特許 7702985 非天然アミノ酸を含むペプチドの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-06-26

(45)【発行日】2025-07-04

(54)【発明の名称】非天然アミノ酸を含むペプチドの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/02 20060101AFI20250627BHJP

   C07K 14/245 20060101ALI20250627BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20250627BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20250627BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20250627BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20250627BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20250627BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20250627BHJP

   C40B 30/04 20060101ALI20250627BHJP

   C40B 50/06 20060101ALN20250627BHJP

【ＦＩ】

C07K1/02 ZNA

C07K14/245

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/31

C12P21/02 C

C40B30/04

C40B50/06

【請求項の数】 25

(21)【出願番号】P 2023068770

(22)【出願日】2023-04-19

(62)【分割の表示】P 2021564050の分割

【原出願日】2020-12-11

(65)【公開番号】P2023099039

(43)【公開日】2023-07-11

【審査請求日】2023-12-08

(31)【優先権主張番号】P 2019224297

(32)【優先日】2019-12-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000003311

【氏名又は名称】中外製薬株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100128381

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 義憲

(72)【発明者】

【氏名】吉井 早貴子

(72)【発明者】

【氏名】下村 康一郎

(72)【発明者】

【氏名】石野 聡

【審査官】井関 めぐみ

(56)【参考文献】

【文献】UniprotKB-A0A377B8T0，2018年11月07日，UniProt [online], [retrieved on 2021.01.14], Retrieved from the Internet : <URL: https://www.uniprot.org/uniprot/A0A377B8T0>, Accession No. A0A377B8T0

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １／０２

Ｃ０７Ｋ １４／２４５

Ｃ１２Ｎ １５／３１

Ｃ１２Ｐ ２１／０２

Ｃ１２Ｎ １／１５

Ｃ１２Ｎ １／１９

Ｃ１２Ｎ １／２１

Ｃ１２Ｎ ５／１０

Ｃ４０Ｂ ３０／０４

Ｃ４０Ｂ ５０／０６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ペプチドの製造方法であって、改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを含む翻訳系中で、１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡを翻訳する工程を含み、前記改変されたＬ３１タンパク質が、以下の（１）から（３）に記載のタンパク質からなる群：
（１）配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、Ｃ末端から６以上４５以下のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を含むタンパク質、
（２）前記（１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が挿入、置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質であって、前記（１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質、
（３）前記（１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質
より選択され、
前記（２）および前記（３）に記載のタンパク質を含むリボソームが、配列番号：１のアミノ酸配列を含む大腸菌野生型Ｌ３１を含むリボソームと比較して、非天然アミノ酸を含むペプチドの翻訳活性が大きい、前記方法。

【請求項2】

前記翻訳系における、全リボソームに対する前記改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームの割合が５０％以上である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ペプチドを環化する工程をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記ペプチドが、その開始アミノ酸の位置に非天然アミノ酸を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

以下の（ａ）～（ｃ）に記載の工程：
（ａ）請求項１～４のいずれか一項に記載された方法によってペプチドを製造する工程、
（ｂ）前記ペプチドまたは前記ペプチドを含むライブラリに標的物質を接触させる工程、および
（ｃ）前記標的物質に結合するペプチドを選択する工程
を含む、標的物質に結合するペプチドのスクリーニング方法。

【請求項6】

以下の（１）から（３）に記載のタンパク質（但し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、Ｃ末端から８アミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を含むタンパク質と、ＭＫＫＤＩＨＰＫＹＥＥＩＴＡＳＣＳＣＧＮＶＭＫＩＲＳＴＶＧＨＤＬＮＬＤＶＣＳＫＶＰＰＶＬＨＷＱＴＡで表されるアミノ酸配列を有するタンパク質を除く。）：
（１）配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、Ｃ末端から９以上４５以下のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、
（２）前記（１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列において、１～９のアミノ酸が挿入、置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質であって、前記（１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質、
（３）前記（１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質
からなる群より選択される、改変されたＬ３１タンパク質であって、
前記（１）、前記（２）および前記（３）に記載のタンパク質を含むリボソームが、配列番号：１のアミノ酸配列を含む大腸菌野生型Ｌ３１を含むリボソームと比較して、非天然アミノ酸を含むペプチドの翻訳活性が大きい、改変されたＬ３１タンパク質。

【請求項7】

以下の（１）から（３）に記載のタンパク質（但し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、Ｃ末端から８アミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を含むタンパク質と、ＭＫＫＤＩＨＰＫＹＥＥＩＴＡＳＣＳＣＧＮＶＭＫＩＲＳＴＶＧＨＤＬＮＬＤＶＣＳＫＶＰＰＶＬＨＷＱＴＡで表されるアミノ酸配列を有するタンパク質を除く。）：
（１）配列番号：２および４２～４８からなる群より選択されるいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（２）前記（１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列において、１～９のアミノ酸が挿入、置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質であって、前記（１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質、
（３）前記（１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質
からなる群より選択される、改変されたＬ３１タンパク質であって、
前記（２）および前記（３）に記載のタンパク質を含むリボソームが、配列番号：１のアミノ酸配列を含む大腸菌野生型Ｌ３１を含むリボソームと比較して、非天然アミノ酸を含むペプチドの翻訳活性が大きい、改変されたＬ３１タンパク質。

【請求項8】

請求項６又は７に記載の改変されたＬ３１タンパク質をコードする単離された核酸。

【請求項9】

請求項８に記載の核酸を含むベクターまたは細胞。

【請求項10】

以下の（ａ）～（ｃ）に記載の工程：
（ａ）請求項９に記載の細胞を培養する工程、
（ｂ）前記細胞の培養物から溶解液を生成する工程、および
（ｃ）前記溶解液からリボソームを精製する工程
を含む、改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームの製造方法。

【請求項11】

請求項６又は７に記載の改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソーム。

【請求項12】

請求項１１に記載のリボソームを含む組成物。

【請求項13】

改変されたＬ３１タンパク質を含む、非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳活性が大きい無細胞翻訳のための合成系であって、
改変されたＬ３１タンパク質が、以下の（１）から（３）に記載のタンパク質：
（１）配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、Ｃ末端から６以上４５以下のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、
（２）前記（１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列において、１～９のアミノ酸が挿入、置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質であって、前記（１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質、
（３）前記（１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質
からなる群より選択され、
前記（２）および前記（３）に記載のタンパク質を含むリボソームが、配列番号：１のアミノ酸配列を含む大腸菌野生型Ｌ３１を含むリボソームと比較して、非天然アミノ酸を含むペプチドの翻訳活性が大きい、前記合成系。

【請求項14】

以下の工程：
（ａ）請求項１０に記載の方法によりリボソームを製造する工程、および
（ｂ）前記リボソームを、非天然アミノ酸がアシル化された開始ｔＲＮＡと混合する工程
を含む、無細胞翻訳系の製造方法。

【請求項15】

以下の工程：
（ａ）マグネシウムイオン濃度が５ｍＭ以下の条件下において、大腸菌を破砕して溶解液を生成する工程、および
（ｂ）前記溶解液からリボソームを精製する工程
を含む、無細胞翻訳系の製造方法。

【請求項16】

以下の工程：
（ａ）マグネシウムイオン濃度が５ｍＭ以下の条件下において、大腸菌を破砕して溶解液を生成する工程、
（ｂ）前記溶解液からリボソームを精製する工程、および
（ｃ）前記リボソームを、非天然アミノ酸がアシル化された開始ｔＲＮＡと混合する工程
を含む、無細胞翻訳系の製造方法。

【請求項17】

前記無細胞翻訳系が２～８ｍＭのマグネシウムイオンをさらに含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記無細胞翻訳系が再構成無細胞翻訳系である、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

以下の工程：
（ｉ）請求項１４～１８のいずれか一項に記載の方法により無細胞翻訳系を製造する工程、および
（ｉｉ）前記無細胞翻訳系を用いて、１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡを翻訳する工程
を含む、ペプチドの製造方法。

【請求項20】

前記ペプチドが、その開始アミノ酸の位置に非天然アミノ酸を含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記翻訳が、イニシエーションサプレッションにより行われる、請求項１９または２０に記載の方法。

【請求項22】

以下の工程：
（Ｉ）請求項１９～２１のいずれか一項に記載された方法によってペプチドを製造する工程、
（ＩＩ）前記ペプチドまたは前記ペプチドを含むライブラリに標的物質を接触させる工程、および
（ＩＩＩ）前記標的物質に結合するペプチドを選択する工程
を含む、標的物質に結合するペプチドのスクリーニング方法。

【請求項23】

前記ペプチドまたは前記ペプチドを含むライブラリが、前記ペプチドを含むライブラリである、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記ライブラリがディスプレイライブラリである、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記ライブラリがｍＲＮＡディスプレイライブラリである、請求項２４記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、非天然アミノ酸を含むペプチドまたは当該ペプチドを含むライブラリの製造方法に関する。また本発明は、当該方法において使用するための改変されたＬ３１タンパク質等に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、非天然アミノ酸を複数含む多様なペプチドのライブラリから医薬品の候補物質を選択する創薬方法が考えられている。なかでも無細胞翻訳系を利用した非天然アミノ酸を含有するペプチドのｍＲＮＡディスプレイライブラリなどは、その多様性、スクリーニングの簡便性の点から期待が集まっている。翻訳系を利用した非天然アミノ酸を含むペプチドの合成法はいくつか報告されている（非特許文献１、２）。しかしながら、これらの文献に記載された方法では翻訳合成の効率が低い。

【0003】

生体内では、ペプチドは、ｍＲＮＡが有する塩基配列情報に即してアミノ酸が重合されることによって合成される。このペプチドの合成過程は翻訳と呼ばれる。翻訳の過程で中心的な役割を果たすのがリボソームである。ｍＲＮＡディスプレイライブラリの調製に用いられる無細胞翻訳系には、通常、精製したリボソームが添加されている。

【0004】

リボソームを構成するタンパク質として、Ｌ３１タンパク質が知られている。Ｌ３１タンパク質はinter subunit Bridge B1bを形成しているタンパク質で、３０Ｓと５０Ｓとの会合状態（７０Ｓ）を安定化する役割がある（非特許文献３）。

【0005】

Ｌ３１タンパク質は、その精製中にプロテアーゼ７によって分解を受けることが知られている。大腸菌野生型株から調製されたリボソーム、プロテアーゼ７を欠損したprotease7 KO株から調製されたリボソーム、およびＬ３１タンパク質を欠損したL31KO株から調製したリボソームについてこれらの活性を比較すると、プロテアーゼ７欠損株から調製したリボソームは、大腸菌野生型株から調製したリボソームやＬ３１欠損株から調製したリボソームと比較して、その活性が大きいことが報告されている（非特許文献３）。またＬ３１欠損株から調製されたリボソームは、in vivoにおいてinitiation rateが３８％下がること、in vitroにおいて７０Ｓの形成速度が遅くなることも報告されている（非特許文献４）。さらに、Ｌ３１欠損株ではFidelityが下がることも報告されている（非特許文献４）。このように、天然アミノ酸からなるペプチドの翻訳においては、プロテアーゼ７による分解を受けていないＬ３１タンパク質を含むリボソームは、切断されたＬ３１タンパク質を含むリボソームやＬ３１タンパク質を含まないリボソームよりもその活性が大きいことが知られていた。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【文献】Maini, R., Umemoto, S. &Suga, H. Ribosome-mediated synthesis of natural product-like peptides viacell-free translation. Current opinion in chemical biology 34, 44-52,doi:10.1016/j.cbpa.2016.06.006 (2016).

【文献】Hartman, M. C., Josephson, K.,Lin, C. W. & Szostak, J. W. An expanded set of amino acid analogs for theribosomal translation of unnatural peptides. PloS one 2, e972,doi:10.1371/journal.pone.0000972 (2007).

【文献】Ueta M, Wada C, Bessho Y, MaedaM, Wada A. Genes Cells. 2017 May;22(5):452-471. doi: 10.1111/gtc.12488. Epub2017 Apr 10. Genes Cells. 2017

【文献】Lilleorg S, Reier K, Remme J,Liiv A. J Mol Biol. 2017 Apr 7;429(7):1067-1080. doi: 10.1016/j.jmb.2017.02.015.Epub 2017 Feb 24. J Mol Biol. 2017

【文献】Chadani Y, Niwa T, Izumi T,Sugata N, Nagao A, Suzuki T, Chiba S, Ito K, Taguchi H. Mol Cell. 2017 Nov2;68(3):528-539.e5. doi: 10.1016/j.molcel.2017.10.020. Mol Cell. 2017

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、一局面において、非天然アミノ酸を含むペプチドの効率的な製造方法、並びに当該方法において使用するための改変されたＬ３１タンパク質、およびこれを含むリボソームを提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、翻訳系を利用して非天然アミノ酸を含むペプチドを製造するにあたり、プロテアーゼ７による分解を受けていないＬ３１タンパク質を含むリボソームとプロテアーゼ７により切断されたＬ３１タンパク質を含むリボソームとの間で、ｍＲＮＡの翻訳効率に違いが生じるか検討を試みた。その結果本発明者らは、イニシエーションサプレッション（Initiation Suppression:iSP）法により非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡを翻訳するときに、プロテアーゼ７により切断されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを使用すると、プロテアーゼ７による分解を受けていないＬ３１タンパク質を含むリボソームを使用する場合と比較して、目的産物の翻訳量が増加することを見出した。また本発明者らは、プロテアーゼ７により切断されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを使用することにより、副生成物の相対的な量も減少させることが可能なことを見出した。これらの結果は、非天然アミノ酸を含まないペプチドの翻訳において従来知られていた事実とは逆の結果であった。さらに本発明者らは、翻訳系のマグネシウムイオン濃度を変えてペプチドの合成を行ったところ、マグネシウムイオン濃度が一定の濃度範囲にある場合に翻訳量が多く、かつ副生成物の割合も低いことを明らかにした。

【0009】

本発明はこのような知見に基づくものであり、具体的には以下〔１〕～〔３７〕に関する。
〔１〕ペプチドの製造方法であって、改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを含む翻訳系中で、１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡを翻訳する工程を含み、前記改変されたL３１タンパク質を含むリボソームは、配列番号：１のアミノ酸配列を含む大腸菌野生型Ｌ３１を含むリボソームと比較して、前記非天然アミノ酸を含むペプチドの翻訳活性が大きい、前記方法。
〔２〕ペプチドの製造方法であって、改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを含む翻訳系中で、１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡを翻訳する工程を含み、前記改変されたＬ３１タンパク質が、以下の（１）から（３）に記載のタンパク質からなる群より選択される、前記方法：
（１）配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、C末端から6以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を含むタンパク質、
（２）前記（１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が挿入、置換、 欠失および／または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質、
（３）前記（１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
〔３〕ペプチドの製造方法であって、改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを含む翻訳系中で、１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡを翻訳する工程を含み、前記改変されたＬ３１タンパク質が、以下の（１）から（３）に記載のタンパク質からなる群より選択される、前記方法：
（１）配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、C末端から6以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、
（２）前記（１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が挿入、置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（３）前記（１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質。
〔４〕前記（１）に記載の、C末端から6以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列が、C末端から8以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列である、〔２〕または〔３〕に記載の方法。
〔５〕前記（１）に記載の、配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、C末端から8以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列が、配列番号：２および４２～４８からなる群より選択されるアミノ酸配列である、〔４〕に記載の方法。
〔６〕前記（２）および前記（３）に記載のタンパク質を含むリボソームが、配列番号：１のアミノ酸配列を含む大腸菌野生型Ｌ３１を含むリボソームと比較して、非天然アミノ酸を含むペプチドの翻訳活性が大きい、〔２〕～〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕前記（１）に記載のタンパク質を含むリボソームが、配列番号：１のアミノ酸配列を含む大腸菌野生型Ｌ３１を含むリボソームと比較して、非天然アミノ酸を含むペプチドの翻訳活性が大きい、〔２〕～〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕前記C末端から6以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列が、C末端から6～50個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列である、〔２〕～〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕前記C末端から6以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列が、C末端から8～50個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列である、〔２〕～〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕前記C末端から6以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列が、C末端から6～43個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列である、〔２〕～〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔１１〕前記C末端から6以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列が、C末端から8～43個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列である、〔２〕～〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔１２〕前記改変されたＬ３１タンパク質が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、C末端から8以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質である、〔１〕～〔１１〕のいずれかに記載の方法。
〔１３〕前記改変されたＬ３１タンパク質が、配列番号：２および４２～４８からなる群より選択されるいずれかで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、〔１〕～〔１２〕のいずれかに記載の方法。
〔１４〕前記翻訳系における、全リボソームに対する前記改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームの割合が５０％以上である、〔１〕～〔１３〕のいずれかに記載の方法。
〔１５〕前記翻訳系が２～８ｍＭのマグネシウムイオンをさらに含む、〔１〕～〔１４〕のいずれかに記載の方法。
〔１６〕前記ペプチドを環化する工程をさらに含む、〔１〕～〔１５〕のいずれかに記載の方法。
〔１７〕前記ペプチドが、その開始アミノ酸の位置に非天然アミノ酸を含む、〔１〕～〔１６〕のいずれかに記載の方法。
〔１８〕前記翻訳が、イニシエーションサプレッションにより行われる、〔１〕～〔１７〕のいずれかに記載の方法。
〔１９〕前記翻訳系に含まれる開始tRNAに非天然アミノ酸がアシル化されている、〔１〕～〔１８〕のいずれかに記載の方法。
〔２０〕前記翻訳活性が、全翻訳産物に対するアミノ酸の読み飛ばしが生じている翻訳産物の割合（iRT割合）で評価される、〔１〕～〔１９〕のいずれかに記載の方法。
〔２１〕前記翻訳活性が、配列番号：１０の鋳型mRNAを用いて、配列番号：２９のペプチドを翻訳することにより評価される、〔１〕～〔２０〕のいずれかに記載の方法。
〔２２〕配列番号：１のアミノ酸配列を含む大腸菌野生型Ｌ３１を含むリボソームのiRT割合と比較して、前記改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームのiRT割合が15%以上低い、〔１〕～〔２１〕のいずれかに記載の方法。
〔２３〕〔１〕～〔２２〕のいずれかに記載の方法により製造されたペプチドまたは当該ペプチドを含む、ライブラリ。
〔２４〕以下（ａ）および（ｂ）に記載の工程を含む、標的物質に結合するペプチドのスクリーニング方法；
（ａ）〔１〕～〔２２〕のいずれかに記載された方法によって得られるペプチドまたは当該ペプチドを含むライブラリ、もしくは、〔２３〕に記載されたペプチドまたはライブラリに標的物質を接触させる工程、および
（ｂ）前記標的物質に結合するペプチドを選択する工程。
〔２５〕〔２〕～〔２４〕のいずれかに記載の、改変されたL31タンパク質。
〔２６〕〔２５〕に記載の、改変されたL31タンパク質（ただし、配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるL31タンパク質を除く）。
〔２７〕〔２５〕または〔２６〕に記載の改変されたＬ３１タンパク質をコードする単離された核酸。
〔２８〕〔２７〕に記載の核酸を含むベクターまたは細胞。
〔２９〕以下（ａ）～（ｃ）に記載の工程を含む、改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームの製造方法；
（ａ）〔２８〕に記載の細胞を培養する工程、
（ｂ）前記細胞の培養物から溶解液を生成する工程、および
（ｃ）前記溶解液からリボソームを精製する工程。
〔３０〕以下（ａ）および（ｂ）に記載の工程を含む、改変されたＬ３１タンパク質の製造方法；
（ａ）〔２８〕に記載の細胞を培養する工程、および
（ｂ）前記細胞の培養物から発現産物を単離する工程。
〔３１〕以下（ａ）および（ｂ）に記載の工程を含む、リボソームの製造方法；
（ａ）マグネシウムイオン濃度が５ｍＭ以下の条件下において、フレンチプレスを使用して、野生型大腸菌の培養物から溶解液を生成する工程、および、
（ｂ）前記溶解液からリボソームを精製する工程。
〔３２〕〔２５〕または〔２６〕に記載の改変されたL31タンパク質を含むリボソーム。
〔３３〕〔３２〕に記載のリボソームを含む組成物。
〔３４〕〔３３〕に記載の組成物であって、全リボソームに対する前記改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームの割合が５０％以上である、組成物。
〔３５〕以下（ａ）および／または（ｂ）をさらに含む、〔３３〕または〔３４〕に記載の組成物；
（ａ）非天然アミノ酸とｔＲＮＡが結合してなるアミノアシルｔＲＮＡ、
（ｂ）１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡ。
〔３６〕非天然アミノ酸がアシル化された開始tRNAをさらに含む、〔３３〕～〔３５〕のいずれかに記載の組成物。
〔３７〕以下の工程を含む、無細胞翻訳系の製造方法；
（ａ）〔２９〕または〔３１〕に記載の方法によりリボソームを製造する工程、および
（ｂ）前記リボソームを、非天然アミノ酸がアシル化された開始tRNAと混合する工程。

【発明の効果】

【0010】

本発明により、非天然アミノ酸を含むペプチドおよび当該ペプチドを含むライブラリの効率的な製造方法が提供された。また本発明により、当該方法において使用するための改変されたＬ３１タンパク質、およびこれを含むリボソームが提供された。本発明の方法を用いることにより、非天然アミノ酸を含むペプチドやそのライブラリを効率的に製造することができる。
従来、プロテアーゼ７により切断されたＬ３１タンパク質を含むリボソームは、切断されていないＬ３１タンパク質を含むリボソームよりもその活性が劣ることが示唆されていた。この事実を踏まえると、本明細書における改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを用いることによって非天然アミノ酸を含むペプチドを効率的に翻訳できることは驚くべき効果であった。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】L31shortリボソームまたはL31intactリボソームを用いて、mR-1配列を翻訳した時の目的産物の翻訳量とiRTペプチドの翻訳量を示すグラフである。

【図2】L31shortリボソームまたはL31intactリボソームを用いて、mR-2配列を翻訳した時の目的産物の翻訳量とiRTペプチドの翻訳量を示すグラフである。

【図3】WT-0MG リボソーム、WT-5MGリボソームまたはWT-10MGリボソームを用いて、mR-1配列を翻訳した時の目的産物の翻訳量とiRTペプチドの翻訳量を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明は、改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを含む翻訳系中で、１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡを翻訳する工程を含む、ペプチドまたはペプチドのライブラリの製造方法に関する。本発明においては、改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを含む翻訳系と、１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡとを混合することにより、ペプチドまたはペプチドのライブラリを製造することができる。したがって本発明は、改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを含む翻訳系と、１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡとを混合し、当該ｍＲＮＡを翻訳する工程を含む、ペプチドまたはペプチドのライブラリの製造方法に関する。本発明の製造方法は、大腸菌野生型に由来する配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有する野生型Ｌ３１タンパク質を含むリボソームを使用する場合と比較して、非天然アミノ酸を含むペプチドを効率的に翻訳することが可能な方法である。

【0013】

Ｌ３１タンパク質はリボソームを構成するタンパク質の一つであり、５０Ｓサブユニットおよび３０Ｓサブユニットの会合に重要な役割を果たす。本発明者らは、大腸菌野生型に由来する配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有する野生型Ｌ３１タンパク質においてC末端側のアミノ酸残基が欠損した改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを含む翻訳系において、１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドを合成した場合、大腸菌野生型Ｌ３１タンパク質を含むリボソームを含む翻訳系において当該ペプチドを合成する場合と比較して、翻訳産物の量が増加することを見出した。さらに本発明者らは、改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを含む翻訳系を用いた場合、大腸菌野生型Ｌ３１タンパク質を含むリボソームを含む翻訳系を使用する場合と比較して、副生成物の相対的な生成量を減少させることが可能なことを見出した。

【0014】

なお本明細書において、「大腸菌野生型Ｌ３１タンパク質」は配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有するＬ３１を指し、これを「大腸菌野生型Ｌ３１」、「ｉｎｔａｃｔなＬ３１」、「Ｌ３１ｉｎｔａｃｔ」などと称する場合がある。また、本明細書において「改変されたＬ３１タンパク質」は「大腸菌野生型Ｌ３１タンパク質においてC末端から６以上のアミノ酸残基が欠損した改変されたＬ３１タンパク質」を指す。本明細書においては、このようなタンパク質のうち、「大腸菌野生型Ｌ３１タンパク質において６３番目以降のアミノ酸残基が欠損した改変されたＬ３１タンパク質」、具体的には配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有するＬ３１を、「ｓｈｏｒｔＬ３１」、「Ｌ３１ｓｈｏｒｔ」などと称する場合がある。また、「大腸菌野生型Ｌ３１タンパク質において（Ｘ＋１）番目以降のアミノ酸残基が欠損した改変されたＬ３１タンパク質」を、「Ｌ３１（１－Ｘ）」と称する場合がある。すなわち、前記ｓｈｏｒｔＬ３１は、「Ｌ３１（１－６２）」とも称する。また本明細書において、あるＬ３１タンパク質を含むリボソームを、該Ｌ３１タンパク質の名称の後に「リボソーム」を付して表記することがある。例えば、「ｉｎｔａｃｔなＬ３１」、「Ｌ３１ｉｎｔａｃｔ」、「ｓｈｏｒｔＬ３１」、「Ｌ３１（１－６２）」または「Ｌ３１ｓｈｏｒｔ」を含むリボソームを、それぞれ、「ｉｎｔａｃｔＬ３１リボソーム」、「Ｌ３１ｉｎｔａｃｔリボソーム」、「ｓｈｏｒｔＬ３１リボソーム」、「Ｌ３１（１－６２）リボソーム」または「Ｌ３１ｓｈｏｒｔリボソーム」などと称する場合がある。また、大腸菌野生型株から精製したリボソームを「ＷＴリボソーム」などと称する場合がある。

【0015】

改変されたＬ３１タンパク質
本開示における製造方法においては、改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを使用することにより、大腸菌野生型Ｌ３１を含むリボソームを使用する場合と比較して、非天然アミノ酸を含むペプチドを効率的に翻訳することが可能である。本発明の一態様において、改変されたＬ３１タンパク質は、
（１）配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、C末端から6以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を含むタンパク質、
（２）前記（１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が挿入、置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質、
（３）前記（１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質、
を例示することができる。

【0016】

前記（１）のタンパク質としては、配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、C末端から8以上のアミノ酸残基、または9以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよく、例えば、C末端から６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個から選択される下限の値と、５０個、４９個、４８個、４７個、４６個、４５個、４４個、４３個、４２個、４１個、４０個、３９個、３８個から選択される上限の値の範囲に含まれる個数のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。また一態様において、前記（１）のタンパクは、配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、C末端から６～５０個の範囲に含まれる個数のいずれかの個数、６～４３個の範囲に含まれる個数のいずれかの個数、８～５０個の範囲に含まれる個数のいずれかの個数、または８～４３個の範囲に含まれる個数のいずれかの個数のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。さらなる態様において、前記（１）のタンパクとして、配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、C末端から６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、２７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、または５０個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。より具体的には、本開示における改変されたＬ３１タンパク質には、配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、C末端から８個、４３個、３８個、３３個、２８個、２３個、１８個、または１３個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を含むタンパク質およびこれらのタンパク質においてアミノ酸残基が改変（欠失、置換、及び／又は挿入）されたタンパク質が含まれる。すなわち、本開示における改変されたＬ３１タンパク質には、
（１）配列番号：２および４２～４８より選択されるいずれかで表されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
（２）配列番号：２および４２～４８より選択されるいずれかで表されるアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が欠失、挿入、置換および／または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質、および
（３）配列番号：２および４２～４８より選択されるいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質
も包含される。
本発明の改変されたＬ３１タンパク質は、配列番号：２および４２～４８のいずれか、または配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質であることが好ましい。
なお本明細書においては、「含む」は「含む」及び「からなる」の両方を意味する。

