7697943 導入遺伝子発現のＤＲＧ特異的低減のための組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-06-16

(45)【発行日】2025-06-24

(54)【発明の名称】導入遺伝子発現のＤＲＧ特異的低減のための組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/864 20060101AFI20250617BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20250617BHJP

   C12N 15/57 20060101ALI20250617BHJP

   C12N 15/56 20060101ALI20250617BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20250617BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20250617BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20250617BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20250617BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20250617BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20250617BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20250617BHJP

   C12N 9/40 20060101ALI20250617BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20250617BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20250617BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20250617BHJP

   A61K 31/711 20060101ALI20250617BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20250617BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20250617BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20250617BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20250617BHJP

   C12N 15/35 20060101ALN20250617BHJP

   C07K 14/015 20060101ALN20250617BHJP

【ＦＩ】

C12N15/864 100Z

C12N7/01 ZNA

C12N15/57

C12N15/56

C12N15/867 Z

C12N15/861 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/113 Z

C12N9/40

A61K35/76

A61K31/7105

A61K35/761

A61K31/711

A61K9/14

A61K9/51

A61K47/36

A61P43/00 111

A61P43/00 121

C12N15/35

C07K14/015

【請求項の数】 18

(21)【出願番号】P 2022524118

(86)(22)【出願日】2020-10-22

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-12-22

(86)【国際出願番号】 US2020056881

(87)【国際公開番号】W WO2021081217

(87)【国際公開日】2021-04-29

【審査請求日】2023-10-10

(31)【優先権主張番号】PCT/US2019/067872

(32)【優先日】2019-12-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/934,915

(32)【優先日】2019-11-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/005,894

(32)【優先日】2020-04-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/924,970

(32)【優先日】2019-10-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/023,602

(32)【優先日】2020-05-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/972,404

(32)【優先日】2020-02-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/038,514

(32)【優先日】2020-06-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/043,600

(32)【優先日】2020-06-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】502409813

【氏名又は名称】ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア

(74)【代理人】

【識別番号】110000741

【氏名又は名称】弁理士法人小田島特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】オルドー，ジュリエット

(72)【発明者】

【氏名】ウイルソン，ジェームス・エム

【審査官】上條 のぶよ

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１９／０１０３３５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１６－５１５８３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１８－５１５６１５（ＪＰ，Ａ）

【文献】Neuroscience，2009年，Vol. 164，p. 711-723

【文献】Human Gene Therapy，2019年06月10日，Vol.30，p.957-966

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－９０

Ｃ１２Ｎ ７／００－０８

Ｃ１２Ｎ １／００－３８

Ｃ１２Ｎ ５／００－２８

Ｃ１２Ｎ ９／００－９９

Ａ６１Ｋ ３５／００－７６８

Ａ６１Ｋ ３１／００－３３／４４

Ａ６１Ｋ ９／００－７２

Ａ６１Ｋ ４７／００－６９

Ｃ０７Ｋ １４／００－８２５

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ベクターゲノムを中にパッケージングしたＡＡＶカプシドを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）であって、前記ベクターゲノムが、配列番号２１の少なくともアミノ酸２８～６５３を含む機能的ヒトアルファ－Ｌ－イズロニダーゼ（ｈＩＤＵＡ）のためのコード配列と、細胞における前記ｈＩＤＵＡの発現を指示する調節配列と、を含み、前記コード配列が、
ａ）配列番号２２のヌクレオチド８２～１９５９、もしくはそれに対して少なくとも９５％同一の配列、
ｂ）配列番号２３のヌクレオチド８２～１９５９、もしくはそれに対して少なくとも９５％同一の配列、
ｃ）配列番号２４のヌクレオチド８２～１９５９、もしくはそれに対して少なくとも９５％同一の配列、
ｄ）配列番号２５のヌクレオチド８２～１９５９、もしくはそれに対して少なくとも９５％同一の配列、または
ｅ）配列番号２６のヌクレオチド８２～１９５９、もしくはそれに対して少なくとも９５％同一の配列を含み、
前記ベクターゲノムが、それぞれｍｉＲ－１８３またはｍｉＲ－１８２に特異的で、且つ前記コード配列の３’末端に作動可能に連結されている、少なくとも２つの後根神経節（ｄｒｇ）特異的ｍｉＲＮＡ標的配列を含む、
ｒＡＡＶ。

【請求項2】

前記カプシドが、ＡＡＶ９、ＡＡＶｈｕ６８、またはＡＡＶｒｈ９１カプシドである、請求項１に記載のｒＡＡＶ。

【請求項3】

発現カセットであって、機能的ヒトアルファ－Ｌ－イズロニダーゼ（ｈＩＤＵＡ）をコードする核酸配列と、前記発現カセットを含有する細胞における前記ｈＩＤＵＡの発現を指示する調節配列と、を含み、前記コード配列が、
ａ）配列番号２２のヌクレオチド８２～１９５９、もしくはそれに対して少なくとも９５％同一の配列、
ｂ）配列番号２３のヌクレオチド８２～１９５９、もしくはそれに対して少なくとも９５％同一の配列、
ｃ）配列番号２４のヌクレオチド８２～１９５９、もしくはそれに対して少なくとも９５％同一の配列、
ｄ）配列番号２５のヌクレオチド８２～１９５９、もしくはそれに対して少なくとも９５％同一の配列、または
ｅ）配列番号２６のヌクレオチド８２～１９５９、もしくはそれに対して少なくとも９５％同一の配列を含み、
前記ベクターゲノムが、それぞれｍｉＲ－１８３またはｍｉＲ－１８２に特異的で、且つ前記コード配列の３’末端に作動可能に連結されている、少なくとも２つの後根神経節（ｄｒｇ）特異的ｍｉＲＮＡ標的配列を含む、
発現カセット。

【請求項4】

前記ｈＩＤＵＡが、天然ｈＩＤＵＡシグナルペプチドを含む、請求項１もしくは２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶまたは請求項３に記載の発現カセット。

【請求項5】

前記ｈＩＤＵＡが、配列番号２１のアミノ酸１～６５３を含む、請求項１、２もしくは４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶまたは請求項３もしくは４に記載の発現カセット。

【請求項6】

前記コード配列が、
ａ）配列番号２２のヌクレオチド１～１９５９、もしくはそれに対して少なくとも９５％同一の配列、
ｂ）配列番号２３のヌクレオチド１～１９５９、もしくはそれに対して少なくとも９５％同一の配列、
ｃ）配列番号２４のヌクレオチド１～１９５９、もしくはそれに対して少なくとも９５％同一の配列、
ｄ）配列番号２５のヌクレオチド１～１９５９、もしくはそれに対して少なくとも９５％同一の配列、または
ｅ）配列番号２６のヌクレオチド１～１９５９、もしくはそれに対して少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項１、２、４もしくは５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶまたは請求項３～５のいずれか一項に記載の発現カセット。

【請求項7】

前記ｈＩＤＵＡが、異種シグナルペプチドを含む、請求項１もしくは２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶまたは請求項３に記載の発現カセット。

【請求項8】

前記調節配列が、組織特異的プロモーターを含む、請求項１、２もしくは４～７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶまたは請求項３～７のいずれか一項に記載の発現カセット。

【請求項9】

前記少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列が、
（ａ）ＡＧＴＧＡＡＴＴＣＴＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡＴＡ（配列番号１）、および／または
（ｂ）ＡＧＴＧＴＧＡＧＴＴＣＴＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＡＡ（配列番号３）を含む、
請求項１、２もしくは４～８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶまたは請求項３～８のいずれか一項に記載の発現カセット。

【請求項10】

それぞれｍｉＲ－１８３またはｍｉＲ－１８２に特異的な、少なくとも３個、または少なくとも４個のｍｉＲＮＡ標的配列が、存在し、且つ前記コード配列の３’末端に作動可能に連結されている、請求項１、２もしくは４～９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶまたは請求項３～９のいずれか一項に記載の発現カセット。

【請求項11】

前記発現カセットが、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターによって担持される、請求項３～１０のいずれか一項に記載の発現カセット。

【請求項12】

（ｉ）非ウイルスベクターが、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、無機粒子、脂質粒子、ポリマーベースのベクター、またはキトサンベースの製剤であるか、または、
（ｉｉ）ウイルスベクターが、組換えパルボウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、または組換えアデノウイルスである、請求項１１に記載の発現カセット。

【請求項13】

機能的ｈＩＤＵＡをコードする配列を含む組換え核酸であって、コード配列が、配列番号２２、２３、２４、２５もしくは２６のヌクレオチド８２～１９５９もしくはヌクレオチド１～１９５９か、または配列番号２２、２３、２４、２５もしくは２６に対して少なくとも９５％同一の配列と、それぞれｍｉＲ－１８３またはｍｉＲ－１８２に特異的で、且つ前記コード配列の３’末端に作動可能に連結されている、少なくとも２つのｄｒｇ特異的ｍｉＲＮＡ標的配列とを含む、組換え核酸。

【請求項14】

前記組換え核酸が、プラスミドである、請求項１３に記載の組換え核酸。

【請求項15】

請求項１、２もしくは４～１０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、請求項３～１０のいずれか一項に記載の発現カセット、または請求項１３もしくは１４のいずれか一項に記載の組換え核酸を含む、宿主細胞。

【請求項16】

請求項１、２もしくは４～１０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、請求項３～１０のいずれか一項に記載の発現カセット、または請求項１３もしくは１４に記載の組換え核酸と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。

【請求項17】

ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）、Ｈｕｒｌｅｒ症候群、Ｈｕｒｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｅ症候群、および／またはＳｃｈｅｉｅ症候群の治療に使用するための、請求項１、２もしくは４～１０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、または請求項１６に記載の薬学的組成物。

【請求項18】

前記治療が併用療法を行うことをさらに含む、請求項１７に記載の使用のための薬学的組成物。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

インビボ遺伝子療法のために選択されるベクタープラットフォームは、霊長類由来のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく。１９６０年代、遺伝子療法産物は、アデノウイルスの調製物から単離されたＡＡＶに由来した（Ｈｏｇｇａｎ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ５５：１４６７－１４７４，１９６６）。これらのベクターは安全であったが、不十分な形質導入のために、臨床では、多くのプログラムが失敗した。２１世紀への変わり目に、研究者らは、内因性ＡＡＶのファミリーを発見し、これは、ベクターとして好ましい安全プロファイルを保持しながら、はるかに高い形質導入効率を達成した（Ｇａｏ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７８：６３８１－６３８８，２００４）。

【0002】

ＡＡＶベクターに対する宿主の有害な応答は、最小限であった。激しい急性炎症応答を引き起こす非ウイルスベクターおよびアデノウイルスベクターとは対照的に（Ｒａｐｅｒ，Ｓ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ ８０：１４８－１５８，２００３、Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ３：６９７－７０７，２００１）、ＡＡＶベクターは炎症促進性ではない。ＡＡＶベクターの投与後、細胞傷害性Ｔ細胞などのベクター形質導入細胞に対する破壊的な適応免疫応答は、最小限であった。動物およびヒトにおいて、ＡＡＶが、血清型、用量、投与経路、および免疫抑制レジメンに応じて、特定の状況下では、カプシドまたは導入遺伝子産物に対する耐容性を誘導し得るという証拠がある（Ｇｅｒｎｏｕｘ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２８：３３８－３４９，２０１７、Ｍａｙｓ，Ｌ．Ｅ．＆Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．Ｍｏｌ
Ｔｈｅｒ １９：１６－２７，２０１１、Ｍａｎｎｏ，Ｃ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ
Ｍｅｄ １２：３４２－３４７，２００６、Ｍｉｎｇｏｚｚｉ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １１０：２３３４－２３４１，２００７）。しかしながら、毒性がこの技術の応用を制限する可能性があることは、ＡＡＶ遺伝子療法の臨床応用の現在の爆発的な増加に関連して明らかである。

【0003】

最も重度の毒性は、ＣＮＳおよび筋骨格系を標的とする高用量ＡＡＶの静脈内投与後に発生した。非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における研究では、血小板減少症および高トランスアミナーゼ血症の急性発症を示し、これは、場合によっては、出血およびショックの致死的症候群に発展した（Ｈｏｒｄｅａｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２６：６６４－６６８，２０１８、Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２９（３）：２８５－２９８，２０１８）。また、ほとんどの高用量ＡＡＶ臨床試験において、肝臓酵素の急性上昇および／または血小板の減少も観察されている（ＡｖｅＸｉｓ，Ｉ．ＺＯＬＧＥＮＳＭＡ Ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，２０１９、Ｓｏｌｉｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｒｏｖｉｄｅｓ ＳＧＴ－００１
Ｐｒｏｇｒａｍ Ｕｐｄａｔｅ，２０１９、Ｐｆｉｚｅｒ，Ｐｆｉｚｅｒ Ｐｒｅｓｅｎｔｓ Ｉｎｉｔｉａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄａｔａ ｏｎ Ｐｈａｓｅ １ｂ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｔｕｄｙ ｆｏｒ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ（ＤＭＤ），２０１９、Ｆｌａｎｉｇａｎ，Ｋ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ １２６：Ｓ５４，２０１９）。稀ではあるが、重度の毒性は、貧血、腎不全、および補体活性化によって特徴付けられている（Ｓｏｌｉｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１９、Ｐｆｉｚｅｒ，２０１９）。

【0004】

より最近では、脳脊髄液（ＣＳＦ）中に、または高用量で血液中にのいずれかでＡＡＶベクターを受けたＮＨＰおよびブタでは、後根神経節（ＤＲＧ）のニューロンが変性する
問題が観察されている（Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２９（３）：２８５－２９８，２０１８、Ｈｏｒｄｅａｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １０：６８－７８，２０１８、Ｈｏｒｄｅａｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １０：７９－８８，２０１８）。この神経毒性は、末梢神経における末梢軸索と、脊髄の後側柱を通って上行する中枢軸索との両方の変性に関連する。

【0005】

ムコ多糖症は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）（ムコ多糖とも呼ばれる）の分解に関与する特異的なリソソーム酵素の欠損によって引き起こされる遺伝性障害の一群である。部分的に分解されたＧＡＧの蓄積は、細胞、組織、および臓器の機能を妨げる。時間の経過と共に、ＧＡＧは、細胞、血液、および結合組織内に蓄積し、細胞および臓器の損傷を増加させる。ムコ多糖症（ＭＰＳ）障害の中で最も深刻なものの１つであるＭＰＳ Ｉは、酵素アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）の欠損によって引き起こされる。具体的には、ＩＤＵＡは、ヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸と呼ばれる２つのＧＡＧから末端イズロン酸残基を除去することが報告されている。ＩＤＵＡは、異なる種類の分子を消化し、再循環する細胞内の区画であるリソソーム内に位置する。ＩＤＵＡ遺伝子における１００を超える変異は、ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）を引き起こすことが見出されており、一塩基多型（ＳＮＰ）が最も一般的である。

【0006】

当該技術分野では、ＭＰＳＩと診断された患者を安全かつ効果的に治療するための遺伝子療法組成物および方法の必要性が存在する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【文献】Ｈｏｇｇａｎ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ５５：１４６７－１４７４，１９６６

【文献】Ｇａｏ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７８：６３８１－６３８８，２００４

【文献】Ｒａｐｅｒ，Ｓ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ ８０：１４８－１５８，２００３

【文献】Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ３：６９７－７０７，２００１

【文献】Ｇｅｒｎｏｕｘ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２８：３３８－３４９，２０１７

【文献】Ｍａｙｓ，Ｌ．Ｅ．＆Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １９：１６－２７，２０１１

【文献】Ｍａｎｎｏ，Ｃ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ １２：３４２－３４７，２００６

【文献】Ｍｉｎｇｏｚｚｉ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １１０：２３３４－２３４１，２００７

【文献】Ｈｏｒｄｅａｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２６：６６４－６６８，２０１８

【文献】Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２９（３）：２８５－２９８，２０１８

【文献】ＡｖｅＸｉｓ，Ｉ．ＺＯＬＧＥＮＳＭＡ Ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，２０１９、Ｓｏｌｉｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｒｏｖｉｄｅｓ ＳＧＴ－００１ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｕｐｄａｔｅ，２０１９、

【文献】Ｐｆｉｚｅｒ，Ｐｆｉｚｅｒ Ｐｒｅｓｅｎｔｓ Ｉｎｉｔｉａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄａｔａ ｏｎ Ｐｈａｓｅ １ｂ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｔｕｄｙ ｆｏｒ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ（ＤＭＤ），２０１９

【文献】Ｆｌａｎｉｇａｎ，Ｋ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ １２６：Ｓ５４，２０１９

【文献】Ｓｏｌｉｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１９、Ｐｆｉｚｅｒ，２０１９

【文献】Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２９（３）：２８５－２９８，２０１８

【文献】Ｈｏｒｄｅａｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １０：６８－７８，２０１８

【文献】Ｈｏｒｄｅａｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １０：７９－８８，２０１８

【発明の概要】

【0008】

一態様では、ベクターゲノムを中にパッケージングしたＡＡＶカプシドを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）であって、ベクターゲノムが、機能的ヒトアルファ－Ｌ－イズロニダーゼ（ｈＩＤＵＡ）のためのコード配列と、細胞におけるｈＩＤＵＡの発現を指示する調節配列と、を含み、コード配列が、配列番号２２のヌクレオチド８２～１９５９、もしくはそれに対して少なくとも９５％同一の配列、配列番号２３のヌクレオチド８２～１９５９、もしくはそれに対して少なくとも９５％同一の配列、配列番号２４のヌクレオチド８２～１９５９、もしくはそれに対して少なくとも９５％同一の配列、配列番号２５のヌクレオチド８２～１９５９、もしくはそれに対して少なくとも９５％同一の配列、または配列番号２６のヌクレオチド８２～１９５９、もしくはそれに対して少なくとも９５％同一の配列を含む、ｒＡＡＶが提供される。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号２１の少なくともアミノ酸２８～６５３、またはそれに対して少なくとも９５％同一の配列を含む機能的ｈＩＤＵＡのためのコード配列を含む。特定の実施形態では、ｈＩＤＵＡは、天然シグナルペプチドを含む。なおさらなる実施形態では、ｈＩＤＵＡは、配列番号２１の全長（アミノ酸１～６５３）、またはそれに対して少なくとも９５％同一の配列を含む。特定の実施形態では、ｈＩＤＵＡコード配列は、配列番号２２のヌクレオチド１～１９５９、もしくはそれに対して少なくとも９５％同一の配列、配列番号２３のヌクレオチド１～１９５９、もしくはそれに対して少なくとも９５％同一の配列、配列番号２４のヌクレオチド１～１９５９、もしくはそれに対して少なくとも９５％同一の配列、配列番号２５のヌクレオチド１～１９５９、もしくはそれに対して少なくとも９５％同一の配列、または配列番号２６のヌクレオチド１～１９５９、もしくはそれに対して少なくとも９５％同一の配列を含む。特定の実施形態では、ｈＩＤＵＡは、異種シグナルペプチドを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、組織特異的プロモーターを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３、ｍｉＲ－１８２、またはｍｉＲ－９６のうちの少なくとも１つに特異的な少なくとも１つの後根神経節（ｄｒｇ）特異的ｍｉＲＮＡ標的配列を含み、少なくとも１つの標的配列が、ｈＩＤＵＡコード配列の３’末端に作動可能に連結されている。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列は、配列番号１、２、３、および４から選択される。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、２個で、少なくとも３個、または少なくとも４個のｄｒｇ特異的ｍｉＲＮＡ標的配列をさらに含む。特定の実施形態では、提供されるｒＡＡＶは、ＡＡＶ９、ＡＡＶｈｕ６８、またはＡＡＶｒｈ９１カプシドを有する。

【0009】

別の態様では、発現カセットであって、機能的ヒトアルファ－ガラクトシダーゼＡ（ｈＩＤＵＡ）をコードする核酸配列と、発現カセットを含有する細胞におけるｈＩＤＵＡの発現を指示する調節配列と、を含み、コード配列が、配列番号２２のヌクレオチド８２～１９５９、もしくはそれに対して少なくとも９５％同一の配列、配列番号２３のヌクレオチド８２～１９５９、もしくはそれに対して少なくとも９５％同一の配列、配列番号２４のヌクレオチド８２～１９５９、もしくはそれに対して少なくとも９５％同一の配列、配
列番号２５のヌクレオチド８２～１９５９、もしくはそれに対して少なくとも９５％同一の配列、または配列番号２６のヌクレオチド８２～１９５９、もしくはそれに対して少なくとも９５％同一の配列を含む、発現カセットが提供される。特定の実施形態では、ｈＩＤＵＡは、配列番号２１の少なくともアミノ酸２８～６５３、またはそれに対して少なくとも９５％同一の配列を有する機能的ｈＩＤＵＡのためのコード配列を含む。特定の実施形態では、ｈＩＤＵＡは、天然シグナルペプチドを含む。特定の実施形態では、ｈＩＤＵＡは、配列番号２１の全長（アミノ酸１～６５３）、またはそれに対して少なくとも９５％同一の配列を含む。さらなる実施形態では、発現カセットは、配列番号２２のヌクレオチド１～１９５９、もしくはそれに対して少なくとも９５％同一の配列、配列番号２３のヌクレオチド１～１９５９、もしくはそれに対して少なくとも９５％同一の配列、配列番号２４のヌクレオチド１～１９５９、もしくはそれに対して少なくとも９５％同一の配列、配列番号２５のヌクレオチド１～１９５９、もしくはそれに対して少なくとも９５％同一の配列、または配列番号２６のヌクレオチド１～１９５９、もしくはそれに対して少なくとも９５％同一の配列を含むｈＩＤＵＡコード配列を含む。なお別の実施形態では、ｈＩＤＵＡは、異種シグナルペプチドを含む。特定の実施形態では、発現カセットは、組織特異的プロモーターを含む。特定の実施形態では、発現カセットは、ｍｉＲ－１８３、ｍｉＲ－１８２、またはｍｉＲ－９６のうちの少なくとも１つに特異的な少なくとも１つの後根神経節（ｄｒｇ）特異的ｍｉＲＮＡ標的配列を含み、少なくとも１つの標的配列が、ｈＩＤＵＡコード配列の３’末端に作動可能に連結されている。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列は、配列番号１、２、３、および４から選択される。特定の実施形態では、発現カセットは、２個で、少なくとも３個、または少なくとも４個のｄｒｇ特異的ｍｉＲＮＡ標的配列をさらに含む。特定の実施形態では、発現カセットは、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターによって担持される。特定の実施形態では、非ウイルスベクターは、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、無機粒子、脂質粒子、ポリマーベースのベクター、またはキトサンベースの製剤から選択される。特定の実施形態では、ベクターは、組換えパルボウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、組換えアデノウイルスである。

【0010】

一態様では、機能的ｈＩＤＵＡをコードする配列を含む組換え核酸であって、コード配列が、配列番号２２、２３、２４、２５、もしくは２６のヌクレオチド８２～１９５９、またはそれに対して少なくとも９５％同一の配列を含む、組換え核酸が提供される。特定の実施形態では、核酸は、機能的ｈＩＤＵＡをコードする配列を含み、コード配列は、配列番号２２、２３、２４、２５、もしくは２６のヌクレオチド１～１９５９、またはそれに対して少なくとも９５％同一の配列を含む。さらなる実施形態では、組換え核酸は、プラスミドである。

【0011】

別の態様では、本明細書に提供されるｒＡＡＶ、発現カセット、または組換え核酸を含有する宿主細胞が提供される。

【0012】

別の態様では、本明細書に提供されるｒＡＡＶ、発現カセット、または組換え核酸と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物が提供される。

【0013】

また、別の態様では、ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）と診断された対象を治療する方法であって、本方法が、本明細書に提供される薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法が提供される。特定の実施形態では、対象は、Ｈｕｒｌｅｒ症候群、Ｈｕｒｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｅ症候群、および／またはＳｃｈｅｉｅ症候群と診断されている。また、ＭＰＳ Ｉ、Ｈｕｒｌｅｒ症候群、Ｈｕｒｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｅ症候群、および／またはＳｃｈｅｉｅ症候群と診断された対象を治療するための、本明細書に提供されるｒＡＡＶ、発現カセット、組換え核酸、または薬学的組成物の使用が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1A-1C】ＡＡＶのＩＣＭ投与後の、ＤＲＧ毒性および二次軸索障害を示す。（図１Ａ）ＤＲＧは、感覚偽単極ニューロンの細胞体を含有し、これらは、末梢神経に位置する末梢軸索と、脊髄の上行性背側白質路に位置する中枢軸索とを介して、感覚メッセージを末梢からＣＮＳに中継する。（図１Ｂ）軸索障害およびＤＲＧ神経変性。軸索障害（左上）は、空であるか、またはマクロファージおよび細胞破片で満たされているかのいずれかである、明らかな液胞として現れる（矢印）。ＤＲＧ病変（右上および左下）：矢印は、神経細胞体変性を示し、一方、丸印は、単核細胞浸潤を示す。右下の写真は、ＡＡＶによってコードされる導入遺伝子の免疫染色を示す（この場合、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））。（図１Ｃ）グレード１～グレード５のＤＲＧ病変およびグレード１～グレード４の背側脊髄軸索障害、ならびに正常範囲以内（ＷＮＬ）の切片の例。重症度グレードは、以下のように定義される。１ 最小（１０％未満）、２ 軽度（１０～２５％）、３ 中等度（２５～５０％）、４ 顕著（５０～９５％）、および５ 重度（９５％を超える）。グレード５は、脊髄では全く観察されなかった。矢印および丸印は、ＤＲＧへの単核細胞浸潤を伴う神経変性（左カラム）および軸索障害（右カラム）を描写する。

【図2A-2F】ＡＡＶのＩＣＭ投与後の、脊髄の背側白質路におけるＤＲＧ毒性および二次軸索障害の高倍率画像を示す。（図２Ａ）初期病変の神経細胞体（丸印）は、ミクログリア細胞（神経貪食）と共に増殖する衛星細胞および浸潤する単核細胞で囲まれている。（図２Ｃ）病変が進行するにつれて、神経細胞体は、消えかけている核を有するか、または核が存在しない小さな不規則形状もしくは鋭角を有する形状の細胞、および細胞質の細胞質高酸素血症を特徴とする、変性の証拠（丸印）を示す。（図２Ｅ）衛星細胞、ミクログリア細胞および単核細胞の完全な消失（星形）を伴う、末期の神経細胞体変性（丸印）。（図２Ｂ、図２Ｄ、および図２Ｆ）ミエロマクロファージを有する拡張された髄鞘（垂直の矢印）およびミエロマクロファージを有さない拡張された髄鞘（水平の矢印）、腫脹した軸索（アスタリスク）、ならびに軸索破片（矢尻）を有する、脊髄の背側白質路の軸索変性。（ヘマトキシリンおよびエオシン、４０倍、スケールバー＝５０μｍ）。

【図3A-3B】ＤＲＧ特異的ｍｉＲＮＡ誘導サイレンシングを使用した過剰発現関連毒性モデルおよび緩和戦略を示す。（図３Ａ）擬単極感覚ニューロンの細胞体は、ＤＲＧ内に位置し、衛星細胞および有窓型毛細血管に囲まれる。偽単極感覚ニューロンの末梢軸索は、末梢神経に位置し、中枢軸索は、脊髄の背側経路に位置する。ＡＡＶベクターは、転写およびタンパク質合成機構をハイジャックし、過負荷をかけ、したがって、細胞ストレス（例えば、分泌タンパク質のための小胞体（ＥＲ）ストレス）および遠位軸索を維持する二次的な不全を引き起こす。衛星細胞は反応性増殖を経て、サイトカインを分泌することによって、リンパ球などの炎症性細胞を引き寄せる。これらの可逆的な変化は、細胞死をもたらす可能性がある。その後、グリア細胞およびマクロファージは、浸潤し、神経細胞体を貪食する。（図３Ｂ）ＤＲＧ特異的サイレンシングのための例示的なＡＡＶ発現カセット設計。ＤＲＧ特異的ｍｉＲＮＡ逆相補配列（ｍｉＲ標的）の４個の短いタンデムリピートを、終止コドンとポリＡとの間に導入する。ＤＲＧニューロンにおいて、ＤＲＧ特異的ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ１８３）とｍＲＮＡの３’非翻訳領域のその標的との間の正確な塩基対形成によって、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を動員し、次いでｍＲＮＡ切断によるサイレンシングを引き起こす。ｍｉＲＮＡ１８３を発現しない他の細胞型では、３’ＵＴＲ領域からの影響なしに、翻訳およびタンパク質合成が起こる。

【図4A-4B】ｑＲＴ－ＰＣＲによるｍｉＲ－１８３存在量の測定を示す。（図４Ａ）組織は、未処理（ＡＡＶで治療されていない）であるか、またはｍｉＲ標的を含まないベクターで治療されたＮＨＰアカゲザルに由来するものであった。前頭皮質（皮質）、心臓、脾臓、小脳、肝臓、髄質、および脊髄（ＳＣ）についてｎ＝３。大腿四頭筋（四頭筋）およびＤＲＧ－頸部セグメントについてｎ＝２。ｍｉＲ－１８３発現データは、皮質と比較した倍率の変化として表される。ＳＤは、生物学的複製物から算出された。一元配置分散分析、次いで、テューキーの多重比較検定。＊ｐ＜０．０５、他の組織と比較して、ＤＲＧにおけるｍｉＲ１８３発現。（図４Ｂ）神経障害性疼痛の病歴を有しない２５歳の白人男性臓器ドナーからのヒトＳＣおよびＤＲＧにおけるｍｉＲ－１８３発現。ＳＣと比較した倍率の変化として表されたデータ。ＳＤは、ｑＲＴ－ＰＣＲウェルの３個の複製物から算出された。

【図5A-5D】インビトロおよびマウスのＤＲＧニューロンにおける導入遺伝子発現を特異的にサイレンシングするｍｉＲ１８３標的を示す。（図５Ａ）ｍｉＲ１８３またはｍｉＲ１４５標的、および対照またはｍｉＲ１８３発現プラスミドを保有するＧＦＰ発現プラスミドと共トランスフェクトした２９３細胞からのＧＦＰウェスタンブロット。実験は、３個の複製物で実施された。平均値として示されるデータ。エラーバーは、標準偏差を示す。（図５Ｂ）４×１０^１２ＧＣ（群当たりｎ＝３～４匹のマウス）の用量で、ＡＡＶ９．ＧＦＰ対照ベクターまたはＡＡＶ９．ＧＦＰ－ｍｉＲベクターをＩＶ注射したＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスからの切片について定量化されたＩＨＣによるＤＲＧ ＧＦＰ陽性ニューロン。ｍｉＲ１８３、ｍｉＲ１４５、およびｍｉＲ１８２の３つのＤＲＧ濃縮ｍｉＲをスクリーニングした。データ点は、マウス当たりの総ＤＲＧニューロンに対するＧＦＰ発現ニューロンの平均パーセンテージを表す。平均値として示されるデータ。エラーバーは、標準偏差を示す。ウィルコクソン検定：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。（図５Ｃ）パネルＢで定量化されたＤＲＧからのＧＦＰ免疫染色の代表的な写真。（図５Ｄ）ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ．ＧＦＰ対照ベクターまたはＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ．ＧＦＰ－ｍｉＲ（ｍｉＲ１８３、ｍｉＲ１４５、ｍｉＲ１８２）をＩＶ注射したＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスからの小脳、皮質、および肝臓の代表的な写真。

【図6A-6C】マウス由来の脳および末梢臓器におけるＧＦＰ発現を示す。（図６Ａ）１×１０１２ＧＣの用量、群当たりｎ＝４で、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ．ＧＦＰ対照ベクターまたはＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ．ＧＦＰ－ｍｉＲベクターをＩＶ注射したＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスからの脳皮質におけるＧＦＰ直接蛍光（曝露時間３秒）。ｍｉＲ１８３、ｍｉＲ１８２、ｍｉＲ９６、およびｍｉＲ１４５の４つのＤＲＧ濃縮ｍｉＲを最初スクリーニングした。（図６Ｂ）４×１０１２ＧＣの用量、群当たりｎ＝３～４で、ＡＡＶ９．ＧＦＰ対照ベクターまたはＡＡＶ９．ＧＦＰ－ｍｉＲベクターをＩＶ注射したＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスからの肝臓（曝露時間１秒）、心臓（曝露時間３秒）、および筋肉（曝露時間１０秒）におけるＧＦＰ直接蛍光。（図６Ｃ）すべてのマウスからのＧＦＰ直接蛍光強度の定量化（群当たりｎ＝３～４）。一元配置分散分析、次いで、テューキーの多重比較検定。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。

【図7A-7C】ＮＨＰへのＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰのＩＣＭ投与後、ＤＲＧにおけるＧＦＰ発現を特異的にサイレンシングし、毒性を低減するｍｉＲ１８３標的を示す。（図７Ａ）３．５×１０^１３ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰ対照ベクター（ｎ＝２）またはＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰ－ｍｉＲ１８３（ｎ＝４）をＩＣＭ注射された成体アカゲザル由来のＤＲＧ、脊髄運動ニューロン、小脳、皮質、心臓、および肝臓のＧＦＰ免疫染色切片の代表的な写真。（図７Ｂ）ＮＨＰにおけるＤＲＧ（動物当たり２～４個の異なる腰部ＤＲＧ、１群当たりｎ＝２～４匹の動物）、脊髄（下位運動ニューロン、動物当たり２～５個の異なる切片、１群当たりｎ＝２～４匹の動物）、小脳、および皮質におけるＧＦＰ陽性細胞の定量化（領域当たり５個の２０倍の倍率視野、１群当たりｎ＝２～４匹の動物）。平均値として示されるデータ。エラーバーは、標準偏差を示す。ウィルコクソン検定：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（図７Ｃ）注射の２ヶ月後の組織病理学では、背側脊髄軸索障害、末梢神経軸索障害（正中神経、腓骨神経および橈骨神経）、ならびにＤＲＧ神経変性および単核細胞浸潤の重症度グレードを示す。１ 最小（１０％未満）、２ 軽度（１０～２５％）、３ 中等度（２５～５０％）、４ 顕著（５０～９５％）、および５ 重度（９５％を超える－観察されていない）。各バーは、１匹の動物を表す。０は、病変が存在しないことを表す。

【図8A-8D】ＮＨＰのｈＩＤＵＡに対するＴ細胞および抗体応答を示す。（図８Ａ～図８Ｃ）注射の９０日後に、ＰＢＭＣ、脾臓、肝臓、および深部頸部リンパ節から単離されたリンパ球におけるインターフェロンガンマＥＬＩＳＰＯＴ応答。各動物は、ｈＩＤＵＡ配列をカバーする３つの重複するペプチドプールを表す３つの値を有する。赤色は、陽性ＥＬＩＳＰＯＴ応答を示し、スポット形成単位が１０６個のリンパ球あたり５５超、および未刺激時の培地陰性対照の３倍として定義される。（図８Ｄ）抗ｈＩＤＵＡ抗体のＥＬＩＳＡアッセイ、血清希釈は１：１，０００。

【図9】ＣＳＦにおけるサイトカイン／ケモカインの濃度を示す。試料を、ベクターの投与時点（Ｄ０）、ならびにベクターの投与後２４時間（２４ｈ）、２１日目（Ｄ２１）および３５日目（Ｄ３５）に回収した。ｓＣＤ１３７、エオタキシン、ｓＦａｓＬ、ＦＧＦ－２、フラクタルカイン、グランザイムＡ、グランザイムＢ、ＩＬ－１α、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｅ／ＩＬ－２５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２８Ａ、ＩＬ－３１、ＩＬ－３３、ＩＰ－１０、ＭＩＰ－３α、パーフォリン、およびＴＮＦβといった分析物を含有するＭｉｌｌｉｐｌｅｘ ＭＡＰキットからの濃度を示すヒートマップ。

【図10】ＮＨＰへのＡＡＶｈｕ６８．ｈＩＤＵＡのＩＣＭ投与後の、ＤＲＧにおけるｈＩＤＵＡの発現を特異的にサイレンシングするｍｉＲ１８３標的を示す。抗ｈＩＤＵＡ抗体免疫蛍光（ＤＲＧ、最初の行、図１３Ａに提供される定量化データ）、抗ｈＩＤＵＡのＩＨＣ（下位運動ニューロン、小脳、皮質）、および抗ＩＤＵＡのＩＳＨ（ＤＲＧの最後の行、図１３Ａに提供される定量化データ）による、ｈＩＤＵＡ発現の代表的な写真。抗ＩＤＵＡのＩＳＨ：曝露時間は、ステロイドの有無にかかわらず、ＡＡＶｈｕ６８．ｈＩＤＵＡに対して２００ｍｓである。感覚ニューロンは、大量の導入遺伝子ｍＲＮＡの発現を示す。ＡＡＶ．ｈＩＤＵＡ－ｍｉＲ１８３に対する曝露時間は、１秒である。感覚ニューロンは、核および細胞質において、低いＩＳＨシグナル（ｍＲＮＡ）を有する。ｍＲＮＡは、このより長い曝露時間で、ニューロンを取り囲む衛星細胞において見ることができる。

【図11A-11C】ｍｉＲ１８３媒介性サイレンシングが、ＤＲＧニューロンに特異的であり、ＡＡＶｈｕ６８．ｈＩＤＵＡをＩＣＭ投与されたＮＨＰにおけるＤＲＧ毒性を完全に防ぐことを示す。（図１１Ａ）ＮＨＰにおけるＤＲＧ（動物当たり５個の異なるＤＲＧ、１群当たりｎ＝３匹の動物）、脊髄（下位運動ニューロン、動物当たり２～５個の異なる切片、１群当たりｎ＝３匹の動物）、小脳、および皮質におけるｈＩＤＵＡ陽性細胞の定量化（領域当たり５個の２０倍の倍率視野、１群当たりｎ＝３匹の動物）。平均値として示されるデータ。エラーバーは、標準偏差を示す。ウィルコクソン検定：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。（図１１Ｂ）注射の３ヶ月後の組織病理スコアリング：０～５のＤＲＧ重症度グレード（動物当たり少なくとも３つの頸部、３つの胸部、および３つの腰部のすべてのＤＲＧからのスコアを示すプロット）、０～５の背側軸索障害グレード（動物当たり少なくとも３つの頸部、３つの胸部、および３つの腰部脊髄切片のすべての異なる切片からのスコアを示すプロット）、ならびに正中神経スコア－動物当たり４つの切片（右側、左側近位および遠位の正中神経）で確立された軸索症および線維症重症度グレード（０～１０）の合計。以下のように定義される重症度グレード。０ 病変なし、１ 最小（１０％未満）、２ 軽度（１０～２５％）、３ 中等度（２５～５０％）、４ 顕著（５０～９５％）、および５ 重度（９５％を超える－観察されていない）。平均値として示されるデータ。エラーバーは、標準偏差を示す。ウィルコクソン検定：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（図１１Ｃ）ｈＩＤＵＡ導入遺伝子特異的プローブ、高倍率のＤＲＧ感覚ニューロンおよび衛星細胞を使用するＩＳＨ、青色ＤＡＰＩでの核の対比染色による１秒の曝露時間。矢印：ＤＲＧ感覚ニューロン、矢尻：衛星細胞。

【図12】ＮＨＰの脳、脊髄、およびＤＲＧにおけるベクター生体分布を示す。Ｔａｑｍａｎ試薬およびベクターのｒＢＧポリアデニル化配列を標的とするプライマー／プローブを使用した、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応による、ベクターゲノムの定量化。二倍体ゲノムあたりのゲノムコピーで表現される結果。エラーバーは、標準偏差（１群当たりｎ＝３匹の動物）を表す。

【図13A-13F】脾臓を陽性対照として用いる、ＤＲＧのアポトーシスマーカー活性化カスパーゼ－３のＩＨＣを示す。（図１３Ａおよび図１３Ｂ）変性神経細胞体（丸印）および周囲の細胞浸潤（矢尻）は、それぞれ、ＡＡＶｈｕ６８．ｅＧＦＰおよびＡＡＶｈｕ６８．ｈＩＤＵＡを注射した動物において、活性化カスパーゼ－３に対して陽性である。（図１３Ｃ）ＡＡＶｈｕ６８．ｅＧＦＰ．ｍｉＲ１８３を注射した動物は、変性神経細胞体（丸印）において、稀な陽性カスパーゼ－３免疫染色を示す。ＡＡＶｈｕ６８．ｅＧＦＰ．ｍｉＲ１８３を注射した動物からのＤＲＧ切片の大部分は、活性化カスパーゼ－３に対して陰性である。（図１３Ｄ）ＡＡＶｈｕ６８．ｈＩＤＵＡ．ｍｉＲ１８３を注射した動物からのニューロンも、活性化カスパーゼ－３に対して陰性である。（図１３Ｅ）正常なＤＲＧを有する未処理のＡＡＶ注射されていない対照ＮＨＰの神経細胞体は、バックグラウンド染色と一致して、拡散した薄い褐色であり、陰性であるとみなされる。（図１３Ｆ）陽性対照としてのＡＡＶｈｕ６８注射したＮＨＰからの脾臓は、胚中心の細胞破片において活性化カスパーゼ－３に対する強力な陽性の多焦点シグナル、赤髄の白血球内で多焦点陽性シグナル（矢印）を有する。周囲の白髄および赤髄は、バックグラウンド染色と一致して、拡散した薄い褐色である。活性化カスパーゼ－３ ＩＨＣ、２０倍、スケールバー＝１００μｍ。

【図14A-14E】ＤＲＧにおけるＵＰＲ制御されたＡＴＦ６についてのＩＨＣを示す。（図１４Ａ）ＡＡＶｈｕ６８．ｅＧＦＰを注射した動物における変性神経細胞体（丸印）は、ＡＴＦ６に対してわずかに陽性であり、神経細胞体の大部分の周囲の衛星細胞（垂直の矢印）、神経細胞体を欠く最も顕著なそのクラスター（水平の矢印）は、強力にＡＴＦ６陽性である。（図１４Ｂ）ＡＡＶｈｕ６８．ｈＩＤＵＡを注射した動物からの変性神経細胞体（丸印）は、変性ニューロンにおけるＡＴＦ６に対して陰性であり、衛星細胞は、細胞質において強く陽性である（水平の矢印）。（図１４Ｃ）ＡＡＶｈｕ６８．ｅＧＦＰ．ｍｉＲ１８３を注射した動物における神経細胞体を欠くクラスター中の衛星細胞（水平の矢印）は、ＡＴＦ６に対して陽性であり、変性神経細胞体（丸印）は、陰性である。ＡＡＶｈｕ６８．ｅＧＦＰ．ｍｉＲ１８３を注射した動物からのＤＲＧ切片の大部分は、ＡＴＦ６に対して陰性である（挿入図）。（図１４Ｄ）ＡＡＶｈｕ６８．ｈＩＤＵＡ．ｍｉＲ１８３を注射した動物からの神経細胞体および衛星細胞は、ＡＴＦ６に対して陰性である。（図１４Ｅ）正常なＤＲＧを有する未処理のＡＡＶ注射されていない対照ＮＨＰの神経細胞体も、ＡＴＦ６に対して陰性である。ＡＴＦ６ ＩＨＣ、２０倍、スケールバー＝１００μｍ。

【図15A-15E】ＤＲＧにおける外因性アポトーシスマーカー活性化カスパーゼ－８についてのＩＨＣを示す。変性神経細胞体（丸印）は、ＡＡＶｈｕ６８．ｅＧＦＰ（図１５Ａ）、ＡＡＶｈｕ６８．ｈＩＤＵＡ（図１５Ｂ）、およびＡＡＶｈｕ６８．ｅＧＦＰ．ｍｉＲ１８３（図１５Ｃ）を注射した動物において、カスパーゼ－８陰性である。周囲の細胞浸潤は、強く陽性である（矢印）。（図１５Ｄ）ＡＡＶｈｕ６８．ｈＩＤＵＡ．ｍｉＲ１８３を注射した動物からのニューロンは、カスパーゼ８陰性であり、カスパーゼ８陽性間質細胞は稀である（矢印）。（図１５Ｅ）正常なＤＲＧを有する未処理のＡＡＶ注射されていない対照ＮＨＰの神経細胞体は、カスパーゼ８陰性であり、カスパーゼ８陽性間質細胞は稀である（矢印）。活性化カスパーゼ－８ ＩＨＣ、４０倍、スケールバー＝５０μｍ。

