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▶ ボード オブ リージェンツ ザ ユニヴァーシティ オブ テキサス システムの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-06-17
(45)【発行日】2025-06-25
(54)【発明の名称】組織常在メモリー様Ｔ細胞を生成するための方法及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0783 20100101AFI20250618BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20250618BHJP
A61K 35/17 20250101ALI20250618BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250618BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20250618BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20250618BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20250618BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20250618BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0783
C12N15/09 Z ZNA
A61K35/17
A61P35/00
A61P29/00
A61P37/04
A61P37/06
A61P43/00 121
【請求項の数】
28
(21)【出願番号】P 2021521143
(86)(22)【出願日】2019-10-18
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-14
(86)【国際出願番号】 US2019057016
(87)【国際公開番号】W WO2020081987
(87)【国際公開日】2020-04-23
【審査請求日】2022-09-30
(31)【優先権主張番号】62/747,523
(32)【優先日】2018-10-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/846,270
(32)【優先日】2019-05-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】518256430
【氏名又は名称】ボード オブ リージェンツ ザ ユニヴァーシティ オブ テキサス システム
(74)【代理人】
【識別番号】110000109
【氏名又は名称】弁理士法人特許事務所サイクス
(72)【発明者】
【氏名】イー カッシアン
(72)【発明者】
【氏名】ハサン ファーラー
【審査官】野村 英雄
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１８／０２２８８３９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】ZAID, A., et al.，"Chemokine receptor-dependent control of skin tissue-resident memoty T cell formation."，THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY，2017年10月01日，Vol.199, No.7，pp.2451-2459，DOI: 10.4049/jimmunol.1700571
【文献】NIZARD, M., et al.，"Induction of resident memory T cells enhances the efficacy of cancer vaccine."，NATURE COMMUNICATIONS，2017年05月24日，Vol.8，15221 (pp.1-11)，DOI: 10.1038/ncomms15221
【文献】MA, C., et al.，"TGF-beta controls the formation of kidney-resident T cells via promoting effector T cell extravasation."，THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY，2017年01月15日，Vol.198, No.2，pp.749-756，DOI: 10.4049/jimmunol.1601500
【文献】HOMBRINK, P., et al.，"Programs for the persistence, vigilance and control of human CD8+ lung-resident memory T cells."，NATURE IMMUNOLOGY，2016年11月28日，Vol.17, No.12，pp.1467-1478，DOI: 10.1038/ni.3589
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
組織常在メモリー様Ｔ細胞（ＴＲＭ様Ｔ細胞）を生成するためのインビトロ方法であって、（ａ）初期エフェクター細胞を生成するため、Ｔ細胞の開始集団を低酸素条件下又は低酸素誘導剤の存在下で培養することと、ここで前記Ｔ細胞の開始集団が、末梢血サンプル中のＣＤ４５ＲＡ ＋ ＣＣＲ７ ＋ ＣＤ８ ＋ ナイーブＴ細胞、または抗原特異的（四量体＋）Ｔ細胞を含む；
（ｂ）ＴＲＭ様Ｔ細胞を生成するため、前記初期エフェクター細胞をトランスフォーミング成長因子β１（ＴＧＦ－β１）の存在下でさらに培養することと、
を含む方法。
【請求項2】
前記末梢血サンプルが、健常対象、がんと診断された対象又はがんを有することが疑われている対象から得られたサンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記開始集団の前記Ｔ細胞が、培養前に、ペプチド、完全長抗原又は細胞ライセートでパルスされた抗原提示細胞により刺激される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記Ｔ細胞が、腫瘍部位から得られたＴ細胞であるか、又は腫瘍浸潤リンパ球である、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記Ｔ細胞が、ナイーブＴ細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
Ｔ細胞の前記開始集団が、ＣＤ８陽性及びペプチドＭＨＣ四量体陽性である細胞について濃縮するため、精製される、請求項４に記載の方法。
【請求項7】
低酸素条件が、５％未満の酸素としてさらに定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記低酸素誘導剤が、低酸素模倣物である、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記低酸素誘導剤又は低酸素模倣物が、塩化コバルト（ＣｏＣｌ２）、デフェロキサミンメシル酸塩（ＤＦＯＭ）、ジメチルオキサリルグリシン（ｄｉｍｅｔｈｙｌｏｘａｌｙｇｌｙｃｉｎｅ）（ＤＭＯＧ）、又はプロリルヒドロキシラーゼ阻害剤である、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記プロリルヒドロキシラーゼ阻害剤が、２－ＯＧ類似体、またはロキサデュスタット（ＦＧ－４５９２）である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
ステップ（ｂ）の培養が、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８ビーズ、支持細胞、抗原提示細胞、人工抗原提示細胞、ペプチド及び／若しくはタンパク質抗原、又はそれらの組み合わせを含む、ＴＣＲ刺激及び同時刺激の存在下で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
ステップ（ｂ）の培養が、ＩＬ－１５の存在下で実施される、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記ＩＬ－１５が、５～２０ｎｇ／ｍＬまたは１０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
ＴＧＦ－β１が、組換えヒトＴＧＦ－β１（ｒｈＴＧＦ－β１）としてさらに定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記ｒｈＴＧＦ－β１が、０．１～５ｎｇ／ｍＬ、１～１．５ｎｇ／ｍＬ、または１．２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
ステップ（ｂ）の培養が、低酸素条件下又は低酸素誘導剤の存在下で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
前記ＴＲＭ様Ｔ細胞が、ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋である、請求項１に記載の方法。
【請求項18】
ステップ（ｂ）で生成された前記細胞の少なくとも３０％又は４０％が、ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記ＴＲＭ様Ｔ細胞が、ＰＤ－１、ＣＤ１０１、及び／又はＣＤ４９ａを発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項20】
前記ＴＲＭ様Ｔ細胞が、大気酸素条件下で培養された細胞と比べて、ＣＤ６９、ＩＴＧＡＥ、ＰＤＣＤ１及び／又はＣＤ１０１のより高い発現を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項21】
前記ＴＲＭ様Ｔ細胞が、大気酸素条件下で培養された細胞と比べて、ＴＮＦα、ＧＺＭＢ、ＳＬＣ２Ａ１、及び／又はＶＥＧＦのより高い発現を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項22】
前記ＴＲＭ様Ｔ細胞が、ＣＸＣＲ６タンパク質の発現を本質的に有しない、請求項１に記載の方法。
【請求項23】
抗原特異的なＴＲＭ様Ｔ細胞を生成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項24】
抗原特異的なＴＲＭ様Ｔ細胞を生成することが、ステップ（ａ）及び／又はステップ（ｂ）中、前記細胞をヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤の存在下で培養することを含み、前記ＨＤＡＣ阻害剤が、トリコスタチンＡ、トラポキシンＢ、フェニル酪酸、バルプロ酸、ボリノスタット（スベラニロヒドロキサム酸又はＳＡＨＡ、Ｚｏｌｉｎｚａ（登録商標）として市販）、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１、Ｂｅｌｅｏｄａｑ（登録商標）として市販）、パノビノスタット（Ｆａｒｙｄａｑ（登録商標）として市販）、ダシノスタット（ＬＡＱ８２４）、エンチノスタット（ＳＮＤＸ－２７５又はＭＳ－２７５）、タセジナリン（ＣＩ９９４）、及びモセチノスタット（ＭＧＣＤ０１０３）からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
ＣＸＣＲ６タンパク質の発現を本質的に有しない、インビトロで培養され単離されたＴＲＭ様Ｔ細胞であって、ＴＲＭ様Ｔ細胞が、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法によって生成されるＴＲＭ様Ｔ細胞。
【請求項26】
ＴＲＭ様Ｔ細胞が、（ａ）ＰＤ－１、ＣＤ１０１、及び／又はＣＤ４９ａを発現する、
（ｂ）ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋である、
（ｃ）ＧＮＬＹ、ＭＹＯ７Ａ、ＩＴＧＡＥ、ＥＧＲ２、ＣＣＬ２０、ＡＴＰ１Ｂ１、ＮＲ４Ａ３、ＰＥＲＰ、ＲＡＳＧＥＦ１Ｂ、ＮＲ４Ａ１、ＢＭＦ、ＥＧＲ１、ＣＸＣＬ１３、ＰＤＣＤ１、ＩＴＧＡ１、ＣＣＬ２２、ＣＡ１０、ＲＧＳ１、ＩＴＧＡ１、ＣＤ１０１、ＴＮＦＲＳＦ９（４－１ＢＢ）、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＮＯＴＣＨ１、ＲＢＰＪ、ＳＴＲＩＰ２、ＡＲＨＧＥＦ４０、ＤＢＨ、ＳＲＧＡＰ３、ＣＳＧＡＬＮＡＣＴ１、ＧＰＲ２５、ＲＧＳ１６、ＤＡＰＫ２、ＮＣＳ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＧＤＰＤ４、ＳＬＣ１Ａ４、ＣＤＫ１４、ＬＭＣＤ１、ＩＬＤＲ２、及び／又はＡＤＣＹ３を発現する、
（ｄ）ＧＮＬＹ、ＭＹＯ７Ａ、ＩＴＧＡＥ、ＥＧＲ２、ＣＣＬ２０、ＡＴＰ１Ｂ１、ＮＲ４Ａ３、ＰＥＲＰ、ＲＡＳＧＥＦ１Ｂ、ＮＲ４Ａ１、ＢＭＦ、ＥＧＲ１、ＣＸＣＬ１３、ＰＤＣＤ１、ＩＴＧＡ１、ＣＣＬ２２、ＣＡ１０、及び／又はＲＧＳ１を発現する、
（ｅ）ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡ１、ＰＤＣＤ１、ＣＤ１０１、ＴＮＦＲＳＦ９（４－１ＢＢ）、ＣＸＣＬ１３、ＣＣＬ２０、ＮＯＴＣＨ１、ＲＢＰＪ、ＮＲ４Ａ１、ＥＧＲ２、及び／又はＲＧＳ１を発現する、
（ｆ）ＭＹＯ７Ａ、ＳＴＲＩＰ２、ＡＲＨＧＥＦ４０、ＩＴＧＡＥ、ＤＢＨ、ＳＲＧＡＰ３、ＣＳＧＡＬＮＡＣＴ１、ＧＰＲ２５、ＲＧＳ１６、ＤＡＰＫ２、ＮＣＳ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＧＤＰＤ４、ＳＬＣ１Ａ４、ＣＸＣＬ１３、ＣＤＫ１４、ＬＭＣＤ１、ＩＬＤＲ２、及び／又はＡＤＣＹ３を発現する
（ｇ）ＣＤ５８、ＮＲ３Ｃ１、ＲＡＰ１ＧＡＰ２、ＳＥＬＰ、ＣＸＣＲ２、ＴＢＸ２１、ＩＴＧＡＬ、ＳＥＬＬ、ＫＬＦ３、ＫＬＦ２、ＲＡＳＧＲＰ２、ＦＡＭ６５Ｂ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＩＴＧＡＭ、ＫＬＲＢ１、ＴＧＦＢＲ３、ＳＭＡＤ３、ＴＮＦＳＦ８、ＤＵＳＰ２、ＰＬＥＫ、ＧＯＬＧＡ２Ｐ７、ＦＯＳＢ、ＰＬＣＧ２、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＣ６Ａ８、ＳＯＣＳ３、及び／又はＰＴＧＥＲ２を発現しないか又はそれらの発現を本質的に有しない
（ｈ）ＣＤ５８、ＮＲ３Ｃ１、ＲＡＰ１ＧＡＰ２、ＳＥＬＰ、ＣＸＣＲ２、ＴＢＸ２１、ＩＴＧＡＬ、ＳＥＬＬ、ＫＬＦ３、ＲＡＳＧＲＰ２、ＩＴＧＡＭ、ＫＬＲＢ１、ＴＧＦＢＲ３、ＳＭＡＤ３、及び／又はＴＮＦＳＦ８を発現しないか又はそれらの発現を本質的に有しない、
（ｉ）ＫＬＦ２、ＫＬＦ３、ＳＥＬＬ、ＦＡＭ６５Ｂ、及び／又はＳＥＲＰＩＮＥ２を発現しないか又はそれらの発現を本質的に有しない、および／または
（ｊ）ＤＵＳＰ２、ＰＬＥＫ、ＧＯＬＧＡ２Ｐ７、ＦＯＳＢ、ＰＬＣＧ２、ＩＴＧＡＭ、ＦＯＳ、ＫＬＦ３、ＳＬＡＭＦ７、ＴＮＦＳＦ８、ＳＬＣ６Ａ８、ＫＬＦ２、ＳＯＣＳ３、及び／又はＰＴＧＥＲ２を発現しないか又はそれらの発現を本質的に有しない、
請求項２５に記載のＴＲＭ様Ｔ細胞。
【請求項27】
ＣＸＣＲ６タンパク質の発現を本質的に伴わないＴＲＭ様Ｔ細胞の有効量を含み、前記ＴＲＭ様Ｔ細胞が、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法により生成される、対象における免疫関連障害の処置剤。
【請求項28】
前記免疫関連障害が、がん、自己免疫不全、移植片対宿主病、同種移植片拒絶、又は炎症性状態である、請求項２７に記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、２０１８年１０月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／７４７，５２３号及び２０１９年５月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／８４６，２７０号の利益を主張し、これら双方の全体は参照により本明細書中に援用される。
本願は、２０１８年１０月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／７４７，５２３号及び２０１９年５月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／８４６，２７０号の利益を主張し、これら双方の全体は参照により本明細書中に援用される。
【0002】
配列表の援用
８ＫＢ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）において測定された時）であり、２０１９年１０月１７日に作成された「ＵＴＦＣＰ１４０８ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称のファイル中に含まれる配列表は、本明細書とともに電子申請により出願され、参照により本明細書中に援用される。
８ＫＢ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）において測定された時）であり、２０１９年１０月１７日に作成された「ＵＴＦＣＰ１４０８ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称のファイル中に含まれる配列表は、本明細書とともに電子申請により出願され、参照により本明細書中に援用される。
【背景技術】
【0003】
１．分野
本発明は、一般に薬学及び免疫学の分野に関する。より詳細には、それは組織常在メモリー様Ｔ細胞を生成するための方法及びその使用に関する。
本発明は、一般に薬学及び免疫学の分野に関する。より詳細には、それは組織常在メモリー様Ｔ細胞を生成するための方法及びその使用に関する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
２．関連技術の説明
組織常在メモリー細胞（ＴＲＭ）は、ウイルス性疾患に対する局所的なフロントライン防御において重要であるメモリーＴ細胞の最近同定されたサブセットである。最近の報告では、この表現型を有する細胞が抗腫瘍免疫における重要な役割を担うことも示唆している。ＴＲＭ分化に関しては比較的にほとんど知られておらず、内因性組織常在メモリー細胞は単離するのが困難であることで、基礎研究におけるそれらの試験及び養子細胞療法におけるそれらの応用が妨げられる。したがって、組織常在メモリー細胞を生成するための方法についての要求は満たされていない。
組織常在メモリー細胞（ＴＲＭ）は、ウイルス性疾患に対する局所的なフロントライン防御において重要であるメモリーＴ細胞の最近同定されたサブセットである。最近の報告では、この表現型を有する細胞が抗腫瘍免疫における重要な役割を担うことも示唆している。ＴＲＭ分化に関しては比較的にほとんど知られておらず、内因性組織常在メモリー細胞は単離するのが困難であることで、基礎研究におけるそれらの試験及び養子細胞療法におけるそれらの応用が妨げられる。したがって、組織常在メモリー細胞を生成するための方法についての要求は満たされていない。
【課題を解決するための手段】
【0005】
一実施形態では、本開示は、組織常在メモリー様Ｔ細胞（ＴＲＭ様Ｔ細胞）を生成するためのインビトロ方法であって、（ａ）Ｔ細胞の開始集団を得ることと；（ｂ）初期エフェクター細胞（ｅａｒｌｙ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）を生成するため、Ｔ細胞の開始集団を低酸素条件下又は低酸素誘導剤の存在下で培養することと；（ｃ）ＴＲＭ様Ｔ細胞を生成するため、初期エフェクター細胞をトランスフォーミング成長因子β１（ＴＧＦ－β１）の存在下でさらに培養することと、を含む方法を提供する。
【0006】
別の実施形態では、本開示は、組織常在メモリー様Ｔ細胞（ＴＲＭ様Ｔ細胞）を生成するためのインビトロ方法であって、（ａ）Ｔ細胞の開始集団を得ることと；（ｂ）初期エフェクター細胞を生成するため、Ｔ細胞の開始集団を低酸素条件下又は低酸素誘導剤の存在下で培養することと；（ｃ）ＴＲＭ様Ｔ細胞を生成するため、初期エフェクター細胞をトランスフォーミング成長因子β１（ＴＧＦ－β１）、トランスフォーミング成長因子β２（ＴＧＦ－β２）、トランスフォーミング成長因子β３（ＴＧＦ－β３）又はトランスフォーミング成長因子β４（ＴＧＦ－β４）の存在下でさらに培養することと、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、培養は、初期エフェクター細胞を生成するため、Ｔ細胞の開始集団を活性化することを含む。
【0007】
さらに別の実施形態では、本開示は、ＴＲＭ様Ｔ細胞を生成するためのインビトロ方法であって、（ａ）Ｔ細胞の開始集団を得ることと；（ｂ）Ｔ細胞の開始集団を低酸素条件下又は低酸素誘導剤の存在下で培養することと；（ｃ）ＴＲＭ様Ｔ細胞を生成するため、Ｔ細胞の開始集団をＴＧＦ－β１の存在下でさらに培養することと、を含む方法を提供する。
【0008】
いくつかの態様では、Ｔ細胞の開始集団は、ＣＤ８＋末梢血Ｔ細胞である。具体的な態様では、ＣＤ８＋末梢血Ｔ細胞は、ヒトＣＤ８＋末梢血Ｔ細胞である。特定の態様では、ヒトＣＤ８＋末梢血Ｔ細胞を得ることは、末梢血サンプルからＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞について選択することを含む。いくつかの態様では、末梢血サンプルは、健常対象から得られる。いくつかの態様では、末梢血サンプルは、がんと診断された対象又はがんを有することが疑われている対象から得られる。いくつかの態様では、末梢血サンプルは、ウイルス性疾患と診断された対象又はウイルス性疾患を有することが疑われている対象から得られる。特定の態様では、Ｔ細胞の開始集団は、ペプチド、完全長抗原又は細胞ライセートでパルスされた抗原提示細胞によるナイーブＴ細胞の刺激により生成された。特定の態様では、Ｔ細胞は、腫瘍部位から得られるか、又は腫瘍浸潤リンパ球である。いくつかの態様では、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞である。例えば、細胞ライセートは、腫瘍ライセートである。具体的な態様では、抗原は、がん抗原である。いくつかの態様では、ペプチドは、がん細胞により差次的に発現されるか又は高度に発現されるタンパク質に由来するペプチドである。いくつかの態様では、ペプチドは、ネオ抗原に由来するか又は突然変異を含むタンパク質に由来するペプチドである。特定の態様では、Ｔ細胞の開始集団は、目的の抗原に特異的なＴ細胞について濃縮される。特定の態様では、Ｔ細胞の開始集団は、ＣＤ８陽性ペプチドＭＨＣ四量体陽性細胞について濃縮するため、精製される。いくつかの態様では、Ｔ細胞の開始集団は、蛍光標識細胞分取により精製される。特定の態様では、Ｔ細胞の開始集団は、改変されたＴ細胞である。いくつかの態様では、改変されたＴ細胞は、クローン化Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の宿主細胞の集団への導入により生成される。特定の態様では、宿主細胞の集団は、末梢血単核球である。いくつかの態様では、クローン化ＴＣＲは、非ウイルス的方法、例えばエピソームベクター又はトランスポゾン－トランスポザーゼ系により、宿主細胞の集団に導入される。特定の態様では、クローン化ＴＣＲは、形質導入により、宿主細胞の集団に導入される。いくつかの態様では、宿主細胞の集団は、ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖を含むウイルスベクターにより形質導入される。特定の態様では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。いくつかの態様では、宿主細胞の形質導入された集団は、ＣＤ８陽性ペプチドＭＨＣ四量体陽性細胞について濃縮するため、精製される。特定の態様では、改変されたＴ細胞は、キメラ抗原受容体を発現した。具体的な態様では、キメラ抗原受容体は、クローン化ＴＣＲを含む。いくつかの態様では、Ｔ細胞の開始集団は、対象から得られた腫瘍浸潤リンパ球である。
