特許 7702954 抗ＯＸ４０抗体およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-06-26

(45)【発行日】2025-07-04

(54)【発明の名称】抗ＯＸ４０抗体およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20250627BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20250627BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20250627BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20250627BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20250627BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20250627BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20250627BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20250627BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20250627BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20250627BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20250627BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20250627BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20250627BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20250627BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28 ZNA

C12N15/13

C12P21/08

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K39/395 N

A61K47/68

A61K48/00

A61P35/00

A61P35/02

A61P37/04

A61K39/395 Y

【請求項の数】 26

(21)【出願番号】P 2022539717

(86)(22)【出願日】2020-12-28

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-01

(86)【国際出願番号】 CN2020140186

(87)【国際公開番号】W WO2021129872

(87)【国際公開日】2021-07-01

【審査請求日】2023-12-21

(31)【優先権主張番号】201911383060.5

(32)【優先日】2019-12-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】63/041,532

(32)【優先日】2020-06-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】524074633

【氏名又は名称】ハイファイバイオ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100107386

【弁理士】

【氏名又は名称】泉谷 玲子

(72)【発明者】

【氏名】チャン，ホンカイ

(72)【発明者】

【氏名】ワン，ユエン

(72)【発明者】

【氏名】ルー，ユン－ユー

(72)【発明者】

【氏名】シェン，ユーチャン

(72)【発明者】

【氏名】ベルトラミネッリ・ニコラ・アルトゥーロ・アルド

(72)【発明者】

【氏名】シュヴァイツァー，リャン

(72)【発明者】

【氏名】エイドリアン，フランシスコ

(72)【発明者】

【氏名】ラウエ，クラウス・アンドレアス

(72)【発明者】

【氏名】チャン，チエン

(72)【発明者】

【氏名】ガン，ジンピン

【審査官】福澤 洋光

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１９／２１４６２４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１６－５１５５４４（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１９／０２８１８２（ＷＯ，Ａ２）

【文献】THE AMERICAN JOURNAL OF HEMATOLOGY/ONCOLOGY，2017年，Vol.13, No.11，pp.4-15

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

Ｃ１２Ｎ １／００－１５／９０

Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

単離された抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
配列番号１に示される重鎖ＣＤＲ１構造ドメイン、配列番号２に示される重鎖ＣＤＲ２構造ドメイン、および配列番号３に示される重鎖ＣＤＲ３構造ドメインを有する、重鎖可変領域と、
配列番号９に示される軽鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号１０に示される軽鎖ＣＤＲ２ドメイン、および配列番号１１に示される軽鎖ＣＤＲ３ドメインを有する、軽鎖可変領域と、を含む、抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項2】

配列番号４に示される重鎖可変領域、または配列番号４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域と、
配列番号１２に示される軽鎖可変領域、または配列番号１２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域と、を含む、請求項１に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項3】

重鎖定常領域および軽鎖定常領域をさらに含み、
前記重鎖定常領域が、配列番号５に示される重鎖定常領域、または配列番号５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する重鎖定常領域であり、かつ／または
前記軽鎖定常領域が、配列番号１３に示される軽鎖定常領域、または配列番号１３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する軽鎖定常領域である、請求項１または２に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項4】

前記重鎖可変領域に連結された重鎖シグナルペプチドおよび／または前記軽鎖可変領域に連結された軽鎖シグナルペプチドをさらに含み、
前記重鎖シグナルペプチドが、配列番号６に示される重鎖シグナルペプチド、または配列番号６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する重鎖シグナルペプチドであり、かつ／または、
前記軽鎖シグナルペプチドが、配列番号１４に示される軽鎖シグナルペプチド、または配列番号１４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する軽鎖シグナルペプチドである、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項5】

ＩｇＧ抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項6】

ＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項５に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項7】

モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１～６のいずれか
一項に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項8】

前記抗原結合フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂである、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項9】

請求項１～８のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントと、追加の治療薬と、を含む抗体－薬物複合体。

【請求項10】

請求項９に記載の抗体－薬物複合体であって、前記抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントが、リンカーを介して前記追加の治療薬に連結される、抗体－薬物複合体。

【請求項11】

請求項１～８のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする、核酸。

【請求項12】

配列番号２０に示される重鎖可変領域ヌクレオチドコード配列、および／または配列番号２８に示される軽鎖可変領域ヌクレオチドコード配列を含む、請求項１１に記載の核酸。

【請求項13】

前記核酸が、配列番号２１に示される重鎖定常領域ヌクレオチドコード配列、および／または配列番号２９に示される軽鎖定常領域ヌクレオチドコード配列をさらに含む、請求項１２に記載の核酸。

【請求項14】

請求項１１から１３のいずれか一項に記載の核酸を含む、発現ベクター。

【請求項15】

請求項１１から１３のいずれか一項に記載の核酸または請求項１４に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。

【請求項16】

請求項１～８のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを調製するための方法であって、前記抗体またはその抗原結合フラグメントを発現するのに好適な条件下で、請求項１５に記載の宿主細胞を培養することと、発現した抗体またはその抗原結合フラグメントを培養培地から回収することと、を含む、方法。

【請求項17】

請求項１～８のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項９もしくは１０に記載の抗体－薬物複合体、または請求項１１～１３のいずれか一項に記載の核酸、または請求項１４に記載の発現ベクターと、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。

【請求項18】

がんの治療における使用のための、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項９もしくは１０に記載の抗体－薬物複合体、または請求項１７に記載の医薬組成物。

【請求項19】

前記がんが、扁平上皮がん、上皮扁平細胞がん、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺がん、肺の扁平上皮がん、腹膜がん、肝細胞がん、胃がん、胃腸がん、胃腸間質がん、膵臓がん、神経膠芽細胞腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、尿路がん、肝腫瘍、乳がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんまたは子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝臓がん、肛門がん、陰茎がん、黒色腫、びまん性表層黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端黒色腫、結節性黒色腫、多発性骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病、および移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ケロイドに関連する異常な血管増殖、浮腫、ならびにメイグス症候群、脳腫瘍および脳がん、頭頸部がん、ならびに付随する転移から選択される、請求項１８に記載の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗体－薬物複合体、または医薬組成物。

【請求項20】

がんを治療するための薬物の調製における、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項９もしくは１０に記載の抗体－薬物複合体、または請求項１７に記載の医薬組成物の使用。

【請求項21】

前記がんが、扁平上皮がん、上皮扁平細胞がん、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺がん、肺の扁平上皮がん、腹膜がん、肝細胞がん、胃がん、胃腸がん、胃腸間質がん、膵臓がん、神経膠芽細胞腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、尿路がん、肝腫瘍、乳がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんまたは子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝臓がん、肛門がん、陰茎がん、黒色腫、びまん性表層黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端黒色腫、結節性黒色腫、多発性骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病、および移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ケロイドに関連する異常な血管増殖、浮腫、ならびにメイグス症候群、脳腫瘍および脳がん、頭頸部がん、ならびに付随する転移から選択される、請求項２０に記載の使用。

【請求項22】

Ｔｒｅｇ機能を阻害すること、ＯＸ４０を発現する細胞を死滅させること、エフェクターＴ細胞機能を増強するかつ／もしくはメモリーＴ細胞機能を増強すること、腫瘍免疫を低下させること、Ｔ細胞機能を増強することならびに／またはＯＸ４０発現細胞を枯渇させること、のうちの１つ以上において使用される、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項９もしくは１０に記載の抗体－薬物複合体、または請求項１７に記載の医薬組成物。

【請求項23】

Ｔｒｅｇ機能を阻害すること、ＯＸ４０を発現する細胞を死滅させること、エフェクターＴ細胞機能を増強するかつ／もしくはメモリーＴ細胞機能を増強すること、腫瘍免疫を低下させること、Ｔ細胞機能を増強することならびに／またはＯＸ４０発現細胞を枯
渇させること、のうちの１つ以上のための薬物の調製における、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項９もしくは１０に記載の抗体－薬物複合体、または請求項１７に記載の医薬組成物の使用。

【請求項24】

請求項１～８のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項９もしくは１０に記載の抗体－薬物複合体、または請求項１７に記載の医薬組成物と、１つ以上の追加の治療薬と、を含む、薬学的組み合わせ。

【請求項25】

請求項１～８のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項９もしくは１０に記載の抗体－薬物複合体、または請求項１７に記載の医薬組成物を含む、キット。

【請求項26】

薬物送達デバイスをさらに含む、請求項２５に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規抗ＯＸ４０抗体、抗ＯＸ４０抗体を含む組成物、抗ＯＸ４０抗体をコードする核酸、抗ＯＸ４０抗体の調製方法、および抗ＯＸ４０抗体の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

固形腫瘍患者の抗腫瘍免疫応答は、特定の生物学的製剤による治療によって強化されてきた。例えば、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））およびペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））の２つの抗ＰＤ－１モノクローナル抗体は、切除不能または転移性黒色腫および転移性非小細胞肺がん等の疾患の治療薬として米国およびＥＵで承認されている。これらの薬物による患者の治療は、無増悪生存期間および／または全生存期間の改善によって測定されるように、抗腫瘍応答をもたらした。既存の標準治療を補完するために、より多くのがん治療製品および方法が当技術分野で依然として必要とされている。

【0003】

ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４は、Ｔ細胞の活性化の過程で免疫抑制の役割を果たし、それによって腫瘍細胞に対するＴ細胞の免疫殺傷機能を阻害する。したがって、これら２つの標的に対するモノクローナル抗体をブロックすることにより、この免疫抑制を軽減し、Ｔ細胞の抗腫瘍免疫機能を回復させることができる。このような抑制性免疫チェックポイント分子に加えて、免疫チェックポイント分子を活性化することが、徐々に医薬品開発の新たな標的となっている。

【0004】

活性化された免疫チェックポイント分子は、Ｔ細胞活性化において共刺激シグナルを伝達する分子であるＴ細胞共刺激受容体を主に指すが、これは腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーに属する。とりわけ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、４－１ＢＢおよびＧＩＴＲ等の受容体は、Ｔ細胞の増殖、活性化および分化を調節するために使用することができる。

【0005】

ＯＸ４０受容体は、ＣＤ１３４およびＴＮＦＲＳＦ４（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４）としても知られ、受容体のＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ２８とは異なり、休止期のナイーブＴ細胞には構成的に発現しない。ＯＸ４０は、活性化の２４～７２時間後に発現する二次共刺激免疫チェックポイント分子である。そのリガンドＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２、ＴＮＦＳＦ４としても知られる）は、休止中の抗原提示細胞にも発現しないが、活性化後に発現する。ＯＸ４０の発現は、Ｔ細胞の完全な活性化に依存する。

【0006】

ＯＸ４０は、そのリガンドＯＸ４０Ｌに結合して、共刺激シグナルを伝達する。ＯＸ４０とＯＸ４０Ｌとの間の相互作用は、ＴＮＦＲ関連分子（ＴＲＡＦ）をＯＸ４０の細胞内ドメインに動員して、ＩＫＫαおよびＩＫＫβ、ならびにＰＩ３ｋおよびＰＫＢ（Ａｋｔ）を含むシグナル伝達複合体を形成し得る。ＯＸ４０はまた、ＴＣＲシグナル伝達と協調して、未知の機構による細胞内Ｃａ^２＋を増加させ、それによってＮＦＡＴの核内移行を促進することもできる。ＯＸ４０は、古典的ＮＦ－κＢ１経路または非古典的ＮＦ－κＢ２経路、ＰＩ３ｋ／ＰＫＢおよびＮＦＡＴ経路を活性化し、それによってＴ細胞の分裂および生存のための遺伝子を調節すると同時に、サイトカイン遺伝子の転写およびサイトカイン受容体の発現を促進する。それは細胞の生存に不可欠である。ＯＸ４０シグナル伝達は、ＣＴＬＡ－４およびＦｏｘｐ３の下方制御を引き起こし得る。

【0007】

ＯＸ４０がそのリガンドＯＸ４０Ｌに結合すると、以下を含む免疫系の応答能力が向上する：１．エフェクターＴ細胞およびメモリーＴ細胞の生存および増殖の増加、ならびにサイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＦＮ－γ等）の分泌の増加；２．制御性Ｔ細胞の免疫抑制活性を低下させ、Ｔ細胞活性化の効果をさらに増幅する。腫瘍微小環境では、免疫活性化がＯＸ４０の発現をもたらす可能性がある。これにより、エフェクターＴ細胞の活性化および増殖を促進し、制御性Ｔ細胞を抑制することができ、その結果として複雑な抗腫瘍免疫応答が得られる。現在、がんの治療における抗ＯＸ４０抗体に関与するいくつかの臨床プロジェクトは、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓのウェブサイトで取得することができる。

【0008】

新しいがん治療の選択肢を提供するために、より新規の抗ＯＸ４０抗体が当技術分野で必要とされている。

【発明の概要】

【0009】

本発明は、ＯＸ４０に特異的に結合して活性化することができる新規抗ＯＸ４０抗体を提供することにより、上記の必要性に対応する。

【0010】

一態様において、本発明は、配列番号１に示される重鎖ＣＤＲ１構造ドメイン、配列番号２に示される重鎖ＣＤＲ２構造ドメイン、および配列番号３に示される重鎖ＣＤＲ３構造ドメインを有する、重鎖可変領域と、配列番号９に示される軽鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号１０に示される軽鎖ＣＤＲ２ドメイン、および配列番号１１に示される軽鎖ＣＤＲ３ドメインを有する、軽鎖可変領域と、を含む、単離された抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。

【0011】

一態様において、本発明は、本明細書に記載のＯＸ４０抗体またはその抗原結合ラグメントと、追加の治療薬と、を含む抗体－薬物複合体を提供する。好ましくは、抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、リンカーによって追加の治療薬に連結される。

【0012】

一態様において、本発明は、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸を提供する。

【0013】

一態様において、本発明は、本明細書に記載の核酸を含む発現ベクターを提供する。

【0014】

一態様において、本発明は、本明細書に記載の核酸または本明細書に記載の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0015】

一態様において、本発明は、抗体またはその抗原結合フラグメントの発現に好適な条件下で本明細書に記載の宿主細胞を培養することと、発現した抗体またはその抗原結合フラグメントを培養培地から回収することと、を含む、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを調製するための方法を提供する。

【0016】

一態様において、本発明は、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または本明細書に記載の抗体－薬物複合体、または本明細書に記載の核酸、または本明細書に記載の発現ベクターと、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物を提供する。

【0017】

一態様において、本発明は、がんの治療に使用するための、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または本明細書に記載の抗体－薬物複合体、または本明細書に記載の医薬組成物を提供する。

【0018】

一態様において、本発明は、がんを治療するための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または本明細書に記載の抗体－薬物複合体、または本明細書に記載の医薬組成物を投与し、それによってがんを治療することを含む、方法を提供する。

【0019】

一態様において、本発明は、がんを治療するための薬物の調製における、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または本明細書に記載の抗体－薬物複合体、または本明細書に記載の医薬組成物の使用を提供する。

【0020】

一態様において、本発明は、以下のうちの１つ以上を行うために使用される、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または本明細書に記載の抗体－薬物複合体、または本明細書に記載の医薬組成物を提供する：Ｔｒｅｇ機能を阻害すること（例えば、Ｔｒｅｇの抑制機能を阻害すること）、ＯＸ４０を発現する細胞（例えば、高レベルのＯＸ４０を発現する細胞）を死滅させること、エフェクターＴ細胞機能を増強するかつ／もしくはメモリーＴ細胞機能を増強すること、腫瘍免疫を低下させること、Ｔ細胞機能を増強することならびに／またはＯＸ４０発現細胞を枯渇させること。

【0021】

一態様において、本発明は、以下のうちの１つ以上を行うための薬物の調製における、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または本明細書に記載の抗体－薬物複合体、または本明細書に記載の医薬組成物を提供する：Ｔｒｅｇ機能を阻害すること（例えば、Ｔｒｅｇの抑制機能を阻害すること）、ＯＸ４０を発現する細胞（例えば、高レベルのＯＸ４０を発現する細胞）を死滅させること、エフェクターＴ細胞機能を増強するかつ／もしくはメモリーＴ細胞機能を増強すること、腫瘍免疫を低下させること、Ｔ細胞機能を増強することならびに／またはＯＸ４０発現細胞を枯渇させること。

【0022】

一態様において、本発明は、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または本明細書に記載の抗体－薬物複合体、または本明細書に記載の医薬組成物と、１つ以上の追加の治療薬と、を含む、薬学的組み合わせを提供する。

【0023】

一態様において、本発明は、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または本明細書に記載の抗体－薬物複合体、または本明細書に記載の医薬組成物を含み、好ましくは薬物送達デバイスをさらに含むキットを提供する。

【0024】

いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、そのアミノ酸配列に１つ以上の点突然変異を含み、点突然変異は、抗体の発達可能性を改善するように設計される。好ましい実施形態において、１つ以上の点突然変異は、宿主細胞における発現中、製造および／もしくは製剤化の間の精製中、ならびに／または対象への投与中に、抗体をより安定にする。好ましい実施形態において、１つ以上の点突然変異は、製造および／または製剤化の間に抗体が凝集する可能性を低くする。いくつかの実施形態において、本発明は、開発可能性の問題が最小限に抑えられたまたは低減された治療用抗体を提供する。例えば、疎水性および／または最適化された電荷は、その配列中の１つ以上のアミノ酸を（例えば、そのＣＤＲのうちの１つ以上において）置換することによって除去または低減することができる。

【0025】

本発明の一実施形態は、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであり、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３３のアミノ酸残基５６～７４に対応するＯＸ４０のエピトープに特異的に結合することができる（配列番号３４：ＣＳＲＳＱＮＴＶＣＲＰＣＧＰＧＦＹＮ）。

【0026】

本発明の別の実施形態は、ＯＸ４０に特異的に結合することができるモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであり、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＯＸ４０リガンドのＯＸ４０への結合を妨害しない。

【0027】

本発明の別の実施形態は、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであり、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの結合は、三量体または多量体の凝集状態においてＯＸ４０リガンドのＯＸ４０への結合を妨害しない。

【0028】

本発明の別の実施形態は、ＯＸ４０に特異的に結合することができるモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであり、抗体のＯＸ４０への結合は、内因性ＯＸ４０リガンドシグナル伝達とともにアゴニストシグナル伝達をもたらす。

【0029】

本発明の別の実施形態は、上記の実施形態のいずれか１つのモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであり、ＯＸ４０はヒトＯＸ４０である。

【0030】

本発明の別の実施形態は、上記の実施形態のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであり、エピトープは配列番号２を含む。

【0031】

本発明の別の実施形態は、上記実施形態のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであり、抗体は、約１ｎＭ～約１０ｎＭのＫ_ＤでＯＸ４０に結合する。

【0032】

本発明の別の実施形態は、上記の実施形態によるモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであり、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントのＯＸ４０への結合は、ＯＸ４０発現を下方制御しないか、または細胞表面上に存在するＯＸ４０の量を減少させない。

【0033】

本発明の別の実施形態は、モノクローナル抗体でがんを治療する方法であり、がんは、固形腫瘍もしくは非固形腫瘍であるか、またはがんは、腫瘍浸潤性Ｔ細胞の細胞表面上にＯＸ４０発現を有するがんである。

【0034】

本発明の別の実施形態は、試料中のＯＸ４０を検出する方法であり、この方法は、試料を本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させることを含む。

【0035】

本発明の別の実施形態は、対象におけるＯＸ４０レベルを決定する方法であり、方法は、
ａ）対照から試料を得ることと、
ｂ）試料を本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させることと、
ｃ）対象のＯＸ４０のレベルを決定することと、を含む。

【0036】

試料は、組織試料もしくは血液試料、またはがん組織試料である。

【図面の簡単な説明】

【0037】

【図1-1】ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のＯＸ４０タンパク質への結合。ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のＥＣ８０は０．７１ｎＭである。

【図1-2】２９３Ｔ細胞の表面に発現するヒトＯＸ４０タンパク質へのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の結合。ＥＣ５０は２ｎＭ（ＭＦＩ）であった。

【図1-3】２９３Ｔ細胞の表面に発現するカニクイザルＯＸ４０タンパク質へのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の結合。ＥＣ５０は２．９ｎＭ（ＭＦＩ）であった。

【図1-4】２９３Ｔ細胞の表面に発現するマウスＯＸ４０タンパク質へのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の結合。ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１は、２９３Ｔ細胞の表面に発現するマウスＯＸ４０タンパク質（ＭＦＩ）には結合しない。

【図1-5】２９３Ｔ細胞の表面に発現するヒトＣＤ４０タンパク質へのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の結合。ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１は、２９３Ｔ細胞の表面に発現するヒトＣＤ４０タンパク質（ＭＦＩ）には結合しない。

【図1-6】２９３Ｔ細胞の表面に発現するヒトＯＸ４０タンパク質への、それぞれ、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１、参照物質１、参照物質２、参照物質３、および参照物質４の結合。ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のＥＣ５０は２．０２ｎＭ（ＭＦＩ）であり、参照物質１のＥＣ５０は２．６７ｎＭ（ＭＦＩ）であり、参照物質２のＥＣ５０は４．１７ｎＭ（ＭＦＩ）であり、参照物質３のＥＣ５０は１．９２ｎＭ（ＭＦＩ）であり、参照物質４のＥＣ５０は２．１１ｎＭ（ＭＦＩ）であった。

【図1-7】２９３Ｔ細胞の表面に発現するカニクイザルＯＸ４０タンパク質への、それぞれ、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１、参照物質１、参照物質２、参照物質３、および参照物質４の結合。ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のＥＣ５０は２．９４ｎＭ（ＭＦＩ）であり、参照物質１のＥＣ５０は２．９１ｎＭ（ＭＦＩ）であり、参照物質２のＥＣ５０は６．１３ｎＭ（ＭＦＩ）であり、参照物質３のＥＣ５０は２．５７ｎＭ（ＭＦＩ）であり、参照物質４のＥＣ５０は３．５４ｎＭ（ＭＦＩ）である。

【図2-1】Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞におけるＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のアゴニスト活性。抗ヒトＩｇＧとの架橋の場合、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のＥＣ５０は２．９ｎＭ（ＧＦＰのＭＦＩ）である。

【図2-2】Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞におけるＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のアゴニスト活性。抗ヒトＩｇＧと架橋しない場合、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のＥＣ５０は、抗ヒトＩｇＧと架橋した場合よりもはるかに大きくなる。三量体ＯＸ４０Ｌ組換えタンパク質は、単独で、抗ヒトＩｇＧとの架橋なしに、ＥＣ５０＝４５ｎＭ（ＧＦＰのＭＦＩ）でＮＦ－ｋｂシグナル伝達を活性化することができる。

【図2-3】Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞におけるＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のアゴニスト活性。ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１は、抗ヒトＩｇＧとの架橋の場合、ＯＸ４０Ｌとの協調的なアゴニスト効果を示し、ＯＸ４０ＬとともにＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１を加えることで、単一成分と比較してＧＦＰのＭＦＩを高める。

【図2-4】初代ＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のアゴニスト活性。初代ＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のアゴニスト活性は、０．２ｎＭのＥＣ５０でＩＬ－２分泌によってアッセイされる。

【図2-5】初代ＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のアゴニスト活性。初代ＣＤ４^＋Ｔ細胞において、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１は、ＯＸ４０Ｌとの協調的なアゴニスト効果を示す。

【図3-1】ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の薬物動態試験。

【図4-1】ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のインビボ抗腫瘍効果。ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１は、ＰＢＳ対照と比較して腫瘍増殖を有意に抑制する。

【図4-2】ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のインビボ抗腫瘍効果。ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１は、マウスの有意な体重減少をもたらし得る副作用を示さない。

【図4-3】異なる用量のＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のインビボ抗腫瘍効果（腫瘍サイズ）。

【図4-4】異なる用量のＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のインビボ抗腫瘍効果（体重）。

【図5-1】ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の加速安定性実験。ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果は、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１が異なる温度条件下で良好な安定性を有することを示している。

【図5-2】ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の分解実験。ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果は、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１が異なるｐＨ条件下で良好な安定性を有することを示している。

【図5-3】ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の酸化ストレス実験。ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果は、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１が酸化ストレス下で良好な安定性を有することを示している。

【図5-4】ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の凍結融解実験。ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果は、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１が凍結融解条件下で良好な安定性有することを示している。

【図6】活性化サルＣＤ４^＋Ｔ細胞へのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の結合。記号：実際のデータ点、曲線：４パラメータモデルを使用した非線形カーブフィット。３人のドナーから単離された活性化Ｔ細胞へのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の結合：２００１０７番（Ａ：陽性細胞％、およびＢ：ＭＦＩ）、Ｍ２０Ｚ０１３００９番（Ｃ：陽性細胞のパーセンテージ、およびＤ：ＭＦＩ）、および２０Ｚ０２５００８番（Ｅ：陽性細胞のパーセンテージ、およびＦ：ＭＦＩ）。

【図7】ＷＴマウスにおけるＢｍｋ１およびＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の時間に対する平均濃度。記号：実際のデータ点の平均。

【図8】ｈＯＸ４０－ＫＩマウスにおけるＢｍｋ１およびＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の時間に対する平均濃度。記号：実際のデータ点の平均。

【図9】腫瘍組織のＣＤ４５^＋細胞中のＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーセンテージ。

【図10】腫瘍組織のＣＤ４^＋Ｔ細胞中のＴｒｅｇのパーセンテージ。

【図11】腫瘍組織のＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＫｉ６７発現。

【図12】腫瘍組織のＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＰＤ－１発現。

【図13】抗ＯＸ４０抗体ＨＦＢ３０１００１のエピトープを示し、このエピトープは、複合体のＯＸ４０およびＯＸ４０Ｌの３Ｄ結晶構造モデルにマッピングされている。

【図14A】細胞ベースの生物発光アッセイで測定されたＯＸ４０リガンドのアゴニスト活性を示す。図１４Ａは、個々のＯＸ４０リガンドの活性を示す。ｙ軸は相対発光（ＲＬＵ）を示す。

【図14B】細胞ベースの生物発光アッセイで測定されたＯＸ４０リガンドのアゴニスト活性を示す。図１４Ｂは、抗ＯＸ４０抗体ＨＦＢ３０１００１、ベンチマーク１またはベンチマーク２の存在下でのＯＸ４０リガンドの活性を示す。ｙ軸は相対発光（ＲＬＵ）を示す。

【図15A】抗体処理後のＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるＯＸ４０発現を示す。図１５Ａは、フローサイトメトリーによって測定された、異なる濃度の抗ＯＸ４０抗体で処理した後にヒトＰＢＭＣから単離されたＯＸ４０陽性ＣＤ４^＋Ｔ細胞のパーセンテージを示している。

【図15B】抗体処理後のＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるＯＸ４０発現を示す。図１５Ｂは、フローサイトメトリーによって測定された、ヒトＯＸ４０ノックインマウスのＭＣ－３８マウス結腸直腸がんモデルにおける１０ｍｇ／ｋｇの抗ＯＸ４０抗体による３回目の処理から２４時間後のＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるＯＸ４０の発現を示している。発現は平均蛍光強度（ＭＦＩ）として測定される。