【0017】

いくつかの態様において、本開示の改変されたL３１タンパク質は、（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、C末端から6以上若しくは8以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を含むタンパク質、または（ｉｉ）配列番号：２および４２～４８より選択されるいずれかで表されるアミノ酸配列を含むタンパク質のアミノ酸配列において、１または複数（例えば１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、若しくは３以下、または、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０、または１０を超える）のアミノ酸が挿入、置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質であってよい。アミノ酸の付加、欠失、置換、及び／又は挿入は、当分野で公知の方法により行うことが可能である。例えば、アミノ酸配列をコードする核酸に対して、例えば部位特異的変異誘発法（Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488-492(1985)）やOverlap extension PCRを行うことができる。これらを適宜、単独でまたは組み合わせて行ってもよい。

【0018】

一般に、タンパク質における１つまたは複数（例えば１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、若しくは３以下、または、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０、または１０を超える）のアミノ酸の改変（例えば、保存的な置換、欠失、挿入、および／または付加）は、そのペプチドの機能に影響を及ぼさず、または元のタンパク質の機能を強化しさえすることが知られている。アミノ酸は、その側鎖の特徴に応じて、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）に分類される。またアミノ酸の側鎖は、脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、ヒドロキシル基を含む側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子を含む側鎖（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸およびアミドを含む側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基を含む側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、および芳香族を含む側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）に分類することもできる。配列番号：１、２、および４２～４８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するタンパク質に含まれるアミノ酸を、同じ特徴を有するグループに分類される他のアミノ酸で改変されたタンパク質もまた、本発明の改変されたＬ３１タンパク質に含まれる。ただし、本発明の改変されたＬ３１タンパク質は、配列番号：２および４２～４８のいずれか、または配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等である限り、非保存的改変も含んでよい。

【0019】

また本発明の一態様において、配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、C末端から6以上、若しくは8以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列、または、配列番号：１、２、および４２～４８のいずれかで表されるアミノ酸配列と高い配列の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質もまた、本開示における改変されたＬ３１タンパク質に包含される。本開示において高い同一性とは、アミノ酸配列全体あるいは塩基配列全体で、少なくとも50％以上、さらに好ましくは70％以上、さらに好ましくは80%以上、さらに好ましくは85%以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上）の配列の同一性を指す。配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA87:2264-2268, 1990、Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873,1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。

【0020】

本開示において「機能的に同等」とは、改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームが、非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳に関して、配列番号：１で表されるアミノ酸配列においてC末端から6以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列（例えば、配列番号：２および４２～４８のいずれかに記載されたアミノ酸配列）からなるＬ３１タンパク質を含むリボソームと同等の翻訳活性を示すことをいう。したがって、あるタンパク質を含むリボソームが、配列番号：１で表されるアミノ酸配列においてC末端から6以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列（例えば、配列番号：２および４２～４８のいずれかに記載されたアミノ酸配列）からなるＬ３１タンパク質を含むリボソームと比較して、非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳に関して同程度の活性を有する場合に、当該あるタンパク質は「配列番号：１で表されるアミノ酸配列においてC末端から6以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列（例えば、配列番号：２および４２～４８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）と機能的に同等なタンパク質」ということができる。本発明者らは、配列番号：１で表されるアミノ酸配列においてC末端から6以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列（例えば、配列番号：２および４２～４８のいずれかに記載されたアミノ酸配列）を含むＬ３１タンパク質を含むリボソームは、配列番号：１に記載されたアミノ酸配列を含むＬ３１タンパク質を含むリボソームと比較して、非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳活性が大きいことを明らかにした。したがって、あるタンパク質を含むリボソームが、配列番号：１に記載されたアミノ酸配列を含むＬ３１タンパク質を含むリボソームと比較して、非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳活性が大きい時に、当該あるタンパク質は「配列番号：１で表されるアミノ酸配列においてC末端から6以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列（例えば、配列番号：２および４２～４８のいずれかに記載のアミノ酸配列）からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質」ということができる。あるいは、あるタンパク質が、配列番号：１に記載されたアミノ酸配列を含むＬ３１タンパク質と比較して、リボソームを構成した時に、リボソームに対して大きな非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳活性を提供した時に、当該あるタンパク質は「配列番号：１で表されるアミノ酸配列においてC末端から6以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列（例えば、配列番号：２および４２～４８のいずれかに記載のアミノ酸配列）からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質」ということができる。

【0021】

本開示において「非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳活性」とは「非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳効率」と表現することもでき、具体的には、非天然アミノ酸を有するｔＲＮＡの取り込みやすさ、非天然アミノ酸をコードするコドンの読み飛ばしの程度、ペプチドの翻訳量、および／または副生成物の生成量が含まれる。
本開示において「非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳活性が大きい」とは「非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳効率が高い」と表現することもでき、具体的には、非天然アミノ酸を有するｔＲＮＡが取り込まれやすい、非天然アミノ酸をコードするコドンの読み飛ばしが少ない、目的ペプチドの生成量が多い、および／または副生成物の生成量が少ないことを意味する。

【0022】

本開示における「非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳活性」は、全翻訳産物に対するアミノ酸の読み飛ばしが生じている翻訳産物の割合を指標として評価することができる。非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡを翻訳すると、目的産物（TM）の他に、開始アミノ酸が読み飛ばされ開始２文字目のアミノ酸から翻訳されたペプチド（本開示において「1iRT」という）や、開始アミノ酸および開始２文字目のアミノ酸が読み飛ばされ開始３文字目のアミノ酸から翻訳されたペプチド（本開示において「2iRT」という）等のイニシエーションリードスルー（iRT）ペプチドが含まれ得る。本開示においては、イニシエーションリードスルー（iRT）と目的産物（TM）の濃度から以下の式により算出される「iRT割合」を、「非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳活性」として採用できる。式中の「iRT total濃度」は、1iRT（開始2文字目から翻訳が開始されたペプチド）濃度と2iRT（開始3文字目から翻訳が開始されたペプチド）濃度の合計値として算出できる。

【0023】

（数１）
iRT割合 = (iRT total濃度 [nM]) / (iRT total濃度 [nM] + TM 濃度[nM]) ×100

【0024】

具体的には、iRT割合は実施例に記載のアミノアシルtRNAや翻訳系等を使用し、実施例に記載の方法で評価することができる。一例として、配列番号：１０の鋳型mRNAを用いて、配列番号：２９～３１のいずれか、好ましくは配列番号：２９のペプチドを翻訳させることにより「非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳活性」を評価することができる。

【0025】

本開示において「非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳活性が大きい」とは、iRT割合が低いことを意味することができる。「配列番号：１のアミノ酸配列を含む大腸菌野生型Ｌ３１を含むリボソームと比較して、前記非天然アミノ酸を含むペプチドの翻訳活性が大きい」とは、例えば、配列番号：１のアミノ酸配列を含む大腸菌野生型Ｌ３１を含むリボソームのiRT割合と比較して、本開示の改変されたL31タンパク質を含むリボソームのiRT割合が15%、20%、25%、または30%以上低いことを意味することができる。

【0026】

なお、原核細胞のリボソームは５０Ｓのラージサブユニットおよび３０Ｓのスモールサブユニットを含む。５０Ｓサブユニットはさらに２３ＳｒＲＮＡおよび５ＳｒＲＮＡならびに複数のタンパク質から構成される。また３０Ｓサブユニットは１６ＳｒＲＮＡおよび複数のタンパク質から構成される。一方、真核細胞のリボソームは６０Ｓのラージサブユニットおよび４０Ｓのスモールサブユニットを含む。６０Ｓサブユニットはさらに２８ＳｒＲＮＡ、５．８ＳｒＲＮＡおよび５ＳｒＲＮＡならびに複数のタンパク質から構成される。また４０Ｓサブユニットは１８ＳｒＲＮＡおよび複数のタンパク質から構成される。リボソームの構成因子は当業者に公知である。

【0027】

アミノ酸
本開示においてペプチドを構成する「アミノ酸」は、α－アミノ酸などの「天然アミノ酸」およびβ－アミノ酸、γ－アミノ酸などの「非天然アミノ酸」を含む。アミノ酸の立体構造は、Ｌ型アミノ酸、Ｄ型アミノ酸のいずれであってもよい。「アミノ酸」、「天然アミノ酸」、「非天然アミノ酸」はそれぞれ、「アミノ酸残基」、「天然アミノ酸残基」、「非天然アミノ酸残基」ということがある。

【0028】

特定の態様において、天然アミノ酸は、以下の２０種類のα－アミノ酸：グリシン（Gly）、アラニン（Ala）、セリン（Ser）、トレオニン（Thr）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、フェニルアラニン（Phe）、チロシン（Tyr）、トリプトファン（Trp）、ヒスチジン（His）、グルタミン酸（Glu）、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン（Gln）、アスパラギン（Asn）、システイン（Cys）、メチオニン（Met）、リジン（Lys）、アルギニン（Arg）、およびプロリン（Pro）からなる。あるいは、上述の２０種類のアミノ酸から、任意の１種類以上のアミノ酸を除いたものを、本開示における天然アミノ酸としてもよい。一態様において、天然アミノ酸は、イソロイシンを除く１９種類のアミノ酸からなる。一態様において、天然アミノ酸は、メチオニンを除く１９種類のアミノ酸からなる。さらなる態様において、天然アミノ酸は、イソロイシンおよびメチオニンを除く１８種類のアミノ酸からなる。天然アミノ酸は通常、Ｌ型アミノ酸である。

【0029】

非天然アミノ酸
本開示において、非天然アミノ酸とは、上記の２０種類のα－アミノ酸からなる天然アミノ酸を除く全てのアミノ酸を表す。非天然アミノ酸の例として、β－アミノ酸、γ－アミノ酸、Ｄ型アミノ酸、天然アミノ酸とは側鎖が異なるα－アミノ酸、α，α－二置換アミノ酸、主鎖のアミノ基が置換基を有するアミノ酸（Ｎ置換アミノ酸）などを挙げることができる。非天然アミノ酸の側鎖は、特に限定されないが、水素原子の他に、例えばアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、シクロアルキルなどを有していてもよい。また、α，α－二置換アミノ酸の場合、２つの側鎖が環を形成していてもよい。さらに、これらの側鎖は、１つ以上の置換基を有していてもよい。特定の態様において、置換基は、ハロゲン原子、Ｏ原子、Ｓ原子、Ｎ原子、Ｂ原子、Ｓｉ原子、またはＰ原子を含む任意の官能基の中から選択することができる。例えば、本開示において「ハロゲンを置換基に有するＣ１－Ｃ６アルキル」とは、アルキルにおける少なくとも一つの水素原子がハロゲン原子で置換された「Ｃ１－Ｃ６アルキル」を意味し、具体的には、例えば、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、フルオロメチル、ペンタフルオロエチル、テトラフルオロエチル、トリフルオロエチル、ジフルオロエチル、フルオロエチル、トリクロロメチル、ジクロロメチル、クロロメチル、ペンタクロロエチル、テトラクロロエチル、トリクロロエチル、ジクロロエチル、クロロエチルなどを含む。また、例えば「置換基を有するＣ５－Ｃ１０アリールＣ１－Ｃ６アルキル」とは、アリールおよび／またはアルキルにおける少なくとも一つの水素原子が置換基により置換された「Ｃ５－Ｃ１０アリールＣ１－Ｃ６アルキル」を意味する。さらに、「置換基を２つ以上有している」とは、ある官能基（例えばＳ原子を含む官能基）を置換基として有し、さらにその官能基が別の置換基（例えばアミノやハロゲンなどの置換基）を有していることも含む。非天然アミノ酸の具体的な例としては、WO2013/100132やWO2018/143145なども参照することができる。

【0030】

非天然アミノ酸の主鎖のアミノ基は、非置換のアミノ基（ＮＨ_２基）でもよく、置換されたアミノ基（ＮＨＲ基）であってもよい。ここで、Ｒは、置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、シクロアルキルを示す。また、プロリンのように主鎖のアミノ基のＮ原子に結合した炭素鎖とα位の炭素原子とが環を形成していてもよい。アミノ基のアルキル置換の例としては、Ｎ－メチル化、Ｎ－エチル化、Ｎ－プロピル化、Ｎ－ブチル化などが、アラルキル置換の例としては、Ｎ－ベンジル化などが挙げられる。Ｎ－メチルアミノ酸の具体的な例としては、Ｎ－メチルアラニン、Ｎ－メチルグリシン、Ｎ－メチルフェニルアラニン、Ｎ－メチルチロシン、Ｎ－メチル－３－クロロフェニルアラニン、Ｎ－メチル－４－クロロフェニルアラニン、Ｎ－メチル－４－メトキシフェニルアラニン、Ｎ－メチル－４－チアゾールアラニン、Ｎ－メチルヒスチジン、Ｎ－メチルセリン、Ｎ－メチルアスパラギン酸などを挙げることができる。

【0031】

ハロゲンを含む置換基としては、ハロゲンを置換基に有するアルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基などが例示され、より具体的には、フルオロアルキル、ジフルオロアルキル、トリフルオロアルキルなどが例示される。

【0032】

Ｏ原子を含む置換基としては、ヒドロキシル（－ＯＨ）、オキシ（－ＯＲ）、カルボニル（－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）、カルボキシル（－ＣＯ_２Ｈ）、オキシカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ）、カルボニルオキシ（－Ｏ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）、チオカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＳＲ）、カルボニルチオ基（－Ｓ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）、アミノカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＮＨＲ）、カルボニルアミノ（－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）、オキシカルボニルアミノ（－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ）、スルホニルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ_２－Ｒ）、アミノスルホニル（－ＳＯ_２－ＮＨＲ）、スルファモイルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ_２－ＮＨＲ）、チオカルボキシル（－Ｃ（＝Ｏ）－ＳＨ）、カルボキシルカルボニル（－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＯ_２Ｈ）が挙げられる。

【0033】

オキシ（－ＯＲ）の例としては、アルコキシ、シクロアルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アラルキルオキシなどが挙げられる。

【0034】

カルボニル（－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）の例としては、ホルミル（－Ｃ＝Ｏ－Ｈ）、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、アラルキルカルボニルなどが挙げられる。

【0035】

オキシカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ）の例としては、アルキルオキシカルボニル、シクロアルキルオキシカルボニル、アルケニルオキシカルボニル、アルキニルオキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシカルボニル、アラルキルオキシカルボニルなどが挙げられる。
（－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ）

【0036】

カルボニルオキシ（－Ｏ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルオキシ、シクロアルキルカルボニルオキシ、アルケニルカルボニルオキシ、アルキニルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、ヘテロアリールカルボニルオキシ、アラルキルカルボニルオキシなどが挙げられる。

【0037】

チオカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＳＲ）の例としては、アルキルチオカルボニル、シクロアルキルチオカルボニル、アルケニルチオカルボニル、アルキニルチオカルボニル、アリールチオカルボニル、ヘテロアリールチオカルボニル、アラルキルチオカルボニルなどが挙げられる。

【0038】

カルボニルチオ（－Ｓ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルチオ、シクロアルキルカルボニルチオ、アルケニルカルボニルチオ、アルキニルカルボニルチオ、アリールカルボニルチオ、ヘテロアリールカルボニルチオ、アラルキルカルボニルチオなどが挙げられる。

【0039】

アミノカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＮＨＲ）の例としては、アルキルアミノカルボニル、シクロアルキルアミノカルボニル、アルケニルアミノカルボニル、アルキニルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、ヘテロアリールアミノカルボニル、アラルキルアミノカルボニルなどが挙げられる。これらに加えて、－Ｃ＝Ｏ－ＮＨＲ中のＮ原子と結合したＨ原子が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された基が挙げられる。

【0040】

カルボニルアミノ（－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルアミノ、シクロアルキルカルボニルアミノ、アルケニルカルボニルアミノ、アルキニルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノ、アラルキルカルボニルアミノなどが挙げられる。これらに加えて－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ中のＮ原子と結合したＨ原子が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された基が挙げられる。

【0041】

オキシカルボニルアミノ（－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ）の例としては、アルコキシカルボニルアミノ、シクロアルコキシカルボニルアミノ、アルケニルオキシカルボニルアミノ、アルキニルオキシカルボニルアミノ、アリールオキシカルボニルアミノ、ヘテロアリールオキシカルボニルアミノ、アラルキルオキシカルボニルアミノなどが挙げられる。これらに加えて、－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ中のＮ原子と結合したＨ原子がアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された基が挙げられる。

【0042】

スルホニルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ_２－Ｒ）の例としては、アルキルスルホニルアミノ、シクロアルキルスルホニルアミノ、アルケニルスルホニルアミノ、アルキニルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、アラルキルスルホニルアミノなどが挙げられる。これらに加えて、－ＮＨ－ＳＯ_２－Ｒ中のＮ原子と結合したＨ原子がアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された基が挙げられる。

【0043】

アミノスルホニル（－ＳＯ_２－ＮＨＲ）の例としては、アルキルアミノスルホニル、シクロアルキルアミノスルホニル、アルケニルアミノスルホニル、アルキニルアミノスルホニル、アリールアミノスルホニル、ヘテロアリールアミノスルホニル、アラルキルアミノスルホニルなどが挙げられる。これらに加えて、－ＳＯ_２－ＮＨＲ中のＮ原子と結合したＨ原子がアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された基が挙げられる。

【0044】

スルファモイルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ_２－ＮＨＲ）の例としては、アルキルスルファモイルアミノ、シクロアルキルスルファモイルアミノ、アルケニルスルファモイルアミノ、アルキニルスルファモイルアミノ、アリールスルファモイルアミノ、ヘテロアリールスルファモイルアミノ、アラルキルスルファモイルアミノなどが挙げられる。さらに、－ＮＨ－ＳＯ_２－ＮＨＲ中のＮ原子と結合した２つのＨ原子はアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群より独立して選択される置換基で置換されていてもよく、またこれらの２つの置換基は環を形成しても良い。

【0045】

Ｓ原子を含む置換基として、チオール（－ＳＨ）、チオ（－Ｓ－Ｒ）、スルフィニル（－Ｓ＝Ｏ－Ｒ）、スルホニル（－Ｓ（Ｏ）_２－Ｒ）、スルホ（－ＳＯ_３Ｈ）が挙げられる。

【0046】

チオ（－Ｓ－Ｒ）の例としては、アルキルチオ、シクロアルキルチオ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、アラルキルチオなどが挙げられる。

【0047】

スルフィニル（－Ｓ＝Ｏ－Ｒ）の例としては、アルキルスルフィニル、シクロアルキルスルフィニル、アルケニルスルフィニル、アルキニルスルフィニル、アリールスルフィニル、ヘテロアリールスルフィニル、アラルキルスルフィニルなどが挙げられる。

【0048】

スルホニル（－Ｓ（Ｏ）_２－Ｒ）の例としては、アルキルスルホニル、シクロアルキルスルホニル、アルケニルスルホニル、アルキニルスルホニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、アラルキルスルホニルなどが挙げられる。

【0049】

Ｎ原子を含む置換基として、アジド（－Ｎ_３、「アジド基」ともいう）、シアノ（－ＣＮ）、１級アミノ（－ＮＨ_２）、２級アミノ（－ＮＨ－Ｒ）、３級アミノ（－ＮＲ（Ｒ'））、アミジノ（－Ｃ（＝ＮＨ）－ＮＨ_２）、置換アミジノ（－Ｃ（＝ＮＲ）－ＮＲ'Ｒ''）、グアニジノ（－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）－ＮＨ_２）、置換グアニジノ（－ＮＲ－Ｃ（＝ＮＲ'''）－ＮＲ'Ｒ''）、アミノカルボニルアミノ（－ＮＲ－ＣＯ－ＮＲ'Ｒ''）が挙げられる。

【0050】

２級アミノ（－ＮＨ－Ｒ）の例としては、アルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、アリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、アラルキルアミノなどが挙げられる。

【0051】

３級アミノ（－ＮＲ（Ｒ'））の例としては、例えばアルキル（アラルキル）アミノなど、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルなどの中からそれぞれ独立して選択される、任意の２つの置換基を有するアミノ基が挙げられ、これらの任意の２つの置換基は環を形成しても良い。

【0052】

置換アミジノ（－Ｃ（＝ＮＲ）－ＮＲ'Ｒ''）の例としては、Ｎ原子上の３つの置換基Ｒ、Ｒ'、およびＲ''が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルの中からそれぞれ独立して選択された基、例えばアルキル（アラルキル）（アリール）アミジノなどが挙げられる。

【0053】

置換グアニジノ（－ＮＲ－Ｃ（＝ＮＲ'''）－ＮＲ'Ｒ''）の例としては、Ｒ、Ｒ'、Ｒ''、およびＲ'''が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルの中からそれぞれ独立して選択された基、あるいはこれらが環を形成した基などが挙げられる。

【0054】

アミノカルボニルアミノ（－ＮＲ－ＣＯ－ＮＲ'Ｒ''）の例としては、Ｒ、Ｒ'、およびＲ''が、水素原子、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルの中からそれぞれ独立して選択された基、あるいはこれらは環を形成した基などが挙げられる。

【0055】

Ｂ原子を含む置換基として、ボリル（－ＢＲ（Ｒ'））やジオキシボリル（－Ｂ（ＯＲ）（ＯＲ'））などが挙げられる。これらの２つの置換基ＲおよびＲ'は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルなどの中からそれぞれ独立して選択されるか、あるいはこれらは環を形成してもよい。

【0056】

ペプチドを構成する「アミノ酸」を構成する少なくとも１つの原子は、原子番号（陽子数）が同じで，質量数（陽子と中性子の数の和）が異なる原子（同位体）であってもよい。当該ペプチドを構成する「アミノ酸」に含まれる同位体の例としては、水素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、リン原子、硫黄原子、フッ素原子、塩素原子などがあり、それぞれ、^２Ｈ、^３Ｈ、^１３Ｃ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^１７Ｏ、^１８Ｏ、^３１Ｐ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１８Ｆ、^３６Ｃｌ等が含まれる。

【0057】

本明細書における「ハロゲン原子」としては、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩが例示される。

【0058】

本明細書において「アルキル」とは、脂肪族炭化水素から任意の水素原子を１個除いて誘導される１価の基であり、骨格中にヘテロ原子（炭素及び水素原子以外の原子をいう。）または不飽和の炭素－炭素結合を含有せず、水素及び炭素原子を含有するヒドロカルビルまたは炭化水素基構造の部分集合を有する。アルキルは直鎖状のものだけでなく、分枝鎖状のものも含む。アルキルとして具体的には、炭素原子数１～２０（Ｃ_１－Ｃ_２０、以下「Ｃ_ｐ－Ｃ_ｑ」とは炭素原子数がｐ～ｑ個であることを意味する）のアルキルであり、好ましくはＣ_１－Ｃ_１０アルキル、より好ましくはＣ_１－Ｃ_６アルキルが挙げられる。アルキルとして、具体的には、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓ－ブチル、ｔ－ブチル、イソブチル（２－メチルプロピル）、ｎ－ペンチル、ｓ－ペンチル（１－メチルブチル）、ｔ－ペンチル（１，１－ジメチルプロピル）、ネオペンチル（２，２－ジメチルプロピル）、イソペンチル（３－メチルブチル）、３－ペンチル（１－エチルプロピル）、１，２－ジメチルプロピル、２－メチルブチル、ｎ－ヘキシル、１，１，２－トリメチルプロピル、１，２，２－トリメチルプロピル、１，１，２，２－テトラメチルプロピル、１，１－ジメチルブチル、１，２－ジメチルブチル、１，３－ジメチルブチル、２，２－ジメチルブチル、２，３－ジメチルブチル、３，３－ジメチルブチル、１－エチルブチル、２－エチルブチル等が挙げられる。

【0059】

本明細書において「アルケニル」とは、少なくとも１個の二重結合（２個の隣接ＳＰ^２炭素原子）を有する１価の基である。二重結合および置換分（存在する場合）の配置によって、二重結合の幾何学的形態は、エントゲーゲン（Ｅ）またはツザンメン（Ｚ）、シスまたはトランス配置をとることができる。アルケニルは、直鎖状のものだけでなく、分枝鎖状ものも含む。アルケニルとして好ましくはＣ_２－Ｃ_１０アルケニル、より好ましくはＣ_２－Ｃ_６アルケニルが挙げられ、具体的には、たとえば、ビニル、アリル、１－プロペニル、２－プロペニル、１－ブテニル、２－ブテニル（シス、トランスを含む）、３－ブテニル、ペンテニル、３－メチル－２－ブテニル、ヘキセニルなどが挙げられる。

【0060】

本明細書において「アルキニル」とは、少なくとも１個の三重結合（２個の隣接ＳＰ炭素原子）を有する、１価の基である。アルキニルは、直鎖状のものだけでなく、分枝鎖状のものも含む。アルキニルとして好ましくはＣ_２－Ｃ_１０アルキニル、より好ましくはＣ_２－Ｃ_６アルキニルが挙げられ、具体的には、たとえば、エチニル、１－プロピニル、プロパルギル、３－ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、３－フェニル－２－プロピニル、３－（２'－フルオロフェニル）－２－プロピニル、２－ヒドロキシ－２－プロピニル、３－（３－フルオロフェニル）－２－プロピニル、３－メチル－（５－フェニル）－４－ペンチニルなどが挙げられる。

【0061】

本明細書において「シクロアルキル」とは、飽和または部分的に飽和した環状の１価の脂肪族炭化水素基を意味し、単環、ビシクロ環、スピロ環を含む。シクロアルキルとして好ましくはＣ_３－Ｃ_８シクロアルキルが挙げられ、具体的には、たとえば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、スピロ［３．３］ヘプチルなどが挙げられる。

【0062】

本明細書において「アリール」とは１価の芳香族炭化水素環を意味し、好ましくはＣ_６－Ｃ_１０アリールが挙げられる。アリールとして具体的には、たとえば、フェニル、ナフチル（たとえば、１－ナフチル、２－ナフチル）などが挙げられる。

【0063】

本明細書において「ヘテロアリール」とは、炭素原子に加えて１～５個のヘテロ原子を含有する、芳香族性の環状の１価の基を意味する。環は単環でも、他の環との縮合環でもよく、部分的に飽和されていてもよい。環を構成する原子の数は好ましくは５～１０（５～１０員ヘテロアリール）であり、より好ましくは５～７（５～７員ヘテロアリール）である。ヘテロアリールとして具体的には、たとえば、フリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジル、ピリダジニル、ピラジニル、トリアジニル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾイミダゾリル、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ベンゾジオキソリル、インドリジニル、イミダゾピリジルなどが挙げられる。

【0064】

本明細書において「アルコキシ」とは、前記定義の「アルキル」が結合したオキシ基を意味し、好ましくはＣ_１－Ｃ_６アルコキシが挙げられる。アルコキシとして具体的には、たとえば、メトキシ、エトキシ、１－プロポキシ、２－プロポキシ、ｎ－ブトキシ、ｉ－ブトキシ、ｓ－ブトキシ、ｔ－ブトキシ、ペンチルオキシ、３－メチルブトキシなどが挙げられる。

【0065】

本明細書において「アルケニルオキシ」とは、前記定義の「アルケニル」が結合したオキシ基を意味し、好ましくはＣ_２－Ｃ_６アルケニルオキシが挙げられる。アルケニルオキシとして具体的には、たとえば、ビニルオキシ、アリルオキシ、１－プロペニルオキシ、２－プロペニルオキシ、１－ブテニルオキシ、２－ブテニルオキシ（シス、トランスを含む）、３－ブテニルオキシ、ペンテニルオキシ、ヘキセニルオキシなどが挙げられる。