【0009】
特定の態様では、低酸素条件は、５％未満の酸素、例えば、４％、３％、２％、１％、又はそれ以下の酸素としてさらに定義される。いくつかの態様では、低酸素誘導剤は、低酸素模倣物である。特定の態様では、低酸素誘導剤又は低酸素模倣物は、塩化コバルト（ＣｏＣｌ２）、デフェロキサミンメシル酸塩（ＤＦＯＭ）、ジメチルオキサリルグリシン（ｄｉｍｅｔｈｙｌｏｘａｌｙｇｌｙｃｉｎｅ）（ＤＭＯＧ）、又はプロリルヒドロキシラーゼ阻害剤、例えば２－ＯＧ類似体である。いくつかの態様では、プロリルヒドロキシラーゼ阻害剤は、ロキサデュスタット（ＦＧ－４５９２）である。
【0010】
いくつかの態様では、ステップ（ｂ）の培養は、ＴＣＲ刺激及び同時刺激の存在下で実施される。特定の態様では、ＴＣＲ刺激及び同時刺激は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８ビーズ、支持細胞、抗原提示細胞、人工抗原提示細胞、ペプチド及び／若しくはタンパク質抗原、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、ＴＣＲ刺激及び同時刺激は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８ビーズを含む。特定の態様では、ステップ（ｂ）の培養は、３～５日間、例えば４日間実施される。特定の態様では、ステップ（ｂ）の培養は、酸素正常状態、例えば２０％酸素で実施される。特定の態様では、ステップ（ｂ）の培養のステップは、例えば２５～１００ＩＵ／ｍＬ、例えば２５、５０、又は７５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で実施される。いくつかの態様では、ステップ（ｂ）の培養は、低酸素条件、例えば２％酸素下で実施される。特定の態様では、培養は、ＩＬ－１５の存在下で実施される。いくつかの態様では、ＩＬ－１５は、５～２０ｎｇ／ｍＬ、例えば７～１２ｎｇ／ｍＬ、具体的には７、８、９、１０、１１、又は１２ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。
【0011】
特定の態様では、ＴＧＦ－β１は、組換えヒトＴＧＦ－β１（ｒｈＴＧＦ－β１）とさらに定義される。いくつかの態様では、ｒｈＴＧＦ－β１は、０．１～５ｎｇ／ｍＬ、例えば１～１．５ｎｇ／ｍＬ、具体的には１．１、１．１５、１．２、１．２５、１．３、１．３５、１．４、１．４５、又は１．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、ｒｈＴＧＦ－β１は、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。さらに他の実施形態では、ｒｈＴＧＦ－β１は、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。いくつかの態様では、ステップ（ｃ）の培養は、低酸素条件下又は低酸素誘導剤の存在下で実施される。特定の態様では、ステップ（ｃ）の培養は、１～３日間、例えば２日間実施される。
【0012】
いくつかの態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞は、ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋である。特定の態様では、ステップ（ｃ）で生成された細胞の少なくとも３０％、例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％又はそれ以上は、ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋細胞である。いくつかの態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞は、ＰＤ－１、ＣＤ１０１、及び／又はＣＤ４９ａを発現する。特定の態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞で発現されたＰＤ－１、ＣＤ１０１、及び／又はＣＤ４９ａは、（例えばフローサイトメトリーを介して）細胞表面発現として測定される。特定の態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞は、大気酸素条件下で培養された細胞と比べて、ＣＤ６９、ＩＴＧＡＥ、ＰＤＣＤ１、及び／又はＣＤ１０１のより高い発現を有する。特定の態様では、ＣＤ６９、ＩＴＧＡＥ、ＰＤＣＤ１、及び／又はＣＤ１０１のより高い発現は、大気酸素条件下で培養された細胞と比べてのＣＤ６９、ＩＴＧＡＥ、ＰＤＣＤ１、及び／又はＣＤ１０１タンパク質のより高い発現である。他の態様では、ＣＤ６９、ＩＴＧＡＥ、ＰＤＣＤ１、及び／又はＣＤ１０１のより高い発現は、大気酸素条件下で培養された細胞と比べてのＣＤ６９、ＩＴＧＡＥ、ＰＤＣＤ１、及び／又はＣＤ１０１ ｍＲＮＡ転写物のより高い発現である。
【0013】
特定の態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞は、大気酸素条件下で培養された細胞と比べて、ＴＮＦＡ、ＧＺＭＢ、ＳＬＣ２Ａ１、及び／又はＶＥＧＦのより高い発現を有する。特定の態様では、ＴＮＦＡ、ＧＺＭＢ、ＳＬＣ２Ａ１、及び／又はＶＥＧＦのより高い発現は、大気酸素条件下で培養された細胞と比べてのＴＮＦα、ＧＺＭＢ、ＧＬＵＴ１、及び／又はＶＥＧＦタンパク質のより高い発現である。他の態様では、ＴＮＦＡ、ＧＺＭＢ、ＳＬＣ２Ａ１、及び／又はＶＥＧＦのより高い発現は、大気酸素条件下で培養された細胞と比べてのＴＮＦＡ、ＧＺＭＢ、ＳＬＣ２Ａ１、及び／又はＶＥＧＦ ｍＲＮＡ転写物のより高い発現である。
【0014】
いくつかの態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞は、大気酸素条件下で培養された細胞と比べて、Ｓ１ＰＲ１、ＫＬＦ２、及び／又はＳＥＬＬの減少した発現を有する。いくつかの態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞は、大気酸素条件下で培養された細胞と比べて、Ｓ１ＰＲ１、ＫＬＦ２、及び／又はＣＤ６２Ｌタンパク質の減少した発現を有する。いくつかの態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞は、大気酸素条件下で培養された細胞と比べて、Ｓ１ＰＲ１、ＫＬＦ２、及び／又はＳＥＬＬ ｍＲＮＡ転写物の減少した発現を有する。
【0015】
具体的な態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞は、ＣＸＣＲ６タンパク質の発現を本質的に有しない。特定の態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞は、ＣＸＣＲ６タンパク質の本質的に検出不能な細胞表面発現を有する。
【0016】
いくつかの態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞は、大気酸素条件下で培養された細胞と比べて、ＧＮＬＹ、ＭＹＯ７Ａ、ＩＴＧＡＥ、ＥＧＲ２、ＣＣＬ２０、ＡＴＰ１Ｂ１、ＮＲ４Ａ３、ＰＥＲＰ、ＲＡＳＧＥＦ１Ｂ、ＮＲ４Ａ１、ＢＭＦ、ＥＧＲ１、ＣＸＣＬ１３、ＰＤＣＤ１、ＩＴＧＡ１、ＣＣＬ２２、ＣＡ１０、ＲＧＳ１、ＩＴＧＡ１、ＣＤ１０１、ＴＮＦＲＳＦ９（４－１ＢＢ）、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＮＯＴＣＨ１、ＲＢＰＪ、ＳＴＲＩＰ２、ＡＲＨＧＥＦ４０、ＤＢＨ、ＳＲＧＡＰ３、ＣＳＧＡＬＮＡＣＴ１、ＧＰＲ２５、ＲＧＳ１６、ＤＡＰＫ２、ＮＣＳ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＧＤＰＤ４、ＳＬＣ１Ａ４、ＣＤＫ１４、ＬＭＣＤ１、ＩＬＤＲ２、及び／又はＡＤＣＹ３のより高い発現を有する。特定の態様では、ＧＮＬＹ、ＭＹＯ７Ａ、ＩＴＧＡＥ、ＥＧＲ２、ＣＣＬ２０、ＡＴＰ１Ｂ１、ＮＲ４Ａ３、ＰＥＲＰ、ＲＡＳＧＥＦ１Ｂ、ＮＲ４Ａ１、ＢＭＦ、ＥＧＲ１、ＣＸＣＬ１３、ＰＤＣＤ１、ＩＴＧＡ１、ＣＣＬ２２、ＣＡ１０、ＲＧＳ１、ＩＴＧＡ１、ＣＤ１０１、ＴＮＦＲＳＦ９（４－１ＢＢ）、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＮＯＴＣＨ１、ＲＢＰＪ、ＳＴＲＩＰ２、ＡＲＨＧＥＦ４０、ＤＢＨ、ＳＲＧＡＰ３、ＣＳＧＡＬＮＡＣＴ１、ＧＰＲ２５、ＲＧＳ１６、ＤＡＰＫ２、ＮＣＳ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＧＤＰＤ４、ＳＬＣ１Ａ４、ＣＤＫ１４、ＬＭＣＤ１、ＩＬＤＲ２、及び／又はＡＤＣＹ３タンパク質のより高い発現。特定の態様では、ＧＮＬＹ、ＭＹＯ７Ａ、ＩＴＧＡＥ、ＥＧＲ２、ＣＣＬ２０、ＡＴＰ１Ｂ１、ＮＲ４Ａ３、ＰＥＲＰ、ＲＡＳＧＥＦ１Ｂ、ＮＲ４Ａ１、ＢＭＦ、ＥＧＲ１、ＣＸＣＬ１３、ＰＤＣＤ１、ＩＴＧＡ１、ＣＣＬ２２、ＣＡ１０、ＲＧＳ１、ＩＴＧＡ１、ＣＤ１０１、ＴＮＦＲＳＦ９（４－１ＢＢ）、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＮＯＴＣＨ１、ＲＢＰＪ、ＳＴＲＩＰ２、ＡＲＨＧＥＦ４０、ＤＢＨ、ＳＲＧＡＰ３、ＣＳＧＡＬＮＡＣＴ１、ＧＰＲ２５、ＲＧＳ１６、ＤＡＰＫ２、ＮＣＳ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＧＤＰＤ４、ＳＬＣ１Ａ４、ＣＤＫ１４、ＬＭＣＤ１、ＩＬＤＲ２、及び／又はＡＤＣＹ３ ｍＲＮＡ転写物のより高い発現。
【0017】
いくつかの態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞は、大気酸素条件下で培養された細胞と比べて、ＧＮＬＹ、ＭＹＯ７Ａ、ＩＴＧＡＥ、ＥＧＲ２、ＣＣＬ２０、ＡＴＰ１Ｂ１、ＮＲ４Ａ３、ＰＥＲＰ、ＲＡＳＧＥＦ１Ｂ、ＮＲ４Ａ１、ＢＭＦ、ＥＧＲ１、ＣＸＣＬ１３、ＰＤＣＤ１、ＩＴＧＡ１、ＣＣＬ２２、ＣＡ１０、及び／又はＲＧＳ１のより高い発現を有する。特定の態様では、ＧＮＬＹ、ＭＹＯ７Ａ、ＩＴＧＡＥ、ＥＧＲ２、ＣＣＬ２０、ＡＴＰ１Ｂ１、ＮＲ４Ａ３、ＰＥＲＰ、ＲＡＳＧＥＦ１Ｂ、ＮＲ４Ａ１、ＢＭＦ、ＥＧＲ１、ＣＸＣＬ１３、ＰＤＣＤ１、ＩＴＧＡ１、ＣＣＬ２２、ＣＡ１０、及び／又はＲＧＳ１のより高い発現は、ＧＮＬＹ、ＭＹＯ７Ａ、ＩＴＧＡＥ、ＥＧＲ２、ＣＣＬ２０、ＡＴＰ１Ｂ１、ＮＲ４Ａ３、ＰＥＲＰ、ＲＡＳＧＥＦ１Ｂ、ＮＲ４Ａ１、ＢＭＦ、ＥＧＲ１、ＣＸＣＬ１３、ＰＤＣＤ１、ＩＴＧＡ１、ＣＣＬ２２、ＣＡ１０、及び／又はＲＧＳ１タンパク質のより高い発現である。特定の態様では、ＧＮＬＹ、ＭＹＯ７Ａ、ＩＴＧＡＥ、ＥＧＲ２、ＣＣＬ２０、ＡＴＰ１Ｂ１、ＮＲ４Ａ３、ＰＥＲＰ、ＲＡＳＧＥＦ１Ｂ、ＮＲ４Ａ１、ＢＭＦ、ＥＧＲ１、ＣＸＣＬ１３、ＰＤＣＤ１、ＩＴＧＡ１、ＣＣＬ２２、ＣＡ１０、及び／又はＲＧＳ１のより高い発現は、ＧＮＬＹ、ＭＹＯ７Ａ、ＩＴＧＡＥ、ＥＧＲ２、ＣＣＬ２０、ＡＴＰ１Ｂ１、ＮＲ４Ａ３、ＰＥＲＰ、ＲＡＳＧＥＦ１Ｂ、ＮＲ４Ａ１、ＢＭＦ、ＥＧＲ１、ＣＸＣＬ１３、ＰＤＣＤ１、ＩＴＧＡ１、ＣＣＬ２２、ＣＡ１０、及び／又はＲＧＳ１ ｍＲＮＡ転写物のより高い発現である。
【0018】
いくつかの態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞は、大気酸素条件下で培養された細胞と比べて、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡ１、ＰＤＣ１、ＣＤ１０１、ＴＮＦＲＳＦ９（４－１ＢＢ）、ＣＸＣＬ１３、ＣＣＬ２０、ＮＯＴＣＨ１、ＲＢＰＪ、ＮＲ４Ａ１、ＥＧＲ２、及び／又はＲＧＳ１のより高い発現を有する。特定の態様では、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡ１、ＰＤＣＤ１、ＣＤ１０１、ＴＮＦＲＳＦ９（４－１ＢＢ）、ＣＸＣＬ１３、ＣＣＬ２０、ＮＯＴＣＨ１、ＲＢＰＪ、ＮＲ４Ａ１、ＥＧＲ２、及び／又はＲＧＳ１のより高い発現は、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡ１、ＰＤＣＤ１、ＣＤ１０１、ＴＮＦＲＳＦ９（４－１ＢＢ）、ＣＸＣＬ１３、ＣＣＬ２０、ＮＯＴＣＨ１、ＲＢＰＪ、ＮＲ４Ａ１、ＥＧＲ２、及び／又はＲＧＳ１タンパク質のより高い発現である。特定の態様では、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡ１、ＰＤＣＤ１、ＣＤ１０１、ＴＮＦＲＳＦ９（４－１ＢＢ）、ＣＸＣＬ１３、ＣＣＬ２０、ＮＯＴＣＨ１、ＲＢＰＪ、ＮＲ４Ａ１、ＥＧＲ２、及び／又はＲＧＳ１のより高い発現は、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡ１、ＰＤＣＤ１、ＣＤ１０１、ＴＮＦＲＳＦ９（４－１ＢＢ）、ＣＸＣＬ１３、ＣＣＬ２０、ＮＯＴＣＨ１、ＲＢＰＪ、ＮＲ４Ａ１、ＥＧＲ２、及び／又はＲＧＳ１ ｍＲＮＡ転写物のより高い発現である。
【0019】
いくつかの態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞は、大気酸素条件下で培養された細胞と比べて、ＭＹＯ７Ａ、ＳＴＲＩＰ２、ＡＲＨＧＥＦ４０、ＩＴＧＡＥ、ＤＢＨ、ＳＲＧＡＰ３、ＣＳＧＡＬＮＡＣＴ１、ＧＰＲ２５、ＲＧＳ１６、ＤＡＰＫ２、ＮＣＳ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＧＤＰＤ４、ＳＬＣ１Ａ４、ＣＸＣＬ１３、ＣＤＫ１４、ＬＭＣＤ１、ＩＬＤＲ２、及び／又はＡＤＣＹ３のより高い発現を有する。特定の態様では、ＭＹＯ７Ａ、ＳＴＲＩＰ２、ＡＲＨＧＥＦ４０、ＩＴＧＡＥ、ＤＢＨ、ＳＲＧＡＰ３、ＣＳＧＡＬＮＡＣＴ１、ＧＰＲ２５、ＲＧＳ１６、ＤＡＰＫ２、ＮＣＳ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＧＤＰＤ４、ＳＬＣ１Ａ４、ＣＸＣＬ１３、ＣＤＫ１４、ＬＭＣＤ１、ＩＬＤＲ２、及び／又はＡＤＣＹ３のより高い発現は、ＭＹＯ７Ａ、ＳＴＲＩＰ２、ＡＲＨＧＥＦ４０、ＩＴＧＡＥ、ＤＢＨ、ＳＲＧＡＰ３、ＣＳＧＡＬＮＡＣＴ１、ＧＰＲ２５、ＲＧＳ１６、ＤＡＰＫ２、ＮＣＳ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＧＤＰＤ４、ＳＬＣ１Ａ４、ＣＸＣＬ１３、ＣＤＫ１４、ＬＭＣＤ１、ＩＬＤＲ２、及び／又はＡＤＣＹ３タンパク質のより高い発現である。特定の態様では、ＭＹＯ７Ａ、ＳＴＲＩＰ２、ＡＲＨＧＥＦ４０、ＩＴＧＡＥ、ＤＢＨ、ＳＲＧＡＰ３、ＣＳＧＡＬＮＡＣＴ１、ＧＰＲ２５、ＲＧＳ１６、ＤＡＰＫ２、ＮＣＳ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＧＤＰＤ４、ＳＬＣ１Ａ４、ＣＸＣＬ１３、ＣＤＫ１４、ＬＭＣＤ１、ＩＬＤＲ２、及び／又はＡＤＣＹ３のより高い発現は、ＭＹＯ７Ａ、ＳＴＲＩＰ２、ＡＲＨＧＥＦ４０、ＩＴＧＡＥ、ＤＢＨ、ＳＲＧＡＰ３、ＣＳＧＡＬＮＡＣＴ１、ＧＰＲ２５、ＲＧＳ１６、ＤＡＰＫ２、ＮＣＳ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＧＤＰＤ４、ＳＬＣ１Ａ４、ＣＸＣＬ１３、ＣＤＫ１４、ＬＭＣＤ１、ＩＬＤＲ２、及び／又はＡＤＣＹ３ ｍＲＮＡ転写物のより高い発現である。
【0020】
いくつかの態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞は、大気酸素条件下で培養された細胞と比べて、ＣＤ５８、ＮＲ３Ｃ１、ＲＡＰ１ＧＡＰ２、ＳＥＬＰ、ＣＸＣＲ２、ＴＢＸ２１、ＩＴＧＡＬ、ＳＥＬＬ、ＫＬＦ３、ＫＬＦ２、ＲＡＳＧＲＰ２、ＦＡＭ６５Ｂ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＩＴＧＡＭ、ＫＬＲＢ１、ＴＧＦＢＲ３、ＳＭＡＤ３、ＴＮＦＳＦ８、ＤＵＳＰ２、ＰＬＥＫ、ＧＯＬＧＡ２Ｐ７、ＦＯＳＢ、ＰＬＣＧ２、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＣ６Ａ８、ＳＯＣＳ３、及び／又はＰＴＧＥＲ２のより低い発現を有する。特定の態様では、ＣＤ５８、ＮＲ３Ｃ１、ＲＡＰ１ＧＡＰ２、ＳＥＬＰ、ＣＸＣＲ２、ＴＢＸ２１、ＩＴＧＡＬ、ＳＥＬＬ、ＫＬＦ３、ＫＬＦ２、ＲＡＳＧＲＰ２、ＦＡＭ６５Ｂ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＩＴＧＡＭ、ＫＬＲＢ１、ＴＧＦＢＲ３、ＳＭＡＤ３ＴＮＦＳＦ８、ＤＵＳＰ２、ＰＬＥＫ、ＧＯＬＧＡ２Ｐ７、ＦＯＳＢ、ＰＬＣＧ２、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＣ６Ａ８、ＳＯＣＳ３、及び／又はＰＴＧＥＲ２のより低い発現は、ＣＤ５８、ＮＲ３Ｃ１、ＲＡＰ１ＧＡＰ２、ＳＥＬＰ、ＣＸＣＲ２、ＴＢＸ２１、ＩＴＧＡＬ、ＳＥＬＬ、ＫＬＦ３、ＫＬＦ２、ＲＡＳＧＲＰ２、ＦＡＭ６５Ｂ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＩＴＧＡＭ、ＫＬＲＢ１、ＴＧＦＢＲ３、ＳＭＡＤ３、ＴＮＦＳＦ８、ＤＵＳＰ２、ＰＬＥＫ、ＧＯＬＧＡ２Ｐ７、ＦＯＳＢ、ＰＬＣＧ２、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＣ６Ａ８、ＳＯＣＳ３、及び／又はＰＴＧＥＲ２タンパク質のより低い発現である。特定の態様では、ＣＤ５８、ＮＲ３Ｃ１、ＲＡＰ１ＧＡＰ２、ＳＥＬＰ、ＣＸＣＲ２、ＴＢＸ２１、ＩＴＧＡＬ、ＳＥＬＬ、ＫＬＦ３、ＫＬＦ２、ＲＡＳＧＲＰ２、ＦＡＭ６５Ｂ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＩＴＧＡＭ、ＫＬＲＢ１、ＴＧＦＢＲ３、ＳＭＡＤ３、ＴＮＦＳＦ８、ＤＵＳＰ２、ＰＬＥＫ、ＧＯＬＧＡ２Ｐ７、ＦＯＳＢ、ＰＬＣＧ２、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＣ６Ａ８、ＳＯＣＳ３、及び／又はＰＴＧＥＲ２のより低い発現は、ＣＤ５８、ＮＲ３Ｃ１、ＲＡＰ１ＧＡＰ２、ＳＥＬＰ、ＣＸＣＲ２、ＴＢＸ２１、ＩＴＧＡＬ、ＳＥＬＬ、ＫＬＦ３、ＫＬＦ２、ＲＡＳＧＲＰ２、ＦＡＭ６５Ｂ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＩＴＧＡＭ、ＫＬＲＢ１、ＴＧＦＢＲ３、ＳＭＡＤ３、ＴＮＦＳＦ８、ＤＵＳＰ２、ＰＬＥＫ、ＧＯＬＧＡ２Ｐ７、ＦＯＳＢ、ＰＬＣＧ２、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＣ６Ａ８、ＳＯＣＳ３、及び／又はＰＴＧＥＲ２ ｍＲＮＡ転写物のより低い発現である。
【0021】
いくつかの態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞は、大気酸素条件下で培養された細胞と比べて、ＣＤ５８、ＮＲ３Ｃ１、ＲＡＰ１ＧＡＰ２、ＳＥＬＰ、ＣＸＣＲ２、ＴＢＸ２１、ＩＴＧＡＬ、ＳＥＬＬ、ＫＬＦ３、ＲＡＳＧＲＰ２、ＩＴＧＡＭ、ＫＬＲＢ１、ＴＧＦＢＲ３、ＳＭＡＤ３、及び／又はＴＮＦＳＦ８のより低い発現を有する。特定の態様では、ＣＤ５８、ＮＲ３Ｃ１、ＲＡＰ１ＧＡＰ２、ＳＥＬＰ、ＣＸＣＲ２、ＴＢＸ２１、ＩＴＧＡＬ、ＳＥＬＬ、ＫＬＦ３、ＲＡＳＧＲＰ２、ＩＴＧＡＭ、ＫＬＲＢ１、ＴＧＦＢＲ３、ＳＭＡＤ３、及び／又はＴＮＦＳＦ８のより低い発現は、ＣＤ５８、ＮＲ３Ｃ１、ＲＡＰ１ＧＡＰ２、ＳＥＬＰ、ＣＸＣＲ２、ＴＢＸ２１、ＩＴＧＡＬ、ＳＥＬＬ、ＫＬＦ３、ＲＡＳＧＲＰ２、ＩＴＧＡＭ、ＫＬＲＢ１、ＴＧＦＢＲ３、ＳＭＡＤ３、及び／又はＴＮＦＳＦ８タンパク質のより低い発現である。特定の態様では、ＣＤ５８、ＮＲ３Ｃ１、ＲＡＰ１ＧＡＰ２、ＳＥＬＰ、ＣＸＣＲ２、ＴＢＸ２１、ＩＴＧＡＬ、ＳＥＬＬ、ＫＬＦ３、ＲＡＳＧＲＰ２、ＩＴＧＡＭ、ＫＬＲＢ１、ＴＧＦＢＲ３、ＳＭＡＤ３、及び／又はＴＮＦＳＦ８のより低い発現は、ＣＤ５８、ＮＲ３Ｃ１、ＲＡＰ１ＧＡＰ２、ＳＥＬＰ、ＣＸＣＲ２、ＴＢＸ２１、ＩＴＧＡＬ、ＳＥＬＬ、ＫＬＦ３、ＲＡＳＧＲＰ２、ＩＴＧＡＭ、ＫＬＲＢ１、ＴＧＦＢＲ３、ＳＭＡＤ３、及び／又はＴＮＦＳＦ８ ｍＲＮＡ転写物のより低い発現である。
【0022】
いくつかの態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞は、大気酸素条件下で培養された細胞と比べて、ＧＮＬＹ、ＭＹＯ７Ａ、ＩＴＧＡＥ、ＥＧＲ２、ＣＣＬ２０、ＡＴＰ１Ｂ１、ＮＲ４Ａ３、ＰＥＲＰ、ＲＡＳＧＥＦ１Ｂ、ＮＲ４Ａ１、ＢＭＦ、ＥＧＲ１、ＣＸＣＬ１３、ＰＤＣＤ１、ＩＴＧＡ１、ＣＣＬ２２、ＣＡ１０、及び／又はＲＧＳ１のより高い発現を有する。特定の態様では、ＧＮＬＹ、ＭＹＯ７Ａ、ＩＴＧＡＥ、ＥＧＲ２、ＣＣＬ２０、ＡＴＰ１Ｂ１、ＮＲ４Ａ３、ＰＥＲＰ、ＲＡＳＧＥＦ１Ｂ、ＮＲ４Ａ１、ＢＭＦ、ＥＧＲ１、ＣＸＣＬ１３、ＰＤＣＤ１、ＩＴＧＡ１、ＣＣＬ２２、ＣＡ１０、及び／又はＲＧＳ１のより高い発現は、ＧＮＬＹ、ＭＹＯ７Ａ、ＩＴＧＡＥ、ＥＧＲ２、ＣＣＬ２０、ＡＴＰ１Ｂ１、ＮＲ４Ａ３、ＰＥＲＰ、ＲＡＳＧＥＦ１Ｂ、ＮＲ４Ａ１、ＢＭＦ、ＥＧＲ１、ＣＸＣＬ１３、ＰＤＣＤ１、ＩＴＧＡ１、ＣＣＬ２２、ＣＡ１０、及び／又はＲＧＳ１タンパク質のより高い発現である。特定の態様では、ＧＮＬＹ、ＭＹＯ７Ａ、ＩＴＧＡＥ、ＥＧＲ２、ＣＣＬ２０、ＡＴＰ１Ｂ１、ＮＲ４Ａ３、ＰＥＲＰ、ＲＡＳＧＥＦ１Ｂ、ＮＲ４Ａ１、ＢＭＦ、ＥＧＲ１、ＣＸＣＬ１３、ＰＤＣＤ１、ＩＴＧＡ１、ＣＣＬ２２、ＣＡ１０、及び／又はＲＧＳ１のより高い発現は、ＧＮＬＹ、ＭＹＯ７Ａ、ＩＴＧＡＥ、ＥＧＲ２、ＣＣＬ２０、ＡＴＰ１Ｂ１、ＮＲ４Ａ３、ＰＥＲＰ、ＲＡＳＧＥＦ１Ｂ、ＮＲ４Ａ１、ＢＭＦ、ＥＧＲ１、ＣＸＣＬ１３、ＰＤＣＤ１、ＩＴＧＡ１、ＣＣＬ２２、ＣＡ１０、及び／又はＲＧＳ１ ｍＲＮＡ転写物のより高い発現である。
