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特許7702150ＳＴＡＴ３のリン酸化抑制剤、自己免疫疾患及びコロナウイルス感染症の予防又は治療剤
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-06-25
(45)【発行日】2025-07-03
(54)【発明の名称】ＳＴＡＴ３のリン酸化抑制剤、自己免疫疾患及びコロナウイルス感染症の予防又は治療剤
(51)【国際特許分類】
A61K 38/22 20060101AFI20250626BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20250626BHJP
A61P 31/16 20060101ALI20250626BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20250626BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20250626BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20250626BHJP
【ＦＩ】
A61K38/22 ZNA
A61P31/14
A61P31/16
A61P37/06
A61P43/00 111
C07K14/47
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2022533676
(86)(22)【出願日】2021-03-01
(86)【国際出願番号】 JP2021007780
(87)【国際公開番号】W WO2022004054
(87)【国際公開日】2022-01-06
【審査請求日】2024-02-16
(31)【優先権主張番号】P 2020112680
(32)【優先日】2020-06-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】504157024
【氏名又は名称】国立大学法人東北大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】大河内 眞也
(72)【発明者】
【氏名】兼平 雅彦
(72)【発明者】
【氏名】岡田 克典
(72)【発明者】
【氏名】黒澤 一
【審査官】原口 美和
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１３／００８６８１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１６－５２０５８３（ＪＰ，Ａ）
【文献】WU, Y. et al.，Upregulation of stanniocalcin‐1 inhibits the development of osteoarthritis by inhibiting survival a，Journal of Cellular Biochemistry，2019年，Vol. 120，pp. 9768-9780，DOI: 10.1002/jcb.28257
【文献】Innovative Medicine，2015年，pp. 131-147，DOI: 10.1007/978-4-431-55651-0_11
【文献】Cytokine: X，2020年05月14日，Vol. 2, No. 2, 100029，pp. 1-7，DOI: 10.1016/j.cytox.2020.100029
【文献】HUANG, L. et al.，Stanniocalcin-1 inhibits thrombin-induced signaling and protects from bleomycin-induced lung injury，SCIENTIFIC REPORTS，2015年，Vol. 5，article number 18117, pp. 1-13
【文献】ZHAO, J. et al.，Stanniocalcin 2 Ameliorates Hepatosteatosis Through Activation of STAT3 Signaling，Frontiers in Physiology，2018年，Vol. 9, Article 873，pp. 1-8
【文献】BONFANTE, S. et al.， Stanniocalcin 1 Inhibits the Inflammatory Response in Microglia and Protects Against Sepsis-Associa，Neurotoxicity Research，2020年10月06日，Vol. 39，pp. 119-132
【文献】ウイルス，Vol. 69, No. 1，2019年，pp. 61-72，<URL: http://jsv.umin.jp/journal/v69-1pdf/virus69-1_061-072.pdf>
【文献】Free Radical Biology and Medicine，2014年，Vol. 71，pp. 321-331，DOI: 10.1016/j.freeradbiomed.2014.03.034
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３８／２２
Ａ６１Ｐ ３１／１４
Ａ６１Ｐ ４３／００
Ａ６１Ｐ ３１／１６
Ａ６１Ｐ ３７／０６
Ｃ０７Ｋ １４／４７
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
スタニオカルシン１を有効成分として含有する、インフルエンザウイルス感染症の予防又は治療剤。
【請求項2】
スタニオカルシン１を有効成分として含有する、ＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２の発現抑制剤。
【請求項3】
吸入剤である、請求項１に記載のインフルエンザウイルス感染症の予防又は治療剤、又は請求項２に記載のＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２の発現抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０２０年６月３０日に出願された、日本国特許出願第２０２０－１１２６８０号明細書（その開示全体が参照により本明細書中に援用される）に基づく優先権を主張する。本発明は、自己免疫疾患及びコロナウイルス感染症の予防又は治療剤に関する。
本出願は、２０２０年６月３０日に出願された、日本国特許出願第２０２０－１１２６８０号明細書（その開示全体が参照により本明細書中に援用される）に基づく優先権を主張する。本発明は、自己免疫疾患及びコロナウイルス感染症の予防又は治療剤に関する。
【背景技術】
【0002】
呼吸器領域においては、間葉系幹細胞（MSCs：Mesenchymal Stem Cells）の肺障害・線維化抑制作用や抗炎症作用が注目されている（非特許文献３）。また、ＴＮＦ－αやＩＬ－１β、ＣＣＬ２、ＩＬ－６などの炎症性サイトカインは、サイトカインストームにおける重要な因子である。特にＩＬ－６／ＪＡＫ／ＳＴＡＴ伝達経路などを介してＩＬ－６が誘導される仕組みはＩＬ－６ ａｍｐｌｉｆｉｅｒ （ＩＬ－６ ＡＭＰ）と呼ばれ、関節リウマチなどに代表される自己免疫疾患、ＣＯＶＩＤ－１９等の重症化の原因と考えられているサイトカインストームの主要機序となる（非特許文献４）。
【0003】
自己免疫疾患は、免疫系が自分自身の正常な細胞及び／又は組織に対して過剰に反応し攻撃してしまうことにより症状を起こす、免疫寛容の破綻による疾患の総称である。自己免疫疾患に分類される疾患は多数あり、またその中には難病に指定されるものもあるため、その治療方法の開発が望まれている。
【0004】
また、コロナウイルスは、いわゆる風邪の症状を起こすウイルスとして知られているが、突然変異により感染力、毒性が高い株が発生することがあり問題となっている。特に、現在、かかる突然変異株である重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）の感染症であるCoronavirus disease 2019（Ｃｏｖｉｄ－１９）、いわゆる新型コロナウイルス感染症が世界中に広まっており、多くの死者もでているため、その治療法の開発が急がれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特許第５９４６１９１号公報
【非特許文献】
【0006】
【文献】Hoffmann et al. Cell 181, 1-10 (2020)
【文献】東京大学ウエブサイト「新型コロナウイルスの感染阻止が期待される国内既存薬剤の同定」：https://www.ims.u-tokyo.ac.jp/imsut/content/000002328.pdf
【文献】Clin Med Insights Circ Respir Pulm Med. 2015; 9: 91-6
【文献】Immunity. 2020; 52: 731-33.
【文献】Mol Immunol 2007 2497
【文献】ウイルス第69巻 第1号，pp.61-72，2019
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明が解決すべき課題は、ＳＴＡＴ３のリン酸化及びＩＬ６ＡＭＰの新規抑制剤を提供することにある。また、本発明は、ＳＴＡＴ３のリン酸化の抑制により処置し得る疾患の、新たな予防又は治療剤を提供することも課題とする。例えば、本発明が解決すべきさらなる課題は、これまで自己免疫疾患の治療効果について知られていなかった物質を有効成分とする新規の自己免疫疾患予防又は治療剤を提供することにある。さらに、これまでコロナウイルス感染症の治療効果について知られていなかった物質を有効成分とする新規のコロナウイルス感染症予防又は治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0008】