【0066】

本明細書において「シクロアルコキシ」とは、前記定義の「シクロアルキル」が結合したオキシ基を意味し、好ましくはＣ_３－Ｃ_８シクロアルコキシが挙げられる。シクロアルコキシとして具体的には、たとえば、シクロプロポキシ、シクロブトキシ、シクロペンチルオキシなどが挙げられる。

【0067】

本明細書において「アリールオキシ」とは、前記定義の「アリール」が結合したオキシ基を意味し、好ましくはＣ_６－Ｃ_１０アリールオキシが挙げられる。アリールオキシとして具体的には、たとえば、フェノキシ、１－ナフチルオキシ、２－ナフチルオキシなどが挙げられる。

【0068】

本明細書において「アミノ」とは、狭義には－ＮＨ_２を意味し、広義には－ＮＲＲ’を意味し、ここでＲおよびＲ’は独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールから選択されるか、あるいはＲおよびＲ’はそれらが結合している窒素原子と一緒になって環を形成する。アミノとして好ましくは、－ＮＨ_２、モノＣ_１－Ｃ_６アルキルアミノ、ジＣ_１－Ｃ_６アルキルアミノ、４～８員環状アミノなどが挙げられる。

【0069】

本明細書において「モノアルキルアミノ」とは、前記定義の「アミノ」のうち、Ｒが水素であり、かつＲ’が前記定義の「アルキル」である基を意味し、好ましくは、モノＣ_１－Ｃ_６アルキルアミノが挙げられる。モノアルキルアミノとして具体的には、たとえば、メチルアミノ、エチルアミノ、ｎ－プロピルアミノ、ｉ－プロピルアミノ、ｎ－ブチルアミノ、ｓ－ブチルアミノ、ｔ－ブチルアミノなどが挙げられる。

【0070】

本明細書において「ジアルキルアミノ」とは、前記定義の「アミノ」のうち、ＲおよびＲ’が独立して前記定義の「アルキル」である基を意味し、好ましくは、ジＣ_１－Ｃ_６アルキルアミノが挙げられる。ジアルキルアミノとして具体的には、たとえば、ジメチルアミノ、ジエチルアミノなどが挙げられる。

【0071】

本明細書における「アミノアルキル」とは、前記定義の「アルキル」の１つまたは複数の水素が前記定義の「アミノ」で置換された基を意味し、Ｃ_１－Ｃ_６アミノアルキルが好ましい。アミノアルキルとして具体的には、たとえば、１－ピリジルメチル、２－（１－ピペリジル）エチル、３－（１－ピペリジル）プロピル、４－アミノブチルなどが挙げられる。

【0072】

本明細書において「アラルキル（アリールアルキル）」とは、前記定義の「アルキル」の少なくとも一つの水素原子が前記定義の「アリール」で置換された基を意味し、Ｃ_７－Ｃ_１４アラルキルが好ましく、Ｃ_７－Ｃ_１０アラルキルがより好ましい。アラルキルとして具体的には、たとえば、ベンジル、フェネチル、３－フェニルプロピルなどが挙げられる。

【0073】

非天然アミノ酸の具体的な例としては、WO2013/100132やWO2018/143145なども参照することができる。

【0074】

一態様において、本願発明に係る製造方法により得られる１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドを医薬品として使用することができる。ペプチドを医薬品として使用する場合、代謝安定性と膜透過性に優れていることが好ましい。このような性質を本明細書において「ドラッグライクネス」あるいは「ドラッグライク」という。本明細書において「ドラッグライクなアミノ酸」とは、α、β及びγアミノ酸であり、主鎖アミノ基（ＮＨ_２基）の水素原子２つのうちの１つ、又は主鎖メチレン基（－ＣＨ_２－基）の水素原子のうち１つあるいは２つはアルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基などで置換されていてもよい。これら置換基は、さらに「ドラッグライクネスに寄与する置換基」で置換されていてもよい。WO2018/225864に開示される「長側鎖」を有するアミノ酸が、ドラッグライクなアミノ酸として好ましく例示される。また、ドラッグライクなアミノ酸は、Ｌ型アミノ酸、Ｄ型アミノ酸、α、α－二置換アミノ酸、Ｎ置換アミノ酸等であってもよい。ドラッグライクなアミノ酸は、翻訳可能である必要は必ずしも無い。「翻訳アミノ酸」から得られたペプチドの側鎖部分（例えばD－チロシンにてヒット化合物が取得された場合には、そこから化学修飾させたD型のアミノ酸、β－アラニンにてヒット化合物が取得された場合には、そこから化学修飾させたβ－アミノ酸）、あるいはNメチルアミノ酸の化学変換によるN置換部分の構造最適化により化学的に合成し得るアミノ酸を含む。これらのアミノ酸はドラッグライクなペプチドの構成要素として機能するため、翻訳後に実施する化学修飾によって得られるペプチドがドラッグライクとなるような範囲から選択される。以下にて述べるとおり、例えばアミノアルキル基を有するリジンは、アミノ基が翻訳後修飾に関与しない場合にはドラッグライクなアミノ酸には含まれない。しかしながら、リジンのアミノ基を翻訳後修飾の反応性官能基として活用する場合（例えば交差ユニット）にはリジンユニットをドラッグライクなアミノ酸のユニットとして含む。このように、「ドラッグライクなアミノ酸」に該当するかどうかは、翻訳後の修飾によって変換された後の官能基にて判断される。このような置換基になり得る例として、別途上で定義した置換基の中から、例えばエステル基（－ＣＯ－ＯＲ）、チオエステル基（－ＣＯ－ＳＲ）、チオール基（－ＳＨ）、あるいは保護されたチオール基、アミノ基（－ＮＨ_２）、モノ置換アミノ基（－ＮＨ－Ｒ）あるいはジ置換アミノ基（－ＮＲＲ'）、あるいは保護されたアミノ基、置換スルホニルアミノ基（－ＮＨ－ＳＯ_２－Ｒ）、アルキルボラン基（－ＢＲＲ'）、アルコキシボラン基（－Ｂ（ＯＲ）（ＯＲ'））、アジド基（－Ｎ_３）、ケト酸基（－ＣＯ－ＣＯ_２Ｈ）、チオカルボン酸基（－ＣＯ－ＳＨ）、ホスホリルエステル基（－ＣＯ－ＰＯ（Ｒ）（Ｒ'））、アシルヒドロキシアミノ基（－ＮＨ－Ｏ－ＣＯ－Ｒ）などが挙げられる。前記ドラッグライクなアミノ酸の側鎖に含まれる隣接しない１又は２個のメチレン基は、酸素原子、カルボニル基（－ＣＯ－）、又はスルホニル基（－ＳＯ_２－）で置換されていてもよい。

【0075】

本明細書における「ドラッグライクネスに寄与する置換基」としては、例えば、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ等）、ヒドロキシ（－ＯＨ）、アルコキシ基（－ＯＲ）、オキシ（－ＯＲ）、アミド（－ＮＲ－ＣＯＲ'もしくは－ＣＯ－ＮＲＲ'）、スルホニル（－ＳＯ_２－Ｒ）、スルフィニル（－ＳＯＲ）、オキシアミノ（－ＮＲ－ＯＲ'）、アミノオキシ（－Ｏ－ＮＲＲ'）、オキシカルボニル（－ＣＯ－ＯＲ）、チオカルボニル（－ＣＯ－ＳＲ）、チオール（－ＳＨ）、チオ（－ＳＲ）、１級アミノ（－ＮＨ_２）、２級アミノ（－ＮＨＲ）あるいは３級アミノ（－ＮＲＲ'）、スルホニルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ_２－Ｒ）、ボリル（－ＢＲＲ'）、ジオキシボリル（－Ｂ（ＯＲ）（ＯＲ'））、アジド（－Ｎ_３）、カルボキシカルボニル（－ＣＯ－ＣＯ_２Ｈ）、ホスホリルカルボニル（－ＣＯ－ＰＯ（Ｒ）（Ｒ'））、カルボニルオキシアミノ（－ＮＨ－Ｏ－ＣＯ－Ｒ）、ヒドロキシアミノ（－ＮＲ－ＯＲ'）、アミノヒドロキシ（－Ｏ－ＮＲＲ'）等の置換基が例示される。

【0076】

また、本開示における１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドを構成する非天然アミノ酸の特に具体的な例として、MeSer(tBuOH)、BODIPYFL-4-AMF、MeCys(StBu)、MeG、MeStBuOH、Nle、S3F5MePyr、SPh2Cl、MeF、MeHph、MeA3Pyr、SPh2Cl、Pic(2)、MeHph、dA等を例示することができる。これらの非天然アミノ酸は、例えばペプチドの2文字目または3文字目の位置に含まれ得る。

【0077】

ペプチド
本開示においてペプチドとは、２以上のアミノ酸がアミド結合及び／又はエステル結合で結合したものをいう。限定を意図しないが、本開示におけるペプチドには、鎖状ペプチド、及び環状ペプチドが含まれる。また、本開示におけるペプチドには、ペプチド、ペプチドと核酸の複合体（ペプチド－核酸複合体）、ペプチドとリボソームと核酸の複合体等が含まれる。また、本開示における「核酸」にはＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びｔＲＮＡが含まれる。また、本開示における「ペプチド」には、その薬学的に許容される塩が含まれてもよい。

【0078】

本開示におけるペプチドは、一態様において、２～１００個、３～５０個、４～３０個、または５～３０個のアミノ酸が、アミド結合及び／又はエステル結合により連結されている。例えば、一態様において、本願発明に係る１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドを医薬品として使用する場合、高い膜透過性を獲得するために、ペプチドを構成するアミノ酸の数は２０以下が好ましく、１８以下、１６以下、１５以下、又は１４以下がより好ましく、１３以下が特に好ましく、具体的には、９、１０、１１、１２、１３が例示される。また高い代謝安定性を獲得するためには、ペプチドを構成するアミノ酸の数は８以上であることが好ましく、９以上がより好ましく、１０以上が更に好ましく、１１以上が特に好ましい。膜透過性と代謝安定性の両立を考慮すると、ペプチドを構成するアミノ酸の数は５～２０、又は７～２０が好ましく、７～１７、８～１６、９～１６、又は１０～１６がより好ましく、８～１３、１０～１５、１１～１５、１０～１４、１０～１３、又は１１～１４がさらに好ましく、１１～１３が特に好ましい。

【0079】

本開示における環状ペプチドの環状部を構成するアミノ酸の数は限定されないが、例えば、４以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、２０以下、１８以下、１６以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、及び１６が挙げられる。膜透過性と代謝安定性の両立を考慮すると、前記環状部を構成するアミノ酸の数は、５～１５が好ましく、５～１４、７～１４、又は８～１４がより好ましく、８～１３、９～１３、８～１２、８～１１、又は９～１２がさらに好ましく、９～１１が特に好ましい。なお、本明細書においてペプチドの「環状部」とは、２以上のアミノ酸残基が連結され、形成されている環状の部分を意味する。

【0080】

非限定の一態様において、本開示における環状ペプチドは直鎖部を有していてもよい。本明細書において、環状ペプチドの部分構造を指す際に使用される「直鎖部」とは、環状部の主鎖構造に含まれない部分であって、該部分の鎖上に少なくとも一つのアミド結合及び／又はエステル結合を有するものをいう。直鎖部のアミノ酸の数（ユニットの数）は０～８であることが好ましく、０～５がより好ましく、０～３がより好ましい。なお、非限定の一態様において、本明細書における直鎖部には天然アミノ酸や非天然アミノ酸（化学修飾や骨格変換されたアミノ酸を含む）が含まれる場合がある。

【0081】

非限定の一態様において、本開示におけるペプチドに含まれる非天然アミノ酸の数は、２以上が好ましく、４以上、５以上、又は６以上がより好ましく、７以上が更に好ましく、８以上が特に好ましく、また、２０以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１０以下、９以下が好ましく例示される。本開示におけるペプチドに含まれる非天然アミノ酸の数としては、環状部を構成するアミノ酸の数の３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上が例示される。また、本開示におけるペプチドに含まれる非天然アミノ酸の種類は、１以上が好ましく、２以上、３以上、又は４以上がより好ましく、７以上が更に好ましく、８以上が特に好ましく、また、２０以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１０以下、９以下が好ましく例示される。

【0082】

本開示における１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドにおいて非天然アミノ酸を含む部位は限定されないが、一態様として開始アミノ酸の位置に非天然アミノ酸を含むことができ、更に、２文字目および／または３文字目のアミノ酸の位置に非天然アミノ酸を含むことができる。

【0083】

開始アミノ酸の部位にｆＭｅｔ以外のアミノ酸を導入した場合、開始２文字目や３文字目のアミノ酸から翻訳が開始されるInitiation read through（iRT）と定義する現象が観察されることが知られている（以下、このようにして生産されたペプチドを、Initiation read throughペプチド（iRTペプチド）と定義する）。本開示における改変されたＬ３１タンパク質、またはこれを含むリボソームを用いることにより、開始アミノ酸の部位に非天然アミノ酸が導入されているペプチドを合成する場合であってもInitiation read throughの現象を防ぐことができる。また、iRTペプチドは環化されない。そのため、環状ペプチドを含むライブラリを作成する場合において、それをコードするmRNAの大部分がiRTペプチドをコードするものになると、ディスプレイ可能な分子数が限られ、環状ペプチドのディスプレイ数が減少し、ライブラリの多様性が減少してしまう。本開示における改変されたＬ３１タンパク質、またはこれを含むリボソームを用いることにより、このようなライブラリの品質低下を防ぐことができる。

【0084】

ペプチドをコードするｍＲＮＡ
本開示においては、１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡを翻訳してペプチドを製造する。ｍＲＮＡとは、タンパク質に翻訳され得る遺伝情報を持ったＲＮＡのことである。遺伝情報はコドンとしてｍＲＮＡ上にコードされており、それらが全２０種類のアミノ酸にそれぞれ対応している。タンパク質の翻訳は開始コドンから始まり、終止コドンで終了する。真核生物における開始コドンは原則としてＡＵＧであるが、原核生物（真正細菌および古細菌）ではＡＵＧの他にＧＵＧやＵＵＧなども開始コドンとして使用されることがある。ＡＵＧはメチオニン（Ｍｅｔ）をコードするコドンであり、真核生物および古細菌ではそのままメチオニンから翻訳が開始される。一方、真正細菌では、開始コドンのＡＵＧのみＮ－ホルミルメチオニン（ｆＭｅｔ）に対応しているため、ホルミルメチオニンから翻訳が開始される。終止コドンには、ＵＡＡ（オーカー）・ＵＡＧ（アンバー）・ＵＧＡ（オパール）の３種がある。終止コドンが翻訳終結因子（release factor;RF）と呼ばれるタンパク質によって認識されると、それまでに合成されたペプチド鎖がｔＲＮＡから解離し、翻訳工程は終了する。一態様において、本開示における１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡとして、少なくとも開始アミノ酸の位置に非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするコドンを含むものを例示することができる。
本開示における１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡにおいて非天然アミノ酸を含む部位は限定されないが、一態様として開始アミノ酸の位置に非天然アミノ酸をコードするコドンを含むことができる。

【0085】

ペプチドの翻訳
上述の通り、本開示においては、１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドを、当該ペプチドをコードするｍＲＮＡから翻訳して製造することができる。本明細書において「翻訳」とは、ペプチドをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）から、該ペプチドを翻訳して合成することを意味する。翻訳とは、リボソームの作用によってｍＲＮＡを鋳型にアミド結合及び／又はエステル結合反応を繰り返すことによって直鎖ペプチドを得る工程である。

【0086】

一局面において、本開示は、非天然アミノ酸を少なくとも１種、２種以上、３種以上、４種以上、又は５種以上含むペプチドまたはペプチドを含むライブラリの製造方法を提供する。限定はされないが、このような製造方法は、以下(i)および(ii)を含んでよい：
(i) 非天然アミノ酸が結合したtRNAを少なくとも１種、２種以上、３種以上、４種以上、又は５種以上用意する工程；
(ii) 前記tRNAのアンチコドンに対応するコドンを少なくとも１つ含む核酸を翻訳系で翻訳し、前記ペプチドを得る工程。
ここで該核酸は前記ｔＲＮＡのアンチコドンに対応するコドンを少なくとも１つ含んでよい。また非限定の一態様において、本開示における１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡは、少なくとも開始アミノ酸の位置に非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするコドンを含むものであってよい。

【0087】

天然のアミノ酸の翻訳では、６４種類のコドンそれぞれに、２０種類のタンパク質性アミノ酸及び翻訳の終止が割り当てられている。翻訳系から特定のアミノ酸を除去すると、当該アミノ酸に対応するコドンが空きコドンになる。そこで、その空きコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAに所望の非天然アミノ酸を連結し、これを加えて翻訳を行えば、当該アミノ酸がそのコドンでコードされることになり、除去したアミノ酸の代わりに所望の非天然アミノ酸が導入されたペプチドが翻訳される。

【0088】

本開示における一態様において、ペプチドの翻訳には、イニシエーションサプレッション（InitiationSuppression：iSP）法を利用することが好ましい。通常の翻訳では、一般的に翻訳開始アミノ酸としてメチオニンがＮ末端アミノ酸として翻訳される。翻訳の開始には専用の「開始ｔＲＮＡ」があり、開始ｔＲＮＡがメチオニン（原核生物ではホルミルメチオニン）と結合しリボソームに運ばれることによって、翻訳が開始され、Ｎ末端のアミノ酸がメチオニン（原核生物ではホルミルメチオニン）となる。これに対し、翻訳系内からメチオニンがアミノアシル化された開始ｔＲＮＡを除去し（または生成されないにし）、予め調製した所望のアミノ酸がアミノアシル化された開始ｔＲＮＡを代わりに翻訳系内に加えることによって、Ｎ末端に所望のアミノ酸を持つペプチドを翻訳することをイニシエーションサプレッション法という。非天然アミノ酸の許容度は、アミノ酸の伸長時よりＮ末端への導入において高く、天然アミノ酸と大きく構造の異なる非天然アミノ酸をＮ末端アミノ酸として利用できることが知られている（非特許文献：J Am Chem Soc. 2009 Apr 15;131(14):5040-1.Translation initiationwith initiator tRNA charged with exotic peptides.Goto Y, Suga H.）。本開示における一態様において、翻訳系に含まれる開始tRNAには非天然アミノ酸がアシル化されていてもよい。

【0089】

翻訳系
本開示において「翻訳系」とは、ペプチドを翻訳するための方法およびペプチドを翻訳するための組成物の両方を含む概念として定義される。本開示において「翻訳系」は、本開示における改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを含むものであれば限定されない。本開示における「翻訳系」は、その他、翻訳に関与する蛋白因子群、ｔＲＮＡ、アミノ酸、ＡＴＰなどのエネルギー源、その再生系を組み合わせたもので、ｍＲＮＡを蛋白質に翻訳することが出来るものを含むことが好ましい。また、翻訳が進行している間の系も、本明細書における「翻訳系」に含まれてよい。本明細書における翻訳系は、ペプチドを翻訳する際の鋳型となる核酸を含んでいてよく、これら以外にも、開始因子、伸長因子、解離因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素などを含むことができる。これらの因子は、種々の細胞の抽出液から精製することによって得ることができる。因子を精製するための細胞は、例えば原核細胞、または真核細胞を挙げることができる。原核細胞としては、大腸菌細胞、高度好熱菌細胞、または枯草菌細胞を挙げることができる。真核細胞としては、酵母細胞、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、植物細胞、昆虫細胞、または動物細胞を材料にしたものが知られている。またｔＲＮＡやアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ARS）は天然に存在するものに加え、人工ｔＲＮＡや非天然アミノ酸を認識する人工アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を用いることもできる。人工ｔＲＮＡや人工アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を用いることにより部位特異的に非天然アミノ酸を導入したペプチドを合成することができる。なお、必要に応じて、翻訳系にT7 RNA polymeraseなどのＲＮＡポリメラーゼを加えることで、鋳型ＤＮＡから転写させることもできる。

【0090】

本明細書において、「翻訳系がある物質を含む」とは、翻訳の開始時に該物質を含んでいなくても、翻訳の過程において系内で該物質が合成され含まれることになる態様も含む。例えば、翻訳の過程で、アミノ酸がアシル化されたｔＲＮＡが合成される場合には、翻訳系が該アミノアシルｔＲＮＡを含むと理解される。

【0091】

翻訳系の主な種類としては、生細胞を利用した翻訳系や、細胞抽出液を利用した翻訳系（無細胞翻訳系）がある。生細胞を利用した翻訳系としては、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞や哺乳動物細胞などの生細胞に、所望のアミノアシルtRNAおよびmRNAをマイクロインジェクション法やリポフェクション法により導入してペプチド翻訳を行う系が知られている（Nowak et al., Science (1995) 268: 439-442）。無細胞翻訳系の例としては、大腸菌（Chen et al., Methods Enzymol (1983) 101: 674-690）、酵母（Gasior et al., J Biol Chem (1979) 254: 3965-3969）、小麦胚芽（Erickson et al., Methods Enzymol (1983) 96: 38-50）、ウサギ網状赤血球（Jackson et al., Methods Enzymol (1983) 96: 50-74）、HeLa細胞（Barton et al., Methods Enzymol (1996)275: 35-57）、あるいは昆虫細胞（Swerdel et al., Comp BiochemPhysiol B (1989) 93: 803-806）などからの抽出液を利用した翻訳系が知られている。このような翻訳系は、当業者に公知の方法またはそれに準ずる方法によって適宜調製することができる。無細胞翻訳系には、ペプチド翻訳に必要な因子をそれぞれ単離・精製して、それらを再構成して構築された翻訳系（再構成型の無細胞翻訳系）も含まれる（Shimizu et al., Nat Biotech (2001) 19: 751-755）。再構成型の無細胞翻訳系には、通常、リボソーム、アミノ酸、tRNA、アミノアシルtRNA合成酵素（aaRS）、翻訳開始因子（例えば、IF1、IF2、IF3）、翻訳伸長因子（例えばEF-Tu、EF-Ts、EF-G）、翻訳終結因子（例えばRF1、RF2、RF3）、リボソーム再生因子（ribosome recycling factor; RRF）、エネルギー源としてのNTP類、エネルギー再生系、および翻訳に必要なその他の因子などが含まれ得る。DNAからの転写反応を併せて行う場合は、さらにRNAポリメラーゼなどが含まれ得る。無細胞翻訳系に含まれる種々の因子は、当業者に周知の方法によって単離・精製することが可能であり、それらを用いて再構成型の無細胞翻訳系を適宜構築することができる。あるいは、ジーンフロンティア社のPUREfrex（登録商標）や、New England BioLabs社のPURExpress（登録商標）などの市販されている再構成型の無細胞翻訳系を利用することもできる。再構成型の無細胞翻訳系の場合、翻訳系の構成成分のうち必要な成分だけを再構成して、所望の翻訳系を構築することができる。

【0092】

PURESYSTEM（登録商標）(BioComber,Japan)は大腸菌における翻訳に必要な蛋白因子類、エネルギー再生系酵素、リボソームそれぞれを抽出、精製し、tRNA、アミノ酸、ATP、GTPなどと混合した再構成無細胞翻訳系である。不純物の含有量が少ないだけでなく、再構成系であるため排除したい蛋白因子、アミノ酸を含まない系を容易に作製することができる((i)Nat Biotechnol. 2001;19:751-5. Cell-free translationreconstituted with purified components. Shimizu Y, Inoue A, Tomari Y, Suzuki T,Yokogawa T, Nishikawa K, Ueda T.(ii)Methods Mol Biol. 2010;607:11-21.PUREtechnology.Shimizu Y, Ueda T.)。

【0093】

例えば、非天然アミノ酸を導入するコドンとして終止コドンを利用する方法が多く報告されているが、前述のPURESYSTEMを用いることで天然アミノ酸、ARSを除いた合成系を構築できる。これにより、除外する天然アミノ酸をコードするコドンに、非天然アミノ酸を対応付けることが出来る(J Am Chem Soc. 2005;127:11727-35.Ribosomal synthesis of unnaturalpeptides. Josephson K, Hartman MC, Szostak JW.)。さらにコドンの縮重を解くことにより天然アミノ酸を除外することなく非天然アミノ酸を加えることが出来る（Kwon I,et al. Breaking the degeneracy of the genetic code. J Am ChemSoc. 2003, 125, 7512-3.）。N-メチルアミノ酸を含むペプチドがPURESYSTEMなどの無細胞翻訳系の活用によりリボソームにて合成できる。

【0094】

より具体的には、翻訳合成は、例えば、大腸菌における翻訳に必要な蛋白因子類（メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ、EF-G、RF1、RF2、RF3、RRF、IF1、IF2、IF3、EF-Tu、EF-Ts、ARS（AlaRS、ArgRS、AsnRS、AspRS、CysRS、GlnRS、GluRS、GlyRS、HisRS、IleRS、LeuRS、LysRS、MetRS、PheRS、ProRS、SerRS、ThrRS、TrpRS、TyrRS、ValRSから必要なものを選ぶ））、リボソーム、アミノ酸、クレアチンキナーゼ、ミオキナーゼ、無機ピロフォスファターゼ、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、E. coli 由来tRNA、クレアチンリン酸、グルタミン酸カリウム、HEPES-KOH pH7.6、酢酸マグネシウム、スペルミジン、ジチオスレイトール、GTP、ATP、CTP、UTPなどを適宜取捨選択して混合したPURESYSTEM等の公知の無細胞翻訳系にmRNAを加えることによって行うことが出来る。また、T7 RNA polymeraseを加えておけば、T7プロモーターを含む鋳型DNAからの転写、翻訳を共役して行なうこともできる。また、所望のアミノアシルtRNA群やアミノアシルtRNA合成酵素（ARS）が許容する非天然アミノ酸群（例えばF-Tyr）を系に添加することによって非天然アミノ酸を含むペプチド化合物を翻訳合成することが出来る（Kawakami T, et al. Ribosomal synthesis of polypeptoids andpeptoid-peptide hybrids. J Am Chem Soc. 2008, 130, 16861-3., Kawakami T, et al.Diverse backbone-cyclized peptides via codon reprogramming. Nat Chem Biol.2009, 5, 888-90.）。さらに、天然のARSに代えて又はこれらに加えて、ARSの改変体を系に含めるとともに、非天然アミノ酸群を系に含めることによっても、非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡを翻訳することが出来る。あるいは、リボソームやEF-Tuなどの変異体を利用することによって、非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳、およびそれに伴う非天然アミノ酸の導入の効率を高めることも出来る(Dedkova LM, et al. Construction of modified ribosomes forincorporation of D-amino acids into proteins. Biochemistry. 2006, 45,15541-51., Doi Y, et al. Elongation factor Tu mutants expand amino acidtolerance of protein biosynthesis system. J Am Chem Soc. 2007, 129, 14458-62.,Park HS, et al. Expanding the genetic code of Escherichia coli withphosphoserine. Science. 2011, 333, 1151-4.)。

【0095】

また本開示における翻訳系は、本開示における改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを、当該翻訳系に含まれる全リボソームに対し、分子数の比率で、少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上（例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上）の割合で含むことが好ましい。「全リボソーム」としては、翻訳系に含まれるリボソームである限り特に限定されないが、本開示における改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームとそれ以外のリボソーム（例えば、大腸菌野生型Ｌ３１を含むリボソームおよびそれと機能的に同等なリボソーム）との合計を例示することができる。
改変されたＬ３１タンパク質の翻訳系に含まれる全リボソームに対する割合は、例えば質量分析器による改変されたＬ３１タンパク質の強度と全リボソームの強度の比率に基づいて算出することができる。