【0023】
いくつかの態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞は、大気酸素条件下で培養された細胞と比べて、ＭＹＯ７Ａ、ＳＴＲＩＰ２、ＡＲＨＧＥＦ４０、ＩＴＧＡＥ、ＤＢＨ、ＳＲＧＡＰ３、ＣＳＧＡＬＮＡＣＴ１、ＧＰＲ２５、ＲＧＳ１６、ＤＡＰＫ２、ＮＣＳ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＧＤＰＤ４、ＳＬＣ１Ａ４、ＣＸＣＬ１３、ＣＤＫ１４、ＬＭＣＤ１、ＩＬＤＲ２、及び／又はＡＤＣＹ３のより高い発現を有する。特定の態様では、ＭＹＯ７Ａ、ＳＴＲＩＰ２、ＡＲＨＧＥＦ４０、ＩＴＧＡＥ、ＤＢＨ、ＳＲＧＡＰ３、ＣＳＧＡＬＮＡＣＴ１、ＧＰＲ２５、ＲＧＳ１６、ＤＡＰＫ２、ＮＣＳ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＧＤＰＤ４、ＳＬＣ１Ａ４、ＣＸＣＬ１３、ＣＤＫ１４、ＬＭＣＤ１、ＩＬＤＲ２、及び／又はＡＤＣＹ３のより高い発現は、ＭＹＯ７Ａ、ＳＴＲＩＰ２、ＡＲＨＧＥＦ４０、ＩＴＧＡＥ、ＤＢＨ、ＳＲＧＡＰ３、ＣＳＧＡＬＮＡＣＴ１、ＧＰＲ２５、ＲＧＳ１６、ＤＡＰＫ２、ＮＣＳ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＧＤＰＤ４、ＳＬＣ１Ａ４、ＣＸＣＬ１３、ＣＤＫ１４、ＬＭＣＤ１、ＩＬＤＲ２、及び／又はＡＤＣＹ３タンパク質のより高い発現である。特定の態様では、ＭＹＯ７Ａ、ＳＴＲＩＰ２、ＡＲＨＧＥＦ４０、ＩＴＧＡＥ、ＤＢＨ、ＳＲＧＡＰ３、ＣＳＧＡＬＮＡＣＴ１、ＧＰＲ２５、ＲＧＳ１６、ＤＡＰＫ２、ＮＣＳ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＧＤＰＤ４、ＳＬＣ１Ａ４、ＣＸＣＬ１３、ＣＤＫ１４、ＬＭＣＤ１、ＩＬＤＲ２、及び／又はＡＤＣＹ３のより高い発現は、ＭＹＯ７Ａ、ＳＴＲＩＰ２、ＡＲＨＧＥＦ４０、ＩＴＧＡＥ、ＤＢＨ、ＳＲＧＡＰ３、ＣＳＧＡＬＮＡＣＴ１、ＧＰＲ２５、ＲＧＳ１６、ＤＡＰＫ２、ＮＣＳ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＧＤＰＤ４、ＳＬＣ１Ａ４、ＣＸＣＬ１３、ＣＤＫ１４、ＬＭＣＤ１、ＩＬＤＲ２、及び／又はＡＤＣＹ３ ｍＲＮＡ転写物のより高い発現である。
【0024】
さらなる態様では、方法は、目的の抗原に対する特異性を有するＴＲＭ様Ｔ細胞を生成することをさらに含む。いくつかの態様では、目的の抗原に対する特異性を有するＴＲＭ様Ｔ細胞は、目的の抗原に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をＴＲＭ様Ｔ細胞に形質導入することにより改変される。他の態様では、目的の抗原に対する特異性を有するＴＲＭ様Ｔ細胞は、目的の抗原に対する特異性を有するＴ細胞の開始集団を使用することにより生成される。いくつかの態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞は、ステップ（ｂ）中、Ｔ細胞の開始集団をペプチドパルス抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）とともに培養することにより活性化される。いくつかの態様では、ＡＰＣは、成熟樹状細胞である。具体的な態様では、ステップ（ｂ）及び（ｃ）は、少なくとも１回反復される。いくつかの態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞は、ステップ（ｂ）及び／又はステップ（ｃ）中、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤の存在下で培養される。特定の態様では、ＨＤＡＣ阻害剤は、トリコスタチンＡ、トラポキシンＢ、フェニル酪酸、バルプロ酸、ボリノスタット（スベラニロヒドロキサム酸又はＳＡＨＡ、Ｚｏｌｉｎｚａ（登録商標）として市販）、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１、Ｂｅｌｅｏｄａｑ（登録商標）として市販）、パノビノスタット（Ｆａｒｙｄａｑ（登録商標）として市販）、ダシノスタット（ＬＡＱ８２４）、エンチノスタット（ＳＮＤＸ－２７５又はＭＳ－２７５）、タセジナリン（ＣＩ９９４）、及びモセチノスタット（ＭＧＣＤ０１０３）からなる群から選択される。
【0025】
いくつかの態様では、目的の抗原は、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺がん、及び肺の扁平上皮がんを含む）、腹膜のがん、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）若しくは胃（ｓｔｏｍａｃｈ）がん（胃腸がん及び胃腸間質がんを含む）、膵がん、子宮頸がん、卵巣がん、肝がん、膀胱がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜若しくは子宮がん、唾液腺がん、腎（ｋｉｄｎｅｙ）若しくは腎（ｒｅｎａｌ）がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、様々なタイプの頭頚部がん、又はメラノーマを標的化又は処置することが意図される。
【0026】
さらに、ＣＸＣＲ６タンパク質を発現しないか、実質的に発現しないか、又は本質的に発現しないＴＲＭ様Ｔ細胞が本明細書に提供される。いくつかの態様では、ＣＸＣＲ６タンパク質の非発現は、ＣＸＣＲ６タンパク質の非細胞表面発現である。他の態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞は、ＣＸＣＲ６ ｍＲＮＡ転写物を発現するが、ＣＸＣＲ６タンパク質を発現しないか又は細胞表面上でＣＸＣＲ６タンパク質を発現する。いくつかの態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞は、目的の抗原に特異的である。別の実施形態では、上に提示されるようなＴＲＭ様Ｔ細胞の集団を含む医薬組成物が提供される。別の実施形態では、ＣＸＣＲ６タンパク質の発現を本質的に伴わないＴＲＭ様Ｔ細胞の集団及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物が提供される。いくつかの態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞は、本実施形態の方法により生成される。いくつかの態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞は、ＰＤ－１、ＣＤ１０１、及び／又はＣＤ４９ａを発現する。特定の態様では、細胞の少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％又はそれ以上は、ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋細胞である。特定の態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞は、ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋細胞である。いくつかの態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞は、大気酸素条件下で培養された細胞と比べて、ＧＮＬＹ、ＭＹＯ７Ａ、ＩＴＧＡＥ、ＥＧＲ２、ＣＣＬ２０、ＡＴＰ１Ｂ１、ＮＲ４Ａ３、ＰＥＲＰ、ＲＡＳＧＥＦ１Ｂ、ＮＲ４Ａ１、ＢＭＦ、ＥＧＲ１、ＣＸＣＬ１３、ＰＤＣＤ１、ＩＴＧＡ１、ＣＣＬ２２、ＣＡ１０、ＲＧＳ１、ＩＴＧＡ１、ＣＤ１０１、ＴＮＦＲＳＦ９（４－１ＢＢ）、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＮＯＴＣＨ１、ＲＢＰＪ、ＳＴＲＩＰ２、ＡＲＨＧＥＦ４０、ＤＢＨ、ＳＲＧＡＰ３、ＣＳＧＡＬＮＡＣＴ１、ＧＰＲ２５、ＲＧＳ１６、ＤＡＰＫ２、ＮＣＳ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＧＤＰＤ４、ＳＬＣ１Ａ４、ＣＤＫ１４、ＬＭＣＤ１、ＩＬＤＲ２、及び／又はＡＤＣＹ３のより高い発現を有する。いくつかの態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞は、大気酸素条件下で培養された細胞と比べて、ＧＮＬＹ、ＭＹＯ７Ａ、ＩＴＧＡＥ、ＥＧＲ２、ＣＣＬ２０、ＡＴＰ１Ｂ１、ＮＲ４Ａ３、ＰＥＲＰ、ＲＡＳＧＥＦ１Ｂ、ＮＲ４Ａ１、ＢＭＦ、ＥＧＲ１、ＣＸＣＬ１３、ＰＤＣＤ１、ＩＴＧＡ１、ＣＣＬ２２、ＣＡ１０、及び／又はＲＧＳ１のより高い発現を有する。いくつかの態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞は、大気酸素条件下で培養された細胞と比べて、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡ１、ＰＤＣ１、ＣＤ１０１、ＴＮＦＲＳＦ９（４－１ＢＢ）、ＣＸＣＬ１３、ＣＣＬ２０、ＮＯＴＣＨ１、ＲＢＰＪ、ＮＲ４Ａ１、ＥＧＲ２、及び／又はＲＧＳ１のより高い発現を有する。いくつかの態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞は、大気酸素条件下で培養された細胞と比べて、ＭＹＯ７Ａ、ＳＴＲＩＰ２、ＡＲＨＧＥＦ４０、ＩＴＧＡＥ、ＤＢＨ、ＳＲＧＡＰ３、ＣＳＧＡＬＮＡＣＴ１、ＧＰＲ２５、ＲＧＳ１６、ＤＡＰＫ２、ＮＣＳ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＧＤＰＤ４、ＳＬＣ１Ａ４、ＣＸＣＬ１３、ＣＤＫ１４、ＬＭＣＤ１、ＩＬＤＲ２、及び／又はＡＤＣＹ３のより高い発現を有する。いくつかの態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞は、大気酸素条件下で培養された細胞と比べて、ＣＤ５８、ＮＲ３Ｃ１、ＲＡＰ１ＧＡＰ２、ＳＥＬＰ、ＣＸＣＲ２、ＴＢＸ２１、ＩＴＧＡＬ、ＳＥＬＬ、ＫＬＦ３、ＫＬＦ２、ＲＡＳＧＲＰ２、ＦＡＭ６５Ｂ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＩＴＧＡＭ、ＫＬＲＢ１、ＴＧＦＢＲ３、ＳＭＡＤ３、及び／又はＴＮＦＳＦ８、ＤＵＳＰ２、ＰＬＥＫ、ＧＯＬＧＡ２Ｐ７、ＦＯＳＢ、ＰＬＣＧ２、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＣ６Ａ８、ＳＯＣＳ３、及び／又はＰＴＧＥＲ２のより低い発現を有する。いくつかの態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞は、大気酸素条件下で培養された細胞と比べて、ＣＤ５８、ＮＲ３Ｃ１、ＲＡＰ１ＧＡＰ２、ＳＥＬＰ、ＣＸＣＲ２、ＴＢＸ２１、ＩＴＧＡＬ、ＳＥＬＬ、ＫＬＦ３、ＲＡＳＧＲＰ２、ＩＴＧＡＭ、ＫＬＲＢ１、ＴＧＦＢＲ３、ＳＭＡＤ３、及び／又はＴＮＦＳＦ８のより低い発現を有する。いくつかの態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞は、大気酸素条件下で培養された細胞と比べて、ＫＬＦ２、ＫＬＦ３、ＳＥＬＬ、ＦＡＭ６５Ｂ、及び／又はＳＥＲＰＩＮＥ２のより低い発現を有する。いくつかの態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞は、大気酸素条件下で培養された細胞と比べて、ＤＵＳＰ２、ＰＬＥＫ、ＧＯＬＧＡ２Ｐ７、ＦＯＳＢ、ＰＬＣＧ２、ＩＴＧＡＭ、ＦＯＳ、ＫＬＦ３、ＳＬＡＭＦ７、ＴＮＦＳＦ８、ＳＬＣ６Ａ８、ＫＬＦ２、ＳＯＣＳ３、及び／又はＰＴＧＥＲ２のより低い発現を有する。
【0027】
別の実施形態では、対象における免疫関連障害を処置するための、ＣＸＣＲ６タンパク質の発現を本質的に伴わないＴＲＭ様Ｔ細胞、例えば本実施形態の方法によって生成されるＴＲＭ様Ｔ細胞を有効量で含む組成物が提供される。特定の態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞は、目的の抗原に対する特異性を有する。
【0028】
さらに、対象における免疫関連障害を処置するための、ＣＸＣＲ６タンパク質の発現を本質的に伴わないＴＲＭ様Ｔ細胞、例えば本実施形態の方法によって生成されるＴＲＭ様Ｔ細胞の有効量での使用が本明細書に提供される。特定の態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞は、目的の抗原に対する特異性を有する。
【0029】
いくつかの態様では、目的の抗原は、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺がん、及び肺の扁平上皮がんを含む）、腹膜のがん、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）若しくは胃（ｓｔｏｍａｃｈ）がん（胃腸がん及び胃腸間質がんを含む）、膵がん、子宮頸がん、卵巣がん、肝がん、膀胱がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜若しくは子宮がん、唾液腺がん、腎（ｋｉｄｎｅｙ）若しくは腎（ｒｅｎａｌ）がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、様々なタイプの頭頚部がん、又はメラノーマを標的化又は処置することが意図される。
【0030】
さらなる実施形態では、対象における免疫関連障害を処置する方法であって、ＣＸＣＲ６タンパク質の発現を本質的に伴わないＴＲＭ様Ｔ細胞、例えば本実施形態の方法によって生成されるＴＲＭ様Ｔ細胞を有効量で対象に投与することを含む方法が提供される。いくつかの態様では、対象はヒトである。
【0031】
いくつかの態様では、免疫関連障害は、がん、自己免疫不全、移植片対宿主病、同種移植片拒絶、又は炎症性状態である。特定の態様では、対象は、組織又は臓器移植を受けている。
【0032】
さらなる態様では、方法は、少なくとも１つの治療薬を投与することをさらに含む。いくつかの態様では、少なくとも１つの第２の治療薬は、化学療法、免疫療法、手術、放射線療法、又は生物学的療法を含む。いくつかの態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞及び／又は少なくとも１つの第２の治療薬は、静脈内に、腹腔内に、気管内に、腫瘍内に、筋肉内に、内視鏡的に、病変内に、経皮的に、皮下に、局所性に、又は直接注射若しくは灌流により投与される。特定の態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞は、第２の治療薬の前に投与される。いくつかの態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞は、第２の治療薬の後に投与される。特定の態様では、ＴＲＭ様Ｔ細胞は、第２の治療薬と同時に投与される。具体的な態様では、免疫療法は、４－１ＢＢ作動薬である。特定の態様では、４－１ＢＢ作動薬は、４－１ＢＢ抗体である。他の態様では、第２の治療薬は、免疫チェックポイント阻害剤である。特定の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ－４、抗ＰＤ１又は抗ＰＤ－Ｌ１阻害剤である。
【0033】
別の実施形態では、対象におけるウイルス感染を処置する方法であって、ＣＸＣＲ６発現を本質的に伴わないＴＲＭ様Ｔ細胞、例えば本方法によって生成されるＴＲＭ様Ｔ細胞、例えば１つ以上のウイルス抗原に対する特異性を有するＴＲＭ様Ｔ細胞を有効量で投与することを含む方法が提供される。
【0034】
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明白になるであろう。しかし、詳細な説明及び具体例が、本発明の好ましい実施形態を示す一方で、本発明の精神及び範囲の中での様々な変更及び修飾がこの詳細な説明から当業者にとって明白になることで、あくまで例示によって示されることは理解されるべきである。
【0035】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示の特定の態様をさらに示すために含まれる。本開示は、これら図面の１つ以上を本明細書中に提示される具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することを通じて、より十分に理解されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【0036】
【図1】組織常在メモリー細胞を生成するための方法を表す模式図。
【0037】
【図2A-2E】低酸素及びＴＧＦ－β１に曝露されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞はＴＲＭ様転写特性を有する。末梢血から単離されたナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞が、２０％Ｏ２下又は２％Ｏ２（低酸素）下で４日間、次いでｒｈＴＧＦ－β１の添加とともにさらに２日間活性化された。ＴＲＭに関連する遺伝子の発現レベルが、定量リアルタイムＰＣＲを介して分析された。（Ａ－Ｅ）低酸素（２％Ｏ２）＋ＴＧＦ－β１下での遺伝子転写物レベルの、ＡｔｍｏｓＯ２（約２０％Ｏ２）＋ＴＧＦ－β１を上回る倍数変化。古典的な低酸素応答性遺伝子は、細胞の低酸素応答の活性化を示すための対照として（Ｅ）で示される。ＣＸ３ＣＲ１の発現は検出できなかった。ｎ＝６、３つの独立実験；多重比較のためのＢｅｎｊａｍｉｎｉ、Ｋｒｉｅｇｅｒ及びＹｅｋｕｔｉｅｌｉ補正を伴う対応ｔ検定；＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１；ＦＤＲ＜０．０５、データは平均＋／－平均値の標準誤差である。
【0038】
【図3A-3C】低酸素をＴＧＦ－β１と組み合わせることで、ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋集団が誘導され、ヒトＴＲＭ関連マーカーが発現される。健常ヒトドナーの末梢血から単離されたナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞が、大気酸素（約２０％）下又は低酸素（２％酸素）下で４日間、次いでｒｈＴＧＦ－β１の添加とともにさらに２日間活性化された。（Ａ）ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋ＴＲＭ様集団の頻度、（Ｂ及びＣ）続いてＴＲＭ関連マーカーの発現がフローサイトメトリーにより評価された。ドナー１名からの代表的結果が（Ｂ）に示され、灰色ヒストグラムが蛍光マイナスワン（ＦＭＯ）対照を表す。ｎ＝７、３つの独立実験；比の対応ｔ検定（Ａ）又は分散分析（Ｃ）；＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１，＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【0039】
【0040】
【図5A-5F】低酸素及びＴＧＦ－β１で誘導されたＴＲＭ表現型細胞が、内因性ＴＲＭについて報告された場合と類似する転写差異を示す。前記の通り、ＣＤ６９－ＣＤ１０３－、ＣＤ６９＋ＣＤ１０３－、及びＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞が生成され、ＲＮＡ配列決定を介するトランスクリプトーム分析用のＲＮＡの単離前に選別された（ｎ＝３）。（Ａ）グローバルトランスクリプトームに基づく、対のＣＤ６９－ＣＤ１０３－、ＣＤ６９＋ＣＤ１０３－、及びＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の主成分分析（ＰＣＡ）。（Ｂ）２０％Ｏ２、２％Ｏ２下、及び２％Ｏ２＋ＴＧＦ－β１下の各々で生成されたＣＤ６９－ＣＤ１０３－（左）細胞、ＣＤ６９＋ＣＤ１０３－（中）細胞、及びＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋（右）細胞についての上位１５０の差次的に発現された遺伝子の教師なしクラスタリング。差次的発現は｜ｌｏｇ２ＦＣ｜≧１及びＦＤＲ＜０．０５によって判定された。（Ｃ）選択された差次的に発現されたＴＲＭ関連遺伝子の発現レベル。正規化濃縮スコア（ＮＥＳ）として提示される、（Ｄ）ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋細胞対ＣＤ６９－ＣＤ１０３－細胞及び（Ｅ）ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋細胞対ＣＤ６９＋ＣＤ１０３－細胞のトランスクリプトームにおける内因性ＴＲＭ及びＴＩＬＲＭに由来する遺伝子シグネチャーのＧＳＥＡ。（Ｆ）（Ｅ）に示されるＴＩＬＲＭ ＧＳＥＡからの上位３４の差次的に発現された遺伝子。
【0041】
【図6A-6B】低酸素及びＴＧＦ－β１で誘導されたＴＲＭにおいて、代謝、遊走、並びにＴＲＭの生成及び維持に関与する経路が差次的に調節される。（Ａ）ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋細胞内で上方制御又は下方制御される各経路の成分をコードする差次的に発現された遺伝子の、ＣＤ６９－ＣＤ１０３－細胞内でのそれらの発現と比べての頻度、及び負の対数変換Ｐ値（右側垂直軸；フィッシャー直接検定）；バーを越える数として示される、インビトロ誘導されたＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋ＴＲＭにおいて濃縮される、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ経路分析（ＩＰＡ）データベースからの上位３０の古典的経路は、各経路内の全遺伝子を表し、バーは有意性の順番で提示される。（Ｂ）低酸素＋ＴＧＦ－β１でインビトロ誘導されたＴＲＭ及び内因性ヒトＴＲＭにおいて差次的に調節されたＩＰＡ古典的経路。
【0042】