かかる状況の下、本発明者らは数千種類の化合物について検討した結果、スタニオカルシン１（ＳＴＣ１）が、ＩＬ－６／ＪＡＫ／ＳＴＡＴ伝達経路の下流にあるＳＴＡＴ３のリン酸化を抑制することを見出した。さらに、本発明者らは、ＳＴＡＴ３のリン酸化抑制に関連し、ＳＴＣ１を用いることで下記の知見を得た。具体的には、本発明者らは、ＳＴＣ１が、エピジェネティックに抗炎症因子SOCS1の発現を誘導することも見出した。その上、本発明者らは、ＳＴＣ１が、細胞表面にある、コロナウイルスのｓタンパク質の受容体及びウイルス外膜と細胞膜との融合に重要な因子の発現を抑制することにより、コロナウイルスの細胞への感染を抑制することも見出した。本発明は、これらの新規の知見に基づくものである。
【0009】
従って、本発明は、以下の項を提供する：
項１．スタニオカルシン１（ＳＴＣ１）を有効成分として含有する、ＳＴＡＴ３のリン酸化抑制剤。
項１．スタニオカルシン１（ＳＴＣ１）を有効成分として含有する、ＳＴＡＴ３のリン酸化抑制剤。
【0010】
項２．スタニオカルシン１を有効成分として含有する、ＪＡＫの発現又はリン酸化抑制剤。
【0011】
項３．スタニオカルシン１を有効成分として含有する、自己免疫疾患の予防又は治療剤。
【0012】
項４．スタニオカルシン１を有効成分として含有する、インフルエンザウイルス感染症の予防又は治療剤。
【0013】
項５．スタニオカルシン１を有効成分として含有する、コロナウイルス感染症の予防又は治療剤。
【0014】
項６．前記コロナウイルスがＡＣＥ２に結合し得るＳタンパク質を有する、項５に記載のコロナウイルス感染症の予防又は治療剤。
【0015】
項７．前記コロナウイルスが、ＳＡＲＳ関連コロナウイルスである、項５又は６に記載のコロナウイルス感染症の予防又は治療剤。
【0016】
項８．スタニオカルシン１を有効成分として含有する、ＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２の発現抑制剤。
【0017】
項９．スタニオカルシン１を有効成分として含有する、ＩＬ６ＡＭＰの抑制剤。
【0018】
項１０．吸入剤である、項１に記載のＳＴＡＴ３のリン酸化抑制剤、項２に記載のＪＡＫの発現又はリン酸化抑制剤、項３に記載の自己免疫疾患の予防又は治療剤、項４に記載のインフルエンザウイルス感染症の予防又は治療剤、項５～７のいずれか一項に記載のコロナウイルス感染症の予防もしくは治療剤、項８に記載のＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２の発現抑制剤又は項９に記載のＩＬ６ＡＭＰの抑制剤。
【発明の効果】
【0019】
本発明によれば、ＳＴＡＴ３のリン酸化及びＩＬ６ＡＭＰの新規抑制剤を提供することができる。また、本発明は、ＳＴＡＴ３のリン酸化の抑制により処置し得る疾患の、新たな予防又は治療剤を提供する。例えば、本発明は、これまで自己免疫疾患の治療効果について知られていなかった物質を有効成分とする新規の自己免疫疾患予防又は治療剤を提供する。さらに、これまでコロナウイルス感染症の治療効果について知られていなかった物質であるＳＴＣ１を有効成分として用いることによって、新規のコロナウイルス感染症の予防又は治療剤を提供することができる。具体的には、本発明によればＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２の発現抑制を介してコロナウイルスの感染を抑制することができるため、コロナウイルスの感染症の予防及び治療に有用である。また、本発明者らはすでに、ＳＴＣ１が肺線維化を有意に抑制することを見出している（特許文献１）。従って、本発明によれば、コロナウイルス感染症の予防又は治療だけでなく、コロナウイルス感染症が重症化した場合も肺線維化を予防すること、肺線維化が生じてしまった場合もその治療、進行抑制効果が期待できるためさらに有用である。また、肺線維症を抑制し得る薬剤が必ずしもコロナウイルス感染症の予防又は治療を奏するとは限らないため本発明のかかる効果は予想外のものである。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】実施例におけるマウスのブレオマイシン（ＢＬＭ）経気道投与肺障害モデルの概要を示す。
【図2】実施例１におけるWestern Blotting及び定量的PCRの結果を示す。
【図3】STC1がミトコンドリアのTCAサイクルおよびその周辺代謝に及ぼす影響についての概要を示す。
【図4】実施例２におけるWestern Blottingの結果を示す。
【図5】実施例２における半定量的メチル化特異的ＰＣＲの結果を示す。
【図6】実施例２におけるＳＭＡＤ７タンパクのアセチル化の程度の測定結果を示す。
【図7】実施例３におけるヘマトキシリンエオジン染色の結果を示す。
【図8】登録番号NP_003146.1として登録されているヒトＳＴＣ１のアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【図9】実施例４－１）におけるWestern Blottingの結果を示す。
【図10】実施例４－２）におけるWestern Blottingの結果を示す。
【図11】実施例４－３）におけるWestern Blotting（A）、半定量的PCR（B）、半定量的メチル化特異的PCRの結果を示す。
【図12】実施例４－４）におけるWestern Blottingの結果を示す。
【図13】実施例４－５）における免疫沈降の結果を示す。
【図14】実施例４－６）におけるWestern Blottingの結果を示す。
【図15】実施例４－７）におけるWestern Blottingの結果を示す。
【図16】実施例４－８）における動物実験の結果を示す。
【図17】実施例において、明らかにした知見の概念図を示す。
【発明を実施するための形態】
【0021】
ＳＴＡＴ３のリン酸化抑制剤
本発明は、スタニオカルシン１を有効成分として含有する、ＳＴＡＴ３のリン酸化抑制剤を提供する。ＳＴＡＴ３（signal transducer and activator of transcription 3）は、ＳＴＡＴタンパク質ファミリーに属するタンパク質であり、ＩＬ－６／ＪＡＫ／ＳＴＡＴ伝達経路等においてリン酸化され、活性化することが知られている。典型的には、ＳＴＡＴ３としては、アミノ酸配列がＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．NP_001356441.1登録されているもの等が挙げられる。
本発明の有効成分であるＳＴＣ１は、特許文献１等に記載されている公知の成分であり、２量体糖蛋白質ホルモンである。本発明において、ＳＴＣ１としては、動物細胞又は組織等から得られる天然のＳＴＣ１分子であってもよく、天然のＳＴＣ１と同一のアミノ酸配列を有する組換え型ＳＴＣ１、遺伝子工学技術により改変されたＳＴＣ１遺伝子に基づいて産生される組換え型ＳＴＣ１、合成されたＳＴＣ１であってもよい。また、本発明において、ＳＴＣ１としては、ＳＴＣ１の活性フラグメントなどの機能的等価物等であってもよい。従って、本発明において、用語「スタニオカルシン１」（ＳＴＣ１）は、そうでないことを明示しない限り、これらの種々のＳＴＣ１を包含する意味で用いられる。
本発明は、スタニオカルシン１を有効成分として含有する、ＳＴＡＴ３のリン酸化抑制剤を提供する。ＳＴＡＴ３（signal transducer and activator of transcription 3）は、ＳＴＡＴタンパク質ファミリーに属するタンパク質であり、ＩＬ－６／ＪＡＫ／ＳＴＡＴ伝達経路等においてリン酸化され、活性化することが知られている。典型的には、ＳＴＡＴ３としては、アミノ酸配列がＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．NP_001356441.1登録されているもの等が挙げられる。
本発明の有効成分であるＳＴＣ１は、特許文献１等に記載されている公知の成分であり、２量体糖蛋白質ホルモンである。本発明において、ＳＴＣ１としては、動物細胞又は組織等から得られる天然のＳＴＣ１分子であってもよく、天然のＳＴＣ１と同一のアミノ酸配列を有する組換え型ＳＴＣ１、遺伝子工学技術により改変されたＳＴＣ１遺伝子に基づいて産生される組換え型ＳＴＣ１、合成されたＳＴＣ１であってもよい。また、本発明において、ＳＴＣ１としては、ＳＴＣ１の活性フラグメントなどの機能的等価物等であってもよい。従って、本発明において、用語「スタニオカルシン１」（ＳＴＣ１）は、そうでないことを明示しない限り、これらの種々のＳＴＣ１を包含する意味で用いられる。
【0022】
また、本発明において使用されるＳＴＣ１としては、ヒト由来のアミノ酸配列を有するもの又はヒト由来のアミノ酸配列に基づいて機能を損なうことなく改変されたもの（例えば、１個又は数個（例えば、２個、２～３個、２～４個、２～５個）のアミノ酸が、欠失、追加及び／又は置換したもの）が好ましい。ヒトＳＴＣ１のアミノ酸配列及び塩基配列は公知であり、登録番号NP#003146.1、NM#003155.2として登録されている。例えば、登録番号NP_003146.1として登録されているヒトＳＴＣ１のアミノ酸配列を配列番号１に示す。また、多くのヒト以外の動物由来のＳＴＣ１についても、アミノ酸配列及び塩基配列が知られている。これらはいずれも、ヒトのＳＴＣ１に対して高い相同性を有することが知られている（表１）。
【0023】
【表1】
【0024】
従って、本発明の一実施形態において、使用可能なＳＴＣ１としては、ヒトＳＴＣ１のアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９４％以上の相同性を有するものが挙げられる。典型的には、ヒトＳＴＣ１配列（例えば２９３細胞由来のヒトＳＴＣ１配列）と１００％一致するアミノ酸配列を有する、天然又はリコンビナントＳＴＣ１（ｒＳＴＣ１）を用いることがさらに好ましい。本発明においては、これらのＳＴＣ１を１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【0025】