【図16A-16F】ＤＲＧの内因性アポトーシスマーカー活性化カスパーゼ－９についてのＩＨＣを示す。（図１６Ａ）ＡＡＶｈｕ６８．ｅＧＦＰを注射した動物における変性神経細胞体（丸印）は、細胞浸潤における陽性の増加を伴うカスパーゼ９陽性である（水平の矢印）。（図１６Ｂ）ＡＡＶｈｕ６８．ｈＩＤＵＡを注射した動物における変性神経細胞体は、細胞浸潤においてカスパーゼ－９陽性細胞をほとんど含まない、カスパーゼ９陰性である（水平の矢印）。（図１６Ｃ）ＡＡＶｈｕ６８．ｅＧＦＰ．ｍｉＲ１８３を注射した動物からのニューロンは、陽性浸潤の細胞を伴い、陰性である（水平の矢印）。（図１６Ｄ）ＡＡＶｈｕ６８．ｈＩＤＵＡ．ｍｉＲ１８３を注射した動物からのニューロンは陰性であり、変性神経細胞体は観察されない。（図１６Ｅ）正常なＤＲＧを有する未処理のＡＡＶ注射されていない対照ＮＨＰの神経細胞体は、稀な陽性間質細胞を伴い、陰性である（水平の矢印）。（図１６Ｆ）陽性対照であるＡＡＶｈｕ６８注射したＮＨＰからの脾臓は、胚中心の細胞破片および赤髄の白血球において陽性である（垂直の矢印）。活性化カスパーゼ－９ ＩＨＣ、４０倍、スケールバー＝５０μｍ。

【図17A-17D】ｈＩＤＵＡをコードする操作された配列の投与後のＩＤＵＡ活性の比較を示す。野生型雄マウスに、ｈＩＤＵＡ配列（ｈＩＤＵＡＣｏＶ１－配列番号２２、ｈＩＤＵＡＣｏＶ２－配列番号２３、ｈＩＤＵＡＣｏＶ３－配列番号２４、ｈＩＤＵＡＣｏＶ４－配列番号２５、ｈＩＤＵＡＣｏＶ５－配列番号２６）、または最適化されていない未処理のコード配列（ｈＩＤＵＡｎａｔ）の送達のために、１ｘ１０^１１ＧＣのＡＡＶｈｕ６８をＩＶ注射した。ＩＤＵＡ活性を、７日目および８日目の血清（図１７Ａ）、ならびに７日目の脳（図１７Ｂ）、心臓（図１７Ｃ）、および肝臓（図１７Ｄ）で測定した。

【図18A-18F】マウスへのｍｉＲ１８３標的配列（４×リピート）を含むか、または含まないＡＡＶｈｕ６８．ｈＩＤＵＡｃｏＶ１を投与した後の結果を示す。（図１８Ａ）ＭＰＳＩマウス（ＩＤＵＡ ＫＯ）に、１×１０^１１ＧＣをＩＣＶ注射し、注射から３０日後または９０日後に安楽死させた。未修飾ｈＩＤＵＡ（ベクター１）を使用した第１の研究において、若いマウス（治療時に１～２ヶ月齢）のコホートを、治療時に進行性疾患を有する老齢マウス（６～８ヶ月齢）のコホートと比較した。ｍｉＲ１８３標的修飾ベクターを使用した第２の研究は、若い１～３ヶ月齢のマウスのみを使用した。（図１８Ｂ～図１８Ｄ）脳および脊髄におけるＩＤＵＡ活性を比較した。脳および胸腰部脊髄の１つの吻側冠状部分を瞬間凍結させた。組織溶解および清澄化後、ＩＤＵＡ酵素活性を、人工基質４－メチルウンベリフェロン（４－ＭＵ）ベースの蛍光アッセイを使用して測定した。タンパク質１ｍｇ当たりの結果を正規化した。（図１８Ｅおよび図１８Ｆ）組織を処理して、ＬＡＭＰ１免疫蛍光を治療有効性のマーカーとして使用して、貯蔵低減を評価した。

【図19A-19B】ＮＨＰにおけるｍｉＲ１８３クラスター調節遺伝子発現（ＡＡＶ－ＩＤＵＡ対ＡＡＶ－ＩＤＵＡ－４ＸｍｉＲ１８３）の分析を伴うスポンジ効果研究からの結果を示す。図１９Ａは、後根神経節（ＤＲＧ）におけるｍｉＲ１８３クラスター調節遺伝子ｍＲＮＡ定量化を提供する。図１９Ｂは、皮質における結果を提供する。ｍｉＲ１８３クラスター調節遺伝子（ＣＡＣＮＡ２Ｄ１またはＣＡＣＮＡ２Ｄ２）の発現の増加はなく、ＤＲＧ（高ｍｉＲ１８３存在量）または前頭皮質（低ｍｉＲ１８３存在量）のいずれかにおけるＡＡＶ－ＩＤＵＡおよびＡＡＶ－ＩＤＵＡ－ｍｉＲ１８３動物からの結果を比較する。

【図20】低濃度（５×１０^５）または高濃度（２．５×１０^８）でのｍｉＲ１８３標的配列の４つのコピーを伴うか、または伴わない、ｅＧＦＰ導入遺伝子を担持する様々なベクターのＡＡＶ９形質導入の結果を示す。ｍｉＲ１８３を伴わない低用量および高用量を、１００（低用量ＡＡＶ９－ｅＧＦＰの場合）または１０（高用量ＡＡＶ９－ｅＧＦＰの場合）の感染多重度（ＭＯＩ）で、アデノウイルス５型（Ａｄ５）ヘルパー共トランスフェクションを行うか、または行わずに試験した。すべてのＤＲＧニューロンが形質導入され、毒性の目に見える兆候は観察されなかった。ＤＲＧニューロンにおいて、ＧＦＰ発現は観察されなかったが、線維芽細胞様細胞において、ある程度の発現が観察された。この結果は、４×ｍｉＲ１８３標的発現カセットによるＧＦＰ転写の抑制を確認する。

【図21】ラットＤＲＧ細胞におけるスポンジ効果研究からの結果を示す。このデータは、細胞がＡＡＶ９－ｅＧＦＰ－ｍｉｒ１８３で形質導入されると、ラットＤＲＧ細胞におけるｍｉＲ１８３レベルが低減することを示す。ＡＡＦ９－ｅＧＦＰ－ｍｉＲ１８３－は、ＧＦＰ－ｍｉＲ１８３ ｍＲＮＡに対するターゲットエンゲージメントを示す。

【図22A-22C】３つの既知のｍｉＲ１８３調節転写産物で評価した、ラットＤＲＧ細胞におけるｍｉＲ１８３スポンジ効果研究の効果を示す。図２２Ａは、モックベクター、ＡＡＶ－ＧＦＰ、またはＡＡＶ－ＧＦＰ－ｍｉＲ１８３ベクターの送達後のラットＤＲＧ細胞におけるＣＡＣＡＮＡ２Ｄ１相対発現の結果を示す。図２２Ｂは、モックベクター、ＡＡＶ－ＧＦＰ、またはＡＡＶ－ＧＦＰ－ｍｉＲ１８３ベクターの送達後のラットＤＲＧ細胞におけるＣＡＣＡＮＡ２Ｄ２相対発現の結果を示す。図２２Ｃは、モックベクター、ＡＡＶ－ＧＦＰ、またはＡＡＶ－ＧＦＰ－ｍｉＲ１８３ベクターの送達後のラットＤＲＧ細胞におけるＡＴＦ３発現の結果を示す。これらの３つのｍｉＲ１８３調節転写産物のｍＲＮＡレベルの相対発現に変化は観察されなかった。

【図23】神経解剖学的所見および顕微鏡的所見を示す。ＤＲＧの神経細胞体（Ａ）は、脊髄の上行性（感覚）背側白質路（Ｃ）および末梢神経系（Ｄ）の中に軸索を中心に向かって突出させる。（Ａ１～Ｄ１）ＤＲＧ病的状態に関連する顕微鏡的病変の神経解剖学的関係。ＤＲＧにおける神経細胞体変性（丸印、Ａ１）は、神経根の中心および末梢の両方に延びる軸索周囲線維症（水平の矢印、Ｂ１）を伴うか、または伴わない軸索変性（垂直の矢印、Ｂ１）を引き起こす。ＤＲＧ神経根における軸索変性は、軸索周囲線維症（水平の矢印、Ｄ１）を伴うか、または伴わない、脊髄の上行性背側白質路（垂直の矢印、Ｃ１）および末梢神経（垂直の矢印、Ｄ１）の中に中心に向かって延びる。（Ａ２～Ｄ２）正常なＤＲＧ、ＤＲＧ神経根、脊髄の背側白質および末梢神経。（ヘマトキシリンおよびエオシン、２０倍、スケールバー＝１００μｍ）。（Ｅ～Ｈ）ＤＲＧ病的状態の様々な段階の高倍率画像。（Ｅ）変性プロセスの初期に、神経細胞体は、ミクログリア細胞および浸潤する単核細胞（神経貪食）と共に、増殖する衛星細胞のみを含み、比較的正常であるように見える（丸印）。（Ｆ）病変が進行するにつれて、神経細胞体は、消えかけている核を有するか、または核が存在せず、細胞質高酸素血症を有する、小さな不規則形状もしくは鋭角を有する形状の細胞を特徴とする、変性の証拠（垂直の矢印）を示す。（Ｇ）神経細胞体変性（丸印）は、衛星細胞、ミクログリア細胞および単核細胞による完全な消失を引き起こす場合があり（星形）、これは、末期の変性と考えられる。（Ｈ）正常なＤＲＧ。（ヘマトキシリンおよびエオシン、４０倍、スケールバー＝５０μｍ。）

【図24A-24D】ＤＲＧ病的状態の重症度に対する研究の特徴の効果を示す。異なる（図２４Ａ）投与経路、（図２４Ｂ）ベクター用量、（図２４Ｃ）組織収集のための注射後の時間、および（図２４Ｄ）ＧＬＰガイドラインに準拠した研究実施による、ＤＲＧ（黒色）および背側脊髄（ＳＣ）軸索（灰色）における平均病理学的スコア。平均の標準誤差を伴う平均結果、表は、各群における動物の数（ｎ）およびスコアリングされた組織学的切片の数（カウント）を示す。群間の比較は、各ＤＲＧならびに脊髄領域（すなわち、頸部、胸部、腰部）内のウィルコクソンの順位和検定を使用して行われ、組み合わせたｐ値は、０．０５レベルで評価された統計学的有意性を有するフィッシャー法を使用して、全体的なＤＲＧまたは脊髄群間比較について算出された。＊は、群間比較の有意性を示し、＃は、ビヒクル対照群との比較のための有意性を示し（図２４Ａ）、または（図２３Ｃ）１８０＋日時点との比較のための有意性を示す。＊，＃ｐ＜０．０５、＊＊，＃＃ｐ＜０．０１、＊＊＊，＃＃＃ｐ＜０．００１、＊＊＊＊，＃＃＃＃ｐ＜０．０００１。統計記号の色コード：ＤＲＧは黒、ＳＣは灰色。

【図25A-25B】ＤＲＧ病的状態の重症度に対する動物の特徴の効果を示す。（図２５Ａ）注射時の動物の年齢が異なる、および（図２５Ｂ）動物の性別が異なる（アカゲザルのみ）、ＤＲＧ（黒色）および背側脊髄（ＳＣ）軸索（灰色）における平均病理学的スコア。平均の標準誤差を伴う平均結果、表は、各群における動物の数（ｎ）およびスコアリングされた組織学的切片の数（カウント）を示す。群間の比較は、各ＤＲＧならびに脊髄領域（すなわち、頸部、胸部、腰部）内のウィルコクソンの順位和検定を使用して行われ、組み合わせたｐ値は、０．０５レベルで評価された統計学的有意性を有するフィッシャー法を使用して、全体的なＤＲＧまたは脊髄群間比較について算出された。＊は、群間比較の有意性を示し、＃は、乳幼児群との比較のための有意性を示す（図２５Ａ）。＊，＃ｐ＜０．０５、＊＊，＃＃ｐ＜０．０１、＊＊＊，＃＃＃ｐ＜０．００１、＊＊＊＊，＃＃＃＃ｐ＜０．０００１。統計記号の色コード：ＤＲＧは黒、ＳＣは灰色。

【図26A-26D】ＤＲＧ病的状態の重症度に対するベクターの特徴の効果を示す。異なる（図２６Ａ）カプシド、（図２６Ｂ）プロモーター、および（図２６Ｃ）導入遺伝子、ならびに非分泌型導入遺伝子に対する分泌型導入遺伝子（図２６Ｄ）による、ＤＲＧ（黒色）および背側脊髄（ＳＣ）軸索（灰色）における平均病理学的スコア。導入遺伝子は、ＳＣ病的状態の重症度に基づいて、１～２０に並べられた。平均の標準誤差を伴う平均結果、表は、各群における動物の数（ｎ）およびスコアリングされた組織学的切片の数（カウント）を示す。（図２６Ａ、図２６Ｂ、および図２６Ｄ）群間の比較は、各ＤＲＧならびに脊髄領域（すなわち、頸部、胸部、腰部）内のウィルコクソンの順位和検定を使用して行われ、組み合わせたｐ値は、０．０５レベルで評価された統計学的有意性を有するフィッシャー法を使用して、全体的なＤＲＧまたは脊髄群間比較について算出された。＊は、群間比較の有意性を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。統計記号の色コード：ＤＲＧは黒、ＳＣは灰色。Ｃ＝頸部、Ｔ＝胸部、Ｌ＝腰部領域。

【図27】重症度グレードの分布を伴う領域的病理スコアを示す。平均の標準誤差（赤色の点および棒）ならびに領域ごとの重症度グレードの分布（積み上げ棒グラフ）を伴う、病理学的スコアの平均パーセンテージの割合。表は、各群における動物の数（ｎ）およびスコアリングされた組織学的切片の数（カウント）を示す。平均値間の比較は、ＴＲＧとＤＲＧ、ならびにＤＲＧとＳＣのそれぞれの領域（すなわち、頸部、胸部、腰部）間のウィルコクソンの順位和検定を使用して行った。統計学的有意性は、０．０５レベルで評価した。＊は、三叉神経の神経節（ＴＲＧ）とＤＲＧとの比較の有意性を示し、＃は、ＤＲＧとＳＣの領域ごとの比較のための有意性を示す。＊＊ｐ＜０．０１、＃＃＃＃ｐ＜０．０００１。

【図28A-28B】末梢神経の病的状態を示す。平均の標準誤差（赤色の点、および棒）ならびに末梢神経ごとの重症度グレードの分布（積み上げ棒グラフ）を伴う、病理学的スコアの平均パーセンテージの割合。表は、各群における動物の数（ｎ）およびスコアリングされた組織学的切片の数（カウント）を示す。一部の末梢神経は大部分の研究で収集されなかったため、統計分析は実施されなかった。

【図29A-29D】脊髄領域ごとに分けられた、ＤＲＧ病的状態の重症度に対する研究の特徴の効果を示す。異なる（図２９Ａ）投与経路、（図２９Ｂ）ベクター用量、（図２９Ｃ）組織収集のための注射後の時間、および（図２９Ｄ）ＧＬＰガイドラインに準拠した研究実施による、ＤＲＧ（黒色）および背側脊髄（ＳＣ）軸索（灰色）領域における平均病理学的スコア。平均の標準誤差を伴う平均結果、表は、各群における動物の数（ｎ）およびスコアリングされた組織学的切片の数（カウント）を示す。Ｃ＝頸部、Ｔ＝胸部、Ｌ＝腰部領域。

【図30A-30B】脊髄領域ごとに分けられた、ＤＲＧ病的状態の重症度に対する動物の特徴の効果を示す。（図３０Ａ）注射時の動物の年齢が異なる、および（図３０Ｂ）動物の性別が異なる（アカゲザルのみ）、ＤＲＧ（黒色）および背側脊髄（ＳＣ）軸索（灰色）領域における平均病理学的スコア。平均の標準誤差を伴う平均結果、表は、各群における動物の数（ｎ）およびスコアリングされた組織学的切片の数（カウント）を示す。Ｃ＝頸部、Ｔ＝胸部、Ｌ＝腰部領域。

【図31A-31C】脊髄領域ごとに分けられた、ＤＲＧ病的状態の重症度に対するベクターの特徴の効果を示す。異なる（図３１Ａ）カプシド、（図３１Ｂ）プロモーター、および（図３１Ｃ）導入遺伝子による、ＤＲＧ（黒色）および背側脊髄（ＳＣ）軸索（灰色）領域における平均病理学的スコア。導入遺伝子は、ＳＣ病的状態の重症度に基づいて、１～２０に並べられた。平均の標準誤差を伴う平均結果、表は、各群における動物の数（ｎ）およびスコアリングされた組織学的切片の数（カウント）を示す。Ｃ＝頸部、Ｔ＝胸部、Ｌ＝腰部領域。

【発明を実施するための形態】

【0015】

ヒト対象へのヒトアルファ－Ｌ－イズロニダーゼ（ｈＩＤＵＡ）遺伝子の送達のための発現カセットおよび複製欠損アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）が本明細書に提供される。ｈＩＤＵＡ遺伝子を送達するために使用される組換えＡＡＶ（「ｒＡＡＶ」）ベクター（「ｒＡＡＶ．ｈＩＤＵＡ」）は、ＣＮＳに対して向性を有し（例えば、ＡＡＶｈｕ６８カプシドを有するｒＡＡＶ）、ｈＩＤＵＡ導入遺伝子は、特異的発現制御エレメント（例
えば、ＣＢ７、サイトメガロウイルスエンハンサーエレメントを有するニワトリβ－アクチンプロモーター）によって制御される。特定の実施形態では、生理学的に適合する水性緩衝液、界面活性剤、および任意選択的な賦形剤を含む製剤緩衝液中に発現カセットまたはｒＡＡＶ．ｈＩＤＵＡベクターの懸濁液を含む、髄腔内、槽内、および全身投与に好適な薬学的組成物が提供される。

【0016】

特定の態様では、本明細書で提供される組成物および方法は、導入遺伝子発現が、ベクターゲノムまたは発現カセット中にｍｉＲＮＡ標的配列を含むことによってＤＲＧニューロン中で抑制される、機能的ｈＩＤＵＡの送達のための療法に有用である。本明細書で使用される場合、「抑制される」および「抑制」という用語は、導入遺伝子発現の部分的な低減、または完全な消滅、またはサイレンシングを含む。導入遺伝子発現は、選択された導入遺伝子に好適なアッセイを使用して評価されてもよい。提供される組成物および方法は、神経変性、二次背側脊髄軸索変性、および／または単核細胞浸潤によって特徴付けられるＤＲＧの毒性を減少させる。特定の実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムは、遺伝子産物コード配列の３’側の非翻訳領域（ＵＴＲ）に、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含む。好適には、２つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列がタンデムで提供され、任意選択的に、スペーサー配列によって分離される。特定の実施形態では、３個以上のｍｉＲＮＡ標的配列がタンデムで提供され、任意選択的に、スペーサー配列によって分離される。特定の実施形態では、８個のｍｉＲＮＡ標的配列がタンデムで提供され、任意選択的に、スペーサー配列によって分離される。

【0017】

本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、ＭＰＳＩ、ならびに／またはＨｕｒｌｅｒおよび／もしくはＨｕｒｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｅおよび／もしくはＳｃｈｅｉｅ症候群の症状のうちの１つ以上を緩和または治療するのに十分な量の酵素を標的細胞に送達し、発現させる、組成物（例えば、ｒＡＡＶ．ｈＩＤＵＡ組成物）の量を指す。「治療」は、ＭＰＳＩ症候群のうちの１つの症状の悪化の予防、および可能であればそれらの症状のうちの１つ以上の逆転を含み得る。治療効果（有効性）を評価する方法を、以下に詳細に記載する。ヒト患者についての「治療有効量」は、動物モデルに基づいて予測されてもよい。好適なネコモデルおよび好適なイヌモデルの例は、以前に記載されている。Ｃ．Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１４）；２２ １２，２０１８－２０２７、Ａ．Ｂｒａｄｂｕｒｙ，ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｍａｒｃｈ ２０１５，２６（１）：２７－３７（これらは参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。イヌモデルに関して、イヌモデルは、典型的には、イヌにおける静脈内投与が、ヒトＩＤＵＡに対する強力で持続的な抗体応答を誘発することが観察されているが、一方、ヒト患者では、投与は良好に耐容性であるため、免疫抑制された動物モデル、または耐容性化された動物である。これらのモデルでは、特定の症状の逆転が観察される場合があり、および／または特定の症状の進行の予防が観察される場合がある。例えば、角膜混濁の補正が観察される場合があり、および／または中枢神経系（ＣＮＳ）における病変の補正が観察され、ならびに／または血管周囲および／もしくは髄膜のｇａｇ貯蔵の逆転が観察される。

【0018】

治療の目標は、疾患を治療するための実行可能なアプローチとして、患者のアルファ－Ｌ－イズロニダーゼ欠損をｒＡＡＶベースのＣＮＳ指向性遺伝子療法によって機能的に補充することである。本明細書に記載のｒＡＡＶベクターから発現される場合、ＣＳＦ、血清、ニューロン、または他の組織もしくは流体で検出される正常レベルの少なくとも約２％の発現レベルは、治療効果を提供し得る。しかし、より高い発現レベルが成し遂げられ得る。そのような発現レベルは、正常な機能的ヒトＩＤＵＡレベルの２％～約１００％であり得る。特定の実施形態では、正常な発現レベルより高いレベルが、ＣＳＦ、血清、または他の組織もしくは流体で検出され得る。

【0019】

本明細書で使用される場合、「ＮＡｂ力価」という用語は、その標的化エピトープ（例えば、ＡＡＶ）の生理学的効果を中和する中和抗体（例えば、抗ＡＡＶ Ｎａｂ）がどれほど多く産生されるかの尺度である。抗－ＡＡＶ ＮＡｂ力価は、例えば、Ｃａｌｃｅｄｏ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２００９．１９９（３）：ｐ．３８１－３９０に記載されているように測定され得、それは参照により本明細書に組み込まれる。

【0020】

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、他の構成要素または方法ステップを含むことを意味する用語である。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が使用される場合、関連する実施形態は、他の構成要素または方法ステップを除外する「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語、および実施形態または発明の性質を実質的に変化させるいずれの構成要素または方法ステップを除外する「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ
ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語を使用する説明が含まれることを理解されたい。本明細書の様々な実施形態は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉を用いて示されているが、様々な状況下では、関連する実施形態は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という言葉を使用して記載されることも理解されるべきである。

【0021】

「ａ」または「ａｎ」という用語は、１つ以上を指し、例えば、「ベクター（ａ ｖｅｃｔｏｒ）」は、１つ以上のベクターを表すことを留意されたい。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、および「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という用語は、本明細書では互換的に使用される。

【0022】

本明細書で使用される場合、「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、別途指定されない限り、与えられた参照からプラスまたはマイナス１０％の可変性を意味する。

【0023】

ヒトアルファ－Ｌ－イズロニダーゼ（ｈＩＤＵＡ）
本明細書で使用される場合、「ヒトアルファ－Ｌ－イズロニダーゼ」または「ｈＩＤＵＡ」という用語は、ヒトアルファ－Ｌ－イズロニダーゼ酵素を指すために互換的に使用される。ギリシャ文字「アルファ」および記号「α」は、本明細書全体で互換的に使用されることが理解されるであろう。本明細書で使用される場合、ｈＩＤＵＡは、天然（野生型）ｈＩＤＵＡタンパク質、およびさらに本明細書で提供される核酸配列から発現されるバリアントｈＩＤＵＡタンパク質、または組成物で送達される場合、もしくは本明細書で提供される方法によって、所望の機能を回復し、症状を緩和し、ＭＰＳＩ、Ｈｕｒｌｅｒ、および／またはＨｕｒｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｅおよび／またはＳｃｈｅｉｅ症候群のうちの１つ以上と関連する症状を改善する、それらの機能的断片を指す。

【0024】

「ヒトアルファ－Ｌ－イズロニダーゼ」または「ｈＩＤＵＡ」は、例えば、本明細書に記載される全長タンパク質（シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を含む）、成熟タンパク質、バリアントタンパク質、またはそれらの機能的断片であり得る。本明細書で使用される場合、「機能的ｈＩＤＵＡ」という用語は、全長天然（野生型）タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２１およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号：Ｐ３５４７５－１に示される）を有する酵素、それらのバリアント（本明細書に記載されるものを含む）、保存的アミノ酸置き換えを有するそれらの変異体、それらの断片、バリアントと保存的アミノ酸置き換えを有する変異体との任意の組み合わせの全長または断片を指し、天然（野生型）ｈＩＤＵＡの生物学的活性レベルの少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも
約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくともほぼ同じ、または１００％より大きな生物学的活性レベルを提供する。特定の実施形態では、機能的ｈＩＤＵＡは、天然ｈＩＤＵＡの基質結合領域（アミノ酸３０５および３０６）を含む。ｈＩＤＵＡのいくつかの天然に存在する機能的多型（バリアント）が記載されており、本発明の範囲内に包含され得る。このようなバリアントが記載されており、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ ２０１４／１５１３４１、および例えば、これも参照により本明細書に組み込まれるＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ；ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ３５４７５を参照されたい。

【0025】

ヒトアルファ－Ｌ－イズロニダーゼ－（配列番号２１）（シグナルペプチド－アミノ酸１～２７）

【表1】

【0026】

天然ヒトＩＤＵＡコード配列（配列番号２０）（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０００２０３．５）；（シグナルペプチド－ヌクレオチド１～８１）ａｔｇｃｇｔｃｃｃｃｔｇｃｇ
ｃｃｃｃｃｇｃｇｃｃｇｃｇｃｔｇｃｔｇｇｃｇｃｔｃｃｔｇｇｃｃｔｃｇｃｔｃｃｔｇｇｃｃｇｃｇｃｃｃｃｃｇｇｔｇｇｃｃｃｃｇｇｃｃｇａｇｇｃｃｃｃｇｃａｃｃｔｇｇｔｇｃａｔｇｔｇｇａｃｇｃｇｇｃｃｃｇｃｇｃｇｃｔｇｔｇｇｃｃｃｃｔｇｃｇｇｃｇｃｔｔｃｔｇｇａｇｇａｇｃａｃａｇｇｃｔｔｃｔｇｃｃｃｃｃｃｇｃｔｇｃｃａｃａｃａｇｃｃａｇｇｃｔｇａｃｃａｇｔａｃｇｔｃｃｔｃａｇｃｔｇｇｇａｃｃａｇｃａｇｃｔｃａａｃｃｔｃｇｃｃｔａｔｇｔｇｇｇｃｇｃｃｇｔｃｃｃｔｃａｃｃｇｃｇｇｃａｔｃａａｇｃａｇｇｔｃｃｇｇａｃｃｃａｃｔｇｇｃｔｇｃｔｇｇａｇｃｔｔｇｔｃａｃｃａｃｃａｇｇｇｇｇｔｃｃａｃｔｇｇａｃｇｇｇｇｃｃｔｇａｇｃｔａｃａａｃｔｔｃａｃｃｃａｃｃｔｇｇａｃｇｇｇｔａｃｃｔｇｇａｃｃｔｔｃｔｃａｇｇｇａｇａａｃｃａｇｃｔｃｃｔｃｃｃａｇｇｇｔｔｔｇａｇｃｔｇａｔｇｇｇｃａｇｃｇｃｃｔｃｇｇｇｃｃａｃｔｔｃａｃｔｇａｃｔｔｔｇａｇｇａｃａａｇｃａｇｃａｇｇｔｇｔｔｔｇａｇｔｇｇａａｇｇａｃｔｔｇｇｔｃｔｃｃａｇｃｃｔｇｇｃｃａｇｇａｇａｔａｃａｔｃｇｇｔａｇｇｔａｃｇｇａｃｔｇｇｃｇｃａｔｇｔｔｔｃｃａａｇｔｇｇａａｃｔｔｃｇａｇａｃｇｔｇｇａａｔｇａｇｃｃａｇａｃｃａｃｃａｃｇａｃｔｔｔｇａｃａａｃｇｔｃｔｃｃａｔｇａｃｃａｔｇｃａａｇｇｃｔｔｃｃｔｇａａｃｔａｃｔａｃｇａｔｇｃｃｔｇｃｔｃｇｇａｇｇｇｔｃｔｇｃｇｃｇｃｃｇｃｃａｇｃｃｃｃｇｃｃｃｔｇｃｇｇｃｔｇｇｇａｇｇｃｃｃｃｇｇｃｇａｃｔｃｃｔｔｃｃａｃａｃｃｃｃａｃｃｇｃｇａｔｃｃｃｃｇｃｔｇａｇｃｔｇｇｇｇｃｃｔｃｃｔｇｃｇｃｃａｃｔｇｃｃａｃｇａｃｇｇｔａｃｃａａｃｔｔｃｔｔｃａｃｔｇｇｇｇａｇｇｃｇｇｇｃｇｔｇｃｇｇｃｔｇｇａｃｔａｃａｔｃｔｃｃｃｔｃｃａｃａｇｇａａｇｇｇｔｇｃｇｃｇｃａｇｃｔｃｃａｔｃｔｃｃａｔｃｃｔｇｇａｇｃａｇｇａｇａａｇｇｔｃｇｔｃｇｃｇｃａｇｃａｇａｔｃｃｇｇｃａｇｃｔｃｔｔｃｃｃｃａａｇｔｔｃｇｃｇｇａｃａｃｃｃｃｃａｔｔｔａｃａａｃｇａｃｇａｇｇｃｇｇａｃｃｃｇｃｔｇｇｔｇｇｇｃｔｇｇｔｃｃｃｔｇｃｃａｃａｇｃｃｇｔｇｇａｇｇｇｃｇｇａｃｇｔｇａｃｃｔａｃｇｃｇｇｃｃａｔｇｇｔｇｇｔｇａａｇｇｔｃａｔｃｇｃｇｃａｇｃａｔｃａｇａａｃｃｔｇｃｔａｃｔｇｇｃｃａａｃａｃｃａｃｃｔｃｃｇｃｃｔｔｃｃｃｃｔａｃｇｃｇｃｔｃｃｔｇａｇｃａａｃｇａｃａａｔｇｃｃｔｔｃｃｔｇａｇｃｔａｃｃａｃｃｃｇｃａｃｃｃｃｔｔｃｇｃｇｃａｇｃｇｃａｃｇｃｔｃａｃｃｇｃｇｃｇｃｔｔｃｃａｇｇｔｃａａｃａａｃａｃｃｃｇｃｃｃｇｃｃｇｃａｃｇｔｇｃａｇｃｔｇｔｔｇｃｇｃａａｇｃｃｇｇｔｇｃｔｃａｃｇｇｃｃａｔｇｇｇｇｃｔｇｃｔｇｇｃｇｃｔｇｃｔｇｇａｔｇａｇｇａｇｃａｇｃｔｃｔｇｇｇｃｃｇａａｇｔｇｔｃｇｃａｇｇｃｃｇｇｇａｃｃｇｔｃｃｔｇｇａｃａｇｃａａｃｃａｃａｃｇｇｔｇｇｇｃｇｔｃｃｔｇｇｃｃａｇｃｇｃｃｃａｃｃｇｃｃｃｃｃａｇｇｇｃｃｃｇｇｃｃｇａｃｇｃｃｔｇｇｃｇｃｇｃｃｇｃｇｇｔｇｃｔｇａｔｃｔａｃｇｃｇａｇｃｇａｃｇａｃａｃｃｃｇｃｇｃｃｃａｃｃｃｃａａｃｃｇｃａｇｃｇｔｃｇｃｇｇｔｇａｃｃｃｔｇｃｇｇｃｔｇｃｇｃｇｇｇｇｔｇｃｃｃｃｃｃｇｇｃｃｃｇｇｇｃｃｔｇｇｔｃｔａｃｇｔｃａｃｇｃｇｃｔａｃｃｔｇｇａｃａａｃｇｇｇｃｔｃｔｇｃａｇｃｃｃｃｇａｃｇｇｃｇａｇｔｇｇｃｇｇｃｇｃｃｔｇｇｇｃｃｇｇｃｃｃｇｔｃｔｔｃｃｃｃａｃｇｇｃａｇａｇｃａｇｔｔｃｃｇｇｃｇｃａｔｇｃｇｃｇｃｇｇｃｔｇａｇｇａｃｃｃｇｇｔｇｇｃｃｇｃｇｇｃｇｃｃｃｃｇｃｃｃｃｔｔａｃｃｃｇｃｃｇｇｃｇｇｃｃｇｃｃｔｇａｃｃｃｔｇｃｇｃｃｃｃｇｃｇｃｔｇｃｇｇｃｔｇｃｃｇｔｃｇｃｔｔｔｔｇｃｔｇｇｔｇｃａｃｇｔｇｔｇｔｇｃｇｃｇｃｃｃｃｇａｇａａｇｃｃｇｃｃｃｇｇｇｃａｇｇｔｃａｃｇｃｇｇｃｔｃｃｇｃｇｃｃｃｔｇｃｃｃｃｔｇａｃｃｃａａｇｇｇｃａｇｃｔｇｇｔｔｃｔｇｇｔｃｔｇｇｔｃｇｇａｔｇａａｃａｃｇｔｇｇｇｃｔｃｃａａｇｔｇｃｃｔｇｔｇｇａｃａｔａｃｇａｇａｔｃｃａｇｔｔｃｔｃｔｃａｇｇａｃｇｇｔａａｇｇｃｇｔａｃａｃｃｃｃｇｇｔｃａｇｃａｇｇａａｇｃｃａｔｃｇａｃｃｔｔｃａａｃｃｔｃｔｔｔｇｔｇｔｔｃａｇｃｃｃａｇａｃａｃａｇｇｔｇｃｔｇｔｃｔｃｔｇｇｃｔｃｃｔａｃｃｇａｇｔｔｃｇａｇｃｃｃｔｇｇａｃｔａｃｔｇｇｇｃｃｃｇａｃｃａｇｇｃｃｃｃｔｔｃｔｃｇｇａｃｃｃｔｇｔｇｃｃｇｔａｃｃｔｇｇａｇｇｔｃｃｃｔｇｔｇｃｃａａｇａｇｇｇｃｃｃｃｃａｔｃｃｃｃｇｇｇｃａａｔｃｃａｔｇａ

【0027】

配列番号２０の全長天然ｈＩＤＵＡの番号付けに関して、アミノ酸１位～２７位にシグナルペプチドが存在し、成熟タンパク質は、アミノ酸２８～６５３を含む。本明細書で使用される場合、「シグナルペプチド」は、新たに合成されるタンパク質のＮ末端に存在する短いペプチド（通常は約１６～３５アミノ酸）を指す。シグナルペプチド、および場合によっては、そのようなペプチドをコードする核酸配列は、シグナル配列、標的化シグナル、局在化シグナル、局在化配列、トランジットペプチド、リーダー配列、またはリーダーペプチドと呼ばれることもある。特定の実施形態では、ｈＩＤＵＡは、成熟タンパク質（シグナルペプチド配列を欠く）である。

【0028】

本明細書に記載されるように、ｈＩＤＵＡは、天然シグナルペプチド（すなわち、配列番号２１のアミノ酸１～２７）、または代替的に、異種シグナルペプチドを含み得る。特定の実施形態では、ｈＩＤＵＡは、異種シグナルペプチドを含む。特定の実施形態では、このような異種シグナルペプチドは、好ましくはヒト由来であり、例えば、ＩＬ－２シグナルペプチドを含み得る。特定の実施形態で動作可能な特定の異種シグナルペプチドとしては、キモトリプシノーゲンＢ２由来のアミノ酸１～２０、ヒトアルファ－１－アンチトリプシンのシグナルペプチド、イズロン酸－２－スルファターゼ由来のアミノ酸１～２５、およびプロテアーゼＣＩ阻害剤由来のアミノ酸１～２３が挙げられる。例えば、ＷＯ２０１８／０４６７７４を参照されたい。他のシグナル／リーダーペプチドは、とりわけ、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ１２、ＩＬ１８など）、インスリン、アルブミン、β－グルクロニダーゼ、オンコスタチン、アルカリプロテアーゼ、またはフィブロネクチン分泌シグナルペプチドに天然に見出されてもよい。また、例えば、ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ．ｄｅ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｍ＝ｌｉｓｔｓｐｄｂ＿ｍａｍｍａｌｉａを参照されたい。このようなキメラｈＩＤＵＡは、天然シグナルペプチドの代わりに異種リーダーを有し得る。任意選択的に、ｈＩＤＵＡ酵素のＮ末端トランケーションは、シグナルペプチドの一部分のみ（例えば、約２～約２５個のアミノ酸、もしくはその間の値のアミノ酸の欠失）、シグナルペプチド全体、またはシグナルペプチドよりも長い断片（例えば、配列番号２１の番号付けに基づいて最大７０個のアミノ酸を欠いていてもよい。任意選択的に、そのような酵素は、約５、１０、１５、または２０アミノ酸長のＣ末端トランケーションを含有してもよい。

【0029】

特定の実施形態では、配列番号２１の全長（アミノ酸１～６５３）に対して少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％同一である配列を有するｈＩＤＵＡを選択してもよい。特定の実施形態では、配列番号２１の成熟タンパク質（アミノ酸２８～６５３）に対して少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％同一である配列が提供される。特定の実施形態では、全長（アミノ酸１～６５３）または成熟タンパク質（アミノ酸３２～６５３）のいずれかのｈＩＤＵＡに対して少なくとも９５％～少なくとも９９％の同一性を有する配列は、適切な動物モデルで試験される場合に、参照（すなわち、天然）ｈＩＤＵＡよりも改善された生物学的効果およびより良好な安全プロファイルを有することを特徴とする。特定の実施形態では、ｈＩＤＵＡ酵素は、ｈＩＤＵＡアミノ酸配列の指定された位置に修飾を含有する。

【0030】

本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置き換え」または「保存的アミノ酸置換」は、当業者によって知られている、類似の生化学的特性（例えば、電荷、疎水性、およびサイズ）を有する異なるアミノ酸へのアミノ酸の変更、置き換え、または置換を指す。また、例えば、ＦＲＥＮＣＨ ｅｔ ａｌ．Ｗｈａｔ ｉｓ ａ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ？Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｍａｒｃｈ １９８３，Ｖｏｌｕｍｅ １９，Ｉｓｓｕｅ ２，ｐｐ １７１－１７５ ａｎｄ ＹＡＭＰＯＬＳＫＹ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｅｘｃｈａｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２００５ Ａｕｇ；１７０（４）：１４５９－１４７２を参照されたい（その各々
は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0031】

一態様では、機能的ｈＩＤＵＡタンパク質をコードする、核酸配列、ならびに例えば、この核酸配列を含む発現カセットおよびベクターが本明細書で提供される。一実施形態では、核酸配列は、配列番号２０で再現される野生型コード配列である。さらなる実施形態では、核酸配列は、配列番号２０の野生型ｈＩＤＵＡ配列に対して少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％同一であり、機能的ｈＩＤＵＡをコードする。

【0032】

本明細書で使用される場合、「核酸」は、ヌクレオチドのポリマー形態を指し、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ならびに上述の合成形態および混合ポリマーを含む。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、またはいずれかの種類のヌクレオチド（例えば、ペプチド核酸オリゴマー）の修飾形態を指す。この用語はまた、一本鎖形態および二本鎖形態のＤＮＡも含む。当業者は、これらの核酸分子の機能的バリアントが本明細書に記載されていることを理解するであろう。機能的バリアントは、標準的な遺伝子コードを使用して直接的に翻訳され、親核酸分子から翻訳されたものと同一のアミノ酸配列を提供することができる核酸配列である。

【0033】

特定の実施形態では、本明細書に記載の機能的ｈＩＤＵＡをコードする核酸分子、および他の構築物は、発現カセットおよびベクターゲノムを生成するのに有用であり、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）における発現のために操作され得る。方法は既知であり、以前に記載されている（例えば、ＷＯ９６／０９３７８）。野生型配列と比較して少なくとも１つの好ましくないコドンが、より好ましいコドンによって置き換えられる場合、配列は、操作されたものとみなされる。本明細書において、好ましくないコドンは、同じアミノ酸をコードする別のコドンよりも生物において使用される頻度が低いコドンであり、より好ましいコドンは、好ましくないコドンよりも生物において使用される頻度が高いコドンである。特定の生物のコドン使用頻度は、コドン頻度表、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎのコドン頻度表に見出すことができる。好ましくは、１つより多い好ましくないコドン、好ましくは、大部分またはすべての好ましくないコドンは、より好ましいコドンによって置き換えられる。好ましくは、生物において最も頻繁に使用されるコドンは、操作された配列で使用される。好ましいコドンによる置き換えは、一般に、より高い発現をもたらす。また、遺伝子コードの縮重の結果として、多数の異なる核酸分子が同じポリペプチドをコードすることができることも当業者によって理解されるであろう。また、当業者は、日常的な技術を使用して、ポリペプチドが発現される任意の特定の宿主生物のコドン使用を反映するために、核酸分子によってコードされるアミノ酸配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を行ってもよいことも理解される。したがって、別途指定されない限り、「アミノ酸配列をコードする核酸配列」は、互いに縮重態様であり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。核酸配列は、日常的な分子生物学技術を使用してクローニングすることができ、またはＤＮＡ合成によってデノボで生成することができ、このことは、ＤＮＡ合成および／または分子クローニングの分野で事業を有するサービス企業（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）によって日常的な手順を使用して行うことができる。

【0034】

特定の実施形態では、本明細書に記載の核酸、発現カセット、ベクターゲノムは、操作された配列であるｈＩＤＵＡコード配列を含む。特定の実施形態では、操作された配列は、対象における産生、転写、発現、または安全性を改善するのに有用である。特定の実施形態では、操作された配列は、得られる治療用組成物または治療の有効性を増加させるのに有用である。さらなる実施形態では、操作された配列は、発現される機能的ｈＩＤＵＡタンパク質の有効性を増加させるのに有用であり、また、機能的ｈＩＤＵＡを送達する治
療試薬の用量を下げることを可能にし得る。特定の実施形態では、操作されたｈＩＵＤＡコード配列は、野生型ｈＩＤＵＡコード配列と比較して、改善された翻訳を特徴とする。

【0035】

「操作された」とは、本明細書に記載の機能的ｈＩＤＵＡ酵素をコードする核酸配列が組み立てられ、任意の好適な遺伝子エレメント、例えば、裸のＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソームなどに配置され、それらは、例えば、非ウイルス送達系（例えば、ＲＮＡベースの系、裸のＤＮＡなど）を生成するために、またはパッケージング宿主細胞中でウイルスベクターを生成するために、および／または対象の宿主細胞への送達のために、その上に担持されるｈＩＤＵＡ配列を宿主細胞へと導入することを意味する。特定の実施形態では、遺伝子エレメントは、ベクターである。一実施形態では、遺伝子エレメントは、プラスミドである。かかる操作された構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作の技術者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、および合成技術を含む。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。

【0036】

核酸配列の文脈における「同一性パーセント（％）」、「配列同一性」、「配列同一性パーセント」、または「同一なパーセント」という用語は、対応するようにアラインメントさせたときに同じである２つの配列中の残基を指す。配列同一性比較の長さは、構築物の全長、遺伝子コード配列の全長、または少なくとも約５００～１０００個のヌクレオチドの断片にわたるものであってもよい。しかしながら、例えば、少なくとも約９個のヌクレオチド、通常は少なくとも約２０～２４個のヌクレオチド、少なくとも約２８～３２個のヌクレオチド、少なくとも約３６個以上のヌクレオチドを有する、より小さな断片間の同一性も望ましい場合がある。