【図7A-7D】低酸素及びＴＧＦ－β１下でのヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の分化がＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋集団の誘導をもたらす。（Ａ）フローサイトメトリー分析において用いられたゲーティング方法。（Ｂ）フローサイトメトリー分析におけるｆｉｘａｂｌｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって判定された細胞生存度。（Ｃ及びＤ）フローサイトメトリーによって判定された、２０％Ｏ２＋ＴＧＦ－β１及び２％Ｏ２＋ＴＧＦ－β１条件を比較する集団頻度における変化。ｎ＝７、３つの独立実験；対応ｔ検定（Ｂ）、比の対応ｔ検定（Ｃ）、又は分散分析（Ｄ）；＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１，＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【0043】
【図8A-8F】１０％Ｏ２及びＴＧＦ－β１下で分化されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＴＲＭ様転写特性を有しない。末梢血から単離されたナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞が２０％Ｏ２（ＡｔｍｏｓＯ２）下又は１０％Ｏ２（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎＯ２）下で４日間、次いでｒｈＴＧＦ－β１の添加とともにさらに２日間活性化された。ＴＲＭ関連遺伝子の発現レベルが、定量リアルタイムＰＣＲを介して分析された。（Ａ－Ｅ）１０％Ｏ２＋ＴＧＦ－β１下での遺伝子転写物レベルの、２０％Ｏ２＋ＴＧＦ－β１を上回る倍数変化。（Ｆ）ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋ＴＲＭ様集団の頻度が次にフローサイトメトリーにより評価された。ドナー１名からの代表的結果が（Ｆ）に示される。ｎ＝３、２つの独立実験；（Ａ－Ｅ）多重比較のためのＢｅｎｊａｍｉｎｉ、Ｋｒｉｅｇｅｒ及びＹｅｋｕｔｉｅｌｉ補正を伴う対応ｔ検定；ＦＤＲ＜０．０５，データは平均＋／－平均値の標準誤差である；（Ｆ）独立ｔ検定、＊Ｐ＜０．０５。
【0044】
【図9A-9B】低酸素及びＴＧＦ－β１で誘導されたＴＲＭ表現型細胞が、内因性ＴＲＭについて報告された場合と類似する転写差異を示す。図４に記載の通り、ＣＤ６９－ＣＤ１０３－、ＣＤ６９＋ＣＤ１０３－、及びＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞が生成され、ＲＮＡ配列決定を介するトランスクリプトーム分析用のＲＮＡの単離前に選別された（ｎ＝３）。（Ａ）内因性ヒトＴＲＭのトランスクリプトーム分析において一般に報告された、選択された遺伝子の発現を示すヒートマップ。（Ｂ）ヒト肺からのＣＤ８＋ＣＤ６９＋Ｔ細胞対ＣＤ８＋ＣＤ６９－Ｔ細胞（Ｋｕｍａｒら、２０１７を参照、参照により本明細書中に援用される）並びに低酸素及びＴＧＦ－β１でインビトロ誘導されたＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋ＴＲＭ（ｉ－ＴＲＭ）に対する正常細胞培養条件からのＣＤ６９－ＣＤ１０３－細胞（ＴＧＦ－β１を伴わない２０％Ｏ２）における転写差異（ｌｏｇ２ＦＣ）を比較するヒートマップ。差次的発現は、ｌｏｇ２ＦＣ≧｜１｜及びＦＤＲ＜０．０５によって判定される。
【0045】
【図10A-10C】（Ａ）末梢血から単離されたナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞が、２０％Ｏ２（ＡｔｍｏｓＯ２）下、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ阻害剤ＦＧ－４５９２（ロキサデュスタット）の存在下で４日間、次いでｒｈＴＧＦ－β１とともにさらに２日間活性化された。４日目のｒｈＴＧＦ－β１の添加とともに２％Ｏ２（低酸素）下で活性化された細胞が、比較目的で示される。ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋集団の頻度は、フローサイトメトリーにより評価されたが、代表的結果がドナー１名におけるＦＡＣＳプロットにて示される（ｎ＝３）。（Ｂ）ＭＡＲＴ－１ペプチドパルス自己樹状細胞による刺激。フローサイトメトリーによって検出された、ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋抗原特異的（四量体＋）Ｔ細胞を生成するため、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞が、４日目のｒｈＴＧＦ－β１の添加とともに、２０％Ｏ２（ＡｔｍｏｓＯ２）下又は２％Ｏ２下で、ＭＡＲＴ－１（Ｍ２７）ペプチドでパルスされた自己単球由来樹状細胞で７日間刺激された。代表的結果が、ドナー１名におけるＦＡＣＳプロットにて示される。ｎ＝４、独立ｔ検定、＊＊Ｐ＜０．０１。データは平均＋／－平均値の標準誤差である。（Ｃ）改良された急速拡大プロトコルにより、抗原特異的Ｔ細胞内でＴＲＭ表現型が誘導される。抗原特異的Ｔ細胞内でＴＲＭ表現型を誘導するため、改良された急速拡大プロトコルにおいて低酸素及びｒｈＴＧＦ－β１が使用された。抗原特異的Ｔ細胞は、自己ＭＡＲＴ－１ペプチドパルス樹状細胞（ＥＴＣ）による刺激又はｇｐ１００に特異的なＴＣＲ（ＴＣＲＴ）の形質導入を介して生成され、蛍光色素コンジュゲート四量体で標識され、選別された。次に、選別された抗原特異的Ｔ細胞が、２０％Ｏ２下で、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）及び照射された支持細胞で刺激され、ＩＬ－２が添加される（通常のＲＥＰ）か、又は２％Ｏ２下でＩＬ－１５が添加され、４日目以降、ｒｈＴＧＦ－β１が添加された。棒グラフは、ＭＡＲＴ－１ ＥＴＣにおける結果を示し、データは平均＋／－平均値の標準誤差であり、ｎ＝３、独立ｔ検定、＊＊Ｐ＜０．０１。
【発明を実施するための形態】
【0046】
組織常在メモリー細胞（ＴＲＭ）は、組織内に存在する非再循環（ｎｏｎ－ｒｅｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ）メモリーＴ細胞であり、組織からの放出及びリンパ節への遊走を可能にする分子が欠如し、フロントライン応答者（ｆｒｏｎｔｌｉｎｅ ｒｅｓｐｏｎｄｅｒｓ）として作用する（Ｍａｍｉ－Ｃｈｏｕａｉｂ ａｎｄ Ｔａｒｔｏｕｒ，２０１９）。ＴＲＭ分化については、比較的にほとんど知られてない。組織に侵入するエフェクターＴ細胞は、組織保持を可能にする遺伝子を上方又は下方制御することにより、ＴＲＭになり得る。本試験では、低酸素及びＴＧＦ－β１がヒト末梢血ＣＤ８＋Ｔ細胞においてＴＲＭ様表現型を誘導し得ることが見出された。本試験では、ヒト末梢血Ｔ細胞、例えばＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋Ｔ細胞がインビトロで低酸素及びＴＧＦ－β１下で分化されるとき、それらはＴＲＭ表現型を発現し、一般に組織常在メモリー細胞に関連するタンパク質マーカー及び遺伝子を発現することが示された（表１）。これらの知見により、ＴＲＭ分化についての以前に報告されていない要因が同定され、養子細胞療法などの基礎研究及びトランスレーショナルな応用としてＴＲＭ表現型細胞を生成する容易な手段が可能になる。
【0047】
したがって、本開示の特定の実施形態は、ＴＲＭ表現型細胞を生成するための方法を提供する。用語「ＴＲＭ表現型細胞」及び「ＴＲＭ様細胞」は、本方法によって提供される細胞を指すように本明細書で互換可能に用いられる。方法は、末梢血Ｔ細胞を低酸素条件下又は低酸素を誘導若しくは模倣する薬剤の存在下で培養することを含み得、例示的な低酸素模倣物として、限定はされないが、塩化コバルト（ＣｏＣｌ２）、デフェロキサミンメシル酸塩（ＤＦＯＭ）、ジメチルオキサリルグリシン（ＤＭＯＧ）、又はプロリルヒドロキシラーゼ阻害剤、例えばロキサデュスタットが挙げられる。この期間中、細胞は、初期エフェクター細胞を生成するため、例えば抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８ビーズにより、ポリクローナルに活性化され得る。用語「初期エフェクター細胞」は、ナイーブ状態からの活性化から１週以内である細胞を指す。活性化は、限定はされないが、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ、支持細胞、抗原提示細胞、人工抗原提示細胞、ペプチド及び／若しくはタンパク質抗原、又はこれらの組み合わせを含む、ＴＣＲ刺激及び同時刺激の存在下で培養することを含んでもよい。初期エフェクター細胞を生成するための活性化後、細胞は、ＴＲＭ表現型細胞を生成するため、ＴＧＦ－β１の存在下でさらに培養される。したがって、低酸素及びＴＧＦ－β１は、ヒトＴＲＭ関連マーカーを発現するＣＤ８＋ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋細胞集団を誘導するため、使用可能である。低酸素及びＴＧＦ－β１下で分化されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＴＲＭ様転写特性を有する。
【0048】
ＴＲＭ様細胞は、抗原特異的にされてもよい。一方法は、ＴＲＭ様細胞を生成するための本明細書に記載の条件下でのナイーブＴ細胞のポリクローナル活性化、続いて抗原特異的なＴＣＲを発現するための形質導入を含んでもよい。ＥＴＣ刺激方法の改変版では、ナイーブＴ細胞は、低酸素下でペプチドパルス抗原提示細胞（又は人工抗原提示細胞）を介して活性化され、続いてｒｈ ＴＧＦ－β１の存在下でさらに培養されてもよい。この活性化は、抗原特異的細胞を生成するため、２回実施されてもよい。別の方法では、抗原特異的なＴＲＭ様細胞は、既に拡大された抗原特異的細胞をＴＲＭ表現型に分化させるため、低酸素及びＴＧＦ－β１とＨＤＡＣ阻害剤などのエピジェネティック修飾剤との組み合わせにより生成されてもよい。
【0049】
本Ｔ細胞、例えばＴ細胞の開始集団は、改変されたＴ細胞であってもよい。特定の実施形態では、改変されたＴ細胞は、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）を含む。特定の実施形態では、改変されたＴ細胞は、腫瘍特異的なエピトープ又はネオエピトープに結合する能力がある組換えＴ細胞受容体を発現するＴ細胞を含む。いくつかの実施形態では、改変されたＴ細胞は、当業者に公知の多くの十分に確立された遺伝子導入方法のいずれかを用いて構築される。特定の実施形態では、改変細胞は、所望される標的腫瘍抗原に特異的なキメラ抗原受容体をコードする核酸又は所望される腫瘍特異的なエピトープ若しくはネオエピトープに特異的な組換えＴＣＲをコードする核酸を導入するためのウイルスベクターに基づく遺伝子導入方法を用いて構築される。特定の実施形態では、改変細胞は、所望される標的腫瘍抗原に特異的なキメラ抗原受容体をコードする核酸又は所望される腫瘍特異的なエピトープ若しくはネオエピトープに特異的な組換えＴＣＲをコードする核酸を導入するための非ウイルスベクターに基づく遺伝子導入方法を用いて構築される。特定の実施形態では、ウイルスベクターに基づく遺伝子導入方法は、レンチウイルスベクターを含む。特定の実施形態では、ウイルスベクターに基づく遺伝子導入方法は、レトロウイルスベクターを含む。特定の実施形態では、ウイルスベクターに基づく遺伝子導入方法は、アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスベクターを含む。非ウイルスベクターに基づく遺伝子導入方法は、エピソームベクター又はトランスポゾン－トランスポザーゼ系を含んでもよい。例えば、トランスポゾン－トランスポザーゼ系は、周知のＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅトランスポゾン－トランスポザーゼ系、又はＴＴＡＡに特異的なトランスポゾンＰｉｇｇｙＢａｃ系であり得る。特定の実施形態では、非ウイルスベクターに基づく遺伝子導入方法は、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）ヌクレアーゼからなる群から選択される遺伝子編集法を含む。特定の実施形態では、非ウイルスベクターに基づく遺伝子編集法は、リポフェクション、ヌクレオフェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、ポリカチオン又は脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、及びＤＮＡの作用物質増強型取り込み（ａｇｅｎｔ－ｅｎｈａｎｃｅｄ ｕｐｔａｋｅ）からなる群から選択されるトランスフェクション又は形質転換方法を含む。
【0050】
特定の実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞は、細胞外抗原結合ドメイン、任意選択的なスペーサー配列、膜貫通ドメイン、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン、及びＣＡＲ Ｔ細胞を活性化又は不活性化するための１つ以上の任意選択的な制御配列を含むＣＡＲ構築物を発現する。
【0051】
特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、所望される標的に特異的に結合する能力がある部分を含む。特定の実施形態では、所望される標的に特異的に結合する能力がある部分は、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む。特定の実施形態では、その抗原結合断片は、所望される標的に特異的に結合する能力があるモノクローナル抗体の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。特定の実施形態では、所望される標的は、腫瘍特異抗原である。特定の実施形態では、腫瘍特異抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、癌胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ＣＡ－１２５、ＭＵＣ－１、上皮腫瘍抗原、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）（例えば、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－１１、又はＭＡＧＥ－Ａ）、突然変異ｐ５３、突然変異ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、葉酸塩結合タンパク質、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ－Ｍｅｔ、メソセリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ－Ｋ、ＩＬ－１１Ｒα、κ鎖、λ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＶＥＧＦＲ２、及びヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）からなる群から選択される。特定の実施形態では、所望される標的は、腫瘍特異的ネオエピトープである。特定の実施形態では、腫瘍特異的ネオエピトープは、インシリコ分析により同定される。特定の実施形態では、腫瘍特異的ネオエピトープは、ヒト対象由来の自己ＴＩＬの集団から同定及び精製される。
【0052】
特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、細胞膜を架橋可能な構造を形成する能力がある任意の合成又は天然アミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、細胞膜を架橋可能な構造は、αヘリックスを含む。特定の実施形態では、膜貫通領域は、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、誘導性Ｔ細胞共刺激分子（ＩＣＯＳ）／ＣＤ２７８、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）／ＣＤ３５７、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＣＲα及びＴＣＲβからなる群から選択される天然に存在する膜貫通タンパク質に由来する。特定の実施形態では、天然に存在する膜貫通タンパク質に由来する膜貫通領域は、他のシグナル伝達タンパク質との相互作用に関与することが知られている配列内に１つ以上のアミノ酸置換を含む。
【0053】
特定の実施形態では、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインは、１つ以上の細胞内チロシンに基づく活性化モチーフ（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ）（「ＩＴＡＭ」）を含む。特定の実施形態では、１つ以上のＩＴＡＭは、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）分子上に存在する。特定の実施形態では、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７、Ｌｉｇｈｔ－Ｒ、ＧＩＴＲ、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される同時刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。
【0054】
特定の実施形態では、Ｔ細胞は、腫瘍特異的エピトープ又はネオエピトープに結合する能力がある組換えＴ細胞受容体を含む。特定の実施形態では、組換えＴ細胞受容体は、対象から単離されたＴ細胞からクローン化された天然に存在するＴＣＲを含む。特定の実施形態では、組換えＴＣＲは、ＴＣＲアルファ（ＴＣＲα）ポリペプチド及びＴＣＲベータ（ＴＣＲβ）ポリペプチドを含むヘテロ二量体（即ちＴＣＲαβ）を含む。特定の実施形態では、組換えＴＣＲは、ＴＣＲガンマ（ＴＣＲγ）ポリペプチド及びＴＣＲデルタ（ＴＣＲδ）ポリペプチドを含むヘテロ二量体（即ちＴＣＲγδ）を含む。
【0055】
特定の実施形態では、組換えＴＣＲαβは、対象から単離され、且つ所望される標的に由来するペプチド抗原に特異的であるクローン化ＴＣＲαβを含む。特定の実施形態では、対象は、哺乳動物である。特定の実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。特定の実施形態では、所望される標的は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、癌胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ＣＡ－１２５、ＭＵＣ－１、上皮腫瘍抗原、メラノーマ関連抗原、突然変異ｐ５３、突然変異ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、葉酸塩結合タンパク質、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ－Ｍｅｔ、メソセリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ－Ｋ、ＩＬ－１１Ｒα、κ鎖、λ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、及びＶＥＧＦＲ２からなる群から選択される腫瘍特異抗原である。特定の実施形態では、組換えＴＣＲγδは、対象から単離され、且つ所望される標的に由来するペプチド抗原に特異的であるクローン化ＴＣＲγδを含む。特定の実施形態では、対象は、哺乳動物である。特定の実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。特定の実施形態では、所望される標的は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、癌胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ＣＡ－１２５、ＭＵＣ－１、上皮腫瘍抗原、メラノーマ関連抗原、突然変異ｐ５３、突然変異ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、葉酸塩結合タンパク質、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ－Ｍｅｔ、メソセリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ－Ｋ、ＩＬ－１１Ｒα、κ鎖、λ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、及びＶＥＧＦＲ２からなる群から選択される腫瘍特異抗原である。
【0056】
さらに、養子細胞療法における、例えばがん又はウイルス性疾患を処置するための、本明細書に提供されるＴＲＭ様細胞の使用を意図した方法が本明細書に提供される。細胞は、免疫抑制のため、例えば移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、組織若しくは臓器拒絶、又は自己免疫状態を有する対象に対して使用されてもよい。
【0057】
【表1】
【0058】
Ｉ．定義
本明細書で用いられるとき、「本質的に含まない」は、特定成分の観点で、特定成分のいずれもが組成物中に意図的に配合されておらず、且つ／又はあくまで汚染物質として又は微量に存在することを意味するように本明細書で用いられる。それ故、組成物の任意の意図されない汚染に起因する特定成分の総量は、０．０５％より十分に少なく、好ましくは０．０１％未満である。特定成分の量が標準的分析法により検出できないような組成物が最も好ましい。
本明細書で用いられるとき、「本質的に含まない」は、特定成分の観点で、特定成分のいずれもが組成物中に意図的に配合されておらず、且つ／又はあくまで汚染物質として又は微量に存在することを意味するように本明細書で用いられる。それ故、組成物の任意の意図されない汚染に起因する特定成分の総量は、０．０５％より十分に少なく、好ましくは０．０１％未満である。特定成分の量が標準的分析法により検出できないような組成物が最も好ましい。
【0059】
本明細書で用いられるとき、「ａ」又は「ａｎ」は、１つ以上を意味してもよい。本明細書の請求項中で用いられ、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と併用されるとき、用語「ａ」又は「ａｎ」は、１つ又は２つ以上を意味してもよい。
【0060】