本発明の有効成分であるＳＴＣ１及びその塩は、水和物又は溶媒和物の形で存在することもあるので、これらの水和物及び溶媒和物もまた本発明の有効成分である化合物に包含される。
【0026】
溶媒和物を形成する溶媒としては、エタノール、プロパノール等のアルコール、酢酸等の有機酸、酢酸エチル等のエステル類、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等のエーテル類、アセトン等のケトン類、ＤＭＳＯ等が例示される。これらの溶媒は、１種単独で、又は２種以上を混合溶媒として用いることができる。
【0027】
本発明においては、本発明の有効成分であるＳＴＣ１そのものをＳＴＡＴ３のリン酸化抑制剤として用いても、薬学的に許容される各種担体（例えば、等張化剤、キレート剤、安定化剤、ｐＨ調節剤、防腐剤、抗酸化剤、溶解補助剤、粘稠化剤等）と組み合わせた医薬組成物として用いてもよい。
【0028】
等張化剤としては、例えば、グルコース、トレハロース、ラクトース、フルクトース、マンニトール、キシリトール、ソルビトール等の糖類、グリセリン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等の多価アルコール類、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等の無機塩類等が挙げられる。これらの等張化剤は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【0029】
キレート剤としては、例えば、エデト酸二ナトリウム、エデト酸カルシウム二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、エデト酸四ナトリウム、エデト酸カルシウム等のエデト酸塩類、エチレンジアミン四酢酸塩、ニトリロ三酢酸又はその塩、ヘキサメタリン酸ソーダ、クエン酸等が挙げられる。これらのキレート剤は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【0030】
安定化剤としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム等が挙げられる。
【0031】
ｐＨ調節剤としては、例えば、塩酸、炭酸、酢酸、クエン酸等の酸が挙げられ、さらに水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物、炭酸ナトリウム等のアルカリ金属炭酸塩又は炭酸水素塩、酢酸ナトリウム等のアルカリ金属酢酸塩、クエン酸ナトリウム等のアルカリ金属クエン酸塩、トロメタモール等の塩基等が挙げられる。これらのｐＨ調節剤は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【0032】
防腐剤としては、例えば、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル等のパラオキシ安息香酸エステル、グルコン酸クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム等の第４級アンモニウム塩、アルキルポリアミノエチルグリシン、クロロブタノール、ポリクォード、ポリヘキサメチレンビグアニド、クロルヘキシジン等が挙げられる。これらの防腐剤は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【0033】
抗酸化剤としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム、乾燥亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、濃縮混合トコフェロール等が挙げられる。これらの抗酸化剤は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【0034】
溶解補助剤としては、例えば、安息香酸ナトリウム、グリセリン、Ｄ－ソルビトール、ブドウ糖、プロピレングリコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、Ｄ－マンニトール等が挙げられる。これらの溶解補助剤は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【0035】
粘稠化剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、エチルセルロース、カルメロースナトリウム、キサンタンガム、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等が挙げられる。これらの粘稠化剤は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【0036】
医薬組成物の実施形態において、組成物中のＳＴＣ１の含有量は特に限定されず、例えば、９０質量％以上、７０質量％以上、５０質量％以上、３０質量％以上、１０質量％以上、５質量％以上、１質量％以上等の条件から適宜設定できる。
【0037】
製剤形態は、特に限定されず、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等の経口投与剤；注射剤（静脈注射、筋肉注射、局所注射等）、含嗽剤、点滴剤、外用剤（軟膏、クリーム、貼付薬、吸入薬）、座剤等の非経口投与剤等の各種製剤形態を挙げることができる。上記製剤形態のうち、好ましいものとしては、外用剤等が挙げられ、なかでも吸入薬（経気道投与薬）が挙げられる。
【0038】
本発明において、ＳＴＣ１の投与量は、投与経路、患者の年齢、体重、症状等によって異なり一概に規定できないが、成人に対する１日投与量が通常、約５０００ｍｇ以下、好ましくは約１０００ｍｇ以下になる量とすればよい。ＳＴＣ１の投与量の下限も特に限定されず、例えば、ＳＴＣ１の投与量として、成人に対する１日投与量が通常、０．１ｍｇ以上、好ましくは０．５ｍｇ以上の範囲で適宜設定できる。１日１回投与する場合は、１製剤中にこの量が含まれていればよく、１日３回投与する場合は、１製剤中にこの３分の１量が含まれていればよい。
【0039】
本発明のＳＴＡＴ３のリン酸化抑制剤は、哺乳動物等の患者に投与される。哺乳動物としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ等が挙げられる。
【0040】
自己免疫疾患の予防又は治療剤
本発明は、スタニオカルシン１を有効成分として含有する、自己免疫疾患の予防又は治療剤を提供する。ＩＬ６などのサイトカインがレセプターに結合するとＪＡＫおよびＳＴＡＴのリン酸化が誘導され、急性期タンパクなどの転写が誘導される（非特許文献５）。ＳＯＣＳはＪＡＫのリン酸化を抑制することにより、間接的にＳＴＡＴのリン酸化も抑制する。ＩＬ６／ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路は、関節リウマチ等、自己免疫疾患の発症に関わる重要な経路と考えられ、創薬のターゲットとなっている。ここで、前述のように、本発明者らは、今回、ＳＴＣ１が、ＩＬ－６／ＪＡＫ／ＳＴＡＴ伝達経路の下流にあるＳＴＡＴ３のリン酸化を抑制することを見出した。本発明はこれらの新たな知見に基づくものである。本発明の有効成分であるＳＴＣ１、その水和物及び溶媒和物をも用い得ること等については前述の通りである。
本発明は、スタニオカルシン１を有効成分として含有する、自己免疫疾患の予防又は治療剤を提供する。ＩＬ６などのサイトカインがレセプターに結合するとＪＡＫおよびＳＴＡＴのリン酸化が誘導され、急性期タンパクなどの転写が誘導される（非特許文献５）。ＳＯＣＳはＪＡＫのリン酸化を抑制することにより、間接的にＳＴＡＴのリン酸化も抑制する。ＩＬ６／ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路は、関節リウマチ等、自己免疫疾患の発症に関わる重要な経路と考えられ、創薬のターゲットとなっている。ここで、前述のように、本発明者らは、今回、ＳＴＣ１が、ＩＬ－６／ＪＡＫ／ＳＴＡＴ伝達経路の下流にあるＳＴＡＴ３のリン酸化を抑制することを見出した。本発明はこれらの新たな知見に基づくものである。本発明の有効成分であるＳＴＣ１、その水和物及び溶媒和物をも用い得ること等については前述の通りである。
【0041】
本発明における対象疾患に関し、自己免疫疾患としては、関節リウマチ、キャッスルマン氏病、クローン病、ウエゲナー肉芽腫症、サルコイドーシス、アトピー性皮膚炎、慢性膿皮症、乾癬、肺炎を伴う高IgE症候群等が挙げられる。
【0042】
本発明においては、本発明の有効成分であるＳＴＣ１そのものを自己免疫疾患の予防又は治療剤として用いても、薬学的に許容される各種担体と組み合わせた医薬組成物として用いてもよい。担体としてはＳＴＡＴ３のリン酸化抑制剤に関して前述したものを、前述した量で同様に使用することができる。
【0043】
また、上記医薬組成物は、ＳＴＣ１以外に、自己免疫疾患の予防又は治療作用を有するとされている化合物をさらに含んでいてもよい。自己免疫疾患の予防又は治療作用を有することが知られている化合物としては、例えば、コルチコステロイド（プレドニゾロン等）、ＪＡＫ阻害薬（トファシチニブ等）、カルシニューリン阻害薬（シクロスポリン・タクロリムス等）、ＤＮＡ合成阻害薬（シクロフォスファミド等）、ｍＴＯＲ阻害薬（シロリムス等）、ＩＭＤＨ阻害薬（ミコファノ-ル酸モフェチル等）、抗体製剤 （トシリズマブ、リツキシマブ等）等が挙げられる。これらの化合物は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。医薬組成物の実施形態における組成物中のＳＴＣ１の含有量、製剤形態、投与量、投与対象となる患者等についてもＳＴＡＴ３のリン酸化抑制剤に関して前述したものを同様である。