【0096】

また本開示における翻訳系は、マグネシウムイオンを含むことが好ましい。リボソームのスモールサブユニットとラージサブユニットの会合状態の維持にはマグネシウムイオンが必要であることが知られている。Ｌ３１タンパク質はリボソームのラージサブユニットとスモールサブユニットの相互作用を形成するタンパク質の一つである。Ｌ３１タンパク質を欠損しているリボソームや、ｓｈｏｒｔＬ３１を含むリボソームは、会合状態を保つために必要なマグネシウムイオン濃度が、ｉｎｔａｃｔなＬ３１を含むリボソームより高いことが明らかにされている。したがって、改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームが用いられる本開示における製造方法においては、マグネシウムイオン濃度を、ｉｎｔａｃｔなＬ３１を含むリボソームが用いられる翻訳系におけるマグネシウムイオン濃度よりも高くすることが好ましい。このような翻訳系を調製するために、本発明の方法においては、マグネシウムイオンを本発明における翻訳系に加える工程をさらに含むことができる。あるいは、本発明においては、マグネシウムイオンがあらかじめ加えられた翻訳系を使用することもできる。加えられるマグネシウムの量は特に限定されないが、例えば、１ｍＭ以上、２ｍＭ以上、３ｍＭ以上、４ｍＭ以上、５ｍＭ以上、６ｍＭ以上または７ｍＭ以上の値から選択される下限と、９ｍＭ以下、８ｍＭ以下、７ｍＭ以下、６ｍＭ以下、５ｍＭ以下、４ｍＭ以下、３ｍＭ以下から選択される上限との任意の組み合わせによって特定可能な範囲を例示することができる。

【0097】

ｔＲＮＡ
非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡを翻訳することにより非天然アミノ酸をペプチドに導入にするにあっては、直交性を有し効率よくリボソームに取り込まれるｔＲＮＡ（(i)Biochemistry. 2003;42:9598-608.Adaptation of an orthogonalarchaeal leucyl-tRNA and synthetase pair for four-base, amber, and opalsuppression. Anderson JC, Schultz PG., (ii)Chem Biol. 2003;10:1077-84.Using asolid-phase ribozyme aminoacylation system to reprogram the geneticcode.Murakami H, Kourouklis D, Suga H.）のアミノアシル化が必要である。tRNAをアミノアシル化する方法として以下の５つの方法を用いることができる。

【0098】

細胞内ではtRNAのアミノアシル化のための酵素として、アミノ酸別にアミノアシルtRNA合成酵素（ARS）が用意されている。そのため第一の方法としては、ある種のARSがN-Me Hisなど非天然アミノ酸を許容することを利用する方法や、非天然アミノ酸を許容する変異アミノアシルtRNA合成酵素を用意し、これを利用する方法が挙げられる（(i)Proc NatlAcad Sci U S A. 2002;99:9715-20. An engineered Escherichia coli tyrosyl-tRNAsynthetase for site-specific incorporation of an unnatural amino acid intoproteins in eukaryotic translationand its application in a wheat germ cell-freesystem.Kiga D, Sakamoto K, Kodama K, Kigawa T, Matsuda T, Yabuki T, Shirouzu M,Harada Y, Nakayama H, Takio K, Hasegawa Y, Endo Y, Hirao I, Yokoyama S.(ii)Science.2003;301:964-7.An expanded eukaryotic genetic code.Chin JW, Cropp TA, AndersonJC, Mukherji M, Zhang Z, Schultz PG. Chin,JW.(iii) Proc Natl Acad Sci U S A.2006;103:4356-61.Enzymatic aminoacylation of tRNA with unnatural aminoacids.Hartman MC, Josephson K, Szostak JW.）。第二に、試験管内でtRNAをアミノアシル化しその後アミノ酸を化学修飾する方法も用いることができる（J Am Chem Soc. 2008;130:6131-6.Ribosomal synthesis of N-methylpeptides.Subtelny AO, Hartman MC, Szostak JW.）。第三に、tRNAの3'末端のCCA配列からCAを除いたものと別途調製したアミノアシル化したpdCpAとをRNAリガーゼで結合させることでアミノアシルtRNAを得ることが出来る(Biochemistry.1984;23:1468-73.T4 RNA ligase mediated preparation of novel "chemicallymisacylated" tRNAPheS.Heckler TG, Chang LH, Zama Y, Naka T, Chorghade MS,Hecht SM.)。種々の非天然アミノ酸の活性エステルをtRNAに担持させるリボザイムであるフレキシザイムによるアミノアシル化もある（J Am Chem Soc. 2002;124:6834-5.Aminoacyl-tRNA synthesis by aresin-immobilized ribozyme.Murakami H, Bonzagni NJ, Suga H.)。第四に、tRNAとアミノ酸活性エステルとをカチオン性ミセル中で超音波混合する方法も用いることができる(Chem Commun (Camb). 2005;(34):4321-3.Simple and quick chemicalaminoacylation of tRNA in cationic micellar solution under ultrasonicagitation. Hashimoto N, Ninomiya K, Endo T, Sisido M.)。第五として、tRNAの3'末端付近に相補的なPNAにアミノ酸活性エステルを結合したものをtRNAに加えることによってもアミノアシル化が可能である（J Am Chem Soc.2004;126:15984-9.In situ chemical aminoacylation with amino acid thioesterslinked to a peptide nucleic acid.Ninomiya K, Minohata T, NishimuraM, Sisido M.）。

【0099】

より具体的には、以下のような方法を用いてアミノアシルtRNAを作製することができる。所望のtRNA配列をコードし、上流にＴ７、Ｔ３もしくはＳＰ６プロモーターを配置した鋳型ＤＮＡを用意し、T7 RNA polymeraseやT3, SP6 RNA polymeraseなどプロモーターに適応したＲＮＡポリメラーゼを利用して転写によってＲＮＡを合成することが出来る。細胞からｔＲＮＡを抽出精製し、ｔＲＮＡの配列の相補配列のプローブを用いて目的の生成ｔＲＮＡを抽出することも出来る。この際目的のｔＲＮＡの発現ベクターで形質転換した細胞をソースにすることも出来る。化学合成によって目的の配列のＲＮＡを合成することも出来る。例えば、このようにして得られた３'末端のＣＣＡ配列からＣＡを除いたｔＲＮＡと別途調製したアミノアシル化したｐｄＣｐＡまたはｐＣｐＡとをＲＮＡリガーゼで結合させることでアミノアシルｔＲＮＡを得ることが出来る（ｐｄＣｐＡ法、ｐＣｐＡ法）。当該ｔＲＮＡは、ペプチドの製造において有用である。あるいは、全長ｔＲＮＡを用意し、種々の非天然アミノ酸の活性エステルをｔＲＮＡに担持させるリボザイムであるフレキシザイムによるアミノアシル化も可能である。また、限定を意図しないが、天然のＡＲＳ又はその改変体を用いて、アミノアシルｔＲＮＡを作製することもできる。天然ＡＲＳ又はその改変体を用いると、翻訳系内で一旦消費されたアミノアシルｔＲＮＡが、天然ＡＲＳやその改変体によって再生成され得るため、予め作製したアミノアシルｔＲＮＡを翻訳系に大量に存在させる必要がない。このようなＡＲＳ改変体は、WO2016/148044に記載される。これらのアミノアシルtRNAの作製方法を適宜組み合わせることもできる。

【0100】

ペプチドの環化
非限定的な一態様において、本開示におけるペプチドまたはペプチドを含むライブラリの製造方法においては、翻訳されたペプチドを環化する工程をさらに含むことができる。環化の態様として、例えば、アミド結合、炭素－炭素結合、チオエーテル結合、ジスルフィド結合、エステル結合、チオエステル結合、ラクタム結合、トリアゾール構造を介した結合、フルオロフォア構造を介した結合等を利用した環化が挙げられる。中でも代謝安定性が高いことから、アミド結合が好ましい。ペプチドの翻訳工程と環化反応の工程は、分離していても、連続して進行してもよい。環化は、例えばWO2013/100132、WO2008/117833、WO2012/074129等に記載された当業者に公知の方法により行うことができる。

【0101】

環形成における結合の態様は、限定されないが、ペプチドのN末端とC末端の結合、ペプチドのN末端と他のアミノ酸残基の側鎖の結合、ペプチドのC末端と他のアミノ酸残基の側鎖の結合、又はアミノ酸残基の側鎖同士の結合のいずれであってもよく、これらの二以上を組み合わせて使用してもよい。

【0102】

非限定の一態様において、本発明は、例えば、以下の工程を含むペプチドまたはペプチドを含むライブラリの製造方法に関する：
（１）１種または複数種の非天然アミノ酸を含む非環状のペプチドを、本明細書に記載の方法によって製造する工程であって、該非環状のペプチドは、C末端側に側鎖の１つに反応点を有するアミノ酸残基、及び、N末端側にもう1つの反応点を有するアミノ酸残基を含む、工程；及び
（２）N末端側のアミノ酸残基の反応点と、C末端側の側鎖に反応点有するアミノ酸残基の当該反応点とを結合させ、アミド結合、炭素-炭素結合又はチオエーテル結合を形成させる工程。
なお、これら（１）と（２）の工程は、分離していても、連続して進行してもよい。

【0103】

具体的には、アミド結合によるペプチドの環化方法の非限定的な一態様として、Ｎ末端のメチオニンのアミノ基と下流（C末端側）に配置したリジンのアミノ基をジスクシンイミジル・グルタレート（ＤＳＧ）でクロスリンクさせることによる環化方法やＮ末端の翻訳開始アミノ酸としてクロロアセチル基を有するアミノ酸誘導体を導入し、下流にＣｙｓを配置することによって分子内環化反応によりチオエーテルを形成させることによる環化方法、Ｎ末端にシステインまたはシステイン類縁体を持ち、Ｃ末端側のアミノ酸の側鎖に活性エステルを持つペプチドを翻訳してネイティブケミカルライゲーションを用いて環化させる方法がある。

【0104】

非限定の一態様において、本開示におけるペプチドのC末端部位はカルボン酸のままではなく、化学修飾されていてよい。例えば、カルボン酸部位をピペリジンなどと反応させ、ピペリジンアミドなどに変換してよい。

【0105】

ライブラリ
また本発明は、本明細書に記載されたペプチドの製造方法により製造されたペプチドおよび当該ペプチドを含むライブラリに関する。また本発明は、本明細書に記載されたペプチドの製造方法によってペプチドを製造する工程を含む、当該ペプチドを含むライブラリに関する。本開示におけるライブラリには、本開示におけるペプチドを含むライブラリ、及び本開示におけるペプチドをコードする核酸を含むライブラリが含まれる。本開示におけるライブラリには、本開示におけるペプチドのライブラリ、ペプチド－核酸複合体のライブラリが含まれる。ライブラリとしては、ディスプレイライブラリが好ましい。ディスプレイライブラリとしては、ディスプレイを利用したライブラリが例示され、中でもｍＲＮＡディスプレイライブラリ、ＤＮＡディスプレイライブラリ、リボソームディスプレイライブラリが好ましく、ｍＲＮＡディスプレイライブラリがより好ましい。

【0106】

ディスプレイライブラリ
ディスプレイライブラリは表現型であるペプチドとその遺伝子型であるペプチドをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡが対応付けられているライブラリである。このライブラリを使用して、標的分子に特異的に結合できるペプチドを同定することができる。例えば、所望の固定した標的にライブラリを接触させ、標的に結合しない分子を洗い流すことで、標的に結合するペプチドの濃縮が可能である(パニング法)。このような過程を経て選択されたペプチドに対応付けられている遺伝子情報を解析することで標的に結合したペプチドの配列を明らかにすることができる。例えば、アミノアシルｔＲＮＡのアナログである抗生物質ピューロマイシンがリボソームによるｍＲＮＡ翻訳伸長中の蛋白質に非特異的に連結されることを利用する方法がmRNAディスプレイ(Proc Natl Acad Sci USA.1997;94:12297-302. RNA-peptide fusions for the in vitro selection of peptidesand proteins. Roberts RW, Szostak JW.)ないしはin vitrovirus(FEBS Lett. 1997;414:405-8. In vitro virus: bonding of mRNA bearingpuromycin at the 3'-terminal end to the C-terminal end of its encoded proteinon the ribosome in vitro. Nemoto N, Miyamoto-Sato E, Husimi Y, Yanagawa H.)として報告されている。

【0107】

Ｔ７プロモーターなどのプロモーターを含むＤＮＡライブラリから転写にて得たｍＲＮＡのライブラリの３'端にピューロマイシンなどのスペーサーを結合しておき、無細胞翻訳系でｍＲＮＡをタンパク質に翻訳させるとピューロマイシンがリボソームによってアミノ酸と間違ってタンパク質に取り込まれ、ｍＲＮＡとこれにコードされる蛋白質が連結され、ｍＲＮＡとその産物が対応付けられたライブラリになる。この過程では大腸菌などの形質転換を含まないため高い効率が実現され、大規模なディスプレイライブラリを構築することが出来る。パニングで濃縮、選択された分子についている遺伝子情報を含むタグであるｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ増幅し、塩基配列を解析することで結合したペプチドの配列を明らかにすることが出来る。

【0108】

無細胞翻訳系を利用したディスプレイライブラリには、mRNAディスプレイの他に、ペプチドとピューロマイシンの複合体が結合しているペプチドをコードするｃＤＮＡからなるライブラリであるcDNAディスプレイ(Nucleic Acids Res.2009;37(16):e108.cDNA display: a novel screening method for functionaldisulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilizationofmRNA-protein fusions.Yamaguchi J, Naimuddin M, Biyani M, Sasaki T, Machida M,Kubo T, Funatsu T, Husimi Y, Nemoto N.)、ｍＲＮＡ翻訳中にリボソームと翻訳産物が比較的安定な複合体であることを利用したリボソームディスプレイ(Proc Natl Acad Sci U S A. 1994;91:9022-6. An in vitro polysomedisplay system for identifying ligands from very large peptide libraries.Mattheakis LC, Bhatt RR, Dower WJ.)、bacteriophageendonuclease P2AがDNAと共有結合を形成することを利用したcovalent display(Nucleic AcidsRes. 2005;33:e10.Covalent antibodydisplay--an in vitro antibody-DNA library selection system.Reiersen H, LobersliI, Loset GA, Hvattum E, Simonsen B, Stacy JE, McGregor D, Fitzgerald K,Welschof M, Brekke OH, Marvik OJ.)、微生物のプラスミドの複製開始蛋白RepAが複製開始点oriに結合することを利用したCIS display(Proc Natl AcadSci U S A. 2004;101:2806-10. CIS display: In vitro selection of peptides fromlibrariesof protein-DNA complexes. Odegrip R, Coomber D, Eldridge B, HedererR,Kuhlman PA, Ullman C, FitzGerald K, McGregor D.)が知られている。また、DNAライブラリを構成するDNAの1分子毎に転写翻訳系をwater-in-oilエマルジョンやリポソームに封入し、翻訳反応を行うin vitrocompartmentalization(Nat Biotechnol. 1998;16:652-6. Man-made cell-likecompartments for molecular evolution. Tawfik DS, Griffiths AD.)も知られている。適宜、公知の方法を用いて上記方法を使用することができる。

【0109】

核酸ライブラリ
本開示における「核酸」には、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）あるいは、人工塩基を有するヌクレオチド誘導体を含むこともできる。また、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むこともできる。本開示において核酸は、目的とする遺伝情報が保持される限り、これらの核酸のいずれか、あるいは混成とすることもできる。すなわち、ＤＮＡ－ＲＮＡのハイブリッドヌクレオチドやＤＮＡとＲＮＡのような異なる核酸が一本鎖に連結されたキメラ核酸も本開示における核酸に含まれる。

【0110】

ペプチドライブラリに含まれるペプチドの鋳型となる核酸のライブラリとしては、mRNAライブラリ、DNAライブラリ等が例示される。ペプチド配列上でアミノ酸残基を固定しない箇所は塩基を混ぜて合成することによって、核酸ライブラリを得ることができる。例えば、DNAライブラリとしては、A, T, G, C、RNAライブラリとしては、A, U, G, Cのそれぞれ4塩基の混合(N)の３の倍数個の繰り返し、もしくはコドンの一文字目二文字目はN、三文字目はW, M, K, Sなどの2塩基の混合として合成する、さらに導入するアミノ酸の種類を16以下に抑えるのであれば、三文字目を1種類の塩基にする方法もある。また、コドンの3文字に相当するコドンユニットを用意し、これを任意の割合で混合して合成に用いることによってアミノ酸残基の出現頻度を自由に調整できる。

【0111】

無細胞翻訳系を用いてこれら核酸ライブラリを翻訳することができる。無細胞翻訳系を使用する場合、目的の核酸の下流にスペーサーをコードする配列を含むことが好ましい。スペーサー配列としては、グリシンやセリンを含む配列が挙げられるがこれに限定されない。またピューロマイシン、その誘導体などリボソームによる翻訳時にペプチドに取り込まれる化合物と核酸ライブラリの間には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ヘキサエチレングリコール（ｓｐｃ１８）のポリマー（例えば５つのポリマー）などで形成されるリンカーを含むことが好ましい。

【0112】

本開示におけるライブラリの製造は、本開示におけるペプチドの製造方法に準じて行うことができ、適宜公知の方法と組み合わせることができる。一態様において、上述した本開示における無細胞翻訳系を使用して本開示におけるペプチドのライブラリを製造できる。すなわち、本開示におけるライブラリの製造方法には、本開示における無細胞翻訳系を使用してペプチドを合成する工程を含んでよい。一態様において、本開示における無細胞翻訳系において記述した、例示、好ましい範囲、態様が、本開示におけるライブラリの製造方法においてもそのまま適用できる。

【0113】

スクリーニング方法
非限定の一態様において、本開示におけるライブラリを使用したスクリーニングにより、標的分子に特異的に結合できるペプチドを選択することができる。

【0114】

非限定の一態様において、本開示におけるスクリーニング方法は、本開示における１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドのライブラリと標的分子を接触させ、標的分子に結合しないペプチドを洗い流すことで標的分子に結合するペプチドを濃縮することができる（パニング）。一態様においては、このようにして選択されたペプチドに含まれる塩基配列情報を含むタグであるｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ増幅し、塩基配列を解析することで、結合したペプチドのアミノ酸配列を明らかにすることができる。なお、一態様において、上記で増幅されたｃＤＮＡを転写することによって、ｍＲＮＡライブラリを得てもよく、これらを鋳型として再度ペプチドのライブラリを製造してもよい。このライブラリは標的分子に結合できるペプチドが濃縮されているため、このライブラリを用いて再度パニングを行うことで、標的分子に特異的に結合できるペプチドを、より濃縮することができる。この工程を複数回繰り返すことにより、目的のペプチドを、更に濃縮することができる。一態様において、このようにして濃縮されたペプチドに含まれる塩基配列情報を基にアミノ酸配列を同定し、標的分子に特異的に結合できるペプチドを製造することができる。一態様において、本開示におけるスクリーニング方法は、in vitroで行うことができる。

【0115】

非限定の一態様において、本開示におけるスクリーニング方法により得られたペプチドを公知の方法により化学修飾等することで、ペプチドを最適化してもよい。本明細書において「最適化」とは、翻訳されたペプチド中のそれぞれのアミノ酸の構造を変換させることにより、よりドラッグライクなペプチドとなるように化学修飾する、より薬効標的に強い活性を有するペプチドとなるように化学修飾する、及び/又は、より毒性が回避されたペプチドとなるように化学修飾することを意味する。

【0116】

非限定の一態様において、本開示におけるスクリーニング方法は、以下の工程を含む：
（ａ）本開示におけるライブラリに含まれるペプチドと標的分子を接触させる工程；
（ｂ）前記標的分子に結合できるペプチドを選択する工程。
本開示におけるスクリーニング方法は、上記工程（ａ）の前に、本明細書に記載の方法によってライブラリを取得する工程を含むことができる。当該ライブラリは、本開示におけるペプチドの製造方法に倣って取得することができる。

【0117】

一態様において、本開示におけるスクリーニング方法は、前記の（ａ）及び（ｂ）の工程を２回以上繰り返すことで、標的分子に特異的に結合できるペプチドを濃縮してもよい。

【0118】

標的分子
本開示におけるスクリーニング方法に用いられる標的分子は特に限定されず、タンパク質、ペプチド、核酸、糖、脂質などが例示されるが、中でもタンパク質を標的とすることが好ましい。また生体内における標的分子の存在場所も特に限定されない。一態様において、細胞内のタンパク質を標的とすることもできる。

【0119】

非限定の一態様において、本開示におけるスクリーニング方法に用いられる標的分子は、担体に固定して使用される。担体としては、標的分子を固定することができれば特に限定されないが、ビーズ又は樹脂が例示される。標的分子は公知の方法により担体に固定することができる。

【0120】

上述のとおり、本開示におけるライブラリ及びスクリーニング方法の標的分子は、特に限定されないが、GTPase KRas (KRAS)、Dual specificitymitogen-activated protein kinase kinase 1 (MEK1)、Mitogen-sctivatedprotein kinase 3 (ERK1)、インターロイキン６受容体 (IL-6R) が例示される。実施例に記載されるように、本開示におけるライブラリは、様々な標的分子に対し特異的に結合できるペプチドを含むため、一態様において、これまで創薬が困難とされてきたtough targetへの創薬を可能にし得る。

【0121】

非限定の一態様において、本開示におけるペプチドの製造方法は、以下の工程を含んでいてよい：
（ｉ）本開示におけるライブラリに含まれるペプチドと標的分子を接触させる工程；
（ｉｉ）該標的分子に結合できるペプチドを選択する工程；及び
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で選択されたペプチドのアミノ酸配列に基づき、ペプチドを製造する工程。
上記方法は、本明細書に記載の方法によってライブラリを取得する工程を含むことができる。

【0122】

非限定の一態様において、本開示におけるライブラリの製造方法、ペプチドの製造方法、及び／又はスクリーニング方法はin vitroで行ってよい。

【0123】

一局面において、本開示におけるペプチドは、環化されたものであってもよい。

【0124】

改変されたＬ３１タンパク質をコードする核酸等
また本発明は、本開示の改変されたＬ３１タンパク質、当該タンパク質を含むリボソーム、当該タンパク質をコードする単離された核酸に関する。また本発明は、当該核酸を含むベクターまたは細胞に関する。
本開示の改変されたL31タンパク質としては、例えば、以下（１）～（６）を挙げることができる。
（１）配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、C末端から6以上のアミノ酸残基、8以上のアミノ酸残基、または9以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を含むタンパク質、
（２）前記（１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が挿入、置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質、
（３）前記（１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質、
（４）配列番号：２および４２～４８より選択されるいずれかで表されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
（５）配列番号：２および４２～４８より選択されるいずれかで表されるアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が欠失、挿入、置換および／または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質であって、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質、および
（６）配列番号：２および４２～４８より選択されるいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であって、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
本開示における改変されたＬ３１タンパク質、当該タンパク質を含むリボソーム、当該タンパク質をコードする単離された核酸等は、例えば、本開示における非天然アミノ酸を含むペプチドや当該ペプチドを含むライブラリの製造等に利用することが可能である。

【0125】

本開示において「単離された」核酸とは、自然環境の要素から分けられた核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、該核酸分子は、染色体外に存在するか、その天然の染色体位置とは違う位置に存在している。天然の染色体に存在しない核酸の場合には、単離された核酸は、細胞内のいずれの位置に存在していてもよい。本開示における「核酸」にはＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ）およびＲＮＡが含まれる。

【0126】

本明細書で言い換え可能に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーのことをいい、DNAおよびRNAを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらのアナログ、またはDNAもしくはRNAポリメラーゼによってまたは合成反応によってポリマーに組み込まれ得る任意の物質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそれらのアナログなどの修飾ヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドの配列に、非ヌクレオチド成分が割り込んでいてもよい。ポリヌクレオチドは、標識へのコンジュゲーションなどの、合成後になされる修飾を含み得る。他のタイプの修飾は、例えば、「キャップ」、1つまたは複数の天然に存在するヌクレオチドとアナログとの置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電連結（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミド酸、カルバメート等）および荷電連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）を伴うもの、例えばタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジン等）などのペンダント部分を含むもの、インターカレート剤（例えば、アクリジン、ソラレン等）を伴うもの、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属等）を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修飾連結（例えば、アルファアノマー核酸等）や非修飾形態のポリヌクレオチドを伴うものを含む。さらに、通常糖に存在する任意のヒドロキシル基は、例えば、ホスホネート基、ホスフェート基によって置換され得、標準的な保護基によって保護され得、もしくはさらなるヌクレオチドへのさらなる連結を生成するよう活性化され得、または固体もしくは半固体支持体にコンジュゲートされ得る。5’および3’末端のOHは、リン酸化またはアミンもしくは1～20炭素原子の有機キャップ基部分で置換され得る。他のヒドロキシルもまた、標準的な保護基に誘導体化され得る。ポリヌクレオチドはまた、例えば以下のものを含む、当技術分野で一般に公知となっているリボースまたはデオキシリボース糖の類似形態を含み得る：2'-O-メチル-、2'-O-アリル-、2'-フルオロ-、または2'-アジド-リボース、炭素環式糖アナログ、α-アノマー糖、アラビノースまたはキシロースまたはリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログ、およびメチルリボシドなどの塩基性ヌクレオシドアナログ。1つまたは複数のホスホジエステル結合は、代替の連結基によって置き換えられ得る。これらの代替の連結基は、これらに限定されるものではないが、ホスフェートが以下のものによって置き換えられている態様を含む：P(O)S（「チオエート」）、P(S)S（「ジチオエート」）、(O)NR₂（「アミデート」）、P(O)R、P(O)OR'、CO、またはCH₂（「ホルムアセタール」）、ここで、各RまたはR'は独立してH、または、任意でエーテル（-O-）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、もしくはアラルジルを含む置換もしくは非置換アルキル（1～20C）である。ポリヌクレオチド中のすべての連結が同一である必要はない。上記の説明は、RNAおよびDNAを含む本明細書で言及されるすべてのポリヌクレオチドに適用される。

【0127】

本開示における改変されたＬ３１タンパク質をコードする核酸を調製するための方法として、例えば、site-directed mutagenesis法（Kramer, W. andFritz,H.-J. (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutagenesis viagapped duplex DNA.Methods in Enzymology, 154: 350-367）が挙げられる。あるいは、ハイブリダイゼーション技術（Southern, E.M. (1975) Journal of Molecular Biology, 98, 503）によっても、配列番号：２および４２～４８より選択されるいずれかに記載の改変されたＬ３１タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする核酸を得ることも可能である。すなわち、本開示における改変されたＬ３１タンパク質をコードする核酸は、配列番号：２および４２～４８より選択されるいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものであってもよい。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者であれば、適宜選択することができる。一例を示せば、25％ホルムアミド、より厳しい条件では50％ホルムアミド、4×SSC、50mM Hepes pH7.0、10×デンハルト溶液、20μg/ml変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション溶液中、42℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、42℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、例えば「2×SSC、0.1％SDS、50℃」、「2×SSC、0.1％SDS、42℃」、「1xSSC、0.1% SDS、37℃」程度で、より厳しい条件としては「2×SSC、0.1％SDS、65℃」、「0.5xSSC、0.1%SDS、42℃」程度で、さらに厳しい条件としては「0.2xSSC、0.1% SDS、65℃」程度で実施することができる。このようにハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほど、配列番号：２および４２～４８より選択されるいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列と高い相同性を有する核酸の単離を期待しうる。但し、上記SSC、SDSおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。