特許請求の範囲における用語「又は」の使用は、代替物のみ又は代替物が相互に排他的であることを指すことが明示されない限り、「及び／又は」を意味するように使用されるが、本開示は、代替物のみと「及び／又は」とを指す定義を支持する。本明細書で用いられるとき、「別の」は、少なくとも第２又はそれ以上を意味してもよい。用語「約（ａｂｏｕｔ）」、「実質的に」及び「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、一般に規定値±５％を意味する。
【0061】
「自己免疫疾患」は、免疫系が正常宿主の一部である抗原（即ち自己抗原）に対する免疫応答（例えばＢ細胞又はＴ細胞応答）を生成し、結果として組織を損傷させる場合の疾患を指す。自己抗原は、宿主細胞に由来してもよい、又は通常は粘膜表面をコロニー化する微生物（共生生物として公知）などの共生生物に由来してもよい。
【0062】
用語「移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）」は、骨髄又は他の組織移植に共通の重篤な合併症を指し、ここでは移植レシピエント自身の組織に対しての提供された免疫学的にコンピテントなリンパ球の反応が認められる。ＧＶＨＤは、血縁ドナー又は非血縁ドナーのいずれかに由来する幹細胞を使用又は含有する任意の移植片で生じ得る合併症である。いくつかの実施形態では、ＧＶＨＤは、慢性ＧＶＨＤ（ｃＧＶＨＤ）である。
【0063】
本明細書で用いられるとき、用語「キメラ抗原受容体」、「ＣＡＲ」、「キメラＴ細胞受容体」、「人工Ｔ細胞受容体」又は「キメラ免疫受容体」は、所望される非ＭＨＣ制限抗原結合特異性を免疫エフェクター細胞、例えばエフェクターＴ細胞上に移植する、改変されたキメラ受容体構築物を指す。ＣＡＲは、例えば、細胞外抗原結合ドメイン（例えば、抗体又は抗体断片、例えば所望される抗原特異性を有する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）など）、スペーサー配列、膜貫通ドメイン、及び１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含んでもよい。例示的な細胞内シグナル伝達ドメインは、１つ以上の細胞内チロシンに基づく活性化モチーフ（「ＩＴＡＭ」）、例えばＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）、及び／又は１つ以上の同時刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、又はそれらの組み合わせなどを含んでもよい。
【0064】
本明細書で用いられるとき、用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置」、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などは、例えば治療薬を対象に投与することにより、又は対象に対して外科的、臨床的、若しくは他の医学的処置を施すことにより、対象における疾患又は病態の症状を寛解、低減、又は緩和するプロセスを指す。
【0065】
本明細書で用いられるとき、用語「対象」又は「患者」は、個体、例えばヒト又は非ヒト生物、例えば霊長類、哺乳動物、又は脊椎動物を指すように本明細書で互換可能に用いられる。
【0066】
用語「治療的利益」又は「治療的に有効な」は、本願全体を通じて用いられるとき、この病態の医学的処置に関して、対象の健康を促進又は増強するものを指す。これは、限定はされないが、疾患の徴候又は症状の頻度又は重症度における低下を含む。例えば、がんの処置は、例えば、腫瘍のサイズにおける減少、腫瘍の侵襲性における低減、がんの成長速度における減少、又は転移の予防を含んでもよい。がんの処置はまた、がんを有する対象の生存を延長することを指してもよい。
【0067】
本明細書で一般に用いられるとき、「薬学的に許容できる」は、合理的なリスク・ベネフィット比に見合う、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー反応、又は他の課題若しくは合併症を伴わない、ヒト及び動物の組織、臓器、及び／又は体液との接触時の使用に適した、健全な医学的判断の範囲内にある化合物、材料、組成物、及び／又は剤形を指す。
【0068】
「薬学的に許容できる塩」は、上で定義される通り、薬学的に許容でき、且つ所望される薬理学的活性を有する、本明細書で開示される化合物の塩を意味する。かかる塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸；又は１，２－エタンジスルホン酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、２－ナフタレンスルホン酸、３－フェニルプロピオン酸、４，４’メチレンビス（３－ヒドロキシ－２－エン－１－カルボン酸）、４－メチルビシクロ［２．２．２］オクト－２－エン－１カルボン酸、酢酸、脂肪族モノ－及びジカルボン酸、脂肪族硫酸、芳香族硫酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、炭酸、ケイ皮酸、クエン酸、シクロペンタンプロピオン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、ヘプタン酸、ヘキサン酸、ヒドロキシナフトエ酸、乳酸、ラウリル硫酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムコン酸、ｏ－（４－ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、シュウ酸、ｐ－クロロベンゼンスルホン酸、フェニル置換アルカン酸、プロピオン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、酒石酸、第三級ブチル酢酸、トリメチル酢酸などの有機酸とともに形成される酸付加塩を含む。薬学的に許容できる塩はまた、存在する酸性プロトンが無機塩又は有機塩と反応する能力があるときに形成されてもよい塩基付加塩を含む。許容できる無機塩は、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アルミニウム及び水酸化カルシウムを含む。許容できる有機塩は、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎ－メチルグルカミンなどを含む。本発明の任意の塩の一部を形成する特定のアニオン又はカチオンが、その塩が全体として薬理学的に許容できる限り重要でないことは理解されるべきである。薬学的に許容できる塩並びにそれらの調製及び使用方法のさらなる例が、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ Ｕｓｅ（Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ ＆ Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ ｅｄｓ．，Ｖｅｒｌａｇ Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，２００２）に提示されている。
【0069】
「薬学的に許容できる担体」、「薬物担体」、又は単に「担体」は、化学薬品を運搬、送達及び／又は輸送することに関与する、活性成分処方とともに製剤化される薬学的に許容できる物質である。例えば、薬物バイオアベイラビリティを調節し、薬物代謝を減少させ、且つ／又は薬物毒性を低減するための徐放性技術を含む、薬剤の送達及び有効性を改善するための薬物担体が使用されてもよい。一部の薬物担体は、特定の標的部位への薬物送達の有効性を増強することがある。担体の例として、リポソーム、微粒子（例えば、乳酸－グリコール酸共重合体製）、アルブミンミクロスフェア、合成高分子、ナノファイバー、タンパク質－ＤＮＡ複合体、タンパク質コンジュゲート、赤血球、ビロソーム、及びデンドリマーが挙げられる。
【0070】
用語「培養する」は、好適な培地中での細胞のインビトロ維持、分化、及び／又は増殖を指す。「濃縮された」は、生物内に存在する場合の組織内で見出されるよりも高い百分率の全細胞内に存在する細胞を含む組成物を意味する。
【0071】
「単離された」生物学的成分（血液材料の一部、例えば血液成分）は、天然に存在する、生物の他の生物学的成分から実質的に分離又は精製されている成分を指す。単離された細胞は、天然に存在する、生物の他の生物学的成分から実質的に分離又は精製されているものである。
【0072】
ＩＩ．使用方法
いくつかの実施形態では、本開示は、養子細胞療法のための方法であって、本開示のＴＲＭ細胞を有効量で投与することを含む方法を提供する。本開示の特定の実施形態では、がん又はウイルス性疾患は、免疫応答を誘発するＴＲＭ細胞集団の養子移植により処置される。いくつかの実施形態では、ＴＲＭ細胞集団自体が、免疫応答を媒介することになる。ＴＲＭ細胞は、一旦インビボで活性化すると、免疫応答を誘発することになる様々な炎症促進性因子、例えばケモカイン及びサイトカインを生成することがある。個体におけるがんの進行を処置するか又は遅延させるための方法であって、ＴＲＭ細胞集団を有効量で個体に投与することを含む方法が本明細書に提供される。本方法は、免疫異常、固形がん、血液がん、及びウイルス感染を処置するため、適用されてもよい。例えば、実施形態による処置の対象のウイルス感染は、ＨＩＶ、ＨＢＶ又はヘルペスウイルス感染であってもよい。
いくつかの実施形態では、本開示は、養子細胞療法のための方法であって、本開示のＴＲＭ細胞を有効量で投与することを含む方法を提供する。本開示の特定の実施形態では、がん又はウイルス性疾患は、免疫応答を誘発するＴＲＭ細胞集団の養子移植により処置される。いくつかの実施形態では、ＴＲＭ細胞集団自体が、免疫応答を媒介することになる。ＴＲＭ細胞は、一旦インビボで活性化すると、免疫応答を誘発することになる様々な炎症促進性因子、例えばケモカイン及びサイトカインを生成することがある。個体におけるがんの進行を処置するか又は遅延させるための方法であって、ＴＲＭ細胞集団を有効量で個体に投与することを含む方法が本明細書に提供される。本方法は、免疫異常、固形がん、血液がん、及びウイルス感染を処置するため、適用されてもよい。例えば、実施形態による処置の対象のウイルス感染は、ＨＩＶ、ＨＢＶ又はヘルペスウイルス感染であってもよい。
【0073】
本処置方法が有用である場合の腫瘍は、任意の悪性細胞型、例えば固形腫瘍又は血液腫瘍に見出されるものを含む。例示的な固形腫瘍として、限定はされないが、膵臓、結腸、盲腸、胃、脳、頭部、頸部、卵巣、腎臓、喉頭、肉腫、肺、膀胱、メラノーマ、前立腺、及び胸部からなる群から選択される臓器の腫瘍を挙げることができる。例示的な血液腫瘍として、骨髄の腫瘍、Ｔ細胞又はＢ細胞悪性腫瘍、白血病、リンパ腫、芽細胞腫、骨髄腫などが挙げられる。本明細書に提供される方法を用いて処置されてもよいがんのさらなる例として、限定はされないが、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺がん、及び肺の扁平上皮がんを含む）、腹膜のがん、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）若しくは胃（ｓｔｏｍａｃｈ）がん（胃腸がん及び胃腸間質がんを含む）、膵がん、子宮頸がん、卵巣がん、肝がん、膀胱がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜若しくは子宮がん、唾液腺がん、腎（ｋｉｄｎｅｙ）若しくは腎（ｒｅｎａｌ）がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、様々なタイプの頭頚部がん、及びメラノーマが挙げられる。
【0074】
がんは、具体的には以下の組織学的タイプであってもよいが、それは、新生物、悪性；がん；がん、未分化；巨細胞及び紡錘細胞がん；小細胞がん；乳頭がん；扁平上皮がん；リンパ上皮がん；基底細胞がん；毛母がん；移行上皮がん；乳頭移行上皮がん；腺がん；ガストリノーマ、悪性；胆管細胞がん；肝細胞がん；肝細胞がんと胆管細胞がんの複合型；小柱腺がん；腺様嚢胞がん；腺腫性ポリープにおける腺がん；腺がん、家族性大腸腺腫症；固形がん；カルチノイド腫瘍、悪性；細気管支・肺胞腺がん；乳頭腺がん；色素嫌性がん；好酸性がん；好酸性腺がん；塩基好性がん；明細胞腺がん；顆粒細胞がん；濾胞腺がん；乳頭・濾胞腺がん；非被包性硬化性がん；副腎皮質がん；類内膜がん；皮膚付属器がん；アポクリン腺がん；皮脂腺がん；耳垢腺がん；粘表皮がん；嚢胞腺がん；乳頭状嚢腺がん；乳頭状漿液嚢胞腺がん；粘液性嚢胞腺がん；粘液性腺がん；印環細胞がん；浸潤性乳管がん；髄様がん；小葉がん；炎症性がん；パジェット病、乳腺；腺房細胞がん；腺扁平上皮がん；扁平上皮化生随伴腺がん；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫、悪性；莢膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫、悪性；アンドロブラストーマ、悪性；セルトリ細胞がん；ライディッヒ細胞腫、悪性；脂質細胞腫瘍、悪性；傍神経節腫、悪性；乳房外傍神経節腫、悪性；褐色細胞腫；血管球血管肉腫；悪性メラノーマ；無色素性メラノーマ；表在拡大型メラノーマ；悪性黒子型メラノーマ；末端黒子型メラノーマ；結節性メラノーマ；巨大色素性母斑における悪性メラノーマ；類上皮細胞メラノーマ；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質性肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー管混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胚性癌腫；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛がん；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管外皮腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨の巨細胞腫；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮歯牙肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；線維性星細胞腫；星状芽細胞腫；神経膠芽腫；乏突起神経膠腫；乏突起膠芽細胞腫；未分化神経外胚葉性；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅神経原腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキンリンパ腫（ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ）；側肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、大細胞、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞性；菌状息肉症；他の特定非ホジキンリンパ腫；Ｂ細胞リンパ腫；低グレード／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中間グレード／濾胞性ＮＨＬ；中間グレードびまん性ＮＨＬ；高グレード免疫芽球性ＮＨＬ；高グレードリンパ芽球性ＮＨＬ；高グレード小型非分割細胞ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連リンパ腫；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；悪性組織球症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞性白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄肉腫；ヘアリー細胞白血病；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；及び慢性骨髄芽球性白血病に限定されない。
【0075】
特定の実施形態は、白血病を処置する方法に関する。白血病は、血液又は骨髄のがんであり、血球、通常は白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ）（白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ））の異常な増殖（増殖による生成）によって特徴づけられる。それは血液腫瘍と称される疾患の広範なグループの一部である。白血病は、疾患のスペクトルを網羅する広義語である。白血病は、急性及び慢性疾患として臨床的且つ病理学的に分類される。
【0076】
本開示の特定の実施形態では、ＴＲＭ細胞は、それを必要とする個体、例えばがん又は感染、例えば細菌又はウイルス感染を有する個体に送達される。次に、細胞は、個体の免疫系を増強することで、がん又は病原細胞の各々を攻撃する。場合によっては、個体に１用量以上の細胞が供される。個体に２用量以上の免疫細胞が供される場合、投与間の期間は、個体における増殖のための期間を許容する上で十分である必要があり、具体的な実施形態では、投与間の期間は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、又はそれ以上である。
【0077】
本開示の特定の実施形態は、免疫介在性障害を処置又は予防するための方法を提供する。一実施形態では、対象は、自己免疫疾患を有する。自己免疫疾患の非限定例として、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎及び精巣炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック・スパート皮膚炎（ｃｅｌｉａｃ ｓｐａｔｅ－ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、慢性疲労免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素症、クローン病、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛－線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ神経障害、若年性関節炎、扁平苔癬、ループスエリテマトーデス、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、１型又は免疫介在性糖尿病、重症筋無力症、ネフローゼ症候群（微小変化群、巣状糸球体硬化症、又は膜性腎症（ｍｅｂｒａｎｏｕｓ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）など）、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎及び皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、全身硬直症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、脈管炎（結節性多発動脈炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、又はヘルペス状皮膚炎脈管炎など）、白斑、及びウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。したがって、本明細書で開示される方法を用いて処置可能である自己免疫疾患のいくつかの例として、限定はされないが、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、クローン病；潰瘍性大腸炎、重症筋無力症、糸球体腎炎、強直性脊椎炎、脈管炎、又は乾癬が挙げられる。対象はまた、喘息などのアレルギー性障害を有し得る。
【0078】
さらに別の実施形態では、対象は移植臓器のレシピエントであり、又は拒絶を予防及び／若しくは処置するため、幹細胞及びＴＲＭ細胞が使用される。特定の実施形態では、対象は、移植片対宿主病を有するか、又は発現するリスクがある。ＧＶＨＤは、血縁ドナー又は非血縁ドナーのいずれかからの幹細胞を使用又は含有する任意の移植で生じ得る合併症である。ＧＶＨＤには、急性及び慢性の２種類がある。急性ＧＶＨＤは、移植から３か月以内に出現する。急性ＧＶＨＤの徴候は、剥離又は水疱形成皮膚を伴い、拡散し、より重篤になることがある手と足の赤みがかった皮疹を含む。急性ＧＶＨＤはまた、胃と腸を冒す可能性があり、その場合、痙攣、悪心、及び下痢を呈する。皮膚及び眼の黄変（黄疸）は、急性ＧＶＨＤが肝臓を冒していることを示す。慢性ＧＶＨＤは、その重症度：ステージ／グレード１は軽度；ステージ／グレード４は重篤、に基づいてランク付けされる。慢性ＧＶＨＤは、移植から３か月又はそれ以降に発現する。慢性ＧＶＨＤの症状は、急性ＧＶＨＤの場合に類似するが、さらに慢性ＧＶＨＤは、眼の粘液膜、口の唾液腺、並びに胃壁及び腸を潤滑する腺を冒すこともある。本明細書で開示される免疫細胞の集団のいずれかを利用することができる。移植臓器の例として、腎臓、肝臓、皮膚、膵臓、肺及び／又は心臓などの固形臓器移植片、又は島、肝細胞、筋芽細胞、骨髄、若しくは造血若しくは他の幹細胞などの細胞移植片が挙げられる。移植片は、顔の組織などの複合移植片であり得る。免疫細胞は、移植前に、移植と同時に、又は移植後に投与可能である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、移植前に、例えば、移植の少なくとも１時間前、少なくとも１２時間前、少なくとも１日前、少なくとも２日前、少なくとも３日前、少なくとも４日前、少なくとも５日前、少なくとも６日前、少なくとも１週前、少なくとも２週前、少なくとも３週前、少なくとも４週前、又は少なくとも１か月前に投与される。１つの具体的な非限定例では、治療有効量の免疫細胞の投与は、移植の３～５日前になされる。
【0079】
いくつかの実施形態では、対象は、ＴＲＭ細胞集団に先立ち、骨髄非破壊的リンパ球枯渇化学療法が施され得る。骨髄非破壊的リンパ球枯渇化学療法は、任意の好適なかかる治療法であり得、任意の好適な経路により施され得る。骨髄非破壊的リンパ球枯渇化学療法は、特にがんがメラノーマであり、それが転移性であり得る場合、例えば、シクロホスファミド及びフルダラビンの投与を含み得る。シクロホスファミド及びフルダラビンを投与する例示的経路は、静脈内である。同様に、シクロホスファミド及びフルダラビンは、任意の好適な用量で投与され得る。特定の態様では、約６０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドが２日間投与され、その後、約２５ｍｇ／ｍ２のフルダラビンが５日間投与される。
【0080】
