰＳ成分を有する新しいチューブに移した。徹底的にボルテックスしてから、チューブを７０００ｒｃｆで約１分間遠心分離し、第２濃縮ＡＴＰＳを形成した。上（Ｔ）相及び下（Ｂ）相を新しいチューブに移し、沈殿成分及び塩と混合した。次に、チューブを２０ｋｒｃｆで２分間遠心分離し、標的核酸断片をペレットとして単離し、脱塩し、さらに分析に適した緩衝液に再懸濁する。上相及び下相におけるＤＮＡ回収％及びタンパク質回収％を決定した。表８は、この実施形態例における実験詳細を示す。

【0082】

【表8】

【0083】

図８は、核酸及びタンパク質回収実験におけるＤＮＡ及びタンパク質回収結果を示す。結果によると、硫酸ナトリウム塩濃度が０．１％から０．８％に増加すれば、下相において約６０％～８５％のより高いＤＮＡ回収がもたらされる（サンプル２及び３）ことが示された。

【0084】

実施例７ － 複数のＴｒｉｔｏｎ ＡＴＰＳ系を使用した標的核酸断片の選択的単離及び濃縮
この実施形態例では、いくつかのＤＮＡ及びタンパク質回収実験により、サンプルを調製し、分析し、様々な濃度の硫酸ナトリウムを評価した。血漿タンパク質２００ｕｌを添加した核酸混合物のサンプル溶液（全部で１０００ｎｇ）を調製し、チューブ内で第１ＡＴＰＳ成分と混合し、第１ＡＴＰＳ系（水／Ｔｒｉｔｏｎ ＡＴＰＳ系）を形成し、約３７℃で約１５分間インキュベートした。徹底的にボルテックスしてから、チューブを７０００ｒｃｆで約１分間遠心分離し、第１単離ＡＴＰＳを形成した。次に、第１ＡＴＰＳからの下相の各々を、沈殿成分を有する新しいチューブに移した。徹底的にボルテックスしてから、チューブを７０００ｒｃｆで約１分間遠心分離し、塩析系において核酸ペレットを形成した。夾雑物を含有する上清を除去した。次に、ペレットに第２ＡＴＰＳ成分を添加した。徹底的にボルテックスしてから、チューブを７０００ｒｃｆで約１分間遠心分離し、第２単離ＡＴＰＳ（グリコールポリマー／塩のＡＴＰＳ系）を形成した。より小さいサイズの核酸を含有する第２上相を新しいチューブに移し、第３ＡＴＰＳ成分と混合し、第３ＡＴＰＳ系（グリコールポリマー／Ｔｒｉｔｏｎ系）を形成した。徹底的にボルテックスしてから、チューブを７０００ｒｃｆで約１分間遠心分離し、上部の白色懸濁液中に第３ＡＴＰＳ（グリコールポリマー／Ｔｒｉｔｏｎ ＡＴＰＳ系）を形成した。次に、水を添加し、白色懸濁液を再懸濁し、上部のＴｒｉｔｏｎが少ない相及び下部のＴｒｉｔｏｎに富む相を有する水／Ｔｒｉｔｏｎ系を形成した。サンプル１及び２において使用した最終抽出体積は、それぞれ２５ｕｌ及び２０ｕｌである。上部のＴｒｉｔｏｎが少ない相は、クリーンな標的核酸を含有する最終生成物である。除去した液体、最終抽出物（すなわちＴｒｉｔｏｎが少ない相）及びＴｒｉｔｏｎに富む相をゲル電気泳動により分析した。図９は、除去した液体、最終抽出物及びＴに富む相のゲル画像結果を示す。「Ｌ」は、参照用ゲルに直接的に充填したＤＮＡラダー（Ｔｈｅｒｍｏ ＧＲ１ｋｂ＋及びＧＲＬ、２５ｂｐ～２０ｋｂｐのＭＡサイズ）を表す。結果によると、標的化核酸が全画分中に存在することが示され、一連の抽出ステップにおいて標的化核酸の一部の減少が示された。さらに、結果によると、最終抽出物が有意な量の標的核酸を含有することが示された。標的の７５ｂｐバンドが最終抽出物中で保持され、添加されたタンパク質を除去する。最終抽出物中の標的核酸の質と量の両方がゲル電気泳動分析にとって十分であった。要するに、複数のＴｒｉｔｏｎ ＡＴＰＳ系は、下流適用のため、標的核酸を単離、精製及び濃縮する場合に効率的である。