【0044】
コロナウイルス感染症の予防又は治療剤
本発明は、ＳＴＣ１を含有する、コロナウイルス感染症の予防又は治療剤を提供する。本発明の有効成分であるＳＴＣ１、その水和物及び溶媒和物をも用い得ること等については前述の通りである。
本発明は、ＳＴＣ１を含有する、コロナウイルス感染症の予防又は治療剤を提供する。本発明の有効成分であるＳＴＣ１、その水和物及び溶媒和物をも用い得ること等については前述の通りである。
【0045】
本発明における対象疾患に関し、コロナウイルスとは、コロナウイルス科（Coronaviridae）に属するウイルスを意図する。コロナウイルスとしては、アルファコロナウイルス属、ベータコロナウイルス属等が挙げられ、好ましくはベータコロナウイルス属等が挙げられる。アルファコロナウイルス属としては、ドゥヴィナコウイルス亜属（例えば、HCoV-229E、等）、セトラコウイルス亜属（例えば、HCoV-NL63等）等が挙げられる。ベータコロナウイルス属としては、エンベコウイルス亜属（例えば、HCoV-OC43、HCoV-HKU1等）、サルベコウイルス亜属、メルベコウイルス亜属（例えば、中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS-CoV）等）等が挙げられ、好ましくは、サルベコウイルス亜属等が挙げられる。サルベコウイルス亜属等としては、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（SARSr-CoV）等が挙げられる。SARSr-CoVとしては、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（SARS-CoV）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（SARS-CoV２）等が挙げられる。
【0046】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２等のコロナウイルスの場合はそのエンベロープ上にＳｐｉｋｅタンパク質（Ｓタンパク質）を有し、当該Ｓタンパク質が細胞膜の受容体（ＡＣＥ２）に結合し、その後、タンパク質分解酵素であるＴｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ， ｓｅｒｉｎｅ ２（ＴＭＰＲＳＳ２）によるタンパク質分解を受け、Ｓタンパク質が活性化されることがウイルス外膜と細胞膜との融合には重要であることが知られており、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染にはＡＣＥ２とＴＭＰＲＳＳ２が気道細胞において必須であると考えられている（非特許文献１、非特許文献２）。本発明者らは、肺障害によってＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２の発現が亢進するところ、本発明の予防又は治療剤の有効成分であるＳＴＣ１を用いることにより、当該肺障害の際のＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２の発現亢進を抑制することを見出した。従って、コロナウイルス感染症の予防又は治療剤は、Ｓタンパク質を有するコロナウイルス、典型的にはＡＣＥ２に結合し得るＳタンパク質を有するコロナウイルスに対して特に有効である。
【0047】
本発明においては、本発明の有効成分であるＳＴＣ１そのものをコロナウイルス感染症の予防又は治療剤として用いても、薬学的に許容される各種担体と組み合わせた医薬組成物として用いてもよい。担体としてはＳＴＡＴ３のリン酸化抑制剤に関して前述したものを同様に使用することができる。
【0048】
また、上記医薬組成物は、ＳＴＣ１以外に、コロナウイルス感染症の予防又は治療作用を有するとされている化合物をさらに含んでいてもよい。コロナウイルス感染症の予防又は治療作用を有することが知られている化合物としては、例えば、ファビピラビル、レムデシビル、イベルメクチン、シクレソニド、トシリズマブ、カモスタット、ナファモスタットが挙げられる。これらの化合物は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。医薬組成物の実施形態における組成物中のＳＴＣ１の含有量、製剤形態、投与量、投与対象となる患者等についてもＳＴＡＴ３のリン酸化抑制剤に関して前述したものを同様である。
【0049】
本発明のコロナウイルス感染症の予防又は治療剤の有効成分であるＳＴＣ１は、少なくともＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２の発現抑制をすることによりコロナウイルス感染症を予防、治療及び／又は緩和する。従って、本発明は、ＳＴＣ１を含む、ＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２の発現抑制剤も提供する。また、本発明者らは、ＳＴＣ１が肺線維化を有意に抑制することを見出し、ＳＴＣ１を有効成分として含有する肺線維症の予防、治療及び／又は進行抑制用医薬組成物は特許となっている（特許文献１）。しかし、コロナウイルス感染症が重篤化すると肺線維化が生じることはあるものの、肺の線維化は多種多様な要因により生じ得ることが知られており、コロナウイルス感染症はそれらのうちの１つに過ぎず、肺線維化を治療し得る化合物がコロナウイルスの感染自体を抑えるとは限らないことは明らかである。また、ＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２の発現とＳＴＣ１との関係についてはこれまで報告は一切ない。従って、本発明におけるＳＴＣ１によるＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２の発現抑制効果及びコロナウイルス感染症の予防又は治療効果は従来技術から予想し得ないものである。また、ＴＭＰＲＳＳ２はインフルエンザ（Ａ型、Ｂ型）、その他の呼吸器関連ウイルス等の感染にも重要な役割を果たしていることが報告されている（非特許文献６）。従って、本発明のＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２の発現抑制剤は、呼吸器関連ウイルス（例えば、コロナウイルス、インフルエンザウイルス）等の予防又は治療剤として使用することもできる。尚、ＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２の発現抑制剤、呼吸器関連ウイルスの予防又は治療剤の有効成分、製剤形態、投与量等は、コロナウイルス感染症の予防又は治療剤と同様である。
ＩＬ－６ ＡＭＰの抑制剤
ＡＣＥ２にＳＡＲＳ－ＣｏＶ２が結合すると、本来ＡＣＥ２に結合して分解されるはずのアンギオテンシン２が、ＡＴ１Ｒというレセプターを通してＴＮＦα、ＩＬ６などを誘導する。その結果、ＳＴＡＴ３が活性化され、ＩＬ６の合成がさらに亢進する。これはＩＬ６自身がＩＬ６を増幅するので、ＩＬ６アンプ（ＡＭＰ）と呼ばれており、ＣＯＶＩＤ１９の劇症化に関わると考えられている。また、自然免疫にウイルスが認識され、ＮｆｋＢが活性化する経路も、ＩＬ６ＡＭＰに相加的に働くと考えられている。前述したように、本発明の有効成分であるＳＴＣ１は、ＩＬ－６／ＪＡＫ／ＳＴＡＴ伝達経路を阻害することによりＩＬ－６ ＡＭＰを抑制する。従って、本発明は、ＳＴＣ１を含む、ＩＬ－６ ＡＭＰの抑制剤も提供する。尚、ＩＬ－６ ＡＭＰの抑制剤の有効成分、製剤形態、投与量等は、前記と同様である。
ＩＬ－６ ＡＭＰの抑制剤
ＡＣＥ２にＳＡＲＳ－ＣｏＶ２が結合すると、本来ＡＣＥ２に結合して分解されるはずのアンギオテンシン２が、ＡＴ１Ｒというレセプターを通してＴＮＦα、ＩＬ６などを誘導する。その結果、ＳＴＡＴ３が活性化され、ＩＬ６の合成がさらに亢進する。これはＩＬ６自身がＩＬ６を増幅するので、ＩＬ６アンプ（ＡＭＰ）と呼ばれており、ＣＯＶＩＤ１９の劇症化に関わると考えられている。また、自然免疫にウイルスが認識され、ＮｆｋＢが活性化する経路も、ＩＬ６ＡＭＰに相加的に働くと考えられている。前述したように、本発明の有効成分であるＳＴＣ１は、ＩＬ－６／ＪＡＫ／ＳＴＡＴ伝達経路を阻害することによりＩＬ－６ ＡＭＰを抑制する。従って、本発明は、ＳＴＣ１を含む、ＩＬ－６ ＡＭＰの抑制剤も提供する。尚、ＩＬ－６ ＡＭＰの抑制剤の有効成分、製剤形態、投与量等は、前記と同様である。
【0050】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【実施例】
【0051】
本実施例においては、ヒトリコンビナント（ｒ）ＳＴＣ１は、BioVender社により製造された。具体的には、２９３細胞にＴＡＧ構造を付加したヒト由来ＳＴＣ１遺伝子を導入し、ＴＡＧ配列を用いてｒＳＴＣ１を分離した。以下の実施例において、上記ヒトリコンビナント（ｒ）ＳＴＣ１を単にＳＴＣ１と示すことがある。
【0052】
実施例１
ブレオマイシン肺障害モデルにおいてＳＴＣ１経気道投与はＡＣＥ２とＴＭＰＲＳＳ２の発現を抑制
本実施例においては、マウスのブレオマイシン（ＢＬＭ）経気道投与肺障害モデルを用いた（図１）。具体的には、Ｄａｙ０に、１群６匹ずつのＣ５７ＢＬ６／Ｊマウス（雌、８週齢）に対し、麻酔薬（塩酸ケタミン３００μg＋キシラジン１６０ngを１００μLの生理食塩水に希釈したもの）を腹腔内に投与することにより麻酔した。その後、頚部を切開し気管を露出させ、２３Ｇのサーフロー針の外套を気管に挿入した。さらに、各群のマウス気管内にサーフロー外套から以下の薬剤をそれぞれ投与した。
（ｉ）Ｓａｌｉｎｅ群（コントロール）：生理食塩水５０μＬ
（ｉｉ）ＢＬＭ群：ブレオマイシン含有生理食塩水５０μＬ（ブレオマイシン濃度０．４ｍｇ／ｍｌ）
（ｉｉｉ）ＢＬＭ＋ＳＴＣ１群：ブレオマイシン含有生理食塩水５０μＬ（ブレオマイシン濃度０．４ｍｇ／ｍＬ）