特定の実施形態では、ＴＲＭ細胞集団の増殖及び活性化を促進する成長因子が、ＴＲＭ細胞集団と同時又は免疫細胞の後のいずれかに対象に投与される。成長因子は、ＴＲＭ細胞集団の増殖及び活性化を促進する任意の好適な成長因子であり得る。好適な免疫細胞成長因子の例として、インターロイキン（ＩＬ）－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１２が挙げられ、それらは、単独で、又はＩＬ－２とＩＬ－７、ＩＬ－２とＩＬ－１５、ＩＬ－７とＩＬ－１５、ＩＬ－２、ＩＬ－７とＩＬ－１５、ＩＬ－１２とＩＬ－７、ＩＬ－１２とＩＬ－１５、又はＩＬ－１２とＩＬ２などの様々な組み合わせで使用可能である。
【0081】
治療有効量のＴＲＭ細胞は、非経口投与、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、胸骨内、又は関節内注射、又は注入を含むいくつかの経路により投与可能である。
【0082】
養子細胞療法における使用が意図されたＴＲＭ細胞の治療有効量は、治療中の対象において所望される効果を得る量である。例えば、これは、進行を阻害するか又は自己免疫若しくは同種免疫疾患の後退を引き起こすのに必要である、又は自己免疫疾患によって引き起こされる症状、例えば疼痛及び炎症を軽減する能力があるＴＲＭ細胞の量であり得る。それは、炎症に関連する症状、例えば、疼痛、水腫及び体温上昇を軽減するのに必要な量であり得る。それはまた、移植臓器の拒絶を低減又は予防するのに必要な量であり得る。
【0083】
ＴＲＭ細胞は、疾患を処置するための標準処置に合致する処置計画、例えば、病態を寛解するための１日～数日にわたる単回若しくは数回投与、又は疾患進行を阻害し、疾患再発を予防するための長期間にわたる周期的投与で投与され得る。製剤中で利用されるべき正確な用量は、投与経路、及び疾患又は障害の重篤度にも依存することになり、施術者の判断及び各患者の状況に従って決定される必要がある。免疫細胞の治療有効量は、処置中の対象、苦痛の重症度及びタイプ、並びに投与様式に依存することになる。いくつかの実施形態では、ヒト対象の処置において使用可能である用量は、少なくとも３．８×１０４個、少なくとも３．８×１０５個、少なくとも３．８×１０６個、少なくとも３．８×１０７個、少なくとも３．８×１０８個、少なくとも３．８×１０９個、又は少なくとも３．８×１０１０個の免疫細胞／ｍ２の範囲である。特定の実施形態では、ヒト対象の処置において使用される用量は、約３．８×１０９個～約３．８×１０１０個の免疫細胞／ｍ２の範囲である。さらなる実施形態では、免疫細胞の治療有効量は、約５×１０６個の細胞／ｋｇ体重～約７．５×１０８個の細胞／ｋｇ体重、例えば、約２×１０７個の細胞／ｋｇ体重～約５×１０８個の細胞／ｋｇ体重、又は約５×１０７個の細胞／ｋｇ体重～約２×１０８個の細胞／ｋｇ体重で変化し得る。免疫細胞の正確な量は、当業者により、対象の年齢、体重、性別、及び生理的状態に基づいて容易に決定される。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から誘導される用量反応曲線から外挿可能である。
【0084】
ＴＲＭ細胞は、免疫介在性障害の処置のための１つ以上の他の治療薬と組み合わせて投与されてもよい。併用療法剤として、限定はされないが、１つ以上の抗微生物剤（例えば、抗生物質、抗ウイルス薬及び抗真菌薬）、抗腫瘍剤（例えば、フルオロウラシル、メトトレキサート、パクリタキセル、フルダラビン、エトポシド、ドキソルビシン、又はビンクリスチン）、免疫枯渇剤（ｉｍｍｕｎｅ－ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）（例えば、フルダラビン、エトポシド、ドキソルビシン、又はビンクリスチン）、免疫抑制剤（例えば、アザチオプリン、又はグルココルチコイド、例えばデキサメタゾン又はプレドニゾン）、抗炎症剤（例えば、グルココルチコイド、例えば、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン若しくはプレドニゾン、又は非ステロイド性抗炎症剤、例えば、アセチルサリチル酸、イブプロフェン若しくはナプロキセンナトリウム）、サイトカイン（例えば、インターロイキン－１０又はトランスフォーミング成長因子－β）、ホルモン（例えば、エストロゲン）、又はワクチンを挙げることができる。さらに、限定はされないが、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリン及びタクロリムス）；ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）；ミコフェノール酸モフェチル、（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ１５４、ＣＤ４５、ＩＶＩＧ、又はＢ細胞を認識する）抗体；化学療法剤（例えば、メトトレキサート、トレオスルファン、ブスルファン）；照射；又はケモカイン、インターロイキン若しくはそれらの阻害剤（例えば、ＢＡＦＦ、ＩＬ－２、抗ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－４、ＪＡＫキナーゼ阻害剤）を含む免疫抑制剤又は免疫寛容誘発剤が投与可能である。かかる追加的な医薬品は、所望される効果に応じて、免疫細胞の投与の前、間、又は後に投与可能である。細胞及び薬剤のこの投与は、同じ経路により又は異なる経路により、また同じ部位若しくは異なる部位のいずれかで可能である。
【0085】
Ａ．併用療法
特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、少なくとも１つの追加的な治療薬を対象に投与するステップをさらに含む。本明細書で開示されるすべての追加的な治療薬は、任意の潜在的毒性、起こり得る副作用、及び任意の他の関連する要因を考慮する、各々の具体的な組成物又は治療法に対する優良臨床試験基準に従い、対象に投与されることになる。
特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、少なくとも１つの追加的な治療薬を対象に投与するステップをさらに含む。本明細書で開示されるすべての追加的な治療薬は、任意の潜在的毒性、起こり得る副作用、及び任意の他の関連する要因を考慮する、各々の具体的な組成物又は治療法に対する優良臨床試験基準に従い、対象に投与されることになる。
【0086】
特定の実施形態では、追加的な治療法は、免疫療法、放射線療法、手術（例えば、腫瘍の外科的切除）、化学療法、骨髄移植、又は上記の組み合わせであってもよい。追加的な治療法は、標的療法であってもよい。特定の実施形態では、追加的な治療法は、一次治療の前に施される（即ちアジュバント療法の場合）。特定の実施形態では、追加的な治療法は、一次処置の後に施される（即ちネオアジュバント療法の場合。
【0087】
特定の実施形態では、追加的な治療法は、免疫療法を含む。特定の実施形態では、免疫療法は、免疫チェックポイント阻害剤を含む。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、プログラム細胞死経路１（ＰＤ－１／ＣＤ２７９）及びそのリガンド（ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ２７４及びＰＤ－Ｌ２／ＣＤ２７３）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ－４／ＣＤ１５２）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３／ＣＤ２２３）、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、Ｉｇを伴うＴ細胞免疫受容体及び免疫受容体チロシンに基づく阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）ドメイン（ＴＩＧＩＴ）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ－３／ＨＡＶｃｒ２）、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ／ＣＤ１５８）、Ｔ細胞活性化のＶドメイン免疫グロブリンサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）、及びアデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）からなる群から選択される免疫チェックポイントタンパク質を阻害する。いくつかの態様では、免疫療法剤は、４－１ＢＢ作動薬である。例示的な４－１ＢＢ作動薬として、限定はされないが、４－１ＢＢ作動薬抗体（例えば、ウトミルマブ）、組換え４－１ＢＢ（限定はされないが、可溶性、マトリックス結合性のスキャフォールド結合形態を含む）、及び４－１ＢＢアプタマーが挙げられる。
【0088】
特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１結合アンタゴニストである。特定の実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ－１抗体である。特定の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、及びＣＴ－０１１からなる群から選択される。特定の実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、イムノアドヘシン（例えば、免疫グロブリン定常領域（例えば免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合されたＰＤＬ１又はＰＤＬ２の細胞外又はＰＤ－１結合部分を含むイムノアドヘシン）である。
【0089】
特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４結合アンタゴニストである。特定の実施形態では、ＣＴＬＡ－４結合アンタゴニストは、抗ＣＴＬＡ－４抗体である。特定の実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、イピリムマブ及びトレメリムマブからなる群から選択される。
【0090】
特定の実施形態では、追加的な治療薬は、放射線療法による処置を含む。特定の実施形態では、放射線療法は、ガンマ線（γ線）、Ｘ線、マイクロ波、陽子線照射、紫外線照射、及び放射性同位元素の腫瘍への直接送達からなる群から選択される。特定の実施形態では、放射線療法は、Ｘ線による処置を含む。特定の実施形態では、Ｘ線は、３～４週間にわたり、５０～２００レントゲンの一日量で施される。特定の実施形態では、Ｘ線は、２０００～６０００レントゲンの単回線量で施される。特定の実施形態では、放射線療法は、放射性同位元素の腫瘍への直接送達を含む。放射性同位元素における線量範囲は、同位体の半減期、放射される放射線の強度及びタイプ、並びに腫瘍細胞による取り込みの程度に応じて広範に変化するが、適切な治療有効量の決定は、当業者のレベルの範囲内である。
【0091】
特定の実施形態では、追加的な治療薬は、一次処置に伴う副作用（例えば、悪心、悪液質など）の処置のための薬剤の投与を含む。特定の実施形態では、追加的な治療法は、免疫療法を含む。特定の実施形態では、追加的な治療法は、放射線療法を含む。いくつかの実施形態では、放射線療法は、γ線照射を含む。特定の実施形態では、追加的な治療法は、手術を含む。特定の実施形態では、追加的な治療法は、放射線療法と手術との組み合わせを含む。特定の実施形態では、追加的な治療法は、アルキル化剤、アントラサイクリン、細胞骨格破壊剤、エポチロン、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、キナーゼ阻害剤、ヌクレオチド類似体及びヌクレオチド前駆体類似体、ペプチド抗生物質、白金に基づく化合物、レチノイド、ビンカアルカロイド、及びそれらの誘導体からなる群から選択される化学療法剤のクラスによる処置を含む。
【0092】
本明細書で検討される追加的な治療法は、本明細書に提供される組成物の投与の前、後、又はそれと同時に施されてもよい。特定の実施形態では、追加的な治療法は、本明細書に提供される組成物の前に施される。特定の実施形態では、追加的な治療法は、本明細書に提供される組成物の後に施される。特定の実施形態では、追加的な治療法は、本明細書に提供される組成物の投与の前又は後に１つ以上の間隔で施される。治療中の対象が併用療法から利益を得るように、追加的な治療法を施すための適切な間隔の決定は、当業者のレベルの範囲内である。
【0093】
Ｂ．医薬組成物
別の態様では、ＴＲＭ細胞及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物及び製剤が本明細書に提供される。
別の態様では、ＴＲＭ細胞及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物及び製剤が本明細書に提供される。
【0094】
本明細書に記載のような医薬組成物及び製剤は、所望される純度を有する活性成分（抗体又はポリペプチドなど）を１つ以上の任意選択的な薬学的に許容できる担体（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２）と、水溶液、例えば正常な生理食塩水（例えば０．９％）及びヒト血清アルブミン（例えば１０％）の形態で混合することにより調製され得る。薬学的に許容できる担体は、一般に、利用される用量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、限定はされないが、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸；単糖、二糖、及び他の糖、例えば、グルコース、マンノース、又はデキストリン；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、亜鉛－タンパク質複合体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【0095】
ＩＩＩ．キット
いくつかの実施形態では、例えばＴＲＭ細胞を生成するための１つ以上の培地及び成分を含み得るキットが提供される。かかる配合物は、ＴＲＭ細胞との組み合わせに適した形態で因子のカクテルを含んでもよい。試薬系は、必要に応じて、水性培地又は凍結乾燥形態のいずれかでパッケージングされてもよい。キットの容器手段は、一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ又は他の容器手段を含むことになり、その中に成分が入れられ、好ましくは好適にアリコートされてもよい。キット内に２つ以上の成分が存在する場合、キットはまた、一般に、第２の、第３の又は他の追加的な容器を含むことになり、その中に追加的な成分が別々に入れられてもよい。しかし、成分の様々な組み合わせが、バイアル中に含まれてもよい。キットの成分は、乾燥粉末として提供されてもよい。試薬及び／又は成分が乾燥粉末として提供されるとき、粉末は、好適な溶媒の添加により再構成され得る。溶媒も別の容器手段で提供されてよいことが想定される。キットはまた、典型的には、市販用に密封された、キット成分を含有するための手段を含むことになる。かかる容器は、注射又はブロー成形プラスチック容器を含んでもよく、その中に所望されるバイアルが保持される。キットはまた、使用説明書を、例えば印刷又は電子フォーマット、例えばデジタルフォーマットで含み得る。
いくつかの実施形態では、例えばＴＲＭ細胞を生成するための１つ以上の培地及び成分を含み得るキットが提供される。かかる配合物は、ＴＲＭ細胞との組み合わせに適した形態で因子のカクテルを含んでもよい。試薬系は、必要に応じて、水性培地又は凍結乾燥形態のいずれかでパッケージングされてもよい。キットの容器手段は、一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ又は他の容器手段を含むことになり、その中に成分が入れられ、好ましくは好適にアリコートされてもよい。キット内に２つ以上の成分が存在する場合、キットはまた、一般に、第２の、第３の又は他の追加的な容器を含むことになり、その中に追加的な成分が別々に入れられてもよい。しかし、成分の様々な組み合わせが、バイアル中に含まれてもよい。キットの成分は、乾燥粉末として提供されてもよい。試薬及び／又は成分が乾燥粉末として提供されるとき、粉末は、好適な溶媒の添加により再構成され得る。溶媒も別の容器手段で提供されてよいことが想定される。キットはまた、典型的には、市販用に密封された、キット成分を含有するための手段を含むことになる。かかる容器は、注射又はブロー成形プラスチック容器を含んでもよく、その中に所望されるバイアルが保持される。キットはまた、使用説明書を、例えば印刷又は電子フォーマット、例えばデジタルフォーマットで含み得る。
【実施例】
【0096】
ＩＶ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含められる。以下の実施例中に開示される技術が、本発明の実施において十分に機能することが発明者によって発見された技術を表し、それ故、その実施における好ましいモードを構成することが考察できることは当業者によって理解される必要がある。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示される具体的な実施形態において多数の変化を設けることができることを理解するだけでなく、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく同様又は類似の結果を得る必要がある。
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含められる。以下の実施例中に開示される技術が、本発明の実施において十分に機能することが発明者によって発見された技術を表し、それ故、その実施における好ましいモードを構成することが考察できることは当業者によって理解される必要がある。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示される具体的な実施形態において多数の変化を設けることができることを理解するだけでなく、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく同様又は類似の結果を得る必要がある。
【0097】
実施例１－組織常在メモリーＴ細胞の生成
末梢血サンプルを健常ヒト対象から得た。ＦＡＣＳを使用して血液を選別し、ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋）ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。次に、Ｔ細胞を多クローン性に大気酸素下（約２０％）又は低酸素下（２％Ｏ２）で４日間活性化させ、「初期エフェクター」を生成した。次に、初期エフェクターを１．２５ｎｇ／ｍＬのｒｈＴＧＦ－β１の存在下でさらに２日間培養した。次に細胞を収集し、ＴＲＭ関連遺伝子及び表面マーカーの発現について分析した。
末梢血サンプルを健常ヒト対象から得た。ＦＡＣＳを使用して血液を選別し、ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋）ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。次に、Ｔ細胞を多クローン性に大気酸素下（約２０％）又は低酸素下（２％Ｏ２）で４日間活性化させ、「初期エフェクター」を生成した。次に、初期エフェクターを１．２５ｎｇ／ｍＬのｒｈＴＧＦ－β１の存在下でさらに２日間培養した。次に細胞を収集し、ＴＲＭ関連遺伝子及び表面マーカーの発現について分析した。
【0098】
低酸素とＴＧＦ－β１との組み合わせにより、ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋集団が誘導され、ＣＤ６９及びＣＤ１０３を含むヒトＴＲＭ関連マーカーが発現されることが見出された（図３）。ＴＲＭ様Ｔ細胞を、さらなる遺伝子の発現における変化についてさらに分析した。低酸素下対大気酸素条件下で培養された細胞がＴＲＭ表現型に関連する遺伝子発現における変化を有することが見出された（図２）。
【0099】
ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞を、ｒｈＴＧＦ－β１の添加の存在下又は不在下で低酸素により活性化させた。ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋集団の頻度をフローサイトメトリーにより評価した。低酸素及びＴＧＦ－β１がＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋細胞を誘導するように協力することが認められた（図４）。
【0100】
さらに、低酸素及びＴＧＦ－β１で誘導されたＴＲＭ表現型細胞が、内因性ＴＲＭについて報告された場合と同様の転写差異を示すことが見出された。ＣＤ６９－ＣＤ１０３－、ＣＤ６９＋ＣＤ１０３－、及びＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞を生成させ、選別してから、ＲＮＡを単離し、ＲＮＡ配列決定を介してトランスクリプトーム分析を行った（ｎ＝３）。図９Ａは、一般に内因性ヒトＴＲＭのトランスクリプトーム分析にて報告された、選択された遺伝子の発現を示すヒートマップを示す。図９Ｂは、ヒト肺からのＣＤ８＋ＣＤ６９＋Ｔ細胞対ＣＤ８＋ＣＤ６９－Ｔ細胞、並びにＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋低酸素及びＴＧＦ－β１でインビトロ誘導されたＴＲＭ（ｉ－ＴＲＭ）に対する正常な細胞培養条件（ＴＧＦ－β１を伴わない２０％Ｏ２）からのＣＤ６９－ＣＤ１０３－細胞における転写差異（ｌｏｇ２ＦＣ）を比較するヒートマップを示す。差次的発現を｜ｌｏｇ２ＦＣ｜≧１及びＦＤＲ＜０．０５により判定した。
【0101】
本試験は、低酸素及びＴＧＦ－β１が、ＣＤ８＋ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋細胞集団を誘導し、ヒトＴＲＭ関連マーカーを発現し、内因性ヒトＴＲＭの場合と類似の転写特性を有するように協力することを示した。この研究は、インビボでのＴＲＭ分化についての別の考えられる要因を示し、この特有の細胞型を利用する養子細胞療法の開発を可能にすると思われる抗原特異的なＴＲＭ様細胞を生成するためのインビトロ方法における基盤を提供する。したがって、本方法は、ＴＲＭ表現型を有する細胞を生成するために用いることができる。
【0102】
実施例２－材料及び方法