【図16】アイソタイプ対照（１０ｍｇ／ｋｇ）、抗ＯＸ４０抗体ベンチマーク１（１ｍｇ／ｋｇ）、または抗ＯＸ４０抗体ＨＦＢ３０１００１（１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ）で処理した後の、ヒトＯＸ４０（ｈＯＸ４０）ノックイン（Ｋ／Ｉ）マウスのＭＣ－３８腫瘍モデルの腫瘍サイズを示す。処理の時点は矢印で示され、エラーバーは平均の標準誤差を示し、有意性は最後の時点での一元配置分散分析によって計算される（＊：ｐ値＜０．０５、＊＊：ｐ値＜０．０１）。

【図17】抗ＯＸ４０抗体ＨＦＢ３０１００１（１０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ）、抗ＯＸ４０抗体ベンチマーク１（１０ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ）、アイソタイプ対照（１０ｍｇ／ｋｇ）による処理、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）処理後の、ＭＣ－３８マウス結腸直腸がんモデルを用いたヒトＯＸ４０（ｈＯＸ４０）ノックイン（Ｋ／Ｉ）マウスの生存率を示す。有意性は、ログランク検定によって計算される（＊：ｐ値＜０．０５、＊＊：ｐ値＜０．０１）。

【図18A】対照（ＩｇＧ１）、ＯＸ４０抗体ベンチマーク１または抗ＯＸ４０抗体@0060ＨＦＢ３０１００１で処理した後の、ヒトＯＸ４０（ｈＯＸ４０）ノックイン（ＫＩ）マウスのＭＣ－３８マウス結腸直腸がんモデルにおける腫瘍微小環境内の免疫細胞集団のフローサイトメトリー測定を示す。図１８Ａは、生存ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋細胞中のＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｋｉ６７^＋Ｔ細胞のパーセンテージを示している。

【図18B】対照（ＩｇＧ１）、ＯＸ４０抗体ベンチマーク１または抗ＯＸ４０抗体@0061ＨＦＢ３０１００１で処理した後の、ヒトＯＸ４０（ｈＯＸ４０）ノックイン（ＫＩ）マウスのＭＣ－３８マウス結腸直腸がんモデルにおける腫瘍微小環境内の免疫細胞集団のフローサイトメトリー測定を示す。図１８Ｂは、生存ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋細胞中のＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｋｉ６７^＋Ｔ細胞のパーセンテージを示している。

【図18C】対照（ＩｇＧ１）、ＯＸ４０抗体ベンチマーク１または抗ＯＸ４０抗体@0062ＨＦＢ３０１００１で処理した後の、ヒトＯＸ４０（ｈＯＸ４０）ノックイン（ＫＩ）マウスのＭＣ－３８マウス結腸直腸がんモデルにおける腫瘍微小環境内の免疫細胞集団のフローサイトメトリー測定を示す。図１８Ｃは、生存ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋細胞中のＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＰＤ－１^＋Ｔ細胞のパーセンテージを示している。

【図18D】対照（ＩｇＧ１）、ＯＸ４０抗体ベンチマーク１または抗ＯＸ４０抗体@0063ＨＦＢ３０１００１で処理した後の、ヒトＯＸ４０（ｈＯＸ４０）ノックイン（ＫＩ）マウスのＭＣ－３８マウス結腸直腸がんモデルにおける腫瘍微小環境内の免疫細胞集団のフローサイトメトリー測定を示す。図１８Ｄは、生存ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋細胞中のＣＤ３^＋ＣＤ８^＋ＰＤ－１^＋Ｔ細胞のパーセンテージを示している。

【図18E】対照（ＩｇＧ１）、ＯＸ４０抗体ベンチマーク１または抗ＯＸ４０抗体@0064ＨＦＢ３０１００１で処理した後の、ヒトＯＸ４０（ｈＯＸ４０）ノックイン（ＫＩ）マウスのＭＣ－３８マウス結腸直腸がんモデルにおける腫瘍微小環境内の免疫細胞集団のフローサイトメトリー測定を示す。図１８Ｅは、生存ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋細胞中のＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋細胞のパーセンテージを示している。

【発明を実施するための形態】

【0038】

一態様において、本発明は、配列番号１に示される重鎖ＣＤＲ１構造ドメイン、配列番号２に示される重鎖ＣＤＲ２構造ドメイン、および配列番号３に示される重鎖ＣＤＲ３構造ドメインを有する、重鎖可変領域と、配列番号９に示される軽鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号１０に示される軽鎖ＣＤＲ２ドメイン、および配列番号１１に示される軽鎖ＣＤＲ３ドメインを有する、軽鎖可変領域と、を含む、単離された抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。

【0039】

一実施形態において、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４に示される重鎖可変領域、または配列番号４と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の相同性を有する重鎖可変領域と、配列番号１２に示される軽鎖可変領域、または配列番号１２と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の相同性を有する軽鎖可変領域と、を含む。

【0040】

一実施形態において、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖定常領域および軽鎖定常領域をさらに含み、好ましくは、重鎖定常領域は、配列番号５に示される重鎖定常領域、または配列番号５と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の相同性を有する重鎖定常領域であり、かつ／または、好ましくは、軽鎖定常領域は、配列番号１３に示される軽鎖定常領域、または配列番号１３と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の相同性を有する軽鎖定常領域である。

【0041】

一実施形態において、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域に連結された重鎖シグナルペプチドおよび／または軽鎖可変領域に連結された軽鎖シグナルペプチドをさらに含み、好ましくは、重鎖シグナルペプチドは、配列番号６に示される重鎖シグナルペプチド、または配列番号６と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の相同性を有する重鎖シグナルペプチドであり、かつ／または、好ましくは、軽鎖シグナルペプチドは、配列番号１４に示される軽鎖シグナルペプチド、または配列番号１４と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の相同性を有する軽鎖シグナルペプチドである。

【0042】

一実施形態において、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ抗体またはその抗原結合フラグメントであり、好ましくは、ＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントである。

【0043】

一実施形態において、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである。

【0044】

一実施形態において、本明細書に記載されるその抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂである。

【0045】

一態様において、本発明は、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントと、追加の治療薬と、を含む抗体－薬物複合体を提供する。好ましくは、抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、リンカーを介して追加の治療薬に連結される。

【0046】

一態様において、本発明は、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸を提供する。

【0047】

一実施形態において、本明細書に記載の核酸は、配列番号２０に示される重鎖可変領域ヌクレオチドコード配列、および／または配列番号２８に示される軽鎖可変領域ヌクレオチドコード配列を含み、好ましくは、核酸は、配列番号２１に示される重鎖定常領域ヌクレオチドコード配列、および／または配列番号２９に示される軽鎖定常領域ヌクレオチドコード配列をさらに含む。

【0048】

一態様において、本発明は、本明細書に記載の核酸を含む発現ベクターを提供する。

【0049】

一態様において、本発明は、本明細書に記載の核酸または本明細書に記載の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0050】

一態様において、本発明は、抗体またはその抗原結合フラグメントを発現するのに好適な条件下で、本明細書に記載の宿主細胞を培養することと、発現した抗体またはその抗原結合フラグメントを培養培地から回収することと、を含む、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを調製するための方法を提供する。

【0051】

一態様において、本発明は、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または本明細書に記載の抗体－薬物複合体、または本明細書に記載の核酸、または本明細書に記載の発現ベクターと、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物を提供する。

【0052】

一実施形態において、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または本明細書に記載の抗体－薬物複合体、または本明細書に記載の医薬組成物は、がんの治療に使用される。一実施形態において、がんは、扁平上皮がん（例えば、上皮扁平細胞がん）、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺がん、および肺の扁平上皮がんを含む）、腹膜がん、肝細胞がん、胃がん（胃腸がんおよび胃腸間質がんを含む）、膵臓がん、神経膠芽細胞腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、尿路がん、肝腫瘍、乳がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんまたは子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝臓がん、肛門がん、陰茎がん、黒色腫、びまん性表層黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端黒色腫、結節性黒色腫、多発性骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病、および移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ケロイドに関連する異常な血管増殖、浮腫（例えば、脳腫瘍に関連する）、ならびにメイグス症候群、脳腫瘍および脳がん、頭頸部がん、ならびに付随する転移から選択される。

【0053】

一態様において、本発明は、がんの治療のための方法であって、がんを治療するために、それを必要とする対象に、治療有効量の本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または本明細書に記載の抗体－薬物複合体、または本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。一実施形態において、がんは、扁平上皮がん（例えば、上皮扁平細胞がん）、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺がん、および肺の扁平上皮がんを含む）、腹膜がん、肝細胞がん、胃がん（胃腸がんおよび胃腸間質がんを含む）、膵臓がん、神経膠芽細胞腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、尿路がん、肝腫瘍、乳がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんまたは子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝臓がん、肛門がん、陰茎がん、黒色腫、びまん性表層黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端黒色腫、結節性黒色腫、多発性骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病、および移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ケロイドに関連する異常な血管増殖、浮腫（例えば、脳腫瘍に関連する）、ならびにメイグス症候群、脳腫瘍および脳がん、頭頸部がん、ならびに付随する転移から選択される。

【0054】

一態様において、本発明は、がんを治療するための薬物の調製における、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または本明細書に記載の抗体－薬物複合体、または本明細書に記載の医薬組成物の使用を提供する。一実施形態において、がんは、扁平上皮がん（例えば、上皮扁平細胞がん）、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺がん、および肺の扁平上皮がんを含む）、腹膜がん、肝細胞がん、胃がん（胃腸がんおよび胃腸間質がんを含む）、膵臓がん、神経膠芽細胞腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、尿路がん、肝腫瘍、乳がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんまたは子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝臓がん、肛門がん、陰茎がん、黒色腫、びまん性表層黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端黒色腫、結節性黒色腫、多発性骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病、および移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ケロイドに関連する異常な血管増殖、浮腫（例えば、脳腫瘍に関連する）、ならびにメイグス症候群、脳腫瘍および脳がん、頭頸部がん、ならびに付随する転移から選択される。

【0055】

一態様において、本発明は、以下のうちの１つ以上における、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または本明細書に記載の抗体－薬物複合体、または本明細書に記載の医薬組成物の使用を提供する：Ｔｒｅｇ機能を阻害すること（例えば、Ｔｒｅｇの抑制機能を阻害すること）、ＯＸ４０を発現する細胞（例えば、高レベルのＯＸ４０を発現する細胞）を死滅させること、エフェクターＴ細胞機能を増強するかつ／もしくはメモリーＴ細胞機能を増強すること、腫瘍免疫を低下させること、Ｔ細胞機能を増強することならびに／またはＯＸ４０発現細胞を枯渇させること。

【0056】

一態様において、本発明は、以下のうちの１つ以上のための薬物の調製における、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または本明細書に記載の抗体－薬物複合体、または本明細書に記載の医薬組成物の使用を提供する：Ｔｒｅｇ機能を阻害すること（例えば、Ｔｒｅｇの抑制機能を阻害すること）、ＯＸ４０を発現する細胞（例えば、高レベルのＯＸ４０を発現する細胞）を死滅させること、エフェクターＴ細胞機能を増強するかつ／もしくはメモリーＴ細胞機能を増強すること、腫瘍免疫を低下させること、Ｔ細胞機能を増強することならびに／またはＯＸ４０発現細胞を枯渇させること。

【0057】

一態様において、本発明は、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または本明細書に記載の抗体－薬物複合体、または本明細書に記載の医薬組成物と、１つ以上の追加の治療薬と、を含む、薬学的組み合わせを提供する。

【0058】

一態様において、本発明は、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または本明細書に記載の抗体－薬物複合体、または本明細書に記載の医薬組成物を含み、好ましくは薬物送達デバイスをさらに含むキットを提供する。

【0059】

本発明のいくつかの実施形態は、ＯＸ－４０に対するアゴニスト抗体を提供する。それは、他のアゴニスト抗ＯＸ－４０抗体と比較して、ＯＸ－４０受容体の下方制御をまったくまたはほとんどもたらさなかった。受容体下方制御の欠如または受容体下方制御の減少は、本発明によって提供されるアゴニスト抗体がそのエピトープを認識することができるという事実に起因し得る。本発明によって提供されるアゴニスト抗体はまた、特に当技術分野で既知の他のアゴニスト抗ＯＸ－４０抗体と比較して、最適化された結合動態を有し得る。

【0060】

本明細書に記載の様々な実施形態の特徴の１つ、いくつか、またはすべてを組み合わせて、本発明のさらなる実施形態を形成することができることを理解されたい。本発明のこれらおよび他の態様は、当業者には明らかである。本発明のこれらおよび他の実施形態を、以下にさらに詳述する。

【0061】

２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、エナンチオマーの最大アライメントについて記載されるときに、その２つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が同じである場合、「同一」であると言われる。２つの配列間の比較は、典型的には、比較ウィンドウにわたって配列を比較し、配列類似性を有する局所領域を特定して比較することにより行われる。本明細書で使用される「比較ウィンドウ」は、少なくとも約２０個（通常、約３０～約７５個、または約４０～約５０個）の連続位置を有するセグメントを指し、２つの配列を最適に整列させた後、１つの配列を同じ数の連続位置を有する参照配列と比較することができる。

【0062】

比較のための配列の最適なアライメントは、バイオインフォマティクスソフトウェアのプログラム一式（Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用し、デフォルトのパラメータを用いて実行することができる。このプログラムは、以下の参考文献に記載されているいくつかのアライメントスキームを実装している：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，１９７８，Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ－Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．Ｉｎ Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（ｅｄ．）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ，Ｖｏｌ．５，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ３，ｐｐ．３４５ ｔｏ ３５８ ｐａｇｅｓ；Ｈｅｉｎ Ｊ．，１９９０，Ｕｎｉｆｉｅｄ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ，ｐｐ．６２６－６４５，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．，１９８９，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１－１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．ａｎｄ Ｍｕｌｌｅｒ Ｗ．，１９８８，ＣＡＢＩＯＳ ４：１１－１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．，１９７１，Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ．１１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．，Ｎｅｓ，Ｍ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６－４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ． ａｎｄ Ｓｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．，１９７３，Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：７２６－７３０。

【0063】

いくつかの実施形態において、「パーセント配列同一性／相同性」は、少なくとも２０の位置を有する比較ウィンドウにわたって最適に整列させた２つの配列を比較することにより決定されるが、この場合、２つの配列の最適なアライメントのために、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部が、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、２０％以下、典型的には５％～１５％、または１０％～１２％の付加または欠失（すなわちギャップ）を含んでもよい。パーセンテージは、以下のように計算することができる：両方の配列中に同じ核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して一致する位置の数を得て、その一致する位置の数を参照配列中の位置の総数（すなわち、比較ウィンドウサイズ）で除し、次いでその結果に１００を乗じて配列同一性／相同性パーセントを得る。

【0064】

代替的に、変異体はまた、天然の遺伝子またはその一部もしくは相補体と実質的に相同であり得る。これらのポリヌクレオチド変異体は、中程度のストリンジェントな条件下で、天然の抗体（または相補的配列）をコードする天然に存在するＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができる。

【0065】

好適な「適度にストリンジェントな条件」は以下を含む：５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０での前洗浄。５×ＳＳＣで５０℃～６５℃で一晩ハイブリダイズする。続いて６５℃で２０分間２回洗浄し、各洗浄には０．１％ＳＤＳを含む２×、０．５×、および０．２×のＳＳＣを使用する。

【0066】

本明細書で使用される場合、「高度にストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、以下の条件のうちの１つまたはいくつかを指す：（１）洗浄に低イオン強度および高温を採用すること、例えば、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ラウリル硫酸ナトリウムを５０℃で使用すること；（２）ハイブリダイゼーション中に、ホルムアミド等の変性剤、例えば、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％ポリスクロース／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５および４２℃）、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドを使用すること；または（３）４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルトハイブリダイゼーション溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍＬ）、０．１％ＳＤＳおよび１０％デキストラン硫酸を使用すること、ならびに４２℃で、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）を使用して洗浄し、５５℃で５０％ホルムアミドを使用して洗浄した後、ＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣの高ストリンジェンシー洗浄液を使用して５５℃で洗浄すること。当業者は、プローブの長さ等の要因に対応するために、温度、イオン強度等を任意選択的に調整する方法を知っている。

【0067】

当業者は、遺伝暗号の縮重に起因して、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することを理解している。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、任意の天然の遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小限の相同性を有する。しかしながら、本発明は、コドン使用頻度の違いに起因して変動するポリヌクレオチドを具体的に企図する。さらに、本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内である。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加、および／または置換等の１つ以上の突然変異に起因して変化する内因性遺伝子である。結果として得られるｍＲＮＡおよびタンパク質は、変更された構造または機能を有する可能性があるが、そうである必要はない。対立遺伝子は、ハイブリダイゼーション、増幅、および／またはデータベース配列比較等の特定の標準的な技術を用いて同定することができる。

【0068】

本発明のポリヌクレオチドは、化学合成、組換え法、またはＰＣＲを用いて得ることができる。化学的ポリヌクレオチド合成の方法は当技術分野で周知であり、本明細書で詳細に説明する必要はない。当業者は、本明細書で提供される配列および市販のＤＮＡシンセサイザーを使用して、所望のＤＮＡ配列を生成することができる。

【0069】

組換え法を用いてポリヌクレオチドを産生するために、本明細書に記載のように、所望の配列を含むポリヌクレオチドを好適なベクターに挿入することができ、ベクターを複製および増幅のために好適な宿主細胞にさらに導入することができる。ポリヌクレオチドは、当技術分野で既知の任意の手段によって宿主細胞に挿入することができる。外因性ポリヌクレオチドを導入するために、直接取り込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ－ハイブリダイゼーション、または電気穿孔によって細胞を形質転換することができる。導入されると、外因性ポリヌクレオチドは、非組込みベクター（プラスミド等）として細胞内に維持され得るか、または宿主細胞ゲノムに組み込まれ得る。そのように増幅されたポリヌクレオチドは、当技術分野で既知の特定の方法によって宿主細胞から単離することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照することができる。

【0070】

代替的に、ＰＣＲはＤＮＡ配列の複製を可能にする。

【0071】

ＲＮＡは、好適なベクター中の単離されたＤＮＡを使用し、それを好適な宿主細胞に挿入することで得ることができる。細胞が複製して、ＤＮＡをＲＮＡに転写すると、次いで、当業者に既知の特定の方法を用いてＲＮＡを単離することができる。

【0072】

好適なクローニングおよび発現ベクターは、プロモーター、エンハンサー、および他の転写調節配列等の様々な成分を含み得る。ベクターはまた、後に抗体可変ドメインを異なるベクターにクローニングできるように構築され得る。

【0073】

好適なクローニングベクターは、標準的な技術に従って構築することができるか、または当技術分野で利用可能な多数のクローニングベクターから選択することができる。選択されるクローニングベクターは、使用されることが意図される宿主細胞によって異なり得る。しかしながら、有用なクローニングベクターは、一般に、それ自体を複製する能力を有する。それらは、特定の制限エンドヌクレアーゼの単一標的を有することができ、かつ／またはベクターを含むクローンを選択するために使用することができるマーカーの遺伝子を保有することができる。好適な例として、プラスミドおよび細菌ウイルス、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（例えば、ｐＢＳ ＳＫ＋）およびそれらの誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにｐＳＡ３およびｐＡＴ２８等のシャトルベクターが挙げられる。これらおよび他の多くのクローニングベクターは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ等の商業的供給業者から入手可能である。

【0074】

発現ベクターがさらに提供される。発現ベクターは、典型的には、本発明によるポリヌクレオチドを含む特定の複製可能なポリヌクレオチド構築物である。発現ベクターは、エピソームとして、またはその染色体ＤＮＡの不可欠な部分として、宿主細胞内で複製可能でなければならないことが暗示される。好適な発現ベクターとして、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスを含むウイルスベクター、コスミド、およびＰＣＴ公開第８７／０４４６２号に開示されている発現ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。担体成分は、典型的には、限定されないが以下のうちの１つ以上を含み得る：複製起点；１つ以上のマーカー遺伝子；好適な転写制御エレメント（プロモーター、エンハンサー、およびターミネーター等）。発現（すなわち、翻訳）のために、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、および終止コドン等の１つ以上の転写制御エレメントも典型的には必要である。

【0075】

目的のポリヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチドを含むベクターは、いくつかの好適な手段のいずれかによって宿主細胞に導入することができる。この手段は、電気穿孔、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ－デキストランまたは他の物質によるトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（例えば、ベクターがポックスウイルス等の感染病原体である場合）を含む。導入ベクターまたはポリヌクレオチドの選択は、一般に、宿主細胞の特性に依存する。

【0076】

本発明の抗体は、組換え法によって調製、発現、産生または単離されたヒト抗体、例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体（後述のセクションＩＩでさらに説明する）、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体（後述のセクションＩＩＩでさらに説明する）、ヒト免疫グロブリン遺伝子トランスジェニック動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７－６２９５を参照のこと）、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを含む任意の他の方法によって、調製、発現、産生、または単離された抗体を含む。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２を参照のこと）。

【0077】

本発明の抗体または抗体部分は、宿主細胞において免疫グロブリン軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子を組換え発現することによって調製することができる。抗体の組換え発現のために、抗体の免疫グロブリン軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡフラグメントを保有する１つ以上の組換え発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクトして、軽鎖および重鎖を宿主細胞で発現させることができるようにする。抗体はまた、好ましくは、宿主細胞が培養される培地に分泌され、そこから抗体を回収することができる。標準的な組換えＤＮＡ法を用いて抗体の重鎖遺伝子および抗体の軽鎖遺伝子を得て、これらの遺伝子を組換え発現ベクターに導入し、次いでベクターを宿主細胞に導入することができる。本明細書において、標準的な方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９）、およびＢｏｓｓらに対する米国特許第４，８１６，３９７号に記載されている方法であり得る。

【0078】

抗体またはその抗原結合フラグメントは、好適な宿主細胞を使用して組換え的に産生することができる。抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸は、発現ベクターにクローニングすることができ、次いで、組換え宿主細胞で抗体合成を達成するために、細胞が免疫グロブリンを追加的に産生しないＥ．ｃｏｌｉ細胞、酵母細胞、昆虫細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞等の宿主細胞に導入することができる。当技術分野で周知の多くの細胞の中で、好ましい宿主細胞として、ＣＨＯ細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞、およびＳｐ２．０細胞が挙げられる。

【0079】

抗体フラグメントは、全長抗体のタンパク質分解もしくは他の分解によって、組換え法によって、または化学合成によって生成することができる。抗体のポリペプチドフラグメント（特に最大約５０アミノ酸のより短いポリペプチド）は、化学合成によって都合よく作製することができる。タンパク質およびペプチドの化学合成のための方法は、当技術分野で既知であり、商業的に入手可能である。

【0080】

本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、親和性成熟させることができる。例えば、親和性成熟抗体は、当技術分野で既知の手順から調製することができる（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９－７８３；Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ ９１：３８０９－３８１３；Ｓｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅ，１６９：１４７－１５５；Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５：１９９４－２００４；Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４（７）：３３１０－９；Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２６：８８９－８９６；およびＷＯ２００４／０５８１８４）。

【0081】

抗体変異体
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体を含む。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって調製することができる。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、および／または挿入および／または置換を含む。最終構築物が所望の特徴、例えば、抗原結合を有する限り、欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせを行って最終構築物を得ることができる。

【0082】

いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、そのアミノ酸配列に１つ以上の点突然変異を含み得る。点突然変異は、抗体の開発可能性を高めるように設計される。例えば、Ｒａｙｂｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．，“Ｆｉｖｅ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｄｅｖｅｌｏｐａｂｉｌｉｔｙ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ，”ＰＮＡＳ，Ｍａｒ．５，２０１９，１１６（１０）４０２５－４０３０は、治療用抗体プロファイリングツール（ＴＡＰ）（ダウンロード可能な可変ドメイン配列の相同性モデルを構築し、５つの開発可能性ガイドラインに対してそれらを試験し、潜在的な配列の役割および古典的な形式を報告するための計算ツール）について記載している。著者はさらに、ｏｐｉｇ．ｓｔａｔｓ．ｏｘ．ａｃ．ｕｋ／ｗｅｂａｐｐｓ／ｓａｂｄａｂ－ｓａｂｐｒｅｄ／ＴＡＰ．ｐｈｐで自由に利用可能なＴＡＰを提供している。抗原に対する所望の親和性を達成することに加えて、治療用モノクローナル抗体の開発には多くの障害がある。これらの障害は、固有の免疫原性、化学的および立体構造的な不安定性、自己会合、高粘度、多重特異性、不十分な発現等を含む。例えば、特に超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）における、高レベルの疎水性は、凝集、粘度、および多重特異性に繰り返し関与してきた。重鎖および軽鎖可変ドメインの正味電荷の非対称性は、高濃度での自己会合および粘度とも関連している。ＣＤＲの正および負に帯電したパッチは、高いクリアランス率および低い発現レベルに関連している。製品の不均一性（例えば、酸化、異性化、またはグリコシル化による）は、多くの場合、翻訳後または同時翻訳修飾を受けやすい特定の配列モチーフによって引き起こされる。配列の役割の特定を容易にするための計算ツールが利用可能である。Ｗａｒｓｚａｗｓｋｉもまた、可変軽鎖－重鎖界面の自動設計により、抗体の親和性および安定性を最適化するための方法を記載している。Ｗａｒｓｚａｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０１９），Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｂｙ ｔｈｅ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｌｉｇｈｔ－ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ １５（８）：ｅ１００７２０７，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｃｂｉ．１００７２０７。追加の方法を用いて、候補抗体の潜在的な開発可能性の問題を特定することができる。さらに、本発明のいくつかの好ましい実施形態において、そのような問題を解決するために、従来の方法によって１つ以上の点突然変異を候補抗体に導入し、それによって最適化された本発明の治療用抗体を得ることができる。

【0083】

ａ）置換、挿入、および欠失変異体
いくつかの実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。代替の突然変異誘発の対象となる部位は、ＨＶＲおよびＦＲを含む。保存的置換は、表Ａの「好ましい置換」という見出しの下に示される。より実質的な変化は、表Ａの「例示的な置換」という見出しの下に提供され、そのアミノ酸側鎖クラスを参照して後にさらに説明される。アミノ酸置換を目的の抗体に導入することができ、生成物を所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下、またはＡＤＣＣもしくはＣＤＣの改善についてスクリーニングすることができる。

【表1】

【0084】

一般的な側鎖の特性に従って、アミノ酸は以下のようにグループ化することができる。
（１）疎水性：Ｎｌｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩＩｅ；
（２）中性、親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｉｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

【0085】

非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと置き換えることを伴う。

【0086】

置換変異体の１つのクラスは、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することに関与する。一般に、さらなる研究のために選択される、結果として生じる変異体は、親抗体と比較して変更された（例えば、改善された）特定の生物学的特性（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）を有し、かつ／または親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持する。例示的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、これは、例えば、本明細書に記載されるもの等のファージディスプレイベースの親和性成熟技術を使用して都合よく生成することができる。簡潔に述べると、１つ以上のＨＶＲ残基を変異させることができ、変異抗体をファージ上に提示し、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングすることができる。