Ｄａｙ１に、上記と同様にして、マウスを麻酔し、各群のマウス気管内にサーフロー外套から以下の薬剤をそれぞれ投与した。
（ｉ）Ｓａｌｉｎｅ群（コントロール）：生理食塩水５０μＬ
（ｉｉ）ＢＬＭ群：生理食塩水５０μＬ
（ｉｉｉ）ＢＬＭ＋ＳＴＣ１群：ＳＴＣ１含有生理食塩水５０μＬ（ＳＴＣ１濃度４０μｇ／ｍＬ）
Ｄａｙ３に各群３匹ずつのマウスに対し、上記と同様の麻酔を施した後、頸動脈を切断することによりマウスを安楽死させ、その後肺を摘出した。さらに、Ｄａｙ１４に各群３匹ずつのマウスに対し、上記と同様の麻酔を施した後、頸動脈を切断することによりマウスを安楽死させ、その後肺を摘出した。
摘出した肺に対し、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った。抗体はＳａｎｔａＣｒｕｚ社の抗ＡＣＥ２抗体（Ｅ－１１，２Ｅ２）、抗ＴＭＰＲＳＳ２抗体（Ｈ８）を使用した。各群のｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇの結果を図２Ａに示す。図２Ａに示すように、ブレオマイシン肺障害により誘導されたＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２の上昇はＳＴＣ１により強力に抑制された。
ブレオマイシン肺障害モデルにおいてＳＴＣ１経気道投与はＡＣＥ２とＴＭＰＲＳＳ２の発現を抑制
本実施例においては、マウスのブレオマイシン（ＢＬＭ）経気道投与肺障害モデルを用いた（図１）。具体的には、Ｄａｙ０に、１群６匹ずつのＣ５７ＢＬ６／Ｊマウス（雌、８週齢）に対し、麻酔薬（塩酸ケタミン３００μg＋キシラジン１６０ngを１００μLの生理食塩水に希釈したもの）を腹腔内に投与することにより麻酔した。その後、頚部を切開し気管を露出させ、２３Ｇのサーフロー針の外套を気管に挿入した。さらに、各群のマウス気管内にサーフロー外套から以下の薬剤をそれぞれ投与した。
（ｉ）Ｓａｌｉｎｅ群（コントロール）：生理食塩水５０μＬ
（ｉｉ）ＢＬＭ群：ブレオマイシン含有生理食塩水５０μＬ（ブレオマイシン濃度０．４ｍｇ／ｍｌ）
（ｉｉｉ）ＢＬＭ＋ＳＴＣ１群：ブレオマイシン含有生理食塩水５０μＬ（ブレオマイシン濃度０．４ｍｇ／ｍＬ）
Ｄａｙ１に、上記と同様にして、マウスを麻酔し、各群のマウス気管内にサーフロー外套から以下の薬剤をそれぞれ投与した。
（ｉ）Ｓａｌｉｎｅ群（コントロール）：生理食塩水５０μＬ
（ｉｉ）ＢＬＭ群：生理食塩水５０μＬ
（ｉｉｉ）ＢＬＭ＋ＳＴＣ１群：ＳＴＣ１含有生理食塩水５０μＬ（ＳＴＣ１濃度４０μｇ／ｍＬ）
Ｄａｙ３に各群３匹ずつのマウスに対し、上記と同様の麻酔を施した後、頸動脈を切断することによりマウスを安楽死させ、その後肺を摘出した。さらに、Ｄａｙ１４に各群３匹ずつのマウスに対し、上記と同様の麻酔を施した後、頸動脈を切断することによりマウスを安楽死させ、その後肺を摘出した。
摘出した肺に対し、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った。抗体はＳａｎｔａＣｒｕｚ社の抗ＡＣＥ２抗体（Ｅ－１１，２Ｅ２）、抗ＴＭＰＲＳＳ２抗体（Ｈ８）を使用した。各群のｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇの結果を図２Ａに示す。図２Ａに示すように、ブレオマイシン肺障害により誘導されたＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２の上昇はＳＴＣ１により強力に抑制された。
【0053】
また定量的ＰＣＲをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社のＡＢＩ７５００ＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲｓｙｓｔｅｍを用いて行った。結果を図２Ｂに示す。図２Ｂに示すように、肺障害によってＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２の発現は亢進した（Ｓａｌｉｎｅ群とＢｌｅｏ群との対比）。そして、図２ＢにおけるＢｌｅｏ群とＢｌｅｏ＋ＳＴＣ１群との対比から明らかなように、ＳＴＣ１の経気道投与は、肺障害時のＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２の発現上昇を抑制した。
前述のように、コロナウイルスの感染には気道細胞におけるＡＣＥ２とＴＭＰＲＳＳ２の存在が必須であるため、上記の結果からＳＴＣ１は、コロナウイルス感染の予防及び治療に有効であると考えられる。また、上記のように肺障害によってＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２の発現が亢進したことから、肺障害によりＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２の発現が更新し、それによりＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２を介してコロナウイルスが細胞内に入り込みやすくなり、さらにコロナウイルス感染症が重症化するという悪循環が生じてしまうことが考えられる。本発明によれば、ＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２発現抑制により、上記悪循環が進むことを抑制できるため有用である。
前述のように、コロナウイルスの感染には気道細胞におけるＡＣＥ２とＴＭＰＲＳＳ２の存在が必須であるため、上記の結果からＳＴＣ１は、コロナウイルス感染の予防及び治療に有効であると考えられる。また、上記のように肺障害によってＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２の発現が亢進したことから、肺障害によりＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２の発現が更新し、それによりＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２を介してコロナウイルスが細胞内に入り込みやすくなり、さらにコロナウイルス感染症が重症化するという悪循環が生じてしまうことが考えられる。本発明によれば、ＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２発現抑制により、上記悪循環が進むことを抑制できるため有用である。
【0054】
【0055】
ＳＴＣ１がＴＧＦβ／ＳＭＡＤシグナル伝達系に及ぼす影響についてｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇと定量的ＰＣＲで解析した。具体的には、リコンビナントＳＴＣ１（５０ｎｇ／ｍｌ）添加した細胞培養液もしくは添加しない細胞培養液の中で、ヒト肺胞上皮細胞株Ａ５４９，Ｈ１２９９、ヒト線維芽細胞株ＭＲＣ５，ＨＦＬ１を２４時間培養した。抗体は、サンタクルーズ社の抗ＳＭＡＤ７抗体（Ｂ８）とＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のＰｈｏｓｐｈｏ－Ｓｍａｄ Ａｎｄｉｂｏｄｙ Ｓａｍｐｌｅｒ Ｋｉｔを使用した。定量的ＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社のＡＢＩ７５００ＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲｓｙｓｔｅｍを用いた。結果を図４Ａ～Ｄに示す。
【0056】
図４に示すように、ＳＴＣ１は肺障害や肺線維化に必要なＳＭＡＤ２／３のリン酸化を抑制した。この効果は、抑制性ＳＭＡＤであるＳＭＡＤ７をＳＴＣ１が誘導したことによるものであった。ＴＧＦｂｅｔａの過剰かつ持続的分泌は、ＳＭＡＤ２／３活性化を介して慢性的な抗酸化ストレスや炎症性サイトカインを惹起する。これらはＣＯＶＩＤ１９等のコロナウイルス感染症重症化（肺障害等）に関与するサイトカインストームに関わる。従って、上記結果から、ＳＴＣ１によるＳＭＡＤ２／３のリン酸化抑制によって、炎症性サイトカインの持続分泌を抑制することにより、コロナ感染症や重症肺炎の肺障害を回避し得るものと考えられる。
ＳＴＣ１がＳＭＡＤ７遺伝子のプロモーター領域のメチル化に及ぼす影響を図５に示す。ＳＴＣ１がＳＭＡＤ７遺伝子のプロモーター領域のメチル化に及ぼす影響については定量的メチル化特異的ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）で解析した。具体的には、各細胞から抽出したゲノミックＤＮＡをバイサルファイト処理（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ－Ｗａｋｏ、ＥｐｉＳｉｇｈｔTM Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２）し、メチル化特異的ＰＣＲ用のポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ Ｅｐｉｓｃｏｐｅ ＭＳＰ ｋｉｔ）とＡＢＩ７５００ＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲｓｙｓｔｅｍを用いて行った。図５に示すように、ＳＴＣ１はＳＭＡＤ７の脱メチル化も誘導した。
ＳＴＣ１がＳＭＡＤ７タンパクのアセチル化に及ぼす影響を図６に示す。ＳＴＣ１がマウスの肺のＳＭＡＤ７に及ぼす影響については、マウスの摘出肺に対する蛍光免疫染色にて解析した。具体的には、実施例１で使用した肺を薄切し、プレパラートに固着させ、ＳＭＡＤ７抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社Ｂ８）、抗アセチル化リジン抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（Ａｃ－Ｋ－１０３）、核染色（ＤＡＣＯ社ＤＡＰＩ）にＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社のＡｌｅｘａ－４８８抗体、Ａｌｅｘａ５９４抗体を組み合わせて、位相差顕微鏡を用いることにより検討した。