【0085】

実施例８ － 異なる分子量を有するポリマーを使用した単離及び濃縮された核酸の回収率
この実施形態例では、サンプルを調製し、分析し、核酸回収に対する第２ＡＴＰＳ系におけるポリマーの異なる分子量を変更する効果を評価した。血漿を添加して調製した核酸混合物の約５０ｎｇのサンプル溶液をチューブ内で同じ第１ＡＴＰＳ成分と混合し、約３７℃で約１５分間インキュベートした。徹底的にボルテックスしてから、チューブを７０００ｒｃｆで約１分間遠心分離し、第１単離ＡＴＰＳを形成した。次に、第１ＡＴＰＳからの第１下相の各々を、低分子量又は中分子量ポリマーのいずれかを含有する、第２ＡＴＰＳ成分を有する新しいチューブに移した。全サンプル中の第２ＡＴＰＳ成分におけるポリマー及び塩をそれぞれ７％及び３５％の同じ濃度で維持した。徹底的にボルテックスしてから、チューブを７０００ｒｃｆで約１分間遠心分離し、第２濃縮ＡＴＰＳを形成した。次に、第２ＡＴＰＳからの反応体積（ｕＬ）を有する第２上相の各々をそれぞれ新しいチューブに移した。上清を新しいチューブに移し、沈殿成分及び塩と混合し、ｐＨを約８～１０に中和した。次に、チューブを２０ｋｒｃｆで２分間回転し、標的核酸断片をペレットとして単離し、脱塩し、さらに分析に適した緩衝液１５ｕｌに再懸濁する。最終生成物の核酸収量をＱｕｂｉｔ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により決定し、回収率を収量から計算した。表９は、この実施形態例における実験詳細及びＤＮＡ収量及び回収率の結果を示す。この実施形態例では、「低」から「中」にかけての分子量差は、１００～１０００Ｄａ以内である。

【0086】

【表9】

【0087】

表９は、「低」から「中」にかけてのポリマー分子量が増加すると、回収率悪化をもたらすことを示し、特定の分子量を有するポリマーが核酸回収率における顕著な性能をもたらす場合があることが示される。

【0088】

実施例９ － 第２ＡＴＰＳにおける異なる上相体積による単離及び濃縮された核酸の回収率
この実施形態例では、サンプルを調製し、分析し、核酸の回収率に対する第２ＡＴＰＳ系における上相の体積を変更する効果を評価した。１つの核酸混合物を調製し、同じ第１ＡＴＰＳ成分を有するチューブにアリコートし、約３７℃で約１５分間インキュベートした。徹底的にボルテックスしてから、チューブを７０００ｒｃｆで約１分間遠心分離し、第１単離ＡＴＰＳを形成した。次に、第１ＡＴＰＳからの第１下相の各々を一緒にプールし、表１０に従い、第２ＡＴＰＳ成分中にポリマー（ＰＭ２）及び塩（ＳＭ２）を異なる体積で有する、第２ＡＴＰＳ成分を有する新しいチューブにアリコートした。徹底的にボルテックスしてから、チューブを７０００ｒｃｆで約１分間遠心分離し、第２濃縮ＡＴＰＳを形成した。次に、第２ＡＴＰＳからの第２上相の各々の体積を測定した。第２上相の各々をそれぞれ新しいチューブに移した。上清を新しいチューブに移し、沈殿成分及び塩と混合し、ｐＨを約８～１０に中和した。次に、チューブを２０ｋｒｃｆで２分間回転し、標的核酸断片をペレットとして単離し、脱塩し、さらに分析に適した緩衝液に再懸濁する。各サンプルについて、クリーンなペレットを形成する能力、Ａ２６０／Ａ２８０の比による核酸純度、最終生成物濃度及び全収量を評価し、決定した。表１０は、この実施形態例における実験詳細及び結果を示す。