【0128】

これにより単離された核酸は、アミノ酸レベルにおいて、配列番号：２および４２～４８より選択されるいずれかに記載の改変されたL31タンパク質と高い相同性を有すると考えられる。また塩基配列レベルにおいて、配列番号：２および４２～４８より選択されるいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする核酸の塩基配列と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、上述の通り、アミノ酸配列全体あるいは塩基配列全体で、少なくとも50％以上、さらに好ましくは70％以上、さらに好ましくは80%以上、さらに好ましくは85%以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上）の配列の同一性を指す。

【0129】

本発明の核酸は、例えば、改変されたＬ３１タンパク質、またはこれを含むリボソームの調製などに利用することが可能である。改変されたＬ３１の組み換えタンパク質、またはこれを含むリボソームを調製する場合には、通常、改変されたＬ３１タンパク質をコードする核酸を適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入し、形質転換細胞を培養して、発現させた改変されたＬ３１タンパク質、またはこれを含むリボソームを単離、精製、培養する。改変されたＬ３１タンパク質は、精製を容易にするなどの目的で、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることも可能である。例えば、大腸菌を宿主としてマルトース結合タンパク質との融合タンパク質として調製する方法（米国New England BioLabs社発売のベクターpMALシリーズ）、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として調製する方法（Amersham Pharmacia Biotech社発売のベクターpGEXシリーズ）、ヒスチジンタグを付加して調製する方法（Novagen社のpETシリーズ）などを利用することが可能である。

【0130】

非限定の一態様において、ベクターは、相同組換えによって本発明の核酸がノックインされたノックインベクターであってもよい。すなわち、本発明の改変されたＬ３１タンパク質、またはこれを含むリボソームは、相同組換えにより本発明の核酸をベクターにノックインすることを通して調製することもできる。このようなベクターは、改変されたＬ３１タンパク質、またはこれを含むリボソームを調製するための本発明の核酸が、大腸菌等の宿主中の標的遺伝子の同一読み取り枠に挿入されるように構築されたものであってもよい。一態様において、本発明の核酸は、ノックインベクターにおいてその翻訳開始点が標的遺伝子の翻訳開始点と一致するように、当該翻訳開始点が含まれるエクソン内に挿入されていることが好ましい。この場合、ノックインベクターにおいて、任意の外来遺伝子の翻訳開始点の5'側には、標的遺伝子の翻訳開始点よりも上流の塩基配列が配置されていることが好ましい。別の一態様において、ノックインベクターの任意の外来遺伝子の5'側にエクソン・イントロン構造配列が付加されている場合には、当該エクソン・イントロン構造の5'側末端が、標的遺伝子の翻訳開始点と一致するように、当該翻訳開始点が含まれるエクソン内に挿入されていることが好ましい。この場合、ノックインベクターにおいて、前記エクソン・イントロン構造の5'側末端の5'側上流には、標的遺伝子の翻訳開始点よりも上流の塩基配列が配置されていることが好ましい。

【0131】

またノックインベクターは、宿主細胞内において複製する能力を有することが好ましい。ノックインベクターは遺伝子工学に利用されるベクターであれば特に限定されず、公知のベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、細菌人工染色体（BAC）ベクター、酵母人工染色体（YAC）ベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターその他のウイルスベクター等が挙げられる。

【0132】

宿主細胞としては、組み換えタンパク質の発現に適した細胞であれば特に制限はなく、上記の大腸菌の他、例えば、酵母、種々の動植物細胞、昆虫細胞などを用いることが可能である。宿主細胞へのベクターの導入には、当業者に公知の種々の方法を用いることが可能である。例えば、大腸菌への導入には、カルシウムイオンを利用した導入方法（Mandel, M., Higa, A. (1970) Journal of Molecular Biology, 53,158-162、Hanahan, D. (1983) Journal of MolecularBiology, 166, 557-580）を用いることができる。宿主細胞内で発現させた改変されたＬ３１タンパク質は、該宿主細胞またはその細胞培養物もしくは培養上清から、当業者に公知の方法により精製し、回収することが可能である。改変されたＬ３１タンパク質を上記のマルトース結合タンパク質などとの融合タンパク質として発現させた場合には、容易にアフィニティー精製を行うことが可能である。

【0133】

本開示の一態様において、本発明の核酸はベクターに挿入されたものであってもよい。ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、JM109、DH5α、HB101、XL1Blue）等で大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ori」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール等）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有するベクターが挙げられるがこれに限定されない。このようなベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Script等が挙げられる。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM-T、pDIRECT、pT7等が挙げられる。改変されたＬ３１タンパク質を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をJM109、DH5α、HB101、XL1-Blue等の大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーター（Wardら,Nature (1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427）、araBプロモーター（Betterら,Science (1988) 240, 1041-1043 ）、またはT7プロモーター等を持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にpGEX-5X-1（ファルマシア社製）、「QIAexpress system」（キアゲン社製）、pEGFP、またはpET等が挙げられる。

【0134】

また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol.(1987) 169, 4379）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。また植物体内で発現するベクターとしてpMH1、pMH2、pCAMBIAなどのベクターが挙げられる。

【0135】

大腸菌以外にも、例えば、改変されたＬ３１タンパク質を製造するためのベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3 (インビトロゲン社製)や、pEGF-BOS(Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF、pCDM8）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BACbaculovairus expression system」（ギブコBRL社製）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、pZIPneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia ExpressionKit」（インビトロゲン社製）、pNV11、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）等が挙げられる。

【0136】

CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら,Nature (1979) 277, 108）、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CMVプロモーター等を持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418等）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等が挙げられる。

【0137】

本発明の形質転換細胞は、例えば、改変されたＬ３１タンパク質、またはこれを含むリボソームの製造や発現のための産生系として使用することができる。タンパク質の製造のための産生系は、in vitroおよびin vivo の産生系がある。

【0138】

真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞（例えば、上述のCHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞に加え、3T3、ミエローマ細胞、BHK （babyhamster kidney）、HeLa、Vero等の細胞）、両生類細胞（例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340））、あるいは昆虫細胞（例えば、sf9 、sf21、Tn5等の細胞）が知られている。CHO 細胞としては、特に、DHFR遺伝子を欠損したCHO 細胞であるdhfr-CHO（Proc.Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220）やCHO K-1 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275）を好適に使用することができる。大量発現を目的とする場合には特にCHO細胞が好ましい。

【0139】

植物細胞としては、後述の植物由来の細胞の他、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotianatabacum ）由来の細胞がタンパク質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。
また真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Aspergillus）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）が知られているがこれらに限定されない。

【0140】

本開示において、改変されたＬ３１タンパク質、またはこれを含むリボソームは、野生型大腸菌の培養物から精製することによっても取得することもできる。すなわち、培養された野生型大腸菌を低濃度のマグネシウムイオンを含むバッファーに懸濁し、それを破砕することにより、改変されたＬ３１タンパク質を含む溶解液を得ることができる。具体的には、野生型大腸菌を、例えば５ｍＭ以下（より具体的には、例えば４ｍＭ以下、３ｍＭ以下、２ｍＭ以下、１ｍＭ以下、または０ｍＭ）のマグネシウムイオンを含むバッファー中で破砕することにより、本明細書に記載の配列番号：１に記載された大腸菌野生型Ｌ３１タンパク質と本開示における改変されたＬ３１タンパク質とを含む溶解液を得ることができる。大腸菌体の破砕は、フレンチプレスによる破砕、超音波処理による破砕、ホモジナイザーによる破砕、ガラズビーズによる破砕、乳鉢による破砕など、当業者に公知の手法を用いて行うことができるが、本開示においてはフレンチプレスによる破砕が好ましい。このようにして調製される溶解液を当業者に公知の手法により精製すると、改変されたＬ３１タンパク質、またはこれを含むリボソームを単離、取得することができる。

【0141】

本発明の別の局面において、本開示における改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを含む組成物が提供される。本開示における組成物は、例えば、非天然アミノ酸を含むペプチドの製造等における翻訳系またはその一部として利用することが可能である。したがって本開示における組成物は、本開示における改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームに加え、例えば、非天然アミノ酸とｔＲＮＡが結合してなるアミノアシルｔＲＮＡ、１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡ等をさらに含むことが好ましい。本開示における組成物は、本開示における改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを、当該組成物に含まれる全リボソームに対し少なくとも、分子数の比率で５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上（例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上）の割合で含むことが好ましい。

【0142】

なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

【実施例】

【0143】

以下に、実施例で本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の内容は必ずしも以下の実施例にのみ限定されるものではない。なお、実施例中では以下の略号を使用した。
ＡＡ 酢酸アンモニウム
ＣＨ_２ＣＮ シアノメチル基
ＣＨ_３ＣＮ アセトニトリル
ＣＴＡＣｌ Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルヘキサデカン－１－アミニウム 塩化物
ＤＢＵ １，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン
ＤＣＭ ジクロロメタン
ＤＩＰＥＡ Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＦＡ ギ酸
Ｆｍｏｃ ９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基
Ｆ－Ｐｎａｚ ４－（２－（４－フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジルオキシカルボニル基：

【化1】

ＭｅＣＮ アセトニトリル
ＮＭＰ N-メチル‐２‐ピロリドン
ＴＥＡ トリエチルアミン
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ テトラヒドロフランＴＭ 目的産物

【0144】

MePheをMeF、Pic(2)をPic2、GlyをG、IleをI、ProをP、ThrをT、MeSer(tBuOH)をMeStBuOH、D-AlaをdA、LeuをL、BODIPYFL-4-AMFをBdp4AMF、Acbz-D-MeCys(StBu)をAcbzdMeCStBu、Acbz-MeCys(StBu)をAcbzMeCStBu、Acbz-Cys(StBu)をAcbzCStBuと省略して記載することがある。

【0145】

実施例１．大腸菌株の構築
ompT（Protease7）の欠損株（L31intact株と定義する）および、L31タンパク質のN末端側62アミノ酸までを発現するL31short株を構築した。リボソームの精製過程において、Protease7はL31タンパク質の62番目のアミノ酸と63番目のアミノ酸の間で分解する事が知られている。
Quick and Easy Conditional Knockout Kit(loxP/Cre)（Gene Bridges 社）のキットに従い、大腸菌株を構築した。

【0146】

ホモロジーアームが付加した機能カセットの作成
機能カセットloxP-PGK-gb2-neo-loxP （Gene Bridges 社, A003）を鋳型に用いてPrime STAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ社, R010A）にてPCR反応をおこなった。得られたPCR産物をQIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN社, 28104）を用いて精製した。機能カセットの濃度は200ng/μL程度であった。ompT（Protease7）欠損株作成用の機能カセットCassette-1はOligo1（配列番号：３）, Oligo2（配列番号：４）のプライマーを用いてPCRを行った。L31short株作成用の機能カセットCassette-2はOligo3（配列番号：５）、Oligo4（配列番号：６）のプライマーセットを用いてPCRを行った。

【0147】

大腸菌株の作成
Quick and Easy Conditional Knockout Kit(loxP/Cre)（Gene Bridges 社）のキットに記載のプロトコルに従って実施した。大腸菌 W3110 株 (Escherichia coli K-12 W3110)を用いて、pRed/ETを形質転換し、Red/ETを発現するコンピテントセルを調製した。機能カセットCasette-1もしくはCasette-2を、調製したコンピテントセルにエレクトロポレーションで導入し、相同組換えを誘導した。得られたコロニーよりコロニーPCRをおこない、増幅されたDNAの長さからカナマイシンカセットの導入かつ目的の遺伝子の欠損あるいは一部欠損を確認した。キット記載のプロトコルに従い、取得した目的の大腸菌株よりLoxp配列で挟まれたカナマイシン耐性遺伝子カセットを欠失させた。取得した大腸菌をシングルコロニー化し、遺伝子組み換え箇所のゲノムDNAの配列を読むことで、目的の株の完成を確認した。

【0148】

実施例２．リボソームの調製方法
大腸菌の培養
W3110株（WT）の培養をおこなった。
前培養培地（Glycerol 5g/L, Yeast Extract 6g/L,KH₂PO_4, 4g/L, K₂HPO₄ 9.3g/L）に菌体W3110株を植菌し、前培養を行った。前培養菌をOD₆₀₀=0.1になるように本培養用培地（Glycerol 10 g/L, Yeast Extract 10 g/L, ポリペプトンN 15 g/L, KH₂PO₄ 4 g/L , MgSO₄・7H₂O 2.4g/L , FeSO₄・7H₂O0.04g/L, CaCl₂・2H₂O 0.04g/L,アデカノールLG-109 0.24g/L）30Lに添加した。培養は50L培養槽で行った。37℃で5.4時間培養し、OD₆₀₀=33.5になったところで回収した。培養液は、500mlずつ分注し、室温に1時間、4℃に1時間静置した。静置後 6000×g, 10minで遠心し、沈澱をD-PBS(-)（タカラバイオ社、T9181）で懸濁して再度6000×g、10分で遠心操作を行った。回収した菌体は液体窒素で凍結し、-80℃で保管した。

【0149】

L31short株、もしくはL31intact株の培養
培養にはLB培地、Miller（ナカライテスク社、20068-75）を使用した。菌体の前培養を行った。前培養した菌体を、OD600=0.05になるように本培養培地に添加した。培養は3Lバッフル付きフラスコ（コーニング社、431253）に、1LのLB培地を添加しておこなった。Climo-shakerISF-1-Xを用いて、37℃で、100rpmで、約2時間40分程度培養して、OD600が1.0程度になった事を確認して、室温に取り出し、1時間静置した。その後4℃で1時間静置した。5000×g、10分で遠心操作を行うことで菌体を回収した。培地と等量のPBS（タカラバイオ社、T9181）で菌体を懸濁して再度5000×g、10分で遠心操作を行った。菌体は液体窒素で凍結し、-80℃で保管した。

【0150】

大腸菌の破砕
L31intact株とL31short株におけるFPを用いた破砕
回収菌体1ODあたり、0.004mLのLysis Buffer（10 mM HEPES-KOH, pH7.6, 5～10 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 10 μg/mL DNaseI）で懸濁した。FrenchPress（Emulsi Flex B15, AVESTIN）を用いて破砕を行った。圧力設定は40Barであった。破砕速度は約1ml/minになるようにコントロールした。20000×g、30分、4℃で遠心操作を行い、上清を回収した。
WT株におけるFPを用いた破砕
次の組成の3種類のLysisBufferを用意した。
Mg10 Lysis Buffer（10mM HEPES-KOH, pH7.6, 50 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 10 μg/mLDNaseI）
Mg5 Lysis Buffer（10mM HEPES-KOH, pH7.6, 50 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 10 μg/mLDNaseI）
Mg0 Lysis Buffer（10mM HEPES-KOH, pH7.6, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 10 μg/mL DNaseI）
各種類のLysis Bufferを用いて、回収菌体1ODあたり、0.004mLのLysisBufferで菌体を懸濁した。 FrenchPress（EmulsiFlex B15, AVESTIN）を用いて破砕を行った。圧力設定は40Barであった。破砕速度は約1ml/minになるようにコントロールした。20000×g、30分、4℃で遠心操作を行い、上清を回収した。

【0151】

大腸菌の精製
L31short株、もしくはL31intact株の硫安沈殿
大腸菌破砕液上清に対して等量の2×硫安沈殿用Buffer（10 mM HEPES-KOH, pH7.6, 5～10 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 3.24M 硫酸アンモニウム, 1mM DTT）を添加して、4℃で30分間撹拌した。4℃、20000×g、40分で遠心操作を行い、上清を回収した。0.22μm (Millipore社)のフィルターでろ過した。

【0152】

WT株の硫安沈殿
大腸菌破砕液上清1mlに対して、乳鉢で細かく砕いた0.222gの硫酸アンモニウムを、スターラーを用いて撹拌しながら添加した。4℃で30分間 撹拌した。4℃、20380×g、40分で遠心操作を行い、上清を回収した。0.22μm (Millipore社) のフィルターでろ過した。

【0153】

Butyl sepharose 精製
Butyl Sepharose 4 FastFlow（GEヘルスケア、17098002）をXK50カラム（GEヘルスケア、28988952）に充填したカラムを使用した。Buffer A(20 mM HEPES-KOH, pH7.6, 10 mM Mg(OAc)₂, 1.5 M(NH4)₂SO₄, 1mM DTT)で、カラムを置換した。2ml/minで、硫安沈殿後のサンプルをカラムに添加した。Buffer Aでカラムを洗浄後、つづいて30% BufferA、70％ Buffer B(20 mM HEPES-KOH, pH7.6, 10 mMMg(OAc)₂, 1mM DTT)でさらに洗浄した。その後、50% Buffer Aと50% BufferBで溶出した。

【0154】

超遠心精製
30% sucrose Buffer (20 mM HEPES-KOH,pH7.6, 10 mM Mg(OAc)₂, 30mM NH₄Cl, 30% Sucrose, 1mM DTT)を超遠心チューブの容量の半量添加し、そこに界面を乱さないようにButyl sepharose精製後の溶出液を添加した。99700×g、20時間、4℃で遠心した。ペレットを保存Buffer（20 mM HEPES-KOH, pH7.6, 6mM Mg(OAc)₂, 30mM KCl, 1mM DTT）で懸濁した。
最終濃度が20～30μMになるように調製した。
最終的にL31shortリボソーム、L31intactリボソーム、WT-10MGリボソーム（Mg10 Lysis Bufferを使用）、WT-5MGリボソーム（Mg5 Lysis Bufferを使用）、WT-0MGリボソーム（Mg0 LysisBufferを使用）の5種類のリボソームの調製をおこなった。

【0155】

実施例３．L31の分解割合の分析
WT-10MGリボソーム、WT-5MGリボソーム、WT-0MGリボソームのL31の分解割合を分析した。

【0156】

サンプル調製方法
40pmolのリボソームを38μLの水で希釈した。トリフルオロ酢酸を1%になるように添加し、リボソーマルRNAを沈澱させた。遠心操作を行い、上清をマトリックス（50%アセトニトリル、5 mg/ml シナピン酸）と1:1で混合し、MALDI/MS用のプレートに1μLスポットして結晶化した。

【0157】

MALDI/MSでの分析
質量分析器（ABS CIEX・TOF/TOF 5800）を用いて、Liner Positiveモードを用いて測定した。リボソーマルタンパク質を内部スタンダードとしてキャリブレーションを行った。キャリブレーションが正しく行われた測定結果を用いた。IntactなL31の割合は、IntactL31のMS intensityをIntact L31のMSのintensityとShortL31のMS intensityの和で割ることで求めた。N=3 で測定を実施し、平均値をintactなL31の割合とした。

【0158】

L31分解率の分析の結果
WT-10MG リボソームでは71％がintactなL31であった。同様にWT-5MGリボソームは20％、WT-0MG リボソームは7%がintactなL31であった。

【0159】

実施例４．無細胞翻訳系に用いるｐＣｐＡ-アミノ酸（アミノアシルｐＣｐＡともいう）の合成
ＬＣＭＳの分析条件は下記のとおりである。

【表1】

【0160】

Pnaz-MeSer(tBuOH)-pCpA (TS01)の合成
化合物ＴＳ０１の合成は、以下のスキームに従って行った。

【化2】

【0161】

Ｎ－（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｏ－（２－ヒドロキシ－２－メチルプロピル）－Ｎ－メチル－Ｌ－セリン（ＴＳ０１－３）の合成

【化3】

【0162】

ＷＯ２０１８２２５８６４に基づいて合成した（２Ｓ）－２－［［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］（メチル）アミノ］－３－（２－ヒドロキシ－２－メチルプロポキシ）プロパン酸（ＴＳ０１－１、４１．０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（０．１０ｍＬ）に溶解し、４－（３－フェニルプロピル）ピペリジン（３２．０ｕＬ，０．１５ｍｍｏｌ）を加えて室温で１５時間撹拌した。ＤＣＭを減圧濃縮により除去し、（２Ｓ）－３－（２－ヒドロキシ－２－メチル－プロポキシ）－２－（メチルアミノ）プロパン酸（ＴＳ０１－２）を粗生成物として得た。得られた（２Ｓ）－３－（２－ヒドロキシ－２－メチル－プロポキシ）－２－（メチルアミノ）プロパン酸（ＴＳ０１－２、粗生成物）とＷＯ２０１８２２５８６４に基づいて合成した炭酸（４－ニトロフェニル）―４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（１１０．０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を、ＤＭＳＯ（０．５０ ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（４１．８ｕＬ，０．３０ｍｍｏｌ）を加えて５０℃で１時間撹拌した。反応液を逆相カラムクロマトグラフィ（０．１％ＦＡ ｉｎ Ｈ_２Ｏ／０．１％ＦＡ ｉｎ ＣＨ_３ＣＮ）で精製し、標題の化合物（ＴＳ０１－３、４０ｍｇ、８４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４７５．４ （Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．６４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）

【0163】

シアノメチル Ｎ－（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｏ－（２－ヒドロキシ－２－メチルプロピル）－Ｎ－メチル－Ｌ－セリナート（ＴＳ０１－４）の合成

【化4】

【0164】

Ｎ－（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｏ－（２－ヒドロキシ－２－メチルプロピル）－Ｎ－メチル－Ｌ－セリン（ＴＳ０１－３、１９．０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）をＣＨ_３ＣＮ（０．２０ｍＬ）に溶解し、ＤＩＰＥＡ（１０．４８ｕＬ，０．０６ｍｍｏｌ）および２－ブロモアセトニトリル（３．２２ｕＬ，０．０４８ｍｍｏｌ）を加えて室温で１２時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、表題の化合物（ＴＳ０１－４）を粗生成物として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ５１４（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．７３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）

【0165】

（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－４－ヒドロキシ－２－（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－ヒドロキシテトラヒドロフラン－３－イル Ｎ－（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｏ－（２－ヒドロキシ－２－メチルプロピル）－Ｎ－メチル－Ｌ－セリナート（ＴＳ０１）の合成

【化5】

【0166】

緩衝液Ａ（１０ｍｌ）に、文献記載（Helv. Chim. Acta, 90,297- 310）の方法で合成したリン酸二水素 （（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（２８．９ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を溶解させ、シアノメチル Ｎ－（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｏ－（２－ヒドロキシ－２－メチルプロピル）－Ｎ－メチル－Ｌ－セリナート（ＴＳ０１－４、粗生成物）のアセトニトリル溶液（０．０２１ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ、０．５０ｍｌ）を滴下し、室温で６０分撹拌した。反応液を０℃に冷却したのちトリフルオロ酢酸（０．５０ｍＬ）を加えた。反応液を０℃で６０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（ＴＳ０１、８．０ｍｇ、１８．０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ １１０９．７ （Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．５０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）

【0167】

なお、緩衝液Ａは以下のように調整した。
Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルヘキサデカン－１－アミニウム 塩化物（６，４０ｇ、２０ｍｍｏｌ）とイミダゾール（６．８１ｇ、１００ｍｍｏｌ）の水溶液に酢酸を添加し、ｐＨ７．９、２０ｍＭ Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルヘキサデカン－１－アミニウム、１００ｍＭイミダゾールの緩衝液Ａ（１Ｌ）を得た。

【0168】

ＢｄｐＦＬ－（４－ＡＭＦ）－ｐＣｐＡ（ＭＴ０１）の合成
（２Ｓ）－３－[４－（アミノメチル）フェニル］－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］プロパン酸（化合物ＭＴ０２）の合成

【化6】

【0169】

窒素雰囲気化、(2S)-3-[4-(アミノメチル)フェニル]-2-[[4-[[2-(4-フルオロフェニル)アセチル]アミノ]フェニル]メトキシカルボニルアミノ]プロパン酸（５００ｍｇ，０．９６８ ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（４．５ｍｌ）懸濁液に４Ｎ ＨＣｌの１，４－ジオキサン溶液を室温で加えた。室温で１時間撹拌した後、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣と［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メチル （４－ニトロフェニル） カーボネート（４１１ ｍｇ、０．９６８ ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（５ｍＬ）懸濁液にＤＩＰＥＡ（４１３ ｍｇ、３．１９ ｍｍｏｌ）を室温で加えた。室温で２時間撹拌した後、ピペリジン（４００ ｍｇ、４．７ ｍｍｏｌ）を室温で加え、１５分撹拌した。反応液を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ＦＡ ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ）にて精製し、（２Ｓ）－３－［４－（アミノメチル）フェニル］－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］プロパン酸（化合物ＭＴ０２）（８３．３ ｍｇ、 １８％収率、３ステップ） を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４８０．３ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）

【0170】

（Ｓ）－３－（４－（（３－（５，５－ジフルオロ－７，９－ジメチル－５Ｈ－４λ ^４ ，５λ ^４ －ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）メチル）フェニル）－２－（（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸（化合物ＭＴ０３）の合成

【化7】

【0171】

窒素雰囲気化、（２Ｓ）－３－［４－（アミノメチル）フェニル］－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］プロパン酸（化合物ＭＴ０２）（１１．８ｍｇ，０．０３０ ｍｍｏｌ）のＮＭＰ（５００ｍｌ）溶液３－（３－（（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）オキシ）－３－オキソプロピル）－５，５－ジフルオロ－７，９－ジメチル－５Ｈ－５λ^４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニ－４－ニウムのＮＭＰ（５００ｍｌ）溶液を室温で加えた。４０℃で１０分撹拌した後、反応液を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ＦＡ ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ）にて精製し、（Ｓ）－３－（４－（（３－（５，５－ジフルオロ－７，９－ジメチル－５Ｈ－４λ^４，５λ^４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）メチル）フェニル）－２－（（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸（化合物ＭＴ０３）（１４．６ ｍｇ、 ６４％収率） を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ７５２．２（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．７９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）

【0172】

（Ｓ）－３－（４－（（３－（５，５－ジフルオロ－７，９－ジメチル－５Ｈ－４λ ^４ ，５λ ^４ －ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）メチル）フェニル）－２－（（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸 シアノメチルエステル（化合物ＭＴ０４）の合成

【化8】

【0173】

窒素雰囲気下、（Ｓ）－３－（４－（（３－（５，５－ジフルオロ－７，９－ジメチル－５Ｈ－４λ^４，５λ^４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）メチル）フェニル）－２－（（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸（５０ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）およびＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（２３．２ μＬ， ０．１３３ ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２００μＬ）に溶解し、２－ブロモアセトニトリル（９．０ μＬ， ０．１３３ ｍｍｏｌ）を０℃で加えたのち、４０℃で３．５時間撹拌した。反応液を濃縮し、（Ｓ）－３－（４－（（３－（５，５－ジフルオロ－７，９－ジメチル－５Ｈ－４λ^４，５λ^４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）メチル）フェニル）－２－（（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸 シアノメチルエステル（化合物ＭＴ０４）を粗生成物として得た。得られた粗生成物は、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ７９１．４（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．９０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）

【0174】

［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－４－ヒドロキシ－２－（（ホスホノオキシ）メチル）テトラハイドロフラン－３－イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－ヒドロキシテトラヒドロフラン－３－イル （２Ｓ）－３－（４－（（３－（５，５－ジフルオロ－７，９－ジメチル－５Ｈ－４λ ^４ ，５λ ^４ －ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）メチル）フェニル）－２－（（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパノエート（化合物ＭＴ０１、ＢｄｐＦＬ－（４－ＡＭＦ）－ｐＣｐＡ）の合成