結果を図６に示す。図６に示すようにＳＴＣ１はＳＭＡＤ７リジン基のアセチル化も誘導した。ＳＭＡＤ７はアセチル化されることにより、安定して発現できる。すなわちＳＴＣ１はＳＭＡＤ７のエピジェネティックな調整を通してＳＭＡＤ７の発現を増強させていることが明らかとなった。
ＳＴＣ１がＳＭＡＤ７遺伝子のプロモーター領域のメチル化に及ぼす影響を図５に示す。ＳＴＣ１がＳＭＡＤ７遺伝子のプロモーター領域のメチル化に及ぼす影響については定量的メチル化特異的ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）で解析した。具体的には、各細胞から抽出したゲノミックＤＮＡをバイサルファイト処理（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ－Ｗａｋｏ、ＥｐｉＳｉｇｈｔTM Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２）し、メチル化特異的ＰＣＲ用のポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ Ｅｐｉｓｃｏｐｅ ＭＳＰ ｋｉｔ）とＡＢＩ７５００ＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲｓｙｓｔｅｍを用いて行った。図５に示すように、ＳＴＣ１はＳＭＡＤ７の脱メチル化も誘導した。
ＳＴＣ１がＳＭＡＤ７タンパクのアセチル化に及ぼす影響を図６に示す。ＳＴＣ１がマウスの肺のＳＭＡＤ７に及ぼす影響については、マウスの摘出肺に対する蛍光免疫染色にて解析した。具体的には、実施例１で使用した肺を薄切し、プレパラートに固着させ、ＳＭＡＤ７抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社Ｂ８）、抗アセチル化リジン抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（Ａｃ－Ｋ－１０３）、核染色（ＤＡＣＯ社ＤＡＰＩ）にＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社のＡｌｅｘａ－４８８抗体、Ａｌｅｘａ５９４抗体を組み合わせて、位相差顕微鏡を用いることにより検討した。
結果を図６に示す。図６に示すようにＳＴＣ１はＳＭＡＤ７リジン基のアセチル化も誘導した。ＳＭＡＤ７はアセチル化されることにより、安定して発現できる。すなわちＳＴＣ１はＳＭＡＤ７のエピジェネティックな調整を通してＳＭＡＤ７の発現を増強させていることが明らかとなった。
【0057】
【0058】
実施例４
ＳＴＡＴ３リン酸化、ＩＬ－６ＡＭＰ等に対するＳＴＣ１の影響の評価 ＜方法＞
・細胞実験
ヒト由来単球細胞ＴＨＰ１細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ニチレイ）および１％ペ二リシンストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）含有ＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ）で２４時間培養したあと、ホルポール１２－ミリスタート１３アセタート（ＰＭＡ）１０ｕＭ添加することによりマクロファージに分化させた。ＰＭＡを加えてから２４時間後に、ヒトリコンビナントＩＬ６を添加しない群、ＩＬ６を１０ｎｇ／ｍｌ添加する群、ＩＬ６を５０ｎｇ／ｍｌ添加する群の３群を用意し、さらにそれらにＳＴＣ１を５０ｎｇ／ｍｌ添加しない群、添加する群を用意、即ち３×２の６群を用意した。それらの条件で２４時間培養後、ウエスタンブロット、免疫沈降、ＰＣＲ、メチル化特異的ＰＣＲ、ｓｉＲＮＡを用いた特異的遺伝子転写の抑制を行った。
・動物実験
本実施例においては、マウスのブレオマイシン（ＢＬＭ）経気道投与肺障害モデルを用いた。
具体的には、実施例１に記載の方法に従い、ブレオマイシン（ＢＬＭ）経気道投与肺障害モデルマウスを用意し、Ｄａｙ３及びＤａｙ１４に各群３匹ずつのマウスから肺を摘出した。
・ウエスタンブロットの方法
ＲＩＰＡバッファーによるＴＨＰ１細胞全抽出液もしくはマウス摘出肺抽出液とＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによる電気泳動後、細胞もしくは組織由来タンパクをＰＶＤＦメンブレンに転写し、１次抗体およびＨＲＰ結合２次抗体でインキュベートした後、発色基質で発色させ、ケミルミノメーターでタンパクの発現を測定した。
ウエスタンブロットに用いた一次抗体は以下の通り。
抗ＳＴＡＴ３抗体（セルシグナリングテクノロジー社（ＣＳＴ），１２６４０）、抗ｐＳＴＡＴ３抗体（ＣＳＴ，９１４５）、抗ＳＯＣＳ１抗体（ＣＳＴ，３９５０）、抗ＩＬ６抗体（ＣＳＴ，１２１５３）、抗ＪＡＫ１抗体（ＣＳＴ，３３４４）、抗ｐＪＡＫ１抗体（ＣＳＴ，７４１２９）抗体、抗Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ抗体（ＣＳＴ，５８３９５）、抗ＡＣＥ２抗体（サンタクルーズ社（ＳＣ），３９０８５１）、抗ＴＭＰＲＳＳ２抗体（ＳＣ，５１５７２７）、抗βＡＣＴＩＮ抗体（Ｒ＆Ｄ，ＭＡＢ８９２９）。２次抗体はそれぞれの動物種に適合したＨＲＰ結合抗体を用いた。
・免疫沈降の方法
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇ ｐｌｕｓ ａｇａｒｏｓｅ （ＳＣ，２００３）と、抗ＪＡＫ１抗体（ＳＣ，１６７７）を結合させた後に、ＲＩＰＡバッファーによるＴＨＰ１細胞全抽出液もしくはマウス摘出肺抽出液を加えることにより、これら抽出液のＪＡＫ１およびＪＡＫ１に結合するタンパクを回収した。還元液とともに煮沸することにより、ＪＡＫ１タンパクとＪＡＫ１に結合するタンパクを分離した。
・半定量的ＰＣＲ
ＴＨＰ１細胞およびマウス肺組織より、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｍＲＮＡを分離後、ｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｃｄｎａ ｋｉｔ （ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にてｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡを作成した。プライマーは、ｐｒｉｍｅｒ ｂｌａｓｔ （ＮＣＢＩ）を用いて設計し、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ＭｉｘおよびＡＢＩ７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて半定量的ＰＣＲを行った。
・メチル化特異的ＰＣＲ
Ｍｅｔｈｙｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウエア （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＳＯＣＳ１遺伝子のプロモーター領域のメチル化および脱メチル化プライマーを設計した。THP1細胞からＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ）を用いて抽出したゲノミックＤＮＡをバイサルファイト処理（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ－Ｗａｋｏ、ＥｐｉＳｉｇｈｔTM Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２）し、メチル化特異的ＰＣＲ用のポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ Ｅｐｉｓｃｏｐｅ ＭＳＰ ｋｉｔ）とＡＢＩ７５００ＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲｓｙｓｔｅｍを用いて行った。
・ｓｉＲＮＡ
ＳＯＣＳ１特異的ｓｉＲＮＡおよびコントロールｓｉＲＮＡはＰｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄ ｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いた。トランスフェクション試薬はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。
ＳＴＡＴ３リン酸化、ＩＬ－６ＡＭＰ等に対するＳＴＣ１の影響の評価 ＜方法＞
・細胞実験
ヒト由来単球細胞ＴＨＰ１細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ニチレイ）および１％ペ二リシンストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）含有ＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ）で２４時間培養したあと、ホルポール１２－ミリスタート１３アセタート（ＰＭＡ）１０ｕＭ添加することによりマクロファージに分化させた。ＰＭＡを加えてから２４時間後に、ヒトリコンビナントＩＬ６を添加しない群、ＩＬ６を１０ｎｇ／ｍｌ添加する群、ＩＬ６を５０ｎｇ／ｍｌ添加する群の３群を用意し、さらにそれらにＳＴＣ１を５０ｎｇ／ｍｌ添加しない群、添加する群を用意、即ち３×２の６群を用意した。それらの条件で２４時間培養後、ウエスタンブロット、免疫沈降、ＰＣＲ、メチル化特異的ＰＣＲ、ｓｉＲＮＡを用いた特異的遺伝子転写の抑制を行った。
・動物実験
本実施例においては、マウスのブレオマイシン（ＢＬＭ）経気道投与肺障害モデルを用いた。