【0037】

同一性パーセントは、タンパク質の全長、ポリペプチド、約１００個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸、もしくはそのペプチド断片にわたるアミノ酸配列、または対応する核酸配列コード配列について容易に決定され得る。好適なアミノ酸断片は、長さが少なくとも約８個のアミノ酸であってもよく、最大で約５０個のアミノ酸であってもよい。一般に、２つの異なる配列間の「同一性」、「相同性」、または「類似性」について言及する場合、「同一性」、「相同性」、または「類似性」は、「アラインメントされた」配列を参照して決定される。「アラインメントされた」配列または「アラインメント」とは、複数の核酸配列またはタンパク質（アミノ酸）配列を指し、参照配列と比較して、多くの場合、欠損または追加の塩基またはアミノ酸についての補正を含む。

【0038】

同一性は、配列のアラインメントを調製することによって、当該技術分野で既知のまたは市販の様々なアルゴリズムおよび／またはコンピュータプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＥｘＰＡＳｙ；Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ；ＦＡＳＴＡ；例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用する）によって決定され得る。アラインメントは、公共のまたは市販のいずれかの様々な多重配列アラインメントプログラムを用いて行われる。例えば、「Ｃｌｕｓｔａｌ
Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」、および「Ｍａｔｃｈ－Ｂｏｘ」プログラムなどの配列アラインメントプログラムが、アミノ酸配列に対して利用可能である。一般に、これらのプログラムのいずれかがデフォルト設定で使用されるが、必要に応じて、当業者は、これらの設定を変更することができる。代替的に、当業者は、別のアルゴリズムまたはコンピュータプログラムを利用することができ、参照のアルゴリズムおよびプログラムによって提供されるように、少なくとも同一性のレベルまたはアラインメントが提供される。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，“
Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２－２６９０（１９９９）を参照されたい。

【0039】

配列に関しての同一性または類似性は、本明細書では、最大配列同一性パーセントを達成するように配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入した後の、本明細書で提供されるペプチドおよびポリペプチド領域と同一（すなわち、同じ残基）または類似（すなわち、共通の側鎖特性に基づく同じ群からのアミノ酸残基、下記を参照されたい）である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。同一性パーセント（％）は、それらのヌクレオチドまたはアミノ酸配列をそれぞれ比較することにより決定されるような、２つのポリヌクレオチド間または２つのポリペプチド間の関係の尺度である。一般に、比較される２つの配列は、配列間に最大の相関を与えるようにアラインメントされる。２つの配列のアラインメントが調べられ、２つの配列間の正確なアミノ酸またはヌクレオチド対応を与える位置の数が決定され、アラインメントの全長によって除算され、それに１００を掛けることにより、同一性％の数字を得る。この同一性％の数字は、比較されるべき配列の全長にわたって決定されてもよく、これは、同じまたは非常に類似した長さの配列に特に適切であり、かつ高度に相同であり、またはこの同一性％の数字は、より短い定義された長さにわたって決定されてもよく、これは、長さが等しくない配列により適切であり、もしくはより低いレベルの相同性を有する。多数のアルゴリズム、およびそれらに基づくコンピュータプログラムが存在し、それらは、文献で使用されるために入手可能であり、および／またはアラインメントおよび同一性パーセントを実行するために公的または商業的に入手可能である。アルゴリズムまたはプログラムの選択は、本発明を限定しない。

【0040】

適切なアラインメントプログラムの例は、例えば、Ｕｎｉｘに基づき、次いで、ＢｉｏｅｄｉｔプログラムにインポートされるソフトウェアＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｈａｌｌ，Ｔ．Ａ．１９９９，ＢｉｏＥｄｉｔ：ａ ｕｓｅｒ－ｆｒｉｅｎｄｌｙ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｅｄｉｔｏｒ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ
ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ ９５／９８／ＮＴ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．４１：９５－９８）、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン９．１（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２：３８７－３９５，１９８４，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡから入手可能）を含む。プログラムＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰは、２つのポリヌクレオチド間の同一性％および２つのポリペプチド配列間の同一性％を決定するために使用されてもよい。

【0041】

配列間の同一性および／または類似性を決定するための他のプログラムは、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢ）、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，ＵＳＡから入手可能であり、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）でＮＣＢＩのホームページによってアクセス可能である、ＢＬＡＳＴファミリーのプログラム、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）を含む。アミノ酸配列を比較するためのＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０残基重量表、ギャップ長さペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を用いることができる、ならびにＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ Ｗ．Ｒ．およびＬｉｐｍａｎ Ｄ．Ｊ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：２４４４－２４４８、１９８８、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ配列分析パッケージの一部として入手可能）。ＳｅｑＷｅｂソフトウェア（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージに対するウェブに基づくインターフェース：Ｇａｐプログラム）。

【0042】

特定の実施形態では、ｈＩＤＵＡコード配列は、配列番号２０の天然ｈＩＤＵＡ配列に対して８０％未満同一であり、配列番号２１のアミノ酸配列をコードする。さらなる実施形態では、ｈＩＤＵＡコード配列は、配列番号２０のヌクレオチド（ｎｔ）８８～１９５９に対して８０％未満同一である配列を含み、配列番号２１のアミノ酸２８～６３５をコードする。

【0043】

特定の実施形態では、ｈＩＤＵＡコード配列は、天然ｈＩＤＵＡコード配列（配列番号２０）と、約９９％未満、約９８％未満、約９７％未満、約９６％未満、約９５％未満、約９４％未満、約９３％未満、約９２％未満、約９１％未満、約９０％未満、約８９％未満、約８８％未満、約８７％未満、約８６％未満、約８５％未満、約８４％未満、約８３％未満、約８２％未満、約８１％未満、約８０％未満、約７９％未満、約７８％未満、約７７％未満、約７６％未満、約７５％未満、約７４％未満、約７３％未満、約７２％未満、約７１％未満、約７０％未満、約６９％未満、約６８％未満、約６７％未満、約６６％未満、約６５％未満、約６４％未満、約６３％未満、約６２％未満、約６１％未満を共有するか、または天然ｈＩＤＵＡコード配列（配列番号２０）との同一性を有する。他の実施形態では、ｈＩＤＵＡコード配列は、天然ｈＩＤＵＡコード配列（配列番号２０）と、約９９％、約９８％、約９７％、約９６％、約９５％、約９４％、約９３％、約９２％、約９１％、約９０％、約８９％、約８８％、約８７％、約８６％、約８５％、約８４％、約８３％、約８２％、約８１％、約８０％、約７９％、約７８％、約７７％、約７６％、約７５％、約７４％、約７３％、約７２％、約７１％、約７０％、約６９％、約６８％、約６７％、約６６％、約６５％、約６４％、約６３％、約６２％、約６１％、またはそれ以下の同一性を共有する。特定の実施形態では、ｈＩＤＵＡコード配列は、配列番号２０に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一であり、機能的ヒトアルファ－Ｌ－イズロニダーゼをコードする。さらなる実施形態では、ｈＩＤＵＡコード配列は、配列番号２３、２４、２５、２６、または２７に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一であり、機能的ヒトアルファ－Ｌ－イズロニダーゼをコードする。

【0044】

同一性は、全長ｈＩＤＵＡ（例えば、配列番号２０のｎｔ１～ｎｔ１９５９）をコードする配列に関するものであってもよく、または成熟ｈＩＤＵＡ（例えば、配列番号２０のｎｔ８２～ｎｔ１９５９）をコードする配列に関するものであってもよい。特定の実施形態では、全長ｈＩＤＵＡは、配列番号２０の約１～約８１に対応する、ヒトアルファ－Ｌ－イズロニダーゼ（すなわち、配列番号２１の１～約２７のアミノ酸をコードする）のリーダーペプチド配列を含む。別の実施形態では、ｈＩＤＵＡ遺伝子は、機能的アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ酵素の分泌部分（すなわち、配列番号２１の約２８～約６５３のアミノ酸）または本明細書で特定されるその機能的バリアントに融合された異種リーダー配列を含む合成ペプチドである機能的合成ヒトアルファ－Ｌ－イズロニダーゼ酵素をコードする。なお別の実施形態では、ｈＩＤＵＡ遺伝子は、配列番号２１の機能的合成ヒトアルファ－Ｌ－イズロニダーゼ酵素をコードし、リーダー配列は、配列番号２１のアミノ酸１～２７をコードする配列番号２０のヌクレオチド１～８１によってコードされ、アミノ酸２８～６５３は、配列番号２０のヌクレオチド８２～１９５９に対して少なくとも８５％、
９５％、もしくは９９％同一である配列、または配列番号２２のヌクレオチド８２～１９５９に対して少なくとも８５％、９５％、もしくは９９％同一である配列によってコードされる。特定の実施形態では、ｈＩＤＵＡコード配列は、配列番号２０のｎｔ１～１９５９、または全長ｈＩＤＵＡをコードする、それに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくは９９％同一の配列を含む。特定の実施形態では、ｈＩＤＵＡコード配列は、配列番号２０のｎｔ８２～ｎｔ１９５９、または機能的ｈＩＤＵＡをコードする、それに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくは９９％同一の配列を含む。特定の実施形態では、ｈＩＤＵＡコード配列は、配列番号２３、２４、２５、または２６のｎｔ１～１９５９、または全長ｈＩＤＵＡをコードする、それに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくは９９％同一の配列を含む。特定の実施形態では、ｈＩＤＵＡコード配列は、配列番号２３、２４、２５、または２６のｎｔ８２～ｎｔ１９５９、または成熟ｈＩＤＵＡ（例えば、配列番号２１のアミノ酸２７～６５３）をコードする、それに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくは９９％同一の配列を含む。

【0045】

さらなる実施形態では、ｈＩＤＵＡコード配列は、配列番号２２、２３、２４、２５、または２６を含む。

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【表2-4】

【表2-5】

【0046】

本明細書で使用される場合、「所望の機能」は、健常な対照の少なくとも約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％のｈＩＤＵＡ酵素活性を指す。

【0047】

本明細書で使用される場合、「症状を緩和する」および「症状を改善する」という語句
、ならびにそれらの文法的変形語は、ＭＰＳＩ、Ｈｕｒｌｅｒ、および／またはＨｕｒｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｅおよび／またはＳｃｈｅｉｅ症候群に関連する症状の逆転、ＭＰＳＩ、Ｈｕｒｌｅｒ、および／またはＨｕｒｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｅおよび／またはＳｃｈｅｉｅ症候群に関連する症状の進行の減速または予防を指す。特定の実施形態では、緩和または改善は、投与前または使用前と比較して、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％減少する、記載された組成物の投与または記載された方法の使用後の患者の症状の総数を指す。別の実施形態では、緩和または改善は、投与前または使用前と比較して、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％減少する、記載された組成物の投与または記載された方法の使用後の症状の重症度または進行を指す。

【0048】

本明細書に記載の機能的ｈＩＤＵＡまたはｈＩＤＵＡコード配列における組成物が、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態、および方法に適用されるように意図されることを理解されたい。

【0049】

発現カセット
特定の実施形態では、機能的ｈＩＤＵＡをコードする核酸配列と、その発現を指示する調節配列とを有する、発現カセットが本明細書に提供される。本明細書で使用される場合、「発現カセット」は、ｈＩＤＵＡ遺伝子をコードする配列（プロモーター）を含む核酸配列を指し、それらのための他の調節配列を含んでもよく、そのカセットは、遺伝子エレメント（例えば、プラスミド）によりパッケージング宿主細胞に送達され、ウイルスベクターのカプシド（例えば、ウイルス粒子）内にパッケージングされてもよい。典型的に、ウイルスベクターを産生するためのそのような発現カセットは、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルに隣接する本明細書に記載のｈＩＤＵＡコード配列と、本明細書に記載されるものなどの他の発現制御配列とを含有する。特定の実施形態では、標的細胞および３’および／または５’ＵＴＲのｍｉＲＮＡ標的配列においてその発現を指示する調節配列に作動可能に連結された機能的な遺伝子産物（例えば、ｈＩＤＵＡ）をコードする核酸配列を含む発現カセットが提供される。本明細書に記載されるように、ｍｉＲＮＡ標的配列は、導入遺伝子発現が望ましくないおよび／または導入遺伝子の発現レベルの低下が所望される細胞に存在するｍｉＲＮＡによって、特異的に認識されるように設計される。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列は、後根神経節における導入遺伝子の発現を特異的に低減する。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列は、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、および／または３’ＵＴＲと５’ＵＴＲの両方に位置する。

【0050】

本明細書で使用される場合、「発現」または「遺伝子発現」という用語は、遺伝子からの情報が、機能的な遺伝子産物の合成に使用されるプロセスを指す。遺伝子産物は、タンパク質、ペプチド、または核酸ポリマー（ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＰＮＡなど）であり得る。

【0051】

本明細書で使用される場合、「調節配列」または「発現制御配列」という用語は、イニシエーター配列、エンハンサー配列、およびプロモーター配列などの核酸配列を指し、それらが作動可能に連結しているタンパク質をコードする核酸配列の転写を誘導するか、抑制するか、またはその他制御する。

【0052】

本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」という用語は、遺伝子産物をコードする核酸配列に連続している発現制御配列、および／またはその転写および発現をトランスでもしくは離れて作用する発現制御配列の両方を指す。

【0053】

「５’ＵＴＲ」は、遺伝子産物のコード配列の開始コドンの上流にある。５’ＵＴＲは
、一般に、３’ＵＴＲよりも短い。一般に、５’ＵＴＲは、約３ヌクレオチド長～約２００ヌクレオチド長であるが、任意選択的に、より長くてもよい。

【0054】

「３’ＵＴＲ」は、遺伝子産物のコード配列の下流にあり、一般に、５’ＵＴＲよりも長い。特定の実施形態では、３’ＵＴＲは、約２００ヌクレオチド長～約８００ヌクレオチド長であるが、任意選択的に、より長くても、またはより短くてもよい。

【0055】

核酸配列またはタンパク質を説明するために使用される「外因性」という用語は、核酸またはタンパク質が、染色体または宿主細胞に存在する位置では、天然に存在しないことを意味する。外因性核酸配列はまた、同じ宿主細胞または対象に由来し、それらに挿入されるが、非天然状態（例えば、異なるコピー数、または異なる調節エレメントの制御下）で存在する配列を指す。

【0056】

核酸配列またはタンパク質を説明するために使用される「異種」という用語は、核酸またはタンパク質が、それが発現される宿主細胞または対象とは異なる生物または同じ生物の異なる種に由来したことを意味する。プラスミド、ベクターゲノム、発現カセット、またはベクターのタンパク質または核酸を参照して使用される場合、「異種」という用語は、タンパク質または核酸が、問題のタンパク質または核酸が天然には互いに同じ関係で見出されないタンパク質または核酸とは別の配列もしくはサブ配列と共に存在することを示す。

【0057】

一実施形態では、提供される発現カセットは、脳脊髄液および脳を含む中枢神経系（ＣＮＳ）における発現および分泌のために設計される。特に所望の一実施形態では、発現カセットは、ＣＮＳおよび肝臓の両方での発現のために有用であり、それにより、ＭＰＳＩ、Ｈｕｒｌｅｒ、Ｈｕｒｌｅｒ－ＳｃｈｅｉｅおよびＳｃｈｅｉｅ症候群の全身およびＣＮＳ関連の効果の両方の治療が可能となる。例えば、本発明者らは、特定の構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶ）が、髄腔内に送達された場合に、所望のレベルで発現を駆動せず、それにより、最適以下のｈＩＤＵＡ発現レベルをもたらすことを観察した。しかし、ニワトリベータ－アクチンプロモーターは、髄腔内送達および全身送達の両方において良好に発現を駆動する。故に、これは、特に望ましいプロモーターである。他のプロモーターが選択されてもよいが、その他のプロモーターを含有する発現カセットが、ニワトリベータ－アクチンプロモーターを用いる場合の利点のすべてを有さなくてもよい。様々なニワトリベータ－アクチンプロモーターが単独で、または様々なエンハンサーエレメント（例えば、ＣＢ７は、サイトメガロウイルスエンハンサーエレメントを有するニワトリベータ－アクチンプロモーターであるＣＡＧプロモーターであり、プロモーターと、ニワトリベータアクチンの第１のエキソンおよび第１のイントロンと、ウサギベータ－グロビン遺伝子のスプライスアクセプターとを含む）、ＣＢｈプロモーターと組み合わせて記載されている［ＳＪ Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２０１１ Ｓｅｐ；２２（９）：１１４３－１１５３］。他の実施形態では、好適なプロモーターとしては、伸長因子１アルファ（ＥＦ１アルファ）プロモーター（例えば、Ｋｉｍ ＤＷ ｅｔ ａｌ，Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １ ａｌｐｈａ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｓ ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．Ｇｅｎｅ．１９９０ Ｊｕｌ １６；９１（２）：２１７－２３を参照されたい）、シナプシン１プロモーター（例えば、Ｋｕｇｌｅｒ Ｓ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ ｓｙｎａｐｓｉｎ １ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｃｏｎｆｅｒｓ ｈｉｇｈｌｙ ｎｅｕｒｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｒｏｍ ａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｒａｔ ｂｒａｉｎ ｄｅｐｅｎｄｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ａｒｅａ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００３
Ｆｅｂ；１０（４）：３３７－４７を参照されたい）、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ
）プロモーター（例えば、Ｋｉｍ Ｊ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ－ｒｉｃｈ ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔｓ ｉｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６－ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＮＣａＰ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．２００４ Ｆｅｂ；１４５（２）：６１３－９．Ｅｐｕｂ ２００３
Ｏｃｔ １６を参照されたい）、またはＣＢ６プロモーター（例えば、Ｌａｒｇｅ－Ｓｃａｌｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ－９ Ｃａｒｒｙｉｎｇ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎ Ｇｅｎｅ，Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６ Ｊａｎ；５８（１）：３０－６．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１２０３３－０１５－９８９９－５を参照されたい）が挙げられ得るが、これらに限定されない。

【0058】

組織特異的であるプロモーターの例は、とりわけ、肝臓および他の組織（アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４－３２、Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１００２－９、アルファ－フェトタンパク質（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７：１５０３－１４）、骨オステオカルシン（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，２４：１８５－９６）、骨シアロタンパク質（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１１：６５４－６４）、リンパ球（ＣＤ２，Ｈａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：１０６３－８、免疫グロブリン重鎖、Ｔ細胞受容体鎖）、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーターなどの神経プロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３－１５）、神経フィラメント軽鎖遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１－５）、および神経特異的ｖｇｆ遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３－８４）についてよく知られている。代替的に、調節可能なプロモーターが選択されてもよい。例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８Ｂ２を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。

【0059】

一実施形態では、発現カセットは、１つ以上の発現エンハンサーを含む。一実施形態では、発現カセットは、２つ以上の発現エンハンサーを含有する。これらのエンハンサーは、同じであっても、異なってもよい。例えば、エンハンサーは、アルファｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサー、またはＣＭＶエンハンサーを含んでもよい。このエンハンサーは、互いに隣接して位置する２つのコピーに存在し得る。代替的に、エンハンサーの二重コピーは、１つ以上の配列により分離されてもよい。さらに別の実施形態では、発現カセットはさらに、イントロン、例えば、ニワトリベータ－アクチンイントロン、ヒトβ－グロブリンイントロン、および／または市販のＰｒｏｍｅｇａ（登録商標）イントロンを含有する。他の好適なイントロンには、当該技術分野で既知のものが含まれ、例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８号などに記載されている。

【0060】

さらに、提供される発現カセットは、適切なポリアデニル化シグナルを含む。一実施形態では、ポリＡ配列は、ウサギグロブリンポリＡである。例えば、ＷＯ２０１４／１５１３４１を参照されたい。代替的に、別のポリＡ、例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化配列、ＳＶ５０ポリＡ、または合成ポリＡ。さらなる他の慣用的な調節エレメントは、追加的に、または任意選択的に、発現カセットまたはベクターゲノムを含んでもよい。

【0061】

一実施形態では、調節配列は、エンハンサーをさらに含む。一実施形態では、調節配列
は、１つのエンハンサーを含む。別の実施形態では、調節配列は、２つ以上の発現エンハンサーを含有する。これらのエンハンサーは、同じであっても、異なってもよい。例えば、エンハンサーは、アルファｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサー、またはＣＭＶエンハンサーを含んでもよい。このエンハンサーは、互いに隣接して位置する２つのコピーに存在し得る。代替的に、エンハンサーの二重コピーは、１つ以上の配列により分離されてもよい。

【0062】

一実施形態では、調節配列は、イントロンをさらに含む。さらなる実施形態では、イントロンは、ニワトリベータ－アクチンイントロンである。他の好適なイントロンには、当該技術分野で既知のものが含まれ、ヒトβ－グロブリンイントロン、および／または市販のＰｒｏｍｅｇａ（登録商標）イントロン、ならびにＷＯ２０１１／１２６８０８に記載のものであってもよい。

【0063】

一実施形態では、調節配列は、ポリアデニル化シグナル（ポリＡ）をさらに含む。さらなる実施形態では、ポリＡは、ウサギグロビンポリＡである。例えば、ＷＯ２０１４／１５１３４１を参照されたい。代替的に、別のポリＡ（例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化配列、ＳＶ４０ポリＡ、または合成ポリＡ）が、発現カセットに含まれ得る。

【0064】

特定の実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子産物のＤＲＧ発現を低減または排除しながら、ヒト対象における発現のために設計される。一実施形態では、発現カセットは、脳脊髄液および脳を含む中枢神経系（ＣＮＳ）における発現のために設計される。特定の実施形態では、発現カセットは、神経細胞（錐体細胞、プルキンエ細胞、顆粒細胞、紡錘細胞、および介在神経細胞など）ならびにグリア細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア、および上衣細胞など）を含む、ＣＮＳに存在する１つ以上の細胞型（後根神経節を除く）における導入遺伝子の発現または発現の増強のために設計される。特定の実施形態では、導入遺伝子の発現の増強は、１つ以上の細胞型で達成され、ＣＮＳの別の細胞型における導入遺伝子の発現は、ほとんどないか、または全くない。特定の実施形態では、発現カセットは、ＣＮＳの細胞以外の細胞での発現に有用である。

【0065】

本明細書で使用される場合、「ｍｉＲＮＡ」は、マイクロＲＮＡを指し、それは、ｍＲＮＡを調節し、タンパク質への翻訳を停止させる小さな非コードＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは、ヌクレオチドの領域である「シード配列」を含有し、相補的な塩基対形成によってｍＲＮＡに特異的に結合し、ｍＲＮＡの破壊またはサイレンシングをもたらす。特定の実施形態では、シード配列は、成熟ｍｉＲＮＡに位置し（５’から３’へ）、一般に、ｍｉＲＮＡの２～７位または２～８位（センス（＋）鎖の５’末端から）に位置するが、それより長い鎖長であってもよい。特定の実施形態では、シード配列の長さは、ｍｉＲＮＡ配列の長さの約３０％以上であり、少なくとも７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長、少なくとも８ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長、７ヌクレオチド～２８ヌクレオチド長、８ヌクレオチド～１８ヌクレオチド長、１２ヌクレオチド～２８ヌクレオチド長、約２０～約２６ヌクレオチド、約２２ヌクレオチド、約２４ヌクレオチド、または約２６ヌクレオチドであり得る。

【0066】

本明細書で使用される場合、「ｍｉＲＮＡ標的配列」は、ＤＮＡプラス鎖上に位置する配列（５’から３’へ）であり、ｍｉＲＮＡシード配列を含むｍｉＲＮＡ配列に少なくとも部分的に相補的である。ｍｉＲＮＡ標的配列は、コードされた導入遺伝子産物の非翻訳領域に対して外因性であり、導入遺伝子発現の抑制が所望される細胞で、ｍｉＲＮＡによって特異的に標的化されるように設計される。「ｍｉＲ１８３クラスター標的配列」という用語は、ｍｉＲ－１８３、－９６および－１８２（Ｄａｍｂａｌ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４３：７１７３－７１８８，２０１５によって記載されている、参照により本明細書に組み込まれるもの）を含む、ｍｉＲ１８３クラスター
（代替的にファミリーと称される）のうちの１つ以上のメンバーに応答する標的配列を指す。理論に束縛されることを意図するものではないが、導入遺伝子（遺伝子産物をコードする）のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、ｍｉＲＮＡを含有する発現カセットが送達される細胞型に存在し、その結果、３’ＵＴＲ ｍｉＲＮＡの標的配列に対するｍｉＲＮＡの特異的結合が、ｍＲＮＡのサイレンシングおよび切断を引き起こし、それによって、ｍｉＲＮＡを発現する細胞においてのみ、導入遺伝子の発現が低減または排除される。

【0067】

典型的には、ｍｉＲＮＡ標的配列は、少なくとも７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長、少なくとも８ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長、７ヌクレオチド～２８ヌクレオチド、８ヌクレオチド～１８ヌクレオチド長、１２～２８ヌクレオチド長、約２０～約２６ヌクレオチド、約２２ヌクレオチド、約２４ヌクレオチド、または約２６ヌクレオチドであり、ｍｉＲＮＡシード配列に相補的である少なくとも１つの連続領域（例えば、７または８ヌクレオチド）を含有する。特定の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲＮＡシード配列と正確な相補性（１００％）を有する配列、またはｍｉＲＮＡシード配列といくつかのミスマッチを含む部分的な相補性を有する配列を含む。特定の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲＮＡシード配列と１００％相補的である少なくとも７～８個のヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲＮＡシード配列と１００％相補的である配列からなる。特定の実施形態では、標的配列は、シード配列と１００％相補的である配列を複数コピー（例えば、２または３コピー）含有する。特定の実施形態では、１００％相補性の領域は、標的配列の長さの少なくとも３０％を含む。特定の実施形態では、標的配列の残部は、ｍｉＲＮＡに対して少なくとも約８０％～約９９％の相補性を有する。特定の実施形態では、ＤＮＡプラス鎖を含む発現カセットでは、ｍｉＲＮＡ標的配列は、ｍｉＲＮＡの逆相補体である。

【0068】

特定の実施形態では、操作された発現カセットであって、ＤＲＧにおける導入遺伝子の発現を抑制するために、ならびに／またはＤＲＧ毒性および／もしくは軸索障害を低減もしくは排除するために、導入遺伝子に作動可能に連結されたｍｉＲ－１８３ファミリーまたはクラスターのうちの１つ以上のメンバーを対象とするｍｉＲ標的配列の少なくとも１つのコピーを含む、操作された発現カセットが本明細書で提供される。特定の実施形態では、操作された発現カセットは、複数のｍｉＲＮＡ標的配列を含み、その結果、ｍｉＲＮＡ標的配列の数が、ＤＲＧ毒性および／または軸索障害を低減および／または排除するために、ＤＲＧにおける導入遺伝子の発現を低減または最小化するのに十分なものとなる。発現カセットは、任意の好適な担体系、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを介して、任意の経路を介して送達され得るが、髄腔内投与に特に有用である。

【0069】

意外にも、ＤＲＧにおける発現を抑制するための本明細書に記載のｍｉＲ－１８３標的配列を含む組成物は、これらに限定されないが、ニューロン（例えば、錐体細胞、プルキンエ細胞、顆粒細胞、紡錘細胞、および介在神経細胞を含む）、またはグリア細胞（例えば、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア、および上衣細胞を含む）を含む、中枢神経系内の１つ以上の異なる細胞型（ＤＲＧ以外）において増強された導入遺伝子発現を提供することが観察されている。この観察は、当初、髄腔内送達経路に従って行われたが、この発現増強効果は、ＣＮＳ送達経路に限定されない。発現の増強は、静脈内送達後にも観察されており、他の経路、例えば、静脈内（例えば、特に高用量送達）、筋肉内（特に高用量送達）、または他の全身送達経路を使用して達成されてもよい。特定の実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ－１８３標的配列を含む組成物は、心臓組織における導入遺伝子発現の増強を提供する。例えば、以下に記載される研究では、対照ベクターと比較して、ｍｉｒ１８３標的含有ベクターを有する背側経路神経節で、導入遺伝子発現の統計的に有意な低減が観察される。意外にも、腰部運動ニューロンと小脳で発現が増強された。特定の実施形態では、ＤＲＧおよび／または８つの他の領域にわたる病的状態の低減が達成される場合があり、頸部、胸部、および腰部脊椎での背側脊髄軸索障害、
ならびに正中神経、腓骨神経、および橈骨神経の軸索障害の病的状態の低減が達成され得る。

【0070】

特定の実施形態では、導入遺伝子のＣＮＳ発現の増強を回避するために（ＤＲＧ発現を抑制しながら）、ＣＮＳを標的としない導入遺伝子を含む発現カセット用のｍｉＲ－１８２標的配列および／またはｍｉＲ－９６標的配列を選択したい場合がある。例えば、骨格筋または肝臓への送達のための導入遺伝子を含む発現カセットは、ＣＮＳ発現のいかなる増強も避けたいが、必要とされ得る高用量と関連し得るＤＲＧ毒性および／または軸索障害を防止したい場合がある。

【0071】

特定の実施形態では、発現カセットは、ｍｉＲ－１８３標的配列である少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含有する。特定の実施形態では、発現カセットは、

を含むｍｉＲ－１８３標的配列を含有する（ｍｉＲ－１８３シード配列に相補的な配列には、下線が引かれている）。特定の実施形態では、発現カセットは、ｍｉＲ－１８３シード配列に１００％相補的な配列を、１コピーより多く（例えば、２または３コピー）含有する。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、約７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長であり、ｍｉＲ－１８３シード配列に少なくとも１００％相補的である少なくとも１つの領域を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、配列番号１に部分的に相補的な配列を含有し、したがって、配列番号１にアラインメントさせた場合、１つ以上のミスマッチがある。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、配列番号１にアラインメントさせた場合、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のミスマッチを有する配列を含み、ミスマッチは非連続であり得る。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、１００％相補的な領域を含み、また、ｍｉＲ－１８３標的配列の長さの少なくとも３０％を含む。特定の実施形態では、１００％相補性の領域は、ｍｉＲ－１８３シード配列と１００％相補性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列の残部は、ｍｉＲ－１８３と少なくとも約８０％～約９９％相補性を有する。特定の実施形態では、発現カセットは、切断された配列番号１を含むｍｉＲ－１８３標的配列（すなわち、配列番号１の５’末端もしくは３’末端のいずれかまたは両方で、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドを欠く配列）を含む。特定の実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子と、１つのｍｉＲ－１８３標的配列とを含む。なお他の実施形態では、発現カセットは、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、または少なくとも７個、または少なくとも８個のｍｉＲ－１８３標的配列を含む。特定の実施形態では、発現カセットは、８個のｍｉＲ－１８３標的配列を含む。

【0072】

特定の実施形態では、発現カセットは、ｍｉＲＮＡ標的配列の組み合わせを含む。特定の実施形態では、標的配列の組み合わせは、同じｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－１８３など）と少なくとも部分的な相補性を有する異なる標的配列を含む。特定の実施形態では、発現カセットは、本明細書で提供されるｍｉＲ－１８３、ｍｉＲ－１８２、および／またはｍｉＲ－９６の標的配列から選択されるｍｉＲＮＡ標的配列の組み合わせを含む。特定の実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子と、２個、３個、または４個のｍｉＲ－９６標的配列とを含む。特定の実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子と、２個、３個、４個、５個、６個、７個、または８個のｍｉＲ－１８２標的配列とを含む。特定の実施形態では、発現カセットは、８個のｍｉＲ－１８２標的配列を含む。特定の実施形態では、発現カセットは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、もしくは少なくとも４個のｍｉＲ－１８３標的配列を含み、任意選択的に、少なくとも１個、少なくとも２個、少
なくとも３個、もしくは少なくとも４個のｍｉＲ－１８２標的配列との組み合わせ、および／または任意選択的に、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、もしくは少なくとも４個のｍｉＲ－９６標的配列との組み合わせを含む。

【0073】

導入遺伝子およびｍｉＲ－１８２を含む組成物は、後根神経節毒性を最小化または排除し、および／または軸索障害を防止することが観察されている。しかしながら、ｍｉＲ－１８２標的配列を含有する発現カセットは、この目的には有効であるが、意外にもｍｉＲ－１８３標的配列を有した複合体化されたもので見出されたように、ＣＮＳ発現を増強することが観察されていない。したがって、これらの組成物は、遺伝子がＣＮＳ以外を標的とすることが望ましい場合がある。

【0074】

特定の実施形態では、発現カセットであって、１つ以上のｍｉＲ－１８３ファミリーの標的配列を含み、導入遺伝子を欠く（すなわち、ｍｉＲ－１８３ファミリーの標的配列が、異種遺伝子産物をコードする配列に作動可能に連結されていない）、発現カセットが本明細書で提供される。

【0075】

特定の実施形態では、発現カセットは、ｍｉＲ－１８２の標的配列である少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含有する。特定の実施形態では、発現カセットは、ｍｉＲ－１８２標的配列を含有し、ＡＧＴＧＴＧＡＧＴＴＣＴＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＡＡ（配列番号３）を含む。特定の実施形態では、発現カセットは、ｍｉＲ－１８２シード配列に１００％相補的である配列を、１コピーより多く（例えば、２または３コピー）含有する。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、約７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長であり、ｍｉＲ－１８２シード配列に少なくとも１００％相補的である少なくとも１つの領域を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、配列番号３に部分的に相補的な配列を含有し、したがって、配列番号３とアラインメントさせた場合、１つ以上のミスマッチがある。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、配列番号３とアラインメントさせた場合、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のミスマッチを有する配列を含み、ミスマッチは非連続であり得る。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、１００％相補的な領域を含み、また、ｍｉＲ－１８２標的配列の長さの少なくとも３０％を含む。特定の実施形態では、１００％相補性の領域は、ｍｉＲ－１８２シード配列と１００％相補性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列の残部は、ｍｉＲ－１８２と少なくとも約８０％～約９９％相補性を有する。特定の実施形態では、発現カセットは、ｍｉＲ－１８２標的配列を含み、切断された配列番号３（すなわち、配列番号３の５’末端もしくは３’末端のいずれかまたは両方で、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドを欠く配列）を含む。特定の実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子と、１つのｍｉＲ－１８２標的配列とを含む。なお他の実施形態では、発現カセットは、少なくとも２つ、３つ、または４つのｍｉＲ－１８２標的配列を含む。

【0076】

特定の実施形態では、発現カセットは、２つ以上の連続するｍｉＲＮＡ標的配列を有し、連続的であり、スペーサーによって分離されていない。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列のうちの２つ以上は、スペーサーによって分離されている。特定の実施形態では、スペーサーは、約１～約１２ヌクレオチド、または約２～約１０ヌクレオチド長、または約３～約１０ヌクレオチド、約４～約６ヌクレオチド長、または３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１１ヌクレオチド長の非コード配列である。任意選択的に、単一の発現カセットは、３つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含有していてもよく、任意選択的に、それらの間に異なるスペーサー配列を有する。特定の実施形態では、１つ以上のスペーサーは、独立して、（ｉ）ＧＧＡＴ（配列番号５）、（ｉｉ）ＣＡＣＧＴＧ（配列番号６）、または（ｉｉｉ）ＧＣＡＴＧＣ（配列番号７）から選択される。特定の実施形態では、スペーサーは、第１のｍｉＲＮＡ標的配列の３’および／または最後のｍｉＲＮＡ標
的配列の５’に位置する。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列間のスペーサーは同じである。

【0077】

特定の実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子と、１つのｍｉＲ－１８３標的配列と、１つ以上の異なるｍｉＲＮＡ標的配列とを含む。特定の実施形態では、発現カセットは、ｍｉＲ－９６標的配列：ｍＲＮＡおよびＤＮＡプラス鎖（５’から３’へ）：ＡＧＣＡＡＡＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＧＣＣＡＡＡ（配列番号２）、ｍｉＲ－１８２標的配列：ｍＲＮＡおよびＤＮＡプラス鎖（５’から３’へ）：および／またはＡＧＴＧＴＧＡＧＴＴＣＴＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＡＡ（配列番号３）を含有する。

【0078】

ｍｉＲ－１４５は、文献では、脳に関連しているが、これまでの研究では、ｍｉＲ－１４５標的配列は、後根神経節における導入遺伝子の発現の低減には効果がないことが示されている。ｍｉＲ－１４５標的配列：ｍＲＮＡおよびＤＮＡプラス鎖（５’から３’へ）：ＡＧＧＧＡＴＴＣＣＴＧＧＧＡＡＡＡＣＴＧＧＡＣ（配列番号４）。

【0079】

本明細書に提供されるように、発現カセットは、標的細胞における導入遺伝子産物の発現を指示する調節配列に作動可能に連結されるか、またはその制御下にある、導入遺伝子を含有する。特定の実施形態では、発現カセットは、本明細書で提供される１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列に作動可能に連結される、導入遺伝子を含有する。特定の実施形態では、発現カセットまたは は、複数のｍｉＲＮＡ標的配列を含有するように設計される。ｍｉＲＮＡ標的配列は、導入遺伝子のＵＴＲに組み込まれる（すなわち、遺伝子のオープンリーディングフレームの３’または下流）。

【0080】

「タンデムリピート」という用語は、２つ以上の連続するｍｉＲＮＡ標的配列の存在を指すように本明細書で使用される。これらのｍｉＲＮＡ標的配列は、連続的であってもよい。すなわち、ある配列の３’末端が、介在配列なしで、次の配列の５’末端の直ぐ上流にあるように、またはその逆になるように、次々と直に位置している。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列のうちの２つ以上が、短いスペーサー配列によって分離されている。

【0081】

本明細書で使用される場合、「スペーサー」としては、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長の任意の選択された核酸配列であり、２つ以上の連続するｍｉＲＮＡ標的配列の間に位置する。特定の実施形態では、スペーサーは、１～８ヌクレオチド長、２～７ヌクレオチド長、３～６ヌクレオチド長、４ヌクレオチド長、４～９ヌクレオチド、３～７ヌクレオチド、またはより長い値である。好適には、スペーサーは、非コード配列である。特定の実施形態では、スペーサーは、４つの（４）ヌクレオチドであり得る。特定の実施形態では、スペーサーは、ＧＧＡＴである。特定の実施形態では、スペーサーは、６つの（６）ヌクレオチドである。特定の実施形態では、スペーサーは、ＣＡＣＧＴＧまたはＧＣＡＴＧＣである。

【0082】

特定の実施形態では、タンデムリピートは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、またはそれより多い同じｍｉＲＮＡ標的配列を含有する。特定の実施形態では、タンデムリピートは、異なるものについて同じであり得る最大８個のｍｉＲＮＡ標的配列を有する。特定の実施形態では、タンデムリピートは、少なくとも２つの異なるｍｉＲＮＡ標的配列、少なくとも３つの異なるｍｉＲＮＡ標的配列、または少なくとも４つの異なるｍｉＲＮＡ標的配列などを含有する。特定の実施形態では、タンデムリピートは、２つまたは３つの同じｍｉＲＮＡ標的配列、および異なる第４のｍｉＲＮＡ標的配列を含有してもよい。

【0083】

特定の実施形態では、発現カセットには、少なくとも２つの異なるセットのタンデムリ
ピートが存在し得る。例えば、３’ＵＴＲは、導入遺伝子のすぐ下流にタンデムリピート、ＵＴＲ配列、およびＵＴＲの３’末端の近くに２つ以上のタンデムリピートを含有し得る。別の例では、５’ＵＴＲは、１つ、２つ、またはそれより多いｍｉＲＮＡ標的配列を含有し得る。別の例では、３’は、タンデムリピートを含有してもよく、５’ＵＴＲは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含有してもよい。

【0084】

特定の実施形態では、発現カセットは、２つ、３つ、４つ、またはそれより多いタンデムリピートを含有し、導入遺伝子の終止コドンの約０～２０ヌクレオチド以内に開始する。他の実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子の終止コドンから少なくとも１００～約４０００ヌクレオチドのｍｉＲＮＡタンデムリピートを含有する。

【0085】

本明細書で使用される場合、「ベクターゲノム」は、ウイルスベクターの中にパッケージングされる核酸配列を指す。一実施例では、「ベクターゲノム」は、少なくとも、５’から３’へ、ベクター特異的配列と、標的細胞でその発現を指示する調節制御配列に作動可能に連結された機能的な遺伝子産物をコードする核酸配列と、非翻訳領域のｍｉＲＮＡ標的配列と、ベクター特異的配列と、を含有する。例えば、ＡＡＶベクターゲノムは、逆位末端反復配列と、発現カセットとを含有し、発現カセットは、例えば、標的細胞において発現を指示する調節制御配列に作動可能に連結された機能的な遺伝子産物をコードする核酸配列と、非翻訳領域のｍｉＲＮＡ標的配列とを含む。本明細書に記載されるように、ｍｉＲＮＡ標的配列は、導入遺伝子の発現が望ましくない（例えば、後根神経節）および／または導入遺伝子の発現レベルの低下が所望される細胞において、ｍｉＲＮＡ配列によって特異的に認識されるように設計される。

【0086】

特定の実施形態では、本明細書に提供されるようなｈＩＤＵＡ配列を含有するベクターゲノムを有するｒＡＡＶが提供される。さらなる実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１４または配列番号１６を含む。各々で、ベクターゲノムは、５’および３’ＩＴＲを含む。さらに、各々は、プロモーター、エンハンサー、ｈＩＤＵＡ遺伝子、およびポリＡを含有する。

【0087】

本明細書に記載の発現カセットが、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態および方法に適用されるように意図されることを理解されたい。

【0088】

ベクター
一態様では、機能的ｈＩＵＤＡをコードする核酸配列を含むベクターが本明細書に提供される。特定の実施形態では、ベクターは、ｈＩＤＵＡコード配列の送達のための本明細書に記載の発現カセットを含む。

【0089】

本明細書で使用される「ベクター」は、核酸配列を含む生物学的部分または化学的部分であり、上述の核酸配列の複製または発現のために適切な標的細胞に導入され得る。ベクターの例としては、限定されないが、組換えウイルス、プラスミド、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、デンドリマー、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）コンジュゲート、磁性粒子、またはナノ粒子が挙げられる。特定の実施形態では、ベクターは、核酸分子であり、機能的ｈＩＵＤＡをコードする操作された核酸がその中に挿入されてもよく、次いで、適切な標的細胞に導入され得る。かかるベクターは、好ましくは、１つ以上の複製起点と、組換えＤＮＡが挿入され得る１つ以上の部位とを有する。ベクターは、しばしば、ベクターを有する細胞が、ベクターを有しない細胞から選択され得る手段を有する（例えば、それらが薬物耐性遺伝子をコードする）。一般的なベクターは、プラスミド、ウイルスゲノム、および「人工染色体」を含む。ベクターの生成、産生、特徴付け、または定量化の従来の方法は、当業者に利用可能である。

【0090】

特定の実施形態では、ベクターは、非ウイルスプラスミドであり、本明細書に記載される発現カセット（例えば、「裸のＤＮＡ」、「裸のプラスミドＤＮＡ」、ＲＮＡ、およびｍＲＮＡ）を含み、様々な組成物およびナノ粒子（例えば、ミセル、リポソーム、カチオン性脂質－核酸組成物、ポリグリカン組成物、および他のポリマー、脂質および／またはコレステロール系－核酸コンジュゲート、ならびに本明細書に記載されるような他の構築物を含む）と組み合わせられてもよい。例えば、Ｘ．Ｓｕ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１１，８（３），ｐｐ７７４－７８７；ｗｅｂ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ：Ｍａｒｃｈ ２１，２０１１、ＷＯ２０１３／１８２６８３、ＷＯ２０１０／０５３５７２、およびＷＯ２０１２／１７０９３０を参照されたい（これらのすべては、参照により本明細書に組み合わされる）。

