知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
7699130タンパク質のグリコシル化プロファイルを調節するための方法および組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-06-18
(45)【発行日】2025-06-26
(54)【発明の名称】タンパク質のグリコシル化プロファイルを調節するための方法および組成物
(51)【国際特許分類】
C12P 21/08 20060101AFI20250619BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20250619BHJP
C12N 1/00 20060101ALI20250619BHJP
C07K 16/00 20060101ALN20250619BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20250619BHJP
【ＦＩ】
C12P21/08
C12N5/10
C12N1/00 G
C07K16/00
C07K19/00
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2022537340
(86)(22)【出願日】2020-12-16
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-22
(86)【国際出願番号】 EP2020086410
(87)【国際公開番号】W WO2021122738
(87)【国際公開日】2021-06-24
【審査請求日】2023-12-15
(31)【優先権主張番号】19218172.5
(32)【優先日】2019-12-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】591032596
【氏名又は名称】メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ－６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ
(74)【代理人】
【識別番号】110003971
【氏名又は名称】弁理士法人葛和国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ツィマー，アリネ
(72)【発明者】
【氏名】エーレット，ヤニケ
(72)【発明者】
【氏名】ツィマーマン，マルティナ
【審査官】松井 一泰
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１１－５１９５６７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５２２０２３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１５－５３５４２３（ＪＰ，Ａ）
【文献】Martina Zimmermann et al.，Impact of Acetylated and Non-Acetylated Fucose Analogues on IgG Glycosylation，Antibodies，2019年01月10日，Vol. 8、No. 9，doi:10.3390/antib8010009
【文献】John G. Allen et al.，Facile modulation of antibody fucosylation with small molecule fucostatin inhibitors and co-crystal structure with GDP-mannose 4,6-dehydratase，ACS Chemical Biology，2016年，Vol. 11、Issue 10
【文献】Janike Ehret et al.，Impact of cell culture media additives on IgG glycosylation produced in Chinese hamster ovary cells，Biotechnology and Bioengineering，2019年01月，Vol. 116，816-830
【文献】Osamu Tsuruta et al.，Synthesis of GDP-5-thiosugars and Their Use as Glycosyl Donor Substrates for Glycosyltransferases，The Journal of Organic Chemistry，2003年，Vol. 68、Issue 16
【文献】湯浅 英哉，硫黄原子を環内に含む糖アナログのグリコシダーゼ阻害剤としての可能性，有機合成化学協会誌，2002年，60巻、8号，774-782
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｐ １／００－ ４１／００
Ｃ０７Ｋ １／００－ １９／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
低減したフコシル化を有する抗体または抗体以外のＦｃ含有タンパク質を作製する方法であって、５－チオ－Ｌ－フコースおよび／または部分的または完全にアセチル化された５－チオ－Ｌ－フコース、非、部分的または完全にアセチル化された形態の２－Ｆ－５－チオ－Ｌ－フコース、５－アルキニル－５－チオ－Ｌ－フコース、６，６，６－トリフルオロ－５－チオ－Ｌ－フコースおよび５－チオ－Ｌ－フコースホスホナートから選択される５－チオ－Ｌ－フコース誘導体を含む培養培地中で宿主細胞を培養することを含み、ここで宿主細胞は糖鎖の還元末端のＮ－アセチルグルコサミンを通してＦｃドメインに結合した少なくとも１のＮ－グリコシド結合型糖鎖を有するＦｃドメインを有する抗体または抗体以外のＦｃ含有タンパク質を発現する、および細胞から抗体または抗体以外のＦｃ含有タンパク質を単離すること、ここで抗体または抗体以外のＦｃ含有タンパク質は、５－チオ－Ｌ－フコースおよび／またはその誘導体が不在である以外は同じ培養条件下で培養された同じ宿主細胞からの抗体または抗体以外のＦｃ含有タンパク質と比較して、糖鎖で低減したフコシル化を有する、前記方法。
【請求項2】
培養培地が、５－チオ－Ｌ－フコースおよび／または部分的または完全にアセチル化された５－チオ－Ｌ－フコースを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
宿主細胞が、流加細胞培養または灌流細胞培養において培養されることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
宿主細胞が、－バイオリアクター内に宿主細胞および水性の細胞培養培地を充填すること
－バイオリアクター中の細胞をインキュベートすること
－バイオリアクター中の細胞のインキュベーションの全時間にわたって絶えず、または該インキュベーション時間内の１回または数回、バイオリアクターに細胞培養培地を添加すること、ここで（whereby）細胞培養培地が、５－チオ－Ｌ－フコースおよび／または部分的または完全にアセチル化された５－チオ－Ｌ－フコース、非、部分的または完全にアセチル化された形態の２－Ｆ－５－チオ－Ｌ－フコース、５－アルキニル－５－チオ－Ｌ－フコース、６，６，６－トリフルオロ－５－チオ－Ｌ－フコースおよび５－チオ－Ｌ－フコースホスホナートから選択される５－チオ－Ｌ－フコース誘導体を含む、
によって培養されることを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
添加される培地が、ｐＨ８．５未満のｐＨを有し、および１０ｎＭと１００ｍｍｏｌ／ｌとの間の濃度で５－チオ－Ｌ－フコースおよび／またはその誘導体を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
チオフコシル化された抗体または抗体以外のＦｃ含有タンパク質を作製するための方法であって、５－チオ－Ｌ－フコースおよび／または部分的または完全にアセチル化された５－チオ－Ｌ－フコース、非、部分的または完全にアセチル化された形態の２－Ｆ－５－チオ－Ｌ－フコース、５－アルキニル－５－チオ－Ｌ－フコース、６，６，６－トリフルオロ－５－チオ－Ｌ－フコースおよび５－チオ－Ｌ－フコースホスホナートから選択される５－チオ－Ｌ－フコース誘導体を含む培養培地中で宿主細胞を培養すること、ここで宿主細胞は、糖鎖の還元末端のＮ－アセチルグルコサミンを通してＦｃドメインに結合した少なくとも１のＮ－グリコシド結合型糖鎖を有するＦｃドメインを有する抗体または抗体以外のＦｃ含有タンパク質を発現する、および細胞からの抗体または抗体以外のＦｃ含有タンパク質を単離すること、を含む前記方法。
【請求項8】
５－チオ－Ｌ－フコースおよび／または部分的または完全にアセチル化された５－チオ－Ｌ－フコース、非、部分的または完全にアセチル化された形態の２－Ｆ－５－チオ－Ｌ－フコース、５－アルキニル－５－チオ－Ｌ－フコース、６，６，６－トリフルオロ－５－チオ－Ｌ－フコースおよび５－チオ－Ｌ－フコースホスホナートから選択される５－チオ－Ｌ－フコース誘導体を含む、乾燥粉末細胞培養培地。
【請求項9】
細胞培養培地が、流加培地であることを特徴とする、請求項８に記載の細胞培養培地。
【請求項10】
細胞培養培地が、溶解して液体培地を提供するときに、液体培地中の５－チオ－Ｌ－フコースの濃度が、１０ｎＭと１００ｍｍｏｌ／ｌの間である量で５－チオ－Ｌ－フコースおよび／またはその誘導体を含む、請求項８または９に記載の細胞培養培地。
【請求項11】
細胞培養培地が、少なくとも１以上の糖類構成要素、１以上のアミノ酸、１以上のビタミンまたはビタミン前駆体、１以上の塩、１以上の緩衝剤構成要素、１以上の補因子および１以上の核酸構成要素を含むことを特徴とする、請求項８～１０のいずれか一項に記載の細胞培養培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、５－チオ－Ｌ－フコースを含む細胞培養培地および抗体または他のＦｃ含有タンパク質のグリコシル化プロファイルを調節し、およびそれによって該タンパク質の結合親和性を調節するための５－チオ－Ｌ－フコースの使用に関する。
【0002】
治療的用抗体およびＦｃ－融合タンパク質のような組み換えタンパク質は、一般的に哺乳動物の細胞株において産生される。
哺乳動物の宿主細胞において産生されるモノクローナル抗体およびＦｃ－融合タンパク質は、グリコシル化を包含する、様々な翻訳語修飾を有し得る。ＩｇＧなどのモノクローナル抗体は、典型的には、各重鎖のアスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７）でＮ結合型グリコシル化部位を有する（無傷の抗体ごとに２つ）。抗体上のＡｓｎ２９７に取り付けられたグリカンは、典型的には、低量の末端のシアル酸および可変量のガラクトースと共に極めて低いか全くないバイセクティングＮ－アセチルグルコサミン（バイセクティングＧＩｃＮＡｃ）を有する複雑な二分岐構造体である。グリカンはまた、大抵は、高いレベルのコアフコシル化を有する。抗体におけるコアフコシル化の低減は、Ｆｃのエフェクター機能、とりわけＦｃガンマ受容体結合およびＡＤＣＣ活性を変更することが示されている。この所見は、低減したコアフコシル化を有する抗体を産生する細胞株の改変における興味へと導いた。
哺乳動物の宿主細胞において産生されるモノクローナル抗体およびＦｃ－融合タンパク質は、グリコシル化を包含する、様々な翻訳語修飾を有し得る。ＩｇＧなどのモノクローナル抗体は、典型的には、各重鎖のアスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７）でＮ結合型グリコシル化部位を有する（無傷の抗体ごとに２つ）。抗体上のＡｓｎ２９７に取り付けられたグリカンは、典型的には、低量の末端のシアル酸および可変量のガラクトースと共に極めて低いか全くないバイセクティングＮ－アセチルグルコサミン（バイセクティングＧＩｃＮＡｃ）を有する複雑な二分岐構造体である。グリカンはまた、大抵は、高いレベルのコアフコシル化を有する。抗体におけるコアフコシル化の低減は、Ｆｃのエフェクター機能、とりわけＦｃガンマ受容体結合およびＡＤＣＣ活性を変更することが示されている。この所見は、低減したコアフコシル化を有する抗体を産生する細胞株の改変における興味へと導いた。
【0003】
いくつかの抗体ベースの免疫療法についての秘訣は、抗体Ｆｃ部分のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）と呼ばれる細胞表面受容体への結合である。細胞質内ドメインに応じて、ＦｃγＲは、種々の免疫応答をトリガーする。共通するものは、活性化受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂ）についての免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）およびＦｃγＲＩＩｂのような抑制性受容体についての免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭｓ）である［Lu J and Sun PD, Structural mechanism of high affinity FcgammaRI recognition of immunoglobulin G. Immunol Rev 2015, 268, 192-200］。さらにまた、受容体は、高親和性ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）ならびに低親和性ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に分類され得る。Bruhns et al.は、種々の受容体クラスのすべての既知の抗体サブクラスへの結合を記載した。ＩｇＧ１は、すべてのクラスの受容体に異なる親和性で結合することが報告されている。ＩｇＧ１の増大する親和性は、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、ＦｃｙＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩａについて観察され、ＦｃγＲＩについて最も高い親和性であった［Bruhns P, Iannascoli B, England P, Mancardi DA, Fernandez N, Jorieux S, and Daeron M, Specificity and affinity of human Fcgamma receptors and their polymorphic variants for human IgG subclasses. Blood 2009, 113, 3716-25］。