具体的には、実施例１に記載の方法に従い、ブレオマイシン（ＢＬＭ）経気道投与肺障害モデルマウスを用意し、Ｄａｙ３及びＤａｙ１４に各群３匹ずつのマウスから肺を摘出した。
・ウエスタンブロットの方法
ＲＩＰＡバッファーによるＴＨＰ１細胞全抽出液もしくはマウス摘出肺抽出液とＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによる電気泳動後、細胞もしくは組織由来タンパクをＰＶＤＦメンブレンに転写し、１次抗体およびＨＲＰ結合２次抗体でインキュベートした後、発色基質で発色させ、ケミルミノメーターでタンパクの発現を測定した。
ウエスタンブロットに用いた一次抗体は以下の通り。
抗ＳＴＡＴ３抗体（セルシグナリングテクノロジー社（ＣＳＴ），１２６４０）、抗ｐＳＴＡＴ３抗体（ＣＳＴ，９１４５）、抗ＳＯＣＳ１抗体（ＣＳＴ，３９５０）、抗ＩＬ６抗体（ＣＳＴ，１２１５３）、抗ＪＡＫ１抗体（ＣＳＴ，３３４４）、抗ｐＪＡＫ１抗体（ＣＳＴ，７４１２９）抗体、抗Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ抗体（ＣＳＴ，５８３９５）、抗ＡＣＥ２抗体（サンタクルーズ社（ＳＣ），３９０８５１）、抗ＴＭＰＲＳＳ２抗体（ＳＣ，５１５７２７）、抗βＡＣＴＩＮ抗体（Ｒ＆Ｄ，ＭＡＢ８９２９）。２次抗体はそれぞれの動物種に適合したＨＲＰ結合抗体を用いた。
・免疫沈降の方法
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇ ｐｌｕｓ ａｇａｒｏｓｅ （ＳＣ，２００３）と、抗ＪＡＫ１抗体（ＳＣ，１６７７）を結合させた後に、ＲＩＰＡバッファーによるＴＨＰ１細胞全抽出液もしくはマウス摘出肺抽出液を加えることにより、これら抽出液のＪＡＫ１およびＪＡＫ１に結合するタンパクを回収した。還元液とともに煮沸することにより、ＪＡＫ１タンパクとＪＡＫ１に結合するタンパクを分離した。
・半定量的ＰＣＲ
ＴＨＰ１細胞およびマウス肺組織より、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｍＲＮＡを分離後、ｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｃｄｎａ ｋｉｔ （ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にてｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡを作成した。プライマーは、ｐｒｉｍｅｒ ｂｌａｓｔ （ＮＣＢＩ）を用いて設計し、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ＭｉｘおよびＡＢＩ７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて半定量的ＰＣＲを行った。
・メチル化特異的ＰＣＲ
Ｍｅｔｈｙｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウエア （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＳＯＣＳ１遺伝子のプロモーター領域のメチル化および脱メチル化プライマーを設計した。THP1細胞からＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ）を用いて抽出したゲノミックＤＮＡをバイサルファイト処理（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ－Ｗａｋｏ、ＥｐｉＳｉｇｈｔTM Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２）し、メチル化特異的ＰＣＲ用のポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ Ｅｐｉｓｃｏｐｅ ＭＳＰ ｋｉｔ）とＡＢＩ７５００ＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲｓｙｓｔｅｍを用いて行った。
・ｓｉＲＮＡ
ＳＯＣＳ１特異的ｓｉＲＮＡおよびコントロールｓｉＲＮＡはＰｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄ ｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いた。トランスフェクション試薬はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。
【0059】
＜結果＞
（ＴＨＰ１細胞データ）
１）ＳＴＣ１はＴＨＰ１細胞におけるＩＬ６誘導性のＳＴＡＴ３リン酸化を強力に抑制する
上記方法に従いＩＬ６（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ６（５０ｎｇ／ｍｌ）及び／又はＳＴＣ１（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＴＨＰ１細胞ならびにこれらを添加していないＴＨＰ１細胞（コントロール）の細胞全抽出液におけるＳＴＡＴ３及びリン酸化ＳＴＡＴ３の有無をウエスタンブロットで測定した結果を図９に示す。図９に示すように、ＳＴＣ１はＩＬ６が誘導するＳＴＡＴ３リン酸化を抑制した。
すなわちＳＴＣ１はＩＬ６誘導性のＳＴＡＴ３リン酸化を抑制することにより、サイトカイン症候群および様々な自己免疫性疾患の治療に役立つ。
（ＴＨＰ１細胞データ）
１）ＳＴＣ１はＴＨＰ１細胞におけるＩＬ６誘導性のＳＴＡＴ３リン酸化を強力に抑制する
上記方法に従いＩＬ６（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ６（５０ｎｇ／ｍｌ）及び／又はＳＴＣ１（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＴＨＰ１細胞ならびにこれらを添加していないＴＨＰ１細胞（コントロール）の細胞全抽出液におけるＳＴＡＴ３及びリン酸化ＳＴＡＴ３の有無をウエスタンブロットで測定した結果を図９に示す。図９に示すように、ＳＴＣ１はＩＬ６が誘導するＳＴＡＴ３リン酸化を抑制した。
すなわちＳＴＣ１はＩＬ６誘導性のＳＴＡＴ３リン酸化を抑制することにより、サイトカイン症候群および様々な自己免疫性疾患の治療に役立つ。
【0060】
２）ＳＴＣ１はＴＨＰ１細胞におけるＩＬ６誘導性のＩＬ６産生増強（ＩＬ６アンプ）を抑制する
上記方法に従いＩＬ６（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ６（５０ｎｇ／ｍｌ）及び／又はＳＴＣ１（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＴＨＰ１細胞ならびにこれらを添加していないＴＨＰ１細胞（コントロール）の細胞全抽出液におけるＩＬ６の有無をウエスタンブロットで測定した結果を図１０に示す。図１０に示すようにＳＴＣ１はＩＬ６が誘導するＩＬ６産生増強（ＩＬ６アンプ）を抑制した。
すなわちＳＴＣ１はＩＬ６誘導性のＩＬ６増幅（ＩＬ６アンプ）を抑制することにより、サイトカイン症候群および様々な自己免疫性疾患の治療に役立つ。
上記方法に従いＩＬ６（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ６（５０ｎｇ／ｍｌ）及び／又はＳＴＣ１（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＴＨＰ１細胞ならびにこれらを添加していないＴＨＰ１細胞（コントロール）の細胞全抽出液におけるＩＬ６の有無をウエスタンブロットで測定した結果を図１０に示す。図１０に示すようにＳＴＣ１はＩＬ６が誘導するＩＬ６産生増強（ＩＬ６アンプ）を抑制した。
すなわちＳＴＣ１はＩＬ６誘導性のＩＬ６増幅（ＩＬ６アンプ）を抑制することにより、サイトカイン症候群および様々な自己免疫性疾患の治療に役立つ。
【0061】
３）ＳＴＣ１はＴＨＰ１細胞においてＳＯＣＳ１を誘導する
上記方法に従いＩＬ６（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ６（５０ｎｇ／ｍｌ）及び／又はＳＴＣ１（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＴＨＰ１細胞ならびにこれらを添加していないＴＨＰ１細胞（コントロール）の細胞全抽出液におけるＳＯＣＳ１のウエスタンブロット（図１１Ａ）、細胞全抽出液ｍＲＮＡを用いたＳＯＣＳ１ｍＲＮＡの半定量的ＰＣＲ法（図１１Ｂ）、細胞全抽出液ＤＮＡを用いたＳＯＣＳ１遺伝子プロモーター領域のメチル化の程度を、メチル化特異的ＰＣＲ法で測定した結果（図１１Ｃ）を示す。
図１１Ａに示すように、ＳＴＣ１はＳＯＣＳ１タンパクの産生を増強した。また、図１１Ｂに示すように、ＳＴＣ１はＳＯＣＳ１のｍＲＮＡ産生を増強した。図１１Ｃに示すように、ＳＴＣ１はＳＯＣＳ１遺伝子プロモーター領域のメチル化を抑制した。図１１Ａ―Ｃの結果は、いずれもＳＴＣ１によるＳＯＣＳ１タンパクの産生亢進を意味する。
すなわち、ＳＴＣ１はＪＡＫを抑制する作用を持つＳＯＣＳ１を誘導することにより、サイトカイン症候群および様々な自己免疫性疾患の治療に役立つ。
上記方法に従いＩＬ６（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ６（５０ｎｇ／ｍｌ）及び／又はＳＴＣ１（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＴＨＰ１細胞ならびにこれらを添加していないＴＨＰ１細胞（コントロール）の細胞全抽出液におけるＳＯＣＳ１のウエスタンブロット（図１１Ａ）、細胞全抽出液ｍＲＮＡを用いたＳＯＣＳ１ｍＲＮＡの半定量的ＰＣＲ法（図１１Ｂ）、細胞全抽出液ＤＮＡを用いたＳＯＣＳ１遺伝子プロモーター領域のメチル化の程度を、メチル化特異的ＰＣＲ法で測定した結果（図１１Ｃ）を示す。