【化9】

【0175】

緩衝液Ａ（５５ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（４７．７ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）を溶解させ、（Ｓ）－３－（４－（（３－（５，５－ジフルオロ－７，９－ジメチル－５Ｈ－４λ^４，５λ^４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）メチル）フェニル）－２－（（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸 シアノメチルエステル（化合物ＭＴ０３）（５２.３ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（５ ｍＬ）を３回に分けて加えたのち、室温で９０分撹拌した。反応液に０℃でＴＦＡ（３ ｍＬ）を加え、５分撹拌したのち、室温にて４０分撹拌した。反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％ ＴＦＡ ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ）にて精製し、表題化合物（化合物ＭＴ０１、ＢｄｐＦＬ－（４－ＡＭＦ）－ｐＣｐＡ）（８．３ ｍｇ、９．１％収率）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ １３８６．７ （Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．６５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）

【0176】

実施例５．アミノアシルｔＲＮＡの合成
tRNAGlu(-CA)の配列
定法により以下のtRNAGluCUU（-CA）を調製した。
配列ＴＲ－１（配列番号：７）
tRNAGluCUU(-CA) RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUCUUACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
定法により以下のtRNAGluCUG（-CA）を調製した。
配列ＴＲ－２（配列番号：８）
tRNAGluCUG(-CA) RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUCUGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
定法により以下のtRNAfMet(CAU)(-CA）を調製した。
配列ＴＲ－3（配列番号：９）
GGCGGGGUGGAGCAGCCUGGUAGCUCGUCGGGCUCAUAACCCGAAGAUCGUCGGUUCAAAUCCGGCCCCCGCAAC

【0177】

アミノアシルｐＣｐＡを用いたアミノアシルｔＲＮＡ合成：その１
５０μＭ 転写tRNAGluCUG(-CA)（配列番号：8）(２０μｌ)に、10X ligation buffer （500 mM HEPES-KOH pH 7.5, 200 mM MgCl₂）(４μｌ)、１０ｍＭ ＡＴＰ （４μｌ）、Nuclease free water （５．６μｌ）を加え、９５℃で２分間加熱した後、室温で５分間放置し、ｔＲＮＡのリフォールディングを行った。１０ｕｎｉｔ／μｌ Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ（New england bio lab.社）（２．４μＬ）および、２．５ｍＭのアミノアシルｐＣｐＡ（TSO1）のＤＭＳＯ溶液 （４μＬ）を加え、１６℃で４５分間ライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液に、最終濃度０．３Ｍになるように酢酸ナトリウムを添加して、フェノール・クロロホルム抽出を行い、エタノール沈殿によりアミノアシルtＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－１）を回収した。回収したアミノアシルｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－１）は、翻訳混合物に添加する直前に１ｍＭ酢酸ナトリウムに溶解した。
化合物ＡＡｔＲ－１
MeSer(tBuOH)- tRNAGluCUG

【0178】

アミノアシルｐＣｐＡを用いたアミノアシルｔＲＮＡ合成：その2
５０μＭ 転写tRNAGluCUU(-CA)(配列番号：7）(２０μｌ)に、10X ligationbuffer （500 mM HEPES-KOH pH 7.5, 200 mM MgCl₂）(４μｌ)、１０ｍＭ ＡＴＰ （４μｌ）、Nuclease free water （５．６μｌ）を加え、９５℃で２分間加熱した後、室温で５分間放置し、ｔＲＮＡのリフォールディングを行った。１０ｕｎｉｔ／μｌ Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ（New england bio lab.社）（２．４μＬ）および、２．５ｍＭのアミノアシルｐＣｐＡ（ＭＴ０１）のＤＭＳＯ溶液 （４μＬ）を加え、１６℃で４５分間ライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液に、最終濃度０．３Ｍになるように 酢酸ナトリウムを添加して、フェノール・クロロホルム抽出を行い、エタノール沈殿によりアミノアシルtＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－２）を回収した。回収したアミノアシルｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－２）は、翻訳混合物に添加する直前に１ｍＭ酢酸ナトリウムに溶解した。
化合物ＡＡｔＲ－２
BODIPYFL-4-AMF-tRNAGluCUU

【0179】

アミノアシルｐＣｐＡを用いたアミノアシルｔＲＮＡ合成：その3
５０μＭ 転写tRNAfMetCAU(-CA）（配列番号：９）(２０μｌ)に、10X ligation buffer （500 mM HEPES-KOH pH7.5, 200 mM MgCl₂）(４μｌ)、１０ｍＭ ＡＴＰ （４μｌ）、Nucleasefree water （５．６μｌ）を加え、９５℃で２分間加熱した後、室温で５分間放置し、ｔＲＮＡのリフォールディングを行った。１０ｕｎｉｔ／μｌ Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ（New england bio lab.社）（２．４μＬ）および、２．５ｍＭの(Acbz-MeCys(StBu)-pCpA (特許文献WO2017150732に記載の化合物nk14)のＤＭＳＯ溶液 （４μＬ）を加え、１６℃で４５分間ライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液に、０．３Ｍ酢酸ナトリウムを添加して、フェノール・クロロホルム抽出を行い、エタノール沈殿によりアミノアシルtＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－３）を回収した。回収したアミノアシルｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－３）は、翻訳混合物に添加する直前に１ｍＭ酢酸ナトリウムに溶解した。）
化合物ＡＡｔＲ－３
Acbz-MeCys(StBu)- tRNAfMetCAU

【0180】

実施例６．LCT12の合成
ＬＣＴ－１２のペプチド合成機によるペプチド合成に用いる（２Ｓ，３Ｒ）－２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－３－（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）ブタン酸（Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ＴＨＰ）－ＯＨ）の合成

【化10】

【0181】

（２Ｓ，３Ｒ）－２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－３－ヒドロキシブタン酸一水和物（Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ－ＯＨの一水和物、東京化成より購入、５．０ｇ、１３．９ｍｍｏｌ）とｐ－トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ、０．１７５ｇ、０．７０ｍｍｏｌ）の混合物にトルエン（５０ｍＬ）を加えて、減圧下トルエンを留去することで共沸により含まれている水分を除去した。得られた残渣に超脱水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、２８ｍＬ）と３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ピラン（８．８ｍＬ、９７ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、５０℃にて４時間攪拌した。ＬＣＭＳ（ＳＱＤＦＡ０５）にて原料の消失を確認後、混合物を２５℃まで冷却し、酢酸エチル（３０ｍＬ）を加えた。続いて飽和塩化ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）を加えて有機層を洗浄し、水層を酢酸エチル（３０ｍＬ）で抽出した。得られた全ての有機層を混合し、これをさらに飽和塩化ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）にて２度洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムにて乾燥し、溶媒を減圧下留去し、粗生成物（９．３ｇ）を得た。

【0182】

得られた粗生成物のうち、４．６５ｇをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ、３０ｍＬ）に溶解させ、次いでｐＨ８．０に調整した１．０Ｍリン酸緩衝液（３０ｍＬ）を加えた。この混合物を５０℃で４時間攪拌した。２５℃まで冷却した後、酢酸エチル（３０ｍＬ）を加え、有機層と水層を分離した。水層に酢酸エチル（３０ｍＬ）を加えて抽出を行った後、得られた全ての有機層を混合し、飽和塩化ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）で２度洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプにて減圧下、２５℃で３０分乾燥させた。

【0183】

得られた残渣をジエチルエーテル（５０ｍＬ）に溶解させ、次いでヘプタン（５０ｍＬ）を加えた。制御した減圧下（～１００ｈＰａ）、ジエチルエーテルのみを留去し、得られた混合物をろ過して固体を得た。このヘプタンでの洗浄操作を２度繰り返した。得られた固体をポンプにて減圧下、２５℃で２時間乾燥させ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ＴＨＰ）－ＯＨのナトリウム塩（２．８０ｇ、６．２６ｍｍｏｌ）を得た。

【0184】

得られた全量のＦｍｏｃ－Ｔｈｒ（ＴＨＰ）－ＯＨのナトリウム塩に酢酸エチル（５０ｍＬ）とｐＨ２．１の０．０５Ｍリン酸水溶液（１４０ｍＬ）を加えて、２５℃にて５分間攪拌した後、有機層と水層を分離した。水層に酢酸エチル（５０ｍＬ）を加えて抽出した後、得られた全ての有機層を混合し、飽和塩化ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）にて２度洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムにて乾燥させ、減圧下溶媒を留去した。残渣をポンプにて減圧下、２５℃で２時間乾燥させた後、得られた固体をｔ－ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ、５０ｍＬ）に溶解させ、溶媒を減圧下留去した。さらにポンプにて減圧下、２５℃で１時間乾燥させることで、（２Ｓ，３Ｒ）－２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－３－（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）ブタン酸（Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ＴＨＰ）－ＯＨ、２．７０ｇ、３０ｍｏｌ％のｔ－ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）が残留）をＴＨＰ保護上の不斉炭素に由来するジアステレオマーとして得た。得られたＦｍｏｃ－Ｔｈｒ（ＴＨＰ）－ＯＨは－２５℃の冷凍庫にて保存した。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４２４．２（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．８４分、０．８５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０１）

【0185】

ＬＣ／ＭＳの標品として用いるＮ末端にＢｄｐＦＬを持つペプチド（ＬＣＴ－１２）の合成

【化11】

【0186】

Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨを担持させた２－クロロ卜リチルレジン（１００ｍｇ）を用い、Ｆｍｏｃアミノ酸としてＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ＴＨＰ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨを用いてペプチド合成機にてペプチドの伸長を行った。Ｆｍｏｃ法によるペプチド合成法に従い、ペプチドの伸長を行った（ＷＯ２０１３１００１３２Ｂ２）。ペプチドの伸長後、Ｎ末端のＦｍｏｃ基の除去をペプチド合成機上にて行った後、レジンをＤＣＭにて洗浄した。

【0187】

レジンにＴＦＥ／ＤＣＭ（１：１、ｖ／ｖ、２ｍＬ）を加えて１時間振とうし、ペプチドのレジンからの切り出しを行った。反応終了後、チューブ内の溶液を合成用カラムでろ過することによりレジンを除き、レジンをＴＦＥ／ＤＣＭ（１：１、ｖ／ｖ、１ｍＬ）にて２回洗浄した。全ての抽出液を混合し、ＤＭＦ（２ｍＬ）を加えた後、減圧下濃縮した。得られた残査をＮＭＰ（０．５ｍＬ）に溶解し、そのうち１／４（１２５μＬ）を次の反応に使用した。ペプチドのＮＭＰ溶液に７６．５ｍＭに調製したＢｄｐＦＬスクシンイミドエステル（１４０μＬ）を室温にて加え、４０℃で終夜撹拌した後、減圧下濃縮した。得られた残査を０．０５Ｍ テトラメチルアンモニウム硫酸水素塩 ｉｎ ＨＦＩＰ（１．２ ｍｌ， ０．０６０ ｍｍｏｌ）に溶解し、室温で２時間撹拌した。反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ＦＡ ＭｅＣＮ／Ｈ_２Ｏ）にて精製し、表題化合物（ＬＣＴ－１２）（０．３ｍｇ）を得た。ＬＣＴ－１２のアミノ酸配列を配列番号：１７に示す。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ １９７２．９ （Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．７４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０１）

【0188】

実施例７．ペプチドの翻訳合成
実験１の概要
L31intact株から調製したリボソーム（L31intact リボソーム）、L31short株から調製したリボソーム（L31short リボソーム）の2種類のリボソームの翻訳特性を比較する実験を実施した。
具体的には、鋳型mRNAの配列mR-1（配列番号：１０）あるいは配列mR-2（配列番号：１１）を化合物AAtR-1、AAtR-2、Initiator-tRNA（AAtR-3）を用いて翻訳し、ペプチド化合物を翻訳合成した。翻訳産物としてはmR-1では、Acbz-MeCys(StBu):MeSer(tBuOH):MePhe:Ile:Ile:Gly:MePhe:BODIPYFL-4-AMF:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly（配列番号：１４）、mR-2ではAcbz-MeCys(StBu):T:MePhe:Ile:Ile:Gly:MePhe:BODIPYFL-4-AMF:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly（配列番号：１６）が翻訳されるように設計した。以後アミノ酸をコロンで区切って表記する。
LC-MSを用いて目的産物（TM）と、副生成物の定量を行った。副生成物として主に観測されたのは開始アミノ酸から3文字目のアミノ酸から翻訳が開始されたInitiation Read through(iRT)ペプチドであった。

【0189】

翻訳条件
翻訳系は、原核生物由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ ｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、翻訳液には下記のものを含む。１ｍＭ ＧＴＰ、１ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭ クレアチンリン酸、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ ｐＨ７．６、１００ｍＭ 酢酸カリウム、２ｍＭ スペルミジン、１ｍＭ ジチオスレイトール、１．０ｍｇ／ｍｌ Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社）（非特許文献：(Yokogawa T, Kitamura Y, Nakamura D, Ohno S, Nishikawa K. 2010.Nucleic acids research 38:e89)に記載の方法で、一部のtRNAを除去している）、３μＭのin vitro転写大腸菌ｔＲＮＡ Ａｌａ１Ｂ、０．２６μＭ ＥＦ－Ｇ、４μｇ／ｍｌ クレアチンキナーゼ、３μｇ／ｍｌ ミオキナーゼ、２ｕｎｉｔ／ｍｌ 無機ピロフォスファターゼ、１．１μｇ／ｍｌ ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、２．７μＭ ＩＦ１、０．４μＭ ＩＦ２、１．５μＭ ＩＦ３、４０μＭ ＥＦ－Ｔｕ、35 μＭ ＥＦ－Ｔｓ、１μＭ ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ、０．４ｕｎｉｔ／μｌ RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１）、０．４～０．５μＭ Penicillin G Amidase (ＰＧＡ)、2.7μM AlaRS、1 μＭ ＧｌｙＲＳ、０．４μＭ ＩｌｅＲＳ、０．５ μＭ 変異体ＰｈｅＲＳ（WO2016/148044）、０．１６μＭ ＰｒｏＲＳ、０．０９μＭ ＴｈｒＲＳ、１μM 変異体ＶａｌＲＳ（WO2016/148044）、 1μM 変異体SerRS（WO2016/148044）、250μM Gly、250μM Lys、100μMIle、250μM Pro、250μM Thr、5mM N-メチルアラニン、5mM N-メチルフェニルアラニン、5mM N-メチルセリン、５mM Ｎメチルバリン。酢酸マグネシウム濃度を2 mM、4 mM、6 mM、8 mMの4点で調製し、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシルｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－３）を25μＭ、化合物 AAtR-1とAAtR-2を含むアミノアシルｔＲＮＡを各10μＭになるように翻訳反応混合物に添加した。また、mRNA (mR-1もしくはmR-2)を1μMになるように翻訳反応混合物に添加した。翻訳には使用されないアミノアシルtRNAを185μM含んでいる。L31shortリボソームまたはL31incactリボソームを1.2μMになるように添加して、３７℃で１時間静置することで行った。その後、95℃で3分間加熱し室温になるまで静置後、Peptidyl-tRNA hydrolase(Pth)を8.58μMになるように添加し37℃で1時間静置した。

【0190】

mRNAの調製
鋳型ＤＮＡ（配列番号：１２または、配列番号：１３）から、RiboMAX LargeScale RNA production System T7（Promega社，Ｐ1280）を用いたin vitro 転写反応により鋳型ｍＲＮＡ、配列ｍＲ－１または配列ｍＲ－２を合成し、RNeasy Mini kit（Qiagen社）により精製した。

【0191】

分析概要
非天然アミノ酸を含むペプチド翻訳産物を含む溶液を10倍希釈し、LC-FLR-MSの装置を用いて分析した。分析データはMSデータより対象となる翻訳されたペプチドの保持時間を同定し、該当保持時間の蛍光ピークを定量することで、ペプチド翻訳量を評価した。なお、定量評価は実施例６にて合成したLCT12を標品により検量線を作成し、相対定量により含有量を算出した。LC-MSは下記の分析条件でおこなった。

【0192】

分析条件

【表2】

【0193】

結果
各リボソームの至適なMg濃度におけるmR-1、mR-2のmRNAの配列の翻訳実験とも、L31shortリボソームで翻訳した場合の目的産物の翻訳量がL31intactリボソームを用いて翻訳した場合に比べて多かった。
各リボソームの至適なMg濃度におけるmR-1、mR-2のmRNAの配列の翻訳とも、副生成物であるiRTペプチドの翻訳量の目的産物に対する割合は、L31short リボソームを用いた場合のほうが、L31intactリボソームを用いた場合に比べて低かった。
開始アミノ酸から2番目の文字がMeSer(tBuOH)であるmR-1の配列のほうが、 ThrであるmR-2の配列に比べて至適Mg²⁺濃度での目的産物の翻訳量のL31shortリボソームによる向上効果が大きかった。
Initiation Suppression (iSup)法を用いた翻訳の際に、L31short株より調製されたL31shortリボソームを用いる事の有用性が示された。

【0194】

L31shortリボソームまたはL31intactリボソームを用いて、mR-1配列、mR-2配列を翻訳した時の目的産物の翻訳量とiRTペプチドの翻訳量を以下に示す。

【0195】

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【表3-4】

【0196】

実験２の概要
実施例２にて、W3110株由来の野生型大腸菌を用いて、破砕バッファーのMg²⁺濃度を10mM、5mM、0mMの3点にてリボソームを調製した。それぞれの調製方法で調製したリボソームをWT-10MGリボソーム、WT-5MGリボソーム、WT-0MGリボソームと呼ぶ。実施例３にて、それぞれのリボソームのL31タンパク質が精製中に分解された割合をMALDI-MSを用いて測定した。その結果、破砕液中のMg²⁺が低いほどL31が分解されていることを示した。
これらのリボソームを用いて実験１と同様に、mR-2の配列を用いて翻訳実験を行った。
その結果、最もL31の分解がされていたWT-0MGリボソームを用いた場合が最も目的産物の量が多い事がわかった。

【0197】

翻訳条件
翻訳系は、原核生物由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ ｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、翻訳液には下記のものを含む。１ｍＭ ＧＴＰ、１ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭ クレアチンリン酸、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ ｐＨ７．６、１００ｍＭ 酢酸カリウム、4 mM酢酸マグネシウム、２ｍＭ スペルミジン、１ｍＭ ジチオスレイトール、１．０ｍｇ／ｍｌ Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社）（非特許文献:(Yokogawa T, Kitamura Y, Nakamura D, Ohno S, Nishikawa K. 2010.Nucleic acids research 38:e89) 記載の方法で、一部のtRNAを除去している）、３μＭのin vitro転写大腸菌ｔＲＮＡ Ａｌａ１Ｂ、０．２６μＭ ＥＦ－Ｇ，４μｇ／ｍｌ クレアチンキナーゼ、３μｇ／ｍｌ ミオキナーゼ、２ｕｎｉｔ／ｍｌ 無機ピロフォスファターゼ、１．１μｇ／ｍｌ ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、２．７μＭ ＩＦ１、０．４μＭ ＩＦ２、１．５μＭ ＩＦ３、４０μＭ ＥＦ－Ｔｕ、35μＭ ＥＦ－Ｔｓ、１μＭ ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ、０．４ｕｎｉｔ／μｌ RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１）、０．５μＭ Penicillin G Amidase (ＰＧＡ) 、2.7μM AlaRS、1μＭＧｌｙＲＳ、０．４μＭ ＩｌｅＲＳ、０．５ μＭ 変異体ＰｈｅＲＳ（WO2016/148044）、０．１６μＭ ＰｒｏＲＳ、０．０９μＭ ＴｈｒＲＳ、１μM 変異体ＶａｌＲＳ（WO2016/148044）、1μM 変異体SerRS（WO2016/148044）。250μM Gly、250μM Lys、100μMIle、250μM Pro、250μM Thr、5mM N-メチルアラニン、5mM N-メチルフェニルアラニン、5mM N-メチルセリン、５mM Ｎメチルバリン。ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシルｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－３）を25μＭ、化合物 AAtR-1とAAtR-2を含むアミノアシルｔＲＮＡを各10μＭになるように翻訳反応混合物に添加した。翻訳には使用されないアミノアシルｔRNAを185μM含んでいる。WT-0MG リボソーム、WT-5MGリボソーム、もしくはWT-10MGリボソームを1.2μM添加して、３７℃で１時間静置することで行った。その後、95℃で3分間加熱し室温になるまで静置後、Peptidyl-tRNA hydrolase (Pth)を8.58μMになるように添加し37℃で1時間静置した。

【0198】

分析概要
非天然アミノ酸を含むペプチド翻訳産物を含む溶液を10倍希釈し、LC-FLR-MSの装置を用いて分析した。分析データはMSデータより対象となる翻訳されたペプチドの保持時間を同定し、該当保持時間の蛍光ピークを定量することで、ペプチド翻訳量を評価した。なお、定量評価は実施例６にて合成したLCT12を標品により検量線を作成し、相対定量により含有量を算出した。LC-MSは下記の分析条件でおこなった。
分析条件

【表4】

【0199】

結果
目的産物の翻訳量は多いものから、WT-0MGリボソーム、WT-5MGリボソーム、WT-10MGリボソームであった。
また、iRTペプチドの目的産物に対する割合が少ないものから順にWT-0MGリボソーム、WT-5MGリボソーム、WT-10MGリボソームであった。
実験1の結果と実施例3の結果から、破砕液中のMg²⁺濃度が低い状態で、L31が分解されているリボソームの比率が多くなり、iSup法における翻訳量を上げることができると示された。

【0200】

【表5】

【0201】

実施例８. L31shortリボソームを用いたパニング
アシル化tRNAの合成
特許文献（ＷＯ２０１３／１００１３２）に記載の手法でパニングに使用するアシル化ｔＲＮＡを調製した。特許文献（WO2018/225864）に記載のPic(2)、MeAla(3-pyr)、Ser(Ph-2-Cl)、MeGlyを含む15種類のアミノ酸を用いて、ＥｌｏｎｇａｔｏｒアミノアシルｔＲＮＡ混合物を調製した。それぞれのアシル化tRNAの翻訳液中の最終濃度は10μM～20μMであった。Ｐｎａｚ保護のｐＣｐＡアミノ酸は、脱保護を実施せずにフェノール抽出以降の作業を行った。ＩｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシルｔＲＮＡは、実施例５の化合物ＡＡｔＲ－３と同一化合物であり、最終濃度が25μMになるように翻訳液中に添加して用いた。

【0202】

ペプチド化合物ライブラリをコードするランダム化された2本鎖DNAライブラリ
特許文献（WO2013/100132）に記載の手法でDNAライブラリを構築した。TTT、TTG、CTT、ATT、ATG、GTT、CCG、ACT、GCT、CAT、CAG、AAC、GAA、TGG、CGG、AGT、AGG、GGTを含む24種類のトリプレットがランダムに8回ないし9回繰り返して出現するものを用意した。

【0203】

ビオチン化標的蛋白質の調製
パニングに使用する標的蛋白質として、GlutathioneS-transferase (GST)を用いた。GSTは大腸菌で発現調製したものを使用した。ビオチン化は非特許文献BMC biotechnology, 2008,8,41 及び非特許文献ProteinScience, 1990;108(4):673-6.に従って行った。

【0204】

パニングに使用する翻訳液
翻訳液は以下の物質を含む。１ｍＭのＧＴＰ、１ｍＭのＡＴＰ、２０ｍＭのクレアチンリン酸、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ ｐＨ７．６，１００ｍＭの酢酸カリウム、6 ｍＭの酢酸マグネシウム、２ｍＭのスペルミジン、１ｍＭのジチオスレイトール、１ｍｇ／ｍｌ Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社）（非特許文献：(Yokogawa T, Kitamura Y, Nakamura D, Ohno S, Nishikawa K. 2010.Nucleic acids research 38:e89）に記載の方法で、一部のtRNAを除去している）、４μｇ／ｍｌのクレアチンキナーゼ、３μｇ／ｍｌのミオキナーゼ、２ｕｎｉｔ／ｍｌの無機ピロフォスファターゼ、１．１μｇ／ｍｌのヌクレオシド二リン酸キナーゼ、０．２６μＭのＥＦ－Ｇ、２．７μＭのＩＦ１、０．４μＭのＩＦ２、１．５μＭのＩＦ３，４０μＭのＥＦ－Ｔｕ、４９μＭのＥＦ－Ｔｓ、１μＭのＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ、１．２μＭのリボソーム（L31short もしくは L31 intact）、２．７３μＭのＡｌａＲＳ、1 μＭのＧｌｙＲＳ、０．４μＭのＩｌｅＲＳ、０．５μＭの変異体ＰｈｅＲＳ（WO2016/148044）、０．１６μＭのＰｒｏＲＳ、１μＭの変異体ＳｅｒＲＳ（WO2016/148044）、０．０９μＭのＴｈｒＲＳ、１μＭの変異体ＶａｌＲＳ（WO2016/148044）、０．１１μＭのＬｙｓＲＳ、３μＭのin vitro転写大腸菌ｔＲＮＡ Ａｌａ１Ｂ、２５０μＭのグリシン、100μＭのイソロイシン、２５０μＭのプロリン、２５０μＭのスレオニン、２５０μＭのリジン、５ｍＭのＮ－メチルバリン、５ｍＭのＮ－メチルセリン、５ｍＭのＮ－メチルアラニン、５ｍＭのＮ－メチルフェニルアラニン、ＥｌｏｎｇａｔｏｒアミノアシルｔＲＮＡ混合物、25 μM InitiatorアミノアシルtRNA、10μM Penicillin G Amidase (ＰＧＡ)。

【0205】

パニングの実施
前述の二本鎖ＤＮＡライブラリとL31shortを含む翻訳液、もしくはL31intactを含む翻訳液を使用し、特許文献（ＷＯ２０１３／１００１３２）に倣ってパニングを実施した。GSTとビオチンとの間にＴＥＶプロテアーゼ認識配列を導入し、ＴＥＶプロテアーゼによる溶出を行った。ペプチドライブラリをビオチン化タンパク質と相互作用させた後に、ストレプトアビジン固定化磁気ビーズで回収後、洗浄作業を行った後、ビーズにＴＥＶ溶出液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１Ｕ／μＬ ＡｃＴＥＶプロテアーゼ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、製品番号１２５７５０１５））を添加し反応させた。反応後、上清を回収しＰＣＲを行った。

【0206】

濃縮配列の解析
最低１ラウンド以上で出現頻度がランクA：0.5 ％以上 またはランクB：0.05%以上または、ランクC：NGSのリード数が50以上、かつ直前のラウンドのプールを分割し標的を添加せずにパニングした場合に比べ、標的を添加した場合に出現頻度が１０倍以上増加する配列を抽出した。その結果、L31short リボソームを用いた翻訳系を用いた場合では、ランクAが33配列、ランクBが253配列ランクCが396配列であった。一方でL31intact リボソームを用いた翻訳系を用いた場合では、ランクAが32配列、ランクBが175配列、ランクCが247配列であった。L31shortリボソームを用いてパニングを実施した場合のほうがL31intactに比べてより多くの種類の配列を濃縮させる事ができた。

【0207】

実施例９．L31変異体リボソームを用いた翻訳実験
実施例9の概要
後述の実施例14に記載のとおり、L31の長さがそれぞれ異なる8種類のL31変異体株を構築した。実施例15に記載のとおり、それらの株と、L31short株、L31intact株、W3110株よりリボソームを調製した。得られた11種類のリボソームを用いてペプチドの翻訳合成を行い、L31変異体を含むリボソームの翻訳特性を調べた。
具体的には、表６にある、R1～R11の11種類のリボソームを用いて、2文字目のアミノ酸が異なる以下の3種類のペプチドを翻訳合成した。なお、本明細書において、以下のようにアミノ酸をコロンで区切ってアミノ酸配列を表記することがある。
AcbzMeCStBu:MeG:MeF:I:I:G:MeF:Bdp4AMF:I:I:P:I:G（配列番号：２９）
AcbzMeCStBu:MeStBuOH:MeF:I:I:G:MeF:Bdp4AMF:I:I:P:I:G（配列番号：３０）
AcbzMeCStBu:L:MeF:I:I:G:MeF:Bdp4AMF:I:I:P:I:G（配列番号：３１）
鋳型mRNAの配列mR-1（配列番号：１０）と2文字目を紡ぐアミノアシルtRNAとしてそれぞれMeG-tRNAGlu(CUG), MeSer(tBuOH)-tRNAGlu(CUG), Leu-tRNAGlu(CUG)を用いた。アミノアシルtRNAは実施例13で調製したものを用いた。