細胞単離及びインビトロ細胞培養：健常なドナー末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を白血球除去により収集し、使用まで液体窒素中で貯蔵した。すべてのヒトサンプル収集は、インフォームドコンセントを得て実施し、ＵＴ ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒの機関審査委員会（ＩＲＢ）により承認された。ＳｔｅｍＣｅｌｌ ＥａｓｙＳｅｐ（商標）キットを使用し、ＣＤ８＋Ｔ細胞を健常ドナーＰＢＭＣから濃縮した。次に、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、及びＣＣＲ７に対する蛍光色素コンジュゲート抗体で細胞を染色した。ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）ＩＩＩ又はＦｕｓｉｏｎセルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、ナイーブＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋細胞を選別した。選別されたナイーブ細胞を、１０ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２（Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ）を有する細胞培地（１０％ＦＢＳ、Ｌ－グルタミン、及びペニシリン－ストレプトマイシンを有するＲＰＭＩ）に再懸濁し、低酸素チャンバー（Ｃｏｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）内の２％酸素又は標準細胞培養インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）内の大気酸素（約２０％）に一晩平衡化した。平衡化後、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標），Ｇｉｂｃｏ）で細胞を４日間活性化させた。４日目、１．２５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＧＦ－β１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を添加し、細胞をさらに２日間培養した。自己ペプチドパルス樹状細胞による刺激又はＴＣＲ形質導入とその後の四量体に基づく選別を介して生成された抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を、通常の急速拡大プロトコル（ＲＥＰ）又はＴＲＭ修飾ＲＥＰを用いて拡大した。３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）を使用し、四量体陽性細胞を１０～１４日間拡大し、ｉ）２０％酸素と通常のＲＥＰの場合にＩＬ－２（５０ＩＵ／ｍｌ）の添加、又はｉｉ）２％酸素と修飾ＲＥＰの場合にＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍｌ）及びｒｈＴＧＦ－β１（１．２５ｎｇ／ｍｌ、４日目開始）の添加のいずれかの下で、支持細胞として同種ＰＢＭＣ及びＬＣＬに２００回照射し、ＴＲＭ表現型を誘導した。
細胞単離及びインビトロ細胞培養：健常なドナー末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を白血球除去により収集し、使用まで液体窒素中で貯蔵した。すべてのヒトサンプル収集は、インフォームドコンセントを得て実施し、ＵＴ ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒの機関審査委員会（ＩＲＢ）により承認された。ＳｔｅｍＣｅｌｌ ＥａｓｙＳｅｐ（商標）キットを使用し、ＣＤ８＋Ｔ細胞を健常ドナーＰＢＭＣから濃縮した。次に、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、及びＣＣＲ７に対する蛍光色素コンジュゲート抗体で細胞を染色した。ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）ＩＩＩ又はＦｕｓｉｏｎセルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、ナイーブＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋細胞を選別した。選別されたナイーブ細胞を、１０ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２（Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ）を有する細胞培地（１０％ＦＢＳ、Ｌ－グルタミン、及びペニシリン－ストレプトマイシンを有するＲＰＭＩ）に再懸濁し、低酸素チャンバー（Ｃｏｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）内の２％酸素又は標準細胞培養インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）内の大気酸素（約２０％）に一晩平衡化した。平衡化後、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標），Ｇｉｂｃｏ）で細胞を４日間活性化させた。４日目、１．２５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＧＦ－β１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を添加し、細胞をさらに２日間培養した。自己ペプチドパルス樹状細胞による刺激又はＴＣＲ形質導入とその後の四量体に基づく選別を介して生成された抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を、通常の急速拡大プロトコル（ＲＥＰ）又はＴＲＭ修飾ＲＥＰを用いて拡大した。３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）を使用し、四量体陽性細胞を１０～１４日間拡大し、ｉ）２０％酸素と通常のＲＥＰの場合にＩＬ－２（５０ＩＵ／ｍｌ）の添加、又はｉｉ）２％酸素と修飾ＲＥＰの場合にＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍｌ）及びｒｈＴＧＦ－β１（１．２５ｎｇ／ｍｌ、４日目開始）の添加のいずれかの下で、支持細胞として同種ＰＢＭＣ及びＬＣＬに２００回照射し、ＴＲＭ表現型を誘導した。
【0103】
フローサイトメトリー：ヒトＴＲＭ関連マーカーの分析のため、ビーズを細胞から除去し、細胞を染色緩衝液で１回洗浄し、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＣＤ８、ＣＤ６９、ＣＤ１０３、ＰＤ－１、ＣＤ１０１、ＣＸＣＲ６、及びＣＤ４９ａに対する蛍光色素コンジュゲート抗体（すべてＢｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。染色後、細胞を４％パラホルムアルデヒド固定緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で固定し、洗浄し、分析まで染色緩衝液中で貯蔵した。ＡＣＥＡ Ｎｏｖｏｃｙｔｅ（登録商標）３０００フローサイトメーターを使用し、染色された細胞を分析した。単一の蛍光色素で染色された補償ビーズ（ＵｌｔｒａＣｏｍｐ（商標），ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び蛍光マイナスワン（ＦＭＯ）サンプルを対照として使用した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、データを分析した。
【0104】
定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ又はｑＰＣＲ）：ヒトＴＲＭ関連遺伝子発現の分析のため、ビーズを細胞から除去し、細胞をＰＢＳで１回洗浄した。Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用し、製造業者の使用説明書に従い、ＲＮＡを単離した。必要な場合、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔを使用し、製造業者の使用説明書に従い、ＲＮＡをさらに精製及び／又は濃縮した。Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用し、第１鎖ｃＤＮＡを合成した。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（登録商標）５リアルタイムＰＣＲシステム及びＰｏｗｅｒＵｐ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、定量リアルタイムＰＣＲを実施した。相対的なｍＲＮＡ遺伝子発現をハウスキーピング遺伝子ＲＰＬ１３Ａに正規化した。使用したプライマーを下表に列挙する。
【0105】
【表2】
【0106】
ＲＮＡ－配列決定トランスクリプトーム分析：ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）ＩＩＩｕセルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、細胞を選別してから、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、続いてＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔを使用し、ＲＮＡを単離した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ Ｋｉｔを使用し、ライブラリーを構築した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）５００プラットフォームを使用し、ＲＮＡ配列決定を実施した。生の読み取り値をヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）参照ゲノム及びトランスクリプトーム（ＧＲＣｈ３８，ＧＥＮＣＯＤＥＶ２３）に、ＨＩＳＡＴ２（バージョン：２．１．０）によりマッピングした。Ｈｔｓｅｑ－ｃｏｕｎｔ（バージョン：２．１．０）を使用し、遺伝子についてのカウント数を得た。Ｒ及びＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージＤＥＳｅｑ２（バージョン１．１４．１）を使用し、差次的に発現された遺伝子を同定した。ＦＤＲ＜０．０５及び｜倍数変化｜＞２を有する遺伝子（ｍＲＮＡのみ、Ｐ値補正用にタンパク質をコードする遺伝子を得る）を差次的に発現されたとみなした。Ｒ及びＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージｆｇｓｅａ（バージョン１．１０．０）を使用し、予め規定された遺伝子セットが２つの生物学的状態（例えば表現型）間で統計学的に有意なコンコーダントな（ｃｏｎｃｏｒｄａｎｔ）差異を示すか否かを判定した。遺伝子セットは、いくつかの予め公表されたＴ細胞シグネチャーから誘導した。ＴＲＭシグネチャーは、いくつかの試験から構築した。肺ＴＲＭ及び乳がんＴＩＬシグネチャーは、遺伝子発現オムニバス（ＧＥＯ）からダウンロードし、各々、ＧＳＥ６１３９７及びＧＳＥ１１０９３８であった。０．０５未満の偽発見率（ＦＤＲ）補正Ｐ値は、有意又は「真」とみなした。
【0107】
有意に差次的に発現された遺伝子（ＦＤＲ＜０．０５及び｜倍数変化｜＞２）の機能的分析を、参照セットとしてのＩｎｇｅｎｕｉｔｙ知識ベースにおけるすべての遺伝子を使用するＩｎｇｅｎｕｉｔｙ（登録商標）経路分析（ＩＰＡ）ソフトウェア（バージョン４８２０７４１３，Ｑｉａｇｅｎ）と、経路が条件間で有意に変更されるか否か（－ｌｏｇ１０［Ｐ値］＞１．３）を判定するためのコア分析における右側フィッシャー直接検定により実施した。
【0108】
統計分析：ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン７，ＧｒａｐｈＰａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用し、データのグラフィカル表示及び統計分析を実施した。データを平均±平均値の標準誤差として表示する。実験群間の結果を、図の説明中に記載の統計学的検定を用いて比較した（分散分析とその後常にチューキーの多重比較検定を行う）。ｐ＜０．０５を統計学的に有意とみなした。
【0109】
実施例３－低酸素はヒト組織常在メモリーＴ細胞分化における環境的要因として作用する
低酸素及びＴＧＦ－β１下で分化したヒトＣＤ８＋Ｔ細胞はＴＲＭ様表現型を得る：炎症性組織内での相対的低酸素という条件で、低酸素圧がＴＲＭ分化へのさらなる要因をもたらし得ることが仮定された。低酸素がＴＲＭ表現型の誘導に寄与し得るか否かを判定するため、ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋）ＣＤ８＋Ｔ細胞をヒト末梢血から選別し、それらを低酸素下（２％Ｏ２）又は正常な細胞培養条件下（大気酸素、約２０％Ｏ２）で４日間活性化し、「初期エフェクター」を生成し、次にｒｈＴＧＦ－β１の存在下でさらに２日培養した。
低酸素及びＴＧＦ－β１下で分化したヒトＣＤ８＋Ｔ細胞はＴＲＭ様表現型を得る：炎症性組織内での相対的低酸素という条件で、低酸素圧がＴＲＭ分化へのさらなる要因をもたらし得ることが仮定された。低酸素がＴＲＭ表現型の誘導に寄与し得るか否かを判定するため、ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋）ＣＤ８＋Ｔ細胞をヒト末梢血から選別し、それらを低酸素下（２％Ｏ２）又は正常な細胞培養条件下（大気酸素、約２０％Ｏ２）で４日間活性化し、「初期エフェクター」を生成し、次にｒｈＴＧＦ－β１の存在下でさらに２日培養した。
【0110】
定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用し、ＴＲＭ転写特性に関連した遺伝子パネルの発現について大集団を評価した。２％Ｏ２＋ＴＧＦ－β１下で分化した細胞は、ヒトＴＲＭのコア転写シグネチャーとしてＫｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．２０１７（参照により本明細書中に援用される）によって同定された遺伝子の大部分の上方制御を示した（即ち、ＣＤ６９、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）、ＰＤＣＤ１（ＰＤ－１）、ＣＤ１０１、及びＣＸＣＲ６）（図２Ａ）。特に、ＩＴＧＡ１（ＣＤ４９ａ）の転写物レベルにおいて差異は認められなかった。さらに、Ｔ細胞再循環において重要な遺伝子の転写物（Ｓ１ＰＲ１、ＫＬＦ２、ＳＥＬＬ（ＣＤ６２Ｌ））は下方制御され、常在メモリー表現型がさらに示唆された。（図２Ｂ）。マウスモデルにおける以前の報告では、Ｓ１ＰＲ１及びＫＬＦ２の下方制御がＴＲＭ分化にとって重要であり、これら遺伝子のレベル低下が内因性ヒトＴＲＭにおいても認められていることが示されている。転写因子Ｅｏｍｅｓにおける転写物は、劇的に減少した（図２Ｃ）。マウスにおける試験では、Ｅｏｍｅｓの消滅がＴＧＦ－β１応答性及びＴＲＭの確立に必要であることが示されている。ＩＲＦ４及びＲＵＮＸ３は上方制御された。ＴＲＭにおけるＩＲＦ４の具体的役割は、依然として明確でないが、その上方制御がヒトＴＲＭにて報告されている。転写因子ＲＵＮＸ３は近年、ＴＲＭ分化の主要な制御因子であることが同定されている。最後に、エフェクター分子ＴＮＦ－α及びグランザイムｂをコードする転写物のレベル上昇が、ヒト肺ＴＲＭにおいて報じられた知見と同様に認められた（図２Ｄ）。古典的な低酸素応答性遺伝子ＳＬＣ２Ａ１（Ｇｌｕｔ－１）及びＶＥＧＦの発現上昇により、細胞が低酸素条件に応答していることが確認された（図１Ｅ）。全体的に、これらの結果は、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞がＴＧＦ－β１と組み合わせて低酸素下で分化されるとき、それらが組織常在メモリー様転写特性を得ることを示す。
【0111】
ヒトＴＲＭのコアシグネチャーであると考えられるマーカーのタンパク質レベル発現を評価するためのフローサイトメトリー分析。試験したすべての健常ドナーにおいて、２％Ｏ２＋ＴＧＦ－β１条件下で、２０％Ｏ２＋ＴＧＦ－β１条件下と比べてＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋細胞における増加が認められた（図２Ａ）。細胞生存度は、２％Ｏ２＋ＴＧＦ－β１細胞において、２０％Ｏ２＋ＴＧＦ－β１細胞に対して同等又は優位であった（図７Ｂ）。これらのＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋細胞は、ＰＤ－１、ＣＤ１０１、及びＣＤ４９ａを発現した（図３Ｂ）。特に、ＣＸＣＲ６表面タンパク質発現は、転写上方制御にもかかわらず認められなかった。ＣＤ６９とＣＤ１０３の双方の発現は、ＴＲＭを明らかにするために現在一般に使用されているが、部分的には内因性常在メモリー細胞内でのＣＤ６９及びＣＤ１０３の異質性発現に起因し、これら表面マーカーのいずれがＴＲＭを同定するための使用に最適であるかについては依然として論争の的である。したがって、２％Ｏ２＋ＴＧＦ－β１条件から、ＣＤ６９－ＣＤ１０３＋、ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋、及びＣＤ６９＋ＣＤ１０３－集団の中でＴＲＭ関連マーカーＰＤ－１、ＣＤ１０１、及びＣＤ４９ａの発現レベルを比較した。予想通り、ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋集団が、最高レベルのＰＤ－１及びＣＤ１０１表面発現を有した（図３Ｃ）。ＣＤ４９ａの発現も高かったが、ＣＤ６９＋ＣＤ１０３－集団で認められた発現レベルに等しかった。異なる酸素条件の比較では、ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋集団において、集団の倍数変化における最も著しい増加が見出された（図７Ｃ、７Ｄ）。これらの結果に基づき、インビトロ誘導されたＴＲＭ細胞としてのＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋集団に対するさらなる分析に注目することを選択した。
【0112】
低酸素及びＴＧＦ－β１曝露はＴＲＭ表現型を得るための相乗的要因である：正常な組織培養条件下での大気酸素レベルが（生理学的に重要である）１０％Ｏ２の効果が評価されたインビボでのＴ細胞によって経験される場合よりも高いことから、Ｔ細胞を循環中で非低酸素下酸素レベルに曝露する。１０％Ｏ２＋ＴＧＦ－β１におけるＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞において２０％Ｏ２＋ＴＧＦ－β１と比べてわずかな増加が認められたが、多重比較における補正により、ＴＲＭシグネチャー遺伝子の発現における２つの条件間で有意差がないことが明らかになった（図８Ａ－Ｅ）。さらに、ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋集団の倍数変化（２０％超のＯ２＋ＴＧＦ－β１）は、２％Ｏ２＋ＴＧＦ－β１条件対１０％Ｏ２＋ＴＧＦ－β１条件において有意により大きかった（図８Ｆ）。
【0113】
低酸素及びＴＧＦ－β１のＴＲＭ表現型細胞の誘発への各寄与を評価するため、インビトロ分化実験を、２％Ｏ２又は２０％Ｏ２下で、ｒｈＴＧＦ－β１の添加の存在下又は不在下で実施した。低酸素及びＴＧＦ－βが各々、これらマーカーの発現を駆動し得るという公表された報告に一致し、低酸素が主にＣＤ６９＋細胞を誘導した一方で、ＴＧＦ－β１はＣＤ１０３＋細胞を誘導した。低酸素又はＴＧＦ－β１が単独でＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋細胞の中規模集団を確かに誘導するが、低酸素とＴＧＦ－β１との組み合わせは、組み合わせ効果がいずれかの条件単独での相加的効果よりも顕著に大きかったことから、常在性表現型の誘導に協力するようにみられる（図４Ａ）。低酸素及びＴＧＦ－β１によって誘導されたＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋細胞は、ＴＲＭマーカーＰＤ－１、ＣＤ１０１、及びＣＤ４９ａを、２０％Ｏ２及び２％Ｏ２条件下の大部分の集団（各々、ＣＤ６９－ＣＤ１０３－及びＣＤ６９＋ＣＤ１０３－）と比べて高レベルで発現した（図４Ｂ）。
【0114】
インビトロ誘導されたＴＲＭは内因性ヒトＴＲＭ遺伝子シグネチャーにおける濃縮を示す：ＣＤ６９－ＣＤ１０３－（２０％Ｏ２）細胞、ＣＤ６９＋ＣＤ１０３－（２％Ｏ２）細胞及びＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋（２％Ｏ２＋ＴＧＦ－β１）細胞の中でのＴＲＭマーカー発現における差異が異なる集団を表すことを示唆したことから、各表現型を選別し、それらの転写特性をＲＮＡ配列決定により分析した。主成分分析（ＰＣＡ）によると、これら３つの集団が互いに異なることが確認された（図５Ａ）。教師なし階層的クラスタリングによると、ＣＤ６９－ＣＤ１０３－細胞及びＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋細胞における遺伝子シグネチャーが異なる一方で、ＣＤ６９＋ＣＤ１０３－細胞がやや中間的な転写特性を有することが示された（図５Ｂ、５Ｃ）。ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋細胞とＣＤ６９－ＣＤ１０３－細胞との間での上位の差次的に発現された遺伝子の比較によると、内因性ヒトＴＲＭについて報告された場合に一致する遺伝子発現パターン、例えば、ＩＴＧＡＥ、ＥＧＲ２、ＧＮＬＹ、ＢＭＦ、ＲＡＳＧＥＦ１Ｂ、及びＮＲ４Ａ１の発現増加、並びにＳＥＬＬ、ＫＬＦ２、及びＫＬＦ３の発現減少が示され、再循環しない転写プログラムが示された（図５Ｂ、５Ｃ）。ＫＬＦ２標的遺伝子Ｓ１ＰＲ１もまた下方制御されたが、倍数変化の閾値を満たさなかった。ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋細胞は、ＩＴＧＡ１、ＰＤＣＤ１、ＣＤ１０１、及びＴＮＦＲＳＦ９の発現増加を示し、それらのすべては、内因性ヒトＴＲＭ内で上方制御されることが常に報告されている。インビボで内因性肺ＴＲＭの維持に寄与することが知られている転写因子ＮＯＴＣＨ１、及びノッチシグナル伝達における中心的役割を担うＲＢＰＪのレベル上昇が認められた（図５Ｃ）。