【0087】

例えば、抗体親和性を改善するために、ＨＶＲに変化（例えば、置換）を加えることができる。ＨＶＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で突然変異を受けるコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９－１９６（２００８）を参照のこと）、および／または抗原と接触する残基は、そのような変化を有することができ、その中で、結果として生じる変異体ＶＨまたはＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリーの構築および再選択による親和性成熟は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（ｅｄｓ．Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１））に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施形態において、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、またはオリゴヌクレオチド特異的変異誘発）によって、成熟のために選択された可変遺伝子に多様性が導入される。次に、二次ライブラリーが作製される。ライブラリーは、次いで、所望の親和性を有する任意の抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するための別のアプローチは、複数のＨＶＲ残基（例えば、１回に４～６残基）がランダム化されるＨＶＲ指向性アプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発またはモデリングを使用して、具体的に同定することができる。特に、ＣＤＲ－Ｈ３およびＣＤＲ－Ｌ３が標的とされることが多い。

【0088】

いくつかの実施形態において、置換、挿入、または欠失は、そのような変化が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、１つ以上のＨＶＲ内で起こり得る。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的変化（例えば、本明細書で提供されるような保守的な置換）がＨＶＲに加えられてもよい。例えば、そのような変化は、ＨＶＲの抗原接触残基の外側にあってもよい。上で提供された変異体ＶＨおよびＶＬ配列のいくつかの実施形態において、各ＨＶＲは、変化しないか、または、１、２、もしくは３個以下のアミノ酸置換を含む。

【0089】

突然変異誘発のために標的化され得る抗体の残基または領域を同定するために使用することができる１つの方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１～１０８５によって記載されるように、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と称される。この方法では、残基または標的残基の群（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕ等の荷電残基）が同定され、アミノ酸（例えば、アラニン酸またはポリアラニン）置換により中和されるかまたは負に帯電され、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを決定する。最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に、さらなる置換を導入することができる。代替的にまたは追加的に、抗原抗体複合体の結晶構造を使用して、抗体と抗原との間の接触点を同定することができる。代替的な候補として、そのような接触残基および隣接残基は、標的化されるかまたは排除され得る。変異体をスクリーニングして、それらが所望の特性を含むかどうかを決定することができる。

【0090】

アミノ酸配列の挿入は、１残基から、１００以上の残基を含むポリペプチドまでの長さのアミノ酸および／またはカルボキシ末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例として、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体のＮ末端またはＣ末端と、抗体の血清半減期を延長する酵素（例えば、ＡＤＥＰＴの場合）またはポリペプチドとの融合を含む。

【0091】

ｂ）グリコシル化変異体
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗体は、抗体のグリコシル化の程度を増加または減少させるように変更することができる。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作製されるかまたは除去されるようにアミノ酸配列を変更することによって、都合よく達成することができる。

【0092】

Ｆｃ領域を含む抗体の場合、それが結合している炭水化物を変更することができる。哺乳動物細胞によって産生される天然抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に典型的にＮ－結合している、分岐した二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、およびシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「骨格」にあるＧｌｃＮＡｃに結合したフコースを含み得る。いくつかの実施形態において、本発明の抗体中のオリゴ糖は、特定の改善された特性を有する抗体変異体を作製するために修飾することができる。

【0093】

一実施形態において、Ｆｃ領域に（直接的または間接的に）結合するフコースを欠いた炭水化物構造を有する抗体変異体が提供される。例えば、そのような抗体中のフコースの量は、１％～８０％、１％～６５％、５％～６５％、または２０％～４０％であり得る。フコースの量は、例えば、ＷＯ２００８／０７７５４６に記載されるように、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法によって測定した場合に、Ａｓｎ２９７に結合したすべての糖構造（複合体、ハイブリッド、および高マンノース構造等）の合計に対するＡｓｎ２９７の糖鎖内の平均フコース量を計算することによって決定することができる。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域の約２９７位（Ｆｅ領域残基のＥｕ番号付け）に位置するアスパラギン残基を指す。しかしながら、Ａｓｎ２９７はまた、抗体のわずかな配列変化に起因して、位置２９７の約±３アミノ酸上流または下流、例えば、２９４～３００位の間にも位置する可能性がある。そのようなフコース化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）、同第２００４／００９３６２１号（協和発酵バイオ株式会社）を参照することができる。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体変異体に関連する刊行物の例として、ＵＳ２００３／０１５７１０８、ＷＯ２０００／６１７３９、ＷＯ２００１／２９２４６、
ＵＳ２００３／０１１５６１４、ＵＳ２００２／０１６４３２８、ＵＳ２００４／００９３６２１、ＵＳ２００４／０１３２１４０、ＵＳ２００４／０１１０７０４、ＵＳ２００４／０１１０２８２、ＵＳ２００４／０１０９８６５、ＷＯ２００３／０８５１１９、ＷＯ２００３／０８４５７０、ＷＯ２００５／０３５５８６、ＴＯ２００５／０３５７７８、ＴＯ２００５／０５３７４２、ＴＯ２００２／０３１１４０、Ｏｋａｚａｋｉｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９－１２４９（２００４）、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例として、タンパク質フコシル化が欠損したＬｅｃ Ｉ３ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３－５４５（１９８６）；米国特許出願第２００３／０１５７１０８Ａ１号、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ；ならびにＷＯ２００４／０５６３１２Ａ１、Ａｄａｍｓら）、およびα－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞等のノックアウト細胞株（例えば、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）、Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０－６８８（２００６）、およびＷＯ２００３／０８５１０７を参照のこと）が挙げられる。

【0094】

例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分された、二分型オリゴ糖を有する抗体変異体がさらに提供される。そのような抗体変異体は、低下したフコシル化および／または改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。そのような抗体変異体の例は、例えば、ＷＯ２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ－Ｍａｉｒｅｔ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）、およびＵＳ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。そのような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。そのような抗体変異体は、例えば、ＷＯ１９９７／３００８７（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．）、ＷＯ１９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）、およびＷＯ１９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。

【0095】

ｃ）Ｆｃ領域変異体
いくつかの実施形態において、１つ以上のアミノ酸修飾を本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入し、それによってＦｃ領域変異体を生成することができる。Ｆｃ領域変異体は、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃ領域）を含み得る。

【0096】

いくつかの実施形態において、本発明は、すべてではないが、いくつかのエフェクター機能を有する抗体変異体を含む。エフェクター機能によって、それは、後に記載する用途への適用に望ましい候補となる。抗体のインビボでの半減期は重要である。補体およびＡＤＣＣ等の特定のエフェクター機能は、不要または有害である。ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性の低下／枯渇を確認するために、インビトロおよび／またはインビボ細胞傷害性アッセイを行うことができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠いている（したがって、ＡＤＣＣ活性を欠いている可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確実にするために行うことができる。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－４９２（１９９１）の４６４ページの表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３：７０５９－７０６３（１９８６）およびＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１４９９－１５０２（１９８５）を参照のこと）、同第５，８２１，３３７号（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１－１３６１（１９８７）を参照のこと）に記載されている。代替的に、非放射性アッセイ（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴ Ｉ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）およびＣｙｔｏＴｏｘ９６非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照のこと）が用いられてもよい。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。代替的にまたは追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されているもの等の動物モデルにおいて、インビボで評価することができる。Ｃｌｑ結合アッセイを行って、抗体がＣｌｑに結合できず、したがってＣＤＣ活性を欠いていることを確認することもできる。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９およびＷＯ２００５／１００４０２のＣｌｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）、Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１：１０４５－１０５２（２００３）、およびＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ １０３：２７３８－２７４３（２００４）を参照のこと）。ＦｃＲｎ結合およびインビボクリアランス／半減期アッセイもまた、当技術分野で既知の方法を用いて行うことができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）を参照のこと）。

【0097】

エフェクター機能が低下した抗体は、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、および３２９のうちの１つ以上の置換を有する抗体を含む（米国特許第６，７３７，０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５および２９７が各々アラニンで置換された、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７、および３２７のうちの２つ以上に置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。

【0098】

ＦｃＲへの結合が改善または低減された特定の抗体変異体が記載されている（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；ＷＯ２００４／０５６３１２、およびＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１－６６０４（２００１）を参照のこと）。

【0099】

いくつかの実施形態において、抗体変異体は、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８、３３３、および／または３３４位（残基のＥＵ番号付け）における置換を有するＦｃ領域を含み得る。

【0100】

いくつかの実施形態において、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９／５１６４２、およびＩｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８－４１８４（２０００）に記載されるように、変更された（すなわち、改善または低減された）Ｃ１ｑ結合および／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）をもたらす変化がＦｃ領域に加えられる。

【0101】

半減期が延長され、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体が、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、母体ＩｇＧの胎児への移行に関与する（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））。これらの抗体は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合を改善する１つ以上の置換をその中に有するＦｃ領域を含み得る。そのようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域残基２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２；４１３、４２４または４３４のうちの１つ以上に置換を有するもの、例えば、Ｆｃ領域残基４３４に置換を有するものを含む（米国特許第７，３７１，８２６号）。

【0102】

Ｆｃ領域変異体の他の例に焦点を合わせている、Ｄｕｎｃａｎ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８－４０（１９８８）、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、およびＷＯ９４／２９３５１も参照されたい。

【0103】

ｄ）システイン操作抗体変異体
いくつかの実施形態において、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置き換えられたシステイン操作抗体、例えば「ｔｈｉｏＭＡｂ」を作製することが望ましい場合がある。特定の実施形態において、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位に存在する。それらの残基をシステインで置き換えることにより、反応性チオール基が抗体のアクセス可能な部位に位置付けられる。さらに、これを使用して、本明細書でさらに説明するように、抗体を薬物部分またはリンカー－薬物部分等の他の部分に結合させて、免疫複合体を作製することができる。いくつかの実施形態において、システインは、以下の残基のうちのいずれか１つ以上で置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）、重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）、および重鎖Ｓ４００のＦｃ領域のもの（ＥＵ番号付け）。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されるように生成することができる。

【0104】

ｅ）抗体誘導体
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で既知であり、かつ容易に入手可能な、追加の非タンパク質性部分を含むようにさらに修飾することができる。抗体誘導体化に好適な部分は、水溶性ポリマーを含むが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマー）、デキストランまたはポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中での安定性に起因して、製造における利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量のものであってもよく、分岐または非分岐であり得る。抗体に結合するポリマーの数は様々であり得、１つ以上のポリマーが結合している場合、それらは同じ分子または異なる分子であり得る。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数および／または種類は、改善されるべき抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が規定条件下での治療に使用されるかどうか等を含み得るが、これらに限定されない考慮事項に基づいて決定することができる。

【0105】

別の実施形態において、放射線への曝露によって選択的に加熱することができる、抗体と非タンパク質性部分との複合体が提供される。一実施形態において、非タンパク質性部分はカーボンナノチューブである（Ｋａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：１１６００－１１６０５（２００５））。放射線は、任意の波長のものであり得、限定されないが、通常の細胞には有害ではないが、抗体－非タンパク質性部分の近くの細胞が死滅する温度まで非タンパク質性部分を加熱する波長を含む。

【0106】

アッセイ
本明細書で提供される抗ＯＸ４０抗体は、当技術分野で既知の様々なアッセイによって、それらの物理的／化学的特性および／または生物学的活性について同定、スクリーニング、または特徴付けすることができる。

【0107】

１．結合アッセイおよび他のアッセイ
一態様において、本発明の抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング等の既知の方法によって、それらの抗原結合活性について試験される。ＯＸ４０結合は、当技術分野で既知の方法を用いて決定することができ、例示的な方法が本明細書に開示される。一実施形態において、結合は、ラジオイムノアッセイを用いて測定される。例示的なラジオイムノアッセイが示される。ＯＸ４０抗体はヨウ素化され、固定濃度のヨウ素化抗体と、漸減濃度の非標識ＯＸ４０抗体の段階希釈液とを含む競合反応混合物が調製される。ＯＸ４０発現細胞（例えば、ヒトＯＸ４０で安定的にトランスフェクトされたＢＴ４７４細胞）が反応混合物に加えられる。インキュベーション後、細胞が洗浄され、細胞に結合したＯＸ４０抗体から遊離ヨウ素化ＯＸ４０抗体が分離される。結合したＯＸ４０ヨウ化物抗体のレベルは、例えば、細胞に関連する放射性を計数することによって決定することができ、結合親和性は、標準的な方法を用いて決定される。別の実施形態において、（例えば、Ｔ細胞のサブセット上で）ＯＸ４０抗体が表面に発現したＯＸ４０に結合する能力が、フローサイトメトリーを用いて評価される。末梢白血球（例えば、ヒト、カニクイザル、ラットまたはマウスから）が得られ、細胞が血清でブロックされる。標識されたＯＸ４０抗体は段階希釈で加えることができ、Ｔ細胞サブセットを同定するために（当技術分野で既知の方法を用いる）Ｔ細胞も染色される。試料のインキュベーションおよび洗浄に続いて、フローサイトメーターを使用して細胞が選別され、当技術分野で周知の方法を用いてデータが分析される。別の実施形態において、表面プラズモン共鳴を用いてＯＸ４０結合を分析することができる。例示的な表面プラズモン共鳴法が示される。

【0108】

別の態様において、競合アッセイを用いて、ＯＸ４０への結合について本明細書に開示される抗ＯＸ４０抗体のいずれかと競合する抗体を同定することができる。特定の実施形態において、そのような競合する抗体は、本明細書に開示される抗ＯＸ４０抗体のいずれかが結合することができる同じエピトープ（例えば、線状または立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープを局在化するための詳細な例示的方法は、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）“Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）に見出すことができる。競合アッセイが示される。

【0109】

例示的な競合アッセイにおいて、第１の標識抗体（ＯＸに結合する、例えば、ｍａｂ １Ａ７．ｇｒ．１、ｍａｂ ３Ｃ８．ｇｒ５）および第２の非標識抗体（第１の抗体のＯＸ４０結合能力と競合するように試験される）は、溶液中で固定化ＯＸ４０とインキュベートすることができる。二次抗体はハイブリドーマ上清に存在し得る。対照として、固定化されたＯＸ４０は、第１の標識抗体を含むが、第２の非標識抗体を含まない溶液中でインキュベートされる。一次抗体がＯＸ４０に結合できる条件下でインキュベートした後、過剰な非結合抗体が除去され、固定化されたＯＸ４０に結合した標識の量が測定される。固定化されたＯＸ４０に関連する標識の量が、対照試料と比較して試験試料で実質的に減少している場合、これは、二次抗体がＯＸ４０への結合について一次抗体と競合することを示している。Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照されたい。

【0110】

２．活性アッセイ
一態様において、生物学的に活性な抗ＯＸ４０抗体を同定するためのアッセイが提供される。本明細書における生物学的活性は、例えば、ＯＸ４０に結合すること（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＯＸ４０に結合すること）、ＯＸ４０媒介性シグナル伝達を増加させること（例えば、ＮＦｋＢ媒介性転写を増加させること）、ヒトＯＸ４０を発現する細胞（例えば、Ｔ細胞）を枯渇させること、ＡＤＣＣおよび／または食作用によりヒトＯＸ４０発現細胞を枯渇させること、Ｔエフェクター細胞機能（例えば、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞）を増強させること（例えば、エフェクターＴ細胞増殖を増加させることおよび／またはエフェクターＴ細胞サイトカイン（例えば、インターフェロンγ）産生を増加させることによる）、メモリーＴ細胞機能（例えば、ＣＤ４＋メモリーＴ細胞）を増強させること（例えば、メモリーＴ細胞増殖を増加させることおよび／またはメモリーＴ細胞サイトカイン産生（例えば、インターフェロンγ）を増加させることによる）、Ｔ細胞機能を調節するＴｒｅｇ抑制を阻害すること（例えば、エフェクターＴ細胞機能（例えば、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞機能）を低下させることによる）、およびヒトエフェクター細胞に結合すること、を含み得る。インビボおよび／またはインビトロでそのような生物学的活性を有する抗体も提供される。

【0111】

いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、そのような生物学的活性について試験される。

【0112】

Ｔ細胞共刺激は、当技術分野で既知の方法を用いて決定することができ、例示的な方法が本明細書に開示される。例えば、Ｔ細胞（例えば、メモリーまたはエフェクターＴ細胞）は、末梢白血球から得ることができる（例えば、フィコール勾配遠心分離を使用してヒト全血から単離される）。メモリーＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋メモリーＴ細胞）またはエフェクターＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋ Ｔｅｆｆ細胞）は、当技術分野で既知の方法を用いてＰＢＭＣから単離することができる。例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製ＣＤ４＋ Ｍｅｍｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ＫｉｔまたはＭｉｌｔｅｎｙｉ社製Ｎａｉｖｅ ＣＤ４＋ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用することができる。単離されたＴ細胞は、抗原提示細胞（例えば、照射されたＣＤ３２およびＣＤ８０を発現するＬ細胞）の存在下で培養され、ＯＸ４０アゴニスト抗体の存在下または非存在下で抗ＣＤ３抗体の添加によって活性化される。Ｔ細胞増殖に対するアゴニストＯＸ４０抗体の効果は、当技術分野で周知の方法を用いて測定することができる。例えば、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、マルチラベルリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で結果を読み取ることができる。Ｔ細胞機能に対するアゴニストＯＸ４０抗体の効果は、Ｔ細胞によるサイトカイン産生を分析することによって決定することができる。一実施形態において、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるインターフェロンガンマ産生は、例えば、細胞培養上清中のインターフェロンガンマを測定することによって決定される。インターフェロンガンマを測定するための方法は、当技術分野で周知である。

【0113】

Ｔｒｅｇ細胞機能は、当技術分野で既知の方法を用いてアッセイすることができ、例示的な方法が本明細書に開示される。一例では、エフェクターＴ細胞の増殖を抑制するＴｒｅｇの能力がアッセイされる。Ｔ細胞（例えば、メモリーＴ細胞またはナイーブＴ細胞の単離）は、当技術分野で既知の方法を用いてヒト全血から単離される。精製されたＣＤ４＋ナイーブＴ細胞は（例えばＣＦＳＥで）標識され、精製されたＴｒｅｇ細胞は異なる試薬で標識される。照射された抗原提示細胞（例えば、ＣＤ３２およびＣＤ８０を発現するＬ細胞）は、標識された精製ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞および精製Ｔｒｅｇと共培養される。共培養は、抗ＣＤ３抗体で活性化し、アゴニストＯＭＯ抗体の存在下または非存在下で試験することができる。適切な時間（例えば、６日間の共培養）の後、ＦＡＣＳ分析を用いて、低減されたマーカー染色（例えば、低減されたＣＦＳＥマーカー染色）における色素希釈により、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞増殖のレベルを追跡する。

【0114】

ＯＸ４０シグナル伝達は、当技術分野で周知の方法を用いてアッセイすることができ、例示的な方法が本明細書に開示される。一実施形態において、ヒトＯＸ４０、およびレポーター遺伝子（例えば、βルシフェラーゼ）に融合したＮＦｋＢプロモーターを含むレポーター遺伝子を発現するトランスジェニック細胞が生成される。ＯＸ４０アゴニスト抗体の細胞への添加により、ＮＦｋＢ転写の増加がもたらされ得、レポーター遺伝子に対するアッセイを用いてそれを検出することができる。

【0115】

食作用は、例えば、単球由来のマクロファージ、または成熟マクロファージの形態および特徴を有するヒト組織球性リンパ腫細胞株であるＵ９３７細胞を使用することによって測定することができる。ＯＸ４０発現細胞は、抗ＯＸ４０アゴニスト抗体の存在下または非存在下で単球由来マクロファージまたはＵ９３７細胞に加えることができる。細胞を適切な期間培養し、１）マクロファージまたはＵ９３７細胞および２）ＯＸ４０発現細胞のマーカーについて二重染色された細胞のパーセンテージを決定し、次いで、ＯＸ４０を発現する細胞のマーカー（例えば、ＧＦＰ）を示す細胞の総数で上記を除すことにより、食作用率を決定することができる。分析はフローサイトメトリーによって行うことができる。別の実施形態において、分析は、蛍光顕微鏡分析によって行うことができる。

【0116】

ＡＤＣＣは、例えば、当技術分野で周知の方法を用いて決定することができる。例示的な方法は、定義のセクションに記載されている。いくつかの実施形態において、ＡＤＣＣアッセイで試験するためにＯＸ４０発現細胞上のＯＸ４０レベルが特徴付けられる。細胞は、検出可能に標識された抗ＯＸ４０抗体（例えば、ＰＥ標識）で染色され、フローサイトメトリーを使用して蛍光レベルが決定され、結果が蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）として示される。別の実施形態において、ＡＤＣＣは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏアッセイキットによって分析することができ、細胞生存率／細胞傷害性は、化学発光によって決定することができる。

【0117】

ＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、およびＦｃγＲＩＩＩＡの２つのアロタイプ（Ｆ１５８およびＶ１５８）に対する様々な抗体の反応は、対応する組換えＦｃγ受容体を使用したＥＬＩＳＡベースのリガンド結合アッセイで結合親和性により測定することができる。精製されたヒトＦｃγ受容体は、Ｃ末端のＧｌｙ／６ｘＨｉｓ／グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ポリペプチドタグに結合した受容体γ鎖の細胞外ドメインを含む融合タンパク質として発現する。それらのヒトＦｃγ受容体に対する抗体の結合親和性は、以下のように決定することができる。低親和性受容体、すなわち、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、およびＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）の２つのアロタイプであるＦ－１５８およびＶ－１５８の場合、抗体対架橋のおおよそのモル比１：３で、ヤギ抗ヒトカッパ鎖のＦ（ａｂ’）２フラグメント（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ；Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）ａｂ’）２と架橋することによって、抗体を試験するために多量体として得ることができる。プレートを抗ＧＳＴ抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）でコーティングし、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックすることができる。０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）およびＥＬｘ４０５（商標）プレート洗浄デバイス（Ｂｉｏｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ；Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）で洗浄した後、Ｆｃγ受容体を２５ｎｇ／ウェルでプレートに加え、室温で１時間インキュベートする。プレートを洗浄した後、試験抗体の段階希釈液を多量体複合体として加えることができ、次いでプレートを室温で２時間インキュベートする。プレートを洗浄して未結合の抗体を除去した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）と結合したヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２のＦ（ａｂ’）２フラグメントを使用して、Ｆｃγガンマ受容体に結合した抗体を検出することができる。次いで、基質であるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を加える。試験したＦｃγ受容体に応じて、プレートを室温で５～２０分間インキュベートして発色を可能にさせることができる。次いで、反応を１Ｍ Ｈ_３ＰＯ_４で停止し、マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）１９０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定する。次いで、重複する抗体希釈液からの平均吸光度値を抗体濃度に対してプロットすることにより、用量反応結合曲線を生成する。Ｆｃγ受容体への結合からの最大反応の５０％（ＥＣ５０）が検出される有効抗体濃度の値は、ＳｏｆｔＭａｘ １９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、４パラメータ式を用いて結合曲線を適合させた後に決定することができる。

【0118】

細胞死を誘導する抗体を選択するために、例えば、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー、または７ＡＡＤの取り込みによって示されるような膜完全性の喪失を、対照と比較して評価することができる。ＰＩ取り込みアッセイは、補体および免疫エフェクター細胞の非存在下で行うことができる。ＯＸ４０発現細胞を、培地のみで、または例えば約１０μｇ／ｍｌの濃度で適切なモノクローナル抗体を含む培地でインキュベートする。細胞を一定期間（例えば、１日間または３日間）インキュベートする。各処理後、細胞を洗浄し、分取する。いくつかの実施形態において、細胞は、細胞凝集塊を除去するために、３５ｍｍのストレーナーキャップ付きの１２×７５試験管（試験管当たり１ｍｌ、処理群当たり３つの試験管）に分取される。次いで、ＰＩ（１０μｇ／ｍｌ）が試験管に加えられる。試料は、ＦＡＣＳＣＡＮ（商標）フローサイトメーターおよびＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴ（商標）ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析することができる。

【0119】

上記のインビトロアッセイのいずれかで使用するための細胞は、ＯＸ４０を自然に発現する、またはＯＸ４０を発現するように操作することができる、細胞または細胞株を含む。そのような細胞には、ＯＸ４０を自然に発現する活性化Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、および活性化メモリーＴ細胞が含まれる。そのような細胞には、ＯＸ４０を発現する細胞株、および通常はＯＸ４０を発現しないがＯＸ４０をコードする核酸でトランスフェクトされた細胞株も含まれる。上記のインビトロアッセイのいずれかで使用するために本明細書で提供される例示的な細胞株には、ヒトＯＸ４０を発現するトランスジェニックＢＴ４７４細胞（ヒト乳がん細胞株）が含まれる。

【0120】

上記のアッセイのいずれも、抗ＯＸ４０抗体の代わりに、またはそれに加えて、本発明の免疫複合体を使用して行うことができると理解されたい。

【0121】

上記のアッセイのいずれも、抗ＯＸ４０抗体および他の治療薬を使用して行うことができると理解されたい。

【0122】

製剤およびその使用
本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、医薬組成物に製剤化することができる。医薬組成物は、凍結乾燥剤または水溶液の形態の、特定の薬学的に許容される担体、賦形剤および／または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｅｄ．Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ）をさらに含み得る。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、リン酸、クエン酸、および他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；ヘキサヒドロキシクオタニウムクロリド；アルジサイド；ベンソニンクロリド（ｂｅｎｓｏｎｉｎ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）；フェノール、ブタノール、もしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルパラベンもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストランを含む他の糖類；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み得る。薬学的に許容される賦形剤は、本明細書でさらに説明される。

【0123】

本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、様々な治療または診断目的に使用することができる。例えば、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、親和性精製剤として（例えば、インビトロ精製のために）および診断剤として（例えば、特定の細胞、組織、または血清における発現の検出のために）使用することができる。

【0124】

本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントの例示的な治療用途には、がんの治療が含まれる。本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントはまた、予防的治療にも使用することができる。

【0125】

治療用途の場合、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、従来の技術によって、哺乳動物、特にヒトに投与することができる。そのような技術は、静脈内（ボーラスとして、または経時的な持続注入による）、筋肉内、腹腔内、脳内、皮下、関節内、滑液嚢内、髄腔内、経口、局所、または吸入によるものであり得る。本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントはまた、必要に応じて、腫瘍内、腫瘍周囲、病変内、または病変周囲経路によっても投与され得る。

【0126】

いくつかの実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、皮下投与される。いくつかの実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、静脈内投与される。

【0127】

医薬組成物は、疾患の重症度に応じて変化し得る頻度で、それを必要とする対象に投与することができる。予防的治療の場合、頻度は、対象の疾患に対する感受性または素因に応じて変化し得る。

【0128】

組成物は、それを必要とする患者に、ボーラス注射として、または持続注入によって投与され得る。例えば、Ｆａｂフラグメントとして提示される抗体のボーラス投与は、０．００２５～１００ｍｇ／ｋｇ体重、０．０２５～０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０１０～０．１０ｍｇ／ｋｇ、または０．１０～０．５０ｍｇ／ｋｇの量で投与することができる。持続注入の場合、Ｆａｂフラグメントとして提示される抗体は、０．００１～１００ｍｇ／ｋｇ体重／分、０．０１２５～１．２５ｍｇ／ｋｇ／分、０．０１０～０．７５ｍｇ／ｋｇ／分、０．０１０～１．０ｍｇ／ｋｇ／分、または０．１０～０．５０ｍｇ／ｋｇ／分の量であり得、１～２４時間、１～１２時間、２～１２時間、６～１２時間、２～８時間、または１～２時間投与される。