【0208】

【表6】

【0209】

LC-MSを用いて目的産物（TM）と、副生成物の定量を行った。副生成物として主に観測されたのは開始アミノ酸から3文字目のアミノ酸から翻訳が開始されたInitiation Read through(iRT)ペプチドであった。本明細書において、開始2文字目から翻訳が開始させるペプチドを1iRT、開始3文字目から翻訳が開始させるペプチドを2iRTと呼ぶことがある。TM（配列番号：29～31）とそれぞれに対する1iRTおよび2iRTを表７～表９に示す。

【0210】

【表7】

【0211】

【表8】

【0212】

【表9】

【0213】

翻訳条件
実施例7実験1の翻訳液組成から、in vitro転写大腸菌ｔＲＮＡ Ａｌａ１Ｂ、Lys、アミノアシルtRNAを除き、0.5uM HisRSを添加している点、6.72unit/ml ミオキナーゼ、59μＭ ＥＦ－Ｔｓ、4 mM酢酸マグネシウム、20μＭ ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシルｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－3）、10μM各種2文字目をコードするアミノアシルtRNA、1.2μM、各種リボソーム、1μMmRNAの組成である点を除き、実施例７の実験１の翻訳条件に従った。

【0214】

分析概要
実施例11にて合成したＬＣＴ67を標品として用いて検量線を作成し定量評価を行った以外は、実施例７の実験２の方法に従い分析を行った。

【0215】

結果
表１０の通り、3種類のいずれの配列においても、R1～R7とR11のリボソームを用いた翻訳ではTMの翻訳量が高く、Initiation Read through (iRT)ペプチドの割合が少ないという翻訳特性を示した。N末端からのアミノ酸残基数が62以下のL31変異体を含むリボソームは、翻訳活性が高くInitiation Read through (iRT)ペプチドの割合が少ないという特性を持つことが示された。なお、iRT割合は次の式で算出した。

【0216】

（数１）
iRT割合 = (iRT total濃度 [nM]) / (iRT total濃度 [nM] + TM 濃度[nM]) ×100

【0217】

【表10】

【0218】

実施例１０．様々なペプチドの翻訳合成におけるL31shortリボソームの効果
実験１ 開始アミノ酸をAcbzdMeCStBuとし、2文字目に各種アミノ酸を配置
実験1の概要
実施例2で精製したL31shortリボソーム、L31intactリボソームを用いて、2文字目のアミノ酸が異なる6種類のペプチドの翻訳合成を行い、L31shortリボソームの優位な翻訳特性が複数のペプチドの翻訳合成で認められる事を確認した。
具体的には、以下のアミノ酸配列（配列番号：３６）の2文字目のアミノ酸（X）が異なる6種類のペプチドを翻訳合成した。ここでXは、Nle、S3F5MePyr、SPh2Cl、I、T、またはLとした。
AcbzdMeCStBu:X:MeF:I:I:G:MeF:Bdp4AMF:I:I:P:I:G（配列番号：３６）

【0219】

鋳型mRNAの配列mR-1（配列番号：１０）と2文字目を紡ぐアミノアシルtRNAとしてそれぞれNle-tRNAGlu(CUG)、S3F5MePyr-tRNAGlu(CUG)、SPh2Cl-tRNAGlu(CUG)、Ile-tRNAGlu(CUG)、Thr-tRNAGlu(CUG)、Leu-tRNAGlu(CUG)を用いた。アミノアシルtRNAは実施例13で調製したものを用いた。

【0220】

LC-MSを用いて目的産物（TM）と、副生成物の定量を行った。副生成物として主に観測されたのは、1iRTと2iRTであった。iRT割合は次の式で算出した。

【0221】

（数１）
iRT割合 = (iRT total濃度 [nM]) / (iRT total濃度 [nM] + TM 濃度[nM]) ×100

【0222】

翻訳条件
実施例9の翻訳条件より、HisRSを除き、8 mM酢酸マグネシウム、3ug/ml ミオキナーゼ、
49μＭ ＥＦ－Ｔｓ、20μＭ ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシルｔＲＮＡ（Acbz-D-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU）（特許文献WO2017150732）の組成である点を除き、実施例9の翻訳条件に従った。

【0223】

分析概要
実施例9の方法に従い分析を行った。

【0224】

結果
表１１の通り、6種類中4配列においてTMの翻訳量はL31shortリボソームを用いた時に、L31intactリボソームを用いた場合に比べて、2.8倍から3.9倍上昇しており、6種類中全ての配列において、iRTの割合はL31shortリボソームを用いた時に、L31intactリボソームを用いた場合に比べて減少していた。

【0225】

【表11】

【0226】

実験2 開始アミノ酸をAcbzMeCStBuとし、2文字目に各種アミノ酸を配置
実験2の概要
実施例2で精製したL31shortリボソーム、L31intactリボソームを用いて、2文字目のアミノ酸が異なる12種類のペプチドの翻訳合成を行い、L31shortリボソームの優位な翻訳特性が複数のペプチドの翻訳合成で認められる事を確認した。
具体的には、以下のアミノ酸配列（配列番号：３７）の2文字目のアミノ酸（X）が異なる12種類のペプチドを翻訳合成した。ここでXは、Nle、MeG、MeF、S3F5MePyr、MeHph、MeA3Pyr、SPh2Cl、G、I、T、MeStBuOH、またはLとした。
AcbzMeCStBu:X:MeF:I:I:G:MeF:Bdp4AMF:I:I:P:I:G（配列番号：３７）

【0227】

2文字目を紡ぐアミノアシルtRNAとしてMeG-tRNAGlu(CUG)、MePhe-tRNAGlu(CUG)、MeHph-tRNAGlu(CUG)、MeA3Pyr-tRNAGlu(CUG)、Gly-tRNAGlu(CUG)、およびMeSer(tBuOH)-tRNAGlu(CUG)を追加で用いた以外は、実施例10の実験1に準じた方法で実験を行った。副生成物として主に観測されたのは、1iRTと2iRTであった。

【0228】

翻訳条件
4 mM酢酸マグネシウム、20μＭｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシルｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－3）である点を除き実施例10実験1の翻訳条件に従った。

【0229】

分析概要
実施例9の方法に従い分析を行った。

【0230】

結果
表１２の通り、12種類中11配列においてTMの翻訳量はL31shortリボソームを用いた時に、L31intactリボソームを用いた場合に比べて、1.6倍から3.7倍上昇しており、12種類中全配列において、iRTの割合はL31shortリボソームを用いた時に、L31intactリボソームを用いた場合に比べて減少していた。

【0231】

【表12】

【0232】

実験3 開始アミノ酸をAcbzCStBuとし、2文字目に各種アミノ酸を配置
実験3の概要
実施例2で精製したL31shortリボソーム、L31intactリボソームを用いて、2文字目のアミノ酸が異なる12種類のペプチドの翻訳合成を行い、L31shortリボソームの優位な翻訳特性が複数のペプチドの翻訳合成で認められる事を確認した。
具体的には、以下のアミノ酸配列（配列番号：３８）の2文字目のアミノ酸（X）が異なる12種類のペプチドを翻訳合成した。ここでXは、Nle、MeG、MeF、S3F5MePyr、MeHph、MeA3Pyr、SPh2Cl、G、I、T、MeStBuOH、またはLとした。実験は、実施例10の実験2に準じた方法で行った。
AcbzCStBu:X:MeF:I:I:G:MeF:Bdp4AMF:I:I:P:I:G（配列番号３８）

【0233】

LC-MSを用いて目的産物（TM）と、副生成物の定量を行った。副生成物として主に観測されたのは、1iRTと2iRTであった。

【0234】

翻訳条件
０．２３μＭ ＥＦ－Ｇ、5.92unit/mlミオキナーゼ2、１．0μｇ／ｍｌ ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、２．4μＭ ＩＦ１、１．3μＭ ＩＦ３、35μＭ ＥＦ－Ｔｕ、52μＭ ＥＦ－Ｔｓ、20μＭ ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシルｔＲＮＡ Acbz-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU（WO2017/150732）である点を除き、実施例9の翻訳条件に従った。

【0235】

分析概要
実施例9の方法に従い分析を行った。

【0236】

結果
表１３の通り、12種類中全配列においてTMの翻訳量はL31shortリボソームを用いた時に、L31intactリボソームを用いた場合に比べて、1.7倍から3.8倍上昇しており、12種類中全配列において、iRTの割合はL31shortリボソームを用いた時に、L31intactリボソームを用いた場合に比べて減少していた。

【0237】

【表13】

【0238】

実験4 開始アミノ酸をfMetとし、2文字目に各種アミノ酸を配置
実験4の概要
実施例2で精製したL31shortリボソーム、L31intactリボソームを用いて、2文字目のアミノ酸が異なる13種類のペプチドの翻訳合成を行い、L31shortリボソームの優位な翻訳特性が複数のペプチドの翻訳合成で認められる事を確認した。
具体的には、以下のアミノ酸配列（配列番号：３９）の2文字目のアミノ酸（X）が異なる13種類のペプチドを翻訳合成した。ここでXは、Nle、MeG、MeF、S3F5MePyr、Pic(2)、MeHph、MeA3Pyr、SPh2Cl、G、I、T、MeStBuOH、またはLとした。
fMet:X:MeF:I:I:G:MeF:Bdp4AMF:I:I:P:I:G（配列番号：３９）

【0239】

2文字目を紡ぐアミノアシルtRNAとしてPic(2)-tRNAGlu(CUG) を追加で用いた以外は、実施例10の実験2に準じた方法で実験を行った。LC-MSを用いて目的産物（TM）と、副生成物の定量を行った。副生成物として主に観測されたのは、1iRTと2iRTであった。

【0240】

翻訳条件
ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシルｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－3）を除き、0.03μM MetRS、0.6μM メチオニルtRNAホルミルトランスフェラーゼ、0.25mM メチオニン、0.1mM folateを添加した点以外は、実施例10実験2の翻訳条件に従った。

【0241】

分析概要
実施例9の方法に従い分析を行った。

【0242】

結果
表１４の通り、13種類中12配列においてTMの翻訳量はL31shortリボソームを用いた時に、L31intactリボソームを用いた場合に比べて、1.2倍から2倍上昇しており、13種類中全配列において、iRTの割合はL31shortリボソームを用いた時に、L31intactリボソームを用いた場合に比べて減少していた。

【0243】

【表14】

【0244】

実験5 開始アミノ酸をAcbzMeCStBu、2文字目のアミノ酸をThrとし、3文字目に各種アミノ酸を配置
実験5の概要
実施例15で精製したL31shortリボソーム、L31intactリボソームを用いて、3文字目のアミノ酸が異なる14種類のペプチドの翻訳合成を行い、L31shortリボソームの優位な翻訳特性が複数のペプチドの翻訳合成で認められる事を確認した。
具体的には、以下のアミノ酸配列（配列番号：４０）の3文字目のアミノ酸（X）が異なる14種類のペプチドを翻訳合成した。ここでXは、Nle、MeF、S3F5MePyr、Pic(2)、MeHph、MeA3Pyr、SPh2Cl、G、I、P、T、MeStBuOH、dA、またはLとした。
AcbzMeCStBu:T:X:I:I:G:MeF:Bdp4AMF:I:I:P:I:G（配列番号：４０）

【0245】

鋳型mRNAの配列mR-3（配列番号：２８）と3文字目を紡ぐアミノアシルtRNAとしてそれぞれNle-tRNAGlu(CUG)、MePhe-tRNAGlu(CUG)、S3F5MePyr-tRNAGlu(CUG)、Pic(2)-tRNAGlu(CUG)、MeHph-tRNAGlu(CUG)、MeA3Pyr-tRNAGlu(CUG)、SPh2Cl-tRNAGlu(CUG)、Gly-tRNAGlu(CUG)、Ile-tRNAGlu(CUG) 、Pro-tRNAGlu(CUG)、Thr-tRNAGlu(CUG)、MeSer(tBuOH)-tRNAGlu(CUG)、D-Ala-tRNAGlu(CUG) 、Leu-tRNAGlu(CUG)を用いた。アミノアシルtRNAは実施例13で調製したものを用いた。

【0246】

LC-MSを用いて目的産物（TM）と、副生成物の定量を行った。副生成物として主に観測されたのは、1iRTと2iRTであった。

【0247】

mRNAの調製
鋳型ＤＮＡ(配列番号：２７)から、RiboMAX Large Scale RNA production System T7（Promega社，Ｐ1280）を用いたinvitro 転写反応により鋳型ｍＲＮＡ、配列ｍＲ－3(配列番号：２８）を調製し、RNeasy Mini kit（Qiagen社）により精製した。

【0248】

翻訳条件
10uM 各種3文字目をコードするアミノアシルtRNAを添加する点を除き、実施例9の翻訳条件に従った。

【0249】

分析概要
実施例9の方法に従い分析を行った。

【0250】

結果
表１５の通り、14種類中全配列においてTMの翻訳量はL31shortリボソームを用いた時に、L31intactリボソームを用いた場合に比べて、1.1倍から20.9倍上昇しており、14種類中全配列において、iRTの割合はL31shortリボソームを用いた時に、L31intactリボソームを用いた場合に比べて減少していた。表中の「1iRT+2iRT濃度」は、クロマトグラムにおいて1iRTおよび2iRTのそれぞれに相当するピークが分離しなかった場合に、各ピークの合算値から定量した1iRTおよび2iRTの合算濃度を表す。

【0251】

【表15】

【0252】

実験6 開始アミノ酸をfMet、2文字目のアミノ酸をThrとし、3文字目に各種アミノ酸を配置
実験6の概要
実施例15で精製したL31shortリボソーム、L31intactリボソームを用いて、3文字目のアミノ酸が異なる15種類のペプチドの翻訳合成を行い、L31shortリボソームの優位な翻訳特性が複数のペプチドの翻訳合成で認められる事を確認した。
具体的には、以下のアミノ酸配列（配列番号：４１）の3文字目のアミノ酸（X）が異なる15種類のペプチドを翻訳合成した。ここでXは、Nle、MeG、MeF、S3F5MePyr、Pic(2)、MeHph、MeA3Pyr、SPh2Cl、G、I、P、T、MeStBuOH、dA、またはLとした。
fMet:T:X:I:I:G:MeF:Bdp4AMF:I:I:P:I:G（配列番号：４１）

【0253】

3文字目を紡ぐアミノアシルtRNAとしてMeG-tRNAGlu(CUG)を追加で用いた以外は、実施例10の実験5に準じた方法で実験を行った。LC-MSを用いて目的産物（TM）と、副生成物の定量を行った。副生成物として主に観測されたのは、1iRTと2iRTであった。

【0254】

翻訳条件
6.72unit/ml ミオキナーゼ、59μＭ ＥＦ－Ｔｓ、0.09μＭ ＧｌｙＲＳである点を除き、実施例10実験4に従った。

【0255】

分析概要
実施例9の方法に従い分析を行った。

【0256】

結果
表１６の通り、15種類中全配列においてTMの翻訳量はL31shortリボソームを用いた時に、L31intactリボソームを用いた場合に比べて上昇しており、L31intactを用いた時のTMの翻訳量は検出限界以下であった。15種類中全配列において、iRTの割合はL31shortリボソームを用いた時に、L31intactリボソームを用いた場合に比べて減少していた。表中の「1iRT+2iRT濃度」は、クロマトグラムにおいて1iRTおよび2iRTのそれぞれに相当するピークが分離しなかった場合に、各ピークの合算値から定量した1iRTおよび2iRTの合算濃度を表す。

【0257】

【表16】

【0258】

実施例１１．LCT-67の合成
LC/MSの標品として用いるN末端にBdpFLを持つペプチド(LCT-67)を以下の手順で合成した。
Fmoc-Gly-OHを担持させた2-クロロ卜リチルレジン(100 mg)を用い、Fmocアミノ酸としてFmoc-Gly-OH、特許文献(WO2018225864)記載の方法で合成したFmoc-Thr(THP)-OH(aa01)、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-MePhe-OH、Fmoc-Pro-OHを用いてペプチド合成機にてペプチドの伸長を行った(アミノ酸の略号については本明細書中に別途記載)。Fmoc法によるペプチド合成法(例えばWO2013100132を参照)に従い、ペプチドの伸長を行った。ペプチドの伸長後、N末端のFmoc基の除去をペプチド合成機上で行った後、レジンをDCMにて洗浄した。

【0259】

レジンにTFE/DCM(1:1、v/v、2 mL)を加えて1時間振とうし、ペプチドのレジンからの切り出しを行った。反応終了後、チューブ内の溶液を合成用カラムでろ過することによりレジンを除き、レジンをTFE/DCM(1:1、v/v、1mL)にて2回洗浄した。全ての抽出液を混合し、DMF(2mL)を加えた後、減圧下濃縮した。得られた残査をNMP(1 mL)に溶解し、4,4-ジフルオロ-5,7-ジメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-プロピオン酸N-スクシンイミジルエステル(5 mg、0.013mmol)を室温にて加え、19時間撹拌した後、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.1％FA MeCN/H₂O)に通し、中間体を含むフラクションを減圧下濃縮した。得られた残査を5％TFA in DCM(2 mL)に溶解し、室温で2時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮した後、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.1％FA MeCN/H₂O)にて精製し、表題化合物(LCT-67)(13 mg)を得た。LCT-67のアミノ酸配列を配列番号：223に示す。
LCMS(ESI) m/z ＝1751.2(M-H)-
保持時間：0.97分(分析条件SQDFA05_02)

【0260】

実施例１２．pCpAアミノ酸の合成
本実施例では、以下の略号を用いた。ＧｌｙまたはＧ（グリシン）、ＩｌｅまたはＩ（イソロイシン）、ＬｅｕまたはＬ（ロイシン）、ＰｈｅまたはＦ（フェニルアラニン）、ＰｒｏまたはＰ（プロリン）、ＴｈｒまたはＴ（トレオニン）。
ＬＣＭＳの分析条件を、下記の表１７に示す。

【0261】

【表17】

【0262】

以下のスキームに従い、アミノアシルｐＣｐＡ（ＳＴ０４、ＳＴ０８、ＳＴ１１、ＳＴ１４、ＳＴ１７、ＳＴ２０、ＳＴ２３、ＳＴ２８、ＳＴ３１、ＳＴ３２、ＳＴ３３、ＳＴ３４）を合成した。

【化12】

【0263】

（２Ｓ）－２－アミノヘキサン酸（化合物ＳＴ０１、Ｎｌｅ－ＯＨ）の合成

【化13】

【0264】

窒素雰囲気下、特許文献（ＷＯ２０１８２２５８５１Ａ１）記載の方法で合成した（２Ｓ）－２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）ヘキサン酸（３５．３ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）にＤＣＭ（０．２ｍｌ）Ｈ２Ｏ（０．８ｍｌ）を室温にて加えた後、４－（３－フェニルプロピル）ピペリジン（０．２１２ｍｌ、１．００ｍｍｏｌ）を室温にて加えて３０分撹拌した。反応混合物を静置し水層を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（２Ｓ）－２－アミノヘキサン酸（化合物ＳＴ０１、Ｎｌｅ－ＯＨ）（１０ｍｇ、７６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ １３０．０ （Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．１４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

【0265】

（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］ヘキサン酸（化合物ＳＴ０２、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｎｌｅ－ＯＨ）の合成

【化14】

【0266】

窒素雰囲気下、（２Ｓ）－２－アミノヘキサン酸（化合物ＳＴ０１、Ｎｌｅ－ＯＨ）（３．９４ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）、特許文献（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）記載の方法で合成した炭酸－（４－ニトロフェニル）－４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（１２．７ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（１５０ｕＬ）、トリエチルアミン（９．６２ｕｌ、０．０７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温において１時間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］ヘキサン酸（化合物ＳＴ０２、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｎｌｅ－ＯＨ）（９ｍｇ、７２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４１５．３ （Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．７４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

【0267】

シアノメチル（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］ヘキサノアト（化合物ＳＴ０３、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｎｌｅ－ＯＣＨ _２ ＣＮ）の合成

【化15】

【0268】

窒素雰囲気下、（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］ヘキサン酸（化合物ＳＴ０２、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｎｌｅ－ＯＨ）（８．３ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（０．１ｍｌ）に、２－ブロモアセトニトリル（２．０μＬ、０．０３ｍｍｏｌ）及びＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（７．０μＬ、０．０４ｍｍｏｌ）を室温にて順番に加えた。反応混合物を室温にて１６時間撹拌したのち反応液を濃縮し、粗生成物シアノメチル （２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］ヘキサノアト（化合物ＳＴ０３、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｎｌｅ－ＯＣＨ_２ＣＮ）を得た。得られた粗生成物をアセトニトリル（０．４５ｍＬ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４５４．４ （Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．８３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

【0269】

［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－［［［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１－イル）－４－ヒドロキシ－２－（ホスホノオキシメチル）オキソラン－３－イル］オキシ－ヒドロキシホスホリル］オキシメチル］－５－（６－アミノプリン－９－イル）－４－ヒドロキシオキソラン－３－イル］ （２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］ヘキサノアト（化合物ＳＴ０４、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｎｌｅ－ｐＣｐＡ）の合成

【化16】

【0270】

緩衝液Ａ（９ｍＬ）に、文献（Helv. Chim. Acta, 90,297-310）記載の方法で合成したリン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（２２ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を溶解させ、シアノメチル （２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］ヘキサノアト（化合物ＳＴ０３、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｎｌｅ－ＯＣＨ_２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（０．４５ｍＬ、０．０２ｍｍｏｌ）を投与し、室温で９０分撹拌した。反応液を０℃に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（０．４５ｍＬ）を加えた。反応液を室温にて３０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ＳＴ０４、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｎｌｅ－ｐＣｐＡ）（５．７ｍｇ、２７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ １０４９．７ （Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．５４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

【0271】

なお、緩衝液Ａは以下のように調製した。
Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルヘキサデカン－１－アミニウム 塩化物（６．４０ｇ、２０ｍｍｏｌ）とイミダゾール（６．８１ｇ、１００ｍｍｏｌ）の水溶液に酢酸を添加し、ｐＨ８、２０ｍＭ Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルヘキサデカン－１－アミニウム、１００ｍＭイミダゾールの緩衝液Ａ（１Ｌ）を得た。

【0272】

（２Ｓ）－２－アミノ－３－［（５－フルオロピリジン－３－イル）メトキシ］プロパン酸（化合物ＳＴ０５、Ｓ３Ｆ５ＭｅＰｙｒ－ＯＨ）の合成

【化17】

【0273】

窒素雰囲気下、特許文献（ＷＯ２０１８２２５８６４Ａ１）記載の方法で合成した（２Ｓ）－２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－３－［（５－フルオロピリジン－３－イル）メトキシ］プロパン酸（４３．６ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）にＤＣＭ（０．２ｍｌ）Ｈ２Ｏ（０．２ｍｌ）を室温にて加えた後、４－（３－フェニルプロピル）ピペリジン（６３．５ｕｌ、０．３ｍｍｏｌ）を室温にて加えて１時間撹拌した。反応混合物を静置し水層を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（２Ｓ）－２－アミノ－３－［（５－フルオロピリジン－３－イル）メトキシ］プロパン酸（化合物ＳＴ０５、Ｓ３Ｆ５ＭｅＰｙｒ－ＯＨ）（１４ｍｇ、６６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ２１３．０ （Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．１９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

【0274】

（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－［（５－フルオロピリジン－３－イル）メトキシ］プロパン酸（化合物ＳＴ０６、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｓ３Ｆ５ＭｅＰｙｒ－ＯＨ）の合成

【化18】

【0275】

窒素雰囲気下、（２Ｓ）－２－アミノ－３－［（５－フルオロピリジン－３－イル）メトキシ］プロパン酸（化合物ＳＴ０５、Ｓ３Ｆ５ＭｅＰｙｒ－ＯＨ）（１０．７ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）、特許文献（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）記載の方法で合成した炭酸－（４－ニトロフェニル）－４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（２１．２ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（２５０ｕＬ）、トリエチルアミン（１６．０ｕｌ、０．１２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温において１時間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］ヘキサン酸（化合物ＳＴ０６、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｓ３Ｆ５ＭｅＰｙｒ－ＯＨ）（２３ｍｇ、９２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４９８．４ （Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．６６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

【0276】

シアノメチル（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－［（５－フルオロピリジン－３－イル）メトキシ］プロパノエート（化合物ＳＴ０７、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｓ３Ｆ５ＭｅＰｙｒ－ＯＣＨ _２ ＣＮ）の合成

【化19】

【0277】

窒素雰囲気下、（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－［（５－フルオロピリジン－３－イル）メトキシ］プロパン酸（化合物ＳＴ０６、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｓ３Ｆ５ＭｅＰｙｒ－ＯＨ）（９．９９ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（０．１ｍｌ）に、２－ブロモアセトニトリル（２．０μＬ、０．０３ｍｍｏｌ）及びＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（７．０μＬ、０．０４ｍｍｏｌ）を室温にて順番に加えた。反応混合物を室温にて１６時間撹拌したのち反応液を濃縮し、粗生成物シアノメチル （２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－［（５－フルオロピリジン－３－イル）メトキシ］プロパノエート（化合物ＳＴ０７、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｓ３Ｆ５ＭｅＰｙｒ－ＯＣＨ_２ＣＮ）を得た。得られた粗生成物をアセトニトリル（０．４５ｍＬ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ５３７．３ （Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．７４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

【0278】

［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－［［［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１－イル）－４－ヒドロキシ－２－（ホスホノオキシメチル）オキソラン－３－イル］オキシ－ヒドロキシホスホリル］オキシメチル］－５－（６－アミノプリン－９－イル）－４－ヒドロキシオキソラン－３－イル］ （２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－［（５－フルオロピリジン－３－イル）メトキシ］プロパノエート（化合物ＳＴ０８、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｓ３Ｆ５ＭｅＰｙｒ－ｐＣｐＡ）の合成

【化20】

【0279】

緩衝液Ａ（９ｍＬ）に、文献（Helv. Chim. Acta, 90,297-310）記載の方法で合成したリン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（２２ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を溶解させ、シアノメチル （２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－［（５－フルオロピリジン－３－イル）メトキシ］プロパノエート（化合物ＳＴ０７、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｓ３Ｆ５ＭｅＰｙｒ－ＯＣＨ_２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（０．４５ｍＬ、０．０２ｍｍｏｌ）を投与し、室温で４０分撹拌した。反応液を０℃に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（０．４５ｍＬ）を加えた。反応液を０℃で１時間撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ＳＴ０８、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｓ３Ｆ５ＭｅＰｙｒ－ｐＣｐＡ）（６．５ｍｇ、２９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ １１３２．７ （Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．５１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

【0280】

（２Ｓ）－１－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル］ピロリジン－２－カルボン酸（化合物ＳＴ０９、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｐｒｏ－ＯＨ）の合成

【化21】

【0281】

窒素雰囲気下、Ｌ－プロリン（４６．１ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、特許文献（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）記載の方法で合成した炭酸－（４－ニトロフェニル）－４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（１７８ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（２．００ｍＬ）、トリエチルアミン（１２８ｕｌ、０．９２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温において２日間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（２Ｓ）－１－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル］ピロリジン－２－カルボン酸（化合物ＳＴ０９、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｐｒｏ－ＯＨ）（１５７ｍｇ、９８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３９９．２ （Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．６６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