【0091】

特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターは、「複製欠陥ウイルス」または「ウイルスベクター」は、ｈＩＤＵＡをコードする核酸配列を含有する発現カセットが、ウイルスカプシドもしくはエンベロープの中にパッケージングされ、ウイルスカプシドもしくはエンベロープ内にパッケージングされたいずれのウイルスゲノム配列も、複製欠損である（すなわち、標的細胞に感染する能力を保持するが、後代ビリオンを生成することはできない）、合成または人工のウイルス粒子を指す。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要とされる酵素をコードする遺伝子を含まない（ゲノムは、人工ゲノムの増幅およびパッケージングに必要とされるシグナルに隣接するｈＩＤＵＡをコードする核酸配列のみを含有する「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」であるように操作されることができる）が、これらの遺伝子は、産生中に供給され得る。したがって、それは、後代ビリオンによる複製および感染が、複製に必要とされるウイルス酵素の存在下以外で生じることができないために、遺伝子療法における使用のために安全であると考えられる。

【0092】

本明細書で使用される場合、組換えウイルスベクターは、任意の好適なウイルスベクターである。実施例は、例示的な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。他の好適なウイルスベクターとしては、例えば、アデノウイルス、ポックスウイルス、ボカウイルス、ハイブリッドＡＡＶ／ボカウイルス、単純ヘルペスウイルス、またはレンチウイルスが挙げられ得る。好ましい実施形態では、これらの組換えウイルスは、複製不能である。

【0093】

発現カセットは、任意の好適な非ウイルスベクター送達系を介して、または好適なウイルスベクターによって送達され得る。好適な非ウイルスベクター送達系は、当該技術分野において既知であり（例えば、Ｒａｍａｍｏｏｒｔｈ ａｎｄ Ｎａｒｖｅｋａｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｒｅｓ．２０１５ Ｊａｎ；９（１）：ＧＥ０１－ＧＥ０６、参照により本明細書に組み込まれる）、当業者によって容易に選択され得、例えば、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、デンドリマー、ＰＬＧＡ、ポリメタクリレート、無機粒子、脂質粒子、ポリマーベースのベクター、またはキトサンベースの製剤を含み得る。

【0094】

特定の実施形態では、ｈＩＤＵＡ配列をコードする核酸を含有する宿主細胞が提供される。特定の実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載のｈＩＤＵＡコード配列を有するプラスミドを含有する。

【0095】

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、ベクター（例えば、組換えＡＡＶ）が産生されるパッケージング細胞株を指し得る。宿主細胞は、任意の手段で（例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、形質転換、ウイルス感染、トランスフェクション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、およびプロトプラスト融合）によって細胞に導入される外因性ＤＮＡまたは異種ＤＮＡを含有する、原核細胞または真核細胞（例えば、ヒト、昆虫、または酵母）であり得る。宿主細胞の例としては、限定されないが、単離され
た細胞、細胞培養物、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非哺乳動物細胞、昆虫細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、中枢神経系の細胞、ニューロン、グリア細胞、または幹細胞が挙げられ得る。

【0096】

特定の実施形態では、宿主細胞は、タンパク質が単離または精製のために十分な量でインビトロで産生されるように、ｈＩＤＵＡの産生のための発現カセットを含有する。特定の実施形態では、宿主細胞は、ｈＩＤＵＡをコードする発現カセット（例えば、その機能的断片を含む）を含有する。本明細書で提供される場合、ｈＩＤＵＡポリペプチドは、治療剤（すなわち、酵素補充療法）として対象に投与される薬学的組成物に含まれ得る。

【0097】

本明細書で使用される場合、「標的細胞」という用語は、機能的ｈＩＤＵＡの発現が所望される任意の標的細胞を指す。特定の実施形態では、「標的細胞」という用語は、ＭＰＳＩ、Ｈｕｒｌｅｒ、Ｈｕｒｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｅおよび／またはＳｃｈｅｉｅ症候群で治療されている対象の細胞を指すことが意図されている。標的細胞の例としては、限定されないが、肝臓細胞、腎臓細胞、平滑筋細胞、およびニューロンが挙げられ得る。特定の実施形態では、ベクターは、エクスビボで標的細胞に送達される。特定の実施形態では、ベクターは、インビボで標的細胞に送達される。

【0098】

本明細書に記載のベクター中の組成物は、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態、および方法に適用されるように意図されることを理解されたい。

【0099】

組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター
一態様では、ＡＡＶカプシドと、その中にパッケージングされたベクターゲノムとを含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）が本明細書で提供される。

【0100】

一実施形態では、調節配列は、上に記載の通りである。一実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶの５’逆位末端反復（ＩＴＲ）、本明細書に記載の発現カセット、およびＡＡＶの３’ＩＴＲを含む。一実施形態では、ベクターゲノムは、ｒＡＡＶベクターを形成するｒＡＡＶカプシドの中にパッケージングされる核酸配列を指す。かかる核酸配列は、発現カセットに隣接するＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含有する。一実施例では、「ベクターゲノム」は、少なくとも、５’から３’へ、ＡＡＶの５’ＩＴＲと、標的細胞でその発現を指示する調節制御配列に作動可能に連結された機能的な遺伝子産物をコードする核酸配列と、非翻訳領域のｍｉＲＮＡ標的配列と、ＡＡＶの３’ＩＴＲと、を含有する。特定の実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ２由来であり、カプシドは、異なるＡＡＶ由来である。代替的に、他のＩＴＲが使用され得る。本明細書に記載されるように、ｍｉＲＮＡ標的配列は、導入遺伝子の発現が望ましくない、および／または導入遺伝子の発現レベルの低下が所望される細胞のｍｉＲＮＡ配列によって、特異的に認識されるように設計される。

【0101】

ＩＴＲは、ベクター産生の際のゲノムの複製およびパッケージングに関与する遺伝子エレメントであり、ｒＡＡＶを生成するために必要とされる唯一のウイルス性シスエレメントである。一実施形態では、ＩＴＲは、カプシドを供給するものとは異なるＡＡＶ由来である。好ましい実施形態では、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列、またはその欠失バージョン（ΔＩＴＲ）が、利便性のため、および規制当局の承認を加速させるために使用され得る。しかしながら、他のＡＡＶ起源からのＩＴＲが選択されてもよい。ＩＴＲの起源がＡＡＶ２からであり、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ起源からのものである場合、得られたベクターは、擬似型であると称され得る。典型的には、ＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶの５’ＩＴＲ、ＮＡＧＬＵコード配列および任意の調節配列、ならびにＡＡＶの３’ＩＴＲを含む。しかし、これらのエレメントの他の構成も好適であり得る。Ｄ配列および末端分離部
位（ｔｒｓ）が欠失している、ΔＩＴＲと称される５’ＩＴＲの短縮バージョンが記載されている。他の実施形態では、全長ＡＡＶ５’および３’ＩＴＲが使用される。

【0102】

本明細書で使用される「ＡＡＶ」という用語は、天然に存在するアデノ随伴ウイルス、当業者に利用可能なアデノ随伴ウイルス、および／または、本明細書に記載の組成物および方法に照らして、ならびに人工ＡＡＶを指す。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターは、ＡＡＶタンパク質カプシドを有するＡＡＶ ＤＮａｓｅ耐性粒子であり、その中にパッケージングされる発現カセットは、標的細胞に送達するためのＡＡＶの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している。ＡＡＶカプシドは、６０個のカプシド（ｃａｐ）タンパク質サブユニットＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３から構成されており、選択されるＡＡＶに応じて、およそ１：１：１０～１：１：２０の比で二十面体対称に配置される。上で特定されるＡＡＶウイルスベクターのカプシドの供給源として、様々なＡＡＶが選択されてもよい。例えば、米国特許出願公開第２００７／００３６７６０Ａ１号、米国特許出願公開第２００９／０１９７３３８Ａ１号、ＥＰ１３１０５７１を参照されたい。また、ＷＯ２００３／０４２３９７（ＡＡＶ７および他のサルＡＡＶ）、米国特許第７７９０４４９号および米国特許第７２８２１９９号（ＡＡＶ８）、ＷＯ２００５／０３３３２１、およびＵＳ７，９０６，１１１（ＡＡＶ９）、およびＷＯ２００６／１１０６８９、ならびにＷＯ２００３／０４２３９７（ｒｈ１０）も参照されたい。また、これらの文書には、他のＡＡＶも記載されており、ＡＡＶを生成するために選択され得る（参照により組み込まれる）。ヒトまたは非ヒト霊長類（ＮＨＰ）から単離され、または操作され、十分に特徴付けられたＡＡＶのうち、ヒトＡＡＶ２が、遺伝子導入ベクターとして開発された最初のＡＡＶであり、それは、異なる標的組織および動物モデルにおいて、効率的な遺伝子導入実験に広く使用されている。別途指定されない限り、本明細書に記載のＡＡＶカプシド、ＩＴＲ、および他の選択されるＡＡＶ成分は、限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ８ｂｐ、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｈｕ３７、ＡＡＶ７Ｍ８、およびＡＡＶＡｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ９０（２０２０年４月２８日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０／３０２７３）、ＡＡＶｒｈ９１（２０２０年４月２８日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０／３０２６６）、ならびにＡＡＶｒｈ９２、ｒｈ９３、およびｒｈ９１．９３（２０２０年４月２８日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０／３０２８１）として一般に特定されているＡＡＶ、既知のもしくは言及されたＡＡＶのうちのいずれかのバリアント、またはまだ発見されていないＡＡＶもしくはそのバリアント、あるいはそれらの混合物を含む、任意のＡＡＶの中から容易に選択され得る。例えば、ＷＯ２００５／０３３３２１を参照されたい（参照により本明細書に組み込まれる）。一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ９カプシドまたはそのバリアントである。特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、ｒＡＡＶベクターの名前で「ＡＡＶ」という用語の後の数値または数値および文字の組み合わせによって指定される。

【0103】

本明細書で使用される場合、ＡＡＶに関して「バリアント」という用語は、既知のＡＡＶ配列に由来する任意のＡＡＶ配列を意味し、保存的アミノ酸置き換えを有するＡＡＶ配列、およびアミノ酸配列または核酸配列にわたって、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、またはそれより大きい配列同一性を共有するＡＡＶ配列を含む。別の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、任意の記載または既知のＡＡＶカプシド配列から最大約１０％のバリエーションを含み得るバリアントを含む。すなわち、ＡＡＶカプシドは、本明細書に提供され、かつ／または当該技術分野で既知のＡＡＶカプシドと、約９０％の同一性～約９９．９％の同一性、約９５％～約９９％の同一性、または約９７％～約９８％の同一性を共有する。一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶカプシドと少なくとも９５％の同一性を共有する。ＡＡＶカプシドの同一性パーセントを決定する場合、比較は、可変タンパク質（例えば、ｖｐ１、ｖｐ２、またはｖｐ３）のうちの
いずれかにわたって行われ得る。

【0104】

ＩＴＲまたは他のＡＡＶ成分は、当業者に利用可能な技術を使用して、ＡＡＶから容易に単離または操作され得る。かかるＡＡＶは、学術的、商業的、または公的資源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から単離、操作、または入手され得る。代替的に、ＡＡＶ配列は、文献またはデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＰｕｂＭｅｄなど）で利用可能であるような公開された配列を参照することによって、合成または他の好適な手段を通して操作され得る。ＡＡＶウイルスは、従来の分子生物学的な技術によって操作することができ、これらの粒子を、核酸配列の細胞特異的送達のため、免疫原性を最小限に抑えるため、安定性および粒子寿命を調整するため、効率的な分解のため、核への正確な送達のためなどに最適化することが可能になる。

【0105】

本明細書で使用される場合、「ｒＡＡＶ」および「人工ＡＡＶ」という用語は、互換的に使用され、限定されないが、カプシドタンパク質と、その中にパッケージングされるベクターゲノムとを含むＡＡＶを意味し、ベクターゲノムは、ＡＡＶとは異種の核酸を含む。一実施形態では、カプシドタンパク質は、天然に存在しないカプシドである。かかる人工カプシドは、選択されたＡＡＶ配列（例えば、ｖｐ１カプシドタンパク質の断片）を使用して、異種配列（異なる選択されたＡＡＶ、同じＡＡＶの非連続部分、非ＡＡＶウイルス源、または非ウイルス源から得ることができる）と組み合わせて、任意の好適な技術によって生成され得る。人工ＡＡＶは、擬似型ＡＡＶカプシド、キメラＡＡＶカプシド、組換えＡＡＶカプシド、または「ヒト化」ＡＡＶカプシドであり得るが、これらに限定されない。１つのＡＡＶのカプシドが異種カプシドタンパク質に置き換えられている擬似型ベクターは、本発明に有用である。一実施形態では、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／８は、例示的な擬似型ベクターである。選択される遺伝子エレメントは、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、およびプロトプラスト融合を含む任意の好適な方法によって送達され得る。かかる構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における技術者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、および合成技術を含む。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。

【0106】

本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ９カプシド」は、（ａ）ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＡＳ９９２６４（参照により本明細書に組み込まれる）（ＡＡＶ ｖｐ１カプシドタンパク質は、配列番号１９に再現される）のアミノ酸配列、および／または（ｂ）ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＹ５３０５７９．１：（ｎｔ１．．．２２１１）（配列番号１８に再現される）のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有するＡＡＶ９を指す。このコード配列からのいくつかのバリエーションは、本発明に包含され、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＡＳ９９２６４およびＵＳ７９０６１１１（同様に、ＷＯ２００５／０３３３２１）における参照アミノ酸配列と約９９％同一性を有する配列を含み得る（すなわち、参照配列からの約１％未満のバリエーション）。かかるＡＡＶは、例えば、天然単離物（例えば、ｈｕ６８、ｈｕ３１もしくはｈｕ３２）、またはアミノ酸置換、欠失、もしくは付加を有するＡＡＶ９のバリアントを含み得る（例えば、ＡＡＶ９カプシドとアラインメントされる任意の他のＡＡＶカプシド、例えば、ＵＳ９，１０２，９４９、ＵＳ８，９２７，５１４、ＵＳ２０１５／３４９９１１、ＷＯ２０１６／０４９２３０Ａ１ｌ、ＵＳ９，６２３，１２０、ＵＳ９，５８５，９７１に記載されているものなどの、対応する位置から「動員される（ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ）」代替的な残基から選択されたアミノ酸置換を含むが、これらに限定されない）。しかしながら、他の実施形態では、ＡＡＶ９の他のバリアント、または上記の参照配列と少なくとも約９５％の同一性を有するＡＡＶ
９カプシドが選択されてもよい。例えば、米国特許出願公開第２０１５／００７９０３８号を参照されたい。カプシド、それ故にコード配列を生成する方法、ならびにｒＡＡＶウイルスベクターを産生する方法が記載されている。例えば、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１－６０８６（２００３）およびＵＳ２０１３／００４５１８６Ａ１を参照されたい。

【0107】

ＡＡＶｈｕ６８は、ｖｐ１（配列番号９）の６７位および１５７位の２つのコードされたアミノ酸により、別の系統群ＦのウイルスであるＡＡＶ９とは異なる。対照的に、他の系統群ＦのＡＡＶ（ＡＡＶ９、ｈｕ３１、ｈｕ３１）は、６７位にＡｌａおよび１５７位にＡｌａを有する。配列番号９の番号付けに基づいて、１５７位にバリン（ＶａｌまたはＶ）を有し、任意選択的に、６７位にグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）を有する、新規のＡＡＶｈｕ６８カプシドおよび／または操作されたＡＡＶカプシドが提供される。また、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１８／１６０５８２も参照されたい（配列表を含む）。

【0108】

本明細書で使用される場合、ＡＡＶの群に関連する「系統群（ｃｌａｄｅ）」という用語は、互いに系統的に関連するＡＡＶの群を指し、ＡＡＶ ｖｐ１アミノ酸配列のアラインメントに基づいて、少なくとも７５％のブートストラップ値（少なくとも１０００反復のうち）および０．０５以下のポアソン補正距離測定値による隣接結合アルゴリズム（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を使用して決定される。隣接結合アルゴリズムは、文献に記載されている。例えば、Ｍ．Ｎｅｉ ａｎｄ Ｓ．Ｋｕｍａｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）を参照されたい。コンピュータプログラムが利用可能であり、それを使用して、このアルゴリズムを実装することができる。例えば、ＭＥＧＡ ｖ２．１プログラムは、修正Ｎｅｉ－Ｇｏｊｏｂｏｒｉ法を実装する。これらの技術およびコンピュータプログラム、ならびにＡＡＶ ｖｐ１カプシドタンパク質の配列を使用して、当業者は、選択されたＡＡＶが、本明細書で特定される１つの系統群（ｃｌａｄｅ）に含まれるか、別の系統群に含まれるか、またはこれらの系統群の外にあるかを容易に決定することができる。例えば、系統群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦを特定し、新規ＡＡＶの核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５３０５５３～ＡＹ５３０６２９）を提供する、Ｇ Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００４ Ｊｕｎ；７８（１０：６３８１－６３８８）を参照されたい。また、ＷＯ２００５／０３３３２１も参照されたい。

【0109】

特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、さらに、以下のうちの１つ以上を特徴とする。ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパクが、配列番号９の１～７３６の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質、配列番号９から産生されるｖｐ１タンパク質、または配列番号９の１～７３６の予測アミノ酸配列をコードする配列番号８に対して少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質、配列番号９の少なくとも約１３８～７３６のアミノ酸の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２タンパク質、配列番号８の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１を含む配列から産生されるｖｐ２タンパク質、または配列番号９の少なくとも約１３８～７３６のアミノ酸の予測アミノ酸配列をコードする配列番号８の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１に対して少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質、ならびに／あるいは配列番号９の少なくとも約２０３～７３６のアミノ酸の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３タンパク質、配列番号８の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１を含む配列から産生されるｖｐ３タンパク質、または配列番号９の少なくとも約２０３～７３６のアミノ酸の予測アミノ酸配列をコードする配列番号８の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１に対して少なくとも
７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質を含む。

【0110】

ＡＡＶｈｕ６８のｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質は、典型的には、配列番号９の全長ｖｐ１アミノ酸配列（アミノ酸１～７３６）をコードする同じ核酸配列によってコードされる選択的スプライシングバリアントとして発現される。任意選択的に、ｖｐ１コード配列は、ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質を発現するために単独で使用される。代替的に、この配列は、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）および／またはｖｐ２固有領域（約ａａ１～約ａａ２０２）を有しない配列番号９のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３アミノ酸配列（約ａａ２０３～７３６）をコードする核酸配列、またはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（配列番号８の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１）、または配列番号９のａａ２０３～７３６をコードする配列番号８に対して少なくとも７０％～少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％）同一の配列のうちの１つ以上と共発現され得る。追加的に、または代替的に、ｖｐ１コード配列および／またはｖｐ２コード配列は、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約１３７）を有しない配列番号９のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２アミノ酸配列（約ａａ１３８～７３６）をコードする核酸配列、またはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（配列番号８のｎｔ４１２～２２１２１）、または配列番号９の約ａａ１３８～７３６をコードする配列番号８に対して少なくとも７０％～少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％）同一の配列と共発現され得る。

【0111】

本明細書に記載されるように、ｒＡＡＶｈｕ６８は、配列番号９のｖｐ１アミノ酸配列をコードするＡＡＶｈｕ６８核酸配列、および任意選択的に、追加の核酸配列（例えば、ｖｐ１および／またはｖｐ２固有領域を含まないｖｐ３タンパク質をコードする配列）由来のカプシドを発現する産生システムで産生されたｒＡＡＶｈｕ６８カプシドを有する。単一の核酸配列ｖｐ１を使用した産生から得られたｒＡＡＶｈｕ６８は、ｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質、およびｖｐ３タンパク質の異種集合体を産生する。より具体的には、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、およびｖｐ３タンパク質内に部分集合体を含有し、配列番号９の予測アミノ酸残基からの修飾を有する。これらの部分集合体は、少なくとも脱アミド化アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）残基を含む。例えば、アスパラギン－グリシン対中のアスパラギンは、高度に脱アミド化されている。

【0112】

一実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１核酸配列は、配列番号８の配列、またはそれに相補的な鎖、例えば、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡを有する。特定の実施形態では、ｖｐ２および／またはｖｐ３タンパク質は、追加的または代替的に、例えば、選択された発現系においてｖｐタンパク質の比を変化させるために、ｖｐ１とは異なる核酸配列から発現され得る。特定の実施形態では、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）および／またはｖｐ２固有領域（約ａａ１～約ａａ２０２）を有しない配列番号９のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３アミノ酸配列（約ａａ２０３～７３６）もしくはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（配列番号８の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１）をコードする核酸配列も提供される。特定の実施形態では、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）を有しない配列番号９のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２アミノ酸配列（約ａａ１３８～７３６）、またはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（配列番号８のｎｔ４１２～２２１１）をコードする核酸配列も提供される。

【0113】

しかしながら、配列番号９のアミノ酸配列をコードする他の核酸配列は、ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドの産生に使用するために選択され得る。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号８の核酸配列、または配列番号８に対して少なくとも７０％～９９％同一、少な
くとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号９をコードする。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号８の核酸配列、または配列番号８の約ｎｔ４１２～約ｎｔ２２１１に対して少なくとも７０％～９９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号９のｖｐ２カプシドタンパク質（約ａａ１３８～７３６）をコードする。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号８の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１の核酸配列、または配列番号８のｎｔに対して少なくとも７０％～９９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号９のｖｐ３カプシドタンパク質（約ａａ２０３～７３６）をコードする。

【0114】

特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号８の核酸配列、または本明細書に記載の修飾（例えば、脱アミド化アミノ酸）を含む配列番号９のｖｐ１アミノ酸配列をコードする少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％の配列を使用して産生される。特定の実施形態では、ｖｐ１アミノ酸配列は、配列番号９に再現される。

【0115】

本明細書で使用される場合、ｖｐカプシドタンパク質を参照するために使用される場合、「異種」という用語またはその任意の文法的変形は、例えば、異なる修飾アミノ酸配列を有するｖｐ１、ｖｐ２、またはｖｐ３モノマー（タンパク質）を有する、同じではないエレメントからなる集合体を指す。配列番号９は、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質のコードされたアミノ酸配列を提供する。ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質（代替的にアイソフォームと称される）に関連して使用される「異種」という用語は、カプシド内のｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質のアミノ酸配列の違いを指す。ＡＡＶカプシドは、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、およびｖｐ３タンパク質内に部分集合体を含み、予測アミノ酸残基からの修飾を有する。これらの部分集合体は、少なくとも特定の脱アミド化アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）残基を含む。例えば、特定の部分集合体は、アスパラギン－グリシン対中の少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの高度脱アミド化アスパラギン（Ｎ）位置を含み、任意選択的に他の脱アミド化アミノ酸をさらに含み、脱アミド化は、アミノ酸変化および他の任意選択的な修飾をもたらす。

【0116】

本明細書で使用される場合、ｖｐタンパク質の「部分集合体」は、別途指定されない限り、少なくとも１つの定義された共通の特徴を有し、少なくとも１つの群メンバーから参照群のすべてのメンバーよりも少ないメンバーからなるｖｐタンパク質の群を指す。

【0117】

例えば、ｖｐ１タンパク質の「部分集合体」は、別途指定されない限り、組み立てられたＡＡＶカプシド中の少なくとも１つの（１）ｖｐ１タンパク質であり、すべてのｖｐ１タンパク質未満である。ｖｐ３タンパク質の「部分集合体」は、別途指定されない限り、１つの（１）ｖｐ３タンパク質から、組み立てられたＡＡＶカプシド中のすべてのｖｐ３タンパク質よりも少ないものまでであり得る。例えば、ｖｐ１タンパク質は、ｖｐタンパク質の部分集合体であってもよく、ｖｐ２タンパク質は、ｖｐタンパク質の別個の部分集合体であってもよく、ｖｐ３はさらに、組み立てられたＡＡＶカプシド中のｖｐタンパク質のさらなる部分集合体であってもよい。別の例では、ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質は、例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの高度脱アミド化アスパラギン、例えば、アスパラギン－グリシン対で異なる修飾を有する部分集合体を含有し得る。

【0118】

別途指定されない限り、高度脱アミド化は、参照アミノ酸位置での予測アミノ酸配列と
比較して、参照アミノ酸位置での少なくとも４５％の脱アミド化、少なくとも５０％の脱アミド化、少なくとも６０％の脱アミド化、少なくとも６５％の脱アミド化、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または最大約１００％の脱アミド化を指す（例えば、配列番号９［ＡＡＶｈｕ６８］の番号付けに基づくアミノ酸５７のアスパラギンの少なくとも８０％が、ｖｐ１タンパク質の合計に基づいて脱アミド化され得るか、または合計ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質の合計に基づいて脱アミド化され得る）。かかるパーセンテージは、２Ｄゲル、質量分析技術、または他の好適な技術を使用して決定され得る。

【0119】

ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質において、４個の残基（Ｎ５７、Ｎ３２９、Ｎ４５２、Ｎ５１２）は、様々なロットにわたって７０％を超える脱アミド化レベルを日常的に示し、ほとんどの場合、９０％を超える。

【0120】

さらなるアスパラギン残基（Ｎ９４、Ｎ２５３、Ｎ２７０、Ｎ３０４、Ｎ４０９、Ｎ４７７、およびＱ５９９）も、様々なロットにわたって最大約２０％の脱アミド化レベルを示す。脱アミド化レベルは、最初にトリプシン消化を使用して特定され、キモトリプシン消化で検証された。

【0121】

ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、およびｖｐ３タンパク質内に部分集合体を含有し、配列番号９の予測アミノ酸残基からの修飾を有する。これらの部分集合体は、少なくとも特定の脱アミド化アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）残基を含む。例えば、特定の部分集合体は、配列番号９のアスパラギン－グリシン対中に少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの高度脱アミド化アスパラギン（Ｎ）位置を含み、任意選択的に、他の脱アミド化アミノ酸をさらに含み、脱アミド化は、アミノ酸の変化および他の任意選択的な修飾をもたらす。

【0122】

特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ９１カプシドを有するｒＡＡＶが提供される。ＡＡＶｒｈ９１カプシドをコードする核酸配列は、配列番号２７に提供され、コードされたアミノ酸配列は、配列番号２８に提供される。ＡＡＶｒｈ９１（配列番号２８）のｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３のうちの少なくとも１つを含むｒＡＡＶが本明細書で提供される。また、ＡＡＶｒｈ９１（配列番号２７）のｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３のうちの少なくとも１つによってコードされるＡＡＶカプシドを含むｒＡＡＶも本明細書で提供される。なお別の実施形態では、ＡＡＶｒｈ９１アミノ酸配列をコードする核酸配列は、配列番号２９に提供され、コードされたアミノ酸配列は、配列番号２８に提供される。また、ＡＡＶｒｈ９１ｅｎｇ（配列番号２９）のｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３のうちの少なくとも１つによってコードされるＡＡＶカプシドを含むｒＡＡＶも本明細書で提供される。特定の実施形態では、ｖｐ１、ｖｐ２、および／またはｖｐ３は、ＡＡＶｒｈ９１（配列番号２８）の全長カプシドタンパク質である。他の実施形態では、ｖｐ１、ｖｐ２、および／またはｖｐ３は、Ｎ末端および／またはＣ末端トランケーション（例えば、約１～約１０個のアミノ酸の切断）を有する。

【0123】

特定の実施形態では、ｒＡＡＶであって、（Ａ）ＡＡＶｒｈ９１カプシドであって、（１）配列番号２８の１～７３６の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるｖｐ１タンパク質、配列番号２７から産生されるｖｐ１タンパク質、または配列番号２８の１～７３６の予測アミノ酸配列をコードする配列番号２７に対して少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ９１ ｖｐ１タンパク質の異種集合体、配列番号２８の少なくとも約１３８～７３６のアミノ酸の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるｖｐ２タンパク質、配列番号２７の少なくともヌクレオチド４１２～２２０８を含む配列から産生
されるｖｐ２タンパク質、または配列番号２８の少なくとも約１３８～７３６のアミノ酸の予測アミノ酸配列をコードする配列番号２７の少なくともヌクレオチド４１２～２２０８に対して少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ９１ ｖｐ２タンパク質の異種集合体、配列番号２８の少なくとも約２０３～７３６のアミノ酸の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現から産生されるｖｐ３タンパク質、配列番号２７の少なくともヌクレオチド６０７～２２０８を含む配列から産生されるｖｐ３タンパク質、または配列番号２８の少なくとも約２０３～７３６のアミノ酸の予測アミノ酸配列をコードする配列番号２７の少なくともヌクレオチド６０７～２２０８に対して少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ９１ ｖｐ３タンパク質の異種集合体を含むＡＡＶｒｈ９１カプシドタンパク質、ならびに／あるいは（２）配列番号２８のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ１タンパク質の異種集合体、配列番号２８の少なくとも約１３８～７３６のアミノ酸のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ２タンパク質の異種集合体、および配列番号２８の少なくとも約２０３～７３６のアミノ酸をコードする核酸配列の産物であるｖｐ３タンパク質の異種集合体であって、ｖｐ１、ｖｐ２およびｖｐ３タンパク質が、配列番号２８のアスパラギン－グリシン対中の少なくとも２つの高度脱アミド化アスパラギン（Ｎ）を含むアミノ酸修飾を有する部分集合体を含有し、任意選択的に、他の脱アミド化アミノ酸を含む部分集合体をさらに含み、脱アミド化が、アミノ酸の変化をもたらすもののうちの１つ以上を含むＡＡＶｒｈ９１カプシドと、（Ｂ）ＡＡＶｒｈ９１カプシド中のベクターゲノムであって、ベクターゲノムが、ＡＡＶ逆位末端反復配列を含む核酸分子、および宿主細胞中で産物の発現を指示する配列と作動可能に連結される産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列を含む、ベクターゲノムと、を含む、ｒＡＡＶが提供される。

【0124】

なお別の実施形態では、組換えアデノ随伴ウイルスｒＡＡＶであって、（Ａ）ＡＡＶｒｈ９１カプシドであって、（１）配列番号２８の１～７３６の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるｖｐ１タンパク質、配列番号２９から産生されるｖｐ１タンパク質、または配列番号２８の１～７３６の予測アミノ酸配列をコードする配列番号２８に対して少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ９１ ｖｐ１タンパク質の異種集合体、配列番号２８の少なくとも約１３８～７３６のアミノ酸の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるｖｐ２タンパク質、配列番号２９の少なくともヌクレオチド４１２～２２０８を含む配列から産生されるｖｐ２タンパク質、または配列番号２８の少なくとも約１３８～７３６のアミノ酸の予測アミノ酸配列をコードする配列番号２９の少なくともヌクレオチド４１２～２２０８に対して少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ９１ ｖｐ２タンパク質の異種集合体、配列番号２８の少なくとも約２０３～７３６のアミノ酸の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現から産生されるｖｐ３タンパク質、配列番号２９の少なくともヌクレオチド６０７～２２０８を含む配列から産生されるｖｐ３タンパク質、または配列番号２８の少なくとも約２０３～７３６のアミノ酸の予測アミノ酸配列をコードする配列番号２８の少なくともヌクレオチド６０７～２２０８に対して少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ９１ ｖｐ３タンパク質の異種集合体を含むＡＡＶｒｈ９１カプシドタンパク質、ならびに／あるいは（２）配列番号２８のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ１タンパク質の異種集合体、配列番号２８の少なくとも約１３８～７３６のアミノ酸のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ２タンパク質の異種集合体、および配列番号２８の少なくとも約２０３～７３６のアミノ酸をコードする核酸配列の産物であるｖｐ３タンパク質の異種集合体であって、ｖｐ１、ｖｐ２およびｖｐ３タンパク質が、配列番号２８のアスパラギン－グリシン対中の少なくとも２つの高度脱アミド化アスパラギン（Ｎ）を含むアミノ酸修飾を有する部分集合体を含有し、任意選択的に、他の脱アミド化アミノ酸を含む部分集合体をさ
らに含み、脱アミド化が、アミノ酸の変化をもたらすもののうちの１つ以上を含むＡＡＶｒｈ９１カプシドと、（Ｂ）ＡＡＶｒｈ９１カプシド中のベクターゲノムであって、ベクターゲノムが、ＡＡＶ逆位末端反復配列を含む核酸分子、および宿主細胞中で産物の発現を指示する配列と作動可能に連結される産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列を含む、ベクターゲノムと、を含む、組換えアデノ随伴ウイルスｒＡＡＶが提供される。

【0125】

特定の実施形態では、提供されるｒＡＡＶは、配列番号２８のアスパラギン－グリシン対中の少なくとも２つの高度脱アミド化アスパラギン（Ｎ）を含むアミノ酸修飾を有するＡＡＶｒｈ９１のｖｐ１、ｖｐ２およびｖｐ３部分集合体を有し、任意選択的に、他の脱アミド化アミノ酸を含む部分集合体をさらに含み、脱アミド化が、アミノ酸の変化をもたらす。配列番号２８の数と比較して、Ｎ－Ｇ対Ｎ５７、Ｎ３８３、および／またはＮ５１２で高レベルの脱アミド化が観察される。特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ９１は、例えば、典型的には１０％未満で脱アミド化された他の残基を有していてもよく、および／またはリン酸化（例えば、存在する場合、約２～約３０％、もしくは約２～約２０％、もしくは約２～約１０％の範囲）（例えば、Ｓ１４９で）、または酸化（例えば、ほぼＷ２２、ほぼＭ２１１、Ｗ２４７、Ｍ４０３、Ｍ４３５、Ｍ４７１、Ｗ４７８、Ｗ５０３、ほぼＭ５３７、ほぼＭ５４１、ほぼＭ５５９、ほぼＭ５９９、Ｍ６３５、および／またはＷ６９５のうちの１つ以上で）を含む他の修飾を有していてもよい。任意選択的に、Ｗは、キヌレニンに酸化され得る。

【表3】

【0126】

特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ９１カプシドは、トリプシン酵素を用いた質量分析を使用して決定される場合、上記の表で特定された位置のうちの１つ以上で、以下に提供する範囲で修飾される。特定の実施形態では、以下の位置、またはＮに続くグリシンのうちの１つ以上は、本明細書に記載されるように修飾される。残基番号は、本明細書に提供されるＡＡＶｒｈ９１配列に基づく。配列番号２８を参照されたい。

【0127】

特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ９１カプシドは、配列番号２８のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ１タンパク質の異種集合体と、配列番号２８の少なくとも約１３８～７３６のアミノ酸のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ２タンパク質の異種集合体と、配列番号２８の少なくともアミノ酸２０３～７３６をコード
する核酸配列の産物であるｖｐ３タンパク質の異種集合体とを含む。

【0128】

特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ９１ ｖｐ１カプシドタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号２７に提供される。他の実施形態では、配列番号２７に対して７０％～９９．９％の同一性を有する核酸配列を選択して、ＡＡＶｒｈ９１カプシドタンパク質を発現させ得る。特定の他の実施形態では、核酸配列は、配列番号２７に対して少なくとも約７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％～９９．９％同一である。しかしながら、配列番号２８のアミノ酸配列をコードする他の核酸配列は、ｒＡＡＶカプシドの産生に使用するために選択され得る。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号２７の核酸配列、または配列番号２７に対して少なくとも７０％～９９．９％同一、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号２８をコードする。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号２７の核酸配列、または配列番号２７の約ｎｔ４１２～約ｎｔ２２０８に対して少なくとも７０％～９９．９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号２８のｖｐ２カプシドタンパク質（約ａａ１３８～７３６）をコードする。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号２７の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２０８の核酸配列、または配列番号２７の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２０８に対して少なくとも７０％～９９．９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号２８のｖｐ３カプシドタンパク質（約ａａ２０３～７３６）をコードする。

【0129】

特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ９１ ｖｐ１カプシドタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号２９に提供される。他の実施形態では、配列番号２９に対して７０％～９９．９％の同一性を有する核酸配列を選択して、ＡＡＶｒｈ９１カプシドタンパク質を発現させ得る。特定の他の実施形態では、核酸配列は、配列番号２９に対して少なくとも約７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％～９９．９％同一である。しかしながら、配列番号２８のアミノ酸配列をコードする他の核酸配列は、ｒＡＡＶカプシドの産生に使用するために選択され得る。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号２９の核酸配列、または配列番号２９に対して少なくとも７０％～９９．９％同一、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号２８をコードする。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号２９の核酸配列、または配列番号２９の約ｎｔ４１２～約ｎｔ２２０８に対して少なくとも７０％～９９．９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号２８のｖｐ２カプシドタンパク質（約ａａ１３８～７３６）をコードする。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号２９の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２０８の核酸配列、または配列番号２９のｎｔ６０７～約ｎｔ２２０８に対して少なくとも７０％～９９．９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号２８のｖｐ３カプシドタンパク質（約ａａ２０３～７３６）をコードする。

【0130】

本発明はまた、本明細書で特定される脱アミド化または他の修飾を低減させるために１つ以上の残基が改変されている、ＡＡＶｒｈ９１カプシド配列（配列番号２８）または変異体ＡＡＶｒｈ９１をコードする核酸配列も包含する。かかる核酸配列は、変異体ＡＡＶｒｈ９１カプシドの産生において使用することができる。

【0131】

特定の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶは、自己相補性ＡＡＶである。略称「ｓｃ」は、自己相補性（ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）を指す。「自己相補性ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸配列によって担持されるコード領域が、分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計されている構築物を指す。感染の際、第２の鎖の細胞介在性の合成を待つのではなく、ｓｃＡＡＶの２つの相補性の半分が会合して、即時の複製および転写が可能な１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ユニットを形成する。例えば、Ｄ
Ｍ ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，“Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，（Ａｕｇｕｓｔ ２００１），Ｖｏｌ ８，Ｎｕｍｂｅｒ １６，Ｐａｇｅｓ１２４８－１２５４を参照されたい。自己相補性ＡＡＶは、例えば、米国特許第６，５９６，５３５号、同第７，１２５，７１７号、および同第７，４５６，６８３号に記載されており、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0132】

特定の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶは、ヌクレアーゼ耐性である。かかるヌクレアーゼは、単一のヌクレアーゼ、またはヌクレアーゼの混合物であり得、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼであり得る。ヌクレアーゼ耐性ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシドが完全に組み立てられたことを示し、産生プロセスから存在し得る汚染核酸を除去するために設計されたヌクレアーゼインキュベーションステップ中の分解（消化）から、これらのパッケージングされたゲノム配列を保護する。多くの場合、本明細書に記載のｒＡＡＶは、ＤＮａｓｅ耐性である。

【0133】

本明細書に記載のｒＡＡＶにおける組成物が、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態、および方法に適用されるように意図されることを理解されたい。

【0134】

ｒＡＡＶ．ｈＩＤＵＡウイルス粒子の産生
本発明は、本明細書に記載のｒＡＡＶ．ｈＩＤＵＡ薬学的組成物および製剤の製造を提供する。本明細書に記載される遺伝子療法ベクターを製造するための方法は、当該分野においてよく知られている方法、例えば、遺伝子療法ベクターの産生のために使用されるプラスミドＤＮＡの生成、ベクターの生成、およびベクターの精製を含む。

【0135】

本明細書に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、既知の技術を使用して生成されてもよい。例えば、ＷＯ２００３／０４２３９７、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、ＵＳ７５８８７７２（Ｂ２）を参照されたい。かかる方法は、宿主細胞を培養することを含み、宿主細胞は、ＡＡＶカプシドをコードする核酸配列、機能的なｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接する本明細書に記載される発現カセット、および発現カセットをＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージングするのを可能にする十分なヘルパー機能を含む。また、ＡＡＶカプシドをコードする核酸配列、機能的なｒｅｐ遺伝子、記載されるベクターゲノム、およびベクターゲノムをＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージングすることを可能にする十分なヘルパー機能を含有する、宿主細胞も本明細書に提供される。一実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。これらの方法は、ＷＯ２０１７／１６０３６０（Ａ２）にさらに詳細に記載されている（参照により本明細書に組み込まれる）。

【0136】

一部の実施形態では、遺伝子療法ベクターは、ＡＡＶベクターであり、生成されたプラスミドは、ＡＡＶゲノムおよび目的の遺伝子をコードするＡＡＶシス－プラスミド、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶトランス－プラスミド、およびアデノウイル
スヘルパープラスミドである。ベクター生成プロセスは、細胞培養の開始、細胞の継代、細胞の播種、プラスミドＤＮＡによる細胞のトランスフェクション、トランスフェクション後の無血清培地への培地交換、ベクター含有細胞および培養培地の回収などの方法ステップを含み得る。回収されたベクター含有細胞および培養培地は、本明細書では粗細胞回収物と称される。

【0137】

粗細胞回収物は、その後、ベクター回収物の濃縮、ベクター回収物の透析濾過、ベクター回収物の顕微溶液化、ベクター回収物のヌクレアーゼ消化、顕微溶液化された中間体の濾過、クロマトグラフィーによる粗精製、超遠心分離による粗精製、接線流濾過による緩衝液交換、および／またはバルクベクターを調製するための製剤化および濾過などの、方法ステップに供される。

【0138】

２ステップの高塩濃度でのアフィニティクロマトグラフィー精製、続いて、アニオン交換樹脂クロマトグラフィーを使用して、ベクター薬物製品を精製し、空のカプシドを除去する。これらの方法は、「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ
ｆｏｒ ＡＡＶ９」と題するＷＯ２０１７／１６０３６０にさらに詳細に記載されている（参照により本明細書に組み込まれる）。簡潔には、パッケージングされたゲノム配列を有するｒＡＡＶ９粒子を、ゲノム欠損ＡＡＶ９中間体から分離するための方法は、組換えＡＡＶ９ウイルス粒子およびＡＡＶ９カプシド中間体を含む懸濁液を、高性能液体クロマトグラフィーに供することを伴い、ＡＡＶ９ウイルス粒子およびＡＡＶ９中間体を、１０．２のｐＨで平衡化された強アニオン交換樹脂に結合させ、約２６０および約２８０での紫外吸光度について溶出液をモニタリングしながら、塩勾配に供する。ｒＡＡＶ９には最適とはいえないが、ｐＨは約１０．０～１０．４の範囲であり得る。この方法では、ＡＡＶ９完全カプシドは、Ａ２６０／Ａ２８０の比が変曲点に到達した場合に溶出するフラクションから回収される。一実施例では、アフィニティクロマトグラフィーステップのために、ダイアフィルトレーションされた産物を、ＡＡＶ２／９血清型を効率的に捕捉するＣａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｏｒｏｓ－ＡＡＶ２／９アフィニティ樹脂（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に適用してもよい。これらのイオン条件下、かなりのパーセンテージの残留細胞ＤＮＡおよびタンパク質が、カラムの中を流れ、ＡＡＶ粒子が、効率的に捕捉される。

【0139】

当業者に利用可能なｒＡＡＶの他の産生方法も利用することができる。好適な方法は、バキュロウイルス発現系または酵母を介した産生を含み得るが、これらに限定されない。例えば、Ｒｏｂｅｒｔ Ｍ．Ｋｏｔｉｎ，Ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｈｕｍ
Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０１１ Ａｐｒ １５；２０（Ｒ１）：Ｒ２－Ｒ６．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１１ Ａｐｒ ２９．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄｒ１４１、Ａｕｃｏｉｎ ＭＧ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｔｒｉｐｌｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２００６ Ｄｅｃ ２０；９５（６）：１０８１－９２、ＳＡＭＩ Ｓ．ＴＨＡＫＵＲ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ．Ｔｈｅｓｉｓ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ Ｇｒａｄｕａｔｅ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｌｏｒｉｄａ，２０１２、Ｋｏｎｄｒａｔｏｖ Ｏ ｅｔ ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ Ｈｅａｄ－ｔｏ－Ｈｅａｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｄ ｉｎ Ｈｕｍａｎ ｖｅｒｓｕｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１７ Ａｕｇ １０．ｐｉｉ：Ｓ１
５２５－００１６（１７）３０３６２－３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２０１７．０８．００３．［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］、Ｍｉｅｔｚｓｃｈ Ｍ ｅｔ ａｌ，ＯｎｅＢａｃ ２．０：Ｓｆ９ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ｆｏｒ
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ１，ＡＡＶ２，ａｎｄ ＡＡＶ８ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｒｅｉｇｎ ＤＮＡ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１７ Ｆｅｂ；２８（１）：１５－２２．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１６．１６４．、Ｌｉ Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ
ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ－ｆｏｒｍ ｇｅｎｏｍｅｓ：ａ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ＤＮＡ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３ Ａｕｇ １；８（８）：ｅ６９８７９．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００６９８７９．Ｐｒｉｎｔ ２０１３、Ｇａｌｉｂｅｒｔ Ｌ ｅｔ
ａｌ，Ｌａｔｅｓｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ ｔｏｗａｒｄ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｊ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ Ｐａｔｈｏｌ．２０１１ Ｊｕｌ；１０７ Ｓｕｐｐｌ：Ｓ８０－９３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｉｐ．２０１１．０５．００８、およびＫｏｔｉｎ ＲＭ，Ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０１１ Ａｐｒ １５；２０（Ｒ１）：Ｒ２－６．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄｒ１４１．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ａｐｒ ２９を参照されたい。