【0129】

全長抗体（無傷の定常領域を有する）として提示される抗体の投与の場合、投与量は、約１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ以上、約２ｍｇ／ｋｇ以上、約３ｍｇ／ｋｇ以上、約４ｍｇ／ｋｇ以上、約５ｍｇ／ｋｇ以上、約６ｍｇ／ｋｇ以上、約７ｍｇ／ｋｇ以上、約８ｍｇ／ｋｇ以上、約９ｍｇ／ｋｇ以上、約１０ｍｇ／ｋｇ以上、約１１ｍｇ／ｋｇ以上、約１２ｍｇ／ｋｇ以上、約１３ｍｇ／ｋｇ以上、約１４ｍｇ／ｋｇ以上、約１５ｍｇ／ｋｇ以上、約１６ｍｇ／ｋｇ以上、約１７ｍｇ／ｋｇ以上、約１９ｍｇ／ｋｇ以上、または約２０ｍｇ／ｋｇ以上であり得る。投与の頻度は、状態の重症度に依存し得る。頻度は、週に３回から、２、３週間に１回まで変動し得る。

【0130】

代替的に、組成物は、皮下注射によって患者に投与することができる。例えば、１～１００ｍｇの用量の抗ＯＸ４０抗体を、週２回、週１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、５週間に１回、６週間に１回、７週間に１回、８週間に１回、９週間に１回、１０週間に１回、１ヶ月に２回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、または３ヶ月に１回の頻度で、患者に皮下または静脈内注射によって投与することができる。

【0131】

いくつかの実施形態において、ヒトにおける抗ＯＸ４０抗体の半減期は、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、約１５日、約１６日、約１７日、約１８日、約１９日、約２０日、約２１日、約２２日、約２３日、約２４日、約２５日、約２６日、約２７日、約２８日、約２９日、約３０日、約５日～約４０日、約５日～約３５日、約５日～約３０日、約５日～約２５日、約１０日～約４０日、約１０日～約３５日、約１０日～約３０日、約１０日～約２５日、約１５日～約４０日、約１５日～約３５日、約１５日～約３０日、または約１５日～約２５日であり得る。

【0132】

いくつかの実施形態において、医薬組成物は、以下の用量で２～６週間毎に皮下または静脈内投与することができる：約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約８ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約８ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約８ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ～約８ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約８ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２．０ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３．０ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ、約４．０ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ、約５．０ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ、約６．０ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ、約７．０ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ、約８．０ｍｇ／ｋｇ、約８．５ｍｇ／ｋｇ、約９．０ｍｇ／ｋｇ、約９．５ｍｇ／ｋｇ、または約１０．０ｍｇ／ｋｇ。

【0133】

いくつかの実施形態において、医薬組成物は、２～６週間毎に約２．０ｍｇ／ｋｇの用量で皮下または静脈内投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約２．０ｍｇ／ｋｇ～約１０．０ｍｇ／ｋｇの用量で、２～６週間毎に皮下または静脈内投与される。

【0134】

例示的な実施形態において、医薬組成物は、２週間毎に皮下投与される。

【0135】

本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、がんを治療するために、単剤療法として、または他の療法と組み合わせて使用することができる。

【0136】

定義
本明細書で別途定義されない限り、本出願に関連して使用される科学用語および技術用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上別段の要求がない限り、単数形は複数形を含み、複数形は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションに関して使用される命名法および技術は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されているものである。

【0137】

抗体の「抗原結合フラグメント」は、抗原に特異的に結合する能力を保持する（好ましくは、実質的に同じ結合親和性を有する）全長抗体のフラグメントを指す。抗原結合フラグメントの例として、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメントであるＦａｂフラグメント、（ｉｉ）ヒンジ領域のジスルフィド結合によって結合された２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｖ）単一アーム抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）、ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、抗特発性（ａｎｔｉ－Ｉｄ）抗体、およびイントラボディが挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン（ＶＬおよびＶＨ）は、異なる遺伝子によってコードされるが、それらは組換え法を用いて合成リンカーによって結合することができる。合成リンカーは、ＶＬ領域とＶＨ領域が対合して一価分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と称される）を形成する単一タンパク質鎖になることを可能にする。例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６（１９８８）およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３（１９８８）を参照されたい。ダイアボディ等の他の形態の一本鎖抗体もまた、本発明に含まれる。ダイアボディは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現する二価の二重特異性抗体の一種であるが、そのような場合にリンカーが用いられると、同じ鎖上で２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるため、それによってドメインを他の鎖の相補的ドメインと強制的に対合させて、２つの抗原結合部位を生じさせる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８（１９９３）；およびＰｏｌｊａｋ ｅｔ ａｌ．，１９９４、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１－１１２３を参照のこと）。

【0138】

抗体の「可変ドメイン」は、抗体軽鎖（ＶＬ）の可変領域または抗体重鎖（ＶＨ）の可変領域を、単独でまたは組み合わせたものを指す。当技術分野で既知であるように、重鎖および軽鎖の可変領域は各々、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）によって接続された３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）からなり、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。

【0139】

可変ドメインの残基は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号が付される。Ｋａｂａｔは、抗体の編集に使用される重鎖または軽鎖可変ドメインの番号付けシステムである。Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５^ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）を参照されたい。この番号付けシステムを使用すると、実際の線状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲの短縮または挿入に対応する、より少ないまたは追加のアミノ酸を含み得る。所与の抗体について、残基のＫａｂａｔ番号付けは、抗体の配列を「標準的な」Ｋａｂａｔ番号付け配列と相同性のある領域と整列させることによって決定することができる。Ｋａｂａｔ番号を割り当てるための様々なアルゴリズムが利用可能である。本明細書に別途記載されない限り、Ｋａｂａｔ番号は、２０１２年に公開されたＡｂｙｓｉｓ（ｗｗｗ．ａｂｙｓｉｓ．ｏｒｇ）で実行されるアルゴリズムを使用して可変領域に割り当てられる。

【0140】

パラトープ残基等の、抗体の特定のアミノ酸残基の位置も、Ｋａｂａｔシステムに従って番号が付される。

【0141】

「相補性決定領域」（ＣＤＲ）は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの両方の集積、ＡｂＭ、接触および／もしくは立体構造の定義、または当技術分野で周知のＣＤＲ決定の任意の方法に従って同定され得る。例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７－８８３（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｌｏｏｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）を参照されたい。ＣＤＲのＡｂＭ定義は、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａとの折衷案であり、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社のＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアＣＤＲを使用した「接触」の定義は、ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６２：７３２－７４５に記載される明らかな抗原接触に基づいている。ＣＤＲの「立体構造の」定義は、抗原結合のエンタルピーに寄与する残基の形成に基づいている（例えば、Ｍａｋａｂｅ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８３：１１５６－１１６６を参照のこと）。さらに他のＣＤＲ境界の定義は、上記方法のうちの１つに厳密に従わなくてもよいが、それにもかかわらずＫａｂａｔ ＣＤＲの少なくとも一部と重複し得る。しかしながら、それらは、予測または実験的知見によって短縮または延長される特定の残基もしくは残基の群、またはさらにはＣＤＲ全体にも依存して、抗原結合に有意な影響を与えない場合がある。本明細書で使用される場合、ＣＤＲは、方法の組み合わせを含む、当技術分野で既知の任意の方法によって定義されるＣＤＲを指し得る。

【0142】

「エピトープ」は、抗体が特異的に結合する抗原（Ａｇ）の領域または範囲、例えば、抗体（Ａｂ）と相互作用するアミノ酸残基を含む領域または範囲を指す。エピトープは、線状または非線状（例えば、立体構造）であり得る。

【0143】

抗体またはその抗原結合フラグメントは、対応する抗体またはその抗原結合フラグメントの結合が相互に排他的である場合、別の抗体またはその抗原結合フラグメントと実質的に同じエピトープに結合する。すなわち、１つの抗体またはその抗原結合フラグメントの結合は、別の抗体またはその抗原結合フラグメントの同時または連続的な結合を妨げる。抗原が２つの対応する抗体またはその抗原結合フラグメントの同時結合に対応することができる場合、エピトープは特有であるか、または実質的に同一ではないとみなされる。

【0144】

「パラトープ」という用語は、上記の「エピトープ」の定義から異なる観点によって派生したものであり、抗原結合に関与する抗体分子の領域または範囲、例えば、抗原と相互作用する残基を含む領域または範囲を指す。パラトープは、線状または立体構造（ＣＤＲの不連続残基等）であり得る。

【0145】

所与の抗体／抗原結合ペアのエピトープ／パラトープは、様々な実験方法および計算的エピトープマッピング法を用いて、様々な詳細レベルで定義および特徴付けることができる。実験方法は、突然変異誘発、Ｘ線結晶解析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、水素／重水素交換質量分析（ＨＸ－ＭＳ）、および様々な競合結合法を含む。各方法は独自の原理に依存しているため、エピトープの説明は、エピトープが決定された方法と密接に関連している。したがって、所与の抗体／抗原対のエピトープ／パラトープは、用いられるマッピング法に応じて異なって定義され得る。

【0146】

最も詳細なレベルにおいて、抗体（Ａｂ）と抗原（Ａｇ）との相互作用に使用されるエピトープ／パラトープは、Ａｇ－Ａｂ相互作用に存在する原子接触の空間座標の定義、および結合の熱力学に対するそれらの相対的な寄与を定義することに関する情報によって決定され得る。ある程度までは、ＡｇとＡｂとの間の原子接触の空間座標を定義することによってエピトープ／パラトープ残基を特徴付けることができる。一態様において、エピトープ／パラトープ残基は、ＡｂおよびＡｇの原子間の距離等の具体的な基準によって定義することができる（例えば、相同抗体の重原子から抗原の重原子までの距離は、そのおおよその定義と等しいかまたはそれよりも少ない）。別の態様において、エピトープ／パラトープ残基は、同族抗体／抗原との水素結合相互作用、または同様に同族抗体／抗体に水素が結合した水分子との水素結合相互作用（水媒介水素結合）に関与するものとして特徴付けることができる。別の態様において、エピトープ／パラトープ残基は、相同抗体／抗原の残基と塩架橋を形成することによって特徴付けることができる。さらに別の態様において、エピトープ／パラトープ残基は、同族抗体／抗原との相互作用に起因して、埋没表面積（ＢＳＡ）に非ゼロ変数を有する残基として特徴付けることができる。あまり詳細ではないレベルでは、エピトープ／パラトープは、機能によって、例えば他のＡｂとの競合結合によって特徴付けることができる。エピトープ／パラトープは、別のアミノ酸による置換がＡｂとＡｇとの間の相互作用の特徴を変化させる（例えば、アラニンスキャニング）アミノ酸残基を含むものとして、より一般的に定義することもできる。

【0147】

エピトープの説明および定義は、使用されるエピトープマッピング法、およびそれが異なる詳細レベルで取得されるという事実に依存するため、同じＡｇ上の異なるＡｂのエピトープの比較は、異なる詳細レベルで類似し得ると推測することができる。例えば、これは、Ｘ線構造から決定されるエピトープのようにアミノ酸レベルで説明することができ、それらが同じアミノ酸残基のセットを含む場合、それらは同一であるとみなされる。競合結合を特徴とするエピトープは、対応する抗体の結合が相互に排他的である場合、すなわち、ある抗体の結合が別の抗体の同時または連続結合を排除する場合、重複しているとみなすことができる。また、抗原が２つの対応する抗体の同時結合に対応することができる場合、エピトープは別個（特有）であるとみなされる。

【0148】

所与の抗体／抗原対のエピトープおよびパラトープは、ルーチン的な方法で同定することができる。例えば、エピトープの一般的な位置は、本明細書においてすでにより完全に記載したように、様々なフラグメントまたは変異体ポリペプチドに結合する抗体の能力を評価することによって決定することができる。抗体内の特定の残基と接触し得るＯＸ４０内の特定の残基は、特定のルーチン的な方法を用いて決定することもできる。例えば、抗体／抗原複合体を結晶化することができる。結晶構造は、抗体と抗原との間の相互作用の特定の部位を特定するために決定および使用することができる。

【0149】

「特異的結合」という用語は当技術分野で周知の用語であり、これらの特異的結合を決定するための方法もまた当技術分野で周知である。分子は、それが代替的細胞または物質と反応または結合する場場合と比べて、より頻繁に、より迅速に、より長い持続時間、および／またはより高い親和性で、特定の細胞または物質と反応または結合する場合、その分子は「特異的結合」を示すとみなされる。抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗体またはその抗原結合フラグメントが、他の物質と比べて、より高い親和性、より高い結合能、より高い容易性、かつ／またはより長い持続時間を有するという特徴を伴って標的に結合する場合、標的に「特異的に結合する」。

【0150】

例えば、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、他の抗原と比べて、より高い親和性、より高い結合能、より高い容易性、かつ／またはより長い持続時間を有するという特徴を伴ってその同族抗原に結合する抗体である。例えば、標準的な結合アッセイ条件下で、抗ＯＸ４０抗体は、試料中のヒトＯＸ４０に特異的に結合することができるが、同じ試料中の他の分子を実質的に認識しないか、またはそれに結合しない。第１の標的に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、第２の標的に特異的に結合する場合もあれば、そうでない場合もあることも理解されたい。したがって、本明細書における「特異的結合」は、排他的結合を（それを含んでもよいが）必ずしも必要としない。必ずしもそうではではないが、通常、本明細書で使用される「結合」は、特異的に結合することを意味する。

【0151】

様々なアッセイ様式を使用して、目的の分子に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを選択することができる。例えば、多くのアッセイの中で、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイ、免疫沈降、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＫｉｎＥｘＡ、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、Ｏｃｔｅｔ（商標）（Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．）、およびウエスタンブロット分析を用いて、抗原に結合する特異的抗体またはその抗原結合フラグメントを同定することができる。典型的には、特定の結合は、バックグラウンド信号またはノイズの少なくとも２倍、より典型的にはバックグラウンドの少なくとも１０倍、バックグラウンドの少なくとも５０倍、バックグラウンドの少なくとも１００倍、バックグラウンドの少なくとも５００倍、バックグラウンドの少なくとも１０００倍、またはバックグラウンドの少なくとも１０，０００倍であり得る。

【0152】

抗体結合の特異性は、抗体とＯＸ４０との間の特異的結合のＫ_Ｄ値を決定し、そのＫ_Ｄ値を、ＯＸ４０に結合しないことが分かっている対照抗体のＫ_Ｄ値と比較することによって評価することができる。一般に、抗体は、Ｋ_Ｄが約×１０^－５Ｍ以下の場合に、抗原に「特異的に」結合する。

【0153】

抗体またはその抗原結合フラグメントが、他の抗原に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントと比べて、より高い親和性、より高い結合能、より高い容易性、かつ／またはより長い持続時間を有するという特徴を伴って抗原に結合しない場合、抗体またはその抗原結合フラグメントは、その抗原に「実質的に結合しない」。典型的には、結合は、バックグラウンド信号またはノイズの２倍以下である。一般に、それは１×１０^－４Ｍ以上、１×１０^－３Ｍ以上、１×１０^－２Ｍ以上、または１×１０^－１Ｍ以上のＫ_Ｄで抗原に結合する。

【0154】

抗体に関して本明細書で使用される「競合する」という用語は、第１の抗体またはその抗原結合部分の抗原への結合が、後続の第２の抗体またはその抗原結合部分の同じ抗原への結合を減少させることを意味する。一般に、第１の抗体の結合は、立体障害、立体構造変化、または共通のエピトープ（またはその一部）への結合をもたらし、その結果、同じ抗原への第２の抗体の結合が減少する。標準的な競合結合アッセイを用いて、２つの抗体が互いに競合するかどうかを判断することができる。

【0155】

抗体競合の好適なアッセイは、Ｂｉａｃｏｒｅの技術の使用を伴う。この技術は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用することができる。相互作用の程度は、典型的には、システム等のバイオセンサーシステムを使用して測定される。例えば、ある抗体が第２の抗体の結合を阻害する能力を決定するために、ＳＰＲをインビトロ競合結合阻害アッセイにおいて使用することができる。抗体競合を測定するための別のアッセイは、ＥＬＩＳＡベースの方法を用いる。さらに、抗体の競合に基づく抗体の「分画」のためのハイスループット法が、ＷＯ２００３／４８７３１に記載されている。ある抗体またはその抗原結合フラグメントが、別の抗体またはその抗原結合フラグメントのＯＸ４０への結合を減少させる場合、競合が存在する。例えば、異なる抗体を逐次的に加える、逐次的結合競合アッセイを用いることができる。一次抗体は、飽和に近い結合を達成するために加えることができ、次いで二次抗体が加えられる。第２の抗体のＯＸ４０への結合が、検出できない場合、または第１の抗体が存在しない場合（中央値は１００％に設定可能）と比較して有意に減少している（例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％）場合、２つの抗体は、互いに競合するとみなされる。

【0156】

競合結合アッセイを行うこともできる。抗原への抗体の結合が、別様に標的に結合する別の抗体または可溶性受容体等の、その標的の別の結合パートナーによる標的の結合と比較される。５０％阻害が生じる濃度はＫ_ｉと称される。理想的な条件下では、このＫ_ｉはＫ_Ｄと等しい。したがって、一般に、Ｋ_ｉの測定は、Ｋ_Ｄの上限を提供するために都合よく用いることができる。異なる分子相互作用に関連する結合親和性（例えば、所与の抗体に対する異なる抗体の結合親和性の比較）は、個々の抗体／抗原複合体のＫ_Ｄの比較によって比較することができる。抗体または他の結合パートナーのＫ_Ｄ値は、当技術分野で確立された方法を用いて決定することができる。

【0157】

「Ｆｃ融合」タンパク質は、１つ以上のポリペプチドがＦｃポリペプチドに作動可能に連結したタンパク質である。Ｆｃ融合は、免疫グロブリンのＦｃ領域を融合パートナーと組み合わせる。「Ｆｃ領域」は、天然配列のＦｃ領域または変異型Ｆｃ領域であり得る。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、一般に、Ｃｙｓ２２６位またはＰｒｏ２３０位のアミノ酸残基からそのカルボキシ末端まで及ぶものとして定義される。Ｆｃ領域の残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１に記載されるように、ＥＵインデックスによる番号付けであり得る。免疫グロブリンのＦｃ領域は、典型的には、２つの定常ドメイン（ＣＨ_２およびＣＨ_３）を含む。当技術分野で既知であるように、Ｆｃ領域は、二量体または単量体の形態で存在し得る。

【0158】

「治療有効量」という用語は、意図される目的を達成するのに十分な量の、抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはそのような抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む組み合わせの量を意味する。正確な量は、治療組成物の成分および物理的特性、意図される患者集団、個々の患者の考慮事項等を含むがこれらに限定されない、多くの要因に依存し得、当業者によって決定され得る。

【0159】

「治療」という用語は、予防的および／または治療的治療を含む。疾患、障害または状態の臨床症状の前に投与される場合、治療は予防的または予防可能であるとみなされる。治療的治療には、例えば、疾患、障害もしくは状態の重症度を軽減もしくは低減すること、または疾患、障害もしくは状態の長さを短縮することが含まれる。

【0160】

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、ある値の＋／－１０％を指す。

【0161】

治療法および組成物
本明細書で提供される抗ヒトＯＸ４０抗体のいずれも、治療の方法において使用することができる。

【0162】

一態様において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、薬物として使用するために提供される。さらに他の態様において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、がんの治療に使用するために提供される。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、治療の方法において使用するために提供される。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、有効量の抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体を個体に投与することを含む、がんを有する個体を治療する方法において使用するために提供される。そのような一実施形態において、方法は、例えば、以下に記載されるように、有効量の少なくとも１つの追加の治療薬を個体に投与することをさらに含む。

【0163】

一態様において、有効量の抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体を個体に投与することを含む、がんを有する個体の免疫機能を（例えば、細胞媒介性の免疫応答を上方制御することにより）増強するのに使用するための抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体が提供される。一態様において、有効量の抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体を個体に投与することを含む、がんを有する個体のＴ細胞機能を増強するのに使用するための抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体が提供される。一態様において、有効量の抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体を個体に投与することを含む、ヒトＯＸ４０発現細胞（例えば、ＯＸ４０発現Ｔ細胞、例えば、ＯＸ４０発現Ｔｒｅｇ）を枯渇させるのに使用するための抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体が提供される。いくつかの実施形態において、枯渇は、ＡＤＣＣを介して達成される。いくつかの実施形態において、枯渇は、食作用によって達成される。腫瘍免疫を有する個体の治療に使用するための抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体が提供される。

【0164】

さらに他の態様において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、感染症（例えば、細菌性もしくはウイルス性感染症または他の病原性感染症）の治療に使用するために提供される。いくつかの実施形態において、本発明は、有効量の抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体を個体に投与することを含む、感染症を有する個体を治療する方法において使用するための抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体を提供する。いくつかの実施形態において、感染症は、ウイルス性および／または細菌性感染症である。いくつかの実施形態において、感染症は病原体感染症である。

【0165】

さらに別の態様において、本発明は、薬物の製造または調製のための抗ＯＸ４０抗体の使用を提供する。一実施形態において、薬物はがんの治療のためである。さらに別の実施形態において、薬物は、がんを有する個体に有効量の薬物を投与することを含む、がんを治療する方法において使用するためのものである。そのような一実施形態において、方法は、以下に記載されるように、有効量の少なくとも１つの追加の治療薬を個体に投与することをさらに含む。

【0166】

一態様において、薬物は、有効量の薬物を個体に投与することを含む、がんを有する個体の免疫機能を（例えば、細胞媒介性の免疫応答を上方制御することにより）増強するためのものである。一態様において、薬物は、有効量の薬物を個体に投与することを含む、がんを有する個体のＴ細胞機能を増強するためのものである。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞機能不全障害はがんである。一態様において、薬物は、有効量の薬物を個体に投与することを含む、ヒトＯＸ４０発現細胞（例えば、高ＯＸ４０発現細胞、例えば、ＯＸ４０発現Ｔ細胞）を枯渇させるために使用される。いくつかの実施形態において、枯渇は、ＡＤＣＣを介して達成される。いくつかの実施形態において、枯渇は、食作用によって達成される。一態様において、薬物は、腫瘍免疫を有する個体を治療するために使用される。

【0167】

さらに他の態様において、感染症（例えば、細菌性もしくはウイルス性感染症または他の病原性感染症）の治療のための薬物が提供される。いくつかの実施形態において、薬物は、有効量の薬物を個体に投与することを含む、感染症を有する個体を治療する方法において使用される。いくつかの実施形態において、感染症は、ウイルス性および／または細菌性感染症である。いくつかの実施形態において、感染症は病原体感染症である。

【0168】

さらに別の態様において、本発明は、がんを治療するための方法を提供する。一実施形態において、方法は、がんを有する個体に有効量の抗ＯＸ４０抗体を投与することを含む。そのような一実施形態において、方法は、例えば、以下に記載されるように、有効量の少なくとも１つの追加の治療薬を個体に投与することをさらに含む。上記の実施形態のいずれかによる「個体」は、ヒトであり得る。

【0169】

一態様において、有効量の抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体を個体に投与することを含む、がんを有する個体の免疫機能を（例えば、細胞媒介性の免疫応答を上方制御することにより）増強するための方法が提供される。一態様において、有効量の抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体を個体に投与することを含む、がんを有する個体のＴ細胞機能を増強するための方法が提供される。一態様において、有効量の抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体を個体に投与することを含む、ヒトＯＸ４０を発現する細胞（例えば、高レベルのＯＸ４０を発現する細胞、例えば、ＯＸ４０を発現するＴ細胞）を枯渇させるための方法が提供される。いくつかの実施形態において、枯渇は、ＡＤＣＣを介して達成される。いくつかの実施形態において、枯渇は、食作用によって達成される。腫瘍免疫を有する個体の治療に使用するための抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体が提供される。

【0170】

いくつかの実施形態において、がんの例としてさらに、Ｂ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＵ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型無核細胞性ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、およびワルデンストロームマクログロブリン血症を含む）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病、および移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症に関連する異常な血管増殖、浮腫（脳腫瘍に関連するもの等）、Ｂ細胞増殖性疾患、およびメイグス症候群が挙げられるが、これらに限定されない。より具体的な例として、再発または難治性のＮＨＬ、フロントライン低悪性度ＮＨＬ、第ＩＩＩ／ＩＶ病期ＮＨＬ、化学療法耐性ＮＨＬ、前駆Ｂリンパ芽球性白血病および／またはリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病および／または前リンパ性白血病および／または小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性リンパ腫、免疫細胞腫および／またはリンパ形質細胞性リンパ腫、リンパ形質細胞性Ｂ細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓性辺縁帯リンパ腫、結節外辺縁帯－ＭＡＬＴリンパ腫、結節性辺縁帯リンパ腫、有毛細胞白血病、形質細胞腫および／または形質細胞骨髄腫、低悪性度／濾胞性リンパ腫、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、濾胞中心リンパ腫、中悪性度びまん性ＮＨＬ、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、侵襲性ＮＨＬ（侵襲性フロントラインＮＨＬおよび侵襲性再発性ＮＨＬを含む）、自家幹細胞移植後の再発性または難治性ＮＨＬ、縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、進行性免疫芽球性ＮＨＬ、進行性リンパ芽球性ＮＨＬ、進行性小型無核細胞性ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬ、バーキットリンパ腫、前駆体（末梢）大顆粒リンパ性白血病、菌状息肉症および／またはセザリー症候群、皮膚リンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫、および血管中心性リンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない。

【0171】

いくつかの実施形態において、がんの例として、限定されないがＢ細胞増殖性疾患がさらに挙げられ、これは、限定されないが、リンパ腫（例えば、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ））およびリンパ性白血病を含み得る。そのようなリンパ腫およびリンパ性白血病は、例えば、ａ）濾胞性リンパ腫、ｂ）小型非切れ込み核細胞性リンパ腫／バーキットリンパ腫（風土性バーキットリンパ腫、散発性バーキットリンパ腫および非バーキットリンパ腫を含む）、ｃ）辺縁帯リンパ腫（結節外辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（粘膜関連リンパ組織リンパ腫、ＭＡＬＴを含む）、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫および脾臓性辺縁帯リンパ腫）、ｄ）マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ｅ）大細胞リンパ腫（Ｂ細胞性びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、びまん性混合細胞リンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫、血管中心性リンパ腫－肺Ｂ細胞リンパ腫を含む）、ｆ）有毛細胞白血病、ｇ）リンパ球性リンパ腫、ワルデンストロームマクログロブリン血症、ｈ）急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ性白血病、ｉ）形質細胞新生物、形質細胞骨髄腫、多発性骨髄腫、形質細胞腫、および／またはｊ）ホジキン病を含む。