【0004】
２つの主要なＦｃエフェクター機能は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）である。ＦｃγＲＩＩＩａを発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、ＡＤＣＣ活性を担当する。一般に、受容体親和性およびそれによる抗体の生物活性は、抗体のグリコシル化のような翻訳後修飾に依存する［Harris RJ, Chin ET, Macchi F, Keck RG, Shyong B-J, Ling VT, Cordoba AJ, Marian M, Sinclair D, Battersby JE, and Jones AJS, Analytical Characterization of Monoclonal Antibodies: Linking Structure to Function. In Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing, ed.; Shire SJ, et al.; Springer New York: New York, NY, 2010, 193-205］。
【0005】
抗体は、Ｆｃ部分における各重鎖上の位置２９７（Ａｓｎ２９７）にて明確なＮ連結型グリコシル化を提示する。組換えタンパク質のＦｃ部分上のコアフコシル化の存在は、フコースの立体障害に起因してＡＤＣＣ応答を低減することが知られている［Mizushima T, Yagi H, Takemoto E, Shibata-Koyama M, Isoda Y, Iida S, Masuda K, Satoh M, and Kato K, Structural basis for improved efficacy of therapeutic antibodies on defucosylation of their Fc glycans. Genes to cells 2011, 16, 1071-1080］。したがって、コアフコシル化の低減は、増強されたＡＤＣＣを導く。このことは、それらのフコシル化同等物と比較して増強されたＡＤＣＣおよび抗腫瘍活性を示す、アフコシル化された（afucosylated）抗ＥＧＦＲおよび抗ＣＳ１抗体のｉｎ ｖｉｖｏ研究によって検証された［Gomathinayagam S, Laface D, Houston-Cummings NR, Mangadu R, Moore R, Shandil I, Sharkey N, Li H, Stadheim TA, and Zha D, In vivo anti-tumor efficacy of afucosylated anti-CS1 monoclonal antibody produced in glycoengineered Pichia pastoris. Journal of Biotechnology 2015, 208, 13-21］。結論として、Ｆｃグリコシル化のモジュレーションは、治療用抗体の生物活性を増強するためのストラテジーである。
【0006】
フコシル化を低減するための方法は、細胞株を改変するための方法を包含する。
細胞株を改変することの代替手段は、グリコシル化経路における酵素に対する小分子インヒビターの使用を包含する。別の選択肢は、複雑なＮ連結型グリカンを有するが、フコシル化が低減している組換え抗体を産生するのに使用する小分子フコース類似体の提供である。このことは、例えば、ＷＯ０９１３５１８１に示唆されている。
しかしいまだ、グリコシル化パターンのモジュレーション、およびよって治療用タンパク質の生物活性のモジュレーションは、改善のための余地がある。
細胞株を改変することの代替手段は、グリコシル化経路における酵素に対する小分子インヒビターの使用を包含する。別の選択肢は、複雑なＮ連結型グリカンを有するが、フコシル化が低減している組換え抗体を産生するのに使用する小分子フコース類似体の提供である。このことは、例えば、ＷＯ０９１３５１８１に示唆されている。
しかしいまだ、グリコシル化パターンのモジュレーション、およびよって治療用タンパク質の生物活性のモジュレーションは、改善のための余地がある。
【0007】
５－チオ－Ｌ－フコースおよび／またはそれのある誘導体の細胞培養培地およびフィードへの添加が、抗体／Ｆｃ含有タンパク質の低減したフコシル化をもたらすことが発見された。生成されたタンパク質は、増強されたＦｃγＲＩＩＩａ結合を呈しており、このことは増大したＡＤＣＣと相関している。驚くべきことに、５－チオ－Ｌ－フコースおよび／またはそれのある誘導体の使用は、フコース類似体の高い組み込みを導いた。
【0008】
本発明は、したがって、低減したフコシル化を有する抗体または他のＦｃ含有タンパク質を作製する方法であって、以下：
５－チオ－Ｌ－フコースおよび／または部分的または完全にアセチル化された５－チオ－Ｌ－フコース、非、部分的または完全にアセチル化された形態の２－Ｆ－５－チオ－Ｌ－フコース、５－アルキニル－５－チオ－Ｌ－フコース、６，６，６－トリフルオロ－５－チオ－Ｌ－フコースおよび５－チオ－Ｌ－フコースホスホナートから選択される５－チオ－Ｌ－フコース誘導体を含む培養培地中で宿主細胞を培養することを含み、ここで宿主細胞は、糖鎖の還元末端のＮ－アセチルグルコサミンを通してＦｃドメインに結合した少なくとも１のＮ－グリコシド結合型糖鎖を有するＦｃドメインを有する抗体または他のＦｃ含有タンパク質を発現する、および細胞から抗体または他のＦｃ含有タンパク質を単離すること、ここで抗体または他のＦｃ含有タンパク質は、５－チオ－Ｌ－フコースおよび／またはその誘導体の不在である以外は同じ培養条件下で培養された同じ宿主細胞からの抗体または他のＦｃ含有タンパク質と比較して、糖鎖で低減したフコシル化を有し、誘導体は、部分的または完全にアセチル化された５－チオ－Ｌ－フコース、非、部分的または完全にアセチル化された形態の２－Ｆ－５－チオ－Ｌ－フコース、５－アルキニル－５－チオ－Ｌ－フコース、６，６，６－トリフルオロ－５－チオ－Ｌ－フコースおよび５－チオ－Ｌ－フコースホスホナートから選択される、
を含む、方法に指向される。
５－チオ－Ｌ－フコースおよび／または部分的または完全にアセチル化された５－チオ－Ｌ－フコース、非、部分的または完全にアセチル化された形態の２－Ｆ－５－チオ－Ｌ－フコース、５－アルキニル－５－チオ－Ｌ－フコース、６，６，６－トリフルオロ－５－チオ－Ｌ－フコースおよび５－チオ－Ｌ－フコースホスホナートから選択される５－チオ－Ｌ－フコース誘導体を含む培養培地中で宿主細胞を培養することを含み、ここで宿主細胞は、糖鎖の還元末端のＮ－アセチルグルコサミンを通してＦｃドメインに結合した少なくとも１のＮ－グリコシド結合型糖鎖を有するＦｃドメインを有する抗体または他のＦｃ含有タンパク質を発現する、および細胞から抗体または他のＦｃ含有タンパク質を単離すること、ここで抗体または他のＦｃ含有タンパク質は、５－チオ－Ｌ－フコースおよび／またはその誘導体の不在である以外は同じ培養条件下で培養された同じ宿主細胞からの抗体または他のＦｃ含有タンパク質と比較して、糖鎖で低減したフコシル化を有し、誘導体は、部分的または完全にアセチル化された５－チオ－Ｌ－フコース、非、部分的または完全にアセチル化された形態の２－Ｆ－５－チオ－Ｌ－フコース、５－アルキニル－５－チオ－Ｌ－フコース、６，６，６－トリフルオロ－５－チオ－Ｌ－フコースおよび５－チオ－Ｌ－フコースホスホナートから選択される、
を含む、方法に指向される。
【0009】
好ましい態様において、宿主細胞は、５－チオ－Ｌ－フコースおよび／または部分的または完全にアセチル化された５－チオ－Ｌ－フコースを含む細胞培養培地中で培養される。
好ましい態様において、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞である。
別の好ましい態様において、宿主細胞は、流加細胞培養または灌流細胞培養において培養される。
好ましい態様において、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞である。
別の好ましい態様において、宿主細胞は、流加細胞培養または灌流細胞培養において培養される。
【0010】
好ましい態様において、宿主細胞は、
－バイオリアクター内に宿主細胞および水性の細胞培養培地を充填すること
－バイオリアクター中の細胞をインキュベートすること
－バイオリアクター中の細胞のインキュベーションの全時間にわたって絶えず、または該インキュベーション時間内の１回または数回、バイオリアクターに細胞培養培地を添加すること、ここで（whereby）細胞培養培地は、５－チオ－Ｌ－フコースを含む、
によって培養される。
好ましくは、添加される培地は、ｐＨ８．５未満のｐＨを有し、および１０ｎｍｏｌ／ｌと１００ｍｍｏｌ／ｌとの間の、好ましくは０．１μｍｏｌ／ｌと１０ｍｍｏｌ／ｌとの間の濃度で、５－チオ－Ｌ－フコースを含む。
－バイオリアクター内に宿主細胞および水性の細胞培養培地を充填すること
－バイオリアクター中の細胞をインキュベートすること
－バイオリアクター中の細胞のインキュベーションの全時間にわたって絶えず、または該インキュベーション時間内の１回または数回、バイオリアクターに細胞培養培地を添加すること、ここで（whereby）細胞培養培地は、５－チオ－Ｌ－フコースを含む、
によって培養される。
好ましくは、添加される培地は、ｐＨ８．５未満のｐＨを有し、および１０ｎｍｏｌ／ｌと１００ｍｍｏｌ／ｌとの間の、好ましくは０．１μｍｏｌ／ｌと１０ｍｍｏｌ／ｌとの間の濃度で、５－チオ－Ｌ－フコースを含む。
【0011】
本発明はさらに、チオフコシル化された抗体または他のＦｃ含有タンパク質を作製するための方法であって、以下：
５－チオ－Ｌ－フコースおよび／または部分的または完全にアセチル化された５－チオ－Ｌ－フコース、非、部分的または完全にアセチル化された形態の２－Ｆ－５－チオ－Ｌ－フコース、５－アルキニル－５－チオ－Ｌ－フコース、６，６，６－トリフルオロ－５－チオ－Ｌ－フコースおよび５－チオ－Ｌ－フコースホスホナートから選択される５－チオ－Ｌ－フコース誘導体を含む培養培地中で宿主細胞を培養すること、ここで宿主細胞は、糖鎖の還元末端のＮ－アセチルグルコサミンを通してＦｃドメインに結合した少なくとも１のＮ－グリコシド結合型糖鎖を有するＦｃドメインを有する抗体または他のＦｃ含有タンパク質を発現する、および細胞から抗体または他のＦｃ含有タンパク質を単離すること、
を含む方法に指向される。
５－チオ－Ｌ－フコースおよび／または部分的または完全にアセチル化された５－チオ－Ｌ－フコース、非、部分的または完全にアセチル化された形態の２－Ｆ－５－チオ－Ｌ－フコース、５－アルキニル－５－チオ－Ｌ－フコース、６，６，６－トリフルオロ－５－チオ－Ｌ－フコースおよび５－チオ－Ｌ－フコースホスホナートから選択される５－チオ－Ｌ－フコース誘導体を含む培養培地中で宿主細胞を培養すること、ここで宿主細胞は、糖鎖の還元末端のＮ－アセチルグルコサミンを通してＦｃドメインに結合した少なくとも１のＮ－グリコシド結合型糖鎖を有するＦｃドメインを有する抗体または他のＦｃ含有タンパク質を発現する、および細胞から抗体または他のＦｃ含有タンパク質を単離すること、
を含む方法に指向される。
【0012】
本発明はさらに、５－チオ－Ｌ－フコースおよび／または部分的または完全にアセチル化された５－チオ－Ｌ－フコース、非、部分的または完全にアセチル化された形態の２－Ｆ－５－チオ－Ｌ－フコース、５－アルキニル－５－チオ－Ｌ－フコース、６，６，６－トリフルオロ－５－チオ－Ｌ－フコースおよび５－チオ－Ｌ－フコースホスホナートから選択される５－チオ－Ｌ－フコース誘導体を含む乾燥粉末細胞培養培地に指向される。
一態様において、細胞培養培地は、流加培地である。
一態様において、細胞培養培地は、流加培地である。
【0013】
別の態様において、細胞培養培地は、溶解して液体培地を提供するときに、液体培地中の５－チオ－Ｌ－フコースおよび／またはその誘導体の濃度が、１０ｎｍｏｌ／ｌと１００ｍｍｏｌ／ｌとの間、好ましくは０．１μｍｏｌ／ｌと１０ｍｍｏｌ／ｌとの間である量で５－チオ－Ｌ－フコースおよび／またはその誘導体を含む。
液体培地、例として、流加培地または灌流培地は、典型的には、細胞培養における５－チオ－Ｌ－フコースおよび／またはその誘導体の最終濃度が、０．１と１ｍｍｏｌ／ｌとの間であるように設計される。
一態様において、細胞培養培地は、少なくとも１以上の糖類構成要素、１以上のアミノ酸、１以上のビタミンまたはビタミン前駆体、１以上の塩、１以上の緩衝剤構成要素、１以上の補因子および１以上の核酸構成要素を含む。
液体培地、例として、流加培地または灌流培地は、典型的には、細胞培養における５－チオ－Ｌ－フコースおよび／またはその誘導体の最終濃度が、０．１と１ｍｍｏｌ／ｌとの間であるように設計される。
一態様において、細胞培養培地は、少なくとも１以上の糖類構成要素、１以上のアミノ酸、１以上のビタミンまたはビタミン前駆体、１以上の塩、１以上の緩衝剤構成要素、１以上の補因子および１以上の核酸構成要素を含む。
【0014】