【0140】

ｒＡＡＶの特徴付けまたは定量化のための従来の方法は、当業者に利用可能である。空および充填粒子の含有量を算出するために、選択された試料（例えば、本明細書の実施例では、イオジキサノール勾配で精製された調製物、ここで、ＧＣの数＝粒子の数）についてのＶＰ３バンド容量が、ロードされたＧＣ粒子に対してプロットされる。得られた線形方程式（ｙ＝ｍｘ＋ｃ）を用いて、試験物ピークのバンド容量中の粒子の数を算出する。次いで、ロードした２０μＬあたりの粒子の数（ｐｔ）に５０を掛けて、粒子（ｐｔ）／ｍＬを得る。Ｐｔ／ｍＬをＧＣ／ｍＬで割って、ゲノムコピーに対する粒子の比（ｐｔ／ＧＣ）を得る。Ｐｔ／ｍＬ－ＧＣ／ｍＬは、空ｐｔ／ｍＬを与える。空ｐｔ／ｍＬをｐｔ／ｍＬで割って、次いで１００を掛けることよって、空粒子のパーセンテージを得る。一般に、空のカプシドおよびパッケージングされたゲノムを含むＡＡＶベクター粒子をアッセイするための方法は、当該分野において既知である。例えば、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９）６：１３２２－１３３０、Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．（２００３）７：１２２－１２８を参照されたい。変性したカプシドについて試験するために、本方法は、３つのカプシドタンパク質を分離することができる任意のゲル（例えば、緩衝液中に３～８％のＴｒｉｓ－アセテートを含む勾配ゲル）からなるＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動に処理済みＡＡＶストックを供し、次いで、試料材料が分離するまでゲルを泳動し、ナイロンまたはニトロセルロースの膜（好ましくは、ナイロン）にゲルをブロットすることを含む。抗－ＡＡＶカプシド抗体は、次いで、変性したカプシドタンパク質、好ましくは、抗－ＡＡＶカプシドモノクローナル抗体、最も好ましくは、Ｂ１抗－ＡＡＶ－２モノクローナル抗体に結合する一次抗体として使用される（Ｗｏｂｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒａｌ．（２０００）７４：９２８１－９２９３）。次いで、一次抗体に結合し、一次抗体、より好ましくは、抗体に共有結合した検出分子を含有する抗－ＩｇＧ抗体、最も好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合したヒツジ抗－マウスＩｇＧ抗体との結合を検出するための手段を含む、二次抗体が使用される。一次抗体と二次抗体との間の結合を半定量的に決定するために、結合を検出するための方法が使用され、好ましくは、放射性アイソトープ放射、
電磁放射、または比色変化を検出することができる検出方法、最も好ましくは、化学発光検出キットが使用される。例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、カラムフラクションからの試料を取って、還元剤（例えば、ＤＴＴ）を含有するＳＤＳ－ＰＡＧＥ充填緩衝液中で加熱することができ、カプシドタンパク質は、プレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル（例えば、Ｎｏｖｅｘ）中で分解された。ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を製造元の指示に従って用いて、銀染色を実施してもよく、または他の適切な染色方法、すなわち、ＳＹＰＲＯルビーもしくはクーマシー染色を実施してもよい。一実施形態では、カラムフラクション中のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の濃度は、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）により測定されることができる。試料は希釈され、ＤＮａｓｅ Ｉ（または別の適切なヌクレアーゼ）で消化されて、外因性ＤＮＡが除去される。ヌクレアーゼの不活化後、試料はさらに希釈され、プライマーおよびプライマー間のＤＮＡ配列に特異的なＴａｑＭａｎ（商標）蛍光発生プローブを用いて増幅される。規定レベルの蛍光（閾値サイクル、Ｃｔ）に到達するのに必要とされるサイクル数は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出システム上で各試料について測定される。ＡＡＶベクター中に含有されるものと同一の配列を含有するプラスミドＤＮＡを利用して、Ｑ－ＰＣＲ反応における標準曲線を作成する。試料から得られたサイクル閾値（Ｃｔ）値を用いて、プラスミド標準曲線のＣｔ値に対してそれを正規化することにより、ベクターゲノム力価を決定する。デジタルＰＣＲに基づくエンドポイントアッセイも使用されることができる。

【0141】

一態様では、広域スペクトルのセリンプロテアーゼ、例えば、プロテイナーゼＫ（例えば、Ｑｉａｇｅｎから商業的に入手可能なもの）を利用する最適化されたｑ－ＰＣＲ方法が使用される。より具体的には、最適化されたｑＰＣＲゲノム力価アッセイは、ＤＮａｓｅ Ｉ消化の後に、試料をプロテアーゼＫ緩衝液で希釈し、プロテアーゼＫで処理し、続いて、熱失活させることを除き、標準的なアッセイと同様である。適切には、試料は、試料サイズと等しい量のプロテアーゼＫ緩衝液で希釈される。プロテアーゼＫ緩衝液は、２倍以上に濃縮されてもよい。典型的には、プロテアーゼＫ処理は、約０．２ｍｇ／ｍＬであるが、０．１ｍｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬで変動し得る。処理ステップは、一般に、約５５℃で約１５分間実施されるが、より低い温度で（例えば、約３７℃～約５０℃）より長い時間にわたって（例えば、約２０分間～約３０分間）、またはより高い温度で（例えば、最高約６０℃）より短い時間にわたって（例えば、約５～１０分間）実施されてもよい。同様に、熱失活は、一般に、約９５℃で約１５分間であるが、温度を下げてもよく（例えば、約７０～約９０℃）、時間を延ばしてもよい（例えば、約２０分間～約３０分間）。次いで、試料は希釈され（例えば、１０００倍）、標準アッセイで記載されるように、ＴａｑＭａｎ分析に供される。

【0142】

追加的に、または代替的に、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）が使用されてもよい。例えば、ｄｄＰＣＲによる一本鎖および自己相補的なＡＡＶベクターゲノム力価を測定するための方法が記載されている。例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４を参照されたい。

【0143】

また、カプシドタンパク質のｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３の比を決定する方法も利用可能である。例えば、Ｖａｍｓｅｅｄｈａｒ Ｒａｙａｐｒｏｌｕ ｅｔ ａｌ，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｃａｐｓｉｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１３ Ｄｅｃ；８７（２４）：１３１５０－１３１６０、Ｂｕｌｌｅｒ ＲＭ，Ｒｏｓｅ ＪＡ．１９７８．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ
ｓ ｉｎ ＫＢ ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２５：３３１－３３８、およびＲｏｓｅ
ＪＡ，Ｍａｉｚｅｌ ＪＶ，Ｉｎｍａｎ ＪＫ，Ｓｈａｔｋｉｎ ＡＪ．１９７１．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８：７６６－７７０を参照されたい。

【0144】

本明細書に記載のｒＡＡＶの産生のための方法が、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態、および方法に適用されるように意図されることを理解されたい。

【0145】

薬学的組成物および製剤
特定の実施形態では、製剤緩衝液中に本明細書に記載されるベクター（例えばｒＡＡＶ）を含む薬学的組成物が本明細書で提供される。特定の実施形態では、薬学的組成物は、機能的ｈＩＤＵＡタンパク質（ＥＲＴ）（例えば、Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ（登録商標）（ラロニダーゼ）、Ｓａｎｏｆｉ Ｇｅｎｚｙｍｅ）との共投与に好適である。一実施形態では、製剤緩衝液中に本明細書に記載されるｒＡＡＶを含む薬学的組成物が提供される。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、約１×１０９ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍＬ～約１×１０１４ＧＣ／ｍＬで製剤化される。さらなる実施形態では、ｒＡＡＶは、約３×１０９ＧＣ／ｍＬ～約３×１０１３ＧＣ／ｍＬで製剤化される。なおさらなる実施形態では、ｒＡＡＶは、約１×１０９ＧＣ／ｍＬ～約１×１０１３ＧＣ／ｍＬで製剤化される。一実施形態では、ｒＡＡＶは、少なくとも約１×１０１１ＧＣ／ｍＬで製剤化される。

【0146】

特定の実施形態では、薬学的組成物は、非ウイルスベクター系におけるｈＩＤＵＡコード配列を有する発現カセットを含む。これには、例えば、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、無機粒子、脂質または脂質様粒子、キトサンベースの製剤、ならびに当該技術分野で既知のその他のものが含まれ得る。かかる非ウイルスベクター系は、例えば、プラスミドもしくは非ウイルス遺伝子エレメント、またはタンパク質ベースのベクターを含み得る。

【0147】

特定の実施形態では、薬学的組成物は、非複製ウイルスベクターを含む。好適なウイルスベクターは、任意の好適な送達ベクター、例えば、組換えアデノウイルス、組換えレンチウイルス、組換えボカウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、または別の組換えパルボウイルスなど、を含み得る。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、それを必要とする患者にｈＩＤＵＡを送達するための組換えＡＡＶである。

【0148】

一実施形態では、薬学的組成物は、ｈＩＤＵＡコード配列を含む発現カセットを含むベクターと、脳室内（ＩＣＶ）、髄腔内（ＩＴ）、大槽内、または静脈内（ＩＶ）注射を介した送達に好適な製剤緩衝液とを含む。一実施形態では、ｈＩＤＵＡコード配列を含む発現カセットは、パッケージングされた組換えＡＡＶ中にある。

【0149】

一実施形態では、薬学的組成物は、酵素補充療法（ＥＲＴ）として対象に送達するための機能的ｈＩＤＵＡポリペプチドまたはその機能的断片を含む。このような薬学的組成物は通常、静脈内投与されるがいくつかの状況において、皮内、筋肉内、または経口投与も可能である。本組成物は、ＭＰＳＩ、Ｈｕｒｌｅｒ、Ｈｕｒｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｅおよび／またはＳｃｈｅｉｅ症候群に罹患しているか、またはその危険性がある個体の予防的治療のために投与され得る。治療用途では、薬学的組成物は、確立された疾患に罹患している患者に、蓄積された代謝産物の濃度を低下させる、および／または代謝産物のさらなる蓄積を防止または阻止するのに十分な量で投与される。リソソーム酵素欠乏症の危険性がある個体については、薬学的組成物は、代謝産物の蓄積を防止または阻害するのに十分な量で予防的に投与される。本明細書に記載のｈＩＤＵＡタンパク質を含む薬学的組成物は、治療有効量で投与される。一般に、治療有効量は、対象における医学的状態の重症度、および対象の年齢、一般的状態、および性別に応じて変化し得る。投薬量は、医師によっ
て決定され得、観察された治療の効果に適合するように、必要に応じて調整され得る。一態様では、本明細書では、ｈＩＤＵＡタンパク質、またはその機能的断片の単位投薬量を含有するように製剤化されたＥＲＴのための薬学的組成物が提供される。

【0150】

特定の実施形態では、製剤は、水性懸濁液中に溶解した界面活性剤、防腐剤、賦形剤、および／または緩衝液をさらに含む。一実施形態では、緩衝液は、ＰＢＳである。別の実施形態では、緩衝液は、人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）、例えば、エリオット製剤緩衝液、またはハーバード装置灌流液（最終イオン濃度（ｍＭ単位で）：Ｎａ １５０、Ｋ ３．０、Ｃａ １．４、Ｍｇ ０．８、Ｐ １．０、Ｃｌ １５５の人工ＣＳＦ）である。様々な好適な溶液が既知であり、緩衝食塩水、界面活性剤、および生理学的に適合する塩、もしくは塩の混合物（イオン強度が約１００ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）～約２５０ｍＭの塩化ナトリウム相当に調整されたもの）、または同等のイオン濃度に調整された生理学的に適合する塩のうちの１つ以上を含む溶液を含む。

【0151】

好適には、製剤は、生理学的に許容されるｐＨ、例えば、ｐＨ６～８、またはｐＨ６．５～７．５、ｐＨ７．０～７．７、またはｐＨ７．２～７．８の範囲に調整される。脳脊髄液のｐＨは約７．２８～約７．３２であるので、髄腔内送達のためには、この範囲内のｐＨが望ましい可能性があるが、静脈内送達のためには、６．８～約７．２のｐＨが望ましい可能性がある。しかし、最も広い範囲内の他のｐＨ、およびこれらの部分範囲が、他の送達経路のために選択されてもよい。

【0152】

好適な界面活性剤または界面活性剤の組み合わせが、非毒性である非イオン界面活性剤の中から選択されてもよい。一実施形態では、例えば、中性ｐＨを有し、平均分子量８４００を有するＰｏｌｏｘａｍｅｒ １８８としても知られているＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８［ＢＡＳＦ］などの、一級ヒドロキシル基末端の二官能ブロックコポリマー界面活性剤が選択される。他の界面活性剤および他のポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖から構成される非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（マクロゴール－１５ヒドロキシステアラート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリン酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール、およびポリエチレングリコールが選択され得る。

【0153】

一実施形態では、製剤は、ポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは、一般に、文字「Ｐ」（ポロキサマーの）に続いて、３桁の数字を用いて命名され、初めの２桁の数字×１００は、ポリオキシプロピレンコアのおよその分子質量を与えるものであり、最後の数字×１０は、ポリオキシエチレン含有量のパーセンテージを与えるものである。一実施形態では、ポロキサマー１８８が選択される。界面活性剤は、懸濁液の最高約０．０００５％～約０．００１％の量で存在してもよい。

【0154】

一実施例では、製剤は、例えば、水中に塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、デキストロース、硫酸マグネシウム（例えば、硫酸マグネシウム・７Ｈ２Ｏ）、塩化カリウム、塩化カルシウム（例えば、塩化カルシウム・２Ｈ２Ｏ）、二塩基性リン酸ナトリウム、およびそれらの混合物のうちの１つ以上を含む、緩衝化食塩水溶液を含有することができる。好適には、髄腔内送達のためには、モル浸透圧濃度は、脳脊髄液と適合する範囲内（例えば、約２７５～約２９０）である、例えば、ｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｍｅｄｓｃａｐｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅ／２０９３３１６－ｏｖｅｒｖｉｅｗを参照されたい。任意選択的に、髄腔内送達のために、商業的に入手可能な希釈剤は、懸濁化剤として使用され得るか、または別の懸濁化剤および他の任意の賦形剤と組み合わせて使用され得る。例えば、Ｅｌｌｉｏｔｔｓ Ｂ（登録商標）溶液［Ｌｕｋａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ］を参照されたい
。

【0155】

特定の実施形態では、製剤は、１つ以上の透過促進剤を含有してもよい。好適な透過促進剤の例には、例えば、マンニトール、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、カプリル酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、またはＥＤＴＡが挙げられ得る。

【0156】

一実施形態では、本明細書に記載の緩衝溶液中にｒＡＡＶを含有する凍結された組成物が凍結された形態で提供される。任意選択的に、１つ以上の界面活性剤（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８）、安定化剤、または防腐剤が、この組成物中に存在する。適切には、使用のために、組成物は解凍され、適切な希釈剤、例えば、滅菌食塩水または緩衝化食塩水を用いて所望の用量に滴定される。

【0157】

特定の実施形態では、製剤（任意選択的に、凍結された）中に懸濁された濃縮されたベクターを含むキットが提供され、任意選択的な希釈緩衝液、ならびに髄腔内投与のために必要とされるデバイス、および他の構成要素が提供される。別の実施形態では、キットは、追加的にまたは代替的に、静脈内送達のための構成要素を含み得る。一実施形態では、キットは、注射を可能にするために、十分な緩衝液を提供する。そのような緩衝液は、濃縮されたベクターの約１：１～１：５希釈、またはそれより多くの希釈を可能にし得る。他の実施形態では、より多量もしくはより少量の緩衝液または滅菌水が含まれ、治療を行う医師により、用量滴定および他の調整が可能になる。さらに他の実施形態では、キットには、デバイスの１つ以上の構成要素が含まれる。

【0158】

特定の実施形態では、本明細書に記載されるベクター（例えばｒＡＡＶ）と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物が本明細書に提供される。本明細書で使用される場合、「担体」は、任意のおよびすべての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。薬学的活性物質に対するかかる媒体および薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補足有効成分を組成物中に組み込むこともできる。リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞などの送達ビヒクルが、本発明の組成物を好適な宿主細胞に導入するために使用され得る。

【0159】

特に、ｒＡＡＶベクターは、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、またはナノ粒子などに封入化された送達のいずれかのために製剤化され得る。一実施形態では、治療有効量の上述のベクターが、薬学的組成物に含まれる。担体の選択は、本発明を限定しない。防腐剤または化学安定化剤などの他の従来の薬学的に許容される担体。好適な例示的な防腐剤としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、およびパラクロロフェノールが含まれる。好適な化学安定化剤としては、ゼラチンおよびアルブミンが含まれる。

【0160】

「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されるときにアレルギーまたは類似の有害反応を生じない分子実体および組成物を指す。

【0161】

本明細書で使用される場合、「投薬量」または「量」という用語は、治療の過程で対象に送達される総投薬量または量、または単一の単位（または複数の単位または分割投薬）投与で送達される投薬量または量を指すことができる。

【0162】

一態様では、製剤緩衝液中に本明細書に記載されるウイルスベクター（例えば、ｒＡＶ
Ｖ）を含む薬学的組成物が本明細書に提供される。特定の実施形態では、組成物は、ヒト患者にとって、その範囲内のすべての整数または分数量、好ましくは１．０×１０^１２ＧＣ～１．０×１０^１４ＧＣを含め、約１．０×１０^９ＧＣ～約１．０×１０^１６ＧＣの範囲にある量の複製欠陥ウイルス（体重７０ｋｇの平均対象を治療するため）を含有するように投薬量単位で製剤化することができる。一実施形態では、組成物は、その範囲内のすべての整数または分数量を含め、用量当たり少なくとも１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、または９×１０^９ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、その範囲内のすべての整数または分数量を含め、用量当たり少なくとも１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、または９×１０^１０ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、その範囲内のすべての整数または分数量を含め、用量当たり少なくとも１×１０^１１、２×１０^１１、３×１０^１１、４×１０^１１、５×１０^１１、６×１０^１１、７×１０^１１、８×１０^１１、または９×１０^１１ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、その範囲内のすべての整数または分数量を含め、用量当たり少なくとも１×１０^１２、２×１０^１２、３×１０^１２、４×１０^１２、５×１０^１２、６×１０^１２、７×１０^１２、８×１０^１２、または９×１０^１２ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、その範囲内のすべての整数または分数量を含め、用量当たり少なくとも１×１０^１３、２×１０^１３、３×１０^１３、４×１０^１３、５×１０^１３、６×１０^１３、７×１０^１３、８×１０^１３、または９×１０^１３ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、その範囲内のすべての整数または分数量を含め、用量当たり少なくとも１×１０^１４、２×１０^１４、３×１０^１４、４×１０^１４、５×１０^１４、６×１０^１４、７×１０^１４、８×１０^１４、または９×１０^１４ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、その範囲内のすべての整数または分数量を含め、用量当たり少なくとも１×１０^１５、２×１０^１５、３×１０^１５、４×１０^１５、５×１０^１５、６×１０^１５、７×１０^１５、８×１０^１５、または９×１０^１５ＧＣを含むように製剤化される。一実施形態では、ヒト適用のために、用量は、その範囲内のすべての整数または分数量を含め、用量当たり１×１０^１０～約１×１０^１２ＧＣの範囲であり得る。

【0163】

一実施形態では、製剤緩衝液中に本明細書に記載されるｒＡＡＶを含む薬学的組成物が提供される。一実施形態では、ｒＡＡＶは、約１×１０^９ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍＬ～約１×１０^１４ＧＣ／ｍＬで製剤化される。さらなる実施形態では、ｒＡＡＶは、約３×１０^９ＧＣ／ｍＬ～約３×１０^１３ＧＣ／ｍＬで製剤化される。なおさらなる実施形態では、ｒＡＡＶは、約１×１０^９ＧＣ／ｍＬ～約１×１０^１３ＧＣ／ｍＬで製剤化される。一実施形態では、ｒＡＡＶは、少なくとも約１×１０^１１ＧＣ／ｍＬで製剤化される。一実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶを含む薬学的組成物は、脳質量１グラム当たり約１×１０^９ＧＣ～脳質量１グラムあたり約１×１０^１４ＧＣの用量で投与される。

【0164】

特定の実施形態では、組成物は、任意の好適な経路による送達のために、好適な水性懸濁媒体（例えば、緩衝生理食塩水）中に製剤化され得る。本明細書で提供される組成物は、高用量のウイルスベクターの全身送達に有用である。ｒＡＡＶの場合、高用量は、少なくとも１×１０^１３ＧＣ、または少なくとも１×１０^１４ＧＣであり得る。しかしながら、改善された安全性のために、本明細書に提供されるｍｉＲＮＡ配列は、他のより低い用量で送達される発現カセットおよび／またはベクターゲノムに含まれ得る。本明細書に記載の水性懸濁液または薬学的組成物は、任意の好適な経路または異なる経路の組み合わせによって、それを必要とする対象に送達されるように設計される。一実施形態では、薬学的組成物は、脳室内（ＩＣＶ）、髄腔内（ＩＴ）、または大槽内注射を介した送達用に製剤化される。一実施形態では、本明細書に記載の組成物は、静脈内（ＩＶ）注射によって、それを必要とする対象に送達するために設計される。代替的に、他の投与経路（例えば
、経口、吸入、鼻腔内、気管内、動脈内、眼内、筋肉内、および他の非経口経路）を選択してもよい。特定の実施形態では、組成物は、本質的に同時に２つの異なる経路によって送達される。

【0165】

本明細書で使用される場合、「髄腔内送達」または「髄腔内投与」という用語は、脊柱管への注射を介する、より具体的には、脳脊髄液（ＣＳＦ）へ到達するようにクモ膜下腔空間への注射による、薬物の投与経路を指す。髄腔内送達は、腰部穿刺、脳室内、後頭下／大槽内、および／またはＣ１－２穿刺を含み得る。例えば、材料は、腰部穿刺により、クモ膜下腔空間にわたって拡散させるために導入され得る。別の実施例では、注射は、大槽内（ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａ）であり得る。大槽内送達は、ベクター拡散を増加させ、および／または投与によって引き起こされる毒性および炎症を低減し得る。例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ
ｏｆ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＡＡＶ９ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１４；１：１４０５１．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１４ Ｄｅｃ １０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｍ．２０１４．５１を参照されたい。

【0166】

本明細書で使用される場合、「大槽内送達（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」または「大槽内投与（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」という用語は、小脳延髄槽内の脳脊髄液への直接的な薬物の投与経路、より詳細には、後頭下穿刺による、または大槽内への直接注射による、または永続的に配置されたチューブによる、薬物の投与経路を指す。

【0167】

本明細書に記載の薬学的組成物および製剤中の組成物が、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態、および方法に適用されるよう意図されることを理解されたい。

【0168】

治療方法
治療有効量の記載のｈＩＤＵＡを送達することを含む、ＭＰＳＩ、Ｈｕｒｌｅｒ、Ｈｕｒｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｅおよび／またはＳｃｈｅｉｅ症候群のための方法が本明細書で提供される。特に、本明細書では、本明細書に記載の治療有効量のｒＡＡＶ．ｈＩＤＵＡを、それを必要とする患者へ送達することを含む、ＭＰＳＩ、Ｈｕｒｌｅｒ、Ｈｕｒｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｅおよび／またはＳｃｈｅｉｅ症候群と診断された患者において神経認知低下を予防、治療、および／または緩和するための方法が提供される。本明細書に記載のｒＡＡＶ．ｈＩＤＵＡベクターの治療有効量は、以下の段落のうちのいずれか１つにおいて特定される症状のうち１つ以上を補正し得る。

【0169】

タンパク質、ペプチド、またはポリペプチド（例えば、免疫グロブリンとして）の配列決定方法は、当業者に既知である。タンパク質の配列が分ると、ウェブベースおよび市販のコンピュータプログラム、ならびにアミノ酸配列を核酸コード配列に逆翻訳するサービスベースの企業が存在する。例えば、ＥＭＢＯＳＳ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｔ／で利用可能）、Ｇｅｎｅ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（ｇｅｎｅｉｎｆｉｎｉｔｙ．ｏｒｇ／ｓｍｓ／ｓｍｓ＿ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．ｈｔｍｌで利用可能）、ＥｘＰａｓｙ（ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／で利用可能）による逆翻訳配列を参照されたい。一実施形態では、ＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡコード配列は、ヒト細胞における最適な発現のために設計される。

【0170】

特定の実施形態では、本明細書に提供される組成物は、所望の導入遺伝子産物を、患者
に送達するのに有用であり、一方で、後根神経節ニューロンにおける導入遺伝子発現を抑制するのに有用である。特定の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、髄腔内または全身的遺伝子療法投与後の神経変性を調節する、および／または二次背側脊髄軸索変性を低減するための方法に有用である。したがって、本明細書で提供される組成物は、ＣＮＳへの遺伝子療法の送達に特に有用であるが、それらは、例えば、高用量の遺伝子療法がＤＲＧ形質導入および毒性をもたらし得る全身ＩＶ送達を含む、他の送達経路にも有用であり得る。本方法は、導入遺伝子およびｍｉＲＮＡ標的を含む発現カセットまたはベクターゲノムを含む組成物を患者に送達することを伴う。

【0171】

特定の実施形態では、本方法は、ＤＲＧにおける導入遺伝子の発現レベルを抑制するために、ｍｉＲ－１８３標的配列を含む発現カセットまたはベクターゲノムを送達することを含む。特定の実施形態では、本方法は、ＤＲＧにおける導入遺伝子発現を抑制するのに有用な発現カセットまたはベクターゲノムを送達することを含み、発現カセットまたはベクターゲノムは、少なくとも２個のｍｉＲ１８３標的配列、少なくとも３個のｍｉＲ１８３標的配列、少なくとも４個のｍｉＲ１８３標的配列、少なくとも５個のｍｉＲ１８３標的配列、少なくとも６個のｍｉＲ１８３標的配列、少なくとも７個のｍｉＲ１８３標的配列、または少なくとも８個のｍｉＲ１８３標的配列を含む。特定の実施形態では、本方法は、ＤＲＧにおける導入遺伝子発現を抑制するのに有用な発現カセットまたはベクターゲノムを送達することを含み、発現カセットまたはベクターゲノムは、８個のｍｉＲ１８３標的配列を含む。特定の実施形態では、本方法は、錐体ニューロン、プルキンエニューロン、顆粒細胞、紡錘ニューロン、介在神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア、および／または上衣細胞のうちの１つ以上から選択される、ＣＮＳに存在する１つ以上の細胞における発現を増強する。

【0172】

特定の実施形態では、網膜、内耳、および嗅覚受容器の下位運動ニューロンにおける導入遺伝子の発現を送達および／または増強するのに有用な方法であって、１つ以上のｍｉＲ－１８３標的配列および／または複数のｍｉＲ－１８３標的配列に作動可能に連結された導入遺伝子を含む発現カセットまたはベクターゲノムを送達することを含む、方法が提供される。特定の実施形態では、細胞または組織は、肝臓または心臓のうちの１つ以上であり得る。

【0173】

なお別の実施形態では、ＣＮＳに存在する細胞に発現カセットまたはベクターゲノムを送達することを含む方法であって、発現カセットまたはベクターゲノムが、１つ以上のｍｉＲ－１８３標的配列を含み、導入遺伝子（すなわち、異種遺伝子産物をコードする配列）を欠く、方法が提供される。かかる実施形態では、ＣＮＳの細胞へのｍｉＲ－１８３の送達が達成される。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３配列を含む発現カセットまたはベクターゲノムの送達は、ＤＲＧ発現の抑制およびＣＮＳに存在する特定の他の細胞における遺伝子発現の増強をもたらす。

【0174】

特定の実施形態では、本明細書に提供される組成物は、ＣＮＳ以外の細胞における導入遺伝子の発現を増強するための方法に有用である。特定の実施形態では、ＣＮＳ以外の細胞における発現を増強するための方法は、ｍｉＲ－１８２標的配列を含む発現カセットまたはベクターゲノムを患者に送達することを含む。

【0175】

一実施形態では、懸濁液は、約６．８～約７．３２のｐＨを有する。

【0176】

これらの用量の送達に適切な容量および濃度は、当業者によって決定され得る。例えば、約１μＬ～１５０ｍＬの容量が選択されてもよいが、より高容量が、成人用に選択されてもよい。典型的に、乳幼児用に好適な容量は、約０．５ｍＬ～約１０ｍＬ、より年長の乳幼児用に、約０．５ｍＬ～約１５ｍＬが選択されてもよい。幼児のためには、約０．５
ｍＬ～約２０ｍＬの容量が選択されてもよい。子供用に、最大約３０ｍＬの容量が選択されてもよい。プレティーンおよびティーンには、最大約５０ｍＬの容量が選択されてもよい。さらに他の実施形態では、患者は、選択された約５ｍＬ～約１５ｍＬ、または約７．５ｍＬ～約１０ｍＬの容量で髄腔内投与を受けることができる。他の好適な容量および投薬量が決定されてもよい。任意の副作用に対する治療的利益のバランスをとるために、投薬量を調整してもよく、そのような投薬量は、組換えベクターが利用されるための治療用途に応じて変化し得る。

【0177】

一実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶを含む組成物は、脳質量１グラム当たり約１×１０^９ＧＣ～脳質量１グラム当たり約１×１０^１４ＧＣの用量で投与される。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、体重１ｋｇ当たり約１×１０^９ＧＣ～体重１ｋｇ当たり約１×１０^１３ＧＣの用量で全身に同時投与される。

【0178】

特定の実施形態では、対象に、治療有効量の、ｈＩＤＵＡ遺伝子産物およびｍｉＲＮＡ標的配列をコードする核酸配列を含み、標的細胞にｈＩＤＵＡを送達し、発現させ、かつＤＲＧ発現を特異的に非標的化する組成物を投与する。

【0179】

特定の実施形態では、ＡＡＶ．アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ（ＡＡＶ．ＩＤＵＡ）遺伝子療法ベクターは、ＩＤＵＡ遺伝子のコード配列（例えば、配列番号１４のｎｔ１９４３～３９０１を参照されたい）に作動可能に連結されたｍｉＲＮＡ１８３クラスター（ｍｉＲ－１８３、ｍｉＲ－１８２、およびｍｉＲ１８３標的配列、またはそれらの組み合わせを含む）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、もしくは少なくとも４つのｍｉＲ標的配列を含むベクターゲノムを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、複数コピーの同じｍｉＲ標的配列を含み、各々は、スペーサー（同じであってもよく、または互いに異なってもよい）によって分離されている。別の実施形態では、ベクターゲノムは、３～６コピーのｍｉＲ１８３クラスター標的配列を含み、任意選択的に、標的配列のうちの１つ以上は、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーに少なくとも約８０％～約９９％相補的である。別の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ１８３標的配列を、１、２、３、または４コピー含む。かかるベクターゲノムは、任意選択的に、ｍｉＲ１８３クラスターのメンバーに対応する追加の標的配列を含有し得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの単一のｍｉＲ標的配列を含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの２つのｍｉＲ標的配列、および任意選択的に、少なくとも１つのスペーサーを含有する。特定の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの３つのｍｉＲ標的配列、および任意選択的に、少なくとも２つのスペーサーを含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、互いに配列が異なるｍｉＲ１８３クラスターの２つ以上のｍｉＲ標的配列を含有する。特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターゲノムは、非ＡＡＶベクターによって担持される。

【0180】

一実施形態では、発現カセットは、ベクターゲノム中、その範囲およびエンドポイント内のすべての整数または分数量を含め、脳質量１グラム当たり約１×１０^９ＧＣ～脳質量１グラム当たり約１×１０^１３ゲノムコピー（ＧＣ）の量で送達される。別の実施形態では、投薬量は、脳質量１グラム当たり１×１０^１０ＧＣ～脳質量１グラム当たり約１×１０^１３ＧＣである。特定の実施形態では、患者に投与されるベクターの用量は、少なくとも約１．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約１．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約２．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約２．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約３．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約３．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約４．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約４．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約５．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約５．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約６．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約６．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約７．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約７．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約８．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約８．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約９．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約９．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約１．０×
１０^１０ＧＣ／ｇ、約１．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約２．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約２．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約３．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約３．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約４．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約４．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約５．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約５．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約６．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約６．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約７．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約７．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約８．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約８．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約９．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約９．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約１．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約１．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約２．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約２．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約３．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約３．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約４．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約４．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約５．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約５．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約６．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約６．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約７．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約７．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約８．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約８．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約９．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約９．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約１．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約１．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約２．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約２．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約３．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約３．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約４．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約４．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約５．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約５．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約６．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約６．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約７．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約７．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約８．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約８．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約９．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約９．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約１．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約１．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約２．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約２．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約３．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約３．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約４．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約４．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約５．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約５．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約６．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約６．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約７．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約７．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約８．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約８．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約９．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約９．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、または約１．０×１０^１４ＧＣ／ｇ脳質量である。

【0181】

特定の実施形態では、本明細書に提供されるｍｉＲ標的配列含有組成物は、患者が必要とする免疫抑制性併用療法の用量、持続時間、および／または量を最小限に抑える。現在、そのような併用療法のための免疫抑制剤としては、グルココルチコイド、ステロイド、代謝拮抗剤、Ｔ細胞阻害剤、マクロライド（例えば、ラパマイシンもしくはラパログ）、および細胞分裂阻害剤（アルキル化剤を含む）、代謝拮抗剤、細胞傷害性抗生物質、抗体、イムノフィリンに対して活性のある物質が挙げられるが、これらに限定されない。免疫抑制剤には、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、白金化合物、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン、ＩＬ－２受容体（ＣＤ２５）指向性抗体またはＣＤ３指向性抗体、抗ＩＬ－２抗体、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、オピオイド、またはＴＮＦ－α（腫瘍壊死因子－α）結合剤を含み得る。特定の実施形態では、免疫抑制療法は、遺伝子療法投与の０、１、２、７日以上前に開始されてもよい。かかる療法は、同じ日に２つ以上の薬物（例えば、プレドニゾン、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）および／またはシロリムス（すなわち、ラパマイシン））の同時投与を伴い得る。これらの薬物のうちの１つ以上が、同じ用量または調整された用量で、遺伝子療法投与後に継続されてもよい。特定の実施形態では、本明細書に提供されるｍｉＲ標的配列含有組成物は、遺伝子療法（例えば、ｒＡＡＶ）ベクターの送達前、送達中、または送達後の免疫抑制療法の必要性を排除する。

【0182】

一実施形態では、本明細書に記載される発現カセットを含む組成物は、必要な対象に１回投与される。特定の実施形態では、発現カセットは、ｒＡＡＶを介して送達される。

【0183】

治療のための候補となる患者は、ＭＰＳＩ、および／またはＨｕｒｌｅｒ、Ｈｕｒｌｅｒ－ＳｃｈｅｉｅおよびＳｃｈｅｉｅと関連する症状を有する小児患者および成人患者である。ＭＰＳＩ障害は、早期重症型（Ｈｕｒｌｅｒ）から後期発症型（Ｓｃｈｅｉｅ）の形態までの疾患のスペクトルである。Ｈｕｒｌｅｒ症候群は、典型的には、ＩＤＵＡ酵素活性がないこと（０％）を特徴とし、早期に診断され、生後１０年間における発達遅滞、肝脾腫大、骨格病変、角膜混濁、関節病変、難聴、心臓病変、および死亡を特徴とする。Ｈｕｒｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｅ患者は、ある程度のＩＤＵＡ酵素活性（０％より大きいが、典型的には２％未満）を有し、変動する知力への影響、呼吸器疾患、閉塞性気道疾患、心血管疾患、関節硬直／収縮、骨格異常、視力低下、および１０代～２０代での死亡を有することが観察されている。Ｓｃｈｅｉｅ症候群を有する患者は、典型的には、「正常な」ＩＤＵＡ酵素活性の少なくとも２％を有し、後に診断される。そのような患者は、典型的には、正常な知能を有するが、肝脾腫大、関節病変、神経絞扼、難聴、心臓病変、および正常な寿命を有する。また、Ｎｅｗｂｏｒｎ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ Ｔｙｐｅ １（ＭＰＳ Ｉ）：Ａ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ Ｆｉｎａｌ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ，Ｆｉｎａｌ Ｖｅｒｓｉｏｎ １．１，Ｐｒｅｐａｒｅｄ ｆｏｒ：ＭＡＴＥＲＮＡＬ ＡＮＤ ＣＨＩＬＤ ＨＥＡＬＴＨ ＢＵＲＥＡＵも参照されたい。

【0184】

本明細書で提供される組成物は、組換え酵素に対する免疫応答に関連する長期間の酵素補充療法（ＥＲＴ）の合併症（軽症から最悪のアナフィキラシーまでにわたる）、ならびに局所および全身感染などの生涯にわたって続く接触部周辺の合併症を回避する。ＥＲＴと対照的に、本発明の組成物は、生涯にわたって継続される毎週の注射を必要としない。理論に束縛されることを意図するものではないが、本明細書に記載の治療的方法は、ＣＮＳ区画の外側で治療効力を提供する連続的で高い循環ＩＤＵＡレベルを提供する高い形質導入効率を伴うベクターにより与えられる効率的な長期間の遺伝子移入を提供することにより、ＭＰＳＩ障害に関連する中枢神経系表現型を少なくとも補正するために有用であると考えられている。加えて、本明細書では、ＣＮＳへのＡＡＶ媒介性送達の前に、タンパク質形態またはｒＡＡＶ．ｈＩＤＵＡの形態で酵素を直接全身送達することを含む様々な経路により、活性のある耐容性を提供し、酵素に対する抗体形成を予防するための方法が提供される。

【0185】

いくつかの実施形態では、Ｈｕｒｌｅｒ症候群と診断された患者は、本明細書に記載の方法に従って治療される。いくつかの実施形態では、Ｈｕｒｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｅ症候群と診断された患者は、本明細書に記載の方法に従って治療される。いくつかの実施形態では、Ｓｃｈｅｉｅ症候群と診断された患者は、本明細書に記載の方法に従って治療される。いくつかの実施形態では、神経認知欠損を有するＭＰＳＩを有する小児対象は、本明細書に記載の方法に従って治療される。

【0186】

特定の実施形態では、新生児（３ヶ月齢またはそれより若い）は、本明細書に記載の方法に従って治療される。特定の実施形態では、３ヶ月齢～９ヶ月齢である乳児は、本明細書に記載の方法に従って治療される。特定の実施形態では、９ヶ月齢～３６ヶ月齢の子供は、本明細書に記載の方法に従って治療される。特定の実施形態では、３歳～１２歳の子供は、本明細書に記載の方法に従って治療される。特定の実施形態では、１２歳～１８歳の子供は、本明細書に記載の方法に従って治療される。特定の実施形態では、１８歳以上の成人が、本明細書に記載の方法に従って治療される。

【0187】

一実施形態では、患者は、Ｈｕｒｌｅｒ症候群を有していてもよく、少なくとも約３ヶ月齢～１２ヶ月齢未満の男児または女児である。別の実施形態では、患者は、男性または女性のＨｕｒｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｅ患者であってもよく、少なくとも約６歳～最大１８歳であってもよい。他の実施形態では、対象は、より高齢またはより若くてもよく、男性で
あっても女性であってもよい。

【0188】

適切には、治療のために選択された患者は、以下の特徴のうちの１つ以上を有する患者を含み得る。血漿、線維芽細胞、または白血球中で測定されるような、欠失または減少したＩＤＵＡ酵素活性により確認されるＭＰＳＩの診断文書、任意の他の神経学的因子または精神医学的因子により説明できない場合、以下のいずれかで規定される、ＭＰＳＩに起因する初期神経認知欠損の証拠文書。－ＩＱテストで平均より低い１標準偏差のスコア、または神経心理学的機能（言語、記憶、注意力、または非言語的能力）の１領域、または－連続的なテストで１より大きな標準偏差の低下という病歴証拠文書。代替的に、尿または遺伝子検査におけるＧＡＧの増加が使用されてもよい。治療の前に、対象、例えば、乳幼児は、好ましくは、ＭＰＳＩ患者、すなわち、ｈＩＤＵＡをコードする遺伝子に変異を有する患者を特定するために遺伝子型決定を受ける。治療前に、ＭＰＳＩ患者を、ｈＩＤＵＡ遺伝子を送達するために使用されるＡＡＶ血清型に対する中和抗体（Ｎａｂ）について評価することができる。特定の実施形態では、５以下のＡＡＶに対する中和抗体力価を有するＭＰＳＩ患者は、本明細書に記載の方法のうちのいずれか１つ以上に従って治療される。

【0189】

治療前に、ＭＰＳＩ患者を、ｈＩＤＵＡ遺伝子を送達するために使用されるＡＡＶベクターのカプシドに対する中和抗体（Ｎａｂ）について評価することができる。そのようなＮａｂは、形質導入効率を妨害し、治療有効性を低下させることができる。ベースライン血清Ｎａｂ力価≦１：５を有するＭＰＳＩ患者は、ｒＡＡＶ．ｈＩＤＵＡ遺伝子療法プロトコルを用いる治療のための良好な候補である。血清Ｎａｂ＞１：５の力価を有するＭＰＳＩ患者の治療は、ｒＡＡＶ．ｈＩＤＵＡベクター送達による治療の前および／または治療中に、組み合わせ療法、例えば、免疫抑制剤での一時的な組み合わせ療法を必要としてもよい。任意選択的に、免疫抑制併用療法は、ＡＡＶベクターカプシドおよび／または製剤の他の構成要素に対する中和抗体の事前アセスメントを伴うことなく、予防的手段として使用されてもよい。事前の免疫抑制療法は、特に、実質的にＩＤＵＡ活性レベルを有さない患者において、ｈＩＤＵＡ導入遺伝子産物に対する潜在的な有害免疫反応を予防するために望ましいものであってもよく、導入遺伝子産物は、「外来」とみなされてもよい。以下に記載される、マウス、イヌ、およびＮＨＰにおける非臨床的試験の結果は、ｈＩＤＵＡに対する免疫応答および神経炎症の発症に一致する。同様の反応は、ヒト対象において生じない可能性もあるが、予防的措置として、免疫抑制療法が、ｒＡＡＶ．ｈＩＤＵＡのすべてのレシピエントについて推奨される。

【0190】

そのような併用療法のための免疫抑制剤としては、グルココルチコイド、ステロイド、代謝拮抗剤、Ｔ細胞阻害剤、マクロライド（例えば、ラパマイシンもしくはラパログ）、および細胞分裂阻害剤（アルキル化剤を含む）、代謝拮抗剤、細胞傷害性抗生物質、抗体、イムノフィリンに対して活性のある物質が挙げられるが、これらに限定されない。免疫抑制剤には、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、白金化合物、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン、ＩＬ－２受容体（ＣＤ２５）指向性抗体またはＣＤ３指向性抗体、抗ＩＬ－２抗体、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、オピオイド、またはＴＮＦ－α（腫瘍壊死因子－α）結合剤を含み得る。特定の実施形態では、免疫抑制療法は、遺伝子療法投与の０、１、２、７日以上前に開始されてもよい。かかる療法は、同じ日に２つ以上の薬物（例えば、プレドニゾン、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）および／またはシロリムス（すなわち、ラパマイシン））の同時投与を伴い得る。これらの薬物のうちの１つ以上が、同じ用量または調整された用量で、遺伝子療法投与後に継続されてもよい。かかる療法は、必要に応じて、約１週間（７日間）、約６０日間、またはそれ以上であり得る。特定の実施形態では、タクロリムスを含まないレジメンが選択される。