【0172】

任意の方法のいくつかの実施形態において、がんは、Ｂ細胞増殖性疾患である。いくつかの実施形態において、Ｂ細胞増殖性疾患は、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、侵襲性ＮＨＬ、再発性侵襲性ＮＨＬ、再発性無痛性ＮＨＬ、難治性ＮＨＬ、難治性無痛性ＮＨＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫、白血病、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、またはマントル細胞リンパ腫である。いくつかの実施形態において、Ｂ細胞増殖性疾患は、緩徐進行性ＮＨＬおよび／または侵襲性ＮＨＬ等のＮＨＬである。いくつかの実施形態において、Ｂ細胞増殖性疾患は、緩徐進行性濾胞性リンパ腫またはびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である。

【0173】

さらに別の態様において、本発明は、例えば、上記の治療方法のいずれかで使用するために、本明細書で提供される抗ＯＸ４０抗体のいずれかを含む医薬製剤を提供する。一実施形態において、医薬製剤は、本明細書で提供される抗ＯＸ４０抗体のいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の実施形態において、医薬製剤は、本明細書で提供される抗ＯＸ４０抗体のいずれかと、例えば、以下に記載されるような少なくとも１つの追加の治療薬と、を含む。

【0174】

本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、Ｔｒｅｇ機能を阻害する（例えば、Ｔｒｅｇの抑制機能を阻害する）ことによってＯＸ４０発現細胞（例えば、高レベルのＯＸ４０を発現する細胞）を死滅させ、エフェクターＴ細胞機能を増加させ、かつ／またはメモリーＴ細胞機能を増加させて、腫瘍免疫を抑制する。本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＯＸ４０発現細胞（例えば、高レベルのＯＸ４０を発現する細胞）を死滅させ、エフェクターＴ細胞機能を増加させ、かつ／またはメモリーＴ細胞機能を増強してがんを治療する。本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＯＸ４０発現細胞（例えば、高レベルのＯＸ４０を発現する細胞）を死滅させ、エフェクターＴ細胞機能を増加させ、かつ／またはメモリーＴ細胞機能を増強して、免疫機能を増強する。本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＯＸ４０発現細胞（例えば、高レベルのＯＸ４０を発現する細胞）を死滅させ、エフェクターＴ細胞機能を増加させ、かつ／またはメモリーＴ細胞機能を増強して、Ｔ細胞機能を増強する。

【0175】

本方法のいずれかのいくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、枯渇する抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体である。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体による治療は、細胞の枯渇（例えば、ＯＸ４０を発現する細胞の枯渇、例えば、高レベルのＯＸ４０を発現する細胞の枯渇）をもたらす。いくつかの実施形態において、枯渇は、ＡＤＣＣを介して達成される。いくつかの実施形態において、枯渇は、食作用によって達成される。

【0176】

本方法のいずれかのいくつかの実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト抗体の投与前のＴｒｅｇ機能に関して、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、例えば、エフェクターおよび／またはメモリーＴ細胞機能（いくつかの実施形態において、エフェクターＴ細胞および／またはメモリーＴ細胞増殖および／またはサイトカイン分泌）のＴｒｅｇ抑制を阻害することにより、Ｔｒｅｇ機能を阻害する。本方法のいずれかのいくつかの実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト抗体の投与前のエフェクターＴ細胞増殖に関して、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、エフェクターＴ細胞増殖を増加させる。本方法のいずれかのいくつかの実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト抗体の投与前のメモリーＴ細胞増殖に関して、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、メモリーＴ細胞増殖を増加させる。いずれかの方法のいくつかの実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト抗体の投与前のエフェクターＴ細胞サイトカイン産生に関して、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、エフェクターＴ細胞サイトカイン産生（例えば、ガンマインターフェロン産生）を増加させる。いずれかの方法のいくつかの実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト抗体の投与前のメモリーＴ細胞サイトカイン産生に関して、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、メモリーＴ細胞サイトカイン産生（例えば、ガンマインターフェロン産生）を増加させる。本方法のいずれかのいくつかの実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト抗体の投与前のＣＤ４＋エフェクターＴ細胞増殖および／またはＣＤ８＋エフェクターＴ細胞増殖に関して、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞増殖および／またはＣＤ８＋エフェクターＴ細胞増殖を増加させる。本方法のいずれかのいくつかの実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト抗体の投与前のメモリーＴ細胞増殖に関して、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、メモリーＴ細胞増殖（例えば、ＣＤ４＋メモリーＴ細胞増殖）を増加させる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与前の増殖、サイトカイン分泌および／または溶解活性に関して、個体のＣＤ４＋エフェクターＴ細胞は、増強された増殖、サイトカイン分泌および／または溶解活性を有する。

【0177】

本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の数は、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与前のものと比較して上昇している。いくつかの実施形態において、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞サイトカイン分泌は、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与前と比較して上昇している。本方法のいずれかのいくつかの実施形態において、個体のＣＤ８＋エフェクターＴ細胞は、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与前のものと比較して、増強された増殖、サイトカイン分泌および／または溶解活性を有する。いくつかの実施形態において、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の数は、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与前のものと比較して上昇している。いくつかの実施形態において、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞サイトカイン分泌は、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与前のものと比較して上昇している。

【0178】

本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ヒトエフェクター細胞に結合し、例えば、ヒトエフェクター細胞によって発現されるＦｃγＲに結合する。いくつかの実施形態において、ヒトエフェクター細胞は、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。いくつかの実施形態において、ヒトエフェクター細胞は、食作用性エフェクター機能を実行する。

【0179】

本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、変異体ＩｇＧｌ Ｆｃポリペプチド（ヒトエフェクター細胞への結合を無効にする突然変異、例えば、ＤＡＮＡまたはＮ２９７Ｇ突然変異を含む）を含む抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、天然配列ＩｇＧｌ Ｆｃ部分を含む抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体と比較して低下した活性（例えば、増殖等のＣＤ４^＋エフェクターＴ細胞機能）を有する。いくつかの実施形態において、変異体ＩｇＧｌ Ｆｃポリペプチド（ヒトエフェクター細胞への結合を無効にする突然変異、例えば、ＤＡＮＡまたはＮ２９７Ｇ突然変異を含む）を含む抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、実質的な活性（例えば、増殖等のＣＤ４^＋エフェクターＴ細胞機能）を有しない。

【0180】

本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、抗体架橋は、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体機能のために必要とされる。いくつかの実施形態において、機能は、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞増殖を刺激することである。いくつかの実施形態において、抗体架橋は、固体表面（例えば、細胞培養プレート）に付着する抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体を提供することによって決定される。いくつかの実施形態において、抗体架橋は、抗体のＩｇＧｌ Ｆｃ部分に突然変異（例えば、ＤＡＮＡまたはＮ２９７Ｓ突然変異）を導入し、次いで、突然変異抗体の機能を試験することによって決定される。

【0181】

本方法のいずれかのいくつかの実施形態において、個体のメモリーＴ細胞は、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与前のものと比較して、増強された増殖および／またはサイトカイン分泌を有する。いくつかの実施形態において、メモリーＴ細胞の数は、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与前のものと比較して上昇している。いくつかの実施形態において、メモリーＴ細胞サイトカイン分泌（レベル）は、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与前のものと比較して上昇している。本方法のいずれかのいくつかの実施形態において、個体のＴｒｅｇは、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与前のものと比較して、エフェクターＴ細胞機能（例えば、増殖および／またはサイトカイン分泌）に対する阻害が低減している。いくつかの実施形態において、エフェクターＴ細胞の数は、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与前のものと比較して上昇している。いくつかの実施形態において、エフェクターＴ細胞サイトカイン分泌（レベル）は、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与前のものと比較して上昇している。

【0182】

本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、腫瘍内（浸潤性）ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の数（例えば、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の総数、または例えば、ＣＤ４５＋細胞中のＣＤ４＋細胞のパーセンテージ）は、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与前のものと比較して上昇している。本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、インターフェロン－γを発現する腫瘍内（浸潤性）ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の数（例えば、ＣＤ４＋細胞を発現する全インターフェロンガンマ、または例えば、全ＣＤ４^＋細胞でインターフェロンを発現するＣＤ４＋細胞のパーセンテージ）は、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与前のものと比較して上昇している。

【0183】

本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、腫瘍内（浸潤性）ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の数（例えば、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の総数、または例えば、ＣＤ８５＋細胞中のＣＤ８＋細胞のパーセンテージ）は、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与前のものと比較して上昇している。本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、インターフェロン－γを発現する腫瘍内（浸潤性）ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の数（例えば、全ＣＤ８＋細胞でインターフェロンを発現するＣＤ８＋細胞のパーセンテージ）は、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与前のものと比較して上昇している。

【0184】

本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、腫瘍内（浸潤性）Ｔｒｅｇの数（例えば、Ｔｒｅｇの総数または、例えば、ＣＤ４＋細胞中のＦｏｘ３ｐ＋細胞のパーセンテージ）は、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与前のものと比較して減少している。

【0185】

本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与は、腫瘍抗原の投与と組み合わされる。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原はタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は核酸を含む。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は腫瘍細胞である。

【0186】

本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、がんは、ヒトエフェクター細胞を示す（例えば、ヒトエフェクター細胞によって浸潤される）。ヒトエフェクター細胞を検出するための方法は、当技術分野で周知であり、例えば、ＩＨＣを含む。いくつかの実施形態において、がんは、高レベルのヒトエフェクター細胞を示す。いくつかの実施形態において、ヒトエフェクター細胞は、ＮＫ細胞、マクロファージ、および単球のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態において、がんは、本明細書に記載される任意のがんであり得る。いくつかの実施形態において、がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、神経膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、黒色腫、乳がん（例えば、三重陰性乳がん）、胃がん、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、または肝細胞がんである。

【0187】

本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、がんは、ＦｃＲ発現細胞を示す（例えば、ＦｃＲ発現細胞によって浸潤される）。ＦｃＲを検出するための方法は、当技術分野で周知であり、例えば、ＩＨＣを含む。いくつかの実施形態において、がんは、高レベルのＦｃＲ発現細胞を示す。いくつかの実施形態において、ＦｃＲはＦｃｙＲである。

【0188】

いくつかの実施形態において、ＦｃＲは活性化ＦｃγＲである。いくつかの実施形態において、がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、神経膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、黒色腫、乳がん（例えば、三重陰性乳がん）、胃がん、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、または肝細胞がんである。

【0189】

上記の実施形態のいずれかによる「個体」は、好ましくはヒトである。

【0190】

本発明の抗体は、治療において、単独でまたは他の薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の抗体は、少なくとも１つの追加の治療薬と同時投与することができる。

【0191】

上記のような併用療法には、併用投与（２つ以上の治療薬が同じ製剤または別個の製剤に含まれる）、および別個の投与が含まれる。この場合、本発明の抗体の投与は、別の治療薬および／または薬物の投与の前、それと同時に、および／またはその後に行うことができる。一実施形態において、抗ＯＸ４０抗体の投与および追加の治療薬の投与は、約１ヶ月以内、または約１、２もしくは３週間以内、または約１、２、３、４、５、もしくは６日間以内である。本発明の抗体はまた、放射線療法と組み合わせて使用することもできる。

【0192】

いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、化学療法または化学療法剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、放射線療法または放射線剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、標的治療または標的治療剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、免疫療法または免疫療法剤、例えば、モノクローナル抗体と組み合わせて投与することができる。

【0193】

いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＰＡＲＰ阻害剤（例えば、オラパリブ、ルカパリブ、ニラパリブ、セジラニブ、ＢＭＮ６７３、ベリパリブ）、トラベクテジン、ｎａｂ－パクリタキセル（アルブミン結合パクリタキセル、ＡＢＲＡＸＡＮＥ）トレバナニブ、パゾパニブ、セジラニブ、パルボシクリブ、エベロリムス、フルオロウラシル（例えば、ＦＯＬＦＯＸ、ＦＯＬＦＩＲＩ）、ＩＦＬ、レゴラフェニブ、Ｒｅｏｌｙｓｉｎ、Ａｌｉｍｔａ、Ｚｙｋａｄｉａ、Ｓｕｔｅｎｔ、Ｔｏｒｉｓｅｌ（テムシロリムス）、Ｉｎｌｙｔａ（アキシチニブ、Ｐｆｉｚｅｒ）、Ａｆｉｎｉｔｏｒ（エベロリムス、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、Ｎｅｘａｖａｒ（ソラフェニブ、Ｏｎｙｘ／Ｂａｙｅｒ）、Ｖｏｔｒｉｅｎｔ、パゾパニブ、アキシチニブ、ＩＭＡ－９０１、ＡＧＳ＿００３、カボザンチニブ、ビンフルニン、Ｈｓｐ９０阻害剤（例えば、アパトルシン（ａｐａｔｏｒｓｉｎ））、Ａｄ－ＧＭ－ＣＳＦ（ＣＴ－００７０）、テモゾロミド、ＩＬ－２、ＩＦＮａ、ビンブラスチン、Ｔｈａｌｏｍｉｄ、ダカルバジン、シクロホスファミド、レナリドミド、アキシチニブ、レナリドミド、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ）、アムルビシン、カルフィルゾミブ、プララトレキサート、および／またはエンザスタウリンと組み合わせて投与することができる。

【0194】

いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＰＤ－１軸結合アンタゴニストと組み合わせて投与することができる。本明細書におけるＰＤ－１軸結合アンタゴニストには、ＰＤ－１結合アンタゴニスト、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニスト、およびＰＤ－Ｌ２結合アンタゴニストが含まれるが、これらに限定されない。「ＰＤ－１」の代替名は、ＣＤ２７９およびＳＬＥＢ２を含む。「ＰＤ－Ｌ１」の代替名は、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－４、ＣＤ２７４、およびＢ７－Ｈを含む。「ＰＤ－Ｌ２」の代替名は、Ｂ７－ＤＣ、Ｂｔｄｃ、およびＣＤ２７３を含む。いくつかの実施形態において、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、およびＰＤ－Ｌ２は、ヒトＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、およびＰＤ－Ｌ２である。いくつかの実施形態において、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１のそのリガンド結合パートナーへの結合を阻害する分子である。特定の態様において、ＰＤ－１リガンド結合パートナーは、ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２である。別の実施形態において、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ１のその結合パートナーへの結合を阻害する分子である。特定の態様において、ＰＤ－Ｌ１結合パートナーはＰＤ－１および／またはＢ７－１である。別の実施形態において、ＰＤ－Ｌ２結合アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ２のその結合パートナーへの結合を阻害する分子である。特定の態様において、ＰＤ－Ｌ２結合パートナーはＰＤ－１である。アンタゴニストは、抗体、その抗原結合フラグメント、免疫アドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドであり得る。いくつかの実施形態において、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ－１抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体）であり得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－１抗体は、ＭＤＸ－１１０６（ニボルマブ、ＯＰＤＩＶＯ）、Ｍｅｒｃｋ ３４７５（ＭＫ－３４７５、ペムブロリズマブ、ＫＥＹＴＲＵＤＡＷＰＣＴ－０１１（ピジリズマブ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、免疫アドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合されたＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２の細胞外部分またはＰＤ－１結合部分を含む免疫アドヘシンである。いくつかの実施形態において、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＡＭＰ－２２４である。いくつかの実施形態において、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ４７３６およびＭＤＸ－１１０５からなる群から選択される。ＭＤＸ－１１０５は、ＢＭＳ－９３６５５９としても知られ、ＷＯ２００７／００５８７４に記載されるような抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。抗体ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０は、ＷＯ２０１０／０７７６３４Ａ１に記載されるような抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。ＭＤＸ－１１０６は、ＭＤＸ－１１０６－０４、ＯＮＯ－４５３８、ＢＭＳ－９３６５５８、またはニボルマブとしても知られ、ＷＯ２００６／１２１１６８に記載されるような抗ＰＤ－１抗体である。Ｍｅｒｃｋ ３４７５は、ＭＫ－３４７５、ＳＣＨ－９００４７５、またはペムブロリズマブとしても知られ、ＷＯ２００９／１１４３３５に記載されるような抗ＰＤ－１抗体である。ＣＴ－０１１は、ｈＢＡＴ、ｈＢＡＴ－１、またはピジルイズマブとしても知られ、ＷＯ２００９／１０１６１１に記載されるような抗ＰＤ－１抗体である。ＡＭＰ－２２４は、Ｂ７－ＤＣＩｇとしても知られ、ＷＯ２０１０／０２７８２７およびＷＯ２０１１／０６６３４２に記載されるようなＰＤ－Ｌ２－Ｆｃ融合可溶性受容体である。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－１抗体は、ＭＤＸ－１１０６である。「ＭＤＸ－１１０６」の代替名は、ＭＤＸ－１１０６－０４、０Ｎ０－４５３８、ＢＭＳ－９３６５５８、またはニボルマブを含む。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－１抗体はニボルマブ（ＣＡＳ登録番号：９４６４１４－９４－４）である。

【0195】

いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、活性化共刺激分子に対するアゴニストと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、活性化共刺激分子は、ＣＤ４０、ＣＤ２２６、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、およびＣＤ１２７を含み得る。いくつかの実施形態において、活性化共刺激分子に対するアゴニストは、ＣＤ４０、ＣＤ２２６、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、またはＣＤ１２７に結合するアゴニスト抗体である。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、抑制性共刺激分子に対するアンタゴニストと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抑制性共刺激分子は、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２としても知られる）、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ－３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＩＤＯ、ＴＩＧＩＴ、ＭＩＣＡ／Ｂ、またはアルギナーゼを含み得る。いくつかの実施形態において、抑制性共刺激分子に対するアンタゴニストは、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ－３（ＬＡＧ－３－ＩｇＧ融合タンパク質（ＩＭＰ３２１）等）、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＩＤＯ、ＴＩＧＩＴ、ＭＩＣＡ／Ｂ、またはアルギナーゼに結合するアンタゴニスト抗体である。

【0196】

いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、アンタゴニスト、例えば、ＣＴＬＡ＿４（ＣＤ１５２としても知られる）に対する遮断抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、イピリムマブ（ＭＤＸ－０１０、ＭＤＸ－１０１、またはＹｅｒｖｏｙ（登録商標）としても知られる）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、トレメリムマブ（チシリムマブまたはＣＰ－６７５、２０６としても知られる）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、アンタゴニスト、例えば、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６としても知られる）に対する遮断抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＭＧＡ２７１と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＴＧＦ－βに対するアンタゴニスト、例えば、メテリムマブ（ＣＡＴ－１９２としても知られる）、フレソリムマブ（ＧＣ１００８としても知られる）、またはＬＹ２１５７２９９と組み合わせて投与することができる。

【0197】

いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞またはＣＴＬ）を発現するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の養子移入を含む治療法と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＵＣＡＲＴ１９と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＷＴ１２８ｚと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＫＴＥ－Ｃ１９（Ｋｉｔｅ）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＴＬ０１９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ドミナントネガティブＴＧＦＩ３受容体、例えば、ドミナントネガティブＴＧＦＷＩ型受容体を含むＴ細胞の養子移入を含む治療法と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＨＥＲＣＲＥＥＭレジメンを含む治療法と組み合わせて投与することができる（例えば、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ ＮＣＴ００８８９９５４を参照のこと）。

【0198】

いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＤ１９に対するアンタゴニストと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＭＯＲ００２０８と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＤ３８に対するアンタゴニストと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ダラツムマブと組み合わせて投与することができる。

【0199】

いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、アゴニスト、例えば、ＣＤ１３７（ＴＮＦＲＳＦ９、４－１ＢＢ、またはＩＬＡとしても知られる）に対する活性化抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３としても知られる）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＤ４０に対するアゴニスト、例えば、活性化抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＰ－８７０８９３と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、アゴニスト、例えば、ＯＸ４０（ＣＤ１３４としても知られる）のアゴニストと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、異なる抗ＯＸ４０抗体（例えば、ＡｇｏｎＯＸ）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＤ２７のアゴニスト、例えば、活性化抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＤＸ－１１２７と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）に対するアンタゴニストと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、ＩＤＯアンタゴニストは、１－メチル－Ｄ－トリプトファン（Ｉ－Ｄ－ＭＴとしても知られる）である。

【0200】

いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、アゴニスト、例えばＣＤ１３７（ＴＮＦＲＳＦ９、４－１ＢＢ、またはＩＬＡとしても知られる）の活性化抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３としても知られる）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＤ４０のアゴニスト、例えば、活性化抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＰ－８７０８９３またはＲ０７００９７８９と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、アゴニスト、例えば、ＯＸ４０（ＣＤ１３４としても知られる）の活性化抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＤ２７のアゴニスト、例えば、活性化抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＤＸ－１１２７（バリルマブとしても知られる）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）に対するアンタゴニストと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、ＩＤＯアンタゴニストは、１－メチル－Ｄ－トリプトファン（１－Ｄ－ＭＴとしても知られる）である。いくつかの実施形態において、ＩＤＯアンタゴニストは、ＷＯ２０１０／００５９５８に記載されるようなＩＤＯアンタゴニストであり、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＩＤＯアンタゴニストは、（例えば、ＷＯ２０１０／００５９５８の実施例２３に記載されるような）４－（｛２－［（アミノスルホニル）アミノ］エチル｝アミノ）－Ｎ－（３－ブロモ－４－フルオロフェニル）－Ｎ’－ヒドロキシ－１，２，５－オキサジアゾール－３－カルボキサミジンである。いくつかの実施形態において、ＩＤＯアンタゴニストは以下のとおりである：

【化1】

【0201】

いくつかの実施形態において、ＩＤＯアンタゴニストは、ＩＮＣＢ２４３６０である。いくつかの実施形態において、ＩＤＯアンタゴニストは、インドキシモド（１－メチル－トリプトファンのＤ異性体）である。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、抗体－薬物複合体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗体－薬物複合体は、メルタンシンまたはモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）を含む。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、抗ＮａＰｉ２ｂ抗体－ＭＭＡＥ複合体（ＤＮＩＢ０６００Ａ、ＲＧ７５９９、またはリファスツズマブベドチンとしても知られる）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、トラスツズマブエムタンシン（Ｔ－ＤＭ１、アドトラスツズマブエムタンシン、またはＫＡＤＣＹＬ．Ａ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈとしても知られる）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、抗ＭＵＣ１６抗体－ＭＭＡＥ複合体、ＤＭＵＣ５７５４Ａと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、抗ＭＵＣ１６抗体－ＭＭＡＥ複合体、ＤＭＵＣ４０６４Ａと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、エンドセリンＢ受容体（ＥＤＮＢＲ）を標的とする抗体－薬物複合体、例えば、ＥＤＮＢＲに対するＭＭＡＥ結合抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｅ（Ｌｙ６Ｅ）を標的とする抗体－薬物複合体、例えば、Ｌｙ６Ｅに対するＭＭＡＥ結合抗体（ＤＬＹＥ５９５３Ａとしても知られる）と組み合わせることができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ポラツズマブベドチンと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＤ３０を標的とする抗体－薬物複合体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＡＤＣＥＴＲＩＳ（ブレンツキシマブベドチンとしても知られる）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ポラツズマブベドチンと組み合わせて投与することができる。

【0202】

いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、血管新生阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＶＥＧＦに対する抗体、例えば、ＶＥＧＦ－Ａと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈとしても知られる）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、アンジオポエチン２（Ａｎｇ２としても知られる）に対する抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＭＥＤＩ３６１７と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＶＥＧＦＲ２に対する抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ラムシルマブと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、アフリベルセプトと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ｚｉｖ－アフリベルセプト（ＶＥＧＦ ｔｒａｐまたはＺＡＬＴＲＡＰ（登録商標）としても知られる）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＶＥＧＦおよびＡｎｇ２に対する二重特異性抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＲＧ７２２１（バヌシズマブとしても知られる）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、血管新生阻害剤およびＰＤ－１軸結合アンタゴニスト（例えば、抗ＰＤ－１抗体等のＰＤ－１結合アンタゴニスト、抗ＰＤ－Ｌ１抗体等のＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニスト、および抗ＰＤ－Ｌ２抗体等のＰＤ－Ｌ２結合アンタゴニスト）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ベバシズマブおよびＰＤ－１軸結合アンタゴニスト（例えば、抗ＰＤ－１抗体等のＰＤ－１結合アンタゴニスト、抗ＰＤ－Ｌ１抗体等のＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニスト、および抗ＰＤ－Ｌ２抗体等のＰＤ－Ｌ２結合アンタゴニスト）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ベバシズマブおよびＭＤＸ－１１０６（ニボルマブ、ＯＰＤＩＶＯ）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ベバシズマブおよびＭｅｒｃｋ ３４７５（ＭＫ－３４７５、ペムブロリズマブ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ベバシズマブおよびＣＴ－０１１（ピジリズマブ）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ベバシズマブおよびＹＷ２４３．５５．Ｓ７０と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ベバシズマブおよびＭＰＤＬ３２８０Ａと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ベバシズマブおよびＭＥＤＩ４７３６と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ベバシズマブおよびＭＤＸ－１１０５と組み合わせて投与することができる。

【0203】

いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、抗腫瘍剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＳＦ－１Ｒ（Ｍ－ＣＳＦＲまたはＣＤ１１５としても知られる）を標的とする薬剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体（ＩＭＣ－ＣＳ４またはＬＹ３０２２８５５としても知られる）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体、ＲＧ７１５５（Ｒ０５５０９５５４またはエマクツズマブとしても知られる）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、インターフェロン、例えば、インターフェロン－αまたはインターフェロン－γと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、Ｒｏｆｅｒｏｎ－Ａ（組換えインターフェロンα－２ａとしても知られる）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＧＭ－ＣＳＦ（組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦ、サルグラモスチム、またはＬｅｕｋｉｎｅ（登録商標）としても知られる）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＩＬ－２（アルデスロイキンまたはＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）としても知られる）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＩＬ－１２と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＩＬ２７と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＩＬ－１５と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＡＬＴ－８０３と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＤ２０を標的とする抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、ＣＤ２０を標的とする抗体は、オビヌツズマブ（ＧＡｌＯ １またはＧａｚｙｖａ（登録商標）としても知られる）またはリツキシマブである。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＧＩＴＲを標的とする抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、ＧＩＴＲを標的とする抗体は、ＴＲＸ５１８である。いくつかの実施形態において、ＧＩＴＲを標的とする抗体は、ＭＫ０４１６６（Ｍｅｒｃｋ）である。

【0204】

いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）の阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、イブルチニブと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ワクチンデヒドロゲナーゼ１（ＩＤＨ１）および／またはワクチンデヒドロゲナーゼ２（ＩＤＨ２）の阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＡＧ－１２０（Ａｇｉｏｓ）と組み合わせて投与することができる。

【0205】

いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、オヌリズマブおよびＰＤ－１軸結合アンタゴニスト（例えば、抗ＰＤ－１抗体等のＰＤ－１結合アンタゴニスト、抗ＰＤ－１ ＰＤ－Ｌ１抗体等のＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニスト、および抗ＰＤ－Ｌ２抗体等のＰＤ－Ｌ２結合アンタゴニスト）と組み合わせて投与することができる。