本発明はさらに、本発明に記載の細胞培養培地を産生するための方法であって、
ａ）５－チオ－Ｌ－フコースおよび／または部分的または完全にアセチル化された５－チオ－Ｌ－フコース、非、部分的または完全にアセチル化された形態の２－Ｆ－５－チオ－Ｌ－フコース、５－アルキニル－５－チオ－Ｌ－フコース、６，６，６－トリフルオロ－５－チオ－Ｌ－フコースおよび５－チオ－Ｌ－フコースホスホナートから選択される５－チオ－Ｌ－フコース誘導体を細胞培養培地の他の構成要素を混合すること、
ｂ）ステップａ）の混合物を製粉に供すること、
による方法に指向される。
好ましい態様において、ステップｂ）は、ピンミル、フィッツミルまたはジェットミルで実施される。
別の好ましい態様において、ステップａ）からの混合物は、製粉の前に０℃未満の温度にまで冷却される。
ａ）５－チオ－Ｌ－フコースおよび／または部分的または完全にアセチル化された５－チオ－Ｌ－フコース、非、部分的または完全にアセチル化された形態の２－Ｆ－５－チオ－Ｌ－フコース、５－アルキニル－５－チオ－Ｌ－フコース、６，６，６－トリフルオロ－５－チオ－Ｌ－フコースおよび５－チオ－Ｌ－フコースホスホナートから選択される５－チオ－Ｌ－フコース誘導体を細胞培養培地の他の構成要素を混合すること、
ｂ）ステップａ）の混合物を製粉に供すること、
による方法に指向される。
好ましい態様において、ステップｂ）は、ピンミル、フィッツミルまたはジェットミルで実施される。
別の好ましい態様において、ステップａ）からの混合物は、製粉の前に０℃未満の温度にまで冷却される。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【0016】
【0017】
【0018】
【0019】
細胞培養培地は、人工的な環境において細胞の成長を支持および維持する。その成長が支持されるだろう生物のタイプに応じて、細胞培養培地は、複雑な混合物の構成要素、ときには１００より多くの種々の構成要素を含む。哺乳動物、昆虫または植物の細胞の増殖に必要とされる細胞培養培地は、典型的には、細菌および酵母の成長を支持する培地よりもはるかに複雑である。化学的に定義された培地は、しばしば、アミノ酸、ビタミン、金属塩、抗酸化剤、キレーター、成長因子、緩衝剤、ホルモン、および当業者に既知であるさらに多くの物質を含むが、まったくこれらのみに限定されるものではない。
【0020】
本発明に従った細胞培養培地は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞の成長を維持および／または支持する構成要素のいずれかの混合物である。それは、複雑な培地であっても、または化学的に定義された培地であってもよい。細胞培養培地は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞の成長を維持および／または支持するのに必要なすべての構成要素を、またはさらなる構成要素が、個別に添加されるようにいくつかの構成要素のみを含み得る。本発明に従った細胞培養培地の例は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞の成長を維持および／または支持するのに必要なすべての構成要素、ならびに培地添加物またはフィードを含む、完全培地である。好ましい態様において、細胞培養培地は、完全培地、灌流培地または流加培地である。基本培地とも呼ばれる完全培地は、典型的には、６．８と７．８との間のｐＨを有する。流加培地は、好ましくは、８．５未満の、好ましくは、６．５と８．５との間のｐＨを有する。
細胞培養培地は、液体培地であってもよく、または乾燥粉末培地であってもよい。
細胞培養培地は、液体培地であってもよく、または乾燥粉末培地であってもよい。
【0021】
典型的には、本発明に従う細胞培養培地は、バイオリアクター中の細胞の成長を維持および／または支持するために使用される。
フィードまたは流加培地は、細胞培養における最初の成長および産生を支持する基本培地ではなく、後のステージで培地に添加されて、栄養素の欠乏を防ぎ、および産生フェーズを持続させる、細胞培養培地である。流加培地は、基本培養培地と比較して、より高い濃度のいくつかの構成要素を有し得る。例えば、アミノ酸または炭水化物を包含する栄養素などの、いくつかの構成要素は、基本培地中の濃度の約５Ｘ、６Ｘ、７Ｘ、８Ｘ、９Ｘ、１０Ｘ、１２Ｘ、１４Ｘ、１６Ｘ、２０Ｘ、３０Ｘ、５０Ｘ、１００Ｘ、２００Ｘ、４００Ｘ、６００Ｘ、８００Ｘ、または約１０００Ｘでさえも流加培地中に存在していてもよい。
フィードまたは流加培地は、細胞培養における最初の成長および産生を支持する基本培地ではなく、後のステージで培地に添加されて、栄養素の欠乏を防ぎ、および産生フェーズを持続させる、細胞培養培地である。流加培地は、基本培養培地と比較して、より高い濃度のいくつかの構成要素を有し得る。例えば、アミノ酸または炭水化物を包含する栄養素などの、いくつかの構成要素は、基本培地中の濃度の約５Ｘ、６Ｘ、７Ｘ、８Ｘ、９Ｘ、１０Ｘ、１２Ｘ、１４Ｘ、１６Ｘ、２０Ｘ、３０Ｘ、５０Ｘ、１００Ｘ、２００Ｘ、４００Ｘ、６００Ｘ、８００Ｘ、または約１０００Ｘでさえも流加培地中に存在していてもよい。
【0022】
哺乳動物の細胞培養培地は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの哺乳動物の細胞の成長を維持および／または支持する構成要素の混合物である。哺乳動物の細胞の例は、ヒトまたは動物細胞、好ましくは、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｉ ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＡＫ－１細胞、ＳＰ２／０細胞、Ｌ５．１細胞、ハイブリドーマ細胞またはヒト細胞である。
【0023】
化学的に定義された細胞培養培地は、いずれの化学的に定義されていない物質をも含まない細胞培養培地である。このことは、培地に使用されるすべての化学物質の化学組成が既知であることを意味する。化学的に定義された培地は、いずれの酵母、動物または植物組織をも含まない；それらは、フィーダー細胞、血清、抽出物または消化物または化学的に定義が乏しいタンパク質を培地に与えるであろう他の構成要素を含まない。化学的に定義されていないかまたは化学的に定義が乏しい構成要素は、それらの化学組成および構造が既知でないもの、様々な組成で存在するもの、または膨大な実験努力でのみ定義され得る－アルブミンまたはカゼインのようなタンパク質の化学組成および構造の評価に匹敵するものである。
【0024】
粉末状の細胞培養培地または乾燥粉末培地は、典型的には、製粉プロセス、凍結乾燥プロセスまたは乾式もしくは湿式造粒プロセスから生じる細胞培養培地である。それは、粉末状の細胞培養培地は、粒状、微粒子状の培地を意味し、液体培地を意味しない。用語「乾燥粉末」は、用語「粉末」と交換可能に使用されてもよい、しかしながら、本明細書に使用されるとき「乾燥粉末」は、単に、粒状の材料の肉眼的形態を指し、および他に指し示されない限り、材料が、複合されたまたは凝集した溶媒を完全に含まないことを意味するとは意図しない。乾燥粉末培地は、製粉または凍結乾燥プロセスから生じ、典型的には、０．５ｍｍ未満、例として、０．０５と０．５ｍｍとの間の粒子サイズを有する。
【0025】
乾式または湿式造粒プロセス、例として、噴霧乾燥、湿式造粒または乾式圧密によるものから生じる乾燥粉末培地は、典型的には、０．５ｍｍ超、例として、０．５と５ｍｍとの間の粒子サイズを有する。乾式圧密は、典型的には、ロールプレスにおいてなされる。ＵＳ６，３８３，８１０Ｂ２は、凝集した真核細胞培養培地粉末を産生する方法を開示する。方法は、乾燥粉末細胞培養培地を溶媒で湿潤させて、次いで湿らせた培地を再び乾燥させて、凝集した乾燥細胞培養培地を得ることを含む。
一態様において、本発明に従った乾燥粉末培地は、乾式圧密によって産生される。
一態様において、本発明に従った乾燥粉末培地は、乾式圧密によって産生される。
【0026】
本発明に従った培地で培養される細胞は、細菌性細胞のような原核細胞であってもよく、または植物もしくは動物細胞のような真核細胞であってもよい。好ましくは、細胞は、哺乳動物の細胞である。細胞は、正常な細胞、不死化細胞、疾患細胞、形質転換された細胞、突然変異細胞、体細胞、生殖細胞、幹細胞、前駆体細胞または胚細胞、確立したかまたは形質転換された細胞株または天然の供給源から得られたもののうちのいずれかであり得る。宿主細胞は、細胞は、Ｆｃドメインを有する抗体または別のＦｃ含有タンパク質を発現するための遺伝子を組み込んだ細胞である。
【0027】
粒子のサイズは、粒子の平均直径を意味する。粒子のサイズが、与えられる場合、粒子の、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％が、与えられた粒子サイズを有すること、または与えられた粒子サイズの範囲内にあることを意味する。粒子直径は、レーザー光散乱によって決定される。
【0028】
不活性雰囲気は、夫々の容器または装置を不活性ガスで充填することによって生成される。好適な不活性ガスは、アルゴンまたは、好ましくは、窒素のような希ガスである。これらの不活性ガスは、非反応性であり、および望ましくない化学反応が起こることを防ぐ。本発明に従ったプロセスにおいて、不活性雰囲気を生成することは、酸素の濃度が、例として、液体窒素または窒素ガスを導入することによって、絶対値で１０％（ｖ／ｖ）未満に低減することを意味する。
【0029】
種々のタイプのミルは、当業者に既知である。
遠心式衝撃式製粉機とも呼ばれる、ピンミルは、破壊エネルギーを提供する高速回転するディスク上の突き出たピンによって、固体を粉状にする。ピンミルは、例えば、Munson Machinery（USA）、Premium Pulman（India）またはSturtevant（USA）により販売される。
遠心式衝撃式製粉機とも呼ばれる、ピンミルは、破壊エネルギーを提供する高速回転するディスク上の突き出たピンによって、固体を粉状にする。ピンミルは、例えば、Munson Machinery（USA）、Premium Pulman（India）またはSturtevant（USA）により販売される。
【0030】
ジェットミルは、圧縮ガスを使用して、粒子を加速させて、プロセスチャンバー内でそれらを互いに激突させる。ジェットミルは、例として、Sturtevant(USA）またはPMT（Austria）によって販売されている。
Fitzpatrick（USA）によって商品化されたフィッツミルは、製粉のためにブレードを有するローターを使用する。
Fitzpatrick（USA）によって商品化されたフィッツミルは、製粉のためにブレードを有するローターを使用する。
【0031】
絶えず実行されるプロセスは、バッチ式で実行されないプロセスである。製粉プロセスが、絶えず実行される場合、培地成分は、ある時間にわたってミル内に永続的に、および着実に供給されることを意味する。
【0032】
細胞培養培地、とくに本発明に従った完全培地は、典型的には、少なくとも１以上の糖類構成要素、１以上のアミノ酸、１以上のビタミンまたはビタミン前駆体、１以上の塩、１以上の緩衝剤構成要素、１以上の補因子および１以上の核酸構成要素を含む。
【0033】
培地は、ピルビン酸ナトリウム、インスリン、植物性タンパク質、脂肪酸および／または脂肪酸誘導体および／またはプルロニック酸（pluronic acid）および／または化学的に調製される非イオン性界面活性剤のような表面活性構成要素もまた含んでもよい。好適な非イオン性界面活性剤の一例は、例として、BASF、Germanyから商品名pluronic（登録商標）のもと入手可能である、ポロキサマーとも呼ばれる、一級ヒドロキシル基で終結する二官能性のブロックコポリマーの界面活性剤である。
【0034】
糖類構成要素は、グルコース、ガラクトース、リボースまたはフルクトース（単糖類の例）またはスクロース、ラクトースまたはマルトース（二糖類の例）のようなすべての単糖類または二糖類である。
【0035】
本発明に従うアミノ酸の例は、チロシン、タンパク質を構成するアミノ酸、とくに必須アミノ酸である、ロイシン、イソロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファンおよびバリン、ならびにＤ－アミノ酸、好ましくはＬ－アミノ酸のようなタンパク質を構成しないアミノ酸である。
チロシンは、Ｌ－またはＤ－チロシンを意味し、好ましくは、Ｌ－チロシンを意味する。
システインは、Ｌ－またはＤ－システインを意味し、好ましくはＬ－システインを意味する。
チロシンは、Ｌ－またはＤ－チロシンを意味し、好ましくは、Ｌ－チロシンを意味する。
システインは、Ｌ－またはＤ－システインを意味し、好ましくはＬ－システインを意味する。
【0036】
ビタミンの例は、ビタミンＡ（レチノール、レチナール、様々なレチノイド、および４つのカロテノイド）、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン、ナイアシンアミド）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサール）、ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ９（葉酸、フォリン酸）、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン、ヒドロキシコバラミン、メチルコバラミン）、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＤ（エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロール）、ビタミンＥ（トコフェロール、トコトリエノール）およびビタミンＫ（フィロキノン、メナキノン）である。ビタミン前駆体もまた包含される。
【0037】