【0191】

それにもかかわらず、一実施形態では、以下の特徴のうちの１つ以上を有する患者は、患者の担当医の裁量によって治療から排除されてもよい。
○ベースラインＭＲＩ試験のレビューにより、ＩＣ注射についての禁忌が示される。
○ＩＣ注射に対する禁忌をもたらす、以前の頭部／頸部手術歴。
○ＣＴ（またはコントラスト）または全身麻酔に対していずれかの禁忌を有する。
○ＭＲＩ（またはガドリニウム）に対するいずれかの禁忌を有する。
○推定糸球体濾過速度（ｅＧＦＲ）＜３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２を有する。
○ＭＰＳＩに起因しない任意の神経認知欠損、または神経精神医学的状態の診断を有する。
○シロリムス、ＭＭＦ、またはプレドニゾンに対するなんらかの過敏反応歴を有する。
○免疫抑制療法に適切でない任意の状態（例えば、絶対的好中球数＜１．３×１０^３／μＬ、血小板数＜１００×１０^３／μＬ、およびヘモグロビン＜１２ｇ／ｄＬ［男性］または＜１０ｇ／ｄＬ［女性］）を有する。
○腰部穿刺に対していずれかの禁忌を有する。
○ＨＳＣＴを受けている。
○治療前の６ヶ月以内にＩＴ投与によりラロニダーゼを受けた。
○いずかの時点でＩＴラロニダーゼを受けており、患者を危険な状況に置く可能性のあるＩＴ投与に関連すると考えられる有意な有害事象を経験した。
○治療の前の少なくとも３ヶ月間で完全に寛解していない、リンパ腫の任意の病歴、または皮膚の扁平上皮細胞もしくは基底細胞がん腫以外の別のがんの病歴。
○患者が、ギルバート症候群の以前に知られた病歴を有さず、総ビリルビンの３５％未満の抱合型ビリルビンを示す分画ビリルビンを有さない限り、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）もしくはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）＞３×正常値上限（ＵＬＮ）、または総ビリルビン＞１．５×ＵＬＮ。
○ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）陽性試験の履歴、活動性もしくは再発性のＢ型肝炎もしくはＣ型肝炎の病歴、またはＢ型肝炎、Ｃ型肝炎もしくはＨＩＶのスクリーニング試験の陽性。
○妊娠中、出産後６週未満、授乳中、または妊娠を計画している（自身またはパートナー）
○治療前１年以内のアルコールまたは薬物乱用歴。
○患者の安全性を損なう可能性のある、重大な、または不安定な医学的状態または心理学的状態を有する。
○コントロールされていない発作。

【0192】

他の実施形態では、治療にあたる医師は、これらの身体的特徴（病歴）のうちの１つ以上の存在が本明細書に提供されるような治療を妨害するべきものでないことを決定し得る。

【0193】

本明細書に記載の方法における組成物が、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態、および方法に適用されるように意図されることを理解されたい。

【0194】

投薬量および投与経路
患者への投与に適切な薬学的組成物は、生理学的に適合する水性緩衝液、界面活性剤、および任意選択的な賦形剤を含む製剤緩衝液中のｒＡＡＶ．ｈＩＤＵＡベクターの懸濁液を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物は、髄腔内に投与される。他の実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物は、大槽内に投与される。他の実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物は、静脈内に投与される。特定の実施形態では、
薬学的組成物は、２０分間（±５分間）にわたって注入により末梢静脈を介して送達される。しかしながら、この時間は、必要に応じて、または所望により、調整されてもよい。しかし、さらに他の投与経路が選択されてもよい。代替的または追加的に、投与経路は、所望される場合、組み合わされてもよい。

【0195】

ｒＡＡＶの単回投与は効果的であると期待されているが、投与は、繰り返されてもよい（特に、新生児の治療では、例えば、１年に４回、半年に１回、１年に１回、または必要に応じて他の回数）。任意選択的に、注入／注射に耐えることのできる対象の年齢および能力を考慮して、治療有効量の初期用量が、分割された注入／注射セッションで送達されてもよい。しかし、安心感および治療的結果の両方の観点で患者に利点を与える、治療用量全量の注射を毎週繰り返す必要はない。

【0196】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ懸濁液は、少なくとも１ｘ１０^９ＧＣ／ｍＬであるｒＡＡＶゲノムコピー（ＧＣ）力価を有する。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ懸濁液中のｒＡＡＶの空／充填粒子比は、０．０１～０．０５（９５％～９９％が空のカプシドを含まない）である。いくつかの実施形態では、それらを必要とするＭＰＳＩ患者は、少なくとも約４ｘ１０^８ＧＣ／ｇ脳質量～約４ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量の用量のｒＡＡＶ懸濁液を投与される。

【0197】

以下の治療的に有効な一定用量のｒＡＡＶ．ｈＩＤＵＡを、示された年齢群のＭＰＳＩ患者に投与することができる。
○新生児：約３．８×１０^１２～約１．９×１０^１４ＧＣ、
○３～９ヶ月：約６×１０^１２～約３×１０^１４ＧＣ、
○９～３６ヶ月：約１０^１３～約５×１０^１４ＧＣ、
○３～１２歳：約１．２×１０^１３～約６×１０^１４ＧＣ、
○１２歳以上：約１．４×１０^１３～約７．０×１０^１４ＧＣ、
○１８歳以上（成人）：約１．４×１０^１３～約７．０×１０^１４ＧＣ。

【0198】

いくつかの実施形態では、１２歳以上のＭＰＳＩ患者（１８歳以上を含む）に投与される用量は、１．４×１０^１３ゲノムコピー（ＧＣ）（１．１×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量）である。いくつかの実施形態では、１２歳以上のＭＰＳＩ患者（１８歳以上を含む）に投与される用量は、７×１０^１３ＧＣ（５．６×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量）である。なおさらなる一実施形態では、ＭＰＳＩ患者に投与される用量は、少なくとも約４ｘ１０^８ＧＣ／ｇ脳質量～約４ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、ＭＰＳＩ新生児に投与される用量は、約１．４ｘ１０^１１～約１．４ｘ１０^１４ＧＣの範囲であり、３～９ヶ月の乳幼児に投与される用量は、約２．４ｘ１０^１１～約２．４ｘ１０^１４ＧＣの範囲であり、９～３６ヶ月のＭＰＳＩ子供に投与される用量は、約４ｘ１０^１１～約４ｘ１０^１４ＧＣの範囲であり、３～１２歳のＭＰＳＩ子供に投与される用量は、約４．８ｘ１０^１１～約４．８ｘ１０^１４ＧＣの範囲であり、１２歳以上の子供および成人に投与される用量は、約５．６ｘ１０^１１～約５．６ｘ１０^１４ＧＣの範囲である。

【0199】

これらの用量の送達に適切な容量および濃度は、当業者によって決定され得る。例えば、約１μＬ～１５０ｍＬの容量が選択されてもよいが、より高容量が、成人用に選択されてもよい。典型的に、新生児用に好適な容量は、約０．５ｍＬ～約１０ｍＬ、より年長の乳児用に、約０．５ｍＬ～約１５ｍＬが選択される。幼児のためには、約０．５ｍＬ～約２０ｍＬの容量が選択されてもよい。小児用に、最大約３０ｍＬの容量が選択されてもよい。プレティーンおよびティーンには、最大約５０ｍＬの容量が選択されてもよい。さらに他の実施形態では、患者は、選択された約５ｍＬ～約１５ｍＬ、または約７．５ｍＬ～約１０ｍＬの容量で髄腔内投与を受けることができる。他の好適な容量および投薬量が決定されてもよい。任意の副作用に対する治療的利益のバランスをとるために、投薬量を調
整してもよく、そのような投薬量は、組換えベクターが利用されるための治療用途に応じて変化し得る。

【0200】

髄腔内送達のための一実施形態では、患者は成人対象であり、用量は、約１×１０^８ＧＣ～５×１０^１４ＧＣを含む。別の実施形態では、用量は、約３．８×１０^１２～約１．９×１０^１４ＧＣを含む。さらなる実施形態では、患者は、Ｈｕｒｌｅｒ症候群を有する少なくとも約３ヶ月齢～最大１２ヶ月齢の乳幼児対象であり、用量は、少なくとも４×１０^８ＧＣ ｒＡＡＶ．ｈＩＤＵＡ／ｇ脳質量～３×１０^１２ＧＣ ｒＡＡＶ．ｈＩＤＵＡ／ｇ脳質量に相当する量を含む。別の実施例では、患者は、少なくとも約６歳～最大１８歳のＨｕｒｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｅ症候群を有する子供であり、用量は、少なくとも４×１０^８ＧＣ ｒＡＡＶ．ｈＩＤＵＡ／ｇ脳質量～３×１０^１２ＧＣ ｒＡＡＶ．ｈＩＤＵＡ／ｇ脳質量に相当する量を含む。

【0201】

有効性モニタリング
療法の有効性は、（ａ）ＭＰＳＩを有する患者における神経認知低下の予防、および（ｂ）疾患のバイオマーカーにおける減少、例えば、ＣＳＦ、血清および／または尿、および／または肝臓および脾臓容積におけるＧＡＧレベルおよび／または酵素活性を評価することにより、測定することができる。神経認知は、例えば、Ｈｕｒｌｅｒ対象のためのＢａｙｌｅｙ’ｓ Ｉｎｆａｎｔｉｌｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｃａｌｅにより測定されるような、またはＨｕｒｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｅ対象のためのＷｅｃｈｓｌｅｒ Ａｂｂｒｅｖｉａｔｅｄ Ｓｃａｌｅ ｏｆ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ（ＷＡＳＩ）により測定されるような、知能指数（ＩＱ）を測定することにより決定することができる。例えば、Ｂａｙｌｅｙ Ｓｃａｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｆａｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（ＢＳＩＤ－ＩＩＩ）を使用して発達指数（ＤＱ）を評価すること、Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｖｅｒｂａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ Ｔｅｓｔを使用して、および／またはＴｅｓｔｓ ｏｆ Ｖａｒｉａｂｌｅｓ ｏｆ Ａｔｔｅｎｔｉｏｎ（ＴＯＶＡ）を使用して記憶を評価することなど、神経認知発達および機能の他の適切な測定が利用されてもよい。適応行動スケール、視覚処理力、細かい運動、コミュニケーション、社会性、日常生活力、ならびに感情的および行動学的健康度などの他の神経心理学的機能がモニターされる。容量測定を獲得するための脳の磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、拡散テンソル撮像法（ＤＴＩ）、および休息状態データ、エコー写真による正中神経断面領域、脊髄圧縮における改善、安全性、肝臓の大きさおよび脾臓の大きさも実施される。

【0202】

任意選択的に、有効性の他の測定は、バイオマーカー（例えば、本明細書に記載のポリアミン）および臨床的結果の評価を含み得る。尿は、総ＧＡＧ含有量、クレアチニンに対するＧＡＧの濃度、およびＭＰＳＩ特異的ｐＧＡＧについて評価される。血清および／または血漿は、ＩＤＵＡ活性、抗ＩＤＵＡ抗体、ｐＧＡＧ、およびヘパリン共同因子ＩＩ－トロンビン複合体の濃度、および炎症マーカーについて評価される。ＣＳＦは、ＩＤＵＡ活性、抗ＩＤＵＡ抗体、ヘキソサミニダーゼ（ｈｅｘ）活性、ならびにｐＧＡＧ（例えば、へパラン硫酸およびデルマタン硫酸）について評価される。ベクターに対する中和抗体および抗ＩＤＵＡ抗体に対する結合抗体の存在が、ＣＳＦおよび血清中で評価されてもよい。ベクターカプシドまたはｈＩＤＵＡ導入遺伝子産物に対するＴ細胞応答が、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより評価されてもよい。ＣＳＦ、血清、および尿中のＩＤＵＡ発現の薬物動態学ならびにベクター濃度もモニタリングされてもよい。

【0203】

ｈＩＤＵＡの全身送達を伴うＣＮＳへのｒＡＡＶ．ｈＩＤＵＡの遺伝子療法送達の組み合わせは、本発明の方法に包含される。全身送達は、ＥＲＴ（例えば、Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ（登録商標）を用いて）を用いて、または肝臓に対する向性を有するｒＡＡＶ．ｈＩＤＵＡ（例えば、ＡＡＶ６８カプシドを有するｒＡＡＶ．ｈＩＤＵＡ）を用いるさらなる遺伝子療法を用いて、成し遂げることができる。

【0204】

全身送達に関連する臨床有効性のさらなる測定は、例えば、整形外科的測定、例えば、骨塩密度、骨塩含有量、骨幾何形状および骨強度、二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＸＡ）により測定される骨密度、身長（立位身長／年齢に対する横たわった状態での長さについてのＺスコア）、骨代謝のマーカー：血清オステオカルシン（ＯＣＮ）および骨特異的アルカリホスファターゼ（ＢＳＡＰ）、Ｉ型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチド（ＩＣＴＰ）およびＩ型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチドα１鎖（ＣＴＸ）の測定、柔軟性および筋力：６分間歩行試験を含む、ＢｉｏｄｅｘおよびＰｈｙｓｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ評価（Ｂｉｏｄｅｘ ＩＩＩ等速強度試験系を使用して、各参加者についての膝および肘の力を評価する）、Ａｃｔｉｖｅ Ｊｏｉｎｔ Ｒａｎｇｅ ｏｆ Ｍｏｔｉｏｎ（ＲＯＭ）、Ｃｈｉｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ／Ｈｅａｌｔｈ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ（ＣＨＡＱ／ＨＡＱ）Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ Ｓｃｏｒｅ、個人の心肺運動をモニタリングするためのＥｌｅｃｔｒｏｍｙｏｇｒａｐｈｉｃ（ＥＭＧ）および／またはＯｘｙｇｅｎ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ、運動検査中のピーク酸素取り込み（ＶＯ２ピーク）、Ａｐｎｅａ／Ｈｙｐｏｐｎｅａ Ｉｎｄｅｘ（ＡＨＩ）、Ｆｏｒｃｅｄ Ｖｉｔａｌ Ｃａｐａｃｉｔｙ（ＦＶＣ）、Ｌｅｆｔ Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ Ｍａｓｓ（ＬＶＭ）を含んでもよい。

【0205】

特定の実施形態では、患者においてＭＰＳＩを診断および／または治療する方法、または治療をモニタリングする方法が提供される。本方法は、本明細書で提供されるように、ＭＰＳＩを有する疑いのあるヒト患者から脳脊髄液または血漿試料を採取することと、試料中のスペルミン濃度レベルを検出することと、１ｎｇ／ｍＬを超えるスペルミン濃度を有する患者においてＭＰＳＩから選択されるムコ多糖症を有する患者を診断することと、有効量のヒトアルファ－Ｌ－イズロニダーゼ（ｈＩＤＵＡ）を、例えば、本明細書に記載のデバイスを使用して、本明細書に提供されるように、診断された患者に送達すること、を伴う。

【0206】

別の態様では、本方法は、ＭＰＳＩ療法をモニタリングし、調整することを伴う。このような方法は、ＭＰＳＩのための療法を受けているヒト患者から脳脊髄液または血漿試料を採取することと、質量分析を実施することにより試料中のスペルミン濃度レベルを検出することと、ＭＰＳＩ治療剤の投与レベルを調整することと、を伴う。例えば、「正常な」ヒトスペルミン濃度は、脳脊髄液中、約１ｎｇ／ｍＬ以下である。しかし、未治療のＭＰＳＩを有する患者は、２ｎｇ／ｍＬ～最大約１００ｎｇ／ｍＬのスペルミン濃度レベルを有し得る。患者が、正常なレベルに近づくレベルを有する場合、任意の併用ＥＲＴの投与量を低減させ得る。逆に、患者が、所望のスペルミンレベルより高いレベルを有する場合、より高い用量、またはさらなる療法（例えば、ＥＲＴ）を患者に提供し得る。

【0207】

スペルミン濃度は、適切なアッセイを用いて測定することができる。例えば、Ｊ Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｌｏｐｅｚ，ｅｔ ａｌ，“Ｕｎｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｐｏｌｙａｍｉｎｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｓ ｐｌａｎｔ ｓａｍｐｌｅｓ ｂｙ ｉｏｎ ｐａｉｒ
ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，”Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４７（２００９）：５９２－５９８，ａｖａｉｌ ｏｎｌｉｎｅ ２８ Ｆｅｂ ２００９、ＭＲ Ｈａｋｋｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ，“Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｕｎｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｐｈａｓｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｉｔｈ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ”，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ，４４（２００７）：６２５－６３４に記載されるアッセイ、定量的同位体希釈液体クロマトグラフィ
ー（ＬＣ）／質量分析（ＭＳ）アッセイ。他の適切なアッセイが用いられてもよい。

【0208】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療剤の有効性は、初期神経認知欠損を有するＭＰＳＩを有する小児対象において投与後５２週目で神経認知を評価することにより、測定される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療剤の有効性は、ＭＰＳＩ患者における神経認知に対するＣＳＦグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の関係を評価することにより、測定される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療剤の有効性は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、例えば、灰白質および白質ならびにＣＳＦ心室の容量分析により測定されるような、ＭＰＳＩ患者におけるＣＮＳに対する身体変化に対する治療剤の効果を評価することにより、測定される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療剤の有効性は、ＭＰＳＩ患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）、血清、および尿中のバイオマーカー（例えば、ＧＡＧ、ＨＳ）に対する治療剤の薬力学的効果を評価することにより、測定される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療剤の有効性は、ＭＰＳＩ患者の生活の質（ＱＯＬ）に対する治療剤の影響を評価することにより、測定される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療剤の有効性は、ＭＰＳＩ患者の運動機能に対する治療剤の影響を評価することにより、測定される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療剤の有効性は、ＭＰＳＩ患者の成長および発達マイルストーンに対する治療剤の効果を評価することにより、測定される。

【0209】

本明細書に記載のｒＡＡＶベクターから発現されるとき、ＣＳＦ、血清、または他の組織中で検出される少なくとも約２％の発現レベルは、治療効果を提供し得る。しかし、より高い発現レベルが成し遂げられ得る。そのような発現レベルは、正常な機能的ヒトＩＤＵＡレベルの２％～約１００％であり得る。特定の実施形態では、正常な発現レベルより高いレベルが、ＣＳＦ、血清、または他の組織中で検出され得る。

【0210】

特定の実施形態では、本明細書に記載のＭＰＳＩおよび／またはそれらの症状を治療、予防、および／または緩和する方法は、Ｈｕｒｌｅｒ対象のためのＢａｙｌｅｙ’ｓ Ｉｎｆａｎｔｉｌｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｃａｌｅにより評価される場合、治療された患者において知能指数（ＩＱ）の有意な増加をもたらす。特定の実施形態では、本明細書に記載のＭＰＳＩおよび／またはそれらの症状を治療、予防、および／または緩和する方法は、Ｈｕｒｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｅ対象のためのＷｅｃｈｓｌｅｒ Ａｂｂｒｅｖｉａｔｅｄ Ｓｃａｌｅ ｏｆ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ（ＷＡＳＩ）により測定される場合、治療された患者において神経認識ＩＱの有意な増加をもたらす。特定の実施形態では、本明細書に記載のＭＰＳＩおよび／またはそれらの症状を治療、予防、および／または緩和する方法は、Ｂａｙｌｅｙ Ｓｃａｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｆａｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔを使用して評価される場合、治療された患者において神経認識ＤＱの有意な増加をもたらす。

【0211】

特定の実施形態では、本明細書に記載のＭＰＳＩおよび／またはそれらの症状を治療、予防、および／または緩和する方法は、機能的ヒトＩＤＵＡレベルの有意な増加をもたらす。特定の実施形態では、本明細書に記載のＭＰＳＩおよび／またはそれらの症状を治療、予防、および／または緩和する方法は、患者の血清、尿および／または脳脊髄液（ＣＳＦ）の試料において測定される場合、ＧＡＧレベルの有意な減少をもたらす。

【0212】

組み合わせ療法
ｈＩＤＵＡの全身送達を伴うＣＮＳへのｒＡＡＶ．ｈＩＤＵＡの遺伝子療法送達の組み合わせは、本発明の方法に包含される。全身送達は、ＥＲＴを用いて（例えば、Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ（登録商標）を用いて）、またはｒＡＡＶ．ｈＩＤＵＡを用いるさらなる遺伝子療法を用いて、成し遂げることができる。

【0213】

特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ｈＩＤＵＡの髄腔内投与は、例えば、肝臓へ指向された第２のＡＡＶ．ｈＩＤＵＡ注射と共投与される。そのような場合では、ベクターは、同じであり得る。例えば、ベクターは、同じカプシドおよび／または同じベクターゲノム配列を有し得る。代替的に、ベクターは異なっていてもよい。例えば、ベクターストックの各々は、異なる調節配列（例えば、各々、異なる組織特異的プロモーターを有する）、例えば、肝臓特異的プロモーター、およびＣＮＳ特異的プロモーターを有するように設計されることができる。追加的に、または代替的に、ベクターストックの各々は、異なるカプシドを有してもよい。例えば、肝臓に指向されたベクターストックは、とりわけ、ＡＡＶ８、ＡＡＶｈｕ６８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ９１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ３Ｂ、またはＡＡＶｄｊから選択されるカプシドを有してもよい。そのようなレジメンでは、各ベクターストックの用量は、髄腔内に送達されるベクター全量が、約１×１０^８ＧＣ～×１×１０^１４ＧＣの範囲内であるように、調整されてもよく、他の実施形態では、両方の経路により送達される合わせたベクターは、１×１０^１１～１×１０^１６の範囲である。代替的に、各ベクターは、約１０^８ＧＣ～約１０^１２ＧＣ／ベクターの量で送達されてもよい。そのような用量は、実質的に同時に、または異なる時点で、例えば、約１日～約１２週間の間隔をあけて、または約３日～約３０日の間隔をあけて、または他の適切な時点で、投与されてもよい。

【0214】

いくつかの実施形態では、患者は、肝臓指向性および髄腔内注射を介してｒＡＡＶ．ｈＩＤＵＡを共投与される。いくつかの実施形態では、治療のための方法は、（ａ）ＭＰＳＩおよび／またはＨｕｒｌｅｒ、Ｈｕｒｌｅｒ－ＳｃｈｅｉｅおよびＳｃｈｅｉｅ症候群と関連する症状を有する患者に、導入遺伝子特異的耐容性を誘導するために十分な量のｈＩＤＵＡ酵素または肝臓指向性ｒＡＡＶ－ｈＩＤＵＡを投与することと、（ｂ）ｒＡＡＶ．ｈＩＤＵＡを患者のＣＮＳへ投与することと、を含み、ｒＡＡＶ－ｈＩＤＵＡは、患者において治療レベルのｈＩＤＵＡの発現を導く。

【0215】

さらなる実施形態では、ＭＰＳＩおよび／またはＨｕｒｌｅｒ、Ｈｕｒｌｅｒ－ＳｃｈｅｉｅおよびＳｃｈｅｉｅ症候群と関連する症状を有する患者を、導入遺伝子特異的耐容性を誘導するために十分な量のｈＩＤＵＡ酵素または肝臓指向性ｒＡＡＶ－ｈＩＤＵＡを用いて耐容性化し、その後、患者にｈＩＤＵＡのＣＮＳ媒介性のｒＡＡＶ媒介性送達を行うことを伴う、ＭＰＳＩおよび／またはＨｕｒｌｅｒ、Ｈｕｒｌｅｒ－ＳｃｈｅｉｅおよびＳｃｈｅｉｅ症候群と関連する症状を有するヒト患者を治療する方法が提供される。特定の実施形態では、患者は、例えば、患者が４週齢未満（新生児期）または乳幼児である場合、ｈＩＤＵＡに対して患者を耐容性化するために、肝臓指向性注射によってｒＡＡＶ．ｈＩＤＵＡを投与され、患者が乳幼児、子供、および／または成人である場合、ＣＮＳにおいてｈＩＤＵＡの治療濃度を発現させるために、患者は引き続き、髄腔内注射によりｒＡＡＶ．ｈＩＤＵＡを投与される。

【0216】

一実施例では、ＭＰＳＩ患者は、生後約２週間以内、例えば、約０～約１４日以内、または約１日～１２日以内、または約３日目～約１０日目、または約５日目～約８日目に、すなわち、患者は、新生児である時期に、患者にｈＩＤＵＡを送達することにより、耐容性化される。他の実施形態では、より年齢の高い乳幼児が選択されてもよい。耐容性化用量のｈＩＤＵＡは、ｒＡＡＶにより送達され得る。しかし、別の実施形態では、用量は、酵素（酵素補充療法）の直接送達により送達される。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において組換えｈＩＤＵＡおよびタバコ細胞［ＬＨ Ｆｕ，ｅｔ ａｌ，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｉｍｐａｃｔ Ｆａｃｔｏｒ：３．６１）．１２／２００９；１７７（６）：６６８－６７５］または植物の種子［Ｘ Ｈｅ ｅｔ ａｌ，Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．２０１３ Ｄｅｃ； １１（９）：１０３４－１０４３］において可溶性ｒｈＩＤＵＡを産生する方法は、文献に記載されている。

【0217】

追加的に、組換えｈＩＤＵＡは、Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ（登録商標）（ラロニダーゼ）として商業的に生産されており、抗ヒトインスリン受容体モノクローナル抗体とアルファ－Ｌ－イズロニダーゼ［ＡＧＴ－１８１、ＡｒｍａＧｅｎ，Ｉｎｃ］の融合タンパク質が有用であり得る。現在では好ましいものではないが、酵素は、「裸の」ＤＮＡ、ＲＮＡ、または別の適切なベクターにより送達されてもよい。一実施形態では、酵素は、患者の静脈内および／または髄腔内に送達される。別の実施形態では、別の投与経路が使用される（例えば、筋内、皮下など）。一実施形態では、耐容性化のために選択されたＭＰＳＩ患者は、耐容性化用量を開始する前にいずれの検出可能な量のｈＩＤＵＡを発現することができない。組換えヒトＩＤＵＡ酵素が送達される場合、髄腔内ｒｈＩＤＵＡ注射は、注射当たり約０．５８ｍｇ／ｋｇ体重または約０．２５ｍｇ～約２ｍｇ総ｒｈＩＤＵＡ（例えば、静脈内または髄腔内）からなり得る。例えば、３ｃｃの酵素（例えば、およそ１．７４ｍｇのＡｌｄｕｒａｚｙｍｅ（登録商標）（ラロニダーゼ））を、９ｃｃの合計注射のために６ｃｃのＥｌｌｉｏｔｔｓ Ｂ（登録商標）溶液で希釈した。代替的に、より高いまたはより低い用量が選択される。同様に、ベクターから発現される場合、より低い発現タンパク質レベルが送達され得る。一実施形態では、耐容性化のために送達されるｈＩＤＵＡの量は、治療有効量よりも少ない。しかしながら、他の用量が選択されてもよい。

【0218】

典型的に、耐容性化用量の投与後に、例えば、耐容性化投与後約３日～約６ヶ月以内、より好ましくは、耐容性化投与後の約７日～約１ヶ月以内に、治療用量が、対象に送達される。しかし、これらの範囲内の他の時点が選択されてもよく、より長いまたはより短い待機期間であってもよい。

【0219】

代替として、免疫抑制療法は、ベクター投与の前、その間、および／またはその後に、ベクターに加えて実施され得る。免疫抑制療法は、上記したように、プレドニゾロン、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、およびタクロリムス、またはシロリムスを含むことができる。下記のタクロリムスを含まないレジメンが好ましいことがある。

【0220】

キット
特定の実施形態では、キットが提供され、製剤（任意選択的に、凍結される）中に懸濁された濃縮された発現カセット（例えば、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターで）を含み、任意選択的な希釈緩衝液、ならびに髄腔内、脳室内、または大槽内投与に必要とされるデバイスおよび構成要素が提供される。別の実施形態では、キットは、追加的にまたは代替的に、静脈内送達のための構成要素を含み得る。一実施形態では、キットは、注射を可能にするために、十分な緩衝液を提供する。そのような緩衝液は、濃縮されたベクターの約１：１～１：５希釈、またはそれ超の希釈を可能にし得る。他の実施形態では、より多量もしくはより少量の緩衝液または滅菌水が含まれ、治療を行う医師により、用量滴定および他の調整が可能になる。さらに他の実施形態では、キットには、デバイスの１つ以上の構成要素が含まれる。好適な希釈緩衝液、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはグリセロール／ＰＢＳが利用可能である。

【0221】

本明細書に記載のキットにおける組成物が、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態、および方法に適用されるように意図されることを理解されたい。

【0222】

デバイス
一態様では、本明細書に提供される組成物は、例えば、ＷＯ２０１７／１３６５００（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている方法および／またはデバイスを介して髄腔内投与され得る。まとめると、本方法は、脊椎針を患者の大槽内に前進するステップと、１本の可撓性チューブを脊椎針の近位ハブに連結し、バルブの出口ポートを可撓性チューブの近位端に連結するステップと、当該前進ステップおよび連結ステッ
プ後、チューブを患者の脳脊髄液で自吸させた後で、一定量の等張溶液を含む第１の容器をバルブのフラッシュ入口ポートに連結するステップと、その後、一定量の薬学的組成物を含む第２の容器をバルブのベクター入口ポートに連結するステップと、を含む。第１および第２容器をバルブに連結した後、流体流れのための通路は、ベクター入口ポートとバルブの出口ポートとの間に開かれ、薬学的組成物は脊椎針を通して患者に注入され、薬学的組成物の注入後、流体流れのための通路は、フラッシュ入口ポートとバルブの出口ポートを通って開かれ、等張溶液は、薬学的組成物を患者にフラッシュするために脊椎針中に注入される。この方法およびこのデバイスは、各々任意選択的に、本明細書で提供される組成物の髄腔内送達のために使用され得る。代替的に、他の方法およびデバイスが、かかる髄腔内送達のために使用され得る。

【0223】

本明細書に記載のデバイスにおける組成物が、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態、および方法に適用されるように意図されることを理解されたい。

【実施例】

【0224】

ここで、以下の実施例を参照しながら、本発明を説明する。これらの実施例は例示のみを目的として提供され、本発明がこれらの実施例に限定されるものとして決して解釈されるべきではなく、本明細書に提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変形例を包含すると解釈されるべきである。

【0225】

実施例１：材料および方法：
動物
動物手順はすべて、ペンシルベニア大学の施設内動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ／Ｍａｃａｃａ Ｍｕｌａｔｔａ）は、Ｃｏｖａｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＩｎｃおよびＰｒｉｍｇｅｎ／Ｐｒｅｌａｂｓ Ｐｒｉｍａｔｅｓから調達した。動物は、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ（ＡＡＡＬＡＣ）のＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ－ａｃｃｒｅｄｉｔｅｄ Ｎｏｎｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｐｒｏｇｒａｍ ｆａｃｉｌｉｔｙ ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａのステンレス鋼製スクイーズバックケージ内に収容された。動物は、給餌、視覚および聴覚刺激、操作、および社会的相互作用などの様々な豊かさ（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｓ）を享受した。Ｃ５６ＢＬ／６Ｊマウス（ストック＃０００６６４）は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。動物を、豊かさを伴う１ケージあたり２～５匹の標準的なケージで、ペンシルベニア大学の遺伝子療法プログラムでＡＡＡＬＡＣ国際認定のマウス用バリアビバリウムに収容した（Ｎｅｓｔｌｅｔｓ巣材）。バリア施設のケージ、給水瓶、および床敷は、オートクレーブ処理し、ケージは、週に１回交換された。自動制御の１２時間の明暗サイクルが維持された。各暗期は、１９：００時（±３０分）に開始した。放射線照射された実験用げっ歯類の餌は、自由摂食で提供された。

【0226】

可能な介入を必要とする任意の状態について、動物飼育および／または獣医スタッフによって動物を毎日視覚的にモニタリングした。これには、毒性、苦痛、および／または行動の変化の徴候について、動物の一般的な外観をモニタリングすることが含まれていた。選択された試験時点で、動物は、限定されないが、バイタルサインを含む追加のパラメータについてもモニタリングされ、臨床病理学のために採血された。記載の試験に登録したすべての動物は、最大で１ヶ月に１回の神経学的評価を有していた。神経学的検査には、精神状態、姿勢、固有受容、および歩行のケージ側評価、ならびに脳神経、運動強度、お
よび反射の拘束された評価が含まれた。動物は、行動の変化または食欲の著しい変化など、痛みまたは不快感の徴候がないか、飼育スタッフによって毎日観察された。いずれの臨床的異常も試験獣医師および試験責任者に報告したが、いずれも試験物質の投与に関連することが疑われるものではなかった。

【0227】

ベクター
ＡＡＶ９．ＰＨＰ．Ｂトランスプラスミド（ｐＡＡＶ２／ＰＨＰ．Ｂ）を、製造元の指示に従ってｐＡＡＶ２／９を鋳型として使用して、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号２１０５１５）を用いて生成した。以前に記載されているように（３７）、ＡＡＶベクターを作製し、滴定した。簡潔には、ＨＥＫ２９３細胞を三重でトランスフェクトし、培養上清を回収し、濃縮し、イオジキサノール勾配で精製した。精製したベクターを、以前に記載されているように（３８）、ウサギベータ－グロビンポリＡ配列を標的とするプライマーを使用して、ドロップレットデジタルＰＣＲで滴定した。ヒトアルファ－Ｌ－イズロニダーゼ（ｈＩＤＵＡ）をコードする操作された配列を、ＣＢ７プロモーターの下でクローニングした。マイクロＲＮＡ配列は、公開データベースｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ（Ｈｓａ－ｍｉｒ－１８３ ＭＩ００００２７３、Ｈｓａ－ｍｉｒ－１８２ ＭＩ００００２７２、Ｈｓａ－ｍｉｒ－９６ ＭＩ０００００９８、Ｈｓａ－ｍｉｒ－１４５ ＭＩ００００４６１）で得られた。ＤＲＧ濃縮ｍｉＲの標的の４つのタンデムリピートを、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはｈＩＤＵＡシスプラスミドの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）にクローニングした。

【0228】

インビボ試験および組織学
マウス
マウスは、ＤＲＧ－ｍｉＲ標的の有無にかかわらず、０．１ｍＬのＰＢＳ（ビヒクル）中、１×１０^１２ゲノムコピー（ＧＣ、５×１０^１３ＧＣ／ｋｇ）のＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、または４×１０^１２ＧＣ（２×１０^１４ＧＣ／ｋｇ）の強化ＧＦＰをコードするＡＡＶ９ベクターを、外側尾静脈を介して受け、注射の２１日後、ＣＯ_２の吸入によって安楽死させた。脳を始めとする組織を速やかに回収し、１０％の中性緩衝ホルマリンに約２４時間浸漬固定し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で短時間洗浄し、ＰＢＳ中の１５％および３０％のスクロースを、４℃で順次平衡化した。次いで、組織を、最適な切断温度の包埋培地中で凍結し、直接ＧＦＰ可視化用に凍結切片を作製した（脳は、３０μｍで切片化し、他の組織は、８μｍ厚で切片化した）。画像は、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ－Ｅ蛍光顕微鏡を用いて取得した。ＤＲＧにおけるＧＦＰ発現を、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって分析した。ＤＲＧを含む脊柱をホルマリン中で２４時間固定し、軟質になるまで１０％のエチレンジアミン四酢酸（ｐＨ７．５）中で脱灰し、標準プロトコルに従ってパラフィン包埋した。切片を、エタノールおよびキシレンシリーズを通して脱パラフィン化し、１０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で６分間沸騰し、抗原賦活化を行い、２％のＨ_２Ｏ_２（１５分間）、アビジン／ビオチンブロッキング試薬（各１５分間、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、およびブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中に１％のロバ血清＋０．２％のＴｒｉｔｏｎ、１０分間）で順次ブロッキングした後、ブロッキング緩衝液に希釈された一次抗体（３７℃で１時間）およびビオチン化二次抗体（１：５００希釈、４５分間；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）でインキュベーションした。ＧＦＰに対するウサギ抗体を一次抗体として使用した（ＮＢ６００－３０８、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、１：５００希釈）。ＤＡＢを基質として用いるＶｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、結合した抗体を、褐色沈殿物として可視化することを可能にした。

【0229】

非ヒト霊長類（ＮＨＰ）
ＮＨＰは、３．５×１０^１３ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰベクター、または１×１０
^１３ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ｈＩＤＵＡベクターを、大槽内に注射された１ｍＬの滅菌人工ＣＳＦ（ビヒクル）の総体積で、以前に記載されているように（４０）、透視ガイダンス下で受けた。安全性の読み取りのために、定期的な採血および脳脊髄液（ＣＳＦ）タップを行った。血清化学、血液学、凝固、およびＣＳＦの分析は、契約施設のＡｎｔｅｃｈ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓによって行われた。動物を、静脈内ペントバルビタール過剰投与で安楽死させ、剖検した。次いで、網羅的な組織病理学的検査用に、組織を採取した。回収した組織を直ちにホルマリンに固定し、パラフィン包埋した。組織病理学的検査の場合、組織切片を、標準プロトコルに従って、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。ＧＦＰ発現のためのＩＨＣは、マウスの研究で記載されているように行ったが、ＧＦＰに対して異なる抗体を使用した（ヤギ抗体、ＮＢ１００－１７７０、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、１：５００希釈、４℃で一晩のインキュベーション）。ｈＩＤＵＡに対する免疫染色は、ＩＨＣに関する上記のプロトコルに従って、ｈＩＤＵＡに対するヒツジ抗体（ＡＦ４１１９，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１：２００希釈）を使用して行った。加えて、切片を、同じ一次抗体を使用して、免疫蛍光（ＩＦ）によってｈＩＤＵＡに対して染色した。ＩＦの場合、切片を、上に記載のように脱パラフィン化し、抗原賦活化用に処理し、次いで、ＰＢＳ中１％のロバ血清＋０．２％のＴｒｉｔｏｎで２５分間ブロッキングした後、ブロッキング緩衝液に希釈された一次抗体（室温で２時間、１：５０希釈）およびＦＩＴＣ標識二次抗体（４５分間、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１：１００希釈）を用いて、順次インキュベーションした。ＤＡＰＩを核の対比染色に用い、切片を、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ Ｇ中でマウントした。

【0230】

インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、内因性サルＩＤＵＡのＲＮＡに結合しないベクターゲノムから転写されたＲＮＡに特異的なプローブを使用して行った。Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによってＺ字型プローブ対を合成し、製造元のプロトコルに従って、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＶｉｅｗＲＮＡ ＩＳＨ Ｔｉｓｓｕｅ Ａｓｓａｙキットを使用して、パラフィン切片上でＩＳＨを行った。陽性シグナルを示すＦａｓｔ Ｒｅｄ沈殿物の析出を、ローダミンフィルターセットを使用した蛍光顕微鏡によって画像化した。ＩＤＵＡのＩＨＣを用いた組織切片を、Ａｐｅｒｉｏ Ｖｅｒｓａスライドスキャナー（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して定量化の目的でスキャンした。

【0231】

組織病理学および形態測定
病理学的スコアリング
ベクター群に対して盲検化された委員会認定の獣医病理学者が、重症度グレードを確立し、以下の定義がなされた：０．病変の不在、１．最小（１０％未満）、２．軽度（１０～２５％）、３．中等度（２５～５０％）、４．顕著（５０～９５％）、および５．重度（９５％超）。背側軸索障害スコアは、各動物において、少なくとも３つの頸部切片、３つの胸部切片、および３つの腰部切片から確立された。ＤＲＧ重症度グレードは、少なくとも３つの頸部切片、３つの胸部切片、および３つの腰部切片から確立された。正中神経スコアは、軸索障害および線維症の重症度グレードの合計であり、最大可能スコアが１０で、左および右の神経の遠位部および近位部で確立された。導入遺伝子発現の定量化のために、委員会認定の獣医病理学者は、未治療の動物から得られた対照スライドからのシグナルと比較することによって、抗ＧＦＰ抗体または抗ｈＩＤＵＡ抗体で免疫染色された細胞をカウントした。２０倍の倍率視野当たりの陽性細胞の総数を、ＩｍａｇｅＪまたはＡｐｅｒｉｏ Ｉｍａｇｅ Ｓｃｏｐｅ細胞計数ツールを使用して、構造当たりおよび動物当たりで、少なくとも５つの視野上で、手動でカウントした。

【0232】

ＩＳＨ定量化
所与の切片内で核シグナル（ベクターゲノムを含有する）を示したＤＲＧニューロンの細胞質ＩＳＨシグナルを定量化した。染色したスライドをスキャンし、分析されるＤＲＧ
の全領域をカバーするように、スクリーンショットを撮影した。ＦｉｊｉバージョンのＩｍａｇｅＪを使用して、ＩＳＨチャンネルのみを示す画像を同一の設定で閾値化し、（Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚａｔｉｏｎツールを使用して）ＩＳＨおよびＤＡＰＩチャンネルを示す対応する画像と同期させた。次いで、閾値化された画像に示される細胞質領域におけるＩＳＨシグナルによって占有される領域のパーセンテージを、「測定」ツールで決定した。

【0233】

ベクター生体分布
ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ カタログ番号５１３０６）でＮＨＰ組織ＤＮＡを抽出し、ベクターゲノムを、Ｔａｑｍａｎ試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびベクターのｒＢＧポリアデニル化配列を標的とするプライマー／プローブを使用して、ｑＲＴ－ＰＣＲによって定量化した。

【0234】

免疫学
ｈＩＤＵＡに対する末梢血Ｔ細胞応答を、ｈＩＤＵＡ導入遺伝子に特異的なペプチドライブラリを使用して、以前に公開された方法に従ってインターフェロンガンマ酵素結合免疫吸着スポットアッセイによって測定した。陽性応答の基準は、１０^６リンパ球あたり＞５５スポット形成単位、かつ未刺激時の培地陰性対照の３倍であった。加えて、Ｔ細胞応答を、試験９０日目に、剖検後、脾臓、肝臓、および深部頸部リンパ節から抽出したリンパ球においてアッセイした。ｈＩＤＵＡに対する抗体を血清中で測定した（１：１，０００試料希釈）。

【0235】

サイトカイン／ケモカイン分析：ＣＳＦ試料を回収し、分析時まで－８０℃で貯蔵した。ＣＳＦ試料を、以下の分析物を含むＭｉｌｌｉｐｌｅｘ ＭＡＰキットを使用して分析した：ｓＣＤ１３７、エオタキシン、ｓＦａｓＬ、ＦＧＦ－２、フラクタルカイン、グランザイムＡ、グランザイムＢ、ＩＬ－１α、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｅ／ＩＬ－２５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２８Ａ、ＩＬ－３１、ＩＬ－３３、ＩＰ－１０、ＭＩＰ－３α、パーフォリン、ＴＮＦβ。ＣＳＦ試料は、二重で評価し、Ｌｕｍｉｎｅｘ ｘＰＯＮＥＮＴ ４．２、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェア６．１を使用して、ＦＬＥＸＭＡＰ ３Ｄ機器で分析した。分析には、２０％未満の％ＣＶを有する試料のみが含まれた。