【0282】

２－Ｏ－（シアノメチル） １－Ｏ－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メチル］ （２Ｓ）－ピロリジン－１，２－ジカルボキシラート（化合物ＳＴ１０、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｐｒｏ－ＯＣＨ _２ ＣＮ）の合成

【化22】

【0283】

窒素雰囲気下、（２Ｓ）－１－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル］ピロリジン－２－カルボン酸（化合物ＳＴ０９、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｐｒｏ－ＯＨ）（４０．０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（０．５ｍｌ）に、２－ブロモアセトニトリル（１３．０μＬ、０．２０ｍｍｏｌ）及びＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（３５．０μＬ、０．２０ｍｍｏｌ）を室温にて順番に加えた。反応混合物を室温にて１６時間撹拌したのち反応液を濃縮し、粗生成物２－Ｏ－（シアノメチル） １－Ｏ－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メチル］ （２Ｓ）－ピロリジン－１，２－ジカルボキシラート（化合物ＳＴ１０、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｐｒｏ－ＯＣＨ_２ＣＮ）を得た。得られた粗生成物をアセトニトリル（３．００ｍＬ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４３８．３ （Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．７６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

【0284】

２－Ｏ－［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－［［［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１－イル）－４－ヒドロキシ－２－（ホスホノオキシメチル）オキソラン－３－イル］オキシ－ヒドロキシホスホリル］オキシメチル］－５－（６－アミノプリン－９－イル）－４－ヒドロキシオキソラン－３－イル］ １－Ｏ－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メチル］ （２Ｓ）－ピロリジン－１，２－ジカルボキシラート（化合物ＳＴ１１、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｐｒｏ－ｐＣｐＡ）の合成

【化23】

【0285】

緩衝液Ａ（６０ｍＬ）に、文献（Helv. Chim. Acta, 90,297-310）記載の方法で合成したリン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（７２．２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を溶解させ、２－Ｏ－（シアノメチル） １－Ｏ－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メチル］ （２Ｓ）－ピロリジン－１，２－ジカルボキシラート（化合物ＳＴ１０、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｐｒｏ－ＯＣＨ_２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（３．００ｍＬ、０．１０ｍｍｏｌ）を投与し、室温で２０時間撹拌した。反応液を０℃に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（３．００ｍＬ）を加えた。反応液を室温で３０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ＳＴ１１、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｐｒｏ－ｐＣｐＡ）（１１ｍｇ、１１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ １０３３．４ （Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．４９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

【0286】

２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］酢酸（化合物ＳＴ１２、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｇｌｙ－ＯＨ）の合成

【化24】

【0287】

窒素雰囲気下、グリシン（３０．０ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、特許文献（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）記載の方法で合成した炭酸－（４－ニトロフェニル）－４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（１７８ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（２．００ｍＬ）、トリエチルアミン（１２８ｕｌ、０．９２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温において２日間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］酢酸（化合物ＳＴ１２、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｇｌｙ－ＯＨ）（５７ｍｇ、４０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３５９．２ （Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．６０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

【0288】

シアノメチル２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］アセテート（化合物ＳＴ１３、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｇｌｙ－ＯＣＨ _２ ＣＮ）の合成

【化25】

【0289】

窒素雰囲気下、２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］酢酸（化合物ＳＴ１２、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｇｌｙ－ＯＨ）（３６．０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（０．５ｍｌ）に、２－ブロモアセトニトリル（１３．０μＬ、０．２０ｍｍｏｌ）及びＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（３５．０μＬ、０．２０ｍｍｏｌ）を室温にて順番に加えた。反応混合物を室温にて１６時間撹拌したのち反応液を濃縮し、粗生成物シアノメチル ２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］アセテート（化合物ＳＴ１３、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｇｌｙ－ＯＣＨ_２ＣＮ）を得た。得られた粗生成物をアセトニトリル（３．００ｍＬ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３９８．３ （Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．６９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

【0290】

［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－［［［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１－イル）－４－ヒドロキシ－２－（ホスホノオキシメチル）オキソラン－３－イル］オキシ－ヒドロキシホスホリル］オキシメチル］－５－（６－アミノプリン－９－イル）－４－ヒドロキシオキソラン－３－イル］ ２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］アセテート（化合物ＳＴ１４、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｇｌｙ－ｐＣｐＡ）の合成

【化26】

【0291】

緩衝液Ａ（６０ｍＬ）に、文献（Helv. Chim. Acta, 90,297-310）記載の方法で合成したリン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（７２．２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を溶解させ、シアノメチル ２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］アセテート（化合物ＳＴ１３、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｇｌｙ－ＯＣＨ_２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（３．００ｍＬ、０．１０ｍｍｏｌ）を投与し、室温で９０分撹拌した。反応液を０℃に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（３．００ｍＬ）を加えた。反応液を室温で３０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ＳＴ１４、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｇｌｙ－ｐＣｐＡ）（１６ｍｇ、１６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ９９３．６ （Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．４７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

【0292】

（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－ヒドロキシブタン酸（化合物ＳＴ１５、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｔｈｒ－ＯＨ）の合成

【化27】

【0293】

窒素雰囲気下、Ｌ－トレオニン（４７．６ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、特許文献（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）記載の方法で合成した炭酸－（４－ニトロフェニル）－４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（１７８ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（２．００ｍＬ）、トリエチルアミン（１２８ｕｌ、０．９２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温において２日間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－ヒドロキシブタン酸（化合物ＳＴ１５、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｔｈｒ－ＯＨ）（１４１ｍｇ、８７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４０３．３ （Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．５９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

【0294】

シアノメチル （２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－ヒドロキシブタノアト（化合物ＳＴ１６、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｔｈｒ－ＯＣＨ _２ ＣＮ）の合成

【化28】

【0295】

窒素雰囲気下、（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－ヒドロキシブタン酸（化合物ＳＴ１５、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｔｈｒ－ＯＨ）（８１．０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（１．０ｍｌ）に、２－ブロモアセトニトリル（２６８μＬ、４．００ｍｍｏｌ）及びＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（６９．９μＬ、０．４０ｍｍｏｌ）を室温にて順番に加えた。反応混合物を室温にて３時間撹拌したのち逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、シアノメチル （２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－ヒドロキシブタノアト（化合物ＳＴ１６、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｔｈｒ－ＯＣＨ_２ＣＮ）（７２．０ｍｇ、８１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４４２．３ （Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．６８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

【0296】

［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－［［［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１－イル）－４－ヒドロキシ－２－（ホスホノオキシメチル）オキソラン－３－イル］オキシ－ヒドロキシホスホリル］オキシメチル］－５－（６－アミノプリン－９－イル）－４－ヒドロキシオキソラン－３－イル］ （２Ｓ，３Ｒ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－ヒドロキシブタノアト（化合物ＳＴ１７、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｔｈｒ－ｐＣｐＡ）の合成

【化29】

【0297】

緩衝液Ａ（６０ｍＬ）に、文献（Helv. Chim. Acta, 90,297-310）記載の方法で合成したリン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（７２．２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を溶解させ、シアノメチル （２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－ヒドロキシブタノアト（化合物ＳＴ１６、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｔｈｒ－ＯＣＨ_２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（３．００ｍＬ、０．１０ｍｍｏｌ）を投与し、室温で９０分撹拌した。反応液を０℃に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（３．００ｍＬ）を加えた。反応液を室温で３０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ＳＴ１７、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｔｈｒ－ｐＣｐＡ）（７ｍｇ、７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ １０３７．４ （Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．４８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

【0298】

（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－４－メチルペンタン酸（化合物ＳＴ１８、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｌｅｕ－ＯＨ）の合成

【化30】

【0299】

窒素雰囲気下、Ｌ－ロイシン（１３．１ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）、特許文献（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）記載の方法で合成した炭酸－（４－ニトロフェニル）－４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（４２．４ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（０．５０ｍＬ）、トリエチルアミン（３２．１ｕｌ、０．２３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温において１時間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－４－メチルペンタン酸（化合物ＳＴ１８、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｌｅｕ－ＯＨ）（２８ｍｇ、６７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４１５．３ （Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．７３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

【0300】

シアノメチル （２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－４－メチルペンタノアト（化合物ＳＴ１９、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｌｅｕ－ＯＣＨ _２ ＣＮ）の合成

【化31】

【0301】

窒素雰囲気下、（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－４－メチルペンタン酸（化合物ＳＴ１８、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｌｅｕ－ＯＨ）（１２．０ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（７５．０ｕｌ）に、２－ブロモアセトニトリル（２０．０μＬ、０．３０ｍｍｏｌ）及びＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（７．８６μＬ、０．０５ｍｍｏｌ）を室温にて順番に加えた。反応混合物を室温にて１時間撹拌したのち反応液を濃縮し、粗生成物シアノメチル （２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－４－メチルペンタノアト（化合物ＳＴ１９、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｌｅｕ－ＯＣＨ_２ＣＮ）を得た。得られた粗生成物をアセトニトリル（０．７５ｍＬ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４５４．３ （Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．８２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

【0302】

［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－［［［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１－イル）－４－ヒドロキシ－２－（ホスホノオキシメチル）オキソラン－３－イル］オキシ－ヒドロキシホスホリル］オキシメチル］－５－（６－アミノプリン－９－イル）－４－ヒドロキシオキソラン－３－イル］ （２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－４－メチルペンタノアト（化合物ＳＴ２０、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｌｅｕ－ｐＣｐＡ）の合成

【化32】

【0303】

緩衝液Ａ（１５ｍＬ）に、文献（Helv. Chim. Acta, 90,297-310）記載の方法で合成したリン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（７２．２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を溶解させ、シアノメチル （２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－４－メチルペンタノアト（化合物ＳＴ１９、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｌｅｕ－ＯＣＨ_２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（０．７５ｍＬ、０．１０ｍｍｏｌ）を投与し、室温で６０分撹拌した。反応液を０℃に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（０．７５ｍＬ）を加えた。反応液を室温で３０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ＳＴ２０、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｌｅｕ－ｐＣｐＡ）（９．６ｍｇ、３１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ １０４９．６ （Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．５４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

【0304】

２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル－メチルアミノ］酢酸（化合物ＳＴ２１、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＧ－ＯＨ）の合成

【化33】

【0305】

窒素雰囲気下、サルコシン（４８３ｍｇ、５．４２ｍｍｏｌ）、特許文献（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）記載の方法で合成した炭酸－（４－ニトロフェニル）－４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）（２.０ｇ、４．７１ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（１５ｍＬ）、トリエチルアミン（９５３．４ｍｇ、９．４２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温において１６時間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル－メチルアミノ］酢酸（化合物ＳＴ２１、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＧ－ＯＨ）（１．４ｇ、７９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３９７ （Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：０．８８分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ３）

【0306】

シアノメチル ２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル－メチルアミノ］アセテート（化合物ＳＴ２２、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＧ－ＯＣＨ _２ ＣＮ）の合成

【化34】

【0307】

窒素雰囲気下、２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル－メチルアミノ］酢酸（化合物ＳＴ２１、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＧ－ＯＨ）（１．３８ｇ、３．６９ｍｍｏｌ）およびＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．９５ｇ、７．３８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２８ｍＬ）に溶解し、２－ブロモアセトニトリル（１．７４ｇ、１４．７５ｍｍｏｌ）を室温において加え、室温で１６時間撹拌した。反応液を濃縮し、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／石油エーテル）にて精製し、シアノメチル ２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル－メチルアミノ］アセテート（化合物ＳＴ２２、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＧ－ＯＣＨ_２ＣＮ）（１．２ｇ、７９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４３６ （Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：０．７０分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ４）

【0308】

［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－［［［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１－イル）－４－ヒドロキシ－２－（ホスホノオキシメチル）オキソラン－３－イル］オキシ－ヒドロキシホスホリル］オキシメチル］－５－（６－アミノプリン－９－イル）－４－ヒドロキシオキソラン－３－イル］ ２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル－メチルアミノ］アセテート化合物ＳＴ２３、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＧ－ｐＣｐＡ）の合成

【化35】

【0309】

緩衝液Ａ（１００ｍＬ）に、文献（Helv. Chim. Acta, 90,297-310）記載の方法で合成したリン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（４２２ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）を溶解させ、シアノメチル ２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル－メチルアミノ］アセテート（化合物ＳＴ２２、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＧ－ＯＣＨ_２ＣＮ）（１２０．７ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（５ｍＬ）をシリンジポンプを用いて１５分以上かけて滴下し、室温で５時間撹拌した。反応液にトリフルオロ酢酸（２．３ｍＬ）を加え、反応液を凍結乾燥したのちに、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ＳＴ２３、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＧ－ｐＣｐＡ）（７６．７ｍｇ、２６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ １００７．５ （Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．４８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

【0310】

化合物ＳＴ２８の合成中間体は、以下のスキームに従って合成した。

【化36】

【0311】

（２Ｓ）－２－［９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニル（メチル）アミノ］－３－ピリジン－３－イルプロパン酸 ２，２，２－トリフルオロ酢酸（化合物ＳＴ２４、Ｆｍｏｃ－ＭｅＡ３Ｐｙｒ－ＯＨ・ＴＦＡ）の合成

【化37】

【0312】

（２Ｓ）－２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－３－ピリジン－３－イルプロパン酸（１５ｇ、３８．６２ｍｍｏｌ）、トリフルオロ酢酸（２７ｍＬ、３４８ｍｍｏｌ）およびパラホルムアルデヒド（（ＣＨ_２Ｏ）_ｎ）（３．４８ｇ、１１６ｍｍｏｌ）をトルエン（５０ｍＬ）に懸濁させ、窒素雰囲気下、４０℃で１６時間撹拌した。室温へと冷却後、反応液を減圧濃縮した。残渣をＤＣＭに溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過および減圧濃縮することで溶媒を除去し、(S)-5-オキソ-4-(ピリジン-3-イルメチル)オキサゾリジン-3-カルボン酸(9H-フルオレン-9-イル)メチルを粗生成物として得た。

【0313】

得られた粗生成物である(S)-5-オキソ-4-(ピリジン-3-イルメチル)オキサゾリジン-3-カルボン酸 (9H-フルオレン-9-イル)（１８ｇ、４４．９５ｍｍｏｌ）をジクロロエタン（１００ｍＬ）に溶解し、トリエチルシラン（Ｅｔ_３ＳｉＨ）（４７ｇ、４０４．２０ｍｍｏｌ）およびトリフルオロ酢酸（１００ｍＬ）を室温で加えた。反応液を窒素雰囲気下、７０℃で１６時間撹拌した後、反応液を減圧濃縮した。得られた残渣を酢酸イソプロピルに溶解し、ｔ－ブチルメチルエーテルとヘキサンの混合溶液（９：１）を加えた。その溶液を室温で２０分間撹拌した後、４℃にて１時間静置した。生じた沈殿物をろ過にて回収し、冷却したｔ－ブチルメチルエーテルとヘキサンの混合溶液（９：１）で洗浄し、（２Ｓ）－２－［９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニル（メチル）アミノ］－３－ピリジン－３－イルプロパン酸 ２，２，２－トリフルオロ酢酸（化合物ＳＴ２４、Ｆｍｏｃ－ＭｅＡ３Ｐｙｒ－ＯＨ・ＴＦＡ）（１９ｇ、９５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４０３ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７７分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ１）

【0314】

（２Ｓ）－２－（メチルアミノ）－３－ピリジン－３－イルプロパン酸（化合物ＳＴ２５、ＭｅＡ３Ｐｙｒ－ＯＨ）の合成

【化38】

【0315】

（２Ｓ）－２－［９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニル（メチル）アミノ］－３－ピリジン－３－イルプロパン酸； ２，２，２－トリフルオロ酢酸（化合物ＳＴ２４、Ｆｍｏｃ－ＭｅＡ３Ｐｙｒ－ＯＨ・ＴＦＡ）（１９ｇ、４７．２１ｍｍｏｌ）に室温にてＤＭＦ（７２ｍＬ）およびピペリジン（２８．５ｍＬ）を添加し、反応混合物を室温において３時間撹拌した。ジエチルエーテル（１４０ｍＬ）およびヘキサン（２８０ｍＬ）を加え、室温においてさらに３時間撹拌した。生じた沈殿物をろ過にて回収し、（２Ｓ）－２－（メチルアミノ）－３－ピリジン－３－イルプロパン酸（化合物ＳＴ２５、ＭｅＡ３Ｐｙｒ－ＯＨ）（７ｇ）を定量的に得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ １８１ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．１５分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ２）

【0316】

（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル－メチルアミノ］－３－ピリジン－３－イルプロパン酸（化合物ＳＴ２６、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＡ３Ｐｙｒ－ＯＨ）の合成

【化39】

【0317】

窒素雰囲気下、（２Ｓ）－２－（メチルアミノ）－３－ピリジン－３－イルプロパン酸（化合物ＳＴ２５、ＭｅＡ３Ｐｙｒ－ＯＨ）（９７０ｍｇ、５．３８ｍｍｏｌ）、特許文献（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）記載の方法で合成した炭酸－（４－ニトロフェニル）－４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（２ｇ、４．７１ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（１５ｍＬ）、トリエチルアミン（９５０ｍｇ、９．４３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を４０℃において１６時間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル－メチルアミノ］－３－ピリジン－３－イルプロパン酸（化合物ＳＴ２６、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＡ３Ｐｙｒ－ＯＨ）（１．０ｇ、４６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４６６ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９８分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ３）

【0318】

シアノメチル（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル－メチルアミノ］－３－ピリジン－３－イルプロパノエート（化合物ＳＴ２７、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＡ３Ｐｙｒ－ＯＣＨ _２ ＣＮ）の合成

【化40】

【0319】

窒素雰囲気下、（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル－メチルアミノ］－３－ピリジン－３－イルプロパン酸（化合物ＳＴ２６、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＡ３Ｐｙｒ－ＯＨ）（８００ｍｇ、１．７２ｍｍｏｌ）およびＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（４４４ｍｇ、３．４４ｍｍｏｌ）の混合物をＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶解し、２－ブロモアセトニトリル（８１８ｍｇ、６．８２ｍｍｏｌ）を室温において加え、室温で６時間撹拌した。反応液を濃縮し、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／石油エーテル）にて精製し、シアノメチル （２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル－メチルアミノ］－３－ピリジン－３－イルプロパノエート（化合物ＳＴ２７、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＡ３Ｐｙｒ－ＯＣＨ_２ＣＮ）（２２１ｍｇ、２５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ５０５ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８３分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ４）

【0320】

［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－［［［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１－イル）－４－ヒドロキシ－２－（ホスホノオキシメチル）オキソラン－３－イル］オキシ－ヒドロキシホスホリル］オキシメチル］－５－（６－アミノプリン－９－イル）－４－ヒドロキシオキソラン－３－イル］ （２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル－メチルアミノ］－３－ピリジン－３－イルプロパノエート（化合物ＳＴ２８、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＡ３Ｐｙｒ－ｐＣｐＡ）の合成

【化41】

【0321】

緩衝液Ａ（１００ｍＬ）に、文献（Helv. Chim. Acta, 90,297-310）記載の方法で合成したリン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（４００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）を溶解させ、シアノメチル （２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル－メチルアミノ］－３－ピリジン－３－イルプロパノエート（化合物ＳＴ２７、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＡ３Ｐｙｒ－ＯＣＨ_２ＣＮ）（１４６ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（５ｍＬ）をシリンジポンプを用いて１５分以上かけて滴下し、室温で１時間撹拌した。反応液にトリフルオロ酢酸（２．３ｍＬ）を加え、反応液を凍結乾燥したのちに、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ＳＴ２８、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＡ３Ｐｙｒ－ｐＣｐＡ）（６４．４ｍｇ、５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ １０９８．５ （Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．３９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０１）

【0322】

（２Ｓ，３Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－メチルペンタン酸（化合物ＳＴ２９、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｉｌｅ－ＯＨ）の合成

【化42】

【0323】

窒素雰囲気下、Ｌ－イソロイシン（５２．５ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、特許文献（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）記載の方法で合成した炭酸－（４－ニトロフェニル）－４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（１７８ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（２ｍＬ）、トリエチルアミン（１２８μＬ、０．９２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温にて２．５日間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（２Ｓ，３Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－メチルペンタン酸（化合物ＳＴ２９、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｉｌｅ－ＯＨ）（１２５ｍｇ、７５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４１５．４ （Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．７４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

【0324】

シアノメチル（２Ｓ，３Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－メチルペンタノアト（化合物ＳＴ３０、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｉｌｅ－ＯＣＨ _２ ＣＮ）の合成

【化43】

【0325】

窒素雰囲気下、（２Ｓ，３Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－メチルペンタン酸（化合物ＳＴ２９、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｉｌｅ－ＯＨ）（４２ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）および２－ブロモアセトニトリル（１３μＬ、０．２００ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５００μＬ）に溶解し、Ｎ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（３５μＬ、０．２００ｍｍｏｌ）を室温において加え、室温で１６時間撹拌した。反応液を濃縮し、粗生成物シアノメチル （２Ｓ，３Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－メチルペンタノアト（化合物ＳＴ３０、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｉｌｅ－ＯＣＨ２ＣＮ）を得た。得られた粗生成物をアセトニトリル（３．００ｍＬ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４５４ （Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．８３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

【0326】

［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－［［［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１－イル）－４－ヒドロキシ－２－（ホスホノオキシメチル）オキソラン－３－イル］オキシ－ヒドロキシホスホリル］オキシメチル］－５－（６－アミノプリン－９－イル）－４－ヒドロキシオキソラン－３－イル］ （２Ｓ，３Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－メチルペンタノアト（化合物ＳＴ３１、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｉｌｅ－ｐＣｐＡ）の合成

【化44】

【0327】

緩衝液Ａ（６０ｍＬ）に、文献（Helv. Chim. Acta, 90,297-310）記載の方法で合成したリン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（７２．２ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌ）を溶解させ、シアノメチル （２Ｓ，３Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－メチルペンタノアト（化合物ＳＴ３０、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｉｌｅ－ＯＣＨ２ＣＮ）（４５．５ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（３．００ｍＬ）を投与し、室温で２０時間撹拌した。反応液を０℃に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（３．００ｍＬ）を加えた。反応液を室温で３０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ＳＴ３１、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｉｌｅ－ｐＣｐＡ）（１２ｍｇ、１１．４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ １０４９．４ （Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．５４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

【0328】

［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－［［［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１－イル）－４－ヒドロキシ－２－（ホスホノオキシメチル）オキソラン－３－イル］オキシ－ヒドロキシホスホリル］オキシメチル］－５－（６－アミノプリン－９－イル）－４－ヒドロキシオキソラン－３－イル］ （２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル－メチルアミノ］－３－フェニルプロパノエート（化合物ＳＴ３２、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＰｈｅ－ｐＣｐＡ）の合成

【化45】

【0329】

ＷＯ２０１８／２２５８６４に記載の方法で合成した。

【0330】

［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－［［［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１－イル）－４－ヒドロキシ－２－（ホスホノオキシメチル）オキソラン－３－イル］オキシ－ヒドロキシホスホリル］オキシメチル］－５－（６－アミノプリン－９－イル）－４－ヒドロキシオキソラン－３－イル］ （２Ｒ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］プロパノエート（化合物ＳＴ３３、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｄ－Ａｌａ－ｐＣｐＡ）の合成

【化46】

【0331】

ＷＯ２０１８／１４３１４５に記載の方法で合成した。

【0332】

２－Ｏ－［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－［［［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１－イル）－４－ヒドロキシ－２－（ホスホノオキシメチル）オキソラン－３－イル］オキシ－ヒドロキシホスホリル］オキシメチル］－５－（６－アミノプリン－９－イル）－４－ヒドロキシオキソラン－３－イル］ １－Ｏ－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メチル］ （２Ｓ）－ピペリジン－１，２－ジカルボキシラート（化合物ＳＴ３４、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｐｉｃ（２）－ｐＣｐＡ）の合成

【化47】

【0333】

ＷＯ２０２０／１３８３３６に記載の方法で合成した。

【0334】

［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－［［［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１－イル）－４－ヒドロキシ－２－（ホスホノオキシメチル）オキソラン－３－イル］オキシ－ヒドロキシホスホリル］オキシメチル］－５－（６－アミノプリン－９－イル）－４－ヒドロキシオキソラン－３－イル］ （２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル－メチルアミノ］－４－フェニルブタノアト（化合物ＳＴ３５、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＨｐｈ－ｐＣｐＡ）の合成

【化48】

【0335】

特許文献（ＷＯ２０２０１３８３３６Ａ１）記載の方法で合成した。

【0336】

［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－［［［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１－イル）－４－ヒドロキシ－２－（ホスホノオキシメチル）オキソラン－３－イル］オキシ－ヒドロキシホスホリル］オキシメチル］－５－（６－アミノプリン－９－イル）－４－ヒドロキシオキソラン－３－イル］ （２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル－メチルアミノ］－４－フェニルブタノアト（化合物ＳＴ３６、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＳＰｈ２Ｃｌ－ｐＣｐＡ）の合成

【化49】

【0337】

特許文献（ＷＯ２０２０１３８３３６Ａ１）記載の方法で合成した。

【0338】

実施例１３．アミノアシルtRNAの合成
実施例５の「アミノアシルｐＣｐＡを用いたアミノアシルｔＲＮＡ合成：その１」に記載の方法に準じ、各種アミノアシルtＲＮＡを合成し、回収した。回収した各種アミノアシルｔＲＮＡは１ｍＭ酢酸ナトリウムに溶解した。完成したアミノアシルtRNAの名称と、用いるアミノアシルpCpAアミノ酸の対応は表１８の通り。

【0339】

【表18】

【0340】

実施例１４．変異体を発現する大腸菌株の作製
L31タンパク質のN末端側から様々な長さで発現するL31変異体株を8種類（L31(1-27)、L31(1-32)、L31(1-37)、L31(1-42)、L31(1-47)、L31(1-52)、L31(1-57)、L31(1-67)）構築した。Quick and Easy ConditionalKnockout Kit (loxP/Cre)（Gene Bridges 社）のキット付属のプロトコルに従い、大腸菌株を構築した。

【0341】

ホモロジーアームが付加した機能カセットの作成
実施例１に記載の方法に準じて、機能カセットを作成した。各株のL31の発現領域の長さと、株を作製するのに用いた機能カセットのPCRに用いたprimerとの対応を表１９に示した。

【0342】

【表19】

【0343】

L31変異体株の作成
実施例１に記載の方法に準じL31変異体株を作成した。

【0344】

実施例１５．リボソームの精製
L31変異体株、L31short株、L31intact株、W3110株を用いたリボソームの調製
実施例２に記載の方法に準じ、株の培養、大腸菌の破砕、大腸菌の精製、Butylsepharose精製、超遠心精製を行った。全ての株に関して、実施例２のL31intact株およびL31short株に関する記載に準じた。大腸菌の破砕には、実施例２に記載のMg10Lysis Bufferを使用した。最終濃度が10～20μMになるように調製し、L31shortリボソーム、L31intactリボソーム、WTリボソーム、L31変異体リボソーム8種類、の合計11種類のリボソームを調製した。

【産業上の利用可能性】

【0345】

本発明は、非天然アミノ酸を含むペプチドおよびペプチドライブラリの製造方法、および、当該方法において使用するための改変されたＬ３１タンパク質等を提供する。本発明の製造方法を用いることにより、非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡを効率よく翻訳し、当該ペプチドやそれを含むライブラリを効率的に製造することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

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