塩の例は、重炭酸塩、カルシウム、塩化物、マグネシウム、ホスファート、カリウムおよびナトリウムなどの無機イオンまたはＣｏ、Ｃｕ、Ｆ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｍｏ、Ｎｉ、Ｓｅ、Ｓｉ、Ｎｉ、Ｂｉ、ＶおよびＺｎなどの微量元素を含む構成要素である。例は、硫酸銅（ＩＩ）五水和物（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、硫酸鉄（ＩＩ）、無水一塩基性リン酸ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）、無水硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、無水二塩基性リン酸ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、塩化マグネシウム六水和物（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）、硫酸亜鉛七水和物である。
【0038】
緩衝剤の例は、ＣＯ２／ＨＣＯ３（カーボネート）、ホスファート、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳおよびＴＲＩＳである。
補因子の例は、チアミン誘導体、ビオチン、ビタミンＣ、ＮＡＤ／ＮＡＤＰ、コバラミン、フラビンモノヌクレオチドおよび誘導体、グルタチオン、ヘムヌクレオチドホスファートおよび誘導体である。
補因子の例は、チアミン誘導体、ビオチン、ビタミンＣ、ＮＡＤ／ＮＡＤＰ、コバラミン、フラビンモノヌクレオチドおよび誘導体、グルタチオン、ヘムヌクレオチドホスファートおよび誘導体である。
【0039】
本発明に従った核酸構成要素は、シトシン、グアニン、アデニン、チミンまたはウラシルのような核酸塩基、シチジン、ウリジン、アデノシン、グアノシンおよびチミジンのようなヌクレオシド、およびアデノシン一リン酸またはアデノシン二リン酸またはアデノシン三リン酸のようなヌクレオチドである。
【0040】
流加培地は、完全培地と比較して異なる組成を有していてもよい。それらは、典型的には、アミノ酸、微量元素およびビタミンを含む。それらは、糖類構成要素もまた含んでもよいが、ときには産生の理由のために糖類構成要素は、別々のフィードにおいて添加されることもある。
【0041】
好適な流加培地は、以下の化合物の１以上を含んでもよい：
本発明に従って凍結することは、温度を０℃未満に冷却することを意味する。
【表1-1】
【表1-2】
本発明に従って凍結することは、温度を０℃未満に冷却することを意味する。
【0042】
用語「抗体」は、（ａ）免疫グロブリンポリペプチドおよび免疫グロブリンポリペプチドの免疫学的に活性な部分、すなわち、特定の抗原（例として、ＣＤ７０）へ免疫特異的に結合する抗原結合部位および複合型Ｎ－グリコシド結合型糖鎖（単数または複数）を含むＦｃドメインを含有する免疫グロブリンファミリーのポリペプチド、またはそのフラグメント、または（ｂ）抗原（例として、ＣＤ７０）へ免疫特異的に結合する、かかる免疫グロブリンポリペプチドまたはフラグメントの保存的に置換された誘導体、を指す。抗体は、例えば、Harlow and Lane、Antibodies: A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988）に一般に記載される。
Ｆｃ含有タンパク質は、Ｆｃドメインまたは複合型Ｎ－グリコシド結合型糖鎖を含む領域を含むいずれかのタンパク質である。
Ｆｃ含有タンパク質は、Ｆｃドメインまたは複合型Ｎ－グリコシド結合型糖鎖を含む領域を含むいずれかのタンパク質である。
【0043】
用語「モノクローナル抗体」は、いずれかの真核細胞または原核細胞クローン、またはファージクローンを包含する単細胞クローンに由来する抗体を指し、それが産生される方法を指すものではない。よって、用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術を通して産生された抗体に限定されない。
【0044】
用語「Ｆｃ領域」は、抗体の定常領域、例として、ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン、任意にＣＨ４ドメインを有する、またはそのようなＦｃ領域の保存的に置換された誘導体を指す。
用語「Ｆｃドメイン」は、抗体の定常領域ドメイン、例として、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ４ドメイン、またはそのようなＦｃドメインの保存的に置換された誘導体を指す。
用語「Ｆａｂ領域」は、抗原へ結合する抗体の可変領域を指す。
用語「Ｆｃドメイン」は、抗体の定常領域ドメイン、例として、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ４ドメイン、またはそのようなＦｃドメインの保存的に置換された誘導体を指す。
用語「Ｆａｂ領域」は、抗原へ結合する抗体の可変領域を指す。
【0045】
「抗原」は、抗体、典型的には、抗体Ｆａｂドメインが特異的に結合する分子である。
用語「特異的に結合」および「特異的に結合する」は、抗体または抗体誘導体が、高度に選択的な様式で対応する標的抗原と結合し、かつ他の抗原の大多数とは結合しないことを意味する。典型的には、抗体または他のＦｃ含有タンパク質は、少なくとも約１ｘ１０－７Ｍ、および好ましくは１０－８Ｍ～１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ、または１０－１２Ｍの親和性で結合し、および予め決められた抗原または近しい抗原以外の非特異的な抗原（例として、ＢＳＡ、カゼイン）への結合のためのその親和性よりも２倍よりも大きい親和性で予め決められた抗原へ結合する。
用語「阻害する」または「の阻害」は、測定可能な量低減すること、または全面的に防ぐこと、とくに反応を触媒する特定の酵素の活性を測定可能な量低減すること、または全面的に防ぐことを意味する。
用語「特異的に結合」および「特異的に結合する」は、抗体または抗体誘導体が、高度に選択的な様式で対応する標的抗原と結合し、かつ他の抗原の大多数とは結合しないことを意味する。典型的には、抗体または他のＦｃ含有タンパク質は、少なくとも約１ｘ１０－７Ｍ、および好ましくは１０－８Ｍ～１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ、または１０－１２Ｍの親和性で結合し、および予め決められた抗原または近しい抗原以外の非特異的な抗原（例として、ＢＳＡ、カゼイン）への結合のためのその親和性よりも２倍よりも大きい親和性で予め決められた抗原へ結合する。
用語「阻害する」または「の阻害」は、測定可能な量低減すること、または全面的に防ぐこと、とくに反応を触媒する特定の酵素の活性を測定可能な量低減すること、または全面的に防ぐことを意味する。
【0046】
用語「アフコシル化」または「アフコシル化された」は、内部のコア構造にフコースを有さないグリカン構造を指す。
本明細書に使用されるとき、「チオフコシル化」または「チオフコシル化された」は、少なくとも１のチオフコースを含むグリカン構造を指す。しばしば「チオフコシル化された」グリカン構造において、フコースは、チオフコースにより置換されている。
本明細書に使用されるとき、「チオフコシル化」または「チオフコシル化された」は、少なくとも１のチオフコースを含むグリカン構造を指す。しばしば「チオフコシル化された」グリカン構造において、フコースは、チオフコースにより置換されている。
【0047】
本明細書に使用されるとき、「５－チオ－Ｌ－フコース」または「チオＦｕｃ」は、糖環において酸素が、硫黄原子に置換された、フコース誘導体を指す。「５－チオ－Ｌ－フコース」は、アルファおよび／またはベータアノマーを意味する。
【化1】
【0048】
本明細書に使用されるとき、「アセチル化５－チオ－Ｌ－フコース」または「ＡｃチオＦｕｃ」は、１～４つのアセチル基を保有する５－チオ－Ｌ－フコースを意味する、チオフコース上のアセチル基の全ての形態を指す。図１は、例えば、４つのアセチル基を保有する過アセチル化５－チオ－Ｌ－フコースを示す。
５－チオ－Ｌ－フコースの誘導体は、非、部分的または完全にアセチル化された形態の２－Ｆ－５－チオ－Ｌ－フコース、５－アルキニル－５－チオ－Ｌ－フコース、６，６，６－トリフルオロ－５－チオ－Ｌ－フコース、５－チオ－Ｌ－フコースホスホナートである。
５－チオ－Ｌ－フコースの誘導体は、非、部分的または完全にアセチル化された形態の２－Ｆ－５－チオ－Ｌ－フコース、５－アルキニル－５－チオ－Ｌ－フコース、６，６，６－トリフルオロ－５－チオ－Ｌ－フコース、５－チオ－Ｌ－フコースホスホナートである。
【0049】
非、部分的または完全にアセチル化された形態の２－Ｆ－５－チオ－Ｌ－フコースは、式Ｉ：
に従う分子であり、式中Ｒは、互いに独立してＨまたはアセチルである。
【化2】
に従う分子であり、式中Ｒは、互いに独立してＨまたはアセチルである。
【0050】
非、部分的または完全にアセチル化された形態の５－アルキニル－５－チオ－Ｌ－フコースは、式ＩＩ：
に従う分子であり、式中Ｒは、互いに独立してＨまたはアセチルである。
【化3】
に従う分子であり、式中Ｒは、互いに独立してＨまたはアセチルである。
【0051】
非、部分的または完全にアセチル化された形態の６，６，６－トリフルオロ－５－チオ－Ｌ－フコースは、式ＩＩＩ：
に従う分子であり、式中Ｒは、互いに独立してＨまたはアセチルである。
【化4】
に従う分子であり、式中Ｒは、互いに独立してＨまたはアセチルである。
【0052】
非、部分的または完全にアセチル化された形態の５－チオ－Ｌ－フコースホスホナートは、式ＩＶ：
に従う分子であり、式中Ｒは、互いに独立してＨまたはアセチルである。
【化5】
に従う分子であり、式中Ｒは、互いに独立してＨまたはアセチルである。
【0053】
以下の画像は、非アセチル化形態を示す。アセチル化形態において、１以上のＯＨ基が、アセチル化されている。
【化6】
【0054】
本明細書に使用されるとき、「コアフコシル化」または「フコシル化」は、Ｎ連結型グリカンの還元末端でのＮ－アセチルグルコサミン（「ＧＩｃＮＡｃ」）へのフコースの付加を指す。
【0055】
本明細書に使用されるとき、「Ｎ－グリコシド結合型糖鎖」または「Ｎ－グリコシド結合型グリカン」は、典型的には、アスパラギン２９７（Ｋａｂａｔの数に従う）に結合されているが、複合型Ｎ－グリコシド結合型糖鎖は、他のアスパラギン残基に連結され得る。本明細書に使用されるとき、複合型Ｎ－グリコシド結合型糖鎖は、以下の構造：
を主に有する二分岐の複合型糖鎖を有し、ここで＋／－は糖分子が存在し得るがし得ないかを指し示し、および数は糖分子間の連結の位置を指し示す。上の構造において、アスパラギンに結合する糖鎖末端は、還元末端と呼ばれ（右側）、および反対側は、非還元末端と呼ばれる。フコースは、大抵還元末端のＮ－アセチルグルコサミン（「ＧＩｃＮＡｃ」）に、典型的にはα１，６結合（ＧＩｃＮＡｃの６位置が、フコースの１位置に連結される）によって結合される。「Ｇａｌ」はガラクトースを指し、および「Ｍａｎ」はマンノースを指す。
【化7】
を主に有する二分岐の複合型糖鎖を有し、ここで＋／－は糖分子が存在し得るがし得ないかを指し示し、および数は糖分子間の連結の位置を指し示す。上の構造において、アスパラギンに結合する糖鎖末端は、還元末端と呼ばれ（右側）、および反対側は、非還元末端と呼ばれる。フコースは、大抵還元末端のＮ－アセチルグルコサミン（「ＧＩｃＮＡｃ」）に、典型的にはα１，６結合（ＧＩｃＮＡｃの６位置が、フコースの１位置に連結される）によって結合される。「Ｇａｌ」はガラクトースを指し、および「Ｍａｎ」はマンノースを指す。
【0056】
「複合型Ｎ－グリコシド結合型糖鎖」は、マンノースのみがコア構造の非還元末端で組み込まれる、高マンノース型の糖鎖を除外するが、以下を包含する、
１）コア構造の非還元末端側が、ガラクトース－Ｎ－アセチルグルコサミン（「ｇａｌ－ＧｌｃＮＡｃ」とも称される）の１以上の枝を有し、およびＧａＩ－ＧＩｃＮＡｃの非還元末端側が、任意にシアル酸、バイセクティングＮ－アセチルグルコサミンまたは同種のものを有する、複合型；または
２）コア構造の非還元末端側が、高マンノース型Ｎ－グリコシド結合型糖鎖および複合型Ｎ－グリコシド結合型糖鎖の両方の枝を有する、ハイブリッド型。
いくつかの態様において、「複合型Ｎ－グリコシド結合型糖鎖」は、コア構造の非還元末端側が、ゼロ、１またはそれ以上のガラクトース－Ｎ－アセチルグルコサミン（「ｇａｌ－ＧｌｃＮＡｃ」とも称される）の枝を有し、およびＧａｌ－ＧｌｃＮＡｃの非還元末端側が、任意にさらにシアル酸、バイセクティングＮ－アセチルグルコサミンまたは同種のものなどの構造を有する、複合型を包含する。
１）コア構造の非還元末端側が、ガラクトース－Ｎ－アセチルグルコサミン（「ｇａｌ－ＧｌｃＮＡｃ」とも称される）の１以上の枝を有し、およびＧａＩ－ＧＩｃＮＡｃの非還元末端側が、任意にシアル酸、バイセクティングＮ－アセチルグルコサミンまたは同種のものを有する、複合型；または
２）コア構造の非還元末端側が、高マンノース型Ｎ－グリコシド結合型糖鎖および複合型Ｎ－グリコシド結合型糖鎖の両方の枝を有する、ハイブリッド型。
いくつかの態様において、「複合型Ｎ－グリコシド結合型糖鎖」は、コア構造の非還元末端側が、ゼロ、１またはそれ以上のガラクトース－Ｎ－アセチルグルコサミン（「ｇａｌ－ＧｌｃＮＡｃ」とも称される）の枝を有し、およびＧａｌ－ＧｌｃＮＡｃの非還元末端側が、任意にさらにシアル酸、バイセクティングＮ－アセチルグルコサミンまたは同種のものなどの構造を有する、複合型を包含する。
【0057】
本発明の要旨は、コアフコシル化、すなわちＦｃ含有タンパク質または抗体のＮ－グリコシド結合型糖鎖のフコシル化を低減する試薬および方法を提供することである。一態様において、フコシル化は、阻害され、よって低減されるかまたは完全に抑制される。別の態様において、Ｆｃ含有タンパク質または抗体のＮ－グリコシド結合型糖鎖は、代わりにチオフコシル化されている。両方の効果はまた、並行して、異なる抗体または異なる２つのグリカン構造を保有する１つの抗体のいずれかにおいて、並行して生じ得る。