【0206】

いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、がんワクチンと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、がんワクチンはペプチドがんワクチンであり、いくつかの実施形態において、個別化されたペプチドワクチンである。いくつかの実施形態において、ペプチドがんワクチンは、多価長ペプチド、多ペプチド、ペプチド混合物、ハイブリッドペプチド、またはペプチドパルス樹状細胞ワクチンである（例えばＹａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ，１０４：１４－２１，２０１３を参照のこと）。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、アジュバントと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、Ｐｏｌｙ－ＩＣＬＣ（Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）としても知られる）、ＬＰＳ、ＭＰＬ、またはＣｐＧ ＯＤＮ等のＴＬＲアゴニストを含む治療と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＩＬ－１と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＨＭＧＢ１と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＩＬ－１０アンタゴニストと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＩＬ－４アンタゴニストと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＩＬ－１３アンタゴニストと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＩＬ－１７アンタゴニストと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＨＶＥＭアンタゴニストと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＩＣＯＳアゴニストと組み合わせて投与（例えば、ＩＣＯＳ－Ｌ、またはＩＣＯＳのアゴニスト抗体を投与）することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＸ３ＣＬ１を標的とする治療と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＸＣＬ９を標的とする治療と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＸＣＬ１０を標的とする治療と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＣＬ５を標的とする治療と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＬＦＡ－ＩまたはＩＣＡＭ１アゴニストと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、セレクチンアゴニストと組み合わせて投与することができる。

【0207】

いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、Ｂ－Ｒａｆの阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ベムラフェニブ（Ｚｅｌｂｏｒａｆ（登録商標）としても知られる）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ダブラフェニブ（Ｔａｆｉｎｌａｒ（登録商標）としても知られる）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、エンコラフェニブ（ＬＧＸ８１８）と組み合わせて投与することができる。

【0208】

いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＥＧＦＲ阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）としても知られる）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＥＧＦＲ－Ｔ７９０Ｍの阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ゲフィチニブと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、アファチニブと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）としても知られる）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）としても知られる）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ロシレチニブと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＡＺＤ９２９１と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＭＥＫ１（ＭＡＰ２Ｋ１としても知られる）および／またはＭＥＫ２（ＭＡＰ２Ｋ２としても知られる）等のＭＥＫの阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、コビメチニブ（ＣＤＣ－０９７３またはＸＬ－５１８としても知られる）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、トラメチニブ（Ｍｅｋｉｎｉｓｔ（登録商標）としても知られる）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ビニメチニブと組み合わせて投与することができる。

【0209】

いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、Ｂ－Ｒａｆの阻害剤（例えば、ベムラフェニブまたはダブラフェニブ）およびＭＥＫの阻害剤（例えば、ＭＥＫ１および／またはＭＥＫ２）（例えば、コビメチニブまたはトラメチニブ）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＥＲＫ（例えば、ＥＲＫ１／２）の阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＧＤＣ－０９９４と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、Ｂ－Ｒａｆの阻害剤、ＭＥＫの阻害剤、およびＥＲＫ１／２の阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＥＧＦＲの阻害剤、ＭＥＫの阻害剤、およびＥＲＫ１／２の阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、１つ以上のＭＡＰキナーゼ経路阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＫ１２７と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、Ｋ－Ｒａｓの阻害剤と組み合わせて投与することができる。

【0210】

いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ｃ－Ｍｅｔの阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、オナルツズマブ（ＭｅｔＭＡｂとしても知られる）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）の阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＡＦ８０２（ＣＨ５４２４８０２またはアレクチニブとしても知られる）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、クリゾチニブと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、セリチニブと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ブパリシブ（ＢＫＭ－１２０）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ピクチリシブ（ＧＤＣ－０９４１としても知られる）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ブパリシブ（ＢＫＭ－１２０としても知られる）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ペリホシン（ＫＲＸ－０４０１としても知られる）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）のデルタ選択的阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、イデラリシブ（ＧＳ－１１０１またはＣＡＬ－１０１としても知られる）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、タセリシブ（ＧＤＣ－００３２としても知られる）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＢＹＬ－７１９と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、Ａｋｔの阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＭＫ２２０６と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＧＳＫ６９０６９３と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、イパタセルチブ（ＣＤＣ－００６８としても知られる）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ｍＴＯＲの阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、シロリムス（ラパマイシンとしても知られる）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、テムシロリムス（ＣＣＩ－７７９またはＴｏｒｉｓｅｌ（登録商標）としても知られる）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、エベロリムス（ＲＡＤ００１としても知られる）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、リダフォロリムス（ＡＰ－２３５７３、ＭＫ＿８６６９、またはデフォロリムスとしても知られる）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＯＳＩ－０２７と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＡＺＤ８０５５と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＩＮＫ１２８と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、二重ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＸＬ７６５と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＧＤＣ－０９８０と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＢＥＺ２３５（ＮＶＰ－ＢＥＺ２３５とも称される）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＢＧＴ２２６と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＧＳＫ２１２６４５８と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＰＦ－０４６９１５０２と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＰＦ－０５２１２３８４（ＰＫＩ－５８７としても知られる）と組み合わせて投与することができる。

【0211】

いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、エストロゲン受容体を選択的に分解する薬剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＧＤＣ－０９２７と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＨＥＲ３の阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、デュリゴツズマブと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＬＳＤ１の阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＭＤＭ２の阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＢＣＬ２の阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ベネトクラクスと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＨＫ１の阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＤＣ－０５７５と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、活性化ヘッジホッグシグナル伝達経路の阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＥＲＩＶＥＤＧＥと組み合わせて投与することができる。

【0212】

いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、放射線療法と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ゲムシタビンと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ｎａｂ－パクリタキセル（ＡＢＲＡＸＡＮＥ）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、トラスツズマブと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＴＶＥＣと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＩＬ２７と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、シクロホスファミドと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、Ｔ細胞を腫瘍に動員する薬剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、リリルマブ（ＩＰＨ２１０２／ＢＭＳ－９８６０１５）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、イデラリシブと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＤ３およびＣＤ２０を標的とする抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＲＥＧＮ１９７９と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＤ３およびＣＤ１９を標的とする抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ブリナツモマブと組み合わせて投与することができる。

【0213】

いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、腫瘍溶解性ウイルスと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、カルボプラチンおよびｎａｂ－パクリタキセルと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、カルボプラチンおよびパクリタキセルと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、シスプラチンおよびペメトレキセドと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、シスプラチンおよびゲムシタビンと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＦＯＬＦＯＸと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＦＯＬＦＩＲＩと組み合わせて投与することができる。

【0214】

上記の併用療法には、併用投与（２つ以上の治療薬が同じ製剤または別個の製剤に含まれる）、および別個の投与が含まれる。この場合、本発明の抗体の投与は、追加の治療薬および／またはアジュバントの投与の前、それと同時、および／またはその後に行うことができる。本発明の抗体はまた、放射線療法と組み合わせて使用することもできる。

【0215】

本発明の抗体（および任意の他の治療薬）は、非経口、肺内、および鼻腔内を含む任意の好適な手段によって投与することができ、局所療法に所望される場合は、病片内投与を行うことができる。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、および皮下投与を含む。投与が短期間であるか長期間であるかに一部依存して、投薬は、任意の好適な経路による（例えば、静脈内または皮下注射等の注射による）ものであり得る。単回投与、複数の時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、およびパルス注入を含むがこれらに限定されない、様々な投薬スケジュールが、本明細書において企図される。

【0216】

本発明の抗体は、適正な医療行為に一致する様式で、製剤化、投薬、および投与することができる。この文脈で考慮されるべき要因は、治療される特定の状態、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、状態の原因、薬物送達の部位、投与方法、投与スケジュール、および医療従事者に既知の他の要因を含む。抗体は、そうである必要ではないが、任意選択的に、問題の障害を予防または治療するために現在使用されている１つ以上の薬剤とともに製剤化される。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害または治療の種類、および上記で考察された他の要因に依存する。それらは一般に、本明細書に記載されるのと同じ投与量および同じ投与経路で、または本明細書に記載される用量の約１％～９９％で、または経験的／臨床的に適切であると判断される任意の用量および任意の経路で使用される。

【0217】

疾患の予防または治療のために、本発明の抗体の適切な用量（単独でまたは１つ以上の他の治療薬と組み合わせて使用される場合）は、治療される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度および疾患の経過、抗体が予防目的または治療目的のどちらで投与されるか、以前の治療法、患者の病歴および抗体に対する反応、ならびに担当医師の裁量に依存し得る。抗体は、１回のまたは一連の治療で患者に投与するのに好適である。疾患の種類および重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ～約４０ｍｇ／ｋｇの抗体を、例えば、１回以上の分割投与または持続注入によって、初期候補用量として患者に投与することができる。典型的な１日量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。数日にわたるまたはそれ以上の反復投与の場合、状態に応じて、通常、疾患症状の所望の抑制が起こるまで治療を継続する。用量は、断続的に、例えば、毎週または３週間毎に（例えば、患者が約２～約２０回用量、または例えば、約６回用量の抗体を投与されるように）投与され得る。より高い初期用量を投与し、続いて１つ以上のより低い用量を投与することができる。しかしながら、他の投与レジメンも有用である場合がある。この治療法の進捗は、従来の技術およびアッセイによって容易にモニタリングすることができる。

【0218】

上記の製剤または治療方法のいずれも、抗ＯＸ４０抗体の代わりに、またはそれに加えて、本発明の免疫複合体を使用して実施され得ることを理解されたい。

【0219】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される抗ＯＸ４０抗体の静脈内（ＩＶ）注入は、３、４、５、６、７、または８週間毎に患者に投与され得る。抗ＯＸ４０抗体の用量は、患者１人当たり５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、３０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、または５００ｍｇであり得る。いくつかの実施形態において、患者は、腎細胞がん、肝細胞がん、または頭頸部扁平上皮がんを有し得る。

【0220】

いくつかの実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、以下のうちの１つ以上を達成する用量および投薬レジメンで患者に投与することができる。

【0221】

以下のような、患者の血液および腫瘍微小環境（ＴＭＥ）における免疫細胞の所望の変化：
●患者の末梢血のフローサイトメトリーによって測定される、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖（例えば、Ｋｉ６７）および活性化（例えば、ＣＤ６９およびＣＤ２５）マーカー、
●患者の末梢血のフローサイトメトリーによって測定される、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞上のＯＸ４０受容体レベルおよび抗ＯＸ４０抗体の占有レベル、ならびに
●多重免疫組織化学（ｍＩＨＣ）または多重免疫蛍光（ｍＩＦ）によって患者の治療前および治療後の腫瘍生検で測定される、標的関与（例えば、ＯＸ４０下方制御）、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞増殖（例えば、Ｋｉ６７上方制御）。

【0222】

いくつかの実施形態において、本明細書における抗ＯＸ４０抗体の用量および投与頻度は、適切なピーク対トラフ比を保証し、反復投与時の蓄積を最小限に抑え、それによって長期的な受容体の飽和とそれに続くＴ細胞枯渇を予防し、その結果として患者の持続的な免疫介在性抗腫瘍活性をもたらす患者の曝露プロファイルを達成するために選択または決定される。

【0223】

いくつかの実施形態において、上記のような免疫細胞および／または患者のＴＭＥにおける所望の変化等の特定の薬力学的（ＰＤ）所見は、抗ＯＸ４０抗体の用量および／または投与頻度を選択または決定するために、曝露プロファイルとともに評価される。

【実施例】

【0224】

実施例１．抗ＯＸ４０抗体ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の調製
合成ＯＸ４０抗体ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の重鎖および軽鎖（配列番号２４および３２）（Ｇｏｌｄｗｉｓｄｏｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）をコードするヌクレオチド配列を合成し、それらをベクターｐＦＵＳＥにそれぞれクローンした；重鎖および軽鎖の両方を含むプラスミドを、ＰＥＩを用いて１：１の比で２９３Ｆ懸濁細胞に一過性にトランスフェクトし、全長抗体を発現させた。培養の１週間後に、ＡＫＴＡシステムを用いて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅプレパックカラムを使用して精製を行った。

【0225】

実施例２．ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の結合特性
実施例２．１ ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のＯＸ４０タンパク質との結合特性
ＥＬＩＳＡによる予備試験のために、参照物質１、参照物質２、参照物質３、参照物質４、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１およびアイソタイプ対照を含む９６ウェルプレートを５μｇ／ｍｌの抗ＯＸ４０抗体で一晩コーティングした。翌日、ＰＢＳＴ中の１％ＢＳＡ（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号Ａ６００３３２－０１００）でプレートを３７℃で２時間ブロックした後、規定濃度のビオチン化ＯＸ４０組換えタンパク質を加えた。

【0226】

抗ＯＸ４０抗体に結合するビオチン化ＯＸ４０組換えタンパク質のＥＣ８０を測定した。図１－１に示すように、参照物質１のＥＣ８０は０．０９ｎＭであり、参照物質２のＥＣ８０は０．２２ｎＭであり、参照物質３のＥＣ８０は０．１６ｎＭであり、参照物質４のＥＣ８０は０．２４ｎＭであり、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のＥＣ８０は０．７１ｎＭであり、ＯＸ４０ＬのＥＣ８０は１．６ｎＭであった。

【0227】

実施例２．２ ２９３Ｔ細胞の表面に発現したＯＸ４０タンパク質に対するＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の結合特性
ヒトＯＸ４０（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号ＨＧ１０４８１－ＵＴ）を過剰発現させるために、カニクイザルＯＸ４０（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号ＣＧ９０８４６－ＵＴ）、マウスＯＸ４０（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号ＭＧ５０８０８－ＵＴ）、またはヒトＣＤ４０（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号ＨＧ１０７７４－ＵＴ）を標的として用いた。これらの標的をコードするＤＮＡプラスミドを、Ｌｉｐｕｓｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ試薬およびＰＬＵＳ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号１５３３８１００）の指示に従って２９３Ｔ細胞に一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、後に使用するために細胞を回収した。結合親和性を決定するために、回収した細胞を、規定濃度の一次抗体ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１とともに４℃で１時間インキュベートした。次いで、ＰＢＳで２回洗浄した後、二次抗体ヤギ抗ヒトＩｇＧ ＰＥ（１：２００；Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ９８５９６）とともに室温で３０分間、細胞をインキュベートした。検出は、Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーターを用いて行った。

【0228】

図１－２に示すように、２９３Ｔ細胞の表面に発現したヒトＯＸ４０タンパク質に対するＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の結合のＥＣ５０は、２ｎＭ（ＭＦＩ）であった。

【0229】

図１－３に示すように、２９３Ｔ細胞の表面に発現したカニクイザルＯＸ４０タンパク質に対するＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の結合のＥＣ５０は２．９ｎＭ（ＭＦＩ）であった。

【0230】

図１－４に示すように、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１は、２９３Ｔ細胞の表面に発現したマウスＯＸ４０タンパク質に結合しなかった（ＭＦＩ）。

【0231】

図１－５に示すように、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１は、２９３Ｔ細胞の表面に発現したヒトＣＤ４０タンパク質に結合しなかった（ＭＦＩ）。

【0232】

２９３Ｔ細胞の表面に発現したヒトＯＸ４０タンパク質に対するＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１、参照物質１、参照物質２、参照物質３、および参照物質４の結合のＥＣ５０を、それぞれ図１～６に示した。ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のＥＣ５０は２．０２ｎＭ（ＭＦＩ）であり、参照物質１のＥＣ５０は２．６７ｎＭ（ＭＦＩ）であり、参照物質２のＥＣ５０は４．１７ｎＭ（ＭＦＩ）であり、参照物質３のＥＣ５０は１．９２ｎＭ（ＭＦＩ）であり、参照物質４のＥＣ５０は２．１１ｎＭ（ＭＦＩ）であった。

【0233】

２９３Ｔ細胞の表面に発現したカニクイザルＯＸ４０タンパク質に対するＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１、参照物質１、参照物質２、参照物質３、および参照物質４の結合のＥＣ５０を、それぞれ図１～７に示した。ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のＥＣ５０は２．９４ｎＭ（ＭＦＩ）であり、参照物質１のＥＣ５０は２．９１ｎＭ（ＭＦＩ）であり、参照物質２のＥＣ５０は６．１３ｎＭ（ＭＦＩ）であり、参照物質３のＥＣ５０は２．５７ｎＭ（ＭＦＩ）であり、参照物質４のＥＣ５０は３．５４ｎＭ（ＭＦＩ）であった。

【0234】

実施例３．ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のアゴニスト活性
実施例３．１ Ｊｕｒｋａｔレポータータンパク質におけるＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のアゴニスト活性
抗ＯＸ４０抗体は、それらの異なる活性様式に従って２つのカテゴリーに分けることができる：第１のクラスのＯＸ４０アゴニスト活性は、Ｆｃ受容体の架橋とは無関係であり、もう一方のクラスは、ＯＸ４０アゴニスト活性のためにＦｃ受容体の架橋を必要とする。腫瘍組織および周辺の流入領域リンパ節は、より多くの腫瘍関連炎症細胞を有する。Ｆｃ受容体ＦｃγＲ２ｂは、腫瘍細胞の周りでクラスター形成する可能性が高い。したがって、「架橋抗体」アゴニストは、より高い組織選択性を有する。腫瘍内微小環境においてのみ、抗体は、有意なアゴニスト効果を有することができるが、体の正常な組織部分では、その効果は低レベルにとどまる。これにより処理の安全域を向上させることができる。

【0235】

ヒトＯＸ４０を構成的に発現するＮＦ－ｋｂ応答エレメントの制御下でＧＦＰ遺伝子を発現する組換えＪｕｒｋａｔレポーター細胞を本試験に用いた。ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のアゴニスト活性を決定するために、９６ウェルプレートを５μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＳＡＢ３７０１２７５）で一晩コーティングした。既定濃度のＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１を、１×１０^５のＪｕｒｋａｔレポーター細胞とともに１つのウェルに加えた。別の実験では、５０ｎＭのＯＸ４０Ｌ（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＯＸＬ－Ｈ５２Ｑ８）をＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１とともに加えて、協調的効果を決定した。２４時間のインキュベーション後、Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞を回収した。さらに、Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーターを使用してＧＦＰ陽性シグナルを検出し、Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞におけるＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のアゴニスト活性を示した。

【0236】

ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のアゴニスト活性は、抗ヒトＩｇＧ架橋に依存する。図２－１に示すように、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のＥＣ５０は、抗ヒトＩｇＧとの架橋の存在下で２．９ｎＭ（ＧＦＰのＭＦＩ）であった。図２－２に示すように、抗ヒトＩｇＧと架橋しない場合、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のＥＣ５０は、抗ヒトＩｇＧと架橋した場合よりもはるかに高かった。図２－２に示すように、三量体ＯＸ４０Ｌ組換えタンパク質単独では、抗ヒトＩｇＧと架橋することなく、ＥＣ５０＝４５ｎＭ（ＧＦＰのＭＦＩ）でＮＦ－ｋｂシグナル伝達を活性化することができた。

【0237】

ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１は、抗ヒトＩｇＧとの架橋の存在下で、ＯＸ４０Ｌとの協調的なアゴニスト効果を示した。図２－３に示すように、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１をＯＸ４０Ｌとともに加えることにより、成分単独と比較してＧＦＰのＭＦＩが増強された。

【0238】

実施例３．２ 初代ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のアゴニスト活性
初代ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のアゴニスト活性を決定するために、９６ウェルプレートを０．３μｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号１６－００３７－８１）および５μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＳＡＢ３７０１２７５）で一晩コーティングした。翌日、ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０４５－１０１）の指示に従って初代ＣＤ４＋Ｔ細胞を回収した。既定濃度のＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１および２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号１６－０２８９－８１）を、１×１０^５の初代ＣＤ４＋Ｔ細胞とともに１つのウェルに加えた。別の実験では、５０ｎＭのＯＸ４０Ｌ（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＯＸＬ－Ｈ５２Ｑ８）をＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１とともに加えて、その協調的効果を決定した。３日間のインキュベーション後、上清中のＩＬ－２分泌のレベルを、ヒトＩＬ－２ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号ＤＹ２０２－０５）の指示に従って検出し、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のアゴニスト活性を示した。

【0239】

初代ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のアゴニスト活性を決定するために、精製したＣＤ４＋Ｔ細胞を、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体および２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体で事前に活性化した。ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１との架橋を促進するために、プレートを５μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧで予めコーティングした。３日間のインキュベーション後、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のアゴニスト活性をＩＬ－２により決定し、図２－４に示すように０．２ｎＭのＥＣ５０を得た。

【0240】

初代ＣＤ４＋Ｔ細胞において、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１は、ＯＸ４０Ｌとの協調的なアゴニスト効果を示した。図２－５に示すように、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１を５０ｎＭのＯＸ４０Ｌとともにインキュベートすることにより、成分単独と比較してＩＬ－２分泌が増強された。

【0241】

実施例４．ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の薬物動態試験
３８４ウェルプレートを、３０μｌ／ウェルのＰＢＳ中１μｇ／ｍｌのＦ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩＲ、カタログ番号１０９－００６－０９８）で一晩コーティングした。ＰＢＳＴ緩衝液で３回洗浄した後、ＰＢＳ中に１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ、および２％ ＢＳＡを含むブロック緩衝液で、プレートを３７℃で１時間ブロックした。次いで、１／１５０で開始する１／３の段階希釈において、マウス血清試料を１５μＬ／ウェルで加え、３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で３回洗浄した後、二次抗体ペルオキシダーゼ－ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩＲ、カタログ番号１０９－０３５－００３）を１／５０００で加え、３７℃で０．５時間インキュベートした。次いで、ＴＭＢ基質（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２１１０１）を加え、さらに１５分間インキュベートした。次に、ＥＬＩＳＡ停止液（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｄｉｎｇｇｕｏ Ｃｈａｎｇｓｈｅｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を加えた。Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ Ｓｋｙ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて４５０ｎｍでプレートを読み取った。

【0242】

１０ｍｇ／ｋｇのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１を、ｈＯＸ４０ノックインマウス（１３１、１３２、１３３、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｍｏｄｅｌ Ｏｒｇａｎｉｓｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒより購入）に静脈内投与した。投与後１時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、および１９６時間のそれぞれに、マウス血清を採取した。図３－１に示すように、ｈＯＸ４０－ＫＩマウス血清中のＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の半減期を２４時間であると決定した。０時間のデータ点は、上から下に、データ点１３１、１３２、および１３３であった。

【0243】

実施例５．ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のインビボ抗腫瘍効果
ｈＯＸ４０ノックインマウスをＳｈａｎｇｈａｉ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｍｏｄｅｌ Ｏｒｇａｎｉｓｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒから購入した。５日間の隔離後、１００μｌのＰＢＳ中の８×１０^５のＭＣ３８腫瘍細胞（Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ Ｚｈａｎｇ Ｈｏｎｇｋａｉ，Ｎａｎｋａｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから提供された）を各マウスに皮下接種した。腫瘍サイズが７０～１００ｍｍ^３に達したとき、抗ＯＸ４０抗体を１００μｌのＰＢＳ中１０ｍｇ／ｋｇで３日毎に５回マウスに腹腔内投与することにより、抗ＯＸ４０抗体による処理を開始した。腫瘍サイズおよびマウスの体重を週に２回測定した。キャリパーを使用して両方向の腫瘍サイズを測定した。腫瘍体積は、以下の式：Ｖ＝０．５ａ×ｂ^２（式中、ａおよびｂは、それぞれ腫瘍の長径および短径である）を使用してｍｍ^３で表した。
７日目：ＭＣ３８腫瘍細胞接種、３５匹の８週齢マウス
－ＭＣ３８細胞は、Ｚｈａｎｇ Ｈｏｎｇｋａｉ教授から入手した
－マウス１匹当たり８×１０^５のＭＣ３８細胞を接種した
０日目：平均腫瘍サイズは７５ｍｍ^３（４０～１２０ｍｍ^３）であった
－群当たり５匹のマウス、合計４つの群：
●ＰＢＳ
●参照抗体１
●ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１
●参照抗体２
－１０ｍｇ／ｋｇの抗体の３日毎に５回の腹腔内投与により開始した。
１８日目：ＰＢＳ対照群の腫瘍が２０００ｍｍ^３のサイズに達した。マウスを屠殺した。
－組織：血液、ＬＮ、肝臓、脾臓、腫瘍
－表現型分析：Ｔ細胞ＣＤ３／ＣＤ４／ＣＤ８、Ｔｒｅｇ ＣＤ４／ＣＤ２５／Ｆｏｘｐ３、ＮＫ ＣＤ３／ＣＤ１６／ＣＤ５６

【0244】

図４－１および図４－２に示すように、この実験は、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１が、ＰＢＳ対照と比較して腫瘍増殖を有意に阻害し、マウスの有意な体重減少を引き起こし得る副作用を示さなかったことを示した。図４－１において、右端のデータ点は、上から下の順に、ＰＢＳ、参照抗体１、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１、および参照抗体２であった。図４－２において、左から２番目のデータ点は、上から下の順に、ＰＢＳ、参照抗体１、参照抗体２、およびＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１であった。

【0245】

抗体の用量反応有効性をｈＯＸ４０ノックインマウスにおいて調べた。本試験の具体的な群は以下のとおりであった：
第１群：ＰＢＳ：３日毎に５回、腹腔内；
第２群：ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１：１ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、３日／４日毎に５回、腹腔内；
第３群：ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１：０．１ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、３日／４日毎に５回、腹腔内；
第４群：参照抗体１：１ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、３日毎に５回、腹腔内。

【0246】

合計２０匹のｈＯＸ４０のノックインマウスを本試験に使用し、各群５匹の４つの群に分けた。

【0247】

マウスにＭＣ３８腫瘍細胞を接種した。平均腫瘍サイズが７５ｍｍ^３のときに開始して、０日目、３日目、６日目、１０日目、および１３日目に５回の抗体注射を行った。腫瘍サイズおよびマウスの体重は、最大３週間、または腫瘍サイズが２０００ｍｍ^３を超えるまで、週２回測定した。

【0248】

異なる用量のＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１での腫瘍サイズおよびマウスの体重の反応結果を、図４－３および図４－４に示した。この実験は、１ｍｇ／ｋｇのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１が、インビボで最良の抗腫瘍効果を示したことを示した。

【0249】

実施例６．ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１展性特性のインビトロ特性評価
実施例６．１ ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の加速安定性実験
抗体試料（ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１、３．１ｍｇ／ｍＬ、ロット番号ＣＰ１８１１３０００４）を、遠心フィルターデバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＵＦＣ５０３０９６）を用いて１０ｍｇ／ｍＬに濃縮した（ロット番号ＪＷ２０１８１２０３、ロット番号２０１９０６２４）。次いで、適切な量の濃縮抗体試料を清潔な６００μｌの試験管に移し、２５℃および４０℃で、それぞれ７日、１４日、および３０日間インキュベートした。