【0236】

インビトロ研究
ｍｉＲ１８３発現
ＭＩＲ１８３ヒトマイクロＲＮＡ発現プラスミドは、ＯｒｉｇｅｎｅのＭＩ００００２７３ベクターから、ＧＦＰと部分的な内部リボソーム進入部位をコードするＫｐｎＩ－ＰｓｔＩ断片を欠失させることによって修飾された。我々は、一過性トランスフェクションおよび抗ＧＦＰ免疫ブロットによって、修飾ベクターからのＧＦＰ発現が欠如していることを確認した。ＧＦＰ発現カセットの３’－ＵＴＲに位置するマイクロＲＮＡ結合部位を有するＧＦＰシスプラスミドを用いて、ＨＥＫ２９３細胞でポリエチレンイミン媒介性の一過性トランスフェクションを行った。トランスフェクションの７２時間後、細胞を、プロテアーゼ阻害剤を含む５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００中で溶解した。合計１３μｇの細胞溶解物を、抗ＧＦＰ免疫ブロット、続いて電気化学発光に基づくシグナル検出および定量化に使用した。実験は、統計分析のために３個の複製物で実施された。

【0237】

ｍｉＲ１８３定量化（ＲＴ－ＰＣＲ）
ヒトＤＲＧおよび脊髄組織は、Ａｎａｂｉｏｓ，Ｉｎｃ．から供給された。腰部ＤＲＧおよび脊髄は、もともと、２５歳の白人男性（神経障害性疼痛の病歴を有しない同意した
臓器ドナー）から得られ、すぐにＲＮＡＬａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）に保存された。３匹の動物由来のＮＨＰアカゲザル組織を以前の研究から入手し、－８０℃の冷凍庫に保管した。ＭｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを全ＲＮＡ単離（Ｑｉａｇｅｎ）に使用し、抽出されたＲＮＡを、プロトコル指示書に従って、ＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で逆転写した。製造元の指示書に従って、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ（Ａｓｓａｙ ＩＤ ００２２６９）およびＲＮＵ６Ｂ（Ａｓｓａｙ ＩＤ ００１９３）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）に特異的なプライマーを有するＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙキットを使用して、異なる組織中のｍｉＲ１８３の存在量を決定するためにｑＲＴ－ＰＣＲを実施した。各ｑＲＴ－ＰＣＲアッセイは、１００ｎｇの総ＲＮＡに由来するｃＤＮＡを用いて３個の複製物で実施され、比較閾値サイクル（Ｃｔ）法により分析した。２^{－ΔΔＣｔ}法を用いて、平均発現ｍｉＲ１８３を、内因性対照遺伝子としてのＲＮＵ６Ｂで正規化した。

【0238】

統計分析
対照群（ｍｉＲ標的ベクターなし）と試験群（ｍｉＲ標的ベクター）との間の統計的差は、ノンパラメトリック両側ウィルコクソンの順位和検定、０．０５のアルファレベル（Ｒバージョン４．０．０）を使用して評価したが、ただし、各サイトカインについてノンパラメトリッククラスカル－ウォリス検定を使用して実施したサイトカイン分析と、群間の差について試験するための時点（アルファ＝０．０５、Ｒバージョン４．０．０）を除く。マウスにおけるＧＦＰ発現について、群間の統計的差は、パラメトリック一元配置分散分析、続いて、テューキーの多重比較検定、０．０５のアルファレベルを用いて評価した。データセットは、シャピロ－ウィルク正規性検定（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７．０５）に合格した。

【0239】

実施例２：導入遺伝子発現のマイクロＲＮＡ媒介性阻害は、ＡＡＶベクターによる背側根神経節毒性を低減する
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを血液または脳脊髄液を介して非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の中枢神経系（ＣＮＳ）に送達することは、後根神経節（ＤＲＧ）の毒性と関連する。従来の免疫抑制レジメンは、おそらく、毒性が高い形質導入速度によって引き起こされる可能性があるため、この毒性を防ぐことはできず、これは、次いで、標的細胞における導入遺伝子産物の過剰な存在量に起因する細胞ストレスを引き起こす可能性がある。本願発明者らは、対応する導入遺伝子ｍＲＮＡの３’非翻訳領域内のベクターゲノムにｍｉＲ１８３の配列標的を導入することによって、ＤＲＧ毒性を排除するためのアプローチを開発した。

【0240】

ＡＡＶベクターは、ＮＨＰでＤＲＧ変性を引き起こす
ＮＨＰでのＤＲＧ毒性における経験に基づいて、毒性の重症度を定量化するシステムを開発した。本願発明者らは、ＤＲＧの脊髄に沿って位置する細胞体、末梢神経内の軸索、および背側白質路を上行する軸索を評価する（図１Ａ）。原発性病変は、ＤＲＧに位置する感覚ニューロン細胞体の変性であると考えられる。顕微鏡での評価は、ＤＲＧ病変の範囲を強調する。初期の神経変性は、増殖する衛星細胞、およびミクログリア細胞、および浸潤された単核細胞によって囲まれた、それ以外は正常な神経細胞体からなる（図２Ａ）。それより後期の神経変性および神経貪食の段階は、びまん性細胞質高酸素血症および核の消失を伴う小さな、不規則な、または鋭角を有する神経細胞体を含む（図１Ｂ、図２Ｃおよび図２Ｅ）。導入遺伝子タンパク質を高度に発現する細胞は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、図１Ｂ）を発現するＡＡＶベクターのＩＣＭ投与を受けた動物における導入遺伝子産物を免疫染色によって実証されるように、変性を受ける可能性が高い。細胞体の死の二次的なものとして、軸索障害（遠位軸索および近位軸索の変性）がある。脊髄の背側白質路は、腫脹した軸索と共に、軸索変性と一致するミエロマクロファージおよび軸索破片
を伴うか、または伴わない、拡張された髄鞘を示す（図１Ｂ、図２Ｂ、図２Ｄ、および図２Ｆ）。図１Ｃは、様々なＤＲＧ毒性および脊髄軸索障害の重症度の例を示す。グレードは、高倍率視野組織病理検査における罹患組織の割合に基づく。１ 最小（１０％未満）、２ 軽度（１０～２５％）、３ 中等度（２５～５０％）、４ 顕著（５０～９５％）、および５ 重度（９５％を超える）。

【0241】

青年／成人のＮＨＰの総実績は、ＩＣＭまたは腰部穿刺（ＬＰ）経路を介してＣＳＦにＡＡＶベクターを投与し、合計で、これまでに発表された毒性学的研究および以下に記載される２つのＮＨＰ実験、ならびにいくつかの未発表の研究を含む２７の研究にわたる２１９匹のサルであった。この実績には、５つのカプシド、２０個の導入遺伝子、５つのプロモーター（ＣＡＧ、ＣＢ７、ＵＢＣ、ｈＳｙｎ、およびＭｅＰ４２６）、１×１０^１２ＧＣ～３×１０^１４ＧＣの用量、勾配またはカラムによって精製されたベクター、３つの製剤（リン酸緩衝食塩水および２つの異なる人工ＣＳＦ）、ならびに様々な発達段階のカニクイザルおよびマカクザルが含まれる。すべての実験群において、ＤＲＧ毒性および軸索障害が観察された。病的状態は、注射後約１ヶ月でピークに達し、最長６ヶ月間（成熟マカクで評価された最長期間である）進行しない。ほとんどの場合、病的状態は軽度から中等度であり、ＮＨＰは、神経障害性疼痛を示唆する臨床的徴候を提示しない。しかしながら、ＧＦＰを発現するベクターを高用量でＩＣＭ注入すると、失調症に関連する重篤な病的状態を引き起こし得る。

【0242】

ＤＲＧニューロンで特異的に発現されたｍｉＲＮＡは、ＡＡＶ導入遺伝子の発現を除去することができる。
ＤＲＧ毒性を軽減する方法を検討する際、いくつかのメカニズムを評価した。以前の研究では、ヒトアルファ－Ｌ－イズロニダーゼ（ｈＩＤＵＡ）またはヒトイズロン酸－２－スルファターゼを発現するＡＡＶ９ベクターをＩＣＭ投与されたＮＨＰを免疫抑制することによって、形質導入されたＤＲＧに対する破壊的な適応免疫応答の役割を分析した。ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）およびラパマイシンによる治療は、ベクターおよび導入遺伝子産物に対する適応免疫応答を鈍化させたが、ＤＲＧ毒性または軸索障害には影響がなかった。

【0243】

本願発明者らの操作モデルは、高度に形質導入されたＤＲＧにおける導入遺伝子産物の過剰発現が、神経傷害および細胞体および関連する軸索の変性、続いて反応性炎症反応につながることを主張する（図３Ａ）。この仮説を調べるために、導入遺伝子発現を特異的に除去するための戦略を設計した。造血由来細胞におけるレンチウイルスベクター発現を制限するため、またはＡＡＶ媒介性遺伝子移入後に肝臓、心臓、または筋肉を非標的化するために以前に展開されたアプローチを使用した。このアプローチは、ＤＲＧニューロンでのみ発現されるｍｉＲＮＡ標的を、導入遺伝子の３’非翻訳領域にクローニングすることを伴っていた（図３Ｂ）。ベクターから発現される任意のｍＲＮＡは、内因的に発現されるｍｉＲＮＡによって破壊されるであろう。

【0244】

既存のｍｉＲＮＡデータベースのスクリーニングおよび文献から、ｍｉＲＮＡ１８３クラスターは、この戦略（ｍｉＲ１８３のためのｍｉＲＢａｓｅトラッカー：ＭＩ００００２７３）の良好な候補であることがわかった。このクラスターは、３つのｍｉＲＮＡ（９６、１８２、および１８３）を含有し、これらはすべて多シストロン性ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡから発現される。通常の条件下では、この複合体の発現は、大部分が、ゼブラフィッシュ、マウス、ラット、およびヒト組織で実証されるように、嗅上皮、耳、網膜、およびＤＲＧのニューロンに制限される。本願発明者らは、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によって、３つのＮＨＰおよび１つのヒトドナーからのこの感覚ニューロン特異的発現パターンを検証した。本願発明者らは、ｍｉＲ１８３が、脊髄に比べてＮＨＰおよびヒトＤＲＧにおいて少なくとも１０倍多く存在すること、ならびにＮＨＰでは、最も低
い存在量は大脳皮質であり（ＤＲＧよりも１０００分の１低い）、次に心臓、脾臓、骨格筋、小脳、肝臓、および髄質であることを示した（図４Ａおよび図４Ｂ）。感覚ニューロンの外側では、クラスターは、がんおよび自己免疫疾患を含むいくつかの病理学的状態で上方制御され得る。本願発明者らの初期スクリーニングには、ラットＤＲＧで発現された、あまり十分には特徴付けられていないｍｉＲＮＡ１４５が含まれていた。これらの複合体のすべての中のｍｉＲＮＡの標的配列は、マウス、サル、およびヒトの間で保存される（ｍｉＲ１８３については、以下ＭＩ００００２７３、ＭＩ０００３０８４、ＭＩ００００２２５、ｍｉＲ１８２についてはＭＩ００００２７２、ＭＩ００００２２４、ＭＩ０００２８１５、ｍｉＲ９６についてはＭＩ０００００９８、ＭＩ００００５８３、ＭＩ０００３０８５、およびｍｉＲ１４５についてはＭＩ００００４６１、ＭＩ００００１６９、ＭＩ０００２５５８のｍｉＲＢａｓｅトラッカーを参照されたい）。

【0245】

ｍｉＲＮＡ戦略の活性および特異性を評価するために、インビトロアッセイを使用した。発現カセットの３’非翻訳領域に標的ｍｉＲＮＡ配列の４つのリピートコンカテマーを含むようにＡＡＶシスプラスミドを構築した。ＡＡＶシスプラスミドを、ｍｉＲ１８３を発現するプラスミドと共に共トランスフェクションした。導入遺伝子であるＧＦＰの発現は、それが同種の認識配列を含む場合にのみ、ｍｉＲ１８３の存在下で低減された（図５Ａ、ｐ＝０．００２７）。

【0246】

ＡＡＶベクター内の潜在的なｍｉＲＮＡ標的のインビボ活性および特異性を、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスにおいてスクリーニングした。本発明者らは、ｍｉＲＮＡ１８３複合体（ｍｉＲ１８２およびｍｉＲ１８３）ならびにｍｉＲ１４５のうちの２つのメンバー由来のｍｉＲＮＡ標的の有無で、ＧＦＰ発現ベクターを評価した。最初に、１８３複合体の別のメンバーであるｍｉＲ９６を試験したが、ｍｉＲ１８３（ｐ＝０．０３）およびｍｉＲ１４５（ｐ＝０．０３）と比較して、マウス皮質におけるＧＦＰ－ｍｉＲ９６導入遺伝子の発現が低下したため、これを排除した（図６Ａおよび図６Ｃ）。動物は、標的ＤＲＧへのＡＡＶ９の高用量静脈内（ＩＶ）注射、およびＣＮＳを標的とする高用量のＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ注射を受けた。動物を２１日目に剖検し、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ならびに脳および肝臓（ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ）、または肝臓、心臓および筋肉（ＡＡＶ９）における直接蛍光顕微鏡法によって、ＤＲＧにおけるＧＦＰの発現について分析した。ＤＲＧニューロンにおけるＧＦＰの発現は、ｍｉＲ１８３標的（ｐ＝０．００００７）およびｍｉＲ１８２標的（ｐ＝０．００００３）を含有するが、ｍｉＲ１４５標的ではないベクターで実質的に低減された（図５Ｂおよび図５Ｃ）。ＭｉＲ１８３標的を含有するベクターによる肝臓、心臓、筋肉、または脳皮質における発現の低減はなく、脳皮質（ｐ＝０．０３）、および心臓（ｐ＝０．０４）において対照ＧＦＰベクターと比較したとき、発現は増強された（図５Ｄ、図６Ａ～図６Ｃ）。このマウス実験では、ベクター誘発性のＤＲＧ毒性がＮＨＰでのみ観察されたため、病的状態に対するｍｉＲ１８３標的媒介性導入遺伝子の抑制の影響を評価することができなかった。この種の違いの理由は不明である。

【0247】

ＩＴＲ．ＣＢ７．ＣＩ．ｅＧＦＰ．ｍｉＲ１４５（４つのコピー）．ｒＢＧ．ＩＴＲのベクターゲノムを配列番号１０に提供し、ＩＴＲ．ＣＢ７．ＣＩ．ＧＦＰ．ｍｉＲ１８２（４つのコピー）．ｒＢＧ．ＩＴＲのベクターゲノムを配列番号１１に提供し、ＩＴＲ．ＣＢ７．ＣＩ．ＧＦＰ．ｍｉＲＮＡ９６（４つのコピー）．ｒＢＧ．ＩＴＲのベクターゲノムを配列番号１２に提供し、ＩＴＲ．ＣＢ７．ＣＩ．ＧＦＰ．ｍｉＲ１８３（４つのコピー）．ｒＢＧ．ＩＴＲのベクターゲノムを配列番号１３に提供する。

【0248】

ｍｉＲ１８３による限定された導入遺伝子の発現は、ＮＨＰにおけるＤＲＧ毒性を低減する。
プロモーターの有望なデータに基づいて、ＮＨＰにおいて、ＧＦＰ ｍｉＲ１８３標的発現カセットを評価した。アカゲザルにおけるＣＢ７プロモーターからのＧＦＰを発現す
るＡＡＶｈｕ６８ベクター（ｎ＝２、１匹の雄、１匹の雌、それぞれ５歳および８歳）またはＧＦＰｍｉＲ１８３（ｎ＝４匹雌、５～６歳の年齢範囲）をＩＣＭ注射した（３．５×１０^１３ＧＣ）。ＧＦＰ発現のために、半数の動物を１４日目に剖検した。残りの動物を６０日目に剖検して、発現およびＤＲＧ毒性を評価した。動物は、臨床的後遺症を伴わずにＩＣＭ投与されたベクターに耐容性であり、ベクター投与後にこの研究に登録されたいずれの動物についても、神経障害性疼痛の証拠は存在しなかった。対照ベクター（ｐ＝０．００５４）と比較して、ｍｉＲ１８３標的含有ベクターを用いたＤＲＧにおけるＧＦＰ発現の統計的に有意な低減を観察したが、一方で、発現は、腰部運動ニューロン（ｐ＝０．０２７３）および小脳（ｐ＝０．００４４）において増強され、皮質、心臓、および肝臓において不変なままであった（図７Ａおよび図７Ｂ）。このことは、９つの領域にわたる病的状態の低減と関連していた（頸髄、胸髄、および腰髄におけるＤＲＧならびに背側脊髄軸索障害、ならびに正中神経、腓骨神経および橈骨神経の軸索障害）。ベクターがｍｉＲ１８３標的を含有しなかった場合、すべての領域で病的状態が存在し、グレード４、グレード２、およびグレード１の間で均等に分布した。ｍｉＲ１８３ベクターを用いた病的状態の最大の程度は、グレード２であり、わずか１１％の領域に存在していた。残りの領域は、グレード１の病的状態（７２％）または病的状態なし（１７％、図７Ｃ）のいずれかを含んでいた。

【0249】

ムコ多糖症Ｉ型患者において欠損した酵素であるｈＩＤＵＡを発現するベクターを使用して、ＮＨＰにおけるｍｉＲ１８３標的配列をさらに評価した。このヒト導入遺伝子を用いた研究は、ＮＨＰにおけるＤＲＧ毒性を強調する最初の公開された報告であった。実験には、以下の３つの群が含まれていた。群１－ｍｉＲ１８３標的（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＵＡｃｏＶ１．ｒＢＧ）を含まない対照ベクター単独（ｎ＝３、２匹の雌、１匹の雄、年齢２．５歳）、群２－ステロイドで治療した動物におけるｍｉＲ１８３標的を含まない対照ベクター（プレドニゾロン１ｍｇ／ｋｇ／日を－７日目から３０日目まで、その後、漸進的に徐々に減らす、ｎ＝３、３匹の雄、年齢２．５～３．５歳）、および群３－ｍｉＲ１８３標的（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＵＡｃｏＶ１．４×ｍｉＲ１８３．ｒＢＧ）を含むベクター（ｎ＝３、２匹の雄、１匹の雌、年齢２．２５～２．５歳）。すべてのベクターゲノムには、ニワトリβアクチンプロモーターおよびＣＭＶエンハンサーエレメント（ＣＢ７プロモーターと称する）の制御下のｈＩＤＵＡコード配列、ニワトリβアクチンスプライスドナーからなるキメライトロン（ＣＩ）（９７３ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ００１８２．１）、およびウサギβ－グロビンスプライスアクセプターエレメント、ならびにウサギβグロビンポリアデニル化シグナル（ｒＢＧ、１２７ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｖ００８８２．１）。ＩＴＲ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＵＡｃｏＶ１．ｒＢＧ．ＩＴＲのベクターゲノムは、配列番号１４で提供されている。ＩＴＲ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＵＡｃｏＶ１．４ｘｍｉＲＮＡ１８３．ｒＢＧ．ＩＴＲのベクターゲノムは、配列番号１６で提供されている。すべての動物に、ＡＡＶｈｕ６８ベクター（１×１０^１３ＧＣ）のＩＣＭ注射を受けさせ、９０日目に剖検を行い、導入遺伝子発現およびＤＲＧ関連毒性を評価した。

【0250】

すべての群由来の動物が、ベクター関連の臨床所見または臨床病理学的な異常を有さず、ＩＣＭベクターに耐容性を示した（表１および表２）。ＣＳＦ中の髄液細胞増多は非常に低く、第２群で１匹、第３群で１匹に限定された（表３）。Ｔ細胞応答（ＥＬＩＳＰＯＴによる測定）およびｈＩＤＵＡに対する抗体の両方が、３つの群すべてにおいて検出された（図８Ａ～図８Ｄ）。ベクター投与の２４時間後にスパイクしたフラクタルカインおよびＭＩＰ－３ａのＣＳＦ量は、群１からの２匹の動物および群３からの３匹の動物で未検出から１００ｐｇ／ｍＬを超える値まで上昇し、一方、これらの分析物は、２４時間では検出することができなかったが、第２群からのＣＳＦでは２１日目および３５日目に増加した（予防的ステロイド）。検出することができない量または微量（１５ｐｇ／ｍＬ未満）のサイトカインおよびケモカインを、注射から２１日後および３５日後（過剰発現誘
発性ストレスが予想される場合）に群３（ｈＩＤＵＡ．ｍｉＲ１８３）の動物のＣＳＦにおいて測定したが、一方、群１からのすべての動物において、いくつかの分析物（フラクタルカイン、ＭＩＰ－３ａ、ＩＬ１６、パーフォリン、およびＩＬ１７）は、１００ｐｇ／ｍＬを超えていた（図９）。

【0251】

免疫蛍光およびインサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を使用して、対照ベクター（ｍｉＲ１８３標的を含まない）を使用した群１および群２において、ＤＲＧにおいて高発現のｈＩＤＵＡが観察された（図１０および図１１Ａ）。他のＣＮＳ区画では（脊髄の下位運動ニューロンならびに小脳および皮質のニューロンを含む）、低度から中程度のｈＩＤＵＡ発現が検出された（図１０および図１１Ａ）。ｍｉＲ１８３標的をベクターに組み込むと（ＡＡＶｈｕ６８．ｈＩＤＵＡ－ｍｉＲ１８３／群３）は、免疫蛍光（図１０上の行、図１１Ａ）および免疫組織化学（図１０、図１１Ａ）によって強調されるように、ＣＮＳ（脊髄、小脳、および皮質）における発現を低減させることなく、ＤＲＧニューロンにおけるｈＩＤＵＡタンパク質発現が除去された（ｐ＝０．０００００３）。ｍＲＮＡレベル（図１０、下の行）では、形質導入ＤＲＧニューロンにおける細胞質ＩＳＨシグナルは、ＡＡＶｕ６８．ｈＩＤＵＡを投与された動物の面積の４２％から、ＡＡＶｈｕ６８．ｈＩＤＵＡ－ｍｉＲ１８３を投与された動物の７％まで低減し（図１１Ａ）、これは８３％の低減を表している。ＣＮＳおよびＤＲＧ全体にわたるベクターの生体分布が、すべての群にわたって本質的に同じであったことから、ＤＲＧにおけるｈＩＤＵＡ発現の低減は、遺伝子導入が低減したためではなかった（図１２）。ステロイドは、対照ベクターと比較して、ＤＲＧにおける発現を中程度に低減させ（ｐ＝０．０００１）、下位運動ニューロンにおける発現を増加させた（ｐ＝０．００２４）（図１０および図１１Ａ）。予想通り、対照ベクター（群１）との投与は、ＧＦＰ発現ベクターと比較して比較的穏やかなＤＲＧ、後側柱、および末梢神経の病的状態を引き起こした。しかしながら、病的状態は、ｍｉＲ１８３標的含有ベクター（群３、図１１Ｂ）で形質導入された動物のＤＲＧ（ｐ＝０．０５８３）、後側柱（ｐ＜０．０００１）、および末梢（正中）神経（ｐ＝０．０１３７）において、まったく存在しなかった。ステロイド（群２）との併用治療は、親ベクター（ｍｉＲ１８３標的を含有しない）の毒性を低下させなかった（図１１Ｂ）が、代わりに、末梢神経（ｐ＝０．０２５６）および背側柱（ｐ＝０．０６６）において毒性を悪化させる傾向と関連があった。

【表4】

【表5】

【表6】

【表7】

【表8】

【表9-1】

【表9-2】

【表10】

【表11】

【表12】

【0252】

ＮＨＰにおけるＡＡＶ誘発性ＤＲＧ毒性は、神経細胞アポトーシスを介して生じる。
ＤＲＧにおけるニューロン変性の機序を検討するために、ｍｉＲ１８３を伴うベクター
および伴わないベクターを注射した動物からいくつかの組織学的切片を選択し、細胞アポトーシスおよび折り畳み不全タンパク質応答（ＵＰＲ）のマーカーについてＩＨＣを行った。初期の研究は、アポトーシスの下流マーカーであるカスパーゼ－３の活性化に焦点を当てた。ヘモトキシリンおよびエオシン評価に基づいて神経変性を示した動物のＤＲＧは、細胞浸潤と共に活性化カスパーゼ－３について陽性のＩＨＣ染色を示した（図１３Ａ～図１３Ｃ）。ＡＡＶ注射されていない動物由来のＤＲＧおよび脾臓由来のＤＲＧは、それぞれ、陰性対照および陽性対照として機能した（図１３Ｅおよび図１３Ｆ）。ＤＲＧにおけるカスパーゼ－３陽性ニューロンは、ＡＡＶ．ｈＩＤＵＡを注射した３匹の動物（１１、０、および１の陽性ＤＲＧニューロン）と比較して、ＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰを注射した動物からの切片でより多く存在した（２０のカスパーゼ－３陽性ＤＲＧニューロン）。各々の場合では、ｍｉＲＮＡ１８３標的配列を含むことで、活性化カスパーゼ－３を有する細胞の数が低減した（ＧＦＰ．ｍｉＲ１８３を有する３および０の陽性ニューロン、ｎ＝２匹の動物、およびｈＩＤＵＡ．ｍｉＲ１８３を有する場合は０、ｎ＝３匹の動物、図１３Ｃ～図１３Ｄ）。ＩＨＣによるカスパーゼ－８の上方制御を評価することによって、外因性経路と称されるものにおいて、適応免疫または先天性免疫によって誘導されるアポトーシスを調査した。カスパーゼ－３陽性ニューロンを有する切片のみが処理された。すべてのベクター群にわたる変性神経細胞体は、活性化カスパーゼ－８に対して陰性であったが、浸潤細胞は、内部陽性対照として機能するカスパーゼ－８に対して強く陽性であった（図１５Ａ～図１５Ｅ）。同じ切片を、アポトーシスの内因性経路の共通マーカーである活性化カスパーゼ９についても評価した。このアポトーシスの機序は、ミトコンドリアの膜透過性の増加およびカスパーゼ９の活性化に起因するシトクロムＣの放出を介して媒介される。ＩＨＣは、ＡＡＶｈｕ６８．ｅＧＦＰを受けた動物において、ＤＲＧの１つの変性神経細胞体においてカスパーゼ－９を示した（図１６Ａ）。しかしながら、ＡＡＶｈｕ６８．ｅＧＦＰ．ｍｉＲＮＡを受け、神経変性を示した動物において、カスパーゼ－９は観察されなかった（図１６Ｃ）。ｍｉＲ１８３の有無にかかわらず、ＡＡＶｈｕ６８．ｈＩＤＵＡベクターを受けた動物からの陽性カスパーゼ９ニューロンは存在しなかったが、このことは、ＡＡＶｈｕ６８．ｅＧＦＰと比較して、これらのベクターで観察された病変の発生率の低下の関数であった可能性があり、これにより、組織学的切片上の変性の適切な段階でニューロンを見つける可能性を低下させる（図１６Ｂおよび図１６Ｄ）。

【0253】

導入遺伝子のタンパク質過剰発現に起因する毒性の提唱された機序を裏付けるために、１群当たり１匹の動物において活性化転写因子６（ＡＴＦ６）についてのＩＨＣを実施した。ＵＰＲは、ゴルジ体においてＡＴＦ６活性化の引き金となり、細胞質断片を生成し、核に移行して、ＥＲ関連結合エレメントの転写を活性化する。ＵＰＲを介したアポトーシスは、内因性経路を介して生じる。ＡＴＦ６についてのＩＨＣは、ＡＡＶｈｕ６８．ｅＧＦＰ（４０個を超える陽性細胞）、ＡＡＶｈｕ．６８．ｈＩＤＵＡ（４０個を超える陽性細胞）、およびＡＡＶｈｕ６８．ｅＧＦＰ．ｍｉＲ１８３（１８個の陽性細胞）を受けた動物のＤＲＧにおけるニューロンおよび神経衛星細胞の細胞質において多焦点陽性であり、このことは、病変の重症度に対応していた（図１４Ａ～図１４Ｃ）。対照的に、ＡＡＶｈｕ６８．ｈＩＤＵＡ．ｍｉＲ１８３、および未処理のＡＡＶ注射されていない対照ＮＨＰを受けた動物は、ＡＴＦ６に対して拡散した陰性であった（図１４Ｄおよび図１４Ｅ）。全体的な研究所見と一致して、ｍｉＲ１８３を有するベクターを受けた動物は、陽性ＡＴＦ６シグナルの低減を示し、このことは、細胞ストレスの低減を示している。

【0254】

ＤＲＧの毒性は、高全身用量のベクターまたはＣＳＦへのベクターの直接送達に依存する任意の遺伝子療法において生じる可能性が高い。この安全上の懸念は、霊長類に限定され、通常は無症候性である。しかしながら、ＤＲＧ毒性は、固有受容欠損に起因する運動失調などの実質的な罹患を引き起こす可能性を有する。食品医薬品局は、近年、遅発性ＳＭＡの髄腔内ＡＡＶ９治験を、ＮＨＰのＤＲＧ毒性に起因して部分的に実施保留し、したがって、この危険性が、ＡＡＶ療法の開発をどのように制限し得るかを強調している。

【0255】

もともと、この毒性は、外来カプシドまたは導入遺伝子のエピトープを対象として、ＤＲＧ形質導入ニューロンに対する破壊的なＴ細胞免疫によって引き起こされると仮定された。しかしながら、ＭＭＦおよびラパマイシンなどの強力な免疫抑制レジメンは、毒性学的研究において毒性を防止せず、本研究においてステロイドを防止しなかった。遅発性であるが、進行性ではないＤＲＧ変性の時間経過は、適応免疫が役割を果たすという考えを裏付けるものではなかった。細胞傷害性Ｔ細胞が関与している場合、本願発明者らは、ＤＲＧおよび導入遺伝子を発現する他の細胞型の変性、ならびに早期に開始し、経時的に進行する単核細胞浸潤を観察したであろう。

【0256】

高レベルのＤＲＧ形質導入で、細胞ストレスが生み出され、これが高度に形質導入されたＤＲＧニューロンにおける変性をもたらす可能性がある。組織学的分析では、変性が、最も多くの導入遺伝子タンパク質を発現するＤＲＧニューロンに限定されることが示された。ニューロン変性は、カスパーゼ－３およびカスパーゼ－９の活性化にも関連しており、したがって、このことは、アポトーシスが、Ｔ細胞によって媒介されるのとは対照的に、細胞内のストレス源によって引き起こされることを示唆している。ｍｉＲＮＡ１８３を介した導入遺伝子発現の細胞特異的除去によるＤＲＧ変性の低減は、カプシドまたはベクターＤＮＡではなく、導入遺伝子由来のｍＲＮＡまたはタンパク質の過剰発現が、このプロセスを駆動することを示唆している。ｍｉＲ標的または未処理の動物を用いた対照と比較して、ｍｉＲ標的を含まないベクターを受けた動物のニューロンおよび衛星細胞におけるＡＴＦ６染色の増加は、ＵＰＲを暗示するが、誘発する機序は、非分泌型（ＧＦＰ）導入遺伝子と分泌型（ＩＤＵＡ）導入遺伝子とで異なる場合がある。

【0257】

自己限定的ではないが、遅延したＤＲＧ神経変性の時間経過は、非免疫毒性が、高度に形質導入されたサブセットの細胞に限定されるという考えと一致する。ＤＲＧ毒性および軸索障害が可逆的であるかどうかは不明である。成体動物を６ヶ月追跡した後に、病的状態の解消は観察されていない。ＩＣＭ注射後、ＮＨＰでＤＲＧ毒性がみられなかった唯一の実験は、ベクターが１ヶ月齢のマカクザルに投与され、４年後に剖検された場合であった。乳児霊長類がＤＲＧ毒性に耐性を有するか、またはそのＤＲＧニューロンが再生能を有するか、または病変がこの長期間にわたって退縮する可能性がある。本願発明者らの知見は、ＤＲＧ毒性が、テイ・サックス病において欠損するリソソーム酵素であるヘキソサミニダーゼを発現するＡＡＶの直接的な脳内投与の後、ＮＨＰのＣＮＳにおいて以前に報告されている神経毒性の一種である導入遺伝子の過剰発現によって引き起こされることを裏付けている。したがって、ＤＲＧ毒性の重症度は、用量、プロモーター強度、および導入遺伝子の性質に影響されるはずである。しかしながら、本願発明者らは、ＤＲＧ毒性がない状態で、成熟霊長類におけるベクターの有効用量を達成することができるＣＮＳ指向性ＡＡＶをまだ発見していない。

【0258】

霊長類において、感覚ニューロンが最も効率的に形質導入される細胞の１つである理由は、理解されていない。ＤＲＧは、ＣＮＳの外側に存在し、多孔質で有窓の毛細血管を有するため、全身投与ベクターによって容易にアクセスされる。全身ベクターは、末梢軸索からの取り込まれた後、逆行性輸送を介してＤＲＧニューロンにアクセスすることもできる。髄腔内（クモ膜下腔内）空間に存在する感覚神経区画の解剖学的構造により、ＣＳＦに送達されるベクターの高い形質導入が促進され得る。後根のＤＲＧニューロンの軸索は、ＣＳＦに曝され、ＩＣＭ／ＬＰ投与後に、ベクターへの容易なアクセスが提供される。ＤＲＧの細胞外液へのクモ膜下腔空間の開放的なアクセスにより、ＤＲＧのニューロンおよび他の細胞へのＩＣＭ／ＬＰベクターの直接的な接触が可能になるはずである。ｍｉＲ１８３標的配列を含むことによるＤＲＧニューロン内の導入遺伝子発現の選択的抑制は、このｍｉＲＮＡの影響を受けないはずの他のＤＲＧ関連細胞における導入遺伝子発現の分析を促進した。ＩＳＨで、周囲のグリア衛星細胞における導入遺伝子のｍＲＮＡが明らか
になり、このことは、直接的な形質導入を示唆し得る。グリア細胞における導入遺伝子のｍＲＮＡの存在の機能的意義は未知である。

【0259】

ベクター導入遺伝子の発現を選択的に阻害すると、ＤＲＧ毒性が低減され、潜在的に排除されるはずである。これを達成するための鍵は、他の場所における発現に影響を与えることなく、ＤＲＧニューロンにおける発現を特異的に消滅させるための戦略を設計することを伴う。現在、カプシド修飾または組織特異的プロモーターを介して、この特異性を達成することはできない。ｍｉＲ１８３の標的をベクターに含めることで、ベクターの製造、効力、または生体分布に影響を与えることなく、ＤＲＧ毒性を低減／排除する所望の結果が達成された。しかしながら、ｍｉＲ１８３およびＲＩＳＣは、高いＧＣ数によって飽和する可能性が高いため、用量ウィンドウは、狭くてもよい。本願発明者らの研究におけるＩＳＨの定量化は、形質導入されたＤＲＧニューロンのｍＲＮＡレベルでの８０％の低減が、毒性を抑制するのに十分であることを示唆している。任意の所与の導入遺伝子に対する本願発明者らのアプローチの実行可能性を確立するためには、動物モデルにおける最小有効性用量研究と組み合わせた慎重な用量範囲研究が不可欠である。ｈＩＤＵＡのＮＨＰ研究には、併用ステロイドと共に非ｍｉＲ１８３標的化ベクターを受けた群が含まれていた（ＡＡＶ試験における免疫媒介性の毒性を緩和するための標準的なアプローチである）。ＤＲＧ毒性は、ステロイド治療群では低減しなかった。この実験は、ＡＡＶ遺伝子療法における予防的ステロイドの限界を示している。

【0260】

ＤＲＧ毒性を減少させるためのこのアプローチのモジュラリティは、ＣＮＳ指向性遺伝子療法のために考慮される任意のＡＡＶベクターにおいて使用され得ることを示唆する。ベクター内のｍｉＲ１８３標的が、ｍｉＲ１８３分子をその通常の標的から逸らす可能性があり、細胞の生理学を乱す可能性がある。これに対する証拠は、ｍｉＲ１８３（ＤＲＧ）を発現する重度に形質導入された細胞に限定される毒性であろう。本願発明者らは、ＡＡＶ ｍｉＲ１８３標的含有ベクターで治療されたＮＨＰにおける毒性を観察していない。ｍｉＲ１８３、１８２、および９６に関して共通の標的を有するｍｉＲ１８３クラスターの冗長性は、単一のｍｉＲＮＡノックアウトモデルに対し、完全なクラスターにおいて示唆されるように、この理論的な危険性を低減し得る。さらに、ｍｉＲ１８３を発現することが知られている他の細胞型（嗅上皮、網膜、内耳、活性化免疫細胞）は、ＩＣＭまたは全身ＡＡＶ送達時に効率的に形質導入されないであろう。ＤＲＧ毒性に対して規制当局によって挙げられている懸念を考慮すると、ｍｉＲＮＡ１８３脱標的化戦略をＣＮＳ遺伝子療法プログラムに組み込むことは慎重であると考えられる。この戦略の主な制限は、ＤＲＧ形質導入が治療効果を達成するために必要である、シャルコー・マリー・トゥースの神経形態のような疾患においてＤＲＧ毒性を緩和することである。

【0261】

まとめると、本願発明者らは、ＮＨＰにおいてＡＡＶ誘発性ＤＲＧ毒性を軽減するアプローチを開発した。このアプローチは、種々の治療用途において、幅広いＡＡＶベクターにわたって試験することができた。

【0262】

実施例３：ＨＩＤＵＡをコードする操作された配列と、ＩＤＵＡ活性および発現に対するｍｉＲ１８３標的配列の効果との比較。
野生型雄マウスに、最適化されていない天然ｃＤＮＡと比較して、ヒトＩＤＵＡをコードする操作された配列（配列番号２２～２６）の送達のために、１ｘ１０^１１ＧＣのＡＡＶｈｕ６８をＩＶ注射した。ｈＩＤＵＡｃｏＶ１（配列番号２２）は、血清において最も速く、最も高い酵素レベルを示し、２１日目にはレベルが安定しており（図１７Ａ）、このことは、有意なレベルの抗薬物抗体がないことを示唆している。ｈＩＤＵＡｃｏＶ１は、一部には迅速な発現（血清の日）および脳内での高レベルの活性に起因して、さらなる研究で評価された（図１７Ｂ）。

【0263】

ＭＰＳＩ（ＩＤＵＡ欠損）マウスに、ｍｉＲ１８３標的（４×リピート）を含むか、または含まないｈＩＤＵＡＣｏｖ１をコードする１×１０^１１ＧＣのＡＡＶｈｕ６８をＩＣＶ注射した。マウスを、注射から３０日後または９０日後に安楽死させた（図１８Ａおよび図１８Ｂ）。ＩＤＵＡ活性は、ｈＩＤＵＡｃｏｖ１またはｈＩＤＵＡｃｏｖ１－ｍｉＲ１８３をコードするＡＡＶｈｕ６８によるＩＣＶ治療の後、野生型を上回っていた（図１８Ｃ～図１８Ｃ）。４×ｍｉＲ１８３標的ベクターを用いると、平均レベルが増加し、このことは、ｍｉＲ１８３標的が構築物中に含まれる場合、有効性がｍｉＲ１８３以上であることを示している。組織を処理して、ＬＡＭＰ１免疫蛍光を治療有効性のマーカーとして使用して、貯蔵低減を評価した。ＬＡＭＰ１蛍光は、ビヒクル対照で治療したＫＯマウスにおいて増加し、ｍｉＲ１８３標的の有無にかかわらず、両方の態様のｈＩＤＵＡをコードするベクターでのＡＡＶ治療の後に皮質において低減した（図１８Ｅおよび図１８Ｆ）。治療有効性は、若いマウスにおいて、それより高齢のマウスと比較して高かった。

【0264】

実施例４：ｍｉＲ１８３クラスター標的配列を有する発現構築物のインビトロ評価
インビトロアッセイを使用して、ｍｉＲＮＡ標的配列を有する構築物の活性および特異性を評価する。上の実施例２に記載されるように、ＨＥＫ２９３細胞（または別の好適な細胞株）を、ＧＦＰ導入遺伝子を有するシスプラスミド、ならびにｍｉＲ－１８２およびｍｉＲ－１８３などの１つ以上のｍｉＲＮＡを発現するプラスミドで共トランスフェクトする。シスプラスミドは、発現カセットの３’ＵＴＲ中の様々な数の対応する標的ｍｉＲＮＡ配列で設計され、代替的なスペーサー配列が導入される。トランスフェクションの７２時間後、ＧＦＰの発現を定量化して、相対的な発現レベルを決定する。

【0265】

例えば、標的ｍｉＲ１８３配列の１、２、３、または４個、または最大で８個のコピーを保有する構築物を試験する。個々の標的配列は、配列番号５～７に提供されるものなど、直接連結されているか、またはスペーサー配列によって分離されている。インビトロ研究の結果に基づいて、ＧＦＰの発現を低減または排除する配列（いくつかのリピートを含む）およびスペーサーの好適な組み合わせが特定される。次いで、この研究からの候補を、標的ｍｉＲＮＡ配列およびスペーサー配列が同じ配置または類似の配置である発現構築物を有するＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ９またはＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ）を送達することによって、インビボでスクリーニングする。例えば、ＤＲＧの脱標的化（すなわち、ＧＦＰ発現の低減）を含む、ＣＮＳでの発現レベルを評価するための例示的なインビボマウス研究が、実施例２に提供されている。

【0266】

また、様々なスペーサー配列を含むかまたは含まない、ｍｉＲ１８２についての標的配列の１、２、３、または４個、または最大で８個のコピーの組み合わせを有する構築物を使用して、同様の研究が行われる。加えて、ｍｉＲ１８２およびｍｉＲ１８３の認識配列の組み合わせおよび異なる配置を有する構築物が生成される。次いで、インビトロで好ましい低減した発現レベルを示すｍｉＲ１８２標的配列のみ、ならびにｍｉＲ１８２およびｍｉＲ１８３標的配列の組み合わせを有する構築物を、例えば、ＡＡＶベクターの投与後にインビボで評価して、ＣＮＳおよびＤＲＧの細胞における毒性および導入遺伝子発現のレベル（脱標的化の程度）を決定する。

【0267】

代替的に、ｍｉＲ１８２標的配列および／または他のｍｉｒ１８３クラスター標的配列（すなわち、ｍｉＲ－１８３、ｍｉＲ－９６、またはｍｉＲ－１８２に対応する標的配列）の組み合わせの１、２、３、または４個、または最大で８個のコピーの組み合わせを有する構築物を生成する。上記の実施例２に記載されるようなＧＦＰ発現アッセイを使用して、組み合わせのｍｉＲ１８２－ｍｉＲ１８３クラスター標的配列を保有する構築物をインビトロで試験する。上述のように、試験した発現カセットは、スペーサー配列によって分離されているか、または分離されていない様々な数のｍｉＲＮＡ標的配列を有する。次いで、ｍｉＲ１８２標的配列および他のｍｉｒ１８３クラスター標的配列の組み合わせを
有する特定の構築物の活性を、次いで高用量でＩＶ投与されるＡＶＶベクターを生成することによってインビボで評価する。上記のように、ＡＡＶベクター導入遺伝子の発現は、ＤＲＧを含む様々な細胞および組織、特に肝臓組織において評価される。

【0268】

さらに、導入遺伝子発現のｍｉＲ１８２標的配列の１、２、３、４個、または最大で８個のコピーの効果を評価する。上述のように、インビトロ試験のための実験的構築物を生成し、ｍｉＲ１８２標的配列を発現カセットの３’ＵＴＲに導入する。複数のｍｉＲ１８２配列が導入される場合、配列は連続的であってもよく、または代替的に、様々な介在スペーサー配列のうちのいずれかによって分離されてもよい。任意の組み合わせのｍｉＲ１８２標的配列、およびスペーサー配列（適用可能な場合）を含む発現カセットを有するＡＡＶベクターを生成し、インビボで試験する。特に、ｍｉＲ１８２標的配列を有する発現カセットの場合、導入遺伝子発現は、ＡＡＶベクターの高用量ＩＶ投与後の筋肉組織において評価される。