【0058】
また提供されるものは、かかる方法によって産生される抗体である。他の側面において、有効量の、５－チオ－Ｌ－フコースおよび／または部分的または完全にアセチル化された５－チオ－Ｌ－フコース、非、部分的または完全にアセチル化された形態の２－Ｆ－５－チオ－Ｌ－フコース、５－アルキニル－５－チオ－Ｌ－フコース、６，６，６－トリフルオロ－５－チオ－Ｌ－フコースおよび５－チオ－Ｌ－フコースホスホナートから選択される５－チオ－Ｌ－フコース誘導体を含む培養培地が提供される。以下において、誘導体は、いつでも特定されているわけではない。５－チオ－Ｌ－フコースが言及される場合に、それが上で同定された誘導体もまた網羅することは自明である。それにもかかわらず好ましいものは、５－チオ－Ｌ－フコースおよび／または部分的または完全にアセチル化された５－チオ－Ｌ－フコースである。
【0059】
いくつかの態様において、Ｆｃ領域（またはドメイン）に結合された複合型Ｎ－グリコシド結合型糖鎖のフコシル化は、完全に抑制されるかまたはそれ以外は５－チオ－Ｌ－フコースが不在である以外は同じ培養条件下で培養された同じ宿主細胞からの抗体または他のＦｃ含有タンパク質と比較して低減している。「５－チオ－Ｌ－フコースが不在である以外は同じ培養条件下で」は、典型的には、細胞培養が、同じ成分を含有し、および同じ条件であるが、５－チオ－Ｌ－フコースが存在しないという違いを有するもとで実施されることを意味する。
【0060】
コアフコシル化を抑制または低減するために、宿主細胞は、５－チオ－Ｌ－フコースおよび／またはその誘導体を含む細胞培養培地中で培養される。
好ましい態様において、宿主細胞が培養される細胞培養培地は、Ｌ－フコースを含まない。
好ましい態様において、宿主細胞が培養される細胞培養培地は、Ｌ－フコースを含まない。
【0061】
宿主細胞が培養される液体細胞培養培地中に含まれる５－チオ－Ｌ－フコースの量は、フコースの組み込みを減少させるのに有効な量である。これに関連して、「有効量」は、フコースの抗体または別のＦｃ含有タンパク質の複合型Ｎ－グリカン結合型糖鎖内への組み込みを少なくとも１０パーセント、少なくとも２０パーセント、少なくとも３０パーセント、少なくとも４０パーセントまたは少なくとも６０パーセント減少させるのに充分である、５－チオ－Ｌ－フコースの量を指す。
典型的には、量は、０．１μＭと１ｍＭとの間である。
流加培地が、細胞培養に添加される場合、それらはより多くの量の５－チオ－Ｌ－フコースを含んでもよい。
典型的には、量は、０．１μＭと１ｍＭとの間である。
流加培地が、細胞培養に添加される場合、それらはより多くの量の５－チオ－Ｌ－フコースを含んでもよい。
【0062】
有効である５－チオ－Ｌ－フコースの量は、標準的な細胞培養方法論によって決定され得る。例えば、細胞培養アッセイは、最適な投薬範囲を同定するのを助けるために用いられてもよい。用いられる正確な量はまた、投与の時間、宿主細胞株、細胞密度等に依拠する。
抗体のフコシル化および／またはチオフコシル化パターンは、培養培地中の５－チオ－Ｌ－フコースの濃度および／または５－チオ－Ｌ－フコースへの曝露の期間を変更することによって調節されてもよい。
抗体のフコシル化および／またはチオフコシル化パターンは、培養培地中の５－チオ－Ｌ－フコースの濃度および／または５－チオ－Ｌ－フコースへの曝露の期間を変更することによって調節されてもよい。
【0063】
本発明の粉末状細胞培養培地は、好ましくは、すべての構成要素を混合し、およびそれらを製粉することによって産生される。構成要素の混合は、製粉によって乾燥粉末状細胞培養培地を産生する当業者にとって既知である。好ましくは、すべての構成要素は、混合物のすべての部分が大体同じ組成を有するように、徹底的に混合される。組成の一様性が高くなるほど、その結果得られる培地の均一な細胞成長に関する品質はより高くなる。
【0064】
製粉は、粉末状細胞培養培地を産生するのに好適であるいずれかのタイプのミルを用いて実施され得る。典型例は、ボールミル、ピンミル、フィッツミルまたはジェットミルである。好ましいものは、ピンミル、フィッツミルまたはジェットミルであり、極めて好ましいものは、ピンミルである。
当業者は、このようなミルを実行する方法を知っている。
当業者は、このようなミルを実行する方法を知っている。
【0065】
約４０ｃｍのディスクの直径を備える大規模な機器のミルは、例として、典型的には、ピンミルのケースにおいては１～６５００回転数／分、好ましいものは、１～３０００回転数／分で実行されるものである。
製粉は、１０と３００μｍとの間の粒子サイズ、最も好ましくは２５と１００μｍとの間の粒子サイズを有する粉末をもたらす、標準的な製粉条件下でなされ得る。
製粉は、１０と３００μｍとの間の粒子サイズ、最も好ましくは２５と１００μｍとの間の粒子サイズを有する粉末をもたらす、標準的な製粉条件下でなされ得る。
【0066】
好ましくは、製粉に供される混合物のすべての構成要素は、乾燥している。このことは、それらが水を含む場合、それらは結晶水のみ含むが、結合していないかまたは配位していない水分子の重量で、１０％以下、好ましくは５％以下、最も好ましくは２％以下で含むことを意味する。
好ましい態様において、製粉は、不活性雰囲気中で実施される。好ましい不活性な保護ガスは、窒素である。
好ましい態様において、製粉は、不活性雰囲気中で実施される。好ましい不活性な保護ガスは、窒素である。
【0067】
別の好ましい態様において、混合物のすべての構成要素は、製粉前に凍結されている。製粉前に成分を凍結することは、０℃未満、および最も好ましくは－２０℃未満の温度に成分を冷却することを確実にするいずれかの手段によってなされ得る。好ましい態様において、凍結することは、液体窒素を用いてなされる。このことは、成分が、液体窒素を用いて、例えば、ミル内への導入前に成分が保管される容器内に液体窒素を注ぐことにより、処理されることを意味する。好ましい態様において、容器は、フィーダーである。容器がフィーダーである場合に、液体窒素は、好ましくは、成分が導入されるフィーダーの側部または側部の近くに導入される。
典型的には、成分は、２～２０秒にわたって液体窒素で処理される。
好ましくは、成分を冷却することは、ミル内に入るすべての成分が、０℃未満、最も好ましくは－２０℃未満の温度であるようになされる。
典型的には、成分は、２～２０秒にわたって液体窒素で処理される。
好ましくは、成分を冷却することは、ミル内に入るすべての成分が、０℃未満、最も好ましくは－２０℃未満の温度であるようになされる。
【0068】
好ましい態様において、すべての成分は容器に入れられ、そこから混合物は、フィーダーに、最も好ましくは計量式スクリューフィーダーに移される。フィーダーにおいて、成分は、ときにはフィーダーのタイプに依拠してさらに混合され－および追加で冷却される。次いで、凍結された混合物は、ミル中で製粉された混合物が、好ましくは０℃未満、より好ましくは－２０℃未満の温度をなお有するように、フィーダーからミルへ移される。
典型的には、混合物の成分のフィーダー内での滞留時間を意味する、ブレンド時間（the blending time）は、１分より多く、好ましくは１５と６０分との間である。
典型的には、混合物の成分のフィーダー内での滞留時間を意味する、ブレンド時間（the blending time）は、１分より多く、好ましくは１５と６０分との間である。
【0069】
ドーセージスネイル（dosage snail）とも呼ばれる計量式スクリューフィーダーは、典型的には、１０～２００回転数／分のスピードで実行され、好ましくは、それはは４０～６０回転数／分で実行される。
典型的には、ミルの温度は、－５０と＋３０℃との間で保たれる。好ましい態様において、温度は、ほぼ１０℃に保たれる。
製粉の間の酸素レベルは、好ましくは、１０％（ｖ／ｖ）未満である。
典型的には、ミルの温度は、－５０と＋３０℃との間で保たれる。好ましい態様において、温度は、ほぼ１０℃に保たれる。
製粉の間の酸素レベルは、好ましくは、１０％（ｖ／ｖ）未満である。
【0070】
プロセスは、例として、バッチ式で、または絶えず実行され得る。好ましい態様において、本発明に従うプロセスは、ある時間にわたって、冷却するためのフィーダー内に混合物の成分を永続的に充填し、および冷却された混合物をフィーダーからミル内に永続的に充填することによって、絶えずなされる。
製粉後、その結果得られる乾燥粉末培地は、粒子のサイズを大きくするために、例として、ロールプレスでの乾式圧密によって、さらに圧縮されてもよい。
製粉後、その結果得られる乾燥粉末培地は、粒子のサイズを大きくするために、例として、ロールプレスでの乾式圧密によって、さらに圧縮されてもよい。
【0071】
例として、製粉または湿式または乾式圧密から生じる、乾燥粉末状培地の使用のために、溶媒、好ましくは水（最も具体的には、蒸留水および／または脱イオン水または精製水または注射用水）または水性緩衝液が培地に添加され、および培地が溶媒中に完全に溶解するまで構成要素が混合され、およびすぐに使える液体培地が、生成される。
溶媒は、生理食塩水、好適なｐＨ範囲（典型的には、ｐＨ１．０とｐＨ１０．０との間の範囲内）を提供する可溶性酸または塩基イオン、安定剤、界面活性剤、保存料、およびアルコールまたは他の極性有機溶媒もまた含んでもよい。
溶媒は、生理食塩水、好適なｐＨ範囲（典型的には、ｐＨ１．０とｐＨ１０．０との間の範囲内）を提供する可溶性酸または塩基イオン、安定剤、界面活性剤、保存料、およびアルコールまたは他の極性有機溶媒もまた含んでもよい。
【0072】
それは、ｐＨの調整のための緩衝剤物質、ウシ胎仔血清、糖等のようなさらなる物質を細胞培養培地および溶媒の混合物に添加することも可能である。次いで、その結果得られる液体細胞培養培地は、成長または維持するために細胞と接触される。
本発明に従う乾燥粉末または粒状の培地は、典型的には、溶解後にその結果得られる液体培地が、有効量の５－チオ－Ｌ－フコース、典型的には、１０ｎｍｏｌ／ｌと１００ｍｍｏｌ／ｌとの間、好ましくは０．１μｍｏｌ／ｌと１０ｍｍｏｌ／ｌとの間で含むような量で５－チオ－Ｌ－フコースを含む。乾燥粉末または粒状の培地は、好ましくは、いずれのＬ－フコースも含有しない。
本発明に従う乾燥粉末または粒状の培地は、典型的には、溶解後にその結果得られる液体培地が、有効量の５－チオ－Ｌ－フコース、典型的には、１０ｎｍｏｌ／ｌと１００ｍｍｏｌ／ｌとの間、好ましくは０．１μｍｏｌ／ｌと１０ｍｍｏｌ／ｌとの間で含むような量で５－チオ－Ｌ－フコースを含む。乾燥粉末または粒状の培地は、好ましくは、いずれのＬ－フコースも含有しない。
【0073】
本発明は、さらに、
ａ）バイオリアクターを提供すること、
ｂ）培養される細胞と本発明に従う乾燥粉末培地を溶解することによって生成される細胞培養培地とを混合すること、
ｃ）ステップｂ）の混合物をインキュベートすること、
による細胞を培養するためのプロセスに指向される。
ａ）バイオリアクターを提供すること、
ｂ）培養される細胞と本発明に従う乾燥粉末培地を溶解することによって生成される細胞培養培地とを混合すること、
ｃ）ステップｂ）の混合物をインキュベートすること、
による細胞を培養するためのプロセスに指向される。
【0074】
一態様において、バイオリアクターは、灌流バイオリアクターである。
バイオリアクターは、細胞が培養され得るいずれかの槽、フラスコまたはタンクである。インキュベーションは、典型的には、好適な温度等のような好適な条件下でなされる。当業者は、好適な温度、ｐＨ、浸透圧、曝気、揺動などの細胞の成長／培養を支持または維持するための好適なインキュベーション条件および環境からの外来微生物による汚染を制限するかまたは理想的に回避するバイオリアクターについて知っている。
バイオリアクターは、細胞が培養され得るいずれかの槽、フラスコまたはタンクである。インキュベーションは、典型的には、好適な温度等のような好適な条件下でなされる。当業者は、好適な温度、ｐＨ、浸透圧、曝気、揺動などの細胞の成長／培養を支持または維持するための好適なインキュベーション条件および環境からの外来微生物による汚染を制限するかまたは理想的に回避するバイオリアクターについて知っている。
【0075】
灌流バイオリアクターは、灌流細胞培養が実施され得るバイオリアクターである。それは、典型的には、細胞培養の間閉鎖されているバイオリアクター槽、槽中の撹拌機、新鮮な培地を導入するためのライン、バイオリアクターからの細胞、液体培地および標的産物を含む採取ストリームを取り除くための採取ライン、および採取物の液体部分が収集され得る間細胞を保持する採取ライン中の細胞保持デバイスを含む。好ましい構成についての詳細を提供する灌流細胞培養についてのレビューは、“Perfusion mammalian cell culture for recombinant protein manufacturing - A critical review” Jean-Marc Bielser et al., Biotechnology Advances 36 (2018) 1328-1340に見出され得る。
【0076】
本発明はまた、
－細胞および水性の細胞培養培地をバイオリアクター内に充填すること、
－バイオリアクター中で細胞をインキュベートすること、
－バイオリアクター中の細胞のインキュベーションの時間全体にわたって絶えず、または該インキュベーション時間内に１回または数回、バイオリアクターに細胞培養培地を添加すること、
によるバイオリアクター中で細胞を培養するためのプロセスに指向され、ここで培地は、好ましくは、ｐＨ８．５未満のｐＨを有し、および少なくとも上に定義されるとおりの５－チオ－Ｌ－フコースおよび／またはその誘導体を含む。
－細胞および水性の細胞培養培地をバイオリアクター内に充填すること、
－バイオリアクター中で細胞をインキュベートすること、
－バイオリアクター中の細胞のインキュベーションの時間全体にわたって絶えず、または該インキュベーション時間内に１回または数回、バイオリアクターに細胞培養培地を添加すること、