【0250】

インキュベートした試料をＳＥＣ－ＨＰＬＣおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した：
ＳＥＣ－ＨＰＬＣの場合、５０μｇの各処理試料を注入し、ｐＨ７．４の１×ＰＢＳ緩衝液（０．７ｍＬ／分の流速で試験当たり４０分間、１０×ＰＢＳ緩衝液（Ｓａｎｇｏｎ、カタログ番号Ｅ６０７０１６－０５００）からＭｉｌｌｉ－Ｑ純水で希釈した）中で試験した。吸吸光度はＵＶ２８０ｎｍで検出した（４℃で保存した未処理の試料も分析のためにロードした）。その結果を下の表１に示した。２５℃および４０℃で最大３０日間インキュベートした後でも、ＳＥＣ曲線上でＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の凝集または分解ピークの有意な増加が観察されなかったことから、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１がそのような処理条件下で良好な安定性を有することが示唆される。４０℃で３０日間インキュベートした後に観察された若干の分解は、高温での長時間インキュベーションによるその不安定性を示唆するものであり得る。

【表2】

【0251】

ＳＤＳ－ＰＡＧＥの場合、４μｇの各処理試料を、非還元および還元条件下で、それぞれ４％～２０％勾配のゲルにロードした。トリス－グリシン緩衝液に１５０Ｖで１時間ゲルを流し、染色液（ＴａＫａＲａ、カタログ番号Ｔ９３２０Ａ）中で１時間超染色し、次いで、蒸留水中で数回脱染し、白色光用プレート上で画像化した（４℃で保存した未処理の試料も分析のためにロードした）。その結果を図５－１に示した。

【0252】

２５℃および４０℃で３０日間インキュベートした後、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の明確な凝集または分解バンドがＳＤＳ－ＰＡＧＥ画像に観察されなかったことから、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１がそのような処理条件下で良好な安定性を有することが示唆される。４０℃で３０日間インキュベートした後、非還元ゲル、および還元ゲル上の凝集バンドとともにわずかに分解したバンドが観察されたことは、高温での長時間インキュベーションによるその不安定性を示唆するものであり得る。

【0253】

実施例６．２ ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の分解実験
１．低ｐＨ圧力試験：
適切な量の抗体（ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１、３．１ｍｇ／ｍＬ）を６００μｌの試験管に移し、次いで２Ｍ酢酸（抗体試料に対する酸のｖ／ｖ、最終ｐＨを約３．５に調整）を１：２０の比で加えた。試料を十分に混合し、室温で０時間、３時間、または６時間インキュベートした。インキュベーション後、中和緩衝液で抗体溶液のｐＨを７．４に調整した（ｐＨ９．０の１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを１３：１００（ｖ／ｖ）の比でインキュベートした試料に加えた）。次いで、試料を前述のようにＳＥＣ－ＨＰＬＣおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した（加速安定性実験を参照のこと。注：４℃で保存した未処理の試料も分析のためにロードした）。

【0254】

２．高ｐＨ圧力試験：
適切な量の抗体（ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１、３．１ｍｇ／ｍＬ）を６００μｌの試験管に移し、次いで１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．５（ｖ／ｖ、最終ｐＨを約８．５に調整）を１：２５の比で加えた。試料を十分に混合し、室温で０時間または６時間インキュベートした。次いで、試料を前述のようにＳＥＣ－ＨＰＬＣおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥ（還元条件下のみ）により分析した。

【0255】

ＳＥＣ分析を表２に示した。対応するｐＨ３．５およびｐＨ８．５の溶液中で最大６時間インキュベートした後、ＳＥＣ曲線上でＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の凝集または分解ピークの増加が観察されなかったことから、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１がそのような処理条件下で良好な安定性を有することが示唆される。

【表3】

【0256】

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を図５－２に示した。低ｐＨおよび高ｐＨ緩衝液中で最大６時間インキュベートした後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上でＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の変化が観察されなかったことから、そのような処理条件下におけるＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の良好な安定性が示唆される。

【0257】

実施例６．３ ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の酸化ストレス実験
適切な量の抗体（ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１、３．１ｍｇ／ｍＬ）を６００μｌの試験管に移し、次いで、Ｈ_２Ｏ_２（それぞれ０．１％および１％）またはｔ－ＢＨＰ（最終濃度０．１％）を加えた。試料を十分に混合し、室温で０時間または６時間インキュベートした。次いで、試料を前述のようにＳＥＣ－ＨＰＬＣおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した

【0258】

注：１）４℃で保存した未処理の試料を分析のためにロードした。２）１００ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むＳＥＣ泳動用緩衝液（ｐＨ６．８）を社内で調製した。

【0259】

ＳＥＣ分析を表３に示した。０．１％Ｈ_２Ｏ_２、１％Ｈ_２Ｏ_２および０．１％ｔ－ＢＨＰ（ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド）の対応する溶液で６時間インキュベートした後、ＳＥＣ曲線上でＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の明らかな変化が観察されなかったことから、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１がそのような処理条件下で良好な安定性を有していたことが示唆される。

【表4】

【0260】

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を図５－３に示した。非還元ゲル上のわずかに分解したバンドを除いて、０．１％Ｈ_２Ｏ_２、１％Ｈ_２Ｏ_２および０．１％ｔ－ＢＨＰ（ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド）の対応する溶液で６時間インキュベートした後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上でＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の明らかな変化は観察されなかった。これは、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１がそのような処理条件下で良好な安定性を有することを示唆するものである。

【0261】

実施例６．４ ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の凍結融解実験
抗体試料（ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１、３．１ｍｇ／ｍＬ、ロット番号ＣＰ１８１１３０００４）を、遠心フィルターデバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＵＦＣ５０３０９６）を用いて１０ｍｇ／ｍＬに濃縮した（ロット番号ＪＷ２０１８１２０３）。次に、適切な量の濃縮抗体試料を清潔な６００μｌの試験管に移し（３×試験管）、試料を液体窒素中で２分間凍結した後、室温の水浴で融解し、同じ手順をさらに２回、４回、またはそれ以上行った。

【0262】

注：１）４℃で保存した未処理の試料を分析のためにロードした。２）１００ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むＳＥＣ泳動用緩衝液（ｐＨ６．８）を社内で調製した。

【0263】

ＤＳＦベースの熱安定性分析の場合：３μｇの各処理試料をＰｒｏｔｅｏＳｔａｔアッセイキット（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＥＮＺ－５１０２７－Ｋ４００）とともにＰＣＲプレート（Ｂｉｏ－Ｒａｄプレート、カタログ番号ＨＳＰ９６５５；Ｂｉｏ－Ｒａｄメンブレン、カタログ番号ＭＳＢ１００１）中で、製造業者の指示に従って各２５μｌの反応において使用した。加熱プログラムは、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＰＣＲ機（Ｃ１０００ ｔｏｕｃｈ、ＣＦＸ９６リアルタイムシステム）で以下のように設定した：２５℃で２分間、１０秒毎に０．５℃ずつ９５℃まで上昇させる。Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄのモードを使用して蛍光吸光度を読み取った。Ｔｍ値は、－ｄＦ／ｄＴの最低点と関連していた。

【0264】

ＳＥＣ分析を表４に示した。ＤＳＦ分析を表５に示した。ＳＥＣ分析は、最大５サイクルの凍結／融解処理後に、ＳＥＣ曲線上でＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の明らかな変化が観察されなかったことを示した。ＤＳＦ分析は、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のＴｍ値が同じ処理後に有意に変化しなかったことを示したことから、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１がそのような処理条件下で良好な安定性を有していたことが示唆される。

【表5】

【表6】

【0265】

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を図５－４に示した。最大５サイクルの凍結／融解処理後に、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上でＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の明らかな変化が観察されなかったことから、そのような処理条件下におけるＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の良好な安定性が示唆される。

【0266】

実施例７
アゴニスト抗体のＯＸ－４０への結合は、受容体下方制御をもたらすことが示されているが、これはインビトロおよび臨床試験で観察されたものである（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１９）。最初の注射後に患者において観察された、結果として生じる標的発現の喪失が、臨床試験におけるＯＸ－４０アゴニスト抗体の成功を制限する可能性があるという仮説がさらに立てられた（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１９）。ＰＢＭＣから単離された、エクスビボで活性化されたナイーブＴ細胞を使用することにより、本発明は、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１による処理が、ベースラインと比較してＯＸ－４０レベルの処理後の減少が少ないことを示した。最適化された結合動態とともに、独自の結合エピトープにより標的の分解が最小限に抑えられ、それによって最初の注射後の標的発現の喪失が回避される。したがって、それは患者への継続的な薬物の投与を可能にする。

【0267】

実施例８
ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のヒト薬物動態（ＰＫ）予測
カニクイザルのＰＫデータを、２コンパートメントモデルに適合させた。図６は、適合させたＰＫ曲線および観測データを示す。適合のＲＭＳＥは０．１７、Ｒ^２は０．９９であり、観測データに良好に適合することを示している。

【0268】

ヒトの２コンパートメントＰＫパラメータは、指数の法則（ＲＯＥ）に基づいて対応するサルパラメータから予測した（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。

【0269】

次いで、予測されたパラメータを使用して、ヒトＰＫ曲線をシミュレートした。図７は、１時間の静脈内注入後の１ｍｇ／ｋｇの単回投与ヒトＰＫプロファイルの例を示した。

【0270】

ｈＯＸ４０ＫＩマウスにおけるＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１ＰＫデータに基づく最低ヒトＰＡＤ予測
ｈＯＸ４０ＫＩマウスにおける１０ｍｇ／ｋｇの用量でのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のＣｍａｘおよびＡＵＣ（０～７２時間）値は、それぞれ１６０．５μｇ／ｍＬおよび２５９１μｇ／ｍＬ＊時間であった。線形ＰＫであったと仮定すると、１ｍｇ／ｋｇ用量でのＣｍａｘおよびＡＵＣ（０－７２ｈ）値は、それぞれ１６μｇ／ｍＬおよび２５９μｇ／ｍＬ＊時間であった。

【0271】

１ｍｇ／ｋｇの用量では、予測されたヒトのＣｍａｘおよびＡＵＣ（０～７２時間）値は、それぞれ２３．７μｇ／ｍＬおよび１２１３μｇ／ｍＬ＊時間であった。ヒトの線形ＰＫであったと仮定すると、最低ＰＡＤは０．６８ｍｇ／ｋｇ（Ｃｍａｘに基づく）または０．２１ｍｇ／ｋｇ（ＡＵＣ（０～７２時間）に基づく）であると予測された。控えめに見ても、最小ヒトＰＡＤは、０．２１ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇの固定用量であると想定された（標準体重７０ｋｇと仮定）。

【0272】

ヒトの投薬頻度に関する考慮事項
ＯＸ４０アゴニズムとそれに続くエフェクターＴ細胞の増殖、および腫瘍微小環境における制御性Ｔ細胞の枯渇を最大化するためには、ＯＸ４０受容体を長期間飽和させないように考慮する必要がある。ＯＸ４０アゴニズム間の適切な時間を確保するための１つの戦略は、目的のアゴニストの著しい蓄積を回避することである。したがって、２週間（Ｑ２Ｗ）、３週間（Ｑ３Ｗ）、または４週間（Ｑ４Ｗ）毎のスケジュールでＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のＰＫプロファイルをシミュレートした。図８は、Ｑ４ＷでシミュレートされたＰＫ曲線を示している。

【0273】

次いで、各スケジュールのＣｍａｘおよびＣｍｉｎ蓄積指数、ならびに定常状態でのＣｍａｘ／Ｃｍｉｎ比を計算した。

【0274】

実用的な考慮事項に加えて、計算されたＡＩおよびＣｍａｘ／Ｃｍｉｎ比に基づいて、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のファースト・イン・ヒューマン試験のために１５ｍｇの開始用量およびＱ４Ｗスケジュールを選択した。

【0275】

ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のヒトＰＫは、典型的なＩｇＧ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）と同様であり、クリアランスが低く（ＣＬ、０．０８４ｍＬ／時間／ｋｇ）、分布容積が小さく（Ｖｄ_ｓｓ、０．０８４Ｌ／ｋｇ）、典型的なｍＡｂ半減期（Ｔ_１／２、７３１時間、約３０日）を有すると予測された。

【0276】

ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の最低ヒトＰＡＤは、カニクイザルＰＫからのヒトＰＫ予測、ｈＯＸ４０ ＫＩマウスにおけるＭＣ３８腫瘍有効性試験からの最小有効用量、およびｈＯＸ４０ＫＩマウスにおけるＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１曝露データに基づいて予測された。ＫＩマウスの曝露／効力の関係のヒトへの外挿は、ヒトにおいて０．２１ｍｇ／ｋｇの最小ＰＡＤを示した。便宜上、同等の固定用量である１５ｍｇが、ヒトにおける開始用量として推奨される。様々な投与頻度で予測された定常状態のＰＫプロファイルに基づくと、推奨される投与頻度は４週間毎に１回（Ｑ４Ｗ）である。

【0277】

本明細書では、フローサイトメトリーを使用して、活性化された初代サルＴ細胞へのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の結合を評価した。その結果を図１に示す。

【0278】

ＣＤ４＋Ｔ細胞を認識することができるＢｍｋ１を陽性対照として用いた。ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１は、３人の異なるドナー（ロット番号２００１０７、Ｍ２０Ｚ０１３００９、およびＭ２０Ｚ０２５００８）から単離された活性化ＣＤ３／ＣＤ２８初代サルＴ細胞に結合することが示された。ＭＦＩ用量反応曲線から計算されたＥＣ５０値は、それぞれ０．０９ｎＭ、０．１９ｎＭ、および０．１７ｎＭであった。

【0279】

ＥＬＩＳＡアッセイの線形検出範囲は、それぞれ、実験２０２００７３０では１２５～１０００ｐｇ／ｍｌ、実験２０２００７３１では１２５～２０００ｐｇ／ｍｌであった。両方の実験のＬＬＯＱは１８．７５ｎｇ／ｍｌであった。

【0280】

本明細書では、１０ｍｇ／ｋｇの単回投与を使用して、ＷＴマウスおよびｈＯＸ４０－ＫＩマウスにおける１０ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇの単回投与での静脈内投与によるＢｍｋ１およびＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１ｄの薬物動態を評価した。Ｂｍｋ１およびＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の平均濃度の時間に対するプロットを、線形および片対数スケールで図７および８に示した。

【0281】

ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１およびＢｍｋ１の全身曝露は、すべての処理マウスで達成された。ＷＴマウス（図７）において、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１およびＢｍｋ１は、用量比例性を伴う同様の線形クリアランスを示した。ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１とＢｍｋ１との線量比は１：１０であったが、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のＣｍａｘとＡＵＣ（０～７２時間）との比は、それぞれ１：６．８および１：７．９であり、Ｂｍｋ１の用量比は、それぞれ１：１１．８および１：８．６であった。

【0282】

１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇでのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の血清クリアランスは、野生型マウスではそれぞれ０．７１±０．３４および１．０６±０．７７ｍｌ／時間／ｋｇであったが、ｈＯＸ４０－ＫＩマウスでは３．０９±０．２７ｍｌ／時間／ｋｇであった。血清クリアランスの同様の差が、Ｂｍｋ１のＰＫでも観察された。野生型マウスにおけるＢｍｋ１の血清クリアランスは、１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇでそれぞれ０．４５±０．１３および０．６２±０．１０ｍｌ／ｈ／ｋｇであり、一方、ｈＯＸ４０－ＫＩマウスでは、１０ｍｇ／ｋｇで７．２４±２．２４ｍｌ／ｈ／ｋｇであった。ｈＯＸ４０はｈＯＸ４０－ＫＩマウスでのみ発現するため、ｈＯＸ４０－ＫＩマウスにおけるより高いクリアランス速度は、標的介在性の薬物消失（ＴＭＤＤ）に起因し得る。

【0283】

１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇでのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の定常状態分布容積（Ｖｄｓｓ）値は、野生型マウスでは０．２１±０．０３および０．２６±０．０２Ｌ／ｋｇであったが、１０ｍｇ／ｋｇでは、ｈＯＸ４０－ＫＩマウスでは０．１４±０．０１Ｌ／ｋｇであった。同様に、Ｂｍｋ１のＶｄｓｓ値は、野生型マウスでは０．１９±０．０２および０．２１±０．０１Ｌ／ｋｇであり、ｈＯＸ４０－ＫＩマウスでは０．０８±０．０３Ｌ／ｋｇであった。

【0284】

Ｔ１／２の有意差は、これら２つの抗体について、ＷＴマウスとｈＯＸ４０ＫＩマウスとの間でも観察された。野生型マウスでは、１０ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇでのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の終末半減期（Ｔ_１／２）は、それぞれ２３９．７２±１４０．４８時間および２７４．５２±１９３．１２時間であった。１０ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇでのＢｍｋ１の終末半減期は、それぞれ２５２．０４±５１．８２時間および３２１．０５±７５．８９時間であった。１０ｍｇ／ｋｇの用量のＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１およびＢｍｋ１の場合、そのＴ１／２値は、ｈＯＸ４０ＫＩマウスで有意に短く、それぞれ３８．６５±４．８４時間および５．４５±１．０９時間であった。

【0285】

実施例９．薬力学的試験
方法：腫瘍増殖のために、３０匹の雌のヒトＯＸ４０ノックインマウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド）の右側にＭＣ－３８腫瘍細胞を皮下接種した。腫瘍接種の９日後、７６～２２６ｍｍ^３（平均腫瘍サイズ１５５ｍｍ^３）の腫瘍サイズを有する２０匹のマウスを選択し、層別ランダム化により、それらの腫瘍体積に基づいて各群に５匹のマウスを含む４つの群に分けた。ランダム化の日（０日目（Ｄ０）として定義）からの処理には以下が含まれていた：アイソタイプ対照、１０ｍｇ／ｋｇ；ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１、０．１ｍｇ／ｋｇ；ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１、１ｍｇ／ｋｇ；およびＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１、１０ｍｇ／ｋｇ。すべての治療薬は、Ｄ０、Ｄ３およびＤ７の腹腔内注射によって投与した。腫瘍サイズおよび動物の体重を、少なくとも週に３回測定した。３回目の投与から６時間後、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）分析のために腫瘍試料を採取し、受容体占有率（ＲＯ）分析のために血液試料を採取し、血漿試料をＨｉＦｉＢｉＯに送った。

【0286】

結果：ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のＰＤ効果を、ＭＣ－３８腫瘍担持ｈＯＸ４０ＫＩマウスで調べた。血液および腫瘍微小環境（主に腫瘍内）の両方で、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１は、Ｔ細胞、主にＣＤ４^＋Ｔ細胞の陽性およびＭＦＩのパーセンテージとして表されるＯＸ４０発現の低下をもたらした。同時に、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１は、Ｔｒｅｇ集団も有意に減少させた。腫瘍微小環境では、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の割合が減少し（主にＴｒｅｇ（ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３^＋細胞）の減少によって引き起こされた）、ＣＤ４^＋Ｔ細胞（Ｋｉ６７^＋細胞）の増殖は増加したが、ＣＤ６９^＋Ｔ細胞は減少した。ＰＤ１の発現は、腫瘍微小環境のＣＤ８^＋Ｔ細胞で低下している。これらの観察結果はすべて、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１処理群において用量依存的であった。総合すると、前述のデータは、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１処理がＯＸ４０シグナル伝達経路を活性化することができ、有効性研究で持続的反応に寄与し得る腫瘍微小環境における観察結果をもたらしたことを示唆するものであった。

【0287】

血液試料中のＯＸ４０発現に対するＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の効果を、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１と競合しないマウス抗ｈＯＸ４０抗体（クローンＡＣＴ３５）を使用して分析した。ＣＤ４^＋、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋およびＣＤ１１ｂ^＋単球における総ＯＸ４０発現を測定した（データは示さず）。ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１処理は、Ｔｒｅｇを含むＣＤ４^＋およびＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞のＯＸ４０発現の有意な下方制御（陽性率およびＭＦＩ）をもたらした。ＣＤ１１ｂ^＋細胞におけるＯＸ４０発現の変化は観察されなかった。

【0288】

ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１処理後の標的関与を評価するために、ＦＣＭ分析において抗ヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）を非競合Ａｂ ＡＣＴ３５と組み合わせて使用した。ＯＸ４０^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＯＸ４０^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞上のｈＩｇＧ^＋集団のパーセンテージは低かった。しかしながら、ＯＸ４０^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞（Ｔｒｅｇを含む）でＭＦＩとして表されるｈＩｇＧ^＋シグナルは、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１における有意な用量依存的増加を示した。

【0289】

ＯＸ４０^＋ＣＤ１１ｂ^＋細胞では、アイソタイプ群および１０ｍｇ／ｋｇのＨＦＢ１０－１ＥｈＧ１処理群で高レベルのｈＩｇＧ^＋シグナルが観察され得た。これは処理用量と相関しており、ｈＩｇＧがＣＤ１１ｂ^＋細胞上のＦｃｇＲによって捕捉されたことを示唆するものである。

【0290】

腫瘍組織において浸潤免疫細胞集団をフローサイトメトリー（「ＦＣＭ」）によって分析した。この例のすべてのＦＣＭ分析プロットについて以下のとおりであった：
●Ｇ１：アイソタイプ対照群；Ｇ２：ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１ ０．１ｍｇ／ｋｇ処理群；Ｇ３：ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１ １ｍｇ／ｋｇ処理群；Ｇ４：ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１ １０ｍｇ／ｋｇ処理群。
●各小点は個々の動物のデータを表し、長方形のバーは群平均を表し、エラーバーはＳＥＭを表していた。

【0291】

Ｔ細胞（ＣＤ３^＋）、ＣＤ４^＋Ｔ、ＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇ（ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋）のパーセンテージを測定し、選択した結果を図９および１０に示した。ナイーブＴ細胞（ＣＤ３^＋ＣＤ４４－ＣＤ６２Ｌ^＋）、メモリーＴ細胞（ＣＤ３^＋ＣＤ４４^＋ＣＤ６２Ｌ^＋）およびエフェクターＴ細胞（ＣＤ３^＋ＣＤ４４^＋ＣＤ６２Ｌ－）も測定した（データは示さず）。本発明の実験条件下では、アイソタイプ対照群（Ｇ１）と比較して、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１で処理した群（Ｇ３およびＧ４、ただしＧ２ではない）は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ、ナイーブＴ細胞およびナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞の有意に減少したパーセンテージを示した。さらに、すべてのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１処理は、メモリーＴ細胞およびメモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞のパーセンテージの有意な減少をもたらした。すべてのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１処理群がメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーセンテージの減少を示したが、Ｇ２およびＧ３のみが統計的有意性に達した。処理群間で、Ｔ細胞（ＣＤ３^＋）、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、およびエフェクターＴ細胞の集団に有意な変化は観察されなかった。

【0292】

腫瘍における異なるＴ細胞サブタイプのＯＸ４０発現、活性化および増殖に対するＨＦＢ１０－１ＥｈＧ１処理の効果をさらに調べた。総ＯＸ４０発現に対するＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の効果を、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１と競合しないマウス抗ｈＯＸ４０抗体（クローンＡＣＴ３５）を使用して分析した。ＣＤ３^＋、ＣＤ４^＋、ＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇ（ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋）におけるＯＸ４０発現を測定した（データは示さず）。ＣＤ３^＋およびＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるＯＸ４０発現は、アイソタイプ対照群（Ｇ１）と比較して、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１処理群のパーセンテージおよびＭＦＩの両方で有意に減少した。Ｔｒｅｇの場合、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１処理は、パーセンテージで表されるＯＸ４０発現は有意に減少させなかったが、ＭＦＩで表されるＯＸ４０発現を有意に減少させた（データは示さず）。ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１処理群のＣＤ８^＋Ｔ細胞では、パーセンテージで表されるＯＸ４０発現は有意に減少したが、ＭＦＩの減少は有意差には達しなかった。

【0293】

ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１（Ｇ３およびＧ４）による処理は、アイソタイプ対照群（Ｇ１）と比較してＣＤ６９^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＰＤ－１^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の有意に低いパーセンテージをもたらした（図１２）。同じ処理により、増殖する（Ｋｉ６７^＋）ＣＤ４^＋Ｔ細胞のパーセンテージも有意に増加した（図１１）。これらの観察結果はすべて、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１処理群で用量依存的であった。

【0294】

実施例１０：エピトープマッピング
モノクローナル抗ＯＸ４０抗体ＨＦＢ３０１００１は、アゴニスト抗体として開発された。表１に、ＨＦＢ３０１００１のＣＤＲ、ＶＨ／ＶＬ、およびＨＣ／ＬＣ配列を示した。

【0295】

結合エピトープは、競合ＥＬＩＳＡアッセイを用いてエピトープビニングを行い、以前に公開された選択抗体およびＯＸ４０リガンド結合エピトープと比較して異なる抗ＯＸ４０抗体のＯＸ４０結合エピトープを探索することによって特徴付けた。簡潔に述べると、プレートを５０μｌの１μｇ／ｍｌ抗ＯＸ４０捕捉抗体、ＯＸ４０Ｌ、またはアイソタイプ対照でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。次いで、ＰＢＳＴ中の１％ＢＳＡを用いてプレートを室温で２時間ブロックした。次に、５０μｌ／ウェルのビオチン－ＯＸ４０（ロット番号１６０９２１１１１、ＣｈｅｍＰａｒｔｎｅｒ；Ｔｏｋｙｏ，ＪＰ）を加えた。ビオチン－ＯＸ４０は、０．５μｇ／ｍＬから開始して８点で１～３倍に希釈し、３７℃で１時間インキュベートした。次いでＨＲＰ結合ストレプトアビジン（１／５０００希釈；５０μｌ／ウェル）を加え、３７℃で１時間インキュベートしてから、１００μｌ／ウェルのＴＭＢを加え、室温で１５分間インキュベートした。５０μｌ／ウェルのＥＬＩＳＡ停止液を加えることにより反応を停止した。ＯＤ値は、Ｔｈｅｒｍｏ社のＭｕｌｔｉｓｃａｎ Ｓｋｙ分光光度計を使用して４５０ｎｍの波長で決定した。