【0115】
内因性ＴＲＭは、様々なケモカインを、おそらくは他の免疫細胞を局所組織に動員する場合のそれらの「アラーム機能」の一部として発現することが多い。内因性ＴＲＭのケモカイン特性に一致して、試験におけるインビトロ誘導されたＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋細胞は、ＣＸＣＬ１３及びＣＣＬ２０、並びにＣＣＬ４、ＣＣＬ５、及びＣＣＬ２２を上方制御した（図５Ｃ）。不明確な役割を有するが、内因性ヒトＴＲＭにおいて常に報告されている遺伝子の発現における変化、例えばＭＹＯ７Ａ及びＲＧＳ１の上方制御、並びにＳＥＲＰＩＮＥ２、ＲＡＰ１ＧＡＰ２、ＲＡＳＧＲＰ２、及びＦＡＭ６５Ｂの下方制御も認められた。
【0116】
それらの知見の生理学的関連性に関する洞察を得るため、末梢血からのＣＤ１０３－エフェクターメモリー細胞又は同じ組織部位内部のＣＤ１０３－Ｔ細胞と比べられた内因性ヒトＣＤ１０３＋ＴＲＭについての公表された分析からの遺伝子シグネチャーを用いて、遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）を実施した。結果によると、ＣＤ６９－ＣＤ１０３－細胞と比べてのＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋細胞の転写特性が、血液ＴＥＭ及び局所ＣＤ１０３－Ｔ細胞と比べてのＴＲＭのシグネチャーに類似する一方で、ＣＤ６９＋ＣＤ１０３－細胞と比べてのＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋細胞が専ら同じ組織内のＴＲＭ対ＣＤ１０３－Ｔ細胞のシグネチャーに類似することが示された（図５Ｄ）。これらの結果は、局所組織に対する循環における酸素圧下での差異の程度を反映する。同じ腫瘍内部のＴＩＬであっても、循環中のＴ細胞に対する組織内のＴ細胞よりも類似した酸素レベルに曝露されることになり、様々な固形腫瘍タイプにおけるＴＩＬの複数の直近の特性が、ＣＤ１０３＋常在メモリー様ＴＩＬ（ＴＩＬＲＭ）の存在を報じている。それ故、低酸素＋ＴＧＦ－β１下で誘導されたＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋細胞を低酸素単独下で誘導されたＣＤ６９＋ＣＤ１０３－細胞と比較し、ＣＤ８＋ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋対ＣＤ８＋ＣＤ６９＋ＣＤ１０３－乳がんＴＩＬについて報じられた遺伝子シグネチャーの濃縮が認められた（図５Ｅ、５Ｆ）。低酸素及びＴＧＦ－βが腫瘍微小環境に共通の特徴であることから、結果として、これら条件がインビボでのＣＤ１０３＋ＴＩＬの生成に寄与することがあることが示される。
【0117】
ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋細胞をＣＤ６９－ＣＤ１０３－細胞と比較するＩｎｇｅｎｕｉｔｙ経路分析（ＩＰＡ）によると、差次的に発現された遺伝子の多くが、解糖、糖新生、及びＴＧＦ－βシグナル伝達経路の成分であることが示された（図６Ａ）。細胞が低酸素及びＴＧＦ－βに曝露されたことで、低酸素が細胞代謝の主要な制御因子であると仮定すると、これらの結果は想定された。ノッチシグナル伝達経路における遺伝子の濃縮も認められ、それは内因性ヒト肺ＴＲＭ内で報告されている（図６Ａ）。これらの知見は、ＴＲＭ分化における代謝の役割についでの疑問を生じさせる。Ｈｏｍｂｒｉｎｋらは、ノッチシグナル伝達の化学的阻害が解糖、酸化的リン酸化、及び脂肪酸代謝経路に関与する遺伝子に影響したことから、肺ＴＲＭにおけるノッチシグナル伝達の主要な役割が代謝プログラムの調節であることを示唆した。低酸素と同様、好気性解糖の既知の修飾物質であるプリン作動性受容体Ｐ２ＲＸ７の欠失が、Ｐ２ＲＸ７欠損細胞がミトコンドリアの質量及び機能の低減、好気性解糖の欠陥、及びグルコース取り込み障害を呈したことから、代謝の調節不全を介してＴＲＭの形成を損なうことも示唆されている。
【0118】
白血球血管外漏出シグナル伝達に関与する差次的に発現された遺伝子の濃縮。上皮接着結合シグナル伝達、インテグリンシグナル伝達、及びパキシリン（Ｐａｘｉｌｉｎ）シグナル伝達が認められたが、すべてが接着斑シグナル伝達に関与し、遊走のプログラム化における変化が示唆された（図６Ｂ）。ＰＩ（３）Ｋ（ホスファチジルイノシトール－３－ＯＨキナーゼ）シグナル伝達がＫＬＦ２のサイトカイン誘導性下方制御に関与し、インビボでのＴＲＭの生成における役割を担うことがあるという先行報告に一致して、イノシトールリン酸シグナル伝達に関与する複数の経路、即ち、３－ホスホイノシチド生合成、イノシトールリン酸化合物のスーパー経路、Ｄ－ミオ－イノシトール（１，４，５，６）－四リン酸生合成、及びＤ－ミオ－イノシトール（３，４，５，６）－四リン酸生合成についても濃縮された。
【0119】
低酸素＋ＴＧＦ－βで誘導されるＴＲＭ転写特性の機能的関連性をより十分に理解するため、Ｋｕｍａｒらによって公表された転写データに対して、経路分析も実施し、Ｔｈ１及びＴｈ２活性化における変化と顆粒球接着及び血管外漏出経路が、それらの内因性肺ＴＲＭ及びインビトロ誘導されたＴＲＭに共通することが見出された。特に、データセットのすべての中で、軸索ガイダンス経路も高度に有意に差次的に調節された。軸索ガイダンスは、最初、表面上は常在メモリーＴ細胞に無関係であり、現在のＴＲＭの文献にて報告されていないが、環境要因が細胞の遊走パターンに影響を及ぼす場合のプロセスである。軸索ガイダンスを司る同じ要素の多くが、免疫細胞輸送を調節することも公知であり、低酸素及び／又はＴＧＦ－βにより調節され得る。
【0120】
ＴＧＦＢ１と組み合わせたＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ阻害剤ＦＧ－４５９２（ロキサデュスタット）の効果を評価するため、さらなる試験を実施した。末梢血から単離したナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞を、２０％Ｏ２（ＡｔｍｏｓＯ２）下、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ阻害剤ＦＧ－４５９２（ロキサデュスタット）の存在下で４日間、次にｒｈＴＧＦ－β１を用いてさらに２日間活性化させた。４日目、ｒｈＴＧＦ－β１の添加とともに２％Ｏ２（低酸素）下で活性化させた細胞を比較用に図１０Ａに示す。組み合わせは、ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋細胞を誘導することが認められた（図１０Ａ）。
【0121】
次に、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞を、４日目のｒｈＴＧＦ－β１の添加とともに２０％Ｏ２（ＡｔｍｏｓＯ２）又は２％Ｏ２下で７日間、ＭＡＲＴ－１（Ｍ２７）ペプチドでパルスした自己単球由来樹状細胞で刺激し、ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋抗原特異的（四量体＋）Ｔ細胞を生成した（フローサイトメトリーにより検出した）（図１０Ｂ）。低酸素及びｒｈＴＧＦ－β１を改良した急速拡大プロトコルにおいて使用し、抗原特異的Ｔ細胞内でＴＲＭ表現型を誘導した。抗原特異的Ｔ細胞を、自己ＭＡＲＴ－１ペプチドパルス樹状細胞（ＥＴＣ）による刺激又はｇｐ１００に特異的なＴＣＲ（ＴＣＲＴ）の形質導入を介して生成し、蛍光色素コンジュゲート四量体で標識し、選別した。次に、選別された抗原特異的Ｔ細胞を、２０％Ｏ２下で、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）及び照射された支持細胞で刺激し、ＩＬ－２を添加する（通常のＲＥＰ）か又は２％Ｏ２でＩＬ－１５を添加し、４日目以降、ｒｈＴＧＦ－β１を添加した。このように、改良した急速拡大プロトコルにより、抗原特異的Ｔ細胞内でＴＲＭ表現型が誘導されることも示された（図１０Ｃ）。
【0122】
したがって、本試験では、ヒト末梢血由来Ｔ細胞からインビトロでＴＲＭ表現型を再現するとともに、ＴＲＭ分化における潜在的要因として低酸素を同定した。ヒトにおいて実施可能な実験に対して明白な制限がある一方で、記述した試験は、低酸素＋ＴＧＦ－βで誘導されたＴＲＭが内因性ＴＲＭ並びに遊走及び代謝に関連する経路の転写及びプロテオミクスのランドスケープを再現するという観察により支持されて、低酸素がＴＲＭ表現型の獲得に寄与し得る環境的要因であるという説得力のある証拠を提供する。
【0123】
本明細書で開示及び主張された方法のすべては、本開示に照らして、過度の実験を行うことなく、構築し、実施することができる。本発明の組成物及び方法が好ましい実施形態の観点で説明されている一方で、本明細書に記載の方法に、且つ方法のステップ又は一連のステップにおいて変更が本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく適用されてもよいことは当業者にとって明らかになるであろう。より具体的には、化学的且つ生理学的に関連する特定の薬剤が本明細書に記載の薬剤と置き換えられてもよい場合、同一又は同様の結果が得られることは明らかになるであろう。当業者にとって明白なすべてのかかる類似する置換及び修飾は、貼付の特許請求の範囲によって定義されるような本発明の精神、範囲及び概念の範囲内にあると思われる。
参考文献
以下の参考文献は、本明細書における提示を補足する、例示的な手順又は他の詳細を提供する程度まで、参照により本明細書中に具体的に援用される。
１）Ａｔｋｕｒｉ，Ｋ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２００５）．Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ａｔ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ｏｘｙｇｅｎ ｌｅｖｅｌｓ ｉｍｐａｃｔｓ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １０２，３７５６－３７５９．
２）Ｃａｌｄｗｅｌｌ，Ｃ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔＨｙｐｏｘｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ：１９５０）１６７，６１４０－６１４９．
３）Ｋｕｍａｒ，Ｂ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ－Ｒｅｓｉｄｅｎｔ Ｍｅｍｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ａｒｅ Ｄｅｆｉｎｅｄ ｂｙ Ｃｏｒｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｉｎ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ ａｎｄ Ｍｕｃｏｓａｌ Ｓｉｔｅｓ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２０，２９２１－２９３４．
４）Ｍａｃｋａｙ，Ｌ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ ＣＤ１０３（＋）ＣＤ８＋ｔｉｓｓｕｅ－ｒｅｓｉｄｅｎｔ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｓｋｉｎ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４，１２９４－１３０１．
５）Ｈｏｍｂｒｉｎｋ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ｐｒｏｇｒａｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ，ｖｉｇｉｌａｎｃｅ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆＨｕｍａｎ ＣＤ８（＋）ｌｕｎｇ－ｒｅｓｉｄｅｎｔ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７，１４６７－１４７８．
６）Ｓｋｏｎ，Ｃ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓ１ｐｒ１ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｓｉｄｅｎｔ ｍｅｍｏｒｙ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４，１２８５－１２９３．
７）Ｍａｃｋａｙ，Ｌ．Ｋ．，ａｎｄ Ｋａｌｌｉｅｓ，Ａ．（２０１７）．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ－Ｒｅｓｉｄｅｎｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３８，９４－１０３．
８）Ｍａｃｋａｙ，Ｌ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ｔ－ｂｏｘ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ Ｃｏｍｂｉｎｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ＴＧＦ－ｂｅｔａ ａｎｄ ＩＬ－１５ ｔｏ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔｉｓｓｕｅ－Ｒｅｓｉｄｅｎｔ Ｍｅｍｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｆａｔｅ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４３，１１０１－１１１１．
９）Ｍａｃｋａｙ，Ｌ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ｈｏｂｉｔ ａｎｄ Ｂｌｉｍｐ１ ｉｎｓｔｒｕｃｔ ａ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｇｒａｍ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｓｉｄｅｎｃｙ ｉｎ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５２，４５９－４６３．
１０）Ｍａｍｉ０Ｃｈｏｕａｉｂ ａｎｄ Ｔａｒｔｏｕｒ．（２０１９）Ｅｄｉｔｏｒｉａｌ：Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓｉｄｅｎｔ Ｍｅｍｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ．Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １０，１－３．
１１）Ｍｉｌｎｅｒ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｒｕｎｘ３ ｐｒｏｇｒａｍｓＣＤ８（＋）Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｉｄｅｎｃｙ ｉｎ ｎｏｎ－ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ｔｕｍｏｕｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ ５５２，２５３－２５７．
参考文献
以下の参考文献は、本明細書における提示を補足する、例示的な手順又は他の詳細を提供する程度まで、参照により本明細書中に具体的に援用される。
１）Ａｔｋｕｒｉ，Ｋ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２００５）．Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ａｔ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ｏｘｙｇｅｎ ｌｅｖｅｌｓ ｉｍｐａｃｔｓ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １０２，３７５６－３７５９．
２）Ｃａｌｄｗｅｌｌ，Ｃ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔＨｙｐｏｘｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ：１９５０）１６７，６１４０－６１４９．
３）Ｋｕｍａｒ，Ｂ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ－Ｒｅｓｉｄｅｎｔ Ｍｅｍｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ａｒｅ Ｄｅｆｉｎｅｄ ｂｙ Ｃｏｒｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｉｎ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ ａｎｄ Ｍｕｃｏｓａｌ Ｓｉｔｅｓ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２０，２９２１－２９３４．
４）Ｍａｃｋａｙ，Ｌ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ ＣＤ１０３（＋）ＣＤ８＋ｔｉｓｓｕｅ－ｒｅｓｉｄｅｎｔ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｓｋｉｎ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４，１２９４－１３０１．
５）Ｈｏｍｂｒｉｎｋ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ｐｒｏｇｒａｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ，ｖｉｇｉｌａｎｃｅ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆＨｕｍａｎ ＣＤ８（＋）ｌｕｎｇ－ｒｅｓｉｄｅｎｔ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７，１４６７－１４７８．
６）Ｓｋｏｎ，Ｃ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓ１ｐｒ１ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｓｉｄｅｎｔ ｍｅｍｏｒｙ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４，１２８５－１２９３．
７）Ｍａｃｋａｙ，Ｌ．Ｋ．，ａｎｄ Ｋａｌｌｉｅｓ，Ａ．（２０１７）．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ－Ｒｅｓｉｄｅｎｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３８，９４－１０３．
８）Ｍａｃｋａｙ，Ｌ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ｔ－ｂｏｘ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ Ｃｏｍｂｉｎｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ＴＧＦ－ｂｅｔａ ａｎｄ ＩＬ－１５ ｔｏ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔｉｓｓｕｅ－Ｒｅｓｉｄｅｎｔ Ｍｅｍｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｆａｔｅ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４３，１１０１－１１１１．
９）Ｍａｃｋａｙ，Ｌ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ｈｏｂｉｔ ａｎｄ Ｂｌｉｍｐ１ ｉｎｓｔｒｕｃｔ ａ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｇｒａｍ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｓｉｄｅｎｃｙ ｉｎ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５２，４５９－４６３．
１０）Ｍａｍｉ０Ｃｈｏｕａｉｂ ａｎｄ Ｔａｒｔｏｕｒ．（２０１９）Ｅｄｉｔｏｒｉａｌ：Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓｉｄｅｎｔ Ｍｅｍｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ．Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １０，１－３．
１１）Ｍｉｌｎｅｒ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｒｕｎｘ３ ｐｒｏｇｒａｍｓＣＤ８（＋）Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｉｄｅｎｃｙ ｉｎ ｎｏｎ－ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ｔｕｍｏｕｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ ５５２，２５３－２５７．
【図1】
【図2A-2B】
【図2C-2E】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B-1】
【図5B-2】
【図5B-3】
【図5B-4】
【図5C】
【図5D-5E】
【図5F】
【図6A-1】
【図6A-2】
【図6B】
【図7A-7D】
【図8A-8E】
【図8F】
【図9A】
【図9B-1】
【図9B-2】
【図9B-3】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【配列表】