によるバイオリアクター中で細胞を培養するためのプロセスに指向され、ここで培地は、好ましくは、ｐＨ８．５未満のｐＨを有し、および少なくとも上に定義されるとおりの５－チオ－Ｌ－フコースおよび／またはその誘導体を含む。
【0077】
好ましい態様において、培地は、流加培地である。
典型的には、流加培地は、５０と３００ｇ／ｌとの間の溶媒中に溶解される個体成分を含む。
別の態様において、培地は、灌流培地である。
典型的には、流加培地は、５０と３００ｇ／ｌとの間の溶媒中に溶解される個体成分を含む。
別の態様において、培地は、灌流培地である。
【0078】
一態様において、本発明のプロセスにおいて、インキュベーションの間に絶えずかまたは１回もしくは該回数内の数回のいずれかでバイオリアクターに添加される流加培地は、異なる組成を有する。
別の、典型的には好ましい態様における、本発明のプロセスにおいて、インキュベーションの間に絶えずかまたは１回もしくは該回数内の数回のいずれかでバイオリアクターに添加される流加培地は、常に同じ組成を有する。
別の、典型的には好ましい態様における、本発明のプロセスにおいて、インキュベーションの間に絶えずかまたは１回もしくは該回数内の数回のいずれかでバイオリアクターに添加される流加培地は、常に同じ組成を有する。
【0079】
本発明の方法によって産生される抗体および抗体誘導体は、細胞培養物から単離され、および例えば、ゲル電気泳動、濾過、透析、および例として、親和性クロマトグラフィーおよび／またはイオン交換クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィーを使用して精製され得る。
【0080】
いくつかの態様において、本発明の方法によって産生される抗体または抗体誘導体は、５－チオ－Ｌ－フコースの不在において産生される抗体または抗体誘導体よりも高いエフェクター機能（例として、ＡＤＣＣ活性）を有する。ＡＤＣＣ活性は、当該技術分野において知られているアッセイを使用して測定されてもよく、および例示の態様において、コアフコシル化された親抗体と比較して、少なくとも１０パーセント、２０パーセント、３０パーセント、４０パーセント、５０パーセント、６０パーセント、７０パーセント、８０パーセント、９０パーセント、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍または２０倍増加する。
【0081】
５－チオ－Ｌ－フコースおよび／またはその誘導体は、それらが、典型的には、細胞の性能（ＶＣＤおよび力価）に対して有意な影響を与えないことから、コアフコシル化を修飾するのにとくに好適である。本発明の方法によって産生される抗体のグリコシル化パターンは、ときにはコアフコシル化が低減され、それによってより少ない全体的なコアフコシル化が生じ、およびときにはコアフコシル化が、チオフコシル化によるその置き換えに起因して低減することを示す。ときには両方の効果が同時に観察され得る。典型的には、フコシル化レベルは、５－チオ－Ｌ－フコースの量を増大して使用することによって減少させ得、および並行して５－チオ－Ｌ－フコースの組み込みは、５－チオ－Ｌ－フコースの量を増大してしようすることによって増大し、ここで効果は、完全に逆平行ではなく、アフコシル化およびチオフコシル化もまた細胞培養に添加される５－チオ－Ｌ－フコースの濃度の慎重な選択によって改変され得る。
【0082】
５－チオ－Ｌ－フコースは、既知のインヒビターである２Ｆ－ペルアセチルフコースと比較して、より高い効率を示す。例４に見られるように、５－チオ－Ｌ－フコース処理を用いた抗体の産生は、７、１０および１２日目に夫々対照と比較して、６４％、６８％および６７％のフコシル化の低減を示した。比較すると、既知のフコース類似体である２Ｆ－ペルアセチルフコースの同じ濃度の添加は、７、１０および１２日目に夫々１１％、５０％および５８％の低減を達成できるにすぎなかった。
【0083】
さらに、５－チオ－Ｌ－フコースを含む培地を用いた本発明の方法を用いて産生された抗体は、それらの受容体へのより高い結合親和性を示すことが示され得る。
【0084】
本発明はさらに、以下の図および例によって例証されるが、それに制限されるものではない。
上および下で引用されたすべての出願、特許、および刊行物、ならびに２０１９年１２月１９日に出願された対応するＥＰ１９２１８１７２．５の開示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
上および下で引用されたすべての出願、特許、および刊行物、ならびに２０１９年１２月１９日に出願された対応するＥＰ１９２１８１７２．５の開示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0085】
例
以下の例は、本発明の実践的な適用を表す。
例１：５－チオ－Ｌ－フコースの存在における組換えタンパク質の発現。
一般的な流加プロセスを、組換えタンパク質のグリコシル化プロファイルに対する５－チオ－Ｌ－フコースの効果を決定するために使用した（図１）。３つの異なるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）および融合タンパク質を発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の４つの異なるクローンを試験した。細胞を、スピンチューブ内で１４と２０日との間３７℃、５％ＣＯ２、および８０％湿度で培養した。出発する細胞密度として、３０ｍＬのCellvento（登録商標）4CHO培地（ｐＨ７．０±０．１）中３×１０５細胞／ｍＬを夫々ｍＡｂ１およびｍＡｂ２を産生するクローン１および２について使用した（Cellvento（登録商標）プラットホーム）。細胞を３２０ｒｐｍの揺動速度で培養し、および３、５、１０、１２および１４日目に３％体積のCellvento（登録商標）4Feed（ｖ／ｖ）を用いて、および７日目に６％（ｖ／ｖ）のフィードを用いて供給した。ｍＡｂ３および融合タンパク質を産生するクローン３および４を、３０ｍＬのEx-Cell（登録商標）Advanced Media（ｐＨ７．２±０．１）中に同じ細胞密度で播種した一方で、揺動を２３０ｒｐｍにセットした。クローン３および４を、３、５、７、１０、１２、１４および１７日目に５％のEx-Cell（登録商標）Advanced Feed（ｖ／ｖ）を用いて供給した。フィードを、４００μＭの５－チオ－Ｌ－フコース、４００μＭのアセチル化５－チオ－Ｌ－フコース、陽性対照として４００μＭのアセチル化２Ｆ－フコースまたは両方のアセチル化フコース類似体について溶媒として使用された夫々の量のＤＭＳＯ（１．１７％）のいずれかで補充した。すべてのCellvento（登録商標）のフィードのｐＨを７．０±０．１に調節し、およびEx-Cell（登録商標）のフィードを８．５±０．１に調節した。
以下の例は、本発明の実践的な適用を表す。
例１：５－チオ－Ｌ－フコースの存在における組換えタンパク質の発現。
一般的な流加プロセスを、組換えタンパク質のグリコシル化プロファイルに対する５－チオ－Ｌ－フコースの効果を決定するために使用した（図１）。３つの異なるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）および融合タンパク質を発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の４つの異なるクローンを試験した。細胞を、スピンチューブ内で１４と２０日との間３７℃、５％ＣＯ２、および８０％湿度で培養した。出発する細胞密度として、３０ｍＬのCellvento（登録商標）4CHO培地（ｐＨ７．０±０．１）中３×１０５細胞／ｍＬを夫々ｍＡｂ１およびｍＡｂ２を産生するクローン１および２について使用した（Cellvento（登録商標）プラットホーム）。細胞を３２０ｒｐｍの揺動速度で培養し、および３、５、１０、１２および１４日目に３％体積のCellvento（登録商標）4Feed（ｖ／ｖ）を用いて、および７日目に６％（ｖ／ｖ）のフィードを用いて供給した。ｍＡｂ３および融合タンパク質を産生するクローン３および４を、３０ｍＬのEx-Cell（登録商標）Advanced Media（ｐＨ７．２±０．１）中に同じ細胞密度で播種した一方で、揺動を２３０ｒｐｍにセットした。クローン３および４を、３、５、７、１０、１２、１４および１７日目に５％のEx-Cell（登録商標）Advanced Feed（ｖ／ｖ）を用いて供給した。フィードを、４００μＭの５－チオ－Ｌ－フコース、４００μＭのアセチル化５－チオ－Ｌ－フコース、陽性対照として４００μＭのアセチル化２Ｆ－フコースまたは両方のアセチル化フコース類似体について溶媒として使用された夫々の量のＤＭＳＯ（１．１７％）のいずれかで補充した。すべてのCellvento（登録商標）のフィードのｐＨを７．０±０．１に調節し、およびEx-Cell（登録商標）のフィードを８．５±０．１に調節した。
【0086】
グルコースレベルは、要求に応じて週内は６ｇ／Ｌまで、および週末にわたっては１３ｇ／Ｌまでの特定の量の４００ｇ／Ｌグルコースストック溶液を添加することによって４ｇ／Ｌ超を維持した。グルコースおよび力価を、分光光度法および比濁法に基づいて、バイオプロセス分析器CEDEX Bio HT（Roche、Mannheim、Germany）を用いて、上清において検出した。生細胞密度（ＶＣＤ）および生存率を、Vi-CELL（商標）XR 2.04セルカウンター（Beckman Coulter、Fullerton、CA、USA）を用いて評価した。
一般に、５－チオ－Ｌ－フコース処理を、いずれの添加物も含まない対照条件と比較した。アセチル化５－チオ－Ｌ－フコースを既知の陽性対照である２Ｆ－ペルアセチルフコースおよび両方のアセチル化フコース類似体の溶解に使用されたＤＭＳＯ対照と比較した。
一般に、５－チオ－Ｌ－フコース処理を、いずれの添加物も含まない対照条件と比較した。アセチル化５－チオ－Ｌ－フコースを既知の陽性対照である２Ｆ－ペルアセチルフコースおよび両方のアセチル化フコース類似体の溶解に使用されたＤＭＳＯ対照と比較した。
【0087】
図２～５に示されるとおり、４つの生物学的複製内で、アセチル化の有無にかかわらず５－チオ－Ｌ－フコース処理は、２つの対照条件および陽性対照と比較すると、これらの４つの調査されたＣＨＯ細胞株の細胞の性能（ＶＣＤおよび力価）に対して有意な影響がないことを示した。わずかな変化をｍＡｂ２およびｍＡｂ３についての両方のプラットフォームにおいて検出した。ｍＡｂ２の産生は、補充されなかった対照と比較して、すべての条件において１２日後にわずかに低減した力価をもたらした。１７日目に、対照における２．１８ｇ／Ｌの力価を、５－チオ－Ｌ－フコース処理およびＤＭＳＯ対照を用いて、夫々２．０２ｇ／Ｌおよび１．９９ｇ／Ｌまで低減させた。陽性対照である２Ｆ－ペルアセチルフコース（１．７８ｇ／Ｌ）と同様のレベルの１．８２ｇ／Ｌへのさらなる低減は、アセチル化５－チオ－Ｌ－フコースを用いて検出された。両方のペルアセチル化フコース類似体がＤＭＳＯに溶解されたため、力価の低減は、部分的には溶媒に起因する。
【0088】
ｍＡｂ３の産生について、５－チオ－Ｌ－フコースおよびアセチル化５－チオ－Ｌ－フコースについて１７日目までの曲線下面積を算出することによって、約１３％および２４％の低減したＶＣＤが検出された（対照と比較して）。ＤＭＳＯ対照は、１３％の同様の低減を示し、そのことはアセチル化５－チオ－Ｌ－フコースの溶媒が、ＶＣＤのさらなる低減を導いた可能性が高いことを指し示した。低減したＶＣＤが力価に影響を与えなかった（２．２５ｇ／Ｌ～２．３３ｇ／Ｌ）ため、それは実験の生物学的変動性内であると探求される。
【0089】
例２：５－チオ－Ｌ－フコースは、グリカン構造内に組み込まれる
対照の流加において産生された組換えタンパク質のグリコシル化プロファイルを、フコース類似体を補充した流加プロセスにおいて得られたプロファイルと比較した。抗体を、プロテインＡ PhyTips（登録商標）（PhyNexus Inc、San Jose、CA）を使用して細胞培養上清から精製した。
対照の流加において産生された組換えタンパク質のグリコシル化プロファイルを、フコース類似体を補充した流加プロセスにおいて得られたプロファイルと比較した。抗体を、プロテインＡ PhyTips（登録商標）（PhyNexus Inc、San Jose、CA）を使用して細胞培養上清から精製した。
【0090】
グリコシル化パターンを、質量分析計と連結した超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ－ＭＳ）によって分析した。精製された抗体を変性させて、およびグリカンをペプチドＮ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）を用いて消化することにより抗体から放出させ、これに続き製造業者のプロトコルに従いGlycoWorks（商標）RapiFluor-MS（商標）N-Glycanキットを用いてグリカンを標識化した。分析のために、それらの疎水性に従ってグリカンを分離するＵＰＬＣグリカンカラム（２．１×１５０ｍｍ）を使用した。クロマトグラフィーを、４５℃で５０ｍＭのギ酸アンモニウム（Ａ）、ｐＨ４．４溶液およびアセトニトリル（Ｂ）勾配を使用して実施した。詳しくは、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで当初はＡ：Ｂの比率は２０：８０（０ｍｉｎ）であり、および３ｍｉｎで２７：７３に、および３５ｍｉｎで３７：６３に変化した。３６．５ｍｉｎから３９．５ｍｉｎまでは移動相としてＡのみが使用され、および流速を０．２ｍｌ／ｍｉｎに低減した。続いて、比率を２０％Ａ：８０％Ｂに変化させ、および流速を４３．１ｍｉｎで５５ｍｉｎでのプロセスの終了まで０．５ｍｌ／ｍｉｎに増大させた。検出を、２６５ｎｍの励起波長および４２５ｎｍの放射波長を用いて蛍光検出器により実施した。グリカン構造の同定を、３０ｓ毎に標準物質で校正される、ポジティブのエレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）を使用したＭＳにより実施した。