【0089】

【表10】

【0090】

より大きい上相体積を有すると、移動又は抽出中に核酸の減少を最小化する傾向があることから有利となる一方、表１０は、上相体積が大きくなると、実際に許容できるＤＮＡペレットのみを生成する（サンプル２及び３）又はさらにＤＮＡペレットを生成しない（サンプル４、６、８～１０）ことを示した。より低い濃度の塩を有するサンプル（サンプル２）は、不十分で不安定なペレットを生成した。より大きい塩体積（サンプル５～１０）は、より安定なペレット及び合理的な収量をもたらした。上相の体積における増加を達成するため、ポリマー濃度は、それに伴って増加させる必要がある。ポリマー濃度が８．７％を超えるように増加したとき、２００μＬを超える上相体積が得られたであろうことが見出される。表１０中のデータは、上相体積が２２０μＬより大きいと、核酸抽出プロセスの失敗をもたらすことを示した。たとえ核酸沈殿が奏功しても、それらは、クリーンでないペレット（未知のペレット又はジャンクペレットのいずれか）を生成し、その結果は、ＤＮＡの純度（Ａ２６０／Ａ２８０）にも反映される。要するに、第２ＡＴＰＳ中のポリマー濃度及び塩濃度がそれぞれ８．７％及び１％未満であり、且つ上相の最終体積が２００ｕＬ未満であれば、ＡＴＰＳ系の得られる核酸産物の収量及び純度が有意に改善されることが発見されている。

【0091】

実施例１０ － 第１及び第２ＡＴＰＳ系における異なる分子量のポリマーによる単離及び濃縮された核酸の回収率
この実施形態例では、サンプルを調製し、分析し、核酸の回収率に対する第１及び第２ＡＴＰＳ系において異なる分子量のポリマーを使用する効果を評価した。核酸混合物のサンプル溶液を調製し、（表１１に従い）異なるポリマー分子量の第１ＡＴＰＳ成分を有するチューブにアリコートし、約３７℃で約１５分間インキュベートした。徹底的にボルテックスしてから、チューブを７０００ｒｃｆで約１分間遠心分離し、第１単離ＡＴＰＳを形成した。次に、第１ＡＴＰＳからの第１下相の各々を、（表１１に従い）異なるポリマー分子量の第２ＡＴＰＳ成分を有する新しいチューブに移した。徹底的にボルテックスしてから、チューブの各々を７０００ｒｃｆで約１分間遠心分離し、第２濃縮ＡＴＰＳを形成した。第２上相の各々をそれぞれ新しいチューブに移した。上清を新しいチューブに移し、沈殿成分及び塩と混合し、ｐＨを約８～１０に中和した。次に、チューブを２０ｋｒｃｆで２分間回転し、標的核酸断片をペレットとして単離し、脱塩し、さらに分析に適した同じ体積の緩衝液に再懸濁する。各サンプルについて、Ａ２６０／Ａ２８０の比による核酸純度及びＤＮＡ濃度を分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）により測定し、決定した。表１１は、この実施形態例における実験詳細及び結果を示す。この実施形態例では、「低」から「高」にかけての分子量差は、２００～２０００Ｄａ以内である。

【0092】

【表11】

【0093】

表１１は、第２ＡＴＰＳにおいて高分子量ポリマーをより低い分子量のポリマーの代わりに使用した場合、ＤＮＡ濃度が約２４ｎｇ／ｕｌから約１７ｎｇ／ｕｌへの有意な減少を有することを示した（サンプル１及び２）。第１ＡＴＰＳにおいて低分子量ポリマーを使用した場合、第１ＡＴＰＳにおいてさらに相が形成されることがなく、したがって核酸が得られないことも示された。結果によると、第１及び第２ＡＴＰＳ系におけるポリマーの分子量の選択は、標的サイズカットオフの選択に加えて核酸回収率に有意に影響することが示された。第２ポリマー成分よりも高い分子量を有する第１ポリマー成分であれば、ＡＴＰＳ系の得られる核酸産物の収量及び純度を有意に改善することになる。