図１１Ａに示すように、ＳＴＣ１はＳＯＣＳ１タンパクの産生を増強した。また、図１１Ｂに示すように、ＳＴＣ１はＳＯＣＳ１のｍＲＮＡ産生を増強した。図１１Ｃに示すように、ＳＴＣ１はＳＯＣＳ１遺伝子プロモーター領域のメチル化を抑制した。図１１Ａ―Ｃの結果は、いずれもＳＴＣ１によるＳＯＣＳ１タンパクの産生亢進を意味する。
すなわち、ＳＴＣ１はＪＡＫを抑制する作用を持つＳＯＣＳ１を誘導することにより、サイトカイン症候群および様々な自己免疫性疾患の治療に役立つ。
【0062】
４）ＳＴＣ１はＴＨＰ１細胞におけるＪＡＫ１の発現およびリン酸化を抑制する
上記方法に従いＩＬ６（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ６（５０ｎｇ／ｍｌ）及び／又はＳＴＣ１（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＴＨＰ１細胞ならびにこれらを添加していないＴＨＰ１細胞（コントロール）の細胞全抽出液におけるＪＡＫ１及びＪＡＫ１リン酸化の有無をウエスタンブロットで測定した結果を図１２に示す。図１２に示すように、ＳＴＣ１はＪＡＫ１の発現およびリン酸化を抑制した。
上記方法に従いＩＬ６（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ６（５０ｎｇ／ｍｌ）及び／又はＳＴＣ１（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＴＨＰ１細胞ならびにこれらを添加していないＴＨＰ１細胞（コントロール）の細胞全抽出液におけるＪＡＫ１及びＪＡＫ１リン酸化の有無をウエスタンブロットで測定した結果を図１２に示す。図１２に示すように、ＳＴＣ１はＪＡＫ１の発現およびリン酸化を抑制した。
【0063】
５）ＳＴＣ１はＩＬ６の存在下では、ＴＨＰ１細胞におけるＳＯＣＳ１とＪＡＫ１の結合を促進し、ＪＡＫ１のユビキチン化を促進する（免疫沈降）
上記方法に従いＩＬ６（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ６（５０ｎｇ／ｍｌ）及び／又はＳＴＣ１（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＴＨＰ１細胞ならびにこれらを添加していないＴＨＰ１細胞（コントロール）の細胞全抽出液を免疫沈降した結果を図１３に示す。免疫沈降はＴＨＰ１全細胞溶解物を使用し、ＪＡＫ抗体とＡ／Ｇアガロースゲルを用いて、ＪＡＫ１とＪＡＫ１結合タンパク質を回収し、還元剤を加え煮沸後にウエスタンブロットを行った。図１３に示すように、ＩＬ６存在下ではＪＡＫ１に結合するＳＯＣＳ１は減少するが、ＳＴＣ１が存在するとＪＡＫ１に結合するＳＯＣＳ１が増加する。それに従ってＪＡＫ１のユビキチン化も促進することが明らかとなった。すなわちＳＴＣ１はＪＡＫ１とＳＯＣＳ１の結合を促進し、ＪＡＫ１のユビキチン化（ＪＡＫ１の分解）を亢進させる。
上記方法に従いＩＬ６（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ６（５０ｎｇ／ｍｌ）及び／又はＳＴＣ１（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＴＨＰ１細胞ならびにこれらを添加していないＴＨＰ１細胞（コントロール）の細胞全抽出液を免疫沈降した結果を図１３に示す。免疫沈降はＴＨＰ１全細胞溶解物を使用し、ＪＡＫ抗体とＡ／Ｇアガロースゲルを用いて、ＪＡＫ１とＪＡＫ１結合タンパク質を回収し、還元剤を加え煮沸後にウエスタンブロットを行った。図１３に示すように、ＩＬ６存在下ではＪＡＫ１に結合するＳＯＣＳ１は減少するが、ＳＴＣ１が存在するとＪＡＫ１に結合するＳＯＣＳ１が増加する。それに従ってＪＡＫ１のユビキチン化も促進することが明らかとなった。すなわちＳＴＣ１はＪＡＫ１とＳＯＣＳ１の結合を促進し、ＪＡＫ１のユビキチン化（ＪＡＫ１の分解）を亢進させる。
【0064】
６）ＳＴＣ１はＴＨＰ１細胞においてＩＬ６が誘導するＡＣＥ２，ＴＭＰＲＳＳ２の発現を抑制する。
上記方法に従いＩＬ６（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ６（５０ｎｇ／ｍｌ）及び／又はＳＴＣ１（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＴＨＰ１細胞ならびにこれらを添加していないＴＨＰ１細胞（コントロール）の細胞全抽出液をウエスタンブロットした結果を図１４に示す。図１４に示すように、ＳＴＣ１はＡＣＥ２とＴＭＰＲＳＳ２の発現を抑制した。従って、ＳＴＣ１はＡＣＥ２とＴＭＰＲＳＳ２の発現を抑制することによりＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の細胞への感染機会を減少させる可能性がある。
上記方法に従いＩＬ６（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ６（５０ｎｇ／ｍｌ）及び／又はＳＴＣ１（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＴＨＰ１細胞ならびにこれらを添加していないＴＨＰ１細胞（コントロール）の細胞全抽出液をウエスタンブロットした結果を図１４に示す。図１４に示すように、ＳＴＣ１はＡＣＥ２とＴＭＰＲＳＳ２の発現を抑制した。従って、ＳＴＣ１はＡＣＥ２とＴＭＰＲＳＳ２の発現を抑制することによりＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の細胞への感染機会を減少させる可能性がある。
【0065】
７）ＳＴＣ１はＳＯＣＳ１依存性にＡＣＥ２，ＴＭＰＲＳＳ２の発現を抑制する。
上記方法に従いＩＬ６（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ６（５０ｎｇ／ｍｌ）及び／又はＳＴＣ１（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＴＨＰ１細胞ならびにこれらを添加していないＴＨＰ１細胞（コントロール）において、ｓｉＲＮＡを用いて、ＳＯＣＳ１を抑制した場合のウエスタンブロットの結果を図１５に示す。ｓｉＣＴＲはコントロール群であり、ＳＯＣＳ１が正常と同じ場合の挙動を示す。図１５に示すように、ＳＴＣ１がＴＨＰ１細胞に誘導するＡＣＥ２，ＴＭＰＲＳＳ２誘導抑制効果はｓｉＲＮＡを用いてＳＯＣＳ１をノックダウンすると消失した。このことは、ＳＴＣ１によるＡＣＥ２，ＴＭＰＲＳＳ２抑制作用はＳＯＣＳ１依存性であることを示す。
（動物モデル：マウス・ブレオマイシン経気道投与モデル、肺に炎症が起きている状態）
上記方法に従いＩＬ６（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ６（５０ｎｇ／ｍｌ）及び／又はＳＴＣ１（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＴＨＰ１細胞ならびにこれらを添加していないＴＨＰ１細胞（コントロール）において、ｓｉＲＮＡを用いて、ＳＯＣＳ１を抑制した場合のウエスタンブロットの結果を図１５に示す。ｓｉＣＴＲはコントロール群であり、ＳＯＣＳ１が正常と同じ場合の挙動を示す。図１５に示すように、ＳＴＣ１がＴＨＰ１細胞に誘導するＡＣＥ２，ＴＭＰＲＳＳ２誘導抑制効果はｓｉＲＮＡを用いてＳＯＣＳ１をノックダウンすると消失した。このことは、ＳＴＣ１によるＡＣＥ２，ＴＭＰＲＳＳ２抑制作用はＳＯＣＳ１依存性であることを示す。
（動物モデル：マウス・ブレオマイシン経気道投与モデル、肺に炎症が起きている状態）
【0066】
８）ＳＴＣ１はブレオマイシン経気道投与によりマウス肺で誘導されるＪＡＫ１の発現誘導、ＪＡＫ１のリン酸化、ＡＣＥ２，ＴＭＰＲＳＳ２発現上昇を抑制する。
上記方法に従い動物（Ｃ５７ＢＬ６マウス）に生理食塩水もしくはブレオマイシンを溶解した生理食塩水を経気管投与し、ブレオマイシンを溶解した生理食塩水を経気管投与群においては、翌日に生理食塩水もしくはＳＴＣ１溶解生理食塩水液を経気管投与し、３日後・１４日後に肺組織を回収しウエスタンブロットした結果を図１６に示す。図１６に示すように、ＳＴＣ１はブレオマイシン惹起された炎症によるＪＡＫ１のリン酸化、ＳＴＡＴ３のリン酸化、ＡＣＥ２の発現上昇、ＴＭＰＲＳＳ２の発現上昇を抑制した。従って、ＳＴＣ１の経気道投与は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ３経路を抑制すると同時にＡＣＥ２，ＴＭＰＲＳＳ２の発現を抑制する。即ち、ＣＯＶＩＤ１９おいてサイトカイン放出症候群を抑制し、ＡＣＥ２、ＴＭＰＲＳＳ２の発現を抑制することにより、ＣＯＶＩＤ１９の感染および重症化を抑制する可能性がある。
図１７に今回明らかにしたＳＴＣ１の作用機序をまとめる。
上記方法に従い動物（Ｃ５７ＢＬ６マウス）に生理食塩水もしくはブレオマイシンを溶解した生理食塩水を経気管投与し、ブレオマイシンを溶解した生理食塩水を経気管投与群においては、翌日に生理食塩水もしくはＳＴＣ１溶解生理食塩水液を経気管投与し、３日後・１４日後に肺組織を回収しウエスタンブロットした結果を図１６に示す。図１６に示すように、ＳＴＣ１はブレオマイシン惹起された炎症によるＪＡＫ１のリン酸化、ＳＴＡＴ３のリン酸化、ＡＣＥ２の発現上昇、ＴＭＰＲＳＳ２の発現上昇を抑制した。従って、ＳＴＣ１の経気道投与は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ３経路を抑制すると同時にＡＣＥ２，ＴＭＰＲＳＳ２の発現を抑制する。即ち、ＣＯＶＩＤ１９おいてサイトカイン放出症候群を抑制し、ＡＣＥ２、ＴＭＰＲＳＳ２の発現を抑制することにより、ＣＯＶＩＤ１９の感染および重症化を抑制する可能性がある。
図１７に今回明らかにしたＳＴＣ１の作用機序をまとめる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【配列表】