【0091】
非天然の５－チオ－Ｌ－フコースを含有するグリカンを、保持時間のシフト、質量のシフトおよび断片化パターンを通して同定した。約＋１６Ｄａの質量のシフトは、フコース（１６４．０６８４ｇ／ｍｏｌ）内の環酸素の５－チオ－Ｌ－フコース誘導体について１８０．０４５５ｇ／ｍｏｌの理論上の質量を導くチオ－Ｌ－フコース誘導体内の硫黄との交換によって引き起こされる。この質量は、１８０．０６３３ｇ／ｍｏｌのガラクトースの質量と同様であるが、より高い分解能の質量分析計（１１５ｐｐｍの質量差）によって区別され得る。
【0092】
さらにまた、フラグメントスペクトルをＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して得た。チオフコースを含有するグリカンの断片化パターンは、夫々のフコシル化グリカン断片化パターンと同様であるが、フコースを含有するグリカンフラグメント毎に異なる。例えば、Rapifluor-GlcNAc-Fucフラグメントは、理論上の質量の６７９．３３０４ｇ／ｍｏｌを提示するが、Rapifluor GlcNAc-チオFucは、理論上の質量の６９５．３０７６ｇ／ｍｏｌを提示する。差は、糖構造の明確な同定を可能にする（図６、Ａ フコシル化Ｇ０Ｆ、Ｂ チオフコシル化Ｇ０チオＦおよびＣ Ｇ１断片化パターン）。
【0093】
加えて、チオフコシル化グリカンの保持時間は、フコシル化グリカンと区別され得る。図７において、８００μＭの５－チオ－Ｌ－フコースで処理されたｍＡｂについての蛍光ピークの保持時間の模範的なシフトが示される。チオフコシル化されたＧ０Ｆピークを１７．１９ｍｉｎで検出したが、Ｇ０ピークの溶離が１７．３８ｍｉｎで生じる。２２．８１および２３．５１ｍｉｎでの両方のフコシル化Ｇ１Ｆアイソフォームの保持時間と比較して、チオフコシル化Ｇ１Ｆアイソフォームピークの分離は、２０．８８および２１．５２ｍｉｎで観察され得る。概して、このデータは、グリカン構造中の５－チオ－Ｌ－フコースによるコアフコシル化の置き換えを確認する。
図７は、放出された、標識化グリカンの分離後にＵＰＬＣを使用して得られた蛍光シグナルを示し、フコシル化グリカンと比較して、チオフコシル化グリカンに対応するピークの保持時間の変化を示す。
図７は、放出された、標識化グリカンの分離後にＵＰＬＣを使用して得られた蛍光シグナルを示し、フコシル化グリカンと比較して、チオフコシル化グリカンに対応するピークの保持時間の変化を示す。
【0094】
例３：５－チオ－Ｌ－フコースは、５－チオ－Ｌ－フコースの組み込みを通してフコシル化を低減し得る。
一般的な流加プロセスを、グリコシル化プロファイルに対する５－チオ－Ｌ－フコースの効果を決定するために使用した。３つの異なるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）および融合タンパク質を発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の４つの異なるクローンを試験した。細胞を、スピンチューブ内で１４と２０日との間３７℃、５％ＣＯ２、および８０％湿度で培養した。出発する細胞密度として、３０ｍＬのCellvento（登録商標）4CHO培地（ｐＨ７．０±０．１）中３ｘ１０５細胞／ｍＬを、夫々ｍＡｂ１およびｍＡｂ２を産生するクローン１および２について使用した（Cellvento（登録商標）プラットホーム）。細胞を３２０ｒｐｍの揺動で培養し、および３、５、１０、１２および１４日目に３％体積のCellvento（登録商標）4Feed（ｖ／ｖ）を用いて、および７日目に６％（ｖ／ｖ）のフィードを用いて供給した。ｍＡｂ３および融合タンパク質を産生するクローン３および４を、３０ｍＬのEx-Cell（登録商標）Advanced Media（ｐＨ７．２±０．１）中に同じ細胞密度で播種した一方で、揺動を２３０ｒｐｍにセットした（Ex-Cell（登録商標）プラットホーム）。クローン３および４を、３、５、７、１０、１２、１４および１７日目に５％のEx-Cell（登録商標）Advanced Feed（ｖ／ｖ）を用いて供給した。フィードを、４００μＭの５－チオ－Ｌ－フコース、４００μＭのアセチル化５－チオ－Ｌ－フコース、陽性対照として４００μＭのアセチル化２Ｆ－フコースまたは両方のアセチル化フコース類似体について溶媒として使用された夫々の量のＤＭＳＯ（１．１７％）のいずれかで補充した。すべてのCellvento（登録商標）のフィードのｐＨを７．０±０．１に調節し、およびEx-Cell（登録商標）のフィードを８．５±０．１に調節した。グルコースレベルは、要求に応じて週内は６ｇ／Ｌまで、および週末にわたっては１３ｇ／Ｌまでの特定の量の４００ｇ／Ｌグルコースストック溶液を添加することによって４ｇ／Ｌ超を維持した。グルコースおよび力価を、分光光度法および比濁法に基づいて、バイオプロセス分析器CEDEX Bio HT（Roche、Mannheim、Germany）を用いて、上清において検出した。
一般的な流加プロセスを、グリコシル化プロファイルに対する５－チオ－Ｌ－フコースの効果を決定するために使用した。３つの異なるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）および融合タンパク質を発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の４つの異なるクローンを試験した。細胞を、スピンチューブ内で１４と２０日との間３７℃、５％ＣＯ２、および８０％湿度で培養した。出発する細胞密度として、３０ｍＬのCellvento（登録商標）4CHO培地（ｐＨ７．０±０．１）中３ｘ１０５細胞／ｍＬを、夫々ｍＡｂ１およびｍＡｂ２を産生するクローン１および２について使用した（Cellvento（登録商標）プラットホーム）。細胞を３２０ｒｐｍの揺動で培養し、および３、５、１０、１２および１４日目に３％体積のCellvento（登録商標）4Feed（ｖ／ｖ）を用いて、および７日目に６％（ｖ／ｖ）のフィードを用いて供給した。ｍＡｂ３および融合タンパク質を産生するクローン３および４を、３０ｍＬのEx-Cell（登録商標）Advanced Media（ｐＨ７．２±０．１）中に同じ細胞密度で播種した一方で、揺動を２３０ｒｐｍにセットした（Ex-Cell（登録商標）プラットホーム）。クローン３および４を、３、５、７、１０、１２、１４および１７日目に５％のEx-Cell（登録商標）Advanced Feed（ｖ／ｖ）を用いて供給した。フィードを、４００μＭの５－チオ－Ｌ－フコース、４００μＭのアセチル化５－チオ－Ｌ－フコース、陽性対照として４００μＭのアセチル化２Ｆ－フコースまたは両方のアセチル化フコース類似体について溶媒として使用された夫々の量のＤＭＳＯ（１．１７％）のいずれかで補充した。すべてのCellvento（登録商標）のフィードのｐＨを７．０±０．１に調節し、およびEx-Cell（登録商標）のフィードを８．５±０．１に調節した。グルコースレベルは、要求に応じて週内は６ｇ／Ｌまで、および週末にわたっては１３ｇ／Ｌまでの特定の量の４００ｇ／Ｌグルコースストック溶液を添加することによって４ｇ／Ｌ超を維持した。グルコースおよび力価を、分光光度法および比濁法に基づいて、バイオプロセス分析器CEDEX Bio HT（Roche、Mannheim、Germany）を用いて、上清において検出した。
【0095】
流加実験の間のグリコシル化プロファイルを調査するために、試料を遠心分離して、および抗体およびＦｃ－融合タンパク質を、プロテインＡ PhyTips（登録商標）（PhyNexus Inc、San Jose、CA）を使用して細胞培養上清から精製した。グリコシル化パターンを、GlycoWorks（商標）RapiFluor-MS（商標）N-Glycanキットを使用して質量分析計と連結した超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ－ＭＳ）に説明されるとおり分析した。
【0096】
一般に、アセチル化の有無にかかわらず５－チオ－Ｌ－フコース処理を、いずれの添加物も含まない対照条件、既知の陽性対照である２Ｆ－ペルアセチルフコースおよび両方のアセチル化フコース類似体を溶解するために使用されたＤＭＳＯ対照と比較した。１２日目の組換え産生されたタンパク質の採取が一般的であるため、１２日目のグリコシル化プロファイルを視覚化した。グリカンの定量化を、蛍光シグナルの相対ピーク面積を使用して得た。ほとんどすべてのピークが、それらの質量に従ったグリカン構造にあてがわれた。未知のグリカン構造および質量検出のないシグナルを未知の種として要約した（示さず）。
【0097】
３つの異なるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）および融合タンパク質を発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の４つの異なるクローンを試験した。コアフコシル化は、異なる組換えタンパク質を産生するすべての試験された細胞株において５－チオ－Ｌ－フコース処理を通して効率的に低減された。
【0098】
５－チオ－Ｌ－フコースによってクローン１において産生されたｍＡｂ１のフコシル化の低減は、フコース類似体の高い組み込みを通して達成された。アセチル化の有無にかかわらず４００μＭの５－チオ－Ｌ－フコースの添加は、対照における９４％のコアフコシル化グリカンと比較して、１２日目に約２６％までのコアフコシル化グリカンの低減をもたらした（図８Ａ）。同じ濃度のアセチル化２Ｆ－フコース（フコシル化を低減する既知のフコース類似体）の添加は効率が悪く、１２日目に３６％のコアフコシル化を導いた。アセチル化２Ｆ－フコースとは対照的に、５－チオ－Ｌ－フコースによるネイティブなフコシル化の低減は、アセチル化を問わず、グリカンの約７０％への５－チオ－Ｌ－フコースの高い組み込みを通して達成された。アフコシル化は、対照および５－チオ－Ｌ－フコースについての５％と比較して、１２日目にアセチル化２Ｆ－フコースによって６０％までのみ増大した。
【0099】
ｍＡｂ２の産生は、対照における７７％のフコシル化と比較して、アセチル化の有無にかかわらず５－チオ－Ｌ－フコース処理後１２日目に８％のコアフコシル化をもたらした（図８Ｂ）。５－チオ－Ｌ－フコース処理に応じてアフコシル化レベルが変化しなかったｍＡｂ１とは対照的に、ｍＡｂ２のフコシル化の低減は、５－チオ－Ｌ－フコースを３２％組み込むことにより、６０％のアフコシル化を達成した（対照条件における２０％と比較して）。既知の陽性対照は、アフコシル化を７８％まで増大させることにより１２日目に１４％のフコシル化レベルを達成した。
【0100】
既知のフコース類似体であるアセチル化２Ｆ－フコースと比較した同じ量のアフコシル化は、ｍＡｂ３を発現するクローン３によってのみ達成され、１２日目に約３４％のアフコシル化を導いた（図８Ｃ）。５－チオ－Ｌ－フコースは４３％組み込まれて、１２日目に対照における９０％および陽性対照における６５％と比較して、２１％低いフコシル化レベルを導いた。
【0101】
ｍＡｂ２についてのものと同様のグリコシル化パターンが、１２日目のクローン４において産生された融合タンパク質について観察された（図８Ｄ）。対照と比較して、コアフコシル化は、アセチル化の有無にかかわらず５－チオ－Ｌ－フコース処理を介して約６３％低減された。両方について、５－チオ－Ｌ－フコースの組み込みは、グリカンの３９％において観察され、および５２％がアフコシル化された。陽性対照は、フコース類似体の検出可能な組み込みなしに８２％のアフコシル化に到達した。
【0102】
概して、１２日目にｍＡｂ２、融合タンパク質、ｍＡｂ３およびｍＡｂ１について夫々約３２％、３９％、４３％、および７０％の組み込まれた５－チオ－Ｌ－フコースの量の増大が検出された。
ｍＡｂ１、ｍＡｂ３、融合タンパク質およびｍＡｂ２について約５％、３４％、５２％および６０％のフコシル化の量の増大が検出された。
ｍＡｂ１、ｍＡｂ３、融合タンパク質およびｍＡｂ２について約５％、３４％、５２％および６０％のフコシル化の量の増大が検出された。
【0103】
図８は、（Ａ）ｍＡｂ１、（Ｂ）ｍＡｂ２、（Ｃ）ｍＡｂ３および（Ｄ）融合タンパク質、を産生するＣＨＯ細胞株を使用したフコシル化プロファイルに対する５－チオ－Ｌ－フコースの影響を示す。データは、１２日目の２つの生物学的複製の平均値±ＳＥＭを表す。
【0104】
例４：プロセスへの５－チオ－Ｌ－フコースの添加は、２Ｆ－ペルアセチルフコースの添加と比較して、より速やかにフコシル化の低減を導く。
５－チオ－Ｌ－フコース補充が組換え産生されたタンパク質のグリコシル化プロファイルへ影響を与えるのに要する時間を特定するために、流加の間の種々の時点で採った試料を調査した。５、７、１０、１２および１４日目の細胞生存率が６０％超である試料を収集した。遠心分離後、抗体およびＦｃ融合タンパク質を、プロテインＡPhyTips（登録商標）（PhyNexus Inc、San Jose、CA）を使用して細胞培養上清から精製した。グリコシル化パターンを、GlycoWorks（商標）RapiFluor-MS（商標）N-Glycanキットを使用して質量分析計と連結した超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ－ＭＳ）によって記載されるとおりに分析した。
流加実験の間のグリカンプロファイルの初期調査は、５－チオ－Ｌ－フコースの高い効率を指し示した。５－チオ－Ｌ－フコース処理を用いたｍＡｂ１の産生は、７、１０および１２日目に対照と比較して夫々６４％、６８％および６７％フコシル化の低減を示した。比較すると、既知のフコース類似体である、２Ｆ－ペルアセチルフコースの同じ濃度の添加は、７、１０および１２日目に、夫々１１％、５０％および５８％の低減しか達成できなかった。このことは、既知のインヒビターである２Ｆ－ペルアセチルフコースと比較して５－チオ－Ｌ－フコースのより高い効率を指し示す。