【0269】

実施例５：導入遺伝子に作動可能に連結されたｍｉＲ標的配列を有するｒＡＡＶの送達は、ｍｉＲ１８３クラスター調節遺伝子の発現を増加させない。
ヒトＣＡＣＮＡ２Ｄ１およびＣＡＣＮＡ２Ｄ２遺伝子（メンバーは、電位依存性カルシウムチャネルをコードする）は、ｍｉＲ１８３クラスター（ｍｉＲ１８３／９６／１８２）の予測標的であり、ヒトドナー由来のＤＲＧにおける、３つすべてのｍｉＲＮＡと、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１およびＣＡＣＮＡ２Ｄ２発現との間に有意な逆相関が観察されている。例えば、Ｐｅｎｇ ａｔ ａｌ，“ｍｉｒＲ－１８３ ｃｌｕｓｔｅｒ ｓｃａｌｅｓ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｐａｉｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ
ｂａｓａｌ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ ｐａｉｎ ｇｅｎｅｓ”．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１７ Ｊｕｎ １６；３５６（６３４３）：１１６８－１１７１．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｍ７６７１．Ｅｐｕｂ ２０１７ Ｊｕｎ １を参照されたい。ｍｉＲ１８３がＣＡＣＮＡ２Ｄ発現を下方制御することが報告されている。しかしながら、「スポンジ効果」が存在する場合、ＣＡＣＮＡ２Ｄの発現の増加が予想され、これは、動物の疼痛および圧力に対する感受性の増加に寄与する。

【0270】

４×ｍｉＲ１８３標的配列を有するか、もしくは有さず、ｅＧＦＰを含むベクターゲノムを含有するか、４×ｍｉＲ１８３標的配列を有するか、もしくは有さず、ｈＩＤＵＡを含むベクターゲノムを含有する、ストックｒＡＡＶを、ラット－ＤＲＧ培地で２．５×１０^１２／ｍＬに希釈し、古い培地を除去した後、０．２５ｍｌを２４ウェルプレートの各ＤＲＧ含有ウェルに添加した。２４時間後、培地を除去し、新鮮な培地と交換した。形質導入は、３個の複製物で行われた（すなわち、ＡＡＶ－ＧＦＰについて３個のウェル、ＡＡＶ－ＧＦＰ－ｍｉＲ１８３については３個のウェル（モック対照について２個のウェル））。形質導入を増強するために、ＡＡＶベクターと共に、ＭＯＩ １０で、アデノウイルスＡＤ５（ＳｉｇｎａＧｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）も添加した。ＲＮＡを各ウェルについて別々に単離し、ｑ－ＲＴ－ＰＣＲに（１つの反応／ウェル、２個の複製物で）使用した。形質導入の７２時間後に、ＤＲＧ培養物から総ＲＮＡを抽出した。

【0271】

標的遺伝子ＣＡＣＮＡ２Ｄ１およびＣＡＣＮＡ２Ｄ２に対するｍｉＲ１８３の発現レベルおよび潜在的なスポンジ効果を、ラットＣＡＣＮＡ２Ｄ１（アッセイＩＤ Ｒｎ０１４４２５８０）およびＣＡＣＮＡ２Ｄ２（アッセイＩＤ：Ｒｎ００４５７８２５）に特異的なプライマーを使用して決定した。図２０は、低濃度（５×１０^５）または高濃度（２．５×１０^８）でのｍｉＲ１８３脱標的化配列の４つのコピーを伴うか、または伴わない、ｅＧＦＰ導入遺伝子を担持する様々なベクターのＡＡＶ形質導入（ＡＡＶ９）の結果を示す。ｍｉＲ１８３を伴わない低用量および高用量を、１００（低用量ＡＡＶ９－ｅＧＦＰの場合）または１０（高用量ＡＡＶ９－ｅＧＦＰの場合）の感染多重度（ＭＯＩ）で、ア
デノウイルス５型（Ａｄ５）ヘルパー共トランスフェクションを行うか、または行わずに試験した。すべてのＤＲＧニューロンが形質導入され、毒性の目に見える兆候は観察されない。ＤＲＧニューロンにおいて、ＧＦＰ発現はみられないが、線維芽細胞様細胞において、ある程度の発現が観察される。このことは、（４×）ｍｉＲ１８３標的発現カセットによるＧＦＰ転写の抑制を確認する。

【0272】

ＮＨＰにおけるｍｉＲ１８３スポンジ効果研究
動物をＡＡＶ－ＩＤＵＡまたはＡＡＶ．ｈＩＤＵＡ．４Ｘｍｉｒ１８３ベクター（ｎ＝３／群）で治療した非ヒト霊長類（ＮＨＰ）アカゲザル研究（１９－０４）から、ＤＲＧ（腰部）および脳（前頭皮質）組織を得た。ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを全ＲＮＡ単離に使用し（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）、次いで、抽出されたＲＮＡを、プロトコルの指示に従って、ＴａｑＭａｎ（商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で逆転写させた。定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を実施し、製造元の指示に従って、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ（アッセイＩＤ００２２６９）およびＲＮＵ６Ｂ（アッセイＩＤ００１９３）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）に特異的なプライマーを有するＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙキットを使用して、異なる組織におけるｍｉＲ１８３の存在量を決定した。同様に、ｍｉＲ１８３の直接標的のうちの２つ、すなわち、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１およびＣＡＣＮＡ２Ｄ２の存在量を、それぞれ、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１（アッセイＩＤ Ｈｓ００９８４８４０）およびＣＡＣＮＡ２Ｄ２（アッセイＩＤ：Ｈｓ０１０２１０４９）に特異的なプライマーを有するＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙキットを使用して測定した。各ｑＰＣＲアッセイは、生物学的複製物からの１００ｎｇの総ＲＮＡに由来するｃＤＮＡを用いて３個の複製物で実施され、比較閾値サイクル（Ｃｔ）法により分析した。ｍｉＲ１８３の平均発現レベルを、内因性対照遺伝子としてＲＮＵ６Ｂで正規化し、２^{－ΔΔＣｔ}法（Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ ＴＤ、Ｌｉｖａｋ ＫＪ．Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｄａｔａ ｂｙ ｔｈｅ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｃ（Ｔ）ｍｅｔｈｏｄ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２００８；３（６）：１１０１－８）を使用して、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１およびＣＡＣＮＡ２Ｄ２の平均レベルを、ＧＡＰＤＨで正規化した。図１９Ａ（ｄｒｇ）および図１９Ｂ（皮質）を参照されたい。ＤＲＧ（高ｍｉＲ１８３存在量）または前頭皮質（低ｍｉＲ１８３存在量）のいずれかにおけるＡＡＶ－ＩＤＵＡあるいはＡＡＶ－ＩＤＵＡ－ｍｉＲ１８３動物を比較するとき、ｍｉＲ１８３クラスター調節遺伝子（ＣＡＣＮＡ２Ｄ１またはＣＡＣＮＡ２Ｄ２）の発現の増加はなかった。

【0273】

ラット新生児後根神経節（ＤＲＧ）ニューロン細胞培養
ラットＤＲＧニューロン（Ｌｏｎｚａ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．）を解凍し、７ｍＬの推奨培地（ＰＮＧＭ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ：２ｍＭのＬ－グルタミン、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン／３７ｎｇ／ｍｌのアムホテリシン、および２％のＮＳＦ－１を含有するＰｒｉｍａｒｙ Ｎｅｕｒｏｎ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）に加えた。次いで、約５．０×１０^５個のＤＲＧニューロンを含有する８ｍＬの培地を、細胞を添加する直前に、ポリＤ－リジン（３０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）でコーティングした２４ウェル組織培養プレートの８ウェル間で分割した。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター中で４時間インキュベートした後、培地を除去し、新鮮な予熱した培地と交換した。シュワン細胞増殖を阻害するために、最初の４時間のインキュベーションの後に、有糸分裂細胞阻害剤（１７．５ｕｇ／ｍＬのウリジンを５μｌと７．５ｕｇ／ｍＬの５－フルオロ－２－デオキシウリジン／培地ｍＬ数を５μｌ）を添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートし、５日目に培地を完全に変化させ、その後３日ごとに５０％培地を変化させた。初期の培養の６日後、上述のようにＡＡＶベクターを用いてラットＤＲＧニューロンを形質導入した。

【0274】

図２１は、ラットＤＲＧ細胞におけるｍｉＲ１８３スポンジ効果研究の効果を示す。ラットＤＲＧ細胞におけるｍｉＲ１８３レベルは、細胞をＡＡＶ９－ｅＧＦＰ－ｍｉｒ１８３で形質導入したときに低減した。ＡＡＶ９－ｅＧＦＰｍｉＲ１８３－は、ＧＦＰ－ｍｉＲ１８３ ｍＲＮＡに対するターゲットエンゲージメントを示す。

【0275】

図２２Ａ～図２２Ｃは、既知のｍｉＲ１８３調節転写産物に対するラットＤＲＧ細胞における効果を示す。図２２Ａは、モックベクター、ＡＡＶ－ＧＦＰ、またはＡＡＶ－ＧＦＰ－ｍｉＲ１８３ベクターの送達後のラットＤＲＧ細胞におけるＣＡＣＡＮＡ２Ｄ１相対発現を示す。図２２Ｂは、モックベクター、ＡＡＶ－ＧＦＰ、またはＡＡＶ－ＧＦＰ－ｍｉＲ１８３ベクターの送達後のラットＤＲＧ細胞におけるＣＡＣＡＮＡ２Ｄ２相対発現を示す。図２２Ｃは、モックベクター、ＡＡＶ－ＧＦＰ、またはＡＡＶ－ＧＦＰ－ｍｉＲ１８３ベクターの送達後のラットＤＲＧ細胞におけるＡＴＦ３発現を示す。これらの３つの既知のｍｉＲ１８３調節転写産物のｍＲＮＡレベルの相対発現に変化はなかった。形質導入されていないモックウェルおよびＧＦＰ－ｍｉＲ１８３形質導入されたウェルと比較して、差は観察されなかった。これらのデータは、これらの細胞におけるスポンジ効果の不存在を示す。ｍｉＲ１８３の残りのレベルのいずれかが十分であるか、またはクラスターの他のメンバー（ｍｉＲ９６および／またはｍｉＲ１８２）が、ｍｉＲ１８３の利用可能性の減少を補うことができる可能性がある。

【0276】

実施例６：ＤＲＧ病的状態のメタアナリシス
血液または脳脊髄液（ＣＳＦ）を介して非ヒト霊長類（ＮＨＰ）にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを投与することで、後根神経節（ＤＲＧ）病的状態を引き起こす可能性がある。この病的状態は、ほとんどの場合、最小限から中程度であり、罹患した動物において臨床的に無症状であり、単核細胞浸潤、神経変性、および中心軸索および末梢軸索の二次軸索病変による組織病理学的分析によって特性決定される。２５６ＮＨＰにおける３３の非臨床研究からデータを集計し、異なる投与経路、用量、時間経過、研究実施、動物の年齢、性別、カプシド、プロモーター、カプシド精製方法、および導入遺伝子の間のＤＲＧ病的状態の重症度のメタアナリシスを行った。ＤＲＧ病的状態は、ＣＳＦにＡＡＶを投与したＮＨＰの８３％、および静脈内（ＩＶ）経路を介したＮＨＰの３２％で観察された。本願発明者らは、注射時の用量および年齢が、重症度に有意に影響を及ぼす一方で、性別は影響を及ぼさないことを示した。ＤＲＧ病的状態は、急性時点（すなわち、１４日以下）では存在せず、注射後１～５ヶ月までは類似しており、６ヶ月後にはそれほど重症ではなかった。ベクター精製方法は、影響を及ぼさず、本願発明者らが試験したすべてのカプシドおよびプロモーターは、いくつかのＤＲＧ病的状態を引き起こした。５つの異なるカプシド、５つの異なるプロモーター、および２０の異なる導入遺伝子からのここに提示されるデータは、ＮＨＰを使用した非臨床研究において、ＤＲＧ病的状態が、ＡＡＶ遺伝子療法後にほぼ普遍的であることを示唆する。治療用導入遺伝子を受けた動物のいずれも、なんら臨床的徴候を示さなかった。神経伝導速度などの感受性技術の組み込みは、少数の動物において、末梢神経軸索症の重症度と相関する修飾を示すことができる。ヒトＣＮＳ試験および高用量ＩＶ研究における感覚神経障害のモニタリングは、臨床的に有意なＤＲＧ病的状態が生じるかどうかを決定することは慎重であるように思われる。

【0277】

材料および方法：
データ入手可能性に関する声明
集計されたデータは、研究に資金を提供したスポンサーが権利を有する特定の導入遺伝子を除き、提供された実験の詳細と共に提示る。

【0278】

動物
このメタアナリシスには、３３件の研究から２３７匹のアカゲザルと１９匹のカニクイ
ザルが含まれていた。動物手順はすべて、ペンシルベニア大学の施設内動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）またはカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）は、Ｃｏｖａｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．（Ａｌｉｃｅ、ＴＸ）、Ｐｒｉｍｇｅｎ／Ｐｒｅｌａｂｓ Ｐｒｉｍａｔｅｓ（Ｈｉｎｅｓ、ＩＬ）、ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ（Ｂａｓｔｒｏｐ、ＴＸ）から調達したか、または寄贈された。動物は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ
ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａまたはＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａで、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ（ＡＡＡＬＡＣ）のＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ－ａｃｃｒｅｄｉｔｅｄ Ｎｏｎｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒａｍ ｆａｃｉｌｉｔｙ ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａのステンレス鋼製スクイーズバックケージ内に収容された。動物は、給餌、視覚および聴覚刺激、操作、および社会的相互作用などの様々な豊かさ（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｓ）を享受した。

【0279】

試験物または対象物の投与
ＣＳＦ投与のために、ＮＨＰは、以前に記載されているように（Ｎ．Ｋａｔｚ，ｅｔ ｌａ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９，２１２－２１９，２０１８）、透視ガイダンス下で、大槽内に注射された滅菌人工ＣＳＦ（ビヒクル）中で希釈されたベクターを受けた。麻酔した動物において、透視ガイダンス下で腰部穿刺を行った。脊椎針をＬ４－５またはＬ５－６空間に挿入した後、ＣＳＦの戻りによって、および／または最大１ｍＬの造影剤（イオヘキソール１８０）を注射することによって、配置を確認した。静脈内投与のために、カテーテルを伏在静脈内に配置し、ベクターを滅菌１倍ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水で希釈した。

【0280】

神経伝導速度検査
動物を、ケタミン／デクスメデトミジンの組み合わせで鎮静し、横臥位または仰臥位で手術台に配置し、ヒートパックで体温を維持した。カソードが記録部位に最も近くになるように、刺激装置のプローブを正中神経上に配置し、２つの針電極を、第ＩＩ指の末節骨のレベル（参照電極）および基節骨のレベル（記録電極）で皮下に刺入し、一方、接地電極を刺激プローブ（カソード）の近位に配置した。小児刺激装置は、ピーク振幅応答に達するまで段階的に増加した刺激を伝えた。最大１０個の最大刺激を平均化し、正中神経について報告した。記録部位から刺激カソードまでの距離（ｃｍ）を測定し、伝導速度を算出するために使用した。伝導速度と感覚神経活動電位（ＳＮＡＰ）振幅の平均値の両方が報告された。

【0281】

ベクター
研究のために、ＡＡＶベクターを作製し、既に記載されているように滴定した（Ｍ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２１，１２５９－１２７１，２０１０、Ｍ．Ｌｏｃｋ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５，１１５－１２５，２０１４）。簡潔には、ＨＥＫ２９３細胞を三重でトランスフェクトし、培養上清を回収し、濃縮し、イオジキサノール勾配で精製した。Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＬＰ）準拠の毒性研究のために、ベクターもまた、ＨＥＫ２９３細胞のトリプルトランスフェクションによって産生され、既に記載されているように（Ｊ．Ｈｏｒｄｅａｕｘ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １０，７９－８８，２０１８）、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用してアフィニティクロマトグラフィーによって精製された。

【0282】

組織病理学
大部分の研究では、委員会認定の獣医病理学者は、最初に試験物／治療群を盲検化し、確立された重症度スコアを、病変の不在について０、最小（１０％未満）について１、軽度（１０～２５％）について２、中等度（２５～５０％）について３、顕著（５０～９５％）について４、および重度（９５％を超える）について５と定義した。これらのスコアは、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色した組織の顕微鏡での評価に基づいており、％は、平均高倍率視野における病変によって影響を受けた組織の割合を表す。すべてのＧＬＰおよび一部の非ＧＬＰ臨床研究では、査読は、外部の委員会認定の獣医病理学者によって完了した。ＤＲＧ変性および脊髄の背側軸索障害からの重症度スコアは、頸部、胸部、および腰部のセグメントから確立された。しかしながら、評価された切片数は、研究によって異なっていた。いくつかの研究において、所与のセグメントについて複数の組織切片がスライド上に存在する場合、スコアは、ＤＲＧおよび脊髄の個々の切片に割り当てられた。これらを、単一の代表的なスコアについて平均化した。本願発明者らは、脊髄軸障害を、すべてのＤＲＧから来る軸索の照合を表すため、ＤＲＧ病的状態のより良い指標と考えている。本願発明者らは、この書類全体で、ＤＲＧ病的状態を、ＤＲＧ細胞体および脊髄、または脊髄単独の組織病理学的所見と定義する。末梢神経軸索症のグレードは、正中（近位および／または遠位）、橈骨、尺骨、坐骨（近位および／または遠位）、腓骨、脛骨、および／または胸骨神経の評価に基づいて確立された。近位および遠位の正中神経について評価が実施されたとき、近位セグメントは、腕神経叢から肘までの神経の部分に対応し、遠位セグメントは、肘から手のひらまでの神経の部分に対応していた。存在する場合、末梢神経における軸索周囲（すなわち、神経内膜）線維症について、重症度スコアを与えた。末梢神経が両側とも評価された場合の研究では、軸索障害および軸索周囲スコアを、各神経について平均化した。

【0283】

データ抽出
病理学的スコアおよびすべての関連する研究情報を含む生データを研究ファイルから抽出し、単一のＥｘｃｅｌスプレッドシートに集計した。２名が独立して、事前に決定された検索条件に基づいてスコアを抽出し、ソートしてグラフを生成し、統計を実行した。抽出された出力の間に矛盾が生じた場合、平等に責任を有する品質管理について合意に達した。

【0284】

統計
各々のパラメータ（すなわち、注射時の年齢、カプシド、投与経路、時間経過、プロモーター、性別、ベクター精製方法、および用量）について、Ｒプログラム（バージョン３．５．０、ｈｔｔｐｓ：／／ｃｒａｎ．ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）内の関数「ｗｉｌｃｏｘ．ｔｅｓｔ」を有するウィルコクソンの順位和検定を使用して、各々のＤＲＧまたはＳＣセグメント（すなわち、頸部、胸部、腰部）についての各々の群の対間の病理学的スコアの比較を行った。次いで、Ｒの「ｍｅｔａｐ」パッケージ中の関数「ｓｕｍｌｏｇ」を有するフィッシャー法を使用して、全体的なＤＲＧまたはＳＣの群間比較のための３つの比較から、組み合わせたｐ値を算出した。統計学的有意性は、０．０５レベルの組み合わせたｐ値で評価した。

【0285】

結果
ＤＲＧ病的状態評価
本願発明者らは、ニューロンおよびその対応する軸索の神経解剖学的評価および全身評価に基づき、ＤＲＧニューロンに対する病変を正確に評価し、スコアリングする方法を開発した。一次感覚ニューロンの神経細胞体は、ＤＲＧ内に位置するクモ膜下腔空間内の各々の脊髄後根の基部にある卵形腫脹である。ＤＲＧニューロンは、偽単極性であり、１つの末梢分枝が末梢神経内に延び、１つの中央分枝は、脊髄白質路内で背側に上行する（図
２３）。神経変性がＤＲＧに均一に影響を及ぼさないことは、代表的な試料を提供するために、頸部、胸部、および腰部領域から複数のＤＲＧが収集される必要があることを意味するというのが、本願発明者らの経験である。ＤＲＧにおける病的状態は、単核炎症性細胞および増殖する常在衛星細胞を伴う単核細胞浸潤として現れ、神経変性は、その後の段階で見られるようになる（図２３、Ａ１の丸印）。神経細胞体損傷に続いて起こるのは、神経根（図２３、Ｂ１）、脊髄の上行性背側経路（図２３、Ｃ１）、および末梢神経（図２３、Ｄ１）におけるＤＲＧ軸索突起に沿った軸索変性（すなわち、軸索障害）である。正常な対応物を伴う典型的な組織病理学的所見は、図２３のＡ１～Ｄ２に示されており、ＤＲＧ病的状態の様々な段階の高倍率画像も示されている。変性プロセスの初期に、神経細胞体は、ミクログリア細胞および浸潤する単核細胞（神経貪食）と共に、増殖する衛星細胞のみを含み、比較的正常であるように見える（図２３のパネルＥ）。病変が進行するにつれて、神経細胞体は、消えかけている核を有するか、または核が存在せず、細胞質高酸素血症を有する、小さな不規則形状もしくは鋭角を有する形状の細胞を特徴とする、変性の証拠（図２３のパネルＦ、垂直の矢印）を示す。末期神経細胞体変性（図２３のパネルＧ、丸印）は、衛星細胞、ミクログリア細胞、および単核細胞によるそれらの完全な消失（図２３のパネルＧ、星形）を伴う。ＤＲＧおよび対応する軸索における組織学的所見の重症度は、平均高倍率視野に対して影響を受けるニューロンまたは軸索のパーセンテージに基づいてグレード分けされる。病変の不在について０、最小（１０％未満）について１、２ 軽度（１０～２５％）、３ 中等度（２５～５０％）、４ 顕著（５０～９５％）、および５ 重度（９５％を超える）。ＤＲＧは、ニューロンの存在量が正常であり、少数のニューロンのみが所与の切片上で変性を示す、モザイクを表す。本願発明者らは、脊髄軸索障害を、すべてのＤＲＧから来る軸索の照合を表すため、ＤＲＧ病的状態のより良い指標と考えている。本願発明者らは、この書類全体で、ＤＲＧ病的状態を、ＤＲＧ細胞体および脊髄、または脊髄単独の組織病理学的所見と定義する。

【0286】

研究と集団の特徴
本願発明者らは、２０１３～２０２０年のＧｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｇｒａｍ
ａｔ Ｐｅｎｎにおいて、ＡＡＶベクターまたはビヒクル対照を注射した２５６匹の動物を含む３３の研究からのデータを集計した。これらの研究のまとめを以下の表に示す。

【表13】

【0287】

ＤＲＧ病的状態の重症度に対する研究の特徴の効果
ＤＲＧ病的状態は、ＡＡＶ ＩＣＭまたはＬＰを受けたＮＨＰの８３％（１７０／２０５匹）、ＩＶ経路のＮＨＰの３２％（８／２５匹）、併用ＩＣＭ＋ＩＶの１００％（４／４匹）、および筋肉内の０％（ＩＭ、０／４匹）で観察された。病理学者は、ＤＲＧにおける重症度スコア、ならびに脊髄および末梢神経における対応する軸索に基づいてＤＲＧ病変をグレード分けした。ＤＲＧならびに脊髄領域（頸部、胸部、および腰部）ごとにスコアを得た。ＤＲＧにおける重症度は、各脊髄領域がＤＲＧに由来する軸索の全体をグループ分けするために、脊髄における重症度よりも低かったため、いくつかのＤＲＧからの病理学的スコアを照合した（図２３）。病的状態の重症度に著しく影響した試験設計パラメータは、投与経路（ＲＯＡ）、用量、および剖検時点であった（図２４Ａ～図２４Ｃ）。非臨床実験室試験のためのＧＬＰ実践の遵守（連邦規則集第５８条のタイトル２１に設定されている通り）は、病的状態の重症度に影響を与えなかった（図２４Ｄ）。ＩＭを除くすべてのＲＯＡは、ビヒクル対照と比較した場合、ＤＲＧおよび脊髄の両方において有意な病的状態を引き起こした（ｐ＝０．０４ＤＲＧおよび脊髄、ＩＶ対ビヒクル、ｐ＜０．００１ ＤＲＧおよびｐ＜０．０００１ 脊髄、他のすべての経路対ビヒクル）。ＩＣ
Ｍ、ＬＰ、およびＩＣＭ／ＩＶはいずれも、ＩＶよりも類似しており、かつ有意に悪かった（ＩＶ対ＩＣＭ ｐ＜０．０００１、ＩＶ対ＬＰ ｐ＝０．０２、ＩＶ対ＩＣＭ／ＩＶ
ｐ＝０．０００６－図２４Ａ）。ＩＭ（図示せず）は、病的状態を引き起こさず（すべてのスコアが０）、ビヒクル対照と同様であった。以下のすべての分析について、ＣＳＦ内投与（すなわち、ＩＣＭまたはＬＰ）を行った動物のみを検討した。２つの低い方の用量範囲（＜３Ｅ＋１２ＧＣおよび３Ｅ＋１２～１Ｅ＋１３ＧＣ）は、類似していたが、一方、最大用量範囲（＞１Ｅ＋１３ＧＣ）は、最低用量範囲（ｐ＝０．００９、脊髄）および中間用量範囲（ｐ＝０．００１ＤＲＧ、ｐ＝０．０５ 脊髄、図２４Ｂ）の両方よりも有意に悪い病理学的スコアが得られた。注射後の時点（すなわち、剖検を実施し、組織を分析したとき）は、２１～６０日、９０日、および１２０～１６９日の間に同様の病的状態の重症度を示した。病的状態は、早期（すなわち、１４日目）の時点では見られず、１８０日以上の長期フォローアップは、他のすべての時点と比較して重症度の有意な低減を示した（ｐ＜０．０００１ 脊髄、ｐ＜０．０００１ ＤＲＧ Ｄ９０、ｐ＜０．００１
ＤＲＧ 他の時点）。

【0288】

ＤＲＧ病的状態の重症度に対する動物の特徴の効果
ベクター投与時の年齢は、病的状態の重症度に有意な影響を及ぼした。幼若期動物は、成体と比較した場合、重症度の低いＤＲＧ変性を有していた（ｐ＝０．００３）が、同様の脊髄軸索障害を有していた（図２５Ａ）。乳幼児として治療された４匹の動物は、既に報告されているように（Ｊ．Ｈｏｒｄｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ３０，９５７－９６６，２０１９）、ＤＲＧまたは脊髄病的状態の兆候を有さなかった。この結果は、小さなｎおよび研究エンドポイント（注射から４年後）の考えられる影響に起因して、慎重に解釈する必要がある。図２４Ａ～図２４Ｄに示されるように、研究期間は、病的状態の重症度に影響を有しており、注射時の年齢および／または研究期間が、病的状態が存在しないことを裏付けているかどうかは不明である。追加的に、重要なことに、性別は、ＳＣまたはＤＲＧ病的状態に影響を及ぼさなかった（図２４Ｂ）。

【0289】

ＤＲＧ病的状態の重症度に対するベクターの特徴の効果
ＤＲＧ神経変性は、すべてのカプシドで存在したが、血清型間で重症度に若干の差があった（図２６Ａ）。このようなバリエーションは、ＤＲＧに限定され、脊髄スコアでは見られない場合、ＤＲＧが、脊髄断面よりもサンプリングアーチファクトに影響されやすいモザイクを表すため、意味がない場合がある。ＡＡＶｈｕ６８（ｐ＝０．０１ 脊髄、ｐ＝０．０００４ ＤＲＧ）よりもＡＡＶ１で、かつよりもＡＡＶ１でＡＡＶ９（ｐ＝０．００７ 脊髄およびＤＲＧ－図２６Ａ）、軸索障害およびＤＲＧスコアは共に有意に悪かった。ユビキタスプロモーターＣＡＧ、ＣＢ７、およびＵｂＣは、いずれも互いに類似していたが、一方、ＣＡＧは、ｈＳｙｎ（ｐ＝０．０２８）よりも悪い軸索障害を引き起こし、ＣＢ７（ｐ＝０．００１）、ＵｂＣ（ｐ＝０．００２）およびｈＳｙｎ（ｐ＝０．０００３、図２６Ｂ）より悪いＭｅＰ４２６を引き起こした。２０個の異なる導入遺伝子を試験し、１つを除くすべてがＤＲＧ病的状態を引き起こした（図２６Ｃ）。病的状態の重症度は、導入遺伝子間で大きく変動した（０．５～２．７の平均脊髄軸索障害スコア）。病的状態の重症度は、分泌型導入遺伝子と比較して非分泌型導入遺伝子で２０～２５％低かった（図２６Ｄ、ＤＲＧについては、分泌型平均＝０．６１、非分泌型平均＝０．４７、ｐ＝０．０５、ＳＣについては、分泌型平均＝１．１７、非分泌型平均＝０．９４、ｐ＝０．０２）。さらに、精製方法（すなわち、非ＧＬＰ研究におけるイオジキサノールおよびＧＬＰ研究におけるカラムクロマトグラフィー）は、ＤＲＧ病的状態の存在または重症度に影響を与えなかった（図２６Ｄ）。

【0290】

ＤＲＧ病的状態の領域的重症度および臨床的症状
頸部、胸部、および腰部脊椎に関する病的状態の領域的な差を評価した。また、三叉神経の神経節（ＴＲＧ）も、クモ膜下腔空間の内側の頭蓋底部に位置するＤＲＧと同様の特
徴を有する感覚神経節を表すため、分析した。図２７は、各領域における実際の病理学的スコアの分布および平均を示す。ＴＲＧ病的状態は、頸部および腰部ＤＲＧと類似していた（有意ではない）が、胸部ＤＲＧは、重症度のスコアが低かった（ｐ＝０．００７）。ＳＣ領域スコアはいずれも、それらの対応するＤＲＧスコアよりも有意に悪く（ｐ＜０．０００１）、このことは、いくつかのＤＲＧからの一致したＳＣ照合軸索であり、それは、より多くの病変を含むことを意味している。切片の大部分は、正常または低い（グレード１）重症度スコアを有し、グレード４のスコアはほとんど報告されておらず、グレード５のスコアは非常に稀にしか報告されていない（グレード５は、平均高倍率視野における病変によって影響を受ける組織表面の９５％以上に相当する）（図２７）。精神状態、姿勢、および歩行のケージ側評価、ならびに脳神経、固有受容、運動強度、感覚機能、および反射の拘束された評価を伴う神経学的検査を実施した。ＡＡＶ ＩＣＭまたはＬＰを投与された２０４匹の動物のうち、運動失調および／または振戦の臨床的徴候を有する明らかな病的状態が発現したのは３匹のみであった。すべての３つの受けたベクターは、１Ｅ＋１３ＧＣを超える用量でＧＦＰをコードし、病的状態は、注射の２１日後に現れた。正中神経の神経伝導速度は、５６匹の動物で記録された。２つは、注射から２８日後で、顕著な両側感覚振幅低減を発現し、剖検まで持続した。これは、顕著な（グレード４の重症度の）軸索障害および正中神経の神経内膜線維症と相関関係にあったが、明らかな臨床の後遺症はなかった。ほとんどの動物は、末梢神経における軸索障害および線維症の重症度グレードが低かった（図２８Ａおよび図２８Ｂ）。

【0291】

考察
ＤＲＧ病的状態および二次軸索障害は、本願発明者らのＮＨＰ研究の大部分では最小限であり、訓練されていない眼で発見することは困難な可能性がある。ＩＣＭ ＡＡＶ投与を評価する本願発明者らの最初のＧＬＰ毒性研究（Ｊ．Ｈｏｒｄｅａｕｘ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １０，７９－８８，２０１８）では、初期病理評価を行ったＣＲＯは、神経病理で経験を積んだ査読病理学者によってのみ捕捉された病変を見逃した。神経変性はまばらであり、ＤＲＧは、ほとんど正常なニューロンと所与の切片上の数少ない変性事象とのモザイクであるため、堅牢な組織学的分析のために複数のＤＲＧを収集する必要があることを発見した（脊髄領域当たり少なくとも３つを推奨する）。ＤＲＧニューロン損傷を検出し、定量化する、より簡単な方法は、脊髄における軸索変性を評価することによって、細胞体内の病的状態の二次的な結果を評価することを伴う。このことは、検出が容易であり、複数のＤＲＧから来る上行線維の照合を表す。

【0292】

正しい組織を収集し、慎重に分析したところ、本願発明者らは、ＡＡＶ ＩＣＭを受けたＮＨＰの８３％、およびＡＡＶ ＩＶを受けたＮＨＰの３２％において、ＤＲＧ病的状態の証拠をいくつか発見した。病的状態を示すＩＶ用量は、１Ｅ＋１３ＧＣ／ｋｇと低く、この用量は、いくつかの血友病試験のために診療所で現在評価されている（Ｂ．Ｓ．Ｄｏｓｈｉ ａｎｄ Ｖ．Ｒ．Ｔｈｅｒ Ａｄｖ Ｈｅｍａｔｏｌ ９，２７３－２９３，２０１８）。製造精製方法は、病的状態に影響を及ぼさなかった。本願発明者らが試験したすべてのカプシドおよびすべてのプロモーターは、あるレベルのＤＲＧ病的状態を示し、このことは、カプシドまたはプロモーターを変更することが実行可能な解決策ではないことを示唆する。非臨床研究の設計と臨床翻訳に関連して、注射時の用量および年齢が重症度に有意に影響を及ぼす一方で、性別は影響を及ぼさないことが分かった。病的状態の重症度に最も大きな影響を及ぼす本願発明者らの研究の態様は、導入遺伝子であり、これは、導入遺伝子の過剰発現が変性につながる初期の事象を駆動するという本願発明者らの仮説と一致する。ほとんどの導入遺伝子について、最小有効用量（ＭＥＤ）を上回る無有害作用量（ＮＯＡＥＬ）を特定することはできなかった。

【0293】

時間経過は、急性時点（すなわち、１４日以下）は組織病理を示さない一方で、より長
い研究（すなわち、１８０日を超える）は、より重症度の低い病的状態を示す傾向があり、このことが、経時的な進行の欠如および可能な部分寛解を示唆するため、研究設計のために考慮することが重要である。本願発明者らの保健当局での経験には、２つの剖検時点を組み込むことを含んでおり、１つは、病的状態の発症後（すなわち、約１ヶ月）であり、もう１つは、病的状態が悪化していないことを示すためのものである（すなわち、４～６ヶ月）。本願発明者らのメタアナリシスに含まれる１ヶ月齢で投与された４匹のＮＨＰ乳幼児は、動物が注射のほぼ４年後に剖検されたときに良好な導入遺伝子発現レベルがあったにもかかわらず、ＤＲＧおよびＳＣ軸索病的状態が存在しないことが顕著であった（Ｊ．Ｈｏｒｄｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ３０，９５７－９６６，２０１９）。この観察結果は、乳幼児への投与時のより良好な安全プロファイル、または急性病的状態が進行せず、実際に解消することを示唆している可能性がある。この研究では、早期の時点での剖検はなかった。

【0294】

治療用導入遺伝子（すなわち、ＧＦＰなどのレポーター遺伝子ではない）を受けた動物のいずれも、臨床所見を示さなかった。後の研究で、本願発明者らは、神経伝導速度測定を用いた感覚ニューロン病的状態の日常的なモニタリングを組み込んだ。本願発明者らは、臨床的後遺症の証拠はなく、より重度の末梢神経軸索障害および線維症（すなわち、グレード４の重症度）に関連する２匹の動物においてＮＣＶ異常を発見した。

【0295】

まとめると、本願発明者らは、ＤＲＧにおける病的状態が、ＡＡＶベクターがクモ膜下腔空間に送達されるとき、および多くの研究において、より高い用量が全身投与されるとき、ほぼすべてのＮＨＰ研究において一貫した所見であることを示した。本願発明者らのメタアナリシスは、顕著な臨床的後遺症が存在しないことが驚くべきことである。他の種における他の非臨床研究の慎重な分析は、新生児ブタを除いてＤＲＧ病的状態の証拠を示すことができず、このことは、ＮＨＰがこの潜在的な病的状態を評価するための最良のモデルであることを示唆している。ヒトＣＮＳ試験および高用量ＩＶ研究における感覚神経障害のモニタリングは、臨床的に有意なＤＲＧ病的状態が生じるかどうかを決定することは慎重であるように思われる。

【0296】

実施例７：ＡＡＶｒｈ９１媒介性ＭＰＳＩ遺伝子療法の開発
非臨床研究を実施して、ＭＰＳＩ導入遺伝子送達に対するＤＲＧ脱標的化ｍｉＲＮＡ標的部位の安全性および有効性に対する効果を評価する。実施例２に記載されるように、発現カセットの３’ＵＴＲ領域における、ｍｉＲ１８３、ＤＲＧ濃縮ｍｉＲの標的の４つのタンデムリピートをクローニングすることによって、ＤＲＧにおける導入遺伝子発現を抑制する戦略は、他の場所（脳、肝臓、心臓）における導入遺伝子発現のいくつかの増強を付与しつつ、ＤＲＧにおけるＧＦＰ発現を除去するのに有効であった。ＮＨＰで試験した場合、４つのタンデムリピートは、ＤＲＧにおける発現が低減し、同じ用量でＡＡＶｈｕ６８．ｈＩＤＵＡを注射した動物と比較した場合、ＡＡＶｈｕ６８．ｈＩＤＵＡ－４×ｍｉＲ１８３を有する１×１０^１３ＧＣ ＩＣＭ注射したＮＨＰからの形質導入されたＤＲＧにおいて、ｍＲＮＡ ＩＳＨシグナルの８０％低減が観察された。この低減は、ＤＲＧ病理状態および二次軸索障害を完全に防ぐのに十分なものであった。以下に記載される研究は、臨床薬物投与およびサンプリングにとって一般的であるように、ＣＮＳ、ＡＡＶｒｈ９１（ＡＡＶ１バリアント）および／またはＣＮＳ標的化投与のためのＯｍｍａｙａリザーバを使用した送達における向上した向性および生体分布を有するカプシドを利用する。

【0297】

非臨床研究の研究
ＮＨＰパイロット研究－ＮｅｘｔＧｅｎ ＤＲＧおよびカプシドの比較
本研究は、アカゲザルへの大槽内（ＩＣＭ）投与後の安全性、薬理学、およびベクター生体分布に関する予備データを取得するように設計されている。
研究設計：
●ベクター：
１．ＡＡＶｈｕ６８．ｈＩＤＵＡ ｃｏＶ１
２．ＡＡＶｒｈ９１．ｈＩＤＵＡ ｃｏＶ１
３．ＡＡＶｒｈ９１．ｈＩＤＵＡ ｃｏＶ１．４ｘｍｉＲ１８３
４．ＡＡＶｒｈ９１．ｈＩＤＵＡ ｃｏＶ１．４ｘｍｉＲ１８２
●動物の数：１５（ｎ＝３／群）
●投与経路：ＩＣＭ
●用量：３ｘ１０^１３ ＧＣ
●生存期間：９０日間

【0298】

生存（Ｉｎ－ｌｉｆｅ）分析には、毎日のケージぎわの観察、標準化された神経学的評価、血清化学パネルの定期的出血、全血球数、凝固パネル、補体活性化、肝機能試験、ＣＳＦ化学の定期的ＣＳＦタップ、および細胞数が含まれる。血清およびＰＢＭＣは、カプシドおよび導入遺伝子に対する体液および細胞の免疫応答を調査するために収集される。

【0299】

ベクター投与から９０日後に本研究の生存期が完了した後、包括的な組織病理学的検査のために回収された組織（査読付きの委員会認定の獣医病理学者）による完全な剖検が行われ、定量的ＰＣＲによるベクター生体内分布の分析、およびｈＩＤＵＡ発現の定量化が行われる。リンパ球を、血液、脾臓、肝臓、および深部頸部リンパ節から回収し、剖検時にこれらの臓器におけるＣＴＬが調べられる。ｍｉＲ標的配列を有するベクターは、主要な組織における最適な生体分布を示しつつ、ＤＲＧ変性および関連する軸索障害を最も良く低減および／または除去することが期待される。

【0300】

ＮＨＰパイロット研究－ＩＣＶリザーバを備えたＡＡＶｒｈ９１ベクター
アカゲザルに移植された脳室内リザーバ／カテーテル系を介するＡＡＶ．ＧＦＰの投与後の安全性、薬理学、およびベクター生体分布を評価するために研究を実施する。この研究の後、この投与経路により評価されるベクターが選択される。
研究設計：
●動物の数：３
●投与経路：ＩＣＶ
●用量：３ｘ１０^１３ ＧＣ
●生存期間：９０日間

【0301】

生存分析には、毎日のケージぎわの観察、標準化された神経学的評価、血清化学パネルの定期的出血、全血球数、凝固パネル、補体活性化、肝機能試験、ＣＳＦ化学の定期的ＣＳＦタップ、および細胞数が含まれる。血清およびＰＢＭＣは、カプシドおよび導入遺伝子に対する体液および細胞の免疫応答を調査するために収集される。

【0302】

ベクター投与から９０日後に本研究の生存期が完了した後、包括的な組織病理学的検査のために回収された組織（査読付きの委員会認定の獣医病理学者）による完全な剖検が行われ、定量的ＰＣＲによるベクター生体内分布の分析、およびｈＩＤＵＡ発現の定量化が行われる。リンパ球は、血液、脾臓、肝臓、および深部頸部リンパ節から採取されて、剖検時にこれらの臓器におけるＣＴＬの存在が調べられる。

【0303】

ＭＰＳＩマウスにおける有効性および用量範囲研究
パイロット用量範囲研究において、ＭＰＳＩマウスにＩＣＶを投与したときに、ＡＡＶｒｈ９１ベクターを評価して、以前のＭＰＳＩ候補と比較して、ｈＩＤＵＡ発現および有効性を決定する。読み出しには、血清および肝臓ＩＤＵＡ活性の読み出し、ならびにＣＮＳにおける貯蔵低減が含まれる。
研究設計：
●動物の数：約５０（ｎ＝１０／群、ＷＴ／ＫＯ対照を含む）
●投与経路：ＩＣＶ
●用量：
●１．３×１０^１１ＧＣ
●４．５×１０^１０ＧＣ
●１．３×１０^１０ＧＣ
●生存期間：９０日間

【0304】

（配列表フリーテキスト）
以下の情報は、数値識別子＜２２３＞の下でフリーテキストを含む配列を提供する。

【表14】

【表15-1】

【表15-2】

【表16-1】

【表16-2】

【表17-1】

【表17-2】

【表18-1】

【表18-2】

【表19-1】

【表19-2】

【表20-1】

【表20-2】

【表21】

【0305】

本明細書に引用されるすべての刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２０年６月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／０４３，６００号、２０２０年６月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／０３８，５１４号、２０２０年５月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／０２３，６０２号、２０２０年４月６日に出願された米国仮特許出願第６３／００５，８９４号、２０２０年２月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／９７２，４０４号、２０１９年１２月２０日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／６７８７２号、２０１９年１１月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／９３４，９１５号、２０１９年１０月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／９２４，９７０号、２０２０年５月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／０２３，５９３号、２０２０年６月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／０３８，４８８号、２０２０年６月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／０４３，
５６２号、および２０２０年９月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／０７９，２９９号は、それらのすべてが参照により本明細書に組み込まれる。同様に、本明細書に参照され、「２０－９３１６ＰＣＴ．ｔｘｔ」とラベル付けされた添付の配列表に表示される配列番号は、参照により組み込まれる。本発明は、特定の実施形態を参照して記載されているが、本発明の趣旨から逸脱することなく修正を行うことができることが理解されよう。かかる修正は、添付の特許請求の範囲内であることが意図される。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図9】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図13E】

【図13F】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【図14E】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【図15E】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図16D】

【図16E】

【図16F】

【図17A】

【図17B】

【図17C】

【図17D】

【図18A】

【図18B】

【図18C】

【図18D】

【図18E】

【図18F】

【図19A】

【図19B】

【図20】

【図21】

【図22A】

【図22B】

【図22C】

【図23】

【図24A-24D】

【図25A-25B】

【図26A-26B】

【図26C】

【図26D】

【図27】

【図28A】

【図28B】

【図29A】

【図29B】

【図29C】

【図29D】

【図30A】

【図30B】

【図31A】

【図31B】

【図31C】

【配列表】

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