【0296】

水素重水素交換質量分析を用いて、結合したエピトープのより詳細な解像度を得た。簡潔に述べると、質量分析（ＨＤＸ－ＭＳ）を使用してＨ／Ｄ交換エピトープマッピングを行い、ＨＦＢ３０１００１と相互作用するＯＸ４０（組換えヒトＯＸ４０）のアミノ酸残基を決定した。Ｈ／Ｄ交換法の一般的な説明は、例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７（２）：２５２－２５９、およびＥｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ－２６５Ａに記載されている。Ｈｉｓタグ付きＯＸ４０抗原タンパク質はＳｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（カタログ番号１０４８１－Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｉｊｉｎｇ，ＣＮ）から購入した。ＨＤＸ－ＭＳ実験は、Ｎｏｖａｂｉｏａｓｓａｙｓ ＬＬＣおよびＴｈｅｒｍｏのＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ質量分析計によって提供されるペプチド質量測定用の統合ＨＤＸ／ＭＳプラットフォームで実行した。４．５μＬの各試料を７５μＬの重水標識緩衝液（１×ＰＢＳ、ｐＤ７．４）とともに、２０℃で３００秒間、６００秒間、１８００秒間、および３６００秒間インキュベートした。４Ｍ塩酸グアニジンおよび０．８５Ｍ ＴＣＥＰを含む８０μＬの緩衝液（最終ｐＨ２．５）を加えることにより、水素／重水素交換を停止した。次いで、反応停止した試料をオンカラムペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ消化に供した後、ＬＣ－ＭＳ分析を行った。質量スペクトルはＭＳのみのモードで記録した。次いで、ペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ消化、ＬＣ－ＭＳ、およびデータ分析を行った。ＨＤＸ標識後、４Ｍ塩酸グアニジン塩酸および０．８５Ｍ ＴＣＥＰを含む８０μＬの緩衝液（最終ｐＨ２．５）を加え、次いで２０℃で３分間インキュベートすることにより試料を変性させた。次いで、内部に充填されたペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ（ｗ／ｗ、１：３）カラムを使用して、混合物をオンカラムペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ消化に供した。得られたペプチドを、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）およびＨｙｂｒｉｄ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に連結されたＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣからなるＵＰＬＣ－ＭＳシステムを使用して分析した。ペプチドは、５０×１ｍｍ Ｃ８カラムで、２％～３３％の溶媒Ｂ（アセトニトリル中の０．２％ギ酸）から開始して２０．５分の勾配を用いて分離した。溶媒Ａは０．１％ギ酸を含む水であった。注入バルブおよび酵素カラム、ならびにそれに関連する接続チューブは、１５℃に維持された冷却ボックス内に配置した。第２のスイッチバルブ、Ｃ８カラム、およびそれに関連するステンレス鋼接続チューブは、－６℃に維持された冷蔵循環ボックス内に配置した。ペプチドの同定は、非特異的酵素消化およびヒトのグリコシル化を共通の変数とみなすように変更されたＢｙｏｎｉｃｓ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ、Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）ソフトウェアを使用して、ＨＦＢ３０１００１配列のＭＳ／ＭＳデータを検索することによって行われた。プリカーサーイオンおよびプロダクトイオンの質量許容差は、それぞれ１０ｐｐｍおよび０．０２Ｄａであった。未加工のＭＳデータを、Ｈ／Ｄ交換ＭＳデータを分析するためのＨＤＸ ＷｏｒｋＢｅｎｃｈソフトウェア（バージョン３．３）を使用して処理した（Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０１２，２３（９），１５１２－１５２１）。重水素取り込みレベルは、重水素化ペプチドとその非標識形態（ｔ０）との平均質量差を使用して計算した。同じペプチドの重水素取り込みレベルを、抗原単独の試料および抗原抗体複合体の試料で比較した。５％を超える相対的な差異は有意であるとみなした。有意なレベルの重水素取り込みを示す複数の重複ペプチドによりエピトープ領域を定義した。ｈＯＸ４０－ｈｉｓからの合計４６のペプチドが、ｈＯＸ４０．ｈｉｓ単独およびＨＦＢ３０１００１試料と複合体を形成したｈＯＸ４０－ｈｉｓから同定され、それはｈＯＸ４０の７０％の配列カバレッジに相当する（図１３）。５％を超える重水素取り込み値のパーセンテージ差を示したペプチドは、著しく保護されていると定義された。ｈＯＸ４０－ｈｉｓの場合、アミノ酸５６～７４ ＣＳＲＳＱＮＴＶＣＲＰＣＧＰＧＦＹＮＤに対応する領域のペプチドは、ＨＦＢ３０１００１によって著しく保護されていたため、エピトープとして定義した。図１３に示すように、エピトープ領域を、Ｃｏｍｐａａｎ ａｎｄ Ｈｙｍｏｗｉｔｚ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．２００６，１４（８），１３２１－３０．から採用された、ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ複合体の３Ｄモデルにマッピングした。ＨＦＢ３０１００１のエピトープは、配列番号３３、ＣＳＲＳＱＮＴＶＣＲＰＣＧＰＧＦＹＮＤ（配列番号３４）のアミノ酸５６～７４として定義された。

【0297】

実施例１１：ＯＸ４０リガンドのアゴニスト活性
ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）のアゴニスト活性を決定するために、ＯＸ４０バイオアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号ＣＳ１９７７０４；Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を、製造業者のプロトコルに従って使用した。このアッセイでは、ヒトＯＸ４０を発現する遺伝子操作されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞株（ＯＸ４０エフェクター細胞）、および応答エレメントによって駆動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子を使用した。簡潔に述べると、ＯＸ４０エフェクター細胞を使用前日にアッセイ緩衝液で培養した。アッセイ当日に、ＯＸ４０Ｌを段階的に希釈し、プレートに加えた。生物発光シグナルは、５時間の誘導後にＢｉｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを使用して定量化した。その結果は、ＯＸ４０ＬがＯＸ４０エフェクター細胞において用量依存的に生物発光シグナルを誘導することを示した（図１４Ａ）。

【0298】

ＯＸ４０－Ｌのアゴニスト活性に対する抗ＯＸ４０抗体の効果を調べるために、ＯＸ４０エフェクター細胞を１０ｎＭ ＯＸ４０Ｌの存在下で抗ＯＸ４０抗体の段階希釈液（ＨＦＢ３０１００１、ベンチマーク１またはベンチマーク２）とともにインキュベートした。ベンチマーク１およびベンチマーク２は、以前に公開された抗ＯＸ４０抗体であり、ＯＸ４０上の抗体エピトープが細胞膜から最も離れているために選択された。他のベンチマークは、ＯＸ４０のリガンド結合ポケット付近での結合として説明された。５時間の誘導後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを使用して生物発光シグナルを定量化した。ベンチマーク１およびベンチマーク２の両方が、用量依存的にＯＸ４０Ｌアゴニズムをブロックしたが、ＨＦＢ３０１００１はブロックしなかった（図１４Ｂ）。その結果は、ＨＦＢ３０１００１が、ベンチマーク１およびベンチマーク２とは異なるＯＸ４０上の結合部位を認識することができることを示した。結合部位はＯＸ４０Ｌのアゴニスト機能を妨害しない。

【0299】

実施例１２：ＯＸ４０受容体調節
ＯＸ４０受容体に結合する抗ＯＸ４０抗体の受容体調節効果を調べるために、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社のＨｕｍａｎ ＣＤ４^＋Ｔ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号１３０－０９６－５３３、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からＣＤ４^＋Ｔ細胞を単離した。初代ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、参照抗体またはＨＦＢ３０１００１の段階希釈液、および０．５μｇ／ｍＬのプレート結合抗ＣＤ３抗体
（クローンＯＫＴ３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１６－００３７－８１）および２μｇ／ｍＬの可溶性抗ＣＤ２８抗体（クローンＣＤ２８．２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１６－０２８９－８１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）とともにインキュベートし、それらを同時に活性化した。３日間のインキュベーション後、抗ＯＸ４０抗体（ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、クローンＡＣＴ３５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１７－１３４７－４２）で染色することにより、総ＯＸ４０表面発現を検出した。アイソタイプ対照と比較して、ＨＦＢ３０１００１はＯＸ４０発現を増強し、これは細胞表面上に安定して保持された（図１５Ａ）。ベンチマークを使用したすべての処理で、ＯＸ４０表面発現は抗体濃度の増加とともにＵ字型であった。ＯＸ４０レベルは減少し、約１ｎＭの最低点に達し、その後再び増加した。

【0300】

実施例１３：結合親和性の決定
ヒトＯＸ４０タンパク質の組換え二量体（ｍＦｃタグ付き）形態に対するＨＦＢ３０１００１の結合親和性を決定するために、Ｏｃｔｅｔ ＱＫｅ機器でバイオフィルム層干渉（ＢＬＩ）実験を行った。様々な濃度の組換えヒトＯＸ４０タンパク質を、センサーで捕捉した試験抗体またはアイソタイプ対照とｐＨ７．４および２５℃で混合した後に解離相が続いた。結合シグナルの変化を記録し、物質移動の制限がある１：１結合モデルを使用して動力学的結合パラメータを決定した。泳動用緩衝液は、０．１％ＢＳＡおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ、ｐＨ７．４とした。動力学的結合実験の前に、抗ヒトＦｃ捕捉センサーを泳動用緩衝液ですすいだ。機器を２５℃の温度になるように調整した。試験抗体およびアイソタイプ対照抗体を泳動用緩衝液で２００ｎＭに希釈した。ＯＸ４０－ｍＦｃタンパク質を泳動用緩衝液で２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５．１２５ｎＭに希釈した。ＯＸ４０タンパク質の抗体への結合は、ｐＨ７．４および２５℃の泳動用緩衝液で測定した。実験は二通り行った。簡潔に述べると、抗ヒトＦｃ捕捉センサーを、最初に泳動用緩衝液中で３００秒間ベースライン化した。次いで、センサーを２００ｎＭ試験抗体溶液と６００秒間混合して、抗体をロードした。次いで、センサーを泳動用緩衝液中で３００秒間再度ベースライン化した後、様々な濃度のＯＸ４０抗原と９００秒間会合させた。次いで、センサーを泳動用緩衝液にさらに９００秒間浸漬することにより解離を行った。並行して、１つのセンサーを参照実験用に選択し、すべてのローディング、会合、および解離のステップを泳動用緩衝液中で行った。陰性対照実験として別のセンサーを選択し、ＨＦＢ－ＴＴ－ｈＧ１アイソタイプ対照抗体をローディングステップに使用し、５００ｎＭ ＯＸ４０－ｍＦｃタンパク質を会合ステップに使用した。センサーグラムは、Ｆｏｒｔｅｂｉｏデータ分析ソフトウェアバージョン８．２（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）により分析した。シグナルは、最初に陰性対照実験から差し引かれ、ベースラインステップを通じて整列させた。動態パラメータは、これらの特定のセンサーグラムを異なる抗原濃度で１：１結合モデルに全体的に適合させることによって得られた。平衡解離定数（ＫＤ）は、解離速度定数と会合速度定数との比（ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）に基づいて計算した。ＨＦＢ３０１００１とヒト由来のＯＸ４０タンパク質との相互作用の動力学的結合パラメータは、ＢＬＩ技術を使用して決定した。このアッセイでは、様々な濃度のＯＸ４０タンパク質を使用して、２５℃およびｐＨ７．４で捕捉されたＨＦＢ１０－１Ｅ１および他の抗体と相互作用させた。以下の結合親和性表は、計算された動力学的結合パラメータを要約したものである。２５℃およびｐＨ７．４で実施された実験では、ＨＦＢ３０１００１は組換えヒトＯＸ４０（ｈＯＸ４０．ｍＦｃ）タンパク質に、４．５ｎＭのＫＤ値を有する高い親和性で結合した。他の２つの比較抗体は、より遅い解離速度を示し、ベンチマーク１では０．４９ｎＭ、ベンチマーク２では０．５８ｎＭの、より低いＫＤ値をもたらした。ＨＦＢ３０１００１のヒトＯＸ４０－ｍＦｃとの相互作用の動力学的結合パラメータは、２５℃およびｐＨ７．４でＢＬＩ技術により決定した。ＨＦＢ３０１００１は、１桁のｎＭ親和性で組換えヒトＯＸ４０－ｍＦｃタンパク質に特異的に結合することができる。ＨＦＢ３０１００１は、試験した他の比較抗体と比較して、より速い解離速度を示した。

【表7】

【0301】

実施例１４．インビボ腫瘍モデル
ＭＣ－３８マウス結腸がんモデルを、ヒトＯＸ４０（ｈＯＸ４０）ノックイン（ＫＩ）マウス（カタログ番号ＮＭ－ＨＵ－０００４１、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｍｏｄｅｌ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．）に使用した。ＭＣ－３８マウス結腸直腸がんモデルにおけるＨＦＢ３０１００１の薬力学的（ＰＤ）効果を評価するために、４５匹の雌のｈＯＸ４０ ＫＩマウスの右側にＭＣ－３８腫瘍細胞（マウス当たり８×１０^５細胞）を皮下接種して腫瘍を発生させた。腫瘍接種の８日後、１０４～２４３ｍｍ^３（平均腫瘍サイズ１８１ｍｍ^３）の範囲の腫瘍を有する１２匹のマウスを選択し、腫瘍体積に応じた層別ランダム化に基づいて、各群に４匹のマウスを含む３つの群に分けた。マウスに、１０ｍｇ／ｋｇの用量の抗ＯＸ４０抗体ＨＦＢ３０１００１、１０ｍｇ／ｋｇの用量の抗ＯＸ４０抗体ベンチマーク１、および１０ｍｇ／ｋｇの用量のＩｇＧ１アイソタイプ対照を注射した。すべての治療薬は、Ｄ０（Ｄ）日目に腹腔内（ｉｐ）注射によって投与した。

【0302】

ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＯＸ４０発現を、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＯＸ４０抗体による３回目の処理の２４時間後にフローサイトメトリーによって測定した。ベンチマーク１は、血液中のＣＤ４^＋Ｔ細胞においてＯＸ４０発現の有意な下方制御を誘導したが、ＨＦＢ３０１００１は誘導しなかった（図１５Ｂ）。

【0303】

皮下ＭＣ－３８マウス結腸直腸がんモデルにおけるＨＦＢ３０１００１のインビボ抗腫瘍活性を評価するために、２６匹の雌のｈＯＸ４０ ＫＩマウスの右側にＭＣ－３８腫瘍細胞（マウス当たり８×１０^５細胞）を皮下接種して腫瘍を発生させた。腫瘍接種の７日後、１０１～１７５ｍｍ^３（平均腫瘍サイズ１３３ｍｍ^３）の腫瘍サイズを有する２０匹のマウスを選択し、腫瘍体積に応じた層別ランダム化に基づいて、各群に５匹のマウスを含む４つの処理群に分けた。マウスに、１ｍｇ／ｋｇおよび０．１ｍｇ／ｋｇの用量の抗ＯＸ４０抗体ＨＦＢ３０１００１、１ｍｇ／ｋｇの抗ＯＸ４０抗体ベンチマーク１、ならびに１０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ１アイソタイプ対照を注射した。すべての治療薬は、Ｄ０、Ｄ３、Ｄ６、Ｄ１０およびＤ１３に腹腔内注射によって投与した。処理の時点は矢印で示され、エラーバーは平均の標準誤差を示し、有意性は最後の時点での一元配置分散分析によって計算される（＊：ｐ値＜０．０５、＊＊：ｐ値＜０．０１）。各処理群の腫瘍サイズは、デジタルノギスを使用して測定された腫瘍の直径（幅、長さ）によってランダム化した後、Ｄ０、Ｄ３、Ｄ６、Ｄ１０、Ｄ１２、およびＤ１５に測定した。図１６に示すように、ＨＦＢ３０１００１は、対照と比較して有意な腫瘍増殖阻害をもたらし、ベンチマーク１よりも優れていた。

【0304】

皮下ＭＣ－３８マウス結腸直腸がんモデルにおけるＨＦＢ３０１００１のインビボ抗腫瘍活性を評価するために、８０匹の雌ｈＯＸ４０ ＫＩマウスの右側にＭＣ－３８腫瘍細胞（マウス当たり８×１０^５細胞）を皮下接種して腫瘍を発生させた。腫瘍接種の７日後、４２～１４７ｍｍ^３（平均腫瘍サイズ８２ｍｍ^３）の範囲の腫瘍を有する６５匹のマウスを選択し、腫瘍体積に応じた層別ランダム化に基づいて、各群に１０匹のマウスを含む７つの処理群に分けた（５匹のマウスしかいなかったＰＢＳ群を除く）。処理は、ランダム化の日（０日目（Ｄ０）として定義）に開始された。マウスに、１０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇおよび０．１ｍｇ／ｋｇの用量の抗ＯＸ４０抗体ＨＦＢ３０１００１、１０ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇの用量の抗ＯＸ４０抗体ベンチマーク１、ならびに１０ｍｇ／ｋｇの用量のＩｇＧ１アイソタイプ対照を注射した。すべての治療薬は、Ｄ０、Ｄ３、Ｄ６、Ｄ１０およびＤ１３に腹腔内注射によって投与した。腫瘍サイズおよび動物の体重を、処理開始後から６１日目まで少なくとも週に３回測定した。有意性は、ログランク検定によって計算した（＊：ｐ値＜０．０５、＊＊：ｐ値＜０．０１）。ランダム化後６０日間、生存を追跡した。１０ｍｇ／ｋｇのＨＦＢ３０１００１で処理したマウスの生存率は、１０ｍｇ／ｋｇのベンチマーク１で処理したマウスの生存率よりも有意に高かった（図１７）。

【0305】

抗ＯＸ４０抗体ＨＦＢ３０１００１による処理の効果をさらに調べるために、抗ＯＸ４０抗体による処理後に腫瘍Ｔ細胞に誘導された変化を、３回目の処理の２４時間後にフローサイトメトリーによって測定した。腫瘍接種の８日後、１０４～２４３ｍｍ^３（平均腫瘍サイズ１８１ｍｍ^３）の範囲の腫瘍を有する１２匹のマウスを選択し、腫瘍体積に応じた層別ランダム化に基づいて、各群に４匹のマウスを含む３つの群に分けた。ＨＦＢ３０１００１によるＫＩ６７^＋細胞の有意な増加が、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の両方に観察された（図１８Ａおよび図１８Ｂ）。加えて、ＨＦＢ３０１００１によるＰＤ－１^＋細胞の有意な減少が、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の両方に観察された（図１８Ｃおよび図１８Ｄ）。さらに、ベンチマークおよびＨＦＢ３０１００１の両方が、腫瘍Ｔｒｅｇの有意な減少をもたらし、ＨＦＢ３０１００１群はより顕著な減少を示した（図１８Ｅ）。

【0306】

参照文献
Ｗａｎｇ，Ｒ．，Ｇａｏ，Ｃ．，Ｒａｙｍｏｎｄ，Ｍ．，Ｄｉｔｏ，Ｇ．，Ｋａｂｂａｂｅ，Ｄ．，Ｓｈａｏ，Ｘ．，Ｈｉｌｔ，Ｅ．，Ｓｕｎ，Ｙ．，Ｐａｋ，Ｉ．，Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ，Ｍ．，Ｍｅｌｅｒｏ，Ｉ．，Ｓｐｒｅａｆｉｃｏ，Ａ．，Ｃａｒｖａｊａｌ，Ｒ．，Ｏｎｇ，Ｍ．，Ｏｌｓｚａｎｓｋｉ，Ａ．，Ｍｉｌｂｕｒｎ，Ｃ．，Ｔｈｕｄｉｕｍ，Ｋ．，Ｙａｎｇ，Ｚ．，Ｆｅｎｇ，Ｙ．，Ｆｒａｃａｓｓｏ，Ｐ．，Ｋｏｒｍａｎ，Ａ．，Ａａｎｕｒ，Ｐ．，Ｈｕａｎｇ，Ｓ．，Ｑｕｉｇｌｅｙ，Ｍ．（２０１９）．Ａｎ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｉｎｆｏｒｍ Ｏｐｔｉｍａｌ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＯＸ４０ Ａｇｏｎｉｓｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１５８／１０７８－０４３２．ＣＣＲ－１９－０５２６．

【0307】

本発明の原理は、好ましい実施形態に関連して上に記載してきたが、この記載は、本発明の範囲を限定するものではなく、単なる例として与えられていることを理解されたい。
本発明は非限定的に、以下の態様を含む。
[態様１]
単離された抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
配列番号１に示される重鎖ＣＤＲ１構造ドメイン、配列番号２に示される重鎖ＣＤＲ２構造ドメイン、および配列番号３に示される重鎖ＣＤＲ３構造ドメインを有する、重鎖可変領域と、
配列番号９に示される軽鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号１０に示される軽鎖ＣＤＲ２ドメイン、および配列番号１１に示される軽鎖ＣＤＲ３ドメインを有する、軽鎖可変領域と、を含む、抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
[態様２]
配列番号４に示される重鎖可変領域、または配列番号４と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の相同性を有する重鎖可変領域と、
配列番号１２に示される軽鎖可変領域、または配列番号１２と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の相同性を有する軽鎖可変領域と、を含む、態様１に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
[態様３]
重鎖定常領域および軽鎖定常領域をさらに含み、
好ましくは、前記重鎖定常領域が、配列番号５に示される重鎖定常領域、または配列番号５と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の相同性を有する重鎖定常領域であり、かつ／または
好ましくは、前記軽鎖定常領域が、配列番号１３に示される軽鎖定常領域、または配列番号１３と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の相同性を有する軽鎖定常領域である、態様１または２に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
[態様４]
前記重鎖可変領域に連結された重鎖シグナルペプチドおよび／または前記軽鎖可変領域に連結された軽鎖シグナルペプチドをさらに含み、
好ましくは、前記重鎖シグナルペプチドが、配列番号６に示される重鎖シグナルペプチド、または配列番号６と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の相同性を有する重鎖シグナルペプチドであり、かつ／または、
好ましくは、前記軽鎖シグナルペプチドが、配列番号１４に示される軽鎖シグナルペプチド、または配列番号１４と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の相同性を有する軽鎖シグナルペプチドである、態様１～３のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
[態様５]
ＩｇＧ抗体またはその抗原結合フラグメントであり、好ましくはＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントである、態様１～４のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
[態様６]
モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである、態様１～５のいずれか
一項に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
[態様７]
前記抗原結合フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂである、態様１～６のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
[態様８]
態様１～７のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントと、追加の治療薬と、を含む抗体－薬物複合体であって、好ましくは、前記抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントが、リンカーを介して前記追加の治療薬に連結される、抗体－薬物複合体。
[態様９]
態様１～７のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする、核酸。
[態様１０]
配列番号２０に示される重鎖可変領域ヌクレオチドコード配列、および／または配列番号２８に示される軽鎖可変領域ヌクレオチドコード配列を含み、
好ましくは、前記核酸が、配列番号２１に示される重鎖定常領域ヌクレオチドコード配列、および／または配列番号２９に示される軽鎖定常領域ヌクレオチドコード配列をさらに含む、態様９に記載の核酸。
[態様１１]
態様９または１０に記載の核酸を含む、発現ベクター。
[態様１２]
態様９または１０に記載の核酸または態様１１に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
[態様１３]
態様１～７のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを調製するための方法であって、前記抗体またはその抗原結合フラグメントを発現するのに好適な条件下で、態様１２に記載の宿主細胞を培養することと、発現した抗体またはその抗原結合フラグメントを培養培地から回収することと、を含む、方法。
[態様１４]
態様１～７のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または態様８に記載の抗体－薬物複合体、または態様９もしくは１０に記載の核酸、または態様１１に記載の発現ベクターと、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
[態様１５]
がんの治療に使用される、態様１～７のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または態様８に記載の抗体－薬物複合体、または態様１４に記載の医薬組成物。
[態様１６]
前記がんが、扁平上皮がん（例えば、上皮扁平細胞がん）、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺がん、および肺の扁平上皮がんを含む）、腹膜がん、肝細胞がん、胃がん（胃腸がんおよび胃腸間質がんを含む）、膵臓がん、神経膠芽細胞腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、尿路がん、肝腫瘍、乳がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんまたは子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝臓がん、肛門がん、陰茎がん、黒色腫、びまん性表層黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端黒色腫、結節性黒色腫、多発性骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病、および移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ケロイドに関連する異常な血管増殖、浮腫（例えば、脳腫瘍に関連する）、ならびにメイグス症候群、脳腫瘍および脳がん、頭頸部がん、ならびに付随する転移から選択される、態様１５に記載の抗Ｏ
Ｘ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗体－薬物複合体、または医薬組成物。
[態様１７]
がんの治療のための方法であって、前記がんを治療するために、それを必要とする対象に、治療有効量の態様１～７のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または態様８に記載の抗体－薬物複合体、または態様１４に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
[態様１８]
前記がんが、扁平上皮がん（例えば、上皮扁平細胞がん）、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺がん、および肺の扁平上皮がんを含む）、腹膜がん、肝細胞がん、胃がん（胃腸がんおよび胃腸間質がんを含む）、膵臓がん、神経膠芽細胞腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、尿路がん、肝腫瘍、乳がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんまたは子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝臓がん、肛門がん、陰茎がん、黒色腫、びまん性表層黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端黒色腫、結節性黒色腫、多発性骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病、および移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ケロイドに関連する異常な血管増殖、浮腫（例えば、脳腫瘍に関連する）、ならびにメイグス症候群、脳腫瘍および脳がん、頭頸部がん、ならびに付随する転移から選択される、態様１７に記載の方法。
[態様１９]
がんを治療するための薬物の調製における、態様１～７のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または態様８に記載の抗体－薬物複合体、または態様１４に記載の医薬組成物の使用。
[態様２０]
前記がんが、扁平上皮がん（例えば、上皮扁平細胞がん）、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺がん、および肺の扁平上皮がんを含む）、腹膜がん、肝細胞がん、胃がん（胃腸がんおよび胃腸間質がんを含む）、膵臓がん、神経膠芽細胞腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、尿路がん、肝腫瘍、乳がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんまたは子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝臓がん、肛門がん、陰茎がん、黒色腫、びまん性表層黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端黒色腫、結節性黒色腫、多発性骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病、および移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ケロイドに関連する異常な血管増殖、浮腫（例えば、脳腫瘍に関連する）、ならびにメイグス症候群、脳腫瘍および脳がん、頭頸部がん、ならびに付随する転移から選択される、態様１９に記載の使用。
[態様２１]
Ｔｒｅｇ機能を阻害する（例えば、Ｔｒｅｇの抑制機能を阻害する）こと、ＯＸ４０を発現する細胞（例えば、高レベルのＯＸ４０を発現する細胞）を死滅させること、エフェクターＴ細胞機能を増強するかつ／もしくはメモリーＴ細胞機能を増強すること、腫瘍免疫を低下させること、Ｔ細胞機能を増強することならびに／またはＯＸ４０発現細胞を枯渇させること、のうちの１つ以上において使用される、態様１～７のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または態様８に記載の抗体－薬物複合体、または態様１４に記載の医薬組成物。
[態様２２]
Ｔｒｅｇ機能を阻害する（例えば、Ｔｒｅｇの抑制機能を阻害する）こと、ＯＸ４０を発現する細胞（例えば、高レベルのＯＸ４０を発現する細胞）を死滅させること、エフェクターＴ細胞機能を増強するかつ／もしくはメモリーＴ細胞機能を増強すること、腫瘍免疫を低下させること、Ｔ細胞機能を増強することならびに／またはＯＸ４０発現細胞を枯
渇させること、のうちの１つ以上のための薬物の調製における、態様１～７のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または態様８に記載の抗体－薬物複合体、または態様１４に記載の医薬組成物の使用。
[態様２３]
態様１～７のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または態様８に記載の抗体－薬物複合体、または態様１４に記載の医薬組成物と、１つ以上の追加の治療薬と、を含む、薬学的組み合わせ。
[態様２４]
態様１～７のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または態様８に記載の抗体－薬物複合体、または態様１４に記載の医薬組成物を含み、好ましくは薬物送達デバイスをさらに含む、キット。

【0308】

【表8-1】

【表8-2】

【表8-3】

【表8-4】

【表8-5】

【表8-6】

【表8-7】

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図1-4】

【図1-5】

【図1-6】

【図1-7】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図2-4】

【図2-5】

【図3-1】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図4-4】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図5-4】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図15A】

【図15B】

【図16】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図18C】

【図18D】

【図18E】

【配列表】

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