【0094】

実施例１１ － 分画成分中のポリマーの異なる分子量及び濃度による単離及び濃縮された核酸の回収率
この実施形態例では、サンプルを調製し、分析し、核酸の回収率に対する分画成分中のポリマーの異なる分子量及び異なる濃度を使用する効果を評価した。約２００ｎｇ／ｍＬのＤＮＡラダーの核酸混合物（Ｔｈｅｒｍｏ ＧＲ１ｋｂ＋及びＧＲＬ、２５ｂｐ～２０ｋｂｐのＭＡサイズ）のサンプル混合物溶液を調製し、同じ第１ＡＴＰＳ成分を有するチューブにアリコートし、約３７℃で約１５分間インキュベートした。徹底的にボルテックスしてから、チューブを７０００ｒｃｆで約１分間遠心分離し、第１単離ＡＴＰＳを形成した。第１ＡＴＰＳからの第１下相の各々を、（表１１に従い）第２ＡＴＰＳ成分を異なるポリマー分子量で有する新しいチューブに移した。徹底的にボルテックスしてから、チューブの各々を７０００ｒｃｆで約１分間遠心分離し、第２濃縮ＡＴＰＳを形成した。第２上相の各々をそれぞれ新しいチューブに移した。次に、第２ＡＴＰＳからの第２上相の各々をそれぞれ新しいチューブに移した。異なる分子量又は異なる濃度のポリマーを含有する分画成分（表１２を参照されたい）を第２ＡＴＰＳからの第２上相に添加し、それぞれ分画混合物を形成した。徹底的にボルテックスしてから、チューブの各々を室温で１０分間（又はサンプル９について３０分間）インキュベートし、約１６，０００ｒｃｆで１０分間回転した。各サンプルにおいて、ペレット「Ｐ」及び上清「Ｓ」が得られた。上清「Ｓ」を新しいチューブに移し、沈殿成分及び塩と混合し、ｐＨを約８～１０に中和した。次に、チューブを２０ｋｒｃｆで２分間回転し、標的核酸断片をペレットとして単離し、脱塩し、さらに分析に適した緩衝液（１×ローディングダイ）１０ｕＬに再懸濁する。得られたペレット「Ｐ」を分析について同様に再懸濁した。表１１は、この実施形態例における実験詳細及び結果を示す。この実施形態例では、「低」から「高」にかけての分子量差は、２００～２０００Ｄａ以内である。

【0095】

図１０は、実施形態例における核酸回収実験におけるペレット「Ｐ」及び上清「Ｓ」のゲル画像結果を示す。「低」から「中」にかけての分子量差は、１００～１０００Ｄａ以内である一方、「低」から「高」にかけての分子量差は、１００～１０００Ｄａ以内である。「Ｐ」は、ペレット中に回収されたＤＮＡを表し、「Ｓ」は、最終ステップにおいて得られた上清中に回収されたＤＮＡを表す。破線は、約１５００ｂｐの分子サイズを示す。結果によると、高分子量ポリマーを分画成分中で使用する場合、約１５００ｂｐを下回るカットオフサイズが達成されることが示された（サンプル１及び２）。ポリマーの分子量が高分子量から中分子量又はさらに低分子量に変化する場合、約１５００ｂｐを下回るカットオフサイズは達成されないことになり、すべての断片サイズを有する核酸の大部分が上清中で保持される傾向がある（サンプル３～６）。さらに、結果によると、二倍又は四倍濃度のポリマーを用いると、すべての断片サイズを有する核酸の大部分がペレット中で保持されることから、合理的な収量で満足なカットオフサイズが達成されないことが示された（サンプル７～１０）。要するに、特定の濃度で高分子量のポリマーであれば、満足なサイズカットオフ及び核酸回収率の結果が達成されることになる。

【0096】

したがって、本発明の例示的実施形態は、十分に説明されている。その説明は、特定の実施形態で言及されるが、本発明がこれらの具体的な詳細のバリエーションにより実施され得ることは、当業者に明らかであろう。したがって、本発明は、本明細書中に示される実施形態に限定されるものとして解釈されるべきではない。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】