５－チオ－Ｌ－フコース補充が組換え産生されたタンパク質のグリコシル化プロファイルへ影響を与えるのに要する時間を特定するために、流加の間の種々の時点で採った試料を調査した。５、７、１０、１２および１４日目の細胞生存率が６０％超である試料を収集した。遠心分離後、抗体およびＦｃ融合タンパク質を、プロテインＡPhyTips（登録商標）（PhyNexus Inc、San Jose、CA）を使用して細胞培養上清から精製した。グリコシル化パターンを、GlycoWorks（商標）RapiFluor-MS（商標）N-Glycanキットを使用して質量分析計と連結した超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ－ＭＳ）によって記載されるとおりに分析した。
流加実験の間のグリカンプロファイルの初期調査は、５－チオ－Ｌ－フコースの高い効率を指し示した。５－チオ－Ｌ－フコース処理を用いたｍＡｂ１の産生は、７、１０および１２日目に対照と比較して夫々６４％、６８％および６７％フコシル化の低減を示した。比較すると、既知のフコース類似体である、２Ｆ－ペルアセチルフコースの同じ濃度の添加は、７、１０および１２日目に、夫々１１％、５０％および５８％の低減しか達成できなかった。このことは、既知のインヒビターである２Ｆ－ペルアセチルフコースと比較して５－チオ－Ｌ－フコースのより高い効率を指し示す。
【0105】
流加におけるより早い５－チオ－Ｌ－フコースの影響を検出するために、ｍＡｂ３の５日目のグリコシル化プロファイルを加えて調査した。５日目に４００μＭの５－チオ－Ｌ－フコース処理を用いて得られた検出されたフコシル化レベルは、既に約４８％という低いレベルであったが、４００μＭのアセチル化２Ｆ－フコースは、５日目に約８４％のフコシル化をもたらし、これは対照において検出された８７％のフコシル化と同様のレベルであった。７、１０、１２および１４日目に対照のフコシル化レベルは、８７％と９０％との間で一定であったが、５－チオ－Ｌ－フコース処理は、コアフコシル化を夫々、約３４％、２５％、２１％、および１８％まで低減させた。比較すると、既知のインヒビターであるアセチル化２Ｆ－フコースは、７、１０、１２および１４日目に、夫々約７８％、７２％、６５％、および５７％までしかフコシル化レベルの低減を示さなかった。したがって、５－チオ－Ｌ－フコースは、バッチまたは灌流プロセスのような短い培養時間での適用についても同様に好ましいであろう。加えて、プロセスを通して添加されるフコース誘導体の必要量を低減するため、またはフコシル化レベルを滴定するために、量の低減または種々の供給体制が適用されてもよい。
【0106】
図９は、（Ａ）ｍＡｂ１または（Ｂ）ｍＡｂ３を産生する流加実験の間の５－チオ－Ｌ－フコースの加速された効果を示す。データは、２つの生物学的複製の平均値±ＳＥＭを表す。
【0107】
例５：５－チオ－Ｌ－フコースの濃度の増大は、より高い組み込みへと導く。
流加の間の５－チオ－Ｌ－フコースの添加を通した種々のフコシル化レベルを達成する能力を、２つのプラットホームおよびｍＡｂ１またはｍＡｂ３のいずれかを産生する２つの異なるクローンを用いて調査した。
細胞を、スピンチューブ内で１４と２０日との間３７℃、５％ＣＯ２、および８０％湿度で培養した。出発する細胞密度として、３０ｍＬのCellvento（登録商標）4CHO培地（ｐＨ７．０±０．１）中３×１０５細胞／ｍＬを、ｍＡｂ１を産生するクローン１について使用したCellvento（登録商標）プラットホーム）。細胞を、３２０ｒｐｍの揺動で培養し、および３、５、１０、１２および１４日目に３％体積のCellvento（登録商標）4Feed（ｖ／ｖ）を用いて、および７日目に６％（ｖ／ｖ）のフィードを用いて供給した。ｍＡｂ３を産生するクローン３を、３０ｍＬのEx-Cell（登録商標）Advanced Media（ｐＨ７．２±０．１）中に同じ細胞密度で播種した一方で、揺動を２３０ｒｐｍにセットした（Ex-Cell（登録商標）プラットホーム）。クローン３を、３、５、７、１０、１２、１４および１７日目に５％のEx-Cell（登録商標）Advanced Feed（ｖ／ｖ）を用いて供給した。
流加の間の５－チオ－Ｌ－フコースの添加を通した種々のフコシル化レベルを達成する能力を、２つのプラットホームおよびｍＡｂ１またはｍＡｂ３のいずれかを産生する２つの異なるクローンを用いて調査した。
細胞を、スピンチューブ内で１４と２０日との間３７℃、５％ＣＯ２、および８０％湿度で培養した。出発する細胞密度として、３０ｍＬのCellvento（登録商標）4CHO培地（ｐＨ７．０±０．１）中３×１０５細胞／ｍＬを、ｍＡｂ１を産生するクローン１について使用したCellvento（登録商標）プラットホーム）。細胞を、３２０ｒｐｍの揺動で培養し、および３、５、１０、１２および１４日目に３％体積のCellvento（登録商標）4Feed（ｖ／ｖ）を用いて、および７日目に６％（ｖ／ｖ）のフィードを用いて供給した。ｍＡｂ３を産生するクローン３を、３０ｍＬのEx-Cell（登録商標）Advanced Media（ｐＨ７．２±０．１）中に同じ細胞密度で播種した一方で、揺動を２３０ｒｐｍにセットした（Ex-Cell（登録商標）プラットホーム）。クローン３を、３、５、７、１０、１２、１４および１７日目に５％のEx-Cell（登録商標）Advanced Feed（ｖ／ｖ）を用いて供給した。
【0108】
フィードを、増大する濃度の５－チオ－Ｌ－フコース、アセチル化５－チオ－Ｌ－フコース、またはアセチル化５－チオ－Ｌ－フコースについて溶媒として使用された夫々の量のＤＭＳＯ（１．１７％）で補充した。すべてのCellvento（登録商標）のフィードのｐＨを、７．０±０．１に調節し、およびEx-Cell（登録商標）のフィードを８．５±０．１に調節した。グルコースレベルは、要求に応じて週内は６ｇ／Ｌまで、および週末にわたっては１３ｇ／Ｌまでの特定の量の４００ｇ／Ｌのグルコースストック溶液を添加することによって４ｇ／Ｌ超を維持した。グルコースおよび力価を、バイオプロセス分析器CEDEX Bio HT（Roche、Mannheim、Germany）を用いて、上清において検出した。
【0109】
ｍＡｂ１を産生するクローン１を用いた用量応答を、２００、４００および８００μＭのアセチル化５－チオ－Ｌ－フコースで実施した（図１０Ａ）。グリコシル化プロファイルを、７、１０および１２日目に調査した。少ない変化しか経時的に検出されなかったため、産生されたＩｇＧのグリカン構造は、３つすべての日の平均値として表される。データは、２００μＭ、４００μＭおよび８００μＭのアセチル化５－チオ－Ｌ－フコースの添加によって、夫々５０％から８１％および８７％まで非天然のフコース類似体の組み込みが増大したことを指し示した。それによって、フコシル化レベルを、両方の対照条件（アセチル化５－チオ－Ｌ－フコースの溶媒として１．１７％のＤＭＳＯを包含する）における９６％のフコシル化と比較して、４６％、１６％および９％低減した。
【0110】
さらにまた、５－チオ－Ｌ－フコースの濃度を増大させる影響を、ｍＡｂ３を産生するクローン３に対して調査した。５０μＭから８００μＭまでの５－チオ－Ｌ－フコースの濃度は、５－チオ－Ｌ－フコースの組み込み量の増大ならびにアフコシル化の量の増大を算出した。最も高い適用濃度である８００μＭの５－チオ－Ｌ－フコースは、約３６％のアフコシル化および約４８％のフコース類似体の組み込みをもたらし、１２日目に約１５％のネイティブなフコシル化グリカンの残存を導いた。その結果として、８００μＭの５－チオ－Ｌ－フコースの添加は、対照と比較して、１２日目に約７５％のフコシル化の低減を可能とした。４００μＭ、２００μＭおよび５０μＭまでの５－チオ－Ｌ－フコースの濃度の段階的な低減は、１２日目に夫々約４４％、３６％および１１％のフコース類似体の組み込みをもたらした。このデータは、５－チオ－Ｌ－フコースの組み込み量は、濃度の慎重な選択によって標的化し得ることを指し示す。
【0111】
図１０は、グリコシル化プロファイルに対する５－チオ－Ｌ－フコースの用量応答を示す。（Ａ）ｍＡｂ１を産生するＣＨＯ細胞株に対するアセチル化５－チオ－Ｌ－フコースの影響。データは、７、１０および１２日目の平均値±ＳＥＭを表す。（Ｂ）ｍＡｂ３を産生するＣＨＯ細胞株に対する５－チオ－Ｌ－フコースの影響。データは、１２日目の２つの生物学的複製の平均値±ＳＥＭを表す。
【0112】
例６：ＦｃγＲＩＩＩａ結合に対する５－チオ－Ｌ－フコース処理の影響
この部分の目的は、チオフコースを含有するプロセスにおいて産生された抗体が、ＦｃｙＲＩＩＩａに高い結合親和性を提示し、およびよってＡＤＣＣが潜在的に増大するか否かを調査することにある。
実に、アフコシル化抗体のＦｃｙＲＩＩＩａへの結合の増大、およびそれによってＡＤＣＣ活性が増強されることは、文献に記載されている。位置１５８におけるフェニルアラニン（Ｆ１５８）またはバリン（Ｖ１５８）残基のいずれかでＦｃγＲＩＩＩａの２つのアイソフォームが知られている。後者のアイソフォームは、Ｆアイソフォームと比較してＩｇＧ１への親和性がより高いことが報告されており、およびこれらの研究のために使用された。
この部分の目的は、チオフコースを含有するプロセスにおいて産生された抗体が、ＦｃｙＲＩＩＩａに高い結合親和性を提示し、およびよってＡＤＣＣが潜在的に増大するか否かを調査することにある。
実に、アフコシル化抗体のＦｃｙＲＩＩＩａへの結合の増大、およびそれによってＡＤＣＣ活性が増強されることは、文献に記載されている。位置１５８におけるフェニルアラニン（Ｆ１５８）またはバリン（Ｖ１５８）残基のいずれかでＦｃγＲＩＩＩａの２つのアイソフォームが知られている。後者のアイソフォームは、Ｆアイソフォームと比較してＩｇＧ１への親和性がより高いことが報告されており、およびこれらの研究のために使用された。
【0113】
５－チオＦｕｃ処理後の試料の結合を、Biacore T200システム（GE Healthcare、Uppsala、Sweden）を使用した表面プラズモン共鳴技術により調査した。分析温度を２５℃に、および試料区画温度を１５℃にセットした。GE HealthcareからのHis capture Kitを使用し、S Sensor Chip CM5シリーズを使用して、アクティブおよび参照フローセルにおいて製造業者の指示に従い、抗Ｈｉｓ抗体を連結した。すべての実験について、固定化レベルを１２１８５±４３６レゾナンスユニット（ＲＵ；１ＲＵ≒１ｐｇ／ｍｍ２）の範囲とした。さらに抗Ｈｉｓ抗体を使用して、AcroBiosystems（Newark、DE、USA)からのHisタグのついたFcγRIIIa V176（CD8-H52H4）を捕捉した。受容体をＨＥＫ２９３細胞において発現させ、および０．０１１μｇ／ｍＬを１０μＬ／ｍｉｎの流速で６０ｓの間に注入して、４．５±０．２ＲＵの補足レベルをもたらした。続いて、ｍＡｂ３を、参照およびアクティブフローセルの両方にわたり、１．９から、５．６、１６．７、５０、１５０および４５０ｎＭの範囲の５つの増大する濃度で、３０μＬ／ｍｉｎの流速にて１５０ｓの間注入した。結合は絶えず記録され、非特異的な結合および注射アーチファクトは自動的に差し引かれた。単一サイクル反応速度論を、３０μＬ／ｍｉｎの流速にて６００ｓの解離時間で使用した。データ収集率を１０Ｈｚで実施した。各実験後、キットの指示に従って両方のフローセルを１０ｍＭのグリシン－ＨＣｌ ｐＨ１．５を用いて３０ｓの間再生させた。３つの技術的複製および２つの生物学的複製のデータを、１：１結合モデルでフィッティングさせた。グローバル解離定数ＫＤは、解離についての運動速度定数（ｋｄ）と会合についての運動速度定数（ｋａ）の値の比率から決定された。データを、対照と比較した倍数変化として表１に提示した。
【0114】
増大した濃度の５－チオ－Ｌ－フコースで処理した細胞は、ＦｃγＲＩＩＩａへの親和性が増大した抗体を産生した。５０μＭの５－チオ－Ｌ－フコースまたは４００μＭの２Ｆ－ＰｅｒＡｃＦｕｃのいずれかで処理して５日目からの試料は、対照と比較して１．２および１．３倍増強した結合を達成した。２００、４００および８００μＭの５－チオ－Ｌ－フコースで処理した試料は、５日目に、対照と比較して、夫々２．０、２．９および２．６倍増大した親和性を示した。後の時点で、ＦｃγＲＩＩＩａへの親和性の増大は、すべての処理された試料について観察された。１２日目に、２．０、３．１、３．８および４．８倍の親和性の増大が、夫々５０、２００、４００および８００μＭの５－チオ－Ｌ－フコース処理で検出された。対照および処理された抗体の同じ一連の濃度の注入から生じるセンサーグラム（図１１）は、１２日目に対照と比較して、５－チオ－Ｌ－フコースで処理した抗体のより高い応答を通したより高い親和性を例証する。加えて、４００μＭの５－チオ－Ｌ－フコースでの処理は、既知のインヒビターである、４００μＭの２Ｆ－ＰｅｒＡｃＦｕｃと比較してわずかに高い結合親和性を示し、このことは３．６倍の親和性の増大を導いた。１４日目に処理された試料は、１２日目と比較して、同様のグリコシル化パターンに起因して、同様のＫＤ値を示した。５－チオ－Ｌ－フコース処理を通して１．７、３．６、４．１および４．５倍に増強された結合は、夫々５０、２００、４００および８００μＭで検出された。
【0115】
表１：５（Ａ）、１２（Ｂ）および１４日目（Ｃ）のＦｃγＲＩＩＩａへのｍＡｂ３の親和性に対する５－チオ－Ｌ－フコース処理の影響。データは、２つの生物学的複製を表す。
【表2】
【表3】
【表4】
【0116】
図１１は、１２日目のｍＡｂ３対照（黒色）または５－チオ－Ｌ－フコース処理されたｍＡｂ３（灰色）へのＦｃγＲＩＩＩａの結合の重ね書きプロットを示す。センサーグラムは、捕捉されたＦｃγＲＩＩＩａへの６から４８６ｎｍまでの一連の濃度の結合レベルを示す（ｎ＝３）。すべてのセンサーグラムは、二重に参照された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
